(57)【要約】  腫脹発生抑制型腫瘍治療用ウイルスを提供することを目的とする。血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）拮抗剤をコードする遺伝子を有する、腫瘍溶解性ウイルス及び当該ウイルスを含む腫瘍治療用医薬組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）拮抗剤をコードする遺伝子を有する、腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２】
ＶＥＧＦ拮抗剤が、抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片である、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３】
ＶＥＧＦ拮抗剤が、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む抗ＶＥＧＦ抗体又は一本鎖抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４】
以下の(i)〜(iii)のいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子：
(i) 配列番号２のポリペプチド；
(ii) 配列番号２のポリぺプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチド；
(iii) 配列番号２のポリぺプチドと７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチド；
及び以下の(iv)〜(vi)のいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子：
(iv) 配列番号４のポリペプチド；
(v) 配列番号４のポリぺプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチド；
(vi) 配列番号４のポリぺプチドと７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチド；
を有する、請求項２又は３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５】
抗ＶＥＧＦ抗体が、ヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６】
ＶＥＧＦ拮抗剤が、可溶性ＶＥＧＦ受容体である、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項７】
以下の(xiii)〜(xv)のいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子を有する、請求項６に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
(xiii) 配列番号２６の塩基配列によりコードされるポリペプチド；
(xiv) 配列番号２６の塩基配列によりコードされるポリぺプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチド；
(xv) 配列番号２６の塩基配列によりコードされるポリぺプチドと７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチド。
【請求項８】
単純ヘルペスウイルスＩ型及びＩＩ型（HSV-1及びHSV-2）、アデノウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、レオウイルス、ワクシニアウイルス、セネカウイルス、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス及びコクサッキーウイルスからなる群から選択されるウイルスの変異体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項９】
腫瘍溶解性ウイルスが、単純ヘルペスウイルスＩ型変異体であって、（ａ）〜（ｃ）のいずれか一以上の特徴を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
（ａ）ＩＣＰ６遺伝子が欠失又は不活化されている、或いは腫瘍特異的プロモーター又は組織特異的プロモーターの制御下で発現する；
（ｂ）γ３４．５遺伝子が欠失又は不活化されている；
（ｃ）ＩＣＰ４７遺伝子が欠失又は不活化されている。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを治療有効量含む、腫瘍治療用医薬組成物。
【請求項１１】
前記腫瘍が、神経系型腫瘍、下垂体部腫瘍、髄芽細胞腫、黒色腫、脳腫瘍、前立腺癌、頭頚部癌、食道癌、腎癌、腎細胞癌、膵臓癌、乳癌、肺癌、結腸癌、大腸癌、胃癌、皮膚癌、卵巣癌、膀胱癌、肉腫、扁平上皮癌、神経外胚葉、甲状腺腫瘍、リンパ腫、肝細胞腫、中皮腫、類表皮癌及び良性腫瘍からなる群より選択されるヒト腫瘍である、請求項１０に記載の腫瘍治療用医薬組成物。
【請求項１２】
前記腫瘍が脳腫瘍であり、局所投与される、腫脹発生抑制型の請求項１０に記載の腫瘍治療用医薬組成物。
【請求項１３】
化学療法及び放射線療法から選択される他の腫瘍治療法と併用される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の腫瘍治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫脹発生抑制型腫瘍溶解性ウイルスに関し、特にＶＥＧＦ拮抗剤をコードする遺伝子を有する腫瘍溶解性ウイルスに関する。本発明は、また、このウイルスを用いた、腫瘍を治療するための医薬組成物及び腫瘍治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスを用いた新しい腫瘍治療法として、腫瘍細胞にウイルスを感染させ、ウイルスの複製に伴いウイルスが腫瘍細胞を破壊することにより、腫瘍を治療する研究が進められている。既存の腫瘍治療法と異なり、ウイルス複製に伴う直接的な殺細胞作用に加えて、腫瘍細胞を破壊する過程で腫瘍細胞特異的な抗腫瘍免疫が惹起され、免疫を介して全身に治療効果を及ぼすという特徴がある。近年、ＨＳＶ−１やアデノウイルスといったウイルスゲノムに人為的遺伝子改変を導入して、腫瘍選択性を高めた遺伝子組換え腫瘍溶解性ウイルスが開発されている（特許文献１〜３、非特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第４２１２８９７号公報
【特許文献２】特許第４９２１６６９号公報
【特許文献３】ＷＯ２０１１／１０１９１２
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Todo, T. et al. (2000). Molecular Therapy, 2, 588-595.
【非特許文献２】Markert, J. M. et al. (2000). Gene Therapy, 7, 867-874.
【非特許文献３】Martuza, R. L. et al. (2000). Journal of Clinical Investigation, 105, 841-846.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者が腫瘍溶解性ウイルスを用いた腫瘍治療法の臨床開発を行う過程で、ウイルスを投与した直後より腫瘍及び腫瘍周囲に腫脹が生じることが判明した。特に、脳腫瘍に対してウイルス療法を行う際に腫脹が出現すると、頭蓋内圧亢進や一時的な神経症状の悪化を来す可能性があり、治療を妨げる要因となり得る。腫瘍溶解性ウイルスを投与した直後より腫瘍及び腫瘍周囲に腫脹が生じることは、本発明者が臨床開発を実施する過程で判明した事象である。【０００６】
このような背景のもと、本発明は、腫脹発生抑制型腫瘍溶解性ウイルスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
腫瘍及び腫瘍周囲の腫脹の既存治療薬として副腎皮質ホルモン（ステロイド）が存在するが、副腎皮質ホルモンは免疫を抑制する副作用がある。一方、ウイルス療法は抗腫瘍免疫を惹起することが重要な治療機序の一つであるため、副腎皮質ホルモンはウイルス療法との併用には不向きである。また、悪性神経膠腫（悪性脳腫瘍）においては、抗ＶＥＧＦ抗体医薬のベバシズマブ（商品名：Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））が脳浮腫軽減目的で投与されることがあるが、ベバシズマブは創傷治癒を妨げる副作用があり、手術でウイルス投与を行う脳腫瘍のウイルス療法との併用においては問題点が多い。【０００８】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、ＶＥＧＦに拮抗するＶＥＧＦ拮抗剤を、腫瘍溶解性ウイルスに発現させることで、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下のものに関する。【０００９】
［１］
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）拮抗剤をコードする遺伝子を有する、腫瘍溶解性ウイルス。
［２］
ＶＥＧＦ拮抗剤が、抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片である、［１］に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
［３］
ＶＥＧＦ拮抗剤が、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む抗ＶＥＧＦ抗体又は一本鎖抗ＶＥＧＦ抗体である、［２］に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
［４］
以下の(i)〜(iii)のいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子：
(i) 配列番号２のポリペプチド；
(ii) 配列番号２のポリぺプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチド；
(iii) 配列番号２のポリぺプチドと７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチド；
及び以下の(iv)〜(vi)のいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子：
(iv) 配列番号４のポリペプチド；
(v) 配列番号４のポリぺプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチド；
(vi) 配列番号４のポリぺプチドと７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチド；
を有する、［２］又は［３］の記載の腫瘍溶解性ウイルス。
［５］
抗ＶＥＧＦ抗体が、ヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体である、［２］〜［４］のいずれかに記載の腫瘍溶解性ウイルス。
［６］
ＶＥＧＦ拮抗剤が、可溶性ＶＥＧＦ受容体である、［１］に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
［７］
以下の(xiii)〜(xv)のいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子を有する、［６］に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
(xiii) 配列番号２６の塩基配列によりコードされるポリペプチド；
(xiv) 配列番号２６の塩基配列によりコードされるポリぺプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチド；
(xv) 配列番号２６の塩基配列によりコードされるポリぺプチドと７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチド。
［８］
単純ヘルペスウイルスＩ型及びＩＩ型（HSV-1及びHSV-2）、アデノウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、レオウイルス、ワクシニアウイルス、セネカウイルス、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス及びコクサッキーウイルスからなる群から選択されるウイルスの変異体である、［１］〜［７］のいずれかに記載の腫瘍溶解性ウイルス。
［９］
腫瘍溶解性ウイルスが、単純ヘルペスウイルスＩ型変異体であって、（ａ）〜（ｃ）のいずれか一以上の特徴を有する、［１］〜［７］のいずれかに記載の腫瘍溶解性ウイルス。
（ａ）ＩＣＰ６遺伝子が欠失又は不活化されている、或いは腫瘍特異的プロモーター又は組織特異的プロモーターの制御下で発現する；
（ｂ）γ３４．５遺伝子が欠失又は不活化されている；
（ｃ）ＩＣＰ４７遺伝子が欠失又は不活化されている。
［１０］
［１］〜［９］のいずれかに記載の腫瘍溶解性ウイルスを治療有効量含む、腫瘍治療用医薬組成物。
［１１］
前記腫瘍が、神経系型腫瘍、下垂体部腫瘍、髄芽細胞腫、黒色腫、脳腫瘍、前立腺癌、頭頚部癌、食道癌、腎癌、腎細胞癌、膵臓癌、乳癌、肺癌、結腸癌、大腸癌、胃癌、皮膚癌、卵巣癌、膀胱癌、肉腫、扁平上皮癌、神経外胚葉、甲状腺腫瘍、リンパ腫、肝細胞腫、中皮腫、類表皮癌及び良性腫瘍からなる群より選択されるヒト腫瘍である、［１０］に記載の腫瘍治療用医薬組成物。
［１２］
前記腫瘍が脳腫瘍であり、局所投与される、腫脹発生抑制型の［１０］に記載の腫瘍治療用医薬組成物。
［１３］
化学療法及び放射線療法から選択される他の腫瘍治療法と併用される、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の腫瘍治療用医薬組成物。【００１０】
本発明は、また、以下の方法及び使用にも関する。
［１４］
［１］〜［９］のいずれかに記載の腫瘍溶解性ウイルスの治療有効量を、腫瘍の治療を必要とする対象に投与することを含む、腫瘍の治療方法。
［１５］
前記腫瘍が、神経系型腫瘍、下垂体部腫瘍、髄芽細胞腫、黒色腫、脳腫瘍、前立腺癌、頭頚部癌、食道癌、腎癌、腎細胞癌、膵臓癌、乳癌、肺癌、結腸癌、大腸癌、胃癌、皮膚癌、卵巣癌、膀胱癌、肉腫、扁平上皮癌、神経外胚葉、甲状腺腫瘍、リンパ腫、肝細胞腫、中皮腫、類表皮癌及び良性腫瘍からなる群より選択されるヒト腫瘍である、［１４］に記載の方法。
［１６］
前記腫瘍が脳腫瘍であり、前記ウイルスが局所投与される、［１４］に記載の方法であって、腫脹発生が抑制される、方法。
［１７］
化学療法及び放射線療法から選択される他の腫瘍治療法と併用される、［１４］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］
腫瘍を治療するための医薬の製造における、［１］〜［９］のいずれかに記載の腫瘍溶解性ウイルスの使用。
［１９］
前記腫瘍が、神経系型腫瘍、下垂体部腫瘍、髄芽細胞腫、黒色腫、脳腫瘍、前立腺癌、頭頚部癌、食道癌、腎癌、腎細胞癌、膵臓癌、乳癌、肺癌、結腸癌、大腸癌、胃癌、皮膚癌、卵巣癌、膀胱癌、肉腫、扁平上皮癌、神経外胚葉、甲状腺腫瘍、リンパ腫、肝細胞腫、中皮腫、類表皮癌及び良性腫瘍からなる群より選択されるヒト腫瘍である、［１８］に記載の使用。
［２０］
前記腫瘍が脳腫瘍であり、前記医薬が局所投与され、前記医薬が腫脹発生抑制型である、［１８］に記載の使用。
［２１］
前記医薬が化学療法及び放射線療法から選択される他の腫瘍治療法と併用される、［１８］〜［２０］のいずれかに記載の使用。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、腫脹発生抑制型腫瘍溶解性ウイルスを提供することができる。これにより、より安全かつ容易に腫瘍治療を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】抗体発現遺伝子からの抗体の発現メカニズム（Zitvogel, L., et al. (1994) Human gene therapy 5, 1493-1506,より改変）。口蹄疫病ウイルス（FMDV）2A配列を使うと、上流と下流の遺伝子発現がほぼ同等となる。タンパク分泌はsignal recognition particle (SRP)を介して行われる。H鎖のIg kappa leader sequenceがリボソームで翻訳されると、SRPがこれを認識して結合し、小胞体上に存在するSRP受容体に結合することで、膜上のtransloconを介して、下流のポリペプチド鎖が粗面小胞体内に送り込まれる。この際にN末端側のleader sequenceはシグナルペプチダーゼによって切断され、そのC末端側のみが粗面小胞体内へ送り込まれる。FMDV-2A配列は翻訳時にシス切断される。L鎖に関しても同様に粗面小胞体内へ送り込まれる。その後ゴルジ体に送られ、furinによって塩基性アミノ酸標的配列Arg-X-(Lys/Arg)-Argが特異的に認識され切断される。これによって、自己開裂した2A配列の残基が切離され、結果として二本鎖抗体が形成され、細胞外に分泌される。
【図２】本実施例で用いたウイルスの構造。TRL、IRLに存在する2つのγ34.5に欠失、ULに存在するICP6にLacZ遺伝子を挿入することによる不活化、USに存在するα47とそれに重複するUS11プロモーター領域に欠失を有するG47Δを基本骨格とする。T-BV及びT-VHVLは、ICP6を欠失させ、欠失領域にLacZとpolyA（PA）及び逆向きのサイトメガロウイルスプロモーター（CMVP）とその下流にそれぞれの抗体発現遺伝子（図中antibodyと表記）を挿入して作製した（A）。LacZとPA、CMVpのみが挿入されたT-01をコントロールウイルスとして使用した（B）。
【図３】T-BACシステム。BACをG47ΔのゲノムのICP6欠失部位に挿入することによって、G47Δゲノムの維持や増幅を容易としたT-BACは、loxP配列とFRT配列を持ち、同様にこの2つの配列を有し、治療遺伝子が挿入されたシャトルベクタープラスミドであるSV-01と混合して、Cre/loxPとFLP/FRTの2つのリコンビナーゼシステムを併用することで、外来遺伝子の挿入とBACの切り出しが起こり、外来遺伝子が挿入されたG47Δの作製が可能となる。KM：カナマイシン耐性遺伝子、CP：クロラムフェニコール耐性遺伝子、lmd：λスタッファー配列、GFP：Green Fluorescent Protein
【図４】抗ヒトVEGF抗体発現のためのアミノ酸配列の設計。ベバシズマブのFab領域、ヒトIgG1のFc領域のアミノ酸配列をそれぞれthe international ImMunoGeneTics information system（IMGT）、National Center for Biotechnology Information（NCBI）のデータベースから入手した。重鎖（H鎖）、軽鎖（L鎖）それぞれに対応するポリペプチドのN末端側に分泌シグナルとしてIg kappa leader sequence及びシグナルペプチダーゼ認識部位を結合したもの同士を、口蹄疫病ウイルス（FMDV）2A配列及びfurin認識配列で結合し、抗ヒトVEGF抗体発現のためのアミノ酸配列を設計した。
【図５】抗VEGF scFv発現のためのアミノ酸配列の設計。Liang, W. C., et al. (2006) The Journal of biological chemistry 281, 951-961に記載されている抗VEGF抗体G6-31のH鎖及びL鎖のFabに対応するアミノ酸配列をリンカーでつなぎ、N末端側には分泌シグナルとしてIg kappa leader sequence及びシグナルペプチダーゼ認識配列を結合して、抗VEGF scFv発現のためのアミノ酸配列を設計した。リンカーはscFvで一般的に使われているGSリンカーを使用した。
【図６】pEX-K-BVの構造を示す模式図である。
【図７】sVEGFR1のcDNA配列を示す図である。
【図８】T-VEGFscFv(VHVLCL)のcDNA配列を示す図である。制限酵素（下線）、コザック配列、開始コドン（四角枠）、Ig kappa leader sequence（下線）、重鎖ＶＨ、リンカー（四角枠）、軽鎖ＶＬ、軽鎖ＣＬ（太字）、終始コドン（四角枠）、制限酵素（下線）の順で記載されている。
【図９】抗ヒトVEGF抗体発現遺伝子のｃDNA。図４のアミノ酸配列を元に、ヒトでのコドンに最適化した塩基配列への変換した後、N末端にKozak配列、開始コドン、BamHI認識配列を、C末端にNotI認識配列をそれぞれ結合し、抗体発現をエンコードするcDNAを設計した。
【図１０】抗VEGF scFv発現遺伝子のｃDNA。Liang, W. C., et al. (2006) The Journal of biological chemistry 281, 951-961に記載されているG6-31のアミノ酸配列から遺伝情報処理ソフトウェアGENETYXを用いてcDNAを設計した。重鎖、軽鎖それぞれに対応するcDNAをリンカーでつなぎ、抗VEGF scFv発現cDNAを作製した。リンカーはscFvで一般的に使われているGSリンカーを使用した。T-BVと同様に、VH配列のN末端側には分泌シグナルとしてIg kappa leader sequence及びシグナルペプチダーゼ認識配列を結合した。
【図１１】BV/SV-01をトランスフェクションしたHEK293T細胞上清を用いたウエスタンブロッティング。HEK293TにBV/SV-01をトランスフェクションし、その培養上清を用いてSDS-PAGE及びnative PAGEを行った。陰性対照にはSV-01をトランスフェクションした上清、陽性対照にはAvastin(登録商標)を用いた。タンパク質の検出には抗ヒトIｇG（H+L）抗体を用いた。SDS-PAGE（図１１Ａ）、native PAGE（図１１Ｂ）いずれにおいても陽性対照であるAvastin(登録商標)と同様の結果となり、今回新規ウイルス作製に用いた抗ヒトVEGF抗体発現型遺伝子の発現するタンパク質が二本鎖抗体であることが確認された。
【図１２】ウイルス感染上清を用いたELISAによる抗ヒトVEGF抗体の発現量の定量。6穴プレートに撒いたVero細胞及びU87MG細胞に対して、T-01、T-BV又はmockをMOI 0.2で感染させ、2 mL培地中で72時間培養した後に、上清を回収し、限外濾過によって2.7倍に濃縮したものを検体とした。スタンダードはAvastin(登録商標)の8段階希釈系列を使用した。ELISAプレートのウェルにヒトVEGFを固相化し、抗ヒトIgG（Fc）抗体で検出した。450 nmの吸光度を測定し、検体の抗VEGF抗体濃度を算出した。Vero細胞、U87MG細胞について、T-BVの感染細胞上清からは、それぞれ256 pg/mL、69 pg/mLの抗VEGF抗体が検出され、T-01及びmockの培養上清からはいずれも検出限界以下であった。
【図１３】U87MG皮下腫瘍におけるT-BVからの抗VEGF抗体の検出。Balb/c nu/nu 雌マウスのU87MG皮下腫瘍が5 mmになったことを確認し、T-01、T-BV及びmock群の各群9匹ずつに群分けした。2 x 106 pfuのウイルスを腫瘍内に単回投与し、PID2、4、6に各群3匹ずつマウスを安楽死させ、皮下腫瘍を摘出し、そこに含まれる抗ヒトVEGF抗体をELISAで定量した。いずれの時点においてもT-BV群からは抗ヒトVEGF抗体の発現を認めた。bar；SEM
【図１４】血管内皮細胞管腔形成試験。T-01又はT-BV感染させたVero細胞の培養上清を検体として用いた。VEGF作用に関する陰性対照/陽性対照として、細胞上清を加えていないn.c./ウイルスを未感染の細胞上清を加えたmockを、抗VEGF作用に関する陰性対照/陽性対照として、T-01の培養上清/培地にAvastin(登録商標)を2段階の濃度で添加したp.c.1（4 ng/mL）・p.c.2（4 μg/mL）を、それぞれ設定した。HUVEC-2を各検体を加えた培地で22時間培養後に、カルセインで染色し、管腔形成像を蛍光顕微鏡下で撮影し、形成された管腔の長さを測定し、全長を算出した。T-BV群ではT-01群と比較して、有意に管腔形成が抑制された（p = 0.014）。bar；SEM
【図１５】血管内皮細胞遊走試験。T-01又はT-BV感染させたVero細胞の培養上清を検体として用いた。VEGF作用に関する陰性対照/陽性対照として、細胞上清を加えていないn.c./ウイルスを未感染の細胞上清を加えたmockを、抗VEGF作用に関する陰性対照/陽性対照として、T-01の培養上清/培地にAvastin(登録商標)を2段階の濃度で添加したp.c.1（4 ng/mL）・p.c.2（4 μg/mL）を、それぞれ設定した。HUVEC-2を各検体を加えた培地で16時間培養後に、遊走してきたHUVEC-2をカルセインで染色した後に蛍光顕微鏡下で撮影し、蛍光強度を算出して比較した。T-BV群ではT-01群と比較して、有意に遊走が抑制された（p = 0.007）。bar；SEM
【図１６】抗VEGF抗体の種間交差性の検討。T-BVをHEK293T細胞にMOI 3で感染させ、15時間培養した上清を用いた。また、対照として抗ヒトVEGF抗体であるAvastin(登録商標)、ウサギ抗マウスVEGF抗体を用いた。また検出抗体と固相化したVEGFとの交差反応による偽陽性を除外するために、mockに関しては2種類の検出抗体を反応させた。450 nmでの吸光度を測定した。抗マウスVEGF抗体はマウスVEGF（mVEGF）・ヒトVEGF（hVEGF）の両方に結合したが、T-BV感染細胞上清及びAvastin(登録商標)はhVEGFにのみ結合した。この結果から、T-BVの発現抗体はAvastin(登録商標)と同様にhVEGFに対する特異性が高いと考えられた。
