(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルを界面活性剤および粒状固体支持体に接触させ、これによってカオトロープ剤が存在せず、かつ、該界面活性剤が0.5〜30％(w/v)濃度で存在する条件下で、上記サンプル中の可溶性ゲノムＤＮＡが、この支持体の表面に、配列に依存しない結合により結合し、次いでこの支持体を結合したゲノムＤＮＡとともに上記サンプルから分離することからなる、サンプルからゲノムＤＮＡを単離する方法。
【請求項２】
上記サンプルから、RNAを単離する追加工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記サンプル中の構造成分を破壊するか、または上記サンプル中の細胞の溶解を達成する１以上の追加工程をさらに含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記界面活性剤が、アニオン性であることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
上記界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウムまたは他のアルキル硫酸アルカリ金属塩、あるいはサルコシルであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記界面活性剤が、１以上の一価のカチオン、キレート化剤または還元剤をさらに含む組成物中に含有されることを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
上記界面活性剤が、アルカリ性溶液中で用いられることを特徴とする請求項１〜６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
上記固体支持体が磁性ビーズを含むことを特徴とする請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
上記固体支持体が疎水性表面を有することを特徴とする請求項１〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
上記ゲノムＤＮＡが上記サンプルから分離され、上記支持体より溶出されることを特徴とする請求項１〜９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
上記ゲノムＤＮＡが加熱することにより溶出されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れかに記載の方法を実施するためのキットであり、請求項１〜９の何れかの方法に記載された粒状固体支持体および１以上の界面活性剤を有する、サンプルからゲノムＤＮＡを単離するためのキット。
【請求項１３】
さらに１以上のバッファ、塩、溶解剤、キレート化剤および／または還元剤を有する請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
さらにRNAを単離するための手段を有する請求項１２または１３に記載のキット。
【請求項１５】
上記サンプルが細胞を含有し、該細胞は免疫磁気的分離により得られることを特徴とする請求項１〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
さらに上記サンプルからRNAを単離する追加工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記細胞が、細胞：ビーズ複合体にある、請求項１５または１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は核酸の単離、および特に細胞からのDNAまたはRNAの単離に関する。
DNAまたはRNAの単離は、多くの生物学的手法および診断手法において、重要な工程である。例えば、核酸がしばしば発見される複合混合物からの核酸の分離は、他の研究および手法、例えば検出、クローニング、塩基配列決定、増幅、ハイブリッド形成、cDNA合成等を行うことができる前にしばしば必要であり、このような複合混合物中に多量に存在する細胞性または他の汚染物質、例えばタンパク質または炭水化物等は、分子生物学において用いられる多くの反応および技術をしばしば妨げる。加えて、DNAがRNA調製物を汚染すること、およびその反対の可能性がある。したがって、調製の観点からだけでなく、DNAまたはRNAの同定に頼った今日用いらている多くの方法、例えば微生物感染の診断、法科学、組織および血液型決定、遺伝的変異の検出等においても、細胞、組織等の複合混合物からの核酸の単離方法が要請されている。
RNA同定において、検出された配列がRNA分子から導かれており、サンプル中のゲノムDNA汚染物からのものではないことを確実にすることが、確かな診断のために重要である。この理由から、DNAからのRNAの分離方法が重要である。また、RNA分子は通常非常に不安定で、細胞および体液中に存在するRNアーゼによって速やかに分離されるので、RNA単離のためには、迅速な方法が要求される。RNAの品質は、多分、mRNAを用いた、特にcDNAを合成するためのプロトコールにおける最終結果の品質を決定する最も重要な要素である。多くの理由から、RNA調製物のDNA汚染を避けることが重要である。最初に、DNAは粘度を増加させ、これはサンプルの操作を困難としてRNA収率の低下につながり、またDNA汚染の可能性によってRNAの品質を低下させる。また、DNA汚染がRNアーゼ酵素を捕獲し、下流側での適用、例えばRT-PCR等を無価値なものとすることがある。
核酸単離のための幾つかの方法が知られているが、一般的に言って、これらは複雑な一連の抽出および洗浄工程によっており、行なうために長時間および労力を要する。さらに、アルコールおよび他の有機溶媒、カオトロープおよびタンパク質分解酵素などの材料の使用がしばしば含まれ、このことは、このような材料が多くの酵素反応および他の下流側工程での適用を阻害する傾向があるため、不利である。
そして、血液または血液製品または組織等の複合出発材料からの核酸単離のための古典的な方法は、場合によってはタンパク質分解酵素の存在下での、界面活性剤またはカオトロープによる生物材料の溶解が含まれ、これに続いて、有機溶媒、例えばフェノールおよび／またはクロロホルム等の有機溶媒を用いた数回の抽出、エタノール沈澱、遠心分離および核酸の透析が行なわれる。DNAからのRNAの精製は、LiClを用いた選択的沈澱、またはフェノール抽出およびエタノール沈澱と組み合わせた酸性グアニジウムチオシアナートを用いる選択的単離を含む。このような方法は、これを行なうのに面倒でかつ長時間を要するだけでなく、比較的多くの工程が要求され、これが分解、サンプルロス、または幾つかのサンプルを同時に処理した場合の相互汚染などの危険を増加させる。RNA単離の場合において、DNA汚染の危険が比較的高い。
RNAの精製において、特にmRNAを単離することが通常望まれる。大多数のmRNA精製戦略は、全体のRNAの単離および単離されたRNAの分画が含まれる。高品質mRNAの調製は、遺伝子構造および遺伝子調整の分析において重要な工程である。
大多数の真核mRNAは、典型的には約50〜300ヌクレオチド長のポリ(A)テールを有している。このようなmRNAは、ポリアデニル化(polyadenylated)またはポリ(A)+mRNAと呼ばれる。細胞全RNAの95%以上になる非ポリアデニル化RNAからのこのポリアデニル化RNAの分離においてこのポリ(A)テールが利用され、幾つかのタイプのポリ(A)テールに対する親和分離が行なわれている。従来の技術では、第一工程としての全RNAの精製および第二工程としてのオリゴ(dT)-セルロースを用いるアフィニティクロマトグラフィーが包含される。この戦略は、どちらかと言えば、長時間を要しかつ労働強化となる。mRNA精製のための他の戦略は、マイクロプレート、ラテックス、アガロースまたは磁性ビーズなどの固体支持体に結合したオリゴ(dT)を用いることである。
ここ４年間にわたって、磁性ビーズがmRNA操作に好ましいことが証明されたため、ポリ(A)+RNA選択のために磁性ビーズ補助戦略がますます一般的に用いられるようになってきている。多くのアプローチにおいて、生成物の収量と品質は、ヌクレアーゼおよび他の汚染物からmRNAをいかに迅速に精製できるかに依存する。磁性ビーズ分離技術を用いることによって、全RNA調製物から、あるいはより重要なことに、固体組織、細胞または体液の粗製溶解物から直接、純水で無傷なポリ(A)+RNAを迅速に得ることができる。全体の手順は、マイクロフュージ(microfuge)管内で、フェノール抽出またはエタノール沈澱なしで行なうことができる。
RNA精製で一般的な一つのアプローチは、生物学的材料の溶解と、次のLiClおよびLiDS/SDS緩衝液中のオリゴdTへのハイブリッド形成とを行ない、これによってフェノール抽出またはプロテイナーゼ-K消化などの追加の工程を避けることであり、これは固体相アプローチと連係して用いることができる。直接的mRNA単離全体はほぼ15分間を要し、溶解緩衝液中においてmRNAが30分間以上安定であるため、このことは精製されたmRNAの高い品質を保証する。しかしながら、この方法の不利な点は、単位重量組織あたりのmRNAが用いられた組織の量に影響され、溶解された細胞の臨界的閾値の上では、mRNAの収率が低下する。
