(57)【要約】  本発明は、一種以上の被検物質と共存した細胞のゲノム関連情報を多種の被検物質について検出する方法を提供する。より詳細には、本発明は、１種以上の被検物質と共存した細胞またはその由来物のゲノム関連情報を検出する方法であって、  １種以上の被検物質と第一バーコード核酸とを含む複数種の第一コンパートメント、および  細胞またはその由来物と第二バーコード核酸連結ビーズとを含む第二コンパートメントをそれぞれ準備し、；  １個の第一コンパートメントと、１個の第二コンパートメントとを融合した、複数種の第三コンパートメントを作成し；  前記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得；  該ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造し；  該増幅物の発現パターンを指標として細胞における前記被検物質の共存後のゲノム関連情報を検出することを含んでなる、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上の被検物質と共存した細胞またはその由来物のゲノム関連情報を検出する方法であって、
前記被検物質と共存させた細胞またはその由来物と、第一バーコード核酸と、第二バーコード核酸連結ビーズとを含んでなる複数の対象コンパートメントを準備し、
ここで、前記第一バーコード核酸は被検物質に予め関連付けされており、
前記第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸を含んでおり、
前記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得、
前記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造し、
前記増幅物の発現パターンを指標として細胞における前記被検物質の共存後のゲノム関連情報を検出すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記第一バーコード核酸と前記被検物質との関連付けが、前記被検物質と、前記細胞またはその由来物と、前記第一バーコード核酸とを共存させることを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象コンパートメントの準備が、前記被検物質と共存させた細胞またはその由来物と第一バーコード核酸とを含んでなるサブコンパートメントと、前記第二バーコード核酸連結ビーズを含んでなるサブコンパートメントとを結合させることを含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
１種以上の被検物質と共存した細胞またはその由来物のゲノム関連情報を検出する方法であって、
１種以上の被検物質と、該被検物質に対応する第一バーコード核酸とを含む複数種の第一コンパートメント、および
細胞またはその由来物と第二バーコード核酸連結ビーズとを含む複数種の第二コンパートメント
をそれぞれ準備し、
前記第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
１個の第一コンパートメントと、１個の第二コンパートメントとを融合した、複数種の第三コンパートメントを作成し、
ここで、第三コンパートメントにおいて細胞またはその由来物と被検物質とは共存しており、
前記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得、
前記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造し、
前記増幅物の発現パターンを指標として細胞における前記被検物質の共存後のゲノム関連情報を検出すること
を含んでなる、方法。
【請求項５】
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として被検物質を同定し、
前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として細胞のゲノム関連情報を検出する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ゲノム関連核酸が、前記細胞ゲノムＤＮＡ、または前記細胞ゲノムに由来するＲＮＡもしくはそのｃＤＮＡである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
第一バーコード核酸が各々、同一の被検物質において共通する第一共通バーコード領域と、第二バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第一ハイブリダイズ領域とを含んでいる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第一共通バーコード領域の配列情報が、被検物質を特定する指標となる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第二ビーズに連結した複数の第二バーコード核酸が各々、互いに共通する第二共通バーコード領域と、互いに峻別しうる第二固有バーコード領域と、ゲノム関連核酸または第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第二ハイブリダイズ領域とを含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第二共通バーコード領域の配列情報が、コンパートメント中に存在する細胞またはその由来物を特定する指標となる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第二固有バーコード領域の配列情報が、ゲノム関連核酸を特定する指標となる、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
第二バーコード核酸が、ＰＣＲプライマー領域をさらに含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
第二ハイブリダイズ領域が、前記第一ハイブリダイズ領域または前記ゲノム関連核酸と相補的な核酸を含んでなる、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
１種以上の被検物質と共存した細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、
前記対象コンパートメントが、第三バーコード核酸を有するビーズをさらに含み、
ここで、第三バーコード核酸を有するビーズは、
各々、各イメージング情報に対応する第三バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各々、各イメージング情報に対応する第三バーコード核酸を含む生物であって、
かつ第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報は互いに峻別可能であり、
細胞の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報とを共に検出して、細胞の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報とを関連付けし、
前記関連付けした第三バーコード核酸を有するビーズから第三バーコード核酸を切断するか取り出し、前記ゲノム関連核酸および第三バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得、
前記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造し、
前記増幅物の発現パターンを指標として細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出すること
をさらに含んでなる、方法。
【請求項１５】
１種以上の被検物質と共存した細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する、請求項４〜１３のいずれか一項に記載の方法であって、
前記第二コンパートメントが、さらに第三バーコード核酸を有するビーズを含み、
ここで、第三バーコード核酸を有するビーズは、
各々、各イメージング情報に対応する第三バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各々、各イメージング情報に対応する第三バーコード核酸を含む生物であって、
かつ第三コンパートメントにおける第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報は互いに峻別可能であり、
細胞の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報とを共に検出して、細胞の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報とを関連付けし、；
前記関連付けした第三バーコード核酸を有するビーズから第三バーコード核酸を切断するか取り出し、前記ゲノム関連核酸および第三バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得、
前記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造し、
前記増幅物の発現パターンを指標として細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出すること
をさらに含んでなる、方法。
【請求項１６】
第三コンパートメントを準備する前、第二コンパートメント、および／または第三コンパートメントにおいて、細胞の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報とを共に検出して、細胞の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報とを関連付けする、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記非破壊的計測情報が、色、蛍光、サイズ、形状、電磁波、透過、位相、散乱、反射、コヒーレントラマン、ラマンおよび吸収スペクトルから選択される少なくとも１つの測定情報に基づくものである、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
１種以上の被検物質と共存した細胞のゲノム関連情報を検出するための、第一バーコード核酸および第二バーコード核酸連結ビーズの組み合わせ物であって、
第一バーコード核酸は各々、細胞と共存する１種以上の被検物質に対応しており、
第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として被検物質を同定し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として細胞のゲノム関連情報を検出することができる、組み合わせ物。
【請求項１９】
１種以上の被検物質と共存した細胞のゲノム関連情報を検出するための、第二バーコード核酸連結ビーズと共に用いる、第一バーコード核酸を含んでなる検出剤であって、
第一バーコード核酸は各々、細胞と共存する１種以上の被検物質に対応しており、
第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として被検物質を同定し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として細胞のゲノム関連情報を検出することができる、検出剤。
【請求項２０】
１種以上の被検物質と共存した細胞のゲノム関連情報を検出するための、第一バーコード核酸と共に用いる、第二バーコード核酸連結ビーズを含んでなる検出剤であって、
第一バーコード核酸各々は、細胞と共存する１種以上の被検物質に対応しており、
第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として被検物質を同定し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として細胞のゲノム関連情報を検出することができる、検出剤。
【請求項２１】
複数種の第一コンパートメントを含む組成物であって、各第一コンパートメントには、それぞれ１種の被検物質と当該１種の被検物質に対応する第一バーコード核酸が含まれる、組成物。
【請求項２２】
１種以上の被検物質と共存した細胞のゲノム関連情報を検出するための、第一バーコード核酸と共に用いる、複数種の第二コンパートメントを含む組成物であって、
第一バーコード核酸各々は、細胞と共存する１種以上の被検物質に対応しており、
各第二コンパートメントは、それぞれ細胞またはその由来物と第二バーコード核酸連結ビーズとを含み、
第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として被検物質を同定し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として細胞のゲノム関連情報を検出することができる、組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１６に記載の方法において検出される細胞またはその由来物のゲノム関連情報に基づき、被検物質をスクリーニングする方法。
【請求項２４】
請求項１４〜１６に記載の方法において検出される細胞の非破壊的計測情報およびゲノム関連情報に基づき、被検物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本特許出願は、２０１８年１１月７日に出願された日本国特許出願２０１８−２１００１２号に基づく優先権の主張を伴うものであり、かかる先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、一種以上の被検物質と共存した細胞のゲノム関連情報を多種の被検物質について効率的に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞を用いた多種薬剤スクリーニングとしてフェノタイプスクリーニングが知られている。フェノタイプスクリーニングとは、細胞や臓器の表現型（フェノタイプ）、例えば、細胞増殖率や細胞死を指標にして、それを変化させる薬剤（例えば、低分子化合物、ペプチド等）を探索する手法である。しかしながら、フェノタイプスクリーニングで入手できる情報は、細胞増殖率や細胞死に止まるものであり、それ以上の情報、特に細胞の遺伝子情報は得られないものであった。また、従来のフェノタイプスクリーニングでは一回のスクリーニング当たりの薬剤の種類数を増やすことや効率的にフェノタイプ情報を同定することも困難であった。【０００４】
また、従来、表現型の検出が行われているのは、細胞集団のみであった。しかしながら、最近の研究では癌組織等の類似した細胞タイプにおいても、細胞毎に遺伝子発現が異なり多様であることが明らかになっており、細胞一つ一つの遺伝子発現等を検出する必要が生じている。【０００５】
そこで、現在、一つの細胞由来の転写産物を検出する方法として、バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドが結合したビーズを用い、シークエンシング技術を用い、細胞の遺伝情報のデータを得る方法が知られている。（特許文献１、非特許文献１）【０００６】
しかしながら、多種薬剤スクリーニングにおいて一細胞の情報を得ることについてもこれまで何ら報告されていなかった。【０００７】
このような技術状況下、一種以上の被検物質を共存した細胞から得られる細胞のゲノム関連情報を、多種の被検物質について効率的に検出する手段が求められているといえる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015)
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１６６７６８号
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、一種以上の被検物質と共存した細胞またはその由来物のゲノム関連情報を、多種の被検物質について効率的に検出することを提供する。
【００１１】
本発明者らは、今般、１種以上の被検物質と該被検物質に対応するバーコード核酸とを含む複数種のコンパートメントと、細胞またはその由来物とバーコード核酸連結ビーズとを含む複数種のコンパートメントを、それぞれ１つずつ融合させてコンパートメントを作成し、細胞またはその由来物と被検物質とを共存させた後に、ゲノム関連情報を測定し関連付けすると、一種以上の被検物質と共存した細胞またはその由来物のゲノム関連情報を、多種の被検物質について効率的に検出しうることを見出した。また、互いに峻別可能なイメージング情報を有するバーコード核酸含有ビーズをさらに含み、細胞の非破壊的計測情報およびビーズのイメージング情報を関連付けした上でゲノム関連情報を測定し、関連付けすると、細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的かつ効率的に検出しうることをさらに見出した。本発明は、かかる知見に基づくものである。
【００１２】
本発明には、以下の発明が包含される。
［１］１種以上の被検物質と共存した細胞またはその由来物のゲノム関連情報を検出する方法であって、
前記被検物質と共存させた細胞またはその由来物と、第一バーコード核酸と、第二バーコード核酸連結ビーズとを含んでなる複数の対象コンパートメントを準備し、
ここで、前記第一バーコード核酸は被検物質に予め関連付けされており、
前記第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸を含んでおり、
前記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得、
前記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造し、
前記増幅物の発現パターンを指標として細胞における前記被検物質の共存後のゲノム関連情報を検出すること
を含んでなる、方法。
［２］前記第一バーコード核酸と前記被検物質との関連付けが、前記被検物質と、前記細胞またはその由来物と、前記第一バーコード核酸とを共存させることを含んでなる、［１］に記載の方法。
［３］前記対象コンパートメントの準備が、前記被検物質と共存させた細胞またはその由来物と第一バーコード核酸とを含んでなるサブコンパートメントと、前記第二バーコード核酸連結ビーズを含んでなるサブコンパートメントとを結合させることを含んでなる、［１］または［２］に記載の方法。
