(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物製剤を、コロイド性を有し、フミン酸、セルロース繊維、炭水化物類およびアミノ酸類を含有する溶液に添加して、３５未満の塩指数を呈する組成物を形成し、その組成物が室温で１年間少なくとも９０％の微生物保存率を保持するようにすることを特徴とする
液体の微生物製剤を保存させる方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
前記組成物が３５以下の塩指数を示す
ことを特徴する方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、
前記微生物製剤が、凍結乾燥された水混和性の胞子製剤、コロニー製剤またはそれらの混合物からなる群から選択される
ことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、
前記微生物製剤が、バシラス属、トリコデルマ属、サツカロマイセス属の種およびそれらの混合物からなる群から選択された種を含んでなる
ことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、
溶液が、３．５以下のｐＨまたは８〜１０のｐＨを有している
ことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、
溶液が、肥料溶液であって、１０００平方フィート当たり少なくとも１／２ポンドの窒素を送達するよう配合されている
ことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法で製造された組成物。
【請求項８】
微生物の胞子または培養物の製剤と、
コロイド性を有し、フミン酸、セルロース繊維、炭水化物およびアミノ酸類を含有する溶液とを含んでなり、
室温下で保存されたとき、微生物の製剤が少なくとも１２ヶ月間、少なくとも９０％生存しているような浸透圧重量モル濃度、粘度、含水量および塩指数を有する
液体組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の組成物であって、
３５以下の塩指数を示す
ことを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項８に記載の組成物において、
前記微生物の胞子または培養物の製剤が、バシラス属、トリコデルマ属、サツカロマイセス属の種およびそれらの混合物由来の胞子または培養物からなる群から選択される
ことを特徴とする組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組成物において、
バシラス属の種が、バシラスサブチリス、バシラスセレウス、バシラスペネトランス、バシラスリヘニホルミス、バシラスメガテリウムおよびそれらの混合物からなる群から選択される
ことを特徴とする組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載の組成物において、
トリコデルマ属の種が、トリコデルマハマタム、トリコデルマハルジアナム、トリコデルマポリスポラム、トリコデルマコニギイ、トリコデルマビリデおよびそれらの混合物からなる群から選択される
ことを特徴とする組成物。
【請求項１３】
請求項１０に記載の組成物において、
前記微生物製剤が、凍結乾燥された水混和性の胞子製剤である
ことを特徴とする組成物。
【請求項１４】
請求項８に記載の方法において、
前記溶液が、各種の長さの連鎖を有するメチレン尿素化合物類を含有していることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項８に記載の方法において、
前記溶液がフミン酸塩を含有している
ことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項８に記載の組成物であって、
土壌に散布したとき、土壌を強化する特性を示す
ことを特徴とする組成物。
【請求項１７】
請求項８に記載の組成物であって、
土壌または植物に散布したとき、植物の病原体を生物学的に防除する
ことを特徴とする組成物。
【請求項１８】
凍結乾燥された水混和性の微生物の胞子または培養物の製剤と、
コロイド性を有し、少なくとも５重量％のフミン酸、少なくとも７重量％のセルロース繊維、少なくとも１％の炭水化物および少なくとも１重量％のアミノ酸類を含有してなる溶液とを含んでなり、
前記炭水化物およびアミノ酸類は植物抽出物由来のものであり、
