(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む腸送達用経口投与組成物：
（Ａ）生物学的に活性な成分；および
（Ｂ）腸吸収の促進に有効量の閉鎖帯毒素。
【請求項２】
前記生物学的に活性な成分が、薬物化合物、生物学的に活性なペプチド、およびワクチンからなる群から選択される、請求項１に記載の経口投与組成物。
【請求項３】
前記薬物化合物が、心臓血管系に作用する薬物、中枢神経系に作用する薬物、抗腫瘍薬物、および抗生物質からなる群から選択される、請求項２に記載の経口投与組成物。
【請求項４】
前記心臓血管系に作用する薬物が、リドカイン、アデノシン、ドブタミン、ドパミン、エピネフリン、ノルエピネフリン、およびフェントラミンからなる群から選択される、請求項３に記載の経口投与組成物。
【請求項５】
前記中枢神経系に作用する薬物が、ドキサプラム、アルフェンタニル、デゾシン、ナルブフィン、ブプレノルフィン、ナロキソン、ケトロラク、ミダゾラム、プロポフォール、メタクリン、ミバクリウム、およびスクシニルコリンからなる群から選択される、請求項３に記載の経口投与組成物。
【請求項６】
前記抗腫瘍薬物が、シタラビン、マイトマイシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびビンブラスチンからなる群から選択される、請求項３に記載の経口投与組成物。
【請求項７】
前記抗生物質が、メチシリン、メズロシリン、ピペラシリン、セトキシチン、セフォニシド、セフメタゾール、およびアズトレオナムからなる群から選択される、請求項３に記載の経口投与組成物。
【請求項８】
前記生物学的に活性なペプチドが、ホルモン、リンホカイン、グロブリン、およびアルブミンからなる群から選択される、請求項２に記載の経口投与組成物。
【請求項９】
前記ホルモンが、テストステロン、ナンドロレン、メノトロピン、インスリン、およびウロフォリトロピンからなる群から選択される、請求項８に記載の経口投与組成物。
【請求項１０】
前記リンホカインが、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−４、およびインターロイキン−８からなる群から選択される、請求項８に記載の経口投与組成物。
【請求項１１】
前記グロブリンが、多価ＩｇＧ、および特異的ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンである、請求項８に記載の経口投与組成物。
【請求項１２】
生物学的に活性な成分の閉鎖帯毒素に対する比が、約１：１０〜３：１の範囲にある、請求項１に記載の経口投与組成物。
【請求項１３】
生物学的に活性な成分の閉鎖帯毒素に対する比が、約１：５〜２：１の範囲にある、請求項１２に記載の経口投与組成物。
【請求項１４】
前記閉鎖帯毒素が、約４０ｎｇ〜１０００ｎｇの量で組成物中に存在する、請求項１に記載の経口投与組成物。
【請求項１５】
前記閉鎖帯毒素が、約４００ｎｇ〜８００ｎｇの量で組成物中に存在する、請求項１４に記載の経口投与組成物。
【請求項１６】
前記閉鎖帯毒素が、腸内での最終濃度が約１０−５Ｍ〜１０−１０Ｍの範囲になるような量である、請求項１に記載の経口投与組成物。
【請求項１７】
前記閉鎖帯毒素が、腸内での最終濃度が約１０−６Ｍ〜５．０×１０−８Ｍの範囲になるような量である、請求項１６に記載の経口投与組成物。
【請求項１８】
糖尿病を処置するための経口投与組成物であって、該経口投与組成物は以下：
（Ａ）インスリン；および
（Ｂ）腸吸収の促進に有効量の閉鎖帯毒素
を含む、経口投与組成物。
【請求項１９】
前記インスリンが、前記組成物中に約１０〜３０ＩＵの量で存在する、請求項１８に記載の経口投与組成物。
【請求項２０】
前記閉鎖帯毒素が、前記組成物中に約１０−１０Ｍ〜４×１０−１０Ｍの量で存在する、請求項１８に記載の経口投与組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明の開発はメリーランド州ボルチモアのメリーランド大学（University of Maryland、Baltimore、Maryland）に支援された。
関連出願の引用
本出願は1995年5月24日に出願された米国特許出願第08/443,864号の一部継続出願である。
発明の分野
本発明は、（A）生物学的に活性な成分；および（B）腸吸収の促進に有効量の閉鎖帯毒素を含む腸送達用経口投与組成物、ならびにその使用方法に関する。
発明の背景
I．腸送達システム
普通の疾患の処置に通常使用される多数の化合物の腸吸収は、その化学・物理的性質に著しく制限される。従って、近年において、腸送達システムの開発は製薬会社にとって最も挑戦すべき研究分野の一つになっている。
腸上皮が、経口投与された化合物（例えば、薬物およびペプチド）の体循環中への吸収に対して主なバリアとなっている。このバリアは、円柱状（columnar）上皮細胞（主として腸細胞、球状細胞、内分泌細胞、およびパネート細胞）の単層で構成され、これらは、その先端表面で接着結合（本明細書において以降、"tj"とする）により結合している（Madaraら、Physiology of the Gastrointestinal Tract；第２版、Johnson編、Raven Press, New York、1251〜1266頁、（1987））。管腔に存在する化合物は、以下の３つの可能なプロセスを介して血流に入り得る。
（i）  能動または促進輸送
（ii）  受動経細胞輸送、あるいは
（iii）  受動傍細胞輸送
能動または促進輸送は細胞キャリアにより生じ、そして蛋白質および糖のような複合体分子の基本成分（例えば、アミノ酸、ペントース、ヘキソース）の輸送に制限される。
受動経細胞輸送は、先端膜および底外側膜の両方を介して分子を分配することが必要である。従って、このプロセスは比較的小さな疎水性化合物に制限される（Jackson、Physiology of the Gastrointestinal Tract；第２版、Johnson編、Raven Press、New York、1597〜1621頁、（1987））。その結果、能動または促進機構で輸送されるこれらの分子を除いて、より大きく、そしてより親水性の分子の吸収は、ほとんどが傍細胞経路に制限される。
しかし、傍細胞経路の使用に関する研究は充分に解明されていない。なぜなら、主として、tj構造および機能の情報が欠如しているからである。従って、傍細胞経路を介した分子の侵入は主にtjにより制限される（Gumbiner、Am. J. Physiol.、253：C749-C758、（1987）；およびMadara、J. Clin. Invest.、83、：1089-1094（1989））。
透過型電子顕微鏡では、tjは隣接細胞の境界で約80nmの長さの領域として現れる。ここでは、隣接細胞の原形質膜は近接して向き合っている（Farquharら、J. Cell Biol.、17：375-412、（1963））。この構造は、刷子縁（先端ドメイン）のすぐ下の上皮細胞の境界となり、上皮細胞とその近辺との間の閉塞を形成する。この閉塞は電荷特異的な様式で小さい分子の拡散を制限し（Pappenheimerら、J. Membrane Biol.、102：2125-2136、（1986）；Madaraら、J. Cell Biol.、102：2125-2136、（1986）；Claudeら、J. Cell Biol.、58：390-400、（1973）；およびBakkerら、J. Membrane Biol.、11：25-35、（1989））、そして分子半径が11Åより大きい分子を完全に排除する（Madaraら、J. Cell Biol.、98：1209-1221、（1985））。従って、tjを"緩める"ことによって傍細胞輸送を増大させる方法の発見にかなりの注目が向けらている。
傍細胞間輸送の制限を克服する一つのアプローチは、生物学的に活性な成分を吸収促進剤と同時に投与することである。現在の腸吸収促進剤のほとんどは、以下の一般的なクラスにあてはまる：
（1）クエン酸およびEDTAのようなカルシウムキレート化剤；ならびに
（2）ドデシル硫酸ナトリウム、胆汁酸塩、パルミトイルカルニチン、および脂肪酸ナトリウム塩のような界面活性剤
しかし、これらのクラスの腸吸収促進剤の両方が、種々の分子の吸収を促進する手段としてのそれらの一般的な有用性を制限する性質を有する。
カルシウムキレート化剤の場合、Ca2+の消費は、tjに直接作用せず、むしろアクチンフィラメントの崩壊、接着接合の崩壊、細胞接着性の減少、およびタンパク質キナーゼの活性化を含む細胞の全体的な変化を誘導する（Citi、J. Cell Biol.、117：169-178、（1992））。さらに、代表的な処方物では粘膜表面に接近するのみで、そして管腔Ca2+濃度は変化し得るので、tjの開裂を迅速に、可逆的に、そして再現し得る様式で誘導するために、十分な量のキレート化剤は、一般的には、適切なより低いCa2+レベルまで投与され得ない。
界面活性剤の場合、これらの薬剤の潜在的な細胞溶解特性が、安全性についての懸念を引き起こす。腸上皮は、外部の小口（ostile）からの毒素、細菌、およびウイルスの侵入に対するバリアを提供する。従って、界面活性剤を用いる上皮の剥脱の可能性、および増加した腸の処置から生じる潜在的な合併症は、界面活性剤を腸吸収促進剤として使用することについての懸念を引き起こす。
従って、上記制限のない腸吸収促進剤の開発が当該分野において要望されている。
II．腸接着結合の機能および調節
tjまたは閉鎖帯（本明細書において以降、"ZO"とする）は吸収および分泌上皮の顕著な特徴の一つである（Madara、J. Clin. Invest.、83：1089-1094、（1989；およびMadara、Textbook of Secretory Diarrhea、Lebenthalら（編）、第11章、125-138、（1990））。先端と底外側区画との間のバリアとして、それらはイオンおよび水溶性溶質の受動拡散を傍細胞経路を介して選択的に調節する（Gumbiner、Am. J. Physiol.、253（Cell Physiol.、22）：C749-C758、（1987））。このバリアは、経細胞ルートに関連する経路の活性により生成される任意の勾配を維持する（Diamond、Physiologist、20：10-18、（1977））。
腸細胞の原形質膜の抵抗性は比較的高いので、経上皮の伝導性の変化は、通常、傍細胞経路の透過性の変化が原因となる（Madara、前出）。ZOは、この傍細胞経路の主要なバリアに相当し、そしてフリーズフラクチャー電子顕微鏡で観察されるように、上皮組織の電気抵抗性は膜貫通タンパク質鎖の数およびZOにおけるその複雑度に依存するように見える（Madaraら、J. Cell Biol.、101：2124-2133、（1985））。
ZOは、かつては静的な構造と考えられていたが、実際には動的であり、そして種々の発生的（Magnusonら、Dev. Biol.、67：214-224、（1978）；Revelら、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.、40：443-455、（1976）；およびSchneebergerら、J. Cell Sci.、32：307-324、（1978））、生理学的（Gilulaら、Dev. Biol.、50：142-168、（1976）：Madaraら、J. Membr. Biol.、100：149-164、（1987）；Mazariegosら、J. Cell. Biol.、98：1865-1877、（1984）；およびSardetら、J. Cell Biol.、80：96-117、（1979））、および病理学的（Milksら、J. Cell. Biol.、103：2729-2738、（1986）；Nashら、Lab. Invest.、59：531-537、（1988）；およびShasbyら、Am. J. Physiol.、255（Cell Physiol.、24）：C781-C788、（1988））環境に適応するという、十分な証拠が存在する。この適応性の基礎となる調節機構はまだ完全に理解されていない。しかし、Ca2+の存在下では、ZOのアセンブリは、最終的にZOエレメントの組織化されたネットワークを形成および調整する生物化学的事象の複雑なカスケードの引金を引く細胞相互作用の結果であり、その構成は部分的に解明されているのみである（Diamond、Physiologist、20：10-18、（1977））。膜貫通タンパク質鎖の候補である。オクルジン（occuldin）が最近同定された（Furuseら、J. Membr. Biol.、87：141-150、（1985））。
