(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
無細胞翻訳系においてポリペプチドを取得する方法であって、反応混合物、供給溶液、および高分子量画分の消耗性成分を用意し、少なくとも２つの多孔質バリアを反応器モジュールの内部に設置し、反応混合物を反応器容積部へ導入し、合成を維持する所定の条件でインキュベートし、標的ポリペプチドを反応器容積部から除去することを含んでなり、合成生成物は、低分子量画分と標的ポリペプチドを含む高分子量成分含有画分とに分岐され、標的ポリペプチドを含む高分子量生成物含有画分は、細孔径が最大で100kDの第１多孔質バリアを介して除去され、反応混合物成分と合成生成物を含む低分子量画分は、細孔径が最大で30kDの第２多孔質バリアの少なくとも一部を介して除去され、供給溶液画分および消耗性成分画分の容積と標的ポリペプチドを含む画分の容積との比を選択し、供給溶液画分と消耗性成分画分の供給様式を実行する、前記方法。
【請求項２】
(i)反応器容積部の入口を介して、または(ii)第２バリアの別の部分の細孔を介して、または(iii)前記入口と前記細孔の両方を介して、供給溶液を反応器容積部へ供給する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
消耗性高分子量成分の画分を、(i)合成前に、もしくは(ii)合成時に１回で、もしくは(iii)合成時に繰り返し反応混合物へ添加するか、または(iv)合成時に連続的に供給する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
反応器へ供給する供給溶液の容積と、反応混合物から除去される標的ポリペプチドを含む高分子量成分含有画分の容積との比が、１〜100である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
無細胞翻訳系においてポリペプチドを取得する方法であって、反応混合物、供給溶液画分、および高分子量画分の消耗性成分を用意し、少なくとも２つの多孔質バリアを反応器モジュールの内部に設置し、反応混合物を反応器容積部へ導入し、合成を維持する所定の条件でインキュベートし、標的ポリペプチドを細孔径が最大で100kDの第１多孔質バリアを介して反応器容積部から除去することを含んでなり、第２多孔質バリアの細孔径は最大で30kDであり、合成時にＮサイクルを形成し、サイクルの各々は少なくとも２段階からなり、第１の段階では、供給溶液の低分子量成分を第１多孔質バリアを介して反応器へ供給し、合成生成物と反応混合物成分を含む低分子量画分を第２多孔質バリアを介して除去し、第２の段階では、供給チャネルと除去チャネルを切り替えて供給溶液の低分子量成分を第２多孔質バリアを介して供給し、合成生成物と反応混合物成分を含む低分子量画分または高分子量画分を第１多孔質バリアを介して除去し、供給溶液画分および消耗性高分子量成分画分の供給様式を実行する、前記方法。
【請求項６】
消耗性高分子量成分の画分を、(i)合成前に、もしくは(ii)合成時に１回で、もしくは(iii)合成時に繰り返し反応混合物へ添加するか、または(iv)合成時に連続的に供給する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
別々にもしくは組み合わせて反応器へ供給される、(i)リボソーム画分、(ii)無細胞系抽出物(S30、S100もしくはその改変体)、または(iii)ポリメラーゼ、プラスミドおよびtRNA、から消耗性高分子量成分を選択する、請求項５記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を実行するための装置であって、
液体回路に接続するための入口と出口を有する反応器容積部と、少なくとも２つの多孔質バリアとを含む少なくとも１つの反応器モジュール、ならびに、少なくとも１つのポンプ、液体回路、生成物または供給溶液を蓄積および貯蔵するためのコンパートメントからなる、供給溶液と消耗性高分子量成分のそれぞれの画分を供給するための系を含んでなり、ここで、前記反応器は、少なくとも１つの反応器容積部を含んでなり、その外側表面は第１および第２多孔質バリアの外側表面と接触しており、第２多孔質バリアの内側表面は低分子量流の入口または出口帯域と連絡しており、第１多孔質バリアの内側は低分子量流および標的ポリペプチドを含む高分子量成分含有流の入口および出口帯域と連絡しており、
各反応器モジュールの反応器容積が50μl〜10mlであり、反応器層の厚みが30μm〜5mmであり、
各反応器容積部の形状が、(i)長方形シートもしくは正方形シートもしくは円形シート、または(ii)らせん状もしくは円柱状に折り畳まれたシートのいずれかであり、
第２多孔質バリアと第１多孔質バリアの表面積の比が１〜100であり、
各反応器容積部が、(i)反応混合物、(ii)反応混合物と磁気攪拌子、または(iii)反応混合物と多孔質増量材、または(iv)反応混合物と多孔質顆粒のいずれかを含み、
各増量材が細孔径200μm〜10nmの多孔質材料から製造され、これらの材料が、(i)束またはシートの形状をした繊維状構造物、(ii)多孔質粒子で被覆された繊維状構造物の複合物、(iii)顆粒状の親和性吸着材、または親和性吸着材で被覆された繊維状構造物の複合物、および(iv)無細胞系の成分を固定化した顆粒から選択され、かつ
前記第１および第２多孔質バリアが、平膜もしくは中空繊維から製造されるか、または一方のバリアが膜から製造され、他方のバリアが中空繊維から製造される、ことを特徴とする前記装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は分子生物学およびバイオテクノロジー、すなわち無細胞翻訳系においてポリペプチドを合成する方法および装置に関する。
【０００２】
発明の背景
無細胞翻訳系におけるポリペプチドの合成に関しては、いくつかの方法が知られている。標的ポリペプチドの生産量が低い、無細胞翻訳系での操作時間が短い等の制限を排除するために、現在広く使用されている方法が提案された(Spirinら、1988年)。この方法は、合成時に、反応混合物から反応生成物を連続的に除去し、低分子量成分の初期濃度を連続的に回復させるという原理に基づくものであり、合成生成物の生産量の増加等のいくつかの改善的発明を特徴としたものである (Alakhovら1991年、Baranovら1993年、Alakhovら1995年)。
【０００３】
供給溶液の注入 (input) と合成生成物の除去によって、公知の方法は以下のとおりに分類される。すなわち、(a)供給溶液成分を反応混合物に加え、また透析膜を通して反応混合物から低分子量成分を除去したり、または低分子量成分および高分子量成分を同時に反応混合物から除去するために、透析法を使用する方法、（ｂ）膜を通して生成物の低分子量成分および高分子量成分を同時に除去し、同時に供給溶液を直接、または膜を通して反応混合物容積に供給するために、連続的に限外濾過を使用する方法、（ｃ）反応混合物へ供給溶液を定期的に供給し、それに引き続き低分子量成分および高分子量成分を透析膜を通して除去する方法、である。こうした方法においては、正または負の電圧パルスの連続生成を犠牲にして、液体流の方向を変えることによって、流れの注入および排出 (output) が可能となっている。
【０００４】