【図１７】in vitro cytotoxicity assay。U87MG細胞（図１７A）、TGS-01細胞（図１７B）、TGS-04細胞（図１７C）におけるin vitro cytotoxicity assayを行った。TGSは浮遊系細胞であるため、MTS assayを用いて殺細胞効果を評価した。コントロール群における生存細胞数に対する各群の生存細胞数の割合をcytopathic effectとして示した。T-01とT-BVの殺細胞効果はほぼ同等と考えられた。bar; ±SD
【図１８】in vitro replication assay。Vero細胞（図１８A）、U87MG細胞（図１８B）に対してウイルスをMOI 0.01で感染させ、24時間及び48時間培養後に培地ごと細胞を回収し、そこに含まれるウイルスの力価を測定した。いずれの細胞・ウイルスにおいても24時間から48時間までにウイルスの複製を認め、いずれの時点でもT-01とT-BVの複製能はほぼ同等と考えられた。bar；SD
【図１９】U87MG皮下腫瘍モデルにおけるT-BVの抗腫瘍効果の検討。Balb/c nu/nu 雌マウスの左側腹部皮下に2 x 106 cellsのU87MG細胞を移植し、腫瘍径が6 mm大になった時点でT-BV、T-01、mockの3群に各群10匹ずつランダムに振り分け、2 x 105 pfuのウイルスを中3日開けて腫瘍内に2回投与し、週2-3回腫瘍径を測定し、腫瘍体積を算出した。ウイルス投与後20日目の時点で、T-01群ではmockに対して有意な腫瘍増大抑制効果を認め（p = 0.00749、独立t検定）、さらにT-BVはT-01と比較して有意な腫瘍増大抑制効果を認めた（p = 0.0211、独立t検定）。bar；SEM
【図２０】U87MG脳内モデルにおけるT-BVの抗腫瘍効果の検討。Balb/c nu/nu 雌マウスの右前頭葉内に2 x 105 cellsのU87MG細胞を定位脳手術装置を用いて移植し、移植後10日目にT-BV、T-01、mockの3群に各群10匹ずつランダムに振り分け、1 x 106 pfuのウイルスを腫瘍内に単回投与し、その後の各個体の生存期間を記録した。ウイルス投与後27日目の時点でmock群は全滅したのに対して、76日目の最終フォローアップの時点で、T-01群で3匹、T-BV群で6匹の生存を認めた。T-01、T-BVともにmockと比較して有意な生存延長効果を示し（ともにp < 0.001）、T-BVはT-01よりも生存期間の延長傾向がみられた（p = 0.163）。
【図２１】TGS-01及びTGS-04脳内腫瘍モデルにおけるT-BVの抗腫瘍効果の検討。Balb/c nu/nu 雌マウスの右前頭葉内に1 x 105 cellsのTGS-01細胞（図２１A）又はTGS-04細胞（図２１B）を定位脳手術装置を用いて移植し、それぞれ移植後10日目及び20日目にT-BV、T-01、mockの3群に各群10匹ずつランダムに振り分け、2 x 106 pfuのウイルスを腫瘍内に単回投与し、各個体の生存期間を記録した。TGS-01脳内腫瘍モデルでは、mock群と比較してT-BV群、T-01群ともに生存期間の有意な延長を認め（ともにp < 0.01）、さらにT-BVはT-01と比較しても生存期間の有意な延長を認めた(p = 0.0475)。TGS-04脳内腫瘍モデルでは、mockと比較してT-01では生存の延長を認めなかったが、T-BVでは生存期間の有意な延長を認めた（p = 0.0495）。
【図２２】脳腫瘍細胞株（U87MG細胞）を用いた脳内腫瘍モデルのMRI撮影。Balb/c nu/nu 雌マウスの右前頭葉内に2 x 105 cellsのU87MG細胞を定位脳手術装置を用いて移植し、移植後11日目にウイルス投与前のMRI（pre）を撮像し、12日目に全20匹に対して、mock群、T-01群、T-BV群及びT+A群に無作為にグループ分けをした上で、2 x 106pfuのウイルスを腫瘍内に単回投与し、PID2、4、6にMRI（T2WI及びT1WI（CE））を撮像した。T+A群については、ウイルス投与日から5日目までAvastin(登録商標) 5 mg/kgを連日腹腔内投与した。ウイルス投与後に腫瘍周囲のT2WIでの高信号域の出現を認めた。
【図２３】U87MG脳内腫瘍モデルにおけるT-BVの腫脹抑制効果の検討(1)（MRI）。U87MG脳内腫瘍モデルのMRIデータを元に、腫脹（浮腫）の定量を行った。T2WI及びT1WI（CE）での高信号域の面積の計測をフリーソフトウェアOsirixを用いて行った。T2WI、T1WI（CE）それぞれについて、ウイルス投与前の高信号域に対する、各撮像日の高信号域の比を算出し、T2WIでの値をT1WI（CE）での値で除することで、腫脹領域の相対値を求めた（図２３A）。mock群では腫脹をほとんど認めず、相対値も一貫してほぼ1で経過していた。T-01群ではPID2、4、6で相対値の上昇を認めるのに対して、T-BV群ではPID4、6、T+A群ではPID2、4、6では相対値が有意に低く（すべてp < 0.05）、腫脹の発生が抑えられていると考えられた（図２３B）。bar；SEM
【図２４】U87MG脳内腫瘍モデルにおけるT-BVの腫脹抑制効果の検討(2)（RT-qPCR）。Balb/c nu/nu 雌マウスを用いたU87MG脳内腫瘍モデルに対して、mock、 T-01、T-BV及びT+A群で各群6匹ずつグループ分けを行い、1 x 106 pfuのウイルスを腫瘍内に単回投与した。T+A群では、ウイルス投与日から5日目までAvastin(登録商標) 5 mg/kgを連日腹腔内投与した。PID6に右前頭葉を採取し、抽出したRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを作製して、マウスAQP4に対する定量PCRを行った。house keeping geneとしてマウスβアクチン（mActb）を用いた。mock群と比較して、T-01群ではマウスAQP４の発現が有意に上昇し（p < 0.01）、T-01群と比較してT-BV群及びT+A群では、AQP4の発現が有意に低下していた（ともにp < 0.01）。bar；SEM
【図２５】U87MG脳内腫瘍モデルにおけるT-BVとT-VHVLの腫脹抑制効果の比較検討（代表的画像）。Balb/c nu/nu 雌マウスの右前頭葉内に2 x 105 cellsのU87MG細胞を定位脳手術装置を用いて移植し、移植後11日目にウイルス投与前のMRI（pre）を撮像し、12日目に全20匹に対して、mock群、T-01群、T-BV群及びT-VHVL群に無作為にグループ分けをした上で、2 x 106 pfuのウイルスを腫瘍内に単回投与し、PID2、4、6にMRI（T2WI及びT1WI（CE））を撮像した。
【図２６】U87MG脳内腫瘍モデルにおけるT-BVとT-VHVLの腫脹抑制効果の比較検討（浮腫領域の定量）。U87MG脳内腫瘍モデルのMRIデータに関して、前述の実験と同様に腫脹（浮腫）の評価を行った。T-01と比較した場合に、T-BVはPID4で有意に腫脹領域の縮小を認め（p = 0.022）、T-VHVLに関してもT-01と比較して腫脹領域の縮小傾向が見られた。bar；SEM
【図２７】U87MG脳内腫瘍モデルに対するウイルス投与後のフローサイトメトリーによるマクロファージの評価（代表的散布図）。Balb/c nu/nu 雌マウスを用いたU87MG脳内腫瘍に対して、T-01、T-BV、T+A、及びmock群で各群9匹ずつにグループ分けを行い、1 x 106 pfuのウイルスを腫瘍内に単回投与し、PID2、4、6に右前頭葉を採取し、単細胞懸濁液を調整した。T+A群については、ウイルス投与日から安楽死までAvastin(登録商標) 5 mg/kgを連日腹腔内投与した。散乱光の二次元プロットでミエリン分画を除き、doublet除去、死細胞除去を行った後、CD45陽性、CD11b陽性、F4/80 陽性でゲーティングしたものをGr-1及びCX3CR1で展開し、M1（Gr-1highCX3CR1low ）、M2（Gr-1lowCX3CR1high ）の2つの細胞集団を分離した。mock投与群では一貫してM2分画が優位であるのに対して、ウイルス投与群ではPID2にM1分画が優位となった。
【図２８−１】M1/M2比の経時的推移。M1、M2それぞれについて、CD45陽性細胞中の割合を算出し、M1/M2の比を算出することで、M1、M2のどちらが優位であるか評価を行った。mock群ではM1/M2の経時的な推移は0.04 - 0.03 - 0.05と一貫してM2優位な状態であるのに対して、ウイルス投与群ではM1/M2 > 1となり、M1優位となった。T-01群ではこのM1/M2の値が6.21 - 1.81 - 0.13と時間経過とともに低下し、M1優位な状態からM2優位な状態に戻るのに対して、T-BV群及びT+A群ではM1/M2の値は、それぞれ6.87 - 1.64 - 0.69、6.42 - 1.41 - 0.69と時間経過とともに低下するものの、PID6でもM1の割合が比較的保たれており、それぞれのM1/M2比はT-01よりも優位に高かった（p < 0.05、 p < 0.01）。bar；SEM
【図２８−２】M1優位な状態が継続することによる、ウイルス力価への影響を調べた。T-01、T-BV及びT+A群について、PID1, PID3及びPID7におけるウイルス力価を調べたところ、いずれの測定日においても、３つの群間でのウイルス力価に有意差は見られなかった。
【図２９】U87MG脳内腫瘍に対するT-BV投与後の血清中の抗VEGF抗体の定量。Balb/c nu/nu 雌マウスのU87MG脳内腫瘍に対して、mock、T-01、T-BV及びT+A群を設定し、各群6匹ずつに群分けした。1 x 106 pfuのウイルスを腫瘍内に単回投与し、PID1、3に各群3匹ずつ静脈採血を行い、その血清に含まれる抗ヒトVEGF抗体をELISAで定量した。T+A群については、ウイルス投与日にAvastin(登録商標) 5 mg/kgを腹腔内に単回投与した。いずれの時点においてもT+A群からは抗ヒトVEGF抗体が検出されたが、他の群ではすべて検出限界以下であった。bar；SEM
【図３０】ELISA法によるT-sVEGFR1及びT-VEGFscFvのVEGF阻害因子タンパク質発現確認を示すグラフである。VeroにT-01、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvを感染させ、48時間培養した上清を用いてELISAを行った。A. T-sVEGFR1の培養上清では、sVEGFR1タンパク質が検出された。B. T-VEGFscFvの培養上清ではVEGFscFvタンパク質が検出された。いずれも、mock及びT-01の培養上清では、検出されなかった。n = 3; Error bar, 標準偏差; ND, Not detected.
【図３１】血管内皮細胞管腔形成試験の結果を示すグラフである。T-01、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvをVeroにMOI 0.2で感染して2日間培養した上清を回収し40倍濃縮した後、Matrigel Matrixがコートされたウェルに加え、さらにHUVECを2×104cells/wellとなるようにまいた。陽性対照は、Bevacizmabを4 μg/mlとなるようにMedium 200 / 1% LSGS に添加したものを、また、陰性対照はMedium 200 / 1% LSGSのみを加えた。22時間培養後、HUVECの管腔形成像を顕微鏡下で撮影し (図３１A) 、管腔の長さの合計を算出し、比較した。T-sVEGFR1及びT-VEGFscFv感染群では、T-01感染群と比較して有意にTube Formationが抑制された (図３１B)。n = 3; Error bar, 標準偏差; *, p < 0.05
【図３２】血管内皮細胞遊走試験の結果を示すグラフである。上部チャンバーにHUVECを1×105 cells/wellとなるようにまいた。また、下部ウェルには、T-01、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvをMOI 0.2で感染して2日間培養した上清を40倍濃縮したものを加えた。また、上部チャンバーにHUVECを1×105 cells/wellとなるようにまいた。陽性対照は、Bevacizmabを4 μg / mlとなるようにMedium 200 / 1% LSGSに添加したものを、また、陰性対照はMedium 200 / 1% LSGSのみを加えた。22時間培養後、calcein AM solutionで上部チャンバーのメンブレンを通過して下部ウェルに遊走したHUVECを蛍光染色して、蛍光顕微鏡下で撮影し (図３２A) 、蛍光強度を測定した (図３２B)。T-sVEGFR1及びT-VEGFscFv感染群では、T-01感染群と比較して有意にHUVECのMigrationが抑制された。n = 3; Error bar, 標準偏差; *, p < 0.05
【図３３】T-sVEGFR1、T-VEGFscFvのHT-29でのin vitroウイルス複製アッセイの結果を示すグラフである。HT-29を6 wellプレートに4×105cells/wellとなるように播種し、T-01、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvをMOI 0.01で感染させ、24時間及び48時間培養後、ウイルスの力価を測定した。24時間後及び48時間後いずれにおいても、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFv感染群では、複製したウイルスの力価はT-01感染群とほぼ同等であった。n = 3; Error bar, 標準偏差。
【図３４】T-sVEGFR1、T-VEGFscFvのHT-29における in vitro 殺細胞アッセイの結果を示すグラフである。HT-29を6 wellプレートに2×105cells/wellとなるように播種し、T-01、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvをMOI 0.1及び0.01で感染させた。感染後、4日間に渡り、24時間後ごとにそれぞれ生存細胞を測定し、Mockに対する細胞数の割合を算出した。T-sVEGFR1及びT-VEGFscFv はT-01とほぼ同等の殺細胞効果を示した。n = 3; Error bar, 標準偏差。
【図３５】HT-29皮下腫瘍モデルに対するT-sVEGFR1及びT-VEGFscFvの抗腫瘍効果を示すグラフである。BALB/c nu/nuの左側腹部皮下にHT-29を1×106cells / 50 μl 投与し、皮下腫瘍を作製した。Day 0とDay 3の二回 、T-01、T-sVEGFR1、T-VEGFscFv及びMockを1×106pfu / 20 μl腫瘍内に投与した。Day 32において、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFv投与群では、T-01投与群と比較して、有意に強い抗腫瘍効果がみられた。n = 8; Error bar, 標準偏差; **, p < 0.01
【図３６】HT-29皮下腫瘍の腫瘍内微小血管密度を示すグラフである。HT-29皮下腫瘍の組織切片のCD31陽性細胞をカウントし、腫瘍内微小血管密度を求めた結果、Day 3及びDay 7ともにT-sVEGFR1及びT-VEGFscFv投与群において、T-01投与群と比較して有意に腫瘍内微小血管が減少した。n = 3; Error bar, 標準偏差; *, p < 0.05
【図３７】CT26皮下腫瘍に対するT-sVEGFR1及びT-VEGFscFvの抗腫瘍効果を示すグラフである。BALB/cマウスの左側腹部皮下にCT26を1×105 cells/ 50μl 投与し、皮下腫瘍を作製した。Day 0とDay 3の2回 、T-01、T-sVEGFR1、T-VEGFscFv及びMockを1×106pfu/ 20 μl腫瘍内に投与した。腫瘍体積を測定したところ、Day 28において、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFv投与群では、T-01と比較して、有意に強い抗腫瘍効果がみられた。n = 7; Error bar, 標準偏差; *, p < 0.05
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態（「本実施形態」ともいう。）に基づき、本発明について詳しく説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。
【００１４】
本実施形態は、一態様において、ＶＥＧＦ拮抗剤をコードする遺伝子を有する、腫瘍溶解性ウイルスに関する。本明細書中、ＶＥＧＦ拮抗剤とは、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の生物学的活性を中和、遮断、低減又は妨害する分子を指し、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ受容体間の相互作用を妨害する分子、例えばＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体に結合し、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体間の相互作用を阻害するか、又は他の方法で妨げる分子を含む。一態様において、本実施形態のＶＥＧＦ拮抗剤は、１ｎＭ〜１μＭ、好ましくは５００ｎＭ〜１μＭのＫｄでＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体と結合する。ＶＥＧＦ拮抗剤としては、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、ＶＥＧＦ受容体、可溶性ＶＥＧＦ受容体（ｓＶＥＧＦＲ）、ペプチドリガンド、ＶＥＧＦ阻害作用を有する核酸等が挙げられ、好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体又はｓＶＥＧＦＲである。
【００１５】
本実施形態において、「ＶＥＧＦ」は、ヒトＶＥＧＦのみならず、非ヒトＶＥＧＦ（例えば、マウス、ラット、ヒト以外の霊長類等のＶＥＧＦ）を含む。一態様において、本実施形態のＶＥＧＦは、本実施形態のウイルスの投与対象である生物のＶＥＧＦであり、例えば本実施形態をヒトに投与する場合、ＶＥＧＦは好ましくはヒトＶＥＧＦである。ＶＥＧＦには、ＶＥＧＦファミリーと呼ばれる７種類の増殖因子、すなわち、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＰＬＧＦ−１及びＰＬＧＦ−２（ＰＬＧＦ：胎盤増殖因子）が存在し、それぞれが異なる物理的及び生物学的性質を有するが、本実施形態において、好ましくは、ＶＥＧＦは、血管内皮細胞の増殖、管腔形成促進等に関与する、ＶＥＧＦ−Ａである。
【００１６】
一態様において、本実施形態のＶＥＧＦ拮抗剤は、十分な親和性及び特異性でＶＥＧＦと結合する抗ＶＥＧＦ抗体である。抗ＶＥＧＦ抗体としては、市販品（例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ラムシルマブ等）を用いてもよいし、他の公知の抗ＶＥＧＦ抗体を用いてもよい。ベバシズマブは、ＶＥＧＦ−Ａと特異的に結合することにより、ＶＥＧＦ−Ａとその受容体（ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２）との結合を阻害する抗体である。ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）は血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）に対するモノクローナル抗体のＦａｂ断片である。ラムシルマブは、ＶＥＧＦＲ−２に対する抗体であり、ＶＥＧＦ−Ａのみならず、Ｃ、ＤとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害することにより、ＶＥＧＦリガンドによるシグナル伝達を阻害する。さらに、抗ＶＥＧＦ抗体として、ＶＥＧＦ抗原を用いて当業者に公知の方法を用いて作製した抗ＶＥＧＦ抗体を用いてもよい。一態様において、本実施形態のＶＥＧＦ拮抗剤は、ベバシズマブである。
【００１７】
一態様において、本実施形態の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ−Ａと結合する抗体及び／又は、ＶＥＧＦと、ＶＥＧＦＲ−１との結合を阻害する抗体であることが好ましい。
【００１８】
本実施形態の一態様において、ＶＥＧＦ拮抗剤が抗ＶＥＧＦ抗体である場合、抗体は完全長抗体であっても、その断片であってもよい。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、好ましくはモノクローナル抗体である。一態様において、抗体の種類は特に限定されず、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、他の動物由来の抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、トリ抗体）等、任意のものを用いることができるが、好ましくは、当該抗体をコードする遺伝子を有する腫瘍溶解性ウイルスが溶解対象とする腫瘍と同一の生物に対する抗体を用いることができる。例えば、腫瘍溶解性ウイルスがヒト腫瘍溶解性である場合、ヒトＶＥＧＦに対するヒト抗体又はヒト化抗体を用いることができる。いずれの抗体も、公知の手法を用いて作製することができる。また、公知の抗体を用いることができる。
【００１９】
本実施形態の一態様において、ＶＥＧＦ拮抗剤は、抗ＶＥＧＦ抗体の断片であってもよい。本明細書において抗体の断片は、抗体の断片自体又は抗体の断片に任意の分子を結合させたもののいずれかであって、もとの抗体と同一のエピトープを認識するものを意味する。もとの抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むものであれば特に限定されず、具体的には、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ領域からなるＦａｂフラグメント；さらにヒンジ領域を含むＦａｂ’フラグメント；２つのＦａｂがヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結されているＦ（ａｂ’）２フラグメント；ＶＬ及びＶＨからなるＦｖ；ＶＬ及びＶＨを人工のポリペプチドリンカーで連結した一本鎖抗体であるｓｃＦｖのほか、ｓｄＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃ（Ｆｖ）２が挙げられるが、これらに限定されず、抗体の抗原結合部位を構成する２つの可変領域である重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を有するものであれば特に限定されない。
【００２０】
これらは、いずれも、公知の手法を用いて作製することができる。例えば、ｓｃＦｖは、ＶＨ及びＶＬを、既知のリンカー（ＧＳリンカー（配列番号：１１）等）で結んで作成することができる。
【００２１】
一態様において、抗体又はその断片は、腫瘍細胞内における半減期の長いものが好ましい。例えば、一本鎖抗体と比較した場合、二本鎖抗体はFc部分の存在により半減期が延長し、抗体依存性の免疫反応が期待できる。
【００２２】
一態様において、本実施形態の腫瘍溶解性ウイルスは、以下の(i)〜(iii)のいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子：
(i) 配列番号２のポリペプチド；
(ii) 配列番号２のポリぺプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチド；
(iii) 配列番号２のポリぺプチドと７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチド；
及び以下の(iv)〜(vi)のいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子：
(iv) 配列番号４のポリペプチド；
(v) 配列番号４のポリぺプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチド；
(vi) 配列番号４のポリぺプチドと７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチド；
を有し、これらのポリペプチドを発現するウイルスである。
【００２３】
一態様において、本実施形態の腫瘍溶解性ウイルスは、以下の(vii)〜(ix)のいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子：
(vii) 配列番号３０のポリペプチド；
(viii) 配列番号３０のポリぺプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチド；
(ix) 配列番号３０のポリぺプチドと７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチド；
及び以下の(x)〜(xii)のいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子：
(x) 配列番号３１のポリペプチド；
(xi) 配列番号３１のポリぺプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチド；
(xii) 配列番号３１のポリぺプチドと７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上９０％以上の相同性を有し、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチド；
を有し、これらのポリペプチドを発現するウイルスである。
【００２４】
一態様において、本実施形態の腫瘍溶解性ウイルスは、Ｆｕｒｉｎ認識配列（配列番号８）及びＦＭＤＶ−２Ａ（配列番号９）のポリペプチドをさらにコードする遺伝子を有することが好ましく、上記(vii)〜(ix)のいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子と、(x)〜(xii)のいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子との間にこれらの配列番号８及び９のポリペプチドをコードする遺伝子を有することがより好ましい。
