(57)【要約】【課題】  本発明は、がん治療耐性を有するメラノーマを判別することにより、効果的なメラノーマの治療を実現することを目的とする。【解決手段】  本発明は、IL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量を指標とした、メラノーマのがん治療耐性を判定する方法、メラノーマ患者のがん治療耐性低減剤による処置への適応性を判定する方法、メラノーマ患者の化学療法、放射線療法又は免疫療法への適応性を判定する方法、メラノーマのがん治療耐性を判定するためのキット、及びメラノーマ患者のがん治療耐性低減剤による処置への適応性を判定するためのキットに関する。【選択図】図１
2019156111.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量を測定する工程、及び
前記発現量が、がん治療耐性を持たないメラノーマにおけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量よりも高い場合、前記検体に含まれるメラノーマはがん治療耐性であると判定する工程
を含む、メラノーマのがん治療耐性を判定する方法。
【請求項２】
がん治療耐性が化学療法、放射線療法又は免疫療法に対する耐性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
メラノーマ患者から採取されたメラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量を測定する工程、及び
前記発現量が、がん治療耐性を持たないメラノーマにおけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量よりも高い場合、前記患者にはがん治療耐性低減剤が適応可能であると判定する工程
を含む、メラノーマ患者のがん治療耐性低減剤による処置への適応性を判定する方法であって、
前記がん治療耐性低減剤は、IL-34の発現を抑制する、IL-34の活性を阻害する及び／又はCSF-1RとIL-34との結合を阻害する物質を有効成分として含有する、前記方法。
【請求項４】
がん治療耐性が化学療法、放射線療法又は免疫療法に対する耐性である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
メラノーマ患者から採取されたメラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量を測定する工程、及び
前記発現量が、がん治療耐性を持たないメラノーマにおけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量と同等又はそれより低い場合、前記患者には、化学療法、放射線療法又は免疫療法が適応可能であると判定する工程
を含む、メラノーマ患者の化学療法、放射線療法又は免疫療法への適応性を判定する方法。
【請求項６】
IL-34をコードするmRNAの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ又はIL-34タンパク質に対する特異抗体を含む、メラノーマのがん治療耐性を判定するためのキット。
【請求項７】
IL-34をコードするmRNAの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ又はIL-34タンパク質に対する特異抗体を含む、メラノーマ患者のがん治療耐性低減剤による処置の適応性を判定するためのキットであって、前記がん治療低減剤がIL-34の発現を抑制する、IL-34の活性を阻害する及び／又はCSF-1RとIL-34との結合を阻害する物質を有効成分として含有する、前記キット。
【請求項８】
IL-34をコードするmRNAの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ又はIL-34タンパク質に対する特異抗体を含む、メラノーマ患者の化学療法、放射線療法又は免疫療法への適応性を判定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン-34（IL-34）タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量を指標とした、メラノーマのがん治療耐性を判定する方法、メラノーマ患者のがん治療耐性低減剤による処置への適応性を判定する方法、メラノーマ患者の化学療法、放射線療法又は免疫療法への適応性を判定する方法、メラノーマのがん治療耐性を判定するためのキット、及びメラノーマ患者のがん治療耐性低減剤による処置への適応性を判定するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
メラノーマ（melanoma、悪性黒色腫）は高悪性度の皮膚がんの一種で、メラニン色素を産生する皮膚細胞であるメラノサイト又は母斑細胞が悪性化した腫瘍と考えられている。悪性黒色腫の罹患率は、男女とも60歳代から高齢になるにつれて高くなる傾向にある。【０００３】
