(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素数が８〜２４の脂肪族モノカルボン酸を有効成分とするＤＮＡポリメラーゼ活性阻害剤。
【請求項２】
脂肪族モノカルボン酸が、炭素数が１２〜２４の飽和脂肪酸又は炭素数が１５〜２４の不飽和脂肪酸である請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼ活性阻害剤。
【請求項３】
炭素数が１５〜２４のモノエンモノカルボン酸又は炭素数が１５〜２０のジエンモノカルボン酸を有効成分とするＤＮＡポリメラーゼ活性阻害剤。
【請求項４】
炭素数が１３〜２４の飽和脂肪酸又はモノもしくはジエンモノカルボン酸を有効成分とするＤＮＡポリメラーゼα活性阻害剤。
【請求項５】
炭素数が８〜２４の飽和脂肪酸、炭素数が１１〜２４のモノエンモノカルボン酸、又は炭素数が１３〜２４のジエンモノカルボン酸を有効成分とするＤＮＡポリメラーゼβ活性阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脂肪酸類からなるＤＮＡポリメラーゼ活性阻害剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ.Ｃ．２.７.７.７）は４種のデオキシリポヌクレオシド三リン酸を基質として鋳型ＤＮＡの塩基配列に従ってＤＮＡ鎖の重合を触媒する酵素であり、生体に広く存在している。高等生物のＤＮＡポリメラーゼにはα、β、γ、δ及びεの５種が知られている。このうち、γはミトコンドリアのＤＮＡ合成用として存在し、核ＤＮＡへの関与の可能性は低いものと考えられている。αは主としてＤＮＡの複製を行なうポリメラーゼであり、βはＤＮＡ損傷の修復を行なうポリメラーゼである。
【０００３】
高等植物におけるＤＮＡポリメラーゼの研究において、体細胞には通常ＤＮＡポリメラーゼβの活性は認められず、ＤＮＡポリメラーゼαの活性のみがＳ期に認められることが知られている。減数分裂細胞でも、ＤＮＡポリメラーゼαの活性はＳ期のみに認められるが、ＤＮＡポリメラーゼβの活性は、前減数分裂期であるＳ期から分裂期のディプロテン期に現存し、特にザイゴテン期、パキテン期の細胞内に多く発現する。パキテン期は減数分裂特有のＤＮＡ合成の行われる時期であることが確認されている（蛋白質  核酸  酵素  ｖｏｌ.３２，Ｎｏ.１１（１９８７）坂口）。植物ではＤＮＡポリメラーゼβが生殖組織中の減数分裂細胞のその分裂期のみに発現し、植物において減数分裂を行って形成されるのは雄の場合は花粉であり、雌の場合は卵細胞である。高等植物には減数分裂異常を持つ多くの例が知られている。この例は、花粉ができない、種子や果実の数が少ない、あるいは全然ないという現象に見られる。
【０００４】
このようなＤＮＡポリメラーゼの阻害剤はあまり知られていないが、例えばアフィジコリン、Ｎ−エチルマレイミドなどが知られている。また、本発明者らは、高等植物のＤＮＡポリメラーゼ群の選択阻害物質を約５，０００種類の放線菌、糸状菌、担子菌などの発酵産物について検索して１５種類の菌株から有効成分を見出し、その内容を既に発表した（第１７回 日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集 ２−１１−１４４，平成６年発行。）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は各種の薬剤の開発に供しうる新たなＤＮＡポリメラーゼ活性阻害剤を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成するべく鋭意検討の結果、ヒトヨタケ科に属する担子菌の子実体及びタコウキン科またはホコリタケ科に属する担子菌の菌糸のアセトン抽出物がＤＮＡポリメラーゼ活性阻害物質を含んでいることを見出した。そして、このアセトン抽出物の各成分を分離して検索を続けた結果、ＤＮＡポリメラーゼ活性阻害物質はリノール酸を主に含む脂肪酸であることを突き止めた。そこで、各種の脂肪酸およびその類縁体のＤＮＡポリメラーゼ活性の有無を巾広く検索し、本発明に到達するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、炭素数が８〜２４の脂肪族モノカルボン酸を有効成分とするＤＮＡポリメラーゼ活性阻害剤に関するものである。
【０００８】
