(57)【要約】  本発明の課題は、小粒径でかつ高輝度の発光が可能な発光色素含有粒子及びそれを用いる病理診断用標識剤を提供することである。  本発明の発光色素含有粒子は、有機樹脂と発光色素とを含有する発光色素含有粒子であって、前記発光色素の含有量が前記有機樹脂を形成するモノマーと前記発光色素との総計に対して１０〜８０ｍｏｌ％の範囲内であり、平均粒径が１〜１００ｎｍの範囲内であることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機樹脂と発光色素とを含有する発光色素含有粒子であって、前記発光色素の含有量が前記有機樹脂を形成するモノマーと前記発光色素との総計に対して１０〜８０ｍｏｌ％の範囲内であり、平均粒径が１〜１００ｎｍの範囲内であることを特徴とする発光色素含有粒子。
【請求項２】
前記発光色素の含有量が、前記有機樹脂を形成するモノマーと前記発光色素との総計に対して２０〜６０ｍｏｌ％の範囲内であることを特徴とする請求項１に記載の発光色素含有粒子。
【請求項３】
前記発光色素のＡｌｏｇＰ値が、１０〜６０の範囲内であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の発光色素含有粒子。
【請求項４】
前記発光色素の自由体積率が、１０〜７０％の範囲内であることを特徴とする請求項１から請求項３までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子。
【請求項５】
前記発光色素含有粒子の水溶液中の吸光度の最大値が１．０となる濃度で、２５℃において測定した最大蛍光発光波長が、前記発光色素のメタノール又はエタノール中の吸光度の最大値が１．０となる濃度で、２５℃において測定した最大蛍光発光波長よりも５ｎｍ以上長波であることを特徴とする請求項１から請求項４までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子。
【請求項６】
前記発光色素が、下記一般式（Ａ１）又は一般式（Ｂ１）で表される構造を有することを特徴とする請求項１から請求項５までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子。
【化１】
2020075751.tif 000031
（式中、複数のＲ1は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を表し、少なくとも一つは炭素数が４〜３０の基を表す。ベンゼン環又はナフタレン環にさらに置換基を有してもよく、＊は、ベンゼン環又はナフタレン環に有しても良い置換基の位置を表す。）
【化２】
2020075751.tif 000032
（式中、Ｒ2は、置換若しくは無置換の、アルキル基、アリール基又はヘテロアリール基を表す。複数のＲ3は、それぞれ独立に、水素原子又は下記一般式（Ｂ２）で表される構造を有する基を表し、少なくとも１つが、下記一般式（Ｂ２）で表される構造を有する基を表す。ナフタレン環にさらに置換基を有してもよく、＊は、ナフタレン環に有しても良い置換基の位置を表す）
【化３】
2020075751.tif 000033
（式中、Ａｒは、アリール環又はヘテロアリール環を表す。Ｒ4はフェニル基以外の置換基を表す。一般式（Ｂ２）で表される基を二つ以上有する場合は、二つのＲ4同士が互いに連結していてもよい。Ｌは、単結合、酸素原子、硫黄原子又は−ＮＲ′−を表す。Ｒ′は、水素原子、アルキル基、アリール基又はヘテロアリール基を表す。）
【請求項７】
請求項１から請求項６までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子を用いることを特徴とする病理診断用標識剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は発光色素含有粒子及び病理診断用標識剤に関し、より詳しくは、小粒径でかつ高輝度の発光が可能な発光色素含有粒子及びそれを用いる病理診断用標識剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
病理染色用の発光色素含有粒子は、対象となる細胞の種類によって、粒子の粒径を制御できることと輝度を調整できることが求められる。【０００３】
生体内の分子の挙動を追う際には、分子より小型又はその運動を妨げない大きさ（５〜３００ｎｍ）の範囲内におさまり、顕微鏡で観察できる程度の発光量を放出可能な粒子を使って観察することが望ましい。また、シリカゲルでは内包させることのできる発光色素の選択性が限定されるのに対して、有機樹脂を用いれば様々な種類の発光色素を含有させることができる。【０００４】
生体内で目的の分子を発光色素含有粒子等で観察する場合には、対象が数百キロＤａのような巨大な分子であっても、タンパク質や薬剤などの構造上の単位であるドメインは１００ｎｍ以下であり、その挙動を詳しく調べるためには、１００ｎｍ以下の小粒径の粒子が必要とされる場合が多くあることがわかってきた。【０００５】
一般的に、粒径が大きい粒子（１５０〜２００ｎｍ）については、粒子の体積が大きいため、粒子を構成する有機樹脂に対して、十分な量の色素を含有させることが可能であり、輝度も検出感度に対して問題はない（例えば特許文献１参照）。
しかし、上述したように目的の分子や物質の挙動を詳しく調べるために１００ｎｍ以下の粒径のように粒径を小さくすると、観察対象であるタンパク質や薬剤などのサイズに近づくため、高精度で空間分解能が良い免疫染色をすることができる反面、顕微鏡で観察できる程度の十分な輝度が得られないことを見いだした。十分な輝度が得られない原因としては、粒径が小さくなると体積も小さくなるため、色素の含有量も少なくなってしまい、その結果として、輝度が低下し観察に十分な程度の発光量が得られないことが判明した。そこで本発明者は小粒径でありながら輝度を高めるために、鋭意検討の結果、粒子に発光色素をできるかぎり多く詰め込むことで輝度を向上させることを試みた。しかしながら、それでも輝度が向上しなかった。更なる検討の結果、発光色素を多く詰め込むことで、特許文献２に記載されているような濃度消光の現象が発生していることに思い至り、本発明に至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４２４９４６４号公報
【特許文献２】国際公開第２０１４／００６９８７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記問題・状況に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、小粒径でかつ高輝度の発光が可能な発光色素含有粒子及びそれを用いる病理診断用標識剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく、発光色素と樹脂との組み合わせを鋭意検討した結果、発光色素と有機樹脂を含有し、平均粒径が１〜１００ｎｍの範囲内の小粒径で、かつ、蛍光色素含有量が１０ｍｏｌ％以上８０ｍｏｌ％以下となる発光色素含有粒子を見いだし、本発明に至った。
すなわち、本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。【０００９】
１．有機樹脂と発光色素とを含有する発光色素含有粒子であって、前記発光色素の含有量が前記有機樹脂を形成するモノマーと前記発光色素との総計に対して１０〜８０ｍｏｌ％の範囲内であり、平均粒径が１〜１００ｎｍの範囲内であることを特徴とする発光色素含有粒子。【００１０】
２．前記発光色素の含有量が、前記有機樹脂を形成するモノマーと前記発光色素との総計に対して２０〜６０ｍｏｌ％の範囲内であることを特徴とする第１項に記載の発光色素含有粒子。【００１１】
３．前記発光色素のＡｌｏｇＰ値が、１０〜６０の範囲内であることを特徴とする第１項又は第２項に記載の発光色素含有粒子。【００１２】
４．前記発光色素の自由体積率が、１０〜７０％の範囲内であることを特徴とする第１項から第３項までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子。【００１３】
５．前記発光色素含有粒子の水溶液中の吸光度の最大値が１．０となる濃度で、２５℃において測定した最大蛍光発光波長が、前記発光色素のメタノール又はエタノール中の吸光度の最大値が１．０となる濃度で、２５℃において測定した最大蛍光発光波長よりも５ｎｍ以上長波であることを特徴とする第１項から第４項までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子。【００１４】
６．前記発光色素が、下記一般式（Ａ１）又は一般式（Ｂ１）で表される構造を有することを特徴とする第１項から第５項までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子。【００１５】
【化１】
2020075751.tif 000002
【００１６】
（式中、複数のＲ1は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を表し、少なくとも一つは炭素数が４〜３０の基を表す。ベンゼン環又はナフタレン環にさらに置換基を有してもよく、＊は、ベンゼン環又はナフタレン環に有しても良い置換基の位置を表す。）【００１７】
【化２】
2020075751.tif 000003
【００１８】
（式中、Ｒ2は、置換若しくは無置換の、アルキル基、アリール基又はヘテロアリール基を表す。複数のＲ3は、それぞれ独立に、水素原子又は下記一般式（Ｂ２）で表される構造を有する基を表し、少なくとも１つが、下記一般式（Ｂ２）で表される構造を有する基を表す。ナフタレン環にさらに置換基を有してもよく、＊は、ナフタレン環に有しても良い置換基の位置を表す）【００１９】
【化３】
2020075751.tif 000004
【００２０】
（式中、Ａｒは、アリール環又はヘテロアリール環を表す。Ｒ4はフェニル基以外の置換基を表す。一般式（Ｂ２）で表される基を二つ以上有する場合は、二つのＲ4同士が互いに連結していてもよい。
Ｌは、単結合、酸素原子、硫黄原子又は−ＮＲ′−を表す。
Ｒ′は、水素原子、アルキル基、アリール基又はヘテロアリール基を表す。）【００２１】
７．第１項から第６項までのいずれか一項に記載の発光色素含有粒子を用いることを特徴とする病理診断用標識剤。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の上記手段により、小粒径でかつ高輝度の発光が可能な発光色素含有粒子及びそれを用いる病理診断用標識剤を提供することができる。
本発明の効果の発現機構ないし作用機構については、明確にはなっていないが、以下のように推察している。【００２３】
色素は有機樹脂と弱い相互作用（例えば、ファンデルワールス力など）をしているが、その相互作用に基づき、小粒径でかつ高輝度の発光を可能にするための最適条件について以下考察する。
発光色素の含有量が１０ｍｏｌ％未満の場合、発光色素の量が少ないことから、輝度が不足し検出感度が低下する。発光色素の含有量が１０〜８０ｍｏｌ％である場合、発光色素と有機樹脂との間で十分な相互作用が働き、発光色素の適切な分散状態が維持されることから、発光色素の凝集や濃度消光が発生することなく多くの発光色素を保持することができる。発光色素の含有量が８０ｍｏｌ％を超えた場合、発光色素と有機樹脂との間で相互作用が働く箇所が減少し、発光色素と有機樹脂との間の相互作用が不十分であることから、発光色素の適切な分散状態が維持されず、発光色素の凝集や濃度消光が発生してしまう。
