(57)【要約】  （１）未染色スライドからＦＦＰＥ切片を削り取る工程を、次の核酸抽出工程に影響を与えることなく簡略化することができ、（２）削り取る際のコンタミネーションのリスクを回避することができ、（３）安価で簡便な手段で選択的にがん部位を分取できる遺伝子検査用標本スライドを提供する。前記遺伝子検査用標本スライドは、検体切片を貼付する遺伝子検査用標本スライドであって、分離される当該検体切片と共にスライドの一部が、スライド上面とスライド下面とを伴った状態で、スライドのそれ以外の部分から分離されることが可能な遺伝子検査用標本スライドである。
2020096031.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体切片を貼付する遺伝子検査用標本スライドであって、分離される当該検体切片と共にスライドの一部が、スライド上面とスライド下面とを伴った状態で、スライドのそれ以外の部分から分離されることが可能な遺伝子検査用標本スライド。
【請求項２】
検体切片を貼付する遺伝子検査用標本スライドであって、当該検体切片の貼付面及び／又は反対側の面に、スライドの一部を、スライドのそれ以外の部分から分離することを補助するガイドが設けられている、遺伝子検査用標本スライド。
【請求項３】
検体切片を貼付する遺伝子検査用標本スライドであって、当該検体切片の貼付面とは反対側の面に、スライドの一部を、スライドのそれ以外の部分から分離することを補助する溝が設けられている、遺伝子検査用標本スライド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子検査用標本スライドの一部を、スライドのそれ以外の部分から分離することのできる分離手段を備えた検体前処理装置と、請求項１〜３のいずれか一項に記載の検体遺伝子検査用標本スライドとを含む、検体前処理用システム。
【請求項５】
（１）検体切片を用意する工程、
（２）スライド上に前記検体切片を貼付する工程、
（３）スライドの一部を、その領域に貼付された検体切片と一緒に、スライドのそれ以外の部分から分離する工程
を含む、検体の前処理方法。
【請求項６】
（１）パラフィン包埋検体切片を用意する工程、
（２）スライド上に前記検体切片を貼付する工程、
（３）スライドの一部を、その領域に貼付された検体切片と一緒に、スライドのそれ以外の部分から分離する工程、
（４）分離したスライド上の検体切片からパラフィンを除去する工程
を含む、検体の前処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子検査用標本スライドに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子検査では種々の検査材料（検体）を取り扱うが、がんのコンパニオン診断薬が登場し、現在最も多い検査材料は未染色スライド（ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片がガラススライドに固定化されたスライド標本）である。未染色スライドから核酸を抽出する際には、ガラススライドからＦＦＰＥ切片をメスで削りとり、削り取ったＦＦＰＥ切片をプラスチック製マイクロチューブに入れ、核酸を抽出することになる。スライド１枚当たりの組織サイズが小さい場合（針生検）は、充分な核酸が抽出できない為、１検体辺り複数枚のスライドからＦＦＰＥ切片を削る必要があり、多くの検体を処理するような場合は、非常に煩雑な作業となり多大な労力を必要とする。また、削り取ったＰＰＦＥ切片をマイクロチューブに入れる行為は静電気の影響で非常に難しく熟練を要す。さらに、削り取ったＦＦＰＥ切片が飛散し検体間での混入（コンタミネーション）のリスクもある。【０００３】
また、がんの検査では、検査材料のスライド標本中にがん部位が存在していることが必要である。そのために標本を作製する際には、連続切片を作製し、その１枚を用いてＨＥ染色を行い、病理医ががん部位の存在を確認する。腫瘍組織のみを選択的に検査することで、周りの正常組織の影響を回避し、より正確な検査結果を得ることが可能となる。正常部位の割合が多い標本の場合は、がん部位にマーキングして検査対象となるべき領域を示す必要がある。従って、ＨＥ染色によりマーキングされた標本を参考にして、未染スライドからマーキングと同等の領域を削り取る場合がある。【０００４】
