(57)【要約】  本発明は、キャッサバ粕および／またはビートパルプ由来の糖液からガラクツロン酸を除去し、精製糖液を製造する方法を提供することを課題とし、かかる課題を解決するために、キャッサバ粕および／またはビートパルプを原料とする精製糖液の製造方法であって、工程（１）キャッサバ粕および／またはビートパルプを少なくともポリガラクツロン酸分解活性を有する糖化酵素によって分解し、ガラクツロン酸を含む糖化液を製造する工程、工程（２）前記糖化液を分画分子量１５０〜１，０００の分離膜に通じてろ過して、非透過側にガラクツロン酸を分離除去し、透過側より精製糖液を回収する工程を含む、精製糖液の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャッサバ粕および／またはビートパルプを原料とする精製糖液の製造方法であって、
工程（１）キャッサバ粕および／またはビートパルプを少なくともポリガラクツロン酸分解活性を有する糖化酵素によって分解し、ガラクツロン酸を含む糖化液を製造する工程、
工程（２）前記糖化液を分画分子量１５０〜１，０００の分離膜に通じてろ過して、非透過側にガラクツロン酸を分離除去し、透過側より精製糖液を回収する工程
を含む、精製糖液の製造方法。
【請求項２】
前記糖化液に含まれるガラクツロン酸の濃度が８ｇ／Ｌ以上である、請求項１に記載の精製糖液の製造方法。
【請求項３】
前記糖化酵素がさらにセルラーゼおよび／またはアミラーゼを含む、請求項１または２に記載の精製糖液の製造方法。
【請求項４】
前記精製糖液がグルコースおよび／またはキシロースを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の精製糖液の製造方法。
【請求項５】
前記分離膜の分画分子量が３００〜８００である、請求項１〜４のいずれかに記載の精製糖液の製造方法。
【請求項６】
前記工程（１）の後工程かつ前記工程（２）の前工程として、前記糖化液を分画分子量２，０００〜１００，０００の範囲の分離膜に通じてろ過し、非透過側から少なくともポリガラクツロン酸分解活性を有する糖化酵素を回収し、透過側から糖化液を回収する工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の精製糖液の製造方法。
【請求項７】
前記精製糖液が、前記精製糖液の重量を基準として２重量％以上のグルコースと、前記グルコースの重量に対する重量比率が０．０７８以下のガラクツロン酸とを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の精製糖液の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法により精製糖液を得る工程および当該工程により得られた精製糖液を発酵原料として化学品を製造する工程を含む、化学品の製造方法。
【請求項９】
キャッサバ粕由来の糖液を含む微生物の発酵用原料であって、前記発酵用原料の重量を基準として２重量％以上のグルコースと、前記グルコースの重量に対する重量比率が０．０７８以下のガラクツロン酸とを含む、微生物の発酵用原料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キャッサバ粕および／またはビートパルプ由来の精製糖液の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境保護の観点から、化石燃料の代替を目指し、バイオマスを原料に糖液を製造し、得られた糖液を発酵原料として化学品を製造する検討が進められている。しかしながら、バイオマス由来の糖液には、発酵原料として利用できる糖の他に、発酵を阻害する物質が含まれている場合もある。このような発酵阻害物質には、ヒドロキシメチルフルフラール、フルフラール、バニリン、クマル酸、クマルアミドなどが知られており、バイオマス由来の糖液を精製して、発酵阻害物質を除去する方法が検討されている。【０００３】
特許文献１には、多糖類系バイオマスを加水分解処理して得られる生成物を分離膜で処理することで単糖を濃縮し、ヒドロキシメチルフルフラール、フルフラール、バニリンなどの発酵阻害物質を除去する方法が開示されている。特許文献２には、セルロース含有バイオマスを加水分解し、ナノろ過膜に通じることでクマルアミドやクマル酸などの発酵阻害物質を分離膜の透過側から除去し精製糖液を製造する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００９／１１０３７４号
【特許文献２】国際公開第２０１０／０６７７８５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、様々なバイオマス由来糖液を用いて発酵法による化学品の製造を試みた結果、キャッサバ粕やビートパルプのようなペクチンを多く含有するバイオマス由来の糖液にはペクチンの主な分解物であるガラクツロン酸が含まれており、ガラクツロン酸は、発酵速度の低下を引き起こす発酵阻害物質であることを見出した。ガラクツロン酸による発酵阻害は知られておらず、これまで糖液からガラクツロン酸を除去する方法は検討されていなかった。【０００６】
そこで、本発明では、キャッサバ粕および／またはビートパルプ由来の糖液からガラクツロン酸を除去し、精製糖液を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した課題を解決するべく鋭意研究した結果、キャッサバ粕および／またはビートパルプを酵素で分解して得られた糖化液を、分画分子量１５０〜１，０００の分離膜に通じてろ過することによって、ガラクツロン酸を非透過側に分離除去し、精製糖液を製造できることを見出した。【０００８】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［９］を包含する。
［１］キャッサバ粕および／またはビートパルプを原料とする精製糖液の製造方法であって、
工程（１）キャッサバ粕および／またはビートパルプを少なくともポリガラクツロン酸分解活性を有する糖化酵素によって分解し、ガラクツロン酸を含む糖化液を製造する工程、
工程（２）前記糖化液を分画分子量１５０〜１，０００の分離膜に通じてろ過して、非透過側にガラクツロン酸を分離除去し、透過側より精製糖液を回収する工程
を含む、精製糖液の製造方法。
［２］前記糖化液に含まれるガラクツロン酸の濃度が８ｇ／Ｌ以上である、［１］に記載の精製糖液の製造方法。