前記胞子または培養物の製剤は、室温で保存されたとき、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも９０％が生存しており、そして
組成物としては、３５以下の塩指数を示すことを特徴とする
土壌強化組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組成物であって、
さらに、植物病原体の生物学的防除性を呈する
ことを特徴とする組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の組成物であって、
３５％以下の水を含有する
ことを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
関連特許願のデータ
この出願は、１９９６年２月２８日出願の米国特許出願第６０／０１２，４６４号の一部継続出願であり、その出願内容を全体的にここに援用する。
技術分野
この発明は、バシラス属（Bacillus）その他の菌類の胞子を含有する貯蔵安定性に優れた土壌強化溶液に関する。
発明の背景
土壌強化、特に生産性が低い土壌の強化、害虫類、線虫類および真菌による病害の防除、堆肥化などの農業用途に、微生物の接種が必要な場合、微生物は、貯蔵溶液中では生存力が失われるので、従来、粉末または顆粒の形態の乾燥製剤が使用されている。微生物を含有する典型的な液体製品は、平均貯蔵寿命が短く、わずか数日間から長くても約３週間までにすぎない。たとえそうであっても、溶液は、植物によって容易に吸収されるし、スプレイ散布機によりカバー範囲を制御するために配合できるので、液体製剤は、用途によっては好ましい製剤である。したがって、微生物を含有する液体は、典型的には、使用直前に混合される。例えば、ストレプトマイセスグリセアビリディス（Streptomyces griseaviridis）菌株を水性懸濁液に添加するTahvonenの米国特許第４，５９５，５８９号およびバシラス属の細菌およびクロレラ（Chlorella）属の藻の種をコンブ類の抽出生成物に添加するTenzerの米国特許第４，６６６，４９７号を参照。
溶液中の微生物を安定化するために、いくつもの試みがなされてきている。Hettrickは、製剤に珪藻土を添加することによって、活性微生物の集団に可逆的休眠が達成されたと報告した（米国特許第３，８９８，１３２号）。Lewisは、少なくとも約２５重量％、好ましくは約４５〜６０重量％の蔗糖溶液中での麦角胞子の貯蔵を開示した。BelletとJoshiの米国特許第４，１６１，３９７号では、ミクロ乾燥された（microdried）細菌をオイルキャリヤーに添加した。Fages他の米国特許第５，３６６，５３２号では、アゾスピリルムリポフェルム（Azospirillum lipoferum）などの根圏から単離した微生物を、多糖マトリックス中にマイクロカプセル化し、肥料と一緒にパッケージした。
しかし、これらの製剤の場合、室温で溶液状態での長期貯蔵安定性は達成されないようであった。例えば、Fages他の試験結果は、一ヶ月間の貯蔵後、生存量が１／５に減少したことを示している（３欄４３行）。同様に、BarachとKamaraは、緩衝液中で酸生成細菌を安定化するため、ポリエチレングリコールまたはアルギン酸ナトリウムを用いたが、典型的に、１５〜１８日後に１／１０まで減少することが観察された（米国特許第４，７２０，４６０号の５欄６８行、６欄４４行および７欄１１〜１２行）。Templetonは、米国特許第３，９９９，９７３号で、氷中に貯蔵した場合、２１日間まで８０％の発芽率を維持したシー．マルバラム（C.malvarum）の胞子濃縮液を開示した。
商業的に貯蔵されている農業製品の貯蔵寿命の間、すなわち室温で少なくとも約１年間生存している微生物胞子を含有する土壌強化溶液があるとよい。
発明の概要
この発明の目的は、室温で貯蔵した場合、少なくとも約１年間生存している微生物の胞子および／またはコロニーを含有する溶液を提供することである。
この発明の他の目的は、特に、やせて乱れた土壌または過去に大量の化学薬品および／または肥料を使用したため微生物の活動が殆どないかまたは全くない土壌を強化するのに有用な、生きている微生物の胞子および／またはコロニーを含有する土壌強化溶液を提供することである。
この発明の追加の目的は、芝生および植物の病害の予防、防除および／または治療および他の有益な目的のため、種子、芝生および葉を処理するのに使用できる有益な殺真菌剤の、生きている微生物の胞子および／またはコロニーを含有する溶液を提供することである。