この標本の一部を削り取る方法としては、レーザーマイクロダイセクション法が知られており、特殊なフィルムを組織に貼り付けレーザーで切り取る方法である。本方法は特殊な装置が必要あり、且つ、装置が高額であること、レーザーで切り出すための専用のガラススライド又はプラスチックフィルムが必要であり高価であること、１枚のスライドから選択的に切り出すのに時間がかかることが課題である。多くの検体を処理する臨床検査では不向きである。【０００５】
近年レーザーマイクロダイセクション法よりもより切り出す時間を短縮し、検査向けに開発されたのがティッシュダイセクション法（検体前処理装置「アベニオ  Ｍｉｌｌｉｓｅｃｔ」、ロシュ・ダイアグノスティックス、非特許文献１）である。前記装置は、先端底部にプラスチック製の刃（切断ブレード）を備え、且つ筒状本体内部にダイセクション試料回収チャンバーを備えた専用のチップを使用し、ＦＦＰＥ切片を貼付したガラススライドにチップを接触させ、チップを回転させることによりスライド上の切片が物理的に切り出され、切片の破片がダイセクション試料回収チャンバー内に回収される。前記装置で使用するチップは、高価であり（約４０００円／個）、コンタミネーション防止のため使い捨てであるため、多くの検体を処理する臨床検査では価格の問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「アベニオ  Ｍｉｌｌｉｓｅｃｔ」添付文書、２０１７年８月作成（第１版）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の課題は、（１）未染色スライドからＦＦＰＥ切片を削り取る工程を、次の核酸抽出工程に影響を与えることなく簡略化することができ、（２）削り取る際のコンタミネーションのリスクを回避することができ、（３）安価で簡便な手段で選択的にがん部位を分取できる検体前処理方法、並びにそれに用いる医療器具および装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題は、以下の本発明により解決することができる：
［１］検体切片を貼付する遺伝子検査用標本スライドであって、分離される当該検体切片と共にスライドの一部が、スライド上面とスライド下面とを伴った状態で、スライドのそれ以外の部分から分離されることが可能な遺伝子検査用標本スライド。
［２］検体切片を貼付する遺伝子検査用標本スライドであって、当該検体切片の貼付面及び／又は反対側の面に、スライドの一部を、スライドのそれ以外の部分から分離することを補助するガイドが設けられている、遺伝子検査用標本スライド。
［３］検体切片を貼付する遺伝子検査用標本スライドであって、当該検体切片の貼付面とは反対側の面に、スライドの一部を、スライドのそれ以外の部分から分離することを補助する溝が設けられている、遺伝子検査用標本スライド。
［４］前記［１］〜［３］のいずれかの遺伝子検査用標本スライドの一部を、スライドのそれ以外の部分から分離することのできる分離手段を備えた検体前処理装置と、［１］〜［３］のいずれかの遺伝子検査用標本スライドとを含む、検体前処理用システム。
［５］（１）検体切片を用意する工程、
（２）スライド上に前記検体切片を貼付する工程、
（３）スライドの一部を、その領域に貼付された検体切片と一緒に、スライドのそれ以外の部分から分離する工程
を含む、検体の前処理方法。
［６］（１）パラフィン包埋検体切片を用意する工程、
（２）スライド上に前記検体切片を貼付する工程、
（３）スライドの一部を、その領域に貼付された検体切片と一緒に、スライドのそれ以外の部分から分離する工程、
（４）分離したスライド上の検体切片からパラフィンを除去する工程
を含む、検体の前処理方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、未染色スライドからＦＦＰＥ切片を削り取る工程を、次の核酸抽出工程に影響を与えることなく簡略化することができる。また、削り取る際のコンタミネーションのリスクを回避することができる。更に、安価で簡便な手段で選択的にがん部位を分取することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ポリスチレン（ＰＳ）スライド上へのＦＦＰＥ切片固着の状態を示す、図面に代わる写真であり、左側は、７ｍｍ×７ｍｍの格子状の溝を掘ったＰＳスライド（ＦＦＰＥ切片の固着前）の状態を示し、右側は、ＦＦＰＥ切片を固着後のＰＳスライドの状態を示す。
