(57)【要約】  本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下して変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株および当該変異株を培養することによりタンパク質を高生産する方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有する、トリコデルマ・リーセイの変異株。
【請求項２】
前記変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｆｕｎｇａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｍｉｄｄｌｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｒｅｇｉｏｎドメイン内でのアミノ酸残基の欠失、置換または付加の変異である、請求項１に記載の変異株。
【請求項３】
前記変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から６７７番目のセリン残基のセリン以外のアミノ酸残基への変異である、請求項１または２に記載の変異株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の変異株を培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の変異株を培養する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載のセルラーゼの製造方法によりセルラーゼを製造する工程および前記工程で得られたセルラーゼを用いてセルロース含有バイオマスを糖化する工程を含む、糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質製造能が向上するトリコデルマ・リーセイの変異株および当該変異株を用いたタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリコデルマ・リーセイは、高いタンパク質製造能を有していることが知られており、これまで同糸状菌を用いたタンパク質の製造の検討が行われてきた。トリコデルマ・リーセイは、タンパク質の中でも特に糖化酵素に分類されるセルラーゼを製造する能力に優れており、例えばセルラーゼ製造量をさらに向上させるため、セルラーゼ製造を制御する因子の過剰発現や欠損が行われている。【０００３】
非特許文献１では、トリコデルマ・リーセイのセルラーゼの製造を制御する因子の中でも、セルラーゼの製造を抑制する転写因子であるＣｒｅ１の機能を低下させることにより高いセルラーゼ製造能を有するトリコデルマ・リーセイの変異株が取得されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊｕｌｉａｎｏ  Ｐ，Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ｈｙｐｅｒ−ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ  ｍｕｔａｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｉｎ  Ｊａｐａｎ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,  Ｖｏｌｕｍｅ ７７，  ２０１３，  Ｉｓｓｕｅ  ３，  Ｐ５３４−５４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のとおり、トリコデルマ・リーセイのタンパク質製造を制御する因子の一つである転写因子が解明されているが、これは、制御機構の一部にすぎないと考える。そこで本発明では、トリコデルマ・リーセイのタンパク質製造を制御する新規因子を探索し、タンパク質製造能が強化されたトリコデルマ・リーセイの変異株の取得および当該トリコデルマ・リーセイの変異株を用いたタンパク質の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、これまで知られていなかったタンパク質製造が向上する新規制御因子を解明できれば、トリコデルマ・リーセイのタンパク質の製造量をさらに向上させることができると考え、鋭意検討した結果、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド内に変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株を培養することにより、タンパク質生産性を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）で構成される。
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有する、トリコデルマ・リーセイの変異株。
（２）前記変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのｆｕｎｇａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｍｉｄｄｌｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｒｅｇｉｏｎドメイン内でのアミノ酸残基の欠失、置換または付加の変異である、（１）に記載の変異株。
（３）前記変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から６７７番目のセリン残基のセリン以外のアミノ酸残基への変異である、（１）または（２）に記載の変異株。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の変異株を培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。
（５）（１）〜（３）のいずれかに記載の変異株を培養する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
（６）（５）に記載のセルラーゼの製造方法によりセルラーゼを製造する工程および前記工程で得られたセルラーゼを用いてセルロース含有バイオマスを糖化する工程を含む、糖の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下したトリコデルマ・リーセイの変異株は、当該変異導入前の親株と比較して、タンパク質の製造能が向上し、タンパク質を高生産することが可能となる。さらに、製造されるタンパク質がセルラーゼの場合には、セルラーゼの各種比活性も向上するという予想外の効果も得られる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、もともとタンパク質の製造能に優れる微生物であるトリコデルマ・リーセイの親株に変異を導入することによって、さらにタンパク質製造能を高めることを特徴としている。具体的には、本発明はトリコデルマ・リーセイの変異株に関するものであり、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下することを特徴としている。
【００１０】
本発明で用いるトリコデルマ・リーセイの親株は野生株には制限されず、タンパク質製造能が高まるように改良された変異株も親株として好ましく用いることができ、例えば、変異剤や紫外線照射などで変異処理を施し、タンパク質の製造性が向上した変異株を上記親株として利用することができる。上記親株の具体例としては、トリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ株（ＮＢＲＣ３１３２６）、ＱＭ９４１４株（ＮＢＲＣ３１３２９）、ＰＣ−３−７株（ＡＴＣＣ６６５８９）、ＱＭ９１２３株（ＮＢＲＣ３１３２７）、ＲｕｔＣ−３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）、ＣＬ−８４７株（Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０，３４１−３４６（１９８８））、ＭＣＧ７７株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｓｙｍｐ．８，  ８９（１９７８））、ＭＣＧ８０株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１２，４５１−４５９（１９８２））及びこれらの派生株などが挙げられる。なお、ＱＭ６ａ株、ＱＭ９４１４株、ＱＭ９１２３株はＮＢＲＣ（ＮＩＴＥ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）より、ＰＣ−３−７株、ＲｕｔＣ−３０株はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手することができる。
