(57)【要約】  本発明は、タンパク質の種々の異なる種類に対する相互作用因子を網羅的に測定することができる網羅的なアッセイを提供する。  本発明では、タンパク質の活性化によって発現が変化する遺伝子の転写調節領域における変化を複数の因子を介在させて統合することによって、当該タンパク質の活性化を検出する系が提供される。それぞれの転写調節領域が有するリガンド刺激前後での転写活性の刺激応答比が相乗的に統合され、高感度なレポーターアッセイ系が構築され得る。
2020026979.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナル伝達を担うタンパク質への被験化合物の作用を調査するためのコンストラクトまたはコンストラクトの組合せであって、該コンストラクトまたはコンストラクトの組合せは、
該タンパク質の活性化により発現が誘導される第１〜第Ｎの遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結されたそれぞれ第１〜第Ｎの因子をコードする第１〜第Ｎのヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｎは２以上の整数である、コンストラクトまたはコンストラクトの組合せ。
【請求項２】
請求項１に記載のコンストラクトまたはコンストラクトの組合せと、
前記第１〜第Ｎの因子の少なくとも１つによって発現が惹起されるように構成された標識をコードするヌクレオチド配列を含むコンストラクトと
を含む、コンストラクトまたはコンストラクトの組合せ。
【請求項３】
シグナル伝達を担うタンパク質への被験化合物の作用を調査するためのコンストラクトの組合せであって、
（１）第１の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の基質（Ｓ）をコードするヌクレオチド配列に連結させた第１のコンストラクトと；
（２）第２の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の酵素（Ｅ１）をコードするヌクレオチド配列に連結させたコンストラクトであって、ここで、ＳとＥ１との酵素反応により生産物Ｐ１が生成される、第２のコンストラクトと；
Ｎが３以上である場合に、３〜Ｎの自然数であるｎのそれぞれについて、
（ｎ）第ｎの遺伝子の転写調節領域をＰ（ｎ−２）を基質として生産物（Ｐ（ｎ−１））を生成する酵素（Ｅ（ｎ−１））をコードする遺伝子に連結させた第ｎのコンストラクトと；
（Ｎ＋１）酵素反応の生産物Ｐ（Ｎ−１）によりレポーター遺伝子が活性化するように構成されたレポーター遺伝子コンストラクトと
を含み、第１〜第ＮのＮ個の遺伝子のそれぞれは、該被験化合物による該タンパク質の刺激により発現が誘導され、ここで、Ｎは２以上の自然数であり、ｎは３〜Ｎまでの自然数である、コンストラクトの組合せ。
【請求項４】
キメラＧタンパク質αサブユニットであって、Ｇα１２／１３に属する第１のＧαサブユニットのアミノ酸配列において、Ｃ末端のアミノ酸配列が該第１のＧαサブユニットとは異なるＧαサブユニットのアミノ酸配列に置き換えられているアミノ酸配列を有する、キメラＧタンパク質αサブユニットをコードするコンストラクトをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコンストラクトまたはコンストラクトの組合せ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のコンストラクトまたはコンストラクトの組合せを含む、シグナル伝達を担うタンパク質への被験化合物の作用を調査するためのキット。
【請求項６】
前記タンパク質の活性化により発現が誘導される第１〜第Ｎの遺伝子を特定することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンストラクト、コンストラクトの組合せまたはキットの製造方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のコンストラクトまたはコンストラクトの組合せを含む細胞。
【請求項８】
シグナル伝達を担うタンパク質を発現する細胞であって、
該タンパク質の活性化により発現が誘導される第１〜第Ｎの遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結されたそれぞれ第１〜第Ｎの因子をコードする第１〜第Ｎのヌクレオチド配列と、
該第１〜第Ｎの因子の少なくとも１つによって発現が惹起されるように構成された標識をコードするヌクレオチド配列と
を含み、ここで、Ｎは２以上の整数である、細胞。
【請求項９】
シグナル伝達を担うタンパク質を発現する細胞であって、
（１）第１の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の基質（Ｓ）をコードする遺伝子に連結させた第１のコンストラクトと；
（２）第２の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の酵素（Ｅ１）をコードする遺伝子に連結させたコンストラクトであって、ここで、ＳとＥ１との酵素反応により生産物Ｐ１が生成される、第２のコンストラクトと；
Ｎが３以上である場合に、３〜Ｎの自然数であるｎのそれぞれについて、
（ｎ）第ｎの遺伝子の転写調節領域をＰ（ｎ−２）を基質として生産物（Ｐ（ｎ−１））を生成する酵素（Ｅ（ｎ−１））をコードする遺伝子に連結させた第ｎのコンストラクトと；
（Ｎ＋１）酵素反応の生産物Ｐ（Ｎ−１）によりレポーター遺伝子が活性化するように構成されたレポーター遺伝子コンストラクトと
を含み、第１〜第ＮのＮ個の遺伝子のそれぞれは、該タンパク質の活性化により発現が誘導され、ここで、Ｎは２以上の自然数であり、ｎは３〜Ｎの自然数である、細胞。
【請求項１０】
膜タンパク質を発現する細胞であって、
該膜タンパク質の活性化により発現が誘導される第１の遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第１の因子をコードする第１のヌクレオチド配列と、
該膜タンパク質の活性化により発現が誘導される第２の遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第２の因子をコードする第２のヌクレオチド配列と、
該第１の因子によって発現が惹起されるように構成された標識をコードするヌクレオチド配列と
を含み、ここで、該第２の因子は、該第１の因子の標識の発現を惹起させる活性を惹起または促進するように構成されている、細胞。
【請求項１１】
前記第１の因子が、転写因子である、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記転写因子が、不活性化した状態で発現されるように構成されている、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記転写因子が、細胞膜アンカー型転写因子である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
前記第２の因子が、プロテアーゼである、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１５】
前記第２の因子が、細胞膜型因子である、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１６】
前記細胞がＨｅＬａ細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項７〜１５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１７】
前記遺伝子は、ＡＲＣ、ＣＣＬ２０、ＣＴＧＦ、ＤＵＳＰ５、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、ＦＯＳＢ、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ３、ＣＹＲ６１およびＦＯＳからなる群から選択される、請求項７〜１６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１８】
膜タンパク質を発現するＨｅＬａ細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞であって、
該膜タンパク質の活性化により発現が誘導される第１の遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第１のヌクレオチド配列であって、細胞膜アンカー型転写因子をコードする、第１のヌクレオチド配列と、
該膜タンパク質の活性化により発現が誘導される第２の遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第２のヌクレオチド配列であって、プロテアーゼをコードする、第２のヌクレオチド配列と、
該転写因子によって発現が惹起されるように構成されたルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列と
を含み、ここで、該膜タンパク質は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、酵素連結型受容体、イオンチャネル連結型受容体、またはチャネルであり、該細胞膜アンカー型転写因子は、細胞膜アンカー部分と転写因子部分との間に、該プロテアーゼによって切断される切断可能リンカーを含み、該細胞がＨｅＬａ細胞のときは、該第１の遺伝子がＮＲ４Ａ１、及び該第２の遺伝子がＣＴＧＦであり、該細胞がＨＥＫ２９３Ｔ細胞のときは、該第１の遺伝子がＦＯＳ、及び該第２の遺伝子がＦＯＳＢである、細胞。
【請求項１９】
キメラＧタンパク質αサブユニットであって、Ｇα１２／１３に属する第１のＧαサブユニットのアミノ酸配列において、Ｃ末端のアミノ酸配列が該第１のＧαサブユニットとは異なるＧαサブユニットのアミノ酸配列に置き換えられているアミノ酸配列を有する、キメラＧタンパク質αサブユニットを含む、請求項７〜１８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２０】
それぞれ異なる膜タンパク質を発現する複数の細胞を含むキットであって、該複数の細胞の各々は、請求項７〜１９のいずれか１項に記載の細胞である、キット。
【請求項２１】
被験化合物の膜タンパク質への作用を網羅的に解析するための、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
請求項７〜１９のいずれか１項に記載の細胞、または請求項５または２０〜２１のいずれか１項に記載のキットを用いることを特徴とする、被験化合物の膜タンパク質への作用の解析方法。
【請求項２３】
請求項７〜１９のいずれか１項に記載の細胞の製造方法であって、
細胞に、前記膜タンパク質またはＧＰＣＲをトランスフェクトする工程と、
前記第１〜第Ｎの遺伝子の遺伝子座に、各遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結されるように前記第１〜第Ｎのヌクレオチドを導入する工程と
を含む、方法。
【請求項２４】
キメラＧタンパク質αサブユニットであって、Ｇα１２／１３に属する第１のＧαサブユニットのアミノ酸配列において、Ｃ末端のアミノ酸配列が、該第１のＧαサブユニットとは異なるＧαサブユニットのアミノ酸配列に置き換えられているアミノ酸配列を有する、キメラＧタンパク質αサブユニット。
【請求項２５】
シグナル伝達を担うタンパク質への被験化合物の作用を調査するために、ある細胞において、該タンパク質の活性化により発現が誘導される遺伝子を同定する方法であって、
該タンパク質を発現する該細胞を、該タンパク質の活性化因子と接触させた場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該細胞を該活性化因子と接触させなかった場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該活性化因子と接触させなかった場合と比較して該活性化因子と接触させた場合に発現が増加する遺伝子を候補遺伝子として選択する工程と
を含む、方法。
【請求項２６】
ある細胞において、シグナル伝達を担うタンパク質の活性化により発現が誘導される遺伝子を同定する方法であって、
該タンパク質を発現する該細胞を、該タンパク質の活性化因子と接触させた場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該タンパク質を発現する該細胞を該活性化因子と接触させなかった場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該タンパク質を発現しない該細胞を、該活性化因子と接触させた場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該タンパク質を発現しない該細胞を、該活性化因子と接触させなかった場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該タンパク質を発現する該細胞を該タンパク質の活性化因子と接触させた場合に、他の場合と比較して発現が増加する遺伝子を候補遺伝子として選択する工程と
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内のシグナル伝達に影響を与える物質の探索またはスクリーニングに関する。本発明は、一部の態様において、物質による受容体の活性化を検出する方法、ならびに該方法において用いられる核酸、系、細胞、タンパク質、および組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在までに、多数の化合物が、製品（例えば、医薬品）として上市されているが、これらの大多数は生体内の何らかの分子（例えば、受容体、チャネル、トランスポーターまたは酵素など）を標的として作用する。例えば、医薬品の開発において、所与の標的分子に対して作用することが見出された化合物は、創薬シーズとして研究が進められる。医薬品開発における研究は莫大なコストを要するが、他方で、シーズが医薬品として用いられる割合は３万分の１とも言われ、非常に低い割合である。【０００３】
開発の失敗においては、化合物が意図された分子以外の分子に作用してしまうことによる予定外の効果が原因となる場合があり、潜在的な開発リスクのある化合物を早い段階で除外することは経済的に意義が大きい。そのためには、開発予定化合物の標的外分子に対する作用を網羅的に検証することが必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、タンパク質（例えば、イオンチャネル、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、酵素連結型受容体、イオンチャネル連結型受容体などの膜タンパク質）の種々の異なる種類に対する相互作用因子を網羅的に測定することができる網羅的なアッセイを提供する。【０００５】
より詳細に述べると、本発明では、このようなタンパク質の活性化（例えば、リガンド、イオンによる刺激による）によって発現が変化する遺伝子の転写調節領域における変化を複数の因子を介在させて統合することによって、当該タンパク質の活性化を検出する系が提供される。それぞれの転写調節領域が有する「リガンド刺激前後での転写活性の刺激応答比」が相乗的に統合され、高感度なレポーターアッセイ系が構築され得る。【０００６】
ある局面において、本発明は、シグナル伝達を担うタンパク質の活性化により発現が誘導される第１〜第Ｎの遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第１〜第Ｎの因子をコードする第１〜第Ｎのヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｎは２以上の整数である、遺伝子コンストラクトを提供する。１つの実施形態では、この遺伝子コンストラクトは、上記第１〜第Ｎの因子の少なくとも１つによって発現が惹起されるように構成された標識をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトと組み合わせられ得る。それぞれの因子は、当該因子とは異なる上記第１〜第Ｎの因子のうちの少なくとも１つの因子の活性を向上させるものであってよく、例えば、それぞれの因子は、他の因子の発現量を増加させるか、または他の因子によって触媒される反応の基質であるか、もしくは当該基質を生成する反応を触媒するものであってもよい。【０００７】
１つの実施形態では、因子のうちの１つとして、細胞膜アンカー型転写因子を用いることができる。加えて、因子のうちの１つとして、プロテアーゼを用いることができる。プロテアーゼは、細胞膜アンカー型転写因子を切断するように構成されてよく、これにより、転写因子が膜から分離して核内へと移動することを可能にする。さらに、上記転写因子によって発現が惹起される標識を用いることができる。標識は、当技術分野で用いられる標識を制限なく用いることができ、一例としては、ルシフェラーゼが挙げられる。これらのコンストラクトは、キットの形で提供されてもよい。【０００８】
別の局面において、本発明は、本明細書において記載されるコンストラクトを含む細胞を提供する。当該細胞は、被験化合物とシグナル伝達を担うタンパク質との相互作用による細胞内へのシグナル伝達の調査に用いることができる。このような細胞において、シグナル伝達を担うタンパク質を過剰発現させてよい。使用される細胞としては必要に応じて様々な種類の細胞を用いることができる。目的の膜タンパク質は外因性に遺伝子導入するので、原理的にはいかなる細胞種であっても使用可能である。【０００９】
本発明の細胞は、それぞれ異なるシグナル伝達を担うタンパク質を発現する複数の細胞を含むキット中で提供されてもよい。このようなキットは、被験化合物の複数の異なるシグナル伝達を担うタンパク質との相互作用を網羅的に解析するために有用である。【００１０】
一部の実施形態では、シグナル伝達を担うタンパク質として、膜タンパク質、例えば、受容体またはチャネルなどを用いることができる。好ましくは、シグナル伝達を担うタンパク質は、ＧＰＣＲである。ＧＰＣＲは、低分子物質を含む多彩なリガンドを認識することが特徴であり、現行医薬品の標的分子の約４割がＧＰＣＲとも言われている。化合物とＧＰＣＲとの相互作用、ならびにＧＰＣＲからのＧタンパク質を介したシグナル伝達を調べることは化合物の応用において非常に重要である。【００１１】
別の局面において、本発明はまた、キメラＧタンパク質、それをコードする核酸、それを発現する細胞、およびそれを用いる方法も提供する。本明細書において、キメラとなっているＧタンパク質αサブユニット、およびそれを含むキメラＧタンパク質が提供される。Ｇタンパク質の受容体への配向性はＧαサブユニットのＣ末端のアミノ酸配列で決定されるため、キメラＧタンパク質を用いることによって、あるＧタンパク質と共役するＧＰＣＲの活性化を、異なるＧタンパク質が活性化されたときに生じる細胞内シグナルを用いて検出することが可能になる。本発明では、あるＧ１２／１３のαサブユニットにおいて、Ｃ末端のアミノ酸配列が、異なるＧタンパク質αサブユニットのアミノ酸配列に置き換えられているキメラＧタンパク質αサブユニットが提供される。【００１２】
本発明で提供されるキメラＧタンパク質は、本明細書に記載される被験化合物とシグナル伝達を担うタンパク質との相互作用を調査するための方法において使用することができる。本明細書に記載されるコンストラクトと、キメラＧタンパク質（またはそれをコードするコンストラクト）とを組み合わせて用いることができる。例えば、上記コンストラクトを含む細胞において、キメラＧタンパク質をさらに発現させることができ、Ｇ１２／１３以外のＧタンパク質（例えば、Ｇｓ）と共役するＧＰＣＲからのシグナルを、Ｇ１２／１３からのシグナルと同じ検出系で検出することができる。【００１３】
別の局面において、本明細書において、ある細胞において、シグナル伝達を担うタンパク質の活性化により発現が誘導される遺伝子を同定する方法が開示される。当該方法は、シグナル伝達を担うタンパク質と被験化合物との相互作用を調査するためのものであり得る。この方法は、タンパク質を発現する細胞を、タンパク質の活性化因子と接触させた場合の細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、細胞を活性化因子と接触させなかった場合の細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、活性化因子と接触させなかった場合と比較して活性化因子と接触させた場合に発現が増加する遺伝子を候補遺伝子として選択する工程とを含んでよい。【００１４】
１つの実施形態において、発現が誘導される遺伝子の同定のために、タンパク質の発現の有無および活性化因子の有無による４群間の比較を行うことができ、タンパク質が発現している細胞を活性化因子と接触させた場合に発現が増加する遺伝子を候補遺伝子として選択することができる。【００１５】
例えば、本発明では、以下の項目において規定される発明が提供される：
（項目１）  シグナル伝達を担うタンパク質への被験化合物の作用を調査するためのコンストラクトまたはコンストラクトの組合せであって、該コンストラクトまたはコンストラクトの組合せは、
該タンパク質の活性化により発現が誘導される第１〜第Ｎの遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結されたそれぞれ第１〜第Ｎの因子をコードする第１〜第Ｎのヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｎは２以上の整数である、コンストラクトまたはコンストラクトの組合せ。
（項目２）  前記項目に記載のコンストラクトまたはコンストラクトの組合せと、
前記第１〜第Ｎの因子の少なくとも１つによって発現が惹起されるように構成された標識をコードするヌクレオチド配列を含むコンストラクトと
を含む、コンストラクトまたはコンストラクトの組合せ。
（項目３）  シグナル伝達を担うタンパク質への被験化合物の作用を調査するためのコンストラクトの組合せであって、
（１）第１の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の基質（Ｓ）をコードするヌクレオチド配列に連結させた第１のコンストラクトと；
（２）第２の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の酵素（Ｅ１）をコードするヌクレオチド配列に連結させたコンストラクトであって、ここで、ＳとＥ１との酵素反応により生産物Ｐ１が生成される、第２のコンストラクトと；
Ｎが３以上である場合に、３〜Ｎの自然数であるｎのそれぞれについて、
（ｎ）第ｎの遺伝子の転写調節領域をＰ（ｎ−２）を基質として生産物（Ｐ（ｎ−１））を生成する酵素（Ｅ（ｎ−１））をコードする遺伝子に連結させた第ｎのコンストラクトと；
（Ｎ＋１）酵素反応の生産物Ｐ（Ｎ−１）によりレポーター遺伝子が活性化するように構成されたレポーター遺伝子コンストラクトと
