(57)【要約】  炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αやＩＬ−６の産生を抑制し、これら炎症性サイトカインの過剰産生に起因するリウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、２型糖尿病などの炎症性疾患に有効な医薬品、及び健康食品等の飲食物としの応用が可能なトマト抽出物を有効成分とする炎症性サイトカイン産生抑制剤であり、分子量分画により分子量が１万以上の高分子画分の生トマト抽出物である炎症性サイトカイン産生抑制剤。
2020017489.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トマト抽出物を有効成分とする炎症性サイトカイン産生抑制剤。
【請求項２】
炎症性サイトカインとしてインターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）又は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）である請求項１に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤。
【請求項３】
トマト抽出物が、生トマトの搾汁液の分子量分画による分子量１万以上の画分である請求項１又は２に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤。
【請求項４】
請求項１ないし３に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤を含有することを特徴とする医薬品又は飲食品。
【請求項５】
経口投与或いは経口的摂取の形態にある請求項４に記載の医薬品又は飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はトマト抽出物を有効成分とする炎症性サイトカイン産生抑制剤、及び炎症性サイトカイン産生抑制飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症性サイトカインとは、リンパ球やマクロファージなどから産生され、細菌やウイルス感染、腫瘍、組織損傷に伴う炎症反応に関与する物質である。例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）などの炎症性サイトカインは、病原菌の侵入に対して免疫機能を賦活化させるなど、本来的には合目的的な機能を有しているが、何らかの原因により過剰に産生され続けるとリウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、２型糖尿病、肥満症（特に、インスリン抵抗性）など様々な疾病を引き起こすことが知られている。
さらには、神経炎症の観点から、うつ病などを引き起こすことが知られている。【０００３】
そのために、このような病態において、ＴＮＦ−αなどのこれら炎症性サイトカインの産生を抑制する薬剤の開発が検討されており、例えば、イブプロフェンやインドメタシン等の既存の抗炎症剤のほか、これまでに種々の化学物質等が提案されている（例えば、特許文献１〜３）。しかしながら、これらの疾病は慢性的な経過をたどることが多く、治療は長期化することから、副作用がなく安全な化合物が特に求められている現状下では、いまだ有効なものは登場してきていない。
かかる観点から、有機化合物に限らず、安全性の確保を主体として、果実の果汁及び／又は抽出物、或いは鉄結合性の糖タンパク質であるラクトフェリンを有効成分とする炎症性サイトカイン産生抑制剤の提案（特許文献４、５）などもなされている。【０００４】
本発明者らは、より有効であり、且つ、経口投与した場合でも安全である炎症性サイトカイン産生抑制剤の検索を目的として、日常的に安全に摂食されている野菜の抽出物についてその作用を検討してきたなかで、トマトの抽出成分に優れた炎症性サイトカインの産生抑制作用があることを見出し、かかるトマト抽出物が、炎症性サイトカインのなかでも特にＩＬ−６、ＴＮＦ−αの産生を有意に抑制することを確認し、本願発明を完成させるに至った。【０００５】
ところで、トマト抽出物についてはこれまでに抗アレルギー剤として提案がなされている（特許文献６）。
当該特許文献が提案する抗アレルギー剤は、実際的なアレルギー疾患の発症メカニズムに基づく、肥満細胞からのヒスタミンやロイコトリエンなどのケミカルメディエーター遊離抑制作用による抗アレルギー剤としての提案であり、本発明の炎症性サイトカインの産生抑制を目的とするものではない。【０００６】
