(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的部位の超音波造影のための造影成分としてアルブミンのみを含み、前記目的部位が乳癌のセンチネルリンパ節であり、色素法及びガンマプローブ法で使用される色素または放射性同位元素を使用することなく、超音波造影により前記センチネルリンパ節を同定し、腫瘍の有無の判断に用いられる皮下投与用超音波造影剤。
【請求項２】
前記アルブミンの投与量が、被検体の体重に対して１０〜６０ｍｇ／ｋｇである請求項１に記載の超音波造影剤。
【請求項３】
前記アルブミンがヒト由来のものである請求項１又は２に記載の超音波造影剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、超音波造影剤に関し、特に目的部位の超音波造影のための造影成分を含む、皮下投与用超音波造影剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
三大成人病の一つといわれる癌は、癌細胞で侵された臓器から他の臓器へ癌細胞が転移することから、癌を早期に発見し、治療することが極めて重要である。このような事情から、これまでに癌に対する診断方法や治療方法が多数報告されている。
例えば、乳癌は局所の疾患ではなく全身病であるという考え方から、最近では乳癌の縮小手術が検討されている。乳癌患者から乳房を切除する拡大手術と乳房を温存する縮小手術との間に、生命予後に差を認めないという報告（Veronesi U et al. 1981; Fisher B et al. 1985）がされて以来、現在では早期の乳癌に対しては、縮小手術が標準術式になっている。乳癌のセンチネルリンパ節（腫瘍からリンパ管に入った癌細胞がその領域において最初に到達するリンパ節）に相当する腋窩リンパ節において癌転移の有無を検索することは、リンパ節郭清を省略する縮小手術を選択するためにも重要である。さらに、このセンチネルリンパ節について病理組織学に癌細胞の有無を調べることで、領域リンパ節全体の転移の有無を予測できるという考えられている。
【０００３】
センチネルリンパ節の同定法に関して、最近、色素法（dye-guided method）とラジオアイソトープを用いたガンマプローブ法（gamma probe-guided method）の報告がなされている。
色素法は、イソスルファンブルー（isosulfan blue）やインジゴカルミン（Indigocarmine）などの色素を使用する同定方法である。しかし、色素法で使用される色素は安価であるものの、その手技として染色された極細のリンパ管を傷つけずに切開して行き、リンパ節に到達する必要がある。このため、色素法は操作が難しく熟練を要し、施設によって正診率にばらつきが出るという欠点がある。一方、ガンマプローブ法は、予め放射性同位元素を含んだコロイド溶液を腫瘍近傍に注入しておき、しばらく放置した後、リンパ節に蓄積したコロイドをガンマプローブを用いて同定する方法である。しかし、ガンマプローブ法は、客観的で精度が高い方法として最近使用する施設が増えてきたが、放射線（アイソトープ）を扱わなければならず、また設備がかなり高価である。このため、ガンマプローブ法の実施に関しては、専ら大きな病院に限られ、一般病院での普及を妨げているのが現状である。
【０００４】
上記色素法やガンマプローブ法に比べて安全で、簡易かつ安価に実施できる検査法として超音波画像を用いる方法があり、これまでに超音波を用いて腋窩リンパ節の転移の有無を検討した報告がいくつかある（Pamio M et al. 1989 ; Feu J et al. 1997 ;  Bruneton JN et al. 1986 ; Nishida M et al. 1989 ; Yang WT et al. 1996）。しかし、これらの報告は、リンパ節像に関して辺縁の不整さ、リンパ門消失（hilus absent）、長短軸比（long-to-short axis ratio ; depth to width ratio）の大きさ等のパラメータを用いて、そのリンパ節が転移しているか否かの判別が可能であるかどうかを論じたものであり、センチネルリンパ節を特定してその変化を判別できるものではなかった。すなわち、上記超音波を用いた方法では、超音波画像上の変化のあったリンパ節がセンチネルリンパ節であるか否かを区別できなかった。その上、特に微小転移等のように超音波画像上明らかな変化を示さない場合には、良悪性の判別は不可能であった。
【０００５】
