(57)【要約】  キャピラリー電気泳動時に、不純物などによるスパイク状のノイズや、標識蛍光体の波長スペクトルとは異なるスペクトルを有するノイズピークが検出されてしまう現象がある。そこで、本開示は、不純物によるノイズ蛍光ピークに影響されずに標識蛍光体自体の強度を特定する技術を提供する。本開示では、ノイズピークに共通する蛍光強度特性（ノイズの蛍光プロファイル）を設定し、ノイズピークを、標識蛍光体とは異なる蛍光体として扱い、標識蛍光体＋ノイズ蛍光体で色変換することで、蛍光体とノイズを分離する（図５参照）。
2020026418.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体ポリマーを試料とし、標識物として複数種の蛍光体を使用し、それぞれの蛍光強度を検出することにより、前記生体ポリマーを分析する生体ポリマー分析方法であって、
前記試料に使用しているＱ種（Ｑは１以上の整数）の標識蛍光体のプロファイルを設定することと、
前記標識蛍光体とは異なるＲ種（Ｒは１以上の整数）の蛍光体である非標識蛍光体のプロファイルを設定することと、
所定の測定方式を用いて、前記試料からの蛍光強度を検出することと、
前記蛍光強度と、前記Ｑ種の標識蛍光体のプロファイルと、前記Ｒ種の非標識蛍光体のプロファイルとを用いて、Ｑ＋Ｒ種の蛍光体を識別することと、
を含む生体ポリマー分析方法。
【請求項２】
請求項１において、
さらに、前記識別されたＱ種の蛍光体のデータから前記生体ポリマーを解析することを含む生体ポリマー分析方法。
【請求項３】
請求項１において、
前記試料からの蛍光強度を検出することにおいて、所定幅の検出波長域を設定し、当該検出波長域をＰ（Ｐは正の整数）個の波長帯に分割して検出する、生体ポリマー分析方法。
【請求項４】
請求項３において、
分割された波長帯ごとの検出強度をｓ（ｐ，ｔ）、前記Ｑ種の標識蛍光体のプロファイルをｘ（ｑ，ｐ）、前記Ｒ種の非標識蛍光体のプロファイルをｙ（ｒ，ｐ）、測定時の背景強度をｂ（ｐ，ｔ）、標識蛍光体からの蛍光強度をｆ（ｑ，ｔ）、非標識蛍光体からの蛍光強度をｎ（ｒ，ｔ）とした場合に、以下の式から、前記Ｑ＋Ｒ種の蛍光体を識別する、生体ポリマー分析方法。
2020026418.tif 000007
または、
2020026418.tif 000008
ここで、ｔは時間、
ｐは分割波長帯の番号（ｐ＝０，１，・・・，Ｐ−１）、
ｑは標識蛍光体種の番号（ｑ＝０，１，・・・，Ｑ−１）、
ｒは非標識蛍光体の番号（ｒ＝０，１，・・・，Ｒ−１）
【請求項５】
請求項４において、
前記式によりｆ（ｑ，ｔ）を算定し、前記Ｑ種の蛍光体を識別する、生体ポリマー分析方法。
【請求項６】
請求項４において、
前記式によりｎ（ｒ，ｔ）を算定し、前記ｓ（ｐ，ｔ）から前記ｎ（ｒ，ｔ）に起因する信号強度を減算することにより、前記非標識蛍光体が除去された分割された波長帯ごとの検出強度を算定し、Ｑ種の蛍光体を識別する、生体ポリマー分析方法。
【請求項７】
請求項１において、
前記試料をキャピラリー内で泳動させること、あるいは前記試料を逐次反応させることを含む、生体ポリマー分析方法。
【請求項８】
請求項１において、
さらに、前記Ｒ種の非標識蛍光体の出現頻度、および当該非標識蛍光体の強度の少なくとも一方が予め設定された閾値以上か否か判断することにより、前記所定の測定方式による測定結果の信頼度を評価することを含む生体ポリマー分析方法。
【請求項９】
生体ポリマーを試料とし、標識物として複数種の蛍光体を使用し、それぞれの蛍光強度を検出することにより、前記生体ポリマーを分析する生体ポリマー分析装置であって、
所定の測定方式を用いて、前記試料からの蛍光強度を検出する測定部と、
前記試料に使用しているＱ種（Ｑは１以上の整数）の標識蛍光体のプロファイルと、前記標識蛍光体とは異なるＲ種（Ｒは１以上の整数）の蛍光体である非標識蛍光体のプロファイルとを格納するメモリと、
前記メモリから前記Ｑ種の標識蛍光体のプロファイルと前記Ｒ種の非標識蛍光体のプロファイルとを読み込み、前記検出強度と、前記Ｑ種の標識蛍光体のプロファイルと、前記Ｒ種の非標識蛍光体のプロファイルとを用いて、Ｑ＋Ｒ種の蛍光体を識別するデータ処理部と、
を備える生体ポリマー分析装置。
【請求項１０】
請求項９において、
前記データ処理部は、さらに、前記識別されたＱ種の蛍光体のデータから前記生体ポリマーを解析する、生体ポリマー分析装置。
【請求項１１】
請求項９において、
前記測定部は、予め設定された所定幅の検出波長域をＰ（Ｐは正の整数）個の波長帯に分割して検出する、生体ポリマー分析装置。
【請求項１２】
請求項１１において、
分割された波長帯ごとの検出強度をｓ（ｐ，ｔ）、前記Ｑ種の標識蛍光体のプロファイルをｘ（ｑ，ｐ）、前記Ｒ種の非標識蛍光体のプロファイルをｙ（ｒ，ｐ）、測定時の背景強度をｂ（ｐ，ｔ）、標識蛍光体からの蛍光強度をｆ（ｑ，ｔ）、非標識蛍光体からの蛍光強度をｎ（ｒ，ｔ）とした場合に、前記データ処理部は、以下の式から、前記Ｑ＋Ｒ種の蛍光体を識別する、生体ポリマー分析装置。
2020026418.tif 000009
または、
2020026418.tif 000010
ここで、ｔは時間、
ｐは分割波長帯の番号（ｐ＝０，１，・・・，Ｐ−１）、
ｑは標識蛍光体種の番号（ｑ＝０，１，・・・，Ｑ−１）、
ｒは非標識蛍光体の番号（ｒ＝０，１，・・・，Ｒ−１）
【請求項１３】
請求項１２において、
前記データ処理部は、前記式からｆ（ｑ，ｔ）を演算し、前記Ｑ種の蛍光体を識別する、生体ポリマー分析装置。
【請求項１４】
請求項１２において、
前記データ処理部は、前記式からｎ（ｒ，ｔ）を算定し、前記ｓ（ｐ，ｔ）から前記ｎ（ｒ，ｔ）に起因する信号強度を減算することにより、前記非標識蛍光体が除去された分割された波長帯ごとの検出強度を算定し、該強度を表示させる機能を有する、生体ポリマー分析装置。
【請求項１５】
請求項９において、
前記データ処理部は、さらに、前記Ｒ種の非標識蛍光体の出現頻度、および当該非標識蛍光体の強度の少なくとも一方が予め設定された閾値以上か否か判断することにより、前記所定の測定方式による測定結果の信頼度を評価する機能を有する、生体ポリマー分析装置。
【請求項１６】
請求項９において、
試料を泳動させる電気泳動機構部、または、逐次反応させる逐次反応機構部をさらに有する、生体ポリマー分析装置。
【請求項１７】
生体ポリマー試料が、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチドであり、前記試料を、塩基種または解析フラグメントごとに異なる蛍光体で標識し、試料からの蛍光を検出することで、その塩基配列・フラグメント種を解析する生体ポリマー分析方法において、
試料に使用しているＱ種の標識蛍光体の蛍光プロファイルと、前記標識蛍光体とは異なる蛍光プロファイルを有するＲ種（Ｒは１以上）の蛍光プロファイルを設定し、
前記検出蛍光強度と、前記Ｑ＋Ｒ種の蛍光プロファイルから、Ｑ種の蛍光体を識別することを特徴とする生体ポリマー分析方法。
【請求項１８】
生体ポリマー試料が、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチドであり、前記試料を、塩基種または解析フラグメントごとに異なる蛍光体で標識し、試料からの蛍光を検出することで、その塩基配列・フラグメント種を解析する生体ポリマー分析装置において、
試料に使用しているＱ種の標識蛍光体の蛍光プロファイルと、前記標識蛍光体とは異なる蛍光プロファイルを有するＲ種（Ｒは１以上）の蛍光プロファイルと、前記検出蛍光強度とから、Ｑ種の蛍光体を識別するデータ処理部を有することを特徴とする生体ポリマー分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生体ポリマー分析方法、および生体ポリマー分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光体を標識とするＤＮＡの塩基配列を決定する方法として、例えば周知のＳａｎｇｅｒらのジデオキシ法がある。このジデオキシ法では、まず、解析するＤＮＡをベクターに導入して増幅し、変性させて一本鎖の鋳型ＤＮＡをつくる。そして、この鋳型ＤＮＡにプライマーＤＮＡを結合させ、プライマーＤＮＡを起点とした相補鎖合成を行わせる。この際、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸の他に、ターミネーターとなる特定の１種のジデオキシヌクレオチド三リン酸を加えておく。このジデオキシヌクレオチド三リン酸が取り込まれたときに相補鎖合成が停止するため、特定の塩基で終わる種々の長さのＤＮＡ断片が得られる。アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）の４種の塩基に対するジデオキシヌクレオチド三リン酸、即ち、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰを使用し、それぞれ上記の相補鎖合成反応を行ない、末端塩基がそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔである種々の長さのＤＮＡ断片を得、これらＤＮＡ断片を分子量分離し、分子量順に塩基種を読むことで塩基配列が解析できる。【０００３】