脂肪族モノカルボン酸は飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸のいずれであってもよく、また、直鎖、分岐のいずれであってもよい。また、アルカリ金属類（リチウム、ナトリウム、カリウム）との塩であってもよい。
【０００９】
飽和脂肪酸、すなわち、アルカンモノカルボン酸の炭素数は８〜２４であるが、好ましくは１２〜２４程度であり、特に好ましくは１６〜１９程度である。ＤＮＡポリメラーゼのうちＤＮＡポリメラーゼαに対する阻害活性では、炭素数が１３〜２４程度、好ましくは１５〜１９程度、特に好ましくは１６〜１９程度である。また、ＤＮＡポリメラーゼβに対する阻害活性では、炭素数が８〜２４、好ましくは８〜１９、特に好ましくは１８〜１９である。
【００１０】
不飽和脂肪酸、すなわちモノエンモノカルボン酸又はポリエンモノカルボン酸の炭素数も８〜２４であるが、好ましくは１１〜２４程度であり、特に好ましくは１５〜２４程度である。モノエニル基又はポリエニル基における２重結合の数は問わず、その炭素数から２重結合を保持できる数でよい。モノエンモノカルボン酸の場合、好ましい炭素数は１１〜２４程度、さらに好ましくは１５〜２４程度、ジエンモノカルボン酸の場合、好ましい炭素数は１５〜２０程度、さらに好ましくは１８〜２０程度である。
【００１１】
ＤＮＡポリメラーゼαに対する阻害活性では、モノエンモノカルボン酸は炭素数が１３〜２４程度、好ましくは１５〜２４程度、ジエンモノカルボン酸は炭素数が１３〜２４程度、好ましくは１８〜２０程度のものが好ましい。
【００１２】
ＤＮＡポリメラーゼβに対する阻害活性では、モノエンモノカルボン酸炭素数が１１〜２４程度、好ましくは１６〜２４程度、さらに好ましくは１７〜２４程度、ジエンモノカルボン酸は炭素数が１３〜２４程度、好ましくは１８〜２０程度である。
【００１３】
トリエンモノカルボン酸は炭素数が１８〜２０程度、テトラエンモノカルボン酸は炭素数２０、ペンタエンモノカルボン酸は炭素数２０、ヘキサエンモノカルボン酸は炭素数２２が好ましい。上記モノカルボン酸類の二重結合の位置に特に制限はない。
【００１４】
本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性阻害剤はいずれも種子形成抑制作用を有しているので種子形成抑制剤として使用することができる。種子形成抑制剤には脂肪族モノカルボン酸又はその塩類をそのまま、あるいは界面活性剤とともに水に加えて懸濁液にして使用すればよい。脂肪族モノカルボン酸が固体だったり、粘度が大きかったりしてそのまま散布、あるいは水に懸濁することが困難な場合には、アルコール、アセトン等の有機溶媒に溶解してそのまま、あるいはさらに界面活性剤とともに水に加えて懸濁液とする。この種子形成抑制剤には公知の種子形成抑制剤と併用することもでき、また、物性や保存性改善等の目的で種々の添加剤を加えることができる。
【００１５】
植物体に使用する時期は、ＤＮＡポリメラーゼα活性阻害剤は花芽形成前ならいつでもよい。一方、ＤＮＡポリメラーゼβ活性阻害剤は生殖細胞中にＤＮＡポリメラーゼ−βが発現する時期あるいはその前であり、具体的には一年草、多年草の草花では幼芽の形成以降から花芽形成の前であり、樹木では新芽が形成し、花芽形成の前に使用する。使用に際しての濃度は、脂肪族モノカルボン酸として０．０１〜１０ｗ／ｖ％が適当である。
【００１６】
適用方法を例示すれば、噴霧、塗布、滴下などの方法が適宜用いられる。
【００１７】
【実施例】
実施例１
市販の各種脂肪酸類のＤＮＡポリメラーゼα，βに対する阻害活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定した。
【００１８】
ＤＮＡポリメラーゼは鋳型となるＤＮＡが存在している場合のみ、４種の前駆体すなわち４種のデオキシヌクレオシド３リン酸〔デオキシアデノシン３リン酸(以下ｄＡＴＰと略)、デオキシグアノシン３リン酸(以下ｄＧＴＰと略)、デオキシシチジン３リン酸(以下ｄＣＴＰと略)、デオキシチミジン３リン酸（以下ｄＴＴＰと略）〕を基質としてＤＮＡを合成する。このことを利用してＤＮＡポリメラーゼ活性は合成ＤＮＡ（ｐｏｌｙ(ｄＡ）／ｏｌｉｇｏ １２−１８（ｄＴ））を鋳型プライマーとし、基質中のｄＴＴＰを3Ｈラベルしておくとポリメラーゼの重合反応により3Ｈ−ｄＴＴＰがＤＮＡ鎖のチミン残基として取り込まれる。このＤＮＡ鎖をＤＥＡＥ−セルロース（ジエチルアミノエチル−セルロース）濾紙に吸着させる。この吸着されたＤＮＡ鎖の放射比活性がＤＮＡポリメラーゼ活性となる。このとき、阻害の有無は試験物質によりＤＮＡポリメラーゼの重合反応が阻害された時、ＤＮＡ鎖への基質の取り込みが少なくなったり全くなくなるため、放射能活性が低下することから判断される。
