(57)【要約】  加熱によって変性するゲル（１５）で形成されたゲル層と、前記ゲル層の一面に形成された金微粒子層（１３）と、を含む細胞培養基材（１４）が充填され、前記細胞培養基材の前記一面側又は他面側で細胞が培養される細胞培養容器。加熱によって変性するゲルを細胞培養容器に充填する工程と、前記ゲルの一面に金微粒子層を形成する工程と、を含む、細胞培養容器の製造方法。該細胞培養容器に配置された細胞から、取得する細胞を選択する工程と、選択された前記細胞の近傍の細胞培養基材に光を照射する工程と、選択された前記細胞を回収する工程と、を含む、細胞の取得方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
加熱によって変性するゲルで形成されたゲル層と、前記ゲル層の一面に形成された金微粒子層と、を含む細胞培養基材が充填され、
前記細胞培養基材の前記一面側又は他面側で細胞が培養される、細胞培養容器。
【請求項２】
前記細胞培養容器が、複数のウェルを有する細胞培養容器であって、前記各ウェルのそれぞれに、前記細胞培養基材が充填されている、請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項３】
前記ウェルが底を有する請求項２に記載の細胞培養容器。
【請求項４】
前記ウェルが底に貫通孔を有する請求項２に記載の細胞培養容器。
【請求項５】
前記貫通孔の径は、前記ウェルの径と同一かそれより小さい、請求項４に記載の細胞培養容器。
【請求項６】
前記ウェルが１ウェル当たり約１細胞配置される径を有する請求項２〜５のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
【請求項７】
前記ウェルが、アレイ状に配置されている、請求項２〜６のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
【請求項８】
前記ゲルが、コラーゲンゲル又はゼラチンゲルである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
【請求項９】
加熱によって変性するゲルを細胞培養容器に充填する工程と、
前記ゲルの一面に金微粒子層を形成する工程と、を含む、細胞培養容器の製造方法。
【請求項１０】
前記細胞培養容器が、複数のウェルを有する細胞培養容器であって、
前記ゲルを細胞培養容器に充填する工程が、前記ゲルを前記ウェルのそれぞれに充填する工程である、請求項９に細胞培養容器の製造方法。
【請求項１１】
前記ゲルの一面に前記金微粒子層を形成する工程は、金微粒子を含む溶液を前記ゲルの上に配置する工程と、
前記溶液中の液体成分を蒸発させる工程と、
を含む、請求項９または１０に記載の細胞培養容器の製造方法。
【請求項１２】
前記複数のウェルは底に貫通孔を有し、
前記ゲルの一面に金微粒子層を形成する工程は、
前記細胞培養容器の細胞培養面となる面を下にして、金微粒子を含む溶液を前記ゲルの上に配置する工程と、
前記溶液中の液体成分を蒸発させる工程と、
前記細胞培養容器を上下反転させる工程と、
を含む、請求項１０に記載の細胞培養容器の製造方法。
【請求項１３】
ウェルを複数有する細胞培養容器の前記ウェル内に金微粒子層を形成する工程と、
前記金微粒子層の上に、加熱によって変性するゲル層を形成する工程と、を含む、細胞培養容器の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞培養容器と、吸引ポンプとを備える、細胞回収システム。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞培養容器に配置された細胞から、取得する細胞を選択する工程と、
選択された前記細胞の近傍の細胞培養基材に光を照射する工程と、
選択された前記細胞を回収する工程と、
を含む、細胞の取得方法。
【請求項１６】
請求項２〜８のいずれか一項に記載の細胞培養容器の前記ウェルのそれぞれに配置された細胞から、取得する細胞を選択する工程と、
選択された前記細胞が配置されているウェルに充填された細胞培養基材に光を照射する工程と、
前記光を照射した細胞培養基材を前記細胞培養容器から取り出す工程と、
前記細胞培養容器から取り出した細胞培養基材から細胞を回収する工程と、を含む、細胞の取得方法。
【請求項１７】
前記細胞培養基材を細胞培養容器から取り出す工程が、前記光を照射した細胞培養基材を吸引する工程である、請求項１６に記載の細胞の取得方法。
【請求項１８】
前記細胞培養基材を細胞培養容器から取り出す工程が、前記光を照射したゲルを前記細胞培養容器中で液体に浮遊させ、該液体を回収する工程である、請求項１６に記載の細胞の取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞回収システムおよび細胞の取得方法に関する。
本願は、２０１８年２月２１日に、日本に出願された特願２０１８−２８９２１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
培養基材で培養された細胞をより効率的に回収するため、例えば、感温性高分子を含む 培養基材の上で細胞を培養し、温度変化を利用して細胞の回収を行う方法が提案されている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平１１−３４９６４３号公報
【発明の概要】
【０００４】
本発明の第１の態様によると、細胞培養容器は、加熱によって変性するゲルで形成されたゲル層と、前記ゲル層の一面に形成された金微粒子層と、を含む細胞培養基材が充填されている。細胞は、細胞培養基材の前記一面側又は他面側で培養される。
