(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸領域の増幅方法であって、
増幅され得る前記標的核酸の前記領域又は前記標的核酸領域の相補体を覆う既知の量のコントロール核酸、及び前記標的核酸を増幅する段階を含んで成り、
増幅された核酸が増幅反応の間に特異的プローブを用いて増幅反応混合物中で検出され、
ここで、増幅された核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションが増幅反応の間にモニタリングされ、
前記コントロール核酸の処理に使用されるプローブが、増幅され得る前記標的核酸又は前記標的核酸の相補体の処理に使用されるプローブに対し平行相補的であり、ここで、前記コントロール核酸の処理のためのプローブのうちの少なくとも８ヌクレオチドの少なくとも１つの隣接配列が前記標的核酸領域又は前記標的核酸領域の相補鎖の処理のためのプローブに対して８０％超平行相補的であり、
ここで、前記コントロール核酸の領域が１又は複数の部分から成り、そして
当該部分のそれぞれの配列が、決定され得る標的核酸領域の一致する部分又はその相補鎖に対して８０％超同一であるか、あるいは８０％超平行相補的であることを特徴とする方法。
【請求項２】
標的核酸領域の定量方法であって、
ａ）前記標的核酸の領域及び、増幅され得る前記標的核酸領域又は前記標的核酸領域の相補体を覆う、既知の量のコントロール核酸を増幅し、
ｂ）前記コントロール核酸から得られる増幅産物の量を示唆するシグナルを検出し、そして前記標的核酸から得られる増幅産物の量を示唆するシグナルを検出し、
ｃ）既知の量の前記コントロール核酸、段階ｂ）で検出された前記コントロール核酸から得られた増幅産物の量を示唆するシグナル、及び段階ｂ）で検出された前記標的核酸から得られた増幅産物の量を示唆するシグナル、を用いて前記標的核酸の量を計算すること、
を含んで成り、
増幅された核酸が増幅反応の間に特異的プローブを用いて増幅反応混合物中で検出され、
ここで、増幅された核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションが増幅反応の間にモニタリングされ、
前記コントロール核酸の処理に使用されるプローブが、増幅され得る前記標的核酸又は前記標的核酸の相補体の処理に使用されるプローブに対し平行相補的であり、ここで、前記コントロール核酸の処理のためのプローブのうちの少なくとも８ヌクレオチドの少なくとも１つの隣接配列が前記標的核酸領域又は前記標的核酸領域の相補鎖の処理のためのプローブに対して８０％超平行相補的であり、
前記コントロール核酸の領域が１又は複数の部分から成り、そして
当該部分のそれぞれの配列が、決定され得る標的核酸領域の一致する部分又はその相補鎖に対して８０％超同一であるか、あるいは８０％超平行相補的であることを特徴とする方法。
【請求項３】
標的核酸の増幅のためのキットであって、取扱説明書、前記標的核酸の増幅のためのプライマー、並びに、少なくともコントロール核酸、標的特異的プローブ及びコントロール特異的プローブ、標的特異的プライマー及びコントロール特異的プライマー、反応緩衝液、ヌクレオチド三リン酸及びポリメラーゼを含む少なくとも１つの反応容器、を含んで成るキットであって、
ここで、前記コントロール核酸が増幅され得る前記標的核酸の領域又は前記標的核酸領域の相補体を覆い、
前記コントロール核酸の処理のためのプローブが、増幅され得る前記標的核酸又は前記標的核酸の相補体の処理に使用されるプローブと平行相補的であり、ここで、前記コントロール核酸の処理のためのプローブのうちの少なくとも８ヌクレオチドの少なくとも１つの隣接配列が前記標的核酸領域又は前記標的核酸領域の相補鎖の処理のためのプローブに対して８０％超平行相補的であり、
前記コントロール核酸の領域が１又は複数の部分から成り、そして
当該部分のそれぞれの配列が、決定され得る標的核酸領域の一致する部分又はその相補鎖に対して８０％超同一であるか、あるいは８０％超平行相補的であることを特徴とするキット。
【請求項４】
標的核酸の増幅のための組成物であって、標的核酸、コントロール核酸、前記標的核酸の処理のための第一プローブ及び前記コントロール核酸の処理のための第二プローブを含んで成り、ここで、前記コントロール核酸が増幅され得る前記標的核酸領域又は前記標的核酸領域の相補体を覆い、
前記コントロール酸の処理に使用されるプローブが、増幅され得る前記標的核酸又は前記標的核酸の相補体の処理に使用されるプローブと平行相補的であり、ここで、前記コントロール核酸の処理のためのプローブのうちの少なくとも８ヌクレオチドの少なくとも１つの隣接配列が前記標的核酸領域又は前記標的核酸領域の相補鎖の処理のためのプローブに対して８０％超平行相補的であり、
前記コントロール核酸の領域が１又は複数の部分から成り、そして
当該部分のそれぞれの配列が、決定され得る標的核酸領域の一致する部分又はその相補鎖に対して８０％超同一であるか、あるいは８０％超平行相補的であることを特徴とする組成物。
【請求項５】
標的核酸の増幅のための反応におけるコントロールとしての核酸の使用であって、
コントロール核酸が、増幅され得る前記標的核酸の前記領域又は前記標的核酸領域の相補体を覆い、
増幅された核酸が増幅反応の間に特異的プローブを用いて増幅反応混合物中で検出され、
ここで、増幅された核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションが増幅反応の間にモニタリングされ、
前記コントロール核酸の処理に使用されるプローブが、増幅され得る前記標的核酸又は前記標的核酸の相補体の処理に使用されるプローブと平行相補的であり、ここで、前記コントロール核酸の処理のためのプローブのうちの少なくとも８ヌクレオチドの少なくとも１つの隣接配列が前記標的核酸領域又は前記標的核酸領域の相補鎖の処理のためのプローブに対して８０％超平行相補的であり、
前記コントロール核酸の領域が１又は複数の部分から成り、そして
当該部分のそれぞれの配列が、決定され得る標的核酸領域の一致する部分又はその相補鎖に対して８０％超同一であるか、あるいは８０％超平行相補的であることを特徴とする使用。
【請求項６】
標的核酸の決定のためのハイブリダイゼーション反応におけるコントロールとしての核酸の使用であって、
コントロール核酸が、増幅され得る前記標的核酸の前記領域又は前記標的核酸領域の相補体を覆い、
増幅された核酸が増幅反応の間に特異的プローブを用いて増幅反応混合物中で検出され、
ここで、増幅された核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションが増幅反応の間にモニタリングされ、
前記コントロール核酸の処理に使用されるプローブが、増幅され得る前記標的核酸又は前記標的核酸の相補体の処理に使用されるプローブと平行相補的であり、ここで、前記コントロール核酸の処理のためのプローブのうちの少なくとも８ヌクレオチドの少なくとも１つの隣接配列が前記標的核酸領域又は前記標的核酸領域の相補鎖の処理のためのプローブに対して８０％超平行相補的であり、
前記コントロール核酸の領域が１又は複数の部分から成り、そして
当該部分のそれぞれの配列が、決定され得る標的核酸領域の一致する部分又はその相補鎖に対して８０％超同一であるか、あるいは８０％超平行相補的であることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特別なコントロール核酸を用いる標的核酸の決定方法、プライマー及び特別なコントロール核酸を用いる前記標的核酸の部分配列の増幅方法、並びに前記コントロール核酸を含むキットに関する。
【０００２】
本発明の背景
