(57)【要約】  妊娠中に使用できる医薬を開発することを課題とする。治療薬が結合又は配位された親水性ポリマーを表面に有する粒子において、親水性ポリマーにより粒子の粒径を制御することにより、胎盤透過性を制御することができることを見出し、粒径が、動的光散乱法により測定した場合に１０〜１００ｎｍである粒子により課題が解決される。
2020209379.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療薬が結合又は配位された親水性ポリマーを表面に有する粒子を含む、妊婦又は妊娠可能性のある女性に対し投与するための医薬組成物であって、粒径が、動的光散乱法により測定した場合に１０〜１００ｎｍである、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記粒子が、ポリエチレングリコール−ポリアミノ酸ブロック共重合体を含むミセルである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ポリエチレングリコール−ポリアミノ酸ブロック共重合体が、以下の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）：
【化１０】
2020209379.tif 000015
（式中、
Ｒ1a及びＲ1bは水素原子、水酸基又は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ1-12アルキル基又はＣ1-12アルコキシ基を表し、
Ｌ1は−（ＣＨ2）b−ＮＨ−を表し、ｂは１〜５の整数であり、
Ｌ2は−（ＣＨ2）c−ＣＯ−を表し、ｃは１〜５の整数であり、
Ｒ2a及びＲ2cは、それぞれ出現ごとに独立して、存在しないか、又はメチレン基を表し、
Ｒ2b及びＲ2dは、カルボキシ基又は任意のアミノ酸側鎖を表し、
Ｒ3は、水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表し、
Ｒ4は、水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基又は開始剤残基を表し、ここで、ａは１〜５の整数であり、Ｘは、一級、二級、三級アミン又は四級アンモニウム塩の内の１種類又は２種類以上を含むアミン化合物残基、又は、アミンでない化合物残基であり、
ｍは２０〜２，０００の整数であり、
ｎは１〜２００の整数である）
で表されるブロック共重合体であり、前記治療薬が、該ブロック共重合体のＲ2b及びＲ2dを介して配位されるか、あるいは直接またはリンカーを介して結合される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記粒径が、２５〜７５ｎｍである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記治療薬のみで投与された場合に妊婦に対して禁忌となる用法及び／又は用量で前記治療薬が投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記治療薬が、抗癌薬、抗炎症薬、抗高血圧薬、及び向精神薬からなる群から選ばれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記抗癌薬が、白金製剤である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記白金製剤が、前記アミノ酸側鎖の１又は２個のカルボキシレート基との配位結合を介して形成される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記治療薬が抗炎症薬であり、流産防止用である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記抗炎症薬が、非ステロイド性抗炎症剤である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記治療薬が抗高血圧薬であり、妊娠高血圧薬治療用である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記抗高血圧薬が、スタチン系抗高血圧薬である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記医薬組成物が、胎児薬害低減用医薬組成物である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記医薬組成物が、胎盤関門透過低減用医薬組成物である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
以下の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）：
【化１１】
2020209379.tif 000016
（式中、
Ｒ1a及びＲ1bは、水素原子、水酸基又は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ1-12アルキル基又はＣ1-12アルコキシ基を表し、
Ｌ1は−（ＣＨ2）b−ＮＨ−を表し、ｂは１〜５の整数であり、
Ｌ2は−（ＣＨ2）c−ＣＯ−を表し、ｃは１〜５の整数であり、
Ｒ2a及びＲ2cは、それぞれ出現ごとに独立して、存在しないか、又はメチレン基を表し、
Ｒ2b及びＲ2dは、カルボキシ基又は任意のアミノ酸側鎖を表し、
Ｒ3は、水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表し、
Ｒ4は、水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基又は開始剤残基を表し、ここで、ａは１〜５の整数であり、Ｘは、一級、二級、三級アミン又は四級アンモニウム塩の内の１種類又は２種類以上を含むアミン化合物残基、又は、アミンでない化合物残基であり、
ｍは２０〜２，０００の整数であり、
ｎは１〜２００の整数である）
で表されるブロック共重合体に、薬物が、該ブロック共重合体のＲ2b及びＲ2dを介し、直接またはリンカーを介して結合された薬物複合化ブロック共重合体であって、前記薬物が、インドメタシン又はシンバスタチンである、前記薬物複合化ブロック共重合体。
【請求項１６】
請求項１５に記載音薬物複合化ブロック共重合体により形成されたミセルを含む医薬組成物であって、粒径が、動的光散乱法により測定した場合に２０〜１００ｎｍである、前記医薬組成物。
【請求項１７】
前記薬物としてインドメタシンを含み、前記医薬組成物が、流産防止用の医薬組成物である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記薬物としてシンバスタチンを含み、前記医薬組成物が、妊娠高血圧治療用の医薬組成物である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
治療薬が結合又は配位されたポリエチレングリコール−ポリアミノ酸ブロック共重合体を含み、妊婦又は妊娠可能性のある女性に対し投与するためのミセルの製造方法であって、
前記ポリエチレングリコール−ポリアミノ酸ブロック共重合体を、水中で再構成する工程、及び、
分画分子量１０，０００〜１００，０００の透析膜を用いて限外ろ過を行って、２０〜１００ｎｍの粒径を有するミセルを取得する工程、
を含む、前記製造方法。
【請求項２０】
前記治療薬が、抗癌薬、抗炎症薬、抗高血圧薬、及び向精神薬からなる群から選ばれる、請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記ポリエチレングリコール−ポリアミノ酸ブロック共重合体が、以下の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）：
【化１２】
2020209379.tif 000017
（式中、
Ｒ1a及びＲ1bは水素原子、水酸基又は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ1-12アルキル基又はＣ1-12アルコキシ基を表し、
Ｌ1は−（ＣＨ2）b−ＮＨ−を表し、ｂは１〜５の整数であり、
Ｌ2は−（ＣＨ2）c−ＣＯ−を表し、ｃは１〜５の整数であり、
Ｒ2a及びＲ2cは、それぞれ出現ごとに独立して、存在しないか、又はメチレン基を表し、
Ｒ2b及びＲ2dは、カルボキシ基又は任意のアミノ酸側鎖を表し、
Ｒ3は、水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表し、
Ｒ4は、水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基又は開始剤残基を表し、ここで、ａは１〜５の整数であり、Ｘは、一級、二級、三級アミン又は四級アンモニウム塩の内の１種類又は２種類以上を含むアミン化合物残基、又は、アミンでない化合物残基であり、
ｍは２０〜２，０００の整数であり、
ｎは１〜２００の整数である）
で表されるブロック共重合体であり、前記治療薬が、前記ブロック共重合体のＲ2b及びＲ2d基との配位結合、あるいは直接又はリンカーを介した結合を介して結合される、請求項１９又は２０に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊婦又は妊娠可能性のある女性に対して投与するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