本発明の第２の態様によると、細胞培養容器の製造方法は、加熱によって変性するゲルを細胞培養容器に充填する工程と、前記ゲルの一面に金微粒子層を形成する工程と、を含む。
本発明の第３の態様によると、細胞回収システムは、第１の態様の細胞培養容器と、前記細胞培養容器に接続された吸引ポンプとを備える。
本発明の第４の態様によると、細胞の取得方法は、第１の態様の細胞培養容器に配置された細胞から、取得する細胞を選択する工程と、選択された前記細胞の近傍の細胞培養基材に光を照射する工程と、選択された前記細胞を回収する工程と、を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】第１の実施形態の細胞培養容器の断面図である。
【図２】第２の実施形態の細胞培養容器の断面図である。
【図３】第３の実施形態の細胞培養容器の断面図である。
【図４】第４の実施形態の細胞培養容器の断面図である。
【図５】一実施形態の細胞培養容器を含む細胞取得システムの構成を示す概念図である。
【図６】第４の実施形態の細胞培養容器を用いて細胞を取得する方法を模式的に示した図である。
【図７】一実施形態の細胞培養容器の構成を示す概念図である。
【図８】一実施形態の細胞回収システムの構成を示す概念図である。
【図９】一実施形態の細胞培養容器を用いた細胞の取得方法の流れを示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
（第１の実施形態）
以下では、適宜図面を参照しながら、一実施形態の細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞回収システム、および細胞の取得方法等について説明する。
【０００７】
細胞培養基材の上で培養した細胞のうち、遺伝子導入に成功した細胞等、特定の細胞を効率的に剥離し、回収することがしばしば必要になる。
本発明者らは、加熱によって変性するゲルで形成されたゲル層と、ゲル層の一面に形成された金微粒子層と、を含む細胞培養基材が充填されている細胞培養容器で細胞を培養した後、外部から極めて短時間光を照射することにより、該細胞培養基材のゲルが非常に効率よく変性することを見出した。そしてこれにより、該細胞が細胞培養基材から剥離するか、または、該細胞が細胞培養基材ごと培養容器から剥離するので、吸引等により、障害を与えることなく該細胞を効率的に回収できることを見出した。
特に、細胞培養容器が複数のウェルを有する場合、外部からの光により、該細胞培養基材が収縮してウェルから剥離し、該細胞培養基材を吸引等により取り出すことにより、該細胞培養基材に接着している目的細胞に障害を与えることなく、該細胞を効率的に回収できることを見出した。
さらに、ゲルを細胞培養容器に充填した後に、ゲルの一面に金微粒子層を形成する方法で細胞培養基材を製造することにより、金微粒子を無駄にすることなく細胞培養容器を製造することができることを見出した。
本実施形態の細胞培養容器を用いることにより、目的細胞を特異的に効率よく回収することを実現する。
【０００８】
図１は、本実施形態の細胞培養容器の第１の実施形態の断面図である。細胞培養容器１は、内部に、加熱によって変性するゲル１５が充填されており、ゲル１５の下面側に金微粒子層１３が形成されている。第１の実施形態においては、細胞培養容器１は、一つの開放口を有する。細胞培養容器１はシャーレ等の蓋を有するものであっても、蓋を有さないものであってもよい。
【０００９】
金微粒子層１３を形成する金微粒子は、光熱変換特性の高い大きさの粒子とすることができ、特に、表面プラズモン共鳴吸収（ＳＰＲ）が起こる大きさとしてもよい。レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定された金微粒子の体積平均径は、例えば、１ｎｍ以上２００ｎｍ未満、１０ｎｍ以上１００ｎｍ未満、３０ｎｍ以上７０ｎｍ未満とすることができる。
所定の体積平均径を有する金微粒子を含む溶液は、例えば、特開２０１３−２３３１０１号公報に記載の方法のように、金イオンを含む溶液（ＨＡｕＣｌ４等）中で還元剤（アスコルビン酸、ヒドロキノン、クエン酸等）の存在下に、金からなる種核を成長させて得ることができる。
金微粒子の体積平均径は、レーザー回折式粒度分布測定装置で測定することができる。
粒度分布測定装置を用いず、簡易的に測定する場合は、透過型電子顕微鏡を用いて撮像し、解析ソフトウェア等を用いて測定して算出してもよい。
【００１０】
ゲル１５は、室温から所定の温度に上昇した場合に変性する。本実施形態で「変性」とは、ゲル１５が温度上昇により、ゲル１５からの細胞の容易な剥離、または細胞培養容器１からのゲル１５の容易な剥離をもたらす構造の変化を起こすことを意味する。ゲル１５がコラーゲンゲルまたはゼラチンゲルの場合、「変性」には、例えば、コラーゲンタンパク質の二次または三次構造の変化によりもたらされる状態であるゾル化や凝集化、低分子化等が含まれる。ゲル１５が変性する温度は、例えば６０℃以下、５０℃以下、又は４０℃以下である。ゲル１５の材料は、後述のゲル１５からの剥離による細胞の取得を可能にするものであれば特に限定されないが、例えば、コラーゲンゲルまたはゼラチンゲルとしてもよい。また、架橋剤を添加したゲルや、二種類以上の高分子を混合して得たゲルを用いることもできる。また、ゲル１５は、金微粒子が分散されたゲルを用いてもよい。
【００１１】
ゲル１５の下面側に金微粒子層１３を形成する方法は、特に制限はないが、例えば、まず、金微粒子を含む溶液を細胞培養容器１に流し込み、一昼夜乾燥させる等により、前記溶液中の液体成分を蒸発させ、細胞培養容器１の底面に金微粒子層１３を形成する。続いて、金微粒子層１３の上にゲル１５を形成する。ゲル１５は、例えばコラーゲンゲルの場合、細胞培養容器１にコラーゲン溶液を注入し、これをゲル化することによって形成することができる。
