(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体試料中の抗原あるいは抗体と特異的に反応する抗体あるいは抗原を固定化した不溶性粒子と被検体試料中の抗原あるいは抗体とを凝集反応させ、生じた凝集混合液に対する光照射による吸光度変化または散乱光変化を測定する免疫測定方法において、前記被検体試料として全血を用い、この全血を、低張液と混合、凍結融解、または超音波振動を与えるのいずれかの手法により、強制的に溶血させるようにしたことを特徴とする血漿成分の免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、免疫測定方法に関し、より詳しくは、被検体試料中の抗原あるいは抗体と特異的に反応する抗体あるいは抗原を固定化した不溶性粒子と被検体試料中の抗原あるいは抗体とを凝集反応させ、生じた凝集混合液に対して近赤外光または赤外光を照射し、そのときの吸光度変化または散乱光変化を測定するようにした免疫測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術およびその欠点】
前記免疫測定方法として、特公昭５８−１１５７５号公報に開示されるものがある。すなわち、この公報の方法は、抗原あるいは抗体を固定化した不溶性担体と体液試料中の抗体あるいは抗原とを抗原抗体反応させ、その反応混合液に６００〜２４００ｎｍから選ばれた波長の光を照射し、その吸光度の増加を測定するものである。この方法は、その有用性から所謂ラテックス免疫比濁法として、現在では免疫測定の主流となっている。
【０００３】
ところが、上記測定方法において用いられる測定試料は、水、血清、尿、食塩水などである。また、臨床検査における一般的な採血の注意点としては、溶血を極力避け、できるだけ速やかに血清・血漿分離することである。この理由は、溶血による光学的測定への影響、血球膜を通してのＮａ、Ｋ、Ｃｌなどの物質の出入り、血球代謝による移動（解糖による乳酸、ビルビン酸の血清中への移動）の影響、目的成分の血球中と血清中の濃度差による影響などが挙げられる。
【０００４】
以上のことから、被検者から得られた血液は、遠心分離を行って血清または血漿に分離した試料を使用しなければならなかった。このため、血液を大量に処理できる大または中病院の中央検査室などでは支障はないが、開業医や緊急検査室では、遠心分離機による前処理が行えないことがあり、したがって、上記方法は必ずしも万全のものではない。
【０００５】
そして、このような一般的な全血の取り扱い環境にあって、免疫検査領域において、血清・血漿分離を行うことなく、全血を直接に測定試料とする精密定量測定方法は存在しなかった。また、血液を溶血せずに測定することは、光学的手段を用いて測定する場合において、赤血球による濁りが大きく、不向きであった。
【０００６】
この発明は、上述の事柄に留意してなされたもので、その目的は、遠心分離機などによって血液を前処理しなくても簡便にしかも短時間で測定を行うことができる免疫測定方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明者らは、鋭意研究した結果、前記臨床検査における一般的な採血の注意点としての溶血を極力避け、できるだけ速やかに血清・血漿分離するという固定概念を覆し、意外にも、凝集反応に影響しない方法を用いて故意かつ強制的に全血を溶血させることにより、全血中の抗原あるいは抗体を測定できることを見出した。
【０００８】
すなわち、前記目的を達成するため、この発明では、被検体試料中の抗原あるいは抗体と特異的に反応する抗体あるいは抗原を固定化した不溶性粒子と被検体試料中の抗原あるいは抗体とを凝集反応させ、生じた凝集混合液に対する光照射による吸光度変化または散乱光変化を測定する免疫測定方法において、前記被検体試料として全血を用い、この全血を、低張液と混合、凍結融解、または超音波振動を与えるのいずれか手法により、強制的に溶血させるようにしている。
