(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血漿中から糖蛋白物質を分離・精製する糖蛋白物質自動精製装置において、
血漿を収容する第一のタンクと、
第一緩衝液を充填し密閉された第二のタンクと、
溶出液を充填し密閉された第三のタンクと、
第二緩衝液を充填し密閉された第四のタンクと、
アフィニティークロマトグラフィー用担体を充填し密閉されたアフィニティークロマトグラフィー用カラムと、
ゲルクロマトグラフィー用担体を充填し密閉されたゲルクロマトグラフィー用カラムと、
該アフィニティークロマトグラフィー用カラムからの液体をゲルクロマトグラフィー用カラムに送るために接続された第一の管路と、
該第二緩衝液を該ゲルクロマトグラフィー用カラムに送るために前記第四のタンクに接続された第二の管路と、
該ゲルクロマトグラフィー用カラムの排出側に接続された第三の管路と、
該血漿、第一緩衝液、溶出液を該アフィニティークロマトグラフィー用カラムに送るために前記第一、第二、第三のタンクに接続された第四の管路と、
該第一の管路に設けられた第一のポンプと、
該第二の管路に設けられた第二のポンプと、
該第三の管路に接続された採取容器と、
該第三の管路の排出側に接続された排液容器と、
を具備し、前記第一、第二、第三のタンクの排出側には各々電磁弁が設けられ、該第四のタンクの排出側に溶液を該排液容器に切り換えて送るための電磁弁が設けられ、該ゲルクロマトグラフィー用カラムの排出側の接続を該採取容器と該排液容器に切り換えるための電磁弁が設けられ、該電磁弁と該ポンプを制御するプログラムデータを予め記憶し、該プログラムデータに基づき精製処理を実行する制御手段が設けられ、前記第一のタンク、第二のタンク、第三のタンク、第四のタンク、第一の管路、第二の管路、第三の管路、第四の管路、採取容器及び排液容器は、滅菌処理されて使用されると共に、使用後は使い捨て器具として処理されることを特徴とする糖蛋白物質自動精製装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血漿中からフィブロネクチン、アンチトロンビン等の糖蛋白物質を分離・精製する糖蛋白物質自動精製装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フィブロネクチンは生体内に広く分布する分子量約460,000 の糖蛋白質であり、特に血漿中には比較的高濃度に存在する。このフィブロネクチンは、細胞間の接合、免疫系等の多方面に生物活性があるが、特に、眼科治療の分野においては、角膜上皮細胞の進展・接着を促進する作用があり、角膜ヘルペス、三叉神経障害あるいは角膜移植後などの遷延性角膜上皮欠損に有効である。このため、フィブロネクチンは、現在、医療機関で手作業により血漿中から精製することにより院内調製され、眼科治療等に使用されている。
【０００３】
このフィブロネクチンは、変性コラーゲンに対して強い親和性をもつため、この性質を利用して、血漿中から精製する精製方法が、現在行なわれている。（例えば、T.Nishida,S.Nakagawa,T.Awata,C.Nishibayashi,R.Manabe,Jpn J. Ophthalmol.,26,416-424(1982)  等参照）
この精製方法は、図１５に示すように、まず、クエン酸ソーダ（3.8 ％）１mlを予め吸引した注射筒に、患者から１０mlの血液を採る。その後、遠心分離によって血漿を分離したのち約６mlの血漿を、予め人工房水でよく洗浄したゼラチン・セファロース入りのカラムに入れ、血漿中のフィブロネクチンのみを特異的に変性コラーゲンであるゼラチンに結合させる（図１５Ａ）。
【０００４】
次に、カラム内にクエン酸添加ＰＢＳ（リン酸緩衝液）を流し入れ、溶出物から蛋白質が認められなくなるまでカラムを洗う（図１５Ｂ）。蛋白質の量はＵＶモニターでチェックし、波長280nm での吸収度が0.05以下になっていることを確認してもよい。次に、４Ｍ（モル）の溶出液をカラムに入れ、フィブロネクチンを溶出させる（図１５Ｃ）。
