(57)【要約】観察装置（１）は、照明光を容器（２）の外部から容器（２）の内部へ照射する照明光学系（６）と、容器（２）内の細胞からの信号光を集める対物レンズ（４）と、対物レンズ（４）によって集められた信号光を検出する検出光学系（８）と、複数の微小な反射要素（７ａが配列されたアレイを有し、照明光学系（６）との間に容器（２）を挟んで配置され、容器（２）を透過した照明光を反射する再帰性反射部材（７）とを備える。
2019163167.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
浮遊培養用の容器内の細胞を観察する観察装置であって、
照明光を前記容器の外部から該容器の内部へ照射する照明光学系と、
前記容器内の前記細胞からの信号光を集める対物レンズと、
該対物レンズによって集められた前記信号光を検出する検出光学系と、
複数の微小な反射要素が配列されたアレイを有し、前記照明光学系との間に前記容器を挟んで配置され、前記容器を透過した前記照明光を反射する再帰性反射部材とを備える観察装置。
【請求項２】
前記照明光学系が、前記対物レンズを経由して前記容器の内部へ前記照明光を照射する請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
前記照明光学系が、前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置された開口を有し、
前記検出光学系が、前記対物レンズの瞳位置または該瞳位置と光学的に共役な位置に配置され前記開口の形状に対応する形状を有する位相膜を備える請求項２に記載の観察装置。
【請求項４】
空気とは異なる屈折率を有する媒質を前記対物レンズと前記容器との間に保持する機構を備える請求項１から請求項３のいずれかに記載の観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察装置に関し、特に、浮遊培養用の容器内の細胞を観察する観察装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ｉＰＳ細胞を初めとする培養細胞を使用した再生医療分野において、培養のスケールアップが望まれている。培養方法には、接着培養と浮遊培養がある。接着培養は、ウェルプレートまたはディッシュのような小型の容器内で細胞を培養する方法である。浮遊培養は、バイオリアクタのような大型の容器内で培養液中に浮遊させながら細胞を培養する方法である。細胞を大量生産するために、培養方法は、接着培養から浮遊培養に変わりつつある（例えば、特許文献１参照。）。特許文献１では、容器内の細胞の培養状況を把握するために、容器内の細胞の画像を取得している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１７−１４０００６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
形状およびサイズが異なる多種多様な浮遊培養用の容器が存在する。特許文献１に開示されている照明装置を用いた場合、容器の種類に関わらず容器内の細胞を常に同一方向から同一角度で安定して照明することが難しく、画質が安定しないという問題がある。例えば、曲率または凹凸を有する容器の壁は、照明光に対してレンズ効果を発揮する。したがって、容器の壁の曲率または凹凸が変化したときに、容器内に入射する照明光の向きおよび角度が変化する。同一の容器であっても、照明光に対する容器の位置および向きに応じて、容器内に入射する照明光の向きおよび角度が変化し得る。
従来の透過照明光学系による位相差観察等においても、培養容器の形状およびサイズの制限を受け、安定した観察像を得ることが難しい。【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、容器内で培養されている細胞を容器の種類に関わらず安定して照明することができる観察装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、浮遊培養用の容器内の細胞を観察する観察装置であって、照明光を前記容器の外部から該容器の内部へ照射する照明光学系と、前記容器内の前記細胞からの信号光を集める対物レンズと、該対物レンズによって集められた前記信号光を検出する検出光学系と、複数の微小な反射要素が配列されたアレイを有し、前記照明光学系との間に前記容器を挟んで配置され、前記容器を透過した前記照明光を反射する再帰性反射部材とを備える観察装置である。【０００７】
本態様によれば、照明光学系から射出された照明光が容器の内部を透過し、続いて再帰性反射部材によって反射された照明光が容器の内部を再度透過する。すなわち、容器内の細胞には、容器の両側から２回、照明光が照射される。容器内では、照明光の照射によって細胞からの信号光が発生する。容器の外部に射出された信号光は、対物レンズによって集められ、検出光学系によって検出される。これにより、容器の内部の細胞を観察することができる。【０００８】
この場合において、再帰性反射部材の微小な反射要素のアレイは、入射した照明光と同一経路に沿って照明光を反射する。すなわち、照明光は、再帰性反射部材と容器の内部との間に存在する容器の壁を同一経路に沿って相互に逆方向に２回透過するので、再帰性反射部材と容器の内部との間の容器の壁が照明光に与えるレンズ効果はキャンセルされる。したがって、再帰性反射部材から容器内に入射する照明光は、再帰性反射部材と容器の内部との間の容器の壁の影響を受けない。これにより、容器内の細胞を容器の種類に関わらず安定的に照明光で照明することができる。【０００９】