直接的mRNA単離における他の一般的なアプローチは、上述したように、グアジニウムイソチオシアナート(GTC)およびサルコシル(sarkosyl)を用いることである。GTC-緩衝液システムは、このカオトロープ塩のRNアーゼ阻害機能によって、大多数の研究者に好まれている。これは、また磁性ビーズアプローチとともに用いることもできる。しかしながら、4M GTC中の細胞溶解物の粘度が高く、ビーズが充分に磁石に吸引されず、結果として、ビーズおよび他の固体相のために、DNA汚染の危険が増加し、かつ低収率となる。
より最近では、固体相の使用による他の方法が提案されている。US-A-5,234,806では、例えば、核酸が、グアニジウム塩などのカオトロープ剤の存在下、シリカ粒子の形態の固体相に結合され、これによってサンプルの残余の部分から分離される方法が説明されている。WO 91/12079では、核酸が沈澱によって固体相の表面に捕獲される方法が説明されている。一般的に言えば、アルコールおよび塩が沈澱剤として用いられる。
このような方法は核酸分離工程をスピードアップするが、アルコール、カオトロープおよび他の同様の薬剤を用いることに伴う不利益がある。カオトロープは高モル濃度で用いることが要求され、結果として高粘度溶液となり、これを用いての作業、特にRNA操作での作業が困難となる。PCRなどの増幅手法、および他の酵素ベースの反応は、アルコールおよび他の剤の阻害または他の妨害効果に非常に感受性が高い。さらに、アルコール沈殿に続いて必要な核酸ペレットの乾燥および核酸の溶解に伴う問題が、PCR等の酵素ベースの手法において、アーチファクトを導くことも知られている。現在このような手法が分子生物学の主流であるため、改善された核酸単離の方法、特に迅速かつ簡単に行なうことができ、かつカオトロープ剤またはアルコール沈殿の使用を避けることができる方法が必要である。また、RNAおよびDNAを区別することができ、同一のサンプルから両方のタイプの核酸を分離することが可能な方法に対する必要性もある。本発明は、このような方法の提供を追求するものである。
特に、サンプルを界面活性剤で処理し、かつ核酸を固体支持体に結合させることを含み、簡単かつ容易に行なえる手法によって、増幅または他の下流側での工程に好適な形態にて核酸がサンプルから単離でき、その上核酸が支持体の除去等によってサンプルから容易に分離できることが発見された。核酸の結合はその配列に依存しない。
従って、一つの観点において、本発明は、サンプルから核酸を単離する方法を提供し、この方法は、サンプルを界面活性剤および固体支持体に接触させ（これによってサンプル中の可溶性核酸が支持体に結合し）、次いで支持体を結合した核酸とともにサンプルから分離することからなる。
核酸は、DNA、RNA、またはその天然または合成修飾体、およびその組合せであってもよい。しかしながら、好ましくは核酸はDNAであり、DNAは、ゲノムまたはcDNAであってもよく、一重鎖または二重鎖、あるいは他のどの様な形態であってもよい。
本発明の方法がDNAを単離するために用いられる場合、この方法は、同一のサンプルからRNAを単離する更なる工程と便利に組み合わせることができる。このような二工程RAN分離におけるこの方法の使用は、以下により詳しく説明する。
サンプルは、核酸を含むどの様な材料、例えば食品および同類の製品、医療サンプルおよび環境サンプル等であってもよい。しかしながら、サンプルは、一般的には、生物学的サンプルであり、あらゆるウィルス性または細胞性材料、例えば全ての原核細胞または真核細胞、ウィルス、バクテリオファージ、マイコプラズマ、原形質体およびオルガネラを包含する。従って、このような生物学的材料は、全てのタイプの哺乳類および非哺乳類動物細胞、植物細胞、藍藻類等の藻類、菌類、バクテリア、原生動物などを含む。そして、代表的なサンプルとしては、全血液および血液由来製品、例えば血漿、血清およびバフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液またはあらゆる他の体液、組織、培養細胞、細胞懸濁液などを挙げることができる。
また、サンプルは、比較的精製された出発材料、例えばPCR製品、または他の核酸回収方法で得られた半精製調製物であってもよい。
核酸含有サンプルは、一般的には、界面活性剤と、固体相とに単に接触させられ、固体相は、界面活性剤に先立って、界面活性剤と同時に、または界面活性剤の後に、サンプルに加えることができる。必要に応じて、その前に、細胞壁などの構造成分を破壊し、または溶解を完遂させるための一つ以上の別の工程を行なってもよい。これを完遂するための手法は、公知である。このように、例えば、血球などのある細胞は界面活性剤だけで溶解できるが、植物または菌類細胞、または固い動物組織は、より激しい処理、例えば、液体窒素中での粉砕、界面活性剤存在下での加熱、界面活性剤存在下でのアルカリ溶解などを必要とすることがある。パラフィン切片などの形態のサンプルのためには、溶解（およびパラフィンの融解）は、例えば超音波オーブンを用いた加熱によって行なうことができる(Banerjee,S.K.et al.,1995,Biotechniques 18:769-773)。また、より密集したある組織は、例えばプロテイナーゼＫ等を用いた酵素処理で充分に核酸を放出させる必要がある。様々な成分が混合され、適当な時間単に放置されて、核酸を支持体に結合させる。便利には、もし他の剤、例えばプロテイナーゼＫ等の酵素などが用いられた場合、これらは界面活性剤とともに含まれていてよい。次いで、支持体は、どのような便利な手段で溶液から取り除いてもよく、その方法は、勿論その支持体の特性に依存し、支持体をサンプル上澄みから取り除く全ての形態、およびその反対の全ての形態、例えば遠心分離、デカンテーション、ピペット操作などを包含する。
この方法での条件は臨界的ではなく、例えば、サンプルを固体相の存在下で界面活性剤と単に混合し、分離前に室温にて、5〜20分間放置することが便利であることが見出された。上記したように、反応時間は臨界的ではなく、5分間以下でもしばしば充分である。しかしながら、もし便利であれば、より長い期間、例えば0.5〜3時間、またはたとえ一夜でも、適用することができる。混合は、如何なる便利な手段を用いてもよく、例えば単に振盪または旋回によって攪拌することを含む。また、所望により、より高温または低温が適用されるが、必須ではない。
界面活性剤は、如何なる界面活性剤であってもよく、広範に知られ、かつ文献に説明されている。したがって、界面活性剤は、陰イオン性および陽イオン性を含むイオン性であっても、非イオン性または両イオン性であってもよい。ここで、“イオン性界面活性剤”という語は、水に溶解した場合に、部分的または完全にイオン形態にある如何なる界面活性剤をも包含する。陰イオン性界面活性剤は特に良好な作用を示し、好ましい。好適な陰イオン性界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)またはアルキル硫酸アルカリ金属塩または同様の界面活性剤、サルコシル、またはこれらの混合物を挙げることができる。
便利には、界面活性剤は、0.2〜30%（重量／体積）、例えば0.5〜30%、好ましくは0.5〜15%、より好ましくは1〜10%の濃度で用いられる。陰イオン性界面活性剤のためには、1.0〜5%、例えば0.5〜5%の濃度が良好な作用を示す。
界面活性剤は、これはアルカリ性でも酸性でもよい単純な水溶液中で供給でき、またはより好ましくは緩衝液中で供給してもよい。如何なる好適な緩衝液も用いることができ、これは例えば、トリス、ビシン、トリシン、および燐酸緩衝液であってもよい。便利には、一価陽イオン源、例えば塩を含ませて核酸捕獲を促進させることができるが、これは必須ではない。好ましい塩は、0.1〜1M、例えば250〜500mMの濃度の塩化物塩、例えば塩化ナトリウム、塩化リチウムなどを包含する。上述したように、他の成分、例えば酵素も含ませてもよい。
界面活性剤組成物中の他の任意成分としては、便利には1〜50mMの濃度のキレート化剤、例えばmEDTA、EGTAおよび他のポリアミノカルボン酸、および例えば1〜10mMの濃度の還元剤、例えばジチオトレイトール(DTT)またはβ-メルカプトエタノールを挙げることができる。
好ましい界面活性剤組成物は、例えば：
100mMトリス-HCl pH7.5
10mM EDTA
2% SDS
または：
100mMトリスCl pH7.5
10mM EDTA
5% SDS
10mM NaCl
または：
100mMトリスCl pH7.5
500mM LiCl
10mM EDTA
1% LiDS
からなる。
界面活性剤は、本発明の方法において、核酸含有材料、例えば細胞および核を溶解して核酸を放出させる機能を示す。また、界面活性剤は、タンパク質、例えばDNA-結合タンパク質の核酸への結合を破壊し、サンプル中の汚染物質が固体支持体に付着するという問題を減少させると信じられている。
固体支持体は、今日広く固定または分離等に使用あるいは提案されている公知の支持体またはマトリックスであってよい。これらは、粒子、シート、ゲル、フィルター、膜、繊維、細管、またはマイクロタイターストリップ、管、プレートまたはウェルなどの形態をとることができる。
