(57)【要約】  淡水産微細藻類の培養方法であって、淡水産細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０、ナトリウムイオン濃度０．１〜０．４Ｍとなるように調製した培地で、培養温度が１５〜６０℃で培養する培養工程を含む、淡水産微細藻類の培養方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
淡水産微細藻類の培養方法であって、
淡水産細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０、ナトリウムイオン濃度０．１〜０．４Ｍとなるように調製した培地で、培養温度が１５〜６０℃で培養する培養工程を含む、
淡水産微細藻類の培養方法。
【請求項２】
淡水産微細藻類の培養方法であって、
淡水産微細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０、ナトリウムイオン濃度０．１〜０．４Ｍとなるように調製した培地で培養する前培養工程と、
前記前培養工程後の淡水産微細藻類を、ナトリウムイオン濃度が前記前培養工程における前記ナトリウムイオン濃度の１．２〜５倍であり水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０となるように調製した培地で培養する本培養工程と、
を含む、請求項１に記載の淡水産微細藻類の培養方法。
【請求項３】
前記本培養工程における前記培地が、水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０、ナトリウムイオン濃度が０．４Ｍ以上となるように調製培地である、請求項１又は２に記載の淡水産微細藻類の培養方法。
【請求項４】
前記本培養工程における前記培地が、海水に、窒素含有塩、リン含有塩及び鉄含有塩を少なくとも添加し、且つ水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０となるように調製した培地である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の淡水産微細藻類の培養方法。
【請求項５】
前記淡水産微細藻類が、イデユコゴメ綱に属する微細藻類である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の淡水産微細藻類の培養方法。
【請求項６】
ナトリウムイオン濃度が０．５Ｍ以上である培地で増殖できない淡水産微細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０、ナトリウムイオン濃度０．１〜０．４Ｍとなるように調製した培地で培養する工程を含む、水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍ以上となるように調製した培地で増殖可能な淡水産微細藻類の生産方法。
【請求項７】
前記淡水産微細藻類が、シアニジウム属に属する微細藻類の１倍体である、請求項６に記載の淡水産微細藻類の生産方法。
【請求項８】
イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体であって、
水素イオン濃度ｐＨ２．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍとなるように調製したＭＡ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で７日間静置培養したときの下記式（１）で算出される値が２以上であり、
水素イオン濃度ｐＨ２．０となるように調整したＭＡ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で７日間静置培養したときの下記式（１）で算出される値が２未満である、
イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体。
（培養開始７日後のＯＤ７５０値−培養開始時のＯＤ７５０値）／（７×培養開始時ＯＤ７５０値）    （１）
【請求項９】
水素イオン濃度ｐＨ７の等張液、または蒸留水中で細胞が破裂する、請求項８に記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体。
【請求項１０】
藻類細胞の乾燥処理を行い、前記乾燥処理後の細胞をｐＨ７の等張液に懸濁すると、前記細胞が破裂する、
請求項８又は９に記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体を、海水に、窒素含有塩、リン含有塩及び鉄含有塩を少なくとも添加し、且つ水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０となるように調製した培地で培養することを含む、
イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体の培養方法。
【請求項１２】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類を屋外で培養することを含む、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、淡水産微細藻類の培養方法に関する。また、耐塩性が付与された淡水産微細藻類の生産方法及び当該生産方法により得られた耐塩性の淡水産微細藻類に関する。より具体的には、屋外大量培養、特に海水での屋外大量培養に適した淡水産微細藻類及びその生産方法に関する。
本願は、２０１８年１０月２日に、日本に出願された特願２０１８−１８７７６３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
微細藻類は、陸上植物と比較して、高い二酸化炭素固定能力を有すること、及び農産物と生育場所が競合しないことから、いくつかの種は、大量培養されて、飼料、機能性食品、化粧品材料等として産業的に利用されている。
微細藻類の産業上利用については、コスト面等から、高価な機能性食品等の利用形態に限られている。微細藻類の生産コストを抑制して産業利用を促進するためには、屋外における大量培養が好ましい。屋外大量培養は、管理が簡易などの特徴を有するものの、コンタミネーションのリスクがあり、また直接外部環境の影響を受けるほか、藻類捕食者等の侵入も問題となる。そのようなリスクを回避するため、屋外大量培養を行う微細藻類としては、環境変動（光、温度等）に耐性を有すること、他の生物が生存できないような条件で培養できること、高密度まで増殖可能であること、等の条件が求められる。
そのため、現在までに、産業的に実用化されているのは、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）等の数種に限られている。これらの藻類種は、屋外大量培養に成功しており、機能性食品やサプリメントの原料として利用されている。【０００３】
他の生物が生存できない環境としては、例えば、海水のような高塩濃度環境が挙げられる。有用微細藻類を高塩濃度培地で培養することに関しては、例えば、特許文献１〜３の報告がある。
特許文献１には、耐塩性藻類を、段階的に塩濃度を増加させた培地で培養することを特徴とする油脂成分を産生する方法が記載されている。特許文献１に記載の方法では、２２０ｎｍの波長において、培地中の硝酸塩含有量を測定した場合、該含有量が、１０ｍｇ/Ｌ以下となるときに、２段階目の塩濃度を増加させることを特徴としている。
特許文献２には、淡水に生息し、炭化水素類産生能を有する藻類シュードコリシスチス・エリプソイディア（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）の培養において、その炭化水素生産能の生産性を高めるために、培養を開始してから培地の光学濃度が飽和状態を示す光学濃度の２分の１の光学濃度に達するまでの間に、培地に塩を投入することが開示されている。
特許文献３には、ドコサヘキサエン酸を産生するクリプセコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ)属の培養において、藻体内にドコサヘキサエン酸を蓄積させるために、培養液の食塩濃度を前記藻類の生育に好適な食塩濃度より０．１〜１０重量％高い値に設定して培養する方法が開示されている。
特許文献１〜３に記載の方法は、微細藻類に塩ストレスを与えて、炭化水素生産能やドコサヘキサエン酸生産能を高めようとするものであり、屋外培養におけるコンタミネーションリスクの抑制を目的とするものではない。【０００４】
一方、単細胞原始紅藻であるイデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する微細藻類は、硫酸酸性温泉において優先増殖する。イデユコゴメ綱には、シアニディオシゾン（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）属、シアニジウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）属、ガルデリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）属がある。シアニディオシゾン属に属するシアニディオシゾン・メロラエ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ  ｍｅｒｏｌａｅ）は、強固な細胞壁を有さない。シアニディオシゾン・メロラエは、極めて単純な細胞小器官セットにより構成されており、ゲノム配列の解読が完了している。そのため、光合成生物の基礎研究のためのモデル生物として利用されており、遺伝子改変技術の開発も進められている（非特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１５／２５５５２号
【特許文献２】特開２０１３−１０２７４８号公報
【特許文献３】特開平０７−０７５５５７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Fujiwara T et al.(2013) Gene targeting in the red alga Cyanidioschyzon merolae: single- and multi-copy insertion using authentic and chimeric selection markers. PLOS ONE. Sep 5;8(9):e73608.
【非特許文献２】Fujiwara T et al.(2015) A nitrogen source-dependent inducible and repressible gene expression system in the red alga Cyanidioschyzon merolae. Front Plant Sci. Aug 26;6:657.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
イデユコゴメ綱に属する淡水産の好酸性微細藻類は、他の生物が生育できないような酸性環境下で生育可能であり、屋外培養に適している。これらの微細藻類に、高塩濃度耐性を付与できれば、酸性かつ高塩濃度の環境で培養することができ、屋外培養時のコンタミネーションリスクがさらに低下する。また、培養に海水を利用することができれば、培養コストを抑制することができる。【０００８】
そこで、本発明は、低ｐＨ且つ高ナトリウムイオン濃度環境下で淡水産微細藻類を良好に増殖させることができる淡水産微細藻類の培養方法、低ｐＨ且つ高ナトリウムイオン濃度環境下で良好に増殖可能な淡水産微細藻類、及び当該淡水産微細藻類の生産方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］微細藻類の培養方法であって、淡水産微細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０、ナトリウムイオン濃度０．１〜０．４Ｍとなるように調製した培地で、培養温度が１５〜６０℃で培養する培養工程を含む、淡水産微細藻類の培養方法。
［２］淡水産微細藻類の培養方法であって、淡水産微細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０、ナトリウムイオン濃度０．１〜０．４Ｍとなるように調製した培地で培養する前培養工程と、前記前培養工程後の淡水産微細藻類を、ナトリウムイオン濃度が前記前培養工程における前記ナトリウムイオン濃度の１．２〜５倍であり水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０となるように調製した培地で培養する本培養工程と、を含む、［１］に記載の淡水産微細藻類の培養方法。
［３］前記本培養工程における前記培地が、水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍ以上となるように調製した培地である、［１］又は［２］に記載の淡水産微細藻類の培養方法。
［４］前記本培養工程における前記培地が、水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０、ナトリウムイオン濃度０．４Ｍ以上となるように調製した培地である、［１］又は［２］に記載の淡水産微細藻類の培養方法。
［５］前記本培養工程における前記培地が、海水に、窒素含有塩、リン含有塩及び鉄含有塩を少なくとも添加し、且つ水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０となるように調製した培地である、［１］〜［４］のいずれかに記載の淡水産微細藻類の培養方法。
［６］前記淡水産微細藻類が、イデユコゴメ綱に属する微細藻類である、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の淡水産微細藻類の培養方法。
［７］ナトリウムイオン濃度が０．５Ｍ以上である培地で増殖できない淡水産微細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０、ナトリウムイオン濃度０．１〜０．４Ｍとなるように調製した培地で培養する工程を含む、水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍ以上となるように調製した培地で増殖可能な淡水産微細藻類の生産方法。
［８］前記淡水産微細藻類が、シアニジウム属に属する微細藻類の１倍体である、［７］に記載の淡水産微細藻類の生産方法。
［９］前記淡水産微細藻類が、ガルデリア属に属する微細藻類の１倍体である、［７］に記載の淡水産微細藻類の生産方法。
