(57)【要約】  細胞を解析するための細胞解析装置であり、１又は複数の培養容器を含む所定の撮影対象領域に亘る、細胞の観察画像を取得する画像取得部（１，２０−２３）、画像取得部により得られた観察画像全体又は該画像中の所定の解析対象領域から、細胞が存在する又は特徴的な細胞が存在する細胞領域を抽出する特定領域抽出部（２５）と、特定領域抽出部により抽出された細胞領域について、その領域の大きさ及び／又は形状に関する指標値を算出する指標値算出部（２６）と、互いに異なる複数の時点において、同一の１又は複数の培養容器中の細胞に対し、画像取得部、特定領域抽出部、及び指標値算出部によりそれぞれ算出された指標値を用い、該指標値の時間的な変化を示すグラフを作成し、該グラフを表示部（４）に表示させる表示処理部（２８）と、を備える。
2020188813.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１又は複数の培養容器中の細胞を解析するための細胞解析装置であって、
１又は複数の培養容器を含む所定の撮影対象領域に亘る、細胞の観察画像を取得する画像取得部と、
前記画像取得部により得られた観察画像全体又は該画像中の所定の解析対象領域から、細胞が存在する又は特徴的な細胞が存在する細胞領域を抽出する特定領域抽出部と、
前記観察画像全体又は前記解析対象領域について、前記特定領域抽出部により抽出された細胞領域の大きさ及び／又は形状に関する指標値を算出する指標値算出部と、
互いに異なる複数の時点において、同一の１又は複数の培養容器中の細胞に対し、前記画像取得部、前記特定領域抽出部、及び前記指標値算出部によりそれぞれ算出された前記指標値を用い、該指標値の時間的な変化を示すグラフを作成し、該グラフを表示部に表示させる表示処理部と、
を備える細胞解析装置。
【請求項２】
前記画像取得部は、撮影対象領域に亘るホログラムデータを取得するホログラフィック顕微鏡と、前記ホログラムデータを用いた所定の演算処理により、位相情報、強度情報又はそれら両方の要素を含む情報のいずれかの空間分布を示す画像を作成する画像再構成部と、を含む、請求項１に記載の細胞解析装置。
【請求項３】
前記特定領域抽出部は、前記細胞領域のほかに、前記画像取得部により得られた画像全体又は該画像中の所定の解析対象領域から、細胞以外の物質が存在する又は画像上で特徴がある特徴領域を抽出し、前記指標値算出部は、前記特徴領域について、その領域の大きさ又は形状に関する指標値を算出する、請求項１に記載の細胞解析装置。
【請求項４】
前記細胞領域の大きさ及び／又は形状に関する指標値は、細胞領域の面積に関連した指標値である、請求項１に記載の細胞解析装置。
【請求項５】
前記撮影対象領域には複数の培養容器を含み、
前記指標値算出部は、前記複数の培養容器それぞれにおける細胞領域の面積の総和、及び／又は、該複数の培養容器それぞれにおける細胞領域の面積の平均、を前記指標値として算出する、請求項４に記載の細胞解析装置。
【請求項６】
前記細胞領域の大きさ及び／又は形状に関する指標値は、個々の細胞領域の長軸方向の長さ、短軸方向の長さ、真円率、又は周縁長の少なくとも一つである、請求項１に記載の細胞解析装置。
【請求項７】
前記指標値算出部はさらに、前記細胞領域及び／又は該細胞領域以外の領域について、画像上の各画素の輝度値を利用して細胞領域及び／又は該細胞領域以外の領域を特徴付ける指標値を算出する、請求項１に記載の細胞解析装置。
【請求項８】
使用される培養容器に関する情報を取得する容器情報取得部と、
前記培養容器に関する情報に基づいて前記ホログラフィック顕微鏡による撮影可能領域の中で細胞の培養が可能である領域を特定し、その細胞の培養が可能である領域をカバーするように撮影対象領域を決めて撮影を実行するように前記ホログラフィック顕微鏡を制御する撮影制御部と、
をさらに備える、請求項２に記載の細胞解析装置。
【請求項９】
ユーザーが培養容器内の領域の中で前記解析対象領域を指定するための解析条件設定部、をさらに備え、
前記特定領域抽出部は、前記解析条件設定部により指定された解析対象領域のみから細胞領域を抽出する、請求項１に記載の細胞解析装置。
【請求項１０】
前記特定領域抽出部は、教師あり機械学習の手法により作成された識別器を用いて細胞領域を抽出する、請求項１に記載の細胞解析装置。
【請求項１１】
前記表示処理部はさらに、前記グラフと前記細胞の観察画像とを別の画面として前記表示部に表示させる、請求項１に記載の細胞解析装置。
【請求項１２】
前記グラフの表示画面内に、前記細胞領域の抽出結果を示す画像を前記細胞の観察画像に重畳するか否かをユーザーが選択するための操作子が配置されている、請求項１２に記載の細胞解析装置。
【請求項１３】
前記表示処理部はさらに、前記特定領域抽出部により抽出された細胞領域とそれ以外の領域とを視覚的に識別可能な態様の画像を、前記グラフと同じ画面内に、又は該グラフとは別の画面として、前記表示部に表示させる、請求項１に記載の細胞解析装置。
【請求項１４】
前記特徴的な細胞は未分化細胞又は未分化逸脱細胞である、請求項１に記載の細胞解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療分野では、近年、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞を用いた研究が盛んに行われている。こうした多能性幹細胞を利用した再生医療の研究・開発においては、多能性を維持した状態の未分化の細胞を大量に培養する必要がある。そのため、適切な培養環境の選択と環境の安定的な制御が必要であるとともに、培養中の細胞の状態を高い頻度で確認する必要がある。【０００３】
従来、再生医療用細胞培養の現場では専ら、培養中の細胞の形態的観察を行うために位相差顕微鏡が使用されていた。位相差顕微鏡を用いるのは、一般に細胞は透明であって通常の光学顕微鏡では良好な観察が難しいためである。【０００４】
これに対し、近年、ホログラフィ技術を用いて細胞の観察画像を取得する装置が実用化されている。この装置は、特許文献１、２等に開示されているように、デジタルホログラフィック顕微鏡で得られたホログラムデータに対し位相回復や画像再構成等のデータ処理を行うことで、細胞が鮮明に観察し易い位相像（インライン型ホログラフィック顕微鏡（In-line Holographic Microscopy：ＩＨＭ）を用いていることから、以下「ＩＨＭ位相像」という）を作成するものである。位相差顕微鏡で得られる位相差顕微画像と同様に、このＩＨＭ位相像でも透明である細胞を比較的明瞭に観察することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際特許公開第２０１８／１５８９４７号
【特許文献２】国際特許公開第２０１８／１５８８１０号
【特許文献３】国際特許公開第２０１６／１６２９４５号
【特許文献４】特開２０１６−１８９７０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
再生医療用細胞を培養する際に、培養容器中に存在する細胞の数や培養容器内の培地上で細胞が占める面積（以下「細胞面積」という場合がある）を把握するのは非常に重要である。何故なら、細胞数や細胞面積は培養条件が適切であるか否かを判断したり培養の継代のタイミングを判断したりするのに重要な指標であるからである。なお、細胞が塊状になって細胞コロニー（以下、単に「コロニー」という）を形成する場合には、個々の細胞を分離して個数を計数するのは困難であるため、細胞面積が指標として用いられることが多い。【０００７】
細胞培養では、培養容器として、培養プレートに形成された１又は複数のウェル、ディシュ（シャーレ）、フラスコ等、様々な形態のものが使用される。こうした培養容器中に存在する細胞の数を求める技術として、特許文献３に記載の方法が従来知られている。この従来の方法では、細胞が培養されている培養容器内の所定の視野範囲に亘る位相差画像を取得し、その画像内で細胞を認識してその数を計数する。位相差顕微鏡により取得可能である視野範囲に亘る位相差画像は培養容器全体のごく一部分であるうえに、位相差顕微鏡では視野範囲を移動する毎に焦点合わせを行う必要があるため、視野範囲を移動しながら位相差画像を繰り返して取得しようとする手間と時間が非常に掛かる。そこで、培養容器全体の有効面積と視野範囲の面積との比率を、上述したように実測で求めた細胞の計数値に乗じることで、培養容器全体の細胞数を推定する。【０００８】
