(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＤＮＡの一本鎖の一つに相補な所定の塩基長の第１の配列と、前記第１の配列の５’末端側に隣接して設けられ前記一本鎖に非相補な所定の塩基長の第２の配列とを備え、かつ前記第２の配列の５’末端の１塩基の種類が互いに異なる第１の４種類のプライマーを用いて第１のＰＣＲを行う工程と、
前記第１のＰＣＲで得られた増幅産物の解析結果からアデニン付加効率を求める工程と、
前記第１の４種類のプライマーの中からアデニン付加の起こり易い配列を決定する第１の決定工程と、
前記第１の配列と前記第２の配列とを備え、５’末端の１塩基が前記第１の決定工程で決定されたアデニン付加の起こり易い配列であり、５’末端から２番目の１塩基の種類が互いに異なる第２の４種類のプライマーを用いて第２のＰＣＲを行なう工程と、
前記第２のＰＣＲで得られた増幅産物の解析結果からアデニン付加効率を求める工程と、
前記第２の４種類のプライマーの中からアデニン付加の起こり易い配列を決定する第２の決定工程とを有することを特徴とするプライマーの塩基配列決定方法。
【請求項２】
標的ＤＮＡの一本鎖の一つに相補な所定の塩基長の第１の配列と、前記第１の配列の５’末端側に隣接して設けられ前記一本鎖に非相補な所定の塩基長の第２の配列とを備え、かつ前記第２の配列の５’末端の１塩基の種類が互いに異なる第１の４種類のプライマーを用いて第１のＰＣＲを行う工程と、
前記第１のＰＣＲで得られた増幅産物の解析結果からアデニン付加効率を求める工程と、
前記第１の４種類のプライマーの中からアデニン付加の起こり易い配列を決定する第１の決定工程と、
前記第１の配列と前記第２の配列とを備え、５’末端の１塩基が前記第１の決定工程で決定されたアデニン付加の起こり易い配列であり、５’末端から２番目の１塩基の種類が互いに異なる第２の４種類のプライマーを用いて第２のＰＣＲを行なう工程と、
前記第２のＰＣＲで得られた増幅産物の解析結果からアデニン付加効率を求める工程と、
前記第２の４種類のプライマーの中からアデニン付加の起こり易い配列を決定する第２の決定工程と、
前記第１の配列と前記第２の配列とを備え、５’末端の１塩基が前記第１の決定工程で決定されたアデニン付加の起こり易い配列であり、５’末端から２番目の１塩基が前記第２の決定工程で決定されたアデニン付加の起こり易い配列であり、５’末端から３番目の１塩基の種類が互いに異なる第３の４種類のプライマーを用いて第３のＰＣＲを行なう工程と、
前記第３のＰＣＲで得られた増幅産物の解析結果からアデニン付加効率を求める工程と、
前記第３の４種類のプライマーの中からアデニン付加の起こり易い配列を決定する第３の決定工程とを有することを特徴とするプライマーの塩基配列決定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＰＣＲ用プライマーおよびＰＣＲ用プライマーの塩基配列決定法に関し、特に、ターミナルトランスフェラーゼ活性を持つ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲ時におけるアデニンの付加反応に好適な、ＰＣＲ用プライマーおよびＰＣＲ用プライマーの配列決定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡあるいはＲＮＡを検出するには、検体から得られたＤＮＡやＲＮＡの配列を増幅してから検出することが一般的であり、そのためにＰＣＲ増幅が行われるのが一般的である。ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を検出するには、ＤＮＡ断片に放射性同位標識や化学発光、蛍光による標識を行い、ゲル電気泳動などでサンプルを分離した後標識物を検出する。最近ＤＮＡ断片にインターカレートする蛍光体や合成ＤＮＡの末端蛍光標識が可能となり、よく用いられるようになってきている。インターカレートする蛍光体を用いる場合には、アガロースゲルで電気泳動したＤＮＡ断片を、エチジウムブロマイドやアクリジンオレンジ等のインターカレーターで標識して検出する。
【０００３】
より正確な断片長の測定には、末端蛍光標識したＤＮＡ断片をポリアクリルアミドゲルで電気泳動して検出する。正確な断片長の測定が必要な方法として、ＲＴ−ＰＣＲ（Revers Transcriptase-PCR, Nature Biotechnology, 1999, 17, 720-722,）、ＦＤＤ（Fluorescent Differential Display, FEBS Letters,1994, 351, 231-236）、ＡＴＡＣ−ＰＣＲ（Adaptor-Tagged competitive-PCR, Nucleic Acids Research, 1997, 25, 4694-4696）、ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorism, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 2766-2770）などが挙げられる。これらは、ＰＣＲ後に増幅産物を蛍光式ＤＮＡシークエンサーで分析する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