その点からみれば、トマト抽出物には、種々の薬理活性が期待できるものであり、本発明者らが検討してきた炎症性サイトカインの産生抑制作用の確認も、トマト抽出物の有効活用の一つとして、極めて特異的なものであるといえる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１５−１７４８５０号公報
【特許文献２】特開２０１４−１０１３２９号公報
【特許文献３】特開２００９−０１３１０６号公報
【特許文献４】特開２００５−０８９３０４号公報
【特許文献５】特開２００６−０６９９９５号公報
【特許文献６】特開２００２−０８０３８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明は、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αやＩＬ−６の産生を抑制し、これら炎症性サイトカインの過剰産生に起因するリウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、２型糖尿病などの炎症性疾患に有効な医薬品、及び健康食品等の飲食物としの応用が可能な、炎症性サイトカイン産生抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる課題を解決するための本発明は、基本的態様として、
（１）トマト抽出物を有効成分とする炎症性サイトカイン産生抑制剤；
（２）炎症性サイトカインとしてインターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、又は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）である上記（１）に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤；
（３）トマト抽出物が、生トマトの搾汁液の分子量分画による分子量１万以上の画分である上記（１）又は（２）に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤；
（４）上記（１）ないし（３）に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤を含有する、医薬品又は飲食品；
（５）経口投与或いは経口的摂取の形態にある上記（４）に記載の医薬品又は飲食品；
である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、経口的な投与、或いは摂取により安全性の高い炎症性サイトカインの産生抑制剤が提供される。
本発明が提供する炎症性サイトカインの産生抑制剤は、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、並びに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）などの炎症性サイトカインの過剰の産生を抑制することから、これらサイトカインの過剰産生に起因するリウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、更には、２型糖尿病、うつ病、肥満症など様々な疾病に対する有効な治療薬となり得るものであり、また、日常的に経口摂取することにより、日々の健康管理を有効に行える利点を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、試験例１の結果を示す図であり、３時間後の結果を示した。
【図２】図２は、試験例１の結果を示す図であり、６時間後の結果を示した。
【図３】図３は、試験例２の結果を示す図であり、３時間後の結果を示した。
【図４】図４は、試験例２の結果を示す図であり、６時間後の結果を示した。
【図５】図５は、試験例３の結果を示す図であり、３時間後の結果を示した。
【図６】図６は、試験例３の結果を示す図であり、６時間後の結果を示した。
【図７】図７は、比較例としての試験例４の結果を示す図であり、３時間後の結果を示した。
【図８】図８は、試験例５の結果を示す図であり、３時間後の結果を示した。
【図９】図９は、試験例５の結果を示す図であり、６時間後の結果を示した。
【図１０】図１０は、試験例６の結果を示す図であり、３時間後の結果を示した。
【図１１】図１１は、試験例６の結果を示す図であり、６時間後の結果を示した。
【図１２】図１２は、試験例７の結果を示す図であり、３時間後の結果を示した。