膜接触部の下にある細胞質偽膜性プラークにおいて6個のタンパク質が同定されたが、それらの機能はまだ確立されていない（Diamond、前出）。ZO-1およびZO-2は、特徴づけされていない130kDタンパク質（ZO-3）との界面活性剤安定性複合体においてヘテロダイマー（Gumbinerら、Proc. Natl. Acad. Sci.、USA、88：3460-2464、（1991））として存在する。免疫電子顕微鏡によるほとんどの研究で、ZO-1は膜接触部の真下に正確に位置づけられている（Stevensonら、Molec. Cell Biochem.、83：129-145、（1988））。他の二つのタンパク質、シングリン（cingulin）（Citiら、Nature（London）333：272-275、（1988））および7H6抗原（Zhongら、J. Cell Biol.、120：477-483、（1993））は膜からさらに離れて位置しており、そしてまだクローニングされていない。小さなGTP結合タンパク質であるRab13もまた、最近、結合領域に位置づけられた（Zahraouiら、J. Cell Biol.、124：101-115、（1994））。他の小さなGTP結合タンパク質が表層細胞骨格を調節すること、すなわち、rhoが局部接触部においてアクチン−膜接着を調節すること（Ridleyら、Cell、70：389-399（1992））、およびracが成長因子誘導膜揺動を調節すること（Ridleyら、Cell、70：401-410（1992））が知られている。より特徴づけられた細胞結合部、局部接触部（Guanら、Nature、358：690-692、（1992））、および接着結合部（Tsukitaら、J. Cell Biol.、123：1049-1053、（1993））のプラークタンパク質の既知の機能との類推に基づいて、tj関連プラークタンパク質は細胞膜を横切る両方向でシグナルを伝達し、表層アクチン細胞骨格への結合を調節することに関与していると仮定されている。
上皮がさらされる多くの多様な生理学的および病理学的攻撃に応答するためには、ZOは複雑な調節系の存在を必要とする迅速かつ調和した応答をなし得なければならない。ZOのアセンブリおよび調節に関与する機構を正確に特徴づけすることが、現在活発な研究の領域である。
現在、tjの構造的および機能的結合が、アクチン細胞骨格と吸収細胞のtj複合体との間に存在するという一連の証拠が存在する（Gumbinerら、前出；Madaraら、前出；およびDrenchahnら、J. Cell. Biol.、107：1037-1048、（1988））。アクチン細胞骨格は、その精密な幾何学模様がアクチン結合タンパク質の大きな構造により調節される微小フィラメントの複雑な網目構造で構成される。アクチン結合タンパク質のリン酸化状態が細胞の原形質膜への細胞骨格結合をどのように調節し得るか、ということについての一例は、ミリストイル化されたアラニンにC富むキナーゼ基質である（本明細書において以降、"MARCKS"とする）。MARCKSは、原形質膜の細胞質面に会合する特定のタンパク質キナーゼC（本明細書において以降、"PKC"とする）の基質である。（Aderem、Elsevier Sci. Pub. （UK）438-443、（1992））。その非リン酸化形態では、MARCKSは膜アクチンと架橋する。従って、MARCKSを介して膜と会合したアクチンの網目構造は比較的剛性であり得る（Hartwigら、Nature、356：618-662、（1992））。活性化PKCは、MARCKSをリン酸化し、これは膜から放出される（Rosenら、J. Exp. Med.、172：1211-1215、（1990）；およびThelenら、Nature、351：320-322、（1991））。MARCKSに結合したアクチンは膜から空間的に分離され、そしてより可塑性であり得る。MARCKSが脱リン酸化されるとそれは膜に戻り、そこで再びアクチンを架橋する（Hartwigら、前出：およびThelenら、前出）。これらのデータは、F−アクチンネットワークが、アクチン結合タンパク質（MARCKSはその一つである）を含むPKC依存性リン酸化プロセスにより再配置され得ることを示唆する。
種々の細胞内媒介物質が、tjの機能および／または構造を変化させることが示されている。両生類胆嚢（Duffeyら、Nature、204：451-452、（1981））の接着結合、金魚（Bakkerら、Am. J. Physiol.、246：G213-G217、（1984））およびカレイ（Krasneyら、Fed. Proc.、42：1100、（1983））両方の腸の接着結合は、細胞内cAMPが増大した場合、受動的なイオンの流れに対して増大した抵抗を示す。また、両生類胆嚢をCa2+イオノフォアにさらすと、tj抵抗が増大し、tj構造の変化を誘導するようにみえる（Palantら、Am. J. Physiol.、245：C203-C212、（1983））。さらに、ホルボールエステルによるPKCの活性化は、腎臓上皮細胞株（Ellisら、C. Am. J. Physiol.、263（Renal Fluid Electrolyte Physiol.、32：F293-F300、（1992））、および腸上皮細胞株（Stensonら、C. Am. J. Physiol.、265（Gastrointest. Liver Physiol.、28：G955-G962、（1993））の両方において傍細胞透過性を増加させる。
III．閉鎖帯毒素
コレラ毒素（CT）をコードするctxA遺伝子を欠失させることにより構築されるVibrio choleraeワクチンの候補のほとんどは、高度の抗体応答を誘発し得るが、半数を超えるそのワクチンは軽度の下痢を発症する（Levineら、Infect. Immun.、56（1）：161-167、（1988））。CTの不在下で誘導された下痢の程度から、V.choleraeは、ctxA配列を欠失した株になお存在する他の腸毒素因子を産生すると仮定された（Levineら、前出）。その結果、V.choleraeにより合成され、後の下痢の原因となる第二の毒素、閉鎖帯毒素（本明細書において以降、"ZOT"とする）が発見された（Fasanoら、Proc. Nat. Acad. Sci.、USA、8：5242-5246、（1991））。zotは、ctx遺伝子のすぐ隣に位置している。V.cholerae株においてctx遺伝子と共にzot遺伝子が高頻度で存在すること（Johnsonら、J. Clin. Microb.、31/3：732-733、（1993）；およびKarasawaら、FEBS Microbiology Letters、106：143-146、（1993））は、コレラに代表的である急性脱水性下痢の原因としてZOTの可能な共同的な働きを示唆する。最近、zot遺伝子がまた、他の腸内病原体で同定された（Tschape、腸チフス熱および他のサロメロシス（Salomellosis）に関する第２回アジア-太平洋シンポジウム、47（要旨）、（1994））。
ウサギ回腸粘膜で試験した場合に、ZOTは、細胞間tjの構造を調整することによって、腸透過性を増加することが以前に発見されている（Fasanoら、前出）。傍細胞経路の変化の結果、腸粘膜はより透過性となることが発見されている。また、ZOTは、Na+-グルコース共役能動輸送には影響せず、細胞傷害性がなく、そして経上皮抵抗を完全に消失させ得ないことも発見された（Fasanoら、前出）。
本発明において、ZOTが異なる大きさおよび構造の分子の組織透過性の可逆的増加を誘導すること、そしてそれ故、生物学的に活性な成分と同時に投与した場合、ZOTは生物学的に活性な成分の腸吸収を促進することが初めて示された。
発明の要旨
本発明の目的は、可逆的かつ再現可能な様式でtjを迅速に開裂する腸吸収促進剤を提供することである。
本発明の別の目的は、腸上皮を損傷することなく安全に使用され得る腸吸収促進剤を提供することである。
本発明のなお別の目的は、生物学的に活性な成分を全身送達し得る投与組成物を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、生物学的に活性な成分が腸で吸収されるような生物学的に活性な成分の経口送達方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、糖尿病の処置方法を提供することである。
本発明のこれらおよび他の目的は、本明細書において以下で提供される発明の詳細な説明で明らかなように、１つの実施態様において：
（A）生物学的に活性な成分；および
（B）腸吸収の促進に有効量の閉鎖帯毒素
を含む腸送達用経口投与組成物により達成される。
別の実施態様において、本発明の上記目的は、腸送達用経口投与組成物を経口投与する工程を包含する生物学的に活性な成分の腸送達方法によって達成される。この経口投与組成物は、
（A）生物学的に活性な成分；および
（B）腸吸収の促進に有効量の閉鎖帯毒素
を含む。
さらに別の実施態様において、本発明の上記目的は、糖尿病患者に経口投与組成物を経口投与する工程を包含する糖尿病の処置方法により達成される。この経口投与組成物は、
（A）インスリン；および
（B）腸吸収の促進に有効量の閉鎖帯毒素
を含む。
【図面の簡単な説明】
図１は、ウサギ回腸におけるpZ14上清で誘導される組織の抵抗（Rt）の変化に対する、PKC阻害剤CGP41251、およびその不活性類似体CGP42700の効果を示す。
図２Ａおよび図２Ｂは、細胞質（図２Ａ）および膜（図２Ｂ）サブ画分における、ZOTのPKC活性に対する経時的な効果を示す。
図３は、ウサギ回腸におけるRtに対する精製ZOTの用量応答曲線を示す。
図４は、精製ZOT（□）およびMBPコントロール（■）と比較した、精製MBP−ZOT（△）のウサギ回腸におけるRtに対する効果を示す。
図５Ａおよび図５Ｂは、ウサギ回腸におけるインスリン（図５Ａ）および免疫グロブリンIgG（図５Ｂ）の経上皮輸送に対する精製MBP−ZOTの可逆的効果を示す。
図６Ａおよび図６Ｂは、ウサギ回腸におけるインスリン（図６Ａ）および免疫グロブリンIgG（図６Ｂ）の経上皮輸送に対する精製ZOTの可逆的効果を示す。
図７Ａ〜図７Ｃは、ウサギ空腸（図７Ａ）、回腸（図７Ｂ）、および結腸（図７Ｃ）における、インビボ灌流アッセイにより測定された水（□）およびインスリン輸送（▲）に対する精製ZOTの効果を示す。
図８は、ウサギ空腸、回腸、および結腸の灌流セグメントを灌流した腸間膜静脈における、ZOTがない場合またはある場合のインスリン（白抜き棒）および14C−PEG−4000（斜線棒）の血清濃度を示す。
図９Ａ〜図９Ｃは、ウサギ空腸（図９Ａ）、回腸（図９Ｂ）、および結腸（図９Ｃ）における、インビボ灌流アッセイにより測定した水（□）および免疫グロブリンIgG輸送（○）に対する精製ZOTの効果を示す。
図１０は、ウサギ空腸、回腸、および結腸の灌流セグメントを灌流した腸間膜静脈における、ZOTがない場合またはある場合の免疫グロブリン（白抜き棒）および14C−PEG4000（斜線棒）の血清濃度を示す。
発明の詳細な説明
上述のように、一つの実施態様において本発明は：
（A）生物学的に活性な成分；および
（B）腸吸収の促進に有効量の閉鎖帯毒素
を含む腸送達用経口投与組成物に関する。
小腸送達用経口投与組成物（例えば、小腸送達）は当該分野で周知である。このような経口投与組成物は一般に胃耐性錠剤またはカプセルを含む（Remington's Pharmaceutical Science、第16版、Osol編、Mack Publishing Co.、第89章、（1980）；Digenisら、J. Pharm. Sci.、83、915-921、（1994）；Vantiniら、Clinica Terapeutica、145、445-451、（1993）；Yoshitomiら、Chem. Pharm. Bull.、40、1902-1905、（1992）；Thomaら、Pharmazie、46、331-336、（1991）；Morishitaら、Drug Design and Delivery、７、309-319、（1991）；およびLinら、Pharmaceutical Res.、８、919-924、（1991）；上記文献はそれぞれ、本明細書にその全体が参照として援用される）。
錠剤は、例えばセルロースアセテートフタレートまたはセルロースアセテートテレフタレートのいずれかを添加して胃耐性にする。
カプセルは、ゼラチンの硬質または軟質のいずれかの可溶性の容器または殻に生物学的に活性な成分を包み込んだ固形投与形態である。カプセルの製造に用いられるゼラチンは、加水分解によるコラーゲン性材料から得られる。ゼラチンには２種類ある。タイプAは酸処理によりブタ皮膚から得られ、タイプBはアルカリ処理により骨および動物の皮膚から得られる。硬質ゼラチンカプセルの使用により、単一の生物学的に活性な成分またはその組み合せを、個々の被験体に最良と思われる正確な投与量レベルで処方することを選択し得る。硬質ゼラチンカプセルは二つの部分で構成され、一方を他方の上にかみ合わせる（slip）ことにより生物学的に活性な成分を完全に包み込む。生物学的に活性な成分、または生物学的に活性な成分を含む胃耐性ビーズをカプセルの長い方の一端に入れ、次いでキャップにかみ合わせることによりこれらのカプセルが満たされる。硬質ゼラチンカプセルは主としてゼラチン、FD&C着色剤、および場合によっては二酸化チタンのような乳白剤で製造される。USPによると、本目的のためのゼラチンは、製造中分解を防ぐために0.15%（w/v）二酸化硫黄を含んでもよい。