現在提案されているＰＣＲと電気泳動に基づいたＤＮＡ断片増幅・検出について紹介したが、実用面では種々の問題がある。ＰＣＲ時にＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ断片へのアデニンの付加反応が起こり、付加の起こった断片と付加の起こらなかった断片によって２つのピークが検出される。アデニン付加の起こる確率は試料ＤＮＡやＰＣＲ条件で変動する。このためピーク割れにより標的ＤＮＡ断片のピーク面積を求めるといった分析が困難になっている。
【０００５】
診断目的のＳＳＣＰ解析に於いては、ピーク面積を求めて定量的な解析を行うことにより、従来法では判断できないＬＯＨ（Loss of Heterozygosity）の検出が可能となっている（K.Sugano, Y.Nakashima, K.Yamaguchi, N.Fukayama, M.Maekawa, H.Ohkura, T.Kakizoe and T.Sekiya, Genes, Chomosomes & Cancer, 1996, 15, 157-164, Sensitive Detection of Loss of Heterozygosity in the TP53 Gene in Pancreatic Adenocarcinoma by Fluorescence-Based Single Strand Conformation Polymorphism Analysis Using Blunt-End DNA Fragments）。しかし、高精度な診断を行うためには、本来のピーク面積に対する隣接するピークの面積の割合を１０％以内に抑える必要がある。
【０００６】
ピーク割れを防ぐには付加したアデニンを取り除くか、積極的に付加を起こして付加を１００％とする２つの方法が考えられる。付加を取り除く方法では、ＰＣＲ後に除去のための酵素処理を行わなければならない（F.Ginot, I.Bordelais, S.Nguyen and G.Gyapay, Nucleic Acids Research, 1996, 24540-541）。一方、付加を積極的に起こすためには、反応液中のＭｇ2+イオンの濃度を調製したり、反応条件を変えることが必要であるが、アデニン付加したＰＣＲ産物を安定して得ることは難しいのが現状である。また、鋳型ＤＮＡ断片の５’末端近傍の配列によってアデニンの付加効率が変化するという報告（V.L.Magnuson, D.S.Ally, S.J.Nyland, Z.E.Karanjawala, J.B.Rayman, J.I.Knapp, A.L.Lowe, S.Ghosh and F.S.Collins, Biotechniqes, 1996, 21, 700-709）があるが、その配列は一般的ではないし、配列の決定方法についての提案はない。
鋳型ＤＮＡ５’末端の配列によって、アデニン付加効率を変化させる方法はテーリングと呼ばれている（M.J.Brownstein, J.D.Carpten and J.R.Smith、 Biotechniques, 1996, 20, 1004-1010）。本発明の目的は、リバースプライマーテーリングに於いて、どのような標的ＤＮＡ断片を増幅するＰＣＲ用プライマーに対しても一般的にアデニン付加を高効率で起こす配列をデザインし、簡便に電気泳動分析可能なＤＮＡ断片を増幅できるプライマー配列を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明では、リバースプライマーの５’末端にアデニン付加を高効率で起こす配列をデザインしたアンカー配列をもつＰＣＲ用プライマーを用いる。アンカー配列とは、標的遺伝子に相補的なプライマー配列の５’末端に位置し、標的ＤＮＡ配列と相補的でない配列である。アンカー配列はＰＣＲの１サイクル目に於いては標的配列にハイブリダイズせず、反対側の相補鎖合成が進行した場合にのみハイブリダイズする。従ってアンカー配列は、ＰＣＲの２サイクル目以降に於いてハイブリダイズし、増幅断片は標的配列とアンカー配列を有する断片となる。アンカー配列は標的ＤＮＡ配列と無関係に設計できるため、アデニン付加を高効率で起こすことができる配列を選ぶことができる。ＰＣＲでのアデニンの付加反応はプライマー５’末端の塩基種によりアデニンの付加効率が異なることが知られており、５’末端の５塩基程度でアデニンの付加効率が決定されている。
【０００８】
本発明では２〜５塩基からなるアンカー配列のうちの１塩基だけを変化させたアンカー配列を持つプライマーを４種類用意し、ＰＣＲを行わせる。ＰＣＲの結果について４種類のアンカー配列のアデニン付加効率を測定することにより、アデニン付加しやすいアンカー配列をスクリーニングする。５’末端から１塩基目のアンカー配列で最も付加が起こる配列を決め、次に、アンカー配列の５’末端から２塩基目を変化させた４種類のプライマーを合成する。１塩基目と同様にＰＣＲを行い、５’末端から２塩基目の配列でアデニン付加が起こりやすい塩基種を決める。この作業を繰り返し、アデニン付加の起こりやすい２〜５塩基からなるアンカー配列を決める。
【０００９】
上述した方法で求めたアデニン付加の起こりやすいアンカー配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行う。その結果、アデニン付加が起こった増幅産物が優先的に得られる。アデニン付加が起こらなかった増幅産物の割合が、アデニン付加の起こった増幅産物に対して１０％以下であれば、定量的解析が要求される診断に使用することが可能となる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下本発明を実施例を用いて説明する。
