(57)【要約】【課題】  高感度、高精度、ＨＰＬＣ法と高相関に、測定試料中のＨｂＡ１ｃ量のＨｂ量に対する割合：ＨｂＡ１ｃ（％）を測定できるイムノクロマト試験片を提供する。【解決手段】  本発明は、サンプルパッドと、テストライン検出試薬とコントロールライン検出試薬とを坦持したコンジュゲーションパッドと、測定試料中のＨｂまたはＨｂＡ１ｃを特異的に捕捉するための抗体Ａと前記コントロールライン検出試薬中の標識物質を特異的に捕捉するための抗体Ｂとを、それぞれ異なる位置に線状に固定したメンブレンと、吸収パッドと、から構成され、前記テストライン検出試薬は、前記測定試料中のＨｂまたはＨｂＡ１ｃを捕捉するための抗体Ｃとセルロース系着色微粒子とブロッキング用タンパク質との複合体であり、前記コントロールライン検出試薬は、セルロース系着色微粒子と標識物質で標識されたブロッキング用タンパク質との複合体であるイムノクロマト試験片である。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）サンプルパッドと、
（２）テストライン検出試薬と、コントロールライン検出試薬とを坦持したコンジュゲーションパッドと、
（３）測定試料中のヘモグロビンまたはヘモグロビンＡ１ｃを特異的に捕捉するための抗体Ａと、前記コントロールライン検出試薬中の標識物質を特異的に捕捉するための抗体Ｂとを、それぞれ異なる位置に線状に固定したメンブレンと、
（４）吸収パッドと、から構成され、
前記テストライン検出試薬は、前記測定試料中のヘモグロビンまたはヘモグロビンＡ１ｃを捕捉するための抗体Ｃとセルロース系着色微粒子とブロッキング用タンパク質との複合体であり、
前記コントロールライン検出試薬は、セルロース系着色微粒子と標識物質で化学的に標識されたブロッキング用タンパク質との複合体である、イムノクロマト試験片。
【請求項２】
前記抗体Ａは測定試料中のヘモグロビンを特異的に捕捉するための抗体であり、かつ前記抗体Ｃは抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体である、請求項１に記載のイムノクロマト試験片。
【請求項３】
前記標識物質がビオチンであり、かつ前記抗体Ｂは抗ビオチン抗体である、請求項１または２に記載のイムノクロマト試験片。
【請求項４】
前記ブロッキング用タンパク質が微生物由来のＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔである、請求項１から３のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
【請求項５】
前記テストライン検出試薬と前記コントロールライン検出試薬が、２：１〜５０：１の混合比（質量比）で前記コンジュゲーションパッドに坦持されている、請求項１から４のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
【請求項６】
前記セルロース系着色微粒子の色が青または黒である、請求項１から５のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
【請求項７】
前記テストライン検出試薬に用いるセルロース系着色微粒子と前記コントロールライン検出試薬に用いるセルロース系着色微粒子とが実質的に同一である、請求項１から６のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載のイムノクロマト試験片、測定試料希釈液およびイムノクロマトリーダーからなる、ヘモグロビンＡ１ｃ量のヘモグロビン量に対する割合を定量するための測定キット。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載のイムノクロマト試験片または測定キットを用い、少なくとも下記工程（ｉ）から（ｉｉｉ）をこの順に経て、測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量のヘモグロビン量に対する割合を定量する方法。
工程（ｉ）：測定試料と測定試料希釈液とを体積比１：４９〜１：９９９で混合し希釈する工程
工程（ｉｉ）：工程（ｉ）の混合液を、サンプルパッドに点着させる工程
工程（ｉｉｉ）：イムノクロマト試験片のテストラインの反射吸光度とコントロールラインの反射吸光度とからヘモグロビンＡ１ｃ量のヘモグロビン量に対する割合を比色定量する工程
【請求項１０】
測定試料と測定試料希釈液とを体積比１：９９〜１：４９９で混合し希釈する、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノクロマト法による測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量のヘモグロビン量に対する割合：ヘモグロビンＡ１ｃ（％）の測定方法、前記測定方法に用いるイムノクロマト試験片、およびイムノクロマト試験片を含むキットに関する。より詳しくは、イムノクロマト法による測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量およびヘモグロビン量をそれぞれ測定することなく、測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量のヘモグロビン量に対する割合：ヘモグロビンＡ１ｃ（％）をイムノクロマト試験片上のラインの反射吸光度から直接定量する測定方法、前記測定方法に用いるイムノクロマト試験片、およびイムノクロマト試験片を含む測定キットおよび測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界糖尿病連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ）によると、世界の糖尿病患者数はアメリカ、ヨーロッパなどの先進国に加え、中国、インド、ブラジルなどの新興国を含めて急増しており、２０１５年で約４．２億人存在し、２０４０年には約６．４億人に及ぶと予測され、糖尿病診断の重要性は増している。【０００３】
糖尿病診断項目の一つであるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃと略すことがある）とは、血液中の酸素を運搬する役割を担うヘモグロビン（以下、Ｈｂと略すことがある）に糖（グルコース）が結合した糖化Ｈｂの内、Ｈｂのβ鎖のＮ末端側に位置するバリン残基が糖化された物質を指し、総Ｈｂ量に対するＨｂＡ１ｃ量の割合であるＨｂＡ１ｃ（％）が過去１〜２ヶ月間の平均血糖値を反映することから、糖尿病の長期的な経過を観察するのに利用されている。【０００４】
従来、ＨｂＡ１ｃ（％）の測定にはＨＰＬＣ法、キャピラリー電気泳動法、酵素比色法、免疫比濁法などの測定技術が利用されていたが、これらの測定方法は専門知識を有することや分析装置が大型かつ高額であるなどの理由から、主に大規模病院や多数の検査を行う検査センターで利用されており、小規模病院ではＨｂＡ１ｃ（％）を簡単に測定できない点が問題となっていた。【０００５】
近年、医療現場ではＰＯＣＴという言葉が注目を集めている。ＰＯＣＴとはＰｏｉｎｔ Ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇの略であり、医療従事者が被験者の傍らで行う臨床検査のことをいう。ＰＯＣＴは大規模病院の中央検査室等で行う臨床検査とは異なり、その場で瞬時に検査結果が得られることから、糖尿病診断においてもＰＯＣＴが広まりつつある。【０００６】
ＨｂＡ１ｃ（％）の測定を目的としたＰＯＣＴの中に、イムノクロマト法を利用した技術が提案されている。イムノクロマト法とは毛細管現象を利用した免疫測定法であり、妊娠検査やインフルエンザ検査などにおいて世界的に普及している。従来のイムノクロマト法は目視判定（定性評価）が一般的であったが、近年、イムノクロマトリーダー等の分析装置を利用して測定試料中に含まれる分析対象物質の量を定量化する技術が開発されつつある。【０００７】
イムノクロマト法を用いて分析対象物質の量を定量する手法の一つとしては、抗原抗体反応を利用したサンドイッチ法が挙げられる。サンドイッチ法では分析対象物質に対してエピトープの異なる２種類の抗体を利用する。一方の抗体は、金コロイド、着色ラテックス粒子、蛍光粒子等の検出粒子と感作した検出抗体として使用する。他方の抗体は、多孔質支持体の表面に線状に固定した捕捉抗体としてテストラインを形成する。加えて、前記検出抗体を特異的に捕捉する抗体を多孔質支持体の表面の、前記テストラインとは異なる位置に線状に固定しコントロールラインを形成する。測定試料中に含まれる分析対象物質は、多孔質支持体の一端（上流側）から展開し、検出抗体と免疫複合体を形成しながら移動し、テストライン上で捕捉抗体と接触して捕捉され発色する。分析対象物質と免疫複合体を形成しなかった遊離の検出試薬はテストライン上を通過し、コントロールラインの抗体に捕捉され発色する。これらの発色強度をイムノクロマトリーダー等の装置を利用することで分析対象物質の量を定量することができる。【０００８】
特許文献１には、保存安定性の向上を目的とした、イムノクロマト法によるＨｂＡ１ｃ（％）測定技術が開示されている。しかしながら、前記発明は、分析対象物質であるＨｂＡ１ｃを２種類の抗ＨｂＡ１ｃ抗体でサンドイッチする構成であるため、測定試料中のＨｂＡ１ｃ量を測定することは可能であるものの、ＨｂＡ１ｃ（％）を測定するには別の手段でＨｂ量を測定する必要があった。また、特許文献２には、生体試料中の検出対象物質の濃度の影響を受けず、コントロールラインの発色強度を安定化できるＨｂＡ１ｃ（％）の測定技術が開示されている。しかし、特許文献１および２では、検出粒子として金コロイドまたはラテックス粒子を使用しているため、感度・精度・ＨＰＬＣ法との相関性の観点から十分ではなかった。【０００９】
特許文献３、４には、ＨｂＡ１ｃのエピトープであるβ鎖のＮ末端をタンパク質表面に露出させるための前処理方法の開発を目的とした、イムノクロマト法によるＨｂＡ１ｃ（％）測定技術が開示されている。前記発明は、テストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）からＨｂＡ１ｃ（％）を直接定量し得る可能性があるという点では一定の効果が期待される。しかしながら、前記発明は、コントロールラインを立てていないため、精度の観点から十分ではなかった。また、検出粒子として金コロイドまたはラテックス粒子を使用しているため、感度・精度・ＨＰＬＣ法との相関性の観点から十分ではなかった。さらに、検出抗体として抗Ｈｂ抗体、捕捉抗体として抗ＨｂＡ１ｃ抗体を使用しているため、Ｈｂ量依存性を完全に回避し得るものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１７−１２９５３３号公報
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ２０１７／０６５２１３
【特許文献３】特開２０１２−２５１７８９号公報
【特許文献４】特開２０１５−１５８５１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記の問題点に鑑みて、従来技術よりも感度・精度・ＨＰＬＣ法との相関性の高い、イムノクロマト法による測定試料中のＨｂＡ１ｃ量のＨｂ量に対する割合：ＨｂＡ１ｃ（％）の測定方法、および前記測定方法に用いるイムノクロマト試験片、イムノクロマト試験片を含むキットを提供することを課題とするものである。より詳しくは、従来よりも測定試料中のＨｂ量の影響を受けにくい、イムノクロマト法による測定試料中のＨｂＡ１ｃ量およびＨｂ量をそれぞれ測定することなく、測定試料中のＨｂＡ１ｃ量のＨｂ量に対する割合：ＨｂＡ１ｃ（％）をメンブレン上のラインの反射吸光度から直接定量する測定方法、および前記測定方法に用いるイムノクロマト試験片、イムノクロマト試験片を含むキットを提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、コンジュゲーションパッドに担持するテストライン検出試薬として、抗Ｈｂ抗体または抗ＨｂＡ１ｃ抗体（検出抗体）、セルロース系着色微粒子（検出粒子）、およびブロッキング用タンパク質（ブロッキング剤）を使用し、コンジュゲーションパッドに担持するコントロールライン検出試薬として、セルロース系着色微粒子（検出粒子）、および標識物質で化学的に標識したブロッキング用タンパク質（ブロッキング剤）を使用することで、従来技術よりも感度・精度・ＨＰＬＣ法との相関性が大幅に向上することを見出した。また、ブロッキング用タンパク質にＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：ＢＰＦを使用することで、感度・精度・ＨＰＬＣ法との相関性がさらに向上することを見出した。さらに、コンジュゲーションパッドに担持する抗体（検出抗体）として抗ＨｂＡ１ｃ抗体、メンブレンに線状に固定する抗体（捕捉抗体）として抗Ｈｂ抗体をそれぞれ使用することで、従来技術よりも測定試料中のＨｂ量の影響を受けにくくなることを見出し、本発明を完成させた。【００１３】
すなわち、代表的な本発明は以下の通りである。
１．  （１）サンプルパッドと、
（２）テストライン検出試薬と、コントロールライン検出試薬とを坦持したコンジュゲーションパッドと、
（３）測定試料中のヘモグロビンまたはヘモグロビンＡ１ｃを特異的に捕捉するための抗体Ａと、前記コントロールライン検出試薬中の標識物質を特異的に捕捉するための抗体Ｂとを、それぞれ異なる位置に線状に固定したメンブレンと、
（４）吸収パッドと、から構成され、
前記テストライン検出試薬は、前記測定試料中のヘモグロビンまたはヘモグロビンＡ１ｃを捕捉するための抗体Ｃとセルロース系着色微粒子とブロッキング用タンパク質との複合体であり、
前記コントロールライン検出試薬は、セルロース系着色微粒子と標識物質で化学的に標識されたブロッキング用タンパク質との複合体である、イムノクロマト試験片。
２．  前記抗体Ａは測定試料中のヘモグロビンを特異的に捕捉するための抗体であり、かつ前記抗体Ｃは抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体である、１に記載のイムノクロマト試験片。
３．  前記標識物質はビオチンであり、かつ前記抗体Ｂは抗ビオチン抗体である、１または２に記載のイムノクロマト試験片。
