(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５-（４-［２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ピリジル）アミノ）エトキシ］ベンジル）−２，４−チアゾリジンジオン、またはその互変異性体またはその医薬上許容される塩またはその医薬上許容される溶媒和物の調製方法であって、５-（４-［２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ピリジル）アミノ）エトキシ］ベンジリデン）−２，４−チアゾリジンジオンまたはその互変異性体またはその医薬上許容される塩またはその医薬上許容される溶媒和物を、ロドトルラ・グルティニスＣＢＳ４４０６またはロドトルラ・ルブラＣＢＳ６４６９由来の微生物レダクターゼで処理し、その後、そうして調製された生成物の医薬上許容される塩または医薬上許容される溶媒和物を調製してもよいことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ある種の置換されたチアゾリジンジオン誘導体の新規な製法、ある種の新規な化合物、かかる化合物からなる医薬組成物、およびかかる化合物の医薬における使用に関する。
欧州特許出願（公開番号０  ３０６２２８号）は、とりわけ、式（Ａ）：
0003782099.tif 000002
［式中、Ａaは置換または非置換の芳香族複素環基を表す］
で示されるある種のチアゾリジンジオン誘導体またはその互変異性体および／またはその医薬上許容される塩、および／またはその医薬上許容される溶媒和物を開示している。
Ｒaは水素原子、アルキル基、アシル基、アラルキル基（ここに、該アリール基は置換されていても置換されていなくてもよい）、または置換または非置換アリール基を表し；ＲbおよびＲcは各々水素原子を表すか、あるいはＲbおよびＲcは一緒になって結合を表す。
Ａbは合計５個までの置換基を有するベンゼン環を表し；ｎ’は２ないし６の範囲の整数を表す。
また、ＥＰ ０３０６２２８は、式（Ａ）の化合物を変換する方法、特に、式（Ａ）［式中、ＲbおよびＲcは一緒になって結合を表す］の化合物のベンジリデン結合を還元してＲbおよびＲcが各々水素を表す式（Ａ）の化合物を得る方法を開示している。
ＥＰ  ０３０６２２８で開示されている特別の還元方法は接触還元方法および金属／溶媒還元方法である。
今回、式（Ａ）の化合物のベンジリデン二重結合の還元は、微生物、特に、酵母微生物からのレダクターゼ酵素によって行うことができ、また驚くべきことに該還元は構造特異的に進行することが判明した。また、該還元はエナンチオマー選択的に進行させることができる。
該プロセスで得られたある種の化合物は新規であり、良好な血中グルコース低下活性を有することが示され、従って、高血糖症の治療および／または予防の使用に優れ、また、II型糖尿病の治療に特に用いられる。
また、これらの化合物は、高脂血症、高血圧、心血管病およびある種の摂食障害の治療および／または予防の使用に優れることが示される。
従って、本発明は、式（II）：
0003782099.tif 000003
［式中、ＴおよびＴ1は式（Ｉ）の定義に同じ］
で示される化合物またはその互変異性体および／またはその塩および／またはその溶媒和物を、適当な赤色酵母から得られた微生物レダクダーゼで処理し：しかる後、要すれば、式（Ｉ）の化合物またはその互変異性体の医薬上許容される塩および／または医薬上許容される溶媒和物を調製することを特徴とする式(Ｉ）：
0003782099.tif 000004
[式中、Ｔは置換または非置換アリール基であってＴ1はＯまたはＳを表す］
で示される化合物またはその互変異性体および／またはその医薬上許容される塩および／またはその医薬上許容される溶媒和物の製法を提供する。
適当には、Ｔは(Ｉａ)、(Ｉｂ)、(Ｉｃ)、(Ｉｄ)、(Ｉｅ)、(Ｉｆ)、(Ｉｇ)、(Ｉｈ)、(Ｉｉ)、(Ｉｊ)、(Ｉｋ)、(Ｉｌ)、(Ｉｍ)、(Ｉｎ)、(Ｉｏ)および(Ｉｐ)：
0003782099.tif 000005
[式中、Ａ1、Ａ2、Ｒ1およびｎはＥＰ  ０３０６２２８の式（Ｉ）の定義に同じ］
0003782099.tif 000006
［式中、Ｒ2、Ｌ1、Ｌ2およびＬ3はＥＰ  ０００８２０３の式（Ｉ）の定義に同じ］
0003782099.tif 000007
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、ＷおよびｎはＥＰ ０１３９４２１の式(Ｉ）の定義に同じ］
0003782099.tif 000008
［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3はＥＰ  ００３２１２８の式（Ｉ）の定義に同じ］
0003782099.tif 000009