【００１１】
（実施例１）
図１は本発明によるアンカー配列を有するＰＣＲ用プライマーを用いたＰＣＲと、その結果の産物の態様および産物を電気泳動して標識の蛍光強度でアンカー配列を有するＰＣＲ用プライマーを評価することを模式的に示す図である。１は試料ＤＮＡである。２はＰＣＲ用フォワードプライマー、４はＰＣＲ用リバースプライマーである。それぞれのプライマーは、試料ＤＮＡ１を二つの一本鎖１−１と１−２とに変性させたときに、それぞれに相補である１２〜２０塩基の塩基長を持つものとされる。フォワードプライマー２の５’末端は蛍光標識Ｆで標識されている。リバースプライマー４の５’末端にはアンカー配列３を接続したものとする。ここで、アンカー配列３は２〜５塩基の塩基長とされ、標的ＤＮＡ配列とは相補的でない配列とされる。従って、アンカー配列３を含めたリバースプライマー４の塩基長は１４〜２５塩基となる。
【００１２】
このようなプライマーを用意して、ターミナルトランスフェラーゼ活性を持つ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行うと、プライマー２、４がそれぞれ矢印に示すように伸長される。先にも述べたように、ＰＣＲの２サイクル目以降に於いては、増幅断片は標的配列とアンカー配列を有する断片となり、これを標的ＤＮＡとしてフォワードプライマー２の伸長反応が起こる。この際、ＰＣＲ産物の３’末端にアデニン付加が起こらなかった断片５とアデニン付加が起こった断片６が増幅される。付加されたアデニンを図ではまるで囲ったＡで表示している。
【００１３】
このようにして得られたＰＣＲ産物を電気泳動して分析すると、エレクトロフェログラム９に示すように、アデニン付加が起こった断片６に由来するピーク８とアデニン付加が起こらなかった断片５に由来するピーク７が検出される。ここで、横軸は塩基長であり、ピーク８とピーク７の塩基長は付加されたアデニンがあるかないかのアデニン１塩基分しか違わないが、図を分かりやすくするためにそれぞれのピークを離して表示した。
アンカー配列３の５’末端がアデニンの付加反応を促進する塩基となっていれば、アデニン付加が起こった断片６に由来するピーク８を、アデニン付加の起こらなかった断片５に由来するピーク７に対して十分に大きくすることができ、分析の精度が向上する。
実施例１では、出芽酵母野生株から抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、試料ＤＮＡ１として用いた。また、ＰＣＲ用フォワードプライマー２として、（配列１）を持ち、５’末端を蛍光体ＨＥＸで標識したフォワードＰＣＲ用プライマーを用いた。（配列１）
５’−ＨＥＸ−ａｇａａｇａｇｇｇｃ  ｔｃｃａａｔｔｔｃｔ  ｃ−３’
一方、ＰＣＲ用リバースプライマー４のうち試料ＤＮＡに対して相補である部分の配列が（配列２）であるＰＣＲ用プライマーを用いた。
（配列２）
５’−ｇｔｇａｇｃａａｔａ  ｃａｃａａａａｔｔｇ  ｔａ−３’
上記のプライマーペアを用いて出芽酵母野生株由来の試料ＤＮＡ１のＰＣＲを行うと、１８７ｂｐの長さのＰＣＲ産物が増幅される。Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造）を用いて、９４°Ｃで３０秒、６０°Ｃで６０秒、７２°Ｃで３０秒からなるサイクルを２５回繰りかえし、その後７２°Ｃで２分間保温する条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を３．５％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動分析した。得られた泳動データは電気泳動装置付属のソフトウェアでベースライン補正を行い、エレクトロフェログラムを作製した。
【００１４】
図２（Ａ）はアンカー配列を持たないリバースプライマーによるＰＣＲにおける増幅産物のエレクトロフェログラム１０を示し、図２（Ｂ）はアンカー配列を持つリバースプライマーによるＰＣＲにおける増幅産物のエレクトロフェログラム１３を示す。図２（Ａ）のエレクトロフェログラム１０では、アデニン付加が起こった断片６によるピーク１１とアデニン付加が起こらなかった断片５によるピーク１２とを比較して分かるように、ピーク１１の方がピーク１２より小さい。また、両者のピークの比率は１：４程度である。一方図２（Ｂ）のエレクトロフェログラム１３では、アデニン付加が起こった断片６によるピーク１１とアデニン付加が起こらなかった断片５によるピーク１２とを比較して分かるように、ピーク１１の方がピーク１２より圧倒的に大きい。すなわち、本実施例によるＰＣＲでは、アンカー配列を持つリバースプライマーによるアデニンの付加反応が促進され、アデニン付加の起こらなかった断片５は、アデニン付加の起こった断片６の１０％以下に抑止されたことが分かる。
図３（Ａ）−（Ｄ）は本発明によるアデニンの付加反応を促進するアンカー配列のスクリーニング法の概念をフローチャートで示したものである。図１で説明したように、試料ＤＮＡ１と、これを一本鎖にしたときのそれぞれを鋳型としてＰＣＲを行うためのＰＣＲ用フォワードプライマー２とＰＣＲ用リバースプライマー４とを用意する。ＰＣＲ用フォワードプライマー２は標的ＤＮＡ断片を増幅するため、標的配列に相補的な配列を持ち、蛍光体Ｆで標識されている。ＰＣＲ用リバースプライマー４は標的配列に相補である配列４と、標的配列に相補でない４塩基からなるアンカー配列３−１，３−２，３−３および３−４とから構成されている。