妊娠中の女性に対しての投薬は、胎児に対する影響を避けるため極力避けられている。胎児に対する影響として、催奇性、流産、早産や胎児発育不良などが挙げられる。安全性が確立されている薬剤は限定的であり、妊娠の判明により投薬の中止が必要となる。また、投薬治療中に妊娠が判明することにより、妊婦は過度の心労に苛まれることもある。一方で、投薬の中止が、妊婦に対して悪影響を及ぼすことが多く、妊娠中にも使用できる医薬の開発が望まれている。妊娠中において問題となる疾患の一つとして、癌が挙げられる。世界では、約２００，０００人もの妊娠女性が癌を患っており、その中でも特に乳癌は、内在性のエストロゲンおよびプロゲステロンへの暴露と関連することが報告されており、妊娠に伴って発症することもある。乳癌リスクは年齢とともに増加するが、妊娠年齢の増加とともに妊婦における乳癌の症例数が増えている。一般に乳癌に対しては、抗癌剤、ホルモン療法、抗体治療薬、放射線療法、手術などが行われるが、妊婦に使用可能な抗癌剤は限られている。【０００３】
妊娠中における炎症、特に細菌性の炎症は、早産のリスクを高めることが知られており、インドメタシンなどの非ステロイド性抗炎症剤を治療に用いることができる。一方で、インドメタシンなどの非ステロイド性抗炎症剤は胎児に影響し、腎不全や消化器不全を引き起こすことが報告されており、その使用には十分な注意が必要とされている。【０００４】
妊婦において頻発する疾患として、妊娠高血圧症が知られており、約２０人に１人の割合で生じる。妊娠高血圧症では、腎機能や肝機能に障害を与え、母体に対して危険であるうえ、胎児発育不全も引き起こしうる。妊娠高血圧症の治療には、ヒドララジン、メチルドパ、ラベタロール、ニフェジピンなどの降圧剤が一般に使用されている。近年の研究では、スタチン系の薬剤が、妊娠高血圧症の治療及び／又は予防に有用であるという報告もあるが（非特許文献１：Plos One （2010）vol. 5, Issue 10, e13663）、スタチン系の薬剤は妊婦への使用は禁忌とされている。また、精神疾患の治療のために投与される精神病薬の中には、催奇性や新生児不適応症候群を引き起こす可能性が否定できず、投薬が中断される場合もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９６／３２４３４号
【特許文献２】国際公開第９６／３３２３３号
【特許文献３】国際公開第９７／０６２０２号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】A. Ahmed Plos One （2010）vol. 5, Issue 10, e13663
【非特許文献２】H. Cabral et. al., Nat. Nanotech. 6 (2011) 815-823
【非特許文献３】K. Shintaku et. al., Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 962,
【非特許文献４】J. R. Huston et. al., Clin. Pharmacol. Ther. 90 (2011) 6
【非特許文献５】M. Nagai et. al., Drug Metab. Dispos. 41 (2013) 2124
【非特許文献６】M. Yokoyama et. al., Makromol. Chem. 190 (1989) 2041-2054
【非特許文献７】A. Harada and K. Kataoka, Macromolecules 28 (1995) 5294-5299
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
妊娠中に使用できる医薬を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、妊娠中に使用できる医薬の開発を目的として、医薬の胎盤透過性に着目して研究を行った。親水性ポリマーにより大きさを制御することにより、胎盤透過性を制御することができることを見出し、本発明に至った。そこで、本発明は以下に関する：【０００９】
［１］  治療薬が結合又は配位された親水性ポリマーを表面に有する粒子を含む、妊婦又は妊娠可能性のある女性に対し投与するための医薬組成物であって、粒径が、動的光散乱法により測定した場合に１０〜１００ｎｍである、前記医薬組成物。
［２］  前記粒子が、ポリエチレングリコール−ポリアミノ酸ブロック共重合体を含むミセルである、項目１に記載の医薬組成物。
［３］  前記ポリエチレングリコール−ポリアミノ酸ブロック共重合体が、以下の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）：
【化１】
2020209379.tif 000003
（式中、
Ｒ1a及びＲ1bは、水素原子、水酸基又は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ1-12アルキル基又はＣ1-12アルコキシ基を表し、
Ｌ1は−（ＣＨ2）b−ＮＨ−を表し、ｂは１〜５の整数であり、
Ｌ2は−（ＣＨ2）c−ＣＯ−を表し、ｃは１〜５の整数であり、
Ｒ2a、及びＲ2ｃは、出現ごとに独立して、存在しないか、又はメチレン基を表し、
Ｒ2b及びＲ2dは、カルボキシ基又は任意のアミノ酸側鎖を表し、
Ｒ3は、水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表し、
Ｒ4は、水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基又は開始剤残基を表し、ここで、ａは１〜５の整数であり、Ｘは、一級、二級、三級アミン又は四級アンモニウム塩の内の１種類又は２種類以上を含むアミン化合物残基、又は、アミンでない化合物残基であり、
ｍは２０〜２，０００の整数であり、
ｎは１〜２００の整数である）
で表されるブロック共重合体であり、前記治療薬が、該ブロック共重合体のＲ2b及びＲ2dを介して配位されるか、又は直接若しくはリンカーを介して結合される、項目２に記載の医薬組成物。
［４］  前記粒径が、２５〜７５ｎｍである、項目１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［５］  前記治療薬のみで投与された場合に妊婦に対して禁忌となる用法及び／又は用量で前記治療薬が投与される、項目１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［６］  前記治療薬が、抗癌薬、抗炎症薬、抗高血圧薬、向精神薬からなる群から選ばれる、項目１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［７］  前記抗癌薬が、白金製剤である、項目６に記載の医薬組成物。
［８］  前記白金製剤が、前記ブロック共重合体の１又は２個のカルボキシレート基との配位結合を介して形成される、項目７に記載の医薬組成物。
［９］  前記治療薬が抗炎症薬であり、流産防止用である、項目１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［１０］  前記抗炎症薬が、非ステロイド性抗炎症剤である、項目９に記載の医薬組成物。
［１１］  前記治療薬が抗高血圧薬であり、妊娠高血圧薬治療用である、項目１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［１２］  前記抗高血圧薬が、スタチン系抗高血圧薬である、項目１１に記載の医薬組成物。
［１３］  前記医薬組成物が、胎児薬害低減用医薬組成物である、項目１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［１４］  前記医薬組成物が、胎盤関門透過低減用医薬組成物である、項目１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［１５］  以下の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）：
【化２】
2020209379.tif 000004
（式中、
Ｒ1a及びＲ1bは水素原子、水酸基又は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ1-12アルキル基又はＣ1-12アルコキシ基を表し、
Ｌ1は−（ＣＨ2）b−ＮＨ−を表し、ｂは１〜５の整数であり、
Ｌ2は−（ＣＨ2）c−ＣＯ−を表し、ｃは１〜５の整数であり、
Ｒ2a及びＲ2ｃは、各出現ごとに独立して、存在しないか、又はメチレン基を表し、
Ｒ2b及びＲ2dは、カルボキシ基又は任意のアミノ酸側鎖を表し、
Ｒ3は、水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表し、
Ｒ4は、水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基又は開始剤残基を表し、ここで、ａは１〜５の整数であり、Ｘは、一級、二級、三級アミン又は四級アンモニウム塩の内の１種類又は２種類以上を含むアミン化合物残基、又は、アミンでない化合物残基であり、
ｍは２０〜２，０００の整数であり、
ｎは１〜２００の整数である）
で表されるブロック共重合体に、薬物が、該ブロック共重合体のＲ2b及びＲ2dを介し、直接またはリンカーを介して結合された薬物複合化ブロック共重合体であって、前記薬物が、インドメタシン又はシンバスタチンである、前記薬物複合化ブロック共重合体。
［１６］  項目１５に記載音薬物複合化ブロック共重合体により形成されたミセルを含む医薬組成物であって、粒径が、動的光散乱法により測定した場合に２０〜１００ｎｍである、前記医薬組成物。
［１７］  前記薬物としてインドメタシンを含み、前記医薬組成物が、流産防止用の医薬組成物である、項目１６に記載の医薬組成物。
［１８］  前記薬物としてシンバスタチンを含み、前記医薬組成物が、妊娠高血圧治療用の医薬組成物である、項目１６に記載の医薬組成物。