【００２５】
一態様において、本実施形態のＶＥＧＦ拮抗剤は、可溶性ＶＥＧＦ受容体（ｓＶＥＧＦＲ）である。ｓＶＥＧＦＲとしては、ｓＶＥＧＦＲ−１、−２及び−３が知られており、一態様において、好ましくは、ｓＶＥＧＦＲは、ＶＥＧＦ−Ａ及びＢとの結合能を有するｓＶＥＧＦＲ−１である。ｓＶＥＧＦＲとしては公知のものを用いることができ、例えば、Park JE et al. (1994) J Biol Chem. Vol. 269(41):25646-54に記載のもの、市販品等を用いることができる。
【００２６】
一態様において、本実施形態の腫瘍溶解性ウイルスは、以下の(xiii)〜(xv)のいずれかのポリヌクレオチドを有する遺伝子を有し、これらのポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現するウイルスである。
(xiii) 配列番号２６の塩基配列によりコードされるポリヌクレオチド；
(xiv) 配列番号２６の塩基配列によりコードされるポリヌクレオチドにおいて、１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(xv) 配列番号２６の塩基配列によりコードされるポリヌクレオチドと７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつＶＥＧＦ結合能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２７】
本明細書において、「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列」という場合、欠失、置換、又は付加されるアミノ酸の個数は、そのアミノ酸配列からなるポリペプチドが、ＶＥＧＦ結合能を有する限り特に限定されないが、例えば、１〜５個、１〜３個、又は１〜２個とすることができる。欠失、置換又は置換される場所は、ペプチドの末端であっても、中間であってもよく、１ヶ所であっても２ヶ所以上であってもよい。
同様に、本明細書において、「１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列」という場合、欠失、置換、又は付加される塩基の個数は、その塩基配列がコードするポリペプチドが、ＶＥＧＦ結合能を有する限り特に限定されないが、例えば、１〜５個、１〜３個、又は１〜２個とすることができる。欠失、置換又は置換される場所は、ポリヌクレオチドの末端であっても、中間であってもよく、１ヶ所であっても２ヶ所以上であってもよい。
【００２８】
上記ポリペプチドがＶＥＧＦ結合能を有するか否かは、当業者に公知の手法を用いて判断することができる。例えば、後述の実施例に記載のＥＬＩＳＡを用いて判断することができる。
【００２９】
本実施形態において、アミノ酸は、天然アミノ酸に加え、その誘導体や人工のアミノ酸、非天然アミノ酸であってもよい。一態様において、本実施形態のアミノ酸は、好ましくは天然アミノ酸である。
【００３０】
本実施形態の腫瘍溶解性ウイルスは、ＶＥＧＦ拮抗剤をコードする遺伝子を有し、腫瘍細胞に投与されると、ウイルス複製に伴って、ＶＥＧＦ拮抗剤を発現する。ＶＥＧＦ拮抗剤をコードする遺伝子を発現するよう腫瘍溶解性ウイルスを改変する手法としては、公知の手法を用いることができる。例えば、ＶＥＧＦ拮抗剤をコードするＤＮＡを、公知の方法（制限酵素を利用する方法等）で、発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを腫瘍溶解性ウイルスにトランスフェクトさせることができる。発現ベクターは、さらに目的遺伝子の発現を調節するプロモーター、複製起点、選択マーカー遺伝子等を含むことができる。プロモーター及び複製起点は、遺伝子を導入する腫瘍溶解性ウイルス及びベクターの種類に応じて適宜選択することができる。
【００３１】
例えば、ＶＥＧＦ拮抗剤が、抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片である場合、発現させようとする抗体のアミノ酸配列又は塩基配列を入手し、目的の領域を、公知の手法により発現させることができる。例えば、ｃＤＮＡから重鎖と軽鎖が等量ずつ発現して効率的な抗体産生が可能となるよう、抗体の重鎖及び軽鎖に対応するポリペプチドをコードする配列を導入し、好ましくは、自己切断活性を有する口蹄疫病（ＦＭＤＶ）−２Ａ配列及びｆｕｒｉｎ開裂部位をコードするアミノ酸配列を共に導入して、ウイルスを改変することができる。さらに、重鎖及び軽鎖に対応するポリペプチドそれぞれのＮ末端に、分泌のためのシグナル配列を有してもよい。このような抗体発現遺伝子からの抗体の発現メカニズムの一例を図１に示す。
【００３２】
上記遺伝子の導入箇所は、腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍溶解性能を維持する限り特に限定されず、例えばウイルスの非必須遺伝子を欠損させた箇所にＶＥＧＦ拮抗剤をコードする遺伝子を導入することができる。ウイルスがHSV-1である場合、後述の表１に示す非必須遺伝子を欠損させて、ＶＥＧＦ拮抗剤をコードする遺伝子を導入することができる。導入した遺伝子の発現は、後述の実施例に示すとおり、公知の手法を用いて確認することができる。
【００３３】
特に、腫瘍溶解性ウイルスが単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）等、ゲノムサイズの大きなウイルスである場合、例えばFukuhara, H. et al. (2005). Cancer research, 65, 10663-10668、ＷＯ２００５／１０３２３７号に記載のＴ−ＢＡＣシステム又はこれに準じたものを用いることができる。ＨＳＶウイルスについてＴ−ＢＡＣシステムを用いる場合、ｌｏｘＰ部位及びＦＲＴ部位を有し、ｌｏｘＰ部位とＦＲＴ部位との間にマーカー遺伝子の発現カセットが少なくとも１種類挿入されたＢＡＣプラスミドを、ＨＳＶゲノムに挿入する第一工程と、目的タンパク質をコードする遺伝子の発現カセットが少なくとも１種類と、少なくとも１種類のマーカー遺伝子と、ｌｏｘＰ部位及びＦＲＴ部位と、がそれぞれ挿入されたシャトルベクターを作製し、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いてシャトルベクターをＨＳＶゲノムのｌｏｘＰ部位に挿入する第二工程と、ＨＳＶゲノムと、Ｆｌｐリコンビナーゼを発現可能なベクターと、を宿主に共感染させ、該ゲノム上のＦＲＴ部位に挟まれた領域を切り出し、目的の遺伝子組換えＨＳＶを産生させる第三工程と、を含む方法により、腫瘍細胞において目的のＶＥＧＦ拮抗剤を発現させることがウイルスを簡便に作成することができる。
【００３４】
（腫瘍溶解性ウイルス）
本実施形態において、腫瘍溶解性ウイルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ。抗がんウイルスともいう。）は、がんの治療に用い得るウイルスであり、腫瘍細胞に感染し、腫瘍細胞で選択的に複製し、ウイルス複製過程で腫瘍細胞を破壊し、周囲の他の腫瘍細胞に感染し、さらに複製する能力を有するものであれば特に限定されず、既知のウイルスを用いることができる。そのようなウイルスの多くは、天然に存在するウイルスを、腫瘍選択性が高まるよう遺伝子改変した変異体である。必要に応じて弱毒化し、抗腫瘍活性増強のための改変（自殺遺伝子の組み込み等）を加えたものであってもよい。
【００３５】
例えば、本実施形態において使用し得る腫瘍溶解性ウイルスとしては、単純ヘルペスウイルスＩ型及びＩＩ型（ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２）、アデノウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、レオウイルス、ワクシニアウイルス、セネカウイルス（セネカバレーウイルス）、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス、コクサッキーウイルスからなる群から選択されるウイルス若しくはウイルス変異体が挙げられる。抗体遺伝子を発現させるためには、抗体が入るサイズのゲノムを有するウイルスが好ましく（一般に、ゲノムの１／１０程度しか改変することができないため）、好ましくは、HSV-1及びHSV-2並びにワクシニアウイルスを用いることができる。
【００３６】
例えば、アデノウイルス変異体である腫瘍溶解性ウイルスの例としては、ＯＮＹＸ−０１５（Khuri et al.(2000). Nat. Med 6(8): 879-85等）、Ｈ１０１（Ｏｎｃｏｒｉｎｅ）（Xia et al. (2004). Ai Zheng 23(12): 1666-70）、Telomelysin (OBP-301)（Kawashima T. et al. (2004) Clim Cancer Res. 10: 285-292）等が挙げられる。
【００３７】
ポリオウイルス変異体である腫瘍溶解性ウイルスの例としては、Goetz et al. (2010). Cytokine & Growth Factor Reviews 21 (2-3): 197、Lal, R. et al. (2009). Current opinion in molecular therapeutics 11 (5): 532-9等に記載のものが挙げられる。
【００３８】
麻疹ウイルス変異体である腫瘍溶解性ウイルスの例としては、ＭＶ−Ｅｄｍ（McDonald et al. (2006). Breast Cancer Treat. 99(2): 177-84）及びこれを用いたＭＶ−ＣＥＡ、ＭＶ−ＮＩＳ等、並びにＨＭＷＭＡＡ（Kaufmann et al. (2013). J. Invest. Dermatol. 133(4): 1034-42）等が挙げられる。
【００３９】
レオウイルスである腫瘍溶解性ウイルスの例としては、Ｒｅｏｌｙｓｉｎ（Oncolytic Biotech）が挙げられる。
【００４０】
ワクシニアウルス変異体である腫瘍溶解性ウイルスの例としては、ＭＤＲＶＶ００２（miRNA-dependent recombinant vaccinia virus 002）及びＭＤＲＶＶ００３（MAPK-dependent recombinant vaccinia virus 003）、並びにD C Mansfield et al. (2016). Gene Therapy, 23, 357-368、SteveH. Thorne (2014). Frontiers in Oncology, 4:155等に記載のものが挙げられる。
【００４１】
セネカウイルスである腫瘍溶解性ウイルスの例としては、ＮＴＸ−０１０（Rudin et al., (2011). Clin. Cancer. Res. 17(4): 888-95）が挙げられる。
【００４２】
水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）変異体である腫瘍溶解性ウイルスの例としては、Stojdl et al. (2000). Nat. Med. 6(7): 821-5、Stojdl et al. (2003). Cancer Cell 4(4): 263-75等に記載のウイルスが挙げられる。
【００４３】
ニューカッスル病ウイルスである腫瘍溶解性ウイルスの一例としては、７３−ＴＰＶ７０１及びＨＤＶ−ＨＵＪ株、Phuangsab et al. (2001). Cancer Lett. 172(1): 27-36、Lorence et al. (2007). Curr. Cancer Drug Targets 7(2): 157-67、Freeman et al. (2006). Mol. Ther. 13(1): 221-8等に記載のウイルスが挙げられる。
【００４４】
コクサッキーウイルス変異体である腫瘍溶解性ウイルスの例としては、コクサッキーＡ（ＣＶＡ）であるＣＶＡ２１及びその改変体(Kelly EJ. Et al. (2008) Nat Med, 14: 1278-1283)、コクサッキーウイルスＢ型３群（ＣＶＢ３）（Miyamoto S. et al.(2012) Cancer Res. 72: 2609-2621）等が挙げられる。
【００４５】
本実施形態の一態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、ＨＳＶ変異体であり、好ましくはＨＳＶ−１変異体である。腫瘍溶解性ウイルスがＨＳＶ−１変異体である場合、例えば特許文献１〜３を参照して腫瘍溶解性のＨＳＶ−１変異体を作製することができる。ＨＳＶ−１は、エンベロープを有する二本鎖ＤＮＡウイルスに分類され、癌治療に有利な以下の特徴を備えている。１）ヒトのあらゆる種類の細胞に感染可能である；２）ウイルスの生活環とゲノム配列が解明されている；３）ウイルス遺伝子の大半は機能が判明しており、遺伝子操作を加えることが可能である；４）ウイルスゲノムが大きい（約１５２ｋｂ）為に、大きな遺伝子や複数の遺伝子を組み込むことができる。さらに、ＨＳＶ−１は臨床応用に適した以下の利点を備える；５）比較的低いｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ）で全ての細胞の死滅が可能である；６）増殖を抑制する抗ウイルス薬が存在する；７）血中抗ＨＳＶ−１抗体は、ウイルスの細胞から細胞への感染拡大に影響しないため、繰り返し投与が可能である；８）ＨＳＶ−１に感受性を示すマウスやサルが存在するために、動物で安全性や効果の前臨床的評価を行える；９）ウイルスＤＮＡが宿主細胞のゲノムに取り込まれず染色体外に存在する。
【００４６】
ＨＳＶ−１のゲノムは、８２％のｌｏｎｇ  ｕｎｉｑｕｅ  ｒｅｇｉｏｎ（ＵＬ）と１２％のｓｈｏｒｔ  ｕｎｉｑｕｅ  ｒｅｇｉｏｎ（Ｕｓ）の２つの固有配列領域と、それぞれの両端に位置するｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ（ＴＲ）とｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ（ＩＲ）の倒置反復配列からなる（表１、Todo, T.(2008).  a journal and virtual library 13, 2060-2064）。ＬとＳの２つの領域はそれぞれ独立して２つの方向を取り得るため、ＨＳＶ−１ゲノムＤＮＡは４つのアイソマーからなる。このゲノムにはＴＲＬ上のＲＬ１、ＲＬ２、ＵＬ上のＵＬ１〜ＵＬ５６、ＴＲＳ上のＲＳ１、ＵＳ上のＵＳ１〜ＵＳ１２に合計８４個の遺伝子が一方向性にコードされており、そのうちの約半数がウイルス増殖には不必要な遺伝子であり、これら非必須遺伝子部分を欠損させることで病原性の減弱や、遺伝子導入が可能である（Carson, J. et al. (2010). Drugs of the future 35, 183-195）。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
腫瘍溶解性ウイルスがＨＳＶ−１変異体である場合、以下の特徴のいずれか一つ以上を有し得る。
−ウイルスＤＮＡ合成に関わる酵素例えば、チミジンキナーゼ（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ，ＴＫ）、リボヌクレオチド還元酵素（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＲＲ）、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ｕｒａｃｉｌ−Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ，ＵＮＧ又はＵＤＧ）等の不活化による、腫瘍細胞特異的な複製能の獲得。
−ＨＳＶ−１の病原性に関わるタンパク質ＩＣＰ３４．５をコードする遺伝子γ３４．５を欠失させることによる、腫瘍細胞特異的な複製能の獲得。
−α４７を欠失させることによる、抗腫瘍効果の獲得。
−野生型への復帰を防止して安全性を高めるための遺伝子の欠失又は不活化（例えば、内在性γ３４．５遺伝子、ＩＣＰ４７遺伝子、α０遺伝子（ＩＣＰ０遺伝子）、ＵＬ４１遺伝子（ｖｈｓ遺伝子）、ＵＬ５６遺伝子の欠失又は不活化）。
−免疫刺激遺伝子（ＩＬ−４，ＩＬ−１０，ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−１２，可溶型Ｂ７．１等）を発現させることによる、抗腫瘍免疫の増強及び生存延長。
−血小板第四因子、トロンボスポンジン、エンドスタチン、ドミナントネガティブＦＧＦ、アンジオスタチン等の血管新生抑制因子を発現する遺伝子を発現させることによる、血管新生抑制効果及び抗腫瘍効果の増強。
−腫瘍の局所浸潤に関与するｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ阻害因子を発現させることによる、抗腫瘍効果の増強。
−ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅを過剰発現させることによる、ウイルスの感染拡大促進。
−腫瘍あるいは組織特異的なプロモーター（ｃａｌｐｏｎｉｎのプロモーター、Ｅ２Ｆ反応性細胞周期依存性プロモーターＢ−ｍｙｂ、Ｎｅｓｔｉｎプロモーター、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＭＵＣ−１、Ｍｕｓａｓｈｉのエンハンサー／プロモーター等）でウイルス遺伝子を制御することによる、腫瘍細胞特異的なウイルス複製能の増強。
【００４９】
一態様において、本実施形態の腫瘍溶解性ウイルスは、好ましくは以下の（ａ）〜（ｃ）の特徴のいずれか一つ以上、より好ましくは、以下の（ａ）〜（ｃ）の特徴を有するＨＳＶ−１である。これらの特徴を有するＨＳＶ−１変異体は、特許文献３等を参照して作製することができる。
（ａ）ＩＣＰ６遺伝子が欠失又は不活化されている、或いは腫瘍特異的プロモーター又は組織特異的プロモーターの制御下で発現する。
（ｂ）γ３４．５遺伝子が欠失又は不活化されている。
（ｃ）ＩＣＰ４７遺伝子が欠失又は不活化されている。
【００５０】
上記（ａ）及び（ｂ）の特徴に関し、非分裂細胞におけるヌクレオチド代謝及びウイルスＤＮＡ合成のために重要な酵素であるＲＲの大サブユニットであるＩＣＰ６、並びに／或いは、ウイルス感染の際に生じるリン酸化ＰＫＲの機能に拮抗するγ３４．５を欠失することで、正常細胞では増殖できないが、分裂がさかんでＲＲ活性が上昇しＰＫＲのリン酸化が抑制されている腫瘍細胞でのみ増殖が可能なウイルスとなる。また、上記（ｃ）の特徴に関し、α４７遺伝子がコードするタンパク質は、ＴＡＰを阻害して宿主細胞表面のＭＨＣクラスＩの発現を抑制することで宿主の免疫サーベイランスから逃れる作用を有するため、α４７遺伝子欠失ＨＳＶ−１では宿主細胞のＭＨＣクラスＩ発現の維持により、免疫細胞に対する刺激が強くなると期待される。さらに上記（ｂ）及び（ｃ）の特徴をいずれも有するＨＳＶ−１は、α４７の欠失によって、α４７とゲノムが重なっているＵＳ１１  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒが同時に欠失するため、ＵＳ１１遺伝子の発現がＩＣＰ４７  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒの制御下におかれることで発現時期が早まり、γ３４．５欠失によって減弱したウイルス複製能を腫瘍細胞に限って復元する作用を有する。
【００５１】
本明細書において、遺伝子の欠失又は不活化とは、遺伝子の全部又は一部を欠失させるか、一部の塩基の置換、修飾、不要な配列の挿入等を通じて、当該遺伝子の発現を抑制することを指し、公知の方法により実施することができる。
【００５２】
本明細書において、腫瘍特異的プロモーター又は組織特異的プロモーターとは、所望の腫瘍細胞や組織において特異的に、その制御下にある遺伝子の発現を可能にするプロモーターを意味し、遺伝子に応じて既知のプロモーターを用いることができる。例えば、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーター（ｈＴＥＲＴプロモーター）やＥ２Ｆプロモーターを用いることができる。
【００５３】
上記（ａ）〜（ｃ）に記載の、γ３４．５遺伝子、ＩＣＰ６遺伝子及び／又はＩＣＰ４７遺伝子の欠失又は不活化を含むＨＳＶとしては、γ３４．５遺伝子を２コピーとも欠失させ、ＩＣＰ６遺伝子を不活化させたＧ２０７、γ３４．５遺伝子遺伝子の２コピーの欠失、ＩＣＰ６遺伝子の不活化、及びＩＣＰ４７遺伝子の欠失を含むＧ４７Δが挙げられる。従って、本実施形態の腫瘍溶解性ウイルスは、Ｇ２０７やＧ４７Δにさらに改変を加えることによって作製することもできる。
特に、Ｇ４７Δは、安全性を向上させる一方で、腫瘍細胞選択的ウイルス複製と抗腫瘍免疫の惹起を格段に改善した腫瘍溶解性ＨＳＶ−１であり、治療域の広さから、ヒトの脳内にも高用量を安全に投与することが可能である（第ＩＩ相試験中）。
【００５４】
（医薬組成物）
本実施形態の一態様は、上述の本実施形態の腫瘍溶解性ウイルスを含む医薬組成物に関する。本実施形態の医薬組成物は、腫瘍細胞で特異的に増殖し、しかも腫脹発生を抑制するため、繰り返し投与も容易に行うことができる。
【００５５】
また、一態様において、本実施形態の医薬組成物によれば、後述の実施例に示すとおり、強い抗菌活性、抗ウイルス活性、抗腫瘍効果を有するＭ１マクロファージが、Ｍ２マクロファージと比較して優位な状態が維持され、しかもＭ１優位な状態であっても医薬組成物中の腫瘍溶解性ウイルスのウイルス力価が低下しないため、高い腫瘍治療効果が得られる。一態様において、本実施形態のウイルスは、ＶＥＧＦ拮抗剤をコードする遺伝子を有しない点を除いて同一の構成を有する腫瘍溶解性ウイルスと比較して、高い腫瘍治療効果を有する。ウイルス力価の測定、Ｍ１及びＭ２マクロファージの比較並びに抗腫瘍効果（ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの殺細胞効果、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生存率延長効果を含む）の確認は、後述の実施例に示すとおり、既知の方法により行うことができる。
【００５６】
さらに、一態様において、本実施形態の医薬組成物によれば、腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍内で複製するたびに腫瘍局所においてＶＥＧＦ拮抗剤（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）を発現するため、ＶＥＧＦ拮抗剤の全身投与と比較して創傷治癒阻害等の副作用のリスクが軽減される。ウイルスの複製能及びＶＥＧＦ拮抗剤の発現量の確認は、後述の実施例に示すとおり、既知の方法により行うことができる。
【００５７】
本実施形態の医薬組成物が有効な腫瘍としては、例えば、神経系型腫瘍（例えば星状細胞腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経繊維腫、神経膠芽腫、上衣腫、神経鞘腫、神経繊維肉腫、神経芽細胞腫）、下垂体部腫瘍（例えば、下垂体腺腫）、髄芽細胞腫、黒色腫、脳腫瘍、前立腺癌、頭頚部癌、食道癌、腎癌、腎細胞癌、膵臓癌、乳癌、肺癌、結腸癌、大腸癌、胃癌、皮膚癌、卵巣癌、膀胱癌、肉腫（例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫）、扁平上皮癌、神経外胚葉、甲状腺腫瘍、リンパ腫、肝細胞腫、中皮腫、類表皮癌、良性腫瘍（例えば、甲状腺の良性腫瘍又は良性前立腺肥大症）等が挙げられる。
【００５８】
本実施形態の医薬組成物は、腫脹発生を抑制するため、腫脹のみならず、腫脹に伴う諸症状を引き起こすことなく、腫瘍の治療を行うことができる。例えば、脳内の腫脹に伴う症状としては、頭痛など軽微な症状のみならず、周囲正常組織への圧迫及び頭蓋内圧亢進による麻痺や失語、意識障害などの重篤な症状が含まれるが、本実施形態の医薬組成物に寄れば、このような症状を引き起こすことなく腫瘍の治療を行うことがの原因頭蓋内圧亢進や一時的な神経症状の悪化を引き起こすことなく、患者のＱＯＬを低下させることなく腫脹の治療を行うことができる。一態様において、本実施形態の医薬組成物は、頭蓋外への転移がほとんどなく、局所治療が重要な、脳腫瘍を含めた頭蓋内の腫瘍の治療に特に有効である。
【００５９】
本実施形態において、腫脹とは、腫瘍自体の腫れ、及び腫瘍の周囲のむくみのいずれも含み、腫瘍及び／又はその周囲の体積が増加し、膨張した状態を指す。本実施形態において、「腫脹発生抑制型」とは、腫脹の発生の抑制、発生する腫脹サイズの縮小、及び腫脹の拡大予防のいずれか一つ以上を指す。理論に束縛されるものではないが、腫瘍溶解性ウイルスを投与した場合に特に問題になる腫脹は、腫瘍自体の腫れであることを本発明者は見出しており、本実施形態のウイルスは、このような腫瘍自体の腫れも含む、腫瘍溶解性ウイルスの投与に伴う腫脹発生を抑制することができる。腫瘍溶解性ウイルスを注射等により幹部に局所投与すると、投与後すぐに腫脹が発生する。この腫脹が持続したまま再度同一部位に局所投与を繰り返すと、さらに腫脹が拡大する。一方、本実施形態のウイルスによれば、この腫脹発生が抑制され、より安全かつ容易に腫瘍治療を行うことができる。
【００６０】
上記の腫脹に伴って浮腫（水分が蓄積して膨張した状態）も発生し得る。外形的には、腫脹と浮腫とは必ずしも明確に区別できないため、本実施形態において、腫脹の発生の程度は、浮腫の発生の程度の測定によっても確認することができる。すなわち、腫脹の発生の程度は、腫脹及び浮腫の測定において当業者に公知の手法を用いて測定することができる。後述の実施例に示すとおり、例えばＭＲＩのＴ２強調での高信号域の比較によって腫脹（浮腫）の発生の程度を確認することができる。また、腫脹及び／又は浮腫の発生との関与が確認されている物質を定量することによっても、その発生の程度を確認することができる。例えば、脳における腫脹であれば、脳浮腫との関係が知られているアクアスポリン（ＡＱＰ）１、ＡＱＰ３、ＡＱＰ４、ＡＱＰ５、ＡＱＰ８、ＡＱＰ９、ＡＱＰ１１、ＡＱＰ１２、特にＡＱＰ４を定量することにより、その発生の程度を確認することができる。
