(57)【要約】【課題】神経幹細胞（特に成人細胞段階）の増殖を効率的に行いたい。【解決手段】  ＦＧＦ−２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有する、神経幹細胞増殖用培地。好ましくは、プロテオグリカンがコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンである。更に好ましくは、プロテオグリカンがサケ鼻軟骨由来のプロテオグリカンである。【選択図】図２
2020075534.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦ−２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有する、神経幹細胞増殖用培地。
【請求項２】
プロテオグリカンがコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンである、請求項１に記載の培地。
【請求項３】
プロテオグリカンがサケ鼻軟骨由来のプロテオグリカンである、請求項１又は２に記載の培地。
【請求項４】
プロテオグリカンの含有量が、１μｇ／ｍｌ以上である、請求項１〜３いずれかに記載の培地。
【請求項５】
ＦＧＦ−２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有する培地を用いて、神経幹細胞を培養する工程を含む、神経幹細胞の増殖方法。
【請求項６】
プロテオグリカンがコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンである、請求項５に記載の神経幹細胞の増殖方法。
【請求項７】
プロテオグリカンがサケ鼻軟骨由来のプロテオグリカンである、請求項５又は６に記載の神経幹細胞の増殖方法。
【請求項８】
プロテオグリカンの培地中の含有量が、１μｇ／ｍｌ以上である、請求項５〜７いずれかに記載の神経幹細胞の増殖方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規神経幹細胞増殖用培地、その培地を用いた神経幹細胞増殖方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病や脊椎損傷などの神経疾患の治療に、ドナー不足さらには倫理的問題などから、神経幹細胞を移植することも検討されている（非特許文献１、特許文献１）。【０００３】
ｉＰＳ細胞の発見により、例えば、患者本人からｉＰＳ細胞を作って、そのｉＰＳ細胞から神経幹細胞を誘導することが可能になり、自分の細胞を治療に使用できる自家移植を行うことも期待されている。しかし、患者本人の細胞からｉＰＳ細胞を経て神経幹細胞を作成するのに、半年以上と長い期間を要すると考えられている。それに加えて、ｉＰＳ細胞は細胞の株ごとに安全性や分化の方向性が大きく異なると考えらえており、安全なｉＰＳ細胞であることを検証するにはさらに長い期間を要するのが現状である。更に、脊髄損傷においては、患者の症状が固定する前に神経幹細胞を移植しないと効果がないと考えられている。そのため、例えば、このように細胞移植が有効な期間が限られる疾患では、ｉＰＳ細胞の移植技術を用いても患者本人の細胞を治療に使うことは難しいと考えられている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｔａｋｅｓｈｉ  Ｍａｔｓｕｉら：ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ  ２０１２，３０：１１０９−１１１９頁
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２７８６４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在も、例えば、患者自身の細胞から短時間で容易に安全な神経幹細胞（神経系の未分化な組織幹細胞）を製造する手段、より好ましくは分化された細胞が含有されずに神経幹細胞を製造する手段、が求められている。【０００７】
そこで、本発明は、短期間で容易に神経幹細胞を製造する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明はかかる課題を解決するためになされたものであり、すなわち、本発明の１つは、「ＦＧＦ−２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有する、神経幹細胞増殖用培地」である。好ましくは、プロテオグリカンがコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンであり、より好ましくは、プロテオグリカンがサケ鼻軟骨由来のプロテオグリカンである。【０００９】