【００１１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有する全長７７４アミノ酸のポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＲ５００３０）としても登録されている。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、機能未知のポリペプチドであるが、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｔｏｏｌによれば、Ｎ末端側から２８０〜７１０番目のアミノ酸残基はｆｕｎｇａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｍｉｄｄｌｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｒｅｇｉｏｎドメインを有すると開示されている。この記載により、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、少なくとも糸状菌の転写調節に関与していると推定される。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号１で表される塩基配列が挙げられる。
【００１２】
本発明における、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を欠損または低下させる方法としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全欠損、ｆｕｎｇａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｍｉｄｄｌｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｒｅｇｉｏｎドメインの全欠損、ｆｕｎｇａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｍｉｄｄｌｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｒｅｇｉｏｎドメインの一部欠損させるような変異を導入する方法が挙げられ、具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子配列に対して、塩基の欠失、挿入、置換などによりフレームシフト変異やストップコドン変異を導入する方法が挙げられる。
【００１３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはｆｕｎｇａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｍｉｄｄｌｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｒｅｇｉｏｎドメインの欠損とは、そのポリペプチドまたはドメインが全て無くなる、一部が無くなる、全てが異なるアミノ酸に変わる、一部が異なるアミノ酸に変わる、またそれらの組み合わせのことを指す。さらに具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列と配列同一性が８０％以下になることを指し、好ましくは５０%以下であり、さらに好ましくは２０％以下であり、さらに好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは３％以下であり、さらに好ましくは１％以下であり、最も好ましくは０％である。
【００１４】
ｆｕｎｇａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｍｉｄｄｌｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｒｅｇｉｏｎドメイン内に位置するアミノ酸配列に欠失、置換、または付加などの変異がおこることによって、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する具体例としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から６７７番目のセリン残基が、セリン以外のアミノ酸残基に変異していることが好ましく、特に好ましくはフェニルアラニンへ変異していることが好ましい。
【００１５】
配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から６７７番目のセリン残基がセリン以外のアミノ酸残基に変異したアミノ酸配列をコードする塩基配列の具体例としては、配列番号１で表される塩基配列において、２５８８番目の塩基であるシトシンがチミンへ変異した配列が挙げられる。当該変異により、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から６７７番目のアミノ酸残基がセリンからフェニルアラニンへ変異する。
【００１６】
また、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現を低下させる、または発現を消失させる変異を導入することによっても、当該ポリペプチドの機能を低下させてもよく、具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子のプロモーターやターミネーター領域の変異によるポリペプチドの発現量の低下または消失によるものであってもよい。一般的にプロモーターとターミネーター領域は、転写に関与する遺伝子の前後数百塩基の両気に相当し、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの転写に関与するプロモーターとターミネーターを含む塩基配列の具体例としては、配列番号１で表される塩基配列が挙げられる。
【００１７】
上記の遺伝子の変異導入は、当業者によって公知の変異剤または紫外線照射などによる変異処理、選択マーカーを用いた相同組換えなどの遺伝子組換え、あるいはトランスポゾンによる変異など、既存の遺伝子変異方法を用いることができる。
【００１８】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株は以下の方法で取得することができる。
【００１９】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全ての機能が欠損または低下した変異株は、親株となるトリコデルマ・リーセイの胞子に対して、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、紫外線などを用いて遺伝子変異処理を行い、得られた変異株の遺伝子を解析して、上記の変異を有する変異株をスクリーニングすることで、取得できる。
【００２０】
本発明の変異株は、当該変異導入前の親株と比較し、タンパク質の製造能が向上するため、本発明の変異株の培養液は、同一の培養条件にて得られた当該変異導入前の親株の培養液と比較して、タンパク質濃度が増加する。また、タンパク質が酵素の場合には、酵素の比活性が増加する。ここで、タンパク質濃度の増加率や酵素の比活性の増加率は、増加していれば特に限定はされないが、２０％以上であることが好ましい。
【００２１】