上記態様においては、前記照明光学系が、前記対物レンズを経由して前記容器の内部へ前記照明光を照射してもよい。
この構成によって、同軸落射照明を用いた細胞からの反射光または散乱光の観察と、透過照明を用いた細胞からの透過光の観察の両方を実現することができる。すなわち、対物レンズを経由した照明光は、対物レンズの光軸に沿って、または略沿って、細胞に照射され、細胞によって反射または散乱された照明光（信号光）が対物レンズによって集められる。これにより、細胞の落射明視野像を観察することができる。一方、再帰性反射部材によって反射された照明光は、対物レンズの光軸に沿って、または略沿って、細胞に照射され、細胞を透過した照明光（信号光）が対物レンズによって集められる。これにより、細胞の透過明視野像を観察することができる。
また、再帰性反射部材までの光路において照明光のケラレの発生を低減することができる。【００１０】
上記態様においては、前記照明光学系が、前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置された開口を有し、前記検出光学系が、前記対物レンズの瞳位置または該瞳位置と光学的に共役な位置に配置され前記開口の形状に対応する形状を有する位相膜を備えていてもよい。
この構成によって、同軸落射照明を用いた位相差観察を行うことができる。すなわち、照明光学系の開口を通過した照明光は、容器の内部を２回透過し、対物レンズに入射する。容器の内部を透過する間に、照明光の一部は、細胞を通過することによって回折され、照明光の他の部分は、回折されることなく直進する。回折されなかった直進光は、開口と光学的に共役な位置に配置された位相膜を通過することによって位相にずれを生じる。そして、直進光と回折光とが干渉することによって、透明な細胞を明暗によって観察することができる。【００１１】
上記態様においては、空気とは異なる屈折率を有する媒質を前記対物レンズと前記容器との間に保持する機構を備えていてもよい。
照明光が透過する位置において容器の壁が曲率または凹凸を有する場合、容器の壁は照明光に対してレンズ効果を発揮する。対物レンズと容器の壁との間に保持された媒質によって容器の壁のレンズ効果を低減し、容器内の細胞をさらに安定的に照明することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、容器内で培養されている細胞を容器の種類に関わらず安定して照明することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施形態に係る観察装置の全体構成図である。
【図２】図１の観察装置に使用される容器の一例である。
【図３】図１の観察装置の再帰性反射部材の構成例である。
【図４】図１の観察装置の変形例の部分構成図である。
【図５】図１の観察装置の他の変形例の部分構成図である。
【図６】図１の観察装置の他の変形例の部分構成図である。
【図７】図１の観察装置の他の変形例の部分構成図である。
【図８】図１の観察装置の他の変形例の全体構成図である。
【図９】図１の観察装置の他の変形例の全体構成図である。
【図１０】図１の観察装置の他の変形例の全体構成図である。
【図１１】図１の観察装置の他の変形例の全体構成図である。
【図１２】図１の観察装置の他の変形例の全体構成図である。
【図１３】図１の観察装置の他の変形例の全体構成図である。
【図１４】図１の観察装置の他の変形例の部分構成図である。
【図１５】図１の観察装置の他の変形例の全体構成図である。
【図１６Ａ】図１の観察装置の他の変形例の部分構成図である。
【図１６Ｂ】図１６Ａの光源を対物レンズの光軸に沿う方向に見た図である。
【図１７Ａ】再帰性反射部材の変形例の構成図である。
【図１７Ｂ】図１７Ａの再帰性反射部材の断面図である。
【図１８】再帰性反射部材の他の変形例の断面図である。
【図１９Ａ】再帰性反射部材の配置の変形例を示す図である。
【図１９Ｂ】図１９Ａの再帰性反射部材の配置の具体例を示す図である。
【図１９Ｃ】図１９Ａの再帰性反射部材の配置の他の具体例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の一実施形態に係る観察装置１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置１は、図１に示されるように、浮遊培養用の容器２内で培養されている細胞を容器２の外側から観察するためのものである。図１は、上方から鉛直方向に見た観察装置１を示している。
【００１５】
容器２は、図２に示されるように、照明光に対して光学的に透明な材質からなる任意の種類の容器である。容器２内には、培養液Ａおよび培養液Ａ中に浮遊する細胞Ｂが収容される。容器２の材質、形状およびサイズは特に制限されない。具体的には、容器２の材質は、硬質および柔軟のいずれであってもよい。容器２の形状は、箱状、筒状、または袋状等の任意の形状であってもよい。容器２のサイズは、大型および小型のいずれであってもよい。参照する図面には、容器２の一例として、柔軟な材質からなる円筒状のバッグが示されている。容器２の内部には、撹拌器のシャフト３ａおよび撹拌羽根３ｂが配置されている。シャフト３ａの回転によって培養液Ａ中の撹拌羽根３ｂが回転し、回転する撹拌羽根３ｂによって培養液Ａが撹拌され、細胞Ｂが培養液Ａ中に浮遊し続ける。
