(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子と過剰発現プロモーターとを含んでなる組換えベクターを細胞質に導入した、イネ科の低温ストレス耐性植物。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
以下の(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子と過剰発現プロモーターとを含んでなる組換えベクターを細胞質に導入した、イネ科の低温ストレス耐性植物。
(c) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項３】
植物が、植物体、植物器官、植物組織、又は植物培養細胞である請求項１又は２に記載の低温ストレス耐性植物。
【請求項４】
イネ科の植物がイネである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の低温ストレス耐性植物。
【請求項５】
以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子と過剰発現プロモーターとを含む組換えベクターをイネ科植物の細胞質に導入することを特徴とする、イネ科植物の低温ストレス耐性の強化方法。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質
【請求項６】
以下の(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子と過剰発現プロモーターとを含む組換えベクターをイネ科植物の細胞質に導入することを特徴とする、イネ科植物の低温ストレス耐性の強化方法。
(c) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項７】
植物が、植物体、植物器官、植物組織、又は植物培養細胞である請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
イネ科植物がイネである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、環境ストレス条件下で発生する活性酸素に対する耐性が強化された形質転換（トランスジェニック）植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
イネの早期栽培及び直播栽培では、生育初期において低温に遭遇しやすく、しばしば著しい低温障害が発生する。また、アジア諸国では塩ストレスや乾燥ストレスによる被害も大きい。これらの被害を軽減するためには、環境ストレス耐性を強化した新品種を開発しなければならない。
【０００３】
イネの環境ストレス耐性強化法としては、環境ストレス耐性の優れる品種・系統を交配親に用い、その交雑後代から耐性の優れる個体・系統を選抜する方法がある。しかし、既存の品種を材料にした育種法では、環境ストレス耐性の大幅な向上を望むには限界がある。そこで、新たなストレス耐性強化法が必要とされている。
【０００４】
一般に、熱帯地方及び亜熱帯地方原産の植物の多くは、12℃以下の非凍結温度に曝されると低温障害を受ける(Lafuente MT, Belver A, Guye MG, Saltveit ME. 1991. Plant Physiology 95, 443-449)。低温感受性植物の中には、中程度の温度に曝された後、低温ストレスに対する耐性が増大するものもあるが(Moynihan MR, Ordentlich A, Raskin I. 1995. Plant Physiology 108, 995-999)、イネ幼苗を含む低温感受性植物の一部はそのような処理では低温ストレス耐性の強化を示さない。
【０００５】
低温感受性植物において、低温ストレスの主体は酸化ストレスである(Hodges DM, Andrews CJ, Johnson DA, Hamilton RI. 1997. Crop Science 37, 857-863、Pinhero RG, Rao MV, Paliyath G, Murr DP, Fletcher RA. 1997 Plant Physiology 114, 695-704)。過酸化水素、スーパーオキシドラジカル、及びヒドロキシルラジカル等の活性酸素種(AOS)は、DNA、脂質、及びタンパク質と急速に反応して細胞損傷を引き起こす(Van Breusegem F, Slooten L,  Stassart J-M, Moens T, Botterman J, Van Montagu M, Inze D. 1999. Plant and Cell Physiology 40, 515-523)。AOSは光を伴う低温ストレスと関係があると考えられているが、分子的及び生化学的証拠によって、暗条件下で低温処理したトウモロコシ幼苗でも低温によって酸化ストレスが生ずることが示された(Prasad, TK, Anderson MD, Martin BA, Stewart CR. 1994 The Plant Cell 6, 65-74)。
【０００６】
いくつかの酵素が効果的にAOSを無毒化することができるが、ストレス状態が長引くと、そのような無毒化システムは飽和してしまい、損傷が生ずる(Van Breusegem F, Slooten L,  Stassart J-M, Moens T, Botterman J, Van Montagu M, Inze D. 1999. Plant and Cell Physiology 40, 515-523)。植物の葉緑体及びサイトゾルにおける主たる過酸化水素無毒化システムは、アスコルビン酸−グルタチオンサイクルと呼ばれ、このサイクルにおいてはアスコルビン酸パーオキシダーゼ(APX)が重要な酵素である(Asada K. 1992. Physiologia Plantarum 85, 235-241)。
【０００７】
近年、このような活性酸素除去系酵素遺伝子を植物に導入して、植物の環境ストレス耐性を向上させる研究がなされている（Plant Physiol．，111，1177−1181，1996、FEBS Letters, 428, 47-51, 1998）。そのような活性酸素耐性植物の作出には、主に活性酸素分子種の除去系酵素（スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)、パーオキシダーゼ、カタラーゼ(CAT)及びグルタチオンレダクターゼ等）の遺伝子を植物に導入する方法が採用されている。
【０００８】
しかしながら、活性酸素除去酵素の遺伝子の導入によって植物中で該酵素の発現量を増大させても、必ずしもストレス耐性が強化されないことが報告されている（Tepperman JM 及びDunsmuir P., Plant Mol. Biol., 14(4):501-511, 1990）。特に活性酸素除去酵素であるアスコルビン酸パーオキシダーゼ(APX)遺伝子の場合、アスコルビン酸量が不足するとこの酵素活性が低下してしまうため、単独で導入してもストレス耐性強化効果は低いと考えられている（Foyer CH, Souriau N, Perret S, Lelandais M, Kunert KJ, Pruvost C, Jouanin L., Plant Physiol., 109:1047-1057, 1995）。
【０００９】
そのため現在では、活性酸素除去系酵素の導入による植物のストレス耐性強化法においては、例えばSOD、CAT、及びAPX、並びにアスコルビン酸供給サイクルに関わる酵素GR等の関連する複数の酵素の活性を同時に強化しなければ、酸化ストレス耐性を効果的に強化することは難しいと言われている。
【００１０】
なお、アスコルビン酸パーオキシダーゼ(APX)としては、異なる細胞内区画に存在するサイトゾル型、葉緑体型等を含む複数のAPXアイソザイムが存在するが（Asada, 1992, Physiol. Plant. 85, 235-241; Miyake C, Asada K., 1992, Plant Cell Physiol. 33:541-553; Yamaguchi K, Mori H, Nishimura M, 1995, Plant Cell Physiol. 36:1157-1162）、活性酸素は主に葉緑体で発生する(Nie GY, Baker NR., Plant Physiol. 95:184-191, 1991)ため、活性酸素除去のためには葉緑体型APX遺伝子の導入が試みられている（森田・田中、蛋白質核酸酵素、44:2232-2238, 1999）。
【００１１】