しかしながら、上記従来技術では、培養容器内で細胞が略均一な密度で存在していないと、培養容器全体における細胞数の精度が低くなる。実際の細胞培養では、例えば、上面視で円形状であるウェルの周縁部に近い部分と中央部とで細胞の密度が大きく異なることがしばしばあり、そうした状況では細胞数の精度はかなり低下することになる。また、細胞面積を算出するために上記技術を採用したとしても、同様の問題が生じる。【０００９】
また、細胞培養においては、細胞数や細胞面積のほかに、細胞やコロニーについて、長軸方向の長さ、短軸方向の長さ、真円率、周縁長などの、その形状に関連する特徴量や、位相差、光路長、或いは微分値などの画像上の特徴量を求めたい場合もあるが、こうした種々の特徴量の平均値や分散値などの統計結果についても、培養容器全体における精度の高い結果を得ることが難しいという問題がある。【００１０】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、その主たる目的は、１若しくは複数の培養容器全体に亘る、又はその複数の培養容器それぞれにおける特定の領域に存在する細胞やコロニーが占める面積についての情報を高い精度で算出するとともに、その情報を、ユーザーが細胞の状態を簡便に評価可能であるように提示することができる細胞解析装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様は、１又は複数の培養容器中の細胞を解析するための細胞解析装置であって、
１又は複数の培養容器を含む所定の撮影対象領域に亘る、細胞の観察画像を取得する画像取得部と、
前記画像取得部により得られた観察画像全体又は該画像中の所定の解析対象領域から、細胞が存在する又は特徴的な細胞が存在する細胞領域を抽出する特定領域抽出部と、
前記観察画像全体又は前記解析対象領域について、前記特定領域抽出部により抽出された細胞領域の大きさ及び／又は形状に関する指標値を算出する指標値算出部と、
互いに異なる複数の時点において、同一の１又は複数の培養容器中の細胞に対し、前記画像取得部、前記特定領域抽出部、及び前記指標値算出部によりそれぞれ算出された前記指標値を用い、該指標値の時間的な変化を示すグラフを作成し、該グラフを表示部に表示させる表示処理部と、
を備えるものである。【００１２】
上記第１の態様の細胞解析装置において解析対象である細胞の種類は特に限定されないが、典型的にはヒトｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞などの多能性幹細胞である。その場合、特徴的な細胞とは、未分化細胞、未分化逸脱細胞などを含むものとすることができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の第１の態様の細胞解析装置では、特定領域抽出部は、画像取得部によって取得された、１若しくは複数の培養容器を含む所定の撮影対象領域に亘る画像の全体、又はその画像中の１若しくは複数の解析対象領域全体に対し、例えば細胞が存在する細胞領域を抽出する。そして、指標値算出部は例えば、抽出された細胞領域の大きさに関する指標値として、細胞領域の面積の総和や、複数の培養容器それぞれにおける細胞領域の面積の平均などを算出する。したがって、本発明の第１の態様によれば、培養容器内で細胞の分布密度が不均一であっても、その不均一性の影響を受けず、高い精度で以て細胞面積などの情報を算出することができる。【００１４】
また本発明の第１の態様の細胞解析装置では、表示処理部は例えば、互いに異なる複数の時点における１又は複数の培養容器中の細胞についてそれぞれ算出された細胞面積などを用い、その細胞面積の時間的な変化を示すグラフを作成しこれを表示部に表示する。したがって、本発明の第１の態様によれば、ユーザーがこうして表示される情報から、細胞培養における培養条件の的確性や培養の継代のタイミングなどを容易に且つ的確に判断することができる。それによって、細胞培養の作業を効率良く行うことができるとともに、作業ミスを軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施形態である細胞解析装置の概略ブロック構成図。
【図２】本実施形態の細胞解析装置を利用した細胞状態の評価作業における作業手順及び処理の流れを示すフローチャート。
【図３】本実施形態の細胞解析装置における撮影動作及び画像再構成処理を説明するための概念図。
【図４】本実施形態の細胞解析装置において、培養に使用する培養容器の情報の表示例を示す図。
【図５】本実施形態の細胞解析装置において、撮影対象領域を限定した場合に撮影される撮像単位の一例を示す図。
【図６】本実施形態の細胞解析装置における識別器選択画面の一例を示す図。
【図７】ウェル内を撮影対象領域として指定した場合の、細胞領域の抽出結果の一例を示す図。
【図８】識別器による細胞領域の抽出結果の一例を示す図。
【図９】識別器による、未分化細胞領域及び未分化逸脱細胞領域の抽出結果の一例を示す図。
【図１０】細胞面積の時間的変化のグラフを含む表示画面の一例を示す図。
【図１１】識別器による領域識別結果と細胞観察画像とを重ね合わせたときの表示画像の一例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明に係る細胞解析装置の一実施形態について、添付図面を参照して説明する。
【００１７】
［装置の全体構成］
図１は、本実施形態の細胞解析装置の概略ブロック構成図である。
この細胞解析装置は、顕微観察部１と、制御・処理部２と、ユーザーインターフェイスである入力部３及び表示部４と、を含む。
ここでは、顕微観察部１はインライン型ホログラフィック顕微鏡であり、レーザダイオードなどを含む光源部１０とイメージセンサ１１とを有し、光源部１０とイメージセンサ１１との間に、細胞（又はコロニー）１３が培養される培養プレート１２或いはそれ以外の培養容器が配置される。
【００１８】
制御・処理部２は、顕微観察部１の動作を制御するとともに顕微観察部１で取得されたデータを処理するものであって、撮影制御部２０と、ホログラムデータ記憶部２１と、位相情報算出部２２と、画像再構成部２３と、再構成画像データ記憶部２４と、特定領域抽出部２５と、指標値計算部２６と、計算結果記憶部２７と、表示処理部２８と、測定・解析条件設定部２９と、を機能ブロックとして備える。
【００１９】
通常、制御・処理部２の実体は、所定のソフトウェア（コンピュータプログラム）がインストールされたパーソナルコンピュータやより性能の高いワークステーション、或いは、そうしたコンピュータと通信回線を介して接続された高性能なコンピュータを含むコンピュータシステムである。即ち、制御・処理部２に含まれる各ブロックの機能は、コンピュータ単体又は複数のコンピュータを含むコンピュータシステムに搭載されているソフトウェアを実行することで実施される、該コンピュータ又はコンピュータシステムに記憶されている各種データを用いた処理、によって具現化されるものである。もちろん、そうした機能の一部を専用のハードウェア回路で実現することも可能である。
【００２０】
［本装置による観察・解析対象の細胞］
本実施形態の細胞解析装置による観察・解析対象である細胞は、培養容器内で培養されている細胞であればその種類を問わないが、典型的には、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞などの多能性幹細胞である。培養容器は、多数のウェルが形成された培養プレート、ディッシュ、フラスコなどである。これら培養容器の大きさや形状は、種類によって或いはメーカーによって様々であり、例えば、１枚の培養プレートに設けられているウェルの数だけみても、６、１２、２４、４８、９６、３８４など、多くの種類がある。なお、１枚の培養プレートに形成されている複数のウェルではそれぞれ異なる株の細胞を独立に培養することが可能であるから、各ウェルがそれぞれ個別の培養容器であると捉えることができる。したがって、例えば６個のウェルが形成されている培養プレートは、６個の培養容器が連結されて一体になったものであるとみなせる。
【００２１】
［本装置における細胞解析の処理動作］
以下、一例として、解析対象がヒトｉＰＳ細胞であり、１枚の培養プレート１２に形成されている６個のウェル中でそれぞれ細胞を培養する場合について、本実施形態の細胞解析装置における解析動作を説明する。
図２は、本実施例の細胞解析装置を用いた細胞の解析作業における作業手順及び処理の流れを示すフローチャートである。
【００２２】
＜ホログラムデータの収集＞
図３は、顕微観察部１における撮影動作、及び制御・処理部２で実施される画像再構成処理を説明するための概念図である。
図３（ａ）は培養プレート１２の一例の略上面図である。この培養プレート１２には上面視円形状である６個のウェル１２ａが形成されており、その各ウェル１２ａ内に収容された培地上で細胞が培養される。ここでは、図３（ａ）に示した１枚の培養プレート１２全体、つまりは６個のウェル１２ａを含む矩形状の範囲全体が顕微観察部１による撮影可能領域である。