核酸の決定は、分析化学における、特に医療における重要な道具となりつつある。例えば、感染症及び遺伝子の状態は、個体から入手した試料における前記症状又は状態を示す核酸の存在又は量に基づいて容易に決定され得る。この理由から、核酸、好ましくはオリゴヌクレオチドと、前記症状又は遺伝子の状態を示す標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを用いる方法が確立された。分枝ＤＮＡの様な高感度技術（米国特許第５，６８１，７０２号、第５，５９７，９０９号、第５，５４５，７３０号、第５，５９４，１１７号、第５，５９１，５８４号、第５，５７１，６７０号、第５，５８０，７３１号、第５，５７１，６７０号、第５，５９１，５８４号、第５，６２４，８０２号、第５，６３５，３５２号、第５，５９４，１１８号、第５，３５９，１００号、第５，１２４，２４６号及び第５，６８１，６９７号）、又は生物において高コピー数で存在する、ｒＲＮＡ標的核酸を検出する方法（ＥＰ  ０  ２７２  ００９）が、当該生物由来の試料中の標的核酸の直接的な検出に使用され得る。しかし、多くの標的核酸は、生物において、当該生物由来の試料中での直接検出が不可能なほどの低濃度で存在している。その様な標的は検出前に増幅する必要がある。適当な増幅法は、例えばＬＣＲ（米国特許第５，１８５，２４３号、第５，６７９，５２４号及び第５，５７３，９０７号；ＥＰ  ０  ３２０  ３０８  Ｂ１；ＷＯ９０／０１０６９；ＷＯ８９／１２６９６；及びＷＯ８９／０９８３５）、サイクリングプローブ技術（米国特許第５，０１１，７６９号、第５，４０３，７１１号、第５，６６０，９８８号、及び第４，８７６，１８７号、並びにＰＣＴ公開公報ＷＯ９５／０５４８０、ＷＯ９５／１４１６、及びＷＯ９５／００６６７）、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）技術（米国特許第５，８４６，７１７号；第５，６１４，４０２号；第５，７１９，０２８号；第５，５４１，３１１号；及び第５，８４３，６６９号）、Ｑ−ベータレプリカーゼ技術（米国特許第４，７８６，６００号）、ＮＡＳＢＡ（米国特許第５，４０９，８１８号；ＥＰ−０  ３２９  ８２２）、ＴＭＡ（米国特許第５，３９９，４９１号、第５，８８８，７７９号、第５，７０５，３６５号、第５，７１０，０２９号）、ＳＤＡ（米国特許第５，４５５，１６６号及び第５，１３０，２３８号）及びＰＣＲ（ＵＳ−Ａ−４，６８３，２０２）である。
【０００３】
核酸決定における誤った結果を最少化するために、複数の国の専門家がコントロール核酸の使用を必要としている。特に、増幅方法を使用する場合に、その様なコントロール核酸が非常に重要であるのは、増幅過程が、誤った結果を導き得る反応条件によって強力に影響され得るためである。時々、誤ったネガティブな結果を導き得る阻害物質が試料中に含まれる。
【０００４】
通常、外部コントロールと内部コントロールは識別され得る。外部コントロール、例えば古典的なポジティブコントロール及びネガティブコントロールは、アッセイが適切に実行されているか否か、又は混入物が含まれているか否かを調べるのに広く使用されている。内部コントロールは、例えば、試料中に恐らく含まれる阻害物質を認識するのに有用であり、又は定量アッセイにおける定量スタンダードとして使用され得る。一般的に別々の反応槽で試験される外部コントロールと対照的に、内部コントロールは同一の反応槽中で、試験され得る解析物と一緒にインキュベートされる。それ故に、コントロール又は当該コントロールの増幅産物は、解析物又は当該解析物の増幅産物と識別可能でなければならない。増幅方法を使用する場合、内部コントロール核酸は、本質的に標的核酸と同一の反応条件下で同時に増幅される。これらの条件は、試薬の濃度、温度、阻害剤の濃度又は酵素活性を含む。コントロールにしばしば使用される配列は、ハウスキーピング遺伝子に由来するが（Chelly et al. (1990) Eur. J. Biochem. 187 : 691-698 ; Mallet et al. (1995) J. Clin. Microbiol. 33 : 3201-3208 を参照のこと）、非天然配列も使用される（Besnard et al. (1995) J. Clin. Microbiol. 32 : 1887-1893 ; Gilliland et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 2725-2729 ; Wang et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9717-9721）。
【０００５】
内部コントロールに由来する増幅された核酸は、例えば識別可能なプローブに対する、それらの異なる長さ又はハイブリダイゼーション能によって、標的核酸に由来する増幅された核酸と識別され得る（引用文献として、Clementi et al. (1990) PCR Methods Applic. 2 : 191-196 ; Clementi et al. (1995) Arch. Vivol. 140 : 1523-1539を参照のこと）。全ての場合において、内部コントロールのヌクレオチド配列は、標的核酸配列と部分的に又は全体的に異なる。しかしながら、核酸の配列及び長さは、そのＧＣ含量、二次構造及び融点を決定し、その結果、ハイブリダイゼーション及び増幅反応におけるその挙動にとって必須である。内部コントロールの異なる配列は、ほぼ全ての場合において、標的核酸のものと比較して、コントロール核酸の異なる挙動を生む。それと対照的に、理想の内部コントロールは、反応の適切なモニタリングを可能にするために、標的核酸を正確に模倣する。
【０００６】
増幅反応における最も重要な観点の１つに、標的核酸に対するプライマーの結合がある。従って、標的核酸と同一のプライマー結合部位を有する内部コントロールが使用される（例えば、Gilliland et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 2725-2729 ; Wang et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9717-9721 ; US 5,219,727 を参照のこと）。これは、プライマーについての反応における競合をまねくことがあり、そしてアッセイの感度の低下をもたらすことがある。
【０００７】
Gilliland et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 2725-2729 は、標的核酸とほぼ同一の核酸配列を有するが、新規な制限酵素開裂部位又は標的核酸に含まれないイントロン領域の配列を含む内部コントロールを記載している。標的との内部コントロールの非常に高い相同性により、核酸及び増幅物は共に、互いにクロスハイブリダイズし得る。使用する検出方法に依存して、このことは特に定量アッセイにおいて間違った結果をまねき得る。また、上記方法は、手の込んだ技術、例えば増幅産物の制限酵素消化及びアガロースゲル電気泳動を必要とする。
【０００８】
本発明の目的は、特に既知の方法の欠点の全部又は一部を回避して、核酸の決定方法を改良することである。
【０００９】
本発明の要約
本発明の主な観点は、長さ、Ｇ／Ｃ含量、二次構造、及び折りたたみの反応速度に関して標的核酸の特性を模倣し、そして更に、それらの配列から各標的核酸から容易に識別され得る核酸を提供することである。これを達成するために、決定され得る前記標的核酸の領域又は前記標的核酸領域の相補鎖を本質的に覆い、そして標的核酸の鎖又はそれと相補的な鎖と少なくとも部分的に平行相補性（ｐａｒａｌｌｅｌ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）である配列が構築される。コントロール核酸配列の平行相補性の１又は複数の部分は、小さなストレッチ、例えば少なくとも８ヌクレオチド、好ましくは１０ヌクレオチドから、最も伸長された場合では、決定され得る完全な標的核酸領域にまで伸長し得る。本発明の好ましい観点において、平行相補性の１又は複数の部分は、プローブ結合部位の配列を含む。
【００１０】
別の好ましい観点において、特に、決定され得る標的核酸領域が決定のために増幅される場合、本発明に従うコントロール核酸も、標的核酸領域の各プライマー結合部位に対して平行相補性であるプライマー結合部位を含み得る。
【００１１】
その様なコントロール核酸は、例えばハイブリダイゼーション及び増幅における内部コントロールとして使用されることがあり、そしてそれ故に化学分析及び医学的診断の分野において有用である。
【００１２】
本発明はまた、試料中の標的核酸領域の増幅方法であって、
前記標的核酸領域及び、増幅され得る前記標的核酸領域、又は前記標的核酸領域の相補体を本質的に覆う、既知の量のコントロール核酸を増幅する段階を含んで成り、それによって増幅され得る前記標的核酸又は前記標的核酸の相補体の領域を本質的に覆う前記コントロール核酸の領域が、前記標的核酸又は前記標的核酸の相補鎖と本質的に平行相補性である、少なくとも８ヌクレオチドの少なくとも１つの隣接配列を含む方法、に関する。
【００１３】
