(57)【要約】  本発明は、細胞膜に局在するＧＰＣ３に特異的に結合でき、かつ、ＣＡＲ−Ｔ細胞を用いたがん免疫療法に有用な一本鎖抗体を含むＣＡＲや、かかるＣＡＲを発現する免疫担当細胞等を提供することを課題とする。  請求項１に定義されている特定の重鎖ＣＤＲ１〜３と、特定の軽鎖ＣＤＲ１〜３とを含み、かつヒト由来ＧＰＣ３ポリペプチドに特異的に結合する一本鎖抗体；該一本鎖抗体のカルボキシル末端に融合した細胞膜貫通領域；及び該細胞膜貫通領域のカルボキシル末端に融合した免疫担当細胞活性化シグナル伝達領域；を含むＣＡＲをコードする遺伝子を作製し、免疫担当細胞へ導入すると、優れたがん細胞傷害活性及びインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生能を有するＣＡＲ発現免疫担当細胞を作製できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＧＰＣ３（Glypican-3）由来のポリペプチドに特異的に結合する一本鎖抗体と、該一本鎖抗体のカルボキシル末端に融合した細胞膜貫通領域と、該細胞膜貫通領域のカルボキシル末端に融合した免疫担当細胞活性化シグナル伝達領域とを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
前記一本鎖抗体が、
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３と、
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３とを含む、
前記ＣＡＲ。
【請求項２】
一本鎖抗体が、
配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む、
請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
一本鎖抗体が、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいは
配列番号１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１又は２に記載のＣＡＲ。
【請求項４】
細胞膜貫通領域と、該細胞膜貫通領域のカルボキシル末端に融合した免疫担当細胞活性化シグナル伝達領域とが、配列番号１４〜１６のいずれかに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載のＣＡＲ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のＣＡＲを発現する免疫担当細胞。
【請求項６】
さらに、インターロイキン７（ＩＬ―７）、及びケモカインリガンド１９（ＣＣＬ１９）を発現する請求項５に記載の免疫担当細胞。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の免疫担当細胞と、薬学的に許容される添加剤とを含有する抗がん剤。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載のＣＡＲをコードするＣＡＲ遺伝子。
【請求項９】
プロモーターと、該プロモーターの下流に作動可能に連結されている請求項８に記載のＣＡＲをコードするＣＡＲ遺伝子とを含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＧＰＣ３（Glypican-3）由来のポリペプチドに特異的に結合する一本鎖抗体と、該一本鎖抗体のカルボキシル（Ｃ）末端に融合した細胞膜貫通領域と、該細胞膜貫通領域のＣ末端に融合した免疫担当細胞活性化シグナル伝達領域とを含むキメラ抗原受容体（Chimeric Antigen Receptor；以下、「ＣＡＲ」ともいう）；前記ＣＡＲを発現する免疫担当細胞；前記免疫担当細胞を含む抗がん剤；前記ＣＡＲをコードするＣＡＲ遺伝子；及び前記ＣＡＲ遺伝子を含むベクター；に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＡＲは、がん細胞の細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体と、Ｔ細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域を融合させた人工的なキメラタンパク質である。ＣＡＲをコードする遺伝子を、腫瘍反応性を示さない末梢血Ｔ細胞（末梢血Ｔリンパ球）に導入することにより、腫瘍反応性を示すＣＡＲ発現Ｔ細胞（以下、「ＣＡＲ−Ｔ細胞」ともいう）を大量に作製することが可能となる。腫瘍反応性を示すＣＡＲ−Ｔ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）との相互作用に依存することなく、がん細胞傷害活性を有する。【０００３】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与によるがん免疫療法、より具体的には、患者からＴ細胞を採取し、かかるＴ細胞にＣＡＲをコードする遺伝子を導入して増幅し、再度患者に移入する療法（非特許文献１）は、現在世界中で臨床試験が進行しており、白血病やリンパ腫などの造血器悪性腫瘍などにおいて有効性を示す結果が得られている。【０００４】
近年、様々なＣＡＲ−Ｔ細胞の研究が進められてきた。例えば、ＣＤ１９抗原結合領域と細胞膜貫通領域と４−１ＢＢ共刺激シグナル領域と、ＣＤ３ζシグナル領域からなるＣＡＲをコードする核酸を含む修飾された自己ヒトＴ細胞を含む医薬組成物（特許文献１）、がん細胞に結合する１つ又は複数のタグ付きタンパク質の配合物と同時に又は別々に被験体に投与される、前記タグ付きタンパク質に結合し、がん細胞死を誘導する１つ又は複数の治療的に有効な抗タグキメラ抗原受容体（ＡＴ−ＣＡＲ）発現Ｔ細胞集団（特許文献２）、ヒト抗体１３９の抗原結合ドメイン、細胞外ヒンジドメイン、細胞膜貫通ドメイン、及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体をコードする核酸を含む細胞（特許文献３）、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む細胞であって、前記キメラ抗原受容体が抗原結合ドメイン、細胞膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達領域、及び、特定のアミノ酸配列を含むＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む細胞（特許文献４）、細胞表面膜上にＣＤ１９特異的キメラ受容体を発現及び保有し、前記キメラ受容体が免疫細胞のエフェクター機能のための細胞内シグナリングドメイン、少なくとも１つの細胞膜貫通ドメイン及び少なくとも１つの細胞外ドメインからなり、細胞外ドメインがＣＤ１９特異的受容体を含む、遺伝子工学的に作製されたＣＤ１９特異的Ｔ細胞（特許文献５）や、細胞内ドメインとしてグルココルチロイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）の細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードする核酸が導入されたキメラ抗原受容体発現細胞（特許文献６）が提案されている。また、最近、本発明者らは、ＣＡＲ−Ｔ細胞中に、インターロイキン７（ＩＬ―７）やケモカインリガンド１９（ＣＣＬ１９）を発現させると、従来のＣＡＲ−Ｔ細胞よりも優れた免疫誘導効果や抗腫瘍活性が発揮されることを報告している（特許文献７）。【０００５】
一方、ＧＰＣ３は、胎生期の組織、特に肝臓・腎臓で発現し、器官形成に関わる細胞外マトリックスタンパク質である。ＧＰＣ３は、成人組織においては胎盤以外に発現は認められないものの、肝細胞がん、メラノーマ、卵巣明細胞がん、肺扁平上皮がん等の様々ながん組織において発現が認められる。このようにＧＰＣ３は、α−フェトプロテイン（α−fetoprotein；ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（Carcinoembryonic antigen；ＣＥＡ）等のタンパク質と同様に、胎生期の組織に発現するタンパク質であるため、胎児性癌抗原に分類される。すなわち、ＧＰＣ３は、正常組織細胞においては発現しないが、がん細胞に特異的に発現する特徴を示すため、がん治療の標的分子や、腫瘍マーカー及び診断マーカーとして有用である。【０００６】
