(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、
前記光源から出た光束のうち、所定波長の励起光束のみを通過させる励起光波長選択手段と、
前記励起光波長選択手段からの光束を所定の変調周波数で交互に左右の円偏光とする円偏光変調器と、
試料が入れられ、前記円偏光変調器を通過した左右の円偏光が交互に照射されるサンプルセルと、
前記サンプルセル内の試料から放射された蛍光のうち、所定波長の蛍光のみを通過させる蛍光波長選択手段と、
前記蛍光波長選択手段からの蛍光を蛍光強度信号とする蛍光測定手段と、該蛍光強度を検出した電気信号のうち、該変調周波数に同期して交流成分を取り出して円二色性蛍光励起スペクトルとする信号処理手段と、
を備え、前記サンプルセルと蛍光測定手段の間に集光系を介さず、かつ、該サンプルセルと蛍光測定手段を近接させたことを特徴とする円二色性蛍光励起スペクトル測定装置。
【請求項２】
請求項１記載の装置において、前記蛍光波長選択手段はカットオフフィルタであり、該カットオフフィルタにより励起光の散乱光の波長域の光を選択的に吸収して除去することを特徴とする円二色性蛍光励起スペクトル測定装置。
【請求項３】
請求項１または２記載の装置において、前記サンプルセルを透過した光の通過コース上に設けられ、該透過光を除去する光トラップを備えたことを特徴とする円二色性蛍光励起スペクトル測定装置。
【請求項４】
請求項１ないし３の何れかに記載の装置において、前記サンプルセルを間に挟み蛍光測定手段の反対側に、その鏡面をサンプルセルに向けて設けられ、該サンプルセル内の試料から放射された蛍光のうち、蛍光測定手段の反対方向に放射された蛍光を入反射して蛍光測定手段へ導く凹面鏡を備えたことを特徴とする円二色性蛍光励起スペクトル測定装置。
【請求項５】
請求項１ないし３の何れかに記載の装置において、実質的に前記サンプルセル外周面のほぼ全周に亘り、その鏡面をサンプルセルに向けて設けられ、該サンプルセル内の試料から放射された蛍光を入反射して、蛍光測定手段へ導く内面反射型の反射鏡を備えたことを特徴とする円二色性蛍光励起スペクトル測定装置。
【請求項６】
請求項１ないし５の何れかに記載の装置において、前記サンプルセル内の試料の高さは、前記励起光束のビーム径とほぼ同一の高さであり、
また底部が高さ調節自在で、該高さ調節が自在の底部上に前記サンプルセルが設けられたセルホルダと、
前記セルホルダ底部の高さを調節可能な高低調節手段と、
を備え、前記サンプルセル内の試料の高さと励起光波長選択手段からの励起光束のビーム径とがほぼ一致するように、前記高低調節手段によりサンプルセルの高さを調節することを特徴とする円二色性蛍光励起スペクトル測定装置。
【請求項７】
請求項１ないし６の何れかに記載の装置において、前記サンプルセルは円筒形よりなることを特徴とする円二色性蛍光励起スペクトル測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は円二色性蛍光励起スペクトル測定装置、特にその蛍光の集光効率と試料の利用効率の改善に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
多くの化学物質において、その絶対構造、立体構造に関する知見は、極めて基本的かつ重要不可欠な情報となっている。特に薬物、毒物、生体物質などの生理活性物質においては、その生理活性が直接にそのキラリティ、すなわち絶対構造、立体構造に依存することから、重要な研究課題とされている。
しかしながら、キラリティのみ異なる光学異性体は、化学的性質は実質的に同一であり、各種物理的特性も極めて近似しているため、これら薬物、毒物、生体物質などの生理活性物質のキラリティを解析する手段としては、Ｘ線結晶構造解析、円二色性スペクトルくらいに限られてくる。特に円二色性スペクトルは、取り扱いが比較的平易であることから、この研究には重要不可欠な手段として広く用いられている。
【０００３】
ところが、例えば生理活性物質などのように試料によっては、この円二色性スペクトル測定のために十分な量を確保することが容易ではない場合も多く、この円二色性スペクトル測定検出感度の向上、あるいはより感度の高い代替の測定手段の実現が強く望まれていた。その代替となり得る手段として、蛍光検出円二色性測定装置が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、従来の蛍光検出円二色性スペクトル測定装置は、もっぱら蛍光検出による選択性の向上にのみ着目されていて、その潜在的な感度向上の可能性については全く考慮されておらず、大きな改善の余地が残されていた。すなわち、蛍光を検出する場合の検出感度は、試料から放射される蛍光の集光効率に依存するため、可能な限りその集光効率を高める設計がなされることが望ましいが、従来の蛍光検出円二色性スペクトル測定装置ではそれがなされておらず、大きな改善の余地が残されていた。
【０００５】