反応混合物容積に対して限外濾過用膜の面積を増加させることで、高分子量の生成物の除去に改善を加えたことで知られる方法がある (Mozayeny，1995年)。しかしながらこの発明の主な欠点の１つは、細孔径が70kD〜100kDである面積の広い限外濾過膜を通して高分子量成分を除去する間に、最終生成物中と一緒に分子量が100kDの有用な作用までもが失われてしまうことであった。この欠点は、無細胞系での操作時間を制限する要因であった。膜の面積が大きければ大きいほど、高い流速で反応器から洗い流されてしまう無細胞系の高分子成分量も増える。また、この発明の別の欠点は、反応混合物を膜表面に沿って接線方向に流すために、外部ループを使用する必要があることであった。反応混合物が液体の連絡を介して通過する間に、３つの要素が無細胞系の作用に影響する。すなわち、（１）反応混合物が外部ループを介して通過する際には、供給溶液は反応混合物の外部容積部分には添加されない、（２）無細胞系に阻害される低分子量生成物は、外部容積から除去されない、（３）液体連絡およびポンプが熱に安定ではなく、また環境によって反応混合物がその温度を変える。こうしたことが、結果の再生を不能にし、および無細胞系での寿命を制限した。
【０００５】
反応器へ供給溶液を注入したり、合成された低分子量もしくは高分子量生成物を膜を介して反応器から除去するために、著者らが反復的なパルスを印加した方法が知られている (Fischerら、1990年)。この方法は、膜を介して流れの方向を変えることにより実現されるものである。しかしながらこの発明の主な欠点の１つは、無細胞系の操作を阻害する合成された低分子量成分が、長時間反応器から除去されないことである。供給溶液が膜を反復的に通過する時間は、膜を介して通過する供給溶液の総容積が、反応混合物の完全容積に等しくなる期間に等しい。こうしたことから、正および負の圧力を生成するためにＮサイクルが形成される。圧力変調のために、供給溶液の一定量と共に阻害生成物が反応器に戻ってしまう。また、この方法の別の欠点は、Ｎサイクルを形成する際、長時間の合成に必要な無細胞系の高分子量成分が反応混合物から激しく洗い流されてしまうことである。したがって、無細胞系の操作を阻害する低分子量成分が反応器に繰り返し戻ることと、効果的な合成を提供する高分子量成分を反応器から除去してしまうことが、細胞系の操作に制約を課してしまう。
【０００６】
操作における透析方法により標的生成物を除去することで、ポリペプチドの合成を行なう方法が知られている（Choi、1997年）。この方法では、１つの膜が反応器を２つの部分に分割する。反応混合物は膜の片側に配置され、供給溶液は別の片側に配置される。反応混合物は、膜表面に沿って、速やかに接線方向に循環する。しかしながらこの方法の欠点の１つは、膜の細孔径が大きいために無細胞系の成分が標的生成物と一緒に除去されてしまうことである。さらに、細孔径が大きいことから透析効果はかなり高いと言えるが、それでも、この方法を無細胞系におけるきわめて効果的な操作であると言いきるには、その透析程度はまだ十分とは言えない。
【０００７】
さらに、無細胞系が機能している間、水性バッファーにアミノ酸、ATP、GTPを含んだものを反応器に添加し、また合成時に形成されて無細胞系を阻害するAMP、GDP、Pi等の低分子量成分を、膜を介して除去する方法が知られている (Alakhovら、1991年)。無細胞系のより経済的な操作を提供するために、低分子量生成物が再生され、膜を介して反応器に戻される。しかしながら、合成された低分子量成分および高分子量成分がどのように反応器から除去され、またポリペプチド除去後にバッファー溶液がどのように再生されるのかについては、提示されている説明や図からは明らかでない。実施例についての記載を考慮すると、低分子量成分および高分子量成分は、限外濾過膜を介して反応器から除去されるようである。限外濾過膜の使用については、いくつかの文献に記載されている (Spirinら1988年、Takanoriら1991年、Spirin1992年、Erdmannら1994年)。この方法の欠点は、カットオフサイズの大きい膜を使用することである。この場合、合成に必要な無細胞系の高分子量成分は、標的生成物と共に反応器から除去される。低分子量成分の容積は、除去される成分の容積に等しく、その結果、限外濾過膜の細孔がすぐに閉塞してしまう。
【０００８】
さまざまな種類の膜を有する反応器について反応区域に供給溶液を添加し、また反応区域から反応生成物を除去する方法としては、２つの膜の間に反応区域を配置する方法が知られている (Matsonら1988年、Wrasidloら1990年、Dziewulskiら1992年)。
【０００９】
Alakhovらの特許 (Alakhovら、1995年)に記載されている方法は、本明細書で提案する本発明の方法の原型となるものである。本発明のポリペプチド合成においては、反応混合物は２枚の平形の膜の間に配置される。これらの膜は、低分子量成分流と高分子量成分流とを分別し、また反応器を３つの区域に分けるものである。すなわち、その３つの区域とは、供給溶液を注入する区域、反応区域、そして生成物を除去する区域である。第１のかなり弱い流れは、反応区域で形成される。これは、高分子量成分（合成されたポリペプチドを含む）が除去される際に通過する多孔質バリアの内部に沿った反応混合物の動きを保証するものである。第２の速い流れは、供給溶液の注入区域で形成される。これは、低分子成分が膜を介して反応系に侵入することを保証する。この低分子量成分の速い流れと高分子量成分の遅い流れは、第１多孔質バリアの外部表面に沿って接線方向の流れを作ること、合成区域に供給溶液を添加するための透析過程とによって得ることができる。高分子量成分が反応器から除去される場合には、膜のカットオフの大きさは、50〜100kDから選択される（実施例７で確証される）。
【００１０】
透析過程によっておおむね決定される、供給溶液成分が反応器に侵入する速度は、無細胞系における長期間のきわめて効果的な操作を維持するには不十分である。
【００１１】
科学的研究や、予備量のポリペプチドの合成に使用する装置に必要な要件は、それぞれに異なっている。100〜200μｇの少量のポリペプチドを合成する際には、高価な設備を使用することなく20〜50時間の合成を確実に行ない、さらに流れの速度調節を手動で行なうか、または自動で行なうかが選択可能な、簡便かつ安価な反応器を利用する必要がある。
【００１２】
予備量のポリペプチドを合成する間、装置はその過程を制御しなければならない。すなわち、反応器内部の流れの速度を操作したり、活性混合(active mixing)または膜もしくは中空繊維の閉塞を防止するその他の動作を犠牲にして、操作時間を延長したり（50時間を超える）、反応混合物に対して供給溶液および消耗性高分子量成分を効果的に添加したり、反応器から合成を阻害する低分子量成分を効果的に除去しなければならない。
【００１３】
ペプチドを持続的に合成する様式で操作し、コンピューターによって制御される装置が知られている（Mozayeny、1995年）。こうしたシステムの中には、複雑かつ高価な設備が含まれる（自動試料採取装置等）。1.0ml（Spirinら、1988年）〜100.0ml（Spirin、1992年）の反応器を伴った装置が知られている。全反応器容積を、より小さい容積を有するいくつかの反応器に割り当てるという原理を利用して、実験室条件下でポリペプチドを合成するように意図された装置と予備合成 (preparative synthesis)を行なう装置に、同一の技術を適用することが可能である。こうした場合、50μl〜1-5mlの容量の少ない反応混合物における通常のポリペプチド合成技術を、操作中のモジュールの量を測定し増加させることによって、最大100-200mlの容量での作業に同時に利用することができる。
【００１４】
