(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＢＶの表面抗原の抗原性を発揮するＢ型肝炎表面抗原タンパク質（ｍＨＢｓＡｇ）において、該タンパク質は、ＨＢｓＡｇ配列の１２２番目の位置のコドン及び１２４番目の位置のコドンの間に、アルギニン及びアラニンがこの順で、またはアルギニン、グリシン及びアラニンがこの順で、挿入された抗原性が修飾されたエンベロープ領域からなることを特徴とする、Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
【請求項２】
１２２番目の位置のコドン及び１２４番目の位置のコドンの間に該アミノ酸残基が挿入される以外は正常なＨＢｓＡｇのＳ−タンパク質と同じである、請求の範囲第１項に記載のｍＨＢｓＡｇ。
【請求項３】
コドンが１２２番目の位置のコドン及び１２３番目の位置のコドンの間に挿入される、請求の範囲第１項または第２項に記載のｍＨＢｓＡｇ。
【請求項４】
コドンが１２３番目の位置のコドン及び１２４番目の位置のコドンの間に挿入される、請求の範囲第１項または第２項に記載のｍＨＢｓＡｇ。
【請求項５】
ｍＨＢｓＡｇがＰｒｅ−Ｓ配列を含むものである、請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のｍＨＢｓＡｇ。
【請求項６】
７５％以上の純度を有する、請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のｍＨＢｓＡｇ。
【請求項７】
請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のｍＨＢｓＡｇをコード化するＤＮＡ配列からなる発現ベクター。
【請求項８】
請求の範囲第７項に記載のベクターで形質転換された宿主。
【請求項９】
請求の範囲第８項に記載の宿主を適当な培養液中で培養し、さらに必要な純度まで製造されたｍＨＢｓＡｇを精製する段階からなる、請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のｍＨＢｓＡｇの調製方法。
【請求項１０】
下記よりなることを特徴とする、生物学的な媒質における抗−ｍＨＢｓＡｇ抗体の診断用のインビトロの検出を目的としたキット：
（ａ）請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のｍＨＢｓＡｇ；
および
（ｂ）抗原抗体反応を検出するために使用される手段。
【請求項１１】
ヒトにおけるＢ型肝炎の感染の診断、予防または治療に使用することを目的とした請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のｍＨＢｓＡｇに対する抗体からなる抗体調製物。
【請求項１２】
請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のｍＨＢｓＡｇをコード化するＤＮＡ配列。
【請求項１３】
ｍＨＢｓＡｇ配列の１２２番目の位置のコドン及び１２４番目の位置のコドンの間に下記順番で挿入されたアルギニン及びアラニン、またはアルギニン、グリシン及びアラニンを有する、請求の範囲第１２項に記載のＤＮＡ配列の断片。
【請求項１４】
請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のｍＨＢｓＡｇをコード化する突然変異ＨＢＶの診断用のインビトロの検出方法に使用される請求の範囲第１２項に記載のＤＮＡ配列または請求の範囲第１３項に記載のＤＮＡ配列の断片。
【請求項１５】
請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のｍＨＢｓＡｇをコード化する突然変異ＨＢＶの存在を決定するためのプローブとして使用される請求の範囲第１２項に記載のＤＮＡ配列または請求の範囲第１３項に記載のＤＮＡ配列の断片。
【請求項１６】
１）ＨＢｓＡｇ配列の１２２番目の位置のコドン及び１２４番目の位置のコドンに隣接するプライマーを用いたＰＣＲ増幅を行い；さらに２）増幅された配列がＨＢｓＡｇ配列の１２２番目の位置のコドン及び１２４番目の位置のコドンの間に挿入された請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のコドンを有するかどうかを決定する段階を有する、請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のｍＨＢｓＡｇをコード化する突然変異ＨＢＶの存在の決定方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス抗原に対して特異性を有するポリペプチドをコードする組換ＤＮＡ分子に関するものである。
さらに詳しくは、本発明は、変異型のＢ型肝炎ウィルスに対するヒトの抗体の生産を刺激するワクチン組成物に関するものである。
様々な血清型のＢ型肝炎ビリオンのゲノムのクローニングは既知である（ミラー(Miller)ら）。Ｂ型肝炎ビリオンであり感染した患者から単離されたデーン粒子は約４２ｎｍの直径を有する。それぞれは、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、キャプシド（ＨＢｃＡｇ）、内因性のポリメラーゼ及びＤＮＡゲノムから構成される。第三のポリペプチドである、「ｅ」抗原（ＨＢｅＡｇ）はＢ型肝炎ウィルスによって作られ、血清中で可溶化した状態で見付かっている。
Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）による感染は、世界中の重大な問題となっているが、集団免疫に使用されるワクチンが現在広く利用されている。ＨＢＶに対する市販のワクチンは、天然のまたは組換体のいずれかの形態を有するＢ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）からなる。正規の（または野生型の）Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原は、Ｐ２４及びそのグリコシル化誘導体ＧＰ２８として知られている２個のタンパク質からなる約２２ｎｍの粒子として感染した患者の血漿から回収でき、これらの２個のタンパク質は両方ともＳタンパク質のコーディング配列またはＨＢＶのＳ−遺伝子として既知のＨＢＶゲノム上の２２６アミノ酸のコーディング配列によってコード化されるものである（チオライス(Tiollais)ら（１９８５年））。ＨＢｓＡｇをコード化する完全なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、ヴァレンツエラ(Valenzuela)ら、ネーチャー(Nature)、２８０巻、頁８１５（１９７９年）に記載されている。ヌクレオチド及びアミノ酸の位置を特定するためにチオライス(Tiollais)らによって用いられた番号付けのシステムを本明細書において使用する。