【図１３】図１３は、試験例７の結果を示す図であり、６時間後の結果を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
上記したように、本発明の基本的態様は、トマト抽出物を有効成分とする炎症性サイトカイン産生抑制剤である。
本発明が提供する炎症性サイトカイン産生抑制剤における有効成分であるトマト抽出物は、成熟した生トマトをホモジネートし、固形分を除去したいわゆる搾汁液から得られ抽出物である。
原料トマトの品種は特に限定されるものではなく、一般に市場に流通している生食用、加工用の品種のいずれであっても使用することが可能である。
【００１３】
搾汁の調製に当たっては、乾燥トマトの場合には、通常は、適切な緩衝液、例えば精製水、生理食塩水などと共にホモジネートするが、本発明にあっては水分を多く含む成熟した生トマトを使用することから、緩衝液を用いることなく、生トマトそれ自体をそのまますり潰し、例えば遠心分離による通常の方法により固形分を除去し、搾汁液を得る。
【００１４】
次いで、かかる搾汁液からトマト抽出物を得るのであるが、本発明にあっては、その抽出方法として、遠心式限外濾過フィルターを用いて、分子量１万以上の分画として抽出物を得るのがよい。
生トマトの搾汁には糖質が多く含まれていることから、分子量を基準として、１万以上の抽出物とするのがよい。
用いる遠心式限外濾過フィルターとしては、目的とする分子量分画に適応し得る種々のフィルターを挙げることができるが、例えば、Merck Millipore社のアミコンウルトラ（登録商標）シリーズを使用することができる。
【００１５】
かくして、生トマト抽出物として、分子量１万以上の抽出物を得ることができるが、得られた抽出物はそのまま使用することができる以外、溶媒を留去して濃縮液として、或いは乾燥物として使用することができる。
乾燥にあたっては、減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥等の通常の乾燥手段を採用することができるが、なかでも凍結乾燥により乾燥物とするのが好ましい。
【００１６】
本発明が提供する生トマト抽出物は、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α等の炎症性サイトカインの産生抑制に対して優れた作用を示し、炎症性サイトカインの産生抑制剤として有益なものである。
本発明の炎症性サイトカインの産生抑制剤の投与は、投与目的、疾患の種類、症状によって異なり、特に限定されるものではないが、剤型は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、液剤等にして直接投与したり、食品や飲水に混ぜて投与したりすることができ、経口的に投与することが望ましい。
また、これらの剤型は、従来から知られている通常の方法で製造することができ、本発明の効果を損なわない範囲で、必要に応じてデキストリン、乳糖、コーンスターチ、乳化剤、防腐剤、賦形剤、増量剤、甘味剤、香味剤、着色剤等の添加剤を配合することも可能である。
【００１７】
一方、本発明の炎症性サイトカイン産生抑制剤は、飲食品として使用することもでき、そのような飲食品としては、清涼飲料水、ジュース等の非アルコール飲料、アルコール飲料、ヨーグルト等の発酵飲料、錠菓（タブレット菓子）や飴等の固形菓子、ガムやグミ菓子糖のチュアブル菓子、並びに、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、蛋白等を含有する栄養補助食品等の形態を挙げることができる。
かかる飲食品には、機能的に特定保健用食品（いわゆる、「トクホ」）、栄養機能食品、及び機能性表示食品等が含まれる。
【００１８】
これらの剤及び飲食品は、炎症性サイトカインの産生抑制能を有するのであり、炎症性サイトカインの過剰産生により引き起こされるさまざまな病態の予防、治療、改善、再発防止に非常に有益なものとなり得るものである。
【００１９】
本発明の炎症性サイトカイン産生抑制剤については、その炎症性サイトカイン産生抑制能を発揮させるための投与量としては、投与目的、疾患の種類、症状によって異なり、特に限定されないが、生トマト抽出物として、一日当たり１〜５，０００ｍｇ、好ましくは５〜１，０００ｍｇ、さらに好ましくは、１０〜２００ｍｇ摂取できるよう配合量等を調整すれば良い。
なお、本発明の生トマト抽出物は、日常的に摂食されている成熟トマトの搾汁から得られるものであり、安全性が高いものであり、本発明において使用される量では毒性は問題にならない。
【実施例】
【００２０】