モジュールの測定原理を利用して、セル内における合成を維持する装置が知られている (Puchingerら1980年、Gebhardら1997年、Huら1997年)。こうした装置においては、供給溶液を供給する入り口と生成物を除去する出口は、すべてのＮ反応器に平行して接続されている。これらの公知の装置は、各Ｎ反応モジュールは速度、圧力、ならびにその他の供給溶液流のパラメーターおよびセルの通常機能に必要なガス等を維持するために利用されるため、セル培養を維持するように設計されており、こうした装置をポリペプチドの合成に適用することはできない。
【００１５】
中空繊維に基づくバイオリアクターの既知のモジュールは (Gebhardら1997年、Huら1997年)、無細胞系での作業の特異性を考慮に入れたものではない。この反応器で使用される繊維のカットオフサイズは同一であり、形状としてはシリンダー内にビームが配置されている。そのため、中空繊維の表面の大部分が互いに接触しあい、作業面積を減少させている。
【００１６】
２層の中空繊維から構成されている 装置が知られている(Yagihashiら、1996年)。各層は、並列に配置され固着された中空繊維からなる。中空繊維の両層は同じサイズのカットオフを有し、中空繊維の表面の大部分は接触しあっている。
【００１７】
それぞれのモジュールが、同じサイズのカットオフを有する中空繊維からなる単１層で構成されている装置が知られている（Pedersenら、1994年）。もっともこの技術は、液体濾過用に開発されたものであり、大量の液体流を伴う作業を意図して設計されたものであるため、その設計に本質的な修正を加えない限りは、無細胞系の反応器において利用することは不可能である。
【００１８】
平膜の利用に関連して考案された数多くのデザインが知られている。こうしたデザインもまた、主に濾過や透析を意図して設計されたものであるため、欠点を有している。
【００１９】
無細胞系におけるポリペプチドの合成装置としては、２つの平膜を含む構造を持つ装置が知られている (Mozayeny, 1995)。元来、この装置 (OMEGATM)は、濾過用に作製されたものであり、生成物の選択区域に大量の空隙容積を有している。供給溶液と高分子量成分は１つの入り口から反応器に添加される。この装置は、Ｎモジュールからなる一般的な構築物の集合体を意図して作製されたものではない。
【００２０】
本発明が提案するポリペプチド合成装置の原型となったものは、Alakhovらの特許（Alakhovら、1995年）に記載された装置である。生成物除去による方法でポリペプチドを合成するこの装置は、２つの多孔質バリアを含んでいる。これらのバリアは、平膜または中空繊維として作製することができる。反応混合物は、中空繊維の外側および内側の両方に配置することができる。
【００２１】
この装置の欠点は、カットオフサイズが同一の２つの多孔質バリアを含んでいることと、低分子量画分流（カットオフサイズ：7.5kD）または高分子量画分流（カットオフサイズ：最大100kD）のどちらか一方を反応器から除去するよう定められていることである。
【００２２】
発明の概要
本発明は、無細胞系におけるポリペプチドの合成方法を提供するものである。本方法では、合成生成物を、低分子量画分と標的ポリペプチドを含む高分子量成分含有画分とに分岐し、低分子量画分の主要部分を第２多孔質バリアの少なくとも一部を介して除去し、供給溶液画分および消耗性成分画分の容積と、標的ポリペプチドを含む画分の容積との比を選択し、供給溶液画分と消耗性成分画分の供給様式を実行する。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、無細胞系におけるポリペプチドの合成方法を記載することである。本方法では、反応混合物の低分子量成分や合成生成物の低分子量成分等の除去される成分からなる低分子量画分を、少なくとも１つの第２多孔質バリアのみを介して反応容積(reaction volume)から除去し、供給溶液画分および消耗性成分画分の供給様式を実行する。
【００２４】
従って、本発明の目的は、合成時にＮサイクルを形成するポリペプチドの取得方法を提供することでもある。サイクルの各々は少なくとも２段階からなり、第１の段階では、供給溶液の低分子量成分を第１多孔質バリアを介して反応器へ供給し、合成生成物と反応混合物成分を含む低分子量画分を第２多孔質バリアを介して除去し、第２の段階では、供給チャネルと除去チャネルを切り替えて供給溶液の低分子量成分を第２多孔質バリアを介して供給し、合成生成物と反応混合物成分を含む低分子量画分または高分子量画分を第１多孔質バリアを介して除去し、供給溶液画分および消耗性高分子量成分画分の供給様式を実行する。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、少なくとも１つの反応器容積(reactor volume)を含んでなる反応器を記述することである。反応器容積の外側表面は第１および第２多孔質バリアの外側表面と接触しており、第２多孔質バリアの内側表面は低分子量流の入口または出口帯域と連絡しており、第１多孔質バリアの内側は低分子量流および標的ポリペプチドを含む高分子量成分含有流の入口および出口帯域と連絡している。
【００２６】
省略形に関するリスト
F1は、供給溶液流である。
【００２７】
F10‐F20は、反応混合物の低分子量成分の流れである。
【００２８】
Psは、合成された標的ポリペプチドである。
【００２９】
Pcは、無細胞系における高分子量成分である。
【００３０】
Rmは、反応混合物である。
【００３１】
ポジション100は、反応器の構造上の要素である。
【００３２】
ポジション200は、装置の液体連絡である。
【００３３】
ポジション300は、装置の個々の要素、すなわち、バルブ、ポンプ、溶出物収納区画、および供給溶液貯蔵区画である。
【００３４】
ポジション400は、制御用装置ブロックである。
【００３５】
発明の詳細な説明
通常、本発明の方法は、以下のような全ステップを含んでいる。
【００３６】
１．無細胞の原核または真核溶解物をもとに反応混合物を調製する。
【００３７】
２．供給溶液および消耗性高分子量画分成分を調製する。
【００３８】
３．反応器の操作方法を決定し、所与の種類の多孔質バリアを伴った反応器モジュールの種類を選択し、少なくとも１つの反応器モジュールを含む構造を持つ合成装置を設置する。
【００３９】
４．各反応モジュールに反応混合物を配置する。
【００４０】
５．操作方法に依り、供給溶液流および消耗性高分子量成分流が反応混合物を通って流れる速度、ならびに低分子量生成物および高分子量生成物が除去される速度を決定しセットする。
【００４１】
６．選択した操作方式により合成を実施し、合成の間は連続的もしくは周期的に多孔質バリアを通して高分子量成分を除去し、または反応器容積内に留める。
【００４２】
７．合成の間、合成生成物の収量を分析し、供給溶液および合成生成物の流れる速度を決定するパラメーターを補正し、消耗性高分子量成分を供給するかまたは供給を停止する。
【００４３】
以下の図を参照しながら、実施の具体例により本発明を説明する。
【００４４】
図１(a-e)は、低分子量画分および標的ポリペプチドを含む高分子量成分画分における流れの分岐原理を、異なる操作方法ごとに説明した構成図である。
【００４５】