を含み、第１〜第ＮのＮ個の遺伝子のそれぞれは、該被験化合物による該タンパク質の刺激により発現が誘導され、ここで、Ｎは２以上の自然数であり、ｎは３〜Ｎまでの自然数である、コンストラクトの組合せ。
（項目４）  キメラＧタンパク質αサブユニットであって、Ｇα１２／１３に属する第１のＧαサブユニットのアミノ酸配列において、Ｃ末端のアミノ酸配列が該第１のＧαサブユニットとは異なるＧαサブユニットのアミノ酸配列に置き換えられているアミノ酸配列を有する、キメラＧタンパク質αサブユニットをコードするコンストラクトをさらに含む、前記項目のいずれかに記載のコンストラクトまたはコンストラクトの組合せ。
（項目５）  前記項目のいずれかに記載のコンストラクトまたはコンストラクトの組合せを含む、シグナル伝達を担うタンパク質への被験化合物の作用を調査するためのキット。
（項目６）
前記コンストラクトを細胞に導入するための薬剤をさらに含む、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目７）  前記タンパク質の活性化により発現が誘導される第１〜第Ｎの遺伝子を特定することを含む、前記項目のいずれかに記載のコンストラクト、コンストラクトの組合せまたはキットの製造方法。
（項目８）  前記項目のいずれかに記載のコンストラクトまたはコンストラクトの組合せを含む細胞。
（項目９）  シグナル伝達を担うタンパク質を発現する細胞であって、
該タンパク質の活性化により発現が誘導される第１〜第Ｎの遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結されたそれぞれ第１〜第Ｎの因子をコードする第１〜第Ｎのヌクレオチド配列と、
該第１〜第Ｎの因子の少なくとも１つによって発現が惹起されるように構成された標識をコードするヌクレオチド配列と
を含み、ここで、Ｎは２以上の整数である、細胞。
（項目１０）  シグナル伝達を担うタンパク質を発現する細胞であって、
（１）第１の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の基質（Ｓ）をコードする遺伝子に連結させた第１のコンストラクトと；
（２）第２の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の酵素（Ｅ１）をコードする遺伝子に連結させたコンストラクトであって、ここで、ＳとＥ１との酵素反応により生産物Ｐ１が生成される、第２のコンストラクトと；
Ｎが３以上である場合に、３〜Ｎの自然数であるｎのそれぞれについて、
（ｎ）第ｎの遺伝子の転写調節領域をＰ（ｎ−２）を基質として生産物（Ｐ（ｎ−１））を生成する酵素（Ｅ（ｎ−１））をコードする遺伝子に連結させた第ｎのコンストラクトと；
（Ｎ＋１）酵素反応の生産物Ｐ（Ｎ−１）によりレポーター遺伝子が活性化するように構成されたレポーター遺伝子コンストラクトと
を含み、第１〜第ＮのＮ個の遺伝子のそれぞれは、該タンパク質の活性化により発現が誘導され、ここで、Ｎは２以上の自然数であり、ｎは３〜Ｎの自然数である、細胞。
（項目１１）  膜タンパク質を発現する細胞であって、
該膜タンパク質の活性化により発現が誘導される第１の遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第１の因子をコードする第１のヌクレオチド配列と、
該膜タンパク質の活性化により発現が誘導される第２の遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第２の因子をコードする第２のヌクレオチド配列と、
該第１の因子によって発現が惹起されるように構成された標識をコードするヌクレオチド配列と
を含み、ここで、該第２の因子は、該第１の因子の標識の発現を惹起させる活性を惹起または促進するように構成されている、細胞。
（項目１１−１）  前記第１の因子が、転写因子である、前記項目のいずれかに記載の細胞。
（項目１１−２）  前記転写因子が、不活性化した状態で発現されるように構成されている、前記項目のいずれかに記載の細胞。
（項目１１−３）  前記転写因子が、細胞膜アンカー型転写因子である、前記項目のいずれかに記載の細胞。
（項目１１−４）  前記第２の因子が、前記転写因子を細胞膜から解離させる活性を有する、前記項目のいずれかに記載の細胞。
（項目１１−５）  前記第２の因子が、プロテアーゼである、前記項目のいずれかに記載の細胞。
（項目１１−６）  前記細胞膜アンカー型転写因子が、細胞膜アンカー部分と転写因子部分との間に、前記第２の因子によって切断される切断可能リンカーを含む、前記項目のいずれかに記載の細胞。
（項目１１−７）  前記第２の因子が、細胞膜型因子である、前記項目のいずれかに記載の細胞。
（項目１１−８）  前記膜タンパク質が、Ｇタンパク質共役受容体、酵素連結型受容体、イオンチャネル連結型受容体、チャネル、トランスポーターまたは細胞接着分子である、前記項目のいずれかに記載の細胞。
（項目１２）  前記細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−１／７細胞、ＨＬ６０細胞、Ｋ５６２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｆ９細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、ＰＣ１２細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＥＦ細胞、Ｕ９３７細胞、Ｃ６細胞、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、ＴＨＰ−１細胞、ＢＷ５１４７細胞、Ｂａ／Ｆ３細胞、Ｙ−１細胞、Ｈ２９５Ｒ細胞、ＭＩＮ６細胞、ＮＩＴ−１細胞およびＭＤＡ−ＭＢ４３５Ｓ細胞から選択される少なくとも１つを含む、前記項目のいずれかに記載の細胞。
（項目１２Ａ）  前記細胞がＨｅＬａ細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、前記項目のいずれかに記載の細胞。
（項目１３）  前記遺伝子は、ＡＲＣ、ＣＣＬ２０、ＣＴＧＦ、ＤＵＳＰ５、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、ＦＯＳＢ、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ３、ＣＹＲ６１及びＦＯＳからなる群から選択される、前記項目のいずれかに記載の細胞。
（項目１３Ａ）  前記第１の遺伝子が、ＮＲ４Ａ１である、前記項目のいずれかに記載の細胞。
（項目１３Ｂ）  前記第２の遺伝子が、ＣＴＧＦである、前記項目のいずれかに記載の細胞。
（項目１３Ｃ）  前記第１の遺伝子が、ＦＯＳである、前記項目のいずれかに記載の細胞。
（項目１３Ｄ）  前記第２の遺伝子が、ＦＯＳＢである、前記項目のいずれかに記載の細胞。
（項目１４）  膜タンパク質を発現するＨｅＬａ細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞であって、
該膜タンパク質の活性化により発現が誘導される第１の遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第１のヌクレオチド配列であって、細胞膜アンカー型転写因子をコードする、第１のヌクレオチド配列と、
該膜タンパク質の活性化により発現が誘導される第２の遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第２のヌクレオチド配列であって、プロテアーゼをコードする、第２のヌクレオチド配列と、
該転写因子によって発現が惹起されるように構成されたルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列と
を含み、ここで、該膜タンパク質は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、酵素連結型受容体、イオンチャネル連結型受容体、またはチャネルであり、該細胞膜アンカー型転写因子は、細胞膜アンカー部分と転写因子部分との間に、該プロテアーゼによって切断される切断可能リンカーを含み、該細胞がＨｅＬａ細胞のときは、該第１の遺伝子がＮＲ４Ａ１、及び該第２の遺伝子がＣＴＧＦであり、該細胞がＨＥＫ２９３Ｔ細胞のときは、該第１の遺伝子がＦＯＳ、及び該第２の遺伝子がＦＯＳＢである、細胞。
（項目１５）  キメラＧタンパク質αサブユニットであって、Ｇα１２／１３に属する第１のＧαサブユニットのアミノ酸配列において、Ｃ末端のアミノ酸配列が該第１のＧαサブユニットとは異なるＧαサブユニットのアミノ酸配列に置き換えられているアミノ酸配列を有する、キメラＧタンパク質αサブユニットを含む、前記項目のいずれかに記載の細胞。
（項目１６）  それぞれ異なる膜タンパク質を発現する複数の細胞を含むキットであって、該複数の細胞の各々は、前記項目のいずれかに記載の細胞である、キット。
（項目１７）  被験化合物の膜タンパク質への作用を網羅的に解析するための、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目１８）  前記項目のいずれかに記載の細胞、または前記項目のいずれかに記載のキットを用いることを特徴とする、被験化合物の膜タンパク質への作用の解析方法。
（項目１９）  前記項目のいずれかに記載の細胞の製造方法であって、
細胞に、前記膜タンパク質またはＧＰＣＲをトランスフェクトする工程と、
前記第１〜第Ｎの遺伝子の遺伝子座に、各遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結されるように前記第１〜第Ｎのヌクレオチドを導入する工程と
を含む、方法。
（項目２０）  キメラＧタンパク質αサブユニットであって、Ｇα１２／１３に属する第１のＧαサブユニットのアミノ酸配列において、Ｃ末端のアミノ酸配列が、該第１のＧαサブユニットとは異なるＧαサブユニットのアミノ酸配列に置き換えられているアミノ酸配列を有する、キメラＧタンパク質αサブユニット。
（項目２１）  前記異なるＧαは、Ｇαｓである、前記項目に記載のキメラＧタンパク質αサブユニット。
（項目２２）  第１のＧαサブユニットのアミノ酸配列において、Ｃ末端の約６アミノ酸が前記異なるＧαサブユニットのアミノ酸配列に置き換えられているアミノ酸配列を有する、前記項目のいずれかに記載のキメラＧタンパク質αサブユニット。
（項目２３）  前記項目のいずれかに記載のキメラＧタンパク質αサブユニットを含む、キメラＧタンパク質。
（項目２４）  前記項目のいずれかに記載のキメラＧタンパク質と、該キメラＧタンパク質と共役しているＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）とを含む、複合体。
（項目２５）  前記項目のいずれかに記載の複合体を含む、細胞。
（項目２６）  前記項目のいずれかに記載のコンストラクトをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の細胞。
（項目２７）  ＧＰＣＲの機能分析に用いるための、前記項目のいずれかに記載の細胞を含む組成物。
（項目２８）  細胞のＧＰＣＲの機能分析に用いるためのコンストラクトであって、該コンストラクトは、Ｇタンパク質サブユニットα１２の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と、置き換えられるＧα１２とは異なるＧタンパク質αサブユニットの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列とを含み、Ｇα１２のアミノ酸配列におけるＣ末端のアミノ酸配列が置き換えられるＧα１２とは異なるＧタンパク質αサブユニットのアミノ酸配列に置き換えられているアミノ酸配列を有するキメラＧタンパク質αサブユニットを発現するように構成されている、コンストラクト。
（項目２９）  シグナル伝達を担うタンパク質への被験化合物の作用を調査するために、ある細胞において、該タンパク質の活性化により発現が誘導される遺伝子を同定する方法であって、
該タンパク質を発現する該細胞を、該タンパク質の活性化因子と接触させた場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該細胞を該活性化因子と接触させなかった場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該活性化因子と接触させなかった場合と比較して該活性化因子と接触させた場合に発現が増加する遺伝子を候補遺伝子として選択する工程と
を含む、方法。
（項目３０）  ある細胞において、シグナル伝達を担うタンパク質の活性化により発現が誘導される遺伝子を同定する方法であって、
該タンパク質を発現する該細胞を、該タンパク質の活性化因子と接触させた場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該タンパク質を発現する該細胞を該活性化因子と接触させなかった場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該タンパク質を発現しない該細胞を、該活性化因子と接触させた場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該タンパク質を発現しない該細胞を、該活性化因子と接触させなかった場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
該タンパク質を発現する該細胞を該タンパク質の活性化因子と接触させた場合に、他の場合と比較して発現が増加する遺伝子を候補遺伝子として選択する工程と
を含む、方法。
（項目３１）  前記タンパク質は、Ｇタンパク質Ｇ１２／１３と特異的に共役するＧＰＣＲである、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３２）  前記細胞において、前記候補遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結されるようにヌクレオチド配列を導入する工程をさらに含む、項目９〜１５のいずれか１項に記載の細胞を製造するための、前記項目のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、従来実現できていなかった、標的タンパク質の網羅的アッセイを可能にする。特に、標的タンパク質がＧＰＣＲである場合、「Ｇｓに共役するＧＰＣＲ」、「Ｇｑに共役するＧＰＣＲ」、「Ｇｉに共役するＧＰＣＲ」、「Ｇ１２／１３に共役するＧＰＣＲ」のいずれのタイプのＧＰＣＲにおいても、そのリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストなどの調節因子を網羅的にアッセイすることが可能となった。本発明は、化合物のリガンド活性のスクリーニングにおいて、感度、Ｓ／Ｎ比、網羅性、および／またはコストについて既存の細胞ベースアッセイより優れるアッセイ系を提供することができる。特に、本発明は、ＧＰＣＲについて、単一アッセイフォーマットで全ＧＰＣＲをモニターすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明のコンストラクトによるリガンド活性測定の機構を示す模式図である。細胞には、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）と目的受容体の遺伝子が導入されている。膜アンカー型人工転写因子とプロテアーゼが受容体刺激によって発現誘導されるように構成されている。これは、膜アンカー型人工転写因子とプロテアーゼとを、受容体刺激により発現が誘導される遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結したコンストラクトを外因性に細胞に導入することによって実現可能である。
【図２】図２は、転写調節領域下流に連結される因子として、細胞膜型転写因子とプロテアーゼを使用することで相乗的なシグナル増幅効果が得られることを示す概念実証実験の結果を示す図である。
【図３】図３は、異なる転写調節領域を有する複数のレポーターアッセイ構成遺伝子（ＮＦＡＴ−ＴＭＧＶとＳＲＦ−ＴＭ３Ｃ）を外因性に一過性に動物細胞に導入することによって検出されたシグナルを示す。横軸はリガンド濃度を示し、縦軸は、各アッセイ系で出力される発光強度を示している。ＴＭＧＶ：膜アンカー型人工転写因子、ＴＭ３Ｃ：プロテアーゼ。
【図４】図４は、同一の転写調節領域を有する複数のレポーターアッセイ構成遺伝子（ＳＲＦ−ＴＭＧＶとＳＲＦ−ＴＭ３Ｃ）を外因性に一過性に動物細胞に導入することによって検出されたシグナルを示す。横軸はリガンド濃度を示し、縦軸は、各アッセイ系で出力される発光強度を示している。ＴＭＧＶ：膜アンカー型人工転写因子、ＴＭ３Ｃ：プロテアーゼ。
【図５】図５は、本発明のコンストラクトの構成の一例である。ＧＰＣＲをリガンドで刺激した際に発現誘導のかかる遺伝子のリスト（ＨｅＬａ細胞）より２つの異なる遺伝子座（ＮＲ４Ａ１遺伝子座、ＣＴＧＦ遺伝子座）を選択し、２つのレポーターアッセイ系構成因子（細胞膜アンカー型人工転写因子、プロテアーゼ）をそれぞれの遺伝子座の３’ＵＴＲにノックインすることができる。
【図６】図６は、リガンド刺激により発現誘導のかかるＮＲ４Ａ１遺伝子及びＣＴＧＦ遺伝子の３’ＵＴＲに、細胞膜アンカー型人工転写因子及びプロテアーゼをそれぞれノックインしたゲノム改変細胞におけるリガンド活性測定機構を示す。
【図７】図７は、リガンドによるＧ１２／１３と共役するＧＰＣＲ（ＧＰＲ５５およびＬＰＡＲ６）の活性化を、本発明のアッセイ系と、従来法とで検出した結果を示す図である。横軸はリガンド濃度を示し、縦軸は、各アッセイ系で出力される発光強度を示している。本発明のアッセイ系では、感度およびＳ／Ｎ比ともに圧倒的な改善（３０倍以上）が示された。本発明により、Ｇ１２／１３と共役するＧＰＣＲの活性化をモニターできる鋭敏なアッセイ系が提供され得る。
【図８】図８は、発現誘導のかかる複数の遺伝子座を利用することにより、実際にシグナルの相乗的な増幅が生じることを示す図である。横軸はリガンド濃度を示し、縦軸は、各アッセイ系で出力される発光強度を示している。この結果は、図３に示される概念実証実験とも一致する。
【図９】図９は、本発明のアッセイ系によって、Ｇｉ／ｏ系のＧタンパク質と共役するＧＰＣＲの活性化と、Ｇｑ／１１系のＧタンパク質と共役するＧＰＣＲの活性化とがモニターできることを示す図である。横軸はリガンド濃度を示し、縦軸は、各アッセイ系で出力される発光強度を示している。従来は、Ｇｉ／ｏの活性化をモニターできる良いレポーター系がなかったが、本発明により、予想外にＧｉ／ｏの活性化によるシグナルが検出された。
【図１０】図１０は、Ｇ１２／ｓキメラＧタンパク質を使用することで、本発明のアッセイ系によってＧｓと共役するＧＰＣＲの活性化も検出することができることを示す図である。黒丸は、従来Ｇｓの活性化をモニターできると考えられていたｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ(ＣＲＥ)−レポーター系による結果を示しているが、β２アドレナリン受容体（Ａｄｒｂ２）およびアデノシン２Ａ受容体（ＡＤＯＲＡ２Ａ）について示されているように、ＣＲＥ−レポーター系で全てのＧｓと共役するＧＰＣＲを評価できるわけではない。しかしながら、そのようなＧｓと共役するＧＰＣＲの活性化についても、本発明によって検出可能である。
【図１１】図１１は、本発明のアッセイ系によりｈＳＳＴＲ２の活性化を検出した結果を示す図である。左図はＧ１２／ｉキメラタンパク質を用いていない場合の結果であり、右図では、キメラ存在下および非存在下での結果が示される。なお、左図と右図において、縦軸のスケールが約２０倍程異なる。
【図１２】図１２は、本発明のアッセイ系によりｈＦｌｔ３の活性化を検出した結果を示す図である。横軸はリガンド濃度を示し、縦軸は、各リガンド濃度で出力される発光強度を示している。
【図１３】図１３は、本発明のアッセイ系によりヒトＥＧＦ受容体の活性化を検出した結果を示す図である。横軸はリガンド濃度を示し、縦軸は、各リガンド濃度で出力される発光強度を示している。尚、本アッセイにおいては、細胞に内因性に発現しているヒトＥＧＦ受容体を利用している。
【図１４】図１４は、本発明において提供される、ある細胞においてあるタンパク質の活性化により発現が誘導される遺伝子の同定方法の一例を示す模式図である。例えば、ＨｅＬａ細胞において、細胞内でＧ１２／１３が特異的に活性化された場合に誘導される遺伝子発現応答を次世代シークエンサーを用いてゲノムワイドで解析することができる。この場合、リガンド添加無し（左）またはリガンド添加有り（右）と、受容体過剰発現無し（上）および受容体過剰発現有り（下）の４群における遺伝子発現を測定することができる。受容体過剰発現有りかつリガンド添加有りの群（右下）で発現が誘導される遺伝子を、使用する遺伝子の候補とすることができる。ＨｅＬａ細胞でＧ１２／１３が特異的に活性化された場合に約１０倍以上の発現誘導がかかる候補遺伝子は、ゲノムワイド発現解析で（約２２０００遺伝子中）１０遺伝子のみであった。
【図１５】図１５は、本発明のHEK293T細胞を使用して樹立したアッセイ系によって、G12/13と共役するGPCR（GPR55およびLPAR6）のリガンドによる活性化を検出した図である。横軸はリガンド濃度を示し、縦軸は、各アッセイ系で出力される発光強度を示している。
【図１６】図１６は、本発明のHEK293T細胞を使用して樹立したアッセイ系によって、Gs系のGタンパク質と共役するGPCR（Adrb2）のリガンドによる活性化と、Gq/11系のGタンパク質と共役するGPCR（HRH1）のリガンドによる活性化とを検出した図である。
【図１７】図１７は、本発明のHEK293T細胞を使用して樹立したアッセイ系においてGq/i1およびGq/i3キメラタンパク質を併用することで、Gi/o系のGタンパク質と共役するGPCR（OPRM1およびSSTR2）のリガンドによる活性化を検出した図である。
【図１８】図１８は、本発明のHEK293T細胞を使用して樹立したアッセイ系によって、受容体型チロシンキナーゼ（Flt3およびEGFR）のリガンドによる活性化を検出した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、其の複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、其の複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。従って、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語及び科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１９】
（１）概要
細胞膜に発現する膜タンパク質にリガンドが結合した後に、同じ時相において生じる複数の細胞内シグナル伝達経路の活性化、すなわちある膜タンパク質の活性化とその下流においてほぼ同時期に生じる複数の異なる遺伝子発現について考える。
【００２０】