【００６１】
本実施形態の医薬組成物の投与方法は特に限定されず、例えば、静脈内、動脈内、脳室内、腹腔内、胸腔内、脊髄腔内、皮下、皮内、表皮内、筋肉内、粘膜表面（例えば、眼、鼻腔内、肺、口腔、腸、直腸、膣、尿路表面）内に投与され得る。好ましくは、注射、内視鏡又は外科的方法により、腫瘍組織に直接局所投与される。局所投与されることにより、ＶＥＧＦ拮抗剤が腫瘍局所において発現するため、ＶＥＧＦ拮抗剤の全身投与と比較して創傷治癒阻害等の副作用のリスクが軽減され、特に外科的方法により腫瘍溶解性ウイルスが投与された場合であっても、外科的方法に伴う創傷の治癒が阻害されないという利点を有する。
【００６２】
本実施形態の医薬組成物は、ヒトを含む哺乳動物の体内にウイルスを導入するための公知の製剤化方法によって製剤化することができる。例えば、アジュバントや任意の担体を含んでいてもよく、アジュバントや担体を添加せずに無菌生理食塩水又は無菌緩衝生理食塩水のような生理学的に許容される溶液で単に希釈したものでもよい。長期保存に適した凍結製剤、乾燥製剤、凍結乾燥製剤等としてもよい。
【００６３】
本実施形態の医薬組成物は、本実施形態の腫瘍溶解性ウイルスを治療有効量含む。本明細書において、治療有効量とは、治療する腫瘍の一つ又は複数の症状が、それによりある程度緩和される作用物質の量を意味し、より具体的には、腫瘍サイズの低下、腫瘍の転移の阻害（遅延又は停止）、腫瘍増殖の阻害（遅延又は停止）、及び腫瘍と関連する一つ又は複数の症状の緩和、の少なくとも一つを示す量を意味する。具体的な投与量は、症状の程度、投与対象の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与時期、投与間隔、製剤の性質、プロモーターの強度等により、当業者が適宜決定することができる。
【００６４】
本実施形態の医薬組成物は、例えば、約１０１〜約１０１２プラーク形成単位（ｐｆｕ）、好ましくは約１０７〜約１０１０ｐｆｕ、さらに好ましくは約１０８ｐｆｕ〜約５×１０９を、注射によりそれぞれ１回又は数回に分けて投与することができる。本実施形態の医薬組成物の投与回数は、対象患者及び対象疾患に応じて適宜設定すことができる。例えば、２週間以内に最初の２回を投与し、その後、３〜５週間間隔で投与することができる。本実施形態の医薬組成物は腫脹発生抑制型であるため、複数回投与した場合でも、投与の度に腫脹が増大するという副作用や、投与時に発生した腫脹が縮小するのまで次の投与を控えるといった不都合がないという利点を有する。
【００６５】
本実施形態の医薬組成物は、さらに他の有効成分を含有することもできるし、他の有効成分を含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。また、本実施形態の医薬組成物は、他の腫瘍治療法、例えば、手術（腫瘍切除等）、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法及びこれらの組み合わせと併用して用いることができる。本実施形態の医薬組成物によるウイルス療法は既存の腫瘍治療法とは異なる機序によるため、例えば放射線療法、化学療法等他の治療法との併用により、腫瘍治療効果が増強し得る。
【００６６】
本実施形態はまた、腫脹発生抑制型腫瘍溶解性ウイルスを用いた、腫瘍の治療方法にも関する。本実施形態はまた、腫瘍を治療するための医薬の製造における、腫脹発生抑制型腫瘍溶解性ウイルスの使用にも関する。当該方法及び使用は、上記医薬組成物にかかる記載を参照して実施することができる。
【００６７】
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
【実施例】
【００６８】
Ａ．材料
１．細胞株及び培地
アフリカミドリザル腎細胞株Vero、ヒト大腸がん細胞株HT-29、マウス大腸癌細胞株CT26、ヒトグリオーマ細胞株U87MG、U251MG、NMC-G1、ヒト胎児腎細胞株HEK293T、ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVEC (BDTM HUVEC-2)、ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVEC-2並びにヒトグリオーマ幹細胞株TGS-01、TGS-04及び1123/Mを使用した。Vero、HT-29、CT26及びU87MGはいずれもAmerican Type Culture Collection（ATCC）より、HEK293Tは理化学研究所バイオリソースセンターより、HUVECは、BD Bioscience (USA)より、HUVEC-2はCorning Life Sciencesより、NMC-G1はJCRB cell bankより、ぞれぞれ購入した。TGS-01及びTGS-04は、東京大学医学部附属病院脳神経外科で開頭腫瘍摘出術を施行された膠芽腫患者の摘出組織から無血清培地で培養し、がん幹細胞マーカー及び限界希釈によるスフィア（浮遊細胞塊）形成能の評価によって分離して樹立したグリオーマ幹細胞株であり、本発明者の研究室で保存されているものを使用した。1123/Mは、乏突起膠腫患者の摘出組織から樹立された幹細胞で、オハイオ州立大学から譲渡されたものを使用した。腫瘍溶解性HSV-1ウイルスであるG47Δは、本発明者の研究室で保存されているものを使用した。【００６９】
Vero、U87MG、U251MG、NMC-G1は10% fetal bovine serum（FBS）（Sigma Aldrich）添加Dulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM）（gibco）で培養した。HT-29は10% FBS を添加したMcCoy’s 5A (Modified) 培地、CT26は10% FBSを添加したRPMI 1640培地で培養した。HUVEC、HUVEC-2は1% Low Serum Growth Supplement（LSGS）（gibco）添加Medium200PRF（gibco）にて培養した。TGS-01、TGS-04はDMEM/F12（1:1）（gibco）500 mLにB-27（gibco）10 mL、45% D-Glucose（Sigma Aldrich）7 mL、200 mM L-glutamin（gibco）5 mL、Insulin（gibco）1.875 mL を加えた培地にEGF（Peprotech）（20 ng/mL）、bFGF（Peprotech）（20 ng/mL）をそれぞれ用時に1,000分の1量を加えた培地（以下、SCM）で培養した。1123/MはDMEM/F12（1:1）500 mLにB-27 10 mL、200 mM L-glutamin 5 mL、Heparin（5 mg/mL）（Sigma Aldrich） 550 μLを加えた培地にEGF（20 ng/mL）、bFGF（Peprotech）（20 ng/mL）をそれぞれ用時に1,000分の1量を加えた培地で培養した。EGF及びbFGFは3日に1回の頻度で培地内に添加した。すべての細胞はインキュベーターで5% CO2、37℃で培養した。ウイルス培養用無血清培地として1% L-glutamin（gibco）添加VP-SFM（gibco）を、co-transfection培地としてOpti-MEM（Sigma Aldrich）を使用した。【００７０】
２．ウイルス
本実施例で作製及び使用したウイルスの代表的な構造を図２に示す。いずれのウイルスも遺伝子組換えHSV-1であるG47Δを基本骨格として作製された。T-01は、ICP6遺伝子の894 bpの欠失部位に外来遺伝子を挿入せず、LacZ及びサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターのみを挿入したコントロールウイルスである。今回作製したT-BV及びT-VHVLは、抗ヒトVEGF抗体発現遺伝子及び抗VEGF一本鎖抗体（VEGF scFv）発現遺伝子がそれぞれCMVプロモーターの下流に挿入されている。挿入された抗体発現遺伝子の詳細及びウイルスの作製方法に関しては後述する。【００７１】
３．大腸菌、大腸菌用培地及び抗生物質
トランスフェクション用大腸菌として、それぞれOne shot DH5α-T1 Competent Cell（Thermo Fisher Scientific）とOne shot PIR1 Competent Cell（Thermo Fisher Scientific）を、エレクトロポレーション用大腸菌としてElectroMax DH10B Electrocompetent Cell（Thermo Fisher Scientific）を、それぞれ使用した。トランスフェクション用培地として、SOC培地（Thermo Fisher Scientific）を使用した。大腸菌の培養にはLB（Thermo Fishier Scientific）培地を使用した。また培地に添加する抗生物質として、カナマイシン硫酸塩（Sigma Aldrich）、クロラムフェニコール（Sigma Aldrich）を使用した。【００７２】
４．血清
血清はウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum；FBS）（Sigma Aldrich）を用いた。熱非働化処理に関しては56℃、30分間の熱処理を行った。【００７３】
５．抗体
抗ヒトVEGF抗体であるベバシズマブ（商品名：Avastin（登録商標））は中外製薬より購入した。
ウエスタンブロッティング用抗体は、goat anti-human IgG- heavy and light chain monkey-absorbed antibodyをBethylから、donkey anti-goat IgG- HRP conjugatedをSanta Cruzから、それぞれ購入した。
ELISA用抗体は、Human VEGF(100-20)、Murine VEGF(450-32)及びRabbit anti-Murine VEGF antibody(500-P131)をPeproTechから、Goat anti-Human IgG-Fc Fragment Antibody HRP conjugated（A80-104P）及びGoat anti-Rabbit IgG-Fc Fragment Antibody HRP conjugated（A120-111P）をBethylから、それぞれ購入した。
免疫組織化学染色用抗体は、ウサギ抗HSV-1抗体（B0114、ポリクローナル）、HRP標識抗ウサギポリマー（K4003）をDakoから、ラット抗マウスCD31抗体（DIA-310、モノクローナル）をdianovaから、ラット抗マウスF4/80抗体（ab6640、モノクローナル）をabcamから、Mouse MAX PO (Rat)(414311)を ニチレイから、それぞれ購入した。
フローサイトメトリー解析用抗体は、Purified Anti-mouse CD16/32 Antibody（101301）、Pacific Blue anti-mouse CD45 Antibody（103126）、APC anti-mouse/human CD11b Antibody（101212）、Brilliant Violet 570 anti-mouse Ly-6G/Ly-6C（Gr-1）Antibody（108431）及びPE/Cy7 anti-mouse CX3CR1 Antibody（149015）をBioLegendから、Rat anti-mouse F4/80: RPE Antibody（MCA497PE）をBio-Radから、それぞれ購入した。【００７４】
６．実験動物
生後5-6週のBALB/cnu/nuマウス（ヌードマウス）の雌を使用した。マウスは日本チャールズリバー又は日本SLCから購入し、specific pathogen free環境下で飼育した。動物実験は「動物愛護及び管理に関する法律」を遵守し、東京大学バイオサイエンス委員会の東京大学動物実験実施マニュアルに従った。【００７５】
Ｂ．実験方法
実施例１：ウイルスの作成
T-BV、T-VHVL、T-sVEGFR1の作製にはT-BACシステムを用いた。T-BACシステムとは、100万bpまでの大きなDNA断片を大腸菌内に単一コピーで安定して保持させることができるF因子プラスミドのレプリコンに基づくクローニングベクターであるbacterial artificial chromosome（BAC）を、G47ΔのゲノムのICP6欠失部位に挿入することによって、G47Δゲノムの維持や増幅を容易とした遺伝子組換えHSV-1の製造技術である（Fukuhara, H. et al. (2005). Cancer research, 65, 10663-10668）。このT-BACにはloxP配列及びFRT配列が含まれており、同様にloxP配列とFRT配列を持つシャトルベクタープラスミドであるSV-01と混合して、Cre/loxP及びFLP/FRTの2つのリコンビナーゼシステムを利用することで、SV-01に搭載された外来遺伝子の挿入とBACの切り出しが起こり、外来遺伝子が挿入されたG47Δの作製が可能となる（図３）。【００７６】
実施例１．１  抗体発現cDNAの作製
抗ヒトVEGF抗体発現遺伝子のcDNAに関して、ベバシズマブのFab領域のアミノ酸配列及びヒトIgG1 Fc領域のアミノ酸配列をそれぞれthe international ImMunoGeneTics information system（IMGT）、及びNational Center for Biotechnology Information（NCBI）のデータベースから入手した。重鎖、軽鎖にそれぞれ対応するポリペプチドのN末端側に分泌シグナルとしてIg kappa leader sequence及びシグナルペプチダーゼ認識部位を結合したものを、口蹄疫病ウイルス（FMDV）-2A配列及びfurin認識配列で結合した。アミノ酸配列及び全体の構造を図４に示す。最終的には転写開始点にKozak配列と開始コドンを挿入し、配列の両端を制限酵素部位BamHIとNotIで挟み、ヒトでのコドンに最適化した塩基配列への変換をユーロフィンジェノミクス株式会社に依頼して1本のcDNAとして作製した。【００７７】
VEGF scFv発現のためのcDNAに関しては、文献（Liang, W. C. et al.(2006). Journal of Biological Chemistry, 281, 951-961）に記載されたヒト・マウス両方のVEGFに結合性を持つ抗VEGF抗体のひとつのクローンであるG6-31の重鎖、軽鎖のアミノ酸配列に基づいて、遺伝情報処理ソフトウェアGENETYX（ゼネティックス）を用いて、それぞれに対応するcDNAを作製した。この重鎖、軽鎖に対応するcDNAを、scFvの基本的構造である4つのグリシンと1つのセリンを繋げたもの（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：１２））を3つ連結したGSリンカーで結合し、N末端側にIg kappa leader sequenceとシグナルペプチダーゼ認識部位を結合した。アミノ酸配列及び全体の構造を図５に示す。最終的には転写開始点にKozak配列と開始コドンを挿入し、配列の両端を制限酵素部位BamHIとNotIで挟み、１本のcDNAとして作製した。以後の実施例１．２〜１．７における手順に関しては、T-BVに関するもののみ示す。T-VHVL及びT-sVEGFR1は、後述の実施例１．８のとおり作製した。【００７８】
実施例１．２  抗ヒトVEGF抗体発現遺伝子搭載プラスミド（pEX-K-BV）の増幅
抗ヒトVEGF抗体発現遺伝子搭載プラスミドである pEX-K-BV（ユーロフィンジェノミクス株式会社製）（図６）をTE buffer に溶解し（1 ng相当）、One shot DH5α-T1 Competent Cellに加えて氷上に30分間静置し、42℃で45秒間熱処理の後、SOC培地を加え、37℃、1時間培養の後、培養液をカナマイシン添加LB寒天培地に全量まき、37℃で一晩培養した。コロニーを採取し、カナマイシン添加LB培地で37℃、8時間培養した。遠心してペレットを回収し、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen）を用いてプラスミドDNAを抽出した。【００７９】
実施例１．３  抗ヒトVEGF抗体発現遺伝子のシャトルベクターSV-01への挿入
SV-01についてはBamHI、NotIで制限酵素処理し、CIAP処理をした。pEX-K-BVについては、BamHI、NotIで制限酵素処理した場合に得られるpEX-K、抗ヒトVEGF抗体発現遺伝子のサイズが2,507 bp、2,261 bpと泳動バンドが近いため、分離を改善する目的で、抗ヒトVEGF抗体発現遺伝子内には認識部位がなく、pEX-Kをほぼ中間で切断するBglIIを併用した。1% アガロースゲルで50 V、80分間電気泳動したのち、UVトランスイルミネーター（UVP）内で目的のバンドを切り出して、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を用いて目的サイズのDNA断片を抽出した。抽出したDNA断片をDNA Ligation Kit Mighty Mix（Takara）と混ぜたのち、One shot PIR1 Competent Cellと混合して、熱処理を加えた後、37℃で1時間培養し、カナマイシン添加LB寒天培地にまいて、37℃で一晩培養した。コロニーを採取してカナマイシン添加LB培地で37℃、24時間培養した後に、遠心してペレットを回収し、QIAprep Spin Miniprep Kit を用いてDNAを抽出した。抽出したDNAをBamHI及びNotIで制限酵素処理した後に1% アガロースゲルで電気泳動してSV-01への抗ヒトVEGF抗体発現遺伝子の挿入確認を行った。【００８０】
実施例１．４  SV-01のT-BACへの挿入
抗ヒトVEGF抗体発現遺伝子の挿入が確認されたSV-01（以下「BV/SV-01」という。）をT-BAC及びCre-recombinaseと混合して37℃で1時間反応させ、Cre-recombinationによるBV/SV-01のT-BACへの挿入を行った。エタノール沈殿を行った後、ElectroMax DH10B Electrocompetent Cellと混合してキュベットに入れ、Gene Pulse Xcellエレクトロポレーションシステム（Bio-Rad）を用いて1.2 kV、25 mF、200 Ωでエレクトロポレーションした後、カナマイシン・クロラムフェニコール添加LB寒天培地で37℃、一晩培養した。コロニーを採取してカナマイシン添加LB培地で37℃、24時間培養した後に、遠心してペレットを回収し、QIAprep Spin Miniprep KitでBV/SV-01/T-BACを抽出した。【００８１】
実施例１．５  BV/SV-01/T-BACの組換えの確認
PCR及び制限酵素処理による構造確認を行った。PCRはBV/SV-01/T-BACを鋳型として、forward/reverse primerをICP6内（ICP6-f1）/LacZ内(SV01-r1)又はSV-01内（SV01-f1）/LacZ内（SV01-r1）にそれぞれ設定し、BV/SV-01の単一での挿入を確認した。挿入の陰性対照としてT-BACを、PCRの陰性対照としてmock（鋳型DNAなし）をおいた。両PCRともにVeritiサーマルサイクラー（Thermo Fisher Scientific）を用いて、denatureを94℃、2分間で行った後、「98℃ 10秒→57℃ 30秒→68℃ 1分30秒」を25サイクル行い、最後に68℃、7分間処理した。PCR産物を1% アガロースゲルで100 V、25分間電気泳動し、泳動パターンの確認を行った。
制限酵素処理に関しては、BV/SV-01/T-BACをHindIII、KpnIで制限酵素処理した後、0.6% アガロースゲルで50 V、一晩電気泳動した。陰性対照として、T-BACを用いた。【００８２】
実施例１．６  VeroへのBV/SV-01/T-BAC、pOG44のコトランスフェクション
BV/SV-01/T-BAC及びFLPリコンビナーゼ発現プラスミドpOG44（Thermo Fisher Scientific）にトランスフェクション試薬FuGENE HD（Promega）を加え、室温で15分間静置後、これをOpti-MEMに置換したVero細胞に添加し、5% CO2、37℃で3時間培養した。その後、10% v/v FBS添加DMEMで一晩、1% v/v 熱非働化FBS添加DMEMで72時間、5% CO2、37℃で培養した。【００８３】
実施例１．７  限界希釈法による単一クローンの単離とウイルスの精製
コトランスフェクション後に50% cytopathic effect（CPE）が確認できたところで蛍光顕微鏡BIOREVO（KEYENCE）を用いてGreen Fluorescence Protein（GFP）の蛍光を観察し、ウイルスにより形成されたプラークの7〜8割の蛍光が消失していること、すなわち、FLPによるBACの切り出しを確認した後、Vero細胞をセルスクレーパーで剥離して培養液ごと回収した。遠心してペレットにphosphate buffer saline（PBS）を加えて、凍結・解凍を3回繰り返した後、超音波破砕操作を加え、細胞内のウイルスを抽出した。続いて限界希釈法で、ウイルスの単一クローンの単離を行った。96穴プレートに1ウェルあたり1 x 104 個のVero細胞をまき、そこに0.3 pfu/wellのウイルス力価で感染を行った。室温で5分間振盪、5% CO2、37℃で90分間培養後、ウイルス液を除き、1% v/v 熱非働化FBS添加DMEMを加えて5% CO2、34.5℃で6日間培養後、GFP陰性の単一プラークを認めるウェルを、96穴プレート3枚あたり3ウェル選択し、培養液ごと回収した。このウイルス液を6穴プレートで増幅した後、再度96穴プレートを用いて限界希釈を行った。これら一連の操作を計3回繰り返すことで、最終的に単一クローンとみなすことのできるウイルスを単離した。【００８４】
続いて単離したウイルスの精製を行った。1枚あたりにVero細胞1 x 107 cellsを撒いたT150フラスコ16枚に対して、単離したウイルスをMOI 0.01で感染させ、室温で5分間振盪後、5% CO2、37℃で90分間培養後、ウイルス液を除き、L-glutamine添加VP-SFM 25 mL/フラスコを加え、5% CO2、34.5℃で培養した。CPEになったことを確認し、細胞をセルスクレーパーで剥離し、培養液ごと回収後、800×gで遠心してペレットを回収し、PBS 16 mLを加えて懸濁後、凍結・解凍を3回繰り返し、2分間の超音波破砕操作を加えた。懸濁液を0.8 μmフィルター、0.45 μmフィルターで順に濾過した後、30% v/v スクロース（Sigma Aldrich）/PBS 4 mLを入れた遠沈管にゆっくり静かに重層し、超遠心機Avanti HP-26XP（Beckman Coulter）を用いて、4℃、24,000×gで90分間遠心した。ペレットを回収し、cold PBS 5 mLでリンスした後、10% グリセロール（Merck Millipore）/PBS 1.6 mLを加え、短時間の超音波破砕を繰り返してペレットを溶解した。150 μLずつ分注した後、ドライアイス・エタノールで凍結し、-80℃で保存し、以下の評価実験に用いた。【００８５】
実施例１．８  T-VHVL及びT-sVEGFR1の作成
上記実施例における、T-BVの作製手順に準じて、VEGF阻害因子である可溶型VEGF受容体1 (sVEGFR1) (Park JE et al. (1994) J Biol Chem. Vol. 269(41):25646-54)（図７）、もしくは一本鎖抗VEGF抗体VEGFscFv (VH-VL) (16, 17, 18)、の遺伝子のcDNAをT-BACシステムを用いて、G47Δの基本骨格のICP6欠失部位に挿入し、作製されたVEGF拮抗剤発現型HSV-1であるT-sVEGFR1とT-VH-VLを作製した。T-VH-VLの培養上清中に分泌されるVEGFscFvタンパク質はELISA法で検出できないため、κ鎖に対するELISA法で検出するためにVEGFscFv (VH-VL) のC末端にκ鎖を融合したVEGFscFv (VH-VLCL)を挿入したT-VEGFscFv (VH-VLCL)（図８）も作製した。【００８６】
実施例２  サザンブロット法によるT-BVの構造確認
最終産物であるT-BVについては、サザンブロット法による構造確認を行った。精製ウイルス（titer 8.4 x 108 pfu/mL）150 μLからQIAamp MinElute Virus Spin Kit（Qiagen）を用いてウイルスDNAを抽出し、エタノール沈殿で濃縮した。濃縮したDNAをHindIIIで37℃、16時間かけて制限酵素処理し、0.6% アガロースゲルで45 V、13時間電気泳動した。UVトランスイルミネーター（UVP）で泳動パターンを確認した後、ゲルを0.25 M 塩酸に室温で20分間浸し、脱プリン化を行った。続いてDenaturing Buffer（3 M NaCl, 0.4 M NaOH）に室温で30分間浸透し、DNAの変性を行った。Turbo Blotterシステム（GEヘルスケア）を用いて、ゲルからNytran SPCナイロンメンブレン（GEヘルスケア）にウイルスDNA断片を転写した。UV CrossLinker（UVP）を用いて、254 nm、120 mJ/cm2で2分間UV照射を行い、DNAをNytran SPCナイロンメンブレン上に固定した。プローブは、BV/SV-01をBamHI、NotIで、SV-01をBglIでそれぞれ制限酵素処理し、0.7% アガロースゲルで100 V、30分間電気泳動し、それぞれのバンドを切り出してQIA Quick Gel Extraction Kitを用いてDNAを抽出した。続いてAlkPhos Direct Labelling and Detection System with CDP-Star（GEヘルスケア）を用いてDNAの標識を行い、BVプローブ、LacZプローブをそれぞれ作製した。