既存の抗ＧＰＣ３抗体の代表として、バイオモザイク社から販売されているモノクローナル抗体１Ｇ１２がある。この抗体はＧＰＣ３の複雑な構造や局在を回避してデザインされた抗原（ＧＰＣ３のＣ末側７０残基のポリペプチド）をBalb/cマウスに免疫し、ハイブリドーマを作製し、当該抗原を用いたスクリーニングにより得られた抗体である。また国内製薬メーカーが開発した抗体ＧＣ３３及びＧＣ１９９も、同様のコンセプトを基にして樹立したモノクローナル抗体であり、ＧＰＣ３のＣ末端側部分断片を抗原として得られた抗体である（特許文献８）。【０００７】
最近、本発明者らは、既存の抗体（例えば、ＧＣ３３、ＧＣ１９９）とは異なるエピトープを認識し、かつ一本鎖抗体の状態でも細胞膜に局在するＧＰＣ３に特異的に結合できる抗ＧＰＣ３抗体を見出している（ＰＣＴ／ＪＰ２０１８／２５７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１４／０１０６４４９号明細書
【特許文献２】特表２０１４−５０４２９４号公報
【特許文献３】特表２０１４−５１６５１０号公報
【特許文献４】特表２０１４−５０７１１８号公報
【特許文献５】特開２０１１−００４７４９号公報
【特許文献６】国際公開第２０１３／０５１７１８号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２０１６／０５６２２８号パンフレット
【特許文献８】特許第４０１１１００号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】中沢洋三  信州医誌  ６１（４）：１９７〜２０３（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、細胞膜に局在するＧＰＣ３に特異的に結合でき、かつ、ＣＡＲ−Ｔ細胞を用いたがん免疫療法に有用な一本鎖抗体を含むＣＡＲや、かかるＣＡＲを発現する免疫担当細胞等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けている。その過程において、国内製薬メーカーが開発した抗ＧＰＣ３抗体（ＧＣ３３抗体）を基に、抗ＧＰＣ３一本鎖抗体を作製し、かかる抗ＧＰＣ３一本鎖抗体が融合したＣＡＲが発現するベクターをＴ細胞へ導入すると、優れたがん細胞傷害活性及びインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生能を有するＣＡＲ−Ｔ細胞を作製できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＧＰＣ３（Glypican-3）由来のポリペプチドに特異的に結合する一本鎖抗体と、該一本鎖抗体のカルボキシル末端に融合した細胞膜貫通領域と、該細胞膜貫通領域のカルボキシル末端に融合した免疫担当細胞活性化シグナル伝達領域とを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
前記一本鎖抗体が、
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３と、
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３とを含む、
前記ＣＡＲ（以下、「本件ＣＡＲ」ということがある）。
〔２〕一本鎖抗体が、
配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む、
上記〔１〕に記載のＣＡＲ。
〔３〕一本鎖抗体が、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいは
配列番号１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
上記〔１〕又は〔２〕に記載のＣＡＲ。
〔４〕細胞膜貫通領域と、該細胞膜貫通領域のカルボキシル末端に融合した免疫担当細胞活性化シグナル伝達領域とが、配列番号１４〜１６のいずれかに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＣＡＲ。
〔５〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のＣＡＲを発現する免疫担当細胞（以下、「本件免疫担当細胞」ということがある）。
〔６〕さらに、インターロイキン７（ＩＬ―７）、及びケモカインリガンド１９（ＣＣＬ１９）を発現する上記〔５〕に記載の免疫担当細胞。
〔７〕上記〔５〕又は〔６〕に記載の免疫担当細胞と、薬学的に許容される添加剤とを含有する抗がん剤（以下、「本件抗がん剤」ということがある）。
〔８〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のＣＡＲをコードするＣＡＲ遺伝子（以下、「本件ＣＡＲ遺伝子」ということがある）。
〔９〕プロモーターと、該プロモーターの下流に作動可能に連結されている請求項８に記載のＣＡＲをコードするＣＡＲ遺伝子とを含むベクター（以下、「本件ＣＡＲ発現ベクター」ということがある）。【００１３】
また、本発明の実施の他の形態として、本件ＣＡＲ発現ベクターを免疫担当細胞に導入するステップを含む、本件ＣＡＲを発現する免疫担当細胞の作製方法；や、本件ＣＡＲ発現ベクターを免疫担当細胞に導入することにより作製された、本件ＣＡＲを発現する免疫担当細胞；や、本件ＣＡＲ遺伝子を含む、本件ＣＡＲを発現する免疫担当細胞（好ましくは、さらにＩＬ−７遺伝子及びＣＣＬ１９遺伝子を含む、本件ＣＡＲ、並びにＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現する免疫担当細胞）；を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によると、本件ＣＡＲが、Ｔ細胞等の免疫担当細胞の細胞膜上に発現すると、当該免疫担当細胞は、優れたがん細胞傷害活性及びＩＦＮ−γ産生能を発揮する。このため、本件ＣＡＲは、免疫担当細胞を用いたがん免疫療法に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｔ細胞（図１Ａ）及びＣＡＲ−Ｔ細胞（図１Ｂ）におけるＣＡＲ（横軸）並びにＣＤ８（縦軸）の発現をフローサイトメーターで解析した結果を示す図である。図中の四角で囲った「Ｑ１」、「Ｑ２」、「Ｑ３」、及び「Ｑ４」の領域は、それぞれ「ＣＡＲ陰性ＣＤ８陽性Ｔ細胞群」、「ＣＡＲ陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞群」、「ＣＡＲ陽性ＣＤ８陰性Ｔ細胞群」、及び「ＣＡＲ陰性ＣＤ８陰性Ｔ細胞群」を示し、これら４種細胞群の全細胞数に対する各細胞群の細胞数の割合（％）をそれぞれの領域に示す。
【図２】Ｓｋ−ＨＥＰ−１細胞（図中の「ｍｏｃｋ」）、及びＳｋ−ＨＥＰ−１ ＧＰＣ３細胞（図中の「ＧＰＣ３」）を、Ｔ細胞群（図中の「Ｔ細胞」）又は抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞を含むＴ細胞群（図中の「ＣＡＲ−Ｔ細胞」）の存在下で培養したときの、ＣＤ４５陰性細胞（残存するＳｋ−ＨＥＰ−１ ＧＰＣ３細胞に相当）数（図２Ａ）、及び全細胞に対する当該ＣＤ４５陰性細胞の割合（図２Ｂ）を解析した結果を示す。
【図３】Ｓｋ−ＨＥＰ−１細胞（図中の「ｍｏｃｋ」）、及びＳｋ−ＨＥＰ−１ ＧＰＣ３細胞（図中の「ＧＰＣ３」）を、Ｔ細胞群（図中の「Ｔ細胞」）又は抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞を含むＴ細胞群（図中の「ＣＡＲ−Ｔ細胞」）の存在下で培養したときの、培養液中に産生されたＩＦＮ−γの濃度を解析した結果を示す図である。