一般には、膜タンパク質にリガンドが結合することによって細胞内の遺伝子転写調節領域が活性化されて、その下流の遺伝子が発現し、それら遺伝子にコードされているタンパク質が生成される。このようにして発現誘導される遺伝子の中から、特にほぼ同時期に発現誘導される独立した複数の遺伝子（遺伝子１、遺伝子２、遺伝子３、さらに遺伝子Nといい、それら遺伝子の転写調節領域をそれぞれ転写調節領域１、転写調節領域２、転写調節領域３、さらに転写調節領域Nという）の存在に着目する。
【００２１】
本発明においては、転写調節領域１の下流に、遺伝子１に代えて第１の目的遺伝子（第１の因子をコードする遺伝子）を連結したコンストラクト１を構築するとともに、転写調節領域２の下流に、遺伝子２に代えて第２の目的遺伝子（第２の因子をコードする遺伝子）を連結したコンストラクト２を構築し、これらのコンストラクトを細胞に導入する。
図１に示すように、タンパク質１を、プロテアーゼ切断領域を有する細胞膜アンカー型人工転写因子とし、タンパク質２をプロテアーゼとすると、リガンドが膜タンパク質（例えばＧＰＣＲ）に結合することによりシグナル伝達が起こり、転写調節領域１が機能して細胞膜アンカー型人工転写因子が発現し、発現及び生成した当該転写因子は細胞膜に結合する。この段階では、この転写因子は細胞膜に結合したままなので不活性型である。
【００２２】
次に、上記シグナル伝達により転写調節領域１の活性化と独立・並行しながら同時期に転写調節領域２が機能してタンパク質２（プロテアーゼ）が発現すると、プロテアーゼは、上記転写因子に連結されているプロテアーゼ切断領域に作用して転写因子を細胞膜から切り離す。細胞膜から切り離された転写因子は核内へ移行し活性型となる。
この活性型転写因子が結合する配列（人工転写因子結合配列）とレポーター遺伝子とを連結したコンストラクト（図１では「人工転写因子結合配列−ルシフェラーゼレポーター」）を作製して、これをコンストラクト１及びコンストラクト２とともに細胞に導入しておけば、上記の通り切り離された転写因子が人工転写因子結合配列に結合し、その下流のレポーター遺伝子が発現する。
【００２３】
結局、リガンドの膜タンパク質への作用は、リガンドが膜タンパク質に結合することによって生じる複数のシグナル伝達経路の活性化度合いの積へと変換されるため、レポーター遺伝子が存在するコンストラクトにおけるレポーター遺伝子の発現を、発光等により検出すれば、相乗的に増幅された出力を得ることができる。従って、リガンドは被験化合物に相当するため、試験する化合物と膜タンパク質の組み合わせの目的に応じて、コンストラクトを適宜構築し、細胞に導入することにより、レポーター遺伝子の発現を指標として、当該被験化合物が膜タンパク質にどのように作用しているかを高い感度で調べることができる。
【００２４】
本発明において、シグナル伝達経路に関与する遺伝子は、上記遺伝子１、遺伝子２の発現に限らず、第３番目、・・・、第Ｎ番目の遺伝子まで関与し得る。そこで本発明においては、被験化合物が上記の系にどのような影響を与えるかを調べるために、膜タンパク質の活性化により同じ時相で発現が誘導されるＮ個の遺伝子（第１〜第Ｎの遺伝子）の転写調節領域に、第１〜第Ｎの因子をコードするヌクレオチド配列（それぞれ第１〜第Ｎのヌクレオチド配列）を、それぞれ作動可能に連結したコンストラクト、又はこれらの組合せを提供する。
【００２５】
（２．定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義及び／又は基本的技術内容を適宜説明する。
本明細書において、「シグナル伝達を担う」分子とは、その分子における変化が、他の分子における変化をもたらす任意の分子を指す。このような分子には、Ｇタンパク質共役型受容体などの受容体、イオンチャネル等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００２６】
本明細書において、ある事象によってある遺伝子の「発現が誘導される」とは、当該事象が生じた場合の当該遺伝子の発現量と、当該事象が生じていない場合の遺伝子の発現量との間に、差異、好ましくは有意差が生じることをいう。
【００２７】
本明細書において、「コンストラクト」とは、一定の構造を有する１つまたは複数の核酸を指し、好ましくは、天然に存在しないものを指す。明示的に特定されない場合、「コンストラクト」は、１つまたは複数のコンストラクトを指す。コンストラクトは、それ自体が単離されているものに限定されず、より長い核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）中に外来配列が挿入されている場合、当該外来配列を含んでいる天然に存在しない構造を有する部分を指す場合もある。
【００２８】
本明細書において、「キメラ」とは、第１のタンパク質の全部または一部と、当該第１のタンパク質とは異なる第２のタンパク質の全部または一部とを含むポリペプチドを指す。本明細書におけるキメラとしては、第１のタンパク質の一部が、第２のタンパク質の対応する部分に置き換えられているものが挙げられる。
【００２９】
本明細書において、用語「活性」は、当該分野で最も広い意味での分子の機能を指す。活性は、限定を意図するものではないが、概して、分子の生物学的機能、生化学的機能、物理的機能または化学的機能を含む。活性は、例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力、および他の分子の機能を活性化するか、促進するか、安定化するか、阻害するか、抑制するか、または不安定化する能力、安定性、特定の細胞内位置に局在する能力を含む。
【００３０】
本明細書において、「活性化」とは、概して、生体や生体物質がその機能を発揮するようになることをいい、タンパク質の活性化とは、そのタンパク質がなんらかの刺激または自然に（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）活性レベルを上昇させて、何らかの機能を発揮することをいう。活性化の結果、例えば、シグナル伝達が生じるなど種々の生体現象が生じる。
【００３１】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様である。したがって、本明細書において「発現産物」とは、このようなポリペプチドもしくはタンパク質、またはｍＲＮＡを含む。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
【００３２】
本明細書において「転写調節領域」としては、転写開始または転写効率を制御可能な配列であり、プロモーター、エンハンサー、応答配列、サイレンサーなどが挙げられる。
【００３３】
本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（例えば、物質、エネルギー、電磁波あるいはある種の光信号などを発する物質など）をいう。本発明で用いられる標識としては、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質、ベータガラクトシダーゼ、ベータラクタマーゼ、アルカリフォスファターゼ、ベータグルクロニダーゼなどを挙げることができるがこれらに限定されない。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。
【００３４】
本明細書において「酵素」とは、広義に解され、任意の反応を触媒するタンパク質の総称であり、それ自体は変化または分解せずに生体内の化学変化を媒介または促進する。酵素と反応する物質を「基質」といい、本明細書では「基質」は最広義に解される。それぞれの酵素には、どのような物質を基質とし、それを何に変化させるかが決まっており、これを酵素の特異性という。本発明では、このような特異性を利用することができる。
【００３５】
本明細書において「導入」とは、核酸などを細胞に入れることをいい、トランスフォーメーション、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、アグロバクテリウム法、直接マイクロインジェクション等により実現することができる。
【００３６】
本明細書において「転写因子」とは、転写を制御するために目的のゲノム遺伝子座または遺伝子と関連する特異的ＤＮＡ配列と結合するタンパク質またはポリペプチドを指す。転写因子は、目的の遺伝子へのＲＮＡポリメラーゼのリクルートを促進（アクチベーターとして）または遮断（リプレッサーとして）し得る。転写因子は、単独で、またはより大きいンパク質複合体の一部として、その機能を実行できる。転写因子によって使用される遺伝子調節の機構には、ａ）ＲＮＡポリメラーゼ結合の安定化または不安定化、ｂ）ヒストンタンパク質のアセチル化または脱アセチル化、およびｃ）コアクチベーターまたはコリプレッサータンパク質のリクルートが含まれるがこれらに限定されない。さらに、転写因子は、基底転写、転写の増強、発生、細胞間シグナル伝達に対する応答、環境合図に対する応答、細胞周期制御および病理発生が含まれるがこれらに限定されない生物学的活性において役割を果たす。転写因子に関する情報に関して、その全体が参考として本明細書に援用されるLatchmanおよびDS  (1997)  Int.  J.  Biochem.  Cell  Biol.  29  (12):  1305〜12;Lee  TI、Young  RA  (2000)  Annu.  Rev.  Genet.  34:  77〜137ならびにMitchell  PJ、Tjian  R  (1989)  Science  245  (4916):  371〜8に対して言及がなされる。細胞膜アンカー型転写因子は、細胞膜に局在する構造を付与した人工的な転写因子である。細胞膜アンカー型転写因子の取り得る構成の例としては、細胞膜タンパク質の細胞内ドメインに連結させる、パルミトイル化などの脂質修飾を介して細胞内側から細胞膜にアンカリングさせる、などが挙げられるが、これに限定されない。
【００３７】
本明細書において、「細胞膜型」または「膜型」とは、細胞膜に局在化する任意の構造を含むか、またはかかる構造と連結されていることをいう。
【００３８】
本明細書において「プロテアーゼ」とは、タンパク質分解酵素とも呼ばれ、タンパク質などのペプチド結合を加水分解する反応を触媒する酵素の総称である。
【００３９】
本明細書において「膜タンパク質」とは、細胞膜の内部または外表面に存在するタンパク質をいう。膜タンパク質は、細胞膜に埋めこまれ，あるいはゆるく結合して存在する。
【００４０】
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいい、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさすことがある。
【００４１】
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本発明の実施形態に係るポリペプチドが「特定のアミノ酸配列」を含むとき、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が化学修飾を受けていてもよい。また、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が塩、または溶媒和物を形成していてもよい。また、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸がＬ型、またはＤ型であってもよい。それらのような場合でも、本発明の実施形態に係るタンパク質は、上記「特定のアミノ酸配列」を含むといえる。
【００４２】
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。
【００４３】
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。本発明において用いられる任意のタンパク質、核酸や遺伝子は、具体的に言及される特定の配列の他その配列に対して相同性を有する配列を含むタンパク質、核酸や遺伝子であってもよく、例えば、本明細書に具体的に記載されるタンパク質をコードする核酸と相同性を有する核酸によってコードされてよい。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【００４４】
本明細書において「機能的等価物」とは、対象となるもとの実体に対して、目的となる機能が同じであるが構造が異なる任意のものをいう。本発明において用いられる任意のタンパク質または核酸は、好ましくは、本明細書に具体的に記載されるタンパク質または核酸の機能的等価物であってよい。本発明の機能的等価物としては、アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加されたものを用いることができる。改変アミノ酸配列は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個のアミノ酸の挿入、置換、もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたものであることができる。１または複数個（好ましくは１もしくは数個または１、２、３、もしくは４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であってもよい。ここで「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該分野において公知である。
【００４５】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ２．２．２８（２０１３．４．２発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメータの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。類似性は、同一性に加え、類似のアミノ酸についても計算に入れた数値である。
【００４６】
本発明の一実施形態において「数個」は、例えば、１０、８、６、５、４、３、または２個であってもよく、それらいずれかの値以下であってもよい。１または数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、または他のアミノ酸による置換を受けたポリペプチドが、その生物学的活性を維持することは知られている（Ｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８４  Ｓｅｐ；８１（１８）：  ５６６２−５６６６．、Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９８２  Ｏｃｔ  ２５；１０（２０）：６４８７−６５００．、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９８４  Ｊｕｎ  ２９；２２４（４６５６）：１４３１−１４３３．）。欠失等を導入した変異型タンパク質から、野生型と同様の活性のあるタンパク質を選択することは、ＦＡＣＳ解析やＥＬＩＳＡ等の各種キャラクタリゼーションを行うことで可能である。
【００４７】
本発明の一実施形態において「９０％以上」は、例えば、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％以上であってもよく、それらいずれか２つの値の範囲内であってもよい。上記「相同性」は、２つもしくは複数間のアミノ酸配列において相同なアミノ酸数の割合を、当該技術分野で公知の方法に従って算定してもよい。割合を算定する前には、比較するアミノ酸配列群のアミノ酸配列を整列させ、同一アミノ酸の割合を最大にするために必要である場合はアミノ酸配列の一部に間隙を導入する。整列のための方法、割合の算定方法、比較方法、およびそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該技術分野で従来からよく知られている（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＧＥＮＥＴＹＸ等）。本明細書において「相同性」は、特に断りのない限りＮＣＢＩのＢＬＡＳＴによって測定された値で表すことができる。ＢＬＡＳＴでアミノ酸配列を比較するときのアルゴリズムには、Ｂｌａｓｔｐをデフォルト設定で使用できる。測定結果はＰｏｓｉｔｉｖｅｓまたはＩｄｅｎｔｉｔｉｅｓとして数値化される。
【００４８】
本発明が、生体分子や物質（タンパク質、核酸など）に言及するとき、好ましくは、「精製された」ものであるか、「単離された」ものであり得る。本明細書において「精製された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その物質または生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本発明で用いられる物質または生物学的因子は、好ましくは「精製された」物質である。本明細書で使用される「単離された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その物質または生物学的因子に天然に随伴する因子が実質的に除去されたものをいう。本明細書中で使用される用語「単離された」は、その目的に応じて変動するため、必ずしも純度で表示される必要はないが、必要な場合、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本発明で用いられる物質は、好ましくは「単離された」物質または生物学的因子である。
【００４９】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。本発明において、例えば、コンストラクトにおいて使用されるヌクレオチド配列は、別の因子のフラグメントであってもよい。あるいは、本発明において、キメラ分子が想定される場合、そのキメラ分子は、ある要素のフラグメントと別の要素のフラグメントの組合せであってもよい。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
【００５０】
本明細書において使用される「切断可能リンカー」は、プロテアーゼで切断される任意のリンカーであり、例えば、特定のアミノ酸配列を有することで特異的に切断されるものなども包含される。
【００５１】
本明細書において、「約」とは、示される値の±１０％の変動までが許容されることを指す。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
【００５２】
（３．シグナル伝達を担う分子）
本発明は、シグナル伝達を担う分子への化合物の作用を調査する手段を提供する。ここで、シグナル伝達を担う分子としては、当該分子の活性化によって下流にシグナルが伝達される分子であれば特段制限はされない。シグナル伝達を担う分子は、被験化合物が直接作用する分子（例えば、受容体そのもの）でもよく、また、被験化合物が作用した分子からのシグナル伝達によって活性化されて下流にシグナルを伝達する分子（例えば、受容体と共役しているタンパク質）でもよい。シグナル伝達を担う分子としては、下流で何らかの遺伝子の発現を誘導するものを用いることができる。シグナル伝達を担う分子としては、例えば、タンパク質、核酸、脂質、糖、またはこれらの複合体などが挙げられるが、好ましくは、シグナル伝達を担うタンパク質である。
【００５３】
シグナル伝達を担う分子として、細胞外のリガンドによる刺激に応答して細胞内へとシグナルを伝達する膜タンパク質が挙げられる。膜タンパク質の例としては、受容体（ＧＰＣＲ、酵素連結型受容体、イオンチャネル連結型受容体など）、チャネル、トランスポーター、細胞接着分子が挙げられる。
【００５４】
１つの実施形態では、シグナル伝達を担うタンパク質は、ＧＰＣＲ、またはＧＰＣＲと共役するＧタンパク質である。ＧＰＣＲは、ゲノム上に全部で約１０００種類存在するとされており、そのうち、匂い受容体以外の受容体（生理活性物質を認識するもの）が約３００種類あり、リガンド（受容体を活性化する物質）が未知な受容体（オーファン受容体）が約１００種類ある。本発明の１つの実施形態では、ＧＰＣＲは、匂い受容体ではないＧＰＣＲであり得る。
【００５５】
ＧＰＣＲは、それぞれ決まったＧタンパク質と共役しており、ＧＰＣＲの活性化がＧタンパク質に伝えられることによって細胞内へのシグナル伝達が実現される。ＧＰＣＲは特徴的な７回膜貫通型構造を有する受容体分子群であり、リガンドにより刺激された受容体はヘテロ三量体ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質：α、β、γの３つのサブユニットから構成される）を介して細胞内へとシグナルを伝達する。Ｇタンパク質はαサブユニットの配列に基づき、Ｇｓ、Ｇｉ、ＧｑおよびＧ１２／１３に大別され、ＧＰＣＲはそれぞれ、「ＧｓにカップルするＧＰＣＲ」、「ＧｑにカップルするＧＰＣＲ」、「ＧｉにカップルするＧＰＣＲ」、「Ｇ１２／１３にカップルするＧＰＣＲ」の４群に分類される。本明細書において、各群のＧタンパク質は、単にＧｓ、Ｇｉ、ＧｑおよびＧ１２／１３と記載されることもある。加えて、マウスおよびラットとヒトのＧＰＣＲはアミノ酸レベルで相同性が高い（８５％以上）が、しばしば人工リガンドによる活性化のされ方に大きな違いが観察されることがあり、リガンドのヒトＧＰＣＲへの作用を知りたい場合、ヒトＧＰＣＲを用いるのが好ましくあり得る。
【００５６】
これらのＧタンパク質は、それぞれ異なる様式で下流へとシグナルを伝達する。Ｇｓのｓは活性化（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）に由来し、Ｇｓは、膜酵素であるアデニル酸シクラーゼを活性化することにより後続するシグナル伝達カスケードを開始する。また、Ｇｓは、ホスホリパーゼＡ２あるいはホスホリパーゼＣなどを活性化して細胞内にシグナルを伝達する。活性化されたアデニル酸シクラーゼにより生成されたｃＡＭＰは、プロテインキナーゼＡを活性化する。Ｇｉは、Ｇｉ／ｏとも称され、ｉ／ｏは阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）／その他（ｏｔｈｅｒ）の頭文字を意味する。Ｇｉは、しばしばアデニル酸シクラーゼの活性を阻害するため、Ｇｓに由来するシグナルを抑制する。加えて、Ｇｉは、βγサブユニットを介してホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣβやホスホジエステラーゼを活性化するなど広範なシグナル伝達系に関与している。Ｇｑは、ホスホリパーゼＣβを活性化することによりシグナル伝達を行う。Ｇ１２／１３は、低分子量Ｇタンパク質であるＲａｓやＲｈｏを介したシグナル伝達系とクロストークする。
【００５７】
ＧＰＣＲは上市されている医薬品の約４割が標的としている受容体分子群とも言われ、化合物によるＧＰＣＲの活性化の観察には大きな意義がある。ＧＰＣＲ刺激によりＧタンパク質が活性化すると細胞内のセカンドメッセンジャー量が変化するため、セカンドメッセンジャー量を測定することによりＧＰＣＲの活性化状態を評価する方法があるが、スクリーニング効率およびコストの点で問題がある。
【００５８】