本発明の変異株は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異以外にも、タンパク質製造量の向上および／または培養液の粘度が低下し培養液中の溶存酸素飽和度の低下が抑制される変異を有していてもよい。具体例としては、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異が挙げられる。
【００２２】
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎのＥＧＲ５０６５４として登録されている。配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは機能未知のポリペプチドであるが、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｅｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｔｏｏｌによれば、Ｎ末端側から９５番目〜２７７番目のアミノ酸残基はＭｉｄｄｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４Ｇドメイン（以降ＭＩＦ４Ｇドメインと記載する。）、Ｎ末端側から３８０番目〜４８５番目のアミノ酸残基はＭＡ−３ドメインを有すると開示されている。ＭＩＦ４ＧおよびＭＡ−３の両ドメインは、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合する機能を有することが知られている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４，１２２６５−１２２７２（２００５）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１，１４７−１５６（２００７））。これらの記載により配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、少なくともＤＮＡおよび／またはＲＮＡに結合する機能を有すると推定される。
【００２３】
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号４で表される塩基配列が挙げられる。ＥＧＲ５０６５４の機能が低下または欠損する遺伝子変異とは、ＥＧＲ５０６５４が有するＭＩＦ４Ｇドメインおよび／またはＭＡ−３ドメインの全欠損、ＭＩＦ４Ｇドメインおよび／またはＭＡ−３ドメインの一部欠損、ＭＩＦ４ＧドメインとＭＡ−３ドメインとの立体配置関係の変化する遺伝子変異が挙げられる。さらに、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下や消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下または欠損させることができる。配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号４で表される塩基配列において、１０３９番目から１０４４番目のいずれかの塩基が欠失する変異が挙げられる。
【００２４】
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損することにより、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損しないトリコデルマ・リーセイと比較し、タンパク質の生産性が向上する。
【００２５】
配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎのＥＧＲ４４４１９として登録されている。配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは機能未知のポリペプチドであるが、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｅｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｔｏｏｌによれば、Ｎ末端側から２６〜４９９番目のアミノ酸残基は「Ｓｕｇａｒ（ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ）  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインを有すると開示されている。この記載により配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、少なくとも菌体の内側と外側の間における糖の輸送に関与していると推定される。
【００２６】
配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号６で表される塩基配列が挙げられる。ＥＧＲ４４４１９の機能が低下または欠損する遺伝子変異とは、ＥＧＲ４４４１９が有するＳｕｇａｒ（ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ）  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインの全欠損、Ｓｕｇａｒ（ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ）  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインの一部欠損、Ｓｕｇａｒ（ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ）  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインの立体配置関係の変化する遺伝子変異が挙げられる。さらに、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下や消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下または欠損させることができる。配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号６で表される塩基配列での１４１５番目に１１塩基が挿入する変異が挙げられる。
【００２７】
配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損することにより、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損しないトリコデルマ・リーセイと比較し、タンパク質の生産性およびβ−グルコシダーゼの比活性が向上する。
【００２８】
配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ６ａ株が持つｂｅｔａ−ａｄａｐｔｉｎ  ｌａｒｇｅ  ｓｕｂｕｎｉｔのＥＧＲ４８９１０として登録されている。配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、真核生物に広く保存されているクラスリンと結合する細胞内外や菌体内外の輸送に関与する小胞を構成するアダプタープロテインを構成するタンパク質のひとつである（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０１,１４１０８−１４１１３（２００４））。
【００２９】
配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号８で表される塩基配列が挙げられる。ＥＧＲ４８９１０の遺伝子変異とは、配列番号８で表される塩基配列での１０８０番目の塩基であるシトシンのアデニンへの変異が挙げられる。
【００３０】
配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド内に変異を有することにより、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド内に変異を有さないトリコデルマ・リーセイと比較し、液体培養時の培養液の粘性が低下する。
【００３１】