以下に、実施例及び試験例を示し、本発明についてより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。【００２１】
実施例１：生トマト抽出物の調製
成熟生トマト（鹿児島県において生産）１０３．９６ｇを裁断し、乳鉢ですり潰した。そのものを、４，０００×ｇ／１５分間の遠心分離を行い、液体部分として２７．５ｍＬを回収した。
液体部分２０ｍＬをAmicon Ultra-15（MWCO:10,000）の遠心式限外濾過フィルターを用いた遠心式限外濾過に供し、４，０００×ｇで遠心した。
遠心後、分子量１万以上の高分子画分および分子量１万以下の低分子画分を得、それぞれ凍結乾燥を行い、生トマト抽出物を得た。【００２２】
このようにして得られた生トマト抽出物は、糖質をメインとし、若干のタンパク質を含有するものであり、そのまま本発明の炎症性サイトカイン産生抑制剤として利用可能である。
本発明の生トマト抽出物は上記の方法により得られた分子量１万以上の分子量画分であるが、比較のため、得られた分子量１万以下の分子量画分も、以下の試験に供した。
なお、以下の試験では、得られた生トマト抽出物をＤＭＥＮ培地（ダルベッコ改変イーグル培地＋１０％ウシ血清＋０．１％抗生物質・抗菌薬）で１００μｇ／ｍＬの濃度に調整し、細胞に供した。【００２３】
試験例１：マウスマイクログリア細胞（ＭＧ６）での生トマト抽出物のＬＰＳ共存下におけるＴＮＦ−α  ｍＲＮＡ発現に及ぼす作用
以下に、具体的手法を記載する。
（１）マウスマイクログリア細胞株（ＭＧ６）を６-well plateに、１×１０５細胞／ｍＬを撒く。
（２）３日から４日後に、コントロール（ＤＭＥＮ培地、１ｍＬ／well）、ＬＰＳ（５ｎｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（５ｎｇ）＋生トマト高分子抽出物（１００μｇ）［液量は１ｍＬ］及び生トマト高分子抽出物（１００μｇ／ｍＬ）の４群の溶液を細胞に適用する。
（３）３時間後および６時間後に培地を抜き取り、０．３ｍＬのＲＬＴ溶液（RNeasy Mini kit, QIAGEN）（１％β−メルカプトエタノールを含む）をwellに加える。
（４）セルスクレーパーで細胞をこすり取る。
（５）細胞懸濁液に７０％エタノールを０．３ｍＬ加え、混和する。
（６）スピンカラム（RNeasy Mini kit, QIAGEN）に上記溶液を入れて、８，０００×ｇで１分間遠心する。
（７）スピンカラムに７００μＬのＲＷ１溶液（RNeasy Mini kit, QIAGEN）を入れて、８，０００×ｇで１分間遠心する。
（８）スピンカラムに５００μＬのＲＰＥ溶液（RNeasy Mini kit, QIAGEN）を入れて、８，０００×ｇで１分間遠心する。このステップを２回繰り返す。【００２４】
（９）スピンカラムを新しいチューブ（１．５ｍＬ）にセットし、５０μＬのRNase-free水を入れて、１分間静置し、１２，０００×ｇで１分間遠心する。このステップを２回繰り返す。
（１０）この水溶液の１１μＬを用いて、Versco cDNA Synthesis Kit（thermoscientific）により、ｃＤＮＡを作製する。
（１１）上記で得られたｃＤＮＡ溶液をRNase-free水で１０倍希釈する。
（１２）この希釈したｃＤＮＡ溶液を用いて、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡとＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの発現を、スタンダード法によるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で測定した。【００２５】
（１３）ＰＣＲには９６−wellプレートを用いた。
（１４）Wellには、水：８．５μＬ、ｃＤＮＡサンプル溶液：２．５μＬ、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ検出プライマーあるいはＴＮＦ−α  ｍＲＮＡ検出プライマー（forward＋reverse）：１．５μＬ、Sybergreen mater mix：１２．５μＬを加える。
（１５）ＰＣＲのサーマルサイクルの条件は、Hold、９４℃、１０分＋3 step ＰＣＲ（４０サイクル；９４℃、３０分＋５５℃、３０秒＋７２℃、３０秒）＋Hold、７２℃、１分とした。
（１６）各群のサンプルごとに、ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの値を求め、コントロールの平均値を１００％として、それぞれの値を％に換算した。