【００１６】
観察装置１は、容器２の側方に配置された対物レンズ４と、光源５からの照明光を対物レンズ４を経由して容器２の外側から容器２の内部へ照射する照明光学系６と、容器２を透過した照明光を容器２へ向かって反射する再帰性反射部材７と、対物レンズ４によって集められた照明光を検出する検出光学系８とを備えている。
【００１７】
光源５は、位相差画像の取得に一般に使用される光源、例えば、水銀、ハロゲン、キセノンまたはＬＥＤ等のランプ光源である。
対物レンズ４の光軸は略水平方向に配置され、対物レンズ４は容器２の方を向いている。対物レンズ４の焦点面Ｆは、容器２の内部に配置される。
【００１８】
照明光学系６は、円環状の開口（リングスリット）６１ａを有する絞り６１と、リレー光学系６２と、ハーフミラー６３とを備えている。符号６４は、光源５から射出された照明光を平行光に変換するレンズである。
絞り６１のリングスリット６１ａは、対物レンズ４の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されている。レンズ６４からの照明光は、絞り６１においてリングスリット６１ａのみを通過する。
【００１９】
リレー光学系６２は、リングスリット６１ａからの照明光をリレーする。このようなリレー光学系６２は、例えば、一対の凸レンズから構成される。
ハーフミラー６３は、リレー光学系６２からの照明光の一部（例えば、２０％）を対物レンズ４に向かって反射する。また、ハーフミラー６３は、対物レンズ４からの照明光の一部（例えば、８０％）を透過させる。
【００２０】
ハーフミラー６３によって反射された照明光は、対物レンズ４の光軸に沿って対物レンズ４に入射し、対物レンズ４から容器２へ向かって射出される。すなわち、対物レンズ４は、照明光学系６の一部としても機能する。対物レンズ４からの照明光は、容器２の側壁を透過し、容器２の内部を略水平方向に横断し、容器２の側壁を再び透過し、容器２の外部へ射出される。絞り６１の位置は、絞り６１に入射する照明光の光軸に直交する方向に調整可能である。絞り６１の位置調整によって、対物レンズ４から容器２に入射する照明光の位置を照明光の光軸に交差する方向に変更することができる。
【００２１】
再帰性反射部材７は、対物レンズ４との間に容器２を略水平方向に挟んで配置されている。再帰性反射部材７は、面Ｐに沿って多数の微小な反射要素７ａが配列されたアレイを有している。面Ｐは、容器２を透過した照明光の光軸に交差する面である。反射要素７ａは、例えば、プリズムまたは球状のガラスビーズである。
【００２２】
図３は、再帰性反射部材７の構成の一例を示している。図３に示されるように、多数の反射要素７ａは、ベース部材７ｂの表面との間に反射膜７ｃを隔てて配置され、ベース部材７ｂの表面に沿って配列されている。図中、符号７ｄは、剥離フィルムであり、符号７ｅは、剥離フィルム７ｄとベース部材７ｂとを接着させる接着剤である。
【００２３】
反射要素７ａに入射した照明光は、反射膜７ｃによって反射され、入射時とは逆向きに反射要素７ａから射出される。反射要素７ａは微小であるので、入射時と射出時との間で照明光の経路のシフトはほとんど生じない。したがって、再帰性反射部材７によって反射された照明光は、再帰性反射部材７に入射する照明光の経路と同一の経路に沿って戻る。すなわち、容器２の内部と再帰性反射部材７との間で照明光は同一経路を往復する。
【００２４】
反射要素７ａが配列される面Ｐは、平面および曲面のいずれであってもよい。例えば、面Ｐは、図１に示されるように、一定の曲率を有し一方向に湾曲する曲面であってもよく、図４に示されるように、複数方向に湾曲する曲面であってもよい。
対物レンズ４および再帰性反射部材７は、対物レンズ４と再帰性反射部材７との間の照明光の光路に撹拌器のシャフト３ａおよび撹拌羽根３ｂが干渉しない位置に配置される。
【００２５】
検出光学系８は、対物レンズ４の瞳位置に配置された位相膜８１と、撮像素子８２と、結像レンズ８３とを備えている。
位相膜８１は、リングスリット６１ａの形状に対応する形状（すなわち円環状）を有する。位相膜８１は、位相膜８１を透過する照明光の位相をシフトさせる。位相膜８１は、図５に示されるように、対物レンズ４の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されていてもよい。符号８４は、対物レンズ４の瞳を位相膜８１にリレーするリレー光学系である。
【００２６】
結像レンズ８３は、対物レンズ４によって集められハーフミラー６３を透過した照明光を撮像素子８２上に結像させる。
撮像素子８２は、２次元イメージセンサ（例えば、ＣＣＤイメージセンサまたはＣＭＯＳイメージセンサ）である。撮像素子８２は、結像レンズ８３によって結ばれた像を撮像し、細胞Ｂの位相差画像を取得する。
【００２７】
次に、観察装置１の作用について説明する。
光源５からの照明光は、図１に示されるように、照明光学系６から対物レンズ４を経由して容器２に照射される。照明光は、容器２内に入射し、容器２内の培養液Ａを透過し、容器２から射出される。続いて、照明光は、再帰性反射部材７によって反射され、再び容器２内に入射し、容器２内の培養液Ａを逆向きに透過し、容器２から射出される。したがって、容器２内で培養液Ａ中に浮遊する細胞Ｂは、対物レンズ４による落射照明と再帰性反射部材７による透過照明の２種類の照明法によって照明される。