【００１５】
ここで、アンカー配列３−１，３−２，３−３および３−４の５’末端に注目して明らかなように、５’末端がそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの４種類の塩基とされている。なお、ＮＮＮの塩基配列はＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔ全ての組み合わせからなる６４（＝４×４×４）種類の塩基配列ということになる。３−１，３−２，３−３および３−４は６４種類のオリゴヌクレオチドの混合物であるが、実質的には５'末端がそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの塩基である４種類のオリゴヌクレオチドとして扱うことができる。図３（Ａ）では、アンカー配列３−１の５’末端がＡとされたＰＣＲ用リバースプライマーによって図１と同様にしてＰＣＲを行い、その結果、アデニン付加の起こらなかったＤＮＡ断片５と、アデニン付加の起こったＤＮＡ断片６とが得られてエレクトロフェログラム９に示すように、アデニンが付加しなかった増幅ＤＮＡ断片５に由来するピーク７の面積とアデニンが付加した増幅ＤＮＡ断片６に由来するピーク８の面積を区別して検出できる。６４種類のオリゴヌクレオチドの内の１つは標的ＤＮＡ断片と相補な配列を持つものとなりうるが、残りの６３種類は非相補であるので、実質的には非相補なアンカー配列として扱って良い。その結果、末端に塩基Ａを持つアンカー配列を持つ折後ヌクレオチドとしてピーク面積を計算する。図３（Ｂ）−（Ｄ）でも同様にして、アデニンが付加しなかった増幅ＤＮＡ断片５に由来するピーク７の面積とアデニンが付加した増幅ＤＮＡ断片６に由来するピーク８の面積を区別して検出できる。
【００１６】
アデニンが付加しなかった増幅ＤＮＡ断片５に由来するピーク７の面積Ｓとアデニンが付加した増幅ＤＮＡ断片６に由来するピーク８のピーク面積ＳAを求め、ピーク面積の割合からアデニンの付加反応の効率（ＳA／（ＳA＋Ｓ））を算出する。高アデニン付加効率を与えるＰＣＲ用リバースプライマーの５’末端の塩基をアンカー配列として採用する。
【００１７】
図４（Ａ）−（Ｄ）に、４種類のアンカー配列３−１，３−２，３−３および３−４を持ったＰＣＲ用リバースプライマーを使用したＰＣＲ産物についての電気泳動結果の具体例をエレクトロフェログラム４１、４２、４３および４４で示す。各エレクトロフェログラムからアデニンが付加した増幅ＤＮＡ断片６に由来するピークの面積ＳAおよびアデニンが付加しなかった増幅ＤＮＡ断片５に由来するピーク面積Ｓを求め、各ＰＣＲ用リバースプライマーについてアデニン付加効率（ＳA／（ＳA＋Ｓ））を求めた結果を比較するグラフ４５を図５に示す。図の場合、グラフ中の（ｃ）のアンカー配列が最も高いアデニンの付加効率を与えたため、（ｃ）のアンカー配列を選定した。（ｃ）のアンカー配列は塩基Ｇであったため、アンカー配列の５’末端の塩基はＧを採用した。
【００１８】
以上のように、アンカー配列のうちの５’末端の１塩基を４種類の塩基としたアンカープライマーを用い、４種類のうち最も効果の高いアンカー配列を、まず、選定する。次いで、アンカー配列のうちの５’末端を選定した塩基とするとともに、５’末端から二つ目の１塩基を４種類の塩基としたアンカープライマーを用い、４種類のうち最も効果の高いアンカー配列を選定する。この操作を繰り返してスクリーニングをしていけば、例えば、４つの塩基からなるアンカー配列３の全ての塩基を決定することができる。
【００１９】
図６に、図３に続くアンカー配列の５’末端から２番目の塩基の決定の流れを示す。まず、５’末端の塩基がＧとされたアンカー配列３−５，３−６，３−７および３−８を持つＰＣＲ用リバースプライマーを用意する。ＰＣＲ用リバースプライマーのアンカー配列３−５，３−６，３−７および３−８の塩基配列においてＮはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの混合塩基である。従って、図６におけるＰＣＲ用リバースプライマーのアンカー配列３−５，３−６，３−７および３−８のＮＮの塩基配列はＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔ全ての組み合わせからなる１６（＝４×４）種類の塩基配列ということになる。用意した４種類のアンカー配列３−５，３−６，３−７および３−８を持つＰＣＲ用リバースプライマーと蛍光標識したＰＣＲ用フォワードプライマー２の組み合わせで標的ＤＮＡをＰＣＲにより増幅する。増幅ＤＮＡ断片をゲル電気泳動で分析し、アデニンが付加しなかったＤＮＡ断片５とアデニンが付加したＤＮＡ断片６とのピーク面積を求め、最も効果の高いアンカー配列を５’末端の二つの塩基種として選定する。
【００２０】
図７に、４種類のアンカー配列３−５，３−６，３−７および３−８を持ったＰＣＲ用リバースプライマーを使用したＰＣＲ産物についての電気泳動結果の具体例をエレクトロフェログラム８０、８１、８２および８３に示す。各エレクトロフェログラムからアデニンが付加した増幅ＤＮＡ断片６に由来するピークの面積ＳAおよびアデニンが付加しなかった増幅ＤＮＡ断片５に由来するピーク面積Ｓを求め、各ＰＣＲ用リバースプライマーについてアデニン付加効率（ＳA／（ＳA＋Ｓ））を求めた結果を比較するグラフ８４を図８に示す。図の場合、グラフ中の（ｃ）のアンカー配列が最も高いアデニンの付加効率を与えたため、（ｃ）のアンカー配列を選定した。（ｃ）のアンカー配列は塩基Ｇであったため、アンカー配列の５’末端から２塩基目の塩基としてＧを採用した。すなわち、アンカー配列は５’末端から２塩基目までの塩基はＧＧとするのが良いことが示された。