［３］前記糖化酵素がさらにセルラーゼおよび／またはアミラーゼを含む、［１］または［２］に記載の精製糖液の製造方法。
［４］前記精製糖液がグルコースおよび／またはキシロースを含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の精製糖液の製造方法。
［５］前記分離膜の分画分子量が３００〜８００である、［１］〜［４］のいずれかに記載の精製糖液の製造方法。
［６］前記工程（１）の後工程かつ前記工程（２）の前工程として、前記糖化液を分画分子量２，０００〜１００，０００の範囲の分離膜に通じてろ過し、非透過側から少なくともポリガラクツロン酸分解活性を有する糖化酵素を回収し、透過側から糖化液を回収する工程を含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の精製糖液の製造方法。
［７］前記精製糖液が、前記精製糖液の重量を基準として２重量％以上のグルコースと、前記グルコースの重量に対する重量比率が０．０７８以下のガラクツロン酸とを含む、［１］〜［６］のいずれかに記載の精製糖液の製造方法。
［８］［１］〜［７］のいずれかに記載の方法により精製糖液を得る工程および当該工程により得られた精製糖液を発酵原料として化学品を製造する工程を含む、化学品の製造方法。
［９］キャッサバ粕由来の糖液を含む微生物の発酵用原料であって、前記発酵用原料の重量を基準として２重量％以上のグルコースと、前記グルコースの重量に対する重量比率が０．０７８以下のガラクツロン酸とを含む、微生物の発酵用原料。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。
本発明では、ガラクツロン酸を含む培地で微生物を培養して化学品の製造を行うと、発酵が阻害され、発酵速度が低下することを新規に見出した。ガラクツロン酸による発酵阻害は、培地中に含まれるガラクツロン酸の濃度が高くなるほど、発酵が阻害され、特にガラクツロン酸が８ｇ／Ｌ以上含まれる培地で培養すると、発酵速度が著しく低下することがわかった。本発明では、ガラクツロン酸濃度が高い糖液を分画分子量１５０〜１，０００の分離膜に通じてろ過することによって、ガラクツロン酸を非透過側に分離除去し、ガラクツロン酸が８ｇ／Ｌ未満の精製糖液を製造することが可能となる。
【００１０】
ガラクツロン酸は、ペクチンを構成する物質である。ペクチンは、ガラクツロン酸がα−１，４結合で連なったポリガラクツロン酸を主成分とした複合多糖類であり、植物の細胞壁などに広く存在することが知られている。ペクチンは加熱等によってゲル化することが知られており、粘度上昇の原因となるため、糖化の際にはペクチンも同様に分解することが好ましい。しかし、キャッサバ粕やビートパルプのようにペクチン含有量の高いバイオマスを少なくともポリガラクツロン酸分解活性を有する糖化酵素によって分解すると、ガラクツロン酸を多く含む糖化液が得られ、ガラクツロン酸を含む糖化液を発酵原料として用いると、発酵が阻害される。
【００１１】
本発明では、キャッサバ粕および／またはビートパルプを原料に用いることができるが、キャッサバ粕がより好ましい。
【００１２】
キャッサバ粕とは、キャッサバの根茎（キャッサバ芋）からデンプンを製造する際の副産物であって、デンプンを取り出した後に排出される残渣のことである。キャッサバ芋からデンプンを製造する方法は、例えば次の方法が挙げられる。最初にキャッサバ芋を洗浄、剥皮し、粗砕する。その後、磨砕機にかけ、組織を粉砕分散する。磨砕分散後、デンプンと繊維分にふるい別けされる。この繊維分がキャッサバ粕である。キャッサバ粕には水分が残存した状態のウエット品と、ウエット品を乾燥させたドライ品があるが、本発明では、いずれも用いることができる。また、どちらか片方のみを用いてもよいし、混合してもよい。本発明に用いる際には、さらに、粉砕処理等を行うことで粒子サイズを調整してもよい。キャッサバ粕は、キャッサバ芋を購入して前述の方法で製造することもできるし、キャッサバ粕排出業者から購入したり、飼料用に市販されているものを購入したりすることもできる。
【００１３】
ビートパルプとは、甜菜（ビート）からショ糖を製造する際の副産物であって、ショ糖を取り出した後に排出される残渣のことである。甜菜からビートパルプを製造する方法は、例えば次の方法が挙げられる。甜菜を磨り潰して糖分を含む汁を絞り出し、繊維粕を回収する。続いて、得られた繊維粕を、アルコール等で洗い流して乾燥させるとビートパルプが得られる。本発明に用いる際には、さらに、粉砕処理等を行うことで粒子サイズを調整してもよい。入手の方法は、甜菜を購入して前述の方法で製造することもできるし、ビートパルプ排出業者から購入したり、飼料用に市販されているものを購入したりすることもできる。
【００１４】
糖化液に含まれるガラクツロン酸の濃度は以下の方法で測定する。
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＳＰＲ−Ｈ、Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＳＣＲ−１０１Ｈ（株式会社島津製作所）
カラム温度：４５℃
検出法：ポストカラムｐＨ緩衝化電気伝導度検出法
移動相：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ  ビストリス、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃
【００１５】
以下に、本発明の精製糖液の製造方法について工程ごとに説明する。
【００１６】
［工程（１）：キャッサバ粕および／またはビートパルプを少なくともポリガラクツロン酸分解活性を有する糖化酵素によって分解し、ガラクツロン酸を含む糖化液を製造する工程］
【００１７】
本発明で用いるポリガラクツロン酸分解活性を有する糖化酵素は、ペクチンの主な構成成分であるポリガラクツロン酸のα−１，４結合を分解する活性を有する糖化酵素であり、ポリガラクツロン酸分解活性は以下の方法により測定する。
【００１８】
