(57)【要約】  本発明は、（１）角層と顆粒層とを有する三次元培養表皮に、膜環境感受性色素を添加して培養する工程；（２）前記三次元培養表皮へ、前記膜環境感受性色素に対する励起波長を照射し、前記膜環境感受性色素から発光されるゲル相ピーク波長の蛍光強度及び液晶相ピーク波長の蛍光強度を順次検出する工程；（３）流動度（ＧＰ）を算出し、前記流動度（ＧＰ）をプロットして流動度分布を作成し、第１極大値を決定する工程；及び（４）皮膚バリア機能値を決定する工程、を含む皮膚バリア機能を評価する方法を提供する。また、本発明は皮膚バリア機能の程度を可視化する方法も提供する。
2019172452.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚バリア機能を評価する方法であって、
（１）角層と顆粒層とを有する三次元培養表皮に、膜環境感受性色素を添加して培養する工程；
（２）前記三次元培養表皮へ、前記膜環境感受性色素に対する励起波長を照射し、前記三次元培養表皮の最下層と平行な面における前記膜環境感受性色素から発光されるゲル相ピーク波長の蛍光強度（ＩLβ）及び液晶相ピーク波長の蛍光強度（ＩPβ）を、前記三次元培養表皮の最下層から最上層又は最上層から最下層に向かって、任意の間隔で、順次検出する工程；
（３）各前記面における前記ゲル相ピーク波長の蛍光強度（ＩLβ）及び前記液晶相ピーク波長の蛍光強度（ＩPβ）から流動度（ＧＰ）を算出し、前記最下層から前記最上層又は前記最上層から前記最下層に向かって前記流動度（ＧＰ）をプロットして流動度分布を作成し、第１極大値を決定する工程；及び
（４）前記第１極大値に隣接する第１極小値、又は前記第１極大値を含む面よりも上層の任意の面の流動度（ＧＰ）を皮膚バリア機能値として決定する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記工程（１）において、対象物質を添加又は塗布する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（１）において陰性対象物質を添加又は塗布した場合の、前記工程（４）において決定された前記皮膚バリア機能値と、
前記工程（１）において対象物質を添加又は塗布した場合の、前記工程（４）において決定された前記皮膚バリア機能値と、を比較することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１極大値は、前記角層と前記顆粒層との境界付近における、最も高い値の前記流動度（ＧＰ）として定義される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記流動度（ＧＰ）が、以下：
【数１】
2019172452.tif 000007
により算出される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記膜環境感受性色素が、Ｌａｕｒｄａｎである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ゲル相ピーク波長が４４０ｎｍであって、液晶相ピーク波長が４９０ｎｍである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（１）において、さらに細胞質染色色素を添加する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
各前記面が、前記顆粒層の任意の１細胞の任意の断面と同一面積である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
皮膚バリア機能の程度を可視化する方法であって、
（１）角層と顆粒層とを有する三次元培養表皮に、膜環境感受性色素を添加して培養する工程；
（２）前記三次元培養表皮へ、前記膜環境感受性色素に対する励起波長を照射し、前記三次元培養表皮の最下層と平行な面における前記膜環境感受性色素から発光されるゲル相ピーク波長の蛍光及び液晶相ピーク波長の蛍光を、前記三次元培養表皮の最下層から最上層又は最上層から最下層に向かって、任意の間隔で、順次検出する工程；及び
（３）各前記面において、検出された前記ゲル相ピーク波長の蛍光及び前記液晶相ピーク波長の蛍光を任意の色彩でそれぞれ描画し、マージした画像を出力する工程、
を含む、方法。
【請求項１１】
前記工程（１）において、対象物質を添加又は塗布する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（１）において陰性対象物質を添加又は塗布した場合の、前記工程（3）で得られる画像と、
前記工程（１）において対象物質を添加又は塗布した場合の、前記工程（３）で得られる画像と、を比較することを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記膜環境感受性色素が、Ｌａｕｒｄａｎである、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ゲル相ピーク波長が４４０ｎｍであって、液晶相ピーク波長が４９０ｎｍである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
皮膚バリア機能の程度を可視化する方法であって、
（１）角層と顆粒層とを有する三次元培養表皮に、膜環境感受性色素を添加して培養する工程；
（２）前記三次元培養表皮へ、前記膜環境感受性色素に対する励起波長を照射し、前記三次元培養表皮の最下層と平行な面における前記膜環境感受性色素から発光されるゲル相ピーク波長の蛍光強度（ＩLβ）及び液晶相ピーク波長の蛍光強度（ＩPβ）を、前記三次元培養表皮の最下層から最上層又は最上層から最下層に向かって、任意の間隔で、順次検出する工程；及び
（３）各前記面において、検出された前記ゲル相ピーク波長の蛍光強度（ＩLβ）及び前記液晶相ピーク波長の蛍光強度（ＩPβ）から任意のピクセル毎に流動度（ＧＰ）を算出し、前記流動度（ＧＰ）を任意の色彩の濃淡又はグラデーションとして前記ピクセル毎に描画し、画像として出力する工程、
を含む、方法。
【請求項１６】
前記工程（１）において、対象物質を添加又は塗布する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程（１）において陰性対象物質を添加又は塗布した場合の、前記工程（３）で得られる画像と、
前記工程（１）において対象物質を添加又は塗布した場合の、前記工程（３）で得られる画像と、を比較することを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記流動度（ＧＰ）が、以下：
【数２】
2019172452.tif 000008
により算出される、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記膜環境感受性色素が、Ｌａｕｒｄａｎである、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ゲル相ピーク波長が４４０ｎｍであって、液晶相ピーク波長が４９０ｎｍである、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚バリア機能を評価する方法及び皮膚バリア機能の程度を可視化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は生体内と生体外の環境を分ける体表を覆う器官である。皮膚は、物理的なバリアとして働くことによって、乾燥や有害物質が生体内へ侵入することを防止し、生命の維持に不可欠な役割を果たしている。【０００３】
高等脊椎動物の皮膚は、最外層から大別すると表皮、真皮、皮下組織の層から形成されている。表皮は、主にケラチノサイトと呼ばれる細胞から構成されており、表皮の最深部（基底層）でケラチノサイトが分裂しながら、上層に向かって有棘層、顆粒層、そして角層へと分化しながら表面へと移動し、やがて垢となって脱落する。このサイクルはヒトの場合概ね４週間で行われる。【０００４】
皮膚のバリア機能を維持させることは生命の維持に不可欠であり、加齢や損傷などによって低下したバリア機能を向上させる物質や方法の探索が行われている。皮膚のバリア機能を回復させる物質として、例えば、キシリトール、エリスリトール、リブロース、プシコース、ガラクトース、マンニトール及びフルクトースなどの物質が知られている（例えば、特許文献１及び非特許文献１）。【０００５】
皮膚の機能を解析するために、表皮構造及びその機能を生体外で模倣した様々な培養皮膚モデルの構築が試みられており、いくつかの製品が市販されている（例えば、特許文献２、非特許文献２参照。）。こうした培養皮膚モデルは、皮膚へ塗布する化粧品や薬剤の安全性試験や、基礎研究等で用いられており、動物を代替するモデルとして利用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−１０３７２８号公報