分子量分離は、ポリアクリルアミドゲルなどを使用する電気泳動で行う。近年は、キャピラリー内にゲルまたは分子量分離できるポリマーを充填し、電気泳動を行う方式が主となっている。このキャピラリー電気泳動法を用いたＤＮＡの塩基配列決定装置（ＤＮＡシーケンサ）は連続自動分析に対応し、高速に多数の試料を並行して分析処理を行うことが可能であり、現在最も広く普及しているＤＮＡシーケンサである。【０００４】
検出される断片の塩基種の判定原理は、上記断片があらかじめ末端塩基種ごとに異なる４種の蛍光体で標識され、特定の検出位置で励起光が照射され、生じる蛍光スペクトルの違いから塩基種を判別するというものである。この原理に基づく装置は、ＤＮＡシーケンサとしての用途以外に、蛍光標識された生体関連物質の分析に幅広く活用できるものである。【０００５】
標識として使用される蛍光体の組み合わせは種々ありえるが、青系、緑系、黄系、赤系色など異なる特性の蛍光体を選定する、例えば、４種の蛍光体の場合、蛍光の極大波長が各々５２８ｎｍ、５４９ｎｍ、５７５ｎｍ、６０２ｎｍとそれぞれ互いにずれているものが使われ、この蛍光極大波長の違いや蛍光スペクトルの違いから、蛍光体種が識別または蛍光体種の混合状態が識別でき、末端塩基種が判定できる。検出される蛍光スペクトルから蛍光体種を算定する方法は、例えば特許文献１に記載されているような周知の方法が使われる。【０００６】
標識として使用する蛍光体種は、塩基配列決定においては通常４種であるが、５種以上を使い、フラグメント種ごとに異なる蛍光体で標識し、ＤＮＡの分子量分離パターンを計測する測定もある。５種以上であっても、検出される蛍光体からの蛍光スペクトル等から蛍光体種を識別し、フラグメント種およびその長さを判別できる。【０００７】
測定装置は、少なくとも蛍光体種の数以上の異なる波長帯の蛍光強度を測定する機能を有している。蛍光体の蛍光スペクトルはそれぞれ異なっており、スペクトル特性に基づく複数の波長帯ごとの蛍光強度比率が蛍光体種毎に異なる。そこで、検出される複数の波長帯の蛍光強度と、蛍光体種毎の蛍光強度比率から、蛍光体種ごとの強度（量）を行列計算により変換する。蛍光体種の量が塩基種の量であることから、塩基毎の量が算定でき、泳動による塩基ごとの時間変化を得ることができる。【０００８】
例えば、特許文献２には、上述したようなキャピラリー電気泳動装置が記載されている。一般に、キャピラリー電気泳動装置では、石英キャピラリー中のポリアクリルアミド等の分離媒体に測定対象であるＤＮＡを含む試料を注入して、キャピラリーの両端部に電圧を印加する。試料中のＤＮＡを含む試料はキャピラリー内を移動し、分子量の大きさ等によって分離されキャピラリー内にＤＮＡバンドが生じる。各ＤＮＡバンドは、上述のような蛍光色素を含むため、レーザ光、ＬＥＤ光などの照射によって蛍光発光する。この蛍光発光を蛍光計測手段で読み取ると、ＤＮＡの配列を決定することができる。蛋白質の分離・分析も同様に行って、蛋白質の構成を調べることができる。キャピラリー電気泳動装置におけるサンプルへの光照射方式は以下のようなものである。すなわち、平面基板上に並んだ複数のキャピラリーからなるキャピラリーアレイの一方あるいは両側の端のキャピラリーにレーザ光を照射し、レーザ光が隣接するキャピラリーに順次に伝搬してキャピラリーアレイを横断するようにして全てのキャピラリーを泳動する試料に照射するものである。また、蛍光検出方式は以下のようなものである。すなわち、キャピラリーアレイ上のレーザ光照射部の像を、集光レンズ、透過型回折格子、結像レンズを通して、２次元ＣＣＤ上に結像する。これにより、複数の蛍光体からの蛍光を、複数の波長帯で（例えば、５００ｎｍから７００ｎｍまでの波長域を１０ｎｍ毎に２０分割して）、その強度を検出する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１１−３０５０２号公報
【特許文献２】特開２００４−１４４４７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献１に開示されているように、検出対象となる蛍光体は、標識に使われている蛍光体（標識蛍光体）である。つまり、上記行列計算により変換は、検出された蛍光強度が、どの蛍光体種（塩基種）由来であるか、または蛍光体種（塩基種）同士の混合比率がどうであるかを決定するものである。【００１１】
しかし、電気泳動において、目的（検出対象）外の成分が泳動されて検出される場合がある。例えば、泳動サンプルに含まれる不純物、ゴミなどが泳動され、キャピラリーの検出領域を通過する場合である。この不純物によるノイズ蛍光ピークは、本来の標識蛍光体のピーク信号に重なったり、単独で検出されたりする。このような場合、ノイズ蛍光ピークが、標識蛍光体のどれか、または複数の標識蛍光体の組み合わせと誤判断されるなど、蛍光体種への変換、塩基種の判定に影響を与えてしまうという懸念がある。【００１２】
このノイズ蛍光信号は、対象としている標識蛍光体の蛍光スペクトルとは異なるため、通常の蛍光スペクトル強度を蛍光体種強度に変換するマトリックス変換では、正しい変換が行われない。そして、ノイズ蛍光信号は、蛍光体種強度に重層され、正確でない強度に計算され、フラグメント種または塩基種の判定に影響を及ぼしてしまうという課題がある。
本開示はこのような状況に鑑みてなされたものであり、不純物によるノイズ蛍光ピークに影響されずに標識蛍光体自体の強度を特定する技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明者らは、標識に使われている蛍光体以外の泳動ピークを解析した結果、標識に使われている蛍光体の蛍光スペクトルとは異なるスペクトルを有していること、および複数の不純物蛍光ピークのスペクトルに共通性があることを見出した。【００１４】
そこで、発明者らの発見に基づき、本開示では、ノイズ蛍光を泳動される蛍光体として扱い、他の標識蛍光体と同じく、ノイズ蛍光の複数の波長帯ごとの蛍光強度比率を決定することとする。また、蛍光スペクトル強度を蛍光体種強度に変換するためのマトリックス変換において、標識蛍光体（Ｑ種）とノイズ蛍光体（Ｒ種）の行列として計算し、標識蛍光体の濃度を算定する。これにより、ノイズ蛍光ピークはノイズとして識別でき、標識蛍光体のピークから除外することが可能になる。【００１５】
本開示に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本開示の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせ及び以降の詳細な記述と添付される請求の範囲の様態により達成され実現される。
本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、請求の範囲又は適用例を如何なる意味においても限定するものではないことを理解する必要がある。
【発明の効果】
【００１６】
本開示によれば、電気泳動データ（エレクトロフェログラム）において、不純物によるノイズ蛍光ピークが検出される場合においても、それに影響されずに、標識蛍光体自体の強度を算定でき、塩基種等生体関連成分を正確に識別し、検出することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本実施形態によるキャピラリー電気泳動装置１００の概略構成例を示す図である。