１．５ｍＬチューブに１０μＬの１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）、２０μＬの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸、６０μＬの超純水を添加し、５０℃で５分間恒温する。次に、１０μＬの適当に希釈した酵素液を加え、５０℃で３０分間反応させた後、１００μＬのジニトロサリチル酸試薬を添加し、５分間煮沸して還元糖の発色を行い、氷水中で急冷する。続いて、４００μＬの超純水を加え、５３５ｎｍにおける吸光度を測定する。別途、５３５ｎｍにおけるガラクツロン酸標準液の検量線を用意しておき、当該検量線よりガラクツロン酸の生成量を求め、１分間に１μｍｏｌのＤ−ガラクツロン酸相当の還元糖を生成する量を酵素１単位（１Ｕ）として算出する。測定のブランクには、酵素液を加えずに上記と同様にジニトロサリチル酸試薬添加まで処理し、その後酵素液を添加して還元糖の発色を行ったものを用いる。検量線は、０〜２．０ｇ／Ｌの範囲のＤ−ガラクツロン酸標準液にジニトロサリチル酸試薬を加えて、上記と同様に発色させたものを用いる。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのＤ−ガラクツロン酸相当の還元糖を生成する量とする。
【００１９】
本発明で用いるポリガラクツロン酸分解活性を有する糖化酵素は、上記活性測定で、タンパク１ｍｇあたり０．１Ｕ以上の活性を有する糖化酵素を用いることが好ましい。タンパク濃度は、ブラッドフォード法などの既存の方法で測定することができる。
【００２０】
本発明で用いる少なくともポリガラクツロン酸分解活性を有する糖化酵素としてペクチナーゼを用いることができる。ペクチナーゼは、ペクチンを分解する酵素の総称であって、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンメチルエステラーゼなどの種類がある。このうち、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼは、ポリガラクツロン酸分解活性を有する。本発明では、少なくともポリガラクツロン酸分解活性を有していれば、いずれも好ましく用いることができ、少なくともポリガラクツロン酸分解活性を有する酵素と、上記のペクチナーゼとして挙げた酵素とを混合して用いてもよい。また、少なくともポリガラクツロン酸分解活性を有する糖化酵素は、市販の酵素製剤を利用するのが簡便で好ましいが、酵素生産微生物の培養液を直接用いてもよく、精製酵素を用いてもよく、複数の酵素を混合して用いてもよい。市販の酵素製剤の例としては、Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）、ペクチナーゼＰＬ「アマノ」（天野エンザイム株式会社製）などを挙げることができる。当該市販ペクチナーゼは、ポリガラクツロン酸分解活性として、タンパク１ｍｇあたり０．１Ｕ以上の活性を有するため好ましい。
【００２１】
ポリガラクツロン酸分解活性を有する糖化酵素の添加量としては、用いる酵素により効果的かつ経済的に妥当な範囲を適宜設定すればよいが、ペクチン含有バイオマスの乾燥重量１ｇあたりポリガラクツロン酸分解活性として０．０１Ｕ以上が好ましく、より好ましくは０．０５Ｕ以上、さらに好ましくは０．１Ｕ以上である。上限に制限はないが、経済性の観点から、例えば、１００Ｕ以下とすることが好ましい。
【００２２】
バイオマスの乾燥重量は、バイオマスの重量（Ｗａ（ｇ））からバイオマスに含まれる水分の重量を引いた重量である。具体的には、赤外線水分計を用いて、水分割合Ｒｗ（重量％）を測定し、下の式（１）より算出した値を用いる。赤外線水分計には、ＦＤ−７２０（株式会社ケツト科学研究所製）を用い、乾燥温度１０５℃で３０秒間の水分変化量が０．０５％以下になったら測定を停止する自動停止モードにて測定した値を用いる。
乾燥重量（ｇ）＝Ｗａ−Ｗａ×Ｒｗ・・・（式１）
【００２３】
酵素による分解反応の好ましい温度条件は、３０〜６０℃が好ましい。
【００２４】
酵素による分解反応に好ましいｐＨの値は例えば、ｐＨ４〜７が好ましい。ｐＨ調整剤には、既存の酸またはアルカリを用いればよい。酸としては、例えば、塩酸、硫酸などがあげられる。アルカリとしては、例えば、水酸化ナトリウム、アンモニアなどがあげられる。
【００２５】
酵素による分解反応の好ましい処理時間は、酵素による分解反応が十分行われる範囲で設定すればよいが、例えば、１〜２４時間、好ましくは２〜１２時間、さらに好ましくは、３〜８時間である。１時間未満では十分に反応が進まないが、２４時間より長い時間ではコンタミネーションの原因になる。
【００２６】
糖化酵素として、ポリガラクツロン酸分解活性を有する糖化酵素以外にさらに他の糖化酵素を加えてもよい。例えば、デンプンの多いバイオマスであればアミラーゼを、セルロースの多いバイオマスであれば、セルラーゼを添加してペクチン含有バイオマスの分解反応を行えば糖化液に含まれる糖量が増加するため好ましい。これらの酵素処理は、別々に実施してもよいし、酵素処理条件が合えば同時に実施してもよい。アミラーゼを添加して分解反応を行えば糖化液に含まれるグルコース量が増加する。セルラーゼを添加して分解反応を行えば、糖化液に含まれるキシロースやグルコースの量が増加する。
【００２７】
アミラーゼの具体例としては、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ等が存在するが、少なくともグルコアミラーゼを含む１以上の酵素で処理することが好ましい。また、この場合、予めペクチン含有バイオマスを６０℃以上に加熱するなどすることでデンプンの水和反応を促進させておくことが好ましい。
【００２８】
グルコアミラーゼの添加量としては、ペクチン含有バイオマスの乾燥重量１ｇあたりのタンパク濃度として０．００１ｍｇ以上であることが好ましく、０．０１ｍｇ以上であることがより好ましく、０．０２ｍｇ以上であることがさらに好ましい。上限に制限はないが、経済性の観点から、例えば、１０ｍｇ以下とすることができる。
【００２９】
アミラーゼは、市販の酵素製剤を利用するのが簡便で好ましいが、酵素生産微生物の培養液を直接用いてもよく、精製酵素を用いてもよく、複数の酵素を混合して用いてもよい。市販の酵素製剤の例としては、グルコアミラーゼとしては、Ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）、グルクザイムＡＦ６（天野エンザイム株式会社製）、グルクザイムＮＬ４．２（天野エンザイム株式会社製）、ＡＭＹＬＯＧＬＵＣＯＳＩＤＡＳＥ（ＭＥＧＡＺＹＭＥ社製）などが挙げられる。
【００３０】