【特許文献２】特開２０１２−２３５９２１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｄｅｎｄａ  Ｍ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｏｐｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｅｘｏｓｅｓ  ｏｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ  ａｆｔｅｒ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ．Ｅｘｐ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１１．Ｎｏｖ；２０（１１）：９４３−９４４．
【非特許文献２】Ｂｅｌｌ  Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｖｉｎｇ  ｓｋｉｎ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９８３  Ｊｕｌ；８１（１  Ｓｕｐｐｌ）：２ｓ−１０ｓ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前述のように皮膚のバリア機能を回復させる物質が知られているが、そのような物質が、どのようなメカニズムで皮膚バリア機能を回復させる効果をもたらすかは明らかでなかった。本発明では、皮膚バリア機能を回復させるメカニズムを明らかにするとともに、そのメカニズムを利用した皮膚バリア機能を評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らが鋭意研究を行った結果、皮膚バリア機能を回復させる物質は、三次元培養表皮の特定の領域、詳しくは、顆粒層の流動性を上昇させる、及び／又は角層の流動性を低下させるメカニズムを有することを見出した。また、皮膚バリア機能を破壊する物質には、逆に、三次元培養表皮の特定の領域、詳しくは、顆粒層の流動性を低下させる、及び／又は角層の流動性を上昇させるメカニズムを有することを見出した。当該メカニズムを利用することによって、新規の皮膚バリア機能を評価する方法及び皮膚バリア機能の程度を可視化する方法を発明するに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。【００１０】
［１］  皮膚バリア機能を評価する方法であって、
（１）角層と顆粒層とを有する三次元培養表皮に、膜環境感受性色素を添加して培養する工程；
（２）前記三次元培養表皮へ、前記膜環境感受性色素に対する励起波長を照射し、前記三次元培養表皮の最下層と平行な面における前記膜環境感受性色素から発光されるゲル相ピーク波長の蛍光強度（ＩLβ）及び液晶相ピーク波長の蛍光強度（ＩPβ）を、前記三次元培養表皮の最下層から最上層又は最上層から最下層に向かって、任意の間隔で、順次検出する工程；
（３）各前記面における前記ゲル相ピーク波長の蛍光強度（ＩLβ）及び前記液晶相ピーク波長の蛍光強度（ＩPβ）から流動度（ＧＰ）を算出し、前記最下層から前記最上層又は前記最上層から前記最下層に向かって前記流動度（ＧＰ）をプロットして流動度分布を作成し、第１極大値を決定する工程；及び
（４）前記第１極大値に隣接する第１極小値、又は前記第１極大値を含む面よりも上層の任意の面の流動度（ＧＰ）を皮膚バリア機能値として決定する工程、
を含む、方法。
［２］  前記工程（１）において、対象物質を添加又は塗布する、［１］に記載の方法。
［３］  前記工程（１）において陰性対象物質を添加又は塗布した場合の、前記工程（４）において決定された前記皮膚バリア機能値と、
前記工程（１）において対象物質を添加又は塗布した場合の、前記工程（４）において決定された前記皮膚バリア機能値と、を比較することを特徴とする、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］  前記第１極大値は、前記角層と前記顆粒層との境界付近における、最も高い値の前記流動度（ＧＰ）として定義される、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］  前記流動度（ＧＰ）が、以下：
【数１】
2019172452.tif 000003
により算出される、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］  前記膜環境感受性色素が、Ｌａｕｒｄａｎである、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の方法。
［７］  ゲル相ピーク波長が４４０ｎｍであって、液晶相ピーク波長が４９０ｎｍである、［６］に記載の方法。
［８］  前記工程（１）において、さらに細胞質染色色素を添加する、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の方法。
［９］  各前記面が、前記顆粒層の任意の１細胞の任意の断面と同一面積である、［１］〜［８］のいずれか１項に記載の方法。【００１１】
［１０］  皮膚バリア機能の程度を可視化する方法であって、
（１）角層と顆粒層とを有する三次元培養表皮に、膜環境感受性色素を添加して培養する工程；
（２）前記三次元培養表皮へ、前記膜環境感受性色素に対する励起波長を照射し、前記三次元培養表皮の最下層と平行な面における前記膜環境感受性色素から発光されるゲル相ピーク波長の蛍光及び液晶相ピーク波長の蛍光を、前記三次元培養表皮の最下層から最上層又は最上層から最下層に向かって、任意の間隔で、順次検出する工程；及び
（３）各前記面において、検出された前記ゲル相ピーク波長の蛍光及び前記液晶相ピーク波長の蛍光を任意の色彩でそれぞれ描画し、マージした画像を出力する工程、
を含む、方法。
［１１］  前記工程（１）において、対象物質を添加又は塗布する、［１０］に記載の方法。
［１２］  前記工程（１）において陰性対象物質を添加又は塗布した場合の、前記工程（３）で得られる画像と、
前記工程（１）において対象物質を添加又は塗布した場合の、前記工程（３）で得られる画像と、を比較することを特徴とする、［１０］又は［１１］に記載の方法。
［１３］  前記膜環境感受性色素が、Ｌａｕｒｄａｎである、［１０］〜［１２］のいずれか１項に記載の方法。
［１４］  ゲル相ピーク波長が４４０ｎｍであって、液晶相ピーク波長が４９０ｎｍである、［１３］に記載の方法。【００１２】
［１５］  皮膚バリア機能の程度を可視化する方法であって、
（１）角層と顆粒層とを有する三次元培養表皮に、膜環境感受性色素を添加して培養する工程；
（２）前記三次元培養表皮へ、前記膜環境感受性色素に対する励起波長を照射し、前記三次元培養表皮の最下層と平行な面における前記膜環境感受性色素から発光されるゲル相ピーク波長の蛍光強度（ＩLβ）及び液晶相ピーク波長の蛍光強度（ＩPβ）を、前記三次元培養表皮の最下層から最上層又は最上層から最下層に向かって、任意の間隔で、順次検出する工程；及び
（３）各前記面において、検出された前記ゲル相ピーク波長の蛍光強度（ＩLβ）及び前記液晶相ピーク波長の蛍光強度（ＩPβ）から任意のピクセル毎に流動度（ＧＰ）を算出し、前記流動度（ＧＰ）を任意の色彩の濃淡又はグラデーションとして前記ピクセル毎に描画し、画像として出力する工程、
を含む、方法。
［１６］  前記工程（１）において、対象物質を添加又は塗布する、［１５］に記載の方法。
［１７］  前記工程（１）において陰性対象物質を添加又は塗布した場合の、前記工程（３）で得られる画像と、
前記工程（１）において対象物質を添加又は塗布した場合の、前記工程（３）で得られる画像と、を比較することを特徴とする、［１５］又は［１６］に記載の方法。
［１８］  前記流動度（ＧＰ）が、以下：
【数２】
2019172452.tif 000004
により算出される、［１５］〜［１７］のいずれか１項に記載の方法。
［１９］  前記膜環境感受性色素が、Ｌａｕｒｄａｎである、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