便利には、支持体は、ガラス、シリカ、ラテックスまたは重合体材料であってよい。核酸の結合のために、大表面積を示す材料が好ましい。理論的考察に束縛されることを望むわけではないが、核酸結合化過程は、支持体を「覆い含む」核酸によって補助されると信じられている。このような支持体は、一般的に不均一な表面を有しており、例えば多孔性または粒状であって、例えば粒子、繊維、ウェブ、焼成物または篩であってよい。粒状材料、例えばビーズ等は、一般的に、そのより大きな結合能力によって好ましく、特に重合体ビーズが好ましい。
便利には、本発明によって用いられる粒状固体支持体は、球状ビーズから成る。ビーズのサイズは臨界的ではないが、これらは、例えば、少なくとも1μm、好ましくは少なくとも2μmの直径のオーダであり、好ましくは10μm以下、より好ましくは6μm以下の最大直径を有する。例えば、直径2.8μmおよび4.5μmのビーズが良好な作用を示す。
単分散粒子、即ち実質的に均一なサイズ（例えば、直径の標準偏差が5%未満のサイズ）の粒子は、非常に均一な反応再現性を与えるという利点を有している。US-A-4336173で開示される技術によって製造された単分散重合体粒子が特に好適である。
本発明の方法で用いるのに好適な非磁性重合体ビーズは、Qiagen、PharmaciaおよびSerotecと同様に、Dyno Particles AS(Lillestrφm,Norway)から入手できる。
しかしながら、操作および分離を補助するために、磁性ビーズが好ましい。ここで用いられる「磁性」という語は、支持体が、磁場に置かれたときに、それに付与される磁気モーメントを有することができ、従ってその場の作用の下で立ち退き可能であることを意味する。言い換えれば、磁性粒子からなる支持体は磁気凝集によって容易に除去でき、磁気凝集は核酸結合工程に続く粒子分離の迅速、簡単かつ効果的な方法を提供し、かつ核酸を分解させるかもしれない専断力を発生させる遠心分離などの従来の方法より、はるかに激しくない方法である。
このように、本発明の方法を用い、結合した核酸を有する磁性粒子は、例えば永久磁石を用いた磁場を適用して、好適な表面上に除去することができる。通常、サンプル混合物を含む容器の側部に磁石を置き、容器の壁に粒子を凝集させ、サンプルの残余を注ぎ出すことで充分である。
反応時の粒子の磁気凝集および塊状化を避けられるため、超常磁性粒子、例えばsintefによってEP-A-106873で開示される超常磁性粒子が特に好ましい。DYNABEADSとしてDynal AS(Oslo,Norway)によって販売される公知磁性粒子が、本発明で用いるのに特に好適である。
本発明で用いる機能化被覆粒子は、米国特許4,336,173号、4,459,378号および4,654,267号によるビーズの改質によって調製することができる。このように、ビーズまたは他の支持体は、異なったタイプの機能化表面持つように、例えば正の電荷、または疎水性を持つように調製することができる。弱くまたは強く正に荷電した表面、弱く負に荷電した中性の表面およびポリウレタン被覆などの疎水性表面が良好な作用を示す。
また、核酸を含む望ましい細胞、例えばウィルスなどを選択的に捕獲できるように改質した固体支持体の使用も可能である。このように、例えば、望ましい細胞のタイプに特異的な抗体、または他の結合タンパク質を担持した支持体を用いることができる。複合混合物中の望ましい標的原料からの核酸だけを分離できるため、これによって核酸の単離にある程度の選択性を導入できる。このようにして、例えば、このような支持体は、サンプルから望ましい細胞タイプ等を分離または除去するのに使用でき、その後、界面活性剤が加えられて、溶解、核酸の放出および支持体への結合が完遂される。
このような選択的細胞捕獲マトリックスの調製は、公知であり、文献に説明されている。
同様に、支持体には、核酸の選択的捕獲を補助するための結合パートナーを与えてもよい。例えば、相補的DNAまたはRNA配列、またはDNA結合タンパク質を用いることができ、あるいはウィルス核酸に結合するウィルスタンパク質も使用できる。このようなタンパク質の固体支持体への結合は公知の技術を用いて達成できる。
必須ではないが、本発明の単離方法に一回以上の洗浄工程を、例えばサンプルからの支持体の分離の後に、導入することが便利である。磁気ビーズの場合、これはビーズからDNAを放出させる前に行なうことが便利である。如何なる便利な洗浄用緩衝液または他の媒体も使用することができる。一般的に言って、低〜中イオン強度緩衝液、例えば10mMトリス-HCl pH8.0/10mM NaClが好ましい。所望により、他の標準的洗浄媒体、例えばアルコールを含むものも用いることができる。
分離工程、および所望による任意の洗浄工程に続いて、核酸を担持する支持体は、好適な媒体、例えば水または低イオン強度緩衝液に移し替え、例えば再懸濁または浸漬される。支持体および望まれる次の工程の性質によっては、支持体から核酸を放出させることが望ましい場合も望ましくない場合もある。
磁性または非磁性ビーズなどの粒子状固体支持体の場合、支持体は、多くの場合、例えばPCRまたは他の増幅に、支持体から核酸を溶出させることなく直接用いることができる。また、多くのDNA検出または同定法のためにも、溶出は必須ではない。なぜならば、DNAはランダムにビーズ表面と接触し、水素結合またはイオンまたは他の力によって多くの点で結合できるが、一般的に、オリゴヌクレオチドに対するハイブリッド形成および増幅のためには、得られるDNAの長さが充分であるからである。
しかしながら、所望ならば、核酸の溶出は、公知の手段、例えば加熱（例えば65℃で5〜10分間）し、次いで支持体を媒体から除去し、溶液中に核酸を残すことによって容易に達成することができる。このような加熱は、PCRにおけるサイクルプログラムの前のDNA変性工程によって自動的に得ることができる。
RNAをDNAから除去することが望ましい場合、これは、DNA分離工程前に、例えばRNAアーゼまたはNaOHなどのアルカリを加えてRNAを分解することで達成できる。
あるいは、上述したように、本発明の方法は、順次サンプルからDNAおよびRNAを分離するために用いることができる。また、本発明の方法は、RNA精製手法において、サンプルからDNAを除去するために用いることもできる。
便利には、逐次分離は、二つの異なる固体相、例えばDNAおよびRNAとで区別できる固体支持体を用いて行なうことができる。従って、このような方法は、上述したようにDNAを単離するための第一工程分離を行なうことを含んていてもよい。次いで、更なる固体支持体をサンプルに加えて、サンプル中に残されたRNAを捕獲することができ、これはRNAまたは残余の核酸を結合できる固体相、または（例えば相補的核酸プローブを担持することにより）特定RNA分子またはRNA分子のサブセット、例えばポリアデニル化RNAを捕獲できる固体相を用いることによる。このようにして、同一のサンプルからDNAおよびRNAまたは両者のサブセットを迅速に単離および分離することができる。これは、例えば単離されたDNAを測定することで、RNA抽出のために用いられる細胞の量を見積もるために有用であり、異なるサンプル間の参照データが得られる。
しかしながら、本発明のDNA単離手法は、予備工程として、容易に他のRNA精製手法と組み合わせることができ、例えば本発明に係る界面活性剤を用いたDNAの単離は、例えばLiClを用いた選択的RNA沈澱工程の前、またはGTCおよびサルコシルを用いたRNA分離の前に行なうことができる。
代表的な手法において、サンプルは界面活性剤の存在下に溶解され、DNAは固体支持体に結合され、その上支持体を除去することで、DNAはサンプルから容易に分離される。所望により、DNAは迅速かつ容易に、増幅または他の下流側の工程のために更に操作できる。次いで、RNAが分離できる。これは、上述したような、本発明の方法の繰り返しを含む固体相を基礎としたシステムによって、または従来の技術、例えば抽出、沈澱またはアフィニティクロマトグラフィーなどによって行うことができる。
本発明の特に有用な態様は、本発明の単離方法を用い、RNAの単離に先立ってサンプルからDNAを除去することであり、この利点は溶解サンプルの粘度を減少させ、かつRNA分子の特異的単離が望まれることにあり、これはまたRNAのDNA汚染の可能性を減少または回避させる。この様な方法は、また、迅速に完遂できるという利点を有している。
本発明は、特に粒子、さらに磁性粒子が支持体として用いられた場合に、自動化し易いという利点がある。
本発明の方法を行なうための様々な反応物および成分が、便利にキットの形態で供給できる。この様なキットは、本発明の更なる観点を示す。
最も単純には、本発明のこの観点では、固体支持体および一つ以上の界面活性剤からなる、サンプルからの核酸単離用キットを提供する。
このようなキットに任意に含まれるものは、緩衝液、塩、タンパク質分解酵素などの溶解剤、キレート化剤および還元剤などである。
RNAの単離には、キットは、更に、RNA単離用手段、例えばRNA単離用の第二支持体、例えば、RNA捕獲用プローブ（例えばオリゴdT）または所望の標的に対する相補的塩基配列のプローブを有する支持体、カオトロープまたは選択的沈澱剤を含んでいてもよい。
本発明を以下の非限定的実施例において詳細に説明するが、説明で参照される図面において：
図1は、実施例1で説明されるように単離されたDNAの光学密度のスキャン（横軸は吸光度(OD)を示し、縦軸は波長(nM)を示す）を示し、0.100の閾値で、最大吸光度(0.427)は257.6nMであり、最小吸光度(0.292)は236.4nMであり；