【００２３】
顕微観察部１は光源部１０及びイメージセンサ１１の組を４組備えており、各組の光源部１０及びイメージセンサ１１はそれぞれ、図３（ａ）に示すように培養プレート１２全体を４等分した四つの４分割範囲８１のホログラムデータの収集を担う。つまり、４組の光源部１０及びイメージセンサ１１が、培養プレート１２全体（つまりは撮影可能領域全体）に亘るホログラムデータの収集を分担する。
【００２４】
一組の光源部１０及びイメージセンサ１１が１回に撮影可能である範囲は、図３（ｂ）に示すように、４分割範囲８１の中の、１個のウェル１２ａを含む略正方形状の範囲８２をＸ軸方向に１０等分、Ｙ軸方向に１２等分して得られる一つの撮像単位８３に相当する範囲である。一つの４分割範囲８１は、１５×１２＝１８０個の撮像単位８３を含む。
【００２５】
四つの光源部１０と四つのイメージセンサ１１とはそれぞれ光源部１０及びイメージセンサ１１を含むＸ−Ｙ面内で、４分割範囲８１と同じ大きさである矩形の四つの頂点付近にそれぞれ配置されおり、培養プレート１２上の異なる四つの撮像単位８３についてのホログラムの取得を同時に行う。そして、後述すように光源部１０及びイメージセンサ１１をＸ−Ｙ面内で所定距離だけステップ状に移動させることで、各組の光源部１０及びイメージセンサ１１が１８０個の各撮像単位８３に相当する範囲のホログラムデータを順番に取得する。従来の一般的な位相差顕微鏡では、撮影（画像の取得）の際に焦点合わせを行う必要があったが、ホログラフィック顕微鏡では後述するようにデータ処理の過程で焦点が合った画像を再構成することが可能である。そのため、撮影時には焦点合わせを行う必要がないという特徴を有している。
【００２６】
上述したように培養容器の大きさや形状は非常に多様であるし、培養容器の容器内部であっても必ずしもその全てが細胞を培養する領域であるとは限らない。細胞観察画像を取得する際には、細胞を培養する領域でない領域についての画像を取得しても意味がないし、測定時間の無駄である。一方、細胞観察画像を取得したあと、実際にユーザーが解析したい（例えば細胞面積を知りたい）領域は細胞が存在する領域全てであるとは限らず、そのうちの一部分のみである場合もある。そこで、本実施形態の細胞解析装置では、次のようにして実際に撮影を行う撮影対象領域や実際に解析を行う解析対象領域を限定できるようにしている。
【００２７】
即ち、測定（撮影）の実行前においてユーザーが測定日時などの情報を入力部３から入力する際に、ユーザーは使用する培養容器のメーカーや型番などの培養容器に関する情報、及び、撮影対象領域を決めるためのスキャン条件や解析対象領域を決めるための解析条件などを入力部３から入力する。そのうえで、観察及び解析対象である細胞１３を培養中である培養プレート１２を顕微観察部１の所定位置にセットし、測定実行を指示する（ステップＳ１）。
【００２８】
ユーザーにより指定された培養容器に関する情報やスキャン条件などは、図４に示すような測定対象情報表示画面１００で確認することができる。図４において、「メーカー型番」１０１はユーザーにより入力された培養プレートのメーカーと型番を示す情報であり、「プレート形状」１０２は１枚の培養プレート全体の形状を示す情報、「ウェル形状」１０３は１個のウェルの形状を示す情報であり、これらはメーカー型番等により一義的に決まる。「プレート基準点」１０４は培養プレートの設置位置に関する情報、「ウェル位置」１０５は６個のウェルそれぞれの中心位置座標を示す情報であり、顕微観察部１に付設されているカメラにより撮影された光学画像から算出される。「スキャン条件」１０６は撮影対象から除外する範囲を示す情報、「解析条件」１０７は後述する細胞領域の抽出等の解析対象から除外する範囲を示す情報であり、これらは必要に応じてユーザーにより入力設定される。
【００２９】
撮影制御部２０は、様々な培養容器について形状や大きさを含む情報が予め登録された容器情報記憶部を有している。撮影制御部２０は入力部３から設定された培養容器に関する情報（メーカー型番）を容器情報記憶部に照合し、図４中に表示されているプレート形状やウェル形状などの情報を読み出す。さらに、装着された培養プレート１２を光学的に撮影した画像に基づいて、プレート基準点やウェルの位置座標などを特定する。そして、入力された情報と光学画像に基づいて取得した位置情報とから、撮影可能領域の中で細胞の培養が可能な領域を算出し、その算出結果に応じて撮影対象領域を決定する（ステップＳ２）。撮影対象領域の詳細については後述する。
【００３０】
撮影対象領域が決まると、撮影制御部２０は、顕微観察部１の各部を制御して撮影を実行してホログラムデータを収集する（ステップＳ３）。
即ち、一つの光源部１０は、１０°程度の微小角度の広がりを持つコヒーレント光を培養プレート１２の所定の領域（一つの撮像単位８３）に照射する。培養プレート１２及び細胞１３を透過したコヒーレント光（物体光１５）は、培養プレート１２上で細胞１３に近接する領域を透過した光（参照光１４）と干渉しつつイメージセンサ１１に到達する。物体光１５は細胞１３を透過する際に位相が変化した光であり、他方、参照光１４は細胞１３を透過しないので該細胞１３に起因する位相変化を受けない光である。したがって、イメージセンサ１１の検出面（像面）上には、細胞１３により位相が変化した物体光１５と位相が変化していない参照光１４との干渉像、つまりホログラムがそれぞれ形成され、このホログラムに対応する２次元的な光強度分布データ（ホログラムデータ）がイメージセンサ１１から出力される。
【００３１】
上述したように、四つの光源部１０からは略同時に培養プレート１２に向けてコヒーレント光が出射され、四つのイメージセンサ１１では培養プレート１２上の異なる撮像単位８３に対応する領域のホログラムデータが取得される。一つの測定位置での測定が終了する毎に、光源部１０及びイメージセンサ１１は図示しない移動部により、Ｘ−Ｙ面内で一つの撮像単位８３に相当する距離だけＸ軸方向及びＹ軸方向にステップ状に順次移動される。これによって、４分割範囲８１に含まれる１８０個又はそれ以下の数の撮像単位８３での測定が実施され、四組の光源部１０及びイメージセンサ１１全体で培養プレート１２全体又は特定の撮影対象領域の測定が実行されることになる。上述したようにホログラフィック顕微鏡では撮影時に焦点合わせを行う必要がないため、一つの測定位置での撮影（測定）に要する時間は短くて済む。それにより、撮影対象領域が広くても比較的短い時間で撮影を終了することができる。上述のように顕微観察部１の四つのイメージセンサ１１で得られたホログラムデータは、測定日時等の属性情報とともに、制御・処理部２に送られホログラムデータ記憶部２１に格納される。
【００３２】
図３（ａ）、（ｂ）に示したように、顕微観察部１では６個のウェル１２ａを含む矩形状の撮影可能領域全体のホログラムデータを取得することが可能であるものの、そのうちの幾つかの撮像単位８３は細胞が全く存在しないウェル１２ａの外側の部分である。こうした撮像単位についてホログラムデータを取得しても該データは無駄である。そこで、ステップＳ２では、撮影制御部２０が、ウェル１２ａの形状やその位置の情報などに基づく演算によって、各撮像単位８３がウェル１２ａの内側領域を含むか否か（つまりはウェル１２ａの外側領域のみを含むものであるか否か）を判断する。そして、ウェル１２ａの内側領域を僅かでも含むと判断した撮像単位８３のみを撮影対象領域として決定する。
【００３３】
図５は、１個のウェル１２ａを含む１０×１２個の撮像単位８３についての、撮影対象領域とそれ以外の領域との区分けの一例である。この例では、全１２０個の撮像単位８３のうち、斜線で示した４８個の撮像単位８３Ｂが撮影対象領域から外れており、残りの７２個の撮像単位８３Ａから撮影対象領域が形成されている。撮影対象領域から外れた撮像単位８３Ｂについては、上述したような撮影動作時にスキップするようにし、ホログラムデータを取得しないようにする。それによって、測定の実行時間を短縮することができるとともに、撮影対象領域についてのホログラムデータのデータ量を減らすことができる。これは、ホログラムデータ記憶部２１におけるメモリ容量の節約と顕微観察部１から制御・処理部２へのデータ転送量の削減に有効である。
【００３４】
もちろん、撮影時には、有意なホログラムデータを得られない部分も含めて撮影可能領域全体について撮影（測定）を実行してホログラムデータを収集し、後述する解析の際に撮影対象領域から外れた撮像単位については解析対象から除外するようにしてもよい。
【００３５】
＜ＩＨＭ位相像の作成＞