配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎのＥＧＲ４５８２８として登録されている。配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは機能未知のポリペプチドであるが、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｅｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｔｏｏｌによれば、Ｎ末端側から８６〜１８６番目のアミノ酸残基はｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＳＦ）−ｔｙｐｅ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインと開示されている。ＨＳＦ−ｔｙｐｅ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインは、ヒートショックプロテインの発現を制御する転写因子であるＨＳＦをコードする遺伝子の上流域に結合する機能を有することが知られている（Ｃｅｌｌ，６５（３），３６３−３６６（１９９１））。
【００３２】
配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号１０で表される塩基配列が挙げられる。ＥＧＲ４５８２８の機能が低下または欠損する遺伝子変異とは、ＥＧＲ４５８２８が有するＨＳＦ−ｔｙｐｅ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインの全欠損、ＨＳＦ−ｔｙｐｅ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインの一部欠損、ＨＳＦ−ｔｙｐｅ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインの立体配置関係の変化する遺伝子変異が挙げられる。さらに、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下や消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下または欠損させることができる。配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号１０で表される塩基配列において、８５番目にグアニン１塩基が挿入するフレームシフトを引き起こす変異が挙げられる。
【００３３】
配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損することにより、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損しないトリコデルマ・リーセイと比較し、タンパク質の生産性が向上する。
【００３４】
配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＲ４７１５５）としても登録されている。配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは機能未知のポリペプチドであるが、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｅｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｔｏｏｌによれば、Ｎ末端側から３６２番目〜５５３番目のアミノ酸残基はＴＬＤドメインと開示されている。ＴＬＤドメインは機能未知である。配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号１２で表される塩基配列が挙げられる。ＥＧＲ４７１５５の機能が低下または欠損する遺伝子変異とは、ＥＧＲ４７１５５が有するＴＬＤドメインの全欠損、ＴＬＤドメインの一部欠損、ＴＬＤドメインの立体配置関係の変化する遺伝子変異が挙げられる。さらに、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下や消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下または欠損させることができる。配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号１２で表される塩基配列において、６番目に配列番号１３で表される４６塩基が挿入するフレームシフト変異が挙げられる。
【００３５】
配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損することにより、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損しないトリコデルマ・リーセイと比較し、タンパク質の生産性が向上する。
【００３６】
配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＲ４８０５６）としても登録されている。配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは機能未知のポリペプチドであるが、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｅｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｔｏｏｌによれば、Ｎ末端側から１３０番目〜１７２番目のアミノ酸残基はＦ−ｂｏｘドメインと開示されている。Ｆ−ｂｏｘドメインは、細胞周期を制御するタンパク質内に見られるドメインであることが知られている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５，２４１７−２４２２（１９９８））。配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号１５で表される塩基配列が挙げられる。ＥＧＲ４８０５６の機能が低下または欠損する遺伝子変異とは、ＥＧＲ４８０５６が有するＦ−ｂｏｘドメインの全欠損、Ｆ−ｂｏｘドメインの一部欠損、Ｆ−ｂｏｘドメインの立体配置関係の変化する遺伝子変異が挙げられる。さらに、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下や消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下または欠損させることができる。配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号１５で表される塩基配列において、４９９番目のシトシンが一塩基欠損するフレームシフト変異が挙げられる。配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損することにより、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損しないトリコデルマ・リーセイと比較し、タンパク質の生産性が向上する。
【００３７】
配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ６ａ株が持つｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ４１，ｐａｒｔｉａｌ（ＥＧＲ４６４７６）としても登録されている。ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ４１は、２量体の複合体で構成されているタンパク質（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２７，２０８０−２７８８（２００８））であり、翻訳直後の新生タンパク質がゴルジ複合体を通過する過程において、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）をアミノ酸残基であるセリンまたはスレオニン残基に転移させる機能（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１１，２８０−２８１（１９９５））を有している。配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号１７で表される塩基配列が挙げられる。
