(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリンの加水分解物由来である、次の式（Ｉ）乃至式（ＩＸ）のいずれかのペプチド、それらの塩類またはそれらの混合物を有効成分として含むことを特徴とする角膜損傷治療剤。
【化１】
0003812957.tif 000018
【化２】
0003812957.tif 000019
【化３】
0003812957.tif 000020
【化４】
0003812957.tif 000021
【化５】
0003812957.tif 000022
【化６】
0003812957.tif 000023
【化７】
0003812957.tif 000024
【化８】
0003812957.tif 000025
【化９】
0003812957.tif 000026
【請求項２】
角膜損傷治療剤が眼シェーグレン症候群治療剤である請求項１記載の角膜損傷治療剤。
【請求項３】
角膜損傷治療剤が化学腐食性角膜潰瘍治療剤である請求項１記載の角膜損傷治療剤。
【請求項４】
点眼剤の態様である請求項１〜３のいずれかに記載の角膜損傷治療剤。
【請求項５】
眼軟膏剤の態様である請求項１〜３のいずれかに記載の角膜損傷治療剤。
【請求項６】
ラクトフェリンの加水分解物由来のペプチド、それらの塩類またはそれらの混合物を０．００００１〜５．０ｗ／ｖ％の割合で含有する請求項４に記載の角膜損傷治療剤。
【請求項７】
ラクトフェリンの加水分解物由来のペプチド、それらの塩類またはそれらの混合物を０．００００１〜５．０ｗ／ｗ％の割合で含有する請求項５に記載の角膜損傷治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ラクトフェリンの加水分解物由来のペプチド類、その誘導体またはそれらの塩類を有効成分として含む角膜損傷治療剤に関する。
【０００２】
【従来技術・発明が解決しようとする課題】
従来より涙，唾液，乳汁等に含まれている天然の鉄結合性蛋白質であるラクトフェリンに、大腸菌，カンジダ菌，クロストリジウム菌等の有害な微生物に対する抗菌作用があることが知られている〔Journal of Pediatrics : 第94巻、第１頁（1979年) 〕。
更に近年、ヒトやウシのラクトフェリンの加水分解物から、ラクトフェリンの数倍から数十倍もの抗菌活性を有するペプチドがいくつか単離されている（特開平５−９２９９４号公報。以下、該ペプチドと記載することがある。）。
該ペプチドは、ヒトを含む哺乳動物の各種疾患の原因となるグラム陽性およびグラム陰性の細菌、酵母等広範囲の微生物に対して、低濃度で公知の抗生物質（例えば、アミノベンジルペニシリン等）とほぼ同等の強い抗菌作用を有し、またビフィズス菌等の有益な腸内細菌には作用しないという極めて有用な物質である。
しかしながら、従来より該ペプチドの抗菌作用のみが注目されており、該ペプチドが有する他の作用・効果についての報告はほとんどなされていないのが実情である。
本発明の目的は、該ペプチド類の新規用途を提供することである。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、該ペプチド類の新規用途を開発すべく種々研究を重ねてきたところ、該ペプチド類が角膜細胞増殖促進作用（より具体的には、例えば角膜上皮細胞増殖促進作用、角膜実質細胞活性化促進作用）を有し、角膜損傷治療剤、例えば眼シェーグレン症候群治療剤（就中、乾燥性角結膜炎）、化学腐食性角膜潰瘍治療剤として有効であるとの新知見を得、これに基づいて本願発明を完成した。
【０００４】
本発明は、ラクトフェリンの加水分解物由来のペプチド類、その誘導体、それらの塩類またはそれらの混合物（以下、該ペプチド類と記載することがある）を有効成分として含有することを特徴とする角膜損傷治療剤である。
【０００５】