セルラーゼは、市販の酵素製剤を利用するのが簡便で好ましいが、酵素生産微生物の培養液を直接用いてもよく、精製酵素を用いてもよく、複数の酵素を混合して用いてもよい。市販の酵素製剤の例としては、セルロシンＴＰ２５（エイチビイアイ株式会社製）、アクレモニウムセルラーゼ（Ｍｅｉｊｉ  Ｓｅｉｋａファルマ株式会社製）、メイセラーゼ（Ｍｅｉｊｉ  Ｓｅｉｋａファルマ株式会社製）などが挙げられる。
【００３１】
キャッサバ粕および／またはビートパルプを少なくともポリガラクツロン酸分解活性を有する糖化酵素によって分解する前の工程として、酵素の反応性を高めるための前処理を行ってもよい。前処理の方法は、公知のバイオマスの前処理方法を行えばよく、硫酸、酢酸などによる酸処理、苛性ソーダ、アンモニアなどによるアルカリ処理、水熱処理、亜臨界水処理、蒸煮処理などが挙げられる。これらの処理方法を単独で実施してもよいし、複数の処理方法を組み合わせてもよい。
【００３２】
［工程（２）：前記糖化液を分画分子量１５０〜１，０００の分離膜に通じてろ過して、非透過側にガラクツロン酸を分離除去し、透過側より精製糖液を回収する工程］
【００３３】
工程（１）で得られた糖化液を分画分子量１５０〜１，０００の範囲の分離膜に通じてろ過すると、非透過側にガラクツロン酸を分離除去し、透過側より精製糖液を回収することができる。
【００３４】
本発明の方法で得られる糖化液には、ガラクツロン酸の他にバイオマス由来の糖が含まれている。分画分子量１５０〜１，０００の範囲の分離膜でガラクツロン酸と分離される糖としては、ガラクツロン酸の分子量１９４より小さい分子量を有するヘキソース、ケトヘキソースおよびペントースなどの単糖が好ましい。具体的には、キシロース：分子量１５０、リボース：分子量１５０、アラビノース：分子量１５０、リキソース：分子量１５０、グルコース：分子量１８０、マンノース：分子量１８０、ガラクトース：分子量１８０、フルクトース：分子量１８０などが挙げられ、これらの中でもグルコースおよび／またはキシロースが含まれていることが好ましい。
【００３５】
上記のヘキソース、ケトヘキソースおよびペントースと、ガラクツロン酸とは、構造が類似しており、同程度の分子量を有する物質であるにもかかわらず、これらが含まれる糖化液を分画分子量１５０〜１，０００の範囲の分離膜に通じてろ過すると、透過側にヘキソース、ケトヘキソースおよびペントースが選択的に透過し、非透過側にガラクツロン酸が選択的に濃縮される。
【００３６】
このような分離膜による物質の透過率の違いは、対象物質の阻止率の値を算出して評価することができる。本発明において、対象物質の阻止率は式（２）で算出される。分離膜の処理面積が大きく、クロスフローろ過での非透過側で分離膜を通過する前と後で対象物質の濃度の差が有る場合、「膜非透過側の対象物質の濃度」とは分離膜を通過する前と後の濃度の平均値をいう。また、阻止率は、ろ過濃度の比較であるため、分離膜に供給する重量ベースのマテリアルバランスとは異なる値である。
対象物質の阻止率（％）＝１００−（膜透過側の対象物質の濃度／膜非透過側の対象物質の濃度）×１００・・・（式２）
【００３７】
本発明では、少なくともガラクツロン酸を含む糖化液を分画分子量１５０〜１，０００の範囲の分離膜に通じてろ過した場合、ガラクツロン酸の阻止率が、糖化液に含まれる糖の阻止率と比べて高い値を示す。つまり、ろ過の前後で各糖の、膜の非透過側の割合を比較すると、高い阻止率を示すガラクツロン酸の割合は、ろ過前の割合と比べて向上し、低い阻止率を示す各糖の割合はろ過前の割合と比べて低下する。その結果、ろ過が進むに従って、非透過側からはガラクツロン酸濃縮液を得ることができる。また、透過側からはガラクツロン酸含有率が低い、精製糖液を得ることができる。また、分画分子量３００〜８００の範囲の分離膜を用いると、透過側から糖の割合が高い精製糖液を得ることができるためより好ましい。
【００３８】
本発明でのガラクツロン酸の好ましい阻止率は、２０％以上１００％以下であり、より好ましくは４０％以上１００％以下であり、さらに好ましくは５０％以上１００％以下であり、特に好ましくは６０％以上１００％以下である。
【００３９】
また、単糖の阻止率はガラクツロン酸の阻止率に比べて、４％以上低い値であることが好ましく、１０％以上低い値であることがより好ましく、２０％以上低い値であることがさらに好ましい。
【００４０】
本発明での分離膜の分画分子量とは、溶質の分子量を横軸に、阻止率を縦軸にとってデータをプロットした分画分子量曲線において溶質の阻止率が９０％となる分子量を膜の分画分子量とよぶ。
【００４１】
本発明における分離膜でのろ過方法は特に限定されないが、膜面に対して水平方向の流れが起こるクロスフローろ過が好ましい。これは分画分子量１５０〜１，０００の範囲の分離膜は膜の孔径が極めて小さいため、膜面に対して水平方向の流れがないと膜面に堆積物が付着するなどしてすぐに膜が詰まってしまうためである。水平方向の流れ、すなわち膜面線速度の値としては、好ましくは５ｃｍ／秒以上５０ｃｍ／秒以下、より好ましくは１０ｃｍ／秒以上３０ｃｍ／秒以下である。
【００４２】
分画分子量１５０〜１，０００の分離膜の素材としては、酢酸セルロース系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマーなどの高分子素材を使用することができるが、前記１種類の素材で構成される膜に限定されず、複数の膜素材を含む膜であってもよい。
【００４３】
本発明で用いる分離膜の具体例としては、フィルムテック社製のＮＦ２７０、Ｓｙｎｄｅｒ社製のＮＦＸ、ＮＦＷ、ＮＦＧ、ＸＴ、ＧＥ  Ｗ＆ＰＴ社製のＤＥＳＡＬ  ＧシリーズＧＥ（Ｇ−５）タイプ、ＤＫシリーズ、ＤＬシリーズ、ＨＬシリーズなどがある。
【００４４】
分画分子量１５０〜１，０００の分離膜によるろ過を行う際の前記糖化液の温度は、膜の耐熱温度の範囲であれば特に制限はないが、５０℃以下の温度に調整することが好ましい。また、分画分子量１５０〜１，０００の分離膜によるろ過を行う際の前記糖化液のｐＨは、分離膜および装置の範囲であれば特に制限がないが、好ましくはｐＨ４〜１０であり、より好ましくはｐＨ５〜８である。
【００４５】
