(57)【要約】開示されているのは、エキナセアの熱水抽出物を有効成分として含む、ストレプトコッカス属菌のバイオフィルム形成抑制剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エキナセアの熱水抽出物を有効成分として含む、ストレプトコッカス属菌のバイオフィルム形成抑制剤。
【請求項２】
エキナセアの熱水抽出物のみを有効成分として含む、請求項１に記載のバイオフィルム形成抑制剤。
【請求項３】
前記エキナセアとして、エキナセアの葉を使用する、請求項１又は２に記載のバイオフィルム形成抑制剤。
【請求項４】
前記ストレプトコッカス属菌が、ストレプトコッカス・ミュータンスである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のバイオフィルム形成抑制剤。
【請求項５】
ガム、マウスウォッシュ、歯磨剤、キャンデー、又は茶飲料である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオフィルム形成抑制剤。
【請求項６】
ヒト用である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のバイオフィルム形成抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオフィルム形成抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルムとは、多糖類に保護された多様な細菌群の集団である。物質表面に付着した細菌が非水溶性グルカン等の多糖類を産生しマイクロコロニーを形成し、マイクロコロニー中で多様な細菌群が繁殖して、バイオフィルムが形成される。バイオフィルムの代表的なものとしては、台所、浴室、洗面所等の水回りで発生するヌメリ、歯周病関連細菌が口腔内に形成するプラーク等が挙げられる。【０００３】
グルカンシュークラーゼ(glucansucrase)は、乳酸菌目のストレプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属、ロイコノストック(Leuconostoc)属、ワイセラ(Weissela)属、又はラクトバチルス(Lactobacillus)属の菌により産生されバイオフィルムを形成することが確認されている。その中でもストレプトコッカス属のストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)及びストレプトコッカス・ダウネイ(Streptococcus downei)は虫歯の原因菌である。【０００４】
ストレプトコッカス・ミュータンス菌はヒトの口腔内に生存し、食事で摂取した糖などを栄養源として増殖する。また、ストレプトコッカス・ミュータンス菌の持つ酵素グルカンシュークラーゼ(GTF)により糖から不溶性のグルカンが生成され、歯の表面にてバイオフィルム(歯垢)が形成される。このバイオフィルムにストレプトコッカス・ミュータンス菌を始め、様々な菌が付着し、酸を生成する。この酸が歯のエナメル質を脱灰し、虫歯を発生させる。それ故、ストレプトコッカス・ミュータンス菌によるバイオフィルム形成を抑制することで虫歯の予防につながる。【０００５】
そのため、バイオフィルムの形成を抑制する種々の方法が報告されている(例えば、特許文献１〜３、非特許文献１)。【０００６】
特許文献１では、豆類の貯蔵タンパク質である豆類７Ｓグロブリンが、ストレプトコッカス・ミュータンスのバイオフィルム形成阻害効果を有することが報告されている。【０００７】
また、特許文献２では、セロトニン及びセロトニンの誘導体がグルカンシュークラーゼ活性を阻害する上、ストレプトコッカス・ミュータンスのバイオフィルム形成阻害効果を有することが報告されている。【０００８】
特許文献３では、アッサム茶の抽出物が細菌のバイオフィルム形成を抑制することができることが報告されている。【０００９】
非特許文献１では、緑茶及び紅茶の抽出物について、ストレプトコッカス・ミュータンス由来のグルコシルトランスフェラーゼによって触媒されるグルカン合成に対する効果を調べた結果、不溶性グルカンの合成を顕著に阻害したことが報告されている。【００１０】
しかしながら、上記で報告されているアッサム茶、緑茶及び紅茶にはカフェインが含まれているため、葉の黄ばみの原因となること及び血管の収縮を促進することから摂取したくない人、並びに妊婦等の摂取できない人がいるという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】日本国特開２０１５−１６６３３４号公報
【特許文献２】日本国特開２０１５−１００７６号公報