この発明のより具体的なさらなる目的は、室温すなわち約２０〜２５℃で少なくとも約１２ヶ月間、好ましくは１８ヶ月間の長期にわたり、少なくとも約９０％が生存している微生物の胞子および／またはコロニーを含有する土壌強化溶液を提供することである。
これらのおよび他の目的がこの発明によって達成され、この発明は、微生物の胞子および／またはコロニーを含有する溶液の保存方法を提供するもので、凍結乾燥された胞子および／またはコロニーなどの微生物胞子製剤を、コロイド性であって、前記胞子および／またはコロニーを室温で保存するため調製されたイオン強度、水分活性およびｐＨを呈する溶液に添加することを含むものである。この発明の典型的な土壌強化溶液は、胞子／コロニーの保存を促進するフミン酸類または種々の長さの連鎖を有するメチレン尿素ポリマー類などの他の有機巨大分子を含有する。いくつかの好ましい実施態様において、この発明の溶液は、ｐＨが約３．５より低いかまたは約３．５に等しい液体肥料であり、少なくとも約５重量％のフミン酸もしくは類縁巨大分子または他の有機ポリマー、少なくとも約７重量％のセルロース繊維、少なくとも約１重量％の炭水化物および少なくとも約１重量％のアミノ酸類を含有している。前記の炭水化物類およびアミノ酸類は、いくつかの実施態様で、コンブの抽出物などの植物の抽出物から誘導される。典型的な実施態様は、農業用としては、１エーカー当たり約８９ｌｂ〜約１７６ｌｂの範囲の窒素を１年間に送達するように配合され、芝生用としては、１０００平方フィート当たり約１／８ｌｂ〜約１ｌｂの窒素を、１年間に合計約４〜約６ｌｂ送達するように配合される。
土壌を強化しおよび／または植物の生物学的防除剤を提供する胞子および／またはコロニーが、好ましい実施態様において用いられる。これらのものとしては、バシラス（Bacillus）属の種などの細菌類、例えばバシラスサブチリス（Bacillus subtilis）（枯草菌）、バシラスセレウス（Bacillus cereus）、バシラスペネトランス（Bacillus penetrans）、バシラスリヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）およびバシラスメガテリウム（Bacillus megaterium）、トリコデルマ（Trichoderma）属などの真菌類、例えばトリコデルマハマタム（Trichoderma hamatum）、トリコデルマハルジアナム（Trichoderma harzianam）、トリコデルマポリスポラム（Trichoderma polysporum）、トリコデルマコニギイ（Trichoderma konigii）、トリコデルマビリデ（Trichoderma viride）、サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母、およびこれらの混合物がある。他の実施例は、以下に後程説明する。
【図面の簡単な説明】
図１は、この発明の３種の溶液中での２種のバシラス属の細菌菌株の安定性を示す線グラフであり、（−◆−）は各種の長さの連鎖を有するメチレン尿素を含有する３０−０−０緩効性液体窒素肥料、（−■−）は微量養分を含有する１８−３−６緩効性液体窒素肥料、そして（−△−）は液体天然有機肥料のＥｓｓｅｎｔｉａｌ（商標）である。
発明の詳細な説明
この発明は、微生物の胞子および／またはコロニーを室温で長期間にわたって保存するために配合された溶液に関する。特に、この発明は、土壌または茎葉に散布する溶液助剤、並びに土壌および植物の生産性と品質を改善する方法に関する。この発明の土壌強化溶液は、植物の成長を刺激し、土壌を若返らせ、そして有益な土壌微生物の増殖を促進する。また、いくつかの実施態様は、芝生や植物の病害の予防、防除および／または治療ならびに発芽および／または成長を促進する他の目的のため天然の病原体も提供する。
この発明の方法と溶液を用いて、いかなる微生物の胞子および／またはコロニーをも保存することができる。土壌および植物の病原体を生物的に防除する有益な微生物の胞子および／またはコロニーが好ましい。この発明の組成物で処理した後、土壌中で、迅速に増殖して基質にコロニーをつくる微生物が特に好ましい。これらの微生物としては、例えば、バシラスサブチリス、バシラスセレウス、バシラスペネトランス、バシラスリヘニフォルミスおよびバシラスメガテリウムなどのバシラス属の種の細菌類、例えばトリコデルマハマタム、トリコデルマハルジアナム、トリコデルマポリスポラム、トリコデルマコニギイおよびトリコデルマビリデなどのトリコデルマ属の種の真菌類、ならびに例えば、サッカロマイセスセレビシエなどの酵母の種があるが、これらに限定されるものではない。以下に説明するように、複数種類の微生物の混合物も保存することができ、多くの実施態様において好ましいものである。各実施例を以下に示す。