ワクチンの生産を目的としたサッカロミセス  セレヴィシアエ(S. cerevisiae)におけるＨＢｓＡｇの発現を可能にする発現ベクター上に酵母のプロモーターの制御下でＨＢＶのＳ−遺伝子のコーディング配列を挿入することが、ハーフォード(Harford)らによってデベロップ  バイオル  スタンダード(Develop. Biol. Standard)、５４巻、頁１２５（１９８３年）において、ヴァレンツエラ(Valenzuela)らによってネーチャー(Nature)、２９８巻、頁３４７（１９８２年）においておよびビッター(Bitter)らによってジェー  メド  ヴィロル(J. Med. Virol.)、２５巻、頁１２３（１９８８年）において記載されている。ピキア  パストリス(Pichia pastoris)における発現が、グレッグ(Gregg)ら、バイオテクノロジー(Biotechnology)、５巻、頁４７９（１９８７年）によって報告されており（また、ヨーロッパ特許公報番号０２２６８４６号をも参照）。また、ハンセヌラ  ポリモルファ(Hansenula polymorpha)における発現も報告されている（ヨーロッパ公報番号０２９９１０８号）。
ワクチンはまた、ヨーロッパ特許公報番号０２７８９４０号に記載されているように、ＨＢｓＡｇタンパク質からなるハイブリッド免疫原性粒子から調製された。このような免疫原性粒子は、例えば、本明細書中ではＰｒｅ−Ｓコーディング配列と称する、ＨＢＶゲノム上でＨＢＶ−Ｓ遺伝子を迅速に進行させるコーディング配列によってコード化されたＨＢｓＡｇｐｒ前駆体タンパク質のすべてまたは一部を含むことができる。このＰｒｅ−Ｓコーディング配列は、一般的に１６３アミノ酸（ay  ＨＢＶのサブタイプの場合）をコードし、Ｐｒｅ−Ｓ１コーディング配列及びＰｒｅ−Ｓ２コーディング配列からなる。後者は、５５アミノ酸をコードし、Ｓタンパク質のコーディング配列を迅速に進行させる。（ヨーロッパ公報番号ＥＰ−Ａ−０２７８９４０号）。
ＨＢＶ−ＤＮＡの表面抗原（Ｓ抗原）オープンリーディングフレームは、３領域、Ｐｒｅ−Ｓ１、Ｐｒｅ−Ｓ２及びＳに分けられる。このオープンリーディングフレームはｌａｒｇｅ、ｍｉｄｄｌｅ及びｍａｊｏｒタンパク質と称するＨＢＶの３個のエンベロープタンパク質をコード化する。ｍａｊｏｒタンパク質、ＨＢｓＡｇは、２２６アミノ酸から構成され、Ｓ遺伝子によってコード化される（チオライス(Tiollais)ら（１９８１年）；チオライス(Tiollais)ら（１９８７年）およびラウ(Lau)ら）。すべての３個のエンベロープタンパク質は、ＨＢｓＡｇの抗原部位を含み、ＨＢｓＡｇに関する既知の免疫検定によって容易に検出される。これらの免疫検定はＨＢＶの感染を診断し、広く血液ドナーをスクリーニングするために広範に使用される。ＨＢｓＡｇの反応性は「ａ」決定基として規定される１２４〜１４７番目のアミノ酸由来の親水性領域の構造上の立体配座に依存する（アシュトン−リカルド(Ashton-Rickardt)らおよびブラウン(Brown)ら）。これらはすべてのＨＢＶのサブタイプに共通であり、これに対する抗体はいずれかのサブタイプによる再感染に対する保護を付与する。
ＨＢＶ−ＤＮＡ配列がＨＢＶプローブと非常に過酷な条件下においてハイブリッド形成することが、血清ＨＢｓＡｇが陰性な患者の肝臓、血清及び血液の単核細胞中で示された（ブレコット(Brechot)ら（１９８５年）およびティアー(Thier)ら）。ドットブロットハイブリゼーション(dot blot hybridisation)またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた様々な実験による近年の結果から、ＨＢｓＡｇが陰性な患者の血清中にＨＢＶのＤＮＡ配列の存在が確認されている。ＰＣＲ技術の発達によって、多くの患者で非常に低レベルのＨＢＶの複製が検出でき、多くの単離体の配列が分析可能になり、これによりウィルスの単離体によっては遺伝学的な多様性が同定された（カーマン(Carman)ら（１９９０年）；ブレコット(Brechot)ら（１９９１年）；ブルム(Blum)ら）。ＨＢＶがかなり地方病性である台湾やサルデーニャ王国では、１．７％及び０．３％のＨＢｓＡｇが陰性な健常な血液ドナーがドットブロットハイブリゼーションによって検出可能な血清中のＨＢＶのＤＮＡを保有していた（ライ(Lai)ら（１９８９年）およびサン(Sun)ら）。また、中国大陸では、抗ＨＢ陽性患者におけるＰＣＲを用いた分子疫学的な調査から、ＨＢｓＡｇが検出不能なＨＢＶのキャリアーが存在し、このような人々は中国の一般的な人口の３％を占めることが示された（ルオ(Luo)ら）。
ＨＢＶの抗原のサブタイプは、血清学的に規定され、ＨＢＶをコード化するゲノム領域中の１塩基の変更によって生じることが示された（オカモト(Okamoto)ら）。しかしながら、すべての現在知られている抗原のサブタイプはＨＢｓＡｇの１２４〜１４７番目のアミノ酸から構成される「ａ」決定基を含む。「ａ」決定基に対する抗体は、すべてのサブタイプに対する保護を付与する。インビトロの突然変異誘発によって、１４７番目のシステインおよび１４２番目のプロリンが「ａ」決定基の全抗原性の発現に重要であることが示された（アシュトン−リカルド(Ashton-Rickardt)ら）。
