(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
図4Aに示される配列番号：１のヌクレオチド配列又は配列番号：１に対して少なくとも90％の類似性を有する相同配列を有する単離されたDNAフラグメントであって、当該相同配列は１−シュークロース：シュークロースフラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードしており、当該タンパク質は下記の反応：
G-(F)n +G-(F)m →G-(F)n-1 +G-(F)m+1，       1≦n≦3，   1≦m≦3
〔上記式中、-Gはグルコシル単位を表わし、そして-Fはフルクトシル単位を表わす〕を触媒する、ことを特徴とするフラグメント。
【請求項２】
請求項１に記載の１又は複数のDNAフラグメントを含んで成る組換えDNA。
【請求項３】
変性されたフルクタンプロフィールを示す遺伝子的に形質転換された微生物又は植物宿主生物を生成するための方法であって、
ｉ）前記宿主生物において活性なプロモーター配列に作用可能に連結されている、請求項１に記載の１又は複数のDNAフラグメントを含んで成るキメラ性遺伝子構造体を調製し；そして
ii）前記キメラ性遺伝子構造体を前記宿主生物のゲノム中に導入する；
段階を含んで成る方法。
【請求項４】
前記宿主生物が植物であり、そしてiii）前記形質転換された植物細胞をトランスジェニック植物に再生する段階をさらに含んで成る請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法により生産される形質転換された植物、又は前記キメラ遺伝子構造体を含んで成る植物細胞、果実、実生もしくは任意の植物部分。
【請求項６】
変性されたフルクタンプロフィールを示す遺伝子的に形質転換された微生物又は植物宿主生物を生成するための方法であって、
ｉ）前記宿主生物において活性なプロモーター配列及び前記宿主において活性なターミネーターに作用可能に連結されている、請求項１に記載の１又は複数のDNAフラグメント及び第二の１又は複数のDNAフラグメントを含んで成るキメラ性遺伝子構造体を調製し、ここで、当該第二のDNAフラグメントは、図4Bに示される配列番号：３のヌクレオチド配列又は配列番号：３に対して少なくとも90％の類似性を有する相同配列を有する単離されたDNAフラグメントであって、当該相同配列は１−フラクタン：フラクタンフラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードしており、当該タンパク質は下記の反応：
G-(F)n +G-(F)m →G-(F)n-1 +G-(F)m+1，      n≧2，  m≧2
〔上記式中、-Gはグルコシル単位を表わし、そして-Fはフルクトシル単位を表わす〕を触媒する、ことを特徴とするフラグメントであり；そして
ii）前記キメラ性遺伝子構造体を前記宿主生物のゲノム中に導入する；
段階を含んで成る方法。
【請求項７】
前記宿主生物が植物であり、そしてiii）前記形質転換された植物細胞をトランスジェニック植物に再生する段階をさらに含んで成る請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法により生産される形質転換された植物、又は前記キメラ遺伝子構造体を含んで成る植物細胞、果実、実生もしくは任意の植物部分。
【発明の詳細な説明】
本発明は、フルクタン（fructan）合成酵素をコードするヌクレオチド、１又は複数の前記ヌクレオチド配列を含んで成る組換えDNA配列、変性された（modified）フルクタンプロフィールを示す遺伝子的に形質転換された宿主生物を製造するための方法、及び前記変性されたフルクタンプロフィールを示す形質転換された植物又は植物部分に関する。
フルクタンは、１又は複数のフルクトシル−フルクトース結合が結合の大多数を構成している炭水化物化合物のグループを意味する。フルクタンは、但し必ずではないが、通常、１つの末端グルコシル単位を有するフルクトースポリマーである〔Ｇ−（Ｆ）n，Ｇ＝場合によっては存在する、ｎ≧２〕。フルクタンにおけるフルクトシル−フルクトース結合は、β−２，６又はβ−２，１結合型のものである。β−２，６フルクトシル−フルクトース結合を主に有するフルクタンは通常、レバンと呼ばれる。β−２，１フルクトシル−フルクトース結合を主に有するフルクタンは通常、イヌリンと呼ばれる。
フルクタン生合成は、通常、いくつかの細菌、真菌類及び藻類において存在し、そしてまた、特定の植物ファミリー、たとえば、ユリ科（たとえばアリウム・セパ（Allium cepa））、イネ科（たとえばロリウム・ペレネ（Lolium perenne））及びキク科（たとえばヘリアンタス・ツベロサス（Helianthus tuberosus））において存在する。細菌及び菌類におけるフルクタンの機能は、ほとんど理解されていない。フルクタンは、炭水化物ストレスの期間の間、移動され得る炭水化物の細胞外貯蔵として作用することが示唆されている（Jacques，1993）。植物においては、フルクタンは、成長のための炭素源として作用する保存炭水化物として機能することができる（Meier and Reid，1982）。フルクタン−貯蔵穀物においては、フルクタン合成は、特定の器官（たとえば、Ｈ．ツベロサスの茎又は塊茎、アリウムsppの球茎、草の葉基部及び茎）のみならず、また、それらの器官内の特定の細胞型（通常、柔組織細胞）に制限される。それらの特定の細胞型においては、液胞がたぶん、フルクタン生合成及び貯蔵の位置である（Darwen and John，1989；Wagnerなど．，1983）。
細菌においては、フルクタン合成細菌の例は、ストレプトコッカス・ムタンス（Streptococcus mutans）及びバシラス・サブチラス（Bacillus subtilus）であり、スクロースからのフルクタンの生合成は、わずか１種の酵素：Ｂ．サブチラスにおけるレバンスクラーゼ（EC２．４．１．10）（Dedonder 1996）及びＳ．ムタンスにおけるレバンスクラーゼ（但し、またフルクトシルトランスフェラーゼとも呼ばれる；FTF，（EC２．４．１．10））により触媒される。細菌性フルクタン合成は、次の可逆反応に従ってスクロース又は他のレセプター分子へのドナースクロース（Ｇ−Ｆ）からのフルクトースの直接的な移行を通して進行する：
ｎ（Ｇ−Ｆ）＋受容体→ｎ（Ｇ）＋受容体−（Ｆ）ａ’  （１）
（ここで、ｎは10,000よりも大きい）。
水、ヘキソース、スクロース、オリゴ糖及びレバンは、スクロースからのフルクトシル単位のための受容体分子として使用することができる（フルクトシルドナー）。
Ｓ．ムタンスにおけるFTF及びＢ．サブチラスにおけるレバンスクラーゼををコードする細菌性DNA配列は、文献にすでに記載されている（Sato and Kuramitsu，1986；Steinmetzなど．1985）。いくつかの源からの細菌性遺伝子は、通常、フルクタンを合成することができない特定の宿主生物を形質転換するために使用され、それにより、フルクタン合成を誘発する（たとえば、Van der Meerなど．，1994；Ebskampなど．，1994を参照のこと）。Ｂ．サブチラスからのレバンスクラーゼ遺伝子及びレウコノストク・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）からのデキストランスクラーゼ遺伝子を用いてのトマト果実の固形分を増強する方法は、WO89/12386号出願に記載されている。通常、フルクタンを合成することができない植物におけるフルクタンパターンを、Ｓ．ムタンスからのレバンスクラーゼをコードするftf遺伝子及びＢ．サブチラスからのレバンスクラーゼをコードするSacB遺伝子を用いて変性するための方法は、NL A9300646号及びWO94/14970号出願に記載されている。宿主植物ゲノムへの組込みの後、レバンの合成を導びくエルウイニア  アミロボラ（Erwinia amylovora）からのレバンスクラーゼ−コードのDNA配列の使用が、DE4227061 A1及びWO A9404692号に記載されている。すべての前記出願においては、細菌からのレバンスクラーゼ遺伝子により形質転換されるトランスジェニック植物が記載されている。従って、それらのトランスジェニック植物は、ドナー細菌により合成されるフルクタンに構造的に匹敵するフルクタンを合成し、そして蓄積する（Van der Meerなど．，1994；Ebskampなど．，1994）。
