(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス属SK-1の細胞抽出液及び培養上清、並びに、硝酸を含む変形基礎培地(MBM)。
【請求項２】
さらに、ポリペプトン、酵母抽出液、K2HPO4、KH2PO4、MgSO2・7H2O、及び、L-チロシンを含む請求項１に記載の変形基礎培地。
【請求項３】
硝酸は、4mM濃度で含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の変形基礎培地。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の変形基礎培地を利用して嫌気的環境でシンビオバクテリウムトエビSC-1を単独培養する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼ(L-tyrosine phenol-lyase) とL-トリプトファンインドールリアーゼ(L-tryptophan indole-lyase)を生産する新規な絶対共生高温菌及びそれと関連する微生物の探索方法に関するものである。
【０００２】
具体的には、本発明は、高温の自然環境から分離した新規な絶対共生高温菌株のシンビオバクテリウムトエビSC-1(Symbiobacterium toebii SC-1)、上記菌を共生パートナーのバチルス属SK-1(Bacillus sp. SK-1)との混合培養せずに単独で純粋培養する方法を利用して生産した耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼとL-トリプトファンインドールリアーゼという2つの酵素、低成長を示すシンビオバクテリウムトエビSC-1の成長を測定する方法及びシンビオバクテリウムトエビSC-1に特異的な抗体を利用して上記菌株と関連する共生微生物を探索する方法に関するものである。
【０００３】
本発明のシンビオバクテリウムトエビSC-1によって生産された耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼとL-トリプトファンインドールリアーゼは、高附加価値医薬用アミノ酸の3,4-ジヒドロキシ-L-フェニルアラニン(以下「L-DOPA」と称する)及びL-トリプトファンを酵素的に合成する生物転換工程に利用できる。
【０００４】
背景技術
一般的に、L-チロシンフェノールリアーゼは、チロシンが誘導物質として添加された培地で培養したエルウィニア(Erwinia)属、エシェリヒア(Escherichia)属及びグラム陰性の腸内細菌から生産され広く分布している酵素である。
【０００５】
L-チロシンフェノールリアーゼは、チロシンをフェノール、ピルビン酸及びアンモニアに加水分解するα,β-除去反応(α,β-elimination)を触媒する。また、これはα,β-除去反応(α，β−elimination)(反応式 1 参照)に逆行する反応によってチロシン合成を触媒する。L-チロシンフェノールリアーゼは、カテコール、ピルビン酸及びアンモニアから高附加価値アミノ酸のL-DOPAを合成する。
<反応式 1>
【０００６】
【化１】
0003778496.tif 000002
【０００７】
一方、L-トリプトファンインドールリアーゼは、下記の反応式2のようにL-トリプトファンをインドール、ピルビン酸及びアンモニアに加水分解するα,β-脱離反応を触媒する。しかし、培地上にアンモニウムが高濃度で存在するとインドールとピルビン酸からα,β-脱離(合成)反応の逆反応(反応式 2 参照)によって L-トリプトファンが合成される。
<反応式 2>
【０００８】
【化２】
0003778496.tif 000003
【０００９】
上記で詳しく見たように、L-チロシンフェノールリアーゼ及びL-トリプトファンインドールリアーゼは、培地で誘導物質として作用して各々L-チロシン及びL-トリプトファンを合成する。
【００１０】
高附加価値医薬用アミノ酸のL-DOPAは、パーキンソン病(Parkinson_ｓ disease)を治療するのに効果的に使用されている。一般的に、L-DOPAは L-チロシンフェノールリアーゼを利用した酵素反応によって生産される。L-DOPAを生産する酵素的生物転換工程は、一般的に中温菌由来の酵素を使用する。L-DOPAを生産する酵素的生物転換工程において酵素の安定性は、生産性及び生産率を高めるのに重要な要因として作用する。しかし、中温菌由来の酵素は、熱に対する安定性が低く変性を起こしやすい。さらに上記中温菌由来の酵素は、合成工程に使用する有機溶媒、高圧、強酸性または強アルカリ性の極端な環境によって安定性が低下し酵素的生物転換工程の生産性及び生産率を低下させる。