［１０］イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体であって、水素イオン濃度ｐＨ２．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍとなるように調製したＭ−Ａｌｌｅｎ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で７日間静置培養したときの下記式（１）で算出される値が２以上であり、水素イオン濃度ｐＨ２．０となるように調製したＭ−Ａｌｌｅｎ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で７日間静置培養したときの下記式（１）で算出される値が２未満である、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体。
（培養開始７日後のＯＤ７５０値−培養開始時のＯＤ７５０値）／（７×培養開始時ＯＤ７５０値）    （１）
［１１］水素イオン濃度ｐＨ７の等張液、または蒸留水中で細胞が破裂する、［１０］に記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体。
［１２］藻類細胞の乾燥処理を行い、前記乾燥処理後の細胞をｐＨ７の等張液に懸濁すると、前記細胞が破裂する、［１０］または［１１］に記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体。
［１３］前記［１０］〜［１２］のいずれか１つに記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体を、海水に、窒素含有塩、リン含有塩及び鉄含有塩を少なくとも添加し、且つ水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０となるように調製した培地で培養することを含む、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体の培養方法。
［１４］前記［１０］〜［１２］のいずれか１つに記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類を屋外で培養することを含む、イデユコゴメ綱に属する微細藻類１倍体の培養方法。
［１５］淡水産微細藻類として、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体であって、水素イオン濃度ｐＨ２．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍとなるように調製したＭ−Ａｌｌｅｎ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で７日間静置培養したときの下記式（１）で算出される値が２以上であり、水素イオン濃度ｐＨ２．０となるように調製したＭ−Ａｌｌｅｎ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で７日間静置培養したときの下記式（１）で算出される値が２未満である、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体を、水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０、ナトリウムイオン濃度０．４Ｍ以上となるように調製した培地で培養することを含む、淡水産微細藻類の培養方法。
（培養開始７日後のＯＤ７５０値−培養開始時のＯＤ７５０値）／（７×培養開始時ＯＤ７５０値）    （１）
［１６］淡水産微細藻類として、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体であって、水素イオン濃度ｐＨ２．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍとなるように調製したＭ−Ａｌｌｅｎ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で７日間静置培養したときの下記式（１）で算出される値が２以上であり、水素イオン濃度ｐＨ２．０となるように調製したＭ−Ａｌｌｅｎ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で７日間静置培養したときの下記式（１）で算出される値が２未満である、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体を、水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０、ナトリウムイオン濃度０．４Ｍ以上となるように調製した培地で培養することを含む、淡水産微細藻類の生産方法。
（培養開始７日後のＯＤ７５０値−培養開始時のＯＤ７５０値）／（７×培養開始時ＯＤ７５０値）    （１）
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば低ｐＨ且つ高ナトリウムイオン濃度環境下で淡水産微細藻類を良好に増殖させることができる淡水産微細藻類の培養方法、低ｐＨ且つ高ナトリウムイオン濃度環境下で良好に増殖可能な淡水産微細藻類、及び当該淡水産微細藻類の生産方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】シアニジウム・エスピー  ＨＫＮ１（１倍体）をＭ−Ａｌｌｅｎ培地（ＭＡ培地）で前培養した後、ＭＡ培地、ＭＡ培地に０．３ＭのＮａＣｌを添加した培地（ＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地）、又はＭＡ培地に０．５ＭのＮａＣｌを添加した培地（ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地）で本培養したときの増殖曲線、並びにＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地で前培養した後、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で本培養したときの増殖曲線（ＯＤ７５０の経時変化）を示すグラフである。
【図２】シアニジウム・エスピー  ＨＫＮ１（１倍体）をＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地で前培養した後、海水培地又はＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で本培養したときの増殖曲線を示すグラフである。
【図３】シアニジウム・エスピー  ＨＫＮ１（１倍体）をＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地で前培養した後、ｐＨ２〜７の海水培地で７日間本培養した後のＯＤ７５０を示すグラフである。
【図４】シアニジウム・エスピー  ＨＫＮ１（２倍体）をＭＡ培地で前培養した後、ＭＡ培地、ＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地、又はＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で本培養したときの増殖曲線、並びにＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地で前培養した後、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で本培養したときの増殖曲線を示すグラフである。
【図５】シアニジウム・エスピー  ＨＫＮ１（２倍体）をＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地で前培養した後、海水培地又はＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で本培養したときの増殖曲線を示すグラフである。
【図６】シアニディオシゾン・メロラエ  １０ＤをＭＡ培地で前培養した後、ＭＡ培地、ＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地、又はＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で本培養したときの増殖曲線、並びにＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地で前培養した後、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で本培養したときの増殖曲線を示すグラフである。
【図７】シアニディオシゾン・メロラエ  １０ＤをＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地で前培養した後、海水培地又はＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で本培養したときの増殖曲線を示すグラフである。
【図８】シアニジウム・エスピー  ＨＫＮ１（１倍体）を、ＭＡ培地、ＭＡ培地＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地、および海水培地で培養した培養品のポリリン酸と液胞を観察した蛍光顕微鏡写真である。
【図９】シアニジウム・エスピーＨＫＮ１（２倍体）を、ＭＡ培地、ＭＡ培地＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地、および海水培地で培養した培養品のポリリン酸と液胞を観察した蛍光顕微鏡写真である。
【図１０】シアニジウム・エスピーＨＫＮ１（１倍体）を、１０Ｌの海水培地で培養したときの増殖曲線を示すグラフである。
【図１１】葉緑体リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット（ｒｂｃＬ）遺伝子に基づくイデユコゴメ綱に属する微細藻類の分子系統樹を示す。各枝の近傍に最尤法によるローカルブートストラップ値（５０以上のみ記載、左）及びベイズ法による事後確率（０．９５以上のみ記載、右）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において、「ＭＡ培地」は、Ｍ−Ａｌｌｅｎ培地を意味する。具体的には、表１に記載の組成を有する培地であって、水素イオン濃度がｐＨ１．０〜６．０となるように硫酸を用いて調整した培地を意味する。単に、「ＭＡ培地」又は「Ｍ−Ａｌｌｅｎ培地」と記載する場合、ＮａＣｌを添加していない培地を意味する。「水素イオン濃度ｐＨ２．０となるように調製したＭ−Ａｌｌｅｎ培地」は、ｐＨ２．０となるように調整した、ＮａＣｌを添加していないＭＡ培地を意味する。
【００１３】
本明細書において、「ＭＡ地＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地」は、ＮａＣｌ濃度が０．３Ｍとなるように調整したＭＡ培地を意味する。具体的には、表４に記載の組成を有する培地であって、水素イオン濃度がｐＨ１．０〜６．０となるように硫酸を用いて調整した培地を意味する。「水素イオン濃度ｐＨ２．０、ナトリウムイオン濃度０．３Ｍとなるように調製したＭ−Ａｌｌｅｎ培地」は、ｐＨ２．０となるように調整したＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地を意味する。
【００１４】
本明細書において、「ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地」は、ＮａＣｌ濃度が０．５Ｍとなるように調整したＭＡ培地を意味する。具体的には、表５に記載の組成を有する培地であって、水素イオン濃度がｐＨ１．０〜６．０となるように硫酸を用いて調整した培地を意味する。「水素イオン濃度ｐＨ２．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍとなるように調製したＭ−Ａｌｌｅｎ培地」は、ｐＨ２．０となるように調整したＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地を意味する。
【００１５】
ＭＡ培地、ＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地、及びＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地において、水素イオン濃度（ｐＨ）は、特に言及がない限り、ｐＨ１．０〜６．０の範囲の任意の値であることができる。
【００１６】
本明細書において、培地中の成分濃度に関して用いられる「Ｍ」は、「ｍｏｌ／Ｌ」を表す。
【００１７】
＜淡水産微細藻類の培養方法＞
一実施形態において、本発明は、淡水産微細藻類の培養方法を提供する。本実施形態の培養方法は、淡水産細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０、ナトリウムイオン濃度０．１〜０．４Ｍとなるように調製した培地で、培養温度が１５〜６０℃で培養する培養工程を含む。前記培養方法は、淡水産微細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０、ナトリウムイオン濃度０．１〜０．４Ｍとなるように調製した培地で培養する前培養工程と、前記前培養工程後の淡水産微細藻類を、ナトリウムイオン濃度が前記前培養工程における前記ナトリウムイオン濃度の１．２〜５倍であり水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０となるように調製した培地で培養する本培養工程と、を含むことが好ましい。
【００１８】
一実施形態において、本実施形態の培養方法は、高塩濃度の酸性培地で本培養を行う前に、０．１〜０．４Ｍのナトリウムイオン濃度の酸性培地で前培養を行うことを特徴とする。かかる前培養を行うことで、耐塩性を有さない淡水産微細藻類であっても、海水と同程度の高塩濃度培地で良好に増殖できるようになる。
【００１９】
本明細書において、前培養工程における培地のナトリウムイオン濃度及び水素イオン濃度（ｐＨ）とは、前培養工程の培養開始時のナトリウムイオン濃度及びｐＨをそれぞれ意味する。前培養工程の培養開始時の培地が「ナトリウムイオン濃度０．１〜０．４Ｍ」であり「ｐＨ１．０〜６．０」である限り、前培養期間中に、ナトリウムイオン濃度又はｐＨが変動して前記範囲を外れた場合であっても、本実施形態の培養方法の前培養工程に包含される。
本培養工程における培地のナトリウムイオン濃度及びｐＨとは、本培養工程の培養開始時のナトリウムイオン濃度及びｐＨをそれぞれ意味する。本培養工程の培養開始時の培地が「ナトリウムイオン濃度が前培養工程におけるナトリウムイオン濃度の１．２〜５倍」であり「ｐＨ１．０〜６．０」である限り、本培養期間中に、ナトリウムイオン濃度又はｐＨが変動して前記範囲を外れた場合であっても、本実施形態の培養方法の本培養工程に包含される。
【００２０】
（淡水産微細藻類）