ところで、植物の低温感受性組織は、予め熱ショック温度に曝すことで、次に曝す低温に対する耐性が増大するという報告がある(Lurie S, Klein JD. 1991. Journal of the American Society for Horticultural Science 116, 1007-1012、Saltveit ME. 1991. Physiologia Plantarum 82, 529-53)。熱ショックが酸化ストレスを引き起こし、それが酸化ストレス防御系に関わる遺伝子を誘導すると考えられる(Morgan RW, Christman MF, Jacobson FS, Storz G, Ames BN. 1986. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 83, 8059-8063)。実際、エンドウ及びシロイヌナズナのapx1遺伝子の発現は、酸化ストレスだけでなく高温ストレスによっても誘導され、またどちらの遺伝子もそのプロモーターに熱ショックシスエレメントを有している(Mittler R, Zilinskas BA. 1992. The Journal of Biological Chemistry 267, 21802-21807、Mittler R, Zilinskas BA. 1994. The Plant Journal 5, 397-405、Storozhenko S, Pauw PD, Van Montagu M, Inze D, Kushnir S.  1998. Plant Physiology 118, 1005-1014)。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ストレス耐性植物を提供すること、及び活性酸素に起因するストレスに対する植物の耐性を強化する方法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、イネ幼苗を高温処理することによって低温ストレス耐性が著しく高まるということを見出し、その知見に基づいて、その発現量の増大により植物の低温ストレス耐性が強化される遺伝子を単離した。その結果、該遺伝子が、これまで植物のストレス耐性強化の上で有用性が低いとされていたサイトゾル型アスコルビン酸パーオキシダーゼをコードしていることが判明した。この遺伝子を過剰発現プロモーターに連結して含む組換えベクターを作製し、植物体に導入することにより、ストレス耐性を強化した形質転換植物を作製して、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の通りである。
(1)  以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子と過剰発現プロモーターとを含んでなる組換えベクターを含む、ストレス耐性植物。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質
上記配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子としては、以下の(c)又は(d)のDNAを含むものが挙げられる。
(c) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
【００１５】
ストレスとしては、活性酸素に起因するもの（例えば環境ストレス）が挙げられる。その環境ストレスとしては、低温ストレス、高温ストレス、塩ストレス、乾燥ストレス、強光ストレス、大気汚染ストレス、農薬ストレス、病害ストレス、及び紫外線ストレスが例示される。
また植物としては、植物体、植物器官、植物組織、又は植物培養細胞を用いることができる。上記植物は、イネ科、ナス科、アブラナ科、マメ科、ウリ科、及びユリ科から選択されるいずれかの科に属するものが挙げられる。特に、上記のイネ科に属する植物はイネでありうる。
【００１６】
(2)  以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子と過剰発現プロモーターとを含んでなる組換えベクターを植物に導入することを特徴とする、植物のストレス耐性の強化方法。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質
上記方法において、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば以下の(c)又は(d)のDNAを含むものが挙げられる。
(c) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
この方法において対象とするストレス及び植物は、上記と同じである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１８】
ある植物において、活性酸素除去系酵素をコードしている特定の遺伝子の発現量が高温処理によって増大する結果、低温ストレス耐性が強化されることを見出して、該遺伝子をその植物から単離することができれば、様々な環境ストレス（高低温、乾燥、強光、塩、大気汚染ガス、病原菌、紫外線等）条件下で発生する活性酸素に対して耐性の高い植物の開発に有用であると思われる。本発明は、このような発想に基づいて完成されたものである。
【００１９】
本発明では、高温処理によって低温ストレス耐性が強化された植物において、高温にて発現量が増大し植物の低温ストレス耐性を強化するサイトゾル型アスコルビン酸パーオキシダーゼの遺伝子を見出した。本発明は、該遺伝子を過剰発現させる形態で組み込んだ形質転換植物であり、さらに、該アスコルビン酸パーオキシダーゼ遺伝子を過剰発現させるように植物に組み込むことを特徴とする植物の酸化ストレス耐性の強化方法である。
【００２０】
本発明の形質転換植物は、配列番号２に示したアミノ酸配列をコードするアスコルビン酸パーオキシダーゼ遺伝子が組み込まれたものである。但し、当該遺伝子について、植物間でも品種等によって多少のアミノ酸配列の相違はあり得る。また、同一植物品種であっても突然変異等によってアミノ酸が変化する場合がある。よって、配列番号２に示すアミノ酸配列のうち複数個（1若しくは数個、例えば１〜10個）のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子を含有する形質転換植物も、本発明に含まれる。
【００２１】
本発明の形質転換植物は、例えば配列番号１に示すアスコルビン酸パーオキシダーゼ遺伝子を有する。但し、当該遺伝子に限定されず、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするすべての遺伝子を含む。
本発明において見出された、発現量の増大によって低温ストレス耐性を強化することができるサイトゾル型アスコルビン酸パーオキシダーゼ遺伝子は、様々な植物種に存在すると考えられ、いずれも同様の手段によって該遺伝子を取得できると考えられる。ここでは一例として、イネ(Oryza sativa L.)を用いて本発明を説明する。
【００２２】
１.  高温処理によるイネ幼苗の低温ストレス耐性の強化
本発明において、植物に導入するための遺伝子は、高温処理により低温ストレス耐性が強化されることが見出されたイネ幼苗から得ることができる。但し、本発明の遺伝子の供給源とする植物は、イネ幼苗に限定されるものではなく、例えばイネの成長した植物体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等)、又は植物培養細胞（例えばカルス）であってもよい。さらに本発明の遺伝子の供給源とする植物は、イネ以外の植物、例えば、限定するものではないが、イネ科に属する他の植物（トウモロコシ等）、又はナス科、アブラナ科、マメ科、ウリ科、ヒルガオ科、ユリ科、シソ科、キク科、バラ科、ミカン科、フトモモ科、ヤナギ科、アカザ科、リンドウ科、若しくはナデシコ科等に属する植物の幼苗若しくは成長した植物体、植物器官、植物組織、又は植物培養細胞であってもよい。上記植物としてはイネ科植物がより好ましく、イネが最も好ましい。本明細書において、「イネ幼苗」とは、イネの種子を発芽させ、５〜10日間、好ましくは７日間にわたり、20〜28℃で、好ましくは25℃で生長させたイネの植物体を意味する。
【００２３】
高温処理によるイネ幼苗の低温ストレス耐性の強化は、イネ幼苗を、障害を引き起こさない程度の高温で一定時間処理した後、通常イネ幼苗に低温障害を引き起こすような温度で低温処理することにより、達成することができる。「障害を引き起こさない程度の高温」とは、植物をその温度で処理した場合に該植物の生育障害又は生理機能障害を招かない温度条件であり、実験条件に合わせて当業者が適宜設定することができるが、イネ幼苗の場合具体的には37〜43℃、好ましくは40〜42℃、最も好ましくは42℃である。高温で処理する「一定時間」は、実験条件に合わせて当業者が適宜設定することができるが、イネ幼苗の場合具体的には３〜24時間、好ましくは６〜24時間、最も好ましくは24時間である。「低温障害」とは、低温の影響による植物の生育障害又は枯死を意味する。「低温障害を引き起こすような温度」とは、植物にそのような障害が引き起こされるような温度条件であり、一般的には12℃以下の非凍結温度であることが好ましく、イネ幼苗の場合具体的には０〜12℃、好ましくは３〜10℃、最も好ましくは５℃である。高温処理及び低温処理は、所定の温度及び湿度に保った条件下に植物を放置することによって実施する。低温処理は暗条件下、光条件下のどちらで行ってもよい。
【００２４】
上記の処理を施したイネ幼苗について、低温ストレス耐性が強化されたことは、外観の観察によって確認することができる。この確認を行うために、例えばイネ幼苗を、低温処理を一定期間行った後、20〜28℃、好ましくは25℃に移して数日間生育させる。低温処理を行う期間は当業者が適宜設定することができるが、イネ幼苗では具体的には５〜10日間、好ましくは７日間である。低温処理後に生育させる期間も、当業者が適宜設定することができるが、具体的には２〜10日間、好ましくは７日間である。本明細書において、「低温ストレス耐性が強化された」とは、植物を特定の処理を施した後に低温条件下に放置し、その後該植物の生育に適した温度、イネ幼苗では具体的には20〜28℃、好ましくは25℃に戻して生育させた場合、無処理の植物を前記植物と同様に低温条件下に放置後に生育に適した温度（例えばイネ幼苗であれば20〜28℃、好ましくは25℃）に戻した場合と比較して、処理を施した植物の生存率が有意に高くなることを意味する。