ＧＰＣＲを含めた細胞膜受容体分子の活性化状態を評価する指標としては、評価したい受容体を動物細胞に過剰発現させ、その細胞をリガンドで刺激した際に惹起される様々な遺伝子発現の変化がしばしば利用される。リガンド刺激前後における遺伝子発現の変化量を定量する場合、その遺伝子により産生されるｍＲＮＡやタンパク質を直接測定するのは実験手技が煩雑で、多数の検体を取り扱うスクリーニングには不向きであるため、通常はそのかわりに外因性レポーター遺伝子プラスミドを用いたレポーターアッセイを施行する。
【００５９】
レポーターアッセイは以下のようにして構築できる。
１）評価したい受容体を過剰発現させた細胞において、リガンド刺激前後でその発現量が有意に上昇する遺伝子群を同定する。
２）この遺伝子群から刺激応答比（リガンド刺激後の発現量／リガンド刺激前の発現量）の高い遺伝子をひとつ選択し、その遺伝子の転写調節領域を同定する。
３）同定された転写調節領域をクローニングし、その下流にレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼなど）を連結させた人工遺伝子（外因性レポーター遺伝子プラスミド）を作製する。
４）評価したい受容体を過剰発現させた細胞に、上記の人工遺伝子を外因性に遺伝子導入し、リガンド刺激前後の外因性レポーター遺伝子産物の活性を測定する。
【００６０】
レポーターアッセイは、ｍＲＮＡやタンパク質を実際に定量するのに比較して、圧倒的に簡便であるが、リガンド刺激前後で発現量が有意に上昇する遺伝子群が無い場合や、あっても刺激応答比が低い遺伝子群しか存在しない場合には、高感度のレポーターアッセイ系を構築するのは困難となる。
【００６１】
そのため、ＧＰＣＲの活性化状態（Ｇタンパク質の活性化状態）をモニターするにはレポーターアッセイで検出するのが最も簡便で効率的であるが、Ｇ１２／１３およびＧｉ／ｏの活性化状態をモニターできる良いレポーター（発現変動遺伝子）が知られていなかった。レポーターアッセイで、Ｇ１２／１３の活性化またはＧｉ／ｏの活性化をモニターするためにはレポーターアッセイにおける改善が必要だった。加えて、Ｇｓの活性化は、例えば、ＣＲＥ−レポーター系でモニターできるとされていたものの、一部のＧｓに共役するＧＰＣＲの活性化が、ＣＲＥ−レポーター系で検出されなかったことが見出されており（図１０を参照）、全てのＧｓに共役するＧＰＣＲをモニターできる系が必要であった。
【００６２】
また、Ｇタンパク質は種類により下流へのシグナル伝達の様式が異なっており、上記のとおり統一したレポーターアッセイ系でモニターできないため、リガンドが未知のオーファンＧＰＣＲのリガンド探索が困難であった。
【００６３】
本発明において、受容体のリガンド刺激後に発現が誘導される複数個の遺伝子群の転写調節領域を、酵素反応を介在させることにより機能的に連結し、それによって個々の転写調節領域が有する「リガンド刺激前後での転写活性の刺激応答比」を相乗的に統合した高感度なレポーターアッセイ系が提供される。本発明のアッセイ系を用いることにより、Ｇｓ、Ｇｉ、ＧｑおよびＧ１２／１３の全ての種類のＧタンパク質に共役する種々のＧＰＣＲを統一的にアッセイすることができる。
【００６４】
なお、本発明で分析し得るＧＰＣＲは以下の１つまたは複数、好ましくは実質的にすべてのものでありうる。
【００６５】
【表１−１】
2020026979.tif 000003
【００６６】
【表１−２】
2020026979.tif 000004
【００６７】
（４．検出系）
本発明では、タンパク質の活性化（例えば、リガンド、イオンによる刺激による）によって発現が変化する遺伝子の転写調節領域における変化を複数の因子を介在させて統合することによって、当該タンパク質の活性化を検出する系が提供される。
【００６８】
１つの実施形態において、あるタンパク質の活性化により発現が誘導される第１〜第Ｎの遺伝子の転写調節領域を、第１〜第Ｎの因子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する（Ｎは２以上の任意の整数であり、以下必要に応じてこの意味で文字Ｎを使用する）。第１〜第Ｎの因子のそれぞれは、当該因子とは異なる上記第１〜第Ｎの因子のうちの少なくとも１つの因子の活性を向上させるものであってよく、例えば、それぞれの因子は、他の因子の発現量を増加させるか、または他の因子によって触媒される反応の基質であるか、もしくは当該基質を生成する反応を触媒するものであってもよい。
【００６９】
ゲノム上の第１〜第Ｎの遺伝子の遺伝子座へ第１〜第Ｎの因子をコードする配列を組み込んでもよく、第１〜第Ｎの遺伝子の転写調節領域と第１〜第Ｎの因子をコードする配列とが作動可能に連結されている核酸分子を導入してもよい。
【００７０】
さらに、本発明のアッセイ系には、第１〜第Ｎの因子の少なくとも１つによって、発現が惹起される標識が含まれ得る。標識としては、その存在を簡便に検出できる分子を用いることができる。標識は、タンパク質であってよく、その場合、標識をコードする配列を含むコンストラクトを用いることができる。
【００７１】
標識としては、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ、βガラクトシダーゼ、βラクタマーゼ、アルカリフォスファターゼが挙げられる。標識の発現の惹起は、因子による標識の転写の活性化によるものであってもよく、その他の因子のシグナルを増強する作用によってもよい。
【００７２】
本発明の系の構築の１つの例としては、受容体のリガンド刺激後に発現が誘導される遺伝子がＮ個（遺伝子＃１から遺伝子＃Ｎ）あると仮定し、以下に示すｎ＋１個のコンストラクトを構築することができる。
（１）「遺伝子＃１の転写調節領域」を「酵素反応の基質（Ｓ）をコードする遺伝子」に作動可能に連結させた第１のコンストラクト
（２）「遺伝子＃２の転写調節領域」を「酵素反応の酵素（Ｅ１）をコードする遺伝子」に作動可能に連結させた第２のコンストラクト
（３）「遺伝子＃３の転写調節領域」を「ＳとＥ１の生産物Ｐ１を基質とする酵素（Ｅ２）をコードする遺伝子」に作動可能に連結させた第３のコンストラクト
（４）「遺伝子＃４の転写調節領域」を「Ｐ１とＥ２の生産物Ｐ２を基質とする酵素（Ｅ３）をコードする遺伝子」に作動可能に連結させた第４のコンストラクト
↓
（Ｎ）「遺伝子＃Ｎの転写調節領域」を「Ｐ（ｎ−３）とＥ（ｎ−２）の生産物Ｐ（ｎ−２）を基質とする酵素（Ｅ（ｎ−１））をコードする遺伝子」に作動可能に連結させた第ｎのコンストラクト
（Ｎ＋１）一連の酵素反応の最終生産物Ｐ（ｎ−１）によりレポーター遺伝子が活性化するように設計されたレポーター遺伝子コンストラクト
【００７３】
上記のｎ＋１個のコンストラクトを外因性に細胞に同時に遺伝子導入するか、あるいはノックインによって細胞内で形成させることにより、異なるＮ個の転写調節領域が有する「リガンド刺激前後での転写活性の刺激応答比」を相乗的に統合した高感度なレポーターアッセイ系を構築できる。
【００７４】
一般的な酵素反応式は、
酵素［Ｅ］＋基質［Ｓ］→酵素基質複合体［ＥＳ］→酵素［Ｅ］＋生産物［Ｐ］
（［  ］は濃度を表す）
で表され、反応速度は［Ｓ］と［Ｅ］の積に比例する。このため、［Ｓ］と［Ｅ］が経過中一定であると仮定すると、反応開始から一定時間後の［Ｐ］も［Ｓ］と［Ｅ］の積に比例する。よって上記の一連の酵素反応で生産される最終生産物Ｐ（ｎ−１）の濃度は、
［Ｐ（ｎ−１）］＝［Ｓ］×［Ｅ１］×［Ｅ２］×・・・×［Ｅ（ｎ−１）］となり、最終的なレポーター遺伝子の刺激応答比は理論上、
（遺伝子＃１の刺激応答比）×（遺伝子＃２の刺激応答比）×（遺伝子＃３の刺激応答比）×（遺伝子＃４の刺激応答比）×・・・×（遺伝子＃Ｎの刺激応答比）、すなわちＮ個の遺伝子がそれぞれ有する刺激応答比のすべてをかけあわせたものとなる（相乗的増幅）。但し、本想定は原理を非常に単純化したモデルであるため、実際の連鎖反応において各反応の［Ｓ］と［Ｅ］は一定ではない。
【００７５】
このように酵素反応を介在させることで複数の遺伝子の転写制御領域を機能的に連結でき、それによりシグナル増幅効果が期待される。この効果を実現するために、転写調節領域下流に連結される因子の組み合わせの一例として細胞膜型転写因子およびプロテアーゼがある（図２）。図２は、細胞膜型転写因子を発現するプラスミドとプロテアーゼを発現するプラスミドの２つを用意し、それぞれを様々な量で外因性に遺伝子導入した（図２を参照）細胞群（細胞にはＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター遺伝子も外因性に導入してある）において測定されたルシフェラーゼ活性を示している。比較している２群間におけるルシフェラーゼ活性の比が倍数として記載されている。例えば、プロテアーゼ１０細胞膜型転写因子１０００を遺伝子導入した群とプロテアーゼ１００細胞膜型転写因子１００００を遺伝子導入した群のルシフェラーゼ活性を測定し比較した結果、プロテアーゼ１００細胞膜型転写因子１００００を遺伝子導入した群はプロテアーゼ１０細胞膜型転写因子１０００を遺伝子導入した群より約１９０倍高いルシフェラーゼ活性を示した。本実験は細胞膜型転写因子の量とプロテアーゼの量の積でルシフェラーゼ活性が規定されることを示すのが主目的であるため、細胞膜型転写因子およびプロテアーゼは構成的なプロモーターによりドライブされており、転写調節領域には連結されていない。
【００７６】
また、上述のような１つの因子が１つの因子を活性化するような関係性に加えて、複数の因子が複合体を形成し、複合体になることにより他の因子または標識を活性化するような複数の因子も使用することができる。この場合は、反応の速度が比較的ゆっくりであることが望ましい。
【００７７】
本発明において、上記のとおり、シグナル伝達を担う分子の活性化により発現が誘導される遺伝子の転写調節領域を用いることができる。細胞により、シグナル伝達を担う分子によって発現が誘導される遺伝子が異なる場合があり得るが、当業者は、本明細書に記載される方法によって適宜同定することができる。
【００７８】
発現が誘導される遺伝子は、発現が誘導された場合に差が検出できるものを用いることができ、複数の遺伝子を組み合わせることで、それぞれの遺伝子単独では十分な感度の検出ができないものも使用可能である。発現が誘導される遺伝子として、発現が誘導された場合に、基底発現の少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．５倍、約２倍、約５倍、約１０倍、またはそれ超の発現量の増加が生じるものを用いることができる。好ましくは、約５〜１０倍程度またはそれ超の発現量の増加が生じる遺伝子が用いられる。本明細書において、４群間比較による発現変動遺伝子の同定が記載されているが、２群間で有意差が生じるものであっても、発現が誘導される遺伝子として用いることができる。
【００７９】
遺伝子の発現量としては、定量的ＰＣＲにおけるサイクル数（例えば、Ｃｔ値）、マイクロアレイにおける蛍光強度、またはＲＮＡ−Ｓｅｑにおけるリードカウント（当該遺伝子にマッピングされたリードカウント）等を使用することができ、当業者は適宜正規化して指標として用いることができる。例えば、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより遺伝子発現量を測定する場合、リードカウントを、ＴＭＭ、ｔｈｅ  ｍｅｄｉａｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｔｉｏ、ＤＥＧＥＳ、ＦＰＫＭ（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｐｅｒ  ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｅｘｏｎ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｒｅａｄｓ  ｍａｐｐｅｄ）またはＲＰＫＭ（ｒｅａｄｓ  ｐｅｒ  ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｅｘｏｎ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｒｅａｄｓ  ｍａｐｐｅｄ）によって標準化した値を用いることができる。
【００８０】
また、発現変動遺伝子の基底の発現量は遺伝子によって異なり、大きいものが好ましいが、例えば、ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析におけるＦＰＫＭ値が約１以上程度であれば使用可能であると考えられる。より好ましくは、ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析におけるＦＰＫＭ値が約５〜１０以上ある遺伝子である。なお、一般的にはＦＰＫＭが１０で高発現、５で中発現、１で低発現とされる。
【００８１】
また、発現が誘導される第１〜第Ｎの遺伝子は、全て異なるものでなくともよい。すなわち、同一の遺伝子の転写調節領域に異なる因子を作動可能に連結してもよい。
【００８２】
「異なる」２つ以上の遺伝子の転写調節領域を利用する場合には、一定の利点が存在する。２つ以上の因子を細胞のゲノムにノックインする場合、同一の場所にノックインするより、ゲノム上の異なる２カ所にノックインするほうが手技的に簡便で確実である。例えば、ＨｅＬａ細胞は一般的には偽３倍体であると考えられているため、２つの因子をゲノム上の同一の場所にノックインしようとする場合、第１の因子をノックインした後に、残りの２つのアリルのどちらかに第２の因子をノックインする必要が生じる。同一遺伝子座を標的とする場合、（１）３つのアリル全てがノックイン可能であるか、（２）３つのアリル全てにおいて転写がオンであるか、は事前には判定不能であるため、ゲノム上の異なる２カ所にノックインするほうが成功の確率が高いと考えられる。
【００８３】
また同一の領域を利用する場合、刺激に非依存的な揺らぎも増幅されるが、異なる領域を使うことでノイズの増幅を避けアッセイ精度の改善が期待される。これは、ハイスループット化が進み、マイクロ流路上のごく少数の細胞で測定するようになった場合などに大きな精度の差として現れ得る。
【００８４】
１つの実施形態では、遺伝子として、ＡＲＣ、ＣＣＬ２０、ＣＴＧＦ、ＤＵＳＰ５、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、ＦＯＳＢ、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ３、ＣＹＲ６１及びＦＯＳからなる群から選択される２つ以上の遺伝子の転写調節領域を用いることができる。さらなる実施形態では、細胞がＨｅＬａ細胞のときは、ＣＴＧＦおよびＮＲ４Ａ１の転写調節領域を用いることができ、細胞がＨＥＫ２９３Ｔ細胞のときは、ＦＯＳ及びＦＯＳＢの転写調節領域を用いることができる。
【００８５】
例えば、細胞内（ＨｅＬａ細胞）でＧ１２／１３が特異的に活性化された場合に誘導される遺伝子発現応答を、次世代シークエンサーを用いてゲノムワイドで解析したところ、約１０倍以上の発現誘導がかかる候補遺伝子はゲノムワイド発現解析で（約２２０００遺伝子中）１０遺伝子であった（下記表２−１に示す。）。
【００８６】
【表２−１】
2020026979.tif 000005
【００８７】
この他、発現誘導がかかる遺伝子としては、例えば、ABHD13、ABL2、ACKR3、ACTG1、ADAMTS1、ADAMTS5、ADAP1、ADM、ADRB2、AEBP2、AEN、AHR、AKAP2、ALDH1B1、ALPK2、ANKRD1、ANKRD33B、AP1AR、ARC、AREG、ARHGAP23、ARHGAP28、ARHGAP32、ARHGDIB、ARID5B、ARL5B、ATF3、ATP2B1、ATXN7、BACH1、BCL10、BHLHE40、BIRC3、BMP2、BMPR1B、BTG2、C19orf71、C1QTNF1、C8orf4、C9orf72、CASZ1、CBX4、CCDC68、CCL20、CCNL1、CCNT1、CD83、CDC42EP2、CDC42SE1、CDH5、CDKN1A、CDKN2AIP、CEBPD、CHD1、CHD2、CITED2、CITED4、CMIP、CNN2、COQ10B、CPEB3、CPEB4、CRB1、CREM、CRISPLD2、CSRNP1、CSRP1、CTGF、CTTNBP2NL、CXCL2、CYR61、DAAM1、DAPP1、DAW1、DCUN1D3、DDAH1、DENND3、DKK1、DNAJB4、DNAJC6、DUSP1、DUSP16、DUSP4、DUSP5、DUSP8、EDN1、EDN2、EGLN1、EGR1、EGR2、EGR3、ELAVL2、ELF3、ELL、ELL2、ELMSAN1、EPAS1、EPGN、EPHA2、EPPK1、ERRFI1、ETS2、ETV3、F3、FAM60A、FAM86B3P、FAT4、FBLIM1、FBXO33、FBXO46、FGF2、FHL1、FHL2、FOSB、FOSL1、FOSL2、FOXC1、FOXC2、FRMD4B、FSTL3、GAB2、GADD45A、GADD45B、GATA6、GLI2、GPCPD1、GPRC5A、GRAMD3、HBEGF、HECA、HELZ2、HES4、HK2、HLA-H、HMGCS1、HRH1、HSPA2、ICAM1、IER2、IER3、IER5、IFFO2、IL32、IL6、IQCJ-SCHIP1、IRF2BP2、IRF2BPL、IRS2、ITGB8、ITPRIP、JAG1、JPH2、JUN、JUNB、JUND、KCNJ12、KCNK1、KDM6B、KIAA0355、KIAA0825、KIAA1217、KLF2、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF9、KLHL29、KRT16、KRT17、KRT34、KRT80、LATS2、LDLR、LIFR、LIMA1、LINC00657、LOC100129550、LYPD3、MAFF、MAFK、MALAT1、MAMDC2、MAP2K3、MAP3K14、MAP3K8、MB21D2、MC1R、MCL1、MESDC1、MFAP5、MFSD2A、MITF、MMP12、MMP24、MN1、MPZL3、MTCL1、MXD1、MYADM、MYH9、NAB1、NAB2、NABP1、NAV2、NCEH1、NCOA7、NEDD9、NFIL3、NFKB2、NFKBIA、NFKBID、NFKBIE、NOCT、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NT5DC3、NT5E、NTN4、NUAK2、NYAP2、OLR1、OTUD1、PANX1、PDE4D、PDP1、PER1、PER2、PFKFB3、PHLDA1、PHLDA3、PHLDB2、PIGA、PIM1、PLAUR、PLEKHG3、PLEKHO2、PMAIP1、PMP22、PPP1R15B、PPP1R3B、PPP1R3C、PPP2R3A、PPTC7、PRDM1、PRG2、PRRG1、PSD4、PTGER4、PTGS2、PTPRH、PXDC1、RAB20、RAB32、RAP1GAP2、RASAL2、RASD1、RASSF8、RC3H1、RCAN1、REL、RELB、RELT、RGS2、RHOB、RIMKLB、RND3、RNF19A、RNF19B、RNF217、ROR1、RP2、RUNX1、RUSC2、SAMD4A、SAV1、SCML1、SDC4、SERPINE1、SERTAD1、SFMBT2、SGK1、SGMS2、SH3RF1、SIK1、SIRT1、SLC19A2、SLC20A1、SLC25A16、SLC26A2、SLC2A13、SLC2A3、SLC30A7、SLC38A2、SLC7A11、SLFNL1、SLFNL1-AS1、SNRK、SOCS3、SOCS6、SOWAHC、SPRED2、SRF、SSC5D、STARD4、STEAP4、STK38L、STX11、TAGLN、TBX3、TGFBR1、TGFBR3、THBS1、TICAM1、TIPARP、TLE4、TM4SF1、TMEM158、TMEM160、TNFAIP3、TNFRSF10A、TNFRSF8、TNS4、TP53I11、TPM1、TPM4、TPPP、TRAF1、TRAF4、TRIB1、TRMT44、TSC22D1、TSC22D2、TUFT1、UBALD1、UGCG、USP2、USP36、USP53、VCL、VGLL3、VPS37B、WDR1、WDR37、WEE1、WWC2、YOD1、ZBTB10、ZBTB21、ZC3H12A、ZC3H12C、ZC3HAV1、ZFAND5、ZFP36、ZFP36L1、ZFP36L2、ZNF217、ZNF267、ZNF281、ZNF324、ZNF331、ZNF529、ZNF548、ZNF644、ZSWIM4、ZYXなどを挙げることができるがこれに限定されず、これらの遺伝子は、実施例Ｃに記載されるような活性を有することが本発明において示されており、これらは、１またはそれより多い遺伝子を用いることが可能である。
【００８８】
また、細胞内（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）でＧ１２／１３が特異的に活性化された場合に誘導される遺伝子発現応答を、次世代シークエンサーを用いてゲノムワイドで解析したところ、約１０倍以上の発現誘導がかかる候補遺伝子はゲノムワイド発現解析で９遺伝子であった（下記表２−２に示す。）。
【００８９】
【表２−２】
2020026979.tif 000006
【００９０】
さらに、本発明において発現誘導がかかる遺伝子としては、以下のものが挙げられる。
NR4A2, LOC100506747, NR4A1, EPPK1, JUN, AMOTL2, FLNA, ARC, IER2, JUNB（少なくともいずれかの実験で5倍以上の発現変動）；ならびに
CNN2, DUSP1, MAFF, GPR3, TPM1, PTGS2, ATF3, G0S2, TRIB1, SNAI2, PDLIM7, NFKBIZ, TIMP3, FHL2, SPRY2, FOSL2, FERMT2, VCL, NUPR1, TPM4, GRASP, NKX2-5, TUFT1, ID1, FOSL1, MYADM, ACTB, LPP, KLF7, KLF6, ADAMTS1, BTG2, ACTG1, CSRNP1, WDR1, SRF, GEM, ZYX, NR2F1, LOC101928358, ITPRIP, FUT1, COL3A1, LIMA1, SLC8A1, JAG1, SLC6A9, PMAIP1, SLC2A10, PCK2, ZFP36L1, MAFB, CBX4, FZD10, ZBTB10, JDP2, ZNF214, RHOB, ID2, RND3, IRF2BPL, BMP2, SOX4, JUND, SLC1A4, PNRC1, SYBU（少なくともいずれかの実験で2倍以上の発現変動） 
【００９１】
本発明における因子としては、様々なものを使用することができるが、１つの好ましい例は、転写因子である。転写因子は、標識の発現または他の因子の発現を増大させるものであり得る。
【００９２】
転写因子は、例えば、人工転写因子であってよい。人工転写因子の例としては、以下の表に記載されるようなものが挙げられ、各々右欄に示されるＤＮＡ配列に結合する。標識または他の因子を当該ＤＮＡ配列に作動可能に連結することができる。
【００９３】
【表３】
2020026979.tif 000007
【００９４】