４．  前記ブロッキング用タンパク質が微生物由来のＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔである、１から３のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
５．  前記テストライン検出試薬と前記コントロールライン検出試薬が、２：１〜５０：１の混合比（質量比）で、前記コンジュゲーションパッドに坦持されている、１から４のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
６．  前記セルロース系着色微粒子の色が青または黒である、１から５のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
７．  前記テストライン検出試薬に用いるセルロース系着色微粒子と前記コントロールライン検出試薬に用いるセルロース系着色微粒子とが実質的に同一である、１から６のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
８．  １から７のいずれかに記載のイムノクロマト試験片、測定試料希釈液およびイムノクロマトリーダーからなる、ヘモグロビンＡ１ｃ量のヘモグロビン量に対する割合を定量するための測定キット。
９．  １から８のいずれかに記載のイムノクロマト試験片または測定キットを用い、少なくとも下記工程（ｉ）から（ｉｉｉ）をこの順に経て、測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量のヘモグロビン量に対する割合を定量する方法。
工程（ｉ）：測定試料と測定試料希釈液とを体積比１：４９〜１：９９９で混合し希釈する工程
工程（ｉｉ）：工程（ｉ）の混合液を、サンプルパッドに点着させる工程
工程（ｉｉｉ）：イムノクロマト試験片のテストラインの反射吸光度とコントロールラインの反射吸光度とからヘモグロビンＡ１ｃ量のヘモグロビン量に対する割合を比色定量する工程
１０．  測定試料と測定試料希釈液とを体積比１：９９〜１：４９９で混合し希釈する、９に記載の測定方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のイムノクロマト試験片は特定の抗体、検出粒子、およびブロッキング用タンパク質を、特定の配置で担持させているため、高感度・高精度・ＨＰＬＣ法との高相関性でかつ測定試料中のＨｂ量の影響を受けずに、測定試料中のＨｂＡ１ｃ量のＨｂ量に対する割合：ＨｂＡ１ｃ（％）を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明のイムノクロマト試験片の一例を示す（上面）図である。
【図２】本発明のイムノクロマト試験片の一例を示す（側面）図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明に用いる測定試料は特に限定されないが、例えば、血液、リンパ液、髄液、汗、尿、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪等の生体試料が挙げられる。血液においては、全血のほか、血液を遠心分離して得られた血清、血球または血漿を試料とすることができる。また、測定試料はヒト由来に限らず、イヌ、ネコ、ウシ等の哺乳動物由来の生体試料も対象である。また、本発明における測定項目は、測定試料中のＨｂＡ１ｃ量のＨｂ量に対する割合：ＨｂＡ１ｃ（％）である。
【００１７】
本発明のイムノクロマト試験片の構成は、イムノクロマト試験片の測定試料溶液の添加部（滴下部）を上流側として、前記添加部を有するサンプルパッド、コンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドの順に連接配置されている。次いで、本発明のイムノクロマト試験片の一例を、図面を参照して説明する。図１および２において、１はサンプルパッド、２はコンジュゲーションパッド、３はメンブレン、４は吸収パッド、５はバッキングシート、６はテストライン、７はコントロールライン、８は粘着シートをそれぞれ示す。
【００１８】
図１および２の例では、イムノクロマト試験片は、幅３〜５ｍｍ（好ましくは、４ｍｍ程度）、長さ４０〜１００ｍｍ（好ましくは６０ｍｍ程度）の細長い短冊状の形態をしている。なお、イムノクロマト試験片のメンブレン３の上流側の端部から約１５ｍｍの位置に測定試料中のＨｂまたはＨｂＡ１ｃを特異的に捕捉するための抗体Ａを線状に固定したテストライン６が形成される。また、前記端部から約２０ｍｍの位置にコントロールライン検出試薬の標識物質を特異的に捕捉するための抗体Ｂを線状に固定したコントロールライン７が形成される。さらに、イムノクロマト試験片のコンジュゲーションパッド２には測定試料中のＨｂまたはＨｂＡ１ｃを捕捉するための抗体Ｃとセルロース系着色微粒子とブロッキング用タンパク質との複合体であるテストライン検出試薬、およびセルロース系着色微粒子と標識物質で化学的に標識したブロッキング用タンパク質との複合体であるコントロールライン検出試薬が坦持されている。
【００１９】
本発明で用いるサンプルパッド１の材質は、測定試料を速やかに吸収した後、下流のコンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドへ展開できる材質のものであれば、特に限定されないが、例えばセルロース製のろ紙または不織布、ガラス製のろ紙または不織布、ポリエステル製のろ紙または不織布、ポリエチレン製のろ紙または不織布が挙げられる。これらの中でも、セルロース製のろ紙が好ましい。また、前記サンプルパッド１の厚さは、０．１〜２．０ｍｍが好ましく、０．２〜１．０ｍｍがより好ましい。厚さが薄いと、下流での測定試料の流れが不均一となり測定精度が低下することがある。一方、厚さが厚いと、下流への展開が遅くなり測定時間が長くなることがある。また、下流への展開に必要となる測定試料の必要量が多くなる。
【００２０】
本発明で用いるコンジュゲーションパッド２の材質は、テストライン検出試薬およびコントロールライン検出試薬を乾燥状態で保持でき、かつ測定試料の下流への展開と共に前記両検出試薬を速やかに放出することができる材質のものであれば、特に限定されないが、例えばセルロース製のろ紙または不織布、ガラス製のろ紙または不織布、ポリエステル製のろ紙または不織布、ポリエチレン製のろ紙または不織布が挙げられる。これらの中でも、ガラス製のろ紙が好ましい。また、前記コンジュゲーションパッド２の厚さは、０．１〜２．０ｍｍが好ましく、０．２〜１．０ｍｍがより好ましい。厚さが薄いと、目的量のテストライン検出試薬およびコントロールライン検出試薬を乾燥状態で保持できないことがある。一方、厚さが厚いと、下流への展開が遅くなり測定時間が長くなることがある。また、下流への展開に必要となる測定試料の必要量が多くなる。
【００２１】
本発明で用いるメンブレン３の材質は、測定試料を精度よく均一に展開できるものであれば、特に限定されないが、例えばセルロース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、またはナイロン製のメンブレンが挙げられる。これらの中でも、ニトロセルロース製のメンブレンが好ましい。
【００２２】
本発明で用いる吸収パッド４の材質は、上流より展開してきた測定試料を速やかに吸収した後、逆流しないよう保持できる材質のものであれば、特に限定されないが、例えばセルロース製のろ紙または不織布、ガラス製のろ紙または不織布、ポリエステル製のろ紙または不織布、ポリエチレン製のろ紙または不織布が挙げられる。これらの中でも、セルロース製のろ紙が好ましい。また、前記吸収パッド４の厚さは、０．２〜５．０ｍｍが好ましく、０．５〜２．０ｍｍがより好ましい。厚さが薄いと、測定試料の滴下量によっては一度吸収パッドに吸収された測定試料がメンブレン側に逆流することがある。一方、厚さが厚いと、イムノクロマト試験片およびイムノクロマト試験片を覆うハウジングケースのサイズも大きくなり、ＰＯＣＴの観点から好ましくない。
【００２３】
本発明で用いるコンジュゲーションパッド２に担持するテストライン検出試薬は、検出抗体としての測定試料中のＨｂまたはＨｂＡ１ｃを捕捉するための抗体Ｃと、検出粒子としてのセルロース系着色微粒子と、ブロッキング剤としてのブロッキング用タンパク質との複合体である。なお、使用する検出粒子や目的とする性能によって、最適なブロッキング剤は異なるため、本発明の目的である高感度・高精度・ＨＰＬＣ法との高相関性でかつ測定試料中のＨｂ量の影響を受けずに、測定試料中のＨｂＡ１ｃ量のＨｂ量に対する割合：ＨｂＡ１ｃ（％）を測定するためには、検出粒子とブロッキング剤の組合せの最適化が必要である。
【００２４】
前記抗体Ｃは、抗Ｈｂ抗体または抗ＨｂＡ１ｃ抗体であり、抗ＨｂＡ１ｃ抗体が好ましい。なお、後述の抗体Ａが抗Ｈｂ抗体のとき抗体Ｃは抗ＨｂＡ１ｃ抗体であり、抗体Ａが抗ＨｂＡ１ｃ抗体であるとき抗体Ｃは抗Ｈｂ抗体である必要がある。抗体Ａおよび抗体Ｃが共に抗Ｈｂ抗体つまり抗Ｈｂ抗体でサンドイッチする構成では、測定試料中のＨｂＡ１ｃを捕捉・検出することはできず、ＨｂＡ１ｃ（％）の測定は不可能である。一方、抗体Ａおよび抗体Ｃが共に抗ＨｂＡ１ｃ抗体、つまり抗ＨｂＡ１ｃ抗体でサンドイッチする構成では、Ｈｂ量により測定結果（補正値）が大きく変動するため、別の手段でＨｂ量を測定する必要がある。つまり、メンブレン上のラインの反射吸光度からＨｂＡ１ｃ（％）を直接定量することはできない。なお、抗Ｈｂ抗体または抗ＨｂＡ１ｃ抗体は、市販品を用いてもよいし、別途公知の方法で製造してもよい。また、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、分子サイズも特に限定されない。
【００２５】
前記セルロース系着色微粒子は、大量の水酸基を有するため、多くの反応性染料を共有結合により保持することができるだけでなく、濃染化した後も水などへの安定分散性を保持することができる。セルロース系着色微粒子として、再生セルロース、精製セルロース、天然セルロース等を用いることができるし、一部誘導体化されたセルロースを用いてもよい。前記セルロース系着色微粒子の質量の２０〜９０ｗｔ％はセルロース由来であることが好ましく、２０〜８０ｗｔ％がより好ましく、２０〜７０ｗｔ％がさらに好ましい。
【００２６】
前記セルロース系着色微粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、１００〜１０００ｎｍが好ましく、２００〜８００ｎｍがより好ましい。平均粒子径が１０００ｎｍより大きいと、下流への展開が遅くなり、測定時間が長くなる。また、メンブレン上に捕捉されやすくなり、バックグラウンド自体が発色してしまうことでテストラインおよびコントロールラインでの発色が不明瞭になる。一方、平均粒子径が小さいと、物理吸着または化学結合できる抗体量が低下し、測定感度が低下することがある。
【００２７】
前記セルロース系着色微粒子の色は、特に限定されないが、例えば赤色、青色、黄色、緑色、黒色、白色、蛍光色が挙げられる。これらの中でも、バックグラウンドのＨｂ由来の赤色の影響を受けにくい青色、黒色が好ましく、青色がより好ましい。このようなセルロース系着色微粒子としては、旭化成社製の着色セルロースナノビーズ（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標））が挙げられるが、この中でもＮａｖｙ（ＢＬ１）、Ｄａｒｋ  Ｎａｖｙ（ＢＬ２）、Ｂｌａｃｋ（ＫＲ１）が好ましく、Ｎａｖｙ（ＢＬ１）、Ｄａｒｋ  Ｎａｖｙ（ＢＬ２）がより好ましい。
【００２８】
前記セルロース系着色微粒子への前記抗体Ｃの結合量は、セルロース系着色微粒子と抗体Ｃの仕込み質量比を調整することで制御でき、特に限定されないが、セルロース系着色微粒子と抗体Ｃとの仕込み質量比は１：０．０１〜１：１が好ましく、１：０．０２〜１：０．５がより好ましく、１：０．０２〜１：０．２がさらに好ましい。質量比が前記範囲を外れると、セルロース系着色微粒子への抗体Ｃの結合量が不十分となるとか、セルロース系着色微粒子への抗体Ｃの結合量が増えすぎ、抗原抗体反応に寄与しない抗体Ｃが増えるため、測定感度が低下することがある。
【００２９】
前記ブロッキング用タンパク質は、特に限定されないが、微生物由来タンパク質のＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下、ＢＰＦと略すことがある）、動物由来タンパク質のウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略すことがある）、カゼインが好ましく、微生物由来タンパク質のＢＰＦがより好ましい。ＢＰＦ（約２２ｋＤａ）はＢＳＡ（約６６ｋＤａ）よりも分子量が小さいため、より高精度の測定が可能である。また、ＢＳＡはウシ由来であるため外来性物質に起因する汚染のリスクがあるが、ＢＰＦは微生物由来であるため前記リスクはない。一方、カゼインの溶解にはアルカリ条件（ｐＨ８．５〜１０）のホウ酸緩衝液を使用する必要があるため、抗体が失活し感度が低下することがある。また、ホウ酸緩衝液は環境リスクも高い。一方、ＢＰＦの溶解には中性条件のトリス、リン酸、ＰＩＰＥＳ等を使用することができるため好ましい。ブロッキング用タンパク質は、市販品を用いてもよいし、別途公知の方法で製造してもよい。また、分子サイズも、特に限定されないが、平均分子量で１００ｋＤａ以下が好ましい。一般的にブロッキング用タンパク質の分子サイズが小さいほど検出粒子１粒子に対するブロッキング用タンパク質の結合量は増加するので、測定精度の向上に寄与する。
【００３０】
前記抗体Ｃと前記セルロース系着色微粒子との結合方法は、特に限定されないが、疎水結合による物理吸着または共有結合による化学結合で感作するのが好ましく、操作が簡便でありかつコストも安い物理吸着がより好ましい。なお、感作効率を向上させるため、セルロース系着色微粒子に反応性活性基を導入してもよい。反応性活性基としては、特に限定されないが、例えばカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、チオール基、エポキシ基、水酸基が挙げられる。これらの中でも、カルボキシル基、アミノ基が好ましい。カルボキシル基の場合は、カルボジイミドを用いてリガンドのアミノ基と共有結合を形成することができる。
【００３１】