図2は、実施例1で説明されるように単離されたDNAサンプルのゲル電気泳動（レーン1：単離物；レーン2：λ Hind III（分子量マーカー））を示し；
図3は、実施例2のPCR製造物のアガロースゲル電気泳動（レーン1：PCR製造物；レーン2：λ Hind III；レーン3：ネガティブPCRコントロール）を示し；かつ
図4は、実施例5のPCR製造物のアガロースゲル電気泳動（レーン1：λ Hind III；レーン2および3：各々単離物AおよびB；レーン4および5：ネガディブコントロール；レーン6：λ Hind III）を示す。
図5は、従来技術で単離されたDNAと、Dynabeads DNA DIRECTを用いて単離されたDNAとの比較を示す。パネルＩは、全血液10μlから単離されたゲノムDNAの量を示し、任意の溶出工程を含みDynabeads DNA DIRECTを用いて単離（レーン1および2）、溶出工程を省略し、Dynabeads DNA DIRECTを用いて単離（レーン3および4）、および従来のDNA単離を用いて単離（レーン5および6）した場合である。レーン7における分子量マーカーは、λ Hind IIIである。パネルIIは、Dynabeads DNA DIRECTにより単離されたDNAの損なわれていない状態（完全性）を示す。レーン1および2は、各々男性ドナーおよび女性ドナーからDynabeads DNA DIRECTを用いて単離されたDNAの20μgからのAMXY PCRを示す。レーン4および5は、各々男性ドナーおよび女性ドナーから従来の方法で単離されたDNAの200ngからのAMXY PCRを示す。レーン3はネガティブコントロールである。
図6は、Dynabeads DNA DIRECTの再現性を示す。図では、各々が2人からの、5つの独立したDynabeads DNA DIRECT単離物を示す。10μlの血液から得られたDNAの半分が図の上部に示され、10%の単離DNAを用いて出発したPCR反応からの製造物の20%が図の下部に示される。分子量マーカーはλ Hind III（Mと記されたレーン）または100bpラダー（Lと記されたレーン）である。
図7は、異なる抗凝血物質の効果を示す。図では、抗凝血化されていない全血液からの、およびEDTE、クエン酸塩またはヘパリンで抗凝血化された血液からのDynabeads DNA DIRECT単離物が示される。同一の抗凝血物質を用いた2つの血液単離を、異なるドナー（AおよびB）からの血液について行なった。10μLの血液から得られたDNAの四分の一が、ヘパリンを除いて図の上部に示され、ヘパリンでは5μlから得られたDNAの半分が示されている。10%の単離DNAを用いて出発したPCR反応からの製造物の20%が、ヘパリンを除いて図の下部に示され、ヘパリンでは20%の単離DNAが出発物質として用いられた。
図8は、サンプル貯蔵条件の効果を示す。パネルＩは、新鮮な状態で、4日間冷蔵し、または4日間凍結して用いたEDTA血液からのDynabeads DNA DIRECT単離物を示す。同一の貯蔵条件での2つの血液単離を、異なるドナーからの血液について行なった。10μlの血液から得られたDNAの半分が図の上部に示され、10%の単離DNAを用いて出発したPCR反応からの製造物の20%が図の下部に示される。パネルIIは、新鮮な状態で、または空気乾燥して再度水和して用いたクエン酸血液からのDynabeads DNA DIRECT単離物を示す。同一の貯蔵条件での2つの血液単離を、異なるドナーからの血液について行なった。10μlの血液から得られたDNAの半分が図の上部に示され、10%の単離DNAを用いて出発したPCR反応からの製造物の20%が図の下部に示される。
図9は、骨髄および培養細胞からのDynabeads DNA DIRECTを示す。パネルＩは、各々二人のドナーからの1、2および5μlの骨髄からのDynabeads DNA DIRECT単離物を示す。レーン上のAまたはBは、ドナーの同一性を示す。得られたDNAの半分が図の上部に示され、10%の単離DNAを用いて出発したPCR反応からの製造物の20%が図の下部に示される。パネルIIは、4×105ダウジ(Daudi)細胞からの2つのDynabeads DNA DIRECT単離物を示す。得られたDNAの十分の一が図の上部に示され、全量が120μlの単離DNAの1μlを用いて出発したPCR反応からの製造物の20%が図の下部に示される。分子量マーカーは、ゲノムDNAについてはλ Hind IIIであり、PCR製造物に付いては100bpラダーである。
図10は、ホルマリン固定、パラフィン埋設材料からのDynabeads DNA DIRECTを示す。レーンAは、肝臓のホルマリン固定、パラフィン埋設切片からのDNA DIRECTによる単離DNAを用いて出発した反応からのPCR製造物の20%が示される。レーンMは分子量マーカー（100bpラダー）であり、レーンBはポジティブコントロール（20ngヒトDNA）であり、レーンCはネガティブコントロール（水からのPCR）である。
図11は、mRNA精製のためのDynabeads DNA DIRECTを示す。mRNAは、Dynabeads DNA DIRECTを用いたDNAの除去の後にDynabeads Oligo(dT)25を用いて、サンプル当り100万のダウジ細胞から単離された。DNA DIRECT Dynabeadsの量を増加させて、ゲノムDNAの除去に用いた；レーン1および2において1mg；レーン3および4において2mg；レーン5および6において5mg；レーン7および8において10mg。レーン9および１０はコントロールであり、直接的mRNA精製の前にDNAを除去しなかった。写真の上部の追加のバンドが、レーン9および１０におけるゲノムDNA汚染を示す。全てのレーンの2つの強いバンドはリボソームRNAを示す。
図12は、(A)バクテリア、(B)菌類、(C)シアノバクテリアおよび(D)植物からのDNA単離およびPCR増幅の結果を示す。全てのサンプルに付いて、DNAは200μlのDNA DIRECTを用いて単離（1サンプルテスト）され、20%の単離DNAおよび10%のRPC製造物がアガロース電気泳動で分析された。バクテリアに付いては、PCR反応当り2.5%の単離DNAが用いられ、他のサンプルについては5%が用いられた。16S rRNA領域が、バクテリアゲノムDNAおよびシアノバクテリア葉緑体DNAから増幅された。菌類およびシアノバクテリアのゲノムDNAからは、18S rDNAが増幅された。グループＩイントロン葉緑体trnLおよびゲノムB15C遺伝子の部分の増幅が、植物について示される。ネガティブコントロールは、DNAを用いずに、他の反応と同様の方法で調製されたサンプルについてのPCRである。
実施例1
細胞培養からのDNA単離
４ x 106 HL 60細胞を、PBSで二回洗浄し、ペレットにした。このペレットを、10μlのPBSに溶解し、0.1mlの溶解バッファ［5% SDS/10 mM TrisCl pH8.0/1 mM EDTA］に再懸濁させたトシル活性化Dynabeads▲Ｒ▼ M-280懸濁物（DYNAL A/Sオスロ、ノルウェーより入手、水中）をオートクレーブすることにより得られる1mgのDynabeads▲Ｒ▼ M-280*を加えた。これに、直ちに1mlの溶解バッファを加え、この懸濁物を室温で5分インキュベートし、その後DNAを結合したDynabeads▲Ｒ▼を、磁石に引き付け、液相を除去した。その後固相を、1mlの洗浄バッファ［50mM NaCl/10mM TrisCl pH8.0/1mM EDTA］で二回洗浄した。最後に、DNAを結合したビーズを、0.1mlの水に再懸濁させ、65℃で5分インキュベートした。このビーズを、磁石に引き付け、液相を取り出した。この液相を、そのDNA含量について分析した。光学密度スキャンの結果（図1）は、純粋なDNAと合致する。OD260/OD280比は1.72であり；水またはTE中の純粋なDNAは1.7〜1.9の比を有する。純粋なDNAについては、溶液のOD260より濃度を決定することができる。50μg/mlの溶液は、OD260=1.0を有する。OD260測定（表1）の0.436（0.1mlの全容量で10mmの光路長）から、収量は2.18μgのDNAと計算することができ、これは出発物質のDNA見積り含量2.67μgの82%である。単離DNAの試料のゲル電気泳動（図2）は、そのほとんどが高分子形態(>20kb)であることを示す。
0003787354.tif 000002
実施例2
全血からのDNAの単離および溶出しない酵素適用
5μlの全血(EDTA血）を、50μlの5% SDSに溶解し、5μlのPBS中の50μgのDynabeads▲Ｒ▼ M-280*を加えた。この溶解物を、1分室温でインキュベートし、0.5mlのTrisCl pH7.5を加えた。この溶解物を、さらに1分室温でインキュベートし、DNAを結合したビーズを磁石に引き付け、液相を除去した。その後このビーズを、0.5mlの10mM TrisCl pH7.5で一度洗浄し、このDNAを結合したビーズを40μlのTE(10mM TrisCl pH8.0/1mM EDTA)に再懸濁させた。４μｌの単離物を、PCR（実施例7で記載したGAPDH PCR）のための出発物質に用いた。PCR反応は、アガロースゲル電気泳動で視覚化されるぐらい（図３）大量の生成物を与えた。50μlのPCR反応物の内10μlを、ゲルに載せた。