他の実施形態は、「ＦＧＦ−２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有する培地を用いて、神経幹細胞又を培養する工程を含む、神経幹細胞の増殖方法」である。
【発明の効果】
【００１０】
この培地を用いることにより、短期間で容易に神経幹細胞を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実験１にて行った実験手順の模式図である。
【図２】各投与群のニューロスフェアの形成数の測定結果である。縦軸は、ニューロスフェア（ＮＳ）の形成割合（％）を示すが、具体的にはコントロール群のＮＳの形成数を１００（％）とした場合のＮＳの形成割合（％）を示す。Ｄｕｎｎｅｔ法による統計解析を行い、＊は有意差を示し、ｐ＜０．０５である。
【図３】各投与群のニューロスフェアの観察結果である。
【図４】実験２にて行った実験手順の模式図である。
【図５】実験３にて行った実験手順の模式図である。
【図６】実験４の結果（スフェアの観察結果）である。図中の「―」は、２００μｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明にかかる培地について説明する。
【００１３】
（神経幹細胞）
神経幹細胞は、自己複製能と多分化能を併せもった、神経系の未分化な組織幹細胞、である。ヒトなどの哺乳類の胎生期の脳では、神経幹細胞が先ずは盛んに増殖することで自らの数を指数関数的に増やし、次いで、非対称分裂を生み出す。また、胎生後期や生後の脳では、アストロサイトやオリゴデンドロサイトを生み出すことが知られている。神経幹細胞は、中枢神経系を構成する主要な細胞型であるニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトの供給源となる細胞である。本発明では、好ましくはヒト、マウスなどの哺乳類由来の細胞を用いる。
【００１４】
（プロテオグリカン）
プロテオグリカンはコアタンパク質にコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸等のグリコサミノグリカン（以下ＧＡＧと表す。）と呼ばれる糖鎖が共有結合した糖タンパク質である。プロテオグリカンは、細胞外マトリックスの主要構成成分の一つとして皮膚や軟骨など体内に広く分布している。ＧＡＧ鎖は分岐を持たない長い直鎖構造を持つ。多数の硫酸基とカルボキシル基を持つため負に荷電しており、ＧＡＧ鎖はその電気的反発力のために延びた形状をとる。また、プロテオグリカンは、糖の持つ水親和性により、多量の水を保持することができる。プロテオグリカンに含まれる多数のＧＡＧ鎖群はスポンジのように水を柔軟に保持しながら、弾性や衝撃への耐性といった軟骨特有の機能を担っている。
【００１５】
プロテオグリカンのコアタンパク質はマトリックス中の様々な分子と結合する性質をもつ。軟骨プロテオグリカンの場合、Ｎ末端側にヒアルロン酸やリンクタンパク質との結合領域を持ち、これらの物質と結合すること、同一分子間で会合することもある。Ｃ末端にはレクチン様領域、ＥＧＦ様領域などを持ち様々な他の分子と結合する。この性質により、プロテオグリカンはそれぞれの組織にあった構造を築く。プロテオグリカンのうち、コンドロイチン硫酸型プロテオグリカンは、コンドロイチン硫酸がコアタンパク質に共有結合されているプロテオグリカンである。
【００１６】
サケ鼻軟骨由来のプロテオグリカンは、サケの鼻軟骨から抽出して得られたプロテオグリカンである。ここで、サケは、例えばサケ属（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）に属する魚であるが、好ましくは細胞増殖性（例えば、培養したい細胞をより効率的に培養すること）の観点で学名が「Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｋｅｔａ」のサケが選択される。また、本発明に係る培地に含まれるプロテオグリカンの含有量は、例えば細胞増殖性の観点で、下限は好ましくは１μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは２μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは５μｇ／ｍｌ以上、更に好ましくは１０μｇ／ｍｌ以上である。
本発明に係る培地に含まれるプロテオグリカンは、例えば公報（日本特許第６３１７０５３号公報）に記載の方法で作製される。
【００１７】
（ＦＧＦ−２）
ＦＧＦ−２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−２、繊維芽細胞成長因子）は、ｂＦＧＦとも呼ばれ、動物の神経組織、下垂体、副腎皮質、胎盤などから単離できる。ＦＧＦ−２は、神経分化、生存、再生を誘導すると共に、胚発生や分化を調節することが知られている。ＦＧＦ−２は、例えば、細胞増殖因子、血管新生因子、神経栄養因子として幅広い機能を有し、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を始めとする様々な細胞に対して、増殖活性を示す。