本発明で用いるコンジュゲーションパッド２に担持するコントロールライン検出試薬は、検出粒子としてのセルロース系着色微粒子と、標識としての標識物質で化学的に標識したブロッキング用タンパク質との複合体である。なお、使用する検出粒子や目的とする性能によって、最適なブロッキング剤は異なるため、本発明の目的である高感度・高精度・ＨＰＬＣ法との高相関性でかつ測定試料中のＨｂ量の影響を受けずに、測定試料中のＨｂＡ１ｃ量のＨｂ量に対する割合：ＨｂＡ１ｃ（％）を測定するためには、検出粒子とブロッキング剤の組合せの最適化が必要である。
【００３２】
前記テストライン検出試薬のセルロース系着色微粒子の平均粒子径と、前記コントロールライン検出試薬のセルロース系着色微粒子の平均粒子径とは、実質的に同一であることが好ましい。ここで、実質的に同一であるとは、平均粒子径が±５０ｎｍ以内であることを意味する。両者の平均粒子径が異なると、下流への展開速度や発色強度に差異が生じ、コントロールラインによるテストラインの補正がうまく機能せず、測定精度が低下することがある。
【００３３】
前記テストライン検出試薬のセルロース系着色微粒子の色と、前記コントロールライン検出試薬のセルロース系着色微粒子の色とは、実質的に同一であることが好ましい。ここで、実質的に同一であるとは、最大吸光波長が±２０ｎｍ以内であることを意味する。両者の色が異なると、例えば一般的な発光ダイオード（以下、ＬＥＤと略すことがある）−フォトダイオード（以下、ＰＤと略すことがある）の測定装置で測定する場合に、テストラインとコントロールラインの各色に対応する複数のＬＥＤ−ＰＤの組み合わせが必要となり、装置が大型化する。
【００３４】
前記標識物質で化学的に標識したブロッキング用タンパク質における標識は、特に限定されないが、比較的安価で、入手し易いことやタンパク質標識分野等で実績があることから、ビオチンまたはジゴキシゲニンが好ましく、ビオチンがより好ましい。
【００３５】
前記標識物質で化学的に標識したブロッキング用タンパク質の標識方法は、化学反応により共有結合を形成するものであれば特に限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法を例示できる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法を用いることで、例えばビオチンのカルボキシル基をＮ−ヒドロキシアミン系化合物と脱水縮合剤存在下で縮合反応し、選択的に活性化し、ブロッキング用タンパク質のアミノ基とアミド結合を介して標識することができる。前記縮合反応に使用するＮ−ヒドロキシアミン系化合物は、特に限定されないが、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステル、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸アミド、Ｎ−ヒドロキシピペリジン、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシマレイミド等が挙げられる。これら化合物を２種以上用いてもよい。これらの中でも、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（以下、ＮＨＳと略すことがある）が、比較的安価で、入手し易いことやペプチド合成分野等で実績があることから好ましい。また、前記縮合反応に使用する脱水縮合剤としては、特に限定されないが、例えば１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩、１−シクロヘキシル−（２−モルホニル−４−エチル）−カルボジイミド・メソｐ−トルエンスルホネートが挙げられる。これらの中でも、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣと略すことがある）がペプチド合成分野等で汎用的な水溶性縮合剤として実績があることから好ましい。また、反応温度は、特に限定されないが、１０〜５０℃が好ましく、２０〜４０℃がより好ましい。反応時間は反応温度によって異なるが、通常は５分〜２４時間である。なお、反応液中に含まれる未反応のＮ−ヒドロキシアミン系化合物や脱水縮合剤は濾過や遠心分離などにより水溶媒から容易に分離することができる。
【００３６】
前記標識物質で化学的に標識したブロッキング用タンパク質におけるブロッキング用タンパク質は、特に限定されないが、微生物由来タンパク質のＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下、ＢＰＦと略すことがある）、動物由来タンパク質のウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略すことがある）、カゼインが好ましく、微生物由来タンパク質のＢＰＦがより好ましい。ＢＰＦ（約２２ｋＤａ）はＢＳＡ（約６６ｋＤａ）よりも分子量が小さいため、より高感度の測定が可能である。また、ＢＳＡはウシ由来であるため外来性物質に起因する汚染のリスクがあるが、ＢＰＦは微生物由来であるため前記リスクはない。一方、カゼインの溶解にはアルカリ条件（ｐＨ８．５〜１０）のホウ酸緩衝液を使用する必要があるが、ホウ酸緩衝液は環境リスクが高い。一方、ＢＰＦの溶解には中性条件のトリス、リン酸、ＰＩＰＥＳ等を使用することができるため好ましい。ブロッキング用タンパク質は、市販品を用いてもよいし、別途公知の方法で製造してもよい。また、分子サイズも、特に限定されないが、平均分子量で１００ｋＤａ以下が好ましい。一般的にブロッキング用タンパク質の分子サイズが小さいほど検出粒子１粒子に対するブロッキング用タンパク質の結合量は増加するので、測定感度の向上に寄与する。
【００３７】
前記テストライン検出試薬のブロッキング用タンパク質と、前記コントロールライン検出試薬のブロッキング用タンパク質とは、製造プロセスの簡略化の観点から、実質的に同一であることが好ましい。
【００３８】
前記標識物質で化学的に標識したブロッキング用タンパク質における標識の導入量は、ブロッキング用タンパク質と標識の仕込みのモル比（以下、導入比と略すことがある）を調整することで制御でき、特に限定されないが、導入比は１：１〜１：１００が好ましく、１：１〜１：５０がより好ましい。導入比が１：１より小さいと、標識の導入量が不十分となり、測定感度が低下することがある。一方、導入比が１：１００より大きいと、標識の導入量が過剰となり、コントロールラインでの非特異発色等により、コントロールラインによるテストラインの補正がうまく機能せず、測定精度が低下することがある。
【００３９】
前記セルロース系着色微粒子への前記標識物質で化学的に標識したブロッキング用タンパク質の結合量は、セルロース系着色微粒子と標識物質で化学的に標識したブロッキング用タンパク質の仕込みの質量比を調整することで制御でき、特に限定されないが、標識物質で化学的に標識したブロッキング用タンパク質を、通常のブロッキング剤としても機能させるには、セルロース系着色微粒子に対し、標識物質で化学的に標識したブロッキング用タンパク質が大過剰に存在するのが好ましい。具体的には、セルロース系着色微粒子と標識物質で化学的に標識したブロッキング用タンパク質との仕込みの質量比は１：１００以上が好ましい。つまり、前記コントロールライン検出試薬には、標識物質で化学的に標識していないブロッキング用タンパク質を含まないのが好ましい。
【００４０】
前記テストライン検出試薬と前記コントロールライン検出試薬は、２：１〜５０：１の混合比（質量比）でコンジュゲーションパッドに担持させるのが好ましく、３：１〜３０：１がより好ましく、６：１〜１５：１がさらに好ましい。混合比が前記範囲を外れると、テストライン検出試薬の量が相対的に低くなるとか、コントロールライン検出試薬の量が相対的に低くなるため、コントロールラインによるテストラインの補正がうまく機能せず、測定精度が低下することがある。
【００４１】
コンジュゲーションパッド２に前記テストライン検出試薬と前記コントロールライン検出試薬を担持させる方法は、特に限定されないが、例えば前記テストライン検出試薬と前記コントロールライン検出試薬を一定比率で混合した後、前記混合液をコンジュゲーションパッドに均一に塗布、噴霧または含浸した後、恒温槽内で適当な温度で一定時間乾燥することで作製することができる。前記混合液の塗布量は、特に限定されないが、ライン長１ｃｍ辺り５〜５０μＬが好ましい。また、前記混合液の（抗体Ｃまたは標識物質で化学的に標識したブロッキング用タンパク質で感作済みの）セルロース系着色微粒子濃度は、特に限定されないが、０．０１〜０．５ｗｔ％が好ましく、０．０２〜０．２ｗｔ％がより好ましく、０．０２〜０．１ｗｔ％がさらに好ましい。濃度が０．０１ｗｔ％より低いと、ＨｂおよびＨｂＡ１ｃを十分捕捉・検出することができず、測定感度が低下することがある。一方、濃度が０．５ｗｔ％より高くても、測定感度の向上は見られず、コストだけが高くなる。次いで、前記塗布後に乾燥するのが好ましい。乾燥温度は、特に限定されないが、２０℃〜８０℃が好ましく、２０℃〜６０℃がより好ましい。乾燥時間は乾燥温度によって異なるが、通常は５〜１２０分間である。
【００４２】
本発明で用いるメンブレン３上のテストライン６を形成する線状に固定した捕捉抗体は、測定試料中のＨｂまたはＨｂＡ１ｃを捕捉するための抗体Ａである。前記抗体Ａは、抗Ｈｂ抗体または抗ＨｂＡ１ｃ抗体であり、抗Ｈｂ抗体が好ましい。なお、前述の抗体Ｃが抗ＨｂＡ１ｃ抗体のとき抗体Ａは抗体Ｈｂ抗体であり、抗体Ｃが抗Ｈｂ抗体であるとき抗体Ａは抗ＨｂＡ１ｃ抗体である必要がある。抗体Ａおよび抗体Ｃが共に抗Ｈｂ抗体、つまり抗Ｈｂ抗体でサンドイッチする構成では、測定試料中のＨｂＡ１ｃを捕捉・検出することはできず、ＨｂＡ１ｃ（％）の測定は不可能である。一方、抗体Ａおよび抗体Ｃが共に抗ＨｂＡ１ｃ抗体、つまり抗ＨｂＡ１ｃ抗体でサンドイッチする構成では、Ｈｂ量により測定結果（補正値）が大きく変動するため、別の手段でＨｂ量を測定する必要がある。つまり、メンブレン上のラインの反射吸光度からＨｂＡ１ｃ（％）を直接定量することはできない。なお、抗Ｈｂ抗体または抗ＨｂＡ１ｃ抗体は、市販品を用いてもよいし、別途公知の方法で製造してもよい。また、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいし、分子サイズも特に限定されない。
【００４３】
本発明で用いるメンブレン３上のコントロールライン７を形成する線状に固定した捕捉抗体は、コントロールライン検出試薬の標識物質を特異的に捕捉するための抗体Ｂである。前記抗体Ｂは、標識物質がビオチンの場合は抗ビオチン抗体であり、標識物質がジゴキシゲニンの場合は、抗ジゴキシゲニン抗体である。なお、抗ビオチン抗体または抗ジゴキシゲニン抗体は、市販品を用いてもよいし、別途公知の方法で製造してもよい。また、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいし、分子サイズも特に限定されない。
【００４４】
メンブレン３に前記テストラインを形成する捕捉抗体と前記コントロールラインを形成する捕捉抗体を線状に固定する方法は、特に限定されないが、例えば前記テストラインを形成する捕捉抗体と前記コントロールラインを形成する捕捉抗体を、それぞれ線上に一定量を異なる位置に塗布した後、恒温槽内で適当な温度で一定時間乾燥することで作製することができる。前記両捕捉抗体の塗布量は、特に限定されないが、ライン長１ｃｍ辺り０．１〜２μＬが好ましい。また、前記両捕捉抗体の塗布濃度は、特に限定されないが、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．２〜５ｍｇ／ｍＬがより好ましく、０．５〜２ｍｇ／ｍＬがさらに好ましい。濃度が低いと、ＨｂおよびＨｂＡ１ｃを十分捕捉・検出することができず、測定感度が低下することがある。一方、濃度を高くしても、測定感度の向上は見られず、コストだけが高くなる。次いで、前記塗布後に乾燥するのが好ましい。乾燥温度は、特に限定されないが、２０℃〜８０℃が好ましく、２０℃〜６０℃がより好ましい。乾燥時間は乾燥温度によって異なるが、通常は５〜１２０分間である。
【００４５】
本発明のイムノクロマト試験片は、前記作製したメンブレン３を粘着シート８の中央付近に貼り付け、次いでコンジュゲーションパッド２をメンブレン３の一方の末端上に一部重ね合わせて貼り付け、次いでサンプルパッド１をコンジュゲーションパッド２のメンブレン３との重なりとは逆の末端上に一部重ね合わせて貼り付け、次いで吸収パッド４をメンブレン３の他方の末端上に一部重ね合わせて貼り付けた後、一定幅の短冊状に切断することで作製することができる。なお、テストライン６およびコントロールライン７は試験片を作製した後に調製してもよいし、試験片を作製する前に調製してもよい。
【００４６】
本発明において、イムノクロマト測定キットは、イムノクロマト試験片に加え、測定試料を前処理および／または希釈するための測定試料希釈液、およびイムノクロマトリーダーを含むのが好ましい。
【００４７】
前記測定試料希釈液は、測定試料の展開性を向上させかつ免疫反応に影響しないノニオン性界面活性剤を含むことが好ましい。前記ノニオン性界面活性剤としては、特に限定されないが、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。また、前記界面活性剤は単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。ノニオン性界面活性剤の濃度としては、０．０１ｗｔ％〜５．０ｗｔ％が好ましく、０．０５ｗｔ％〜４．０ｗｔ％がより好ましく、０．１ｗｔ％〜３．０ｗｔ％がさらに好ましい。濃度が低いと、下流への展開が困難となることがある。また、展開が不均一となり測定精度が低下することがある。一方、濃度が高いと、物理的に吸着している、検出粒子と抗体、および／またはメンブレンと抗体が乖離し、測定値が得られないことがある。
【００４８】
前記測定試料希釈液は、無機塩類やｐＨ調整に用いる緩衝剤を添加しても良い。前記緩衝剤としては、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）が挙げられる。これらの中でも、本発明に用いる抗体の至適ｐＨ範囲である７．０付近において充分な緩衝能力を有する等の理由から、トリス、リン酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳが好ましく、トリス、リン酸、ＰＩＰＥＳがより好ましい。