本発明は前記従来技術の課題に鑑みなされたものであり、その目的は検出感度の向上を図ることができると共に、試料の利用効率の改善を図ることができる円二色性蛍光励起スペクトル測定装置を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明にかかる円二色性蛍光励起スペクトル測定装置は、光源と、該光源から出た光束のうち、所定波長の励起光束のみを通過させる励起光波長選択手段と、該励起光波長選択手段からの光束を所定の変調周波数で交互に左右の円偏光とする円偏光変調器と、試料が入れられ、該円偏光変調器を通過した左右の円偏光が交互に照射されるサンプルセルと、該サンプルセル内の試料から放射された蛍光のうち、所定波長の蛍光のみを通過させる蛍光波長選択手段と、該蛍光波長選択手段からの蛍光を蛍光強度信号とする蛍光測定手段と、該蛍光強度を検出した電気信号のうち、該変調周波数に同期して交流成分を取り出して円二色性蛍光励起スペクトルとする信号処理手段と、を備え、サンプルセルと蛍光測定手段の間に集光系を介さず、かつ、該サンプルセルと蛍光測定手段を近接させたことを特徴とする。
【０００７】
なお、前記装置において、前記蛍光波長選択手段はカットオフフィルタであり、該カットオフフィルタにより励起光の散乱光の波長域の光を選択的に吸収して除去することが好適である。
また、前記装置において、前記サンプルセルを透過した光の通過コース上に設けられ、該透過光を除去する光トラップを備えることが好適である。
【０００８】
また、前記装置において、前記サンプルセルを間に挟み蛍光測定手段の反対側に、その鏡面をサンプルセルに向けて設けられ、該サンプルセル内の試料から放射された蛍光のうち、蛍光測定手段の反対方向に放射された蛍光を入反射して蛍光測定手段へ導く凹面鏡を備えることが好適である。または、実質的に前記サンプルセルの外周面のほぼ全周に亘り、その鏡面をサンプルセルに向けて設けられ、該サンプルセル内の試料から放射された蛍光を入反射して蛍光測定手段へ導く内面反射型の反射鏡を備えることも好適である。
また、前記装置において、前記サンプルセル内の試料の高さは、前記励起光束のビーム径とほぼ同一の高さであり、
【０００９】
また底部が高さ調節自在で、該高さ調節が自在の底部上に前記サンプルセルが設けられたセルホルダと、
前記セルホルダ底部の高さを調節可能な高低調節手段と、
を備え、前記サンプルセル内の試料の高さと励起光波長選択手段からの励起光束のビーム径とがほぼ一致するように、前記高低調節手段によりサンプルセルの高さを調節することが好適である。
さらに、前記装置において、前記サンプルセルは円筒形よりなることが好適である。
【００１０】
【発明の実施形態】
以下、図面に基づき本発明の好適な実施形態を説明する。
図１には本発明の一実施形態にかかる円二色性蛍光励起スペクトル測定装置が示されている。
【００１１】
同図に示す円二色性蛍光励起スペクトル測定装置１０は、光源１２と、励起光波長選択手段である分光器１４と、ピエゾエラスティックモジュレータ（ＰＥＭ）よりなる円偏光変調器１６と、サンプルセル１８と、蛍光波長選択手段であるカットオフフィルタ１９と、蛍光測定手段であり、光増倍管（ＰＭＴ）よりなる検出器２０と、プリアンプ２２と、直流アンプ２４と、交流アンプ２６と、ロック・インアンプ２８と、直流アンプ３０と、Ａ／Ｄ変換器３２と、Ｉ／Ｏ装置３４と、分光器ドライバ３６と、ＰＥＭドライバ３８と、ＰＭＴ印加電圧制御回路４０と、制御手段であるＣＰＵ４２と、記憶手段４４を備える。
【００１２】
そして、光源１２の発光方向前方には分光器１４が設置され、この分光器１４により波長走査され順次所定波長の単色光となり、さらに所定の振動方向の直線偏光となった光束は、分光器１４の前方に設置された円偏光変調器１６を通過する。この円偏光変調器１６では、左右円偏光が所定の変調周波数信号ｓ１（本実施形態においては図２（ａ）に示すように５０ｋＨｚ）で交互につくられて、サンプルセル１８内の試料に照射される。
【００１３】
ここで、サンプルセル１８内の試料に励起光束Ｌ１である左右円偏光の不等吸収が起こると、円偏光変調器１６の変調周波数信号ｓ１に対応して蛍光Ｌ２にも強弱の波が生じ検出器２０に到達するが、試料から放射された蛍光Ｌ２は、カットオフフィルタ１９により励起光束Ｌ１の散乱光が取り除かれ、目的の蛍光波長域の光のみが検出器２０に入射する。
以上のようにして本実施形態にかかる円二色性蛍光励起スペクトル測定装置１０を構成することにより、試料から放射された蛍光を測定することができる。
【００１４】
なお、本実施形態では円偏光変調器１６を用いているため、検出器２０の出力信号には、直流成分信号ｓ３にわずかの交流成分信号ｓ４が含まれており（図２（ｂ）参照）、この交流成分信号ｓ４には、左右の円偏光で励起したときの蛍光強度の差（励起スペクトルの差）が反映している（同図（ｃ）参照）。
このため、本実施形態においては、例えばこの励起スペクトルの差を求めることにより、円二色性蛍光励起スペクトル（図３参照）を得ることができる。
【００１５】