（１７）統計学的有意差検定は、分散分析後、Turkey-Kramer法を用いた。【００２６】
その結果を、図１及び２に示した。
図１は３時間後の結果であり、図２は６時間後の結果である。
図１に示した結果からも判明するように、本発明の生トマト抽出物は、３時間後の結果において、ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの発現を効果的に抑制していることが理解される。【００２７】
試験例２：マウスマイクログリア細胞（ＭＧ６）での生トマト抽出物のＬＰＳ共存下におけるＩＬ−１β  ｍＲＮＡ発現に及ぼす作用
以下に、具体的手法を記載するが、その手法は、上記試験例１に準ずるものである。
（１）マウスマイクログリア細胞株（ＭＧ６）を６-well plateに、１×１０５細胞／ｍＬを撒く。
（２）３日から４日後に、コントロール（ＤＭＥＮ培地、１ｍＬ／well）、ＬＰＳ（５ｎｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（５ｎｇ）＋生トマト高分子抽出物（１００μｇ）［液量は１ｍＬ］及び生トマト高分子抽出物（１００μｇ／ｍＬ）の４群の溶液を細胞に適用する。
（３）３時間後および６時間後に培地を抜き取り、０．３ｍＬのＲＬＴ溶液（RNeasy Mini kit, QIAGEN）（１％β−メルカプトエタノールを含む）をwellに加える。
（４）セルスクレーパーで細胞をこすり取る。
（５）細胞懸濁液に７０％エタノールを０．３ｍＬ加え、混和する。
（６）スピンカラム（RNeasy Mini kit, QIAGEN）に上記溶液を入れて、８，０００×ｇで１分間遠心する。
（７）スピンカラムに７００μＬのＲＷ１溶液（RNeasy Mini kit, QIAGEN）を入れて、８，０００×ｇで１分間遠心する。
（８）スピンカラムに５００μＬのＲＰＥ溶液（RNeasy Mini kit, QIAGEN）を入れて、８，０００×ｇで１分間遠心する。このステップを２回繰り返す。【００２８】
（９）スピンカラムを新しいチューブ（１．５ｍＬ）にセットし、５０μＬのRNase-free水を入れて、１分間静置し、１２，０００×ｇで１分間遠心する。このステップを２回繰り返す。
（１０）この水溶液の１１μＬを用いて、Versco cDNA Synthesis Kit（thermoscientific）により、ｃＤＮＡを作製する。
（１１）上記で得られたｃＤＮＡ溶液をRNase-free水で１０倍希釈する。
（１２）この希釈したｃＤＮＡ溶液を用いて、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡとＩＬ−１β  ｍＲＮＡの発現を、スタンダード法によるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で測定した。【００２９】
（１３）ＰＣＲには９６−wellプレートを用いた。
（１４）Wellには、水：８．５μＬ、ｃＤＮＡサンプル溶液：２．５μＬ、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ検出プライマーあるいはＩＬ−１β  ｍＲＮＡ検出プライマー（forward＋reverse）：１．５μＬ、Sybergreen mater mix：１２．５μＬを加える。
（１５）ＰＣＲのサーマルサイクルの条件は、Hold、９４℃、１０分＋3 step ＰＣＲ（４０サイクル；９４℃、３０分＋５５℃、３０秒＋７２℃、３０秒）＋Hold、７２℃、１分とした。
（１６）各群のサンプルごとに、ＩＬ−１β  ｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの値を求め、コントロールの平均値を１００％として、それぞれの値を％に換算した。
（１７）統計学的有意差検定は、分散分析後、Turkey-Kramer法を用いた。【００３０】
その結果を、図３及び４に示した。
図３は３時間後の結果であり、図４は６時間後の結果である。
図に示した結果からも判明するように、本発明の生トマト抽出物は、３時間後の結果において、ＩＬ−１β  ｍＲＮＡの発現を効果的に抑制していることが理解される。【００３１】
試験例３：マウスマイクログリア細胞（ＭＧ６）での生トマト抽出物のＬＰＳ共存下におけるＩＬ−６  ｍＲＮＡ発現に及ぼす作用
以下に、具体的手法を記載するが、その手法は、上記試験例１に準ずるものである。
（１）マウスマイクログリア細胞株（ＭＧ６）を６-well plateに、１×１０５細胞／ｍＬを撒く。
