(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に許容される賦形剤と哺乳動物中で血管新生を阻害する活性を有するアンジオスタチンフラグメントを含む薬学的組成物であって、前記組成物がクリングル１領域、クリングル２領域、クリングル３領域、クリングル１−２領域、クリングル２−３領域またはこれらの組合わせからなるグループから選択される１または２以上のクリングル領域フラグメントを含むことを特徴とする血管新生の阻害を必要とする患者を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
アンジオスタチンフラグメントは、クリングル２−３領域またはクリングル１−２領域のアミノ酸配列を有する請求の範囲第１項に記載の医薬組成物。
【請求項３】
アンジオスタチンフラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８またはこれらの組合わせからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む請求の範囲第２項に記載の医薬組成物。
【請求項４】
アンジオスタチンフラグメントが、クリングル１領域のアミノ酸配列を有する請求の範囲第１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
クリングル１領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む請求の範囲第４項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
アンジオスタチンフラグメントが、クリングル２領域のアミノ酸配列を有する請求の範囲第１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
クリングル２領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む請求の範囲第６項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
アンジオスタチンフラグメントが、クリングル３領域のアミノ酸配列を有する請求の範囲第１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
クリングル３領域が、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１７；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９；ＳＥＱ  ＩＤ ＮＯ：２０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む請求の範囲第８項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
薬学的に許容される賦形剤と哺乳動物中で血管新生を阻害する活性を有するアンジオスタチンフラグメントを含む医薬組成物であって、前記組成物はプラスミノーゲン分子のクリングル１領域、クリングル２領域、クリングル３領域、クリングル１−２領域、クリングル２−３領域またはこれらの組合わせからなるグループから選択される１または２以上のクリングル領域フラグメントを含むことを特徴とする血管新生の阻害を必要とする患者を治療するための医薬組成物。
【請求項１１】
哺乳動物中で血管新生を阻害する活性を有するアンジオスタチンフラグメントをコードする単離されたＤＮＡ配列を含む組成物であって、前記アンジオスタチンフラグメントは、クリングル１領域、クリングル２領域、クリングル３領域、クリングル１−２領域、クリングル２−３領域またはこれらの組合わせからなるグループから選択される１または２以上のクリングル領域フラグメントを含むことを特徴とする血管新生の阻害を必要とする患者を治療するための組成物。
【請求項１２】
クリングル領域フラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７；ＳＥＱ  ＩＤ ＮＯ：８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６；ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１７；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９；ＳＥＱ  ＩＤ ＮＯ：２０；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５；ＳＥＱＩＤ ＮＯ：２６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８またはこれらの組合わせからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む請求の範囲第１１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、アンジオスタチン(angiostatin)と称され、可逆的に内皮細胞の増殖を阻害する内皮形成阻害物質に関する。さらに詳細には、本発明は、血液や尿などの体液から単離される、または組み換えを使用する方法、酵素を使用する方法または化学的方法により合成できるアンジオスタチンタンパク質に関する。アンジオスタチンは、血管新生関連性疾患を阻害および血管新生プロセスを調節できる。さらに本発明は、アンジオスタチン測定のための診断アッセイおよびキット、アンジオスタチンの位置特定のための組織化学検査キット、アンジオスタチンおよびアンジオスタチンの生合成をモニターする分子プローブをコードするＤＮＡ配列、アンジオスタチンに特異的な抗体、アンジオスタチンレセプターに対するタンパク質性作動物質および拮抗物質の開発、刺激性および遮断性の抗アンジオスタチンレセプター特異的抗体、およびアンジオスタチンタンパク質に結合する細胞毒性物質に関する。
発明の背景
本明細書で使用する通り、「血管新生」という言葉は、組織や器官内で新しい血管が発生することを意味する。通常の生理学的条件下では、ヒトおよび動物は、非常に限定された状況においてのみ血管新生を行う。たとえば、通常、傷の治癒、胎児または胚の発達、および黄体、子宮内膜、胎盤の形成時において観察される。内皮（endothelium）とは、漿液膣(serous cavity)、リンパ管および血管の内側にある扁平な上皮細胞の薄い層のことである。
コントロール下、および非コントロール下における血管新生は、どちらも同じように進行すると考えられる。内皮細胞と基底膜（basement membrane）に囲まれた血管周辺細胞が毛細血管を形成する。血管新生は先ず、内皮細胞および白血球の放出する酵素によって基底膜が浸食される。次いで、血管の内膜を覆う内皮細胞が基底膜を貫いて突き出る。血管新生刺激因子の誘導により、浸食された基底膜を通って内皮細胞が移動する。移動した細胞が、親血管から肉芽(sprout)を形成し、ここで内皮細胞が細胞分裂と増殖を行う。内皮肉芽が互いに融合して毛細血管蹄(capillary loop)を形成し、新しい血管をつくる。
さまざまな疾病、腫瘍の転移や内皮細胞の異常な増殖内では、持続的でコントロールされない血管新生が起きており、これらの状態において見られる病理学的損傷を裏付けている。コントロールされない血管新生を起こすさまざまな疾病の病理学的状態は、血管新生依存型か血管新生関連型の疾病の別に分類されている。
癌の成長は血管新生依存性であるという仮説が始めて提唱されたのは、１９７１年である(Folkman J., Tumor angiogenesis: Therapeutic implications., N. Engl. Jour. Med. 285:1182-1186, 1971)。この論文は、非常にシンプルな表現で次のように述べている「いったん腫瘍が出現すると、腫瘍細胞集団が増殖するに先立ち、必ず腫瘍上に収束する新しい毛細血管が増大する」。腫瘍の出現は、現時点では腫瘍の成長における前血管形成段階、すなわち細胞集団の大きさが数マイクロリットル、数百万個までで、既存の宿主の微小血管上で生存できる段階にあたると理解されている。この段階を越えて腫瘍が大きくなるには、新たな毛細血管の誘導が必要である。たとえば、マウスの早期前血管形成段階の肺微小転移は、組織切片を高性能の顕微鏡で観察しなければ検出できない。
この考え方を裏付ける間接的な例には、以下のものがある。
（１）マウスの皮下の透明の間腔(transparent chamber)に移植された腫瘍の成長速度は、血管形成前は緩慢で直線増加を示し、血管形成後は急速で指数増加を示す。(Algire GH, et al. Vascular reactions of normal and malignant tumors in vivo I. Vascular reactions of mice to wounds and to normal and neo plastic transplants. J. Natl. Cancer Inst. 6:73-85, 1945)
（２）単離された潅流臓器中の血管の増殖されない腫瘍は、１から２ｍｍ3までにしか成長できないが、これがマウスに移植されて血管形成すると、この大きさの１，０００倍超にまで急速に大きくなる。(Folkman J, et al., Tumor behavior in isoloated perfused organs: In vitro growth and metastasis of biopsy material in rabbit thyroid and canine intestinal segment. Annals of Surgery 164:491-502, 1966)。
（３）血管のない角膜における腫瘍の進行は、緩慢で直線的成長を示すが、血管形成後は指数的成長に転じる。(Gimbrone, M.A., Jr. et al., Tumor growth and neovascularization: An experimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Cancer Institute 52:41-427, 1974)
（４）ウサギの前眼房の水溶液中に懸濁された腫瘍は生存しており、１ｍｍ3未満の大きさの無血管性腫瘍のままである。これはいったん虹彩血管床に移植されると、血管を新生して急速に成長し、２週間以内に元の大きさの１６，０００倍にまで達する。(Gimbrone MA Jr., et al., Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularizaion. J. Exp. Med. 136:261-276)
（５）腫瘍はニワトリの胚の漿尿膜上に移植されると、７２時間までの無血管性段階の間は緩慢に成長し、平均直径は０．９３＋０．２９ｍｍを越えない。血管形成開始後は、２４時間以内に急速な腫瘍の増大が起こり、７日目までにこれらの血管形成した腫瘍の平均直径は８．０＋２．５ｍｍに達する。(Kninghton D., Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British J. Cencer, 35:347-356, 1977)
（６）ウサギの肝臓における転移巣の血管柱(vascular cast of metastases)は、転移の大きさは不均一であるが、血管形成が起こる大きさの限界点は比較的均一であることを示した。腫瘍は一般に直径１ｍｍまでは無血管性で、これを越えると血管が形成される。(Lien W., et al., The blood supply of experimental liver metastases. II. A microcirculatory study of normal and tumor vessels of the liver with the use of perfused silicone rubber. Surgery 68:334-340, 1970)
（７）膵島のベータ細胞に癌を発生する形質転換マウスにおいて、前血管形成の肥大した島は、大きさが１ｍｍまでである。６〜７週の週齢で、４から１０パーセントの島で血管形成が起こり、これらの島は前血管形成段階の島の大きさの１０００倍以上の大きな血管形成腫瘍となる。(Folkman J. et al., Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature 339:58-61, 1989)
（８）ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子: vascular endothelial growth factor）に対して特異的な抗体は、微小血管密度を低下させ、ＶＥＧＦを血管新生の唯一のメディエーターとしている３種類のヒトの腫瘍の成長を「有意にあるいは非常に強く」阻害する（ヌードマウスにおいて）。この抗体はインビトロにおける腫瘍細胞の成長は阻害しない。(Kim K J, et al., Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo. Nature 362:841-844, 1993)
（９）抗ｂＦＧＦモノクローナル抗体は、血管新生の唯一のメディエーターとするｂＦＧＦの分泌に依存するマウスの腫瘍の成長を７０％阻害する。この抗体は、インビトロにおける腫瘍細胞の成長は阻害しない。（Hori A et al., Suppression of solid tumor growth by immunoneutralizing monoclonal antibody against human basic fibroblast growth factor. Cancer Research, 51:6180-6184, 1991）
（１０）ｂＦＧＦの腹腔内注入は、腫瘍内の毛細管内皮細胞の成長を刺激することにより、一次腫瘍の成長と転移を促進する。腫瘍細胞それ自身はｂＦＧＦのレセプターを有さず、ｂＦＧＦはインビトロにおいて腫瘍細胞の分裂促進因子ではない。(Gross JL, et al. Modulation of solid tumor growth by bFGF. Proc. Amer. Assoc. Canc. Res. 31:79, 1990)
（１１）ある特異的な血管新生阻害剤（ＡＧＭ−１４７０）は、インビボにおいて腫瘍の成長と転移を阻害するが、インビトロでは腫瘍細胞の増殖を阻害する活性がずっと低い。この阻害物質は腫瘍細胞の増殖を阻害する場合より４けた低い濃度で、血管内皮細胞増殖を最大反応の半分に阻害する。(Ingber D, et al., Angioinhibins: Synthetic analogues of fumagillin which inhibit angiogenesis and suppress tumor growth. Nature, 48:555-557, 1990)。さらに、腫瘍の成長が血管新生依存性であるという間接的な臨床所見が報告されている。
（１２）ガラス体に転移するヒトの網膜芽細胞腫瘍は、（摘出した目から取り出してインビトロで分析する場合は）生存しており、3Ｈ−チミジンを取り込むにもかかわらず、１ｍｍ3未満の大きさに限定された無血管性の球体に進行する。
（１３）子宮癌は小さな無血管性の白いシードとして腹膜に転移する（１から３ｍｍ3）。これらの移植癌はそれらのひとつ、または複数が血管形成を受けるまでほとんど大きくならない。
（１４）乳癌（Weidner N, et al., Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive breast carcinoma. N. Engl. J. Med. 324:1-8, 1991, and Weidner N, et al., Tumor angiogenesis: A new significant and independent prognostic indicator in early stage breast carcinoma, J Natl. Cancer Inst. 84:1875-1887, 1992）および前立腺癌（Weidner N, Carroll PR, Flax J, Blumenfeld W, Folkman J. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma. American Journal of Pathology, 143(2):401-409, 1993）における血管新生の強度は、将来に転移するリスクの大きさと強く相関する。
（１５）ヒト皮膚メラノーマからの転移は、血管新生以前に起こることはまれである。血管新生が開始すると、病巣の厚みの増大および転移リスクが増大する。(Srivastava A, et al., The prognostic significance of tumor vascularity in intermediate thickness (0.76-4.0 mm thick skin melanoma. Amer. J. Pathol. 133:419-423, 1988）
（１６）膀胱癌においては、疾患の状態および程度を表す指標としては、細胞学的指標よりも血管形成タンパク質であるｂＦＧＦの尿中濃度のほうが感度が高い。（Nguyen M, et al., Elevated levels of an angiogenic protein, basic fibroblast growth factor, in urine of bladder cancer patients. J. Natl. cancer Inst. 85:241-242, 1993）
このように、癌の転移において血管新生が主要な役割を果たしていることは明らかである。この血管新生活性を抑制または消失させることができれば、腫瘍は存在したとしても大きくはならないことになる。疾患において、血管新生を防止することで、新しい微小管系の侵入による損傷を防止できる可能性がある。血管新生プロセスのコントロールを目的とする療法は、これらの疾患を治癒または緩和できる可能性がある。
このように、好ましくない血管の増殖、特に腫瘍内への増殖を阻害できる組成物および方法が必要とされる。また、前記組成物を検出、測定、位置特定する方法も必要とされる。前記組成物は、転移前の腫瘍中における内因性の成長因子の活性に打ち勝ち、腫瘍内における毛細血管の形成を防止し、これによって腫瘍の成長を阻害できるものでなければならない。前記組成物、組成物のフラグメント、および組成物に特異的な抗体は、また、傷の治癒や生殖などの他の血管新生プロセスにおきる毛細血管の形成も調節できなければならない。前記組成物および血管新生を阻害する方法は、好ましくは毒性がなく副作用が少ないものであるべきである。また前記組成物の生合成される部位および前記組成物の結合部位を検出、測定、位置特定する方法も必要とされる。前記組成物および前記組成物のフラグメントは、放射活性および放射活性以外のいずれもの標識のための他の分子と抱合できるものである必要がある。
発明の要約
本発明は、血管新生を調節、および望まれない血管新生、特に腫瘍の成長に関連する血管新生を阻害するに有効な組成物および方法を提供するものである。本発明は、アンジオスタチンと称され、インビトロにおいてｂＦＧＦなどの内因性の成長因子の血管新生活性を克服する能力と、プラスミノーゲンのおよそ９８番目のアミノ酸から始まるプラスミノーゲン内の一部分とのアミノ酸配列相同性および構造的類似性を特徴とするタンパク質を含む。アンジオスタチンは、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用した測定でおよそ３８キロダルトンから４５キロダルトンの間の分子量を有し、マウスの完全なプラスミーゲン分子の９８番目のアミノ酸から始まるマウスのプラスミノーゲンフラグメントと非常に似たアミノ酸配列を有するタンパク質からなる（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。
アンジオスタチンのアミノ酸配列は、種間でわずかに異なる。たとえば、ヒトのアンジオスタチンにおいて、アミノ酸配列は、上記のマウスのプラスミノーゲンフラグメントの配列とほとんど同一であるが、活性なヒトのアンジオスタチン配列は、完全なヒトプラスミノーゲンのアミノ酸配列の９７または９９番目のいずれかのアミノ酸から始まっている。さらに、ヒトのプラスミノーゲンのフラグメントは、マウスの腫瘍モデルにおいて示されるものと類似の抗血管新生活性を有する。なお、活性なアンジオスタチン分子中のアミノ酸の数は変化する場合があり、内皮阻害活性を有する全てのアミノ酸配列が本発明に含まれる。
本発明は、血管新生を阻害するに十分な容量の、高度に生成されたアンジオスタチン、アンジオスタチン誘導体、アンジオスタチンフラグメントあるいはアンジオスタチン凝集体を含む組成物をヒトまたは動物に投与することにより、望まれない、およびコントロールされない血管新生が介在する疾患およびプロセスを治療する方法、および組成物を提供するものである。本発明は、特に、腫瘍の治療、または腫瘍の成長の抑制に有用である。前血管新生転移性腫瘍を有するヒトまたは動物にアンジオスタチンを投与することにより、これらの腫瘍の成長、または増大が防止される。
また、本発明は、アンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列、アンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクター、およびアンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列を含有するひとつ、または複数の発現ベクターを含有する細胞をも包含する。さらに、本発明は、インビボでのアンジオスタチン濃度を改善する目的でアンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列を患者に導入する遺伝子治療法も包含する。
また、本発明は、生物学的液体および組織中におけるアンジオスタチン検出、および測定、組織および細胞内におけるアンジオスタチンの位置特定のための診断方法、およびキットも含む。前記診断方法およびキットは、当業者に広く知られているいかなる構成のものでもよい。また、本発明は、アンジオスタチン分子およびその分子の部分に特異的な抗体、およびアンジオスタチンに特異的な抗体の結合を阻害する抗体をも含む。これらの抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。癌や他の血管新生が介在する患者の発病、または再発の診断あるいは予知を目的とする、アンジオスタチンの有無や量を検出する診断キットにおいて、アンジオスタチンに特異的な抗体を使用することができる。アンジオスタチンに特異的な抗体はまた、ヒトまたは動物に投与して、ヒトまたは動物にアンジオスタチンに対する受動免疫を与え、これにより血管新生の阻害を小さくすることもできる。
また、本発明は体液中のアンジオスタチンと結合する抗体の有無およびその量を検出するための診断方法およびキットをも含む。この診断方法およびキットは、当業者に広く知られているいかなる構成のものでもよい。
また、本発明は、アンジオスタチンレセプターに結合して、細胞に適切な信号を伝達し、作動物質または拮抗物質として作用するところの抗アンジオスタチンレセプター特異的抗体をも含む。
また、本発明はアイソトープ標識、または陽電子射出断層撮影、オートラジオグラフィー、フローサイトメトリー、ラジオレセプター結合アッセイ、および免疫組織化学検査を含むが、これに限定されない手法を使用したアンジオスタチン結合部位の検出および可視化に使用する他の分子、またはタンパク質で標識できるアンジオスタチンタンパク質フラグメントおよびアナログを含む。
また、これらのアンジオスタチンタンパク質およびアナログは、アンジオスタチンレセプターにおいて、作動物質および拮抗物質として作用し、アンジオスタチンの生物学的活性を増強または妨害する。このようなタンパク質は、アンジオスタチンレセプターの単離に使用する。
また、本発明は、治療および研究目的での細胞毒性薬剤と結合させた、アンジオスタチン、アンジオスタチンフラグメント、アンジオスタチン抗血清、またはアンジオスタチンレセプター作動物質およびアンジオスタチンレセプター拮抗物質を含む。さらにまた、アンジオスタチン、アンジオスタチンフラグメント、アンジオスタチン抗血清、またはアンジオスタチンレセプター作動物質、およびアンジオスタチンレセプター拮抗物質は、薬学的に許容される賦形剤、および任意で生分解性ポリマーなどの徐放性物質または化合物と合わされて治療用組成物を形成する。
本発明は、アンジオスタチンの転写および翻訳に関与するリボ核酸、およびデオキシリボ核酸を検出する分子プローブを含む。これらの分子プローブは、組織および細胞内でのアンジオスタチン生合成の検出および測定の手段を提供する。
このように、本発明の目的のひとつはアンジオスタチンを含む組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、血管新生の介在する疾患およびプロセスを治療する方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、体液または組織中におけるアンジオスタチンの有無および量を検出する診断、または予知方法およびキットを提供することである。
本発明のさらに別の目的は、これに限定されないが、血管腫、固形腫瘍、血液由来の腫瘍、白血病、転移、毛細血管拡張症、乾癬、強皮症、化膿性肉芽腫、心筋血管新生、クローン病、プラーク血管新生、冠動脈側副枝、大脳側副枝、動静脈異常形成、虚血性四肢血管新生、角膜疾患、皮膚潮紅、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、水晶体後線維増殖、関節炎、糖尿病性血管新生、黄斑変性、創傷の治癒、消化性潰瘍、ヘリコバクター関連性疾患、骨折、ケロイド、脈管形成、造血、排卵、月経、胎盤形成、およびネコ引っ掻き熱などを含む血管新生が介在する疾患およびプロセスの治療のための方法と化合物を提供することである。
本発明の別の目的は、癌の治療またはその成長を抑制する組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、インビボまたはインビトロにおいてアンジオスタチンを産生する酵素の産生または活性を調節または似せる組成物を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、このようなアンジオスタチン、または抗アンジオスタチン抗体を必要としているヒトまたは動物に、アンジオスタチンＤＮＡを直接注入することにより、アンジオスタチン、または抗アンジオスタチン抗体を提供することである。
本発明のひとつの目的は、体液中のアンジオスタチンに対して特異的な抗体の有無および量を検出する方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、プラスミノーゲンは認識せず、アンジオスタチン分子内の特定の部位に選択的なアンジオスタチンに対する抗体を含む組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、癌の検出または予後診断の方法を提供することである。
本発明の別の目的は、インビボおよびインビトロにおいてアンジオスタチン結合部位の可視化および定量に使用する組成物を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、アンジオスタチン生合成の検出および定量に使用する組成物を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、これに伴う副作用が最小限である癌の治療法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、癌の治療または癌の成長を抑制する細胞毒性物質を結合したアンジオスタチンまたはアンジオスタチンタンパク質を含む組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、アンジオスタチン関連組成物を特定の部位に標的送達するための方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、血管新生プロセスの調節のための遺伝子治療に有用な組成物および方法を提供することである。
本発明のこれらおよび他の目的、特徴および効果は、下記の開示された実施態様の詳細な説明および添付の請求の範囲を検討した後に、明らかになるものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１完全なマウスのプラスミノーゲンのアミノ酸配列を示す。
図２は、マウスのアンジオスタチンの開始配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、マウスのプラスミノーゲンタンパク質フラグメントの配列とヒト（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、アカゲザル（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ブタ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ウシ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）の配列の相当部分との比較を示す。マウスの配列が１番目、次いでヒト、アカゲザル、ブタ、ウシの順である。
図３は、一次腫瘍の存在または非存在下における、肺の腫瘍細胞のＢｒｄＵ標識インデックスである。
図４は、インビボにおけるｂＦＧＦに誘導された血管新生に対するルイスラット肺一次腫瘍の影響のマトリゲル分析を示す。
図５は、ルイスラット肺癌（ＬＬＣ−Ｌｏｗ）を宿すマウスから得た血清と正常マウスから得た血清の用量反応曲線を示す。ウシ毛細血管内皮細胞をｂＦＧＦ誘導７２時間増殖アッセイを使用して検定した。
図６は、腹水中では低および高転移性腫瘍のいずれもが内皮細胞分裂活性を有するが、血清中では低転移性腫瘍系のみが内皮阻害活性を有することを示す。
図７は、腫瘍を宿す動物から得た粗精製の血清と尿のＣ４逆相クロマトグラフィーのプロファイルを示す。
図８は、完全なプラスミノーゲン分子、ヒトのプラスミノーゲンリジン結合サイトＩ調製物から得た活性画分、腫瘍を宿すマウスから得た濃縮尿、および正常マウスから得た濃縮尿で処置後１３日目のマウスの肺表面転移を示す。
図９は、ヒトのプラスミノーゲンの完全なプラスミノーゲン分子、リジン結合サイトＩ調製物から得た活性画分、腫瘍を宿すマウスから得た濃縮尿、および正常マウスから得た濃縮尿で処置後１３日目のマウスの肺重量を示す。
図１０は、ｐＴｒｃＨｉｓベクターの概略図である。
図１１は、１０リットルの大量培養されたヒトアンジオスタチンを発現する大腸菌の、ヒトプラスミノーゲンクリングル領域１〜３に対するモノクローナル抗体をプローブとした免疫ブロットである。矢印は組み換えられたヒトアンジオスタチンを示す。Ａ）は、０．２Ｍアミノカプロン酸で溶出された組み換えアンジオスタチンを示す。Ｂ）は、リジンカラムの１ＸＰＢＳでの最後の洗浄液を示す。Ｃ）は破損した細胞からの透明な細胞溶解産物を示す。
図１２は、成長するウシ毛細血管内皮細胞のパーセント阻害を保存液の希釈の関数として示す；Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、およびＥはヒトアンジオスタチン抗血管新生活性を発現する組み換えクローンである；Ｃ１、Ｃ２、Ｄ１、およびＤ２対照は、アンジオスタチンをコードするヒトのＤＮＡ配列を含まないベクターを含有する負の対照クローンである。
図１３は、インビトロにおけるウシ毛細血管内皮細胞に対する組み換えヒトアンジオスタチンの増殖阻害作用を示す。
図１４は、一次腫瘍の除去および生理食塩水または抗血管新生作用を有するフマギリンアナログを使用した処置後の、成長増殖インデックスおよびアポプトシスインデックスを示す。
図１５は、インビボにおけるヒトアンジオスタチンの４０ｍｇ／ｋｇ／日の単回投与による治療によるマウスのＴ２４１一次腫瘍の成長の阻害を示す。
図１６は、インビボにおけるヒトアンジオスタチンの４０ｍｇ／ｋｇ／投与（８０ｍｇ／ｋｇ／日）二回投与による治療によるマウスのＬＬＣ−ＬＭ一次腫瘍の成長の阻害を示す。
図１７は、ルイスラット肺癌の一次腫瘍の除去のその肺転移の成長に与える作用を示す。
図１８は、腫瘍切除後の成長増殖およびアポプトシスインデックスを示す。
図１９は、Ｔ２４１線維肉腫細胞を移植されたマウスにおける腫瘍総容積に対するアンジオスタチンタンパク質投与の作用を時間の関数として示した。
図２０は、ルイスラットの肺癌（ＬＭ）細胞を移植されたマウスにおける腫瘍総容積に対するアンジオスタチンタンパク質投与の作用を時間の関数として示した。
図２１は、細網肉腫細胞を移植されたマウスにおける腫瘍総容積に対するアンジオスタチンタンパク質投与の作用を時間の関数として示した。
図２２は、ヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞を移植された免疫欠損ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍総容積に対するアンジオスタチンタンパク質投与の作用を、２４日以上の期間にわたり、時間の関数として示した。
図２３は、ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ細胞を移植された免疫欠損ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍総容積に対するアンジオスタチンタンパク質投与の作用を、２４日以上の期間にわたり、時間の関数として示した。
