(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
無毒化豚丹毒菌ＹＳ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４６６）の表面抗原をコードする遺伝子ＳｐａＡ．１の一部を取り除きマイコプラズマ・ハイオニューモニエのＰ９７アドヘジン遺伝子の一部を挿入した配列表１に示された塩基配列を染色体上に有し、菌体表面にマイコプラズマ・ハイオニューモニエの付着蛋白であるＰ９７アドヘジンの一部を発現することを特徴とする豚丹毒菌ＹＳ−１９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３１６）。
【請求項２】
請求項１に記載の豚丹毒菌ＹＳ−１９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３１６）の菌体を非ヒト動物に投与することを特徴とする非ヒト動物の免疫化方法。
【請求項３】
請求項１に記載の豚丹毒菌ＹＳ−１９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３１６）の菌体を非ヒト動物の鼻腔内に投与して粘膜免疫を誘導することを特徴とする、非ヒト動物の免疫化方法。
【請求項４】
請求項２または３のいずれか１項に記載の豚丹毒菌ＹＳ−１９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３１６）の菌体が生菌体であることを特徴とする、非ヒト動物の免疫化方法。
【請求項５】
請求項２乃至４のいずれか１項に記載の非ヒト動物が豚であることを特徴とする、豚の免疫化方法。
【請求項６】
無毒化豚丹毒菌ＹＳ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４６６）の表面抗原をコードする遺伝子ＳｐａＡ．１の一部を取り除きマイコプラズマ・ハイオニューモニエのＰ９７アドヘジン遺伝子の一部を挿入した配列表１に示された塩基配列をもつことを特徴とする、遺伝子カセット。
【請求項７】
無毒化豚丹毒菌ＹＳ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４６６）の表面抗原をコードする遺伝子ＳｐａＡ．１の一部を取り除きマイコプラズマ・ハイオニューモニエのＰ９７アドヘジン遺伝子の一部を挿入した配列表１に示された塩基配列から発現されることを特徴とする、蛋白。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、無毒化された豚丹毒菌の菌体表面にマイコプラズマ・ハイオニューモニエの付着に関わる蛋白Ｐ９７アドヘジンの一部を発現する豚丹毒菌変異株の作出および該菌株を用いて非ヒト動物を免疫化する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
豚丹毒は豚丹毒菌（エリシペロスリクス属菌）の感染によって起こる豚の疾病で、１００年以上も前から世界中の養豚地帯で発生している。エリシペロスリクス属菌は自然界に広く分布し、種々の哺乳類や鳥類からも分離される。特に、豚ではエリシペロスリクス・ルシオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)とエリシペロスリクス・トンジラーラム(Erysipelothrix tonsillarum)が原因となる豚丹毒が発生している。
【０００３】
豚丹毒の予防にはワクチンが有効で、日本では強毒菌をアクリフラビン加寒天培地で継代して弱毒化した菌（アクリフラビン耐性株：小金井株）で製造した生ワクチンが広く使用されている。このワクチンは菌体表面に存在する蛋白抗原に対して産生される抗体によりエリシペロスリクス属の種々の血清型に対する感染防御が成立することが知られている。
【０００４】
豚丹毒菌小金井株以外の弱毒化した生ワクチン候補株を Shimojiらが報告している(Infection and Immunity,1998,66,p3250-3254) 。詳細については、特許公報第 2992980号に示されているとおりであるが、豚丹毒生ワクチン候補株ＹＳ−１株(FERM P-16466)は、豚丹毒菌の菌体最外層に存在し、病原性に関与する莢膜多糖の発現に関わる遺伝子をトランスポゾン挿入手法を用いて不活性化したものであり、豚に対して無毒である。
【０００５】
豚丹毒菌の菌体表面に存在する感染防御抗原については、いくつかの報告があある。Timoney とGroschupらは豚丹毒菌の菌体表面に存在する 66-64キロダルトンの蛋白質に対する抗体が豚丹毒菌の強毒株からの攻撃を防御すること、さらにこの感染防御は豚丹毒菌の血清型に特異的なものではないことを報告した(Veterinary Microbiology 37,1993,p381-387 ) 。
