(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン、ナイロンまたはニトロセルロースのシート、メッシュまたはスポンジ状の培養基材を、アルブミン、血清タンパク、スキムミルク及びゼラチンからなる群から選択されるタンパク質を用いて、支持体に接着してなる培養基。
【請求項２】
支持体が、プラスチック、ガラス、セラミックス、金属、布のマイクロプレート、カルチャーディッシュ、カルチャーフラスコ、スライドグラス、板である、請求項１記載の培養基。
【請求項３】
アルブミン、血清タンパク、スキムミルク及びゼラチンからなる群から選択されるタンパク質を含む水性液体を施した支持体表面に、コラーゲン、ナイロンまたはニトロセルロースのシート、メッシュまたはスポンジ状の培養基材を載せたのち、乾燥することを特徴とする培養基の調製方法。
【請求項４】
支持体が、プラスチック、ガラス、セラミックス、金属、布のマイクロプレート、カルチャーディッシュ、カルチャーフラスコ、スライドグラス、板である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
タンパク質を含む水性液体が、タンパク質を０．３〜１０．０％含有し、溶媒が、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水または培養液である、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
タンパク質を含む水性液体が、タンパク質を０．３〜１０．０％含有するタンパク質溶液であって、当該溶液の溶媒が、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水または培養液である、請求項３〜５のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動物、昆虫および植物の細胞または組織培養法において培養のために使われる各種の培養基材を、支持体に接着し、培養基材が予め接着された培養基を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、動物、昆虫および植物の細胞または組織の培養は、培養容器としては、９６穴、２４穴、１２穴または６穴のマイクロカルチャープレート；直径３．５cm、６cmまたは１０cmのカルチャーディッシュ；容量３０ml、５０ml、２５０ml、６５０mlまたは９００mlのカルチャーフラスコ等を用い、これらの容器中に培養液を満たし、動物、昆虫および植物の細胞または組織を浮遊ないしは付着させて行われている。
【０００３】
最近では、これらの細胞または組織を培養液中に直接浮遊ないしは付着させるのではなく、コラーゲン、ナイロンまたはニトロセルロース製のシート、メッシュ、ゲルまたはスポンジ等の培養基材上にのせ、これを培地中に浮かせて培養する方法が開発されている。
【０００４】
しかしながら、これらの培養基材は、固定されていない状態であるため、培養中の振動等により、動物、昆虫および植物の細胞または組織が培養基材から落下してしまい、培養に失敗することがしばしば起きている。
【０００５】
培養基材を培養基に固定する方法としては、有機溶媒系の接着剤または熱溶解による方法がある。しかし、有機溶媒系の接着剤による接着では、有機溶媒系の接着剤から出る毒性物質のためにしばしば組織が破壊されることがあり、また、熱溶解による方法は、素材によっては接着できないものもある等の難点があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、培養中の振動等により動物、昆虫および植物の細胞または組織が培養基材から落下することによる培養の失敗を防止するために、これらの培養細胞または組織に対して実質的に毒性を示さず、熱によらない方法により、培養基材が予め接着された培養基、およびその調製方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、特定のタンパク質が培養基と培養基材との間の接着作用を有することを発見し、その接着作用を利用して培養基と培養基材とを接着させることにより上記の問題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、培養基材を、タンパク質を用いて、支持体に接着してなる培養基を提供する。又、本発明は、タンパク質溶液を施した支持体表面に培養基材を載せたのち、乾燥することを特徴とする培養基の調製方法を提供する。
【０００９】
より詳細には、本発明は、動物、昆虫および植物の細胞または組織に対して実質的に毒性を示さないタンパク質を接着剤として用いて、培養基材を接着することを特徴とする、培養基材が予め接着された細胞または組織培養容器およびその調製方法を提供する。
【００１０】
本発明によれば、培養すべき細胞または組織に対して実質的に毒性を示さず、熱によらない接着法で培養基材を支持体に固定し、培養基材からこれらの細胞または組織が落下するのを防止することが可能になる。