本発明の実施形態において、転写因子は、不活性化した状態で発現されるように構成され得る。「不活性化」は、例えば、転写因子が、転写が行われる核内へと移動しないようになっているか、または、活性でない状態（例えば、脱リン酸化状態など）になっていることによって実現され得る。このような状態で転写因子を発現させることにより、第２の因子の発現との相乗的なシグナルの増強が期待できる。
【００９５】
好ましくは、転写因子として、細胞膜アンカー型転写因子を用いることができる。細胞膜アンカー型転写因子は、細胞膜に局在化する任意の分子と転写因子とを連結したものであってよい。例えば、細胞膜に局在化する分子と転写因子とを、必要に応じて間にペプチドリンカーを含む融合タンパク質として発現させるものであってもよい。リンカーは、切断可能リンカーであってよく、例えば、後述のプロテアーゼにより特異的に切断される配列を有していてもよい。上記以外の細胞膜アンカー型転写因子の取り得る構成の例として、転写因子をパルミトイル化などの脂質修飾を介して細胞内側から細胞膜にアンカリングさせる、などが挙げられる。このように転写因子を細胞膜に局在化する分子に連結する、または転写因子の一部として細胞膜に局在化する部分を含めることによって、細胞膜アンカー型転写因子として利用することができる。
【００９６】
本発明における因子として、上記の不活性化した状態で発現された転写因子を、活性な状態に変更する活性を有する因子を用いることができる。例えば、かかる因子は、転写因子を細胞膜から解離させる活性を有していてもよい。転写因子の構造に応じて、当業者は、適切な因子を選択して用いることができる。例えば、転写因子が、ペプチド性の切断可能リンカーを介して膜結合部分と連結している場合、プロテアーゼ（好ましくは、リンカー配列に特異的なプロテアーゼ）を用いることができる。
【００９７】
本発明における因子として、プロテアーゼを用いることができる。プロテアーゼとしては、例えば、３Ｃ（ＨＲＶ  ３Ｃ  プロテアーゼ、Ｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅとも）、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ）、カスパーゼ３／７、エンテロキナーゼ、カスパーゼ８、ＰＳＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）またはカリクレイン関連ペプチダーゼ−３（ＫＬＫ３）、ＳＡＲＳ  ３ＣＬ１（３Ｃ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  ＳＡＲＳ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、第Ｘａ因子プロテアーゼ、トロンビンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９８】
本発明の１つの実施形態において、転写因子を活性な状態に変更する活性を有する因子（例えば、プロテアーゼ）は細胞膜型のものであってよい。かかる細胞膜型因子は、細胞膜に局在化する構造と連結するか、または細胞膜に局在化する構造を含んでよい。細胞膜型因子の構造としては、本明細書に記載される細胞膜アンカー型転写因子における、細胞膜に局在化する構造を同様に用いることができる。細胞膜型因子の取り得る構成の例として、因子（例えば、プロテアーゼ）を細胞膜タンパク質の細胞内ドメインに連結させる、あるいはパルミトイル化などの脂質修飾を介して細胞内側から細胞膜にアンカリングさせる、などが挙げられる。このように因子を細胞膜に局在化する分子に連結する、または因子の一部として細胞膜に局在化する部分を含めることによって、細胞膜型因子として利用することができる。かかる細胞膜型因子を利用することで、基質（細胞膜型転写因子）と酵素（細胞膜型プロテアーゼ）が同一細胞内コンパートメントに局在し効率よく反応が進行する。これにより基質と酵素の量が限定される条件下でもシグナルを感度よく検出できる効果が期待される。
【００９９】
１つの例では、前述の発現誘導のかかる遺伝子リスト（ＨｅＬａ細胞）より、２つの異なる遺伝子座（ＮＲ４Ａ１  ｌｏｃｕｓ、ＣＴＧＦ  ｌｏｃｕｓ）を選択することができる。またそれら遺伝子座の３’ＵＴＲに細胞膜アンカー型人工転写因子とプロテアーゼをノックインすることができる（図５）。図５に示されるようなコンストラクトを形成することによって、ＧＰＣＲ刺激で細胞膜アンカー型人工転写因子とプロテアーゼの発現が誘導されるようにゲノムが改変されたＨｅＬａ細胞が得られる（図６）。
また、本発明の別の態様において、細胞がHEK293Tの場合は、選択された２つの異なる遺伝子座（FOS locusおよびFOSB locus）の3’UTRに細胞膜型人工転写因子とプロテアーゼをノックインすることにより、HeLa細胞と同様の機能を持つインディケーター細胞を作成することができる。
【０１００】
そのような細胞を用いて、以下のように被験化合物のリガンド活性を測定できる。
１．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅと目的ＧＰＣＲの遺伝子をレポーター細胞に導入する。
２．ＧＰＣＲ刺激により膜アンカー型人工転写因子とプロテアーゼが発現誘導されるようにあらかじめアッセイに使用する細胞のゲノムは改変されている。
３．ＧＰＣＲ刺激で誘導された転写因子とプロテアーゼが相乗的にルシフェラーゼ発現を誘導する。
【０１０１】
（５．コンストラクト・キット）
１つの実施形態において、シグナル伝達を担うタンパク質への被験化合物の作用を調査するためのコンストラクトまたはコンストラクトの組合せが提供される。コンストラクトまたはコンストラクトの組合せは、シグナル伝達を担うタンパク質の活性化により発現が誘導される第１〜第Ｎの遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結されたそれぞれ第１〜第Ｎの因子をコードする第１〜第Ｎのヌクレオチド配列を含み得る。Ｎは２以上の整数である。このコンストラクトまたはコンストラクトの組合せと、上記第１〜第Ｎの因子の少なくとも１つによって発現が惹起されるように構成された標識をコードするヌクレオチド配列を含むコンストラクトとを含む、コンストラクトの組合せも提供され得る。
【０１０２】
また、これらはキットとして提供されてもよい。１つの実施形態において、シグナル伝達を担うタンパク質への被験化合物の作用を調査するためのキットが提供され、キットは、上記コンストラクトまたは上記コンストラクトの組み合わせを含み得る。
【０１０３】
さらなる実施形態では、シグナル伝達を担うタンパク質への被験化合物の作用を調査するためのキットであって、複数の直列的に関連する因子を含むキットが提供され得る。例えば、キットは、
（１）第１の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の基質（Ｓ）をコードするヌクレオチド配列に連結させた第１のコンストラクトと；
（２）第２の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の酵素（Ｅ１）をコードするヌクレオチド配列に連結させたコンストラクトであって、ここで、ＳとＥ１との酵素反応により生産物Ｐ１が生成される、第２のコンストラクトと；
Ｎが３以上である場合に、３〜Ｎの自然数であるｎのそれぞれについて、
（ｎ）第ｎの遺伝子の転写調節領域をＰ（ｎ−２）を基質として生産物（Ｐ（ｎ−１））を生成する酵素（Ｅ（ｎ−１））をコードする遺伝子に連結させた第ｎのコンストラクトと；
（Ｎ＋１）酵素反応の生産物Ｐ（Ｎ−１）によりレポーター遺伝子が活性化するように構成されたレポーター遺伝子コンストラクトと
を含み、第１〜第ＮのＮ個の遺伝子のそれぞれは、該被験化合物による該タンパク質の刺激により発現が誘導され、ここで、Ｎは２以上の自然数であり、ｎは１〜Ｎまでの自然数である、キットであり得る。キットには、本明細書に記載されるキメラＧタンパク質αサブユニットをコードするコンストラクトがさらに含まれ得る。キットは、コンストラクトまたはコンストラクトの組合せを細胞に導入するため、あるいはコンストラクトまたはコンストラクトの組合せを細胞内で形成するための薬剤をさらに含んでもよい。上記タンパク質の活性化により発現が誘導される第１〜第Ｎの遺伝子を特定することによって、上記コンストラクト、コンストラクトの組合せまたはキットを製造することができる。
【０１０４】
（６．細胞）
本発明において、本明細書に記載されるアッセイ系を組み込んだ細胞が提供される。細胞としては、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−１／７細胞、ＨＬ６０細胞、Ｋ５６２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｆ９細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、ＰＣ１２細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＥＦ細胞、Ｕ９３７細胞、Ｃ６細胞、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、ＴＨＰ−１細胞、ＢＷ５１４７細胞、Ｂａ／Ｆ３細胞、Ｙ−１細胞、Ｈ２９５Ｒ細胞、ＭＩＮ６細胞、ＮＩＴ−１細胞およびＭＤＡ−ＭＢ４３５Ｓ細胞からなる群から選択される１または複数の細胞を使用することが可能である。
【０１０５】
本発明の細胞は、本明細書に記載されるアッセイ系に加えて、本明細書に記載されるキメラＧタンパク質またはそれをコードする核酸を含んでよい。また、本発明の細胞は、所望のシグナル伝達を担う分子（またはシグナル伝達を担う分子を活性化させる分子、例えば、受容体）を過剰発現させたものであってよい。
【０１０６】
本発明の細胞は、本明細書に記載されるアッセイ系を構成する複数の核酸分子を導入することによって作製することができる。すなわち、当該細胞株においてシグナル伝達を担う分子の活性化によって発現が誘導される第１〜第Ｎの遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第１〜第Ｎの因子をコードする核酸配列を含む、１つまたは複数の核酸分子を、細胞に導入することによって作製することができる。
【０１０７】
核酸の細胞への導入は、リポフェクション、ジーンガン、塩化カルシウム法、リン酸カルシウム沈殿、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、  アグロバクテリウム法、ウイルス感染、直接マイクロインジェクションなどによって行うことができる。
【０１０８】
あるいは、第１〜第Ｎの因子を内在性の第１〜第Ｎの遺伝子の遺伝子座に組み込むことによって細胞内でコンストラクトを形成し、本発明の細胞を作製することができる。内在性遺伝子座への組み込みには、当技術分野で公知の技術を用いることができ、例えば、ゲノム編集技術を用いることができる。
【０１０９】
ゲノム編集技術としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＰＰＲヌクレアーゼ、Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（相同組み換え）、それらの改変法などを用いることができる。ゲノム編集について、当業者は、Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  （２０１２）  Ｃｈａｐｔｅｒ  １２：  Ｕｎｉｔ  １２．１５、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （２０１２）  ３０：  ４６０−４６５、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  （２０１１）  ３９：  ｅ８２、特表２０１３−５１３３８９号公報、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （２００２）  ２０：  １３５−１４１、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  （２００８）  ３１：  ２９４−３０１、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （２０１１）  ８：  ６７−６９、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （２００８）  ２６：６９５−７０１、特許第４９６８４９８号公報、特開２０１３−１２８４１３号公報等の情報を参照して適宜行うことができる。
【０１１０】
本発明においては、シグナル伝達を担うタンパク質を発現する細胞であって、上記タンパク質の活性化により発現が誘導される第１〜第Ｎの遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結されたそれぞれ第１〜第Ｎの因子をコードする第１〜第Ｎのヌクレオチド配列と、該第１〜第Ｎの因子の少なくとも１つによって発現が惹起されるように構成された標識をコードするヌクレオチド配列とを含み、ここで、Ｎは２以上の整数である、細胞が提供される。
【０１１１】
細胞は、シグナル伝達を担うタンパク質を発現し、直線的に関連する複数の因子を含んでいてもよい。例えば、細胞は、
（１）第１の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の基質（Ｓ）をコードする遺伝子に連結させた第１のコンストラクトと；
（２）第２の遺伝子の転写調節領域を酵素反応の酵素（Ｅ１）をコードする遺伝子に連結させたコンストラクトであって、ここで、ＳとＥ１との酵素反応により生産物Ｐ１が生成される、第２のコンストラクトと；
Ｎが３以上である場合に、３〜Ｎの自然数であるｎのそれぞれについて、
（ｎ）第ｎの遺伝子の転写調節領域をＰ（ｎ−２）を基質として生産物（Ｐ（ｎ−１））を生成する酵素（Ｅ（ｎ−１））をコードする遺伝子に連結させた第ｎのコンストラクトと；
（Ｎ＋１）酵素反応の生産物Ｐ（Ｎ−１）によりレポーター遺伝子が活性化するように構成されたレポーター遺伝子コンストラクトと
を含み、第１〜第ＮのＮ個の遺伝子のそれぞれは、該タンパク質の活性化により発現が誘導され、ここで、Ｎは２以上の自然数であり、ｎは１〜Ｎの自然数である。
【０１１２】
１つの実施形態において、それぞれ異なる膜タンパク質を発現する複数の細胞を含むキットが提供され、複数の細胞の各々は、本明細書に記載される特徴を有している。キットは、被験化合物の膜タンパク質への作用を網羅的に解析するためのものであり得る。１つの実施形態では、本明細書に記載の細胞、または本明細書に記載のキットを用いることを特徴とする、被験化合物の膜タンパク質への作用の解析方法が提供される。
【０１１３】
本明細書に記載の細胞の製造方法として、細胞に、膜タンパク質またはＧＰＣＲをトランスフェクトする工程と、発現が誘導される第１〜第Ｎの遺伝子の遺伝子座に、各遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結されるように前記第１〜第Ｎのヌクレオチドを導入する工程とを含む、方法が提供される。
【０１１４】
本発明の細胞は、膜タンパク質を発現する細胞であって、
該膜タンパク質の活性化により発現が誘導される第１の遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第１のヌクレオチド配列であって、細胞膜アンカー型転写因子をコードする、ヌクレオチド配列と、
該膜タンパク質の活性化により発現が誘導される第２の遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結された第２のヌクレオチド配列であって、プロテアーゼをコードする、ヌクレオチド配列と、
該転写因子によって発現が惹起されるように構成されたルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列と
を含み、ここで、該膜タンパク質は、Ｇタンパク質共役受容体、酵素連結型受容体、イオンチャネル連結型受容体、またはチャネルであり、該細胞膜アンカー型転写因子は、細胞膜アンカー部分と転写因子部分との間に、該プロテアーゼによって切断される切断可能リンカーを含む細胞である。
当該細胞としては、ＨｅＬａ細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞が挙げられる。そして、細胞がＨｅＬａ細胞のときは、例えば、該第１の遺伝子はＮＲ４Ａ１であり、該第２の遺伝子はＣＴＧＦである。また、細胞がＨＥＫ２９３Ｔ細胞のときは、例えば、該第１の遺伝子はＦＯＳであり、該第２の遺伝子はＦＯＳＢである。
【０１１５】
（７．キメラ）
別の局面において、本発明はまた、キメラＧタンパク質、それをコードする核酸、それを発現する細胞、およびそれを用いる方法も提供する。本明細書において、キメラとなっているＧタンパク質αサブユニット、およびそれを含むキメラＧタンパク質が提供される。Ｇタンパク質の受容体への配向性はＧαサブユニットのＣ末端のアミノ酸配列で決定されるため、キメラＧタンパク質を用いることによって、あるＧタンパク質と共役するＧＰＣＲの活性化を、異なるＧタンパク質が活性化されたときに生じる細胞内シグナルを用いて検出することが可能になる。本発明では、あるＧ１２／１３のαサブユニットにおいて、Ｃ末端のアミノ酸配列が、異なるＧタンパク質αサブユニットのアミノ酸配列に置き換えられているキメラＧタンパク質αサブユニットが提供される。
【０１１６】
異なるＧαサブユニットとしては、Ｇαｓ、ＧαｉおよびＧαｑが挙げられるが、好ましくは、Ｇαｓサブユニットである。キメラとして置き換える範囲は、Ｇ１２／１３のαサブユニットのＣ末端側の、約５０アミノ酸以下、約４０アミノ酸以下、約３０アミノ酸以下、約２０アミノ酸以下、または約１０アミノ酸以下のアミノ酸であってよく、好ましくは６アミノ酸である。
【０１１７】
本発明で提供されるキメラＧタンパク質は、本明細書に記載される被験化合物のシグナル伝達を担うタンパク質への作用を調査するための方法において使用することができる。本明細書に記載されるコンストラクトと、キメラＧタンパク質（またはそれをコードするコンストラクト）とを組み合わせて用いることができる。例えば、上記コンストラクトを含む細胞において、キメラＧタンパク質をさらに発現させることができ、Ｇ１２／１３以外のＧタンパク質（例えば、Ｇｓ）と共役するＧＰＣＲからのシグナルを、Ｇ１２／１３からのシグナルと同じ検出系で検出することができる。
【０１１８】
１つの実施形態では、キメラＧタンパク質は、配列番号６の配列、配列番号８の配列またはそれと少なくとも約９０％の配列同一性を有する配列あるいはそのフラグメントを有するαサブユニットを含み得る。
【０１１９】
１つの実施形態は、キメラＧタンパク質αサブユニットであって、Ｇα１２／１３に属する第１のＧαサブユニットのアミノ酸配列において、Ｃ末端のアミノ酸配列が、該第１のＧαサブユニットとは異なるＧαサブユニットのアミノ酸配列に置き換えられているアミノ酸配列を有する、キメラＧタンパク質αサブユニットである。異なるＧαとして、Ｇαｓを用いることができる。Ｃ末端の約６アミノ酸を異なるＧαサブユニットのアミノ酸配列に置き換えることができる。これらのキメラＧタンパク質αサブユニットを含む、キメラＧタンパク質も提供される。キメラＧタンパク質と該キメラＧタンパク質と共役しているＧＰＣＲとを含む複合体、またはそれを含む細胞が提供される。細胞は、本明細書に記載されるコンストラクトをさらに含んでもよい。これらの細胞を、ＧＰＣＲの機能分析に用いることができる。キメラＧタンパク質は、それをコードするヌクレオチド配列を含むコンストラクトとしても提供可能である。
【０１２０】
（８．遺伝子同定）
また、他の局面において、本発明は、ある細胞において、シグナル伝達を担うタンパク質の活性化により発現が誘導される遺伝子を同定する方法を提供する。この方法で見いだされた活性化可能な遺伝子は、本発明のタンパク質の網羅的アッセイにおいて利用することができ、本発明のコンストラクトの一部として用いることができる。
【０１２１】
本発明のこの方法は、シグナル伝達を担うタンパク質と被験化合物との相互作用を調査するためのものであり得る。方法は、タンパク質を発現する細胞を、タンパク質の活性化因子と接触させた場合の細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、細胞を活性化因子と接触させなかった場合の細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、活性化因子と接触させなかった場合と比較して活性化因子と接触させた場合に発現が増加する遺伝子を候補遺伝子として選択する工程とを含んでよい。
【０１２２】
発現が誘導される遺伝子の同定について、タンパク質の発現の有無および活性化因子の有無による４群間の比較を行うことができ、タンパク質が発現している細胞を活性化因子と接触させた場合に発現が増加する遺伝子を候補遺伝子として選択することができる。
【０１２３】
１つの実施形態では、シグナル伝達を担う分子への被験化合物の作用を調査するために、ある細胞において、上記分子の活性化により発現が誘導される遺伝子を同定する方法が提供される。方法は、上記分子を発現する細胞を、上記分子の活性化因子と接触させた場合の細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、該細胞を該活性化因子と接触させなかった場合の該細胞における遺伝子発現レベルを得る工程とを含み得る。また、活性化因子と接触させなかった場合と比較して該活性化因子と接触させた場合に発現が増加する遺伝子を候補遺伝子として選択する工程を含み得る。
【０１２４】
１つの実施形態において、ある細胞において、シグナル伝達を担う分子の活性化により発現が誘導される遺伝子を同定する方法であって、４群間の比較を特徴とする方法が提供される。方法は、上記分子を発現する細胞を、上記分子の活性化因子と接触させた場合の細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
上記分子を発現する細胞を活性化因子と接触させなかった場合の細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
上記分子を発現しない細胞を、上記分子の活性化因子と接触させた場合の細胞における遺伝子発現レベルを得る工程と、
上記分子を発現しない細胞を、上記分子の活性化因子と接触させなかった場合の細胞における遺伝子発現レベルを得る工程とを含み得る。また、上記分子を発現する細胞を上記分子の活性化因子と接触させた場合に、他の場合と比較して発現が増加する遺伝子を候補遺伝子として選択する工程を含み得る。
【０１２５】
シグナル伝達を担う分子として、Ｇタンパク質Ｇ１２／１３と特異的に共役するＧＰＣＲを用い得る。この方法は、アッセイ用細胞の製造のためのものであってよく、上記細胞において、上記候補遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結されるようにヌクレオチド配列を遺伝子座に組み込むことによって、細胞を製造することが可能である。
【０１２６】