本発明の内容において、小腸送達用経口投与組成物には、生物学的に活性な成分および閉鎖帯毒素が、胃において胃液で相当程度不活性化されることを防止する緩衝剤水溶液を含む液状組成物も含まれるため、生物学的に活性な成分および閉鎖帯毒素が活性型で小腸に到達し得る。本発明で用いられ得るこのような緩衝剤水溶液の例には、重炭酸緩衝液（pH5.5〜8.7、好ましくは約pH7.4）が含まれる。
経口投与組成物が液状組成物である場合、安定性の問題を最小限にするため組成物は投与直前に調合されることが好ましい。この場合、液状組成物は、凍結乾燥した生物学的に活性な成分および閉鎖帯毒素を緩衝剤水溶液に溶解して調合し得る。
使用される特定の生物学的に活性な成分は、本発明にとって重要ではなく、そして、例えば大きさや電荷に係わりなくそれがなければ経細胞経路で吸収されない任意の薬物化合物、生物学的に活性なペプチド、ワクチンまたはその他任意の部分で有り得る。
本発明で用いられ得る薬物化合物の例には、心臓血管系に作用する薬物、中枢神経系に作用する薬物、抗腫瘍薬物および抗生物質が含まれる。
本発明で用いられ得る心臓血管系に作用する薬物の例には、リドカイン、アデノシン、ドブタミン、ドパミン、エピネフリン、ノルエピネフリン、およびフェントラミンが含まれる。
本発明で用いられ得る中枢神経系に作用する薬物の例にはドキサプラム、アルフェンタニル、デゾシン、ナルブフィン、ブプレノルフィン、ナロキソン、ケトロラク、ミダゾラム、プロポフォール、メタクリン、ミバクリウム、およびスクシニルコリンが含まれる。
本発明で使用され得る抗腫瘍薬にはシタラビン、マイトマイシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびビンブラスチンが含まれる。
本発明で用いられ得る抗生物質の例にはメチシリン、メズロシリン、ピペラシリン、セトキシチン（cetoxitin）、セフォニシド、セフメタゾール、およびアズトレオナムが含まれる。
本発明で用いられ得る生物学的に活性なペプチドの例にはホルモン、リンホカイン、グロブリン、およびアルブミンが含まれる。
本発明で用いられ得るホルモンの例にはテストステロン、ナンドロレン、メノトロピン、インスリン、およびウロフォリトロピン（urofolltropin）が含まれる。
本発明で用いられ得るリンフォカインの例にはインターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターロイキン−1、インターロイキン−2、インターロイキン−4、およびインターロイキン−8が含まれる。
本発明で用いられ得るグロブリンの例にはα−グロブリン、β−グロブリン、およびγ−グロブリン（免疫グロブリン）が含まれる。
本発明で用いられ得る免疫グロブリンの例には多価IgGまたは特異性IgG、IgA、およびIgM、例えば抗破傷風抗体が含まれる。
本発明で用いられ得るアルブミンの例は、ヒト血清アルブミンである。
本発明で用いられ得るワクチンの例には、ペプチド抗原および弱毒化微生物およびウイルスが含まれる。
本発明で用いられ得るペプチド抗原の例には、腸毒素原性E.coliの非耐熱性腸毒素Ｂサブユニット、コレラ毒素Ｂサブユニット、腸病原体の莢膜抗原、腸病原体の線毛（fimbriaeまたはpili）、HIV表面抗原、塵アレルゲン、およびダニアレルゲンが含まれる。
本発明で用いられ得る弱毒化微生物およびウイルスの例には腸毒素原性Escherichia coli、腸病原性Escherichia coli、Vibrio cholerae、Shigella flexneri、Salmonella typhi、Helicobacter pylori、およびロタウイルスのそれらが含まれる（Fasanoら、Le Vaccinazioni in Pediatria、Vierucciら編集、CSH、Milan、109〜121頁、（1991）；Guandaliniら、Management of Digestive and Liver Disorders in Infants and Children、Elsevior、Butzら編集、Amersterdam、第25章、（1993）；Levineら、Sem. Ped. Infect. Dis.、５、243-250、（1994）；Kaperら、Clin. Micrbiol. Rev.、８、48-86、（1995）；およびMacArthurら、JAMA、273、729-734、（1995）、上記文献はそれぞれ、本明細書にその全体が参照として援用される）。
生物学的に活性な成分がインスリンである場合、本発明の経口投与組成物は糖尿病の処置に有用である。
使用される生物学的に活性な成分の量は本発明にとって重要ではなく、選択される特定の成分、処置される疾患または状態、ならびに処置される被験体の年齢、体重、および性別に依存して変わる。
使用される閉鎖帯毒素（以後「ZOT」とする）の量も本発明にとって重要ではなく、処置される被験体の年齢、体重、および性別に依存して変わる。腸による生物学的に活性な成分の吸収を促進するために本発明で使用されるZOTの最終濃度は、一般に、約10-5M〜10-10M、好ましくは約10-6M〜5.0×10-8Mの範囲である。腸内でこのような最終濃度を達成するためには、本発明の一回の経口投与組成物中のZOTの量は、一般に約40ng〜1000ng、好ましくは約400ng〜800ngである。
生物学的に活性な成分と使用されるZOTとの比率は本発明にとって重要ではなく、選択した時間内で送達されるべき生物学的に活性な成分の量に依存して変化する。一般に生物学的に活性な成分と本発明に使用されるZOTとの重量比は約1:10〜3:1、好ましくは約1:5〜2:1の範囲である。
糖尿病処置法では、投与されるZOTの量は約10-10M〜4×10-10Mであり、そしてそれと一緒に投与されるインスリンの量は約10IU〜30IUである。
ZOTはV. choleraeにより生産される。ZOTがもたらされるV. choleraeの特定の株は本発明にとって重要ではない。このようなV. cholerae株の例には、569B株、395株、およびE7946株が含まれる（Levineら、上述；Johnsonら、上述；およびKarasawaら、上述）。
本明細書で使用されるように、「ZOT」とは399アミノ酸の成熟タンパク質、およびtj制御能を有するその変異体を指す。例えば、アミノ酸1〜8のN末端欠失体がZOT活性に影響せずに作製し得、そしてZOTのN末端融合タンパク質もZOT活性に影響せずに作製し得る。このような変異体は、部位特異的変異誘発により容易に調製し得、本明細書に記載のようにZOT活性についてスクリーニングし得る。
ZOTは、例えば、zot遺伝子を過剰発現する遺伝子操作されたE. coli株（Baudryら、Infect. Immun.、60、428-434、（1992））（単独、または他の遺伝子、例えばマルトース結合タンパク質（以下の実施例5参照）もしくはグルタチオン−S−トランスフェラーゼ（以下の実施例6参照）と融合されている）により得られ、精製し得る。
以下の実施例は説明のためのみに提供されるもので、そしてどのような方法によっても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１
腸細胞細胞骨格に対するZOTの効果
小腸細胞（Madaraら、J. Cell Biol., 97:125-136（1983））、および腎細胞（Mezaら、J. Cell Biol., 87:746-754（1980））において、細胞骨格配置の病理生理学的変化は、閉塞性tj抵抗、電荷選択性、および構造に、主要な変化を生じ得る。これらの特異的混乱（perturbation）により誘発される応答は、閉塞性tj構造の拡大、および傍細胞カチオン選択性の変化からなる。これらのデータは、傍細胞経路が、ZOを調節する細胞表面構造における表現型の変化を生じる細胞内事象によって調節され得ることを示唆する。しかし、このようなtj改変を導く細胞内事象のカスケードは、未だ明かにされていない。
Ａ．細胞骨格配置に対するZOTの効果
ZOTが、細胞骨格再配置に対する効果を有するどうかを評価するために、プラスミドpZ14で形質転換されたV. cholerae株CVD110の培養後に得られたMr＞10,000の上清画分（以下「pZ14上清」）を、IEC6細胞の組織培養物に対して試験した。
CVD110は、全ての既知毒素遺伝子（ctxA、zot、およびace遺伝子）が欠失しているV. cholerae（E1 Torバイオタイプ）株である（Michalskiら、Infect. Immun., G1:4462-4468（1993））。
プラスミドpZ14は、誘導性tacプロモーターによって転写されたzot遺伝子を含む。プラスミドpZ14を、pBB241をHindIIIで消化することによって構築した。pBB241を、全zot配列を有するClaI-XbaIフラグメントを、プラスミドpUC19にクローニングすることによって得た（Baudryら、前出）。5'突出（overhang）をクレノウフラグメントでフィルイン（fill in）し、そして線状化プラスミドをXbaIで消化し、1.5kbのzotフラグメントを得た。このフラグメントを、Maniatisら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor（1989）に記載されているpHSG274中に見出されるKanRカセットによってAmpR遺伝子を分断すること（interruption）により改変されたベクターpTTQ181（Amersham, Arlington Heights, IL）に、クローニングした。すなわち、pTTQ181をEcoRIで消化し、フィルインし、そしてXbaIで消化した。1.5kbのXbaI zotフラグメントを、得られたベクターに正しい方向で連結し、そしてこれを「pZ14」と呼んだ。
IEC6細胞は、無菌ラット小腸の陰窩細胞（crypt cell）に由来し（Quaroniら、Methods in Cell Biology, 20章、21B:403-426（1980））、これを、細胞培養フラスコ（Falcon）中、37℃にて、95％O2/５％CO2雰囲気中で、完全培地において増殖させた。完全培地は、4.5g/lのグルコースを補充し、そして5.0％（v/v）ウシ胎児血清（放射線照射済み）、10μg/mlのインスリン、4.0mMのL-グルタミン、50U/mlのペニシリン、および50μg/mlのストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地を含んだ。使用する継代数は、15と20との間で変化した。
Mr＞10,000の上清画分を、以下のように調製した。pZ14で形質転換されたCVD110を、50μg/mlのカナマイシンを含有するLuria Bertani（以下「LB」）ブロス中で、37℃にて一晩培養し、pZ14プラスミドを有するカナマイシン耐性株を選択した。次いで、培養物を希釈して、0.4〜0.5の初期OD 600nmを得た。次に、tacプロモーターからZOTの発現を誘導するために、2.0mMのイソプロピル-チオ-β-D-ガラクトピラノシド（IPTG）（5'-3'Incorporation, Boulder, CO）を培養物に添加し、これを、37℃にてさらに２時間インキュベートした。次に、培養培地を回収し、冷却して、5,000×gで10分間４℃にて遠心分離した。得られた液体を回収し、そして0.45μmフィルター（Millipore）を通過させた。次いで、得られた培養上清を、10kDa Mカットオフサイズを有するCentriconフィルター（Vangard International Corp., NJ）を通す限外濾過にかけた。Mr＞10kDa画分を、リン酸緩衝化生理食塩水（pH7.4）（以下「PBS」）で２回洗浄し、PBS中で元の容量まで戻し、下記のように、細胞骨格再配置に対する活性について試験した。
１．蛍光顕微鏡観察
2.0×104 IEC6細胞/mlを、直径13mmのガラスカバースリップに播種し、そして30μlのpZ14上清（１:33希釈）、またはネガティブコントロールとして30μlのPBSに、37℃にて24時間曝した。次いで、細胞を、PBS（pH7.4）中の3.7％（v/v）のホルムアルデヒドにおいて、室温にて10分間固定した。同じ緩衝液中で洗浄後、その細胞を、PBS（pH7.4）中の0.5％（v/v）のTriton X-100（Sigma）において、室温にて10分間浸透化させた。次に、得られた固定した細胞を、5.0μg/mlのフルオレセイン−ファロイジン（Sigma）とともに、37℃にて30分間インキュベートした。最後に、この細胞をPBSで洗浄し、カバースリップに、１：１グルセロール−PBS（pH8.0）をマウントし、そして各条件について200細胞を、Nikon Optiphot蛍光顕微鏡を用いて、ブラインド様式で３連（in triplicate）にて分析し、細胞のＦ−アクチン細胞骨格ネットワーク（ストレスファイバーと定義する）を可視化した。