さらに、ハワード  トーマス(Howard Thomas)およびウィリアム  カーマン(William Carman)は、ＷＯ  ９１／１４７０３号で、ＨＢＶに感染した母親から生まれたワクチン注射された子供における変異型のＨＢｓＡｇ断片を報告した。配列決定から、５８７番目のヌクレオチド位置におけるグアノシンからアデノシンへの点突然変異によりＨＢｓＡｇの「ａ」決定基において１４５番目の位置のグリシンからアルギニンへのアミノ酸の変化が生じることが明らかになった（カーマン(Carman)ら（１９９０年）をも参照）。同様のＨＢＶ突然変異体が、活性化されて（ワクチン）または受動的に（超免疫グロブリン）誘導された、体液の免疫圧力下(humoral immune pressure)で宿主中で複製されることが報告された（オカモト(Okamoto)ら（１９９２年）およびマクマホン(McMahon)ら）。しかしながら、ＨＢｓＡｇおよび抗−ＨＢｓ（ワクチン誘導）の長期間の存在が上記患者の血清中によっては既知の免疫検定によって検出されることから、突然変異によって抗原性は完全には失われないことが示唆される（カーマン(Carman)ら（１９９０年）、オカモト(Okamoto)ら（１９９２年）およびマクマホン（McMahon）ら）。
臨床的なおよび疫学的な観点から、標準的なアッセイにおいてＨＢｓＡｇの反応を起こさずに患者のＨＢＶの分子の形態を調査することはより重要である。ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ−ＤＮＡ、さらには抗−ＨＢｓ陽性である日本の患者からの配列決定の結果より、Ｐｒｅ−Ｓ２領域の９〜２２番目のアミノ酸が欠失し、さらにＰｒｅ−Ｓ２の３及び８番目、およびＨＢｓの「ａ」決定基の第一のループの１２６、１３１及びの１３３番目の位置のアミノ酸が置換されていることが示された（モリヤマ(Moriyama)ら）。他の単離体からの推定されたアミノ酸配列分析から、ｍａｊｏｒ  ＨＢｓタンパク質の３、５３及び２１０番目の位置における置換が明らかになり、これらはすべて共通の「ａ」決定基の外側にあり、血清中のＨＢｓＡｇの消失を説明することができない（リアング(Liang)ら）。
ここ１０年の間、Ｂ型肝炎ウィルスの様々な推定上の変異型または突然変異体が記載されてきた。例えば、マクマホン(McMahon)らは、抗−ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体で処置された肝臓の移植患者におけるＨＢｓＡｇの推定（ＤＮＡ配列分析によって推定）上のモノクローナル抗体結合ドメイン中にグリシンからアルギニンへの置換が記載されている（コールド  スプリング  ハーバー  シンポジウム  オン  ザ  モレキュラー  バイオロジー  オブ  ヘパティティス  ビー  ウィルセス(Cold Spring Harbor Symposium on the Molecular Biology of Hepatitis B Viruses)、１９８９年９月）。
カーマン(Carman)らによる調査、および特許出願ＷＯ  ９４／２６９０４号の対象において、２個の特定のアミノ酸、アスパラギン及びトレオニンがＨＢｓＡｇ配列の１２２番目の位置に挿入された修飾された「ａ」決定基を有する突然変異Ｂ型肝炎ウィルスが記載されている。さらに、１４５番目の位置で野生型のアルギニンからグリシンに置換された突然変異もまた、アミノ酸配列のリストにおいて詳細に記載されている。
他の報告によると、循環性のＢ型肝炎表面抗原(circulating hepatitis B surface antigen)を有する子供や成人が見付かったことから、２つの認可されたＢ型肝炎ワクチンのうちの一方による免疫処置後に特殊な抗体（抗−ＨＢｓ）が存在するにもかかわらず、ウィルスが複製していることが示される（ザネッティ(Zanetti)ら）。モノクローナル抗体を用いたＨＢｓＡｇの分析から、循環性の抗原が「ａ」決定基を持たないまたは上記決定基はマスクされていることが示された。Ｂ型肝炎ウィルスの変異型の出現が、恐らく感染が地方病である地域での免疫処置に関連した疫学的な圧力により、検出されたと結論付けられた。しかしながら、この変異型の特徴はさらに明らかにされなかった。
ザネッティ(Zanetti)らの研究から、少なくとも罹患しやすい免疫原性の性質を有する宿主では、「エスケープミュータント」、即ち、免疫性を中和しないように突然変異された複製する感染性ウィルスを生じることは現在利用されているＢ型肝炎ワクチンの大きな欠点であることは明らかである。このような変異型ウィルスは、明らかに、病気を引き起こす能力を有しており、遺伝すると考えられる。したがって、この変異型ウィルスは、正常なＨＢｓＡｇを基礎としたワクチンによって生産される抗体によって有効に中和されないので、重大な免疫処置の問題を生じる。他の突然変異もＨＢＶで報告されているが、これらの変化した抗原性に関する重要性は不明である（モリヤマ(Moriyama)らおよびライ(Lai)ら（１９９０年））。
ＨＢＶ感染が非常に地方病となっている地域である、中国では、ＰＣＲを用いた近年の研究により、特発性肝硬変、活動性慢性肝炎（ＣＡＨ）または持続性慢性肝炎（ＣＰＨ）のいずれかに罹っているＨＢｓＡｇ陰性患者の３０〜４０％は血清または肝臓組織中に複製するＨＢＶ−ＤＮＡを有することが示唆される（ツァング(Zhang)ら）。これらの研究は、ＨＢＶの変異型は、中国人集団中に存在し、血清中ではＨＢｓＡｇが検出不能であるという特性を有することを示すものである。驚くべきことに、このような推定上の突然変異体は分子レベルでは特徴が明らかにされていなかった。