図２４は、マウスのプラスミノーゲンｃＤＮＡに由来するマウスアンジオスタチンタンパク質をコードするマウスＤＮＡ配列のクローニングの概略図である。マウスアンジオスタチンは、マウスのプラスミノーゲンクリングル領域１〜４を含む。ＰＣＲは、ポリメラーゼチェイン反応の略である；Ｐ１は、ＰＣＲのための５’末端オリゴヌクレオチドプライマーである；Ｐ２は、ＰＣＲのための３’末端オリゴヌクレオチドプライマーである；ＳＳは、シグナル配列である；ＡＴＧは、翻訳開始コドンである；ＴＡＡは、翻訳停止コドンである；ＨＡは、ヘマグルチニンエピトープタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳＬ）；Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３およびＫ４は、それぞれマウスのプラスミノーゲンクリングル領域１、２、３、および４である。ＣＭＶはサイトメガロウイルスプロモーターである；Ｔ７は、バクテリオファージプロモーターである；ＰＡは未活性化タンパク質である；ＳＰ６は、Ｓｐ６プロモーターである。
図２５は、非感染細胞（ｍｏｃｋ）；アンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列を含まないベクター（ベクター５）のみで感染させた細胞、および２つのアンジオスタチン発現クローン（ＡＳＴ３１およびＡＳＴ３７）における日数の関数とした細胞数を示す。パネル（ａ）は、Ｔ２４１細胞の感染結果を示す。パネル（ｂ）は、ＬＬ２細胞の感染結果を示す。
図２６は、アンジオスタチンクローンを含有する大腸菌細胞に由来する細胞培養液の細胞数についての結果を示す。非感染細胞（ｍｏｃｋ）；アンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列を含まないベクターのみで感染させた細胞（ベクター５）、および３つのアンジオスタチン発現クローン（ＡＳＴ２５、ＡＳＴ３１およびＡＳＴ３７）。パネル（ａ）は、対照（ｍｏｃｋ）および全てのアンジオスタチンクローン（発現および非発現）の細胞培養液の細胞数についての培養結果を示す。パネル（ｂ）は、対照（ｍｏｃｋ）、ベクターのみ（ベクター６）、およびマウスのアンジオスタチンを発現するアンジオスタチンクローンの細胞培養液の細胞数についての培養結果を示す。パネル（ｃ）は、対照（ｍｏｃｋ）およびマウスのアンジオスタチンを発現するアンジオスタチンクローンの精製培養液の細胞数についての培養結果を示すが、ここにおいて培養液はリジン結合組成物を回収するためにリジン−セファロースカラムで精製された。
図２７は、Ｔ２４１線維肉腫細胞の移植時の関数とした、マウスにおける腫瘍総容積に対する作用を示すが、ここでは線維肉腫細胞は、アンジオスタチンタンパク質をコードするＤＮＡ配列を保有するベクターで感染させ、およびベクターはアンジオスタチンタンパク質を発現することができる。「非感染」とは、マウスに移植された無加工のＴ２４１線維肉腫細胞である。「ベクター６」は、マウスに移植された、アンジオスタチンタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含まないベクターのみで感染させたＴ２４１線維肉腫細胞である。「クローン２５、クローン３１、クローン３７」は、マウスに移植された、アンジオスタチンタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むベクターで感染させたＴ２４１線維肉腫細胞の３種のアンジオスタチン産生クローンである。
図２８は、ヒトプラスミノーゲンおよびそのクリングルフラグメントの構造を図示したものである。ヒトプラミノーゲンは、Ａｓｎ289に一ケ所のＮ−結合糖鎖付加部位を有する、７９１個のアミノ酸を含む一本鎖タンパク質である。５個の分れたドメインに存在するＮ末端の５６１個のアミノ酸を含むヒトプラスミノーゲンのプロテアーゼでない領域はクリングルと呼ばれ、これらの構造を分けているタンパク質と共に○で示している（Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４およびＫ５）。三重のＳ−Ｓ結合で結合されたクリングルのそれぞれは、８０個のアミノ酸を含む。アンジオスタチンは最初の４個のクリングルドメイン（Ｋ１−４）にあたり、クリングル３（Ｋ１−３）とクリングル４（Ｋ４）はエラスターゼでヒトプラスミノーゲンを消化することによって得られる。残りのクリングルフラグメントは、大腸菌で発現された組み換えタンパク質である。ＳＳ＝シグナル配列。ＰＡ＝前活性化タンパク質。
図２９は、還元条件下での、プラスミノーゲンの精製した組み換え体および変成していないクリングルフラグメントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。（Ａ）大腸菌溶解産物から精製した個々の組み換えクリングルフラグメントを、１５％ＳＤＳゲルに流し、クマシーブルーで染色した。レーンあたり各タンパク質５μｇを流した。（レーン２＝クリングル１（Ｋ１）；レーン３＝クリングル２（Ｋ２）；レーン４＝クリングル３（Ｋ３）；レーン５＝クリングル４（Ｋ４）；レーン１＝分子量マーカー）。（Ｂ）精製された大きなクリングルフラグメントをクマシーブルーで染色した。クリングル１−４（レーン２）およびクリングル１−３（レーン３）を、ヒトプラスミノーゲンをエラスターゼで消化することにより、リジン−セファロースクロマトグラフィーによって精製した。クリングル２−３（レーン４）の組み換えフラグメントを、大腸菌で発現させ、インビトロで再度折りたたみさせた。分子量マーカーは左に示している（レーン１）。
図３０は、アンジオスタチンの各々の組み換えクリングルフラグメントによる内皮細胞増殖の阻害を示す。クリングルフラグメントを、１ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦの存在下で７２時間、ウシ毛細血管内皮細胞でアッセイした。（Ａ）２種類のリジン−結合クリングル、ｒＫ１およびｒＫ４の抗内皮細胞増殖効果。高親和性リジン結合クリングル、Ｋ１（−○−）は、用量依存性にＢＣＥ細胞の増殖を阻害した。中親和性リジン結合クリングル、Ｋ４（−●−）は、高濃度の時にのみわずかな阻害活性を示した。（Ｂ）非リジン結合Ｋ２およびＫ３によるＢＣＥ細胞増殖の阻害。Ｋ２（−■−）およびＫ３（−□−）は両方とも、用量依存性にＢＣＥ細胞増殖を阻害した。データは、３回の測定の平均＋／−ＳＥＭを示す。
図３１は、アンジオスタチンの大きなクリングルフラグメントの抗内皮細胞増殖活性を示す。タンパク分解フラグメント、Ｋ１−４（アンジオスタチン）（−○−）およびＫ１−３（−■−）は、用量依存性にＢＣＥ細胞増殖を阻害した。組み換えＫ２−３（−●−）フラグメントは、Ｋ１−３およびＫ１−４よりも阻害は弱かった。データは、阻害のパーセントとして、３回の測定の平均（＋／−ＳＥＭ）を示す。
図３２は、組み換えクリングル２およびクリングル３の相加的阻害活性を示す。（Ａ）ｒＫ２−３の完全なフラグメント（図３１も参照）は、３２０ｎＭの濃度でのみ弱い阻害効果を示した。１６９番目のシステインをセリンに置換したｒＫ２の変異フラグメントとＫ３（２９７番目のシステインをセリンに置換）をＢＣＥ細胞で共にアッセイしたときに、相加的阻害が見られた。各値は３回の測定の平均＋／−ＳＥＭを示す。（Ｂ）Ｋ２とＫ３の構造図示およびアミノ酸配列。鎖内クリングルＳ−Ｓ結合が、Ｋ２のシステイン169およびＫ３のシステイン297間に存在することが以前に報告された（Sohndel, S., Hu, C. −K., Marti, D., Affolterm M., Schaller, J. Llinas, M., and Rickli, E. E. (1996) Biochem.印刷中）。
図３３は、クリングルフラグメントの組合せによる内皮細胞増殖の阻害を示す。アッセイは、３２０ｎＭ濃度の各クリングルフラグメントを用いて行った。値は、阻害のパーセントとして３回の測定の平均（＋／−ＳＥＭ）を示す。（Ａ）様々な独立のクリングルフラグメントの組合せによるフラグメントの阻害効果。（Ｂ）組合せたクリングルフラグメントの組合せによる阻害活性。
図３４は、還元およびアルキル化後の内皮細胞におけるアンジオスタチンの阻害活性を示す。（Ａ）ヒトアンジオスタチンの還元（レーン２）および非還元（レーン１）型のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。精製したヒトアンジオスタチンは、ＤＴＴで還元し、過剰量のヨードアセトアミドでタンパク質のアルキル化を行った。処置した標品は透析し、ＢＣＥ細胞でアッセイした。（Ｂ）３２０ｎＭ濃度での還元および非還元型のアンジオスタチンによるＢＣＥ細胞増殖の阻害。データは、３回測定の平均の阻害＋／−ＳＥＭを示す。
図３５は、ヒトアンジオスタチンの推定されるクリングルドメインのアミノ酸配列を示す。４個のクリングルドメインの配列を、保存されたシステイン残基に従って並べた。同一で保存されたアミノ酸残基は、影を付けている。クリングル４中の四角で囲ったアミノ酸残基は、２２番目と８０番目の保存されたシステイン残基に隣接した、プラスに荷電した２個のリジン酸基を示す。
図３６は、発現したアンジオスタチンのリジン結合性と反応性を示す。
図３６Ａは、クマシーで染色したゲル（４０μｌ泳動）を示す。
図３６Ｂは、同じゲルの免疫ブロット（２０μｌ泳動）を示す。レーン１は、誘導された培養の震盪フラスコからの培養液を示し、５０キロダルトンの位置のアンジオスタチンタンパク質と数種の他のタンパク質を示す。誘導された培養からの培養液を緩衝液で１：１に希釈し、リジンセファロース上で直接泳動した。レーン２は、リジンセファロースを通り抜けた非結合画分を示す。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現されたアンジオスタチンタンパク質は、全てリジンカラムに結合する。レーン３は、０．２Ｍアミノカプロン酸による特異的な溶出を示し、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現されたアンジオスタチンタンパク質はリジンと結合し、リジンセファロース上の同一性のために１ステップで精製することができることを示す。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現されたアンジオスタチンタンパク質は、また、クリングル１〜３に対する立体配座依存性のモノクローナル抗体（ＶＡＰ）によって認識される。
図３７は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現されたアンジオスタチンタンパク質は、変成非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー染色ゲルにおいて、４９キロダルトンと５１．５キロダルトンの位置に泳動される二量体であるようであることを示す。高マンノース構造に特異的なＮ−グリカナーゼを用いて、発現されたアンジオスタチンタンパク質から１本のＮ−結合複合体を除去すると、４９．５キロダルトンの一本のバンドになる。パネルＡおよびパネルＢはそれぞれ、クマシー染色をしたゲルと、同じゲルの免疫ブロットを示す。レーン１は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現された精製されたアンジオスタチンタンパク質を示す。レーン２は、Ｎ−グリカナーゼなしで消化条件下でインキュベートしたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現された精製されたアンジオスタチンタンパク質を示す。レーン３は、Ｎ−グリカナーゼで消化したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現された精製されたアンジオスタチンタンパク質を示す。
図３８Ａは、クマシーゲル上で二連で泳動された、４μｇのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現された精製されたアンジオスタチンタンパク質を示す。
図３８Ｂは、精製された組み換え体がＢＣＥ増殖を阻害することを示す。ｂＦＧＦの存在下（●）あるいは非存在下（○）、対照としてＰＢＳとｂＦＧＦの存在下（△）、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現されたアンジオスタチンタンパク質とｂＦＧＦの存在下（△）における７２時間後のＢＣＥアッセイ細胞数を示す。
図３８Ｃは、阻害が用量依存性であることを示す。
図３９は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現された精製アンジオスタチンタンパク質を一次腫瘍と共にマウスの全身に（皮下）に与えたことを示す。
図３９ＡとＢは、生理食塩水、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現されたアンジオスタチンタンパク質、あるいはプラスミノーゲン由来アンジオスタチンタンパク質で毎日処置したそれぞれのマウスの転移巣の数と肺重量を示す。生理食塩水で処置したマウスの肺と比較して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現されたアンジオスタチンタンパク質あるいはプラスミノーゲン由来アンジオスタチンタンパク質で処置したマウスの肺は、血管新生を伴わず、転移は有効に抑制されていた。
図４０は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現されたアンジオスタチンで処置したマウスの肺は微小転移のためにピンク色であったが、生理食塩水で処置した対象グループの肺は血管新生した転移巣によって完全に覆われていたことを示す。
図４１は、ニッケルアフィニティクロマトグラフィーのもとでの様々なステージの精製及び凝集段階における組み換えマウスアンジオスタチンの、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）写真を示す（レーン１−３はｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ(封入体)洗浄液、レーン４は尿中の不溶性画分、レーン５はアフィニティカラム開始材料、レーン６はカラムの通り抜け、レーン７は溶出アンジオスタチン）。
図４２は、ウシ毛細血管内皮細胞に対する組み換えマウスアンジオスタチン凝集体。
図４３は、ルイスラット肺癌を移植したマウスにおいてアンジオスタチン凝集体を２ｍｇ／ｋｇ／日投与したときの腫瘍容量に対する効果を示す。
図４４は、ルイスラット肺癌を移植したマウスにおいてアンジオスタチン凝集体を１０ｍｇ／ｋｇ／日投与したときの腫瘍容量に対する効果を示す。
詳細な説明
本発明は、血管新生に媒介されるまたは血管新生を伴う疾患およびプロセスの検出および治療をする組成物および方法を含む。前記組成物は、アンジオスタチンで、これらに限定されないが血清、尿および腹水を含む体液から単離することができ、または化学的または生物学的方法（たとえば、細胞培養、組み換え遺伝子発現、タンパク質合成、および活性なアンジオスタチンを得るためのプラスミノーゲン、またはプラスミンのインビドロ酵素分解）によって合成される。組み換え手法には、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）を使用するＤＮＡ源からの遺伝子増幅、および逆転写酵素／ＰＣＲを使用するＲＮＡ源からの遺伝子増幅が含まれる。アンジオスタチンは、未血管新生または血管新生腫瘍などの組織内への血管の増殖を阻害する。
また、本発明は、アンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列を保有するベクターからなる組成物で、前記ベクターは細胞内に存在する時にアンジオスタチンを発現できるものである組成物、ベクターを有する細胞からなる組成物であって、前記ベクターはアンジオスタチンまたはアンジオスタチンのフラグメントまたはアナログをコードするＤＮＡ配列を有するものであり、前記ベクターは細胞内に存在する時にアンジオスタチンを発現できるものであり、およびベクターを有する細胞をヒトまたはヒト以外の動物に移植することからなる方法であって、前記ベクターはアンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列を有するものであり、前記ベクターは細胞内に存在する時にアンジオスタチンを発現できるものである方法を包含する。
さらにまた、本発明は、治療用の組成物を作成するために薬学的に許容される賦形剤、および必要に応じ生分解性ポリマーなどの徐放性化合物または組成物と合わされたアンジオスタチン、アンジオスタチンフラグメント、アンジオスタチン抗血清、アンジオスタチンレセプター作動物質またはアンジオスタチンレセプター拮抗物質を包含する。特に本発明は、アンジオスタチンと特異的に結合する抗体からなる組成物を含み、前記抗体はプラスミノーゲンと結合しない。
さらに詳細には、本発明は、アンジオスタチンと称される、およそ３８から４５キロダルトン（ｋＤ）の分子量を有し、インビトロにおいてｂＦＧＦなどの内因性成長因子の血管新生活性に打ち勝つことのできるタンパク質を含む。アンジオスタチンは、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用した測定でおよそ３８キロダルトンから４５キロダルトンの間の分子量を有し、マウスの完全なプラスミノーゲン分子の９８番目のアミノ酸から始まるマウスのプラスミノーゲンフラグメントと非常に類似したアミノ酸配列を有するタンパク質である。「非常に類似した」という表現は、アンジオスタチンアミノ酸配列に関して使用される場合、抗血管新生活性を有し、およそ３８キロダルトンから４５キロダルトンの間の分子量を有するアミノ酸配列で、またマウスのプラスミノーゲンのおよそ９８番目のアミノ酸から始まる、３８キロダルトンから４５キロダルトンの間の分子量のマウスのプラスミノーゲンのタンパク質フラグメントとの高い配列相同性を有するアミノ酸配列であるということである。高い相同性とは、少なくともおよそ６０％のアミノ酸相同性、好ましくは少なくともおよそ７０％のアミノ酸相同性、さらに好ましくは少なくともおよそ８０％のアミノ酸相同性を指す。ここで使用される「内皮阻害活性」とは、たとえば線維芽細胞成長因子存在下における細胞培養中のウシの毛細血管内皮細胞の成長を阻害するなどの一般的な血管新生を阻害する分子の能力を指す。
完全なマウスのプラスミノーゲン分子のアミノ酸配列を図１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示す、アンジオスタチンの配列は、およそ９８番目のアミノ酸から始まる。活性なヒトのプラスミノーゲン分子も、完全なヒトプラスミノーゲン分子の９７または９９番目のいずれかのアミノ酸から始まっている。マウスから得たアンジオスタチンの始めの３３９個のアミノ酸のアミノ酸配列は図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）に示され、ヒト（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、アカゲザル（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ブタ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ウシ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）プラスミノーゲン由来のプラスミノーゲンタンパク質フラグメントに相当する配列と比較されている。これらの配列が、それらのアミノ酸の５０％よりずっと多くが同一であることを考えると、アンジオスタチンのアミノ酸配列は種間で実質的には類似していると理解される。アンジオスタチンのアミノ酸の総数は、正確には分かっていないが、活性分子の分子量によって決められる。本発明のアンジオスタチンのアミノ酸配列は、プラスミノーゲン分子が由来する種により異なるかもしれない。このように、ヒトプラスミノーゲン由来の本発明のアンジオスタチンは、マウス由来のアンジオスタチンと配列が少し異なるが、マウスの腫瘍モデルにおいて示されるように抗血管新生活性を有する。
アンジオスタチンは、インビトロにおいて内皮細胞の成長を阻害する能力があることが判明している。アンジオスタチンは、他の細胞タイプに由来する細胞株の成長は阻害しない。特に、アンジオスタチンはルイスラット肺癌細胞株、ミンク肺上皮細胞、３Ｔ３線維芽細胞、ウシ大動脈平滑筋細胞、ウシ網膜色素上皮、ＭＤＣｋ細胞（イヌ腎臓上皮）、ＷＩ３８細胞（ヒト胎児肺線維芽細胞）ＦＥＮ細胞（マウス胎児線維芽細胞）およびＬＭ細胞（マウス結合組織）に対しては作用しない。腫瘍を宿すマウス内の内因性アンジオスタチンは、およそ１０ｍｇアンジオスタチン／ｋｇ体重の全身濃度において、転移を阻害する作用がある。
アンジオスタチンは、プラスミノーゲン分子のクリングル領域により決定される特異的な三次元構造を有する。（Robbins, K.C.,”The plasminogen-plasmin enzyme system”Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Practice, 2nd Edition, ed. by Colman, R.W. et al. J.B. Lippincott Company, pp. 340-357, 1987）こういったクリングル領域は５つあり、これらは構造的に関係したモチーフで、プラスミノーゲン分子のＮＨ2末端部分に、実質的な配列相同性がある。アンジオスタチンの三次元構造は、プラスミノーゲンクリングル領域１から３および４の一部を取り囲むと考えられている。プラスミノーゲン分子の各クリングル領域は、約８０アミノ酸からなり、３つのジスルフィド結合が含まれる。このシステインモチーフは、他の生物学的活性を有するタンパク質にも存在することが知られている。これらのタンパク質には、これに限定されないが、プロトロンビン、肝細胞成長因子、拡散因子(scatter factor)、およびマクロファージ刺激タンパク質が含まれる。（Yoshimura, T, et al.,”Cloning, sequencing, and expression of human macrophage stimulating protein (MSP, MST1) confirms MSP as a member of the family of kringle proteins and locates the MSP gene on Chromosome 3”J. Biol. Chem., Vol.268, No.21, pp.15461-15468, 1933）。三次元クリングル様構造またはシステインモチーフを有する、インビボにおいて抗血管新生活性を有する単離タンパク質またはタンパク質はすべて、本発明に属すると考えられる。
また本発明は、癌などの疾患の診断または予後観察の目的での体液および組織中のアンジオスタチンの検出も含む。また本発明は、細胞および組織中のアンジオスタチン結合部位およびレセプターの検出を含む。また本発明は、これに限定されるものではないが関節炎や腫瘍などを含む血管新生性疾患およびプロセスを、アンジオスタチンの産生を刺激すること、および／または高度に精製されたアンジオスタチン、またはアンジオスタチン作動物質または拮抗物質、および／またはアンジオスタチン抗血清またはアンジオスタチン抗血清に対する抗血清を患者に投与することによって、治療または予防する方法を含む。さらなる治療方法には、アンジオスタチン、アンジオスタチンフラグメント、アンジオスタチンアナログ、アンジオスタチン抗血清または細胞毒性剤を結合させたアンジオスタチンレセプター作動物質および拮抗物質の投与を含む。なお、アンジオスタチンは動物由来でもヒト由来のものでもよいと理解されるものである。アンジオスタチンは、化学反応または発現システムと連帯する組み換え手法により合成されてもよい。アンジオスタチンは、単離されたプラスミノーゲンまたはプラスミンを酵素で切断させて血管新生活性を有するタンパク質を形成することにより作成することもできる。アンジオスタチンは、また、プラスミノーゲンを切断してアンジオスタチンにする内因性酵素の作用を模倣する化合物によって作成することもできる。アンジオスタチン産生は、また、プラスミノーゲン切断酵素の活性に作用する化合物により調節できる。
アンジオスタチンと特異的に結合する抗体を使用した受動的抗体療法は、生殖、発達、および傷の治癒と組織の修復などの血管新生依存性プロセスの調節に使用することができる。さらに、アンジオスタチン抗体のＦａｂ領域に対する抗血清を投与して、アンジオスタチンと結合する内因性のアンジオスタチン抗血清の作用をブロックすることができる。
また本発明は、患者の内でアンジオスタチンをコードする遺伝子をコントロールするという遺伝子療法も包含する。遺伝子産生タンパク質の発現のために細胞にＤＮＡを移す、または送達する様々な方法、または遺伝子治療と呼ばれる方法が、先行技術としてここに含むGene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo, N. Yang, Crit. Rev. Biotechn. 12(4):335-356 (1992)に開示されている。遺伝子治療には、エクスビボまたはインビボ治療のいずれかで使用するための、体細胞または生殖系細胞内にＤＮＡ配列を組み込むことが含まれる。遺伝子治療は、遺伝子を交換、正常または異常な遺伝子機能を増幅、および感染症や他の病気と戦う作用をする。
これらの医学的問題を遺伝子治療で治療するという手法には、欠陥のある遺伝子を識別した後に機能を有する遺伝子を付与して欠陥遺伝子の機能を代替するか、機能が少しある遺伝子を増幅するといった治療戦略；症状を治療するまたは組織や器官の治療に対する感受性をより高めるような産生タンパク質をコードする遺伝子を付与するといった予防的戦略が含まれる。予防的戦略の一例には、アンジオスタチンなどの遺伝子を患者の体内に導入し血管新生の発生を予防する、または腫瘍細胞の放射線に対する感受性を高める遺伝子を導入してから腫瘍に放射線照射をすれば殺せる腫瘍細胞数が増加するなどがある。
本発明において、アンジオスタチンＤＮＡまたはアンジオスタチン調節配列を導入する多くのプロトコールが想定されている。特にアンジオスタチンに関連して通常見られるものとは異なるプロモーター配列、またはアンジオスタチンタンパク質の産生を増幅させる他の配列の移入も、遺伝子治療の方法として想定されている。この技術の例は、Transkaryotic Therapies, Inc., of Cambridge, Massachusettsにみられるが、これは相同組み換えを使用して細胞内のエリスロポエチン遺伝子を活性化する「遺伝子スイッチ」を挿入するものである。Genetic Engineering News, April 15, 1994を参照のこと。通常の状態でアンジオスタチン（またはアンジオスタチンレセプター）を発現しない細胞内においてアンジオスタチン（またはアンジオスタチンレセプター）を活性化するのに、このような「遺伝子スイッチ」を使用できる可能性がある。
遺伝子治療における遺伝子導入方法は、広く三つのカテゴリーに分類される−物理的方法（エレクトロポーレーション、直接的遺伝子導入および粒子砲撃等）、化学的方法（脂質を基にするキャリア、または他の非ウイルス性ベクター）、および生物学的方法（ウイルス由来ベクターおよびレセプター取り込み）。たとえば、ＤＮＡで被覆したリポソームを含む非ウイルス性ベクターを使用することもできる。このようなリポソーム／ＤＮＡ複合体は、患者に直接に経静脈注入することができる。このリポソーム／ＤＮＡ複合体は肝臓で濃縮され、肝臓でＤＮＡはマクロファージやクッパー細胞に供給されると考えられている。これらの細胞は寿命が長く、従って長期間にわたって供給されたＤＮＡの発現が得られる。さらに、治療用ＤＮＡの標的送達として、ベクターや遺伝子の「むき出し」状態のＤＮＡを、所望の器官、組織または腫瘍に直接注入することもできる。
遺伝子治療の方法論は、供給先によって処方することもできる。基本的な遺伝子の供給方法には、エクスビボ遺伝子導入、インビボ遺伝子導入、およびインビトロ遺伝子導入が含まれる。エクスビボ遺伝子導入においては、細胞が患者から採取され細胞培養で増殖させる。この細胞にＤＮＡを移入し、ＤＮＡを移入された細胞の数を増殖させ、患者に再度移植する。インビトロ遺伝子導入においては、形質転換細胞は、組織培養細胞等の細胞培養で成長させた細胞で、特定の患者から採取された特定の細胞ではない。これらの「実験室細胞」はＤＮＡを導入され、それぞれ患者への移植や他の用途において、導入された細胞が選択、増加される。
インビボ遺伝子導入では、細胞が患者の体内にある状態で患者の細胞内にＤＮＡが導入される。方法には、患者への遺伝子送達に非感染性ウィルスを使用したウィルス媒介遺伝子導入を使用すること、または患者内の治療部位にむき出しのままのＤＮＡを注入し、遺伝子産生タンパク質が発現される細胞の一部にＤＮＡを取り込ませることを含む。さらに、たとえば「遺伝子ガン（gene gun）」の使用などの、ここに記載する他の方法も、アンジオスタチンＤＮＡまたはアンジオスタチン調節配列のインビドロ挿入に使用することができる。
遺伝子治療の化学的方法には、ＤＮＡに細胞膜を通過させて運ぶ脂質を基にする化合物（必ずしもリポソームでなくてもよい）を含んでもよい。負に帯電するＤＮＡに結合する正に帯電する脂肪を基にするイオンであるリポフェクチンまたはチトフェクチンは、細胞膜を通過して細胞内部にＤＮＡを供給できる複合体を形成する。他の化学的方法では、レセプターを基にするエンドサイトシスを使用するが、これには、特定のリガンドと細胞表面のレセプターの結合およびこれを包み込んで細胞膜を通って移動させることが含まれる。リガンドがＤＮＡと結合し、複合体全体が細胞内に移送される。リガンド遺伝子複合体は血中に注入され、レセプターを有する標的細胞が特異的にリガンドと結合してリガンド−ＤＮＡ複合体が細胞内に移送される。
多くの遺伝子治療方法では、細胞内に遺伝子を挿入するのにウィルスベクターを使用している。たとえば、加工されたレトロウィルスベクターは、エクスビボ法において、遺伝子を抹消および腫瘍浸潤リンパ球、肝臓細胞、表皮細胞、筋細胞、または他の体細胞中に遺伝子を導入するために使用されている。これらの加工細胞は、次いで患者に導入され、挿入ＤＮＡによる遺伝子産物を供給する。
ウィルスベクターは、また、インビボプロトコールにおいて細胞に遺伝子を挿入するために使用されている。外部遺伝子の組織特異的な発現を得るために、シス作用性調節要素、または組織特異的であることが判明しているプロモータを使用することができる。または、これは、インビボで、特異的な解剖組織学的部位へのＤＮＡまたはウィルスベクターのｉｎ  ｓｉｔｕ送達により達成できる。たとえば、インビボにおける血管への遺伝子導入は、インビトロで移転された内皮細胞を動脈壁の選択された部位に移植することで得られた。周囲の細胞もウィルスに感染し、遺伝子産物を発現した。たとえばカテーテルなどでウィルスベクターをインビボ部位に直接送達し、一定の部分のみウィルスに感染させて長期的で部位特異的な遺伝子発現を得ることができる。レトロウィルスベクターを使用したインビボ遺伝子もまた、その器官に通じる血管中に加工したウィルスを注入することで、乳房組織および肝臓組織のおいて実証されている。
遺伝子治療プロトコールに使用されているウィルスベクターには、レトロウィルス、ポリオウィルスやＳｉｎｄｂｉｓウィルスなどの他のＲＮＡウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルス、ＳＶ４０、牛痘および他のＤＮＡウィルスなどが含まれるがこれに限定されるものではない。複製欠損マウス  レトロウィルスベクターが、もっとも広範に使用される遺伝子導入ベクターである。マウス白血病レトロウィルスは、タンパク質コア（ｇａｇ）の中に納まり、宿主範囲を決定する糖タンパク質エンベロープ（ｅｎｖ）で周囲を被覆された、一本鎖ＲＮＡと核コアタンパク質とポリメラーゼ（ｐｏｌ）酵素の複合体である。レトロウィルスの遺伝子構造は、５’および３’のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）の間に位置するｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含む。ウィルスの構造タンパク質がイントランスにパッケージング細胞株に供給されれば、５’および３’ＬＴＲおよびパッケージングシグナルを保有する最低限のベクターで、ベクターパッケージング、感染、標的細胞への取り込みを十分に行えるということをレトロウィルスのベクターシステムでは利用している。遺伝子導入におけるレトロウィルスの基本的な利点は、大半のタイプの細胞が有効に感染して遺伝子を発現すること、標的細胞の染色体ＤＮＡ中に正確な単一コピーベクターを挿入できること、およびレトロウィルスゲノムの取扱いが簡単である事が含まれる。
アデノウィルスは、キャプシドタンパク質で周囲を取り囲まれた、コアタンパク質と複合体を形成する直線の二本鎖ＤＮＡからなる。分子ウィルス学における進展により、これらの生物の生理を利用してインビボにおいて標的細胞内に新しい遺伝子配列を導入できるベクターが作成できるようになった。アデノウィルスを基にするベクターは、遺伝子産物ペプチドを高濃度に発現する。アデノウィルスベクターはウィルスの力価が低くても感染効率が高い。さらに、ウィルスは、細胞と離れた状態のビリオンとしても完全な感染力を有するので、産生細胞株への注入が不要である。その他のアデノウィルスベクターに考えられる利点は、インビボにおいて長期間にわたり異種遺伝子の発現が得られることである。