【図４】Ｓｋ−ＨＥＰ−１細胞（図中の「ｍｏｃｋ」）、及びＳｋ−ＨＥＰ−１ ＧＰＣ３細胞（図中の「ＧＰＣ３」）を、Ｔ細胞群（図中の「Ｔ細胞」）又は抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞を含むＴ細胞群（図中の「ＣＡＲ−Ｔ細胞」）の存在下で培養したときの、培養液中に産生されたＩＬ−７（図４Ａ）とＣＣＬ１９（図４Ｂ）の濃度を解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本件ＣＡＲは、ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重（Ｈ）鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＨ鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＨ鎖ＣＤＲ３と、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽（Ｌ）鎖ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＬ鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＬ鎖ＣＤＲ３とを含み、かつ、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＧＰＣ３由来のポリペプチド（ヒトＧＰＣ３の５３７番目のグリシン〜５６３番目のリジンからなるポリペプチドに相当）に特異的に結合する一本鎖抗体（single chain Fv；ｓｃＦｖ）（以下、「本件一本鎖抗体」ということがある）；ii）本件一本鎖抗体のＣ末端に融合した細胞膜貫通領域；及びiii）かかる細胞膜貫通領域のＣ末端に融合した免疫担当細胞活性化シグナル伝達領域；のｉ）〜iii）を少なくとも含むポリペプチドであり、ここで、本件一本鎖抗体と細胞膜貫通領域との間や、細胞膜貫通領域と免疫担当細胞活性化シグナル伝達領域との間は、ペプチドリンカーやＩｇＧ４ヒンジ領域を介して融合してもよい。また、本件一本鎖抗体には、通常、上記Ｈ鎖ＣＤＲ１〜３を含むＨ鎖可変（Ｖ）領域と、上記Ｌ鎖ＣＤＲ１〜３を含むＬ鎖Ｖ領域とが含まれ、ここでＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域との間は、通常、ペプチドリンカーを介して結合している。
【００１７】
上記ペプチドリンカーの長さとしては、例えば、１〜１００アミノ酸残基、好ましくは１０〜５０アミノ酸残基を挙げることができる。また、本件抗体におけるペプチドリンカーとしては、具体的には、１〜４つのグリシン（Ｇ）と、１つのセリン（Ｓ）とからなるアミノ酸配列が３つ連続に連なったものを挙げることができる。
【００１８】
本件一本鎖抗体のＶ領域のうち、ＣＤＲ１〜３以外の領域として、フレームワーク領域（ＦＲ）が含まれる。かかるＦＲのうちＨ鎖ＦＲとしては、Ｈ鎖ＣＤＲ１のＮ末端に連結されているＨ鎖ＦＲ１や、Ｈ鎖ＣＤＲ１のＣ末端（Ｈ鎖ＣＤＲ２のＮ末端）に連結されているＨ鎖ＦＲ２や、Ｈ鎖ＣＤＲ２のＣ末端（Ｈ鎖ＣＤＲ３のＮ末端）に連結されているＨ鎖ＦＲ３や、Ｈ鎖ＣＤＲ３のＣ末端に連結されているＨ鎖ＦＲ４を挙げることができる。また、上記ＦＲのうちＬ鎖ＦＲとしては、Ｌ鎖ＣＤＲ１のＮ末端に連結されているＬ鎖ＦＲ１や、Ｌ鎖ＣＤＲ１のＣ末端（Ｌ鎖ＣＤＲ２のＮ末端）に連結されているＬ鎖ＦＲ２や、Ｌ鎖ＣＤＲ２のＣ末端（Ｌ鎖ＣＤＲ３のＮ末端）に連結されているＬ鎖ＦＲ３や、Ｌ鎖ＣＤＲ３のＣ末端に連結されているＬ鎖ＦＲ４を挙げることができる。
【００１９】
上記Ｈ鎖ＦＲ１としては、具体的には、配列番号７で示されるアミノ酸配列の１〜３０番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。
【００２０】
上記Ｈ鎖ＦＲ２としては、具体的には、配列番号７で示されるアミノ酸配列の３６〜４９番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。
【００２１】
上記Ｈ鎖ＦＲ３としては、具体的には、配列番号７で示されるアミノ酸配列の６７〜９８番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。
【００２２】
上記Ｈ鎖ＦＲ４としては、具体的には、配列番号７で示されるアミノ酸配列の１０５〜１１４番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。
【００２３】
上記Ｌ鎖ＦＲ１としては、具体的には、配列番号８で示されるアミノ酸配列の１〜２３番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。
【００２４】
上記Ｌ鎖ＦＲ２としては、具体的には、配列番号８で示されるアミノ酸配列の４０〜５４番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。
【００２５】
上記Ｌ鎖ＦＲ３としては、具体的には、配列番号８で示されるアミノ酸配列の６２〜９３番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。
【００２６】
上記Ｌ鎖ＦＲ４としては、具体的には、配列番号８で示されるアミノ酸配列の１０３〜１１３番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。
【００２７】
本件一本鎖抗体のＦＲとしては、既知のヒト抗体のＦＲが好ましい。かかる「既知のヒト抗体のＦＲ」としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知の配列データベースに登録されているヒト抗体のＦＲ、ヒト抗体の各サブグループに由来する共通配列(Human Most Homologous Consensus Sequence；Kabat, E. A.らのSequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）から選択されたＦＲ等を挙げることができる。
【００２８】
本件一本鎖抗体におけるＨ鎖ＣＤＲ１は、通常、kabatによる番号付け（文献「kabat, E.A. et al., (1991) NIH Publication No. 91-3242, sequences of proteins of immunological interest」参照）でＨ３１〜３５の位置に存在する。また、本件一本鎖抗体におけるＨ鎖ＣＤＲ２は、通常、kabatによる番号付けでＨ５０〜５２、Ｈ５２Ａ、及びＨ５３〜６５の位置に存在する。また、本件一本鎖抗体におけるＨ鎖ＣＤＲ３は、通常、kabatによる番号付けでＨ９５〜１００、Ｈ１００Ａ、Ｈ１００Ｂ、Ｈ１０１、及びＨ１０２の位置に存在する。また、本件一本鎖抗体におけるＬ鎖ＣＤＲ１は、通常、kabatによる番号付けでＬ２４〜３４の位置に存在する。また、本件一本鎖抗体におけるＬ鎖ＣＤＲ２は、通常、kabatによる番号付けでＬ５０〜５６の位置に存在する。また、本件一本鎖抗体におけるＬ鎖ＣＤＲ３は、通常、kabatによる番号付けでＬ８９〜９７の位置に存在する。
【００２９】
本件一本鎖抗体におけるＨ鎖Ｖ領域としては、具体的には、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖Ｖ領域を挙げることができ、また、本件一本鎖抗体におけるＬ鎖Ｖ領域としては、具体的には、配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖Ｖ領域を挙げることができる。
【００３０】
本件一本鎖抗体としては、具体的には、後述する本実施例でその効果が実証されているもの、すなわち、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む一本鎖抗体や、配列番号１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む一本鎖抗体を挙げることができる。
【００３１】