［式中、Ａ、Ｒ、Ｒ1およびＸはＥＰ  ０４２８３１２の式（Ｉ）の定義に同じ］
0003782099.tif 000010
［式中、Ａ、Ｂ、ＲおよびＲ1はＥＰ  ０４２８３１２の式（II）の定義に同じ］
0003782099.tif 000011
［式中、Ｒ1はＥＰ  ０４８９６６３の式（Ｉ）の定義に同じ］
0003782099.tif 000012
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびｎはＥＰ  ０１５５８４５の式（Ｉ）の定義に同じ］
0003782099.tif 000013
［式中、Ｒ1はＥＰ  ０２５７７８１の式（Ｉ）の定義に同じ］
0003782099.tif 000014
［式中、Ａｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、ｎ、ＵおよびＷは米国特許第５１０４８８８号の式（Ｉ）の定義に同じ］
0003782099.tif 000015
［式中、Ａ、Ｒ1、Ｒ2およびＸはＥＰ  ０２０８４２０の式（Ｉ）の定義に同じ］
0003782099.tif 000016
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｘ、Ｚ、ｍおよびｎはＥＰ  ０１７７３５３の式（Ｉ）の定義に同じ］
ＥＰ  ０３１９１８９の式（Ｉ）による
0003782099.tif 000017
［式中、Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｘ1、Ｘ2、ｎおよびＺはＥＰ  ０３３２３３１の式（Ｉ）の定義に同じ］
0003782099.tif 000018
［式中、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｚ1およびｎはＥＰ  ０３３２３３２の定義に同じ］
および
0003782099.tif 000019
［式中、ＱおよびＸは国際出願ＷＯ  ９２／１８５０１の式（Ｉ）の定義に同じ］
からなるリストより選択される基である。
好都合には、Ｔは前記定義式(Ｉａ)、(Ｉｃ)、(Ｉｅ)、(Ｉｆ)、(Ｉｉ)、(Ｉｋ)または（Ｉｏ）の基である。
特に、Ｔは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）および（ｉ）：
0003782099.tif 000020
0003782099.tif 000021
からなるリストから選択される基を表す。
適当には、Ｔは前記定義の式（Ｉａ）の基を表す。
好ましくは、Ｔ1はＳを表す。
かくして、好ましい態様において、本発明は、式（２）：
0003782099.tif 000022
［式中、Ａ1、Ａ2、Ｒ1およびｎは式（１）の定義に同じ］
で示される化合物を適当な赤色酵母から得られた微生物レダクターゼで処理し；しかる後、要すれば、式（１）の化合物またはその互変異性体の医薬上許容される塩および／または溶媒和物を調製するすることを特徴とする式（１）：
0003782099.tif 000023
［式中、Ａ1は置換または非置換の芳香族複素環基；Ｒ1は水素、アルキル基、アシル基、アラルキル基（ここに、該アリール基は置換または非置換）、または置換または非置換アリール基；Ａ2は合計５個までの置換基を有するベンゼン環；およびｎは２ないし６の範囲の整数を表す］
で示される化合物またはその互変異性体またはその医薬上許容される塩、および／またはその医薬上許容される溶媒和物を提供する。
特に断りのない限り、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（Ｉｆ）、（Ｉｇ）、（Ｉｈ）、（Ｉｉ）、（Ｉｊ）、（Ｉｌ）、（Ｉｍ）、（Ｉｎ）、（Ｉｏ）または（Ｉｐ）の前記した基における各変数の適当、好都合および好ましい値は、各該式にて前記した欧州および国際特許出願および米国特許の定義に同じである。
特に、式（１）および式（２）における変数Ａ1、Ａ2、Ｒ1およびｎの適当、好都合および好ましい値はＥＰ  ０３０６２２８の式（Ｉ）に定義した通りである。
式（１）および式（２）におけるＡ1の最も好ましい値は２−ピリジル基である。
式（１）および式（２）におけるＡ2の最も好ましい値は、式：
0003782099.tif 000024
の基である。
式（１）および式（２）におけるＲ1の最も好ましい値はメチル基である。
式（１）および式（２）におけるｎの最も好ましい値は２である。
Ｔの最も好ましい値は前記式（ａ）の基である。
式（１）の最も好ましい値は５−（４−［２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ピリジル）アミノ）エトキシ］ベンジル）−２，４−チアゾリジンジオン、またはその互変異性体形および／またはその医薬上許容される塩、および／またはその医薬上許容される溶媒和物である。