［１９］  治療薬が結合又は配位されたポリエチレングリコール−ポリアミノ酸ブロック共重合体を含み、妊婦又は妊娠可能性のある女性に対し投与するためのミセルの製造方法であって、
前記ポリエチレングリコール−ポリアミノ酸ブロック共重合体を、水中で再構成する工程、及び、
分画分子量１０，０００〜１００，０００の透析膜を用いて限外ろ過を行って、２０〜１００ｎｍの粒径を有するミセルを取得する工程、
を含む、前記製造方法。
［２０］  前記治療薬が、抗癌薬、抗炎症薬、抗高血圧薬、向精神薬からなる群から選ばれる、項目１９に記載の製造方法。
［２１］  前記ポリエチレングリコール−ポリアミノ酸ブロック共重合体が、以下の一般式（１−ａ）または（１−ｂ）：
【化３】
2020209379.tif 000005
（式中、
Ｒ1a及びＲ1bは水素原子、水酸基又は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ1-12アルキル基又はＣ1-12アルコキシ基を表し、
Ｌ1は−（ＣＨ2）b−ＮＨ−を表し、ｂは１〜５の整数であり、
Ｌ2は−（ＣＨ2）c−ＣＯ−を表し、ｃは１〜５の整数であり、
Ｒ2a及びＲ2ｃは、各出現ごとに独立して、存在しないか、又はメチレン基を表し、
Ｒ2b及びＲ2dは、カルボキシ基又は任意のアミノ酸側鎖を表し、
Ｒ3は、水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表し、
Ｒ4は、水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基又は開始剤残基を表し、
ここで、ａは１〜５の整数であり、Ｘは、一級、二級、三級アミン又は四級アンモニウム塩の内の１種類又は２種類以上を含むアミン化合物残基、又は、アミンでない化合物残基であり、
ｍは２０〜２，０００の整数であり、
ｎは１〜２００の整数である）
で表されるブロック共重合体であり、前記治療薬が、前記ブロック共重合体のＲ2b又はＲ2dを介して配位されるか、あるいは直接又はリンカーを介して結合される、項目１９又は２０に記載の製造方法。
［２２］  妊婦又は妊娠可能性のある女性における疾患の治療又は予防に使用するための治療薬が結合又は配位された親水性ポリマーを表面に有する粒子であって、粒径が、動的光散乱法により測定した場合に１０〜１００ｎｍである、前記粒子。
［２３］妊婦又は妊娠可能性のある女性において、流産又は早産の防止、予防又は治療に使用するための抗炎症薬が結合又は配位された親水性ポリマーを表面に有する粒子であって、粒径が、動的光散乱法により測定した場合に１０〜１００ｎｍである、前記粒子。
［２４］妊婦又は妊娠可能性のある女性において、妊娠高血圧の予防又は治療に使用するための抗高血圧薬が結合又は配位された親水性ポリマーを表面に有する粒子であって、粒径が、動的光散乱法により測定した場合に１０〜１００ｎｍである、前記粒子。
［２５］  胎児の薬害が低減される、項目２２〜２４のいずれか一項に記載の粒子。
［２６］  胎盤関門透過性が低減される、項目２２〜２４のいずれか一項に記載の粒子。
［２７］  妊婦又は妊娠可能性のある女性において疾患を治療又は予防する方法であって、妊婦又は妊娠可能性のある女性に、治療薬が結合又は配位された親水性ポリマーを表面に有する粒子を投与することを含み、ここで前記粒子の粒径が、動的光散乱法により測定した場合に１０〜１００ｎｍである、前記方法。
［２８］  妊婦又は妊娠可能性のある女性において、流産又は早産の防止、予防又は治療するための方法であって、抗炎症薬が結合又は配位された親水性ポリマーを表面に有する粒子を、妊婦又は妊娠可能性のある女性に投与することを含み、ここで粒径が、動的光散乱法により測定した場合に１０〜１００ｎｍである、前記方法。
［２９］  妊婦又は妊娠可能性のある女性において、妊娠高血圧の予防又は治療するための方法であって、抗高血圧薬が結合又は配位された親水性ポリマーを表面に有する粒子を、妊婦又は妊娠可能性のある女性に投与することを含み、ここで粒径が、動的光散乱法により測定した場合に１０〜１００ｎｍである、前記方法。
［３０］  胎児の薬害が低減される、項目２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
［３１］  胎盤関門透過性が低減される、項目２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
［３２］  妊婦又は妊娠可能性のある女性における疾患の治療又は予防に使用するための医薬の製造のための、治療薬が結合又は配位された親水性ポリマーを表面に有し、粒径が動的光散乱法により測定した場合に１０〜１００ｎｍである粒子の使用。
［３３］  妊婦又は妊娠可能性のある女性において、流産又は早産の防止、予防又は治療するための医薬の製造のための、治療薬が結合又は配位された粒子であって、親水性ポリマーを表面に有し、粒径が動的光散乱法により測定した場合に１０〜１００ｎｍである粒子の使用。
［３４］妊婦又は妊娠可能性のある女性において、妊娠高血圧の予防又は治療するための医薬の製造のための、治療薬が結合又は配位された粒子であって、親水性ポリマーを表面に有し、粒径が動的光散乱法により測定した場合に１０〜１００ｎｍである粒子の使用。
［３５］  胎児の薬害が低減される、項目３２〜３４のいずれか一項に記載の使用。
［３６］  胎盤関門透過性が低減される、項目３２〜３４のいずれか一項に記載の使用。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の医薬組成物は、胎盤透過性が低く、医薬の胎児への影響を低減することができる。これにより、妊婦又は妊娠の可能性のある女性に対して投与可能な医薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、高分子ミセルの胎盤および胎児への集積性を示す写真である。
【図２】図２は、３０ｎｍサイズのミセル投与後の元素（Pt、Fe、K、Ca）の分析を示す写真である。
【図３】図３は、オキサリプラチン、及びダハプラチン内包ミセル（粒径３０ｎｍ及び７０ｎｍ）を投与された妊娠マウスの胎児における白金含有量を示すグラフである。
【図４】図４は、オキサリプラチン、及びダハプラチン内包ミセル（粒径３０ｎｍ及び７０ｎｍ）を投与された妊娠マウスの胎盤における白金含有量を示すグラフである。
【図５】図５は、ヒト胎盤灌流モデルによる薬剤の胎盤透過性を示すグラフである。図５Ａでは、オキサリプラチン、３０ｎｍダハプラチン内包ミセル、７０ｎｍダハプラチン内包ミセル、及び８−ａｒｍＰＥＧについての結果を示す。図５Ｂでは、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍのＰＥＧ被覆金ナノ粒子について結果を示す。
【図６】図６は、ヒト胎盤への薬剤の集積量を示すグラフである。
【図７】図７は、PEG-poly(Asp-Furan-OH)の1H-NMRスペクトラムを示す。
【図８】図８は、血中およびエンドソームのｐＨにおけるミセルの安定性を示すグラフである。
【図９】図９は、マクロファージ内におけるインドメタシン放出量を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ヒト胎盤灌流モデルによる薬剤の胎盤透過性を示すグラフである。
【図１１】図１１は、インドメタシン内包高分子ミセルの組織移行性を示す図である。図１１Ａは、回収された臓器の配置位置を示し、図１１Ｂ〜Ｅは、投与の１時間後、４時間後、８時間後、及び２４時間後におけるインドメタシン内包高分子ミセルの蛍光を示す。これらの実験により、インドメタシンミセルが、肝臓、腎臓、脾臓、子宮体、及び胎盤に分布し、そして各時点で胎児には到達していないことを示す。
【図１２】図１２は、インドメタシン内包高分子ミセルの組織移行性の評価を示す図である。妊娠マウスへインドメタシン内包高分子ミセルを投与後、（Ａ）腎臓、（Ｂ）肝臓、（Ｃ）脾臓、（Ｄ）胎盤、（Ｅ）胎児へのインドメタシンの移行量を示す。
【図１３】早産マウスモデルにおけるインドメタシン、インドメタシン内包高分子ミセルの投与による生存率を示すグラフである。
【図１４】図１４は、妊娠高血圧モデルマウスにおける薬剤投与後の血圧変化を示すグラフである。
【図１５】図１５は、妊娠高血圧モデルマウスにおける薬剤投与後の胎児の体重変化を示すグラフである。
【図１６】図１６は、妊娠高血圧モデルマウスにおける薬剤投与後の尿中アルブミン量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、妊婦又は妊娠可能性のある女性に対し投与するための医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、治療薬が結合又は配位された親水性ポリマーを表面に有する粒子を含み、その粒径が、動的光散乱法により測定した場合に１０〜１００ｎｍであることを特徴とする。胎盤透過性の観点から、通常、粒径は１０ｎｍ以上であり、好ましくは２０ｎｍ以上であり、さらに好ましくは２５ｎｍ以上である。治療薬の効能を発揮する観点から、通常、粒径は１００ｎｍ以下であり、好ましくは９０ｎｍ以下であり、より好ましくは８０ｎｍ以下、さらにより好ましくは７５ｎｍ以下である。このサイズの粒子であれば、胎盤透過性が低く、胎児への毒性を低減することができる。本発明の組成物において、粒子の粒径の多分散度（ＰＤＩ）は、０．２以下が好ましく、さらにより好ましくは０．１以下である。本発明の医薬組成物に含まれる粒子は、胎盤透過性が低減されていることから、胎児薬害低減用又は胎盤関門透過低減用の医薬組成物として使用しうる。
【００１３】