【００１９】
ＤＮＡポリメラーゼαは次のようにして調製した。
【００２０】
子牛胸腺を緩衝液（５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７.５、０.３Ｍ塩化カリウム、０．１％トリトンＸ−１００、１ｍＭＰＭＳＦ、２ｍＭβ−メルカプトエタノール、２ｍＭベンズアミジン、１０ｍＭ重亜硫酸ナトリウム）中でホモジネートする。これをホスホセルロースカラムにのせて、０．２５Ｍから０．４Ｍ塩化カリウムで溶出してくるフラクションを集める。ＵＦ−１００ｐｓウルトラフィルター(東洋ソーダ)を用いて、約１０ｍｇ／ｍｌの蛋白濃度になるように濃縮する。遠心により不溶物を除く。免疫アフィニテカラムにのせ、流速４０ｍｌ／ｈｒで１２時間循環させる。（免疫アフィニテカラムは、プレカラムに人血清蛋白７５０ｍｇを５０ｍｌセファロースに結合させたカラムと５０ｍｇの兎ＩｇＧを１０ｍｌセファロースに結合させたカラムを直列につないだものを用い、プロテインＡ純化モノクロナール抗体ＭＴ−１７ＩｇＧ１０ｍｇを５ｍｌセファロースに結合させたカラムである。）モノクロナール抗体カラムをはずし、５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５／β−メルカプトエタノール(緩衝液Ａ)に０．３Ｍ塩化カリウム、０．１％トリトンＸ−１００を含む液でカラムの２０倍相当量で洗浄する。次に、(１)３Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａによりカラムの５倍相当量で溶出、続いて(２)５０％エチレングリコールを含む緩衝液Ａによりカラムの５倍相当量で溶出、(３)３．２Ｍ塩化マグネシウムを含む緩衝液Ａによりカラムの５倍相当量で溶出を行う。(１)〜(３)の画分を１０％グリセロールを含む緩衝液Ａ２ｌで透析する。５０％グリセロールになるように調整して、−２５℃で保存する。
【００２１】
（参考文献）
Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，９５０（１９８８）２６３〜２７３
【００２２】
ＤＮＡポリメラーゼβは次のようにして調製した。
【００２３】
大腸菌の遺伝子組み換え体(ＪＭｐβ５)を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ｘＹＴ培地１Ｌ、３７℃で培養する。培養液の吸光度が６００ｎｍで０．５になったところでイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)を０．５ｍＭになるように添加する。さらに培養を続けた後で、集菌すると湿重量で３ｇの菌体が得られる。約１．６ｇの菌体を５ｍｌの溶液（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．８、２５％ショ糖、１２．５ｍｇ卵白リゾチーム）中に懸濁し、４℃で１時間インキュベートする。その後ＥＤＴＡを５０ｍＭになるように加え、５分間静置する。次に、５ｍｌの溶解液（０．５％ノニデットＰ−４０、０．８Ｍ塩化カリウム、２ｍＭＰＭＳＦ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．８）で菌体を溶解する。これを１２，０００ｇで３０分間遠心し、上清を回収し、超音波によりＤＮＡを切断する。
【００２４】