このため、本発明は小粒径でありながらも、発光色素が粒子中で凝集することを抑制し濃度消光が発生することを防止することができることから、高輝度の発光が可能な発光色素含有粒子を実現できるものと考えられる。
また、本発明は励起光により比較的長時間照射された場合においても、輝度の変動が少ないことから、優れた耐光性を実現できるものと考えられる。
さらに、発光色素含有粒子は、有機樹脂としては、生体組織との親和性の高い、親水性のものを使用することが好ましい。特に、親水性有機樹脂を使用した場合、疎水性色素を使用すれば、親水性有機樹脂中に一度取り込まれた疎水性色素は、水溶液中で有機樹脂と安定な相互作用を維持すると推察しており、より好ましいと考えている。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の発光色素含有粒子は、有機樹脂と発光色素とを含有する発光色素含有粒子であって、前記発光色素の含有量が前記有機樹脂を形成するモノマーと前記発光色素との総計に対して１０〜８０ｍｏｌ％の範囲内であり、平均粒径が１〜１００ｎｍの範囲内であることを特徴とする。この特徴は、下記各実施態様（形態）に共通する又は対応する技術的特徴である。
本発明の実施態様としては、多岐にわたる染色形態において濃度消光の発生を抑制し、適切な輝度を確保するとの観点から、発光色素の含有量が、前記有機樹脂を形成するモノマーと前記発光色素との総計に対して２０〜６０ｍｏｌ％の範囲内であることが好ましい。
【００２５】
また、発光色素のＡｌｏｇＰ値が、１０〜６０の範囲内であることが、粒子中に色素を多く含有し、かつ形成する有機樹脂中における発光色素が高い分散性を持つ効果が得られることから好ましい。
また、本発明においては、発光色素の自由体積率が１０〜７０％の範囲内であることが、色素の凝集を抑制しつつ粒子に多くの色素を詰め込むことができることから好ましい。
また、本発明においては、立体の嵩高い発光色素を使用することが、粒子中で発光色素が凝集しにくくなり、色素含有率が増えても濃度消光が抑制され輝度を向上させることができることから好ましい。
【００２６】
また、前記発光色素含有粒子の水溶液中の吸光度の最大値が１．０となる濃度で、２５℃において測定した最大蛍光発光波長が、前記発光色素のメタノール又はエタノール中の吸光度の最大値が１．０となる濃度で、２５℃において測定した最大蛍光発光波長よりも５ｎｍ以上長波であることが、粒子中で発光色素が有機樹脂との間にある強さの相互作用を保ち発光色素同士が凝集しない分散状態を安定した状態で保持される効果が得られることから好ましい。
【００２７】
また、本発明の実施態様としては、本発明の効果発現の観点から、発光色素が、前記一般式（Ａ１）又は一般式（Ｂ１）で表される構造を有すること好ましい。
本発明の発光色素含有粒子は、病理診断用標識剤に好適に用いることができる。
【００２８】
以下、本発明とその構成要素、及び本発明を実施するための形態・態様について詳細な説明をする。なお、本願において、「〜」は、その前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用する。
なお、本発明では、樹脂粒子とは、有機樹脂で構成される粒子をいう。
【００２９】
《発光色素含有粒子の概要》
本発明の発光色素含有粒子は、有機樹脂と発光色素とを含有する発光色素含有粒子であって、前記発光色素の含有量が前記有機樹脂を形成するモノマーと前記発光色素との総計に対して１０〜８０ｍｏｌ％の範囲内であり、平均粒径が１〜１００ｎｍの範囲内であることを特徴とする。
【００３０】
本発明において、発光色素含有粒子とは、単数又は複数の発光色素分子が化学的又は物理的な作用により樹脂粒子に固定化された構造を有する物質を総称する用語であり、その形態は特に限定されるものではない。発光色素は、その全てが有機樹脂と弱い相互作用で吸着していてもよく、またその一部が有機樹脂と共有結合で結合していてもよい。粒子中の有機樹脂と色素の存在状態としては、粒子全体で色素が有機樹脂中に均一に分散していることが、濃度消光が生じにくいことから好ましい。
【００３１】
（有機樹脂）
本発明において、有機樹脂とは、主鎖に炭素原子を含む分子量が３００以上の樹脂を表す。具体例としては、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリシクロヘキシレンジメチレンテレフタレート（ＰＣＴ）等のポリオレフィン樹脂、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリフェニレンサルファイド、ポリカーボネート、ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、アクリル系樹脂、アミノ系樹脂、ポリエステル系樹脂、エポキシ系樹脂、アクリル系樹脂とアミノ系樹脂の混合樹脂及びポリエステル系樹脂とアミノ系樹脂、セルロース樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリメタクリル酸メチル樹脂、ポリアクリロニトリル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ポリアルコール樹脂、ポリ酢酸アリル樹脂、ポリオキシメチレン樹脂、ポリ−ｎ−ブチルイソシアネート樹脂、ポリエチレンオキシド樹脂、６−ナイロン樹脂、ポリ−β−オキシプロピオン酸エステル樹脂、フェノール樹脂、尿素樹脂、メラミン樹脂、アルキッドメラミン樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリ（Ｎ−ビニルホルムアミド）樹脂、ポリ（Ｎ−ビニルイソブチルアミド）樹脂、ポリアクリル酸樹脂、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）樹脂、ポリ（Ｎ−ビニルピロリジノン）樹脂、ポリヒドロキシエチルメタクリレート樹脂、ポリオキシエチレンメタクリレート樹脂、ポリエチレングリコールジメチルエーテル樹脂、ポリスチレンスルホン酸樹脂などが挙げられる。
【００３２】
本発明の有機樹脂として、好ましくは、親水性の有機樹脂である。具体的には、尿素樹脂、メラミン樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリ（Ｎ−ビニルホルムアミド）樹脂、ポリ（Ｎ−ビニルイソブチルアミド）樹脂、ポリアクリル酸樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）樹脂、ポリ（Ｎ−ビニルピロリジノン）樹脂、ポリヒドロキシエチルメタクリレート樹脂、ポリオキシエチレンメタクリレート樹脂、ポリエチレングリコールジメチルエーテル樹脂、ポリスチレンスルホン酸樹脂などが好ましい。
【００３３】
本発明に係る有機樹脂は、熱硬化性樹脂であっても、熱可塑性樹脂であってもよい。例えば、キシレンのような有機溶媒を用いる透徹工程において発光色素が溶出しにくいという観点からは、緻密な架橋構造の内部に発光色素を固定化することができる、メラミン樹脂等の熱硬化性樹脂を含有する（のみからなる）有機樹脂が好ましい。
【００３４】
熱硬化性樹脂としては、例えば、メラミン、尿素、グアナミン類（ベンゾグアナミン、アセトグアナミンなどを含む）及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも一種のモノマーから形成される構成単位を含むものが挙げられる。これらのモノマーは、いずれか一種を単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。所望によりさらに、一種又は二種以上の上記化合物以外のコモノマーを併用してもよい。
熱硬化性樹脂の具体例としては、メラミン・ホルムアルデヒド樹脂、尿素・ホルムアルデヒド樹脂が挙げられる。
【００３５】
これらの熱硬化性樹脂の原料としては、上述したようなモノマーそのもののみならず、モノマーとホルムアルデヒドやその他の架橋剤等の化合物とをあらかじめ反応させて得られるプレポリマーを用いてもよい。例えば、メラミン・ホルムアルデヒド樹脂の製造においては一般的に、メラミンとホルムアルデヒドとをアルカリ条件下で縮合して調製されるメチロールメラミンがプレポリマーとして用いられており、当該化合物はさらにアルキルエーテル化（水中での安定性を向上させるためのメチル化、有機溶媒中での溶解性を向上させるためのブチル化等）されたものであってもよい。
【００３６】
また、上記の熱硬化性樹脂は、その構成単位に含まれる水素の少なくとも一部が、電荷を持つ置換基、又は共有結合を形成しうる置換基に置き換えられたものでもよい。このような熱硬化性樹脂は、公知の手法により少なくとも一つの水素が上記の置換基に置き換えられた（誘導体化された）モノマーを原料として用いることにより合成することができる。
【００３７】
このような熱硬化性樹脂は、公知の手法に従って合成することができる。例えば、メラミン・ホルムアルデヒド樹脂は、前述したようにしてあらかじめ調製されたメチロールメラミンを、必要に応じて酸等の反応促進剤を添加した上で加熱して重縮合させることにより合成することができる。
【００３８】
一方、熱可塑性樹脂としては、例えば、（メタ）アクリル酸及びそのアルキルエステル、アクリロニトリル、又はこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも一種の単官能モノマー（一分子中に重合反応に関与する基、上記の例ではビニル基を一個持つモノマー）から形成される構成単位を含むものが挙げられる。これらのモノマーは、いずれか一種を単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。所望によりさらに、一種又は二種以上の上記化合物以外のコモノマーを併用してもよい。上記の熱可塑性樹脂は、例えばジビニルベンゼンのような多官能モノマー（１分子中に重合反応に関与する基、上記の例ではビニル基を２個以上持つモノマー）から形成される構成単位、つまり架橋部位を含んでいてもよい。例えば、ポリメタクリル酸メチルの架橋物が挙げられる。
【００３９】
さらに、上記の熱可塑性樹脂は、本発明における発光色素含有粒子を表面修飾するための官能基を有する構成単位を含んでいてもよい。例えば、エポキシ基を有するメタクリル酸グリシジルのようなモノマーを原料とすることにより、エポキシ基が表面に配向した発光色素含有粒子を調製することができる。このエポキシ基は、過剰のアンモニア水と反応させることによりアミノ基に変換することができる。このようにして形成されるアミノ基には、公知の手法に従って（必要に応じてリンカーとなる分子を介して）、各種の生体分子を導入することができる。
【００４０】
本発明において、発光色素含有粒子中の発光色素の含有量は、次に示す方法によって算出した。
（１）特定の温度下で、メタノール又はエタノール中でのモル吸光係数を測定する（値をεとする）。特定の温度は、メタノール又はエタノールにおいて発光色素の溶解度が最も高い又は比較的高い温度に設定する。なお、メタノール又はエタノールは、発光色素に対して溶解度の高い方を選択する。
（２）（１）と同じ温度下で発光色素含有粒子の水溶液中での吸光度を測定し、発光色素含有粒子１ｇあたりの吸光度の値をＡとする。なお、発光色素含有粒子は、表面に生体関連結合性物質等が修飾されており、又は有機樹脂と発光色素以外の他の成分を含有するものであっても良い。