【０００５】
このようにして精製されたフィブロネクチンと溶出液とを分離するために、次に人工房水をフィブロネクチンと溶出液中に入れ、ゲル濾過を行い（図１５Ｄ，Ｅ）、人工房水中に溶解している状態のフィブロネクチンを得ていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記調製に用いられているフィブロネクチンの精製は、大部分が手作業で行なわれるため、各工程での操作が繁雑で、且つ時間管理をする必要があり、また、精製作業者が精製に長時間従事する必要がある等の問題があった。更に、従来の精製作業は密閉構造で行なっていないため、フィブロネクチンを無菌的に採取することが困難な問題があった。さらに、この精製作業には高度な熟練性を必要とするため、均一な品質のフィブロネクチンを高い収率で精製するためには、熟練した専従者をおく必要があった。更に、手作業でのフィブロネクチンの精製は、精製作業者や患者にとって、ウイルス感染等の危険性があり、特に、精製過程においてＵＶ検出器を使用する場合には、他の患者へのウイルス感染の危険性を伴う問題が生じていた。
【０００７】
本発明は、上記の点に鑑みてなされたもので、血漿中からフィブロネクチン等の糖蛋白物質を自動化して、無菌的に、安全に、高い収率で精製することができる糖蛋白物質自動精製装置を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明の糖蛋白物質自動精製装置は、血漿中から糖蛋白物質を分離・精製する糖蛋白物質自動精製装置において、血漿を収容する滅菌処理された第一のタンクと、第一緩衝液を充填し密閉された第二のタンクと、溶出液を無菌充填し密閉された第三のタンクと、第二緩衝液を充填し密閉された第四のタンクと、アフィニティークロマトグラフィー用無菌担体を充填し密閉されたアフィニティークロマトグラフィー用カラムと、ゲルクロマトグラフィー用無菌担体を充填し密閉されたゲルクロマトグラフィー用カラムと、アフィニティークロマトグラフィー用カラムからの液体をゲルクロマトグラフィー用カラムに送るために接続された第一の管路と、第二緩衝液をゲルクロマトグラフィー用カラムに送るために前記第四のタンクに接続された第二の管路と、ゲルクロマトグラフィー用カラムの排出側に接続された第三の管路と、血漿、第一緩衝液、溶出液をアフィニティークロマトグラフィー用カラムに送るために前記第一、第二、第三のタンクに接続された第四の管路と、第一の管路に設けられた第一のポンプと、第二の管路に設けられた第二のポンプと、第三の管路に接続された採取容器と、第三の管路の排出側に接続された排液容器と、を具備し、前記第一、第二、第三のタンクの排出側には各々電磁弁が設けられ、第四のタンクの排出側に溶液を排液容器に切り換えて送るための電磁弁が設けられ、ゲルクロマトグラフィー用カラムの排出側の接続を採取容器と排液容器に切り換えるための電磁弁が設けられ、該電磁弁と該ポンプを制御するプログラムデータを予め記憶し、該プログラムデータに基づき精製処理を実行する制御手段が設けられ、前記第一のタンク、第二のタンク、第三のタンク、第四のタンク、第一の管路、第二の管路、第三の管路、第四の管路、採取容器及び排液容器は、滅菌処理されて使用されると共に、使用後は使い捨て器具として処理されることを特徴とする。ここで、電磁弁とは、管路を電磁的に開閉する構造の全てを含む概念である。
【０００９】
【発明の作用・効果】
このような構成の糖蛋白物質自動精製装置は、予め工場などにおいて、第二のタンクに第一緩衝液が、第三のタンクに溶出液が、第四のタンクに第二緩衝液が各々無菌状態で充填され、各タンクは密閉される。また、アフィニティークロマトグラフィー用カラムにはアフィニティークロマトグラフィー用担体が無菌状態で充填されて密閉され、カラムゲルクロマトグラフィー用カラムにはゲルクロマトグラフィー用担体が無菌状態で充填されて密閉される。
【００１０】