実施例3
溶解バッファおよび洗浄バッファの以下の組合せを用いて実施例1を繰り返し、以下の結果を得た。
（ここで、+++は非常に良好なDNA単離を示す。）
0003787354.tif 000003
実施例4
実施例1の操作を辿ると、未被覆Dynabeads▲Ｒ▼ M-450（Dynal A/S,オスロ、ノルウェー）を用いて同様の結果を達成することができる。
実施例5
免疫磁気分離を用いて血液から得られたCD2陽性細胞からのDNAの単離
この実験は、二つの同様の単離からなっていた。50μlの血液を、50μlのPBS［150mM NaCl/10mM Na2HPO4,pH7.4］および10μl(4 x 106ビーズ）のDynabeads▲Ｒ▼ M-450 Pan-T(CD2)(Dynal AS,オスロ、ノルウェーより入手可能）と混合した。この混合物を、静かに傾けて回転させながら、室温で30分間インキュベートした。細胞/ビーズ複合体を、磁石に引き付け、液体を取り出した。この細胞/ビーズ複合体を、200μlのPBSで四回洗浄し、200μgのDynabeads▲Ｒ▼ M-280*（同上）および200μlの溶解バッファ[100mM Tris-HCl,pH8.0/500mM LiCl/10mM EDTA,pH8.01/1% LiDS]を加えた。この混合物を、室温で5分間インキュベートし、DNA/ビーズ複合体を磁石引き付け、上澄みを除去した。DNA/ビーズ複合体を、200μlの洗浄バッファ[10mM Tris-HCl,pH8.0/150mM LiCl/1mM EDTA,pH8.0]で二回洗浄し、50μlの水に再懸濁させた。65℃で5分後、ビーズを磁石に引き付け、上澄みを新しい管に移した。5μlの上澄みを、ポリメラーゼ連鎖反応（実施例７で記載したGAPDH PCR）の鋳型として用い、この反応は、アガロースゲル電気泳動で視覚化されるぐらい（図4）大量の生成物を与えた。
実施例6
伝統的方法または本願の方法で単離されたDNA間の収量および完全さの比較
フェノール抽出およびエタノール沈澱に基づいた伝統的方法を用いて、ゲノムDNAを5mlのEDTA抗凝固性の血液から単離した。Dynabeads DNA DIRECT（Dynal A/S,オスロ、ノルウェーより市販され、実施例1で記載したDynabeads▲Ｒ▼ M-280*と等価のビーズを含有したキット）を用いて、同じ血液試料の10μlからの四種の単離を行った。二つの単離物からのDNAを65℃で5分間溶出し、一方、他の二つの単離物からのDNAをDynabeadsの存在下で放置した。四つのDynabeads DNA DIRECT単離物からの全てのDNAを、伝統的に単離されたDNAの0.2%ぐらいアガロースゲルに載せた。載置した伝統的に単離されたDNAのフラクションは、血液10μlからの収量に相当する（5mlの0.2%）。
伝統的なDNA単離を、Johnらの方法(John,S.W.M.,G.Weitzner,R.RosenおよびC.R.Scriver.1991.A Rapid Procedure for Extracting Genomic DNA from Leukocytes.Nucl.Acid.Res.19(2):408）に従って行った。
Dynabeads DNA DIRECTを用いて、血液の溶解物は、200μlのDynabeads DNA DIRECT（一つの試料試験）を、10μlの血液と、1.5mlのマイクロ遠心分離管中で混合することで得た（溶解/結合バッファ中200μgの非被膜Dynabeads）。溶解物を、台の上に室温で5分間放置し、ゲノムDNAをDynabeadsに吸着させた。
DNA/Dynabeads複合体を磁石（Dynalの磁気粒子回収器E(Magnetic Particle Collector E)(MPC-E)に引き付け、この溶解物を吸引し、廃棄した。
この複合体を、洗浄バッファ（キット部品の一つ）中でDynal MPCに引き付け、上澄みを廃棄することで、二回洗浄した。最後に、この複合体を、10μlのTE pH8.0（キットにて供給される）で再懸濁させた。
溶出を行った際に、この溶出を、懸濁物を65℃で5分間加熱すること、およびビーズを磁石に引き付けることで行った。DNA含有水相を取り出し、実験に用いた。
このDNAを、エチジウムブロミド染色した1.5%アガロースゲル上で視覚化した。電気泳動は、1 x TAEバッファ中で行い、結果をDS34ポラロイドカメラおよびポラロイド667フィルムを用いて記録した。
この実験の結果を、図５のパネルＩに示す。血液1μl当たりの収量は、この二つの方法（レーン1〜4対  レーン5〜6）に関して同様であり、溶出工程の間で非常に少ないDNAを損失している（レーン1〜2対  レーン3〜4）。また、λ Hind III分子量マーカーのバンドである23.13kbより遅いため、両方の方法からのDNAの分子量は、20kbを超える。
DNA DIRECTを、一人は男性でありもう一人は女性である、二人の異なるドナーからのACD血液からDNAを単離するために用いた。単離物の各々から、10%を、二つの伝統的なDNA単離物の各々から200ngとなるように、X-Yホモローグアメロゲニン(X-Y homologous amelogenin)(AMXY)遺伝子（Akane,A.,K.,Matsubara,H.Nakamura,S.TakahashiおよびK.Kimura.1994.Purification of Highly Degraded DNA by Gel Filtration for PCR.BioTechniques16(2)：235-238）のアンプリコン(amplicon)のPCR増幅用の出発物質として用いた。
DNA DIRECTおよび伝統的なDNA単離は、この実施例の最初の部分に記載したように行われた。
全PCR反応を50μl反応容積にて行い、10 x PCRバッファ(Perkin Elmer)を１ xの最終濃度まで加え、dNTP(pharmacia)を0.2mMの最終濃度まで加え、および1ユニットのアンプリタック(amplitaq)(Perkin Elmer)を反応ごとに用いた。5pmolのそれぞれのプライマーAMXY-1F（5′-CTGATGGTTGGCCTCAAGCCT-GTG-3′)およびAMXY-4R(5′-TTCATTGTAAGAGCAAAGCAAACA-3′)を反応ごとに加えた。PCRを、Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600で行った。AMXYアンプリコンのためのPCR条件は、94℃で4分、38x［94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分］、72℃で10分であった。
50μlのPCR反応物の内10μlを、エチジウムプロミド染色した1.5%アガロースゲル上で視覚化した。電気泳動は、1 x TAEバッファ中で行い、結果はDS34ポラロイドカメラおよびポラロイド667フィルムを用いて記録した。
この実験の結果を、図5のパネルIIに示す。X-Yホモローグアメロゲニン遺伝子は、DNA劣化に対して敏感であることが知られている(Akane et al1994,上記）。劣化の増加については、908bp長のXバンドが、719bp長のYバンドに比べて、徐々に弱くなっている。図5のパネルIIより、XおよびYバンドの相対強度は、Dynabeads DNA DIRECT法および伝統的な方法を用いて単離されたDNAについて匹敵し、二つの方法については劣化度が同じであることを示していることは明らかである。伝統的に単離されたDNAからのPCR反応は、DNA DIRECT単離されたDNAからの反応よりも幾分か多くの生成物を与えた。これの理由は、伝統的に単離されたDNAからのPCR反応では、DNA DIRECT単離されたDNAからのPCR反応におけるよりも、10倍多い鋳型が用いられたことである。
0003787354.tif 000004
実施例7
二人のドナーのそれぞれの血液試料からの5種の独立なDNA単離
この実験に関し、我々は、Dynal AS,オスロ、ノルウェーより市販されているDynabeads DNA DIRECTキットを用いた。バッファの組成は、実施例6に記載した通りである。
5種のDNA単離は、二人の比較的低い白血球カウントのクエン酸処理された血液試料（試料A：3.6 x 106細胞/ml、試料B：2.6 x 106細胞/ml）のそれぞれより行われた。
血液の溶解物は、200μlのDynabeads DNA DIRECT（一つの試料試験）を、血液と、1.5mlのマイクロ遠心分離管中で混合することで得た。溶解物を、台の上に室温で5分間放置し、ゲノムDNAをDynabeadsに吸着させた。
DNA/Dynabeads複合体を磁石（Dynalの磁気粒子回収器E(MPC-E))に引き付け、この溶解物を吸引し、廃棄した。
その後、この複合体を、洗浄バッファ（キット部品の一つ）中でDynal MPCに引き付け、上澄みを廃棄することで、二回洗浄した。最後に、この複合体を、40μlのTE pH8.0（キットにて供給される）で再懸濁させた。この再懸濁物は、溶出なしでPCRおよびゲル電気泳動に用いた。