【００１８】
（ＥＧＦ）
ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、上皮増殖因子）は、上皮性細胞をはじめとする種々の細胞に対し増殖を促進する作用を持つポリペプチドである。ＥＧＦの作用は種特異性が少なく，上皮細胞，繊維芽細胞，肝細胞などさまざまな細胞に対し増殖効果を示す。生体においては細胞の増殖・分化に重要な役割を果たしている成長因子と考えられている。
【００１９】
（培地について）
本発明で用いる、ＦＧＦ−２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有されるために用いる基礎培地は、公知の培地を用いることができる。例えば、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、ビタミン）を含む培地（例えば、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ（例えば、以下実施例にて用いたＤＭＥＭ／ハムＦ−１２培地（ナカライテスク株式会社、０８４６０−９５））、Ｆｉｓｃｈｅｒ培地、α培地、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ培地、Ｌ−１５培地、ＮＣＴＣ培地、Ｆ−１２培地、ＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ培地）などである。また、必要に応じて、更なる添加物（抗生物質など）も含まれてもよい。
【００２０】
本発明で用いる培地には、好ましくは、血清は含まれない場合もある。血清が含まれない場合もあるのは、血清には未知の分化誘導剤が含まれており、本発明のニューロン割合が高い分化を阻害し得る可能性もあるためである。例えば、ＧＡＢＡ作動性ニューロン以外のニューロンを優先的に誘導したい場合には、血清の存在によりＧＡＢＡ作動性ニューロンの誘導割合が高くなる可能性があるため、血清は存在しないことが好ましいと考えられている。
【００２１】
本発明で用いる培地の物質の状態は特に制限がないが、培地調製の簡便さ（例えば浮遊培養を行うときには培地調製をよりしやすいと考えられること）などの観点で液体培地の方が好ましい。
【００２２】
（神経幹細胞の増殖方法）
本発明の培地を用いて神経幹細胞を増殖させるために培養する期間は特に限定しないが、培養させる細胞を播種してから少なくとも３日間以上、好ましくは５日間以上、更に好ましくは７日以上が好ましい。
【００２３】
この培養する温度は特に限定しないが、増殖の最適化を更に図る観点で、下限は好ましくは３６〜３７℃以上、より好ましくは３６℃以上、更に好ましくは３６．５℃以上、増殖の最適化を更に図る観点で、上限は好ましくは３８．５℃以下、より好ましくは３８℃以下、更に好ましくは３７．５℃以下、である。
【００２４】
この培養する環境のＣＯ２濃度は特に限定しないが、増殖の最適化を更に図る観点で、下限は好ましくは３．５％以上、より好ましくは４％以上、更に好ましくは４．５％以上、増殖の最適化を更に図る観点で、上限は好ましくは１０％以下、より好ましくは６％以下、更に好ましくは５．５％以下、である。
【００２５】
この培養の仕方（例えば、浮遊培養、接着培養）は特に限定しないが、培養の簡便さ（例えば、含有成分を均質に混合しやすいと考えられること）などの観点で浮遊培養の方が好ましい。
【実施例】
【００２６】
［実験１：ニューロスフェア（ＮＳ）の形成数の測定と、ＮＳの観察］
ＦＧＦ−２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有することに培養される細胞が神経幹細胞であることを確認等するために、ＮＳの形成数の測定とＮＳの形態の観察を行った。【００２７】
（神経幹細胞の培養の手順）
実験１で行った神経幹細胞の培養の手順（実験手順）を以下説明する。なお、図１には、この実験手順の模式図を示す。日本エスエルシー株式会社製のＩＣＲマウスを用いて妊娠１４日目のメスのマウスを作製した。そして、そのマウスの体内に存在するマウス胎児を取り出し、そのマウス胎児の大脳皮質から分散した細胞を準備した。この分散では、０．０５ｗ／ｖ％トリプシン（富士フイルム和光純薬株式会社の製品（０．２５ｗ／ｖ％トリプシン−１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有）（商品コード：２０１−１６９４５、２０９−１６９４１））をＰＢＳにて希釈したもの）を用いた。この分散した細胞のうち２４万個の細胞を用いて、以下の投与群（コントロール、培地１、培地２、培地３）を作製した。この細胞を、６万個／１サンプルずつ、分けて用いた。