そして、使用時に、滅菌処理された第一のタンクに血漿が収容される。制御手段は、予めプログラムされた処理工程を経時的に順に実行する。先ず電磁弁とポンプを制御して第二のタンクから第一緩衝液をアフィニティークロマトグラフィー用カラムに送り、第四のタンクから第二緩衝液をゲルクロマトグラフィー用カラムに送り、両カラム内の充填剤を平衡化する。次に、第一のタンクから血漿をアフィニティークロマトグラフィー用カラム内に送り、アフィニティークロマトグラフィー用担体に固定されたゼラチンにフィブロネクチンを吸着させる。次に、電磁弁とポンプを制御して第二のタンクから第一緩衝液を再びアフィニティークロマトグラフィー用カラムに送り、カラム内を洗浄し、これにより、カラム中のフィブロネクチン（糖蛋白物質）以外の不要な成分を排出除去する。その後、電磁弁とポンプ等を制御して第三のタンクから溶出液をアフィニティークロマトグラフィー用カラム内に送り、ゼラチンに吸着されていたフィブロネクチンを溶出させ、ゲルクロマトグラフィー用カラムに送り込む。
【００１１】
電磁弁とポンプ等を制御して第四のタンクから第二緩衝液をゲルクロマトグラフィー用カラムに送り込み、分子の大きさにより分離させる。ゲルクロマトグラフィー用担体は、分子量の小さい物質ほど良く捕捉し、分子量の大きい物質ほど早く溶出する性質があるため、フィブロネクチン（糖蛋白物質）がゲルクロマトグラフィー用担体から溶出され始めるタイミングは実験から予め把握されている。このタイミングをはかって、ゲルクロマトグラフィー用カラムから溶出されるフィブロネクチン（糖蛋白物質）を、カラムの排出を切り替えて滅菌処理された採取容器に採取する。
【００１２】
このように、上記糖蛋白物質自動精製装置によれば、精製処理を完全に自動化して糖蛋白物質を精製することができ、手作業で精製する場合に比べ、熟練技術を必要とせず、遥かに効率よく短時間（手作業では約２時間かかるが、この装置を使用した場合約３０〜４０分間）で糖蛋白物質を精製することができる。
【００１３】
また、予め工場などにおいて、第二のタンクに第一緩衝液が、第三のタンクに溶出液が、第四のタンクに第二緩衝液が各々無菌状態で充填され、各タンクは密閉される。また、アフィニティークロマトグラフィー用カラムにはアフィニティークロマトグラフィー用担体が無菌状態で充填されて密閉され、カラムゲルクロマトグラフィー用カラムにはゲルクロマトグラフィー用担体が無菌状態で充填されて密閉されるから、細菌の混入やウイルス感染などを回避して安全に糖蛋白物質を精製することができる。従来のように処理工程でＵＶモニター等の回路を再使用せず、タンク、管路、及びカラムは使い捨て使用が可能であるから、ウイルス感染等を回避して、安全に精製が可能となる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。図１はフィブロネクチン自動精製装置の概略構成図を示し、図２はその制御系のブロック図を示し、図３はコントロールパネルの正面図を示している。
【００１５】
図１において、２は第一緩衝液のタンク、１は血漿を入れるためのタンク、４は第二緩衝液のタンク、３は溶出液のタンクである。各タンク１〜４の底部には送出用の管路が接続され、タンク１、２、３の出口には溶液の送出を制御するために電磁弁５、６、７が各々に設けられる。タンク１、２、３の底部に接続された管路はアフィニティークロマトグラフィー用カラム１２の上部に接続される。
【００１６】
アフィニティークロマトグラフィー用カラム１２は、アフィニティークロマトグラフィーによりフィブロネクチンを吸着・分離するカラムで、注射筒状のカラム内にアフィニティークロマトグラフィー用担体（例えばベースゲルとしてセルロースを、リガンドとしてゼラチンを用いた担体）を充填したものであり、例えばゼラチン−セルロファイン（チッソ社製）が使用される。
【００１７】
アフィニティークロマトグラフィー用カラム１２の底部に管路Ｋ１が接続され、その管路Ｋ１の中間にポンプＰ１が配置され、管路Ｋ１の先端は電磁弁８を介してゲルクロマトグラフィー用カラム１３に接続されると共に、電磁弁９を介して排出用の管路Ｋ３に接続される。ゲルクロマトグラフィー用カラム１３は、ゲルクロマトグラフィーにより溶出液を分離するカラムで、例えば注射筒状のカラム内にセルロースを架橋剤で架橋したものを充填している。例えばセルロファインＧＨ−２５ｍ（チッソ社製）を使用することができる。