この発明を実施する場合、胞子又は全微生物、胞子を含有する収穫されおよび／または凍結乾燥された微生物のコロニーを含む、を各種溶液に添加する。これらの溶液は、肥料類、堆肥、食品類および医薬組成物などの用途のように、生きている微生物の胞子および／またはコロニーを必要とする用途向けに配合することができる。液体肥料が、土壌を強化する目的には好ましい。胞子および／またはコロニーの凍結乾燥性剤のような水混和生の乾燥した粉末または顆粒が、多くの実施態様において好ましい。この発明の溶液に添加される胞子または微生物の量は、それ自体固定されておらず、土壌および／または植物が必要とする改善の程度、配合に必要な微生物の種の数と特定、そして配合物中の他の成分の濃度によって必然的に決まる。好ましい実施態様では、組成物をスプレイ散布することによって土壌の微生物を復活させるのに有効な量の胞子および／またはコロニーを利用する。典型的な実施態様は、製剤が送達されるとき、１平方フィート当たり約１０００〜約１，０００，０００コロニー形成単位（ＣＦＵ）を送達するのに十分な胞子および／またはコロニーを含有している。
この発明の保存性溶液は、本質がコロイド性であって、フミン酸および／または他の有機巨大分子を含有している。「コロイド」という用語は、大分子、小分子の凝集体、またこれら二つの混合物を含有してなる物質の状態を意味する。典型的な実施態様は、フミン酸および／または各種の連鎖長を有するメチレン尿素化合物などの大分子を含有している。それら粒子は、異なる物質で囲まれ、分散された相が外相で囲まれるようになっている。それら両方の相とも、固体または液体であってよい（ときには気体のこともある）。大部分の実施態様で、一方の相は水を含有してなり、その典型的な範囲は、全組成物中、約３５〜約５８重量％の水であるが、実施態様によっては、全組成物中、約２０重量％より少ない水を含有している。
典型的な溶液は、少なくとも約５重量％のフミン酸、少なくとも約７重量％のセルロース繊維、少なくとも約１％の炭水化物および少なくとも約１重量％のアミノ酸類を含有している。用語「フミン酸」は、土壌、石炭および泥炭を含む腐植質から誘導される、高分子フェノール構造を有する複雑なアロメラニン巨大分子を意味し、それは有機物の分解によって生成し、そして通常、金属、特に鉄をキレート化する。フミン酸、フミン酸とフルボ酸、フミン酸カリウムなどの腐植質由来の他の酸との混合物、およびそれらの混合物を含有する溶液が、いくつかの実施態様において好ましいものである。約３．５〜５．０グラム毎リットルのフミン酸濃度が典型的であり、約１２重量％を越える濃度、例えば１５％になると、その溶液がゲル化する傾向がある。
各溶液のｐＨ、イオン強度および水分活性を選択して、溶液中に貯蔵された胞子および／またはコロニーの貯蔵寿命を最大にして少なくとも１年間、好ましくは少なくとも１８ヶ月間にし、そして溶液と胞子および／またはコロニーとの間のイオン交換を最少にする。好ましいｐＨは、酸性であり、例えば約３．５以下のｐＨを呈するが、より高いｐＨ、例えば約８〜約１０のｐＨの溶液が他の実施態様において用いられている。いくつかの実施態様では、溶液のイオン強度は約０．０５Ｍ以下である。
低温殺菌された液体肥料の溶液が、いくつかの好ましい実施態様において採用されている。いくつかの典型的な実施態様のものは、農業用途には、１年間に１エーカー当たり約８９ｌｂ〜約１７６ｌｂの範囲の窒素を送達するよう配合され、そして芝生用には、１０００平方フィート当たり約１／８ｌｂ〜約１ｌｂの窒素を年間合計約４〜約６ｌｂ送達するよう配合される。当業者に知られているように、窒素の必要量は、異なる植物種の間で変わり、そして散布必要量は、散布方法（土壌、種子および／または茎葉）、肥料の濃度および季節変動によって変わり、以前の虫害、干ばつなどの他の要因も最適量が如何程になるかを左右する。例えば、ある種の暖季型牧草は、寒季型牧草より多量の窒素を必要とする。以下に説明する一実施態様では、この発明の一つの溶液は、１平方フィート当たり１／２ｌｂの窒素をゆっくり送達するよう配合されている。その実施態様および他の実施態様において、この発明の溶液は、各種の長さの連鎖を有するメチレン尿素化合物、または上記のように他の有機重合体を含有している。いくつかの実施態様は、水の吸収と保持を改善し、かつ溶液の茎葉植物および種子に対する散布と分散を助ける界面活性剤を含有している。これらのものは、例えば１週間を超える長期間にわたる茎葉に対する固着を助け、そして場合によっては、ある用途では５週間までの固着が好ましい。