図1aは、標的ポリペプチドを連続的に除去する方式におけるモジュール内部の流れの分岐を表わす構成図である。この反応モジュールは、その内部に、第１多孔質バリア110および第２多孔質バリア120を使用して３つの区域を形成するケース100を含む。反応混合物Rmは、合成が始まる前に反応区域130に供給される。供給溶液流F1は、入り口151を通過して反応区域130に入り、第１および第２多孔質バリアを通過する反応混合物から、合成された高分子量成分および低分子量成分を取り除く。低分子量画分の主要部分は、カットオフサイズの小さい第２多孔質バリア120を通過し、流れF20を形成して、出口142を通って反応器容積から除去される。同時に、合成された高分子量成分Ps、無細胞系成分Pc、および低分子量成分の一部であるF10が、総合的流れPc+Ps+F10を形成し、カットオフサイズの大きい第１多孔質バリア110を通過し、出口162を通って反応混合物から取り除かれる。反応器に供給される供給溶液の総容積と、総合的流れPc+Ps+F10の容積との比率は、２〜100から選択される。この比率は好ましくは10〜50である。第１多孔質バリア110を通過する流れの速度を落とせば、多孔質バリア110の表面に高分子量成分層が形成されることは少なくなり、従って高分子量成分および低分子量成分によって膜の細孔が閉塞されるプロセスも減少する。反応混合物中の合成ポリペプチドPsの濃度が高くなると、次の洗浄段階が促進される。第１多孔質バリア110のカットオフサイズは、合成されるポリペプチドの分子量およびその立体構造 (spatial organization) に依り選択される。
【００４６】
図1bは、標的ポリペプチドを定期的に除去する方法におけるモジュール内部の低分子量画分および高分子量画分の流れの分岐を表わす構成図である。この反応モジュールは、その内部に、第１多孔質バリア110および第２多孔質バリア120を使用して、３つの区域を形成するケース100を含む。反応混合物Rmは、合成が始まる前に入口151から反応容積130内部に供給される。合成の間、多孔質バリア110および120を通り、Ｎサイクルの流れの注入および除去が行なわれる。各サイクルは、２つの段階からなる。第１段階では、供給溶液流F1が、入口161から、第１バリア110を通って反応容積130内部に浸透する。供給溶液は、流れF20を形成し多孔質バリア120を通って出口142から出て行く反応混合物の低分子量成分および合成された低分子量生成物にとって代わる。第２段階では、多孔質バリア110および120を通り注入および除去される流れの方向が変わる。入り口141および第２バリア120を通って、供給溶液流F2は、区域130内部に浸透する。供給溶液の圧力により形成される、反応混合物の低分子量成分および高分子量成分の流れは、多孔質バリア110および出口162を通過し、流れPc+Ps+F10を形成する。第２段階の終了時に１つのサイクルが終わり、次のサイクルが開始されるか、または合成が完了する。Ｎサイクルの間、反応器に供給される供給溶液の総容積と、総流Pc+Ps+F10の容積との比率は、２〜100から選択される。この比率は好ましくは10〜50である。
【００４７】
流れが第１多孔質バリア110を通過する際の速度を落とせば、多孔質バリア110の表面上に高分子量成分層が形成されることが少なくなり、従って高分子量成分および低分子量成分によって膜の細孔が閉塞されるプロセスも減少する。反応混合物中の合成ポリペプチドPsの濃度が高くなると、次の洗浄段階が促進される。第１多孔質バリア110のカットオフのサイズは、合成されるポリペプチドの分子量およびその立体構造に依り選択される。第１および第２多孔質バリアは、多孔質バリアを通過する流れの方向を変えることにより洗浄される。１サイクルの持続時間、ならびに第１段階および第２段階の持続時間の一時的な比率は、全合成稼動期間を通して一定に保たれているか、または合成の条件によって変わる。合成が活発に行なわれ、反応混合物中のポリペプチド濃度が急速に増大するような場合は、多孔質膜が閉塞されることを防ぐために、各サイクルの持続時間は短縮され、その結果自動的に細孔の洗浄がより頻繁に行なわれることになる。
【００４８】
図1cは、生成物を選択しない操作方式における流れの方向を表わしたスキームである。合成の間、すべての高分子量成分は反応混合物内部にとどまる。供給溶液流F1は、最大細孔径100kDの第１多孔質バリア110を通って入り込む。無細胞系を阻害する低分子量生成物流F10は、第２多孔質バリア120を介して除去される。第１多孔質バリアは、流れF1のアロケーターであり、供給溶液を反応混合物のあらゆる箇所に均一に供給している。
【００４９】
図1dは、少なくとも１つの第１多孔質バリアおよび第２多孔質バリアの２つの部分を有する反応器モジュールに関して生成物を選択しない操作方式における流れの方向を表わしたスキームである。合成の間、供給溶液流F1および／または高分子量の消耗性成分の一部が、最大細孔径100kDの第１多孔質バリア110を通って浸透する。この多孔質バリアは、流れF1のアロケーターであり、供給溶液を反応混合物のあらゆる箇所に均一に供給している。無細胞系を阻害する低分子量生成物流F10は、最大細孔径30kDの第２多孔質バリアの２つの部分121および122を介して除去される。
【００５０】
図1eは、少なくとも１つの第１多孔質バリアおよび第２多孔質バリアの２つの部分を有する反応器モジュールに関して生成物を選択する操作方法における流れの方向を表わした図である。合成の間、標的ポリペプチドを含むすべての高分子量成分は、最大細孔径100kDの第１多孔質バリア110を介して除去される。供給溶液流F1は、最大細孔径30kDの第２多孔質バリアの２つの部分のうちの一方の部分121から入り込む。この多孔質バリアは、流れF1のアロケーターであり、供給溶液を反応混合物のあらゆる箇所に均一に供給している。無細胞系を阻害する低分子量生成物流F10は、最大細孔径30kDの第２多孔質バリアのもう一方の部分122を介して除去される。
【００５１】
本発明で考慮する方法を実現するために、反応器モジュールに関するいくつかの構造物が提供される。本装置は、種々の方式で生成物の合成を行なうことを可能にしている。本モジュールを使用するにあたってはいくつかの条件を考慮に入れておく必要がある。
【００５２】
１．反応器に関しては、少なくとも２つの過程を同時に行なう必要がある。すなわち、(a) 供給溶液の注入と、 (b)合成を阻害する低分子量成分の除去である。
【００５３】
２．供給溶液の注入と生成物中の低分子量成分の除去は、合成が許容可能な度合以下に低下するまで、実施されなければならない。
【００５４】
３．本装置は、多孔質膜または中空繊維の効果的な洗浄を可能としなければならず、さらに、合成された低／高分子量成分／生成物の注入／除去を行なうために、液体連絡中に最低限の空隙容積を含んでいなければならない。
【００５５】
第１条件と第２条件を実現するための反応器モジュールとしては、反応混合液のとにかく薄い層を形成できるものが最も好ましい。第１および第２多孔質バリアが所定の面積であってカットオフが選択したサイズである場合に、最遠隔地点の供給溶液濃度が許容水準にまで下がるまでの間に、かつ合成を阻害する低分子量成分濃度がこの水準を越えない間に、反応器における供給溶液注入の平均速度が反応混合液の供給溶液成分を最遠隔地点にまで確実に注入するものであれば、層の厚さは0.1ｍｍから10ｍｍの間から選択される。
【００５６】
少なくとも一回の注入で供給溶液および／または高分子量成分が直接反応器に移動するモードで作動する装置を使用する場合、反応器内をさらに混合するのが望ましい。回転磁性攪拌バー、または外部閉ループを経た反応混合液の移転、またはその他の方法で混合できる。
【００５７】