増幅方法に関して、その様なコントロール核酸は追加の利点を有する。これらの核酸のプライマー結合部位が、当該標的のプライマー結合部位に対して平行相補性である場合、これらのコントロールは当該標的に結合するプライマーの特性を模倣するが、プライマー結合部位及びコントロール核酸のプライマーの配列は、標的核酸のものとは異なる。当該標的及び当該コントロールの増幅のためのプライマーの競合は回避され、そしてアッセイの感度及び直線範囲は改良され得る。
【００１４】
言及したコントロールは、核酸の決定のための任意なハイブリダイゼーション及び増幅方法において使用され得る。このコントロール核酸の使用は、決定され得る標的核酸の特徴を反映するが、なおも別々に検出可能であり得るコントロールについての必要性によって引き起こされる。
【００１５】
本発明の詳細な説明
本発明は主に、別の第２核酸配列と平行相補性の配列を有する第１核酸が、第１核酸配列と比較して、その長さ、ＧＣ含量、Ｔｍ及び二次構造によって限定される、非常に類似のハイブリダイゼーション特性を有するが、配列は完全に異なるという観察に基づいている。その様な核酸が、標的核酸の決定のためのコントロール核酸として使用され得るのは、当該コントロール核酸、標的核酸、その増幅物が非常に類似のハイブリダイゼーション挙動を有するが、それらの異なる配列によってなおも別々に検出可能なことによる。
【００１６】
本発明に従う好ましいコントロール核酸は、決定され得る標的核酸の領域を本質的に覆い、決定され得る前記標的核酸の領域又は前記標的核酸の相補体を本質的に覆う前記コントロール核酸の領域が、前記標的核酸又は前記標的核酸の相補鎖と本質的に平行相補性である少なくとも８ヌクレオチドの少なくとも１つの隣接配列を含むことを特徴とする。
【００１７】
本文における、決定され得る標的核酸の領域を本質的に覆うとは、コントロール核酸のこの領域が１又は複数の部分から成り、これによって各部分の配列が、決定され得る標的核酸領域の一致した部分又は相補鎖と本質的に同一又は本質的に平行相補性であることを意味する。従って、コントロール核酸のこの領域は、本質的に同一、本質的に平行相補性又は部分的に本質的に平行相補性、のいずれかであり、一方、他の部分は、決定され得る標的核酸領域の関連領域又は標的核酸の相補鎖と本質的に同一である。従って、このコントロール核酸領域は、決定され得る標的核酸領域の領域又は標的核酸の相補鎖と比較したときに、本質的に同一のハイブリダイゼーション特性を有する。二次構造の挙動のわずかな変化は、多過ぎる、本質的に平行相補性部分と本質的に同一部分とがコントロール核酸において組み合わされる場合に生じることがあるが、このことはＧＣ含量に作用しない。コントロールの挙動がなおも標的の挙動を模倣することを保証するために、決定され得る標的核酸の領域を覆うコントロール核酸領域は、本質的に平行相補性又は本質的に同一のいずれかである、１０未満、好ましくは６未満の部分から成ることが好ましい。
【００１８】
本質的に同一又は同一な配列が容易に識別され得るので、決定され得る標的核酸の領域を覆うコントロール核酸の領域が、標的核酸及びコントロール核酸又はそれらの増幅物の明確な決定を可能にするために、例えばプローブハイブリダイゼーションによって、前記標的核酸配列と本質的に平行相補性である、少なくとも８ヌクレオチドの少なくとも１つの隣接配列、更に好ましくは少なくとも１０ヌクレオチドの少なくとも１つの配列を含むことが非常に重要である。
【００１９】
第１核酸の一部は、標的核酸配列の相補鎖配列が逆配向で読まれる場合に、当該第１核酸配列が、第２核酸配列又はその一部の相補鎖配列と同一であるならば、第２核酸又はその一部と平行相補性である。天然核酸にとって、このことは、３′末端から５′末端への読み込みを意味する。例を図１に与える。
核酸配列 5'-AGCGCATGCCAGATTACTGGC-3'（配列番号１）の平行相補鎖配列は、5'-TCGCGTACGGTCTAATGACCG-3'（配列番号２）である。
【００２０】
当該相補鎖に対する平行相補鎖配列は、5'-CGGTCATTAGACCGTACGCGA-3'(配列番号１７）である。
【００２１】
本発明に従うコントロール核酸の部分は、標的核酸に対して１００％同一又は１００％平行相補性である必要はないが、この場合が好まれる。これらの部分が本質的に同一又は本質的に平行相補性のいずれかであれば十分である。本質的に同一とは、コントロール核酸のこの部分又はこれらの部分の相同性が、標的核酸の関連部分が対照の場合、８０％以上、更に好ましくは９０％以上であることを意味する。本質的に平行相補性とは、コントロール核酸のこの一部又はこれらの部分の相同性が、標的核酸の関連部分が対照の場合、８０％以上、更に好ましくは９０％以上平行相補性であることを意味する。
【００２２】
相同性及び相補性の正確な決定のために、適当なコンピュータープログラム、例えばＦａｓｔＡ（Pearson and Lipman（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 ; 2444-2448 (1998) ; Wisconsin Package（商標）、ＦａｓｔＡバージョン、デフォルト設定：ワードサイズ２（ｐ−ｐ）、６（ｎ−ｎ）；１０．０（ｐ−ｐ）、２．０（ｎ−ｎ）を超すＥ（  ）値のスコアは示さない）を使用することが好ましい。
【００２３】
本発明に従うコントロール核酸はまた、対立遺伝子型の様な、関連配列を有する標的核酸の決定のためのハイブリダイゼーション及び増幅反応において有用である。この目的のために、標的核酸の各対立遺伝子型のために新規コントロールを合成することは必要ではない。
【００２４】
例えば、１つのプローブハイブリダイゼーション段階をモニタリングするための純粋なコントロールとして、ハイブリダイゼーション方法において使用され得る本発明に従うコントロール核酸は、決定され得る標的核酸の領域を本質的に覆い、決定され得る前記標的核酸又は前記標的核酸の相補体の領域を本質的に覆う前記コントロール核酸の領域が、前記標的核酸又は前記標的核酸の相補鎖と本質的に平行相補性である、少なくとも８ヌクレオチドの少なくとも１つの隣接配列を含むことを特徴とする。前記方法において最も重要な領域は、実際に決定される標的核酸である、標的特異的プローブと実際に結合する標的核酸の領域である。従って、多くの場合において、この領域が内部コントロールによって覆われることは差し支えない。この領域が１５ヌクレオチドより短く、更に好ましくは１０ヌクレオチドより短い場合、コントロール核酸の関連領域は、標的核酸のプローブハイブリダイゼーション領域と本質的に平行相補性であることが好ましい。標的核酸のプローブハイブリダイゼーション領域が１５ヌクレオチドより長く、更に好ましくは１０ヌクレオチドより長い場合、コントロール核酸の関連領域は、標的核酸のプローブハイブリダイゼーション領域に対して完全に平行相補性であるか、又は当該領域に対して部分的に本質的に平行相補性であるか、そのいずれであってもよく、一方、他の部分は本質的に同一である。当該コントロール核酸とのハイブリダイゼーションのための、本質的に相補性の、好ましくは相補性のプローブを用いて、標的核酸とそのプローブとのハイブリダイゼーションを模倣するが、更に両ハイブリダイゼーション複合体を別々に決定せしめることも可能である。
【００２５】
増幅コントロールは、増幅過程をモニタリングすることを可能にする。典型的なＰＣＲアッセイにおける例を探す場合、このことは、プライマーハイブリダイゼーション段階、プライマーの伸長、増幅効率及び／又は更にプローブハイブリダイゼーション段階を含み得る。本発明に従う好ましい増幅コントロールが、増幅される標的核酸の領域を本質的に覆う領域に隣接する領域を含むことがあるのは、当該コントロールの増幅に使用される好ましいプライマーが、当該コントロールの配列に依存する標的の増幅のためのプライマーと、本質的に平行相補性又は本質的に同一、更に好ましくは平行相補性又は同一、のいずれかであることによる。従って、当該コントロール核酸の増幅物は、当該コントロールの隣接領域は含まないが、増幅される標的核酸の領域を本質的に覆う領域及び両増幅物の長さだけは本質的に同一である。
【００２６】
増幅され得る標的核酸領域を本質的に覆うコントロール核酸の領域は、上記標的核酸の一致する部分と本質的に平行相補性又は本質的に同一、そのいずれかである複数の部分から構築され得る。増幅され得る標的核酸の領域を覆うコントロール核酸の好ましい組み合わせを表１に列記する。
【表１】