【図２】本実施形態によるキャピラリー電気泳動装置１００の構成要素である検出機構部３７の概略内部構成（光検出系）例を示す図である。
【図３】解析手法１に基づいてデータ処理部１０１が実行する電気泳動データ解析処理を説明するためのフローチャートである。
【図４】解析手法２に基づいてデータ処理部１０１が実行する電気泳動データ解析処理を説明するためのフローチャートである。
【図５】実施例１によるノイズ蛍光除去の効果を示す図である。
【図６】実施例２によるノイズ蛍光除去の効果を示す図である。
【図７】実施例３で使用した標識蛍光体の蛍光分光プロファイル：ｘ（ｑ，ｐ）、およびノイズ蛍光プロファイル：ｙ（ｒ，ｐ）（ｑ＝０，１，２，３、ｒ＝０、ｐ＝０，１，２，．．．，１９）を示す図である。
【図８】測定された電気泳動時のエレクトロフェログラムｓ（ｐ，ｔ）の一例を示す図である。
【図９】最小自乗法により解析されたノイズ蛍光体の強度波形：ｎ（ｒ、ｔ）の一部（ノイズ蛍光１の信号強度９０１）を示す図である。
【図１０】ノイズピークを演算により除去した結果（各標識蛍光体からの蛍光強度波形ｆ（ｑ、ｔ）：蛍光体１から４の強度波形１００１から１００４）を示す図である。
【図１１】比較例として、ノイズ蛍光体を設定せずに計算された標識蛍光体からの蛍光強度波形（蛍光体１から４の強度波形１１０１から１１０４）を示す図である。
【図１２】４種の標識蛍光体のプロファイル（蛍光体１から４のプロファイル１２０１から１２０４）と２種のノイズ蛍光体のプロファイル（ノイズ蛍光１および２のプロファイル１２０５および１２０６）を示す図である。
【図１３】実施例４で用いた標識蛍光体の蛍光分光プロファイル：ｘ（ｑ，ｐ）（ｑ＝０，１，２，３，４、ｐ＝０，１，２，．．．，１９）を示す図である。
【図１４】実施例４で用いたノイズ蛍光プロファイル：ｙ（ｒ，ｐ）（ｒ＝０，１、ｐ＝０，１，２，．．．，１９）を示す図である。
【図１５】測定された電気泳動時のエレクトロフェログラムｓ（ｐ，ｔ）の一例を示す図である。
【図１６】解析手法１に従って算出されたノイズ蛍光体の強度波形：ｎ（ｒ、ｔ）の一部を示す図である。
【図１７】解析手法１による演算によって得られた結果（泳動時の標識蛍光体からの蛍光強度波形：ｆ（ｑ、ｔ））を示す図である。
【図１８】比較例として、ノイズ蛍光体の蛍光プロファイルｙ（ｒ，ｐ）を設定せずに算出された標識蛍光体からの蛍光強度波形を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、添付図面を参照して本実施形態および実施例について説明する。添付図面では、機能的に同じ要素は同じ番号で表示される場合もある。なお、添付図面は本開示の原理に則った具体的な実施形態と実装例を示しているが、これらは本開示の理解のためのものであり、決して本開示を限定的に解釈するために用いられるものではない。
【００１９】
また、本実施形態では、当業者が本開示を実施するのに十分詳細にその説明がなされているが、他の実装・形態も可能で、本開示の技術的思想の範囲と精神を逸脱することなく構成・構造の変更や多様な要素の置き換えが可能であることを理解する必要がある。従って、以降の記述をこれに限定して解釈してはならない。
【００２０】
さらに、本実施形態は、後述するデータ処理部の機能を汎用コンピュータ上で稼動するソフトウェアで実装しても良いし、専用ハードウェア又はソフトウェアとハードウェアの組み合わせで実装しても良い。
【００２１】
本実施形態は、蛍光体を標識とするＤＮＡ、タンパク等の生体関連成分（生体ポリマー）の解析技術に関し、例えば、ＤＮＡの塩基配列を決定する方法、及びその装置、またはＤＮＡの分子量分離パターンを計測する方法、及びその装置に関するものである。
【００２２】
本実施形態は、標識蛍光体のプロファイルの他に、標識蛍光体以外の蛍光体（非標識蛍光体）のプロファイル（例えば、ノイズのプロファイル）を予め設定し、これを用いて、非標識蛍光体の蛍光強度の時間変化（波形）を演算（後述の式（１）等参照）で求め、検出されるエレクトロフェログラム信号からノイズを除去することを特徴としている。また、本実施形態は、後述の式（１）から直接的に泳動時の標識蛍光体からの蛍光強度を演算で求めることを特徴としている。
【００２３】
＜キャピラリー電気泳動装置の構成例＞
図１は、本実施形態によるキャピラリー電気泳動装置１００の概略構成例を示す図である。キャピラリー電気泳動装置１００は、生体ポリマー分析装置であって、例えば、試料を分離するための分離媒体を含むキャピラリーからなるマルチキャピラリーアレイ１と、マルチキャピラリーアレイの負電極２と試料導入部２２とを浸すバッファー液３を保持する第１バッファー容器２３と、バルブ６を有するゲルブロック４と、ゲルブロック４とアース電極７とを浸すバッファー液１２を保持する第２バッファー容器２５と、キャピラリーアレイ内に泳動媒体であるゲルを注入するためのシリンジ１０と、試料に依存する情報を取得するための検出部２６と、泳動される試料内の蛍光体を励起するためのレーザ光９を光照射箇所８に照射する光源２０と、試料から生じる蛍光を取得する検出機構部３７と、キャピラリーアレイ１の温度を調節する恒温槽１１と、分離媒体に電圧を印加する高圧電源２１と、各種処理を実行するデータ処理部（プロセッサ）１０１と、後述の各標識蛍光体のプロファイル（蛍光分光プロファイルと同義）および各ノイズ蛍光プロファイルを格納するメモリ１０２と、過去の検出データや演算結果などを格納する記憶デバイス１０３と、オペレータが指示や各種データ等を入力する入力デバイス（マウス、キーボード、各種スイッチ、タッチパネルなど）１０４と、検出（測定）結果、演算結果や判定結果などを出力する出力デバイス（表示デバイス、警告音などを発するスピーカなど）１０５と、を備える。
【００２４】
マルチキャピラリーアレイ１は、管状部材である石英製キャピラリー１６複数本（例えば、９６本、２４本、１６本、1２本、８本など）で構成され、光照射箇所（レーザ光９を照射する場所）８を含む検出部２６で平面上に整列したものを使用する。各キャピラリー１６はポリイミドなどで被覆されているが、光照射箇所８では被覆除去され、光照射が可能になっている。また、マルチキャピラリーアレイ１には、ＤＮＡ分子などのサンプルが含まれている検査試料と検査試料中のＤＮＡ分子を分離するための分離媒体であるポリマー水溶液が充填される。マルチキャピラリーアレイ１の一端には、キャピラリー１６内に試料を導入できる試料導入部２２が形成され、負電圧を印加できる負電極２が配置されている。他端には、ゲルブロック４と連結するゲルブロック接続部５を有し、ゲルブロック４からキャピラリーアレイ１に分離媒体（例えば、分子ふるい効果を有するポリマー水溶液）が注入される。検出部２６は、試料導入部２２とゲルブロック接続部５との間に設けられる。
【００２５】
泳動分離媒体であるポリマー水溶液をキャピラリー１６内に注入する流動媒体注入機構２４は、ゲルブロック４と、シリンジ１０と、バルブ６とを有する。各キャピラリー１６内に泳動媒体であるポリマー水溶液を充填する際には、例えば、図示しない制御部によって、バルブ６が閉じられ、シリンジ１０が押し込まれることによって、シリンジ１０内のポリマー水溶液がキャピラリー内に注入される。
【００２６】
キャピラリーアレイ１、ゲルブロック４、バッファー液３、負電極２、アース電極側のバッファー１２、アース電極７、および高圧電源２１は、分離媒体（ポリマー水溶液）中で検査試料を電気泳動させるための電圧印加機構を構成する。電気泳動をさせる際には、負電極２はバッファー液３に浸され、図示しない制御部はバルブ６を開放する。これにより、負電極２、バッファー液３、キャピラリーアレイ（より正確には、各キャピラリー１６内のポリマー水溶液）１、ゲルブロック（より正確には、ゲルブロック４内のポリマー水溶液）４、アース電極側のバッファー１２、およびアース電極７からなる通電路が形成される。この通電路に高圧電源２１により電圧が印加される。通電路に電圧が印加されると、検査試料が分離媒体（ポリマー水溶液）中を電気泳動し、その分子量等の性質に従って分離される。
【００２７】