【００１８】
一方、第二緩衝液用のタンク４の底部に管路Ｋ２が接続され、この管路Ｋ２の中間にポンプＰ２が配置され、管路Ｋ２の先端はゲルクロマトグラフィー用カラム１３に接続される。また、ゲルクロマトグラフィー用カラム１３の底部には管路Ｋ３が接続され、管路Ｋ３には電磁弁１０が接続されると共に、精製されたフィブロネクチンを送出する側と、溶出液など不要な溶液を排出する側に切り替える切換電磁弁１０が接続され、電磁弁１０の排出側に排液を入れるための排液容器（袋）１５が接続され、更に、フィブロネクチンを送出する側には精製液を入れる採取容器１４が電磁弁１１を介して接続される。
【００１９】
なお、上記ポンプＰ１、Ｐ２にはモータ（例えばステッピングモータ）により駆動される小形のポンプ（例えばペリスタリックポンプ）が使用され、ポンプ停止時、管路の液体の流通を完全に遮断する構造である。また、採取側と排出側を切り換える切換電磁弁１１は、通常の切換弁に代えて、例えばソレノイドプランジャを管路Ｋ３となるチューブに連結し、そのチューブを排出側と採取容器側に曲げて移動させるように構成することもできる。
【００２０】
上記構成の精製装置は、図２に示す制御装置により制御される。この制御装置は、例えばＣＰＵを内蔵したシーケンサ２０を主要部として構成され、そのシーケンサ２０には、駆動回路を介して上記ポンプＰ１、Ｐ２、電磁弁５〜１１が接続され、図３に示すようなコントロールパネル上の各機器が接続される。即ち、精製処理のステップを表示するステップ表示器４３、溶液の単位時間流量を表示する流量表示器４４、工程の時間を表示する時間表示器４５、及び溶液の総流量を表示する総流量表示器４６が表示用ドライバを介してシーケンサ２０に接続される。
【００２１】
運転モードでは、ステップ表示器４３に現在のステップが表示され、流量表示器４４には現在の単位時間流量が表示され、時間表示器４５には開始してから現在までの経過時間が表示され、総流量表示器４６には現在のステップでの総流量が表示される。
【００２２】
また、コントロールパネルに設けた、始動時用のスタートスイッチ２２、ステップを進めるためのアドバンススイッチ２３、動作を一時停止するためのストップスイッチ２４、設定値をリセットするためのリセットスイッチ２５、運転と設定のモードを切り替えるモードスイッチ２６、設定する項目を選択するセレクトスイッチ２７、設定値を上げるためのアップスイッチ２８、設定値を下げるためのダウンスイッチ２９、設定用のセットスイッチ２１が、シーケンサ２０に接続される。シーケンサ２０には設定値を記憶するための不揮発性のメモリが内蔵される。
【００２３】
更に、タンク付近の温度を検出するためのサーミスタ等の温度センサ３０が設けられ、温度検出表示回路３１により検出された温度は温度表示器３２に表示される。また、異常時等にその異常を報知する報知用のブザー３３が設けれる。血漿からのフィブロネクチンの精製は、２２℃付近で最も良好な収率を示す。
【００２４】
シーケンサ２０内のメモリには、予め以下に示すようなフィブロネクチンの精製のためのプログラムが記憶され、時間経過に従って各ステップを読み出し、精製のための各処理を順に実行していく。
【００２５】
なお、本装置においては、予め工場などでタンク２〜４に第一緩衝液、溶出液、及び第二緩衝液が無菌状態で充填されて密閉されている。また、アフィニティークロマトグラフィー用カラムにはアフィニティークロマトグラフィー用担体が無菌状態で充填されて密閉され、カラムゲルクロマトグラフィー用カラムにはゲルクロマトグラフィー用担体が無菌状態で充填されて密閉されている。
【００２６】
第一緩衝液として例えばクエン酸ソーダ添加ＰＢＳ（リン酸緩衝液）がタンク２に充填され、タンク４には第二緩衝液として例えば滅菌ＰＢＳ（リン酸緩衝液）が充填され、タンク３には溶出液として例えばアルギニン塩酸塩が充填される。そして、タンク１には血液から分離した血漿が入れられ、精製運転を行う。