このとき細胞培養容器１に流し込む金微粒子溶液の濃度は、例えば、１００μＭ以上２０００μＭ未満、２５０μＭ以上１５００μＭ以下、又は２５０μＭ以上８００μＭ以下としてもよい。金微粒子溶液の濃度が低いと、金微粒子の発熱量が小さくなるため、ゲル１５の収縮率が小さくなり、ゲル１５からの剥離成功確率が下がる傾向がある。一方、金微粒子溶液の濃度が高いと、局所での温度上昇が大きくなるため、温度制御が難しくなり、また細胞傷害性が高くなる傾向がある。なお、金微粒子は、デンドリマーに内包させたり、ゲルに対して親和性を有する分子で修飾したりする等、保護剤を用いてより安定化するようにしてもよい。
【００１２】
（第２の実施形態）
図２は、細胞培養容器の第２の実施形態の断面図である。細胞培養容器１は、内部に、加熱によって変性するゲル１５が充填されており、ゲル１５の上面側に金微粒子層１３が形成されている。ゲル１５と金微粒子層１３の配置以外は、図１に示される第１の実施形態と同様である。
【００１３】
このような細胞培養基材１４を作製する方法は、特に制限はないが、例えば、まず細胞培養容器１内にゲル１５を充填する。ゲル１５の充填方法は、第１の実施形態と同様に行うことができる。その上に、金微粒子を含む溶液を流し込み、一昼夜乾燥させる等して、溶液中の液体成分を蒸発させ、金微粒子層１３を形成して、細胞培養基材１４を作製することができる。
【００１４】
ゲル１５の上面又は下面に金微粒子層が形成された細胞培養基材１４の上面への細胞の配置は、例えば、細胞を含む液体を細胞培養容器１に流し込むことによって行うことができる。細胞培養容器１に流し込む細胞の数は、細胞を含む液体の濃度を調節することにより行うことができる。
また、細胞培養容器１は、光透過性を有するものであっても良い。これにより細胞培養容器１の底を介しても、細胞培養基材１４に光を照射することができる。細胞培養容器１は、本実施形態の細胞培養容器１の技術的特徴を損なわない限り任意の形状で構成され得る。
【００１５】
（第３の実施形態）
図３は、本実施形態の細胞培養容器１の第３の実施形態の断面図である。本実施形態においては、細胞培養容器１は複数のウェル１１を有する。第３の実施形態においては、前記各ウェルのそれぞれにおいて、金微粒子層１３の上にゲル１５が充填されている。
金微粒子層１３の形成とゲル１５の充填は、第１の実施形態と同様に行うことができる。
【００１６】
金微粒子層１３の上にゲル１５が積層された細胞培養基材１４上への細胞の配置は、例えば、細胞を含む液体を細胞培養容器１に流し込むことによって行うことができる。別の方法として、インクジェットプリンタを用いて、ウェル１１のそれぞれに細胞を播種してもよい。
細胞培養容器１は、１ウェル当たり約１細胞配置される構成としてもよい。これにより、細胞を１つずつ選択し回収することができるので、所望の細胞のみ回収することが可能である。「１ウェル当たり約１細胞配置される」とは、細胞を含む液体を細胞培養容器１に流し込んだとき、細胞が配置されるウェル１１のうち、細胞が１つだけ配置されたウェル１１が最も多くなる状態をいい、２つ以上の細胞が配置されたウェル１１や、１つも細胞が配置されていないウェル１１が存在してもよい。
１ウェル当たり約１細胞配置される構成とする方法の一例として、ウェル１１の径を調節することが挙げられる。１ウェル当たり約１細胞配置される径として、例えば、培養する細胞の平均径又は平均最長径の１倍以上３倍未満、又は１．３倍以上２倍未満の径が挙げられる。細胞培養容器１の各ウェルの径は、例えば、１０μｍ〜５００μｍ、２０μｍ〜４００μｍ、または３０μｍ〜３００μｍとしてもよい。ウェルの径が大きくなりすぎると、光照射による変性が生じにくくなる傾向がある。
１ウェル当たり約１細胞配置される構成とする別の方法として、細胞を含む液体の濃度を調節することも挙げられる。
１ウェル当たり約１細胞配置される構成とするさらに別の方法として、隣り合うウェル１１の距離（隣り合ったウェル１１の開口部の最小距離）を調節することも挙げられる。
細胞培養容器１は、ウェル１１をいくつ有してもよい。ウェル１１は、例えば、細胞培養容器１にアレイ状（マイクロアレイ状）に配置することができる。このとき、隣り合うウェル１１の距離を調節することにより、１ウェル当たりに配置される細胞数を調節することも可能である。
上述のように、インクジェットプリンタを用いて、各ウェルに約１細胞ずつ播種してもよい。
１ウェル当たり約１細胞配置される構成は、上述の方法の少なくとも一つ、及び／又はその他の方法により、当業者が適宜設計することができる。
また、細胞培養容器１は、光透過性を有するものであっても良い。これによりウェル１１の底を介しても、細胞培養基材１４に光を照射することができる。細胞培養容器１は、本実施形態の細胞培養容器１の技術的特徴を損なわない限り任意の形状で構成され得る。
なお、第３の実施形態では、金微粒子層１３の上にゲル１５を充填したが、細胞培養容器１がマイクロアレイ状の場合も、第２の実施形態と同様にゲル１５の上に金微粒子層１３を形成してもよい。
【００１７】
（第４の実施形態）
図４は、本実施形態の細胞培養容器１の第４の実施形態の断面図である。本実施形態においては、細胞培養容器１は複数のウェル１１を有し、細胞培養容器１のウェル１１は底に貫通孔１２を有する。貫通孔１２の径は、ウェル１１の径と同一でも小さくてもよい。図４では、貫通孔１２とウェル１１の径が同一である。また、図４では、ウェル１１及び貫通孔１２部分いっぱいに細胞培養基材１４が充填されているが、細胞培養基材１４がウェル１１及び貫通孔１２部分いっぱいに充填されていなくてもよい。ウェル１１に充填されている細胞培養基材１４に光を照射することにより、細胞培養基材１４の下面に存在する金微粒子の発熱によりゲル１５が収縮し、細胞培養基材１４がウェル１１の壁面から剥離する。剥離した細胞培養基材１４は、貫通孔１２より吸引等により回収することができる。