（３）（１）のεと（２）のＡの値から、発光色素含有粒子１ｇあたりの発光色素のモル数Ｃ［ｍｏｌ］を算出する。
Ａ／ε＝粒子１ｇあたりの発光色素量Ｃ［ｍｏｌ］
（４）発光色素の分子量（Ｍｄ）と（３）のＣ［ｍｏｌ］の値から、発光色素含有粒子１ｇあたりの発光色素量Ｄ［ｇ］を算出する。
【００４１】
Ｍｄ×Ｃ［ｍｏｌ］＝Ｄ［ｇ］／粒子１ｇ
（５）発光色素含有粒子１ｇから、発光色素含有粒子１ｇあたりの発光色素量Ｄ［ｇ］を引いた質量Ｅ（＝１−Ｄ［ｇ］）［ｇ］を、有機樹脂のモノマー単位の分子量（Ｍｐ）で除算し、その商を有機樹脂のモル数Ｅｍとして算出する。
なお、有機樹脂と発光色素以外にも他の成分が含有されている場合は、それぞれの成分について、当該成分の質量と分子量に基づいて当該成分のモル数を算出し、発光色素以外の各成分のモル数の総計を「色素以外の成分のモル数」として算出すれば良い。発光色素以外の各成分の質量を特定することができない場合は、発光色素以外の各成分の質量の総計を、有機樹脂のモノマー単位の分子量（Ｍｐ）で除算し、その商を「色素以外の成分のモル数」と見なしても良い。
Ｅ［ｇ］／Ｍｐ＝Ｅｍ［ｍｏｌ］
（６）発光色素含有粒子１ｇのモル数を算出し、それに対する発光色素の含有量（ｍｏｌ％）を算出する。
発光色素含有粒子１ｇのモル数＝発光色素含有粒子１ｇあたりの有機樹脂のモル数Ｅｍ［ｍｏｌ］＋発光色素含有粒子１ｇあたりの発光色素のモル数Ｃ［ｍｏｌ］
発光色素含有粒子中の発光色素の含有量（ｍｏｌ％）＝Ｃ／（Ｅｍ＋Ｃ）×１００
なお、有機樹脂と発光色素以外にも他の成分が含有されている場合は、「色素以外の成分のモル数」を発光色素含有粒子１ｇのモル数の代わりに使用し、「色素以外の成分のモル数」に対する発光色素の含有量（ｍｏｌ％）を算出すれば良い。また、発光色素含有粒子に複数種類の発光色素が含有されている場合は、それぞれの種類の発光色素について（１）〜（３）を行い当該種類の発光色素のモル数を算出し、各種類の発光色素のモル数の総計と発光色素含有粒子１ｇのモル数又は「色素以外の成分のモル数」との比を、発光色素の含有量（ｍｏｌ％）として算出すれば良い。
【００４２】
＜発光色素＞
本発明で用いる発光色素は、蛍光発光する色素でもリン光発光する色素でもどちらでもよい。発光色素として、例えば、ナフタレンイミド系色素分子、ペリレンイミド系色素分子、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ＮＢＤ系色素分子、ピレン系色素分子、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ系色素分子、シアニン系色素分子、スクアリリウム系色素、シアニン系色素、芳香族炭化水素系色素、オキサジン系色素、カルボピロニン系色素、ピロメセン系色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＤＹ系色素分子（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）系色素分子、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素分子等が挙げられる。
【００４３】
具体的には、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等を挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。特に好ましい発光色素として、ナフタレンイミド系色素分子、ペリレンイミド系色素分子を挙げることができる。
【００４４】
［イミド誘導体］
本発明に係る発光色素として、ナフタレンイミド系色素分子及びペリレンイミド系色素分子のイミド誘導体を挙げることができる。
これらの色素は、以下（Ａ）及び（Ｂ）に示す立体障害を起こす、かさ高い置換基を導入することにより、色素含有量を増やしても濃度消光が抑制され、発光量子収率が向上するという特徴を有している。このため、本発明に好適に用いることができる。以下ペリレンイミド誘導体を例にして説明する。
【００４５】
（Ａ）Ｎ−フェニルイミド構造のフェニル基のオルト位に比較的大きな置換基Ｒを導入する。
イミドのカルボニル基とＮ−フェニルイミド構造のフェニル基のオルト位に比較的大きな置換基との立体障害によりフェニル基がペリレン環に対して垂直に配向するため、オルト位の置換基Ｒが効果的にπ平面を遮蔽することができる。
【００４６】
（Ｂ）ペリレン環のベイエリアにオルト置換基Ｒを持つアリール基を導入する。
ペリレン環のベイエリアの立体的混み合いによりアリール基（この場合フェニル基）がペリレン環に対して垂直に配向するため、オルト位の置換基Ｒが効果的にπ平面を遮蔽することができる。
【００４７】
以下、一般式（Ａ１）又は一般式（Ｂ１）で表される構造を有する化合物について説明する。
［一般式（Ａ１）で表される構造を有するイミド誘導体］
【００４８】
【化４】
2020075751.tif 000005
【００４９】
（式中、複数のＲ1は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を表し、少なくとも一つは炭素数が４〜３０の基を表す。ベンゼン環又はナフタレン環にさらに置換基を有してもよく、＊は、ベンゼン環又はナフタレン環に有しても良い置換基の位置を表す。）
【００５０】
イミドの窒素原子に置換したフェニル基のオルト位にかさ高い（炭素数４以上）の置換基があることでπ平面（ここではナフタレン環）を遮蔽し、高い発光量子収率を示すことができる。
＊に示した位置に有しても良い置換基としては、特に制限されない。
具体的には、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基等）、シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等）、アルケニル基（例えば、ビニル基、アリル基等）、アルキニル基（例えば、エチニル基、プロパルギル基等）、芳香族炭化水素基アリール基（例えば、フェニル基、ｐ−クロロフェニル基、メシチル基、トリル基、キシリル基、ナフチル基、アントリル基、アズレニル基、アセナフテニル基、フルオレニル基、フェナントリル基、インデニル基、ピレニル基、ビフェニリル基等）、芳香族複素環基ヘテロアリール基（例えば、ピリジル基、ピリミジニル基、フリル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、ピラゾリル基、ピラジニル基、トリアゾリル基（例えば、１，２，４−トリアゾール−１−イル基、１，２，３−トリアゾール−１−イル基等）、ピラゾロトリアゾリル基、オキサゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、チアゾリル基、イソオキサゾリル基、イソチアゾリル基、フラザニル基、チエニル基、キノリル基、ベンゾフリル基、ジベンゾフリル基、ベンゾチエニル基、ジベンゾチエニル基、インドリル基、カルバゾリル基、カルボリニル基、ジアザカルバゾリル基（前記カルボリニル基のカルボリン環を構成する炭素原子の一つが窒素原子で置き換わったものを示す）、キノキサリニル基、ピリダジニル基、トリアジニル基、キナゾリニル基、フタラジニル基等）、複素環基（例えば、ピロリジル基、イミダゾリジル基、モルホリル基、オキサゾリジル基等）、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、オクチルオキシ基、ドデシルオキシ基等）、シクロアルコキシ基（例えば、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基等）、アリールオキシ基（例えば、フェノキシ基、ナフチルオキシ基等）、アルキルチオ基（例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基、ペンチルチオ基、ヘキシルチオ基、オクチルチオ基、ドデシルチオ基等）、シクロアルキルチオ基（例えば、シクロペンチルチオ基、シクロヘキシルチオ基等）、アリールチオ基（例えば、フェニルチオ基、ナフチルチオ基等）、アルコキシカルボニル基（例えば、メチルオキシカルボニル基、エチルオキシカルボニル基、ブチルオキシカルボニル基、オクチルオキシカルボニル基、ドデシルオキシカルボニル基等）、アリールオキシカルボニル基（例えば、フェニルオキシカルボニル基、ナフチルオキシカルボニル基等）、スルファモイル基（例えば、アミノスルホニル基、メチルアミノスルホニル基、ジメチルアミノスルホニル基、ブチルアミノスルホニル基、ヘキシルアミノスルホニル基、シクロヘキシルアミノスルホニル基、オクチルアミノスルホニル基、ドデシルアミノスルホニル基、フェニルアミノスルホニル基、ナフチルアミノスルホニル基、２−ピリジルアミノスルホニル基等）、アシル基（例えば、アセチル基、エチルカルボニル基、プロピルカルボニル基、ペンチルカルボニル基、シクロヘキシルカルボニル基、オクチルカルボニル基、２−エチルヘキシルカルボニル基、ドデシルカルボニル基、フェニルカルボニル基、ナフチルカルボニル基、ピリジルカルボニル基等）、アシルオキシ基（例えば、アセチルオキシ基、エチルカルボニルオキシ基、ブチルカルボニルオキシ基、オクチルカルボニルオキシ基、ドデシルカルボニルオキシ基、フェニルカルボニルオキシ基等）、アミド基（例えば、メチルカルボニルアミノ基、エチルカルボニルアミノ基、ジメチルカルボニルアミノ基、プロピルカルボニルアミノ基、ペンチルカルボニルアミノ基、シクロヘキシルカルボニルアミノ基、２−エチルヘキシルカルボニルアミノ基、オクチルカルボニルアミノ基、ドデシルカルボニルアミノ基、フェニルカルボニルアミノ基、ナフチルカルボニルアミノ基等）、カルバモイル基（例えば、アミノカルボニル基、メチルアミノカルボニル基、ジメチルアミノカルボニル基、プロピルアミノカルボニル基、ペンチルアミノカルボニル基、シクロヘキシルアミノカルボニル基、オクチルアミノカルボニル基、２−エチルヘキシルアミノカルボニル基、ドデシルアミノカルボニル基、フェニルアミノカルボニル基、ナフチルアミノカルボニル基、２−ピリジルアミノカルボニル基等）、ウレイド基（例えば、メチルウレイド基、エチルウレイド基、ペンチルウレイド基、シクロヘキシルウレイド基、オクチルウレイド基、ドデシルウレイド基、フェニルウレイド基ナフチルウレイド基、２−ピリジルアミノウレイド基等）、スルフィニル基（例えば、メチルスルフィニル基、エチルスルフィニル基、ブチルスルフィニル基、シクロヘキシルスルフィニル基、２−エチルヘキシルスルフィニル基、ドデシルスルフィニル基、フェニルスルフィニル基、ナフチルスルフィニル基、２−ピリジルスルフィニル基等）、アルキルスルホニル基（例えば、メチルスルホニル基、エチルスルホニル基、ブチルスルホニル基、シクロヘキシルスルホニル基、２−エチルヘキシルスルホニル基、ドデシルスルホニル基等）、アリールスルホニル基又はヘテロアリールスルホニル基（例えば、フェニルスルホニル基、ナフチルスルホニル基、２−ピリジルスルホニル基等）、アミノ基（例えば、アミノ基、エチルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジフェニルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジタートブチル基、シクロヘキシルアミノ基、ブチルアミノ基、シクロペンチルアミノ基、２−エチルヘキシルアミノ基、ドデシルアミノ基、アニリノ基、ナフチルアミノ基、２−ピリジルアミノ基等）、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等）、フッ化炭化水素基（例えば、フルオロメチル基、トリフルオロメチル基、ペンタフルオロエチル基、ペンタフルオロフェニル基等）、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、メルカプト基、シリル基（例えば、トリメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリフェニルシリル基、フェニルジエチルシリル基等）、ホスホノ基、カルボキシ基、スルホ基が挙げられる。