【００２７】
先ず、モードスイッチ２６を操作して設定モードに切り換え、セレクトスイッチ２７を操作して各ステップの設定項目を切り替えながら、各ステップの単位時間流量（ｍｌ／ｍｉｎ）、総流量（ｍｌ）、及び各ステップの時間を設定する。例えば、図４の表に示すように、サブステップ１−Ｐを含めて各ステップ１〜９における単位時間流量（ｍｌ／ｍｉｎ）と総流量（ｍｌ）を、例えばサブステップ１−Ｐであれば、単位時間流量を０．７（ｍｌ／ｍｉｎ）、総流量を２０（ｍｌ）というように設定する。
【００２８】
図４の表において、ステップは、サブステップ１−Ｐとメインのステップ１〜９からなり、各ステップは１から順に実施される。サブステップは１−Ｐのみである。溶液は、そのステップで使用される溶液を示す。タンクＮｏ．はその溶液を溜めるタンクを示す。供給ポンプはその時点で作動しているポンプの符号を示す。総流量はその時点までに流した溶液の総流量を示す。単位時間流量は、その時点の溶液の単位時間当りの流量を示す。カラムはその時点で処理を行なっているカラムを示す。排出ポンプはその時点で作動している排出ポンプを示す。工程はそのステップが排出工程か採取工程かを示す。電磁弁はその時点で開作動している電磁弁を示す。
【００２９】
次に、モードスイッチを操作して運転モードに切り替え、スタートスイッチを操作して精製運転に入る。図４と図５〜図１３の動作説明図を参照してフィブロネクチンの精製処理の一例を説明する。なお、本発明は、ここに示す実施例に限定されるものではない。
【００３０】
【実施例】
▲１▼  運転モードがスタートすると、シーケンサは、先ず、ステップ１を実施し、図５に示すように、電磁弁６、９を開動作させ、ポンプＰ１を起動し、これにより、タンク２から第一緩衝液がアフィニティークロマトグラフィー用カラム１２に流入する。第一緩衝液（クエン酸ソーダ添加ＰＢＳ）はカラム１２中の充填剤の平衡化を行ない、ポンプＰ１により排出用の管路Ｋ３を通して排出される。このステップ１は約７分間行なわれる。同時に、サブステップ１−Ｐが実施され、電磁弁１０を開動作させ、ポンプＰ２の作動により第二緩衝液（滅菌ＰＢＳ）が管路Ｋ２を通りゲルクロマトグラフィー用カラム１３に流入し、管路Ｋ３を通して排出されることにより、カラム１３中の充填剤の平衡化が行なわれる。このサブステップ１−Ｐによるカラム１３の洗浄は後述のステップ４まで継続される。
【００３１】
▲２▼  次に、ステップ２に進み、図６に示すように、電磁弁６が閉鎖して電磁弁５が開き、ポンプＰ１が作動する。これにより、タンク１内の血漿が、アフィニティークロマトグラフィー用カラム１２に流入し、この時血漿中の糖蛋白物質（例えばフィブロネクチン）がアフィニティークロマトグラフィー用カラム１２内の充填剤に吸着し、フィブロネクチンが分離された血漿は、ポンプＰ１により排出用の管路Ｋ３を通して排出される。このステップ２は約３分間行なわれる。
【００３２】
▲３▼  次に、ステップ３に進み、図７に示すように、ステップ１と同様に、電磁弁５が閉鎖して電磁弁６が開き、ポンプＰ１が作動し、タンク２から第一緩衝液がアフィニティークロマトグラフィー用カラム１２に流入し、ポンプＰ１により排出用管路Ｋ３を通して排出される。このステップ３は約１１分間行なわれ、フィブロネクチンが吸着した充填剤を第一緩衝液で洗浄することにより、挾雑物の排除を行ない、フィブロネクチンの純度を高める。
【００３３】
▲４▼  次に、ステップ４に進み、図８に示すように、電磁弁６が閉鎖して電磁弁７が開き、ポンプＰ１が作動する。このステップ４は約３分間実施され、溶出液（アルギニン塩酸塩）がアフィニティークロマトグラフィー用カラム１２内に流入し、この溶出液は管路Ｋ３を通して排出される。これにより、カラム１２中の充填剤に吸着したフィブロネクチンを溶出液中に溶出させる。
【００３４】