【０００９】
【００１０】
【００１１】
【００１２】
上記発明によれば、
（１）全血被検液を遠心分離操作などの前処理を行うことなく、直接、全血被検液を用いることにより、測定時間の短縮、測定コストの低減および測定操作の簡略化が図れる。そして、遠心分離操作を行う必要がないということは、遠心分離機や遠心分離容器の費用、被検液の採血容器から遠心分離容器への移替えの手間および遠心分離操作のための時間が不要になるとともに、それだけ、検査要員が血液に接触する機械が少なくて済み、感染への危険性が大幅に低減される。
【００１３】
（２）抗原抗体反応に影響しない方法で全血中の血球を強制的に溶血させることにより、一般のラテックス免疫比濁法を用いた測定キットと組み合わせることができ、精度のよい測定データを得ることができるとともに、広範囲な応用が可能になる。
【００１４】
（３）溶血試薬をラテックス試薬に含ませることによって、測定装置の構成を簡単にすることができ、測定時間を短縮することができる。
【００１５】
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、この発明の詳細を実施例によって詳細に説明する。
【００１７】
まず、各実施例を説明する前に、検討に用いた試薬を下記表１に示す。なお、この表１における符号ａ〜ｇは、以下の図５〜７における符号と同じである。
【００１８】
【表１】
0003779885.tif 000002
【００１９】
〔実施例１〕：溶血試薬による溶血法
ＥＤＴＡ−２Ｋ抗凝固剤を用いて通常の採血法により採血した人全血０．０４ｍＬを、図１に示すようなセル長５ｍｍの石英製のセル５に収容し、これに、前記表１に示した溶血試薬水溶液ａ〜ｇをそれぞれ２．０ｍＬ添加し、図２に示すような分光光度計１（例えば日立製作所製：Ｕ−３４１０）を用いて、波長３００〜１０００ｎｍにおける吸収スペクトル（図５参照）、波長８００ｎｍにおける溶血反応タイムコース（図６参照）および波長８００ｎｍにおけるそれぞれの反応開始後５分目の吸光度と反応開始後４〜５分目における１分間当たりの吸光度変化（表１参照）を求め、各種溶血試薬の溶血能力を調べた。
【００２０】
なお、前記図２において、２は近赤外光または赤外光などの照射光Ｌを発するハロゲンランプからなる光源、３は集光レンズ、４は回折格子、６は増幅器、７はコンピュータなどの演算・記録装置である。また、Ｓはセル５内に収容された試料としての溶血処理を施した全血である。
【００２１】
図５に示すように、試薬ｊ（生理食塩水）の未溶血ではその濁りによって全波長での吸光度が２．５以上となり、ラテックス凝集反応を光学的に検出する際に影響を与える結果となった。一方、同図に示すように、試薬ａ（純水）、試薬ｂ（サポニン水溶液）を用いることにより、上記のような濁りはなくなり、ラテックス凝集度合いを検出できることが判った。また。表１および図６から、試薬ａ（純水）、試薬ｂ（サポニン）、試薬ｃ（トリトンＸ−１００）、試薬ｆ（ラウリル硫酸ナトリウム）および試薬ｇ（ベンザルコニウムクロライド）は、人全血を短期間に溶血する能力があることが判る。
【００２２】
〔実施例２〕：凍結による溶血法
図３は、全血を溶血させるのに用いる凍結セルホルダー９の一例を示すもので、セル５を挿入保持できるとともに、測光窓１０を備えたアルミニウム製のセルブロック１１にペルチェ素子（例えばメルコア製）１２を接合してなるものである。１３はペルチェ素子１２に適宜の直流電流を供給するための電源、Ｌは光源２からの近赤外光または赤外光である。
【００２３】
ＥＤＴＡ−２Ｋ抗凝固剤を用いて通常の採血法により採血した人全血０．０４ｍＬを、図３に示すように、凍結セルホルダー９にセットされたセル５内に収容し、ペルチェ素子１２に所定の方向の電流を１０分間通電して人全血を完全に凍結した。その後、ペルチェ素子１２に方向とは逆方向の電流を通電して凍結した人全血を融解し、これに生理食塩水２．０ｍＬを添加して融解希釈した後、分光光度計１を用いて波長８００ｎｍにおける反応開始後５分目の吸光度と反応開始後４〜５分目における１分間当たりの吸光度変化（表１参照）を求め、溶血試薬の溶血能力を調べた。表１においてｈで示すように、人全血を凍結・融解することによってこれ４溶血できることが判る。