【００２５】
以上記載の処理を行って準備したイネ幼苗の外観を観察し、生存率の評価を行うことができる。例えば、生育を再開した幼苗を生存体とし、生長が止まった幼苗又は枯死幼苗を非生存体として評価する。上記実験は最低２回繰り返して行うことが望ましい。
このような生存率の評価により、高温処理及び低温処理を施したイネ幼苗の低温ストレス耐性強化を証明することができる。また同時に、以上の処理によって、低温ストレス耐性が顕著に強化されたイネ幼苗を得ることができる。
【００２６】
２.  高温処理後及びそれに続く低温処理後の活性酸素除去系酵素の活性測定による、低温ストレス耐性強化に関わる酵素の同定
高温処理後及びそれに続く低温処理後のイネ幼苗における活性酸素除去系酵素の活性を測定することにより、高温ストレスで活性が上昇し、低温処理後もその活性が高く維持されるような酵素を、低温ストレス耐性の強化に関わるタンパク質として同定することができる。
【００２７】
活性測定においては、高温処理後及びそれに続く低温処理後の活性の比較解析に適した測定対象植物の組み合わせを決定する。例えば、高温処理も低温処理もしない対照イネ幼苗、高温処理したイネ幼苗、高温処理後に低温処理したイネ幼苗、及び高温処理をせずに低温処理したイネ幼苗について各々適切な処理条件を決定し、準備する。
【００２８】
次いで、準備したそれぞれのイネ幼苗から試料を採取する。試料としては、特に限定するわけではないが葉を用いることができる。それぞれの試料を緩衝液中でホモジナイズし、そのホモジネートを遠心分離し、酵素を含む上清を採取する。このような酵素を含む抽出液を得る方法は特に限定されるものではなく、公知の任意の方法を使用できる。緩衝液も慣用の組成のものを使用することができ、例えば１％Triton X-100含有50mMリン酸バッファー(pH 7.0)を用いることができる。続いて、この酵素を含む抽出液を、酵素活性の低下を回避できるように、好ましくは直ちに次の酵素アッセイに用いる。
【００２９】
活性測定の対象とする活性酵素除去系酵素としては、アスコルビン酸パーオキシダーゼ(APX)、スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)、パーオキシダーゼ、カタラーゼ(CAT)、及びグルタチオンレダクターゼ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの活性の測定方法には、各酵素に適した通常公知の方法を用いる。例えば、APX活性は、Saruyama及びTanida(1995)に記載の方法により測定することができる。すなわち、APXを含む反応系にH2O2を添加することによってアスコルビン酸酸化反応を開始させ、アスコルビン酸濃度を示す290nmでの吸光度を計測し、その吸光度の低下量をAPX相対活性とする方法である。また例えば、CAT活性の測定はTanida, 1996の記載に従って行うことができる。この方法では240nmでの吸光度を計測し、その低下量をCATの相対活性とする。SOD活性は、例えば、NBT法（Beyer及びFridovich, 1987）に基づくアッセイキット（SOD test、Wako社製）を使用して測定することができる。但し、これらの酵素活性の測定方法は、記載のものに限定されるわけではない。
【００３０】
以上の活性測定により、高温処理を施したイネ幼苗ではAPX活性レベルが有意に増大しており、さらに高温処理後に低温処理を施した後も高いAPX活性が保持されていることを確認することができる。低温障害の主な原因が低温ストレスによって生ずる活性酸素による膜脂質の過酸化であると言われていることからも、高温処理によるAPX活性の上昇がイネ幼苗の低温ストレス耐性の強化に寄与していると考えられる。
【００３１】
３.  APX遺伝子の単離及び発現解析
以上の処理工程により得られる低温ストレス耐性イネ幼苗から、高温処理により活性が上昇するAPXの遺伝子を単離する。さらに、その遺伝子の高温処理後及びそれに続く低温処理後の転写レベルをノーザンブロット解析にて確認することにより、該遺伝子が高温処理により発現誘導されることを確認することができる。
【００３２】
(1) APX遺伝子の単離
高温処理後のイネ幼苗から採取した試料を常法で処理して全mRNAを抽出し、それらを鋳型としてオリゴdTプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖cDNAを作製した後、該一本鎖cDNAから二本鎖cDNAを合成する。高温処理は、１.に記載の方法に従って、処理する植物の低温ストレス耐性が顕著に強化されるのに十分な時間にわたって行うが、イネ幼苗の場合は６時間以上、好ましくは24時間、高温処理する。
さらにそのcDNAを鋳型として、既知のアスコルビン酸パーオキシダーゼ(APX)遺伝子のDNA配列を基に設計したプライマーを用いたPCRにより、高温処理後に発現されているAPX遺伝子の全体を含むDNA断片を増幅し、APX遺伝子を単離する。
【００３３】
既知のAPX遺伝子配列としては、例えばイネサイトゾル型APX(APXa)の遺伝子のcDNA配列（Morita S, Kaminaka H, Yokoi H, Masumura T, Tanaka K. 1997, Plant Physiology 40, 113, 306; 受託番号D45423）が挙げられるが、他のタイプのAPX遺伝子、あるいは他の植物のAPX遺伝子のDNA配列を使用してもよい。好ましくは、APXをコードするORF全体を増幅するように設計したプライマーを用いて、APXコード配列全体を含むDNA断片を増幅する。
【００３４】
このようにして得られたDNA増幅断片を、通常公知の方法により適切なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製する。この単離クローンについて、インサートAPX cDNAの塩基配列を決定する。塩基配列の決定はマキサム-ギルバートの化学修飾法、又はM13ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置（例えばAloka社製DNAシークエンサーLIC-4200LS-2等）を用いて配列決定が行われる。
【００３５】
決定したAPX遺伝子の塩基配列は、既知のAPX遺伝子のDNA配列と比較することができる。塩基配列の比較は、例えば、該配列と、「DDBJ/EMBL/GenBank 国際塩基配列データベース」(例えばDDBJは、http://www.ddbj.nig.ac.jpよりアクセスできる)から入手した他のAPX遺伝子のDNA配列とをアライメントすることにより行うことができる。あるいは、本発明のAPX遺伝子のDNA配列との相同性が高い他のDNA配列を、本発明のAPX cDNA配列に対する相同性検索によってデータベースより入手して比較することができる。これらの配列比較によって、イネ幼苗にて高温処理により発現が誘導されるAPX遺伝子のDNA配列が、イネサイトゾル型アスコルビン酸パーオキシダーゼ(APXa)の遺伝子のcDNA配列と同一であることが分かった。従って、本発明の方法にて単離されるAPX遺伝子はサイトゾル型APX遺伝子である。本発明のAPXa遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。
【００３６】
(2) APXa遺伝子の発現解析
(1)で得られたAPXa遺伝子の単離クローンをプローブとして、高温処理後及びそれに続く低温処理後のイネ幼苗におけるAPXa遺伝子の発現解析を行うことができる。
まず、高温処理後とそれに続く低温処理後のAPXa遺伝子発現の比較解析に適した測定対象植物の組み合わせを決定する。例えば、高温処理も低温処理もしない対照イネ幼苗、高温処理イネ幼苗、高温処理後に低温処理したイネ幼苗、及び高温処理を行わずに低温処理したイネ幼苗について各々適切な処理条件を決定する。それら処理幼苗を準備し、次いでそれぞれから試料を採取する。これらの各試料から、常法により全RNAを抽出し、これをエタノール沈殿等の手法を用いて精製する。
【００３７】
精製した全RNAに対して、上記APXa遺伝子プローブを使用して通常公知の方法でノーザンブロット解析を行うことにより、APXa mRNA発現量を調べることができる。その具体的な方法としては、例えば、精製全RNAを電気泳動し、ブロッティングし、標識したAPXa遺伝子プローブとハイブリダイズさせる。そしてその標識を適切な方法で検出したハイブリダイゼーションシグナルを定量的に読み取る。APX遺伝子プローブの標識には、32P、35S等の放射性同位元素、又はジゴキシゲニン(DIG)、アルカリホスファターゼ、ビオチン、若しくは蛍光等の非放射性標識を用いることができるがこれらに限定されるものではない。また標識法としてはランダムプライム法がよく用いられるが、それ以外の通常公知の各種標識法も用いることができる。これらの標識に対するシグナル検出には、例えばオートラジオグラフィー法を用いることができる。このようなオートラジオグラムは、限定するものではないが、バイオイメージングアナライザー等の画像解析装置を使用することによって精度良く定量解析を行うことができる。