ＤＮＡ送達の機械的方法には、リポソームや他の膜融合のための小胞体などの融合に適した脂質小胞体、リポフェクチンのようなＤＮＡを取り込むカチオン脂質の脂質粒、ＤＮＡのポリリジン−媒介移送、胚や体細胞内へのＤＮＡのマイクロインジェクションなどのＤＮＡの直接注入、「遺伝子ガン」で使用される金粒子などのような空気圧により送達されるＤＮＡ被覆粒子、およびリン酸カルシウムＤＮＡ導入などのような無機化学的方法も含まれる。別の方法であるリガンド媒介遺伝子治療では、特定の細胞や組織にＤＮＡを向かわせるために、ＤＮＡを特定のリガンドと複合させてリガンド−ＤＮＡ抱合体を形成する。
プラスミドＤＮＡを筋肉細胞に注射すると、ＤＮＡ感染し、マーカー遺伝子の持続的に発現する細胞を高い割合で得られることが判明している。プラスミドのＤＮＡは、細胞のゲノムに組み込まれる場合も組み込まれない場合もある。感染ＤＮＡが取り込まれない場合は、最終的に分化した非増殖性の組織において、長期間、細胞またはミトコンドリアゲノム中における突然変異による挿入、欠失、変更の恐れもなく、ＤＮＡ感染および遺伝子産物タンパク質を発現させることができる。永久である必要はないが、長期間にわたる特定の細胞への治療遺伝子の導入は、遺伝子性疾患または予防的使用における治療を可能とする。レシピエント細胞のゲノムに突然変異が起こることなく、遺伝子産物レベルを一定に維持するためにＤＮＡを定期的に再度注射することができる。外因性ＤＮＡが取り込まれないことは、全てのＤＮＡ構築物が様々な遺伝子産物の発現を行う状態で、ひとつの細胞内に数種類の異なる外因性ＤＮＡ構築物の存在を可能とするかもしれない。
粒子媒介による遺伝子導入方法は、始め形質転換植物組織において使用されていた。ＤＮＡで被覆した高密度粒子（金またはタングステンなど）を、標的器官、組織または細胞を貫通できるだけの高速に加速させるための原動力を得るのに、粒子砲撃装置、または「遺伝子ガン」を使用する。粒子砲撃は、インビドロシステムで、またはエクスビボまたはインビボ手法と組み合わせて、細胞、組織または器官にＤＮＡを導入するために使用できる。
遺伝子導入のためのエレクトロポーレーションでは、細胞または組織がエレクトロポーレーション媒介性の遺伝子導入を受けやすくするために、電流を使用する。ＤＮＡ分子が細胞内へと通過できるように膜の透過性を高くするために、所定の電界強度を伴う短い電気インパルスを使用する。この技術は、隠微吐露システムでまたはエクスビボまたはインビボ手法と組み合わせて、細胞、組織または器官にＤＮＡを導入するために使用できる。
外来ＤＮＡを細胞に移入するのに、インビボにおけるキャリア媒介による遺伝子導入を使用できる。キャリアーＤＮＡ複合体は簡単に体液または血流中に導入され、次いで部位特異的に体内の標的器官または組織に向かう。リポソームや、ポリリジン、リポフェクチンまたはチトフェクチンなどのポリカチオンの双方とも使用できる。細胞特異的または器官特異的なリポソームを作成でき、このようにリポソームによって運ばれる外来ＤＮＡは、標的細胞中に取り込まれる。特定の細胞上の特異的なレセプターを標的とする免疫リポソームの注入は、レセプターを保有する細胞へのＤＮＡを導入する簡単な方法として使用できる。これまで使用されてきた別のキャリアシステムは、インビボ遺伝子導入として、ＤＮＡを肝臓細胞に運ぶためのアシアロ糖タンパク質／ポリリジン抱合体システムを使用するものである。
また、ＤＮＡがレシピエント細胞に運ばれた後に細胞質内または核質内に留まるように、導入ＤＮＡを他の種類のキャリアと複合することもできる。特別に作成した小胞複合体中の核タンパク質キャリアとＤＮＡを結合させ、直接核に運搬されるようにすることもできる。
アンジオスタチンの遺伝子調節は、アンジオスタチン遺伝子、またはアンジオスタチン遺伝子に関連したコントロール領域、またはこれに相当するＲＮＡ転写物と結合する化合物を投与して、転写または翻訳の速度を調節することで行える。さらに、インビボでアンジオスタチンを供給する源を提供するために、アンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列を導入した細胞を患者に投与すこともできる。たとえば、アンジオスタチンをコードする核酸配列を含むベクターで細胞を感染させることもできる。ここにおいて使用される「ベクター」という言葉は、特定の核酸配列を含有またはこれに関連し、その特定の核酸配列を細胞内に移送する機能を果たすキャリアのことである。ベクターの例には、プラスミド、およびウィルスなどの感染性微生物、またはリガンド−ＤＮＡ抱合体、リポソーム、脂質−ＤＮＡ複合体などの非ウィルス性ベクターがある。アンジオスタチンＤＮＡ配列からなる組換ＤＮＡ分子は、アンジオスタチンが発現できる発現ベクターを形成するための発現コントロール配列と協働的に結合されていることが望ましい。感染細胞は患者の正常組織由来の細胞でも、患者の疾患組織の細胞でもよく、または患者の細胞でなくともよい。
たとえば、患者から採取した腫瘍細胞を、本発明のアンジオスタチンタンパク質を発現するベクターに感染させ、患者に再度導入することもできる。感染した腫瘍細胞は、患者の体内において腫瘍の生育を抑制できる濃度のアンジオスタチンを産生する。患者はヒトでもヒト以外の動物でもよい。細胞はベクター以外のもの、またはエレクトロポーレーション、イオンポーレーション、または「遺伝子ガン」の使用など、当業で既知の物理的または化学的方法で感染させてもよい。さらに、アンジオスタチンＤＮＡをキャリアの助けなしに、直接患者に注入してもよい。特に、アンジオスタチンＤＮＡは皮膚、筋肉、または血液に注入することができる。
患者にアンジオスタチンを導入するための遺伝子治療プロトコールは、細胞の、またはミニクロゾームのゲノムにアンジオスタチンＤＮＡを組み込むことによるものでも、細胞の細胞質または核質内で別個に複製する、または複製しないＤＮＡ構築物の組み込みによって行うものでもよい。アンジオスタチンの発現は、長期間継続するものでも、細胞、組織または器官内のアンジオスタチンタンパク質濃度、または血中濃度を所望の値に維持するために定期的に注入を繰り返してもよい。
アンジオスタチンは、ＨＰＬＣ  Ｃ４カラム（表３を参照）で単離することができる。アンジオスタチンタンパク質は、アセトニトリル勾配の３０％から３５％において溶出される。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）における、還元条件下、活性を有するタンパク質バンドは、約３８キロダルトンの位置に単一のピークとして溶出される。
発明者らは、転移巣内の血管新生を抑制し、これにより転移巣そのものの成長を阻害するアンジオスタチンを含む内皮細胞増殖に対して特異的な阻害物質が、一次腫瘍の成長中には血流へ放出されていることをすでに証明している。一次腫瘍に伴って放出されるアンジオスタチンの発生源は、知られていない。この化合物は、特異的なプロテアーゼによるプラスミノーゲンの分解により産生されるか、またはアンジオスタチンをコードする特定の遺伝子の発現によってアンジオスタチンが産生される可能性がある。
一次腫瘍が血管を形成する表現型となるのは、血管新生タンパク質の産生が正常細胞の産生する内皮細胞阻害物質に優る場合であるが、この内皮細胞阻害物質は悪性転換中は産生低下調節(down-regulated)を受けると考えられている。個々の腫瘍細胞におけるアンジオスタチンの産生が、親細胞での産生に比較して減少する調節を受けていても、腫瘍全体が産生する阻害物質の総量は、循環系に流入して離れた部位の微小転移巣の内皮成長を抑制するのに十分である可能性がある。アンジオスタチンは、一次腫瘍の放出する血管新生タンパク質よりもずっと長期間にわたり循環系に残存する。このように血管新生タンパク質は局所的に作用するが、アンジオスタチンは全身的に作用し、比較的に長い半減期で血中を循環する。アンジオスタチン半減期はおよそ１２時間から５日である。
以下の仮説に拘束されることを望むものではないが、ある腫瘍が血管新生状態になると、１種類または複数の血管新生タンパク質を放出するが（例、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦなど）、これは局所的に作用し、近隣の一次腫瘍内の内皮を血管外の方向から攻撃するが、循環しない（または短い半減期で循環する）と考えられる。一次腫瘍がその集団を拡大し続けるためには、これらの血管新生タンパク質は、内皮細胞阻害物質（血管新生の阻害物質）の作用に打ち勝つに十分な量を産生される必要がある。いったん、こういった一次腫瘍が順調に成長を始めると、腫瘍は内皮細胞阻害物質を血管中に放出し続ける。この仮説によれば、これらの阻害物質は一次腫瘍から離れた場所で作用し、血管内から転移巣の毛細血管内皮に作用し、循環を続ける。このように、離れた場所にある転移巣がちょうど血管新生を開始しようという時、その近隣の毛細血管内皮は流入するアンジオスタチンにより阻害を受けていることとなる。
一次腫瘍が、循環系に継続的にアンジオスタチンを放出するような大きさにいったん到達すると、二つ目の腫瘍移植片（または微小転移巣）がその血管新生を開始または増大させることは難しい。一つ目の腫瘍の移植の直後に二つ目の腫瘍移植片（たとえば、皮下スペース内、または角膜内、または経静脈的に肺内への移植）を移植した場合は、一つ目の腫瘍は二番目の腫瘍を十分に抑制できない（二番目の腫瘍の血管新生が、十分に開始してしまうため）。二つの腫瘍を同時に移植した場合は（例、両わきなど）阻害物質は互いに同等の阻害効果を有する。
本発明のアンジオスタチンは、
（ｉ）腫瘍を宿すヒトおよび動物に抗血管新生療法として投与される；
（ｉｉ）予後観察のマーカーとして、ヒトおよび動物の血清、尿、または組織中アンジオスタチンをモニターする；
（ｉｉｉ）同じような血管新生分子について、癌患者の血清および尿を分析する基準として使用される。
本発明の一部として、アンジオスタチンは血液または尿などの患者の体液から単離することができ、またはアンジオスタチンは、当業者がよく知る組換えＤＮＡ法または合成タンパク質化学法により作成することができると考えられる。タンパク質精製法は、当業界で広く知られており、アンジオスタチンを精製および阻害物質活性を検定する方法の特別な例は、下記の実施例に記載される。ヒト内因性アンジオスタチンの単離は、同様の手法を使用して行われる。
組換えＤＮＡ手法を使用してアンジオスタチンを生産する方法の一例は、次のステップを伴う、（１）上記の通りおよびさらに詳細には下記の通り、アンジオスタチンを同定および精製、（２）精製した阻害物質のＮ末端アミノ酸配列を決定、（３）前記アンジオスタチン配列の５’および３’ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを合成、（４）ポリメラーゼを使用してアンジオスタチン遺伝子配列を増幅、（５）表現ベクターのような、適切なベクターへ増幅配列を挿入、（６）微生物や阻害物質遺伝子を発現できる他の表現系へ遺伝子を有するベクターを導入、および（７）組み換え技術で産生した阻害物質を単離するステップ。適切なベクターにはウイルス、バクテリアおよび真核細胞の（酵母など）表現ベクターが含まれる。上記の手法は、”Molecular Cloning: A Laboratory Manual”Second Edition by Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, 1989などの実験マニュアルに、詳細にわたり記載されている。ヒトのプラスミノーゲンのＤＮＡ配列は既に公表されており（Browne, M.J., et al.,”Expression of recombinant human plasminogen and aglycoplasminogen in Hela cells”Fibrinolysis Vol.5 (4). 257-260, 1991）、これを本明細書に先行技術として含めた。
アンジオスタチンの遺伝子は、高濃度でアンジオスタチンを発現する細胞または組織（腫瘍細胞など）から、次のように単離することもできる、すなわち、（１）組織からメッセンジャーＲＮＡを単離し、（２）逆転写酵素を使用して、これに相当するＤＮＡ配列を作成し、（３）適当なプライマーとポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）を使用して、活性なアンジオスタチンアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を増幅する方法で単離する。
アンジオスタチン、または生物学的に活性なアンジオスタチンフラグメントを生産するさらに別の方法は、タンパク質合成による方法である。下記にさらに詳細に説明されるアッセイシステムを使用して、生物学的に活性なアンジオスタチンフラグメントをいったん見つけられれば、これを、たとえば、自動タンパク質配列決定法などにより配列決定することができる。または、たとえば、上記の方法などによって、アンジオスタチンをコードする遺伝子またはＤＮＡ配列がいったん分離されれば、当業で広く知られた手動式、または自動式配列決定方法により、ＤＮＡ配列を決定することができる。この場合は、核酸配列からアミノ酸配列に関する情報が得られる。このように、トリプシン消化などの特別な方法で生物学的に活性なフラグメントが作成できれば、またはそのフラグメントのＮ末端の配列が決まれば、残るアミノ酸配列は、これに相当するＤＮＡ配列から決定することができる。
タンパク質のアミノ酸配列が判明すれば、”Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach”E. Atherton and R.C. Sheppard, IRL Press, Oxford, Englandに例示されているなどの当業において広く知られた技術により、フラグメントを合成することができる。同様に、後にそれぞれが結合して、より大きなフラグメントを形成する複数のフラグメントを合成することもできる。これらの合成タンパク質フラグメントは、インビトロおよびインビボでの作動性および拮抗性を試すために、特定の位置にアミノ酸置換を行って作成することもできる。組織に対する親和力が強いタンパク質フラグメントは、アフィニティーカラムにおいて、アンジオスタチンレセプターを分離するのに使用することができる。アンジオスタチンレセプターの分離および精製は、アンジオスタチンの作用機構の解明に向けて基本的なステップである。アンジオスタチンレセプターの単離およびアンジオスタチン作動物質および拮抗物質の同定は、生物学的活性の最終経路である、アンジオスタチンレセプターの活性を調節する薬剤の開発を容易にする。レセプターが単離できれば、ｉｎ  ｓｉｔｕおよび溶液ハイブリダイゼーション技術を使用して、レセプターの位置と合成をモニターする核酸プローブを作成することができる。さらに、アンジオスタチンレセプターの遺伝子を単離し、発現ベクター中に組み込んで親の腫瘍細胞などの細胞に導入し、その細胞タイプ、すなわち組織または腫瘍細胞のアンジオスタチンと結合する能力を増大し局所における血管新生を阻害することができる。
アンジオスタチンは、血管新生の介在する、または血管新生を含む疾患またはプロセスの治療に有効である。本発明は、有効量のアンジオスタチン、または生物学的に活性なアンジオスタチンのフラグメント、または集合して抗血管新生活性を有するアンジオスタチンフラグメント混合物、またはアンジオスタチン作動物質または拮抗物質により血管新生介在性疾患を治療する方法を含む。血管新生介在性疾患には、固形腫瘍；白血病のような血液由来の腫瘍；腫瘍転移巣；たとえば血管腫、聴神経腫、神経繊維芽腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫などの良性腫瘍；リューマチ様関節炎；乾癬；糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、水晶体後繊維増殖、皮膚紅潮などの眼球血管新生疾患；オースラー−ウエ−バ−症候群；心筋血管新生；プラーク血管新生；末梢血管拡張；血友病関節；血管繊維細胞腫；および創傷肉芽などが含まれるが、これに限定されるものではない。アンジオスタチンは、内皮細胞の過剰または異常な刺激による疾患の治療に有効である。これらの疾患には、腸癒着、クローン病、アテローム硬化、強皮症、たとえばケロイドのような過形成瘢痕などがあるが、これに限定されるものではない。アンジオスタチンは、胚の着床に必要な血管新生を防止することにより、バースコントロール薬として使用できる。アンジオスタチンは、ネコ引っ掻き病(Rochele minalia quintosa)および潰瘍（Helicobacter pylori）などのような病理学的帰結として血管新生を起こす疾患の治療に有用である。
アンジオスタチンの合成タンパク質フラグメントには、さまざまな用途がある。高い特異性および結合活性でアンジオスタチンレセプターに結合するタンパク質を放射活性標識して、オートラジオグラフィーまたは膜結合技術を用いて、結合部位の可視化または定量に使用することができる。この応用は、重要な診断および研究手段を与えるものである。アンジオスタチンレセプターの結合特性についての知見は、レセプターに関連する形質導入メカニズムの調査を容易にする。
さらに、アンジオスタチンタンパク質を半減期の短い放射性同位元素で標識することにより、ポジトロンエミッショントモグラフィーや他の最新のラジオグラフィー技術を利用してインビボにおいてレセプター結合部位の可視化が可能となり、アンジオスタチン結合部位を有する腫瘍の位置特定ができる。
これらの合成タンパク質中にシステマティックにアミノ酸置換を行うことで、レセプターに対するアンジオスタチンの結合を促進または減少させる親和性の高いアンジオスタチンレセプターに対する作動物質または拮抗物質を得ることができる。このような作動物質は、微小転移の成長を抑制し、これにより腫瘍の拡散を制限するのに使用される。アンジオスタチンの拮抗物質は、血管新生が不十分でない場合においてアンジオスタチンの阻害作用を遮断し、血管新生を促進する。たとえば、この治療は、糖尿病における損傷修復を促進する治療効果がある。
アンジオスタチンタンパク質は、腫瘍細胞の培養細胞からアンジオスタチンレセプターを単離するアフィニティーカラムの作成に使用される。アンジオスタチンレセプターの単離、精製に次いで、アミノ酸配列をおこなう。この情報をもとに、アンジオスタチンレセプターの遺伝子または遺伝子配列を同定、単離することができる。次に、クローン化した核酸配列を、レセプターを発現する能力のあるベクターに挿入するために作成する。これらの技術は、当業者には広く知られている。アンジオスタチンレセプターをコードする核酸配列の腫瘍細胞への導入、およびＤＮＡ導入された腫瘍細胞によるレセプターの発現は、これらの細胞の内因性または外因性アンジオスタチンに対する反応性を増大し、これにより転移巣の成長速度を低下させる。
リシンなどの細胞毒性物質はアンジオスタチンおよび高い親和性を持つアンジオスタチンタンパク質フラグメントに結合し、アンジオスタチンと結合する細胞を破壊する手段を得ることができる。これらの細胞は、微小転移および一次腫瘍などを含むがこれらに限定されない、多くの部位において見いだされる。細胞毒性物質を結合させたタンパク質は、所望の部位への送達を最大限に行えるような方法で注入される。たとえば、リシンの結合した高親和性アンジオスタチンフラグメントを、標的部位に血液を供給している血管中または標的に直接カニューレで送達する。このような薬剤はまた、インフュージョンカニュレにつなげた浸透圧ポンプを使用してコントロールしながら送達される。いくつかのアンジオスタチン拮抗物質を血管新生刺激物質と同時に投与して、組織の血管形成を増大させることもできる。この治療方法は、転移癌を破壊するのに有効な手法である。
アンジオスタチンは、病気の治療を目的とする他の成分や手法と組み合わせて使用されることもある。たとえば、腫瘍を手術、放射線照射または化学療法といった従来の治療法とアンジオスタチンで治療し、その後、微小転移腫瘍の休止状態を継続させ、残存するすべての一次腫瘍の成長を安定および阻害するために、患者に引き続きアンジオスタチンを投与することもできる。更に、アンジオスタチン、アンジオスタチンフラグメント、アンジオスタチン抗血清、アンジオスタチンレセプター作動物質、アンジオスタチンレセプター拮抗物質またはこれらの組み合わせは、薬学的に許容される賦形剤および任意で生分解性ポリマーなどの徐放性基質と組み合わされて治療用組成物が形成される。
本明細書において、徐放性基質とは、酵素、または酸／塩基加水分解反応、または溶解により分解する材料で、通常はポリマーでできている。いったん体内に挿入されると、この基質は酵素または体液により作用を受ける。徐放性基質は、好ましくは、リポソーム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチド  コ−グリコリド（乳酸とグリコール酸のコポリマー）ポリアンヒドライド、ポリ（オルソ）エステル、ポリタンパク質、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、ポリサッカライド、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、およびシリコンなどの生体適合材料から選択される。好ましい生分解性基質は、ポリラクチド、ポリグリコリド、またはポリラクチド  コ−グリコリド（乳酸とグリコール酸のコポリマー）のいずれかの基質である。
本発明の血管新生を調節する治療用組成物は、固体、液体またはエアロゾルでもよく、および既知のいずれかの投与経路で投与される。固体の治療成分の例には、錠剤、クリーム、植え込み型剤形がある。錠剤は経口投与、治療用クリームは局所投与される。植え込み型投与ユニットは、たとえば腫瘍の部位などに局所的に投与してもよく、または治療用血管新生調節成分を全身に放出するために、たとえば皮下に植え込んでもよい。液体成分の例には、皮下、静脈、動脈注射用の剤形および、局所および眼内投与用剤形を含む。エアロゾル剤形の例には、肺への投与のための吸入用剤形が含まれる。
また、本発明アンジオスタチンは、阻害物質およびそのレセプターに特異的な抗体を作成するのに使用できる。前記抗体は、ポリクローナルでもモノクローナル抗体のいずれでもよい。アンジオスタチンまたはアンジオスタチンレセプターに特異的に結合するこれらの抗体は、体液または組織のアンジオスタチン、またはアンジオスタチンレセプターの検出または定量を目的とする、当業者に広く知られている診断方法およびキットにおいて使用することができる。これらの検査の結果は、癌および他の血管新生介在性疾患の発生または再発を、診断または予想するのに使用できる。
アンジオスタチンはまた、アンジオスタチンに結合する能力を有する抗体を、検出および定量する診断方法、およびキットに使用することができる。これらのキットは、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて一次腫瘍が分泌するアンジオスタチンの存在下における微小転移腫瘍の拡散を示す、血中のアンジオスタチン抗体の検出を可能とするであろう。こういった抗アンジオスタチン抗体が血中にある患者では、多発性腫瘍および癌を発症する可能性が高く、治療後または寛解期間の後に癌が再発する可能性が高い。これらの抗アンジオスタチン抗体のＦａｂフラグメントは、抗アンジオスタチン抗体を中和するのに使用することができる抗アンジオスタチンFabフラグメント抗血清を作成するにあたり、抗原として使用することができる。このような方法は、抗アンジオスタチン抗体による血中アンジオスタチンの排除を低下させ、血中アンジオスタチン濃度を有効に上昇させる。
本発明の他の構成は、過剰の内因性アンジオスタチンの作用を遮断する方法である。これは、システム中の好ましくないアンジオスタチンに対して特異的な抗体でヒトまたは動物に受動的に免疫を与えることで行える。この治療は、異常な排卵、月経、胎盤形成、および血管形成の治療において重要である。これは、転移プロセスにおけるアンジオスタチン排除の効果を調べるにあたり、有用な手段を提供するものである。アンジオスタチン抗体のＦａｂフラグメントには、アンジオスタチンとの結合部位が含まれる。このフラグメントは、当業者において既知の技術を使用してアンジオスタチン抗体から単離される。アンジオスタチン抗血清のＦａｂフラグメントは、抗Ｆａｂフラグメント血清の産生を開始させるための抗原として使用される。アンジオスタチンのＦａｂフラグメントの抗血清を点滴すれば、アンジオスタチンのアンジオスタチン抗体との結合を防止ででる。治療効果は、アンジオスタチンと抗アンジオスタチンのＦａｂフラグメントの結合を遮断することで内因性抗アンジオスタチン抗体を中和することにより得られる。この治療の純効果は、内因性血中アンジオスタチンが標的細胞に到達することを容易にし、これにより転移の拡散を減少させるものである。
なお、本発明は、内皮形成阻害活性を有するアンジオスタチンのすべての誘導体を含有すると考えられる。本発明は、完全なアンジオスタチンタンパク質、アンジオスタチンタンパク質の誘導体、および生物学的活性なアンジオスタチンタンパク質のフラグメント全体を含む。これらには、アミノ酸置換、またはアミノ酸基に糖または他の分子が結合するアンジオスタチン活性を有するタンパク質が含まれる。また、本発明は、アンジオスタチンおよびアンジオスタチンレセプターをコードする遺伝子、およびこれらの遺伝子により発現されるタンパク質を含む。
上記のアンジオスタチン活性を有するタンパク質およびタンパク質フラグメントは、当業者に既知の製剤方法を使用した薬学的に許容される剤形で、単離および高度に精製されたタンパク質、およびタンパク質フラグメントとして提供することができる。これらの剤形は、標準的な経路で投与することができる。一般に、この組み合わせ物は、局所、経皮、腹腔内、頭蓋内、脳室内、膣内、子宮内、経口、直腸、または非経口（たとえば、静脈内、髄腔内、皮下、または筋肉内）経路で投与することができる。さらに、アンジオスタチンは、これを徐放させるような生分解性ポリマー中に含有させることもでき、前記ポリマーを、薬剤送達が必要とされる場所、たとえば腫瘍の部位の周辺に、またはアンジオスタチンが全身的に徐々に放出されるように植え込むこともできる。直接に転移癌成長部位中にまたはその腫瘍への供給血管中への送達など、目的の部位にカニューレを使用して、高濃度のアンジオスタチンをコントール下で送達するために浸透圧ミニポンプもまた使用される。生分解性ポリマーおよびその使用途は、たとえば、本明細書中に先行技術として全体を含めている、Brem et al., J. Neurosurg. 74:441-446 (1991)に詳細に記載される。
本発明のアンジオスタチンの用量は、疾患の状態、または治療する症状、および体重およびヒトまたは動物の状態、および薬剤の投与経路などの他の臨床的要因によって決められる。ヒトおよび動物の治療においては、およそ０．５ｍｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇの間のアンジオスタチンが投与できる。その特定の動物またはヒト内におけるアンジオスタチンの半減期により、アンジオスタチンは１日数回から１週間に１回までの割合で投与される。なお、本発明は、ヒトおよび動物における使用の双方への適用があることが理解される。本発明の方法は、単独および複数投与、同時または長時間にわたるものを想定している。
アンジオスタチン剤形には、口、直腸、眼（ガラス体内または眼房内を含む）、鼻、局所（頬および舌下を含む）、子宮内、膣、非経口（皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮内、頭蓋内、気管内および硬膜外を含む）投与に適切なものを含む。アンジオスタチン剤形は、便利なように、用量単位の剤形にしたり、従来の薬学上技術を使用して調製できる。このような技術には、活性成分および薬学的キャリアまたは賦形剤を混合する段階を含む。一般に、製剤は、均一かつ丁寧に、活性成分と液体キャリア、または細かくした固体キャリアまたはその双方とを混合し、それから、必要があれば製剤を成形して調製される。
非経口投与に適当な剤形には、水溶性または非水溶性滅菌注射液で、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を投与対象者の血液と等張とするための溶質を含んでもよい注射液；および水溶性または非水溶性滅菌懸濁液で、懸濁剤と粘ちょう化剤を含んでもよい。製剤は、１回用量または複数用量が入る容器、たとえば、密封アンプルおよびバイアルなどに入って提供されてもよく、および使用の直前に滅菌液体キャリア、たとえば注射用水などを加えるだけでよい、凍結乾燥状態で保存することもできる。即席の注射溶液および懸濁液は、先に記載したようなものの滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製できる。
好ましい１回用量剤形は、投与成分の１日分の用量または単位、１日分のサブドース、またはこれの適当な画分を含むものである。なお、投与成分に加えて、特に上記のように、本発明の剤形には、該当する剤形の種類によって当業で従来より使用される他の薬剤を含むものである。患者に二元的な治療を提供するために、必要に応じて、細胞毒性物質を、アンジオスタチンタンパク質または生物学的に機能を有するこれのタンパク質フラグメントに混合または結合することもできる。
本発明の血管新生阻害タンパク質は、標準的なマイクロケミカル設備で合成することができ、純度はＨＰＬＣおよびマススペクトロフォトメトリーで確認できる。タンパク質合成、ＨＰＬＣ精製およびマススペクトロフォトメトリーの方法は、一般に当業で知られているものである。また、アンジオスタチンタンパク質およびアンジオスタチンレセプタータンパク質は、組み換え大腸菌または酵母菌表現系において産生され、カラムクロマトグラフィーで精製される。
これに限定されないが、以下を含むいくつかの応用用途のために、完全なアンジオスタチン分子から各種のタンパク質フラグメントを合成することができる；特異的抗血清の作成のための抗原として、アンジオスタチン結合部位において活性な作動物質および拮抗物質として、アンジオスタチンと結合する細胞を狙って殺すための細胞毒性物質と結合、またはこれと組み合わせて使用するタンパク質としての用途。これらのタンパク質を含むアミノ酸配列は、アンジオスタチン分子の外側領域のその位置を基に選択され、抗血清との結合を利用できる。アンジオスタチンのアミノおよびカルボキシ末端、および分子の中央部分は、合成されるフラグメントのなかにそれぞれ別に表現される。
これらのタンパク質配列は、ゲンバンクブルックヘブンプロテイン(GenBank Brookhaven protein, SWISS-PROT)およびＰＩＲなどのタンパク質配列データベースを使用して、配列相同性の可能性を検討するために、既知の配列と比較される。この情報により、他の分子との配列相同性が高い配列を排除することができ、特異性の高いアンジオスタチンの抗血清、作動物質、拮抗物質を開発できる可能性を高めている。
アンジオスタチンおよびアンジオスタチン由来タンパク質は、標準的な方法を使用して他の分子と結合することができる。アンジオスタチンのアミノおよびカルボキシ末端の双方ともに、チロシンとリジン残基を有し、たとえば、従来技術を使用した放射活性標識などの多くの技術でアイソトープまたはアイソトープ以外の標識が付与される（チロシン残基−クロラミンＴ、ヨードゲン、ラクトペルオキシダーゼ；リジン残基−ボルトン−ハンター試薬）。これらのカップリング技術は、当業者には広く知られているものである。また、これらの残基を持たないフラグメントにチロシンまたはリジンを付与して、タンパク質上の反応性のアミノおよびヒドロキシル基の標識付与を行いやすくできる。カップリング手法は、スルフヒドラル、カルボキシル、アミド、フェノール、およびイミダゾールを含むがこれに限定されないアミノ酸上で利用できる機能基によって選択される。これらのカップリングを行うには、様々な試薬が使用されるが、その中には、グルタルアルデヒド、ジアゾ化ベンジジン、カルボジイミドおよびｐ−ベンゾキノンが含まれる。
アンジオスタチンタンパク質は、アイソトープ、酵素、キャリアタンパク質、細胞毒性物質、蛍光分子、ケミルミネセンス、バイオルミネセンスおよびその他の様々な用途のための化合物と化学的にカップリングされる。カップリング反応の効率は、その特定の反応に適切なそれぞれの手法によって測定される。たとえば、アンジオスタチンタンパク質を125Ｉで放射標識するには、クロラミンＴと比活性の高いＮａ125Ｉを使用して行う。反応はメタ重亜硫酸ナトリウムで停止させ、反応混合物は使い捨てカラムで脱塩する。標識されたタンパク質をカラムから溶出し画分を回収する。各画分から一部を採取し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。このようにして、未反応のＮａ125Ｉを、標識済アンジオスタチンタンパク質から分離する。最も高い比放射活性を示したタンパク質画分を、アンジオスタチン抗血清に対する結合能力の分析などの後の使用のために保管する。
タンパク質抱合体の他の応用は、ポリクローナル抗血清の製造である。たとえば、リジン残基を有するアンジオスタチンタンパク質を、グルタルアルデヒドを使用して精製ウシ血清アルブミンに結合する。反応の効率は、放射標識タンパク質の取り込みを測定して判断する。未反応のグルタルアルデヒドおよびタンパク質は、透析で分離する。抱合体は後の使用のために保管する。