所定の液体培地が存在している６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、ＣＡＴ＃１４０６７５）に播種する。６ウェルプレートに、１ウェルあたり、所定の液体培地が２ｍｌ、この細胞が１万個存在するように、各ウェルに均等に播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、７日間培養した。７日間培養後、所定の位相差顕微鏡（倍率２０倍）により、各投与群の６ウェルプレート中の形成された細胞塊を観察した。この観察において、形成された細胞塊のうち半径５０μｍ以上のものをニューロスフェアと定めて、このニューロスフェアの数を測定した。なお、この７日間培養後の観察の比較対象として、各投与群の培養０日の観察も所定の位相差顕微鏡（倍率２０倍）を用いて同様に行った。【００２８】
各投与群（コントロール、培地１、培地２、培地３）の液体培地の組成は以下である。なお、どの投与群でも、基礎培地としてＤＭＥＭ／ハムＦ−１２（ナカライテスク株式会社、０８４６０−９５）を用いたが、以下では、５０ｍｌ中の各成分の組成を示す。
（コントロール）
・Ｎ２  ５００μｌ
・Ｂ２７  １ｍｌ
・Ｈｅｐａｒｉｎ  ５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
・抗生物質  １００μｌ
（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・ＥＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・プロテオグリカンの含有なし【００２９】
（培地１）
・Ｎ２  ５００μｌ
・Ｂ２７  １ｍｌ
・Ｈｅｐａｒｉｎ  ５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
・抗生物質  １００μｌ
（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・ＥＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・プロテオグリカン  最終濃度１０μｇ／ｍｌ【００３０】
（培地２）
・Ｎ２  ５００μｌ
・Ｂ２７  １ｍｌ
・Ｈｅｐａｒｉｎ  ５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
・抗生物質  １００μｌ
（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・ＥＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・プロテオグリカン  最終濃度１００μｇ／ｍｌ【００３１】
（培地３）
・Ｎ２  ５００μｌ
・Ｂ２７  １ｍｌ
・Ｈｅｐａｒｉｎ  ５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
・抗生物質  １００μｌ
（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・ＥＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・プロテオグリカン  最終濃度１０００μｇ／ｍｌ【００３２】
なお、この各投与群（コントロール、培地１、培地２、培地３）に含有されている成分は、以下のものを用いた。
・Ｎ２：Ｎ−２  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００Ｘ）
（ｇｉｂｃｏ：１７５０２−０４８）
・Ｂ２７：Ｂ−２７ＴＭ  Ｐｌｕｓ  ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔビタミンＡ不含（５０Ｘ）  （ｇｉｂｃｏ：Ａ３５８２８−０１）
・Ｈｅｐａｒｉｎ：  ヘパリンナトリウム（ナカライテスク（商品コード：１７５１３−９６、１７５１３−４１、１７５１３−５４）
・抗生物質：ペニシリン―ストレプトマイシン（ＷＡＫＯ：１６８−２３１９１）
・ｂＦＧＦ：ｂＦＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：１００−１８Ｂ）
・ＥＧＦ：ＥＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：３１５−０９）
・プロテオグリカン：プロテオグリカン、サケ鼻軟骨由来（富士フイルム和光純薬会社（商品コード：１６２−２２１３１、１６８−２２１３３））【００３３】
（各投与群のニューロスフェア（ＮＳ）の形成数の測定結果）
この測定結果を図２に示す。この図２で示しているのは、コントロール群のＮＳの形成数を１００（％）とした場合のＮＳの形成割合（％）である。培地１は１１７．３１７７５３３７６０１４％であり、培地２は１３４．６７７９５０９４０２１８％であり、培地３は１４９．３０５５０８５５３６２３％である。プロテオグリカンの含有量が増加することにより、ＮＳの形成数が増加することが確認された。培地２と培地３については、コントロールと比べ、統計学的に有意にＮＳの形成数が増加することが確認された。【００３４】