【００１１】
このような中温菌由来の酵素の問題点を克服するために、本発明者らは、酵素的合成工程に高温菌由来の酵素を使用しようと努力した。一般的に高温環境で適応して増殖する高温菌は、熱に対して安定な耐熱性酵素を持っていると知られている。耐熱性酵素は熱に対して安定なだけではなく、有機溶媒、高濃度の水素イオンまたは化学変性剤に対しても安定性を持っていて、酵素的生物転換工程で耐熱性酵素が産業的に利用可能であると提示されている(韓国特許第0229284号)。
【００１２】
それで本発明者らは、上記L-DOPA及びL-トリプトファン生産の酵素的生物転換工程に利用できる耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼ及びL-トリプトファンインドールリアーゼを研究するために共生微生物の単独培養方法を開発した。本発明者らは、上記単独培養方法を利用して耐熱性のL-チロシンフェノールリアーゼ及びL-トリプトファンインドールリアーゼ活性を示す新規な共生高温菌のシンビオバクテリウムトエビSC-1を同定した。
【００１３】
また、本発明者らは、シンビオバクテリウムトエビSC-1の低成長(Low growth)を測定する方法及び上記菌株に特異的な抗体を利用して上記菌株と関連する共生微生物を探索する方法を開発することによって本発明を完成した。
【００１４】
発明の要約
本発明の目的は、高い酵素活性を持った耐熱性のL-チロシンフェノールリアーゼ及びL-トリプトファンインドールリアーゼの新規な絶対共生高温菌を提供することである。
【００１５】
また、本発明の他の目的は特異的な抗体を利用して新規な絶対共生高温菌と関連する共生菌を探索する方法を提供することである。
【００１６】
本発明によれば、上記の目的と長所は容易に得ることができる。
本発明は、新規な絶対共生高温菌のシンビオバクテリウムトエビSC-1を提供する。
【００１７】
また、本発明は、新規なシンビオバクテリウムトエビSC-1によって生産される耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼ及びL-トリプトファンインドールリアーゼを提供する。
【００１８】
また、本発明は、新規なシンビオバクテリウムトエビSC-1を純粋培養する方法を提供する。
【００１９】
また、本発明は、新規なシンビオバクテリウムトエビSC-1とその関連する菌の成長を測定する方法及びシンビオバクテリウムトエビSC-1に特異的な抗体を利用して自然環境から上記菌株と関連する共生菌株を探索する方法を提供する。
本発明のさらなる特徴は以下に表す。
【００２０】
発明の好ましい形態の詳細な説明
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、韓国の土壌から分離した新規な絶対共生高温菌シンビオバクテリウムトエビSC-1を提供する。シンビオバクテリウムトエビSC-1は、耐熱性バチルス属SK-1(寄託番号 : KCTC 0306BP)と絶対共生を有することを確認した。
【００２１】
本発明のシンビオバクテリウムトエビSC-1の分離、単独培養方法、形態的及び生理学的特性を下記に示す。
【００２２】
1) シンビオバクテリウムトエビSC-1の分離
本発明者らは、濃縮培養でL-チロシンフェノールリアーゼ活性を持った高温性微生物2 種を分離した。色々な試料をL-チロシン含有濃縮培地に接種した。上記微生物は、新規なグラム陰性の高温菌であり、L-チロシンフェノールリアーゼ活性を持った桿菌形態の高温菌2種を分離した。これらは、耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼ活性を持ったグラム陰性の高温菌シンビオバクテリウムトエビSC-1及び胞子を生成するグラム陽性の高温菌バチルス属SK-1で、お互いに絶対共生関係にあった(図1 参照)。
【００２３】
シンビオバクテリウムトエビSC-1の耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼ活性は、4-アミノアンチピリン(4-aminoantipyrine)を含む培養培地からフェノールを検出することによって簡単に測定できる。
【００２４】
発色反応法を利用して、高温で生育した混合培養液から強いフェノールの発色反応が検出された。
【００２５】
2) シンビオバクテリウムトエビSC-1の単独培養