▲５▼  次に、ステップ５に進み、図９に示すように、電磁弁９、１０が閉鎖、電磁弁８が開放、ポンプＰ１が作動した状態で、ポンプ２が停止する。これにより、サブステップ１−Ｐでの第二緩衝液（滅菌ＰＢＳ）によるゲルクロマトグラフィー用カラム１３中の充填剤の洗浄が終了し、タンク３内の溶出液（アルギニン塩酸塩）がアフィニティークロマトグラフィー用カラム１２から管路Ｋ１を通してゲルクロマトグラフィー用カラム１３内に流入する。このステップ５は約２分間実施される。これにより、フィブロネクチンを含む溶出液がゲルクロマトグラフィー用カラム１３に送られる。
【００３５】
▲６▼  次に、ステップ６に進み、図１０に示すように、電磁弁７、８を閉鎖し、ポンプＰ１を停止させる。電磁弁１０を閉じ、ポンプ２が作動した状態で、タンク４内の第二緩衝液（滅菌ＰＢＳ）によって管路Ｋ２内のフィブロネクチンを含んだ溶出液をゲルクロマトグラフィー用カラム１３に強制的に送り込む。このステップ６は、約１５秒間実施される。
【００３６】
▲７▼  次に、ステップ７に進み、図１１に示すように、電磁弁１０を開放し、ポンプＰ２が作動し、第二緩衝液がタンク４から管路Ｋ２を通り、カラムに入る。これにより、管路２に残っているフィブロネクチンを含む溶出液を送り込む。このステップ７は約１分間実施される。
【００３７】
▲８▼  次に、ステップ８に進み、図１２に示すように、ポンプＰ２が作動し、これにより、第二緩衝液がタンク４から管路Ｋ２を通り、ゲルクロマトグラフィー用カラム１３内に入る。このステップ８は約４分間実施され、カラム１３内に入ったフィブロネクチンを含む溶出液は、ゲルろ過の原理により分離され、高分子成分であるフィブロネクチンが真っ先に管路Ｋ３に流出する。
【００３８】
即ち、ゲルクロマトグラフィー用担体は、分子量の小さい物質ほど良く捕捉し、分子量の大きい物質ほど早く溶出・分離する性質があるため、フィブロネクチンがゲルクロマトグラフィー用担体から溶出・分離され始めるタイミングは、使用材料の成分、量、粒径等が同じであれば略一定であり、実験から把握することができる。
【００３９】
▲９▼  次に、ステップ９に進み、図１３に示すように、電磁弁１０が閉鎖して電磁弁１１が開き、ポンプＰ２が作動する。上記と同様に、第二緩衝液がタンク４から管路Ｋ２を通りゲルクロマトグラフィー用カラム１３内に入る。
【００４０】
このステップ９の開始時が、ほぼフィブロネクチンのゲルクロマトグラフィー用担体からの溶出開始時点であるから、溶出液を含まない分離されたフィブロネクチンを含む緩衝液がカラム１３内から流出し始め、排出用管路Ｋ３を通して採取容器１４に採取される。このステップ９は約２分間実施され、血漿中に含まれるフィブロネクチンが高い効率で採取される。
【００４１】
上記ステップ１〜９は無菌状態を保つようにして行なわれ、滅菌された容器１４にフィブロネクチンは採取される。また、一旦使用したタンク１〜４、管路Ｋ１〜Ｋ３、カラム１２、１３、採取容器１４、及び排液容器１５は廃棄され、これらは使い捨て器具として使用され、新たな血漿で新たなフィブロネクチンを精製する際には、新たなタンク１〜４、管路Ｋ１〜Ｋ３、カラム１２、１３、採取容器１４、及び排液容器１５が装着される。採取されたフィブロネクチンには例えば適量の抗生剤を添加して点眼剤とされ、採血した患者自身の治療薬として使用される。また、精製されたフィブロネクチンは点眼剤の他、劇症肝炎、手術後の細菌感染症等の治療薬としても使用可能である。
【００４２】
【実験例】
図１に示す本発明の精製装置により得られたフィブロネクチン溶液について、純度、生物活性等の評価を以下のように行なった。
【００４３】
▲１▼  ＳＤＳ電気泳動によるフィブロネクチン純度の確認
本精製装置で精製されたフィブロネクチンをミニスラブゲル電気泳動法にて精製状況を確認した。ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）及び２−メルカプトエタノール（還元剤）を用いた電気泳動を行ない、その後、ゲルをＣＢＢ（クマシーブリリアントブルーＲ２５０）染色を行なった。試料として本精製装置で精製されたフィブロネクチン、精製前のヒト血漿、ヒトフィブロネクチン凍結乾燥品を用いた。
【００４４】