【００２８】
容器２内を２回透過する間に、照明光の一部（信号光）は、培養液Ａ中に浮遊する透明な細胞Ｂを透過し、屈折する。容器２を２回透過した後、照明光は、対物レンズ４に入射し、対物レンズ４およびハーフミラー６３を透過し、結像レンズ８３によって撮像素子８２上に結像される。
【００２９】
ここで、対物レンズ４内には、リングスリット６１ａと光学的に共役な位置に位相膜８１が配置されている。容器２内で細胞Ｂを透過した照明光（屈折光）は、対物レンズ４内で位相膜８１とは異なる位置を通過し、対物レンズ４から射出される。一方、容器２内で細胞Ｂを透過しなかった照明光（直進光）は、対物レンズ４内で位相膜８１を透過することによって位相にシフトが与えられ、対物レンズ４から射出される。したがって、撮像素子８２上には、屈折光と直進光との干渉による明暗がついた細胞Ｂの光学像が形成され、撮像素子８２によって細胞Ｂの位相差画像が取得される。
【００３０】
この場合において、再帰性反射部材７は、上述したように、多数の微小な反射要素７ａによって、入射時と同一経路に沿って照明光を反射する。したがって、再帰性反射部材７から容器２内に入射した照明光は、再帰性反射部材７と容器２の内部との間に存在する容器２の側壁の形状に関わらず、容器２内の細胞Ｂを同一方向から同一角度で照明する。
【００３１】
例えば、容器２の側壁が曲率または凹凸を有する場合、容器２の側壁は照明光に対してレンズ効果を発揮する。ただし、容器２の側壁を照明光が同一経路に沿って往復することによって、レンズ効果はキャンセルされる。すなわち、再帰性反射部材７から容器２内に入射する照明光の向きおよび角度は、再帰性反射部材７と容器２の内部との間の側壁の影響を受けない。したがって、容器２が柔軟な材質からなり容器２の側壁が継時的に変形したとしても、あるいは、容器２を形状およびサイズが異なる他の容器２に交換したとしても、再帰性反射部材７からの照明光によって容器２内の細胞Ｂを安定的に照明することができる。
【００３２】
対物レンズ４と容器２の内部との間の容器２の側壁が平坦である場合、対物レンズ４から容器２内に入射した照明光は、対物レンズ４の光軸に沿って進む。すなわち、同軸落射照明が実現される。
一方、対物レンズ４と容器２の内部との間の容器２の側壁が曲率または凹凸を有する場合、対物レンズ４から容器２内に入射する照明光の光軸が、容器２の側壁のレンズ効果によって対物レンズ４の光軸に対して傾く。その結果、再帰性反射部材７から対物レンズ４に戻った照明光（直進光）の位置が、位相膜８１の位置から光軸に交差する方向にずれることがある。このような場合には、再帰性反射部材７から対物レンズ４に戻った照明光（直進光）が位相膜８１を透過するように、絞り６１の位置調整によって、照明光学系６から容器２に照射される照明光の位置が調整される。
【００３３】
本実施形態においては、図６および図７に示されるように、対物レンズ４と容器２との間に、空気とは異なる屈折率を有する媒質Ｍが充填されてもよい。媒質Ｍは、例えば、水、オイル、ゲルまたは吸水性ポリマである。媒質Ｍの屈折率は、培養液Ａの屈折率と同一または近いことが好ましい。媒質Ｍの屈折率は、容器２の材質の屈折率と同一または近くてもよい。
対物レンズ４と容器２との間の媒質Ｍによって、対物レンズ４から容器２内に入射する照明光に対する、容器２の側壁のレンズ効果が低減される。これにより、容器２の側壁が曲率または凹凸を有する場合に、対物レンズ４から細胞Ｂに照射される照明光の向きおよび角度を安定させることができる。
【００３４】
媒質Ｍは、図６に示されるように、媒質Ｍの表面張力によって対物レンズ４と容器２との間に保持されてもよい。あるいは、図７に示されるように、媒質Ｍを対物レンズ４と容器２との間に保持する機構９が設けられていてもよい。
【００３５】
機構９は、例えば、対物レンズ４の先端面と容器２の側壁との間の空間を密閉する筒状の壁９ａと、流動性の媒質Ｍを収容する容器９ｂと、壁９ａの内部と容器９ｂの内部とを接続する管９ｃとを備えている。容器９ｂから壁９ａの内部へ管９ｃを経由して媒質Ｍが供給される。壁９ａは、長手方向（対物レンズ４の光軸に沿う方向）に伸縮可能であることが好ましい。例えば、壁９ａは、蛇腹構造を有していてもよい。壁９ａの伸縮によって、壁９ａの内部の密閉性を維持しながら対物レンズ４を光軸方向に移動させることができる。
【００３６】
本実施形態においては、照明光学系６が、対物レンズ４を経由して照明光を容器２に照射することとしたが、これに代えて、図４に示されるように、対物レンズ４を経由せずに照明光を容器２に照射してもよい。図４の照明光学系６は、対物レンズ４の側方に配置され、照明光を射出する光源６５を備えている。照明光の光軸を対物レンズ４の光軸にできるだけ近付かせるために、光源６５は対物レンズ４の近傍に配置されることが好ましい。
【００３７】
本実施形態においては、照明光学系６から容器２に略水平方向に照明光が照射されることとしたが、照明光学系６から容器２への照明光の照射方向は、水平方向以外の方向であってもよい。
例えば、図８に示されるように、照明光学系６から容器２へ上方向に照明光が照射されてもよい。図８の変形例において、対物レンズ４は容器２の下方に配置され、再帰性反射部材７は、容器２の上方に配置される。
【００３８】