アンジオスタチンに対する抗血清、アンジオスタチンアナログ、アンジオスタチンのタンパク質フラグメントおよびアンジオスタチンレセプターを作成することができる。タンパク質の合成および精製後、当業者に既知の確立された手法で、モノクローナルおよびポリクローナル抗血清を作成する。たとえば、ポリクローナル抗血清は、ウサギ、ヒツジ、ヤギまたは他の動物において作成される。ウシ血清アルブミンなどのキャリア分子と抱合されたアンジオスタチンタンパク質、またはアンジオスタチン自身を、アジュバンド混合液と混合してエマルジョンを作成し、背中、首、わき腹、および場合によっては足の裏の複数の部位に皮下注射する。ブースター注射は、２から４週間毎など、一定の期間毎におこなう。採血は、たとえば、拡張後の耳末梢静脈を使用した静脈穿刺により、各回の注射から約７から１０日後におこなう。血液サンプルは、摂氏４度で一晩凝固させた後、摂氏４度、３０分間、約２，４００Ｘｇで遠心分離する。血清を回収し、小分けにし、直ちに使用する場合は摂氏４度で、後の分析用には摂氏マイナス２０からマイナス９０度にて保存する。
ポリクローナル抗血清の形成の全ての血清サンプルおよびモノクローナル抗血清の産生培地サンプルは、抗体価を測定する。抗体価は、いくつかの方法、たとえばドットブロットおよび密度分析を使用したもの、およびプロテインＡ，二次抗血清、冷エタノールまたは木炭−デキストランを使用した放射活性タンパク質−抗体複合体の沈降と引き続くガンマカウンタ−による活性測定など、によって測定される。また、最も抗体価の高い抗血清は、市販のアフィニティーカラムで精製する。アンジオスタチンタンパク質は、アフィニティーカラム内のゲルにカップリングされる。抗血清サンプルをカラムに通すと、抗アンジオスタチン抗体はカラムに結合して残る。これらの抗体を次いで溶出して回収し、力価測定と特異性について評価する。
最も抗体価の高い抗血清は、以下について評価する；ａ）抗原の特異的結合が最大で非特異的結合が最小となる最適な抗血清希釈倍率、ｂ）標準置換曲線における斬増するアンジオスタチンタンパク質との結合能力、ｃ）プラスミノーゲンおよび関連する種のアンジオスタチンを含む関連タンパク質およびタンパク質との交差反応の可能性、ｄ）血漿、尿、組織および培養細胞培地の抽出物中のアンジオスタチンタンパク質に対する検出能力。
アンジオスタチンおよびアンジオスタチンレセプターの測定用キットもまた、本発明の一部であると考えられる。最大の抗体価および特異性を有し、血漿、尿、組織および培養細胞培地の抽出物中のアンジオスタチンタンパク質を検出できる抗血清は、アンジオスタチンの迅速、高信頼性、高感度、および特異的な測定および位置特定をおこなう使用が簡便なキットを作成するためにさらに検討される。これらのアッセイキットは、以下の技術を含むがこれに限定されるものではない；競合および非競合的アッセイ、ラジオイムノアッセイ、バイオルミネセンスおよびケミルミネセンスアッセイ、フルオロメトリックアッセイ、サンドイッチアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ドットブロット、ＥＬＩＳＡなどの酵素結合アッセイ、マイクロタイタープレート、尿または血液の迅速なモニタリング用の抗体でコーティングしたストリップまたはディップスティック、およびイムノチトケミストリー。各キットの範囲について、アッセイの感度、精度、信頼性、特異性、および再現性を確立する。標準置換曲線の２０％、５０％および８０％地点において、アッセイ内およびアッセイ間の変動を確立する。
研究および臨床で一般に使用されるアッセイキットの一例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）キットである。アンジオスタチンＲＩＡを、以下に説明する。アンジオスタチンまたはアンジオスタチンタンパク質への放射性ヨウ素付与および精製をきちんと行った後、最大の抗体価を有する抗血清を数種類の希釈倍率にして、適当な緩衝液システム中に比較的一定量の放射活性、１０，０００ｃｐｍなどを添加した試験管中に添加する。他の試験管に緩衡液または免疫前の血清を入れて、非特異的な結合を測定する。摂氏４度で２４時間インキュベーションした後、プロテインＡを添加し、試験管を浸透し、室温で９０分間インキュベートし、摂氏４度、約２，０００〜２，５００Ｘｇで遠心分離し、標識抗原に結合した抗体の複合体を沈殿させる。上清を吸引して除去し、沈殿物中の放射活性をガンマカウンターで測定する。非特異的結合を差し引いた後、標識タンパク質の約１０から４０％と結合した希釈倍率の抗血清についてさらに検討を行う。
次に、抗血清の作成に使用したある希釈範囲（約０．１ｐｇから１０ｎｇ）のアンジオスタチンタンパク質を、既知の量のこのタンパク質を、放射活性タンパク質および抗血清を入れた試験管に添加して評価する。さらにたとえば、２４から４８時間インキュベートした後、プロテインＡを添加し、試験管を遠心分離にかけ、上清を除去し、沈殿物の放射活性を測定する。放射標識をしないアンジオスタチンタンパク質（標準品）による放射標識アンジオスタチンタンパク質結合の置換から、標準曲線が得られる。数種類の濃度の他のアンジオスタチンタンパク質フラグメント、プラスミノーゲン、異なる種のアンジオスタチン、および相同なタンパク質をアッセイ試験管に添加して、アンジオスタチン抗血清の特異性を確認する。
一次および二次腫瘍、ルイスラット肺癌、アンジオスタチン産生細胞培養物、胎盤、子宮および、脳、肝臓、および小腸などの他の組織を含むがこれに限定されない、様々な組織の抽出物を、アンジオスタチンを抽出する為に継続的に用いられている抽出手法を使用して調製する。組織抽出物を凍結乾燥またはスピードバックした後、アッセイ緩衡液を添加して各量をＲＩＡ試験管に入れる。既知のアンジオスタチン産生細胞の抽出物は、標準曲線と並行する置換曲線を描いたが、一方、アンジオスタチンを産生しない組織の抽出物は、アンジオスタチン抗血清において放射標識されたアンジオスタチンと置換しなかった。さらに、ルイスラット肺癌を有する動物から得た尿、血漿、および脳脊髄液を、斬増量でアッセイ試験管に添加した。並行の置換曲線は、組織および体液中のアンジオスタチンを測定するアンジオスタチンアッセイの有用性を示す。
アンジオスタチンを含有する組織抽出物は、さらに、その一部を逆相ＨＰＬＣにかけて確認をした。溶出画分を回収し、スピードバックで乾燥させ、ＲＩＡ緩衡液で再構成しアンジオスタチンＲＩＡで分析した。最大のアンジオスタチン免疫活性は、アンジオスタチンの溶出ポジションに相当する画分中に存在した。
アッセイキットは、手引き書、抗血清、アンジオスタチンまたはアンジオスタチンタンパク質および場合によっては、放射標識アンジオスタチンおよび／または結合アンジオスタチンアンジオスタチン抗体複合体の沈殿用の試薬を提供するものである。キットは腫瘍を持つ、または持たない動物およびヒトの生物学的液体および組織抽出物中のアンジオスタチンの測定に有用である。
他のキットは、組織および細胞中のアンジオスタチンの位置特定に使用される。このアンジオスタチン免疫組織化学キットでは、手引き書、アンジオスタチン抗血清、および場合によっては、遮断血清（ブロッキング血清）およびフルオレセインイソチオシアネートなどの蛍光分子または一次抗血清を可視化するのに使用される他の試薬を結合された二次抗血清を提供する。免疫組織化学技術は、当業者においては広く知られている。このアンジオスタチン免疫組織化学キットでは、光学および電子顕微鏡の双方を使用して、組織切片および培養細胞中のアンジオスタチンの位置を特定できる。これは研究および臨床用のどちらにも使用できる。例えば、腫瘍を生検または採取し、アンジオスタチン産生部位を検査するために組織切片をミクロトームで切除する。このような情報は、腫瘍の発見と治療において、診断および場合によっては治療において有用である。アンジオスタチンの生合成部位を可視化する他の方法には、アンジオスタチンメッセンジャーＲＮＡをプローブとするｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、核酸を放射標識する方法がある。同様に、免疫組織化学技術を使用して、アンジオスタチンレセプターの位置を特定し、可視化、定量することができる。
本発明は、以下の実施例によりさらに詳細に説明されるが、これらの実施例はどのような場合でも本発明の特許請求の範囲を限定すると解釈されるものではない。なお、反対に他の実施例、変更およびこれの均等物によることもでき、それは、この説明を読めば、本発明の精神および／または添付の請求の範囲を外れる事なく、当業者に連想されるものであることが明らかである。
実施例１
転移巣の成長が一次腫瘍によって阻害され、一次腫瘍の切除で促進される動物−腫瘍システムの選択
自身の転移を阻害する能力のある様々なマウスの腫瘍をスクリーニングして、ルイスラット肺癌を選択した。この癌において最も有効に肺転移を阻害するのは、一次腫瘍である。同系Ｃ５７ＢＩ６／Ｊ６週齢オスのマウスに１ｘ１０6の腫瘍細胞を注射（背部皮下）した。肉眼で確認できる腫瘍が始めて出現したのは、３〜４日後であった。腫瘍の大きさが約１，５００ｍｍ3に達した時、マウスを２つのグループに無作為に分けた。１つのグループでは腫瘍を完全に切除し、２つ目のグループでは疑手術をおこなって腫瘍はそのまま残した。転移巣の成長を阻害するのは、大きさ５００から３，０００ｍｍ3の腫瘍であるが、高い生存率で局所再発を起こさずに安全に切除できる一次腫瘍の大きさは、最大で１，５００ｍｍ3である。
２１日後、全てのマウスを屠殺し、剖検をおこなった。一次腫瘍をそのまま残したマウスでは、４＋２の肉眼で確認できる転移巣があったのに対して、腫瘍を切除したマウスでは５０＋５の転移巣があった（ｐ＜０．０００１）。これらのデータは、以前に証明されているように、腫瘍の大きさと密接に相関する肺重量によっても確認された。腫瘍をそのまま残したマウスに比較して、腫瘍を切除したマウスの肺の湿重量は、４００％大きかった。（ｐ＜０．０００１）
この実験モデルは、再現性のあるデータを与え、記載の実験は再現性があった。この腫瘍は、「ルイスラット肺癌−低転移性」（ＬＬＣ−Ｌｏｗ）と名付けられた。この腫瘍はまた、ＢおよびＴリンパ球を欠損するＳＣＩＤマウスにおけるのとほとんど同一のパターンで転移を抑制した。
実施例２
一次腫瘍除去の有無に関係なく、高い転移性を有するルイスラット肺癌腫瘍の変異種の単離
実施例１のひとつのグループのマウスのＬＬＣ−Ｌｏｗ細胞株から、ルイスラット肺癌の転移性の高い変異種が自然発生的に生じた。これを実施例１に記載の方法にしたがって単離し、再度移植した。この腫瘍（ＬＬＣ−Ｈｉｇｈ）は、一次腫瘍の有無に関係なく３０箇所以上の肉眼で確認できる肺転移巣を形成した。
実施例３
転移巣の大きさおよびその中の腫瘍細胞の増殖速度。転移を阻害する一次腫瘍の作用（ＬＬＣ−Ｌｏｗ）
全ての実験において、Ｃ５７ＢＩ６／Ｊ６マウスを使用した。マウスの皮下に、ＬＬＣ−Ｌｏｗ細胞を接種し、１４日後に半数のマウスの一次腫瘍を切除した。腫瘍切除から５、１０、１５日後にマウスを屠殺した。肺転移巣の組織学的切片を採取した。一次腫瘍をそのまま残したマウスには、肺に血管新生のない微小転移巣があった。これらの転移巣は、直径が１２〜１５細胞層以内で、腫瘍切除から１５日後でさえも有意に増大しなかった。これに対して、一次腫瘍を切除したマウスでは、手術後５日ですでに血管新生した大きな転移巣が出現していた。これらの転移巣は、腫瘍除去後１５日目には、（肺重量および組織学的検査に反映されるように）さらに４倍に大きくなった。一次腫瘍を切除したマウスのうちおよそ５０％が、実験が終了する前に肺転移で死亡した。一次腫瘍をそのままにしたマウスはすべて、実験の終了まで生存していた。
転移巣内の腫瘍細胞の複製速度は、事前にマウスに注射したＢｒｄＵに染色された核を数えることて測定した。一次腫瘍を切除しないマウスにおいて、ＢｒｄＵを取り込んだ腫瘍細胞の割合が高かったのは小型の無血管性転移巣であったが、一次腫瘍を切除したマウスでは、血管新生中の大きな転移巣で同程度のＢｒｄＵの取り込みが観察された（図３）。この所見は、一次腫瘍の存在は、転移内の腫瘍細胞の複製速度に直接の影響を与えないことを示唆する。
図３において、左のパネルは、一次腫瘍の有無における肺の腫瘍細胞のＢｒｄＵラベリングインデックスを示す。免疫組織化学的染色に先立ち、切片は０．２Ｍ  ＨＣｌで１０分間、透過化し、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2中、１μｇ／ｍｌのプロテナーゼＫ（ベーリンガーマンハイムＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）で摂氏３７度で１５分間消化した。ラベリングインデックスは、２５０倍、陽性核の割合をカウントして判断する。図３の右のパネルは、一次腫瘍を切除しない、または手術後５、１０、１５日に一次腫瘍を切除した場合の腫瘍の肺総重量の分析を示す。マウスは、ＢｒｄＵ（０．７５ｍｇ／マウス）の腹腔内注入から６時間後に屠殺された。
実施例４
無傷の一次腫瘍の存在下における肺転移巣中の血管新生の阻害
肺転移巣における血管新生の程度を測定するために、フォン・ヴィレブランド(ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ)因子（内皮に特異的なマーカー、ダコ社カーペンテリア、カリフォルニアにて入手可能）に対する抗体で組織を染色した。無傷の一次腫瘍を有する動物の転移巣では、既存の肺血管の周囲に薄いカフ（８〜１２個の腫瘍細胞の層）が形成されていた。血管の内側を覆う内皮細胞を除いて、フォン・ヴィレブランド因子に対して陽性な細胞はほんのわずか、または存在しなかった。これと反対に、一次腫瘍切除後５日目の動物における肺転移巣は、大きいばかりでなく、フォン・ヴィレブランド因子で強く染色された内皮細胞を含む毛管肉芽で浸潤されていた。
肺転移巣中の内皮細胞の存在に関する免疫組織化学的分析においては、接種後１９日の無傷の一次腫瘍を伴う肺転移巣には、既存の微小血管の周囲を腫瘍細胞がカフに取り囲んでいた。転移巣は、最大で８から１２個の細胞層までであった。微小血管の周囲に血管新生の証拠はなく、新しい微小血管は観察されなかった。これは、血管新生前の段階の最大の大きさの無血管性の転移巣の典型であった。
一次腫瘍を切除してから５日後（一次腫瘍の接種後１９日）に採取された組織の免疫組織化学的分析では、肺において既存の血管の周囲を転移巣が取り囲んでいた。一方、一次腫瘍を切除しなかったサンプルでは、腫瘍は血管新生していた。このように無傷の一次腫瘍は、転移巣における新たな毛細血管の形成を阻害するが、転移巣内の腫瘍細胞の増殖は一次腫瘍による影響を受けない。
実施例５
マウス角膜において、一次腫瘍は移植された二次腫瘍の血管新生を抑制する。この二つ目の腫瘍の成長は阻害される。
０．２５から０．５ｍｍ2のルイスラット肺癌（ＬＬＣ−Ｌｏｗ）を、第０日にマウスの角膜に移植した。（Muthukkaruppan Vr., et al., Angiogenesis in the mouse cornea. Science 205:1416-1418, 1979）一次腫瘍は、角膜への移植の４または７日前；角膜への移植の日；角膜への移植の４または７日後のいずれかに、１ｘ１０6個のＬＬＣ−Ｌｏｗ細胞を背部の皮下に接種して形成させた。対照マウスは角膜移植は受けたが皮下腫瘍の接種は受けなかった。他の対照マウスは、角膜移植と角膜移植の４日まえに背部にＬＬＣ−Ｈｉｇｈ腫瘍細胞の接種をおこなった。角膜は、角膜腫瘍の成長（接眼マイクロメーターで測定した）および角膜縁の端からの新しい毛細血管の成長について、スリットランプ立体顕微鏡で毎日検査した。
一次皮下腫瘍を宿さない対照マウスでは、大半の角膜（６／８）で角膜移植後６から７日目から血管新生がはじまっており、１０日目まで続いた。１０日目までに、血管新生した角膜腫瘍は、全眼の容積の約四分の一にまで到達していた。一次皮下ＬＬＣ−Ｌｏｗ腫瘍がある場合は、角膜移植の最低４日前までに一次腫瘍を形成させていた場合は、角膜移植片は血管新生していなかった（表１）。血管新生がない場合は、角膜腫瘍は、角膜内で薄い白色の無血管性円板として緩慢に成長した。
しかし、角膜の移植から４日経過する前に一次腫瘍を移植しなかったた場合は、角膜は血管新生し、３／３の角膜腫瘍は、腫瘍を宿さない対照と同じ速度で成長した。ＬＬＣ−Ｈｉｇｈの皮下一次腫瘍がある場合は、大半の角膜（２／３）が、角膜移植後７日目に血管新生を開始し１０日目まで続いた。ここでもまた、１０日目までに、血管新生した角膜腫瘍は、全眼の容積の約四分の一にまで到達していた。
0003787157.tif 000002
眼腫瘍移植の７日前に一次ＬＬＣ−Ｌｏｗ皮下腫瘍が移植された場合（すなわち−７）は、０／１０の角膜において血管新生があると予想される。しかし、腫瘍のうち２つは（２／１０）は、大きすぎたために（３ｃｍ3超）壊死性となった。
実施例６
無傷の一次腫瘍は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の二次皮下移植片に誘導される血管新生を阻害する。
実施例４および５は、一次腫瘍が、二次転移巣中における血管新生を阻害することを記載しているが、これらの研究は、一次腫瘍が：（ｉ）直接、あるいは（ｉｉ）転移腫瘍細胞の血管新生活性を低下調節することにより間接的に、内皮増殖（または血管新生）を阻害しているのかを明らかにしていない。これらの二つの可能性の違いを明確にするために、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含有するマトリゲルの移植により、皮下血管新生の病巣を誘導した。(Passaniti A, et al., A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and anti-angiogenic agent using reconstituted basement membrane, heparin and fibroblast grwoth factor. Lab.Invest. 67:519,1992)
ヘパリン存在下、２５または５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有するマトリゲル（基底膜タンパク質の抽出物）を、正常なマウスおよび腫瘍を宿すマウス（ＬＬＣ−Ｌｏｗ）の腹面に皮下注射した。４日後にマウスを屠殺し、ゲル中のヘモグロビン濃度を測定して血管新生を定量した。マトリゲルに入った新しい血管数がヘモグロビン濃度に相関することは、以前に証明されている。（Folkman J., Angiogenesis and its inhibitiors in”Important Advances in Oncology 1985”, VT DeVita, S. Hellman and S. Rosenberg, editors, J.B. Lippincott, Philadelphia 1985）組織学的調査のために、他にいくつかのゲルを用意した。正常マウスでは、５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有するマトリゲル沈殿物は、完全な赤色である。これは、新たな毛細血管が濃密に広がり、２．４ｇ／ｄｌのヘモグロビンを含んだ。ｂＦＧＦを含まないマトリゲルは、透明の灰色で、ヘモグロビン含有量はわずか０．４ｇ／ｄｌである（６倍の差）。これに対して、一次腫瘍を有するマウスから得たマトリゲルには、０．５ｇ／ｄｌのヘモグロビンしか含まれなかった（図４）。
この実験におけるほぼ完全な血管新生の阻害は、ルイスラット肺の一次腫瘍の存在は、ｂＦＧＦの誘導する血管新生を直接阻害することを示唆する。
実施例７
一次腫瘍を除去した動物への、腫瘍を宿す動物から得た血清の導入は、転移を抑制する。
マウスにルイスラット肺癌を上記のように移植した。１５日後、腫瘍の大きさが約１，５００ｍｍ3の時、マウスを無作為に４つのグループに分けた。３つのグループでは、一次腫瘍を外科的に完全に切除した；一つのグループでは（偽手術手順を行った後）腫瘍をそのまま残した。３つの切除グループのマウスは、その後、毎日、生理食塩水、正常で腫瘍を宿さないマウスから得た血清、または１，５００ｍｍ3のルイスラット肺癌を宿すマウスから得た血清の腹腔内注射を受けた。腫瘍をそのまま残したマウスのグループは、生理食塩水の腹腔内注射を受けた。全てのマウスは、２１日間処置後、安楽死させ、肺転移巣を計数した（表２）。
0003787157.tif 000003
結果は、肺重量で確認された。ふたつのグループ間の差はｐ＝＜０．０００１「（５５と５０）対（７と３）」。同様の結果は、腫瘍を宿す動物の尿中のアンジオスタチンを使用して得られている。
実施例８
ウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞アッセイ
ＢＣＥ細胞は、９継代から14継代の間のもののみ使用される。０日目に、ＢＣＥ細胞をゼラチンを入れた（ＰＢＳ中１．５％ゼラチン、摂氏３７度、１０％ＣＯ2で２４時間後、０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄）２４ウエルプレートに、１２，５００細胞／ウエルの濃度で撒く。細胞数の計数には、ヘモサイトメーターを使用する。１０％の加熱不活性化（摂氏５６度、２０分間）子ウシ血清と１％グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン（ＧＰＳ）を含有する５００μｌのＤＭＥＭ中に懸濁した細胞をプレートに撒く。
ＢＣＥ細胞に、以下のチャレンジを行う：培養液を除去し、２５０μｌのＤＭＥＭ／５％ＢＣＳ／１％ＧＰＳに置き換える。次にテストするサンプルをウエルに入れる。（量は、テストするサンプルによって異なる）プレートを摂氏３７度／１０％Ｃｏ2に約１０分置く。２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含む２５０μｌのＤＭＥＭ／５％ＢＣＳ／１％ＧＰＳを各ウエルに添加する。最終的な培養液は、１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含む５００μｌのＤＭＥＭ／５％ＢＣＳ／１％ＧＰＳとなる。プレートを摂氏３７度／１０％Ｃｏ2インキュベータに戻し、７２時間置く。
４日目に、培養液を除去して、その後すべてのウエルを２から３分間トリプシン消化して（０．５ｍｌ、トリプシン／ＥＤＴＡ）細胞を計数する。懸濁した細胞を９．５ｍｌのヘミトールを入れたシンチレーションバイアルに移し、コールターカウンターを使用して計数する。１活性単位とは、内皮細胞をｂＦＧＦ１ｎｇ／ｍｌ中で７２時間インキュベートした場合に、毛細血管内皮増殖の最大限の半分の阻害の効果を与えるアンジオスタチンを含有する血清量である。
実施例９
低転移性のルイスラット肺腫瘍（ＬＬＣ−Ｌｏｗ）を宿すマウスから得た血清は、インビトロにおける毛細血管内皮細胞増殖を阻害する。
７２時間増殖アッセイにおいて、ウシ毛細血管内皮細胞は、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ１ｎｇ／ｍｌ）により刺激を受けた。腫瘍を宿すマウスから得た血清をこれらの培養物に添加すると、用量依存および可逆的に内皮細胞の成長を阻害した。正常血清は阻害性がなかった（図５）。内皮細胞の増殖は、腫瘍を宿すｎｕ／ｎｕマウスおよびＳＣＩＤマウスから得られた血清によっても同様に（対照と比較して）阻害された。一次腫瘍を除去すると、３〜５日目までにアンジオスタチン活性は血清から消失した。
腫瘍を宿す動物の血清はまた、ウシ動脈内皮細胞および自然発生性マウスの血管内皮腫由来の内皮細胞を阻害した（Obeso, et al.,”Methods in Laboratory Investigation, A Hemangioendothelioma-derived cell line; Its use as a Model for the Study of Endothelial Cell Biology,”Lab. Invest., 63(2), pgs 259-269, 1990）が、ルイスラット肺腫瘍細胞、３Ｔ３線維芽細胞、動脈平滑筋細胞、ミンク肺上皮、またはＷ１３８ヒト胎児肺線維芽細胞は阻害しなかった。
実施例１０
転移を阻害しないルイスラット肺腫瘍（ＬＬＣ−Ｈｉｇｈ）を宿すマウスの血清は、インビトロにおける毛細血管内皮細胞の増殖を阻害しない。
ＬＬＣ−Ｈｉｇｈの一次腫瘍を宿すマウスの血清は、対照に比較して、ｂＦＧＦの刺激するウシ毛細血管内皮細胞の増殖を有意に阻害しなかった。また、この血清は、精製の始めの二段階（ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーおよびゲル濾過）終了後には、どの画分にもアンジオスタチン活性が見られなくなる。
実施例１１
ルイスラット肺癌（低転移性）から得た腹水もアンジオスタチン血清を産生する。
ＬＬＣ−ＬｏｗまたはＬＬＣ−Ｈｉｇｈ腫瘍細胞（１０6）のいずれかをマウスの腹腔内に注入すると、１週間後、１０〜２０匹のマウスのそれぞれより、１〜２ｍｌの血液の混じった腹水が得られた。腸間腫瘍の幡種が見られた。次いでマウスを安楽死させた。心臓穿刺により血清を得た。対照として、正常の、腫瘍を宿さないマウスから血清を得た。血清と腹水は遠心分離により、細胞を除去し、上清をｂＦＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）で刺激されたウシ毛細血管内皮細胞刺激においてアッセイした（実施例８を参照）。双方のタイプの腫瘍から得た腹水は、７２時間後において対照に比較して、毛細血管内皮細胞の増殖を有意に刺激した（たとえば、１００％増殖）（図６）。反対に、低転移性マウスから得た血清は、内皮細胞増殖を阻害した（対照の７９％に抑制）。高転移の細胞系から得た血清は、２００％の刺激をした。
これらのデータは、低転移の細胞系の腹水には、アンジオスタチンを凌駕する優勢な内皮成長刺激因子が含まれること示す。この条件は、固形一次腫瘍に類似している。さらに、刺激活性に打ち消されているが、血清中にアンジオスタチン活性が現れている。このパターンは、固形一次腫瘍（ＬＬＣ−Ｌｏｗ）と同様である。高転移性の腫瘍（ＬＬＣ−Ｈｉｇｈ）から得た腹水は、また、優勢な内皮細胞刺激因子を含むが、血清中にアンジオスタチンは確認されない。
実施例１２
カラムクロマトグラフィーによる血清からのアンジオスタチンの分画と成長阻害画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析
アンジオスタチンを精製するために、腫瘍を宿すマウスの血清をプールした。上記のインビトロ阻害因子活性アッセイにより検定された阻害活性を、ヘパリン−セファロース、バイオゲルＡ０．５ｍｍアガロースゲル、および数サイクルのＣ４逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、連続的にクロマトグラフ化した。内皮阻害活性を有するＨＰＬＣ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、見かけ上還元された３８，０００ダルトンの分子量の明確なバンドを示し、これは約２Ｘ１０7の比活性にまで、およそ１００万倍（表３参照）精製された。精製の各段階で、プールされた画分を、既知の内皮阻害物質存在について特異的な抗体を使用して検査した。粗製または精製画分中に、血小板因子第４因子、トロンボスポジンまたは腫瘍増殖因子β（ＴＧＦβ）は検出されなかった。
0003787157.tif 000004
実施例１３
カラムクロマトグラフィーによる尿からのアンジオスタチンの分画と成長阻害画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析
血清からの内皮細胞阻害物質の精製は、各マウス得られる少量の血清または、血清中の大量のタンパク質により、妨害される。
腫瘍を宿すマウスから得た尿が分析され、これに、腫瘍を持たないマウスおよびＬＬＣ−Ｈｉｇｈ腫瘍を宿すマウスの尿中には存在しない内皮細胞増殖の阻害物質が含有されることが判明した。この内皮細胞阻害活性の精製は、血清の精製に使用されたと同じ方法で行われた（上記参照）（図７）。
図７は、腫瘍を宿す動物の粗製血清または尿のＣ４逆相クロマトグラフィーを示す。全ての画分は、実施例８に記載される通り、ｂＦＧＦを添加したウシ毛細血管内皮細胞において７２時間増殖アッセイで検定された。いずれの場合も、明確な阻害ピークが、３０から３５％アセトニトリルで画分２３に溶出するのが観察された。腫瘍を宿す動物の血清の、３サイクル目のＣ４逆相クロマトグラフィーから得た阻害活性を有する画分のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は、およそ３８，０００ダルトンの位置に一本のバンドを示した。
実施例１４
血中のアンジオスタチンの分析
実施例９に記載の方法に従って内皮阻害作用がアッセイされた。アンジオスタチンは、シンクロパック(Synchropak)ＨＰＬＣ  Ｃ４カラムで単離された。（シンクロム社、ラファィエット、インディアナ州）阻害物質は、３０から３５％のアセトニトリル勾配において溶出された。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の還元条件のゲル（ｂ−メルカプトエタノール（５％ｖ／ｖ）において、活性を有するタンパク質バンドは３８キロダルトンの位置に溶出された。非還元条件においては、活性を有するタンパク質バンドは２８キロダルトンの位置に溶出された。最初のサンプルが尿または血清から単離されたもののどちらであっても、活性は同じポイントに検出された。他のバンドには活性は検出されなかった。
このバンドに含まれる活性は、加熱（摂氏１００度、１０分間）または、トリプシン処理で消失した。活性を有するバンドを、水／クロロホルム混合液（１：１）で抽出した場合、水相のみに活性が検出された
実施例１５
ヒトプラスミノーゲン由来の阻害作用のあるフラグメントの精製
プラスミノーゲンリジン結合サイトＩは、シグマ化学株式会社より入手した。この調製物は、エラスターゼで消化したヒトプラスミノーゲンの精製物である。この方法で得たリジン結合サイトＩは、プラスミンＡ鎖（クリングル１＋２＋３）中の少なくとも始めの３つのトリプルループ構造（番号１から３）を凝集体の状態で含有するタンパク質の集まりである。（Sotrrup-Jensen,L., et al., in Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol.3, 191, Davidson,J.F., et al., eds. Raven Press, New York 1978およびWiman, B., et al., Biochemica et Biophysica Acta, 579, 142 (1979)）。プラスミノーゲンリジン結合サイトＩ（シグマ化学株式会社、セントルイス、ミズリー州）は、水中に再懸濁し、ＨＰＬＣグレードの水／０．１％ＴＦＡで事前に平衡化したＣ４逆相カラムに添加された。カラムを水／０．１％ＴＦＡからアセトニトリル／０．１％ＴＦＡまでの勾配で溶出し、画分をポリプロピレン製試験管で回収した。各画分の一部をスピードパックで蒸発させ、水中に再懸濁し、増殖アッセイにおいてＢＣＥｓに添加した。阻害活性のある画分について、溶出用の同様の勾配を用いて、この手順を２回繰り返した。阻害活性は、最終のＣ４カラム精製においおて３０〜３５％アセトニトリルにおいて溶出された。阻害活性のある画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、見かけの還元分子量が４０、４２．５、４５キロダルトンの３つの明瞭なバンドが示された。非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、３０、３２．５、３５キロダルトンの分子量の３本のバンドが出現した。
実施例１６
ＳＤＳ−ＰＡＧＥからの阻害活性の抽出
ヒトプラスミノーゲン由来の精製物から得た阻害活性を有する精製画分を、非変性条件下においてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。隣のレーンでは同じサンプルを泳動させて銀染色を施しておき、そのバンドに相当する部分のゲルを切り出し、ポリプロピレン製試験管に入れて、１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中、摂氏４度、１２時間インキュベートした。上清を除去し、生理食塩水中で６時間の透析を２回（ＭＷＣＯ＝６−８０００）、蒸留水中で６時間の透析を２回行った。透析物は、真空遠心分離にて乾燥させた。生成物は生理食塩水中に再懸濁し、１ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽成長因子の刺激を与えたウシ毛細血管内皮細胞に添加して７２時間アッセイをおこなった。３つのバンドのそれぞれから抽出されたタンパク質は、毛細血管内皮細胞を阻害した。
実施例１７
プラスミノーゲンフラグメント治療の研究
マウスにルイスラット肺癌を移植し、腫瘍が１，５００〜２，０００ｍｍ3になった時に切除する。手術の日に、マウスを６匹づつ、６つのグループに無作為に割り振った。マウスには、ヒトプラスミノーゲンの３種類の精製された阻害活性のあるフラグメント、完全なヒトプラスミノーゲン、腫瘍を宿す動物の尿、正常マウスの尿、または生理食塩水のいずれかを毎日腹腔内注入した。偽手術のみを行った腫瘍を宿すマウスの１グループには、生理食塩水の注射をおこなった。一次腫瘍の切除直後、ローディング投与として、２４μｇ（１．２ｍｇ／ｋｇ／日／マウス）の阻害活性を有するプラスミノーゲンフラグメントをマウスに腹腔内注入した。その後、実験期間を通して、毎日１２μｇ（０．６ｍｇ／ｋｇ／日／マウス）の阻害活性を有するフラグメントをマウスに腹腔内注入した。対照マウスには、腫瘍の切除後、同じ用量の完全なプラスミノーゲン分子を投与した。尿投与用には、正常または腫瘍を宿すマウスの尿を濾過、十分に透析、凍結乾燥、そして滅菌水に再懸濁して２５０倍の濃縮液を作成した。一次腫瘍の切除の日にローディング投与として、腫瘍を宿すマウスまたは正常マウスから得た透析尿濃縮液、０．８ｍｌを２回の腹腔内注射としてマウスに投与した。その後実験の期間中、透析濃縮尿０．４ｍｌを毎日マウスに腹腔内注入した。処置は１３日間おこない、１３日目に全てのマウスを屠殺して剖検した。