式（２）の最も好ましい値は５−（４−［２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ピリジル）アミノ）エトキシ］ベンジル）−２，４−チアゾリジンジオン、またはその互変異性体形および／またはその医薬上許容される塩、および／または溶媒和物である。
特に断りのない限り、式(Ｉａ)、(Ｉｂ)、(Ｉｃ)、(Ｉｄ)、(Ｉｅ)、(Ｉｆ)、(Ｉｇ)、(Ｉｈ)、(Ｉｉ)、(Ｉｊ)、(Ｉｌ)、(Ｉｍ)、(Ｉｎ)、(Ｉｏ)または(Ｉｐ)の前記した基における各化合物の適当、好都合および好ましい医薬上許容される塩、医薬上許容される溶媒和物および互変異性体の各式にて前記した欧州または国際特許出願または米国特許の定義に同じである。
特に、適当な医薬上許容される塩は、例えばアルミニウムのごとき金属塩、ナトリウムまたはカリウムのごときアルカリ金属塩、カルシウムまたはマグネシウムのごときアルカリ土類金属塩、アンモニウムまたは置換アンモニウム塩、例えば、トリエチルアミン、２−ヒドロキシエチルアミン、ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミンもしくはトリ−（２−ヒドロキシエチル）−アミンのごときヒドロキシアルキルアミン、ビシクロヘキシルアミンのごときシクロアルキルアミンのような低級アルキルアミンでの塩、プロカイン、ジベンジルピペリジン、Ｎ−ベンジル−β−フェネチルアミン、ジヒドロアビエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ビスデヒドロアビエチルアミン、グルカミン、Ｎ−メチルグルカミンまたはピリジン、コリジンもしくはキノリンのごときピリジン型の塩基での塩を包含する。
特に、適当な医薬上許容される溶媒和物は水和物を包含する。
適当な赤色母は、前記還元を提供する赤色酵母であり、公知の赤色酵母、ならびに紫外線、化学突然変異誘発剤および遺伝子操作を含めた通常の突然変異方法のごとき常法によって公知の赤色酵母から生産され得る赤色酵母を含む。
特別の赤色酵母は、属ロドトルラ（Rhodotorula)、ロジスポリジウム（Rhodosporidium)またはその異名の種を包含する。
属ロドトルラ（Rhodotorula)の特別の例は、ロドトルラ・グリティニス（Rhodotorula glitinis)ＣＢＳ４４０６、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra)ＣＢＳ  ６４６９、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra)ＣＢＳ１７およびロドトルラ・グリティニス（Rhodotorula glitinis)ＩＦＯ  ０８６９を包含する。
属ロジスポリジウム（Rhodosporidium)の特別の例は、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides)ＣＢＳ１４を包含する。
属ロドトルラ（Rhodotorula)およびロドスポリジウム（Rhodosporidium)およびその異名の適当の種は、「ザ・イースツ（The Yeasts)」、第２版、１９７０、ジェイ・ロッダー（J. Lodder)編、ノース−ホランド・パブリッシング・カンパニー（North-Holland Publishing Co.)に開示されている。
公知の赤色酵母は、ナショナル・コレクション・オブ・イースト・カルチャーズ・カタログ（Naitonal Collection of Yeast Cultures Catalogue)、１９９０、ＡＦＲＣ、インスティテュート・オブ・フード・リサーチ（Instituts of Food Research)、ノルイック（Norwich)、英国に開示されているごとき適当なコレクションから入手できる。
ロドトルラ・グリティニス（Rhodotorula glinitis)ＣＢＳ  ４４０６、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra)ＣＢＳ  ６４６９、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra)ＣＢＳ１７およびロドスポリジウム・トルロイデスRhodosporidium toruloides)ＣＢＳ１４は公知の酵母微生物であって、セントラル・ビュロウ・フォール・シメルカルチャーズ（Central bureau voor Schimmelcultures)、バールン（Baarn)、デルフト（Delft)、オランダ国から入手できる。ロドトルラ・グリティニス（Rhodotorula glinitis)ＩＦＯ  ０８６９は公知の酵母微生物であって、ファーメンテーション(Fermantation)、大阪、日本国から入手できる。
式（Ｉ）および式（１）の化合物は、式中星印「＊」で示す少なくとも１個の不斉炭素原子を有し；それらは、従って、少なくとも２つの光学異性体形で存在する。