（２）３日から４日後に、コントロール（ＤＭＥＮ培地、１ｍＬ／well）、ＬＰＳ（５ｎｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（５ｎｇ）＋生トマト高分子抽出物（１００μｇ）［液量は１ｍＬ］及び生トマト高分子抽出物（１００μｇ／ｍＬ）の４群の溶液を細胞に適用する。
（３）３時間後および６時間後に培地を抜き取り、０．３ｍＬのＲＬＴ溶液（RNeasy Mini kit, QIAGEN）（１％β−メルカプトエタノールを含む）をwellに加える。
（４）セルスクレーパーで細胞をこすり取る。
（５）細胞懸濁液に７０％エタノールを０．３ｍＬ加え、混和する。
（６）スピンカラム（RNeasy Mini kit, QIAGEN）に上記溶液を入れて、８，０００×ｇで１分間遠心する。
（７）スピンカラムに７００μＬのＲＷ１溶液（RNeasy Mini kit, QIAGEN）を入れて、８，０００×ｇで１分間遠心する。
（８）スピンカラムに５００μＬのＲＰＥ溶液（RNeasy Mini kit, QIAGEN）を入れて、８，０００×ｇで１分間遠心する。このステップを２回繰り返す。【００３２】
（９）スピンカラムを新しいチューブ（１．５ｍＬ）にセットし、５０μＬのRNase-free水を入れて、１分間静置し、１２，０００×ｇで１分間遠心する。このステップを２回繰り返す。
（１０）この水溶液の１１μＬを用いて、Versco cDNA Synthesis Kit（thermoscientific）により、ｃＤＮＡを作製する。
（１１）上記で得られたｃＤＮＡ溶液をRNase-free水で１０倍希釈する。
（１２）この希釈したｃＤＮＡ溶液を用いて、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡとＩＬ−６  ｍＲＮＡの発現を、スタンダード法によるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で測定した。【００３３】
（１３）ＰＣＲには９６−wellプレートを用いた。
（１４）Wellには、水：８．５μＬ、ｃＤＮＡサンプル溶液：２．５μＬ、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ検出プライマーあるいはＩＬ−６  ｍＲＮＡ検出プライマー（forward＋reverse）：１．５μＬ、Sybergreen mater mix：１２．５μＬを加える。
（１５）ＰＣＲのサーマルサイクルの条件は、Hold、９４℃、１０分＋3 step ＰＣＲ（４０サイクル；９４℃、３０分＋５５℃、３０秒＋７２℃、３０秒）＋Hold、７２℃、１分とした。
（１６）各群のサンプルごとに、ＩＬ−６  ｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの値を求め、コントロールの平均値を１００％として、それぞれの値を％に換算した。
（１７）統計学的有意差検定は、分散分析後、Turkey-Kramer法を用いた。【００３４】
その結果を、図５及び６に示した。
図５は３時間後の結果であり、図６は６時間後の結果である。
図に示した結果からも判明するように、本発明の生トマト抽出物は、３時間後及び６時間後の結果において、ＩＬ−６  ｍＲＮＡの発現を効果的に抑制していることが理解される。【００３５】
試験例４：マウスマイクログリア細胞（ＭＧ６）での生トマト抽出物のＬＰＳ共存下におけるＴＮＦ−α  ｍＲＮＡ発現に及ぼす作用
比較のため、生トマト抽出物として低分子量（分子量１万以下）画分の炎症性サイトカインの産生抑制作用を検討した。
低分子量の生トマト抽出物として１００μｇ／ｍＬ用いて試験例１と同様の手法より検討した。
その結果を図７に示した。
図７に示した結果からも判明するように、低分子の生トマト抽出物には炎症性サイトカインの産生抑制効果は認められず、分子量として１万以上の高分子量画分の生トマト抽出物に炎症性サイトカインの産生抑制効果が認められることが判明した。【００３６】
試験例５：マウスマクロファージ（Ｒａｗ２６４）での生トマト抽出物のＬＰＳ共存下におけるＴＮＦ−α  ｍＲＮＡ発現に及ぼす作用
試験例１におけるマウスマイクログリア細胞株（ＭＧ６）に代えて、マウスマクロファージ細胞株（Ｒａｗ２６４）を用いて、同様の手法により検討した。
すなわち、以下の具体的手法により検討した。
（１）マウスマクロファージ細胞株（Ｒａｗ２６４）を６-well plateに、１×１０５細胞／ｍＬを撒く。