早期に発見されたメラノーマの治療は、原発部位の広範切除術、センチネルリンパ節生検術、所属リンパ節郭清術等の外科的処置によって行われるが、発見・診断が遅れ、外科的処置では対応することができない、特に転移が観察されるステージIII又はIVにまで進行したメラノーマの治療は一般に困難である。ステージIVの転移性メラノーマの5年生存率は、約11％に留まっている。【０００４】
メラノーマは化学療法、放射線療又は免疫療法等のがん治療に対してしばしば耐性（以下、がん治療耐性と表す）を獲得することが知られている。化学療法及び放射線療法は、その性質上、がん組織と正常組織とを厳格に区別して治療を行うことが元々困難な方法であり、例えば化学療法では薬効と毒性との差が小さいため副作用が発生し易く、また放射線療法はがん周辺の正常組織にも放射線を照射せざるを得ないという問題を抱えているため、化学療法及び放射線療法に対するがん治療耐性は深刻な問題となる。【０００５】
メラノーマの治療法として、重粒子線や陽子線といった特殊な放射線を用いた治療が有効であるとされているが、これら特殊な放射線治療は、特殊且つ大規模な設備の設置が必要とされる他、高度先進医療としての高額な経済的負担、放射線障害による後遺症等の問題を有する。【０００６】
近年は、化学療法及び放射線療法に加えて、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4（CTLA4）及びprogrammed death 1（PD-1）等の免疫チェックポイント分子を標的とした免疫療法によるメラノーマ治療が行われている。しかしながら、かかる免疫療法においても治療耐性の出現が報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ribas, A. et. al., JAMA, 2016, 315(15): 1600-1609.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、がん治療耐性を有するメラノーマを判別することにより、効果的なメラノーマの治療を実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、がん治療耐性を有するメラノーマにおいては、がん治療耐性を有さないメラノーマと比べてIL-34 発現量が亢進していることを見出し、以下の発明を完成させた。【００１０】
（１）メラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量を測定する工程、及び
前記発現量が、がん治療耐性を持たないメラノーマにおけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量よりも高い場合、前記検体に含まれるメラノーマはがん治療耐性であると判定する工程
を含む、メラノーマのがん治療耐性を判定する方法。
（２）がん治療耐性が化学療法、放射線療法又は免疫療法に対する耐性である、（１）に記載の方法。
（３）メラノーマ患者から採取されたメラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量を測定する工程、及び
前記発現量が、がん治療耐性を持たないメラノーマにおけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量よりも高い場合、前記患者にはがん治療耐性低減剤が適応可能であると判定する工程
を含む、メラノーマ患者のがん治療耐性低減剤による処置への適応性を判定する方法であって、
前記がん治療耐性低減剤は、IL-34の発現を抑制する、IL-34の活性を阻害する及び／又はCSF-1RとIL-34との結合を阻害する物質を有効成分として含有する、前記方法。
（４）がん治療耐性が化学療法、放射線療法又は免疫療法に対する耐性である、（３）に記載の方法。
（５）メラノーマ患者から採取されたメラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量を測定する工程、及び
前記発現量が、がん治療耐性を持たないメラノーマにおけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量と同等又はそれより低い場合、前記患者には、化学療法、放射線療法又は免疫療法が適応可能であると判定する工程
を含む、メラノーマ患者の化学療法、放射線療法又は免疫療法への適応性を判定する方法。
（６）IL-34をコードするmRNAの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ又はIL-34タンパク質に対する特異抗体を含む、メラノーマのがん治療耐性を判定するためのキット。
（７）IL-34をコードするmRNAの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ又はIL-34タンパク質に対する特異抗体を含む、メラノーマ患者のがん治療耐性低減剤による処置の適応性を判定するためのキットであって、前記がん治療低減剤がIL-34の発現を抑制する、IL-34の活性を阻害する及び／又はCSF-1RとIL-34との結合を阻害する物質を有効成分として含有する、前記キット。