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【００２７】
本発明に従う塩基配列のみが重要であり、バックボーンは、必ずしも天然糖−リン酸塩バックボーンである必要はない。従って、修飾されたバックボーン又は非天然バックボーン、例えばペプチド核酸（ＷＯ９２／２０７０２）を有する本発明に従うコントロールとして核酸を使用することも可能である。塩基類似体を含むコントロール核酸を用いる場合、これらの塩基が、可能な限り厳密に標的核酸のハイブリダイゼーション挙動を模倣するために、標的核酸配列の関連部位に含まれる相補天然塩基と類似の特性を有することに注意するべきである。また、増幅コントロール核酸としてコントロール核酸を使用する場合、コントロール核酸の性質が使用される増幅方法によるコントロール核酸の増幅を可能にするはずであることに注意すべきである。
【００２８】
本発明に従うコントロール核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡのコード鎖、あるいはそれらの相補鎖の配列に基づいて構築され得る。当該コントロールは、例えば化学合成され、そして適当なベクター、例えばプラスミド、ファージ核酸、又は細菌若しくはウイルスのゲノムにおいてクローン化され、あるいはそれらが構築される様に使用され得る。その様なコントロール核酸はｉｎ  ｖｉｔｒｏで増幅され、又はコントロールの核酸配列を含むベクターでトランスフェクションされた細菌において産生され得る。その様なコントロール核酸は、直接試験に使用されるか、あるいは例えばアーマード（ａｒｍｏｒｅｄ）ＲＮＡ（米国特許第５，６７７，１２４号）としてパッケージングされるか又はリポソーム内にパッケージングされ得る。
【００２９】
標的核酸は決定され得る核酸である。これは任意な起源のものでもよく、例えばウイロイド、ウイルス、細菌、又は細胞起源のものでもよい。それは溶液、例えば血液、血清、血漿又は尿から、懸濁液、固体上に固定化されるもの、細胞含有培地、細胞スメア、固定化された細胞、組織片又は固定化された生物から誘導され得る。好ましくは、決定され得る核酸は溶液中にある。決定され得る核酸は、更に例えば組換え、断片化、増幅及び／又はＲＮＡからのｃＤＮＡ形成によって、標的核酸に誘導される核酸であってもよい。
【００３０】
標的核酸は、様々な方法のうちの１つを用いて最初の試料を処理することによって利用可能な形態に至る。これは、例えばpHの変化（アルカリ性）、加熱、温度の同期変化（凍結／融解）、生理学的増殖条件の変化、洗浄剤、カオトロピック塩又は酵素（例えばプロテアーゼ又はリパーゼ）の使用を、単独で、又は組み合わせて含んで成る。本発明に従うコントロール核酸が、試料調製段階の前又は間に加えられる場合、これらのコントロール核酸はまた、その後の増幅及び／又はハイブリダイゼーション段階に加えて、試料調製のためのコントロールとして使用され得る。この目的のために、コントロール核酸は、標的核酸の性質に依存する、ＤＮＡ又はＲＮＡとして加えられ得る。それはまた、タンパク質又は他の細胞若しくはウイルス成分に付着している試料中にしばしば含まれる、標的核酸と同様にパッケージングされ得る。更に厳密に標的核酸を模倣するために、コントロール核酸は、例えばタンパク質コート内で、例えばアーマードＲＮＡの様にパッケージングされ得る。
【００３１】
本発明に従うコントロール核酸は、コントロールとして、好ましくは内部コントロールとして、ハイブリダイゼーション法、例えば分枝ＤＮＡ法又はリボソームＲＮＡの標的の決定において使用されることがあり、あるいはアレイハイブリダイゼーション法のためにも有用なことがある。
【００３２】
それらはまた、例えばコントロールとして、好ましくは内部コントロールとして、標的増幅法、例えばＴＭＡ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、及びＰＣＲにおいても有用である。好ましい方法はＰＣＲである。原理においては、例えば感染物質又は遺伝子状態を示唆する標的核酸は、プライマー配列が適当な反応条件下で特異的に結合し得る鋳型として使用される。使用する方法に依存して、プライマーは、例えばポリメラーゼを用いてヌクレオチドモノマーにより伸長され、又はすぐ近くでハイブリダイズされる更なるプライマーとライゲーションされ得る。増幅産物自体が直接又は間接的に鋳型として働く様な場合、標的核酸は指数的に増幅され得る。また、直鎖（ｌｉｎｅａｒ）増幅法も知られている。増幅産物は直接的に、例えばアガロースゲル電気泳動によって、又は少なくとも１つの配列特異的プローブによる更なるハイブリダイゼーション反応の実施によって検出され得る。
【００３３】
本発明に従うプライマーは、核酸鋳型とハイブリダイズされる場合に、好ましくは酵素によって、更に好ましくは例えば原核生物起源のポリメラーゼによって伸長され、又は修飾され得る分子である。ＰＣＲ熱安定性ポリメラーゼを用いる場合、例えばＴ．アクアチカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。伸長は、モノデオキシリボヌクレオシド三リン酸由来のモノヌクレオチド単位を、前記プライマーの一方の末端、好ましくは３′−ＯＨ末端に加える。プライマーの全体的な長さ及び塩基配列は、増幅反応の必要とされる特異性によって決定される。ＰＣＲを実施するのに好ましいプライマーの長さは、モノヌクレオチド及び／又は核酸類似体モノマーから選択される、サブユニットを含む１０〜４０の、最も好ましくは１５〜３０の塩基である。一般的に、その長さのプライマーは、他の増幅法にも有用である。１つ以上のプライマーが増幅に使用される場合、例えばＰＣＲを用い、又は１つの反応において複数の標的核酸を増幅する場合、好ましくは互いにハイブリダイズし得ないプライマーが使用されるのは、それらが５個以上の連続した相補塩基のストレッチを全く含まないためである。
【００３４】
ＰＣＲの場合、プライマーのハイブリダイゼーションの位置は典型的に、伸長産物のハイブリッドにおいて、それらの最初の３′末端の間に少なくとも１０、しかし１０００を超えない、好ましくは１００〜５００ヌクレオチドのストレッチがある様に選択される。
【００３５】
通常、プライマーが、反応条件下での増幅を可能にするために、標的核酸と十分に強く結合することが重要であるが、プライマーが好ましくは標的核酸とのみ結合し、そして試料中に含まれ得る他の核酸との結合が避けられるべきであることに注意せねばならない。従って、１０〜４０ヌクレオチドの長さ、更に好ましくは１５〜３５ヌクレオチドの長さのプライマーが好ましい。好ましくは、プライマーはオリゴヌクレオチドである。
【００３６】
プローブは、標的核酸又は増幅された標的核酸の決定に使用される分子である。それはまた、標的核酸又は増幅された標的核酸の配列を決定するために使用され得る。この目的のために、異なる配列を有するプローブが使用され得る。その様なプローブはまた、例えば標的核酸の異なる対立遺伝子の形態の決定又は標的の属及び種特異的決定のために使用され得る。プローブは好ましくはオリゴヌクレオチドであるが、類似体、例えばＰＮＡも使用され得る。配列特異的ハイブリダイゼーションを可能にするために、プローブは好ましくは１０以上のヌクレオチドであり、更に好ましくは１０〜４０ヌクレオチドを有する。標的核酸の検出を可能にするために、増幅物及びその結果としてのプローブ−ハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にするために、使用されるプローブ及び／又はプライマーは、直接又は間接的に検出され得るが、あるいは標的核酸、増幅物及びその結果としてのプローブ−ハイブリダイゼーション複合体を、固相に固定化せしめる基とカップリングされ得る。
【００３７】
標識は、解析物の存在を決定するために検出可能な、又は検出可能とされ得る基として、当業者に広く知られている。周知の標識は蛍光標識、例えばフルオレセイン、電気化学発光標識、例えばルテニウム錯体、又は別の分子全体によって認識され得る部分、例えばハプテンによって産生される抗体によって認識され得るハプテン又は固定化され得る部分、例えばビオチン（固相、例えば管又はビーズにコーティングされるストレプトアビジン）である。標識は、例えばプローブ又はプライマーと結合されることがあり、あるいは標識ヌクレオチド三リン酸単位として増幅された核酸内に組み込まれることがある。更に標識は、他の手段によって、例えばその標識又は標識された挿入物の、二本鎖ＤＮＡ内への挿入によって、標的核酸又は増幅された標的核酸の検出を可能にするものが使用され得る。標識は、プライマー又はプローブ、又は組み込まれた前記プライマーを有する任意の産物の検出のために、決定され得る核酸又は標識ヌクレオチドを組み込んだ、増幅された標的核酸と、前記プライマー又はプローブによって形成されるハイブリッドを決定するために、そのいずれかで使用され得る。