式（II）の化合物は公知の方法、例えば、前記欧州および国際特許出願または米国特許に開示されている適当な方法によって調製できる。前記欧州および国際出願特許および米国特許の内容を、ここに出典明示して、本明細書の一部とみなす。
特に、式（２）の特別の化合物はＥＰ  ０３０６２２８に開示された方法によって調製できる。
微生物レダクターゼ酵素は、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.)、１９８２、１５０巻、４９８−５０５、エイチ・ギルバートおよびエム・ツリー（H. Gilberrt and M. Tully)、欧州特許出願第０１９８４４０号および英国特許第１４７４５１９号に開示されているごとき通常の培養技術によって適当な赤色酵母から得ることができる。
該レダクターゼは純粋な酵素として単離できるか、あるいは、該レダクターゼの適当な源を反応に入れることができる。
該レダクターゼの適当な源は、前記した微生物からの全酵母細胞培養または固定化酵母細胞を包含し、適当には、該酵母細胞はロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis)ＣＢＳ４４０６またはロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra)ＣＢＳ６４６９である。
該微生物は、酵母エキス、合成培地、例えばペプトン、またはその混合物、例えば酵母エキス／ペプトンブロスを含むいずれの適当な増殖培地においても、該微生物の増殖に相当するいずれの温度にても増殖させることができ、該温度は使用する微生物の性質により２０℃ないし５０℃の範囲内の温度のごとく室温または室温よりわずかに高い温度が一般的であり、適当な温度は２０℃ないし４０℃、好都合には、２０℃ないし３０℃、例えば２８℃が適当である。
式（II）の化合物の還元は、前記培地を含めたいずれの適当な溶媒中にても、あるいは、細胞または固定化細胞の分離または移行の後に、緩衝液、例えば５ｗ／ｖスクロースを含有する水性クエン酸塩緩衝液ｐＨ３．７５のごとき塩溶液中で行うことができる。
一般に、ジオキサンのごとき水混和性溶媒、酢酸メチルのごとき部分的に混和性の溶媒、あるいはアセト酢酸エチルのごとき水不混和性溶媒であり得る有機溶媒中の溶液として、式（II）の化合物を反応系に導入する。次いで、得られた単一または二相系で反応を行うことができる。
一般に、２ないし７、４ないし７または８ないし１０の範囲のごとき、あるいはより特別には２ないし４、３ないし５、４ないし６、５ないし７、６ないし８または８ないし１０、例えば、ｐＨ３またはｐＨ８のごとく、２ないし１０のｐＨ範囲であり得る、所要の生成物の形成の適当な速度を与えるいずれのｐＨにても反応を行うことができる。
本発明の１の特別の態様において、基質の立体的選択還元を与えることが示される酸性ｐＨにて反応を行って、星印を付した炭素原子の１のエナンチオマー（「選択したエナンチオマー」）に富む生成物を得る。
従って、式（II）の前記定義の化合物を適当な赤色酵母から得られた微生物レダクターゼと反応させることからなり、該反応を酸性ｐＨで行い；しかる後、要すれば、エナンチオマー豊富化合物（Ｉ）またはその互変異性体の医薬上許容される塩および／または医薬上許容される溶媒和物を得ることを特徴とする当該化合物の５０％を超えて式（ＩＡ）：
0003782099.tif 000025
［式中、ＴおよびＴ1は式（Ｉ）の定義に同じであって「＊＊」炭素原子がエナンチオマー炭素原子を意味する］
の化合物の形態である式(Ｉ)の化合物（以後、「エナンチオマー豊富化合物(Ｉ)」という）の製法が提供される。
式（ＩＡ）の化合物における変数ＴおよびＴ1の値は式（Ｉ）の化合物で述べた通りである。
式（ＩＡ）の化合物の最も好ましい値は（＋）５−（４−［２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ピリジル）アミノ）エトキシ］−ベンジル）チアゾリジン−２，４−ジオン、またはその互変異性体および／またはその医薬上許容される塩および／またはその医薬上許容される溶媒和物である。
適当な酸性ｐＨは２ないし６の範囲、特に２ないし４、好ましくはｐＨ３である。
該立体選択的プロセスは、（＋）−５−（４−［２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ピリジル）アミノ）エトキシ］−ベンジル）チアゾリジン−２，４−ジオンにおけると同等炭素原子と同じ星印炭素原子における立体化学を有するエナンチオマーに富むエナンチオマー豊富化合物（Ｉ）を与え；Ｘ−線解析は（Ｒ）−エナンチオマーを示す。
いずれの特別のエナンチオマー豊富化合物（Ｉ）についても最適豊富化を与える特別の酸性ｐＨおよび反応温度のごとき反応条件はルーチン的実験によって決定できる。