（８）IL-34をコードするmRNAの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ又はIL-34タンパク質に対する特異抗体を含む、メラノーマ患者の化学療法、放射線療法又は免疫療法への適応性を判定するためのキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、IL-34の発現量を指標としてメラノーマのがん治療耐性を判定することが可能になる。これにより、がん治療耐性を有するメラノーマに対しては、通常のがん治療を行う前に又はこれと組み合わせてがん治療耐性低減剤による処置を行うことで、効果的ながん治療を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ニボルマブ抵抗性転移性メラノーマ患者における疾患及び治療の経過を示す図である。
【図２】IL-34又はメラノーマ抗原に対する免疫組織化学染色を行った原発性又はニボルマブ抵抗性転移性メラノーマの顕微鏡観察像である。
【図３】IL-34（図３Ａ）又はメラノーマ抗原（図３Ｂ）に対する免疫組織化学染色を行った原発性又はニボルマブ抵抗性転移性メラノーマの顕微鏡観察像（上段：原発性メラノーマ、下段：ニボルマブ抵抗性転移性メラノーマ）及び平均蛍光強度を示すグラフである。
【図４】CD163に対する免疫組織化学染色を行った原発性又はニボルマブ抵抗性転移性メラノーマの顕微鏡観察像及び平均蛍光強度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の第１の態様は、メラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量を測定する工程、及び前記発現量ががん治療耐性を持たないメラノーマにおけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量よりも高い場合、前記検体に含まれるメラノーマはがん治療耐性であると判定する工程を含む、メラノーマのがん治療耐性を判定する方法に関する。
【００１４】
本発明において用いられるメラノーマを含む検体は、医学的にメラノーマであると診断された患者の原発性若しくは転移性のメラノーマから採取されたもの、又は株化されたメラノーマ細胞を含むものであり得る。検体は、タンパク質若しくはmRNAの検出を目的とした一般的な処置を施されたものであってもよく、又はホルマリン固定などの一般的な保存的処置を施されたものであってもよい。
【００１５】
検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量は、塩基配列又はアミノ酸配列が公知である遺伝子又はタンパク質の発現を確認することが可能な、当業者に公知の各種方法を採用して行うことができる。ヒトのIL-34の遺伝子及びタンパク質に翻訳されるmRNAの塩基配列はNCBI GeneにGene ID:146433として、タンパク質のアミノ酸配列はUniProtKB/Swiss-Protにアクセッション番号Q6ZMJ4.1として登録されている。
【００１６】
IL-34タンパク質の発現量の測定は、これに特異的な抗体を用いて、直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法等のELISA法、RIA法、インサイツハイブリダイゼーション、イムノブロット解析、ウエスタンブロット解析、及び組織アレイ解析等の周知の方法によって行うことができる。
【００１７】
IL-34タンパク質に特異的な抗体は、IL-34タンパク質に結合するが、他のタンパク質にほとんど又は全く結合しない抗体であり、IL-34タンパク質に対する高い結合親和性を有する抗体と表すこともできる。IL-34タンパク質に対する高い結合親和性を有する抗体は、例えば10-7 M以下、好ましくは10-8 M以下、より好ましくは10-9 M以下の解離定数KDを持つ抗体である。
【００１８】
IL-34タンパク質に特異的な抗体は由来する動物種により制限されず、またポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体のいずれでもよく、免疫グロブリン全長からなる抗体又はFab断片、F(ab’)2断片、diabody、Fv、ScFv、Sc(Fv)2などの抗体の部分断片などでもよい。
【００１９】
IL-34タンパク質に特異的な抗体は、好ましくは遺伝子組換え手法で作製された組換えヒトIL-34タンパク質又はその断片等を抗原として、ウサギ、マウス、ラット等の適当な実験動物への免疫によるポリクローナル抗体作製方法、免疫動物由来のB細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマを利用する又は抗体ファージライブラリーを利用するモノクローナル抗体作製方法を含む一般的な抗体作製方法によって調製することができる。