遺伝子の発現の測定は、当技術分野で公知の任意の方法によって行うことができる。例えば、遺伝子の発現量を測定する技術としては、マイクロアレイ、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、定量的ＰＣＲ等が挙げられる。好ましくは、ＲＮＡ−Ｓｅｑを採用することができる。シークエンシングの手法は、核酸試料の配列を決定することができる限り限定されず、当技術分野で公知の任意のものを利用することができるが、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を用いることが好ましい。次世代シークエンシングとしては、パイロシーケンシング、合成によるシークエンシング（シークエンシングバイシンセシス）、ライゲーションによるシーケンシング、イオン半導体シーケンシングなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１２７】
本発明の遺伝子同定方法は、例えば、「次世代シークエンサー：目的別アドバンスメソッド」（細胞工学別冊）、およびCold  Spring  Harb  Protoc.  2015  Nov;  2015(11):  951-969.等の文献を参照して適宜実施することができる。
【０１２８】
（９．応用）
本発明は、網羅的に被験化合物の膜タンパク質への作用を調査するのに利用可能である。網羅的な調査は、意図されるある特定の標的への作用を調査するのみではなく、意図される標的とは異なる分子への作用、すなわちオフターゲット活性を検出するのに有用である。特定の標的への作用を調べることで、被験化合物の医薬等への有用性を調べることができるのに加え、オフターゲット活性の検出により、化合物の安全性試験または毒性試験を行うことができる。したがって、本発明は、創薬の支援に有用である。１つの利用法としては、標的となる受容体を活性化させる被験化合物の、標的となる受容体を含めた、１または複数の受容体への結合をスクリーニングすることができる。結合をスクリーニングできる受容体として、本明細書に挙げられるものを標的とすることができるが、例えば、ＧＰＣＲ（例えば、今まで活性化の検出が難しかったＧ１２／１３に共役するＧＰＣＲ）を標的とすることができる。ＧＰＣＲには味覚に関する受容体（例えば、苦味受容体）が含まれ、一例として、苦味受容体への作用を調べることで、被験化合物の呈味特性を調べることができる。また、網羅的なスクリーニングにより、リガンドが未知であるいわゆるオーファン受容体を標的とすることもできる。加えて、本明細書の実施例に示されるように、受容体型チロシンキナーゼの活性化を検出することも可能である。
【実施例】
【０１２９】
＜実施例Ａ１：発現が誘導される複数の遺伝子の転写調節領域配列を用いるレポーター系＞
［概要］
本実施例において、異なる転写調節領域を有する複数のレポーターアッセイ構成遺伝子を外因性に一過性に動物細胞に導入することでシグナルが増幅することを示す。より詳細には、異なる転写調節領域（本実験においてはＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ）転写調節領とＳＲＦ（ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ）転写調節領域）を有する複数のレポーターアッセイ構成遺伝子を外因性に一過性に動物細胞に導入することでシグナルが増幅することを示す。【０１３０】
［材料および方法］
ＧＰＣＲ群に属するアンジオテンシン１型受容体（ｈＡｇｔｒ１）はそのリガンドであるアンジオテンシンＩＩにより活性化され、アッセイに使用する細胞種に依存せず（どの細胞種においてもほぼ共通して）、ＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ）転写調節領域やＳＲＦ（ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ）転写調節領域をもつ遺伝子の発現を上昇させることが既に知られている。そこで、これらの二つの転写調節領域に連結する因子として、以下に示す二つの人工遺伝子（ＴＭＧＶとＴＭ３Ｃ）を作成した。【０１３１】
（１）  細胞膜型人工転写因子（ＴＭＧＶ：ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｇａｌ４ＶＰ６４）の作成
ストップコドンを欠失させたヒトＩＬ２受容体アルファ鎖（ＮＭ＿０００４１７）のＣ末端に、ＨＲＶプロテアーゼ３Ｃ認識切断配列（ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１））を含むアミノ酸配列ＧＳＳＳＬＥＶＬＦＱＧＰＧＳＳＳ（配列番号２）をｉｎ−ｆｒａｍｅで連結し、そのＣ末端にさらに開始コドンを欠失させたＧａｌ４ＶＰ６４（ＧＶ：人工転写因子）をｉｎ−ｆｒａｍｅで連結した。【０１３２】
（２）  細胞膜型ＨＲＶプロテアーゼ３Ｃ（ＴＭ３Ｃ：ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ３Ｃ）の作成
ストップコドンを欠失させたヒトＩＬ２受容体アルファ鎖（ＮＭ＿０００４１７）のＣ末端に、ＧＳリンカー配列（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３））、開始コドンとストップコドンを共に欠失させたＨＲＶプロテアーゼ３Ｃ（アミノ酸配列はヒト化されている）を順にｉｎ−ｆｒａｍｅで連結し、さらにそのＣ末端に当該膜タンパク質を不安定化させる目的でＰＥＳＴ配列を付加した。【０１３３】
上記の（１）ＴＭＧＶ、（２）ＴＭ３Ｃを同時に細胞に遺伝子導入すると、ＩＬ２受容体の輸送システムに乗り両者とも細胞膜に移行する。両者が細胞膜上で会合すると（１）が基質（Ｓ）、（２）が酵素（Ｅ）として働き、細胞膜より人工転写因子ＧＶが細胞質へとリリースされる。膜よりリリースされたＧＶ（ｓｏｌｕｂｌｅ  ＧＶ：ｓＧＶ）は、酵素反応の結果生じた生産物（Ｐ）と捉えることができる。すなわち、（１）ＴＭＧＶおよび（２）ＴＭ３Ｃの細胞膜での濃度の積によって生産物（ｓＧＶ）の量が規定される。生産されたｓＧＶの量は、ＵＡＳ配列にｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを連結させたＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅというレポーター遺伝子（ＵＡＳはｓＧＶ結合配列：ｓＧＶが結合することによりルシフェラーゼの発現が誘導される）を利用して定量化できる。【０１３４】
よって、本実施例においては以下に記す３つの異なる組み合わせのプラスミドカクテルを用意した。
（１）  ｈＡｇｔｒ１＋ＮＦＡＴ−ＴＭＧＶ＋Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ−ｐｒｏｍｏｔｏｒ（Ｃｐ）−ＴＭ３Ｃ＋ＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
（ＴＭＧＶのみにリガンド刺激により発現誘導がかかる）
（２）  ｈＡｇｔｒ１＋Ｃｐ−ＴＭＧＶ＋ＳＲＦ−ＴＭ３Ｃ＋ＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
（ＴＭ３Ｃのみリガンド刺激により発現誘導がかかる）
（３）ｈＡｇｔｒ１＋ＮＦＡＴ−ＴＭＧＶ＋ＳＲＦ−ＴＭ３Ｃ＋ＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
（ＴＭＧＶとＴＭ３Ｃの両者においてリガンド刺激により発現誘導がかかる）【０１３５】
使用する細胞：ＨｅＬａ細胞【０１３６】
Ｄａｙ１：ＨｅＬａ細胞を２４０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６穴プレートに播種した。【０１３７】
Ｄａｙ２：９６穴プレートに播種してから２４時間以内に１ｗｅｌｌあたりＤＮＡ８４．６ｎｇ（ｈＡｇｔｒ１  ６０ｎｇ＋ＴＭＧＶ  １２ｎｇ＋ＴＭ３Ｃ  ０．６ｎｇ＋ＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １２ｎｇからなるプラスミドカクテル）をリポフェクション法により遺伝子導入した。【０１３８】
Ｄａｙ３：遺伝子導入２４時間後に細胞をリガンドにより刺激した（アンジオテンシンＩＩ：１００、１０、０ｎＭの濃度にて）。６時間刺激後、培養上清を捨て、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ用の基質を添加し、発光シグナルをプレートリーダーにて測定した。【０１３９】
［結果］
結果は図３に示される。（３）において、（１）および（２）と比較してより良好なリガンド濃度依存的なシグナルが検出された。異なる転写調節領域を有する複数のレポーターアッセイ構成遺伝子を外因性に一過性に動物細胞に導入することでシグナルが増幅することが実証された。【０１４０】
＜実施例Ａ２：同一の転写調節領域配列を有する複数のレポーターアッセイ構成遺伝子の使用＞
［概要］
本実施例は、同一の転写調節領域（本実験においてはＳＲＦ（ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ）  転写調節領域）を有する複数のレポーターアッセイ構成遺伝子を外因性に一過性に動物細胞に導入することでシグナルが増幅することを示すことを目的とする。【０１４１】
［材料および方法］
ＧＰＣＲ群に属するアンジオテンシン１型受容体（ｈＡｇｔｒ１）はそのリガンドであるアンジオテンシンＩＩにより活性化され、アッセイに使用する細胞種に依存せず（どの細胞種においてもほぼ共通して）、ＳＲＦ（ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ）転写調節領域をもつ遺伝子の発現を上昇させることが既に知られている。【０１４２】
そこで、以下に示す３つの異なる組み合わせのプラスミドカクテルを用意した。
（１）  ｈＡｇｔｒ１＋ＳＲＦ−ＴＭＧＶ＋Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ−ｐｒｏｍｏｔｏｒ（Ｃｐ）−ＴＭ３Ｃ＋ＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
（ＴＭＧＶのみリガンド刺激により発現誘導がかかる）
（２）  ｈＡｇｔｒ１＋Ｃｐ−ＴＭＧＶ＋ＳＲＦ−ＴＭ３Ｃ＋ＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
（ＴＭ３Ｃのみリガンド刺激により発現誘導がかかる）
（３）  ｈＡｇｔｒ１＋ＳＲＦ−ＴＭＧＶ＋ＳＲＦ−ＴＭ３Ｃ＋ＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
（ＴＭＧＶとＴＭ３Ｃの両者においてリガンド刺激により発現誘導がかかる）【０１４３】
使用する細胞：ＨｅＬａ細胞【０１４４】
Ｄａｙ１：ＨｅＬａ細胞を２４０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６穴プレートに播種した。【０１４５】
Ｄａｙ２：９６穴プレートに播種してから２４時間以内に１ｗｅｌｌあたりＤＮＡ８４．６ｎｇ（ｈＡｇｔｒ１  ６０ｎｇ＋ＴＭＧＶ  １２ｎｇ＋ＴＭ３Ｃ  ０．６ｎｇ＋ＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １２ｎｇからなるプラスミドカクテル）をリポフェクション法により遺伝子導入した。【０１４６】
Ｄａｙ３：遺伝子導入２４時間後に細胞をリガンドにより刺激した（アンジオテンシンＩＩ：１００、１０、０ｎＭの濃度にて）。６時間刺激後、培養上清を捨て、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ用の基質を添加し、発光シグナルをプレートリーダーにて測定した。【０１４７】
［結果］
結果は図４に示される。（３）において、（１）および（２）と比較してより良好なリガンド濃度依存的なシグナルが検出された。同一の転写調節領域を有する複数のレポーターアッセイ構成遺伝子を外因性に一過性に動物細胞に導入することでシグナルが増幅することが実証された。【０１４８】
＜実施例Ａ３：Ｇ１２／１３にカップルするＧＰＣＲを高感度に検定できる新規ＧＰＣＲアッセイ系で使用するインディケーター細胞の樹立＞
［概要］
Ｇ１２／１３タンパク質の活性化前後で高い応答比をもって反応する転写調節領域が現時点では明らかになっていないため、Ｇ１２／１３にカップルするＧＰＣＲを通常のレポーターアッセイ系によって評価することは困難である。そこで、前述の実施例での知見を利用して、Ｇ１２／１３にカップルするＧＰＣＲの評価を行うことができるかを検証した。【０１４９】
［材料および方法］
リガンドにより刺激されたＧＰＣＲはヘテロ三量体ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質：α、β、γの３つのサブユニットから構成される）を介して細胞内へとシグナルを伝達する。Ｇタンパク質はαサブユニットの配列に基づき、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｑ、Ｇ１２／１３に大別され、ＧＰＣＲはそれぞれ、「ＧｓにカップルするＧＰＣＲ」、「ＧｑにカップルするＧＰＣＲ」、「ＧｉにカップルするＧＰＣＲ」、「Ｇ１２／１３にカップルするＧＰＣＲ」の４群に分類される。【０１５０】
アッセイに使用する動物細胞種に依存せず「Ｇ１２／１３タンパク質の活性化前後で、高い応答比をもって反応する転写調節領域」が現時点では明らかになっていないため、「Ｇ１２／１３にカップルするＧＰＣＲ」を通常のレポーターアッセイ系によって評価することは困難である。【０１５１】
まず、「Ｇ１２／１３のみに特異的にカップルするＧＰＣＲ」を過剰発現させたＨｅＬａ細胞を用意した。次にその過剰発現させたＧＰＣＲに対応するリガンドで細胞を刺激し（Ｇ１２／１３タンパク質を特異的に活性化）、リガンド刺激前後で発現誘導がかかる遺伝子群をリストアップした（候補遺伝子の同定については、後述の実施例Ｃも参照されたい）。「Ｇ１２／１３タンパク質の活性化前後で、高い応答比をもって反応する転写調節領域」が知られていないという事実と合致して、高い刺激応答比（３０倍以上）をもって発現誘導がかかる遺伝子は同定できず、中等度の刺激応答比（５−１０倍程度）をもって発現誘導がかかる遺伝子を数個認めるのみであった。
そこで１０倍程度の中等度の刺激応答比を有する二つの遺伝子（遺伝子＃１と遺伝子＃２）に着目した。（遺伝子＃１：ＮＲ４Ａ１、遺伝子＃２：ＣＴＧＦ）【０１５２】
遺伝子の転写は、染色体の異なる場所に存在する複数の転写調節領域によって協調的に制御されることが多い。リガンド刺激前後で非常に高い刺激応答比をもって発現誘導がかかる遺伝子に着目できる場合には、その遺伝子の複数ある転写調節領域のうちの一つをクローニングし、それを基に人工レポーター遺伝子プラスミドを作製しても十分な刺激応答比をもつレポーターアッセイ系を構築できる可能性がある。しかし、本ケースのように、もともと中等度の刺激応答比しか持たない遺伝子に着目した場合には、その遺伝子の複数ある転写調節領域のうちの一つをクローニングし人工レポーター遺伝子プラスミドを作製しても十分な刺激応答比をもつレポーターアッセイ系を構築できない可能性がある。【０１５３】
そこで本件においては、通常の手法を採用するかわりに、遺伝子＃１と遺伝子＃２の３’ＵＴＲに直接レポーターアッセイ系の構成要素（すなわちＴＭＧＶおよびＴＭ３Ｃ）をノックインすることでレポーターシステムそのものを細胞の染色体に内在化する（細胞に内因化する）という逆転の発想を採用し、ＨｅＬａ細胞に内因性に存在する遺伝子＃１と遺伝子＃２の転写制御機構の全てをあますところなく利用することで、ＴＭＧＶおよびＴＭ３Ｃの転写を制御するインディケーター細胞を樹立した（図５および図６）。【０１５４】
上記インディケーター細胞の樹立にあたり、まず前述の２つのレポーターアッセイ系の構成要素のＮ末端側にＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）配列を付加した遺伝子断片、すなわち、（１）ＩＲＥＳ−ＴＭＧＶおよび（２）ＩＲＥＳ−ＴＭ３Ｃを作成した。【０１５５】
この２つの遺伝子断片をゲノム編集技術を用いて、ＨｅＬａ細胞ゲノム内の遺伝子＃１と遺伝子＃２の３’ＵＴＲにそれぞれノックインした。２つの異なるゲノム部位に上記の２つの遺伝子断片がノックインされた細胞をモノクローン化し、アッセイ系に供するインディケーター細胞とした（インディケーターＨｅＬａ細胞）。【０１５６】
インディケーターＨｅＬａ細胞の作成手順
Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ５４０：１４４−１４９，２０１６に記載されるゲノム編集手順を参考として、インディケーターＨｅＬａ細胞を以下のとおり作成した。【０１５７】
（１）ＩＲＥＳ−ＴＭＧＶ遺伝子断片をＣＲＩＳＰＲでゲノムの標的部位（一番目の標的部位：遺伝子＃１の３’ＵＴＲ）にノックインするため、ＩＲＥＳ−ＴＭＧＶのＮ末端側にｆｌｏｘ−Ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎ耐性遺伝子カセット（あらかじめｌｏｘＰでＢｌａｓｔｃｉｄｉｎ耐性遺伝子カセットの両脇が挟まれている）を連結し、その両端にさらにＣＲＩＳＰＲがゲノム上で認識する核酸配列（一番目の標的部位用）と同一の配列を付加したプラスミドをｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔバックボーンで構築した。すなわち、下記のような核酸配列となる：
（ＣＲＩＳＰＲ認識配列：一番目の標的部位用）−（ｆｌｏｘ−Ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎカセット）−（ＩＲＥＳ−ＴＭＧＶ）−（ＣＲＩＳＰＲ認識配列：一番目の標的部位用）
以後これをＴＭＧＶ  ｄｏｎｏｒ  ｐｌａｓｍｉｄ（ＤＰ−ＴＭＧＶ）と記す。【０１５８】
（２）ＣＲＩＳＰＲを利用してゲノムの標的部位（一番目の標的部位）にＤＮＡ二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ：ＤＳＢ）を引き起こすために必要なプラスミドをｐＸ３３０−Ｕ６−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ−ＣＢｈ−ｈＳｐＣａｓ９（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃４２２３０）を基にして構築した（ｐＶ３３０−１ｓｔ  ｔａｒｇｅｔ）。【０１５９】
（３）ＨｅＬａ細胞を６ｃｍ  ｄｉｓｈに５×１０＾５細胞播種し、播種翌日に“ｐＶ３３０−１ｓｔ  ｔａｒｇｅｔ  ３μｇ＋ＤＰ−ＴＭＧＶ  ０．０３μｇ”をリポフェクション法を用いて一過性に遺伝子導入した。【０１６０】
（４）遺伝子導入翌日より、細胞培養液にＢｌａｓｔｃｉｄｉｎを１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、約二週間培養した。【０１６１】
（５）Ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎ存在下で増殖したＨｅＬａ細胞を限界希釈し、モノクローン化した。【０１６２】
（６）モノクローン化されたそれぞれのクローンよりゲノムを回収し、標的部位（一番目の標的部位）に（ｆｌｏｘ−Ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎカセット）−（ＩＲＥＳ−ＴＭＧＶ）遺伝子断片が挿入されているかどうかをｇｅｎｏｍｉｃ  ＰＣＲ法にて確認した。【０１６３】
（７）標的部位に（ｆｌｏｘ−Ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎカセット）−（ＩＲＥＳ−ＴＭＧＶ）遺伝子断片が挿入されていたクローンにＣｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを一過性に遺伝子導入し（細胞を６ｃｍ  ｄｉｓｈに５×１０＾５細胞播種し、播種翌日にｉＣｒｅ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ発現プラスミド  ３μｇをリポフェクション）、遺伝子導入翌日より細胞培養液にｐｕｒｏｍｙｃｉｎを１０ｕｇ／ｍｌとなるように添加し、三日間培養した。このステップによりゲノムからＢｌａｓｔｃｉｄｉｎカセットが除去され、目的ゲノム部位（一番目の標的部位）にＩＲＥＳ−ＴＭＧＶのみが挿入された状態となる。【０１６４】
（８）このようにして樹立されたモノクローン群を以下の方法によりさらに選別した：Ｇ１２／１３に特異的にカップルするＧＰＣＲとしてＧＰＲ５５が知られている。そこで、樹立されたそれぞれのクローンにＧＰＲ５５発現プラスミド＋ＴＭ３Ｃ発現プラスミド＋ＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅのプラスミドカクテルを遺伝子導入し（９６穴プレートの１ｗｅｌｌあたりそれぞれ６０ｎｇ、１０ｎｇ、３０ｎｇをリポフェクション）、遺伝子導入２４時間後にＧＰＲ５５のリガンドであるＬＰＩ（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ：３ｕＭ、３００ｎＭ、０ｎＭの３濃度を使用）で細胞を６時間刺激した。刺激後、培養上清を捨て、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ用の基質を添加し、発光シグナルをプレートリーダーにて測定した。このアッセイにより、ＬＰＩ刺激に最も鋭敏に反応するクローンを同定し、これ以降の実験に使用した（このクローンを今後Ｎ１８２と記す）。【０１６５】
（９）ＩＲＥＳ−ＴＭ３Ｃ遺伝子断片をＣＲＩＳＰＲでゲノムの標的部位（二番目の標的部位：遺伝子＃２の３’ＵＴＲ）にノックインするため、ＩＲＥＳ−ＴＭ３ＣのＮ末端側にｆｌｏｘ−Ｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子カセット（あらかじめｌｏｘＰでＮｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子カセットの両脇が挟まれている）を連結し、その両端にさらにＣＲＩＳＰＲがゲノム上で認識する核酸配列（二番目の標的部位用）と同一の配列を付加したプラスミドをｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔバックボーンで構築した。すなわち、下記のような核酸配列となる：
（ＣＲＩＳＰＲ認識配列：二番目の標的部位用）−（ｆｌｏｘ−Ｎｅｏｍｙｃｉｎカセット）−（ＩＲＥＳ−ＴＭ３Ｃ）−（ＣＲＩＳＰＲ認識配列：二番目の標的部位用）
以後これをＴＭ３Ｃ  ｄｏｎｏｒ  ｐｌａｓｍｉｄ  （ＤＰ−ＴＭ３Ｃ）と記す。【０１６６】
（１０）ＣＲＩＳＰＲを利用してゲノムの標的部位（二番目の標的部位）にＤＳＢを引き起こすために必要なプラスミドをｐＸ３３０−Ｕ６−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ−ＣＢｈ−ｈＳｐＣａｓ９（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃４２２３０）を基にして構築した（ｐＶ３３０−２ｎｄ  ｔａｒｇｅｔ）。【０１６７】