適当には、該立体選択的反応は、７０％ｗ／ｗを超えるものが化合物（ＩＡ）、都合良くは、８０％ｗ／ｗを超えるものがそうであるエナンチオマー豊富化合物（Ｉ）を与える。最も好都合には、該立体選択的プロセスからの生成物は、８０−１００％ｗ／ｗが式（ＩＡ）の化合物、好ましくは９０−９５％のごとき９０−１００％が、最も好ましくは９５−１００％が、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％ｗ／ｗが式（ＩＡ）の化合物であるエナンチオマー豊富化合物（Ｉ）を与える。
前記エナンチオマー豊富化合物（Ｉ）は本発明のさらなる態様であると考えられる。従って、本発明は、エナンチオマー豊富化合物（Ｉ）またはその互変異性体および／またはその医薬上許容される塩および／またはその医薬上許容される溶媒和物を提供する。
また、本発明は、５０％ｗ／ｗを超えて式（ＩＡ）の化合物の形態であり；適当には、７０％を超えて、好都合には８０％を超えて式（ＩＡ）の化合物の形態であるエナンチオマー豊富化合物（Ｉ）またはその互変異性体および／またはその医薬上許容される塩および／またはその医薬上許容される溶媒和物を提供する。最も好都合には、エナンチオマー豊富化合物（Ｉ）は、８０−１００％ｗ／ｗが式（ＩＡ）の化合物であり、好ましくは、９０−９５％のごとく９０−１００％が、最も好ましくは９５−１００％が、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％ｗ／ｗが式（ＩＡ）の化合物である形態である。
１の好ましい態様において、好ましくは光学的に純粋な形態である式（ＩＡ）の化合物またはその互変異性体および／またはその医薬上許容される塩および／またはその医薬上許容される溶媒和物が提供される。
化合物の絶対立体化学は、Ｘ−線結晶学のごとき常法によって決定できる。
該反応は、所要の生成物の形成の適当な速度を提供するいずれの温度にても、一般には、２０℃ないし４０℃、好ましくは２０℃ないし３０℃の範囲、例えば２８℃のごとき２０℃ないし５０℃の範囲のように室温またはわずかに室温よりも高温で行うことができる。
いずれの前記反応からの生成物も、相分離および／またはジクロロメタンのごとき適当な溶媒への抽出によって精製でき、しかる後、要すれば、クロマトグラフィーに付すことができる。
また、前記反応は、細胞の反応または固定化において有機相を連続的にリサイクルすることを含めた連続的生産方法を用い、固定化したバイオマス上の有機溶媒中の基質をカラム、ループリアクターまたは他の同様のリアクターに通すことを含む連続的生産法を用いて行うことができる。
固定化した細胞調製物は常法、例えば、「細胞用の固定化マトリックスとしてのアルギネート（Alginate as immobilisation matrix for cells)」、スミズロッドおよびスキヤック−ブレク（Smidsrod and Skjak-Braek)、ティブテック（Tibtech)１９９０、８、７１−７８または「固定化酵素および細胞（Immobiolised enzymes and cells)」；ロスバール、ケネディおよびカブラル（Rosevar. Kennedy and Cabral)、ＩＯＰパブリッシング・リミテッド、１９８７に開示されている常法により調製できる。
前記したごとく、エナンチオマー豊富化合物（Ｉ）は有用な治療特性を有するものとして示される。本発明は、従って、活性な治療物質として用いるエナンチオマー豊富化合物（Ｉ）またはその互変異性体および／またはその医薬上許容される塩および／またはその医薬上許容される溶媒和物を提供する。
かくして、本発明は、高血糖症の治療および／または予防に用いるエナンチオマー豊富化合物（Ｉ）またはその互変異性体および／またはその医薬上許容される塩および／またはその医薬上許容される溶媒和物を提供する。
また、本発明のさらなる態様において、本発明は、高脂血症、高血圧、心血管病および摂食障害の治療および／または予防に用いるエナンチオマー豊富化合物（Ｉ）またはその互変異性体および／またはその医薬上許容される塩および／またはその医薬上許容される溶媒和物を提供する。
エナンチオマー豊富化合物（Ｉ）、またはその互変異性体および／またはその医薬上許容される塩および／またはその医薬上許容される溶媒和物は、それ自体で、あるいは好ましくは、医薬上許容される担体も含む医薬組成物として投与できる。
従って、本発明は、エナンチオマー豊富化合物(Ｉ)またはその互変異性体および／またはその医薬上許容される塩および／またはその医薬上許容される溶媒和物、およびそのための医薬上許容される担体よりなる医薬組成物も提供する。
本明細書中で用いる「医薬上許容される」とは、ヒトおよび獣医学用途の化合物、組成物および成分を含み；例えば、「医薬上許容される塩」は獣医学上許容される塩を含む。
所望ならば、当該組成物は、使用ための書いたまたは印刷した用法を伴ったパックの形態とし得る。