また、分光器１４、円偏光変調器１６の動作は、それぞれ分光器ドライバ３６、ＰＥＭドライバ３８により管理されている。
このような円二色性蛍光励起スペクトル測定装置１０においては、もともと微弱な蛍光のさらに差を解析しなければならないため、通常の蛍光測定装置と比較しても一層の蛍光検出効率の向上が要求される。
以下、本実施形態の特徴的事項について詳細に説明するが、まず本実施形態における蛍光の集光効率の改善方法について説明する。
【００１６】
サンプルセルと検出器の配置
従来においては、サンプルセル１８の設置場所に空間を確保してその扱いを容易にするため、図４（ａ）に示すように、検出器２０をサンプルセル１８より離し、このサンプルセル１８と検出器２０との間の光路中に、集光系である集光レンズ４６，４８を設置していた。
【００１７】
しかしながら、従来のように検出器２０をサンプルセル１８より離すと、集光レンズ４６，４８の開口角は限られていて十分大でなく、その分、集光効率も限られていた。また、集光系は最低２枚のレンズ４６，４８を設けていたため、この集光レンズ４６，４８の表面での反射によっても、試料から放射された蛍光Ｌ２の約２０％程度をロスしていた。
【００１８】
そこで、本実施形態においては、同図（ｂ）に示すように、前記集光系である集光レンズ４６，４８を介さず、カットオフフィルタ１９を介して検出器２０をサンプルセル１８に近接させている。
この結果、試料から放射された蛍光Ｌ２の大部分を検出器２０に入射させることができる。これにより、蛍光Ｌ２の集光効率を最大とすることができるので、検出感度の向上を図ることができる。
【００１９】
カットオフフィルタ
従来より、一般的な蛍光分光光度計などの円二色性蛍光励起スペクトル測定装置では、検出する蛍光Ｌ２の波長を選択するために回折格子を用いた分光器を組み込むのが普通である。
しかしながら、このような分光器を組み込むことにより、検出する蛍光Ｌ２の波長を可変することができる、蛍光の波長純度をコントロールすることができる、などの利点があるものの、光学素子の効率のために光のロスが避けられず、その分、機構が複雑となりコストがかかるなどのマイナス面もあった。
【００２０】
そこで、本実施形態においては、励起光Ｌ１の散乱光さえ取り除くことができれば、それより長い波長の光の全部を用いても何等問題なく、むしろ光の量が増えて感度を向上させるためには好都合であることから、検出器２０側の分光器として前記図４（ｂ）に示すようにカットオフフィルタ１９を用いることが好適である。
このカットオフフィルタ１９は、入射した光のうち、励起光Ｌ１の散乱光の波長成分のみを吸収して、それより長波長の蛍光のみを検出器２０に入射させるので、検出器２０に入射される蛍光Ｌ２の量を増やすことができ、検出感度の向上を図ることができる。
【００２１】
また、このカットオフフィルタ１９の厚さは数ｍｍ程度と薄いため、その後段に設置される検出器２０をサンプルセル１８にできる限り近接させて、その開口比を大きく確保することにも役立つ。これにより、集光効率の向上を図ることができるので、検出感度の向上を図ることもできる。
【００２２】
光トラップ
試料を透過した光束は迷光となり、測定の妨害となるおそれがあった。また、本実施形態のように励起光として円偏光を用いた場合には、試料を透過した円偏光に反射が生じると偏光状態が変わり、最悪、逆方向の円偏光となって再度サンプルセル１８に戻るおそれがあった。そして、このような逆方向の円偏光がサンプルセル１８に入射すると、試料の励起に関わり、左右の円偏光励起による蛍光強度の差を小さくし、折角の信号を小さくしてしまう。
【００２３】
そこで、本実施形態においては、これらの影響を取り除くため、前記図４（ｂ）に示すように、サンプルセル１８からの透過光Ｌ３を除去することが可能な光トラップ５０を設けている。これにより、前述のようなノイズを大幅に低減することができると共に、最大信号の確保を行うことができる。
【００２４】
凹面鏡
前記図４（ｂ）に示すように、試料からの蛍光Ｌ２は、励起光Ｌ１の照射方向に関わらず、全包囲に放射されるが、検出に用いられるのは、そのうちの１方向である検出器２０方向でしかなく、その他は無駄となる。
そこで、本実施形態においては、サンプルセル１８を間に挟み検出器２０の反対側に凹面鏡５２を設置して、その焦点をサンプルセル１８のほぼ中央部に位置させる。これにより、検出器２０の反対側に放射された蛍光Ｌ２も、この凹面鏡５２で入反射されてサンプルセル１８に戻り、そのまま検出器２０に入射することができる。
【００２５】
この結果、検出器２０に入射する蛍光Ｌ２の量を増やすことができるので、検出感度の向上を図ることができる。
【００２６】
内面反射型の筒形反射鏡
本実施形態においては、前記図４（ｂ）に示す凹面鏡５２に代わり、図５に示すように、サンプルセル１８として円筒形セルを用い、該円筒形セルの周囲を一部除いた内面反射型の筒形反射鏡で囲み込み、光の利用効率を上げることも好適である。
【００２７】