この発明の溶液は、好ましくは以下のものを含有している。すなわち、天然の植物および動物産物由来の、中間代謝産物類、代謝産物類、単純糖類、ペプチド類、アミノ酸類、アミド類、酵素類、フミン酸塩類、リグニン、有機キレート化合物類、およびセルロース繊維である。実例としては、商品名Ｎｉｔｒｏ−３０  ＳＲＮ（商標）またはＥｓｓｅｎｔｉａｌ（商標）で市販されている商業液体肥料またはこれらの混合物があるが、これらに限定されるものではない。この発明を実施するのに有用なこれらの配合物および類縁配合物の利点は、これら配合物が、上記のように、植物組織への薄膜固着を促進するのに有用な糖類、天然の湿潤剤類などを含有し、製品が長期間にわたって生存し続けることである。実施例を後で示す。
いかなる理論にも縛られたくはないが、この発明の溶液中で微生物の胞子および／またはコロニーが長期間安定である理由は、溶液のコロイド性に関連があって、それが浸透圧重量モル濃度（オスモル濃度）と浸透圧を制御しているようである。フミン酸または他の無荷電のコロイドおよび／または有機重合体、特に大きな巨大分子を含有する溶液中で、水は利用できなくなるか、または物理的に混入されるか若しくは吸蔵される。さらに、上記のように、この発明の多くの典型的な溶液は、水の含有量は約２０％より少ない。これらの溶液中に貯蔵されている胞子および／またはコロニーは、通常なら胞子を破裂および破壊して生存力を失わせる浸透圧ストレスがないので、生存し続ける。
肥料産業において時々用いられるこの特性を表す一つの尺度は、「塩指数（salt index）」（ここではＳＩと表示する）と呼称されるもので、肥料製品が、それを施用される種子または植物を損傷する傾向を表す尺度である。塩指数は、１％の溶液が伝導する電流の大きさを測定することによって評価される。可溶性の塩の含量が高ければ高いほど、その肥料製品はより多くの電流を伝導する。硝酸ナトリウムの塩指数が、伝導する標準製品として使用される。つまり、硝酸ナトリウムが標準の基準値１００を割当てられ、他の製品はこれと比較される。種々の栄養源が他の物より濃度が高いため、および日焼けの可能性（burn potential）が塩指数はもちろん散布量や他の要因によって影響されるため、いく分かの変動はあるが、典型的に、塩指数が高ければ高いほど、肥料製品が種子の発芽や植物の成長を損う傾向が高い。例えば、種子上に置くことが推奨される市販の根付け肥料製品の大部分は、４０〜５０の範囲内の塩指数を有する。普通肥料（common fertilizers）である９−１８−９、７−２１−７および１０−３４−０などは、それぞれ、４０、６０および６２の塩指数を有し、そして、他の多数の市販肥料である硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウムおよび塩化カリウムなどは、それぞれ、１０５、１００および１１６と高い塩指数を有している。他の実証的な実施例としては、塩指数が６９の硫酸アンモニウム、塩指数が７４の硝酸カリウム、塩指数７５の尿素および塩指数が４６の硫酸カリウムがある。この発明の利点は、好ましい実施態様のものが約３５より低い塩指数を有することである。この発明を実施するのに有用な肥料の例としては、後続の各実施例に記載されているような天然の有機肥料があり、それらは典型的に約３．５以下の塩指数を有するもので、リン酸一アンモニウム（ＳＩ≒３０）、リン酸二アンモニウム（ＳＩ≒３４）、過リン酸塩（Ｃａ（Ｈ2ＰＯ）2＋ＣａＳＯ4、ＳＩ≒７．８）、重過リン酸塩（Ｃａ（Ｈ2ＰＯ4）2、ＳＩ≒１０）、リン酸一カリウム（ＳＩ≒８．４）など、およびそれらの混合物があるが、それらに限定されるものではない。一実施態様の塩指数はゼロである。