［４］１種以上の被検物質と共存した細胞またはその由来物のゲノム関連情報を検出する方法であって、
１種以上の被検物質と、該被検物質に対応する第一バーコード核酸とを含む複数種の第一コンパートメント、および
細胞またはその由来物と第二バーコード核酸連結ビーズとを含む複数種の第二コンパートメント
をそれぞれ準備し、
前記第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
１個の第一コンパートメントと、１個の第二コンパートメントとを融合した、複数種の第三コンパートメントを作成し、
ここで、第三コンパートメントにおいて細胞またはその由来物と被検物質とは共存しており；
前記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得、
前記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造し、
前記増幅物の発現パターンを指標として細胞における前記被検物質の共存後のゲノム関連情報を検出すること
を含んでなる、方法。
［５］第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として被検物質を同定し、
前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として細胞のゲノム関連情報を検出する、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の方法。
［６］前記ゲノム関連核酸が、前記細胞ゲノムＤＮＡ、または前記細胞ゲノムに由来するＲＮＡもしくはそのｃＤＮＡである、［１］〜［５］のいずれか一つに記載の方法。
［７］第一バーコード核酸が各々、同一の被検物質において共通する第一共通バーコード領域と、第二バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第一ハイブリダイズ領域とを含んでいる、［１］〜［６］のいずれか一つに記載の方法。
［８］第一共通バーコード領域の配列情報が、被検物質を特定する指標となる、［１］〜［７］のいずれか一つに記載の方法。
［９］前記第二ビーズに連結した複数の第二バーコード核酸が各々、互いに共通する第二共通バーコード領域と、互いに峻別しうる第二固有バーコード領域と、ゲノム関連核酸または第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第二ハイブリダイズ領域とを含んでなる、［１］〜［８］のいずれか一つに記載の方法。
［１０］前記第二共通バーコード領域の配列情報が、コンパートメント中に存在する細胞またはその由来物を特定する指標となる、［８］に記載の方法。
［１１］前記第二固有バーコード領域の配列情報が、ゲノム関連核酸を特定する指標となる、［９］または［１０］に記載の方法。
［１２］第二バーコード核酸が、ＰＣＲプライマー領域をさらに含んでなる、［１］〜［１１］のいずれか一つに記載の方法。
［１３］第二ハイブリダイズ領域が、前記第一ハイブリダイズ領域または前記ゲノム関連核酸と相補的な核酸を含んでなる、［９］〜［１２］のいずれか一つに記載の方法。
［１４］１種以上の被検物質と共存した細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法であって、
前記対象コンパートメントが、第三バーコード核酸を有するビーズをさらに含み、
ここで、第三バーコード核酸を有するビーズは、
各々、各イメージング情報に対応する第三バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各々、各イメージング情報に対応する第三バーコード核酸を含む生物であって、
かつ第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報は互いに峻別可能であり、
細胞の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報とを共に検出して、細胞の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報とを関連付けし、
前記関連付けした第三バーコード核酸を有するビーズから第三バーコード核酸を切断するか取り出し、前記ゲノム関連核酸および第三バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得、
前記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造し、
前記増幅物の発現パターンを指標として細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出すること
をさらに含んでなる、方法。
［１５］１種以上の被検物質と共存した細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する、［４］〜［１３］のいずれか一つに記載の方法であって、
前記第二コンパートメントが、さらに第三バーコード核酸を有するビーズを含み、
ここで、第三バーコード核酸を有するビーズは、
各々、各イメージング情報に対応する第三バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各々、各イメージング情報に対応する第三バーコード核酸を含む生物であって、
かつ第三コンパートメントにおける第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報は互いに峻別可能であり、
細胞の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報とを共に検出して、細胞の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報とを関連付けし、
前記関連付けした第三バーコード核酸を有するビーズから第三バーコード核酸を切断するか取り出し、前記ゲノム関連核酸および第三バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得、
前記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造し、
前記増幅物の発現パターンを指標として細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出すること
をさらに含んでなる、方法。
［１６］第三コンパートメントを準備する前、第二コンパートメント、および／または第三コンパートメントにおいて、細胞の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報とを共に検出して、細胞の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報とを関連付けする、［１４］または［１５］に記載の方法。
［１７］前記非破壊的計測情報が、色、蛍光、サイズ、形状、電磁波、透過、位相、散乱、反射、コヒーレントラマン、ラマンおよび吸収スペクトルから選択される少なくとも１つの測定情報に基づくものである、［１４］〜［１６］のいずれか一つに記載の方法。
［１８］１種以上の被検物質と共存した細胞のゲノム関連情報を検出するための、第一バーコード核酸および第二バーコード核酸連結ビーズの組み合わせ物であって、
第一バーコード核酸は各々、細胞と共存する１種以上の被検物質に対応しており、
第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として被検物質を同定し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として細胞のゲノム関連情報を検出することができる、組み合わせ物。
［１９］１種以上の被検物質と共存した細胞のゲノム関連情報を検出するための、第二バーコード核酸連結ビーズと共に用いる、第一バーコード核酸を含んでなる検出剤であって、
第一バーコード核酸は各々、細胞と共存する１種以上の被検物質に対応しており、
第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として被検物質を同定し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として細胞のゲノム関連情報を検出することができる、検出剤。
［２０］１種以上の被検物質と共存した細胞のゲノム関連情報を検出するための、第一バーコード核酸と共に用いる、第二バーコード核酸連結ビーズを含んでなる検出剤であって、
第一バーコード核酸各々は、細胞と共存する１種以上の被検物質に対応しており、
第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として被検物質を同定し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として細胞のゲノム関連情報を検出することができる、検出剤。
［２１］複数種の第一コンパートメントを含む組成物であって、各第一コンパートメントには、それぞれ１種の被検物質と当該１種の被検物質に対応する第一バーコード核酸が含まれる、組成物。
［２２］１種以上の被検物質と共存した細胞のゲノム関連情報を検出するための、第一バーコード核酸と共に用いる、複数種の第二コンパートメントを含む組成物であって、
第一バーコード核酸各々は、細胞と共存する１種以上の被検物質に対応しており、
各第二コンパートメントは、それぞれ細胞またはその由来物と第二バーコード核酸連結ビーズとを含み、
第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として被検物質を同定し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として細胞のゲノム関連情報を検出することができる、組成物。
［２３］［１］〜［１７］に記載の方法において検出される細胞またはその由来物のゲノム関連情報に基づき、被検物質をスクリーニングする方法。
［２４］［１４］〜［１７］に記載の方法において検出される細胞の非破壊的計測情報およびゲノム関連情報に基づき、被検物質をスクリーニングする方法。
【００１３】
本発明によれば、一種以上の被検物質と共存した細胞またはその由来物のゲノム関連情報を、多種の被検物質について効率的に検出できる。さらに、本発明によれば、細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的かつ効率的に検出することができる。さらに、本発明によれば、細胞として一細胞の情報を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】第一バーコード核酸に関する模式図である。
【図２】第二バーコード核酸連結ビーズに関する模式図である。
【図３】検出方法に関する模式図である。
【図４】第三バーコード核酸を有するビーズに関する模式図である。
【図５】検出方法の別の態様を示す模式図である。
【図６】第一バーコード核酸、第二バーコード核酸連結ビーズおよび第三バーコード核酸を有するビーズの別の態様を示す模式図である。
【図７】第一バーコード核酸、第二バーコード核酸連結ビーズおよび第三バーコード核酸を有するビーズのさらに別の態様を示す模式図である。
【図８】第三バーコード核酸を有するビーズの別の態様を示す模式図である。
【図９】第一バーコード核酸、第二バーコード核酸連結ビーズおよび第三バーコード核酸を有するビーズの別の態様を示す模式図である。
【図１０】コンパートメントの製造方法を示す模式図である。
【図１１】コンパートメントの製造方法の別の態様を示す模式図である。
【図１２】第二バーコード核酸連結ビーズおよび細胞を封入した液滴（コンパートメント）の写真である。写真の中心に存在する球状体が第二バーコード核酸連結ビーズであり、その周辺に浮いているベシクルが細胞である。
【図１３】第二バーコード核酸連結ビーズ、第三バーコード核酸を有するビーズおよび細胞を封入した液滴（コンパートメント）の写真である。写真の中心に存在する球状体が第二バーコード核酸連結ビーズであり、第二バーコード核酸連結ビーズの周辺に浮いているのが細胞であり、液滴の周縁部に存在する薄い像が第三バーコード核酸を有するビーズである。
【発明の具体的説明】
【００１５】
定義
本明細書において「ゲノム関連情報」とは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸に由来する核酸配列情報をいう。ここで、「ゲノム関連核酸」とは、好ましくは細胞のゲノムＤＮＡ、細胞ゲノムに由来するｍＲＮＡ等のＲＮＡもしくはそのｃＤＮＡ、または細胞で発現する蛋白質等の分子に特異的に相互作用（例えば、結合）する核酸プローブ（以下、細胞で発現する蛋白質等の分子に特異的な核酸プローブともいう）をいう。前記核酸プローブは、標的とする蛋白質等の分子に特異的に結合する分子（以下、結合分子ともいう）に切断可能に連結された互いに峻別しうるバーコード核酸を含むことが好ましい。また、核酸がゲノムＤＮＡである場合には、当該ＤＮＡは制限酵素等で切断された断片でも良いし、当該ＤＮＡ断片にＤＮＡタグが導入されていても良い。
【００１６】
本明細書において「バーコード領域」とは、Ｔ（チミン）またはＵ（ウラシル）、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、およびＣ（シトシン）を含む塩基配列の領域であって、後述の共通バーコード領域または固有バーコード領域の配列であれば限定されない。また、バーコード核酸はバーコード領域を含む核酸であり、細胞のゲノム関連情報、前記細胞と共存した被検物質やビーズ由来のイメージング情報を識別可能とするものである。
バーコード領域の種類としては、共通バーコード領域、固有バーコード領域の二種類が存在する。
共通バーコード領域とは、同一の識別の対象において共通するバーコード領域である。識別の対象が被検物質である場合には、例えば、被検物質毎に異なるバーコード領域、すなわち、一つの被検物質において共通するバーコード領域が挙げられる。共通バーコード領域で標識することにより、各被検物質が識別可能とされる。また、１つのコンパートメント中に被検物質の組み合わせが含まれる等、識別の対象が被検物質の組み合わせである場合には、該組み合わせ毎に異なるバーコード領域、すなわち、特定の被検物質の組み合わせにおいて共通するバーコード領域であるか、被検物質毎で共通する共通バーコード領域を有するバーコード核酸で標識することが挙げられる。かかる共通バーコード領域で標識することにより、被検物質の組み合わせが識別可能とされる。識別の対象が一細胞のゲノム関連情報である場合には、細胞毎に異なるバーコード領域、すなわち、一つの細胞において共通するバーコード領域が挙げられる。共通バーコード領域で標識することにより、同細胞由来のゲノム関連情報が識別可能とされる。また、識別の対象がビーズのイメージング情報の場合には、同一のイメージング情報を有するビーズ毎に異なるバーコード領域、すなわち、同一のイメージング情報を有するビーズにおいて共通するバーコード領域が挙げられる。共通バーコード領域で標識することにより、同一のイメージング情報を有するビーズ由来のイメージング情報を識別可能とするものである。
さらに、細胞で発現する蛋白質等の分子に特異的な核酸プローブにおいて、該核酸プローブは該蛋白質等の分子に特異的に結合する分子（結合分子）を含むものである。ここで、前記核酸プローブにおける、前記結合分子毎に異なるバーコード領域、すなわち、同一の結合分子において共通するバーコード領域も共通バーコード領域とされる。
また、固有バーコード領域とは、バーコード核酸毎に異なるバーコード領域で標識することにより、各バーコード核酸を各々峻別可能とするものである。例えば、固有バーコード領域に標識されることにより、各バーコード核酸に連結したビーズ、各バーコード核酸を含む生物、各バーコード核酸とハイブリダイズしたゲノム関連核酸が識別可能とされる。
バーコード領域の長さは、特に限定されるものでないが、好ましくは１０〜４０塩基長の配列である。例えばバーコード領域が１２塩基長である場合は、４１２種類の多様性のあるバーコード配列を一度に核酸増幅することができ、４１２種類のビーズを作製することができる。
【００１７】
本明細書において「ハイブリダイズする」とは、バーコード核酸のハイブリダイズ領域が、細胞ゲノムもしくはその由来物に対応するゲノム関連核酸または別のバーコード核酸と二本鎖の複合体を形成することを意味する。ここで、かかる二本鎖の複合体を形成する例示的条件としては、３７℃、４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  ＳＤＳでのハイブリダイゼーションおよび５５℃〜６０℃の０．５Ｘ〜１ＸＳＳＣでの洗浄が挙げられる。上記二本鎖の複合体を形成する際の別の態様として、複合体の形成がストリンジェントな条件下で行われることが挙げられる。ここでストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的な複合体が形成され、非特異的な複合体が形成されない条件をいい、上記例示的条件を含む。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（ThirdEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照して設定することができる。バーコード核酸のハイブリダイズ領域がハイブリダイズする配列としては、かかるハイブリダイズ領域に相補的な配列が挙げられる。
したがって、「ハイブリダイズ領域」は、細胞ゲノムもしくはその由来物に対応するゲノム関連核酸または別のバーコード核酸に結合する（ハイブリダイズする）領域が好ましい。かかるハイブリダイズ領域は、バーコード核酸においてバーコード領域と共に存在することが好ましい。
例えば、ゲノム関連核酸がｍＲＮＡである場合は、第二バーコード核酸における第二ハイブリダイズ領域はＴにより構成されるポリチミンであることが好ましい。ポリチミンの長さはｍＲＮＡのポリアデニン（Ａ）テールとアニーリングし得る（ハイブリダイズし得る）長さであればよい。上記の場合、第一および第三ハイブリダイズ領域はポリチミンに相補的な配列、例えば、ポリアデニン（ポリＡ）であることが好ましい。
ゲノム関連核酸がゲノムＤＮＡ等のＤＮＡである場合、第二バーコード核酸における第二ハイブリダイズ領域は当該ＤＮＡの特定の配列または当該ＤＮＡに導入されたＤＮＡタグの配列と相補的な配列を含んでなることが好ましい。上記の場合、第一および第三ハイブリダイズ領域は第二ハイブリダイズ領域に相補的な配列であることが好ましい。