【００３８】
固相は、反応混合物中で実質的に可溶性でない固体であり、例えばビーズ、ネット、管の内側表面、マイクロタイタープレート又は装置の試験槽の形態である。本質的に反応混合物を含むために使用されるが、固定化可能なプローブ、プライマー又はコントロール核酸をそれと結合させることが目的の場合は、それは前記プローブ、プライマー又はコントロール核酸の部分を認識し、そして結合することが可能な、その表面の試薬又はコーティングを含むことがある。
【００３９】
異質な検出方法を用いて、例えばプローブハイブリダイゼーションによる検出が、増幅段階後に行われる。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中で、又は固定化後に固相上で検出され得る。また、更なる分離又は洗浄段階無しに、反応混合物中で増幅された核酸を決定することを可能にする、同質の検出形式も知られている。この目的のために、複数のプローブハイブリダイゼーション形式が知られており、例えばＴａｑｍａｎ（米国特許第５２１００１５号及び第５４８７９７２号）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｔｅｒ（ＵＳ４，９９６，１４３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ（ＷＯ９５／１３３９９、米国特許第５，１１９，８０１号及び第５，３１２，７２８号）、Ｓｕｎｒｉｓｅ（米国特許第５，８６６，３３６号）、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（ＰＣＴ／ＧＢ９８／０３５２１）である。この様な方法は、増幅反応全体に及んで合成される増幅物のレベルを検出するために使用され得る。内部コントロール、例えば本発明に従う内部コントロールを、複数の標的の反応において、又は決定のために使用する場合、各標的及びコントロールのために測定されるシグナルは、互いに識別され得る。その理由のために、例えば、異なる標的及びコントロール又は反応混合物中でこれらの核酸から派生する増幅された核酸の同時の測定を可能にする、異なるプローブ又はプライマーと付着する異なる標識が使用され得る。
【００４０】
本発明に従うコントロール核酸は、化学的に合成され、クローン化され、当業界で知られている他の方法によって増幅され又は単離され得る核酸である。それは、好ましくはＲＮＡモノマー又はＤＮＡモノマーから作られるが、天然又は非天然塩基又は糖類似体も含み得る。平行相補性部分により、コントロール核酸は、標的核酸の配列と比較して異なる配列を有しており、そして多くの場合、その様な配列は既知の方法、例えばホスホラミダイト技術によって少なくとも１度合成的に生成されなければならない。本発明に従う、より長い核酸の生成を可能にするために、ねじれ型の所望のコントロール核酸の両方の鎖と重複する、短かい約４０〜１２０塩基長のオリゴヌクレオチドが合成され得る。これらのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後及びその後のライゲーション段階後に、当該核酸は、例えばベクター内にクローン化されることがあり、又は本発明に記載の様に直接的に使用され得る。クローン化された核酸は、例えば細菌において増幅され、そして標準的な方法（Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laborator, 2001, ISBN 0879695765）を用いて単離され得る。当該核酸がＲＮＡである場合、それは、例えば適当なプロモーター配列、例えばＴ７ファージプロモーター配列を含むベクターを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写によって合成され得る。当該核酸は、裸の核酸として使用されるか、又は粒子内に、例えばアーマードＲＮＡ（ＵＳ５，６７７，１２４）としてパッケージングされるか、又はウイロイド、ウイルス、細菌、若しくは細胞性生物に包埋され得る。
【００４１】
その様な核酸は、例えば、核酸のハイブリダイゼーション及び増幅反応を調節するのに有用である。それらは、試料中の阻害剤の存在に起因する偽のネガティブな結果を同定するために、又は定量アッセイにおけるスタンダードとして使用され得る。コントロールは、異なる容器（外部コントロール）における平行反応において処理されるか、又は同一の反応容器（内部コントロール）において標的として同時処理されることがあるが、後者の方が好ましい。
【００４２】
コントロールコンストラクトにおける本質的に平行相補性の部分は、１若しくは複数のプローブ結合部位及び／又は１若しくは複数のプライマー結合部位及び／又は１若しくは複数のプライマー／プローブ隣接領域を含むことがあり、最も伸長された場合では、対応する標的核酸の全配列を含むことがある。
【００４３】
このことは、本発明に従うコントロール核酸の処理の間に、標的核酸の処理に使用されるものと本質的に平行相補性の、好ましくは平行相補性のプライマー及び／又はプローブが使用され得ることを意味している。対応するプライマー及びプローブは、主にプローブ及びプライマーのハイブリダイゼーション効率並びに増幅効率を反映する、同一のＧＣ含量及びハイブリダイゼーション特性を示すが、これらの反応成分に関して競合が全く生じないのは、コントロール核酸と結合する当該プライマー及び／又はプローブが標的核酸と結合し得ず、逆もまた同様のためである。試料中の標的核酸が極めて低量の場合、その様な競合は、最終的に当該標的の不在又はプローブ結合の低下を招くことがある。従って、平行相補性プライマー及びプローブの使用は、アッセイの感度及び直線範囲を増大せしめることがある。しかしながら、標的核酸及びコントロール核酸の増幅のために同一のプライマーを用いることが、一組のプライマーで十分であり、そして標的特異的プライマーの直接的なコントロールで可能であるという利点を支えることに注意するべきである。
【００４４】
定性試験において、本発明のコントロール核酸は、好ましくは内部コントロール核酸として使用される、偽のネガティブな結果を同定するために使用され得る。極めて厳密に当該標的を模倣するこの能力に起因して、それは同一の方法で阻害剤にかけられる。特に、コントロール核酸が低濃度で反応に加えられるのは、この場合において、当該系が、阻害物質の発生に対して非常に高感度で反応するためである。その様なコントロール核酸も、スタンダードとして、好ましくは内部標準（Ｓｔａｎｄａｒｄ）として、例えば平行実験の結果の標準化のための手段として使用され得る。
【００４５】
定量試験において、本発明のコントロール核酸は、試料中に含まれる標的核酸の出発レベルを決定するための定量スタンダードとして使用され得る。既知の量のスタンダード核酸は、同一の反応条件のもと、標的核酸と一緒に、好ましくは内部定量スタンダードとして同時増幅される。増幅後、又は同種の検出の場合は増幅反応の間に、増幅された標的核酸の量及び増幅されたスタンダード核酸の量が決定される。反応においてそれらを用い、そしてスタンダード核酸の初回量を知ることにより、増幅前に試料中に存在していた標的核酸の初回量を計算することが可能である。定量のための複数の方法が当業界で知られており、例えば内部標準曲線、外部標準曲線及びＰａｙａｎモデル（例えば Haberhausen et al., Journal of Clinical Microbiology, Vol 36, p.628-633）を用いる概念を含む。注意すべきことは、合成された増幅物の絶対量を測定する必要がないことである。ほとんどの目的にとって、例えば、増幅物と標識プローブとのハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション複合体のシグナル強度の測定によって決定され得る相対量で十分である。
【００４６】