本出願は、それが植物由来のフルクトシルトランスフェラーゼをコードするDNA配列に関連していることにおいて前記出願とは異なる。それらの酵素は、アミノ酸レベル及びDNAレベルで有意な相同性は存在しないので、細菌性酵素とは構造的に異なる。さらに、植物におけるフルクタン生合成の機構は、細菌における機構とは実質的に異なる。細菌におけるフルクタン生合成に比較して、植物におけるフルクタンの形成は１つ以上の酵素により介在される。たとえば、ヘリアンタス・ツベロサス（the Jerusalem Artichoke）においては、フルクタン生合成は次の２種の酵素により触媒される：スクロース：スクロース  フルクトシルトランスフェラーゼ（SST，EC２．４．１．99）及びフルクタン：フルクタン  フルクトシルトランスフェラーゼ（FFT，EC２．４．１．100）。Ｈ．ツベロサスからのSST及びFFTは、β−２，１結合のフルクタン（イヌリン）の合成に包含され、そして従って、また１−SST及び１−FFTとしても企画される。１−FFTは、Ｈ．ツベロサスの塊茎から精製された（Lascherなど．，1993，Koops and Jonker，1994）。SSTの精製は、達成するには一層困難であることがわかっている。推定上のSSTは、いくつかの植物源から、非常に低い収率で精製されている（Shiomi and Izawa，1980；Praznikなど．，1990；Angenentなど．，1993）。しかしながら、それらの研究のどれにおいても、酵素の純度は、納得のゆくようには示されていない。さらに、単離された酵素がインバーターゼを表わさないことが、それらの研究において結論的には示されていない。
多量の１−SST及び１−FFTがＨ．ツベロサスの塊茎から均質にまで精製されており（１−FFT：Koops and Jonke 1994）、そしてそれらの反応機構は広範に研究されている。Ｈ．ツベロサスからの１−SSTは、次の反応に従って、フルクタン生合成の初期段階、すなわちスクロース（Ｇ−Ｆ）の２種の分子からの三糖１−ケストース（１−〔Ｇ−（Ｆ）2〕）の合成を触媒する：
Ｇ−Ｆ＋Ｇ−Ｆ→１−〔Ｇ−（Ｆ）2〕＋Ｇ            （２）
ここで、Ｇ−Ｆ＝スクロース、−Ｆ＝フルクトシル単位、−Ｇ＝グルコシル単位、Ｇ＝グルコース。
１−SSTはまた、四糖１，１−〔Ｇ−（Ｆ）3〕及び五糖１，１，１−〔Ｇ−（Ｆ）4〕の形成を触媒する（図３Ａ）。従って、１−SST活性は、次の一般的反応により記載され得る：
Ｇ−（Ｆ）n＋Ｇ−（Ｆ）m→Ｇ−（Ｆ）n-1＋
Ｇ−（Ｆ）m+1，１≦ｎ≦３，１≦ｍ≦３              （３）
Ｈ．ツベロサスからの１−SSTが、Ｇ−（Ｆ）n，１≦ｎ≦３からのフルクトシル単位から水上への移行をある程度、移行することができることがまた見出された。
第２酵素１−FFTは、高い程度の重合を伴ってフルクタンの形成を触媒する。この酵素は、次の一般的な反応に従って、三糖、四糖及びより大きなフルクトースポリマー間でのフルクトシル単位の移行により重合反応を触媒する：
Ｇ−（Ｆ）n＋Ｇ−（Ｆ）m→Ｇ−（Ｆ）n-1＋
Ｇ−（Ｆ）m+1，ｎ≧２，ｍ≧２                      （４）
１−FFTは、スクロース（Ｇ−Ｆ）とガラクタンとも呼ばれる、ガラクトース（Gal）−含有炭水化物〔（Gal）n−Ｇ−Ｆ〕との間のフルクトシル単位の移行を触媒することがまた見出されている。たとえば、１−FFTは、Ｇ−（Ｆ）3から、〔Gal−Ｇ−（Ｆ）3〕の形成をもたらすラフィノース（Gal−Ｇ−Ｆ）上へのフルクトシル単位の移行を触媒することができる。Ｈ．ツベロサスからの両１−SST及び１−FFTがフルクトシル受容体として他の基質を使用することができることは、除外され得ない。
１−SST及び１−FFTはいくらかの重複する活性を有するけれども、両酵素は、四糖及び五糖の形成を触媒することができ（反応３又は４）−１−SST及び１−FFTは明らかに異なった酵素である。１−SST及び１−FFTタンパク質は、異なった物性を有し、そして異なった遺伝子によりコードされる。１−SST及び１−FFTは、実質的に異なった酵素的性質を有する。１−FFTは、フルクタン合成の初期段階（反応２）を触媒することができないが、他方１−SSTは５〔Ｇ−（Ｆ）n，ｎ＞４〕よりも高い程度の重合を伴ってフルクタンポリマーの形成を触媒することができない。結論的には、１−SST活性のみにより、５〔Ｇ−（Ｆ）n，２≦ｎ≦４〕までの程度の重合を伴ってスクロースからオリゴフルクタンを合成することが単に可能である。より高い重合の程度を伴って及び基質としてスクロースを用いて、フルクタンを合成するためには、１−SST及び１−FFTの両方が必要とされる。１−FFT活性のみにより、スクロースからフルクタンを合成することは不可能である。精製された１−SST及び精製された１−FFTを含むタンパク質画分が少なくとも15〔Ｇ−（Ｆ）12，図３Ｂ〕の程度の重合を伴っているフルクタンの合成のための単一の基質としてスクロースを用いることができることが、本発明者により見出された。
細菌性フルクタンは、重合の程度及び枝分れのタイプ、並びに結果的に、化学的及び物理的性質において、植物におけるフルクタンとは異なる。一般的に、植物からのフルクタンは、1000以下のフルクトシル単位からアセンブルされる。Ｈ．ツベロサスからのフルクタンは、100以下のフルクトシル単位からアセンブルされる。細菌から合成されたフルクタンは、10,000以上のフルクトシル単位を含むことができる。従って、植物及び細菌性フルクタンは、それらの可能な用途において異なる。比較的低い程度の重合を有するフルクタン、たとえばアステラセアエ（Asteraceae）（たとえば、Jerusalem Artichoke，chicory又はdahlia）から単離されたフルクタンに関しては、カルシウム結合剤及び界面活性剤におけるリン置換体としての用途はすでに研究されている（WO91/17189）。他の用途は、フルクタンの感覚刺激性質に関連している。フルクタンＧ−（Ｆ）nの甘味強度は、低下する重合の程度（低下するｎ−値）により低下する。オリゴフルクタンＧ−（Ｆ）2及びＧ−（Ｆ）3の甘味強度は、スクロース（Ｇ−Ｆ）のその強度に近い。ひじょうに長い鎖のフルクタン、たとえば細菌において生じるフルクタンは、まったく甘くない。ひじょうに短い鎖のフルクタン、たとえばスクロース：スクロース  フルクトシルトランスフェラーゼにより合成されるフルクタンは、それらの甘味フルクタンが非−う食原性であり、そして低カロリー甘味剤としての使用のための可能性を開く、ヒトの消化管における消化を耐えることができる追加の利点を有する甘味剤として使用され得る。短い鎖のフルクタン及びまた、長い鎖のフルクタンは、生物界面活性剤の親水性成分として使用され得る。
すでにクローン化されている、レバンスクラーゼをコードする細菌性遺伝子に比較して、SST及びFFTをコードする遺伝子は、植物からこれまで単離されたことはない。本発明者は、アミノ酸レベルで、植物からのSST及びFFT−コードの遺伝子は、既知のレバンスクラーゼに対して有意な類似性を有さず、そしてDNAレベルで、レバンスクラーゼ遺伝子に対する有意な程度の相同性を有さないことを見出した。この理由のために、細菌からの異種レバンスクラーゼプローブを用いて、植物からフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を単離することは不可能であった。精製されたSST及びFFT酵素のアミノ酸配列及びそれらの推定されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて植物からSST及びFFT−コードの遺伝子を単離することはまた不可能であった。これについての理由は、植物からのフルクトシルトランスフェラーゼの精製についての方法が記載されているが、SST及びFFT酵素を、有意に多くの量で及び有意に高い程度の純度を伴って、得ることはこれまで不可能であったことである。
本発明の目的は、SST及びFFTをコードするヌクレオチド配列を供給することである。
本発明のもう１つの目的は、フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする、SST又はFFTをコードするヌクレオチド配列の組換え又は突然変異誘発により得られるヌクレオチド配列を供給することである。