電気泳動装置１００の光学系は、光源２０と、光照射箇所８を含む検出部２６と、検出部２６から生じる蛍光３５を検出する検出機構部３７とで構成される。光源２０は、レーザ光９（４８８．０ｎｍおよび５１４．５ｎｍの光）を発振する。レーザ光９に代えてバンドパスフィルタなどで単色化したＬＥＤ光やその他蛍光励起可能な光源から出射される光を使用してもよい。検出部２６には、レーザ光９がキャピラリーアレイ１を透過する個所である光照射箇所８が並列に配置されている。そして、複数本のキャピラリーの光照射箇所８を同時に貫くように、検出部２６に対して、キャピラリー１６の並びの両方向（図１では上下方向）からレーザ光９が照射される。このレーザ光９が検査試料を励起して、検査試料から蛍光が放出されることになる。２次元検出器３４を含む検出機構部３７がこの蛍光を検出することにより、ＤＮＡ分子配列等の検査試料に依存した情報を取得できる。
【００２８】
＜検出機構部３７の内部構成例＞
図２は、本実施形態によるキャピラリー電気泳動装置１００の構成要素である検出機構部３７の概略内部構成（光検出系）例を示す図である。図２には、検出機構部３７と光照射箇所８が示されている。
【００２９】
検出機構部３７は、蛍光集光レンズ３１と、グレーティング３２と、フォーカスレンズ３３と、ＣＣＤカメラやＣＭＯＳカメラなどの２次元検出器３４と、を備える。図示していないが、光路途中に、励起光を除去するための光学フィルタを適宜挿入してもよい。光照射箇所８にレーザ光９が照射されることで生じる、アレイ台１５に載置されたキャピラリー１６中の検査試料からの蛍光３５は、蛍光集光レンズ３１によって平行光３６となり、グレーティング３２によって分光され、フォーカスレンズ３３によって２次元検出器３４上に結像される。図２右側にその結像に関する要素（キャピラリーアレイ１、光照射箇所８、グレーティング３２、２次元検出器３４）の構成例が示されている。Ｙ軸方向にキャピラリーアレイ１のアレイ像（図では１６本）が並び、Ｘ軸方向に各キャピラリー１６からの発光が分光されて結像し、２次元検出器のＸ方向の１画素ごとに異なる波長での蛍光強度が検出される。データ処理部１０１は、例えば、オペレータが入力デバイス１０４から入力した指示に応答して、検出された蛍光強度の信号を解析し、塩基配列などを決定する。また、データ処理部１０１は、例えば、オペレータによって入力された指示に応答して、蛍光強度の信号や解析結果である塩基配列などを出力デバイス１０５に出力（表示）する。
【００３０】
＜電気泳動データ解析の概要＞
続いて、本実施形態における電気泳動データ（エレクトロフェログラム）解析の概要について説明する。
電気泳動装置１００は、泳動中の信号を指定の時間で繰り返し検出する（レーザ光９を連続照射し、検出を周期的あるいは所定期間毎に実行してもよいし、レーザ光９の照射タイミングと信号検出タイミングとを同期させてもよい）。なお、繰り返し回数をｔとする（１秒に１回測定する場合は回数＝時間（秒）となる）。
【００３１】
また、各標識蛍光体から発する蛍光は、各蛍光スペクトルに従い、分光波長ごとに特定の強度比率で発光する。これをグレーティング、プリズムなどで、分光して検出器で検出する。標識蛍光体の組み合わせを基に、波長Ｗ１から波長Ｗ２までの検出波長域を設定し、この範囲の蛍光を複数の波長帯に分けて検出する。例えば、５２０ｎｍから７００ｎｍまでの波長領域を連続する２０波長帯に２次元検出器３４のセンサ面を分割して検出する。このように分割波長帯番号をｐ（＝０，１，２， ．．． ， Ｐ−１；Ｐ＝分割数）、標識蛍光体種の番号をｑ（＝０，１，２，．．．，Ｑ−１；Ｑ＝蛍光体種数）、ノイズ蛍光の番号をｒ（＝０， ．．． ，Ｒ−１；Ｒ＝設定したノイズ蛍光体種数）とし、時間ｔでの各信号成分を下記のように表記する。
検出される分割波長帯毎のエレクトロフェログラム信号：ｓ（ｐ，ｔ）
泳動時の標識蛍光体からの蛍光強度：ｆ（ｑ，ｔ）
泳動されている蛍光性ノイズの強度：ｎ（ｒ，ｔ）
分割波長帯毎の背景強度：ｂ（ｐ，ｔ）
標識蛍光体の蛍光プロファイル：ｘ（ｑ，ｐ）
設定したノイズの蛍光プロファイル：ｙ（ｒ，ｐ）
【００３２】
ｓ（ｐ，ｔ）は、複数の波長帯に分けて検出された強度（測定された信号）である。ｆ（ｑ，ｔ）は、泳動されたバンド等から発する各蛍光体の蛍光強度である。ｎ（ｒ，ｔ）は、泳動されたバンドに含まれると考えられるノイズの強度である。ｂ（ｐ，ｔ）は、各検出波長帯の背景強度である。背景強度は、ベースラインとなる信号の強度であり、実際に検出されたｓ（ｐ，ｔ）において非パルス的な変動をする信号を抽出することによって得られる。ｘ（ｑ，ｐ）は、各標識蛍光体の蛍光プロファイルであり、各標識蛍光体（標識蛍光体種（ｑ））自体が発光する際に検出波長帯（ｐ）毎に検出される強度を蛍光体種毎に規格化したプロファイルである。標識蛍光体が決まれば一意に特定され、蛍光スペクトルに相当するものである。ｙ（ｒ，ｐ）は、ノイズとみなされる蛍光に対してｘ（ｑ，ｐ）と同様に算定したプロファイルであり、ノイズの蛍光スペクトルに相当するものとして設定する。例えば、蓄積された検出データに基づいてノイズを解析（または、ノイズが如何なる特性を有しているかを仮定）して抽出されたプロファイルである。なお、ここでは、“ノイズのプロファイル”と表現しているが、標識蛍光体とは異なる別の蛍光体のプロファイルと表現することができる。
【００３３】
上記で、ｓ（０，ｔ）、…、ｓ（Ｐ−１，ｔ）をＰ行１列で表した行列をＳ、ｆ（０，ｔ）、…、ｆ（Ｑ−１，ｔ）をＱ行１列で表した行列をＦ、ｎ（０，ｔ）、…、ｎ（Ｒ−１，ｔ）をＲ行１列で表した行列をＮ、ｂ（０，ｔ）、…、ｂ（Ｐ−１，ｔ）をＰ行１列で表した行列をＢ、ｘ（０，０）、…、ｘ（Ｑ−１，Ｐ−１）をＰ行Ｑ列で表した行列をＸ、ｙ（０，０）、…、ｙ（Ｒ−１，Ｐ−１）をＰ行Ｒ列で表した行列をＹ、とすれば、式（１）と表現できる。なお、式（１）では、行列Ｓ、Ｆ、Ｎ、Ｂ、Ｘ、Ｙを太字体・イタリック体で表示している。
【数１】
2020026418.tif 000003
例えば、分割数を２０、標識蛍光体数を６、ノイズ蛍光体数を２とすると、式（２）のように表現することができる。
【００３４】
【数２】
2020026418.tif 000004
【００３５】
また、式（１)より、行列Ｆと行列Ｎをまとめて（Ｑ＋Ｒ）行１列の行列Ｇに置き換え、行列Ｘと行列ＹをまとめてＰ行（Ｑ＋Ｒ）の行列Ｚに置き換えることで、式（３）のように表現することができる。そして、分割数Ｐを２０、標識蛍光体数Ｑを６、ノイズ蛍光体数Ｒを２とすると、式（３）は式（４）のように表現することができる。なお、式（３）では、行列Ｓ、Ｇ、Ｂ、Ｚを太字体・イタリック体で表示している。
【００３６】
【数３】
2020026418.tif 000005
【００３７】
【数４】
2020026418.tif 000006
【００３８】
式（３）は、ノイズを蛍光体とみなし、試料に使用している標識蛍光体Ｑ種とノイズ蛍光体Ｒ種が試料に含まれると想定し、Ｑ+Ｒ種の蛍光体で、蛍光スペクトル強度から蛍光体種強度に変換する行列変換方式となる。
【００３９】
ノイズ蛍光が検出されない場合は、行列Ｎ≒０となり、通常の変換になるが、泳動によってノイズピークが検出される場合は、上記を元に、行列Ｆおよび行列Ｎを求めることが、塩基種などを算定する上で、有効になる。
【００４０】
行列Ｘおよび行列Ｙは、蛍光体種、蛍光スペクトル分割条件などの泳動条件によって決まる固定値であり、この値と測定される行列Ｓ、行列Ｂから、各時刻の行列Ｆ、行列Ｎを最小自乗法により決定する。この処理により、ノイズ蛍光ピークの影響が除外された標識蛍光体強度波形行列Ｆを得ることができ、塩基種、フラグメント種の正確な値を得ることが可能となる（解析手法１）。
【００４１】
また、上記計算で得られる行列Ｎから検出波長帯毎の強度、すなわち行列ＹＮを算定し、行列Ｓから差し引くことで、ノイズピークを除去したエレクトロフェログラムを得ることが可能になる（解析手法２）。
【００４２】
＜データ処理部における解析処理＞
ここでは、上述した解析手法１および２をデータ処理部１０１が実行する処理として説明する。図３は、解析手法１に基づいてデータ処理部１０１が実行する電気泳動データ解析処理を説明するためのフローチャートである。図４は、解析手法２に基づいてデータ処理部１０１が実行する電気泳動データ解析処理を説明するためのフローチャートである。
【００４３】
（i）解析手法１に基づく処理
（i-1）ステップ３０１