親水性ポリマーを表面に有する粒子であれば、任意の粒子が使用されてよく、ブロック共重合体により形成されるミセルやベシクル、表面を親水性ポリマーで覆われたリポソームなどであってもよい。
【００１４】
親水性ポリマーとしては、医薬、特にドラッグデリバリーシステムに一般的に使用される親水性ポリマーであれば任意のポリマーを使用することができる。一例として、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリペプチド、多糖などが挙げられうる。ミセルを製造する観点では、ポリエチレングリコール−ポリアミノ酸ブロック共重合体を使用することができる。ポリエチレングリコール−ポリアミノ酸ブロック共重合体としては、本技術分野に既知の任意のものを使用しうる。ポリエチレングリコール−ポリアミノ酸ブロック共重合体のアミノ酸として、側鎖にカルボキシ基を有するグルタミン酸又はアスパラギン酸を使用することができる。一例として、以下の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）：
【化４】
2020209379.tif 000006
（式中、
Ｒ1a及びＲ１ｂは水素原子、水酸基、又は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ1-12アルキル基又はＣ1-12アルコキシ基を表し、
Ｌ1は−（ＣＨ2）b−ＮＨ−を表し、ｂは１〜５の整数であり、
Ｌ2は−（ＣＨ2）c−ＣＯ−を表し、ｃは１〜５の整数であり、
Ｒ2a、及びＲ2cは、出現ごとに独立して、存在しないか、又はメチレン基を表し、
Ｒ2b及びＲ2dは、カルボキシ基又は任意のアミノ酸側鎖を表し、
Ｒ3は、水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表し、
Ｒ4は、水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基又は開始剤残基を表し、ここで、ａは１〜５の整数であり、Ｘは、一級、二級、三級アミン又は四級アンモニウム塩の内の１種類又は２種類以上を含むアミン化合物残基、又は、アミンでない化合物残基であり、
ｍは２０〜２，０００の整数であり、
ｎは１〜２００の整数である）
で表されるブロック共重合体を使用することができる。治療薬は、Ｒ2b及びＲ2dにおいて、直接またはリンカーを介して結合されるか、又は配位される。
【００１５】
ここで、一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）の構造式中、繰り返し単位数（重合度）が「ｍ」のセグメントがＰＥＧ由来の非荷電性親水性セグメント（以降「ＰＥＧセグメント」と表示する場合がある）であり、繰り返し単位数が「ｎ」のセグメントがアミノ酸由来のセグメント（以降「ポリアミノ酸セグメント」と表示する場合がある）である。
【００１６】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Ｒ1a及びＲ1bは、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ1-12アルキル基又はＣ1-12アルコキシ基を表す。直鎖もしくは分枝のＣ1-12としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、iso−プロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、デシル、ウンデシル等を挙げることができる。また置換された場合の置換基としては、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ2-7アシルアミド基、同一もしくは異なるトリ−Ｃ1-6アルキルシロキシ基、シロキシ基又はシリルアミノ基を挙げることができる。ここで、アセタール化とは、ホルミルのカルボニルと、例えば、炭素数１〜６個のアルカノールの２分子又は炭素原子数２〜６個の分岐していてもよいアルキレンジオールとの反応によるアセタール部の形成を意味し、当該カルボニル基の保護方法でもある。例えば、置換基がアセタール化ホルミル基であるときは、酸性の温和な条件下で加水分解して、他の置換基であるホルミル基（−ＣＨＯ）（又はアルデヒド基）に転化できる。
【００１７】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Ｌ1及びＬ2は、連結基を表す。具体的には、Ｌ1は−（ＣＨ2）b−ＮＨ−（ここでｂは１〜５の整数である）であることが好ましく、Ｌ2は−（ＣＨ2）c−ＣＯ−（ここでｃは１〜５の整数である）であることが好ましい。
【００１８】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Ｒ2a及びＲ2ｃは、出現ごとに独立して存在しないか、又はメチレン基を表す。アミノ酸としてアスパラギン酸を用いた場合、アスパラギン酸の側鎖のカルボキシ基と主鎖の窒素との間で脱水縮合が生じ、スクシンイミド中間体が生成する。次にこの中間体が開裂することで、イソアスパラギン酸への異性化が生じうる。したがって、アスパラギン酸がイソアスパラギン酸へと異性化した場合には、Ｒ2a及びＲ2cの位置にメチレン基が生じ、Ｒ2b及びＲ2dはカルボキシ基となる。Ｒ2a及びＲ2cが存在しない場合は異性化が生じずに、アミノ酸が主鎖でペプチド結合をしていることを示す。ブロック共重合体における異性化の割合は任意でありうる。したがって、Ｒ2a及びＲ2cが存在しない場合には、Ｒ2b及びＲ2dは、任意のアミノ酸側を表し、これらの基を介して薬剤が配位されるか、又は直接若しくはリンカーを介して薬剤が結合されうる。アミノ酸側鎖としては、任意の生体構成アミノ酸の側鎖であってよいが、薬剤を結合させる観点から、セリン、スレオニン、アルギニン、ヒスチジン、リジン、システイン、グルタミン酸及びアスパラギン酸の側鎖であることが好ましい。Ｒ2a及びＲ2cが存在する場合、Ｒ2b及びＲ2dは、カルボキシ基となる。ポリアミノ酸セグメント中におけるアスパラギン酸のイソアスパラギン酸への異性化は偶発的に生じうることから、本明細書において、主鎖同士のアミド結合のみを表す式が記載される場合であっても、上述の式（Ｉ）及び（ＩＩ）のように異性化が生じたポリマーを排除することを意図するものではない。アミノ酸の反復単位は、それぞれブロックを形成して存在するか、あるいはランダムに存在できる。
【００１９】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Ｒ3は、水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表す。具体的には、Ｒ3は、アセチル基、アクリロイル基又はメタクリロイル基であることが好ましい。
【００２０】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Ｒ4は水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基又は開始剤残基を表す。ここで、ａは１〜５の整数であり、Ｘは、一級、二級、三級アミン又は四級アンモニウム塩の内の１種類又は２種類以上を含むアミン化合物残基、又は、アミンでない化合物残基であることが好ましい。
【００２１】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、ｍは２０〜２，０００の整数であり、４０〜５００の整数であることが好ましく、より好ましくは４５〜３００の整数である。また、ｎは１〜２００の整数であり、２０〜１００の整数であることが好ましく、より好ましくは３０〜５０の整数である。
【００２２】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）における各繰り返し単位は、記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムな順で存在することができる。特に、ポリアミノ酸セグメント中における各繰り返し単位についてのみ、上記の通りランダムな順で存在し得ることが好ましい。
【００２３】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で示されるブロックコポリマーの分子量（Ｍｗ）は、限定はされないが、５，０００〜４０，０００であることが好ましく、より好ましくは８，０００〜２２，０００である。また、個々のセグメントについては、ＰＥＧセグメントの分子量（Ｍｗ）は、１，０００〜２０，０００であることが好ましく、より好ましくは２，０００〜１２，０００であり、ポリアミノ酸セグメントの分子量（Ｍｗ）は、全体で４，０００〜２０，０００であることが好ましく、より好ましくは６，０００〜１０，０００である。
【００２４】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で示されるブロックコポリマーの製造方法は、限定はされないが、例えば、Ｒ1a−又はＲ1b−とＰＥＧ鎖のブロック部分とを含むセグメント（ＰＥＧセグメント）を予め合成しておき、このＰＥＧセグメントの片末端（Ｒ1a−又はＲ1b−と反対の末端）に、所定のモノマーを順に重合し、その後必要に応じて側鎖をアニオン性基を含むように置換又は変換する方法、あるいは、上記ＰＥＧセグメントと、アニオン性基を含む側鎖を有するブロック部分とを予め合成しておき、これらを互いに連結する方法などが挙げられる。当該製法における各種反応の方法及び条件は、常法を考慮し適宜選択又は設定することができる。上記ＰＥＧセグメントは、例えば、特許文献１：ＷＯ９６／３２４３４号公報、特許文献２：ＷＯ９６／３３２３３号公報及び特許文献３：ＷＯ９７／０６２０２号公報等に記載のブロック共重合体のＰＥＧセグメント部分の製法を用いて調製することができる。