上述した一連の測定（撮影）が終了すると、位相情報算出部２２はホログラムデータ記憶部２１からホログラムデータを順次読み出し、光波の伝播計算処理を行うことで２次元的な各位置における位相情報及び振幅情報を復元する。これら情報の空間分布は撮像単位８３毎に求まるから、全ての撮像単位８３の位相情報及び振幅情報が得られたならば、画像再構成部２３は、その位相情報や振幅情報に基づいて、撮影対象領域全体の位相画像つまりはＩＨＭ位相像を形成する（ステップＳ４）。
【００３６】
即ち、画像再構成部２３は撮像単位８３毎に算出された位相情報の空間分布に基づき各撮像単位８３のＩＨＭ位相像を再構成する。そして、その狭い範囲のＩＨＭ位相像を繋ぎ合わせるタイリング処理（図３（ｄ）参照）を行うことで、撮影対象領域つまりは培養プレート１２全体又はそのうちの特定の撮影対象領域についてのＩＨＭ位相像を形成する。ＩＨＭ位相像を構成するデータは再構成画像データ記憶部２４に保存される。なお、タイリング処理の際には、撮像単位８３の境界でのＩＨＭ位相像が滑らか繋がるように適宜の補正処理を行うとよい。
【００３７】
また、通常の処理で得られる再構成画像は取得されたホログラムデータにより原理的に求まる最高解像度のＩＨＭ位相像であるが、それだけでなく、その最高解像度のＩＨＭ位相像を元に、ビニング処理等により解像度を落とした複数の解像度のＩＨＭ位相像を作成する。そして、こうした様々な解像度のＩＨＭ位相像を構成するデータを再構成画像データ記憶部２４に保存する。これにより、様々な解像度のＩＨＭ位相像をあとで選択的に表示する際に、表示処理部２８は必要な解像度の再構成画像データを再構成画像データ記憶部２４から読み出してきて、表示すべき画像を迅速に形成することができる。
【００３８】
また、位相情報算出部２２は、ホログラムデータに基づいて、位相情報のほかに、強度情報や、位相情報と強度情報とをマージした擬似位相情報なども併せて算出し、画像再構成部２３はこれらに基づく再生像（ＩＨＭ強度像、ＩＨＭ擬似位相像）を作成することもできる。これら画像はＩＨＭ位相像に代えて使用されることもある。また、ホログラムデータに基づいてＩＨＭ位相像等を作成する際には、複数の焦点位置におけるＩＨＭ位相像等をそれぞれ作成することができる。これにより、撮影時に焦点合わせを行うことなく、合焦位置におけるＩＨＭ位相像を得ることができる。
【００３９】
＜細胞領域等の抽出＞
次に、特定領域抽出部２５は撮影対象領域に対応するＩＨＭ位相像から、細胞が存在する細胞領域、特定の細胞が存在する細胞領域、或いは、それ以外の特徴領域を抽出する処理を実行する（ステップＳ５）。ここでは、多層ニューラルネットワークを用いたディープラーニングなどの機械学習アルゴリズムにより学習された識別器を利用して、より簡単言えば、ディープラーニングによる画像セグメンテーションの技術を用いて、領域抽出を実行する。
【００４０】
具体的には、例えば、細胞が存在しない背景領域と細胞が存在する細胞領域とを担当者が判断してそれぞれ二値にラベル付けした多数のＩＨＭ位相像を教師データとして用意し、この教師データを多層ニューラルネットワークで学習させることにより識別器（識別モデル）を作成する。この識別器は、ＩＨＭ位相像を構成するデータを入力として、二値のラベルに応じてセグメンテーションされた画像を識別結果として出力するものである。特定領域抽出部２５はこの識別器を有しており、上述したように作成された解析対象のＩＨＭ位相像を入力データとして識別器に入力する。そして、識別器の出力として、背景領域と細胞領域にそれぞれ含まれる画素がラベル付けされたセグメンテーション画像を得る。
【００４１】
識別器は１種類のみでもよいが、本実施形態の細胞解析装置では、複数種類の識別器を特定領域抽出部２５に用意しておき、ユーザーによる手動選択によって、６個のウェル１２ａ毎に異なる識別器を使用した領域抽出処理を実施できるようにしている。
【００４２】
図６は、識別器選択画面１１０の一例を示す図である。ステップＳ５の実行前の適宜の時点でユーザーが入力部３で所定の操作を行うと、測定・解析条件設定部２９は識別器選択画面１１０を表示部４に表示する。識別器選択画面１１０には、ウェル対応識別器リスト１１１が配置されている。このリスト１１１において解析パラメータは識別器を示しており、図６の例では、ウェル番号が「１」であるウェルについては「CellAnalysis_01」との名称の識別器が使用されることを意味している。該リスト１１１の右端の下矢印記号１１３をクリック操作すると、登録されている識別器の一覧がダウンメニューで表示されるから、ユーザーがその中から所望のものを選択してクリック操作することで識別器を選択することができる。
【００４３】
また、ユーザーが識別器の名称を見ても、その識別器がどのような解析に適しているか、どのような領域抽出を行うものであるか、等の判断ができない場合がある。そこで、ウェル対応識別器リストの各行にコメント欄を付設して、その時点で選択されている識別器について予め記入されているコメントが表示されるようにしてもよい。もちろん、こうしたコメントは、マウスカーソルを識別器名称の上に位置させたときに、ポップアップで表示するようにしてもよい。また、図６では、ウェル番号によって異なる識別器が選択された状態であるが、ユーザーがいずれか一つの識別器の名称を選択したうえで「全てのウェルに適用する」ボタンを１１４をクリック操作すると、その識別器が全てのウェルに対して設定されるようにすることができる。
【００４４】
一般に、互いに異なる識別器とは、識別アルゴリズムは同じ（例えば同じ多層ニューラルネットワークを用いたディープラーニング）であるものの、学習時の教師データが相違するものである。即ち、同じラベル付け（例えば細胞領域と背景領域との二値のラベル）であっても、学習させるＩＨＭ画像自体が相違すれば、識別器としては異なるものとなる。細胞の種類が異なる場合はもちろんのこと、細胞の種類は同じであっても培養条件が相違すると、細胞の形状などが異なる場合がある。そこで、それぞれ異なる培養条件の下で培養された細胞のＩＨＭ画像を教師データとしてそれぞれ識別器を作成しておき、培養条件に応じた識別器を選択して解析を行うことで、培養条件の相違の影響を軽減してより精度の高い識別が可能である。
【００４５】
また、ラベル付けが異なるものも当然、識別器としては異なるものである。具体的には、背景領域と細胞領域との二つの領域に対応するラベル付けをしたＩＨＭ画像を教師データとして学習することで作成した識別器のほかに、背景領域、未分化細胞領域、及び未分化逸脱細胞領域の三つの（又はそれ以上の複数種類）の領域に対応するラベル付けをしたＩＨＭ画像を教師データとして学習することで作成した識別器を使用することができる。さらにまた、細胞領域だけでなく、ゴミなどの異物が存在している領域や、干渉縞などのように画像上で何らかの特徴的な模様が存在する領域なども、それらを特徴領域としてラベル付けして識別器を作成することができる。このような異なる識別器は、解析の目的や細胞の状態等に応じて使い分けることができる。
【００４６】
また、特定領域抽出部２５では、或る一つ又は複数のウェルに対するＩＨＭ位相像から細胞領域や特徴領域を抽出する際に、互いに異なる複数の識別器を組み合わせて使用するようにしてもよい。例えば、細胞領域と背景領域とを識別する第１の識別器から得られた領域抽出結果と、未分化逸脱細胞領域とそれ以外の領域とを識別する第２の識別器から得られた領域抽出結果とを組み合わせる、具体的には互いに異なるセグメンテーション画像での画素毎の論理和、論理積、排他的論理和などの論理演算を行うことにより、未分化逸脱でない細胞領域の抽出結果などを得られるようにすることができる。
【００４７】
図８は、背景領域と細胞領域とを識別可能な識別器を用いて細胞領域を抽出した（セグメンテーションを実施した）結果の画像の一例を示す図である。この画像では、背景領域と細胞領域とは異なる表示色で示されている。この抽出結果の画像では、細胞及びコロニーが存在する領域が良好に抽出されている。図９は、背景領域、未分化細胞領域、及び未分化逸脱細胞領域の三つを識別可能な識別器を用いて、セグメンテーションを実施した結果の画像の一例を示す図である。背景領域、未分化細胞領域、及び未分化逸脱細胞領域はそれぞれ異なる表示色で示されている。この抽出結果の画像では、細胞領域と背景領域とが良好に識別されるとともに、同じ細胞領域でも未分化細胞と未分化逸脱細胞とが良好に識別されている。
【００４８】
図７は、ウェルの周縁部付近のＩＨＭ位相像（右側）、及びそのＩＨＭ位相像全体を解析対象領域として細胞領域を抽出した結果の画像（左側）を示す図である。図７から、略円形状であるウェル周縁部の内側が撮影対象領域として定められており、その撮影対象領域における細胞（コロニー）が適切に検出できていることが分かる。
