(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞不純物を取り除いてプラスミドＤＮＡを精製する方法であって：
（ａ）前記プラスミドＤＮＡを含有する宿主細胞を溶解し、そして溶解物を塩で処理して宿主染色体ＤＮＡを沈殿させ；
（ｂ）前記の塩で処理した溶解物にポリエチレングリコールを添加して前記プラスミドＤＮＡの沈殿物を取得し；
（ｃ）前記沈殿物を溶解して溶液を取得し、そして前記溶液を高い塩濃度に調節して前記宿主細胞不純物を沈殿させ；
（ｄ）前記の高い塩濃度に調節した溶液を清澄化し、そして前記清澄化溶液にサイズ排除又は陰イオン交換クロマトグラフィーを適用する；
工程を含み、リゾチーム、外来性ＲＮアーゼ、プロテイナーゼＫ、フェノール、クロロホルム、及びエチジウムブロミドの不存在下で実施される該方法。
【請求項２】
宿主細胞不純物を取り除いてプラスミドＤＮＡを精製する方法であって：
（ａ）前記プラスミドＤＮＡを含有する宿主細胞を塩基中で溶解して溶解物を取得し、そして続いて塩及び酸で処理して宿主染色体ＤＮＡを沈殿させ；
（ｂ）前記の塩で処理した溶解物に１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコールを添加して前記プラスミドＤＮＡを沈殿させ；
（ｃ）前記沈殿物を緩衝液中で溶解して溶液を取得し、そして前記溶液を酢酸アンモニウムで最終濃度が２．５Ｍとなるように調節して前記宿主細胞不純物を沈殿させ；
（ｄ）工程（ｃ）において酢酸アンモニウムで調節した溶液を清澄化し、そして当該溶液にサイズ排除又は陰イオン交換クロマトグラフィーを適用する；
工程を含み、リゾチーム、外来性ＲＮアーゼ、プロテイナーゼＫ、フェノール、クロロホルム、及びエチジウムブロミドの不存在下で実施される該方法。
【請求項３】
宿主細胞不純物を取り除いてプラスミドＤＮＡを精製する方法であって：
（ａ）前記プラスミドＤＮＡを含有する宿主細胞を溶解して溶解物を取得し；
（ｂ）工程（ａ）で得られた溶解物にポリエチレングリコールを添加して前記プラスミドＤＮＡの沈殿物を取得し；
（ｃ）前記沈殿物を溶解して溶液を取得し；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた溶液に第２の沈殿剤を添加して前記宿主細胞不純物を沈殿させ；
（ｅ）工程（ｄ）で得られた溶液を清澄化し、そして前記溶液にサイズ排除又は陰イオン交換クロマトグラフィーを適用する；
工程を含み、リゾチーム、外来性ＲＮアーゼ、プロテイナーゼＫ、フェノール、クロロホルム、及びエチジウムブロミドの不存在下で実施される該方法。
【請求項４】
前記第２の沈殿剤が高分子量のポリオール及び高濃度の塩から成る群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記高分子量のポリオールがＰＥＧである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＥＧがＰＥＧ８０００である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記高濃度の塩が酢酸アンモニウム、塩化リチウム、塩化ナトリウム、及び酢酸ナトリウムから成る群から選択される、請求項１又は４に記載の方法。
【請求項８】
前記高濃度の塩が酢酸アンモニウムである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
更に、酵素、有機抽出剤、及び突然変異原試薬のいずれも添加しないで実施される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
更に、前記の精製したプラスミドＤＮＡを滅菌し、製剤化し、そしてバイアル充填する工程を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞が細菌である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）において、ポリエチレングリコールを添加する前に、ケイソウ土シリカろ過助剤によるろ過が実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記クロマトグラフィーがサイズ排除クロマトグラフィーである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記クロマトグラフィーがイオン交換クロマトグラフィーである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記サイズ排除クロマトグラフィーが、前記プラスミドＤＮＡ含有溶解液を、２０，０００塩基対のＤＮＡ排除限界を有するサイズ排除媒体に８．０のｐＨ及び１５０mMの塩濃度で接触させ、そしてプラスミドＤＮＡに富むフラクションを回収することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記イオン交換クロマトグラフィーが、前記プラスミドＤＮＡ含有溶解液を陰イオン交換媒体に８．０のｐＨで接触させ、０．７Ｍ〜０．９Ｍの塩勾配を展開し、そしてプラスミドＤＮＡに富むフラクションを回収することを含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はプラスミドＤＮＡの製造方法に関するものである。本方法は特に、ミリグラム、グラム及びキログラム量の医薬品等級プラスミドＤＮＡを組換え細胞から単離しそして精製する方法に関するものである。本発明の方法は遺伝子治療法の分野で有用である。
発明の背景
Ａ．背景
医薬品等級のＤＮＡを製造するための新規製造方法を提供する。プラスミドＤＮＡを精製する現在の技術水準の技術は、実験室規模の遠心の使用、有毒な有機溶媒による抽出及び動物由来の酵素（リゾチーム、ＲＮアーゼ、プロテイナーゼＫ）の使用に依存している。溶解物からのプラスミドＤＮＡの最終精製は、実験室規模の超遠心、調製用ゲル電気泳動及び研究装置のクロマトグラフィーなどの方法を使用して達成される。これらの技術はいずれも医薬品等級プラスミドＤＮＡの大規模製造には適していない。現行技術の欠点は以下に説明する。
現行の実験室方法はプラスミドＤＮＡ製造にはなじみにくい。プラスミドＤＮＡに富む粗製溶解物を調製するために広範に使用されている２つの実験室方法、即ちボイリング法及びアルカリ溶解法が存在する。これらの方法は共に、ニワトリの卵白リゾチームを使用して細菌細胞壁を破壊する。実験室規模の遠心はしばしば粗溶解物から細胞破片を分離するために行われる。膵臓ＲＮアーゼはしばしば、粗溶解物中の核酸の概ね75％を占める宿主由来ＲＮＡを減少させるために使用される。フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール又はこの混合物の改変物による有機抽出は典型的には夾雑タンパク質を減少させるために使用される。この時点で、粗溶解物は依然としてかなりの夾雑宿主染色体ＤＮＡを含有している。更なる処理が必要である。
上記の、粗溶解物から部分的に精製されたＤＮＡを得るための方法は、医薬品等級のＤＮＡを製造するための最適プロトコールではない。リゾチームやＲＮアーゼのような動物由来の酵素は１つの問題を提示する。動物由来であるために、これら酵素は最終プラスミド製品中にウイルスを夾雑させる可能性がある。有機溶媒も問題が多い。これらの化学品は非常に有毒であり、従って製品が医薬品を意図されている場合、最終投与形態中では除去されていなければならない。更に、これらの溶媒では貯蔵、安全な使用及び危険な廃棄物の処分に関してだけでなく、これら溶媒の除去の証明に関してもかなりの費用が方法の費用に加算される。
粗溶解物から単離されたプラスミドＤＮＡは、最もしばしば塩化セシウム／エチジウムブロミド（CsCl／EtBr）平衡超遠心によって更に精製される。共有結合で閉じた環状プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ及び染色体ＤＮＡに対するEtBrの結合能力の違いによってもたらされる密度差によって、これら３つの異なる核酸はCsCl勾配超遠心で富化フラクションに分画することができる。
CsCl／EtBr勾配遠心も医薬的に許容可能なＤＮＡの製造方法として望ましくない。これはＤＮＡを製造するために経済的に規模拡大できる技術ではない。更に、EtBrは、医薬品中ではたとえ痕跡値であっても存在が許容されないような、非常に有毒で、突然変異原性で且つ催奇形性の試薬であり、そして安全な処分に関して重大な問題を提示する。
染色体ＤＮＡを減少させるために粗溶解物を膵臓ＲＮアーゼで処理し、続いてアルカリ／界面活性剤で処理する上記の方法の変法がある。フェノール：クロロホルムによる有機抽出の後にエタノールによるＤＮＡの沈殿、再懸濁及びＤＮＡのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿を行う。また、この方法も医薬品製造になじみにくい時間のかかる実験室規模の方法である。これは、食品医薬品庁（ＦＤＡ）が安全であると一般的に認めている（ＧＲＡＳ）ものではない動物由来の酵素、毒性溶媒及び試薬を使用する。
本明細書に開示した新規方法は遺伝子治療のような用途のための医薬品等級ＤＮＡの製造に適している。この方法は、超らせん、開環状（relaxed）及びコンカテマーを含む種々の形態のプラスミドＤＮＡを分離することができる。この製造方法によって製造されるＤＮＡは、タンパク質、脂質、炭水化物、エンドトキシン、染色体ＤＮＡ及びＲＮＡのような宿主由来の夾雑物を本質的に含有しないか又は痕跡量しか含有していない。これは動物由来又は他に由来する酵素を全く使用しないで製造される。精製はＦＤＡが安全であると一般的に認めている試薬だけを使用して達成される。本発明の製造方法は、大量のＤＮＡ（ミリグラム、グラム、キログラム）に規模拡大できる新規な一連の単位操作から構成されており、そして現行の方法よりかなり経済的である。そして、この製造方法で組み合わせられる一連の単位操作は製品ＤＮＡを適当なバイアルに無菌充填することなどで完了する。これらの特性によって、本明細書に記載した製造方法は現行の技術水準の方法と明白に識別されそしてこの方法は医薬品等級ＤＮＡの製造に特に良好に適する。
Ｂ．利点
上記したＤＮＡ精製用のCsCl／EtBr勾配超遠心の代替法を開発するためにかなりの努力がなされている。これらの方法は全て、最後の超遠心工程をより安全で且つより規模拡大できる方法で置き換えることに基づいている。この目的はCsCl／EtBr勾配方法の同一品質基準を満たすことである。しかし乍ら、標準的なCsCl／EtBr方法を含むこれらの方法はどれも、市販を許可される医薬品に必要な同一性、純度、安全性及び効力の品質基準を達成していない。
組換え技術による医薬品等級タンパク質の製造により、これらのタンパク質が許可医薬品になるためには、宿主夾雑物（例えば、大腸菌ＤＮＡ、大腸菌タンパク質、大腸菌ＲＮＡ、エンドトキシン）が許容され難くそして痕跡値でも厳しく規制されることが教示されている。安全であると一般的に認められていない処理試薬の残留物が同等に厳重な基準に合致しなければならないことは標準的な医薬品の製造から知られている。