【００２４】
〔実施例３〕：超音波振動による溶血法
図４は、全血を溶血させるのに用いる超音波ノズル１４の一例を示すもので、ステンレス鋼製のノズル１５に超音波発振子１６を結合したもので、１７は発振回路、１８は吸引用シリンジである。
【００２５】
ＥＤＴＡ−２Ｋ抗凝固剤を用いて通常の採血法により採血した人全血０．０４ｍＬをノズル１５内に吸引し、その状態で超音波発振子１６を５分間動作させることにより、ノズル１５内の人全血Ｂを溶血した。その後、この溶血した人全血Ｂを全量セル５に収容し、さらに、これに生理食塩水２．０ｍＬを添加して希釈した後、分光光度計１を用いて波長８００ｎｍにおける反応開始後５分目の吸光度と反応開始後４〜５分目における１分間当たりの吸光度変化（表１参照）を求め、溶血試薬の溶血能力を調べた。表１において符号ｉで示すように、人全血に超音波振動を与えることによりこれを溶血できることが判る。
【００２６】
〔実施例４〕：ＣＲＰの測定方法１
１）抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液の調整
平均粒径０．２μｍのポリスチレンラテックス（例えば日本合成ゴム社製：固形分１０％）１０ｍＬに、約１０ｍｇ／ｍＬの抗ヒトＣＲＰウサギ抗体液（ｐＨ７．５、１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液、０．１％アジ化Ｎａ）を添加し、３０℃で一昼夜静置した後、３６００ｒｐｍで遠心分離した沈澱物に０．２Ｗ／Ｖ％牛血清アルブミン  ｐＨ８．５、１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液を添加し、抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス懸濁液に調整した。
【００２７】
２）ＣＲＰ測定方法
ＥＤＴＡ−２Ｋ抗凝固剤を用いて通常の採血法により採血した人全血０．０４ｍＬをセル１に収容し、これに、表１に示した溶血試薬水溶液ａ〜ｇを０．５ｍＬ添加し、３７℃で３分間インキュベーションした後、上記１）で調整した抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス懸濁液を１．５ｍＬ添加し、分光光度計１を用いて波長８００ｎｍにおける反応開始後４〜５分目における１分間当たりの吸光度変化を求めた。
【００２８】
別途、血漿を検体とした市販のラテックス免疫比濁法ＣＲＰ測定キットを用いて前記検体を検定して検量線を作成した。図７は、前記ＣＲＰ測定に得られた結果に基づいて作成した検量線を示すもので、純水ａおよびサポニン水溶液ｂなどを用いて全血を強制的に溶血したものにおいては、図中の符号ａ，ｂで示すように、良好な感度の検量線が得られた。しかしながら、各種界面活性剤ｃ〜ｇを用いた場合には、凝集反応が阻害され、図中の符号ｃ〜ｇで示すように、免疫反応には適さないという結果となった。
【００２９】
〔実施例５〕：凍結法または超音波振動法による溶血試料を用いたＣＲＰ測定方法
前記実施例２または実施例３で溶血した後の生理食塩水による希釈操作の代わりに、実施例４で作製した抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス懸濁液を２．０ｍＬ添加し、分光光度計１を用いて波長８００ｎｍにおける反応開始後４〜５分目における１分間当たりの吸光度変化を求めた。
【００３０】
別途、血清または血漿を検体とした市販のラテックス免疫比濁法ＣＲＰ測定キットを用いて前記検体を検定して検量線を作成した。この場合、図７の符号ｈ，ｉで示すように、良好な感度の検量線が得られた。