本明細書において、アミノ酸およびペプチドは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会で採用された略記法に基づいて、次の略号を用いて表記される。
Ala-: L-アラニン残基
Arg-: L-アルギニン残基
Asn-: L-アスパラギン残基
Asp-: L-アスパラギン酸残基
Cys-: L-システイン残基
Gln-: L-グルタミン残基
Glu-: L-グルタミン酸残基
Gly-: L-グリシン残基
His-: L-ヒスチジン残基
Ile-: L-イソロイシン残基
Leu-: L-ロイシン残基
Lys-: L-リジン残基
Met-: L-メチオニン残基
Phe-: L-フェニルアラニン残基
Pro-: L-プロリン残基
Ser-: L-セリン残基
Thr-: L-スレオニン残基
Trp-: L-トリプトファン残基
Tyr-: L-チロシン残基
Val-: L-バリン残基
【０００６】
本発明の角膜損傷治療剤の有効成分である該ペプチド類は、該ペプチド、その誘導体、それらの塩類、それらの混合物等の本発明の目的を達成しえるものであれば特に限定はない。
該ペプチドは、公知の化合物であり、公知のラクトフェリンの加水分解物由来のペプチドである。該ペプチドには、例えば、下記式（Ｉ）〜（IV）に示す少なくとも２０個、通常２０〜４７個、好ましくは２５〜３８個、より好ましくは２５個のアミノ酸残基からなるペプチド類が含まれる。
【０００７】
【化１０】
0003812957.tif 000002
【０００８】
【化１１】
0003812957.tif 000003
【０００９】
【化１２】
0003812957.tif 000004
【００１０】
【化１３】
0003812957.tif 000005
【００１１】
（なお、ここでＣｙｓ* −はジスルフィド結合の形成を防止するため、チオール基を化学的に修飾したシステインを示す。）
【００１２】
該ペプチド類の具体例としては、ウシ由来のラクトフェリンの加水分解物から単離される下式で示されるペプチド
【００１３】
【化１４】
0003812957.tif 000006
【００１４】
【化１５】
0003812957.tif 000007
【００１５】
【化１６】
0003812957.tif 000008
【００１６】
および、ヒト由来のラクトフェリンの加水分解物から単離される下式で示されるペプチド
【００１７】
【化１７】
0003812957.tif 000009
【００１８】
【化１８】
0003812957.tif 000010
【００１９】
が例示される。好ましくは、式（VII)および式(IX)で示されるペプチドであり、より好ましくは式(VIII)で示されるペプチドである。
【００２０】
誘導体としては、例えばシステイン残基のチオール基が化学的に修飾（例えば、アセトアミドメチル化等）されたペプチドが例示される。
塩類としては、薬理学上許容されうる塩であればよく、例えば無機酸（塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等）、有機酸（マレイン酸、フマール酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、酢酸、乳酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、パモ酸等）との酸付加塩および第４級塩等が挙げられる。
【００２１】
本発明で使用される該ペプチド類は、既知の方法によって製造される。例えば、特開平５−９２９９４号公報の第９欄第１５行〜第１０欄第１８行に記載の方法に従って化学的に合成することもできるし、また、同公報第７欄第２２行〜第８欄第４６行に記載の方法に従って哺乳類のラクトフェリンの加水分解物から単離することができる。
誘導体も、各誘導体に応じて自体既知の方法にて製造される。
