(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
500Da以上の限外濾過膜で分画したフェルラ酸の重合体からなる哺乳動物細胞サイクリックAMP濃度上昇剤。
【請求項２】
500Da以上の限外濾過膜で分画したフェルラ酸の重合体からなるサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤。
【請求項３】
フェルラ酸の重合体が、酵素合成されたものである請求項１記載の哺乳動物細胞サイクリックAMP濃度上昇剤。
【請求項４】
フェルラ酸の重合体が、酵素合成されたものである請求項２記載のサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤。
【請求項５】
酵素がペルオキシダーゼである請求項３記載の哺乳動物細胞サイクリックAMP濃度上昇剤。
【請求項６】
酵素がペルオキシダーゼである請求項４記載のサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤。
【請求項７】
フェルラ酸の重合体が、フェルラ酸とラジカル重合開始剤を用いて化学合成されたものである請求項１記載の哺乳動物細胞サイクリックAMP濃度上昇剤。
【請求項８】
フェルラ酸の重合体が、フェルラ酸とラジカル重合開始剤を用いて化学合成されたものである請求項２記載のサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明者は、フェルラ酸をH2O2の存在下、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素、やラジカル重合開始剤で脱水素重合させてフェルラ酸重合体を得た。  研究の結果、このフェルラ酸重合体が、哺乳動物細胞サイクリックAMP濃度上昇作用あるいはサイクリックAMPホスホジエステラーゼ阻害作用を有することを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【０００２】
【従来の技術】
リグニンは、セルロース、ヘミセルロースとともに、木材の主要成分として、自然界に最も豊富に存在する有機物質の一つである。しかし、パルプ生産時に副生される蒸解溶出液を原料として生産されるリグニンスルホン酸が、主に工業用分散剤として利用されているにすぎない未利用の天然資源である。
また、リグニンは穀類のフスマなどのほか、子嚢菌類、担子菌類からも抽出することが可能であり、豊富な天然有機物質の有効利用は大きな課題であった。また、ブナシメジなどはオガクズなどを主成分とする培地で人工栽培されているが、収穫後の培地の有効利用が課題であった。
一方、松かさ、各種のキノコの菌糸などの抽出液のリグニン画分に抗HIV-1活性のあることが知られている。リグニン様物質については他に末梢血単核細胞によるサイトカインの産生促進、マクロファージの活性化、培養細胞系でのインフルエンザウイルスや単純ヘルペスウイルスのプラーク形成抑制などの生理活性が報告されている。更に、リグニンの構成成分であるp-クマル酸、フェルラ酸、カフェー酸をH2O2の存在下、西洋ワサビペルオキシダーゼで脱水素重合させた高分子の合成リグニンも抗HIV-1活性を有することが確認されている（日本臨床, Vol.51, p.127 (1993)）。しかし、これらは未だ、実用化されておらず、血管内皮細胞に働きサイクリックAMP濃度を上昇させるなどの報告はされていない。
【０００３】
サイクリックAMP（サイクリックアデノシン3', 5'- 一リン酸、環状AMP、cAMP）は多くのホルモンや神経伝達物質の情報を細胞内の標的分子に伝えるセカンドメッセンジャーであり、細胞膜に存在するアデニル酸シクラーゼによって、ATPから合成される。サイクリックAMPは細菌や動物界に広く存在する。高等動物では、各種のホルモンが受容体・Ｇ蛋白質・アデニル酸シクラーゼを活性化し、サイクリックAMPの産生を促進する。動物におけるサイクリックAMPの作用点はサイクリックAMP依存性プロテインキナーゼ（Aキナーゼ）であり、Aキナーゼは細胞内の多くの蛋白質を基質とするため、サイクリックAMPは細胞の多彩な機能を調節する。例えば、Aキナーゼは転写因子CREB（サイクリックAMP応答配列結合蛋白質）をリン酸化し、リン酸化されたCREBがCRE（サイクリックAMP応答配列）に結合し遺伝子の転写活性を制御することが知られている。
このような機能を有するサイクリックAMPはサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼによって5'-AMPに分解される。サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼはアデニル酸シクラーゼとともに、細胞内のサイクリックAMPの量的水準を調節していると考えられている。サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼは脳、肺、肝臓、心臓など種々の組織中に存在し、カルモジュリン（活性化因子）に対する結合性、基質に対する親和性などが異なる数種類の酵素が存在する。
このように、アデニル酸シクラーゼ、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼなどの活性を制御することにより、サイクリックAMPの濃度を調節することにより、様々な生体機能を調節することが可能と考えられる。