【特許文献３】日本国特開２０１２−３６１０６号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】M. Hattori et al., Effect of Tea Polyphenols on Glucan Synthesis by Glucosyltransferase from Streptococcus mutans, Chem. Pharm. Bull., 38(3), 717-720(1990)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、安全性が高く、優れたバイオフィルム形成抑制作用を有する、ストレプトコッカス属菌のバイオフィルム形成抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、後述する試験例で示すように、ストレプトコッカス・ミュータンス菌によるバイオフィルム形成抑制作用が知られていないエキナセアについて、エキナセアと同様に飲料などで利用されている緑茶の活性と比較し、高いバイオフィルム形成抑制効果、同等程度のグルカンシュークラーゼ阻害活性効果を示すことを見出した。さらに、緑茶はストレプトコッカス・ミュータンス菌に対して増殖能を示すのに対して、エキナセアの熱水抽出物は増殖抑制を示すことを見出した。その上、エキナセアはカフェインが含まれていないことから、上記のような問題もない。【００１５】
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、以下のストレプトコッカス属菌のバイオフィルム形成抑制剤を提供するものである。【００１６】
項１．エキナセアの熱水抽出物を有効成分として含む、ストレプトコッカス属菌のバイオフィルム形成抑制剤。
項２．エキナセアの熱水抽出物のみを有効成分として含む、項１に記載のバイオフィルム形成抑制剤。
項３．前記エキナセアとして、エキナセアの葉を使用する、項１又は２に記載のバイオフィルム形成抑制剤。
項４．前記ストレプトコッカス属菌が、ストレプトコッカス・ミュータンスである、項１〜３のいずれか一項に記載のバイオフィルム形成抑制剤。
項５．ガム、マウスウォッシュ、歯磨剤、キャンデー、又は茶飲料である、項１〜４のいずれか一項に記載のバイオフィルム形成抑制剤。
項６．ヒト用である、項１〜５のいずれか一項に記載のバイオフィルム形成抑制剤。
項７．エキナセアの熱水抽出物の有効量を哺乳動物に投与する工程を含む、ストレプトコッカス属菌のバイオフィルム形成を抑制させる方法。
項８．前記エキナセアとして、エキナセアの葉を使用する、項７に記載の方法。
項９．前記ストレプトコッカス属菌が、ストレプトコッカス・ミュータンスである、項７又は８に記載の方法。
項１０．前記エキナセアの熱水抽出物が、ガム、マウスウォッシュ、歯磨剤、キャンデー、又は茶飲料の形態で投与される、項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
項１１．前記哺乳動物がヒトである、項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
項１２．ストレプトコッカス属菌のバイオフィルム形成抑制剤の製造における、エキナセアの熱水抽出物の使用。
項１３．前記エキナセアとして、エキナセアの葉を使用する、項１２に記載の使用。
項１４．前記ストレプトコッカス属菌が、ストレプトコッカス・ミュータンスである、項１２又は１３に記載の使用。
項１５．前記バイオフィルム形成抑制剤が、ガム、マウスウォッシュ、歯磨剤、キャンデー、又は茶飲料である、項１２〜１４のいずれか一項に記載の使用。
項１６．前記バイオフィルム形成抑制剤が、ヒト用である、項１２〜１５のいずれか一項に記載の使用。
項１７．エキナセアの熱水抽出物を有効成分として含む、ストレプトコッカス属菌のバイオフィルム形成抑制用組成物。
項１８．前記エキナセアとして、エキナセアの葉を使用する、項１７に記載の組成物。
項１９．前記ストレプトコッカス属菌が、ストレプトコッカス・ミュータンスである、項１７又は１８に記載の組成物。
項２０．ガム、マウスウォッシュ、歯磨剤、キャンデー、又は茶飲料である、項１７〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
項２１．ヒト用である、項１７〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１７】
エキナセアの熱水抽出物は、優れたバイオフィルム形成抑制作用、グルカンシュークラーゼ阻害活性作用、及びストレプトコッカス属菌に対する増殖抑制作用を有することから、ストレプトコッカス属菌のバイオフィルム形成抑制剤の有効成分として有用である。【００１８】
また、エキナセアは、現在も花を含む地上部及び根が、北米及び欧州を中心にサプリメントとして広く利用されており、安全な素材である。そして、エキナセアにはカフェインが含まれておらず、カフェインを摂取したくない人及び摂取できない人にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】試験例におけるストレプトコッカス・ミュータンス菌に対する抗菌作用の試験結果を示すグラフである。縦軸はOD600を、横軸は時間(hr)を表す。バーの値は平均値±SD、**:p<0.01、n=4