【００２２】
本発明の角膜損傷治療剤は、角膜細胞、就中角膜上皮細胞に対して細胞増殖促進作用を有し、さらに角膜実質細胞に対して遊走活性化作用を有するものであり、例えば眼シェーグレン症候群治療剤、化学腐食性角膜潰瘍治療剤として使用される。
眼シェーグレン症候群は、涙液等の分泌が減少し、角膜細胞、特に角膜上皮細胞が破壊され、乾性角結膜炎等の症状を呈する疾病である。
該ペプチド類は、角膜上皮細胞増殖促進作用を有し、従って上記眼シェーグレン症候群に有効である。より具体的には涙液の分泌機能不全による涙液分泌減少症、涙液分泌減少に伴って生じる角膜上皮びらん症、それらに伴う各種の症状、例えば眼乾燥感，異物感，羞明，灼熱感，結膜の充血，糸状角膜炎，粘稠性ある目脂等の症状の改善に効果がある。
また、該ペプチド類は、角膜実質の繊維芽細胞の活性化を促進することによる化学腐食性角膜潰瘍に対する治癒促進効果があり、化学腐食性角膜潰瘍治療剤としても有用である。化学腐食としては、アルカリ腐食が代表的なものとして挙げられる。
【００２３】
本発明の角膜損傷治療剤は、通常該ペプチド類自体、またはこれと公知の薬理学的に許容され得る担体、賦形剤、希釈剤等と混合し、公知の方法に従って、点眼剤，眼軟膏剤，散剤，顆粒剤，錠剤，カプセル剤，注射剤等の形態に製剤化されて経口的または非経口的に投与することができる。特に、点眼剤または眼軟膏剤の剤形とすることが好ましい。
【００２４】
点眼剤の態様の角膜損傷治療剤としては、水溶液剤が例示される。点眼剤のｐＨは該ペプチド類が安定で眼粘膜への刺激性が少ないｐＨ、例えばｐＨ約３〜８、好ましくはｐＨ約４〜６の範囲に調整される。該ペプチド類の含有量は適応疾患等に応じて適宜変更することができるが、点眼剤全体に対して通常０．００００１〜５．０ｗ／ｖ％、好ましくは０．０００１〜１ｗ／ｖ％である。
【００２５】
点眼剤には、さらに通常点眼剤に配合されうる緩衝剤，等張化剤，保存剤，増粘剤，安定化剤，抗酸化剤，ｐＨ調整剤，キレート剤，吸収促進剤等の各種の添加剤を適宜配合することができる。
【００２６】
緩衝剤としては、ｐＨ４〜６に緩衝能を有する緩衝剤を使用することができる。例えば、ホウ酸塩緩衝剤，クエン酸塩緩衝剤，酒石酸塩緩衝剤，リン酸塩緩衝剤（リン酸二水素一ナトリウム，リン酸一水素二ナトリウム，リン酸二水素一カリウム，リン酸一水素二カリウム等），酢酸ナトリウム等の酢酸塩緩衝剤およびε−アミノカプロン酸，グルタミン酸ナトリウム等のアミノ酸塩等が挙げられる。
緩衝剤の含有割合は、点眼剤中に通常０．０５〜０．５ｗ／ｖ％である。
【００２７】
等張化剤としては、点眼剤として通常使用されるブドウ糖，マンニトール，ソルビトール等の糖類、グリセリン，ポリエチレングリコール，プロピレングリコール等の多価アルコール類、塩化ナトリウム等の塩類等が用いられる。等張化剤は、点眼剤の浸透圧が涙液と等張になる量で添加すればよい。
【００２８】
保存剤としては、抗菌作用および抗黴作用を有する無毒性、無刺激性である眼に適用可能な化合物が挙げられる。例えば、塩化ベンザルコニウム，塩化ベンゼトニウム等の第４級アンモニウム塩；グルコン酸クロルヘキシジン等の陽イオン性化合物；パラオキシ安息香酸メチル，パラオキシ安息香酸エチル，パラオキシ安息香酸プロピル，パラオキシ安息香酸ブチル等のパラオキシ安息香酸エステル類；デヒドロ酢酸ナトリウム；チメロサール等が挙げられる。
【００２９】
増粘剤としては、例えばヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸およびそれらの塩等が用いられる。溶解補助剤（安定化剤）としては、例えばシクロデキストリン類，ポリビニルピロリドン等の水溶性高分子、ポリソルベート８０等の界面活性剤、メチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース等の水溶性高分子等が用いられる。