また、細胞で発現する蛋白質等の分子に特異的な核酸プローブがバーコード核酸を含み、当該バーコード核酸がハイブリダイズ領域を含む場合には、第二バーコード核酸における第二ハイブリダイズ領域は当該ハイブリダイズ領域と相補的な配列を含んでなることが好ましい。上記の場合、上記核酸プローブに連結したバーコード核酸におけるハイブリダイズ領域は第二ハイブリダイズ領域に相補的な配列であることが好ましい。
【００１８】
１種以上の被検物質と共存した細胞またはその由来物のゲノム関連情報の検出方法  本発明の第一の態様によれば、１種以上の被検物質と共存した細胞またはその由来物のゲノム関連情報を検出する方法は、
１種以上の被検物質と、該被検物質に対応する第一バーコード核酸とを含む複数種の第一コンパートメント、および
細胞またはその由来物と第二バーコード核酸連結ビーズとを含む複数種の第二コンパートメント
をそれぞれ準備し、
前記第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、；
１個の第一コンパートメントと、１個の第二コンパートメントとを融合した、複数種の第三コンパートメントを作成し、
ここで、第三コンパートメントにおいて細胞またはその由来物と被検物質とは共存しており；
前記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得；
該ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造し；
該増幅物の発現パターンを指標として細胞における前記被検物質の共存後のゲノム関連情報を検出することを含んでなることを特徴としている。
【００１９】
以下、本発明を特に限定するものではないが、本発明の第一の態様における検出方法を、工程毎に好ましい実施態様に基づき説明する。
【００２０】
第一、第二および第三コンパートメント準備工程
本発明の第一コンパートメントおよび第二コンパートメント準備工程は、１コンパートメント当たり、１種以上の被検物質と該被検物質に対応する第一バーコード核酸とを含む複数種の第一コンパートメント、および細胞またはその由来物と第二バーコード核酸連結ビーズとを含む複数種の第二コンパートメントをそれぞれ準備する工程である。ここで、第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結している。
【００２１】
コンパートメント
本発明のコンパートメントとしては、１種以上の被検物質と該被検物質に対応する第一バーコード核酸とを含む第一コンパートメント、細胞またはその由来物と第二バーコード核酸連結ビーズとを含む第二コンパートメント、第一コンパートメントと第二コンパートメントとを融合した第三コンパートメント、第四コンパートメントおよび第五コンパートメントが挙げられる。かかるコンパートメントはそれぞれ、コンパートメント中の各成分の組み合わせを、他のコンパートメントと区別しうる区画の単位である。
【００２２】
本発明のコンパートメントの形態は、特に限定されず、例えば、ウェル、液滴またはゲル粒子の形態とすることができる。より具体的な例としては、水性液滴（例えば、油中の水性液滴）、油滴、ハイドロゲルのゲル粒子、エマルション等の複数の非混合界面の重なった水・油の構造体、ミセルまたはリポソーム等の単分子膜または二重分子膜による小胞、マルチウェルプレートのウェル等が挙げられる。
【００２３】
また、コンパートメントの基材としては、被検物質による細胞の影響を測定する観点からは、ハイドロゲル（例えば、低融点アガロース等のアガロース、コラーゲン、アルギン酸等の細胞培養等において足場となる素材等）をはじめとする水性基材を使用することが好ましく、低融点アガロースがより好ましい。さらに、コンパートメントには、細胞培養培地、生理食塩水を含めてもよい。
【００２４】
本発明のコンパートメントは、他のコンパートメントとの峻別の観点から、その周縁部に物理的なバリア機能を有していることが好ましい。かかるバリア機能を有するコンパートメントの好適な製造方法としては、相分離法等が挙げられる。相分離法においては、例えば、細胞およびビーズと水性基材を混合して水性液滴を得、該水性液的を疎水性溶媒中に懸濁させることにより、コンパートメントを生成することができる。
【００２５】
細胞またはその由来物
検出の対象となる細胞の種類、形態は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、目的に応じて細胞を選択することができる。また、上記コンパートメントに含まれる細胞は、細胞の由来物であってもよい。かかる由来物としては、細胞の破砕物、細胞の内容物、細胞の溶解物、細胞から構成されるユニット（例えば、細胞塊、スフェロイド、オルガノイド）が挙げられる。
【００２６】
細胞の由来物（例えば、細胞の破砕物、内容物、溶解物等）は、細胞と細胞溶解バッファー等とを共存させる等の公知手法を用いることにより取得することができる。細胞からその由来物を取得する工程としては、第一コンパートメントと第二コンパートメントを融合して第三コンパートメントを作成する際に細胞溶解バッファー等を共に封入して行ってもよく、細胞および第二バーコード核酸連結ビーズと共に細胞溶解バッファーを封入して第二コンパートメント中で生成させてもよい。
【００２７】
第二および第三コンパートメントにおける細胞の数は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されないが、シングルセル解析の観点からは、１つのコンパートメント当たり１つであることが好ましい。しかしながら、例えば、１細胞毎とするとその応答にばらつきが生じる可能性が高いことから、より信頼度の高い応答計測を行うために、１つのコンパートメント当たりの細胞の数を複数としてもよく、本発明にはかかる態様も包含される。
【００２８】
なお、細胞またはその由来物には、第一バーコード核酸と共に第１コンパートメントを安定に製造する観点から、細胞またはその由来物の表面と第一バーコード核酸と連結しうるリンカー（例えば、オリゴヌクレオチド領域と脂質領域（コレステロール等）とを備えたリンカー等）を接合させておいてもよい。
【００２９】
被検物質
本発明の被検物質は、所望の細胞での応答を検討する被検物質であれば特に限定されず、化合物（例えば、薬剤、培地成分）、細胞等が挙げられる。
【００３０】
第一および第三コンパートメントにおける被検物質の種類数は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されないが、細胞応答の簡素化または明確化の観点からは、１つのコンパートメント当たり１種類であることが好ましい。しかしながら、例えば、複数種の被検物質に対しての細胞の応答を調べる場合には、１つのコンパートメント当たりの被検物質の種類を複数としてもよく、本発明にはかかる態様も包含される。
【００３１】
第一バーコード核酸
本発明の第一バーコード核酸は、各被検物質に対応するバーコード領域を含んでいれば、特に限定されず、例えば、該核酸はＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれら組み合わせである。
【００３２】
本発明の第一バーコード核酸は、各々同一の被検物質に共通して対応する第一共通バーコード領域と、後述の第二バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第一ハイブリダイズ領域を含んでなることが好ましい。ここで、第一共通バーコード領域の配列情報を用いることにより、第一および第三コンパートメントにおける同一の被検物質を一対一に対応し識別できる。したがって、第一共通バーコード領域の配列情報を用いることにより、第三コンパートメント中に存在する被検物質を同定することができる。
【００３３】
第一ビーズ
上記第一バーコード核酸は核酸単体であってもよく、第一ビーズに連結されるか（以下、第一バーコード核酸連結ビーズともいう）または第一ビーズ中に存在していてもよい。  本明細書において、ビーズとは、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、バーコード核酸が連結できる粒子もしくはバーコード核酸を含むことができる粒子またはバーコード核酸を含むことができる生物が好ましい。または、ビーズの形状も限定されない。
第一バーコード核酸は第一ビーズ一つあたり同一の第一バーコード核酸が複数連結しているか、第一ビーズ一つあたり同一の第一バーコード核酸が複数存在していることが好ましい。
また、上記第一ビーズに連結されるか上記第一ビーズ中に存在する第一バーコード核酸は一種類であることが好ましい。
【００３４】
第一ビーズが粒子である場合、その材質は、特に限定されないが、セレン化カドミウム（CdSe）、硫化亜鉛（ZnS）、硫化カドミウム（CdS）、セレン化亜鉛（ZnSe）、酸化亜鉛（ZnO）、二酸化ケイ素（SiO2）等の半導体材料でできた量子ドット（半導体ナノ粒子）等の半導体、金等の重金属等の無機物質、アクリルアミド、アガロース、コラーゲン、アルギン酸、セルロース、キトサン、ヒアルロン酸、シリコーンハイドロゲル、ＰＥＧ系等のハイドロゲル、ポリスチレン、ポリプロピレン、親水性ビニルポリマー（例えば、Toyopearl HW-65S(東ソー株式会社)）等の樹脂、またはこれらのハイドロゲル素材を化学的に架橋したもの、またはＰＥＧまたはその誘導体が結合した親水性ビニルポリマー等が挙げられ、好ましくは、ハイドロゲルであり、より好ましくは、アクリルアミド、アルギン酸である。かかる第一ビーズは細胞を培養する場合の支持体ともなり得る。
【００３５】
第一ビーズが生物である場合、生物の種類、形態は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、目的に応じて生物を選択することができる。かかる生物としては、真核生物もしくは原核生物またはその細胞が挙げられ、例えば微生物等であり、具体的には、大腸菌等のバクテリア、酵母等の真菌が挙げられる。かかる生物は、第一バーコード核酸を有するプラスミドを含むことが好ましく、第一バーコード核酸を有するプラスミドを増幅できることがさらに好ましい。
【００３６】
以下、本発明を特に限定するものではないが、本発明の第一バーコード核酸の一態様を図１に従って説明する。
図１では、第一バーコード核酸の一態様として、第一バーコード核酸がＤＮＡである態様を示す。第一バーコード核酸１０１は第一共通バーコード領域１０２および第一ハイブリダイズ領域１０３を含む。ここで、第一ハイブリダイズ領域１０３としてポリアデニンが挙げられる。
【００３７】
第一バーコード核酸の製造方法
第一バーコード核酸は特定の核酸配列を固相合成法または酵素合成法により調製される。バーコード核酸がＲＮＡである場合は、一本鎖バーコード核酸の相補鎖となるＤＮＡ鋳型を合成した後、線形増幅反応にて、ＤＮＡ鋳型上のプロモーター配列に結合して一本鎖バーコード領域を含むＲＮＡを合成する、Ｔ７等のＲＮＡポリメラーゼにより合成してもよい。バーコード核酸がＤＮＡである場合は、該バーコード核酸は本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、例えば、既知配列を用いて合成されおよび／または設計されてもよい。
第一バーコード核酸連結ビーズは、後述の第三バーコード核酸を有するビーズの製造方法と同様の製造方法を用いることができる。
【００３８】
第二バーコード核酸連結ビーズ
図２では、ゲノム関連核酸、および第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ（以下、第二バーコード核酸連結ビーズともいう）の一態様を示す。
図２では、第二バーコード核酸連結ビーズ２０７を示し、第二バーコード核酸２０２が第二ビーズ２０１に連結している。第二バーコード核酸２０２は、第二共通バーコード領域２０３、第二固有バーコード領域２０４および第二ハイブリダイズ領域２０５を含む。第二バーコード核酸２０２は、第二ビーズ側から順に、ＰＣＲプライマー領域２０６、第二共通バーコード領域２０３、第二固有バーコード領域２０４および第二ハイブリダイズ領域２０５を含む。上記第二ハイブリダイズ領域２０５はポリチミンである。第二バーコード核酸２０２は、第二固有バーコード領域２０４を含むため、各第二バーコード核酸としてはそれぞれ異なる配列を有する。したがって、第二ビーズに連結する複数の第二バーコード核酸は複数種の第二バーコード核酸となることが好ましい。
第二ビーズは、多数のゲノム関連核酸とハイブリダイズできる観点から、１，０００〜１００，０００の第二バーコード核酸と連結していることが好ましい。
【００３９】
第二ビーズ
本発明の第二ビーズの材質は、第一ビーズ粒子と同様の材質を用いることができる。
本発明の第二ビーズの材質は、好ましくは、ハイドロゲル、樹脂であり、より好ましくは、アクリルアミド、ポリスチレン、親水性ビニルポリマー、ＰＥＧまたはその誘導体が結合した親水性ビニルポリマーである。
【００４０】
第二バーコード核酸
本発明の第二バーコード核酸は、バーコード領域を含んでいれば、特に限定されず、例えば、該核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれら組み合わせである。第二バーコード核酸は第二ビーズに直接的または間接的に連結することができる。
【００４１】
本発明の第二バーコード核酸は、互いに共通する第二共通バーコード領域と、互いに峻別しうる第二固有バーコード領域と、第二ハイブリダイズ領域とを含むことが好ましい。ここで、上記第二共通バーコード領域の配列情報は、コンパートメント中に第二バーコード核酸と共に存在する細胞を特定する指標として用いることができる。さらに、上記第二固有バーコード領域の配列情報は、ゲノム関連核酸を特定する指標として用いることができる。また、上記第二ハイブリダイズ領域は、ゲノム関連核酸、第一バーコード核酸、第三バーコード核酸および後述の第四バーコード核酸のそれぞれとハイブリダイズすることができる。したがって、第二ハイブリダイズ領域がポリチミン、またはゲノム関連核酸と相補的な核酸を含むことが好ましい。
上述のように、ゲノム関連核酸は上記第二共通バーコード領域の配列情報に関連づけられるため、該ゲノム関連核酸が由来する細胞を特定することができる。さらに、上記第二バーコード核酸は第一バーコード核酸とハイブリダイズするため、第一バーコード核酸の第一共通バーコード領域等の配列情報も上記第二共通バーコード領域の配列情報に関連づけられることとなる。なお、上述のように、第一共通バーコード領域の配列情報は各被検物質に対応している。
さらに、上記第二バーコード核酸は第三バーコード核酸とハイブリダイズするため、第三バーコード核酸を有するビーズの第三共通バーコード領域等の配列情報も上記第二共通バーコード領域の配列情報に関連づけられることとなる。なお、第三共通バーコード領域の配列情報は各第三ビーズのイメージング情報に関連づけられている。また、細胞の非破壊的計測情報も各第三ビーズのイメージング情報に関連づけられている。したがって、ゲノム関連核酸情報と細胞の非破壊的計測情報に一対一に対応できる。
【００４２】
第二バーコード核酸連結ビーズの製造方法
複数種の第二バーコード核酸連結ビーズの製造方法は、公知の手法により製造することができる。例えば、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015)またはGierahn, T. M et al., Seq-Well: A Portable, Low-Cost Platform for High-Throughput Single-Cell RNA-Seq of Low-Input Samples；Nat Methods. 14, 395-398 (2017)に記載の方法により製造することができる。
【００４３】
上記方法を簡単に述べると、第二バーコード核酸における第二共通バーコード領域は分割プール合成 (split-and-pool synthesis) により製造することができる。例えば、分割プール合成工程をｎラウンド行うことにより製造できる。各ラウンドは、ｉ）ビーズの集団を４個に分割する工程、ｉｉ）各ビーズ集団毎にＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれかを合成する工程、ｉｉｉ）４つのビーズ集団を合わせてプールする工程からなる。ラウンド数ｎは、製造するバーコード配列の長さにより適宜設定できる。例えば、ｎ＝６〜４０が挙げられる。
上記第二共通バーコードを製造した後に、第二固有バーコード領域を合成する。第二共通バーコード領域に連結した全てのビーズに対してＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの全ての塩基の存在下での合成をｍラウンド行う。ラウンド数ｍは、製造するバーコード配列の長さにより適宜設定できる。例えば、ｍ＝３〜１５が挙げられる。
【００４４】
以下、本発明を特に限定するものではないが、本発明の第一〜第三コンパートメント準備工程の一態様を図３ａに従って説明する。
まず、ｎ種の被検物質、すなわち、被検物質１  ３０１〜被検物質ｎ  ３０３、および、被検物質１  ３０１、被検物質ｎ  ３０３にそれぞれ対応する第一バーコード核酸  ３０２、３０４を準備する。その後、１つの被検物質に対応する第一バーコード核酸をそれぞれ含む第一コンパートメント３０５を準備する。なお、図３ａでは、第一バーコード核酸はＤＮＡであり、第一共通バーコード領域およびポリアデニンを含む。
【００４５】
また、組織または複数の細胞等検出対象となる細胞群３０６、複数の第二バーコード核酸連結ビーズ３０７をそれぞれ準備する。ここで、第二バーコード核酸はＤＮＡであり、ＰＣＲプライマー領域、第二共通バーコード領域、第二固有バーコード領域およびポリチミンを含む。
【００４６】
図３ａでは、被検物質１種類とそれに対応するバーコード核酸１種類を含むように第一コンポーネントを作成する。かかる第一コンパートメント作成工程により１種類の被検物質とそれに対応するバーコード核酸が関連付けられる。具体的には、例えば、被検物質１種類とそれに対応するバーコード核酸１種類をウェル等で混合することによって作成する。
【００４７】
一方、細胞群３０６および複数の第二バーコード核酸連結ビーズ３０７を分配処理することにより複数種の第二コンパートメント３０８を得る。上記分配処理により、上記細胞群３０６のうちの一細胞３１０、第二バーコード核酸連結ビーズ３０７の組み合わせを複数種の第二コンパートメント３０８に分配する。
分配処理の方法は後述する。
【００４８】
上記第二バーコード核酸連結ビーズの１コンパートメント当たりの数は、特に限定されないが、同一細胞由来のゲノム関連情報の識別または同一コンパートメントにおける複数細胞のゲノム関連情報の識別の観点から、１コンパートメント当たり１つが好ましい。
【００４９】