上記細胞膜貫通領域としては、細胞膜を貫通することができるペプチドであればよく、例えば、ＣＤ８、Ｔ細胞受容体のα、β鎖、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、ＥＧＦＲ（Epidermal Growth Factor Receptor）、又はＧＩＴＲ由来の細胞膜貫通領域の全部又は一部の領域を挙げることができ、具体的には、配列番号１４に示されるアミノ酸配列の１〜８３番目のアミノ酸残基からなるヒトＣＤ８細胞膜貫通領域を挙げることができる。また、上記細胞膜貫通領域としては、細胞膜を貫通することができるペプチドのＣ末端側の１〜１０アミノ酸残基、好ましくは６〜７アミノ酸残基が削除されたものであってもよく、例えば、配列番号１４に示されるアミノ酸配列の１〜７７番目のアミノ酸残基からなる、前記ヒトＣＤ８細胞膜貫通領域の改変体１や、配列番号１４に示されるアミノ酸配列の１〜７６番目のアミノ酸残基からなる、前記ヒトＣＤ８細胞膜貫通領域の改変体２を挙げることができる。
【００３２】
上記免疫担当細胞活性化シグナル伝達領域としては、本件一本鎖抗体がヒトＧＰＣ３に結合した際に、免疫担当細胞内にシグナル伝達することが可能な領域であればよく、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７，ＯＸ４０、ＨＶＥＭ、ＣＤ３ζ、Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  γｃｈａｉｎの細胞内領域のポリペプチドから選択される少なくとも１種又は２種以上を含むものが好ましく、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、及びＣＤ３ζの細胞内領域のポリペプチド３種を含むものがより好ましい。かかるＣＤ２８の細胞内領域のポリペプチドとしては、具体的には、配列番号１４に示されるアミノ酸配列の８５〜１２４番目のアミノ酸残基からなるヒトＣＤ２８の細胞内領域のポリペプチドを挙げることができる。また、上記「４−１ＢＢの細胞内領域のポリペプチド」としては、具体的には、配列番号１４に示されるアミノ酸配列の１２５〜１７０番目のアミノ酸残基からなるヒト４−１ＢＢの細胞内領域のポリペプチドを挙げることができる。また、上記ＣＤ３ζの細胞内領域のポリペプチドとしては、具体的には、配列番号１４に示されるアミノ酸配列の１７２〜２８３番目のアミノ酸残基からなるヒトＣＤ３ζの細胞内領域のポリペプチドを挙げることができる。
【００３３】
なお、配列番号１４に示されるアミノ酸配列の８４番目のアルギニン（Ａｒｇ）、配列番号１５に示されるアミノ酸配列の７８番目のアルギニン、配列番号１６に示されるアミノ酸配列の７７番目のアルギニンは、上記ヒトＣＤ８由来の細胞膜貫通領域のポリぺプチドと上記ヒトＣＤ２８の細胞内領域のポリペプチドの共通配列である。また、配列番号１４に示されるアミノ酸配列の１７１番目のロイシン（Ｌｅｕ）、配列番号１５に示されるアミノ酸配列の１６５番目のロイシン、配列番号１６に示されるアミノ酸配列の１６４番目のロイシンは、上記ヒト４−１ＢＢの細胞内領域のポリペプチドと上記ヒトＣＤ３ζの細胞内領域のポリペプチドの共通配列である。
【００３４】
本明細書において、「免疫担当細胞」とは、生体において免疫機能を担う細胞（好ましくは、生体から分離された細胞）を意味する。免疫担当細胞としては、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｂ細胞等のリンパ球系細胞や、単球、マクロファージ、樹状細胞等の抗原提示細胞や、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞等の顆粒球を挙げることができ、具体的には、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、マウス等の哺乳動物由来のＴ細胞、中でもヒト由来のＴ細胞を好適に例示することができる。また、Ｔ細胞は、例えば、血液、骨髄液等の体液や、脾臓、胸腺、リンパ節等の組織、若しくは原発腫瘍、転移性腫瘍、がん性腹水等のがん組織から免疫担当細胞を含む細胞集団を分離し、得ることができる。また、前記細胞集団に含まれるＴ細胞の割合を高めるため、分離した前記細胞集団を、必要に応じて定法により更に単離又は精製し、得ることもできる。さらに、Ｔ細胞は、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）やｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cells）から作製されたものを利用してもよい。かかるＴ細胞としては、アルファ・ベータＴ細胞、ガンマ・デルタＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、ＮＫＴ細胞を挙げることができる。なお、免疫担当細胞の由来と投与対象とは同じであっても異なってもよい。さらに、投与対象がヒトの場合において、免疫担当細胞としては、投与対象としての患者本人から採取した自家細胞を用いても、他人から採取した他家細胞を用いてもよい。すなわち、ドナーとレシピエントは一致しても不一致でもよいが、一致することが好ましい。
【００３５】
上記投与対象としては、哺乳動物又は哺乳動物細胞を好適に挙げることができ、かかる哺乳動物の中でも、ヒト、マウス、イヌ、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、サル、チンパンジーをより好適に挙げることができ、ヒトを特に好適に挙げることができる。
【００３６】
本件ＣＡＲは、好ましくは、がん治療において、がん患者から採取された免疫担当細胞の細胞表面上にエクスビボで発現させるために用いられる。免疫担当細胞としてＴ細胞を用いる場合、本件ＣＡＲにおける細胞膜貫通領域と、かかる細胞膜貫通領域のＣ末端に融合した免疫担当細胞活性化シグナル伝達領域とからなるペプチドとしては、具体的には、配列番号１４〜１６のいずれかに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドを挙げることができる。また、本件ＣＡＲとしては、具体的に、本件一本鎖抗体と、かかる一本鎖抗体のＣ末端側に連結した、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドとを含むものや、本件一本鎖抗体と、かかる一本鎖抗体のＣ末端側に連結した、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドとを含むものや、本件一本鎖抗体と、かかる一本鎖抗体のＣ末端側に連結した、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドとを含むものを挙げることができる。
【００３７】
本件免疫担当細胞としては、本件ＣＡＲを発現する免疫担当細胞であればよく、本件ＣＡＲは通常天然には存在しないため、内在性ではなく、外来性のＣＡＲを発現する免疫担当細胞である。本件免疫担当細胞としては、さらに、ＩＬ―７及び／又はＣＣＬ１９を発現するものが好ましい。免疫担当細胞がＩＬ―７及び／又はＣＣＬ１９の発現が認められない細胞（例えば、Ｔ細胞）である場合や、免疫担当細胞がＴ細胞以外であってＩＬ―７及び／又はＣＣＬ１９の発現が低い細胞の場合には、本件免疫担当細胞としては、外来性のＩＬ―７及び／又はＣＣＬ１９を発現するものが好ましい。ここで、外来性のＩＬ―７及び／又はＣＣＬ１９を発現する免疫担当細胞は、免疫担当細胞に、外来性のＩＬ−７遺伝子及び／又はＣＣＬ１９遺伝子（好ましくは、プロモーターの下流に作動可能に連結されている外来性のＩＬ−７遺伝子及び／又はＣＣＬ１９遺伝子）を導入することにより得ることができる。外来性のＩＬ−７遺伝子及び／又はＣＣＬ１９遺伝子を導入して得られた免疫担当細胞は、該免疫担当細胞内に、ゲノムに組み込まれた状態で、あるいは、ゲノムに組み込まれない状態（例えば、エピソーマルな状態）で、外来性のＩＬ−７遺伝子及び／又はＣＣＬ１９遺伝子を含有する。なお、本件免疫担当細胞には、本件免疫担当細胞を培養して得られた本件ＣＡＲを発現する細胞培養物も含まれる。
【００３８】