工程（１）の後工程かつ工程（２）の前工程としてガラクツロン酸を含む糖化液を分画分子量２，０００〜１００，０００の分離膜に通じてろ過を行って、透過液を工程（２）に用いてもよい。また、当該ろ過により、透過側から得られる糖化液中の固形分を減少させることができるため、工程（２）で使用する分離膜への負荷を低減することができる。この場合、非透過側からは、工程（１）で糖化液の調製に使用した糖化酵素を回収することができる。回収した糖化酵素は再利用することができ、具体的には、工程（１）を繰り返し行う場合や、工程（１）と（２）を連続的に行う場合に再利用することができる。
【００４６】
分画分子量２，０００〜１００，０００の分離膜の好ましい分画分子量の範囲は、分画分子量５，０００〜１００，０００の範囲であり、より好ましくは分画分子量５，０００〜５０，０００の範囲である。
【００４７】
分画分子量２，０００〜１００，０００の分離膜の素材としては、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリフッ化ビニルデン（ＰＶＤＦ）、再生セルロース、セルロース、セルロースエステル、スルホン化ポリスルホン、スルホン化ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリ４フッ化エチレンなどを使用することができる。ただし、前記糖化液をバイオマスの酵素処理により調製する場合、酵素剤にセルロース分解に関わる酵素群が含まれていることがあり、再生セルロース、セルロース、セルロースエステルが分解を受けるため、ＰＥＳ、ＰＶＤＦなどの合成高分子を素材とした分離膜を使用することが好ましい。
【００４８】
本発明で用いる分画分子量２，０００〜１００，０００の分離膜の具体例としては、ＧＥ  Ｗ＆ＰＴ社製ＤＥＳＡＬブランドのＭシリーズ、Ｐシリーズ、ＧシリーズのＧＨ（Ｇ−１０）タイプ、ＧＫ（Ｇ−２０）タイプ、ＧＭ（Ｇ−５０）タイプ、“ＤＵＲＡＴＨＥＲＭ”（登録商標）シリーズのＨＷＳ  ＵＦタイプ、ＳＴＤ  ＵＦタイプや、Ｓｙｎｄｅｒ社製のＶＴ、ＭＴ、ＳＴ、ＳＭ、ＭＫ、ＭＷ、ＬＹ、ＢＮ、ＢＹ、旭化成株式会社製の“マイクローザ”（登録商標）ＵＦシリーズ、日東電工株式会社製のＮＴＲ−７４１０、ＮＴＲ−７４５０などがある。
【００４９】
また、分画分子量２，０００〜１００，０００の分離膜によるろ過の前に糖化液を精密ろ過膜に通じてろ過して微粒子を取り除いてもよい。精密ろ過膜は、平均細孔径が０．０１〜１０μｍ程度の分離膜が好ましく用いられる。
【００５０】
また、分画分子量１５０〜１，０００の分離膜で精製した精製糖液の糖濃度を高めるために、さらに濃縮してもよい。濃縮の方法は、特に限定されず、膜濃縮であっても、蒸発濃縮であっても、それらを組み合わせても構わないが、経済性の観点から、膜濃縮が好ましい。濃縮に用いる分離膜としては、非透過側に単糖を選択的に濃縮できれば特に限定されないが、分画分子量１５０未満の分離膜が好ましい。単糖のロスの観点から、より好ましくは分画分子量１００以下である。
【００５１】
本発明で得られた糖液は、単糖の濃度が高く、また、発酵阻害物質であるガラクツロン酸の濃度が低減しているため、微生物の発酵用原料として好ましく用いることができる。本発明で得られる精製糖液を微生物の発酵用原料として用いる場合には、発酵効率の観点から発酵用原料中に、グルコースが２重量％以上含まれていることが好ましく、かつガラクツロン酸の含有量が、グルコースに対して、０．０７８以下の重量比率であり、さらに好ましくは０．０５５以下である。また、ガラクツロン酸の含有量は、発酵用原料に対して、０．８重量％以下が好ましい。
【００５２】
ここで、特にキャッサバ粕にはデンプンが多く含まれており、乾燥キャッサバ粕あたり約４０〜５０重量％がデンプンで構成されていることが知られている。よって、デンプンを分解することでキャッサバ粕由来の糖液には、微生物が発酵しやすいグルコースが多く含まれているが、グルコースの重量比率に対するガラクツロン酸の重量比率が高く、発酵原料として用いると、発酵が阻害され、発酵速度が低下してしまう。そこで、本発明の方法を用いれば、キャッサバ粕由来の糖液であっても、ガラクツロン酸の濃度を低下させ、グルコースに対するガラクツロン酸の重量比率を低下させることができ、発酵原料として好ましく用いることができる。
【００５３】
この比率の糖液を調製するために、分画分子量１５０〜１，０００の分離膜を用いたろ過を繰り返し行って、ガラクツロン酸の含有比率を低下させてもよい。
【００５４】
得られた精製糖液を発酵原料に使用して、化学品を製造することができる。本発明により、ペクチン含有バイオマス由来の糖化液に含まれるガラクツロン酸が除去されるため、発酵微生物の生育阻害が解消され、発酵速度が向上する。
【００５５】
本発明の方法で得られる精製糖液を発酵原料として化学品を製造する際に利用する微生物は、パン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌などが挙げられる。微生物は自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。ガラクツロン酸による発酵阻害を受けやすい微生物は特に限定されないが、酵母、特にＳａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母が挙げられる。
【００５６】
発酵により得られる化学品としては、微生物や培養細胞が生産する物質であれば特に制限はない。具体例としては、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。例えば、アルコールとしては、エタノール、ブタノール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、グリセロールなど、有機酸としては、酢酸、乳酸、コハク酸、リンゴ酸など、アミノ酸としては、リジン、グルタミン酸など、核酸としては、イノシン酸、グアニル酸、イノシン、グアノシンなどを挙げることができる。また、酵素などのタンパク質、抗生物質などのような物質の生産に適用することもできる。したがって、本発明により様々な化学品を製造することが可能である。
【実施例】
【００５７】
（参考例１）グルコース、キシロース、アラビノースの分析方法
グルコース、キシロース、アラビノースそれぞれの濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＨＩＬＩＣｐａｋ  ＶＧ−５０  ４Ｅ  ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社）
カラム温度：４０℃