（１１）Ｎ１８２細胞を６ｃｍ  ｄｉｓｈに５ｘ１０＾５細胞播種し、翌日に“ｐＶ３３０−２ｎｄ  ｔａｒｇｅｔ  ３ｕｇ＋ＤＰ−ＴＭ３Ｃ  ０．０３ｕｇ”をリポフェクション法を用いて一過性に遺伝子導入した。【０１６８】
（１２）遺伝子導入翌日より、細胞培養液にＧ４１８を１ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、約二週間培養した。【０１６９】
（１３）Ｇ４１８存在下で増殖したＮ１８２細胞にＣｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを一過性に遺伝子導入し（細胞を６ｃｍ  ｄｉｓｈに５ｘ１０＾５細胞播種し、播種翌日にｉＣｒｅ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ発現プラスミド  ３ｕｇをリポフェクション）、遺伝子導入翌日より細胞培養液にｐｕｒｏｍｙｃｉｎを１０ｕｇ／ｍｌとなるように添加し、三日間培養した。このステップによりゲノムからＮｅｏｍｙｃｉｎカセットが除去され、目的ゲノム部位（二番目の標的部位）にＩＲＥＳ−ＴＭ３Ｃのみが挿入された状態となる。【０１７０】
（１４）Ｇ４１８およびｐｕｒｏｍｙｃｉｎ存在下で増殖したＮ１８２細胞を限界希釈し、モノクローン化した。【０１７１】
（１５）モノクローン化されたそれぞれのクローンよりゲノムを回収し、標的部位（二番目の標的部位）にＩＲＥＳ−ＴＭ３Ｃ遺伝子断片が挿入されているかどうかを、ｇｅｎｏｍｉｃ  ＰＣＲ法にて確認した。【０１７２】
（１６）標的部位にＩＲＥＳ−ＴＭ３Ｃ遺伝子断片が挿入されていたクローンを以下の方法によりさらに選別した：樹立されたそれぞれのクローンにＧＰＲ５５発現プラスミド＋ＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅのプラスミドカクテルを遺伝子導入し（９６穴プレートの１ｗｅｌｌあたりそれぞれ６０ｎｇ、３０ｎｇをリポフェクション）、遺伝子導入２４時間後にＧＰＲ５５のリガンドであるＬＰＩ（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ：３ｕＭ、３００ｎＭ、０ｎＭの３濃度を使用）で細胞を６時間刺激した。刺激後、培養上清を捨て、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ用の基質を添加し、発光シグナルをプレートリーダーにて測定した。このアッセイにより、ＬＰＩ刺激に最も鋭敏に反応するクローンを同定した（このクローンを今後ＮＣＰ１９と記す）。【０１７３】
新規ＧＰＣＲアッセイ系のアッセイプロトコール
使用するプラスミド
（１）評価したいＧＰＣＲを発現するプラスミド  （ＧＰＣＲ発現プラスミド）
（２）ＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ｓＧＶによりｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの発現が誘導される人工レポーター遺伝子）【０１７４】
使用する細胞
ＮＣＰ１９（図６）【０１７５】
手順
Ｄａｙ１：ＮＣＰ１９細胞を２４０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６穴プレートに播種する。【０１７６】
Ｄａｙ２：９６穴プレートに播種してから２４時間以内に１ｗｅｌｌあたりＤＮＡ９０ｎｇ（ＧＰＣＲ  ６０ｎｇ＋ＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ３０ｎｇからなるプラスミドカクテル）をリポフェクション法により遺伝子導入する。【０１７７】
Ｄａｙ３：遺伝子導入２４時間後に細胞をリガンドにより刺激。６時間刺激後、培養上清を捨て、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ用の基質を添加し、発光シグナルをプレートリーダーにて測定する。【０１７８】
ＧＰＣＲとして、以下の受容体：ＧＰＲ５５（Ｇ１２／１３）、ＬＰＡＲ６（Ｇ１２／１３）、ＯＰＲＭ１（Ｇｉ／ｏ）、ＳＳＴＲ２（Ｇｉ／ｏ）、ＨＲＨ１（Ｇｑ／１１）、ＧＰＲ１１９（Ｇｓ）、Ａｄｒｂ２（Ｇｓ）およびＡＤＯＲＡ２Ａ（Ｇｓ）を用いた。【０１７９】
［従来法］
ＧＰＲ５５およびＬＰＡＲ６について、従来法での検出も試みた。詳細は以下のとおり。
使用する細胞：ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣより購入）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞
使用するプラスミド
（１）評価したいＧＰＣＲを発現するプラスミド（ＧＰＣＲ発現プラスミド）
本実験においてはＧＰＲ５５およびＬＰＡＲ６発現プラスミド
（２）ＳＲＦ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ【０１８０】
Ｄａｙ１：ＨｅＬａ細胞もしくはＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２４０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６穴プレートに播種した。【０１８１】
Ｄａｙ２：９６穴プレートに播種してから２４時間以内に１ｗｅｌｌあたりＤＮＡ９０ｎｇ（ＧＰＣＲ  ６０ｎｇ＋ＳＲＦ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ３０ｎｇからなるプラスミドカクテル）をリポフェクション法により遺伝子導入した。【０１８２】
Ｄａｙ３：遺伝子導入２４時間後に細胞をリガンドにより刺激（刺激濃度は図７を参照）。６時間刺激後、培養上清を捨て、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ用の基質を添加し、発光シグナルをプレートリーダーにて測定した。【０１８３】
これらについての結果は、図７中で「ＳＲＦ−ｌｕｃ＋ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ）」および「ＳＲＦ−ｌｕｃ＋ＨＥＫ２９３Ｔ」として示される。【０１８４】
また、ＧＰＲ５５およびＬＰＡＲ６について、外因性プロテアーゼを用いたシグナル検出も行った。このアッセイ系は、プロテアーゼが、構成的なプロモーターでプロテアーゼを発現するプラスミドを介して外因性に導入されている点でＮＣＰ１９細胞を利用したアッセイ系と異なっている。より詳細には以下のとおり。
使用する細胞：Ｎ１８２細胞（ＴＭＧＶのみが既にゲノムにノックインされている細胞）
使用するプラスミド
（１）評価したいＧＰＣＲを発現するプラスミド（ＧＰＣＲ発現プラスミド）
本実験においてはＧＰＲ５５およびＬＰＡＲ６発現プラスミド
（２）ＴＭ３Ｃ発現プラスミド（プロテアーゼを構成的なプロモーターで発現するプラスミド）
（３）ＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ【０１８５】
Ｄａｙ１：Ｎ１８２細胞を２４０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６穴プレートに播種した。【０１８６】
Ｄａｙ２：９６穴プレートに播種してから２４時間以内に１ｗｅｌｌあたりＤＮＡ１００ｎｇ（ＧＰＣＲ  ６０ｎｇ＋ＴＭ３Ｃ  １０ｎｇ＋ＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ３０ｎｇからなるプラスミドカクテル）をリポフェクション法により遺伝子導入した。【０１８７】
Ｄａｙ３：遺伝子導入２４時間後に細胞をリガンドにより刺激（刺激濃度は図８を参照）。６時間刺激後、培養上清を捨て、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ用の基質を添加し、発光シグナルをプレートリーダーにて測定した。【０１８８】
これについての結果は、図８中で「細胞膜型人工転写因子（ノックイン）＋プロテアーゼ（外来性）」として示される。【０１８９】
また、ＧＰＲ１１９（Ｇｓ）、Ａｄｒｂ２（Ｇｓ）およびＡＤＯＲＡ２Ａ（Ｇｓ）について、従来Ｇｓの活性化に用いられているＣｒｅ−レポーター系を用いる検出も行った。詳細は、以下のとおり。【０１９０】
使用する細胞：ＨｅＬａ細胞
使用するプラスミド
（１）評価したいＧＰＣＲを発現するプラスミド  （ＧＰＣＲ発現プラスミド）
本実験においてはＧＰＲ１１９、Ａｄｒｂ２およびＡＤＯＲＡ２Ａ発現プラスミド
（２）ＣＲＥ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ【０１９１】
Ｄａｙ１：ＨｅＬａ細胞を２４０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６穴プレートに播種した。【０１９２】
Ｄａｙ２：９６穴プレートに播種してから２４時間以内に１ｗｅｌｌあたりＤＮＡ９０ｎｇ（ＧＰＣＲ  ６０ｎｇ＋ＣＲＥ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ３０ｎｇからなるプラスミドカクテル）をリポフェクション法により遺伝子導入した。【０１９３】
Ｄａｙ３：遺伝子導入２４時間後に細胞をリガンドにより刺激（刺激濃度は図１０を参照）した。６時間刺激後、培養上清を捨て、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ用の基質を添加し、発光シグナルをプレートリーダーにて測定した。これについての結果は、図１０にＣＲＥ−ｒｅｐｏｒｔｅｒ（従来法）として示される。【０１９４】
［結果］
各濃度のリガンドの添加により、各アッセイ系から得られたシグナル（発光強度・リガンド最低濃度時のシグナルからの変化倍率）を、図７〜図１１に示す。上記アッセイプロトコールにより、リガンド濃度の増加に伴うシグナルの増大が観察された。【０１９５】
［考察］
上記のアッセイプロトコールにより、「Ｇ１２／１３にカップルするＧＰＣＲ」の活性化は問題なく評価できた（図７および８）。本アッセイ系の目的の１つであった「Ｇ１２／１３にカップルするＧＰＣＲ」の高感度の評価が達成された。従来法では活性化が評価できていない（図７）。【０１９６】
また、因子のうちの１つを遺伝子座にノックインしなかった場合（プロテアーゼを外因性とした場合）と比較して、リガンド濃度依存的なシグナルの増大がより大きくなっていた（図８）。これは、２つの因子のそれぞれがリガンド刺激の下流での転写調節の影響を受けるようにすることがシグナルの増大において重要であることを示唆している。【０１９７】
さらに、同じアッセイプロトコールにより「ＧｑにカップルするＧＰＣＲ」、「ＧｉにカップルするＧＰＣＲ」も評価することが可能であった（図９および図１１）。また、Ｇｓに関しては、試験された３つのＧｓにカップルするＧＰＣＲの活性化について、従来法であるＣＲＥ−レポーターアッセイでは検出できなかったが、ＧＰＲ１１９において、上記アッセイプロトコールによってシグナルが検出された（図１０）。【０１９８】
＜実施例Ａ４：受容体型チロシンキナーゼＦｌｔ３の活性化の検出＞
［概要］
本実施例は、ＮＣＰ１９細胞を用いたアッセイ系により、ＧＰＣＲだけでなく他の受容体の活性化状態をモニターできることを示すことを目的とする。本実施例ではＧＰＣＲ以外の細胞膜受容体の一例として受容体型チロシンキナーゼファミリーに属するヒトＦｌｔ３（ｈＦｌｔ３）を実験対象とした。【０１９９】
［材料および方法］
使用する細胞：ＮＣＰ１９
使用するプラスミド
（１）  ｈＦｌｔ３を発現するプラスミド（ｈＦｌｔ３発現プラスミド）
（２）  ＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ【０２００】
Ｄａｙ１：ＮＣＰ１９細胞を２４０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６穴プレートに播種した。【０２０１】
Ｄａｙ２：９６穴プレートに播種してから２４時間以内に１ｗｅｌｌあたりＤＮＡ９０ｎｇ  （ｈＦｌｔ３  ６０ｎｇ＋ＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ３０ｎｇからなるプラスミドカクテル）をリポフェクション法により遺伝子導入した。【０２０２】
Ｄａｙ３：遺伝子導入２４時間後に細胞をリガンドにより刺激（Ｆｌｔ３−Ｌｉｇａｎｄ：３０、３、０．３、０．０３、０ｎｇ／ｍｌの濃度にて）。６時間刺激後、培養上清を捨て、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ用の基質を添加し、発光シグナルをプレートリーダーにて測定した。【０２０３】
［結果］
結果を、図１２に示した。図１２に示されるように、Ｆｌｔ３−Ｌｉｇａｎｄの添加によるｈＦｌｔ３の活性化がルシフェラーゼの発光として検出された。ＮＲ４Ａ１およびＣＴＧＦ遺伝子の転写調節領域にＴＭＧＶおよびＴＭ３ＣがノックインされているＮＣＰ１９細胞を用いたアッセイ系により、ＧＰＣＲだけでなく他の受容体の活性化状態をモニターできることが示された。【０２０４】
＜実施例Ａ５：ヒトＥＧＦ受容体の活性化の検出＞
［概要］
本実施例は、ＮＣＰ１９細胞を用いたアッセイ系により、ＧＰＣＲだけでなく他の受容体の活性化状態をモニターでうることを示すことを目的とする。本実施例ではＧＰＣＲ以外の細胞膜受容体の一例として受容体型チロシンキナーゼファミリーに属するヒトＥＧＦ受容体を実験対象とした。尚、ヒトＥＧＦ受容体であるｈＥＧＦＲ、ｈＥｒｂＢ２、ｈＥｒｂＢ３はＮＣＰ１９細胞に内在性に発現している。【０２０５】
［材料および方法］
使用する細胞：ＮＣＰ１９
使用するプラスミド
ＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ【０２０６】
Ｄａｙ１：ＮＣＰ１９細胞を２４０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６穴プレートに播種した。【０２０７】
Ｄａｙ２：９６穴プレートに播種してから２４時間以内に１ｗｅｌｌあたりＤＮＡ３０ｎｇ  （ＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ３０ｎｇ）をリポフェクション法により遺伝子導入した。【０２０８】
Ｄａｙ３：遺伝子導入２４時間後に細胞をリガンドにより刺激した（ＥＧＦ：１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０，０１ｎＭ、０ｎＭの濃度にて）。６時間刺激後、培養上清を捨て、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ用の基質を添加し、発光シグナルをプレートリーダーにて測定した。【０２０９】
［結果］
結果を、図１３に示した。図１３に示されるように、ＥＧＦの添加によるＥＧＦ受容体の活性化がルシフェラーゼの発光として検出された。ＮＲ４Ａ１およびＣＴＧＦ遺伝子の転写調節領域にＴＭＧＶおよびＴＭ３ＣがノックインされているＮＣＰ１９細胞を用いたアッセイ系により、ＧＰＣＲだけでなく他の受容体の活性化状態をモニターできることが示された。【０２１０】
＜実施例Ａ６：ＧＰＣＲの解析＞
上記実施例に記載される方法に従って、以下のＧＰＣＲのいずれかを細胞に発現させる。上記実施例に記載される方法に従って、ＧＰＣＲを発現させた細胞をリガンド刺激し、受容体の活性化状態をモニターする。【０２１１】
【表４−１】
2020026979.tif 000008
【０２１２】
【表４−２】
2020026979.tif 000009
【０２１３】
＜実施例Ｂ１：キメラＧタンパク質＞
［概要］
ＧｓにカップルするＧＰＣＲの一部（Ａｄｒｂ２、ＡＤＯＲＡ２Ａ）については、上記のアッセイプロトコールを用いた場合に活性化が検出されなかった（図１０）。プロトコールの変更により、「ＧｓにカップルするＧＰＣＲ」の効率の良い評価を実現するため、以下の実験を行った。【０２１４】
［材料および方法］
実施例Ａ３のプロトコールにおいて、Ｄａｙ２を以下のとおり変更し、その他は同様にしてＡｄｒｂ２およびＡＤＯＲＡ２Ａ（Ｇｓ）の活性化の評価を行った。【０２１５】
＜変更点＞
Ｄａｙ２：９６穴プレートに播種してから２４時間以内に１ｗｅｌｌあたりＤＮＡ１２０ｎｇ（ＧＰＣＲ  ６０ｎｇ＋ＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ３０ｎｇ＋Ｇ１２／ｓ  ｃｈｉｍｅｒａ  ３０ｎｇからなるプラスミドカクテル）をリポフェクション法により遺伝子導入する。【０２１６】
Ｇ１２／ｓキメラ
Ｇタンパク質の受容体への配向性はＧαサブユニットのＣ末端の数個のアミノ酸配列で決定される。よって、胴体部分はすべてＧα１２由来で、Ｃ末端最後の６アミノ酸のみＧαｓ由来となるＧα１２／ｓキメラ（今後は単にＧ１２／ｓキメラと呼ぶ）を作成した（下記アミノ酸配列を参照のこと）。このＧ１２／ｓキメラは「ＧｓにカップルするＧＰＣＲ」とカップルすることが可能で、しかも野生型Ｇ１２が活性化されたときに生じる細胞内シグナルと同じシグナルを細胞内に惹起することができる。【０２１７】
キメラＧタンパク質の作製については、Ｃｏｎｋｌｉｎ  ＢＲ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：２７４−２７６，  １９９３およびＣｏｎｋｌｉｎ  ＢＲ  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５０：８８５−８９０，  １９９６等を参考とすることができる。【０２１８】
このようなキメラを、高効率でＧ１２／１３タンパク質の活性化を評価することができる系と併せて利用することによって、Ｇｓタンパク質と共役するＧＰＣＲの活性化を成功裡に評価することができる。Ｇ１２／１３タンパク質の活性化をＧｑ経路に変換して評価する目的でＧｑ／１２キメラを構築したものが報告されているが、Ｇ１２／１３タンパク質の活性化を評価することが困難である場合には、Ｇ１２／ｓキメラを同様の目的で使用することはできない。【０２１９】
【化１】
2020026979.tif 000010
【化２】
2020026979.tif 000011
【化３】
2020026979.tif 000012
【０２２０】
［結果］
本実施例のプロトコールを用いた場合、Ａｄｒｂ２およびＡＤＯＲＡ２Ａのいずれについても、リガンド濃度依存的なシグナルの増大を検出することができた（図１０）。【０２２１】
［考察］
上記変更により、「ＧｓにカップルするＧＰＣＲ」の活性も効率よく評価することが可能であることが示される。また、この結果から、「どのＧタンパク質にカップルするか不明のＧＰＣＲ（オーファンＧＰＣＲ）」を評価する際にも上記のように変更したプロトコールの使用が望ましいと考えられる。【０２２２】
実施例Ａの結果と併せて考慮すると、本発明のＧＰＣＲアッセイ系において、Ｇ１２／１３タンパク質が特異的に活性化された際に発現誘導がかかる２つの異なる遺伝子の３’ＵＴＲに上記の（１）ＩＲＥＳ−ＴＭＧＶおよび（２）ＩＲＥＳ−ＴＭ３Ｃをノックインすることで樹立したレポーター細胞ＮＣＰ１９を使用したところ、予想どおり「Ｇ１２／１３にカップルするＧＰＣＲ」を高感度に評価できただけでなく、「ＧｓにカップルするＧＰＣＲ」、「ＧｑにカップルするＧＰＣＲ」、「ＧｉにカップルするＧＰＣＲ」まで網羅的かつ高感度に評価できるという予想外の利点が判明した。【０２２３】
＜実施例Ｂ２：Ｇ１２に基づくキメラＧタンパク質＞
［概要］
本実施例は、ＮＣＰ１９細胞を用いたアッセイ系において、Ｇ１２／ｓキメラ以外のキメラＧタンパク質も有用であることを示すことを目的とする。Ｇｉに共役する受容体として知られるヒトソマトスタチン２型受容体（ｈＳＳＴＲ２）およびＧ１２／ｉキメラを実験対象とした。【０２２４】
［材料および方法］
使用する細胞：ＮＣＰ１９
使用するプラスミド
（１）ｈＳＳＴＲ２を発現するプラスミド（ｈＳＳＴＲ２発現プラスミド）
（２）ＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
（３）Ｇ１２／ｉキメラ蛋白質を発現するプラスミド（Ｇ１２／ｉ発現プラスミド）【０２２５】
なお、ヒトＧｉ１アミノ酸配列および本実施例で用いたキメラＧ１２／ｉの配列は以下のとおりであった。【０２２６】
【化４】
2020026979.tif 000013
【化５】
2020026979.tif 000014
【０２２７】
Ｄａｙ１：ＮＣＰ１９細胞を２４０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６穴プレートに播種した。【０２２８】
Ｄａｙ２：９６穴プレートに播種してから２４時間以内に１ｗｅｌｌあたりＤＮＡ１００ｎｇ（ｈＳＳＴＲ２  ５０ｎｇ＋ＵＡＳ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２５ｎｇ＋Ｇ１２／ｉ−ｃｈｉｍｅｒａ（またはｍｏｃｋ）  ２５ｎｇ）からなるプラスミドカクテル）をリポフェクション法により遺伝子導入した。【０２２９】
Ｄａｙ３：遺伝子導入２４時間後に細胞をリガンド（ソマトスタチン）により刺激した（ＳＳＴ１４：１００、３０、１０、１、０．１、０ｎＭの濃度にて）。６時間刺激後、培養上清を捨て、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ用の基質を添加し、発光シグナルをプレートリーダーにて測定した。【０２３０】
［結果］
結果を図１１に示した。Ｇ１２／ｉキメラタンパク質なしでも活性は十分に検出できる（図１１左）が、キメラ存在下では、その活性検出能が有意に改善される（図１１右）。なお、左図と右図において、縦軸のスケールが約２０倍程異なることに注意されたい。【０２３１】
＜実施例Ｃ：タンパク質が活性化された際に発現誘導がかかる遺伝子群の同定手順＞
［概要］
本発明のアッセイ系の構築のための、使用する細胞において目的タンパク質の活性化によって発現が誘導される遺伝子の同定方法を実証する。【０２３２】
［材料および方法］
Ｇタンパク質Ｇ１２／１３を特異的に活性化させるＧＰＣＲとしてＧＰＲ５５およびＬＰＡＲ６の２つの受容体が知られている。そこでＨｅＬａ細胞と、ＧＰＲ５５およびＬＰＡＲ６とを用いて、以下のような７条件で実験を施行した。なお、ＬＰＩはＧＰＲ５５のリガンド、ＬＰＡ（Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）はＬＰＡＲ６のリガンド、としてそれぞれ機能することが既に知られている物質である。
条件１  ＨｅＬａ細胞（野生型）
条件２  ＨｅＬａ細胞（野生型）＋ｍｏｃｋ＋ＬＰＩ１０ｕＭ：１時間刺激
条件３  ＨｅＬａ細胞（野生型）＋ＧＰＲ５５＋Ｖｅｈｉｃｌｅ：１時間刺激
条件４  ＨｅＬａ細胞（野生型）＋ＧＰＲ５５＋ＬＰＩ１０ｕＭ：１時間刺激
条件５  ＨｅＬａ細胞（野生型）＋ｍｏｃｋ＋ＬＰＡ１０ｕＭ：１時間刺激
条件６  ＨｅＬａ細胞（野生型）＋ＬＰＡＲ６＋Ｖｅｈｉｃｌｅ：１時間刺激
条件７  ＨｅＬａ細胞（野生型）＋ＬＰＡＲ６＋ＬＰＡ１０ｕＭ：１時間刺激【０２３３】