プラスミドＤＮＡを製造しそして精製するための本明細書で開示した方法は、大腸菌のような組換え細胞から由来の医薬品に対してＦＤＡや他の国の同様な機関によって設定された基準を全て満たしている。
現行技術水準の方法を超える本発明方法の利点は以下の通りである。
・大規模製造になじみ易い規模拡大できる単位操作から構成されている。
・ＲＮＡ、宿主ＤＮＡ、タンパク質、リポ多糖のような宿主夾雑物を確実に除去する。
・ＲＮアーゼ、リゾチーム及びプロテイナーゼＫのような動物由来の外来タンパク質の添加に依存していない。
・有毒な有機抽出剤の使用に依存していない。
・エチジウムブロミドのような突然変異原試薬の使用に依存していない。
・ＦＤＡのような医薬品規制当局により安全であると一般的に認められている試薬しか使用していない。
発明の概要
本発明は、細菌、例えば大腸菌、酵母、真菌並びに哺乳動物及び昆虫細胞を含む組換え細胞由来の医薬品に関してＦＤＡや他の国の同様な機関が設定した全ての基準を満たすプラスミドＤＮＡの製造及び精製方法に関するものである。
これまでのＤＮＡ単離方法は最後の遠心工程をより安全で且つより規模拡大できる方法に置き換えることに基づいており、その目的はCsCl／EtBr勾配方法の同一品質基準を満たすことである。しかし乍ら、標準的なCsCl／EtBr方法を含めてこれらの方法はどれも、市販を許可される医薬品に必要な同一性、純度、安全性及び効力の品質基準を達成していない。本明細書に記載した発明方法は、細胞から無菌的充填を経て投与に適する最終製品に至るまでの全工程に、より高品質のＤＮＡの製造を可能にする追加的工程を採用する。
本発明による単位操作の新規組合せによって、先行しているどの方法とも顕著に異なる方法がもたらされる。本明細書では、下記の特徴を有するプラスミドＤＮＡの精製方法を開示する。
・毒性又は動物由来の物質を何も使用していない。
・ミリグラム、グラム及びキログラム量に規模拡大できる単位操作からなっている。
・細胞ペーストから最後の無菌充填までの全工程を含む点で包括的である。
・これまでのプラスミド精製方法では決して達成されなかった、医薬品の許可を受けるのに必要な品質基準（同一性、純度、効力）を満たす。
本発明によって達成された進歩はこれまでのどのＤＮＡ単離方法とも実質的に異なる知的前進である。
本発明によれば、（ａ）プラスミドＤＮＡを有する細胞を溶解して溶解物を取得し、（ｂ）不溶性物質除去手段でこの溶解物を処理して溶解液（solute）を取得し、そして（ｃ）この溶解液に分画ＰＥＧ沈殿（differential PEG precipitation）及びクロマトグラフィーを適用してプラスミドＤＮＡを精製する工程を含むプラスミドＤＮＡの製造方法が提供される。
本発明の他の態様では、プラスミドＤＮＡはＧＲＡＳ試薬を用いて製造され、プラスミドＤＮＡは酵素の不存在下で製造され、プラスミドＤＮＡは有機抽出剤の不存在下で製造され、プラスミドＤＮＡは突然変異原の不存在下で製造され、溶解、処理及び適用工程の規模を拡大してプラスミドＤＮＡを大規模に製造することができ、また、これらの溶解、処理及び適用工程の結果医薬品等級の物質が生成する。
本発明の尚もう１つの態様では、請求項１の方法は、（ｄ）プラスミドＤＮＡを製剤化し、滅菌しそしてバイアル充填して治療投与に適する製品を得る工程を更に含む。滅菌はろ過を含み得る。
本発明のもう１つの特徴によれば、請求項１における細胞は緩衝液中に懸濁されそして希塩基又は希塩基と界面活性剤中に溶解される。緩衝液は酢酸ナトリウムであってもよく、塩基は水酸化ナトリウムであってもよくそして界面活性剤は非イオン界面活性剤であってもよい。細胞を酢酸ナトリウム緩衝液に懸濁して均質な細胞懸濁物を得てもよく、そして細胞を水酸化ナトリウムと非イオン界面活性剤の溶液中で溶解して溶解物を得てもよい。この溶解物はその後の処理の前に酸で中和してもよい。
本発明の更にもう１つの特徴では、請求項１の不溶性物質除去手段はフィルターを含む。
本発明の他の態様では、請求項１の分画ＰＥＧ沈殿の後にクロマトグラフィーを行い、分画ＰＥＧ沈殿は、不純物の沈殿物を取得するためのＰＥＧによる第１の沈殿及びプラスミドＤＮＡ沈殿物を取得するためのＰＥＧによる第２の沈殿を含む、第１の沈殿は第２の沈殿に先行し、また、第１の沈殿は第１のプラスミドＤＮＡ含有溶液にＰＥＧを加えて低いＰＥＧ濃度を得ることを含み、一方第２の沈殿は第２のプラスミドＤＮＡ含有溶液にＰＥＧを加えて高いＰＥＧ濃度を得ることを含む。
本発明の更に他の態様では、請求項１のクロマトグラフィーはイオン交換クロマトグラフィー若しくはゲルろ過クロマトグラフィー又はこれらの組合せを含み、ゲルろ過クロマトグラフィーはプラスミドＤＮＡ含有溶液を、約20,000塩基対のＤＮＡ排除限界を有するサイズ排除媒体に約8.0のｐＨ及び約150mMの塩濃度で接触させそしてプラスミドＤＮＡに富むフラクションを回収することを含み、また、イオン交換クロマトグラフィーはプラスミドＤＮＡ含有溶液を陰イオン交換体に約8.0のｐＨで接触させ、約0.7Ｍから約0.9Ｍの間で塩勾配で展開し、そしてプラスミドＤＮＡに富むフラクションを回収することを含む。
本発明において、請求項１の工程（ｂ）が、アルコール又はＰＥＧで処理して、溶解液又は溶解液から得られるプラスミドＤＮＡ含有溶液からプラスミドＤＮＡ沈殿物を回収することを更に含んでもよい。同様に、請求項１の工程（ｂ）は、高濃度塩で処理して、溶解液又は溶解液から得られるプラスミドＤＮＡ含有溶液から不純物の沈殿物を除去することを更に含んでもよい。
本発明のもう１つの態様では、請求項１の細胞は大腸菌細胞である。
【図面の簡単な説明】
図１はＶＣＬ−1005のプラスミドマップである。
発明の詳細な説明
本発明は、遺伝子治療のような用途のための医薬品等級ＤＮＡを製造するのに適する新規な方法に関するものである。この方法は標準的なCsCl／EtBr勾配方法に取って代わりそしてより高品質の製品を与える。超らせん、開環状（relaxed）及びコンカテマーを含む同一の配列を有する種々の形態のプラスミドＤＮＡを分離することができる。この製造方法によって製造されるＤＮＡは宿主由来夾雑物を本質的に全く含有しないか又は痕跡値しか含有していない。精製はＦＤＡが安全であると一般的に認めている（ＧＲＡＳ）試薬だけを使用して達成される。バイアル製品は、これまでのプラスミド精製方法では決して達成されなかった、医薬品の許可取得に必要な品質基準（同一性、純度、効力）を満たす。
この製造方法によって、ミリグラム、グラム及びキログラム量の医薬品等級プラスミドＤＮＡが製造される。一般的に、この方法は、プラスミドＤＮＡを有する、振盪フラスコ培養、バイオリアクター又は発酵器培養から得られる細胞（例えば、細菌、酵母、真菌、哺乳動物、昆虫又は他の細胞）を溶解して粗溶解物を取得し、ろ過、遠心、任意の形態のクロマトグラフィー及び／又は分画沈殿を使用して、プラスミドＤＮＡに顕著に富む、部分的に精製されたＤＮＡ中間体を濃縮しそして細胞破片のような宿主夾雑物から分離し、クロマトグラフィー及び／又は分画沈殿によって、部分的に精製されたＤＮＡ中間体からタンパク質、ＲＮＡ、脂質及び染色体ＤＮＡのような残存夾雑物を除去し、クロマトグラフィー及び／又は分画沈殿によって、ＤＮＡの残存夾雑物や残存体の精密分離を達成し、所望のプラスミドフラクションを滅菌して、処理中に混入した空中微生物を除去し、そして医薬品投与形態を適切に送達（deliver）するためバイアルに無菌的に充填する、ことを含む。
この製造方法において、これらの工程はＦＤＡが安全であると一般的に認めている塩、緩衝液、溶媒、抽出剤及び沈殿剤を使用する。エンドトキシン／発熱物質はＦＤＡが許容する値にまで生成物から有効に分離される。宿主染色体ＤＮＡは製品ＤＮＡから分離される。宿主タンパク質は製品ＤＮＡから単離される。種々の形態、すなわち、超らせん、開環状及びコンカテマーのＤＮＡが分離される。この方法は規模拡大可能な単位操作からなっている。この方法は危険な有機廃棄物を生成しない。
標準的な実験室方法を使用するプラスミドＤＮＡの精製はしばしば不完全であり、許容できないレベルのＲＮＡ、タンパク質、エンドトキシン及び宿主染色体ＤＮＡが残るが、本発明の方法は完全である。宿主ＤＮＡ、エンドトキシン／発熱物質、ＲＮＡ及びタンパク質のレベルは検出可能でないか又は痕跡量まで減少する。
次の図表は標準的な実験室方法を本明細書に記載した製法方法の１つの応用例と比較したものである：
0003782104.tif 000002
精製後に、プラスミドＤＮＡを品質管理によって分析してこれが仕様を満たしていることを確認する。品質管理の完了後、ＤＮＡを無菌バイアル充填物に製剤化する。
ＦＤＡ及び同様な機関によって設定された基準
米国連邦法は、ヒトの治療における医薬物質の使用は連邦政府当局によって承認されることを要求している。実施責任は食品医薬品庁（ＦＤＡ）の責任であり、ＦＤＡはこのような承認を確実に行うために適切な法令を発布し、これは米国食品医薬品法第301〜392条（21 U.S.C. 301-392）に詳記されている。動物の組織から製造される製品を含む生物学的材料についての法令は米国公衆衛生福祉法第262条（42 U.S.C. 262）で規定されている。大部分の外国は同様な承認を要求している。法令は国によって異なっているが、個々の手順は当業者に良く知られている。
プラスミドＤＮＡ
本発明のプラスミドＤＮＡに制限はない。これらのプラスミドとしては、例えば、原核生物及び真核生物ベクター、クローニング及び発現ベクター、pBR322及びpUCベクター並びにこれらの誘導体等を含むもの、そして種々の複製開始点、例えばpMB1やColE1のような原核生物複製開始点並びに酵母、真菌、昆虫及び哺乳動物細胞での複製を促進するもの（例えば、ＳＶ40 ori）のような真核生物複製開始点を有するもの、そしてまたクローニングや発現を促進する多数の遺伝子要素、例えば、選択遺伝子、ポリリンカー、プロモーター、エンハンサー、リーダーペプチド配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル等を包含するものが考えられる。ベクター、開始点及び遺伝子要素の選択は必要条件に基づいて変わり、そしてこれは当該技術分野の研究者の技倆の範囲内である。同様に、宿主は、細菌、酵母、真菌、昆虫及び哺乳動物の細胞を含む原核生物及び真核生物のなかから選択することができる。好ましい宿主は微生物細胞、特に大腸菌のような微生物である。任意の適当な大腸菌株が考えられる。同様に、多様な構造タンパク質（又はペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、リンタンパク質、アミド化タンパク質等）をコードする遺伝子をプラスミド中に挿入することができ、そしてこれらの遺伝子は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド等の配列を構成することができる。これらの配列は化学合成又は遺伝子操作技術（Sambrook、Fritsch、ManiatisのMolecular Cloning, A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年、及びCurrent Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Assoc. ＆ Wiley、1987年、参照、これらは共に参照により本明細書に明示的に含める）を使用して得ることができ、そして更に、これらの配列をプラスミド中に挿入し、そしてその後追加的な遺伝子操作技術（同上）を使用して宿主細胞中に導入することができる。プラスミドＤＮＡ含有宿主の培養については、培養は上記した参照文献中に開示されているような既知の方法を使用して実施することができ、バッチ発酵、補給型バッチ発酵、連続培養、タイプＩ、II及びIII発酵、無菌発酵、共同発酵、保護発酵等に従って、インキュベーター、バイオリアクター、発酵器等が考えられる。培養条件（例えば、培地、温度、ｐＨ，時間、撹拌、曝気等）を状況に適合させることは経験的に可能であり、そしてそれは当業者の技倆の範囲内である。