検出機構部３７は、レーザ光９を照射することによって検査試料から生じる蛍光を検出する。検出機構部３７では、２次元検出器３４において、検出波長帯０からＰ−１（Ｐ：波長分割数であって、例えば、Ｐ＝２０）までＰ分割され、所定の泳動時間ｔ（例えば、ｔ＝０から１００００）の検出データが繰り返し出力される。そして、データ処理部１０１は、検出機構部３７から繰り返し出力される検出データをエレクトロフェログラム信号（電気泳動データ）ｓ（ｐ，ｔ）として取得する。つまり、ここでは、分割波長帯数（Ｐ個）分のエレクトロフェログラム信号が得られることになる。データ処理部１０１は、例えば、順次得られる各波長帯のエレクトロフェログラム信号ｓ（ｐ，ｔ）をメモリ１０２に一時的に格納する。
【００４４】
（i-2）ステップ３０２
データ処理部１０１は、メモリ１０２から各波長帯におけるエレクトロフェログラム信号を読出し、当該信号から、非パルス的変化を示している信号を背景強度の時間変化の信号ｂ（ｐ，ｔ）としてそれぞれ抽出する。つまり、分割波長帯（Ｐ分割）毎にエレクトロフェログラム信号が取得されるため、Ｐ個の背景強度の時間変化が抽出されることになる。より具体的には、例えば、エレクトロフェログラム信号ｓ（ｐ，ｔ）にローパスフィルタをかけることにより、高周波成分である蛍光強度信号を取り除き、さらに、波形の谷を検出してその位置を結んでえられる信号を背景強度の時間変化ｂ（ｐ，ｔ）とすることができる。または、一定区間ごとに最小となる強度を得、それらを結んで背景強度の時間変化とする方式などもある。
【００４５】
（i-3）ステップ３０３
データ処理部１０１は、予め用意されている、検査試料で使用されている各標識蛍光体の蛍光プロファイルと、標識蛍光体以外の蛍光体（非標識蛍光体：例えば、ノイズ）の蛍光プロファイルを、メモリ１０２から読み込む。各標識蛍光体プロファイルは、標識蛍光体の種類が分かれば一意に特定されるプロファイルである。ノイズの蛍光プロファイルは、ノイズが有するプロファイルの特徴を仮定し、当該仮定されたプロファイルの特徴に基づいて、過去に取得した複数の電気泳動データ（エレクトロフェログラム信号）のそれぞれを解析することにより、決定される。従って、これらのプロファイルは、泳動条件（蛍光体種、分割条件等）によって決まる固定値である。例えば、各標識蛍光体のプロファイル、およびノイズの蛍光プロファイルは、電気泳動を実行する前に求められており、予めメモリ１０２に格納されているものとする。
【００４６】
（i-4）ステップ３０４
上記式（２）あるいは（４）は、所定の波長分割数における、検出されたエレクトロフェログラム信号ｓ（ｐ，ｔ）、泳動時の背景強度ｂ（ｐ，ｔ）、各標識蛍光体の蛍光プロファイルｘ（ｑ，ｐ）、設定したノイズプロファイルｙ（ｒ，ｐ）と、泳動時の標識蛍光体からの蛍光強度ｆ（ｑ，ｔ）と泳動時の蛍光性ノイズの強度ｎ（ｒ，ｔ）との関係を規定している。
データ処理部１０１は、例えば、式（４）に基づき、各時間の蛍光強度ｆ（ｑ，ｔ）と各時間の蛍光性ノイズの強度ｎ（ｒ，ｔ）を、最小自乗法（一例）を用いて算出する。
【００４７】
（i-5）ステップ３０５
データ処理部１０１は、ステップ３０４で算出した各時間の蛍光強度ｆ（ｑ，ｔ）を、標識蛍光体別に出力デバイス（表示装置）１０５に表示する（例えば、実施例２の図１０参照）。
【００４８】
（i-6）ステップ３０６
データ処理部１０１は、ステップ３０４で算出した各時間の蛍光強度ｆ（ｑ，ｔ）を解析し、検査試料に含まれる塩基配列を決定する。決定した塩基配列の情報を出力デバイス（表示装置）１０５に表示してもよい。なお、塩基配列の決定法については周知の方法（例えば、特許文献１に記載の方法）を用いることができる。
【００４９】
（ii）解析手法２に基づく処理
解析手法２では、ステップ３０１から３０４までは解析手法１と同じ処理が行われる。そこで、ここでは解析手法１とは異なるステップ４０１から４０３についてのみ説明する。
【００５０】
（ii-1）ステップ４０１
データ処理部１０１は、メモリ１０２から読み込んだノイズの蛍光プロファイルｙ（ｒ，ｐ）とステップ３０４で算出した泳動時の蛍光性ノイズの強度ｎ（ｒ，ｔ）とを乗算し、これを検出された各波長帯のエレクトロフェログラム信号ｓ（ｐ，ｔ）から減算し、ノイズピーク成分を除去したエレクトロフェログラム信号を取得する。
【００５１】
（ii-2）ステップ４０２
データ処理部１０１は、ステップ４０１で算出した、ノイズピーク成分を除去した各波長帯のエレクトロフェログラム信号を、出力デバイス（表示装置）１０５に表示する（例えば、実施例１の図５下段や図６下段参照）。
【００５２】
（ii-3）ステップ４０３
データ処理部１０１は、ステップ４０２で算出した、ノイズピーク成分を除去した各波長帯のエレクトロフェログラム信号を解析し、検査試料に含まれる塩基配列を決定する。決定した塩基配列の情報を出力デバイス（表示装置）１０５に表示してもよい。なお、塩基配列の決定法については周知の方法（例えば、特許文献１に記載の方法）を用いることができる。
【００５３】
＜実施例１＞
図５は、実施例１によるノイズ蛍光除去の効果を示す図である。実施例１は、解析手法２に基づいて得られる測定結果である。図５上段は、測定（検出）されたエレクトロフェログラムｓ（ｐ，ｔ）の時間変化、図５中段は演算によって得られたノイズ蛍光ｎ（ｒ，ｔ）の時間変化、図５下段がｎ（ｒ，ｔ）に基づく検出波長帯成分をｓ（ｐ，ｔ）から除去した、ノイズ蛍光ピークの影響の少ないエレクトロフェログラムを示している。
【００５４】
図５は、蛍光体種が５種の場合で、ノイズ蛍光を１種としてあらかじめ蛍光プロファイルを測定し、設定した場合の測定および演算結果を示している。図５において、ｓ（ｐ，ｔ）の時間変化は、２０分割された信号のうち、２、５、８、１１、１４、１７番目の強度を抜き出して表示した（各波形が６つの検出波長帯の強度変化を示している）。また、泳動時間ｔ＝９６４０ｓｃａｎ付近にノイズピーク５０１が検出された。当該ノイズピーク５０１は、検出されるバンド幅が蛍光体フラグメントのバンド幅に比べ小さく、ノイズであると確認することができた。図５上段の信号波形ｓ（ｐ，ｔ）の時間変化からノイズ蛍光成分（図５中段の信号波形）に基づく検出波長帯を差し引きすることで、ノイズピークの除去された波形（図５下段の信号波形）が得られ、塩基解析が正確にできるようになる。
【００５５】
また、図５には示していないが、直接、標識蛍光体からの蛍光強度ｆ（ｑ，ｔ）の時間変化を式（３）に基づいて決定した場合（解析手法１）でも、ノイズピークが除かれた蛍光強度波形を得ることができる。このように、本来の蛍光体の泳動バンドのピークにノイズが重なった場合でもその影響を除くことができる。
【００５６】
＜実施例２＞
図６は、実施例２によるノイズ蛍光除去の効果を示す図である。実施例２は、実施例１と同様に、解析手法２に基づいて得られる測定結果である。図６では、図１と同様に、図６上段は測定（検出）されたエレクトロフェログラムｓ（ｐ，ｔ）の時間変化、図６中段は演算によって得られたノイズ蛍光ｎ（ｒ，ｔ）の時間変化、図６下段はノイズ蛍光成分に基づく検出波長帯強度成分をｓ（ｐ，ｔ）から除去したノイズ蛍光ピークの影響の少ないエレクトロフェログラムを示している。
【００５７】
実施例２においては、泳動時間ｔ＝１１１７０、１２２２０、１２６５０、１２７２０ｓｃａｎ付近にノイズピークが検出され、ｓ（ｐ，ｔ）にそのノイズピーク６０１から６０４が見られる。１１１７０および１２２２０ｓｃａｎ付近のピーク６０１および６０２は、蛍光プロファイルから判断すると標識蛍光体と異なることが分かる。また、１２６５０および１２７２０ｓｃａｎ付近のピーク６０３および６０４は、他の多数の泳動バンドと比べ、バンド幅が狭くなっていることからもノイズと識別される。このように、ノイズピークが判定できていることと確認できた。図６上段のｓ（ｐ，ｔ）の時間変化から、算定されたノイズ蛍光成分（図６中段の信号波形）に基づく検出波長帯強度成分を差し引きすることで、ノイズピークの除去された信号波形（図６下段の信号波形）が得られた。このノイズピークが除去された信号波形に基づけば、塩基解析を正確に実行することができるようになる。
【００５８】
＜実施例３＞
実施例３は、解析手法１に基づく結果の効果について示すものである。実施例３では、塩基配列決定用の試料を測定する場合に、４種の標識蛍光体を使用した例が示されている。蛍光体１、２、３、および４として、蛍光の極大波長が各々５２８ｎｍ、５４９ｎｍ、５７５ｎｍ、および６０７ｎｍとなる蛍光体を使用する。２次元検出器３４として、Ｘ方向の画素数が２５６、または５１２画素を使用し、約０．７２ｎｍ／画素程度に波長分散させて蛍光を結像させる。検出波長域をＷ１＝５２０ｍ、Ｗ２＝６９２ｎｍと設定し、ほぼ均等の波長帯幅となるように２０分割して検出する（各波長帯の幅は約８．６ｎｍ）。２次元検出器３４では、約１２画素ごとに強度を積算して強度を算定する。