【００４９】
前記測定試料希釈液による測定試料の希釈倍率は、特に限定されないが、５０〜１０００倍希釈が好ましく、１００〜５００倍希釈がより好ましい。測定試料の希釈倍率が低く濃度が高いと、下流への展開が困難になることがある。また、測定試料中の共雑物質の影響も受けやすくなり、測定精度が低下することがある。一方、測定試料の希釈倍率が高く濃度が低いと、測定試料中のＨｂおよびＨｂＡ１ｃの濃度が低下し、測定感度が低下することがある。
【００５０】
前記イムノクロマト試験片は、少なくともサンプルパッド１上に測定試料を滴下するための第一の開口部、メンブレン３上にテストライン６とコントロールライン７を測定するための第二の開口部を有する適当なプラスチック製のハウジングケースに収容されたものでも良い。
【００５１】
本発明のイムノクロマト試験片を用いてメンブレン上でＨｂＡ１ｃ（％）の測定を行う方法は、特に限定されないが、以下の方法が例示できる。初めに、測定試料と測定試料希釈液とを所定の希釈倍率で混合することで展開可能な希釈測定試料を得る。次いで、前記希釈測定試料をサンプルパッド１に滴下することで、希釈測定試料は毛細管現象によりサンプルパッド１を通過してコンジュゲーションパッド２に展開する。その際、希釈測定試料はコンジュゲーションパッド２に坦持されたテストライン検出試薬およびコントロールライン検出試薬を溶解しながら、希釈測定試料中のＨｂＡ１ｃとテストライン検出試薬中の抗ＨｂＡ１ｃ抗体で感作したセルロース系着色微粒子とが免疫複合体を形成する。なお、希釈測定試料中のＨｂＡ１ｃ以外のＨｂ（例えば、ＨｂＡ０等）はテストライン検出試薬とは免疫複合体を形成しない。次いで、前記希釈測定試料はメンブレン３に展開する。希釈測定試料がテストライン６に到達すると、前記免疫複合体はテストラインを形成する捕捉抗体（抗Ｈｂ抗体）で捕捉されて集積し、テストライン６が発色する。なお、希釈測定試料中のＨｂＡ１ｃ以外のＨｂ（例えば、ＨｂＡ０等）もテストラインを形成する捕捉抗体（抗Ｈｂ抗体）で捕捉されて集積するため、テストライン上では免疫複合体とＨｂＡ１ｃ以外のＨｂ（例えば、ＨｂＡ０等）との競合的な捕捉が生じ、捕捉される確率は測定試料中のＨｂＡ１ｃ量のＨｂ量に対する割合：ＨｂＡ１ｃ（％）に依存する。つまり、テストラインの発色強度から、ＨｂＡ１ｃ（％）を直接測定することが可能となる。その後、前記希釈測定試料がコントロールライン７に到達すると、コントロールライン検出試薬中の標識物質（ビオチン）で化学的に標識したブロッキング用タンパク質で感作したセルロース系着色微粒子はコントロールラインを形成する捕捉抗体（抗ビオチン抗体）で捕捉されて集積し、コントロールライン７が発色する。最後に、前記希釈測定試料は吸収パッド４で吸収される。
【００５２】
前記ＨｂＡ１ｃ（％）はテストラインの発色強度から直接測定してもよいし、希釈測定試料の流動斑を考慮し、テストラインの発色強度をコントロールラインの発色強度で割り算した補正値から測定してもよい。
【００５３】
本発明のイムノクロマト試験片を用いたＨｂＡ１ｃ（％）の測定原理は、前述の通り、テストライン上での免疫複合体とＨｂＡ１ｃ以外のＨｂ（例えば、ＨｂＡ０等）との競合的な捕捉によるものであるため、希釈測定試料中の総Ｈｂ量が、テストラインを形成する捕捉抗体（抗Ｈｂ抗体）の量より十分多い必要がある。具体的には、希釈測定試料中の総Ｈｂとテストラインを形成する捕捉抗体（抗Ｈｂ抗体）のモル比は、５：１〜２０００：１が好ましく、１０：１〜１５００：１がより好ましく、２０：１〜１０００：１がさらに好ましい。モル比が小さいと、Ｈｂ量により測定結果（補正値）が大きく変動するため、別の手段でＨｂ量を測定する必要が生じることがある。つまり、メンブレン上のラインの反射吸光度からＨｂＡ１ｃ（％）を直接定量することができないことがある。一方、モル比が大きいと、テストラインが薄くなり、測定感度が低下することがある。
【００５４】
本発明のイムノクロマト試験片のテストラインおよびコントロールラインの測定方法は、特に限定されず、市販のイムノクロマトリーダーを用いてもよいし、別途公知の方法でイムノクロマトリーダーを製造してもよい。検出系としては、特に限定されないが、例えばＬＥＤ−ＦＤ、ＬＥＤ−ＣＭＯＳ、ＬＥＤ−ＣＣＤを使用することができる。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例で記載するＨｂＡ１ｃ（％）は全てＮＧＳＰ値である。【００５６】
（実施例１）
（１）ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬の調製
８．５７ｍｇ／ｍＬの抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体（ＨｂＡ１ｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＯＡＭＡ０２３２９、ＡＶＩＶＡ  ＳＹＳＴＥＭ  ＢＩＯＬＯＧＹ社製）を蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）で１．０ｍｇ／ｍＬに調製した。次いで、１．０ｗｔ％のセルロース系着色微粒子（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）、ＢＬ２：Ｄａｒｋ  Ｎａｖｙ、平均粒子径３６５ｎｍ、旭化成社製）１００μＬ、１０ｍＭのトリス緩衝液（２０４−０７８８５、和光純薬工業社製）（ｐＨ７．０）９００μＬ、および前記１．０ｍｇ／ｍＬ（０．１ｗｔ％）の抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体１００μＬを１５ｍＬの遠沈管に加え、ボルテックスで撹拌した。次いで、３７℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）に入れ１２０分間静置した。次いで、１．０ｗｔ％のＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ：ＢＰＦ（ＢＰＦ−３０１、東洋紡社製）、１０ｍＭのトリス緩衝液（２０４−０７８８５、和光純薬工業社製）からなるブロッキング液（ｐＨ７．０）１２ｍＬを加え、さらに３７℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）で６０分間静置した。次いで、遠心分離機（ＭＸ−３０７、トミー精工社製）とラックインローター（ＴＭＡ−３００、トミー精工社製）とラック（ＡＲ５１０−０４、トミー精工社製）を用い、１０，０００×ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、抗体感作セルロース系着色微粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、１０ｍＭのトリス緩衝液（２０４−０７８８５、和光純薬工業社製）からなる洗浄液（ｐＨ７．０）１２ｍＬを加え、超音波分散機（ＵＨ−５０、エスエムテー社製）で１０秒間処理した。次いで、遠心分離機（ＭＸ−３０７、トミー精工社製）とラックインローター（ＴＭＡ−３００、トミー精工社製）とラック（ＡＲ５１０−０４、トミー精工社製）を用い、１０，０００×ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、抗体感作セルロース系着色微粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、１５ｗｔ％のスクロース（１９６−０００１５、和光純薬工業社製）、０．２％のＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ：ＢＰＦ（ＢＰＦ−３０１、東洋紡社製）、１０ｍＭのトリス緩衝液（２０４−０７８８５、和光純薬工業社製）からなる塗布液（ｐＨ７．０）２．０ｍＬを加え、超音波分散機（ＵＨ−５０、エスエムテー社製）で１０秒間処理し、ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬を得た。なお、前記ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬中の検出粒子濃度は０．５ｍｇ／ｍＬ（０．０５ｗｔ％）、抗体濃度は０．０５ｍｇ／ｍＬ（０．００５ｗｔ％）であった。【００５７】
（２）ＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬の調製
Ｄビオチン（０４８２２−９１、ナカライテスク社製）１６ｍｇ、およびジメチルスルホキシド：ＤＭＳＯ（０８９０４−１４、ナカライテスク社製）１０００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブに加え、ボルテックスで撹拌し、Ｄビオチン溶液を得た。次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩：ＥＤＣ（１５０２２−８６、ナカライテスク社製）２０ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド：ＮＨＳ（１８９４８−０２、ナカライテスク社製）２０ｍｇ、および蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）１００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブに加え、ボルテックスで撹拌し、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を得た。次いで、前記Ｄビオチン溶液１００μＬおよび前記ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液１００μＬを混合した後、２５℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）に入れ１５分間静置し、Ｄビオチン／ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を得た。次いで、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ：ＢＰＦ（ＢＰＦ−３０１、東洋紡社製）１０ｍｇ、および蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）１００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブに加え、ボルテックスで撹拌し、ＢＰＦ溶液を得た。次いで、前記Ｄビオチン／ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液１００μＬと前記ＢＰＦ溶液１００μＬを混合した後、２５℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）に入れ３０分間静置し、Ｄビオチン−ＢＰＦ溶液を得た。次いで、１．０ｗｔ％のセルロース系着色微粒子（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）、ＢＬ２：Ｄａｒｋ  Ｎａｖｙ、平均粒子径３６５ｎｍ、旭化成社製）１００μＬ、１０ｍＭのトリス緩衝液（２０４−０７８８５、和光純薬工業社製）（ｐＨ７．０）９００μＬ、および前記Ｄビオチンン−ＢＰＦ溶液１００μＬを１５ｍＬの遠沈管に加え、ボルテックスで撹拌した。次いで、３７℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）に入れ１２０分間静置した。次いで、１．０ｗｔ％のＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ：ＢＰＦ（ＢＰＦ−３０１、東洋紡社製）、１０ｍＭのトリス緩衝液（２０４−０７８８５、和光純薬工業社製）からなるブロッキング液（ｐＨ７．０）１２ｍＬを加え、さらに３７℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）で６０分間静置した。次いで、遠心分離機（ＭＸ−３０７、トミー精工社製）とラックインローター（ＴＭＡ−３００、トミー精工社製）とラック（ＡＲ５１０−０４、トミー精工社製）を用い、１０，０００×ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、Ｄビオチン感作セルロース系着色微粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、１０ｍＭのトリス緩衝液（２０４−０７８８５、和光純薬工業社製）からなる洗浄液（ｐＨ７．０）１２ｍＬを加え、超音波分散機（ＵＨ−５０、エスエムテー社製）で１０秒間処理した。次いで、遠心分離機（ＭＸ−３０７、トミー精工社製）とラックインローター（ＴＭＡ−３００、トミー精工社製）とラック（ＡＲ５１０−０４、トミー精工社製）を用い、１０，０００×ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、Ｄビオチン感作セルロース系着色微粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、１５ｗｔ％のスクロース（１��６−０００１５、和光純薬工業社製）、０．２％のＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ：ＢＰＦ（ＢＰＦ−３０１、東洋紡社製）、１０ｍＭのトリス緩衝液（２０４−０７８８５、和光純薬工業社製）からなる塗布液（ｐＨ７．０）２．０ｍＬを加え、超音波分散機（ＵＨ−５０、エスエムテー社製）で１０秒間処理し、ＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬を得た。なお、前記ＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬中の検出粒子濃度は０．５ｍｇ／ｍＬ（０．０５ｗｔ％）、ブロッキング用タンパク質の標識導入比は１：７であった。【００５８】
（３）ＨｂＡ１ｃ測定用メンブレンカードの作製