【００３８】
ＥＧＲ４６４７６の機能が低下または欠損する遺伝子変異とは、ＥＧＲ４６４７６が有するｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ４１，ｐａｒｔｉａｌの全欠損、ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ４１，ｐａｒｔｉａｌの一部欠損、ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ４１，ｐａｒｔｉａｌの立体配置関係の変化する遺伝子変異が挙げられる。さらに、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下や消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下または欠損させることができる。配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号１７で表される塩基配列において、６２６１番目のシトシンがアデニンへ変異することによりストップコドンが挿入する変異が挙げられる。配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損することにより、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損しないトリコデルマ・リーセイと比較し、タンパク質の生産性が向上する。
【００３９】
また、本発明は前記変異株を培養する工程を含むタンパク質の製造方法に関する。
【００４０】
培養方法は特に限定されず、例えば遠沈管、フラスコ、ジャーファーメンター、タンクなどを用いた液体培養や、プレートなどを用いた固体培養などで培養することができる。トリコデルマ・リーセイは、好気的条件で培養することが好ましく、これらの培養方法の中でも、特にジャーファーメンターや、タンク内に通気や撹拌を行いながら培養する深部培養が好ましい。通気量は、０．１〜２．０ｖｖｍ程度が好ましく、０．３〜１．５ｖｖｍがより好ましく０．５〜１．０ｖｖｍが特に好ましい。培養温度は、２５〜３５℃程度が好ましく、２５〜３１℃がより好ましい。培養におけるｐＨの条件は、ｐＨ３．０〜７．０が好ましく、ｐＨ４．０〜６．０がより好ましい。培養時間は、タンパク質が生産される条件で、回収可能な量のタンパク質が蓄積されるまで行う。通常、２４〜２８８時間、好ましくは２４〜２４０時間、より好ましくは３６〜２４０時間、さらに好ましくは３６〜１９２時間である。
【００４１】
本発明で製造するタンパク質は特に制限はないが、菌体外に分泌されるタンパク質を効率的に製造することができ、中でも好ましくは酵素であり、より好ましくはセルラーゼ、アミラーゼ、インベルターゼ、キチナーゼ、ペクチナーゼ等の糖化酵素であり、さらに好ましくはセルラーゼである。
【００４２】
本発明で製造されるセルラーゼには、様々な加水分解酵素が含まれており、キシラン、セルロース、ヘミセルロースに対する分解活性を持つ酵素などが含まれている。具体例としては、セルロース鎖の加水分解によりセロビオースを製造するセロビオハイドラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）、セルロース鎖の中央部分から加水分解するエンドグルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）、セロオリゴ糖およびセロビオースを加水分解するβ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）、ヘミセルロースや特にキシランに作用することを特徴とするキシラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８）、キシロオリゴ糖を加水分解するβ−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３７）などが挙げられる。
【００４３】
本発明のトリコデルマ・リーセイ変異株が親株と比較してタンパク質の製造能が向上していることや、セルラーゼの比活性が向上していることは、変異株および親株を同じ条件で培養して得られる培養液を以下の方法により測定されるタンパク質濃度やβ−グルコシダーゼ比活性、β−キシロシダーゼ比活性およびセロビオハイドロラーゼ比活性からなる群から選択されるいずれか１種以上の比活性の比較により確認する。
【００４４】
タンパク質濃度は、変異株および親株の培養液を１５，０００×ｇで１０分間遠心分離して得られた上清を希釈し、Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ  プロテインアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）２５０μＬに希釈した上清を５μＬ添加し、室温で１５分間静置後の５９５ｎｍで用いる吸光度を測定する。牛血清アルブミン溶液を標準液とし、検量線に基づいて糖化酵素溶液に含まれるタンパク質濃度を算出する。
【００４５】
β−グルコシダーゼ比活性は、前記培養液上清に、まず、１ｍＭのｐ−ニトロフェニル−β−グルコピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加して３０℃で１０分間反応させる。次に２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定する。最後に１分間あたり１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕとして比活性を算出する。
【００４６】
β−キシロシダーゼ比活性は、前記培養液上清に、まず、１ｍＭのｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で３０分間反応させ、次に、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定する。最後に１分間あたり１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕとして比活性を算出する。
【００４７】
セロビオハイドロラーゼ比活性は、前記培養液上清に、まず、１ｍＭのｐ−ニトロフェニル−β−ラクトピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で６０分間反応させ、次に、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定する。最後に、１分間あたり１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕとして比活性を算出する。本発明の変異株の培養工程に用いる培地の組成は、トリコデルマ・リーセイがタンパク質を製造できるような培地組成となっていれば特に制限はなく、トリコデルマ属菌の周知の培地組成を採用することができる。窒素源としては、例えば、ポリペプトン、肉汁、ＣＳＬ、大豆かすなどを用いることができる。また、培地には、タンパク質を製造させるための誘導物質を添加してもよい。
【００４８】
本発明によりセルラーゼを製造する場合には、培地にラクトース、セルロースおよびキシランからなる群から選択される少なくとも１種類または２種類以上の誘導剤を含む培地で培養することができる。また、セルロースやキシランは、セルロースやキシランを含むバイオマスを誘導物質として添加してもよい。セルロールやキシランを含有するバイオマスの具体例としては、種子植物、シダ植物、コケ植物、藻類、水草などの植物の他、廃建材なども用いることができる。種子植物は、裸子植物と被子植物に分類されるが、どちらも好ましく用いることができる。被子植物はさらに単子葉植物と双子葉植物に分類されるが、単子葉植物の具体例としては、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、コーンコブ、稲わら、麦わらなどが挙げられ、双子葉植物の具体例としては、ビートパルプ、ユーカリ、ナラ、シラカバなどが好ましく用いられる。