本実施形態の培養方法は、ｐＨ１．０〜６．０の酸性条件下で増殖可能な淡水産微細藻類に適用可能である。「淡水産微細藻類」とは、淡水域に生息する微細藻類を意味する。淡水のナトリウムイオン濃度は、通常、０．０５質量％未満である。淡水域は、特に限定されず、河川、湖沼、温泉、地下水等が挙げられるが、ｐＨ１．０〜６．０の酸性条件の淡水域であることが好ましい。そのような酸性条件の淡水域としては、酸性温泉（硫酸酸性温泉など）が好ましく例示される。本明細書において、「微細藻類」とは、単細胞の藻類を意味する。
【００２１】
ｐＨ１．０〜６．０の酸性条件下で増殖可能な淡水産微細藻類としては、例えば、イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する微細藻類が挙げられる。イデユコゴメ綱は、分類学上、紅色植物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に分類される。イデユコゴメ綱には、現在、シアニディオシゾン（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）属、シアニジウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）属、及びガルデリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）属の３属が分類されている。イデユコゴメ綱に属する微細藻類としては、これまでに多くの種類の微細藻類が知られておりここで列挙することはしないが、図１１に、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の葉緑体ｒｂｃＬ遺伝子の塩基配列を用いた系統樹を示す。
【００２２】
本実施形態の培養方法は、淡水産微細藻類の中でも、耐塩性を有さない淡水産微細藻類に適用することが好ましい。ここで「耐塩性を有さない」とは、海水又は海水と同等のナトリウムイオン濃度（約０．５Ｍ）の培地で培養した場合に、淡水産微細藻類用培地（ナトリウムイオン濃度０．０５Ｍ以下）で培養した場合と比較して、増殖が抑制されること（増殖できないことを含む）を意味する。前記増殖の抑制は、淡水産微細藻類用培地における増殖速度と比較して、増殖速度が６０％以上低下することが好ましく、８０％以上低下することがより好ましい。ｐＨ１．０〜６．０の酸性条件下で増殖可能で耐塩性を有さない淡水産微細藻類としては、図１１に示すイデユコゴメ綱に属する微細藻類を挙げることができる。例えば、シアニジウム属に属する微細藻類の１倍体、シアニディオシゾン・メロラエ、ガルデリア属に属する微細藻類の１倍体等が挙げられる。
【００２３】
イデユコゴメ綱に属する微細藻類は、１倍体の細胞形態又は２倍体の細胞形態をとることができるものがある。本発明者らは、２倍体の細胞形態をとる細胞群から１倍体の細胞形態をとる細胞群を得る方法や、逆に１倍体の細胞形態を取る細胞群から２倍体の細胞形態をとする細胞群を得る方法を提供している（国際公開第ＷＯ２０１９／１０７３８５号）。
【００２４】
後述する実施例で示すように、シアニジウム属に属する微細藻類の２倍体は耐塩性を有するが、１倍体は耐塩性を有さない。１倍体及び２倍体の細胞形態を有するシアニジウム属に属する微細藻類の具体例としては、例えば、シアニジウム・エスピー（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）ＹＦＵ３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３３４）（以下、「ＹＦＵ３株」という。）、及びシアニジウム・エスピー（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）ＨＫＮ１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３３３）（以下、「ＨＫＮ１株」という。）等、並びにこれらの近縁種、変異株、及び子孫が挙げられる。
以下、ＹＦＵ３株について、２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを区別して記載する場合には、２倍体の細胞形態を「ＹＦＵ３株（２倍体）」、１倍体の細胞形態を「ＹＦＵ３株（１倍体）」と記載する。同様に、ＨＫＮ１株について、２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを区別して記載する場合には、２倍体の細胞形態を「ＨＫＮ１株（２倍体）」、１倍体の細胞形態を「ＨＫＮ１株（１倍体）」と記載する。単に、「ＹＦＵ３株」又は「ＨＫＮ１株」と記載する場合には、２倍体の細胞形態及び１倍体の細胞形態の両方を包含するものとする。
【００２５】
藻類が２倍体であるか、１倍体であるかの判定は、同一遺伝子座のコピー数を確認することにより行うことができる。すなわち、同一遺伝子座のコピー数が１であれば、１倍体であると判定される。また、次世代シーケンサー等を用いて、藻類が１倍体であることの判定を行うこともできる。例えば、次世代シーケンサー等で全ゲノムのシーケンスリードを取得し、それらのシーケンスリードをアセンブルした後、アセンブルして得られた配列に対して、シーケンスリードをマッピングする。２倍体ではアレルごとの塩基の違いがゲノム上の様々な領域で見つかるが、１倍体では１アレルしか存在しないため、その様な領域は見つからない。
あるいは、ＤＡＰＩ等の核染色試薬で細胞を染色し、１倍体であることが既知である細胞と比較して、同等の蛍光輝度を示す細胞を１倍体と判定し、約２倍の蛍光輝度を示す細胞を２倍体と判定してもよい。あるいは、ＤＡＰＩ等の核染色試薬で細胞を染色し、２倍体であることが既知である細胞と比較して、同等の蛍光輝度を示す細胞を２倍体と判定し、約１／２倍の蛍光輝度を示す細胞を１倍体と判定してもよい。
【００２６】
ＹＦＵ３株（１倍体）は、日本国大分県由布市の温泉の高温酸性水より単離された単細胞紅藻である。ＹＦＵ３株は、２０１７年５月３０日付で、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３３４として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３３４として、２０１８年４月２０日付で国際寄託に移管されている。
ＨＫＮ１株は、日本国神奈川県足柄下郡箱根町の温泉の高温酸性水より単離された単細胞紅藻である。ＨＫＮ１株（１倍体）は、２０１７年５月３０日付で、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３３３として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３３３として、２０１８年４月２０日付で国際寄託に移管されている。
【００２７】
また、本実施形態の培養方法を適用する淡水産微細藻類は、酸性温泉などの淡水域から単離してもよく、カルチャー・コレクション等から入手してもよい。例えば、シアニディオシゾン・メロラエは、国立研究開発法人国立環境研究所微生物系統保存施設（日本国茨城県つくば市小野川１６−２）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；10801 University Boulevard Manassas, VA 20110 USA）等から入手することができる。
【００２８】
また、本実施形態の培養方法を適用する淡水産微細藻類は、自然界から単離されたものに限定されず、天然の淡水産微細藻類に変異が生じたものであってもよい。変異は、自然発生的に生じたものであってもよく、人為的に生じたものであってもよい。例えば、シアニディオシゾン・メロラエは、ゲノムサイズが小さく（約１６Ｍｂｐ）、ゲノム配列の解読が完了しているため（Matsuzaki M et al., Nature. 2004 Apr 8;428(6983):653-7.）、遺伝子改変を行いやすい。したがって、例えば、遺伝子改変により作製されたシアニディオシゾン・メロラエの形質転換体（例えば、栄養成分が強化された形質転換体）に、本実施形態の培養方法を適用してもよい。また、遺伝子改変可能であれば、他の淡水産微細藻類の形質転換体に、本実施形態の培養方法を適用してもよい。
【００２９】
また、ガルデリア属に属する微細藻類の中にも、１倍体の細胞形態及び２倍体の細胞形態をとることができるものがある。例えば、ガルデリア属に属する微細藻類の２倍体を、一定期間（例えば、１〜３週間程度）培養することにより、１倍体の細胞形態を得ることができる。１倍体の細胞を得るために２倍体の細胞を培養する培地としては、例えば、酸性温泉排水培地、塚原鉱泉培地（Hirooka et al. 2016 Front in Microbiology）等が好適に利用可能である。ガルデリア属に属する微細藻類の１倍体又はその形質転換体にも、本実施形態の培養方法を適用可能である。ガルデリア属に属する微細藻類としては、例えば、Ｇ．  ｐａｒｔｉｔａ（ＮＢＲＣ  １０２７５９）、及びＧ．  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（ＳＡＧ１０８．７９等）等が挙げられる。ガルデリア属に属する微細藻類は、酸性温泉などの淡水域から単離してもよく、カルチャー・コレクション等から入手してもよい。カルチャー・コレクションとしては、前記シアニディオシゾン・メロラエで挙げたカルチャー・コレクションに加えて、ＮＩＴＥ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＢＣ；日本国東京都渋谷区西原２−４９−１０）、ＧＥＯＲＧ−ＡＵＧＵＳＴ−ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＧＯＴＴＩＮＧＥＮ  ｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ（ＳＡＧ）等が挙げられる。
【００３０】
イデユコゴメ綱に属する微細藻類の中でも、１倍体の藻類細胞は強固な細胞壁を有さないことが多い。そのような強固な細胞壁を有さない１倍体の細胞形態の藻類細胞は、中和処理、低張処理、凍結融解処理などの比較的温和な処理により、細胞を破壊することができる。なお、本明細書において、「強固な細胞壁を有さない」とは、下記（Ａ）〜（Ｃ）の細胞破裂処理のいずれかで細胞破裂を生じることを意味する。
【００３１】
（Ａ）藻類細胞をｐＨ７の等張液に懸濁し、１週間以上放置する。
（Ｂ）藻類細胞を蒸留水に懸濁し、１分以上放置する。
（Ｃ）藻類細胞の乾燥処理を行い、ｐＨ７の等張液に懸濁する。
上記（Ａ）〜（Ｃ）において、藻類細胞が培養細胞である場合、各処理を行う前に、遠心分離等により培地を除去し、等張液等で藻類細胞を洗浄してもよい。
上記（Ａ）及び（Ｃ）において、等張液としては、１０％スクロース及び２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むｐＨ７の緩衝液が挙げられる。
上記（Ｃ）において、乾燥処理としては、冷蔵庫内（４℃）での乾燥、凍結乾燥等が挙げられる。乾燥処理には、遠心分離により回収した藻類細胞の沈殿を用いる。冷蔵庫内で乾燥する場合、乾燥処理時間は、藻類細胞の量によるが、３日以上が例示される。
【００３２】
また、細胞破裂が生じたか否かは、上記（Ａ）〜（Ｃ）の細胞破裂処理後の藻類細胞懸濁液を遠心分離（１，５００×ｇ、３分）し、藻類細胞懸濁液中の全タンパク質量に対する、遠心上清中のタンパク質量の割合を求めることにより、判定することができる。具体的には、下記式により求められる破裂率が、２０％以上である場合に、細胞破裂が生じたと判定することができる。
【００３３】
【数１】
2020071444.tif 000002
【００３４】
あるいは、藻類細胞懸濁液中の藻類細胞を光学顕微鏡（例えば、倍率６００倍）で観察し、細胞破裂が生じている細胞の割合が、藻類細胞全体の１０％程度以上、好ましくは２０％程度以上である場合に、細胞破裂が生じたと判断してもよい。
【００３５】
上記（Ａ）〜（Ｃ）の細胞破裂処理では、ｐＨ７の等張液を用いることができるため、上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの細胞破裂処理で細胞破裂が生じる細胞は、ｐＨ７の条件下で細胞破裂が生じる細胞であるということができる。
ｐＨ７の条件下で、その細胞が破裂する微細藻類であれば、培養槽の外に流出した場合に、外部環境で生育することが困難であり、環境へのコンタミネーションを抑制することができる。
藻類細胞が強固な細胞壁を有さない場合、光学顕微鏡による観察（例えば、倍率６００倍）では、通常、細胞壁が観察されない。なお、ｐＨ６以下の条件での温和な低張処理により細胞破裂が生じるか否かは、強固な細胞壁を有さない微細藻類であるか否かの判定には影響しない。
【００３６】
［前培養工程］
前培養工程は、淡水産微細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０、ナトリウムイオン濃度０．１〜０．４Ｍとなるように調製した培地で培養する工程である。
【００３７】
前培養工程で用いる培地は、ナトリウムイオン濃度が０．１〜０．４Ｍであり、ｐＨが１．０〜６．０の培地であれば特に限定されない。例えば、一般的な淡水産微細藻類用培地に、０．１〜０．４Ｍのナトリウムイオンを添加し、ｐＨ１．０〜６．０に調整したものを好ましく用いることができる。
淡水産微細藻類用培地は、特に限定されず、培養する淡水産微細藻類の種類に応じて適宜適切なものを選択すればよい。淡水産微細藻類用培地としては、例えば、窒素源、リン源、鉄源、微量元素（亜鉛、ホウ素、コバルト、銅、マンガン、モリブデンなど）等を含む無機塩培地が例示される。例えば、窒素源としては、アンモニウム塩、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素、アミン類等が挙げられ、リン源としては、リン酸塩、亜リン酸塩等が挙げられ、鉄源としては、塩化鉄、硫酸鉄、クエン酸鉄等が挙げられる。淡水産微細藻類用培地の具体例としては、例えば、２×Ａｌｌｅｎ培地（Allen MB. Arch. Microbiol. 1959 32:270-277.）、Ｍ−Ａｌｌｅｎ培地（Minoda A et al. Plant Cell Physiol. 2004 45: 667-71.）、ＭＡ２培地（Ohnuma M et al. Plant Cell Physiol. 2008 Jan;49(1):117-20.）等が挙げられる。なお、本明細書においては、Ｍ−Ａｌｌｅｎ培地を「ＭＡ培地」と記載することがある。
【００３８】
ナトリウムイオン濃度は、０．１〜０．４Ｍの範囲内で、後述の本培養工程におけるナトリウムイオン濃度に応じて適宜選択すればよい。より具体的には、本培養工程で予定するナトリウムイオン濃度の０．２〜０．８倍のナトリウムイオン濃度を選択することができる。ナトリウムイオン濃度は、本培養工程におけるナトリウムイオン濃度の０．５倍以上であることが好ましく、０．５〜０．７倍であることがより好ましく、０．５〜０．６倍であることがさらに好ましい。
例えば、本培養工程におけるナトリウムイオン濃度を海水と同程度（約０．５Ｍ）とする場合、前培養工程におけるナトリウムイオン濃度は０．２５Ｍ以上であることが好ましく、０．２５〜０．３５Ｍであることがより好ましく、０．２５〜０．３Ｍであることがさらに好ましい。