好ましい態様において、本発明のコントロール核酸は、米国特許第４，６８３，１９５号；第４，６８３，２０２号及び第４，９６５，１８８号、Saiki et al., Science 230 : 1350-1354 ; mullis et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51 : 263-273 ; 及びMullis and Faloona, 1987, Methods Enzymol. 155 : 335-350に記載の、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用される。しかしながら、本発明はいずれのハイブリダイゼーション又は増幅方法にも限定されない。
【００４７】
コントロール核酸は、反応のある段階で加えられ得る。通常、試料、例えば血液、血清、唾液又は組織試料の核酸は、当業界で知られている試料調製方法によって少なくとも部分的に精製される。使用される特定の方法は本発明の必須部分ではない。コントロール核酸は試料調製前に加えられることがあり、その結果当該コントロール核酸を、試料中に含まれる標的核酸と同時処理せしめる。このことは、後の増幅及び／又はプローブハイブリダイゼーション段階に加え、試料調製段階をモニタリングすることを可能にする。
【００４８】
あるいは、当該コントロール核酸は、標的核酸及びコントロール核酸の同時増幅のモニタリングを可能にするために、試料調製後に増幅反応混合物に加えられることもあるが、ハイブリダイゼーション段階をモニタリングするために、増幅後に、プローブハイブリダイゼーション段階時に加えられることもある。
【００４９】
好ましくは、コントロール核酸の増幅のために、標的核酸の増幅のために使用されるプライマーと本質的に同一又は本質的に平行相補性のいずれかであるプライマーが使用される。その様なコントロール特異的プライマーが、各標的特異的プライマーと本質的に同一の融解温度を有する場合、他の多重増幅反応と比較して、標的核酸及びコントロール核酸の増幅に適した、適切な温度サイクルプロファイルを見つけることは容易である。プローブがコントロール核酸又は増幅されたコントロール核酸の決定のために使用され、当該プローブが標的核酸又は増幅された標的核酸の決定に使用されるプローブと比較して本質的に平行相補性である場合にも同じことが適用される。
【００５０】
ＰＣＲを用いて標的核酸及びコントロール核酸を増幅する場合、反応混合物は典型的に、標的核酸に加えて、コントロール核酸、特異的プライマー及び同種の検出にとって任意のプローブ及び更なる反応成分、例えば適当な緩衝液（例えばトリシン）、二価の陽イオン、例えばＭｇ2+又はＭｎ2+、ポリメラーゼ、好ましくは熱安定性ポリメラーゼ、並びに４つのデオキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を含む。増幅反応は、当業界で知られているサーモサイクラー、例えばＰＥ９６００（又はＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００）（Perkin Elmer corp.）で、二本鎖核酸の変性、標的及びコントロールに対するプライマーの配列特異的ハイブリダイゼーション並びにポリメラーゼによるプライマーの伸長を可能にする温度サイクルプロファイルを用いて実施され得る。この温度サイクルは、決定にとって十分な量の増幅された核酸の合成を可能にするのに必要な程度繰り返され得る。通常３０〜４０サイクル行われる。
【００５１】
増幅された核酸が、増幅後のプローブハイブリダイゼーションによって決定される場合、増幅された核酸は、例えば熱又はアルカリによって変性され、中和され（必要に応じて）、プローブが加えられ、そして増幅された核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションが、適当な条件（温度及び化学的環境）のもとで行われる。その様な条件は、いくつかの匹敵する実験を行う専門家によって容易に決定され得る。特異的ハイブリダイゼーション複合体は、上述の標識及び他の検出手段を用いて検出され得る。
【００５２】
同種の検出形式の場合、増幅された核酸は、好ましくは増幅反応の間に、増幅反応混合物中で検出される。増幅された核酸が特異的プローブを用いて決定される場合、当該プローブは、増幅反応の開始前に、増幅反応に加えられる。更に、その様な決定形式は、管を増幅後に開く必要がなく、そしてコンタミネーションの危険性が最小化されるという利点を有する。増幅反応の間に増幅された核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションは、異なる方法を用いてモニタリングされ得る。適当な検出器がサーモサイクラー内に組み込まれている場合（すなわちＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００，Perkin Elmer）、反応の間に検出され得る蛍光標識を用いて、非常にしばしばプローブが標識される。特異的な増幅された核酸とハイブリダイズした、又はハイブリダイズする、プローブの検出のみを可能にするために、本明細書で引用される、複数の形式が確立されてきた。ＴａｑＭａｎ形式を用いて、ハイブリダイズされたプローブは、二次の、好ましくは当該プローブに結合した蛍光標識によって放射されるシグナルの測定を可能にする、当該プローブの５′末端からの一次消光標識を切断するポリメラーゼによって部分的に消化される。この蛍光シグナルは、反応において合成される、特異的な増幅された核酸の量に関する測定値として使用される。コントロール核酸に特異的なプローブが、好ましくは別の波長を有する光を放射する標的核酸に特異的なプローブ以外の別の蛍光標識を有する場合、両プローブのシグナルは、同一の反応管内で別々に測定され得る。２つのシグナルは、例えば試料中に存在する標的核酸の初回量を計算するために使用され得る。
【００５３】
本発明の好ましい対象は、標的核酸の定量方法であって、
ａ）前記標的核酸の領域及び、増幅され得る前記標的核酸領域又は前記標的核酸領域の相補体を本質的に覆う、既知の量のコントロール核酸を増幅し、それによって増幅され得る前記標的核酸領域又は前記標的核酸の相補体を本質的に覆う前記コントロール核酸の領域は、前記標的核酸又は前記標的核酸の相補鎖に対して平行相補性の、少なくとも８ヌクレオチドの少なくとも１つの隣接配列を含み、
ｂ）前記コントロール核酸から得られる増幅産物の量を示唆するシグナルを検出し、そして前記標的核酸から得られる増幅産物の量を示唆するシグナルを検出し、
ｃ）既知の量の前記コントロール核酸、段階ｂ）で決定された前記コントロール核酸から得られた増幅産物の量を示唆するシグナル、及び段階ｂ）で決定された前記標的核酸の量を示唆するシグナル、を用いて前記標的核酸の量を計算すること、
を含んで成る方法である。
【００５４】
本発明の更なる対象は、標的核酸領域の増幅のための反応におけるコントロール核酸であって、増幅され得る前記標的核酸の領域又は前記標的核酸領域の相補体を本質的に覆うコントロール核酸にあり、これによって増幅され得る標的核酸の領域又は前記標的核酸の相補体を本質的に覆う前記コントロール核酸の領域は、前記標的核酸又は前記標的核酸の相補鎖に対して本質的に平行相補性である、少なくとも８ヌクレオチドの少なくとも１つの隣接配列を含む。
【００５５】
本発明の更なる対象は、標的核酸及びコントロール核酸を含んで成り、標的核酸領域を検出するためのハイブリダイゼーション又は増幅反応混合物において存在する組成物であって、それによって前記コントロール核酸が、決定され得る前記標的核酸の領域又は前記標的核酸領域の相補体を本質的に覆い、決定され得る前記標的核酸の領域又は前記標的核酸の相補体が、前記標的核酸又は前記標的核酸の相補鎖に対して本質的に平行相補性である少なくとも８ヌクレオチドの少なくとも１つの隣接配列を含むことを特徴とする組成物にある。
【００５６】
本発明の更なる対象は、取扱説明書及び少なくともコントロール核酸を含む少なくとも１つの容器を含んで成る標的核酸の増幅のためのキットであって、それによって前記コントロール核酸が増幅され得る前記標的核酸の領域又は前記標的核酸領域の相補体を本質的に覆い、増幅され得る前記標的核酸の領域又は前記標的核酸の相補体を本質的に覆う前記コントロール核酸の領域が、前記標的核酸又は前記標的核酸の相補鎖に対して本質的に平行相補性である。少なくとも８ヌクレオチドの少なくとも１つの隣接配列を含むことを特徴とするキットにある。更に好ましいキットは、説明書及びコントロール核酸に加えて、他の反応成分、例えば標的又はコントロール特異的プローブが、標的又はコントロール特異的プライマー、反応緩衝液、ヌクレオチド三リン酸あるいは酵素、例えばポリメラーゼを含む。これらの成分は、当該キットの第一容器内に梱包され得るが、１又は複数の更なる容器内にも含まれ得る。更に好ましいのは、取扱説明書及び本発明に従う少なくとも１つのコントロール核酸を含むハイブリダイゼーション法を用いる標的核酸の検出に有用なキットである。