（ＮＳの観察結果）
この観察結果を図３に示す。７日間培養後の観察結果（図３の「培養７日」）の比較対象として、培養０日（図３の「培養０日」）の観察結果も挙げている。コントロールに比べ、培地１〜３では、多くのＮＳが確認された。なお、図３の矢印で示しているのは、一部のＮＳである。【００３５】
よって、ＦＧＦ−２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有することにより、より多くの神経幹細胞を増殖することが確認された。【００３６】
［実験２：デュアルルシフェラーゼアッセイ（Ｈｅｓ−１の転写活性の確認）］
神経幹細胞の未分化性の維持とアストロサイトへの分化を制御するタンパク質（転写因子）であるＨｅｓ−１の転写活性を確認することにより、上述の神経幹細胞（ＦＧＦ−２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有することに培養された細胞）が、未分化性の維持等がされているかどうかを確認した。【００３７】
このデュアルルシフェラーゼアッセイの手順を以下説明する。
まず、神経幹細胞を準備した。なお、図４には、この実験手順の模式図を示す。日本エスエルシー株式会社製のＩＣＲマウスを用いて妊娠１４日目のメスのマウスを作製した。そして、そのマウスの体内に存在するマウス胎児を取り出し、そのマウス胎児の大脳皮質から分散した細胞を準備した。この分散では、０．０５ｗ／ｖ％トリプシン（富士フイルム和光純薬株式会社の製品（０．２５ｗ／ｖ％  トリプシン−１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有）（商品コード：２０１−１６９４５、２０９−１６９４１））をＰＢＳにて希釈したもの）を用いた。この分散した細胞を、約６万個／１サンプルずつに分けて、以下の７つの投与群（コントロール、培地１、培地２、培地３、培地４、培地５、培地６）用のサンプルを作製した。【００３８】
このサンプルに、トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社、Ｎｅｏｎ（登録商標）  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、Ｈｅｓ−１ｃＤＮＡ及びレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子）を遺伝子導入した。Ｈｅｓ−１ｃＤＮＡ及びレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子）は、ａｄｄｇｅｎｅ社製の「ｐＨｅｓ１（２．５ｋ）−ｌｕｃ（Ｐｌａｓｍｉｄ  ＃４３８０６）」を用いた。この遺伝子導入後、各投与群（コントロール、培地１、培地２、培地３、培地４、培地５、培地６）の液体培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、１日間培養した。１日間培養後、各サンプルにルシフェラーゼ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、ＮｅｏｎＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）を添加して、検出システム（プロメガ株式会社、ＧｌｏＭａｘＴＭ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）を用いて、各サンプルのルシフェラーゼの発現を観察した。【００３９】
このデュアルルシフェラーゼアッセイで用いた各投与群（コントロール、培地１、培地２、培地３、培地４、培地５、培地６）の液体培地の組成は以下である。コントロールと培地１と培地２と培地３は、上述の実験１で用いた液体培地と同じ組成である。なお、どの投与群でも、基礎培地としてＤＭＥＭ／ハムＦ−１２（ナカライテスク株式会社、０８４６０−９５）を用いたが、以下では、５０ｍｌ中の各成分の組成を示す。なお、この培養において、コーニング社の「ＣｏｓｔａｒＴＭ  ２４  ウェル」を用いた。【００４０】
（コントロール）
・Ｎ２  ５００μｌ
・Ｂ２７  １ｍｌ
・Ｈｅｐａｒｉｎ  ５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
・抗生物質  １００μｌ
（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・ＥＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・プロテオグリカンの含有なし【００４１】
（培地１）
・Ｎ２  ５００μｌ
・Ｂ２７  １ｍｌ
