(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレスに対してラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１を防御する方法であって、
該微生物を、約３．５％のＮａＣｌで約１５分処理する工程を含む、上記方法。
【請求項２】
ストレスに対してラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１を防御する方法であって、
該微生物を、約４８℃の温度で約１５分処理する工程を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、極端な温度変化及び浸透圧ショックの影響を含むストレスに対する防御を有する細菌細胞；防御された細菌細胞を含む栄養組成物又は医薬組成物；及びストレスに対して細菌を防御する方法に関する。
【０００２】
本明細書において「〜を含む」という用語は、「他にもあるが、〜を含む」という意味である。これは「〜のみからなる」という意味ではない。さらに「ストレス」という用語は、「有害な状態」と交換できるように用いられる。これは、特に限定されないが、温度（熱ショック、冷ショック）、塩（浸透圧ショック）、ｐＨ（ｐＨショック）、化学的ストレス（抗生物質、アルコール、Ｈ2Ｏ2など）、栄養ストレス、ＵＶストレス、冷ストレス及び酸素濃度（酸化ストレス）の有害な状態を含む。
【０００３】
本明細書中の標準的アミノ酸、ＲＮＡ及びＤＮＡコードは、ＩＵＢ生化学命名委員会（IUB Biochemical Nomenclature Commission）の規定に従って使用される。
【０００４】
乳酸菌（ＬＡＢ）のような細菌は、環境中に普遍的に存在し、主に発酵製品の製造に利用されていることは公知である。例えば食品工業において細菌は、乳製品の発酵やスターター培養物の製造に利用されている。スターター培養物の製造、食品の発酵、製造及び保存中に利用される細菌は、一般的にその生存性、安定性、及び活性を劇的に低下させる作用を有する、異なる種類の有害な状態を処理しなければならない。これらの有害な状態は、製造条件により変化し、熱ショック（凍結乾燥又は噴霧乾燥）、浸透圧ショック（乾燥）及びｐＨショック（発酵）がある。これらのストレスに対処する細菌の感受性又は無能力は、細菌を大量に使用する場合に問題となることは、理解されるであろう。
【０００５】
ヒトの腸（主に、小腸と大腸）中のビフィズス菌（Bifidobacteria）又は乳酸菌（lactobacilli）の存在は、一般に健康に寄与する因子であると認められている。さらにビフィズス菌と乳酸菌は、消化器感染症を含む疾患の予防又は治療に有用であると考えられている。この点で、小腸中のビフィズス菌と乳酸菌の大きな集団を維持し、これらの細菌を含む製品を与えるべきである。これらの製品はしばしば、異なる種のビフィズス菌又は乳酸菌を含む。しかし、製品の製造や保存中にビフィズス菌や乳酸菌が受けるストレスは、その生存性及び／又は生理活性を大きく低下させることがある。
【０００６】
亜致死的（sublethal）温度変化又は他の亜致死的ストレス（酸素ショックや浸透圧ショックへの暴露を含む）に対する細菌培養物の自然の応答には、「ストレスタンパク質」と呼ぶ明確なポリペプチドのセットの迅速な発現がある。これらのタンパク質により、例えばラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ラクトバシルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバシルス・サケイ（Lactobacillus sakei）、エンテロコッカス・フェーカリス（Enterococcus faecalis）、及びラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）のようなグラム陽性細菌が、本来は増殖制限の条件に適合することを可能になることが証明されている。
【０００７】
最も研究されているストレスタンパク質の１つは、熱ショックタンパク質又はシャペロンである。これらのタンパク質は一般に、新たに合成されたタンパク質の成熟に関与し、これらは、変性タンパク質の再折り畳みを助ける。ＬＡＢにおいて無数のストレス応答遺伝子が性状解析されており、これには、新たに合成されたタンパク質の正しい折り畳みと変性タンパク質の修復に関与する、２つの主要なシャペロン装置（ｇｒｏＥＳ／ｇｒｏＥＬ及びｈｒｃＡ／ｇｒｐＥ／ｄｎａＫ／ｄｎａＪ）をコードするものが含まれる。
【０００８】
顕著なことに、ビフィズス菌と乳酸菌を包含する細菌は、未保護細菌では致死的なストレスのレベルに対して、保護されることができることがわかった。驚くべきことにこれは、細菌を亜致死レベルのストレス処理に付すことにより行われる。驚くべきことに、この初期ストレス処理後には、細菌に悪影響を与えるには、より高レベルのストレスが必要であることがわかった。ストレスにより傷害される細胞は、追加のストレスにはより対応しにくいと考えられていたため、これは予想外である。実際、逆の事実が見つかっており、前ストレス処理細胞は、前ストレス処理しない対照細胞と比較して、より高いストレスレベルに耐えることができる。