【００３０】
抗酸化剤としては、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、トコフェロール、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等が挙げられる。キレート剤としては、エデト酸ナトリウム（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム）、クエン酸ナトリウム等が例示される。ｐＨ調整剤としては、塩酸，クエン酸，リン酸，酢酸，酒石酸，水酸化ナトリウム，水酸化カリウム，炭酸ナトリウム，炭酸水素ナトリウム等が挙げられる。
【００３１】
点眼剤は、公知の水溶液剤の製法に従い、医薬上許容される溶媒（例：滅菌精製水、滅菌緩衝液等の水性溶媒）に該ペプチド類を溶解させることにより調製される。例えば、溶媒に必要に応じて上記した緩衝剤、等張化剤、保存剤等の添加剤を添加し、ｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム溶液等）を用いてｐＨ調整後、該ペプチド類を溶解させて均質な水溶液剤を得る。以上の点眼剤の調製は、無菌操作法により行うか、あるいは適当な段階で滅菌処理を施すことにより行われる。
【００３２】
眼軟膏剤の態様の角膜損傷治療剤は、通常用いられる眼用軟膏基剤中に該ペプチド類を混和し、常法に従って製剤化することによって調製することができる。該ペプチド類の含有量は適応疾患等に応じて適宜変更することができるが、眼軟膏剤全体に対して通常０．００００１〜５．０ｗ／ｗ％、好ましくは０．０００１〜１ｗ／ｗ％である。
【００３３】
眼軟膏剤用の基剤としては、ワセリン，プラスチベース，流動パラフィン，ポリエチレングリコール，カルボキシメチルセルロースが好ましい。また、軟膏剤においても、必要に応じて前記の例えば保存剤等の添加剤を配合させることができる。
【００３４】
さらに、本発明の角膜損傷治療剤には、本発明の目的に反しない限り、別種の薬効を奏する成分を適宜含有させることもできる。
【００３５】
眼シェーグレン症候群治療のための本発明製剤の投与量は、患者の年齢，体重，症状，治療剤の剤型等によっても異なるが、例えば成人患者に点眼剤として用いる場合は、有効成分である該ペプチド類を約０．００００１〜５．０ｗ／ｖ％、好ましくは約０．０００１〜１ｗ／ｖ％程度含有する点眼剤として、症状に応じて１回量１〜数滴を１日１〜４回投与することが好ましい。眼軟膏剤の場合は、有効成分である該ペプチド類を約０．００００１〜５．０ｗ／ｗ％、好ましくは約０．０００１〜１ｗ／ｗ％程度含有する眼軟膏剤として、症状に応じて１日２〜５回程度投与することが好ましい。
【００３６】
角膜損傷治療のための本発明製剤の投与量は、患者の年齢，体重，症状，治療剤の剤型等によっても異なるが、例えば成人患者に点眼剤として用いる場合は、有効成分である該ペプチド類を約０．００００１〜５．０ｗ／ｖ％、好ましくは約０．０００１〜１ｗ／ｖ％程度含有する点眼剤として、症状に応じて１回量１〜数滴を１日１〜４回投与することが好ましい。眼軟膏剤の場合は、有効成分である該ペプチド類を約０．００００１〜５．０ｗ／ｗ％、好ましくは約０．０００１〜１ｗ／ｗ％程度含有する眼軟膏剤として、症状に応じて１日２〜５回程度投与することが好ましい。
該ペプチド類は、ヒトの初乳や通常摂取している牛乳等に由来する天然のペプチドであることから極めて安全性の高いものであり、例えば式（ＶＩＩ）のペプチドの場合、特開平６−１７２２００号公報の試験例２に記載されているとおりＬＤ５０は２０００ｍｇ／ｋｇ体重以上である。
【００３７】
【実施例】
以下、実施例をもって本発明をより詳細に説明し、試験例によって本発明の効果を明らかにするが、これらは単なる例示であって、これらによって本発明の範囲が限定されるものではない。
