(57)【要約】  本発明は、試料中の２−アミノフェノール類やその前駆体の測定を可能とするための高感度測定方法、及びそれらの測定用試薬を含む測定キットを提供することを課題とする。    ２−アミノフェノール類に、酸化剤、還元物質及びメディエーターを作用させることで、還元物質の減少量、酸化物質の増加量及び活性酸素種の増加量のうちの少なくとも１つを測定する工程（Ａ）を含む、２−アミノフェノール類の測定方法。
2019182008.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−アミノフェノール類に、酸化剤、還元物質及びメディエーターを作用させることで、還元物質の減少量、酸化物質の増加量及び活性酸素種の増加量のうちの少なくとも１つを測定する工程（Ａ）を含む、２−アミノフェノール類の測定方法。
【請求項２】
酸化剤がフェノール系化合物に作用する酸化酵素である、請求項１に記載の２−アミノフェノール類の測定方法。
【請求項３】
還元物質がＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨからなる群より選択される少なくとも１つであり、メディエーターがジアホラーゼである、請求項１又は２に記載の２−アミノフェノール類の測定方法。
【請求項４】
酸化物質が、ＮＡＤＨの酸化物質であるＮＡＤ＋、及びＮＡＤＰＨの酸化物質であるＮＡＤＰ＋からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１〜３の何れか１項に記載の２−アミノフェノール類の測定方法。
【請求項５】
活性酸素種が、ヒドロキシルラジカル、スーパーオキシドアニオン及び過酸化水素からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１〜４の何れか１項に記載の２−アミノフェノール類の測定方法。
【請求項６】
２−アミノフェノール類が、２−アミノフェノール、３−ヒドロキシキヌレニン、及び３−ヒドロキシアントラニル酸からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１〜５の何れか１項に記載の２−アミノフェノール類の測定方法。
【請求項７】
工程（Ａ）の前又は同時に、２−アミノフェノール類の前駆体を２−アミノフェノール類に変換する工程（Ｂ）を含む、請求項１〜６の何れか１項に記載の２−アミノフェノール類の測定方法。
【請求項８】
２−アミノフェノール類の前駆体がＬ−キヌレニンであり、Ｌ−キヌレニンをキヌレニンモノオキシゲナーゼにより３−ヒドロキシキヌレニンに変換する工程、又は２−アミノフェノール類の前駆体がアントラニル酸であり、アントラニル酸をアントラニル酸モノオキシゲナーゼにより３−ヒドロキシアントラニル酸に変換する工程を含む、請求項７に記載の２−アミノフェノール類の測定方法。
【請求項９】
酸化剤、還元物質及びメディエーターを含む、請求項１〜８の何れか１項に記載の測定方法に使用するための２−アミノフェノール類測定用試薬。
【請求項１０】
酸化剤、還元物質及びメディエーターを含む、請求項１〜８の何れか１項に記載の測定方法に使用するための２−アミノフェノール類測定キット。
【請求項１１】
２−アミノフェノール類の前駆体を２−アミノフェノール類に変換する変換用試薬と、請求項９記載の測定用試薬とを含む、２−アミノフェノール類の前駆体測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を用いた２−アミノフェノール類の測定方法及び測定キット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリプトファン代謝産物である３−ヒドロキシキヌレニンや３−ヒドロキシアントラニル酸は、ともに２−アミノフェノール類として知られており、またその前駆体物質としてＬ−キヌレニンやアントラニル酸が知られている。これらの物質は血中濃度が数１０ｎＭ〜数μＭ程度と低いことから、酵素法による測定は困難と考えられており、ＨＰＬＣ／ＭＳ法による分析が一般的である（例えば、非特許文献１、２）。
しかしながら、例えば、がん患者のＬ−キヌレニン濃度を低下させるための医薬品としてインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ阻害剤（ＩＤＯ阻害剤）、トリプトファン−２，３−ジオキシゲナーゼ阻害剤（ＴＤＯ阻害剤）、キヌレニン分解酵素製剤等の開発が進められており、またアルツハイマー病やハンチントン病患者の３−ヒドロキシキヌレニン濃度を低下させるための医薬品としてキヌレニン−３−モノオキシゲナーゼ阻害剤（ＫＭＯ阻害剤）等が開発中であるという状況において、上記２−アミノフェノール類やその前駆体のバイオマーカーとしての意義が注目されている。抗がん剤としてのＩＤＯ阻害剤やＴＤＯ阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体等の免疫チェックポイント阻害剤との併用も想定されており、投薬前の検査等で使用可能な患者を適切に選定することも議論されている。その結果、例えば、上記阻害剤のスクリーニング等の医薬品開発業務のため、又はその医薬品を使用する場合におけるコンパニオン診断薬として、２−アミノフェノール類やその前駆体を簡便に高感度測定できる方法が求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ, ８７７ （２００９）６０３−６０９
【非特許文献２】Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，５５（１９９１）１４３−１４８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、試料中の２−アミノフェノール類やその前駆体の測定を可能とするための高感度測定方法、及びそれらの測定用試薬を含む測定キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで、本発明者らは、酵素を用いた２−アミノフェノール類の測定法について検討した。その結果、２−アミノフェノール類に、酸化剤、還元物質及びメディエーターを作用させることで、２−アミノフェノール類の濃度に依存して、還元物質が減少するとともに、２−アミノフェノール類の濃度に依存して、酸化物質及び活性酸素種が増加することが分かった。これら還元物質の減少量、酸化物質の増加量及び活性酸素種の増加量のうち少なくとも１つを測定することで、簡便、正確かつ高感度に２−アミノフェノール類を定量できる方法を見出し、本発明に至った。また２−アミノフェノール類の前駆体であっても、そこから２−アミノフェノール類に至る反応と組み合わせることによって同様の測定が可能であることも見出した。【０００６】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１１］を提供するものである。