すなわち、サンプルセル１８として円筒形セルを用いたときの光利用効率をさらに上げるためには、図５に示すように、円筒形セルの周りに内面反射型の筒形反射鏡を設置することが好適であり、その１つは、同図（ａ）に示すように内面反射型の円筒形鏡５４の一部（例えば検出器２０の口径とほぼ同様）を切り欠いたものを用いて、試料から実質的に全方位へ放射された蛍光を、この円筒形鏡５４にて入反射させて、前記図１に示す検出器２０に入射させることができる。
【００２８】
もう１つは、同図（ｂ）に示すような、内面反射型の楕円筒形鏡４８を用いることができる。そして、この楕円筒形鏡５６の切り抜き部分（例えば検出器２０の口径とほぼ同様）から遠い方の焦点が、サンプルセル１８である円筒形セルの中心に一致するように設ける。これにより、サンプルセル１８である円筒形セルから放射された蛍光を、もう１つの焦点に集光した後、効率的に前記図１に示す検出器２０に導くことができる。
【００２９】
この結果、試料から放射された蛍光のうち、検出器２０方向だけでなく、実質的に全方向に放射された蛍光を検出器２０に入射させることができる。これにより、検出器２０に入射する蛍光の量を増やすことができるので、検出感度の向上を図ることができる。
なお、前記円筒形鏡５４、楕円筒形鏡５６などの内面反射型の筒形反射鏡としては、金属製の筒体の内面を研磨したものを用いることができる。
【００３０】
また、サンプルセルとして無蛍光ガラス製の円筒形セルを用い、その外周面に、前記筒形反射鏡としてアルミなど反射率の高い金属を蒸着、メッキすることでも前記円筒形鏡５４、楕円筒形鏡５６と同様の効果を得ることもできる。しかも、このようにサンプルセル１８の外周面に鏡面を設けることにより、サンプルセルをキズや劣化などから有効に保護することもできる。
【００３１】
導光パイプ
本実施形態においては、試料から放射された蛍光Ｌ２を、できる限り効率的に検出器２０に集光させるためには、前記図４に示すように、サンプルセル１８、カットオフフィルタ１９および検出器２０を直接近接させることも好適であるが、このほか、図６に示すように、サンプルセル１８とカットオフフィルタ１９との間の光路中に、その内面が鏡面研磨された導光パイプ５８を設けることも好適である。
【００３２】
この結果、サンプルセル１８から図中右方向に放射された蛍光Ｌ２の一部は、該導光パイプ５８の内面にて反射せずに直接カットオフフィルタ１９を介して検出器２０に入射するものもあるが、また導光パイプ５８の内面に入射した蛍光Ｌ２も、その内面にて１回ないし複数回入反射して、カットオフフィルタ１９を介して検出器２０に入射することができる。これにより、前記図４に示すサンプルセル１８、カットオフフィルタ１９および検出器２０を直接近接させる構成と同様に、試料から放射された蛍光Ｌ２の集光効率の向上を図ることができるので、検出感度の向上を図ることができる。
【００３３】
サンプルセルの形状の違いによる蛍光の集光効率の改善
試料と空気の屈折率の違いにより、サンプルセル１８として角形セルを用いた場合、サンプルセル１８から外部に蛍光が出るとき、図７（ａ）に示すように、蛍光Ｌ２が開くように屈折する。このため、検出器２０に入射される蛍光Ｌ２は、その検出器２０の口径とサンプルセル１８からの距離とで幾何学的に決まる開口立体角と比較して少なくなる。
そこで、本実施形態のように、同図（ｂ）に示すようにサンプルセル１８として円筒形セルを用いることにより、その回転軸方向の事情は変わらないが、径方向では屈折がないため、その分だけ、高い光の利用効率を確保することができるので、検出感度の向上を図ることができる。
【００３４】
以上のようにしてサンプルセル１８、カットオフフィルタ１９、検出器２０、光トラップ５０、凹面鏡５２、内面反射型の筒形反射鏡５４，５６、導光パイプ５８などを適宜構成して蛍光の集光効率の向上を図ることにより、蛍光のように微弱な光を検出する場合でも検出感度の向上を図ることができる。
つぎに、本実施形態における試料の利用効率の改善について説明する。
【００３５】
サンプルセルの形状の違いによる試料の利用効率の改善
図８（ａ）に示すように、サンプルセル１８の励起光束Ｌ１の通らない部分（図中黒い部分）は、測定に関与しない部分であり、限られた試料の量から、より濃い試料溶液を調整するためには無駄な部分となる。
そこで、本実施形態においては、サンプルセル１８として円筒形セルを用い、同図（ｂ）に示すように、励起光束Ｌ１とほぼ同じ形状の円形に形成された端部であるセル窓板より励起光束Ｌ１を入射させることにより、同図（ａ）に示すようにサンプルセル１８として角形セルを用い、側方のセル窓板より励起光束Ｌ１を入射させた場合に比較し、その無駄な部分（図中黒い部分）を低減することができるので、試料の利用効率の改善を図ることができる。
また、それ以外にもサンプルセル１８として円筒形セルを用いると、つぎのような利点が得られる。
【００３６】
すなわち、円筒形セルの方が角形のものに比較し、前記励起光束Ｌ１の入射するセル窓板の歪みを少なく作成することができる。この歪みは、本実施形態において励起円偏光の偏光状態を乱し、ベースラインの曲がりの原因となるものであるため、サンプルセル１８としてこの歪みの少ない円筒形セルを用いることにより、得られるスペクトルの質的な向上を図ることもできる。