【図２】実施例２で使用した電熱カッターの、図面に代わる写真である。
【図３】ＰＳスライドの下面を冷却しながらＰＳスライドを溝に沿って切断する様子を示す、図面に代わる写真である。
【図４】ＰＳスライドの切断前後の様子を示す、図面に代わる写真である。
【図５】脱パラフィン（デパラ）処理（実施例３における手順（４））前後の様子を示す、図面に代わる写真である。
【図６】７ｍｍ×７ｍｍ２枚分のスライド片から抽出した場合のエリアごとのＤＮＡ抽出量を決定するために、吸光度測定を実施した結果を示す写真およびグラフである。グラフは、左から、エリア（２−ＡＢ）、エリア（３−ＡＢ）、エリア（４−ＡＢ）、エリア（５−ＡＢ）である。
【図７】７ｍｍ×７ｍｍ３枚分のスライド片から抽出した場合のエリアごとのＤＮＡ抽出量を決定するために、吸光度測定を実施した結果を示す写真およびグラフである。グラフは、左から、エリア（２−ＡＢＣ）、エリア（３−ＡＢＣ）、エリア（４−ＡＢＣ）、エリア（５−ＡＢＣ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明においては、組織検体または細胞検体（特には病理組織・細胞検体）、好ましくはホルマリン固定パラフィン包埋した組織検体または細胞検体から薄切した検体切片を本発明のスライド上に貼付し、がん部位等の必要な領域のみを、その領域に対応するスライドの一部領域と共に、適当な手段を用いて、それ以外の部分から分離した後、分離したスライド上の検体切片から、遺伝子検査に供する核酸を抽出する。
【００１２】
本発明で扱うことのできる検体としては、特に限定されるものではないが、病理診断を行うための一般的な検体を広く取り扱うことができ、例えば、組織検体、細胞検体等を挙げることができる。好ましくは、常法によりホルマリン固定パラフィン包埋した組織検体または細胞検体（ＦＦＰＥ組織検体又は細胞検体）である。
【００１３】
本発明では、前記検体から常法（例えば、ミクロトーム）により薄切して得られた検体切片を、本発明のスライドの検体切片貼付面に広げた状態で張り付ける。
本発明のスライドの形状および大きさは、特に限定されるものではないが、これまでと操作感覚が変わらず、また、既存の器具が利用できるように、従来公知の観察標本作製用のスライドグラスに準ずる形状および大きさであることが好ましい。例えば、縦７６ｍｍ程度、横２６ｍｍ程度、厚さ１ｍｍ程度の矩形形状である。
【００１４】
本発明のスライドは、少なくとも一方の面が検体切片を載せるための貼付面であり、スライドの一部を、分離される検体切片と共に、スライドのそれ以外の部分から分離することができる。本発明においては、スライドの一部をスライドのそれ以外の部分から分離する際に、スライド上面とスライド下面とを伴った状態で分離できるように、貼付面、及び／又は、その反対側の面（以下、基底面と称する）にその分離を補助するガイドを設ける。前記ガイドは、スライドの貼付面もしくは基底面のいずれか一方、又は両面に設けることができるが、分離する際に検体切片を傷つけないように基底面に設けることが好ましい。
【００１５】
前記貼付面は、検体切片を載せるため、検体切片を載せる領域（以下、載置領域と称する）は平滑面であることが好ましい。なお、検体切片を載せることを想定しない領域、例えば、スライドの端部は、平滑面である必要はなく、例えば、持ったときに滑りにくいように、粗面とすることもできるし、あるいは、情報を記載するのに適したメモ欄を設けることもできる。
また、貼付面は、パラフィン包埋した検体切片が張り付きやすいように、親水性であることが好ましく、例えば、スライド全体を親水性材料から形成することもできるし、あるいは、任意の材料で形成したスライドの貼付面となる表面に親水処理を行うこともできる。また、貼付面となるスライド表面全体のうち、貼付に好適な箇所以外を疎水性あるいは撥水性とすることによって、望む箇所に貼付し易くすることができる。
【００１６】