［２０］  ゲル相ピーク波長が４４０ｎｍであって、液晶相ピーク波長が４９０ｎｍである、［１９］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、三次元培養表皮の皮膚バリア機能を容易に評価することが可能になる。これにより、皮膚へ塗布する化粧品や薬剤の安全性試験、基礎研究に有用な最適な三次元培養表皮モデルが選択可能となる。また、本発明によれば、皮膚バリア機能を改善又は回復させる、新規の物質を容易にスクリーニング可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】三次元培養表皮の断面（Ｘ−Ｚ平面）の蛍光顕微鏡像を示す。三次元培養表皮にＬａｕｒｄａｎ及びＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄを添加して培養後、８２０ｎｍの波長で励起させ、Ｌａｕｒｄａｎ４４０ｎｍ（青）又はＬａｕｒｄａｎ４９０ｎｍ（緑）の蛍光を検出した。また、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄの蛍光（赤）も検出した。それらの蛍光像をマージした。最上層から順に、角層、顆粒層、有棘層、基底層を示す。
【図２】三次元培養表皮の蛍光顕微鏡像、及びその流動度分布を示す。（Ａ）三次元培養表皮の蛍光像（Ｘ−Ｙ平面）を、Ｚ軸に沿って１．３μｍ毎に撮影した像を示す。最上層（左上）から下層（右下）の順番に並べた。青：Ｌａｕｒｄａｎ４４０ｎｍ、緑：Ｌａｕｒｄａｎ４９０ｎｍ、赤：Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ。（Ｂ）各平面の流動度（ＧＰ）を右の式に従って算出し、最上層から下層に沿って０．３２５μｍ毎にプロットした流動度分布である。ＳＣ：角層、ＳＧ１：顆粒層第１層。
【図３】三次元培養表皮の顆粒層の一細胞に着目した場合の、Ｚ軸に沿った顆粒層第１層（ＳＧ１）周辺の流動度分布を示す。（Ａ）顆粒層の一細胞に着目した場合の、０．３２５μｍ毎にプロットした流動度分布を示す。ＳＣ：角層、ＳＧ１：顆粒層第１層、ＳＧ２：顆粒層第２層、ＧＰSG：ＧＰにおける第１極小値（ＳＧ１細胞のＺ軸方向の中心部分）。（Ｂ）Ｘ−Ｚ面の細胞の模式図を示す。（Ｃ）（Ａ）のグラフの任意のＧＰ値を示す平面における蛍光像を示す。青：Ｌａｕｒｄａｎ４４０ｎｍ、緑：Ｌａｕｒｄａｎ４９０ｎｍ、赤：Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄの蛍光像をマージした図。
【図４】三次元培養表皮の顆粒層の一細胞に着目した場合の、Ｚ軸に沿った顆粒層第１層（ＳＧ１）周辺の流動度分布（未処理）を示す。（Ａ）未処理の三次元培養表皮の蛍光像（Ｘ−Ｙ平面）を、Ｚ軸に沿って０．６５μｍ毎に撮影した像を示す。上層（左上）から下層（右下）の順番に並べた。青：Ｌａｕｒｄａｎ４４０ｎｍ、緑：Ｌａｕｒｄａｎ４９０ｎｍ、赤：Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ。（Ｂ）顆粒層の一細胞に着目した場合の、０．３２５μｍ毎にプロットした流動度分布を示す。ＳＧ１：顆粒層第１層、ＧＰSG：ＧＰにおける第１極小値（ＳＧ１細胞のＺ軸方向の中心部分）。
【図５】三次元培養表皮の顆粒層の一細胞に着目した場合の、Ｚ軸に沿った顆粒層第１層（ＳＧ１）周辺の流動度分布（水処理）を示す。（Ａ）水処理後の三次元培養表皮の蛍光像（Ｘ−Ｙ平面）を、Ｚ軸に沿って０．６５μｍ毎に撮影した像を示す。上層（左上）から下層（右下）の順番に並べた。青：Ｌａｕｒｄａｎ４４０ｎｍ、緑：Ｌａｕｒｄａｎ４９０ｎｍ、赤：Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ。（Ｂ）顆粒層の一細胞に着目した場合の、０．３２５μｍ毎にプロットした流動度分布を示す。ＳＧ１：顆粒層第１層、ＧＰSG：ＧＰにおける第１極小値（ＳＧ１細胞のＺ軸方向の中心部分）。
【図６】三次元培養表皮の顆粒層の一細胞に着目した場合の、Ｚ軸に沿った顆粒層第１層（ＳＧ１）周辺の流動度分布（１００ｍＭキシリトール処理）を示す。（Ａ）キシリトール処理後の三次元培養表皮の蛍光像（Ｘ−Ｙ平面）を、Ｚ軸に沿って０．６５μｍ毎に撮影した像を示す。上層（左上）から下層（右下）の順番に並べた。青：Ｌａｕｒｄａｎ４４０ｎｍ、緑：Ｌａｕｒｄａｎ４９０ｎｍ、赤：Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ。（Ｂ）顆粒層の一細胞に着目した場合の、０．３２５μｍ毎にプロットした流動度分布を示す。ＳＧ１：顆粒層第１層、ＧＰSG：ＧＰにおける第１極小値（ＳＧ１細胞のＺ軸方向の中心部分）。
【図７】三次元培養表皮の顆粒層の一細胞に着目した場合の、Ｚ軸に沿った顆粒層第１層（ＳＧ１）周辺の流動度分布（１００ｍＭフルクトース処理）を示す。（Ａ）フルクトース処理後の三次元培養表皮の蛍光像（Ｘ−Ｙ平面）を、Ｚ軸に沿って０．６５μｍ毎に撮影した像を示す。上層（左上）から下層（右下）の順番に並べた。青：Ｌａｕｒｄａｎ４４０ｎｍ、緑：Ｌａｕｒｄａｎ４９０ｎｍ、赤：Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ。（Ｂ）顆粒層の一細胞に着目した場合の、０．３２５μｍ毎にプロットした流動度分布を示す。ＳＧ１：顆粒層、ＧＰSG：ＧＰにおける第１極小値（ＳＧ１細胞のＺ軸方向の中心部分）。
【図８】ポリオール添加による顆粒層の脂質における流動度（ＧＰ）を示す。未処理、水処理、１００ｍＭキシリトール処理、１００ｍＭフルクトース処理した場合の顆粒層の流動度（ＧＰ）の平均値±標準偏差（ＳＤ）、ｐ値及びｎ数を示す。
【図９】三次元培養表皮の顆粒層の一細胞に着目した場合の、Ｚ軸に沿った顆粒層第１層（ＳＧ１）周辺の流動度分布（アセトン/エーテル処理）を示す。（Ａ）アセトン/エーテル処理後の三次元培養表皮の蛍光像（Ｘ−Ｙ平面）を、Ｚ軸に沿って０．６５μｍ毎に撮影した像を示す。上層（左上）から下層（右下）の順番に並べた。青：Ｌａｕｒｄａｎ４４０ｎｍ、緑：Ｌａｕｒｄａｎ４９０ｎｍ、赤：Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ。（Ｂ）顆粒層の一細胞に着目した場合の、０．３２５μｍ毎にプロットした流動度分布を示す。ＳＧ１：顆粒層、ＧＰSG：ＧＰにおける第１極小値（ＳＧ１細胞のＺ軸方向の中心部分）。
【図１０】アセトン／エーテル添加による顆粒層の脂質における流動度（ＧＰ）を示す。未処理、水処理、アセトン／エーテル処理した場合の顆粒層の流動度（ＧＰ）の平均値±標準偏差（ＳＤ）、ｐ値及びｎ数を示す。
【図１１】未処理、水処理、アクアインプール１４０７、ポリエチレングルコール１０００（ＰＥＧ）、又はポリプロピレングリコール１０００（ＰＰＧ）処理後の三次元培養表皮の蛍光像（Ｘ−Ｙ平面）を、Ｚ軸に沿って０．６５μｍ毎に撮影した像を示す。上層（左上）から下層（右下）の順番に並べた。青：Ｌａｕｒｄａｎ４４０ｎｍ、緑：Ｌａｕｒｄａｎ４９０ｎｍ、赤：Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ。
【図１２】未処理、水処理、アクアインプール１４０７、ＰＥＧ又はＰＰＧ処理後の角層の脂質における流動度（ＧＰ）を示す。未処理、水処理、アクアインプール１４０７、ＰＥＧ、又はＰＰＧ処理した場合の角層の流動度（ＧＰ）の平均値±標準偏差（ＳＤ）、ｐ値及びｎ数を示す。
【図１３】ＰＢＳ又は３％オレイン酸・ＰＢＳ溶液で処理後の三次元培養表皮の蛍光像（Ｘ−Ｙ平面）を、Ｚ軸に沿って０．６５μｍ毎に撮影した像を示す。上層（左上）から下層（右下）の順番に並べた。青：Ｌａｕｒｄａｎ４４０ｎｍ、緑：Ｌａｕｒｄａｎ４９０ｎｍ、赤：Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ。
【図１４】ＰＢＳ又は３％オレイン酸・ＰＢＳ溶液で処理後の角層の脂質における流動度（ＧＰ）を示す。ＰＢＳ又は３％オレイン酸・ＰＢＳ溶液で処理した場合の角層の流動度（ＧＰ）の平均値±標準偏差（ＳＤ）、ｐ値及びｎ数を示す。
【図１５】三次元培養表皮の流動度（ＧＰ値）画像を示す。三次元培養表皮のＧＰ値（Ｘ−Ｙ平面）を、Ｚ軸に沿って１．３μｍ毎に示した画像を示す。最上層（左上）から下層（右下）の順番に並べた。マゼンタ：高ＧＰ値、緑：低ＧＰ値。ＳＣ：角層、ＳＧ１：顆粒層第１層。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみに限定されない。
【００１６】
本明細書において、「三次元」とは、従来の付着細胞を細胞培養皿等での培養で得られるほぼ１層の細胞層、つまり、二次元の細胞層の状態とは異なり、細胞が垂直方向へと積み重なり、又は重層化した態様をいう。例えば、本発明において用いられる三次元培養表皮は、表皮細胞が重層化されて厚みをもった三次元化した構造体をいう。
【００１７】