【０００９】
異種の型のストレスで処理することにより得られる１つの型のストレスに対する防御は、「交差防御（cross-protection）」と呼ばれる。１つのストレスで処理して傷害された細胞は、さらなる亜致死的又は致死的ストレスに対してより感受性になると考えられていたため、これは予想外である。
【００１０】
従って第１の面において本発明は、未防御細菌細胞に対しては致死的である条件に対する防御を有する細菌細胞を提供し、防御細胞は、細菌細胞を亜致死レベルのストレスによる処理に付すことにより得られる。
【００１１】
第２の面において本発明は、未防御細菌に対しては致死的である条件に対する防御を有する細菌を含む栄養組成物を提供し、防御細菌は、細菌を亜致死レベルのストレスによる処理に付し、これらを回復させることにより得られる。
【００１２】
さらなる面において本発明は、熱ショック、浸透圧ショック、ｐＨショック、酸化ストレス、化学的ストレス、栄養ストレス、ＵＶストレス、冷ストレスからなる群から選択される亜致死レベルのストレスで、細菌細胞を処理する工程を含む、ストレスに対して細菌細胞を防御する方法を提供する。
【００１３】
好ましくは本方法は、細胞が回復することを可能にする追加の工程を含む。
好ましくは化学的ストレスは、抗生物質、アルコール又はＨ2Ｏ2で処理することにより提供される。
好ましくは細菌細胞は、ビフィズス菌、乳酸菌、腸球菌、ストレプトミセス（Streptomyces）及び桿菌を含む群から選択される。
【００１４】
さらに好ましくは細菌細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium breve）、又はラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）である。これらの細菌が与える利点は、これらはその基質を急速に酸性にする能力を有し、従って微生物学的に安全な製品を製造することである。さらにこれらは、ヒトや動物の健康に寄与する。さらにこれらは、腸の病原菌による攻撃に対して防御的役割を示し、抗癌性、抗突然変異誘発性、及び抗腫瘍形成性に関係している。理論に拘泥されるつもりはないが、最近の報告は、これらが、抗微生物活性により直接腸管中で、腸の細胞を介する免疫調節により間接的に、又は正常な常在微生物叢の機能を修飾することにより、作用する可能性を示唆している。
【００１５】
好ましくは細菌、さらに好ましくはビフィズス菌と乳酸菌は、本来は致死的塩濃度に対して防御するために亜致死的塩濃度で処理されるか、又は本来は致死的温度に対して防御するために亜致死的熱ストレスで処理される。さらに結果は、塩（例えば、ＮａＣｌ）による処理が、致死的熱ストレスに対して、又は凍結−融解の致死的サイクルに対して、これらの細菌を防御することを示している。従って本発明は代替的に、熱ストレスに対して防御するために塩で細胞を処理する工程、又は塩ストレスに対して防御するために有害な温度条件で細胞を処理する工程を含む。
【００１６】
好ましくは細菌細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）又は、ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）から選択される。さらに好ましくは、細菌細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１又は、ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１から選択される。
【００１７】
好ましくは致死的塩濃度（例えば、０．１％〜０．４％）に対する防御は、約０．０１〜約０．１％の塩で約１５〜約６０分処理することにより行われる。好ましくは塩は、胆汁酸塩である。
【００１８】
好ましくは致死的熱ストレス（例えば、約５０℃〜約６０℃）に対する防御は、約３７℃〜約５０℃で約１５〜６０分処理するか、又は約１％〜約４％の塩濃度で約３０〜約６０分処理することにより行われる。
【００１９】
好ましくは凍結−融解（例えば、１〜１０サイクル）に対する防御は、１％〜４％の塩濃度で細胞を処理することにより行われる。
【００２０】
好ましくはビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１細胞が防御される。さらに好ましくはビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１細胞の防御は、その増殖サイクルの対数期に、致死的刺激の前に、約０．１％の胆汁酸塩に細胞を約３０分付すことにより、致死的胆汁酸塩濃度（例えば、約０．２％〜約０．３％で３０分）に対して行われる。
【００２１】
好ましくはビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１細胞の防御は、その増殖サイクルの静止期に、致死的刺激の前に、約０．０５％の胆汁酸塩で細胞を約３０分処理することにより、致死的胆汁酸塩濃度（例えば、約０．０７５％〜約０．１５％で約３０分）に対して行われる。
【００２２】
好ましくはビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１細胞が防御される。さらに好ましくはビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１細胞の防御は、その増殖サイクルの対数期に、致死的刺激の前に、約０．１％の胆汁酸塩に細胞を約３０分付すことにより、致死的胆汁酸塩濃度（例えば、約０．３％〜約０．４％で約３０分）に対して行われる。
【００２３】
好ましくはビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１細胞の防御は、その増殖サイクルの静止期に、致死的刺激の前に、約０．１％の胆汁酸塩に細胞を約３０分付すことにより、致死的胆汁酸塩濃度（例えば、約０．１５％で約３０分）に対して行われる。
【００２４】
好ましくはビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１細胞の防御は、その増殖サイクルの静止期に、約２％のＮａＣｌに細胞を約１時間付すことにより、本来は致死的作用の（例えば、約３〜約４サイクル）の凍結−融解（約−８０℃〜ほぼ室温（好ましくは約２０℃〜約３０℃、さらに好ましくは２５℃））に対して行われる。
【００２５】
好ましくはビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１細胞の防御は、その増殖サイクルの対数期に、約４５℃で約３０分、約４７℃で約１５分、又は１％もしくは２％のＮａＣｌで約１時間、細胞を処理することにより、本来は致死的となる２０分間の５５℃の温度に対して行われる。
【００２６】
好ましくはラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１細胞が防御される。さらに好ましくはラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１細胞の防御は、その増殖サイクルの対数期に、約３．５％のＮａＣｌで約１５分、又は約４８℃で約１５分、細胞を処理することにより、本来は致死的となる１時間までの５５℃の温度に対して行われる。
【００２７】
好ましくはラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１細胞の防御は、その増殖サイクルの静止期に、約４８℃で約１５分、又は約３．５％のＮａＣｌで約１５分、細胞を処理することにより、本来は致死的となる１時間までの５５℃の温度に対して行われる。
【００２８】
株と増殖条件
ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４９０、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ５８５、及びビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）ＮＣＣ２９８を、０．５g/l システインを補足したＭＲＳ培地中で、３７℃で嫌気的条件（９８％窒素と２％水素）下で培養した。ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）ＭＧ１３６３を、ＭＲＳ培地中で３０℃で増殖させた。大腸菌（Escherichia coli）ＴＧ１（アマシャム（Amersham））を、ルリア−ベルタニ（Luria-Bertani）培地中で３７℃で培養した。ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１をＭＲＳ中で３７℃で増殖させた。
【００２９】
ストレス処理
細胞をＯＤ６００（６００nmでの光学密度）０．４〜０．７まで増殖させたか、又は静止期で取って、異なる時期に種々のストレス条件に付した。凍結−融解実験に使用した細胞を、食塩水中で濃縮後、−８０℃に付した。塩化ナトリウムを試料に加えて塩ストレスを与え、一方、胆汁酸塩ストレスのためにはオキシガル（OXGALL）（商標）（ディフコ（Difco））を使用した。
【００３０】
ビフィズス菌のストレス処理を、嫌気的条件下で行い、生存細胞の測定は好気的条件下で行った。乳酸菌細胞を、微好気性条件下で増殖させ、ストレス処理と生存細胞数の測定は、好気的条件下で行った。
【００３１】
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【００３２】
前誘導と致死的刺激の時間は、株とストレス条件に依存して、５分〜２時間の間で変動する。
【００３３】
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【００３４】