本発明の１つの適用では、ヒトの固形腫瘍（ＶＣＬ−1005）を治療するために設計される医薬品等級のプラスミドＤＮＡが製造される。１つの臨床的な手法は、乳酸加リンガー希釈剤中で処方された陽イオン脂質混合物（例えば、ＤＭＲＩＥ及びＤＯＰＥ）とヒトの主要組織適合性抗原をコードする遺伝子（ＨＬＡ−Ｂ7）（Nabel、Gray J.等、Proc. Nat. Acad. Sci.、USA 90:11307〜11311(1993年)）とのコンプレックスを腫瘍に注入することである。この抗原は特定の個人に特有であり、そして臓器移植拒絶のような強い免疫応答に関与する。ＨＬＡ−Ｂ7遺伝子はＨＬＡ−Ｂ7タンパク質の生成をコードする。このタンパク質の発現は、腫瘍細胞に対する強力な細胞毒性Ｔリンパ球応答を身体に生じさせることが期待される。ＶＣＬ−1005の説明は実施例１で提供し、その構築の説明は実施例２に示し、そしてＶＣＬ−1005の発酵方法の特徴は実施例３に示す。
細胞ペースト
プラスミドＤＮＡ含有宿主細胞の培養完了後、組換え体を通常の方法、例えば、特定の適用に依存して、実験室、パイロットプラント又は産業規模の遠心及び／又はろ過によって回収する。これらの細胞は標準的な方法を使用して冷凍貯蔵するか又は直ちに処理することができる。
緩衝液中での細胞の再懸濁
得られた細胞ペーストは、細胞を再懸濁する再懸濁技術を使用して緩衝液中に再懸濁する。緩衝液に制限はない。好ましくは、緩衝液は食品医薬品庁（ＦＤＡ）が安全と一般的に認めている（ＧＲＡＳ）試薬に含まれる。このような緩衝液は、酢酸ナトリウム、クエン酸カリウム、一塩基若しくは二塩基リン酸ナトリウム又はこれらの混合物等を含有し、好ましくは酢酸ナトリウムである。ｐＨ及びイオン強度の選択はまさに当業者の技倆レベルの範囲内である。
細胞の溶解
この工程では、溶解技術を使用して上記細胞を溶解して、染色体ＤＮＡ、高分子量ＲＮＡ、タンパク質及び膜コンプレックスのような非プラスミド不純物を沈殿させる。好ましい態様によれば、細胞はリゾチームのような動物又はその他に由来する酵素に頼ることなく溶解される。有利には、溶解は希塩基又は希塩基と界面活性剤中で行われる。塩基及び界面活性剤のいずれにも制限はない。これらはＧＲＡＳ試薬と同等であることが好ましい。上記のような塩基は水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、重炭酸ナトリウム等であり、一方上記のような界面活性剤は医薬的に許容可能な非イオン界面活性剤、例えば、ポリソルベート（商標Tween（登録商標）で販売されている）、ユニオンカーバイド（Union Carbide）によって販売されているポリオキシエチレンエーテル（Triton（登録商標））等である。NaOHとトゥイーン（登録商標）の組合せ物が有利であり、トゥイーン（登録商標）80が好ましい。ｐＨとイオン強度の最適化は当業者の技倆の範囲内である。アルカリ溶解の代替的な態様は、例えば、フレンチプレス（French Press）、ミクロフルイダイザー（microfluidizer）等を使用する機械的破壊である。
溶解物の酸性化
任意に、この工程で酸性化技術を使用して上記溶解物を酸性としてアルカリ処理中にもたらされる粘度上昇を減少させ細胞溶解で生じた不溶性物質のその後の除去を促進する。任意の酸を使用することができる。好ましくは、酸は、氷酢酸、リン酸、クエン酸等のようなＧＲＡＳ成分である。ｐＨとイオン強度の適合化は経験的に可能でありそして当該技術分野の技術者の技倆の範囲内である。
細胞破片及び他の不純物の除去
この工程で、細胞溶解中に放出される細胞破片や高分子量不純物は、実験室、パイロットプラント又は産業的規模の遠心及び／又はろ過によって通常の方法で除去される。ろ過は、その次の積極的沈殿の前に清澄な溶解物を確保するのに有利である。実務者に良く知られているように、ろ過は、セルロース、ケイソウ土、セライト（登録商標）ろ過助剤等を含む助剤を使用して不均質又は粘性溶液の流動特性を高めることができる。
本発明の方法に従って溶解物をろ過する材料は、プラスミドＤＮＡをろ液と共に通過させ得るほど十分に大きいが組み立てたフィルターが不溶性物質の大部分を保持するほど十分に小さい直径を有する穴又は孔を有する。孔のサイズは不規則的であってもよくそして全体的な効果により沈殿物が保持される限り変更可能である。従って、孔のサイズは、好ましくは約0.1〜100ミクロンであり、約0.5〜50の範囲が特に好ましい。フィルターを製造する材料は合成材料又は有機若しくは無機天然材料でよいが、これは夾雑する核物質を含有する可能性がある天然に存在する有機の植物又は動物製品とすべきではない。フィルター材料はまた有利には、オートクレーブ処理可能で、適応性があり（malleable）そして強力であり、そして特有の実験状況に適合できる種々のろ過効率を達成するように層状で組み立てることができる。フィルター材料は好ましくは非吸着性でありそして親水性又は疎水性であることができるが、疎水性はろ液の流れを妨げないようにすべきである。適当なフィルター材料の例は、ガラス、プラスチック若しくは金属スクリーン、多孔性フィルム、セルロース若しくは繊維マット、織布若しくは不織布、又はナイロン若しくはレーヨンのような合成布、例えばミラクロス（Miracloth）（登録商標）（Calbiochem、カタログ番号475855、カリフォルニア州ラジョラ）、即ち22から25μmの平均孔サイズを有する合成不織レーヨン布である。多孔性のフリットガラスディスクのような材料を使用することができるが、フィルター材料は好ましくは柔軟性である。ろ過は重力、加圧又は減圧条件下で実施することができる。
清澄ろ液からのプラスミドＤＮＡの沈殿
プラスミドＤＮＡの沈殿物を得るための方法は典型的には、細胞を溶解し、例えばエタノール又はイソプロパノールを使用するアルコール沈殿によってプラスミドＤＮＡを採取することを特徴とし、そして温度、一価陽イオンの存在及び遠心の変動要因が関係する。この技術は小規模処理に適するが、プラスミドＤＮＡの大規模医薬品製造に適用するときには問題になる。アルコールを沈殿剤として使用するとき、再現性のある結果を得るためには温度を厳密に制御しなければならない。アルコールを大容量で使用するときに温度を必要な程度に維持することは費用がかかり且つ操作し難い。更に、方法の規模を拡大するとき、アルコールは爆発耐性の沈殿タンク及び処理領域（例えば、爆破壁等）を必要とする。この要件は建物の設計及び建築費用を著しく高める可能性がある。これはまた、このような施設を設置できる地域を制限する可能性もある。更に、エタノールと２−プロパノールは危険廃棄物として処理しなければならない。この種の廃棄物処理は高価になる可能性がある。大量のアルコールの使用に依存しない方法を設計することが有利である。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は他の同様な高分子量ポリオールは、タンパク質及び核酸の回収の両方で沈殿剤及び抽出剤として使用することができる。ＰＥＧ沈殿はＤＮＡの製造に有利である。ＰＥＧは医薬品の許容可能な成分である。アルコール沈殿剤とは異なって、再現性のある結果を得るのに温度を厳密に監視する必要がない。ＰＥＧは、アルコールのように爆発性のような問題を与えず、また危険廃棄物の難点もない。
これらの理由により、任意に、アルコール沈殿をＰＥＧ沈殿で代替する。この工程で、ＰＥＧを清澄ろ液に加えてＰＥＧを高濃度にする。最終濃度を約10％のＰＥＧ（重量／容量）にすることが有利であろう（上述）。ＰＥＧ−8000が好ましい。標準的な沈殿技術の適用並びにｐＨ及びイオン強度の選択は当業者の技倆の範囲内である。
部分的に精製したＤＮＡの採集
アルコール又はＰＥＧ沈殿の結果、形成されるプラスミドＤＮＡの沈殿物は、実験室、パイロットプラント又は産業的規模の遠心及び／又はろ過による通常の方法で分離される。
ろ過は、溶媒を効率的に通過させながらプラスミドＤＮＡ沈殿物を回収するのに効果的な孔サイズの要件を満たす任意のフィルター材料で実施することができる。フィルターの孔サイズは、ろ過性能が効果的である限り、変動可能である。この用途に最も有効なフィルターはろ過すべき凝集ＤＮＡの大きさに依存し、そして凝集物の大きさは、沈殿剤と溶媒に依存する。フィルター、沈殿物及び溶媒のマッチングは経験的に可能であり、そして当該技術分野の研究者の技倆の範囲内である。効果的なろ過は、フィルター上での最大の生成物回収と最小の夾雑物保持によって決定される。適切なフィルターは約0.1〜100ミクロン、好ましくは約0.1〜50ミクロンの孔直径又は孔直径範囲を有する。この工程のプラスミドＤＮＡろ過用のフィルター材料は、好ましくは、細胞破片の分離に関して上記した物理的特性を有する。即ち、該材料は、合成若しくは無機材料、又は核成分が夾雑しておらず、オートクレーブ処理可能で、強くそして適応性のある材料で製造される。
部分的に精製したＤＮＡの緩衝液への溶解及び高濃度塩によるＲＮＡ及びリポ多糖不純物の沈殿
本発明の方法全体を通して、プラスミド沈殿物を緩衝液に再懸濁するときには、再懸濁技術を使用し、そして好ましくはＧＲＡＳ緩衝化剤である緩衝液を使用する。
この工程で、高濃度塩沈殿は沈殿技術を使用しそしてｐＨとイオン濃度を選択して実施することができ、そしてこれらは当該技術分野の熟練者に既知である。高濃度塩沈殿は夾雑ＲＮＡの幾らかそして多くのリポ多糖を除去するのに有効である。塩に制限はないが、好ましくはＧＲＡＳ成分である。酢酸アンモニウム、塩化リチウム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム等が有用であり、酢酸アンモニウムが好ましい。
沈殿した不純物の除去
高濃度塩沈殿の結果、形成される不純物の沈殿物は、実験室、パイロットプラント又は産業的規模の遠心及び／又はろ過による標準的な技術を使用して分離される。ろ過は、不純物の沈殿物を保持し、一方プラスミドＤＮＡろ液の回収を可能にするのに効果的な孔サイズの要件を満たす任意のフィルター材料で実施することができる。効果的なろ過は、フィルター上での最大の夾雑物回収と最小のプラスミド保持、即ち最適の生成物通過によって決定される。適切なフィルターは約0.1〜100ミクロン、好ましくは約0.1〜50ミクロンの孔直径又は孔直径範囲を有する。この工程のろ過用のフィルター材料は、好ましくは、ろ過に関して上記した物理的特性を有する。即ち、該材料は、合成若しくは無機材料、又は核成分が夾雑しておらず、オートクレーブ処理可能で、強くそして適応性のある材料で製造される。