本明細書において、「三次元培養表皮」とは、生体に生来的に備わっている皮膚組織とは区別されるものであって、細胞間の接着タンパク質を分解してバラバラにして得られた皮膚組織由来の細胞、及び／又は、多能性幹細胞から分化誘導して得られた皮膚を構成する細胞、を含む細胞群を、細胞培養容器等に播種し、細胞培養基材上で培養して再構築した三次元皮膚様組織をいう。本発明において、三次元培養表皮を構成する細胞は、表皮細胞を含んでおり、「三次元培養表皮シート」ということもできる。本発明において、三次元培養表皮又は三次元培養表皮シートは、表皮細胞以外の細胞、例えば、表皮を構成する表皮細胞以外の細胞（メラニン細胞、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞等）及び／又は、真皮組織に含まれる細胞（線維芽細胞、神経細胞、肥満細胞、形質細胞、血管内皮細胞、組織球、ｍｅｉｓｓｎｅｒ小体、等）が含まれていてもよい。
【００１８】
本明細書において、三次元培養表皮に含まれる細胞は、いずれの動物由来であってもよいが、脊椎動物由来が好ましく、哺乳動物由来がより好ましく、ヒト由来であることが最も好ましい。
【００１９】
本明細書において、「表皮細胞」とは、表皮組織を構成する分化段階の異なる全ての細胞を含む細胞をいう。表皮細胞は、主に、角化細胞又はケラチノサイトとも呼ばれる細胞から構成されている。生体において、表皮組織は、分化段階の異なる表皮細胞が層状に重なって形成されている。表皮の最深部は基底層又は基底細胞層（以下、「基底層」という。）と呼ばれ、円柱状の細胞が一層を形成し、幹細胞を含むと考えられている。基底層は真皮との境界面でもあり、その上層には有棘層が存在する。
【００２０】
有棘層とは、有棘細胞層とも呼ばれ、生体組織においては２〜１０層程度から構成されている。この層は、互いに棘で繋がっているように見えるために有棘層と呼ばれる。基底層の細胞のみが増殖能を有しており、表皮細胞は分化段階が進むにつれて扁平な形状に変化しながら外層へと移動する。
【００２１】
有棘層より分化段階が進むと、ケラトヒアリン顆粒、ラメラ顆粒を有する顆粒層（顆粒細胞層）を形成する。顆粒層は、生体組織においては２〜３層程度で構成されている。
【００２２】
顆粒層よりさらに分化段階が進むと、細胞核が消失し、角層（角質細胞層）を形成する。表皮組織は大別して上述の４種類の層を構成し、表皮細胞の他にも、メラニン細胞、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞等が含まれており、それぞれ紫外線が真皮へ到達することを防いだり、皮膚の免疫機能に重要な役割を果たしたり、知覚に関与したりする。本発明において用いられる、三次元培養表皮は、表皮細胞以外の細胞が含まれても良く、使用する用途に応じて適宜変更することが可能である。
【００２３】
皮膚が備える「バリア機能」とは、一般に、体内の水分や生体成分の損失を防止する機能や、生体外部から生体内部へ異物（微生物、ウイルス、ホコリ等）が入ることを防止する機能をいう。本明細書において、三次元培養表皮が有するバリア機能は、経表皮水分蒸散量（Ｔｒａｎｓｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｗａｔｅｒ  ｌｏｓｓ：ＴＥＷＬ）を調べることにより評価することができる。三次元培養表皮からの経表皮水分蒸散量、すなわち、水分透過量が少ないほど、バリア機能が高いことを示す。経表皮水分蒸散量を調べる方法は、当業者に用いられる一般的な方法を用いることができる（例えば、Ｋｕｍａｍｏｔｏ  Ｊ．，Ｔｓｕｔｓｕｍｉ  Ｍ．，Ｇｏｔｏ  Ｍ．，Ｎａｇａｙａｍａ  Ｍ．，Ｄｅｎｄａ  Ｍ．Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｅｄａｒ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）ｐｏｌｌｅｎ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｌｅｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｅｘ  ｖｉｖｏ．Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．３０８：４９−５４，２０１６を参照のこと）。
【００２４】
本発明において用いられる三次元培養表皮に含まれる細胞は、生体組織、特に皮膚組織を細かく刻み、コラゲナーゼ、トリプシン等のタンパク質分解酵素で処理されて得られた初代表皮細胞であってもよく、初代表皮細胞を継代操作して増殖させた表皮細胞であってもよく、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、又はＭｕｓｅ細胞等の多能性幹細胞から分化誘導して得られる表皮細胞を用いてもよく、株化された表皮細胞であってもよい。
【００２５】
本明細書において、初代表皮細胞とは、生体組織から採取した後に細胞培養容器で一度だけ培養されて回収された表皮細胞であり、「継代回数０（又は、第１世代）」の表皮細胞ともいう。コンフルエント又はサブコンフルエントになった継代回数０の表皮細胞を、当業者にとって公知の方法により継代操作し、さらに増幅培養することが可能である。１度の継代操作により得られた表皮細胞は、「継代回数１（又は、第２世代）」の表皮細胞という。継代操作数に対応して「継代回数２、３、４・・・ｎ（ｎ（整数）は継代回数）（第ｎ＋１世代）」と表現することができる。市販の初代培養細胞（例えば、クラボウ社の凍結ＮＨＥＫ（ＮＢ）、カタログ番号：ＫＫ−４００９）には、本明細書でいう継代回数０〜継代回数２程度のものまでを初代培養細胞として提供されているものもあるが、この場合の継代回数は、市販の細胞に添付の書類等に記載されている継代回数又は世代数を参考にすることができる。
【００２６】
三次元培養表皮を作製する場合、表皮細胞を含む細胞群を三次元化するキットが市販されており、それを購入して作製することが可能である（例えば、ケラチノサイト三次元培養スターターキット、ＣＥＬＬｎＴＥＣ社）。
【００２７】
本発明の一実施形態において使用される初代表皮細胞の継代回数は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０以上であってもよい。本発明の実施形態において、使用される初代表皮細胞の動物種は、特に限定されないが、好ましくはヒト由来である。また、本発明の実施形態において、使用される初代表皮細胞は、胎児、新生児、未成年、又は成人由来等いずれのものであってもよいが、好ましくは胎児、新生児、又は未成年由来の細胞である。ヒトの未成年由来の細胞を用いる場合、例えば、２０歳未満、１〜１９歳、１〜１０歳、１〜５歳の細胞を用いるのが好ましい。ヒトの成人由来の細胞を用いる場合であっても、若年、例えば、２０歳〜２９歳、３０歳〜３９歳、４０歳〜４９歳の細胞を用いることが好ましい。
【００２８】
本発明の一実施形態において、三次元培養表皮の平均の厚さは、２０μｍ以上、２１μｍ以上、２２μｍ以上、２３μｍ以上、２４μｍ以上、２５μｍ以上、２６μｍ以上、２７μｍ以上、２８μｍ以上、２９μｍ以上、３０μｍ以上、３５μｍ以上、４０μｍ以上、４５μｍ以上、５０μｍ以上、５５μｍ以上、６０μｍ以上、６５μｍ以上、７０μｍ以上、７５μｍ以上、８０μｍ以上、８５μｍ以上、９０μｍ以上、９５μｍ以上、１００μｍ以上、１０５μｍ以上、１１０μｍ以上、１１５μｍ以上、１２０μｍ以上、１２５μ以上、１５０μｍ以上、１７５μｍ以上、２００μｍ以上、２２５μｍ以上、２５０μｍ以上、２７５μｍ以上、３００μｍ以上であってもよい。三次元培養表皮の平均の厚さの上限値は、表皮細胞の動物種、継代回数、年齢等により変化するため、特に限定されない。
【００２９】
＜三次元培養表皮の製造方法＞
本発明の一実施形態において用いられる三次元培養表皮に含まれる表皮細胞の播種数については、公知の方法に従えばよい。例えば、表皮細胞を、０．０１×１０6〜１０．０×１０6個／ｃｍ2、好ましくは０．０５×１０6〜５．０×１０6個／ｃｍ2、より好ましくは０．１×１０6〜１．０×１０6個／ｃｍ2の量で播種する。表皮細胞の培養に用いられる培地（培養液ともいう）としては、通常使用される培地、例えばＫＧ培地、ＥｐｉｌｉｆｅＫＧ２（クラボウ社）、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２（クラボウ社）、アッセイ培地（ＴＯＹＯＢＯ社）、ＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ，Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＣＥＬＬｎＴＥＣ社）などを用い、約３７℃で０〜１４日間かけて培養することができる。培地としては、その他にＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）又は２−０−ａ−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸含有ＫＧＭとＤＭＥＭを１：１混合した培地などが使用できる。表皮細胞を三次元化（重層化）するためには、ＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ、３Ｄ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｍｅｄｉｕｍ（ＣＥＬＬｎＴＥＣ社）を用いても良い。その他の公知の培地を使用してもよい。