ストレスファイバーの正常分析は、PBSネガティブコントロールとともにインキュベートされた細胞にて認められた。しかし、IEC6細胞をpZ14上清とともにインキュベートした場合、ストレスファイバーが細胞周囲に再分布された、細胞骨格の完全な再配置が観察された（24時間インキュベーションでピークに達した）。
pZ14培養上清への48時間曝露後、Ｆ−アクチン構成（organization）は、24時間曝された細胞とは、変化がないままであった。ネガティブコントロール中のＦ−アクチン構成は、48時間の調査期間にわたって変化がないままであった。
２．走査電子顕微鏡観察
並行研究において、pZ14上清またはPBSネガティブコントロールとともにインキュベートされたIEC6細胞を、走査電子顕微鏡観察により分析した。
より詳細には、IEC6細胞を、24ウエルプレートのウエル中に挿入された直系13mmのガラスカバースリップ上に、5.0×109細胞/ウエルで播種した。30μlのpZ14上清または30μlのPBSネガティブコントロールのいずれかに、37℃にて24時間曝露後、細胞を、0.1Mカコジル酸緩衝液（pH7.4）中の2.5％（v/v）グルタルアルデヒドにおいて、室温にて20分間固定した。1.0％のOsO4（v/v）において30分間の後固定（post-fixation）に続き、その細胞を、段階的な濃度（graded）のエタノールに通して脱水し、CO2下で臨界点乾燥し、そしてスパッタリングによる金被覆した。サンプルを、Cambridge走査電子顕微鏡により精査した。
PBSネガティブコントロールと比較した場合、ZOT曝露細胞の表面の改変が認められた。すなわち、ZOTは、細胞周囲のあたりに微絨毛の消失をおもに誘導した（中央部には乏しい）。これらの表面変化は、上記の蛍光顕微鏡観察において認められたZOTにより誘導されたＦ−アクチン再分布と一致する。
３．ウサギ回腸の研究
次いで、細胞骨格再構成（reorganization）に関する実験を、Fasanoら、Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 8:5242-5246（1991）により記載されているように、Ussingチャンバーにマウントされたウサギ回腸を使用して実施した。
より詳細には、２〜３kgの成長雄ニュージーランド白色ウサギを、頸部脱臼により屠殺した。回腸の20cmセグメントを取り出し、リンスして腸内容物を除去し、腸間膜の縁に沿って切開し、そして筋肉層と漿膜層をはいだ。次いで、このように調製された粘膜の８シートを、ルーサイトUssingチャンバー（1.12cm2開口）にマウントし、電位固定装置（EVC 4000 WPI, Saratosa, FL）に接続し、そして53mM NaCl、5.0mM KCl、30.5mMマンニトール、1.69mM Na2HPO4、0.3mM NaH2PO4、1.25mM CaCl2、1.1mM MgCl2、および25mM NaHCO3を含有する、新たに調製されたリンゲル溶液に浸した。浴液を、恒温循環ポンプに接続された水ジャケットリザーバーを用いて37℃に維持し、95％O2/５％CO2を通気した。
300μlのpZ14上清を、粘膜側に添加した。300μlのpZ14上清を漿膜側にも添加して、浸透圧の平衡を保った。電位差（PD）を10分毎に測定し、そして短絡電流（Isc）および組織抵抗（Rt）を、Fasanoら（前出）により記載されたように計算した。組織変化性のため、データをΔRt（時間ｘでのRt）−（時間０でのRt）として計算した。各実験の最後に、0.5mMグルコースを各チャンバーの粘膜側に添加した。グルコースに応答してIscの増加を示した。（組織生存性を示す）組織のみを、分析に含めた。
60分間のインキュベーション後にRtに対するZOTの最大効果が得られると、上記のように、pZ14上清またはPBSネガティブコントロールのいずれかに曝された組織を固定し、そしてフルオレセイン−ファロイジンでＦ−アクチンを染色した。
コントロールウサギ回腸は、刷子縁の均質な蛍光染色、および隣接する腸細胞間のアクチン微小フィラメントの柱状分布によって特徴づけられた。pZ14上清に曝されたウサギ回腸は、刷子縁の異常染色を示し、これは、基礎をなす細胞質内でのＦ−アクチンの部分再分布に関連した。これらの変化は、あまり分化していない陰窩細胞と比較して、絨毛先端の成熟細胞においてより明白であった。
４．アクチンプールの評価
アクチンは、細胞の細胞骨格ネットワークの主要な構成部分の１つであり、可溶性単量体Ｇ−アクチンプールとフィラメント状Ｆ−アクチンプール間のシフトは、アクチン構成の変化を反映する（Drenchahnら、J. Cell Biol., 107:1037-1048）。従って、Ｇ−アクチンプールおよびＦ−アクチンプールに対するZOTの効果を評価した。
より詳細には、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Rockville, MD）ATCC No. 209CCLから得たウシ肺動脈内皮細胞（Goldblumら、J. Cell Physiol., 157:197-205（1993））を、20％（v/v）の熱不活化（56℃、30分間）ウシ胎児血清（HyClone Laboratories, Logan UT）、4.0mM Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、およびビタミンに富むダルベッコ改変イーグル培地中で、50U/mlペニシリンおよび50μg/mlストレプトマイシンの存在下に、95％O2/５％CO2下で37℃にて増殖させた。培養物を、均一な形態、および市販の3H-ベンジル-Phe-Ala-Pro基質（Ventrex Laboratories, Inc., Portland, ME）を用いるアンジオテンシン変換酵素活性の定量的測定により、内皮であることを決定した。細胞継代３〜７のみを使用した。
内皮Ｆ−アクチンを、Goldblumら（前出）による記載のように、蛍光光度法によって測定した。より詳細には、50U/mlペニシリンおよび50μg/mlストレプトマイシンの存在下の、20％（v/v）の熱不活化（56℃、30分間）ウシ胎児血清（HyClone Laboratories, Logan UT）、4.0mM Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、およびビタミンに富む2.0mlのダルベッコ改変イーグル培地中の、5.8×105の内皮細胞を、６ウエルプレートのウエルに播種し、そして95％O2/５％CO2下で37℃にて72時間培養した。単層を、30μlのpZ14上清（1:33希釈）に24時間曝し、その後これらを、75mM KCl、3.0mM MgSO4、1.0mMエチレングリコール四酢酸（EGTA）、10mMイミダゾール、0.2mMジチオトレイトール（DTT）、10μg/mlアプロチニン、および0.1mMフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）を含有する緩衝液で２回洗浄し、そして3.7％（v/v）ホルムアルデヒドで15分間固定した。次に、その単層を、上記緩衝液中の0.2％（v/v）Triton X-100で、室温にて５分間浸透化し、1.65×10-7M NBD−ファリシジン（phallicidin；Sigma）で20分間染色し、そして氷冷メタノールを用いて、−20℃にて一晩抽出した。染色および抽出を暗所にて実施した。抽出物をキュベット（curvette）に回収し、そして内皮内の蛍光を、Perkin-Elmer LS30発光分光光度計において、室温にて、465nm励起（10nmスリット）および535nm発光（10nmスリット）で測定し、そして内皮細胞の総タンパク質１mgあたりの任意蛍光単位に表した。
固定した浸透化内皮単層へのNBD−ファリシジン適用は、その細胞へのプローブの78.8％浸透を生じ、そして蛍光光度法により測定されるように、99.98％の細胞内プローブが一回のメタノール処理で抽出された。
アクチン再構成は、可溶性単量体Ｇ−アクチンプールおよびフィラメント状Ｆ−アクチンプールの相互的（reciprocal）変化を包含し得るが、一方、総アクチンプールは変化しないままである。Ｆ−アクチンプールおよびＧ−アクチンプールを測定するための上記の方法論は、同じウシ肺動脈内皮単層でのタンパク質測定を除く、固定、透過、および抽出の手順を包含する。従って、Ｆ−アクチンおよびＧ−アクチン測定の標準化については、総タンパク質測定用に追加的な同時にプレートされた細胞を、Ｆ−アクチンプールおよびＧ−アクチンプールについてアッセイされた単層と同一条件下で培養した。
より詳細には、６ウエルプレートのウエル中のコンフルエント後のウシ肺動脈内皮単層を、PBS（pH7.4）で２回洗浄し、そして１〜２分間、穏やかに撹拌しながら、0.5mg/mlのトリプシンに曝すことによって、穏やかに剥離し、その直後に、PBSを含有する上記ダルベッコ培地で中和した。その細胞を、600×ｇで10分間、４℃にて遠心分離し、再びPBS（pH7.4）で２回洗浄し、3.0％（W/V）ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、1.0mM DTT、10mM PMSF、1.0mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、および50mM Tris-HCl（pH8.0）を含有する溶解緩衝液中で溶解させた。次いで、溶解物を、標準Bio-Rad DC Protein Assay（Bio-Rad Chemical Division, Richmond, CA）を用いて、タンパク質濃度についてアッセイした。
内皮Ｇ−アクチンを、Goldblumら（前出）により記載されるように、DNAseI阻害アッセイを使用して測定した。より詳細には、ウシ膵臓DNAseI（Sigma）を、0.125M Tris-HCl（pH7.5）、5.0mM MgCl2、2.0mM CaCl2、1.0mM NaN3、および0.1mM PMSF中に、10mg/mlの濃度に溶解して、その安定性を増大させた。次いで、ストック溶液を、20mMイミダゾール（pH7.5）、30mM NaCl2、および15％（v/v）グリセロールで、100×希釈した。酵素を２時間毎に新たに作成し、そして氷上に維持した。仔ウシ胸腺DNA（１型、Sigma）をDNAseIの基質として使用した。線状DNA調製物を細片に切断し、そして0.1M Tris-HCl（pH7.5）、4.0mM MgSO4、1.8mM CaCl2中に、80mg DNA/mlの濃度で懸濁した。DNAを４℃で48時間ゆっくりと撹拌して溶液にし、その後、その溶液を、0.45μmおよび0.22μmの孔サイズのフィルターを順次通過させて、そして４℃で保存した。最終基質の260nmでの吸光度は、1.05と1.15との間で変化した。次いで、DNAseIを、Gilford反応分光計（Ciba Corning Diagnostics）のキュベット中で、DNA基質と混合し、260nmでのODの直線部分の勾配を記録した。20mM Tris-HCl（pH7.5）、1.0M酢酸ナトリウム、1.0mM CaCl3、1.0mMアデノシン三リン酸（ATP）、0.75Mグアニジン−HCｌに溶解した精製ウシ骨格筋アクチン（Sigma）を、G-アクチン標準として使用して、アッセイを較正した。
６ウエルプレート中で増殖させたウシ内皮単層を、30μlのpZ14上清に曝した。単層を、Ca2+およびMg2+を含まないダルベッコPBSで洗浄し、そして1.0％（v/v）Triton X-100、2.0mM MgCl3、2.0mM EGTA、0.2mM ATP、0.5mM DTT、0.1mM PMSFを含有するハンクス平衡化塩溶液を含む、0.5ml/ウエルの溶解緩衝液で５分間浸透化させた。次いで、Ｇ−アクチン含有上清を、DNAseI阻害アッセイにおいて試験して、標準曲線の直線部分にあたる阻害阻害活性（すなわち、30〜70％阻害）を生じさせた。阻害活性を、Ｇ−アクチン濃度に内挿し、これを使用して、μg/mg総内皮細胞タンパク質で表されるＧ−アクチンを計算した。
Rtに対するZOTの影響を排除するために15分間煮沸した30μlのpZ14上清、およびpTTQ181（Amersham, Arligton Heights, IL）で形質転換したV. cholera CVD110株（Michalskiら、前出）由来の30μlの上清（以下、「pTTQ181上清」）に曝した単層を、ネガティブコントロールとして使用した。
pZ14上清は、pTTQ181上清またはpZ14煮沸上清と比較して、Ｇ−アクチンプールの有意な減少（−27％）、およびＦ−アクチンプールの相互的（reciprocal）増加（＋22％）を誘導した（下記の表Ｉを参照のこと）。Ｇ−アクチンからＦ−アクチンへのこのシフトは、アクチン重合化と矛盾しない。この効果は、pZ14上清を15分間煮沸することによって完全に排除された。