その後、１個の第一コンパートメント３０５と、１個の第二コンパートメント３０８とを融合させ複数種の第三コンパートメント３０９を作成する。ここで、第三コンパートメントにおいて、細胞またはその由来物と被検物質とが共存している。
１個の第一コンパートメント３０５と１個の第二コンパートメント３０８とを融合させて第三コンパートメント３０９を作成する方法は、公知の手法を用いることができる。例えば、B.L. Wang et al., Nat Biotechnol. 32(5), 473-8 (2014 May)、B. Demaree et al., J Vis Exp. (135), 57598 (2018)、L. Xu et al., Lab Chip. 12(20), 3936-42 (2012)、L. Mazutis et al., Lab Chip. 9(20), 2902-8 (2009)に記載の方法が挙げられる。  
【００５０】
さらに、分配処理時に、後の工程で必要な試薬、例えば、ＰＣＲリアクション・ミックス等のＰＣＲ用試薬を同時に封入しても良い。
【００５１】
被検物質共存下における細胞の培養工程
必要に応じ、細胞またはその由来物と被検物質とを第三コンパートメントにおいて共存した状態で培養してもよい。かかる培養とは、例えば、第三コンパートメントを所望の培養時間、培養温度で保持することが挙げられる。第三コンパートメントの保持において、複数種の第三コンパートメントを保持できるリザーバに、第三コンパートメントを移動し保持してもよい。上記工程は、公知の手法により行うことができる。例えば、J.J. Agresti et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 107(9), 4004-9 (2010)、A. Abbaspourrad et al., Sci Rep., 5, 12756 (2015)、B.L. Wang et al., Nat Biotechnol., 32(5), 473-8 (2014)に記載の方法により行うことができる。
【００５２】
ここで、培養時間、培養温度としては、被検物質に対しての細胞の応答評価が可能な程度の培養時間、培養温度を設定することができる。かかる培養時間は、例えば、０時間以上１４日以下が挙げられ、好ましくは２時間以上２日以下である。培養温度は、例えば、０℃以上１００℃以下が挙げられ、好ましくは２０℃以上４０℃以下である。
【００５３】
第三コンパートメントにおいて細胞またはその由来物と被検物質とを共存させ培養する場合には、被検物質に対する細胞の応答が細胞培養中に行われることから、培養後に細胞溶解バッファーを加える工程を含むことが好ましい。上記工程は、公知の手法により行うことができる。例えば、図３ｂに示すように、細胞溶解バッファーを含む水性溶媒３２３を含む第四コンパートメント３２４と第三コンパートメント３０９とを融合させ第五コンパートメント３１５を作成してもよい。かかる融合方法としては、例えば、B.L. Wang et al., Nat Biotechnol. 32(5), 473-8 (2014 May)、B. Demaree et al., J Vis Exp. (135), 57598 (2018)、L. Xu et al., Lab Chip. 12(20), 3936-42 (2012)、L. Mazutis et al., Lab Chip. 9(20), 2902-8 (2009)に記載の方法が挙げられる。
【００５４】
ハイブリダイズ複合体取得工程
ハイブリダイズ複合体取得工程は、前記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得る工程を含む。
上記工程は、公知の手法により行うことができる。例えば、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015)またはZheng GX et al., Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 6;8:14049 (2017)に記載の方法により行うことができる。
以下、特に限定するものではないが、ハイブリダイズ複合体取得工程の一態様を図３ｂに従って説明する。
上述の様に、複数種の第三コンパートメント作成工程、および、必要に応じ、被検物質共存下における細胞の培養工程、細胞溶解バッファー添加工程に続き、細胞を溶解する。その後、コンパートメント内で、細胞由来ｍＲＮＡ３１２および第一バーコード核酸３０２をそれぞれ、第二バーコード核酸３１３にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズ複合体３１４を得る。その後に、液滴を破壊する。
【００５５】
ハイブリダイズ複合体由来の増幅物の製造工程
ハイブリダイズ複合体由来の増幅物の製造工程は、上記ハイブリダイズ複合体取得工程で得られたハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造する工程を含む。
上記工程は、公知の手法により行うことができる。例えば、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015)またはZheng GX et al., Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 6;8:14049 (2017)に記載の方法により行うことができる。
【００５６】
以下、特に限定するものではないが、ハイブリダイズ複合体由来の増幅物の製造工程の一態様を図３ｃに従って説明する。
上述のハイブリダイズ複合体取得工程で得られたハイブリダイズ複合体に対して、相補鎖ＤＮＡの合成および逆転写反応を行う。この合成反応および逆転写反応により、細胞由来ｍＲＮＡ３１２に対するｃＤＮＡ３１７が合成され、第一バーコード核酸３０２に対する相補鎖ＤＮＡ３１６が合成される。その後、鋳型切り替え（テンプレートスイッチング）を行ってもよい。
【００５７】
その後、ＰＣＲ反応を行う。このＰＣＲ反応により、第一バーコード核酸３０２と第二バーコード核酸３１３とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物３１９、および、細胞由来ｍＲＮＡ３１２と第二バーコード核酸３１３とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物３２０の２種類の増幅物３１８が生じる。なお、ゲノム関連核酸がＤＮＡである場合には、上記ＰＣＲ反応としてエクステンションＰＣＲ法を行うことができる。
その後、得られた増幅物に基づいて、被検物質１〜ｎをそれぞれ含む各第三コンパートメントに由来する、第一増幅物および第二増幅物を含む増幅物のライブラリーを調製する。
【００５８】
細胞における被検物質共存後のゲノム関連情報の検出工程
細胞における被検物質共存後のゲノム関連情報の検出工程は、上記ハイブリダイズ複合体由来の増幅物の製造工程で得られた増幅物の発現パターンを指標として細胞と共存した被検物質を同定し該細胞のゲノム関連情報を検出する工程を含む。上記増幅物の発現パターンとしては、例えば、シークエンシングにより得られた、増幅物の配列情報、例えば、該配列情報中の第一バーコード核酸の配列情報（例えば、第一共通バーコード領域の配列情報）、第二バーコード核酸の配列情報（例えば、第二共通バーコード領域の配列情報、第二固有バーコード領域の配列情報）等が挙げられる。
【００５９】
以下、特に限定するものではないが、細胞における被検物質共存後のゲノム関連情報の検出工程の一態様を図３ｄに従って説明する。
上述のハイブリダイズ複合体由来の増幅物の製造工程で得られた増幅物（第一増幅物、第二増幅物）の配列をシーケンサーにより決定し、増幅物の配列情報の解析を行う。第二増幅物の解析では、第二共通バーコード領域の配列情報を指標として、各増幅物の由来する細胞を割り当てる。また、第二固有バーコード領域の配列情報により、各ｍＲＮＡ分子を識別できることから、該配列情報を指標として、細胞毎のｍＲＮＡの配列およびその発現量等の情報を得ることができる。上記第二増幅物の解析で得られた情報に基づき、細胞毎のトランスクリプトーム情報３２２を得ることができる。
【００６０】
次に、上記細胞と共存した被検物質３２１の同定を行う。ここで、上述のように、第一バーコード核酸は被検物質３２１に対応している。したがって、上記同定では、第一バーコード核酸の第一共通バーコード領域の配列情報に基づいて、各第一増幅物に対し、細胞と共存した被検物質３２１を割り当てることができる。
【００６１】
次に、細胞と共存した被検物質３２１と、トランスクリプトーム情報３２２のマッチングを行う。したがって、各第三コンパートメント中の細胞のゲノム関連情報と共存した被検物質を、１対１で結びつけることができる。
したがって、１種以上の被検物質と共存した細胞またはその由来物のトランスクリプトーム情報等のゲノム関連情報の検出により、共存した被検物質に対しての細胞の応答を評価することができる。
【００６２】
１種以上の被検物質と共存した細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する方法
本発明の第二の態様によれば、本発明は、第一の態様による検出方法に加え、１種以上の被検物質と共存した細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する方法をさらに含む。
かかる方法は、上述の、１種以上の被検物質と共存した細胞またはその由来物のゲノム関連情報を検出する方法であって、
前記第二コンパートメントが、さらに第三バーコード核酸を有するビーズを含み、
ここで、第三バーコード核酸を有するビーズは、
各々、各イメージング情報に対応する第三バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各々、各イメージング情報に対応する第三バーコード核酸を含む生物であって、
かつ第三コンパートメントにおける第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報は互いに峻別可能であり、
細胞の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報とを共に検出して、細胞の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報とを関連付けし、
関連付けした第三バーコード核酸を有するビーズから第三バーコード核酸を切断するか取り出し、前記ゲノム関連核酸および第三バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得、
ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造し、
増幅物の発現パターンを指標として細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出すること
をさらに含んでなることを特徴としている。
【００６３】
上記第二の態様における、コンパートメント、細胞またはその由来物、被検物質、第一バーコード核酸およびその製造方法、第一ビーズ、第二バーコード核酸連結ビーズおよびその製造方法、第二ビーズ、ならびに第二バーコード核酸の態様はいずれも、上記第一の態様における記載に準じることができる。
【００６４】
第三バーコード核酸を有するビーズ
本発明の第三バーコード核酸を有するビーズで用いられる第三ビーズは、そのイメージング情報に基づき、各コンパートメント中の細胞またはその由来物の非破壊的計測情報を特定するための指標として用いられる。したがって、本発明の第三ビーズは、細胞またはその由来物と共にコンパートメントに分配することが可能であり、かつイメージング情報を測定可能なビーズとすることができる。また、各コンパートメントに分配されるビーズは、コンパートメント内の細胞またはその由来物の非破壊的計測情報を特定する指標として機能することから、互いに峻別しうるイメージング情報を有していることが好ましい。  
【００６５】
上記第三ビーズのイメージング情報としては、各コンパートメントにおける第三ビーズのイメージング情報が互いに峻別しうるものであれば、特に限定されないが、ビーズ自体が有するイメージング情報であっても標識されることにより付与されるイメージング情報であってもよい。ここで、「イメージング」とは、空間情報に基づき時間的に重なっている、ビーズ等の被検対象の計測情報を分離測定しうる方法を包含する。上記イメージングにより取得される被検対象の計測情報をイメージング情報という。上記イメージング情報としては、例えば、色（カラー）、蛍光、サイズ、形状、電磁波、透過、位相、散乱、反射、コヒーレントラマン、赤外分光、ラマン分光、吸収スペクトル、第三ビーズの数から選択される少なくとも１つの測定情報が挙げられる。イメージング情報としては、好ましくは、赤外分光イメージング、ラマン分光イメージング、カラーイメージング、蛍光イメージングである。
【００６６】
蛍光としては、有機系蛍光分子、生体由来蛍光分子、量子ドット、重金属等の無機物質、またはそれらの組み合わせにより得ることができる。
【００６７】
透過、位相、散乱、反射等の測定情報は、濃度によって屈折率や色の異なる有機物質、無機物質、またはそれらの組み合わせにより得ることができる。また、これら情報は明視野観察法等により得ることができる。
【００６８】
吸収スペクトル、ラマンは、吸収、ラマン散乱スペクトルを有する吸収波長帯（分子フットプリント）の異なる有機分子、無機物質、それら組み合わせにより得ることができ、例えば、細胞信号と重ならない波長帯を有するアルキン系化合物が挙げられる。
【００６９】
また、コヒーレントラマンに関しては、例えば、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）法、誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）法により測定することができる。
【００７０】
ビーズのサイズ、色、形状に関しても、第三ビーズのイメージング情報となり、これらサイズ、色、形状はビーズを例えばフローリソグラフィにより形成することにより、多種多様なものとなりうる。また、これら情報は明視野観察法等により得ることができる。
【００７１】
また、ビーズのイメージング情報は、細胞と空間的に分離されるため、細胞の非破壊的計測情報と干渉する事なく、分離することができる。
【００７２】
上記第三ビーズは、バーコード核酸が連結できる粒子またはバーコード核酸を含むことができる生物であれば特に限定されず、形状も限定されない。
第三ビーズが粒子である場合、その材質は、第一ビーズと同様の材質を用いることができる。第三ビーズの材質は、好ましくは、ハイドロゲルであり、より好ましくは、アクリルアミド、アルギン酸である。
第三ビーズが生物である場合、第一ビーズと同様の生物を用いることができる。かかる生物としては、具体的には、大腸菌等のバクテリア、酵母等の真菌が挙げられる。かかる生物は第三バーコード核酸を有するプラスミドを増幅できることが好ましい。
【００７３】
上記第三ビーズの１コンパートメント当たりの数は、特に限定されず、１つでも良いが、互いに峻別しうるコンパートメントの種類数を増やすために、複数であることが好ましく、２〜１００がより好ましく、２、３、４、５、６、７、８、９、１０がさらに好ましい。複数の第三ビーズを同時にコンパートメントに閉じ込めることにより、少ない種類の第三ビーズのイメージング情報の組み合わせにより、コンパートメント内の第三ビーズのイメージング情報の組み合わせのバリエーションの数を急激に増加することができ、大量のコンパートメントを互いに峻別することができる。ここで、第三ビーズは同一のイメージング情報を有するものも存在するが、異なる種類のイメージング情報を有する第三ビーズがコンパートメント中に複数存在することが好ましい。
例えば、第三ビーズのイメージング情報として、ビーズのサイズ、蛍光の色、蛍光の濃度を選択した例を以下に示す。ビーズのサイズが３種類（３、７、１１μｍ）、蛍光色素の色が３色（青、緑、赤）、蛍光色素の濃度による強度レベルが６種類（０、１、２、３、４、５）とする。その場合、第三ビーズの種類としては、（強度レベルサイズ種類−１）×サイズ種類＝（６３−１）×３＝６４５となる。
ここで、コンパートメント中に、第三ビーズが３個存在する場合、第三ビーズの各組み合わせの種類としては６４５Ｃ３＞１０７通りと非常に多くの種類の組み合わせを得ることができる。
【００７４】
細胞の非破壊的計測情報
上記細胞の非破壊的計測情報としては、細胞の特徴を認識できるものであれば、特に限定されず、イメージング情報、細胞から得られる形態情報、細胞から得られる物理波（例えば、音、超音波）の測定情報、細胞から得られる電磁波（例えば、光、テラヘルツ）の測定情報が挙げられる。ここで、上記イメージング情報は第三ビーズのイメージング情報と同様に得ることができる。上記非破壊的計測情報としては、例えば、色、蛍光、サイズ、形状、電磁波、透過、位相、散乱、反射、コヒーレントラマン、赤外分光、ラマン、もしくは吸収スペクトル等の測定情報に基づくイメージング情報、または、核、細胞質の大きさ、細胞骨格の粗密さ、内部構造の特徴量、膜の一様さ、各構造の蛍光強度、分子局在、分子もしくは観察対象の位置関係等の細胞の形態情報が挙げられ、好ましくは、細胞から得られる形態情報である。
【００７５】
第三バーコード核酸と切断可能に連結されかつ互いに峻別しうるイメージング情報を有する第三ビーズ
本発明における、第三バーコード核酸を有するビーズは、各々、各イメージング情報に対応する第三バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、各々、各イメージング情報に対応する第三バーコード核酸を含む生物であることが好ましい。
【００７６】
図４では、第三バーコード核酸と切断可能に連結されかつ互いに峻別しうるイメージング情報を有する第三ビーズ４０６（以下、第三バーコード核酸連結ビーズ、ともいう）の一態様として、第三バーコード核酸がＲＮＡである態様を示す。
第三バーコード核酸４０２が、互いに峻別しうるイメージング情報を有する第三ビーズ４０１に連結している。第三バーコード核酸４０２は第三共通バーコード領域４０３および第三ハイブリダイズ領域４０４を含む。第三バーコード核酸４０２は、第三ビーズ側から順に、第三共通バーコード領域４０３および第三ハイブリダイズ領域４０４を含む。ここで、第三ハイブリダイズ領域４０４としてポリアデニンが挙げられる。さらに、第三バーコード核酸４０２は、切断可能なリンカー４０５を介して切断可能に、ビーズ４０１に連結している。
【００７７】
第三バーコード核酸を含む生物