あらかじめハイブリダイゼーションインキュベーター（Taitec）で55℃に温めておいたHybridization buffer（GEヘルスケア）をNytran SPCナイロンメンブレンとともにハイブリバッグに入れてシールし、55℃、30分間反応させた後、標識済のプローブを加えて55℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。Nytran SPCナイロンメンブレンを一次洗浄液（2 M urea, 0.1% v/v SDS, 50 mM Na phosphate（pH7.0）, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 , 0.2% v/v Blocking Reagent）で55℃、20分間洗浄の後、二次洗浄液（50 mM Tris base, 100 mM NaCl）で、室温、10分間洗浄した。Detection Solution（GEヘルスケア）で室温、4分間処理したのち、ImageQuant LAS-4000（GEヘルスケア）で撮影した。【００８７】
実施例３  ウイルス力価の測定
本実施例において、使用したウイルスの力価（タイター）は単位をplaque forming unit（pfu）で表し、以下のように測定した。タイターの測定は、実際のタイターが予想タイターと大きく異なることがないかを確認する目的で、実験でウイルスを使用するたびに行った。Vero細胞を3.6 x 105cells/2 mL 10% FBS添加DMEM/wellずつ6穴プレートにまき、5% CO2、37℃下で一晩培養した。翌日に予想タイターを元に、1% v/v 熱非働化FBS添加Dulbecco’s phosphate buffered saline（DPBS）（Sigma Aldrich）でウイルスの3段階の希釈系列を調製した。1% v/v 熱非働化FBS添加DPBS 1 mL/wellでVero細胞が播種されたプレートを洗浄した後に、3段階に希釈したウイルス液を各濃度2ウェルずつ、計6ウェルに700 μL/wellずつ加えた。ウイルス液を添加した6穴プレートを室温で5分間振盪し、5% CO2、37℃で1時間培養した。ウイルス液を除き、1% v/v 熱非働化FBS添加DMEMに5% ヒト免疫グロブリンG（日本血液製剤機構）を0.1% v/vとなるように添加した培地を2 mL/wellずつ加え、5% CO2、34.5℃で72時間培養した。培地を除き、PBS 1 mL/wellで1回洗浄した後、メタノール 1 mL/wellを加え、室温で5分間静置し、固定を行った。メタノールを除去して乾燥した後、20分の1倍希釈Giemsa染色液（Merck Millipore）で染色し、蒸留水で洗浄した。乾燥させた後、顕微鏡でプラーク数を測定し、希釈倍率を元にタイターをpfu/mLとして算出した。【００８８】
実施例４  in vitroにおけるウイルスの殺細胞効果の検討
実施例４．１  U87MG細胞での殺細胞効果の検討
U87MG細胞を6穴プレートに2 x 105 cells/2 mL 10% v/v FBS添加DMEM/wellずつまき、5% CO2、 37℃で一晩培養した。1% v/v 熱非働化FBS添加DPBSでMOI 0.1、0.01のT-01とT-BVのウイルス希釈液を調製し、各ウイルス、各濃度3ウェルずつ、ウイルス液又はmock（1% v/v 熱非働化FBS添加DPBS）を700 μL/well加えた。室温で5分間振盪し、5% CO2、37℃で1時間培養した後、ウイルス液を除き、1% v/v熱非働化FBS添加DMEM 2 mL/wellを加えて、5% CO2、34.5℃で培養した。感染から4日間連続で生細胞数をCoulter Counter（Beckman Coulter）により計測し、mockの生細胞数に対する割合として算出した。【００８９】
実施例４．２  TGS-01、TGS-04での殺細胞効果の検討
TGS-01、TGS-04は幹細胞性維持のため無血清培地での培養が必要であり、無血清培地での培養で浮遊細胞塊（スフィア）を形成するため、接着系細胞とは異なる評価が必要となる。そこで、テトラゾリウム化合物 ([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS])を用いた比色法で生細胞数を測定するMTS試験での評価を行った。MTS試験は、MTSが代謝活性のある細胞内のNADPH又はNADHによって、発色性のホルマザン産物へと変換され、得られた着色溶液の490 nmにおける吸光度を測定することで、生細胞数の定量化を行う評価法である。本実験ではCellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit（Promega）を用いて測定を行った。非接着処理96穴プレート（NUNC）にTGS細胞を4,000 cells/SCM 50 μL/wellずつまき、1% v/v 熱非働化FBS添加DPBSでMOI 1、0.1、0.01のT-01及びT-BVのウイルス希釈液を調製し、各ウイルス、各濃度3ウェルずつ、ウイルス液又はmock（1% v/v 熱非働化FBS添加DPBS）を10 μL/well加えた。室温で5分間振盪の後、5% CO2、37℃で1時間培養し、SCM 50 μL加えて、5% CO2、37℃で培養した。感染から1日後に、MTS＋フェナジンメトサルフェート（PMS）の混合液（20:1）を20 μL/wellずつ加え、さらに5% CO2、37℃で24時間培養後に96ウェルプレートリーダーAD200（Beckman Coulter）で490 nmの吸光度を測定した。この試薬の添加と24時間後の測定を感染から4日間連続で行い、mockでの吸光度に対する割合として算出した。【００９０】
実施例５  in vitroにおけるウイルス複製試験
Vero細胞及びU87MG細胞を6穴プレートに3 x 105cells/2 mL 10% v/v FBS添加DMEM/wellずつまき、5% CO2 、37℃で一晩培養した。1% v/v 熱非働化FBS添加DPBSでMOI 0.01のT-01とT-BVのウイルス希釈液を調製し、各ウイルス、各濃度3 wellずつ、ウイルス液又はmock（1% v/v 熱非働化FBS添加DPBS）を700 μL/well加えた。室温で5分間振盪し、5% CO2、37℃で1時間培養した後、ウイルス液を除き、1% v/v 熱非働化FBS添加DMEM 2 mL/wellを加えて、5% CO2、37℃で培養した。感染から24時間後及び48時間後に、細胞をセルスクレーパーで剥がし、培養液ごと、各ウェル毎に回収した。ドライアイス・エタノールによる凍結と融解を3サイクル繰り返した後、1分間の超音波による細胞破砕処理を加えたものを用いて、前述の方法と同様にタイターの測定を行った。【００９１】
実施例６  発現タンパクの確認
実施例６．１  ウエスタンブロット法による発現タンパクの確認
はじめに検体の調製を行った。6穴プレートにHEK293T細胞を8 x 105 cells/2 mL 10% v/v FBS添加DMEM/wellずつまき、5% CO2、37℃で8時間培養した後、1.6 μg BV/SV-01及びコントロールとしてSV-01をトランスフェクション試薬FuGENE HDとOptiMEMとを混合し、HEK293T細胞に滴下し、5% CO2、37℃で48時間培養し、BV/SV-01及びSV-01をHEK293T細胞にトランスフェクションした。上清を回収し、0.2 μmフィルターで濾過し、Amicon Ultra-15, 10K（Merck Millipore）を用いて限外濾過で濃縮したものを検体として保存した。陽性対照として、Avastin（登録商標）（中外製薬）を用いた。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）存在下で行うSDS-PAGEと、SDSを用いないnative PAGEを行った。【００９２】
実施例６．１．１  SDS-PAGE
40% w/v-Acrylamide/Bis Mixed Solution（29:1）2.4 mL、1 M Tris/HCl 3 mL、蒸留水 2.47 mL、SDS（10% v/v） 80 μL、APS（10% v/v）40 μL、TEMED 8 μLを調合して12%のseparate gelを作製し、ゲル作製用ガラス板セットの間に流し込み、上から蒸留水を重層して20分ほど静置し、固まったところで上層の蒸留水を除き、40% w/v-Acrylamide/Bis Mixed Solution（29:1）312.5 μL、1 M Tris/HCl 312.5 μL、蒸留水 1.835 mL、SDS（10% v/v）25 μL、APS（10% v/v）12.5 μL、TEMED 2.5 μLを調合した5%のstacking gelを重層することでゲルを作製した。ゲルを泳動槽内にセットした後、陽極槽・陰極槽には泳動バッファー（0.12 M Tris・HCl、0.192 M グリシン、3.47 mM SDS）を注いだ。ロードするタンパク量は500 ngで統一されるように、蒸留水及び4x loading buffer (0.25 M Tris・HCl pH 6.8、8% v/v SDS、40% v/v glycerol、20% v/v 2-メルカプトエタノール、0.2% v/v ブロモフェノールブルー) を混合し、100℃で10分間沸騰の後、on iceで急冷した。検体をウェルにロードし、stacking gel内は10 mA、250 V、10 W、separating gel内では20 mA、250 V、10 W、ともに室温で泳動した。ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜（Merck Millipore）をメタノールに浸した後、トランスファバッファー（0.048 M Tris、0.039 M Glysin、20% v/v メタノール、SDS（10%）100 μL）に浸した状態で、トランスブロットSDセル（Bio-Rad）を用いて100 mA、60分でタンパク質をPVDF膜にトランスファーした。Blocking Oneを用いて室温で、50分間ブロッキングした後、一次抗体としてgoat anti-human IgG-heavy and light chain monkey-absorbed antibody（1/2000希釈）を4℃で一晩反応させた。PVDF膜を洗浄した後、二次抗体としてdonkey anti-goat IgG-horseradish peroxidase（HRP）conjugated（1/2000希釈）を室温で2時間反応させ、洗浄の後、Pierce Western Blotting Substrate（1:1）（Thermo Fisher Scientific）を室温で5分間反応させ、LAS4000で撮影した。【００９３】
実施例６．１．２  native PAGE
ゲルは、プレキャストゲルNativePAGE Novex 3-12% Bis Tris Gels（Thermo Fisher Sientific）を使用した。ゲルを泳動槽内にセットした後、陽極槽には陽極バッファー（0.05 M BisTris、0.05 M Tricine）を、陰極槽には陰極バッファー（泳動バッファー（0.05 M BisTris、0.05 M Tricine、NativePAGE Cathode Additive（Thermo Fisher Scientific））を注いだ。ロードするタンパク量は500 ngで統一されるように、蒸留水及び4x NativePAGE Sample Buffer（Thermo Fisher Scientific）を混合した。検体をウェルにロードし、始めの60分間は150 V、8-10 mAで、残りは250 V、2-4 mAで30-90分、熱による変性を防ぐため、すべて4℃低温室内で泳動した。PVDF膜へのタンパク質のトランスファーはXcell2 Blot Module（Thermo Fisher Scientific）を用いて、inner chamberをトランスファバッファー（0.5 M Tricine、0.5 M Bis-Tris、0.02 M EDTA）で、outer chamberを蒸留水で満たし、25 V、1時間でタンパク質をPVDF膜にトランスファーした。Blocking Oneで室温、50分間ブロッキングした後、一次抗体としてgoat anti-human IgG-heavy and light chain monkey-absorbed antibody（1/2000希釈）を4℃で一晩反応させた。PVDF膜を洗浄した後、二次抗体としてdonkey anti-goat IgG- HRP conjugated（1/2000希釈）を室温で2時間反応させ、洗浄の後、Pierce Western Blotting Substrate Plus（40:1）（Thermo Fisher Scientific）を室温で5分間反応させ、LAS4000で撮影した。【００９４】
実施例６．２  ELISAによるin vitroにおける抗ヒトVEGF抗体発現の定量
6穴プレートにU87MG細胞を4 x 105 cells/2 mL 10% v/v FBS添加DMEM/wellずつまき、5% CO2、37℃で12時間培養した後、1% v/v 熱非働化FBS添加DPBSでMOI 0.2のT-01とT-BVのウイルス希釈液を作製し、各ウイルス3ウェルずつ、ウイルス液又はmock（1% v/v 熱非働化FBS添加DPBS）を700 μL/well加えた。室温で5分間振盪し、5% CO2、37℃で1時間培養した後、ウイルス液を除き、DMEM 2 mL/wellを加えて、5% CO2、37℃で72時間培養した。上清を回収し、Amicon Ultra-15, 10Kを用いて限外濾過で2.7倍濃縮したものを検体とした。検量線を描くためのスタンダードとしてはAvastin（登録商標）を使用し、原液（25 mg/mL）を基準に90 ng/mLから1/3ずつ8段階の希釈系列を作製した。スタンダード及び検体、検出抗体の希釈にはSample/conjugate diluent（Bethyl）を用いた。ELISAにはELISA Starter Accessory Kit（Bethyl）を使用した。micro titer wellにRecombinant Human VEGF 165（Peprotech）を50 ng/100μLずつ入れ、室温で1時間反応させ、抗原の固相化を行った。ELISA Wash Solution 100 μL/wellで5回洗浄した後、Blocking Solution 200 μL/wellを入れ、室温で30分間ブロッキングを行った。ELISA Wash Solution 200 μL/wellで5回洗浄した後、スタンダード及び検体を100 μL/wellずつ入れ、室温で1時間反応させた。ELISA Wash Solution 100 μL/wellで5回洗浄した後、検出抗体としてgoat anti-human IgG-Fc fragment antibody HRP conjugated（1/100000希釈）を100 μL/wellずつ入れ、室温で1時間反応させた。5回洗浄の後、TMB Substrateを100 μL/wellずつ加え、遮光して15分間反応させた後、Stop Solution（0.18 M H2SO4）を100 μL/wellずつ加え、96ウェルプレートリーダーAD200を用いて450 nmの吸光度を測定した。スタンダードで得られた吸光度を元に検量線を描き、検体の抗ヒトVEGF抗体濃度を算出した。検量線は画像処理フリーソフトウェアImage Jで作製した。【００９５】
実施例７  T-BV発現抗体の機能の確認
HUVEC-2を用いて、血管内皮細胞管腔形成試験及び血管内皮細胞遊走試験を行い、T-BVの発現するタンパク質のVEGF阻害効果の確認を行った。はじめに検体の調製を行った。Vero細胞からのVEGF発現量はU87MG細胞とほぼ同等であることを確認の上、検体調製にはVero細胞を用いた。Vero細胞をT150フラスコに8 x 106 cellsずつまき、37℃、5% CO2下で8時間培養の後、T-01、T-BV、mock（1% v/v 熱非働化FBS添加DPBS）をMOI 0.2で感染させ、室温で5分間振盪し、37℃、5% CO2下で1時間培養した。ウイルス液を除き、DMEM 15 mLに交換し、37℃、5% CO2下でさらに3日間培養した。上清を回収し、Amicon Ultra-15, 10Kで限外濾過して40倍濃縮した。【００９６】
実施例７．１  血管内皮細胞管腔形成試験
BD BioCoat Angiogenesis System-Endothelial Cell Tube Formation（BD Bioscience）を用いて行った。BD BioCoat Angiogenesis Plateを細胞播種の24時間前に4℃で溶解後、HUVEC-2を2 x 104 cells/wellずつ播種した。各ウェルに調製した検体を2.5 μLずつ添加した3群に加え、陽性対照としてmock 2.5 μLにAvastin（登録商標）を10 pg/2.5 μL又は10 ng/2.5 μL添加した2群（各、p.c.1、p.c.2）、陰性対照として細胞培養上清を添加しない群の計6群での評価を行った。各群3ウェルずつ行った。各ウェルの培養液の総量が50 μLとなるように1% v/v LSGS添加Medium200を加え、37℃、5% CO2で17時間培養した。培養液を除き、Hanks’ Balanced Salt Solution（HBSS）（Thermo Fisher Scientific） 100 μL/wellで洗浄を2回繰り返した後、8 μg/mL Calcein AM（BD Bioscience）を50 μL/wellずつ加え、37℃で30分間標識した。Calcein AMを除き、HBSS 100 μL/wellで2回洗浄後に蛍光顕微鏡BIOREVOで各wellを撮影した後、管腔の長さを測定し各群3ウェルの管腔長総和の平均値として算出した。【００９７】
実施例７．２  血管内皮細胞遊走試験
BD BioCoat Angiogenesis System-Endothelial Cell Migration（BD Bioscience）を用いて行った。上部チャンバーにHUVEC-2を1 x 105cells/wellずつ播種し、下部のウェルには調整した検体を19 μLずつ添加した3群に加え、陽性対照としてmock 19 μLにAvastin（登録商標）を380 pg/19 μL又は380 ng/19 μL添加した2群（各、p.c.1、p.c.2）、陰性対照として細胞培養上清を添加しない群の計6群での評価を行った。各群3ウェルずつ行った。各ウェルの培養液の総量が750 μLとなるように1% v/v LSGS添加Medium200を加え、37℃、5% CO2で22時間培養した。24穴プレートに8 μg/mL Calcein AMを500 μL/wellずつ分注したものを別途準備しておき、上部チャンバーの中の培養液及びメンブレン下面に付着した培地を除き、Calcein AMの入った24穴プレートに移して37℃で90分間標識した。蛍光顕微鏡BIOREVOで各ウェルにおける494 nm/517 nmでの蛍光強度を測定して、各群3ウェルの平均値として算出した。【００９８】
実施例８  T-BVの発現抗体の種間交差性の確認
はじめに検体の調製を行った。T150フラスコにHEK293T細胞を6 x 106 cells撒き、37℃、5% CO2で8時間培養した後、T-BVをMOI 3で感染させ、室温で5分間振盪の後、37℃、5% CO2で1時間培養した。ウイルス液を除き、VP-SFMを15 mL加え、さらに15時間培養した後、上清を回収し、限外濾過で20倍濃縮して作製した。一次抗体には、T-BVの感染上清濃縮液、Avastin（登録商標）及びウサギ抗マウスVEGF抗体を用いた。二次抗体には、T-BVの感染上清濃縮液及びAvastin（登録商標）に関してはFc部分がヒト由来であるため、抗ヒトIgG-Fc抗体を、ウサギ抗マウスVEGF抗体に関しては抗ウサギIgG-Fc抗体を、それぞれ用いて検出した。上記で作製した細胞上清濃縮液について行ったELISAで、抗ヒトVEGF抗体濃度は8.85 ng/mLであったことに基づき、陽性対照はAvastin（登録商標）及び抗マウスVEGF抗体の濃度を8.85 ng/mLと0.885 ng/mLの二段階に設定した。陰性対照は、VP-SFMを用いた。固相化した2種類のVEGFと、検出のための2種類の二次抗体との間の交差反応による偽陽性の可能性を考慮し、陰性対照では各VEGFを固相化したウェルそれぞれに2種類の二次抗体を反応させるクロスオーバーの反応系を設定した。【００９９】
ELISAキットはELISA Starter Accessory Kit（Bethyl）を使用した。micro titer wellに、ヒトVEGF又はマウスVEGFを50 ng/100 μL/wellずつ入れ、室温で1時間反応させ、抗原の固相化を行った。ELISA Wash Solution 100 μL/wellで5回洗浄した後、ELISA Blocking Solution 200 μL/wellを入れ、室温で30分間ブロッキングを行った。ELISA Wash Solution 200 μL/wellで5回洗浄した後、検体100 μL/wellずつ入れ、室温で1時間反応させた。ELISA Wash Solution 100 μL/wellで5回洗浄の後、各二次抗体（1/100000希釈）を100 μL/wellずつ入れて、室温で1時間反応させた。ELISA Wash Solutionで5回の洗浄の後、TMB Substrateを100 μL/wellずつ入れ、遮光下で15分間反応の後、Stop Solutionを100 μL/wellずつ加えて、96ウェルプレートリーダーAD200を用いて450 nmの吸光度を測定した。【０１００】
実施例９  動物実験
動物実験において治療に用いたウイルス液は、全てフィルター滅菌したグリセロールを10%の割合で添加したPBSを使用し、細胞懸濁液に関してはTGSについてはDMEM/F12（1:1）を、それ以外の細胞株ではDMEMを使用した。またmock群に関しては、精製の際にウイルス液の代わりに1% v/v 熱非働化FBS添加DPBSをVero細胞に添加し、以後の手順はウイルスと同様に精製したものを投与した。全身麻酔はケタミン（第一三共）とキシラジン（バイエル）の腹腔内注射又はイソフルラン（ファイザー）の吸入による麻酔法を用いた。【０１０１】
実施例９．１  抗腫瘍効果の検討
実施例９．１．１  皮下腫瘍モデルにおけるウイルスの腫瘍内投与実験
ケタミンとキシラジンの腹腔内投与による全身麻酔下のBALB/c nu/nuマウスの左側腹部に、50 μL DMEMに懸濁した2 x 106 cellsのU87MG細胞を26 G針を用いて皮下に移植した。腫瘍計測はノギスを用いて週2〜3回の頻度で行い、腫瘍体積は腫瘍長径×短径×厚さ（mm3）で算出した。
腫瘍径が6 mm大になったことを確認し、各治療群それぞれ10匹ずつに無作為に群分けをした後に、ウイルスの腫瘍内投与を行った。ケタミンとキシラジンの腹腔内投与による全身麻酔下に10% v/v グリセロール添加PBSで希釈した2 x 105 pfu/20 μLのT-01、T-BV又はmockを、30 G針を装着したマイクロシリンジ#1710（Hamilton）を用いて投与した。ウイルス初回投与日をday 0とし、day 3にも同量のウイルスの腫瘍内投与を行った。ウイルス投与後も、引き続き週に2-3回の腫瘍径の計測を行い、腫瘍体積を算出した。【０１０２】
実施例９．１．２  脳内腫瘍モデルにおけるウイルスの腫瘍内投与による生存実験
ケタミンとキシラジンの腹腔内投与による全身麻酔下に、BALB/c nu/nuマウスの頭部を小動物脳定位固定装置MODEL900（David Kopf Instruments）で固定し、右前頭葉内にDMEM 2 μLに懸濁した2 x 105 cellsのU87MG細胞を、マイクロシリンジ#1701N（Hamilton）を用いて注入した。刺入部位はbregmaから右外側に2 mm、前方に1 mmの部位とし、この直上に長さ4 mm程度の縦の皮膚切開をおき、骨膜を剥離した後に穿頭した後、穿刺針を脳表から深さ3 mmに進め、2分間かけて細胞懸濁液を注入し、5分間保持した後、2分間かけて穿刺針を抜去した。皮膚を5-0バイクリル（ジョンソン・エンド・ジョンソン）で縫合した。TGS-01、TGS-04に関しては、DMEM 2 μLに懸濁した1 x 105 cellsを同じ操作手順で右前頭葉内に移植した。
腫瘍が2〜3 mm大になるのを目処として、U87MG及びTGS-01に関しては腫瘍移植から10日目、TGS-04に関しては20日目に各治療群それぞれ10匹ずつ無作為に群分けをした後に、ウイルスの腫瘍内投与を行った。ケタミンとキシラジンの腹腔内投与による全身麻酔下にマウスの頭部を小動物脳定位固定装置で固定し、腫瘍移植においた皮膚切開部を再開創し、U87MGについては10% v/v グリセロール添加PBSで希釈した1 x 106 pfu/5 μLのT-01、T-BV又はmockを、TGS-01及びTGS-04については2 x 106 pfu/5 μLのT-01、T-BV又はmock を、それぞれマイクロシリンジ#1701Nを用いて注入した。異なるウイルスの混入を防ぐため、マイクロシリンジはウイルス毎に別のものを準備した。刺入部位・深さは腫瘍移植時と同じに設定した。2分間かけてウイルス液を注入し、5分間保持した後、2分間かけて穿刺針を抜去した。皮膚を5-0バイクリルで縫合した。ウイルスは単回投与で、投与日をday 0とし、各マウスの生存期間を記録した。【０１０３】
実施例９．２  腫脹抑制効果の検討
実施例９．２．１  核磁気共鳴画像法（magnetic resonance imaging; MRI）
実施例９．２．１．１  各種ヒト脳腫瘍細胞株を用いた脳内腫瘍モデルの作製及びウイルスの腫瘍内投与