第４の実施形態に係る細胞培養容器１を作製する方法は、特に制限はないが、例えば、まず各ウェル１１及び貫通孔１２にゲル１５を充填し、図４とは上下反転した状態で（面１６ａが上になるように）細胞培養容器１を載置し、ゲル上に金微粒子を含む溶液を配置する。そして、一昼夜乾燥させる等して、溶液中の液体成分を蒸発させ、金微粒子層１３を形成した後、細胞培養容器１の面１６ｂが上になるように上下反転させればよい。各ウェル１１にゲル１５を充填する方法も特に限定されないが、一例として、別の容器にゲル１５の層を形成し、そこに細胞培養容器１の面１６ｂを押し付けることによりゲル１５をウェル１１に挿入する方法が挙げられる。
なお、第４の実施形態では、ゲル１５の下側（面１６ａ側）に金微粒子層１３が形成されているが、ゲル１５の上面（細胞を培養するのと同じ側。面１６ｂ側）に金微粒子層１３が形成されていてもよい。
【００１８】
図５は、第３の実施形態の細胞培養容器を用いて細胞の取得を行う細胞回収システム１０００を示す概念図である。細胞取得システム１０００は、細胞培養容器１と、倒立顕微鏡７０とを備える。
細胞培養容器１に、別の培養容器で培養された細胞３０を培養液２０とともに流し込む。培養液２０は培養液、緩衝液等で置換又は希釈してもよい。細胞培養容器１に流し込む細胞３０は、細胞培養容器１に流し込んだとき、１ウェル当たり１細胞になるような濃度としてもよい。
【００１９】
細胞培養容器１の各ウェル１１に充填された細胞培養基材１４の上面に配置された細胞３０は、各ウェル１１の細胞培養基材１４の上面で培養される。各ウェル１１に充填された細胞培養基材１４の上面で培養された細胞３０のうち、単離して取得したい細胞を選択細胞３００とし、その他の細胞を非選択細胞３０１とする。選択細胞３００はその態様は特に限定されないが、例えば、適切に遺伝子等が改変されレポーター遺伝子等の判別手段により特徴が現れている細胞や、初期化や適切な分化等が誘導されて構造上判別可能な特徴を有している細胞等が挙げられる。
なお、選択細胞３００は、上記のように単一の細胞３０でもよいし、複数の細胞３０または複数の細胞３０を含んで構成されるコロニーでもよい。
【００２０】
倒立顕微鏡７０は、照射部７１と、ダイクロイックミラー７２と、レンズ系７３と、観察部７４と、支持台７５とを備える。
なお、正立顕微鏡を用いて細胞回収システム１０００を構築してもよい。
【００２１】
照射部７１は、レーザー光を出射する。照射部７１から出射されるレーザー光の波長は、金微粒子層１３の金微粒子が光熱変換特性を発揮する波長域に設定される。特に表面プラズモン共鳴吸収（ＳＰＲ）が起こる波長域に設定してもよい。細胞培養基材１４に照射されるレーザー光は、細胞培養基材１４に照射した場合に細胞培養基材１４の上面の細胞に重大な損傷を与えない波長およびエネルギーを有するものであればよい。照射部７１から出射されるレーザー光の波長は、例えば、４００ｎｍ以上１２００ｎｍ未満、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ未満、５３２ｎｍ等に設定される。細胞培養容器１へ入射するレーザー光の出力は、例えば０．１ｍＷ以上１０００ｍＷ未満、０．４ｍＷ以上１００ｍＷ未満とすることができる。レーザー光の波長およびエネルギーは、細胞に傷害を与えずに細胞培養基材１４に含まれるゲルに効率よく温度上昇および変性を起こすよう、適宜調整される。照射部７１から出射した光は、ダイクロイックミラー７２に入射する。
なお、選択細胞３００の近傍の細胞培養基材１４を選択的に照射することができれば、照射部７１の出射光は特にレーザー光に限定されず、コヒーレントでない単色光や一定の波長範囲の光からなる光でもよい。
【００２２】
ダイクロイックミラー７２は、照射部７１からのレーザー光を反射するとともに、細胞培養容器１からの可視光を透過させて観察部７４へと出射する。ダイクロイックミラー７２で反射されたレーザー光は、不図示のガルバノミラー等により適切な位置にレーザー光が照射されるように光の向きが調節され、レンズ系７３を透過して細胞培養容器１に入射する。細胞培養容器１に入射したレーザー光は、細胞培養容器１の底部を透過した後、細胞培養基材１４の所定の位置で収束する。図５では、収束するレーザー光７を、一点鎖線を用いて模式的に示した。
なお、所望の位置にレーザー光７を収束することができれば、レーザー光７の照射光学系の構成は特に限定されない。
【００２３】
細胞培養基材１４におけるレーザー光７の収束位置は、例えば、選択細胞３００に傷害を与えない、選択細胞３００の下方の細胞培養基材１４中の任意の位置とすることができ、例えばレーザー光７のスポット径、ＰＳＦ（Ｐｏｉｎｔ Ｓｐｒｅａｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）やＰＳＦに基づくパラメータ等に基づいて定められる。選択細胞３００への影響を低くするために、金微粒子層１３自体又は金微粒子層１３付近としてもよい。これにより、高い光発熱効果が得られるとともに、金微粒子が発する熱による細胞毒性が低減されるので、選択細胞３００が熱に弱い細胞の場合にも好適である。
細胞培養基材１４におけるレーザー光７の集束位置は、選択細胞３００までの距離が１００μｍ以上であるゲル１５内の位置としてもよい。また、細胞培養基材１４におけるレーザー光の集束位置は、細胞培養基材１４の中心部ではなく、ウェル１１の壁面に近い位置でもよい。
【００２４】