なお、図８に於いては、最も効果の低かった（ｂ）のアンカー配列以外の（ａ）、（ｄ）についても検討した結果以下のことが分かった。図８（ａ）、（ｄ）ともにアデニンの付加効率は図８（Ｃ）とそれほど遜色はないが、（ｄ）については図７に示すエレクトロフェログラム８３に於いて、アデニンが付加しなかった増幅産物５由来のピークとアデニンが付加した増幅産物６由来のピークを分離して検出してしまうため、採用しないこととした。（ａ）については図７に示すエレクトロフェログラム８０のピークはアデニンが付加しなかった増幅産物５由来のピークとアデニンが付加した増幅産物６由来のピークとが、図７に示すエレクトロフェログラム８２のピークと同一ピークと認識されたため、採用することとした。（ａ）のアンカー配列の塩基はＡであるため、アンカー配列の５’末端から２塩基目の塩基としてＡを採用した。すなわち、アンカー配列は５’末端から２塩基目までの塩基はＧＡとするのが良いことが示された。
この結果、本実施例では、アンカー配列は５’末端から２塩基目までの塩基はＧＧまたはＧＡとするのが良いことが示されたことになる。
図９に、図６に続く５’末端から３番目の塩基の決定の流れを示す。この例では、アンカー配列の５’末端から２塩基目までの塩基はＧＧとした場合について述べるが、これをＧＡとしたときはＧＧをＧＡと読み替えれば良い。まず、５’末端からの二つの塩基がＧＧとされたアンカー配列３−９，３−１０，３−１１および３−１２を持つＰＣＲ用リバースプライマーを用意する。ＰＣＲ用リバースプライマーのアンカー配列３−９，３−１０，３−１１および３−１２の塩基配列においてＮはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの塩基である。従って、図９におけるＰＣＲ用リバースプライマーのアンカー配列３−９，３−１０，３−１１および３−１２のＮの塩基配列はＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔの４種類の塩基配列ということになる。用意した４種類のアンカー配列３−９，３−１０，３−１１および３−１２を持つＰＣＲ用リバースプライマーと蛍光標識したＰＣＲ用フォワードプライマー２の組み合わせで標的ＤＮＡをＰＣＲにより増幅する。増幅ＤＮＡ断片をゲル電気泳動で分析し、アデニンが付加しなかったＤＮＡ断片５とアデニンが付加したＤＮＡ断片６とのピーク面積を求め、最も効果の高いアンカー配列を５’末端の三つの塩基種として選定する。
【００２１】
図１０に４種類のアンカー配列３−９，３−１０，３−１１および３−１２を持つＰＣＲ用リバースプライマーを用いてＰＣＲを行った増幅産物を電気泳動して得たエレクトロフェログラムである。各エレクトロフェログラムから各ＰＣＲ用リバースプライマーについてアデニン付加効率を求める。
【００２２】
図１１は４種類のアンカー配列３−９，３−１０，３−１１および３−１２を持つＰＣＲ用リバースプライマーを用いてＰＣＲを行った増幅産物についてのアデニン付加効率を比較したグラフ９０を示す。先の例と同様に、最も効果の高いアンカー配列を５’末端から３塩基目の塩基種として選定することになるが、実施例１の場合、３塩基目のスクリーニングの結果アデニン付加効率に差はなく、どのアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマーでもアデニン付加が起こった断片しか検出されなかった。従って、３塩基目の選定は行う必要がないことになる。
【００２３】
このように、本実施例では、５’末端から２塩基目までの塩基によりアデニン付加効率を必要な値にできるアンカー配列を決定できる。従って、必ずしもアンカー配列を４塩基とする必要はない。すなわち、実施例１では、アンカー配列は５’末端にＧＡあるいはＧＧの配列を有するアンカー配列とすれば良いことが分かった。一般的には、５塩基以上スクリーニングを行うとアデニン付加効率の差は小さくなるため、実用上、アンカー配列の長さは５塩基程度とすれば十分である。
【００２４】
図１２（Ａ），（Ｂ）に、本実施例により決定されたアンカー配列をもつＰＣＲ用リバースプライマーの構造を模式的に示す。アンカー配列をもつＰＣＲ用リバースプライマー９１は標的ＤＮＡにハイブリダイズする配列部分９５と、配列９５の５’末端側に隣接し、標的ＤＮＡと非相補なアンカー配列９４から構成されている。アンカー配列の５’末端２塩基はＧＡの塩基配列もしくはＧＧの塩基配列となっている。
【００２５】
アンカー配列を３塩基とするときは、前述したように、アンカー配列は合計４×４×４＝６４通りの配列がありうるが、実施例１では３回のスクリーニングで６４通りの配列から高いアデニン付加効率を与えるアンカー配列を決定することができた。以上のように高アデニン付加効率を与えるアンカー配列を決定し、決定したアンカー配列を標的ＤＮＡに相補な配列の５’末端側に持つようにＰＣＲ用リバースプライマーの塩基配列を決定した。本実施例のように高アデニン付加効率を与えるアンカー配列を持つプライマーを用いたＰＣＲを行い、増幅産物を電気泳動により検出する解析方法ではアデニン付加した増幅産物のピークだけを検出することができ、高い分解能の解析結果を得ることができる。