培地のナトリウムイオン濃度の調整は、市販のナトリウムイオン試薬を用いてもよく、食塩を用いて行ってもよい。また、天然海水、濃縮海水、人工海水等をナトリウムイオン濃度が０．１〜０．４Ｍとなるように希釈し、適宜、窒素源、リン源、鉄源、及び微量元素等を添加して用いてもよい。天然海水としては、表層水又は海洋深層水をろ過したものを使用できるほか、市販品も使用可能である。天然海水の市販品としては、例えば、ナジーム１０（伊豆１０ｍの表層海水）、及びナジーム８００（伊豆赤沢８００ｍ海洋深層水）（いずれも日本ＱＣＥ  ｂｌｕｅｌａｂ事業部）等が挙げられる。人工海水の市販品としては、例えば、ダイゴＩＭＫ培地、ダイゴ人工海水ＳＰ（いずれも日本製薬株式会社）等が挙げられる。
【００３９】
天然海水、特に海水表層に含まれる主要なイオンの濃度としては、例えば、下記の組成が知られている。この組成は海洋の表層における一般的な組成と思われ、また、地域において塩分濃度が異なることは周知である。そのため、海水の塩分濃度を定義することは困難であるが、金属イオンにおいてはナトリウムが主要な金属であることは疑いない。そこで、発明者らは、概ねナトリウムイオン濃度として０．４Ｍを超える場合は海水条件であるとした。より海水条件に近いナトリウムイオン濃度としては、０．４５Ｍ以上、さらに好ましくは０．５Ｍ以上である。
ナトリウムイオン  １．０５５６質量％
マグネシウムイオン  ０．１２７２質量％
カルシウムイオン  ０．０４００質量％
カリウムイオン  ０．０３８０質量％
ストロンチウムイオン  ０．０００８質量％
塩化物イオン  １．８９８０質量％
硫酸イオン０．２６４９質量％
臭化物イオン  ０．００６５質量％
炭酸水素イオン  ０．０１４０質量％
フッ化物イオン  ０．０００１質量％
ホウ酸  ０．００２６質量％
【００４０】
水素イオン濃度は、ｐＨ１．０〜６．０の範囲内で、淡水産微細藻類の種類に応じて適宜選択すればよい。例えば、淡水産微細藻類が、イデユコゴメ綱に属する微細藻類である場合、ｐＨ１．０〜５．０が好ましく、ｐＨ１．０〜３．０がより好ましい。
培地のｐＨ調整は、例えば、硫酸、塩酸等の無機酸、水酸化カリウム等の無機塩基等を用いて行うことができる。また、培養中のｐＨ変動を抑制するために、任意に、ｐＨ緩衝剤を培地に添加してもよい。
【００４１】
前培養工程は、淡水産微細藻類の細胞を、培地に接種することにより開始することができる。培養開始時の藻類濃度は、特に限定されないが、例えば、ＯＤ７５０＝０．０５〜０．５の細胞濁度とすることができる。「ＯＤ７５０」とは、７５０ｎｍでの吸光度を意味する。培養開始時の細胞濁度は、ＯＤ７５０＝０．０５〜０．３であることが好ましい。
【００４２】
前培養工程における温度条件は、淡水産微細藻類の種類に応じて適宜選択すればよい。一般的には、培養温度は、１５〜６０℃を例示することができ、好ましくは１５〜５０℃、さらに好ましくは３０〜５０℃である。淡水産微細藻類が、イデユコゴメ綱に属する微細藻類である場合、培養温度は３０〜５０℃が好ましい。
前培養工程における光条件は、淡水産微細藻類の種類に応じて適宜選択すればよい。一般的には、５〜２０００μｍｏｌ／ｍ２ｓを例示することができる。淡水産微細藻類が、イデユコゴメ綱に属する微細藻類である場合、５〜１５００μｍｏｌ／ｍ２ｓが好ましい。光条件は、連続光であってもよく、明暗周期（１０Ｌ：１４Ｄなど）を設けてもよい。前培養工程は、自然光下で行ってもよい。
前培養工程におけるＣＯ２条件は、淡水産微細藻類の種類に応じて適宜選択すればよい。一般的には、０．０４〜５％ＣＯ２条件を例示することができる。淡水産微細藻類が、イデユコゴメ綱に属する微細藻類である場合、０．０４〜３％ＣＯ２条件が好ましい。イデユコゴメ綱に属する微細藻類の中でも、ガルデリア属は高ＣＯ２濃度耐性が高く、１００％ＣＯ２でも生育可能であるため、淡水産微細藻類がガルデリア属に属する微細藻類である場合には、１００％ＣＯ２条件としてもよい。また、ＣＯ２条件は、大気中ＣＯ２濃度であってもよい。
【００４３】
前培養工程における培養方法は、特に限定されず、微細藻類の培養方法として一般的に用いられる方法を用いればよい。具体例としては、静置培養、通気培養（２００〜４００ｍＬ  ａｉｒ／ｍｉｎなど）、振とう培養（１００〜２００ｒｐｍなど）等が挙げられる。
【００４４】
前培養工程における培養期間は、特に限定されないが、誘導期の期間を終えて対数期にさしかかるまでの期間が必要であり、通常３日以上が必要であり、好ましくは５日以上であり、より好ましくは７日以上である。前培養工程を前記下限日数以上の期間行うことで、本培養工程における淡水産微細藻類の増殖をより良好に維持することができる。前培養期間の上限は、特に限定されないが、対数期を終えて定常期にまでさしかかるまで行うと、本培養において微細藻類の増殖を良好に維持する上で不適切である。前培養期間としては、３〜２０日が好ましく、５〜１５日がより好ましく、７〜１０日がさらに好ましい。
前培養のスケールは本培養のスケールに応じて選択することが出来る。本培養で微細藻類の育種や変異株の選択等小スケールで培養する場合は、前培養を小スケールで行うことができ、通常は、０．１〜１０００ｍＬで行われる。また、本培養で工業的に大量生産が行われる場合には、前培養を１〜１０Ｌ程度で行われる場合もある。
【００４５】
［本培養工程］
本培養工程は、前記前培養工程後の淡水産微細藻類を、ナトリウムイオン濃度が前培養工程におけるナトリウムイオン濃度の１．２〜５倍であり水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０となるように調製した培地で培養する工程である。
【００４６】
本培養工程で用いる培地は、ナトリウムイオン濃度が前記前培養工程で用いた培地の１．２〜５倍であり、ナトリウムイオン濃度で換算して０．４Ｍ以上、好ましくは０．４５Ｍ以上、より好ましくは０．５Ｍ以上のものを用いることが出来る。水素イオン濃度は、ｐＨ１．０〜６．０の培地であれば特に限定されない。例えば、一般的な淡水産微細藻類用培地に、前記濃度のナトリウムイオンを添加し、ｐＨ１．０〜６．０に調整したものを好ましく用いることができる。淡水産微細藻類用培地としては、前記「［前培養工程］」で挙げたものと同様のものが挙げられる。
【００４７】
本培養工程で用いる培地は、海水に、適宜、窒素源、リン源、鉄源、及び微量元素等を添加し、ｐＨを１．０〜６．０に調整したものであってもよい。海水は、天然海水であってもよく、人工海水であってもよく、濃縮海水を希釈したものであってもよい。天然海水及び人工海水の市販品としては、前記「［前培養工程］」で挙げたものと同様のものが挙げられる。本培養工程において、大量培養を行う場合には、天然海水を用いることでコストを抑制することができる。天然海水は、表層水であってもよく、海洋深層水であってもよい。天然海水は、ろ過等を行って、不純物を除去したものが好ましい。海水に添加する窒素源、リン源、鉄源、及び微量元素等は、淡水産微細藻類の種類に応じて適宜選択すればよい。
【００４８】
淡水産微細藻類が、イデユコゴメ綱に属する微細藻類である場合、海水に、窒素含有塩、リン含有塩及び鉄含有塩を少なくとも添加することが好ましい。
窒素含有塩としては、アンモニウム塩、硝酸塩、及び亜硝酸塩等の窒素含有無機塩類等が挙げられる。中でも、窒素含有塩としては、アンモニウム塩（硫酸アンモニウムなど）が好ましい。アンモニウム塩の海水への添加量としては、アンモニウムイオン濃度として、２０〜１００ｍＭが例示される。
リン含有塩としては、リン酸塩、及び亜リン酸塩等のリン含有無機塩類等が挙げられる。中でも、リン含有有塩としては、リン酸塩（リン酸二水素カリウムなど）が好ましい。リン酸塩の海水への添加量としては、リン酸イオン濃度として、２〜１０ｍＭが例示される。
鉄含有塩としては、塩化鉄（ＩＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩ）、クエン酸鉄（ＩＩ）及びこれらの水和物等が挙げられる。中でも、鉄含有塩としては、塩化鉄（ＩＩＩ）が好ましい。鉄含有塩の海水への添加量としては、鉄イオン濃度として、０．１〜２ｍＭが例示される。
その他、海水には、ホウ酸、マンガン、亜鉛、モリブデン、コバルト、銅等の微量元素を添加することが好ましい。
淡水産微細藻類がイデユコゴメ綱に属する微細藻類である場合、本培養工程で用いる培地の具体例としては、後述の表９に記載の「海水培地」が好ましく例示される。
【００４９】
本培養工程で用いる培地のナトリウムイオン濃度は、特に限定されないが、前記前培養工程における前記ナトリウムイオン濃度の１．１〜５倍、好ましくは１．２〜５倍であり、１．４〜２倍であることがより好ましく、１．５〜２倍であることがさらに好ましい。本培養工程で海水を利用する場合、ナトリウムイオン濃度は約０．４Ｍ以上であり、用いる微細藻類種によっては１Ｍ以下の培地が用いられる。
また、本培養工程を屋外で行う場合には、他の生物のコンタミネーションを抑制するために、０．５Ｍ以上のナトリウムイオン濃度を用いることもできる。例えば、ナトリウムイオン濃度を０．５〜１Ｍとしてもよい。
培地のナトリウムイオン濃度の調整は、前記前培養工程における培地と同様に行うことができる。
【００５０】
水素イオン濃度は、ｐＨ１．０〜６．０の範囲内で、淡水産微細藻類の種類に応じて適宜選択すればよい。例えば、淡水産微細藻類が、イデユコゴメ綱に属する微細藻類である場合、ｐＨ１．０〜５．０が好ましく、ｐＨ１．０〜３．０がより好ましい。
また、本培養工程を屋外で行う場合には、他の生物のコンタミネーションを抑制するために、より低いｐＨ（ｐＨ１．０〜２．０など）を用いることもできる。
培地のｐＨ調整は、前記前培養工程における培地と同様に行うことができる。
【００５１】
本培養工程は、前培養工程の培養液を、本培養工程における培地に接種することにより開始することができる。培養開始時の藻類濃度は、特に限定されないが、例えば、ＯＤ７５０＝０．０５〜０．５の細胞濁度とすることができる。「ＯＤ７５０」とは、７５０ｎｍでの吸光度を意味する。培養開始時の細胞濁度は、ＯＤ７５０＝０．０５〜０．３であることが好ましい。
【００５２】
本培養工程における培養スケールは、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、微細藻類の育種や変異株の選択等を行う場合は、小スケールで本培養を行うことができ、通常は、１０ｍＬ〜１０Ｌ程度で行われる。また、本培養で工業的な大量生産が行われる場合には、２０〜５０００Ｌ程度で培養を行ってもよい。５００Ｌの大量培養を行う場合には、屋外培養を行ってもよい。
【００５３】
本培養工程における温度条件、光条件、ＣＯ２条件及び培養方法は、上述の前培養条件と同様とすることができる。
また、本培養工程は、屋外で培養を行ってもよい。この場合、温度条件、光条件及びＣＯ２条件は、培養槽が設置された外部環境の条件とすることができる。本培養工程を屋外培養とした場合でも、ｐＨ１．０〜６．０の酸性条件下での培養であるため、他の生物の混入を抑制することができる。また、淡水産微細藻類として、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体を用いた場合、ｐＨ７の環境下での生存が困難であるため、屋外の培養槽から外部環境に放出された場合でも当該環境の汚染が抑制される。
【００５４】
本培養工程における培養期間は、特に限定されず、所望のバイオマス量が得られるまで培養を継続することができる。あるいは、微細藻類の生育状況を確認し、定常期となるまで培養を行ってもよい。
【００５５】
本実施形態の培養方法によれば、淡水産微細藻類を低ｐＨ及び高ナトリウムイオン濃度の培地で、培養開始時から短い誘導期で良好に増殖させることができる。そのため、屋外培養の場合であっても、他の生物の侵入を効果的に抑制することができる。また、イデユコゴメ綱に属する微細藻類（特に１倍体）は中性条件下では死滅するため、仮にイデユコゴメ綱に属する微細藻類（特に１倍体）が大量培養系から環境中に放出される場合があったとしても生物学的封じ込めが可能である。そのため、有用物質を生産する淡水産微細藻類の屋外大量培養に好適に適用することができる。
【００５６】
＜淡水産微細藻類の生産方法＞
一実施形態において、本発明は、水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍ以上となるように調製した培地で増殖可能な淡水産微細藻類の生産方法を提供する。本実施形態の淡水産微細藻類の生産方法は、ナトリウムイオン濃度が０．５Ｍ以上である培地で増殖できない淡水産微細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０〜６．０、ナトリウムイオン濃度０．１〜０．４Ｍとなるように調製した培地で培養する工程を含む。
【００５７】
本実施形態の方法で用いる淡水産微細藻類は、ナトリウムイオン濃度が０．５Ｍ以上である培地で増殖できない淡水産微細藻類である。
淡水産微細藻類が、ナトリウムイオン濃度が０．５Ｍ以上である培地で増殖できないか否かは、対象の淡水産微細藻類をナトリウムイオン濃度が０．５Ｍ以上である培地で培養し、経時的に細胞濁度（ＯＤ７５０）を測定することにより確認することができる。培養開始時から、ＯＤ７５０が上昇しない場合には、当該淡水産微細藻類は、ナトリウムイオン濃度が０．５Ｍ以上である培地で増殖できない淡水産微細藻類であると判定することができる。
また、淡水産微細藻類は、ｐＨ１．０〜６．０で増殖可能であることが好ましい。
そのような淡水産微細藻類としては、例えば、シアニジウム属に属する微細藻類の１倍体が挙げられる。シアニジウム属に属する微細藻類の１倍体の具体例としては、ＨＫＮ１株（１倍体）及びＹＦＵ３株（１倍体）が挙げられる。
【００５８】
本実施形態の方法は、前記のような淡水産微細藻類を、ナトリウムイオン濃度が０．１〜０．４ＭであるｐＨ１．０〜６．０の培地で培養する工程を含む。当該工程は、前記「＜淡水産微細藻類の培養方法＞」の「［前培養工程］」と同様に行うことができる。
【００５９】
本実施形態の方法によれば、耐塩性を有さない淡水産微細藻類に、耐塩性を付与して、塩化ナトリウ濃度が０．５Ｍ以上であるｐＨ１．０〜６．０の培地で増殖可能な淡水産微細藻類を得ることができる。当該淡水産微細藻類が生育可能な高塩濃度及び低ｐＨの環境では、他の生物の侵入が抑制される。また、イデユコゴメ綱に属する微細藻類（特に１倍体）は中性条件下では死滅するため、仮にイデユコゴメ綱に属する微細藻類（特に１倍体）が大量培養系から環境中に放出される場合があったとしても生物学的封じ込めが可能である。そのため、当該淡水産微細藻類は屋外大量培養に好適に用いることができる。
【００６０】
＜耐塩性を有するイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体＞