上記条件７を例にとり、以下に実験手順を説明する（図１４を参照）。【０２３４】
Ｄａｙ１：ＨｅＬａ細胞を６ｃｍ  ｄｉｓｈに５ｘ１０＾５細胞播種
Ｄａｙ２：ＬＰＡＲ６を発現するプラスミド  ２ｕｇをリポフェクション法にてＨｅＬａ細胞に遺伝子導入
Ｄａｙ３：遺伝子導入より２４時間経過後、細胞をＬＰＡ１０ｕＭにて１時間刺激。刺激後すぐに細胞よりｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収。【０２３５】
実験はそれぞれの条件につき、ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで施行した。よって、サンプル数は全部で２１サンプル（７ｘ３＝２１）となった。【０２３６】
上記実験手順にて回収された２１個のｔｏｔａｌ  ＲＮＡサンプルを次世代シークエンサーを利用したＲＮＡ  ｓｅｑ解析に供した。
実験（１）：条件１、２、３および４の４群間で比較
実験（２）：条件１、５、６および７の４群間で比較【０２３７】
実験（１）においては条件４でのみ、実験（２）においては条件７でのみ、発現量が有意に上昇している遺伝子をリストアップした。【０２３８】
ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析は、ＧｅｎｅＷｉｚ（日本）に委託して行った。シーケンシングに使用した次世代シークエンサーはＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ４０００であり、シークエンシングは１５０ペアエンドで行った。サンプルあたり２０００〜２６００万ＰＥリード（６〜８ＧＢ）が得られた。【０２３９】
ＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｍＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）をライブラリー調製に使用した。シーケンシングデータについては、アダプター配列をＣｕｔａｄａｐｔ（ｈｔｔｐ：／／ｃｕｔａｄａｐｔ．ｒｅａｄｔｈｅｄｏｃｓ．ｉｏ／ｅｎ／ｓｔａｂｌｅ／）で除去し、低クオリティ塩基（Ｐｈｒｅｄクオリティスコア＜２０）を有する３’末端をＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｔｉｍｆｌｕｔｒｅ／ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ）によってトリミングした。次に、すべてのサンプルが２×１０７を超える総リードカウントを有することを確認した。リードを、ＳＴＡＲ  ｖｅｒ２．５．２ｂ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ａｌｅｘｄｏｂｉｎ／ＳＴＡＲ）を用いてｍｍ９参照配列にアライメントした。ユニークマッピング率＞９０％のサンプルは、その後の分析に使用可能であった。Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓパッケージｖｅｒ２．２．１を用いて、遺伝子発現の定量化および示差的発現解析を行った（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｌｅ−ｔｒａｐｎｅｌｌ−ｌａｂ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ）。【０２４０】
［結果］
この二つの実験において共通してリストアップされた遺伝子を目的の遺伝子群とした。【０２４１】
当該遺伝子群を以下の表５に示す。【０２４２】
【表５】
2020026979.tif 000015
【０２４３】
さらにこの他、以下の遺伝子において発現変動が観察された：
THBS1、AREG、SLFNL1、SLFNL1-AS1、CDH5、NR4A2、CYR61およびCRISPLD2（少なくともいずれかの実験で１０倍以上の発現変動）；
FOSL1、TNFAIP3、EPPK1、NUAK2、CXCL2、KDM6B、PHLDA1、CSRNP1、TAGLN、PTGER4、JUN、ATF3、NCOA7、ADAMTS1、EDN1、ZC3H12C、PTGS2、DCUN1D3、ITPRIP、JUNB、SDC4、ERRFI1、SRF、MYADM、MMP12、MAFF、RCAN1、F3、IL6、LDLR、KRT34、EDN2、GADD45A、KRT17、TUFT1、MN1、DUSP4、KLF6、REL、ABL2、CITED2、MAFK、RND3、KLF2、TRIB1およびPHLDB2（いずれの実験でも５倍以上の発現変動）；
RASD1、SOWAHC、DUSP8、OTUD1、ARL5B、ETV3、ZFP36、NAV2、ITGB8、SERPINE1、NOCT、ZBTB10、BMP2、TRAF1、EPHA2、IER2、TNS4、ELMSAN1、ADAMTS5、TSC22D2、ZNF281、BCL10、RNF217、BTG2、ELL2、KIAA1217、GPCPD1、NAB2、MCL1、TIPARP、EPGN、RIMKLB、IER5、C8orf4、ADM、KRT16、NFKBID、ZNF331、SERTAD1、PSD4、DAPP1（いずれかの実験で５倍以上の発現変動）；ならびに
WEE1、TBX3、PMAIP1、ARID5B、BACH1、ZFP36L2、VGLL3、GATA6、AKAP2、PLAUR、TICAM1、JAG1、SLC7A11、FOXC2、HBEGF、GPRC5A、KCNJ12、STARD4、YOD1、RHOB、IRS2、SLC30A7、C19orf71、PPP1R15B、USP36、BHLHE40、LIFR、STK38L、LOC100129550、RUNX1、CEBPD、KLF7、KLF5、LATS2、HECA、PPP1R3B、GADD45B、BIRC3、NT5DC3、ATXN7、ZNF644、FOSL2、PER2、MAP3K14、NABP1、FGF2、NFKBIA、JUND、RC3H1、RUSC2、DUSP16、ELF3、NEDD9、FAM86B3P、CREM、IQCJ-SCHIP1、HK2、ZNF548、ZNF217、PER1、AHR、SLC2A13、PDP1、HRH1、PFKFB3、TPPP、JPH2、CPEB4、MB21D2、HLA-H、SLC38A2、FRMD4B、PTPRH、SSC5D、PLEKHO2、EGLN1、FOXC1、PDE4D、CPEB3、ZSWIM4、TGFBR1、PRG2、CCDC68、IER3、FBLIM1、RASSF8、USP2、PPTC7、CDC42EP2、ZFAND5、SGK1、TNFRSF8、LYPD3、CITED4、MYH9、SIK1、SGMS2、ZC3H12A、DUSP1、IRF2BPL、ZFP36L1、EPAS1、TMEM160、NCEH1、KLF9、TMEM158、NAB1、RNF19A、KCNK1、PRDM1、IRF2BP2、CHD1、MXD1、KIAA0355、ELL、PIGA、CNN2、ABHD13、MESDC1、SCML1、TGFBR3、DDAH1、ANKRD33B、MAP3K8、MAP2K3、SOCS6、MPZL3、UGCG、AEN、CDKN1A、C9orf72、CHD2、RNF19B、VCL、MFSD2A、RELT、HELZ2、ZNF529、ADAP1、RP2、FBXO46、ETS2、ANKRD1、NFKBIE、SH3RF1、SFMBT2、AEBP2、ZYX、HES4、CBX4、GLI2、SNRK、MTCL1、MITF、ARHGAP28、ELAVL2、PMP22、SOCS3、MALAT1、WDR37、SLC2A3、COQ10B、CCNL1、PXDC1、SLC26A2、PIM1、FAM60A、OLR1、STX11、ZBTB21、SPRED2、CTTNBP2NL、CCNT1、ZNF324、UBALD1、LIMA1、ACTG1、SLC19A2、PRRG1、TLE4、ICAM1、IFFO2、PLEKHG3、ARHGAP23、GAB2、NYAP2、DKK1、NT5E、DENND3、USP53、CD83、MC1R、PANX1、SLC20A1、KLF4、TNFRSF10A、SIRT1、DNAJB4、STEAP4、PHLDA3、FAT4、C1QTNF1、AP1AR、KRT80、ZC3HAV1、SAV1、ACKR3、TP53I11、CMIP、RGS2、CDKN2AIP、ADRB2、TSC22D1、TM4SF1、FBXO33、CSRP1、BMPR1B、RELB、NTN4、ATP2B1、CDC42SE1、ALDH1B1、TRMT44、ROR1、VPS37B、TRAF4、PPP2R3A、HSPA2、DAAM1、LINC00657、CASZ1、DAW1、ALPK2、GRAMD3、RAB20、MAMDC2、SAMD4A、RASAL2、WWC2、RAP1GAP2、DNAJC6、PPP1R3C、TPM4、KIAA0825、WDR1、NFKB2、FSTL3、ARHGAP32、NFIL3、ZNF267、HMGCS1、FHL2、TPM1、KLHL29、CRB1、SLC25A16、MFAP5、FHL1、MMP24、RAB32、IL32およびARHGDIB（いずれの実験でも２〜５倍の発現変動）。【０２４４】
これらの遺伝子についても、本明細書に記載される方法において、「発現が誘導される遺伝子」として使用し得る。【０２４５】
［考察］
上述の手順によって、特定のタンパク質の活性化によって発現が誘導される遺伝子群を同定できることが示された。このような遺伝子群を用いて、本明細書に記載される複数因子を連結したレポーター系を構築することができる。【０２４６】
実施例ＡおよびＢにおいては、ＨｅＬａ細胞を用いたが、タンパク質活性化により異なる発現調節が生じる細胞を用いる場合、本実施例の手順によって、発現が誘導される遺伝子群を同定してアッセイ系を構築することが可能である。
実際に、後述する実施例Eに示すように、本実施例の手順によってHEK293T細胞を使用して同様のアッセイ系を作製することに成功した。【０２４７】
＜実施例Ｄ１：細胞アレイ＞
上述の実施例ＡおよびＢに記載される手順に従い、それぞれが複数の異なる受容体を過剰発現する複数の細胞を提供する。複数のウェルを有するアレイにおいて、それぞれの細胞を各ウェル内で維持する。被験化合物をアレイ上にアプライすることによって、複数の受容体に対する被験化合物の作用の網羅的な調査を簡便に行うことができる。【０２４８】
受容体としてはＧＰＣＲを用いることができ、実施例ＡおよびＢに記載される細胞を用いることにより、受容体以外の部分の構成が同一である細胞を用いて、ＧｓにカップルするＧＰＣＲ、ＧｑにカップルするＧＰＣＲ、ＧｉにカップルするＧＰＣＲ、およびＧ１２／１３にカップルするＧＰＣＲの全てに対する被験化合物の作用を同時に調査することができる。【０２４９】
＜実施例Ｄ２：コンストラクト＞
ある膜タンパク質によって発現が誘導される第１〜第Ｎの遺伝子の転写調節領域の配列を用いて、第１〜第Ｎの遺伝子の転写調節領域の配列をそれぞれ含む第１〜第Ｎのコンストラクトを提供する。それぞれのコンストラクトは、特定の因子をコードする配列を、転写調節領域と作動可能に連結した状態で含む。それぞれの因子は、他の因子の活性を促進するものである。それぞれのコンストラクトは、一連の核酸分子上に存在してもよく、異なる核酸分子上に存在してもよい。【０２５０】
第１〜第Ｎのコンストラクトは、細胞を化合物スクリーニング用に改変するためのキット中で提供される。キットは、膜タンパク質を過剰発現させるためのコンストラクトを含み得る。キットは、因子のいずれかにより発現が惹起されるように構成されたレポーター遺伝子を含むコンストラクトを含み得る。【０２５１】
＜実施例Ｄ３：解析＞
全ヒトＧＰＣＲに対応する細胞を含む実施例Ｄ１のアレイを用いて、被験化合物の全ヒトＧＰＣＲ（匂い受容体を除く）に対する活性を調査する。アレイの各ウェルの反応から、被験化合物が、どのＧＰＣＲに対して活性を有するかを調べることができる。これにより、被験化合物が、いずれかのヒトＧＰＣＲに対してＯｆｆ−Ｔａｒｇｅｔ活性を有するか、あるいはＯｆｆ−Ｔａｒｇｅｔ活性がないことを確認することができる。これにより、例えば、臨床試験開始後に予想外の副作用で臨床試験が中止になるリスクを軽減出来る。また、ある活性が知られた化合物についても、全ヒトＧＰＣＲに対する活性を評価することで新規の活性を同定することができる。【０２５２】
＜実施例Ｄ４：１細胞アッセイによるハイスループットスクリーニング＞
マイクロ流路ディスクあるいはその他の１細胞アッセイシステムを用い、各チェンバーに１個の細胞を培養する。多数の異なる受容体プラスミドを含む適当に低濃度なトランスフェクション試薬を用意し、これを多数のチェンバーの細胞に一気にアプライする。こうすることで、試薬に含まれる受容体群のサブセットを各細胞にトランスフェクトさせることができる（試薬に１００種類の受容体プラスミドが含まれるとして、そのうち数種類が各々の細胞にトランスフェクトすることが想定される）。試薬中の受容体プラスミド濃度が低いので、各細胞にトランスフェクトされる受容体は確率論的に決まる。最後に単一の化合物あるいは複数の化合物の混合物を複数のチェンバーの細胞に一気にアプライする。洗浄し別の化合物をアプライすることを繰り返してもよい。反応があったチェンバーの細胞にシングルセルＰＣＲを掛けることで、化合物に応答する受容体候補を効率よく絞りこむことができる。【０２５３】
＜実施例Ｄ５：細胞にストレスを与える化合物の探索＞
本明細書で記載されているノックインレポーター細胞であるＮＣＰ１９細胞は、様々な細胞膜受容体がそれらに対応するリガンドで刺激された際に惹起されるシグナルを感知できるだけでなく、細胞そのものがストレスを受けた際のストレス応答もモニターできるものと予想される。よって、細胞膜受容体などを外因性に遺伝子導入することなしに、ＮＣＰ１９細胞そのものに被検化合物を作用させることで、その化合物が細胞にストレス応答を誘導する化合物であるかを検討できるアッセイ系となりうる。【０２５４】
＜実施例Ｄ６：癌遺伝子（発癌性変異体）の探索＞
本明細書の実施例Ａ４およびＡ５で示すように、本明細書で記載されているノックインレポーター細胞であるＮＣＰ１９細胞は、ＧＰＣＲだけでなく、受容体型チロシンキナーゼがそのリガンドで活性化された際に生じる細胞内シグナル（増殖シグナル）も感知できる。このことはすなわち、遺伝子変異によって恒常的な活性化状態にある受容体型チロシンキナーゼ変異体（これらは多くの場合、細胞において癌遺伝子として機能する）をＮＣＰ１９に一過性に外因性に遺伝子導入すれば、ＮＣＰ１９細胞におけるレポーター活性はリガンド刺激非依存的に高値を示す事が予想される。よって、ＮＣＰ１９細胞に様々な癌遺伝子候補変異体を一過性に導入し、それらの変異体それぞれが惹起するレポーター活性を調べれば、どの候補変異体分子がより強力な細胞増殖活性を有するかワンステップで検証することが可能となる。【０２５５】
＜実施例Ｄ７：苦味受容体＞
上述の実施例ＡおよびＢに記載される手順に従い、それぞれが複数の苦味受容体を過剰発現する複数の細胞を提供する。複数のウェルを有するアレイにおいて、それぞれの細胞を各ウェル内で維持する。被験化合物をアレイ上にアプライすることによって、被験化合物の苦味受容体への作用の網羅的な調査を簡便に行うことができる。【０２５６】
＜実施例Ｄ８：オーファン受容体＞
上述の実施例ＡおよびＢに記載される手順に従い、リガンド未知の受容体を過剰発現する細胞を提供する。複数のウェルを有するアレイにおいて、細胞を各ウェル内で維持する。複数の被験化合物をアレイ上にアプライすることによって、オーファン受容体を活性化させる化合物の網羅的なスクリーニングを簡便に行うことができる。【０２５７】
＜実施例Ｅ：異なる細胞でのアッセイ系の構築＞
［概要］
ＨｅＬａ細胞以外の細胞株を用いて、本発明のアッセイ系を構築し、被験化合物のスクリーニングを行うことができることを実証する。【０２５８】
［材料および方法］
（発現変動遺伝子の同定）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、Ｇタンパク質Ｇ１２／１３を特異的に活性化させるＧＰＣＲ（ＧＰＲ５５もしくはＬＰＡＲ６）と、当該ＧＰＣＲのリガンドとして機能することが既に知られている物質を用いて実験を施行する。
条件１  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（野生型）
条件２  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（野生型）＋ｍｏｃｋ＋リガンド１０ｕＭ：１時間刺激
条件３  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（野生型）＋ＧＰＣＲ＋Ｖｅｈｉｃｌｅ：１時間刺激
条件４  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（野生型）＋ＧＰＣＲ＋リガンド１０ｕＭ：１時間刺激【０２５９】
実施例Ｃに記載される条件に従い、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡサンプルを回収し、次世代シークエンサーを利用したＲＮＡ  ｓｅｑ解析に供し、条件４でのみ発現量が有意に上昇している遺伝子をリストアップした。
リストアップされた遺伝子を目的の遺伝子群とした。当該遺伝子群を以下の表6に示す。【０２６０】
【表６】
2020026979.tif 000016
【０２６１】
さらにこの他、以下の遺伝子において発現変動が観察された：
NR4A2, LOC100506747, NR4A1, EPPK1, JUN, AMOTL2, FLNA, ARC, IER2, JUNB（少なくともいずれかの実験で5倍以上の発現変動）；ならびに
CNN2, DUSP1, MAFF, GPR3, TPM1, PTGS2, ATF3, G0S2, TRIB1, SNAI2, PDLIM7, NFKBIZ, TIMP3, FHL2, SPRY2, FOSL2, FERMT2, VCL, NUPR1, TPM4, GRASP, NKX2-5, TUFT1, ID1, FOSL1, MYADM, ACTB, LPP, KLF7, KLF6, ADAMTS1, BTG2, ACTG1, CSRNP1, WDR1, SRF, GEM, ZYX, NR2F1, LOC101928358, ITPRIP, FUT1, COL3A1, LIMA1, SLC8A1, JAG1, SLC6A9, PMAIP1, SLC2A10, PCK2, ZFP36L1, MAFB, CBX4, FZD10, ZBTB10, JDP2, ZNF214, RHOB, ID2, RND3, IRF2BPL, BMP2, SOX4, JUND, SLC1A4, PNRC1, SYBU（少なくともいずれかの実験で2倍以上の発現変動） 【０２６２】
（インディケーター細胞の構築）
リストアップされた遺伝子から遺伝子#1としてFOS、遺伝子#2としてFOSBを選択した。【０２６３】
実施例A3に記載される手順に従い、HEK293T細胞のFOSおよびFOSBの遺伝子座の3’UTRにTMGVおよびTM3Cをノックインした。【０２６４】
（アッセイ性能の確認）
上記細胞にGPCR発現プラスミドおよびUAS-レポーター遺伝子のプラスミドを導入し、当該GPCRリガンドで細胞を刺激した。GPCRとして、以下の受容体：GPR55(G12/13), LPAR6(G12/13), Adrb2(Gs), HRH1(Gq/11), OPRM1(Gi/o), SSTR2(Gi/o)を用いた。また、上記細胞を使用して受容体型チロシンキナーゼ（Flt3およびEGFR）の活性化も測定した。【０２６５】
[結果]
各濃度のリガンドの添加により、各アッセイ系から得られたシグナル（発光強度・リガンド最低濃度時のシグナルからの変化倍率）を図15-図18に示す。HeLa細胞で作製されたインディケーター細胞と同様に、HEK293T細胞で作製されたインディケーター細胞においても、検定した各受容体においてリガンド濃度の増加に伴うシグナルの増大が観察された。
[考察]
本実施例の結果より、本発明のインディケーター細胞は、実施例A3の方法により細胞株の種類によらず作製されうることが示された。【０２６６】
＜実施例Ｆ：異なる因子でのアッセイ系の構築＞
細胞において、Ｇタンパク質Ｇ１２／１３の活性化により発現が増加する遺伝子＃１および遺伝子＃２の遺伝子座に、第１の因子および第２の因子をノックインする。【０２６７】
例えば、第１の因子としてリン酸化されることで転写活性がオンになる転写因子、第２の因子として第１の因子をリン酸化するリン酸化酵素を使用できる。【０２６８】
あるいは、第１の因子として人工不活性型転写因子、第２の因子としてプロテアーゼを使用できる：プロテアーゼにより人工不活性型転写因子の一部の構造が取り除かれることにより、転写因子内に存在する核移行シグナルが表層化し、核移行可能な活性型転写因子になる。もしくはプロテアーゼにより人工不活性型転写因子の一部の構造が取り除かれることにより、転写因子内に存在するDNA結合ドメインや転写活性化ドメインが作動可能となり活性型転写因子になる。【０２６９】
（注釈）
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、上述の説明および実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０２７０】
本発明のアッセイ系は、生理活性を有する化合物のスクリーニングに利用可能である。本発明は、感度およびＳ／Ｎに関して改善された（１桁以上）Ｇ１２／１３に共役するＧＰＣＲに対する鋭敏なアッセイ系を提供できるだけでなく、単一アッセイフォーマット下で「Ｇｓに共役するＧＰＣＲ」、「Ｇｑに共役するＧＰＣＲ」、「Ｇｉに共役するＧＰＣＲ」のモニタリングも可能にする。またＧＰＣＲ以外の受容体群やチャネル群にも応用可能な万能性を有する。本発明により、生理活性を有する化合物の医薬品等への利用において、生理活性を有する化合物のオンターゲットスクリーニングだけでなく、被検化合物が予想外の受容体を活性化することにより惹起される副作用を早期（臨床試験前）に予測するオフターゲットスクリーニングにも利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０２７１】
配列番号１：ＨＲＶプロテアーゼ３Ｃ認識切断配列
配列番号２：ＴＭＧＶ中のリンカー配列
配列番号３：ＧＳリンカー配列
配列番号４：ヒトＧ１２アミノ酸配列
配列番号５：ヒトＧｓアミノ酸配列
配列番号６：Ｇ１２／ｓキメラアミノ酸配列
配列番号７：ヒトＧｉ１アミノ酸配列
配列番号８：Ｇ１２／ｉ１キメラアミノ酸配列
【図１】
2020026979.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020026979.tif 000026
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2020026979.tif 000029
【図１４】
2020026979.tif 000030
【図１５】
2020026979.tif 000031
【図１６】
2020026979.tif 000032
【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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