［１］２−アミノフェノール類に、酸化剤、還元物質及びメディエーターを作用させることで、還元物質の減少量、酸化物質の増加量及び活性酸素種の増加量のうちの少なくとも１つを測定する工程（Ａ）を含む、２−アミノフェノール類の測定方法。
［２］酸化剤がフェノール系化合物に作用する酸化酵素である、前項［１］に記載の２−アミノフェノール類の測定方法。
［３］還元物質がＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨからなる群より選択される少なくとも１つであり、メディエーターがジアホラーゼである、前項［１］又は［２］に記載の２−アミノフェノール類の測定方法。
［４］酸化物質が、ＮＡＤＨの酸化物質であるＮＡＤ＋、及びＮＡＤＰＨの酸化物質であるＮＡＤＰ＋からなる群より選択される少なくとも１つである、前項［１］〜［３］の何れか１項に記載の２−アミノフェノール類の測定方法。
［５］活性酸素種が、ヒドロキシルラジカル、スーパーオキシドアニオン及び過酸化水素からなる群より選択される少なくとも１つである、前項［１］〜［４］の何れか１項に記載の２−アミノフェノール類の測定方法。
［６］２−アミノフェノール類が、２−アミノフェノール、３−ヒドロキシキヌレニン及び３−ヒドロキシアントラニル酸からなる群より選択される少なくとも１つである、前項［１］〜［５］の何れか１項に記載の２−アミノフェノール類の測定方法。
［７］工程（Ａ）の前又は同時に、２−アミノフェノール類の前駆体を２−アミノフェノール類に変換する工程（Ｂ）を含む、前項［１］〜［６］の何れか１項に記載の２−アミノフェノール類の測定方法。
［８］２−アミノフェノール類の前駆体がＬ−キヌレニンであり、Ｌ−キヌレニンをキヌレニンモノオキシゲナーゼにより３−ヒドロキシキヌレニンに変換する工程、又は２−アミノフェノール類の前駆体がアントラニル酸であり、アントラニル酸をアントラニル酸モノオキシゲナーゼにより３−ヒドロキシアントラニル酸に変換する工程を含む、前項［７］に記載の２−アミノフェノール類の測定方法。
［９］酸化剤、還元物質及びメディエーターを含む、前項［１］〜［８］の何れか１項に記載の測定方法に使用するための２−アミノフェノール類測定用試薬。
［１０］酸化剤、還元物質及びメディエーターを含む、前項［１］〜［８］の何れか１項に記載の測定方法に使用するための２−アミノフェノール類測定キット。
［１１］２−アミノフェノール類の前駆体を２−アミノフェノール類に変換する変換用試薬と、［９］記載の測定用試薬とを含む、２−アミノフェノール類の前駆体測定キット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によって、簡便、正確かつ高感度に２−アミノフェノール類及び／又はその前駆体を定量することができる。例えば、３−ヒドロキシキヌレニンの前駆体であるＬ−キヌレニンに、ＮＡＤＨとキヌレニンモノオキシゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨの酸化に伴う３４０ｎｍの吸光度変化を測定する公知の方法の場合、Ｌ−キヌレニン１μＭあたりの吸光度変化は、光路長１ｃｍのセルを使用した場合、０．００６［ａｂｓ］程度であるのに対し、本発明の方法においては、Ｌ−キヌレニン１μＭあたり３４０ｎｍの吸光度変化は少なくとも０．１［ａｂｓ］と極めて大きく、高感度に測定可能なことから、低濃度のＬ−キヌレニン測定が可能になる。該方法は、吸光光度法による測定が可能で、広く普及している生化学自動分析装置を使用できるため、多試料の測定に適しており、さらに臨床検査の現場でも利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】基質として３−ヒドロキシアントラニル酸（ＯＨ−ＡＡ）、還元物質としてＮＡＤＨを用いた２−アミノフェノール類の測定において、メディエーターとしてのジアホラーゼ及び酸化剤としてのペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の影響を示した図。
【図２】基質として、各濃度の２−アミノフェノール（２−ＡＰ）、３-ヒドロキシアントラニル酸（ＯＨ−ＡＡ）又は３−ヒドロキシキヌレニン（ＯＨ−Ｋｙｎ）、還元物質としてＮＡＤＨ、メディエーターとしてジアホラーゼ、酸化剤としてＰＯＤを使用して、還元物質であるＮＡＤＨの減少量を測定することで、２−アミノフェノール類を測定した図。
【図３】基質として３−ヒドロキシキヌレニン（ＯＨ−Ｋｙｎ）又はその前駆体であるＬ−キヌレニン（Ｌ−Ｋｙｎ）、還元物質としてＮＡＤＨ、メディエーターとしてジアホラーゼ、酸化剤としてＰＯＤを使用して、還元物質であるＮＡＤＨの減少量を測定することで、２−アミノフェノール類又は２−アミノフェノールの前駆体を測定した図。
【図４】基質として３−ヒドロキシキヌレニンの前駆体であるＬ−キヌレニン（Ｌ−Ｋｙｎ）、還元物質としてＮＡＤＨ、メディエーターとしてジアホラーゼ、酸化剤としてＰＯＤを使用して、還元物質であるＮＡＤＨの減少量を測定することで、２−アミノフェノール類の前駆体を測定した図。
【図５】基質として３−ヒドロキシキヌレニンの前駆体であるＬ−キヌレニン（Ｌ−Ｋｙｎ）、還元物質としてＮＡＤＨ、メディエーターとしてジアホラーゼ、酸化剤としてビリルビンオキシダーゼを使用して、還元物質であるＮＡＤＨの減少量を測定することで、２−アミノフェノール類の前駆体を測定した図。
【図６】基質として３−ヒドロキシキヌレニンの前駆体であるＬ−キヌレニン（Ｌ−Ｋｙｎ）、還元物質としてＮＡＤＨ、メディエーターとしてジアホラーゼ、酸化剤としてラッカーゼを使用して、還元物質であるＮＡＤＨの減少量を測定することで、２−アミノフェノール類の前駆体を測定した図。
【図７】基質として３−ヒドロキシアントラニル酸（ＯＨ−ＡＡ）、還元物質としてＮＡＤＨ、メディエーターとしてジアホラーゼ、酸化剤としてＰＯＤを使用して、酸化物質であるＮＡＤ＋の増加量を測定することで、２−アミノフェノール類を測定した図。
【図８】基質として３−ヒドロキシアントラニル酸（ＯＨ−ＡＡ）、還元物質としてＮＡＤＨ、メディエーターとしてジアホラーゼ、酸化剤としてＰＯＤを使用して、各反応時間における活性酸素種の増加量としてキノン型色素の生成量を測定することで、２−アミノフェノール類を測定した図。
【図９】基質として３−ヒドロキシキヌレニン（ＯＨ−Ｋｙｎ）、還元物質及びメディエーターとしてジチオトレイトールを使用し、酸化剤としてラッカーゼを使用した場合と使用しなかった場合において、酸化型ジチオトレイトールの増加量を測定することで、２−アミノフェノール類を測定した図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、基質である２−アミノフェノール類に酸化剤、還元物質及びメディエーターを作用させることで、還元物質の減少、酸化物質の増加、及び活性酸素種の増加が認められるので、それら還元物質の減少量、酸化物質の増加量及び活性酸素種の増加量のうちの少なくとも１つを測定することを特徴とする、２−アミノフェノール類の測定方法に関する。