本発明の１実施形態に係るイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、ナトリウムイオン濃度が０．５Ｍのような高塩濃度の培地で生育するが、天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は生育ができない。しかし、本発明の１実施形態に係る培養方法により、前培養期間中に耐塩性を獲得すると、０．５Ｍのナトリウムイオン濃度の培地でも生育できるようになる。このとき、前培養期間中よりも短期間の誘導期の後、対数増殖を開始する特徴があり、この特徴はさらに培地を植え継いでも同様である。しかも、耐塩性獲得をした本発明の１倍体藻類は、ＮａＣｌを添加していないＭＡ培地に植え継ぐと、生育しないかまたは生育が不良となってしまうという特徴がある。
生育が良好かどうかについては、コントロールの培養条件と比較することによってもできるが、本発明の１実施形態においては、自己の培養初期状態の細胞数と所定期間経過する間に増大した細胞数の比の大小により検討する。具体的には式（１）により計算する。細胞数は培養液の７５０ｎｍにおける吸光度ＯＤを測定することにより求め、所定期間は７日間とし、式（１）の値が２以上の場合は生育が良好であり、２未満の場合は生育が不良であるとする。生育が不良の原因としては、環境条件に馴化するのに時間を要することや、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は強固な細胞壁を持たないために高張液の浸透圧に耐えられず細胞が破壊されて死滅していることが考えられる。細胞が破壊されていることの確認については顕微鏡で観察することが考えられるが、定量性を確保することが困難である。そのため、本発明の１実施形態においては、細胞の内容物であるフィコシアニンの量を測定することで定量的な考察を行う。
【００６１】
一実施形態において、本発明は、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体であって、水素イオン濃度ｐＨ２．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍとなるように調製したＭＡ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で７日間静置培養したときの下記式（１）で算出される値が２以上であり、ＭＡ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で７日間静置培養したときの下記式（１）で算出される値が２未満である、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体を提供する。
（培養開始７日後のＯＤ７５０値−培養開始時のＯＤ７５０値）／（７×培養開始時ＯＤ７５０値）で示される培養速度    （１）
【００６２】
「水素イオン濃度ｐＨ２．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍとなるように調製したＭＡ培地」は、実施例における表５に記載される培地（以下、「ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地」ともいう）である。本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で増殖することができる。さらに、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光の条件で、静置培養したとき、下記式（１）で算出される増殖速度が２以上になるという特徴を有する。
（培養開始７日後のＯＤ７５０値−培養開始時のＯＤ７５０値）／（７×培養開始時ＯＤ７５０値）    （１）
【００６３】
前記式（１）において、「培養開始時のＯＤ７５０値」とは、培養開始時（０時間）において波長７５０ｎｍで測定した培養液の吸光度を意味する。通常、培養開始時のＯＤ７５０値が、０．１となるように、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体をＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地に接種し、培養を開始する。前記式（１）において、「培養開始７日後のＯＤ７５０値」とは、培養開始から７日（１６８時間）後において波長７５０ｎｍで測定した培養液の吸光度を意味する。培養液の吸光度は、吸光度計で測定することができる。
培養は、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光の条件で、７日間の静置培養で行う。培養スケールは、特に限定されないが、例えば、２４穴プレートを用いて、１ｍＬの培養液で培養することができる。
【００６４】
天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で増殖することはできない。そのため、天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体をＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で培養した場合、前記式（１）で算出される値は、２未満である。しかしながら、本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、高ナトリウムイオン濃度に対する耐性を有しているため、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地でも良好に増殖することができる。したがって、本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体をＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で培養した場合、前記式（１）で算出される値が２以上となる。本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で培養したときの前記式（１）で算出される値が、３以上であることが好ましく、４以上であることがより好ましい。
【００６５】
上記特徴に加えて、本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、ＭＡ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で静置培養したとき、前記式（１）で算出される値が２未満であるという特徴を有する。ＭＡ培地は、実施例における表１に記載される培地である。通常、培養開始時のＯＤ７５０値が、０．１となるように、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体をＭＡ培地に接種し、培養を開始する。培養は、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光の条件で、７日間の静置培養で行う。培養スケールは、特に限定されないが、例えば、２４穴プレートを用いて、１ｍＬの培養液で培養することができる。
【００６６】
天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、ＭＡ培地で良好に増殖することができる。そのため、天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体をＭＡ培地で培養した場合、前記式（１）で算出される値は、通常２以上となる。しかしながら、本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、高ナトリウムイオン濃度に対する耐性を有する一方、低ナトリウムイオン濃度での増殖能力が低下する。したがって、本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体をＭＡ培地で培養した場合、前記式（１）で算出される値が２以上となる。本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、ＭＡ培地で培養したときの前記式（１）で算出される値が、１．８未満であることが好ましく、１．５未満以上であることがより好ましい。
【００６７】
本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、ＭＡ培地に懸濁したときの死滅率が、３０％以上であることが好ましく、４０％以上であることがより好ましく、５０％以上であることがさらに好ましい。前記死滅率が３０％以上であると、環境中に藻類細胞が放出されたとしても、ナトリウムイオン濃度が低い環境中では藻類細胞の生存が難しい。そのため、屋外の開放培養系で培養した場合でも、環境へのコンタミネーションが起こりにくい。
【００６８】
前記死滅率は、以下のように算出されるものである。
ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で培養を行った後、２ｍＬの前記培地に懸濁したときにＯＤ７５０＝１となる量の藻類細胞を回収し、下記の処理１〜３を行う。
処理１：ＭＡ培地２ｍＬに懸濁し、ボルテックスで１０分間振盪する。
処理２：ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地２ｍＬに懸濁し、ボルテックスで１０分間振盪する。
処理３：ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地０．１ｍＬに懸濁後、−１９６℃で凍結し、前記培地で２ｍＬとなるようにメスアップし、ボルテックスで１０分間振盪する。
【００６９】
次いで、下記式により、死滅率を算出する。
死滅率（％）＝｛（処理２後のＰＣ濃度−処理１後のＰＣ濃度）／（処理２後のＰＣ濃度−処理３後のＰＣ濃度）｝×１００
前記式中、「ＰＣ濃度」は、フィコシアニン濃度を表す。ＰＣ濃度は、処理１〜３のいずれかを行った後の懸濁液について、積分球を取り付けた分光光度計を用いて、６２０ｎｍ及び６７８ｎｍの吸光度を測定することにより求めることができる。ＰＣ濃度は、６２０ｎｍ及び６７８ｎｍの吸光度から、下記式により算出することができる。
ＰＣ濃度（μｇ／ｍｌ）＝１３８．５×Ａ６２０−３５．４９×Ａ６７８
【００７０】
本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つ以上の特徴を有することが好ましく、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか２つの特徴を有することがより好ましく、下記（ａ）〜（ｃ）の全ての特徴を有することがさらに好ましい。
（ａ）天然の前記微細藻類の１倍体と比較して、ナトリウムイオン濃度が０．５ＭであるｐＨ１．０〜６．０の培地での培養開始後７日間の増殖速度が大きい。
（ｂ）天然の前記微細藻類の１倍体と比較して、ナトリウムイオン濃度が０．０５Ｍ以下であるｐＨ１．０〜６．０の培地での培養開始後７日間の増殖速度が小さい。
（ｃ）ナトリウムイオン濃度が０．０５Ｍ以下であるｐＨ１．０〜６．０の培地での培養開始後７日間の増殖速度と比較して、ナトリウムイオン濃度が０．５ＭであるｐＨ１．０〜６．０の培地での培養開始後７日間の増殖速度が大きい。
【００７１】
「天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類」とは、自然界で生息するイデユコゴメ綱に属する微細藻類又は前記微細藻類と同様の性質を有する当該種類の微細藻類をいう。天然の微細藻類は、自然界から単離され、ナトリウムイオン濃度が０．０５Ｍ以下であるｐＨ１．０〜６．０の培地で培養することにより維持されたものであってもよい。
「天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体」とは、自然界で生息するイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体又は自然界で生息するイデユコゴメ綱に属する微細藻類の２倍体から得られた１倍体をいう。ナトリウムイオン濃度が０．０５Ｍ以下であり、ｐＨ１．０〜６．０となるように調製された培地で天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の２倍体を一定期間（例えば、１〜３週間程度）、一定条件で培養し、減数分裂した微細藻類を顕微鏡下において物理的に選択し、天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体を得ることができる。
【００７２】
イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体が、上記（ａ）の特徴を有するか否かは、当該微細藻類の１倍体と当該微細藻類と同じ種である天然の微細藻類とを、ナトリウムイオン濃度が０．５ＭであるｐＨ１．０〜６．０の培地で培養し、培養開始後７日間の増殖速度を比較することにより判定することができる。前記増殖速度が、天然の微細藻類の１倍体よりも大きい場合には、当該微細藻類が上記（ａ）の特徴を有すると判定される。
【００７３】
イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体が、上記（ｂ）の特徴を有するか否かは、当該微細藻類の１倍体と当該微細藻類と同じ種である天然の微細藻類とを、ナトリウムイオン濃度が０．０５Ｍ以下であるｐＨ１．０〜６．０の培地で培養し、培養開始後７日間の増殖速度を比較することにより判定することができる。前記増殖速度が、天然の微細藻類の１倍体よりも小さい場合には、当該微細藻類が上記（ｂ）の特徴を有すると判定される。
【００７４】
イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体が、上記（ｃ）の特徴を有するか否かは、当該微細藻類の１倍体を、ナトリウムイオン濃度が０．０５Ｍ以下であるｐＨ１．０〜６．０の培地及びナトリウムイオン濃度が０．５ＭであるｐＨ１．０〜６．０の培地で培養し、両培地における培養開始後７日間の増殖速度を比較することにより判定することができる。前記ナトリウムイオン濃度が０．５ＭであるｐＨ１．０〜６．０の培地での増殖速度が、ナトリウムイオン濃度が０．０５Ｍ以下であるｐＨ１．０〜６．０の培地での増殖速度よりも大きい場合には、当該微細藻類が上記（ｃ）の特徴を有すると判定される。
【００７５】
ナトリウムイオン濃度が０．５ＭであるｐＨ１．０〜６．０の培地、及びナトリウムイオン濃度が０．０５Ｍ以下であるｐＨ１．０〜６．０の培地としては、上記「＜淡水産微細藻類の培養方法＞」で挙げた培地と同様の培地が挙げられる。上記（ａ）〜（ｃ）における培養条件としては、例えば、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光の条件での静置培養が挙げられる。培養スケールは、特に限定されないが、例えば、２４穴プレートを用いて、１ｍＬの培養液で培養することができる。
【００７６】