反応混合液の薄層を形成する装置には、多孔質バリアの層間に分離器を１つ備えるモジュールが最も好ましい。異なるタイプの分離器が使用可能であり、１つかそれ以上の層、毛管素材、毛管素材の層と多孔性粒子との組み合わせ、有機、合成もしくはセラミック素材由来の１つかそれ以上の薄層シート、金属もしくはその組成物、ならびに層間の多孔性粒子から成る群より選択することができる。また別のタイプの分離器としては、中空ファイバーがあげられる。濾過に広く用いられ、異なるタイプのセルロースまたは合成重合素材からなるフィルター、金属ならびにセラミックも分離器として使用できる。積層毛管素材の役割は、２つの多孔質バリアを分離するのみならず、分子結合がおきる面積を増し、ひいては合成につながる反応速度を増すことである（Albertsら、1986）。
【００５８】
固定化多孔性粒子で積層毛管構造表面上を覆い、使用するのもより良い方策である。繊維の直径は、中空繊維の直径によるが、0.1から0.001である。10ミクロンから0.1ｍｍの多孔性素材粒子を繊維表面に積層する。中空繊維を第１および／または第２多孔質バリアとして使用する場合は、積層素材の繊維は、その繊維間のスペースを占める中空繊維に沿ってか、または中空繊維の中心軸に対する角度が90度を超えない角度（すなわち、中空繊維の層をまたいで）で収容される。多孔性粒子を形成できる素材としては（Choiら、1997）、重合素材（セルロース、ゼラチン、コラーゲン）、金属化合物および無機酸化物（アルミニウム、シリカ、チタン、ジルコニウム、モリブデン、バナジウム、コバルト）ならびに各種の沸石があげられる。多孔性粒子は、多糖類を含む高分子電解質複合体を形成する、陰電荷を帯びた多糖類と陽電荷を帯びたポリマーを基礎として、微粒子としても使用できる（Ovodovら、1995）。こうした複合体は例えば、アルギン酸ナトリウムおよびポリ-L-リシン、アルギン酸ナトリウムおよびキトサン、ペクチンおよびポリイミン、ならびにペクチンおよびキトサンにより形成できる。多孔性粒子を成す素材には、クロマトグラフィーで用いる吸着剤があげられる。アフィニティー吸着剤を使って、反応容量内に多孔性媒質を作製（Sreate）したり、合成後に標的ポリペプチドを反応系から単離したりもできる。合成を阻害する化学的活性や可能性は多孔性素材のいくつかに限定される。
【００５９】
無細胞系を顆粒に固定化する場合（Ovodovら、1995；Alakhovら、1995）、第１多孔質バリアの表面に無細胞系を固定化したミクロ顆粒を何層か積層し、反応器全体を積層のミクロ顆粒で満たすことのできるような反応器モジュールの設計が最も望ましい。この場合、やや薄いミクロ顆粒層を形成するが、これは供給溶液を合成ゾーンに供給し、かつ最適の速度で低分子・高分子量成分を取り除けるように、反応器の高さによって決まる。
【００６０】
図２a-eに、平らな半浸透性膜および中空繊維あるいはその組み合わせを多孔質バリアとして用いる場合の、反応器モジュール中に形成できるいろいろな薄層の例を示す。
【００６１】
図２aは、膜120の平らな表面と第１バリア110の役割を果たす中空繊維の円筒状表面との間に形成され、少なくとも１つの層が並行に並ぶ中空繊維である、反応混合液の薄層を例示する。中空繊維量は、第１および第２バリアのカットオフサイズ、ならびにバリアの面積を決める中空繊維の直径による。第１バリアのカットオフサイズと第２バリアのカットオフサイズの比が、3から10であれば、第１バリア面積は第２バリア面積の0.2から1.0である。
【００６２】
図２ｂは、第１バリア110および第２バリア120として機能する２つの層間に反応層を形成する例を示す。各層内で中空繊維は相互に並行に配置する。別々の層に配置する中空繊維の中心軸は、並行であるか、または70度から110度の角度にある。第１層の中空繊維量  対  第2層の中空繊維量の比は、カットオフサイズ比により、1から0.1の間の値となる。反応器の総容量を複数のモジュールからなる場合にこのようなモジュールの設計が最も好ましい。この場合、モジュールは、第１および第２バリアからの中空繊維層が互い違いになり、低分子量および高分子量成分の流れが反応器の総容量を通じて均一に分配されるように、モジュールを配置する。
【００６３】
その効率が100-200Mg（例えば濃縮反応混合液を用いる場合）の既知の水準よりも2倍から４倍高い、無細胞系でこの合成を行う場合、反応器への供給溶液注入を高め、合成産物が膜孔を塞ぐことによる影響を低減させる必要がある。反応混合液の全容量について供給溶液を確実に均一に分配し、カットオフの閉鎖を低減するには、多孔質バリアを３つ備えるモジュールを用いる。この際、互いに並行な中空繊維の一層を第１多孔質バリアとして使用する。この層は、小さいサイズのカットオフを有する第２多孔質バリアとして機能する多孔質バリア間のモジュールの中間部分に位置する。この例では、第２多孔質バリアの面積は２倍であり、これにより合成を阻害する低分子量産物の除去が促進され、かつ除去される低分子量産物の流れが形成される際の圧力が下がる。
【００６４】
図２ｃは、反応層が二つの平らな膜の間に配置され、この膜の間に中空繊維層を１つ備える、反応器モジュールを例示する。このモジュールの設計は、１つの反応器単位が複数のモジュールから形成される場合により好ましい。この際、低分子量成分を除去するゾーンは互いに結合させ、液体連絡の数および長さは減らす。
【００６５】
図２ｄは、中空繊維が３層を成すモジュールの設計を示す。各層の中空繊維は、互いに並行に配置される。中間層は、その中空繊維の中心軸がその他の層の中心軸に対して70度から110度の角度にあるか、または並行であるように、配置する。好ましくは、垂直な配置の軸を使用する。この際、格子または多孔性積層素材がこの層間に配置されていなければ、中空繊維の第１、第２、および第３層の表面と表面が接触するゾーン面積を減らす。第１および第３層の中空繊維量  対  第二層の中空繊維量の比は、中空繊維のカットオフサイズ比に応じて、1から0.1となる。
【００６６】
上記のような反応器モジュール例では、シート膜や中空繊維１層から成るシートの形状は、方形または円形であり得る。図２e と図２ｆは、反応容量が（i）らせんまたは（ii）円筒の形をとっている円筒形を有する反応器モジュールを示す。
【００６７】
既知の設計との違いは、使用する中空繊維のいろいろなカットオフサイズと直径を備える、２層構造を形成するところにある。図２eは、中空繊維から成る中央の構成要素が、最大100ｋDのカットオフを有する第１多孔質バリアの役割を果たす、モジュールを示す。このモジュールは、第１と第２多孔質バリアが直接接触するのを防ぐため、繊維素材で被覆する。次に第２多孔質バリアの中空繊維を、中央の構成要素の周りに配置する。第２多孔質バリアの中空繊維量およびその表面積は、第１バリアのそれの5倍から10倍程度である。中空繊維のビームは、カバー内に配置する。このカバーは、反応混合液の注入口と排出口を有し、かつその端面がYagihashiらの記載（1996）にあるように接着しており、円筒形カバーの片側からの一方の多孔質バリアの排出口と、その反対側からの他方の多孔質バリアの排出口を形成する。図2ｆは、多孔質または積層素材が２層間に位置する二層設計を示す。第１および第２バリアの役割を果たす、予備的に調製した１層構造のシートは、巻いた状態で反応器への注入口151を備える円筒形カバーの内側に位置する。第１バリアの各中空繊維の内部排出口は、円筒の一部からの共通排出口161で１つになり、第２バリアの各中空繊維の内部排出口は、円筒の反対の部分にある共通排出口で１つになる。
【００６８】