本発明のスライドにおける貼付面及び／又は基底面に設けるガイドは、スライドの一部を、スライドのそれ以外の部分から分離することを補助することのできる構造であれば、特に限定されるものではなく、例えば、目印となる線、分離に必要な力を軽減できる溝などを挙げることができる。本発明のスライドは、貼付面に張り付けた検体切片の内、必要な領域（例えば、がん部位）のみを選択的に分離するために、その領域が乗っているスライド領域ごと、分離することを特徴としている。本発明における前記分離方法としては、例えば、打ち抜き具により必要な領域のみを打ち抜く方法、切開手段により必要な領域のみを切り出す方法、切開手段により必要な領域のみを切り離す方法、スライドに力を加えて必要な領域と不要な領域とを折り曲げて切り離す方法などを挙げることができる。
【００１７】
以下、ガイドとして溝を設ける態様を例にとって本発明を説明するが、溝以外の態様（例えば、目印となる線）についても、当業者であれば、適宜応用することが可能である。スライドの基底面に設ける溝のパターンとしては、例えば、所定形状の領域が連続的に配置されるように、溝を設けることができる。例えば、前記領域が六角形形状である場合には、蜂の巣状に六角形が配置されるように、溝を設けることができる。また、前記領域が正方形形状である場合には、碁盤目状に正方形が配置されるように、溝を設けることができる。この他の形状としては、スライドの貼付面から見たときに、載置領域の内部が隙間なく埋められる形状であれば、特に限定されるものではなく、例えば、三角形形状、四角形形状（例えば、正方形、長方形、平行四辺形、台形、菱形等）、又はこれらの組合せを挙げることができる。このような連続的配置の場合、任意の１又は複数の領域を分離（例えば、打ち抜き、切り出し、切り離し、折り曲げ等）できるため、載置領域内の所望の領域を分離できる利点がある。
【００１８】
スライドの基底面に設ける溝の別のパターンとしては、例えば、所定形状の領域が不連続に配置（すなわち、所定形状が海に浮かぶ島のように配置）されるように、溝を設けることができる。この場合の形状としては、連続的配置に関して先に挙げた各形状以外にも、任意の形状を採用することができ、例えば、円形形状（真円もしくは楕円）等を挙げることができる。このような不連続的配置の場合、任意の形状を採用できる利点がある。
【００１９】
スライドの基底面に設ける溝の更に別のパターンとしては、例えば、スライドの短辺又は長辺（好ましくは短辺）に平行な複数本の直線が任意の間隔（好ましくは等間隔）で配置されるように、あるいは、スライドの短辺又は長辺（好ましくは短辺）に平行な直線が一本だけ配置されるように、溝を設けることができる。この場合、スライドに力を加えて折り曲げることにより、必要な領域と不要な領域とを切り離すことができるため、特別な装置を必要としない利点がある。
【００２０】
スライドの基底面に設ける溝の深さ、幅は、スライドの一部を、スライドのそれ以外の部分から分離する際に、それに必要な力を軽減できる深さであれば、特に限定されるものではなく、例えば、スライドの厚さ、材料、分離する際の力や方法等により適宜決定することができる。
【００２１】
溝の深さは、スライドの厚みに対して、例えば、２５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上である。なお、溝が深すぎる場合、スライドの強度が充分でない場合があり、溝の深さはスライドの厚みに対して、９０％以下であることが好ましい。
【００２２】
溝の幅は、スライドへの溝形成が可能であり、また、スライドの取扱いが可能であれば、特に限定しないが、溝の幅が大き過ぎると選択性が落ちるため１ｍｍ以下の幅が好ましい。また、打ち抜き等を実施する際に溝への選択性を考慮し０．１ｍｍ以上であることが好ましい。切り離す際の容易性を考慮すると０．５ｍｍ程度であることが好ましい。
【００２３】
スライドの基底面に設ける溝において、隣接する溝の間隔は、分析目的により設定することができるが、腫瘍組織等の選択性を考慮すると、直方形の場合、例えば、縦１０ｍｍ以下及び横１０ｍｍ以下であり、縦５ｍｍ以下及び横５ｍｍ以下の間隔であることが好ましく、２ｍｍ×２ｍｍ程度の間隔であることがより好ましい。下限は特に限定されるものではないが、例えば、０．５ｍｍ×０．５ｍｍ以上である。当業者であれば、分離が可能であり、且つ、切り離した後の取り扱いの容易さ及び溝の幅を考慮して、適宜設計することができる。