（２）３日から４日後に、コントロール（ＤＭＥＮ培地、１ｍＬ／well）、ＬＰＳ（５ｎｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（５ｎｇ）＋生トマト高分子抽出物（１００μｇ）［液量は１ｍＬ］及び生トマト高分子抽出物（１００μｇ／ｍＬ）の４群の溶液を細胞に適用する。
（３）３時間後および６時間後に培地を抜き取り、０．３ｍＬのＲＬＴ溶液（RNeasy Mini kit, QIAGEN）（１％β−メルカプトエタノールを含む）をwellに加える。
（４）セルスクレーパーで細胞をこすり取る。
（５）細胞懸濁液に７０％エタノールを０．３ｍＬ加え、混和する。
（６）スピンカラム（RNeasy Mini kit, QIAGEN）に上記溶液を入れて、８，０００×ｇで１分間遠心する。
（７）スピンカラムに７００μＬのＲＷ１溶液（RNeasy Mini kit, QIAGEN）を入れて、８，０００×ｇで１分間遠心する。
（８）スピンカラムに５００μＬのＲＰＥ溶液（RNeasy Mini kit, QIAGEN）を入れて、８，０００×ｇで１分間遠心する。このステップを２回繰り返す。【００３７】
（９）スピンカラムを新しいチューブ（１．５ｍＬ）にセットし、５０μＬのRNase-free水を入れて、１分間静置し、１２，０００×ｇで１分間遠心する。このステップを２回繰り返す。
（１０）この水溶液の１１μＬを用いて、Versco cDNA Synthesis Kit（thermoscientific）により、ｃＤＮＡを作製する。
（１１）上記で得られたｃＤＮＡ溶液をRNase-free水で１０倍希釈する。
（１２）この希釈したｃＤＮＡ溶液を用いて、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡとＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの発現を、スタンダード法によるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で測定した。【００３８】
（１３）ＰＣＲには９６−wellプレートを用いた。
（１４）Wellには、水：８．５μＬ、ｃＤＮＡサンプル溶液：２．５μＬ、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ検出プライマーあるいはＴＮＦ−α  ｍＲＮＡ検出プライマー（forward＋reverse）：１．５μＬ、Sybergreen mater mix：１２．５μＬを加える。
（１５）ＰＣＲのサーマルサイクルの条件は、Hold、９４℃、１０分＋3 step ＰＣＲ（４０サイクル；９４℃、３０分＋５５℃、３０秒＋７２℃、３０秒）＋Hold、７２℃、１分とした。
（１６）各群のサンプルごとに、ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの値を求め、コントロールの平均値を１００％として、それぞれの値を％に換算した。
（１７）統計学的有意差検定は、分散分析後、Turkey-Kramer法を用いた。【００３９】
その結果を、図８及び９に示した。
図８は３時間後の結果であり、図９は６時間後の結果である。
図９に示した結果からも判明するように、本発明の生トマト抽出物は、６時間後の結果において、ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの発現を効果的に抑制していることが理解される。【００４０】
試験例６：マウスマクロファージ（Ｒａｗ２６４）での生トマト抽出物のＬＰＳ共存下におけるＩＬ−１β  ｍＲＮＡ発現に及ぼす作用
試験例５の手法に順じ、検討した。
すなわち、
（１）マウスマクロファージ細胞株（Ｒａｗ２６４）を６-well plateに、１×１０５細胞／ｍＬを撒く。
（２）３日から４日後に、コントロール（ＤＭＥＮ培地、１ｍＬ／well）、ＬＰＳ（５ｎｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（５ｎｇ）＋生トマト高分子抽出物（１００μｇ）［液量は１ｍＬ］及び生トマト高分子抽出物（１００μｇ／ｍＬ）の４群の溶液を細胞に適用する。
（３）３時間後および６時間後に培地を抜き取り、０．３ｍＬのＲＬＴ溶液（RNeasy Mini kit, QIAGEN）（１％β−メルカプトエタノールを含む）をwellに加える。
（４）セルスクレーパーで細胞をこすり取る。
（５）細胞懸濁液に７０％エタノールを０．３ｍＬ加え、混和する。
（６）スピンカラム（RNeasy Mini kit, QIAGEN）に上記溶液を入れて、８，０００×ｇで１分間遠心する。