【００３７】
サンプルセルの高低調節手段
生体成分のような試料では、その絶対量を確保することが困難であることが多く、測定には限られた微少量しか用いられないことが一般的である。一方、測定で得られる信号強度は濃度に依存する。
したがって、感度を確保するためには、利用できる試料をできるだけ少量の溶媒に溶解してできる限り濃い試料溶液６０とし、測定に供するのが好ましい。より具体的には、測定において励起光に照射されない試料部分を最小にするようにし、それに必要なギリギリの量の試料溶液６０を調整するのが好ましい。
【００３８】
そこで、本実施形態においては、図９に示すように、その底部６２ａが高さ調節自在で、該底部６２ａにサンプルセル１８が設けられたセルホルダ６２と、セルホルダ底部６２ａを図中上下させてサンプルセル１８の高さを調節可能な高低調節手段６４を備えることが好適である。
そして、高低調節手段６４を駆動させて、励起光束Ｌ１をカバーすることができるギリギリの高さまでサンプルセル１８を持ち上げることにより、サンプルセル１８として円筒形セルを用いた場合は勿論、たとえこれに角形のものを用いた場合でも、試料溶液６０を該励起光束Ｌ１をカバーすることができる最低限の量で済ませることができる。
【００３９】
以上のようにしてサンプルセル１８、セルホルダ６２、高低調節手段６４などを構成することにより、励起光束Ｌ１をカバーすることができる必要最低限の試料量で蛍光測定を行うことができるので、試料の利用効率の改善を図ることができる。
【００４０】
なお、本発明の円二色性蛍光励起スペクトル測定装置としては、上記実施形態のものに限られるものでなく、種々の態様の変更が可能であり、例えば前記図１に示すＩ／Ｏ装置３４に、可搬型コンピュータのインターフェースをケーブル接続し、同図に示すＣＰＵ４２の制御機能、記憶手段４４の記憶機能などの各機能を、可搬型コンピュータ内蔵のＣＰＵ、リムーバブルディスク、ハードディスクなどの記憶手段で代用することも可能である。これにより、測定終了後にはその可搬型コンピュータのみを外部へ持ち出して上記データ処理を行うことができるので、作業性の向上などを図ることもできる。
つぎに、本実施形態において可能な種々の信号処理方法について説明する。
【００４１】
円二色性蛍光励起スペクトル
図１０に一般的な（吸収）円二色性スペクトルの１例を示す。これは２Ｒ，３Ｒ−ビスナフトイルブタンジオールの１．７８ｐｐｍのアセトニトリル溶液について測定されたものである。この試料については極めて明瞭な円二色性スペクトルが得られているが、この試料を１００倍希釈した１７．８ｐｐｂの溶液については、図１１に示すように、最早ノイズの大きさと同じ程度の信号レベルとなって、このスペクトルの測定の主たる目的である構造解析に用いることはできない。
【００４２】
本実施形態の１つである円二色性蛍光励起スペクトル測定装置は、このような希薄な試料について、なお解析に利用できる高感度な円二色性蛍光励起スペクトルに利用できる。図１２に示すのは、先の１７．８ｐｐｂの試料について得られた円二色性蛍光励起スペクトルで、Ｓ／Ｎ比で比べて（吸収）円二色性スペクトルの２０倍の感度が得られている。因みに本実施形態によらない図４に示したような従来の円二色性蛍光励起スペクトル測定で測定した円二色性蛍光励起スペクトルに比べて、Ｓ／Ｎ比で６倍の感度が得られている。
【００４３】
ところで、この図１２に示した円二色性蛍光励起スペクトルでは、その縦軸が規格化されておらず、試料間の直接比較ができない。これを補うために、本実施形態では以下に述べる方法によって円二色性蛍光励起スペクトルの大きさの規格化を行うことが可能である。
すなわち、前述のように直流アンプ２４で分離された直流成分信号ｓ３も、そのままＡ／Ｄ変換器３２、Ｉ／Ｏ装置３４を介してＣＰＵ４２に入力されるが、ＣＰＵ４２に入力された直流成分信号ｓ３は、そのまま全蛍光励起スペクトル（同図（ｂ）参照）として記憶手段４４に入力され記憶される。
【００４４】
全蛍光励起スペクトルを取得後、ＣＰＵ４２は記憶手段４４に適宜アクセスして全蛍光励起スペクトルを読み出す。また、ＣＰＵ４２は読み出された全蛍光励起スペクトルを所定の波長区間（本実施形態においては２２０ｎｍ〜２６０ｎｍ）で積分して０でない積分値Ｉを得る。
積分値Ｉを取得後、ＣＰＵ４２は、記憶手段４４に適宜アクセスして円二色性蛍光励起スペクトルを読み出す。また、ＣＰＵ４２は読み出された円二色性蛍光励起スペクトルを前記積分値Ｉで割り算することにより、この円二色性蛍光励起スペクトルの大きさを規格化する。
【００４５】
全蛍光励起スペクトルを所定の波長区間で積分して得られた積分値Ｉは、０でない１つの値であるから、ノイズとは無縁である。この積分値Ｉで円二色性蛍光励起スペクトルを割り算することにより、ノイズを増やさずに、その大きさを規格化することができる。これにより、種々の試料間で円二色性蛍光励起スペクトルを適正に比較することもできる。