本発明の第三ビーズは、第三バーコード核酸を含みかつ互いに峻別しうるイメージング情報を有する生物（以下、第三バーコード核酸を含む生物、ともいう）であってもよい。  かかる生物は、第三バーコード核酸を有するプラスミドを含むことが好ましい。また、かかる生物におけるイメージング情報は、本発明のイメージング情報であれば特に限定されないが、好ましくは、生物の個数、蛍光であり、蛍光としては各色のスペクトルのみならずその輝度情報も含む。さらに、蛍光はプラスミド中に存在する蛍光タンパク質遺伝子から発現する蛍光タンパク質により得られることが好ましい。したがって、本発明の生物は、例えば、第三バーコード核酸と蛍光タンパク質遺伝子とを有するプラスミドを含むことが好ましい。ここで、第三バーコード核酸は第三共通バーコード領域（例えば、蛍光タンパク質毎に共通した共通バーコード領域）および第三ハイブリダイズ領域を含み、第三ハイブリダイズ領域としてポリアデニンが挙げられる。さらに、第三バーコード核酸は第三固有バーコード領域を含んでいてもよい。かかる第三固有バーコード領域は生物の各クローンを峻別可能とするものである。したがって、本発明の生物におけるプラスミドの構成は、例えば、順に、蛍光タンパク質遺伝子領域、第三固有バーコード領域、第三共通バーコード領域、および第三ハイブリダイズ領域とされる。
【００７８】
第三バーコード核酸
本発明の第三バーコード核酸は、各イメージング情報に対応するバーコード領域を含んでいれば、特に限定されず、例えば、該核酸はＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれら組み合わせである。
【００７９】
本発明の第三バーコード核酸は、各々同一のイメージング情報に対応する第三ビーズにおいて共通する第三共通バーコード領域と、第二バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第三ハイブリダイズ領域を含んでなることが好ましい。ここで、第三共通バーコード領域の配列情報を用いることにより、各コンパートメントにおける同一のイメージング情報を有する第三ビーズのイメージング情報に一対一に対応できる。したがって、関連付けにより、同一コンパートメント中に存在する細胞の非破壊的計測情報を特定する指標とすることができる。
【００８０】
上記第三バーコード核酸は第三ビーズ一つあたり同一の第三バーコード核酸が複数連結していることが好ましい。
また、本発明の第三ビーズは一種類の第三バーコード核酸を連結していることが好ましい。
【００８１】
第三バーコード核酸は第三ビーズと直接的または間接的に連結することができる。第三バーコード核酸は第三ビーズと切断可能に連結されることが好ましく、例えば、切断可能なリンカーにより連結することができる。本発明において、切断可能なリンカーとは、化学的に切断可能なリンカー、ＵＶ等の光切断可能なリンカー、熱学的に切断可能なリンカー、酵素学的に切断可能なリンカー等が挙げられる。上記リンカーを用いることで、連結された核酸をビーズから切断し、分離または遊離できることを示す。このようなリンカーとしては、例えは、光により切断可能なリンカーとして、ＰＣ−ビオチン、ｉＳｐＰＣ等、化学的に切断可能なリンカーとして、ジスルフィド結合等が挙げられる。
【００８２】
本発明の第三ビーズの好ましい別の態様としては、各々互いに峻別しうる第三固有バーコード領域、プライマー領域をさらに含んでいてもよい。本発明の第三ビーズの好ましいさらに別の態様としては、切断可能なリンカーを介してアクリルホスホロアミダイド部分（Acrydite（商標））等のアクリルアミド部分を有していてもよい。
【００８３】
第三バーコード核酸と切断可能に連結されかつ互いに峻別しうるイメージング情報を有する第三ビーズの製造方法
第三バーコード核酸と連結している第三ビーズの製造方法は、公知の手法に準じて製造することができる。例えば、A. M. Klein et al., Droplet Barcoding for Single-Cell Transcriptomics Applied to Embryonic Stem Cells. Cell. 161, 1187-1201 (2015) に記載の方法に準じて製造することができる。
上記方法の一例としては、マイクロ流体エマルジョン技術により、第三バーコード核酸含有アクリルアミド：ビスアクリルアミド水溶液を有機溶媒層中でアクリルアミド重合体とし、第三ビーズとして用いる。ここで、第三バーコード核酸に結合した切断可能なリンカーのビーズ連結側はアクリルホスホロアミダイド部分（Acrydite（商標））等のアクリルアミド部分で修飾することができる。上記修飾によりアクリルアミドの重合時に、第三バーコード核酸もアクリルアミド重合体に共に重合される。このエマルション化の前に、例えば、上記水溶液に、蛍光標識されたアクリルアミドモノマーを溶解させておくことにより、各色での種々の蛍光強度を有する第三ビーズを作成することができる。具体的には、第三ビーズはフローフォーカシング・デバイス(flow focusing device)、またはマイクロウェル等のマイクロ流体技術を用いた液滴製造法を用いて製造することができる。ビーズのサイズは、フローフォーカシング・デバイスでは流体条件を変えることにより、マイクロウェルではそれぞれのチャンバーのサイズを変更することにより制御することができる。重合化した後、得られた第三ビーズを液滴から取り出し、何回か洗浄し、第三ビーズとして用いる。
【００８４】
第三バーコード核酸と連結している第三ビーズの製造方法は、公知の手法でも製造することができる。例えば、特表２００９−５１３９４８号公報、特表２０１７−５０６８７７号公報に記載の方法により製造することができる。
上記方法の一例を述べる。まず、第三バーコード核酸は特定の核酸配列を固相合成法または酵素合成法により調製される。その後、切断可能なリンカーを介して第三ビーズに結合する。バーコード核酸がＲＮＡである場合は、一本鎖バーコード核酸の相補鎖となるＤＮＡ鋳型を合成した後、線形増幅反応にて、ＤＮＡ鋳型上のプロモーター配列に結合して一本鎖バーコード領域を含むＲＮＡを合成する、Ｔ７等のＲＮＡポリメラーゼにより合成してもよい。
【００８５】
以下、本発明を特に限定するものではないが、本発明の第二の態様における第一〜第三コンパートメント準備工程の別の態様を図５ａに従って説明する。
まず、ｎ種の被検物質、すなわち、被検物質１  ５０１〜被検物質ｎ  ５０３、および、被検物質１  ５０１、被検物質ｎ  ５０３にそれぞれ対応する第一バーコード核酸  ５０２、５０４を準備する。その後、１つの被検物質に対応する第一バーコード核酸をそれぞれ含む第一コンパートメント５０５を準備する。なお、図５ａでは、第一バーコード核酸はＤＮＡであり、第一共通バーコード領域およびポリアデニンを含む。
また、組織または複数の細胞等検出対象となる細胞群５０６、複数種の第二バーコード核酸連結ビーズ５０７、複数種の第三バーコード核酸を有するビーズ５０８をそれぞれ準備する。なお、図５ａでは、第三バーコード核酸はＲＮＡであり、第三共通バーコード領域およびポリアデニンを含み、ＵＶ切断可能なリンカーを介して第三ビーズに連結している。また、第二バーコード核酸はＤＮＡであり、ＰＣＲプライマー領域、第二共通バーコード領域、第二固有バーコード領域およびポリチミンを含む。
【００８６】
図５ａでは、被検物質１種類とそれに対応するバーコード核酸１種類を含むように第一コンポーネントを作成する。具体的には、例えば、被検物質１種類とそれに対応するバーコード核酸１種類をウェル等で混合することによって作成する。
【００８７】
一方、細胞群５０６、複数種の第二バーコード核酸連結ビーズ５０７および複数種の第三バーコード核酸を有するビーズ５０８を分配処理することにより複数種の第二コンパートメント５０９を得る。上記分配処理により、上記細胞群５０６のうちの一細胞５１１、第二バーコード核酸連結ビーズ５０７、第三バーコード核酸を有するビーズ５０８の組み合わせを複数種の第二コンパートメント５０９に分配する。
分配処理の方法は後述する。
【００８８】
上記第二バーコード核酸連結ビーズの１コンパートメント当たりの数は、特に限定されないが、同一細胞由来のゲノム関連情報の識別または同一コンパートメントにおける複数細胞のゲノム関連情報の識別の観点から、１コンパートメント当たり１つが好ましい。
【００８９】
その後、１個の第一コンパートメント５０５と、１個の第二コンパートメント５０９とを融合させ複数種の第三コンパートメント５１０を作成する。ここで、第三コンパートメントにおいて、細胞またはその由来物と被検物質とは共存している。
１個の第一コンパートメント５０５と１個の第二コンパートメント５０９とを融合させて第三コンパートメント５１０を作成する方法は、公知の手法を用いることができる。例えば、B.L. Wang et al., Nat Biotechnol. 32(5), 473-8 (2014 May)、B. Demaree et al., J Vis Exp. (135), 57598 (2018)、L. Xu et al., Lab Chip. 12(20), 3936-42 (2012)、L. Mazutis et al., Lab Chip. 9(20), 2902-8 (2009)に記載の方法が挙げられる。
【００９０】
ここで、各コンパートメントにおける細胞と第三ビーズとの位置関係は、細胞の非破壊計測情報および第三ビーズのイメージング情報の取得を妨げない限り特に限定されず、細胞や第三ビーズの種類、サイズ、性質に応じて、適宜設定できる。すなわち、本発明においては、細胞と第三ビーズとはイメージング情報を共に取得しうる限り、同一コンパートメント内において第三ビーズと細胞とが接するかもしくは接さずに共に存在していてもよく、第三ビーズが細胞の内部に導入されていてもよい。第三ビーズと細胞が接する態様の好適な例としては、例えば、細胞表面と第三ビーズとが直接接着されるかまたは市販の細胞膜修飾剤を用いることにより第三ビーズを細胞に担持させる態様等が挙げられる。また、第三ビーズと細胞が接しない態様の好適な例としては、同一コンパートメント内で第三ビーズが細胞と接合することなく存在している態様や、細胞を含まないが第三ビーズを包含するサブコンパートメントと細胞とを接合させることによりサブコンパートメントを細胞に担持させる態様等が挙げられる。また、第三ビーズが細胞の内部に導入される態様の好適な例としては、第三ビーズが細胞に捕食されている態様等が挙げられる。
【００９１】
さらに、分配処理時に、後の工程で必要な試薬、例えば、ＰＣＲリアクション・ミックス等のＰＣＲ用試薬を同時に封入しても良い。
【００９２】
細胞の非破壊的計測情報とビーズのイメージング情報の関連付け工程
本発明の細胞の非破壊的計測情報とビーズのイメージング情報の関連付け工程は、細胞の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報とを共に検出して、細胞の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報とを関連付けする工程を含む。
以下、本発明を特に限定するものではないが、本発明の第二の態様における非破壊的計測情報の関連付け工程の一態様を図５ｂに従って説明する。
【００９３】
第三コンパートメント５１０の一細胞５１１の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズ５０８のイメージング情報とを共に測定する。さらに、得られた測定結果に基づき、第三コンパートメント５１０における一細胞５１１の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズ５０８のイメージング情報とを関連付けをする。
【００９４】
上記細胞の非破壊的計測情報と、第三ビーズのイメージング情報とを共に検出または測定する方法としては、フローサイトメトリー（例えば、流路を流れるコンパートメントを観察するイメージングフローサイトメトリー法等）、顕微鏡測定（一般的な光学顕微鏡を用いたマイクロウェル内のコンパートメント観察法等）等が挙げられる。
【００９５】
また、本発明の別の態様によれば、第三コンパートメント５１０は、ビーズのイメージング情報により特定することができることから、例えば、被検物質と細胞との共存前の細胞の非破壊的計測情報およびイメージング情報の取得後に、被検物質と細胞とを共存させて所定時間経過した後、例えば、６時間〜２日後に、細胞の非破壊的計測情報等を再度測定することも可能である。このような検出を繰り返すことにより、細胞の非破壊的計測情報をモニタリングすることもできる。
【００９６】
図５ｆおよび図５ｇでは、一例としてイメージング情報の解析スキームをより具体的に説明する。
図５ｆは、サイズ、ＲＧＢ、蛍光輝度やその他の光学特性をコントロールして作製されたｍ種類（ＩＤ）の第三ビーズのイメージング情報を指標とする場合の第三ビーズのデータベースの模式図である。図５ｆでは、第三ビーズのイメージング情報を計測し、得られた第三ビーズのイメージング情報に光学的ビーズＩＤを紐付けしている。
さらに、図５ｇでは、細胞および第三ビーズの組合せの測定を行い、細胞の非破壊的計測情報と第三ビーズのイメージング情報を関連付けしている。まず、各第三ビーズの光学バーコードＩＤが読み出される（ここで、光学的なキャリブレーションが行われる）。また、各第三ビーズには、第三ビーズに連結する第三バーコード核酸の第三共通バーコード領域に基づいて核酸バーコードＩＤが付与されている。したがって、上記第三バーコード核酸を有するビーズの核酸バーコードＩＤの組合せと上記光学的ビーズＩＤの組合せとを照合し、細胞が特定される。この後、細胞の非破壊的計測情報と細胞のゲノム関連情報とを紐付けることができる。
【００９７】
本発明の細胞の非破壊的計測情報と第三ビーズのイメージング情報の検出および関連付け工程は、上述の第三コンパートメントのみならず、第三コンパートメントを準備する前および／または第二コンパートメントにおいても実施することができる。具体的には、被検物質と細胞との共存前の第二コンパートメントまたは第三コンパートメントを準備する前、および／または、被検物質と細胞の共存後の所定時間経過後に、細胞の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報とを共に検出することができる。
【００９８】
ここで、第二コンパートメントを準備する前に細胞の非破壊的計測情報と第三ビーズのイメージング情報とを共に検出して関連付けする態様における細胞と第三ビーズとの位置関係は、上述の第二または第三コンパートメントにおける細胞と第三ビーズの位置関係と同様であり、細胞の非破壊計測情報および第三ビーズのイメージング情報の取得を妨げない限り特に限定されず、細胞や第三ビーズの種類、サイズ、性質に応じて、適宜設定できる。すなわち、本発明においては、細胞の非破壊計測情報と第三ビーズのイメージング情報とを共に取得しうる限り、分配中の流路内において第三ビーズと細胞とが接するかもしくは接さずに共に存在していてもよく、第三ビーズが細胞の内部に導入されていてもよい。好適な例としては、例えば、第三ビーズを細胞に担持させる態様、細胞を含まないが第三ビーズを包含するサブコンパートメントと細胞とを接合させることによりサブコンパートメントを細胞に担持させる態様、第三ビーズが細胞に捕食されている態様等が挙げられる。ここで、第二コンパートメントの準備前の細胞と第三ビーズとの位置関係とは、細胞および第三バーコード核酸を有するビーズが第二コンパートメントに封入される前、例えば、第二コンパートメントに分配中の流路内における細胞と第三ビーズとの位置関係が挙げられる。
【００９９】
被検物質共存下における細胞の培養工程
必要に応じ、細胞またはその由来物と被検物質とを第三コンパートメントにおいて共存した状態で培養してもよい。かかる培養とは、例えば、第三コンパートメントを所望の培養時間、培養温度で保持することが挙げられる。第三コンパートメントの保持において、複数種の第三コンパートメントを保持できるリザーバに、第三コンパートメントを移動し保持してもよい。上記工程は、公知の手法により行うことができる。例えば、J.J. Agresti et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 107(9), 4004-9 (2010)、A. Abbaspourrad et al., Sci Rep., 5, 12756 (2015)、B.L. Wang et al., Nat Biotechnol., 32(5), 473-8 (2014)に記載の方法により行うことができる。
ここで、培養時間、培養温度としては、被検物質に対しての細胞の応答評価が可能な程度の培養時間、培養温度を設定することができる。かかる培養時間は、例えば、０時間以上１４日以下が挙げられ、好ましくは２時間以上２日以下である。培養温度は、例えば、０℃以上１００℃以下が挙げられ、好ましくは２０℃以上４０℃以下である。
【０１００】
第三コンパートメントにおいて細胞またはその由来物と被検物質とを共存させ培養する場合には、被検物質に対する細胞の応答が細胞培養中に行われることから、培養後に細胞溶解バッファーを加える工程を含むことが好ましい。上記工程は、公知の手法により行うことができる。例えば、図５ｃに示すように、細胞溶解バッファーを含む水性溶媒５２２を含む第四コンパートメント５２３と第三コンパートメント５１０とを融合させ第五コンパートメント５２４を作成してもよい。かかる融合方法としては、例えば、B.L. Wang et al., Nat Biotechnol. 32(5), 473-8 (2014 May)、B. Demaree et al., J Vis Exp. (135), 57598 (2018)、L. Xu et al., Lab Chip. 12(20), 3936-42 (2012)、L. Mazutis et al., Lab Chip. 9(20), 2902-8 (2009)に記載の方法が挙げられる。
【０１０１】
ハイブリダイズ複合体取得工程
ハイブリダイズ複合体取得工程は、前記関連付けした第三ビーズから第三バーコード核酸を切断した後、前記ゲノム関連核酸、第一バーコード核酸および第三バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得る工程を含む。
上記工程は、公知の手法により行うことができる。例えば、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015)またはZheng GX et al., Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 6;8:14049 (2017)に記載の方法により行うことができる。
以下、特に限定するものではないが、本発明の第二の態様におけるハイブリダイズ複合体取得工程の一態様を図５ｃに従って説明する。