【０００６】
MakinoらはTimoney とGroschupらの報告したものとは異なる表面感染防御抗原をクローニングし、surface protective antigen(SpaA)と名付けた(Microbial Pathogenesis 1998,25,p101-109) 。また、同様の遺伝子は Shimojiらによってもクローニングされている(Infection and Immunity 1999,67,p1646-1651) 。Shimoji らがクローニングした遺伝子は、Makinoらのものと多少異なることから、彼らはこれをspaA.1と名付けている。彼らはこの報告の中で、この遺伝子は 597個のアミノ酸からなるポリペプチドと特徴的なシグナル配列の29アミノ酸をコードしており、成熟蛋白の分子量は69,017ダルトンであること、さらにＣ末端領域に20個のアミノ酸からなる繰り返し配列が存在することを報告している。また、この蛋白の感染防御に関わる領域はＮ末端側の１／３の領域に存在することを報告している。
【０００７】
一方、豚のマイコプラズマ肺炎は養豚の盛んな国々で古くから多発する慢性肺炎で、その起因菌はマイコプラズマ・ハイオニューモニエ(Mycoplasma hyopneumoniae)である。この疾病は伝播が迅速で罹患率は高い。致死率は低いが飼料効率の低下が著しく、養豚経営上損害の大きい疾病の一つである。
【０００８】
豚マイコプラズマ肺炎を予防するため、わが国では数種類のワクチンが市販されている。これらは、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの菌体または培養上清を不活化したものにアジュバンドとして油性アジュバンドもしくはアルミニウムゲルアジュバンドを添加したもので、いずれも単一の病原体に対するワクチンすなわち単味ワクチンである。また、これらは不活化ワクチンであるため、生涯２回から３回のワクチン注射が推奨されており、さらにこれらのワクチンでは細胞性免疫や粘膜免疫の誘導は弱い。
【０００９】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエは、豚の下部気道粘膜や肺胞上皮細胞に定着し、増殖する。近年、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの感染初期に働く豚気管繊毛への付着に重要な菌体側の抗原蛋白が報告されている。Zhang らの報告(Infection and Immunity 1995,p1013-1019)によれば、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの菌体表面に存在する分子量97キロダルトンの蛋白で、 P97アドヘジンと名付けられた蛋白が豚気管繊毛への付着に大きな役割を果している。また、Hsu らの報告(Journal of Bacteriology 1997,p1317-1323) によれば、この P97アドヘジンには、二つの特徴的なアミノ酸の反復繰り返し配列があり、それぞれ反復繰り返し領域１、反復繰り返し領域２と呼ばれている。この二つの反復繰り返し領域のうち、反復繰り返し領域１に表現されるアミノ酸配列が豚気管繊毛細胞への付着に関わっている。また、Hsu らは、この反復繰り返し領域１に対する単クローン抗体は豚気管繊毛細胞への付着を阻害することも合わせて報告している(Infection and Immunity 1998,p4762-4766)。反復繰り返し領域２については、豚気管繊毛細胞への付着には関与しないとされているが、その領域の役割については明らかではない。
【００１０】
P97アドヘジン蛋白に対する単クーロン抗体が豚気管繊毛細胞に対するマイコプラズマ・ハイオニューモニエの付着を阻害することから P97アドヘジン蛋白をワクチン抗原とする試みがKingらにより実験的になされている(Vaccine 1997,p25-35) 。彼らが明らかにした付着関連蛋白は当初Mhp1と名付けられたが、これは P97アドヘジン蛋白と同様の蛋白である。彼らはクローニングした P97アドヘジン蛋白遺伝子を大腸菌で発現させ、得られた組換え蛋白を適当なアジュバンドと混合し実験的ワクチンとしている。しかし、このワクチンを免疫された豚の肺病変の程度は免疫していない豚と差が見られなかった。そして、彼らはその原因として、免疫された豚は P97アドヘジン蛋白に対する血液中の抗体は上昇しているが、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの付着部位である呼吸器の粘膜表面への抗体産生を誘導できないことが原因であると考察している。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