この発明の配合物を用いて保存することができる微生物および／またはその胞子は、さらに上記の土壌強化および土壌の質の改善に関する次のような望ましいいくつもの特性、すなわち植物病原体の生物的防除（先に述べた）、望ましい植物ホルモン類、例えばオーキシン類、ジベレリン類およびサイトカイニン類の強化および／または産生、並びにリン酸塩類の可溶化などの特性を呈する。バシラスサブチリスのある種の菌株は、例えば、落葉後、高木に塗布（散布）すると、リンゴの枝の葉痕にコロニーをつくるエヌ．ガリゲナ（N.Galligena）を阻害する（Cook, R.J.およびBaker, K.F.著、「The Nature and Practice of Biological Control of Plant Pathogens」、米国ミネソタ州セントポール所在のAPS Press社、１９８３年、３０８頁）。イー．ヘルビコーラ（E.Herbicola）およびシュードモナス（Pseudomonas）属の分離菌は、ナシ状果の高木の火傷病を部分的に抑制することが報告されている（同上文献）。いくつかのバシラス属の種は、タバコ、ベイマツおよびリンゴの高木の葉または針葉にスプレー散布すると有用な抗生物質を産生し、そして葉面の微生物の緩衝能によって天然の葉の保護が行われることが実証されている（同上文献の２１６頁）。アゾバクター（Azobacter）、リゾビウム（Rhizobium）、バシラス（Bacillus）、クレブシエラ（Klebsiella）、アゾスピリルム（Azospirillum）、エンテロバクター（Enterobacter）、セラチア（Serratia）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、アルスロバクター（Arthrobacter）、アエロバクター（Aerobacter）、アクチノマイセス（Actinomyces）、バシラス（Bacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）および他の属の細菌類が、各種の食用植物の圃場に散布すると、養分吸収の促進、発芽の増大、実生出芽の増大、新たな生合成の刺激などを含む各種の機構によって、成長を刺激し、収穫量を増大し、および他の好ましい結果をもたらす（Frankenberger,W.T.およびArshad著「Phytohormones in Soils, Microbial Production and Function」、米国ニューヨーク所在のMarcel Dekker社、１９９５年、３〜５頁、２０〜２１頁、および３６〜３７頁）。
この発明の別の利点は、好ましい溶液が、散布後、微生物が増殖するように微生物に与える養分とともに、土壌と植物に対し、生物学的に利用可能な形態で炭素が豊富な有機物質を供給することである。この発明の溶液は、土壌または茎葉に散布されると、胞子の発芽および／またはコロニーに対する優れた食餌源を提供する。この発明の別の利点は、好ましい溶液が、増殖中の微生物が容易に吸収できる多種類の天然産の代謝産物を含有し、そして、土壌中での種子の発芽、根の発育および植物の成長を促進することである。
上記にかいつまんで述べたように、この発明のさらに別の利点は、いくつかの実施態様のものが、植物の病害、特に真菌が起源の病害の予防、防除および／または治療を行うのに有用な微生物の胞子および／または培養物を配合されていることである。例示的な実施例を後ほど提供する。例えば、一つの実施態様は、バシラスサブチリスＧＢ０３（ＥＰＡ登録番号７５０１−１４４）の生存力を維持する。なお、この細菌は、コロニーを作って、根系を発育させ、根系を冒すフサリウム（Fusarium）、リゾクトニア（Rhizoctonia）、アルテルナリア（Alternaria）およびアスペルギラス（Aspergillus）属の細菌のような病害生物を抑制することが確認されている。この発明の組成物は、発育中の根系はもとより発育させた根系を処理するのに用いることができる。根系が発育し、成長しそして機能するにつれて、この細菌は根とともに増殖し、増殖期を通じて保護を広げる。この生物的保護の結果、その植物によってよく育つ根系を樹立し維持することができる。
加えて、ビー．サブチリスＧＢ０３は、多くのマメ科植物で使用すると、窒素固定細菌による結節化（根粒着生）の量が増大することが報告されている。この結節化の改善は、より健康な根系の結果であり、より多くの結節部位を天然産の土壌窒素固定細菌で作ることができる。以下に実施例を示す。
実施例
下記の諸実施例は、この発明をさらに例示して説明するために提供する物であり、いかなる意味でも、この発明を限定すると解釈すべきではない。特にことわらない限り、パーセントは全て重量によるものであり、説明されるその特定の処理ステップの重量パーセントに関する。
実施例１