本発明のさらにもう１つの目的は、SST及び／又はFFT−コードの遺伝子の導入により、非フルクタン合成穀物類をフルクタン合成穀物類に形質転換するための方法を提供することである。
本発明のさらにもう１つの目的は、通常フルクタンを合成する穀物類におけるフルクタン合成を（部分的に）停止せしめることである。
従って、本発明は、図４Ａに示されるようなヌクレオチド配列（配列番号１）を有するDNAフラグメント、又は１−スクロース：スクロース  フルクトシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも70％の程度の相同性を有する相同配列を提供する。さらに、本発明は、図４Ｂに示されるようなヌクレオチド配列（配列番号２）を有するDNAフラグメント、又は１−フルクタン：フルクタン  フルクトシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも70％の程度の相同性を有する相同配列を提供する。
１−スクロース：スクロース  フルクトシルトランスフェラーゼ（１−SST）及び１−フルクタン：フルクタン  フルクトシルトランスフェラーゼ（１−FFT）が、ヘリアンタス・ツベロサスの塊茎から精製された。精製された酵素はトリプシン消化によりペプチドに分解され、そしてその得られるペプチド混合物はHPLCにより分離された。Ｎ−末端アミノ酸の配列決定が選択されたペプチドについて行なわれた。１−SST及び１−FFTに対して特異的なアミノ酸配列が、RT−PCRへの使用のために、それぞれ、１−SST及び１−FFTに対して特異的な縮重されたオリゴヌクレオチドプライマーを企画するために使用された。PCRが、鋳型としてcDNA、すなわち末端−特異的プライマー、及び１−SST又は１−FFTのいづれかに対して特異的な縮重されたプライマーを用いて実施された。第１鎖のcDNAが、Ｈ．ツベロサスからの塊茎から単離されたポリ（Ａ）+RNAから合成された。１−FFT−特異的プライマーにより、RT−PCRは800bpの特異的フラグメントをもたらした。450及び800bpのPCRフラグメントを続いて用いて、それぞれ、１−SST及び１−FFTをコードする十分な長さのcDNA配列を単離するためにＨ．ツベロサスの塊茎から製造されたcDNAライブラリーをスクリーンした。
本発明の植物からのSST及びFFT−コード配列は、宿主生物、たとえば植物のゲノム中への挿入の後、少なくとも１つのフルクトシル単位を含む炭水化物（スクロース、オリゴフルクタン、フルクタン又はガラクタン）の濃度の変化を誘発し、又はオリゴフルクタン、フルクタン又はガラクタンの重合の程度の変化を引き起こす。本発明は、前記炭水化物に関与する。なぜならば、スクロースはSSTのための基質であり、オリゴフルクタンはSSTの生成物であり、高い重合度を有するオリゴフルクタン及びフルクタンはFFTの基質及び生成物であるからである。さらに、前記フルクトシルトランスフェラーゼ酵素はまた、フルクトシル受容体としてラフィノースシリーズのガラクタンとのトランスフルクトシル化反応を行なうことができる。
本発明は、相同配列が他の植物源に由来するか、又は植物源又は微生物からのフルクトシルトランスフェラーゼ−コードの配列の突然変異誘発により得られるかに関係なく、Ｈ．ツベロサスからの１−SST−コードの配列に少なくとも70％の同一性を有するDNA配列を包含する。相同性の程度は少なくとも80％であることが好ましく、より好ましくは、相同性の程度は少なくとも85％であり、そしてさらにより好ましくは、相同性の程度は少なくとも90％である。特に最も好ましくは、相同性の程度は少なくとも95％である。
本発明は、相同配列が他の植物源に由来するか、又は微生物からのフルクトシルトランスフェラーゼ−コードの配列の突然変異誘発により得られるかに関係なく、Ｈ．ツベロサスからの１−FFT−コードの配列に少なくとも70％の同一性を有するDNA配列を包含する。相同性の程度は少なくとも80％であることが好ましく、より好ましくは、相同性の程度は少なくとも85％であり、そしてさらにより好ましくは、相同性の程度は少なくとも90％である。特に最も好ましくは、相同性の程度は少なくとも95％である。
本発明はまた、植物からのSST及び／又はFFT−コードの配列、及び他の原核又は真核源、たとえば細菌及び菌類からのフルクトシルトランスフェラーゼコードの配列を用いて、インビボ及びインビトロ組換えにより得られるDNA配列を包含する。
本発明は、宿主生物のゲノム中への挿入の後、２，３及び／又は４のフルクトシル単位〔Ｇ−（Ｆ）n，２≦ｎ≦４〕から成るオリゴフルクタンの合成を誘発する植物からのSST−コードのDNA配列に関する。本発明はまた、SST−コードのDNA配列と共に宿主生物のゲノム中への挿入の後、高い重合度を有するフルクタン〔Ｇ−（Ｆ）n，ｎ＞４〕の合成を誘発する植物からのFFT−コードのDNA配列にも関する。
本発明はまた、SST又はFFTをコードする配列、又は前記配列の一部を含んで成るキメラ性遺伝子構造体にも関し、ここで前記配列はアンチセンス配向で存在する。フルクタンを合成することができる植物へのそれらのアンチセンス構造体の導入は、SST又はFFT触媒された反応の阻害を引き起こし、又はSST又はFFT発現の阻害を引き起こすであろう。
本発明は、SSTをコードする配列又は前記配列の一部を含んで成るキメラ性遺伝子構造体に関し、ここで前記コード配列はアンチセンス配向で存在する。フルクタンを合成することができる宿主植物、たとえばキク科、ユリ科及びイネ科の植物のゲノム中へのそれらのアンチセンス構造体の導入は、オリゴフルクタン〔Ｇ−（Ｆ）n，２≦ｎ≦４〕へのスクロースの転換を減じ又は阻止する。SSTのみがそのようなトランスジェニック植物においてフルクタン合成の第１段階（反応２）を触媒することができるので、また高い重合度〔Ｇ−（Ｆ）n，ｎ＞４〕を有するフルクタンの合成のみが減じられ又は阻止され、そしてそれらの植物はフルクタンよりもむしろスクロースを蓄積するであろう。
本発明は、FFTをコードする配列又は前記配列の一部を含んで成るキメラ性遺伝子構造体に関し、ここで前記コード配列はアンチセンス配向で存在する。フルクタンを合成することができる宿主植物のゲノム中へのそれらのアンチセンス構造体の導入は、オリゴフルクタン〔Ｇ−（Ｆ）n，２≦ｎ≦４〕の高い重合度を有するフルクタン〔Ｇ−（Ｆ）n，ｎ＞４〕への転換を減じ又は阻止する。このようにして得られたトランスジェニック植物は、高い重合度を有するフルクタンよりもむしろオリゴフルクタンを蓄積するであろう。
従って、本発明は、変性されたフルクタンプロフィールを示す遺伝子的に形質転換された宿主生物を生成するための方法を提供し、ここで前記方法は、
ｉ）前記宿主生物において活性的なプロモーター配列及び前記宿主生物において活性的なターミネーター配列に操作可能的に連結される、上記で定義されたような１又は複数のDNAフラグメント、又は逆の配向での前記DNAフラグメントを含んで成るキメラ性遺伝子構造体を調製し、そして
ii）前記キメラ性遺伝子構造体を前記宿主生物のゲノム中に導入する段階を含んで成る。
前記宿主生物は、微生物か又は植物であり得る。宿主生物が植物である場合、前記方法は、さらに、
iii）前記形質転換された植物細胞をトランスジェニック植物に再生する段階を含んで成る。
より特定には、本発明の方法は、次の段階を含んで成る：
ａ．次の配列を実質的に含んで成るキメラ性遺伝子の構成：
意図された標的生物、標的器官、組織又は細胞における機能的RNA又はタンパク質の形成を確保するプロモーター、SST又はFFTをコードするDNA配列；前記DNA配列に操作可能的に連結される転写ターミネーター、ここで前記SST又はFFT−コードのDNA配列はプロモーターに機能的に連結されており、標的シグナル、又は特定の非細胞区画へのSST又はFFTの標的化を確保するトランジットペプチドをコードするDNA配列；
ｂ．前記DNA配列を含んで成る遺伝子材料を得るために、前記宿主生物のゲノム中への前記キメラ性遺伝子の導入；及び
ｃ．形質転換された宿主生物における前記遺伝子材料の再生。
本発明の組換えDNAにおいては、SST又はFFTをコードするDNA配列は好ましくは、十分に高い発現レベルで、宿主生物、たとえば細菌、酵母、藻類又は植物におけるDNA配列の適切な発現を確保する調節配列に連結される。調節配列は、プロモーター、停止シグナル及び転写又は翻訳エンハンサーである。プロモーターは、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV）の35Ｓプロモーター、又は糖−誘発性プロモーター、たとえばpatatineプロモーター、又は器官−特異的プロモーター、たとえば塊茎特異的ジャガイモプロティナーゼインヒビター■プロモーター、又はいづれか他の誘発性又は組織特異的プロモーターであり得る。