0003846901.tif 000002
５.F-アクチンに対するZOT効果およびZO-1タンパク質分布
並行研究を、ZOTのF-アクチンに対する効果、および、tj複合体を含むように頂上切片にされたIEC6細胞内でのZO-1タンパク質の分布について実施した。
より詳細には、カバースリップ上で培養された、2.0 x 104 IEC6細胞／mlを、30μlのpZ14上清と、37℃で24時間インキュベートした。インキュベーション後に、その細胞をPBS（pH7.4）中3.7%（V/V）ホルムアルデヒドで、室温にて10分間固定した。同じ緩衝液での洗浄後に、細胞をPBS（pH7.4）中0.5%（V/V）Triton X-100で、室温にて10分間透過性にした。次に、その細胞を、5.0μg/mlフルオレセイン-ファロイジン、および2.0μg/ml抗ZO-1抗体7445（Zymed laboratory Inc, South San Francisco, CA）の両方と、37℃で30分間インキュベートした。最後に、細胞を、PBS（pH7.4）で洗浄し、カバースリップにグリセロール-PBSをのせ（1:1希釈）（pH8.0）、Nikon Optiphot蛍光顕微鏡を用いて、各条件について200細胞を、ブラインド様式で３連で分析した。結果を、細胞骨格再配置を示す細胞のパーセントとして表した。
ネガティブコントロールとして、IEC6細胞のF-アクチンフィラメント複合体ネットワーク（フルオレセイン-ファロイジンで染色された）を、pTTQ181上清30μlと、24時間インキュベートした。
両ZO-1アイソザイムを認識する抗ZO-1抗体7445でプローブした、同細胞内のZO-1の免疫蛍光局在性は、もっぱら細胞と細胞の境界に沿うZO-1の均一な連続染色を示した。逆に、pZ14上清は、中央に局在する経細胞質アクチンフィラメントの消失、および細胞と細胞との界面からのZO-1の再分布を導いた。ZO-1タンパク質のtj複合体からの再分布は、そのチロシンのリン酸化に関係しなかった。
まとめて、これらの結果は、ZOTによって誘導されたアクチン重合化が、tj複合体からのZO-1タンパク質の再分布に機械論的に連結されることを示す。従って、ZO-1は、ZOT誘導アクチン再構成およびtj開口間の１つの連結であり得る。
実施例２
ZOTの細胞内媒介物質
数種の細胞内媒介物質（cAMP、Ca++、およびPKCを含む）が、tj透過性の変化に機械論的に結びつけられている（Madara、前出；およびBaldaら、J. Membrane Biol., 122:193-202（1991））。しかし、V. cholerae 395上清（CTおよびZOTの両方を含有する）に予め曝したウサギ回腸におけるテオフィリン（ホスホジエステラーゼ阻害剤）に対する応答が、ネガティブコントロールに曝した組織中に誘導されたものと類似の、Iscにおける最大の応答を誘導するという観察は、組織透過性のZOT誘導性の変化が、cAMPに媒介されないことを示唆する。（Fasanoら、前出）。ZOT含有上清を単独または精製CTと組み合わせて試験したとき、同様の結果が得られた。これらの結果は、コントロールまたはZOTに曝された組織での、細胞内cAMPの総量が類似していることを示唆する。したがって、PKCがZOT活性を媒介しているかどうかを決定するために、ウサギ小腸およびIEC6細胞を、PKCインヒビターであるスタウロスポリンに曝した（MacLeodら、Amer. Physiol. Soc., 192:C950-C955（1992））。
Ａ．ウサギ小腸
より詳細には、筋肉および漿膜層を剥いだウサギ回腸を、Ussingチャンバ−中に固定し、そして次に、単独または10nMスタウロスポリンとの組み合わせのいずれかで、300μl（1:33希釈）のpZ14上清に曝し、pZ14上清への曝露10分前または露出の間添加した。次いで、Rt変化を10分毎に記録した。
10nMスタウロスポリンが、pZ14上清によって誘導されたRtの減少を、完全に阻害することを見出した。スタウロスポリンは強力ではあるが、PKC活性の非選択的阻害剤（Meyerら、Int. J. Cancer, 43:851-856（1989））であるので、スタウロスポリン誘導体、すなわち、選択的にPKCを阻害するCGP41251（Meyerら、前出）を、次いでZOT誘導アクチン再構成および組織透過性について試験した。
より詳細には、筋肉および漿膜層を剥いだウサギ回腸を、Ussingチャンバ−中に固定し、そして次に、単独または10nM CGP41251との組み合わせのいずれかで、300μl（1:33希釈）のpZ14上清に曝し、pZ14上清への曝露10分前または曝露の間じゅう加えた。10mMの不活性なスタウロスポリンアナログ、すなわち、CGP42700に、10分間またはpZ14上清の曝露の間、予め曝したUssingチャンバーを、ネガティブコントロールとして使用した。次いで、Rt変化を10分毎に記録した。その結果を図１に示す。
図１に示されているように、不活性アナログであるCGP47200ではなく、10nM CGP41251での前処理は、pZ14上清で誘導されるRt変化を阻害した。組織を同様の様式でpTTQ181上清に曝したときには、有意な変化は認められなかった。
ホルボールエステルは、PKC活性化剤である。従って、ホルボールエステルである12-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート（TPA）を、ZOTがPKCを介して作用することを確認するために試験した。
より詳細には、筋肉および漿膜層を剥いだウサギ回腸を、Ussingチャンバ−中に固定し、次いで、単独または10-8M TPAとの組み合わせのいずれかで、300μl（1:33希釈）のpZ14上清に曝し、pZ14上清への曝露10分前または曝露の間じゅう加えた。次いで、Rt変化を10分毎に記録した。
pTTQ181上清と比較して、Rtの有意な減少が、pZ14上清で誘導された（-7.33 ± 2.55対-2.57 ± 1.51mohms.cm2；ｐ＜0.005）。同じ組織に添加したとき、pZ14上清との併用によるTPAは、TPAのみで認められたものとは異ならないRtの減少を生じた（総Rt変化：-7.37±3.2mohms.cm2）。これらの結果は、ZOTおよびTPAの腸透過性に対する効果が、付加的でないことを実証し、このことは、その両方がPKCを介して作用することを示唆する。
Ｂ.IEC6細胞
次いで、PKCインヒビター存在下での、ZOTのIEC6細胞のアクチン細胞骨格に対する効果を評価した。
より詳細には、2.0 x 105 IEC6細胞を、30μlのpZ14上清への曝露30分前または曝露の間、10nM CGP41251または10nM CGP42700のいずれかで前処理した。37℃での24時間インキュベーション後に、カバースリップ上で培養された2.0 x 104 IEC6細胞／mlを、PBS（pH7.4）中3.7%（V/V）ホルムアルデヒドで、室温にて10分間固定した。同緩衝液で洗浄後、その細胞を、PBS（pH7.4）中0.5%（V/V）Triton X-100で、室温にて10分間、透過性にさせた。次いで、細胞を、5.0μg/mlフルオレセイン-ファロイジンと、37℃にて30分間インキュベートした。最後に、その細胞をPBS（pH7.4）で洗浄し、カバースリップにグリセロール-PBS（1:1希釈）（pH8.0）をのせ、Nikon Optiphot蛍光顕微鏡を用いて、ブラインド様式で、各条件に対して200細胞を３連で分析した。結果は、細胞骨格再配置を示す細胞のパーセントとして表した。
pZ14上清を加えたときに、62%の細胞が、細胞骨格再配置を示したが、PBSに曝された細胞の27%、およびpTTQ181上清に曝された細胞の21%のみが、影響を受けた。10nMのCGP41251での前処理（その不活性な10nMのアナログCGP42700ではない）は、ZOTの細胞骨格効果をブロックした（それぞれに、影響を受けた細胞の31%対58%）。
さらに、ZOT誘導アクチン重合化、すなわち、G-アクチンプールの減少およびF-アクチンプールの増加が、ウシ肺動脈内皮細胞を、上記のように試験し、そして10nMのCGP412512で前処理したとき、有意にブロックされたが、10nMのCGP42700での前処理では、このような妨害は生じなかった（前記表Ｉを参照のこと）。
これらのまとめたデーターは、ZOTがPKCを活性化し、そしてこの活性化がアクチン重合化およびtjの最終的な解放の両方に近接して生じることを示す。
Ｃ.PKC状態
PKCは、全ての細胞内で２つの状態、すなわち、キナーゼが細胞質に会合している不活性状態、およびその分子が細胞質から膜に移動される活性状態で、存在する（Thomasら、Methods Enzymol., 1410:399-435（1987））。従って、PKCの状態を、pZ14上清に曝されたIEC6細胞で、直接測定した。
より詳細には、コンフルエントなIEC6単層を、時間間隔を増しながら（0、３分、10分）、30μlのpZ14上清（1:33希釈）で処理した。ZOT曝露後に、IEC6細胞を機械的破壊（25ゲージ針に力を加えて３回を通す）によって溶解し、細胞質および膜画分を、４℃で、13,000 x gで30分間遠心して分離し、［γ-32P］ATP由来の32Pのヒストン１への取り込みを測定することによって、PKC活性をアッセイした（Ellisら、Am. J. Physiol. 263:F293-F300（1992））。コントロールとして、PKC活性もまた、Yasudaら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 166:1220（1990）の記載に従い、アセチル化ミエリン塩基性タンパク質のリン酸化の測定に基づいて、PKCアッセイシステム（Gibco BRL, Grand Island, NY）を使用して測定した。正味PKC活性値は、PKC 19-26（PKC偽基質インヒビター）の存在下でのPKC活性と非存在下でのPKC活性の差を反映する（Yasudaら、前出）。総PKC比活性（pmol／分）を、総タンパク質に標準化した。その結果を図2A-2Bに示す。
図2A-2Bに示されているように、pZ14上清は、膜のPKC活性の有意な増加（1.72倍）（図2B）、およびより低い程度の細胞質PKC活性の増加（図2A）を誘導した。３つの実験を平均して、このZOT誘導PKC活性の増加は３分でピーク（134.0pmol／分／mgタンパク質対77.6pmol／分／mgタンパク質ベースライン値）に達し、10分でベースライン値（65.4pmol／分／mgタンパク質）に戻った。これらのデータは、組織透過性に対するZOT効果が、PKCに媒介されることを直接証明する。
Ｄ.PKCアイソザイム
PKCの分子クローニングおよび配列分析は、いくつかの近縁であるが異なる、別個の生理学的特性を有するアイソザイムをコードする遺伝子ファミリーの存在を実証した（Azzaiら、Eur. J. Biochem., 208:547-557（1992））。スタウロスポリンおよびそのより特異的な誘導体CGP41251は、Ca2+非依存性グループBアイソザイムに比較して、Ca2+依存性グループA PKCアイソザイムを、優先的に阻害する（McGlynnら、J. Cell Biochem., 49:239-250（1992）；およびMarteら、Cell Growth and Differ., 5:239-247（1994））。結果として、回腸のエンテロサイトについて記載されている（Hyunら、Comp. Biochem. Physiol.,108C:171-178（1994））、唯一検出可能なCa2+依存性PKCアイソザイム、PKC-αに焦点を絞った実験を実施した。
より詳細には、上記のように得られた、15-30μgタンパク質／レーン細胞質膜画分を、8.0%（W/V）SDS-PAGEによって分離した。分離されたタンパク質を、Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell（Bio-Rad）のナイロン膜（N-Immobilon, Millipore）に移した。膜を、0.05%（V/V）Tween 20を含有するPBS（以後「PBS-T」）でリンスし、5.0%（V/V）脱脂ミルクを含有するPBS-T中で、室温にて１時間ブロックした。アフィニティー精製された抗PKC-αおよび抗PKC-ε抗体（Gibco BRL）を、0.83%（V/V）脱脂ミルクを含有するPBS-Tで希釈（1:500）して、最適飽和条件を得、そして膜と４℃にて16時間インキュベートした。インキュベーション後に、最初に膜を、PBS-T中5.0%（V/V）脱脂ミルクで洗浄し（３x、15分間）、次にPBS-Tで洗浄して（1 x、15分間）、そして西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されたヤギ抗ウサギIgGの1:30,000希釈物と、室温にて２時間インキュベートした。PBS-T中5.0%（V/V）脱脂ミルクで十分に洗浄後、免疫反応バンドを、増強化学発光法（Amersham）によって、現像した。