分析に必要な間隔に応じて、隣接する複数の溝から、適宜、分離する大きさを選ぶこともできる。
【００２４】
本発明のスライドの材料は、検体切片をスライドの貼付面に張り付けた状態で検体切片及びスライドの一部を、それ以外の部分から分離することができ、且つ、分離後の核酸抽出に影響を与えない限り、特に限定されるものではないが、例えば、ガラスや樹脂等が挙げられ、樹脂としては、有機樹脂（例えば、ポリアクリル、ポリアミド、ポリブチレンフタレート、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリエチレンフタレート、ポリアセタール、ポリプロピレン、ポリフェニレンオキサイド、ポリフェニレンサルファイド、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、クロロトリフルオロエチレン、フッ化ビニリデン、ペルフルオロアルコキシフッ素樹脂など）等を挙げることができる。例えば、遺伝子解析分野で一般的に使用されている、ガラス、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリアクリル等が特に好ましく、更に、顕微鏡観察等で透明性が要求される場合には、ガラスやポリアクリル等が好ましい。
【００２５】
なお、検体切片をスライドの貼付面に張り付けることができる材料であることが好ましいが、検体切片をスライドの貼付面に張り付けることができない材料であっても、適当な表面処理（例えば、親水処理）により同特性を付与できる材料であれば、用いることができる。例えば、一般的に細胞組織切片をガラススライドに固定する際には、細胞表面のリン脂質の負の荷電を利用し接着させることができる。そのため、ガラススライド表面上は接着性を向上させるためアミノ酸であるポリ−Ｌ−リジンやアミノシランでコートすることができる。また、細胞組織片の伸展作業性を考慮すると表面は親水性であることが作業効率がよい。
【００２６】
本発明のスライドは、所定の分離手段を備えた検体前処理装置と組み合わせて、本発明の検体前処理用システムを構成することができる。
前記検体前処理装置における前記分離手段は、本発明のスライドの一部を、スライドのそれ以外の部分から分離することのできる分離手段である限り、特に限定されるものではない。
前記分離を打ち抜きにより実施する場合、前記分離手段としては、必要な領域のみを打ち抜くことができる打ち抜き具を挙げることができる。
前記分離を切り出し又は切り離しにより実施する場合、前記分離手段としては、必要な領域のみを切り出し又は切り離すことができる切断手段を挙げることができる。
前記分離を折り曲げにより実施する場合、前記分離手段としては、必要な領域と不要な領域とを折り曲げて切り離すことができる折り曲げ手段を挙げることができる。
【００２７】
本発明の前処理方法は、
（１）検体切片（好ましくはパラフィン包埋検体切片）を用意する工程、
（２）スライド上に前記検体切片を貼付する工程、
（３）スライドの一部を、その領域に貼付された検体切片と一緒に、スライドのそれ以外の部分から分離する工程
を含む。
また、本発明の前処理方法は、前記検体がパラフィン包埋検体切片である場合には、前記工程（１）〜（３）に加えて、
（４）分離したスライド上の検体切片からパラフィンを除去する工程
を含むことができる。
【００２８】
本発明方法における前記（１）の検体切片準備工程および前記（２）の検体切片貼付工程では、通常の観察標本作製と同様にして、検体切片を用意し、スライド（好ましくは本発明のスライド）上に検体切片を貼付することができる。例えば、検体切片としてホルマリン固定パラフィン包埋検体切片（ＦＦＰＥ検体切片）を用いる場合、例えば、患者等から採取した組織検体または細胞検体をホルマリン固定した後、脱水・脱脂・パラフィン浸透・パラフィン包埋の各操作を実施し、得られたパラフィン包埋ブロックをミクロトームにより連続的に薄切することにより、検体切片を得ることができる。得られた検体切片を、例えば、スライド上に載せた蒸留水の上に浮かべ、加温して伸展させ、そのまま乾燥することにより、あるいは、温湯に浮かべて伸展させた後、スライドで掬い上げることにより、スライド上に貼付することができる。