本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、前記実施形態の淡水産微細藻類の生産方法により得ることができる。イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体の具体例としては、シアニディオシゾン・メロラエ、シアニジウム属する微細藻類の１倍体、及びガルデリア属に属する微細藻類の１倍体が挙げられる。シアニジウム属に属する微細藻類の１倍体の具体例としては、ＨＫＮ１株（１倍体）及びＹＦＵ３株（１倍体）が挙げられる。ガルデリア属に属する微細藻類の１倍体の具体例としては、Ｇ．  ｐａｒｔｉｔａ、及びＧ．  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ等が挙げられる。中でも、シアニジウム属に属する微細藻類又はガルデリア属に属する微細藻類の１倍体が好ましく、シアニジウム属に属する微細藻類の１倍体がより好ましく、ＨＫＮ１株（１倍体）又はＹＦＵ３株（１倍体）がさらに好ましく、ＨＫＮ１株（１倍体）が特に好ましい。
【００７７】
本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類は、ナトリウムイオン濃度が０．６Ｍ以上であるｐＨ１．０〜６．０の培地で増殖できることが好ましく、ナトリウムイオン濃度が０．７Ｍ以上であるｐＨ１．０〜６．０の培地で増殖できることがより好ましく、ナトリウムイオン濃度が０．８Ｍ以上であるｐＨ１．０〜６．０の培地で増殖できることがさらに好ましく、ナトリウムイオン濃度が０．９Ｍ以上であるｐＨ１．０〜６．０の培地で増殖できることが特に好ましい。本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類は、ナトリウムイオン濃度が１Ｍ以上であるｐＨ１．０〜６．０の培地で増殖できるものであってもよい。
【００７８】
本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類は、ナトリウムイオン濃度が０．５ＭであるｐＨ１．０〜６．０の培地で培養した後、ナトリウムイオン濃度が０．５ＭであるｐＨ１．０〜６．０の新たな培地に植え継いだ場合であっても増殖速度が維持されることが好ましい。これにより、本実施形態の微細藻類を、ナトリウムイオン濃度が０．５ＭであるｐＨ１．０〜６．０の培地で継体培養して維持することができる。また、前記のように維持した本実施形態の微細藻類を、任意の時期に、ナトリウムイオン濃度が０．５ＭであるｐＨ１．０〜６．０の培地で大量培養した場合でも、良好に増殖させることができる。
【００７９】
本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、海水と同程度のナトリウムイオン濃度で良好に増殖することができるため、海水に、窒素含有塩、リン含有塩及び鉄含有塩を少なくとも添加し、且つｐＨ１．０〜６．０に調整した培地を用いて良好に増殖させることができる。そのような培地の具体例としては、前記「＜淡水産微細藻類の培養方法＞」の「［本培養工程］」で挙げたものと同様のものが挙げられる。
【００８０】
本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、高ナトリウムイオン濃度及び低ｐＨの環境で良好に増殖することができるため、屋外大量培養に好適に用いることができる。
【実施例】
【００８１】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００８２】
（培地の調製）
表１に示す組成のＭ−Ａｌｌｅｎ培地（ＭＡ培地）を調製した。具体的には、Ａ２  Ｆe  ｓｔｏｃｋ以外の培地成分を混合し、硫酸でｐＨ２．０に調整した後、オートクレーブにより滅菌した。オートクレーブ滅菌後、フィルター滅菌した４ｍＬのＡ２  Ｆｅ  ｓｔｏｃｋを添加し、ＭＡ培地とした。
表２及び表３に、Ａ２  ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ及びＡ２  Ｆｅ  ｓｔｏｃｋの組成をそれぞれ示す。【００８３】
【表１】
2020071444.tif 000003
【００８４】
【表２】
2020071444.tif 000004
【００８５】
【表３】
2020071444.tif 000005
【００８６】
ＭＡ培地に、０．３Ｍ  ＮａＣｌを加えて、ＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地を調製した。また、ＭＡ培地に、０．５Ｍ  ＮａＣｌを加えて、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地を調製した。ＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地及びＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地の組成を表４及び表５にそれぞれ示す。表４及び表５中のＡ２  ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ及びＡ２  Ｆｅ  ｓｔｏｃｋは、それぞれ表２及び表３に示すものである。【００８７】
【表４】
2020071444.tif 000006
【００８８】
【表５】
2020071444.tif 000007
【００８９】
以下の実施例において、前記培地を前培養又は本培養に用いる場合、各培地を下記のように表記する場合がある。
前培養に用いる場合
ＭＡ培地：培地（Ａ）
ＭＡ＋０．３M  ＮａＣｌ培地：培地（Ｂ）
ＭＡ＋０．５M  ＮａＣｌ培地：培地（Ｃ）
本培養に用いる場合
ＭＡ培地：培地（ａ）
ＭＡ＋０．３M  ＮａＣｌ培地：培地（ｂ）
ＭＡ＋０．５M  ＮａＣｌ培地：培地（ｃ）【００９０】
（生育状況の測定）
微細藻類の生育状況は、細胞濁度（ＯＤ７５０）により確認した。具体的には、吸光度計（ＢＩＯ−ＲＡＤ  社のＳｍａｒｔＳｐｅｃ  Ｐｌｕｓ）を用いて、藻類培養液の７５０ｎｍにおける吸光度を測定し、細胞濁度（ＯＤ７５０）を求めた。【００９１】
（培養方法）
シアニジウム・エスピー  ＨＫＮ１の培養は、前培養も本培養もともに、特に断りのない限り、ＣＯ２インキュベーター内での、静置培養により行った。培養温度は４２℃とし、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光を用い、ＣＯ２濃度は２％とした。特に断りのない限り、培養は、２４穴プレートで、１ｍＬの培養液で行った。
シアニディオシゾン・メロラエ  １０Ｄの培養は、前培養も本培養もともに、特に断りのない限り、通気培養（３００ｍＬ  ａｍｂｉｅｎｔ  ａｉｒ／ｍｉｎ）により行った。培養温度は４２℃とし、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光を用いた。特に断りのない限り、培養は、２４穴プレートで、１ｍＬの培養液で行った。
シアニジウム・エスピー  ＨＫＮ１及びシアニディオシゾン・メロラエ  １０Ｄのいずれも、前培養開始時及び本培養開始時の細胞濁度は、ＯＤ７５０＝０．１となるようにした。特に断りのない限り、培養は、２４穴プレートで、１ｍＬの培養液で行った。【００９２】
（ポリリン酸の定性分析）
ポリリン酸の存在については次のようにＤＡＰＩ染色により観察した。
培養液に最終濃度１％（ｗ／ｖ）になる様にｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅを加えた後に、最終濃度が３μｇ／ｍＬになる様にＤＡＰＩを加え、蛍光顕微鏡で観察した。【００９３】
（液胞の定性分析）
液胞の存在については次のようにキナクリン染色により観察した。
培養液に最終濃度が１００ｍＭになる様に１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）緩衝液を加えた後に、最終濃度が４０μｇ／ｍＬになる様にキナクリンを加え、１５分間、室温で静置した。遠心後（１５００ｇ、５分）、上澄みを捨て、沈殿にＭＡ培地を加え、３７℃で３０分静置し、蛍光顕微鏡で観察した。【００９４】
［実施例１］
シアニジウム・エスピー  ＨＫＮ１（１倍体）（以下、「ＨＫＮ１（１倍体）」と略記する場合がある）を、ＭＡ培地（培地（Ａ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、培地（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）を用いて７日間静置培養した（本培養）。本培養中、経時的に培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（１倍体）の生育状況を確認した。
また、ＨＫＮ１（１倍体）をＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ（培地（Ｂ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、培地（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）を用いて７日間静置培養した（本培養）。本培養中、経時的に培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（１倍体）の生育状況を確認した。
結果を表６及び図１に示す。図１は、表１に示すＯＤ７５０の変化をグラフにしたものである。【００９５】
【表６】
2020071444.tif 000008
【００９６】
表６及び図１に示すように、前培養が培地（Ａ）であった場合、本培養が培地（ａ）及び培地（ｂ）のときには同様の増殖を示したが、本培養が培地（ｃ）のときには増殖しなかった。
一方、前培養が培地（Ｂ）であった場合、本培養が培地（ｃ）のときでも、上記培地（ａ）及び培地（ｂ）の場合と同様の増殖を示した。【００９７】
［実施例２］
天然海水としてナジーム１０（表層の海水：日本ＱＣＥ  ｂｌｕｅｌａｂ事業部）を使用した。ＭＡ培地の成分をそれぞれ海水（ナジーム１０）に添加して、ＨＫＮ１（１倍体）を培養し、ＭＡ培地中のどの成分がＨＫＮ１（１倍体）の生育に寄与するのかを確認した。
本培養に用いた培地を表７〜８に示す。ナジーム１０に、表７〜８に示すＭＡ培地成分を添加して、硫酸でｐＨ２．０に調整し、培地１〜１７を調製した。なお、マグネシウム及びカルシウムは、海水中に豊富に存在するため、培地１〜１６では、ＭｇＳＯ４及びＣａＣｌ２を添加しなかった。培地１７は、ポジティブコントロールとして、ＭＡ培地相当のＭｇＳＯ４及びＣａＣｌ２を添加した。【００９８】
ＨＫＮ１（１倍体）を培地（Ｂ）で１週間、前培養した後、培地１〜１７のいずれかの培地で１０日間、本培養を行った。本培養１０日後、培地のＯＤ７５０を測定し、ＨＫＮ１（１倍体）の生育状況を確認した。結果を表７〜８に示す。【００９９】
【表７】
2020071444.tif 000009
【０１００】
【表８】
2020071444.tif 000010
【０１０１】
表７〜８に示すように、培地１６及び培地１７は同等の増殖を示した。これらの結果から、海水に、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ａ２  Ｆｅ  ｓｔｏｃｋ、及びＡ２  ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌ  ｅｌｅｍｅｎｔを添加することにより、ＨＫＮ１（１倍体）の生育に適した海水培地として使用できることが確認できた。
上記培地１６の組成を表９に示す。以下の実施例で「海水培地」と表記するものは、表９に示す組成の培地である。表９中のＡ２  ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ及びＡ２  Ｆｅ  ｓｔｏｃｋは、それぞれ表２及び表３に示すものである。【０１０２】
【表９】
2020071444.tif 000011
【０１０３】
［実施例３］
ＨＫＮ１（１倍体）をＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地（培地（Ｂ））で１週間前培養し、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地（ポジティブコントロール）（培地（ｃ））又は海水培地で、７日間、本培養した。本培養中、経時的に培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（１倍体）の生育状況を確認した。
結果を表１０及び図２に示す。図２は、表１０に示すＯＤ７５０の変化をグラフにしたものである。【０１０４】
【表１０】
2020071444.tif 000012
【０１０５】
表１０及び図２に示すように、ＨＫＮ１（１倍体）は、培地（ｃ）及び海水培地のいずれの培地で本培養を行った場合でも同等の増殖を示した。【０１０６】
［実施例４］
ＨＫＮ１（１倍体）の生育に及ぼすｐＨの影響を確認するために、ｐＨをｐＨ２〜７の間で変化させた海水培地をそれぞれ用意した。ｐＨの調製は、硫酸又は水酸化カリウムを用いて行った。
ＨＫＮ１（１倍体）をＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ（培地（Ｂ））で１週間前培養し、上述のようにｐＨを調整した各海水培地で、７日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（１倍体）の生育状況を確認した。
結果を表１１、及び図３に示す。図３は、表１１に示すＯＤ７５０をグラフにしたものである。【０１０７】
【表１１】
2020071444.tif 000013
【０１０８】
表１１及び図３に示すように、ＨＫＮ１（１倍体）は、ｐＨ６以下では増殖できるが、ｐＨ７では増殖できなかった。なお、一般的に、アンモニアを窒素源とする培地で藻類を増殖させると、藻類の増殖に伴いｐＨが低下するため、緩衝剤やアルカリ性物質を加えてｐＨを中性付近に維持する必要がある。しかしながら、好酸性のＨＫＮ１（１倍体）でｐＨ調整の必要はなかった。【０１０９】
［実施例５］
シアニジウム・エスピー  ＨＫＮ１（２倍体）（以下、「ＨＫＮ１（２倍体）」と略記する場合がある）を、ＭＡ培地（培地（Ａ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、培地（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）を用いて７日間静置培養した（本培養）。本培養中、経時的に培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（２倍体）の生育状況を確認した。
また、ＨＫＮ１（２倍体）をＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ（培地（Ｂ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、培地（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）を用いて７日間静置培養した（本培養）。本培養中、経時的に培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（２倍体）の生育状況を確認した。