低濃度のＰＥＧによる高分子量ＤＮＡ及びＲＮＡ不純物の沈殿
分画ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿は、プラスミドＤＮＡの回収を最大にしそして夾雑物の保持を最小にして優れたプラスミドＤＮＡ中間体をもたらすことによって有機抽出や他の不利な精製計画に取って代わり得ることが分かった。実施例７では、分画沈殿を有効にするために必要な最適ＰＥＧ濃度を決定するために実施された滴定（titration）が例示される。この例示に基づいて、当該技術分野の熟練者は同様な滴定を実施して同等に最適のパーセントを確認することができる。
本発明によれば、ＰＥＧを使用する分画沈殿は、夾雑物や宿主由来の不純物からのプラスミドの単離を達成するために、プラスミドＤＮＡ溶液にＰＥＧを異なる濃度で逐次添加することによって構成される。連続して、ＰＥＧは夾雑物や不純物を析出させるのに十分な低いパーセントでプラスミド含有溶液に導入されるか又はプラスミドＤＮＡを落とすのに十分に有効な高いパーセントで導入される。低濃度カットは高濃度カットに先行してもよく、若しくは高濃度カットが低濃度カットに先行してもよく、又は、高濃度カット、低濃度カットそして高濃度カットの順序の一連の沈殿を行ってもよい。
好ましい態様では、約４％のＰＥＧカット（重量／容量）及び約10％のＰＥＧカット（重量／容量）が実施される。４％カットは染色体ＤＮＡ及びＲＮＡのような不純物を取り出す消極的沈殿であり、一方10％カットによって高度に精製された状態のプラスミドＤＮＡが沈殿する。低濃度ＰＥＧ沈殿で開始し次いで高パーセントＰＥＧ沈殿を行うことが有利であろう。例えば、４％カットは高濃度カットの先に行ってもよいが、この決定は状況によって変わる。ＰＥＧ−8000が好ましい。このように、プラスミドＤＮＡ含有試料（例えば、上記のろ液）に、ＰＥＧの採集濃度が４％（ｗ／ｖ）を達成するのに十分なＰＥＧを添加する。当該技術分野の熟練者に認められているような標準的な沈殿技術を適用し且つｐＨとイオン強度を調整することによって、消極的沈殿はこのような態様で達成される。
沈殿した不純物の除去
沈殿した不純物は、沈殿した不純物の除去に関して上記した通常の遠心及び／又はろ過方法に除去される。
高濃度ＰＥＧによるプラスミドＤＮＡの沈殿
上記した分画ＰＥＧ沈殿に従って、可溶性夾雑物や不純物からプラスミドを析出させるのに十分な高濃度のＰＥＧをプラスミドＤＮＡ試料に加える。低濃度ＰＥＧカットを実施した後に得られるろ液にＰＥＧを導入することが有利であろう。かくして、４％カットを実施しそしてその後の高濃度カットを実施することができる。10％カットは有益であることが証明されよう。この場合には、ＰＥＧは最終濃度が10％（重量／容量）になるように試料に添加される。ＰＥＧ8000が好ましい。ｐＨとイオン強度の選択及び標準的な沈殿技術の適用は当該技術分野の実務者に明白でありこの工程は首尾良く実施されよう。
プラスミドＤＮＡの回収
プラスミドＤＮＡは、部分的に精製したＤＮＡの採取に関して上記した遠心又はろ過によって通常の方法で採取される。
緩衝液中でのプラスミドＤＮＡペレットの溶解
プラスミドＤＮＡは緩衝液、好ましくはＧＲＡＳ緩衝化剤に溶解され、最終精製用に調製される。
染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、リポ多糖及びタンパク質のような多数の宿主夾雑物から分離すると、プラスミドＤＮＡに富むが未だ少量のＲＮＡオリゴヌクレオチド、痕跡量の染色体ＤＮＡ、タンパク質、エンドトキシン及び処理で残った残留物を含有している可能性のある試料が得られる。本発明によれば、更なる精製は、残存する核酸、巨大分子、小分子量体及び残留物を生成物から除去し、そして更には共有結合で閉じた環状ＤＮＡ、即ち超らせん単量体をニックのある環状プラスミド（開環状（relaxed）単量体）及びコンカテマー体（超らせん二量体等）から単離する独立の工程として実施することができる。この目的のためにはクロマトグラフィー工程が実施される。イオン電荷、分子サイズ及び／又は他の特性の差異を利用して所望のプラスミドＤＮＡ種を精製する。クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び任意の同様なクロマトグラフィー、並びに、更にはプラスミドＤＮＡの最終精製をもたらすこれらのクロマトグラフィーの任意の組合せも考えられる。
ファルマシアＳ−1000を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによる残存不純物（高分子量のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質及びエンドトキシン）の除去
サイズ排除法は単純で且つ再現性のあるクロマトグラフィー方法である。この方法は、夾雑するＲＮＡ、染色体ＤＮＡ、タンパク質及びエンドトキシン、そして更には種々のプラスミドＤＮＡ種の正確で且つ再現性のある分離が可能であるため、プラスミドＤＮＡを精製する優れた方法であることが見い出された。実施例８では、ゲルろ過法（及び立体排除法）としても知られているサイズ排除法はクロマトグラフィー工程の好ましい実施態様を例示する。
対象の生成物プラスミドは、ＶＣＬ−1005の分子量、即ち３×106kDのオーダーの分子量を有している。このプラスミドが約５kbの大きさであって、プラスミドはこの大きさの約半分又はこの大きさの３、４若しくは５倍であることもあるが、プラスミドの分子量は約１桁しか異ならない。対照的に、エンドトキシンは50,000kDの平均分子量を有している。かくして、生成物はサイズ排除カラムでエンドトキシンから容易に分離するであろうと仮定された。更に、アガロースゲル分析によっても、問題の主要夾雑物は主として分子量の差異によって生成物と区別できることが示された。これらの特徴を組み合わせることによって、サイズ排除クロマトグラフィーは魅力的な代替的精製法となった。
ＤＮＡのクロマトグラフィー精製は新しい１組の問題を提示する。ＤＮＡ上の表面電荷分布はタンパク質で見られるものと非常に異なっている。タンパク質は、イオン交換マトリックスと一緒に使用して高分解能分離を達成できる特有の空間荷電フットプリントを有するドメインを有している。しかし、ＤＮＡは均一にマイナスに荷電した表面を有しており、タンパク質に共通する明白なドメインを有していない。上記で示唆したように、プラスミドＤＮＡはまた非常に大きい。大部分の市販で入手可能なイオン交換マトリックスは300〜1000Åの範囲の孔サイズを有している。プラスミドＤＮＡには少なくとも4000Åの孔が必要である。ＤＮＡは大きい孔の陰イオン交換マトリックスに良好に結合するので、ＲＮＡは単純な塩勾配でプラスミドＤＮＡから容易に分離される。しかし乍ら、エンドトキシン、プラスミドコンカテマー及び宿主細胞ＤＮＡはしばしばプラスミドピークに混入する。これらの理由により、陰イオン交換は部分的精製及び／又はプラスミドＤＮＡの濃縮には有用であり、そしてこのようなものとして考えられるが、この方法は市販で入手できるマトリックスやＤＮＡの構造／電荷に固有の制限によって制限される。
サイズ排除クロマトグラフィーの利点は、医薬品を製造するために設計される方法における最終仕上げ工程としての有用性によって高められる。金属や塩のような小分子量夾雑物は一般的に確実に除去され、再現性のある組成を有する製品が得られる。サイズ排除を検討する決定がなされたのはこれらの理由によるものであった。
ファルマシアＳ−1000（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）は非常に高分子量の生成物と適合する分子排除特性を有する市販で入手可能なマトリックスであるので、これをサイズ排除媒体として選択した。この樹脂は20,000塩基対のＤＮＡ排除限界を有することがファルマシア（Pharmacia）によって報告されている。ファルマシアＳ-1000を使用するサイズ排除クロマトグラフィーは残存不純物の除去及び種々のプラスミドＤＮＡ種の識別に優れていることが見い出された（実施例８）。このように、ゲルろ過材料は、非常に高分子量の生成物を分離できる限り制限はなく、そして好ましくはファルマシアＳ−1000マトリックス又はその誘導体、代替物若しくは等価物である。
この工程に従って、次に、試料をクロマトグラフィーカラムに負荷する。分離は一般的にイソクラティクで（isocratically）、即ち単一の移動相を使用して行われる。分子分離用の緩衝液は、当該技術分野の技術者によって認められているような適切なイオン濃度及びｐＨの水性緩衝液で構成される。試料容量のカラムベッド容量に対する割合は適切でなければならない。流速は適当な速度に維持される。クロマトグラフィーは定型的なクロマトグラフィー技術を使用して実施される。
クロマトグラフィー工程のもう１つの態様では、一定のｐＨでの分子のイオン電荷又は等電点（ｐＩ）に基づいてプラスミドＤＮＡ分子を夾雑分子から分離するためにイオン交換クロマトグラフィーを実施する。イオン交換カラムには、支持マトリックスを構成するプラスに荷電したビーズ（陰イオン交換体用）又はマイナスに荷電したビーズ（陽イオン交換体用）を充填することができる。分子の電荷密度及びｐＩで、分子の分離に適する支持マトリックスのイオン容量が決まる。
イオン交換操作は２つの異なる移動相又は緩衝液を使用して（即ち、勾配条件下で）行うことができる。開始緩衝液は低濃度塩又は低イオン濃度緩衝液でよい。溶出緩衝液は開始緩衝液よりかなり高いイオン濃度を有してよい。操作ｐＨは試料の溶解度及び支持マトリックスの安定性によって決定することができる。例えば、イオン交換体は約６〜11のｐＨ及び約0.3から1.0Ｍ NaClの間で展開される直線勾配で流すことができる。水と混合し得る有機溶媒（例えば、アセトニトリル）を使用して保持時間を減少させることができるが、有機化学品廃棄物を貯蔵しないために有機溶媒の使用を回避することが好ましい。
更にもう１つの態様では、アフィニティークロマトグラフィーを使用して特異的な活性に基づいて分子を分離する。アフィニティークロマトグラフィーは多数の種々のタイプのマトリックスで達成することができる。アフィニティー支持体には、分子と共有結合し得るもの及び支持体に結合したリガンド（このリガンドで認識し得る分子を精製する）を含有するものが含まれる。アフィニティー支持体の選択性及び結合特性は分離すべき分子によって決定される。