検出法：示差屈折計検出器
検出器温度：４０℃
移動相：水：アセトニトリル＝２５：７５
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ【００５８】
（参考例２）ガラクツロン酸の分析方法
ガラクツロン酸は下記に示すＨＰＬＣ条件で標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＳＰＲ−Ｈ、Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＳＣＲ−１０１Ｈ（株式会社島津製作所）
カラム温度：４５℃
検出法：ポストカラムｐＨ緩衝化電気伝導度検出法
移動相：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ  ビストリス、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃【００５９】
（参考例３）キャッサバ粕を原料とした糖化液の調製
キャッサバ粕（含水率１１％）１．５ｋｇに対し、ＲＯ水６．５Ｌ、α−アミラーゼとして熱安定型アミラーゼ（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）を１ｇ加えて混合し、９０℃、２時間オートクレーブした。６Ｎ硫酸（和光純薬株式会社製）にてｐＨを５．０に調整した後、グルコアミラーゼとしてアミログルコシダーゼｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（シグマアルドリッチジャパン合同会社）を１ｇ、ポリガラクツロン酸分解活性を有する糖化酵素としてＰｅｃｔｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ（シグマアルドリッチジャパン合同会社）をキャッサバ粕乾燥重量１ｇあたり１Ｕ加え、撹拌しつつ５０℃で８時間酵素反応し糖化液を得た。得られた糖化液を固液分離して残渣を除去し、液体画分を回収した。液体画分はザルトポア２（ザウトリウスジャパン株式会社製）を用い、精密ろ過を行った。次に、限外ろ過膜ＳＰＥ５０（分画分子量５０，０００、Ｓｙｎｄｅｒｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ社製）を用いて、操作温度３５℃、膜面線速度２０ｃｍ／ｓｅｃの条件下でフラックスが０．１ｍ／Ｄａｙで一定となるように操作圧力を制御しながらろ過を行った。膜処理後のｐＨは４．８であった。透過側から回収したキャッサバ粕の糖化液のグルコース濃度およびガラクツロン酸濃度を分析した結果を表１に示す。【００６０】
【表１】
2019189651.tif 000002
【００６１】
（参考例４）エタノールの分析方法
培養液中のエタノールを下記に示すＨＰＬＣ条件で標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒシリーズ  ＳＨ１０１１（昭和電工）
カラム温度：６５℃
検出法：示唆屈折検出器
検出器温度：４０℃
移動相：０．００５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ【００６２】
（参考例５）ガラクツロン酸添加培地によるエタノール発酵試験
エタノール発酵微生物には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＯＣ−２株）を利用した。５ｍＬのＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で１６時間培養した（前培養）。表２に示す組成の培地にガラクツロン酸０ｇ／Ｌ（培地１）、１ｇ／Ｌ（培地２）、２ｇ／Ｌ（培地３）、４ｇ／Ｌ（培地４）、８ｇ／Ｌ（培地５）、１６ｇ／Ｌ（培地６）をそれぞれ添加し、フィルター（ステリカップ０．２２μｍ、メルクミリポア）に通じてろ過した。培地１〜６をそれぞれ試験管に１０ｍＬはかりとり、濁度が０．５になるように前培養液を添加した。３０℃で培養を行い、２４時間後のエタノール濃度を参考例４の方法で測定し、エタノールの生産速度を算出した。結果を表３に示す。【００６３】
これらの結果により、培地中のガラクツロン酸濃度が高まると、製造されるエタノール濃度が低下し、エタノールの発酵速度も低下することがわかった。特に、ガラクツロン酸濃度が８ｇ／Ｌ以上含まれる培地においては、発酵速度が著しく低下した。【００６４】
【表２】
2019189651.tif 000003
【００６５】
【表３】
2019189651.tif 000004
【００６６】
（比較例１）分画分子量６５の膜を用いたキャッサバ粕由来糖化液の膜分離
分離膜として、膜Ａ：ＵＴＣ−７０（分画分子量６５、東レ株式会社）を使用し、参考例３に記載の方法で調製した２Ｌの糖化液のろ過を行った。膜分離装置は“ＳＥＰＡ”（登録商標）ＣＦ−ＩＩ（有効膜面積１４０ｃｍ２、ＧＥ  Ｗ＆ＰＴ）を使用し、操作温度は３５℃、膜面線速度は２０ｃｍ／ｓｅｃとし、ろ過圧３ＭＰａの条件下で非透過側の液量が０．５Ｌになるまでろ過処理を行った。非透過液を回収し、参考例１の方法でグルコース濃度を、参考例２の方法でガラクツロン酸濃度を、式（２）に従ってガラクツロン酸の阻止率を算出した結果を表４に示す。【００６７】
（比較例２）分画分子量１０，０００の膜を用いたキャッサバ粕由来糖化液の膜分離
分離膜として、膜Ｆ：“ＤＵＲＡＴＨＥＲＭ”（登録商標）ＨＷＳ  ＵＦタイプ（分画分子量１０，０００、ＧＥ  Ｗ＆ＰＴ）を用い、参考例３に記載の方法で調製した２Ｌの糖化液のろ過を行った。膜分離装置は“ＳＥＰＡ”（登録商標）ＣＦ−ＩＩ（有効膜面積１４０ｃｍ２、ＧＥ  Ｗ＆ＰＴ）を使用し、操作温度は３５℃、膜面線速度は２０ｃｍ／ｓｅｃとし、ろ過圧０．１ＭＰａの条件下で非透過側の液量が０．５Ｌになるまでろ過処理を行った。非透過液を回収し参考例１の方法でグルコース濃度を、参考例２の方法でガラクツロン酸濃度を、式（２）に従ってガラクツロン酸の阻止率を算出した結果を表４に示す。【００６８】
（実施例１）分画分子量１５０〜１，０００の膜を用いたキャッサバ粕由来糖化液の膜分離