本発明の組換えDNAにおいては、SST又はFFT−コードのDNA配列は、好ましくは、植物において操作性であり、そして異なった植物器官、組織又は細胞においてDNA配列の適切な発現を確保する調節配列に連結される。より好ましいプロモーターは、通常、スクロース（フルクタン合成のための一次基質）を蓄積する器官及び細胞タイプにおいて活性的であるプロモーターである。フルクタンの生成は、多量のスクロースを貯蔵する器官、たとえば砂糖大根の上部の根又はサトウキビの茎において特に好都合である。根の他に、他の器官又は細胞タイプが、スクロースの合成、加工、輸送及び蓄積に関与する。従って、SST又はFFT−コードの配列はまた、葉、茎、塊茎、再生性器官及び種子において適切に発現される。
本発明の組換えDNAにおいては、SST又はFFTをコードするDNA配列は、スクロースを含む非細胞区画にSST又はFFT成熟タンパク質を向けるトランジットペプチドをコードする配列を含み、又はその配列に連結される。フルクタンの生成は、ひじょうに高い濃度のスクロース（900モルｍ3までの）を蓄積することができる液胞において特に好都合である。液胞の他に、他の非細胞区画が、スクロースの合成（細胞質）、プロセッシング（細胞質、ミトコンドリア、プラスチド）及び輸送（細胞壁、細胞質）に関与している。従って、本発明は、特定の非細胞区画、たとえば液胞、細胞壁、ミトコンドリア、プラスチド及び細胞質へのSST又はFFT生成物の標的化を可能にする配列の使用に関する。
本発明はまた、SST又はFFTをコードする配列又はその配列の一部を含んで成る遺伝子構造体にも関し、ここで前記コード配列はアンチセンス配向で存在する。それらの遺伝子構造体においては、SST又はFFTコードの配列は好ましくは、通常、フルクタンを合成することができる細胞タイプにおいてアンチセンスRNAの形成を確保するプロモーターに連結される。
本発明の組換えDNAはまた、除草剤耐性、植物成長促進、植物成長阻害、抗菌、抗細菌、抗ウィルス及び／又は抗線虫性質を有し、又は耐ストレス性を付与するタンパク質をコードすることができる。本発明の組換えDNAはさらに、生殖不能性を誘発するタンパク質をコードすることができる。DNAが異種生物中に導入される予定である場合、それは既知のmRNA不安定性モチーフ（たとえばATに富む領域）を除去するために変性され得；そしてポリアデニル化シグナル、及び／又は組換えDNAが挿入される予定である生物により好まれるコドンが使用され、その結果、宿主生物におけるそのような変性されたDNAの発現は、同じ宿主生物における変性されていない組換えDNAの発現により得られるものよりも一層高いものである。
本発明はまた、上記方法により生成される、形質転換された宿主生物、特に形質転換された植物を提供する。本発明は好ましくは、農業用、飼草用、野菜、観賞用及び果実収穫物、より好ましくは、砂糖大根、サトウキビ、ジャガイモ、ペチュニア、アルファルファ、大豆、米、ライグラス、チモチグラス、小麦、大麦、サトウモロコシ、トウモロコシ、チコリー、キクイモ、チューリップ、メロン、タマネギ、ニンニク、トマト、イチゴ、リンゴ及びナシを包含する。さらに、本発明は、本明細書において定義されたようなSST又はFFTをコードする配列を含んで成る、組換えDNAを有する、植物細胞、種子、果実、実生又はいづれかの植物部分を包含する。さらに、本発明は、安定して導入され、そしてメンデルの法則に従って遺伝できるDNAを含む形質転換された植物の子孫、及び／又はそのような植物及びそのような子孫の種子を包含する。
実  験
１−SSTの精製
ヘリアンタス・ツベロサス“Colombia”の塊茎を、１−SST及び１−FFTの抽出のために使用した。塊茎は、急速な塊茎成長及び多量のフルクタン蓄積の期間である８〜９月に収穫された。塊茎を洗浄し、そして液体窒素において凍結した。400ｇの凍結塊茎（−80℃）を微粉砕し、そしてその後、すぐに、10％（ｗ／ｖ）グリセロール、１モル／ｍ3のMgSO4，１モル／ｍ3のNa2EDTA，１モル／ｍ3のPMSF（Sigma，USA），１モル／ｍ3のDTT，1.5％（ｗ／ｖ）のPVPP及び20モル／ｍ3のNa2SaO4を含む、50モル／ｍ3のリン酸（Ｐ）緩衝液（pH6.5）900cm3において、Waringブレンダーを用いて均質化した。そのホモジネートを３層のMiraclothを通して濾過し、そして17,000ｇで１時間、遠心分離した。
タンパク質抽出物を４℃で維持し、そして（NH4）2SO4により45％飽和に調整した。不溶性タンパク質を遠心分離（10,000ｇ，30分）によりペレット化し、そして捨てた。45％上清液を、（NH4）2SO4のさらなる添加により70％飽和した。第２回目の遠心分離段階の後に得られたペレットを、１モル／ｍ3のDTT及び１モル／ｍ3のPMSF（Sigma，USA）を含む50モル／ｍ3のリン酸（Ｐ）緩衝液（pH6.5）60cm3に再溶解し、そして１モル／ｍ3のPMSF及び１モル／ｍ3のDTTを含む10モル／ｍ3のＰ−緩衝液（pH6.5）に対する16時間の透析により脱塩化した。緩衝液の交換の後、透析はさらに３時間、続けられた。それらの全工程は、０〜４℃の間の温度で実施された。遠心分離された透析物（30,000ｇ，30分）を、10モル／ｍ3のビス−トリス（pH6.5），１モル／ｍ3のDTT，１モル／ｍ3のPMSF及び５モル／ｍ3のEDTAのMilli Ｑ水の溶液により予備洗浄された、25×120mmのＱ Sepharose Phast Flowカラム（４℃）上に適用した。結合されたタンパク質を、５cm3／分の流速で、同じ緩衝液中、NaClグラジエント（０〜300モル／ｍ3）により溶出した。１−SSTは、200〜250モル／ｍ3のNaClで溶出した。Ｑ Sepharose画分を、固体（NH4）2SO4により400モル／ｍ3に調節した。20cm3の画分を、500モル／ｍ3の（NH4）2SO4，１モル／ｍ3のDTT，１モル／ｍ3のPMSF，２モル／ｍ3のEDTA及び0.1％のCHAPS（緩衝液Ａ）を含む、10モル／ｍ3のビス−トリス緩衝液（pH6.5）により12℃で予備平衡化された、Phenyl Sepharose High Perfurmance又はPhenyl Sepharose High Suhstitutionの15×50mmカラム上に負荷した。結合されたタンパク質の溶出を、25％（ｖ／ｖ）のエチルグリセロールを含む緩衝液Ａ（100−０％）（（NH4）2SO4を含まない）の線状グラジエントを用いて、１cm3／分の流速で実施した。１−SSTは、100モル／ｍ3の（NH4）2SO4で溶出した。
10cm3までのPhenyl Sepharose画分を、20モル／ｍ3のビス−トリス（pH6.5）、250モル／ｍ3のNaCl，0.5モル／ｍ3のCaCl2，0.5モル／ｍ3のMnCl2，１モル／ｍ3のDTT及び１モル／ｍ3のDMSFの溶液により予備洗浄された５×50mmのConcanavalin Ａ Sepharoseカラム上に注入した。結合された１−SSTを、同じ緩衝液中、500モル／ｍ3のα−CH3−マンノピラノシドにより溶出した。
１つのConcanavalin Ａ−実施の活性画分をプールし、そして球状（15μｍ）のヒドロキシルアパタイト（Merck，German）を充填した５×200カラムに適用した。カラムを、２モル／ｍ3のCaCl2，10モル／ｍ3のNaCl，１モル／ｍ3のDTT，１モル／ｍ3のPMSF及び0.1％のCHAPS溶液（緩衝液Ａ）により予備平衡化した。カラムに結合されるタンパク質を、緩衝液Ａ及び500モル／ｍ3のリン酸カリウム緩衝液（pH6.5）の段階的グラジエントにより、0.5ml／分の流速で溶出した。１−SSTが75〜100モル／ｍ3のリン酸カリウムで溶出した。
１つのヒドロキシルアパタイト実施の活性画分をプールし、そして10モル／ｍ3のＰ−緩衝液、pH6.5，１モル／ｍ3のDTT，１モル／ｍ3のEDTA及び0.1％のCHAPSにより予備平衡化された５×50mmのMono Ｑ−カラム上に適用した。結合されたタンパク質を、0.5cm3／分の流速で、NaClグラジエント（０−500モル／ｍ3）により溶出した。１−SSTが250モル／ｍ3のNaClて溶出した。