この結果、図１４の電気泳動後の摸式図に示すように、ヒトフィブロネクチン凍結乾燥品と本精製装置で精製されたフィブロネクチンは電気泳動後のゲル上で同等の位置にバンドとして確認された。また、ＣＢＢ染色では単一のバンドとして確認された。これにより、本発明の精製装置を使用すればフィブロネクチンの精製は可能であり、ＣＢＢ染色では他のバンドが確認されていないことから、高純度であると考えられる。
【００４５】
▲２▼  フィブロネクチン量の確認
本精製装置で精製されたフィブロネクチンを２８０nmの波長を用いた吸光度値を基にタンパク質量として測定した結果、アルブミンと比較して約０．１６〜０．９３mg/mL 含まれた。また、ＢＳＡと比較してもアルブミンと比較した時と同様な値を得ることができた。次の表１に採取されたタンパク質量と吸光度値を示す。
【００４６】
【表１】
0003793962.tif 000002
▲３▼  フィブロネクチンの接着活性の確認
ＢＨＫ２１Ｃ１３細胞を用い、ウサギ血から分離した血漿を使い、本精製装置で精製したフィブロネクチンの生物活性を確認した。細胞接着活性は西田らの方法に従った。
【００４７】
精製されたフィブロネクチンを添加することでその生物活性を確認したところ、本精製装置で精製されたフィブロネクチンを添加した試験と添加しない試験では、細胞の接着数に差が確認された。この結果から、本精製装置によって精製されたフィブロネクチンは細胞接着活性を持つと考えられる。次の表２に細胞接着数の違いを示す。
【００４８】
【表２】
0003793962.tif 000003
このように、上記精製装置を使用すれば、精製処理を完全に自動化してフィブロネクチンを精製することができ、手作業で精製する場合に比べ、熟練技術を必要とせず、遥かに効率よく短時間（手作業では約２時間かかるが、この装置を使用した場合約３０〜４０分間）でフィブロネクチンを精製することができる。
【００４９】
また、予め工場などにおいて、第二のタンクに第一緩衝液が、第三のタンクに溶出液が、第四のタンクに第二緩衝液が各々無菌状態で充填され、各タンクは密閉される。また、アフィニティークロマトグラフィー用カラムにはアフィニティークロマトグラフィー用担体が無菌状態で充填されて密閉され、カラムゲルクロマトグラフィー用カラムにはゲルクロマトグラフィー用担体が無菌状態で充填されて密閉されるから、フィブロネクチンを安全に無菌的に精製することができる。
【００５０】
また、従来のように処理工程でＵＶモニター等の回路を再使用せず、タンク１〜４、管路Ｋ１〜Ｋ３、カラム１２、１３、採取容器１４及び排液容器１５は使い捨て使用するため、ウイルス感染等の危険を回避することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施形態を示す自動精製装置の構成図である。
【図２】同装置の制御系のブロック図である。
【図３】コントロールパネルの正面図である。
【図４】精製工程の各ステップの動作状態を示すチャート図である。
【図５】ステップ１の動作説明のための構成図である。
【図６】ステップ２の動作説明のための構成図である。
【図７】ステップ３の動作説明のための構成図である。
【図８】ステップ４の動作説明のための構成図である。
【図９】ステップ５の動作説明のための構成図である。
【図１０】ステップ６の動作説明のための構成図である。
【図１１】ステップ７の動作説明のための構成図である。
【図１２】ステップ８の動作説明のための構成図である。
【図１３】ステップ９の動作説明のための構成図である。
【図１４】実験結果を示す電気泳動後の摸式図である。
【図１５】従来の手作業によるフィブロネクチンの精製を示す説明図である。
【符号の説明】
１、２、３、４−タンク
５〜１１−電磁弁
１２−アフィニティークロマトグラフィー用カラム
１３−ゲルクロマトグラフィー用カラム
２０−シーケンサ
Ｋ１〜Ｋ４−管路
１４−採取容器
１５−排液容器
Ｐ１、Ｐ２−ポンプ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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