また、目的部位がセンチネルリンパ節ではなく心臓であるが、超音波を用いる方法も報告されている。この方法では、アルブミンを造影剤として経静脈的な投与方法で使用している〔例えば、アルブミンマイクロバブルス（albumin microbubbles）（Mark W et al. 1989）やアルブネクス（Albunex）（Ananda R et al. 1994 ; Klibanov AL et al. 1998 ; Jonathan R et al. 1998）〕。しかし、これらは、いずれも心臓の造影を目的とするものであり、センチネルリンパ節を造影及び同定するものではなく、ましてやセンチネルリンパ節における腫瘍の有無を判別できることを示すものでもない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
かくして本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、本発明は、上記色素法やガンマプローブ法よりも安全、簡易かつ安価に行なえる超音波を用いる手法で、センチネルリンパ節を含む特定の目的部位を同定し、かつ腫瘍細胞の有無を判断し得る手段の提供を目的とする。より具体的には、本発明はセンチネルリンパ節を超音波を用いて同定できる超音波造影剤を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記色素法及びガンマプローブ法で使用される色素及び放射性同位元素を使用せずに、被検体のセンチネルリンパ節を含む特定の目的部位を同定でき、しかも安全、簡易かつ安価に行なえる超音波を用いた造影剤の探索に鋭意検討した。また、本発明者らは、これまで心臓の超音波造影に用いられていたアルブミンをセンチネルリンパ節の造影に応用することも視野に入れた探索に鋭意検討した。
【０００８】
一般に超音波造影法では、所定量の造影剤を静脈内又は子宮腔内（子宮卵管エコー図検査目的）に投与するのが常識とされ、それ以外の投与方法についてはこれまで報告されていない。
本発明者らは、造影剤を皮下投与した場合、静脈内投与では得られなかった効果を奏するのではないかという、これまでの常識を覆すような発想に基づいて、実験を繰り返した。その結果、造影剤を皮下投与した場合には、目的部位の超音波造影が可能となるだけではなく、静脈内投与を行った場合よりも少ない投与量で超音波造影できることを見出し本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、目的部位の超音波造影のための造影成分を含む皮下投与用超音波造影剤に関する。
【００１０】
本発明は、特にセンチネルリンパ節の超音波造影に好適であり、造影成分としてはアルブミンが好ましい。
【００１１】
前記造影成分がアルブミンである場合、アルブミンを高エコーで超音波画像で観察するためには、アルブミンの投与量が被検体の体重に対して１０〜６０ｍｇ／ｋｇであることが好ましい。
【００１２】
また、ヒトの乳癌手術におけるリンパ節郭清の指標ともなるセンチネルリンパ節を同定するためには、アルブミンはヒト由来のものであることが好ましい。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施の形態において、さらに詳細に説明する。
本発明は、目的部位の超音波造影のための造影成分を含む。本発明を用いれば、所望の目的部位を、超音波診断装置を用いて超音波造影することにより、例えば、目的部位における癌細胞の転移の有無を確認することができる。
【００１４】
本発明における目的部位は、造影成分により超音波造影できる部位であれば特に限定されない。好ましくは癌の転移の指標となるセンチネルリンパ節である。センチネルリンパ節は、腫瘍からリンパ流に入った癌細胞が最初に到達するリンパ節であり、領域リンパ節の中で最初に転移が発生する場所であるといわれている。したがって、このセンチネルリンパ節に癌の転移がなければ、それより下流にある領域のリンパ節には転移がないと判断できるため、癌転移の有無を調べるのに有効である。
【００１５】
本発明で用いられる造影成分は、超音波を照射したときに造影機能を発揮し得る成分であれば特に限定されない。このような成分としては、例えば、アルブミン、ガラクトース・パルミチン酸混合物、ブタン・リン脂質混合物、プロパン・リン脂質混合物、スズコロイド、フチン酸（phytic acid）、イオウコロイドなどが挙げられるが、中でもアルブミンが特に好ましい。
【００１６】
アルブミンは、ヒト血清等のみならず多くの動植物組織や体液中に広く存在する可溶性タンパク質であり、例えば、ヒト血清アルブミンは、低アルブミン血症や出血性ショックの治療などの治療に用いられている。アルブミンは、血液成分の一成分であるため、これを本発明の造影剤として使用する場合、ガンマプローブ法で用いるアイソトープ粒子よりも遥かに安全である。また、アルブミンは、例えば、ヒト血清アルブミンであれば市販のものを利用できるため、入手し易い利点がある。