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２１】
なお、本明細書において「含む、含有する(comprise)」とは、「本質的にからなる(essentially consist of)」という意味と、「のみからなる(consist of)」という意味をも包含する。
【００２２】
本発明のストレプトコッカス属菌のバイオフィルム形成抑制剤は、エキナセアの熱水抽出物を有効成分として含むこと、好ましくはエキナセアの熱水抽出物のみを有効成分として含むことを特徴とする。
【００２３】
エキナセア(ムラサキバレンギク、学名：Echinacea purpurea)は、キク科ムラサキバレンギク属に属するアメリカ原産の多年草である。エキナセアはハーブの一種であり、免疫力を高めることによる、風邪、インフルエンザなどの予防効果があると考えられている。
【００２４】
本発明において、エキナセアの一部若しくは全体の抽出物を使用することができる。エキナセアの一部としては、葉、樹皮、茎、幹、果実、種子、花、根などが挙げられ、これらを単独又は複数部位を組み合わせて使用することができ、好ましくは葉である。また、エキナセアとしては、生の物、乾燥した物、切断又は粉砕された物などいずれの状態の物も使用することができる。
【００２５】
エキナセアの熱水抽出物を製造する際の抽出の温度は、適宜設定され得、通常40〜100℃、好ましくは70〜100℃である。抽出時間は、適宜設定され得、通常5分〜5日、好ましくは10分〜24時間である。抽出回数は、通常1〜5回、好ましくは1〜3回である。エキナセアの熱水抽出物を製造する際に使用する際の水としては、特に制限されず、例えば、水道水、地下水、ミネラルウォーター、イオン交換水、蒸留水、純水などが挙げられる。
【００２６】
回収した熱水抽出物は、そのままでも使用することができ、必要に応じて、フィルター、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー(ゲル濾過)、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、透析法、これらの組合せなどによる精製を行い得る。
【００２７】
上記エキナセアの熱水抽出物としては、回収された抽出液(必要に応じて更に精製されたものも含む)、当該抽出液を濃縮した濃縮液、凍結乾燥、スプレードライ等により当該抽出液の溶媒が除去された固形物などが含まれる。ここで、抽出液の濃縮、凍結乾燥及びスプレードライは、常法に従って行うことができる。
【００２８】
本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、本発明の効果が妨げられない限り、追加の成分を含み得る。かかる追加の成分を含む場合、バイオフィルム形成抑制剤中のエキナセアの熱水抽出物の割合としては、0.001〜99.9質量%、好ましくは0.01〜80質量%、より好ましくは0.1〜70質量%、更に好ましくは1〜50質量%を例示することができる。
【００２９】
本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、その形態を特に問うものではなく、例えば粉末状、顆粒状、錠剤状、カプセル状、液状、懸濁液状、乳液状などの製剤形態を有し得る。
【００３０】
本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、化粧品、食品組成物、医薬部外品及び医薬品の成分として、好適に使用することができる。
【００３１】
本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、化粧品、食品組成物(特に、保健、健康維持、増進等を目的とする食品組成物(例えば、健康食品、機能性食品、栄養組成物(nutritional composition)、栄養補助食品、サプリメント、保健用食品、特定保健用食品、栄養機能食品、又は機能性表示食品))、医薬部外品及び医薬品の意味も包含するものである。また、本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、ストレプトコッカス属菌のバイオフィルム形成抑制作用を付与する添加剤についての意味も包含するものである。
【００３２】
上記の化粧品には、エキナセアの熱水抽出物以外に、通常化粧品に用いられる成分、例えば、殺菌剤、保存剤、界面活性剤、アルコール類、水性成分、水、着色剤、pH調整剤、溶解補助剤、研磨剤、発泡剤、保湿剤、酵素、香味剤、キレート剤、増粘剤、清掃剤(乳酸菌)等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００３３】