【００２０】
また、WO2016/204216及びその対応米国出願公開US2018/0193453A1に記載されている抗IL-34抗体、R&D systemsから市販されている抗IL-34抗体であるMAB5265、ミリポアから市販されているMABT493、その他の既存の抗IL-34抗体も利用することができる。
【００２１】
IL-34タンパク質に対する特異抗体は、蛍光物質（例えば、FITC、ローダミン、ファロイジン等）、金等のコロイド粒子、Luminex（登録商標、ルミネックス社）等の蛍光マイクロビーズ、重金属（例えば、金、白金等）、色素タンパク質（例えば、フィコエリトリン、フィコシアニン等）、放射性同位体（例えば、3H、14C、32P、35S、125I、131I等）、酵素等（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、ビオチン、ストレプトアビジンその他の標識化合物によって標識されていてもよい。
【００２２】
IL-34をコードするmRNAの発現量の測定は、その塩基配列を基に設計される適当な塩基配列からなるプライマー核酸を用いたPCR法、IL-34 mRNAの塩基配列又はこれに相補的なDNA若しくはRNA（cDNA若しくはcRNA）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるプローブ核酸を用いたハイブリダイゼーション法、IL-34 mRNAの塩基配列にハイブリダイズし得る塩基配列からなるプローブ核酸が固定化されたチップを用いたマイクロアレイ法、RNAシーケンシング法その他の、IL-34 mRNAの発現を検出することができる公知の方法により行うことができる。
【００２３】
PCR法は、定量RT-PCR法、典型的にはリアルタイムRT-PCR法が好ましい。定量RT-PCR法においては、IL-34 mRNAから逆転写反応によってcDNAを合成し、これを特異的に増幅するプライマーセットを用いて、IL-34 mRNAの発現量が測定される。プライマーセットは、IL-34 mRNAから逆転写されたcDNAとアニールし、当該cDNA又はその一部を特異的に増幅することができるものであれば、cDNAとのアニーリング部位や増幅領域の長さといった条件に制限はなく、当業者はこれらの条件を適宜選択することができる。ここで特異的に増幅するとは、IL-34 mRNAから逆転写されたcDNAを増幅することができるが、他のcDNAをほとんど又は全く増幅しないことを意味する。プライマーセットのうちの少なくとも１つのプライマーの配列は、IL-34 mRNAから逆転写されたcDNAに選択的にアニールするように設計することが好ましい。また、プライマーの長さに特に制限はないが、典型的には15〜30塩基である。
【００２４】
TaqMan（登録商標）アッセイを利用したリアルタイムRT-PCR法においては、プライマーセットに加えて、増幅領域に特異的にハイブリダイズし得る標識プローブが用いられる。TaqMan（登録商標）アッセイではプローブの特異的ハイブリダイゼーションに基づいて増幅産物を検出することから、この方法で用いられるプライマーセットは、SP3 mRNAから逆転写されたcDNAを他の鋳型DNAよりも優先的に増幅することができればよく、必ずしも特異的に増幅することは必要とされない。
【００２５】
ハイブリダイゼーション法及びマイクロアレイ法においては、IL-34 mRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAに特異的にハイブリダイズし得るプローブを用いて、IL-34 mRNAの発現量が測定される。プローブは、IL-34 mRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAに特異的にハイブリダイズすることができるものであれば、ハイブリダイズする位置やハイブリダイズする領域の長さといった条件に制限はなく、当業者はこれらの条件を適宜選択することができる。またプローブは、IL-34 mRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAに特異的にハイブリダイズすることができる限り、その塩基配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。
【００２６】
特異的にハイブリダイズするとは、IL-34 mRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAにハイブリダイズすることができるが、他のcDNA若しくはcRNAにほとんど又は全くハイブリダイズしないことを意味する。プローブの配列は、IL-34 mRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAにもっぱら存在し、他のRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAにはあまり存在しない塩基配列に基づいて設計することが好ましい。また、プローブの長さに特に制限はなく、例えば10〜500塩基であることができる。