単離物の各々から、10%を、グルセルアルデヒドホスフェートジヒドロゲナーゼ(DAPDH)遺伝子のアンプリコン(amplicon)のPCR増幅用の出発物質として用いた。全PCR反応を50μlの反応容積にて行い、10 x PCRバッファ(Perkin Elmer)を1 xの最終濃度まで加え、dNTP(Pharmacia)を0.2mMの最終濃度まで加え、および1ユニットのアンプリタック(amplitaq)(Perkin Elmer)を反応ごとに用いた。それぞれ5pmolのプライマーGAPDH-Forward(5′-ACAGTCCATGCCATCACTGCC-3′)およびGAPDH-Reverse(5′-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′）を反応ごとに加えた。PCRを、Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600で行った。GAPDHアンプリコンのためのPCR条件は、94℃で4分、34 x［94℃で30秒、61℃で30秒、72℃で1分］、72℃で10分であった。
ゲノムDNAおよびPCR生成物の両方を、エチジウムブロミド染色した1.5%アガロースゲル上で視覚化した。50μlの反応物の内10μlを、単離ゲノムDNAの50%となるように、アガロースゲルに載せた。電気泳動は、１ x TAEバッファ中で行い、結果はDS34ポラロイドカメラおよびポラロイド667フィルムを用いて記録した。
この実験の結果を、図6に示す。異なる単離物間で、有意差は観察されなかった。他の凝集剤を用いて、並びにより高い白血球カウントのドナーからも同様の結果を得た。
実施例8
異なる抗凝集剤を有する血液からのDNA単離
Dynabeads DNA DIRECT（Dynal AS,オスロ、ノルウェーより市販されているキット）を用いて、未処理の全血、並びにEDTA、クエン酸塩またはヘパリンで抗凝集化した血液からDNAを単離した。出発物質のそれぞれのタイプからは、異なるドナーからの血液を用いて、二つの別々の単離を行った。キットにおけるバッファの成分は、実施例6に記載した通りである。
血液からの細胞を含むDNAの溶解物は、200μlのDynabeads DNA DIRECT（一つの試料試験）を、5μlのヘパリン血液または10μlの他の血液試料と、1.5mlのマイクロ遠心分離管中で混合することで得た。溶解物を、台の上に室温で5分間放置し、ゲノムDNAをDynabeadsに吸着させた。
DNA/Dynabeads複合体を磁石（Dynalの磁気粒子回収器E(MPC-E))に引き付け、この溶解物を吸引し、廃棄した。
その後、この複合体を、洗浄バッファ（キット部品の一つ）中でDynal MPCに引き付け、上澄みを廃棄することで、二回洗浄した。最後に、この複合体を、20〜40μlのTE pH8.0（キットにて供給される）で再懸濁させた。我々は、40μlを標準容積として用いたが、出発物質がヘパリン血液であるならば20μlを用いた。
単離物の各々から、10%（ヘパリン試料からは20%）を、グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ(DAPDH)遺伝子のアンプリコン(amplicon)のPCR増幅用の出発物質として用いた。PCRを、Dynabeads存在下で、TEの懸濁物に対して直接行った。全PCR反応を50μlの反応容積にて行い、10 x PCRバッファ(Perkin Elmer)を１ xの最終濃度まで加え、dNTP(Pharmacia)を0.2mMの最終濃度まで加え、および1ユニットのアンプリタック(amplitaq)(Perkin Elmer)を反応ごとに用いた。それぞれ5pmolのプライマーGAPDH-Forward(5′-ACAGTCCATGCCATCACTGCC-3′)およびGAPDH-Reverse(5′-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′)を反応ごとに加えた。PCRを、Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600で行った。GAPDHアンプリコンのためのPCR条件は、94℃で４分、34 x［94℃で30秒、61℃で30秒、72℃で1分］、72℃で10分であった。
50μlの反応物の内10μlを、単離ゲノムDNAの25%（ヘパリン試料からは50%）となるように、アガロースゲルに載せた。ゲノムDNAおよびPCR生成物の両方を、エチジウムブロミド染色した1.5%アガロースゲル上で視覚化した。電気泳動は、１ x TAEバッファ中で行い、結果はDS34ポラロイドカメラおよびポラロイド667フィルムを用いて記録した。
この実験の結果を、図7に示す。ヘパリン化した試料からの単離が、たった5μlの血液からであったため、PCRのための出発物質としてこれらの単離物からのDNAの20%を用いることは、10μlの血液からのものである、他の単離物からの10%を用いることと比較できる。このことを考慮に入れたとき、用いられる抗凝集剤のタイプが結果に対して有意な影響を及ぼさないことは明らかである。
ここで記載した実験において、ヘパリンリチウムを用いた。たとえ、ヘパリンリチウムが他の系において阻害効果を有することが示されていたが（Panaccio,M.,M.GeorgeszおよびA.M.Lew.1993.FoLT PCR:A Simple PCR Protocol for Amplifying DNA Directly from Whole Blood.BioTechniques14(3):238-243）、この系において、ヘパリンリチウムおよびヘパリンナトリウムについては同様の結果が得られた。DNA DIRECTは、ACD（図5のパネルII）またはCPD（データ示さず）で抗凝集化した血液に対しても、十分に動作した。
実施例9
異なる条件下で保存した血液試料からのDNAの単離
Dynabeads DNA DIRECT（Dynal AS,オスロ、ノルウェーより市販されているキット）を用いて、二人の異なるドナーからのEDTA血液からDNAを単離した。残りの血液試料を二つに分け、一方の部分を4℃で保存し、もう一方の部分を-20℃で保存した。4日後、凍結した試料を溶かし、凍結した試料と+4℃で保持した試料との両方からDNAを単離した。キットのバッファの成分は、実施例6に記載した通りである。
血液の溶解物は、200μlのDynabeads DNA DIRECT（一つの試料試験）を、血液と、1.5mlのマイクロ遠心分離管中で混合することで得た。その後、溶解物を台の上に室温で5分間放置し、ゲノムDNAをDynabeadsに吸着させた。
DNA/Dynabeads複合体を磁石（Dynalの磁気粒子回収器E(MPC-E))に引き付け、この溶解物を吸引し、廃棄した。
その後、この複合体を、洗浄バッファ（キット部品の一つ）中でDynal MPCに引き付け、上澄みを廃棄することで、二回洗浄した。最後に、この複合体を、40μlのTE pH8.0（キットにて供給される）で再懸濁させた。PCRおよびアガロースゲル電気泳動の両方を、Dynabeadsの存在下で、TEの懸濁物に対して直接行った。
6種の単離物（新鮮、冷蔵および凍結）の各々から、10%を、実施例8で記載したようにDAPDHアンプリコン(amplicon)のPCR増幅用の出発物質として用いた。ゲノムDNAおよびPCR生成物の両方を、エチジウムブロミド染色した1.5%アガロースゲル上で視覚化した。50μlの反応物の内10μlを、単離ゲノムDNAの50%となるように、アガロースゲルに載せた。電気泳動は、１ x TAEバッファ中で行い、結果は、DS34ポラロイドカメラおよびポラロイド667フィルムを用いて記録した。この実験の結果を、図8のパネルＩに示す。この系では、+4または-20℃で4日保存では悪影響が観察されなかった。
この実施例の最初の方で記載したようにDynabeads DNA DIRECTを用いることにより、DNAを二つのクエン酸塩処理の血液試料から単離し、また同じ二つの試料から10μlをプラスチック表面にスポットし、室温で空気乾燥させた。乾燥した血液スポットを1.5ml管に移し、40μ1のPBSを加え、この管を室温で静かに攪拌しながら90分間放置し、DNAをDynabeads DNA DIRECTとともに単離した。4種の単離物の各々（新鮮および乾燥）より、10%を実施例8で記載したようにDAPDHアンプリコン(amplicon)のPCR増幅用の出発物質として用いた。ゲノムDNAおよびPCR生成物の両方を、エチジウムブロミド染色した1.5%アガロースゲル上で視覚化した。50μlの反応物の内10μlを、単離ゲノムDNAの50%となるように、アガロースゲルに載せた。電気泳動は１ x TAEバッファ中で行い、結果はDS34ポラロイドカメラおよびポラロイド667フィルムを用いて記録した。この実験の結果を、図8のパネルIIに示す。乾燥血液からの収量は良好であり、単離DNAはPCRに好適である。
実施例10
骨髄および培養細胞からのDNAの単離
骨髄からのDNA単離
健康な二人のドナーの各々からのヘパリン化した骨髄の1、2および5μlを、DNA DIRECTでのDNA単離のための出発物質として用いた。バッファの組成は、実施例6に記載した通りである。骨髄の溶解物は、200μlのDynabeads DNA DIRECT（一つの試料試験）を、ヘパリン化した骨髄と、1.5mlのマイクロ遠心分離管中で混合することで得た。その後、溶解物を台の上に室温で5分間放置し、ゲノムDNAをDynabeadsに吸着させた。