それぞれの各PKCイソ型に対するアミノ酸配列を有する、イソ型特異合成ペプチド（Gibco BRL）を、コントロールとして使用した。合成ペプチドは、αPKCのV3領域中の独特な配列：
（Ala-Gly-Asn-Lys-Val-Ile-Ser-Pro-Ser-Glu-Asp-Arg-Arg-Gln，配列番号１）、εPKCのV3領域中の独特な配列：
（Lys-Gly-Phe-Ser-Tyr-Phe-Gly-Glu-Asp-Leu-Met-Pro，配列番号２）をベースとした。
イムノブロティングによって決定されるように、IEC6細胞のpZ14上清による短時間の（３分）処理は、細胞の細胞質から膜へのPKC-αアイソザイムの有意な移動を誘導した。この減少は、インキュベーションの10分後に部分的に戻った。10-7M TPAは、細胞質PKC-αの類似してはいるがより持続的な（2時間まで）減少を誘導し、これに対しこのイソ型の下降調節は、インキュベーションの24時間後に認められた。PKC-αの調節サブユニットの連続的な時間依存性蓄積は、細胞質で認められた。PKC-αの有意な増加は、pZ14上清またはTPAポジティブコントロールに曝された細胞から得られた、いずれの膜画分にも検出されなかった。
これらの結果は、PKC-αが、ZOT誘導アクチン再配置およびtj分解の細胞内媒介物質であることに、強力な証拠を提供する。
Ｅ.セリンリン酸化
IEC6細胞での実験もまた、PKCリン酸化の基質を同定するための、両細胞膜または細胞質サブ画分中の、標的タンパク質のセリンリン酸化を測定するために実施した。
より詳細には、2.0 x 105IEC6細胞／ウエルを、時間間隔を増しながら（0、15分、30分、45分）、10-10M精製MBP-ZOT（実施例５で得られた）に曝した。反応を、冷却PBS（pH7.4）（３回洗浄した）で停止し、そしてその細胞を上記のようにかき集めそして溶解した。次いで、細胞質および膜のサブ画分を上記のように得た。各調製物の20-30μgを、8.0%（W/V） SDS-PAGEによって分離した。分離されたタンパク質を、Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell（Bio-Rad）のナイロン膜（N-Immobilon, Millipore）に移した。膜をリンスして、そして5.0%（V/V）脱脂ミルクを含有するPBS-T中で、室温にて１時間ブロックした。モノクローナル抗セリン抗体（Sigma Immunochemicals）を、0.83%（V/V）脱脂ミルクを含有するPBS-Tで希釈（1:1000）して、最適飽和条件を得、膜とともに４℃にて16時間インキュベートした。インキュベーション後に、最初に膜を、PBS-T中5.0%（V/V）脱脂ミルクで洗浄し（３x、15分間）、次いでPBS-Tで洗浄し（１x、15分間）、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されたヤギ抗ウサギIgG抗体の1:30,000希釈物と、室温にて２時間インキュベートした。PBS-T中5.0%（V/V）脱脂ミルクで十分に洗浄後、免疫反応バンドを、増強化学発光法（Amersham）によって、現像した。
その結果は、精製MBP-ZOTが、見かけ分子量が100-120kDa細胞質タンパク質の時間依存性セリンリン酸化を誘導したことを示した。このタンパク質は、ZOTに誘導されたPKCリン酸化の標的を示し得、そしてtjの解放を導く細胞内シグナル化に関連し得る。
実施例３
ZOT活性の選択性
tjに対するZOTの効果を研究するための至適なインビトロ系を確立するために、ZOT応答性についていくつかの細胞株をスクリーニングした。チャンバーアッセイは感受性の高い方法ではあるが、多数のサンプルのスクリーニングには適していないためである。これに変わるシステムのサーチにおいて、ZOTの組織培養アッセイを開発した。
Ａ.異なる細胞株に対するZOTの特異的効果
ZOTがtj調節に対して選択的な作用を示すのか、または広範な作用を示すのかを確立するために、ZOTの応答性についていくつかの細胞株を試験した。より具体的には、ヒト結腸癌細胞株HT-29 Cl 19A（Van Den Bergheら、Biochem.J.,258:673-679（1992））およびCaCo2（Nathら，J.Diarrhoeal Dis.,8:133-142（1990））を10%（v/v）ウシ胎児血清、40μg/lペニシリンおよび90μg/lストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地中、細胞培養フラスコ（Falcon）内で、37℃、95%O2/5%CO2の加湿大気下で、増殖させた。この細胞は、コンフルエンスが70-80%に達していた場合、５日毎にトリプシン処理を行った後、表面比1:5で継代培養を行った。本研究で用いた細胞の継代数は15代と30代との間であった。
HT-29 Cl 19AまたはCaCO2の単層を、ポリスチレン環（直径6.4mm、Transwell Costar）に強固に取り付けた細胞培養処理ポリカーボネートフィルター上でコンフルエンスまで増殖させた（表面比１:2.5でプレーティングした12-14日後）。そのフィルターを、改良Ussingチャンバーの漿膜および粘膜画分を分割する強固に結合した挿入物に設置し、上記のようにウサギの腸を用いて実験を行った。
pTTQ181上清ネガティブコントロールの30μlに曝したの単層と比較して、pZ14上清（1:33希釈）30μlに曝したHT-29 Cl 19Aの単層（n=4、各サンプルとも３時間まで試験した）でのRtに有意な変化は認められなかった。一方、CaCO2細胞の単層で試験する場合、pZ14上清30μlによりRtの有意な低下が誘発されたことは、これらの二つの細胞株間でZOTに対する感受性が異なることを示唆する。
Ｂ．F-アクチンの構成
F-アクチンの構成に対するZOTの効果を研究するために、同様な様式でIEC6およびLLC-PK1（Hullら、In Vitro, 12:670-677（1976））細胞培養を試験した。
LLC-PK,すなわちブタ腎皮質細胞（Hullら，上記）を37℃、95%O2/5%CO2の大気中、細胞培養フラスコ（Falcon）中で増殖させた。培養培地は10%（v/v）ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地から構成されていた。細胞が70-80%のコンフルエンスに達したら、毎週、0.25%（w/v）トリプシンを含む0.02%（w/v）EDTAでトリプシン処理することにより、継代数185〜200代の範囲の細胞を継代した。
IEC6細胞をpz14上清30μlに曝し、次に上記のフルオレセイン-ファロイジンを用いて、F-アクチンを探査した（probed）ところ、有意なアクチンの再構成が認められたのに対し、LLC-PK1細胞では有意な変化は検出されなかった。
ZOTは、選択的な透過性化効果（おそらく、「感受性」細胞上にのみ存在する特異的な細胞レセプターと相互作用する）を示すという観察は、細胞骨格およびPKCの活性化に対する効果と合わせて、tjに対する直接作用よりはむしろZOTが細胞内経路を介して作用することを示す。
実施例４
ZOT活性におけるホスホリパーゼＣの役割
ホスホリパーゼＣ（以下「PLC」とする）は、ホスファチジルイノシトール二リン酸（以下「PIP2」とする）を、イノシトール三リン酸（以下「IP3」とする）＋ジアシルグリセロール（以下「DAG」とする）に変換する酵素である。PLCは、ZOのアセンブリおよび閉塞ならびにそれらの調節に参加し得る。PKCのZOに対する効果は、IP3（Ca2+を介する）およびDAG（Berridteら,Nature, 341:197-205（1989））の両者によって誘発されたPKCの活性化に対して二次的である。
ZOTの細胞骨格再配置、アクチンの重合および組織透過性の変化に対する効果は、上記のようにPKC活性化が関与することが明らかにされている。ZOTの主たる標的がPKCであるかPLCであるかを確立するために、IEC6細胞および実施例１で述べたUssingチャンバーにおける実験を繰り返したが、サンプルを100mM硫酸ネオマイシンで10分間プレインキュベートし、全体を通してpZ14上清への曝露を行った。ネオマイシンはPIP2に結合する基質であり、そしてPLCによるそのIP3＋DAGへの変換を防止する。
100mMネオマイシンで前処理し、次いで、pZ14上清に曝したIEC6細胞培養物は、細胞骨格再配置を示す細胞の比率（2.0±5.17）は、ZOTのみに曝した場合（49.0±9.23;p<0.05）と比較して低いことが示された。ウサギ回腸を予め、100mM硫酸ネオマイシンに曝した場合、非処理組織においてZOTにおより誘発される組織透過性の増加は部分的に防止された。
これらの結果は、膜貫通PLCが、ZOT誘導性アクチン再配置および組織透過性の役割を果たすことを示す。
実施例５
ZOTの精製
10kDaのMWカットオフを有するラミナフローフィルター（lamina flow filter）を用い、pZ14上清5000mlを1000倍に濃縮し、次いで、8.0%（w/v）SDS-PAGEに供した。SDS-PAGEゲルのクーマシーブルー染色によりタンパク質のバンドを検出した。同様の様式で処理されたコントロールのpTTQ181上清と比較して、ZOTに相当するタンパク質バンドは検出されなかった。それゆえ、zot遺伝子がpZ14中の高誘導性かつ強力なtacプロモータの後ろに位置していたとしても、1000倍に濃縮されたpZ14上清中のタンパク質のレベルは、クーマシー染色されたSDS-PAGEゲルによっては依然として検出され得なかった。
そこで、産生されるZOTの量を増加させるために、zot遺伝子をマルトース結合タンパク質と（以下「MBP」とする）遺伝子インフレームで融合させ、MBP-ZOT融合タンパク質を作製した。
zot遺伝子をE.coliのmalE遺伝子に融合させることによって、ZOT遺伝子を発現および精製するために、MBPベクターpMAL-c2（Biolab）を使用した。この構築物は、強力な誘導性tacプロモーターおよびmalE翻訳開始シグナルを使用し、クローニングされたzot遺伝子の高いレベルの発現を与える。ベクターpMAL-c2は、malEシグナル配列の正確な欠失を有し、これは融合タンパク質の細胞質内発現をもたらす。融合タンパク質（Biolab）の単離を促進するために、MBPのアフィニティークロマトグラフィーによる精製を用いた。
より具体的には、ベクターpMAL-c2はEcoRI（malE遺伝子の3'末端で切断する）により綿状化され、クレノウフラグメントで埋められ、XbaI（pMAL-c2ポリリンカー内に１つの部位を有する）により消化された。orfをコードするZOTは、プラスミドpBB241（Baudryら、上記）からサブクローニングされた。プラスミドpBB241は、BssHIIによって消化され、クレノウフラグメントで埋められ、そしてXbaIにより消化された。次いで、平滑−XbaIフラグメントはpMAL-c2へサブクローニングされ、プラスミドpLC10-cを得る。両挿入物、およびベクターは平滑および粘着性の末端を有していたため、正確な方向が得られ、挿入物の5'末端と融合したmalEの3'末端を伴う。次いで、pLC10-cを、E.coli DH5α株にエレクトロポレートした。pBB241では、BssHII制限部位はzot orf内にある。それゆえ、MBP-ZOT融合タンパク質では、ZOTのアミノ酸１〜８が欠落している。
MBP-ZOT融合タンパク質を精製するために、0.2%（w/v）グルコースおよび100μg/mlアンピシリンを含むLuria Bertaniブロス10mlに、pLC10-cを含む単一コロニーを接種し、37℃、振盪下で１晩インキュベートした。培養物を、同様の新鮮培地1.0Lで1:100に希釈し、37℃、振盪下で、約1.0×108細胞/mlとなるまで増殖させた。次いで、MBP-ZOTの発現を誘導するため、0.2mMのIPTGを添加し、そしてその培養物を37℃でさらに３時間インキュベートした。次いで、細菌をペレット化し、そして20mM Tris-HCl、0.2M NaCl、1.0mM EDTA、10mM 2-ME、1.0mM NaN3を含有する氷冷「カラム緩衝液」20mlに再懸濁させた。この菌体浮遊液をフレンチプレス処理によって溶解し、そして４℃、13,000×gで30分間スピンした。その上清を集め、カラム緩衝液で1:5に希釈し、そしてカラム緩衝液で予め平衡化させたアミロース樹脂の１×10カラム（Biolabs、MBP-融合精製システム）にロードした。５容量のカラム緩衝液で洗浄した後、10mMのマルトースを含有するカラム緩衝液10mlをロードしてMBP-ZOT融合タンパク質を溶出させた。培養物1.0Lから得られる典型的収率は２〜３mgのタンパク質であった。
