(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記理化学的性質を有するアルカリフォスファターゼ。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル  ＋  Ｈ2Ｏ  →  アルコール  ＋  オルソリン酸
２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、β−グリセロリン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰに作用する。
３．至適温度：５０℃
４．至適ｐＨ：ｐＨ１１以上
５．熱安定性：５５℃以下（ｐＨ７．５、１５分間）
６．安定ｐＨ：ｐＨ６〜１１（２５℃、１６時間）
７．Ｋｍ値：０．４１ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸に対する）
８．分子量：（ゲルろ過法）  ６３０，０００
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）  ５６，０００
９．糖鎖を有する。
【請求項２】
アクレモニウム属に属し、アルカリフォスファターゼ生成能を有する菌株を培地にて培養し、培養物よりアルカリフォスファターゼを採取することを特徴とする請求項１に記載のアルカリフォスファターゼの製造法。
【請求項３】
アルカリフォスファターゼ生成能を有する菌株が、アクレモニウム・ストリクタムＴＥ５０８４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６８２）である請求項２記載のアルカリフォスファターゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、熱安定性に優れた新規なアルカリフォスファターゼおよびその製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アルカリフォスファターゼは、主として抗体、抗原、核酸等の生体物質量をそれらに結合できる物質量で評価する際に、その結合できる物質の標識用酵素として様々なバイディングアッセイに用いてられている。例えばイムノアッセイの分野では、ヘテロジニアス・イムノアッセイ法にペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素とともによく利用されており、抗原、抗体に直接に、またはアビジンやビオチンなどを介して、間接に結合させて利用されている。また、近年は遺伝子解析の分野においてもＤＮＡプローブ等に直接に、またはアビジンやビオチンを介して、間接に結合して利用されている。
【０００３】
抗原、抗体または核酸の検出に適したアルカリフォスファターゼの基質としては、ｐ−ニトロフェニルリン酸、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、ジオキセタン発光基質（ＰＰＤ、ＡＭＰＰＤなど）が従来から使用されている。これらの基質とアルカリフォスファターゼとの反応により生じた可視光線、蛍光、発光を測定することにより、生体物質の量が測定できる。
【０００４】
標識用酵素が備える条件としては、高純度、高い安定性、ターンオーバーが高い、標識しやすい官能基を持つ、基質に対するＫｍ値が低い、バックグラウンドが低い、検出に適した基質がある等が挙げられる。様々な標識酵素の中でアルカリフォスファターゼがもつ大きな利点は、バックグラウンドが他の酵素より低いことおよび検出に適した基質があることなどである。上記した性質を最も兼ね備えたアルカリフォスファターゼとしては、仔牛小腸由来のもの、大腸菌のもの等が従来から知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
仔牛小腸由来のアルカリフォスファターゼは、比活性が高いことおよび糖鎖を有しているため、様々な標識法が使用できる。しかし、その一方で、安定性に乏しいことが知られている（Besman,M.,Coleman,J.E.,J.Biol.Chem.,260,1190(1985)) 。また、大腸菌由来のアルカリフォスファターゼは安定性が高く、純度も高い標品を容易に得ることが出来るが、比活性が低く、仔牛小腸由来のものの３％程度しかないことが知られている。また糖鎖を有さないので、標識すべき生体物質と結合させる方法が限られている（Reid,R.W.,wilson,I.B. in “The enzymes", 3rd.Ed.(Boyer,P.D.,Ed),373(1971)。このため高純度のものが得やすい微生物より安定性が高く、しかも糖鎖を有するアルカリフォスファターゼが求められていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、アクレモニウム（Acremonium）属に属する微生物から、熱安定性に優れ、糖鎖を有する新規アルカリフォスファターゼを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は下記理化学的性質を有するアルカリフォスファターゼである。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル  ＋  Ｈ2 Ｏ  →  アルコール  ＋  オルソリン酸