【００５９】
図７は、実施例３で使用した標識蛍光体の蛍光分光プロファイル：ｘ（ｑ，ｐ）、およびノイズ蛍光プロファイル：ｙ（ｒ，ｐ）（ｑ＝０，１，２，３、ｒ＝０、ｐ＝０，１，２，．．．，１９）を示す。実施例３では、標識蛍光体は蛍光体１、２、３、４の４種であり、ノイズ蛍光体は１種として、あらかじめ各々の蛍光強度特性を別途解析し、その蛍光プロファイルを得た。図７には、標識蛍光体１から４のプロファイル７０１から７０４、およびノイズ蛍光体１のプロファイル７０５が示されている。なお、信号強度は分割した全波長帯の強度の積算値が１になるように規格化して表示している。
【００６０】
図７に示されるように、４種の標識蛍光体、および１種のノイズ蛍光体は波長プロファイルが異なっており、上述の式（３）から、最小自乗法により逆変換が可能である。そこで、図３で説明したように、データ処理部１０１が、最小自乗法を用いて、泳動時の標識蛍光体からの蛍光強度波形：ｆ（０，ｔ）、ｆ（１，ｔ）、ｆ（２，ｔ）、ｆ（３，ｔ）、およびノイズ蛍光体の強度波形：ｎ（０，ｔ）を演算する。
【００６１】
図８は、測定された電気泳動時のエレクトロフェログラムｓ（ｐ，ｔ）の一例を示している。図８では、泳動時間ｔ＝８６００ｓｃａｎから９１００ｓｃａｎとし、検出波長帯０から検出波長帯１９の２０波長帯のそれぞれの強度変化が示されている。そして、図９は、最小自乗法により解析されたノイズ蛍光体の強度波形：ｎ（０，ｔ）の一部（ノイズ蛍光１の信号強度９０１）を示す図である。図９からも分かるように、ｔ＝８８００ｓｃａｎ付近にノイズピークが検出されている。しかし、本開示の手法（解析手法１）によれば、このようなノイズピークが検出されても、標識蛍光体からの蛍光強度波形はその影響を除いて解析することができる。図１０は、ノイズピークを演算により除去した結果（各標識蛍光体からの蛍光強度波形ｆ（０，ｔ）、ｆ（１，ｔ）、ｆ（２，ｔ）、ｆ（３，ｔ）：蛍光体１から４の強度波形１００１から１００４）を示している。一方、図１１は、比較例として、ノイズ蛍光体を設定せずに計算された標識蛍光体からの蛍光強度波形（蛍光体１から４の強度波形１１０１から１１０４）を示している。図１１の蛍光体１の蛍光強度波形１１０１は、泳動時間ｔ＝８８００から８８５０に亘って鈍っており、ノイズの蛍光強度波形（図９）の影響を受けていることが分かる。そのため、波形が鈍った部分における塩基の識別の判断を誤る可能性がある。つまり、蛍光体１の強度波形１１０１の鈍りが小さければ誤りが生じる可能性は小さくなるが、強度波形１１０１の鈍りが大きいと蛍光体１の塩基が重なって表示されているという可能性も出てくる。よって、正確に塩基識別をするためには、ノイズ成分を除去しなければならない。これに対して、図１０に示される蛍光強度波形ｆ（ｑ，ｔ）：（ｑ＝０、１、２、３）では、ノイズピーク付近（泳動時間ｔ＝８８００付近）における標識蛍光体からの蛍光強度がより正確に算定されていることが分かる。
【００６２】
なお、ノイズ蛍光体として実施例では１種を設定したが、２種類として設定すれば、異なるプロファイルを有するノイズも除去することが可能で、より正確性が高まる。例えば、図１２は、４種の標識蛍光体のプロファイル（蛍光体１から４のプロファイル１２０１から１２０４）と２種のノイズ蛍光体のプロファイル（ノイズ蛍光１および２のプロファイル１２０５および１２０６）を示す図である。この場合も、４種の標識蛍光体１２０１から１２０４と２種のノイズ蛍光体１２０５および１２０６とは互いに波長プロファイルが異なっており、識別が可能となる。
【００６３】
また、検出波長領域を分割して検出する場合、必ずしも検出波長帯を連続させる必要はなく、非連続（飛び飛び）の波長帯を用いてもよい。さらに、各波長帯の波長幅も、波長帯ごとに同じ幅（検出波長帯幅が均等：実施例３では均等に設定されている）でなく、任意の幅（例：不均等に設定した検出波長帯幅：後述の実施例４（図１３および１４）ではピーク部分の波長帯幅を他の部分よりも大きく設定している）でもよい。例えば、蛍光極大波長付近をより広く（大きく）したり、レーザ光９のラマン散乱が検出される波長帯についてその幅を狭く（小さく）したり、その波長帯からの信号を検出しないようにしたりすることが可能である。検出波長幅を連続かつ均等にすると、標識蛍光体やノイズ蛍光体に由来しないレーザ光９のラマン散乱の影響が検出信号に現れてしまうため、不均等に検出波長幅を設定することは有効である。分割数も各実施例で示した２０個でなくてもよい。それらの条件で、標識蛍光体の蛍光プロファイル、ノイズ蛍光体の蛍光プロファイルを設定すればよい。
【００６４】
＜実施例４＞
実施例４では、５種の標識蛍光体を使用し、５種のフラグメントを解析した。標識蛍光体１、２、３、４、５として、蛍光の極大波長が各々５２０ｎｍ、５５０ｎｍ、５７０ｎｍ、５９０ｎｍ、６５５ｎｍ付近となる蛍光体を使用した。また、２次元検出器３４として、Ｘ方向の画素数が２５６または５１２画素を使用し、約０．７２ｎｍ／画素程度に波長分散させて蛍光を結像させる。検出波長域をＷ１＝５２２．５ｎｍ、Ｗ２＝６９０ｎｍと設定した。波長帯分割数は実施例３と同様に２０分割とした。また、各検出波長帯の波長幅（＝画素数）は同一ではなく、蛍光極大波長付近を広く（大きく）、それ以外を狭く（小さく）設定した。検出波長帯の幅と間隔は不ぞろいに設定した。
【００６５】
図１３は、実施例４で用いた標識蛍光体の蛍光分光プロファイル：ｘ（ｑ，ｐ）を示す図である。図１４は、実施例４で用いたノイズ蛍光プロファイル：ｙ（ｒ，ｐ）（ｑ＝０，１，２，３，４、ｒ＝０，１、ｐ＝０，１，２，．．．，１９）を示す図である。実施例４では、標識蛍光体は蛍光体１、２、３、４、５の５種であり、ノイズ蛍光体を２種として予め各々の蛍光強度特性を別途解析し、その蛍光プロファイルを得た。蛍光プロファイルの強度は、波長帯の強度の積算値が１になるように規格化して表示している。なお、検出波長帯番号１、４、７、１０、および１６は、概略５つの蛍光極大波長域の蛍光を検出する設定となっている。また、図１３および図１４から分かるように、５種の標識蛍光体、および２種のノイズ蛍光体は、蛍光プロファイルが互いに異なっている。従って、式（３）に基づいて、最小自乗法により逆変換が可能である。このため、データ処理部１０１は、上述した解析手法１に従って、泳動時の標識蛍光体からの蛍光強度波形：ｆ（ｑ，ｔ）、およびノイズ蛍光体の強度波形：ｎ（ｒ，ｔ）を算出する。
【００６６】
図１５は、測定された電気泳動時のエレクトロフェログラムｓ（ｐ，ｔ）の一例を示す図である。図１５では、泳動時間ｔ＝１００００ｓｃａｎから１１５０００ｓｃａｎでの検出波長帯０から検出波長帯１９の２０波長帯の強度変化が示されている。また、図１６は、解析手法１に従って算出されたノイズ蛍光体の強度波形：ｎ（ｒ，ｔ）の一部を示す図である。図１５を参照すると、ｔ＝１１１００ｓｃａｎ付近に標識蛍光体からの蛍光ではないピーク１５０１が検出されている。図１５では、ピーク１５０１の蛍光プロファイルは、５種の標識蛍光体とは異なり、また、明らかにバンド幅が蛍光体の標識されたフラグメントに比べて狭い。このため、ピーク１５０１は、ノイズピークであると認識することができる。しかしながら、実施例４では、このようなノイズピーク１５０１が検出されても、標識蛍光体からの蛍光強度波形はその影響を除いて解析することができた。
【００６７】
図１７は、解析手法１による演算によって得られた結果（泳動時の標識蛍光体からの蛍光強度波形：ｆ（ｑ，ｔ））を示す図である。一方、図１８は、比較例として、ノイズ蛍光体の蛍光プロファイルｙ（ｒ，ｐ）を設定せずに算出された標識蛍光体からの蛍光強度波形を示す図である。図１８では、ｔ＝１１１００ｓｃａｎ付近に鋭いピーク１８０１が認識される。これに対して、図１７に示される蛍光強度波形ｆ（ｑ，ｔ）においては、ピーク１８０１が出現していない。そして、データ処理部１０１は、ノイズピーク１８０１を除去した蛍光強度波形を解析処理する。これにより、ノイズの影響の少ないフラグメント解析をすることができる。
【００６８】