中国人の患者（即ち、ＨＢｓＡｇが検出可能でない患者）からの単離体は、「ａ」決定基の直前の、１２２及び１２４番目のコドンの間にアミノ酸がさらに挿入された挿入突然変異体(insertion mutant)である。このような配列の変更は既知のＨＢＶサブタイプでは従来報告されておらず、同じ地域出身の３０人のＨＢｓＡｇが陽性の中国人の患者では見当たらなかった。興味深いことに、挿入が起こった領域はＨＢｓＡｇの重要なエピトープ領域である。挿入された配列は、サブタイプの決定基（ｄ）を決定する１２２番目のコドンのすぐ下流でありかつ「ａ」決定基のすぐ上流であることが知られている。１２２番目の位置のコドンの前後のヌクレオチド及びアミノ酸配列はすべて野生型のＨＢＶで記載されたものと同様である（図６及び７）。理論によって結び付くことを望まないが、我々は、このような突然変異によって「ａ」決定基のおよび「ｄ」サブタイプのエピトープに影響を与える立体配座の変化が生じると考えている。一つの可能性としては、アミノ酸の挿入によって「ａ」決定基の２個のループの場所的な構成に影響を与えることによってエピトープが変化することがある。他の可能性としては、モノクローナル抗体（ウォーターズ(Waters)ら）によって規定される、「ａ」決定基の第一のループが（従来考えられているよりも）より上流のアミノ酸を含むことが挙げられる。我々は、上記のアミノ酸が従前に示唆されている（ウォーターズ(Waters)らおよびアシュトン−リカルド（Ashton-Rickardt）ら）ように１２４番目ではなく１２２番目より上流のジスルフィド架橋によって形成されていることを報告する。挿入されたアミノ酸が１４アミノ酸から１６または１７アミノ酸にループの距離を増加させ、これによりこのループの立体配座を変え、中和抗体の結合を阻害する。
本発明において、我々は、血清がドットブロットハイブリゼーションによるとＨＢＶ−ＤＮＡに対して陽性であるが市販のポリクローナル抗体を基礎とした免疫決定ではＨＢｓＡｇ陰性である中国人の患者から単離したＨＢＶの新規な変異型または「エスケープミュータント」を報告する。さらに、本発明は、既知のＨＢＶワクチンは上述した新規に発見された突然変異体では有効でないので、これらのワクチンに関連した欠点を克服する、または少なくとも軽減するものである。
本発明は、ＨＢＶエンベロープ領域の１２２番目の位置のすぐ下流に少なくとも２個のアミノ酸が挿入されたＨＢＶの新規に確認された突然変異体の特性を提供するものである。本発明はまた、試験サンプルにおける突然変異ＨＢＶの存在を測定する方法、およびこれらの方法に使用できる試薬を提供するものである。本発明のすべての概念は、ＨＢｓＡｇゲノムの５１９番目のヌクレオチドの下流に少なくとも６個のヌクレオチドが挿入されたのに相当する、ＨＢｓＡｇ配列の１２２番目の位置の下流に少なくとも２個のアミノ酸が挿入された「ａ」決定基の修飾を提供するものである。
突然変異ＨＢＶ由来の核酸配列、またはこの一部は試験サンプルにおける突然変異ＨＢＶの存在を測定するためのプローブとして使用できる。この配列はまた、このような突然変異ＨＢＶのゲノム内でコード化された突然変異ＨＢＶ抗原のポリペプチド配列を利用でき、診断試験における標準物質若しくは試薬としておよび／またはワクチン成分として有用であるポリペプチドの生産を可能にする。上記ポリペプチド配列内に含まれるエピトープに対するモノクローナル及びポリクローナル抗体もまた、診断試験さらには治療用薬剤用に、抗ウィルス剤のスクリーニングのために、および上記核酸配列がそれに由来である突然変異ＨＢＶの単離を目的として使用できる。
上記突然変異ＨＢｓＡｇは必要であればＰｒｅ−Ｓ配列を含んでもよいと解される。
本発明による変異型ＨＢｓＡｇタンパク質またはその断片を、これ以降、「ｍＨＢｓＡｇ」と略称する。
これらのｍＨＢｓＡｇ突然変異体は、「自然に発生する」形態ではなく、血液産物を含まない、合成または非常に精製された材料であることが好ましい。
好ましくは、本発明において記載されるこれらの突然変異体は全長のＨＢｓＡｇに相当し、少なくとも２個のアミノ酸残基が１２２番目の位置の下流に挿入されている以外は野生型のＨＢｓＡｇと同じである。
好ましくは、ＨＢｓＡｇ突然変異体は、例えば、７５％以上の純度、より好ましくは９０％以上の純度、最も好ましくは９５〜１００％の純度等、非常に精製された形態を有する。
本発明のさらなる概念によると、免疫保護できる量の上記ＨＢｓＡｇの「エスケープミュータント」を適当な担体と組み合わせることからなるワクチン組成物を提供するものである。
本発明の他の概念を以下に記載する。
本発明のｍＨＢｓＡｇ及びワクチンは、ウィルスのＨＢｓＡｇの「ａ」決定基のすぐ上流の領域（エンベロープ領域）が修飾された上記したような「エスケープミュータント」の出現によって考えられる問題を解決するために使用される。特に、本発明のワクチンは、少なくとも２個のアミノ酸が１２２番目の位置の下流に挿入されたＨＢｓＡｇアミノ酸配列中に修飾されたＨＢＶエンベロープ領域を有すると定義された変異型のＨＢＶに対して保護される、またはこのような変異型のＨＢＶの遺伝の発生を防止するために使用されるという利点を有する。
したがって、ヒトに安全でかつ有効量の本発明によるワクチンを投与することからなる、変異型のＨＢＶによる感染に関連した病気の症状に対してヒトを保護する方法をも提供するものである。
本発明の他の概念によると、治療、特に予防に使用されることを目的としたｍＨＢｓＡｇを提供するものである。
本発明はまた、変異型のＨＢＶの感染に関連した病気の症状に対してヒトを保護することを目的としたワクチン組成物の製造におけるｍＨＢｓＡｇの使用を提供するものである。
存在する変異型ＨＢＶウィルスに対してヒトを免疫処置するために使用される際には、ワクチンにおけるｍＨＢｓＡｇ配列は、変異型ＨＢＶウィルスにおけるｍＨＢｓＡｇ配列と、一般的に一致する、または抗原性的には等価であると考えられる。
好ましくは、本発明のｍＨＢｓＡｇにおける１２２番目の位置の後に挿入されるアミノ酸残基は、６個またはそれ以上のヌクレオチドの挿入によって誘導されるものである。余分なアミノ酸をコード化する挿入されたヌクレオチドは正常なＨＢｓＡｇにおける１２３番目のコドンの３個のヌクレオチドのいずれかに影響を与える。
理論的には、エンベロープタンパク質の親水性を変化させる突然変異によって、抗原性が変化し変異型のＨＢＶが出現できる。野生型の親水性及び上記領域が突然変異したものの親水性は全く異なる。本明細書中に記載された親水性の減退は抗原性の損失と相関があることが多い。第一のループにおける突然変異体の親水性が増加することによって、エンベロープの脂質におけるｍａｊｏｒタンパク質が変換したタンパク質が得られ、これにより、立体配座の顕著な効果が得られる。
本発明の好ましい実施態様においては、正常なＨＢｓＡｇの１２２番目の位置の後の残基は「ａ」決定基の親水性を減少させる。
本発明の他の好ましい実施態様によると、ｍＨＢｓＡｇは、１２２番目の位置の下流に少なくとも２個のアミノ酸残基が挿入される以外は正常な（野生型の）ＨＢｓＡｇのＳ−タンパク質と同じである。