・Ｈｅｐａｒｉｎ  ５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
・抗生物質  １００μｌ
（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・ＥＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・プロテオグリカン  最終濃度１０μｇ／ｍｌ【００４２】
（培地２）
・Ｎ２  ５００μｌ
・Ｂ２７  １ｍｌ
・Ｈｅｐａｒｉｎ  ５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
・抗生物質  １００μｌ
（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・ＥＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・プロテオグリカン  最終濃度１００μｇ／ｍｌ【００４３】
（培地３）
・Ｎ２  ５００μｌ
・Ｂ２７  １ｍｌ
・Ｈｅｐａｒｉｎ  ５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
・抗生物質  １００μｌ
（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・ＥＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・プロテオグリカン  最終濃度１０００μｇ／ｍｌ【００４４】
（培地４）
・Ｎ２  ５００μｌ
・Ｂ２７  １ｍｌ
・Ｈｅｐａｒｉｎ  ５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
・抗生物質  １００μｌ
（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
・ｂＦＧＦの含有なし
・ＥＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・プロテオグリカン  最終濃度１０００μｇ／ｍｌ【００４５】
（培地５）
・Ｎ２  ５００μｌ
・Ｂ２７  １ｍｌ
・Ｈｅｐａｒｉｎ  ５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
・抗生物質  １００μｌ
（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・ＥＧＦの含有なし
・プロテオグリカン  最終濃度１０００μｇ／ｍｌ【００４６】
（培地６）
・Ｎ２  ５００μｌ
・Ｂ２７  １ｍｌ
・Ｈｅｐａｒｉｎ  ５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
・抗生物質  １００μｌ
（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
・ｂＦＧＦ  １５０μｌ（最終濃度３０ｎｇ／ｍｌ）
・ＥＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・プロテオグリカンの含有なし【００４７】
なお、この各投与群（コントロール、培地１、培地２、培地３、培地４、培地５、培地６）に含有されている成分は、以下のものを用いた。
・Ｎ２：Ｎ−２  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００Ｘ）
（ｇｉｂｃｏ：１７５０２−０４８）
・Ｂ２７：Ｂ−２７ＴＭ  Ｐｌｕｓ  ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔビタミンＡ不含（５０Ｘ）
（ｇｉｂｃｏ：Ａ３５８２８−０１）
・Ｈｅｐａｒｉｎ：  ヘパリンナトリウム（ナカライテスク（商品コード：１７５１３−９６、１７５１３−４１、１７５１３−５４）
・抗生物質：ペニシリン―ストレプトマイシン（ＷＡＫＯ：１６８−２３１９１）
・ｂＦＧＦ：ｂＦＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：１００−１８Ｂ）
・ＥＧＦ：ＥＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：３１５−０９）
・プロテオグリカン：プロテオグリカン、サケ鼻軟骨由来（富士フイルム和光純薬会社（商品コード：１６２−２２１３１、１６８−２２１３３））【００４８】