分子をアフィニティーカラムに結合させそしてアフィニティーカラムから分子を溶出するのに必要な条件も同様に特定の各分子毎で変動する。一般的に、分子のアフィニティー精製は単純な段階勾配（step gradients）で達成することができ、これは１つの緩衝液即ち結合緩衝液による結合と、もう１つの緩衝液即ち溶出緩衝液による放出とを含む。分子の結合及び溶出特性が知られていない場合、精製を最適化するように塩又はｐＨを直線勾配で増加させることが有用である。論理的な一連の溶出条件は、酸溶出、塩基溶出又はカオトロピック剤である。溶出剤を選択した後、溶出条件は濃度、時間及び温度を最適化することによって改善することができる。
更にもう１つの態様では、分子の表面疎水性の差異に基づいて分子を分画するために疎水性相互作用クロマトグラフィーを実施することができる。（逆相クロマトグラフィーは一般的にこれらの同じ特徴を利用するが、有機溶出溶媒を必要とするためあまり好ましくない。）クロマトグラフィーマトリックスと結合した疎水性リガンドと疎水性基間の相互作用がこの化学現象に介在し、そしてそのため脱塩能力に関して作用するのに特に適したものである。マトリックスのタイプ、疎水性基の性質並びに吸着及び溶出の条件は関係分子特有の特性に合せて調整することができる。
本明細書で提供したクロマトグラフィーの態様のいずれを選択しそして使用するかは当該分野の技術者の技倆の範囲内である。クロマトグラフィー方法はシリカ及びポリマーに基づく技術を使用することができる。クロマトグラフィーのこれらの適用はＨＰＬＣ及びＦＰＬＣ系と適合する。溶出曲線は、例えばＵＶ吸光度、アガロースゲル電気泳動及び他の分析方法によって、連続して記録するか又は個々のフラクションを調べて決定することができる。
フラクションのプール
生成物含有フラクションをプールしてプラスミドＤＮＡの医薬品等級物質を得ることができる。
医薬品等級プラスミドＤＮＡ
プラスミドＤＮＡの医薬品等級物質の取得に続いて、この物質を製剤化用緩衝液、上記のような乳酸加リンガー注射用媒体又は他の無害の緩衝化送達媒体中で希釈することができ、又はこれを沈殿させるか若しくは濃縮しそしてその後、当該技術分野の熟練者によって認められている既知の技術を使用して製剤化用緩衝液中に入れることができる。
この段階で、医薬品等級プラスミドＤＮＡを含有する溶液を滅菌してもよい。幾つかの滅菌技術のいずれかを採用することができる。好ましい態様では、滅菌はろ過によって達成される。
ろ液を効率的に通過させるほど十分に大きいが、処理中に導入した空中微生物等をフィルター材料が保持できるほど十分に小さい直径を有する孔を特徴とするフィルター材料を使用することができる。従って、孔サイズは好ましくは約0.01〜10ミクロンであり、特に好ましくは約0.1〜１ミクロンの範囲である。フィルターを製造する材料は合成材料又は有機若しくは無機天然材料でよいが、この材料はプラスミドＤＮＡと結合する傾向が有するべきでない。また、プラスミドＤＮＡと一緒にフィルターを通過するように意図されている物質、例えば製剤化用緩衝液を構成する成分等を制限する傾向があるべきでない。加えて、この材料は非発熱物質であるべきである。好ましい態様では、フィルター材料は約0.2μmの平均孔サイズを有する。フィルターはまた、重要なことに、無菌である。
滅菌は有利には、クラス100フード又は同様な無菌条件下で実施される。プラスミドＤＮＡは無菌ろ過の前か又は後かのいずれかで沈殿又は濃縮しそして製剤化用緩衝液に再懸濁することができると考えられる。更に、最後に、最終製品は無菌処理中にバイアルに充填し、このバイアルを密封しそして表示をし、そしてこの医薬品を、例えばインビボ又はエクスビボ遺伝子治療法における治療投与用に発送することができる。
本発明の具体的な特徴は、以下の実施例を参照して更に容易に理解することができ、これらの実施例は本発明を例示するためのものであって本発明の範囲を例示した特定の実施態様に限定することを意図するものではない。
実施例１  ＶＣＬ−1005の説明
ＶＣＬ−1005はプラスミドＤＮＡから構成されていた。（プラスミドマップは図１として添付する。）このプラスミドＤＮＡはpBR322プラスミドから誘導されそしてヒトＭＨＣ遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ7をコードしていた。このプラスミドは細菌発酵で生成された。
共有結合で閉じた環状（主として超らせん）ＤＮＡ巨大分子は、このプラスミドＤＮＡの１部分によってコードされるカナマイシン耐性タンパク質の発現を要求する選択培地中で増殖した細菌細胞で生合成された。このＤＮＡは続いて、本質的に全ての他の細胞材料を除いて精製された。このプラスミドは約5000bpの大きさであり、そしてこれは約３×106g.m.u.の分子量であった。
カナマイシン耐性タンパク質（Tn903）をコードする細菌的に発現された遺伝子にえて、このプラスミドＤＮＡは、ＨＬＡ−Ｂ7と称されるクラス１の主要組織適合性複合体のＨ鎖（ヒトＨＬＡＢ7 ｃＤＮＡ）及びＬ鎖（チンパンジーＢ−2 ミクログロブリン ｃＤＮＡ）タンパク質もコードしていた。これら２つのタンパク質はバイシストロニックｍＲＮＡで発現された。このｍＲＮＡの真核細胞転写は、３'ロングターミナルリポート（ＬＴＲ）由来のラウス肉腫ウイルスプロモーター配列及びウシ成長ホルモン遺伝子由来の転写終結／ポリアデニル化シグナル配列に依存していた。Ｈ鎖の真核細胞発現は５'キャップ依存性タンパク質翻訳開始部位によって調節された。Ｌ鎖の発現は、脳心筋炎ウイルス由来のキャップ非依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）配列によって調節された。さらに、細菌細胞におけるこのプラスミドの複製は細菌性複製開始点の存在下で調節された。
精製プラスミドＤＮＡの個々の調整物は、260ナノメートルにセットした光源を有する分光光度計を使用する光学密度吸光度測定によって濃度を測定した（１吸光度単位＝50μgの二本鎖ＤＮＡ）。共有結合で閉じた環状生成物のプラスミドサイズ及びパーセントは、既知の標準品に対するアガロースゲル電気泳動の移動度によって決定した。追加的な特徴付けは、プラスミドＤＮＡの選択的制限エンドヌクレアーゼ消化を使用し、続いてアガロースゲル電気泳動によって、予測されるＤＮＡフラグメントを分離しそしてサイズ分けして行った。コーディング配列の発現は、選択培地（カナマイシン耐性用）中での形質転換細菌細胞の増殖並びにインビトロ細胞培養物中で増殖させＶＣＬ1005プラスミドＤＮＡ ＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥでトランスフェクションした真核細胞でのＨＬＡＢ7のＨ及びＬ鎖のＦＡＣ抗原提示アッセイによって測定した。
実施例２  ＶＣＬ−1005の構築
ＶＣＬ−1005は、高コピー数細菌プラスミドＤＮＡ中にクローン化したＤＮＡの独立断片を使用して構築した。このプラスミドは、その配列が細菌細胞での高レベル複製を促進し、細菌細胞の培養中に支配的な選択的耐性タンパク質を発現し、そして真核細胞中に導入したとき２つのクラス１ ＭＨＣ成分タンパク質、即ちＨＬＡ−Ｂ7及びＢ−２ミクログロブリンの高レベル発現を行うように設計された。各成分は、標準的な分子生物学方法及び市販で入手可能な制限エンドヌクレアーゼや他のＤＮＡ修飾酵素（即ち、大腸菌（クレノウフラグメント）ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージT7 ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージT4 リガーゼ等）を使用してバックボーンプラスミド中にサブクローン化した。サブクローン化した生成物は、制限エンドヌクレアーゼマップ作成及び結合ＤＮＡ配列分析の両方によってフィデリティー及び配向（必要な場合）について試験した。最終的なＤＮＡプラスミド医薬品はＤＮＡの両ストランドに関して完全に配列決定された。後のＶＣＬ-1005ＤＮＡのドメインに対する言及は全て、任意に#１と称しているＲＳＶプロモーター５'末端由来の第１のヌクレオチドに基づいている。
バックボーンプラスミドＤＮＡは、分子生物学研究室で広く使用されそしてその複製開始点が天然に存在する細菌プラスミド、ColiE1から取られているベクター、pBR322から誘導された（Bolivar，R.等、Gene 2:95〜113(1977年)）。ＶＣＬ−1005プラスミドで使用したpBR322の952塩基対フラグメントは、ユニークなEcoR1制限エンドヌクレアーゼ部位をpBR322塩基１としたとき、pBR322の塩基番号2244（Acc1制限エンドヌクレアーゼ部位、ブラント末端）から塩基番号3193（BspH1制限エンドヌクレアーゼ部位）までの領域に相当した。このバックボーンプラスミドフラグメントはＶＣＬ 1005 ＤＮＡの塩基番号4013から4965の間に見られ、そして細菌性複製開始点を含んでいた。これは細菌又は動物細胞のどちらかで発現されることが知られているどんなオープン読み取り枠も含有していなかった。
真核生物遺伝子発現はトリラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）３'ＬＴＲプロモーター配列によって調節された。この配列はＲＳＶのシュミットルピン株由来であり（Swanstrom, R.等、Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A. 78:124〜128(1981年)）、そしてウイルス塩基番号8673のPvu II部位とウイルス塩基番号9146のBfa Ｉ部位に囲まれたＤＮＡを単離してクローン化した。真核細胞での異種遺伝子の発現を調節するためにこのプロモーター配列を使用することはゴーマン（Gorman）Ｃ．等によって10年以上前に記載された（Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A. 79:6777〜6781(1982年)）。ＶＣＬ−1005プラスミドの構築に使用したＲＳＶ ＤＮＡフラグメントはｐＲＳＶ β−グロビンから取得した（Gorman，C.等、Science 221: 551〜553(1983年)）。この調節配列はトリレトロウイルス中に見られたが、この３'ＬＴＲはトリ又は哺乳動物細胞のどちらでも固有の発癌性活性を有していないことが試験されそして証明された（Westphal, C.等、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:411〜416(1985年)）（Mahon, M.等、Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A. 85:1165〜1168(1988年)）（Overbeek, U.等、Science 231:1574〜1577(1986年)）。ＶＣＬ−1005中のＲＳＶ ＬＴＲプロモータードメインは塩基対１〜529に相当した。これには、下流のコーティング配列の高レベルの真核細胞発現を行うようにこの調節配列を修飾している化学合成オリゴヌクレオチドＤＮＡの56塩基対領域が含まれていた。このオリゴヌクレオチドによってＲＳＶ ＤＮＡ配列中に本来見られるポリアデニル化シグナル配列（即ち、Xba  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位、ＴＣＴＡＧＡによってＡＡＴＡＡＡ）が除去された。このオリゴヌクレオチドはまた、翻訳開始コドン、ＡＴＧの近くに強力な翻訳シグナル配列を導入した（Kozak, M.等、Nucleic Acids Res. 15:8125(1987年)）。更に、この合成オリゴヌクレオチドを使用して、５'及び３'ＤＮＡ要素の両方のサブクローン化を助けるために多数の制限エンドヌクレアーゼ部位（即ち、SaII、HindIII及びNcoI）も組み入れた。