一般的に、共生高温菌は共生パートナーとの混合培養せずに単独で培養するのは不可能である。また、現在の技術では肉眼で識別可能なコロニー形態で培養が可能な微生物は極少数である(Lee S.Y.等, Appl. Environ. Microbiol., 62, 3787-3797, 1996 ; Ward D. M.等, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62, 1353-1370, 1998)。これは異なる微生物との相互関係(例をあげると共生関係)だけではなく実際に生物環境で繁殖する能力の為である。
【００２６】
例をあげると、エタノールからメタノールを生産する為に他の微生物と相互協力するメタノバクテリウム属(Metanobacterium sp.) 微生物(Bryant 等、 Archiv. fur Mikrobiologie, 50, 20-31, 1967)及びポリビニルアルコールの酸化的分解の為に協力する二種のシュードモナス属(Pseudomonas sp.) 微生物(Shimao 等、Agric. Biol. Chem. 48, 2873-2876, 1984)等は、共生パートナーとの混合培養によってのみ成長が可能である。
【００２７】
一方、寄生(parasite)の関係では、寄生する微生物の成長のために宿主から成長因子を供給される等、パートナーとしての宿主微生物の協力が絶対的に要求される。例をあげるとブデロビブリオ(Bdellovibrio)の場合、これらは自身の成長に必須的な成長因子の供給を受けるためにグラム陰性バクテリアを溶血させて生育すると明かされている(Rudy E. G., The Procaryotes, 3400-3415, 1992)。
【００２８】
本発明者らは、上記のような耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼを生産する耐熱性微生物をスクリーニングする過程で新規な共生高温菌シンビオバクテリウムトエビSC-1を同定した。しかし、シンビオバクテリウムトエビSC-1は、必須成長因子を得るために共生パートナーにバチルス属SK-1を必要とするため、本発明者らは、バチルス属SK-1とシンビオバクテリウムトエビSC-1を分離できず、シンビオバクテリウムトエビSC-1の単一コロニーを得られなかった。
【００２９】
それで、本発明者らは、単独培養が不可能なシンビオバクテリウムトエビSC-1及びバチルス属SK-1混合培養からシンビオバクテリウムトエビSC-1 単一コロニーを得て、単独で培養する為に変形基礎培地(MBM)を利用した単独培養方法を開発した。
【００３０】
本発明者らは、バチルス属SK-1を培養した培地及び上記微生物を破砕した抽出物を成長因子として含んだMBM培地を製造した。
【００３１】
その結果、本発明者らは低酸素性条件でMBM培地を使用した単独培養方法によって シンビオバクテリウムトエビSC-1及びバチルス属SK-1混合培養からシンビオバクテリウムトエビSC-1単一コロニーを得た。
【００３２】
したがって、本発明の共生パートナーの培養培地及び抽出物を含むMBM培養培地を使用した単独培養方法は、新規なシンビオバクテリウムトエビSC-1及びこれと共生関係にある微生物を単独に培養するのに有用である。
【００３３】
3) シンビオバクテリウムトエビSC-1の菌学的性質
シンビオバクテリウムトエビSC-1の成長のための最適の温度及びpHは、最適温度 60℃及び最適pH7ないしpH8であった(図2参照)。
【００３４】
シンビオバクテリウムトエビSC-1はグラム陰性細菌として、まだ、バーゲイズマニュアル(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)にも登録されていない新規共生高温菌である。
【００３５】
16S rRNAを利用した系統分類学的研究の結果、シンビオバクテリウムトエビSC-1は、胞子を形成して嫌気的条件で成長し好熱性等の特性を持ったバチルス-クロストリジウム属(Bacillus sp.-Clostridium sp.)グループと最も高い相同性を示した。
【００３６】
このような根拠から、本発明者らは上記耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼ及び耐熱性L-トリプトファンインドールリアーゼを生産する新規な共生高温菌をシンビオバクテリウムトエビSC-1(Symbiobacterium toebii SC-1)と命名して、1999年10月29日付で韓国生命工学研究院(KRIBB)遺伝子銀行(KCTC)に寄託した(寄託番号 : KCTC 0685BP)。
【００３７】
また、本発明は、耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼ及び耐熱性L-トリプトファンインドールリアーゼを提供する。