反応モジュールの形態は、以下の条件によって選ばれる。すなわち、反応ゾーンの洗浄、反応混合液の反応ゾーンへの空気ゾーン形成を伴わない、利用可能な注入、供給溶液および合成の低分子量および高分子量成分の注入／除去ゾーン内最小容量の維持である。膜と中空繊維のカットオフを明瞭にする（clearing）ために、モジュールの組立てと分解を単純化することは非常に重要である。（少なくとも１つのモジュールを使用する場合）膜、密閉層、上部および底部カバーをモジュールのフレーム内に格納して、組立て構造を形成する。一方の多孔質バリアをフレームに接着し、他方のバリアを取り外しできるようにすると好ましい。これにより、反応ゾーンへ簡単にアクセスする機会が提供され、また操作中に起こりえる膜または中空繊維の欠陥を決定できる。
【００６９】
好ましくは、多孔質バリアを支持し、層を密閉するといった二つの機能を果たせる成型素材を使用する。こうした素材としては、膜および中空繊維の素材である重合素材によく接着する、シリコン密閉素材もしくはその他の合成素材があげられる。こうした素材の特質により、圧入の労なくして、繰返し型を再生できる。
【００７０】
多孔質バリアは種々の素材で形成できる。しかし、合成の終了後、反応器の分解なしに、またはその分解時および続く組立て時に、孔の再生と精製が可能であるものが最も望ましい。各種の膜や中空繊維のタイプの詳細については、会社の技術カタログに詳細な記載がある（操作ガイド、1997）。
【００７１】
第１多孔質バリア110のカットオフは、30から300ｋDの範囲から選ぶ。分子量が20から40ｋDのほとんどのポリペプチドには、50から100ｋDのカットオフの使用がより望ましい。第２バリア120のカットオフは、合成されるポリペプチドの分子量と低分子量成分の所定の流れがこのバリアを通過する条件によって、1から30ｋDの範囲となる。分子量20から40ｋDのポリペプチドの合成には、カットオフが10から12ｋDであるバリア120の使用が好ましい。
【００７２】
図3-6は、異なる操作モードの装置概要例を示す。ポリペプチドを合成するのに最もシンプルな装置（図３）は、高分子量成分を反応混合液から除去することのないモードを使用する。このモードは、少なくとも１つの反応モジュール100、ポンプ312および供給溶液315の収容部（capacities）、ならびに低分子量成分の廃棄コンパートメント316から成る。反応混合液は注入口151を経て反応器に入る。ポンプ312によって、供給溶液は注入口161と第1バリア110を経て反応混合液に供給される。系の操作を阻害する低分子量成分は、第２多孔質バリア120および排出口142を経て反応器から除去され、廃棄コンパートメント316に至る。
【００７３】
実験者が産物の連続除去モードを選ぶ場合の例では、流れは以下のように分配される。最初の工程で、ポリペプチド合成のための系のインストール（図４）を、反応器100を用いて行う。反応器100は、２つの多孔質バリアを有する少なくとも1つの反応モジュール、ポンプ312および314、供給溶液の貯蔵用収容部315、廃棄画分316、ならびに高分子量（目的のポリペプチドを伴う）分画317から成る。
【００７４】
この装置は以下のように作動する。反応混合液は液体連絡注入口150を経てモジュールの反応ゾーンに入り、収容部315からの供給溶液は、液体連絡210およびポンプ312を通じてこのモジュールの次の注入口151に供給され、反応器全容量に分配されて、合成産物と置き換わる。合成したポリペプチドを含む、合成による高分子量産物は、第1多孔質バリア110を浸透して通過し、所定の速度でポンプ314を経て反応器から除去される。ポンプ312により生じる圧力によって、低分子量成分は第2多孔質バリア120および、直接、廃棄コンパートメント316に接続している排出口142を通じて除去される。第1および第2多孔質バリアのカットオフサイズならびにポンプの速度は合成の条件によって決まる。このモードで用いるモジュールの設計には、２つの平らな膜か（図1a）または2層の中空繊維（図２b,e,f）、またはこの組み合わせ（バリアの一方が膜で、他方が中空繊維からなる組み合わせ（図2a））の形で、少なくとも２つの多孔質バリアの存在を要する。
【００７５】
合成条件に、反応ゾーンの全ての地点について供給溶液を均一に注入することが必要な場合、３つの多孔質バリアから成る反応器モジュールを備える装置を用いる。このような装置の例を図５に示す。反応混合液は注入口151を通じて反応器に入る。供給溶液210の流れは収容部315から液体連絡230、注入口142および多孔質バリア121を経て反応器に入る。多孔質バリアのタイプは、合成条件によって決まる。第1バリア110が中空繊維からできており、２つの第2バリア121と122が平らな膜または中空繊維から形成されていると、より好都合である。多孔質バリア122の第2の部分内の負の圧力により、供給溶液は多孔質バリア121を通して、反応混合液の薄層上にある反応器内へ浸透する。この負の圧力は、ポンプ312により生じる。ポンプ312を経る注入は、第2多孔質バリア122の内部表面と接続している排出口143へつながる。ポンプ312の排出口は、低分子量成分用の廃棄コンパートメント316につながる。生成物の高分子量成分は反応混合液の薄層全体にわたって一定の間隔をおいて配置される中空繊維からできている第1バリア110を通して除去される。中空繊維の内部部分は、共通排出口161内に組み込まれている。共通排出口161は、ポンプ314の注入口につながる。ポンプ314の排出口は、高分子量成分用コレクター317に接続されている。
【００７６】
予備的合成の実施が必要で、反応混合容量が1ｍｌから500ｍｌまでである場合、N  反応モジュールを並行に接続する形が用いられる。Nモジュールを並行に接続する装置の概要図を、図６に示す。この例は、標的生成物の高分子量成分を各サイクル終了後に定期的に取り除くと同時に、第1および第2多孔質バリアの孔を自動的に洗浄する場合の生成物の定期的除去に基づく。反応器100は、注入口151を通して反応混合液で満たす。初期条件においては、バルブV3とV4は開いているが、バルブV1とV２は閉じている。サイクルの第1段階で、供給溶液は収容部315から、ポンプ312とバルブV3を経て、同時に全てのN注入口161に移動する。次いで供給溶液は、中空繊維の内部開口を通過するかまたは第１多孔質バリア110が形成される膜の内部表面を通過する。供給溶液は第１多孔質バリア110の孔から簡単に浸透し、反応系の容量を満たす。合成の低分子量成分は、小さなカットオフの第２多孔質バリア120を通過し、N排出口142および低分子量成分用の廃棄コンパートメント316中の開いたバルブV4を通して除去される。１つのサイクルの第1段階が終わり、第2段階が始まると、バルブV3とV4が閉じ、バルブV1とV2が開く。ポンプ313が、バルブV2につながるチャネル内に負の圧力を生成する。負の圧力下においては、標的ポリペプチドを含む合成の高分子量成分は、第１バリア110を通じて反応器を去り、排出口161、バルブV2およびポンプ313を経て画分コレクタ317に向かう。同時に、ポンプ313により生じた負の圧力の作用により、収容部315、注入口141および第２バリア120から、供給溶液が反応器に向かう。このサイクルの第２段階において、第２多孔質バリア120を経る供給溶液の流れは、サイクルの第1段階で形成される低分子量成分とは異なる方向へ向かう。従って、サイクルの第1段階で閉じているであろう第２バリア120の孔は、サイクルの第２段階では、開いており、第２バリア120の水力抵抗が取り戻される。サイクルの第２段階終了後、その第１段階が形成される。第１多孔質バリア110を経る高分子量成分の流れは止められる。サイクルの第1段階で、第１多孔質バリアを経る流れはその方向を変え、サイクルの第２段階では高分子量成分によって閉じているであろう第１バリア110の孔が開き、第１バリア110の水力抵抗が取り戻される。サイクルは第２段階の終了と共に終了し、制御装置でバルブの切換えを監視してこのサイクルの最初の段階の形成にを促進する。反応器に入った供給溶液の容量と反応器から除去された高分子量成分の画分容量との割合は、サイクルの第１と第２段階の時間の一時的な割合を変え、またその全持続期間を変えることで変化する。