【００５１】
また、これらの置換基は、上記の置換基によってさらに置換されていてもよい。さらに、これらの置換基同士が結合して環を形成してもよい。隣接する置換基同士が形成する環状構造は、芳香環であっても脂肪環であってもよく、またヘテロ原子を含むものであってもよく、さらに環状構造は２環以上の縮合環であってもよい。
好ましくは、＊の位置には置換基を有しないか、又は置換基がアルキル基、ハロゲン原子シアノ基、二つカルボン酸が縮合したカルボン酸無水物、若しくは基置換基同士が結合した縮合環である。
【００５２】
Ｒ1は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を表し、少なくとも一つは炭素数が４〜３０の基を表す。
Ｒ1で示される置換基は、具体的には、＊が有してもよい上記の置換基の中から選ぶことができるが、少なくとも一つは、炭素数が４〜３０の基である。炭素数が４〜３０の基であることによって、イミドのカルボニル基とＲ1との立体障害により窒素原子に置換したフェニル基がナフタレン環に対して垂直に配向するため、オルト位の置換基Ｒ1が効果的にπ平面を遮蔽することができる。また、Ｒ1は、炭素鎖中に酸素原子又は硫黄原子を有することが好ましい。より好ましくは、炭素鎖中に酸素原子を有することである。炭素鎖中に酸素原子又は硫黄原子を有するにより、より柔軟な構造となり、Ｒ1によるπ平面の遮蔽効果を高めることができる。
【００５３】
Ｒ1は好ましくは、アルキル基（例えば、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、３−エチルペンチル等）、シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルエチル等）、アルケニル基（例えば、プロぺニル基、ヘキセニル基等）、アルキニル基（例えば、プロピニル基、ヘキシニル基、フェニルエチニル等）、アリール基（例えば、フェニル基、ｐ−クロロフェニル基、メシチル基、トリル基、キシリル基、ナフチル基、アントリル基、アズレニル基、アセナフテニル基、フルオレニル基、フェナントリル基、インデニル基、ピレニル基、ビフェニリル基等）、ヘテロアリール基（例えば、ピリジル基、ピリミジニル基、フリル基、ピロリル基、ベンゾイミダゾリル基、ピラゾリル基、ピラジニル基、ベンゾオキサゾリル基、チエニル基、キノリル基、ベンゾフリル基、ジベンゾフリル基、ベンゾチエニル基、ジベンゾチエニル基、インドリル基、カルバゾリル基、カルボリニル基、ジアザカルバゾリル基（前記カルボリニル基のカルボリン環を構成する炭素原子の一つが窒素原子で置き換わったものを示す）、キノキサリニル基、ピリダジニル基、トリアジニル基、キナゾリニル基、フタラジニル基等）、複素環基（例えば、ピロリジル基、イミダゾリジル基、モルホリル基、オキサゾリジル基等）、アルコキシ基（例えば、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、オクチルオキシ基、ドデシルオキシ基、２−エチルブチルオキシ等）、シクロアルコキシ基（例えば、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基等）、アリールオキシ基（例えば、フェノキシ基、ナフチルオキシ基等）、アルキルチオ基（例えば、ペンチルチオ基、ヘキシルチオ基、オクチルチオ基、ドデシルチオ基等）、シクロアルキルチオ基（例えば、シクロペンチルチオ基、シクロヘキシルチオ基等）、アリールチオ基（例えば、フェニルチオ基、ナフチルチオ基等）、アルコキシカルボニル基（例えば、ブチルオキシカルボニル基、オクチルオキシカルボニル基、ドデシルオキシカルボニル基等）、アリールオキシカルボニル基（例えば、フェニルオキシカルボニル基、ナフチルオキシカルボニル基等）、スルファモイル基（例えば、ブチルアミノスルホニル基、ヘキシルアミノスルホニル基、シクロヘキシルアミノスルホニル基、オクチルアミノスルホニル基、ドデシルアミノスルホニル基、フェニルアミノスルホニル基、ナフチルアミノスルホニル基、２−ピリジルアミノスルホニル基等）、アシル基（例えば、ブチルカルボニル基、ペンチルカルボニル基、シクロヘキシルカルボニル基、オクチルカルボニル基、２−エチルヘキシルカルボニル基、ドデシルカルボニル基、フェニルカルボニル基、ナフチルカルボニル基、ピリジルカルボニル基等）、アシルオキシ基（例えば、ブチルカルボニルオキシ基、オクチルカルボニルオキシ基、ドデシルカルボニルオキシ基、フェニルカルボニルオキシ基等）、アミド基（例えば、プロピルカルボニルアミノ基、ペンチルカルボニルアミノ基、シクロヘキシルカルボニルアミノ基、２−エチルヘキシルカルボニルアミノ基、オクチルカルボニルアミノ基、ドデシルカルボニルア��ノ基、フェニルカルボニルアミノ基、ナフチルカルボニルアミノ基等）、カルバモイル基（例えば、ジエチルアミノカルボニル基、プロピルアミノカルボニル基、ペンチルアミノカルボニル基、シクロヘキシルアミノカルボニル基、オクチルアミノカルボニル基、２−エチルヘキシルアミノカルボニル基、ドデシルアミノカルボニル基、フェニルアミノカルボニル基、ナフチルアミノカルボニル基、２−ピリジルアミノカルボニル基等）、ウレイド基（例えば、ペンチルウレイド基、シクロヘキシルウレイド基、オクチルウレイド基、ドデシルウレイド基、フェニルウレイド基ナフチルウレイド基、２−ピリジルアミノウレイド基等）、スルフィニル基（例えば、ブチルスルフィニル基、シクロヘキシルスルフィニル基、２−エチルヘキシルスルフィニル基、ドデシルスルフィニル基、フェニルスルフィニル基、ナフチルスルフィニル基、２−ピリジルスルフィニル基等）、アルキルスルホニル基（例えば、ブチルスルホニル基、シクロヘキシルスルホニル基、２−エチルヘキシルスルホニル基、ドデシルスルホニル基等）、アリールスルホニル基又はヘテロアリールスルホニル基（例えば、フェニルスルホニル基、ナフチルスルホニル基、２−ピリジルスルホニル基等）、アミノ基（例えば、ジフェニルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、シクロヘキシルアミノ基、ブチルアミノ基、シクロペンチルアミノ基、２−エチルヘキシルアミノ基、ドデシルアミノ基、アニリノ基、ナフチルアミノ基、２−ピリジルアミノ基等）フッ化炭化水素基（例えば、デカフルオロブチル基、ペンタフルオロフェニル基等）シリル基（例えば、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリフェニルシリル基、フェニルジエチルシリル基等）である。
【００５４】
Ｒ1は嵩高い基であることがより好ましく、アリール基、ヘテロアリール基、２級以上の炭素が含まれるアルキル基（例えば２級炭素：イソブチル基、シクロヘキシル基、シクロペンチル基、コレステリル基、３級炭素：ｔｅｒｔ−ブチル基、アダマンチル基、［２，２，２］ビシクロオクチル基等）、３級アミノ基（例えば、ジエチルアミノ基、ジフェニルアミノ基等）、３級シリル基（例えば、トリイソプロピルシリル基、トリフェニルシリル基、フェニルジエチルシリル基等）などが挙げられる。アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アシル基、アシルオキシ基、アミド基の末端にこのようなかさ高い基を有することもできる。
【００５５】
［一般式（Ａ２−１）〜一般式（Ａ２−６）で表される構造を有するイミド誘導体］
一般式（Ａ１）で表される構造を有するイミド誘導体が、下記一般式（Ａ２−１）〜一般式（Ａ２−６）で表される構造を有することが好ましい。
【００５６】
【化５】
2020075751.tif 000006
【００５７】
（式中、複数のＲ1は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を表し、少なくとも一つは炭素数が４〜３０の基を表す。Ｒ5、Ｒ6及びＲ7は、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基又はアリールオキシ基を表す。
【００５８】
［一般式（Ａ３）で表される構造を有するイミド誘導体］
一般式（Ａ２−２）で表される構造を有するイミド誘導体が、下記一般式（Ａ３）で表される構造を有することが好ましい。
【００５９】
【化６】
2020075751.tif 000007
【００６０】
（式中、複数のＲ1は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を表し、少なくとも一つは炭素数が４〜３０の基を表す。複数のＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基又はアリールオキシ基を表す。Ｒ6は、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基又はアリールオキシ基を表す。）
ペリレンビスイミド誘導体は、高い発光量子収率を示すだけでなく、高い耐光性を示すため望ましい。
【００６１】
Ｒ5は、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基又はアリールオキシ基を表し、一般式（Ａ２）で示したＲ5と同義である。
Ｒ6は、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基又はアリールオキシ基を表し、一般式（Ａ２）で示したＲ6と同義である。
【００６２】
［一般式（Ａ４）で表される構造を有するイミド誘導体］
一般式（Ａ３）で表される構造を有するイミド誘導体が、下記一般式（Ａ４）で表される構造を有することが好ましい。
【００６３】
【化７】
2020075751.tif 000008
【００６４】
（式中、複数のＲ1は、それぞれ独立に、水素原子又は置換基を表し、少なくとも一つは炭素数が４〜３０の基を表す。）
ベイエリアがフェノキシ基の場合、溶解性の向上及び波長の長波長化できることから蛍光色素として望ましい。
Ｒ1は、それぞれ独立に、水素原子置換基を表し、少なくとも一つは炭素数が４〜３０の基を表し、
【００６５】
［一般式（Ｂ１）で表される構造を有するイミド誘導体］
本発明のイミド誘導体は、一般式（Ｂ１）で表される構造を有することが好ましい。
【００６６】
【化８】
2020075751.tif 000009
【００６７】
（式中、Ｒ2は、置換若しくは無置換の、アルキル基、アリール基又はヘテロアリール基を表す。複数のＲ3は、それぞれ独立に、水素原子又は下記一般式（Ｂ２）で表される構造を有する基を表し、少なくとも１つが、下記一般式（Ｂ２）で表される構造を有する基を表す。ナフタレン環にさらに置換基を有してもよく、＊は、ナフタレン環に有しても良い置換基の位置を表す）