【００３８】
本発明者らは、新規な高温性共生シンビオバクテリウムトエビSC-1から生産される耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼ及びL-トリプトファンインドールリアーゼの酵素活性を測定する為に、シンビオバクテリウムトエビSC-1を液体変形基礎培地(MBM)に接種して亜硝酸が存在する嫌気的条件下で培養した。上記菌株を収得する為に培養培地を破砕して遠心分離し、抽出物を得た。上記破砕試料を利用してシンビオバクテリウムトエビSC-1によって生産される耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼ及びL-トリプトファンインドールリアーゼの酵素活性を測定した。
【００３９】
具体的に、上記抽出物はトリス緩衝溶液及びL-チロシンフェノールリアーゼまたはL-トリプトファンインドールリアーゼの基質にL-チロシンまたはL-トリプトファンを各々混合した。上記の抽出物と上記の基質が反応する酵素反応中にピルビン酸が生成された。本発明者らは、上記で生産されるピルビン酸の量を測定することによって酵素活性を測定した。
【００４０】
その結果、本発明の共生高温菌シンビオバクテリウムトエビSC-1は、L-チロシンフェノールリアーゼ及びL-トリプトファンインドールリアーゼを生産して、上記酵素は各々L-チロシンとL-トリプトファンからピルビン酸を形成することを確認した。
【００４１】
したがって、本発明のシンビオバクテリウムトエビSC-1から生成される耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼ及び耐熱性L-トリプトファンインドールリアーゼは、カテコール、ピルビン酸及びアンモニアからL-DOPAを、インドール、ピルビン酸及びアンモニアからL-トリプトファンを各々酵素的に合成できる生物転換工程に非常に安定な触媒酵素である。
【００４２】
また、本発明は、低成長収率のシンビオバクテリウムトエビSC-1 及びこれに関連する共生微生物の成長を簡単に測定する方法を提供する。
【００４３】
シンビオバクテリウム属菌株は、成長収率がとても低い微生物であるため分光光度計を使用してOD600で吸光度を測定したり、マイクロコロニーの数を数えて上記微生物の成長を測定することは不可能である。
【００４４】
それで、本発明者らはシンビオバクテリウムトエビSC-1の成長を嫌気性条件での硝酸還元反応を利用して測定した。シンビオバクテリウムトエビSC-1は、嫌気的条件で硝酸を還元する。シンビオバクテリウムトエビSC-1は、硝酸(nitrate)を電子受容体(electron acceptor)に利用して亜硝酸(nitrite)に還元させる。硝酸還元によって生成された還元力でATPを生産して上記微生物の成長に利用する。
【００４５】
上記で述べてきたように、シンビオバクテリウムトエビSC-1は、硝酸を還元して蓄積した亜硝酸を成長するために使用する為、ジアゾチゼーション(Diazotization, Hanson and Philips, Methods for general microbiology and molecular bacteriology, pp. 351-355)方法により蓄積された亜硝酸の量を測定することによって上記微生物の成長を測定できる。ジアゾチゼーション方法によってシンビオバクテリウムトエビSC-1の培養液試料にスルファニルアミド(sulfanylamide)反応液及びN-(1-ナフチル)-エチレンジアミンジヒドロクロライド(N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride)溶液を添加して発色反応させる。発色反応後、543nmで吸光度を測定して亜硝酸の量を定量する。吸光度は、シンビオバクテリウムトエビSC-1の成長程度を示す(図4 参照)。
【００４６】
亜硝酸の吸光度標準曲線(図5 参照)によると、試料内に蓄積された亜硝酸の吸光度値は30で、上記の値は亜硝酸4mMに該当する。ここで、1mMの蓄積された亜硝酸濃度は、2.5×106個の細胞数に等しい。したがって、4mMの亜硝酸濃度から、培養試料に1×107/ｍｌのシンビオバクテリウムトエビSC-1が存在することが分かる。
【００４７】
また、本発明は、シンビオバクテリウムトエビSC-1に特異的に製造された抗体を利用して上記と関連する細菌を探索する方法を提供する。
【００４８】