本発明の特に好ましい実施態様によると、１２２番目の位置の下流の修飾は、アルギニン、次にアラニンをそれぞれ挿入することである。また、アルギニン、グリシン及びアラニンをこの順で１２２番目の位置の下流に挿入することも好ましい。
本発明の各概念の好ましい態様は、必要であれば変更を加えて、他の各概念と同様である。
本発明を以下の実施例によって詳細に説明する。この実施例は下記図面を参照するものである：
図１は、患者番号１の連続的な血清中のアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを示すものである。正常なレベルは４０μｉ／リットル未満である。血清のＨＢＶマーカーを、様々な示された時間で測定した。１９９２年８月に、ＨＢＶのＤＮＡがＰＣＲによって検出されたがＨＢｓＡｇ及び他のＨＢＶマーカーは検出されなかった。
図２は、患者番号２の連続的な血清中のＡＬＴレベルおよび血清中のＢ型肝炎ウィルスマーカーを示すものである。略称は：ｗが野生型を示し；ｍは突然変異体を示す。
図３は、表面遺伝子のオープンリーディングフレーム、ＰＣＲ及び配列決定用のプライマーの位置、および重なりポリメラーゼオープンリーディングフレーム（Ｐ  ＯＲＦ）を図で示したものである。陰がつけられた丸は開始及び終止コドンを示し、陰がつけられた四角は「ａ」決定基に関する挿入のホットスポット（５２２〜５９３番目の位置）を示すものである。ヌクレオチドの番号付けは、本単離体はＥｃｏＲＩ部位を持たないので、既知のＨＢＶのＤＮＡ配列と同様、仮のＥｃｏＲＩ部位からである。
図４は、ＰＣＲ産物を直接的に配列決定した後の単離体１及び２のヌクレオチド挿入物（左及び右）を野生型のもの（中央）と比較したものを示す。矢印は挿入の点を示す。
図５は、単離体１及び２（左及び右）のヌクレオチド及びアミノ酸配列を野生型（ａｄｗ）と比較したものを示す。挿入された配列には下線が付されている。
図６は、ｍＨＢｓＡｇ単離体１の完全なヌクレオチド配列を示すものである。上方の配列は突然変異ＨＢｓＡｇ単離体の表面遺伝子及び「ａ」決定基の配列を示すものであり、下方の配列は野生型の配列を示すものである。（−−−）はアミノ酸の挿入のあった点を示す。
図７は、ｍＨＢｓＡｇ単離体１の完全なヌクレオチド配列を示すものである。上方の配列は突然変異ＨＢｓＡｇ単離体の表面遺伝子及び「ａ」決定基の配列を示すものであり、下方の配列は野生型の配列を示すものである。（−−−）はアミノ酸の挿入のあった点を示す。
表１は、ポリメラーゼ連鎖反応及び配列決定反応に使用された合成オリゴヌクレオチドプライマーを示すものである。
表２は、モノクローナル抗体への患者番号１及び２由来の血清ＨＢｓＡｇの陽性／陰性結合率を示すものであり、この際、ａｄｗの野生型をコントロールとして使用した。
表３は、従来既知の野生型の配列（ａｄｗ）及び野生型と同じ地域出身の中国人の単離体と比較した突然変異Ｓ遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸配列の相同性を列挙したものである。
ＨＢＶ突然変異体は塩基のラン(run of bases)によって特徴付けられた配列の特定の領域においてより共通して見付かっている。この場合、研究により挿入は４つのアデノシンのラン(run)と関連する。この領域は中国人のＨＢｓＡｇ陰性のＨＢＶキャリアーからの単離体によっては挿入のための「ホットスポット」であると考えられる。
本発明のさらなる概念によると、ｍＨＢｓＡｇの調製方法およびこれから得られるワクチン組成物を提供するものである。
好ましくは、ｍＨＢｓＡｇは、ペプチド合成によってまたはより好ましくは組換ＤＮＡ技術によって、合成により得られる。
組換ＤＮＡ分子及び配列の構築、操作及び確認方法は当該分野において既知である。ＨＢｓＡｇのＨＢＶ  Ｓタンパク質を修飾して本発明のｍＨＢｓＡｇを得るためには、１２２番目の位置の下流に、コドンＣＧＧ及びＧＣＡ、またはそれぞれアルギニン及びアラニンをコード化する他のトリプレットコドンの組み合わせを挿入することが望ましい。または、コドンＣＡＣ、ＧＧＧ若しくはＧＣＧ、またはそれぞれアルギニン、グリシン及びアラニンをコード化する他のトリプレットコドンの組み合わせを、１２２及び１２４番目の位置のヌクレオチドの間に挿入してもよい。
様々な方法が配列を適当に変更するために利用できる。一つの好ましい方法としては、ウィルスまたは酵母のコドン頻度を用いた目的とするコーディング配列の、亜リン酸またはホスホアミダイト化学による、完全ｄｅ  ｎｏｖｏ合成がある。
ＤＮＡの合成は営業的に様々な会社から市販されている、このような遺伝子の合成例は、ハイデン(Hayden)及びマンデッキー(Mandecki)、ＤＮＡ、７巻、頁５７１（１９８８年）やこれに記載される引例に記載されている。
第二の方法は、ボトスタイン(Botstein)及びショートル(Shortle)、サイエンス(Science)、２２９巻、頁１１９３（１９８２年）に記載されているように、すでにＨＢＶゲノムを有するベクター由来の適当な制限断片を１本鎖のベクター上にクローニングし、その後部位特異的なインビトロの突然変異誘発を行うことである。ａｙサブタイプのＨＢＶゲノムがｐＢＲ３２２上にクローニングされた組換プラスミドｐＲＩＴ１０６０１を有する大腸菌Ｋ１２株Ｃ６００(E. coli K12 C600)の培養物は、１９８２年６月２日に受託番号ＡＴＣＣ  ３９１３２号でアメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)にブダペスト条約に基づいて寄託された。２２６アミノ酸のＨＢｓＡｇタンパク質を特定するＳ−遺伝子をコードする配列またはＰｒｅ  ポリペプチドをコードするそれより長い配列が、標準的な組換ＤＮＡ技術によってこのようなクローンから切り出せる。
適当な制限断片としては、ｐＲＩＴ１０６０１のＳ−遺伝子コーディング領域内の５７５ｂｐのＸｂａＩ−ＡｃｃＩ断片がある。インビトロの突然変異誘発に使用されるベクターシステムは市販されている。このようにして得られた突然変異遺伝子断片をＳ−遺伝子中に再挿入する。
第三の方法としては、ホ(Ho)ら、ジーン(Gene)、７７巻、頁５１（１９８９年）に記載されているようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて目的とする突然変異による変更を行うものである。