照射部７１からのレーザー光７を金微粒子層１３の金微粒子が光熱変換し、レーザー光７の収束位置の近傍のゲルが変性すると、選択細胞３００が付着しているゲルが収縮し、ウェル１１の壁面から剥離する。従って、細胞培養容器１に培養液や緩衝液等の流体を流し入れることにより、選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４を流体中に浮遊させ、流体ごと回収することができる。
【００２５】
また、ウェル１１の下方の貫通孔１２から、収縮した細胞培養基材１４を、吸引ポンプ等を用いた吸引により取り出すこともできる（図６参照）。
【００２６】
観察部７４は、接眼レンズ等を備え、不図示の照明により照らされた細胞培養容器１からの可視光をユーザにより観察可能にする。ユーザは、細胞培養容器１からの可視光を見て、支持台７５を移動させる等して細胞培養容器１を適切に位置合わせ等することができる。
なお、レーザー光７の照射光学系とは異なるレーザー光源およびガルバノミラーを用いてレーザー走査を行うことにより細胞培養容器１の画像を取得し、不図示の表示装置に表示する構成としてもよい。
【００２７】
支持台７５は、細胞培養容器１を支持する。支持台７５は不図示の移動機構によりＸＹＺの各方向に移動可能であり、これにより細胞培養容器１を任意の位置に調整することが可能である。支持台７５は、例えば、透明発熱体が形成されたガラスを含んで構成され、細胞培養容器１の底部へレーザー光７を透過させると共に、細胞培養容器１全体の温度を制御する。
なお、細胞培養容器１の大きさ、構造等に応じて、レーザー光７の光路となる部分に開口部が形成されている支持台７５を用いることもできる。
【００２８】
図７は、第３の実施形態の細胞培養容器１のＸＺ平面の断面図を示したものである。
本実施形態の細胞培養基材１４は、ゲル１５の厚さを、例えば０．０５ｍｍ以上、０．０５ｍｍ以上１．７ｍｍ以下、又は０．１ｍｍ以上１．２ｍｍ以下とすることができる。ゲル１５の厚さが薄すぎるとゲル１５を均一または平坦に作成することが難しくなる傾向がある。一方でゲル１５の厚さが厚すぎると、ゲル１５を収縮させるために光を照射する時間が長くなることがある。
ここで、ゲル１５の厚さは、細胞培養基材１４のウェル１１の深さ方向における厚さ、例えばウェル１１の中心軸に沿った厚さとする。
【００２９】
（細胞回収システム）
本実施形態の細胞回収システムの概略図を図８に示す。図８は、第３の実施形態及び第４実施形態の細胞培養容器１を用いた細胞回収システムを示したが、細胞培養容器１は、第１の実施形態及び第２の実施形態の細胞培養容器であってもよい。
本実施形態の細胞回収システムは、本実施形態の細胞培養容器１と前記細胞培養容器１に接続された吸引ポンプ４０と、を備える。前記細胞培養容器１に吸引ポンプ４０を接続することにより、レーザー光７を照射することにより収縮した、選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４を、吸引により回収することができる。
細胞培養容器１と吸引ポンプ４０との接続は、選択細胞３００を吸引できるか、選択細胞３００が付着した、光により収縮した細胞培養基材１４を吸引できれば、いかなる接続方法でもよい。例えば、第３の実施形態に係る細胞培養容器１の上面へ接続して、培養液２０とともに、選択細胞３００を吸引する接続方法や、図６に示したように第４の実施形態に係る細胞培養容器１の貫通孔１２に接続して、貫通孔１２から、選択細胞３００が付着した、光により収縮した細胞培養基材１４を吸引する接続方法等が挙げられる。
【００３０】
図９は、本実施形態の細胞培養容器１を用いた細胞の取得方法および生産方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ２００１において、細胞を含む培養液を細胞培養容器１に流し込む。培養液中の細胞の濃度が高い場合は、細胞を含む培養液を細胞培養容器１に流し込む前に、該培養液を培養液等により希釈してもよい。細胞培養容器１が複数のウェルを有する場合は、細胞培養容器のウェル当たり１個の細胞が配置されるように希釈してもよい。ステップＳ２００１が終了したら、ステップＳ２００３に進む。
【００３１】
ステップＳ２００３において、細胞培養容器に充填した細胞培養基材１４の上面で細胞を培養する。ステップＳ２００３が終了したら、ステップＳ２００５に進む。ステップＳ２００５において、培養液を吸引除去する。培養液の除去後、細胞培養容器１内に充填された細胞培養基材１４の上面を洗浄してもよい。洗浄はＰＢＳ等を用いて行い、不要な浮遊物や沈殿物等が取り除かれる。ステップＳ２００５が終了したら、ステップＳ２００７に進む。
【００３２】
ステップＳ２００７において、細胞培養基材１４の上面で培養された細胞３０の中から、取得する細胞３０（選択細胞３００）を選択する。必要に応じて、蛍光蛋白質が発現している細胞３０や、構造的特徴を持った細胞３０が選択される。ステップＳ２００７が終了したら、ステップＳ２００９に進む。ステップＳ２００９において、支持台７５の温度を適宜調節し、細胞培養容器１を細胞培養基材１４の全体的な変性が起きる温度未満の温度、例えば、３７℃以上４０℃未満に加熱する。細胞培養容器１の加熱は、細胞培養容器１を温度制御可能なインキュベーター内に配置することによって行ってもよい。レーザー光７の照射を行う前に細胞培養容器１の温度を上げることで、レーザー光７の照射時間を短くすることができ、選択細胞３００への細胞傷害性を低減することができる。
なお、ステップＳ２００９とステップＳ２００７は順序を逆にしてもよい。いずれの場合も、ステップ２００９が終了してから次のステップ（ステップＳ２００７又はステップＳ２０１１）に進んでもよく、ステップＳ２００９を継続したまま、次のステップ以降を行ってもよい。
【００３３】