【００４９】
＜細胞面積等の指標値の算出＞
指標値計算部２６は、上述したように抽出された細胞領域や特徴領域に対し所定の演算処理を実施することで、例えばウェル毎の、或いは複数のウェルを含む培養プレート全体の細胞面積に関連する指標値を計算する（ステップＳ６）。そして、算出された指標値を計算結果記憶部２７に保存する。
【００５０】
一例としては、ウェル毎にＩＨＭ位相像上で抽出された細胞領域の画素数を積算し、その画素数に、１画素に対応するウェル内での実際の面積値を乗じることで、ウェル毎の細胞面積を算出することができる。また、こうして求めた一つのウェルにおける細胞面積とウェルの内部面積とから、ウェルの内部領域において細胞が占める領域の割合や、ウェル内部領域での単位面積当たりの細胞面積も算出することができる。さらに、１枚の培養プレート全体での細胞面積の総和や、１枚の培養プレート中の複数のウェルそれぞれにおける細胞面積の平均や分散といった統計量を算出することもできる。
【００５１】
また、未分化逸脱細胞領域と未分化細胞領域とを抽出した場合には、ウェル毎に、未分化逸脱細胞の占める面積と未分化細胞が占める面積との比率などを算出することができる。また、異物が存在している領域や、干渉縞などの画像上で何らかの特徴的な模様が存在する領域などを特徴領域として抽出した場合には、それら特徴領域の面積や、その特徴領域の面積とウェル内部面積との比率、或いは、特徴領域の面積と細胞領域の面積との比率などを算出することができる。
【００５２】
さらにまた、指標値計算部２６は、細胞領域の面積以外の、その大きさや形状に関連した種々の指標値を算出することもできる。具体的には、抽出された細胞領域は個々の細胞の形状又は複数の細胞の塊であるコロニーの形状であるので、その領域毎に、長軸方向の長さ、短軸方向の長さ、周縁長、真円率などの、大きさや形状を反映した特徴的な指標値を算出することができる。それにより、ウェル毎に、例えば細胞領域の周縁長の平均や分散などの統計量を算出することができる。さらにまた、細胞の大きさや形状には直接関連しない、細胞領域や特徴領域における画像上の輝度値やその輝度値の勾配、さらには輝度値の空間的な変化を示す微分値など、画像の特徴を示す数値を算出し、これに基づく細胞（又はコロニー）領域や特徴領域の特徴量を算出できるようにしてもよい。また、上述した面積値などの異なる指標値を組み合わせることで、新たな指標値を算出してもよい。なお、こうした指標値の算出には、例えば特許文献４などに記載されている既存の手法を用いることができる。
【００５３】
＜指標値の時間的変化の状況の表示＞
上述したような解析処理が終了したあと、ユーザーが入力部３で所定の操作を行うと、表示処理部２８は、直近の解析結果と、同じ培養プレート１２についての過去の解析結果とに基づいて、解析結果の時間的な変化を示すグラフを作成して表示部４に表示する（ステップＳ７）。図１０は、ウェル毎の細胞密集度（ウェルの内部面積に対する細胞面積の割合）の時間的な変化を示すグラフを表示させた一例である。
【００５４】
図１０に示すように、この解析結果表示画面１２０には、表示する培養プレート及びウェルを選択するための培養容器選択指示欄１２１と時間経過グラフ１２２とが配置されている。ユーザーは培養容器選択指示欄１２１で、時間経過グラフ１２２上に表示したい培養プレートとウェルを選択してチェックマークを入れる。さらに表示グラフ選択欄１２３で表示したいグラフに使用する指標値を選択する。図１０の例では、細胞密集度（Confluency）が選択されている。
【００５５】
上記のような選択が実施されると、表示処理部２８は、計算結果記憶部２７に保存されている、指定されたプレート名に対応付けられている指定された指標値の計算結果を読み出し、細胞培養期間を横軸（又は縦軸）に、指標値の値を縦軸（又は横軸）に割り当て、指定されているウェル毎に、各測定時点における値をプロットしてグラフを作成する。そして、この時間経過グラフ１２２を解析結果表示画面１２０内に表示する。各ウェルに対応するグラフ１２２上の線はそれぞれ異なる色で表示される。これにより、ユーザーは、各ウェルにおける指標値の経時変化や、ウェル毎の指標値の経時変化の相違、を容易に評価することができる。
【００５６】
ユーザーが表示グラフ選択欄１２３で指標値の選択を変更すると、その変更操作に応じて表示処理部２８は、指標値を変更して新たなグラフを作成し、表示しているグラフを更新する。それにより、様々な指標値についての経時変化を順に確認することができる。また、図１０に示すように、時間経過グラフ１２２には一つの培養プレート上の複数のウェルに対する指標値だけでなく、別の培養プレート上のウェルに対する指標値の経時変化も重ねて示すことができる。これにより、例えば基準となる培養プレート又はウェルとの相違などの評価も容易に行うことができる。
【００５７】
また、ユーザーが時間経過グラフ１２２上で各測定時点を示すプロットの一つをクリック操作すると、表示処理部２８はその指示されたプロット点に対応する、つまりその測定時点、プレート、及びウェルに対応付けられているＩＨＭ位相像を特定する。そして、該ＩＨＭ位相像を構成するデータを再構成画像データ記憶部２４から取得して画像を形成し、表示部４の画面上に表示する。その画像は解析結果表示画面１２０の一部に表示してもよいし、新たに開いた別のウインドウに表示してもよい。ユーザーは、この表示された画像により、任意の測定時点の任意のウェルにおける細胞の状態を確認し検討することができる。
【００５８】
解析結果表示画面１２０には、上記のようにＩＨＭ位相像を表示する際に、そのＩＨＭ位相像に、領域抽出結果であるセグメンテーション画像を重ね合わせるか否かを選択するための切替ボタン１２４が配置されている。この切替ボタン１２４による選択に応じて、解析結果表示画面１２０とは別の画面上に、ＩＨＭ位相像のみを表示するのか、或いは、ＩＨＭ画像に半透明のセグメンテーション画像を重ねた図１１に示すような合成画像を表示するのか、を切り替えることができる。ユーザーが解析結果表示画面１２０上でこうした選択を行ったうえで、時間経過グラフ１２２上で任意のプロット点を選択指示することにより、効率良く、目的とする細胞観察画像を表示させて確認することができる。
【００５９】
また、解析結果表示画面１２０には、ＣＳＶファイル出力ボタン、画面キャプチャボタン、及び、ＰＣ出力ボタンなどの出力指示ボタン１２５、が配置されている。ユーザーがこうしたボタンのクリック操作を行うことによって、解析結果表示画面１２０上で確認した時間経過グラフ１２２を、ＣＳＶファイル（テキストファイル）、画面キャプチャ、又は、画面のファイル（例えばＪＰＥＧファイル）のいずれかで出力することができる。ＣＳＶファイルとして出力する際には、領域抽出処理に使用した識別器の種類や特徴量の計算種別などをグラフ１２２上の測定プロット毎に出力するとよい。これにより、グラフ１２２上の各プロット点について、領域抽出に使用した識別器の種類や特徴量の計算の種別の情報を明示することができる。
【００６０】
以上のようにして本実施形態の細胞解析装置では、実際に培養容器全体又は複数の培養容器全体について細胞が十分に観察可能であるように取得された画像（ＩＨＭ画像）に基づいて、細胞領域などを良好に抽出し、その抽出された細胞領域が占める面積などの指標値を算出することができる。したがって、細胞の密度が培養容器内で均一でない場合でも、細胞面積などの指標値を正確に求めることができる。さらに本実施形態の細胞解析装置では、一つの培養容器で培養中である細胞について、細胞面積などの指標値の時間的な変化をグラフ上で一目で確認することができる。それにより、例えば培養条件の適否や培養の継代のタイミングの判断を適切に且つ容易に行うことができる。
【００６１】
また、ディッシュなどの培養容器の周縁部近傍のＩＨＭ位相像は、その容器の壁面による光の反射などの影響によって、画質が十分でない場合がある。また、細胞の種類や播種の方法、培養条件などによっては、細胞が培養容器の周縁部に偏って、又は逆に中央部に偏って存在することもある。このように、測定の制約や細胞の種類、培養条件などによっては、培養容器の特定範囲を撮影対象や解析対象から除外したいことがある。これに対し、本実施形態の細胞解析装置では、図４に示した測定対象情報表示画面１００中のスキャン条件又は解析条件を適切に設定することで特定の範囲を撮影や解析から除外することができる。それによって、不要な撮影や解析を省くことができ、作業の効率化を図るとともに、目的に即した正確な解析結果を得ることができる。
【００６２】