通常、本発明の医薬組成物は、注射および経皮吸収によるごとき他の経路による投与用の組成物も考えられるが、経口投与に適している。
特に、経口投与用に適した組成物は、錠剤およびカプセル剤のごとき単位用量形態である。カシェ剤に存在させる粉末のごとく他の固定した単位用量単位も使用できる。
通常の医薬プラクティスにおいて、担体は希釈剤、充填剤、崩壊剤、湿潤剤、滑沢剤、着色剤、フレーバー剤または他の通常のアジュバントからなり得る。
典型的な担体は、例えば、マイクロクリスタリンセルロース、スターチ、ナトリウムスターチグリコート、ポリビニルピロリドン、ポリビニルポリピロリドン、ステアリン酸マグネシウムまたはナトリウムラウリルスルフェートを包含する。
最も適当には、該組成物は単位用量形態に処方する。かかる単位用量は、通常、０．１ないし１０００ｍｇ、より通常には０．１ないし５００ｍｇ、より特別には０．１ないし２５０ｍｇの範囲の量の有効成分量を含有する。
さらに、本発明は、エナンチオマー豊富化合物（Ｉ）またはその互変異性体および／またはその医薬上許容される塩および／またはその医薬上許容される溶媒和物の有効かつ非毒性量を、治療を要する高血糖症のヒトまたは非ヒト哺乳動物に投与することを特徴とするヒトまたは非ヒト哺乳動物において高血糖症を治療および／または予防する方法を提供する。
さらに、本発明は、エナンチオマー豊富化合物（Ｉ）またはその互変異性体および／またはその医薬上許容される塩および／またはその医薬上許容される溶媒和物の有効かつ非毒性量を、治療を要する高脂血症のヒトまたは非ヒト哺乳動物に投与することを特徴とするヒトまたは非ヒト哺乳動物において高脂血症を治療および／または予防する方法を提供する。
便宜には、有効成分は前記した医療組成物として投与でき、これは本発明の特別の態様を形成する。
高血糖症ヒトの治療および／または予防、および／または高脂血症ヒトの治療および／または予防において、エナンチオマー豊富化合物（Ｉ）またはその互変異性体および／またはその医薬上許容される塩および／またはその医薬上許容される溶媒和物は、前記したごとき用量にて、７０ｋｇの成人が一般に０．１ないし６０００ｍｇ、より通常には約１ないし１５００ｍｇの範囲となる合計日用量にて１日当たり１ないし６回投与できる。
高血糖症非ヒト哺乳動物、特にイヌにの治療および／または予防において、有効成分は、約０．０２５ｍｇ／ｋｇないし２５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１ｍｇ／ｋｇないし２０ｍｇ／ｋｇの範囲の量で通常１日に１回または２回口から投与できる。
高血圧、心血管病および摂食障害の投与法は、一般に、高血糖症で前記した通りである。
さらなる態様において、本発明は、エナンチオマー豊富化合物（Ｉ）またはその互変異性体および／またはその医薬上許容される塩および／またはその医薬上許容される溶媒和物の、高血糖症の治療および／または予防用の医薬品の製造のための使用を提供する。
また、本発明は、本発明は、エナンチオマー豊富化合物（Ｉ）またはその互変異性体および／またはその医薬上許容される塩および／またはその医薬上許容される溶媒和物の、高脂血症、高血圧、心血管病またはある種の摂食障害の治療および／または予防用の医薬品の製造のための使用を提供する。
以下の実施例は本発明を説明する。触媒活性、従って、収量は、公知の技術によって、微生物の株改良を行うことによって改良できる。
実施例：微生物培養培地の調製
以下の微生物培養培地を以下の実施例で用いた。
培地Ａ：酵母エキス（１０ｇ）、および菌学的ペプトン（２０ｇ）を脱イオン水に溶解して１リットルとし、２Ｍ水酸化ナトリウム溶液の添加によってｐＨを７．０−７．２に調整した。これを滅菌に先立って５００ｍｌリットルのエルレンマイヤーフラスコに９０ｍｌの容量ずつ分配し、その後、３０％ｗ／ｖＤ−グルコース溶液１０ｍｌを濾過滅菌しつつ各フラスコに添加した。
培地Ｂ；（ＮＨ4）2ＨＰＯ4（１３ｇ）、ＫＨ2ＰＯ4（７ｇ）、酵母エキス（３ｇ）、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（０．８ｇ）、ＮａＣｌ（０．１ｇ）、ＺｎＳＯ４．７Ｈ2Ｏ（６０ｍｇ）、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（９０ｍｇ）、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ（５ｍｇ）およびＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ（１００ｍｇ）を脱イオン水に溶解して９００ｍｌとし、２Ｍ水酸化ナトリウム溶液の添加によってｐＨを７．０−７．２に調整した。これを圧力滅菌につき５００ｍｌリットルのエルレンマイヤーフラスコに９０ｍｌずつ分配し、その後、４０％（ｗ／ｖ）Ｄ−グルコース溶液１０ｍｌを濾過滅菌して各フラスコに添加した。