本件免疫担当細胞は、本件ＣＡＲ発現ベクターを、免疫担当細胞へ導入することにより作製することができる。導入する方法としては、免疫担当細胞にＤＮＡを導入する方法であればよく、例えば、エレクトロポレーション法（Cytotechnology,3,133(1990)）、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５号公報）、リポフェクション法（Proc.Natl.Acad.Sci.U．S.A.,84,7413(1987)）、ウイルス感染法等の方法を挙げることができる。かかるウイルス感染法としては、ＣＡＲ発現ベクター（国際公開２０１６／０５６２２８号パンフレット）と、パッケージングプラスミドとをＧＰ２−２９３細胞（タカラバイオ社製）、Ｐｌａｔ−ＧＰ細胞（コスモ・バイオ社製）、ＰＧ１３細胞（ATCC CRL-10686）、ＰＡ３１７細胞（ATCC CRL-9078）などのパッケージング細胞にトランスフェクションして組換えウイルスを作製し、かかる組換えウイルスをＴ細胞に感染させる方法を挙げることができる。本件ＣＡＲ発現ベクターを導入して得られた免疫担当細胞（本件免疫担当細胞）は、ゲノムに組み込まれた状態で、あるいは、ゲノムに組み込まれない状態で、該免疫担当細胞内に本件ＣＡＲ遺伝子を含有する。
【００３９】
また、本件免疫担当細胞は、本件ＣＡＲをコードするヌクレオチドをコードするヌクレオチドを、公知の遺伝子編集技術を用いて、適切なプロモーターの制御下で発現可能なように、細胞のゲノムに組み込むことによって製造してもよい。公知の遺伝子編集技術としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ）、ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）−Ｃａｓシステム等のエンドヌクレアーゼを用いる技術を例示することができる。
【００４０】
本件抗がん剤は、「抗がんのため（すなわち、がんの増殖を抑制するため）」という用途が特定された、本件免疫担当細胞と、薬学的に許容される添加剤とを含有する組成物であればよく、ここで薬学的に許容される添加剤としては、例えば、生理食塩水、緩衝生理食塩水、細胞培養培地、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール、安定剤、可溶化剤、界面活性剤、緩衝剤、防腐剤、等張化剤、充填剤、潤滑剤を挙げることができる。また、上記添加剤は、１種類の添加剤からなる単体であっても、複数種類（少なくとも２種類）の添加剤を含む混合物であってもよい。
【００４１】
本件抗がん剤は、当業者に既知の方法を用いて、がん増殖の抑制（換言すると、がん治療）を必要とする被験者（がん患者）に投与することができ、投与方法としては、例えば、静脈内、腫瘍内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、髄内、心臓内、関節内、滑液嚢内、頭蓋内、髄腔内、くも膜下（髄液）等へ注射する方法や、腫瘍部位へカテーテルを利用して投与する方法を挙げることができる。
【００４２】
本件抗がん剤に含まれる本件免疫担当細胞の数としては、がんの種類、位置、重症度、治療を受ける被験体の年齢、体重、状態などの条件を基に、適宜選択することができ、例えば、一回の投与において１×１０４〜１×１０１０個、好ましくは１×１０５〜１×１０９個、より好ましくは５×１０６〜５×１０８個である。
【００４３】
本件抗がん剤の投与回数は、例えば、１日あたり４回、３回、２回、１回である。また、本件抗がん剤の投与間隔は、例えば、１日おき、２日おき、３日おき、４日おき、５日おき、６日おき、７日おき、８日おき、９日おき、１月おきである。
【００４４】
本件抗がん剤の投与対象のがんとしては、例えば、大腸癌（結腸癌又は直腸癌）；胃癌；肝臓癌；脳腫瘍；肺癌（腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌）；食道癌；十二指腸癌；小腸癌；皮膚癌；乳癌；前立腺癌；膀胱癌；膣癌；子宮頸部癌；子宮体癌；腎臓癌；膵臓癌；脾臓癌；気管癌；気管支癌；頭頚部癌；胆嚢癌；胆管癌；精巣癌；卵巣癌；骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、神経組織、血管組織、又は造血組織における癌（具体的には、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫などの肉腫；肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽腫などの芽腫；胚細胞腫瘍；リンパ腫；白血病）；等を挙げることができる。
【００４５】
本件抗がん剤は、他の抗がん剤と併用して用いることもできる。他の抗がん剤としては、シクロホスファミド、ベンダムスチン、イオスファミド、ダカルバジン等のアルキル化薬、ペントスタチン、フルダラビン、クラドリビン、メソトレキセート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、エノシタビン等の代謝拮抗薬、リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツズマブ等の分子標的薬、イマチニブ、ゲフェチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダサチニブ、スニチニブ、トラメチニブ等のキナーゼ阻害剤、ボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、シクロスポリン、タクロリムス等のカルシニューリン阻害薬、イダルビジン、ドキソルビシンマイトマイシンＣ等の抗がん性抗生物質、イリノテカン、エトポシド等の植物アルカロイド、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン等のプラチナ製剤、タモキシフェン、ビカルダミド等のホルモン療法薬、インターフェロン、ニボルマブ、ペンブロリズマブ等の免疫制御薬を挙げることができる。
【００４６】
上記「本件抗がん剤と他の抗がん剤と併用して用いる」方法としては、他の抗がん剤を用いて処理し、その後本件抗がん剤を用いる方法や、本件抗がん剤と他の抗がん剤を同時に用いる方法や、本件抗がん剤を用いて処理し、その後他の抗がん剤を用いる方法を挙げることができる。また、本件抗がん剤と他の抗がん剤と併用した場合には、がんの治療効果がより向上するとともに、それぞれの投与回数又は投与量を減らすことで、それぞれによる副作用を低減させることが可能となる。
【００４７】
本件ＣＡＲ遺伝子としては、ｉ）本件一本鎖抗体、ii）本件一本鎖抗体のＣ末端に融合した細胞膜貫通領域、及びiii）かかる細胞膜貫通領域のＣ末端に融合した免疫担当細胞活性化シグナル伝達領域のｉ）〜iii）を少なくとも含むポリペプチドをコードする抗体遺伝子（ヌクレオチド）であれば特に制限されず、ここで、本件一本鎖抗体をコードする抗体遺伝子としては、具体的には、配列番号９に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなるＨ鎖Ｖ領域遺伝子（配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子）と、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなるＬ鎖Ｖ領域遺伝子（配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子）とを含む抗体遺伝子を挙げることができる。
【００４８】
本明細書において、用語「同一性」は、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列近似性の程度（これは、クエリー配列と他の好ましくは同一の型の配列（核酸若しくはタンパク質配列）とのマッチングにより決定される）を意味する。「同一性」を計算及び決定する好ましいコンピュータープログラム法としては、例えば、ＧＣＧ  ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）（Altschul et al.，J.Mol.Biol.1990，215:403-410;Altschul et al．，Nucleic Acids Res.1997,25:3389-3402;Devereux et al．，Nucleic Acid Res．1984,12:387）、並びにＢＬＡＳＴＮ  ２．０（Gish W．，http:／／blast．Wustl．edu，1996−2002）、並びにＦＡＳＴＡ（Pearson及びLipman,Proc.Natl．Acad．Sci．USA 1988,85:2444−2448）、並びに最も長く重複した一対のコンティグを決定及びアライメントするＧＣＧ  ＧｅｌＭｅｒｇｅ（Wibur及びLipman,SIAM J.Appl.Math.1984,44:557-567;Needleman及びWunsch,J．Mol．Biol．1970，48:443-453）を挙げることができる。