ステップＳ２０１１において、選択細胞３００が付着している細胞培養基材１４中の収束位置に向けて細胞培養容器１の下側からレーザー光７を照射する。細胞培養容器１の下側からレーザー光７を照射することで、選択細胞３００に直接光が当たり細胞傷害を引き起こすことを避けることができる。レーザー光を照射することで、金微粒子層１３における金微粒子の発熱により、選択細胞３００近傍のゲル１５が変性して収縮し、選択細胞３００とゲルとの結合が弱まって選択細胞３００が細胞培養基材１４から剥離するか、細胞培養基材１４が細胞ごとウェル１１の壁面から剥離する。選択細胞３００、又は細胞培養基材１４がウェル１１の壁面から剥離したら、ステップＳ２０１３に進む。
なお、複数の細胞を選択する場合は、ステップＳ２００７で複数の細胞を選択し、ステップＳ２００９で細胞培養容器１を加熱し、ステップＳ２０１１で選択された複数の細胞にレーザー光を照射すればよい。あるいは、まずステップＳ２００９を行って細胞培養容器１を加熱し、加熱を止めて、または加熱を継続したまま、ステップＳ２００７の細胞の選択とステップＳ２０１１のレーザー光の照射を、すべての選択細胞について光が照射されるまで繰り返し行ってもよい。
【００３４】
ステップＳ２０１３において、細胞培養容器１上に培養液や緩衝液等の流体が十分に存在する場合にはそのままで、流体の量が不十分な場合には細胞培養容器１に培養液や緩衝液等の流体を流し入れることにより、選択細胞３００、又は細胞培養容器１のウェル１１の壁面から剥離した細胞培養基材１４が流体中に浮遊する。したがって、細胞培養容器１を傾けるか、吸引するなどして流体を回収することにより、選択細胞３００を回収することができる。選択細胞３００が細胞培養基材１４に付着している場合は、選択細胞３００を細胞培養基材１４ごと回収することができる。
または、細胞培養容器１が複数のウェル１１を有しており、ウェル１１が底に貫通孔１２を有する場合は、ウェル１１の下方の貫通孔１２から、収縮した細胞培養基材１４を、吸引ポンプ等を用いた吸引により回収してもよい。ステップＳ２０１３が終了したら、ステップＳ２０１５に進む。
ステップＳ２０１５において、ステップＳ２０１３で選択細胞３００が回収された場合は、回収した細胞３００をそのまま、他の培地等に配置して培養を行うことができ、ステップＳ２０１３で選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４が回収された場合は、回収した選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４を、コラゲナーゼ等を用いてゲルを溶解させ、細胞培養基材１４に付着した選択細胞３００を細胞培養基材１４から回収し、回収した選択細胞３００を、他の培地等に配置して培養を行うことができる。ステップＳ２０１５が終了したら、処理を終了する。なお、ステップＳ２０１３において、選択細胞３００を回収したら、ステップＳ２００７に戻って他の細胞３０を選択細胞３００として取得してもよい。また、回収した選択細胞は、そのまま臨床、研究、工業用等の様々な用途に使用してもよい。
【００３５】
上述の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）本実施形態の細胞培養容器１は、加熱によって変性するゲル１５で形成されたゲル層と、前記ゲル層の一面に形成された金微粒子層１３と、を含む細胞培養基材１４が充填されている。この細胞培養容器１の前記一面側又は他面側で細胞を培養し、細胞培養基材１４に光を照射することにより、金微粒子をゲル１５に分散させた場合に比較して、高い効率で金微粒子を発熱させることができるので、選択した細胞３００を細胞培養基材１４から効率よく剥離させ、回収することができる。また、特に、ゲル層の下面に金微粒子層が形成されている場合、光照射で金微粒子が熱を発する場所が細胞から遠くなるので、熱による細胞毒性を低減させることができる。
（２）一実施形態の細胞培養容器１において、細胞培養容器１は複数のウェル１１を有している。細胞培養容器１の前記ウェルのそれぞれには、加熱により変性するゲル１５で形成されたゲル層と、前記ゲル層の一面に形成された金微粒子層１３と、を含む細胞培養基材１４が充填されている。この細胞培養容器１の上面で細胞を培養すると、金微粒子をゲル１５に分散させた場合に比較して、極めて短い時間、細胞培養基材１４に光を照射することにより、選択した細胞３００が付着している細胞培養基材１４が収縮し、該細胞培養基材１４をウェル１１から剥離させることができる。光により収縮した、選択した細胞３００が付着した細胞培養基材１４を吸引等により回収することにより、選択した細胞３００を細胞培養基材１４ごと回収することができる。このため、選択した細胞３００に障害を与えることなく、単位時間当たりの細胞回収数を多くすることができる。また、特に、ゲル層の下面に金微粒子層が形成されている場合、光照射で金微粒子が熱を発する場所が細胞から遠くなるので、熱による細胞毒性を低減させることができる。
【００３６】
（３）一実施形態の細胞培養容器１において、細胞培養容器１は複数のウェル１１を有し、ウェル１１は底を有している。これにより、培養液、緩衝液等の流体に、ウェル１１から剥離した細胞培養基材を浮遊させることができるので、細胞３００が付着した細胞培養基材１４を流体ごと回収することができる。
（４）一実施形態の細胞培養容器１において、細胞培養容器１は複数のウェル１１を有し、ウェル１１は細胞培養容器１の底に貫通孔１２を有する。これにより、細胞培養容器の底から貫通孔１２を通じて収縮した、選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４を吸引ポンプ等により回収することができる。