【００３１】
〔実施例６〕：ＣＲＰの測定方法２
前記実施例４で用いた抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス懸濁液の代わりに、市販のラテックス免疫比濁法ＣＲＰ測定キットを用い、溶血試薬として０．５Ｗ／Ｖ％サポニン水溶液を用いる以外は実施例４と同様の測定方法により、波長８００ｎｍにおける反応開始後４〜５分目における１分間当たりの吸光度変化を求め、事前に作成した検量線より、全血を検体としたこの発明の分析値と血清を検体とした分析値との相関試験（ｎ＝４０）を実施したところ、図８に示すように、良好な結果が得られた。
【００３２】
〔実施例７〕：ヘマトクリット補正
前記実施例６において、この発明による分析値に関して、測定した全血検体を同時に血球カウンタ（例えば堀場製作所製：ＬＣ−２４０Ａ）によって、そのヘマトクリット値を測定し、
Ａ’＝Ａ×１００／（１００−ヘマトクリット％）              …（１）
但し、Ａ：実際に測定された吸光度変化量、Ａ’：被検体試料中の血漿成分を１００％に換算した吸光度変化量）
なる演算を行って求めた分析値と血清を検体とした分析値との相関試験（ｎ＝４０）を実施したところ、図９に示すように、実施例６の結果よりもより良好な結果が得られた。
【００３３】
上述の実施例では、凝集混合液に対する光照射による吸光度変化を測定するようにしているが、これに代えて、散乱光変化を測定するようにしてもよい。
【００３４】
【発明の効果】
この発明においては、被検体試料中の抗原あるいは抗体と特異的に反応する抗体あるいは抗原を固定化した不溶性粒子と被検体試料中の抗原あるいは抗体とを凝集反応させ、生じた凝集混合液に対する光照射による吸光度変化または散乱光変化を測定する免疫測定方法において、前記被検体試料として全血を用い、この全血を、低張液と混合、凍結融解、または超音波振動を与えるのいずれかの凝集反応に影響を与えない手法により、強制的に溶血させるようにしている。
【００３５】
したがって、この発明によれば、全血被検液を遠心分離操作などの前処理を行うことなく、直接、全血被検液を用いることができるので、測定時間の短縮、測定コストの低減および測定操作の簡略化が図れる。そして、検査要員が血液に接触する機械が少なくて済み、感染への危険性が大幅に低減される。
【００３６】
【図面の簡単な説明】
【図１】  この発明方法で用いるセルの一例を示す斜視図である。
【図２】  この発明方法で用いる分光光度計の構成を概略的に示す図である。
【図３】  この発明方法で用いる凍結セルホルダーの一例を示す斜視図である。
【図４】  この発明方法で用いる用いる超音波ノズルの一例を示す斜視図である。
【図５】  各種の溶血試薬水溶液を用いて全血を溶血させた試料の波長３００〜１０００ｎｍにおける吸収スペクトルを示す図である。
【図６】  各種の溶血試薬水溶液を用いて全血を溶血させた試料の波長８００ｎｍにおける溶血反応タイムコースを示す図である。
【図７】  ＣＲＰ測定を行ったときに得られた検量線の一例を示す図である。
【図８】  ヘマトクリット補正を行わないときにおける全血検体と血漿検体との相関関係を示す図である。
【図９】  ヘマトクリット補正を行ったときにおける全血検体と血漿検体との相関関係を示す図である。
【符号の説明】
Ｂ…全血、Ｓ…溶血処理を施した全血、Ｌ…照射光。
【図１】
0003779885.tif 000003
【図２】
0003779885.tif 000004
【図３】
0003779885.tif 000005
【図４】
0003779885.tif 000006
【図５】
0003779885.tif 000007
【図６】
0003779885.tif 000008
【図７】
0003779885.tif 000009
【図８】
0003779885.tif 000010
【図９】
0003779885.tif 000011