【００２６】
（実施例２）
本発明はＳＳＣＰに適用できる。図３−図１１を参照しながら説明したのと同様にして、標的ＤＮＡを、蛍光標識したＰＣＲ用フォワードプライマーとアデニン付加を高効率で起こす組み合わせの塩基を５’末端側に配列されたアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲによってアデニン付加の起こった断片とアデニン付加の起こらなかった断片が増幅される。ＰＣＲ産物を熱変性、急冷した後に、１０％グリセロールを含む６％ポリアクリルアミドゲルをＳＳＣＰ用電気泳動ゲルとして用いて電気泳動する。電気泳動バッファーは１０％グリセロールを含む１×ＴＢＥバッファーを用いた。
【００２７】
図１３（Ａ）、（Ｂ）はアデニン付加のＳＳＣＰにおける影響を評価した一例であり、図２に対応する図である。図１３（Ａ）はアンカー配列を持たないリバースプライマーによるＰＣＲにおける増幅産物の解析結果のエレクトロフェログラム１４０を示し、図１３（Ｂ）はアンカー配列を持つリバースプライマーによるＰＣＲにおける増幅産物の解析結果のエレクトロフェログラム１４１を示す。図１３（Ａ）のエレクトロフェログラム１４０では、父性由来のＤＮＡから増幅されアデニン付加が起こった断片に由来するピーク１４２と、アデニン付加が起こらなかった断片に由来するピーク１４３と、母性由来のＤＮＡから増幅されアデニン付加が起こった断片に由来するピーク１４４と、アデニン付加が起こらなかった断片に由来するピーク１４５が検出される。エレクトロフェログラム１４０ではアデニン付加の起こらなかった断片とアデニン付加の起こった断片が３：１であり、アデニン付加した断片が１０％以上混じっている。一方、図１３（Ｂ）のエレクトロフェログラム１４１では、父性由来のＤＮＡから増幅されアデニン付加の起こった断片に由来するピーク１４２と、母性由来のＤＮＡから増幅されアデニン付加の起こったピーク１４４が検出されている。図から分かるように、エレクトロフェログラム１４１では、アデニン付加の起こらなかった断片はほとんど検出されていない。
【００２８】
図１３（Ａ）、（Ｂ）から分かるように、アンカー配列を持つリバースプライマーによりアデニンの付加反応を促進することにより、ＰＣＲ産物をアデニン付加の起こらなかった断片とアデニン付加の起こった断片の混合物からアデニン付加の起こらなかった断片を除外したものとすることができる。この結果、ＳＳＣＰによる診断をより高精度なものにできる。
（実施例３）
本発明はマルチプレックスＰＣＲにも適用することができる。実施例１と同様、蛍光標識したＰＣＲ用フォワードプライマーとアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマーを用いて標的ＤＮＡをＲＣＲ増幅する。実施例１では１つの反応チューブにて１つの標的ＤＮＡを増幅することを前提として説明したが、マルチプレックスＰＣＲでは１つの反応チューブにて複数の標的ＤＮＡを同時に増幅し、ＰＣＲ産物を電気泳動分離して同時に検出することができる。アンカー配列は標的ＤＮＡの配列とは相補でないという条件を満たせば良く、標的ＤＮＡの配列とは無関係に設計できるため、全てのＰＣＲ用リバースプライマーに対して同じアンカー配列を使用できる。
【００２９】
図１４（Ａ）は標的ＤＮＡを蛍光標識したＰＣＲ用フォワードプライマー群とアンカー配列を持たないＰＣＲ用リバースプライマー群を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動分析した場合のエレクトロフェログラム１５０を示す図であり、図１４（Ｂ）は標的ＤＮＡを蛍光標識したＰＣＲ用フォワードプライマー群とアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマー群を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動分析した場合のエレクトロフェログラム１５１を示す図である。図１４（Ａ）に示すように、アデニン付加効率を促進するアンカー配列を用いずにマルチプレックスＰＣＲを行った場合、エレクトロフェログラム１５０では、ピークが近接し、定量的解析が困難になる場合がある。しかし、図１４（Ｂ）に示すように、アデニン付加効率を促進するアンカー配列を持つＰＣＲ用プライマーを用いてマルチプレックスＰＣＲを行うと、エレクトロフェログラム１５１のように、ピークの近接が緩和される。このため、高度なマルチプレックス化が可能となる。実施例３では、アデニン付加が起こらなかった断片由来のピークが検出されないため、高度なマルチプレックス化が可能となる。
【００３０】
（アンカー配列を求めるソフトウェアの実施例）