それぞれの場合において、ｍＨＢｓＡｇのコーディング配列は適当な宿主中で適当なプロモーターの制御下で発現する。
ｍＨＢｓＡｇをコード化するＤＮＡ配列を有する発現ベクターは新規であり、本発明のさらなる概念を形成するものである。上記発現ベクターが形質転換された宿主もまた本発明のさらなる別の概念を形成するものである。
好ましい概念によると、サッカロミセス  セレヴィシアエ(S. cerevisiae)、ピキア  パストリス(Pichia pastoris)またはハンセヌラ  ポリモルファ(Hansenula polymorpha)が宿主として用いられ、発現は、酵母のＴＤＨ３プロモーター（グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)遺伝子、ヴァレンツエラ(Valenzuela)ら、１９８２年；ビッター(Bitter)ら、１９８８年を参照）またはＰＨ０５（ミヤノハラ(Miyanohara)ら、１９８３年）、ＭＯＸ、ＦＭＤＨ（ＥＰ−Ａ−０２９９１０８号を参照）及びＡＯＸ（ＥＰ−Ａ−０２２６８４６号を参照）等の、酵母のプロモーターの制御下で行われる。
形質転換された宿主を既知の手段によって培養または発酵し、ｍＨＢｓＡｇを抽出及び精製できる。酵母細胞からのＨＢｓＡｇの精製は当該分野では既知であり、Ｕ．Ｓ．特許番号４，６４９，１９２号；４，６８３，２９４号；４，６９４，０７４号または４，７３８，９２６号のいずれかに従って行うことができる。本発明のｍＨＢｓＡｇの精製は類似の方法で行われる。
ｍＨＢｓＡｇを含有するワクチンは既知の技術によって調製され、好ましくは緩衝化生理食塩水中に免疫保護が得られる(immunoprotective)量のｍＨＢｓＡｇを含み、水酸化アルミニウムやリン酸アルミニウム等の様々な既知のアジュバントのいずれかと混合または吸着する。「免疫保護が得られる(immunoprotective)」とは、十分な量のｍＨＢｓＡｇが十分な保護抗体または細胞が介在する免疫反応を誘導し重篤な副作用を伴うことなく感染物質に対する保護が与えられるために投与されることを意味する。ｍＨＢｓＡｇの投与量は、ワクチンがアジュバント化されているか否かで異なるが、通常、１〜１０００μｇのタンパク質の範囲内である。好ましくは１〜２００μｇのタンパク質が使用され、より好ましくは５〜４０μｇのタンパク質である。投与量及び投与回数は、患者の抗体価や他の応答性を考慮して標準的な投与範囲で決定される。
ｍＨＢｓＡｇはまた、正常なＨＢｓＡｇまたはワクチンの配合用のＰｒｅＳ１若しくはＰｒｅＳ２ポリペプチドの全部若しくは一部若しくは複数の部分を含む均質な若しくは複合ＨＢｓＡｇ粒子等の他のＨＢｓＡｇと混合されてもよい。さらに、ｍＨＢｓＡｇは、他の生物のタンパク質由来のエピトープを有するハイブリッドＨＢｓＡｇ粒子とおよび他の免疫原と混合して二価または多価ワクチンを形成してもよい。ワクチン調製物に関しては、通常、「ワクチン」（ヴォラー(Voller)ら著、ユニヴァーシティ  パーク  プレス(University Park Press)、バルチモア、エムディ(Baltimore, MD)アメリカ合衆国、１９７８年）に記載されている。
ｍＨＢｓＡｇは、変異型ＨＢＶウィルス感染用の検出キット中の免疫試薬などとして含ませるために使用できる。また、ｍＨＢｓＡｇは、既知の方法によってポリクローナルやモノクローナル抗体を得るために使用されてもよく、この際、モノクローナル抗体は変異型の抗原に特異的であり正常なＨＢｓＡｇを認識しないものであってもよい。
本発明の他の実施態様によると、突然変異ＨＢＶ抗体やこれらの複合体を含む血清と免疫学的に反応するポリペプチド、およびこれらのポリペプチドにおける突然変異ＨＢＶに特異的なエピトープに対して生じる抗体を、突然変異ＨＢＶ抗体の存在、または生物学的な試験サンプル中のウィルスおよび／またはウィルス抗原の存在を検出するために免疫検定に用いることができる。これらの免疫検定の設計は変更され、このような変更は当該分野においては既知である；これらの変更は本明細書中に記載されている。免疫検定は、クローンを含む突然変異ＨＢＶ核酸配列由来の、またはこれらのクローンにおける突然変異ＨＢＶ核酸配列由来の複合核酸配列由来の、またはこれらのクローンの核酸配列がそれ由来である突然変異ＨＢＶゲノム由来のポリペプチド等の、１つのウィルス抗原を使用するものであってもよい。または、免疫検定が、上記源由来のウィルス抗原を組み合わせて使用するものであってもよい。さらに、免疫検定が、例えば、同一のウィルス抗原に対するモノクローナル抗体、または様々なウィルス抗原に対するポリクローナル抗体を用いるものであってもよい。検定としては、下記に限られるものでないが、競合、直接反応またはサンドイッチ型のアッセイを基礎とするものが挙げられる。検定は、固相を用いるものであってもまたは免疫沈降若しくは固相を用いない他の方法によって行われるものであってもよい。シグナル発生化合物(signal generating compound)として標識を用いる検定およびこれらの標識の例は本明細書中に記載されている。シグナルはまた、継続中のＵ．Ｓ．特許出願番号６０８，８４９号；０７０，６４７号；４１８，９８１号；及び６８７，７８５号に記載されているように、ビオチンやアビジン、酵素標識またはビオチン抗ビオチンシステムを用いることによって増幅されるものであってもよい。突然変異ＨＢＶの免疫優性領域由来のエピトープを含む組換ポリペプチドを感染患者の生物学的な試験サンプルにおけるウィルス抗体の検出に使用してもよい。また、抗体を急性の感染と非急性の感染とを区別するのに使用されてもよいと考えられる。免疫診断に適用でき、適当な試薬を含むキットは、適当な容器中に突然変異ＨＢＶエピトープまたは突然変異ＨＢＶエピトープに対する抗体を含む本発明のポリペプチド等の、適当な材料、さらには検定を行うに当たって必要な残りの試薬や材料を、適当な検定の指示と共に、充填することによって構築される。
したがって、本発明の好ましい概念によると、下記よりなることを特徴とする、生物学的な媒質における、およびワクチン注射後の特定の中和抗体における抗−ｍＨＢｓＡｇ抗体の診断用のインビトロの検出を目的としたキットを提供するものである：
ａ）本明細書中に規定されるｍＨＢｓＡｇ；および