【００１１】
本発明により使用されるタンパク質としては、アルブミン、血清タンパク、スキムミルク、ゼラチンが挙げられる。これらのタンパク質を、０．３〜１０．０％の水性液体又は溶液として用いることができる。溶媒としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、培養液等が挙げられる。好ましくは０．５〜３％の水性液体又は溶液であり、特に、１％ゼラチン溶液が、価格的に安く、かつ接着力がよい。この溶液は、ゼラチンを蒸留水に溶解し、０．３μｍのポアーサイズのニトロセルロースろ過膜でろ過滅菌することにより作製することができ、冷蔵保存により長期間保存することができる。その他のタンパク質を用いる場合にも、同様にして溶液を調製し、保存することができる。
【００１２】
支持体としては、プラスチック、ガラス、セラミックス、金属、布のマイクロプレート、カルチャーディッシュ、カルチャーフラスコ、スライドグラス、板が挙げられる。特に、９６穴、２４穴、１２穴または６穴のマイクロカルチャープレート；直径３．５cm、６cmまたは１０cmのカルチャーディッシュ；容量３０ml、５０ml、２５０ml、６５０mlまたは９００mlのカルチャーフラスコ等の、プラスチック製の培養容器が好適に使用される。
【００１３】
本発明の方法により支持体に接着されうる培養基材としては、コラーゲン、ナイロンまたはニトロセルロースのシート、メッシュまたはスポンジ状基材が挙げられる。
【００１４】
本発明によれば、支持体への培養基材の接着は、例えば以下のようにして行うことができる。タンパク質の水性液体又は溶液、例えば１％ゼラチン溶液を、適当量、支持体となる培養容器の表面に滴下し、その上に培養基材をのせ、これを無菌的に室温で乾燥させることにより、培養容器に培養基材を接着することができる。
【００１５】
本発明によるタンパク質の水性液体又は溶液を用いる接着は、培養基材がタンパク製のものである場合ほど接着性が強いが、それ以外の組成の培養基材も充分接着することができる。例えば、２４穴のマイクロカルチャープレートにコラーゲン製とニトロセルロース製のスポンジ状培養基材を本発明の方法により接着し、逆さにして強くたたくことでスポンジ状培養基材の接着度を検討すると、コラーゲン製培養基材は１００％が接着し、ニトロセルロース製培養基材でも５０％も接着していることが確認できる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
実施例：
ゼラチン（和光純薬工業社製、Gelatin)１ｇを１００mlの蒸留水に溶解し（ゼラチン濃度１％）、滅菌したポアーサイズ０．３μm のニトロセルロース膜によりろ過して、滅菌した。この１％ゼラチン溶液を、２４穴マイクロカルチャープレートのウェルの中央にピペットで一滴滴下し、その上に、８mmの正方形に切ったスポンジ状ゲル（コラーゲンゲル）をのせて、室温で無菌的に乾燥させ、接着した。
【００１７】
試験例：接着による毒性の検討
ウサギ皮膚を剃毛し、直径６mm、厚さ３mmの円筒形に細切した。上記実施例のようにして、２４穴マイクロカルチャープレートに、８mmの正方形に切ったスポンジ状ゲル（コラーゲンゲル）を１％ゼラチンで接着したウェルの区域と、同じゲルを接着せずに入れたウェルの区域とを用意し、１０％のウシ胎児血清を添加したイーグルの最小必須培地を満たした。このゲルのブロックに培地を含ませ、その上に細切した組織を載せて、温度３７℃、湿度１００％、５％炭酸ガスおよび９５％大気の条件下で培養を行った。培養後、組織片を、ＭＴＴ（３−〔４，５−Dimethylthiazol −２−yl〕−２，５−diphenyltetrazolium bromide ；Thiazolyl blue）を１mg/ml の濃度で含む生理食塩水中１ml中に投じ、３７℃で２４時間処理した。その後、ジメチルスルホキシド１ml中に組織片を入れ替えて生じた色素を抽出し、５６０nmの吸光度計で計測した。得られた結果を第１図に示した。各点は、同一濃度の検体を３回繰り返して測定して得られた数値の平均である。また、データのばらつきは標準偏差で示してある。
結果は、接着した区域と、接着していない区域との間に有為な差がなく、培養組織片に対して接着による毒性が現れていないことがわかる。
【００１８】
【発明の効果】
本発明によれば、熱によらない簡便な接着方法で効率よく培養基材を支持体に接着した培養容器が提供され、動物、昆虫および植物の細胞または組織に対して接着に由来する毒性による悪影響を与えることなく、培養基材からこれらの細胞または組織が落下することによる培養の失敗を防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】培養組織に対する接着の影響を示す図。
【図１】
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