前誘導と致死的刺激の時間は、株とストレス条件に依存して、５分〜２時間の間で変動する。
【００３５】
ＤＮＡ技術
染色体ＤＮＡの単離は、標準的方法に従って行った。
【００３６】
ｍＲＮＡの分析
ドットブロットハイブリダイゼーションのために、標準的方法に従って総ＲＮＡを単離し、変性させ、非荷電ナイロン膜（ジーンスクリーン（GeneScreen）、ＮＥＮ）に移行させた。膜をプレハイブリダイズ（１時間、４０℃）し、次に１００pmolのＤＩＧ標識プローブ（ベーリンガー（Boehringer））で４時間ハイブリダイズさせた。０．１％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣ中で４０℃で５分で２回膜を洗浄し、プローブ依存性温度（これは、２つのｄｎａＫ特異的プローブＧＳＲ５（５’−ＣＡＴＣＧＡＡＧＧＴＧＣＣＧＣＣＡＣ−３’）とＧＳＲ８（５’−ＴＣＧＴＣＡＣＣＡＣＣＧＡＧＧＴＧ−３’）についてそれぞれ４６℃と４８℃、及び普遍的プローブ１０２８Ｒ（５’−ＣＣＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＴＴＡＣＧＧ−３’）について５１℃である）で１回洗浄した。検出は、製造業者の説明書に従って行った。
【００３７】
ＰＣＲ増幅
縮重プライマーＨＳ１（５’−ＡＴＩＡＣＩＧＴＩＣＣＩＧＣＩＴＡ（Ｔ／Ｃ）ＴＴ（Ｔ／Ｃ）ＡＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＡ−３’）とＨＳ２（５’−ＣＡＴＩＧＴ（Ｔ／Ｃ）ＴＣＩＡＴＩＣＣＩＡ（Ａ／Ｇ）ＩＧＡＩＡ（Ｇ／Ａ）ＩＧＧ−３’）と、鋳型として１μｇの染色体ＤＮＡを使用して、コアｄｎａＫ領域を増幅した。増幅反応は、総量１００μｌ（各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、５０pmolの各プライマー、２．５ＵのＳｕｐｔｅｒ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＨＴバイオテクノロジー（HT Biotechnology））及び対応する１×ＰＣＲ緩衝液を含有する）で行った。反応は、パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）サーマルサイクラーを用いて行った：最初の変性を９５℃で５分行った後、９５℃で１分、５５℃で１分、及び７２℃で１分を３０サイクル行い、最後に７２℃で１０分伸長を行った。
【００３８】
ｄｎａＫ遺伝子の同定
バリル（Barril）ら（１９９４）の整列に基づき、我々は、同一のアミノ酸配列を有するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、大腸菌（Escherichia coli）、及びバシルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）のＤｎａＫの２つの領域を選択し、それぞれラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）ＤｎａＫの１１４〜１２２位と３６６〜３７４位のアミノ酸に対応する２つの縮重プライマーＨＳ１とＨＳ２を設計した。このプライマー対を、鋳型としてＮＣＣ４８１、ＮＣＣ４９０、ＮＣＣ５８５、ＮＣＣ２５１、及びＮＣＣ２９８の染色体ＤＮＡを使用するＰＣＲ増幅のために使用した。各株について２つの断片を得た。すべての株について、サイズが２つの陽性対照大腸菌（Escherichia coli）とラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）の断片に対応する断片を、アガロースゲルから単離し、精製し、配列決定した。各断片で、既知のＤｎａＫタンパク質のコア領域と高い配列類似性を示す読みとり枠を同定した。ストレプトミセス（Streptomyces）とマイコバクテリア（mycobacteria）ならびにラクトバシルス・サケイ（Lactobacillus sakei）、杆菌、及びストレプトコッカス（Streptocossus）と、特に高い同一性が観察された。
【００３９】
ｄｎａＫ遺伝子発現のｍＲＮＡ分析
ｄｎａＫの転写誘導を、熱ショックと追加の一般的ストレス条件に暴露した細胞で調べた。対数期のビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１とビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１細胞を、０．１％胆汁酸塩、１．５％ＮａＣｌ、又は４２℃と４５℃で１０分の熱ショックに付した。ＮＣＣ４８１とＮＣＣ２５１について、それぞれ４７℃と５０℃の最高温度を試験した。対数期と静止期の非誘導細胞を、いつも対照として使用した。総ＲＮＡを単離し、ドットブロットハイブリダイゼーションに付した。ｄｎａＫ特異的プローブＧＳＲ８とＧＳＲ５を、それぞれＮＣＣ４８１とＮＣＣ２５１について使用した。普遍的プローブ１０２８Ｒを選択して、膜上のＲＮＡの量と質を証明した。細胞を高温に付すと、ｄｎａＫ特異的ｍＲＮＡの濃度の上昇が観察された（図１）。ＮＣＣ２５１に対して、ＮＣＣ４８１のｄｎａＫは、静止期に入る細胞でほんのわずかに誘導された。さらにＮＣＣ２５１では胆汁酸塩とＮａＣｌ処理後に、ｄｎａＫのわずかな誘導が観察された。ＮＣＣ４８１には、同一条件下で有意な誘導は得られなかった。