実験の結果は、図８と９に示す。図８は、１３日間の処置後の表面肺転移巣を示す。表面肺転移巣とは、剖検時においてマウスの肺に観察された転移巣の数を指す。立体顕微鏡を使用して転移巣を計数した。図８は、実際に計数された表面肺転移巣の平均値と標準誤差を示す。図示されるように、一次腫瘍を有するマウスのグループでは転移は見られなかった。一次腫瘍を切除し、生理食塩水による処置を受けたマウスでは広範な転移が見られた。ヒト由来のプラスミノーゲンフラグメントによる処置を行ったマウスでは転移は見られなかった。完全なプラスミノーゲン分子による処置を行ったマウスでは、広範な転移が見られ、完全なプラスミノーゲン分子には内皮阻害活性がないことを示した。腫瘍を宿すマウスから得た透析および濃縮した尿による処置をおこなったマウスでは、転移はなかった。正常マウスの尿の濃縮液で処置したマウスでは広範な転移が見られた。肺重量の測定でも同様の結果が得られた（図９）。
実施例１８
マウスおよびヒトアンジオスタチンのアミノ酸配列
マウス尿から単離されたアンジオスタチンおよびヒトのリジン結合サイトＩフラグメント調製物から単離されたアンジオスタチンのアミノ酸配列を、アプライドバイオシステムモデル４７７Ａタンパク質シークエンサーを使用して決定した。フェニルチオヒダントインアミノ酸画分を、ラインに接続したＡＢＩモデル１２０Ａ  ＨＰＬＣによって同定した。Ｎ末端配列から決定したアミノ酸配列、およびマウスおよびヒトのアンジオスタチンのトリプシン消化の結果から、アンジオスタチンのアミノ酸配列は、マウスのプラスミノーゲンの９８番目のアミノ酸から始まる配列に類似していることが示唆される。このように、アンジオスタチンのアミノ酸配列は、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動で決定されるように約３８キロダルトンから４５キロダルトンの分子量を有するタンパク質から成り、マウスの完全なプラスミノーゲン分子の９８番目のアミノ酸から始まるマウスのプラスミノーゲンフラグメントと実質的に同様のアミノ酸配列を有する分子である。マウスアンジオスタチンの始めのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を、図１に示す。アミノ酸配列の長さは、図１に示されるものよりも少し長いまたは短い可能性もある。
ヒトのリジン結合サイトＩの活性画分のＮ末端アミノ酸分析およびトリプシン消化（実施例１５参照）の結果は、この画分の配列が、ヒトのプラスミノーゲンのおよそ９７または９９番目のアミノ酸から開始していること、およびヒトのアンジオスタチンとマウスのアンジオスタチンに相同性があることを示している。ヒトのアンジオスタチンの始めのアミノ酸配列（アミノ酸９８から開始）を図２に示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。図２において、マウスとヒトのアンジオスタチンのアミノ酸配列を、ブタ、ウシ、アカゲザルといった他の種のプラスミノーゲン内のアミノ酸配列の相当する部分と比較しているが、これはこれらの種においてアンジオスタチンが存在することを示すものである。
実施例１９
大腸菌内におけるヒトのアンジオスタチンの発現
大腸菌内における真核生物の遺伝子の翻訳の有効性を高めるために、ｐＴｒｃＨｉｓＡベクター（インビトロゲン社製）（図１０）を使用して、ｔｒｃプロモーターからの転写を高いレベルに調節した。金属との親和性を有する樹脂を使用した一段階のみで精製するためにＮ末端にニッケルを結合したポリヒスチジンテイルを融合した状態で、アンジオスタチンを発現させた。発現後、融合タンパク質中のエンテロキナーゼ分解認識サイトを利用して、精製した組み換えタンパク質からＮ末端ヒスチジン融合タンパク質を除去できる。組み換えヒトアンジオスタチンタンパク質は、リジンと結合することが判明しており；クリングル領域１、２、および３に対して特異的なモノクローナル抗体と交差反応性があり、インビトロにおいて、ｂＦＧＦの誘導する内皮細胞増殖を阻害する。
挿入片を作成するために、ヒトの肝臓ｍＲＮＡから、ヒトのアンジオスタチンをコードする遺伝子フラグメントを得、これを逆転写し、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）および特異的なプライマーを使用して増幅した。１１３１の塩基対からなる生成物は、ヒトのプラスミノーゲンの９３番目から４７０番目のアミノ酸をコードするものである。増幅したフラグメントは、ｐＴｒｃＨｉｓＡのＸｈｏＩ／ＫｐｎＩサイト中にクローニングし、この構築物をＸＬ−１Ｂ（ストラタジーン社にて入手可能）大腸菌宿主細胞中に導入した。プラスミドベクターｐＴｒｃＨｉｓＡのみを保有する対照クローンも同様にＸＬ−１Ｂ大腸菌宿主細胞に転換した。このクローンを、ベクター対照クローンと呼ぶ。どちらのクローンも、以下の記載の通り、同様に精製した。
発現コロニーは、以下のように選択した。アンジオスタチンをコードする遺伝子で形質転換した大腸菌のコロニーリフトをＩＰＴＧをしみ込ませたニトロセルロースフィルター上で生育させ、ＬＢ寒天培地に塗布する。ＩＰＴＧで発現を誘導した後、コロニーをニトロセルロースフィルター上で溶解する。ニトロセルロースリフトをブロックし、濯いだ後、アンジオスタチンの特異的なコンフォメーションを認識する２種類のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ  ＤｃｄおよびＶａｐ；ノートルダム大学のS.G. McCanceおよびF.J. Castellinoより贈与）をプローブとして検索した。ｍＡｂｓが認識する発現の強いコロニーを選択した。
最大の発現を得られる最適時間を確認するために、ＩＰＴＧ誘導の前後の様々な時間に細胞を集め、繰り返し凍結−融解サイクルを行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティング、ｍＡｂｓ  ＤｃｄおよびＶａｐプローブ検索により分析した。
これらの結果、ｐＴｒｃＨｉｓＡ／ＨＡｓＨ４クローンが選択された。ＩＰＴＧ誘導を４時間行った後、沈殿させた細胞を回収し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ8.0、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％グリセロール、２００ｍｇ／ｍｌリゾチーム中に懸濁して３０分間、摂氏４度において撹拌した。この泥状液体を１４，０００ｒｐｍ、２５分間遠心分離し、沈殿物を５０ｍＭＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％グリセロールおよび０．１％ＤＯＣ中に再懸濁した。この懸濁液を１時間、摂氏４度で撹拌し、１４，０００ｒｐｍで２５分間遠心分離した。この段階での上清画分には、発現されたアンジオスタチンが含まれる。大腸菌の発現するヒトアンジオスタチンは、元のアンジオスタチンの物理特性、すなわちリジンに結合するという特性を有することが判明した。したがって、一段階で、リジン−セファロースカラム（ファルマシア社またはシグマ社製）を使用して、大腸菌の発現したアンジオスタチンを精製した。アンジオスタチンのカラムからの溶出には、０．２Ｍイプシロン−アミノ-n-カプロン酸、ｐＨ７．５を用いた。
これらの実験に続いて、規模を拡大して１０リットルのｐＴｒｃＨｉｓＡ／ＨＡｓＨ４クローンをバッチ発酵した。この拡大規模の誘導で得られた細胞を沈殿させ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５中に懸濁させ、中間段階は摂氏１０度に冷却しながら１０，０００ｐｓｉで３回破砕した。得られたライゼートを、１０，０００ｒｐｍ、３０分間、摂氏４度において遠心分離して浄化し、リジン−セファロースカラムで発現されたアンジオスタチンを単離した（図１１）。
大腸菌が発現したヒトアンジオスタチン精製物を、水中でよく透析し、凍結乾燥した。発現されたヒトアンジオスタチンは、培養液中（ＤＭＥＭ、５％ＢＣＳ、１％ゲンタマイシン／ペニシリン／ストレプトマイシン）に３μｇ／ｍｌの濃度で再懸濁し、実施例８、３９ページに記載されるように、インビトロにおけるウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞アッセイに使用した。同様に、ベクターのみを含有する対照クローンも、ｐＴｒｃＨｉｓＡ／ＨＡｓＨ４クローンと同じ方法で処理した。これは、全く同様にＩＰＴＧで誘導し、細菌ライゼートを使用してリジンを結合し、０．２Ｍアミノカプロン酸で溶出し、十分に透析して凍結させた。この対照の調製物も、３μｇ／ｍｌの同じ濃度で培地中に再懸濁した。組み換えアンジオスタチンサンプルと対照は、それぞれ異なる誘導および発酵バッチ、別個の精製過程で得たもので、双方ともメリーランドのエンターメド社(EntreMed)において作成された。ＢＣＥアッセイは、これらのコードされたサンプルを使用して、盲検方法でボストンの子供病院(Childre's Hospital)で実施された。
組み換えヒトアンジオスタチンのＢＣＥアッセイの結果により、大腸菌で発現したヒトアンジオスタチンが、ｂＦＧＦ（１ｎｇ／ｍｌの濃度で使用）によるＢＣＥ細胞の増殖を阻害することが示された（図１２）。培養液中に懸濁した（約３μｇ／ｍｌの濃度）組み換えアミノ酸保存液は、１：５、１：１０、１：２０に希釈して使用した。パーセント阻害は、以下にしたがって計算した。
0003787157.tif 000005
ＢＣＥ細胞増殖のパーセント阻害は、同じ濃度のプラスミノーゲン由来のアンジオスタチンによる値と同等かそれ以上であった。再度実施したＢＣＥアッセイの結果を図１３に示したが、ここでは１：５に希釈した保存液を使用し、組み換えアンジオスタチンは、プラスミノーゲン由来のアンジオスタチンと同程度のパーセント阻害を示した。図１３は、ヒト組み換えアンジオスタチンタンパク質は、細胞培養において、ＢＣＥの増殖を６０％以上、さらに７５％以上も阻害するという驚嘆すべき結果を示す。
実施例２０
アンジオスタチンは、アポトーシス（細胞自滅）速度を増大させることにより、微小転移を休止状態に維持する。
Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスにルイスラット肺癌細胞（１ｘ１０6）を皮下接種後、大きさ約１．５ｃｍ3の一次腫瘍が出現した。一次腫瘍の外科的切除または、偽手術をマウスに施した。手術後５、１０、および１５日目にマウスを屠殺し、肺の組織学的検査を行った。一次腫瘍を切除したマウスでは、偽手術をおこなった対照と比較して、かなり増大した転移巣が見られた（図１４）。転移巣の増大とともに肺重量が有意に増大していた。
臭化デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みにより測定される、腫瘍細胞増殖の分析では、５、９、および１３日目において、一次腫瘍をそのままにしたマウスと切除したマウス間に差はなく、腫瘍塊の増大は増殖の促進により説明できないことを示した（図１５）。したがって、これらのマウスにおいて細胞の死滅について検討した。遺伝子発現における変化に依存する細胞の死滅の過程で、発生および小腸などの組織における迅速な増殖組織における細胞の消滅を説明する、アポトーシスを、ターミナルデオキヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）技術を使用した免疫組織科学的に標識したＤＮＡフラグメントを使用して調査した。アポトーシス指標は、各屠殺時に測定した。一次腫瘍の切除は、調査した全ての時点において、統計的に有意にアポトーシス指標を増大（約３から４倍）させる原因となった（図１５）。
一次腫瘍を切除したマウスに外因性の血管新生抑制物質を投与することで、これを裏付ける証拠が得られた。この物質ＴＮＰ−１４７０（以前にＡＧＭ−１４７０と命名されたＯ−クロロアセチルカルバモイルフマギロール）は、抗血管新生活性が報告されているフマギリンのアナログである。ＴＮＰ−１４７０の皮下投与（３０ｍｇ／ｋｇ、二日毎）により、上記の一次腫瘍をそのまま残したラットで得たのと非常に類似した結果を得た。これらの動物では、生理食塩水を注射した対照ラットと比較して、肺重量が小さく、増殖指標は同等、アポトーシス指標は増大していた（図１６）。
これらのデータは、腫瘍細胞の増殖と細胞の死滅の速度が均衡状態にある間は、転移は休止状態にあることを示している。おそらく、腫瘍細胞中のアポトーシスを増加させることにより転移巣の成長をコントロールしている血管新生阻害物質が排除されることが原因で、一次腫瘍を切除すると転移巣の成長が急速に増大する。これらの作用は、一次腫瘍の切除と外因性の血管新生阻害剤の投与に引き続いて観察されるものと類似している。総合して考えると、これらのデータは、一次腫瘍が微小転移巣を休止させるアンジオスタチンを放出していることを示唆するものである。
実施例２１
インビボにおけるアンジオスタチンによる一次腫瘍の治療
アンジオスタチンは、上記の実施例１５に記載されるように、ヒトのプラスミノーゲンを制限的にエラスターゼ消化して精製した。アンジオスタチンをリン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁して、６週齢オスＣ５７ＢＩ６／Ｊマウスに投与した。ルイスラット肺癌もしくはＴ２４１線維芽肉腫細胞のいずれか１ｘ１０6個をマウスの皮下に移植した。４日後、腫瘍の大きさは８０〜１６０ｍｍ3の時にアンジオスタチンによる治療を開始した。アンジオスタチンの４０ｍｇ／ｋｇの単回投与、または８０ｍｇ／ｋｇの２回投与を、腹腔内（ｉｐ）または皮下（ｓｃ）注射でおこなった。治療を１９日間継続した後、マウスは各時点で屠殺された。
１日用量４０ｍｇ／ｋｇをｉｐ投与した場合のアンジオスタチンは、Ｔ２４１一次腫瘍の成長を非常に強く阻害した（図１７）。この成長阻害作用は、２日以内に肉眼で確認できる程度になり、実験の期間中、度合いが強くなっていった。１８日目には、アンジオスタチン投与マウスの腫瘍の容量は、生理食塩水を注射した対照マウスの腫瘍のおよそ３８％となった。この差は、統計的に有意である。（ｐ＜０．００１、スチュデントのｔ検定）。
アンジオスタチン投与（１日用量８０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与または皮下投与で１日２回投与）も、ＬＬＣ−ＬＭ一次腫瘍の成長速度を有意に低下させた（図１７）。この阻害作用は、４日目に確認され、以後、調査した時点全てにおいて程度が増大していった。実験の最終日（１９日）には、アンジオスタチン投与マウスの平均腫瘍容積は、生理食塩水を投与した対照のわずか２０％であり、有意な差があった（ｐ＜０．００１、スチュデントのｔ検定）。
別の実験では、Ｔ２４１線維肉腫、ルイスラット肺癌（ＬＭ）、または細網肉腫を移植したマウスにアンジオスタチン（５０ｍｇ／ｋｇ ｑ１２ｈ）を投与した。各タイプの腫瘍細胞において、アンジオスタチンを投与したマウスでは、腫瘍がかなり小さくなった。図１９は、Ｔ２４１線維肉腫について、２４日目のアンジオスタチン投与マウスの平均腫瘍容積は、非投与マウスのわずか１５％であったことを示す。図２０は、ルイスラット肺癌（ＬＭ）について、２４日目のアンジオスタチン投与マウスの平均腫瘍容積は、非投与マウスのわずか１３％であったことを示す。図２１は、細網肉腫について、２４日目のアンジオスタチン投与マウスの平均腫瘍容積は、非投与マウスのわずか１９％であったことを示す。掲載のデータは、各時点における４匹のマウスの平均値である。
これらの結果は、アンジオスタチンが、インビボにおいて異なる３種類の一次腫瘍の非常に強力な阻害物質であることを示す。
実施例２２
インビボにおけるマウス中のヒトの細胞由来の一次腫瘍のアンジオスタチンによる治療
２種類のヒトの腫瘍細胞系、ヒトの前立腺癌ＰＣ−３とヒトの乳癌ＭＤＡ−ＭＢ、に対するアンジオスタチンの作用を調べた。免疫不全ＳＣＩＤマウスにヒトの腫瘍細胞を移植し、実施例２１に記載のように、マウスに５０ｍｇ／ｋｇのアンジオスタチンを基本的に１２時間毎に投与した。その結果、本発明のアンジオスタチンタンパク質が、ヒトの腫瘍細胞の成長を強力に阻害することが示された。図２２は、ヒトの前立腺癌ＰＣ−３に関し、２４日目において、アンジオスタチンを投与したマウスの平均腫瘍容積は、投与をおこなわない対照マウスのわずか２％であることを示している。図２３は、ヒトの乳癌ＭＤＡ−ＭＢに関するもので、２４日目において、アンジオスタチンを投与したマウスの平均腫瘍容積は、投与をおこなわない対照マウスのわずか８％であることを示している。
実施例２３
遺伝子治療−アンジオスタチン遺伝子導入の腫瘍の容積に対する効果
マウスのプラスミノーゲンアミノ酸１から４６０をコードする、マウスのプラスミノーゲンｃＤＮＡ（American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）より入手）に由来する、アンジオスタチンをコードする１３８０塩基対のＤＮＡ配列を、ＰＣＲを使用して作成し、発現ベクターに導入した。この発現ベクターをＴ２４１線維肉腫細胞に導入し、ＤＮＡ導入細胞をマウスに移植した。対照マウスには、非ＤＮＡ導入Ｔ２４１または、ベクターのみを導入したＴ２４１（すなわち、アンジオスタチンを発現しない感染細胞）を移植した。３種類のアンジオスタチン発現ＤＮＡ導入細胞のクローンを、実験で使用した。平均腫瘍容積を、時間につれて測定した。その結果、ＤＮＡを導入しない、および非発現対照細胞に比較して、アンジオスタチン発現細胞クローンのマウスにおいて平均腫瘍容積の驚異的かつ劇的な低下が示された。
マウスアンジオスタチンタンパク質をコードするマウスＤＮＡ配列は、マウスのプラスミノーゲンｃＤＮＡに由来する。マウスのアンジオスタチンには、マウスのプラスミノーゲンクリングル領域１〜４が含まれる。このクローンの構築の概略図を図２４に示す。
マウスのアンジオスタチンタンパク質クローンを、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTMトランスフェクションシステム（ライフテクノロジーズ社、ゲティスバーグ、ＭＤにて入手可能）を使用して、Ｔ２４１線維肉腫細胞に導入した。ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTM試薬は、メンブラン濾過した水中の、カチオン脂質N-[1-（2,3-ジオレイロキシ）プロピル]-n,n,n-トリメチルアンモニウムクロライド(DOTMA)およびジオレコイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)の１：１（ｗ／ｗ）リポソーム製剤である。
細胞の一過性のトランスフェクションのための手順は以下の通りである：
１．Ｔ２４１細胞を６０ｃｍ2の組織培養皿で成長させ、血清を添加した適当な成長培地２ｍｌ中に
0003787157.tif 000006
細胞を接種する。
２．摂氏３７度で、ＣＯ2インキュベーター中で、細胞が４０〜７０％培養血を満たすまで細胞をインキュベートする。通常１８から２４時間かかるが、所要時間は細胞のタイプによって違う。Ｔ２４１腫瘍細胞の程度は約７０％である。
３．以下の溶液を１２ｘ７５ｍｍの滅菌試験管に準備する：
溶液Ａ：各トランスフェクション処理用に、５μｇのＤＮＡを１００μｌの血清を含まないＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉリデュースド血清培地（Reduced Serum Medium:ライフテクノロジーズ社より入手可能）中に希釈する（組織培養等級の脱イオン水も使用できる）。
溶液Ｂ：各トランスフェクション処理用に、３０μｇのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮを１００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地で希釈する。
４．２種類の溶液を混合し、穏やかに撹拌し、室温で１０から１５分間インキュベートする。
５．血清を含まない培地で２回細胞を洗浄する。
６．各トランスフェクション処理用に、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTM試薬−ＤＮＡ複合体を含有する各試験管に、０．８ｍｌの血清を含まない培地を添加する。穏やかに撹拌し、その複合体を細胞に載せる。
７．ＣＯ2インキュベーター中、約１２時間、摂氏３７度にて細胞をインキュベートする。
８．ＤＮＡを含有する培地を、１ｍｇ／ｍｌ選択培地含有血清で置き換え、細胞をＣＯ2インキュベーター中、摂氏３７度にて、合計４８から７２時間インキュベートする。
９．トランスフェクションから４８から７２時間後、細胞抽出物の遺伝子活性を検定する。
ＤＮＡ導入した細胞は、アンジオスタチン特異的抗体を使用して、アンジオスタチンタンパク質の発現について検定することができる。または、およそ１０から１４日後、ＣＭＶ−アンジオスタチンを導入したＴ２４１細胞中に、Ｇ４１８抵抗性コロニーが出現する。また、ベクターのみを導入したクローンの中にも、多くのクローンが見られたが、導入をしなかったクローンでは見られなかった。免疫蛍光法を使用して、Ｇ４１８抵抗性クローンを、アンジオスタチン発現クローンとして選択した。
面白いことに、図２５および２６に示す通りに、アンジオスタチンを導入したＴ２４１細胞とルイスラット肺癌のインビトロにおける細胞増殖は阻害されないか、または反対の作用を受ける。
図２７は、トランスフェクション実験の結果を示す。アンジオスタチン発現Ｔ２４１導入クローンは、３種類とも、平均腫瘍容積が対照マウスよりもずっと少なかった。クローン３７を移植したマウスの平均腫瘍容積は、対照マウスのわずか１３％で、クローン３１およびクローン２５では、それぞれ対照マウスの腫瘍容積のわずか２１％と３４％であった。これらの結果は、アンジオスタチンをコードするＤＮＡ配列は、細胞中に導入できること、導入されたＤＮＡ配列は、移植先の細胞によってアンジオスタチンタンパク質を発現する能力を有すること、発現されたアンジオスタチンはインビボで作用し、腫瘍の成長を低下させることを証明した。
実施例２４
インビボにおけるアンジオスタチン発現部位の位置特定
インビボにおけるアンジオスタチンタンパク質の発現部位を位置特定するために、ルイスラット肺癌細胞(マウス)、Ｔ２４１線維芽肉腫（マウス）、およびバーキットのリンパ腫細胞（ヒト）、腫瘍細胞から直接採取したもの、または数継代後の細胞培養によるものなどの様々な細胞タイプから得られた全ＲＮＡを分析してアンジオスタチン転写物の存在を確認した。サンプルをノーザン分析した結果、マウスのプラスミノーゲンに相当する約２．４ｋｂのシグナルがひとつ示された正常マウスの肝臓ＲＮＡ以外のすべてのサンプルでは、ｔｈｎ配列とのシグナルハイブリダイゼーションがないことが判明した。ヒトのサンプルのノーザン分析の結果、ヒトのプラスミノーゲンに相当する約２．４ｋｂのシグナルがひとつ示された正常ヒト肝臓ＲＮＡ以外では、ヒトのアンジオスタチン配列とのシグナルハイブリダイゼーションがないことが判明した。
逆転写ポリメラーゼチェイン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析の結果、正常マウス肝臓以外では、サンプル中にマウスアンジオスタチン配列でプローブ検索される生成物がないことが判明した。逆転写ポリメラーゼチェイン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析の結果、正常ヒト肝臓サンプル以外では、全てのヒトから得たサンプル中に、ヒトアンジオスタチン配列でプローブ検索される生成物がないことが判明した（マウスでの予想サイズは１，０５０ｂｐ、ヒトでは１，１３４ｂｐ）。
このように、上記の全てのマウスのサンプル中では、マウスアンジオスタチン転写物（マウスのプラスミノーゲンのアミノ酸９７から４５０と同一と考えられる）が産生されず、上記ヒトのサンプル中ではヒトアンジオスタチン転写物（ヒトのプラスミノーゲンのアミノ酸９３から４７０と同一と考えられる）を産生されないと考えられる。正常なマウス／ヒトの肝臓で得られた陽性シグナルは、プラスミノーゲンとのハイブリダイゼーションのものである。
実施例２５
酵母菌中におけるアンジオスタチンの発現
ヒトのプラスミノーゲンのアミノ酸９３から４７０までをコードする遺伝子フラグメントを、酵母菌Pichia pastoris中のＰＨＯ１分泌シグナルを利用してタンパク質の分泌発現を可能とする、ｐＨＩＬ−ＳＩ（インビトロゲン社）のＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩサイト中にクローニングした。同様に、ヒトのプラスミノーゲンのアミノ酸９３から４７０までをコードする遺伝子フラグメントを、酵母菌Pichia pastoris中のα因子分泌シグナルを利用してタンパク質の分泌発現を可能とする、ｐＰＩＣ９（インビトロｇｅｎ）中のＳｎａＢＩ／ＥｃｏＲＩサイト中にクローニングした。これらのシステムで発現されたヒトアンジオスタチンタンパク質には、タンパク質プロセッシング、タンパク質ホールディング（折りたたみ）、および糖化などの翻訳後の修飾など、大腸菌での発現システムにはない多くの利点がある。
Pichia pastoris中での遺伝子の発現は以下に記載される：Sreekrishna, K. et al.,(1988) High level expression of heterologous proteins in methylotropic yeast Pichia pastoris. J. Basic Microbiol. 29 (4): 265-278、およびClare, J.J. et at. (1991) Production of epidermal growth factor in yeast: High-level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies, Gene 105:205-212、どちらも本明細書に、先行技術として含めた。
実施例２６
遺伝子導入動物および植物におけるアンジオスタチンタンパク質の発現
アンジオスタチン遺伝子転写物を発現するウシまたはブタ科などの遺伝子導入動物を作成する。遺伝子導入動物は、たとえば、これらの動物の乳中にアンジオスタチンタンパク質を発現する。さらに、アンジオスタチン遺伝子転写物を発現する食用の遺伝子導入植物を作成する。
外来ＤＮＡを発現する遺伝子導入動物の作成は、本明細書に先行技術として含めるSmith H. Phytochrome transgenics: functional, ecological and biotechnical applications, Semin. Cell. Biol. 1994 5(5):315-325、に記載されている。
実施例２７
内皮細胞の増殖を阻害するアンジオスタチン断片の特徴
後述の実施例はアンジオスタチン断片の個々の、または組合せの活性を特徴付けている。データは、個々のクリングル構造間で機能的差異があることと、強力な抗内皮細胞活性すなわち抗血管新生活性がこの様なアンジオスタチンのタンパク質断片によって得られることを示唆している。
ここで用いられている「アンジオスタチン断片」という用語は、内皮細胞の増殖阻害活性を有するアンジオスタチンあるいはプラスミノーゲンのタンパク質誘導体を意味する。アンジオスタチン断片は、血管新生が介在する疾患や状態の治療に有用である。たとえば、アンジオスタチン断片は、腫瘍の成長の阻害あるいは抑制のために用いることができる。このようなアンジオスタチン断片のアミノ酸配列は、実施例において特に指示がないかぎり、マウスプラスミノーゲン（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１）、マウスアンジオスタチン（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２）、ヒトアンジオスタチン（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３）、アカゲザルアンジオスタチン（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４）、ブタアンジオスタチン（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５）およびウシアンジオスタチン（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６）の一部分から選択することができる。
ここで用いられているように”クリングル１”は、内皮細胞阻害活性あるいは抗血管新生活性を有し、以下のクリングル１に相同的なアミノ酸配列から成り立っているプラスミノーゲンのタンパク質誘導体を意味する。一例を挙げると、これらに限定されるものではないが、実施例において特に指示がないかぎり、マウスクリンゲル１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７）、ヒトクリングル１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８）、アカゲザルクリングル１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９）、ブタクリングル１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０）、およびウシクリングル１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１１）がある。マウスクリングル１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１のマウスプラスミノーゲンのアミノ酸配列１０３から１８１番目（１０３と１８１番目を含めて）に相当し、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２のマウスアンジオスタチンのアミノ酸配列の６から８４番目（６と８４番目を含めて）に相当する。ヒトクリングル１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８）、アカゲザルクリングル１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９）、ブタクリングル１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１０）、およびウシクリングル１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１１）は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４、ＳＥＱ  ＩＤＮｏ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６のアンジオスタチンのアミノ酸配列の６から８４番目（６と８４番目を含めて）に相当する。
ここで用いられているように”クリングル２”は、内皮細胞阻害活性あるいは抗血管新生活性を有し、以下のクリングル２に相同的なアミノ酸配列から成り立っているプラスミノーゲンのタンパク質誘導体を意味する。一例を挙げると、これらに限定されるものではないが、実施例において特に指示がないかぎり、マウスクリンゲル２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２）、ヒトクリングル２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１３）、アカゲザルクリングル２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１４）、ブタクリングル２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１５）、およびウシクリングル２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１６）がある。マウスクリングル２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１２）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１のマウスプラスミノーゲンのアミノ酸配列１８５から２６２番目（１８５と２６２番目を含めて）に相当し、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２のマウスアンジオスタチンのアミノ酸配列の８８から１６５番目（８８と１６５番目を含めて）に相当する。ヒトクリングル２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１３）、アカゲザルクリングル２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１４）、ブタクリングル２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１５）、およびウシクリングル２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１６）は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４、ＳＥＱ  ＩＤＮｏ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６のアンジオスタチンのアミノ酸配列の８８から１６５番目（８８と１６５番目を含めて）に相当する。