先に述べたように、豚丹毒菌は自然界に広く分布することから、豚は常に感染の危険にさらされている。そこでワクチンにより豚を免疫化することは、豚丹毒を予防する重要な手段である。また、豚マイコプラズマ肺炎は罹患率が高く、日齢に関係なく発症し、慢性経過をたどることから経済上の損失が大きく、ワクチンによりコントロールすべき疾病である。一方、養豚産業において豚丹毒菌以外にも重篤な疾病が存在し、豚をより健康的な状態で育てるためには非常に多くの種類のワクチン注射が必要である。所が、豚にとってはワクチン注射自体がストレスとなることも多く、このストレスを軽減するためにはワクチンの注射回数を減らすことが一つの手段となる。
【００１２】
従って、１回のワクチン投与で数種類の疾病に対して豚を免疫化できることは、豚のストレスを軽減でき、さらに生きた毒性の無い微生物を使用できることは、液性免疫だけではなく、細胞性免疫および粘膜免疫の誘導も期待できる有効な方法であるので、そのようなワクチンの開発が望まれていた。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、これらの課題を解決するために種々検討を行った結果、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの付着蛋白を菌体表面に発現する無毒化豚丹毒菌を作出するに至った。すなわち、無毒化豚丹毒菌ＹＳ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４６６）の表面抗原をコードする遺伝子ＳｐａＡ．１の一部を取り除きマイコプラズマ・ハイオニューモニエのＰ９７アドヘジン遺伝子の一部を挿入した配列表１に示された塩基配列を染色体上に有し、菌体表面にマイコプラズマ・ハイオニューモニエの付着蛋白であるＰ９７アドヘジンの一部を発現することを特徴とする豚丹毒菌ＹＳ−１９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３１６）である。
【００１４】
本発明の第二は、無毒化豚丹毒菌ＹＳ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４６６）の表面抗原をコードする遺伝子ＳｐａＡ．１の一部を取り除きマイコプラズマ・ハイオニューモニエのＰ９７アドヘジン遺伝子の一部を挿入した配列表１に示された塩基配列を染色体上に有し、菌体表面にマイコプラズマ・ハイオニューモニエの付着蛋白であるＰ９７アドヘジンの一部を発現する豚丹毒菌ＹＳ−１９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３１６）の菌体を非ヒト動物に投与することを特徴とする非ヒト動物の免疫化方法であって、菌体が生菌体であることが好ましい。
【００１５】
本発明の第三は、無毒化豚丹毒菌ＹＳ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４６６）の表面抗原をコードする遺伝子ＳｐａＡ．１の一部を取り除きマイコプラズマ・ハイオニューモニエのＰ９７アドヘジン遺伝子の一部を挿入した配列表１に示された塩基配列を染色体上に有し、菌体表面にマイコプラズマ・ハイオニューモニエの付着蛋白であるＰ９７アドヘジンの一部を発現する豚丹毒菌ＹＳ−１９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３１６）の菌体を非ヒト動物の鼻腔内に投与して粘膜免疫を誘導することを特徴とする非ヒト動物の免疫化方法であって、菌体が生菌体であることが好ましく、非ヒト動物が豚であることが特に好ましい。
【００１６】
本発明の第四は、無毒化豚丹毒菌ＹＳ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４６６）の表面抗原をコードする遺伝子ＳｐａＡ．１の一部を取り除きマイコプラズマ・ハイオニューモニエのＰ９７アドヘジン遺伝子の一部を挿入した配列表１に示された塩基配列をもつことを特徴とする、遺伝子カセットである。
【００１７】