各ウェルにおけるルシフェラーゼの発現量（Ｈｅｓ−１の転写活性）の観察結果を以下記載する。コントロール群の発現量を１００としたところ、培地１の群の発現量は１２３．８３、培地２の群の発現量は１３１．２４、培地３の群の発現量は１５９．５１、培地４の群の発現量は１１３．８５、培地５の群の発現量は１１９．６７、培地６の群の発現量は１３１．５５であった。ルシフェラーゼの発現量が高いほど、Ｈｅｓ−１の転写活性が高くなり、神経幹細胞の未分化性を維持している細胞と考えられる。培地６はポジティブコントロールとして神経幹細胞の未分化能を維持している細胞とするが、培地６（プロテオグリカンは含有しないがコントロールと比較してｂＦＧＦの含有量が３倍である培地）と比較して、培地１、培地２及び培地３の群（ＦＧＦ−２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有することに培養された細胞）が神経幹細胞の未分化性を維持していることが確認された。【００４９】
［実験３：ＮＳの形成数の測定］
プロテオグリカンの代わりに、ＧＡＧを含有した培地にて、この培地で培養された細胞がＮＳの形成ができるかどうかを確認した。この実験３において、ＧＡＧは、プロテオグリカンと異なり、コアタンパク質が結合されていない。【００５０】
この実験３の手順を以下説明する。なお、図５には、この実験手順の模式図を示す。日本エスエルシー株式会社製のＩＣＲマウスを用いて妊娠１４日目のメスのマウスを作製した。そして、そのマウスの体内に存在するマウス胎児を取り出し、そのマウス胎児の大脳皮質から分散した細胞を準備した。この分散では、０．０５ｗ／ｖ％トリプシン（富士フイルム和光純薬株式会社の製品（０．２５ｗ／ｖ％  トリプシン−１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有）（商品コード：２０１−１６９４５、２０９−１６９４１））をＰＢＳにて希釈したもの）を用いた。この分散した細胞のうち１８万個の細胞を用いて、以下の投与群（コントロール、培地２、培地７）を作製した。この細胞を、６万個／１サンプルずつ、分けて用いた。所定の液体培地が存在している６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、ＣＡＴ＃１４０６７５）に播種する。６ウェルプレートに、１ウェルあたり、所定の液体培地が２ｍｌ、この細胞が１万個存在するように、各ウェルに均等に播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、６日間培養した。６日間培養後、所定の位相差顕微鏡（倍率２０倍）により、各投与群の６ウェルプレート中の形成された細胞塊を観察した。この観察において、形成された細胞塊のうち半径５０μｍ以上のものをニューロスフェアと定めて、このニューロスフェアの数を測定した。なお、この６日間培養後の観察の比較対象として、各投与群の培養０日の観察も所定の位相差顕微鏡（倍率２０倍）を用いて同様に行った。【００５１】
各投与群（コントロール、培地２、培地７）の液体培地の組成は以下である。コントロールと培地２は、上述の実験１で用いた液体培地と同じ組成である。なお、どの投与群でも、基礎培地としてＤＭＥＭ／ハムＦ−１２（ナカライテスク株式会社、０８４６０−９５）を用いたが、以下では、５０ｍｌ中の各成分の組成を示す。
（コントロール）
・Ｎ２  ５００μｌ
・Ｂ２７  １ｍｌ
・Ｈｅｐａｒｉｎ  ５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
・抗生物質  １００μｌ
（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・ＥＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・プロテオグリカンの含有なし【００５２】
（培地２）
・Ｎ２  ５００μｌ
・Ｂ２７  １ｍｌ
・Ｈｅｐａｒｉｎ  ５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
・抗生物質  １００μｌ
（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・ＥＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・プロテオグリカン  最終濃度１００μｇ／ｍｌ【００５３】
（培地７）
・Ｎ２  ５００μｌ
・Ｂ２７  １ｍｌ
・Ｈｅｐａｒｉｎ  ５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
・抗生物質  １００μｌ
（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・ＥＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
・ＧＡＧ  最終濃度１００μｇ／ｍｌ【００５４】
なお、この各投与群（コントロール、培地２、培地７）に含有されている成分は、以下のものを用いた。
・Ｎ２：Ｎ−２  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００Ｘ）
（ｇｉｂｃｏ：１７５０２−０４８）