上述の細胞の非破壊的計測情報とビーズのイメージング情報の関連付け工程および複数種の第三コンパートメント作成工程、および、必要に応じ、被検物質共存下における細胞の培養工程、細胞溶解バッファー添加工程に続き、切断可能なリンカーを切断（例えば、ＵＶ照射によりＵＶ切断可能なリンカーを切断）し、第三バーコード核酸５１６を切り離し、その後細胞を溶解する。その後、コンパートメント内で、第一バーコード核酸５０２、細胞由来ｍＲＮＡ５１２および第三バーコード核酸５１６をそれぞれ、第二バーコード核酸５１３にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズ複合体５１４を得る。その後に、液滴を破壊する。
【０１０２】
ハイブリダイズ複合体由来の増幅物の製造工程
ハイブリダイズ複合体由来の増幅物の製造工程は、上記ハイブリダイズ複合体取得工程で得られたハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造する工程を含む。
【０１０３】
上記工程は、公知の手法により行うことができる。例えば、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015)またはZheng GX et al., Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 6;8:14049 (2017)に記載の方法により行うことができる。
以下、特に限定するものではないが、本発明の第二の態様におけるハイブリダイズ複合体由来の増幅物の製造工程の一態様を図５ｄに従って説明する。
上述のハイブリダイズ複合体取得工程で得られたハイブリダイズ複合体に対して、相補鎖ＤＮＡの合成および逆転写反応を行う。この合成反応および逆転写反応により、細胞由来ｍＲＮＡ５１２に対するｃＤＮＡ５１５が合成され、第一バーコード核酸５０２に対する相補鎖ＤＮＡ５１７、第三バーコード核酸５１６に対するｃＤＮＡ５２８が合成される。その後、鋳型切り替え（テンプレートスイッチング）を行ってもよい。
その後、ＰＣＲ反応を行う。このＰＣＲ反応により、第一バーコード核酸５０２と第二バーコード核酸５１３とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物５１９、細胞由来ｍＲＮＡ５１２と第二バーコード核酸５１３とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物５２０、および、第三バーコード核酸５１６と第二バーコード核酸５１３とのハイブリダイズ複合体に由来する第三増幅物５２１の３種類の増幅物５１８が生じる。なお、ゲノム関連核酸がＤＮＡである場合には、上記ＰＣＲ反応としてエクステンションＰＣＲ法を行うことができる。
その後、得られた増幅物に基づいて、被検物質１〜ｎをそれぞれ含む各第三コンパートメントに由来する、第一、第二および第三増幅物を含む増幅物のライブラリーを調製する。
【０１０４】
細胞における非破壊的計測情報と被検物質共存後のゲノム関連情報との一体的検出工程
細胞における非破壊的計測情報と被検物質共存後のゲノム関連情報とを一体的に検出する工程は、上記ハイブリダイズ複合体由来の増幅物の製造工程で得られた増幅物の発現パターンを指標として細胞における非破壊的計測情報と被検物質共存後の該細胞のゲノム関連情報とを一体的に検出する工程を含む。かかる工程は、さらに該細胞と共存した被検物質を同定する工程も含む。上記増幅物の発現パターンとしては、例えば、シークエンシングにより得られた、増幅物の配列情報、例えば、該配列情報中の第一バーコード核酸の配列情報（例えば、第一共通バーコード領域の配列情報）、第二バーコード核酸の配列情報（例えば、第二共通バーコード領域の配列情報、第二固有バーコード領域の配列情報）および第三バーコード核酸の配列情報（例えば、第三共通バーコード領域の配列情報、第三固有バーコード領域の情報）等が挙げられる。
【０１０５】
以下、特に限定するものではないが、本発明の第二の態様における細胞における非破壊的計測情報と被検物質共存後の該細胞のゲノム関連情報とを一体的に検出する工程の一態様を図５ｅに従って説明する。
【０１０６】
上述のハイブリダイズ複合体由来の増幅物の製造工程で得られた増幅物（第一増幅物、第二増幅物および第三増幅物）の配列をシーケンサーにより決定し、増幅物の配列情報の解析を行う。第二増幅物の解析では、第二共通バーコード領域の配列情報を指標として、各増幅物の由来する細胞を割り当てる。また、第二固有バーコード領域の配列情報により、各ｍＲＮＡ分子を識別できることから、該配列情報を指標として、細胞毎のｍＲＮＡの配列およびその発現量等の情報を得ることができる。上記第二増幅物の解析で得られた情報に基づき、細胞毎のトランスクリプトーム情報５２７を得ることができる。
【０１０７】
次に、上記細胞と共存した被検物質５２５の同定を行う。ここで、上述のように、第一バーコード核酸は被検物質５２５に対応している。したがって、上記同定では、第一バーコード核酸の第一共通バーコード領域の配列情報に基づいて、各第一増幅物に対し、細胞と共存した被検物質５２５を割り当てることができる。
【０１０８】
次に、細胞の非破壊的計測情報５２６の解析を行う。ここで、上述のように、細胞の非破壊的計測情報と第三ビーズのイメージング情報とが関連付けられており、該第三ビーズには、各イメージング情報に対応している第三バーコード核酸が連結している。したがって、上記解析では、第三バーコード核酸の第三共通バーコード領域の配列情報に基づいて、各第三増幅物に対し、由来する細胞の非破壊的計測情報５２６を割り当てることができる。
【０１０９】
次に、細胞と共存した被検物質５２５、細胞の非破壊的計測情報５２６、およびトランスクリプトーム情報５２７のマッチングを行う。したがって、各第三コンパートメントにおける被検物質と共存した細胞の非破壊的計測情報と該被検物質共存後の細胞のゲノム関連情報とを、１対１で結びつけることができる。
したがって、上記検出により、共存した被検物質に対しての細胞の応答を遺伝子レベルのみならず細胞の形態等からも評価することができる。
【０１１０】
さらに、第一バーコード核酸、第二バーコード核酸連結ビーズおよび第三バーコード核酸を有するビーズおよびの別の態様を図６に示す。図６では、別の態様として、第一バーコード核酸、第二バーコード核酸および第三バーコード核酸がそれぞれＤＮＡである態様を示す。
【０１１１】
図６Ａの第三バーコード核酸を有する第三ビーズ６００では、第三バーコード核酸６０２が、互いに峻別しうるイメージング情報を有する第三ビーズ６０１に連結している。第三バーコード核酸６０２は第三共通バーコード領域６０３および第三ハイブリダイズ領域６０４を含む。第三バーコード核酸６０２は、第三ビーズ側から順に、第三共通バーコード領域６０３および第三ハイブリダイズ領域６０４を含む。さらに、第三バーコード核酸６０２は、切断可能なリンカー６０５を介して切断可能に、第三ビーズ６０１に連結している。さらに、第三ハイブリダイズ領域６０４は下記第二ハイブリダイズ領域６１５に相補的な配列である。
【０１１２】
また、図６Ａの第二バーコード核酸連結ビーズ６１０では、第二バーコード核酸６１２が第二ビーズ６１１に連結している。第二バーコード核酸６１２は、第二共通バーコード領域６１３、第二固有バーコード領域６１４および第二ハイブリダイズ領域６１５を含む。第二バーコード核酸６１２は、第二ビーズ側から順に、ＰＣＲプライマー領域６１６、第二共通バーコード領域６１３、第二固有バーコード領域６１４および第二ハイブリダイズ領域６１５を含む。上記第二ハイブリダイズ領域６１５はゲノム関連核酸６２２の特定の配列とハイブリダイズする、当該配列に相補的な配列である。
また、図６Ａの第一コンパートメント６２５は、被検物質１  ６２３および被検物質１に対応する第一バーコード核酸６２４を含む。ここで、第一バーコード核酸６２４は第一共通バーコード領域６２７および第一ハイブリダイズ領域６２６を含む。
【０１１３】
さらに、図６Ａは、第三バーコード核酸と連結している第三ビーズ６００、第二バーコード核酸連結ビーズ６１０、被検物質１  ６２３、第一バーコード核酸６２４、および細胞６２０を含む第三コンパートメント６３０を示す。
また、図６Ｂでは、ハイブリダイズ複合体を示す。ここで、第二バーコード核酸６１２は第二ハイブリダイズ領域６１５にて、第三バーコード核酸６０２の第三ハイブリダイズ領域６０４とハイブリダイズしている。さらに、第二バーコード核酸６１２は第二ハイブリダイズ領域６１５にて、ゲノム関連核酸６２２の特定の配列６２１とハイブリダイズしている。さらに、第二バーコード核酸６１２は第二ハイブリダイズ領域６１５にて、第一バーコード核酸６２４の第一ハイブリダイズ領域６２６とハイブリダイズしている。
【０１１４】
さらに、第一バーコード核酸、第三バーコード核酸を有するビーズおよび第二バーコード核酸連結ビーズのさらに別の態様を図７に示す。図７では、第一バーコード核酸および第二バーコード核酸がそれぞれＤＮＡであり、細胞で発現する蛋白質等の分子に特異的な核酸プローブ７２０（以下、核酸プローブ７２０ともいう）を含む態様を示す。
【０１１５】
図７Ａの第三バーコード核酸を有する第三ビーズ７００では、第三バーコード核酸７０２が、互いに峻別しうるイメージング情報を有する第三ビーズ７０１に連結している。第三バーコード核酸７０２は第三共通バーコード領域７０３および第三ハイブリダイズ領域７０４を含む。第三バーコード核酸７０２は、第三ビーズ側から順に、第三共通バーコード領域７０３および第三ハイブリダイズ領域７０４を含む。さらに、第三バーコード核酸７０２は、切断可能なリンカー７０５を介して切断可能に第三ビーズ７０１に連結している。さらに、第三ハイブリダイズ領域７０４は下記第二ハイブリダイズ領域７１５に相補的な配列である。
【０１１６】
また、図７Ａの第二バーコード核酸連結ビーズ７１０では、第二バーコード核酸７１２が第二ビーズ７１１に連結している。第二バーコード核酸７１２は、第二共通バーコード領域７１３、第二固有バーコード領域７１４および第二ハイブリダイズ領域７１５を含む。第二バーコード核酸７１２は、第二ビーズ側から順に、ＰＣＲプライマー領域７１６、第二共通バーコード領域７１３、第二固有バーコード領域７１４および第二ハイブリダイズ領域７１５を含む。上記第二ハイブリダイズ領域７１５は核酸プローブ７２０のハイブリダイズ領域７２４に相補的な配列である。
【０１１７】
また、図７Ａの第一コンパートメント７５０は、被検物質１  ７５１および被検物質１に対応する第一バーコード核酸７５１を含む。ここで、第一バーコード核酸７５２は第一共通バーコード領域７５４および第一ハイブリダイズ領域７５３を含む。
【０１１８】
図７Ｂ（１）では、核酸プローブ７２０を示す。図７Ｂ（２）では、上記核酸プローブ７２０を細胞７３０と混合し洗浄することにより得られた、上記核酸プローブ７２０が細胞７３０で発現する蛋白質に結合する態様を示す。さらに、図７Ｂ（３）では、第三バーコード核酸を有する第三ビーズ７００、第二バーコード核酸連結ビーズ７１０、被検物質１  ７５１および第一バーコード核酸７５２とともに、上記核酸プローブ７２０が結合した細胞７３０を含む第三コンパートメント７４０を示す。
【０１１９】
図７Ｂ（１）の核酸プローブ７２０では、第四バーコード核酸７２２が、細胞で発現する目的蛋白質等の分子に特異的に結合する分子７２１（以下、結合分子７２１ともいう）に連結している。第四バーコード核酸７２２は第四共通バーコード領域７２３および第四ハイブリダイズ領域７２４を含む。第四バーコード核酸７２２は、結合分子７２１から順に、第四共通バーコード領域７２３および第四ハイブリダイズ領域７２４を含む。さらに、第四バーコード核酸７２２は、切断可能なリンカー７２５を介して切断可能に、結合分子７２１に連結している。さらに、第四ハイブリダイズ領域７２４は第二ハイブリダイズ領域７１５に相補的な配列である。上記核酸プローブ７２０は、結合分子７２１毎に異なる第四バーコード核酸７２２を含む複数種類のプローブであって良い。
【０１２０】
また、図７Ｃはハイブリダイズ複合体を示す。第二バーコード核酸７１２は第二ハイブリダイズ領域７１５にて、第三バーコード核酸７０２の第三ハイブリダイズ領域７０４とハイブリダイズしている。さらに、第二バーコード核酸７１２は第二ハイブリダイズ領域７１５にて、第四バーコード核酸７２２の第四ハイブリダイズ領域７２４とハイブリダイズしている。さらに、第二バーコード核酸７１２は第二ハイブリダイズ領域７１５にて、第一バーコード核酸７５２の第一ハイブリダイズ領域７５３とハイブリダイズしている。  上記核酸プローブ７２０の第四共通バーコード領域７２３の配列に由来する増幅物の配列情報の解析を行うことにより、目的とする分子に関しての、被検物質共存後の細胞での発現の有無や量を確認することができる。
したがって、細胞で発現する分子に特異的な核酸プローブを用いることにより、被検物質共存後の細胞における大量プロテオミクスと細胞の非破壊的計測情報とが一対一に対応できる。
【０１２１】
さらに、第三バーコード核酸を有するビーズの別の態様を図８に示す。図８では、別の態様として、第三バーコード核酸がＤＮＡであり、特定の配列を含む態様を示す。
【０１２２】
図８Ａの第三バーコード核酸と連結しているビーズ８００では、第三バーコード核酸８０２が、互いに峻別しうるイメージング情報を有する第三ビーズ８０１に連結している。第三バーコード核酸８０２は第三共通バーコード領域８０３および第三ハイブリダイズ領域８０４を含む。第三バーコード核酸８０２は、第三ビーズ側から順に、第三共通バーコード領域８０３および第三ハイブリダイズ領域８０４を含む。さらに、第三バーコード核酸８０２は、切断可能なリンカー８０５を介して切断可能に、第三ビーズ８０１に連結している。さらに、第三バーコード核酸８０３と切断可能なリンカー８０５の間に、特定の配列８０６を含む。さらに、第三ハイブリダイズ領域８０４は第二ハイブリダイズ領域８１５に相補的な配列である。
【０１２３】
また、図８Ｂ（１）では、ハイブリダイズ複合体における第三バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズの態様を示す。８１０は第二バーコード核酸連結ビーズを示す。ここで、第二バーコード核酸８１２は第二ハイブリダイズ領域８１５にて、第三バーコード核酸８０２の第三ハイブリダイズ領域８０４とハイブリダイズしている。さらに、図８Ｂ（２）に示すように、特定の配列８０６に相補的な配列のプライマー８０７を用いることにより、第三バーコード核酸８０２および第二バーコード核酸８１２と相補的なＤＮＡが合成され、さらに、第二バーコード核酸８１２の相補的なＤＮＡの合成はテンプレートスイッチングにより行われる。
【０１２４】
さらに、第一バーコード核酸、第二バーコード核酸連結ビーズおよび第三バーコード核酸を有するビーズの別の態様を図９に示す。図９では、別の態様として、第一バーコード核酸、第二バーコード核酸および第三バーコード核酸がそれぞれＤＮＡである態様を示す。
図９Ａはコンパートメントの準備工程を示す。図９Ａの第三バーコード核酸と連結している第三ビーズ９００では、第三バーコード核酸９０２が、互いに峻別しうるイメージング情報を有する第三ビーズ９０１に連結している。第三バーコード核酸９０２は第三共通バーコード領域９０３および第三ハイブリダイズ領域９０５を含む。第三バーコード核酸９０２は、第三ビーズ側から順に、ＰＣＲプライマー領域９０８、第三共通バーコード領域９０３、第三固有バーコード領域９０４および第三ハイブリダイズ領域９０５を含む。さらに、第三バーコード核酸９０２は、切断可能なリンカー９０６を介して切断可能に、第三ビーズ９０１に結合したアクリルホスホロアミダイド部分（Acrydite（商標））等のアクリルアミド部分９０７に連結している。さらに、第三ハイブリダイズ領域９０５はポリアデニンである。
【０１２５】
また、図９Ａの第二バーコード核酸連結ビーズ９１０では、第二バーコード核酸９１２が第二ビーズ９１１に連結している。第二バーコード核酸９１２は、第二共通バーコード領域９１３、第二固有バーコード領域９１４および第二ハイブリダイズ領域９１５を含む。第二バーコード核酸９１２は、第二ビーズ側から順に、ＰＣＲプライマー領域９１６、第二共通バーコード領域９１３、第二固有バーコード領域９１４および第二ハイブリダイズ領域９１５を含む。上記第二ハイブリダイズ領域９１５はポリチミンである。９２０は細胞を示す。
また、図９Ａの第一バーコード核酸９２８は第一共通バーコード領域９２９および第一ハイブリダイズ領域９３０を含む。ここで、第一ハイブリダイズ領域９３０はポリアデニンである。９２６は被検物質１を示す。
【０１２６】
図９Ｂ〜Ｅは、細胞の非破壊的計測情報とビーズのイメージング情報との関連づけ工程を経た後の、ハイブリダイズ複合体取得工程を示す。
【０１２７】
図９Ｂでは、光切断可能なリンカーを切断し、細胞を溶解している。図９Ｂでは、第三バーコード核酸９０２が切断された第三ビーズ９０１、第二バーコード核酸連結ビーズ９１０、および細胞由来ｍＲＮＡ９２１を示す。
また、図９Ｃでは、ハイブリダイズ複合体を示す。ここで、第二バーコード核酸９１２は第二ハイブリダイズ領域９１５にて、第一バーコード核酸９２８の第一ハイブリダイズ領域９３０とハイブリダイズしている。さらに、ＤＮＡポリメラーゼ９３１により相補鎖ＤＮＡ９３２が合成される。ここで、第二バーコード核酸９１２は第二ハイブリダイズ領域９１５にて、第三バーコード核酸９０２の第三ハイブリダイズ領域９０５とハイブリダイズしている。さらに、ＤＮＡポリメラーゼ９２２により相補鎖ＤＮＡ９２３が合成される。また、第二バーコード核酸９１２は第二ハイブリダイズ領域９１５にて、細胞由来ｍＲＮＡ９２１のポリアデニンとハイブリダイズしている。
【０１２８】
図９Ｄでは、ハイブリダイズ複合体において、逆転写反応が行われ、細胞由来ｍＲＮＡ９２１に対するｃＤＮＡ９２４が合成される。
【０１２９】
図９Ｅでは、合成されたｃＤＮＡの３’末端がＤＮＡタグ９２５によりタグ化されている。上記ＤＮＡタグは、ＰＣＲのプライマーサイトとして用いることができ、例えば、トランスポゾンMosaic End(ME)配列が挙げられる。
【０１３０】
分配処理
本発明における分配処理、すなわち、コンパートメントの製造方法の一態様を図１０、１１に基づき、具体的に説明する。
図１０は、被検物質、第一バーコード核酸、細胞および第二バーコード核酸連結ビーズを含む態様においてコンパートメントを製造する方法を示す。