本発明の第五は、無毒化豚丹毒菌ＹＳ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４６６）の表面抗原をコードする遺伝子ＳｐａＡ．１の一部を取り除きマイコプラズマ・ハイオニューモニエのＰ９７アドヘジン遺伝子の一部を挿入した配列表１に示された塩基配列から発現されることを特徴とする、蛋白である。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明にいう無毒化豚丹毒菌ＹＳ−１株とは、特許公報第 2992980号に記載のとおり、豚丹毒菌強毒株Fujisawa-SmRのトランスポゾン変異株に由来し、テトラサイクリン感受性を示す豚丹毒菌莢膜欠損変異株(FERM P-16466)、をいう。
【００２１】
豚丹毒菌SpaA.1遺伝子のクローニングは、Shimoji らがすでに報告（Infection and Immunity 1999,p1646-1651）しているとおり、豚丹毒菌藤沢株の染色体遺伝子をGalan とTimoney らの方法(Infection and Immunity 1990,58,p3116-3121) にしたがい抽出し、この染色体遺伝子を制限酵素Sau3AIで部分消化し、3-5 キロベースペアの遺伝子断片をシクロースグラジエント遠心法で分画し、得られた遺伝子断片をZap Express Vector（Stratagene社製: La Jolla,Calf.）の BamHIサイトに連結し、Gigapack III Gold packaging extract(Stratagene社製) を用いてインビトロパッケージングを行い、得られた組換えファージを大腸菌に感染させ、寒天平板上にファージプラークをつくらせた。このファージプラークを予めＩＰＴＧ(isopropylthiogalactoside)を染み込ませたニトロセルロース膜に転写し、実験的に豚丹毒強毒株を感染させた豚から得られた血清と反応させ、酵素抗体法により、反応するプラークを検出した。選択された組換えファージにクローニングされている豚丹毒の遺伝子を大腸菌内で発現させ、発現された蛋白を精製し、マウスに免疫した。免疫後、強毒豚丹毒菌藤沢株で攻撃した。この攻撃に対し、防御能を示した蛋白を発現する組換えファージクローンを最終的に選択した。さらに、選択したクローンをExAssistヘルパーファージ・大腸菌XLOLR システム（Stratagene社製）を用いてファージミドpERc6 を作製した。ファージミドpERc6 の挿入遺伝子配列をサイクルシークエンス法により決定し、この配列をジーンバンクに登録されている配列と比較したところ、牧野らの報告している豚丹毒菌の表面防御蛋白(Surface protective antigen:SpaA) と高いホモロジーを示した。しかし、牧野らの報告とは、特にＣ末端側の配列が異なることから、この遺伝子をspaA.1とした。ファージミドpERc6 をサブクローニングし、spaA.1遺伝子の完全長を含むファージミドpERc6.1 を作製した。
【００２２】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ付着関連遺伝子のクローニングは、Hsuらの報告(Journal of Bacteriology 1997, p1317-1323)しているマイコプラズマ・ハイオニューモニエP97アドヘジン蛋白の塩基配列を参考にして、P97アドヘジン遺伝子中に含まれる二つの反復繰り返し配列を含むようにプライマーを設計した。マイコプラズマ・ハイオニューモニエE-1株の染色体遺伝子を簡易的に抽出し、ポリメラーゼチェーン(PCR)の鋳型とした。マイコプラズマ・ハイオニューモニエE-1株は、Moriらの報告(National Insutitute Animal Health Q 1983, p111-116)により、豚に対する起病性が確認されている病原性株である。これら鋳型とプライマーを用いてＰＣＲによりP97アドヘジンの一部の遺伝子を増幅させた。得られた増幅産物をTAクローニングベクターpCR2.1(Invitrogen)にクローニングした。大腸菌ＴＯＰ10(Invitrogen)にトランスフォーメーションし、マイコプラズマの反復繰り返し配列領域１と２の遺伝子を含むプラスミドpCR2.1TA23を得た。クローニングされた遺伝子をER1+2とし、この配列をサイクルシークエンス法で決定した。この配列は図１に示したようにHsuらの報告した配列と反復繰り返し配列領域１で異なっており、アミノ酸に翻訳した場合の比較で、Ala(Thr)-Lys-Pro-Glu(Val)-Ala(Thr)を繰り返しの１単位と考えた場合Hsuらの報告したマイコプラズマ・ハイオニューモニエ232株では14回の繰り返し、マイコプラズマ・ハイオニューモニエE-1株では11回の繰り返しであった。反復繰り返し配列２では両株間では差は認められなかった。これらの明らかとなった配列を参考にＰＣＲ用プライマーを設計した。これは反復繰り返し配列領域１と２を増幅し、さらに増幅遺伝子の両端に制限酵素EcoRIサイトをもつようにした。