分離膜として、膜Ｂ：ＮＦＸ（分画分子量１５０−３００、Ｓｙｎｄｅｒ）、膜Ｃ：ＮＦＷ（分画分子量３００−５００、Ｓｙｎｄｅｒ）、膜Ｄ：ＮＦＧ（分画分子量６００−８００、Ｓｙｎｄｅｒ）、膜Ｅ：ＳＰＥ１（分画分子量１０００、Ｓｙｎｄｅｒ）を用い、参考例３に記載の方法で調製した２Ｌの糖化液のろ過を行った。膜分離装置は“ＳＥＰＡ”（登録商標）ＣＦ−ＩＩ（有効膜面積１４０ｃｍ２、ＧＥ  Ｗ＆ＰＴ）を使用し、操作温度は３５℃、膜面線速度は２０ｃｍ／ｓｅｃとし、ろ過圧０．５ＭＰａの条件下で非透過側の液量が０．５Ｌになるまでろ過処理を行った。非透過液を回収し、参考例１の方法でグルコース濃度を、参考例２の方法でガラクツロン酸濃度を、式（２）に従ってガラクツロン酸の阻止率を算出した結果を表４に示す。【００６９】
これらの結果から、分画分子量１５０より小さい分離膜である分離膜Ａで糖化液をろ過した結果、透過液中にグルコースおよびガラクツロン酸はほとんど検出できず、グルコースとガラクツロン酸を分離できないことがわかった。また、分画分子量１，０００より大きい分離膜である分離膜Ｆで糖化液をろ過した結果、透過液中に含まれるグルコースおよびガラクツロン酸の濃度は、ろ過前とほとんど変化がなく、グルコースとガラクツロン酸を分離できないことがわかった。【００７０】
分画分子量１５０〜１０００の範囲の分離膜である膜Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅを用いてろ過した結果、透過液側から回収した精製糖液に含まれるグルコースの割合は増加し、ガラクツロン酸の割合が低下した。すなわち、実施例１の結果から、分画分子量１５０〜１，０００の範囲の分離膜を用いてろ過を行った場合、ガラクツロン酸が非透過側に選択的に除去され、透過側よりガラクツロン酸が除去された精製糖液を回収できることが分かった。また、分画分子量３００〜８００の範囲の分離膜である分離膜Ｃ、Ｄで糖化液をろ過すると、ガラクツロン酸が除去され、かつグルコース濃度の高い精製糖液を得られることがわかった。【００７１】
【表４】
2019189651.tif 000005
【００７２】
（実施例２）キャッサバ粕由来精製糖液の濃縮
実施例１において、膜Ｂ、ＣまたはＤを用いて得られた精製糖液１．５Ｌをそれぞれ比較例１で用いた膜Ａでろ過し、非透過液のグルコース濃度が１２０ｇ／Ｌ程度になるまで精製糖液の濃縮を行った。ろ過操作は比較例１と同様の条件で行った。非透過液を回収し、参考例１の方法でグルコース濃度を、参考例２の方法でガラクツロン酸濃度を分析した結果を表５に示す。
これらの結果により、本操作により精製糖液中の糖濃度を高めることができ、発酵原料としてより利用しやすくなった。【００７３】
（比較例３）キャッサバ粕由来精製糖液の濃縮
実施例１において、膜Ｆを用いて得られた精製糖液１．５Ｌを比較例１で用いた膜Ａでろ過し、非透過液のグルコース濃度が１２０ｇ／Ｌ程度になるまで精製糖液の濃縮を行った。ろ過操作は比較例１と同様の条件で行った。非透過液を回収し、参考例１の方法でグルコース濃度を、参考例２の方法でガラクツロン酸濃度を分析した結果を表５に示す。【００７４】
【表５】
2019189651.tif 000006
【００７５】
（実施例３）キャッサバ粕由来精製糖液を用いたエタノール発酵
実施例１で参考例３の糖化液を分離膜Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅでろ過した精製糖液４種類を発酵原料として利用して、微生物の発酵によるエタノール製造を行い、エタノールの発酵速度を比較した。エタノール発酵微生物には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＯＣ−２株）を利用した。５ｍＬのＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で１６時間培養した（前培養）。試験管に、上記４種類の精製糖液をそれぞれフィルター（ステリカップ０．２２μｍ、メルクミリポア）に通じてろ過したものを９ｍＬはかりとり、さらに２０重量％に調整したコーンスティープリカー（王子コーンスターチ株式会社）１ｍＬを添加し混合した。それぞれの試験管に、濁度が０．５になるように前培養液を添加した。３０℃で培養を行い、７時間後と、１２時間後のエタノール濃度を参考例４の方法で測定した。エタノールの発酵速度の結果を表６に示す。【００７６】
（比較例４）キャッサバ粕由来精製糖液を用いたエタノール発酵
参考例３で調製したキャッサバ粕由来の糖化液を用いた以外は、実施例３と同様の条件・操作で培養を行い、７時間後と、１２時間後のエタノール濃度を参考例４の方法で測定した。エタノールの発酵速度の結果を表６に示す。【００７７】
（比較例５）キャッサバ粕由来精製糖液を用いたエタノール発酵
比較例２で膜Ｆを利用して得られた糖液を用いた以外は、実施例３と同様の条件・操作で培養を行い、７時間後と、１２時間後のエタノール濃度を参考例４の方法で測定した。エタノールの発酵速度の結果を表６に示す。【００７８】
これらの結果から、膜Ｂで処理した糖化液は、その膜Ｃ〜Ｆで処理した糖化液に比べてグルコース濃度が低く、１２時間後の発酵速度は、比較例とほとんど変化しなかったが、７時間後の発酵速度では、比較例に対して生産速度の向上効果が確認できた。よって、実施例３のエタノール発酵速度の値は、比較例４または比較例５のエタノール発酵速度の値と比べて高く、糖化液からガラクツロン酸を除去することによって、エタノールの生産速度が向上することがわかった。【００７９】
【表６】
2019189651.tif 000007
【００８０】
（実施例４）キャッサバ粕由来精製糖液の濃縮液を用いたエタノール発酵
実施例２で得られた精製キャッサバ粕濃縮糖液を用いた以外は、実施例３と同様の条件・操作で培養を行い、２３時間後のエタノール濃度を参考例４の方法で測定した。エタノールの発酵速度の結果を表７に示す。【００８１】
（比較例６）キャッサバ粕由来精製糖液の濃縮液を用いたエタノール発酵
比較例３で得られた精製キャッサバ粕濃縮糖液を用いた以外は、実施例３と同様の条件・操作で培養を行い、２３時間後のエタノール濃度を参考例４の方法で測定した。エタノールの発酵速度の結果を表７に示す。【００８２】
実施例４のエタノール発酵速度の値は、比較例６のエタノール発酵速度の値と比べて高く、糖化液からガラクツロン酸を除去することによって、エタノールの生産速度が向上することがわかった。【００８３】
【表７】
2019189651.tif 000008
【００８４】
（参考例６）ビートパルプを原料とした糖化液の調製