各種ヒト脳腫瘍に対するT-BVの腫脹抑制効果の検討を行うために、U87MG、U251MG、NMC-G1、TGS-01、1123/Mを用いてBALB/c nu/nuマウス脳内腫瘍モデルを作製し、ＭＲＩを用いた腫瘍の描出が最も容易であったU87MGを用いて試験を行った。移植した細胞数:2 x 105(cells)、ウイルス投与日：腫瘍移植から１２日後、ウイルス投与量：1 x 106(pfu)。前述と同様の方法で右前頭葉内に腫瘍細胞移植を行った。MRIで腫瘍がウイルス投与に適した大きさであることを確認の後、前述と同様の方法で腫瘍内投与した。また陽性対照として、T-01とAvastin（登録商標）併用群（T+A群；T-01の腫瘍内投与から5日間連続でAvastin（登録商標）5 mg/kgの腹腔内投与を行う）を設定した。【０１０４】
実施例９．２．１．２  MRIの撮像
イソフルランによる吸入麻酔下及び呼吸モニタリング下にMRI撮像を行った。撮像は小動物用MRI ICON 1TTM（Brucker Biospin）を用いた。MRIの撮像パラメーターは以下のとおり設定した。
T2強調像（T2WI）： repetition time (TR) = 2,000 msec; echo time (TE) = 85 msec; 6 slices; thickness = 0.7 mm; field of view (FOV) = 20 x 20 mm; matrix = 96 x 96; number of averages (NA) = 8。
T1強調像（T1WI）: TR = 400 msec; TE = 12 msec; 6 slices; thickness = 0.7 mm; FOV = 20 x 20 mm; matrix = 96 x 96; NA = 10。
造影T1WI（T1WI（CE））はT2WI撮像後にMRI用造影剤マグネビスト（登録商標）（バイエル）をPBSで20分の1倍に希釈したものを100 μL経眼窩静脈投与した後に撮像した。
腫瘍移植後はT2WI、T1WI（CE）を適宜撮像し、腫瘍形成を確認した。腫瘍が形成されたことを確認後、ウイルス投与日を決め、その前日に全個体に関してT2WI及びT1WI（CE）を撮像し、大きさ及び形状がウイルスの腫瘍内投与に適している個体を選出した後に、無作為にmock群及びウイルス治療群に群分けをした。ウイルス投与2、4、6日後（post inoculation day (PID) 2、4、6）にもMRIを同じ撮像フェーズで撮像した。【０１０５】
実施例９．２．１．３  腫脹領域の評価
撮像した画像は、DICOM画像処理フリーソフトウェアOsirixを用いてT2WIでの高信号域及びT1WI（CE）での造影領域の面積を計測した。T2WI及びT1WI（CE）それぞれにおける高信号域の面積（mm2）について、ウイルス投与前日に撮像したものをそれぞれS2p、S1pとし、ウイルス投与後ｎ日目に撮像したものについてはそれぞれS2n、S1nとし、腫瘍周囲の腫脹（浮腫）を（S2n/S2p）÷（S1n/S1p）で相対値として算出した。【０１０６】
実施例９．２．２  RT-qPCRによるマウスアクアポリン（AQP）4の定量
実施例９．２．２．１  U87MG脳内腫瘍モデルの作製及びウイルスの腫瘍内投与
前述と同様の方法で、BALB/c nu/nuマウスの右前頭葉内にDMEM 2 μLに懸濁した2 x 105cellsのU87MG細胞の移植を行った。腫瘍移植10日後に各治療群それぞれ6匹ずつに無作為に群分けをした後、1 x 106 pfu/5 μLのT-01、T-BV又はmockを前述と同様の方法で腫瘍内投与した。陽性対照として、T+A群を設定した。【０１０７】
実施例９．２．２．２  RT-qPCR
PID6に全てのマウスを安楽死させ、腫瘍を含んだ右前頭葉を摘出し、RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen）を用いてRNAを抽出した。続いてこのRNAから、逆転写酵素ReverTra Ace qPCR RT master mix（Toyobo）を用いてcDNAを作製した。PCRプライマーはTaqman Gene Expression AssaysのマウスAQP4のプライマー（Mm_00802131_m1）及びマウスβアクチンのプライマー（Mm_02619580_g1）を使用し、7500 FastリアルタイムPCRシステム（Thermo Fisher Scientific）を用いた。データ解析はマウスβアクチンをリファレンス遺伝子としてサイクル比較法を用いて算出した。【０１０８】
実施例９．２．３  T-BVとT-VHVLの腫脹抑制効果の比較
前述と同様の方法で、BALB/c nu/nuマウスの右前頭葉内にDMEM 2 μLに懸濁した2 x 105 cellsのU87MG細胞の移植を行った。ウイルス投与に関しては、MRIで腫瘍がウイルス投与に適した大きさであることを確認できた腫瘍移植10日後に、1 x 106 pfu/5 μLのT-01、T-BV、T-VHVL又はmockを前述と同様の方法で腫瘍内投与した。MRIの撮像方法、タイミング及び腫脹の評価に関しては、T-BVの腫脹抑制効果確認実験と同様に行った。【０１０９】
実施例９．３  ウイルス投与後の腫瘍環境に対する影響
実施例９．３．１  脳腫瘍モデルに対するウイルス投与後の病理学的検討（免疫組織化学染色）
実施例９．３．１．１  U87MG脳内腫瘍モデルの作製及びウイルスの腫瘍内投与、プレパラート作製
前述と同様の方法で、BALB/c nu/nuマウスの右前頭葉内にDMEM 2 μLに懸濁した2 x 105cellsのU87MG細胞の移植を行った。腫瘍移植10日後に各治療群それぞれ6匹ずつに群分けをした後、1 x 106 pfu/5 μLのT-01、T-BV又はmockを前述と同様の方法で腫瘍内投与した。陽性対照として、T+A群を設定し、Avastin（登録商標） 5 mg/kgをウイルス投与日から安楽死まで連日投与した。PID2、4にマウスを各群3匹ずつ安楽死させた後、脳を摘出し、中性緩衝ホルムアルデヒド（10）（Sigma-Aldrich）に24時間浸透させて固定した。固定パラフィン包埋装置Tissue-Tek VIP-5-Jr（サクラ精機）でパラフィン包埋し、パラフィン包埋ブロック作製装置Tissue-Tek TECプラス（サクラ精機）でパラフィンブロックを作製し、ミクロトーム（Leica）で腫瘍中心部を4 μmの厚さで薄切して連続切片を作製した。
また、T-BV、T-VHVLを投与した場合の血管新生の評価を目的として、同様にBALB/c nu/nuマウスの右前頭葉内にDMEM 2 μLに懸濁した2 x 105cellsのU87MG細胞を移植して脳内腫瘍モデルを作製し、腫瘍移植10日後に各治療群それぞれ6匹ずつに群分けをした後、1 x 106 pfu/5 μLのT-01、T-BV、T-VHVL又はmockを前述と同様の方法で腫瘍内投与した。以下、同様にパラフィン切片を作製した。【０１１０】
実施例９．３．１．２  免疫組織化学染色
プレパラートを43℃の伸展器上で一晩伸展・乾燥させた後、キシレンに30分浸して脱パラフィン処理を行い、100% エタノール、90% v/v エタノール、70% v/v エタノールに10分ずつ浸して親水化処理をした。蒸留水で洗浄の後、マイクロウェーブ法で抗原賦活化処理を行い、Peroxidase-Blocking Solution（Dako）を用いて内因性ペルオキシダーゼのブロッキングを行った。Tris-HCl Buffer Saline（TBS）で10分間洗浄した後、1.5% v/v Normal Goat Serum（Vector Laboratories）に室温で15分浸してブロッキングを行った。一次抗体反応は以下の抗体及び希釈倍率で、室温で1時間反応させた。抗HSV-1抗体（1：2000）、抗マウスCD31抗体（1:40）、抗マウスF4/80抗体（1:2000）。希釈には1.5% v/v Normal Goat Serumを用いた。一次抗体反応の後、TBSで10分間洗浄した。二次抗体反応はHRP標識抗ウサギポリマー又はMouse MAX PO (Rat)を用いて、室温で30分間反応させた。TBSで10分間洗浄の後、DAB Substrate Kit（Vector Laboratories）に浸して検出した。検出の後、ヘマトキシリンで7分間対比染色を行い、70% v/v エタノール、90% v/v エタノール、100% エタノールに各10分間ずつ順次浸して脱水し、キシレンに10分浸して透徹した後に、非脂溶性封入剤マウントクイック（大道産業）で封入した。【０１１１】
実施例９．３．１．３  腫瘍血管新生に関しての評価
腫瘍血管新生については、ウイルス投与後のU87MG脳内腫瘍モデルに対するマウスCD31の免疫組織化学染色を行ったプレパラートを用いて、腫瘍内の血管数を計測することで評価した。血管数の計測はWeidnerらの方法（Weidner, N. et al. (1991) The New England journal of medicine 324, 1-8）に従って行った。バーチャルスライドスキャナNanozoomer（浜松ホトニクス）を用いて、各群各日n = 3の検体プレパラートに関して倍率200倍で血管密度が最大の部分を撮像し、CD31陽性細胞をカウントして平均血管数を算出した。【０１１２】
実施例９．３．２  脳腫瘍モデルに対するウイルス投与後のマクロファージの変化
実施例９．３．２．１  U87MG脳内腫瘍モデルの作製及びウイルスの腫瘍内投与
前述と同様の方法で、BALB/c nu/nuマウスの右前頭葉内にDMEM 2 μLに懸濁した2 x 105 cellsのU87MG細胞の移植を行った。腫瘍移植10日後に各治療群それぞれ9匹ずつに群分けをした後、ウイルス投与に関しては、1 x 106 pfu/5 μLのT-01、T-BV又はmockを前述と同様の方法で腫瘍内投与した。陽性対照として、T+A群を設定し、Avastin（登録商標） 5 mg/kgをウイルス投与日から最長5日間、安楽死まで連日投与した。【０１１３】
実施例９．３．２．２  フローサイトメトリーによるマクロファージの評価
PID2、4、6にマウスを各群3匹ずつ安楽死させた後、速やかに腫瘍を含む右前頭葉を摘出し、Naural tissue dissociation kit（Miltenyi Biotec）及びgentleMACS Octo Dissociator（Miltenyi Biotec）を用いて、組織を分散して単細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液をエッペンドルフチューブに移し、PBS 1 mLに懸濁し、Fixable Viability Dye eFluor 780（Affymetrix）を1 μL加えてvortexし、4℃、遮光下で30分間反応させ、死細胞の染色を行った。Flow Cytometry Staining Buffer（eBioscience）で2回洗浄した後、1 mLに懸濁して検体とした。はじめに抗マウスCD16/32抗体を2 μL加え、on iceで5〜10分間反応させ、Fcレセプターを介した抗体の非特異的結合のブロッキングを行った。条件検討の結果、検体100 μLあたりに添加する抗体量は以下のように決定した。抗CD45抗体（0.5 μL）、抗CD11b抗体（1 μL）、抗F4/80抗体（5 μL）、抗Gr-1抗体（0.5 μL）、抗CX3CR1抗体（0.5 μL）。これらの抗体全てを各検体チューブに添加した染色サンプルの他に、蛍光補正のために1種類の抗体のみを添加した単染色サンプル、及び感度調整のための無染色サンプルも併せて準備した。tappingで混和し、4℃、遮光下で30分間反応させた後、Flow Cytometry Staining Bufferで2回洗浄した。Flow Cytometry Staining Buffer 100 μLに懸濁し、4% v/v ホルマリン/PBS 10 μLを加えて固定し、フローサイトメーターCytoFLEX（Beckman Coulter）で解析を行った。はじめに無染色検体で各蛍光の感度調整を行い、単染色サンプルで蛍光補正を行った後に、染色サンプルの解析を行った。マクロファージはCD45陽性、CD11b陽性、F4/80陽性の集団で、このうち、M1はGr-1highCX3CR1low、M2はGr-1lowCX3CR1highとして分離可能である。散乱光の二次元プロットによってミエリン分画をゲートアウトし、死細胞染色によって死細胞除去を行った後、CD45陽性分画について、CD11b及びF4/80で二次元プロット展開し、両陽性細胞について、Gr-1及びCX3CR1で二次元プロット展開することによって、M1マクロファージ、M2マクロファージを分離した。M1、M2それぞれについて、CD45陽性細胞中の割合を算出し、M1/M2の比を算出することで、マクロファージのM1/M2シフト状況の評価を行った。【０１１４】
実施例９．３．２．３  ウイルス複製試験及びウイルス力価の測定 (in vivo)
前述と同様の方法で、U87MG細胞をマウスに皮下移植して腫瘍を形成した。腫瘍移植約20日後、腫瘍径が6mm大程度となったことを確認し、各治療群それぞれ12匹ずつに無作為に群分けをした後に、前述と同様の方法でウイルスの投与を行った。投与は、1 x 106 pfuのT-01、T-BV、mock又はT-01+Avastin（登録商標）の腹腔内投与（T+A）であった。T+A群では、Avastin（登録商標）を5mg/kg体重の量で5日間腹腔内投与した（ウイルス接種の直前から投与開始）。ウイルス接種直後、1日後、3日後又は7日後に、腫瘍を回収し、300μLの氷冷PBS中でホモジェナイズし、凍結と融解を3サイクル繰り返した後、力価を実施例3と同様の手法によりVero細胞を用いて測定した（各群の各測定日につき、n=3）。【０１１５】
実施例９．４  in vivoにおけるT-BVの抗体発現の確認
実施例９．４．１  皮下腫瘍モデルに対するT-BV投与後の投与局所での抗体発現の確認
前述と同様の方法で、BALB/c nu/nuマウスの左側腹部に50 μL DMEMに懸濁した2 x 106 cellsのU87MG細胞を移植した。腫瘍径が5 mm大になった時点でT-01群、T-BV群、mock群各群9匹ずつ無作為に分け、2 x 106 pfu/20 μLのT-01、T-BVを腫瘍内に単回投与した。PID2、4、6にマウスを各群3匹ずつ安楽死させて皮下腫瘍を摘出し、1/100量のコンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル（Roche）及び1/1000量の1Mジチオトレイトール（Wako）を添加したice-cold Cell Lysis Buffer（Wako）500 μL中で破砕した後、Amicon Ultra-15, 10Kで2倍に濃縮した。マウスのin vivo検体にはマウスIgGが多く含まれており、ELISAへの非特異的な反応を低減するため、免疫沈降法を利用してマウスIgGを除去することとし、Anti-mouse IgG(H&L), F(ab’)2 Fragment(Sepharose Bead Conjugate)（Cell Signaling Technology）を10 μLずつ検体に加え、4℃で1時間転倒混和後に遠心し、得られた上清をELISAに用いた。ELISAは、前述と同様の方法で、ヒトVEGFを固相化したウェルを用い、スタンダードはAvastin（登録商標）を段階希釈したものを用いた。96ウェルプレートリーダーで450 nmの吸光度を計測し、スタンダードをもとに画像処理フリーソフトウェアImageJを用いて検量線を描き、検体中の抗ヒトVEGF抗体濃度を算出した。【０１１６】
実施例９．４．２  脳内腫瘍モデルにおけるウイルス投与後の発現抗体の血中濃度の確認
T-BVを脳内腫瘍モデルに投与した際に、発現する抗ヒトVEGF抗体の血中濃度をELISAで測定した。前述と同様の方法でBALB/c nu/nuマウスの右前頭葉内にDMEM 2 μLに懸濁した2 x 105 cellsのU87MG細胞を移植し、腫瘍移植10日後にT-01群、T-BV群、T+A群及びmock群それぞれ6匹ずつに群分けをした後に、ウイルス投与に関しては、1 x 106 pfu/5 μLのT-01、T-BV又はmockを腫瘍内投与した。T+A群に関しては、Avastin（登録商標） 5 mg/kgをウイルス投与日に腹腔内に単回投与した。PID1、3に各群3匹ずつ静脈採血を行い、血清中のVEGF濃度をELISAで測定した。【０１１７】
実施例１０  T-VHVL及びT-sVEGFR1の評価
実施例１０では、実施例１．８で作製したT-VHVL及びT-sVEGFR1について、以下のとおり評価した。
実施例１０．１  ウイルスの力価測定
Vero細胞を6 wellプレートに3.6×105 cells/wellとなるように播種し、37℃、5% CO2の条件下で培養した。16時間後、1% 熱非働化FBS (1% IFBS) 添加PBSで洗浄後、10倍の希釈系列のウイルス液を加え、37℃、5% CO2の条件下で培養した。1時間後、ウイルス液を除き、0.1% ヒト免疫グロブリンを加えた1% IFBS 添加DMEMを培地として加え、34.5℃、5% CO2条件下で培養した。3日後、PBSで洗浄し、メタノールで固定した。乾燥させた後、蒸留水で20倍希釈したギムザ液で染色し、洗浄、乾燥し、顕微鏡下でプラーク数をカウントし、ウイルス力価 (pfu/ml) を算出した。【０１１８】
実施例１０．２  ウイルスDNAのサザンブロッティング法による構造確認
精製したウイルスから、QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Netherlands) を用いて、メーカーのプロトコールに従ってウイルスDNAを抽出した後、Kpn Iを用いて制限酵素処理した。0.6% アガロースゲルを用いて、35 Vの電圧で16時間電気泳動した後、ナイロン膜(Turbo Blotter, Whatman, US) にウイルスDNAを転写した。プローブはsVEGFR1及びVEGFscFvのDNA断片をアルカリフォスファターゼで標識してそれぞれ作製し (AlkPhos Direct with CDP-Star, GE Healthcare, USA)、DNAが転写された膜とハイブリダイゼーションを行い、AlkPhos Direct with CDP-Star (GE Healthcare, USA) を用いて検出した。【０１１９】
実施例１０．３  T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvのVEGF阻害因子タンパク質発現確認 (in vitro)
T-sVEGFR1を細胞に感染させた際に発現する可溶型VEGFR1タンパク質の確認には、Human sVEGF-R1 / FLT-1 ELISA Kit (BioVendor, USA) を、T-VEGFscFvを感染させた際に発現する一本鎖抗VEGF抗体の確認には、Human Kappa ELISA Kit (Bethyl Laboratories, USA) をそれぞれ用いた。
Vero細胞を6 wellプレートに3×105 cells/wellとなるように播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した。16時間後、1% IFBS 添加PBSで洗浄し、T-01、T-sVEGFR1もしくはT-VEGFscFvをmultiplicity of infection (MOI) 0.5で感染させ、 37℃、5% CO2条件下で培養した。Mock (陰性コントロール) は、1% IFBS添加PBSをウイルス液の代わりに加えた。1時間後、ウイルス液を除き、1% IFBS 添加DMEMを加え、37℃、5% CO2条件下で培養した。48時間後、培養上清を回収し、メーカーのプロトコールに従って、ELISA法による測定を行った。【０１２０】
実施例１０．４  血管内皮細胞管腔形成試験 (in vitro)
血管内皮細胞管腔形成試験は、BD BioCoatTM Angiogenesis System-Endothelial Cell Tube Formation (BD Bioscience, USA) を用いて行った。VeroをT-150フラスコに1×107 cells播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した。16時間後、T-01、T-sVEGFR1もしくはT-VEGFscFvをMOI 0.2で感染させ、37℃、5% CO2条件下で培養した。90分後、ウイルス液を除き、DMEM (血清なし) を加え、37℃、5% CO2条件下で培養した。2日後、培養上清を回収し、ヒト免疫グロブリンを50 μg/mlとなるように加え、ウイルスを不活化した。回収した上清をAmicon(R) Ultra-15 10K (Merck Millipore, Ireland) で限外濾過し、40倍濃縮した。Matrigel Matrixがコートされた96 wellプレートに1 well当たり、HUVECを2×104 cells /wellとなるように播種した。そこに、濃縮した培養上清2.5 μlと1% LSGS添加Medium 200を47.5 μl加え、37℃、5% CO2条件下で培養した。なお、陽性対照として、抗VEGFヒト化モノクローナル抗体であるBevacizmab (中外製薬、東京) を4 μg/mlとなるように1% LSGS 添加Medium 200に加えたもの50 μlを各ウェルに加えた。また、陰性対照として1% LSGS 添加Medium 200のみを50 μl加えた。18時間後、BIOREVO (KEYENCE, 大阪) で各ウェルを撮影した後、管腔の長さをImage Jソフトウェアで測定し、長さの合計を算出して比較した。【０１２１】
実施例１０．５  血管内皮細胞遊走試験 (in vitro)
血管内皮細胞遊走試験は、BD BioCoatTM Angiogenesis System-Endothelial Cell Migration (BD Bioscience, USA) を用いて行った。Vero細胞をT-150フラスコに1×107cells播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した。16時間後、T-01、T-sVEGFR1もしくはT-VEGFscFvをMOI 0.2で感染させ、37℃、5% CO2条件下で培養した。90分後、ウイルス液を除き、DMEM (血清なし) を加え、37℃、5% CO2条件下で培養した。2日後、培養上清を回収し、ヒト免疫グロブリンを50 μg/mlとなるように加え、ウイルスを不活化した。回収した培養上清をAmicon(R) Ultra-15 10Kで限外濾過し、40倍濃縮した。上部チャンバーにはHUVECを1×105 cells/wellとなるように播種した。また、下部の24 wellプレートには1 wellあたり濃縮した培養上清19 μlと1% LSGS 添加Medium 200を731 μl加えた。なお、陽性対照として、Bevacizmabを4 μg/ml となるように1% LSGS 添加Medium 200に添加したもの750μlを各ウェルに加えた。また、陰性対照として1% LSGS 添加Medium 200のみを750 μl加えた。37℃、5% CO2条件下で22時間培養後、calcein AM solutionでHUVECを蛍光染色した。BIOREVO (KEYENCE, 大阪) を用いて各ウェルを撮影した後、494 / 517 nmで蛍光強度を測定し、上部チャンバーのメンブレンを通過して下部ウェルに遊走したHUVECを評価した。【０１２２】
実施例１０．６  ウイルス複製試験 (in vitro)
HT-29を6 wellプレートに4×105 cells/wellとなるように播種し、10% FBS 添加McCoy’s 5A (Modified)、37℃、5% CO2条件下で培養した。16時間後、1% IFBS 添加PBSで洗浄し、T-01、T-sVEGFR1もしくはT-VEGFscFvをMOI 0.01で感染させ、37℃、5% CO2条件下で培養した。1時間後、ウイルス液を除き、1% IFBS 添加McCoy’s 5A (Modified)を加え、37℃、5% CO2条件下で培養した。24時間及び48時間後に、セルスクレーパーで細胞をかきとり、上清とともに回収したウイルスの力価を測定した。【０１２３】
実施例１０．７  ウイルスの殺細胞効果の検討 (in vitro)
HT-29を6 wellプレートに2×105 cells/well播種し、37℃、5% CO2条件下で培養した。16時間後、1% IFBS 添加PBSで洗浄し、T-01、T-sVEGFR1もしくはT-VEGFscFvをMOI 0.1及び0.01で感染させ、 37℃、5% CO2条件下で培養した。Mockは、1% IFBS 添加PBSをウイルス液の代わりに加えた。1時間後、ウイルス液を除き、1% IFBS 添加McCoy’s 5A (Modified)を加え、34.5℃、5% CO2条件下で培養した。感染後、4日間に渡り、24時間後ごとにそれぞれ生存細胞をコールターカウンター (Beckman Coulter, CA, USA) で測定し、Mockに対する細胞数の割合を算出した。【０１２４】
実施例１０．８  HT-29細胞株及びCT26細胞株の VEGF発現量の検討 (in vitro)
HT-29もしくはCT26を6 wellプレートに3×105cells/wellとなるように播種し、37℃、5% CO2条件下で、HT-29は1% IFBS 添加McCoy’s 5A (Modified) 、CT26は1% IFBS 添加RPMI1640で培養した。48時間後、培養上清を回収し、HT-29はHuman VEGF Quantikine ELISA Kit (R&D Systems, USA) を、CT26はMouse VEGF Quantikine ELISA Kit (R&D Systems, USA) 用いて上清中のVEGFを定量した。【０１２５】
実施例１０．９  HT-29皮下腫瘍モデルに対する抗腫瘍効果の検討
BALB/c nu/nu(5週齢、メス、SLC社、静岡) にキシラジンとケタミンを腹腔内投与して全身麻酔をかけ、マウスの左側腹部皮下に1匹あたりHT-29を1×106 cells / 50μl McCoy’s 5A (Modified) (血清なし) 投与した。腫瘍径が5 mmに達した14日後をDay 0とし、マウスを無作為に4群に分け、T-01、T-sVEGFR1、T-VEGFscFvもしくはMockを1腫瘍あたり1×106 pfu / 20 μlを腫瘍内に投与した。なお、ウイルスの希釈にはPBSに10% のグリセロール加えたものを使用した。また、Mockは陰性コントロールとして、Veroにウイルスを感染させずに、同様の培養及び精製工程を施して作製したものを使用した。また、一回目のウイルス投与から3日後のDay 3にも同様にウイルスを投与した。皮下腫瘍は週2回の頻度で長径、短径、厚みを測定し、腫瘍体積 (mm3) ＝長径×短径×厚みとして算出した。【０１２６】