なお、本実施形態の装置では、解析対象から除外する範囲を測定対象情報表示画面１００で設定するようにしていたが、測定対象情報表示画面１００には「解析条件」１０７の項目を設けず、識別器選択画面など、解析の条件を設定するための画面内に、解析対象から除外する範囲を設定できる項目を設けるようにしてもよい。その場合、識別器と解析対象から除外する範囲とをセットとして、ウェル毎に指定できるようにしてもよい。
【００６３】
［上記実施形態の装置の各種変形例］
上記実施形態の細胞解析装置は、上記説明した以外にも、以下のような様々な変形が可能である。
【００６４】
＜変形例１＞
上記実施形態の細胞解析装置において特定領域抽出部２５では解析対象領域についてのみ細胞領域や特徴領域を抽出する処理を実行するが、その際に、ＩＨＭ位相像の中で解析対象領域に含まれる範囲のみのデータを用いて領域抽出処理を行うようにしてもよいが、それ以外に次のようにしてもよい。
【００６５】
即ち、一つの方法としては、ＩＨＭ位相像の中で解析対象領域の領域外ある部分にマスク処理を実施し、そのマスク処理された部分から取り出されたデータを無効データとして扱うか或いはゼロデータとする。これにより、解析対象領域の領域外も含んで領域抽出処理を実行しても、実質的に解析対象領域のみについて細胞領域や特徴領域を抽出することができる。また、別の方法としては、ＩＨＭ位相像の中で解析対象領域の領域外についても領域抽出処理を実施する（例えば撮影対象領域全体について領域抽出処理を実施する）が、その抽出結果に対し解析対象領域の領域外についてマスク処理を行う又は解析対象領域のみのデータを使用する。これによっても、実質的に解析対象領域のみについての細胞領域や特徴領域の抽出結果を得ることができる。
【００６６】
＜変形例２＞
上記実施形態の細胞解析装置では、細胞領域等を抽出するために、機械学習の一手法であるディープラーニングを用いて作成される識別器を用いていたが、それ以外の機械学習法による判別分析又は回帰分析を利用してもよい。具体的には、サポートベクターマシン、ランダムフォレストなどを利用してもよい。また、機械学習により作成される識別器を用いる代わりに、ＩＨＭ位相像の輝度値やテクスチャ画像などを用いて特徴的な領域を抽出する方法を用いることもできる。いずれにしても、或る画像情報からその画像上の特徴的な領域を検出、識別することができる方法であればよい。
【００６７】
＜変形例３＞
また、上記実施形態の細胞解析装置では、ウェル毎に異なる識別器を使用することは可能であるし、一つのウェル（ＩＨＭ位相像）に対し複数の識別器を使用してそれぞれ得られた領域抽出結果を合わせて一つの領域抽出結果を得ることも可能である。それに対し、一つのＩＨＭ位相像について種類の異なる識別器で領域抽出処理をそれぞれ実行し、その結果を保存しておき、ユーザーからの指示に応じて、その複数の領域抽出結果を並べて、切り替えて、又は重ねて表示できるようにしてもよい。これにより、異なる種類の識別器による領域抽出結果の差異を容易に比較することができる。また、その比較結果に基づいて、より適切な識別器を選択することも可能である。
【００６８】
＜変形例４＞
また、上記実施形態の細胞解析装置では、制御・処理部２において全ての処理を実施しているが、一般に、ホログラムデータに基づく位相情報の計算や画像の再構成処理には膨大な量の計算が必要である。また、細胞状態の判定処理の負荷も大きい。そこで、顕微観察部１に接続されたパーソナルコンピュータを端末装置とし、この端末装置と高性能なコンピュータであるサーバとがインターネットやイントラネット等の通信ネットワークを介して接続されたコンピュータシステムを利用し、上記のような煩雑な計算や処理は高性能なコンピュータで行い、顕微観察部１の制御や処理後のデータを用いた表示処理などを比較的低性能のパーソナルコンピュータで実行するように役割を分けてもよい。
【００６９】
さらにまた、上記実施形態及び各変形例はいずれも本発明の一例であり、本発明の趣旨の範囲でさらに適宜変形、修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは明らかである。
【００７０】
［種々の態様］
本発明の第１の態様は、１又は複数の培養容器中の細胞を解析するための細胞解析装置であって、
１又は複数の培養容器を含む所定の撮影対象領域に亘る、細胞の観察画像を取得する画像取得部と、
前記画像取得部により得られた観察画像全体又は該画像中の所定の解析対象領域から、細胞が存在する又は特徴的な細胞が存在する細胞領域を抽出する特定領域抽出部と、
前記観察画像全体又は前記解析対象領域について、前記特定領域抽出部により抽出された細胞領域の大きさ及び／又は形状に関する指標値を算出する指標値算出部と、
互いに異なる複数の時点において、同一の１又は複数の培養容器中の細胞に対し、前記画像取得部、前記特定領域抽出部、及び前記指標値算出部によりそれぞれ算出された前記指標値を用い、該指標値の時間的な変化を示すグラフを作成し、該グラフを表示部に表示させる表示処理部と、
を備えるものである。
【００７１】
第１の態様の細胞解析装置では、１又は複数の培養容器を含む所定の撮影対象領域に亘る細胞の観察画像を取得したあと、その観察画像全体又は該画像中の所定の解析対象領域の全体について、細胞領域の抽出を行う。即ち、ユーザーが細胞面積を確認したい解析対象領域について、そのうちの一部分をサンプリングした領域ではなく、解析対象領域全体に対し細胞領域の抽出を実行する。そして、その抽出結果に基づいて、細胞（又はコロニー）の面積などを算出し、その面積の総和や平均、培養容器の内部面積に対する細胞面積の比率などの指標値を計算する。したがって、第１の態様によれば、培養容器内で細胞の分布密度が不均一であっても、その不均一性の影響を受けず、高い精度で以て細胞面積などの情報を算出することができる。
【００７２】
また本発明の第１の態様の細胞解析装置では、表示処理部は例えば、互いに異なる複数の時点における１又は複数の培養容器中の細胞についてそれぞれ算出された細胞面積などを用い、その細胞面積の時間的な変化を示すグラフを作成しこれを表示部に表示する。したがって、第１の態様によれば、ユーザーがこうして表示される情報から、細胞培養における培養条件の的確性や培養の継代のタイミングなどを容易に且つ的確に判断することができる。それによって、細胞培養の作業を効率良く行うことができるとともに、細胞培養に係る作業ミスを軽減することができる。
【００７３】
本発明の第２の態様では、第１の態様の細胞解析装置において、
前記画像取得部は、撮影対象領域に亘るホログラムデータを取得するホログラフィック顕微鏡と、前記ホログラムデータを用いた所定の演算処理により、位相情報、強度情報又はそれら両方の要素を含む情報のいずれかの空間分布を示す画像を作成する画像再構成部と、を含むものとすることができる。
【００７４】
ホログラフィック顕微鏡では撮影の際に焦点合わせを要せず、或る程度の２次元的な範囲の撮影（ホログラムデータの取得）を短時間で終了することができる。さらにまた、画像再構成部で位相像等を作成する際に、合焦位置における精細な画像を作成することが可能であるとともに、必要に応じて、解像度を落とした低解像の画像も作成することができる。それにより、第２の態様では、例えば多数のウェルが形成されている培養プレート全体、或いは大容量のフラスコ全体など、撮影対象領域が広い場合であっても、短時間で効率的に測定を終了することができる。そのため、細胞を培養している培養容器をインキュベータから取り出している時間を短縮し、細胞培養に及ぼす影響を軽減することができる。また、細胞培養作業のスループット向上も図ることができる。
【００７５】
本発明の第３の態様では、第１又は第２の態様の細胞解析装置において、
前記特定領域抽出部は、前記細胞領域のほかに、前記画像取得部により得られた画像全体又は該画像中の所定の解析対象領域から、細胞以外の物質が存在する又は画像上で特徴がある特徴領域を抽出し、前記指標値算出部は、前記特徴領域について、その領域の大きさ又は形状に関する指標値を算出するものとすることができる。
【００７６】
第３の態様によれば、細胞面積等の細胞に関連する情報のほかに、例えばゴミなどの異物に関する情報、或いは、撮影時に画像に現れる干渉縞などの画像自体に由来する情報も収集することができる。
【００７７】
本発明の第４の態様では、第１〜第３の態様のいずれか一つの細胞解析装置において、  前記細胞領域の大きさ及び／又は形状に関する指標値は、細胞領域の面積に関連した指標値であるものとすることができる。
【００７８】
本発明の第５の態様では、第４の態様の細胞解析装置において、
前記撮影対象領域には複数の培養容器を含み、
前記指標値算出部は、前記複数の培養容器それぞれにおける細胞領域の面積の総和、及び／又は、該複数の培養容器それぞれにおける細胞領域の面積の平均、を前記指標値として算出するものとすることができる。