３．６ｍｇ／ｍＬの抗Ｈｂモノクローナル抗体（ＨＢＡ１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＯＡＭＡ０２３２６、ＡＶＩＶＡ  ＳＹＳＴＥＭ  ＢＩＯＬＯＧＹ社製）を蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）で１．０ｍｇ／ｍＬに調製した。次いで、１．０ｍｇ／ｍＬの抗ビオチンポリクローナル抗体（Ｂｉｏｔｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａ１５０−１１１Ａ、ＢＥＴＨＹＬ社製）を蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）で０．５ｍｇ／ｍＬに調製した。次いで、上流側に２０ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部、中央に２５ｍｍ×３００ｍｍのメンブレン部、下流側に１５ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部から構成される６０ｍｍ×３００ｍｍのメンブレンカード（Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  １２０  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃａｒｄｓ、ＨＦ１２０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）のメンブレン部の上流側から１５ｍｍの位置に、分注プラットフォーム（ＸＹＺ３０６０、ＢＩＯＤＯＴ社製）と、Ｂｉｏ Ｊｅｔノズル（ＢＨＱＨＲ−ＸＹＺ、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、前記１．０ｍｇ／ｍＬの抗Ｈｂモノクローナル抗体を１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した後、４５℃に調整した乾燥機（ＷＦＯ−５１０、東京理化器械社製）で３０分間乾燥し、ライン幅約１ｍｍのテストラインを形成した。さらに、前記テストラインを形成したメンブレンカードのメンブレン部の上流側から２０ｍｍの位置に、分注プラットフォーム（ＸＹＺ３０６０、ＢＩＯＤＯＴ社製）と、Ｂｉｏ Ｊｅｔノズル（ＢＨＱＨＲ−ＸＹＺ、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、前記０．５ｍｇ／ｍＬの抗ビオチンポリクローナル抗体を１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した後、４５℃に調整した乾燥機（ＷＦＯ−５１０、東京理化器械社製）で３０分間乾燥し、ライン幅約１ｍｍのコントロールラインを形成することで、ＨｂＡ１ｃ測定用メンブレンカードを得た。【００５９】
（４）ＨｂＡ１ｃ測定用コンジュゲーションパッドの作製
前記ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬および前記ＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬を、６：１の割合（質量比）で混合した。なお、ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬およびＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬中の粒子濃度が同一である場合は、体積比６：１の割合で混合すればよい。次いで、１０ｍｍ×３００ｍｍのコンジュゲーションパッド（ＧＬＡＳＳＦＩＢＥＲ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ  ＰＡＤ、ＧＦＤＸ００１０５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の全面に、分注プラットフォーム（ＸＹＺ３０６０、ＢＩＯＤＯＴ社製）と、Ａｉｒ Ｊｅｔノズル（ＡＪＱＨＲ−ＸＹＺ、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、前記混合液を１５μＬ／ｃｍの塗布量で均一に塗布した後、４５℃に調整した乾燥機（ＷＦＯ−５１０、東京理化器械社製）で３０分間乾燥し、ＨｂＡ１ｃ測定用コンジュゲーションパッドを得た。【００６０】
（５）ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片の作製
前記ＨｂＡ１ｃ測定用メンブレンカードの上流側の２０ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部に、メンブレン部と５ｍｍ重なるよう前記ＨｂＡ１ｃ測定用コンジュゲーションパッドを貼り合わせた。次いで、さらに上流側に前記コンジュゲーションパッドと５ｍｍ重なるよう２０ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＦＩＢＥＲ  ＳＡＭＰＬＥ  ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を貼り合わせた。次いで、前記ＨｂＡ１ｃ測定用メンブレンカードの下流側の１５ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部に、メンブレン部と２ｍｍ重なるよう２０ｍｍ×３００ｍｍの吸収パッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＦＩＢＥＲ  ＳＡＭＰＬＥ  ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を貼り合わせた。次いで、ギロチン式カッティングモジュール（ＣＭ５０００、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、幅４ｍｍ、長さ６３ｍｍの短冊状にカットすることで、ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を得た。【００６１】
（６）測定試料希釈液の調製
りん酸緩衝生理食塩粉末（１６２−１９３２１、和光純薬工業社製）１袋、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート：Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（１６６−２１２１３、和光純薬工業社製）２ｇ、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル：ＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）−１００（１６０−２４７５１、和光純薬工業社製）２ｇ、および蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）２００ｍＬを５００ｍＬガラス瓶に加え、測定試料希釈液（５０ｍＭ  ＰＢＳ、１．０ｗｔ％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１．０ｗｔ％ＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）−１００）を調製した。【００６２】
（７）希釈試料の調製
市販のＨｂＡ１ｃ標準物質であるＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料（ＱＲＭ  ＨｂＡ１ｃ  ２００７−１、検査医学標準物質機構社製、Ｌ１〜Ｌ５の５水準）を、それぞれ前記測定試料希釈液にて５００倍に希釈することで、ＨｂＡ１ｃ（％）がＬ１＝５．０１％、Ｌ２＝５．６５％、Ｌ３＝７．３５％、Ｌ４＝９．５１％、Ｌ５＝１１．２６％で、かつＨｂ濃度がＬ１〜Ｌ５＝０．２８０ｇ／Ｌの希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１〜Ｌ５）を得た。次いで、市販のＨｂ標準物質である総ヘモグロビン常用参照標準物質（ＪＣＣＲＭ９１２−２、検査医学標準物質機構社製、Ｌ、Ｍ、Ｈの３水準）を、それぞれ前記測定試料希釈液にて５００倍に希釈することで、ＨｂＡ１ｃ（％）がＬ、Ｍ、Ｈ＝５．２０％で、かつＨｂ濃度がＬ＝０．１５６ｇ／Ｌ、Ｍ＝０．２７４ｇ／Ｌ、Ｈ＝０．３５９ｇ／Ｌの希釈Ｈｂ試料（Ｌ、Ｍ、Ｈ）を得た。【００６３】
（８）ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片の評価：感度の評価
前記ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次いで、前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１、Ｌ４）１００μＬを、マイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下し、２５℃で１０分間静置した。次いで、メンブレン上のコントロールラインおよびテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）をイムノクロマトリーダー（Ｃ１００６０−１０、測定モード：Ｌａｔｅｘ、Ｌｉｎｅ、浜松ホトニクス社製）を用いて測定した。前記実験操作を前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１、Ｌ４）に対してそれぞれＮ＝１０（合計で前記ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を２０本使用）で行った。感度の指標として、前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ４）のテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）のＮ＝１０平均値と、前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１）のテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）のＮ＝１０平均値との差：ΔＬ４−Ｌ１（ｍＡｂｓ）を算出し、ΔＬ４−Ｌ１≧２００ｍＡｂｓを３点（ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、１５０ｍＡｂｓ≦ΔＬ４−Ｌ１＜２００ｍＡｂｓを２点（ｇｏｏｄ）、１００ｍＡｂｓ≦ΔＬ４−Ｌ１＜１５０ｍＡｂｓを１点（ａｖｅｒａｇｅ）、ΔＬ４−Ｌ１＜１００ｍＡｂｓを０点（ｂａｄ）と評価した。実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片の感度はΔＬ４−Ｌ１＝２６０ｍＡｂｓで３点と、高感度な測定が可能であった。【００６４】
（９）ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片の評価：精度の評価
前記ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次いで、前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１、Ｌ４）１００μＬを、マイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下し、２５℃で１０分間静置した。次いで、メンブレン上のコントロールラインおよびテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）をイムノクロマトリーダー（Ｃ１００６０−１０、測定モード：Ｌａｔｅｘ、Ｌｉｎｅ、浜松ホトニクス社製）を用いて測定した。前記実験操作を前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１、Ｌ４）に対してそれぞれＮ＝１０（合計で前記ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を２０本使用）で行った。精度の指標として、前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１、Ｌ４）のテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）をコントロールラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）で割算した補正値（Ｌ１、Ｌ４）をそれぞれ算出した後、得られた補正値（Ｌ１、Ｌ４）のＮ＝１０におけるＣＶ（Ｌ１、Ｌ４）（％）をそれぞれ算出し、さらにＣＶ（Ｌ１）（％）とＣＶ（Ｌ４）（％）との平均値：ＣＶ（％）を算出し、ＣＶ＜３％を３点（ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、３％≦ＣＶ＜５％を２点（ｇｏｏｄ）、５％≦ＣＶ＜１０％を１点（ａｖｅｒａｇｅ）、１０％≦ＣＶを０点（ｂａｄ）と評価した。実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片の精度はＣＶ＝２．０％で３点と、高精度な測定が可能であった。【００６５】
（１０）ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片の評価：ＨＰＬＣ法との相関性の評価