【００４９】
本明細書において、「少なくとも８０％以上の同一性」とは、同一性が８０％以上であることを意味し、好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、特により好ましくは９８％以上、最も好ましくは１００％の同一性を意味する。
【００５０】
本明細書において、「配列番号Ｘに示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列」とは、換言すると、「配列番号Ｘに示されるアミノ酸配列において、０、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」であり、かつ、配列番号Ｘに示されるアミノ酸配列と同等の機能を有する。ここで、「１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜３０個の範囲内、好ましくは１〜２０個の範囲内、より好ましくは１〜１５個の範囲内、さらに好ましくは１〜１０個の範囲内、さらに好ましくは１〜５個の範囲内、さらに好ましくは１〜３個の範囲内、さらに好ましくは１〜２個の範囲内の数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を意味する。これらアミノ酸残基の変異処理は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発等の当業者に既知の任意の方法により行うことができる。
【００５１】
本明細書において、「プロモーターの下流に作動可能に連結されている・・・遺伝子」とは、プロモーターが遺伝子の転写を開始することができるように、プロモーターＤＮＡと、遺伝子ＤＮＡとが機能的に連結されていることを意味する。
【００５２】
本件ＣＡＲ発現ベクターにおけるプロモーターとしては、プロモーターの下流に位置する本件ＣＡＲ遺伝子がコードするｍＲＮＡの転写を開始させる領域であればよく、プロモーターには、通常転写開始点（ＴＳＳ）が含まれる。
【００５３】
本件ＣＡＲ発現ベクターにおけるプロモーターやベクターの種類は、導入する宿主細胞（免疫担当細胞）の種類に応じて適宜選択することができ、ここで、プロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、ＨＩＦプロモーター等を挙げることができる。また、ベクターとしては、例えば、ｐＭＳＧＶベクター（Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002)）やｐＭＳＣＶベクター（タカラバイオ社製）などのレトロウイルスベクター又はかかるベクター由来のものを挙げることができる。
【００５４】
本件ＣＡＲ発現ベクターとしては、遺伝子発現効率をさらに高めるために、エンハンサー領域やリボソーム結合領域（ＲＢＳ；ribosome binding site）のヌクレオチド配列をさらに含むものや、本件免疫担当細胞のスクリーニングのために、本件免疫担当細胞の種類に応じた薬剤耐性遺伝子（例えば、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ジェネティシン耐性遺伝子等）をさらに含むものであってもよい。かかるエンハンサー領域は、通常プロモーターの上流に配置され、ＲＢＳは、通常プロモーターと本件ＣＡＲ遺伝子の間に配置される。本件ＣＡＲ発現ベクターにおける本件ＣＡＲ遺伝子のヌクレオチド配列は、発現させる本件免疫担当細胞に合わせてコドン配列の最適化がされていてもよい。本件ＣＡＲ、本件ＣＡＲ発現ベクター、及び本件ＣＡＲ遺伝子は、遺伝子組み換え技術を用いて公知の方法により作製することができる。
【００５５】
本件ＣＡＲ発現ベクターとしては、本件ＣＡＲ遺伝子以外の遺伝子、例えば、ＩＬ―７遺伝子、ＣＣＬ１９遺伝子、アポトーシス作用を有するポリペプチドをコードする遺伝子（自殺遺伝子）をさらに含むもの（好ましくは、プロモーターの下流に作動可能に連結されているＩＬ―７遺伝子、ＣＣＬ１９遺伝子、自殺遺伝子）であってもよい。かかる自殺遺伝子としては、例えば、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ［ＨＳＶ-ＴＫ］をコードする遺伝子、誘導性カスパーゼ９［inducible caspase 9］をコードする遺伝子を挙げることができる。本件ＣＡＲ発現ベクターに自殺遺伝子を含ませることによって、がんの治療経過に応じて、例えば、がん細胞が消失した場合に、自殺遺伝子がコードするポリペプチドの機能を活性化する薬剤（例えば、ＨＳＶ-ＴＫの場合、ガンシクロビルであり、誘導性カスパーゼ９の場合、二量体誘導化合物［chemical induction of dimerization:CID］であるＡＰ１９０３）を投与することにより、不要となった、生体内の本件免疫担当細胞を死滅させることが可能となる（Cooper LJ., et. al. Cytotherapy. 2006;8(2):105-17., Jensen M. C. et. al. Biol Blood Marrow Transplant. 2010 Sep;16(9):1245-56., Jones BS. Front Pharmacol. 2014 Nov 27;5:254., Minagawa K., Pharmaceuticals (Basel). 2015 May 8;8(2):230-49., Bole-Richard E., Front Pharmacol. 2015 Aug 25;6:174）。
【００５６】
本明細書において引用された、学術文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００５７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、ＧＰ２−２９３パッケージング細胞株（タカラバイオ社製）の培養は、１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と、ペニシリンＧ及びストレプトマイシン硫酸塩とを含むＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）培養液存在下、ＣＯ２インキュベーター（３７℃条件下）内で行った。また、ヒトＴ細胞の培養は、ペニシリンＧ（１００Ｕｎｉｔ／ｍＬ）等を含むＧＴ−Ｔ５５１（タカラバイオ社製）培養液存在下、ＣＯ２インキュベーター（３７℃条件下）内で行った。
【実施例】
【００５８】
１．材料の調製
［ＣＡＲ、ｈＩＬ−７、ｈＣＣＬ１９、及びＨＳＶ−ＴＫ発現レトロウイルスベクターの作製］
国内製薬メーカーが開発した抗ＧＰＣ３抗体（ＧＣ３３抗体）のＨ鎖Ｖ領域（ＶＨ）及びＬ鎖Ｖ領域（ＶＬ）のアミノ酸配列に基づき、２種類の抗ＧＰＣ３  ヒト型ｓｃＦｖ（ＶＨ−リンカー−ＶＬ［配列番号１２のアミノ酸配列からなるポリペプチド］、及びＶＬ−リンカー−ＶＨ［配列番号１３のアミノ酸配列からなるポリペプチド］）をデザインした（表１参照）。かかるリンカーは、ポリペプチド「ＧＧＧＧＳ」を３回繰り返した１５アミノ酸残基からなるものを使用した。【００５９】
【表１】
2020017479.tif 000002
表中、二重四角はリンカーを示し、一重下線はＶＨを示し、二重下線はＶＬを示す。【００６０】