【００４９】
また、セルロースやキシランを含むバイオマスは、前処理されたものを用いてもよい。前処理方法は特に限定されないが、例えば、酸処理、硫酸処理、希硫酸処理、アルカリ処理、水熱処理、亜臨界処理、微粉砕処理、蒸煮処理、など公知の手法を用いることができる。このような前処理をされたセルロールやキシランを含むバイオマスとして、パルプを用いてもよい。
【００５０】
前記変異株を培養した培養液に含まれるタンパク質を回収する方法は特に限定されないが、前記変異株の菌体を培養液から除去し、タンパク質を回収することができる。菌体の除去方法としては、遠心分離法、膜分離法、フィルタープレス法などが例として挙げられる。
【００５１】
また、前記変異株を培養した培養液から菌体を除去せずに、タンパク質の溶解液として利用する場合には、培養液中でトリコデルマ・リーセイの変異株が生育できないように処理することが好ましい。菌体が生育できないように処理する方法としては、熱処理、薬剤処理、酸・アルカリ処理、ＵＶ処理などが挙げられる。
【００５２】
タンパク質が酵素の場合には、上記のように菌体を除去又は生育していないように処理した培養液を、そのまま酵素液として利用することができる。
【００５３】
また、製造対象であるタンパク質がセルラーゼの場合には、当該セルラーゼを用いて、セルロース含有バイオマスを糖化して、糖を製造することができる。また、前記変異株を培養して得られるセルラーゼは、前記変異導入前の親株を培養して得られるセルラーゼと比較して特にβ−グルコシダーゼの比活性が高いため、効率的にセルロース含有バイオマスを分解してグルコース濃度の高い糖液を得ることができ、より多くの糖を得ることができる。
【００５４】
本発明で用いるセルロース含有バイオマスは、上記の誘導剤として記載したセルロースを含むバイオマスと同様のバイオマスや、前処理されたバイオマスを用いることができる。
【００５５】
糖化反応の条件は、特に限定されないが、糖化反応の温度は、２５〜６０℃の範囲であることが好ましく、特に３０〜５５℃の範囲であることがより好ましい。糖化反応の時間は、２時間〜２００時間の範囲であることが好ましい。糖化反応のｐＨは、ｐＨ３．０〜７．０の範囲が好ましく、ｐＨ４．０〜６．０の範囲であることがさらに好ましい。トリコデルマ属由来セルラーゼの場合、その反応最適ｐＨは５．０である。さらに、加水分解の過程でｐＨの変化が起きるため、反応液に緩衝液を添加する、あるいは酸やアルカリを用いて一定ｐＨを保持しながら実施することが好ましい。
【００５６】
糖化液から酵素を分離回収する場合には、糖化液を限外ろ過膜などでろ過し、非透過側に回収することができる、必要に応じてろ過の前工程として、糖化液から固形分を取り除いておいてもよい。回収した酵素は、再び糖化反応に用いることができる。
【実施例】
【００５７】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。【００５８】
＜参考例１＞タンパク質濃度測定条件
使用するタンパク質濃度測定試薬：Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｂｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ製
測定条件
測定温度：室温
タンパク質濃度測定試薬：２５０μＬ
糸状菌の培養液：５μＬ
反応時間：５分
吸光度：５９５ｎｍ
標準品：ＢＳＡ。【００５９】
＜参考例２＞セルラーゼの比活性の測定条件
（β−グルコシダーゼ比活性の測定条件）
基質：ｐ−ニトロフェニル−β−グルコピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）
反応液：１ｍＭのｐ−ニトロフェニル−β−グルコピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬ
酵素希釈液：１０μＬ
反応温度：３０℃
反応時間：１０分間
反応停止剤：２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬ
吸収度：４０５ｎｍ。【００６０】
（β−キシロシダーゼ比活性の測定条件）
基質：ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）
反応液：１ｍＭのｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬ
酵素希釈液：１０μＬ
反応温度：３０℃
反応時間：１０分間
反応停止剤：２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬ
吸収度：４０５ｎｍ。【００６１】
（セロビオハイドロラーゼ比活性の測定条件）
基質：ｐ−ニトロフェニル−β−ラクトピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）
反応液：１ｍＭのｐ−ニトロフェニル−β−ラクトピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬ
酵素希釈液：１０μＬ
反応温度：３０℃
反応時間：１０分間
反応停止剤：２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬ
吸収度：４０５ｎｍ。【００６２】
＜参考例３＞セルロース含有バイオマスの糖化試験
セルロース含有バイオマスとして、Ａｒｂｏｃｅｌ（登録商標）  Ｂ８００（レッテンマイヤー社製）または平均粒径１００μｍに粉末化したバガスを用いた。酵素液としては、トリコデルマ・リーセイまたはトリコデルマ・リーセイ変異株の培養液を１ｍＬ採取して遠心分離し、菌体を除去した上清を回収し、さらに０．２２μｍのフィルターでろ過したろ液を用いた。【００６３】
（糖化反応）
糖化反応の緩衝液として１Ｍ  酢酸ナトリウムバッファー１００μＬ、雑菌の繁殖防止として５０ｇ／Ｌ  エリスロマイシン溶液２μＬ、糖化対象物として、Ａｒｂｏｃｅｌ（登録商標）Ｂ８００（レッテンマイヤー株式会社製）または平均粒径１００μｍに粉末化したバガスをそれぞれ０．１ｇ用いた。また、酵素液は、Ａｒｂｏｃｅｌ（登録商標）  Ｂ８００を用いたフラスコ培養により得られた酵素液は、Ａｒｂｏｃｅｌ（登録商標）  Ｂ８００を糖化対象物とした場合は４５０μＬ、粉末バガスを糖化対象物とした場合は４００μＬ用いた。ラクトースを用いたフラスコ培養により得られた酵素液は、Ａｒｂｏｃｅｌ（登録商標）  Ｂ８００を糖化対象物とした場合は３５０μＬ、粉末バガスを糖化対象物とした場合は４００μＬそれぞれ添加し、計１ｍＬになるよう滅菌水でメスアップしたものを２ｍＬチューブに入れた。５０℃の温度条件で２４時間糖化反応を行い、糖化物を遠心分離した上清を糖化液として回収し、回収した糖化液の１０分の１量の１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を添加して、酵素反応を停止させた。反応停止後の糖化液中のグルコース濃度を下記に示すＵＰＬＣで測定した。【００６４】
（グルコース濃度の測定）
グルコースは、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  システム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて、以下の条件で定量分析した。グルコースの標品で作製した検量線をもとに、定量分析した。
カラム：ＡＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ  １．７μｍ  ２．１×１００ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ
分離法：ＨＩＬＩＣ
移動相：移動相Ａ：８０％アセトニトリル、０．２％ＴＥＡ水溶液、移動相Ｂ：３０％アセトニトリル、０．２％ＴＥＡ水溶液とし、下記グラジエントに従った。グラジエントは下記の時間に対応する混合比に到達する直線的なグラジエントとした。
開始条件：（Ａ９９．９０％、Ｂ０．１０％）、開始２分後：（Ａ９６．７０％、Ｂ３．３０％）、開始３．５分後：（Ａ９５．００％、Ｂ５．００％）、開始３．５５分後：（Ａ９９．９０％、Ｂ０．１０％）、開始６分後：（Ａ９９．９０％、Ｂ０．１０％）。