【００７７】
溶解産物の濃度を上げると合成されるポリペプチド量を増やせることは知られている（Kimら、1996）。引用文献に記載のデータは、無細胞系を阻害する産物を反応混合液から除去しない、バッチタイプの反応に関する。バッチタイプの反応は合成産物の収量を減らす。産物の低分子量成分を反応器から除去し、合成の間にその活性を失う高分子量成分を供給すれば、ポリペプチドの収量を上げることができる。産物の低分子量ならびに高分子量成分を反応器から除去する際に、供給溶液のみならず、リボソーム画分、抽出物（S30、S100およびその他）、ポリメラーゼ（T7、T5、SP6およびその他）、プラスミド、ｔRNA、酵素またはその組み合わせのような溶解産物成分を反応器に加えることが可能であることは実験により明らかにされている。
【００７８】
提示された反応器モジュールの構築により、以下に記載の方法で、供給溶液と溶解産物成分を反応器に加えることが可能になる。（a）供給溶液の全容量を反応器注入口を経由して供給する（b）供給溶液の全容量を第１バリアを経由して供給する。（c）  供給溶液の一部を、第１バリアを経由して供給し、残りの部分を、反応器注入口を経由して供給する。（d）供給溶液の一部を、サイクルの第一段階の間に、第１バリアを経由して供給し、残りの部分をサイクルの第２段階の間に、第２バリアを経由して供給する。（e）  溶解産物成分の全容量を、供給溶液の全容量またはその一部と一緒に反応器注入口を経由して供給する。（f）最大の溶解産物成分（リボソームおよびその他）および供給溶液の一部を反応ゾーンの注入口を経由して供給する一方、小さな溶解産物成分および供給溶液の一部は少なくとも１つのバリアの孔を経て反応ゾーン中に供給する。例として図５に、ポンプ314が収容部318からの溶解産物の高分子量成分をコントローラでモニターしながら供給できる場合の例を示す。
【００７９】
反応器モジュールは、20℃から40℃に調整する（通常の温度範囲は25℃から37℃）。供給溶液温度は+2℃から+７℃が望ましい。ポンプは手動操作するかあるいはコントローラブロック400により監視する。このブロックは操作モードのプログラミングを提供する。Roche  Diagnostic  Boehringer  Mannheimが開発したコンピュータに基づく自動化システムは優れた収率を示した（Simonenko、1998）。コントローラブロックにより、サイクルの持続期間ならびにサイクル中の２つの段階の比率を調整できる。
【００８０】
例えば圧力ゲージの取付け時、カットオフの閉鎖レベルによる液体回路内圧力変化を追跡し、またやがては工程条件を変化させることが可能である。
【００８１】
ここで提案するフロー分岐方法により、数十時間の間、高速で、機能的に活性な生成物を伴う、無細胞原核および真核生物抽出物中でのポリペプチド合成が提供される。例として、繊維性GFPの合成をあげる。この合成は、図4にそのブロックダイヤグラムを示した装置の助けを借りて行う。50ｋDから10ｋDのカットオフを有する限外濾過膜を反応器モジュール内の第１および第２多孔質バリアとして用いた。反応ゾーンの容量は400μlであった。
【００８２】
この例においては、転写／翻訳の結合系におけるポリペプチドの予備的合成方法を用いた（Baranovら、1989）。無細胞系の効率予測はもっぱら合成されたポリペプチドに含まれる放射性アミノ酸の量を測定して行われる（Alakhovら、1991）。また別な方法では、蛍光性（Kolbら、1996、Crameriら、1996）のようなポリペプチドの特定の性質を利用する。
【００８３】
大腸菌からの抽出物S30は、下記に述べる改変した方法（Zubay、1973）により調製される。
【００８４】
大腸菌細胞A19を波長582nmにおける培養物の光学密度が0．8になるまでまで増殖させる。培養細胞は遠心分離により回収する。得られたバイオマスを、緩衝液A（10ｍM  Tris-AcpH8.2、14ｍMのMg(OAc)2、60ｍM  KCｌ、1ｍMジチオスレイトール）に再懸濁し、  10,000ｇで30分間遠心分離することによって２回洗浄する。洗浄したバイオマスは緩衝液容量4  対  細胞容量1の比率で、緩衝液Aに再懸濁する。得られた懸濁液は、1600バールの圧力落下で、フレンチプレスにより破壊する。破壊は+4℃で行う。市販のプロテアーゼ阻害剤を、製造業者が推奨する濃度で、得られた細胞抽出物に添加し、混合物を30,000ｇで３０分間遠心分離する。攪拌せずに、上清容量の３分の２を回収する。回収した容量分を再び30,000ｇで30分間遠心分離する。攪拌せずに、上清容量の3分の２を回収する。手順は全て+4℃で行う。緩衝液Bは、750ｍM  Tris-Ac  pH8.2、21ｍM  Mg（OAｃ）2、7.5ｍMジチオスレイトール、6ｍM  ATP、500ｍMのアセチルリン酸、および20アミノ酸各500μMを含む。取得した溶液は、37℃で80分間インキュベートする。インキュベーション終了後、抽出液を緩衝液C（10ｍM  Tris-Ac  pH8.2、14ｍM  Mg(OAc)2、60ｍM  KOAｃ、0.5ｍMジチオスレイトール）に対して16時間、透析する。透析は、500倍量の緩衝液Cを２回取り替えて、+４℃で行う。透析後、得られた容量を10,000ｇで３０分間遠心分離にかけ、アリコートに選別し、液体窒素で凍結させ、-70℃で貯蔵する。
【００８５】
転写／翻訳の結合系は以下のように調製する。
【００８６】
反応混合液1ｍｌは、大腸菌からの抽出物S30を200から400μｌ、大腸菌からの全ｔRNAを0.1から0.5ｍｇ、プラスミド超らせんDNAを0.01から0.03、バクテリオファージT7のポリメラーゼ由来のDNA依存性RNAを2000から3000U、ヒト胎盤のリボヌクレアーゼ阻害剤を10から50Uを、緩衝液D（50-100ｍM HEPES-KOH、または50-100ｍM Tris-Ac、または50-100ｍM TES-KOH、または50-100ｍM  MOPS-KOH、または50-100ｍM  BES−KOH、ｐH7.0-7.6）中に含む。この反応混合液に、10-20ｍM  Mｇ（OAｃ）2またはMgCl2、120-230ｍM  KOAｃまたはL-グルタミン酸カリウム、1.0-2.0ｍM  ATP、1.0-2.0ｍM  GTP、0.8-1.5ｍM  CTP、0.8-1.5ｍM  UTP、25-40ｍM  アセチルリン酸、40μｇ/ｍlロイコボリン、1ｍM  ジチオスレイトール、4％グリセロール、0.02％  NaN3および、19個のアミノ酸（一定の容量のアリコートにて対照合成を行う1つを除く）各150-250μMを含む、低分子量化合物を添加する。
【００８７】
調製した転写／翻訳系は、異なる２つの容量に分ける。より少ない容量（30-50μl）はマイクロチューブに入れ、放射性標識を含むアミノ酸をこれに加える。次いで5-10μlのアリコートをマイクロチューブから取り出し、一定の容量中の合成動態を評価する。合成したポリペプチド量は、トリクロロ酢酸を含むグラス繊維性フィルター上のアリコートの放射性同位体で照射した粒子を用いた沈降を液体シンチレータで計数し、測定する。次に150-250μMの濃度の欠けているアミノ酸を残りの容量に加え、注意深くわずかに攪拌後、反応セル中に入れる。合成は、反応混合液を通して反応器モジュールへ供給溶液を通過させながら、26℃から37℃で行う。
【００８８】
供給溶液は、以下のように調製する。