２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、β−グリセロリン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰに作用する。
３．至適温度：５０℃
４．至適ｐＨ：ｐＨ１１以上
５．熱安定性：５５℃以下（ｐＨ７．５、１５分間）
６．安定ｐＨ：ｐＨ６〜１１（２５℃、１６時間）
７．Ｋｍ値：０．４１ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸に対する）
８．分子量：（ゲルろ過法）        ６３０，０００
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）    ５６，０００
９．糖鎖を有する。
【０００８】
また本発明はアクレモニウム属に属し、アルカリフォスファターゼ生産能を有する菌株を培地にて培養し、培養物より該アルカリフォスファターゼを採取することを特徴とするアルカリフォスファターゼの製造法である。
【０００９】
本発明の酵素の起源は、上記理化学的性質を有するアルカリフォスファターゼを産生するものであれば、動物、植物、微生物など如何なる起源のものを用いても良い。好ましくは、上記性質を有するアルカリフォスファターゼを産生しうるアクレモニウム（Acremonium）属カビであって、好適な例としてはアクレモニウム・ストリクタム（Acremonium strictum)ＴＥ５０８４が挙げられる。アクレモニウム・ストリクタムＴＥ５０８４(FERM P-14682)は福井県敦賀市の土壌より分離した菌株であり、その菌学的性質は以下の通りである。
【００１０】
（ａ）培養的・形態的性質
（１）麦芽エキス寒天培地：２０℃、１０日間培養で集落の直径は１４〜１６ｍｍに成長した。集落表面の色は明るいオレンジからピンク色を呈し、裏面の色は黄色から黄褐色を呈していた。集落表面の組織は羊毛状若しくはビロード状若しくは粘質状であった。分生子柄は長さ８〜２５μｍであり、分生子は粘塊状に形成し、大きさは４〜６×１〜２μｍ、楕円形から円筒状で滑面を有していた。厚膜胞子は形成しなかった。
（２）オートミール寒天培地：２０℃、１０日間培養で集落の直径は２２〜２４ｍｍに成長した。集落表面の色は明るいオレンジからピンク色を呈し、裏面の色は黄色から黄褐色を呈していた。集落表面の組織は羊毛状若しくはビロード状若しくは粘質状であった。分生子柄は長さ８〜２５μｍであり、分生子は粘塊状に形成し、大きさは４〜６×１〜２μｍ、楕円形から円筒状で滑面を有していた。厚膜胞子は形成しなかった。
【００１１】
0003778297.tif 000002
【００１２】
上記菌学的性質同定のための実験法および分類同定の基準は、主として宇田川俊一、松田良男監訳「食品菌学ハンドブック」（１９８４）医歯訳出版およびK.H.Domsch and W.Gams “Compendium of Soil fungi",volume 1(1993)IHW-Verlag を参考にした。以上の文献および菌学的性質を参考にすると、アクレモニウム・ストリクタム（Acremonium strictum)ＴＥ５０８４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６８２）と命名した。
【００１３】
本発明の酵素を製造するにあたっては、上記アルカリフォスファターゼ生産菌を栄養培地に培養し、該培養物からアルカリフォスファターゼを採取することにより製造できる。
アルカリフォスファターゼ生産菌の培養にあたって使用する培地としては、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコース、グリセロール等が使用される。窒素源としては、例えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素含有化合物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が使用される。またアルカリフォスファターゼの生産誘導として、リン酸濃度を低くしておくことが望ましい。
培地は通常振盪培養、あるいは通気撹拌培養で行う。培養温度は２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃、培養ｐＨ５〜１１の範囲で、好ましくは６〜１０に制御するのが良い。これら以外の条件下でも使用する菌株が生育すれば実施できる。培養期間は通常１〜７日で生育し、菌体内および菌体外にアルカリフォスファターゼが生産蓄積される。
【００１４】
本発明の酵素の精製法は、一般に使用される精製法を用いれば良い。例えば、菌体除去後の培地を、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやポリエチレンイミンなどの凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セルロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などにより精製することができる。またこれらの方法で得られた粗酵素液や精製酵素液は、例えばスプレードライや凍結乾燥により粉末化できる。さらには適当な担体に固定化して固定化酵素として使用できる。
【００１５】
次に、本発明のアルカリフォスファターゼの活性測定法を示す。