【００５７】
本発明の更なる対象は、標的核酸の増幅のための反応又は標的核酸領域の決定のためのハイブリダイゼーション反応におけるコントロールとしてのコントロール核酸の使用であって、それによって前記コントロール核酸が、増幅され、又はハイブリダイズされ得る前記標的核酸の領域又は前記標的核酸領域の相補体を本質的に覆い、増幅され、又はハイブリダイズされ得る前記標的核酸の領域又は前記標的核酸の相補体を本質的に覆う前記コントロール核酸の領域が前記標的核酸又は前記標的核酸の相補鎖と本質的に平行相補性である、少なくとも８ヌクレオチドの少なくとも１つの隣接配列を含むことを特徴とする前記使用に関する。
【００５８】
本発明は以下の例によって例示される：
例
例１
ＨＣＶ標的プローブ配列と平行相補性であるプローブ配列の設計
ＴａｑｍａｎアッセイにおけるＨＣＶ核酸の検出のために、ＨＣＶアンプリコン（配列番号１０）と結合する、以下のプローブが使用され得る。
ＳＴ６５０（配列番号３）：
5'(Cy5-) CGG TGT ACT CAC CG (FAMs) TTC CGC AGA CCA CTA TGG C-PO4-3'
Ｃｙ５：アルキルホスファチジルリンカー（Pharmacia Biotech Ｃｙ５−Ｎ−エチル−ホスホラミダイト）を用いる、ペンタメチン（Ｐｅｎｔａｍｅｔｈｉｎ）−ジ−インドカルボシアニンによるオリゴヌクレオチド誘導体化
ＦＡＭｓ：２−（アミノ−シクロヘキシル）プロパン−１，３−ジオール−リンカー（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ  ＣＸ−ＦＡＭ−ホスホラミダイト）を用いる、６−カルボキシ−フルオレセインによるオリゴヌクレオチド誘導体化
【００５９】
この適用に含まれる全てのＨＣＶ特異的配列が、ＨＣＶＩ型ゲノムの配列（ＮＣＢＩ，Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０５４２４９又はＡＪ０００００９）に由来する。
【００６０】
内部コントロール検出にとって最良のプローブは正確に標的プローブを模倣するが、当該標的プローブと識別可能である。標的プローブの平行相補配列、いわゆるＳＴ６５０ｐｃ（配列番号５）は、内部コントロールのプローブ自体としても使用され得る。ＳＴ６５０ｐｃは、標的プローブと同一のＧＣ含量、ＧＣ／ＡＴ配列、長さ、二次構造を有し、そしてその結果同一の融解温度を有する。更に、Ｇ及びＡがＣ及びＴによってそれぞれ置換されており、そして逆もまた同様であるので、それは標的プローブと識別可能である。ＳＴ２５３５（配列番号４）は、ＨＣＶの配列と関連しておらず、例えばＨＣＶの配列と本質的に同一又は本質的に平行相補性でない配列を含む。ＳＴ２５３についての結合配列を含む内部コントロールは、標的核酸決定反応を制御するために、プローブＳＴ２５３５と一緒に使用され得る。標的核酸配列と関連していない配列を含むプローブ及びコントロールは、しばしば従来技術において使用されている。それと対照的に、ＳＴ６５０ｐｃ（配列番号５）は、標的プローブを完全に模倣する性質を有している。
【００６１】
ＳＴ６５０ｐｃ（配列番号５）プローブは、ＳＴ６５０Ｐｃ結合配列を含む全ての内部コントロール又は定量スタンダードコンストラクトと共に使用され得る。
ＳＴ２５３５（配列番号４）：
5' (Cy5-) TGG ACT CAG TCC T(HEXs)T GGT CAT CTC ACC TTC T-PO4 3'
ＨＥＸｓ：２−（アミノ−シクロヘキシル）プロパン−１，３−ジオール−リンカー（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ  ＣＸ−ＨＥＸ−ホスホラミダイト）を用いる、ヘキサクロロ−６−カルボキシ−フルオレセインによるオリゴヌクレオチド誘導体化
ＳＴ６５０ｐｃ（配列番号５）：
5' (CY5-) GCC ACA TGA GTG GC(HEXs) AAG GCG TCT GGT GAT ACC G-PO4 3'
【００６２】
二次構造の予測は、ソフトウェアＭｆｏｌｄのバージョン３．０（著作権：1996 Dr.M.Zuker, M.Zuker, D.H.Mathews & D.H.Turner, Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction : A Practical Guide, In RNA Biochemistry and Biotechnology, J. Barciszewski & B.F.C.Clark, eds., NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, (1999) ）を用いて行った。図２で見られる様に、予測された二次構造は、標的プローブと平行相補性プローブとの間で同一である。
【００６３】
例２
ＨＣＶ標的プライマー配列と平行相補性であるプライマー配列の設計並びに標的プライマー及び平行相補性プライマーによって形成される、形成され得る二次構造の比較：
ＨＣＶ核酸の増幅のために、以下のプライマーが使用される。
ＳＴ２８０（配列番号６）：
5' GCA GAA AGC GTC TAG CCA TGG CGT TA 3'
ＳＴ７７８（配列番号７）：
5' GCA AGC ACC CTA TCA GGC AGT ACC ACA A 3'
これらの増幅プライマーの平行相補配列は、
ＳＴ２８０ｐｃ（配列番号８）：
5' CGT CTT TCG CAG ATC GGT ACC TCA AT 3'
ＳＴ７７８ｐｃ（配列番号９）：
5' CGT TCG TGG GAT AGT CCG TCA TGG TGT T 3'
である。
【００６４】
これらの設計された内部プライマーは、内部コントロールの増幅に使用される。内部コントロールの増幅が非競合的であるのは、標的及び内部コントロールが増幅のために異なるプライマーを使用するためである。それにもかかわらず、設計された平行相補性プライマーは、ＧＣ含量、ＧＣ／ＡＴ配列、長さ、二次構造及びそれらに起因する融解温度に関して、標的プライマーと非常に近い構造を有している。ＳＴ２８０ｐｃ及びＳＴ７７８ｐｃは、増幅プライマーとして、非競合的であり、そして適当なプライマー結合部位を含む全ての内部コントロール及び定量スタンダードコンストラクトに使用され得る。
【００６５】
Ｍｆｏｌｄのバージョン３．０で行われた二次構造の予測は、標的プライマーと平行相補性プライマーとの間で同一である（図３を参照のこと）。
【００６６】
例３
ＨＣＶ配列と平行相補性である、ＨＣＶの非競合的定性及び定量核酸試験のための内部コントロールの構築
二本鎖ＤＮＡフラグメントは、高度に保存された５′−ＵＴＲ領域を含むＨＣＶ  Ｉ型ゲノムの５′フラグメントと平行相補性である、６０〜１２０bpの長さを有する重複オリゴヌクレオチドを用いてクローン化された。合成され、そしてクローン化されたフラグメントは９４３bpの長さであり、そしてＲＮＡ発現ベクター（ＡＭＢＩＯＮ，Ａｕｓｔｉｎ，ＵＳＡ）のＢｇｌII／ＨｉｎｄIII 部位内にクローン化された。発現は、ＭＳ−２−コートタンパク質、ＭＳ−２パッケージングシグナル及び５′ＨＣＶフラグメントの平行相補配列の遺伝子を含むＲＮＡを含むアーマードＲＮＡ粒子をもたらす。このＲＮＡは標的と識別可能であるが、平行相補性のために、ＧＣ含量並びにＧ又はＣ及びＡ又はＴの配列が、主に二次構造に影響を及ぼす対応するＨＣＶフラグメントと同一である。このコンストラクトは、例２及び１でそれぞれ言及したプライマー及びプローブを用いる非競合的方法で、ＨＣＶ標的（配列番号１０）と一緒に同一の反応で同時増幅され、そして検出される。
【００６７】
ＱＳ（ｐｃ）ＨＣＶ（配列番号１１）のクローン化されたＢｇｌII／ＨｉｎｄIII フラグメントの配列
配列    新規：９４３bp
組成    ２０３  Ａ；２８７  Ｃ；２８２  Ｇ；１７１  Ｔ；０  それ以外
パーセンテージ  ２２％  Ａ；３０％  Ｃ；Ｇ  １８％  Ｔ；０％  それ以外
分子量（kDa）：ｓｓＤＮＡ：２９１．２４  ｄｓＤＮＡ：５８１．５
起源
【表２】
0003787101.tif 000003