化粧品の用途も任意であり、例えば、(練又は液体)歯磨剤、マウスウォッシュ等が挙げられる。
【００３４】
上記の食品組成物には、必要に応じて、賦形剤、光沢剤、ミネラル類、ビタミン類、フラボノイド類、キノン類、ポリフェノール類、アミノ酸、核酸、必須脂肪酸、清涼剤、結合剤、甘味料、崩壊剤、滑沢剤、着色料、香料、安定化剤、防腐剤、徐放調整剤、界面活性剤、溶解剤、湿潤剤等を配合することができる。
【００３５】
食品組成物には、動物(ヒトを含む)が摂取できるあらゆる飲食品が含まれる。飲食品の種類は、特に限定されず、例えば、飲料類(コーヒー、ジュース、茶飲料のような清涼飲料、乳飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト飲料、炭酸飲料、日本酒、洋酒、果実酒のような酒等)；スプレッド類(カスタードクリーム等)；ペースト類(フルーツペースト等)；洋菓子類(チョコレート、ドーナツ、パイ、シュークリーム、ガム、ゼリー、キャンデー、クッキー、ケーキ、プリン等)；和菓子類(大福、餅、饅頭、カステラ、あんみつ、羊羹等)；氷菓類(アイスクリーム、アイスキャンデー、シャーベット等)；食品類(カレー、牛丼、雑炊、味噌汁、スープ、ミートソース、パスタ、漬物、ジャム等)；調味料類(ドレッシング、ふりかけ、旨味調味料、スープの素等)などが挙げられる。
【００３６】
サプリメントとして使用する際の投与単位形態については特に限定されず適宜選択でき、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤、散剤等が挙げられる。
【００３７】
食品組成物の摂取量は、摂取者の体重、年齢、性別、症状などの種々の条件に応じて適宜設定することができる。
【００３８】
上記の医薬品には、エキナセアの熱水抽出物のみを使用することもでき、ビタミン、生薬など日本薬局方に記載の他の医薬成分と混合して使用することもできる。
【００３９】
本発明の組成物を、医薬品として調製する場合、エキナセアの熱水抽出物を、医薬品において許容される無毒性の担体、希釈剤若しくは賦形剤とともに、タブレット(素錠、糖衣錠、発泡錠、フィルムコート錠、チュアブル錠、トローチ剤などを含む)、カプセル剤、丸剤、粉末剤(散剤)、細粒剤、顆粒剤、液剤、懸濁液、乳濁液、シロップ、ペーストなどの形態に調製して、経口及び口腔用の製剤にすることが可能である。
【００４０】
医薬品の投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状などの種々の条件に応じて適宜決定することができる。
【００４１】
なお、本発明の医薬品及び化粧品には、医薬部外品も包含される。
【００４２】
以上説明した本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、ヒトを含む哺乳動物(好ましくはヒト)に対して適用されるものである。また、本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、基本的に、経口用として又は口腔内に使用されるものである。
【００４３】
後述する試験例で示すようにエキナセアの熱水抽出物は、優れたバイオフィルム形成抑制作用、グルカンシュークラーゼ阻害活性作用、及びストレプトコッカス属菌に対する増殖抑制作用を有することから、ストレプトコッカス属菌(特に、ストレプトコッカス・ミュータンス)のバイオフィルム形成抑制剤の有効成分として有用である。
【００４４】
このように、エキナセアの熱水抽出物は、ストレプトコッカス属菌のバイオフィルム形成抑制作用を有することから、う蝕(虫歯)、歯肉炎、歯周病、口臭などの予防効果が期待される。
【００４５】
また、エキナセアは、現在も花を含む地上部及び根が、北米及び欧州を中心にサプリメントとして広く利用されており、安全性が高い。そして、エキナセアにはカフェインが含まれておらず、カフェインを摂取したくない人及び摂取できない人にも有用である。
【００４６】
上記の化粧品、食品組成物、医薬部外品及び医薬品には、例えば、「バイオフィルムの形成を抑制する旨」、「う蝕(虫歯)を予防する旨」、「歯肉炎を予防する旨」、「歯周病を予防する旨」、「口臭を予防する旨」等の表示が付されていてもよい。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。【００４８】
試験例１
グルカンシュークラーゼは乳酸菌目のストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ワイセラ属、又はラクトバチルス属の菌により産生されバイオフィルムを形成することが確認されている。その中でもストレプトコッカス属のストレプトコッカス・ミュータンス及びストレプトコッカス・ダウネイは虫歯の原因菌である。本試験ではその中でも、虫歯の原因菌として一般的に知られる、ストレプトコッカス・ミュータンスによるグルカンシュークラーゼ活性、及びバイオフィルム形成に着目して試験を実施した。【００４９】