ここで用いられているように”クリングル３”は、内皮細胞阻害活性あるいは抗血管新生活性を有し、以下のクリングル３に相同的なアミノ酸配列から成り立っているプラスミノーゲンのタンパク質誘導体を意味する。一例を挙げると、これらに限定されるものではないが、実施例において特に指示がないかぎり、マウスクリングル３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１７）、ヒトクリングル３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１８）、アカゲザルクリングル３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１９）、ブタクリングル３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２０）、およびウシクリングル３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２１）がある。マウスクリングル３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１７）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１のマウスプラスミノーゲンのアミノ酸配列２７５から３５２番目（２７５と３５２番目を含めて）に相当し、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２のマウスアンジオスタチンのアミノ酸配列の１７８から２５５番目（１７８と２５５番目を含めて）に相当する。ヒトクリングル３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１８）、アカゲザルクリングル３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１９）、ブタクリングル３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２０）、およびウシクリングル３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２１）は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４、ＳＥＱ  ＩＤＮｏ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６のアンジオスタチンのアミノ酸配列の１７８から２５５番目（１７８と２５５番目を含めて）に相当する。
ここで用いられているように”クリングル４”は、内皮細胞阻害活性あるいは抗血管新生活性を有し、以下のクリングル４に相同的なアミノ酸配列から成り立っているプラスミノーゲンのタンパク質誘導体を意味する。一例を挙げると、これらに限定されるものではないが、実施例において特に指示がないかぎり、マウスクリングル４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２２）、ヒトクリングル４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２３）がある。マウスクリングル４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２２）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１のマウスプラスミノーゲンのアミノ酸配列３７７から４５４番目（３７７と４５４番目を含めて）に相当する。
ここで用いられているように”クリングル２−３”は、内皮細胞阻害活性あるいは抗血管新生活性を有し、以下のクリングル２−３に相同的なアミノ酸配列から成り立っているプラスミノーゲンのタンパク質誘導体を意味する。一例を挙げると、これらに限定されるものではないが、実施例において特に指示がないかぎり、マウスクリングル２−３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２４）、ヒトクリングル２−３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２５）、アカゲザルクリングル２−３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２６）、ブタクリングル２−３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２７）、およびウシクリングル２−３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２８）がある。マウスクリングル２−３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２４）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１のマウスプラスミノーゲンのアミノ酸配列１８５から３５２番目（１８５と３５２番目を含めて）に相当し、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２のマウスアンジオスタチンのアミノ酸配列の８８から２５５番目（８８と２５５番目を含めて）に相当する。ヒトクリングル２−３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２５）、アカゲザルクリングル２−３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２６）、ブタクリングル２−３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２７）、およびウシクリングル２−３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２８）は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４、ＳＥＱ  ＩＤＮｏ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６のアンジオスタチンのアミノ酸配列の８８から２５５番目（８８と２５５番目を含めて）に相当する。
ここで用いられているように”クリングル１−３”は、内皮細胞阻害活性あるいは抗血管新生活性を有し、以下のクリングル１−３に相同的なアミノ酸配列から成り立っているプラスミノーゲンのタンパク質誘導体を意味する。一例を挙げると、これらに限定されるものではないが、実施例において特に指示がないかぎり、マウスクリングル１−３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２９）、ヒトクリングル１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３０）、アカゲザルクリングル１−３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３１）、ブタクリングル１−３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３２）、およびウシクリングル１−３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３３）がある。マウスクリングル１−３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２９）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１のマウスプラスミノーゲンのアミノ酸配列１０３から３５２番目（１０３と３５２番目を含めて）に相当し、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２のマウスアンジオスタチンのアミノ酸配列の６から２５５番目（６と２５５番目を含めて）に相当する。ヒトクリングル１−３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３０）、アカゲザルクリングル１−３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３１）、ブタクリングル１−３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３２）、およびウシクリングル１−３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３３）は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４、ＳＥＱ  ＩＤＮｏ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６のアンジオスタチンのアミノ酸配列の６から２５５番目（６と２５５番目を含めて）に相当する。
ここで用いられているように”クリングル１−２”は、内皮細胞阻害活性あるいは抗血管新生活性を有し、以下のクリングル１−２に相同的なアミノ酸配列から成り立っているプラスミノーゲンのタンパク質誘導体を意味する。一例を挙げると、これらに限定されるものではないが、実施例において特に指示がないかぎり、マウスクリングル１−２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３４）、ヒトクリングル１−２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３５）、アカゲザルクリングル１−２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３６）、ブタクリングル１−２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３７）、およびウシクリングル１−２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３８）がある。マウスクリングル１−２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３４）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１のマウスプラスミノーゲンのアミノ酸配列１０３から２６２番目（１０３と２６２番目を含めて）に相当し、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２のマウスアンジオスタチンのアミノ酸配列の６から１６５番目（６と１６５番目を含めて）に相当する。ヒトクリングル１−２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３５）、アカゲザルクリングル１−２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３６）、ブタクリングル１−２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３７）、およびウシクリングル１−２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３８）は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４、ＳＥＱ  ＩＤＮｏ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６のアンジオスタチンのアミノ酸配列の６から１６５番目（６と１６５番目を含めて）に相当する。
ここで用いられているように”クリングル１−４”は、内皮細胞阻害活性あるいは抗血管新生活性を有し、以下のクリングル１−４に相同的なアミノ酸配列から成り立っているプラスミノーゲンのタンパク質誘導体を意味する。一例を挙げると、これらに限定されるものではないが、実施例において特に指示がないかぎり、マウスクリングル１−４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３９）、ヒトクリングル１−４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４０）がある。マウスクリングル１−４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３９）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１のマウスプラスミノーゲンのアミノ酸配列１０３から４５４番目（１０３と４５４番目を含めて）に相当する。
クリングル１、クリングル２、クリングル３、クリングル４、クリングル２−３、クリングル１−３、クリングル１−２、クリングル１−４のアミノ酸配列はそれぞれ上記で特定した特別のクリングル配列に相同的なものである。好ましくは、アミノ酸配列は明らかにされている配列との相同性において、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％を有する。既に列挙した断片に対する様々なアミノ酸の置換、付加、欠失あるいは他の修飾はアンジオスタチン断片の内皮細胞増殖抑制活性あるいは抗血管新生活性を増強あるいは修飾することがある。”機能的な相同物”と言う用語は、結果として同じか機能的に同等な遺伝子産物をコードすることとなる異なる配列の欠失、付加あるいは置換を含む発明に伴って変更を加えた配列も使用することができることを意味している。遺伝子産物それ自身がアミノ酸配列の欠失、付加、置換をアンジオスタチン配列中に含むことができる。それによって、不顕性の変化がもたらされ、機能的にアンジオスタチンタンパク質と同等のものが創出されることができる。このようなアミノ酸の置換は含まれるアミノ酸の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、あるいは両極性の性質に基づいて行うことができる。例えば、陰性に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸、グルタミン酸があり、陽性に荷電したアミノ酸にはリジン、ヒスチジン、アルギニンがあり、非荷電性の基を有するアミノ酸は同等な親水性値を示し、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンを含む。また、非極性基を有するアミノ酸は同様の親水性値を示し、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、トリプトファンを含む。このような修飾は、本請求の範囲と精神を拡大することを目的とはしていない。例えば、クリングル間のＳ−Ｓ結合によるホモ二量体化を防ぐ目的でリコンビナント  ヒトクリングル２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１３）中のシステイン残基Ｃ４と、リコンビナント  クリングル３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１８）中のＣ４２がセリンに置換されている。さらに、それによって断片の内皮細胞増殖抑制活性を失うことなしに、様々なアミノ酸の置換、付加、欠失あるいは他の修飾を上記で特定されたアンジオスタチン断片において行うことが可能で、従ってこれらは本請求の範囲を拡大することを目的とするものではないことが理解さる。”有意には変化させない”という用語によって、アンジオスタチン断片がここで明かにしている最も相同的なアンジオスタチン断片の内皮細胞増殖抑制活性に比べて少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％の活性を有することを意味している。
遺伝子の構築と発現
ヒトプラスミノーゲン（ＨＰｇ）のクリングル１（Ｋ１）、クリングル２（Ｋ２）、クリングル３（Ｋ３）、クリングル４（Ｋ４）、クリングル２−３（Ｋ２−３）とコードするｃＤＮＡ断片の作製に当たっては、ＰＣＲを基礎にした方法が使用された。組換え体クリングル１（ｒＫ１）、クリングル２（ｒＫ２）、クリングル３（ｒＫ３）、クリングル４（ｒＫ４）、およびクリングル２−３（ｒＫ２−３）は、以前に記載されている（Menhart, N., Shel, L.C., Kelly, R.F., and Castellino, F.J. (1991) Biochem. 30, 1948-1957; Marti, D., Schaller, J., Ochensberger, B., and Rickli, E.E.(1994) Eur. J. Biochem. 219, 455-462; Sohdel, S., Hu, C.-K., Mardi, D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M., and Rickli, E.E. (1996) Biochem. in press; Rejante, M.R., Byeon, I.-J.L., and Llinas, M., (1991) Biochem. 30, 11081-11092）様に大腸菌に発現させた。図３２Ｂに示したようなクリングル間のＳ−Ｓ結合による架橋形成によるホモ二量体化を防止するためにｒＫ２のＣ１６９およびｒＫ３のＣ２９７のシステイン残基は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１３と１８の４番目と４２番目に認められる如くセリンに変異させた（Sondel, S., Hu, C.-K., Mardi, D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M., and Rickli, E.E. (1996) Biochem. in press）。ｒＫ３とｒＫ２−３は、タンパク質の精製に使用するアミノ末端の６個のヒスチジン標識を付加している（図示せず）。
タンパク質の分解処理
Ｋ１−３、Ｋ１−４、Ｋ４の断片はすでに上記したごとく（Powell,J.R.,and Castellino,F.J.(1983) Biochem 22,923-927）リジン−ＨＰｇ（アボットラブス社）のブタエラスターゼ（シグマ社）による分解によって作製された。略記すると、１．５ｍｇのエラスターゼを２００ｍｇのヒトプラスミノーゲンと５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０中において震盪しながら室温で一晩培養した。反応はジイソプロピルフッ化リン酸（ＤＦＰ）（シグマ社）を最終濃度１ｍＭで添加することによって停止させた。反応混合液はさらに３０分間室温で震盪した後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０で一晩透析した。
タンパク質の精製
組み換えＫ１は、ＤＨ５α大腸菌の菌体中でｐＳＴＩＩプラスミドベクターを用いて発現させた。このタンパク質は、リジンセファロース４Ｂ（ファルマシア）とモノＱ（バイオラド）カラムを用いたクロマトグラフィーによって単一にまで精製された。ｒＫ２およびｒＫ３を発現する大腸菌の菌体（系統ＨＢ１０１）を１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２ｘＹＴ培地中に３℃でＯＤ600が約０．８になるまで増殖させた。組換え体タンパク質の産生を誘導するために、ＩＰＴＧ（イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を最終濃度が１ｍＭになるように添加した後、さらに３７℃で４．５時間培養した。菌体は、遠心によって回収し、沈渣を−８０℃で保存した。融解した菌体溶解物は、抽出液（６Ｍ塩酸グアニジン、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．０溶液）に再懸濁した。懸濁液を、１５，０００ｘｇで３０分間遠心した後、上清中にｂ−メルカプトエタノールを最終濃度が１０ｍｍになるように添加した。上清を次いで、抽出液で事前に平衡化したニッケル（Ｎｉ2）−ＮＴＡアガロースカラム（１．５ｃｍｘ５ｃｍ）に充填した。カラムは、ｐＨ８．０とｐＨ６．３の抽出液でそれぞれ連続的に洗浄した。組換え体Ｋ２とＫ３は、ｐＨ５０の抽出液によって溶出された。
タンパク質の分解産物の断片であるＫ１−３、Ｋ１−４およびＫ４は、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したリジンセファロースカラム（２．５ｃｍｘ１５ｃｍ）で、１８０ｎｍの吸光度が０．００５になるまで精製した。吸着したクリングル断片は２００ｍＭのε−アミノカプロイン酸を含むトリス緩衝液ｐＨ８．０を用いて溶出した。溶出した試料は、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ５．０に対して一晩透析し、同じ緩衝液で平衡化したバイオラドモノ−Ｓカラムに添加した。Ｋ４、Ｋ１−３、Ｋ１−４の断片は、２０ｍＭリン酸／１ＭＫＣｌ溶液ｐＨ５の０〜２０％、２０〜５０％、５０〜７０％の非連続勾配によって溶出した。ほとんどのＫ１−３、Ｋ１−４断片は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、０．５ＭＫＣｌによってカラムから溶出された。全ての断片を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液で一晩透析した。透析後、Ｋ１−３、Ｋ１−４断片は、さらに２０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０で平衡化したヘパリンセファロースカラム（５ｃｍｘ１０ｃｍ）（シグマ社）を用いて精製した。Ｋ１−３断片は３５０ｍＭの塩化カリウムで溶出され、Ｋ１−４は、通り抜ける画分から回収された。精製されたクリングル断片はＳＤＳゲル上で銀染色、抗ヒトＫ４、Ｋ１−３ポリクローナル抗体を用いたウエスタン免疫染色解析、およびアミノ末端の配列決定によって解析した。
インビトロでの再折たたみ
ｒＫ２、ｒＫ３、ｒＫ２−３の再折たたみは、標準的な手法（Cleary, S., Mulkerrin, M. G., and Kelly, R. R. (1989) Biochem. 28, 1884-1891）に従って行った。精製したタンパク質をｐＨ８．０に調製した後、ジチオスレイトルを最終濃度５ｍＭになるように添加した。一晩培養後、溶液を、１．２５ｍＭの還元型グルタチオンを含む４倍量の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０で希釈した。１時間の培養後、酸化型グルタチオンを最終濃度１．２５ｍＭ加え、４℃で６時間培養した。復元したタンパク質は最初は水で２日間透析し、５０ｍＭリン酸緩衝生理食塩液ｐＨ８．０にてさらに２日間透析した。溶液は次いで、同じリン酸緩衝生理食塩水で平衡化したリジン−Ｂｉｏ−ゲルカラム（２ｃｍｘ１３ｃｍ）に充填した。カラムを、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、タンパク質を５０ｍＭ  ６−ＡＨＡ（６−アミノヘキサン酸）を含むリン酸緩衝液にて溶出した。逆相ＨＰＬＣを、アクアポアブチルカラム（２．１ｘ１００ｍｍ、ワイドポア３０ｎｍ、７ｍｍ、アプライドバイオシステム社）を用いて行い、ヒューレットパッカード社の液体クロマトグラフィーをアセトニトリルの勾配で使用した。
還元とアルキル化
クリングル断片の還元とアルキル化は、標準的な方法（Cao, Y. , and Pettersson, R. F., (1990) Growth Factor3, 1013）に従って行った。血清を含まない３００−５００ｍｌのＤＭＥ培地に入った約２０−８０ｍｇの精製タンパク質を０．５Ｍ  ＤＴＴ１５ｍｌと共に１５分間室温にて培養した。培養後、０．５Ｍヨード酢酸アミド３０ｍｌを反応液に添加した。タンパク質溶液は、最初に２０倍量のＤＭＥＭに対して４℃で一晩透析した。溶液はさらに２０倍量の新鮮なＤＭＥＭに対して４℃で４時間透析した。透析後、試料はＳＤＳゲル上で分析し、その内皮細胞増殖に対する阻害活性を測定した。
内皮細胞増殖試験
ウシ微小血管内皮細胞（ＢＣＥ）は、既報（Folkman, J., Haudenschild, C. C. and Zetter, B. R. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci USA. 76、5217-5221）の如く単離し、１０％熱非働化ウシ胎児血清（ＢＣＳ）、抗生物質、３ｎｇ／ｍｌの組み換えヒトｂＦＧＦ（Ｓｃｉｏｓ  Ｎｏｖａ、Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ）を添加したＤＭＥＭ中で維持した。６穴プレート中で成長させた単層ＢＣＥ細胞を０．０５％のトリプシン溶液中に分散させた。細胞は、１０％ＢＣＳを含むＤＭＥＭ中に再懸濁させた。０．５ｍｌ中の約１２，５００個の細胞をゼラチン処理した２４穴プレートのそれぞれのウェルに加え、３７℃（１０％ＣＯ2下で）、２４時間培養した。培養液を５％のＢＣＳを含む新鮮なＤＭＥＭ５００ｍｌで置換し、クリングル断片のそれぞれ、あるいは組合せをｎ＝３で各ウェルへ添加した。３０分間培養後、ｂＦＧＦを最終濃度１ｎｇ／ｍｌで添加した。７２時間の培養後、細胞をトリプシン処理し、Ｈｅｍａｔａｌｌ（Fisher Scientific, Pittsburg, PA）に再懸濁し、コルターカウンターで計数した。
ヒトプラスミノーゲンのクリングル断片の精製と特徴の解析
ヒトプラスミノーゲンの個々のクリングル（Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４）およびクリングル２−３（Ｋ２−３）をコードするｃＤＮＡ断片は、ＰＣＲを基礎とした方法で増幅させた。（図２８）ＰＣＲで増幅したｃＤＮＡ断片は、細菌用発現ベクターにクローニングした。大腸菌で発現させた組み換えタンパク質は、インビトロで再折たたみさせたのち、ＨＰＬＣに組み込んだクロマトグラフィーを用いて、９８％以上にまで均質に精製した（図２９）。還元条件下において、組み換えＫ２、Ｋ３、およびＫ４は１２−１３キロダルトンの分子量して泳動され、それぞれのクリングル断片の予測される分子量に一致した（図２９Ａ、２−４レーン）。１７キロダルトンより高分子量側に泳動される組み換えＫ１は、ＳＤＳゲル電気泳動によって同定した。Ｋ１−４、Ｋ１−３の断片は、以前に記述したとおり（Powell.,J.R., and Castellino, F. J. (1983) Biochem. 22, 923-927 ; Brockway, W. J., and Castellino, F. J. (1972) Arch. Biochem. Biophys）、ヒトリジン−プラスミノーゲン（Ｌｙｓ−ＨＰｇ）をエラスターゼでタンパク分解することによって得られた。これらの推定分子量がそれぞれ、４３キロダルトンと３５キロダルトンである２つの断片（図２９Ｂ、レーン１、２）も均質にまで精製した。精製断片のＮ端末アミノ酸配列の分析結果は、同一の−ＹＬＳＥ−であり、それぞれＫ１−３、Ｋ１−４ではＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０がそれに続いた。Ｋ４のＮ末端配列は−ＶＶＱＤ−であったが、約２０％は−ＶＱＤ−であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３がそれに続いた。どちらもヒトアンジオスタチン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のバリン176とバリン177から始まる予想される配列から推定された。
個々のクリングルの抗内皮細胞増殖活性
アンジオスタチンの個々の組み換えクリングル断片について、ｂＦＧＦによって刺激されたウシ微小血管内皮（ＢＣＥ）細胞の増殖に対する阻害活性を評価した。図３０Ａに図示したように、ｒＫ１はＢＣＥ細胞の増殖を濃度依存的に阻害した。５０％阻害（ＥＤ50）をもたらすのに必要なｒＫ１濃度は約３２０ｎｍであった（表４）。それに比較して、ｒＫ４は、内皮細胞増殖に対してわずかしか、あるいは全く阻害効果を示さなかった。組み換えＫ２、ｒＫ３、２種のリジン結合のないクリングルも内皮細胞増殖に対して濃度依存的な阻害をもたらした（図３０Ｂ）。しかし、ｒＫ２阻害強度は、ｒＫ１およびｒＫ３よりも本質的に弱かった（ＥＤ50=４６０）（図３０および表４）。これらのクリングルの高濃度存在下においても、細胞毒性およびアポトーシスを起こしている内皮細胞に特有な形態、たとえば、円形化、剥がれ、および細胞の断片化などは認められなかった。これらのデータは、アンジオスタチンの抗内皮細胞増殖活性が、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３によってそれぞれ別々に認められ、Ｋ４にはほとんど認められないことを示している。
0003787157.tif 000007
Ｋ１−３とＫ１−４断片の抗内皮細胞増殖活性
複合型のクリングル断片の抗内皮細胞増殖活性を評価するために、精製したタンパク質分解断片であるヒトＫ１−４、Ｋ１−３、ｒＫ２−３のＢＣＥ細胞に対する効果を評価した。これまで認められているように（O'Reilly, M.S., Holmgren, L., Shing. Y., Chen, C., Rosenthal, R.A., Moses, J., Lane, W.S., Cao, Y., Sage, E.H., and Folkman, J. (1994) Cell 79, 315-328）、図３１に図示したごとく、ＢＣＥ細胞増殖はアンジオスタチン様断片Ｋ１−４によって有意に阻害された（ＥＤ50＝１３５ｎＭ）（表４）。Ｋ１−３断片においては抗内皮細胞増殖活性の増強が認められた（ＥＤ50＝７０ｎＭ）（表４）。内皮細胞増殖の阻害は濃度依存的に起こった。これらの結果はアンジオスタチンからＫ４を除去することによって抗内皮細胞増殖活性が増強することを意味している。
ｒＫ２とｒＫ３による相加的な阻害
ｒＫ２−３断片はｒＫ２単独の場合と同様な弱い阻害効果しか示さなかった（図３１）。しかし、ｒＫ２とｒＫ３は両者とも内皮細胞増殖を阻害した（図３０Ｂ）。このことは、Ｋ３の持つ阻害効果がＫ２−３構造中で隠されてしまっていることを意味している。これまでの構造的な検討から、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のシステイン91とシステイン219に相当するヒトプラスミノーゲンのＫ２（システイン169）とＫ３（システイン297）の間にクリングル間のＳ−Ｓ結合が存在することが判っている（Sondel, S., Hu, C.-K., Marti, D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M., and Rickli, E.E. (1996) Biochem.印刷中）図３２Ｂ参照。ｒＫ２とｒＫ３の組合せの場合での阻害効果について検討した。興味あることに、個々のｒＫ２とｒＫ３断片をＢＣＥ細胞に同時に添加した場合、相加的な阻害効果が観察された。図３２Ａ参照。これらの結果は、Ｋ２−３の最大阻害効果を得るためには、Ｋ２とＫ３間のＳ−Ｓ結合による架橋を開裂させたほうがよいことを示している。
クリングル構造の適切な折たたみはアンジオスタチンの抗内皮細胞活性に必須である
クリングル構造の折たたみが抗内皮細胞増殖活性に必要かどうか検討するために、未変性のアンジオスタチンをＤＴＴで還元した後にウシ微小血管内皮細胞に対する効果を評価した。還元した後に、アンジオスタチンをさらにヨード酢酸アミドで処理しアルキル化し、ＳＤＳゲル電気泳動にて分析した。図３４Ａに示すように、ＤＴＴ処理したタンパク質は、未変性のアンジオスタチンが分子量約３３キロダルトンの所に泳動されるのに比べ（レーン１）、分子量約４２キロダルトンとより高分子量側に泳動され（レーン２）、これはアンジオスタチンが完全に還元されたことを示している。アンジオスタチンの抗増殖活性は還元後に大部分が失われた（図３４Ｂ）。これらの結果から我々は、内皮細胞増殖に対する強力な阻害活性を維持するためには、クリングル内のＳ−Ｓ結合を介した正確な折たたみが必要とされると結論付けた。
ヒトプラスミノーゲンのクリングル構造部位のアミノ酸配列を並べて比較すると、図３５に示されているように、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３およびＫ４は同じ全体構成とアミノ酸配列の相同性（５６−８２％判明）を示すことが判った。これらの構造のうちで、高親和性リジン結合クリングルであるＫ１は、最も強力に内皮細胞増殖を阻害する部分である。興味あることに中等度のリジン結合親和性を示す断片であるＫ４は阻害効果を欠いている。これらの結果はクリングル構造のリジン結合部位が阻害効果の発現に必ずしも直接関わっているわけではないことを示している。これらのクリングル構造間でのアミノ酸配列の保存と機能的な多様性は、進化の過程におけるＤＮＡの複製に際して生じる変異の役割を検討するのに理想的な系である。構造的に関連したタンパク質によって示される血管新生の調節に準じた同様な活性の変動は、−Ｃ−Ｘ−Ｃ−ケモカインやプロラクチン−成長ホルモン群においても観察される（Maione, T.E., Gray, G.S., Petro, A.J., Hunt, A.L., and Donner, S.I. (1990) Science 247, 77-79; Koch, A.E., Polverini, P.J., Kunkel, S.L., Harlow, L.A., DiPietro, L.A., Elner, V.M., Elner, S.J., and Strieter, R.M. (1992) Science 258, 1798-1801.; Cao, Y., Chen, C., Weatherbee, J.A., Tsang, M., and Folkman, J. (1995) J. Exp. Med. 182, 2069-2077.; Strieter, R.M., Polverini, P.J., Arenberg, D.A., and Kunkel, S.L. (1995) Shock 4, 155-160.; Jackson, D., Volpert, O.V., Bouck, N., and Linzer, D.I.H. (1994) Science 266, 1581-1584）。