具体的には、まず、被検物質１〜ｎと該被検物質１〜ｎに対応する第一バーコード核酸１〜ｎとをそれぞれ含む複数種の第一コンパートメント１００１を準備する。一方、細胞１００２、第二バーコード核酸連結ビーズ１００３を含む溶液を油１００４中に入れ、第二コンパートメント１００５としての液滴を作成する。次に、第一コンパートメント１００１と第二コンパートメント１００５とを融合して第三コンパートメント１００６を作成する。得られた第三コンパートメント１００６をリザーバ１００７に移動し一定時間培養を行う。一方、細胞溶解バッファーを含む水性溶媒１００８が油１００９の充填された流路に放出され、第四コンパートメント１０１０が作成される。次に、第四コンパートメント１０１０と第三コンパートメント１００６とを融合して第五コンパートメント１０１１を作成し、出口１０１２で放出する。上記方法において、具体的にコンパートメントの製造に使用する機器としては、フローフォーカシング・デバイス等のマイクロ流体技術を用いた液滴製造法に用いられる機器が挙げられる。上記機器としては、本発明を妨げない限り、公知の機器を用いることができる。フローフォーカシング・デバイス等のマイクロ流体技術を用いた液滴製造法に用いられる機器として、例えば、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015)、Microfluid Nanofluid(2008)5:585-594, Applied Physics Letters、Vol.85, No.13, 27, September 2004, p2649-2651、T. M. Gierahn et al., Seq-Well: portable, low-cost RNA sequencing of single cells at high throughput, Nature Methods, 14, 395-398 (2017)、特表２０１３−５０８１５６等に記載の機器が挙げられる。
【０１３１】
図１１は、被検物質、第一バーコード核酸、細胞、第二バーコード核酸連結ビーズおよび第三バーコード核酸を有するビーズを含む態様において、コンパートメントを製造し、細胞の非破壊的計測情報と第三ビーズのイメージング情報とを共に検出および／または測定する方法を示す。
具体的には、まず、被検物質１〜ｎと該被検物質１〜ｎに対応する第一バーコード核酸１〜ｎとをそれぞれ含む複数種の第一コンパートメント１１０１を準備する。一方、細胞１１０２、第二バーコード核酸連結ビーズ１１０３および第三バーコード核酸を有するビーズ１１０４を含む溶液を油１１０５中に入れ、第二コンパートメント１１０６としての液滴を作成する。次に、第一コンパートメント１１０１と第二コンパートメント１１０６とを融合して第三コンパートメント１１０７を作成する。得られた第三コンパートメント１１０７をリザーバ１１０９に移動し一定時間培養を行う。一方、細胞溶解バッファーを含む水性溶媒１１１１が油１１１２の充填された流路に放出され、第四コンパートメント１１１３が作成される。次に、第四コンパートメント１１１３と第三コンパートメント１１０７とを融合して第五コンパートメント１１１４を作成し、出口１１１５で放出する。非破壊的計測情報の測定は、第三コンパートメントにおいて培養前および培養後に行われる。培養の前と後に各１種類の測定、例えば蛍光イメージング測定１１０８、明視野イメージング１１１０を行うことができる。ここで、培養前の蛍光イメージング測定では、細胞および第三ビーズの正確なイメージング情報を得ることができ、培養後の明視野イメージングでは、被検物質との共存後の細胞および第三ビーズの組み合わせを確認することができる。また、かかる方法によれば、細胞および第三ビーズの自然な状態が撮影可能になる。また、培養前に、蛍光イメージング測定および明視野イメージング測定を行ってもよく、ラマン等の非修飾イメージング測定を用いてもよい。上記方法において、具体的に使用する機器としては、コンパートメントの製造には上述のようにフローフォーカシング・デバイス等のマイクロ流体技術を用いた液滴製造法に用いられる機器が挙げられ、非破壊的計測情報の測定には、イメージングフローサイトメトリー等が挙げられる。上記機器としては、本発明を妨げない限り、公知の機器を用いることができる。上記フローフォーカシング・デバイス等のマイクロ流体技術を用いた液滴製造法に用いられる機器によれば、色、形、サイズをはじめとするイメージング情報を有するビーズを効率よく大量に製造することができる。
【０１３２】
別の態様
なお、本発明の方法において、第三コンパートメントは、上述の通り、第一および第二コンパートメントを融合することにより製造してよいが、被検物質と第一バーコード核酸との関連付け、および第二バーコード核酸と細胞またはそのゲノム由来物との関連付けを妨げない範囲において、第一および第二コンパートメントへ封入する成分の組み合わせや、第三コンパートメントの製造方法は適宜変更して実施することができる。したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、１種以上の被検物質と共存した細胞またはその由来物のゲノム関連情報を検出する方法であって、被検物質と共存させた細胞またはその由来物と、第一バーコード核酸と、第二バーコード核酸連結ビーズとを含んでなる複数の対象コンパートメントを準備し、ここで、前記第一バーコード核酸は被検物質に予め関連付けされており、第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸を含んでおり、ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得、ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造し、増幅物の発現パターンを指標として細胞における前記被検物質の共存後のゲノム関連情報を検出することを含んでなる方法が提供される。別の好ましい態様においては、対象コンパートメントは、第一の態様における第一コンパートメントに対応する。
【０１３３】
別の好ましい態様において、第一バーコード核酸と前記被検物質との関連付けは、被検物質と、細胞またはその由来物と、第一バーコード核酸とを共存させることを含んでなることが好ましい。また、細胞またはその由来物と第一バーコード核酸を共存させる際には、対象コンパートメントを安定に製造する観点から、細胞またはその由来物の表面と、第一バーコード核酸とをリンカー等により結合させることが好ましい。
【０１３４】
また、対象コンパートメントの準備は、前記被検物質と共存させた細胞またはその由来物と第一バーコード核酸とを含んでなるサブコンパートメントと、前記第二バーコード核酸連結ビーズを含んでなるサブコンパートメントとを結合させることを含んでなることが好ましい。
【０１３５】
さらに別の好ましい態様によれば、第三バーコード核酸を有するビーズを用いて、１種以上の被検物質と共存した細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出することができる。さらに別の好ましい態様によれば、１種以上の被検物質と共存した細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する方法において、上記対象コンパートメントは、第三バーコード核酸を有するビーズをさらに含み、ここで、第三バーコード核酸を有するビーズは、各々、各イメージング情報に対応する第三バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、各々、各イメージング情報に対応する第三バーコード核酸を含む生物であって、かつ第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報は互いに峻別可能であり、細胞の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報とを共に検出して、細胞の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報とを関連付けし、関連付けした第三バーコード核酸を有するビーズから第三バーコード核酸を切断するか取り出し、前記ゲノム関連核酸および第三バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得、ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造し、増幅物の発現パターンを指標として細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出すること
をさらに含んでなる。
【０１３６】
上記別の好ましい態様のさらなる詳細については、第一の態様および第二の態様に準じて実施することができる。
【０１３７】
組み合わせ物
本発明の別の実施態様によれば、１種以上の被検物質と共存した細胞のゲノム関連情報を検出するための、第一バーコード核酸および第二バーコード核酸連結ビーズの組み合わせ物であって、第一バーコード核酸は各々、細胞と共存する１種以上の被検物質に対応しており、第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として被検物質を同定し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として細胞のゲノム関連情報を検出することができることを特徴としている。また、本発明の組み合わせ物は、１種以上の被検物質と共存した細胞のゲノム関連情報を検出するために用いる限り、特に制限されず、１つの組成物または試薬等の剤の形態であってもよく、複数種の組成物または試薬等の剤の組み合わせから構成されていてもよい。また、上記組み合わせ物は一体的にまたは別体として構成されていてもよい。上記複数または別体としての組成物の組み合わせとしては、例えば、第一バーコード核酸を含んでなる組成物と、第二バーコード核酸連結ビーズを含んでなる組成物との組み合わせが挙げられる。ここで、上記組み合わせ物は、細胞１種以上の被検物質と共存した細胞のゲノム関連情報を検出する方法に用いるための試薬キットであってもよい。かかる試薬キットは、緩衝液、逆転写反応またはＰＣＲ反応に必要な試薬、細胞溶解バッファー等の必要な試薬、使用説明書等を備えていてもよい。
【０１３８】
第一バーコード核酸を含んでなる検出剤
本発明の別の実施態様によれば、１種以上の被検物質と共存した細胞のゲノム関連情報を検出するための、第二バーコード核酸連結ビーズと共に用いる、第一バーコード核酸を含んでなる検出剤であって、第一バーコード核酸は各々、細胞と共存する１種以上の被検物質に対応しており、第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として被検物質を同定し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として細胞のゲノム関連情報を検出することができることを特徴としている。
【０１３９】
第二ビーズを含んでなる検出剤
本発明の別の実施態様によれば、１種以上の被検物質と共存した細胞のゲノム関連情報を検出するための、第一バーコード核酸と共に用いる、第二バーコード核酸連結ビーズを含んでなる検出剤であって、第一バーコード核酸各々は、細胞と共存する１種以上の被検物質に対応しており、第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として被検物質を同定し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として細胞のゲノム関連情報を検出することができることを特徴としている。
【０１４０】
複数種の第一コンパートメントを含む組成物
本発明の別の実施態様によれば、複数種の第一コンパートメントを含む組成物であって、各第一コンパートメントには、それぞれ１種の被検物質と当該１種の被検物質に対応する第一バーコード核酸が含まれることを特徴としている。かかる組成物は、スクリーニングに用いるための組成物、すなわち、ライブラリーとして使用できる。本発明の好ましい別の態様によれば、上述の複数種の第一コンパートメントを含む組成物は、１種以上の被検物質と共存した細胞のゲノム関連情報を検出するための、第二バーコード核酸連結ビーズと共に用いる、第一コンパートメントを含む組成物であってもよく、ここで、第一バーコード核酸は各々、細胞と共存する１種以上の被検物質に対応しており、第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として被検物質を同定し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として細胞のゲノム関連情報を検出することができる。上述の複数種の第一コンパートメントを含む組成物における第一コンパートメントの形態は特に限定されず、第一コンパートメントの形態が油中の水性液滴である場合には、上記組成物は、水性液滴と共に油を含んでいてもよい。
【０１４１】
複数種の第二コンパートメントを含む組成物
本発明の別の実施態様によれば、１種以上の被検物質と共存した細胞のゲノム関連情報を検出するための、第一バーコード核酸と共に用いる、複数種の第二コンパートメントを含む組成物であって、第一バーコード核酸各々は、細胞と共存する１種以上の被検物質に対応しており、各第二コンパートメントは、それぞれ細胞またはその由来物と第二バーコード核酸連結ビーズとを含み、第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として被検物質を同定し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として細胞のゲノム関連情報を検出することができることを特徴としている。本発明のさらに別の実施態様によれば、１種以上の被検物質と共存した細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するための、第一バーコード核酸と共に用いる、複数種の第二コンパートメントを含む組成物であって、第一バーコード核酸各々は、細胞と共存する１種以上の被検物質に対応しており、；各第二コンパートメントは、それぞれ細胞またはその由来物、第二バーコード核酸連結ビーズおよび第三バーコード核酸を有するビーズを含み、；第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸、第一バーコード核酸あるいは第三バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、第三バーコード核酸を有するビーズは、各々、各イメージング情報に対応する第三バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、各々、各イメージング情報に対応する第三バーコード核酸を含む生物であって、かつ第三コンパートメントにおける第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報は互いに峻別可能であり、；第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として被検物質を同定し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として細胞のゲノム関連情報を検出することができ、；細胞の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報とを共に検出して、細胞の非破壊的計測情報と、第三バーコード核酸を有するビーズのイメージング情報とを関連付けし、；第三バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第三増幅物の発現パターンを指標として細胞における非破壊的計測情報を検出でき、；該被検物質と共存した細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出することができることを特徴としている。上述の複数種の第二コンパートメントを含む組成物は、被検物質のスクリーニングのための組成物として使用できる。上述の複数種の第二コンパートメントを含む組成物における第二コンパートメントの形態は特に限定されず、第二コンパートメントの形態が油中の水性液滴である場合には、上記組成物は、水性液滴と共に油を含んでいてもよい。
【０１４２】
被検物質のスクリーニング方法
本発明の好ましい態様によれば、本発明の第一の態様の検出方法において検出される細胞またはその由来物のゲノム関連情報に基づき、被検物質をスクリーニングする方法が提供される。本発明の別の好ましい態様によれば、本発明の第二の態様の検出方法において検出される細胞の非破壊的計測情報およびゲノム関連情報に基づき、被検物質をスクリーニングする方法が提供される。
【０１４３】
上記の組み合わせ物、第一ビーズを含んでなる検出剤、第二ビーズを含んでなる検出剤、組成物およびスクリーニング方法の態様はいずれも、本発明の検出方法に関する記載に準じて実施することができる。
【実施例】
【０１４４】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されない。また、特に言及しない限り、本発明の測定方法および単位は日本工業規格（JIS）の規定に従う。【０１４５】
例１：コンパートメントの製造試験
本実験においては、マイクロ流体デバイスを用いて、薬剤（Lipopolysaccharide：LPS）、細胞（THP1細胞）、第二バーコード核酸連結ビーズ（Macosko-2011-10(V+), ChemGenes社製(商標））を同時に内包する液滴が生成し、安定に存在できることを確認した。本実施例において液滴（コンパートメント）の生成には、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015)の記載に準じて、フローフォーカシングデバイスを用いた。水相には10％FBS添加RPMI1640 培地を用い、LPSを2μg/mLの濃度で溶かした。有機溶媒相にはDroplet Generator oil for EvaGreen（BioRad社製）を用いた。有機溶媒相に用いたDroplet Generator oil for EvaGreenは、酸素の透過性を有し、細胞の液滴内培養に適している。【０１４６】
実験においては、前記の構成要素を水相内で混合したのち、マイクロ流体デバイスに流し込んだところ、図１２に示される通り、複数構成要素を閉じ込めた微小で均一系の液滴（コンパートメント）が生成し、安定に存在できることが顕微鏡写真により確認できた。図１２において、中心に存在するのが第二バーコード核酸連結ビーズであり、周辺に浮いているのが細胞である。【０１４７】
また、同様の機構に対して、前記の構成要素に第三バーコード核酸を有するビーズを追加して水相内で混合したのち、マイクロ流体デバイスに流し込んだところ、複数構成要素を閉じ込めた微小で均一系の液滴（コンパートメント）が生成され、図１３に示される通り、安定に存在できることが顕微鏡写真により確認できた。図１３において、中心に存在するのが第二バーコード核酸連結ビーズ、第二バーコード核酸連結ビーズの周辺に浮いているのが細胞、液的の周縁部に薄く見える球体が第三バーコード核酸を有するビーズである。【０１４８】