・Ｂ２７：Ｂ−２７ＴＭ  Ｐｌｕｓ  ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔビタミンＡ不含（５０Ｘ）
（ｇｉｂｃｏ：Ａ３５８２８−０１）
・Ｈｅｐａｒｉｎ：  ヘパリンナトリウム（ナカライテスク（商品コード：１７５１３−９６、１７５１３−４１、１７５１３−５４）
・抗生物質：ペニシリン―ストレプトマイシン（ＷＡＫＯ：１６８−２３１９１）
・ｂＦＧＦ：ｂＦＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：１００−１８Ｂ）
・ＥＧＦ：ＥＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：３１５−０９）
・プロテオグリカン：プロテオグリカン、サケ鼻軟骨由来（富士フイルム和光純薬会社（商品コード：１６２−２２１３１、１６８−２２１３３））、なおこのプロテオグリカンから常法によりＧＡＧのみを精製し作製したものが実験３で用いたＧＡＧである。【００５５】
ＮＳの形成数の測定結果を次に記載する。コントロールの群のＮＳの形成数を１００（％）とした場合のＮＳの形成割合（％）である。培地２の群は１１８．７％であり、培地７の群は５８．８％であった。プロテオグリカンの構造（コアタンパク質とＧＡＧ構造との結合構造）により、ＮＳの形成ができることが示唆された。【００５６】
［実験４：グリア細胞を生み出す可能性のある幹細胞の作製結果］
本発明で用いる、ＦＧＦ−２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有されるために用いる培地が、神経幹細胞だけでなく、グリア細胞を生み出す可能性のある幹細胞（神経幹細胞に比べ老化した細胞）を作製できる可能性について記載する。次のように実験を行った。【００５７】
まず、次のように、神経幹細胞を準備した。日本エスエルシー株式会社製のＩＣＲマウスを用いて妊娠１４日目のメスのマウスを作製した。そして、そのマウスの体内に存在するマウス胎児を取り出し、そのマウス胎児の大脳皮質から分散した細胞を準備した。この分散では、０．０５ｗ／ｖ％トリプシン（富士フイルム和光純薬株式会社の製品（０．２５ｗ／ｖ％  トリプシン−１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有）（商品コード：２０１−１６９４５、２０９−１６９４１））をＰＢＳにて希釈したもの）を用いた。この分散した細胞のうち１２万個の細胞を用いて、以下の投与群（コントロール、培地３）を作製した。この細胞を、６万個／１サンプルずつ、分けて用いた。所定の液体培地が存在している６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、ＣＡＴ＃１４０６７５）に播種した。６ウェルプレートに、１ウェルあたり、所定の液体培地が２ｍｌ、この細胞が１万個存在するように、各ウェルに均等に播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、７日間培養した。７日間培養後、できた細胞塊を再分散した。【００５８】
次に、この再分散した細胞（１２万個）を用いて、以下の投与群（コントロール、培地３）を作製した。この細胞を、６万個／１サンプルずつ、分けて用いた。所定の液体培地が存在している６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、ＣＡＴ＃１４０６７５）に播種した。６ウェルプレートに、１ウェルあたり、所定の液体培地が２ｍｌ、この細胞が１万個存在するように、各ウェルに均等に播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、７日間培養した。７日間培養後、できた細胞塊について、所定の位相差顕微鏡（倍率２０倍）を用いて、スフェア（二次スフェア）の形成数などを確認した。【００５９】
なお、コントロールと培地３は、上述の実験１で用いた液体培地と同じ組成である。【００６０】
実験結果を図６に示す。図６では、このスフェア（二次スフェア）の写真を示す。図６の矢印で示すのが二次スフェアである。培地３の群では、二次スフェア（グリア細胞を生み出す可能性のある幹細胞）の形成を確認できた。このスフェアの形成数であるが、コントロールの群のスフェアの形成数を１００％とした場合、培地３の群では１３２．７％であった。【００６１】
以上、本発明の実施の形態（実施例も含め）について、図面も参照して説明してきたが、本発明の具体的構成は、これに限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、設計変更等があっても、本発明に含まれるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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