さらに配列を検討したところ、Ｋ４はシステイン２２と７８に近接してそれぞれ２つの陽性に荷電したリジン残基を有することが判明した（図３５）。1Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析によって、これら４つのリジンは、リジン５７と共にＫ４中に陽性に荷電した部位の中心を形成することが明かとなった（Llinas M, 未発表データ）、一方他のクリングル構造はそのような陽性荷電した部位を欠如している。このリジンに富む領域がクリングル４の阻害活性の喪失に寄与しているのかどうかはこれからの研究課題である。Ｋ４は他の細胞種の増殖を亢進すること、および細胞内カルシウム放出を増加させることが報告されている（Donate, L.E., Gherardi, E., Srinivasan, N., Sowdhamini, R., Aporicio, S., and Blundell, T.L. (1994) Prot. Sci. 3, 2378-2394）。アンギオスタシンからＫ４を除去すると内皮細胞に対する抑制効果が増強するという事実は、この構造がＫ１−３の抑制効果のうちのいくらかを妨げている事を示唆している。
アンジオスタチンとその関連するクリングル断片が特異的に内皮細胞増殖を抑制する基礎となる作用機序については、未検討である。阻害が増殖している内皮細胞に特異的に発現している受容体を介しているものなのか、アンジオスタチンは内皮細胞内に取り込まれることによって、その後細胞増殖を阻害するのかは、依然明確ではない。あるいは、アンジオスタチンは内皮細胞の接着受容体、例えばインテグリンavB3と相互作用することによって、インテグリン介在性の血管新生（Brooks, P.C., Montgomery, A.M., Rosenfeld, M., Reisfeld, R.A., Hu, T. Klier, G., and Cheresh, D.A. (1994) Cell 79, 1157-1164）を阻害しているのかもしれない。興味あることにFriedlanderら（Friedlander, M., Brooks, P.C., Shaffer, R.W., Kincaid, C.M., Varner, J.A., and Cheresh, D.A. (1995) 240, 1502）は最近、生体における（ｂＦＧＦあるいは腫瘍壊死因子によって誘導される）角膜あるいは漿尿膜モデルでの血管新生は、avb3依存的であると報告した。しかし、ＶＥＧＦ、ＴＧＦａあるいはフォルボールエステルによって誘導される血管新生はavb5依存的であった。それぞれのインテグリンに対する抗体はこれらの経路の内の一つを特異的に阻害し、両インテグリンに対する環状タンパク質性拮抗剤は、それぞれのサイトカインによって誘導される血管新生を阻害した（Friedlander, M., Brooks, P.C., Shaffer, R.W., Kincaid, C.M., Varner, J.A., and Cheresh, D.A. (1995) 270,1502）。ｂＦＧＦとＶＥＧＦによって誘導される血管新生はアンジオスタチンによって阻害されるので、これらインテグリン依存性の血管新生に共通の経路を阻害しているのかも知れない。
最近数１０年間に数多くの内因性の血管新生阻害因子が同定された（Folkman, J. (1995) N. Engl. J. Med. 333, 1757-1763）。９つの解析されている内皮細胞抑制因子のうちで、いくつかがタンパク質分解物である。たとえば、ヒトプロラクチンのＮ末端の１６キロダルトン断片が内皮細胞の増殖を阻害し、生体で血管新生を阻害する（Clapp, C., Martial, J.A., Guzman, R.C., Rentierdelrue, F., and Weiner, R.I. (1993) Endocrinology 133, 1292-1299）。最近の論文において、D'Angeloらは、抗血管新生性の１６キロダルトンのＮ末端断片は、微小血管においてＶＥＧＦやｂＦＧＦによって活性化されたマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）を阻害したと報告した（D'Angelo, G., Struman, I., Martial, J., and Weiner, R. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 6374-6378）。アンジオスタチンと同様に、元々の完全なプロラクチン分子は内皮細胞の増殖を阻害しないし、血管新生阻害物質でもない。血小板因子４（ＰＦ−４）は高濃度で血管新生を阻害する（Maione, T.E., Gray, G.S., Petro, A.J., Hunt, A.L., and Donner, S.I. (1990) Science 247, 77-79; Cao, Y., Chen, C., Weatherbee, J.A., Tsang, M., and Folkman, J. (1995) J. Exp. Med. 182, 2069-2077）。しかし、Ｎ末端が切断された、タンパク質分解的に切られたＰＦ−４断片は元々の完全なＰＦ−４に対して、抗細胞増殖活性において３０−５０倍の増強を示した（Gupta, S.K., Hassel, T., and Singh, J.P. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 7799-7803）。フィブロネクチン、マウスの上皮成長因子（ＥＧＦ）およびトロンボスポンジンのより短い断片もまた特異的に内皮細胞増殖を阻害すると報告されている（Homandberg, G.A., Williams, J.E., Grant, D., Schumacher, B., and Eisenstein, R. (1985) Am. J. Pathol. 120, 327-332; Nelson, J., Allen, W.E., Scott, W.N., Bailie, J.R., Walker, B., McFerran, N.V., and Wilson, D.J. (1995) Cancer Res. 55, 3772-3776; Tolsma, S.S., Volpert, O.V., Good, D.J., Frazer, W.A., Polverini, P.J., and Bouck, N. (1993) J. Cell Biol. 122, 497-511）。大きいタンパク質をタンパク質分解することによって元々の分子の立体構造が変わったり、抗血管新生的な新たな活性部位が露出したりするのかも知れない。従って、タンパク質分解酵素が血管新生において重要な役割を演じている。これまでに生体におけるそのようなタンパク質分解酵素の調節機構についてはほとんど知られていない。
結果はまた、アンジオスタチンのＳ−Ｓ結合を介したクリングル構造への折たたみが内皮細胞増殖に対する阻害的な効果の維持に必要であることも示した。プラスミノーゲンに見られるようなクリングル構造は他の様々なタンパク質においても認められている。たとえば、アポリポプロテイン（ａ）はプラスミノーゲンのクリングル４の繰り返しを３７個も持っている（McLean, J.W., Tomlinson, J.E., Kuang, W.-J., Eaton, D.L., Chen, E.Y., Fless, G.M., Scanu, A.M., and Lawn, R.M. (1987) Nature 330, 132-137）。プロトロンビンのアミノ末端部分もプラスミノーゲンのものと同様な２つのクリングルを持つ（Walz, D.A., Hewett-Emmett, D., and Seegers, W.H. (1977) Proc.Natl. Acad. Sci. 74, 1969-1973）。ウロキナーゼもまたプラスミノーゲンと徹底的に相同性を示すクリングル構造を有している（Gunzler, W.A., J., S.G., Otting, F., Kim, S.-M.A., Frankus, E., and Flohe, L. (1982) Hoppe-Seyler's A. Physiol. Chem. 363, 1155-1165）。さらに、サーファクタントタンパク質Ｂと肝成長因子もクリングル構造を備えている（Johansson, J., Curstedt, T., and Jonvall, H. (1991) Biochem. 30, 6917-6921; Lukker, N.A., Presta, L.G., and Godowski, P.J. (1994) Prot. Engin. 7, 895-903）。
実施例２８
アンジオスタチン断片による転移と内皮細胞増殖の阻害
下記の実施例において、追加のアンジオスタチン断片の活性の特徴を解析している。データは強力な抗内皮細胞および腫瘍抑制活性が、アンジオスタチンのこのような断片によって得られることを示唆している。
ここで用いられているように”クリングル１−４ＢＫＬＳ”は、内皮細胞阻害活性を有し、以下のクリングル１−４ＢＫＬＳに相同的なアミノ酸配列から成り立っているプラスミノーゲンのタンパク質誘導体を意味する。一例を挙げると、これらに限定されるものではないが、実施例において特に指示がないかぎり、マウスクリングル１−４ＢＫＬＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４１）、ヒトクリングル１−４ＢＫＬＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４２）がある。マウスクリングル１−４ＫＬＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４１）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１のマウスプラスミノーゲンのアミノ酸配列９３から４７０番目（９３と４７０番目を含めて）に相当する。本実施例は”アンジオスタチン断片”はプラスミノーゲン断片でも構わないこと、およびたとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で示されるようなアンジオスタチンよりも大きなアミノ酸配列を包含すること、さらにまた治療的な内皮細胞増殖阻害活性あるいは抗血管新生活性を有することを明らかにした。
クリングル１−４ＢＬＫＳのアミノ酸配列は、上記で同定した特定のクリングル１−４ＢＬＫＳの配列と相同的である。好ましくは、アミノ酸配列は明らかにされている配列との相同性において、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％を有する。断片の内皮細胞阻害効果を改善あるいは修正するために、様々なアミノ酸の置換、欠失そして他の修飾をすることが可能である。このような修飾は本請求の範囲および精神を拡げる事を目的とはしていない。さらに、断片の内皮細胞阻害活性を有意に変化させないような、様々な不顕性のアミノ酸置換、付加、あるいは欠失もなされることが可能であり、従ってこれらが本請求の範囲および精神を拡げる事を目的とはしていないことが理解される。
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを用いたアンジオスタチンのクローニング
アンジオスタチンをコードする配列をVentポリメラーゼ（New England Biolabs）とそれぞれＸｈｏＩとＥＣｏＲＩのリンカーをもつプライマー＃１５４
（5'-ATCGCTCGAGCGTTATTTGAAAAGAAAGTG-3'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）と＃１５１
（5'-ATCGGAATTCAAGCAGGACAACAGGCGG-3'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）を用いたＰＣＲによってｐＴｒｃＨｉｓ／ＨＡｓを鋳型として増幅した。このプラスミドは、ヒトプラスミノーゲン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）のアミノ酸９３番目から４７０番目をコードし、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの本来の分泌信号であるＰＨＯ１を用いてｐＨＩＬ−Ｓ１発現ベクターのＸｈｏＩ／EＣｃｏＲＩ制限酵素部位部位にクローニングするための配列を含んでいる。この同様な配列が同様の方法でそれぞれＳｎａ  ＢＩ制限酵素部位とＲｃｏＲh制限酵素部位を持つプライマー＃１５６
（5'-ATCGTACGTATTATTTGAAAAGAAAGTG-3'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）と＃１５１を用いて，α因子の分泌信号を用いているｐＰｌＣ９発現ベクターのＳｎａ  ＢＩ／ＥｃｏＲＩ制限酵素部位部位にクローニングするためた増幅した増幅結果の産物はゲルで精製し、リンカー部位を適当な酵素で精製し、さらに再びジーン  クリーン（Ｂｉｏ１０１）を用いて精製した。これらの遺伝子断片は適当なベクター中に組み込まれた。得られたクローンを選択し、クローンのプラスミド調製品を得て、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主株ＧＳ１１５に形質転換したときにＨｉｓ+ＭｕｔsおよびＨｉｓ+Ｍｕｔ+組み換え体を得るために線状化した。挿入はＰＣＲにて確認した。
Ｈｉｓ+およびＨｉｓ+Ｍｕｔ+組み換え体は両者ともメタノールで誘導され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシー染色とクリングル１から３に対するマウスモノクローナル抗体（Castellino, Enzyme Research Laberatories, Inc., South Bend, IN）を用いた免疫ブロットによって、アンジオスタチンを高レベルに発現しているものを選抜した。
これらから、ＧＳ１１５形質転換Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓクローン、ｐＨＩＬ−Ｓ１／ＨＡｓ１８を選択し、Ｈｉｓ+Ｍｕｔs表現系と特徴付けた。
ｐＨＩＬ−Ｓ１／ＨＡｓ１８の発現
ｐＨＩＬ−Ｓ１／ＨＡｓ１８からのアンジオスタチンの発現は、Ｈｉｓ+Ｍｕｔsクローンに特有である。バッフル震盪フラスコ中での誘導において、１リットルのＯＤ600細胞を１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．０、硫酸アンモニウムを用いた１．３４％イースト・ナイトロジェン・ベース、０．００００４％ビオチンおよび０．５％メタノールを含む１５０ｍｌの緩衝メタノール複合培地中で１リットルのバッフルフラスコを用いて培養した。細胞は、３０℃、２５０ｒｐｍで常に震盪した。２４時間おきに、最終濃度０．５％になるように無水メタノールをバッチに添加した。１２０時間後、５０００ｒｐｍ、１０分間、遠心し、上清を使用するときまで−７０℃にて保存した。
リジン−セファロースクロマトグラフィーによるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発酵培地からのアンジオスタチンの精製
全ての手順は４℃にて行った。アンジオスタチンを含む粗発酵培地、普通２００ｍｌを、１４，０００ｘｇで遠心し、３０キロダルトンの分子量遮断メンブレンＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３０（アミコン）を用いて最初の量の４分の１にまで濃縮した。同量の５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５を濃縮した試料に添加し、再び最初の試料の量の４分の１にまで濃縮した。試料を再び、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５を用いて容量比１：１に希釈した。６０ｇのリジン−セファロース４Ｂ（ファルマシア）を５００ｍｌの氷冷した５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５中に再懸濁し、４８ｘ１００ｍｍカラム（充填容量〜１８０ｍｌ）に詰めた。カラムを、１．５ｍｌ／分の流速で、カラム容量（ＣＶ）の７．５倍の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で一晩洗浄した。試料を１．５ｍｌ／分の流速でカラムに載せ、その後、１．５ＣＶの５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５を用いて３ｍｌ／分の流速でカラムを洗浄した。カラムをその後、１．５ＣＶのリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４を用いて３ｍｌ／分の流速で洗浄した：アンジオスタチンを、それから０．２Ｍ  ε−アミノ−ｎ−カプロン酸、ｐＨ７．４を用いて３ｍｌ／分の流速で溶出した。有意な吸光度を示す画分を集め、脱イオン水に対して２４−４８時間透析し、凍結乾燥した。１００ｍｇの全タンパク質からの収量は、アンジオスタチン１０ｍｇであった。カラムを、５倍のカラム容量の５０ｍＭリン酸ナトリウム／１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を用いて再生した。
ウシ毛細血管内皮細胞増殖試験
ウシ毛細血管内皮細胞は、前記のように得た。細胞は、７５ｃｍ2細胞培養用フラスコ中で、３ｍｇ／ｍｌの組み換えヒトｂＦＧＦ（Scios Nova, Mountainview, CA）、１０％熱非働化仔牛血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５ｍｇ／ｍｌファンギゾン（fungizone）（BioWhittaker）を含むＤＭＥＭ培地で維持された。解析は以前に記したように行った。
動物試験
６週から８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の皮下に、マウスルイス肺癌−低転移性系統（ＬＬＣ−ＬＭ）を移植した（１ｘ１０6細胞／注入）。移植してからおよそ１４日後、一次腫瘍が１．５ｃｍ3に達したときに動物をメトキシフルレンにて麻酔し、一次腫瘍を外科的に切除した。切開部位は、簡単な継続縫合を行って閉じた。この群の半数の動物に、外科手術直後に組み換えあるいはプラスミノーゲン由来アンギオテンシンを十分量（３ｍｇ／ｋｇ皮下）と、その後１４日間毎日１．５ｍｇ／ｍｌを注入した。対照群のマウスには、外科手術後１４日間毎日、同量のＰＢＳを投与した。全てのマウスを、一次腫瘍を切除して１４日後（腫瘍を移植して２８日後）に屠殺し、肺を切除して重量を測定し、表面転移巣をステレオマイクロスコープにて計数した。
組換えヒトアンジオスタチン断片の特徴
全部で２６個のシステイン残基を含むヒトプラスミノーゲンのクリングル１から４を含有するヒトアンジオスタチンをコードする遺伝子断片を、メチルトロピック酵母であるＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓに発現させた。アンジオスタチンを発現したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓはリジンセファロースに結合し、ε−アミノカプロン酸で特異的に溶出することができる。プラスミノーゲンのクリングル１および４の物理学的特性（Sottrup−Jensen, Lら、Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol. 3 (1978) Ravens Press, N. Y. p. 191）を有する、完全に機能を有するεアミノカプロン酸−結合性クリングルが、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって発現され分泌されうる事、および再折たたみを必要としない技術によって精製されうることを示す（図３６ＡおよびＢ）。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来の発現されたアンジオスタチンおよびプラスミノーゲンのエラスターゼ切断によって精製されたアンジオスタチンは、クリングル１から３に対する立体配座依存性モノクローナル抗体（Castellino, Enzyme Research Laboratories. Inc., South Bend, IN）によって認識される（図３６Ｂ）。この抗体は、プラスミノーゲンあるいはアンジオスタチンの還元型は認識することができない。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現アンジオスタチンは、変性非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー染色ゲル上で、４９キロダルトンおよび５１．５キロダルトンに泳動される二量体のようである。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現タンパク質は、主に高マンノース型のＮ−結合性グリコシル化およびわずかにＯ−結合性グリコシル化によって翻訳後に修飾される。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現アンジオスタチン中のグリコシル化の可能性を調べるために、我々は、高マンノース構造に特異的なエンドグリコシダーゼＨによって組み換えアンジオスタチンを切断したところ、５１．５キロダルトンのバンドが４９キロダルトンのバンドと同位置に移動した（図３７ＡおよびＢ）。最初にシアル酸残基を除去するためにノイラミニダーゼ処理をした後にＯ−グリカナーゼ消化を行うと、二量体の泳動パターンに変化はなかった（データは示さない）。これらの結果は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現アンジオスタチンには２種類の型があることを示す：（１）以下の構造である可能性のＮ−結合性複合体鎖を有する：
0003787157.tif 000008
および（２）いかなる糖鎖も持たない．
インビトロにおけるウシ毛細血管内皮細胞の阻害
組み換えによって発現されたアンジオスタチンが抗血管新生活性を有するかどうかを調べるために、ＢＣＥをｂＦＧＦの存在化で培養し、精製した組み換えアンジオスタチンの添加がＢＣＥの増殖を阻害するかどうかを検討した。精製したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現アンジオスタチンは、インビトロにおけるウシ内皮細胞のｂＦＧＦによって誘導される増殖を用量依存的に（図３８Ｃ）阻害した（図３８Ｂ）。１μｇｍｌの組み換えアンジオスタチンでは、阻害は８０％であった。５０％阻害は、ヒトプラスミノーゲンのエラスターゼ切断由来のアンジオスタチンで得られる値と一致した。
インビボにおける転移の抑制
アンジオスタチンが最初に同定され、移植可能なマウスＬＬＣ（ＬＭ）株を使用した。同系のＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの皮下に移植すると、腫瘍は迅速に成長し、１４日以内に１．５ｃｍ3以上の腫瘍塊を形成する。原発腫瘍を切除した後、肺における微小転移が指数関数的に急成長し、肺全体の表面を覆うまでになる。これらの転移巣は、原発巣の切除後１４日後には高度に血管の分布を受けている。もし、原発巣が依然として残っている場合は、微小転移は潜在化しており巨視的に観察されることはない。転移巣の成長に対する抑制効果を検討するために、原発腫瘍の切除後に組換えアンジオスタチンをマウスに全身的に投与した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓが発現したアンジオスタチンを全身性に３０μｇ／マウス／日で投与することによって、転移巣の成長を表面への転移のスコア化（図３９Ａ）および肺の全重量（図３９Ｂ）として定量した場合、それを抑制していた。原発腫瘍を切除し、組換えアンジオスタチンあるいはプラスミノーゲンをエラスターゼで分解して得られたアンジオスタチンを毎日投与したマウスの肺の重量は、正常マウスの肺重量（１９０〜２００ｍｇ）と同程度であった。原発腫瘍を切除し、引き続き組換えアンジオスタチンを毎日投与されたマウスの肺はピンク色で、血管の供給を受けていない微小転移が最小限認められた（図４０）。それに比較して、原発腫瘍の切除後に生理食塩水を投与されていたマウスの肺は、血管の分布した転移巣で覆われていた（図４１）。さらに注目すべき重要な点は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓが発現したアンジオスタチンが今回の検討で用いた投与量、投与法によって全身性あるいは局所性の毒性を全く示さなかったことである。炎症および出血の事実は全ての処置マウスにおいて認められなかった。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓが発現したアンジオスタチンタンパク質は２つの重要な天然タンパク質の物理的特性を有している。（１）ヒトプラスミノーゲンのクリングル１〜３に対して作製された、立体構造依存的な抗体によって認識される（図３６Ｂ）。（２）リジンを結合する（図３６Ａ、Ｂ）。これらの特性は組換えアンジオスタチンタンパク質が、本来の分子を模倣する立体構造を保つ形で発現されていることを示している。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓが発現したアンジオスタチンタンパク質はｂＦＧＦで刺激されたウシ微小血管内皮細胞の増殖をインビトロで阻害する（図３８）。全身性に投与した場合、放置すれば致死的な転移性のＬｅｗｉｓ肺癌を抑制状態に維持する（図３９ＡとＢ、図４０）。
初期のデータでは、マウスから切除した新鮮なＬｅｗｉｓ肺癌あるいはインビトロの培養系で４回継代したＬＬＣ細胞にはアンジオスタチンの転写物は認められなかった。肝臓で産生されるプラスミノーゲンは、循環血流中で濃度が１．６±０．２μＭに維持されている。ＬＬＣ−ＬＭ腫瘍の場合、結合型あるいは循環血流中のプラスミノーゲンを切断しアンジオスタチンを産みだす酵素を発現していると言う可能性がある。別の可能性としては、腫瘍部位に集積する炎症系の細胞がそのような酵素を産生するのかも知れない。
本来のヒトプラスミノーゲンと同様にＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの発現するプラスミノーゲンがどちらも糖鎖修飾されている形とされていない形として産生されるのは大変興味深い。ヒトプラスミノーゲンの場合単一の遺伝子に相当する単一の転写物が両方の形状を生産し得る。ＴＰＡで認められるものと同様に、ヒトプラスミノーゲンの異なった翻訳後修飾のメカニズムは不明である。
アンジオスタチンはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって極めて良く発現される。上清は１００ｍｇ／Ｌのタンパク質を含んでいる。従って、臨床試験に必要とされる量は簡単に産生され、その技術の習熟者には良く知られた一般的な方法を用いて精製することができる。この発現系の開発と、精製された組換えアンジオスタチンのインビトロとインビボの転移に対する活性が、これらの断片の腫瘍増殖の抑制と癌患者あるいは血管新生が介在する疾患を患っている他の患者の延命を来たす能力を評価する上での基礎をなしている。
実施例２９
アンジオスタチン凝集体の産生と投与
この実施例は、内皮細胞増殖および腫瘍成長を阻害するためにアンジオスタチン凝集体の産生と投与について記載する。一般的に、大腸菌から産生される組み換えタンパク質はインビボで活性を獲得するためには可溶化した後再び折り畳むこと（復元、還元し、アルキル化する）が必要と考えられる。この過程において、しばしばかなりの量のタンパク質が失われてしまう。本実施例においては、凝集型のアンジオスタチンが精製後に作製され、その後の復元、還元、アルキル化を経ずに、血管新生と腫瘍増殖を抑制する目的で直接使用された。従って、本実施例においては驚くべきほどにアンジオスタチンの生産と使用が効率的な方法を提示している。この凝集型のアンジオスタチンと、運搬供与の方法についてもアンジオスタチンの持続放出の手段を提供している、従ってその効率を最適化している。ここで用いている”凝集型のアンジオスタチン”と言う用語は、後でより詳細に記載するように、本質的に精製されているが、手で再折たたみをしていないアンジオスタチンを意味している。
アンジオスタチンの発現
迅速で生産性が高く廉価であるという利点を持つ大腸菌を用いた発現系が、マウスアンジオスタチンの発現に用いられた。ＰＣＲを基礎にしたアンジオスタチンの発現系を構築する作戦に沿って、プラスミノーゲンのクリングル１−４のｃＤＮＡ配列（プラスミノーゲンのｃＤＮＡはＡＴＣＣより購入した）の両外側に位置する２つのオリゴプライマーを作製した。（一例としてMenhart, N., Shel, L.C., Kelly, R.F., and Castellino, F.J. (1991) Biochem. 30, 1948-1957); Marti, D., Schaller, J., Ochensberger, B., and Rickli, E.E. (1994) Eur. J. Biochem. 219, 455-462; Sondel, S., Hu, C.-K., Marti, D., Affolter, M., Schaller, J., Llinas, M., and Rickli, E.E. (1996) Biochem.印刷中; Rejante, M.R., Byeon, I.-J.L., and Llinas, M. (1991) Biochem. 30, 11081-11092を参照）ＰＣＲ産物は、Ｔ７ ｌａｃプロモーターとオリゴヒスチジン配列を持つｐＥＴ２２ベクター（Ｎｏｖｅｇｅｎ社）のＮｃｏＩとＸｈｏＩ制限酵素部位に挿入した。次いでｃＤＮＡはｌａｃ ＵＶ５の制限下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を染色体上に持つ大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）系統）を形質転換させた。組換えアンジオスタチンの発現はＩＰＴＧの添加によって誘導された。発現されたアンジオスタチンは、宿主細胞内で封入体として蓄積し、典型的にはクマシ−ブルー染色によれば全細胞中のタンパク質の４０％以上を占める。
本発明は、どのような種由来であっても組換えアンジオスタチンとその断片は、本技術に習熟している者に良く知られている多様なベクターと宿主の系列において発現することが可能であると期待している。
アンジオスタチンの精製と凝集
超音波処理した封入体を含んだ宿主細胞の不溶性画分は、９０００ｒｐｍで２５分の遠心と洗浄の繰り返しで精製した。結果得られた産物は、クマシーブルー染色によって評価したところ８０％のアンジオスタチンを含んでいる。融合タンパク質のＮ末端オリゴヒスチジン部位は、封入体を６Ｍウレアで可溶化することによる変性条件下でＮｉ2+−ＮＴＡアガロースカラム（１．５ｃｍｘ５ｃｍ）を用いたキレートアフィニティークロマトグラフィーを用いることによって便利で経済的に精製することを可能にする。図４１のレーン７に見られるように、精製したアンジオスタチンはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でクマシーブルー染色によって、およそ４５キロダルトン〜６５キロダルトンの間、より好ましくは約５５キロダルトンの単一のバンドとして認められる。この一段階のクロマトグラフィーは本質的にタンパク質を均質なまでに精製することができるが、本発明は、本技術分野にに習熟している者に良く知られている多様な他の精製法についてもこの製品を得るために適用することができると期待する。
溶出液中のタンパク質は、次いでリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に対して２４時間に３回透析液を交換して４℃で透析（分子量１５，０００カットオフ）した。透析の間、白い沈殿が認められた。試料を透析チューブから回収し、沈殿物を遠心によって取り去った。沈殿物は次いでボルテックスを用いてＰＢＳ中に再懸濁し、動物実験に供するように微細な懸濁液を作製した、あるいは−２０℃で保存した。この沈殿物は凝集型アンジオスタチンを成す。他の選択として一例を示せば、２０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．９／１５０ｍＭ食塩も透析液として用いることができる。本発明は、本開示の視点から本技術分野で習熟するものによって日常的に決定できる制限内で、より多くのあるいはより少ない透析あるいは多様な他の透析用緩衝液が、相当量の凝集型のアンジオスタチンを得るために利用可能であることを期待している。