結果を表１２及び図４に示す。図４は、表１２に示すＯＤ７５０の変化をグラフにしたものである。【０１１０】
【表１２】
2020071444.tif 000014
【０１１１】
表１２及び図４に示すように、ＨＫＮ１（２倍体）は、培地（Ａ）及び培地（Ｂ）のいずれの培地で前培養を行った場合でも、培地（ａ）、培地（ｂ）及び培地（ｃ）の本培養で同等の増殖速度を示した。【０１１２】
［実施例６］
ＨＫＮ１（２倍体）をＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地（培地（Ｂ））で１週間前培養し、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地（ポジティブコントロール）（培地（ｃ））又は海水培地で、７日間、本培養した。本培養中、経時的に培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（２倍体）の生育状況を確認した。
結果を表１３及び図５に示す。図５は、表１３に示すＯＤ７５０の変化をグラフにしたものである。【０１１３】
【表１３】
2020071444.tif 000015
【０１１４】
表１３及び図５に示すように、ＨＫＮ１（２倍体）は、培地（ｃ）及び海水培地のいずれの培地で本培養を行った場合でも同等の増殖速度を示した。【０１１５】
［実施例７］
シアニディオシゾン・メロラエ  １０Ｄ（以下、「１０Ｄ）」と略記する場合がある）を、ＭＡ培地（培地（Ａ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、培地（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）を用いて７日間静置培養した（本培養）。本培養中、経時的に培地のＯＤ７５０を測定して、１０Ｄの生育状況を確認した。
また、１０ＤをＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ（培地（Ｂ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、培地（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）を用いて７日間静置培養した（本培養）。本培養中、経時的に培地のＯＤ７５０を測定して、１０Ｄの生育状況を確認した。
結果を表１４及び図６に示す。図６は、表１４に示すＯＤ７５０の変化をグラフにしたものである。【０１１６】
【表１４】
2020071444.tif 000016
【０１１７】
表１４及び図６に示すように、１０Ｄは、前培養が培地（Ａ）であった場合、本培養が培地（ａ）及び培地（ｂ）のときには同様の増殖を示した。一方、本培養が培地（ｃ）のときには、本培養３日までは徐々にＯＤ７５０が低下したが、５日目に回復し、その後は培地（ａ）及び培地（ｂ）と同等の増殖速度を示した。
一方、前培養が培地（Ｂ）であった場合、本培養が培地（ｃ）のときでも、培養開始時から、上記培地（ａ）及び培地（ｂ）の場合と同様の増殖を示した。【０１１８】
［実施例８］
１０ＤをＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地（培地（Ｂ））で１週間前培養し、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地（ポジティブコントロール）（培地（ｃ））又は海水培地で、７日間、本培養した。本培養中、経時的に培地のＯＤ７５０を測定して、１０Ｄの生育状況を確認した。
結果を表１５及び図７に示す。図７は、表１５に示すＯＤ７５０の変化をグラフにしたものである。【０１１９】
【表１５】
2020071444.tif 000017
【０１２０】
表１５及び図７に示すように、１０Ｄは、培地（ｃ）及び海水培地のいずれの培地で本培養を行った場合でも同等の増殖速度を示した。【０１２１】
［実施例９］
ＭＡ培地で１週間培養したＨＫＮ１（１倍体）を、ＯＤ７５０＝０．１となるようにＭＡ培地に移植して、７日間、ＣＯ２インキュベーター内（２％ＣＯ２）で静置培養し、ＨＫＮ１（１倍体）のＭＡ培地培養品とした。  ＭＡ培地で１週間培養したＨＫＮ１（１倍体）を、ＭＡ培地＋０．３Ｍ  ＮａＣｌで１週間前培養した後、ＭＡ培地＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地に移植し、７日間、ＣＯ２インキュベーター内（２％ＣＯ２）で静置培養した。これを、ＭＡ培地＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地培養品とした。
ＭＡ培地で１週間培養したＨＫＮ１（１倍体）を、ＭＡ培地＋０．３Ｍ  ＮａＣｌで１週間前培養した後、海水培地に移植し、７日間、ＣＯ２インキュベーター内（２％ＣＯ２）で静置培養した。これを海水培地培養品とした。
各培地培養品について、ＤＡＰＩによりポリリン酸の定性分析を、キナクリンにより液胞の定性分析を行った。
結果を図８に示す。
ＭＡ培地培養品、ＭＡ培地＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地培養品、海水培地培養品をＤＡＰＩで染色したところ、ＭＡ培地培養品にのみポリリン酸が認められた。ポリリン酸が存在すると言われる液胞をキナクリンで染色したところ、液胞の染色のされ方に違いはなかった。【０１２２】
［実施例１０］
藻類としてＨＫＮ１（２倍体）を用いたこと以外は実施例９と同様にして培養して、ＭＡ培地培養品、ＭＡ培地＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地培養品、及び海水培地培養品の３種類の培養品を製造した。それぞれ、実施例９と同様に、ＤＡＰＩによりポリリン酸の定性分析を、キナクリンにより液胞の定性分析を行った。
結果を図９に示す。ＭＡ培地培養品にはポリリン酸が確認できなかったが、ＭＡ培地＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地培養品および海水培地培養品では、表層付近を中心にポリリン酸が観察された。また、ポリリン酸が存在すると言われる液胞はいずれの培養品も同様に観察された。【０１２３】
［実施例１１］
１０Ｄを、ＭＡ培地（培地（Ａ））又はＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ（培地（Ｂ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、ＮａＣｌ濃度を０〜１０００ｍＭの間で変化させたＭＡ培地で、７日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、１０Ｄの生育状況を確認した。結果を表１６に示す。
また、培地（Ｂ）での前培養後、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））で１０Ｄを７日間本培養して得られた藻類細胞を、ＭＡ培地（培地（ａ））又はＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））に植え継ぎ、さらに７日間培養した。培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、１０Ｄの生育状況を確認した。結果を表１７に示す。【０１２４】
本培養開始時及び植え継ぎ時の培地のＯＤ７５０は０．１となるようにした。以下の実施例１２〜１７でも同様とした。表１７中、「式（１）−（Ａ）」は、培地（Ａ）で前培養した後、表に示すＮａＣｌ濃度で本培養した微細藻類の式（１）で算出した値を示す。「式（１）−（Ｂ）」は、培地（Ｂ）で前培養した後、表に示すＮａＣｌ濃度で本培養した微細藻類の式（１）で算出した値を示す。以下、実施例１２〜１７でも同様である。ＯＤ７５０が＜０．１であるものは、式（１）で値を算出できないため、「−」とした。【０１２５】
【表１６】
2020071444.tif 000018
【０１２６】
【表１７】
2020071444.tif 000019
【０１２７】
表１６に示すように、培地（Ｂ）で前培養したものでは、培地（Ａ）で前培養したものと比較して、ＮａＣｌ  ０ｍＭの培地で本培養した場合の増殖が抑制された。一方、５００ｍＭ以上の高ＮａＣｌ濃度では、培地（Ａ）で前培養したものでは、増殖が認められなかったのに対し、培地（Ｂ）で前培養したものでは５００ｍＭの高塩濃度でも増殖が確認された。【０１２８】
表１７に示すように、培地（ｃ）で本培養した後、培地（ａ）に植え継いだものでは増殖が抑制されたが、培地（ｃ）に植え継いだものでは、良好な増殖が見られた。
また、培地（ｃ）で本培養して得られた藻類細胞は、培養液を遠心後に藻類細胞を回収し、ｐＨ７の蒸留水に投入したところ、細胞が破裂することが確認された。  【０１２９】
［実施例１２］
ＨＫＮ１（１倍体）を、ＭＡ培地（培地（Ａ））又はＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ（培地（Ｂ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、ＮａＣｌ濃度を０〜１０００ｍＭの間で変化させたＭＡ培地で、７日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（１倍体）の生育状況を確認した。結果を表１８に示す。【０１３０】
また、培地（Ｂ）での前培養後、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））でＨＫＮ１（１倍体）を７日間本培養して得られた藻類細胞を、ＭＡ培地（培地（ａ））又はＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））に植え継ぎ、さらに７日間培養した。培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（１倍体）の生育状況を確認した。結果を表１９に示す。【０１３１】
【表１８】
2020071444.tif 000020
【０１３２】
【表１９】
2020071444.tif 000021
【０１３３】
表１８に示すように、培地（Ｂ）で前培養したものでは、ＮａＣｌ  ０ｍＭの培地で本培養した場合の増殖が認められなかった。一方、４００ｍＭ以上の高ＮａＣｌ濃度では、培地（Ａ）で前培養したものでは、増殖が認められなかったのに対し、培地（Ｂ）で前培養したものでは４００ｍＭ以上の高塩濃度でも増殖が確認された。  【０１３４】
表１９に示すように、培地（ｃ）で本培養した後、培地（ａ）に植え継いだものでは増殖が抑制されたが、培地（ｃ）に植え継いだものでは、良好な増殖が見られた。【０１３５】
［実施例１３］
ＨＫＮ１（２倍体）を、ＭＡ培地（培地（Ａ））又はＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ（培地（Ｂ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、ＮａＣｌ濃度を０〜１０００ｍＭの間で変化させたＭＡ培地で、７日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（２倍体）の生育状況を確認した。結果を表２０に示す。【０１３６】
また、培地（Ｂ）での前培養後、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））でＨＫＮ１（２倍体）を７日間本培養して得られた藻類細胞を、ＭＡ培地（培地（ａ））又はＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））に植え継ぎ、さらに７日間培養した。培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（２倍体）の生育状況を確認した。結果を表２１に示す。【０１３７】
【表２０】
2020071444.tif 000022
【０１３８】
【表２１】
2020071444.tif 000023
【０１３９】
表２０に示すように、培地（Ｂ）で前培養したものでは、培地（Ａ）で前培養したものと比較して、ＮａＣｌ低濃度の培地で本培養した場合の増殖が若干抑制される傾向にあった。一方、８００ｍＭ以上の高ＮａＣｌ濃度では、培地（Ａ）で前培養したものでは、増殖が認められなかったのに対し、培地（Ｂ）で前培養したものでは８００ｍＭ以上の高塩濃度でも増殖が確認された。【０１４０】
表２１に示すように、培地（ｃ）で本培養した後、培地（ａ）に植え継いだもの及び培地（ｃ）に植え継いだもののいずれも、良好な増殖が見られた。【０１４１】
［実施例１４］
Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｐａｒｔｉｔａ  （ＮＢＲＣ  １０２７５９）（１倍体）を、ＭＡ培地（培地（Ａ））又はＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ（培地（Ｂ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、ＮａＣｌ濃度を０〜１０００ｍＭの間で変化させたＭＡ培地で、７日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、Ｇ．  ｐａｒｔｉｔａ（１倍体）の生育状況を確認した。結果を表２２に示す。【０１４２】
また、培地（Ｂ）での前培養後、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））でＧ．  ｐａｒｔｉｔａ（１倍体）を７日間本培養して得られた藻類細胞を、ＭＡ培地（培地（ａ））又はＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））に植え継ぎ、さらに７日間培養した。培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、Ｇ．  ｐａｒｔｉｔａ（１倍体）の生育状況を確認した。結果を表２３に示す。【０１４３】
【表２２】
2020071444.tif 000024
【０１４４】
【表２３】
2020071444.tif 000025
【０１４５】
表２２に示すように、培地（Ｂ）で前培養したものでは、培地（Ａ）で前培養したものと比較して、ＮａＣｌ  ０ｍＭの培地で本培養した場合の増殖が抑制された。一方、７００ｍＭ以上の高ＮａＣｌ濃度では、培地（Ｂ）で前培養したものは、培地（Ａ）で前培養したものと比較して、増殖抑制率が低かった。【０１４６】
表２３に示すように、培地（ｃ）で本培養した後、培地（ａ）に植え継いだものでは増殖が抑制されたが、培地（ｃ）に植え継いだものでは、良好な増殖が見られた。【０１４７】
［実施例１５］