【００４０】
生存と交差防御
ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１、及びビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１の増殖と生存を、異なる温度、胆汁酸塩及び塩条件下で試験した。
【００４１】
注目すべきことに、対数期のＮＣＣ２５１は、亜致死的熱ストレスで処理した後に、５５℃の一般的な致死的温度に対して耐性の上昇を示した。細胞を４７℃に１５分付した後、１０分と２０分熱ショックを与えると、それぞれほとんど２４倍と１２８倍の高温耐性が観察された（図２）。これらの数字は、細胞の前誘導が、本来は致死的な刺激に対して細胞を防御するのにどの程度予想外に有効となるかを示しているため、注目される。１．５％ＮａＣｌで１時間前処理することにより、５５℃に対する細胞の９倍と１５倍の交差防御が達成された。熱ストレスに対する同等の防御はまた、４５℃で３０分又は２％ＮａＣｌで１時間前誘導することにより、観察することができた（図２）。
【００４２】
ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１の増殖サイクルの対数期の細胞は、３．５％ＮａＣｌ又は４８℃で１５分前処理すると、５５℃で３０分に対して、４００倍の高い防御を示した。３．５％ＮａＣｌと４８℃で１５分前処理した試料では、５５℃で１時間後、５５℃に対してそれぞれ１０倍と５倍の高い防御が観察された（図８）。
【００４３】
ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１の静止期の細胞は、３．５％ＮａＣｌと４８℃で１５分前処理後に、５５℃で１時間に対して注目すべき２０倍の高い防御を示した（図９）。
【００４４】
静止期のビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１の細胞は、２％ＮａＣｌで１時間前ストレスを行うと、凍結−融解の連続的サイクル後１４倍高い生存を示した（図３）。４サイクルの凍結−融解後、１０倍高い生存が観察された。
【００４５】
ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１とビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１の対数期ならびに静止期に、致死的胆汁酸塩濃度に対して防御が観察された。対数期の細胞を０．１％胆汁酸塩で事前条件に付す（例えば、３０分）と、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１の対数期の細胞で、０．３％と０．４％の胆汁酸塩に対してそれぞれ３００倍と２１倍の防御を示した（図６）。０．１５％の胆汁酸塩の致死的濃度下で、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１の静止期の細胞（０．１％胆汁酸塩で前誘導した）の生存の８１倍の上昇が観察された（図７）。ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１について、同様の結果が得られた。０．１％オキシガルで前誘導した対数期の細胞は、致死的濃度の０．２％、０．２５％、及び０．３％のオキシガルに対して、それぞれ４００倍、１８００倍、及び５８０倍優れた生存を示した（図４）。静止期の細胞は、０．０５％オキシガルで３０分前誘導すると、０．０７５％、０．１％、及び０．１５％のオキシガル３０分に対して、３倍、２９倍、及び１５０倍優れた生存を示した（図５）。
【００４６】
フラハウト（Flahaut）ら（１９９６）が発表した結果（０．３％胆汁酸塩に対してエンテロコッカス・フェーカリス（Enterococcus faecalis）の防御が３０秒のみ達成された）に対して、注目すべきことに、細胞は、致死的胆汁酸塩濃度に対して３０分防御されることができた。これは、予測できることではなかった。
【００４７】
ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４９０、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ５８５、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１及びビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）ＮＣＣ２９８のｄｎａＫのコア領域を、ＰＣＲ増幅し、同定した。以後のｍＲＮＡ分析は、ＮＣＣ２５１とＮＣＣ４８１において、ｄｎａＫの誘導は、転写レベルで制御されることを示した。転写は、一般的に熱により誘導され、ＮＣＣ２５１についてはまた、塩と胆汁酸塩を用いる処理によっても誘導される。