【００３８】
上記のようにAPXa mRNA量の解析を行うことによって、高温処理によるAPXa遺伝子の発現量の増大と、それに続く低温処理後の前記発現量の高レベルでの維持を確認することができる。それにより、本発明の方法により単離されるAPXa遺伝子が、高温処理により発現誘導されることが確認される。
【００３９】
４.  APXa遺伝子の高温誘導性プロモーターの解析
APXa遺伝子が高温処理により発現誘導されることから、この遺伝子は高温誘導性プロモーターを持つことが推察される。この考えに基づき、該遺伝子が高温誘導性プロモーターを持つことを塩基配列決定によって確認することで、該遺伝子が直接高温により誘導されることを証明することができる。
【００４０】
この証明のために、イネゲノムDNAを鋳型としてAPXa遺伝子の上流領域をPCR増幅して、イネのAPXa遺伝子のプロモーターを含みうるDNA断片を得ることができる。このDNA断片を得るためのPCR増幅法としては、熱非対称組み合わせポリメラーゼ連鎖反応(TAIL-PCR)法(Liu Y-G, Mitsukawa N, Oosumi T, Whittier RF. 1995, The Plant Journal 8, 457-463)を用いることができるが、好適な他の方法を使用してもよい。TAIL-PCR法では、使用するセンス方向プライマーを、より内側へと段階的に配置される３種の遺伝子特異的プライマーとして設計する。さらに、アンチセンス方向プライマーとしてランダム縮重プライマーを使用するが、このプライマーの設計はLiu Y-G, Mitsukawa N, Oosumi T, Whittier RF. 1995, The Plant Journal 8, 457-463に記載に基づいて行うことができる。この場合、３種のAPXa遺伝子特異的プライマーをより外側に配置されるものから順にランダム縮重プライマーと組み合わせて使用して、３段階のPCR反応を連続的に行うことで、APXaのプロモーターを含む領域を増幅することができる。
【００４１】
この反応の最終段階で得られた増幅産物について、通常公知の方法によりベクター中にクローニングし、配列決定を行う。そしてそのDNA塩基配列を、推定上の熱ショックエレメントを含む他の遺伝子のプロモーター領域、例えばシロイヌナズナaxp1遺伝子のプロモーターと比較する。推定上の熱ショックエレメント(HSE)は、熱ショック因子(HSF)結合最小限モチーフ5'-nGAAnnTTCn-3'を有する配列であり、APXa遺伝子の上流領域がこのモチーフと一致する配列を有するかどうかを確認することにより、それが高温誘導性プロモーターである可能性を検証できる。APXa遺伝子が高温誘導性プロモーターを有することが確認されることで、該遺伝子が高温により発現誘導される結果、イネ幼苗の低温ストレス耐性が強化されるという発見を裏付けることができる。
【００４２】
５.  APXa遺伝子の導入による形質転換植物の作製
上記工程により、APXa遺伝子は、高温により発現量が増大し、その結果イネ幼苗の低温ストレス耐性を強化することが明らかになる。この発見に基づき、サイトゾル型APX遺伝子を植物に導入して過剰発現させることにより、植物の低温ストレス耐性を強化することが考えられる。
【００４３】
植物中にサイトゾル型APX遺伝子を導入して過剰発現させるためには、サイトゾル型APX遺伝子と過剰発現プロモーターとを含んでなる組換えベクターを構築し、それを用いて植物を形質転換するのが一般的手法である。
配列番号１に、本発明の形質転換植物に導入するサイトゾル型アスコルビン酸パーオキシダーゼ遺伝子の塩基配列を、配列番号２に本発明の形質転換植物に導入する遺伝子がコードするサイトゾル型アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列を含むタンパク質がアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
【００４４】
例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２で表わされるアミノ酸配列に１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
【００４５】
ここで、本発明においてアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性とは、
アスコルビン酸 + H2O2→ アスコルビン酸酸化物 + 2H2O
の反応を触媒する活性を意味する。なお、本発明のタンパク質の上記活性は、タンパク質を加えた反応液にアスコルビン酸とH2O2を添加し、その反応液の吸光度変化などを測定することでその有無を確認することができる。
【００４６】
また、上記サイトゾル型APX遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNAであって、アスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAと過剰発現プロモーターとが連結された組換えベクターを含む形質転換植物も本発明に含まれる。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち60％以上、好ましくは80％以上の相同性を有するDNAの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が150〜900mM、好ましくは600〜900mMであり、温度が60〜68℃、好ましくは65℃での条件をいう。
【００４７】
さらに、部位特定変異誘発等によってサイトゾル型APXをコードする改変されたDNAを合成し、それと過剰発現プロモーターとを含んでなる組換えベクターを構築し、それによって植物を形質転換することもできる。APXa遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutan-K(TAKARA社製）やMutan-G(TAKARA社製）)などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異の導入が行われる。
【００４８】
ベクター中に組み込むサイトゾル型APX DNA断片は、上記の方法に従ってクローニングされたサイトゾル型APX遺伝子から得るだけでなく、一旦塩基配列が決定された後には、化学合成により、又はサイトゾル型APX遺伝子クローンを鋳型としたPCR増幅により、得ることもできる。
【００４９】
(1) サイトゾル型APX遺伝子を組み込んだ過剰発現ベクターの構築
植物に導入するためのサイトゾル型APX遺伝子、例えばAPXa遺伝子を含む組換えベクターは、上記の方法に従って得られるサイトゾル型APX DNA断片、例えばAPXa cDNA増幅断片を、適当なベクター中に過剰発現プロモーターへ連結するように組み込むことによって構築することができる。サイトゾル型APX遺伝子を挿入するベクターは、過剰発現プロモーターを含み、対象とする植物宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。あるいは、サイトゾル型APX遺伝子は、過剰発現プロモーターに予め連結したものを適当なベクター中に挿入してもよい。
【００５０】
特に好適な過剰発現プロモーターを含む組換えベクターの例としては、挿入遺伝子を効果的に過剰発現させることができるpMLH7133(Mitsuhara et al., Plant Cell Rhysiology 37:49-59, 1996)中のGUS遺伝子を、本発明のサイトゾル型APX遺伝子で置換したものが挙げられる。
【００５１】
ベクターにサイトゾル型APX遺伝子を組み込むには、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、ベクターDNAの過剰発現プロモーター下流の適当な制限酵素部位に挿入してベクターに連結する方法などが用いられる。
サイトゾル型APX遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、ベクターには、過剰発現プロモーター、サイトゾル型APX遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００５２】
(2) 形質転換体の作製
上記のように構築した組換えベクターを植物に導入することにより、形質転換植物体を得ることができる。
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等)又は植物培養細胞（例えばカルス）のいずれをも意味するものである。形質転換に用いられる植物としては、例えば、限定するものではないが以下記載の植物が挙げられるが、高温処理による低温ストレス耐性強化が見出される植物であることが好ましく、具体的にはイネ科に属する植物が好ましく、イネがより好ましい。
【００５３】
ナス科：ナス(Solanum melongena L.)、トマト(Lycopersicon esculentum Mill)、ピーマン(Capsicum annuum L. var. angulosum Mill.）、トウガラシ(Capsicum annuum L.)、タバコ(Nicotiana tabacum L.)