【００２５】
こうして形成されるＰＥＧセグメント部分とポリアミノ酸セグメント部分との結合は、一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示されるブロック共重合体の製造方法に応じて、適当な連結様式をもとり得、そして本発明の目的に沿う限り、どのような連結基で結合されていてもよい。製造方法は特に限定されるものではないが、一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）のポリマーを製造する場合の一方法として、末端にアミノ基を有するＰＥＧ誘導体を用いて、そのアミノ末端から、例えば、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート（ＢＬＡ）やγ−ベンジル−Ｌ−グルタメート等の保護アミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を開環重合させてブロック共重合体を合成し、その後側鎖ベンジル基を他のエステル基に変換するか、又は部分もしくは完全加水分解することにより目的のブロック共重合体を得る方法が挙げられる。この場合共重合体の構造は一般式（Ｉ）となり、連結基Ｌ１は用いたＰＥＧセグメントの末端構造に由来する構造となるが、好ましくは−（ＣＨ2）b−ＮＨ−である（ここで、ｂは１〜５の整数である。）。
【００２６】
また、ポリアミノ酸セグメント部分を合成してから、予め用意したＰＥＧセグメント部分と結合させる方法でも、本発明の共重合体は製造可能であり、この場合結果的に上記の方法で製造したものと同一の構造となることもあるが、一般式（ＩＩ）に対応する構造となることもあり、連結基Ｌ2は特に限定されるものではないが、好ましくは−（ＣＨ2）c−ＣＯ−である（ここで、ｃは１〜５の整数である。）。
【００２７】
本発明の親水性ポリマーには、薬剤が結合又は配位されうる。薬剤は、リンカーを介して又は直接親水性ポリマーに結合するか、又は親水性ポリマーに配位されうる。親水性ポリマーが式（Ｉ）又は（ＩＩ）のブロック共重合体である場合に、Ｒ2b及びＲ2dにおいて、薬剤が配位又は結合されうる。薬物に白金などの重金属が含まれる場合には、薬物の重金属に対して、アミノ酸側鎖のカルボキシ基のプロトンが遊離して形成したカルボキシレート基が配位する。薬物が直接結合される場合、アミノ酸側鎖のカルボキシ基、アミノ基、チオール基を介して結合されうる。薬物の任意の基を結合に用いることができるが、一例としてカルボキシ基、アミノ基、チオール基などを利用することができる。リンカーを介して結合する場合、リンカーＬ3は、本技術分野において使用される任意のリンカーを用いることができ、例えばＣ1-6アルキレンである。さらに別の態様では、ポリアミノ酸のカルボキシ基又はその誘導体に対しヒドラジンを反応させて、ヒドラジド基（この場合、Ｍは、−ＮＨ−ＮＨ2）を形成させ、ヒドラジド基を介してケトンを有する薬物と結合されてもよい。この場合リンカーＬは、ヒドラゾン結合となる。薬物とポリアミノ酸とを結合するリンカーは、所望の粒子を製造できる観点で、本技術分野に既知の任意のリンカーを用いることができる。
【００２８】
本発明の医薬組成物に含まれる治療薬は、任意の治療薬であってよい。特に妊婦において、必要とされる治療薬が挙げられ、一例として、抗がん剤、抗炎症薬、抗高血圧薬、向精神薬などを使用しうる。抗がん剤としては、胃、皮膚、喉頭、口内、咽頭、食道、消化器、すい臓、肺、脳、骨、骨髄、乳など任意の臓器における癌の治療用の抗癌剤が挙げられるが、特に妊婦においてかかりやすい乳癌の治療用の薬剤が挙げられる。
【００２９】
抗癌薬として使用される薬剤としては、白金製剤、アルキル化薬、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管阻害薬、内分泌治療薬などが使用されうる。白金製剤としては、ダハプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチンが挙げられる。白金製剤は、胎児への集積の検出が容易であり、製品開発の点で優れている。アルキル化薬としては、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ブスルファン、チオテパなどのナイトロジェンマスタード系、ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバジン、プロカルバシン、テモゾロマイド、カルムスチン、ストレプトゾトシン、ベンダムスチンなどのニトロソウレア系が挙げられる。代謝拮抗薬として、フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、ヒドロキシウレア、チオグアニン、フルダラビン、クラドリビン、シラタビン、ゲムシタビンなどが挙げられる。トポイソメラーゼ阻害薬としては、カンプトテシン、イリノテカン、ノギテカン、アントラサイクリン、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン、レボフロキサシン、シプロフロキサインなどが挙げられる。微小管重合阻害剤としては、ビンクリスチン、ビンデシン、パクリタキセル、ドセタキセルなどが挙げ荒れる。内分泌治療薬としては、アナストロゾール、エキセメスタン、タモキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、レトロゾールなどが挙げられる。特に妊婦に頻発する乳癌に対する治療薬として用いる観点から、内分泌治療薬などがあげられる。より安全性を高める観点から、胎児への影響が少ないことが実証されているドキソルビシン、シクロホスファミド、フルオロウラシルなどが使用されてもよい。
【００３０】
本発明の具体的な態様では、本発明は、ポリエチレングリコール・ポリアミノ酸ブロックコポリマーに配位されたダハプラチン誘導体ミセルを含む妊婦又は妊娠可能性のある女性に対し投与するための医薬組成物に関する。このダハプラチン誘導体ミセルでは、オキサリプラチンのオキサレート基が離脱した部分構造であるダハプラチンは、オキサレート基の代わりにポリアミノ酸（特にグルタミン酸又はアスパラギン酸）のカルボキシレート基に配位しており、ミセルサイズが、１０〜１００ｎｍ、好ましくは２０〜９０ｎｍ、より好ましくは２５〜７５ｎｍであることを特徴とする。このようなダハプラチン誘導体ミセルを含む医薬組成物は、作用薬剤であるダハプラチンが投与された場合には、妊婦又は妊娠可能性のある女性に対し禁忌となる用量及び用法で投与されうる。一例として、ダハプラチン誘導体ミセルは、９０〜１２０  ｍｇ／ｍ２で、週１回で、妊婦又は妊娠可能性のある女性に投与しうる。
【００３１】
抗炎症薬は、インドメタシン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン、ジクロフェナク、イブプロフェン、アセチルサリチル酸、セレコキシブ、エトドラク、メロキシカムなどの非ステロイド性抗炎症剤である。抗炎症薬を含む本発明の医薬組成物は、鎮痛解熱薬、関節リウマチの治療薬として使用しうるとともに、早産や流産の治療又は予防用途として使用しうる。インドメタシンなどは、炎症領域で作用することが所望されることから、炎症領域の低ｐＨに応答して放出されるように設計されうる。また、炎症部のマクロファージにより貪食されることで、マクロファージが有しているエステラーゼの作用により薬物が放出されるように設計されてもよい。また子宮内膜症のような炎症につながる疾患の治療薬、感染症に伴う炎症、免疫に伴う炎症の治療薬についても妊婦が罹患するする炎症の治療薬については、本書における抗炎症薬に含めることができる。
【００３２】
高血圧薬として、Ｃａ拮抗薬、ＡＲＢ、ＡＣＥ阻害薬、利尿薬、β遮断薬、α遮断薬、及びスタチン系高脂血症薬が挙げられる。Ｃａ拮抗薬としては、アムロジピン、ニフェジピン、ニカルジピン、ベニジピン、バルニジピン、ニトレンジピン、ニソルジピン、アゼルニジピン、マニジピン、エフォニジピン、シルニジピン、アラニジピンなどのジヒドロピリジン系の薬剤、ジルチアゼムなどのベンゾチアゼピン系の薬剤、ベラパミルなどのフェニルアルキルアミン系の薬剤が挙げられる。ＡＲＢとしては、バルサルタン、ロサルタン、カンデサルタン、イルベサルタン、アジルサルタンなどが挙げられる。ＡＣＥ阻害薬としては、イミダプリル、エナラプリル、デラプリル、シラザプリル、キナプリル、テモカプリル、ペリンドプリル、リシノプリル、トランドラプリルなどが挙げられる。利尿薬としてはトリクロロメチアジド、ヒドロクロロチアジド、フロセミド、トラセミド、アゾセミド、スピロノラクトン、トリアムテレン、エプレレノンなどが挙げられる。β遮断薬としては、アテノロール、ビソプロロール、ベタキソロール、メトプロロール、プロプラノロール、ナドロール、ニプラジロール、カルテオロール、ビンドロール、アモスラロール、アロチノロール、カルベジロール、ラベタロール、ベバントロールなどが挙げられる。α遮断薬としては、ウラビジル、テラゾシン、プラゾシン、ドキサゾシン、ブナゾシンなどが挙げられる。スタチン系薬剤としては、シンバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、アトルバスタチンなどが挙げられる。スタチン系薬剤を包含する本発明の医薬組成物は、抗高血圧薬、抗高脂血症薬、妊娠高血圧症治療又は予防薬として使用しうる。スタチン系薬剤は、主に肝臓においてコレステロール合成を阻害することから、肝臓において作用するように設計することが好ましい。
【００３３】