【００２７】
プローブは、IL-34 mRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸であってもよい。当業者は、ストリンジェンシーに影響を及ぼす温度、プローブ濃度、プローブの長さ、反応時間、イオン強度、塩濃度といった種々の要素を考慮して、ストリンジェントな条件を適宜設定し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るプローブを設計することができる。ストリンジェントな条件は、例えば5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。
【００２８】
プライマーセット及びプローブは、採用される測定方法の原理及びIL-34遺伝子の塩基配列に基づいて、当業者が適宜設計し、一般的な核酸合成方法又は遺伝子工学的方法によって調製することができる。またプライマー核酸又はプローブ核酸は、用いられる方法に応じて、蛍光物質（例えば、Cy3、Cy5、FITC、Alexa Flour等）、放射性同位体（例えば、3H、14C、32P、35S、125I、131I等）、酵素、ビオチン、ストレプトアビジンその他の標識化合物によって標識されていてもよい。
【００２９】
検体中のメラノーマのがん治療耐性の判定は、当該検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量を、がん治療耐性を持たないメラノーマ（以下、対照メラノーマという）におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量と比較することにより行われる。具体的には、メラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量が対照メラノーマにおける発現量よりも高い場合、前記検体に含まれるメラノーマはがん治療耐性であると判定される。本発明において、がん治療耐性とは、がんの治療的処置に対する耐性、特に化学療法、放射線療法及び免疫療法よりなる群から選択される少なくとも１種のがん治療に対する耐性を意味する。
【００３０】
がん治療耐性を持たない対照メラノーマとしては、がん治療耐性を持たないことが実験的に確認されたメラノーマ細胞株、又はがん治療耐性を持たないことが医学的に確認されたメラノーマ患者から採取されたメラノーマを挙げることができる。対照メラノーマは、化学療法、放射線療法又は免疫療法のいずれかに対する耐性を持たないものであればよいが、これらのがん治療のいずれに対しても耐性を持たないメラノーマであることが望ましい。対照メラノーマにおけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量は、検体における発現量の測定と同様にして測定することができる。判定に用いられる対照メラノーマにおける発現量のデータは、前記メラノーマを含む検体における発現量と同時に測定されたものであっても、又は前記メラノーマを含む検体とは別に予め測定されたものであってもよい。
【００３１】
メラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量が対照メラノーマにおける発現量よりも高いこと、すなわちメラノーマ患者から採取された検体中のメラノーマががん治療耐性であることは、当該患者のメラノーマは治療困難であり再発リスクが高いことを示唆する。
【００３２】
また、メラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量が対照メラノーマにおける発現量よりも高いことは、本発明者らの発明にかかる国際特許出願WO2016/204216及びその対応米国出願公開US2018/0193453A1に記載されるようなIL-34の発現や活性を抑制するがん治療耐性低減剤による処置が適応可能であることをも意味する。
【００３３】
したがって、本発明は、メラノーマ患者から採取されたメラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量を測定する工程、及び前記発現量が、がん治療耐性を持たないメラノーマにおけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量よりも高い場合、前記患者にはがん治療耐性低減剤が適応可能であると判定する工程を含む、メラノーマ患者のがん治療耐性低減剤による処置への適応性を判定する方法であって、前記がん治療耐性低減剤は、IL-34の発現を抑制する、IL-34の活性を阻害する及び／又はCSF-1RとIL-34との結合を阻害する物質を有効成分として含有する、前記方法を別の態様として提供する。本発明はさらに、上記のがん治療耐性低減剤による処置への適応性判定方法によってがん治療耐性低減剤が適応可能であると判定されたメラノーマ患者に有効量のがん治療耐性低減剤を投与する工程を含む、メラノーマの治療耐性を低減させる方法を別の態様として提供する。