【００３８】
実施例１
常法により、次の処方で点眼剤を調製した。
処方１    点眼剤（１００ｍｌ中），ｐＨ５．０
式(VII) のペプチド          １ｇ
塩化ナトリウム          ０．９ｇ
酢酸ナトリウム          ０．１ｇ
酢酸                    適量
滅菌精製水              適量
【００３９】
実施例２
常法により、次の処方で点眼剤を調製した。
処方２    点眼剤（１００ｍｌ中），ｐＨ４．０
式(IX)のペプチド        ０．１ｇ
塩化ナトリウム          ０．９ｇ
ε−アミノカプロン酸    ０．１ｇ
滅菌精製水              適量
【００４０】
実施例３
常法により、次の処方で眼軟膏剤を調製した。
処方３    眼軟膏剤（１００ｇ中）
式(I) のペプチド          ０．５ｇ
流動パラフィン          １０．０ｇ
白色ワセリン            適量
【００４１】
実施例４
常法により、次の処方で注射剤を調製した。
処方４    注射剤  （１００ml中）、pH６．０
式(IV)のペプチド          ０．０１ｇ
マンニトール              ５．０ｇ
水酸化ナトリウム        適量
注射用水                適量
【００４２】
【試験例】
以下に、本発明の角膜損傷治療剤の有効性を示す薬理試験およびその結果を示す。
【００４３】
試験例１
眼シェーグレン症候群モデルマウスであるＭＲＬ／１マウスを用いて、該ペプチドの乾燥性角膜病変に対する効果を検討した。
【００４４】
▲１▼試験物質
該ペプチドを生理食塩液に溶解して０．２％濃度に調製し、被験薬とした。なお、調製は１週間に１回行った。該ペプチドとしては、下式で示されるウシ由来のものを使用した。
【００４５】
【化１９】
0003812957.tif 000011
【００４６】
▲２▼試験動物
６週齢の雄性ＭＲＬ／１マウスを用いた。５週齢のマウスを１週間予備飼育して、角膜等に異常のないことを確認し使用した。飼育条件は室温：２３±２℃、湿度：５５±１０％に設定した飼育室内で、固形飼料（放射線滅菌飼料ＭＲストック、日本農産工業）および水道水を自由摂取させた。
▲３▼試験方法
マウスが６週齢になった時点で、右眼に０．２％該ペプチドあるいは生理食塩液を１日４回、１回５μｌ点眼し（以下、本試験例においてそれぞれ該ペプチド群、対照群という）、スリットランプを用いて角膜上皮を点眼開始から１か月間隔で観察し、以下に示す基準に従って採点評価した。
点眼開始３，５および７か月後には一部のマウスを屠殺し、角膜，副涙腺，舌下腺および顎下腺の組織標本を作成し、Ｈ．Ｅ−ＰＡＳ重複染色を行い顕微鏡観察を行った。
【００４７】
0003812957.tif 000012
尚、各評価の中間と考えられる症状は０．５点間隔で評価した。
【００４８】
▲４▼試験結果および考察
シェーグレン症候群マウスの角膜上皮の経時的観察結果を表１に示した。
点眼開始１か月後に対照群に僅かな点状の混濁症状が現れ、２か月後には角膜中央部に軽度の地図状混濁が認められ始めた。３か月後には角膜上皮の混濁領域は広がり、更にフルオレセインによる角膜染色において、点状の染色斑が認められ、その後も同様の染色班が認められた。３か月後の病理学的評価では角膜上皮の表層の剥離が認められ、副涙腺では粘性分泌物による涙管の閉塞が認められた。５カ月後においても同様の症状が認められた。また、シェーグレン症候群の症状である舌下腺および顎下腺での腺細胞の空胞および副涙腺での粘性分泌物による涙管の閉塞が認められた。
これに対して、該ペプチド群では５か月後までのスリットランプによる観察では角膜上皮の混濁は軽度であり、有意な角膜上皮混濁抑制効果が認められた。また、病理学的評価では対照群に比較して、角膜上皮の表層の剥離は軽度であった。