【００１０】
酸化剤、還元物質及びメディエーターの添加順序は、２−アミノフェノール類の高感度測定が可能であれば、特に指定はなく、それらの混合物を同時に添加することも可能である。
【００１１】
（２−アミノフェノール類又はその前駆体を含む試料）
本発明の方法で用いられる試料（基質）は、２−アミノフェノール類やその前駆体を含む試料であれば特に限定されず、例えばヒトを含む哺乳類の生体試料、例えば、血液（血清、血漿）、唾液、尿、脳脊髄液等が挙げられる。これらのうち、臨床診断目的には血液の使用が一般的であるが、血液を試料とする場合、血清、血漿又は除蛋白した血液を用いるのが好ましい。非侵襲検査であれば、唾液、尿を試料として利用することが可能である。
【００１２】
本発明における、２−アミノフェノール類とは、ＣＡＳ番号９５−５５−６で示される２−アミノフェノールの構造を有する化合物であれば特に限定されない（フェノールのヒドロキシ基から見てオルト位にアミノ基を置換基として有していれば、それ以外の位置にはいかなる置換基が結合してもよいが、置換基を有する場合、アミノ基又はヒドロキシ基から見てオルト位に位置するのが好ましい。置換基としては、例えばカルボキシル基、Ｃ２〜６アシル基、２−アミノ−２−カルボキシエチルカルボニル基、ニトロ基、ヒドロキシ基、ハロゲン原子等が挙げられるが、特に限定されない。）。例えば、２−アミノフェノール（ｏ−アミノフェノール）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ヒドロキシ−ＤＬ−キヌレニン、３−ヒドロキシ−Ｌ−キヌレニン又は３−ヒドロキシ−Ｄ−キヌレニン）、３−ヒドロキシアントラニル酸（２−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸）、２−アミノクレゾール、２−アミノニトロフェノール、２−アミノクロロフェノール、２−アミノ−３−ヒドロキシアセトフェノン等が２−アミノフェノール類として挙げられる。
【００１３】
本発明における、２−アミノフェノール類の前駆体とは、何らかの化学反応を行うことで、前記２−アミノフェノール類に変換される化合物を表し、その範囲内であれば特に限定されない。例えば、キヌレニン（ＤＬ−キヌレニン、Ｄ−キヌレニン、Ｌ−キヌレニン）、アントラニル酸、２−アミノフェノールリン酸、２−アミノフェノールグルコシド等が２−アミノフェノール類の前駆体として挙げられる。
【００１４】
（前処理工程）
生体試料の測定では、測定に支障となる可能性のある夾雑還元物質、夾雑蛋白質、金属イオン及びその他物質等の少なくとも１つの物質やその影響を公知の方法で除去又は低減するため、前処理工程用試薬を用いた、前処理工程を含んでもよい。夾雑還元物質としては例えば、ビリルビン、アスコルビン酸、尿酸等が挙げられる。ビリルビンの低減のためにビリルビンオキシダーゼ、アスコルビン酸の低減のためにアスコルビン酸オキシダーゼ、尿酸の低減のためにウリカーゼ等の酵素をそれぞれ使用した前処理が挙げられる。さらに、過酸化水素やペルオキシダーゼによる処理も行うことができる。これら前処理工程に使用する酵素及び物質がその後の測定に影響を及ぼす可能性がある場合は、阻害剤、分解酵素等を加えることでその影響を軽減することができる。なお、酵素の使用量、反応ｐＨ及び温度は、それぞれの酵素の至適ｐＨ及び温度を踏まえて、適宜設定することができる。酵素の使用量は、前処理液中の濃度が例えば０．１〜１０００Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．５〜１００Ｕ／ｍＬである。反応温度は、例えば１５〜５０℃、好ましくは２０〜４５℃、より好ましくは２５〜４０℃である。反応ｐＨは、例えば５．０〜１１．０、好ましくは５．５〜１０．５、より好ましくは６．０〜１０．０である。反応時間は、例えば１〜６０分、好ましくは１〜４０分間である。
【００１５】
夾雑蛋白質は例えば、過塩素酸、トリクロロ酢酸等の除蛋白剤を用いた公知の方法で低減することができる。低減処理後、炭酸カリウム等を用いて中和することで、試料として使用することができる。なお、除蛋白剤処理によって、ビリルビン、ヘモグロビン等の夾雑還元物質の低減も可能である。
【００１６】
金属イオンは例えば、金属キレート剤で低減することができる。金属キレート剤は特に限定されないが、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ビシン（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）、ＣｙＤＴＡ（トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−四酢酸）等が好適に用いられる。なお、金属キレート剤の使用濃度は、本測定に影響を及ぼさない範囲で適宜設定することができるが、例えば１０ｍＭ以下、好ましくは２ｍＭ以下である。またマグネシウムイオン等は、リン酸を添加することで低減することも可能である。
【００１７】
上述の前処理を施した液については、前処理後直ぐに測定に使用してもよく、冷蔵又は冷凍で保管後に使用してもよい。
【００１８】
（工程（Ａ））
（酸化剤）
本発明で使用する酸化剤は、２−アミノフェノール類を酸化することができるものである。この酸化剤は、２−アミノフェノール類の高感度測定が可能なものであれば特に限定されないが、例えば酸化還元酵素が挙げられ、好ましくは酸化酵素、より好ましくはフェノール系化合物に作用する酸化酵素である。具体的には、ペルオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１１．１．Ｘ）、ラッカーゼ（ＥＣ番号１．１０．３．２）、ビリルビンオキシダーゼ（ＥＣ番号１．３．３．５）、アミノフェノールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１０．３．４）、カテコールオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１０．３．１）、チロシナーゼ（ＥＣ番号１．１４．１８．１）、ミエロペルオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．２）、３−ヒドロキシアントラニル酸オキシダーゼ（ＥＣ番号１．１０．３．５）、フェロオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１６．３．１）、フェノール−２−モノオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１４．１３．