【００３４】
本発明におけるがん治療耐性低減剤は、がんの治療耐性に関与する分子であるIL-34の発現を抑制する、IL-34の活性を阻害する及び／又はCSF-1RとIL-34との結合を阻害する物質を有効成分として含有する。IL-34の発現を抑制する、IL-34の活性を阻害する及び／又はCSF-1RとIL-34との結合を阻害する物質は、IL-34をコードする遺伝子からのRNA転写若しくはタンパク質翻訳を阻害することができる、IL-34がCSF-1Rとの結合を介して発揮する生理活性を阻害することができる、及び／又はCSF-1Rに作用してIL-34との結合を阻害することができる若しくはIL-34に作用してCSF-1Rとの結合を阻害することができる物質であればよい。かかる物質は、核酸、抗体、ペプチド及び化合物よりなる群から選択することができる。
【００３５】
IL-34の発現を阻害する物質の例としては、IL-34をコードしている遺伝子の公知の塩基配列を基にして当業者が設計、作製することができる、アンチセンスRNA又はsiRNA等の阻害性核酸を典型例として挙げることができる。
【００３６】
IL-34がCSF-1Rとの結合を介して発揮する生理活性を阻害することのできる物質の例としては、CSF-1Rとの結合部位以外の部位においてIL-34に特異的に結合し、IL-34がCSF-1Rと結合してもその生理活性を発揮させないように働く抗体等を挙げることができる。
【００３７】
また、IL-34とヒトCSF-1Rとの結合を特異的に阻害する物質としては、CSF-1R又はIL-34に、特にIL-34に特異的に結合することで、IL-34とヒトCSF-1Rとの結合を阻害する物質が好ましい。そのような物質の例は、CSF-1R上のIL-34結合部位をブロックすることでIL-34とCSF-1Rとの結合を阻害する抗CSF-1R抗体、前記結合部位とは異なる部位でCSF-1Rに結合するが立体障害的にIL-34とCSF-1Rとの結合を阻害する抗CSF-1R抗体、IL-34上のCSF-1R結合部位をブロックすることでIL-34とCSF-1Rとの結合を阻害する抗IL-34抗体、又は前記結合部位とは異なる部位でIL-34に結合するが立体障害的にIL-34とCSF-1Rとの結合を阻害する抗IL-34抗体等を挙げることができる。CSF-1RはIL-34の他にM-CSFとも結合することから、本発明においてはM-CSFとCSF-1Rとの結合に影響を与えないという点で、IL-34に結合する抗体の利用が好ましい。
【００３８】
IL-34とヒトCSF-1Rとの結合を特異的に阻害する物質としてのIL-34タンパク質に特異的な抗体は、IL-34タンパク質に結合するが、他のタンパク質にほとんど又は全く結合しない抗体であり、IL-34タンパク質に対する高い結合親和性を有する抗体と表すこともできる。IL-34タンパク質に対する高い結合親和性を有する抗体は、例えば10-7 M以下、好ましくは10-8 M以下、より好ましくは10-9 M以下の解離定数KDを持つ抗体である。
【００３９】
本発明において利用される前記抗体、特にIL-34タンパク質に特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体であり得て、また当該抗体のFab、Fab’、F(ab’)2、scFv、ダイアボディ（diabody）、dsFv、Fv、ScFv、Sc(Fv)2、CDRを含むペプチド等の抗体誘導体も本発明において利用することができる。
【００４０】
抗体は、好ましくは遺伝子組換え手法で作製された組換えヒトIL-34を抗原としてウサギ、マウス、ラット等の適当な実験動物を免疫することを含むポリクローナル抗体作製方法、免疫動物由来のB細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマを利用する又は抗体ファージライブラリーを利用するモノクローナル抗体作製方法を含む一般的な抗体作製方法によって調製することができる。あるいは、WO2016/204216及びその対応米国出願公開US2018/0193453A1に記載されている抗IL-34抗体、R&D systemsから市販されている抗IL-34抗体であるMAB5265、ミリポアから市販されているMABT493、その他の既存の抗IL-34抗体を使用してもよい。
【００４１】
上記抗体を有効成分とするがん治療耐性低減剤は、抗体を含有する医薬製剤に用いられる一般的な担体を用いて凍結乾燥製剤又は水溶液の形態に調製されて使用されることが好ましい。担体の例としては、緩衝剤、抗酸化剤、保存剤、タンパク質、親水性ポリマー、アミノ酸、キレート化剤及び非イオン性界面活性剤等を挙げることができるが、これらには限定されない。
【００４２】
がん治療耐性低減剤は、IL-34の発現を抑制する、IL-34の活性を阻害する及び／又はCSF-1RとIL-34との結合を阻害することのできる、前記阻害性核酸又は抗体以外の物質を含んでもよい。そのような物質は、IL-34を発現している適当な細胞を用いた発現抑制能のスクリーニング、又はCSF-1Rを発現している適当な細胞とIL-34とを用いたIL-34の活性阻害能若しくは結合阻害能のスクリーニングを通じて探索することができる。