【００１７】
本発明で用いられるアルブミンの由来としては特に限定されない。しかし、アルブミンが抗原性を有する場合には、アレルギー等の抗原抗体反応に起因する問題が生じ得るため好ましくない。そこで、本発明ではヒト由来アルブミン、例えばヒト血清アルブミンを好適に用いることができる。ヒト血清アルブミンとしては、医療用に通常使用される純度にまで精製されたものであれば、本発明においては特に問題なく使用できる。具体的には電気泳動法で分析した場合にその８０％以上がアルブミンであるものが好ましい。また、ウイルス等の不活性化のため、加熱処理したものが好ましい。医薬品として市販されているヒト血清アルブミンが特に好適に用いられる。
【００１８】
また本発明で用いられるアルブミンとしては、遺伝子組換により得られた微生物により産生されるアルブミンも用いることができる。精製工程において夾雑物やウイルス等が混入される危険性を回避する観点からは、このような遺伝子組換え技術により得られたアルブミンがより好ましい。
【００１９】
本発明の造影剤は、造影成分を含有するが、その他に薬理学上許容し得る成分をさらに含有することができる。薬理学上許容し得る成分としては、超音波診断用造影剤に用いられ、当業者に知られているあらゆる成分を挙げることができ、このような成分として、例えば、安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、保存剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、界面活性剤、無痛化剤などを挙げることができる。
【００２０】
上記薬理学上許容し得る成分をより具体的に説明すると、安定化剤としては、例えば、グリシン、アラニン等の通常のＬ−型アミノ酸、グルコース、マンノース等の単糖類、ショ糖、マルトース等の二糖類、マンニトール、キシリトール等の糖アルコール類、デキストラン等の多糖類などを挙げることができる。また、殺菌剤としては、ベンザルコニウム塩、クロルヘキシジン塩、パラオキシ安息香酸エステル類等を挙げることができる。緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、あるいはこれらの塩等を挙げることができる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類等を挙げることができる。キレート剤としては、エデト酸ナトリウム、クエン酸等が例示される。その他、アセチルトリプトファンナトリウム、カプリル酸ナトリウムなどを挙げることができる。
なお、ｐＨ値についてはｐＨ調節剤により６．４〜７．４の範囲にすることが好ましい。
【００２１】
本発明の造影剤は、被検体に皮下投与されることを特徴とする。すなわち、本発明の造影剤は、これまで静脈内に投与されるのが一般的であった従来の造影剤とは異なり、被検体の皮下組織に皮下投与される。本発明の造影剤を皮下投与することにより、これまで造影に必要とされた投与量よりも少ない量で、しかも短時間かつ簡単に目的部位の造影をすることができる。
【００２２】
例えば、目的部位がセンチネルリンパ節である場合、リンパ管内に本発明の造影剤を吸収させる必要がある。しかるに、リンパ節及びリンパ管は、深部組織内よりも体表面浅層の静脈に伴行して多く分布する。このため、センチネルリンパ節を造影する場合には、本発明の造影剤を静脈内投与ではなく皮下投与することにより、本発明の造影剤を速やかにセンチネルリンパ節に到達させることができる。すなわち、静脈内に造影剤を投与した場合、造影剤は大静脈系を介して心臓へ到達し、心臓からさらに大動脈系を介して末梢の動脈など全身へ均等に分布される。このため、造影剤が全身に分布してしまうと、表面浅層にあるリンパ管を造影することはできず、ましてや静脈内の局所にあるリンパ節を造影するためには不十分である。
本発明の造影剤は、皮下組織内のリンパ網が分布している部位に注入すること、及びアルブミン等の造影剤が自然にリンパ管に取り込まれセンチネルリンパ節へ到達する、いわゆるリンパ流に着目したものであり、解剖生理学上も理にかなった造影剤である。
【００２３】
本発明の造影剤の被検体に対する投与量は、被検体の目的部位の超音波造影に十分な量であれば特に限定されない。本発明の投与量は、被検体の年齢、性別、体重、併用する他の医薬及びその他医学分野の当業者に認識されている様々な要因に応じて最適量を選択することができる。特に本発明は皮下投与されるため、本発明の被検体に対する投与量は従来の静脈投与量に比べて１／２〜２／３程度と少量になるメリットがある。
【００２４】