７又は１．１４．１４．２０）、グリキサゾンシンターゼ（ＥＣ番号１．１０．３．１５）、２−アミノフェノール１，６−ジオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１３．１１．７４）、２−アミノ−５−クロロフェノール１，６−ジオキシゲナーゼ（ＥＣ番号１．１３．１１．７６）等が例示される。その中で好ましいのはペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ又はアミノフェノールオキシダーゼであり、特にペルオキシダーゼ、ラッカーゼ又はビリルビンオキシダーゼが好ましい。これらフェノール系化合物に作用する酸化酵素は、単独又は組み合わせて使用することもでき、その他の酵素と組み合わせて使用することもできる。酸化酵素、例えばペルオキシダーゼ、ラッカーゼ又はビリルビンオキシダーゼの濃度は、２−アミノフェノール類を含まない系では、還元物質の減少、酸化物質及び活性酸素種の増加が殆ど認められず、２−アミノフェノール類を含む系では、還元物質の減少、酸化物質及び活性酸素種の増加が認められる濃度であれば、その範囲は限定されないが、好ましくは０．００１〜１，０００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは０．０１〜１００Ｕ／ｍＬである。反応ｐＨ、温度及び時間は、それぞれの酵素に適した条件に合わせて適宜設定することができる。反応温度は、例えば１５〜５０℃、好ましくは２０〜４５℃、より好ましくは２５〜４０℃である。反応ｐＨは、例えば４．５〜１０．５、好ましくは５．０〜１０．０、より好ましくは５．５〜９．５である。反応時間は、例えば１〜６０分、好ましくは１〜４５分、より好ましくは１〜３０分である。なお、上記反応において、増大した活性酸素種の影響が認められる場合は、カタラーゼやスーパーオキシドディスムターゼ等の酵素を併用することで、その影響を低減することも可能である。
【００１９】
（還元物質）
本発明で使用する還元物質としては、２−アミノフェノール類の高感度測定が可能なものであれば特に限定されないが、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの少なくとも１つが好ましく、それらの誘導体等も挙げられる。ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの誘導体とは、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨの安定性向上、モル吸光係数の上昇等のために使用することができる。例えば、特開２０１２−２２４６３８公報で示されるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ誘導体等、公知のものを使用することができる。還元物質の濃度としては、本測定に影響を及ぼさない範囲で適宜設定することができるが、例えば０．０１ｍＭ以上が好ましく、より好ましくは０．０５ｍＭ以上である。その他、メディエーターとしての機能も有している還元物質として、ジチオトレイトールやアスコルビン酸等も使用可能である。
【００２０】
（メディエーター）
本発明で使用するメディエーター（電子伝達体）としては、２−アミノフェノール類の高感度測定が可能なものであれば特に限定されないが、例えば還元物質としてＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの少なくとも１つ、又はそれらの誘導体を使用する場合はジアホラーゼが好ましい。ジアホラーゼを使用する場合、使用量としては反応液における濃度が０．０１Ｕ／ｍＬ以上が好ましく、０．１Ｕ／ｍＬ以上がより好ましい。ジアホラーゼは、還元物質と反応するものであればその種類は限定されないが、例えば、ＥＣ番号１．６．５．Ｘ、ＥＣ番号１．６．９９．１、ＥＣ番号１．６．９９．３、ＥＣ番号１．８．１．４等に分類されるものを使用することができる。
【００２１】
反応温度、反応ｐＨ及び反応時間は、酵素等の至適ｐＨ及び温度を踏まえて適宜設定することができる。反応温度は、例えば１５〜５０℃、好ましくは２０〜４５℃、より好ましくは２５〜４０℃である。反応ｐＨは、特に限定されないが、ジアホラーゼを使用する場合は、ｐＨ４．５〜１０．５が好ましく、ｐＨ５．０〜１０．０がより好ましく、ｐＨ５．５〜９．５が更に好ましい。反応時間は、例えば１〜６０分間、好ましくは１〜４０分間、より好ましくは１〜３０分間である。得られる感度は、使用する酵素量を増やすほど、また反応時間を長くするほど高くなると考えられる。
【００２２】
（還元物質の測定法）
還元物質の測定は、例えば、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びそれらの誘導体のうちの少なくとも１つの変化量（減少量）の測定によって行うことができる。該測定方法としては、例えば、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの少なくとも１つの変化量を測定する場合は、３４０ｎｍでの吸光度測定が挙げられる。ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの少なくとも１つの誘導体の変化量を測定する場合は、それぞれの誘導体において最適な波長で吸光度を測定することで、簡単に還元物質濃度の減少を測定することが可能である。チオＮＡＤＨ及びチオＮＡＤＰＨの少なくとも１つを使用した場合は、４００ｎｍ近傍での吸光度測定が可能である。また還元物質としてアスコルビン酸を使用した場合は、２６５ｎｍ近傍での吸光度測定が可能である。
【００２３】
その他の手法としては、一定時間反応後に、ＮＡＤＨ類に対し、ホルマザン色素等の酸化還元系発色試薬をメディエーター存在下で反応させて吸光度を測定する方法、又はＮＡＤＨ類に作用する酸化酵素、例えばＮＡＤＨオキシダーゼ等を作用させて得られた過酸化水素を、後述の活性酸素種の測定法に記載の手法で測定する方法で、残存する還元物質濃度を算出することも可能である。その他、公知の蛍光法や電気化学的な測定等も可能である。また前記の各成分を適宜含有する還元物質測定用試薬を調製することもできる。
【００２４】
これらの測定手段は特に限定されないが、例えば分光光度計（例えば、日本分光製のＶ−６６０）を用いた吸光度測定が挙げられる。
【００２５】
なお、還元物質の濃度が高すぎる場合は、分光光度計の測定範囲内になるように適宜希釈して測定することも可能である。
【００２６】
（酸化物質の測定法）