本発明の別の態様では、本発明は、ポリエチレングリコール・ポリアミノ酸ブロック共重合体に結合された薬物、及び当該ブロック共重合体から形成されるミセルに関する。ここで、ポリエチレングリコール・ポリアミノ酸ブロック共重合体は、本明細書中で定義される式（Ｉ）又は（ＩＩ）のポリエチレングリコール・ポリアミノ酸ブロック共重合体である。ポリエチレングリコール・ポリアミノ酸ブロック共重合体に結合された薬物としては、上述の任意の薬物が使用されうるが、特に、インドメタシン及びシンバスタチンである。
【００３４】
治療薬がインドメタシンである場合、インドメタシンは、上述のブロック共重合体のＲ2b及びＲ2dにおいて、リンカーＬ3を介して結合され、インドメタシンのカルボキシル基がリンカーＬ3に結合される。一例として、Ｒ2b及びＲ2dはアスパラギン酸側鎖又はグルタミン側鎖であり、その場合の化学式を下記に示す：
【化５】
2020209379.tif 000007
（式中、Ｒ1a、Ｒ1b、Ｒ3、Ｒ4、ｍ、ｎ、ｂは、本明細書中に定義された通りであり、
ｃは１又は２であり、Ｌ3は、Ｃ1−Ｃ6アルキレンを表す）
本発明に係るインドメタシン結合ブロック共重合体は、水中で自己組織化し、ミセルを形成することができる。
【００３５】
ミセル内で架橋を形成する観点から、架橋のために一部の薬剤結合部分にフランが導入されていてもよい。架橋部のフルフリル基は、さらにビスマレイミドなどの架橋剤を作用されることで、ミセル形成にあたり架橋を形成することができる。治療薬がインドメタシンであり、フルフリル基が導入された本発明の化合物は、一例として下記の構造を有する：
【化６】
2020209379.tif 000008
（式中、
Ｒ1a、Ｒ3、Ｒ4、ｍ、ｎ、ｂは、本明細書において既に定義された通りであり、
ｋは、導入される架橋の数を表し、ｋは、０〜１９９の整数であり、
ｃは１又は２であり、Ｌ3は、Ｃ1−Ｃ6アルキレンを表す。）。また本発明の別の態様では、フルフリル基が導入された本発明の化合物をミセル化し、１，１−（メチレンジ−４，１−フェニレン）ビスマレイミド（BMI）の添加により架橋されたミセルに関してもよい。
【００３６】
治療薬がシンバスタチンである場合、シンバスタチンは、アミノ酸の側鎖のカルボキシ基に直接エステル結合により結合されうる。シンバスタチン結合ブロック共重合体は、一例として下記のとおりである：
【化７】
2020209379.tif 000009
（式中、
Ｒ1a、Ｒ3、Ｒ4、ｍ、ｎ、ｂは、本明細書において既に定義された通りであり、
ｃは１又は２である）。
本発明の別の態様は、本発明に係るシンバスタチン結合ブロック共重合体を水中で自己組織化して形成させたミセルに関する。
【００３７】
本発明は、治療薬が結合又は配位されたポリエチレングリコール−ポリアミノ酸ブロック共重合体を含むミセルの製造方法にも関する。このミセルは、治療薬が結合又は配位されたポリエチレングリコール−ポリアミノ酸ブロック共重合体から主に構成されるが、所望のサイズを達成することができれば、他の任意の成分が含まれてもよい。本発明のミセルの製造方法は、具体的に、以下の：
治療薬が結合又は配位されたポリエチレングリコール−ポリアミノ酸ブロック共重合体を、水中で再構成する工程、及び、
分画分子量１０，０００〜１００，０００透析膜を用いて限外ろ過を行って、２０〜１００ｎｍの粒径を有するミセルを取得する工程、
を含む。さらに膜サイズ０．１５〜０．３のフィルターを通して精製する工程を含んでもよい。ミセルのサイズは、動的散乱法を用いることにより測定することができる。
【００３８】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例】
【００３９】
実施例１：サイズの異なる高分子ミセルを用いた胎盤および胎児に対する集積性の評価
この実施例では、サイズの異なる高分子ミセルおよび低分子化合物の胎盤および胎児への集積性を、妊娠モデルマウスを用いた蛍光分析、元素分析および質量分析により評価した。【００４０】
ダハプラチン内包ミセルの調製
蛍光標識された２種類（粒径３０ｎｍ及び７０ｎｍ、粒径３０ｎｍのミセルはＡｌｅｘａ−５５５標識、粒径７０ｎｍのミセルはＡｌｅｘａ６４７標識）のダハプラチン内包ミセルを調製した(非特許文献２：H. Cabral et. al., Nat. Nanotech. 6 (2011) 815-823)。【００４１】
妊娠モデルマウスへの投与
妊娠後１４日目のマウスに２種類のダハプラチン内包ミセル（粒径３０ｎｍ及び７０ｎｍ）の混合溶液を投与した。投与４８時間後に胎盤と胎児と摘出し、凍結サンプルを調製した。その後、凍結切片（厚さ：１０ｍｍ）を作製し、ヘキストにより核染色を行った。ヘキスト由来の蛍光（図１Ａ）、及びミセルの標識（Ａｌｅｘａ  ５５５及びＡｌｅｘａ６４７）由来の蛍光（図１Ｂ及びＣ）を測定した。次いで、ダハプラチン内包ミセル（粒径３０ｎｍ）が投与された妊娠マウスから取得された胎児の凍結切片中における白金、鉄、カリウム、カルシウムの分布をシンクロトロン（Ｓｐｒｉｎｇ−８）により測定した（図２）。図１の結果から、２種類のダハプラチン内包ミセル（粒径３０ｎｍ及び７０ｎｍ）が胎児（Ｆ）に集積していないことが確認された。粒径３０ｎｍのダハプラチン内包ミセルでは、胎児（Ｆ）への集積は見られなかったものの、胎盤の胎児側のラビリンス（labyrinth）（Ｌ）層までミセルの集積がみられた。粒径７０ｎｍのダハプラチン内包ミセルでは、胎盤の母体側の脱落膜（dedidua)（Ｄ）層までの集積がみられたが、Ｄ層とＬ層の間にある海綿状栄養膜細胞（spongiotrophoblast)（Ｓ）層への集積は見られなかった。この結果より、薬剤のサイズを精密に設計することにより胎盤内分布を制御できることが示された。図２のからは、ダハプラチン由来の白金元素が胎児内に見られないことから、薬剤のサイズを３０ｎｍ以上にすることにより胎盤の通過が抑制されたことが示された。【００４２】
妊娠後１４日目に２種類のダハプラチン内包ミセル（粒径３０ｎｍ及び７０ｎｍ）、およびダハプラチンの活性体であるオキサリプラチン（８ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ投与した。投与４８時間後に胎盤と胎児と摘出し、摘出後の胎盤と胎児に１ｍＬのｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Promega, USA）を添加し、ホモジェナイズ後に誘導結合プラズモン質量分析により組織内の白金元素を定量した（図３：胎児、図４：胎盤）。図３の結果から、オキサリプラチンを投与された妊娠マウスの胎児において、ダハプラチン内包ミセルを投与された妊娠マウスの胎児と比較して、白金の胎児への集積性が有意に高く、粒子サイズを３０ｎｍ以上にすることにより粒子の胎盤通過が抑制されたことが示された。図４の結果から、オキサリプラチンを投与された妊娠マウスの胎児と、ダハプラチン内包ミセル（粒径３０ｎｍ及び７０ｎｍ）を投与された妊娠マウスの胎児とにおいて、白金の胎盤への集積がみられたが、オキサリプラチン投与群と比較して、粒径３０ｎｍのミセルの投与群で集積が低下し、さらに粒径７０ｎｍのミセルの投与群で低下した。このことから、薬剤のサイズを精密に設計することにより胎盤への集積性を制御できることが示された。【００４３】
実施例２−１：ヒト胎盤に対する透過性の評価
この実施例では、サイズの異なる高分子ミセルおよび低分子化合物、ポリマーのヒト胎盤における透過性を、ヒト胎盤灌流モデルを用いて評価した。【００４４】
薬剤の調製
実施例１のダハプラチン内包ミセルの調製に従い、蛍光標識された粒径３０ｎｍ及び７０ｎｍのダハプラチン内包ミセルを調製した。末端にアジド基を有する８分岐ＰＥＧ（分子量：４０ｋＤａ、１０ｎｍサイズ（動的光散乱法）、２０ｍｇ、０．５０μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．０ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、Ｃｙ３−ＤＢＣＯ（７．０ｍｇ、６．０μｍｏｌ）を添加し−２０°Ｃで一晩反応させた。その後、純水に対する透析（ＭＷＣＯ：６，０００−８，０００）および凍結乾燥によりＣｙ３標識８ａｒｍＰＥＧを得た。【００４５】
ヒト胎盤灌流モデルについては非特許文献３（K. Shintaku et. al., Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 962） 非特許文献４（J. R. Huston et. al., Clin. Pharmacol. Ther. 90 (2011) 67)に従い作製した。具体的には、東大病院の産婦人科から提供されたヒト胎盤の母体側にニードル（１８ゲージ）を、胎児側の静脈と動脈にそれぞれニードル（１８ゲージ）を導入し、非特許文献５（M. Nagai et. al., Drug Metab. Dispos. 41 (2013) 2124)に従い作製したKrebs-Ringer炭酸バッファーを３７°Ｃで３０分間灌流した（母体側の流速：１５ｍＬ／ｍｉｎ、胎児側の流速：３ｍｌ／ｍｉｎ）。ここで、バッファーは過酸化水素水と塩化鉄の酸化還元反応により生成した酸素により飽和させた。その後、ダハプラチン内包ミセル（粒径３０ｎｍ及び７０ｎｍ）（ダハプラチンの投与量：８５．４ｍｇ／Ｌ）、オキサリプラチン（２．７ｍｇ／Ｌ）およびＣｙ３標識８ａｒｍＰＥＧ（蛍光強度：３，０００（ＲＦＵ））を６０分間灌流し、胎児側の静脈からの溶液を５分ごとに１  ｍＬずつ回収した。オキサリプラチンおよびダハプラチン内包ミセル投与群については回収したサンプル中の白金含有量を誘導結合プラズモン質量分析により測定した。ポリマーについては、蛍光強度をＨＰＬＣ法により定量した。各薬剤の投与量に対する透過量の割合を算出して図５に示した。また、オキサリプラチンおよびダハプラチン内包ミセル投与群については、実験後、胎盤に９０％硝酸水溶液を２ｍＬ添加し、１％硝酸水溶液２ｍＬに溶解し、胎盤中の白金含有量を誘導結合プラズモン質量分析により定量した。得られた白金含有量については胎盤の質量により規格化した（図６）。図５の結果から、オキサリプラチンは胎盤を透過したが、ダハプラチン内包ミセル（粒径３０ｎｍ及び７０ｎｍ）はともに胎盤を透過しなかったことから、薬剤のサイズを３０ｎｍ以上にすることにより胎盤の透過が抑制されたことが示唆された。また、８‐ａｒｍＰＥＧにおいて、オキサリプラチンに比較して低下しているものの、胎盤の透過が見られたことから、薬剤のサイズに関して１０ｎｍから３０ｎｍの間に閾値が存在することが示唆された。図６の結果より、オキサリプラチンが胎盤に集積しミセルが胎盤に集積しなかったことから、マウスとヒトの胎盤構造の違いによりミセルの胎盤への集積が抑制されたことが示された。その結果、薬剤のサイズを３０ｎｍ以上にすることにより胎盤への集積および透過を抑制できることが確認された。【００４６】