前記ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次いで、前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１〜Ｌ５）１００μＬを、マイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下し、２５℃で１０分間静置した。次いで、メンブレン上のコントロールラインおよびテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）をイムノクロマトリーダー（Ｃ１００６０−１０、測定モード：Ｌａｔｅｘ、Ｌｉｎｅ、浜松ホトニクス社製）を用いて測定した。前記実験操作を前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１〜Ｌ５）に対してそれぞれＮ＝１０（合計で前記ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を５０本使用）で行った。相関性の指標として、前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１〜Ｌ５）のテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）をコントロールラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）で割算した補正値（Ｌ１〜Ｌ５）をそれぞれ算出した後、得られた補正値（Ｌ１〜Ｌ５）と、前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１〜Ｌ５）のＨｂＡ１ｃ（％）、Ｌ１＝５．０１％、Ｌ２＝５．６５％、Ｌ３＝７．３５％、Ｌ４＝９．５１％、Ｌ５＝１１．２６％とのピアソン相関係数：ｒを算出し、ｒ≧０．９５を３点（ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、０．９０≦ｒ＜０９５を２点（ｇｏｏｄ）、０．８５≦ｒ＜０．９０を１点（ａｖｅｒａｇｅ）、ｒ＜０．８５を０点（ｂａｄ）と評価した。実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片の相関性はｒ＝０．９８で３点と、ＨｂＡ１ｃ（％）との高い相関性を有していた。【００６６】
（１１）ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片の評価：Ｈｂ濃度依存性の評価
前記ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次いで、前記希釈Ｈｂ試料（Ｌ、Ｍ、Ｈ）１００μＬを、マイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下し、２５℃で１０分間静置した。次いで、メンブレン上のコントロールラインおよびテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）をイムノクロマトリーダー（Ｃ１００６０−１０、測定モード：Ｌａｔｅｘ、Ｌｉｎｅ、浜松ホトニクス社製）を用いて測定した。前記実験操作を前記希釈Ｈｂ試料（Ｌ、Ｍ、Ｈ）に対してそれぞれＮ＝１０（合計で前記ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を３０本使用）で行った。Ｈｂ濃度依存性の指標として、前記希釈Ｈｂ試料（Ｌ、Ｍ、Ｈ）のテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）をコントロールラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）で割算した補正値（Ｌ、Ｍ、Ｈ）をそれぞれ算出した後、得られた補正値（Ｌ、Ｍ、Ｈ）の各Ｎ＝１０で合計Ｎ＝３０のＣＶ（Ｈｂ）（％）を算出し、ＣＶ（Ｈｂ）＜３％を３点（ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、３％≦ＣＶ（Ｈｂ）＜５％を２点（ｇｏｏｄ）、５％≦ＣＶ（Ｈｂ）＜１０％を１点（ａｖｅｒａｇｅ）、１０％≦ＣＶ（Ｈｂ）を０点（ｂａｄ）と評価した。実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片のＨｂ濃度依存性はＣＶ（Ｈｂ）＝２．８％で３点、つまり測定試料中のＨｂＡ１ｃ（％）が同じであれば、Ｈｂ量によらず一定の測定結果（補正値）が得られることを確認した。【００６７】
（１２）ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片の評価：非特異吸着の評価
前記ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次いで、蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）１００μＬを、マイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下し、２５℃で１０分間静置した。次いで、メンブレン上のテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）をイムノクロマトリーダー（Ｃ１００６０−１０、測定モード：Ｌａｔｅｘ、Ｌｉｎｅ、浜松ホトニクス社製）を用いて測定した。前記テストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）が、１０ｍＡｂｓ未満を２点（ｇｏｏｄ）、１０〜２０ｍＡｂｓを１点（ａｖｅｒａｇｅ）、２０ｍＡｂｓ超を０点（ｂａｄ）と評価した。実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片の非特異吸着は、テストラインの反射吸光度＜１０ｍＡｂｓ（測定下限以下）で２点、つまりテストライン検出試薬中の検出粒子のブロッキングが問題ないことを確認した。【００６８】
（実施例２）
ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬の調製に用いる抗体として、抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体（ＨｂＡ１ｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＯＡＭＡ０２３２９、ＡＶＩＶＡ  ＳＹＳＴＥＭ  ＢＩＯＬＯＤＹ社製）の代わりに抗Ｈｂモノクローナル抗体（ＨＢＡ１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＯＡＭＡ０２３２６、ＡＶＩＶＡ  ＳＹＳＴＥＭ  ＢＩＯＬＯＧＹ社製）を用い、かつＨｂＡ１ｃ測定用メンブレンカードの作製に用いる抗体として、抗Ｈｂモノクローナル抗体（ＨＢＡ１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＯＡＭＡ０２３２６、ＡＶＩＶＡ  ＳＹＳＴＥＭ  ＢＩＯＬＯＧＹ社製）の代わりに抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体（ＨｂＡ１ｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＯＡＭＡ０２３２９、ＡＶＩＶＡ  ＳＹＳＴＥＭ  ＢＩＯＬＯＤＹ社製）を用いた以外は実施例１と同様にしてＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を作製し評価した。得られた評価結果を表１に示す。【００６９】
（実施例３、４）
ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬およびＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬の調製に用いるブロッキング用タンパク質（標識したブロッキング用タンパク質も含む）として、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ：ＢＰＦ（ＢＰＦ−３０１、東洋紡社製）の代わりにＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ（Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）（実施例３）、カゼイン（０３０−０１５０５、和光純薬工業社製）（実施例４）を用いた以外は実施例１と同様にしてＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を作製し評価した。なお、カゼインを使用する場合は、ブロッキング液、洗浄液、塗布液の緩衝剤として、１０ｍＭのトリス緩衝液（２０４−０７８８５、和光純薬工業社製）（ｐＨ７．０）の代わりに、１００ｍＭのホウ酸緩衝液（０２１−０２１９５、和光純薬工業社製）（ｐＨ９．０）を使用した。得られた評価結果を表１に示す。【００７０】
（実施例５〜９）
ＨｂＡ１ｃ測定用コンジュゲーションパッドの作製工程において、前記ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬および前記ＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬を、セルロース系着色微粒子（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）、ＢＬ２：Ｄａｒｋ  Ｎａｖｙ、平均粒子径３６５ｎｍ、旭化成社製）の質量換算で６：１の割合で混合する代わり１：１（実施例５）、３：１（実施例６）、１５：１（実施例７）、３０：１（実施例８）、６０：１（実施例９）の割合で混合した以外は実施例１と同様にしてＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を作製し評価した。得られた評価結果を表１に示す。【００７１】
（実施例１０、１１）
ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬およびＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬の調製に用いる検出粒子として、セルロース系着色微粒子（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）、ＢＬ２：Ｄａｒｋ  Ｎａｖｙ、平均粒子径３６５ｎｍ、旭化成社製）の代わりにセルロース系着色微粒子（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）、ＲＥ１：Ｒｅｄ、平均粒子径３３０ｎｍ、旭化成社製）（実施例１０）、セルロース系着色微粒子（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）、ＲＥ２、Ｄａｒｋ  Ｒｅｄ、平均粒子径３４０ｎｍ、旭化成社製）（実施例１１）を用い、かつイムノクロマトリーダー（Ｃ１００６０−１０、測定モード：Ｌａｔｅｘ、Ｌｉｎｅ、浜松ホトニクス社製）の代わりにイムノクロマトリーダー（Ｃ１００６０−１０、測定モード：Ｇｏｌｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄ、Ｌｉｎｅ、浜松ホトニクス社製）を用いて測定した以外は実施例１と同様にしてＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を作製し評価した。得られた評価結果を表１に示す。【００７２】
（実施例１２）
ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬およびＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬の調製に用いる検出粒子として、セルロース系着色微粒子（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）、ＢＬ２：Ｄａｒｋ  Ｎａｖｙ、平均粒子径３６５ｎｍ、旭化成社製）の代わりにセルロース系着色微粒子（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）、ＢＬ１：Ｎａｖｙ、平均粒子径３２５ｎｍ、旭化成社製）を用いた以外は実施例１と同様にしてＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を作製し評価した。得られた評価結果を表１に示す。【００７３】
（実施例１３）
ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬の調製に用いる検出粒子として、セルロース系着色微粒子（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）、ＢＬ２：Ｄａｒｋ  Ｎａｖｙ、平均粒子径３６５ｎｍ、旭化成社製）の代わりにセルロース系着色微粒子（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）、ＲＥ１：Ｒｅｄ、平均粒子径３３０ｎｍ、旭化成社製）を用い、かつイムノクロマトリーダー（Ｃ１００６０−１０、測定モード：Ｌａｔｅｘ、Ｌｉｎｅ、浜松ホトニクス社製）の代わりにイムノクロマトリーダー（Ｃ１００６０−１０、測定モード：Ｇｏｌｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄ、Ｌｉｎｅ、浜松ホトニクス社製）を用いて測定した以外は実施例１と同様にしてＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を作製し評価した。得られた評価結果を表１に示す。【００７４】
（実施例１４〜１７）
希釈測定試料の調製工程において、市販のＨｂＡ１ｃ標準物質であるＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料（ＱＲＭ  ＨｂＡ１ｃ  ２００７−１、検査医学標準物質機構社製、Ｌ１〜Ｌ５の５水準）および市販のＨｂ標準物質である総ヘモグロビン常用参照標準物質（ＪＣＣＲＭ９１２−２、検査医学標準物質機構社製、Ｌ、Ｍ、Ｈの３水準）を、それぞれ測定試料希釈液にて５００倍に希釈する代わりに、５０倍（実施例１４）、１００倍（実施例１５）、１０００倍（実施例１６）、２０００倍（実施例１７）に希釈した以外は実施例１と同様にしてＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を作製し評価した。得られた評価結果を表１に示す。【００７５】
（実施例１８〜２０）
ＨｂＡ１ｃ測定用メンブレンカードの作製に用いる３．６ｍｇ／ｍＬの抗Ｈｂモノクローナル抗体（ＨＢＡ１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＯＡＭＡ０２３２６、ＡＶＩＶＡ  ＳＹＳＴＥＭ  ＢＩＯＬＯＧＹ社製）を蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）で１．０ｍｇ／ｍＬに調製する代わりに、０．２ｍｇ／ｍＬ（実施例１８）、０．５ｍｇ／ｍＬ（実施例１９）、２．０ｍｇ／ｍＬ（実施例２０）に調製した以外は実施例１と同様にしてＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を作製し評価した。得られた評価結果を表１に示す。【００７６】