具体的に、本発明者らは上記共生微生物と関連する菌株を分離する為に、ウサギから回収されたシンビオバクテリウムトエビSC-1特異抗体が使用できる。上記抗体を生理食塩水に懸濁させ自然界採取試料と混合して特異抗体に結合した微生物を混合液から分離した。上記方法で回収した微生物を濃縮培養するか自然界から関連する共生微生物を分離する為にL-チロシンを含んだ混合培地で培養した。
【００４９】
発明を実施するための最良の方法
<実施例>
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。
但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
【００５０】
<実施例 1> シンビオバクテリウムトエビSC-1の同定
<1-1> 耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼ活性菌株の探索
L-チロシンフェノールリアーゼを生産する微生物を分離する為の濃縮培養を始めるために本発明者らは基礎培地(BM)を使用した。BMは、1ｌの蒸留水に5gのポリペプトン(polypeptone)、1gの酵母抽出物(Yeast extract)、6gのK2HPO4、0.5gのMgSO4及び0.5gのL-チロシン(L-tyrosine)を含む。
【００５１】
具体的には、濃縮培養をする為に上記BM培地に1%の堆肥を入れた。上記の堆肥は韓国慶州の土壌堆肥から選択した。上記の培養は、500mlエルレンマイヤーフラスコ(Erlenmeyer flask)に200mlのBMを入れて旋動震盪機で60℃を維持して培養した。2週間培養後に培養液を4-アミノアンチピリンと反応させL-チロシンフェノールリアーゼに生成されたフェノール量を測定した。フェノール-陽性反応を示す2ｍｌの培養液を200ｍｌの新BM培地に移し上記の過程を3回行なった。各移し過程後にフェノールは全体的に蓄積された。
【００５２】
本発明者らは終点希釈技術(end point dilution technique)を利用してL-チロシンフェノールリアーゼを生産する微生物を分離しようとした。フェノール-陽性反応を示す最も多く希釈されたチューブは終点希釈技術を使用して3回移し換えた。3回の移し換え後、フェノール-陽性培養で二種類の細胞が常に観察された。
【００５３】
60℃で培養しながらL-チロシンフェノールリアーゼを生産する微生物を培養する為の濃縮培養の結果、始めに本発明者らは、色々な構成で培養した後、1週間後に測定してフェノール-陽性反応を示す培養液を分離した。連続的に移し換えた後にも上記の活性は変らずに維持された。単独培養物を分離する為に、濃縮培養液をBM培地で希釈して培養した。L-チロシンフェノールリアーゼの活性を示す終点希釈培養液は、シンビオバクテリウムトエビSC-1 及びバチルス属SK-1の二種類の形態の菌株を含んでいた。しかし、BM アガープレートでだけ発見されるバチルス属SK-1は、チロシンフェノールリアーゼの活性を持っていなかった。本発明者らは混合培養からSC-1菌株を分離できなかった。
【００５４】
<1-2>濃縮培養からシンビオバクテリウムトエビSC-1の分離
<1-1>の結果、濃縮培養液をBMアガープレートに塗抹してバチルス属SK-1 単一コロニーを分離した。しかし、BMアガープレートから異なる菌株のシンビオバクテリウムトエビSC-1の単一コロニーは、獲得できなかった。本発明者らは、シンビオバクテリウムトエビSC-1の単一コロニーを得るために共生パートナーのバチルス属SK-1の破砕抽出液、培養培地及び10mM硝酸をBM培地と1:1体積比で混合して寒天混合培地(MBM)を製造した。遠心分離されたペレットの細胞抽出液は、濾過-殺菌後添加した。終点希釈培養液は、MBMアガープレートに塗抹して嫌気性環境で培養した。MBMアガープレートに現われたコロニーは、新しいMBMプレートに移した。L-チロシンフェノールリアーゼを生産する能力を確認したり純度を確認したりする為に単一コロニーを液体MBM培地に移した。保管する為に、単独培養物をグリセロール-MBM培地(50:50 体積比)に混合して-20℃で貯蔵した。
【００５５】
本発明者らは、いかなる栄養培地を使用したプレートからもSC-1菌株のコロニーが観察されなかったため、共生微生物の必須成長因子を提供する為に変形された培地を考案した。
【００５６】
上記微生物の共生パートナーのバチルス属SK-1培養液のペレットからの培養液及び細胞抽出物をBM培地に添加し、嫌気性条件下で3日間培養した後、MBMアガープレートでマイクロコロニー(1.0mm以下の直径)が観察された。
【００５７】
上記コロニーは、単独培養液が4-アミノアンチピリンとの赤色発色反応を示し L-チロシンフェノールリアーゼを生産する新規な共生高温菌であることを確認した。