この実施例では、微生物を、３種の溶液を用いて安定化した。溶液１は、Ｎｉｔｒｏ−３０  ＳＲＮ（商標）すなわち各種の長さの連鎖を有するメチレン尿素を含有する３０−０−０の８０〜８５％の緩効性窒素肥料製品である。溶液１は、ｐＨが８．５で、塩指数が非常に低く、かつ植物構成要素に対する植物毒性が非常に低い。接種源として商品名Ｅｎｖｉｒｏｍａｔｅ（商標）で入手できる水混和性粉末中にバシラスサブチリス、バシラスリヘニフォルミスおよびバシラスメガリウム（４５４×１０9〜２×１０12コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｌｂ）、サッカロマイセスセレビシエ（２５０×１０9細胞／ｌｂ）、セルラーゼ（２１，０００濾紙単位（ＦＰＵ）／ｌｂ）、ペクチナーゼ（６５００リンゴ絞りかす（ＡＰＵ）／ｌｂ）、２、５００ＣＳＵ／ｌｂより少なくないプロテアーゼを含有する乾燥微生物製剤を、溶液１に、液体肥料トン当たり約２．５ｌｂの比率で添加する。すなわち、肥料の散布量が１０００平方フィート当たり１／２ｌｂの窒素の場合、１平方フィート当たり１×１０6ＣＦＵを超えるバシラス属の細菌の微生物散布量を達成するのに十分な比率で添加する。これら微生物は、１８ヶ月間９８％が生存していた。類似の結果が２８−０−０液体肥料で得られた。
同じ微生物を、肥料トン当たり１．７５ｌｂの比率で、液体１８−３−６の５０％緩効性肥料（溶液２）に添加した。１０００平方フィート当たり１／２ｌｂの窒素の散布量の場合、これは約１×１０6ＣＦＵのバシラス属の細菌の追加散布に相当する。これらの試料を、一定に時間間隔をおいて生存率を監視しチェックした。試料は、１８ヶ月間９８％が生存していた。
同じ微生物製剤を、溶液３すなわちＥｓｓｅｎｔｉａｌ（商標）という天然有機質肥料であって、約６％のフミン酸、１０％のセルロース繊維、１．２％のリグニン、３％の単糖／二糖類、０．１％のコンブ抽出物、２％の炭水化物類、０．００２５％の天然の湿潤剤類、１３．１７ｍｇ／ｌｂのリボフラビン、０．３１４％のビタミンＢ６および４．２１％の無機質と他の化学薬剤（Ｆｅ、Ｃａ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｉ、Ｂ、Ｓ、Ｐ、ＫおよびＮ）を含有する肥料に、トン当たり約４．７５ｌｂの比率で添加した。この肥料の灰分は約２％であり、そして植物抽出物、コンブ抽出物および他のタンパク質由来のアミノ酸成分は、典型的に、約０．３９％のグルタミン酸、０．１％のトレオニン、０．３５％のアスパラギン酸、０．１６％のセリン、０．１９％のタンパク質、０．０２％のメチオニン、０．５３％のグリシン、０．２６％のアラニン、０．１％のバリン、０．０８％のフェニルアラニン、０．０７％のイソロイシン、０．０１％のチロシン、０．１７％のロイシン、０．１２％のアルギニン、０．１６％のリシン、０．０４％のヒスチジン、０．１２％のアルギニン並びに痕跡量のβアラニン、シスチンおよびタウリンを含有している。もし、１０００平方フィート当たり約４オンスの肥料が散布されるとすると、１平方フィート当たり約１×１０6ＣＦＵのバシラス属の細菌が散布されることになる。試料は、１８ヶ月間９８％が生存していた。
２種のバシラスサブチリスＣＨ２００とＣＨ２０１の菌株の培養物を、同じ３種の溶液で試験して、下記の平板培養試験結果を得た（ＣＦＵ／ｇのバシラス胞子数で表した）。
0003793578.tif 000002
試験結果をプロットして図１に示す。上記のデータから、この発明の溶液中で胞子が長期間にわたって生存していることが分かる。
実施例２
この実施例では、この発明の組成物を配合するのに有用ないくつかの溶液の物理特性を示す。
この発明の組成物の塩指数を、Standard Method Leco  ＦＰ４２８、Soil Ch.Anly.、Jackson、２４５頁を用いて測定し、検出限界は０．０１であった。それぞれ３０．４％（実施例１のＮｉｔｒｏ−３０（商標））および２６．９％の全窒素を含有するこの発明の２種の溶液は検出可能な塩指数を示さず、そして、全窒素が１０．４％の第三の溶液は３２の塩指数を示した。１８−３−６肥料は塩指数が１７であり、Ｎｉｔｒｏ−３０（商標）の別の試料（全窒素＝２８．９４％）は塩指数が２であり、そしてＴｒｉｐｌｅ  Ｔｅｎ（全窒素＝１０．７５％）は塩指数が２６であった。
Ｎｉｔｒｏ−３０（商標）の２５℃における平均のブルックフィールド粘度は、１５〜３０センチポアズであった。同じ製品の比重は、２５℃で比重計で測定したところ、平均１．２４９（範囲＝１．２４〜１．２６）であった。ｐＨは、同じ温度で１０．１であった。
実施例３
この実施例では、植物の真菌による病害に対する処理剤としてのこの発明の組成物の有用性について情報を提供する。