【００８９】
供給溶液1ｍｌは、下記の低分子量物質を含む。すなわち、緩衝液D中に、10-20ｍM  Mｇ（OAｃ）2またはMgCl2、120-230ｍM  KOAｃまたはL-グルタミン酸カリウム、1.0-2.0ｍM  ATP、1.0-2.0ｍM  GTP、0.8-1.5ｍM  CTP、0.8-1.5ｍM  UTP、25-40ｍM  アセチルリン酸、40μｇ/ｍlロイコボリン、1ｍM  ジチオスレイトール、4％グリセロール、0.02％  NaN3および、20個のアミノ酸各150-250μM。緩衝液Dは、50-100ｍM  HEPES−KOH、または50-100ｍM  TES-KOH、または50-100ｍM  MOPS-KOH、または50-100ｍM  BES-KOH、pH7.0-7.6を含む。この溶液に、10ｍM  Tris-Ac  pH8.2、14ｍM  Mg(OAc)2、60ｍM  KOAｃ、0.5ｍMジチオスレイトールを含む、緩衝液C  200-400μlを添加する。
【００９０】
実施例１
分岐流を備えた大腸菌由来の連続無細胞系における、腔腸動物細菌であるAequoria victoriaのグリーン蛍光タンパク質(GFP)のGFP遺伝子含有DNA鋳型からの結合(coupled)転写／翻訳
GFPの突然変異遺伝子、リボソーム結合部位のヌクレオチド配列、およびバクテリオファージT7のDNA依存性RNAポリメラーゼに対するプロモーターのヌクレオチド配列を含むプラスミドDNAを鋳型として使用する。
【００９１】
結合転写／翻訳系を以下のように調製する。
【００９２】
１mlの反応混合物には、大腸菌由来のS30抽出物200〜400μl、全大腸菌tRNA調製物0.1〜0.5ml、プラスミド超ヘリックスDNA 0.01〜0.03mg、バクテリオファージT7のDNA依存性RNAポリメラーゼ2000〜3000Ｕ、バッファーＥ(100mM HEPES-KOH, pH7.6)中のヒト胎盤由来のリボヌクレアーゼインヒビター10〜50Ｕが含まれる。この反応混合物へ、12mM Mg(OAc)2、220mM KOAc、1.2mM ATP、1.0mM GTP、0.8mM CTP、0.8mMUTP、30mMアセチルリン酸、40μg/mlのロイコボリン、１mジチオトレイトール、４％グリセロール、0.02％NaN3、およびロイシンを除く19種類のアミノ酸各160μMを含む低分子量物質を添加する。
【００９３】
調製した転写／翻訳系を不等量に二分する。少ない方の容積(30〜50μl)をマイクロチューブへ入れ、ここへ比放射活性38mCu/mmolを有する100μM濃度の[14C]-L-ロイシンを添加する。次いで５〜10μlのアリコートをマイクロチューブから選択し、一定容積で合成の速度論を推定する。合成ポリペプチドの量は、アリコートをトリクロロ酢酸によってガラス繊維フィルター上へ沈澱させ、液体シンチレーションカウンターで照射粒子を推定することで測定する。ロイシンを160μMの濃度で残りの容積へ添加し、軽くかつ慎重に混合した後調製物を反応セルへ入れる。
【００９４】
合成は26℃にて反応セル内で行う。供給溶液は、反応セルへ１時間当たり反応セルの内容積の1.5〜２倍に等しい速度で供給する。生成物は、１時間当たり反応セルの内容積の1/20〜1/8倍に等しい速度で取り出す。合成の全期間にわたって、カットオフが50kDの膜を介して取り出した生成物の特定の蛍光を記録する。収集容積全ての蛍光によって系の効率を推定する。合成時に回収した画分中に含まれるGFP量を表すヒストグラムを図７に示す。画分中に含まれるGFP量は、精製GPF調製物の特定蛍光の測定値データをその濃度に対してプロットした検量線によって推定する。図８には、一定容積でインキュベートした対照アリコートにおける合成GFPの濃度変化の合成時間依存性を表す図を示す。濃度は、放射性アミノ酸のポリペプチドへの取込みによって測定する。さらに、収集した容積全てをポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、蛍光を記録することによって新たに合成された生成物を管理する。合成時に回収した画分から選択したアリコートを用いたゲル電気泳動の写真を図９に示す。精製GFP調製物を対照として使用する。重層するタンパク質の量は0.3mgとする。
【００９５】
結合転写／翻訳系１ml当たり、機能的に活性な生成物150〜200μgが48時間で得られる。
【００９６】
実施例２
単一流を備えた大腸菌由来の連続無細胞系における、腔腸動物細菌であるAequoria victoriaのグリーン蛍光タンパク質(GFP)のGFP遺伝子含有DNA鋳型からの結合転写／翻訳
DNAを取得し、実施例１に記載したように結合転写／翻訳系を用意する。合成は、図３にブロック線図を示した装置を使用して行う。直径１mmかつカットオフサイズが100kDの中空繊維を、反応器モジュールの第１多孔質バリアとして使用した。カットオフサイズが10kDかつ表面積が４cm2の限外濾過膜を、第２多孔質バリアとして使用した。反応器容積は400μlとした。
【００９７】
供給溶液流を、反応セルへ１時間当たり反応セルの内容積の1.5〜２倍に等しい速度で供給する。生成物は取り出さない。
【００９８】
合成終了時に反応セルから取り出した溶液の蛍光から系の効率を推定し、次いで合成されたポリペプチドの量を測定する。次いで、一定容積における対照合成の効率と比較する。図10には、一定容積でインキュベートした対照アリコートにおける合成GFPの濃度変化の合成時間依存性を表す図を示す。濃度は、放射性アミノ酸のポリペプチドへの取込みによって測定する。さらに、回収した容積全てをポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、蛍光を記録することによって新たに合成された生成物を管理する。一定容積の結合転写／翻訳系から、合成の終了後に反応セルから選択したアリコートを用いたゲル電気泳動の写真を図11に示す。精製GFP調製物を対照として使用する。重層するタンパク質の量は0.3mgとする。
【００９９】
合成中、結合転写／翻訳系１ml当たり、機能的に活性な生成物60μgが24時間で得られる。
【０１００】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】  a〜cは、流れの分布原理を異なる操作方式ごとに示すスキームである。
【図２】  a〜fは、公表されている原理に基づくモジュールの構成図である。
【図３】  標的ポリペプチドを除去しない方式でポリペプチドを合成する装置の構成図である。
【図４】  標的ポリペプチドを除去する方法でポリペプチドを合成する装置の構成図である。
【図５】  モジュール中の３つの多孔質バリアで標的ポリペプチドを除去する方式でポリペプチドを合成する装置の構成図である。
【図６】  標的ポリペプチドを定期的に除去する方式でポリペプチドを合成する装置の構成図である。
【図７】  実施例１の記載に従って画分中のGFP量を反映させた柱状図である。
【図８】  実施例１のデータに従った、対照アリコートにおける合成の指標時間と合成GFPの濃度の変化との保存的関係を示す。
【図９】  実施例１のデータに基づくSDS電気泳動の写真である。
【図１０】  実施例２のデータに従った、対照アリコートにおける合成の指標時間と合成GFPの濃度の変化との保存的関係を示す。
【図１１】  実施例２のデータに基づくSDS電気泳動の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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