（５）一実施形態の細胞培養容器は、細胞培養容器１は複数のウェル１１を有し、ウェル１１が１ウェル当たり約１個の細胞を配置できる径を有する。これにより、所望の細胞の回収が容易になる。
（６）一実施形態の細胞培養容器において、ゲル１５は、ゼラチンゲルまたはコラーゲンゲルである。これにより、製造、取扱い等が容易となる。
（７）一実施形態の細胞培養容器の製造方法は、加熱によって変性するゲル１５を細胞培養容器１に充填する工程と、前記ゲルの一面に金微粒子層１３を形成する工程と、を含む。細胞培養容器が、複数のウェルを有する場合、金微粒子を分散させた細胞培養基材の各ウェルへの充填は、通常、金微粒子を分散させたゲルを大きめの容器内で作製し、細胞培養容器を、当該ゲルに押し付けることにより行うが、このとき、作製したゲルを全てのウェルに充填するのは困難なため、ウェル外にはみ出した分、ゲルのロスが発生することになる。ゲルには金微粒子が分散されているので、ゲルのロスに伴い、金微粒子もロスが発生する。しかしながら、ゲルを細胞培養容器１に充填し、前記ゲルの一面に金微粒子層を形成することにより、金微粒子を分散させた細胞培養基材を細胞培養容器に充填する場合と比較して、金微粒子を無駄にすることなく、選択細胞３００を回収できる細胞培養容器を得ることができる。
（８）一実施形態の細胞培養容器の製造方法において、細胞培養容器１は複数のウェル１１を有し、ウェル１１のそれぞれに、前記ゲル１５を充填し、ゲル一面に金微粒子層１３を形成する。これにより、金微粒子を無駄にすることなく、選択細胞３００を回収できる細胞培養容器を得ることができる。
（９）一実施形態の細胞培養容器の製造方法は、ウェルを複数有する細胞培養容器１の前記ウェル内に金微粒子層１３を形成する工程と、前記金微粒子層１３の上に、加熱によって変性するゲル層を形成する工程と、を含む。これにより、金微粒子を無駄にすることなく、選択細胞３００を回収できる細胞培養容器を得ることができる。
（１０）一実施形態の細胞回収システムは、細胞培養容器１と細胞培養容器１に接続された吸引ポンプ４０と、を備える。これにより、選択細胞３００、又は選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４を吸引ポンプ４０により吸引することができ、選択細胞３００、又は選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４の回収が容易になる。
（１１）一実施形態の細胞の取得方法は、細胞培養容器１に配置された細胞から、取得する細胞３００を選択する工程と、選択された細胞３００の近傍の細胞培養基材１４に光を照射する工程と、選択された前記細胞を回収する工程と、を含む。これにより、選択細胞３００に障害を与えることなく、選択細胞３００を回収することができる。
（１２）一実施形態の細胞の取得方法は、細胞培養容器１のウェル１１のそれぞれに配置された細胞から、取得する細胞３００を選択する工程と、選択された細胞３００が配置されているウェル１１に充填された細胞培養基材１４に光を照射する工程と、細胞培養基材１４を取り出す工程と、細胞培養基材１４から細胞を回収する工程と、を含む。これにより、選択した細胞３００を、細胞培養基材１４ごと回収することができる。このため、細胞３００に障害を与えることなく、単位時間当たりの細胞回収数を多くすることができる。
（１３）一実施形態の細胞の取得方法において、ウェル１１に充填されている細胞培養基材１４を取り出す工程は、ウェル１１に充填されている細胞培養基材１４を吸引ポンプ等により吸引する工程である。これにより、選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４を、吸引により回収することができ、選択細胞３００に障害を与えることなく回収することができる。
（１４）一実施形態の細胞の取得方法において、細胞培養基材１４を取り出す工程は、細胞培養容器１に培養液や緩衝液等の流体を流し入れる工程である。これにより、選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４を、流体とともに回収することができ、選択細胞３００に障害を与えることなく回収することができる。
（１５）一実施形態の細胞の取得方法において、細胞培養基材１４から選択細胞３００を回収する工程は、コラゲナーゼを細胞培養基材１４に添加する工程である。これにより、細胞培養基材１４から、選択細胞３００に障害を与えることなく、回収することができる。
【００３７】
本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
【実施例】
【００３８】
細胞としてＨｅＬａ細胞を用いて本実施形態の細胞の取得を行った。【００３９】
（試薬調製）
・ＰＢＳ（−）
ＮａＣｌ（４．００３ｇ）、ＫＣｌ（０．１００３ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．１００６ｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４（０．５７５ｇ）をイオン交換水（５００ｍＬ）に溶かした後、オートクレーブで滅菌してＰＢＳ（−）を調製した。
・１０倍無機塩培地
イオン交換水（１０ｍＬ）へＣａＣｌ２無水物（２０．２ｍｇ）、ＭｇＣｌ・６Ｈ２Ｏ（２３．５ｍｇ）、ＫＣｌ（４０．４ｍｇ）、ＮａＣｌ（６３９．７ｍｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（１４．１ｍｇ）を加えて溶解させて１０倍無機塩培地を調製した。
・再構成溶液
ＮａＯＨ（０．０５Ｍ，１０ｍＬ）へＮａＨＣＯ３（２１９．７ｍｇ）、ＨＥＰＥＳ（４７７．１２ｍｇ）を加えて溶解させて再構成溶液を調製した。
・希塩酸