【００７９】
第４及び第５の態様によれば、細胞（特にコロニー）の培養条件の適否や継代のタイミングの判断に有用な情報を得ることができる。
【００８０】
本発明の第６の態様では、第１〜第５の態様のいずれか一つの細胞解析装置において、  前記細胞領域の大きさ及び／又は形状に関する指標値は、個々の細胞領域の長軸方向の長さ、短軸方向の長さ、真円率、又は周縁長の少なくとも一つであるものとすることができる。
【００８１】
また本発明の第７の態様では、第１〜第６の態様のいずれか一つの細胞解析装置において、
前記指標値算出部はさらに、前記細胞領域及び／又は該細胞領域以外の領域について、画像上の各画素の輝度値を利用して細胞領域及び／又は該細胞領域以外の領域を特徴付ける指標値を算出するものとすることができる。
【００８２】
第６及び第７の態様によれば、細胞やコロニーの状態を判断するのに有用な情報や培地の状態などを評価するのに有用な情報を得ることができる。
【００８３】
本発明の第８の態様では、第２の態様の細胞解析装置において、
使用される培養容器に関する情報を取得する容器情報取得部と、
前記培養容器に関する情報に基づいて前記ホログラフィック顕微鏡による撮影可能領域の中で細胞の培養が可能である領域を特定し、その細胞の培養が可能である領域をカバーするように撮影対象領域を決めて撮影を実行するように前記ホログラフィック顕微鏡を制御する撮影制御部と、
をさらに備えるものとすることができる。
【００８４】
第８の態様によれば、撮影可能領域の中で細胞が存在しないことが分かっている領域についての撮影の実行を省略することができる。それにより、測定時間を短縮することができるとともに、収集されるホログラムデータのデータ量を削減し、データを保存する記憶部の記憶容量を節約したり、データ転送時間を短縮したりすることができる。
【００８５】
本発明の第９の態様では、第１〜第８の態様のいずれか一つの細胞解析装置において、
ユーザーが培養容器内の領域の中で前記解析対象領域を指定するための解析条件設定部、をさらに備え、
前記特定領域抽出部は、前記解析条件設定部により指定された解析対象領域のみから細胞領域を抽出するものとすることができる。
【００８６】
第９の態様によれば、ユーザーが着目している領域についてのみ領域抽出処理を実施したり、培養容器内であっても細胞が実質的に殆ど存在していない領域を除外した領域についてのみ領域抽出処理を実施したりすることができる。それにより、領域抽出処理の処理時間を短縮することができるとともに、その処理結果のデータ量も削減することができる。
【００８７】
本発明の第１０の態様では、第１〜第９の態様のいずれか一つの細胞解析装置において、
前記特定領域抽出部は、教師あり機械学習の手法により作成された識別器を用いて細胞領域を抽出するものとすることができる。
【００８８】
教師あり機械学習の手法は特に限定されず、例えば、多層ニューラルネットワークを用いたディープラーニング、サポートベクターマシンなど、様々な手法を用いることができる。
第１０の態様によれば、例えば、細胞あり・無しの領域をそれぞれ適切にラベル付けした多数の画像を教師データとして用いた学習を行うことで、識別精度の高い識別器を作成し、例えば細胞が存在する領域を高い精度で抽出することができる。それにより、細胞領域の面積などの指標値の精度も向上させることができる。
【００８９】
本発明の第１１の態様では、第１〜第１０の態様のいずれか一つの細胞解析装置において、
前記表示処理部はさらに、前記グラフと前記細胞の観察画像とを別の画面として前記表示部に表示させるものとすることができる。
【００９０】
本発明の第１２の態様では、第１１の態様の細胞解析装置において、
前記グラフの表示画面内に、前記細胞領域の抽出結果を示す画像を前記細胞の観察画像に重畳するか否かをユーザーが選択するための操作子が配置されているものとすることができる。
【００９１】
第１１及び第１２の態様によれば、ユーザーがグラフ上で着目した培養時間における細胞の状態を直ぐに観察画像で確認することができる。また、細胞の観察画像をグラフとは別の画面上に表示しているので、複数の培養時間における観察画像を表示させ、それらを比較することも可能である。
【００９２】
本発明の第１３の態様では、第１〜第１２の態様のいずれか一つの細胞解析装置において、
前記表示処理部はさらに、前記特定領域抽出部により抽出された細胞領域とそれ以外の領域とを視覚的に識別可能な態様の画像を、前記グラフと同じ画面内に、又は該グラフとは別の画面として、前記表示部に表示させるものとすることができる。
【００９３】
ここでいう視覚的に識別可能な態様とは、典型的には異なる表示色による表示である。これにより、ユーザーがグラフ上で着目した培養時間における観察領域の状態を直ぐに確認することができる。
【００９４】
本発明の第１４の態様では、第１〜第１３の態様のいずれか一つの細胞解析装置において、前記特徴的な細胞は未分化細胞又は未分化逸脱細胞であるものとすることができる。
これにより、例えば多能性幹細胞の培養時に、除去対象である未分化逸脱細胞がどの程度存在しているのかを一目で把握することが可能である。
【符号の説明】
【００９５】
１…顕微観察部
１０…光源部
１１…イメージセンサ
１２…培養プレート
１２ａ…ウェル
１３…細胞
１４…参照光
１５…物体光
２…制御・処理部
２０…撮影制御部
２１…ホログラムデータ記憶部
２２…位相情報算出部
２３…画像再構成部
２４…再構成画像データ記憶部
２５…特定領域抽出部
２６…指標値計算部
２７…計算結果記憶部
２８…表示処理部
２９…測定・解析条件設定部
３…入力部
４…表示部
１００…測定対象情報表示画面
１１０…識別器選択画面
１１１…ウェル対応識別器リスト
１２０…解析結果表示画面
１２１…培養容器選択指示欄
１２２…時間経過グラフ
１２３…表示グラフ選択欄
１２４…切替ボタン
【図１】
2020188813.tif 000003
【図２】
2020188813.tif 000004
【図３】
2020188813.tif 000005
【図４】
2020188813.tif 000006
【図５】
2020188813.tif 000007
【図６】
2020188813.tif 000008
【図７】
2020188813.tif 000009
【図８】
2020188813.tif 000010
【図９】
2020188813.tif 000011
【図１０】
2020188813.tif 000012
【図１１】
2020188813.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】令和3年8月3日(2021.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１又は複数の培養容器中の細胞を解析するための細胞解析装置であって、
１又は複数の培養容器を含む所定の撮影対象領域に亘る、細胞の観察画像を取得する画像取得部と、
前記画像取得部により得られた観察画像全体又は該画像中の所定の解析対象領域から、細胞が存在する又は特徴的な細胞が存在する細胞領域を抽出する特定領域抽出部と、
前記観察画像全体又は前記解析対象領域について、前記特定領域抽出部により抽出された細胞領域の大きさ及び／又は形状に関する指標値を算出する指標値算出部と、
互いに異なる複数の時点において、同一の１又は複数の培養容器中の細胞に対して実施される、前記画像取得部、前記特定領域抽出部、及び前記指標値算出部の一連の処理によって、その時点毎に算出された前記指標値を用い、該指標値をプロット点とする指標値の時間的な変化を示すグラフを作成し、該グラフを表示部に表示させるとともに、該グラフ上でプロット点を指示するユーザーによる操作を受けて、指示されたプロット点に対応する細胞の観察画像を前記表示部に表示させ、且つ、その表示された細胞の観察画像に前記細胞領域の抽出結果を示す画像を重畳するか否かをユーザーが選択するための操作子を前記グラフの表示画面内に配置して表示する表示処理部と、
を備える細胞解析装置。
【請求項２】
前記画像取得部は、撮影対象領域に亘るホログラムデータを取得するホログラフィック顕微鏡と、前記ホログラムデータを用いた所定の演算処理により、位相情報、強度情報又はそれら両方の要素を含む情報のいずれかの空間分布を示す画像を作成する画像再構成部と、を含む、請求項１に記載の細胞解析装置。
【請求項３】
前記特定領域抽出部は、前記細胞領域のほかに、前記画像取得部により得られた画像全体又は該画像中の所定の解析対象領域から、細胞以外の物質が存在する又は画像上で特徴がある特徴領域を抽出し、前記指標値算出部は、前記特徴領域について、その領域の大きさ又は形状に関する指標値を算出する、請求項１に記載の細胞解析装置。