【００４６】
円二色性蛍光励起スペクトルの利点
円二色性蛍光励起スペクトルの縦軸を規格化する方法として、従来、左右の円偏光励起による蛍光強度の差を、蛍光強度の和で割った量を蛍光検出円二色性スペクトルとして測定していた。本実施形態でも、この蛍光検出円二色性スペクトルを、先の円二色性蛍光励起スペクトルを全蛍光励起スペクトルで割ることにより、得ることができる。この間の関係は下記数１で表される。
【００４７】
【数１】
0003778320.tif 000002
ただし、ΔＡは吸収円二色性スペクトル、Ｓは蛍光検出円二色性スペクトル、ΔＦは円二色性蛍光励起スペクトル、Ａは左右の円偏光に対する試料物質の吸収係数の平均値である。また、通常の円二色性分散計において（吸収）円二色性スペクトルΔＡは、試料を透過した左右円偏光の強度差ΔＩと、その平均値Ｉより下記数２で表される。
【００４８】
【数２】
0003778320.tif 000003
いずれのスペクトルでも（吸収）円二色性スペクトルと比較して１桁ないし２桁高い感度を得ることができる。これは、例えば通常の紫外可視分光光度計と分光蛍光光度計で期待される感度の違い、あるいは、ＨＰＬＣにおいて紫外可視検出器と蛍光検出器で期待される感度の違い（至適な試料についてはいずれも蛍光のほうが１桁ないし３桁高い感度が得られる）に匹敵するものであり、微少量しか用意することができないような試料の測定に、莫大な恩恵をもたらすものである。
【００４９】
さらに、これら２者を比較すると、円二色性蛍光励起スペクトルはΔＦ、蛍光検出円二色性スペクトルはＳを測定することになる。この蛍光検出円二色性スペクトルは、前記数１のように後で係数を演算してΔＡに直すことができ、その解釈方法も確立しているという利点がある。
一方、Ｓは全蛍光強度（直流成分信号ｓ３）で割り算している分だけノイズが大きくなり、さらに蛍光のない波長領域では分母が０（もちろん分子も０）となるので、０／０を演算する結果、ノイズがより拡大してスペクトルの質が著しく低下するという宿命をもっている。
【００５０】
これに対し、円二色性蛍光励起スペクトルは、ΔＦは割り算しない分だけノイズが極めて少なく、蛍光のない波長領域でもノイズが拡大することなく、スペクトルの質が確保され、試料の量に対する感度の点では、顕著な利点を有する。
また、蛍光性夾雑物や、キラリティに関与しない蛍光性官能基の影響を受けないので、その分、選択性の点でも有利である。
また、蛍光で検出することで選択性も向上し、化合物の特定の部位に特異的な解析が可能となる。さらに、生のままでは蛍光をもっていない物質についても、蛍光の官能基を化学的に導入することにより、高感度に測定解析する道が開けたこととなり、その効果は極めて大きい。
【００５１】
図１３には本発明にかかる円二色性蛍光励起スペクトルを用いた場合と、従来の蛍光検出励起スペクトルを用いた場合との検出感度の比較結果が示されている。
同図に示すように、本実施形態にかかる円二色性蛍光励起スペクトルを示す同図（ａ）は、従来例の蛍光検出励起スペクトルを示す同図（ｂ）と比較して、蛍光のない波長域ではノイズが１桁以上低減され、蛍光のある波長域ではノイズが約５０％低減されていることが理解される。
【００５２】
このように本実施形態にかかる円二色性蛍光励起スペクトル装置を用い、蛍光検出円二色性スペクトルを得ることも可能であるが、前述した理由からノイズの少ない円二色性蛍光励起スペクトルを得ることにより、該スペクトルを用い、試料の適正な分析を行うこともできる。
このほか、本実施形態においては、下記透過光モニタ手段を用いることにより、別の信号処理を行うことも可能である。
【００５３】
透過光モニタ手段
本実施形態においては、図１４（ａ）に示すように、サンプルセル１８を透過した光Ｌ３の通過コース上に、該透過光Ｌ３を光電変換して透過光強度信号ｓ５とする透過光側検出器６６を備えることも可能である。
透過光側検出器６６は、例えば光増殖管（ＰＭＴ）よりなり、該透過光側検出器６６から出力された透過光強度信号ｓ５は、まず増幅器６８で増幅される。
さらに、同図（ｂ）に示されるように、サンプルセル１８と透過光側検出器６６との間の光路中に、透過光側検出器６６から出力される透過光強度信号ｓ５と、蛍光側検出器２０から出力信号される蛍光強度信号ｓ２とがほぼ同一の強度信号となるように、サンプルセル１８からの透過光Ｌ３を減光して透過光側検出器６６に入射させる減光フィルタ７０を設けることが可能である。
【００５４】
そして、前述のようにして減光フィルタ７０を設けることにより、透過光強度信号ｓ５と蛍光強度信号ｓ２とがほぼ同一の強度信号となるように調節したうえで、透過光側検出器６６から出力される透過光強度信号ｓ５が常に一定となるように、検出器印加電圧アンプ７２で透過光側検出器６６の印加電圧を調節し、かつ、この印加電圧と同じ電圧を蛍光側検出器２０にも印加して上記測定を行うことにより、例えば光源１２を交換した場合などのように、前述のようにして得られた円二色性蛍光励起スペクトルに、光源エネルギの波長依存性や分光器の波長特性が重畳してしまうのを防ぐことができる。