検出方法：ＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出器）
流速：０．３ｍＬ/ｍｉｎ
温度：５５℃。【００６５】
＜実施例１＞配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを欠損させたトリコデルマ・リーセイの変異株の作製
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする配列番号１で表される遺伝子を選択マーカーとしてアセトアミド、選択マーカー遺伝子としてアセトアミドを分解することができるアセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）と置き換えることで破壊する。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を欠損させるため、配列番号１８で表される遺伝子配列からなるＤＮＡ断片を作製し、当該ＤＮＡ断片をトリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株に形質転換して配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株を作製する。この方法により、配列番号１で表される塩基配列が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株が得られる。ａｍｄＳを含むＤＮＡ配列の上流および下流に、上記の配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片を導入するために、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株の遺伝子配列と相同的な部分を付加するように変異導入用プラスミドを作製する。【００６６】
具体的には、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株から定法に従って抽出したゲノムＤＮＡと配列番号１９および２０で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＰａｃＩとＮｏｔＩで処理したＤＮＡ断片を上流ＤＮＡ断片とする。また、配列番号２１および２２で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＭｌｕＩとＳｐｅＩで処理したＤＮＡ断片を下流ＤＮＡ断片とする。そして、上流及び下流ＤＮＡ断片をＰａｃＩとＮｏｔＩ、ＭｌｕＩとＳｐｅＩの制限酵素をそれぞれ用いてａｍｄＳが挿入されたプラスミドへ導入し、変異導入用プラスミドを構築する。そして、変異導入用プラスミドを制限酵素ＰａｃＩとＳｐｅＩで処理し、配列番号１８で示す得られたＤＮＡ断片でトリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株を形質転換する。分子生物学的手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，１ｓｔ，２ｎｄ，３ｒｄ（１９８９）の記載通りに行う。また、形質転換は、標準的な手法であるプロトプラスト−ＰＥＧ法を用い、具体的にはＧｅｎｅ，６１，１６５−１７６（１９８７）の記載通りに行う。【００６７】
（変異株の作製・評価）
前述の方法に従って取得したトリコデルマ・リーセイの変異株をトリコデルマ・リーセイ  変異株Ｉとして、以下のタンパク質製造試験並びにタンパク質濃度およびセルラーゼ比活性測定の実験に用いた。【００６８】
＜実施例２＞トリコデルマ・リーセイ変異株の培養試験
（前培養）
実施例１で作製したトリコデルマ・リーセイの変異株の胞子を１．０×１０７／ｍＬになるように生理食塩水で希釈し、その希釈胞子溶液２．５ｍＬを表１に示した１Ｌバッフル付フラスコへ入れた２５０ｍＬの前培養培地へ接種させ、振盪培養機にて２８℃、１２０ｒｐｍの条件にて７２時間培養を行う。コントロールとして、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株を用い、以下同様の実験操作を行う。【００６９】
【表１】
2020075787.tif 000002
【００７０】
（本培養）
Ａｒｂｏｃｅｌ  Ｂ８００（レッテンマイヤー社）を表２で示した本培養培地に添加し、５Ｌジャーファーメンター（バイオット社製）を用い、深部培養検討を行う。【００７１】
トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株および実施例１で作製したトリコデルマ・リーセイの変異株の前培養液２００ｍＬをＡｒｂｏｃｅｌ  Ｂ８００が添加された本培養培地２．５Ｌに接種する。【００７２】
培養条件は、本培養培地に前培養培地を接種後、２８℃、７００ｒｐｍ、通気量１００ｍＬ／ｍｉｎの培養条件にて、ｐＨ５．０に制御しながら深部培養を行う。【００７３】
【表２】
2020075787.tif 000003
【００７４】
（培養液の採取）
培養開始１２０時間経過後にそれぞれ２０ｍＬの培養液を採取する。採取した培養液の１部は、１５，０００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行い、上清を得る。その上清を０．２２μｍのフィルターでろ過し、そのろ液をセルラーゼ溶液として、以下の実験に用いる。【００７５】
（タンパク質濃度の測定）
参考例１の条件で、培養開始１２０時間経過時に採取した培養液におけるタンパク質濃度を測定する。その結果、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株の培養液におけるタンパク質濃度は、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株の培養液におけるタンパク質濃度と比較して高くなる。【００７６】
（酵素活性の測定）
参考例２の条件で、培養開始１２０時間経過時に採取した培養液におけるセルラーゼの比活性として、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドラーゼの比活性をそれぞれ測定する。比活性は、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定し、１分間あたり１μｍｏｌの基質を遊離する活性を１Ｕとして算出する。その結果、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株の培養液における上記３種類の比活性は、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株の培養液における比活性と比較して高くなる。【００７７】
（フラスコ培養）
実施例１で作製したトリコデルマ・リーセイ  変異株Ｉの胞子を、１．０×１０７／ｍＬになるように生理食塩水で希釈し、その希釈胞子溶液０．１ｍＬを表３に示したＡｒｂｏｃｅｌ（登録商標）  Ｂ８００（レッテンマイヤー社）またはラクトースが含まれる５０ｍＬバッフル付フラスコへ入れた１０ｍＬのフラスコ培地へ接種させ、振盪培養機にて２８℃、１２０ｒｐｍの条件にて１２０時間培養を行った。【００７８】
また、変異株Ｉの変異導入前の親株であるトリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株についても比較対象として前述の方法に従って１２０時間培養を行った。【００７９】
【表３】
2020075787.tif 000004
【００８０】
（培養液の採取）
フラスコ培養開始１２０時間後に１ｍＬ培養液を採取した。培養液を１５，０００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行い、上清を得た。その上清を０．２２μｍのフィルターでろ過し、そのろ液を以下の各種実験に用いた。【００８１】
（タンパク質濃度の測定）