次いで、精製MBP-ZOT融合タンパク質のMBP融合パートナーをMBP-ZOT20μgあたり1.0μgの第Xa因子プロテアーゼ（Biolabs）を用いて切断した。第Xa因子プロテアーゼはZOTのアミノ酸末端の直前を切断する。そのようにして得られたZOTタンパク質を、8.0%（w/v）SDS-PAGEゲルにかけ、そして電気分離チャンバー（electroseparation chamber）（Schleicher & Schuell, Keene,NH）を用いてゲルから電気溶出した。
Ussingチャンバーを用いて試験したところ、得られた精製ZOTは用量依存性のRtの減少を誘導し、そのED50は7.5×10-8Mであった（図３）。
実施例６
抗ZOT抗血清の産生
特異的抗血清を得るために、キメラのグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）-ZOTタンパク質を発現させ、精製した。
より具体的には、鋳型DNAとしてプラスミドpBB241（Baudryら,上記）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によってzot orfを増幅させるために、オリゴヌクレオチドプライマーを使用した。正方向プライマー（TCATCACGGC GCGCCAGG、配列番号３）はzot orfのヌクレオチド15-32に相当し、そして逆方向プライマー（GGAGGTCTAG AATCTGCCCG AT、配列番号４）はctxA orfの5'末端に相当した。それゆえ、ZOTのアミノ酸１〜５は、得られた融合タンパク質において欠落していた。増幅産物を、pGEX-2T（Pharmacia, Milwaukee,WI）中のGST遺伝子の末端に位置するポリリンカー（SmaI部位）に挿入した。pGEX-2Tは融合タンパク質発現ベクターであり、これはSchistosoma japonicumのGSTとの融合タンパク質としてクローニングされた遺伝子を発現する。その融合遺伝子はtacプロモーターの制御下にある。IPTGによる誘導により、抑制解除が起こり、GST融合タンパク質が発現する。
得られたpLC11と名付けた組換えプラスミドを、E.Coli DH5αにエレクトロポレートした。GST-ZOT融合タンパク質を精製するために、100μg/mlアンピシリンを含むLuria Bertaniブロス10mlに、pLC11を含む単一コロニーに接種し、３７℃、振盪下で１晩インキュベートした。培養物を、同様の新鮮培地1.0Lで1:100に希釈し、そして37℃、振盪下で、約1.0×108細胞/mlとなるまで増殖させた。次いで、GST-ZOTの発現を誘導させるため、0.2mMのIPTGを添加し、そしてその培養物を37℃でさらに３時間インキュベートした。次いで、細菌をペレット化し、氷冷PBS（pH7.4）20mlに再懸濁させ、そしてフレンチプレス法により溶解した。そのGST-ZOT融合タンパク質はこれらの条件では可溶化せず、菌体ペレット画分と共に沈殿した。それゆえ、そのペレットを、0.00625M Tris-HCl（pH6.8）、0.2M 2-ME、2.0%（w/v）SDS、0.025%（w/v）ブロモフェノールブルーおよび10%（v/v）グリセロールを含むLaemli溶解緩衝液に再懸濁させ、8.0%（w/v）PAGE-SDSゲル上で電気泳動にかけ、そしてクーマシーブリリアントブルーで染色した。融合タンパク質に相当する約70kDaのバンド（GST 26kDa＋ZOT 44kDa）を、電気分離チャンバー（Schleicher & Schuell, Keene,NH）を用いてゲルから電気溶出した。
得られた溶出タンパク質（10-20μg）のうち10μgを、同容積の完全フロイントアジュバントと混合してウサギに注射した。４および８週後に不完全フロイントアジュバントにより２回の追加免疫を行った。
特異的抗体の産生を測定するために、10-10MのZOTを、２つの融合タンパク質MBP-ZOTおよびGST-ZOTとともにナイロン膜上に移し、そしてウサギ抗血清の1:5000希釈液とともに穏やかに震盪しながら４℃で１晩インキュベートした。次いで、フィルターをPBS-Tで15分間４回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギの抗ウサギIgGの1:30,000希釈液とともに室温で２時間インキュベートした。フィルターを、0.1%（v/v）Tweenを含むPBSで15分間、４回、再洗浄し、そして増強された化学発光（Amersham）を用いて免疫応答性バンドを検出した。
免疫ブロット上で、ウサギ抗血清が見い出され、そしてZOTならびにMBP-ZOTおよびGST-ZOT融合タンパク質も認められるが、MBPネガティブコントロールは認められない。
さらに、適切な抗ZOT抗体の産生を確認するために、Ussingチャンバー内で中和実験を行った。pZ14上清とともに37℃で60分間プレインキュベートした場合、ZOT特異的抗血清（1:100希釈）は、Ussingチャンバー内に装着したウサギ回腸に対してZOTによって誘導されるRtの低下を完全に中和することができた。
実施例７
ZOTに対するレセプター
Yersinia pseudotuberculosisのMBP-インベーシン融合タンパク質は、哺乳動物細胞のインテグリンレセプターに結合し得、そしてMBP-インベーシン融合タンパク質を産生するプラスミドを有する非病原性E.coliに対して、侵襲性表現型をもたらす（Leongら、The EMBO J.,9（6）:1979-1989（1990））。その結果、MBP-ZOT融合タンパク質が、腸の特異的結合部位を認識し、そして組織透過性を増大する能力を保持しているかどうかを決定するために試験を実施した。
より具体的には、筋層および漿膜層を露出させたウサギ回腸を、Ussingチャンバーに装着し、次いで、10-10Mの精製MBP-ZOTまたは精製ZOTのいずれかに暴露し、両者を組織の筋層側に添加した。10-10M MBPをネガティブコントロールとして用いた。次いで、Rtの変化を10分間隔で記録した。その結果を図４に示す。
図４に示すように、精製MBP-ZOT融合タンパク質（△）はウサギ回腸において、精製ZOT（□）により誘導されると同等のRt低下を誘導することが見い出されたが、MBPネガティブコントロール（■）によって誘導される変化と比較して、有意な差が認められた。Rtに対する精製MBP-ZOTおよびZOTの効果は、両者とも、それらの部分を取り除いた24時間後には容易に回復可能であった。これらのデータはMBP-ZOT融合タンパク質のZOT組成部分に、ZOT腸レセプターを認識し、そして結合し得ることを実証する。
実験の最後に、MBP-ZOTに曝された組織を、Fasanoら、前出に記載の電子顕微鏡観察用に固定し、次いで、金標識の抗MBPモノクローナル抗体（Biolabs New England Lab）（1:25希釈）と共にインキュベートした。MBP-ZOT融合タンパク質に曝された組織では、有意な数の免疫金粒子が認められた。
IEC6細胞、CaCo2、T84（Nathら、前出）およびウシ内皮細胞を含むいくつかの細胞株を用いて同様な結合実験を実施した。2.0×105のこれらの細胞を、５×10-9MのMBP-ZOTまたは5.0×10-9MのMBPネガティブコントロールのいずれかとともに、異なる時間間隔（５分、30分、60分）、および温度（４℃または37℃）でインキュベートした。次いで、細胞を冷メタノールで固定し、そしてフルオレセイン標識抗MBP抗体（1:100希釈）とともにインキュベートした。
IEC6、CaCo2およびウシ内皮細胞単層を（種々の温度および時間間隔で試験して）MBP-ZOT融合タンパク質に曝した場合、MBPネガティブコントロールに曝した細胞と比較して、蛍光を発する粒子の数が有意に増加していた。これに対し、T84細胞をMBP-ZOTとインキュベートした場合では有意な染色は観察されなかった。これらの結果は、ZOTが各種の細胞株間に分布する特異的表面レセプターと相互作用を示す。
10-10MのMBP-ZOT融合タンパク質に曝し、次いで、４℃で60分間、抗ZOT抗血清の1:500希釈物とインキュベートした同じタイプのIEC6単層を用い、実験を繰り返した。さらに、（上記と同じ時間間隔および温度）でMBP-ZOT融合タンパク質に曝した細胞は、MBPネガティブコントロールと比較して、顕著な数の蛍光粒子を示したことから、そのリガンドが融合タンパク質からなり、そしてMPBを含む分解産物ではないが、ZOTでもないことが確認された。
精製ZOTを用い、そして同じ細胞株および上記で試験した実験条件で、細胞単層をフルオレセイン標識抗ZOT抗血清とインキュベートした場合も同様な結果が得られた。
腸内におけるZOTレセプターの局部分布と、絨毛−陰窩軸に沿った分布を確立するために、空腸、近位および遠位回腸、および結腸を含む異なる腸セグメントをUssingチャンバー内に装着し、そして10-9Mの精製MBP-ZOT融合タンパク質または10-9MのMBPネガティブコントロールのいずれかに曝露させた。
精製MBP-ZOT融合タンパク質を用いる場合、空腸および遠位回腸でRtの有意な減少が観察されたが、結腸は影響を受けなかった。一旦、MBP-ZOT融合タンパク質のRtに対する最大効果が得られたら、MBP-ZOTまたはMBPのいずれかに曝した組織を固定し、そして上記のように染色した。
Rtの減少を示したセグメント、すなわち空腸および遠位回腸は、MBPネガティブコントロールに曝した同じ腸部位と比較して、蛍光発光粒子の数が有意な増加を示した。
このデータは、ZOTレセプターの分布が腸内で異なり、空腸および遠位回腸ではより多く認められ、絨毛−陰窩軸に沿って減少していることを実証する。この分布は、絨毛の成熟細胞においてZOTにより誘導される優位なF-アクチンの再分布と一致する。
上記の実施例１〜７の結果は、（1）ZOTが細胞膜レセプターと相互作用を示し、その表面発現は、種々の細胞間および腸内で異なる（すなわち、空腸および遠位回腸内に存在するが、結腸内には存在しない）；レセプターは、絨毛−陰窩軸に沿って減少する；（2）ZOTは時間および投与量依存性の細胞骨格の再構成を誘導する；（3）この再構成は、アクチンフィラメントへのアクチンモノマーのPKC-α-依存性重合に関連しており、そして接着結合複合体からのZO-1タンパクの再分布に、機械的に関連する。（4）この細胞内シグナルはtjの可逆的開口をもたらし、そしておそらく傍細胞経路の生理的調節の間、作動していることが示される。
実施例８
腸吸収促進剤としてのZOT
ZOTが、（1）腸上皮の生存性に影響を及ぼさず、（2）細胞傷害性ではなく、（3）腸経上皮抵抗を完全に消失させることはできず、そして最も重要なことに、（4）組織透過性の可逆的増加を誘導する、という観察は、ZOTが、生物学的に活性な成分の吸収を増強するように腸tjを調節するためのツールとして有用であることを、本発明で示した。このことは、以下のインビトロおよびインビボ研究において確認された。
Ａ．インビトロ研究
２〜３kgの成体雄性ニュージーランド白色ウサギを頸部脱臼により屠殺した。遠位回腸の20cmのセグメントを切除し、腸間膜の縁に沿って切開し、そして腸内容物を除去洗浄した。次いで、漿膜および筋肉の層を剥離した８片の腸を、Ussingチャンバー（開口1.12cm2）にのせ、そして新たに調製したリンゲル液に浸した。試験の間中、この溶液を37℃に維持し、そして95％O2/５％CO2を通気した。
送達されるべき生物学的に活性な成分のプロトタイプとして、125Iで標識されたインスリン、および125Iで標識されたIgGを試験した。
一旦組織が定常状態に達したら、対にした組織（その抵抗に基づいてマッチングさせた）を、管腔側で、10-11Mのインスリンまたは156.25-ngのIgGのいずれかに、単独でまたは10-10MのMBP-ZOT融合タンパク質の存在下で曝露した。次いで、漿膜側由来の1.0mlおよび粘膜側由来の50μlを直ちに得て、基底値を確立した。次いで漿膜側由来のサンプルを、その後８０分まで20分間隔で採集した。次いで、レゼバーを空にし、リンゲル液で２回洗浄し、そして事前にチャンバーに添加した、10-11Mのインスリンまたは156.25ngのIgGのみを含む新たなリンゲル液で再び満たした。その結果を図5Aおよび5Bに示す。
図5Aおよび5Bに示すように、MBP-ZOT融合タンパク質は、時間依存性かつ可逆的様式で、インスリン（２倍）（図5A）およびIgG（10倍）（図5B）の両方の経腸吸収を増加することが見出された。これらの変化は、腸Rtの減少に対応した。
MBP-ZOT融合タンパク質の代わりに、精製ZOTを同様に試験した場合、時間依存性および可逆的な、インスリン（２倍）（図6A）およびIgG（+50%）（図6B）の両方の経腸吸収増加がまた観察された。この吸収の増加は、精製ZOTによるRtの減少と一致していた。
Ｂ．インビボ研究
腸管腔から血流中への分子の移動に対するZOTの効果を実証するために、インビボ試験として腸灌流アッセイを用いた。腸灌流は、Sladenら，Biochem. Biophys. Acta, 288:443-456（1972）に記載の方法をわずかに改変して実施した。すなわち、ラットではなくウサギを用い、そして灌流速度は0.2ml/分ではなく0.4ml/分を用い、そして腸膜静脈にカニューレ挿入し、灌流したセグメントを排液した。