【００５５】
このほか、同図（ｂ）において、透過光側検出器６６と蛍光側検出器２０の印加電圧を、検出器印加電圧アンプ７２によりそれぞれ一定に固定したうえで（それぞれの電圧は当然異なる）、透過光側検出器６６から出力される透過光強度信号ｓ５と、蛍光側検出器２０から出力される蛍光強度信号ｓ２を同時に得るが、これらの信号は、例えば前記図１に示すＣＰＵ４２に入力され、ＣＰＵ４２は入力された信号より、前述のようにして円二色性蛍光励起スペクトルと、透過光強度スペクトルを得る。得られたこれらのスペクトルは記憶手段４４に別々に入力され記憶される。
【００５６】
そして、ＣＰＵ４２は記憶手段４４に適宜アクセスして各スペクトルを読み出し、読み出された円二色性蛍光励起スペクトルを透過光強度スペクトルで割り算することによっても、やはり光源エネルギの波長依存性や分光器の波長特性が重畳しない円二色性蛍光励起スペクトルを得ることができる。
このように透過光強度には試料の光吸収は影響を及ぼすが、本実施形態による測定で一般に測定対象となる試料の濃度は極めて薄く、そのような試料の光吸収は極わずかであり、実質的に透過光側検出器６６から出力される透過光強度信号は、光源エネルギの波長依存性や分光器の波長特性のみを反映していると見なすことができる。
【００５７】
したがって、前述のようにして透過光側検出器６６から出力される透過光強度信号が一定となるように、検出ゲインを設定することにより、これらの影響を確実にスペクトルから除くことができる。
このほか、本実施形態においては、同図に示す装置において、蛍光検出円二色性スペクトルを求め、この蛍光検出円二色性スペクトルより、さらに円二色性スペクトルを得ることも可能である。
すなわち、蛍光側検出器２０の印加電圧を一定にしておいて直流成分信号ｓ３と交流成分信号ｓ４を別々に得、ＣＰＵ４２が前記交流成分信号ｓ４を直流成分信号ｓ３で割り算することにより、蛍光検出円二色性スペクトルを得ることが可能である。
【００５８】
同様にして透過光側検出器６６から出力される透過光強度信号ｓ５（透過光強度信号ｓ５の直流成分信号ｓ５DC，交流成分信号ｓ５AC）も前記蛍光強度信号ｓ２と同時に得、これと試料のない溶媒だけのときの透過光強度のスペクトルとの比の逆数の対数をとり吸光度スペクトルとし、前記蛍光円二色性スペクトルを該吸光度スペクトルで割り算することにより、円二色性スペクトルを得ることも可能である。
さらに、本実施形態においては、下記異常光モニタ手段を用いることにより、別の信号処理を行うことも可能である。
【００５９】
異常光モニタ手段
本実施形態においては、図１５に示すように、励起側の分光器１４の中から異常光を取り出し、その強度を異常光側検出器７４でモニタし、モニタされた異常光強度データで、前記交流成分信号ｓ４を割り算することにより、光源エネルギの波長依存性を補正し、かつ、その時間変動を補正することが可能である。
すなわち、本実施形態のように検出感度の向上を図るため、直流成分信号ｓ３による割り算を除いた結果、例えば光源１２を交換した場合など、蛍光強度信号ｓ２には、光源エネルギの波長分布、光源エネルギの時間ドリフトという好ましからぬ要素が含まれるおそれがある。
そこで、実施形態においては、これらの影響を避けるため、励起側の分光器１４で直線偏光をつくり出すときに不要となる異常光（常光と同じ強度がある）を異常光側検出器７４でモニターする。
【００６０】
異常光側検出器７４から出力された異常光強度信号は、まず増幅器７６で増幅され、さらに例えば前記図１に示すＡ／Ｄ変換器３２、Ｉ／Ｏ装置３４を介して、ＣＰＵ３２に入力される。
そして、ＣＰＵ４２は、波長走査速度を考慮したうえで、入力されたデータに十分な時定数τを掛けて平滑化し、この平滑化されたデータで、前記交流成分信号ｓ４を割り算することにより、光源エネルギの波長分布、光源エネルギの時間ドリフトを補正することができる。
【００６１】
また、前述のようにデータのレベルで割り算する代わりに、異常光側検出器７４から出力される異常光の検出レベルが一定となるように異常光側検出器７４のゲインをコントロールし、さらにそのコントロールレベルを蛍光側検出器２０の印加電圧にもフィードバックさせることにより（ダイノードフィードバック）、同様の効果を得ることもできる。
【００６２】
【発明の効果】
以上説明したように本発明にかかる円二色性蛍光励起スペクトル測定装置によれば、サンプルセルと蛍光測定手段の間に集光系を介さず、かつ、該サンプルセルと蛍光測定手段を近接させたので、試料から放射された蛍光の大部分を蛍光測定手段に入射させることができる。これにより蛍光の集光効率の向上を図ることができるので、検出感度の向上を図ることもできる。
なお、前記装置において蛍光波長選択手段として励起光の散乱光の波長域の光を選択的に吸収して除去することが可能なカットオフフィルタを用いることにより、回折格子を用いた分光器の場合に比較し光のロスが少なくなるので、検出感度の向上を図ることができる。