＜方法＞
エキナセア又は緑茶の乾燥物0.5 gを25 mLの水で溶解し、10分間熱水抽出した後、定性濾紙No.2 (ADVATEC )にて濾過し、遠心エバポレーターGenevac EZ-2にて乾燥し、蒸留水にて所定濃度に調整し、試験を実施した。グルカンシュークラーゼ阻害活性、ストレプトコッカス・ミュータンス菌に対する抗菌作用、ストレプトコッカス・ミュータンス菌によるバイオフィルム形成抑制作用の評価を行った。【００５０】
グルカンシュークラーゼ阻害活性の評価は、酵素反応により生じたグルコース量をグルコースCII-テストワコー(富士フイルム和光純薬株式会社)を用いて測定した。【００５１】
抗菌作用はストレプトコッカス・ミュータンス菌をブレインハートインフュージョン培地で37℃にて、0, 4, 8, 20, 24時間インキュベートし、菌の増殖を濁度(600 nm)にて評価した。【００５２】
ストレプトコッカス・ミュータンス菌によるバイオフィルム形成抑制作用はブレインハートインフュージョン培地で37℃にて、48時間インキュベートし、マイクロタイタープレートに付着したストレプトコッカス・ミュータンスをクリスタルバイオレットにより染色し、エタノールにより抽出したものを595 nmで測定した。【００５３】
＜結果＞
グルカンシュークラーゼ阻害活性の試験結果を以下の表１に示す。【００５４】
【表１】
2020059828.tif 000002
【００５５】
エキナセア葉の熱水抽出物のグルカンシュークラーゼ阻害活性(IC50)は、4.03 mg/mLと、Hattori M1)らによってストレプトコッカス・ミュータンス菌によるバイオフィルム形成抑制が報告されている緑茶(IC50: 3.48 mg/ml)と比較して0.86倍と同等の阻害活性を示した。【００５６】
ストレプトコッカス・ミュータンス菌に対する抗菌作用の試験結果を図１に示す。【００５７】
緑茶では1.25, 2.50, 5.00 mg/mlの濃度にて20時間、24時間後、ストレプトコッカス・ミュータンスが有意に増加した。しかしながら、エキナセア葉の熱水抽出物では同時間にてストレプトコッカス・ミュータンス菌の増加はいずれの濃度でも確認されなかった。【００５８】
ストレプトコッカス・ミュータンス菌によるバイオフィルム形成抑制作用の試験結果を以下の表２に示す。なお、表中、ブレインハートインフュージョン培地にて培養したときのバイオフィルム形成量を100%とした。【００５９】
【表２】
2020059828.tif 000003
【００６０】
ストレプトコッカス・ミュータンス菌のバイフィルム形成抑制作用は、エキナセア葉及び緑茶の熱水抽出物を2.5 mg/ml暴露した際のバイオフィルム形成量を確認したところ、それぞれ49.1%, 71.8%であり、エキナセア葉熱水抽出物は緑茶熱水抽出物と比較して強いバイオフィルム形成抑制作用が確認された。【００６１】
以上のことから、エキナセアはストレプトコッカス・ミュータンス菌によるバイオフィルム形成抑制作用が知られていない新規な素材であり、エキナセアと同様に飲料などで利用されている緑茶の活性と比較し、高いバイオフィルム形成抑制効果、同等程度のグルカンシュークラーゼ阻害活性効果を示すことが判明した。また、緑茶はストレプトコッカス・ミュータンス菌に対して増殖能を示すのに対して、エキナセアは増殖抑制を示した。
1) Hattori M, Kusumoto IT, Namba T, Ishigami T, Hara Y., Effect of tea polyphenols on glucan synthesis by glucosyltransferase from Streptococcus mutans., Chem Pharm Bull (Tokyo). 38(3), 717-20, 1990. 【００６２】
試験例２
エキナセア葉の乾燥物1.0 gを20 mLの蒸留水にて、60分間熱水抽出し、定性濾紙No.2 (ADVATEC)にて濾過した。ろ過残渣を用いて更に2回熱水抽出を行った。また、エキナセア葉の乾燥物1.0 gを20 mLの95%エタノールにて、10分間振とう抽出し、定性濾紙No.2 (ADVATEC)にて濾過した。ろ過残渣を用いて更に2回振とう抽出を行った。得られたろ液を遠心エバポレーターmiVAC及び凍結乾燥器FREEZE DRYER FD-5Nにて乾燥し、得られた抽出物粉末重量より、抽出効率を算出した。その結果を表３に示す。その結果、エタノール抽出4%に対して熱水抽出はその8倍の32%の抽出効率であった。【００６３】
【表３】
2020059828.tif 000004
【図１】
2020059828.tif 000005
【国際調査報告】
2020059828.tif 000006
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