ビートパルプ（含水率１０％）１．０ｋｇに対し、ＲＯ水７．０Ｌ、ポリガラクツロン酸分解活性を有しかつセルラーゼを含む糖化酵素としてアクレモニウムセルラーゼ（Ｍｅｉｊｉ  Ｓｅｉｋａファルマ株式会社製）をビートパルプ乾燥重量１ｇあたり１Ｕ加え、撹拌しつつ５０℃で２３時間酵素反応し糖化液を得た。得られた糖化液を固液分離して残渣を除去し、液体画分を回収した。液体画分はザルトポア２（ザウトリウスジャパン株式会社製）を用い、精密ろ過を行った。次に、限外ろ過膜ＳＰＥ５０（分画分子量５０，０００、Ｓｙｎｄｅｒｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ社製）を用いて、操作温度３５℃、膜面線速度２０ｃｍ／ｓｅｃの条件下でフラックスが０．１ｍ／Ｄａｙで一定となるように操作圧力を制御しながらろ過を行った。膜処理後のｐＨは４．５であった。透過側から回収したピートパルプ糖化液の単糖濃度およびガラクツロン酸濃度を分析した結果を表８に示す。【００８５】
【表８】
2019189651.tif 000009
【００８６】
（比較例７）分画分子量６５の膜を用いたビートパルプ由来糖化液の膜分離
分離膜として、膜Ａ：ＵＴＣ−７０（分画分子量６５、東レ株式会社）を使用し、参考例６に記載の方法で調製した２Ｌの糖化液のろ過を比較例１と同様の方法にて行った。非透過液を回収し、参考例１の方法で単糖濃度を、参考例２の方法でガラクツロン酸濃度を、式（２）に従ってガラクツロン酸の阻止率を算出した結果を表９に示す。【００８７】
（比較例８）分画分子量１０，０００の膜を用いたビートパルプ由来糖化液の膜分離
分離膜として、膜Ｆ：“ＤＵＲＡＴＨＥＲＭ”（登録商標）ＨＷＳ  ＵＦタイプ（分画分子量１０，０００、ＧＥ  Ｗ＆ＰＴ）を用い、参考例６に記載の方法で調製した２Ｌの糖化液のろ過を比較例２と同様の方法にて行った。非透過液を回収し参考例１の方法で単糖濃度を、参考例２の方法でガラクツロン酸濃度を、式（２）に従ってガラクツロン酸の阻止率を算出した結果を表９に示す。【００８８】
（実施例５）分画分子量１５０〜１，０００の膜を用いたビートパルプ由来糖化液の膜分離
分離膜として、膜Ｂ：ＮＦＸ（分画分子量１５０−３００、Ｓｙｎｄｅｒ）、膜Ｃ：ＮＦＷ（分画分子量３００−５００、Ｓｙｎｄｅｒ）、膜Ｄ：ＮＦＧ（分画分子量６００−８００、Ｓｙｎｄｅｒ）、膜Ｅ：ＳＰＥ１（分画分子量１０００、Ｓｙｎｄｅｒ）を用い、参考例６に記載の方法で調製した２Ｌの糖化液のろ過を実施例１と同様の方法で行った。非透過液を回収し、参考例１の方法で単糖濃度を、参考例２の方法でガラクツロン酸濃度を、式（２）に従ってガラクツロン酸の阻止率を算出した結果を表９に示す。【００８９】
【表９】
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【００９０】
これらの結果から、キャッサバ粕糖化液と同様にビートパルプ由来糖化液についても分画分子量１５０〜１０００の範囲の分離膜でろ過すると、ガラクツロン酸が除去され、かつ単糖濃度の高い精製糖液を得られることがわかった。【００９１】
（参考例７）回収酵素液のポリガラクツロン酸分解活性測定
１．５ｍＬチューブに１０μＬの１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）、２０μＬの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸、６０μＬの超純水を添加し、５０℃で５分間恒温する。次に、１０μＬの適当に希釈した回収酵素液を加え、５０℃で３０分間反応させた後、１００μＬのジニトロサリチル酸試薬を添加し、５分間煮沸して還元糖の発色を行い、氷水中で急冷する。続いて、４００μＬの超純水を加え、５３５ｎｍにおける吸光度を測定する。別途、５３５ｎｍにおけるガラクツロン酸標準液の検量線を用意しておき、当該検量線よりガラクツロン酸の生成量を求め、１分間に１μｍｏｌのＤ−ガラクツロン酸相当の還元糖を生成する量を酵素１単位（１Ｕ）として算出する。測定のブランクには、酵素液を加えずに上記と同様にジニトロサリチル酸試薬添加まで処理し、その後酵素液を添加して還元糖の発色を行ったものを用いる。検量線は、０〜２．０ｇ／Ｌの範囲のＤ−ガラクツロン酸標準液にジニトロサリチル酸試薬を加えて、上記と同様に発色させたものを用いる。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのＤ−ガラクツロン酸相当の還元糖を生成する量とする。【００９２】
（実施例６）限外ろ過膜による酵素回収
参考例３の限外ろ過膜ＳＰＥ５０の非透過側の液には、限外ろ過膜で阻止された酵素が回収できる。これを回収酵素液とし、参考例７の方法で回収酵素液あたり（ｍＬ）のポリガラクツロン酸分解活性（Ｕ）を測定した結果を表１０に示す。本結果より、ガラクツロン酸と単糖との膜分離の前工程として限外ろ過膜によるろ過を行うことで、回収した酵素の再利用が可能となり、酵素コストを削減できる。【００９３】
【表１０】
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【００９４】
（実施例７）ｐＨ４−８の条件における膜分離
分離膜として、膜Ｃ：ＮＦＷ（分画分子量３００−５００、Ｓｙｎｄｅｒ）を用い、参考例３に記載の方法でｐＨ４、５、６、７，８に調製した各２Ｌの糖化液のろ過を行った。膜分離装置は“ＳＥＰＡ”（登録商標）ＣＦ−ＩＩ（有効膜面積１４０ｃｍ２、ＧＥ  Ｗ＆ＰＴ）を使用し、操作温度は３５℃、膜面線速度は２０ｃｍ／ｓｅｃとし、ろ過圧０．５ＭＰａの条件下で非透過側の液量が０．５Ｌになるまでろ過処理を行った。非透過液を回収し、参考例１の方法でグルコース濃度を、参考例２の方法でガラクツロン酸濃度を、式（２）に従ってガラクツロン酸の阻止率を、さらに参考例１の方法でグルコース濃度を、式（２）に従ってグルコースの阻止率を算出し、ガラクツロン酸の阻止７とグルコースの阻止率の差を求めた結果を表１１に示す。【００９５】
これらの結果から、ｐＨ４〜８の糖化液において、グルコースとガラクツロン酸を分離可能であることを確認した。また、ｐＨ５以上では、グルコースとガラクツロン酸の阻止率の差が１０％より大きく、より一層分離性能が高いことを確認した。【００９６】
【表１１】
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【国際調査報告】
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