【００３０】
本発明において用いられる三次元培養表皮は、セルカルチャーインサートを含む細胞培養容器に表皮細胞を播種し、増殖培養させることによって、三次元化（重層化）し、かつ、角質化が促進される。具体的には、表皮細胞を培地に懸濁し、セルカルチャーインサート上に播種する。培地を充填したボトムウェルに、セルカルチャーインサートを浸漬させて培養する。これにより、表皮細胞の上部及び底部の両方から培地が供給される。
【００３１】
セルカルチャーインサート上の表皮細胞が、コンフルエント又はサブコンフルエントになるまで数日間程度（１〜６日間程度、好ましくは２〜４日間程度）培養させることが好ましい。その後、細胞の三次元化（重層化）をさらに促進するために、セルカルチャーインサート内外の培地を、例えば、ＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ、３Ｄ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｍｅｄｉｕｍ（ＣＥＬＬｎＴＥＣ社）へ交換することが好ましい。これにより、さらに表皮細胞の三次元化が促進される。ＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ、３Ｄ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｍｅｄｉｕｍ（ＣＥＬＬｎＴＥＣ社）へと培地を交換して培養後、１〜３６時間後、好ましくは６時間〜２４時間後、さらに好ましくは１２時間〜１８時間後、セルカルチャーインサートの内部の培地のみを除去して表皮細胞の上面を気相に暴露させて培養することが好ましい。これによって、表皮細胞の三次元化及び角質化がさらに促進され、より厚い三次元培養表皮が得られる。三次元培養表皮を培養する培地、例えば、上記のＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ、３Ｄ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｍｅｄｉｕｍには、Ｌ（＋）−アスコルビン酸（ビタミンＣ）（例えば、５０μｇ／ｍＬ）が添加されていることが好ましい。Ｌ（＋）−アスコルビン酸（ビタミンＣ）が添加された培地によって、さらに三次元培養表皮の肥厚化が促進される。
【００３２】
なお、本発明における各培養工程の培養温度は由来動物の体温付近であればよく、例えば、ヒト細胞の場合は、３３〜３８℃程度が好適である。
【００３３】
上記の方法によって得られる三次元培養表皮は、例えば、化学物質（例えば、化粧料、工業製品、家庭用品、薬剤、皮膚外用剤等）に対する皮膚の反応性を評価する方法に用いることができる。また、本発明の皮膚バリア機能を評価する方法に用いることができる。さらにまた、化学物質を添加することによって、皮膚バリア機能を改善及び／又は回復させる化学物質をスクリーニングする方法に用いることができる。
【００３４】
一実施態様において、上記方法によって作製され、本発明に用いられる三次元培養表皮は、例えば、図１のような構造を有する。三次元培養表皮に、生体膜のゲル相及び液晶相を検出するＬａｕｒｄａｎ（後述）と、細胞質を染色するＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（後述）とを添加して培養後、断面（Ｘ−Ｚ面）を公知の共焦点蛍光顕微鏡を用いて撮影した結果、図１の像が得られる。角層と顆粒層との間はＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄが蛍光する層が見られ、これにより、角層と顆粒層とを見分けることができる。蛍光像から、顆粒層の下部には有棘層及び基底層を観察することができる。
【００３５】
＜皮膚バリア機能を評価する方法＞
一実施態様において、本発明は、皮膚バリア機能を評価する方法を提供する。本発明は、以下の工程を含む。
【００３６】
（１）角層と顆粒層とを有する三次元培養表皮に、膜環境感受性色素を添加して培養する工程；
（２）前記三次元培養表皮へ、前記膜環境感受性色素に対する励起波長を照射し、前記三次元培養表皮の最下層と平行な面における前記膜環境感受性色素から発光されるゲル相ピーク波長の蛍光強度（ＩLβ）及び液晶相ピーク波長の蛍光強度（ＩPβ）を、前記三次元培養表皮の最下層から最上層又は最上層から最下層に向かって、任意の間隔で、順次検出する工程；
（３）各前記面における前記ゲル相ピーク波長の蛍光強度（ＩLβ）及び前記液晶相ピーク波長の蛍光強度（ＩPβ）から流動度（ＧＰ）を算出し、前記最下層から前記最上層又は前記最上層から前記最下層に向かって前記流動度（ＧＰ）をプロットして流動度分布を作成し、第１極大値を決定する工程；及び
（４）前記第１極大値に隣接する第１極小値、又は前記第１極大値を含む面よりも上層の任意の流動度（ＧＰ）を皮膚バリア機能値として決定する工程。
【００３７】
本明細書において、「膜環境感受性色素」とは、生体膜、例えば細胞膜やオルガネラ膜に取り込まれ、励起波長を照射した場合、膜環境の状態に応じて、異なる発光波長（ピーク波長）を生じる色素をいい、例えば、６−プロピオニル−２−（ジメチルアミノ）ナフタレン（Ｐｒｏｄａｎ）、６−アクリロイル−２−（ジメチルアミノ）ナフタレン（Ａｃｒｙｌｏｄａｎ）、２’−ジメチルアミノ−６’−ナフトイル−４−トランス−シクロヘキサン酸（ＤＡＮＣＡ）、６−ラウロイル−２−（ジメチルアミノ）ナフタレン（Ｌａｕｒｄａｎ）、アニリノナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）、Ｂｉｓ−ＡＮＳ、スチレン誘導体ＤＣＶＪ、Ｄａｐｏｘｙｌ誘導体などが含まれる。生体膜において、脂質分子やタンパク質分子は膜面中で側方拡散運動を行っており、その拡散運動が「膜の流動性」（すなわち、「膜の柔らかさ」）を決定している。膜環境感受性色素を用いることにより、「膜の流動性」を測定することが可能となる。
【００３８】
例えば、Ｐｒｏｄａｎは、無極性溶媒（中では３９２ｎｍの発光波長から、水中での５２３ｎｍの発光波長まで大きくシフトすることが知られている分子である。そのため、Ｐｒｏｄａｎは、タンパク質の構造変化にともなうアミノ酸残基の水環境への露出度や、膜の相転移（ゲル相又は液晶相）にともなう極性度の変化の測定に用いることができる。
【００３９】
例えば、Ｌａｕｒｄａｎは、ＤＰＰＣ（ジパルミトイル  フォスファチジルコリン）中において、ゲル相では、４４０ｎｍに発光スペクトルのピークを示し、液晶相では、４９０ｎｍに発光スペクトルのピークを示す。本発明において、膜環境感受性色素を用いて、膜環境感受性色素から発光されるゲル相ピーク波長の蛍光強度（ＩLβ）及び液晶相ピーク波長の蛍光強度（ＩPβ）を測定することにより、三次元培養表皮の生体膜の流動度（ＧＰ：Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を予測することが可能となる。本発明に用いられる膜環境感受性色素として、好ましくは、Ｌａｕｒｄａｎである。
【００４０】
本発明者らは、上記工程（１）〜（４）を実施して、三次元培養表皮における生体膜の流動度（ＧＰ）を、最下層から最上層又は最上層から最下層に向かって、任意の間隔でプロットして流動度分布を作成した結果、公知の皮膚バリア機能を向上させる物質には、三次元培養表皮の特定の領域、特に、顆粒層の流動性を上昇させる、及び／又は角層の流動性を低下させるメカニズムを有することを見出した。また、皮膚バリア機能を破壊する物質には、逆に、三次元培養表皮の顆粒層の流動性を低下させる、及び／又は角層の流動性を上昇させるメカニズムを有することを見出した。すなわち、当該メカニズムに着目することによって、本発明にかかる三次元培養表皮の皮膚バリア機能を評価する方法を完成させた。具体的な態様について、以下に説明する。
【００４１】
図２及び図３では、膜環境感受性色素として、Ｌａｕｒｄａｎが用いられている。一実施態様において、三次元培養表皮の最下層と平行な面における前記膜環境感受性色素から発光されるゲル相ピーク波長の蛍光強度（ＩLβ）及び液晶相ピーク波長の蛍光強度（ＩPβ）を、前記三次元培養表皮の最下層から最上層又は最上層から最下層に向かって、任意の間隔で、順次検出する（図２（Ａ）及び図３（Ｃ）参照）。一実施態様において、三次元培養表皮の最下層と平行な各面における流動度（ＧＰ）を算出し、それをＺ軸にプロットすることによって流動度分布（図２（Ｂ）及び図３（Ａ）参照）が得られる。