本発明の造影成分がアルブミンである場合、アルブミンの投与量は被検体の体重に対して１０〜６０ｍｇ／ｋｇであることが好ましく、１０〜４０ｍｇ／ｋｇであることがより好ましく、１０〜２０ｍｇ／ｋｇであることがさらに好ましい。アルブミンの投与量が被検体の体重に対して１０ｍｇ／ｋｇ以上あれば、皮下投与後の患部における超音波診断の際に高エコースポットとして確認でき、超音波画像上のセンチネルリンパ節をより正確に同定することができる。また６０ｍｇ／ｋｇ以下であれば、皮下投与した患部が硬結することもなく、かつ、前記高エコースポットがブロード化してセンチネルリンパ節の特定が困難になることもない。
【００２５】
本発明の造影剤を被検体に投与する場合、本発明の造影剤をそのままの状態で皮下投与することができる。また、必要に応じて本発明の造影剤を攪拌し、又は微小気泡を付加した状態で皮下投与することもできる。なお、微小気泡の付加は、公知の方法を用いることができる。
【００２６】
本発明を用いた超音波造影に使用される超音波診断装置は、公知の超音波診断装置であることができる。例えば、通常市販されている体表用の探触子を有する超音波診断装置を使用することもできる。
【００２７】
本発明の造影剤は、ヒトを含む哺乳類動物、好ましくはヒトのセンチネルリンパ節を同定するための造影剤として用いることができる。特に、本発明の造影剤を乳癌のリンパ節転移の有無を確認するために使用すれば、その後の治療方針を決定する上で有意義である。
以下、本発明をブタを被検体とした実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されることはない。
【００２８】
【実施例】
実験に使用したブタは９匹（Ａ〜Ｄ）で、生後４〜８週、体重８〜２１ｋｇであった。注射前にあらかじめ両側の頚部を超音波画像で観察し、リンパ節の位置、数、大きさを確認しておいた。その結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
（実施例１）
全身麻酔下のブタの両側頚部のリンパ節を対象に、超音波画像を用いて観察した。
注射する造影剤は、２５w/v％ブタアルブミン溶液で、これらは市販の精製されたブタアルブミン（Fraction V Powder；SIGMA；St．Louis；USA）２．５ｇに対し、７．５ｍｌの生理食塩水を混ぜて撹拝し、作製した。この造影剤のブタの体重あたり０．１〜０．２ｍｌ／ｋｇ（１．０〜２．０ｍｌ）の量を、最も口側にあるリンパ節より４〜７ｃｍ離れた口側の皮下に２３Ｇの注射針を用いて注射した。２５％ブタアルブミン溶液は、４匹（pigＡ：生後４週１０ｋｇ、pigＢ：生後６週１５ｋｇ、pigＣ：生後７週１８ｋｇ、pigＤ：生後８週２１ｋｇ）に使用し、超音波検査は注射後５−１５分間、３０秒ごとに行なった。
トランスジューサー（Transducer）を軽く皮膚に接触させて、それぞれのリンパ節の像に変化がないか注意深く観察した。それぞれのブタとも片側での実験終了後３０〜６０分空けて、対側にも同じ量の造影剤を皮下注射し、同様の経時的観察を行なった。トラスジューサーは、周波数５．０−８．０MHzのリニア型トランスジューサー（1iear array transducer(Acuson Sequoia 512 Ultrasound System ; Acuson Inc. ; Mountain View,CA)を使用した。結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
実施例１で使用された４匹のブタ（pigＡ〜Ｄ）のうち、まずpigＡに２５％ブタアルブミンの１ｍｌを皮下注射した後、３分後より両側とも最も口側のリンパ節のリンパ門付近に小さな点状の高エコーを認めるようになった。徐々にその高エコーは鮮明になり、５分後には右側ではリンパ門に１〜２ｍｍの２つの高エコースポットが認められるようになり、一方、左側では４〜５個の点状の高エコーの集簇を認めた（図１）。その他のリンパ節では明らかな超音波画像の変化は認めなかった。
【００３３】
PigＢに２５％ブタアルブミン１．５ｍｌを皮下注入した後、右側は３分後より、左側は４分後より、それぞれ最も口側のリンパ節のリンパ門付近に小さな点状の高エコーを認めるようになった。徐々に高エコーは鮮明になり、５分後には右側ではリンパ門に１〜２ｍｍの高エコースポットを認め、一方左側では３ｍｍの彗星状のエコーを伴う高エコーを認めた（図２）。その他のリンパ節については、超音波画像上、明らかな変化は観察されなかった。
【００３４】
PigＣの最も口側のリンパ節より７ｃｍ口側の皮下に２５％ブタアルブミン２．０ｍｌを注入した。左右側とも３分後より、右側は口側寄りの１１ｍｍと１０ｍｍのリンパ節のリンパ門付近にほぼ同時期に小さな点状の高エコーを認めるようになり、左側では口側の１１ｍｍのリンパ門に高エコーを認めた。高エコーは徐々に鮮明になり、５分後には右側の１１ｍｍのリンパ節のリンパ門には４ｍｍ大の、１０ｍｍのリンパ節のリンパ門には３ｍｍ大の高エコースポットの集篠を形成し（図３）、一方、左側ではリンパ門に１〜３ｍｍ大の高エコーを数個認めた。その他のリンパ節に超音波画像上、明らかな変化は観察されなかった。