【００６８】
【化９】
2020075751.tif 000010
【００６９】
（式中、Ａｒは、アリール環又はヘテロアリール環を表す。Ｒ4はフェニル基以外の置換基を表す。一般式（Ｂ２）で表される基を二つ以上有する場合は、二つのＲ4同士が互いに連結していてもよい。Ｌは、単結合、酸素原子、硫黄原子又は−ＮＲ′−を表す。Ｒ′は、水素原子、アルキル基、アリール基又はヘテロアリール基を表す。）
【００７０】
Ａｒで表したアリール環又はヘテロアリール環のオルト置換基Ｒ4がペリレン環に向かって配向し、効果的にπ平面を遮蔽するため高い量子収率を示すことができる。
Ａｒは、置換基を有しても良いアリール環又はヘテロアリール環を表し、アリール環としては、例えば、ベンゼン環、ナフタレン環、アズレン環、アントラセン環、フェナントレン環、ナフタセン環及びピレン環等を挙げることができる。
ヘテロアリール環としては、ピリジン環、ピリミジン環、フラン環、ピロール環、イミダゾール環、ベンゾイミダゾール環、ピラゾール環、ピラジン環、トリアゾール環、ピラゾロトリアゾール環、オキサゾール環、ベンゾオキサゾール環、チアゾール環、チオフェン環、キノリン環、ベンゾフラン環、ジベンゾフラン環、インドール環、キノキサリン環、トリアジン環等を挙げることができる。
Ａｒは、アリール環を表すことが好ましい。
【００７１】
Ｒ4はフェニル基以外の置換基を表し、一般式（Ａ１）において、＊が有してもよい置換基からフェニル基以外の基を選択することができる。
Ｒ′で表されるアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基は、一般式（Ａ１）において、＊が有してもよい置換基として挙げたアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基と同義である。
【００７２】
Ｒ4は、好ましくはアルキル基（例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、へキシル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソブチル基、ネオペンチル基）、シクロアルキル基（例えばシクロペンチル基、シクロヘキシル基）、フェニル基を除くアリール基（例えばナフチル基、アントリル基）、ヘテロアリール基（例えばピリジル基、カルバゾリル基）、アルケニル基（例えばブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基）、アルキニル基（例えばプロピニル基、ヘキシニル基、フェニルエチニル基、トリメチルシリルエチニル基）、シリル基（例えばトリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリフェニルシリル基）、アルコキシ基（メトキシ基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ基）又はアリールオキシ基（フェノキシ基、ナフトキシ基）である。
【００７３】
［一般式（Ｂ３−１）〜一般式（Ｂ３−４）で表される構造を有するイミド誘導体］
一般式（Ｂ１）で表される構造を有するイミド誘導体が、下記一般式（Ｂ３−１）〜一般式（Ｂ３−４）で表される構造を有することが好ましい。
【００７４】
【化１０】
2020075751.tif 000011
【００７５】
（式中、Ｒ2は、それぞれ独立に、置換若しくは無置換の、アルキル基、アリール基又はヘテロアリール基を表す。複数のＲ3は、それぞれ独立に、水素原子又は前記一般式（Ｂ２）で表される構造を有する基を表し、少なくとも１つが、前記一般式（Ｂ２）で表される構造を有する基を表す。Ｒ8及びＲ9は、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルコキシ基又はアリールオキシ基を表す。）
【００７６】
Ｒ2及びＲ3は、一般式（Ｂ１）におけるＲ2及びＲ3と同義である。
Ｒ8及びＲ9で表されるアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルコキシ基及びアリールオキシ基は、一般式（Ａ１）において、＊が有してもよい置換基として挙げたアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルコキシ基及びアリールオキシ基と同義である。
【００７７】
［一般式（Ｂ４）で表される構造を有するイミド誘導体］
前記一般式（Ｂ３−１）で表される構造を有するイミド誘導体が、下記一般式（Ｂ４）で表される構造を有することが好ましい。
【００７８】
【化１１】
2020075751.tif 000012
【００７９】
（式中、複数のＲ2は、それぞれ独立に、置換若しくは無置換の、アルキル基、アリール基又はヘテロアリール基を表す。Ｒ4はフェニル基以外の置換基を表す。Ｒ4同士が互いに連結していてもよい。Ｒ11は、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アミノ基、アシル基、アシルオキシ基、アミド基、カルボキシ基又はスルホ基を表す。）
ベイエリア４カ所全てがフェノキシ基の場合、置換基Ｒ4が、それぞれペリレン環の上下に配向し、遮蔽効果が高まるため望ましい。
Ｒ2及びＲ4は、それぞれ一般式（Ｂ１）におけるＲ2及びＲ4と同義である。
【００８０】
更に、前記一般式（Ｂ４）において、Ｒ4のいずれか２つがペリレン上を横断し連結していることが望ましい。連結することによりペリレン環同士の相互作用を効果的に阻害し、より高い発光量子収率を示す。
【００８１】
さらに、本発明の発光色素として、好ましくは、ＡｌｏｇＰ値が１０〜６０の範囲内である発光色素含有粒子色素であり、より好ましくは、１５．５〜４５．０の範囲内である。
【００８２】
ＡｌｏｇＰ値とは、Ｇｈｏｓｅ−Ｃｒｉｐｐｅｎ−Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｎ  ｏｃｔａｎｏｌ−ｗａｔｅｒ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔのことであり、ｌｏｇＰ値の予想値である。ｌｏｇＰ値とは、化合物の疎水性を規定する無次元数の指標であり、一般的に、ｎ−オクタノールと水を用いたオクタノール／水の分配係数で表される。値が大きいほど疎水性が高い。本明細書のＡｌｏｇＰ値は、非特許文献１（Ｇｈｏｓｅ，  Ａｒｕｐ  Ｋ．，  Ｖｅｌｌａｒｋａｄ  Ｎ．  Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｎ，  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｊ．  Ｗｅｎｄｏｌｏｓｋｉ，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａ  １９９８，  １０２，  ３７６２．）に記載の手法を用いて、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社の計算ソフトＣＡＮＶＡＳを使って計算した。
【００８３】
ＡｌｏｇＰ値が１０未満の場合、色素が親水的であり、有機樹脂に一旦導入された色素が水中に漏れ出してしまうことから、発光色素含有粒子の色素含有量が減少し、蛍光発光輝度が不足してしまう。ＡｌｏｇＰ値が１０以上であれば、色素の疎水性が比較的高いため、有機樹脂に一旦導入された色素が水中に漏れ出すことが抑制される。一方、ＡｌｏｇＰ値が６０を超えると、色素の疎水性が高すぎるため、溶解する有機溶媒の種類が極端に制限され、また色素を含有する有機樹脂と混合しなくなり、粒子中に取り込まれなくなる恐れがある。ＡｌｏｇＰ値が６０以下であれば、有機溶媒の種類が極端に制限され、また色素が有機樹脂と混合しなくなり粒子中に取り込まれなくなることが抑制される。
【００８４】
本発明の発光色素は、自由体積率が１０〜７０％の範囲内であることが好ましい。より好ましくは、１５〜６０％の範囲内である。自由体積率とは、一定温度・圧力下で，分子自身がもつ単位質量当たりの体積から，その分子の占有している体積を差し引いた残りの体積の比率を表す。自由体積率が１０％未満である場合、発光色素の立体構造が平面状あるため、粒子中で凝集しやすく濃度消光が起こりやすい。自由体積率が７０％以上である場合には、発光色素１分子が占める体積が大きすぎて、粒子中に含有できる発光色素量がかえって低下してしまう。本明細書の自由体積率は、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社のＭａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓｕｉｔｅ）を使って、単位体積に対して、分子が占める占有体積を自由体積率として計算した。
【００８５】
また、発光色素の発光波長は用途に応じて所望のものを選択することができる。例えば、病理診断において、エオジン等を用いた形態観察用の染色と同時に発光色素を用いた免疫染色を行う用途が想定される場合は、発光色素からの発光を目視で観察することができ、かつ蛍光を発するエオジンの発光波長と被らないよう、発光色素の発光波長は赤〜近赤外とすることが好適である。例えば、励起極大波長が５５５〜６２０ｎｍ、発光極大波長が５８０〜７７０ｎｍの範囲にある発光色素が好ましい。
【００８６】
（例示化合物）
本発明において用いることのできる発光色素の具体例は次の通りであるが、本発明はこれらの発光色素を用いる実施形態に限定されるものではない。
【００８７】
【化１２】
2020075751.tif 000013
【００８８】
【化１３】
2020075751.tif 000014
【００８９】
【化１４】
2020075751.tif 000015
【００９０】
【化１５】
2020075751.tif 000016
【００９１】
【化１６】
2020075751.tif 000017
【００９２】
【化１７】
2020075751.tif 000018
【００９３】
【化１８】
2020075751.tif 000019
【００９４】
【化１９】
2020075751.tif 000020
【００９５】
【化２０】
2020075751.tif 000021
【００９６】
【化２１】
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【００９７】
【化２２】
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【００９８】
【化２３】
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【００９９】
【化２４】
2020075751.tif 000025
【０１００】
【化２５】
2020075751.tif 000026
【０１０１】
本発明に係る発光色素として、発光色素含有粒子の水溶液中の吸光度の最大値が１．０となる濃度で２５℃において測定した最大蛍光発光波長が、発光色素単独のメタノール又はエタノール中、吸光度の最大値が１．０となる濃度で２５℃において測定した最大蛍光発光波長よりも５ｎｍ以上長波となるような発光色素を使ったときに、特に輝度が高くなることを見いだした。
【０１０２】