【００４２】
本明細書において、「三次元培養表皮の最下層」とは、三次元培養表皮を培養している基材の培養面と接触することにより形成された三次元培養表皮の最下層面をいう。また、本明細書において、「Ｘ−Ｙ面」とは、三次元培養表皮を培養している基材の培養面と平行な面をいう。また、本明細書において、Ｚ軸とは、前記Ｘ−Ｙ面と垂直な軸をいう。
【００４３】
ゲル相ピーク波長の蛍光強度（ＩLβ）及び液晶相ピーク波長の蛍光強度（ＩPβ）は、例えば、共焦点蛍光顕微鏡や多光子励起顕微鏡（例えば、二光子励起顕微鏡）によって撮影し、得られた画像を解析することによって検出することができる。検出するゲル相ピーク波長の蛍光強度（ＩLβ）及び液晶相ピーク波長の蛍光強度（ＩPβ）は、使用する膜環境感受性色素に応じて、適宜選択される。
【００４４】
一実施態様において、三次元培養表皮の最下層と平行な面の間隔は、例えば、０．０１μｍ〜５０μｍ、好ましくは０．０５μｍ〜１０μｍ、より好ましくは、０．１μｍ〜５μｍである。
【００４５】
得られたゲル相ピーク波長の蛍光強度（ＩLβ）及び液晶相ピーク波長の蛍光強度（ＩPβ）から、例えば、以下の式に従って、流動度（ＧＰ）を算出することができる。
【数３】
2019172452.tif 000005
【００４６】
一実施態様において、膜環境感受性色素がＬａｕｒｄａｎである場合、ゲル相ピーク波長が４４０ｎｍであり、液晶相ピーク波長が４９０ｎｍである。そのため、例えば、以下の式に従って、流動度（ＧＰ）を算出することができる。
【数４】
2019172452.tif 000006
［式中、Ｉ440nmは、４４０ｎｍにおける蛍光強度を示し、Ｉ490nmは、４９０ｎｍにおける蛍光強度を示す］
【００４７】
上記式によって、各面における流動度（ＧＰ）を算出し、前記最下層から前記最上層又は前記最上層から前記最下層に向かって前記流動度（ＧＰ）をプロットして流動度分布を作成することにより、例えば、図２（Ｂ）及び図３（Ａ）のグラフが得られる。相対的に流動度（ＧＰ）が低いと、流動性が相対的に高いことを示し、相対的に流動度（ＧＰ）が高いと、流動性が相対的に低いことを示す。
【００４８】
本明細書において、「第１極大値」とは、上記のように作成された流動度分布において、角層（ＳＣ）と顆粒層（特に顆粒層第１層（ＳＧ１））との境界付近における、最も高い値の流動度（ＧＰ）として定義される（図２（Ｂ）及び図３（Ａ）参照）。顆粒層は、一般的に、２〜３層の細胞から形成されており（本明細書においては、角層に近い層から、顆粒層第１層（ＳＧ１）、顆粒層第２層（ＳＧ２）、顆粒層第３層（ＳＧ３）と呼ぶ。角層（ＳＣ）と顆粒層第１層（ＳＧ１）との境界は、細胞核が消失した角層（ＳＣ）の細胞は染色しない色素、例えば、細胞質染色色素（例えば、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ）を添加することによって、さらに明確に認識可能となる（図１参照）。
【００４９】
本明細書において、「皮膚バリア機能値」とは、後述する「第１極小値」、「第２極小値」、「第３極小値」、又は「第１極大値を含む面よりも上層の任意の流動度（ＧＰ）」をいう。「皮膚バリア機能値」は、好ましくは「第１極小値」及び／又は「第１極大値を含む面よりも上層の任意の流動度（ＧＰ）」である。
【００５０】
本明細書において、「第１極小値」とは、上記のように作成された流動度分布において「第１極大値」を示す流動度（ＧＰ）に隣接し、顆粒層第１層（ＳＧ１）の領域の流動度（ＧＰ）のうち最も低い値の流動度（ＧＰ）として定義される（図２（Ｂ）及び図３（Ａ）参照）。本発明者らは、皮膚のバリア機能が、顆粒層（特に第１顆粒層（ＳＧ１）の中心部分）の流動度（ＧＰSG）、すなわち、第１極小値と逆相関することを初めて明らかにした。換言すると、複数の三次元培養表皮において、第１極小値を比較することにより、皮膚バリア機能が高い又は低いことを評価することができる。
【００５１】
本明細書において、「第２極小値」とは、上記のように作成された流動度分布において、顆粒層第２層（ＳＧ２）の領域の流動度（ＧＰ）のうち最も低い値の流動度（ＧＰ）として定義される。本明細書において、「第３極小値」とは、上記のように作成された流動度分布において、顆粒層第３層（ＳＧ３）の領域の流動度（ＧＰ）のうち最も低い値の流動度（ＧＰ）として定義される。第２極小値及び／又は第３極小値も、本発明の皮膚バリア機能を評価する方法に用いてもよいが、より明確に比較できることから、第１極小値を用いることが好ましい。
【００５２】
一実施態様の本発明は、前記工程（１）において、対象物質を添加し、第１極小値の値を比較することによって、皮膚のバリア機能を改善及び／又は回復させる対象物質をスクリーニングする方法を提供することが可能となる。
【００５３】
本明細書において、「第１極大値を含む面よりも上層の任意の面の流動度（ＧＰ）」は、角層における任意の面の流動度（ＧＰ）をいう。本発明者らは、皮膚のバリア機能に影響を与える物質の添加が、角層の流動度と相関することを明らかにした。換言すると、複数の三次元培養表皮において、角層（例えば、三次元培養表皮において、最上層から第１極大値を含む面の間）の流動度（ＧＰ）を比較することにより、皮膚バリア機能が高い又は低いことを評価することができる。
【００５４】
また、他の実施態様の本発明では、さらに、前記工程（１）において陰性対象物質を添加又は塗布した場合の、前記工程（４）において決定された前記皮膚バリア機能値と、前記工程（１）において対象物質を添加又は塗布した場合の、前記工程（４）において決定された前記皮膚バリア機能値と、を比較することによって、皮膚のバリア機能を改善及び／又は回復させる対象物質をスクリーニングする方法を提供することが可能となる。本実施態様において、スクリーニングの対象物質としては、例えば、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物又は細胞培養上清、植物由来の化合物又は抽出物（例えば、生薬エキス、生薬由来の化合物）、及び微生物由来の化合物若しくは抽出物又は培養産物などであってもよい。
【００５５】
また、一実施態様の本発明では、ゲル相ピーク波長の蛍光強度（ＩLβ）及び液晶相ピーク波長の蛍光強度（ＩPβ）を検出する各面を、顆粒層の任意の１細胞の任意の断面と同一面積に限定してもよい（図３参照）。蛍光強度を検出する各面の面積は、共焦点蛍光顕微鏡や多光子励起顕微鏡（例えば、二光子励起顕微鏡）によって撮影して得られた画像を、後から、任意のプログラム（例えば、ニコンインステック社のＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を用いることによって限定することができる。これによって、ノイズが減少し、第１極大値と皮膚バリア機能値が明確に認識できるようになる。
【００５６】
＜皮膚バリア機能の程度を可視化する方法（第１態様）＞
一実施態様において、本発明は、以下の工程を含む、皮膚バリア機能の程度を可視化する方法を提供する。
【００５７】
（１）角層と顆粒層とを有する三次元培養表皮に、膜環境感受性色素を添加して培養する工程；
（２）前記三次元培養表皮へ、前記膜環境感受性色素に対する励起波長を照射し、前記三次元培養表皮の最下層と平行な面における前記膜環境感受性色素から発光されるゲル相ピーク波長の蛍光及び液晶相ピーク波長の蛍光を、前記三次元培養表皮の最下層から最上層又は最上層から最下層に向かって、任意の間隔で、順次検出し、工程；及び
（３）各前記面において、検出された前記ゲル相ピーク波長の蛍光及び前記液晶相ピーク波長の蛍光を任意の色彩でそれぞれ描画し、マージした画像を出力する工程。
【００５８】
なお、皮膚バリア機能の程度を可視化する方法（第１態様）は、上記の皮膚バリア機能を評価する方法、又は後述の皮膚バリア機能の程度を可視化する方法（第２態様）で説明される各要素を適用することができる。
【００５９】
一実施態様において、本発明に用いられる膜環境感受性色素は、Ｌａｕｒｄａｎを用いてもよい。三次元培養表皮の最下層と平行な面における前記膜環境感受性色素から発光されるゲル相ピーク波長の蛍光及び液晶相ピーク波長の蛍光を、前記三次元培養表皮の最下層から最上層又は最上層から最下層に向かって、任意の間隔で順次検出した後（工程（２））、各前記面において、検出された前記ゲル相ピーク波長の蛍光及び前記液晶相ピーク波長の蛍光を任意の色彩でそれぞれ描画し（例えば、ゲル相ピーク波長の蛍光：青、液晶相ピーク波長の蛍光：緑）、それらの画像をマージして出力することで、図２（A）が得られる（工程（３））。