実施例２−２：ヒト胎盤に対する透過性の評価
胎盤を通過する物質の大きさを同定するために、ＰＥＧ被覆金ナノ粒子（ＮＰ）の１０、２０、及び３０ｎｍ（5 mL, Nanocs, Inc., USA）を用いて、実施例２−１と同様にｅｘ  ｖｉｖｏヒト胎盤潅流実験を行った。１０ｎｍ金ＮＰを潅流すると、胎児側からの金ナノ粒子の検出量は時間依存的に増加し、６０分後に投与量の４．５８％に達した。また、２０ｎｍのＧｏｌｄ  ＮＰを潅流した場合、胎児側からの検出線量は２．２１％であった。一方、３０ｎｍのＧｏｌｄナノ粒子を潅流した場合、胎児側からの検出線量は６０分後に投与線量の０．０５％であった。結果を図５Ｂに示す。これらの結果は、材料が胎盤を通過するために２０ｎｍから３０ｎｍの間のサイズのカットオフがあり得ることを示唆する。【００４７】
実施例３：早産治療に向けたインドメタシン内包ミセルの調製
この実施例では、インドメタシン内包ミセルの構築に向けて、ブロック共重合体の合成およびミセルの調製を行った。
実験方法
既報(非特許文献６：M. Yokoyama et. al., Makromol. Chem. 190 (1989) 2041-2054)に従い、ＰＥＧ（分子量：１２，０００Ｄａ）の一級アミンを開始剤とするＮＣＡ重合法によりＰＥＧ−ｐｏｌｙ（β−ｂｅｎｚｙｌ−Ｌ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）（ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）を合成した。その後、下記のスキームに従い４−アミノ−１−ブタノールおよび２−アミノメチルフランとＰＢＬＡ鎖とのアミノリシス反応によりＰＥＧ−ｐｏｌｙ（Ａｓｐ−Ｆｕｒａｎ−ＯＨ）（ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ｆｕｒａｎ−ＯＨ））を合成した。
【化８】
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【００４８】
具体的には、ＰＥＧ−ＰＢＬＡをベンゼン凍結乾燥法により脱水し、蒸留したＤＭＦ（１００ｍｇ／ｍＬ）に溶解した。その後、蒸留した４−アミノ−１−ブタノールおよび２−アミノメチルフランをＰＢＬＡ鎖に対して２当量添加し、室温で６時間反応した。反応後、反応溶液を過剰量のジエチルエーテルに添加し、ポリマーを得た。次に、ポリマー中のヒドロキシル基をインドメタシンのエステル化によりポリマーへのインドメタシンの導入を行った。具体的には、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）およびインドメタシンを混合し（ＤＭＡＰ／ＷＳＣ／インドメタシン＝２：３：１（質量比））、ＤＭＦ（１ｍｇ／ｍＬ）に溶解した。その後、溶液をインドメタシンとＰＢＬＡ鎖のモル比が４になるようにＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ｆｕｒａｎ−ＯＨ）に加え、室温で１晩反応した。その後、反応溶液を過剰量のジエチルエーテルに添加し、ポリマーを得た。得られたポリマーの組成については1Ｈ−ＮＭＲにより測定した。1Ｈ−ＮＭＲより４−アミノ−１−ブタノールの導入率が８０％、２−アミノメチルフランの導入率が２０％であることが確認された。【００４９】
インドメタシン内包ミセルについては透析法により調製した。ポリマーをＤＭＳＯ（２、７、１４ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、純水に対して透析（ＭＷＣＯ：３，５００Ｄａ）し、フィルター（０．２２μｍ）により精製した。その後、１，１−（メチレンジ−４，１−フェニレン）ビスマレイミド（ＢＭＩ）をミセル溶液に添加し、５０°Ｃで２日間反応した。反応後に限外ろ過法（ＭＷＣＯ：１００，０００Ｄａ）およびフィルター（０．２２μｍ）により精製した。調製したミセルのサイズおよび多分散度（ＰＤＩ）を動的光散乱法（ＤＬＳ）により測定した。
【表１】
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図7より、ＰＡｓｐ鎖の重合度が３２、インドメタシンの導入量が１６（／ｐｏｌｙｍｅｒ）、フランの導入量が６（／ｐｏｌｙｍｅｒ）であることが確認された。ＤＬＳ測定より、２、７、１４ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度で調製したミセルがそれぞれ４１ｎｍ（ＰＤＩ：０．０９）、３７ｎｍ（ＰＤＩ：０．０４）、３９ｎｍ（ＰＤＩ：０．０４）サイズであることが確認され、ミセル調製時のポリマー濃度がミセルのサイズに大きな影響を与えないことが示唆された。また、表１よりＢＭＩ架橋後のサイズが４０ｎｍであったことから、架橋前後でサイズが変化しないことを確認した。【００５０】
実施例４：インドメタシン内包ミセルの安定性試験
この実施例では、インドメタシン内包ミセルの安定性の指標として、界面活性剤の添加後のミセルの散乱光強度、および生理塩条件とエンドソーム内ｐＨ条件下でのインドメタシン放出量を測定した。
実験方法
界面活性剤の１つであるドデシルスルホン酸ナトリウム（ＳＤＳ）をミセル溶液に添加することにより安定性の指標とした。具体的には、ＳＤＳ（２０ｇ）を純水（８０ｍＬ）に溶解し６５°Ｃで撹拌した。その後、ＳＤＳ溶液に純水（１００ｍＬ）を添加し、２０％ＳＤＳ水溶液とした。調製した２０％ＳＤＳ水溶液（１０μＬ）をミセル溶液（７０μＬ）に添加し、撹拌後にＤＬＳによりサイズ、多分散度および散乱光強度（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｏｕｎｔ  ｒａｔｅ  （ＤＣＲ））を測定した。
また、生理塩条件およびエンドソーム内ｐＨ条件下でのインドメタシン放出量を測定することにより安定性の指標とした。具体的には、インドメタシン内包ミセルを純水に対して透析（ＭＷＣＯ：３,５００Ｄａ）し、透析後のサンプル内のインドメタシン量をＨＰＬＣ法により測定した。
【表２】
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【００５１】
表２より、ＢＭＩ架橋前のミセル（ＮＣＬ）がＳＤＳ添加により散乱光強度が減少した一方で、架橋後のミセル（ＣＬ）がＳＤＳ添加後も散乱光強度が減少しなかったことから、架橋によりミセルの安定性が向上したことが示唆された。また、図８より、血中ｐＨ（ｐＨ７．４）およびエンドソームｐＨ（ｐＨ５．３）においてインドメタシンの放出がみられなかったことから、血中およびエンドソーム内においてインドメタシンを安定に内包できることが示唆された。【００５２】
実施例５：マクロファージ内におけるインドメタシンの放出試験
この実施例では、インドメタシン内包ミセルからのインドメタシンの放出を、マクロファージ細胞内におけるインドメタシン量を測定することにより評価した。【００５３】
実験方法
マクロファージ細胞（ＲＡＷ２４６．７細胞）の培養については、細胞培養用６ウェルプレートに２００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で細胞を播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有ＤＭＥＭ内で２４時間培養した。その後、実施例４で作成されたインドメタシン内包ミセル（インドメタシン量：０．５ｍｇ／ｍＬ：ミセル径：約４０ｎｍ、架橋有）とインドメタシン単体（０．５ｍｇ／ｍＬ）をそれぞれ添加し、２４、４８、７２時間後に細胞をＰＢＳにより洗浄し、２％ＳＤＳ（１ｍＬ）を添加し細胞懸濁液を作製した。溶液中のインドメタシン量をＨＰＬＣ法により測定した（図９）。図９より、インドメタシン内包ミセル（ＣＬ）からのインドメタシン放出量がインドメタシン単体（ＦＤ）の取り込み量と同程度であることから、マクロファージ内のエステル分解酵素によるミセル内のエステル結合の開裂、その結果としての効率的なインドメタシンの放出が示唆された。【００５４】
実施例６：インドメタシン内包高分子ミセルを用いたヒト胎盤に対する透過性の評価
この実施例では、サイズの異なる高分子ミセルおよび低分子化合物、ポリマーのヒト胎盤における透過性を、ヒト胎盤灌流モデルを用いて評価した。【００５５】
実験方法