ＰＣＲに用いるプライマー配列を決める段階に於いて、簡便にアンカー配列を持つＰＣＲ用プライマーの塩基配列を設計できるソフトウェアがあると有用である。図１５に、そのために工夫されたソフトウェアのフローチャートの実施例を示す。ステップ１０１では、アンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマー１からアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマーｎについて、図３−図１１で説明した手順でＰＣＲを行う。ステップ１０２では、ステップ１０１で行われたＰＣＲの産物から、それぞれのアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマーについて、アデニン付加効率を計算する。ステップ１０３では、ステップ１０２の結果から、アデニン付加効率を比較し、より高いアデニン付加効率を与えるアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマーを判断し、選択する。ステップ１０４では、ステップ１０３の結果から、高アデニン付加効率を与えるアンカー配列をファイルに格納しておく。ここで、注目すべきなのは、ステップ１０３では、より高いアデニン付加効率を与えるアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマーを選択するが、本ソフトウェアは、任意の標的ＤＮＡに適用するためのアンカー配列を選択するためのものであるから、選択されたアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマーから、アンカー配列のみを切り出してファイルに格納することである。
ここで、ステップ１０４までは、本ソフトウェアにとっては、いわば、準備段階とも言うべきものであって、標的ＤＮＡに対するＰＣＲ用プライマーの決定の処理はステップ１０５以降である。
ステップ１１１では、標的ＤＮＡの配列を導入する。ステップ１１２では標的ＤＮＡの増幅領域を決定する。ステップ１１３では、標的ＤＮＡの増幅領域の配列に対応して、従来法に従い適当なＴｍ値を持ち、プライマー内あるいはプライマー間で二次構造を形成しないようなＰＣＲ用フォワードプライマーとＰＣＲ用リバースプライマーの塩基配列を設計する。次に、ステップ１１４では、ステップ１０４までで予め準備されファイルに格納されているアンカー配列の一つ（アンカー配列の候補）を取り出して、ステップ１１３で設計されたＰＣＲ用リバースプライマーの５'末端に結合してアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマーを仮決定する。ステップ１１５では、アンカー配列を付け加えた結果ステップ１１３で二次構造を形成しないように設計されたＰＣＲ用リバースプライマーが、二次構造を形成するものとなったか否かを評価して、もし、二次構造やプライマーダイマーを形成するものとなった場合には、別のアンカー配列の候補を選択して、別のアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマーを仮決定する。二次構造を形成するものとなっていなければ、ステップ１１７で、この仮決定されたものをアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマーとして決定する。
ステップ１１５で、３２回以上二次構造を形成するアンカー配列と判定されたとき、すなわち、ステップ1１６がＹｅｓとなったときは、ステップ１１２に戻り、標的ＤＮＡの増幅領域を決定し直したうえで上述したようにしてアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマーとして決定する。なお、本実施例の場合では、アンカー配列が５’末端側のＧＡに続く２塩基全てのアンカー配列について調べることで１６回、５’末端側のＧＧに続く２塩基全てのアンカー配列について調べることで１６回のチェックが行われるが、これら全ての場合で二次構造を形成する場合にはステップ１１２に戻ることにした。
【００３１】
以上のようにソフトウェアを用いると、複数のアンカー配列から高アデニン付加効率を与えるアンカー配列を簡単に決定できる。また、高アデニン付加効率を与えるアンカー配列をファイルに格納しておくことができ、さまざまなプライマーに対してアンカー配列候補として選択できる。アンカー配列を付け加えたプライマーが二次構造を形成するかどうかをチェックすることで、アンカー配列を持つＰＣＲ用プライマーを簡単に設計し、塩基配列を決定できる。ユーザーから標的ＤＮＡ配列と増幅産物のおおよその塩基長の情報を得て、アンカー配列を持つＰＣＲ用プライマーをデザインするサービスも可能である。
【００３２】
（その他）
上述の実施例においては、ＰＣＲ用フォワードプライマーを蛍光標識することを前提としてＰＣＲ用リバースプライマーにアンカー配列を付け加えるものとして説明したが、逆にＰＣＲ用リバースプライマーを蛍光標識するものとした場合にも本発明が適用できることは言うまでもない。この場合、ＰＣＲ用フォワードプライマーの５'末端にアンカー配列を付け加えれば良いのである。
ＰＣＲ用フォワードプライマーとＰＣＲ用リバースプライマー両方にアンカー配列を付け加えても良い。
【００３３】
【発明の効果】
標的ＤＮＡ配列に対するＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片の末端に付加するアデニンを高効率で付加させることができ、高分解能の解析が可能となる。
【配列表】
0003779600.tif 000002
配列表フリーテキスト
（１）配列番号１の配列に関する他の関連する情報の記載
酵母遺伝子（ＹＧＲ２８１Ｗ）を増幅するフォワードプライマー。
（２）配列番号２の配列に関する他の関連する情報の記載
酵母遺伝子（ＹＧＲ２８１Ｗ）を増幅するリバースプライマーの酵母遺伝子（ＹＧＲ２８１Ｗ）に相補な配列。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるアンカー配列を有するＰＣＲ用プライマーを用いたＰＣＲと、その結果の産物の態様および産物を電気泳動して標識の蛍光強度でアンカー配列を有するＰＣＲ用プライマーを評価することを模式的に示す図。