DNA/Dynabeads複合体を磁石（Dynalの磁気粒子回収器E(MPC-E))に引き付け、この溶解物を吸引し、廃棄した。
その後、この複合体を、洗浄バッファ（キット部品の一つ）中でDynal MPCに引き付け、上澄みを廃棄することで、二回洗浄した。最後に、この複合体を、40μlのTE pH8.0（キットにて供給される）で再懸濁させた。PCRおよびアガロースゲル電気泳動の両方を、Dynabeadsの存在下で、TEの懸濁物に対して直接行った。
6種の単離物の各々から、10%を、実施例8で記載したようにDAPDHアンプリコン(amplicon)のPCR増幅用の出発物質として用いた。
ゲノムDNAおよびPCR生成物の両方を、エチジウムブロミド染色した1.5%アガロースゲル上で視覚化した。50μlの反応物の内10μlを、単離ゲノムDNAの50%となるように、アガロースゲルに載せた。電気泳動は、１ x TAEバッファ中で行い、結果はDS34ポラロイドカメラおよびポラロイド667フィルムを用いて記録した。
この実験の結果を、図9のパネルＩに示す。出発物質容積当たりの収量が、血液（図5〜8）からよりも骨髄からの方が高いということは、図9のパネルＩから明らかである。DNA含有細胞の濃度が血液中よりも骨髄中の方が非常に高いため、これは予期されることである。5μlの骨髄は、DNA DIRECTの一回の試料試験により扱うことのできる上限に近い。試料サイズおよびDNA収量の間での良好な相関が、1〜5μlの試料サイズ間隔において観察されたが、1μlからの収量でさえもが少なくとも10回のPCR反応のために充分である。
培養細胞からのDNAの単離
4 x 105のダウジ細胞(Daudi cells)の二つの試料を、DNA DIRECTを用いるDNA単離のための出発物質として用いた。4 x 105の培養細胞（ダウジ細胞系）からのDNA単離を、Dynabeads DNA DIRECTの1ml（5つの試料試験）を用いた以外は、上述のように行った。したがって、洗浄工程は、1mlの洗浄バッファ中で行った。DNA/Dynabeads複合体を、120μlTE中で再懸濁し、骨髄に関しては、再懸濁後の溶出工程を行わなかった。
単離物の各々から、全量120μlの内1μlを、実施例8で記載したようにDAPDHアンプリコン(amplicon)のPCR増幅用の出発物質として用いた。
ゲノムDNAおよびPCR生成物の両方を、エチジウムプロミド染色した1.5%アガロースゲル上で視覚化した。50μlの反応物の内10μlを、単離ゲノムDNAの10%となるように、アガロースゲルに載せた。電気泳動は、1 x TAEバッファ中で行い、結果はDS34ポラロイドカメラおよびポラロイド667フィルムを用いて記録した。
この実験の結果を、図9のパネルIIに示し、これは、少なくとも120PCR反応をこの規模の単離物から続けることができることを示している。
実施例11
ホルマリン固定しパラフィンに埋め込んだ肝切片からのDNAの単離
Dynabeads DNA DIRECT（Dynal AS,オスロ、ノルウェーより市販されているキット）を用いて、ホルマリン固定しパラフィンに埋め込んだ肝切片からDNAを単離した。キットのバッファの成分およびビーズ濃度は、実施例６に記載した通りである。
過剰のパラフィンを、メスの刃を用いて試料の端部より除去した。試料の溶解物は、200μlのDynabeads DNA DIRECT（一つの試料試験）を、1.5mlのマイクロ遠心分離管中の試料に添加することで得た。その後、溶解物を台の上に室温で5分間放置し、ゲノムDNAをDynabeadsに吸着させた。DNAおよびDynabeadsを含有する溶解物を細胞の破片およびパラフィンは残して新しい管に移した。
DNA/Dynabeads複合体を磁石（Dynalの磁気粒子回収器E(MPC-E))に引き付け、この溶解物を吸引し、廃棄した。
その後、この複合体を、洗浄バッファ（キット部品の一つ）中でDynal MPCに引き付け、上澄みを廃棄することで、二回洗浄した。最後に、この複合体を、10μl滅菌水で再懸濁させた。Dynabeadsを含有するこの懸濁物を、実施例8で記載したようにDAPDHアンプリコン(amplicon)のPCR増幅用の出発物質として用いた。PCR生成物を、エチジウムブロミド染色した1.5%アガロースゲル上で視覚化した。50μlの反応物の内10μlを、アガロースゲルに載せた。電気泳動は、１ x TAEバッファ中で行い、結果はDS34ポラロイドカメラおよびポラロイド667フィルムを用いて記録した。この実験の結果を、図10に示す。PCR増幅可能な材料は、明らかに、ホルマリン固定しパラフィンに埋め込んだ肝切片から得られた。
実施例12
mRNA単離前のDNA DIRECTを用いたゲノムDNAの除去
mRNAを、試料ごとに100万個のダウジ細胞から単離した。細胞を、0.75mlの溶解/結合バッファを用い、バッファ中DNA DIRECT Dynabeads存在下で溶解した。この試料を、5分間インキュベートし、DNA-Dynabeads複合体を、DynalのMPC-Eを2分間用いることで回収した。試料ごとに1、2、5および10mgの異なる量のDNA DIRECTビーズを用いてゲノムDNAを除去した（図11）。
各試料からの溶解物を、標準的な操作（DynalのmRNA DIRECTキットプロトコル）に従って、1mgのDynabeadsオリゴ(dT)25を含む新しい管に移した。Dynabeadsを、上記溶解物と混合し、ポリアデニル化mRNAを、室温で5分間ハイブリッド化することにより捕獲した。mRNA-Dynabead複合体を、MPC-E磁石を用いて、管を磁石台に2分間載せることで回収した。溶液を除去して廃棄した。LiDSを含む洗浄溶液(0.75ml)を加え、ピペットで吸引、排出することでビーズを完全に洗浄した。mRNA-Dynabead複合体を磁石を用いて回収し、洗浄操作を、LiDS含有洗浄バッファを用いて一回繰り返し、界面活性剤を含まない洗浄バッファを用いて二回繰り返した。最後に、精製されたmRNAを、20μlの5mM Tris-HCl pH7.5バッファ中で、65℃で2分間インキュベートすることにより、Dynabeadsより溶出させた。溶出物を、エチジウムブロミドを用いた1.0%アガロースゲル中の未変性ゲル電気泳動により分析した。図11に、この実験からの結果を示す。
EtBr-染色は、二次構造に起因して二重鎖DNAおよびrRNAの両方を現わす。二本のリボソームRNAバンドが、全てのレーンにおいて明瞭に視覚化されている。図11のレーン9〜10において、幾らかのゲノムDNAが、mRNA精製操作後の混入物として存在している。DYNALからの推奨mRNA操作では、細胞溶解後にDNA切断工程を挿入し、DNA混入の可能性を低減させている。DNA DIRECTビーズでのDNA除去を用いることにより、この切断工程は必要ない。
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実施例13
DNA単離のための一般的な方法：
PCR用のバクテリア、菌類、藻類、植物および脊椎動物からのDNA
大腸菌(E.Coli)およびバセイルス・セレウス(Baceillus cereus)は、LB媒体中で37℃で一夜育て、アグロバクテリウム・テュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)は、YEB媒体中で約40時間28℃で一夜育てた(Sambrook,J.et al.,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbour Laboratory,NY.)。シアノバクテリアおよびプロクロルトリクス(Prochlorthrix)は、NIVA媒体中で、14日間18℃で、20ミクロアインシュタインの照度を用いて育てた（Norwegian Institute of Water Research,1991,藻類の培養回収）。2億〜20億のバクテリアまたは450,000のシアノバクテリアを、DNA単離ごとに用いた。
2%マルト抽出物を含有する寒天培地板を、菌糸体成長に用い、14日間室温でインキュベートした。菌糸体を、スパチュラを用いて上記寒天培地板の表面を擦ることにより単離した。菌類の子実体を、天然の個体群から得た。空気乾燥および新鮮な菌類の子実体を、それぞれ1〜3mgおよび3〜20mgの範囲において、DNA単離ごとに用いた。
パン酵母であるサッカロマイセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisiae)を、商業的な提供者より得た。藻類は、IMR媒体中7日間照明下で培養した(Eppley,R et al.,1967,Exp.Mar,Biol.Ecol.1,191-208)。アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)およびオオムギ(Hordeum vulgare)の新鮮な葉を、若い植物（3週間令）から摘んだ。上皮を、パーチ(Perca fluvatilis)のひれから得た。約1mgの湿重量の酵母、30〜100mgの若い植物の葉および100〜400mgのパーチを、DNA単離ごとに用いた。