【００４８】
これらの知見を考慮すると、ビフィズス菌及び／又は乳酸菌のストレス前処置により、本来は致死的な同種又は異種のストレス条件下の生存の確率が顕著に上昇すると結論された。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、異なる種類のストレスに１０分間暴露した後の、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１とビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１の細胞のＲＮＡのドットブロットハイブリダイゼーションの結果を示す。ハイブリダイゼーションは、ＮＣＣ４８１とＮＣＣ２５１についてそれぞれ特異的なプローブＧＳＲ８とＧＳＲ５を使用して行った。
【図２】  図２は、対数期における異なる前誘導後の、５５℃でのビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１の生存のグラフを示す。細胞をＭＲＳとシステイン中で３７℃で、ＯＤ６００が０．４〜０．７まで増殖させた。アリコートを取って、４７℃に１５分、４５℃に３０分、又は１．５％ＮａＣｌもしくは２％ＮａＣｌに１時間付した；対照は３７℃に維持した。試料を５５℃に移行させ、１０分及び２０分後、生存細胞数を測定した。
【図３】  図３は、３サイクル及び４サイクルの凍結−融解後のビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１の生存のグラフを示す。静止期の細胞を取り、２％ＮａＣｌに１時間付し、対照は塩を無添加で維持した。試料を−８０℃に移行させ、室温で融解した。このサイクルを３回と４回繰り返してから、生存細胞数を測定した。
【図４】  図４は、対数期における致死的胆汁酸塩条件下のビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１の生存のグラフを示す。細胞を、ＯＤ６００（６００nmでの光学密度）０．４〜０．７まで増殖させ、３０分間０．１％オキシガルに付した。対照は、オキシガル無添加で維持した。試料のアリコートを取り、０．２％、０．２５％、及び０．３％オキシガルに３０分移行させ、生存細胞数を測定した。
【図５】  図５は、致死的胆汁酸塩条件下の静止期のビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＮＣＣ４８１の生存のグラフを示す。細胞を、３０分間０．０５％オキシガル処理に付した。対照は、オキシガル無添加で維持した。試料のアリコートを取り、０．０７５％、０．１％、及び０．１５％オキシガルに３０分移行させ、生存細胞数を測定した。
【図６】  図６は、致死的胆汁酸塩条件下の対数期のビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１の生存のグラフを示す。細胞を、ＯＤ６００（６００nmでの光学密度）０．４〜０．７まで増殖させ、３０分間０．１％オキシガル処置に付した。対照は、オキシガル無添加で維持した。試料のアリコートを取り、０．３％、及び０．４％オキシガルに３０分移行させ、生存細胞数を測定した。
【図７】  図７は、致死的胆汁酸塩条件下の静止期ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）ＮＣＣ２５１の生存のグラフを示す。細胞を、３０分間０．１％オキシガル処理に付した。対照は、オキシガル無添加で維持した。試料のアリコートを取り、０．１５％オキシガルに３０分移行させ、生存細胞数を測定した。
【図８】  図８は、致死的熱条件下でのラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１の生存のグラフを示す。細胞を、ＭＲＳ中で３７℃でＯＤ６００（６００nmでの光学密度）０．４〜０．７まで増殖させた。試料を取り、３．５％ＮａＣｌ又は４８℃に１５分間付した。対照は３７℃に維持した。次に試料を５５℃に移行させ、３０分と６０分後、生存細胞数を測定した。
【図９】  図９は、致死的熱条件下での増殖サイクルの静止期のラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１の生存のグラフを示す。試料を取り、３．５％ＮａＣｌ又は４８℃に１５分間付した。対照は３７℃に維持した。次に試料を５５℃に移行させ、６０分後、生存細胞数を測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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