得られた増幅産物を制限酵素EcoRIで処理し、予め制限酵素EcoRIで処理しておいた発現ベクターpBAD/gIII(Invitrogen)に連結し、プラスミドpBAD/gIIIER1+2を得た。次にこのプラスミドをもつ大腸菌をアラビノース存在下で培養し、蛋白の発現を誘導した。この大腸菌の発現蛋白をイムノブロティング法にて解析した。イムノブロティングには、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ232株P97アドヘジンに対する単クローン抗体(CHEMICON社製)を用いた。この抗体はマイコプラズマ・ハイオニューモニエの豚繊毛細胞に対する付着を阻害する活性をもつ。イムノブロティングの結果、36キロダルトン付近に反応を認め、これは遺伝子配列から推定される分子量と一致していた。
【００２３】
本発明にいう遺伝子カセットは、図２に示すように、プラスミドpERc6.1の制限酵素地図からSpaA.1遺伝子内に２箇所の制限酵素EcoRIサイトが存在していることが明らかであったため、プラスミドpERc6.1を制限酵素EcoRIで処理し、次にプラスミドpCR2.1TA23にクローニングされているER1+2遺伝子をＰＣＲ法で増幅した。用いたプライマーは制限酵素EcoRIサイトをもち、SpaA.1遺伝子とアミノ酸への翻訳の際の読みの枠が一致するように設計した。得られた増幅産物を制限酵素EcoRIで処理し、準備したプラスミドpERc6.1と連結させ、大腸菌にトランスフォーメーションし、プラスミドpERMh1を保有する大腸菌を得た。このプラスミドpERMh1はSpaA.1遺伝子のＮ末端側にプロモーター配列を含むため、通常使用されるＩＰＴＧなどの蛋白発現のために添加される薬剤の添加なしに、大腸菌で蛋白を発現した。大腸菌の増殖に伴って発現された蛋白をウェスターン・ブロティングで解析すると、分子量約69キロダルトンの蛋白にSpaA.1に対する単クローン抗体とマイコプラズマ・ハイオニューモニエのP97アドヘジンに対する単クローン抗体の両抗体の反応がみられた。このSpaA.1に対する単クローン抗体は受身感染防御能をもつ抗体であり、この結果から豚丹毒菌SpaA蛋白とマイコプラズマ・ハイオニューモニエP97アドヘジン蛋白の一部とが融合したキメラ蛋白の発現が確認でき、さらに合わせて、この蛋白の発現に関わる遺伝子カセットが作製できた。
【００２４】
無毒化豚丹毒菌ＹＳ−１株(FERM P-16466)の菌体表面にマイコプラズマ・ハイオニューモニエの付着蛋白の一部を発現する豚丹毒菌ＹＳ−１株（すなわち、豚丹毒菌無毒株ＹＳ−19株(FERM BP-7316)）の作出は、図３に示したように次の手順に従って行う。pERMh1のインサート全体を増幅するための制限酵素ClaIサイトをもつＰＣＲプライマーを５’側に設計し、そのプライマーとT7プライマーを用いてＰＣＲを行った。その増幅産物を制限酵素ClaIで処理し、予め制限酵素ClaIで処理しておいたストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)と大腸菌のシャトルベクターpGA14に連結した。このプラスミドをエレクトロポレーションにより豚丹毒菌ＹＳ−１株(FERM P-16466)に導入し、エリスロマイシン耐性を示すようになったＹＳ−５株を得た。ＰＣＲ法によりこの株は目的とする遺伝子を保有することが確認されたが、コロニーブロットによる解析では、この株はマイコプラズマ・ハイオニューモニエP97アドヘジン遺伝子を発現していないことが確認された。そこで、目的とする遺伝子が染色体上にインテグレートされた株を選択するため、ＹＳ−５株をエリスロマイシンを含まない培地で継代してＹＳ−19株(FERM BP-7316)を得た。この株の菌体表面に存在する蛋白について、SpaA1に対する単クローン抗体とP97アドヘジンに対する単クローン抗体との反応性について調べた成績を図４に示した。レーン１はＹＳ−１菌体、レーン２はＹＳ−19菌体、でそれぞれの単クローン抗体と反応し、ＹＳ−19株に特異的な反応を示す図中の矢印に示したSpaA-P97アドヘジンキメラ蛋白のバンドが検出された。すなわち、マイコプラズマ・ハイオニューモニエのアドヘジン蛋白を菌体表面に発現する豚丹毒菌無毒株ＹＳ−19株(FERM BP-7316)を作出することができたのである。
【００２５】
【実施例】
本発明の詳細を実施例に基づいて説明するが、本発明の趣旨はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２６】
（実施例１）