ヒトＨＬＡ−Ｂ7及びＢ2ミクログロブリンタンパク質のクラス１ＭＨＣコーディング配列は上記したＲＳＶ ＬＴＲの３'に位置していた。単一のバイシストロニックｍＲＮＡ分子の真核生物転写はＲＳＶプロモータードメインによって調節された。このバイシストロニックｍＲＮＡの翻訳はキャップ依存性及びキャップ非依存性リボソーム認識配列の両方の影響を受けた。キャップ非依存性シグナルはネズミ脳心筋炎（ＥＭＣ）ウイルスゲノムから取得され、そしてＨＬＡ−Ｂ7のＨ鎖とＬ鎖の間でクローン化された。
実施例３  ＶＣＬ−1005の発酵
発酵方法は、ブラウン（Braun）発酵器中で、ＴＢ培地（完全、抗生物質カナマイシンを含有する）中10Ｌのバッチ発酵として実施した。
ａ．接種物の調製
抗生物質カナマイシンを含有する大腸菌株ＤＨ10Ｂグリセリンストックの冷凍分別物0.1mlを使用して、１ＬのＴＢ培地（完全）を含有する２Ｌフラスコに接種した。ＴＢ培地は、イーストエキストラクト24ｇ及びトリプチカーゼペプトン12ｇを２Ｌの振とうフラスコに加えて調製した。次に、900mlの脱イオン水をこのフラスコに加えそしてよく混合した。内容物が全て溶解したとき、グリセリン４mlを加えそしてよく混合した。フラスコに栓をしそして栓をステリガード（Sterigard）紙で覆った。次に、フラスコを121℃以上で30分間オートクレーブ処理した。培地が冷えた時、無菌カナマイシン50mg及び無菌リン酸塩溶液100mlを加えた。リン酸塩溶液は、500mlフラスコ中脱イオン水100mlにＫ2ＨＰＯ412.5ｇとＫＨ2ＰＯ42.3ｇを溶解して調製した。このフラスコに栓をしそして栓をステリガード紙で覆った。次に、フラスコを121℃以上で30分間オートクレーブ処理した。カナマイシンとリン酸塩溶液を加えて、ＴＢ培地は完全になった。接種したフラスコは、振とう器インキュベーター室内で37℃及び300〜400rpmで10〜20時間振とうした。
ｂ．発酵器の準備
ブラウンバイオスタット（Braun Biostat）ＥＤ発酵器を水酸化ナトリウム溶液、続いてリン酸洗浄液で清浄化し、次いで脱イオン水で徹底的にすすいだ。ｐＨプローブは、ｐＨ7.0の標準緩衝液、次いでｐＨ4.0の標準緩衝液中に浸漬して較正した。発酵器に６Ｌの脱イオン水を加えた。次に、イーストエキストラクト粉末240ｇ及びトリプチカーゼペプトン120ｇを発酵器に加えた。撹拌機を作動させて粉末の溶解を促進した。次に、グリセリン40ml及び消泡剤1.5mlを発酵器に加えた。発酵器の壁を脱イオン水ですすいで容量を９Ｌにした。発酵器の内容物は、コントロールユニット上でバッチコントロール自動サイクルを使用して121℃で30分間滅菌した。
ｃ．発酵条件
発酵器は、次のコントロールループ、すなわち、ｐＨ，溶解酸素（ＤＯ）及び温度を使用してモニターした。温度は30℃±0.5°にコントロールした。撹拌速度は600rpmに設定しそして気流コントロールは１v/v/m±0.1v/v/mに設定し、ｐＨは7.0±0.5であった。
ｄ．発酵接種
発酵器のコントロールループは全て正しく作動することが確認された。発酵器のヘッドプレートの隔壁を、３フィートから４フィートで、3/32内径の３つのシリコン管が連結されている滅菌した製造者の接種用部品で突き刺した。１個の無菌管を使用して１Ｌのリン酸塩溶液を発酵器中に導入した。第２の無菌管を使用して接種物を発酵器中に導入した。第３の無菌管は、必要な場合ｐＨをコントロールするために残しておいた。溶液は全て蠕動ポンプを使用して発酵器中に導入した。無菌カナマイシン溶液50mg／ml、即ち500mg／発酵器をリン酸塩溶液に加えた。
ｅ．発酵及び細胞採取
発酵は自動コントロール下で上記したパラメータで進めた。発酵ブイヨン試料は時々採取バルブから取り出し、発酵はＯＤ600が20又はそれより多くなったとき完了した。細胞は、風袋を測定した１Ｌの遠心瓶中に採取バルブからブイヨンを取り出すことによって発酵器から採取した。4900rpmまでで30分間遠心して細胞を濃縮した。上清液を傾瀉し、そして瓶の重量を測定して細胞収量を測定した。
実施例４  ＶＣＬ−1005の精製
ＶＣＬ−1005は次のプロトコールを使用して精製した。
ａ．細胞溶解
細胞ペーストは、室温で磁気撹拌機を用いて湿潤細菌重量１グラム当たり７mlの溶液Ｉ（61mMグルコース ＋ 25mMトリス緩衝液 ｐＨ8.0＋10mM ＥＤＴＡ ｐＨ8.0）中に完全に再懸濁した。この溶液に、湿潤細菌重量当たり14mlの溶液II（0.2Ｎ NaOH＋１％ＳＤＳ）を加え、そして清澄な粘性溶液になるまで撹拌した。この溶解した細胞溶液は、染色体ＤＮＡの切断を防ぐためそれ以上撹拌しないで氷上で10分間インキュベートした。この溶解した細胞溶液に、湿潤細菌重量当たり10.5mlの氷冷溶液III（３Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ5.0）を加え、上下を逆にし、激しく撹拌し、そして氷上で10分間インキュベートした。
ｂ．ろ過
溶解物は２層のミラクロス（登録商標）を通して注意深くろ過して細菌細胞壁を除去した。これを、各回16層のミラクロス（登録商標）を通して更に３回繰り返した。粗ＤＮＡろ液は、0.6容量の冷（約−20℃）イソプロパノール約200mlを一度に加えそして撹拌して沈殿させ、そして室温で１〜２時間インキュベートした。粗核酸沈殿物は５℃で12000rpmで30分間遠心して集めた。上清液を捨てた後、15分間ペレットの水気を切り、そしてその後垂直に立てて５分間風乾した。ＤＮＡペレットは、細菌の最初の湿潤重量当たり約１mlのＴＥ緩衝液（0.01Ｍトリス塩基＋0.001Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ8.0）を使用してＴＥ緩衝液中に完全に再懸濁した。
ｃ．ＲＮＡ及びリポ多糖の除去
ペレットを上記したようにしてＴＥ緩衝液に再懸濁した後、細菌の最初の湿潤重量当たり0.29グラムの酢酸アンモニウムを最終濃度が2.5ＭになるようにＤＮＡ／ＴＥ再懸濁物中に溶解した。必要な場合、ＴＥ緩衝液を更に追加して容量を補正した。この混合物を氷上で15分間インキュベートし、そしてその後この工程を一夜継続するか又は４℃に変えた。
この混合物を10,000rpmで20分間遠心した。上清液は0.8μの膜を通してろ過し、そしてその後等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1）を加えた。このフェノール等の組合せ物を磁気撹拌機を使用して室温で30分間撹拌した。上記の組合せ物を5000rpmで暫時遠心して水と有機相の分離を促進した。上部の水性相を集め、そして２容量の−20℃のエタノールを添加して混合しそして−20℃で少なくとも１時間又は一夜インキュベートしてＤＮＡを沈殿させた。
沈殿物含有物を12,000rpmで30分間遠心した。上清液を捨て、そして15分間残っているペレットの水気を切り、そしてその後垂直に立てて５分間風乾した。ペレットはＴＥ緩衝液中に、細菌の最初の湿潤重量当たり0.5mlを使用して再懸濁した。
再懸濁ペレットにｐＨ5.2の酢酸ナトリウムを加えて1.1Ｍの最終濃度にした。この溶液に、最終濃度が４％ＰＥＧになるように1.6Ｍ NaCl中30％のＰＥＧを加えた。このＰＥＧ含有物質は４℃で少なくとも８時間インキュベートした。
ｄ．最後のＤＮＡ沈殿
４％ＰＥＧ沈殿に続いて、この物質を12,000rpmで30分間遠心した。上清液を清浄な瓶に傾瀉しそしてＰＥＧの最終濃度が10％になるように1.6Ｍ NaCl中30％のＰＥＧを更に追加した。このＰＥＧ含有物質を４℃で少なくとも８時間インキュベートした。次に、これを上記したようにして遠心した。ペレットの水気を切り、そしてその後少量（＜10ml）のＴＥ緩衝液中に再懸濁した。10分の１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ5.2を加え、そしてその後２容量の冷（約−20℃）エタノールを加えた。この混合物を−20℃で少なくとも１時間インキュベートした。これを12,000rpmで４℃で30分間遠心しそして少量のカラム緩衝液（詳細については下記参照）中に再懸濁した。
ｅ．ゲルろ過クロマトグラフィー
ファルマシアＳ−1000（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）サイズ排除タンデムカラムを２つのファルマシアＸＫ26／100カラム（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）中に注ぎ最終ベッド高を80〜85cm（2.6×80cm）とし、各々は約900mlの総カラム容量となった。これらのカラムを個々に１方向に圧力充填し、上下を逆にしそして平衡化と操作のために連続して連結した。このカラムは、ＴＥ＋150mM NaCl、ｐＨ8.0中で平衡化し、そして0.75ml／分又は17cm／時間の流速度で流した。
総カラム容量の１％未満の、上記緩衝液に溶解した部分的に精製したプラスミドＤＮＡを0.22ミクロンの無菌非発熱物質シリンジフィルターでろ過し、そしてカラムに負荷した。カラム操作及びフラクション採取はファルマシアＦＰＬＣ（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）で自動化した。
生成物（超らせん単量体）は0.3から0.4カラム容量で二量体の直後に溶出し始めそして僅かに二量体と重複した。生成物はカラムへの全負荷量に依存して0.5〜0.6カラム容量で溶出を完了した。
生成物溶出領域でフラクション（カラム容量の約0.5〜１％）を集め、そして0.8％アガロースゲルで分析した。生成物溶出の正確な領域はゲル分析から決定した。適当なフラクションをプールし、そして２容量の冷エタノールを用いて−20℃で一夜沈殿させた。
エタノール沈殿フラクションを12,000rpmで４℃で30分間回転させた。薄層状流フード中で15分間ペレットの水気を切り、上下を逆にしそして５分間風乾した。このペレットを、最終濃度が約１mg／mlになるように米国薬局方（ＵＳＰ）の注射用乳酸加リンガー液に再懸濁した。これによってプラスミドＤＮＡの医薬品等級物質が構成された。試料をＱＣに提供し、そして残りは貯蔵するか又は投与及び無菌充填用に濃度を調整した。
クロマトグラフィー後に、カラム及びＦＰＬＣを１カラム容量の0.1Ｍ NaOHで衛生的にした。
実施例５  安全であると一般的に認められていない試薬を使用しないプラスミドに富む粗溶解物の製造