ボールド体で印刷されたもの：増幅のためにプライマーＳＴ２８０ｐｃ及びＳＴ７７８ｐｃを使用する場合のアンプリコン（配列番号１２）
【００６８】
例４
一本鎖ＨＣＶ標的アンプリコンと、一本鎖内部コントロールアンプリコン、そして寄せ集めの内部コントロールアンプリコンＱＳＨＣＶ（配列番号１３）とによって形成される、形成され得る二次構造の比較
寄せ集めのコントロール核酸（配列番号１３）は、ＳＴ２８０及びＳＴ７７８プライマー結合部位、ＳＴ２５３５プローブ結合部位を有しており、そしてＨＣＶ標的アンプリコンと同一の長さのものであり、そして同一のＧＣ含量を有する。折りたたみは、Ｍｆｏｌｄのバージョン３．０で行った。図４を参照のこと。
【００６９】
ＨＣＶアンプリコン及び平行相補的ＱＳ（ｐｃ）ＨＣＶアンプリコンは、類似の二次構造を形成する性質を有する。これは、当業界の技術水準にある、寄せ集めの内部コントロール（ＱＳＨＣＶ）アンプリコン（配列番号１３）によって形成される構造と異なる。ＱＳ（ｐｃ）ＨＣＶアンプリコン（配列番号１２）がＨＣＶ標的アンプリコンの非常に近い模倣物であるので、ＱＳ（ｐｃ）ＨＣＶ（配列番号１１）は、標的の増幅を制御するためにより良い選択である。
【００７０】
例５
天然プライマー結合部位を有するＨＣＶ（ＩＣＳＪ６２０ＨＣＶ）の競合的、定性及び定量核酸試験のための内部コントロールのクローニング
例３に従い、プライマー結合部位の他に、ＨＣＶ  Ｉ型の５′ＵＴＲと平行相補性の合成３７５bp  ＤＮＡフラグメントがクローン化された。当該プライマー結合部位は、標的とコントロールとの間での競合的ＰＣＲを可能にする標的配列と同一である。両プライマー間の配列は、標的を模倣するために平行相補性である。当該プライマー間のＧＣ含量、長さ並びにＧ／Ｃ及びＡ／Ｔの配列が標的と同一であるので、このコンストラクトは標的アンプリコンと非常に近い。このコンストラクトは、例１で言及した標的増幅プライマー及び平行相補性プローブを用いて、競合的な方法でＨＣＶ標的と一緒の同一反応で同時増幅され、そして検出され得る。
【００７１】
ＩＣＳＪ６２０ＨＣＶ（配列番号１４）
配列    新規３７５bp；
組成    ７６  Ａ；１０４  Ｃ；１１７  Ｇ；７８  Ｔ；０  それ以外
パーセンテージ  ２０％  Ａ；２８％  Ｃ；３１％  Ｇ；２１％  Ｔ；０％  それ以外
分子量（kDa）：ｓｓＤＮＡ：１１６．０５  ｄｓＤＮＡ：２３１．２
起源
【表３】
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ボールド体で印刷されたもの：増幅のためにプライマーＳＴ２８０及びＳＴ７７８を使用する場合のアンプリコン（配列番号１５）
【００７２】
例６
ＨＣＶ  １ｂ野生型、ＱＳＨＣＶ及びＱＳ（ｐｃ）ＨＣＶ由来のアニーリング曲線の比較
ＨＣＶ−１ｂ野生型、ＱＳＨＣＶ及びＱＳ（ｐｃ）ＨＣＶの関連フラグメントが増幅され、そして次に増幅産物が、アンプリコンの折りたたみ動態を調べるための挿入剤として、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎを用いるアニーリング実験において比較された。
1000IU      比較可能な濃度のHCV-1b RNA，QSHCV又はQS(pc)HCV (IU：国際単位，WHO-標準）
5％      DMSO
5.64％      グリセロール
50mM      トリシン（pH＝8.3）
100mM      KOAc（pH＝7.5）
300μM     dNTP（Ａ，Ｃ，Ｇ）
50μM     dTTP
500μM     dUTP
20pmol    NTQ21-46-A（アプタマー、配列：CGA TCA TCT CAG AAC ATT CTT AG            C GTT TTG TTC TTG TGT ATG ATC G-PO4）
40Ｕ      ZO5ポリメラーゼ
10Ｕ      UNG（ウラシル-N-グリコシラーゼ）
3mM      Mn (Ac)2
12μl     Sybr-Green（1：300希釈、Molecular Probes, Leiden Netherlands            ; DMSO中で10000倍濃縮）
100μlまで DEPC-水処理したプライマー
ＨＣＶ−１ｂ及びＱＳＨＣＶの増幅のプライマー
15pmol    ST280
40pmol    ST778
ＱＳ（ｐｃ）ＨＣＶの増幅のプライマー
15pmol    ST280pc
40pmol    ST778pc
ポリメラーゼＺＯ５は米国特許第５，４５５，１７０号及び米国特許第５，６７４，７３８号に記載されている。
増幅サイクル：
（50℃    240s
59℃    1800s）１ｘ
（95℃    15s
58℃    25s）  ５ｘ
（91℃    15s
58℃    25s）  55ｘ
アニーリング曲線
９０℃から開始して７０℃まで冷却する０．５℃の段階。
各段階２０秒。
【００７３】
増幅及びアニーリング曲線（Ｓｙｂｒ−Ｇｒｅｅｎの相互作用によって検出される）は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００（Perkin Elmer Corp.）で行った。
【００７４】
アニーリング曲線の比較（図５を参照のこと）
当該アッセイにおける基準はＨＣＶ−１ｂアンプリコンのアニーリング曲線である。当業界で使用される内部コントロールコンストラクトＱＳＨＣＶはより高い融解温度を示し、一方、平行相補性コントロール配列ＱＳ（ｐｃ）ＨＣＶは、ほぼ完全にＨＣＶ−１ｂアンプリコンのアニーリング曲線と適合している。
【００７５】
【配列表】
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0003787101.tif 000006
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0003787101.tif 000009
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0003787101.tif 000011
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヌクレオチド配列及びその平行相補配列並びに類似の二次構造を形成するそれらの能力の一例を示す（ＱＳ：定性又は定量アッセイにおいて使用され得るコントロール核酸）。
【図２】図２は、プローブＳＴ６５０（ＨＣＶ特異的プローブ）、ＳＴ６５０ｐｃ（ＳＴ６５０と平行相補的）及びＳＴ２５３５（非関連配列）についての、Ｍｆｏｌｄのバージョン３．０（著作権：1996 Dr.M.Zuker, M.Zuker, D.H.Mathews & D.H.Turner, Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction : A Practical Guide, In RNA Biochemistry and Biotechnology, J. Barciszewski & B.F.C.Clark, eds., NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, (1999)）で行われた二次構造の予測を示す。
【図３】図３は、プライマーＳＴ２８０（ＨＣＶ特異的）、ＳＴ２８０ｐｃ（ＳＴ２８０と平行相補的）、ＳＴ７７８（ＨＣＶ特異的）及びＳＴ７７８ｐｃ（ＳＴ７７８と平行相補的）についての、Ｍｆｏｌｄのバージョン３．０で行った二次構造の予測を示す。
【図４】図４は、ＨＣＶアンプリコン、ＱＳ（ｐｃ）ＨＣＶアンプリコン（ＨＣＶアンプリコンと平行相補的）及びＱＳＨＣＶアンプリコン（寄せ集めのヌクレオチド配列、ＳＴ２５３５プローブ結合配列、ＳＴ２８０及びＳＴ７７８プライマー結合部位を含み、そしてＨＣＶアンプリコンと同一の長さであるコントロールアンプリコン）についての、Ｍｆｏｌｄのバージョン３．０で行った二次構造の予測を示す。
【図５】図５は、ＨＣＶ−１ｂ増幅物と比較して、異なる内部スタンダードＱＳＨＣＶ増幅物（配列番号１４）及びＱＳ（ｐｃ）ＨＣＶ増幅物（配列番号１３）に由来する増幅された核酸のアニーリング曲線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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