本発明で測定する酸化物質としては、２−アミノフェノール類の高感度測定が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、還元物質としてＮＡＤＨを使用する場合は、２−アミノフェノール類の濃度に依存して、酸化物質であるＮＡＤ＋が増加し、還元物質としてＮＡＤＰＨを使用する場合は、２−アミノフェノール類の濃度に依存して、酸化物質であるＮＡＤＰ＋が増加する。したがって、それらの酸化物質の少なくとも１つの濃度を測定することで、２−アミノフェノール類の濃度の測定が可能である。ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋等の酸化物質の濃度の測定方法は、公知の手法であってもよく、酸化物質がＮＡＤ＋及びＮＡＤＰ＋の少なくとも１つの場合は、例えば公知文献（Chem Commun (Camb). 2013, 49 (98):11500-2）に従い、アセトフェノン、２−アセチルベンゾフラン等を反応させ、生じた蛍光物質を蛍光法で測定する方法が挙げられる。
【００２７】
又は、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする酵素と組み合わせて、産生する酸化物質の濃度を公知の手法で測定することも可能である。例えば、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする脱水素酵素による反応で産生したＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを３４０ｎｍの吸光度等で測定することも可能である。この場合は、脱水素酵素を添加する前に公知の酸処理等を行うことで、残存するＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの少なくとも１つの分解や酵素失活を行うのが望ましい。更に、エタノール、アルコール脱水素酵素及びアルデヒド酸化酵素を作用させること、又は乳酸、乳酸脱水素酵素及びピルビン酸酸化酵素を作用させることによって得られた過酸化水素を、後述の活性酸素種の測定法に記載の手法で測定することも可能である。また前記の各成分を適宜含有する酸化物質測定用試薬を調製することもできる。
【００２８】
なお、還元物質としてはジチオトレイトールを使用する場合は、本反応で得られた酸化物質である酸化型ジチオトレイトールを２８３ｎｍ近傍の吸光度で測定する方法も可能である。
【００２９】
（活性酸素種の測定法）
本発明の２−アミノフェノール類の測定方法においては、酸化剤、還元物質及びメディエーター添加後、そのまま又は前述の酵素反応等を追加することで、ヒドロキシルラジカル、スーパーオキシドアニオン又は過酸化水素に代表される活性酸素種を生じさせることもできるので、これら活性酸素種を公知の手法で測定してもよい。例えば、産生した活性酸素種にスーパーオキシドディスムターゼを作用させる等の手法で過酸化水素を発生してから、トリンダー試薬（フェノール／アミノアンチピリン系）、新トリンダー試薬（アニリン／アミノアンチピリン系）、ルミノール試薬等を使用し、吸光度や化学発光により測定するという方法が挙げられる。また前記の各成分を適宜含有する活性酸素種測定用試薬を調製することもできる。
【００３０】
（分光光度計による測定）
分光光度計による測定では、レート法及びエンドポイント法から適宜選択することが好ましい。測定に用いられる分光光度計としては、日本分光、日立ハイテクノロジーズ、島津製作所等各社から販売されている市販品が挙げられる。分光光度計を用いて、還元物質の減少量、酸化物質の増加量及び活性酸素種の増加量のうちの少なくとも１つを測定することで、２−アミノフェノール類の濃度の測定が可能である。例えば、２−アミノフェノール類である２−アミノフェノール、３−ヒドロキシキヌレニン、３−ヒドロキシアントラニル酸等、又は２−アミノフェノール類の前駆体であるＬ−キヌレニン、アントラニル酸等の濃度は、光路長１ｃｍのセルを使用した場合、１μＭあたり好ましくは０．１［ａｂｓ］以上の高感度で測定可能で、より好ましくは０．２［ａｂｓ］以上、更に好ましくは０．５［ａｂｓ］以上の高感度で測定可能である。
【００３１】
（工程（Ｂ））
（２−アミノフェノール類の前駆体の変換）
本発明においては、前記工程（Ａ）の前又は同時に、２−アミノフェノール類の前駆体を２−アミノフェノール類に変換する工程（Ｂ）を含んでいてもよい。変換後の２−アミノフェノール類を測定することで、２−アミノフェノール類の前駆体の測定も可能である。該変換工程としては、酵素反応等が好適に用いられる。例えば、２−アミノフェノール類の前駆体がＬ−キヌレニンである場合、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの少なくとも１つとキヌレニンモノオキシゲナーゼとを作用させてヒドロキシ基を付与し、３−ヒドロキシキヌレニンに変換することができる。２−アミノフェノール類の前駆体がアントラニル酸である場合、テトラヒドロ葉酸及びアントラニル酸モノオキシゲナーゼを作用させてヒドロキシ基を付与し、３−ヒドロキシアントラニル酸に変換することができる。２−アミノフェノール類の前駆体が２−アミノフェノールリン酸（２−アミノフェノール類のヒドロキシ基にリン酸基が結合したもの）の場合は、ホスファターゼを作用させてリン酸基を除去することによって、２−アミノフェノールに変換することができる。また２−アミノフェノール類の前駆体が２−アミノフェノールグルコシド（ヒドロキシ基に糖類が結合したもの）である場合は、アミラーゼやグリコシダーゼを作用させることによって、２−アミノフェノールに変換することができる。すなわち、２−アミノフェノールリン酸を使用すれば、試料中のホスファターゼ活性を、また２−アミノフェノールグルコシドを使用すれば、試料中のアミラーゼ活性やグリコシダーゼ活性を、産生した２−アミノフェノール量からそれぞれ測定することもできる（言い換えれば、２−アミノフェノール類の前駆体の種類によって様々な酵素活性の測定ができるということになる。）。また前記の各成分を適宜含有する前駆体変換用試薬を調製することもできる。なお、試料中の測定に支障をきたす物質の影響を除去又は低減するために、工程（Ｂ）を入れた測定と入れない測定をそれぞれ実施し、その差をもって評価するという手法も可能である。
【００３２】
（任意成分）
本発明の２−アミノフェノール類の測定方法においては、当業者に公知の、他の任意成分を適宜含有させ、前記酵素等試薬成分の安定性を高めてもよい。任意成分は測定に影響のない成分であれば特に限定されないが、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、糖類、糖アルコール類、カルボキシル基含有化合物、酸化防止剤、界面活性剤、酵素活性に悪影響を与えないアミノ酸類、緩衝剤等が挙げられる。また酸化剤やメディエーターの反応性向上、反応特異性、試薬の乾燥性及び／又は溶解性等を向上又は改善する目的で、前記安定化剤やその他物質を配合することも可能である。
【００３３】
（試薬及びキット）