アブラナ科：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、アブラナ(Brassica campestris L.)、ハクサイ(Brassica pekinensis Rupr.)、キャベツ(Brassica oleracea L. var. capitata L.)、ダイコン(Raphanus sativus L.)、ナタネ(Brassica campestris L., B. napus L.)
イネ科：トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativa)、コムギ(Triticum aestivum L.)、オオムギ(Hordeum vulgare L.)
マメ科：ダイズ(Glycine max)、アズキ(Vigna angularis Willd.)、インゲン(Phaseolus vulgaris L.)、ソラマメ(Vicia faba L.)
ウリ科：キュウリ(Cucumis sativus L.)、メロン(Cucumis melo L.)、スイカ(Citrullus vulgaris Schrad.)、カボチャ(C. moschata Duch., C. maxima Duch.)
ヒルガオ科：サツマイモ(Ipomoea batatas)
ユリ科：ネギ(Allium fistulosum L.)、タマネギ(Allium cepa L.)、ニラ(Allium tuberosum Rottl.)、ニンニク(Allium sativum L.)、アスパラガス(Asparagus officinalis L.)
シソ科：シソ(Perilla frutescens Britt. var. crispa)
キク科：キク(Chrysanthemum morifolium)、シュンギク(Chrysanthemum coronarium L.)、レタス(Lactuca sativa L. var. capitata L.）
バラ科：バラ(Rose hybrida Hort.)、イチゴ(Fragaria x ananassa Duch.)
ミカン科：ミカン(Citras unshiu)、サンショウ(Zanthoxylum piperitum DC.)
フトモモ科：ユーカリ(Eucalyptus globulus Labill)
ヤナギ科：ポプラ(Populas nigra L. var. italica Koehne)
アカザ科：ホウレンソウ(Spinacia oleracea L.)、テンサイ（Beta vulgaris L.）
リンドウ科：リンドウ(Gentiana scabra Bunge var. buergeri Maxim.)
ナデシコ科：カーネーション(Dianthus caryophyllus L.)
【００５４】
上記組換えベクターは、通常の形質転換方法、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法、エレクトロポレーション法等によって植物中に導入することができる。例えばアグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)に導入し、この菌株をイネのカルスに接種して感染させ、形質転換植物を得ることができる。
【００５５】
また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばPDS-1000(BIO-RAD社)等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は450〜2000psi程度の圧力、4〜12cm程度の距離で行う。
【００５６】
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターをパーティクルガン法、エレクトロポレーション法等で培養細胞に導入する。
形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。
【００５７】
遺伝子が植物に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換植物からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。PCRは、組換えベクターに挿入したcDNA断片を増幅するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００５８】
６.  形質転換植物体のストレス耐性の評価
上記サイトゾル型APX遺伝子を含む過剰発現組換えベクターを植物に導入すると、得られる形質転換植物は、ストレスに対する耐性が強化される。従って、当該形質転換植物は、ストレス耐性植物として使用することができる。従来の活性酸素除去系酵素の遺伝子の導入による植物のストレス耐性強化法においては、APXは単独の導入では効果が低いとされていただけでなく、サイトゾル型APXは葉緑体型APXと比べて効果が期待されていなかったことから、本発明においてサイトゾル型APXの単独導入により植物の低温ストレス耐性が強化されることは予想外の効果である。
【００５９】
ここで、ストレスとしては、活性酸素に基づくストレスが挙げられる。活性酸素に基づくストレスとは、植物体内に活性酸素を発生させる環境ストレスに基づくストレスを意味し、野生型植物をこの環境下に放置すると、生育障害あるいは枯死する程度のストレスを意味する。例えば、イネ幼苗を５℃、相対湿度80％の低温下に放置したときのストレス状態がある。本発明のストレス耐性植物は、上記活性酸素の条件でも生育することが可能である。
【００６０】
活性酸素は、種々の環境ストレスに曝されると発生する。環境ストレスとしては、高温ストレス、低温ストレス、乾燥ストレス、強光ストレス、塩ストレス、大気汚染ストレス、農薬ストレス、病害ストレス、紫外線ストレス等が挙げられ、これらのストレスは単独でも複数組み合わさったものでもよい。
【００６１】
「高温ストレス」とは、35℃以上の条件を数分以上、持続的又は一時的に負荷されたときのストレスを意味する。
「低温ストレス」とは、10℃以下の条件を数分以上、持続的又は一時的に負荷されたときのストレスを意味する。
「乾燥ストレス」とは、水が枯渇した状態が、持続的又は一時的に負荷されたときのストレスを意味する。
「強光ストレス」とは、光合成能を超える強光が植物に照射されたときのストレスを意味し、例えば2,000μmol/s/m2以上の光が持続的又は一時的に照射された場合が該当する。
「塩ストレス」とは、土壌に蓄積した塩類により土壌の水分ポテンシャルが低下して、植物体が水分を吸収できなくなるなど、植物体の生理機能に損傷を与えるときのストレスを意味する。
「大気汚染ストレス」とは、大気汚染物質（オゾン、PAN：ペルオキシアセチルナイトレート、二酸化硫黄、フッ化水素及びエチレン等）が持続的又は一時的に負荷されたときのストレスを意味する。
「農薬ストレス」とは植物体が農薬に持続的又は一時的に接触したときのストレスを意味する。
「病害ストレス」とは、かび等による害を受けたときのストレスを意味し、害としては、例えばダイズ紫斑病などが挙げられる。
「紫外線ストレス」とは、100〜400nmの波長を有する紫外線が持続的又は一時的に照射された場合が該当する。
【００６２】
ストレス耐性植物は、サイトゾル型APX遺伝子が過剰発現される形態で組み込まれた本発明の形質転換植物（トランスジェニック植物）を、上記ストレス耐性植物として使用し得る程度に育種することにより作出することができる。この場合、植物にとって上記各種ストレスが生じる条件において、生理機能に損傷を与えず、ひいては成長阻害や枯死等をせずに耐性を示す植物を選抜すればよい。