より詳細には、24時間の絶食後、2.5〜３kgの成体雄性ニュージーランド白色ウサギを50mg/kg体重のケタミンで麻酔し、その後7.0mg/kg体重のキシラジンを筋肉内注射した。ランプにより、それらの体温を37℃に維持した。正中切開により腹腔を切開し、異なる３つの腸セグメント：（1）トライツ靱帯の下の近位空腸、（2）遠位回腸、および（3）近位結腸、にカニューレ挿入した。第２のカニューレを、近位カニューレの10〜15cm下に入れた。セグメントを、37℃に加温した0.9%（w/v）NaClで洗浄し、腸内容物を取り除いた。近位カニューレを、ポリビニル管でぜん動ポンプ（モデルWPI SP220 I）に接続し、そして３つのセグメントを、2.0mmol/lグルコース、4.0mmol/l KCl、25mmol/l NaHCO3、3.0g/l PEG-4000および3.0mCi/100ml 14C-PEG-4000を含む溶液で、0.4ml/分の速度で灌流した。この溶液はまた、143pmol/mlのインスリンまたは8.33ng/mlのIgGのいずれかを含有していた。すべての溶液をNaClで等張に調整し、そして95％O2/５％CO2での通気によりpHを7.4に固定した。
溶出物を遠位カニューレから20分アリコートで採取した。30分間の初期平衡期間をさせ、その後、試験した生物学的に活性な成分の正味の輸送の基底測定値のための３回の連続した20分間の採取期間が続き、研究した各セグメントにおける水分および電解質をともなった。
続いて、143pmol/mlのインスリンまたは8.33ng/mlのIgGのいずれかを含むPBS中の10-10MのZOTを灌流溶液中に添加し、そして第２の灌流期間（30分間の平衡＋3×20分間の採取）を実施した。
ZOTの腸透過性に対する効果が可逆的かどうかを立証するために、第１の期間で使用したのと同じPBSを用いて、第３の灌流期間を実施した。
各灌流期間の終了時に、灌流セグメントを排液している腸間膜静脈にカニューレ挿入し、そして血液サンプルを得て、血流中に達した生物学的に活性な成分およびPEGの量を測定した。実験の終了時点で、動物を屠殺し、そして灌流したセグメントを単離し、測定し、乾燥し、そして重量測定した。その結果を図7A〜7Cに示す。
図7A〜7Cに示すように、精製ZOTは、空腸（図7A）および遠位回腸（図7B）の両方におけるインスリン（▲）の通過の10倍の増加を誘導したのに対し、結腸（図7C）では実質的な変化は観察されなかった。ZOTにより誘導されたインスリンの吸収増加は、tjの開口後の水分吸収（□）の減少に対応した。この効果は、60分の灌流溶液からのZOTの抜き取り以内で完全に可逆的であった。
精製ZOTはまた、空腸および回腸において、インスリン（白棒）および非吸収性マーカーであるPEG-4000（斜線棒）の両方の血中濃度を有意に増加させたが、結腸では上昇させなかった（図8）。一旦ZOTを抜き取ると、インスリンおよびPEG-4000の量は基底値に戻った。
同様な結果がIgGについて認められた。すなわち、ZOTは、IgG（○）の経腸吸収を、空腸で6倍（図9A）、回腸では2倍（図9B）の増加を誘導した。結腸では有意な変化は検出されなかった（図9C）。IgG吸収の増加は可逆的であり、そしてZOTによる水分吸収（□）の減少と一致していた。
精製ZOTはまた、灌流した小腸セグメントを排液する腸間膜静脈中のIgG（2倍）（白棒）およびPEG-4000（+75%）（斜線棒）の両方の血中濃度を増加させたのに対し、灌流した結腸セグメントの血流においては変化は観察されなかった（図10）。
上記の結果は、生物学的に活性な成分のZOTとの同時投与により、生物学的に活性な成分の腸輸送が促進されること、およびこの促進は比較的小さな分子（5733 Da:インスリン）および大きな分子（140〜160KDa:IgG）の両方について有効であることを実証する。
実施例９
糖尿病の処置におけるZOTの使用
上記の実施例８でインビトロおよびインビボの両方で実証された、ZOTの存在下における、インスリンの腸吸収の増加が、糖尿病の処置に有用であることを立証するために、急性Ｉ型糖尿病雄性BB/Worラット（Haberら，J.Clin.Invest., 95:832-837（1993））に、ZOTの存在下または非存在下で、インスリンを経口投与し、そしてラットの血糖レベルを測定した。
より詳細には、12匹の急性Ｉ型糖尿病雄性BB/Worラットを（Department of Pathology of the University of Massachusettsより入手した）、113.2mg/kg体重のケタミンおよび0.68mg/kg体重のアセプロマジンの混合物で麻酔した。次いで、Harmsら、J.Applied Physiol., 36:391-392（1974）に記載のように、各ラットの頸静脈にカニューレ挿入し、頻繁な血液廃液を可能にした。ラットは一晩絶食させた。
翌日、メトキシフルランの吸入によりラットを鎮静化させ、そして固定されたカニューレの先端を胃洞内に設置するために、食道内にカニューレを挿入した。次いで、カニューレ挿入した食道を介して、ラットに、以下１つの処置を与えた：
（1）胃酸を中和するように、400μlのNaHCO3緩衝液中で、通常（regular）ヒトインスリン（Humulin▲R▼ R, Eli Lilly, 10〜30 IU）を経口投与した（1.5g/100ml;pH7.4）；
（2）Humulin▲R▼ R（10〜30 IU）および精製ZOT（1.0×10-10M〜4.0×10-10M）を400μlのNaHCO3緩衝液中で経口で同時投与した；
（3）Humulin▲R▼ R（用量を、動物供給者の推奨に従って、動物の体重およびグルコースレベルに基づいて確立した；1.2〜2.6 IU）を非経口投与し、そして400μlのNaHCO3緩衝液を経口投与した（ポジティブコントロール）、または
（4）400μlのNaHCO3緩衝液を経口投与した（ネガティブコントロール）。
各ラットの血液中のグルコースレベルを、ミクロ法（micromethod）アッセイ（One Touch▲R▼ II血液グルコースメーター、Lifescan, Johnson & Johnson Co.）を用いて、処置前、およびその後20分間隔で評価した。試験開始60分後に、ラットの摂餌を認めた。可能な偏りを回避するために、各ラットに、異なる日に、上記で列挙した４つ全ての処置を与えるように計画した。プロトコルの全体が完了する前に数匹の動物が死亡したので、数匹の糖尿病ラットのみが、上記で列挙した４つ全ての処置を受けた。原因は受けた４つの処置のいずれとも有意には関連していなかったが、主に頸静脈カニューレ挿入の感染性合併症に起因した。異なる処置群は、動物の体重および基底血糖レベルの点で匹敵した。結果を以下の表IIに示す。
0003846901.tif 000003
上記の表IIに示すように、単独に経口投与した場合、10〜30 IUの漸増濃度のインスリンは、処置したラットの血糖を有意に減少させなかった。しかし、インスリンを経口でZOTと同時投与した場合、血液グルコースレベルの有意な減少がみられた。同時投与の際にみられた減少は、ポジティブコントロール（すなわち、インスリンの従来の非経口投与）でみられた減少に匹敵した。ZOTを、10 IUほどの、低いインスリンと同時投与した場合、血液グルコースレベルの減少が得られた。インスリンとZOTとを経口で同時投与したラットの血液グルコースレベルのピーク減少に達するまでの平均時間（97分）は、インスリンを非経口投与したラットにおいて観察された平均時間（110分）と同様であった。さらに、ZOT（4.0×10-10Mまで）およびインスリン（30 IUまで）の両方の濃度の増加により、糖尿病ラットの血糖の用量依存性の減少が誘導された。
上記の表IIの結果は、経口で輸送されたインスリンが、その生物学的活性を維持すること、および毒性効果（すなわち、重篤な低血糖または低血糖性昏睡）が、経口投与したインスリンの範囲内（これは、有効な非経口インスリン用量の20倍までであった）で観察されないことを実証している。これらの知見は重大な実際上の意味を有する。なぜなら、インスリンの治療指数（すなわち、最小有効用量と最小毒性用量との間の比）が比較的低いからである。
本発明を詳細に、そして特定の実施態様について記載したが、種々の変更および改変が、その精神および目的から逸脱することなくされ得ることが、当業者に明白となる。
配列表
（1）一般的情報：
（i）出願人：ファサノ，アレッシオ
（ii）発明の名称：腸送達用経口投与組成物およびその使用方法
（iii）配列数：４
（iv）連絡住所：
（A）名称：スグルー，ミオン，ジン，マックピーク，アンド シーズ
（B）番地：２１００  ペンシルバニア  アベニュー，エヌ．ダブリュー．，スイート  ８００
（C）市：ワシントン，ディー．シー．
（D）州：ディー．シー．
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：20037
（ｖ）コンピュータ読み出し形態：
（A）媒体型：フロッピー  ディスク
（B）コンピューター：IBM PC  互換用
（C）OS：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：パテントイン  リリース  ナンバー1.0，バージョン  ナンバー1.25
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：
（B）出願日：1996年2月9日
（C）分類：
（vii）先願データ：
（A）出願番号：08/443,864
（B）出願日：1995年5月24日
（C）分類：
（viii）代理人／事務所情報：
（A）氏名：キット，ゴードン
（B）登録番号：30,764
（C）照会／記録番号：A-6724
（ix）電話回線情報：
（A）電話：202-293-7060
（B）テレファックス：202-293-7860
（2）配列番号１の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：１４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：合成ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（xi）配列：配列番号１：
0003846901.tif 000004
（2）配列番号２の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：１２アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：合成ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（xi）配列：配列番号２：
0003846901.tif 000005
（2）配列番号３の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：１８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：合成DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号３：
0003846901.tif 000006
（2）配列番号４の情報：
（i）配列の特色：
（A）長さ：２２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：合成DNA
（iii）ハイポセティカル配列：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：配列番号４：
0003846901.tif 000007
【図１】
0003846901.tif 000008
【図２Ａ】
0003846901.tif 000009
【図２Ｂ】
0003846901.tif 000010
【図３】
0003846901.tif 000011
【図４】
0003846901.tif 000012
【図５Ａ】
0003846901.tif 000013
【図５Ｂ】
0003846901.tif 000014
【図６Ａ】
0003846901.tif 000015
【図６Ｂ】
0003846901.tif 000016
【図７Ａ】
0003846901.tif 000017
【図７Ｂ】
0003846901.tif 000018
【図７Ｃ】
0003846901.tif 000019
【図８】
0003846901.tif 000020
【図９Ａ】
0003846901.tif 000021
【図９Ｂ】
0003846901.tif 000022
【図９Ｃ】
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【図１０】
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