本発明は、酸化剤、還元物質及びメディエーターを含む、２−アミノフェノール類測定用試薬及び測定キットを提供する。該試薬又はキットは、前記の２−アミノフェノール測定に使用するための試薬又はキットであり、測定に必要な各種成分をさらに含むことが好ましい。例えば、目的のｐＨにおいて緩衝能を有する緩衝剤、前処理工程用試薬、還元物質測定用試薬、酸化物質測定用試薬及び活性酸素種測定用試薬のうちの少なくとも１つを含むことができる。安定化剤として前述の任意成分や緩衝剤を添加することも可能である。２−アミノフェノール類の前駆体を測定する場合は、前駆体から２−アミノフェノール類へ変換可能な、例えば酵素等の前駆体変換用試薬と、前記２−アミノフェノール類測定用試薬とを組み合わせれば、２−アミノフェノール類の前駆体測定キットを提供できる。なお、本発明のキヌレニン測定用の試薬及びキットの組成物は、保存又はキヌレニンの測定に適した溶液（例えば、緩衝液）中に溶解した組成物の状態、又は凍結乾燥された状態（例えば、粉末）であるのが望ましい。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。【００３５】
［実施例１］
（２−アミノフェノール類の測定における酸化剤とメディエーターの有無の影響確認）
２−アミノフェノール類として３−ヒドロキシアントラニル酸（ＯＨ−ＡＡ）、酸化剤としてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）（富士フイルム和光純薬製）、還元物質としてＮＡＤＨ、及びメディエーターとしてジアホラーゼ（ニプロ製）を使用して、ＮＡＤＨの減少量を測定することで、２−アミノフェノール類を測定した。【００３６】
９６穴マイクロプレートのウェル１〜４に、１Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０μＬ、１ｍＭ  ＮＡＤＨ２０μＬ、超純水１００μＬ及び４０μＭ  ＯＨ−ＡＡ２０μＬを、各々添加し、３７℃で５分間加温した。なお、前記ＯＨ−ＡＡの代わりに超純水を添加したウェル５〜８をコントロールとした。【００３７】
ＯＨ−ＡＡを添加した各ウェルにおいて、ウェル１及び５には超純水４０μＬを、ウェル２及び６には１０Ｕ／ｍＬ  ＰＯＤ２０μＬと超純水２０μＬを、ウェル３及び７には超純水２０μＬと５Ｕ／ｍＬジアホラーゼ２０μＬを、又はウェル４及び８には１０Ｕ／ｍＬ  ＰＯＤ２０μＬと５Ｕ／ｍＬジアホラーゼ２０μＬをそれぞれ添加し、反応を開始した。３７℃で１２分間反応させた後、３４０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ３８４、モレキュラーデバイス社製）で測定した。測定値は光路長が１ｃｍとなるように換算した。ＯＨ−ＡＡを添加したウェル１〜４の吸光度から対応するコントロールの吸光度を減算し、その絶対値をΔＡｂｓ３４０として図１に示す。ＰＯＤ、ジアホラーゼをともに含むウェル４においては、ＯＨ−ＡＡの添加により大きなΔＡｂｓ３４０を示した。【００３８】
なお、２−アミノフェノール類として２−アミノフェノール、３−ヒドロキシキヌレニンを選択した場合も同様の傾向を示した。【００３９】
［実施例２］
（還元物質の減少量測定による２−アミノフェノール類の測定）
２−アミノフェノール類として２−アミノフェノール（２−ＡＰ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（ＯＨ−ＡＡ）又は３−ヒドロキシキヌレニン（ＯＨ−Ｋｙｎ）、酸化剤としてＰＯＤ、還元物質としてＮＡＤＨ、及びメディエーターとしてジアホラーゼを使用して、還元物質であるＮＡＤＨの減少量を測定することで、２−アミノフェノール類を測定した。【００４０】
３ｍＬ容石英セル（光路長１ｃｍ）に超純水１，０００μＬ、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２００μＬ、１ｍＭ  ＮＡＤＨ２００μＬ、１０μＭ、２０μＭ又は４０μＭの２−ＡＰを２００μＬ（それぞれ、２−ＡＰ終濃度１μＭ、２μＭ、４μＭ）添加し、３７℃で５分間加温した。その後、１０Ｕ／ｍＬ  ＰＯＤを２００μＬ及び１０Ｕ／ｍＬ  ジアホラーゼを２００μＬ添加し、反応を開始した。３７℃で１０分間反応させた後、３４０ｎｍの吸光度を分光光度計（Ｖ−５６０、日本分光製）で測定した。同様に２−ＡＰの代わりにＯＨ−ＡＡ又はＯＨ−Ｋｙｎを使用した測定もそれぞれ実施した。なお、前記２−ＡＰの代わりに超純水を添加したサンプルをコントロールとした。【００４１】
各２−アミノフェノール類の終濃度１μＭ、２μＭ及び４μＭの３４０ｎｍの吸光度からコントロール（各２−アミノフェノール類０μＭ）の３４０ｎｍの吸光度を減算し、その絶対値をΔＡｂｓ３４０とした。各２−アミノフェノール類の終濃度に対するΔＡｂｓ３４０の値をプロットし、図２に示す。【００４２】
図２に示すように、２−アミノフェノール類として、２−ＡＰ、ＯＨ−ＡＡ又はＯＨ−Ｋｙｎを使用した何れの場合も、２−アミノフェノール類の濃度が増すにつれ濃度依存的にΔＡｂｓ３４０が増大していた。基質濃度１μＭにおけるΔＡｂｓ３４０は約０．１〜０．３［ａｂｓ］と高い値を示しており、還元物質の減少量を測定することで、２−アミノフェノール類の高感度測定が可能であることが確認できた。【００４３】
［実施例３］
（２−アミノフェノールの前駆体の測定１）
２−アミノフェノール類として３−ヒドロキシキヌレニン（ＯＨ−Ｋｙｎ）又は２−アミノフェノール類の前駆体としてＬ−キヌレニン（Ｌ−Ｋｙｎ）を使用して、還元物質であるＮＡＤＨの減少量を測定することで、２−アミノフェノール類又は２−アミノフェノールの前駆体を測定した。尚、酸化剤としてＰＯＤ、還元物質としてＮＡＤＨ及びメディエーターとしてジアホラーゼを使用した。【００４４】
ＯＨ−Ｋｙｎを用いた測定は、実施例２の測定条件のうち、ＯＨ−Ｋｙｎの終濃度を０．２５μＭ、０．５μＭ又は１μＭに変更し、さらにＰＯＤ及びジアホラーゼ添加後の３７℃における反応時間を２０分間に変更した。反応開始１０分後及び２０分後の３４０ｎｍの吸光度をそれぞれ測定し、それぞれのΔＡｂｓ３４０を実施例２の手法に従い算出した。【００４５】
Ｌ−Ｋｙｎの測定は３ｍＬ容石英セル（光路長１ｃｍ）に超純水８００μＬ、１Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２００μＬ、１ｍＭ  ＮＡＤＨ２００μＬ、２．５μＭ、５μＭ又は１０μＭのＬ−Ｋｙｎ２００μＬ（それぞれ、Ｌ−Ｋｙｎ終濃度０．２５μＭ、０．５μＭ又は１μＭ）、及び１Ｕ／ｍＬキヌレニンモノオキシゲナーゼ２００μＬ（自社調製、Myxococcus stipitatus由来（配列番号１））を添加し、３７℃で１０分間加温した。その後、１０Ｕ／ｍＬ  ＰＯＤ２００μＬ及び１０Ｕ／ｍＬ  ジアホラーゼ２００μＬを添加し、３７℃で反応を開始した。反応開始１０分後及び２０分後の、３４０ｎｍの吸光度を分光光度計（Ｖ−５６０、日本分光製）で測定した。尚、Ｌ−Ｋｙｎの代わりに超純水を使用したサンプルをコントロールとした。さらに、キヌレニンモノオキシゲナーゼの代わりに超純水を使用した測定も実施した。【００４６】