培養液Ａの液面は、表面張力によって凹面となり、照明光に対してレンズ効果を発揮する。図８の変形例によれば、再帰性反射部材７を用いることによって、培養液Ａの液面が照明光に与えるレンズ効果をキャンセルすることができる。
【００３９】
本実施形態においては、リングスリット６１ａおよび位相膜８１を用いて細胞Ｂの位相差画像を観察することとしたが、これに代えて、細胞Ｂの明視野画像を観察してもよい。すなわち、図４または図５に示されるように、照明光学系６が絞り６１を備えず、検出光学系８が位相膜８１を備えていなくてもよい。図４および図５の変形例において、細胞Ｂの落射明視野画像と透過明視野画像が観察される。
【００４０】
本実施形態と同様の構成を落射型の微分干渉観察に適用してもよい。
この場合には、図９に示されるように、照明光学系６が、光源５からの照明光を通過させるポラライザ（偏光子）９１を備え、観察装置１が、対物レンズ４の瞳位置近傍に複屈折素子９２を備え、検出光学系８がアナライザ（直交ニコル、検光子）９３を備えていてもよい。複屈折素子９２は、例えばＤＩＣプリズムであり、ポラライザ９１を透過した照明光を透過させ、かつ対物レンズ４によって集光された細胞Ｂからの信号光を透過させる。アナライザ９３は、複屈折素子９２を透過した細胞Ｂからの信号光を透過させる。
【００４１】
光源５からの照明光は、ポラライザ９１を透過することによって偏光方向を一方向に設定され、複屈折素子９２を透過することによって偏光方向の異なる２つの照明光に分けられる。その後、２つの照明光は細胞Ｂを透過する。光路の異なる２つの照明光には、厚さの変化を有する細胞Ｂを透過する際に光路差が与えられる。２つの照明光は、再帰性反射部材７によって反射された後に、再度細胞Ｂの同一位置を透過することによって光路差が再度与えられる。
【００４２】
そして、２つの照明光は、複屈折素子９２を再度通過することによって同じ光路に合成され、アナライザ９３を通過する。これにより、光路差を有する２つの照明光の干渉によって明暗のコントラストが発生し、細胞Ｂを微分干渉像により観察することができる。
この場合においても、細胞Ｂの各位置を透過した照明光を再帰性反射部材７によって再度同一位置に通過させることにより、複屈折により発生する位相差を２倍にすることができる。
【００４３】
本実施形態と同様の構成を偏斜照明による透過観察に適用してもよい。
この場合には、図１０に示されるように、照明光学系６が、対物レンズ４の瞳位置に光学的に共役な位置に、光軸中心から径方向に離れた位置に配置されたリングスリット（開口）１０１を備え、細胞Ｂに対して特定の角度で照明光を入射させることとしてもよい。
対物レンズ４の光軸に対して斜め方向に細胞Ｂを透過した照明光が再帰性反射部材７によって反射されることにより、対物レンズ４とは反対側から対物レンズ４の光軸に対して斜め方向に細胞Ｂに照明光が照射される偏斜照明が生成される。そして、細胞Ｂを透過した照明光がハーフミラー６３によって分岐されＣＣＤ等の撮像素子８２によって撮影されることにより、立体感のある細胞Ｂの像を観察することができる。
【００４４】
図１０の観察装置と同様の構成を暗視野観察に適用してもよい。
この場合には、図１１に示されるように、検出光学系８が、対物レンズ４の瞳位置と光学的に共役な位置近傍において、リングスリット（開口）１０１に対応する位置に配置される減光部材１０２を備えていてもよい。減光部材１０２は、例えば、照明光の一部をカットする絞り、または、ＮＤフィルタである。
この構成によれば、偏斜照明として再帰性反射部材７から細胞Ｂを通過した直接光の光量を減光部材１０２によって抑えることができ、これによって暗視野観察を行うことができる。
【００４５】
図１１には、暗視野観察への適用例を示したが、減光部材１０２に代えて位相膜を備えることによって、位相差観察専用の対物レンズを用いなくても位相差観察を行うことができるという利点がある。
【００４６】
本実施形態において、図１２に示されるように、蛍光観察が可能な構成であってもよい。
この場合には、照明光学系６が、励起フィルタ１２１を備え、検出光学系８が、ダイクロイックミラー１２２および励起カットフィルタ１２３を備える。光源５から射出された照明光は、リレー光学系１２４によってリレーされ、励起フィルタ１２１を透過することによって励起光に生成され、励起光が細胞Ｂに照射される。励起光の照射によって、細胞Ｂ内に含有されている蛍光物質が励起され、細胞Ｂから蛍光（信号光）が発生する。蛍光は、ダイクロイックミラー１２２によって照明光学系６の光路から分岐され、励起光カットフィルタ１２３によって励起光が除去された後に撮像素子８２によって撮影される。これによって、蛍光観察を行うことができる。
【００４７】
図１２の観察装置と同様の構成を落射型のレーザ走査共焦点蛍光観察に適用してもよい。
この場合には、図１３に示されるように、照明光学系６が、レーザ光源１３１およびスキャナ１３２を備え、検出光学系８が、共焦点ピンホール１３４および光検出器１３５を備える。光検出器１３５は、例えば、ＰＭＴ（光電子増倍管）である。
レーザ光源１３１からのレーザ光（励起光）は、照明光学系６および対物レンズ４によって容器２内に入射し、対物レンズ４の焦点面Ｆ上に集光され、光スポットを形成する。光スポットは、スキャナ１３２によって２次元的に走査される。
【００４８】