すべてのカラム、カラム充填物及びクロマトグラフィー装置は、特にことわらない限り、Pharmacia（スエーデン）から入手した。
１−PPTの精製
粗タンパク質抽出物を、１−SSTの精製について記載されるようにして、Ｈ．ツベロサスの塊茎から得た。遠心分離の後に得られるような、粗タンパク質抽出物の上清液を、（NH3）3SO4により45％飽和に調整し、そして１時間、撹拌した。不溶性タンパク質を、10,000ｇでの30分間の遠心分離によりペレット化した。ペレットを、50モル／ｍ3のＰ−緩衝液、pH6.5，１モル／ｍ3のDTT及び１モル／ｍ3のPMSFの溶液60cm3に再溶解し、そして１モル／ｍ3のPMSF及び１モル／ｍ3のDTTを含む10モル／ｍ3のクエン酸塩／リン酸塩（Ｃ／Ｐ）緩衝液（pH4.5）に対して一晩、透析した。透析管の内容物を、0.2ＭのNa2HPO4によりpH6.5に再調整し、そして不溶性タンパク質を、30,000ｇでの１時間の遠心分離により除去した。上清液を、Milli Ｑ水（Millipore B．V．，The Netherlands）中、１モル／ｍ3のDTT，１モル／ｍ3のPMSF及び10モル／ｍ3のＰ−緩衝液（pH6.5）の溶液により予備平衡化されたＱ Sepharose Phost Flow（Phormacia）の25×120mmカラム上に負荷した。カラムを４℃に冷却した。結合されたタンパク質を、5cm3／分の流速で、陽性NaClグラジエントにより溶出した。１−FFTは、200〜250モル／ｍ3のNaClで溶出した。
固体（NH4）2SO4を、Ｑ Sepharose画分に添加し、750モル／ｍ3の最終濃度にした。５cm3の画分を、750モル／ｍ3の（NH4）2SO4及び１モル／ｍ3のDTTを含む、10モル／ｍ3のＰ−緩衝液（pH6.5）により予備平衡化されたPhenyl Sepharose High Performance（Pharmacia）の15×50mmカラム上に負荷した。結合されたタンパク質を、12℃で、１cm3／分の流速で、負の（NH4）2SO4グラジエントにより溶出した。１−FFTは、450〜400モル／ｍ3の（NH4）2SO4で溶出した。
Phenyl Sepharose画分（４cm3までの）を、10モル／ｍ3のＰ−緩衝液（pH6.5）及び１モル／ｍ3のDTTにより予備洗浄されたHiload 16×600mmのSuperdex 75予備グレードカラム（Pharmacia）上に注入した。タンパク質を、20℃で0.5cm3／分の流速で、同じ緩衝液により溶出した。１−FFTは、注入の後、95〜105分で溶出した。
１−FFT及び１−SSTアッセイ
カラム画分の１−FFT活性を、35℃で通常のようにしてアッセイした。25mm3のアリコートを、100モル／ｍ3のＣ／Ｐ−緩衝液（pH6.5）１cm3当たり、25mm3（0.3ｇ）のNeosugar Ｐ（Meiji Seika Kaisha，Ltd，Tokyo，Japan：Neosugarは、１％ヘキソース、４％スクロース、42％Ｇ−（Ｆ）2，44％Ｇ−（Ｆ）3及び７％Ｇ−（Ｆ）4から成る）と共に混合した。３時間後、その反応を、水浴におけるインキュベーション混合物を５分間、煮沸することによって停止した。GF4の正味増量を、１−FFT活性の目安として取った。
１−SST活性のためには、15mm3のカラム画分を、100モルcm3のＣ／Ｐ−緩衝液（pH5.0）中、500モル／ｍ3のGF15mm3と共に混合し、そして35℃で３時間インキュベートした。GF2合成を、１−SST活性の目安として取った。
糖及びフルクタンの分析
スクロース及びオリゴフルクタンを、2.1×220mmのSperi−５RP18カラム（Brownlee Labs，Santa Clara，USA）を用いてRP−HPLCにより分析した。Milli Ｑ水を、37℃で0.3cm3／分の流速で溶離剤として使用した。グルコース及びフルクトースを、0.75cm3／分でMilli Ｑ水により85℃で実施された6.5×300mm  Shodex SC−1011カラム（Millipore B．V．，Waters Chromatography Division，The Netherland）上で定量化した。糖を、2142屈折率の検出器（RID，Pharmacia）により検出した。オリゴフルクタンは、Ｈ．ツベロサスから又はNeosugar Ｐから精製されたオリゴフルクタンからの保持時間と前記オリゴフルクタンの保持時間とを比較することにより、そして個々のオリゴフルクタンのグルコース／フルクトースの割合により確認された。
高い重合度を有する、オリゴフルクタン及びフルクタンのHPAEC分析を、250×４mmのCarboPac PA1アニオン交換カラム及び25×３mmのCarboPac PAガードカラムを備えたDionex Series 4000イオンクロマトグラフィー上で行なった。フルクタンを、１ml／分の流速で、0.1モル／ｍ3のNaOH中、0.25×0.4モル／ｍ3のNaAcの60分間の線状グラジエントにより分離した。検出は、金−作用性電極を有するパルスされた電流分析器（PAD）によるものであった。パルスの適用される電位は、それぞれ0.5，0.1及び0.05秒の間、0.1，0.6及び−0.6Ｖで維持された。ラムノースが内部標準として使用された。フルクタンは、Heinze and Praznik（1991）の方法に従って、Ｈ．ツベロサスから単離され、そして精製されたフルクタン標準の保持時間とそれらの保持時間とを比較することにより同定された。
１−SST及び１−FFTのアミノ酸配列決定
１−SSTのMono Ｑ画分又は１−FFTのSuperdex75画分を脱塩化し、そしてContricon−10（２cm3）限外濾過装置（Grace B．V．，Amicon division，The Netherland）における遠心分離により濃縮し、そして続いて、−20℃で80％（ｖ／ｖ）の水性アセトンにおける沈殿により集めた。１−SST及び１−FFT（それぞれ50μｇ）を、SDS−緩衝液（Laemmli，1970）に溶解し、そしてプレーキャストされたExcelGel SDS、グラジエント８−18上で分離した。タンパク質を、Rosenfeldなど．（1992）に従って、クーマシーブリリアントブルーにより染色した。染色された１−SST（２つのバンド；その固有の不安定性のために、１−SSTはSDS処理により分解される）及び１−FFTバンドを、外科用メスにより切り出し、そして洗浄し、乾燥せしめ、そしてRosen feldなど．（1992）の方法に従って、部分的に再水和化した。配列決定−グレードのトリプシン（0.5μｇ；Boehringer，Germany）を、前記ゲルスライスに添加し、そしてタンパク質のイン−ゲル消化を30℃で４時間行なった。得られるペプチドを、50μｌのアセトニトリル、水、トリフルオロ酢酸及びTween 20（60：40：0.001：0.0002，ｖ／ｖ）によるそれぞれ20分の２回の抽出により回収した。その得られるペプチド混合物を、４ml／分の流速で０〜60％の水性アセトニトリル中、0.1％のTFAの線状グラジエントにより9.3×250mmのSaperPac Rep−Ｓカラム（Pharmacia）上で溶出する分離用RP-HPLCにより分離した。個々のペプチド画分を手動的に集め、そして−80℃で貯蔵した。選択されたペプチドのアミノ酸配列を、モデル120Ａ  RP−HPLC単位（Applied Biosystems）にオンラインで連結されるモデル477Ａパルス−液体配列決定器を用いて、エドマン分解により決定した。１−SST又は１−FTTに対して特異的なアミノ酸配列を、PCRのためのプライマーとしても使用される、その対応する分解されたDNA配列（例１、表１）に翻訳した。
DNA方法
DNA及びRNA単離、サブクローニング、制限分析及び配列決定を、分子生物学マニュアル（Sambrookなど．1989，Ausubelなど．1994）に記載されるような標準の方法を用いて実施した。
cDNA合成
ポリ（Ａ）+RNAを、Ｈ．ツベロサス“Colombia”の塊茎から単離した。一本鎖cDNAを、次の末端特異的プライマーによりポリ（Ａ）+RNAをプライムすることによって10μｇのポリ（Ａ）+RNAから逆転写酵素により合成した；５’−CCGAATTCAATACGACTCACTATAGCG(T)13−３’。
PCR