【図２】（Ａ）はアンカー配列を持たないリバースプライマーによるＰＣＲにおける増幅産物のエレクトロフェログラムを示し、（Ｂ）はアンカー配列を持つリバースプライマーによるＰＣＲにおける増幅産物のエレクトロフェログラムを示す図。
【図３】（Ａ）−（Ｄ）は本発明によるアデニンの付加反応を促進するアンカー配列のスクリーニング法の概念を示すフローチャート。
【図４】（Ａ）−（Ｄ）は４種類のアンカー配列を持ったＰＣＲ用リバースプライマーを使用したＰＣＲ産物についての電気泳動結果の具体例を示すエレクトロフェログラム。
【図５】４種類のアンカー配列を持ったＰＣＲ用リバースプライマーを使用したＰＣＲ産物についての電気泳動結果のアデニン付加効率（ＳA／（ＳA＋Ｓ））を求めた結果を比較するグラフ。
【図６】図３に続くアンカー配列の５’末端から２番目の塩基の決定の流れを示す図。
【図７】４種類のアンカー配列を持ったＰＣＲ用リバースプライマーを使用したＰＣＲ産物についての電気泳動結果の具体例を示すエレクトロフェログラム。
【図８】４種類のアンカー配列を持ったＰＣＲ用リバースプライマーを使用したＰＣＲ産物についての電気泳動結果のアデニン付加効率（ＳA／（ＳA＋Ｓ））を求めた結果を比較するグラフ。
【図９】図６に続くアンカー配列の５’末端から３番目の塩基の決定の流れを示す図。
【図１０】４種類のアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマーを用いてＰＣＲを行った増幅産物を電気泳動して得たエレクトロフェログラム。
【図１１】４種類のアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマーを用いてＰＣＲを行った増幅産物についてのアデニン付加効率を比較したグラフ。
【図１２】（Ａ），（Ｂ）は本実施例により決定されたアンカー配列をもつＰＣＲ用リバースプライマーの構造を模式的に示す図。
【図１３】（Ａ）、（Ｂ）はアデニン付加のＳＳＣＰにおける影響を評価した一例であり、（Ａ）はアンカー配列を持たないリバースプライマーによるＰＣＲにおける増幅産物の解析結果のエレクトロフェログラムを示し、（Ｂ）はアンカー配列を持つリバースプライマーによるＰＣＲにおける増幅産物の解析結果のエレクトロフェログラムを示す図。
【図１４】（Ａ）は標的ＤＮＡを蛍光標識したＰＣＲ用フォワードプライマー群とアンカー配列を持たないＰＣＲ用リバースプライマー群を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動分析した場合のエレクトロフェログラムを示し、（Ｂ）は標的ＤＮＡを蛍光標識したＰＣＲ用フォワードプライマー群とアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマー群を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動分析した場合のエレクトロフェログラムを示す図。
【図１５】簡便にアンカー配列を持つＰＣＲ用プライマーの塩基配列を設計できるソフトウェアの実施例を示す図。
【符号の説明】
（実施例１）
１：試料ＤＮＡ、１−１，１−２：試料ＤＮＡ１の二つの一本鎖、２：ＰＣＲ用フォワードプライマー、３：アンカー配列、４：ＰＣＲ用リバースプライマー、Ｆ：蛍光標識、５：ＰＣＲ産物の３’末端にアデニン付加が起こらなかった断片、６：ＰＣＲ産物の３’末端にアデニン付加が起こった断片、７，１２：アデニン付加が起こらなかった断片５に由来するピーク、８，１１：アデニン付加が起こった断片６に由来するピーク、９，１０，１３，４１，４２，４３，４４，８０，８１，８２，８３，８５，８６，８７，８８，１４０，１４１，１５０，１５１：エレクトロフェログラム、４５，８４，９０：グラフ、９１：アンカー配列を持つリバースプライマー、９２：ＧＡの塩基配列、９３：ＧＧの塩基配列、９４：アンカー配列、９５：リバースプライマー、１０１−１０５及び１１１−１１６：処理ステップ、１４２：父性由来のＤＮＡから増幅されアデニン付加の起こった断片に由来するピーク、１４３：父性由来のＤＮＡから増幅されアデニン付加の起こらなかった断片に由来するピーク、１４４：母性由来のＤＮＡから増幅されアデニン付加が起こった断片に由来するピーク、１４５：母性由来のＤＮＡから増幅されアデニン付加が起こらなかった断片に由来するピーク。
【図１】
0003779600.tif 000003
【図２】
0003779600.tif 000004
【図３】
0003779600.tif 000005
【図４】
0003779600.tif 000006
【図５】
0003779600.tif 000007
【図６】
0003779600.tif 000008
【図７】
0003779600.tif 000009
【図８】
0003779600.tif 000010
【図９】
0003779600.tif 000011
【図１０】
0003779600.tif 000012
【図１１】
0003779600.tif 000013
【図１２】
0003779600.tif 000014
【図１３】
0003779600.tif 000015
【図１４】
0003779600.tif 000016
【図１５】
0003779600.tif 000017