（実施例２１〜２３）
ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬の調製に用いる８．５７ｍｇ／ｍＬの抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体（ＨｂＡ１ｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＯＡＭＡ０２３２９、ＡＶＩＶＡ  ＳＹＳＴＥＭ  ＢＩＯＬＯＧＹ社製）を蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）で１．０ｍｇ／ｍＬに調製する（ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬中の抗体濃度は０．０５ｍｇ／ｍＬ）代わりに、０．２ｍｇ／ｍＬ（ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬中の抗体濃度は０．０１ｍｇ／ｍＬ）（実施例２１）、０．４ｍｇ／ｍＬ（ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬中の抗体濃度は０．０２ｍｇ／ｍＬ）（実施例２２）、２．０ｍｇ／ｍＬ（ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬中の抗体濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ）（実施例２３）に調製した以外は実施例１と同様にしてＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を作製し評価した。得られた評価結果を表１に示す。【００７７】
【表１】
2019138898.tif 000003
【００７８】
（比較例１）
（１）ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬の調製
８．５７ｍｇ／ｍＬの抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体（ＨｂＡ１ｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＯＡＭＡ０２３２９、ＡＶＩＶＡ  ＳＹＳＴＥＭ  ＢＩＯＬＯＧＹ社製）を蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）で０．０５ｍｇ／ｍＬに調製した。次いで、ＯＤ５２０＝１．０の金コロイド粒子（ＥＭＧＣ４０：Ｒｅｄ、平均粒子径４０ｎｍ、ＢＢＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）１３．５ｍＬ、５０ｍＭのりん酸二水素カリウム（１６６−０４２５５、和光純薬工業社製）（ｐＨ７．０）１．５ｍＬ、および前記０．０５ｍｇ／ｍＬの抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体１．５ｍＬを５０ｍＬの遠沈管に加え、軽く撹拌した。次いで、２５℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）に入れ１０分間静置した。次いで、１０ｗｔ％のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ（Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）からなるブロッキング液１ｍＬを加え、軽く撹拌した。次いで、遠心分離機（ＭＸ−３０７、トミー精工社製）とラックインローター（ＴＭＡ−３００、トミー精工社製）とラック（ＡＲ５１０−０４、トミー精工社製）を用い、８，０００×ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、抗体感作金コロイド粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、１．０ｗｔ％のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ（Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（１９２−１３９２５、和光純薬工業社製）、２０ｍＭのトリス緩衝液（２０４−０７８８５、和光純薬工業社製）からなる洗浄液（ｐＨ８．２）３０ｍＬを加え、超音波分散機（ＵＨ−５０、エスエムテー社製）で１０秒間処理した。次いで、遠心分離機（ＭＸ−３０７、トミー精工社製）とラックインローター（ＴＭＡ−３００、トミー精工社製）とラック（ＡＲ５１０−０４、トミー精工社製）を用い、８，０００×ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、抗体感作金コロイド粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、２．５ｗｔ％のスクロース（１９６−０００１５、和光純薬工業社製）、０．２５ｗｔ％のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ（Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、３７．５ｍＭの塩化ナトリウム（１９２−１３９２５、和光純薬工業社製）、２０ｍＭのトリス緩衝液（２０４−０７８８５、和光純薬工業社製）からなる塗布液（ｐＨ８．２）を加え、超音波分散機（ＵＨ−５０、エスエムテー社製）で１０秒間処理し、塗布液の液量によりＯＤ５２０＝４．０になるよう調整することで、ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬を得た。なお、前記ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬中の検出粒子濃度はＯＤ５２０＝４．０、抗体濃度は０．０２ｍｇ／ｍＬ（０．００２ｗｔ％）であった。【００７９】
（２）ＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬の調製
Ｄビオチン（０４８２２−９１、ナカライテスク社製）１６ｍｇ、およびジメチルスルホキシド：ＤＭＳＯ（０８９０４−１４、ナカライテスク社製）１０００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブに加え、ボルテックスで撹拌し、Ｄビオチン溶液を得た。次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩：ＥＤＣ（１５０２２−８６、ナカライテスク社製）２０ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド：ＮＨＳ（１８９４８−０２、ナカライテスク社製）２０ｍｇ、および蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）１００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブに加え、ボルテックスで撹拌し、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を得た。次いで、前記Ｄビオチン溶液１００μＬおよび前記ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液１００μＬを混合した後、２５℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）に入れ１５分間静置し、Ｄビオチン／ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を得た。次いで、Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ（Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）１０ｍｇ、および蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）１００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブに加え、ボルテックスで撹拌し、ＢＳＡ溶液を得た。次いで、前記Ｄビオチン／ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液１００μＬと前記ＢＳＡ溶液１００μＬを混合した後、２５℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）に入れ３０分間静置し、Ｄビオチン−ＢＳＡ溶液を得た。次いで、ＯＤ５２０＝１．０の金コロイド粒子（ＥＭＧＣ４０：Ｒｅｄ、平均粒子径４０ｎｍ、ＢＢＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）１３．５ｍＬ、５０ｍＭのりん酸二水素カリウム（１６６−０４２５５、和光純薬工業社製）（ｐＨ７．０）１．５ｍＬ、および前記Ｄビオチン−ＢＳＡ溶液１００μＬを５０ｍＬの遠沈管に加え、軽く撹拌した。次いで、２５℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）に入れ１０分間静置した。次いで、１０ｗｔ％のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ（Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）からなるブロッキング液１ｍＬを加え、軽く撹拌した。次いで、遠心分離機（ＭＸ−３０７、トミー精工社製）とラックインローター（ＴＭＡ−３００、トミー精工社製）とラック（ＡＲ５１０−０４、トミー精工社製）を用い、８，０００×ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、Ｄビオチン感作金コロイド粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、１．０ｗｔ％のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ（Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（１９２−１３９２５、和光純薬工業社製）、２０ｍＭのトリス緩衝液（２０４−０７８８５、和光純薬工業社製）からなる洗浄液（ｐＨ８．２）３０ｍＬを加え、超音波分散機（ＵＨ−５０、エスエムテー社製）で１０秒間処理した。次いで、遠心分離機（ＭＸ−３０７、トミー精工社製）とラックインローター（ＴＭＡ−３００、トミー精工社製）とラック（ＡＲ５１０−０４、トミー精工社製）を用い、８，０００×ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、Ｄビオチン感作金コロイド粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、２．５ｗｔ％のスクロース（１９６−００��１５、和光純薬工業社製）、０．２５ｗｔ％のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ（Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、３７．５ｍＭの塩化ナトリウム（１９２−１３９２５、和光純薬工業社製）、２０ｍＭのトリス緩衝液（２０４−０７８８５、和光純薬工業社製）からなる塗布液（ｐＨ８．２）を加え、超音波分散機（ＵＨ−５０、エスエムテー社製）で１０秒間処理し、塗布液の液量によりＯＤ５２０＝４．０になるよう調整することで、ＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬を得た。なお、前記ＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬中の検出粒子濃度はＯＤ５２０＝４．０、ブロッキング用タンパク質の標識導入比は１：７であった。【００８０】
以下、実施例１と同様にしてＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を作製した。次いで、イムノクロマトリーダー（Ｃ１００６０−１０、測定モード：Ｌａｔｅｘ、Ｌｉｎｅ、浜松ホトニクス社製）の代わりにイムノクロマトリーダー（Ｃ１００６０−１０、測定モード：Ｇｏｌｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄ、Ｌｉｎｅ、浜松ホトニクス社製）を用いた以外は実施例１と同様にして評価した。得られた評価結果を表２に示す。検出粒子に金コロイド粒子を使用すると、感度、精度、および相関性が不十分であった。また、ブロッキングが不十分であり、非特異吸着が確認された。【００８１】
（比較例２）
ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬およびＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬の調製に用いるブロッキング用タンパク質（標識したブロッキング用タンパク質も含む）として、Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ（Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）の代わりにＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ：ＢＰＦ（ＢＰＦ−３０１、東洋紡社製）を用いた以外は比較例１と同様にしてＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を作製し評価した。得られた評価結果を表２に示す。検出粒子に金コロイド粒子を使用すると、感度、精度、および相関性が不十分であった。【００８２】
（比較例３）
（１）ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬の調製