【請求項４】
前記細胞領域の大きさ及び／又は形状に関する指標値は、細胞領域の面積に関連した指標値である、請求項１に記載の細胞解析装置。
【請求項５】
前記撮影対象領域には複数の培養容器を含み、
前記指標値算出部は、前記複数の培養容器それぞれにおける細胞領域の面積の総和、及び／又は、該複数の培養容器それぞれにおける細胞領域の面積の平均、を前記指標値として算出する、請求項４に記載の細胞解析装置。
【請求項６】
前記細胞領域の大きさ及び／又は形状に関する指標値は、個々の細胞領域の長軸方向の長さ、短軸方向の長さ、真円率、又は周縁長の少なくとも一つである、請求項１に記載の細胞解析装置。
【請求項７】
前記指標値算出部はさらに、前記細胞領域及び／又は該細胞領域以外の領域について、画像上の各画素の輝度値を利用して細胞領域及び／又は該細胞領域以外の領域を特徴付ける指標値を算出する、請求項１に記載の細胞解析装置。
【請求項８】
使用される培養容器に関する情報を取得する容器情報取得部と、
前記培養容器に関する情報に基づいて前記ホログラフィック顕微鏡による撮影可能領域の中で細胞の培養が可能である領域を特定し、その細胞の培養が可能である領域をカバーするように撮影対象領域を決めて撮影を実行するように前記ホログラフィック顕微鏡を制御する撮影制御部と、
をさらに備える、請求項２に記載の細胞解析装置。
【請求項９】
ユーザーが培養容器内の領域の中で前記解析対象領域を指定するための解析条件設定部、をさらに備え、
前記特定領域抽出部は、前記解析条件設定部により指定された解析対象領域のみから細胞領域を抽出する、請求項１に記載の細胞解析装置。
【請求項１０】
前記特定領域抽出部は、教師あり機械学習の手法により作成された識別器を用いて細胞領域を抽出する、請求項１に記載の細胞解析装置。
【請求項１１】
前記表示処理部は、前記指示されたプロット点に対応する細胞の観察画像を前記グラフとは別の画面として前記表示部に表示させる、請求項１に記載の細胞解析装置。
【請求項１２】
前記表示処理部はさらに、前記特定領域抽出部により抽出された細胞領域とそれ以外の領域とを視覚的に識別可能な態様の画像を、前記グラフと同じ画面内に、又は該グラフとは別の画面として、前記表示部に表示させる、請求項１に記載の細胞解析装置。
【請求項１３】
前記特徴的な細胞は未分化細胞又は未分化逸脱細胞である、請求項１に記載の細胞解析装置。
【請求項１４】
前記指標値算出部は、一又は複数の培養容器の全体における細胞領域の面積を前記指標値として算出し、前記表示処理部は、該細胞領域の面積の時間的変化を示すグラフを表示する、請求項４に記載の細胞解析装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明の第１の態様は、１又は複数の培養容器中の細胞を解析するための細胞解析装置であって、
１又は複数の培養容器を含む所定の撮影対象領域に亘る、細胞の観察画像を取得する画像取得部と、
前記画像取得部により得られた観察画像全体又は該画像中の所定の解析対象領域から、細胞が存在する又は特徴的な細胞が存在する細胞領域を抽出する特定領域抽出部と、
前記観察画像全体又は前記解析対象領域について、前記特定領域抽出部により抽出された細胞領域の大きさ及び／又は形状に関する指標値を算出する指標値算出部と、
互いに異なる複数の時点において、同一の１又は複数の培養容器中の細胞に対し、前記画像取得部、前記特定領域抽出部、及び前記指標値算出部によりそれぞれ算出された前記指標値を用い、該指標値の時間的な変化を示すグラフを作成し、該グラフを表示部に表示させる表示処理部と、
互いに異なる複数の時点において、同一の１又は複数の培養容器中の細胞に対して実施される、前記画像取得部、前記特定領域抽出部、及び前記指標値算出部の一連の処理によって、その時点毎に算出された前記指標値を用い、該指標値をプロット点とする指標値の時間的な変化を示すグラフを作成し、該グラフを表示部に表示させるとともに、該グラフ上でプロット点を指示するユーザーによる操作を受けて、指示されたプロット点に対応する細胞の観察画像を前記表示部に表示させ、且つ、その表示された細胞の観察画像に前記細胞領域の抽出結果を示す画像を重畳するか否かをユーザーが選択するための操作子を前記グラフの表示画面内に配置して表示する表示処理部と、
を備えるものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
［種々の態様］
本発明の第１の態様は、１又は複数の培養容器中の細胞を解析するための細胞解析装置であって、
１又は複数の培養容器を含む所定の撮影対象領域に亘る、細胞の観察画像を取得する画像取得部と、
前記画像取得部により得られた観察画像全体又は該画像中の所定の解析対象領域から、細胞が存在する又は特徴的な細胞が存在する細胞領域を抽出する特定領域抽出部と、
前記観察画像全体又は前記解析対象領域について、前記特定領域抽出部により抽出された細胞領域の大きさ及び／又は形状に関する指標値を算出する指標値算出部と、
互いに異なる複数の時点において、同一の１又は複数の培養容器中の細胞に対して実施される、前記画像取得部、前記特定領域抽出部、及び前記指標値算出部の一連の処理によって、その時点毎に算出された前記指標値を用い、該指標値をプロット点とする指標値の時間的な変化を示すグラフを作成し、該グラフを表示部に表示させるとともに、該グラフ上でプロット点を指示するユーザーによる操作を受けて、指示されたプロット点に対応する細胞の観察画像を前記表示部に表示させ、且つ、その表示された細胞の観察画像に前記細胞領域の抽出結果を示す画像を重畳するか否かをユーザーが選択するための操作子を前記グラフの表示画面内に配置して表示する表示処理部と、
を備えるものである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
また本発明の第１の態様の細胞解析装置では、表示処理部は例えば、互いに異なる複数の時点における１又は複数の培養容器中の細胞についてそれぞれ算出された細胞面積などを用い、その細胞面積の時間的な変化を示すグラフを作成しこれを表示部に表示する。したがって、第１の態様によれば、ユーザーがこうして表示される情報から、細胞培養における培養条件の的確性や培養の継代のタイミングなどを容易に且つ的確に判断することができる。それによって、細胞培養の作業を効率良く行うことができるとともに、細胞培養に係る作業ミスを軽減することができる。また、第１の態様によれば、ユーザーがグラフ上で着目した培養時間における細胞の状態を直ぐに観察画像で確認することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
本発明の第１１の態様では、第１〜第１０の態様のいずれか一つの細胞解析装置において、
前記表示処理部はさらに、前記グラフと前記細胞の観察画像とを別の画面として前記表示部に表示させるものとすることができる。
前記表示処理部は、前記指示されたプロット点に対応する細胞の観察画像を前記グラフとは別の画面として前記表示部に表示させるものとすることができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
第１１の態様によれば、細胞の観察画像をグラフとは別の画面上に表示しているので、複数の培養時間における観察画像を表示させ、それらを比較することが可能である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
本発明の第１２の態様では、第１〜第１１の態様のいずれか一つの細胞解析装置において、
前記表示処理部はさらに、前記特定領域抽出部により抽出された細胞領域とそれ以外の領域とを視覚的に識別可能な態様の画像を、前記グラフと同じ画面内に、又は該グラフとは別の画面として、前記表示部に表示させるものとすることができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
本発明の第１３の態様では、第１〜第１２の態様のいずれか一つの細胞解析装置において、前記特徴的な細胞は未分化細胞又は未分化逸脱細胞であるものとすることができる。
これにより、例えば多能性幹細胞の培養時に、除去対象である未分化逸脱細胞がどの程度存在しているのかを一目で把握することが可能である。
【国際調査報告】
2020188813.tif 000014
2020188813.tif 000015
2020188813.tif 000016
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