凝集型アンジオスタチンのインビトロ試験
実施例８にて概略を示したように、ウシ微小血管内皮（ＢＣＥ）細胞が本評価に用いられた。細胞に本実施例で示した様に作製された凝集型組換えヒトアンジオスタチンを添加した。結果は、凝集型アンジオスタチンに曝露した内皮細胞が有意に阻害されることを明らかにしている図４２に示した。
凝集型アンジオスタチンのインビボ試験
全ての動物実験は小児病院の動物実験施設において、施設のガイドラインに従って行われた。
Ａ．本実施例に記載されているように作製された凝集型組換えマウスアンジオスタチンは、ニワトリＣＡＭ試験によって評価した。（O'Reilly, M.S., Holmgren, L., Shing, Y., Chen, C., Rosenthal, R.A., Moses, M., Lane, W.S., Cao, Y., Sage, E.H., and Folkman, J. Cell (1994) 79:315-328）２５μｇの用量で微小血管の形成に対する阻害効果は１００％であった（５個のニワトリＣＡＭ試験の全てにおいて、２〜３+の阻害範囲を示した）。１００μｇの用量では、微小血管形成に対する阻害効果は９６時間持続した。他の血管新生阻害剤とプラスミノーゲン由来のアンジオスタチンの効果は約４８時間持続することが知られている。このことは、凝集型アンジオスタチンが持続性放出という利点をもたらすことを示唆している。
Ｂ．Ｌｅｗｉｓ肺癌は、Ｃ５７Ｂｌ６マウスの後背部中央の皮下に接種した。マウスは、既に記載したように調製した０．１ｍｌのＰＢＳ中の１ｘ１０6個の細胞を植え付けられ、飼育ケージに６匹以下の群で入れられた。腫瘍は、ダイアル式ノギスで測定し、腫瘍容積は幅ｘ幅ｘ長さｘ０．５２と言う式で決定された。処置群対対照との腫瘍容積の比（Ｔ／Ｃ）は、最終の時点で算出した。
３から５日経って腫瘍容積が１００−２００立方ミリメーターになった後、マウスをランダムに２つの独立の試験に分けた。最初の試験においては、マウスは２−３ｍｇ／ｋｇの凝集型組換えマウスアンジオスタチンのＰＢＳ懸濁液を２４時間おきに腫瘍部位とは離れた場所に皮下投与された（ｎ=３匹／群）。対照群では、相当する量の生理食塩液を投与された。２つ目の独立の試験においては（ｎ=６匹／群）、実験用マウスは１０ｍｇ／ｋｇの凝集型組換えマウスアンジオスタチンのＰＢＳ懸濁液を２４時間おきに腫瘍部位とは離れた場所に皮下投与された。対照群では、相当する量の生理食塩液を投与された。
凝集型組換えマウスアンジオスタチン懸濁液を投与されたいずれのマウスにおいても毒性、体重減少は認められなかった。マウスにおいては凝集型アンジオスタチンが注射後皮下の固形物質として認められ、数時間かけて吸収した。このことは、それが徐々に可溶化される事を示唆し、凝集型アンジオスタチンは持続性放出の効率的な手段であることを示している。両方の用量においてＬｅｗｉｓ肺癌の原発巣において処置群のマウスにおいては有意な成長の阻害が認められた。図４３、４４を参照のこと。（対照の生理的食塩液群においては、死亡例が出始め、処分しているが）１９日間に渡って１日１回、１０ｍｇ／ｋｇ／日を投与されて得られたＴ／Ｃ値は０．０６であり、この発明の知見以前では得られなかったような腫瘍容積の縮小である。
本実施例におけるインビトロとインビボの結果は、ヒトにおいて内皮細胞増殖、血管新生、腫瘍の成長の阻害のために記載した製品と過程との使用がうまくいくことを期待させる基礎をなすものである。理論に縛られることを望むわけではないが、この方法で作製された凝集型組換えアンジオスタチンは、通常復元されているエラスターゼによって作製されるアンジオスタチンや他の精製タンパク質と異なる立体構造を持ち、従って異なる物理学的特性を持つ可能性がある。精製した組換えアンジオスタチンは、凝集型の懸濁液を作製するために比較的大量の緩衝液か水に対して透析することによって沈殿させられる。これは、不正確に折り畳まれたタンパク質が不溶性になり凝集するために起こると考えられている。以前は、変性した凝集型タンパク質が生体においてこのように極めて有効であることは期待されなかったであろう。明かにされた強力な抗腫瘍活性は、皮下からの凝集タンパク質の遅いが持続的な溶解と放出に因るものと信じられる。本発明はさらに、天然界に存在するあるいは組換えのアンジオスタチンとアンジオスタチン断片が、復元する必要無しに内皮細胞の増殖と腫瘍の成長を効果的に阻害できる凝集型の天然あるいは組換えのアンジオスタチンあるいはアンジオスタチンの凝集型断片を得るために記載された精製法を用いることによって使用されることを期待している。
なお、これまでに記載した事項は、本発明の好ましい実施態様にのみ関連し、後記に添付される特許の請求範囲に記載される本発明の範囲と精神から逸脱することなく多くの修飾や変更を加えることができるものである。様々な参考文献がここで引用されており、この記載によってその全体を包含するものである。
配列表
（１）一般情報：
（i）出願人：フォークマン，エム．ジューダ
オーレイリー，マイケル，エス．
イーハイ，カオ
シム，ビー．キム  リー
（ii）発明の名称：アンジオスタチンフラグメント、
アンジオスタチン凝集体および使用方法
（iii）配列の数：４５
（iv）連絡先住所：
(A)受取人：ジョーンズ  ＆  アスキュー
(B)番地：１９１  ピーチツリー  ストリート，３７階
(C)都市名：アトランタ
(D)州名：ジョージア
(E)国名：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：30303-1769
(V)コンピュータ読取形式：
(A)媒体型：フロッピーディスク
(B)コンピュータ：IBM  PC  コンパティブル
(C)オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：PatentIn  リリース#1.0，バージョン#1.30
（vi）最新の出願データ：
(A)出願番号：US
(B)出願日：
(C)分類：
（viii）弁理士／代理人情報：
(A)氏名：ウォーレン，ウィリアム  エル．
(B)登録番号：36,714
(C)参照／事件番号：05213-0126
（ix）通信情報：
(A)電話番号：404-818-3700
(B)ファックス番号：404-818-3799
（２）配列番号１に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：８１２アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖型
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：マウス
（vii）直接の起源
(B)クローン名：プラスミノーゲン
（xi）配列：配列番号１
0003787157.tif 000009
0003787157.tif 000010
0003787157.tif 000011
0003787157.tif 000012
（２）配列番号２に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：３３９アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：マウス
（vii）直接の起源
(B)クローン名：アンジオスタチン  フラグメント
（xi）配列：配列番号２
0003787157.tif 000013
0003787157.tif 000014
（２）配列番号３に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：３３９アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ヒト（Homo sapiens）
（vii）直接の起源
(B)クローン名：アンジオスタチン  フラグメント
（xi）配列：配列番号３
0003787157.tif 000015
0003787157.tif 000016
（２）配列番号４に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：３３９アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（vi）起源：
(A)生物名：アカゲザル（Rhesus monkey）
（vii）直接の起源
(B)クローン名：アンジオスタチン  フラグメント
（xi）配列：配列番号４
0003787157.tif 000017
0003787157.tif 000018
（２）配列番号５に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：３３９アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（vi）起源：
(A)生物名：ブタ
（vii）直接の起源
(B)クローン名：アンジオスタチン  フラグメント
（xi）配列：配列番号５
0003787157.tif 000019
0003787157.tif 000020
（２）配列番号６に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：３３９アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（vi）起源：
(A)生物名：ウシ
（vii）直接の起源
(B)クローン名：アンジオスタチン  フラグメント
（xi）配列：配列番号６
0003787157.tif 000021
0003787157.tif 000022
（２）配列番号７に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：７９アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
(A)生物名：マウス
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ１
（xi）配列：配列番号７
0003787157.tif 000023
（２）配列番号８に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：７９アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
(A)生物名：ヒト（Homo sapiens）
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ１
（xi）配列：配列番号８
0003787157.tif 000024
（２）配列番号９に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：７９アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：アカゲザル（Rhesus monkey）
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ１
（xi）配列：配列番号９
0003787157.tif 000025
（２）配列番号１０に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：７９アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ブタ
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ１
（xi）配列：配列番号１０
0003787157.tif 000026
（２）配列番号１１に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：７９アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ウシ
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ１
（xi）配列：配列番号１１
0003787157.tif 000027
（２）配列番号１２に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：７８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：マウス
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ２
（xi）配列：配列番号１２
0003787157.tif 000028
（２）配列番号１３に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：７８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ヒト（Homo sapiens）
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ２
（xi）配列：配列番号１３
0003787157.tif 000029
（２）配列番号１４に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：７８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：アカゲザル（Rhesus monkey）
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ２
（xi）配列：配列番号１４
0003787157.tif 000030
（２）配列番号１５に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：７８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ブタ
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ２
（xi）配列：配列番号１５
0003787157.tif 000031
（２）配列番号１６に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：７８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ウシ
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ２
（xi）配列：配列番号１６
0003787157.tif 000032
（２）配列番号１７に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：７８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：マウス
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ３
（xi）配列：配列番号１７
0003787157.tif 000033
（２）配列番号１８に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：７８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ヒト（Homo sapiens）
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ３
（xi）配列：配列番号１８
0003787157.tif 000034
（２）配列番号１９に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：７８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：アカゲザル（Rhesus monkey）
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ３
（xi）配列：配列番号１９
0003787157.tif 000035
（２）配列番号２０に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：７８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ブタ
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ３
（xi）配列：配列番号２０
0003787157.tif 000036
（２）配列番号２１に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：７８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ウシ
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ３
（xi）配列：配列番号２１
0003787157.tif 000037
（２）配列番号２２に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：７８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：マウス
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ４
（xi）配列：配列番号２２
0003787157.tif 000038
（２）配列番号２３に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：７８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ヒト（Homo sapiens）
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ４
（xi）配列：配列番号２３
0003787157.tif 000039
（２）配列番号２４に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：１６８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：マウス
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ２−３
（xi）配列：配列番号２４
0003787157.tif 000040
（２）配列番号２５に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：１６８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ヒト（Homo sapiens）
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ２−３
（xi）配列：配列番号２５
0003787157.tif 000041
（２）配列番号２６に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：１６８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：アカゲザル（Rhesus monkey）
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ２−３
（xi）配列：配列番号２６
0003787157.tif 000042
（２）配列番号２７に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：１６８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ブタ
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ２−３
（xi）配列：配列番号２７
0003787157.tif 000043
（２）配列番号２８に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：１６８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ウシ
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ２−３
（xi）配列：配列番号２８
0003787157.tif 000044
（２）配列番号２９に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：１６８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：マウス
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ１−３
（xi）配列：配列番号２９
0003787157.tif 000045
0003787157.tif 000046
（２）配列番号３０に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：２５０アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ヒト（Homo sapiens）
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ１−３
（xi）配列：配列番号３０
0003787157.tif 000047
（２）配列番号３１に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：２５０アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：アカゲザル（Rhesus monkey）
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ１−３
（xi）配列：配列番号３１
0003787157.tif 000048
（２）配列番号３２に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：２５０アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ブタ
（xi）配列：配列番号３２
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ１−３
（xi）配列：配列番号３２
0003787157.tif 000049
（２）配列番号３３に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：２５０アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ウシ
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ１−３
（xi）配列：配列番号３３
0003787157.tif 000050
（２）配列番号３４に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：１６０アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：マウス
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ１−２
（xi）配列：配列番号３４
0003787157.tif 000051
（２）配列番号３５に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：１６０アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ヒト（Homo sapiens）
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ１−２
（xi）配列：配列番号３５
0003787157.tif 000052
（２）配列番号３６に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：１６０アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：アカゲザル（Rhesus monkey）
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ１−２
（xi）配列：配列番号３６
0003787157.tif 000053
（２）配列番号３７に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：１６０アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ブタ
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ１−２
（xi）配列：配列番号３７
0003787157.tif 000054
（２）配列番号３８に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：１６０アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ウシ
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ１−２
（xi）配列：配列番号３８
0003787157.tif 000055
（２）配列番号３９に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：３５２アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：マウス
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ１−４
（xi）配列：配列番号３９
0003787157.tif 000056
0003787157.tif 000057
0003787157.tif 000058
（２）配列番号４０に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：３５２アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ヒト（Homo sapiens）
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ１−４
（xi）配列：配列番号４０
0003787157.tif 000059
0003787157.tif 000060
（２）配列番号４１に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：３７８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：マウス
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ１−４ＢＫＬＳ
（xi）配列：配列番号４１
0003787157.tif 000061
0003787157.tif 000062
（２）配列番号４２に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：３７８アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ヒト（Homo sapiens）
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Ｋ１−４ＢＫＬＳ
（xi）配列：配列番号４２
0003787157.tif 000063
0003787157.tif 000064
（２）配列番号４３に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：３０  base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ヒト（Homo sapiens）
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Primer  １５４
（xi）配列：配列番号４３
0003787157.tif 000065
（２）配列番号４４に関する情報
（i）配列の特性：
(A)配列の長さ：２８  base pairs
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ヒト（Homo sapiens）
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Primer  １５１
（xi）配列：配列番号４４
0003787157.tif 000066
（２）配列番号４５に関する情報
（i）配列の特性：２８  base pairs
(A)配列の長さ：
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：１
(D)トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（V）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
（vi）起源：
(A)生物名：ヒト（Homo sapiens）
（vii）直接の起源
(B)クローン名：Primer  １５６
（xi）配列：配列番号４５
0003787157.tif 000067
【図１】
0003787157.tif 000068
0003787157.tif 000069
【図２】
0003787157.tif 000070
0003787157.tif 000071
0003787157.tif 000072
【図３Ａ】
0003787157.tif 000073
【図３Ｂ】
0003787157.tif 000074
【図４】
0003787157.tif 000075
【図５】
0003787157.tif 000076
【図６】
0003787157.tif 000077
【図７Ａ】
0003787157.tif 000078
【図７Ｂ】
0003787157.tif 000079
【図８】
0003787157.tif 000080
【図９】
0003787157.tif 000081
【図１０】
0003787157.tif 000082
【図１１】
0003787157.tif 000083
【図１２】
0003787157.tif 000084
【図１３】
0003787157.tif 000085
【図１４】
0003787157.tif 000086
【図１５Ａ】
0003787157.tif 000087
【図１５Ｂ】
0003787157.tif 000088
【図１５Ｃ】
0003787157.tif 000089
【図１６Ａ】
0003787157.tif 000090
【図１６Ｂ】
0003787157.tif 000091
【図１６Ｃ】
0003787157.tif 000092
【図１７】
0003787157.tif 000093
【図１８】
0003787157.tif 000094
【図１９】
0003787157.tif 000095
【図２０】
0003787157.tif 000096
【図２１】
0003787157.tif 000097
【図２２】
0003787157.tif 000098
【図２３】
0003787157.tif 000099
【図２４】
0003787157.tif 000100
【図２５Ａ】
0003787157.tif 000101
【図２５Ｂ】
0003787157.tif 000102
【図２６Ａ】
0003787157.tif 000103
【図２６Ｂ】
0003787157.tif 000104
【図２６Ｃ】
0003787157.tif 000105
【図２７】
0003787157.tif 000106
【図２８】
0003787157.tif 000107
【図２９Ａ】
0003787157.tif 000108
【図２９Ｂ】
0003787157.tif 000109
【図３０Ａ】
0003787157.tif 000110
【図３０Ｂ】
0003787157.tif 000111
【図３１】
0003787157.tif 000112
【図３２Ａ】
0003787157.tif 000113
【図３２Ｂ】
0003787157.tif 000114
【図３３Ａ】
0003787157.tif 000115
【図３３Ｂ】
0003787157.tif 000116
【図３４Ａ】
0003787157.tif 000117
【図３４Ｂ】
0003787157.tif 000118
【図３５】
0003787157.tif 000119
【図３６Ａ】
0003787157.tif 000120
【図３６Ｂ】
0003787157.tif 000121
【図３７Ａ】
0003787157.tif 000122
【図３７Ｂ】
0003787157.tif 000123
【図３８Ａ】
0003787157.tif 000124
【図３８Ｂ】
0003787157.tif 000125
【図３８Ｃ】
0003787157.tif 000126
【図３９Ａ】
0003787157.tif 000127
【図３９Ｂ】
0003787157.tif 000128
【図４０】
0003787157.tif 000129
【図４１】
0003787157.tif 000130
【図４２】
0003787157.tif 000131
【図４３】
0003787157.tif 000132
【図４４】
0003787157.tif 000133