湿潤細胞ペースト200グラムに、0.2Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ8.2を600ml加えた。この混合物を約５〜10分間静かに混合して均質な細胞懸濁液を得た。この均質な細胞懸濁液に0.2Ｍ水酸化ナトリウムと１％トゥイーン（登録商標）80（ｗ／ｖ）の溶液500mlを加えた。この懸濁液を約５〜10分間静かに混合して溶解物を得た。脱イオンＨ2Ｏを溶解物に加えて容量を2000mlにした。次に、氷酢酸を加えてｐＨ5.0とした。その後、ろ過によって細胞破片を除去した。ろ液に冷（約−20℃）２−プロパノール1200mlを加えてプラスミドに富み部分的に精製されたＤＮＡ沈殿物を得た。
実施例６  アルコール又は遠心を使用しないプラスミドに富む部分的に精製されたＤＮＡの製造
ａ．細胞溶解
先ず、大腸菌細胞200グラム（湿潤重量）を約４〜８℃で一夜解凍した。解凍した生物集団を10リットルのカルボイに移した。次に、0.05Ｍ ＥＤＴＡを含む溶液Ｉを1.4リットル加え、そして細胞を均質になるまで混合した。（溶液Ｉ＝0.025Ｍトリス塩基、0.016Ｍグルコース、ｐＨ8.0）。
次に、カルボイ中の細胞に0.05Ｍ ＥＤＴＡを含む溶液IIを2.8リットル加えた。得られた混濁液はカルボイを繰り返し反転させて混合した。カルボイを水気のある氷中に10分間置いた。（溶液II＝１％ＳＤＳ、0.2Ｍ NaOH）。
次に、0.05Ｍ ＥＤＴＡを含む溶液III（添加前に４〜８℃で冷却保持した）を2.1リットル加え、そして得られた溶液は、羊毛状の物質が均一に分布するまでカルボイを繰り返し反転させて混合した。カルボイを水気のある氷に10分間戻した。（溶液III＝3.0Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ5.0）。
ｂ．ろ過
溶解物は、ブフナー漏斗装置中の２層のミラクロス（登録商標）を通して注いで大きい組織片を除去した。これを、各回16層のミラクロス（登録商標）を通して更に２回繰り返した。粗ろ液の最終容量は5.05リットルであった。
ｃ．ＰＥＧ−8000によるプラスミドＤＮＡ沈殿
次に、粗ろ液に600グラムのＰＥＧ−8000を撹拌しながら加えた。0.01Ｍトリス塩基、0.05Ｍ ＥＤＴＡ、1.6Ｍ NaCl、ｐＨ8.0を用いて容量を6.0リットルにした。溶液の最終ｐＨは測定しなかった。これによってＰＥＧ−8000の最終濃度は10％（ｗ／ｖ）になった。ガラス製のカルボイを４〜８℃に移しそして一夜撹拌した。
ｄ．プラスミドＤＮＡのろ過
一夜インキュベートした後、分析等級のセライト（登録商標）ろ過助剤（Celite  Corp.、カリフォルニア州ロンポク）120グラム（20グラム／リットル）を10％ＰＥＧ−8000プラスミドＤＮＡ沈殿物に加え、そして室温に撹拌を継続した。これを混合する一方、ワットマンNo.１と同等の直径10インチのフィルターで覆った直径約８インチの広いメッシュポリプロピレンスクリーンを用いて10インチのブフナー漏斗を組み立てた。これを、ＴＥ緩衝液中のセライト（登録商標）を約１cm適用して予め被覆した。予め被覆した後、６リットルの10％ＰＥＴ−8000で部分的に精製したＤＮＡ沈殿物を吸引してブフナー装置に適用した。ろ過後、プラスミドＤＮＡ沈殿物を含有するセライト（登録商標）ケーキが比較的乾燥するまで（10分間）吸引を続けた。
ｅ．プラスミドＤＮＡ沈殿物の回収
セライト（登録商標）ケーキを取り出しそして１リットルの0.01Ｍトリス塩基、0.05Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ8.0中に懸濁し90分間撹拌した。この工程によって、ケーキ上に集められたプラスミドＤＮＡ沈殿物は溶解された。この懸濁されたケーキに酢酸アンモニウムを最終濃度が約2.5Ｍになるように加えた。約４〜８℃で30分間撹拌を継続した。この時点での容量は1.5リットルであった。酢酸アンモニウムによってリポ多糖とＲＮＡ不純物の一部が沈殿した。得られたスラリーは、上記したのと全く同じワッマンNo.１と同等のフィルターを有するブフナー装置でもう１度ろ過した。この工程で、酢酸アンモニウムで沈殿した不純物はセライト（登録商標）ケーキで捕獲され、そしてプラスミドＤＮＡはろ液中に通過した。
ｆ．プラスミドＤＮＡの最終精製
（実験のこの時点で、材料をできるだけ早くファルマシアＳ−1000カラム（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）にかけて収量及び不純物の分布範囲を決定するために、２−プロパノール沈殿によってプラスミドＤＮＡろ液を濃縮することに決定した。実地的には、プラスミドＤＮＡは陰イオン交換、限外ろ過又は第２のＰＥＧ−8000沈殿で濃縮されるであろう。）
この工程で、ろ液1.5リットルを工程ｅから回収した。残っているセライト（登録商標）は、ろ液をワットマンNo.１等価物、続いて0,8ミクロンのニトロセルロース膜を連続して通過させてろ液から除去した。
次に、冷（約−20℃）２−プロパノール0.9リットルを最終ろ液に加え、そして得られた溶液を−20℃の冷凍庫に１時間入れた。沈殿したＤＮＡをソーバル（Sorvall）ＲＣ3中9000rpm、４℃で45分間遠心して集めた。上清液を捨て、ペレットの水気を切り、そしてその後約15分間風乾した。回収されたプラスミドＤＮＡの約３分の１を含むペレットを５mlの0.01Ｍトリス塩基、0.01Ｍ ＥＤＴＡ、0.15Ｍ NaCl、ｐＨ8.0中に溶解した。
この試料を、0.01Ｍトリス塩基、0.01Ｍ ＥＤＴＡ、0.15Ｍ NaCl、ｐＨ8.0中で前もって平衡化させたタンデム（2.6cm×100cm）ファルマシアＳ−1000カラム（総カラム容量＝900ml）（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）に直接付した。このカラムは0.75ml／分すなわち17cm／時間の流速で流した。
次に、250mlの溶出容量から650mlまで５mlフラクションを集めた。これらのフラクションを標準的な0.8％アガロースゲルで分析し、そしてフラクション28〜40を主として単量体の超らせんプラスミドＤＮＡとしてプールした。最終収量は、95％以上閉じた環状ＤＮＡが2.1mgであると決定された。
これらの工程を残りのプラスミド濃縮物について繰り返し、そして2.4mgと3.16mgが回収され、総回収は7.56mgとなった。
実施例７  フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール及び同様な有機抽出剤による有機抽出の代わりのＰＥＧ−8000の使用
分画ＰＥＧ沈殿は、プラスミドＤＮＡの最適な回収及び夾雑物の最小の残留に関して有機抽出及び他の精製系を代替し、部分的に精製された優れたプラスミドＤＮＡ生成物が製造されることが確認された。
ａ．ＰＥＧ−8000の滴定
幾つかのＰＥＧ−8000値を調べてプラスミドＤＮＡを沈殿させる適切な濃度を決定した。
上記実施例６に記載した、溶液III後のろ過で精製された清澄な溶解物がこの実験の出発物質であった。実験対照は0.7容量の−20℃の２−プロパノールで処理した。1.6Ｍ NaClを含有する30％のＰＥＧ−8000ストック溶液を調製しそして上記粗溶解物に加えて、下記表に示す最終ＰＥＧ濃度を得た。
0003782104.tif 000003
得られた溶液を良く混合しそして10℃の水浴中に一夜入れた。
次に、溶液を、10,000rpmのＧＳＡローターを使用してソーバルＲＣ3中で40分間遠心した。瓶の水気を切り、そしてペレットを５mlのＴＥ＋0.7Ｍ NaCl中に再懸濁した。次に、プラスミドＤＮＡ溶液１mlを、２容量のエタノールを用いて−70℃で２時間再沈殿させた。（これは単に、0.8％アガロースゲルによる分析用試料の調製工程として実施した。ＰＥＧが試料中に残っているとＤＮＡがゲル上ですじになる原因になる可能性がある。）核酸の濃度は260nmでのＵＶ吸光度を測定して推定し、そして結果を下記に示す。
0003782104.tif 000004
ゲルは、５％ＰＥＧ−8000ではほんの少量の単量体プラスミドしか沈殿しないことを示した。しかしながら、より高分子量の夾雑物はより低いＰＥＧ濃度で優先的に沈殿した。10％ＰＥＧで、プラスミドは十分に沈殿した。これらの結果は、Ａ260読み取りに関連させるとき特に意味があった。
より顕著に吸収性の物質（約３×）はＰＥＧ法より標準的な２−プロパノール法によって沈殿した。しかしこれらの方法は共に、アガロースゲル実験に基づいて同じ量の生成物（超らせんプラスミド）を沈殿させることが観察された。これらのデータによって、ＰＥＧは、他の不純物は沈殿させないで、アルコールと同じ位有効に生成物を落下させることが確立された。
ｂ．ＰＥＧ−8000カット
より高分子量のＤＮＡはより低いＰＥＧ濃度で優先的に沈殿するという特性を利用して一連のＰＥＧカットを実施した。
−20℃の２−プロパノール0.7容量を用いて−70℃２時間で溶解物1000mlから部分的に精製したＤＮＡを沈殿させた。次にこの溶液を10,000rpmのＧＳＡローターを使用してソーバルＲＣ3中で40分間遠心した。得られたペレットの水気を切りそして風乾した。次に、これらのペレットをＴＥ緩衝液に溶解しそして一緒にプールした。10mlを２−プロパノール対照として取り出した。この材料の残りを1.11Ｍ酢酸ナトリウムとしそして４×50mlのコニカル試験管に等量（各々約10ml）に分けた。次に、1.6Ｍ NaCl中30％のＰＥＧを各試験管に加え、ＰＥＧ−8000濃度を３％、４％、５％及び６％ＰＥＧ−8000として。混合後、これらの材料を10℃の水浴中で一夜インキュベートした。これらのペレットの水気を切り、そしてその後ＴＥ緩衝液５mlに溶解しそしてアガロースゲル分析用に10マイクロリットルを取り出した。残存材料、即ち上清液を1.11Ｍ酢酸ナトリウムとし、そして全容量を10mlに調整した。観察されたＡ260読み取りはこの項の下記表に示す。
次の工程で、1.6Ｍ NaCl中30％のＰＥＧを各上清液含有試験管に加え、10％の最終ＰＥＧ−8000濃度とした。混合後、内容物を10℃の水浴中で一夜インキュベートした。得られたペレットを遠心して集めそしてＴＥ緩衝液10mlに溶解した。得られたＡ260読み取り値を以下に示す。
0003782104.tif 000005
次に、全処理試料を0.8％アガロースゲルで分析した。
アガロースゲル分析によって、３％ＰＥＧはニックのあるプラスミドは沈殿させるが生成物は沈殿させないことが示された。同様に、４％ＰＥＧもニックのあるプラスミドと高分子量ＤＮＡを沈殿させることが観察された。これらの両ＰＥＧ濃度でかなりの量の夾雑ＲＮＡが沈殿した。５％ＰＥＧで、かなりの量の生成物が沈殿していた。これらの結果から、４％Pegカットに続いて10％ＰＥＧカットを行うと最高品質の生成物が最良の収量で得られるであろうと結論した。
実施例８  種々の形態のＤＮＡのサイズ排除分離並びにプラスミドＤＮＡからのＲＮＡ、染色体ＤＮＡ及びタンパク質の分離
宿主夾雑物及びプラスミドＤＮＡ種の優れた分離を得るためにサイズ排除クロマトグラフィーを確立した。
ａ．初期実験