本発明の効果の発現機構・作用機構については明確にはなっていないが、おそらく、色素が有機樹脂と弱い相互作用（例えば、ファンデルワールス力など）をしており、有機樹脂、特に、親水性有機樹脂中に一度取り込まれた疎水性色素は、水溶液中で有機樹脂と安定な相互作用を維持すると推察している。なお、メタノール又はエタノールは、発光色素に対して溶解度の高い方を選択することができる。
【０１０３】
本発明の発光色素粒子は、有機樹脂と発光色素は弱い相互作用で吸着していてもよく、有機樹脂と発光色素が共有結合で結合していてもよい。
本発明においては、色素どうしの分子内相互作用よりも有機樹脂と色素の相互作用が強いほうが好ましい。
粒子中の有機樹脂と色素の存在状態としては、粒子全体で色素が有機樹脂中に均一に分散していることが好ましい。色素が局在化すると濃度消光が生じやすい。
【０１０４】
＜発光色素含有粒子の製造方法＞
本発明の発光色素含有粒子は、発光色素として特定の条件を満たすものを用いた上で、各種の有機樹脂について公知の重合工程（１）に準じて製造することができる。また、そのような方法により得られた発光色素含有粒子は、さらに修飾工程（２）により、生体関連結合性物質を連結させてもよい。
【０１０５】
熱硬化性樹脂を用いた発光色素含有粒子は、基本的に乳化重合法に従って製造することができるが、界面活性剤及び重合反応促進剤を用いる次のような重合工程により製造することが好ましい。なお、このような製造方法により得られる発光色素含有粒子において、発光色素の大部分が、望ましくは実質的に全てが樹脂粒子に含有された状態で固定化されるが、一部の発光色素が樹脂粒子の表面に結合ないし付着した状態で固定化されることが排除されるものではない。また、発光色素が含有された状態において、どのような化学的又は物理的な作用で発光色素が樹脂粒子に固定化されているかは限定されるものではない。本発明では、重合工程に先立って、樹脂原料と発光色素とをあらかじめ共有結合させたり、樹脂原料に積極的に荷電した置換基を導入したりするための誘導体化工程を設ける必要はない（そのような工程を用いなくても、発光強度や耐光性に優れた発光色素含有粒子が得られる）が、所望によりそのような工程を併用することも排除されるものではない。
【０１０６】
（１）重合工程
重合工程は、発光色素、樹脂原料（モノマー又はオリゴマーないしプレポリマー）、好ましくはさらに界面活性剤及び重合反応促進剤を含有する反応混合物を加熱して樹脂の重合反応を進行させ、発光色素を含有する樹脂粒子を生成させる工程である。
【０１０７】
反応混合物に含まれる各成分の添加順序は特に限定されるものではない。典型的には、発光色素の水溶液に界面活性剤を添加し、続いて樹脂原料を添加し、最後に重合反応促進剤を添加するという順序が用いられる。あるいは、界面活性剤の水溶液に樹脂原料を添加し、続いて重合反応促進剤を添加して樹脂粒子の合成反応を進行させながら、発光色素の水溶液を添加するという順序であってもよい。なお、このような重合工程に用いられる、本発明による特定の発光色素の水溶液の濃度は、従来の発光色素の水溶液の濃度よりも比較的高めの範囲（例えば２５０〜４５０μＭ）で調節することができる。
重合反応の条件（温度、時間等）は、樹脂の種類、原料混合物の組成などを考慮しながら適切に設定することができる。
【０１０８】
重合方法としては、公知の重合方法であれば特に限定されるものではない。公知の重合法としては、例えば塊状重合、乳化重合、ソープフリー乳化重合、シード重合、懸濁重合等の方法が挙げられる。塊状重合の場合は、粉砕後、分級することで所望の粒径の樹脂粒子を得ることができる。乳化重合とは、水等の媒体と、媒体に溶解し難いモノマーと乳化剤（界面活性剤）を混合し、そこに媒体に溶解可能な重合開始剤を加えて行う重合法である。得られる粒子径のバラツキが少ないという特徴がある。ソープフリー乳化重合とは、乳化剤を用いない乳化重合である。均一径の粒子が得られるという特徴がある。シード重合とは、重合開始の際に別途で作られた種（シード）粒子を入れて行われる重合である。種粒子として粒子径と粒子径分布、量（個数）を任意に定めて重合することになり、所望の粒子径と粒子径分布を狙って重合できるという特徴がある。懸濁重合とは、モノマーと溶媒の水とを機械的に攪拌して、懸濁させて行う重合方法である。粒子径が小さくかつ整った粒子を得られることが特徴である。
【０１０９】
具体例としてメラミン樹脂等の熱硬化性樹脂の合成を挙げると、反応温度は通常７０〜２００℃、反応時間は通常２０〜１２０分間である。なお、反応温度は発光色素の性能が低下しない温度（耐熱温度範囲内）とすることが適切である。加熱は複数の段階に分けて行ってもよく、例えば、相対的に低温で一定時間反応させた後、昇温して相対的に降温で一定時間反応させるようにしてもよい。
【０１１０】
重合反応の終了後は、反応液から余剰の樹脂原料、発光色素、界面活性剤等の不純物を除去し、生成した発光色素含有粒子を回収して精製すればよい。例えば、反応液を遠心分離にかけ、不純物が含まれている上澄みを除去した後、超純水を加えて超音波照射して再度分散させて洗浄する。これらの操作は、上澄みに樹脂や発光色素に由来する吸光、蛍光が見られなくなるまで複数回繰り返し行うことが好ましい。
【０１１１】
（界面活性剤）
界面活性剤としては、公知の乳化重合用乳化剤を用いることができる。界面活性剤には、アニオン系（陰イオン系）、ノニオン系（非イオン系）、カチオン系（陽イオン系）のものがある。正に荷電した置換基ないし部位を有する（カチオン系の）熱硬化性樹脂を合成する場合は、アニオン系又はノニオン系の界面活性剤を用いることが好ましい。逆に負に荷電した置換基ないし部位を有する（アニオン系の）熱硬化性樹脂を合成する場合は、カチオン系又はノニオン系の界面活性剤を用いることが好ましい。
【０１１２】
アニオン系の界面活性剤としては、例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（製品名「ネオペレックス」シリーズ、花王株式会社）が挙げられる。ノニオン系の界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系（製品名「エマルゲン」シリーズ、花王株式会社）の化合物、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が挙げられる。カチオン系の界面活性剤としては、例えば、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミドが挙げられる。
【０１１３】
界面活性剤の添加量を調節することにより、樹脂粒子の粒子径を調節することができるとともに、その粒子径の変動係数が小さい、つまり粒子サイズの揃った発光色素含有粒子を製造することができる。界面活性剤の添加量は、例えば、樹脂原料に対して１０〜６０質量％の割合、あるいは原料混合物全体に対して０．１〜３．０質量％である。界面活性剤の添加量を増やすと粒径が小さくなる傾向にあり、逆に界面活性剤の添加量を減らすと粒径が大きくなる傾向にある。
【０１１４】
（重合反応促進剤）
重合反応促進剤は、メラミン樹脂等の熱硬化性樹脂の重縮合反応を促進するとともに、当該樹脂又は発光色素に含まれるアミノ基のような官能基にプロトン（Ｈ＋）を付与して荷電させ、静電的相互作用を起こしやすくする機能を有する。熱硬化性樹脂の反応は加温のみでも進行するが、重合反応促進剤を加えるとより低温で進行するので、反応や性能を制御できる範囲で添加することができる。このような重合反応促進剤としては、例えば、ギ酸、酢酸、硫酸、パラトルエンスルホン酸、ドデシルベンゼンスルホン酸などの酸が挙げられる。なお、発光色素がカルボキシ基やスルホ基を有する化合物である場合、当該発光色素も上記の酸と同様にプロトンを供与することもできる。
【０１１５】
（２）修飾工程
必要に応じて行われる修飾工程は、発光色素含有粒子の用途に応じて、発光色素含有粒子の表面に生体関連結合性物質などを連結するための工程である。
【０１１６】
本発明の属する技術分野においては、蛍光標識体と生体関連結合性物質などとを連結するための様々な手法が知られており、本発明においてもそのような手法を利用することができる。
【０１１７】
例えば、カルボキシ基、アミノ基、アルデヒド基、チオール基、マレイミド基等の反応性官能基同士の間で起きる反応を利用して、蛍光標識体（その表面に存在する一方の反応性官能基）と生体関連結合性物質（その分子中に存在するもう一方の反応性官能基）とを結合させることができる。また、これらが有する官能基同士を直接的に結合することができない場合は、分子の両末端にそれぞれ所定の官能基を有する「リンカー分子」を介して結合させることもできる。このような反応は、必要な試薬類を添加して所定の時間経過させることにより行うことができる。
【０１１８】
具体例としては、表面にヒドロキシ基を有する発光色素含有粒子にシランカップリング剤（例えばアミノプロピルトリメトキシシラン）を反応させてアミノ基を導入し、一方でストレプトアビジンにチオール基導入試薬（例えばＮ−スクシミジルＳアセチルチオ酢酸）を反応させてチオール基を導入し、最後に、アミノ基とチオール基の両方と反応性を有するマレイミド基を両端に有するＰＥＧ（ポリエチレングリコール）系のリンカー分子を反応させて、発光色素含有粒子とストレプトアビジンとを連結させる方法が挙げられる。
【０１１９】
また、例えばグリシジルメタクリレートを原料モノマーとして用いて樹脂（アクリル系樹脂）を合成した場合、発光色素含有粒子の表面には当該モノマーに由来するエポキシ基が表れている。この発光色素含有粒子にアンモニア水を添加することにより、そのエポキシ基をアミノ基に変換し、さらにそのアミノ基に所望の生体関連結合性物質などを連結させることができる。
本発明における発光色素含有粒子の平均粒径は１〜１００ｎｍであり、好ましくは３０〜１００ｎｍである。
【０１２０】
製造した発光色素含有粒子の平均粒径の測定は、当該分野で知られた方法により行うことができる。具体的には、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を適切な倍率で撮影し、発光色素含有粒子の断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径（面積円相当径）として測定することができる。発光色素含有粒子の集団の粒子サイズの平均（平均粒径）及び変動係数は、十分な数（例えば１０００個）の発光色素含有粒子について上記のようにして粒子サイズ（粒径）を測定した後、平均粒径はその算術平均として算出され、変動係数は式：１００×粒径の標準偏差／平均粒径、により算出される。
【０１２１】
本発明において、粒径のばらつきを示す変動係数は特に限定されないが、通常は２０％以下であり、好ましくは５〜１５％である。
本発明において、輝度は下記式で表される。
輝度＝モル吸光係数（ε）×量子収率×１／１０００
【０１２２】
＜発光色素含有粒子の用途＞
［病理診断用標識剤］
本発明の病理診断用標識剤は、本発明の発光色素含有粒子を用いることを特徴とする。
本発明の発光色素含有粒子の用途は特に限定されるものではないが、典型的には、試料（組織切片）に含まれる検出対象物質を標識し、免疫染色において蛍光観察できるようにするための、病理診断用標識剤としての用途が挙げられる。すなわち、上述したような本発明の発光色素含有粒子は、免疫染色の実施形態に応じた生体関連結合性物質を連結させて、複合体（コンジュゲート）として使用することが好適である。
【０１２３】