なお、実施例４においては、ノイズ蛍光体を１種として設定しても、ノイズ除去の効果を見出すことができた。また、フラグメント解析においては、標識蛍光体種が６種あるいは４種の場合等のように、蛍光体の種々の組み合わせに対応することができ、ノイズピークを識別してその影響を少なくすることができる。
【００６９】
＜電気泳動結果の信頼性表示処理＞
上記実施例１から４では、標識蛍光体以外の物質からの蛍光強度をノイズとして抽出している（図５、６、９、および１６参照）。このようなノイズは、電気泳動結果に出現しないことが理想であるが、ゼロとすることは非常に困難である。ノイズの混入が不可避であったとしても、抽出されるノイズ出現頻度が多かったり、ノイズの強度（レベル）が大きすぎたりする場合には、対応する電気泳動の結果（検出データ）自体の信頼性が低いと判断することできる。そこで、例えば、信頼性が低いと判断できるノイズ出現頻度の閾値と強度の閾値を予め設定する。そして、データ処理部１０１は、抽出したノイズの出現頻度および強度が上記閾値を超えるか否か判断し、少なくとも一方の閾値を超えた場合には、電気泳動結果の信頼性が低いと判定して、判定結果を出力デバイス１０５に出力する。出力形態は、警告音であってもよいし、画面にアラート表示をしてもよい。このようにすることにより、ピーク強度とその発生頻度から泳動結果を評価する泳動評価判定部を有する電気泳動装置を提供することができる。そして、オペレータは、電気泳動の測定を再度実行すべきか判断することができるようになる。
【００７０】
＜まとめ＞
（i）本実施形態では、キャピラリー電気泳動で試料を泳動させて、その時間波形を解析しているが、本開示はキャピラリー電気泳動に限定されず、泳動全般について適用可能で同様の効果を有する。また、標識蛍光体以外の物質による発光は、泳動以外の測定方式を用いた場合にも発生しうる。
【００７１】
電気泳動においては、反応させたサンプルを、分子ふるい効果を有する媒体（例えば、ポリマー水溶液）中で泳動させると分子量が小さい順から流れ、特にＤＮＡの場合には一塩基ずつ分離するため、これを順次読み込むことにより、信号強度を測定することができる。一塩基ずつ読み込むのは基本的なシーケンスであるため、一塩基ずつ読み込む方法として、電気泳動以外の別の方法を用いることもできる。例えば、基板に一塩基毎に蛍光体を取り付けて読み込み、それを外して、次の塩基に蛍光体を取り付けて読み込むといった手順を繰り返すことによっても一塩基ずつ信号を読み込むことができる。このようなＤＮＡの塩基配列を逐次反応させながら検出する方式や装置でも、反応検出時に標識蛍光体以外からの蛍光が重層される場合がある。つまり、標識蛍光体以外の蛍光体（ノイズ蛍光体とみなす）による信号が検出される場合があり、これがノイズとなる。このように一塩基ずつ読み込む場合でも、検出される信号における時間情報は、連続的に塩基を読み込む塩基泳動と基本的に同じであるため、塩基に由来する蛍光強度信号にノイズが重層されて検出されることになる。そして、標識蛍光体以外の物質による発光を特定し、その蛍光プロファイルを設定し、標識蛍光体とそれ以外の蛍光体からの蛍光が発光するとして変換演算することにより、標識蛍光体の強度と、標識蛍光体以外の蛍光強度とを分離することができ、塩基種をより正確に算定することが可能になる。
よって、本開示の技術を適用すれば、電気泳動以外の方法でも、電気泳動の場合と同様にノイズを除去することができる。
【００７２】
（ii）ＤＮＡを例として、本実施形態について説明したが、本開示の技術は、多糖類、タンパク質（酵素、ペプチド）、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）など、生体ポリマーに対して適用可能である。
【００７３】
（iii）本実施形態では、生体ポリマーに使用するＱ種（Ｑは１以上の整数）の標識蛍光体のプロファイルと、標識蛍光体とは異なるＲ種（Ｒは１以上の整数）の蛍光体である非標識蛍光体（例えば、ノイズ）のプロファイルとを予め設定しておき、メモリ１０２や記憶デバイス１０３に保持しておく。また、電気泳動などの測定方式を用いて、複数の波長帯の強度の時間変化を検出する。そして、データ処理部（例えば、プロセッサ）１０１は、メモリ１０２などから標識蛍光体のプロファイルと非標識蛍光体のプロファイルを読み込み、複数の波長帯の強度の時間変化と、Ｑ種の標識蛍光体のプロファイルと、Ｒ種の非標識蛍光体のプロファイルとを用いて、Ｑ＋Ｒ種の蛍光体を識別する。さらに、データ処理部１０１は、識別されたＱ種の蛍光体のデータから生体ポリマーを解析する。解析は、周知の技術を用いて実行される。このように非標識蛍光体のプロファイルを導入することにより、不純物によるノイズに影響されずに標識蛍光体自体の強度を算定でき、生体ポリマーの成分を正確に検出し、識別することができるようになる。
【００７４】
本実施形態では、所定幅の検出波長域（例えば、５２０ｎｍから７００ｎｍ）を設定し、当該検出波長域をＰ（Ｐは正の整数：例えば、２０分割）個の波長帯に分割して、複数の蛍光体の強度の時間変化（ｓ（ｐ，ｔ））を検出する。このようにすることにより、波長帯毎に各標識蛍光体の蛍光強度比率が異なるため、精度良くかつ効率的に標識蛍光体および非標識蛍光体を検出し、これらを分離することができるようになる。
【００７５】
具体的には、本実施形態では、２つの方法で、標識蛍光体および非標識蛍光体を識別することができる。１つ目は、例えば、上述の式（１）（あるいは式（３））から、ｆ（ｑ，ｔ）を演算し、得られたｆ（ｑ，ｔ）を用いてＱ種の蛍光体を識別する方法である（解析手法１）。２つ目は、式（１）からｎ（ｒ，ｔ）を演算し、ｓ（ｐ，ｔ）からｎ（ｒ，ｔ）に基づく検出波長帯成分を減算することにより非標識蛍光体の蛍光強度を除去し、非標識蛍光体が除去された複数の蛍光体の強度の時間変化を用いて、Ｑ種の蛍光体を識別する方法である。（解析手法２）。
【００７６】
さらに、本実施形態では、さらに、Ｒ種の非標識蛍光体の出現頻度、および当該非標識蛍光体の強度の少なくとも一方が予め設定された閾値以上か否か判断することにより、測定結果の信頼度を評価するようにしてもよい。このようにすることにより、オペレータは再度測定を実行した方がよいか判断することが可能となる。
【００７７】
（iv）本開示は、上述の実施形態や実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。また、実施形態や実施例の記載は、本開示の技術を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【００７８】
標識蛍光体として４から６種のほか、種々に適用可能である。また、ノイズ蛍光体として１種類、２種類のほか、複数種類を設定することも可能である。蛍光体の組み合わせも実施例記載のほか、種々の組み合わせが可能である。検出波長帯の設定も分割数をより多くすることも可能である。これらの組み合わせに応じた、蛍光プロファイルをそれぞれ設定すれば同様の解析が可能である。さらに、上記実施例では、ＤＮＡを測定対象としたが、たんぱく質などの生体関連成分を、分離検出する方法および装置についても適用でき、同様に不純物由来の蛍光成分の影響を受けない、または影響の少ない測定をすることが可能である。
【符号の説明】
【００７９】
１  キャピラリーアレイ
２  負電極
３  負電極側のバッファー液
４  ゲルブロック
５  ゲルブロックへの接続部
６  バルブ
７  アース電極
８  光照射箇所
９  レーザ光
１０  シリンジ
１１  恒温槽
１２  アース電極側のバッファー液
１５  アレイ台
１６  キャピラリー
２０  光源
２１  高圧電源
２２  試料導入部
２３  第１バッファー容器
２４  流動媒体注入機構
２５  第２バッファー容器
２６  検出部
３１  蛍光集光レンズ
３２  グレーティング
３３  フォーカスレンズ
３４  ２次元検出器
３５  キャピラリー部からの発光
３６  キャピラリー部らの発光が蛍光集光レンズによって平行光となった光束
３７  蛍光の検出機構部
１００  キャピラリー電気泳動装置
１０１  データ処理部
１０２  メモリ
１０３  記憶デバイス
１０４  入力デバイス
１０５  出力デバイス
【図１】
2020026418.tif 000011
【図２】
2020026418.tif 000012
【図３】