【００５８】
<1-3> シンビオバクテリウムトエビSC-1の同定
本発明者らは、生育形態、大きさ及び染色された細胞を観察する為に光学顕微鏡を使用した。グラム反応は、バースオロメウJ. W.（Bartholomew J. W.）等(Stain Technol., 37, 846-858, 1962)が提示する方法によって細胞を処理した後、光学顕微鏡で観察した。シンビオバクテリウムトエビSC-1及びバチルス属SK-1間の物理的接触は、培養する間光学顕微鏡を通して観察した。透過電子顕微鏡で観察する為に、サンプルはグルタルアルデヒド(glutar aldehyde)及びプラチナム-シャドウ(platinum shadowed)と混合した。剥離切片は、ミロシニチェンコM. L.（Miroshnichenko M. L.）等(Syst. Appl. Microbiol., 12, 257-262, 1989)が提示する方法によって得た。
【００５９】
シンビオバクテリウムトエビSC-1のコロニーは、半透明だった。シンビオバクテリウムトエビSC-1は、桿菌の形態、グラム陰性、直径は0.2ないし0.3μｍ及び1ないし5μｍであった。シンビオバクテリウムトエビSC-1の最適成長温度及びpHは、60℃及びpH7ないしpH8であった(図 2)。
【００６０】
本発明者らは微生物好気的環境及び硝酸還元環境でMBMアガープレートに培養したシンビオバクテリウムトエビSC-1のコロニーを観察した。本発明者らは亜硝酸が化学定量的な量で蓄積され窒素ガスが生成されない硝酸還元条件でシンビオバクテリウムトエビSC-1が成長できることを確認した。しかし、好気性環境でのシンビオバクテリウムトエビSC-1の成長は非常に制限的であった。
【００６１】
シンビオバクテリウムトエビSC-1の主な脂肪酸組成は枝分れのある脂肪酸及び直線脂肪酸であり、メナキノン組成の主要構成成分は、MK-6及びMK-7であった。
【００６２】
16S rDNA 分析による系統分類学的類縁関係を詳しく見た結果、上記微生物はシンビオバクテリウムトエビSC-1であると確認され、既存の微生物グループと90%以下の類似性を示すためどの属にも属さない新規な微生物であることが確認できた(図 3)。
【００６３】
このような理由から本発明者らは、L-チロシンフェノールリアーゼ及びL-トリプトファンインドールリアーゼを生産する新規な共生高温菌をシンビオバクテリウムトエビSC-1と命名し、1999年10月29日付で韓国生命工学研究院(KRIBB)内遺伝子銀行(KCTC)に寄託した(寄託番号 : KCTC 0685BP)。
【００６４】
<実施例 2> 耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼとL-トリプトファンインドールリアーゼの活性測定
本発明者らは、本発明の新規な共生高温菌シンビオバクテリウムトエビSC-1から生産される耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼ及びL-トリプトファンインドールリアーゼの酵素活性を測定する為に、細胞抽出液を準備した。具体的に、シンビオバクテリウムトエビSC-1をMBM液体培地に接種して硝酸を含んだ嫌気的環境で培養した。
【００６５】
細胞を分離する為に上記細胞培養液を遠心分離した。遠心分離後、上記細胞ペレットを超音波破砕して破砕抽出物を獲得した。上記抽出物を利用してシンビオバクテリウムトエビSC-1から生産される耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼ及びL-トリプトファンインドールリアーゼの活性を測定した。
【００６６】
硝酸還元反応が起きる嫌気的条件で48時間純粋培養した後、遠心分離してシンビオバクテリウムトエビSC-1菌体を収穫した。上記の収穫された菌体を超音波破砕機で破砕し上記で得た破砕試料を共生高温菌シンビオバクテリウムトエビSC-1から生産される耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼ及びL-トリプトファンインドールリアーゼの粗酵素液に使用した。
【００６７】
<2-1> 耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼの活性
本発明者らは、シンビオバクテリウムトエビSC-1によって生産される耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼの酵素活性を測定する為に、0.1Mトリス緩衝液(Tris-HCl、pH 8.5)0.2ml及び10mMのL-チロシンを上記の粗抽出物と混合して反応混合液を準備した。