20,000塩基対のＤＮＡ排除限界を有するファルマシアＳ−1000サイズ排除媒体（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）をファルマシアＸＫ26／100カラム（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）へ注ぎ、最終ベッド高80cm（2.6×80cm）とし、総カラム容量は425mlとなった。このカラムは１方向に圧力充填し、そして平衡化および操作時は逆方向にした。カラムをＴＥ及び150mM NaCl、ｐＨ8.0中で平衡化させそして1.5ml／分又は17cm／時間の流速で流した。
プラスミドＤＮＡは細胞ペースト200ｇを使用して調製した。エタノール沈殿によってＤＮＡを濃縮し、試料を10mlのＴＥ及び150mM NaCl、ｐＨ8.0中に溶解し、そしてカラムに付した（ベッド容量の1.1％）。
４つのピークが分離されそして標準的なアガロースゲル方法によって分析された。ピーク１は染色体のものであり、ピーク２は二量体と超らせんの混合物であり、ピーク３はＲＮＡであり、そしてピーク４はゲル上に何も見られずＡ260：Ａ280比が1.3であったのでタンパク質であると思われた。
ｂ．ＰＥＧ沈殿とＳ−1000サイズ排除クロマトグラフィーの方法の統合
標準的なプロパノールと、４％ＰＥＧ沈殿及びＳ−1000サイズ排除カラムを採用した３つの変法を平行評価した。先ず、細胞ペースト189グラムを、材料を実験群に分ける前に、上記の実施例４に記載したようにして酢酸アンモニウム工程で処理した。４つの処理の基本的な差異は下記表に記載する。
0003782104.tif 000006
これらの実験によって、4／10ＰＥＧ 8000カット（４％ＰＥＧ Ppt）を用いると、フェノール／クロロホルム抽出（フェノール）、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）及びＲＮアーゼを省くことができることが確認された。
上記処理後に、標準的なクロマトグラフィー方法によって材料をＱセファロースＨＰカラム、陰イオン交換体（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）を通過させた。
Ｑカラムから得た沈殿プラスミドをＴＥ＋0.15Ｍ NaClに溶解しそしてＳ−1000カラムで分画した。これらのカラムはＴＥ＋0.15Ｍ NaCl中0.75ml／分で流した。これらの実験から得られるＳ−1000のプロフィールによって、処理群ＩＶが処理群Ｉ〜IIIと同様に有効であることが証明された。即ち、4／10ＰＥＧ8000カットを使用することによって有機抽出並びに動物酵素ＲＮアーゼ及びプロテイナーゼＫでの処理は余分になることが見いだされた。更に、Ｓ−1000カラムを使用すると、全ての場合に、染色体ＤＮＡ、二量体及び超らせんプラスミド、ＲＮＡ並びにタンパク質の優れた分離が得られることも観察された。
アガロースゲル電気泳動はこれらの結果を裏付けた。４つの処理群の分析で二量体及び超らせんプラスミドの分離における小さい変動が認められ、処理群Ｉ及びIIIでは処理群II及びIVより多くの二量体が得られた。4／10ＰＥＧ8000カットは、他の方法では同じ精製レベルを得るには有機抽出並びにプロテイナーゼＫ及びＲＮアーゼ処理が必要であるので、優れていることが明らかであった。更に、実質的な分画がＳ−1000カラムの使用によって達成されることも明白であった。エンドトキシン及びサザンブロット分析によっても同様にこれらの結果が実証された。
実施例９  種々の形態のＤＮＡを分離するタンデムサイズ排除カラム
プラスミドＤＮＡは上記実施例８に記載したようにして調製し、そしてファルマシアＳ−1000サイズ排除媒体（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）を充填した２つのファルマシアＸＫ26／100カラム（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）を含み、約900mlの総タンデムカラム容量となっているタンデムサイズ排除カラムに付した。種々の形態のＤＮＡの分画は直列に連結されたカラムの分離能の増加によって高められた。
実施例１０  種々の形態のＤＮＡのイオン交換分離及びプラスミドＤＮＡからのＲＮＡの分離
この特別の実施例では陰イオン交換媒体ＱセファロースＨＰ（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）が静止相であった。分離は、ｐＨ8.0のＥＤＴＡを含むトリス緩衝液中のNaClを0.7Ｍ〜0.9Ｍの勾配で展開して達成された。負荷物は本明細書に記載した標準的な実験室的方法によって調製した。ＲＮＡはカラムを直接通過し、一方種々の形態のＤＮＡ（ニックのあるプラスミド、超ラセンＤＮＡ）は塩勾配で分離された。
実施例１１  サイズ排除クロマトグラフィーによるエンドトキシンの除去
プラスミドＤＮＡは上記実施例８に記載されたようにしてサイズ排除クロマトグラフィーによって分画した。試料負荷物中のエンドトキシン濃度はＬＡＬで測定したとき約300,000ＥＵ／プラスミドＤＮＡmgであった。プラスミドプール中のエンドトキシン濃度は約30〜100ＥＵ／プラスミドＤＮＡmgであった。
実施例１２  医薬品製造方法によって製造したプラスミドＤＮＡ製品の効力
本明細書に記載した医薬品製造方法によって精製したＶＣＬ−1005プラスミドＤＮＡの効力は、ＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥを使用する脂質介在性インビトロトランスフェクション後に、ＨＡＬＬ細胞（ヒトメラノーマ細胞系）でのＨＬＡ−Ｂ7遺伝子発現によって測定した。同様な方法で精製したＶＣＬ−1005の作用参照（working reference）を陽性対照として使用し、そして試験試料の相対的効力を測定した。
トランスフェクション前日に、６ウエルプレート中にウエル当たり200,000〜400,000個のＨＡＬＬ細胞を接種した。細胞はトランスフェクション前に概ね80〜90％の集密的細胞単層であった。ＤＮＡはOpti−ＭＥＭのような血清減少培地中で10μg／mlに希釈しそしてＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥは20μg／mlに希釈した。次に、これらを１つのポリスチレン管中で一緒にしてトランスフェクション用のコンプレックスを形成させた。１ウエル当たり１mlのコンプレックス（５μgＤＮＡ、５μgＤＭＲＩＥ、５μgＤＯＰＥ）、を用いて上記細胞をデュプリケート又はトリプリケートでトランスフェクションさせた。細胞は37℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。トランスフェクションして１〜４時間及び24時間後に細胞に新たな培地及びウシ胎児血清を補充した。トランスフェクションして48時間後に細胞を採取した。細胞表面でのＨＬＡ−Ｂ7遺伝子発現は抗ＨＬＡ−Ｂ7、次いで蛍光第二抗体（抗マウスIgGモノクロナール抗体Ｒ−フィコエリシン複合体）で標識した。細胞の免疫蛍光染色をフローサイトメトリーで分析した。
陰性対照（トランスフェクションされていない細胞又は関係のない遺伝子でトランスフェクションされた細胞）とは対照的に、トランスフェクションされた細胞では平均蛍光強度の上昇が認められた。試験物質は平均蛍光強度に関して陰性対照より少なくとも２倍の平均蛍光強度の上昇があり、そして相対的な効力は参照ロットの1/2から２倍（50％〜200％）であった。
実施例１３  無菌充填によってプラスミドＤＮＡ医薬品等級物質から医薬品プラスミドを製造する方法
上記実施例４ａ〜ｅ参照。この実施例では、プラスミドＤＮＡの医薬品等級物質から次のように方法を継続する。
出発物質は、ＵＳＰ注射用乳酸加リンガー液又は他の無害の緩衝化した送達用媒体中１mg／ml又は他の適当に決定された濃度のプラスミドＤＮＡ医薬品等級溶液であった。このプラスミドＤＮＡ溶液は、クラス100の生物安全性領域で0.2ミクロンの無菌フィルター又はその等価物でろ過した。ろ液を無菌の発熱物質不含容器に集めた。クラス100領域で、0.35mlの無菌プラスミドＤＮＡ溶液又は他の適切な量を発熱物質不含の無菌のタイプＩホウケイ酸塩ガラスバイアルに小分けした。この実施例では、各バイアルは0.35mgのＤＮＡを含有していた。バイアルは、無菌テフロンで被覆した灰色のブチル栓及びフリップオフアルミニウムシールで包装した。シールは密閉を完全にするために襞をつけた。次に、これらのバイアルを品質管理に付しそして適切に表示した。
実施例１４  医薬品等級ＤＮＡの品質仕様
プラスミドＶＣＬ−1005を標準的な大腸菌株ＤＨ10Ｂ（ＢＲＬ、メリーランド州ガイザーバーグ）中にトランスフォームした。細胞は標準的なＴＢ培地を使用して10Ｌの発酵器（Braun）中で増殖させた。指数増殖期の終わりに、遠心によって細胞を採取しそしてアルカリ溶解（リゾチームを使用しないで）で溶解した。細胞破片はろ過して分離した。プラスミドＤＮＡを沈殿させそして標準的な低圧クロマトグラフィーで分画した。適当なフラクションをプールしそしてＤＮＡを製剤化した。濃度を調整しそしてＤＮＡを無菌ろ過して無菌バイアル中に充填した。本発明の方法を使用すると、ＦＤＡによって規定されている大腸菌由来の医薬品の同一性、純度、効力及び安全性の規準を満たす十分な物質が前臨床及び臨床試験用に製造されそして精製された。
品質管理基準は次のとおりであり、この製品はこの規準を満たし医薬品等級ＤＮＡとなった。
0003782104.tif 000007
これらのデータによって主要な宿主夾雑物の除去が確立されたと同時に、コンカテマープラスミドＤＮＡや単量体プラスミドＤＮＡを含む種々の形態のプラスミドＤＮＡの分離も証明された。
加えて、マウスにおける急性及び反復投与毒性実験を実施した。シノモルグスモンキーでの反復投与毒性実験も実施した。急性毒性の徴候もまた残留毒性の徴候も見られなかった。
実施例１５  プラスミドＤＮＡの単独又は陽イオン脂質混合物と組み合わせての送達
本発明の医薬品製造方法によって精製されたプラスミドＤＮＡは単独でか又は陽イオン脂質混合物と組み合わせて患者に送達することができる。例えば、医薬品はＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥ脂質混合物とコンプレックス化したＶＣＬ−1005プラスミドＤＮＡである。プラスミドＤＮＡとＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥは別個の容器に個々に処方する。ＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥ脂質バイアルは先ず乳酸加リンガー注射用媒体を用いて再構築しそしてその後、臨床使用前に臨床施設でＶＣＬ−1005プラスミドＤＮＡバイアルと組み合わせる。組み合わせると同時に、このコンプレックスを医薬品適用のために患者に送達する。
本発明の特定の実施態様を詳細に記載したが、これらの実施態様は例示であって限定するものではなく、そして本発明の真の範囲は下記請求の範囲で特定されることは当該技術分野の熟練者に明白であろう。
【図１】
0003782104.tif 000008