【００２９】
本発明方法における前記（３）の分離工程では、適当な分離方法を用いて、スライドの一部を、スライドのそれ以外の部分から分離することにより、その上に載った検体切片も同時に分離することができる。前記分離方法としては、本発明のスライドに関して説明した各種分離方法を用いることができる。分離する領域は、例えば、前記工程（２）で得られた検体切片貼付スライドの内、１枚をＨＥ染色し、必要な領域（例えば、がん部位）をマーキングすることにより、それに対応する領域として特定することができる。
【００３０】
本発明方法における前記（４）のパラフィン除去工程では、前記工程（３）で分離したスライド上の検体切片について脱パラフィン処理を実施する。前記脱パラフィン処理としては、例えば、有機溶剤を用いる方法、ミネラルオイルを用いる方法等を挙げることができる。
【００３１】
有機溶剤を用いる脱パラフィン処理においては、前記有機溶剤として、検体切片を溶解せず、且つ、パラフィンを溶解できる溶媒を使用し、例えば、キシレンを挙げることができる。例えば、キシレンを使用する場合には、検体切片が貼付されたスライドにキシレンを加え、混和後、遠心処理を行い、上清であるキシレンを除去することにより、固形物として検体切片を取得することができる。
より具体的には、サンプルが充分に浸る量（１ｍＬのキシレン）を添加し、１０秒間ボルテックス撹拌する。室温（１５〜２５℃）、１５０００ｒｐｍで２分間遠心処理し、脱パラフィン後の細胞ペレットを作成する。上清のキシレン除去後にエタノール（９６〜１００％）をキシレンと同量（１ｍＬ）添加し１０秒間ボルテックスすることで、残留しているキシレンをサンプルからエタノールで抽出する。室温、１５０００ｒｐｍで２分間遠心処理し、上清のエタノールを除去することでＤＮＡ抽出処理可能な組織片を得ることができる。
【００３２】
ミネラルオイルを用いる脱パラフィン処理にでは、検体切片が貼付されたスライドにサンプルが充分に浸る量のミネラルオイルを加え、混和後、プロテアーゼを含む細胞可溶化水溶液を加え、熱処理（例えば、５６℃で１時間）を行い、二相分離した水相／油相の内、水相を回収することにより、検体切片中の核酸（ＤＮＡ）を回収することができる。
より具体的には、適量（３００μＬ）のミネラルオイルを加え９０℃で２０分インキュベートすることで脱パラフィン可能であり、その後、一般的なＤＮＡ抽出キットで抽出処理することができる（Analytical Biochemistry, 395(2009), 265-267）。
また、同様の原理を用いた商品として、脱パラフィン試薬（Ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；ＱＩＡＧＥＮ）が販売されている。この試薬では、Ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを適量（切片量により分けている：１６０μＬ又は３２０μＬ）加えボルテックス撹拌１０秒後、５６℃で３分間インキュベートし、インキュベート後のサンプルを室温に戻した後、一般的なＤＮＡ抽出キットで抽出することができる。
例えば、一般的な抽出キットの一例であるＱＩＡＧＥＮ社抽出キットに従うと、Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１８０μＬ）を加えボルテックス後、遠心処理し、続いて、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（２０μＬ）を加え５６℃で１時間インキュベート後、９０℃で１時間インキュベート後、遠心処置を行い、下層の水溶液相を回収し、回収した水溶液相を抽出キットで処理することができる。
【００３３】
本発明の前処理方法により得られた検体切片または検体切片に由来する核酸溶液は、常法に従って、遺伝子検査の試料として使用することができる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００３５】
《実施例１：ポリスチレン（ＰＳ）スライドへのＦＦＰＥ切片固着》