【００６８】
上記の反応混合液は、60℃で1時間反応させた。0.2ml 60%の酸化カリウム塩溶液及び0.1ml 2%のサリチルアルデヒド(salicylaldehyde)を上記酵素反応混合液に加えて、混合液を発色させるために37℃で30分間反応させた。反応後、混合液を生理食塩水で2倍希釈して、混合液に含まれたピルビン酸の量を測定して酵素活性を測定した。
【００６９】
その結果、L-チロシンフェノールリアーゼの酵素活性は、蛋白質1mg当0.01unitであることを確認した(表 1)。
【００７０】
<2-2> 耐熱性L-トリプトファンインドールリアーゼの活性
本発明者らは、シンビオバクテリウムトエビSC-1が生産する耐熱性L-トリプトファンインドールリアーゼの酵素活性を測定する為に、0.1M 燐酸塩緩衝溶液0.2ml及び10mMのL-トリプトファンを破砕抽出液0.1mlと混合した酵素反応混合液を製造した。以後の工程は、<2-1>と同じである。
【００７１】
その結果、耐熱性L-トリプトファンインドールリアーゼの酵素活性は、蛋白質1mg当り0.34unitであることを確認した(表 1)。
【００７２】
<表 1>   耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼとL-トリプトファンインドールリアーゼの活性測定
【００７３】
【表１】
0003778496.tif 000004
【００７４】
* 酵素活性1unitは、1分間に反応産物1μmolを作る酵素量と定義する。蛋白質の濃度は、ブラッドフォード(Bradford)方法で測定した。
【００７５】
<実施例 3> 硝酸還元反応を利用した低成長微生物の成長性測定
本発明のシンビオバクテリウムトエビSC-1は、成長収率がとても低い微生物であり、分光光度計でOD600での吸光度測定及びマイクロコロニーの数を数えることは不可能である。
【００７６】
本発明者らは、シンビオバクテリウムトエビSC-1の成長を測定する為に嫌気性条件下で硝酸呼吸を利用した。嫌気性条件でシンビオバクテリウムトエビSC-1が硝酸を循環することを確認した。シンビオバクテリウムトエビSC-1は、酸素の代わりに硝酸を電子受容体に利用して硝酸を亜硝酸に還元した。また硝酸還元から生成された還元力を利用してATPを生産し、ATPを上記微生物の生長に使用した。
【００７７】
上記で見たように、硝酸を還元して成長するシンビオバクテリウムトエビSC-1は、同時に亜硝酸を蓄積する為、ジアゾチゼーション方法(Hanson and Philips, Method for general microbiology and molecular bacteriology, 351-355)を利用して培養培地に蓄積された亜硝酸の量を測定することによって上記微生物の成長を測定できる。
【００７８】
本発明者らは上記方法にしたがってシンビオバクテリウムトエビSC-1をスルファニルアミド(sulfanylamide)水溶液及びN-(1-ナフチル)-エチレンジアミンジヒドロクロライド(N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride)水溶液に混合した。発色反応後、蓄積された亜硝酸の量は543nmの吸光度で培養混合液を測定し、上記測定された吸光度はシンビオバクテリウムトエビSC-1の相対的な成長を示すものである(図 4)。
【００７９】
本発明者らは、亜硝酸の標準成長曲線を提供し、これを通して培養試料内蓄積された亜硝酸の量を計算した(図 5)。本発明者らは亜硝酸の値からシンビオバクテリウムトエビSC-1の細胞成長を測定した。
【００８０】
ここで 1mMの亜硝酸蓄積は、2.5×106細胞/mlの細胞成長を現わす。その結果、培養試料に蓄積された亜硝酸の吸光度(最適濃度, OD)は30で、この値は標準曲線を利用すると4mM亜硝酸濃度と計算された。したがって、培養試料のシンビオバクテリウムトエビSC-1の成長は1×107細胞/mlであった。また本発明者らは上記の成長測定方法をマルチウェルプレート(multi well plate)等に適用してシンビオバクテリウムトエビSC-1の成長を間接的に確認した(図 6)。
【００８１】
したがって、本発明の成長測定は、シンビオバクテリウムトエビSC-1及びこれと関連する菌株の成長をたやすく、すばやく測定できるだけではなく、現在分光光度計またはマイクロコロニーの数を数えることが不可能な低成長率を示す自然の微生物にも使用できる。
【００８２】
<実施例 4> シンビオバクテリウムトエビSC-1 特異抗体を利用した関連共生微生物の探索