ストレス耐性植物としての使用開始時期は、耐性を示す植物を選抜した後であればいつでもよい。
上記の形質転換植物のストレス耐性は、ストレス条件下に放置した後の生存率を上記記載に従って評価することによって、相対的に定量化することができる。
【００６３】
例えば、本発明のサイトゾル型APX遺伝子を導入した形質転換体から育種した植物体に低温処理を施し、その後25℃に戻して生育させた植物体の生存率を評価する。同時に、野生型植物体に同様の低温処理を施した場合の植物体の生存率を評価し、形質転換植物の生存率との比較を行えば、形質転換植物のストレス耐性の強化を実証することができる。
【００６４】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明を更に具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６５】
［実施例１］
イネ幼苗の高温処理による低温ストレス耐性の強化
イネ（Oryza sativa L., 品種：きらら397）の種子を27℃の水につけて３日間吸湿させ、直径９cmのぺトリ皿に入れて湿らせたバーミキュライトに播き、25℃及び相対湿度80％にて暗条件下で発芽させた。７日後、幼苗を相対湿度100％、42℃に1、3、9、及び24時間曝露し、その後相対湿度80％の暗条件下で５℃の低温に７日間曝露した。対照幼苗は25℃に曝露した。低温処理後、イネ幼苗を25℃の生育チャンバーに移し、7日間生育させた。その幼苗について、外観の観察に基づいて生存率を評価した。その際、十分に生長している幼苗は生存体とし、生長しない幼苗及び枯死幼苗は非生存体とした。実験は全て最低２回繰り返して行った。
【００６６】
７日間の低温処理（５℃）のみを行った対照イネ幼苗は低温障害を示した。５℃に移す前に24時間の高温処理（42℃）を施したイネ幼苗では、そのような低温障害は生じなかった。高温処理したイネ幼苗を低温に移す前に25℃に４日間置いた場合は、もはやその幼苗は低温ストレス耐性を示さなかった。
【００６７】
イネ幼苗の低温ストレス耐性に対する様々な時間の高温処理の効果については、図１に示した。42℃で６時間の高温処理を施した後、５℃で７日間低温処理したところ、幼苗の50％以上が生存した。低温ストレス耐性は高温処理時間に比例して強化された。42℃で６時間以上高温処理することで低温ストレス耐性は顕著に強化され、特に42℃で24時間高温処理することによって、低温処理後の生存率が劇的に増大した。
【００６８】
［実施例２］
高温ストレス及び低温ストレスに対するAPX、CAT、SODの活性測定
高温処理及びその後の低温処理に対する活性酸素除去系酵素の活性を測定することにより、低温ストレス耐性の強化に関わる酵素を同定した。
【００６９】
25℃、24時間の処理を施したイネ幼苗（対照）、42℃の高温処理（24時間）を施したイネ幼苗、及び42℃、24時間の高温処理後５℃で７日間低温処理したイネ幼苗、並びに25℃、24時間の処理後５℃で７日間低温処理したイネ幼苗の葉を、それぞれ１％Triton X-100を含む50mMリン酸バッファー(pH 7.0)と共にホモジナイズした。この各ホモジネートを４℃にて12,000g、20分間遠心分離し、上清を直ちに酵素アッセイに用いた。
【００７０】
まずアスコルビン酸パーオキシダーゼ(APX)活性を、Saruyama及びTanida(1995)に記載の方法により測定した。反応混合液（1.0ml）は、NaN3、0.5mM アスコルビン酸、1.54mM H2O2、及び上記酵素画分を含む50mM リン酸カリウム（pH 7.0）からなる。H2O2の添加によってアスコルビン酸酸化反応を開始させ、アスコルビン酸濃度を示す290nmでの吸光度を計測した。その結果、吸光度の低下が測定された。この低下量をAPXの相対活性として測定した。カタラーゼ(CAT)活性の測定はTanida, 1996の記載に従って行い、240nmでの吸光度を計測し、その低下をCATの相対活性として測定した。スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)活性は、NBT法（Beyer及びFridovich, 1987）に基づくアッセイキット（SOD test、Wako社製）を使用して測定した。
【００７１】
以上の測定の結果、42℃の高温処理を施した幼苗はAPX活性レベルが有意に向上しており、高温処理後５℃で７日間の低温処理を施した後でも高い活性を保持していた（図２）。高温処理した幼苗のCAT活性はより低いレベルに低下し、さらに低温ストレスにより劇的に低下した。（図２）。SOD活性は高温処理区と低温処理区のどちらにおいても処理区間で有意な差が認められなかった（図２）。また、同様にグルタチオンリダクターゼ活性及び還元型アスコルビン酸含量についても調べたが、高温処理による影響は認められなかった。従って、高温処理後の幼苗の低温ストレス耐性の強化にはAPX活性の増大が寄与していると考えられた。
【００７２】
［実施例３］
APX遺伝子の単離及び発現解析
高温処理により発現が誘導されるAPX遺伝子を単離し、さらにその遺伝子の高温処理後及びそれに続く低温処理後の転写レベルについて、ノーザンブロット解析を行った。
(1) APX遺伝子の単離
実施例１に記載の方法に従って、42℃、24時間の高温処理を施したイネ幼苗の葉を採取し、乳鉢にて液体窒素中で磨砕した。これによりパウダー状になった葉を常法で処理して全RNAを抽出し、それを鋳型として逆転写酵素を用いてcDNAを作製した。cDNA作製にはcDNA Synthesis Kit（TaKaRa社製）を用いた。
【００７３】
このcDNAを鋳型として、APX遺伝子プローブとするDNA断片を、すでに報告のあるイネAPXa遺伝子のcDNA配列（Morita S, Kaminaka H, Yokoi H, Masumura T, Tanaka K. 1997, Plant Physiology 40, 113, 306 ;受託番号D45423）に基づきAPXaをコードするORF全体を増幅するように設計した以下のプライマーを用いて、PCR法により増幅した。
Pri-1: 5'-ACCCGCAGCCATGGCTAAGAACTAC-3'（配列番号３）
Pri-2: 5'-ACTAGAAACCTCTTAAGCATCAGCG-3'（配列番号４）
使用したPCR反応液組成は以下の通りである。
cDNA        100ng
Pri-1       0.5μM
Pri-2       0.5μM
dNTPs       0.2mM
Taq DNAポリメラーゼ(GIBCO BRL社製)   １U
なお、Taq DNAポリメラーゼは最終濃度1.5mMとなる量にてMgCl2を含むTaq DNAポリメラーゼ反応バッファー中に溶解したものを用いた。PCR反応は、94℃で１分、60℃で１分、72℃で１分のサイクルを１サイクルとしてこれを30サイクル行った。
【００７４】
このようにして得られたPCR増幅断片は低融点アガロースゲルで電気泳動後、増幅されたバンドをゲルより切り出し精製した。精製したPCR増幅物は、TAクローニング(Invitrogen社製)を用いて、pCR2.1ベクター中にクローニングした。pCR2.1ベクターにクローニングされた各々のクローンは大腸菌に形質転換後、常法によりプラスミドを回収し、制限酵素（BamHI及びEcoRV）処理を行い、インサート断片の大きさと向きでスクリーニングを行った。
【００７５】