１−SST又は１−FFT及び末端特異的プライマー、すなわち５’−CCGAATTCAATACGACTCACTATAGCG−３’に対して特異的な縮重されたオリゴヌクレオチドを、一本鎖cDNAの増幅のために使用した。PCRを、100ｐモルのcDNA鋳型、100ｐモルの末端特異的プライマー、及び１−SST又は１−FFTに対して特異的な100ｐモルのプライマーを含むPCR緩衝液（Life Technologies）50μｌにおいて行なった。増幅は、変性（１分、92℃）、アニーリング（１分、42℃）、及び増幅（１分、72℃）の30サイクルを包含した。得られるフラグメントを、0.7％のアガロースにおいて電気泳動し、ゲルから切り出し、アガロースマトリックスから単離し、そしてpMOSBlueベクター（Amereham）中にサブクローン化した。PCRにより生成される、１−SST及び１−FFT特異的フラグメントを用いて、Uni−ZAP XR cDNAライブラリーをスクリーンした。
cDNAライブラリーの構成及びスクリーニング
Ｈ．ツベロサス“Colombia”の塊茎から単離された10μｇのポリ（Ａ）+RNAを、Uni−ZAP XR cDNAライブラリー（Stratagene）の構成のための出発材料として使用した。ライブラリーの構成、プレート化及びスクリーニングは、Stratagene（La Jolla，California、カタログ番号237211）により開発された方法に従って行なわれた。１−SST又は１−FFTに対して特異的な32Ｐ−ラベルされたDNAプローブを、ランダムオリゴヌクレオチドプライミングにより調製し、そして約100,000個のプラークをスクリーンするために使用した。ハイブリダイゼーション及びHybond−Ｎ膜の洗浄を、緊縮条件（65℃でのハイブリダイゼーション、0.1×SSC，0.1％ SDSによる最終洗浄段階、65℃）下で行なった。陽性クローンを精製し、pBluescript phagemidを、Exassist／Solrシステム（Stratagene）を用いてUni-ZAPベクターから切り出し、そして挿入体を、制限酵素分析、ハイブリダイゼーション及び配列決定により分析した。
トランスジェニック植物の分析
糖及びフルクタンの分析
葉組織50mgを、液体窒素において凍結し、そしてEppendorf管において0.1cm3のMilli Ｑ水により均質化した。そのホモジネートを90℃に５分間、加熱し、次に14,000ｇで10分間、遠心分離した。透明な上清液を、TLCにより分析した：上清液２μｌを、シリカゲルＧ 1500（Schleicher ＆ Schuell）プレート上にスポットした。TLCプレートを、アセトン、水（９：１，ｖ／ｖ）、又はブタン−１−オール、プロパン−２−オール及び水（３：12：４，ｖ／ｖ）により２度、展開した。炭水化物を、尿素−リン酸によりTLCプレートを噴霧することによって可視化した（Wiseなど．1995）。
１−FFTアッセイ
葉組織（50mg）を液体窒素において凍結し、そして２モル／ｍ3のMgSO4，２モル／ｍ3のNa2EDTA，２モル／ｍ3のPMSF（Sigma，USA），２モル／ｍ3のDTT，1.5％（ｗ／ｖ）の可溶性PVPD（Merck）及び20モル／ｍ3のNa3S2O5を含む25モル／ｍ3のリン酸（Ｐ）緩衝液（pH6.5）0.1cm3により、Eppendorf管において均質化した。そのホモジネートを４℃で10分間、14,000ｇで遠心分離した。透明な上清液を、１−FFTアッセイのために使用した。50μｌの上清液を、２モル／ｍ3のＧ−（Ｆ）3，80モル／ｍ3のＧ−（Ｆ）4，50モル／ｍ3のクエン酸塩／リン酸塩緩衝液（pH5.5）及び0.02％（ｗ／ｖ）のNaN3を含むアッセイ混合物50μｌと共に混合した。そのアッセイ混合物を28℃で暗室においてインキュベートした。サンプル15μｌを、インキュベーションの４，20，44及び68時間後に採取し；そしてTLCにより分析した。
例
例１．スクロース：スクロースフルクトシルトランスフェラーゼ（１−SST）及びフルクタンフルクトシルトランスフェラーゼ（１−FFT）の精製及び１−SST及び１−FFTをコードするcDNAの単離
１−SST及び１−FFTを、ヘリアンタス  ツベロサスの塊茎から、沈殿枝法、いくつかの連続的クロマトグラフィー法及び電気泳動を用いて精製した。Mono Ｑカラムから溶出する、１−SST−活性を有する画分は、活性PAGEの後、１つのバンドを付与した。１−SSTをSDSにより分解し、従ってSDS PAGEによる分析は27及び55kDaの２種のバンドを生成した（図１、レーン２）。Superdex 75ゲル透過カラムから溶出する、１−FFT−活性を有する画分は、SDS PAGEに基づいて、70kDaの推定分子量を有する１つのバンドを付与した（図１、レーン３）。１−SSTのみが、単独の基質としてスクロースからオリゴフルクタンを合成することができた（図３Ａ，80時間のインキュベーション）。精製された１−FFTと精製された１−SSTとを組合すことによって、スクロースを、少なくとも15の重合程度を有するフルクタンに転換することができた〔Ｇ−（Ｆ）14，図３Ｂ，80時間のインキュベーション〕。
エドマン分解法（フェニルイソチオシアネート）によるアミノ酸配列決定のために、55kDa(１−SST)及び70kDa(１−FFT)タンパク質バンドを、SDS PAGEゲルから切り出し、そしてトリプシンによるタンパク質分解消化にゆだねた。得られるペプチド混合物を、別々の実験においてRP−HPLCにより分離した（図２Ａ−Ｃ）。26分及び37分後（両者とも１−SSTの25kDaフラグメントから、図２Ａ）、27分、34分及び37分後（１−SSTの55kDaフラグメントから、図２Ｂ）、28分及び32分後（１−FFTから、図２Ｃ、32分で溶出する画分はペプチド７及び８を含んだ）に溶出するペプチドを手動的に集め、そしてＮ−末端アミノ酸配列決定にゆだねた（表１）。
表１．１−SST（25及び55kDaのポリペプチド）及び１−FFTのトリプシン消化の後に得られる、選択されたペプチドのアミノ酸配列、及びRP-HPLCによるその得られるペプチド混合物の分離。
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アミノ酸配列２（１−SST，25kDa），６及び７（１−FFT）を用いて、PCRのために使用される１−SST又は１−FFTに対して特異的なDNAプライマーを消化した。プライマー２，６又は７を用いてのPCRは、それぞれ約450bp，800bp及び300bpのDNAを生成した。特異的プライマーとしてオリゴヌクレオチド７、及び鋳型として800bpのPCRフラグメントを用いての一連のPCRはまた、300bpのフラグメントが800bpのフラグメントに含まれることを示唆する300bpのPCRフラグメントを生成した。
Ｈ．ツベロサスの塊茎から単離されたmRNAから構成されたUni−ZAP cDNAライブラリーを、450bpの１−SST又は800bpの１−FFTフラグメントのいづれかによりスクリーンした。約100,000のcDNAクローンのスクリーニングは、450bpのフラグメントにハイブリダイズする約20の陽性クローン及び800bpのフラグメントにハイブリダイズする25のクローンを生成した。450bpのフラグメントにハイブリダイズするクローンのDNAは、800bpのフラグメントに対してハイブリダイズせず、そして逆もまた真である。陽性クローンを精製し、pBlnescript phagemidsをUni−ZAPベクターから切り出し、そして挿入体を制限酵素分析、ハイブリダイゼーション及び配列決定により特徴づけた。
１−SST及び１−FFTのDNA配列及びそれらの対応するアミノ酸配列は、それぞれ図４Ａ及び４Ｂに示される。１−SSTをコードする配列番号１は、1890個の塩基対の読み取り枠を有し、そして630個のアミノ酸残基のタンパク質をコードする。DNAレベルに基づけば、１−SSTは、ニンジン（Daucus carota）からの可溶性の酸性β−フルクトフラノシダーゼ（＝酸性インベルターゼ）cDNAとの68％の同一性を示す。アミノ酸レベルで、１−SSTは、ニンジンからの可溶性の酸性β−フルクトフラノシダーゼとの66％の類似性を示す。
１−FFTをコードする配列番号２は、1845個の塩基対の読み取り枠を有し、そして615個のアミノ酸残基及び約69kDaの分子量のタンパク質をコードする。これは、SDS−PAGEにより確立される場合、精製された１−FFTタンパク質の分子量に対応する（Koops and Jonker，1994）。DNAレベルに基づけば、１−FFTは、ニンジンからの可溶性の酸性β−フルクトフラノシダーゼ（＝酸性インベルターゼ）cDNAとの65％の同一性を示す。アミノ酸レベルで、１−FFTは、ニンジンからの可溶性の酸性β−フルクトフラノシダーゼと60％の類似性を示す。