実施例１０．１０  HT-29皮下腫瘍モデルのCD31免疫組織化学染色
BALB/c nu/nu (5週齢、メス、SLC社、静岡) に全身麻酔をかけ、マウスの左側腹部皮下に1匹あたりHT-29を1×106 cells / 50μl McCoy’s 5A (Modified) (血清なし) 投与した。14日後をDay 0とし、マウスを無作為に4群に分け、T-01、T-sVEGFR1、T-VEGFscFvもしくはMockを1匹あたり1×106 pfu / 20μl腫瘍内に投与した。Day 3にも同様にウイルスを投与した。Day 3 (2回目のウイルス投与前) とDay 7にマウスを頸椎脱臼で安楽死させ、皮下腫瘍組織を切り出し、ホルマリン固定した。24時間後、固定した組織をPBSで洗浄し、パラフィン包埋した。厚さ4 μmのパラフィン切片を98℃の200倍希釈イムノセイバー (日新EM株式会社、東京) で45分間処理し、抗原の賦活化を行った。2% Normal Goat Serum / TBSでブロッキングを行った後、１次抗体として、ウサギ抗CD31抗体（abcam, UK）を2% BSA / TBSで50倍希釈し、組織切片と１時間反応させ、EnVision+System-HRP Labeled Polymer Anti-Rbbit (Dako, Denmark) を30分反応させ、DAB  Substrate kit（Vector laboratories, Burlingame, CA）で抗体の検出を行った。腫瘍血管新生については、腫瘍内の微小血管密度で評価した。微小血管密度は、Weidner Nらの論文に従って (19)、組織切片の顕微鏡 (×20) での一視野あたりの微小血管の平均数とし、Nanozoomer (HAMAMATSU, 静岡) を用いて、組織切片を無作為に10か所撮影し、CD31陽性細胞をカウントした結果を平均することによって算出した。【０１２７】
実施例１０．１１  Real Time Quantitative Polymerase Chain Reaction (PCR) によるウイルスDNAの定量
BALB/c nu/nu(5週齢、メス、SLC社、静岡) に全身麻酔をかけ、マウスの左側腹部皮下に1匹あたりHT-29細胞を1×106 cells / 50μl McCoy’s 5A (Modified) (血清なし) 投与した。14日後をDay 0とし、マウスを無作為に4群に分け、T-01、T-sVEGFR1、T-VEGFscFvもしくはMockを1匹あたり1×106 pfu / 20 μl腫瘍内に投与した。Day 3にマウスを頸椎脱臼で安楽死させ、皮下腫瘍を切り出し、-80℃で凍結保存した。後日解凍し、PBSを加えホモジェナイズし、QIAamp DNA Mini Kitを用いて、メーカーのプロトコール通りにウイルスDNAを抽出した。HSV-1のDNAを検出するためのプライマー及びプローブは、HSV-1のDNA polymeraseをコードする遺伝子の領域に対して設計した以下のものを用いた。
HSV DNApoly-F : 5’-GGCACGCGGCAGTACTTT-3’（配列番号２７）
HSV DNApoly-R : 5’-CCATGCGCTCGCAGAGA-3’（配列番号２８）
HSV DNApoly-T : 5’-AGGTCGACAGGCACCTACAATGCCG-3’ TAMRA (リポータ色素：FAM)（配列番号２９）
また、Real Time Quantitative PCRは、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2×) (Applied Biosystems, USA) を使用した。ウイルスのゲノムコピー数の定量は、HSV-1のDNA polymeraseをコードする遺伝子の配列を含むプラスミドを作製して、そのDNAの希釈系列を作製し、検量線を作製して、それをもとに測定した。【０１２８】
実施例１０．１２  CT26皮下腫瘍モデルに対する抗腫瘍効果の検討
BALB/c (5週齢、メス、SLC社、静岡) にキシラジンとケタミンを腹腔内投与して全身麻酔をかけ、マウスの左側腹部皮下に1匹あたりBALB/c 由来のCT26を1×105cells / 50 μl RPMI1640 (血清なし) 投与した。腫瘍径が5 mmに達した10日後をDay 0とし、マウスを無作為に4群に分け、T-01、T-sVEGFR1、T-VEGFscFv及びMockを1匹あたり1×106 pfu / 20 μl腫瘍内に投与した。また、一回目のウイルス投与から3日後のDay 3にも同様にウイルスを投与した。皮下腫瘍は週2回の頻度で長径、短径、厚みを測定し、腫瘍体積 (mm3) ＝長径×短径×厚みとして算出した。【０１２９】
Ｃ．統計解析
統計解析は、2群間の検定に関しては、特筆しない限り、エクセル統計（Microsoft）を用いてStudent t検定を、多群間の検定に関しては、SPSS Statistics version 22（IBM）を用いてSidak法による多重検定を、それぞれ行った。MRIを用いた腫脹の評価実験では同一個体に対する反復測定を考慮し、repeated ANOVAを行い、交互作用のあるものにはSidak法による多重検定を行った。脳内腫瘍モデルの生存期間に関してはJMP12（SAS Institute）を用いて、Kaplan Meier法で累積生存率曲線を描き、検定にはLogrank検定又はWilcoxon検定を行った。p値が0.05未満の場合に群間に有意差ありとした。【０１３０】
Ｄ．結果
結果Ｉ  T-BVの作製
結果Ｉａ  抗VEGF抗体発現cDNAの作製（実施例１．１の結果）
抗VEGF抗体発現型の腫瘍溶解性ウイルスを作製するためのアミノ酸配列設計は、図４及び図５に示したとおりである。本実施例で用いた抗VEGF抗体であるベバシズマブは、165残基のヒトVEGF（VEGF165）をマウスに免疫して得られたハイブリドーマ細胞株から選択されたマウス抗ヒトVEGFモノクローナル抗体muMAb A4.6.1産生株の抗体遺伝子に関して、抗原特異性に関与する相補性決定領域（CDR）はそのままに、フレームワーク領域（FR）をヒト化することで作製したヒト化抗ヒトVEGFモノクローナル抗体である。cDNAからの効率的な抗体産生には重鎖と軽鎖が等量ずつ発現することが必要であるため、アミノ酸配列設計において、重鎖、軽鎖にそれぞれ対応するポリペプチドを、FMDV-2A配列及びfurin開裂部位のアミノ酸配列で結合する方法を採用した（図４、図１）。
アミノ酸配列より作製した抗ヒトVEGF抗体発現遺伝子のcDNA及びVEGF scFv発現遺伝子のcDNAの配列情報をそれぞれ図９及び１０に示す。【０１３１】
結果Ｉｂ  目的遺伝子のSV-01への挿入とcDNAからの発現タンパクの確認（実施例１．２、実施例１．３、実施例６．１の結果）
作製したcDNAを搭載したプラスミドpEX-K-BVから目的のcDNAを制限酵素処理で切り出し、SV-01へ挿入してBV/SV-01を得た。続いて、目的のcDNAからのタンパク発現を確認する目的で、BV/SV-01をHEK293T細胞にトランスフェクションして得た培養上清中に含まれるタンパクに対して、ウエスタンブロット法を行った。一般的に、抗体に対するウエスタンブロット法での解析では、SDS-PAGEと、native PAGEの二種類の電気泳動を併用する。SDS-PAGEでは、タンパクを還元してジスルフィド結合を切断してから泳動するが、この過程で抗体の重鎖同士、及び重鎖と軽鎖をつなぐジスルフィド結合が切断されるために、重鎖（50 kDa）、軽鎖（25 kDa）に相当する2本のバンドが検出される。一方で、native PAGEでは、タンパクが未変性のまま泳動されるため、高次構造を保ったままの泳動が可能であり、四量体（150 kDa）に相当する1本のバンドのみが検出される。本実施例でもこの2種類のPAGEを行うことで、作製したcDNAからのタンパク発現の解析を行った。
SDS-PAGEにおいて、陰性対照であるSV-01をトランスフェクションした検体では、バンドが検出されなかったのに対して、BV/SV-01をトランスフェクションした検体及び陽性対照のAvastin（登録商標）では、分子量25 kDaと50 kDaに相当する2本のバンドを検出した（図１１Ａ）。native PAGEにおいては、SV-01をトランスフェクションした検体では、バンドの検出を認めなかったのに対して、BV/SV-01をトランスフェクションした検体及びAvastin（登録商標）では分子量150 kDaに相当する1本にバンドを検出した（図１１Ｂ）。これらの結果から、本実験で遺伝子組換えに使用した、抗ヒトVEGF抗体発現遺伝子からの発現タンパクが二本鎖抗体として矛盾しないことが示された。【０１３２】
結果Ｉｃ  目的遺伝子のG47Δへの挿入とウイルス精製（実施例１．４〜１．７の結果）
続いて、BV/SV-01のT-BACへの挿入を行った。SV-01及びT-BACにはloxP部位が内包されており、Cre-recombinationによってBV/SV-01/T-BACを作製した。この段階での構造確認のためのPCRを行った。採取した10個すべてのクローンでBV/SV-01の挿入が認められ、そのうちのひとつのクローンで二重挿入が確認された。このPCRで単一挿入が確認されたクローンから2つのクローンを選択して、それぞれのDNAをHindIIIあるいはKpnIで制限酵素処理し電気泳動パターンを確認した。HindIIIで処理したものでは、BV/SV-01が挿入された場合には、抗ヒトVEGF抗体発現遺伝子の2,261 bpが加わり、HindIIIによって切断される部位が2ヶ所増えることで、14,986 bpのバンドが消失し、13,151 bp、7,958 bp、6,233 bpの各バンドが出現した。KpnIで処理したものでは、BV/SV-01が挿入された場合にのみ、抗ヒトVEGF抗体発現遺伝子の2,261 bpが加わり、KpnIで切断される部位が5ヶ所加わることで、3,853 bpのバンドが消失し、9,010 bp、5,122 bp、175 bp、1,040 bp、677 bp、728 bpのバンドが出現すると予想され、実際に予想通りの泳動パターンが得られた。以上の結果から、この2つのクローンは予定通り組換えが起こっていることが確認できたため、続いて、FLP リコンビナーゼ発現プラスミドpOG44と混合し、Vero細胞にコトランスフェクションし、BAC配列を除去した。BACにはGFP発現遺伝子が内包されているため、蛍光顕微鏡でGFPの発現が消失していることを確認することで、BACの除去を確認した。ウイルスを回収し、限界希釈法による単一クローンの抽出を行った。【０１３３】
結果Ｉｄ  T-BVの構造確認（実施例２の結果）
最終生成産物であるT-BVに関しては、ウイルスから抽出したDNAを用いて、サザンブロット法による構造確認を行った。プローブには挿入した抗ヒトVEGF抗体発現遺伝子に相当するDNAプローブ（BVプローブ）、LacZ遺伝子領域に相当するプローブ（LacZプローブ）を用いた。BVプローブでハイブリダイズした場合には、予想通りT-01ではバンドは検出されなかったが、T-BVでは13,151 bpのバンドが検出された。LacZプローブでハイブリダイズした場合には、T-01で検出される10,890 bpのバンドの代わりに、T-BVでは13,515 bpのバンドが検出され、予定通りの部位に抗ヒトVEGF抗体発現遺伝子が挿入されていることが確認された。
以上の工程で、目的とするT-BVが作製されたことが確認できた。【０１３４】
結果ＩＩ  T-BVの発現抗体の評価
結果ＩＩａ  T-BV発現抗体の定量（実施例６．２の結果）
はじめにin vitroにおけるT-BVの抗体発現量の定量のため、Vero細胞及びU87MG細胞のウイルス感染細胞培養上清を用いて抗ヒトVEGF抗体に対するELISAを行った。Vero細胞、U87MG細胞について、T-01及びmockの培養上清からはいずれも検出限界以下であったのに対して、T-BVを感染させた培養上清からは、それぞれ256 pg/mL、69 pg/mLの抗VEGF抗体が検出された（図１２）。
続いてin vivoにおけるT-BVの抗体発現量の定量を行った。BALB/c nu/nuマウスの左側腹部皮下に作製したU87MG皮下腫瘍に対して、T-01群、T-BV群、mock群各群9匹ずつに無作為に分けた後に2 x 106 pfuのウイルスを腫瘍内に単回投与した。PID2、4、6に各群3匹ずつから皮下腫瘍を摘出し、そこに含まれる抗ヒトVEGF抗体をELISAで定量した。T-BV群、T-01群、mock群それぞれに関して、PID2ではそれぞれ186.2 pg/mL、44.0 pg/mL 、38.8 pg/mL、PID4ではそれぞれ93.4 pg/mL、19.6 pg/mL、41.4 pg/mL、PID6ではそれぞれ137.8 pg/mL、44.1 pg/mL、55.7 pg/mLとなった（図１３）。皮下腫瘍を用いたELISAでは使用する組織懸濁液のタンパク濃度が高いためにmock及びT-01では非特異的な反応がみられたものの、T-BV群ではいずれの時点でも測定値がmock及びT-01よりも有意に高くなっており、抗ヒトVEGF抗体のin vivoでの発現が示唆された。【０１３５】
結果ＩＩｂ  T-BV発現抗体の機能確認（実施例７の結果）
T-BVの発現するタンパクのVEGF阻害作用を調べるため、血管内皮細胞管腔形成試験及び血管内皮細胞遊走試験を行った。
血管内皮細胞管腔形成試験は、VEGFなどの血管新生刺激因子によって、プレート内に均一にコーティングされたマトリゲル基底膜マトリックス内に血管内皮細胞のチューブ形成が誘導される現象を利用して、形成されたチューブの長さを定量することで、血管新生刺激因子のスクリーニングに用いられる実験法である。本実施例では、管腔の長さの総和（μm）が、n.c.、mock、p.c.1、p.c.2、T-01 、T-BVの順に、817、26,558、16,408、1,117、24,267、7,358となり、T-BVはT-01と比較して管腔形成を有意に抑制した（p = 0.002）（図１４）。
血管内皮細胞遊走試験はVEGFなどの血管新生刺激因子に向かって血管内皮細胞が遊走する現象を利用して、ヒトフィブロネクチンを均一にコーティングしたメンブレンで区切られた2つのコンパートメントのうち、片方にVEGFなどの血管刺激因子を、他方に血管内皮細胞を入れ、メンブレンの小孔を通じて血管刺激因子の刺激によって遊走した血管内皮細胞を定量することで、血管新生刺激因子のスクリーニングに用いられる実験法である。本実施例では、n.c.に対する蛍光強度が、mock、p.c.1、p.c.2、T-01、T-BVの順に、2.76、2.63、0.62、2.85、1.77となり、T-BVはT-01と比較してHUVEC-2の遊走を有意に抑制した（p = 0.001）（図１５）。
これらの実験結果から、T-BVの発現抗体はVEGF阻害作用を持つことが示された。【０１３６】
結果ＩＩｃ  T-BV発現抗体の種間交差性の検討（実施例８の結果）
一般的にVEGFは種間交差性を持つのに対して、抗ヒトVEGF抗体であるベバシズマブはヒトVEGFに対する特異性が高く、マウスVEGFに対してはほとんど反応しないことが知られている（Yu, L., et al. (2008). Investigative ophthalmology & visual science 49, 522-527）。本実施例のようにヒト脳腫瘍細胞株を移植したマウスモデルを使用した場合、腫瘍局所ではヒト・マウス両方のVEGFの作用が予想される。したがって、T-BVの発現する抗体のヒト及びマウスVEGFに対する結合性を確認しておくことは、T-BVの効果のメカニズムを考察する上で重要と考えられた。そこで、ヒト・マウスそれぞれのVEGFに対するT-BVの発現抗体の結合性について、ELISAを用いて評価実験を行った。
抗マウスVEGF抗体はマウスVEGF、ヒトVEGFの両方に結合したのに対して、T-BVが発現した抗体はマウスVEGFには結合せず、ヒトVEGFにのみ結合し、Avastin（登録商標）と同様の結果を示した（図１６）。このことから、T-BVの発現する抗ヒトVEGF抗体はAvastin（登録商標）と同様にヒトVEGFに対する高い種特異性があると考えられた。【０１３７】
結果ＩＩＩ  T-BVのウイルスとしての評価
結果ＩＩＩａ  in vitroにおけるT-BVの殺細胞効果の検討（実施例４の結果）
遺伝子組換えによって目的遺伝子を挿入されたT-BVが、T-01と比較してin vitroにおいて同等の殺細胞効果を持っているかを確認するため、U87MG細胞に対してin vitro cytotoxicity assayを行った。また、化学療法にも放射線治療にも抵抗性で、膠芽腫が治療困難である要因と考えられているグリオーマ幹細胞に対する殺細胞効果を確認する目的で、TGS-01細胞、TGS-04細胞を用いたin vitro cytotoxicity assayを併せて行った。
U87MG細胞に対して、T-01及びT-BVは、MOI 0.01で感染4日後の細胞生存率（mock群の生細胞数との比率）が、それぞれ60.9%、67.9%であり、MOI 0.1では、それぞれ20.8%、19.6%と同等の高い殺細胞効果を示した（それぞれ、p = 0.18、p = 0.15）。
TGS-01細胞に対して、T-01及びT-BVは、MOI 0.01ではそれぞれ25.6%、43.6%、MOI 0.1ではそれぞれ4.1%、6.6%、MOI 1ではそれぞれ2.0%、1.8%であった（それぞれ、p < 0.01、p = 0.10、p = 0.84）。 
TGS-04細胞に対しては、T-01及びT-BVは、MOI 0.01ではそれぞれ12.5%、25.8%、MOI 0.1ではそれぞれ5.4%、7.1%、MOI 1ではそれぞれ6.1%、5.5%であった（それぞれ、p = 0.08、p < 0.05、p = 0.33）。
T-BVは、いずれの細胞株においてもT-01と比較して、ほぼ同形のグラフとなり、同等の殺細胞効果を示した（図１７）。【０１３８】
結果ＩＩＩｂ  in vitroにおけるT-BVの複製能の検討（実施例５の結果）
続いて、Vero細胞及びU87MG細胞におけるT-01、T-BVのウイルス複製試験を行った。Vero細胞では、24時間後にはそれぞれ、9.71 x 104 pfu/mL、1.22 x 105 pfu/mL、48時間後にはそれぞれ、1.32 x 106 pfu/mL、1.24 x 106 pfu/mLであった（各p = 0.06、0.43）。U87MG細胞では、24時間後にはそれぞれ、6.02 x 103 pfu/mL、7.81 x 103 pfu/mL、48時間後にはそれぞれ、2 x 105 pfu/mL、2.16 x 105pfu/mLであった（各p = 0.29、0.53）。いずれの細胞においても、T-BVはT-01とほぼ同等の複製能を持つと考えられた（図１８）。このことは、ウイルスが複製する過程で腫瘍細胞を破壊し、複製に伴って治療遺伝子から目的とするタンパクが発現されることを考慮すると、十分な殺細胞効果及びタンパク発現による機能を発揮する上で重要である。【０１３９】
結果ＩＶ  in vivoにおけるT-BVの抗腫瘍効果の検討
結果ＩＶａ  U87MG皮下腫瘍モデルにおけるT-BVの抗腫瘍効果の検討（実施例９．１．１の結果）
U87MG皮下腫瘍モデルを作製し、腫瘍径が6 mm大になった時点でT-01、T-BV及びmockの3群に各群10匹ずつランダムに分け、2 x 105 pfuのウイルスをday 0とday 3の2回、腫瘍内投与を行った。エクセル統計(Microsoft)を用いて独立ｔ検定により比較したところ、ウイルス投与後20日目の時点で、T-01群ではmockに対して有意な腫瘍増大抑制効果を認め（p = 0.00749）、さらにT-BVはT-01と比較して有意な腫瘍増大抑制効果を認めた（p = 0.0211）（図１９）。【０１４０】
結果ＩＶｂ  U87MG脳内腫瘍モデルにおけるT-BVの抗腫瘍効果の検討（実施例９．１．２の結果）
U87MG脳内腫瘍モデルを用いた抗腫瘍効果の検討を行った。脳腫瘍モデルに対して、10日目にT-01、T-BV及びmockの3群に各群10匹ずつランダムに分け、1 x 106 pfuのウイルスを腫瘍内に単回投与した。T-01投与群及びT-BV投与群はmock群と比較して有意な生存期間の延長を認めた（ともにp < 0.01）。T-BVはT-01よりも生存期間の延長傾向がみられた（p = 0.163）（図２０）。
以上の結果から、T-BVはT-01と比較して、in vivoにおけるより高い抗腫瘍効果を持つことが示された。【０１４１】
結果ＩＶｃ  TGS-01及びTGS-04脳内腫瘍モデルにおけるT-BVの抗腫瘍効果の検討（実施例９．１．２の結果）
グリオーマ幹細胞であるTGS-01及びTGS-04を用いた脳内腫瘍モデルは、少ない細胞数で対側への浸潤像を示す境界不明瞭な腫瘍を形成し、実際の臨床での膠芽腫により近い病理像を示す。また、グリオーマ幹細胞は放射線治療や化学療法に対して抵抗性を示し、グリオーマが難治性である要因でもある。そこで、グリオーマ幹細胞に対するin vivoでの効果検討のために、TGS-01及びTGS-04の脳内腫瘍モデルを作製し、2 x 106 pfuのT-01、T-BV又はmockを各群10匹ずつ腫瘍内に単回投与する治療実験を行った。TGS-01脳内腫瘍モデルに関しては、mockと比較して、T-BV、T-01ともに生存期間の有意な延長を認め（ともにp < 0.01）、さらにT-BVはT-01と比較して生存期間の有意な延長を認めた（p = 0.0475）。TGS-04モデルに関しては、mockと比較して、T-01では生存の延長を認めなかったが、T-BVでは生存期間の有意な延長を認めた（p = 0.0495）（図２１）。
このことから、グリオーマ幹細胞に対して、T-BVはT-01と比較してin vivoにおいてより高い抗腫瘍効果を持つことが示された。【０１４２】
結果Ｖ  T-BVの腫脹抑制効果の検討
U87MG脳内腫瘍モデルに対して、T-BVを投与した際に、T-01を投与した場合と比較してT2WIでの高信号域にどのような変化が生じるかを、小動物用MRIを用いて評価した。  
また、脳浮腫発生に関してAQP4が強い関連を持つという報告があることから、RT-qPCRによるマウスAQP4の発現量の定量を行うことでT-BVの腫脹抑制効果の検証を併せて行う方針とした。【０１４３】
結果Ｖａ  MRIによる腫脹の定量
MRIにおいて、血管に富む腫瘍は、常磁性造影剤投与によって縦緩和時間が短縮するため、T1WIで増強され、高信号域として描出される。一方で、浮腫など自由水を含む組織は横緩和時間が長いため、T2WIで高信号域として描出される。膠芽腫に対するウイルス療法の臨床試験において、腫瘍はT1WI（CE）で高信号域として描出され、ウイルス投与後に生じる浮腫はT2WIで高信号域として描出される。したがって、本実施例では、脳内腫瘍モデルの腫瘍内へのウイルス投与後にMRIを経時的に撮像し、T1WI（CE）、T2WIにおける腫瘍周囲の高信号域を計測することで、T-BVの腫脹抑制効果の検討を行った。【０１４４】
結果Ｖｂ  動物モデルの検討
U87MG、U251MG、NMC-G1、TGS-01、1123/Mの各細胞株について、BALB/c nu/nuマウスの右前頭葉内に定位脳手術装置を用いて細胞の移植を行い、経時的にMRIを撮像し、ＭＲＩを用いた腫瘍の描出が最も容易であったU87MGを用いた（図２２）。なお、U251MG、NMC-G1では腫脹形成速度が遅く、U87MG、TGS-01、1123/M腫瘍の安定した造影増強を得ることが困難であった。【０１４５】
結果Ｖｃ  U87MG脳内腫瘍モデルにおけるウイルス投与後のMRI評価（実施例９．２．１の結果）
U87MG脳内腫瘍モデルに対して、腫瘍移植後11日目にMRIを撮像し、腫瘍の大きさ、形状を確認後に、T-01、T-BV、T+A及びmock群の各群6匹ずつに無作為にグループ分けを行った。12日目に1 x 106 pfuの腫瘍内への単回投与を行い、PID2、4、6にMRIを撮像した。画像を元に面積を計測し、前述した計算式に基づいて面積比を算出した。この面積比に関して、PID2 - 4 - 6の経過で、T-01群では1.32 - 1.32 - 1.20と推移しているのに対して、T-BV群及びT+A群では、それぞれ1.12 - 1.06 - 1.04、1.01 - 1.01 - 1.04と推移しており、T-01群と比較して、T-BV群、T+A群では有意に低い結果となった（各、p = 0.015、0.002）（図２３）。この結果から、T-BV投与又はT-01にAvastin（登録商標）全身投与を追加することによって、脳腫脹が軽減することが示された。【０１４６】
結果Ｖｄ  RT-qPCRによるウイルス投与後のAQP4の定量（実施例９．２．２の結果）
AQPは1992年に発見された、水分子を選択的に透過させる膜タンパクである。哺乳類ではAQP0からAQP12までの13種類が報告されている。構造的には、その多くが300以下のアミノ酸で構成された6回貫通型の膜タンパクであり、2箇所にNPAボックスというアスパラギン（N）-プロリン（P）-アラニン（A）という保存性の高い部分が存在することが特徴である。この部分は疎水性が高く、膜を貫通せずに膜内に折れ込んでいて水分子の通過孔を形成している。脳にはAQP1、AQP3、AQP4、AQP5、AQP8、AQP9、AQP11、AQP12と多くの種類のAQPが発現していることが報告されているが、そのなかで、AQP4は他臓器と比較して脳における発現量が非常に多く、その分布から血液脳関門における水の移動などに関与していると考えられている。また、AQP4は脳浮腫の発生に強い関連が報告されており、脳浮腫の初期段階ではその発生に関与している可能性が高い。そこで、ウイルス投与後の腫脹変化を定量する目的で、ウイルス投与後のU87MG脳内腫瘍モデルの右前頭葉を用いて、マウスAQP4に関するRT-qPCRによる定量を行った。