以上のことより、該ペプチドはシェーグレン症候群を呈するＭＲＬ／１マウスにおける乾燥性角膜病変に対して点眼投与で効果があるものと考えられる。
【００４９】
【表１】
0003812957.tif 000013
【００５０】
試験例２
該ペプチドの角膜実質細胞活性化促進作用に起因する角膜障害治療効果を調べた。
【００５１】
▲１▼試験物質
試験例１で使用したのと同じペプチドを生理食塩液で溶解し、１．０％および０．５％濃度に調製し、被験薬とした。
▲２▼試験動物
試験動物として体重２ｋｇの雄性白色家兎を用いた。これらの家兎は入荷日に受入れ検査を行い、異常のないことを確かめた後、室温を２３±３℃、湿度を５５±１０％に設定した飼育室内で一匹ずつ飼育し、固形飼料（ラボＲストック，日本農産工業）を１日８０ｇ与え、水道水を自動供水にて自由摂取させた。
▲３▼試験方法
家兎の角膜の中央部に１Ｎ  ＮａＯＨをしみこませた直径６ｍｍの濾紙を１分間接触させアルカリ腐食を起こさせた。アルカリ腐食を起こした後、直ちに０．５％、１．０％の該ペプチドあるいは生理食塩液を１日８回、１回あたり５０μｌずつ、右眼に点眼し、左眼は無処置とした。観察は以下の項目に従って１、３および５日目に行った。６日目には眼球を摘出して常法に従って固定・包理・薄切した後、角膜をトルイジンブルーおよびヘマトキシリンエオジンで染色し、潰瘍辺縁部の繊維芽細胞（fibroblast cell)の遊走を評価した。
【００５２】
0003812957.tif 000014
【００５３】
▲４▼試験結果および考察
アルカリ潰瘍を起こさせた家兎角膜上皮の観察結果を表２に、病理評価を表３に示した。スリットランプによる観察では、３日目では角膜混濁の程度に各群間に差は認められなかった。５日目では、生理食塩液点眼では角膜上皮の修復を認め、角膜混濁の進行は認められなかった。これに対して該ペプチド群では角膜混濁の進行抑制と混濁面積の縮小が認められた。
角膜の病理評価では生理食塩液点眼に比較して、該ペプチドの点眼によって実質細胞の活性化および角膜実質の繊維芽細胞の遊走の促進が認められた。
以上のことより、該ペプチドにおいて、角膜実質の繊維芽細胞の活性化を促進することにより、化学腐食による角膜潰瘍の治癒促進効果を発揮することが明らかになった。
【００５４】
【表２】
0003812957.tif 000015
【００５５】
【表３】
0003812957.tif 000016
【００５６】
試験例３
該ペプチド類の培養角膜上皮細胞の増殖効果を調べた。
▲１▼試験方法：
９６穴プレートにヒト角膜上皮細胞を１穴あたり20％ confluentになるよう播種し、10％ウシ胎児血清を含むDMEM/HamF12 1:1 等比混合培養液で24時間前培養後、0.0001％、0.0003％、0.001 ％、0.003 ％、0.01％、0.03％、0.1 ％、0.3 ％、0.5 ％の各濃度の該ペプチドを含む培養液（培養液はいずれもウシ胎児血清不含のDMEM/HamF12 1:1 等比混合培養液）に交換し、３日間培養した。培養後、Neutralredの取込みを測定することにより生細胞数を測定し、細胞増殖に対する該ペプチド類の影響を検討した。該ペプチドとしては、試験例１と同じものを使用した。
▲２▼試験結果：
【００５７】
【表４】
0003812957.tif 000017
【００５８】
該ペプチドは角膜上皮細胞の増殖を促進した。
【００５９】
【発明の効果】
本発明の角膜損傷治療剤は、例えば角膜上皮細胞増殖促進作用を有し、シェーグレン症候群の眼病変である乾燥性角結膜炎の治療に効果があり、涙液の分泌減少に伴って生じる各種の症状、例えば眼乾燥感，異物感，羞明，灼熱感，結膜の充血，糸状角膜炎等の症状および角膜上皮びらん症を有効に改善することができる。また、本発明の角膜損傷治療剤は、例えば角膜実質細胞活性化促進作用を有し、化学腐食性角膜潰瘍治療剤として有用である。