ＰＳスライド（縦７６ｍｍ×横２６ｍｍ×厚さ１ｍｍ；ケニス社）の片面に７ｍｍ×７ｍｍで格子状の溝を作成した（図１左）。溝の作成にあたっては、プラスチックカッター（オルファ社）を用いた。溝の深さは今回規定できていないが、目視概算で０．５ｍｍ〜０．７ｍｍ程度となるようにした。【００３６】
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片のスライド上への固着に関しては、一般的なガラススライド上へのＦＦＰＥ切片固着と同じ手順で実施した。まず、パラフィンブロックから１０μｍの厚みで切り出したＦＦＰＥ切片を水浴に浮かべ、ＰＳスライドの平らな面（溝を掘っていない側；貼付面）にすくい取る様に乗せた。その後、風乾させることである程度の水分を飛ばした。
更に、ＰＳスライド上のＦＦＰＥ切片とスライドを強固に接着させるために、溝を掘った側（基底面）を下面として、スライドをヒートブロック上に乗せ６５℃で加温した。加温は、パラフィンが透明になる（溶ける）まで実施し、その後自然冷却させることでスライド上にＦＦＰＥ切片を固着させた（図１右）。【００３７】
《実施例２：ポリスチレン（ＰＳ）スライドの切断》
ＰＳスライドの切断には、樹脂カット用電熱カッター（太洋電気産業社  ＨＥ−１１０）に、メスの替え刃を直接固定化したものを自作し用いた（図２）。なお、ＰＳスライドの切断には、超音波カッターを用いることも可能で、容易にスライドを切断できる。電熱カッターを用いる場合、直接樹脂にあてると樹脂が融けてしまい、溝のラインで切断できないことがある。そのため、本実施例では、スライド下面（溝を彫ってある側）からスライドを冷却することで、樹脂が融けるのを防いだ。低温（−２０℃）で冷却した鉄性のプレートを用いて下方からＰＳスライドを冷却しながら、スライド上面（溝を彫っていない側）から溝に沿って切断した（図３）。溝に沿って切断したスライドを図４に示す。【００３８】
《実施例３：ポリスチレン（ＰＳ）スライドからのＤＮＡ抽出の検討１》
脱パラフィン処理には、脱パラフィン試薬（Ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；ＱＩＡＧＥＮ）を用いた。脱パラフィン後の回収溶液から、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＤＮＡ抽出処理を実施した。処理は、添付文書記載の手順に従い実施した。以降のＤＮＡ抽出の検討は、特に断りが無い限り、以下の手順にて行った。
（１）脱パラフィン試薬３２０μＬを添加
（２）５６℃で３分間加温し、室温に戻す
（３）Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＴＬ；ＱＩＡＧＥＮ）１８０μＬを添加し、ボルテックス撹拌実施後、１０，０００ｒｐｍで1分間遠心処理
（４）プロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ；ＱＩＡＧＥＮ）２０μＬを添加
（５）５６℃で１時間、シェークヒートブロックで加温反応
（６）９０℃で１時間、ヒートブロックで加温
（７）キット付属溶液（Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＬ；ＱＩＡＧＥＮ）２００μＬを添加
（８）エタノール２００μＬを添加
（９）下層の液相部分を回収
（１０）QIAamp MinElute Columnを用いて精製回収実施【００３９】
本実施例では、ＦＦＰＥ切片を溶液中に回収できるか、処理によるＰＳスライド片の変化を確認することを目的とした。図４に示すような、切断後の各ＰＳスライド片（スライド片２、３、４、５）を２ｍＬのマイクロチューブ（エッペンドルフチューブ）に入れ、添付文書記載の手順に従い、ＤＮＡ抽出操作を行った。前記手順（４）の後に、スライド上に固着させたＦＦＰＥ切片がきれいに剥がれていることを確認した（図５）。また、前記手順（５）の９０℃の熱処理を実施するとＰＳスライド片が乳白色化したが、形状は保ったままであった。【００４０】
《実施例４：ポリスチレン（ＰＳ）スライドからのＤＮＡ抽出の検討２》
本実施例では、ＤＮＡ抽出に影響がないか確認することを目的とした。