光スポットの走査範囲内に細胞Ｂが存在する場合、光スポットの各走査位置において、細胞Ｂ内に含有されている蛍光物質が励起されて蛍光が発生し、発生した蛍光が各走査位置から全方向に射出される。各走査位置から発生した蛍光の一部は、容器２を透過し、対物レンズ４によって集光され、スキャナ１３２を経由してレーザ光の光路を戻る途中でダイクロイックミラー１２２によってレーザ光の光路から分岐される。その後、蛍光は、結像レンズ８３、共焦点ピンホール１３４および励起光カットフィルタ１２３を通過し、光検出器１３５によって検出される。
【００４９】
細胞Ｂが透明であるため、細胞Ｂに入射したレーザ光の一部は、細胞Ｂを透過し、容器２から対物レンズ４とは反対側へ射出される。射出されたレーザ光は、再帰性反射部材７によって反射されて、同じ経路を辿って、再度、細胞Ｂに対物レンズ４とは反対側から入射する。
【００５０】
この場合において、再帰性反射部材７は、多数の微小の反射要素７ａによって、経路のシフトをほとんど発生させることなく同じ経路を戻すようにレーザ光を反射する。これにより、容器２による曲率等の状態に関わらず、レーザ光の光スポットを最初の走査位置とほぼ同一位置に再度形成することができる。
【００５１】
すなわち、同じ走査位置にレーザ光を往復２回にわたって照射するので、各走査位置において発生させる蛍光をほぼ２倍に増大させることができる。これにより、明るい蛍光画像を取得することができるという利点がある。
【００５２】
容器２内のレーザ光が通過する領域の全てにおいて蛍光が発生するが、対物レンズ４の焦点位置に形成される光スポット以外の領域において発生した蛍光は、共焦点ピンホール１３４を通過できないため、光検出器１３５によって検出されることはない。
【００５３】
図１３には、共焦点蛍光観察の一例として、スキャナ１３２と共焦点ピンホール１３４とを備えるレーザ走査型を示したが、これに代えて、図１４に示されるように、共焦点ディスク１４１を備える方式を採用してもよい。
共焦点ディスク１４１は、対物レンズ４の焦点位置と光学的に共役な位置に配置され、励起光および蛍光を透過させる複数のピンホール１４１ａを備える。検出光学系８は、複数のピンホール１４１ａを通過した蛍光を同時に検出可能なＣＣＤイメージセンサ等の撮像素子１４２を備える。
【００５４】
光源５からの照明光から、励起フィルタ１２１によって励起光が生成される。生成された励起光は、共焦点ディスク１４１を通過し、集光レンズ１４３によって集光される。これにより、容器２内に配置される対物レンズ４の焦点位置に、多数の光スポットが形成される。共焦点ディスク１４１を回転等させることによって、多数の光スポットを容器２内において走査することができる。
【００５５】
各走査位置において発生した蛍光は、共焦点ディスク１４１のピンホール１４１ａを通過した後、ダイクロイックミラー１２２によって励起光の光路から分岐され、励起光カットフィルタ１２３によって励起光が除去された後に撮像素子１４２によって撮影される。
この場合においても、再帰性反射部材７によって、各光スポットの位置に励起光が２回照射される。また、各光スポットの位置において発生した蛍光も再帰性反射部材７により反射されることによって、当該光スポットから発生した蛍光の一部として検出される。したがって、明るい蛍光画像を取得することができるという利点がある。
【００５６】
蛍光観察においては、図１５に示されるように、光源５として、多光子蛍光観察用に、極短パルスレーザ光を射出する光源１５１を用いてもよい。
図１５の観察装置は、検出光学系８のダイクロイックミラー１２２を対物レンズ４の直近に配置し、共焦点用のピンホール１３４，１４１をなくしている点で、前述した蛍光観察装置と相違している。
【００５７】
光源１５１からの極短パルスレーザ光は、スキャナ１３２によって走査され、対物レンズ４の焦点位置に集光され、光スポットを形成する。焦点位置の光スポットでは、光子密度が増大する。したがって、多光子励起効果により、光スポットの位置において限定的に蛍光が発生する。発生した蛍光の内、対物レンズ４側に射出された蛍光は、対物レンズ４によって集光され、ダイクロイックミラー１２２によって極短パルスレーザ光の光路から分岐され、励起光カットフィルタ１２３によってレーザ光成分が除去され、光検出器１３５によって検出される。これにより、蛍光画像を取得することができる。
【００５８】
レーザ走査型の共焦点蛍光観察と同様にして、極短パルスレーザ光は再帰性反射部材７によって反射されるが、再度入射した容器２内の光スポットの位置において波面を分割して反射されることにより、パルス幅が増大するので多光子励起効果は発生しない。したがって、レーザ走査型の共焦点蛍光観察とは異なり、励起光の２回照射による蛍光量の増加効果は得られない。ただし、蛍光を光スポットの位置において限定的に発生させるため、反射要素７ａによる微小なシフトが発生してもフレアを発生させることがない。したがって、再帰性反射部材７側に射出された蛍光を再帰性反射部材７によって容器２の同じ位置に戻し、対物レンズ４によって集光することができる。このように、通常の落射型の観察では捨てられている蛍光を回収することで、明るい蛍光画像を取得することができるという利点がある。
【００５９】
図１５と同様の構成により、多光子励起効果により発生した蛍光に代えて、極短パルスレーザ光が入射されることにより細胞Ｂにおいて誘起される第２次高調波（ＳＨＧ）および第３次高調波（ＴＨＧ）を検出する観察装置を採用してもよい。