この結果得られた約770bpのcDNA断片を含むクローンについて、Thermo Sequenase Cycle Sequencing Kit（アマシャム社製）を用いてシーケンス反応を行い、DNAシークエンサー(LIC-4200LS-2, Aloka社製)によって塩基配列の決定を行った。その結果、このcDNA配列（配列番号１）が、プローブ設計に用いたイネAPXa遺伝子のDNA配列（Morita S, Kaminaka H, Yokoi H, Masumura T, Tanaka K. 1997, Plant Physiology 40, 113, 306 ;受託番号D45423）と一致していたことから、単離したAPX遺伝子が、イネサイトゾル型アスコルビン酸パーオキシダーゼAPXaをコードしていることが判明した。
【００７６】
(2) APXa遺伝子の発現解析による高温処理による発現誘導の確認
(1)で得られたAPXa遺伝子を含むクローンをプローブとして、高温処理後及びそれに続く低温処理後のイネ幼苗から抽出したAPXa mRNAに対するノーザンブロット解析を行った。
【００７７】
実施例１に記載の方法に従って準備した、25℃の対照イネ幼苗、42℃の高温処理（1、3、6、9、12、24時間）を行ったイネ幼苗、42℃の高温処理（24時間）後に５℃に移して７日間低温処理したイネ幼苗、及び高温処理を行わず25℃に24時間置いた後に５℃に移して７日間低温処理したイネ幼苗から、それぞれシュートを採取した。このシュート１gから、フェノール／SDS法により全RNAを抽出し、これをエタノール沈殿及びLiCl沈殿により精製した。
【００７８】
精製した全RNA(20μg)を1.2％アガロースゲルにて電気泳動し、ナイロンメンブレンに転写し、32P標識した上記のAPXa遺伝子プローブによるハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションシグナルは、そのオートラジオグラムをバイオイメージングアナライザー(FUJIX社製, BAS 1000)で画像解析することにより可視化した。
【００７９】
この結果を図３に示す。図に示されている通り、イネ幼苗のAPXa mRNAレベルは、１時間の高温処理によって約1.8倍に増加することが示された。同様に、3、6、9、12、24時間の高温処理後のAPXa mRNAレベルも、無処理の対照と比較して有意に高かった。低温処理後のAPXa mRNAレベルは、高温処理を行ったイネ幼苗では、高温処理のみのものと比べて低下してはいるが、高温処理を行わなかったイネ幼苗と比較するとなお高い値を示していた。
従って、クローニングされたAPXa遺伝子が高温処理により発現誘導されたことが確認された。
【００８０】
［実施例４］
APXa遺伝子の高温誘導性プロモーターの解析
イネゲノムDNAを鋳型として、APXa遺伝子の上流領域を、熱非対称組み合わせポリメラーゼ連鎖反応(TAIL-PCR)法(Liu Y-G, Mitsukawa N, Oosumi T, Whittier RF. 1995, The Plant Journal 8, 457-463)により増幅した。使用したAPXa特異的プライマーTR1(5'-GTAGGAGATGGTGGGTATCT-3'：配列番号５)、TR2(5'-TATCTCCTCCTTGATGGGGCT-3'：配列番号６)及びTR3(5'-TCACGACGGGGTAGTTCTTA-3'：配列番号７)は、イネAPXaの既知のcDNA配列(Morita S, Kaminaka H, Yokoi H, Masumura T, Tanaka K. 1997, Plant Physiology 40, 113, 306)に基づいて設計した。さらに、Liu Y-G, Mitsukawa N, Oosumi T, Whittier RF. 1995, The Plant Journal 8, 457-463に記載の方法に従って、ランダム縮重プライマーであるAD(GTNCGASWCANAWGTT：配列番号８)を合成した。センス方向プライマーとして３種のAPXa特異的プライマー(TR1、TR2、TR3)を、アンチセンス方向プライマーとしてADプライマーを用いて、３段階のPCR反応を連続的に行い、APXa遺伝子のプロモーターを含む領域を増幅した。１回目のPCR反応液（20μl）組成は、以下の通りである。
イネゲノムDNA    20ng
TR1プライマー    4pmol
ADプライマー   100pmol
dNTPs            200μM
Taq DNAポリメラーゼ（GIBCO BRL社製）  0.8U
【００８１】
なお、Taq DNAポリメラーゼは最終濃度1.5mMとなる量にてMgCl2を含むTaq DNAポリメラーゼ反応バッファー中に溶解したものを用いた。PCR反応は、以下の温度条件(1)〜(5)を連続して行った。
(1)  94℃1分の後、95℃1分
(2)  94℃1分、65℃1分、72℃3分を１サイクルとして、5サイクル
(3)  94℃1分の後、25〜30℃で3分冷却し、3分かけて72℃へ上昇させて72℃3分、を1サイクル
(4)  94℃30秒、68℃1分、72℃3分、94℃30秒、68℃1分、72℃3分、94℃30秒、44℃1分、72℃3分を１サイクルとして、15サイクル
(5)  72℃5分
【００８２】
この1回目のPCRにより得られた増幅産物1μlを50μlの滅菌水で希釈し、そのうち1μlを以下の反応液（19μl）に加えた。
TR2プライマー  4pmol
ADプライマー  80pmol
dNTPs          200μM
Taq DNAポリメラーゼ（GIBCO BRL社製）  0.6U
【００８３】
なお、Taq DNAポリメラーゼは最終濃度1.5mMとなる量にてMgCl2を含むTaq DNAポリメラーゼ反応バッファー中に溶解したものを用いた。PCR反応は、以下の温度条件(6)及び(7)を連続して行った。
(6)  94℃30秒、64℃1分、72℃3分、94℃30秒、64℃1分、72℃3分、94℃30秒、44℃1分、72℃3分を１サイクルとして、12サイクル
(7)  72℃5分
【００８４】
この2回目のPCRにより得られた増幅産物1μlを10μlの滅菌水に希釈し、そのうち1μlを以下の反応液（99μl）に加えた。
TR3プライマー  30pmol
ADプライマー  400pmol
dNTPs          200μM
Taq DNAポリメラーゼ（GIBCO BRL社製）  3U
【００８５】
なお、Taq DNAポリメラーゼは最終濃度1.5mMとなる量にてMgCl2を含むTaq DNAポリメラーゼ反応バッファー中に溶解したものを用いた。PCR反応は、以下の温度条件(8)及び(9)を連続して行った。
(8)  94℃1分、44℃1分、72℃3分を１サイクルとして、20サイクル
(9)  72℃5分
TR3とADとを用いた第３段階の反応により得られた増幅産物を、1.2％アガロースゲルにて電気泳動し、400bpの断片をゲルから抽出して、これをTAクローニング(Invitrogen社製)を用いてpCRIIベクター中にクローニングした。インサートDNAはDNAシークエンサー(LIC-4200LS-2, Aloka社製)を使用して配列決定した。このイネAPXa遺伝子のプロモーター領域の配列を配列番号９に示す。さらにそのDNA塩基配列をシロイヌナズナaxp1遺伝子のプロモーター領域と比較した。
【００８６】
本発明のAPXa遺伝子のプロモーター領域は、TATA boxの81bp上流に位置する一領域を除いては、シロイヌナズナのapx1遺伝子とはごく低い相同性しか有しなかった。その一領域は、推定上の熱ショックエレメント(HSE)nGAAn及びnTTCnを含んでいる（図4A）。HSEは熱ショック因子(HSF)結合最小限モチーフ5'-nGAAnnTTCn-3'を有し、このモチーフはシロイヌナズナapx1プロモーターのHSEと同一であった（図4B）。またCCAATモチーフも-215位置に見出された。