Ｇ．  ｐａｒｔｉｔａ（２倍体）を、ＭＡ培地（培地（Ａ））又はＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ（培地（Ｂ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、ＮａＣｌ濃度を０〜１０００ｍＭの間で変化させたＭＡ培地で、７日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、Ｇ．  ｐａｒｔｉｔａ（２倍体）の生育状況を確認した。結果を表２４に示す。【０１４８】
また、培地（Ｂ）での前培養後、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））でＧ．  ｐａｒｔｉｔａ（２倍体）を７日間本培養して得られた藻類細胞を、ＭＡ培地（培地（ａ））又はＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））に植え継ぎ、さらに７日間培養した。培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、Ｇ．  ｐａｒｔｉｔａ（２倍体）の生育状況を確認した。結果を表２５に示す。【０１４９】
【表２４】
2020071444.tif 000026
【０１５０】
【表２５】
2020071444.tif 000027
【０１５１】
表２４に示すように、培地（Ｂ）で前培養したものでは、培地（Ａ）で前培養したものと比較して、高ＮａＣｌ濃度の培地での増殖が向上する傾向があった。【０１５２】
表２５に示すように、培地（ｃ）で本培養した後、培地（ａ）に植え継いだもの及び培地（ｃ）に植え継いだもののいずれも、良好な増殖が見られた。【０１５３】
［実施例１６］
Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（ＳＡＧ１０８．７９）（１倍体）を、ＭＡ培地（培地（Ａ））又はＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ（培地（Ｂ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、ＮａＣｌ濃度を０〜１０００ｍＭの間で変化させたＭＡ培地で、７日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、Ｇ．  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（１倍体）の生育状況を確認した。結果を表２６に示す。【０１５４】
また、培地（Ｂ）での前培養後、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））でＧ．  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（１倍体）を７日間本培養して得られた藻類細胞を、ＭＡ培地（培地（ａ））又はＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））に植え継ぎ、さらに７日間培養した。培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、Ｇ．  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（１倍体）の生育状況を確認した。結果を表２７に示す。【０１５５】
【表２６】
2020071444.tif 000028
【０１５６】
【表２７】
2020071444.tif 000029
【０１５７】
表２６に示すように、培地（Ｂ）で前培養したものでは、培地（Ａ）で前培養したものと比較して、ＮａＣｌ  ０ｍＭの培地で本培養した場合の増殖が抑制された。一方、７００ｍＭ以上の高ＮａＣｌ濃度では、培地（Ａ）で前培養したものでは、増殖が認められなかったのに対し、培地（Ｂ）で前培養したものでは７００ｍＭ以上の高塩濃度でも増殖が確認された。【０１５８】
表２７に示すように、培地（ｃ）で本培養した後、培地（ａ）に植え継いだものでは増殖が抑制されたが、培地（ｃ）に植え継いだものでは、良好な増殖が見られた。【０１５９】
［実施例１７］
Ｇ．  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（２倍体）を、ＭＡ培地（培地（Ａ））又はＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ（培地（Ｂ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、ＮａＣｌ濃度を０〜１０００ｍＭの間で変化させたＭＡ培地で、７日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、Ｇ．  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（２倍体）の生育状況を確認した。結果を表２８に示す。【０１６０】
また、培地（Ｂ）での前培養後、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））でＧ．  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（２倍体）を７日間本培養して得られた藻類細胞を、ＭＡ培地（培地（ａ））又はＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））に植え継ぎ、さらに７日間培養した。培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、Ｇ．  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（２倍体）の生育状況を確認した。結果を表２９に示す。【０１６１】
【表２８】
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【０１６２】
【表２９】
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【０１６３】
表２８に示すように、培地（Ｂ）で前培養したものでは、培地（Ａ）で前培養したものと比較して、高ＮａＣｌ濃度の培地での増殖が向上する傾向があった。【０１６４】
表２９に示すように、培地（ｃ）で本培養した後、培地（ａ）に植え継いだもの及び培地（ｃ）に植え継いだもののいずれも、良好な増殖が見られた。【０１６５】
上記の結果を総合すると、１倍体の淡水産微細藻類では、０．３ＭのＮａＣｌ濃度で前培養を行うことにより、０ＭのＮａＣｌで前培養したときと比較して、０．５Ｍ以上のＮａＣｌ濃度で本培養したときの増殖が向上することが確認された。これにより、前記式（１）で算出される値が２以上となった。また、０．３Ｍ以上のＮａＣｌ濃度で培養を行った後は、０ＭのＮａＣｌで前培養したときと比較して、０ＭのＮａＣｌ濃度での増殖が抑制されることが確認された。また、０．３ＭのＮａＣｌ濃度で前培養を行うことにより、０ＭのＮａＣｌ濃度の培地での増殖速度よりも、０．５ＭのＮａＣｌ濃度の培地での増殖速度が上昇する傾向にあった。また、０．５ＭのＮａＣｌ濃度で本培養した後、０．５ＭのＮａＣｌ濃度の培地への植え継ぎが可能なことも確認された。
また、０．３ＭのＮａＣｌ濃度で前培養を行うことにより、１倍体の淡水産微細藻類でも、５００〜１０００ｍＭの高ＮａＣｌ濃度の範囲で増殖可能であることが確認された。屋外培養を想定した場合、水の蒸発や、雨水の流入により、培養中に塩濃度が変動することが考えられる。上記の結果より、０．３ＭのＮａＣｌ濃度で前培養したイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、塩濃度の変動に対する寛容性を示し、屋外培養に十分耐えることが示された。【０１６６】
［実施例１８］
ＨＫＮ１（１倍体）を、ＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地（培地（Ｂ））で７日間前培養した後、さらに海水培地で１週間前培養した。次いで、前記のＨＫＮ１（１倍体）を、１０Ｌの海水培地に植え継いで本培養を行った。本培養は、ビニールハウス中で行い、光、温度及びＣＯ２濃度の制御は行わなかった。本培養は、通気培養で行い、培養期間は、２０１９年５月１３日〜２０１９年７月１日とした。定期的に培養液をサンプリングし、７５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図１０に示す。
図１０に示すように、１０Ｌのスケールでも、海水培地で良好に増殖できることが確認された。【０１６７】
［実施例１９］
ＨＫＮ１（１倍体）を、ＭＡ培地、ＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地、又はＭＡ＋０．５  ＮａＣｌ培地で７日間培養した。２ｍＬの培地に懸濁したときに、ＯＤ７５０＝１となる量の藻類細胞を含む培養液を３本のマイクロチューブに回収した。培養液の遠心分離（１５００×ｇ、５分）を行い、上清を除去し、ペレットを回収した。ペレットとして回収した各藻類細胞を、下記処理１〜３のいずれかで処理した。
処理１：ＭＡ培地２ｍＬに懸濁し、ボルテックスで１０分間振盪した。
処理２：前記培養に用いた培地と同じ培地２ｍＬに懸濁し、ボルテックスで１０分間振盪した。
処理３：前記培養に用いた培地と同じ培地０．１ｍＬに懸濁後、−１９６℃で凍結し、前記培養に用いた培地と同じ培地で２ｍＬとなるようにメスアップし、ボルテックスで１０分間振盪した。【０１６８】
藻類細胞が壊れると、細胞内容物が培地中に放出され、フィコシアニン（ＰＣ）が酸性の培地に晒されて退色する。凍結処理（処理３）により、藻類細胞が１００％死滅すると仮定し、下記式により処理１による藻類細胞の死滅率を算出した。【０１６９】
死滅率（％）＝｛（処理２後のＰＣ濃度−処理１後のＰＣ濃度）／（処理２後ＰＣ濃度−処理３後のＰＣ濃度）｝×１００【０１７０】
ＰＣ濃度は、積分球（ＩＳＲ−２６００Ｐｌｕｓ；島津製作所）を取り付けた分光光度計（ＵＶ−２６００；島津製作所）を用いて、６２０ｎｍ及び６７８ｎｍの吸光度を測定することにより測定した。ＰＣ濃度は、以下の式により算出した。
ＰＣ濃度（μｇ／ｍｌ）＝１３８．５×A６２０−３５．４９×A６７８【０１７１】
結果を表３０に示す。【０１７２】
【表３０】
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【０１７３】
表３０に示すように、ＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地又はＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で培養した藻類細胞は、ＭＡ培地への再懸濁により細胞が壊れやすくなっていることが確認された。【０１７４】
［実施例２０］
ＨＫＮ１（１倍体）に替えて１０Ｄを用いたこと以外は、実施例１９と同様の方法で、前記処理１による藻類細胞の死滅率を算出した。その結果を表３１に示す。【０１７５】
【表３１】
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【０１７６】
表３１に示すように、ＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地又はＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で培養した藻類細胞は、ＭＡ培地への再懸濁により細胞が壊れやすくなっていることが確認された。また、ＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地で培養した藻類細胞に比べて、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で培養した藻類細胞の方が、死滅率が高くなった。【０１７７】
［実施例２１］
ＨＫＮ１（１倍体）に替えてＧ．  ｐａｒｔｉｔａ（１倍体）を用いたこと以外は、実施例１９と同様の方法で、前記処理１による藻類細胞の死滅率を算出した。その結果を表３２に示す。【０１７８】
【表３２】
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【０１７９】
表３２に示すように、ＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地又はＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で培養した藻類細胞は、ＭＡ培地への再懸濁により細胞が壊れやすくなっていることが確認された。また、ＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地で培養した藻類細胞に比べて、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で培養した藻類細胞の方が、死滅率が高くなった。【０１８０】
［実施例２２］
ＨＫＮ１（１倍体）に替えてＧ．  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（１倍体）を用いたこと以外は、実施例１９と同様の方法で、前記処理１による藻類細胞の死滅率を算出した。その結果を表３３に示す。【０１８１】
【表３３】
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【０１８２】
表３３に示すように、ＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地又はＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で培養した藻類細胞は、ＭＡ培地への再懸濁により細胞が壊れやすくなっていることが確認された。また、ＭＡ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ培地で培養した藻類細胞に比べて、ＭＡ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ培地で培養した藻類細胞の方が、死滅率が高くなった。
【産業上の利用可能性】
【０１８３】
本発明によれば、低ｐＨ且つ高ナトリウムイオン濃度環境下で淡水産微細藻類を良好に増殖させることができる淡水産微細藻類の培養方法、低ｐＨ且つ高ナトリウムイオン濃度環境下で良好に増殖可能な淡水産微細藻類、及び当該淡水産微細藻類の生産方法が提供される。
本発明によれば、安価に入手できる海水により淡水酸微細藻類を大量に培養することができるので、藻類を利用した有用物質の生産に有用である。さらに、淡水酸微細藻類が大量に培養されれば、それによって大気中の二酸化炭素を吸収することも期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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