検出対象物質は特に限定されるものではないが、病理診断においては一般的に、その目的に応じた抗原が選択される。例えば、乳癌に関する病理診断においてはＨＥＲ２を検出対象物質とすることができる。また、検出対象物質は、生体固有のものでなくても良い。例えば、検出対象物質は、薬剤であっても良い。
【０１２４】
生体関連結合性物質の第一の例として、検出対象物質と特異的に結合する抗体（一次抗体）が挙げられる。発光色素含有粒子と一次抗体とからなる複合体は、検出対象物質に直接結合して蛍光標識することができる（一次抗体法）。
【０１２５】
生体関連結合性物質の第二の例として、検出対象物質と特異的に結合する抗体（一次抗体）に結合する抗体（二次抗体）が挙げられる。例えば、一次抗体がウサギから産生した抗体（ＩｇＧ）である場合、二次抗体は抗ウサギＩｇＧ抗体となる。検出対象物質に結合している一次抗体に、発光色素含有粒子と二次抗体とからなる複合体が結合することにより、検出対象物質を間接的に蛍光標識することができる（二次抗体法）。
【０１２６】
生体関連結合性物質の第三の例として、アビジン、ストレプトアビジン又はビオチンが挙げられる。この場合、二次抗体は、発光色素含有粒子と複合体化している物質と結合しうる物質と複合体化される。例えば、発光色素含有粒子とアビジン又はストレプトアビジンとの複合体を用いる場合は、二次抗体とビオチンとの複合体が組み合わされて用いられる。検出対象物質に結合している一次抗体に、二次抗体とビオチンとの複合体が結合し、当該複合体にさらに発光色素含有粒子とアビジン又はストレプトアビジンとからなる複合体が結合することにより、検出対象物質を間接的に蛍光標識することができる（ビオチン−アビジン法又はサンドイッチ法）。これとは逆に、発光色素含有粒子とビオチンとの複合体を、二次抗体とアビジン又はストレプトアビジンとの複合体と組み合わせて用いることもできる。
【０１２７】
一次抗体は、選択された検出対象物質に応じて、それと特異的に結合するものを選択すればよい。例えば、検出対象物質がＨＥＲ２である場合、一次抗体としては抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を用いることができる。このような一次抗体（モノクローナル抗体）は、マウス、ウサギ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、チキンなどを免疫動物とする一般的な手法により産生することができる。
【０１２８】
二次抗体は、選択された一次抗体に応じて、それと結合するものを選択すればよい。例えば、一次抗体がウサギ抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体である場合、二次抗体としては抗ウサギＩｇＧ抗体を用いることができる。このような二次抗体も一般的な手法により産生することができる。
その他にも、検出対象物質を核酸分子とし、それに対応する生体関連結合性物質として、当該核酸分子と相補的な塩基配列を有する核酸分子を用いることも可能である。
【０１２９】
発光色素含有粒子に生体関連結合性物質が連結した複合体は、公知のいかなる手法によって作製されたものであってもよい。例えば、アミンとカルボン酸の反応によるアミド化、マレイミドとチオールの反応によるスルフィド化、アルデヒドとアミンの反応によるイミン化、エポキシとアミンの反応によるアミノ化を利用することができる。このような反応に関与する官能基は、樹脂粒子の表面にあらかじめ存在するもの（樹脂の原料モノマーに由来する官能基）であってもよいし、樹脂粒子の表面に存在する官能基を公知の手法に従って変換した官能基や、表面修飾等により導入された官能基であってもよい。必要に応じて適切なリンカー分子を利用してもよい。
【０１３０】
したがって、本発明の別の側面において、本発明の発光色素含有粒子を使用した組織免疫染色用キットが提供される。このキットは少なくとも、本発明の発光色素含有粒子、発光色素含有粒子に生体関連結合性物質が連結された複合体、又は当該複合体を調製するための発光色素含有粒子、生体関連結合性物質及び試薬類を含む。このキットはさらに、必要に応じて、一次抗体、二次抗体、前記生体関連結合性物質（例えばストレプトアビジン）と組み合わせて用いられる他の生体関連結合性物質（例えばビオチン）、所望の複合体を形成するための試薬類、その他の免疫組織染色に用いられる試薬類などを含んでいてもよい。
【０１３１】
（生体物質検出方法）
本発明の発光色素含有粒子を用いた蛍光標識剤は、例えば、情報性を高めるために免疫染色と形態観察染色を併用する生体物質検出方法、より具体的には、（１）蛍光標識体を用いて組織切片を免疫染色する工程と、（２）形態観察用の染色剤を用いて組織切片を形態観察染色する工程と、（３）染色後の組織切片を蛍光観察する工程、とを含む生体物質検出方法において使用することができる。なお、（１）の免疫染色工程及び（２）の形態観察染色工程はどちらを先におこなってもよい。
【０１３２】
通常、上記の生体物質検出方法の工程（１）に先だって、常法に従って、組織切片の脱パラフィン処理、及び抗原の賦活化処理が行われる。
免疫染色工程（１）は、前述したような蛍光標識剤（発光色素含有粒子及び生体関連結合性物質の複合体）の形態に応じて、検出対象物質を適切に標識することができるよう、必要な物質を順次組織切片に添加して反応させればよい。
【０１３３】
形態観察染色工程（２）は、常法に従って行うことができる。組織標本の形態観察に関しては、細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤〜濃赤色に染色される、エオジンを用いた染色が標準的に用いられている。また、細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色〜淡青色に染色される、ヘマトキシリンを用いた染色も標準的に用いられている（これら２つの染色を同時に行う方法はヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）として知られている）。
通常、工程（１）及び（２）の後、工程（３）の前に、エタノールに浸漬する脱水処理、キシレン等の有機溶媒に浸漬する透徹処理、封入剤を用いる封入処理などが行われる。
【０１３４】
蛍光観察工程（３）では、上記工程により免疫染色及び形態観察染色が施された組織切片に、用いられている発光色素に応じた適切な波長を有する励起光を照射することにより、その蛍光標識体が発する蛍光を観察する。このような工程により、その組織切片内に存在する抗原等の所定の生体分子を検出することができ、分子標的薬（例えばヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体である抗体医薬「ハーセプチン」（商標））の適用の適否を判定するための情報として利用することができる。
【０１３５】
励起光の照射には、一般的な蛍光観察と同様の照射手段を用いればよく、例えば、蛍光顕微鏡が備えるレーザ光源から、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させるフィルタを用いて、適切な波長及び出力の励起光を染色された組織切片に照射すればよい。蛍光観察は、蛍光顕微鏡の鏡筒から行ってもよいし、蛍光顕微鏡に設置されたカメラが撮影した画像を別途表示手段（モニタ等）に表示して行ってもよい。発光色素によるが、蛍光顕微鏡の鏡筒からの目視によっては十分に蛍光を観察することができない場合であっても、カメラによる画像の撮影を通じて蛍光を観察することが可能な場合もある。必要に応じて所定の波長を選択的に透過させるフィルタを用いてもよい。
【０１３６】
なお、本発明においては同一の組織切片に対して免疫染色及び形態観察染色の両方が施されているが、形態観察染色による像を観察する際には、免疫染色用の発光色素を励起させるための励起光を照射する必要はなく、光学顕微鏡と同様の観察条件下で観察すればよい。
【実施例】
【０１３７】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例において「部」又は「％」の表示を用いるが、特に断りがない限り「質量部」又は「質量％」を表す。【０１３８】
［実施例１］
［発光色素含有粒子の作製］
＜発光色素含有粒子Ｎｏ．１〜１１、１３〜２０及び２２〜４８の作製＞
本発明及び比較例の発光色素含有粒子Ｎｏ．１〜１１、１３〜２０及び２２〜４８を、下記表に示す所定の条件に従って作製した。
発光色素（表Ｉ〜表IIIに記載の種類）５０μｍｏｌを、表Ｉ〜表IIIに記載の溶解溶媒０．２ｍＬに溶解した溶液に、界面活性剤（表Ｉ〜表IIIに記載の種類）を０．５ｖｏｌ％になるように水２０ｍＬを加えた。この溶液をホットスターラー上で攪拌しながら、表Ｉ〜表IIIに記載の溶解温度まで昇温させたのちに、有機樹脂（表Ｉ〜表IIIに記載の種類と量）を加えた。【０１３９】
溶液に、添加剤（表Ｉ〜表IIIに記載の種類と量）を加え、発光色素含有粒子を作製した。得られた分散液を遠心分離にかけて（２００００Ｇで９０分間）粒子を回収し、超純水で洗浄して精製した。
遠心分離後の上澄み除去及び超純水への再分散による処理を５回繰り返した。【０１４０】
洗浄後の樹脂粒子０．１ｍｇをエタノール１．５ｍＬ中に分散し、アミノプロピルトリメトキシシラン「ＬＳ−３１５０」（信越化学工業株式会社）２μＬを加えて８時間、撹拌しながら室温で反応させて表面アミノ化処理を行った。表面がアミノ化された樹脂粒子の濃度を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液にリンカー試薬「ＳＭ（ＰＥＧ）１２」（サーモサイエンティフィック社製、ｃａｔ．Ｎｏ．２２１１２）を最終濃度１０ｍＭとなるよう添加、混合して、撹拌しながら室温で１時間反応させた。反応液を１０，０００Ｇで２０分間の遠心分離にかけ、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加えて沈降物を分散させ、同一条件で再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで、末端にマレイミド基を有するＰＥＧ鎖で表面修飾された樹脂粒子を得た。【０１４１】
チオール基を導入したストレプトアビジンは以下のようにして作製した。まず、１ｍｇ／ｍＬに調整したストレプトアビジン（和光純薬工業株式会社）の水溶液４０μＬに、６４ｍｇ／ｍＬに調整したＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ、ｐｉｒｃｅ社製）の水溶液７０μＬを加え、室温で１時間より反応させることにより、ストレプトアビジンのアミノ基に対して保護されたチオール基（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−Ｓ−ＣＯ−ＣＨ3）を導入した。続いて、ヒドロキシルアミン処理により、保護されたチオール基から遊離のチオール基（−ＳＨ）を生成させて、ストレプトアビジンにチオール基（−ＳＨ）を導入する処理を完了させた。この溶液をゲルろ過カラム（Ｚａｂａ  Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ：フナコシ）に通して脱塩し、チオール基を導入したストレプトアビジンを得た。【０１４２】