従って本発明のAPXa遺伝子は推定上の高温誘導性プロモーターを有することが判明した。そのことは、APXa遺伝子が高温で誘導されてイネ幼苗の低温ストレス耐性を強化することを裏付ける結果である。
【００８７】
［実施例５］
APXa遺伝子の導入による形質転換イネの作製
(1) APXa遺伝子を組み込んだ過剰発現ベクターの構築
実験例３においてクローニングしたAPXa遺伝子DNAを鋳型として、翻訳開始点の直前に制限酵素BamHIの認識配列を挿入したプライマーPri-3（5'-ACCCGGATCCATGGCTAAGAACTAC-3'：配列番号１２）と翻訳終止点の直後に制限酵素SacIの認識配列を挿入したプライマーPri-4（5'-ACTAGAGAGCTCTTAAGCATCAGCG-3'：配列番号１３）を用いてPCR法によってDNA増幅し、コード領域の両端に制限酵素BamHIとSacIの認識配列を付与したAPXa DNA断片を得た。使用したPCR反応液（20μl）組成は以下の通りである。
DNA    100ng
Pri-3  0.5μM
Pri-4  0.5μM
dNTPs  0.2mM
Taq DNAポリメラーゼ（GIBCO BRL社製）  1U
なお、Taq DNAポリメラーゼは最終濃度1.5mMとなる量にてMgCl2を含むTaq DNAポリメラーゼ反応バッファー中に溶解したものを用いた。PCR反応は、94℃で1分、60℃で1分、72℃で1分のサイクルを１サイクルとしてこれを30サイクル行った。
【００８８】
このようにして得られたPCR増幅断片をBamHI及びSacIで切断し、1%アガロースゲルにて電気泳動し、約760pbの該DNA断片をゲルから抽出及び精製した。組み込むベクターには農林水産省農業生物資源研究所（現・独立行政法人農業生物資源研究所）が開発したpMLH7133ベクター(Mitsuhara et al., Plant Cell Rhysiology 37:49-59, 1996)を使用した。このベクターを制限酵素BamHI及びSacIで切断し、上記のように調製したAPXa遺伝子を含むDNA断片を挿入することによって、pMLH7133のインサートDNAのGUSをAPXaで置換した組換えベクターを構築した。この組換えベクターをpMLH7133-APXaと称し、その構造を図５に示した。
【００８９】
この組換えベクターpMLH7133-APXaを、アグロバクテリウム法によりイネ品種「ゆきひかり」に導入した。この「ゆきひかり」は、低温ストレス耐性に優れる北海道のイネ品種である。具体的には、pMLH7133-APXaをエレクトロポレーション法によりアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)に導入し、それを共存培養によりイネ「ゆきひかり」の胚盤由来カルスに感染させることによって、pMLH7133-APXaを導入した。次いで、この形質転換によって得られたカルスを、ハイグロマイシン（50mg/l）を含む再分化培地で培養することにより植物体に再生させた。
【００９０】
［実施例６］
APXa遺伝子を導入した形質転換イネの低温ストレス耐性の評価
実施例５で得られた形質転換植物体を２度自殖して得られたT2世代について、実施例１の記載に従って、５℃、10日間の低温処理を行い、その後25℃に戻した後のイネの生存率を調べた。比較のために、原品種の「ゆきひかり」についても同様の条件で低温処理を行った。
【００９１】
その結果、原品種の「ゆきひかり」の生存率が0%だったのに対し、導入遺伝子をホモで持つイネAPX991217-5-2は48%の生存率を示した（図６）。すなわち、本発明のサイトゾル型アスコルビン酸パーオキシダーゼAPXaの遺伝子を導入したイネは、低温ストレス耐性の優れる「ゆきひかり」が100%枯死するような厳しい低温条件下でも48%が生存できるという顕著な低温ストレス耐性の強化が示された。
【００９２】
【発明の効果】
本発明により、様々な環境ストレス（高低温、乾燥、強光、塩、大気汚染ガス、病原菌、紫外線等）条件下で発生する活性酸素に対して耐性の強化されたトランスジェニック植物が提供される。本発明にかかるサイトゾル型アスコルビン酸パーオキシダーゼ遺伝子を植物に導入する方法は、様々な環境ストレス（高低温、乾燥、強光、塩、大気汚染ガス、病原菌、紫外線等）条件下で発生する活性酸素に対して耐性の高い植物の開発に有用である。
【００９３】
【配列表】
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0003845661.tif 000003
0003845661.tif 000004
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【００９４】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：合成プライマー
配列番号４：合成プライマー
配列番号５：合成プライマー
配列番号６：合成プライマー
配列番号７：合成プライマー
配列番号８：合成プライマー、第３塩基及び第１１塩基のnは、a、t、g、又はcのいずれかである。
配列番号１２：合成プライマー
配列番号１３：合成プライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、イネ幼苗を、0、3、6、9、及び24時間にわたり42℃にて高温処理すると、６時間以上の処理区において、低温ストレス耐性が顕著に強化されることを示した図である。**は１％水準で有意であることを示す。
【図２】図２は、25℃処理した幼苗（対照）、42℃高温処理（24時間）した幼苗、42℃高温処理（24時間）後５℃で７日間低温処理した幼苗、及び25℃処理した後５℃で７日間低温処理した幼苗における、カタラーゼ(CAT)、スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)、アスコルビン酸パーオキシダーゼ(APX)の各活性を示した図である。*は５％水準で有意、**は１％水準で有意であることを示す。
【図３】図３は、25℃処理した幼苗（対照）、42℃高温処理（1, 3, 6, 9, 12, 24時間）した幼苗、42℃高温処理（24時間）後５℃で７日間低温処理した幼苗、及び25℃処理した後５℃で７日間低温処理した幼苗における、APXa遺伝子のmRNA発現量を、ノーザンブロット解析のオートラジオグラム、及びその定量解析結果にて示した図である。オートラジオグラムについてはrRNA存在量を比較対照として示した。*は５％水準で有意であることを示す。
【図４】図４は、APXa遺伝子のプロモーター領域に、熱ショック因子(HSF)が結合するための最小限熱ショックエレメント(HSE)モチーフnGAAnnTTCnが存在することを示した図である。Aは、APXa遺伝子のプロモーター構造を示す。ATGは翻訳開始コドンを示し、APXa遺伝子のcDNAの5'端を矢印および＋１で示した。図中の数値は転写開始点からの塩基数である。Bは、イネAPXaプロモーター上のHSE（上段）とシロイヌナズナapx1プロモーター上のHSE（下段）との比較。HSEのモチーフnGAAnを大文字で示した。HSF結合のための最小限のモチーフnGAAnnTTCnを内向きの矢印で示した。その両側には１塩基置換されたモチーフが存在している。
【図５】イネに導入した組換えベクターpMLH7133-APXaの構造を示した図である。
【図６】原品種ゆきひかりと形質転換イネ（APX991217-5-2）における低温処理後の生存率の違いを示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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