例えば、肺の炎症過程では、体液性因子が血管内皮細胞に働き、細胞間の隙間から血液中の蛋白質性の液が間質に入り込みやすくなり、浮腫をもたらす。血管内皮細胞のサイクリックAMP濃度上昇はこのような内皮透過性を抑制することが報告されている（Am. J. Physiol., Vol.275, p.L203 (1998）)。
また、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼを阻害する物質としてはテオフィリンなどプリンアルカロイド系のものが多く報告されているが、リグニン関連物質にそのような活性は報告されていない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、天然に豊富に存在するリグニンを医薬品あるいは特定保健用食品素材として有効利用、高度利用することを目的として、動物細胞を用いて様々な生理活性を評価した結果、フェルラ酸の重合体に動物細胞のサイクリックAMP濃度を上昇させる作用あるいはサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害作用のあることが判明し、本発明に至った。
すなわち本発明は
（ａ）哺乳動物細胞サイクリックAMP濃度上昇作用を有するフェルラ酸の重合体（ｂ）サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害作用を有するフェルラ酸の重合体
をそれぞれ、哺乳動物細胞サイクリックAMP濃度上昇剤及びサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤として用いることに関する。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００５】
【本発明の実施の形態】
本発明に係るフェラル酸重合体は、H2O2の存在下、西洋ワサビペルオキシダーゼでフェルラ酸を脱水素重合させ合成することも可能である。ペルオキシダーゼによる脱水素重合は、例えばChem. Pharm. Bull. Vol.39, p.950 (1991)に記載された方法で行うことが出来る。また、西洋ワサビペルオキシダーゼのほか、ラッカーゼ等の酵素を用いることができる。
また、マンガントリス(アセチルアセトナート）、フェントン試薬、トリクロロ三価バナジウム等のラジカル重合開始剤を用いて、p-クマル酸を脱水素重合させることもできる。
【０００６】
次に、本発明におけるフェルラ酸を酵素合成してフェルラ酸重合体として水溶性リグニン様物質を得る場合について説明する。まず、フェルラ酸をペルオキシダーゼ処理に付し、フェルラ酸を重合させる。重合条件としてはフェルラ酸が重合される条件であれば特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液中にフェルラ酸及びペルオキシダーゼ、過酸化水素を添加し20〜60℃で30分以上反応させることにより行う。好ましくは、20〜40℃で１時間以上反応させることにより行う。ペルオキシダーゼ処理されたフェルラ酸は、定法による脱塩処理、減圧乾燥に付され、フェルラ酸酸重合体が得られる。また、低分子量の重合体は水溶液を1 kDaあるいは500 Daの限外濾過膜を用いて分画することにより得ることが出来る。
【０００７】
本発明のサイクリックAMP濃度上昇作用物質、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤は、そのままで、または通常用いられる個体坦体、液体坦体、乳化分散剤等により錠剤、粉剤、水和剤、乳剤、カプセル剤等の形に製剤化してサイクリックAMP濃度上昇剤、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤として使用することが出来る。上記坦体としては、水、ゼラチン、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ラクトース、植物油等が挙げられる。また、本発明の物質は内皮透過性亢進を抑制する、あるいはサイクリックAMPをセカンドメッセンジャーとするホルモンの代替をする医薬としての利用の他、さまざまな食品中に添加して機能性食品、特定保健用食品などとして用いることが出来る。かかる食品として、清涼飲料、乳酸飲料、スープ、チーズ、ハム、菓子類などが挙げられる。本発明の物質はまた、ペットフード、飼料などに添加してペットや家畜に対してホルモンの代替をして健康を改善する目的で用いることが出来る。
【０００８】
【実施例】
以下、本発明に係る動物細胞サイクリックAMP濃度上昇剤、サイクリックAMPホスホジエステラーゼ阻害剤の実施例を説明する。ただし、本発明は、このような実施例に限定されるものでなく、特許請求の範囲の技術的事項の範囲内でさらにいろいろな実施例があることは言うまでもない。
（フェルラ酸重合体の合成例）
以下のＡ、Ｂ、Ｃの３種類の溶液を調整した。
Ａ液：フェルラ酸1g／50mMリン酸緩衝液（pH8.0）200ml
Ｂ液：西洋ワサビペルオキシダーゼ10mg／50mMリン酸緩衝液（pH8.0）200ml
Ｃ液：0.1%H2O2、50mMリン酸緩衝液（pH8.0）175ml