以上の実験から、細胞、第二バーコード核酸連結ビーズ、第三バーコード核酸を有するビーズを封入したコンパートメントを安定に製造しうることが確認された。【０１４９】
また、複数のサブコンパートメントに別々の構成成分の組み合わせを封入して、細胞、第二バーコード核酸連結ビーズ、第三バーコード核酸を有するビーズを封入したコンパートメントを製造しうることから、このように複数の構成成分を含有させても液滴は安定であったことから、薬剤（ＬＰＳ）と対応する第１バーコード核酸をさらに用いて、薬剤（ＬＰＳ）と共存した細胞のゲノム関連情報を検出できるか確認することとした。【０１５０】
例２：薬剤（ＬＰＳ）と共存した細胞のゲノム関連情報の検出確認試験
本実験では、まずチューブ1内において、コレステロール修飾が付加されたオリゴヌクレオチドリンカー（以下、コレステロール修飾が付加されたオリゴヌクレオチドリンカーを「アンカーＣＭＯ」とも称する）(5'-3'Cholesterol-TEG-GTAACGATGGAGCTGTCACTTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-3'（配列番号１）)と細胞とを水中で混合した。また、オリゴヌクレオチドリンカー中の「3'Cholesterol-TEG」はhttps://sg.idtdna.com/site/Catalog/Modifications/Product/2555に記載の市販品を使用している。また、細胞としてはＴＨＰ１細胞を用い、細胞濃度は１Ｘ１０７／ｍＬであり、溶媒としてはPhosphate Buffer Saline(PBS)を用い、アンカーＣＭＯ終濃度は２５０ｎＭとした。４℃、５分間のインキュベーションを行った。 そこに、もう一方のコレステロール修飾が付加された共オリゴヌクレオチドリンカー(アンカーＣＭＯ：5'-AGTGACAGCTGGATCGTTAC-3'Cholesterol-TEG-3'（配列番号２）)をさらに混合した。共アンカーＣＭＯ終濃度は２５０ｎＭとした。４℃で５分間のインキュベーションを行った。【０１５１】
次に、チューブ１内には、第一バーコード核酸Ａ（８塩基）を含むオリゴヌクレオチドの水溶液を混合し、インキュベーションした。この際に用いられた細胞は第一バーコード核酸Ａを含むオリゴヌクレオチドは、5’-CCTTGGCACCCGAGAATTCCACCACAATGA30-3’（配列番号３）であった。ここで、第一バーコード核酸Ａの末端に付加されたA30は３０残基からなるポリアデニン（ｐｏｌｙ（Ａ30））である。また、第一バーコード核酸Ａの終濃度は２５０nＭとした。インキュベーションは４℃で５分間実施した。【０１５２】
また、チューブ２内においては、チューブ１と同様の手法および条件により、細胞と第一バーコード核酸Ｂ（８塩基）を含むオリゴヌクレオチドをＰＢＳ中で混合して水溶液を得た。用いられた第一バーコード核酸Ｂ（８塩基）を含むオリゴヌクレオチドは、5’-CCTTGGCACCCGAGAATTCCATGAGACCTA30-3’（配列番号４）であった。【０１５３】
次に、各チューブにおいて細胞を１０％ＦＢＳと５０μＭ ２−メルカプトエタノール入りのＲＰＭｌ−１６４０培地に再懸濁した。そして、チューブ１に対してのみ、薬剤としてＤｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）に懸濁したＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）を最終濃度２μｇ／ｍＬで添加した。チューブ２には、薬剤の溶剤であるＤＭＳＯのみを添加した。チューブ１およびチューブ２を、３７℃、ＣＯ２下で、１時間のインキュベーションを行った。ここまでの実験により、薬剤ＬＰＳあり（チューブ１）、薬剤なし（チューブ２）、という薬剤条件をそれぞれ、第一バーコード核酸Ａ、Ｂに対応させた。【０１５４】
次に、チューブ１の第一バーコード核酸Ａと細胞とをコンパーメント化して第一バーコード核酸Ａと細胞を含むコンパートメントＡを得、さらにチューブ２の第一バーコード核酸Ｂと細胞をコンパートメント化し、第一バーコード核酸Ｂを含むコンパートメントＢを得た。さらに、コンパートメントＡとコンパートメントＢを細胞比が９５：５になるように混合してコンパートメント混合物Ｘを得、コンパートメントＡとコンパートメントＢを細胞比が１：１になるように混合したコンパートメント混合物Ｙを得た。【０１５５】
コンパートメント混合物Ｘ、Ｙそれぞれより、細胞約４８００個を含む溶液８０ｕＬを分注し、１細胞解析を行った。薬剤ごとに対応する第一バーコード核酸の読み出しには、液滴技術を用いた１細胞解析技術である１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ社製Ｃｈｒｏｍｉｕｍコントローラー装置と同じく１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ社製の単一細胞３’試薬キットｖ３を用いた。この技術では、マイクロ流路中に大量の液滴（コンパートメント）を作製し、それぞれの１液滴中に、液滴ごとに異なる第二バーコード核酸連結ビーズと１細胞を確率的に１：１で混合する。すなわち、コンパートメント混合物Ｘ、コンパートメント混合物Ｙのいずれに対しても、コンパートメント毎に第二バーコード核酸連結ビーズが確率的に１：１で封入されるように処理した。ここで、上記キットで使用される第二バーコード核酸連結ビーズにおいて、第二ビーズには、複数の第二バーコード核酸がリンカーを介して連結している。さらに、当該第二ビーズに連結した複数の第二バーコード核酸は各々、互いに共通する第二共通バーコード領域（１６塩基）と、互いに峻別しうる第二固有バーコード領域（１２塩基）と、細胞のゲノム由来の核酸または第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第二ハイブリダイズ領域とを含んでいる。【０１５６】
そして、薬剤に対応する第一バーコード核酸の末端の第一ハイブリダイズ領域（ｐｏｌｙ（Ａ））、細胞由来のｍＲＮＡのｐｏｌｙ（Ａ）末端をそれぞれ、第二バーコード核酸連結ビーズの第二ハイブリダイズ領域（ｐｏｌｙ（ｄＴ）配列）と結合させるようにコンパートメントを静置した。さらに各液滴の中で逆転写酵素を用いた逆転写反応を行い、第一バーコード核酸用のプライマー5’-CTTGGCACCCGAGAATTCC-3’（配列番号５）と、１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ社製の単一細胞３’試薬キットｖ３に含まれる相補鎖ＤＮＡプライマーを用いて、各複合体を処理し、各相補鎖ＤＮＡを生成させた。【０１５７】
その後、１つ１つの液滴を混合した状態で液滴を破壊し、それぞれの液滴から抽出された相補鎖ＤＮＡ群をＰＣＲリアクションにより増幅させ、インビトロジェン社のQubit FluorometerでＤＮＡ濃度を測定したところ、コンパートメント混合物Ｘは23.4ng/μL、コンパートメント混合物Ｙは30.4ng/μLであった。【０１５８】
次に、１細胞ごとに、第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物、ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物を含むシーケンスライブラリをPCRリアクションにより作成した。プライマーとしては、Read1側（Universal I5プライマー）は5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’（配列番号６）を使用した。Read2側(TruSeq RPIプライマー)としては、コンパートメント混合物Ｘについて5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’（配列番号７）、コンパートメント混合物Ｙについて5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’（配列番号８）を用いた。得られた次世代シーケンスライブラリは、アジレント社のD5000スクリーンテープを用いて、DNAサイズと濃度を測定し、ライブラリーの品質確認を行った。【０１５９】
次世代シーケンシングには、イルミナ社のMiSeq試薬キットv3 を用い、イルミナ社のMiSeq次世代シーケンサーを使用した。得られたシーケンスデータは、FASTQフォーマットのテキストファイルとしてRead1側とRead2側それぞれ読み出し、Python3（Python Software Foundation）、並びにDropseqToolsおよびUMITools（オープンソースの解析パッケージ）を用いて解析した。【０１６０】
コンパートメント混合物Ｘについては、第二共通バーコード領域（１６塩基）と第二固有バーコード領域（１２塩基）のリード総数は、１９，９１２，６８２であった。さらに、第二共通バーコード領域（１６塩基）と第二固有バーコード領域（１２塩基）と対応できた第一バーコード核酸配列数が、１６，３５４，６７０であった。そのうち、薬剤ＬＰＳありと対応する第一バーコード核酸Ａのリード数が第一バーコード核酸リード数全体の８５．１％、薬剤なしと対応する薬剤なしと対応する第一バーコード核酸Ｂのリード数が０．８％であった。さらに読み出しエラーを補正したのち、細胞（第二共通バーコード領域配列）を、ユニークなリード数（第二固有バーコード）の多い順に並べた際の、上位１００細胞に対応した第一バーコード核酸配列の一覧を表１に示す。【０１６１】
【表１】
2020096015.tif 000002
【０１６２】
また、コンパートメント混合物Ｙについては、第二共通バーコード領域（１６塩基）と第二固有バーコード領域（１２塩基）のリード総数は、１０，７９５，１５４であり、第二共通バーコード領域（１６塩基）と第二固有バーコード（１２塩基）と対応できた第一バーコード核酸配列数が、７，５８７，０６１であった。そのうち、薬剤ＬＰＳありと対応する第一バーコード核酸Ａのリード数が第一バーコード核酸リード数全体の５１．３％、薬剤なしと対応する第一バーコード核酸Ｂのリード数が第一バーコード核酸リード数全体の３５．６％であった。【０１６３】
これら一連の実験により、ＤＮＡバーコード種類に対応させた薬剤ＬＰＳあり、薬剤なしという各細胞に与えられた条件を、次世代ゲノムシークエンサーを用いた１細胞遺伝子発現解析技術により、１細胞ごとに読み出すことができることを確認した。
【符号の説明】
【０１６４】
１０１  第一バーコード核酸
１０２  第一共通バーコード領域
１０３  第一ハイブリダイズ領域
２０１  第二ビーズ
２０２  第二バーコード核酸
２０３  第二共通バーコード領域
２０４  第二固有バーコード領域
２０５  第二ハイブリダイズ領域
２０６  ＰＣＲプライマー領域
２０７  第二バーコード核酸連結ビーズ
３０１  被検物質１
３０２  被検物質１に対応する第一バーコード核酸
３０３  被検物質ｎ
３０４  被検物質ｎに対応する第一バーコード核酸
３０５  第一コンパートメント
３０６  細胞群
３０７  第二バーコード核酸連結ビーズ
３０８  第二コンパートメント
３０９  第三コンパートメント
３１０  細胞
３１２  細胞由来ｍＲＮＡ
３１３  第二バーコード核酸
３１４  ハイブリダイズ複合体
３１５  第五コンパートメント
３１６  第一バーコード核酸に対する相補鎖ＤＮＡ
３１７  細胞由来ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
３１８  増幅物
３１９  第一増幅物
３２０  第二増幅物
３２１  細胞と共存した被検物質
３２２  細胞のトランスクリプトーム情報
３２３  細胞溶解バッファーを含む水性溶媒
３２４  第四コンパートメント
４０１  第三ビーズ
４０２  第三バーコード核酸
４０３  第三共通バーコード領域
４０４  第三ハイブリダイズ領域
４０５  切断可能なリンカー
４０６  第三バーコード核酸連結ビーズ
５０１  被検物質１
５０２  被検物質１に対応する第一バーコード核酸
５０３  被検物質ｎ
５０４  被検物質ｎに対応する第一バーコード核酸
５０５  第一コンパートメント
５０６  細胞群
５０７  第二バーコード核酸連結ビーズ
５０８  第三バーコード核酸を有するビーズ
５０９  第二コンパートメント
５１０  第三コンパートメント
５１１  細胞
５１２  細胞由来ｍＲＮＡ
５１３  第二バーコード核酸
５１４  ハイブリダイズ複合体
５１５  細胞由来ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
５１６  第三バーコード核酸
５１７  第一バーコード核酸に対する相補鎖ＤＮＡ
５１８  増幅物
５１９  第一増幅物
５２０  第二増幅物
５２１  第三増幅物
５２２  細胞溶解バッファーを含む水性溶媒
５２３  第四コンパートメント
５２４  第五コンパートメント
５２５  細胞と共存した被検物質
５２６  細胞の非破壊的計測情報
５２７  細胞のトランスクリプトーム情報
５２８  第三バーコード核酸に対するｃＤＮＡ
６００  第三バーコード核酸を有するビーズ
６０１  第三ビーズ
６０２  第三バーコード核酸
６０３  第三共通バーコード領域
６０４  第三ハイブリダイズ領域
６０５  切断可能なリンカー
６１０  第二バーコード核酸連結ビーズ
６１１  第二ビーズ
６１２  第二バーコード核酸
６１３  第二共通バーコード領域
６１４  第二固有バーコード領域
６１５  第二ハイブリダイズ領域
６１６  ＰＣＲプライマー領域
６２０  細胞
６２１  ゲノム関連核酸の特定の配列
６２２  ゲノム関連核酸
６２３  被検物質１
６２４  被検物質１に対応する第一バーコード核酸
６２５  第一コンパートメント
６２６  第一ハイブリダイズ領域
６２７  第一共通バーコード領域
６３０  第三コンパートメント
７００  第三バーコード核酸を有するビーズ
７０１  第三ビーズ
７０２  第三バーコード核酸
７０３  第三共通バーコード領域
７０４  第三ハイブリダイズ領域
７０５  切断可能なリンカー
７１０  第二バーコード核酸連結ビーズ
７１１  第二ビーズ
７１２  第二バーコード核酸
７１３  第二共通バーコード領域
７１４  第二固有バーコード領域
７１５  第二ハイブリダイズ領域
７１６  ＰＣＲプライマー領域
７２０  核酸プローブ
７２１  細胞で発現する目的蛋白質等の分子に特異的に結合する分子
７２２  第四バーコード核酸
７２３  第四共通バーコード領域
７２４  第四ハイブリダイズ領域
７２５  切断可能なリンカー
７３０  細胞
７４０  第三コンパートメント
７５０  第一コンパートメント
７５１  被検物質１
７５２  被検物質１に対応する第一バーコード核酸
７５３  第一ハイブリダイズ領域
７５４  第一共通バーコード領域
８００  第三バーコード核酸を有するビーズ
８０１  第三ビーズ
８０２  第三バーコード核酸
８０３  第三共通バーコード領域
８０４  第三ハイブリダイズ領域
８０５  切断可能なリンカー
８０６  特定の配列
８０７  特定の配列に相補的な配列のプライマー
８１０  第二バーコード核酸連結ビーズ
８１２  第二バーコード核酸
８１５  第二ハイブリダイズ領域
９００  第三バーコード核酸を有しているビーズ
９０１  第三ビーズ
９０２  第三バーコード核酸
９０３  第三共通バーコード領域
９０４  第三固有バーコード領域
９０５  第三ハイブリダイズ領域
９０６  切断可能なリンカー
９０７  アクリルアミド部分
９０８  ＰＣＲプライマー領域
９１０  第二バーコード核酸連結ビーズ
９１１  第二ビーズ
９１２  第二バーコード核酸
９１３  第二共通バーコード領域
９１４  第二固有バーコード領域
９１５  第二ハイブリダイズ領域
９１６  ＰＣＲプライマー領域
９２０  細胞
９２１  細胞由来ｍＲＮＡ
９２２  ＤＮＡポリメラーゼ
９２３  相補鎖ＤＮＡ
９２４  細胞由来ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
９２５  ＤＮＡタグ
９２６  被検物質１
９２８  第一バーコード核酸
９２９  第一共通バーコード領域
９３０  第一ハイブリダイズ領域
９３１  ＤＮＡポリメラーゼ
９３２  相補鎖ＤＮＡ
１００１  第一コンパートメント
１００２  細胞
１００３  第二バーコード核酸連結ビーズ
１００４  油
１００５  第二コンパートメント
１００６  第三コンパートメント
１００７  リザーバ
１００８  細胞溶解バッファーを含む水性溶媒
１００９  油
１０１０  第四コンパートメント
１０１１  第五コンパートメント
１０１２  出口
１１０１  第一コンパートメント
１１０２  細胞
１１０３  第二バーコード核酸連結ビーズ
１１０４  第三バーコード核酸を有するビーズ
１１０５  油
１１０６  第二コンパートメント
１１０７  第三コンパートメント
１１０８  蛍光イメージング測定
１１０９  リザーバ
１１１０  明視野イメージング
１１１１  細胞溶解バッファーを含む水性溶媒
１１１２  油
１１１３  第四コンパートメント
１１１４  第五コンパートメント
１１１５  出口
【図１】
2020096015.tif 000003
【図２】
2020096015.tif 000004
【図３ａ】
2020096015.tif 000005
【図３ｂ】
2020096015.tif 000006
【図３ｃ】
2020096015.tif 000007
【図３ｄ】
2020096015.tif 000008
【図４】
2020096015.tif 000009
【図５ａ】
2020096015.tif 000010
【図５ｂ】
2020096015.tif 000011
【図５ｃ】
2020096015.tif 000012
【図５ｄ】
2020096015.tif 000013
【図５ｅ】
2020096015.tif 000014
【図５ｆ】
2020096015.tif 000015
【図５ｇ】
2020096015.tif 000016
【図６】
2020096015.tif 000017
【図７】
2020096015.tif 000018
【図８】
2020096015.tif 000019
【図９】
2020096015.tif 000020
【図１０】
2020096015.tif 000021
【図１１】
2020096015.tif 000022
【図１２】
2020096015.tif 000023
【図１３】
2020096015.tif 000024
【配列表】
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【国際調査報告】
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