Ａｒｂｏｃｅｌ（登録商標）  Ｂ８００を用いた培養では、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株を培養した培養液に含まれるタンパク質濃度を１とした場合、トリコデルマ・リーセイ  変異株Ｉの培養液に含まれるタンパク質濃度の相対値は１．２であり、変異株のタンパク質製造能は親株よりも向上することを確認した。【００８２】
ラクトースを用いた培養でも、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株を培養した培養液に含まれるタンパク質濃度を１とした場合、トリコデルマ・リーセイ  変異株Ｉの培養液に含まれるタンパク質濃度の相対値は１．２であり、変異株のタンパク質製造能は親株よりも向上することを確認した。【００８３】
（セルラーゼ各種比活性の測定）
Ａｒｂｏｃｅｌ（登録商標）  Ｂ８００を用いた培養では、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株を培養した培養液のセルラーゼの各種比活性を１とした場合、トリコデルマ・リーセイ  変異株Ｉを培養した培養液のセルラーゼの各種比活性の相対値は、β−グルコシダーゼ比活性は１．４、β−キシロシダーゼ比活性は１．５、セロビオハイドロラーゼ比活性は１．８であり、セルラーゼの各種比活性も向上するという予想外の効果が得られることを確認した。【００８４】
ラクトースを用いた培養でも、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株を培養した培養液のセルラーゼの各種比活性を１とした場合、トリコデルマ・リーセイ  変異株Ｉを培養した培養液のセルラーゼの各種比活性の相対値は、β−グルコシダーゼ比活性は１．４、β−キシロシダーゼ比活性は２．０、セロビオハイドロラーゼ比活性は１．６でありセルラーゼの各種比活性も向上するという予想外の効果が得られることを確認した。【００８５】
（糖化反応試験）
参考例３で記載した手法に従い、トリコデルマ・リーセイ  変異株Ｉのフラスコ培養開始から１２０時間目の培養液をセルラーゼとして用いて、セルロース含有バイオマスの糖化反応試験を行った。セルロース含有バイオマスとして、Ａｒｂｏｃｅｌ（登録商標）  Ｂ８００または粉末バガスを用いた。【００８６】
その結果、Ａｒｂｏｃｅｌ（登録商標）  Ｂ８００を糖化対象物とした場合の糖化反応において、Ａｒｂｏｃｅｌ（登録商標）  Ｂ８００を用いてフラスコ培養することにより得られたトリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株のセルラーゼを用いた場合の糖化液に含まれるグルコース濃度を１とした場合、トリコデルマ・リーセイ  変異株Ｉのセルラーゼを用いた場合の糖化液のグルコース濃度の相対値は１．８、ラクトースを用いてフラスコ培養することにより得られたセルラーゼを用いた場合の糖化液に含まれるグルコース濃度の相対値も１．６であった。【００８７】
粉末バガスを糖化対象物とした場合の糖化反応において、Ａｒｂｏｃｅｌ（登録商標）  Ｂ８００を用いてフラスコ培養することにより得られたトリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株のセルラーゼを用いた場合の糖化液に含まれるグルコース濃度を１とした場合、トリコデルマ・リーセイ  変異株Ｉのセルラーゼを用いた場合の糖化液のグルコース濃度の相対値は１．２、ラクトースを用いてフラスコ培養することにより得られたセルラーゼを用いた場合の糖化液に含まれるグルコース濃度の相対値も１．３であった。【００８８】
この結果より、トリコデルマ・リーセイ  変異株Ｉが生産するセルラーゼは、親株が生産するセルラーゼよりも酵素活性に優れ、それによりセルロース含有バイオマスからのグルコースを製造する能力が優れることを確認した。【００８９】
＜実施例３＞配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド内に変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株の作製その２
トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株の継代株であるＱＭ９４１４−Ｅ株に対し、遺伝子変異処理を行って変異株であるＱＭ９１４１−Ｆ株を取得した。遺伝子変異処理は、ＱＭ９４１４−Ｅ株の胞子を、表１に示す前培養培地１ｍＬあたり１．０ｘ１０５胞子になるよう接種し、前培養培地１５ｍＬを半日培養した後に遠心分離を行い、胞子を回収した。そして、回収した胞子をトリス−マレイン酸バッファー（ｐＨ６．０）にて１０ｍＬの胞子溶液になるよう懸濁し、そこへトリス−マレイン酸バッファー（ｐＨ６．０）で１．０ｇ／Ｌになるよう溶解させたＮＴＧ溶液を０．５ｍＬ添加し、２８℃、１００分間、遺伝子変異処理を行った。遺伝子変異処理した胞子は、遠心分離にて回収した後に、トリス−マレイン酸バッファー（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、最終的にトリス−マレイン酸バッファー（ｐＨ６．０）１０ｍＬにて懸濁したものを遺伝子変異処理胞子とした。【００９０】
その遺伝子変異処理胞子を、結晶セルロースを添加して調製した寒天培地へ添加し、コロニー周囲に生じるセルラーゼによる結晶セルロース分解領域であるハロの大きさを指標とし、ハロの大きかったＱＭ９４１４−Ｆ株を選抜した。【００９１】
ＱＭ９４１４−Ｅ株とＱＭ９４１４−Ｆ株の遺伝子解析を行ったところ、ＱＭ９４１４−Ｅ株では配列番号１で表される塩基配列が保持されていたが、ＱＭ９４１４−Ｆ株では配列番号１で表される塩基配列の２５８８番目のシトシンがチミンへ変異していた。当該変異は、配列番号１で表される塩基配列がコードする配列番号２で表されるアミノ酸配列の６７７番目のセリン残基をフェニルアラニン残基へ変異させる変異である。【００９２】
＜実施例４＞配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株を用いたタンパク質の製造試験
（タンパク質濃度とセルラーゼ各種比活性の測定）
実施例３で取得したＱＭ９４１４−Ｆ株について、実施例２と同様の方法で培養を行い、参考例１と参考例２の条件で、培養開始から１２０時間経過時の培養液におけるタンパク質濃度とセルラーゼの比活性を測定した。コントロールには、ＱＭ９４１４−Ｅ株を用いた。結果を表３に示す。【００９３】
これらの結果、ＱＭ９４１４−Ｅ株と比較して、ＱＭ９４１４−Ｆ株は、２．６倍培養液中のタンパク質濃度が高くなった。また、ＱＭ９４１４−Ｅ株と比較して、ＱＭ９４１４−Ｆ株の各種比活性は、β−グルコシダーゼは３．１倍、β−キシロシダーゼは１．５倍、セロビオハイドロラーゼは２．０倍高くなった。【００９４】
（糖化反応試験）
参考例３で記載した手法に従い、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４−Ｆ株の培養開始から１２０時間目の培養液をセルラーゼとして用いて、セルロース含有バイオマスの糖化反応試験を行った。セルロース含有バイオマスとして、Ａｒｂｏｃｅｌ（登録商標）  Ｂ８００または粉末バガスを用いた。【００９５】
その結果、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４−Ｅ株のセルラーゼを用いた場合の糖化液に含まれるグルコース濃度を１とした場合、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４−Ｆ株のセルラーゼを用いた場合の糖化液のグルコース濃度の相対値は、Ａｒｂｏｃｅｌ（登録商標）  Ｂ８００を糖化対象物とした場合は１．１、粉末バガスを糖化対象物とした場合の糖化反応においては１．２であった。【００９６】
この結果より、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４−Ｅ株が生産するセルラーゼは、親株が生産するセルラーゼよりも酵素活性に優れ、それによりセルロース含有バイオマスからのグルコースを製造する能力が優れることを確認した。
【配列表】
2020075787000001.app
【国際調査報告】
2020075787.tif 000005
2020075787.tif 000006
2020075787.tif 000007
2020075787.tif 000008