【００６０】
一実施態様において、マージして出力される画像の間隔は、例えば、０．０１μｍ〜５０μｍ、好ましくは０．０５μｍ〜１０μｍ、より好ましくは、０．１μｍ〜５μｍである。
【００６１】
本発明の方法によって得られる、三次元培養表皮の最下層から最上層又は最上層から最下層に表示される一群の画像は、皮膚バリア機能の程度を可視化している。例えば、角層に相当する画像（例えば、最上層から第１極大値を含む面の間の画像）において、ゲル相ピーク波長の蛍光が優位であると、流動性が低く、バリア機能が高いことを示す。また、例えば、顆粒層に相当する画像において、液晶相ピーク波長の蛍光が優位であると、流動性が高く、バリア機能が高いことを示す。
【００６２】
一実施態様において、本発明の方法によって得られる、三次元培養表皮の最下層から最上層又は最上層から最下層に並べられた一群の画像は、図２（A）のように全ての画像が同時に表示された画像であってもよく、例えば、各画像が最下層から最上層又は最上層から最下層の順番に経時的に表示されるものであってもよい。また、出力される画像は、モニタであってもよく、プリントアウトされたものであってもよい。
【００６３】
＜皮膚バリア機能の程度を可視化する方法（第２態様）＞
他の実施態様において、本発明は、以下の工程を含む、皮膚バリア機能の程度を可視化する方法を提供する。
【００６４】
（１）角層と顆粒層とを有する三次元培養表皮に、膜環境感受性色素を添加して培養する工程；
（２）前記三次元培養表皮へ、前記膜環境感受性色素に対する励起波長を照射し、前記三次元培養表皮の最下層と平行な面における前記膜環境感受性色素から発光されるゲル相ピーク波長の蛍光強度（ＩLβ）及び液晶相ピーク波長の蛍光強度（ＩPβ）を、前記三次元培養表皮の最下層から最上層又は最上層から最下層に向かって、任意の間隔で、順次検出する工程；及び
（３）各前記面において、検出された前記ゲル相ピーク波長の蛍光強度（ＩLβ）及び前記液晶相ピーク波長の蛍光強度（ＩPβ）から任意のピクセル毎に流動度（ＧＰ）を算出し、前記流動度（ＧＰ）を任意の色彩の濃淡又はグラデーションとして前記ピクセル毎に描画し、画像として出力する工程。
【００６５】
なお、皮膚バリア機能の程度を可視化する方法（第２態様）は、上記の皮膚バリア機能を評価する方法、又は皮膚バリア機能の程度を可視化する方法（第１態様）で説明される各要素を適用することができる。
【００６６】
各前記面において、工程（１）及び（２）を経て検出したゲル相ピーク波長の蛍光強度（ＩLβ）及び液晶相ピーク波長の蛍光強度（ＩPβ）から、任意のピクセル毎に流動度（ＧＰ）を算出することができる。算出された流動度（ＧＰ）は、任意の色彩の濃淡又はグラデーションとしてピクセル毎に描画し、画像として出力することができる（工程（３））。算出された流動度（ＧＰ）を任意の色彩で描画する方法として、例えば、補色（反対色ともいう）関係にある２色の色彩のグラデーション（例えば、高ＧＰ値：マゼンダ、低ＧＰ値：緑、図１５参照）を用いてもよく、３色以上のグラデーションとして表現してもよい。これにより、視覚的にＧＰ値の高低、すなわち、流動度を認識することができる。
【００６７】
得られた画像より、例えば、角層に相当する画像（例えば、最上層から第１極大値を含む面の間の画像）において、高ＧＰ値を示す色彩が優位であれば、流動性が低く、バリア機能が高いことを示す。また、例えば、顆粒層に相当する画像において、低ＧＰ値を示す色彩が優位であれば、流動性が高く、バリア機能が高いことを示す。
【実施例】
【００６８】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。【００６９】
＜細胞の準備＞
本発明に用いられる表皮細胞は、新生児由来ケラチノサイト（以下、「ケラチノサイト」）（クラボウ社、製品名：凍結ＮＨＥＫ（ＮＢ）、カタログ番号：ＫＫ−４００９）を使用した。継代培養は、販売会社から提供されたインストラクションに従い行った。【００７０】
＜実施例１＞
以下の方法によって、三次元培養表皮を作製した。
（１）１２−Ｗｅｌｌ  Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ  Ｈａｎｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔｓ  ０．４μｍ  ＰＥＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、以下、「セルカルチャーインサート」）に、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ  ＣＴＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）をＤＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）で５０倍希釈し、１つのセルカルチャーインサートに８６μＬ滴下し、１．５時間３７℃の条件に維持した。
（２）ＣＥＬＬｓｔａｒｔ  ＣＴＳを除去し、継代回数４の新生児由来ケラチノサイト２２〜２５万個をＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ，Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＣＥＬＬｎＴＥＣ社）５００μＬに分散し、セルカルチャーインサート内に滴下、同じ培地（ＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ，Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）を１ｍＬセルカルチャーインサート外部に滴下し、７２時間３７℃、ＣＯ2インキュベーターで培養した。
（３）セルカルチャーインサート内外のＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍを除去し、ＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ、３Ｄ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｍｅｄｉｕｍ（ＣＥＬＬｎＴＥＣ社）（５０μｇ／ｍＬのＬ（＋）−アスコルビン酸を添加）で置き換え、１６時間３７℃、ＣＯ2インキュベーターで培養した。
（４）セルカルチャーインサート内外の培地を除去し、セルカルチャーインサート内は空気に曝露し、セルカルチャーインサート外に５００μＬ  ＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ、３Ｄ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｍｅｄｉｕｍ（５０μｇ／ｍＬのＬ（＋）−アスコルビン酸を添加）を入れた。
（５）毎日セルカルチャーインサート外の５００μＬ  ＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ、３Ｄ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｍｅｄｉｕｍ（５０μｇ／ｍＬのＬ（＋）−アスコルビン酸を添加）を交換しながら３７℃ＣＯ2インキュベーターで７日間培養した。【００７１】
（６）インサートに新生児由来ケラチノサイトを播種してから１２日目に、２０μＭ  Ｌａｕｒｄａｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を添加したＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ、３Ｄ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｍｅｄｉｕｍ（５０μｇ／ｍＬのＬ（＋）−アスコルビン酸を添加）に交換した。
（７）１３日目に、２０μＭ  Ｌａｕｒｄａｎ及び２μＭ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を添加したＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ、３Ｄ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｍｅｄｉｕｍ（５０μｇ／ｍＬのＬ（＋）−アスコルビン酸を添加）に交換して、培養した。【００７２】