ミシガン州立大学のキャンパスで、夏期月間、注水されている多年生のライグラスに対するブラウンパッチ病用殺真菌剤を評価する試験を行った。このライグラスは、１．５インチの高さに維持され、病害を促進するため、１ヶ月間に１０００平方フィート当たり２ｌｂの窒素を施肥した。試験区域は、２’×４．５’で、列間の細道は１’であった。各処理は、４回ずつ繰り返した。ブラウンパッチ病の試験区域に、ひき割りトウモロコシ粉／砂混合物上で増殖しているリゾクトニアソラニ（Rhizoctonia Solani）を接種して、均一な病害の発生を促した。区域は、夜間、高湿度を保持するため、数晩、プラスチック製温室トレイで覆った。これらのトレイは、朝には取り除いた。
試験中、商品名Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（商標）およびＣｏｍｐａｎｉｏｎ２（商標）で市販されているこの発明の組成物を、１０００平方フィート当たり４液量オンス、１４日間隔で散布した。標準として、Ｄａｃｏｎｉｌ  Ｕｌｔｒｅｘ（商標）およびＴｈａｌｏｎｉｌ（商標）（４Ｌ）を、やはり１４日間隔で、それぞれ３．８オンス／１０００平方フィートおよび６オンス／１０００平方フィートのレベルでグラスパッチ（grass patches）に散布した。パッチは、４０日後、冒された各パン（pan）に対する面積百分率を評価する尺度で比較した。Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（商標）で処理した四つの区域の平均ＬＳＤは２２．５％であり、Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ２（商標）で処理した場合は３２．５％であったが、Ｄａｃｏｎｉｌ  Ｕｌｔｒｅｘ（商標）とＴｈａｌｏｎｉｌ（商標）の場合のそれぞれの対応する平均値は０．５％と３．０％であった。全体が冒されたことを示す未処理の対照と比べて、これらの試験結果は、この発明の組成物を使用すると、ブラウンパッチ病が著しく減少することを示した。
芝草の別の病害のドラースポット病を評価する類似の試験を、ラトガーズ大学の夏の圃場で再度行った。殺真菌剤を四つの区域に散布し、結果を平均した。Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ２（商標）を、４．０液量オンス／１０００平方フィートのレベルで、スプレーで、２８日間隔で２回散布し、次に１４日間隔で２回散布した。４回の繰り返し試験の区域当たり病変中心の数は、８週間の試験過程にわたる間隔をおいた時点で、４３．０から３１．０へ、そして２６．５へと低下した。同じ期間に同じ間隔で、未処理の対照区域は、６８．５、６９．２および３９．５の病変中心／区域を示した。同じ期間にわたって、Ｄａｃｏｎｉｌ  Ｕｌｔｒｅｘ（商標）を０．９５オンス／１０００平方フィート、１４日間隔で散布して、同じ日数間隔の時点で計数したところ、４３．２、２８．２および３３．２の病変／区域を示した。これらの試験結果は、明白に、この発明の組成物の殺真菌特性を示している。
加えて、殺真菌剤として有効なことが知られているビー．サブチリスの菌株ＧＢ０３（ＥＰＡ登録番号７５０１−１４４）を、前記実施例１で述べた要領で、この発明の組成物中での生存について試験した。この菌株は、約１８ヶ月間生存した。
実施例４
この実施例では、この発明のいくつかの実施態様の薄膜固着性を示す。
実施例１で使用したＮｉｔｒｏ−３０（商標）を茎葉スプレーとして使用した。その未希釈製品は、密度が１．２３ｇ／ｃｍ3、ｐＨが８．２〜８．５、粘度が０．８〜３．５Ｐａ・ｓ、そして塩指数が３０であった。０．５％〜４％の散布量で、ホップ類、リンゴ類、アザレア類、ロドデンドロン、テンジクアオイ、タバコおよびトマト植物の低木または高木に散布したところ、その溶液は、５週間にもわたって葉の組織上に滞留する緩効性肥料を提供した。
以上の説明は、この発明を例示する目的のものであって、この発明を限定するものではなく、そして当該技術分野の当業者にこの発明をどのように実施するかを教示するものである。この説明を読めば当業者にとって明らかになるであろうようなこの発明の全ての自明の変更や変形例を詳細に述べることは、意図していない。しかし、そのような自明の変更や変形は、後記特許請求の範囲で定義されるこの発明の範囲内に含まれることを、意図している。文脈上ことさらに反対の意味を示さない限り、これらの特許請求の範囲は、そこに意図されている目的を満たすために有効な、特許請求がされている要素およびステップを如何なる順序であってもカバーすることを意味している。
上で引用した各特許、各論文および各書籍抜粋は、その全体をこの明細書に援用するものである。
【図１】
0003793578.tif 000003