堅い細胞壁を有する多細胞組織を、機械的に壊し、DNA収量を上げた。菌類の子実体は、フォアセプス(foreceps)を用いて約2分間すりつぶした。植物葉は、2分間液体窒素中で乳棒を用いて均質化した(Kontes Scientific Instruments,Vineland,New Jersey,USA)。他の全ての試料については、細胞を破壊するのに機械的作業を必要としなかった。
DNA単離
Dynabeads DNA DIRECT（Dynal AS,オスロ、ノルウェーより市販されているキット）を用いて、DNA単離を行った。細胞および器官の溶解物は、200μlのDynabeads DNA DIRECT（溶解/結合バッファ中200μg未被膜Dynabeads）を、試料と、1.5mlのマイクロ遠心分離管中で混合することで得た。その後、溶解物を台の上に室温で5〜15分間放置し、ゲノムDNAをDynabeadsに吸着させた。幾つかのバクテリア、および植物については、65℃15分間のインキュベーションを用いて、吸着工程前の溶解を向上させた。
DNA/Dynabeads複合体を磁石（Dynalの磁気粒子回収器E(MPC-E))に引き付け、この溶解物を吸引し、廃棄した。
その後、この複合体を、洗浄バッファ（キット部品の一つ）中でDynal MPCに引き付け、上澄みを廃棄することで、二回洗浄した。最後に、この複合体を、40μlのTE pH8.0（キットにて供給される）で、激しくピペット処理することにより再懸濁させた。懸濁物を65℃で5分間加熱し、ビーズを磁石に引き付けることにより、溶出を行った。DNA含有水相を取り出し、実験に用いた。
DNAを、エチジウムブロミド染色した1.5%アガロースゲル上で視覚化した。
電気泳動は、1 x TAEバッファ中で行い、結果はDS34ポラロイドカメラおよびポラロイド667フィルムを用いて記録した。
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DNA DIRECT単離プロトコルからの収量の評価については、標準的なフェノール/クロロホルム-ベースの方法を用いた。藻類、脊椎動物およびバクテリアDNAは、上記Sambrook,J.et al.,1989,に記載されたプロトコルを用いて単離した。シアノバクテリアは、単離前にアルミナタイプA-5(Sigma Chemicals Co., St.Louis,USA)を用いて均質化し、完全な溶解を確実にした。植物および菌類のDNAはScot,O.R.およびBendich,A.J.,1994,“Plant Molecular Biology Manual”,page D1:1-8,Kluwer Academic Publisher,Belgiumに記載されたプロトコルを用いて単離した。
PCR増幅
各試料タイプに関して、再現性を、別々のDNA単離物、連続的なDNA希釈および種々のPCRアッセイを用いることにより試験した。DNA単離試薬およびPCR試薬は、別々の各実験において混入物をなくすために制御した。全てのPCR反応は、15pmolのプライマー、200μMのdNTP、10mMのTris-HCl pH8.8、1.5mMのMgCl2、50mMのKCl、0.1% Triton x-100、1ユニットのDynaZyme熱安定性のポリメラーゼ(Finnzymes Oy,Finland)および0.1-5μlの単離DNAを含有する50μl反応容積で行った。PCRは、Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600で行った。
アプリコン(amplicon)およびオリゴヌクレオチドプライマー
全てのPCR反応を、94-97℃で3〜5分間のDNA変性工程で開始し、72℃で5分間の伸長工程で終了した。
バクテリアおよび藻類：
アンプリコン(amplicon)は、バクテリアおよび藻類の葉緑体からのIUD番号付け(Brosius,J.,et al.,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,57,4801-4805)に従った、大腸菌(E.Coli)塩基334〜939に対応する16S rRNA領域であった。
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プライマーCCは、-21 M13共通プライマーに相補性の5′末端を有し、このことはそれをDNAの直接シークエンシングに好適にしている。増幅：96℃で15秒間および70℃で2分間の30サイクル。
藻類：
18S rRNA領域を、Medlin et al.,1990,Gene,71,491-499に記載されたプライマーAおよびBを用いて増幅した。
増幅：94℃で30秒間、50℃で1分間および72℃で1分間の35サイクル。
菌類：
18S rRNA領域（約600bp.）を、White et al.,1990.Innis,M.A.et al.,による“PCR Products,a Guide to Methods and Applications”,page 315-322,Academic Press,New Yorkに記載されたプライマーNS3およびNS4を用いて増幅した。
増幅：94℃で30秒間、53℃で30秒間および72℃で1分間の5サイクル；続いて、94℃で30秒間、50℃で30秒間（各サイクルごとに15秒ずつ増やす）および72℃で1分間の25サイクル。
植物：
葉緑体中のtRNAグループＩイントロンを、Fangan et al.,1994,BioTechniques 16,484-494に記載されたプライマーCおよびDを用いて増幅した。
増幅：94℃で30秒間、55℃で30秒間および72℃で1分間の30サイクル。
アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)遺伝子BI5C(800bp)の一部分を以下のプライマーを用いて増幅した。
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増幅：94℃で30秒間、59℃で30秒間および72℃で1分間の35サイクル。
オオムギ(Barley)遺伝子Bl5C(800bp)の一部分を以下のプライマーを用いて増幅した。
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増幅：94℃で30秒間、60℃で30秒間および72℃で1分間の35サイクル。
パーチ(perch)：
ミトコンドリアD-ループフラグメント(800-900bp)を、Hoelzel et al.,1991,Mol,Biol.Evol.,8,475-493に記載されたプライマーHV2、および以下のプライマーを用いて増幅した。
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増幅：96℃で1分間、52℃で2分間および72℃で2分間の30サイクル。
増幅したフラグメントを、エチジウムブロミド染色した1.5%アガロースゲル上で視覚化した。電気泳動は、1 x TAEバッファ中で行い、結果はDS34ポラロイドカメラおよびポラロイド667フィルムを用いて記録した。
この実験の結果を、図12および表2に示す。
バクテリア：
標準的なプロトコルは、試験したバクテリアに関して、100-1000ngの範囲のDNA収量を与えた（図12A）。幾つかのシアノバクテリアに関しては、余分の初期インキュベーション工程（65℃で15分間）を用いた溶解の向上により、DNA収量が実質的に増加した（500ngから1mg以上まで）。全ての場合において、0.25%の単離DNAを用いることにより良好な増幅が得られた。
菌類：
最高のDNA収量は新鮮な子実体(100-200ng)と比較して、乾燥した子実体(300-500ng)から得られた（図12B）。菌糸体は、おそらく試料ごとの細胞数が低いため、低いDNA回収を与えた。しかしながら、ほとんどの場合において、5%の単離DNAが、見事なPCR生成物を与えるのに十分であった（表2、図12B）。子実体に関しては、0.5-5%のDNAを、各PCRに用いた。
藻類：
試験した全ての藻類は、標準的なプロトコルおよびDNA DIRECTの一つの試料試験を用いることで、200-400ngの範囲のDNA収量を与えた（表2、図12C）。見事なPCR結果が、ゲノムDNAおよび葉緑体DNAの増幅の両方について、PCR反応ごとに5%の単離DNAを用いることにより得られた。
植物：
植物の葉から良好なDNA収量を得るためには、液体窒素中での均質化が必要であった。余分の初期インキュベーション工程（65℃で15分間）はまた、結果を向上させた（図12D）。見事なPCR結果が、ゲノムDNAおよび葉緑体DNAの増幅の両方について、PCR反応ごとに5%の単離DNAを用いたときに得られた。
魚類：
300-500ngのDNA収量が、標準的なプロトコルおよび一つの試料試験を用いることで、魚のひれからルーチンに得られた（表2）。ミトコンドリアDNAが、5%の単離DNAを用いることで見事に増幅された。
試験した全ての種からのPCR生成物は、固相シークエンシング(Hultman et al.,1989,Nucleic Acids Res.,17,4937-4946）により直接的な配列決定が容易にできた。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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