各ＯＨ−Ｋｙｎ濃度又はＬ−Ｋｙｎ濃度における反応開始１０分後及び２０分後のそれぞれのΔＡｂｓ３４０を、実施例２の手法に従い算出した。ＯＨ−Ｋｙｎの各終濃度又はＬ−Ｋｙｎの各終濃度に対するΔＡｂｓ３４０の値をそれぞれプロットし、図３に示す。【００４７】
図３に示すように、ＯＨ−Ｋｙｎ、Ｌ−Ｋｙｎの何れを使用した場合も、ＯＨ−Ｋｙｎ又はＬ−Ｋｙｎの濃度が増すにつれ濃度依存的にΔＡｂｓ３４０が増大していた。さらに、反応時間が１０分間の場合に比べ、２０分間の方が、より高い濃度まで直線性が認められた。また２−アミノフェノール類であるＯＨ−Ｋｙｎの測定結果と、ＯＨ−Ｋｙｎの前駆体であるＬ−ＫｙｎをキヌレニンモノオキシゲナーゼでＯＨ−Ｋｙｎに変換処理した場合の結果が合致しており、２−アミノフェノールの前駆体であっても適切な変換処理工程を経ることで、２−アミノフェノールの前駆体を測定できることが判明した。なお、Ｌ−Ｋｙｎ測定の際に、キヌレニンモノオキシゲナーゼを加えなかった場合、Ｌ−Ｋｙｎ濃度によらずΔＡｂｓ３４０はほぼ０であった。【００４８】
本測定においては、２０分間反応後のＯＨ−Ｋｙｎ又はＬ−Ｋｙｎ１μＭにおけるΔＡｂｓ３４０は約０．５［ａｂｓ］と高い値を示しており、高感度測定が可能であることが確認できた。【００４９】
［実施例４］
（２−アミノフェノールの前駆体の測定２）
２−アミノフェノールの前駆体であるＬ−キヌレニン（Ｌ−Ｋｙｎ）の測定において、実施例３の測定から測定時のｐＨや使用する試薬の種類や濃度を変えた測定を実施した。【００５０】
Ｌ−Ｋｙｎの測定は３ｍＬ容石英セル（光路長１ｃｍ）に、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ又は５μＭのＬ−Ｋｙｎ１００μＬ（それぞれ、Ｌ−Ｋｙｎ終濃度０．０４８μＭ、０．０９５μＭ、０．１４μＭ、０．１９μＭ又は０．２４μＭ）を添加後、３２５μＭ  ＮＡＤＨ／２ｍＭ  ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を１，６００μＬ添加し、３７℃で５分間加温した。その後、１Ｍ  緩衝液（リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０、７．０）又はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０））１００μＬ、２６Ｕ／ｍＬキヌレニンモノオキシゲナーゼ１００μＬ、２６Ｕ／ｍＬ  ＰＯＤ１００μＬ及び２６０Ｕ／ｍＬジアホラーゼ１００μＬ、超純水１００μＬをプレミックスして取得した液４００μＬを添加し、３７℃で反応を開始した。反応開始５分後の、３４０ｎｍの吸光度を分光光度計（Ｖ−６６０、日本分光製）で測定した。なお、Ｌ−Ｋｙｎの代わりに超純水を使用したサンプルをコントロールとした。【００５１】
最終的な反応液中の各Ｌ−Ｋｙｎ濃度における反応開始５分後のそれぞれのΔＡｂｓ３４０を、実施例２の手法に従い、ｐＨ毎に算出した。Ｌ−Ｋｙｎの各終濃度に対するΔＡｂｓ３４０の値をそれぞれプロットし、図４に示す。【００５２】
図４に示すように、今回の試験範囲であるｐＨ６．０〜８．０においては、Ｌ−Ｋｙｎの濃度が増すにつれ濃度依存的にΔＡｂｓ３４０が増大していた。なお、ｐＨが低くなると感度上昇するものの、Ｌ−キヌレニン終濃度が高くなるにつれてΔＡｂｓ３４０の値が頭打ちになる傾向であった。【００５３】
本測定においては、５分間反応後のＬ−Ｋｙｎ０．０９５μＭにおけるΔＡｂｓ３４０は約０．１〜０．２［ａｂｓ］、すなわち１μＭあたりでは約１〜２［ａｂｓ］と高い値を示しており、種々のｐＨにおいて、実施例３と比べて更に高感度な測定が可能であることが確認できた。【００５４】
［実施例５］
（２−アミノフェノールの前駆体の測定３）
２−アミノフェノールの前駆体であるＬ−Ｋｙｎの測定に関し、酸化剤としてＰＯＤではなく、（ｉ）ビリルビンオキシダーゼ（ニプロ製）又は（ｉｉ）ラッカーゼ（Aspergillus由来、シグマアルドリッチ製）を使用した測定をそれぞれ実施した。【００５５】
Ｌ−Ｋｙｎの測定方法は、実施例４と同じである。但し、反応中の緩衝液としては、（ｉ）１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μＬ又は（ｉｉ）１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１００μＬを使用した。また酸化剤として２６Ｕ／ｍＬ  ＰＯＤ１００μＬの代わりに、（ｉ）７８Ｕ／ｍＬビリルビンオキシダーゼ１００μＬ又は（ｉｉ）５０ＬＡＭＵ／ｇラッカーゼ１００μＬを使用した。ΔＡｂｓ３４０の算出方法は実施例４と同じである。Ｌ−Ｋｙｎの各終濃度に対するΔＡｂｓ３４０の値をそれぞれプロットし、（ｉ）の結果を図５に、（ｉｉ）の結果を図６にそれぞれ示す。【００５６】
図５及び図６に示すように、Ｌ−Ｋｙｎの濃度が増すにつれ濃度依存的にΔＡｂｓ３４０が増大していた。【００５７】
本測定においては、５分間反応後のＬ−Ｋｙｎ０．０９５μＭにおけるΔＡｂｓ３４０は、（ｉ）約０．１１［ａｂｓ］及び（ｉｉ）約０．０９［ａｂｓ］、すなわち１μＭあたりでは約１［ａｂｓ］前後と高い値を示しており、酸化剤を別のものにしても、実施例４と同様に、高感度測定が可能であることが確認できた。【００５８】
［実施例６］
（酸化物質の増加量測定による３−ヒドロキシアントラニル酸の測定）
２−アミノフェノール類として３−ヒドロキシアントラニル酸（ＯＨ−ＡＡ）を使用して、酸化物質であるＮＡＤ＋の増加量を測定することで、２−アミノフェノール類を測定した。なお、酸化剤としてＰＯＤ、還元物質としてＮＡＤＨ及びメディエーターとしてジアホラーゼを使用した。【００５９】
１．５ｍＬ容チューブに１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０μＬ、１ｍＭ  ＮＡＤＨ４０μＬ、超純水８０μＬ、２．５μＭ、５μＭ又は１０μＭのＯＨ−ＡＡ２０μＬをそれぞれ添加し、３７℃で５分間加温した。その後、１０Ｕ／ｍＬ  ＰＯＤ２０μＬ及び１０Ｕ／ｍＬジアホラーゼ２０μＬを添加し、３７℃で１０分間反応させた。なお、ＯＨ−ＡＡの代わりに超純水使用したサンプルをコントロールとした。【００６０】
反応後、各チューブに１Ｍ塩酸２０μＬを加え、５０℃で３０分間加温することで未反応ＮＡＤＨを分解した。その後、１Ｍ  ＮａＯＨ２０μＬ及び１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）６０μＬを加え中和した。【００６１】