プラスミドpERMh1の発現するキメラ蛋白を適当な方法で精製した。この精製蛋白をウサギに免疫し、抗体を得た。この抗体の性状を豚丹毒菌菌体およびマイコプラズマ・ハイオニューモニエ菌体とウエスターン・ブロッティングで反応させた。その結果、この抗体は図５レーン１に示すように、豚丹毒菌のSpaA.1蛋白６９キロダルトンと反応を認め、また、レーン２に示すように、マイコプラズマ・ハイオニューモニエのP97アドヘジン蛋白との反応を認めた。
【００２７】
（実施例２）
ＹＳ−19株(FERM BP-7316)を１０8個約３０日齢の豚に鼻腔内投与した。経日的に採血および鼻腔スワブを採取して、抗体測定用の材料とした。抗体価の測定はELISA法によって行い、血清材料については、IgG抗体価を、鼻腔スワブについてはIgA抗体価を、それぞれ測定した。ELISA抗原にはプラスミドpER6.1により大腸菌にて発現したSpaA.1蛋白およびプラスミドpBAD/gIIIER1+2により大腸菌にて発現したP97アドヘジン蛋白の一部を用いた。図６にはＹＳ−19株(FERM BP-7316)免疫豚の豚丹毒菌およびマイコプラズマ・ハイオニューモニエに対する血清中のELISA抗体価の推移を示し、図７には該豚の鼻腔スワブ中のIgA抗体価を示した。血清中の抗体および鼻腔中の抗体共に、ＹＳ−19株(FERM BP-7316)接種２週間後から上昇し始め、注射後６週後をピークに徐々に低下した。これらの成績からＹＳ−19株(FERM BP-7316)は鼻腔内投与により、豚丹毒SpaA.1に対する抗体とマイコプラズマ・ハイオニューモニエP97アドヘジンに対する抗体を血清中および鼻腔粘膜上に誘導できる株であることが明らかとなった。
【００２８】
【発明の効果】
現在、家畜の疾病をコントロールするために、多くのワクチンが使用されている。ワクチンには大きく分けて弱毒化した微生物を用いる生ワクチンと死滅させた微生物を用いる不活化ワクチンがある。生ワクチンは液性免疫と細胞性免疫の両者を誘導することが可能であるが、生きた微生物を用いるため、安全性が問題となる。すなわち、接種された非ヒト動物の体内で、増殖しすぎることにより発症してしまったり、増殖した微生物が体外に排出され環境を汚染してしまったりという問題を抱える。さらに、これらの問題を解決しようと弱毒化を進めるとワクチンとしての効果が無くなる。一方、不活化ワクチンは液性免疫の誘導能に優れ、安全性も高い。また、複数の疾病に対する免疫を誘導させるための混合比も比較的容易である。しかし、最大の難点は細胞性免疫の誘導化が非常に低いことである。
【００２９】
また、近年、液性免疫と細胞性免疫という考え方以外に、全身性免疫と局所免疫という考え方が注目されている。従来のワクチンは全身性免疫を誘導することに主眼が置かれてきたが、疾病の種類によっては局所の免疫が重要な働きをしていることが明らかとなり、これを誘導する方法が多くの研究者により検討されている。この方法の一つに、生きた微生物を抗原の運び屋とする方法がある。これは無毒化はされているが、非ヒト動物の粘膜上皮から体内への侵入能を損なっていない微生物に、遺伝子操作により異種の微生物の抗原を発現させ、これを粘膜上に接種することにより、無毒化されている微生物自身とそれが運ぶ異種微生物抗原に対する局所免疫を誘導させようというものである。この試みはすでに鶏ではマレック病ウイルスを用いて行われている。しかし、豚の疾病に対するこのような微生物は開発されていない。
【００３０】
従って、今回発明者らが開発したマイコプラズマ・ハイニューモニエ抗原を発現する豚丹毒菌はそれを鼻腔内投与することにより、局所免疫と全身性免疫の両者を誘導でき、さらには２種類の疾病に対して効果がある次世代のワクチンにつながる新規の微生物である。
【００３１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】マイコプラズマ・ハイオニューモニエ２３２株とＥ−１株の反復繰り返し領域の遺伝子配列の比較
【図２】マイコプラズマ・ハイオニューモニエＰ９７アドヘジン蛋白発現豚丹毒菌ＹＳ−１９株の作製（１）
【図３】マイコプラズマ・ハイオニューモニエＰ９７アドヘジン蛋白発現豚丹毒菌ＹＳ−１９株の作製（２）
【図４】ＹＳ−１９株発現蛋白の解析
【図５】ＹＳ−１９株免疫血清と豚丹毒菌ＹＳ−１株およびマイコプラズマ・ハイオニューモニエＥ−１株との反応性
【図６】ＹＳ−１９株免疫豚の豚丹毒菌およびマイコプラズマ・ハイオニューモニエに対する血清中のＥＬＩＳＡ抗体価
【図７】ＹＳ−１９株免疫豚の豚丹毒菌およびマイコプラズマ・ハイオニューモニエに対する鼻腔スワブ中のＩｇＡ−ＥＬＩＳＡ抗体価
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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