調製した末端に、マレイミド基を有するＰＥＧ鎖で表面修飾された発光色素含有メラミン粒子と、調製したチオール基を導入したストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有するＰＢＳ中で混合し、１時間反応させることで、樹脂粒子にＰＥＧ鎖を介してストレプトアビジンを結合させた。この反応液に１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルタで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応物を除去し、ストレプトアビジン修飾発光色素含有メラミン樹脂粒子を得た。【０１４３】
＜発光色素含有粒子Ｎｏ．１２及び２１の作製＞
比較例の発光色素含有粒子Ｎｏ１２及び２１を、下記表に示す所定の条件に従って作製した。【０１４４】
発光色素（表Ｉ及び表IIに記載の種類と量）と３−アミノプロピルトリメトキシシラン（信越シリコーン社製、ＫＢＭ９０３）３ｍＬを溶解溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。【０１４５】
得られたオルガノアルコキシシラン化合物０．６ｍＬを、９９％エタノール４８ｍＬ、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）０．６ｍＬ、超純水２ｍＬ、及び２８質量％のアンモニア水２．０ｍＬと５℃で３時間混合した。【０１４６】
上記工程で作製した混合液を１００００Ｇで２０分間遠心分離し、上澄みを除去した。この沈殿に対して、エタノールを加えて、沈殿物を分散させ、再度遠心分離をするリンスを行った。さらに同様のリンスを２回繰り返し、発光色素含有シリカ粒子を得た。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、上述のように平均粒径を測定した。【０１４７】
得られた発光色素含有シリカ粒子を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有してＰＢＳを用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようにＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−ドデカンエチレングリコール］エステル）を混合し、５℃で１時間反応させた。【０１４８】
この混合液を、１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後に、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで、末端にマレイミド基がついた発光色素含有シリカ粒子を得た。【０１４９】
発光色素含有シリカ粒子に結合可能なストレプトアビジンを以下のように調製した。
まず、１ｍｇ／ｍＬに調整したストレプトアビジン（和光純薬工業社製）４０μＬを２１０μＬのボレートバッファーに加えた後、６４ｍｇ／ｍＬに調整した２−イミノチオラン塩酸塩（シグマアルドリッチ社製）７０μＬを加え、室温で１時間反応させた。これにより、ストレプトアビジンのアミノ基に対してチオール基（−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2+Ｃｌ-）−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＳＨ）を導入した。【０１５０】
このストレプトアビジン溶液をゲルろ過カラム（Ｚａｂａ  Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ：フナコシ）により脱塩し、上記シリカ粒子に結合可能なストレプトアビジンを得た。このストレプトアビジン全量（０．０４ｍｇ含有）とＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを用いて上記０．６７ｎＭに調整したシリカ粒子７４０μＬとを混合し、室温で１時間反応させた。【０１５１】
１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルタで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジン修飾発光色素含有シリカ粒子を得た。
なお、表Ｉ〜表IIIでは、有機樹脂の欄にシリカ粒子を用いたことを示した。【０１５２】
＜組織染色工程＞
［免疫組織染色］
上記で作製した発光色素含有粒子を含む組織染色用染色剤を用いて、ヒト乳房組織の免疫染色を行った。ここで組織染色用染色剤は、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液等の緩衝液を用いた。染色切片は組織アレイスライド（コスモ・バイオ社製、品番ＣＢ−Ａ７１２）を用いた。組織アレイスライドを脱パラフィン処理後、水に置換洗浄し、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。抗原の賦活化処理後の組織アレイスライドを、ＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で０．０５ｎＭに稀釈した抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体（４Ｂ５）を組織切片と２時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で稀釈したビオチン標識抗ウサギ抗体と、３０分間反応させた。さらに、上記組織染色用染色剤を用いて、すなわち上記製造したストレプトアビジンを有する色素樹脂粒子と２時間反応させ、その後洗浄を行うことにより、免疫組織化学染色切片が得られた。得られた免疫組織化学染色切片を４％中性パラホルムアルデヒド水系緩衝液に１０分間浸漬することにより、固定処理を行った。【０１５３】
［形態染色］
上記で固定処理した免疫組織化学染色切片に対してＨＥ染色を行い、染色後の切片をエタノールに浸漬することにより脱水し、脱水切片をさらにキシレンに浸漬し風乾させることにより透徹を行ったところ、二重染色切片が得られた。なお、形態染色としてＨＥ染色を行なっても、後述の耐光性評価に影響は無い。【０１５４】
［封入］
上記形態染色を行なったものについて、キシレン系封入剤であるエンテランニュー（メルク社製）を滴下し、カバーガラスを被せ封入した。【０１５５】
＜組織サンプルの評価＞
顕微鏡観察及び画像取得時の励起波長条件は、励起５７５〜６００ｎｍでは視野中心部付近の照射光強度が９００Ｗ／ｃｍ2、励起４５０〜４９０ｎｍでは視野中心部付近の照射光強度が９００Ｗ／ｃｍ2、励起３６５ｎｍでは視野中心部付近の照射光強度が５００Ｗ／ｃｍ2、励起３４５〜３９５ｎｍでは視野中心部付近の照射光強度が５００Ｗ／ｃｍ2、になるようにした。なお、照射光強度は対物４０倍レンズ装着時の光エネルギー値をアドバンテスト社製パワーメータ８２３０で測定し、４０倍レンズ照射視野面積（約φ４５０μｍ）で割ることで算出している。画像取得時の露光時間は画像の輝度が飽和しないよう任意に設定し画像を取得した。例えば１０００ｍ秒で測定を行なった。なお、取得画像は補正を加えず、輝度値がフルレンジでリニアとなるようにした。【０１５６】
形態観察用染色像を用いた画像処理により、細胞の形状（細胞膜の位置）を特定し、免疫染色像と重ねあわせて、細胞膜上に発現しているＨＥＲ２タンパク質を標識したストレプトアビジン修飾発光色素含有粒子を表す輝点を発光色素含有粒子数として抽出して計測した。細胞膜上の輝点のうち輝度が所定の値以上のものは、その輝点の輝度を発光色素含有粒子数１粒子あたりの輝度で除して発光色素含有粒子数に換算した。【０１５７】
単位面積（１００μｍ2）あたりの発光色素含有粒子数の平均値、あるいは、１枚の染色スライドあたり５視野においてそれぞれ１００個ずつ選択した細胞における１細胞あたりの発光色素含有粒子数の平均値を測定した。【０１５８】
さらに、発光色素の含有量は前述の方法で測定した。平均粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し、発光色素含有粒子の断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径（面積円相当径）として測定した。
以上の結果を表Ｉ〜表IIIに示す。【０１５９】
【表１】
2020075751.tif 000027
【０１６０】
【表２】
2020075751.tif 000028
【０１６１】
【表３】
2020075751.tif 000029
【０１６２】
表Ｉ〜表IIIより、本発明の発光色素含有粒子は、平均粒径が小さくても、単位体積当たりの発光色素含有粒子数平均分子量が多く、発光輝度が高いことが分かる。
具体的には、下記の通りである。
１．発光色素含有粒子Ｎｏ．４〜Ｎｏ．１１からは、同じ発光色素であっても、粒径が１００ｎｍを超えると、単位面積あたりの発光色素含有粒子数が著しく減少することが分かる。また、粒径が増大するに連れて、単位面積あたりの発光色素含有粒子数が減少することからも、１００ｎｍを超える大粒子では認識できない部位があるが、小粒径の粒子であれば認識部位が多く、空間分解能が高いことが分かる。
２．発光色素含有粒子Ｎｏ．８とＮｏ．１２及びＮｏ．１８〜２１からは、同じ発光色素であっても、有機樹脂の方は、シリカ粒子の方よりも粒径が小さいこと及び発光色素含有量が多いため、単位面積あたりの発光色素含有粒子数が遥かに多いことが分かる。
３．ＡｌｏｇＰ値が１０未満のものは、発光色素含有量が少ない（２０ｍｏｌ％を下回る）。原因としては、親水性が高いことから水中に漏れ出すことが推察される（段落００８３参照）。
４．ＡｌｏｇＰ値が６０を超えるものは、発光色素含有量が更に少ない（１０ｍｏｌ％を下回る）。そのため単位面積あたりの発光色素含有粒子数が著しく減少する。原因としては、疎水性が高いことから発光色素含有粒子中に取り込まれないことが推察される（段落００８３参照）。
また、励起光により比較的長時間照射された場合においても、単位面積あたりの発光色素含有粒子数の変動が少なく、高い耐光性を持つことも確認できた。【０１６３】
［実施例２］
＜発光色素含有粒子の発光波長測定＞
発光色素含有粒子に含有する色素のメタノール又はエタノール中の吸光度の最大値が１．０となる濃度で、２５℃において測定した最大蛍光発光波長と、発光色素含有粒子の水溶液中の吸光度の最大値が１．０となる濃度で、２５℃において測定した最大蛍光発光波長を測定した結果を下表に示す。なお、溶解度の観点から、発光色素の構造番号１及び２は、溶媒としてエタノール、発光色素の構造番号１４、１５及び１７は、メタノールを用いて発光色素を溶解した。
以上の結果を表IVに示す。【０１６４】
【表４】
2020075751.tif 000030
【０１６５】
表IVから、本発明の発光色素含有粒子の水溶液中の最大蛍光発光波長が、発光色素のメタノール又はエタノール中の最大蛍光発光波長よりも５ｎｍ以上長波であることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１６６】
本発明の発光色素含有粒子は、小粒径でかつ高輝度の発光が可能であり、病理診断用標識剤に用いることができる。例えば、組織切片に含まれる検出対象物質を標識し、免疫染色において蛍光観察できるようにするための病理診断用標識剤として好ましく用いることができる。
【国際調査報告】
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