デザインした２種類の抗ＧＰＣ３  ヒト型ｓｃＦｖのうち、ＶＨ−リンカー−ＶＬ（配列番号１２のアミノ酸配列からなるポリペプチド）を例として選択し、その下流に、ヒトＣＤ８由来細胞膜貫通領域；及びヒトＣＤ２８／４−１ＢＢ／ＣＤ３zeta由来免疫担当細胞活性化シグナル伝達領域；からなる融合ペプチド（配列番号１７のアミノ酸配列の２４３〜５２５番目のアミノ酸残基）を連結し、配列番号１７のアミノ酸配列からなる抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲをデザインした（表２参照）。【００６１】
【表２】
2020017479.tif 000003
表中、一重下線は、抗ＧＰＣ３ ヒト型scFvを示し、二重下線は、ヒトＣＤ８由来細胞膜貫通領域；及びヒトＣＤ２８／４−１ＢＢ／ＣＤ３zeta由来免疫担当細胞活性化シグナル伝達領域；からなる融合ペプチドを示す。【００６２】
さらに、デザインした抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲの上流には、ヒトイムノグロブリンＨ鎖由来シグナルシーケンス（配列番号１８の１〜１９番目のアミノ酸残基）を連結し、また、その下流には、順に、２Ａ自己切断型ペプチド（配列番号１８のアミノ酸配列の５５１〜５７５番目のアミノ酸残基）、ヒト（ｈ）ＩＬ−７（配列番号１８のアミノ酸配列の５７７〜７５３番目のアミノ酸残基）、２Ａ自己切断型ペプチド（配列番号１８のアミノ酸配列の７５４〜７７８番目のアミノ酸残基）、ｈＣＣＬ１９（配列番号１８のアミノ酸配列の７７９〜８７６番目のアミノ酸残基）、２Ａ自己切断型ペプチド（配列番号１８のアミノ酸配列の８７７〜９０１番目のアミノ酸残基）、及び単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）（配列番号１８のアミノ酸配列の９０２〜１２７７番目のアミノ酸残基）を連結し、配列番号１８のアミノ酸配列からなる融合ポリペプチド（抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ＋ｈＩＬ−７＋ｈＣＣＬ１９＋ＨＳＶ−ＴＫ）をデザインした（表３参照）。【００６３】
【表３】
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表中、一重四角はヒトイムノグロブリンＨ鎖由来シグナルシーケンスを示し、二重四角は２Ａ自己切断型ペプチドを示し、一重下線はＣＡＲを示し、二重下線はｈＩＬ−７を示し、破下線はｈＣＣＬ１９を示し、波下線はＨＳＶ−ＴＫを示す。【００６４】
そして、上記融合ポリペプチド（ＣＡＲ＋ｈＩＬ−７＋ｈＣＣＬ１９＋ＨＳＶ−ＴＫ）をコードし、かつヒト型のコドンに最適化したヌクレオチド配列からなる遺伝子ＤＮＡ（配列番号１９のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、表４参照）を、ｐＭＳＧＶレトロウイルスベクター（Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002)）に組み込み、ＣＡＲ、ｈＩＬ−７、ｈＣＣＬ１９、及びＨＳＶ−ＴＫ発現用レトロウイルスベクター（以下、「抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ等発現用レトロウイルスベクター」という）を作製した（国際公開２０１６／０５６２２８号パンフレット参照）。【００６５】
【表４】
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表中、一重四角はヒトイムノグロブリンＨ鎖由来シグナルシーケンスをコードする遺伝子を示し、二重四角は２Ａ自己切断型ペプチドをコードする遺伝子を示し、一重下線はＣＡＲをコードする遺伝子を示し、二重下線はｈＩＬ−７をコードする遺伝子を示し、破下線はｈＣＣＬ１９をコードする遺伝子を示し、波下線はＨＳＶ−ＴＫをコードする遺伝子を示す。【００６６】
［組換えレトロウイルスの作製］
作製した抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ等発現用レトロウイルスベクターを、リポフェクタミン３０００（ライフテクノロジー社製）を用いてＧＰ２−２９３パッケージング細胞株（タカラバイオ社製）へトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後に、産生された組換えレトロウイルス（抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ等発現用レトロウイルス）を含む培養上清を回収した。【００６７】
［組換えレトロウイルスのＴ細胞への感染］
抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を作製するために、組換えレトロウイルス（抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ等発現用レトロウイルス）を、Ｔ細胞へ感染させることで、上記Ｔ細胞に上記抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ等発現用レトロウイルスベクターを導入した。具体的には、末梢血単核球を、健常人末梢血から定法に従って単離した後、固層化した抗ＣＤ３モノクローナル抗体クローン（ＯＫＴ３）（５μｇ／ｍＬ）及びレトロネクチン（登録商標；タカラバイオ社製、２５μｇ／ｍＬ）、並びにＩＬ−２存在下で４８時間活性化培養した。ウイルス吸着プレートは、レトロネクチンでコートしたプレート上に、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ等発現用組換えレトロウイルスを含む培養上清を添加後、４℃、２０００ｇにて２時間遠心し、作製した。作製したウイルス吸着プレート上に、活性化培養したヒトＴ細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように播種し、ＩＬ−２の存在下で一晩培養した。翌日にＴ細胞を回収し、新しいウイルス吸着プレートに播種して２回目のウイルス感染を行った。４時間培養後に細胞を回収し、３倍量の培養液を添加して細胞培養用プレートに播種した後、３日間培養した。【００６８】
２．方法
［フローサイトメトリー解析］
抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ等発現用レトロウイルスを感染させたヒトＴ細胞が、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲを発現していることを確認するために、フローサイトメトリー解析を行った。具体的には、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ等発現用レトロウイルスを感染させたヒトＴ細胞群（抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞を含むＴ細胞群）を、ビオチン化したリコンビナントＧＰＣ３タンパク質（Ｒ＆Ｄ社製）の存在下で、氷上で３０分インキュベートした。ＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）を加えて遠心処理し、上清を除いた後、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）と、ＢＶ４２１標識ストレプトアビジン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を添加し、氷上で３０分インキュベートした。ＡＰＣ及びＢＶ４２１の検出、並びにこれらの蛍光レベルの測定は、フローサイトメーター（ＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて行った。なお、ネガティブコントロールとして、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ等発現用レトロウイルス未感染のヒトＴ細胞群（Ｔ細胞群）についても、同様にフローサイトメトリー解析を行った。【００６９】
［ＧＰＣ３発現がん細胞に対する傷害活性］
抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞のがん細胞傷害活性を確認するために、ＧＰＣ３発現がん細胞を、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞を含むＴ細胞群存在下で培養した。具体的には、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞を含むＴ細胞群と、肝細胞がん由来細胞株（Ｓｋ−ＨＥＰ−１細胞）（ＥＣＡＣＣより購入）、又はＧＰＣ３を発現させたＳｋ−ＨＥＰ−１細胞（Ｓｋ−ＨＥＰ−１ ＧＰＣ３細胞）とを、１：１（１×１０５個／ウェル）にて混合し、２４ウェルプレートで培養した。４８時間後に細胞を回収し、Phycoerythrin標識抗ＣＤ４５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）存在下で、氷上で３０分インキュベートした。ＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）を加えて遠心処理し、上清を除いた後、Phycoerythrinの検出及び蛍光レベルの解析は、フローサイトメーター（ＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて行い、ＣＤ４５陽性細胞（Ｔ細胞に相当）、及びＣＤ４５陰性細胞（残存するＳｋ−ＨＥＰ−１ ＧＰＣ３細胞に相当）の数及び割合を測定した。【００７０】
［抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生能］
抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞が、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生能を有するか否かを解析した。具体的には、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞を含むＴ細胞群（図３中の「ＣＡＲ−Ｔ細胞」）、又は遺伝子非導入Ｔ細胞群（図３中の「Ｔ細胞」）を、Ｓｋ−ＨＥＰ−１細胞、又はＳｋ−ＨＥＰ−１ ＧＰＣ３細胞と、１：１（１×１０５／ウェルずつ）にて混合し、２４ウェルプレートで４８時間培養し、培養上清中に産生されるＩＦＮ−γの濃度をＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）にて測定した。【００７１】
［抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞のＩＬ−７及びＣＣＬ１９産生能］
抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９産生能を有するか否かを解析した。具体的には、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞を含むＴ細胞群（図４中の「ＣＡＲ−Ｔ細胞」）、又は遺伝子非導入Ｔ細胞群（図４中の「Ｔ細胞」）を、Ｓｋ−ＨＥＰ−１細胞、又はＳｋ−ＨＥＰ−１ ＧＰＣ３細胞と、１：１（１×１０５／ウェルずつ）にて混合し、２４ウェルプレートで４８時間培養し、培養上清中に産生されるＩＬ−７及びＣＣＬ１９の濃度をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ社製）にて測定した。ネガティブコントロールとして、ＣＡＲ遺伝子非導入Ｔ細胞群（Ｔ細胞）と、Ｓｋ−ＨＥＰ−１細胞、又はＳｋ−ＨＥＰ−１ ＧＰＣ３細胞を同条件にて培養した。【００７２】
３．結果
［フローサイトメトリー解析］
抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ等発現用レトロウイルスを感染させたヒトＴ細胞群のうち、４８．１％の細胞が、ＢＶ４２１が検出されるＣＡＲ陽性であることが示された（図１Ｂ参照）。一方、当該レトロウイルス未感染のヒトＴ細胞群ではほとんどＣＡＲ陽性細胞は認められなかった（図１Ａ参照）。この結果は、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ等発現用レトロウイルスを感染させたヒトＴ細胞群のうち、約５０％の細胞が抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲを発現するＴ細胞（抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞）であることを示している。【００７３】
［ＧＰＣ３発現がん細胞に対する傷害活性］
抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞を含むＴ細胞群は、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ等発現用レトロウイルス未感染のＴ細胞群を用いた場合と比べ、Ｓｋ−ＨＥＰ−１ ＧＰＣ３細胞（図２の「ＧＰＣ３」）に対する傷害活性が非常に高く、Ｓｋ−ＨＥＰ−１ ＧＰＣ３細胞のほとんどを死滅させた（図２参照）。一方、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞を含むＴ細胞群は、Ｓｋ−ＨＥＰ−１細胞（図２の「ｍｏｃｋ」）に対しては、Ｔ細胞群と同様に、傷害活性をほとんど示さなかった（図２参照）。この結果は、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＧＰＣ３を発現するがん細胞特異的に細胞傷害活性を発揮することを示している。【００７４】
［抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生能］
抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞を含むＴ細胞群は、Ｓｋ−ＨＥＰ−１ ＧＰＣ３細胞存在下では、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ等発現用レトロウイルス未感染のＴ細胞群を用いた場合と比べ、ＩＦＮ−γ産生能が非常に高かった（図３参照）。一方、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞を含むＴ細胞群は、Ｓｋ−ＨＥＰ−１細胞存在下では、Ｔ細胞群と同様に、ＩＦＮ−γ産生能はほとんど認められなかった（図３参照）。この結果は、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞における抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖが、がん細胞におけるＧＰＣ３表面抗原に結合し、活性化した結果、ＩＦＮ−γが産生されたことを示している。【００７５】
［抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞のＩＬ−７及びＣＣＬ１９産生能］
抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞を含むＴ細胞群は、Ｓｋ−ＨＥＰ−１細胞存在下では低値のＩＬ−７とＣＣＬ１９を産生したが、Ｓｋ−ＨＥＰ−１ ＧＰＣ３細胞存在下では、さらに高いＩＬ−７とＣＣＬ１９を産生した（図４参照）。抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ等発現用レトロウイルス未感染のＴ細胞群では、Ｓｋ−ＨＥＰ−１細胞存在下でもＳｋ−ＨＥＰ−１ ＧＰＣ３細胞存在下でも、ＩＬ−７産生とＣＣＬ１９産生はほとんど認められなかった。この結果は、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ−Ｔ細胞はＩＬ−７やＣＣＬ１９を産生することを示している。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明は、免疫担当細胞を用いたがん免疫療法の分野に資するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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