2020026418.tif 000013
【図４】
2020026418.tif 000014
【図５】
2020026418.tif 000015
【図６】
2020026418.tif 000016
【図７】
2020026418.tif 000017
【図８】
2020026418.tif 000018
【図９】
2020026418.tif 000019
【図１０】
2020026418.tif 000020
【図１１】
2020026418.tif 000021
【図１２】
2020026418.tif 000022
【図１３】
2020026418.tif 000023
【図１４】
2020026418.tif 000024
【図１５】
2020026418.tif 000025
【図１６】
2020026418.tif 000026
【図１７】
2020026418.tif 000027
【図１８】
2020026418.tif 000028
【手続補正書】
【提出日】令和3年1月27日(2021.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体ポリマーを試料とし、標識物として複数種の蛍光体を使用し、それぞれの蛍光強度を検出することにより、前記生体ポリマーを分析する生体ポリマー分析方法であって、
前記試料に使用しているＱ種（Ｑは１以上の整数）の標識蛍光体のプロファイルを設定することと、
前記標識蛍光体とは異なるＲ種（Ｒは１以上の整数）の蛍光体である非標識蛍光体のプロファイルを設定することと、
所定の測定方式を用いて、前記試料からの蛍光強度を検出することと、
前記蛍光強度と、前記Ｑ種の標識蛍光体のプロファイルと、前記Ｒ種の非標識蛍光体のプロファイルとを用いて、Ｑ＋Ｒ種の蛍光体を識別することと、
を含む生体ポリマー分析方法。
【請求項２】
請求項１において、
さらに、前記識別されたＱ種の蛍光体のデータから前記生体ポリマーを解析することを含む生体ポリマー分析方法。
【請求項３】
請求項１において、
前記試料からの蛍光強度を検出することにおいて、所定幅の検出波長域を設定し、当該検出波長域をＰ（Ｐは正の整数）個の波長帯に分割して検出する、生体ポリマー分析方法。
【請求項４】
請求項３において、
分割された波長帯ごとの検出強度をｓ（ｐ，ｔ）、前記Ｑ種の標識蛍光体のプロファイルをｘ（ｑ，ｐ）、前記Ｒ種の非標識蛍光体のプロファイルをｙ（ｒ，ｐ）、測定時の背景強度をｂ（ｐ，ｔ）、標識蛍光体からの蛍光強度をｆ（ｑ，ｔ）、非標識蛍光体からの蛍光強度をｎ（ｒ，ｔ）とした場合に、以下の式から、前記Ｑ＋Ｒ種の蛍光体を識別する、生体ポリマー分析方法。
2020026418.tif 000029
または、
2020026418.tif 000030
ここで、ｔは時間、
ｐは分割波長帯の番号（ｐ＝０，１，・・・，Ｐ−１）、
ｑは標識蛍光体種の番号（ｑ＝０，１，・・・，Ｑ−１）、
ｒは非標識蛍光体の番号（ｒ＝０，１，・・・，Ｒ−１）
【請求項５】
請求項４において、
前記式によりｆ（ｑ，ｔ）を算定し、前記Ｑ種の蛍光体を識別する、生体ポリマー分析方法。
【請求項６】
請求項４において、
前記式によりｎ（ｒ，ｔ）を算定し、前記ｓ（ｐ，ｔ）から前記ｎ（ｒ，ｔ）に起因する信号強度を減算することにより、前記非標識蛍光体が除去された分割された波長帯ごとの検出強度を算定し、Ｑ種の蛍光体を識別する、生体ポリマー分析方法。
【請求項７】
請求項１において、
前記試料をキャピラリー内で泳動させること、あるいは前記試料を逐次反応させることを含む、生体ポリマー分析方法。
【請求項８】
請求項１において、
さらに、前記Ｒ種の非標識蛍光体の出現頻度、および当該非標識蛍光体の強度の少なくとも一方が予め設定された閾値以上か否か判断することにより、前記所定の測定方式による測定結果の信頼度を評価することを含む生体ポリマー分析方法。
【請求項９】
生体ポリマーを試料とし、標識物として複数種の蛍光体を使用し、それぞれの蛍光強度を検出することにより、前記生体ポリマーを分析する生体ポリマー分析装置であって、
所定の測定方式を用いて、前記試料からの蛍光強度を検出する測定部と、
前記試料に使用しているＱ種（Ｑは１以上の整数）の標識蛍光体のプロファイルと、前記標識蛍光体とは異なるＲ種（Ｒは１以上の整数）の蛍光体である非標識蛍光体のプロファイルとを格納するメモリと、
前記メモリから前記Ｑ種の標識蛍光体のプロファイルと前記Ｒ種の非標識蛍光体のプロファイルとを読み込み、前記検出された蛍光強度と、前記Ｑ種の標識蛍光体のプロファイルと、前記Ｒ種の非標識蛍光体のプロファイルとを用いて、Ｑ＋Ｒ種の蛍光体を識別するデータ処理部と、
を備える生体ポリマー分析装置。
【請求項１０】
請求項９において、
前記データ処理部は、さらに、前記識別されたＱ種の蛍光体のデータから前記生体ポリマーを解析する、生体ポリマー分析装置。
【請求項１１】
請求項９において、
前記測定部は、予め設定された所定幅の検出波長域をＰ（Ｐは正の整数）個の波長帯に分割して検出する、生体ポリマー分析装置。
【請求項１２】
請求項１１において、
分割された波長帯ごとの検出強度をｓ（ｐ，ｔ）、前記Ｑ種の標識蛍光体のプロファイルをｘ（ｑ，ｐ）、前記Ｒ種の非標識蛍光体のプロファイルをｙ（ｒ，ｐ）、測定時の背景強度をｂ（ｐ，ｔ）、標識蛍光体からの蛍光強度をｆ（ｑ，ｔ）、非標識蛍光体からの蛍光強度をｎ（ｒ，ｔ）とした場合に、前記データ処理部は、以下の式から、前記Ｑ＋Ｒ種の蛍光体を識別する、生体ポリマー分析装置。
2020026418.tif 000031
または、
2020026418.tif 000032
ここで、ｔは時間、
ｐは分割波長帯の番号（ｐ＝０，１，・・・，Ｐ−１）、
ｑは標識蛍光体種の番号（ｑ＝０，１，・・・，Ｑ−１）、
ｒは非標識蛍光体の番号（ｒ＝０，１，・・・，Ｒ−１）
【請求項１３】
請求項１２において、
前記データ処理部は、前記式からｆ（ｑ，ｔ）を演算し、前記Ｑ種の蛍光体を識別する、生体ポリマー分析装置。
【請求項１４】
請求項１２において、
前記データ処理部は、前記式からｎ（ｒ，ｔ）を算定し、前記ｓ（ｐ，ｔ）から前記ｎ（ｒ，ｔ）に起因する信号強度を減算することにより、前記非標識蛍光体が除去された分割された波長帯ごとの検出強度を算定し、当該算定された検出強度を表示させる機能を有する、生体ポリマー分析装置。
【請求項１５】
請求項９において、
前記データ処理部は、さらに、前記Ｒ種の非標識蛍光体の出現頻度、および当該非標識蛍光体の強度の少なくとも一方が予め設定された閾値以上か否か判断することにより、前記所定の測定方式による測定結果の信頼度を評価する機能を有する、生体ポリマー分析装置。
【請求項１６】
請求項９において、
試料を泳動させる電気泳動機構部、または、逐次反応させる逐次反応機構部をさらに有する、生体ポリマー分析装置。
【請求項１７】
生体ポリマー試料が、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチドであり、前記生体ポリマー試料を、塩基種または解析フラグメントごとに異なる蛍光体で標識し、試料からの蛍光を検出することで、その塩基配列・フラグメント種を解析する生体ポリマー分析方法において、
試料に使用しているＱ種の標識蛍光体の蛍光プロファイルと、前記標識蛍光体とは異なる蛍光プロファイルを有するＲ種（Ｒは１以上）の蛍光プロファイルを設定し、
検出蛍光強度と、前記Ｑ＋Ｒ種の蛍光プロファイルから、Ｑ種の蛍光体を識別することを特徴とする生体ポリマー分析方法。
【請求項１８】
生体ポリマー試料が、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチドであり、前記生体ポリマー試料を、塩基種または解析フラグメントごとに異なる蛍光体で標識し、試料からの蛍光を検出することで、その塩基配列・フラグメント種を解析する生体ポリマー分析装置において、
試料に使用しているＱ種の標識蛍光体の蛍光プロファイルと、前記標識蛍光体とは異なる蛍光プロファイルを有するＲ種（Ｒは１以上）の蛍光プロファイルと、検出蛍光強度とから、Ｑ種の蛍光体を識別するデータ処理部を有することを特徴とする生体ポリマー分析装置。
【国際調査報告】
2020026418.tif 000033
2020026418.tif 000034
2020026418.tif 000035
2020026418.tif 000036