中和後、各チューブから７５μＬずつを９６穴マイクロウェルプレートに入れ、３４０ｎｍの吸光度を測定して、該測定値をブランク値とした。各ウェルに１０Ｕ／ｍＬアルコールデヒドロゲナーゼ（和光純薬工業製）１０μＬ、４０％エタノール１０μＬ及び超純水５μＬを添加し、室温で５分間静置した。５分後の３４０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。測定値は光路長が１ｃｍになるように換算した。各測定値から、対応するブランク値を減算した（測定値Ａ）。さらに各ＯＨ−ＡＡ濃度の各測定値Ａから、コントロール（ＯＨ−ＡＡ  ０μＭ）の測定値Ａを減算し、ΔＡｂｓ３４０を算出した。【００６２】
ＯＨ−ＡＡの各終濃度に対するΔＡｂｓ３４０の値をプロットし、図７に示す。なお、ＯＨ−ＡＡ終濃度は、最後の超純水５μＬ添加後の濃度である０．１２５〜０．５μＭとした。図７に示すように、ＯＨ−ＡＡの濃度が増すにつれ濃度依存的にΔＡｂｓ３４０が増大しており、ＯＨ−ＡＡ０．５μＭにおけるΔＡｂｓ３４０は約０．１［ａｂｓ］であった。よって、酸化物質（ＮＡＤ＋）の増加量を測定することで、２−アミノフェノール類の高感度測定が可能であることが確認できた。【００６３】
［実施例７］
（活性酸素種の増加量測定による３−ヒドロキシアントラニル酸の測定）
２−アミノフェノール類として、３−ヒドロキシアントラニル酸（ＯＨ−ＡＡ）を使用して、活性酸素種であるスーパーオキシドアニオン及び過酸化水素の増加量としてキノン型色素の生成量を５００ｎｍで測定することによって、２−アミノフェノール類を測定した。なお、酸化剤としてＰＯＤ、還元物質としてＮＡＤＨ及びメディエーターとしてジアホラーゼを使用した。【００６４】
３ｍＬ容石英セル（光路長１ｃｍ）に超純水４００μＬ、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２００μＬ、１ｍＭ  ＮＡＤＨ２００μＬを添加した。さらに、トリンダー試薬である１０ｍＭ  ４−アミノアンチピリン２００μＬ及び１００ｍＭフェノール２００μＬを添加し、１０μＭ、２０μＭ又は４０μＭのＯＨ−ＡＡを２００μＬ（それぞれ、ＯＨ−ＡＡ終濃度１μＭ、２μＭ、４μＭ）添加して、３７℃で５分間加温した。その後、１０Ｕ／ｍＬ  ＰＯＤを２００μＬ、１０Ｕ／ｍＬ  ジアホラーゼ２００μＬ及び３００Ｕ／ｍＬスーパーオキシドディスムターゼ（ナカライテスク製）２００μＬを添加し、３７℃で反応を開始した。反応開始３０分後及び６０分後の５００ｎｍの吸光度を分光光度計（Ｖ−６６０、日本分光製）で測定し、キノン型色素の生成量を測定することで、活性酸素種の増加量を測定した。なお、ＯＨ−ＡＡの代わりに超純水を使用したサンプルをコントロールとした。【００６５】
ＯＨ−ＡＡの終濃度１μＭ、２μＭ、４μＭの５００ｎｍの吸光度からコントロール（ＯＨ−ＡＡ  ０μＭ）の５００ｎｍの吸光度を減算し、その絶対値をΔＡｂｓ５００とした。ＯＨ−ＡＡの各終濃度に対するΔＡｂｓ５００の値をプロットし、図８に示す。【００６６】
図８に示すように、ＯＨ−ＡＡの濃度が増すにつれ濃度依存的にΔＡｂｓ５００が増大していた。よって、活性酸素種の増加量を測定することで２−アミノフェノール類の高感度測定が可能であることが確認できた。【００６７】
［実施例８］
（ジチオトレイトールを使用した２−アミノフェノール類の測定）
還元物質及びメディエーターとしてジチオトレイトール、２−アミノフェノール類として３−ヒドロキシキヌレニン（ＯＨ−Ｋｙｎ）を使用して、酸化物質である酸化型ジチオトレイトールの増加量を測定することで、２−アミノフェノール類を測定した。なお、酸化剤として実施例５のラッカーゼを使用した。【００６８】
９６穴マイクロプレートのウェル２〜４に、超純水１２０μＬ、１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２０μＬ、１０μＭ、２０μＭ又は４０μＭのＯＨ−Ｋｙｎを２０μＬ（それぞれ、ＯＨ−Ｋｙｎ終濃度１μＭ、２μＭ、４μＭ）、１０ＬＡＭＵ／ｇラッカーゼ２０μＬを各々添加し、２５℃で５分間加温した。なお、前記ＯＨ−Ｋｙｎの代わりに超純水を添加したウェル１をコントロールとし、併せて別ウェルにてラッカーゼの代わりに超純水を添加する試験も実施した。【００６９】
ＯＨ−Ｋｙｎを添加した各ウェルに、５ｍＭジチオトレイトールを２０μＬ添加し、２５℃６０分間静置した。経時的に２８３ｎｍの吸光度をプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ３８４、モレキュラーデバイス社製）で測定した。測定値は光路長が１ｃｍとなるように換算した。６０分後におけるＯＨ−Ｋｙｎを添加したウェル２〜４の吸光度から対応するコントロール（ウェル１）の吸光度を減算し、その絶対値をΔＡｂｓ２８３として図９に示した。【００７０】
図９に示したように、ＯＨ−Ｋｙｎの濃度が増すにつれ濃度依存的にΔＡｂｓ２８３が増大していた。よって、ジチオトレイトールを使用した系でも、２−アミノフェノール類の高感度測定が可能であることが確認できた。なお、酸化剤であるラッカーゼ未添加の場合は、ΔＡｂｓ２８３の上昇はほとんど認められなかった。【００７１】
［実施例９］
（２−アミノフェノール類の測定キット）
以下の組成からなる２−アミノフェノール類の測定キットを調製した。【００７２】
【表１】
2019182008.tif 000003
【００７３】
本測定キットは、液Ａ及びＢからなり、測定直前に等量混合するものとした。本混合液に対し、２−アミノフェノール類として、濃度未知の３−ヒドロキシキヌレニン（ＯＨ−Ｋｙｎ）を含む試料又は超純水（コントロール）を同量混合し、３７℃で反応させた。その後、還元物質であるＮＡＤＨの量を３４０ｎｍで測定した。試料の測定値からコントロールの測定値を減算し、ΔＡｂｓ３４０を算出した。算出した値を、既知濃度のＯＨ−Ｋｙｎを使用して作成した検量線に当てはめることで、試料中のＯＨ−Ｋｙｎの濃度を算出できた。よって、該キットを用いて、２−アミノフェノール類の定量が可能であることが確認できた。なお、液Ｂにキヌレニンモノオキシゲナーゼも配合しておくことで、２−アミノフェノール類の前駆体であるＬ−キヌレニンの測定も同様に可能であった。
【図１】
2019182008.tif 000004
【図２】
2019182008.tif 000005
【図３】
2019182008.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019182008.tif 000010
【図８】
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【図９】
2019182008.tif 000012
【配列表】
2019182008000001.app
【国際調査報告】
2019182008.tif 000013
2019182008.tif 000014
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