上清はＰＣ緩衝液（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７.６、０.１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレトール、１０％グリセロール）で０．４Ｍ塩化カリウムなるように希釈し、０．４Ｍ塩化カリウムを含むＰＣ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロースカラム(１Ｘ７ｃｍ)にのせてクロマトグラフィーを行う。活性フラクションを集め、ＰＣ緩衝液で０．２Ｍ塩化カリウムなるように希釈し、０．２Ｍ塩化カリウムを含むＰＣ緩衝液で平衡化したホスホセルロースカラム（１Ｘ１０ｃｍ）にのせる。同緩衝液で洗浄後、０．２Ｍから０．７Ｍ塩化カリウムを含むＰＣ緩衝液の１５０ｍｌ直線勾配でクロマトグラフィーを行う。高活性フラクションを集めＰＣ緩衝液で３倍に希釈した後、０．１５Ｍ塩化カリウムを含むＰＣ緩衝液で平衡化した子牛胸腺ＤＮＡセルロースカラム（０．６Ｘ５ｃｍ）にのせる。同緩衝液で洗浄後、０．６Ｍ塩化カリウムを含むＰＣ緩衝液で溶出する。
【００２５】
高活性フラクションを集め、８０％硫安を加え０℃、１時間インキュベーションした後、１０，０００ｇ、３０分間、４℃で遠心する。沈殿物を０．１５Ｍ塩化カリウムを含むＰＣ緩衝液３ｍｌに溶解し、５０％グリセロールになるように調製し、０．１５Ｍ塩化カリウムを含むＰＣ緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−１５０カラム（１．２Ｘ５０ｃｍ）にのせる。同緩衝液で溶出させ、高活性フラクションを集め、再度ＤＮＡセルロースカラム(０．６Ｘ５ｃｍ)を行なう。
【００２６】
高活性フラクションを集め、０．２Ｍ塩化カリウムを含むＰＣ緩衝液で平衡化したＭＯＮＯ−Ｓカラムにのせる。同緩衝液で洗浄後、０．２Ｍから１．０Ｍ塩化カリウムを含むＰＣ緩衝液による直線勾配で溶出させ、高活性フラクションを集める。
【００２７】
高活性フラクションは５０％グリセロールになるよう調整し、−２０℃で保存する。
【００２８】
（参考文献）
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８８，２７，２９８３〜２９９０
【００２９】
酵素阻害活性の測定法
試験用の反応液として以下の通り調整した。
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）：５０ｍＭ
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）：１ｍＭ
塩化マグネシウム：５ｍＭ
グリセリン：１５％（ｖ／ｖ）
ｐｏｌｙ（ｄＡ）：１０μｇ／ｍｌ
ｏｌｉｇｏ１２−１８（ｄＴ）：５μｇ／ｍｌ
トリチウムでラベルしたデオキシチミジン３リン酸(3Ｈ−ｄＴＴＰ）を含むｄＴＴＰ：１０μＭ（１００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）
ＤＮＡポリメラーゼβに対しては
さらに塩化カリウム：１５０ｍＭ（ＤＮＡポリメラーゼαに対しては、０ｍＭ）
【００３０】
１６μｌの酵素溶液と脂肪酸類をメタノールに溶解した液４μｌ（１５００μＭ）を混合したもの８μｌを、上記の反応液１６μｌに加えた。３７℃で６０分間インキュベートした対照試験液は阻害物質の入っていないメタノール液を使用した。インキュベート後各試験液１８μｌをＤＥＡＥ−セルロースろ紙に吸着させ、このろ紙を５％（ｗ／ｖ）Ｎａ2ＨＰＯ4、水、エタノールで洗浄した。この洗浄条件では１０ヌクレオチド以上のポリマーはろ紙に吸着される。次いで、風乾してトルエンシンチレータを入れたバイアルに沈め、液体シンチレーションカウンタで放射線量を測定した。その測定結果により酵素反応の阻害率を以下の式で求めた。
【００３１】
阻害率(％）＝
(１−試験溶液の比活性(ｃｐｍ)／対照溶液の比活性(ｃｐｍ))×１００
【００３２】
上記方法で各種脂肪酸類の濃度１００μＭで測定したＤＮＡポリメラーゼα，βの阻害活性を表１〜５に示す。
【００３３】
表中、数字が大きいほど阻害作用が強いことを表している。
【００３４】
【表１】
0003821867.tif 000002
【００３５】
【表２】
0003821867.tif 000003
【００３６】
【表３】
0003821867.tif 000004
【００３７】
【表４】
0003821867.tif 000005
【００３８】
【表５】
0003821867.tif 000006
【００３９】
【発明の効果】
本発明により新規なＤＮＡポリメラーゼ活性阻害剤を提供することができた。本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性阻害剤は新規薬剤の開発範囲を拡大させることができる。例えば毒性の問題のない種子形成抑制剤として使用することができる。