ｂ）抗原抗体反応を検出するために使用される手段。
本発明のさらなる概念によると、ヒトにおけるＢ型肝炎の感染の診断、予防または治療に使用することを目的とした抗−ｍＨＢｓＡｇ抗体からなる抗体調製物を提供するものである。また、Ｂ型肝炎の感染を予防または治療するための有効量の上記抗−ｍＨＢｓＡｇ抗体によるヒトの処置方法を提供するものである。
本発明を、以下の実施例によって詳細に説明する。
実施例
患者番号１は、６年間の非Ａ非Ｂ慢性肝炎の履歴を有する５８才の男性であった。１９９２年８月に、ＨＢＶ−ＤＮＡがＨＢｓＡｇ及び他のＨＢＶマーカーの不存在下でＰＣＲによって発見された（図１）。この段階で、患者は肝硬変を有していた。
患者番号２は、中国の南方の出身の２３才の女性であり、１９９３年３月における定常的な試験では血清中のアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルが若干上昇しており、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇは陽性であったが、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｍ及びＩｇＧ抗−ＨＢｓは両方とも陰性であった。１９９４年１月の追試では、彼女は依然としてＨＢＶ−ＤＮＡは陽性であり、また、抗−ＨＢ陽性であったが、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及び抗−ＨＢｓは陰性であった（図２）。
２人の患者は、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）及びＨＣＶ−ＲＮＡは陰性であった。同じ地域出身の、慢性の肝臓病または肝細胞癌を患っている３０人のＨＢｓＡｇ陽性の中国人の患者について研究した。
血清学的な調査
ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、全抗−ＨＢｃ、ＩｇＭ抗−ＨＢｓおよび抗−ＨＢｓを市販された酵素免疫検定（アボット  ラボラトリーズ(Abbott Laboratories)、ノース  シカゴ、イリノイ州(North Chicago, Illinois)、アメリカ合衆国）によって試験した。ＨＢｓＡｇ及び抗−ＨＢｓの結果は英国で確認された。
モノクローナル抗体の結合
「ａ」決定基に結合することが知られている―パネル(panel)の抗−ＨＢｓモノクローナル抗体を用いて、「ａ」決定基のエピトープにおけるより特異的な変化を規定した。ポリスチレンビーズ（ノースアンブリア  バイオロジカルズ(Northumbria Biologicals)、ノースアンバーランド(Northumberland)、イギリス国）を抗体ＲＦＨＢｓ−１、ＲＦＨＢｓ−２及びＲＦＨＢｓ−７で被覆した後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）における５０％新生児ウシ血清で１：２に希釈された血清サンプルと共にインキュベートした。結合したＨＢｓＡｇを、「アウスリアＩＩ(AusRIA II)」キット（アボット  ダイグノスティックス(Abbott Diagnostics)）の125Ｉ−抗−ＨＢｓを用いて検出したところ、ＲＦＨＢｓ−１及びＲＦＨＢｓ−２は１２４〜１３７番目のアミノ酸配列を含む環状ペプチドに結合しおよびＲＦＨＢｓ−７は１３９〜１４７番目のアミノ酸由来の環状ペプチドに結合した。
肝炎マーカー
ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、全抗−ＨＢｃ、ＩｇＭ抗−ＨＢｃ、及び抗−ＨＢｓを酵素免疫検定（アボット  ラボラトリーズ(Abbott Laboratories)、ノース  シカゴ、イリノイ州(North Chicago, IL)）によって試験した。
ドットブロットハイブリダイゼーション
ＨＢＶ−ＤＮＡを、ウェラー(Welller)ら、ジェー  メド  ヴィロル(J. Med. Virol.)、９巻、頁２７３〜２８０（１９８２年）において記載された方法を修飾したドットブロットハイブリダイゼーションによって検出した。
ＨＢＶ−ＤＮＡの抽出、ＰＣＲ及び直接的な配列決定
５０μｌの血清を６８℃で２時間、２００μｌの容積で０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、２５ｍＭ  酢酸ナトリウム、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼｋ（ベーリンガーマンハイム(Boehringer Mannheim)、レウェス(Lewes)、イギリス国）の存在下で消化し、フェノールによる抽出を２回行った後、クロロホルムによる抽出を２回行い、さらにＨＢＶ−ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。７０％エタノールで２回洗浄した後、ＤＮＡペレットを１０μｌの水に再懸濁した。
５μｌの抽出されたＨＢＶ−ＤＮＡをＰＣＲ増幅用の鋳型として使用した。１セットのプライマー（ａｄｗサブタイプ）としての、ＰＯ５′（５′−ＴＧＣＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＡＴ、２８１８〜２８３３番目の位置）、およびＰＯＬ３（５′−ＡＡＧＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＣ、１４０９〜１３９５番目の位置）（表２）を用いて、Ｐｒｅ−Ｓ１、Ｐｒｅ−Ｓ２及びＳ遺伝子を含む１８００ｂｐの断片を得た（図３）。別のセットのプライマーである、Ｍ３（５′−ＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＧＧＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＴ、１７８１〜１７５５番目の位置）及び３Ｃ（５′−ＣＴＡＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＧＡ、２４６０〜２４３９番目の位置）を用いて、Ｐｒｅ−Ｃ及びＣ領域を増幅させた。同様の血清サンプルを、様々なプライマーのセットを用いて別個に中国及びイギリス国で分析した。