（７）スピンカラムに７００μＬのＲＷ１溶液（RNeasy Mini kit, QIAGEN）を入れて、８，０００×ｇで１分間遠心する。
（８）スピンカラムに５００μＬのＲＰＥ溶液（RNeasy Mini kit, QIAGEN）を入れて、８，０００×ｇで１分間遠心する。このステップを２回繰り返す。【００４１】
（９）スピンカラムを新しいチューブ（１．５ｍＬ）にセットし、５０μＬのRNase-free水を入れて、１分間静置し、１２，０００×ｇで１分間遠心する。このステップを２回繰り返す。
（１０）この水溶液の１１μＬを用いて、Versco cDNA Synthesis Kit（thermoscientific）により、ｃＤＮＡを作製する。
（１１）上記で得られたｃＤＮＡ溶液をRNase-free水で１０倍希釈する。
（１２）この希釈したｃＤＮＡ溶液を用いて、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡとＩＬ−１β  ｍＲＮＡの発現を、スタンダード法によるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で測定した。【００４２】
（１３）ＰＣＲには９６−wellプレートを用いた。
（１４）Wellには、水：８．５μＬ、ｃＤＮＡサンプル溶液：２．５μＬ、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ検出プライマーあるいはＩＬ−１β  ｍＲＮＡ検出プライマー（forward＋reverse）：１．５μＬ、Sybergreen mater mix：１２．５μＬを加える。
（１５）ＰＣＲのサーマルサイクルの条件は、Hold、９４℃、１０分＋3 step ＰＣＲ（４０サイクル；９４℃、３０分＋５５℃、３０秒＋７２℃、３０秒）＋Hold、７２℃、１分とした。
（１６）各群のサンプルごとに、ＩＬ−１β  ｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの値を求め、コントロールの平均値を１００％として、それぞれの値を％に換算した。
（１７）統計学的有意差検定は、分散分析後、Turkey-Kramer法を用いた。【００４３】
その結果を、図１０及び１１に示した。
図１０は３時間後の結果であり、図１１は６時間後の結果である。【００４４】
試験例７：マウスマクロファージ（Ｒａｗ２６４）での生トマト抽出物のＬＰＳ共存下におけるＩＬ−６  ｍＲＮＡ発現に及ぼす作用
試験例５及び６に順じ、マウスマクロファージ細胞株（Ｒａｗ２６４）を用いて、ＩＬ−６  ｍＲＮＡの発現に及ぼす作用を検討した。【００４５】
その結果を、図１２及び１３に示した。
図１２は３時間後の結果であり、図１３は６時間後の結果である。【００４６】
以上の試験例５ないし７の検討の結果から、本発明の生トマト抽出物は、特にマウスマクロファージ細胞株（Ｒａｗ２６４）で、ＬＳＰ刺激によるＴＮＦ−α  ｍＲＮＡ発現の上昇を有意に抑制していることが理解される。【００４７】
上記した各試験例の結果からもよく理解できるように、本発明の生トマト抽出物は、その分子量が１万以上の高分子量画分のものは、低分子量画分に比較して、良好に炎症性サイトカイン産生抑制効果が発揮されており、従って、本発明の高分子トマト抽出物に抗炎症作用があることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明により、経口的な投与、或いは摂取により安全性の高い炎症性サイトカインの産生抑制剤が提供される。
本発明が提供する炎症性サイトカインの産生抑制剤は、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、並びに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）などの炎症性サイトカインの過剰の産生を抑制することから、これらサイトカインの過剰産生に起因するリウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、２型糖尿病、肥満症（特に、インスリン抵抗性）、更にはうつ病など様々な疾病に対する有効な治療薬となり得るものであり、また、日常的に経口摂取することにより、日々の健康管理を有効に行える利点を有するものであり、その産業上の利用性は多大なものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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