１−SST及び１−FFTは酸性インベルターゼと比較的高い程度の相同性を有するが、１−SST又は１−FFT及びインベルターゼは明らかに異なった酵素であることが示された。１−SST及び１−FFTは、スクロースの加水分解（インベルターゼ活性）を触媒することができないことが示された。スクロースに対する、精製された１−SST及び１−FFTの加水分解活性を、広範囲のpH及びスクロース濃度で試験した。それらのいづれの条件下でも有意なインベルターゼ活性は存在しなかった（Koops and Jonker，1994）。68％よりも高い相同性は、１−SSTをコードするDNA配列とPDB，GENBANK，GENBANK最新情報、EMBL及びEMBL最新情報のヌクレオチド配列データベース内のいづれかの知られているDNA配列との間で観察されなかった。１−FFTをコードするDNA配列と、PDB，GENBANK，GENBANK最新情報、EMBL及びEMBL最新情報のヌクレオチド配列データベース内のいづれかの知られているDNA配列との間で、65％よりも高い相同性は観察されなかった。
例２．キメラ性sst遺伝子の構成
pSST103と称する、十分な長さのsst cDNAクローンを、PCRを用いて、ATG（位置34）でのNcoＩ部位及び停止コドン（位置1924）の下流でのEcoRＶの部位の導入のために使用した。増強されたCaMV35Ｓプロモーター、ALMVリーダー配列、uidA遺伝子及びnosターミネーター配列を含むプラスミドpMOG18（Penなど.，1992）からuidAコード配列をsst cDNAにより置換した。pMOG18を、BamHＩにより消化し、クレノウDNAポリメラーゼによりフィルインし、そしてNcoＩにより消化した。NcoＩ及びEcoRＩにより切断されたsst PCRフラグメントを、このベクター中に連結し、クローンpSST217をもたらした。完全なキメラ性構造体(enh．35Ｓ＋ALMV−sst−nos)を含むpSST217のEcoRＩ／HindIIフラグメントを、pBINPLUS（Van Engelenなど.，1995）、すなわちpBIN19（Bevan，1984）に由来する二元植物形質転換ベクターのEcoRＩ及びHindIII部位中にクローン化し、プラスミドpVS１をもたらした（図５Ａ）。
例３．キメラ性fft遺伝子の構成
pFFT111と称する、十分な長さのfft cDNAクローンを、PCRを用いて、ATG（位置29）でのNcoＩ部位及び停止コドン（位置1874）の下流でのBamHＩ部位の導入のために使用した。増強されたCaMV35Ｓプロモーター、ALMVリーダー配列、uidA遺伝子及びnosターミネーター配列を含むプラスミドpMOG18（Penなど.，1992）からuidAコード配列をfft cDNAにより置換した。NcoＩ及びBamHＩにより消化されたPCRフラグメントを、NcoＩ及びBamHＩにより消化されたpMOG18ベクター中に連結し、クローンpFFT209を得た。完全なキメラ性構造体(enh．35Ｓ＋ALMV−fft−nos)を含むpFFT209のHindIII／EcoRＩフラグメントを、pBINPLUS（Van Engelenなど.，1995）、すなわちpBIN19（Bevan，1984）に由来する二元植物形質転換ベクターのHindIII及びEcoRＩ部位中にクローン化し、プラスミドpVF１をもたらした（Fig ５Ｂ）。
例４．ペチュニア及びジャガイモ植物の形質転換
二元ベクターpVS１及びpVF１（図５）を、Ｅ．コリXL１−Blueからアグロバクテリウム  ツメファシエンス株AGLOに、三親性接合により接合した（Dittaなど.，1980）。非接合体を用いて、Horschなど.，（1985）により記載されるようにして、ペチュニアハイブリダ（Petunia hybrida）の葉ディスク（leaf discs）を形質転換した。その葉ディスクは、若い開花していない植物の上部の葉から調製された。Ｐ．ハイブリダ品種のW115もまた、形質転換実験に使用された。接合体はまた、前で記載されたように（Visser，1991）、二倍体ジャガイモ（ソラナムツベロサム（Solanum tuberosum），Kardal品種）の茎外植体を形質転換するために使用された。カナマイシン含有培地上での苗条及び根の再生の後、植物を土壌に置き、そして室温に移した。植物は、対照として作用する二元ベクターを欠いているアグロバクテリウム株AGLOにより処理された葉ディスク及び茎外植体から再生した（カナマイシンを含まない培地上で）。
例５．sst及びfft遺伝子を発現するトランスジェニック植物の分析
pVS１構造体を有する、約25のトランスジェニックペチュニア植物及び25のトランスジェニックのジャガイモ植物を再生し、そしてpVF１を有する25のトランスジェニックペチュニア及びジャガイモ植物を再生した。10のペチュニア及び10のジャガイモ植物を、二元ベクターを欠いているアグロバクテリウム株AGLOにより形質転換した。それらの植物は対照として用いられた。形質転換された植物から単離されたゲノムDNAのサザンロット分析は、導入されたキメラ性遺伝子の平均１〜５のコピーが組込まれたことを示した（データは示されていない）。
トランスジェニック植物の炭水化物組成を、２種の実質的に異なった技法：液体−液体隔壁に基づいて炭水化物を分離する薄層クロマトグラフィー（TLC）（TLC処理後、フルクタンはフルクトース特異的色彩反応により検出された）及び電荷に基づいてアルカリ性条件（pH13）下で炭水化物を分離し、そして金作用性電極による酸化により炭水化物を検出するHPAECにより分析した。pVS１を有するジャガイモ及びペチュニア植物からの葉抽出物の分析は、トランスジェニック植物種がSST活性の結果である生成物を含むことを示した。TLCは、ジャガイモの葉の抽出物に、少なくとも三糖Ｇ−（Ｆ）2及び最とも好ましくはまた四糖Ｇ−（Ｆ）3及び五糖Ｇ−（Ｆ）4の存在を示し、そしてそれらのオリゴフルクタンは対照植物においては不在であった（図６）。ジャガイモ及びまた、トランスジェニックＰ．ハイブリダ植物の葉抽出物におけるＧ−（Ｆ）2及びＧ−（Ｆ）3の存在は、HPAE分析により示された（図７及び８）。TLCよりも敏感且つより特異的であるHPAECはまた、トランスジェニックジャガイモに少量のＧ−（Ｆ）4を示した（図８）。図６〜８の結果は、sst遺伝子がＰハイブリダ及びジャガイモの両者において酵素的活性SSTタンパク質として発現されることを明確に示した。
pVF１構造体を有するトランスジェニック植物は、FFTがフルクタンの合成のための初期基質としてオリゴフルクタン（たとえば、Ｇ−（Ｆ）2又はＧ−（Ｆ）3）を必要とするので、フルクタンを含まなかった。オリゴフルクタンは、SST活性を欠いている植物、たとえば野生型ジャガイモ又はペチュニア、又はpVF１構造体を単に含むトランスジェニック植物においては存在しない。pVF１構造体を有するトランスジェニック植物におけるFFT活性の存在は、従って、FFT活性測定により確証される。トランスジェニックジャガイモにおける活性FFTの存在を評価するために使用されるFFTアッセイは、Ｇ−（Ｆ）4を犠牲にして、Ｇ−（Ｆ）n，ｎ＞４の合成を触媒するFFTの能力に基づかれた。pVF１構造体を有するジャガイモ植物からの全体の葉タンパク質抽出物を、Ｇ−（Ｆ）4含有アッセイ混合物と共に混合し、そして高い重合度（Ｇ−（Ｆ）n，ｎ＞４）を有するフルクタンの存在をTLCにより試験した。すでに、４時間のインキュベーションの後、４よりも高い重合度を有するフルクタン、たとえばＧ−（Ｆ）4，Ｇ−（Ｆ）5，Ｇ−（Ｆ）6，Ｇ−（Ｆ）7及びＧ−（Ｆ）8が検出され得たが、ところがそれらのフルクタンは対照混合物には不在であった（図９）。これは、またfft遺伝子が酵素的活性FFTタンパク質中に発現されることを示唆する。
図面の説明
図１．１−SST精製のMono Ｑ画分及びSDS−PAGEに基づく１−FFT精製のSuperdex HR75画分の分析。レーン１、分子量マーカー（MWはkDaで与えられる）；レーン２，１−SST活性を有するMono Ｑ画分；レーン３，１−FFT活性を有するSuperdex HR75画分。