（８−１）１４日目に、バイオプシーパンチを用いて、セルカルチャーインサートと共に三次元培養表皮を直径６ｍｍに打ち抜き、反転させてスライドガラスの上に乗せた。さらにその上に重しを乗せた。反転した状態で、二光子顕微鏡を用いて画像を取得した。なお、Ｌａｕｒｄａｎは、８２０ｎｍで励起させ、４４０ｎｍ及び４９０ｎｍの発光像を検出し、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄは８２０ｎｍで励起させ、６０２ｎｍの発光像を検出し、マージさせた。
（９−１）得られた画像を、ニコン社のＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓを用いて解析し、流動度（ＧＰ）を算出し、流動度分布を作成した。【００７３】
図１は、Ｘ−Ｚ面における三次元培養表皮の蛍光像を示している。図２は、三次元培養表皮の蛍光顕微鏡像、及びその流動度分布を示す。図３は、三次元培養表皮の顆粒層の一細胞に着目した場合の、顆粒層第１層（ＳＧ１）周辺の流動度分布を示す。【００７４】
図１〜３に示すように、上記方法を用いることにより、三次元培養表皮の皮膚バリア機能を評価するために用いられる第１極大値及び第１極小値を決定することができた。【００７５】
＜実施例２＞
実施例１の（１）〜（７）と同一の手順によって、三次元培養表皮を作製した。得られた三次元培養表皮に対し、さらに以下の工程を実施した。【００７６】
（８−２）１４日目に、２００μＬの水または１００ｍＭキシリトールまたは１００ｍＭフルクトースを角層側から添加し、３７℃、ＣＯ2 ５％で２時間インキュベートした。２時間後に溶液を取り除き、３７℃、ＣＯ2 ５％で１時間インキュベートした。１時間後にバイオプシーパンチを用いて、セルカルチャーインサートと共に三次元培養表皮を直径６ｍｍに打ち抜き、反転させてスライドガラスの上に乗せた。さらにその上に重しを乗せた。反転した状態で、二光子顕微鏡を用いて画像を取得した。なお、Ｌａｕｒｄａｎは、８２０ｎｍで励起させ、４４０ｎｍ及び４９０ｎｍの発光像を検出し、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄは８２０ｎｍで励起させ、６０２ｎｍの発光像を検出し、マージさせた。【００７７】
その後、実施例１の（９−１）を実施した。【００７８】
上記の結果を図４（未処理）、図５（水添加）、図６（１００ｍＭ  キシリトール）及び図７（１００ｍＭフルクトース）に示す。図４〜図７の第１極小値（ＧＰSG）の値を図８に示す。結果からも明らかであるように、皮膚のバリア機能を改善する物質であるキシリトール及びフルクトースは、未処理又は水処理の場合と比較して、有意に脂質の流動性を向上させることが明らかとなった。【００７９】
＜実施例３＞
実施例１の（１）〜（７）と同一の手順によって、三次元培養表皮を作製した。得られた三次元培養表皮に対し、さらに以下の工程を実施した。【００８０】
（８−３）１４日目に、２００μＬの水または、皮膚のバリア機能を破壊するアセトン／エーテル（５０％（ｖ／ｖ））を角層側から添加し、室温で３分間インキュベートし、３分後に溶液を取り除いた。これを２回繰り返した。バイオプシーパンチを用いて、セルカルチャーインサートと共に三次元培養表皮を直径６ｍｍに打ち抜き、反転させてスライドガラスの上に乗せた。さらにその上に重しを乗せた。反転した状態で、二光子顕微鏡を用いて画像を取得した。なお、Ｌａｕｒｄａｎは、８２０ｎｍで励起させ、４４０ｎｍ及び４９０ｎｍの発光像を検出し、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄは８２０ｎｍで励起させ、６０２ｎｍの発光像を検出し、マージさせた。【００８１】
その後、実施例１の（９−１）を実施した。【００８２】
図１０の結果からも明らかであるように、皮膚のバリア機能を破壊する物質であるアセトン／エーテルを添加することにより、未処理又は水処理の場合と比較して、有意に脂質の流動性を低下させることが明らかとなった。【００８３】
＜実施例４＞
実施例１の（１）〜（５）と同一の手順によって、三次元培養表皮を作製した。得られた三次元培養表皮に対し、さらに以下の工程を実施した。【００８４】
（６−２）インサートに新生児由来ケラチノサイトを播種してから９日目に、２０μＭ  Ｌａｕｒｄａｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を添加したＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ、３Ｄ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｍｅｄｉｕｍ（５０μｇ／ｍＬのＬ（＋）−アスコルビン酸を添加）に交換した。【００８５】
（７−２）１０日目に、２０μＭ  Ｌａｕｒｄａｎ及び２μＭ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を添加したＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ、３Ｄ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｍｅｄｉｕｍ（５０μｇ／ｍＬのＬ（＋）−アスコルビン酸を添加）に交換して、培養した。【００８６】
（８−４）１１日目に、未処理、２００μＬの水、皮膚のバリア機能を促進するものとして知られるアクアインプール１４０７（１０ｍＭ（１％（ｗ／ｖ））、皮膚のバリア機能を促進せずアクアンプール１４０７と同じ分子量であるポリエチレングリコール１０００（ＰＥＧ）（１０ｍＭ（１％（ｗ／ｖ））、ポリプロピレングルコール１０００（ＰＰＧ）（１０ｍＭ（１％（ｗ／ｖ））を角層側から添加し、３７℃、ＣＯ2 ５％で３０分間インキュベートした。３０分後に溶液を取り除き、３７℃、ＣＯ2 ５％で３０分間インキュベートした。バイオプシーパンチを用いて、セルカルチャーインサートと共に三次元培養表皮を直径６ｍｍに打ち抜き、反転させてスライドガラスの上に乗せた。さらにその上に重しを乗せた。反転した状態で、二光子顕微鏡を用いて画像を取得した。なお、Ｌａｕｒｄａｎは、８２０ｎｍで励起させ、４４０ｎｍ及び４９０ｎｍの発光像を検出し、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄは８２０ｎｍで励起させ、６０２ｎｍの発光像を検出し、マージさせた。【００８７】
その後、実施例１の（９−１）を実施した。【００８８】
図１１および図１２の結果からも明らかであるように、アクアインプール１４０７を添加することにより、未処理、水処理、ＰＥＧ処理又はＰＰＧ処理の場合と比較して、角層において有意に脂質の流動性を低下させることが明らかとなった。【００８９】
＜実施例５＞
実施例４の（１）〜（５）（６−２）（７−２）と同一の手順によって、三次元培養表皮を作製した。得られた三次元培養表皮に対し、さらに以下の工程を実施した。【００９０】
（８−５）１１日目に、２００μＬのＰＢＳ、又は脂質の配向性を緩くする働きをもつオレイン酸・ＰＢＳ溶液（（３％（ｖ／ｖ））を角層側から添加し、３７℃、ＣＯ2 ５％で３０分間インキュベートした。３０分後に溶液を取り除き、３７℃、ＣＯ2 ５％で３０分間インキュベートした。バイオプシーパンチを用いて、セルカルチャーインサートと共に三次元培養表皮を直径６ｍｍに打ち抜き、反転させてスライドガラスの上に乗せた。さらにその上に重しを乗せた。反転した状態で、二光子顕微鏡を用いて画像を取得した。なお、Ｌａｕｒｄａｎは、８２０ｎｍで励起させ、４４０ｎｍ及び４９０ｎｍの発光像を検出し、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄは８２０ｎｍで励起させ、６０２ｎｍの発光像を検出し、マージさせた。【００９１】
その後、実施例１の（９−１）を実施した。【００９２】
図１３および図１４の結果からも明らかであるように、オレイン酸を添加することにより、ＰＢＳ処理の場合と比較して、角層において有意に脂質の流動性を上昇させることが明らかとなった。【００９３】
＜実施例６＞
実施例１の（１）〜（７）（８−１）と同一の手順によって、三次元培養表皮を作製した。得られた三次元培養表皮に対し、さらに以下の工程を実施した。【００９４】
（９−２）得られた画像を、ニコン社のＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓを用いて解析し、１ピクセル毎に流動度（ＧＰ）を算出し、高ＧＰ値をマゼンダ、低ＧＰ値を緑とするグラデーションで描画した（図１５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2019172452.tif 000021
【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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