U87MG脳内腫瘍モデルに対して、T-01、T-BV、T+A、mock群を設定し、PID6に右前頭葉を摘出してRNAを抽出し、逆転写酵素を用いてcDNAを作製し、マウスAQP及びマウスβアクチンに対するTaqmanプライマーを用いて定量PCRを行った。mock群と比較してT-01群ではAQP4発現が有意に上昇しており(p < 0.001)、T-01群と比較して、T-BV群及びT+A群ではAQP4発現が有意に低下していた(p < 0.001)（図２５）。この結果からもT-BV投与又はT-01にAvastin（登録商標）全身投与を併用することによって、脳の腫脹が軽減すると考えられた。
MRI及びAQP4に対するRT-qPCRの結果から、脳腫瘍に対するウイルス投与後の腫脹に関して、T-BVにはAvastin（登録商標）の全身投与と同等の腫脹抑制作用があることが示された。【０１４７】
結果ＶＩ  T-BV及びT-VHVLの腫脹抑制効果の比較検討（実施例９．２．３の結果）
U87MG脳内腫瘍モデルに対して、1 x 106 pfuのT-01、T-BV、T-VHVL又はmockを投与し、その後経時的にMRIを撮像した（図２５）。T-01と比較して、T-BVではPID4で腫脹の有意な減少を認めた（p = 0.039）。また、T-VHVLでも腫脹の抑制傾向が認められた（p = 0.397）（図２６）。【０１４８】
結果ＶＩＩＩ  ウイルス投与後の腫瘍環境に対する影響
抗VEGF抗体には血管新生抑制効果だけではなく免疫に対する作用があることが報告されている（Roland, C. L. et al. (2009) PloS one 4, e7669, (2009)）。そこで、各種ウイルスを投与したU87MG脳内腫瘍モデルを用いて免疫組織化学染色による血管新生・マクロファージの評価を行った。【０１４９】
結果ＶＩＩＩａ  免疫組織化学染色（実施例９．３．１の結果）
U87MG脳内腫瘍モデルに対して、T-01、T-BV、T+A又はmockを投与し、PID2、4に大脳を摘出後、パラフィン切片を作製し、免疫組織化学染色による検討を行った。ウイルス投与による変化を評価対象とするため、HSV-1染色で腫瘍に対するウイルスの感染を確認した上で、血管新生の評価としてマウスCD31染色を、浸潤マクロファージの評価としてマウスF4/80染色をそれぞれ行った。
マウスCD31染色に関して、mock群では、血管の形状、分布ともに均一であるのに対して、ウイルス投与群では、血管径が太く、不均一な分布を示した。血管密度は、mockと比較してウイルス投与群では高い傾向にあったが、ウイルス投与群間での有意差及び傾向は認めなかった。またT-VHVLにおいても同様に明らかな血管新生の抑制は認めなかった。
浸潤マクロファージの評価では、mock群では腫瘍へのマクロファージの浸潤を認めるものの、全体的に疎で均一な分布であるのに対して、ウイルス投与群ではウイルス感染部を中心として密に集簇している病理像が得られ、ウイルス群間での明らかな違いは認めなかった。【０１５０】
結果ＶＩＩＩｂ  フローサイトメトリー（実施例９．３．２の結果）
U87MG脳内腫瘍モデルを用いた免疫組織化学染色において、ウイルス投与群ではウイルス感染部を中心としてマクロファージの集簇している病理像が得られたことから、フローサイトメトリーによる定量を行うこととした。マクロファージはM1マクロファージとM2マクロファージに大別される。M1マクロファージは細菌感染やウイルス感染などによって誘導され、強い抗菌あるいは抗ウイルス活性、抗腫瘍効果を発揮する。一方で、M2マクロファージは、組織修復や血管新生、腫瘍増殖の促進、免疫抑制機能を持つ。腫瘍の進展に伴うさまざまなサイトカインの影響によって、腫瘍組織に浸潤する腫瘍随伴マクロファージ（Tumor-associated macrophage (TAM)）はM1からM2にシフトしていると考えられている。そこで、腫瘍にウイルスを投与した際に、TAMがどのように変化し、投与するウイルスによってその変化にどのような違いがあるかを確認するために、U87MG脳内腫瘍に対するPID2、4、6の右前頭葉を用いて、フローサイトメトリーを行った。代表的な散布図を図２７に示す。mock群ではどの時点でも一貫してM2優位な所見が得られたのに対して、いずれのウイルス投与群でもPID2にM1優位な状態となった。その後、T-01群ではPID6にはM1優位な状態からM2優位なもとの状態に近づくのに対して、T-BV群及びT+A群ではPID6でもM1とM2の割合がほぼ等しい状態を保ち、mock群と比較してM1優位な状態が継続していた（図２８−１）。【０１５１】
上記のとおり、M1マクロファージは抗ウイルス活性を有するため、M1優位な状態が継続することによる、ウイルス力価への影響を調べた。T-01、T-BV及びT+A群について、PID1, PID3及びPID7のいずれにおいても、ウイルス力価に顕著な差はみられなかった（図２８−２）。これらの結果から、抗ヒトVEGF抗体の発現は、ウイルス力価に悪影響を与えることなく、マクロファージがM1優位になることを介して、HSV-1に抗腫瘍活性を付与可能であることが示唆された。
従来のM1マクロファージに関する研究結果を踏まえると、本実験で確認されたとおり、M1優位の状態が維持されることが、T-BVの抗腫瘍効果の高さの一因と考えられる。M1マクロファージはファゴサイトーシス（食作用）活性を有するため、M1優位となることによりウイルス力価が低下し得るのではないかと考えられたが、驚くべきことに、ウイルス複製に対するネガティブな作用はみられず、T-BVの抗腫瘍効果の高さは、ウイルス力価への影響を伴わなかった。【０１５２】
結果Ｘ  in vivoにおけるT-BVの抗体発現の確認（実施例９．４の結果）
機能付加型ウイルスを生体に投与した際に発現されるタンパクの分布を確認することは、安全性を検討する上で重要である。そこで、in vivoにおいてT-BVを脳内腫瘍に投与した際に、発現される抗ヒトVEGF抗体の血中からの検出量について評価を行った。
BALB/c nu/nuマウスの右前頭葉に作製したU87MG脳内腫瘍に対して、T-01群、T-BV群、T+A群及びmock群各群6匹ずつに無作為に分けた後に1 x 106 pfuのウイルスを腫瘍内に単回投与した。PID1、PID3に各群3匹ずつ静脈採血を行い、分離した血清中の抗ヒトVEGF抗体をELISAで定量した。Avastin（登録商標）の腹腔内への単回投与を行ったT+A群でのみ、PID1、PID3のそれぞれにおいて、114.5 ng/mL、106.9 ng/mLの抗VEGF抗体を検出したが、T-BV群をはじめ、その他の群ではいずれも検出限界以下であった（図２９）。【０１５３】
結果ＸＩ  T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvの評価結果（実施例１０の結果）
(1) T-sVEGFR1 、T-VEGFscFv (VH-VL) 及びT-VEGFscFv (VH-VLCL) のウイルスゲノム構造のサザンブロッティング法による確認
まず、T-sVEGFR1 、T-VEGFscFv (VH-VL) 及びT-VEGFscFv (VH-VLCL) を用いて実験を行うにあたり、それぞれのウイルスDNAに正しくVEGF阻害因子の遺伝子が組み込まれているか確認するため、精製した各ウイルスからDNAを抽出し、サザンブロッティングを行った。VEGFscFv (VH-VL) プローブでは、T-VEGFscFv (VH-VL) 及びT-VEGFscFv (VH-VLCL) で、それぞれ5543bp及び5868bpのDNA断片が検出され、VEGFscFv (VH-VL) 及びVEGFscFv (VH-VLCL) の遺伝子の挿入が確認された (図示せず) 。一方、sVEGFR1プローブを用いたサザンブロットでは、T-sVEGFR1で6798 bpのDNA断片が検出され、sVEGFR1 の遺伝子の挿入が確認された(図示せず)。以上より、T-sVEGFR1 、T-VEGFscFv (VH-VL) 及びT-VEGFscFv (VH-VLCL) はG47Δの基本骨格のICP6欠失部位に正しくVEGF阻害因子の遺伝子が挿入されていることが確認できた。【０１５４】
(2) T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvのVEGF阻害因子タンパク質発現確認 (in vitro)
T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvを細胞に感染させた際、それぞれsVEGFR1及びVEGFscFvタンパク質が培養上清中に分泌されるどうか確認するためELISA法による測定を行った。その結果、T-sVEGFR1感染群ではsVEGFR1が1.66±0.30 ng/mlの濃度で (図３０Ａ)、T-VEGFscFv感染群では、VEGFscFvタンパク質が87.30±7.99 ng/mlの濃度で (図３０Ｂ) それぞれ検出された。【０１５５】
(3) T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvの抗VEGF機能の検討 (in vitro)
T-sVEGFR1及びT-VEGFscFv がそれぞれVEGF阻害因子を発現することが確認できたので、これらが実際に抗VEGF機能を有するか検討するため、血管内皮細胞管腔形成試験及び血管内皮細胞遊走試験を行い、T-01と比較評価した。【０１５６】
a. 血管内皮細胞管腔形成試験 
T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvが血管内皮細胞であるHUVECの管腔形成に及ぼす効果を検討するために、血管内皮細胞管腔形成試験を行った。ウイルスの培養上清とHUVECをMatrigel Matrixで共培養し、22時間後のHUVECの管腔の長さの合計からウイルス培養上清の管腔形成に与える影響を比較した。その結果、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFv感染群ではT-01感染群と比較して有意に管腔形成が抑制された (図３１)。【０１５７】
b. 血管内皮細胞遊走試験
次にT-sVEGFR1及びT-VEGFscFvがHUVECの遊走に及ぼす効果を検討するため、血管内皮細胞遊走試験を行った。ウイルスの培養上清とHUVECを共培養し、16時間後、遊走してきたHUVECを蛍光染色した後、蛍光強度を測定し、ウイルス培養上清のHUVECの遊走に与える影響を比較した。その結果、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFv感染群では、T-01感染群と比較して有意に遊走が抑制された(図３２)。【０１５８】
これらの実験結果により、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvは、in vitroで抗VEGF機能を有することが示された。【０１５９】
(4) ウイルス複製試験 (in vitro) 
ウイルスに遺伝子を挿入した場合にウイルス複製能が減弱する可能性が知られている。そこで、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvが、T-01と同等の複製能をもつかを検討するために、HT-29を用いてin vitro viral replication assayを行った。複製したウイルスの力価をそれぞれ測定した結果、24時間後では、T-01は感染させたウイルス量の6.43±0.47倍、T-sVEGFR1は9.94±2.95倍、T-VEGFscFvは16.07±11.28倍のウイルス力価であった。また48時間後では、T-01は51.79±3.09倍、T-sVEGFR1は69.04±8.25倍、T-VEGFscFvは88.10±41.70倍であった (図３３)。
以上より、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvはin vitroで、T-01とほぼ同等の複製能を持つことが示された。【０１６０】
(5) ウイルスの殺細胞効果の検討 (in vitro)
T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvが、T-01と同等の殺細胞効果をもつかを検討するために、HT-29を用いてin vitro cytotoxicity assayを行った。その結果、4日後の細胞生存率はMOI 0.1では、T-01感染群で4.1±0.25% 、T-sVEGFR1感染群で3.9±2.34% 、T-VEGFscFv感染群で8.4±0.78% となった。また、MOI 0.01では、T-01感染群で38±7.65% 、T-sVEGFR1感染群で43±0.71% 、T-VEGFscFv感染群で49±6.68% となった (図３４)。
以上より、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvはin vitroで、T-01とほぼ同等の殺細胞効果を有することが示された。【０１６１】
(6) HT-29細胞株及びCT26細胞株のVEGF発現量の検討 (in vitro)
次に、VEGF阻害因子を発現するT-sVEGFR1及びT-VEGFscFvのin vivoにおける抗腫瘍効果をT-01と比較検討するにあたり、in vivoの実験に用いるHT-29及びCT26がVEGFタンパク質を分泌するかどうかを確認するため、ELISAを行った。
HT-29もしくはCT26の培養上清中のVEGFタンパク質量を測定したところ、VEGFタンパク質が検出され（ヒトVEGF: 709.5±129.0[pg/ml]、マウスVEGF: 682.7±3.3[pg/ml]）、HT-29及びCT26はVEGFタンパク質を産生する細胞株であることが確認された。よって、これらの細胞株はT-sVEGFR1及びT-VEGFscFvのin vivoでの抗腫瘍効果検討に適すると考えられた。【０１６２】
(7) HT-29皮下腫瘍モデルに対するT-sVEGFR1及びT-VEGFscFvの抗腫瘍効果の検討
T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvのin vivoにおける抗腫瘍効果を検討するため、VEGFを産生することが確認されたHT-29を用いてヌードマウス皮下腫瘍モデルを作製し、治療効果を観察した。
HT-29をヌードマウスの左側腹部皮下に投与して皮下腫瘍を作製し、腫瘍径が5 mmに達した14日後のDay 0及びその3日後のDay 3にT-01、T-sVEGFR1、T-VEGFscFv及びMockを皮下腫瘍内に投与した。
Day 32において、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFv投与群では、T-01と比較して、有意に強い抗腫瘍効果がみられた (図３５) 。なお、T-sVEGFR1投与群とT-VEGFscFv投与群では、抗腫瘍効果は同程度であった。
この結果から、HT-29皮下腫瘍モデルにおいてT-sVEGFR1及びT-VEGFscFvは、T-01と比較して有意に強い抗腫瘍効果を有することが示された。【０１６３】
(8) HT-29皮下腫瘍モデルのCD31免疫組織化学染色による腫瘍内血管新生の検討
HT-29皮下腫瘍モデルにおいて、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvは T-01より有意に高い抗腫瘍効果を示した。そこで、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvの抗腫瘍効果増強の作用機序を明らかにするため、腫瘍内血管新生に対するウイルスの効果について検討した。
腫瘍内血管を検討するにあたり、HT-29をヌードマウスの左側腹部皮下に投与して皮下腫瘍を作製し、腫瘍径が5 mmに達した14日後をDay 0として、Day 0及びDay 3にT-01、T-sVEGFR1、T-VEGFscFv及びMockを皮下腫瘍内に投与した。Day 3 (二回目のウイルス投与前) 及びDay 7に皮下腫瘍組織を採取して、ホルマリン固定の後、パラフィン切片を作製し、血管内皮細胞マーカーCD31に対する免疫組織化学染色を行った (図10A)。
免疫染色を施した組織切片における微小血管をカウントし、腫瘍内微小血管密度を求めた。その結果、Day3では、顕微鏡下 (×20) でのカウント数が、 Mock感染群が52.3±9.2 count、T-01感染群が31.6±5.9 count、T-sVEGFR1感染群が13.7±5.8 count、T-VEGFscFv感染群が11.8±4.9 countであった。またDay7では、Mock感染群が48.0±7.0 count、T-01感染群が36.4±11.1 count、T-sVEGFR1感染群が11.3±1.7 count、T-VEGFscFv感染群が11.0±3.8 countであった。Day 3及びDay 7ともにT-sVEGFR1及びT-VEGFscFv投与群において、T-01投与群と比較して有意に腫瘍内微小血管が減少した (図３６）。 
このことから、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvは腫瘍内血管新生を抑制する機能を持つことが示され、この腫瘍血管新生抑制機能は、T-01と比較したこれら二つのウイルスの抗腫瘍効果増強の作用機序の一つと考えられた。【０１６４】
(9) Real Time Quantitative PCR によるウイルスDNAの定量
CD31免疫染色の結果より示唆されたT-sVEGFR1及びT-VEGFscFvの腫瘍内血管新生抑制機能は、T-01と比較したこれら二つのウイルスの抗腫瘍効果増強の作用機序の一つと考えられた。しかし、VEGFは血管新生を促進するだけでなく、マクロファージなどのVEGF受容体陽性免疫担当細胞の遊走を促進する機能を有すると報告されている。また一方で、マクロファージは治療用ウイルスを貪食することにより、治療用ウイルスの複製効率を低下させるとの報告がある。このマクロファージの貪食作用による治療用ウイルスの複製効率低下を克服するため、抗VEGF抗体であるBevacizmabと治療用HSVを併用すると、マクロファージの腫瘍内浸潤が減少し、ウイルスの複製効率が向上することによって抗腫瘍効果が増強した、とも報告されている。
そこで、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvのT-01と比較した抗腫瘍効果増強の作用機序の一つとして、マクロファージの腫瘍内浸潤抑制によるウイルスの感染効率の向上も考えられるのではないかと考えた。まず、HT-29皮下腫瘍モデルにおけるウイルスの感染効率について検討するため、HT-29をヌードマウスの左側腹部皮下に投与して皮下腫瘍を作製し、腫瘍径が5 mmに達した14日後をDay 0として、Day 0にT-01、T-sVEGFR1、T-VEGFscFv及びMockを皮下腫瘍内に投与した。Day 3に皮下腫瘍を採取してDNAを抽出し、 HSV-1のDNA polymeraseをコードする遺伝子をターゲットにリアルタイムPCRを行い、腫瘍内ウイルスDNAを定量した。
ウイルス投与3日後に腫瘍からDNA抽出し、リアルタイムPCRを行ったところ、その結果、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFv投与群は共にT-01投与群とほぼ同等のウイルスDNA量が検出された。なお、Mock投与群では、ウイルスDNAは検出されなかった。
このことから、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvとT-01との間には、ウイルスDNAの複製効率 に有意な差はなく、抗腫瘍効果増強の主要な要因ではないと考えられた。【０１６５】
(10) CT26皮下腫瘍モデルに対するT-sVEGFR1及びT-VEGFscFvの抗腫瘍効果の検討
リアルタイムPCRの結果から、ウイルスの複製効率はHT-29皮下腫瘍モデルにおいて、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvのT-01と比較した抗腫瘍効果の増強の要因ではないことが分かった。更に、前述の腫瘍血管新生阻害機能以外にT-sVEGFR1及びT-VEGFscFv の抗腫瘍効果増強の要因がないか、検討を進めた。そこで、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFvが抗腫瘍免疫に与える影響を調べるために、免疫機能が正常であるBALB/cマウスとVEGFを産生することが確認されたBALB/c由来の大腸癌細胞株CT26を用いて実験を行った。まず、CT26皮下腫瘍に対するT-sVEGFR1及びT-VEGFscFv の抗腫瘍効果を調べた。CT26をBALB/cの左側腹部皮下に投与して皮下腫瘍を作製し、腫瘍径が5 mmに達した10日後をDay 0として、Day 0及びDay 3にT-01、T-sVEGFR1、T-VEGFscFv及びMockを皮下腫瘍内に投与した。
腫瘍体積を測定し、観察を続けたところ、最初のウイルス投与から28日後のDay 28において、T-sVEGFR1及びT-VEGFscFv投与群では、T-01投与群と比較して、有意に強い抗腫瘍効果がみられた (図３７)。 
この結果から、ヌードマウスでの検討と同様、免疫正常マウスにおいてもT-sVEGFR1及びT-VEGFscFvは、T-01と比較して有意に高い抗腫瘍効果を有することが示された。また、Day 28で、T-sVEGFR1 投与群では7匹中4匹、T-VEGFscFv投与群では7匹中6匹の腫瘍が消失するなど、ヌードマウスでの検討より高い治療効果を示す傾向があった。T-sVEGFR1及びT-VEGFscFv は、T-01より効率的に抗腫瘍免疫が誘導できた結果、抗腫瘍効果が高まった可能性もあると考えられた。【０１６６】
Ｅ．考察
（１）抗ＶＥＧＦ抗体発現腫瘍溶解性ウイルスの作製
腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍内で複製するたびに腫瘍局所においてタンパクを発現することから、非増殖型ウイルスベクターに比べてタンパク発現量が格段に多くなる一方で、タンパク発現は局所にとどまるため、全身投与と比較して副作用のリスクは軽減される。結果Ｘで示したとおり、Avastin（登録商標）の腹腔内投与の併用では血清中からベバシズマブが高濃度で検出されたのに対して、T-BV投与では腫瘍局所からのみ発現抗体が検出され、血清からは検出限界以下であった。【０１６７】
抗ＶＥＧＦとして、一本鎖抗体を導入した腫瘍溶解性ウイルスと二本鎖抗体を導入した腫瘍溶解性ウイルスとを比較した場合、いずれのウイルスも腫脹の発生を抑えた。二本鎖抗体を導入したウイルスの場合には、二本鎖抗体はFc部分の存在により半減期が延長し、抗体依存性の免疫反応が、より期待できる。【０１６８】
（２）ウイルス投与後の腫脹発生のメカニズム
腫瘍に対するウイルス療法で見られる腫脹に関する報告は渉猟する限りないが、膠芽腫に対するG47Δの臨床試験ではウイルス投与後のMRI（T2WI）で腫瘍周囲の高信号域としてしばしば見られる現象である。【０１６９】
本実施例でのMRIを用いたウイルス投与後の脳の腫脹の評価において、T-BV及びAvastin（登録商標）併用で腫脹抑制効果を示し、T-VHVLでは腫脹抑制傾向を示したことから、ウイルス投与に伴う脳の腫脹にはVEGFが関与することが示唆された（図２２、２５）。また、U87MG脳内腫瘍モデルに対するウイルス投与後のMRI（T2WI）で腫瘍周囲の高信号域を認めた個体では免疫組織化学染色でHSV-1感染と血管新生が確認できた。このことから、ウイルス投与によって生じるT2WIでの腫瘍周囲の高信号域は、腫瘍細胞にウイルスが感染した場合に出現すると考えられた。また、抗VEGF抗体の作用によってその出現が抑制されることから、腫脹の発生にはVEGFが関与すると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【０１７０】
本発明によれば、腫脹をきたすことなく、腫瘍溶解性ウイルスによる腫瘍治療を行うことができ、医療の分野において産業上の利用可能性を有する。【０１７１】
本出願は、２０１８年３月３０日に出願された日本国特許出願第２０１８−０６８８４７号に基づく優先権を主張するものであり、この内容はここに参照として組み込まれる。
【配列表フリーテキスト】
【０１７２】
配列番号１：図４に記載の抗ヒトＶＥＧＦ抗体発現のためのアミノ酸配列全体
配列番号２：図４のＶＨ鎖（アミノ酸配列）
配列番号３：図４のＣＨ鎖（アミノ酸配列）
配列番号４：図４のＶＬ鎖（アミノ酸配列）
配列番号５：図４のＣＬ鎖（アミノ酸配列）
配列番号６：図４のIg kappa leader sequence（アミノ酸配列）
配列番号７：図４のシグナルペプチダーゼ認識配列（アミノ酸配列）
配列番号８：図４のFurin認識配列（アミノ酸配列）
配列番号９：図４のＦＭＤＶ−２Ａ配列（アミノ酸配列）
配列番号１１：図５のＧＳリンカー
配列番号１０：図５に記載の抗ＶＥＧＦｓｃＦｖ発現のためのアミノ酸配列全体
配列番号１２：図５のＧＳリンカーのうち１ユニット
配列番号１３：図９の抗ヒトＶＥＧＦ抗体発現遺伝子ｃＤＮＡ
配列番号１４：図９のＶＨのｃＤＮＡ
配列番号１５：図９のＣＨのｃＤＮＡ
配列番号１６：図９のＶＬのｃＤＮＡ
配列番号１７：図９のＣＬのｃＤＮＡ
配列番号１８：図９のIg kappa leader sequence（ｃＤＮＡ）
配列番号１９：図９のシグナルペプチダーゼ認識配列（ｃＤＮＡ）
配列番号２０：図９のFurin認識配列（ｃＤＮＡ）
配列番号２１：図９のＦＭＤＶ−２Ａ配列（ｃＤＮＡ）
配列番号２２：図１０の抗ＶＥＧＦｓｃＦｖ発現遺伝子ｃＤＮＡ
配列番号２３：図１０のGs linker（ｃＤＮＡ）
配列番号２４：図８のＴ−ＶＥＧＦｓｃ（ＶＨＶＬＣＬ）のｃＤＮＡ
配列番号２５：図８のＣＬのｃＤＮＡ
配列番号２６：図７のｓＶＥＧＦＲ１のｃＤＮＡ
配列番号２７：HSV DNApoly-F 
配列番号２８：HSV DNApoly-R 
配列番号２９：HSV DNApoly-T 
配列番号３０：図４のＶＨ鎖＋ＣＨ鎖（アミノ酸配列）
配列番号３１：図４のＶＬ鎖＋ＣＬ鎖（アミノ酸配列）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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