この場合、光源１５１として、例えば、波長１２００ｎｍの極短パルスレーザ光を射出する光源が採用される。励起光カットフィルタ１２３として、波長１２００ｎｍの極短パルスレーザ光を遮断し、波長６００ｎｍおよび波長４００ｎｍの極短パルスレーザ光を透過させるフィルタが採用される。
【００６０】
細胞Ｂ内の特定の物質によって非線形効果によって発生する高調波（信号光）を検出することにより、蛍光標識することなく透明な細胞を検出することができる。また、通常、高調波は、極短パルスレーザ光の入射方向とは反対側に透過する方向に多く発生する。本例によれば、細胞Ｂから対物レンズ４とは反対側に発生した高調波が再帰性反射部材７によって細胞Ｂ側に戻される。これにより、コンパクトな落射型の構成によって高調波を効率的に検出することができるという利点がある。
【００６１】
上記の蛍光観察において、再帰性反射部材７に近接して配置され蛍光を遮断する光学フィルタを備えていてもよい。
光学フィルタは、レーザ光の照射によって細胞Ｂにおいて発生した蛍光のうち、再帰性反射部材７側に射出された蛍光を遮断する。したがって、光学フィルタは、例えば、容器２と再帰性反射部材７との間に配置される。
【００６２】
散乱の強い細胞Ｂの場合には、細胞Ｂにおいて発生した蛍光が再帰性反射部材７側に射出される。再帰性反射部材７で反射された蛍光は、細胞Ｂで再度散乱されることによってコントラストを低下させることがある。再帰性反射部材７と細胞Ｂとの間に光学フィルタを配置することによって、再帰性反射部材７側に射出される蛍光が光学フィルタで遮断され、励起光のみが光学フィルタを透過する。そして、励起光のみが再帰性反射部材７によって反射され、細胞Ｂに再度入射する。これにより、コントラストの低下を防ぎつつ、蛍光強度を２倍にできる。
【００６３】
具体的には、細胞Ｂの各位置を透過した励起光は再帰性反射部材７によって反射されて細胞Ｂの同じ位置に再度入射するので、細胞Ｂの各位置において約２倍の蛍光を発生させることができる。
【００６４】
これにより、明るい蛍光画像を取得することができる。
この場合において、光源が点光源ではない場合（例えば、水銀光源）には、軸上の励起光のみならず、軸外の励起光も細胞Ｂに照射される。本実施形態に係る観察装置によれば、軸上の励起光のみならず軸外の励起光についても、再帰性反射部材７によって同一経路を戻るように反射されるので、上記効果を得ることができる。
【００６５】
上記実施形態および変形例において、図１６Ａに示されるように、光源５を対物レンズ４の周囲に配置してもよい。特に、図１６Ｂに示されるように、光源５をリング状に配置してもよい。
このような配置によれば、細胞Ｂによって散乱された散乱光を観察することが可能となり、偏斜照明様の観察を行うことができる。また、蛍光観察の場合には、検出光学系８の光軸外から細胞Ｂに励起光が照射されるので、対物レンズ４によって集光される励起光が少なくなり、良好な蛍光画像を取得することができる。
【００６６】
図１７Ａから図１８は、再帰性反射部材７の構造の変形例を示している。上記実施形態および変形例において、図１７Ａから図１８に示される、凹凸形状を有する再帰性反射部材７を採用してもよい。
再帰性反射部材７は、図１７Ａおよび図１７Ｂに示されるように、幾何学的な形状を有する反射部材であり、反射された照明光が再帰性反射部材７に入射する照明光の経路と同一の経路に沿って戻るように構成されていてもよい。図１７Ａおよび図１７Ｂの例の場合、３枚の反射面から１つの反射要素７ａが構成される。
あるいは、再帰性反射部材７は、図１８に示されるように、波面状の反射部材であり、反射された照明光が再帰性反射部材７に入射する照明光の経路と同一の経路に沿って戻るように構成されていてもよい。
【００６７】
上記実施形態および変形例においては、再帰性反射部材７が容器２外に配置されることとしたが、図１９Ａに示されるように、再帰性反射部材７が容器２と一体に設けられていてもよい。
再帰性反射部材７は、その効果を発揮することができる限りにおいて、容器２の任意の位置に設けることができる。例えば、図１９Ｂに示されるように、再帰性反射部材７は、容器２の壁２ａの外面に沿って設けられていてもよい。あるいは、図１９Ｃに示されるように、容器２の壁２ａの内部に設けられていてもよい。
【００６８】
上記実施形態および変形例において使用される容器２の材質は、光学的に透明であることが好ましい。また、容器２の材質の屈折率Ｎｄは、１．３〜２であることが好ましい。例えば、容器２の材質は、フッ素樹脂またはガラスであることが好ましい。
【００６９】
これまで観察装置について説明してきが、本発明は、再帰性反射部材を用いて、容器内で浮遊する細胞を観察する観察方法も含む。
容器内で浮遊する細胞を観察する観察方法の一例は、
（Ａ）容器内の細胞に照明光を照射する照射ステップと、
（Ｂ）照射ステップにおいて前記細胞に照射され該細胞を透過した光を再帰性反射させる反射ステップと、
（Ｃ）反射ステップにおいて再帰性反射され、前記細胞を透過した、または前記細胞によって散乱された光を撮影する撮影ステップと、を含む。
【００７０】
容器内で浮遊する細胞を観察する観察方法の他の例は、
（ａ）容器内の細胞に照明光を照射する照射ステップと、
（ｂ）照射ステップにおいて前記細胞に照射され該細胞を透過した光を再帰性反射させる反射ステップと、
（ｃ）照射ステップおよび／または再帰性反射ステップにおいて前記細胞に照射された照明光によって細胞から発せされる蛍光を撮影する撮影ステップと、を含む。