図２．ａ．１−SSTの25kDaポリペプチド（Ａ）；ｂ．１−SSTの55kDaポリペプチド（Ｂ）；ｃ．１−FFTの70kDaポリペプチド（Ｃ）のトリプシン消化物のRP−HPLC分離。矢印により示される遊離溶出ペプチド画分を手動的に集め、そしてアミノ酸配列決定にゆだねた。
図３．精製された１−SST（Ａ）及び精製された１−SST及び精製された１−FFTの混合物（Ｂ）によりスクロースから合成されたオリゴフルクタンのHPAEC分離。その反応は、100モル／ｍ3のスクロース、２モル／ｍ3のDTT，10モル／ｍ3のクエン酸塩／リン酸塩緩衝液、pH5.0，0.01％のアジ化ナトリウムにおいて25℃で実施された。反応時間は、80時間であった。反応は、反応混合物を５分間、煮沸することによって停止された。ラムノースは、内部標準として使用された。
図４．単離された１−SST（Ａ）及び１−FFT（Ｂ）cDNAのヌクレオチド配列及び推定されるアミノ酸配列。精製された１−SST及び１−FFTタンパク質のアミノ酸配列決定（また、表１を参照のこと）により決定されたアミノ酸は下線が引かれている。
図５．遺伝子構造体pVS１（Ａ）及びpVF１（Ｂ）。キメラ構造体は、ALMV翻訳エンハンサー（Ｘ）、sst（Ｙ）又はfft（Ｗ）のコード配列、及びnos停止シグナル（Ｚ）、並びに増強されたCaMV35Ｓプロモーターから成る。クローニング工程に使用された制限部位は示されている。
図６．pSF１構造体を有するトランスジェニックジャガイモ植物におけるフルクタンのTLC分析。TLCプレートは、90％水性アセトンにおいて２度、展開された。Ｓ＝スクロース標準、Ｇ＝グルコース標準、Ｆ＝フルクトース標準、Ｈ＝Ｈ．ツベロサスの塊茎からの標準のフルクタン混合物、Ｎ＝Neosugar標準、Ｋ＝Ｇ−（Ｆ）2標準、No.１〜６は、pVS１構造体を有する個々のジャガイモ植物を示す。ＣはAGLO構造体を有する対照の植物である。
図７．pVS１構造体を有するペチュニアハイブリダの葉から抽出された炭水化物（ａ）、Ｈ．ツベロサスの塊茎から抽出された標準のフルクタン混合物（ｂ）、及びAGLO構造体を有する対照のペチュニアの葉からの炭水化物（ｃ）のHPAEC分離。
図８．pVS１構造体を有するジャガイモ（ソラナムツベロサム）の葉から抽出された炭水化物（ａ）、Ｈ．ツベロサスの塊茎から抽出された標準のフルクタン混合物（ｂ）、及びAGLO構造体を有する対照のジャガイモの葉からの炭水化物（ｃ）のHPAEC分離。
図９．pVF１構造体を有するトランスジェニックジャガイモ植物の葉のタンパク質抽出物によりＧ−（Ｆ）4から合成されたフルクタンのTLC分析。TLCプレートは、ブタン−１−オール、プロパン−２−オール及び水（３：12：４，ｖ／ｖ）において２度、展開された。Ｓ＝スクロース標準、Ｎ＝Neosugar標準、Ｈ＝Ｈ．ツベロサスの塊茎からの標準のフルクタン混合物。No.１〜８は、pVF１構造体を有する個々の異なったトランスジェニックジャガイモ植物を表わす。Ｃ1及びＣ2は、AGLO構造体を有する対照の植物である。
定義及び略語
フルクタン命名法はLewis（1993）に従っての通りである。
フルクトシル単位：他の糖分子（たとえば、グルコース、フルクトース又はガラクトース）に結合されるフルクトース分子。−Ｆ−（たとえば、Ｇ−Ｆ）又は−Ｆ−（たとえば、Ｇ−Ｆ−Ｆ）として短縮される。１つ以上のフルクトシル単位から成る分子（たとえば、Ｇ−Ｆ−Ｆ−Ｆ−Ｆ−Ｆ−Ｆ）に関しては、短縮された表記が用いられる〔Ｇ−（Ｆ）6〕又はGF6。Ｇ−（Ｆ）6は、１つのグルコシル及び６つのフルクトシル単位から成る。Ｇ−（Ｆ）6は１つのフルクトシル−グルコース結合及び５つのフルクトシル−フルクトース結合から成る。オリゴフルクタン：１，２又は３個のフルクトシル−フルクトース結合を有するいづれかの化合物（グルコースは存在できるが、しかし必ずしも必要ではない）。本出願において、用語オリゴフルクタンとは、SST−活性の生成物〔Ｇ−（Ｆ）2，Ｇ−（Ｆ）3及びＧ−（Ｆ）4〕を示すために使用された。オリゴフルクタンは、一般的に、短鎖のフルクタン又は低重合度のフルクタンとして示される。本出願において、オリゴフルクタンはまた、２，３又は４個のフルクトシル単位から成る化合物を包含する（但し、グルコシル単位は欠いている）。
フルクタン：１又は複数のフルクトシル−フルクトース結合がその結合の主要を構成するいづれかの化合物（グルコースは存在できるが、しかし必ずしも必要ではない）。フルクタンは、言及される物質が化学的に明確である列挙できる名詞として使用される（たとえば、フルクタンＧ−（Ｆ）2及びＧ−（Ｆ）13）。本出願においては、フルクタンは、FFT活性の生成物として定義される（Ｇ−Ｆn，２≦ｎ≦60）。特にことわらない限り、フルクタンはまた、オリゴフルクタンを包含する。フルクタンの制限されたグループを示すために、“Ｇ−Ｆn，ｎ＝・・”が使用される。本出願においては、フルクタンはまた、１よりも多くのフルクトシル単位から成る（但し、グルコシル単位は欠いている）化合物も包含する。
イヌリン：β−２，１−フルクトシル−フルクトース結合をほとんど有するフルクタン（グルコースは存在することができるが、しかし必ずしも必要ではない）。
レバン：β−２，１−フルクトシル−フルクトース結合をほとんど有するフルクタン（グルコースは許容されるが、しかし必ずしも必要ではない）。レバンはまた、細菌性フルクタンは必ずしも、優先的にβ−２，６−フルクトシル−フルクトース結合から成らないけれども、細菌起源からのフルクタンを示すためにも使用される。たとえば、バシラス  サブチラスからレバンスクラーゼにより合成されたフルクタンは、優先的にβ−２，１−フルクトシル−フルクトース結合（イヌリン）を有する。
レバンスクラーゼ：フルクタンの合成に包含される細菌起源の酵素。
スクロース：スクロース  フルクトシルトランスフェラーゼ（SST）：フルクタン合成の初期段階（反応２）を触媒する植物由来の酵素。酵素はまた、オリゴフルクタン〔Ｇ−（Ｆ）n，ｎ≦ｎ≦４〕の合成にも包含される（反応３）。本出願においては、標示SSTは、１−SST、すなわちβ−２，１−フルクトシル−フルクトース結合をほとんど有するオリゴフルクタンの生合成に関与するSST形；又は６−SST、すなわちβ−２，６−フルクトシル−フルクトース結合をほとんど有するオリゴフルクタンの生合成に関与するSST形；又は１−SST及び６−SSTのいづれかを包含することができる。
フルクタン：フルクタン  フルクトシルトランスフェラーゼ（FFT）：フルクタンの合成に関与する植物由来の酵素。オリゴフルクタン及び高い重合度のフルクタンの合成を触媒できる酵素。Ｈ．ツベロサスからのFFTは、Ｈ．ツベロサスからのSSTと重複する活性を有するが（反応３）、しかしフルクタン合成の初期段階を触媒できない（反応２）。本出願においては、表示FFTは、１−FFT、すなわちβ−２，１−フルクトシル−フルクトース結合をほとんど有するオリゴフルクタンの生合成に関与するFFT形；又は６−FFT、すなわちβ−２，６−フルクトシル−フルクトース結合をほとんど有するフルクタンの生合成に関与するFFT形；又は１−FFT及び６−FFTのいづれかを包含することができる。
インベルターゼ：β−フルコシダーゼ又はβ−フルコフラノシダーゼ。
重合度（DP）：フルクトシル及びグルコシル残基の合計量を示すための用語；たとえば、Ｇ−（Ｆ）2は、３つのDPを有する。Ｇ−（Ｆ）nにおけるｎ−値は、重合度の上昇と共に上昇する。
フルクタンプロフィール：植物、植物器官又は植物細胞由来の抽出物における、フルクタンのサイズ／分布のパターン又は他方では、フルクタンの相対量及び種類を説明するための用語。抽出物のフルクタンパターンを分析するために現在、最とも信頼できる方法は、高性能アニオン交換クロマトグラフィー及びパルスされたアンペロメトリック（amperometric）検出（Chatlertonなど.，1990）によるものである。
シコリウム  インチバス（Cichorium intybas）：チコリー。
HPLC：高性能液体クロマトグラフィー。化合物の複雑な混合物の分離のための技法。この技法の変法は、高性能逆相クロマトグラフィー（RP HPLC）、又はパルスされたアンペロメトリック検出と組合しての高性能アニオン交換クロマトグラフィー（HPAEC−PAD、たとえば図３を参照のこと）。
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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