【００４３】
本発明におけるがん治療耐性低減剤は、WO2016/204216及びその対応米国出願公開US2018/0193453A1中にもその詳細が開示されている。当該文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４４】
がん治療耐性低減剤は、先に例示されるもの以外の薬学的に許容される賦形剤、安定化剤、担体等の成分と医薬組成物を形成し又は製剤化して使用することができる。薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十七改正日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。
【００４５】
本発明におけるがん治療耐性低減剤又はこれを含む医薬組成物は、筋内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与等、非経口的に投与されることが好ましく、そのような投与経路に適した製剤、例えば注射剤又は点滴剤等であることが好ましい。
【００４６】
がん治療耐性低減剤又はこれを含む医薬組成物は、治療耐性がんを有する患者に投与することで当該がんの治療耐性を低減させ、化学療法、放射線療法及び／又は免疫療法によるがん治療の有効性を高めることができるものと期待されることから、これらのがん治療と組み合わせて用いられることが好ましい。したがって、本発明は、前述のがん治療耐性低減剤による処置への適応性判定方法によってがん治療耐性低減剤が適応可能であると判定された患者に有効量のがん治療耐性低減剤を投与する工程、並びに前記がん治療耐性低減剤の投与と一緒に又は別々に、同時に又は逐次的に、がんの化学療法、放射線療法及び／又は免疫療法を前記患者に施す工程を含む、治療耐性がんの治療方法をさらなる別の態様として提供する。
【００４７】
また、第一の態様の判定方法と対照的に、メラノーマ患者から採取されたメラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量が対照メラノーマにおける発現量と同等又はそれより低いことは、当該患者が有するメラノーマはがん治療に耐性ではなく、当該患者にはがんの一般的治療的処置である化学療法、放射線療法又は免疫療法が適応可能であることを意味する。したがって、本発明は、メラノーマ患者から採取されたメラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量を測定する工程、及び前記発現量が、対照メラノーマにおけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量と同等又はそれより低い場合、前記患者には、化学療法、放射線療法又は免疫療法が適応可能であると判定する工程を含む、メラノーマ患者の化学療法、放射線療法又は免疫療法への適応性を判定する方法をさらなる別の態様として提供する。
【００４８】
本発明が提供する各判定方法は、各判定を行うためのデータの収集方法、各判定を補助する方法と表すこともできる。
【００４９】
本発明の別の態様は、IL-34をコードするmRNAの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ又はIL-34タンパク質に対する特異抗体を含む、メラノーマのがん治療耐性を判定するためのキットに関する。
【００５０】
本発明のまた別の態様は、IL-34をコードするmRNAの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ又はIL-34タンパク質に対する特異抗体を含む、メラノーマ患者のがん治療耐性低減剤による処置の適応性を判定するためのキットであって、前記がん治療低減剤がIL-34の発現を抑制する、IL-34の活性を阻害する及び／又はCSF-1RとIL-34との結合を阻害する物質を有効成分として含有する、前記キットに関する。
【００５１】
本発明のさらなる別の態様は、IL-34をコードするmRNAの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ又はIL-34タンパク質に対する特異抗体を含む、メラノーマ患者の化学療法、放射線療法又は免疫療法への適応性を判定するためのキットに関する。
【００５２】
上記キットに含まれるプライマーセット、プローブ、特異抗体及びこれらの使用方法並びにがん治療低減剤の説明は、上で述べたとおりである。また上記キットは、プライマーセット、プローブ又は特異抗体に加えて、それぞれの測定又は検出方法に応じて、例えばdNTP、酵素、標識用又は検出用試薬、コントロール用試薬（例えば、ポジティブ又はネガティブコントロール用のオリゴヌクレオチド又は抗原）、緩衝液、pH調整剤、安定剤、固相支持体、反応容器、取扱説明書等をさらに含んでもよい。
【００５３】