８．５７ｍｇ／ｍＬの抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体（ＨｂＡ１ｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＯＡＭＡ０２３２９、ＡＶＩＶＡ  ＳＹＳＴＥＭ  ＢＩＯＬＯＧＹ社製）を５０ｍＭのりん酸二水素カリウム（１６６−０４２５５、和光純薬工業社製）（ｐＨ７．０）で１．０ｍｇ／ｍＬに、１０ｗｔ％ラテックス粒子（Ｅｓｔａｐｏｒ（登録商標）、Ｋ０３０：Ｂｌｕｅ、平均粒子径３００ｎｍ、Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を５０ｍＭのりん酸二水素カリウム（１６６−０４２５５、和光純薬工業社製）（ｐＨ７．０）で１．０ｗｔ％に、それぞれ調製した。次いで、前記１．０ｗｔ％のラテックス粒子１００μＬ、および前記１．０ｍｇ／ｍＬの抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体１００μＬを１５ｍＬの遠沈管に加え、ボルテックスで撹拌した。次いで、２５℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）に入れ６０分間静置した。次いで、１．０ｗｔ％のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ（Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）からなるブロッキング液１２ｍＬを加え、さらに２５℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）で６０分間静置した。次いで、遠心分離機（ＭＸ−３０７、トミー精工社製）とラックインローター（ＴＭＡ−３００、トミー精工社製）とラック（ＡＲ５１０−０４、トミー精工社製）を用い、８，０００×ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、抗体感作ラテックス粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、１．０ｗｔ％のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ（Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、５０ｍＭのりん酸二水素カリウム（１６６−０４２５５、和光純薬工業社製）からなる洗浄液（ｐＨ７．０）１２ｍＬを加え、超音波分散機（ＵＨ−５０、エスエムテー社製）で１０秒間処理した。次いで、遠心分離機（ＭＸ−３０７、トミー精工社製）とラックインローター（ＴＭＡ−３００、トミー精工社製）とラック（ＡＲ５１０−０４、トミー精工社製）を用い、８，０００×ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、抗体感作ラテックス粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、１．０ｗｔ％のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ（Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、５０ｍＭのりん酸二水素カリウム（１６６−０４２５５、和光純薬工業社製）からなる塗布液（ｐＨ７．０）２ｍＬを加え、超音波分散機（ＵＨ−５０、エスエムテー社製）で１０秒間処理し、ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬を得た。なお、前記ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬中の検出粒子濃度は０．５ｍｇ／ｍＬ（０．０５ｗｔ％）、抗体濃度は０．０５ｍｇ／ｍＬ（０．００５ｗｔ％）であった。【００８３】
（２）ＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬の調製
Ｄビオチン（０４８２２−９１、ナカライテスク社製）１６ｍｇ、およびジメチルスルホキシド：ＤＭＳＯ（０８９０４−１４、ナカライテスク社製）１０００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブに加え、ボルテックスで撹拌し、Ｄビオチン溶液を得た。次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩：ＥＤＣ（１５０２２−８６、ナカライテスク社製）２０ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド：ＮＨＳ（１８９４８−０２、ナカライテスク社製）２０ｍｇ、および蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）１００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブに加え、ボルテックスで撹拌し、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を得た。次いで、前記Ｄビオチン溶液１００μＬおよび前記ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液１００μＬを混合した後、２５℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）に入れ１５分間静置し、Ｄビオチン／ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を得た。次いで、Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ（Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）１０ｍｇ、および蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）１００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブに加え、ボルテックスで撹拌し、ＢＳＡ溶液を得た。次いで、前記Ｄビオチン／ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液１００μＬと前記ＢＳＡ溶液１００μＬを混合した後、２５℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）に入れ３０分間静置し、Ｄビオチン−ＢＳＡ溶液を得た。次いで、１０ｗｔ％ラテックス粒子（Ｅｓｔａｐｏｒ（登録商標）、Ｋ０３０：Ｂｌｕｅ、平均粒子径３００ｎｍ、Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を５０ｍＭのりん酸二水素カリウム（１６６−０４２５５、和光純薬工業社製）（ｐＨ７．０）で１．０ｗｔ％に調製した。次いで、前記１．０ｗｔ％のラテックス粒子１００μＬ、および前記Ｄビオチン−ＢＳＡ溶液１００μＬを１５ｍＬの遠沈管に加え、ボルテックスで撹拌した。次いで、２５℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）に入れ６０分間静置した。次いで、１．０ｗｔ％のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ（Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）からなるブロッキング液１２ｍＬを加え、さらに２５℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）で６０分間静置した。次いで、遠心分離機（ＭＸ−３０７、トミー精工社製）とラックインローター（ＴＭＡ−３００、トミー精工社製）とラック（ＡＲ５１０−０４、トミー精工社製）を用い、８，０００×ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、Ｄビオチン感作ラテックス粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、１．０ｗｔ％のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ（Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、５０ｍＭのりん酸二水素カリウム（１６６−０４２５５、和光純薬工業社製）からなる洗浄液（ｐＨ７．０）１２ｍＬを加え、超音波分散機（ＵＨ−５０、エスエムテー社製）で１０秒間処理した。次いで、遠心分離機（ＭＸ−３０７、トミー精工社製）とラックインローター（ＴＭＡ−３００、トミー精工社製）とラック（ＡＲ５１０−０４、トミー精工社製）を用い、８，０００×ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、Ｄビ���チン感作ラテックス粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、１．０ｗｔ％のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ（Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、５０ｍＭのりん酸二水素カリウム（１６６−０４２５５、和光純薬工業社製）からなる塗布液（ｐＨ７．０）２ｍＬを加え、超音波分散機（ＵＨ−５０、エスエムテー社製）で１０秒間処理し、ＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬を得た。なお、前記ＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬中の検出粒子濃度は０．５ｍｇ／ｍＬ（０．０５ｗｔ％）、ブロッキング用タンパク質の標識導入比は１：７であった。【００８４】
以下、実施例１と同様にしてＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を作製し評価した。得られた評価結果を表２に示す。検出粒子にラテックス粒子を使用すると、感度、精度、および相関性が不十分であった。また、ブロッキングが不十分であり、非特異吸着が確認された。【００８５】
（比較例４）
ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬およびＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬の調製に用いるブロッキング用タンパク質（標識したブロッキング用タンパク質も含む）として、Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ（Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）の代わりにＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ：ＢＰＦ（ＢＰＦ−３０１、東洋紡社製）を用いた以外は比較例３と同様にしてＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を作製し評価した。得られた評価結果を表２に示す。検出粒子にラテックス粒子を使用すると、感度、精度、および相関性が不十分であった。【００８６】
（比較例５）
比較例３のＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬の代わりに実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬を使用した以外は比較例４と同様にしてＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を作製し評価した。得られた評価結果を表２に示す。テストライン検出試薬の検出粒子にのみラテックス粒子を使用しても、感度、精度、および相関性が不十分であった。【００８７】
（比較例６）
ＨｂＡ１ｃ測定用メンブレンカードの作製に用いる抗体として、抗Ｈｂモノクローナル抗体（ＨＢＡ１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＯＡＭＡ０２３２６、ＡＶＩＶＡ  ＳＹＳＴＥＭ  ＢＩＯＬＯＧＹ社製）の代わりに抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体（Ｈｕｍａｎ ＨｂＡ１ｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＭＡＢ００３０−ＭＯ６Ａ、Ａｂｎｏｖａ社製）を用いる以外は実施例１と同様にしてＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を作製し評価した。得られた評価結果を表２に示す。抗ＨｂＡ１ｃ抗体でサンドイッチする構成では、Ｈｂ量により測定結果（補正値）が大きく変動するため、別の手段でＨｂ量を測定する必要があることがわかった。つまり、メンブレン上のラインの反射吸光度からＨｂＡ１ｃ（％）を直接定量することはできなかった。【００８８】
【表２】
2019138898.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明により、高感度・高精度・ＨＰＬＣ法との高相関性でかつ測定試料中のＨｂ量の影響を受けずに、測定試料中のＨｂＡ１ｃ量のＨｂ量に対する割合：ＨｂＡ１ｃ（％）を測定できるイムノクロマト試験片を提供することができる。
【符号の説明】
【００９０】
１：サンプルパッド
２：コンジュゲーションパッド
３：メンブレン
４：吸収パッド
５：バッキングシート
６：テストライン
７：コントロールライン
８：粘着シート
【図１】
2019138898.tif 000005
【図２】
2019138898.tif 000006
【国際調査報告】
2019138898.tif 000007
2019138898.tif 000008
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