実施例１：遊離酵母細胞を用いる還元
ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra)ＣＢＳ  ６４６９のループを用いて培地Ａの振とうフラスコを接種し、これを振とうしつつ２８℃で７２時間インキュベートした。このブロス（１ｍｌ）を用いて培地Ａの同様のフラスコを接種し、これを遠心に先立って４８時間振とうした。ペレットを、５％（ｗ／ｖ）スクロースを含有する０．１Ｍ  トリス／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０に再懸濁して１．３の相対的ブロス細胞密度とした。２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中のこの懸濁液（４０ｍｌ）分に５−（４−［２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ピリジル）アミノ）エトキシ］ベンジリデン）チアゾリジン−２，４−ジオン（１，４−ジオキサン中の５ｍｇ／ｍｌ溶液の７．５ｍｌ）を添加し、混合物を２８℃で２２時間振とうした。遠心し、続いて上澄み４１．５ｍｌを取り出し、これはＨＰＬＣにより、５−（４−［２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ピリジル）アミノ）エトキシ］ベンジル）チアゾリジン−２，４−ジオンの８０％生成を示した。
実施例２：固定化酵母細胞を用いる還元
ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra)ＣＢＳ  ６４６９のループを用いて培地Ｂの振とうフラスコを接種し、これを２８℃で７２時間インキュベートした。このブロス（１ｍｌ）を用いて培地Ａの同様のフラスコを接種し、これを１２０ｍｌのブロスの遠心に先立って４８時間振とうした。得られたペレットを０．１Ｍ  トリス／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０中で１回洗浄し、この緩衝液中に再懸濁して１２．５ｍｌとした。同緩衝液中の等容量の２％（ｗ／ｖ）アルギン酸ナトリウム溶液を添加し、標準的な方法（細胞用の固定化マトリックスとしてのアルギネート（Alaginate as immobilisation matrix for cells)、スミズロッドおよびスクヤック−ブレク（Smidsrod and Skjak-Braek)、ティブテック（Tibtech)１９９０、８、７１−７８）を用いて細胞を固定化した。得られたビーズを前記したトリス緩衝液で洗浄し、容量をこの緩衝液で４０ｍｌとした。２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中のこの懸濁液に５−（４−［２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ピリジル）アミノ）エトキシ］ベンジリデン）チアゾリジン−２，４−ジオン（１，４−ジオキサン中の５ｍｇ／ｍｌ溶液の７．５ｍｌ）を添加し、混合物を２８℃で２２時間振とうした。上澄みをデカントし、ビーズをトリス緩衝液中の２０％（ｖ／ｖ）１，４−ジオンサン５０ｍｌで洗浄した。合した溶液のＨＰＬＣは８７％の５−（４−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ピリジル）アミノ）エトキシ］ベンジル）チアゾリジン−２，４−オンへの変換を示した。生成物をジクロロメタンに抽出し、有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発させて分光分析によって確認して生成物を得た。
実施例３：遊離酵母細胞を用いる還元
ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra)ＣＢＳ  ６４６９のループを用いて培地Ａの振とうフラスコを接種し、これを２８℃で７２時間インキュベートした。このブロス（１ｍｌ）を用いて培地Ａの同様のフラスコを接種し、これを１０ｍｌのブロスの遠心に先立って４８時間振とうした。ペレットを、５％（ｗ／ｖ）スクロースを含有する０．３Ｍ  トリス／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０に再懸濁して容量４．０ｍｌとした。２５ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中のこの懸濁液に５−（４−［２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ピリジル）アミノ）エトキシ］ベンジリデン−１，４−ジオン（１，４−ジオキサン中の８．３ｍｇ／ｍｌ溶液の０．５５ｍｌ）を添加し、混合物を２８℃で４時間振とうした。ＨＰＬＣによる反応混合物のアッセイは、５９％の生成物（５−[４−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ピリジル）アミノ）エトキシ］ベンジル）チアゾリジイン−２，４−ジオン）への変換を示し、これは、ラセミ標準と同一のエナンチオマー比を有していた。