プライマーセット又はプローブを含む上記キットは、GAPDHやアクチンといったハウスキーピング遺伝子を検出する内部コントロール用のプライマーセット又はプローブをさらに含んでもよい。また、特異抗体を含む上記キットは、IL-34タンパク質に結合した特異抗体を検出するために蛍光物質、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Horse Radish Peroxidase）等の標識物質をコンジュゲートした2次抗体や、前記特異抗体と異なる部位でIL-34タンパク質と結合する抗体をさらに含んでもよい。
【００５４】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
北海道大学の自主臨床研究に関する承認及びヒトを対象とする医学系研究に関する倫理指針の下、患者の同意を得て、以下の研究が行われた。
（１）試験方法
臨床検体
左足底に5mm厚の色素性病変を有する74歳の日本人女性が、2008年2月に皮膚科（北海道大学病院、札幌）に入院し、外科手術を受けた。術後に細胞診によりステージIII Bのメラノーマとの診断が確認され、メラノーマTNM分類に従ってpT4bN2aM0と分類された。患者は次いでインターフェロンβ（DAV-Feron）で治療を受けたが、初回投与後に患者の希望により治療を中止した。2014年に患者はin-transit転移を再度呈し、2014年から2015年の間にダカルバジン治療を受けた（8回投与）。8回目のダカルバジン投与の後、遠隔リンパ節で転移性メラノーマが確認された。患者は次いで2015年から2016年の間にニボルマブ（2mg/kg/3週間）での治療を受けた。2016年12月に遠隔リンパ節へのメラノーマ転移の増大を示し、転移部位でサンプリングが行われた。図１に疾患及び治療の経過を示す。【００５６】
免疫組織化学（IHC）
Opal 4色蛍光IHCキット（Perkin-Elmer NEL810001KT）を製造業者の指示に従って使用して、原発部位及び転移部位から採取したメラノーマ組織のホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）切片の多重免疫蛍光染色を行った。詳細には、原発性又は転移性メラノーマ組織由来パラフィン包埋臨床検体の4μm厚薄片をキシレン中で脱パラフィンし、エタノール中で再水和した。抗原回収は、Immunosavers（Nissin、Tokyo、Japan）を用いて98℃で45分間行った。内在性ペルオキシダーゼ活性を低下させるため、切片を0.3％H2O2を用いて室温で10分間処理した。4% Block Ace (DS Pharma Biomedical, Tokyo, Japan)によりブロッキングした後、切片を以下の一次抗体と共に、4℃で一晩インキュベートした。
抗ヒトIL-34抗体（1：200希釈、クローン1D12、ミリポア、MABT493）
抗ヒトメラノーマ抗体（1:50希釈、Abcam社ab732）
抗ヒトCD163抗体（1：200希釈、BIO-RAD MCA1853T）又は
抗ヒトCD8抗体（1：100希釈、BioLegend 372902）【００５７】
次に、切片をPBS-T（0.1M PBS、0.3％Triton）で3回洗浄した。10％ヤギ正常血清でブロッキングした後、切片をHRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体（1:100希釈、BioLegend 4053061）と共に室温で30分間インキュベートした。PBS-T（0.1M PBS、0.3％Triton）で3回洗浄した後、切片をフルオロフォア増幅試薬で10分間浸漬した。最後に、切片をDAPIで5分間対比染色し、VECTASHIELDマウンティング培地にマウントした。各切片について600倍の倍率で2人の独立した研究者によって腫瘍領域を客観的に判定し、切片毎に20超の無作為に選択した腫瘍領域について、FV1000 OLYMPUSソフトウェアを用いてIL-34、メラノーマ抗原、CD163又はCD8免疫反応性の定量値を測定した。【００５８】
統計解析
独立した２群間の差の有意性は、スチューデントのt検定により決定した。p値<0.05を統計的に有意とした。【００５９】
（２）結果と考察
原発性又はニボルマブ抵抗性転移性メラノーマにおけるIL-34又はメラノーマ抗原の免疫組織化学染色の代表例を図２に、無作為に選択した腫瘍領域におけるIL-34、メラノーマ抗原及びCD163の定量値をそれぞれ図３Ａ、図３Ｂ及び図４に示す。原発性メラノーマと比較して、転移性メラノーマにおいてIL-34の発現は有意に増加していた。また、転移性メラノーマにおけるIL-34の高発現は、腫瘍微小環境において免疫抑制及び腫瘍形成促進機能の増強を示すCD163陽性マクロファージ（M2マクロファージ）の頻度増加と正の相関を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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