実施例３と同様に、図６及び図７に示す各ＰＳスライド片（スライド片２、３、４、５）を使用して、脱パラフィン後の回収溶液から、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＤＮＡ抽出処理を実施した。ＤＮＡ抽出は、添付文書記載の手順に従い実施した。
ＤＮＡの溶出は３０μＬの溶出液を用いて行い、溶出後のＤＮＡ濃度は、ナノドロップ超微量分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。７ｍｍ×７ｍｍ２枚分のスライド片からの抽出（図６）と、７ｍｍ×７ｍｍ３枚分のスライド片から抽出（図７）した結果を示す。【００４１】
また、今回抽出されたＤＮＡ量から組織体積あたりのＤＮＡ量を概算した。結果を表１に示す。抽出に使用したスライド全面に組織が固定されてはいないが、今回は外挿を目的とし、組織エリアは、使用したスライドのエリア（７ｍｍ×７ｍｍ）として計算した。すなわち、２面の場合、７ｍｍ×７ｍｍ×２面×１０μｍ（ＦＦＰＥ切片厚み）で、３面の場合、７ｍｍ×７ｍｍ×３面×１０μｍ（ＦＦＰＥ切片厚み）で、それぞれ計算した。算出された結果は、一般社団法人日本病理学会が平成３０年３月１日に発行している「ゲノム診療病理組織検体取り扱い規定」内で記載されている結果（実証データ３  日常診療下で作製されたＦＦＰＥブロックから得られたＤＮＡ収量：手術検体で中央値が約０．５μｇ／ｍｍ３、生検検体で中央値が約２μｇ／ｍｍ３）と比較しても同程度の量で抽出されていた。このことから、本法においても既存の抽出処理と同等以上のＤＮＡが抽出可能であることが確認された。【００４２】
【表１】
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【００４３】
《実施例５：抽出ＤＮＡの評価》
本実施例では、リアルタイムＰＣＲ測定により、抽出後のＤＮＡから目的の遺伝子が増幅出来るかを評価した。増幅対象はＲＨＯＡ遺伝子とし、測定に使用したプライマー、プローブの配列を表２に示す。【００４４】
【表２】
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【００４５】
リアルタイムＰＣＲの反応組成と反応温度を以下に示す。
フォワードプライマー（Ｆ  ｐｒｉｍｅｒ）とリバースプライマー（Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ）は各２００ｎｍｏｌ／Ｌ、プローブは１００ｎｍｏｌ／Ｌ、Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ｔａｑ（Ｐｒｏｂｅ  ｑＰＣＲ）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）を用いて測定した。サンプルには表１で示した各濃度のサンプル５μＬを用いて測定を実施した。リアルタイムＰＣＲ測定はＬＣ４８０（Ｒｏｃｈｅ）を用いて実施した。反応温度は、９５℃で３０秒間保持した後、９５℃で３秒、６２℃で３０秒を１サイクルとし、４５サイクル実施した。樹脂スライド抽出物の比較用に、従来の手法でガラススライドから抽出したＦＦＰＥ切片を用いた。【００４６】
その結果、既存のガラススライドからの抽出に対して、図６で抽出されたＤＮＡは平均で１１５％であった。また、図７で抽出されたＤＮＡは平均で９５％であった。このことから、リアルタイムＰＣＲを実施した場合において、既存のガラススライドから抽出したＤＮＡと本法により抽出したＤＮＡでは影響を認めなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明は、遺伝子検査の分野で利用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変法や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【００４８】
配列表の配列番号１〜３は、それぞれ、Ｆ  ｐｒｉｍｅｒ配列、Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ配列、Ｐｒｏｂｅ配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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