本発明者らは、自然界からシンビオバクテリウムトエビSC-1と関連する共生微生物を分離する為にシンビオバクテリウムトエビSC-1に対して特異的な抗体を製造した。
具体的には、シンビオバクテリウムトエビSC-1に特異的な抗体は下記の方法によって製造した。
【００８３】
まず、単独培養されたシンビオバクテリウムトエビSC-1を0.5%ホルマリンで処理して固定させた。次に、固定されたシンビオバクテリウムトエビSC-1を生理食塩水で希釈した。最後に、希釈されたシンビオバクテリウムトエビSC-1溶液をウサギに接種した。ウサギから抗-血清を回収してシンビオバクテリウムトエビSC-1に対する特異的な抗体に使用した。
【００８４】
自然界試料(堆肥、土壌及び温泉水等)1gを10mlの0.85%生理食塩水で希釈した後、ホモジナイザー(homogenizer)で破砕した。上記で得た混合液は5分間遠心分離(15,000 rpm)して上澄み液を分離した。このようにして得た上澄み液5mlに上記で製造されたシンビオバクテリウムトエビSC-1特異抗体を添加して混合した後、常温で1時間反応させた。
【００８５】
混合液内で特異的な抗体が結合された微生物を分離するために、混合液を上記抗体に特異的に結合する蛋白質A-セファロース(protein A-Sepharose, Pharmacia)0.5gを処理して、常温で10分間反応させた。反応後、微生物を蛋白質A-セファロースに特異抗体が結合した複合体に結合させて遠心分離で分離し、生理食塩水で3回弱く洗浄した。
【００８６】
上記の方法で分離した微生物は、濃縮培養の接種源に利用したりまたは強い振動で抗体-蛋白質A-セファロース複合体を除去後、共生微生物の分離に利用した。
【００８７】
したがって、本発明の探索方法はシンビオバクテリウムトエビSC-1を探索し、微生物群集の研究の為に自然界から上記微生物を分離するのに有用に使用できる。
【００８８】
産業的の利用可能性
本発明は、新規な高温性共生微生物菌株のシンビオバクテリウムトエビSC-1、共生パートナーのバチルス属SK-1(Bacillus sp. SK-1)との混合培養せずに単独培養したシンビオバクテリウムトエビSC-1によって生産される耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼとL-トリプトファンインドールリアーゼに関するものである。したがって、本発明のシンビオバクテリウムトエビSC-1によって生産される耐熱性L-チロシンフェノールリアーゼとL-トリプトファンインドールリアーゼは、高附加価値アミノ酸の3,4-ジヒドロキシ-L-フェニルアラニン(L-DOPA)及びL-トリプトファンを酵素的に合成する生物転換工程においてとても安定な酵素として提供できる。
また、本発明は、低成長収率を示すシンビオバクテリウムトエビSC-1の成長を測定する方法及び特異抗体を利用してこれと関連する共生関係にある微生物を探索する方法を提供する。
本発明の成長測定方法は、現在分光光度計またはマイクロコロニーの数を数えることが不可能な低成長率を示す自然の微生物にも使用できる。また、本発明の探索方法は、共生微生物を探索して、微生物群集の研究の為に自然界から上記微生物を分離するのに有用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の新規な高温性共生微生物シンビオバクテリウムトエビSC-1 及びその共生パートナーのバチルス属SK-1の電子顕微鏡写真を示したものである。
ａ：シンビオバクテリウムトエビSC-1
ｂ：バチルス属 SK-1
【図２】  新規なシンビオバクテリウムトエビSC-1の最適成長温度及びpHを示したものである。
（a） : 最適 pH
（b） : 最適成長温度
【図３】 新規なシンビオバクテリウムトエビSC-1の16S rRNA 塩基配列分析の結果である。
【図４】 硝酸還元条件下で純粋培養方法によって培養した新規なシンビオバクテリウムトエビSC-1の成長形態を示したものである。
−●−：シンビオバクテリウムトエビSC-1の成長
−▽−：亜硝酸(mM)の減少
−〇−：亜硝酸(mM)の増加
【図５】 ジアゾチゼーション方法によって測定した亜硝酸の吸光度標準曲線を示したものである。
【図６】 低成長測定方法をマルチウェルプレート(multi well plate)に適用してシンビオバクテリウムトエビSC-1の成長を示したもので、色の強度は細胞の成長と直接的な関連がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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