また、前記装置においてサンプルセルを透過した光の通過コース上に設けられ、該透過光を除去する光トラップを備えることにより、励起光の散乱光が蛍光測定手段に入射してしまうのを防ぐことができるので、該励起光の散乱光による測定妨害を大幅に低減することができる。
さらに、透過光が反射して逆の円偏光となって再び試料の励起に関わり、正当な円二色性蛍光励起スペクトルの取得を妨害することを防ぐことができる。
また、前記装置においてサンプルセルを間に挟み蛍光測定手段の反対側に、その鏡面をサンプルセルに向けて設けられ、該サンプルセル内の試料から放射された蛍光のうち、蛍光測定手段の反対方向に放射された蛍光を入反射して蛍光測定手段へ導く凹面鏡を備えることにより、あるいは、該凹面鏡に代わり、実質的に前記サンプルセル外周面のほぼ全周に亘り、その鏡面をサンプルセルに向けて設けられ、該サンプルセル内の試料から放射された蛍光を入反射して、サンプルセルと蛍光測定手段の間の光路中へ導く内面反射型の反射鏡を備えることにより、蛍光測定手段方向とは異なる方向へ放射された蛍光でも集光して蛍光測定手段へ入射させることができるので、検出感度の向上を図ることができる。
また、前記装置において、サンプルセル内の試料の高さと励起光波長選択手段からの励起光束のビーム径とがほぼ一致するように、高低調節手段によりサンプルセルの高さを調節することにより、サンプルセル内に入れる試料量を励起光束のビーム径とほぼ同一の高さの必要最低限の量で蛍光測定を行うことができるので、試料の利用効率の改善を図ることができる。
さらに、前記装置においてサンプルセルは円筒形よりなるものを用い、例えば励起光束のビームの形状ととほぼ同様の円形である円筒形セルの端部より励起光束を入射させることにより、角形よりなるものを用いた場合に比較し、励起光束の照射されない試料部分を大幅に低減することができるので、必要最低限の試料量で蛍光測定を行い、試料を利用効率の向上を図ることができると共に、角形のものに比較し励起光束が入射されるセル窓板の歪みが少ないので、得られるスペクトルの質的な向上を図ることもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施形態にかかる円二色性蛍光励起スペクトル測定装置の概略構成の説明図である。
【図２】図２（ａ）は円偏光変調器の周波数信号の１例、図２（ｂ）は検出器の出力信号の１例、図２（ｃ）は左右の円偏光で励起したときの励起スペクトルの１例である。
【図３】円二色性蛍光励起スペクトルの１例である。
【図４】図４（ａ）は従来のサンプルセルと検出器の配置状態の説明図、図４（ｂ）は図１に示す装置において好適なサンプルセルと検出器の配置状態の説明図である。
【図５】図１に示す装置において好適な内面反射型の筒形鏡の説明図である。
【図６】図１に示す装置において好適な導光パイプの説明図である。
【図７】サンプルセルの形状の違いによる集光効率の違いの説明図である。
【図８】サンプルセルの形状の違いによる試料の利用効率の違いの説明図である。
【図９】図１に示す装置において好適なサンプルセルの高低調節手段の説明図である。
【図１０】一般的な円二色性スペクトルの１例である。
【図１１】一般的な希薄試料の円二色性スペクトルの１例である。
【図１２】前記図１２に示す希薄試料と同様の希薄試料の円二色性蛍光励起スペクトルの１例である。
【図１３】前記図１２に示す円二色性蛍光励起スペクトルを用いた場合と、蛍光検出円二色性スペクトルを用いた場合の検出感度の比較説明図である。
【図１４】図１に示す装置に透過光モニタ手段を用いたデータ処理方法の説明図である。
【図１５】図１に示す装置に異常光モニタ手段を用いたデータ処理方法の説明図である。
【符号の説明】
１０  円二色性蛍光励起スペクトル測定装置
１２  光源
１４  分光器（励起光波長選択手段）
１６  円偏光変調器
１８  サンプルセル
１９  カットオフフィルタ（蛍光波長選択手段）
２０  検出器（蛍光測定手段）
ｓ１  変調周波数信号
ｓ２  蛍光強度信号
ｓ３  直流成分信号
ｓ４  交流成分信号
【図１】
0003778320.tif 000004
【図２】
0003778320.tif 000005
【図３】
0003778320.tif 000006
【図４】
0003778320.tif 000007
【図５】
0003778320.tif 000008
【図６】
0003778320.tif 000009
【図７】
0003778320.tif 000010
【図８】
0003778320.tif 000011
【図９】
0003778320.tif 000012
【図１０】
0003778320.tif 000013
【図１１】
0003778320.tif 000014
【図１２】
0003778320.tif 000015
【図１３】
0003778320.tif 000016
【図１４】
0003778320.tif 000017
【図１５】
0003778320.tif 000018