まず下記反応混液をキュベットに調製し、３７℃で約５分予備加温する。
２．６ｍｌ  １Ｍジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ１０．２５
０．３ｍｌ  ０．１Ｍｐ−ニトロフェニルリン酸（上記緩衝液に溶解）
次に、酵素溶液０．１ｍｌを加え、緩やかに混和後、水を対照に３７℃で制御された分光光度計で４０５ｎｍの吸光度変化を３〜４分間記録し、その初期直線部分から１分間当たり吸光度変化を求める。盲検は反応混液に酵素溶液の代わりに酵素希釈液（０．２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 を含む０．１Ｍジエタノールアミン緩衝液）を加え、上記同様に操作を行って１分間当りの吸光度を求めた。上記条件下で１分間に１マイクロモルのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００１６】
【発明の効果】
本発明によって熱安定性に優れた、糖鎖を有するアルカリフォスファターゼを得ることができる。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す。
実施例１
０．５％β−グリセロリン酸二ナトリウム、０．５％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．０２％硫酸マグネシウム、０．００２％リン酸一カリウム、１％炭酸ナトリウムを含む培地１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに移し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行った。種菌として、アクレモニウム・ストリクタムＴＥ５０８４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６８２）を一白金耳植菌し、３０℃で４８時間培養し、種培養液とした。次に同培地６Ｌを１０ｌジャーファーメンターに移し、１２１℃で１５分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液１００ｍｌを移し、３００ｒｐｍ，通気量２ｌ／分、３０℃で７２時間培養した。得られた培養液について遠心分離を行い、上清液を得た。本液を硫安分画、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、セファデックスＧ−２００によるゲルろ過により比活性２，０００Ｕ／ｍｇにまで精製した。
得られたアルカリフォスファターゼは下記特性を有していた。
１．下記反応を触媒した。
【００１８】
オルソリン酸モノエステル  ＋  Ｈ2 Ｏ  →  アルコール  ＋  オルソリン酸
【００１９】
２．基質特異性
【００２０】
【表１】
0003778297.tif 000003
【００２１】
３．Ｋｍ値
ｐ−ニトロフェノールに対するＫｍ値は、０．４１ｍＭであった。
４．至適ｐＨ
０．９７Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．０〜１１．０）中での酵素活性を測定した。その結果は図１に示す通りであって、至適ｐＨは１１以上であった。
５．安定ｐＨ
グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２〜３）、酢酸緩衝液（ｐＨ３〜６）、Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８〜９）、グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９〜１０）で２５℃、１６時間保存してその残存活性を測定した。その結果、図２に示す通りであって、安定ｐＨはｐＨ６〜１１であった。
６．至適温度
各温度における酵素活性を測定した。その結果は図３に示す通りであって、至適温度は５０℃であった。
７．熱安定性
本発明の酵素を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で１５分間保温した後、残存する酵素活性を測定した。その結果は図４に示す通りであって、５５℃まで安定であった。
８．金属要求性
Ｍｇ++が必須であるが、Ｃｏ++、Ｍｎ++、Ｃａ++、Ｎｉ++で代替できた。
９．分子量            ６３０，０００（ゲルろ過法）
５６，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
１０．糖含量              ３７％（フェノール硫酸法）
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明酵素の反応ｐＨと相対活性との関係を示すグラフである。
【図２】本発明酵素のｐＨ安定性を示すグラフである。
【図３】本発明酵素の反応温度と相対活性との関係を示すグラフである。
【図４】本発明酵素の熱安定性を示すグラフである。
【図１】
0003778297.tif 000004
【図２】
0003778297.tif 000005
【図３】
0003778297.tif 000006
【図４】
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