ヒト胎盤灌流モデルについては非特許文献３(K. Shintaku et. al., Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 962）非特許文献４（J. R. Huston et. al., Clin. Pharmacol. Ther. 90 (2011) 67)に従い作製した。具体的には、東大病院の産婦人科から提供されたヒト胎盤の母体側にニードル（１８ゲージ）を、胎児側の静脈と動脈にそれぞれニードル（１８ゲージ）を導入し、非特許文献５(M. Nagai et. al., Drug Metab. Dispos. 41 (2013) 2124)に従い作製したＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ炭酸バッファーを３７°Ｃで３０分間灌流した（母体側の流速：１５ｍＬ／ｍｉｎ、胎児側の流速：３ｍｌ／ｍｉｎ）。ここで、バッファーは過酸化水素水と塩化鉄の酸化還元反応により生成した酸素により飽和させた。その後、実施例４で作成されたインドメタシン内包ミセル（インドメタシン量：２ｍｇ／Ｌ：ミセル径：約４０ｎｍ、架橋有）とインドメタシン単体（２ｍｇ／Ｌ）を６０分間灌流し、胎児側の静脈からの溶液を５分ごとに回収した。回収したサンプル中のインドメタシン量をＨＰＬＣ法により定量した（図１０）。インドメタシン（ＩＮＤ）を還流させた場合、６０分後の通過率は１７．６％であった（ｎ＝３）。一方、インドメタシン内包ミセル（ＩＮＤ／ｍ）を還流させた場合、６０分後の通過率は０．０３％であった（ｎ＝３）（ｐ＜０．０５）。図１０の結果より、インドメタシン単体が胎盤を透過したがミセルが胎盤を透過しなかったことから、薬剤のサイズを３０ｎｍ以上にすることにより、薬剤のヒト胎盤の通過が抑制されたことが示唆された。【００５６】
実施例６‐２：インドメタシン内包高分子ミセルの組織移行性の評価
妊娠１８日及び１９日目の朝に、蛍光標識インドメタシンミセル（IND用量／kgとして１０ｍｇ）を妊娠マウスの尾静脈から投与した。１時間後、４時間後、８時間後、及び２４時間後に、マウスを安楽死させ、脳、肺、心臓、肝臓、脾臓、膵臓、両腎臓、胎児、臍帯、胎盤、羊膜、子宮体部、子宮頸部、大腿筋、大腿骨を回収し、そしてＩＶＩＳイメージングシステムを用いて薬剤分布を評価した。図１１Ａは、回収された臓器の配置位置を示す。図１１Ｂ〜Ｅは、投与の１時間後、４時間後、８時間後、及び２４時間後における蛍光を示す。これらの実験により、インドメタシンミセルが、肝臓、腎臓、脾臓、子宮体、及び胎盤に分布し、そして各時点で胎児には到達していないことが示された。【００５７】
実施例６‐３：インドメタシン内包高分子ミセルの組織移行性の評価
妊娠１８日及び１９日目の朝に、インドメタシン（IND用量／kgとして１ｍｇ）及びを妊娠マウスの尾静脈から投与した。１時間後、４時間後、８時間後、及び２４時間後に、マウスを安楽死させ、胎児、胎盤、子宮体部、子宮、腎臓、肝臓及び脾臓を回収した。サンプルをホモジナイズし、そして組織中のインドメタシン濃度をＨＰＬＣにより計測した。インドメタシンミセル投与群では、組織中における遊離インドメタシンと、ミセル状態のインドメタシンを合計量として検出した。なぜなら、インドメタシンミセルはホモジナイズするために水酸化ナトリウムを使用した場合に分解するからである。遊離インドメタシン群では、２４時間後に母体への投与量の０．５７％が胎児から検出され、これが最大値であった。一方、インドメタシンミセル群では、母体への投与量の０．０１３％のみが胎児に分布し、これも２４時間後が最大値であった。したがって、インドメタシンミセル投与は、遊離インドメタシン投与に比較して、（Ｅ）胎児への分布量を有意に低下させ（ｐ＜０．０５）、そしてこれによりインドメタシンミセルが、マウスの胎盤を通過しないことが示された。さらに、（Ａ）腎臓、（Ｂ）肝臓、（Ｃ）脾臓、及び（Ｄ）胎盤などの臓器では、２４時間内で検出されたインドメタシン量は、臓器ダメージを引き起こすほどの量ではなかった（図１２Ａ〜Ｅ）。【００５８】
実施例７：早産モデルマウスを用いたインドメタシン内包ミセルの治療効果
この実施例では、インドメタシン内包ミセルによる早産抑制効果および毒性を、早産モデルマウスを用いて評価した。【００５９】
実験方法
早産モデルマウスは既報 (L. L. Reznikov et. al., Biol. Reprod. 60 (1999) 1231-1238)に従い、リポ多糖 (LPS)を子宮頸管に投与する方法により作成した。具体的には、妊娠１５日目にＬＰＳ（３μｇ／ｍｏｕｓｅ）をマウス経口投与用のソフトチューブを介して膣内腔に投与した。
その後、妊娠１５、１６、１７、１８日目にインドメタシン内包ミセル（１０ｍｇ／ｋｇ:ミセル径：約４０ｎｍ、架橋有/無）とインドメタシン単体（１ｍｇ／ｋｇ）と投与し、妊娠１９日目までの分娩を早産とした。また、妊娠１９日目に開腹し、胎児の生存率を測定した。結果を図１３に示す。【００６０】
【表３】
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【００６１】
表３より、ミセルおよびインドメタシン単体の投与により早産マウスの数が減少したことから、子宮頸管におけるインドメタシンによる炎症の抑制が示唆された。また、ミセルの投与により胎児の生存率が増加したことから、薬物のサイズの増加により胎児への集積量が減少したことが示唆された。【００６２】
実施例８：妊娠高血圧の治療に向けた、シンバスタチン内包ミセルの調製
この実施例では、妊娠高血圧の治療に向けて、ブロック共重合体へのシンバスタチンの導入およびミセルの調製を行った。【００６３】
実験方法
非特許文献７ (A. Harada and K. Kataoka, Macromolecules 28 (1995) 5294-5299)に従い、PEG (分子量: 12,000 Da)の一級アミンを開始剤とするＮＣＡ重合法によりＰＥＧ−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパラテート）（ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）を合成し、側鎖構造のベンジル基を脱保護することによりPEG-poly(L-aspartate) (PEG-PAsp)を合成した。下記のスキームの通り、PEG-PAspのカルボキシル基とシンバスタチンのヒドロキシル基のエステル化によりポリマーへのシンバスタチンの導入を行った。
【化９】
2020209379.tif 000014
ＰＥＧ−ＰＡｓｐをＤＭＦ（１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、ＰＡｓｐ鎖のカルボキシル基に対して１０当量のＤＭＡＰ、ＥＤＣおよびシンバスタチンを添加し、室温で２４時間反応した。その後、反応溶液を過剰量のジエチルエーテルに添加し、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）を得た。1Ｈ−ＮＭＲよりシンバスタチンの導入量は１．２ｍｇ／（ｍｇ  ｐｏｌｙｍｅｒ）であった。【００６４】
シンバスタチン内包ミセルについては透析法により調製した。ポリマーをＤＭＡｃ（１ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、純水に対して透析（ＭＷＣＯ：３，５００Ｄａ）し、フィルター（０．２２μｍ）により精製した。調製したミセルのサイズおよび多分散度（ＰＤＩ）を動的光散乱法（ＤＬＳ）により測定した。【００６５】
結果
１Ｈ−ＮＭＲよりシンバスタチンの導入量は１．２ｍｇ／（ｍｇ  ｐｏｌｙｍｅｒ）であった。また、ＤＬＳ測定よりサイズが３５ｎｍ、ＰＤＩが０．２３のミセルが得られたことが確認された。【００６６】
実施例９：妊娠高血圧モデルマウスを用いたシンバスタチン内包ミセルの治療効果および毒性試験
この実施例では、シンバスタチン内包ミセルによる降圧効果および毒性を、妊娠高血圧モデルマウスを用いて評価した。【００６７】
実験方法
妊娠高血圧モデルマウスは既報 (C. C. Zhou et. al., Nat. Med. 14 (2008) 855-862)に従い、アンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）を投与する方法により作成した。具体的には、妊娠１０日目から１７日目まで、妊娠マウスに皮下ポンプ（流速：１．０μＬ／ｈ）を介してＡｎｇＩＩ（１．５ｇ／ｋｇ）を投与し、高血圧のモデルとした。【００６８】
妊娠１０日目から１７日目にシンバスタチン内包ミセル（２０μｇ／ｋｇ：Simvastain Micelle）とシンバスタチン単体（２０μｇ／ｋｇ：Simvastatin）、プラバスタチン（２０μｇ／ｋｇ：Plavastatin）と投与し、薬剤非投与群（ＮＳ）と比較して、母体における血圧、尿タンパク量および胎児の体重を評価した。血圧については妊娠１０、１３、１５、１７日目に血圧計により評価した（図１４）。胎児の体重（ＦＢＷ（ｇ））については妊娠１７日目に胎児を摘出し、その体重を測定した（図１５）。尿タンパク質については妊娠１０、１１、１６、１７日目の尿中のアルブミン量を測定した（図１６）。【００６９】
結果
図１４より、薬剤投与群において未投与群よりも血圧が低下していることから、スタチン製剤による血圧低下が確認された。また、シンバスタチン内包ミセル群においてＡｎｇ  ＩＩ投与前と同程度の血圧を示したことから、ミセル内のエステル結合の開裂、その結果としての薬剤の徐放性の効果が示唆された。図１５より、シンバスタチン内包ミセル群（AngiI-Simvastatin Micelle）において胎児の体重がＡｎｇ  ＩＩ未投与群（NS-NS）と同程度であったことから、高血圧の解消による胎盤機能の改善が示唆され、ミセル化によるサイズの増大、その結果としての胎児への集積量の減少も示唆された。図１６より、シンバスタチン内包ミセル群において尿中アルブミン量の増加が抑制されたことから、高血圧の解消による腎機能の改善が示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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