ＰＣＲ産物の直接的な配列決定を「ｆｍｏｌ」シークエンシングキット（′fmol′Sequencing Kit）（プロメガ  コーポレイション(Promega Co.)、サウスアンプトン(Southampton)、イングランド）を用いて行った。配列決定用のプライマー（表１）の末端を、３７℃で１０分間、１０単位のポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガーマンハイム(Boehringer Mannheim)）を用いて１０μｌの容積で２５μＣｉの32Ｐ−アデノシントリホスフェート（アマシャム  インターナショナル(Amerhsam International)、アマシャム(Amerhsam)、イギリス国）で標識した。１．５μｌの反応混合物を配列決定反応に直接用いた。９０μｌのＰＣＲ産物を室温で１０分間等容の４モル／リットルの酢酸ナトリウム及び２倍容のイソプロパノールで沈殿させ、１０分間遠心することによってペレット化した後、７０％エタノールで２回洗浄した。２０μｌの水に再懸濁した後、９．５μｌのＤＮＡを末端標識されたプライマー及び５単位のＴａｑ酵素（プロメガ  コーポレイション(Promega Co.)）を含む反応緩衝液に添加した。ジデオキシヌクレオチドターミネーション配列決定(dideoxynucleotide termination sequencing)を製造社の指示に従って行った。この配列決定サイクルを３０回行った。変性、アニーリング及び拡張段階は、それぞれ、３０秒間、３０秒間及び１分間であった。
Ｓ遺伝子のクローニングおよび配列決定
直接的な配列決定の結果から、患者番号２の最初の血清（１９９３年２月）は野生型及び突然変異型ウィルスの混合物の形態を有していることが示された。上記血清サンプルＰＣＲ産物及び患者番号２の後のＰＣＲ産物をｐＵＣ１９ベクター中にクローニングし、直接的な配列決定の結果を確認した。増幅されたＨＢＶ−ＤＮＡのヌクレオチド配列をシークエナーゼＤＮＡ配列決定用キット（バージョン２．０、ユーエスビー、ケンブリッジ(USB, Cambridge)、イングランド）を用いて決定した。
疎水性プロット
野生型及び変異型のウィルス単離体由来のＨＢｓＡｇの「ａ」決定基のそれぞれ１２２〜１３７番目及び１２２〜１３９または１４０番目のアミノ酸（挿入されたアミノ酸を含む）を、プロシス  ソフトウェアー(Prosis software)（ファルマシア(Pharmacia)、セント  アルバンス(St. Albans)、イングランド）を用いて分析した。
ドットブロットハイブリダイゼーション
ＨＢＶ−ＤＮＡは、別に２回ＰＣＲによって増幅した後に患者番号１の血清中で検出可能であった。
患者番号２では、ＨＢＶ−ＤＮＡは、１０μｇ／５０μｌの血清で、１９９３年３月及び１９９３年９月にドットプロットハイブリダイゼーションによって検出可能であった。１．０μｇのＨＢＶ−ＤＮＡが２．３×１０6のＨＢＶゲノムと等価であるとすると、この患者の血清は１ｍｌ当たり約４．６×１０7個のウィルス粒子を含むと考えられた。ＨＢｓＡｇは１回目のサンプルでは検出できたが２回目のサンプルでは検出できなかった。１９９４年１月には、ＨＢＶ−ＤＮＡはＰＣＲによってのみ検出でき、ＨＢｓＡｇは依然として検出不能であった。
モノクローナル抗体結合に関する研究
患者番号１及び２およびコントロール（ａｄｗ）として用いられたＨＢｓＡｇ陽性の患者における結合に関する研究から、血清中のＨＢｓＡｇは患者番号２ではすべての３つのモノクローナル抗体に結合し、アウスリアＩＩ(AusRIA II)キットのポリクローナル抗−ＨＢｓによって検出できることが示された（表２）。
ＰｒｅＳ−Ｓ遺伝子及びＰｒｅＣ／Ｃ領域の配列決定
Ｓ遺伝子は、単離体１では６８７ｂｐから、単離体２では６９０ｂｐからおよび野生型では６８１ｂｐから構成される。突然変異体のＳヌクレオチド及びアミノ酸配列を、同じサブタイプ（ａｄｗ）の既知の配列と、さらには同じ地域出身のＨＢｅＡｇ−陽性キャリアーからの野生型株と、比較した（表３に示されるとおり）。
配列決定の結果から、Ｓ遺伝子中に挿入物があることが明らかに示された（図４）。挿入された配列は、単離体１では１２２及び１２３番目のコドンの間に２個のアミノ酸（Ａｒｇ−Ａｌａ）をさらにコード化し、単離体２では１２３及び１２４番目のコドンの間に３個のアミノ酸（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）をさらにコード化する（図５）。これらの挿入はＨＢｓＡｇの「ａ」決定基の直前で起こる。このような挿入は既知のＨＢＶのサブタイプの報告された配列には記載されておらず、中国の同じ地域出身の３０人の中国人のＨＢｓＡｇ陽性の患者から得た共通配列が欠損していた。
直接的な配列決定の結果はクローニング配列決定(cloning sequencing)によって確認された。患者番号２から採られた第一の血清からの１０クローンのうち、８クローンが上記したようなイン−フェーズインサーション(in-phase insertion)を有し、うち２クローンは野生型であり、さらに、第二及び第三の血清サンプルからの１５クローンはすべて変異型であった。したがって、患者番号２からの第一の血清は野生型及び突然変異型のウィルスの混合物の形態を有していることから、突然変異体が徐々に出現し、後の血清ではこの突然変異体が優性になることを示した。Ｐｒｅ−Ｓ１及びＰｒｅ−Ｓ２遺伝子には前記したようなアミノ酸の欠失または置換はなかった。
疎水性プロット
カイト(Kyte)及びドゥーリトル(Doolittle)の方法に従って行ったところ、平均疎水性定数(mean hydrophobicity index)が野生型の「ａ」決定基の１２２〜１３７番目のアミノ酸では−０．４８であり、単離体１の１２２〜１３９番目のアミノ酸では０であり、さらに単離体２の１２２〜１４０番目のアミノ酸では−０．８９であった。これより、突然変異「ａ」決定基は野生型のウィルス由来の同じ領域に比べると疎水性が高かった。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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