実施例４：エナンチオマー豊富生成物の生成
ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra)ＣＢＳ  ６４６９を実施例１に記載したごとくに増殖させ、６６ｍｌ遠心培地からの細胞ペレットをｐＨ３．０、３．５または４．０いずれかの５％ｗ／ｖスクロースを含有する０．１Ｍ  クエン酸緩衝液２５ｍｌに再懸濁した。各々に１，４−ジオキサン中の５−（４−［２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ピリジル）アミノ）エトキシ］ベンジリデン）チアゾリジン−２，４−ジオンの８．３３ｍｇ／ｍｌ溶液の３．４４ｍｌを添加した。フラスコ中で４時間振とうした後、反応混合物をＨＰＬＣによって生成物につき検定した。
0003782099.tif 000026
これらの結果を用い、２２０ｍｌブロスからのペレットをクエン酸緩衝液／スクロースｐＨ３．７５の８８ｍｌに再懸濁し、５００ｍｌフラスコ中２つの４４ｍｌ分の各々を前記基質溶液６ｍｌに添加した。３時間２８℃で振とうした後、反応混合物を遠心し、細胞を前記緩衝液系中の１２％ｖ／ｖ１，４−ジオキサン２５ｍｌで洗浄した。ＨＰＬＣは合した上澄み中の生成物が９４：６のエナンチオマーの比率であることを示した。
該溶液を真空下室温にて２／３の元の容量に減少させてジオキサンを除去した。１０％アンモニア水溶液を用いて該溶液をｐＨ８に塩基性化し、グシロロメタン（３×５０ｍｌ）で抽出した。合した有機抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過し、＜２５℃にて真空下で蒸発乾固し、ガム状生成物を濃塩酸（０．２ｍｌ）を含有する水（１０ｍｌ）に溶解した。２４時間で２℃まで冷却した後、この固体を濾過し、真空下で乾燥して（２０℃）（＋）５−（４−［２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ピリジル）アミノ）エトキシ］−ベンジル）チアゾリジン−２，４−ジオン塩酸塩を得た（融点１２３．５−１２４℃；水）。
実施例５：ロドトルラ・グルティニス（Rhosotorula glutinis)ＣＢＳ４４０６を用いる還元
ロドトルラ・グルティニス（Rhosotorula glutinis)ＣＢＳ４４０６を実施例２に記載したごとくに培養して１２０ｍｌのブロスを得た。該ブロスを遠心し、５％（ｗ／ｖ）スクロースを含有するｐＨ８．０の０．１Ｍ  トリス／ＨＣｌ緩衝液１２．５ｍｌに再懸濁した。等容量の２％（ｗ／ｖ）アルギン酸ナトリウムを添加し、細胞を実施例２におけるごとくに固定化し、次いで前記緩衝液に再懸濁して４０ｍｌとした。該懸濁液を２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに分配し、それに１，４−ジオキサン中の５−（４−［２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ピリジル）アミノ）エトキシ］ベンジリデン）チアゾリン−２，４−ジオンの５ｍｇ／ｍｌ溶液７．５ｍｌを添加した。該フラスコを２８℃で２２時間振とうし、次いで上澄みをＨＰＬＣを用いて分析し、５−（４−［２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ピリジル）アミノ）エトキシ］ベンジル）チアゾリジン−２，４−ジオンの５１％生成が示された。
実施例６：ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra)ＣＢＳ６４６９を用いる還元
ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra)を実施例１記載したごとくに培養した。ブロス（１２ｍｌ）を遠心し、５％（ｗ／ｖ）スクロースを含有するｐＨ９．０の０．３Ｍトリス／ＨＣｌ緩衝液４．０ｍｌに再懸濁した。該懸濁液を２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに分配し、これに１，４−ジオキサン中の５−（４−［２−Ｎ−（２−ベンゾオキサゾリル−（Ｎ−メチル）アミノ）エトキシ］ベンジリデン）チアゾリジン−２，４−ジオンの８．３ｍｇ／溶液０．５５ｍｌを添加した。該フラスコを２８℃で２４時間振とうし、次いで該ブロスをＨＰＬＣを用いて分析し、５−（４−［２−Ｎ−］（２−ベンゾオキサゾリル−（Ｎ−メチル）アミノ）エトキシ］ベンジル）チアゾリジン−２，４−ジオンの４９％生成が示された。