ステップ（Ｃ）または（ｃ）に記載された再帰性反射は、照明光の入射角と射出角とが等しい、または略等しいことを意味し、上述した微小な反射要素によって実現される。
【符号の説明】
【００７１】
１  観察装置
２  容器
３ａ  シャフト
３ｂ  撹拌羽根
４  対物レンズ
５  光源
６  照明光学系
６１  絞り
６１ａ  リングスリット、開口
６２  リレー光学系
６３  ハーフミラー
７  再帰性反射部材
７ａ  反射要素
８  検出光学系
８１  位相膜
８２  撮像素子
８３  結像レンズ
９  機構
Ａ  培養液
Ｂ  細胞
Ｍ  媒質
【図１】
2019163167.tif 000003
【図２】
2019163167.tif 000004
【図３】
2019163167.tif 000005
【図４】
2019163167.tif 000006
【図５】
2019163167.tif 000007
【図６】
2019163167.tif 000008
【図７】
2019163167.tif 000009
【図８】
2019163167.tif 000010
【図９】
2019163167.tif 000011
【図１０】
2019163167.tif 000012
【図１１】
2019163167.tif 000013
【図１２】
2019163167.tif 000014
【図１３】
2019163167.tif 000015
【図１４】
2019163167.tif 000016
【図１５】
2019163167.tif 000017
【図１６Ａ】
2019163167.tif 000018
【図１６Ｂ】
2019163167.tif 000019
【図１７Ａ】
2019163167.tif 000020
【図１７Ｂ】
2019163167.tif 000021
【図１８】
2019163167.tif 000022
【図１９Ａ】
2019163167.tif 000023
【図１９Ｂ】
2019163167.tif 000024
【図１９Ｃ】
2019163167.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月21日(2020.8.21)
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
浮遊培養用の容器内の細胞を観察する観察装置であって、
照明光を前記容器の外部から該容器の内部へ照射する照明光学系と、
前記容器内の前記細胞からの信号光を集める対物レンズと、
該対物レンズによって集められた前記信号光を検出する検出光学系と、
複数の微小な反射要素が配列されたアレイを有し、前記照明光学系との間に前記容器を挟んで配置され、前記容器を透過した前記照明光を反射する再帰性反射部材とを備える観察装置。
【請求項２】
前記照明光学系が、前記対物レンズを経由して前記容器の内部へ前記照明光を照射する請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
前記照明光学系が、前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置された開口を有し、
前記検出光学系が、前記対物レンズの瞳位置または該瞳位置と光学的に共役な位置に配置され前記開口の形状に対応する形状を有する位相膜を備える請求項２に記載の観察装置。
【請求項４】
空気とは異なる屈折率を有する媒質を前記対物レンズと前記容器との間に保持する機構を備える請求項１から請求項３のいずれかに記載の観察装置。
【請求項５】
前記反射要素が、プリズムまたはガラスビーズである、請求項１から請求項４のいずれかに記載の観察装置。
【請求項６】
前記容器が、バイオリアクタまたはバッグである、請求項１から請求項５のいずれかに記載の観察装置。
【請求項７】
前記容器の内部には、撹拌羽根が配置されている、請求項１から請求項６のいずれかに記載の観察装置。
【請求項８】
前記信号光が、前記細胞を透過した透過光、前記細胞によって散乱された散乱光、前記細胞から発せられる蛍光のいずれかである、請求項１から請求項７のいずれに記載の観察装置。
【請求項９】
前記細胞が、前記容器内を浮遊する浮遊細胞である、請求項１から請求項８のいずれに記載の観察装置。
【請求項１０】
容器内で浮遊する細胞の観察方法であって、
前記容器内で浮遊する細胞に照明光を照射する照射ステップと、
該照射ステップにおいて前記細胞に照射され該細胞を透過した前記照明光を再帰性反射させる反射ステップと、
該反射ステップにおいて再帰性反射された前記照明光が再び前記細胞を透過した透過光、または前記細胞によって散乱された散乱光を撮影する撮影ステップと、を含む観察方法。
【請求項１１】
容器内で浮遊する細胞の観察方法であって、
前記容器内で浮遊する細胞に照明光を照射する照射ステップと、
該照射ステップにおいて前記細胞に照射され、該細胞を透過した前記照明光を再帰性反射させる反射ステップと、
前記照射ステップまたは／および前記反射ステップにおいて前記細胞に照射された前記照明光によって前記細胞から発せられる蛍光を撮影する撮影ステップと、を含む観察方法。
【国際調査報告】
2019163167.tif 000026
2019163167.tif 000027
2019163167.tif 000028