０．０５ＭのＨＣｌ水溶液をｐＨメーター（堀場製作所社製、ｐＨ／ＣＯＮＤＭＥＴＥＲＤ−５４）を用いてｐＨ３．０に調整することで希塩酸（ｐＨ３．０）を作製した。ここで、１０倍無機塩培地、再構成溶液、希塩酸（ｐＨ３．０）はそれぞれフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、孔径０．２０μｍ）を用いてフィルター滅菌した。
・濃縮金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）溶液
２ｍＬ（１ｍＬ×２）の、金ナノ粒子を成長させた溶液であるＧｒｏｗｔｈ溶液［Ｓ.  Ｙａｇｉ,  ｅｔ  ａｌ,  Ｊ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ,  １５９,  Ｈ６６８  （２０１２）参照］を遠心管に入れ２５℃、回転数３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上澄み溶液（０．９ｍＬ×２）を除去し、超純水（０．３ｍＬ×２）を添加して、濃縮ＡｕＮＰ溶液（Ａｕ７５０μＭ）を作製した。【００４０】
（コラーゲン溶液の作製）
クリーンベンチ（昭和科学社製，Ｓ−１００１ＰＲＶ）内で、細胞培養基材［新田ゼラチン社製，Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ（登録商標）Ｉ−Ａ，コラーゲン濃度０．３ｗｔ%，ｐＨ３．０，０．５６ｍＬ］へ希塩酸（０．４２ｍＬ）、１０倍無機塩培地（０．２０ｍＬ）、再構成溶液（０．２０ｍＬ）を氷冷下で、この順番で加えてコラーゲンゲル溶液（２．１ｍＬ）を調製した。【００４１】
（井戸型マイクロアレイ（細胞培養容器）の作製）
１０２０個の底を有するウェルが形成されたアクリル製のマイクロアレイを作製した。ウェルの径と深さは２００μｍ、隣接するウェルの中心間の距離が３３０μｍ、各ウェルの底からマイクロアレイの底までの距離を約８００μｍとした。マイクロアレイをエタノールで置換し、続いて純水で置換した。上記で調製した濃縮金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）溶液を各ウェルの底に配置し、３７℃で一昼夜静置した。さらに、上記で作製したコラーゲン溶液を２００μＬで３回置換し、各ウェルをコラーゲンゲルで満たした。これを、ダイレクトヒートＣＯ２インキュベーター内で３７℃下、３０分間インキュベーションした。【００４２】
（貫通穴型マイクロアレイ（細胞培養容器）の作製）
１０２０個の底に貫通孔を有するウェルが形成されたアクリル製のマイクロアレイを作製した。ウェルと貫通孔の径は等しく２００μｍとし、ウェルの深さは２００μｍ、隣接するウェルの中心間の距離は３３０μｍとした。３５ｍｍ培養皿に上記で作製した包埋コラーゲン溶液を１．８ｍＬ加え、これを、ダイレクトヒートＣＯ２インキュベーター内で３７℃下、３０分間インキュベーションしゲルを作製した。次に、マイクロアレイの底面を上記のゲルに押しつけ、各ウェルをコラーゲンゲルで満たした。その後、コラーゲンゲル上に上記で調製した濃縮金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）溶液を配置し、３７℃で一昼夜静置した。そして、マイクロアレイを反転させ、ゲルが露出している面を細胞培養面とした。【００４３】
（細胞播種および剥離）
作製した細胞培養容器にＤＭＥＭに分散させたＨｅＬａ細胞（６０００個／マイクロアレイ）を流し込み、３７℃で１日間培養した後、培地を吸引除去した。顕微鏡下、アルミシートを載せた３７℃サーモプレート上もしくは細胞培養チャンバー内で、スポット径が最小となるように設定し光照射した。【００４４】
光照射にはＰＡ（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）落射蛍光装置（ニコン社製，ＴＩ−ＰＡＵ）を経由してレーザー光源（シグマ光機社製，波長５３２ｎｍ，出力５０ｍＷ）を組み込み、波長５３２ｎｍの光透過性をもつミラーユニット（ニコン社製，ＴＲＩＴＣ）を設置したものを使用し、細胞は倒立型蛍光顕微鏡（ニコン社製,  ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｔｉ−Ｕ）およびイメージングセンサー制御ソフトウェア（ＷＲＡＹＭＥＲ社製，ＷｒａｙＳｐｅｃｔ）を用いて蛍光/位相差観察および撮像を行った。観察は４倍、１０倍の対物レンズ（ニコン社製，Ｐｌａｎ−Ｆｌｕｏｒ）を用いて行った。【００４５】
（結果）
井戸型マイクロアレイでは、３０秒間の光照射でゲルが変性し、マイクロアレイから剥離した。ゲル内に金ナノ粒子を均一に分散・包埋させた場合は、ゲルの変性に６０秒間要したので（データ示さず）、本発明の細胞培養容器により、照射時間を２分の１に短縮できたことになる。
貫通穴型マイクロアレイでは、ゲル内に金ナノ粒子を均一に分散・包埋させた場合は、８秒間の光照射でゲルが変性したが、熱に弱いＨｅＬａ細胞は１秒間の照射でも殺傷された（データ示さず）。一方、本発明の方法では、２秒間の光照射でゲルを変性させることができ、細胞も生存していた。
【符号の説明】
【００４６】
１…細胞培養容器、７…レーザー光、１０…細胞培養容器本体、１１…ウェル、１２…貫通孔、１３…金微粒子層、１４…細胞培養基材、１５…ゲル、２０…培養液、３０…細胞、４０…吸引ポンプ、７０…顕微鏡、３００…選択細胞、１０００…細胞回収システム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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