【００３５】
PigＤの最も口側のリンパ節より７ｃｍ口側の皮下に２５％アルブミン２．０ｍｌを注入した。右側は１分後に、口側の１２ｍｍのリンパ節のリンパ門に数ｍｍの高エコーを認め（図４（ａ））、徐々にその高エコーが増大し、３分後には５ｍｍ大の高エコー理領域を形成した（図４（ｂ））。左側では２分後に口側の８ｍｍのリンパ門に小さな高エコーを認め、３分後には右側同様５ｍｍ大の高エコー領域を形成した（図４（ｃ））。その他のリンパ節に超音波画像上、明らかな変化は観察されなかった。
【００３６】
上記実施例１のpigＡ〜Ｄの４匹とも注射後約１５分間観察したが、５分後以降は画像上変化を認めなかった（表２参照）。
【００３７】
（実施例２）
超音波像の変化とブタアルブミンとがどのように対応しているかを検討するために、観察終了後、速やかに上記実施例１のpigＤを殺し、左側の８ｍｍのリンパ節をそのリンパ門（hilus）で結紮した後に、丁寧に摘出した。ホルマリン固定後、水槽内に水浸させて超音波診断装置で詳細に観察した。
【００３８】
図５に示すように、in vivo同様in vitroでもリンパ門に高エコー領域を認め、さらにin vivoでは観察されなかったリンパ節辺縁にも所々に点状の高エコーを認めた。
【００３９】
（実施例３）
前記摘出リンパ節の病理標本を作成し、アルブミンの存在及びその分布を確認するため、アルブミンを免疫染色（Rabbit Anti-Human Albumin ; DAKO ; Denmark）し、顕微鏡で観察した。
【００４０】
リンパ門において拡張した輸出リンパ管とその中に褐色に染まったアルブミンの小塊が観察された。これは、超音波で観察されたリンパ門の高エコー領域に相当するものであった。また、図６に示すように、リンパ節辺縁においても拡張した輸入リンパ管内やリンパ洞内に褐色に染まったアルブミンが観察された。これはin vitroで観察されたリンパ節辺縁の点状の高エコーに相当した。
また、図７に示すように、拡張した輸出リンパ管内の強拡大像では、アルブミンが濃縮し、ネットワーク状に集塊を形成しているのが観察された。
【００４１】
（比較例１）
実施例１の２５％ブタアルブミンをガラクトース・パルミチン酸混合物（レボビスト：登録商標）に変更し、かつ皮下投与を静脈投与に変更した以外は実施例１と同様の方法で行った。その結果を表３に示す。
【００４２】
【表３】
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【００４３】
表３より、いずれのブタのいずれのリンパ節においてもリンパ門の高エコー領域はみられなかった。これより本発明の造影剤を静脈投与した場合には、センチネルリンパ節の同定はできないことが分かる。
【００４４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明であれば、比較的少量の投与量で安全、簡易かつ安価に目的部位を超音波を用いて造影することのできる、皮下投与のための超音波造影剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  生後４週、１０ｋｇのブタの左側頚部における最口側にある１４ｍｍ大のリンパ節のエコー像である。
【図２】  生後６週、１５ｋｇのブタの左側頚部における最口側にある２３ｍｍ大のリンパ節のエコー像である。
【図３】  生後７週、１８ｋｇのブタの右側頚部における３個連なるリンパ節のエコー像である。
【図４】（ａ）生後８週、２１ｋｇのブタの右側頚部における最口側にある１２ｍｍ大のリンパ節において２５w/v％アルブミン溶液を２ｍｌ皮下投与後１分後のエコー像である。
（ｂ）上記リンパ節における２５w/v％アルブミン溶液の皮下投与後３分後のエコー像である。
（ｃ）生後８週、２１ｋｇのブタの左側頚部における最口側にある８ｍｍ大のリンパ節において２５w/v％アルブミン溶液を２ｍｌ皮下投与後３分後のエコー像である。
【図５】  リンパ節を摘出し、ホルマリン固定後、水浸させて超音波で観察したときのエコー像である。
【図６】  リンパ節の病理標本を作成し、免疫染色にてアルブミンを染色したときの染色状態を示す写真である。
【図７】  輸出リンパ管内に蓄積したアルブミン塊を強拡大像で観察したときの写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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