Ａ、Ｂ両液を混合し、撹拌しつつ25℃に保った。これにＣ液を２時間かけて滴下した。Ｃ液全量の滴下終了後、さらに25℃で１時間撹拌を続けた。これに、pH3になるまで酢酸を加え、氷浴中で１時間冷却した。これを4℃、8,000rpm、20分間遠心分離して沈殿を回収し、希塩酸（pH2）に懸濁し、再度遠心分離した。同様の操作を繰り返した後沈殿を回収し、メタノール80mlに溶解した。溶液を濾過し、濾液を希塩酸（pH2）1,000ml中に滴下し、氷浴中で１時間冷却した。これを4℃、8,000rpmにて20分間遠心分離し、得られた沈殿を水に溶解し、pHを７付近に合わせた。これを分画分子量30kDa、10kDa、1kDa、500Daの限外濾過ろ過膜（アミコン社製）を通過させて＞30kDa、10kDa-30kDa、1kDa-10kDa、500Da-1kDaの４段階に分画し、減圧乾燥した。以上により褐色の粉末各20〜40mgを得た。この粉末はフーリエ変換赤外分光法の結果からリグニン様の構造を有する重合体であることを確認した。
【０００９】
実施例１（サイクリックAMP濃度上昇剤としての有効性の確認）
ブタ肺動脈内皮細胞（継代数１、セルシステムズ社より購入）をCS-C培地（D-MEM培地とハムF12培地を1：1に等比混合した培地に、10％ウシ胎児血清、15mMヘペス、Acidic FGF、ヘパリンを添加した培地、セルシステムズ社より購入）を添加した25cm2フラスコ（コラーゲンでコーティングしたフラスコ）にて5％ CO２存在下、37℃で４日間の培養を行った。古い培養液を捨て、10mlのEDTA溶液による洗浄後、これにトリプシ-EDTA溶液2mlを加え、顕微鏡にて細胞を観察し細胞が丸くなりつつある状態で、トリプシンインヒビター溶液を2ml加えた。細胞を基質より剥がし、直ちにCS-C培地10mlを加え100Gで5分間遠心した。遠心上清を捨て、これにCS-C培地20mlを加え、コラーゲンでコーティングした24穴（１穴2cm2）のプレートに１穴あたり1mlを播種したのち、5％ CO２存在下、37℃で３〜４日間の培養を行った。次にプレートの各穴の培地を捨て、1mlのCS-C培地にて各穴を２回洗浄した。その後、CS-C培地を各穴あたり360μl添加し、40μlの活性測定用試料（対照として同容量の蒸留水）を加え、軽く振とうした後、5％ CO2存在下、37℃で１時間静置した。なお、試料添加時における細胞数は１穴あたり4.0 x 105個であり、実験は全て２連で行った。
反応はアマシャム・ファルマシアバイオテク社より購入したサイクリックAMP EIAシステムのキットに添付されたA1緩衝液（0.05M酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.8、0.02％ウシ血清アルブミン、2.5％ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド）を45μl添加することで終了し、細胞内及び培地中に放出された全サイクリックAMP量を同キットにより測定した。その結果を表１に示す。また、別に行った濃度依存性の実験を表２に示す。
【００１０】
【表１】
0003774759.tif 000002
【００１１】
【表２】
0003774759.tif 000003
【００１２】
実施例２（サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤としての有効性の確認）
サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害作用の測定は下記の方法により行った。
シグマ社より購入したウシ脳由来ホスホジエステラーゼアクチベータ（カルモジュリン）を緩衝液（62.5mMトリス塩酸緩衝液、pH7.5、6.3mM塩化マグネシウム、3.8mM β-メルカプトエタノール、0.038mM塩化カルシウム）に溶解し、14.3ユニット/mlのアクチベータ溶液とした。また、シグマ社より購入したウシ脳由来ホスホジエステラーゼを上記緩衝液に0.1ユニット/mlの濃度に溶解し、酵素溶液とした。1mMのサイクリックAMP水溶液を基質溶液とした。
0.5ml容量のプラスチックチューブに、アクチベータ溶液140μl、酵素溶液20μl、測定試料溶液20μlを入れ、30℃で5分間保温した後、基質溶液20μlを加えよく混合して、30℃で40分間反応を行った。その後、10％トリフルオロ酢酸20μlを添加することにより反応を停止させた。反応停止後、生成したAMPを下記条件下で高速液体クロマトグラフィーにより定量した。
高速液体クロマトグラフィー測定条件
カラム：μBondasphere 5μC18 300Å（ウォーターズ社3.9 x 150 mm）
溶出液：0.1％トリフルオロ酢酸を含む0〜63％のアセトニトリルの直線濃度勾配（20分）
流速：１ml/min
検出：260nmの紫外部吸収
このような実験を複数回行い、阻害率を次の式より算出した。
阻害率＝ (A - B) / A  X  100   (％)
［式中、Ａ：阻害剤を含まない場合のAMPのピーク面積、Ｂ：阻害剤添加の場合のAMPのピーク面積］
また、上記阻害率が50％になるペプチド濃度をIC50値で表した。
このようにして得られたIC50値を表３に示す。
【００１３】
【表３】
0003774759.tif 000004
【００１４】
【発明の効果】
本発明のサイクリックAMP濃度上昇剤は下記の効果を奏する。
（１）哺乳動物細胞に働いてサイクリックAMP濃度上昇作用を有する。
（２）サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害作用を有する。
（３）人のほか、犬、猫などのペット、牛、豚、馬などの産業動物におけるサイクリックAMPをセカンドメッセンジャーとするホルモンの代替をする、また、肺血管内皮の炎症による内皮透過性亢進を抑制するなど、健康を改善する目的で用いることが出来る。
（４）本発明のサイクリックAMP濃度上昇剤は、フェルラ酸を酵素的ないしフェルラ酸とラジカル重合開始剤を用いて化学的に重合させて合成できる。