(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ保護基を有するアミノアルキル基を６位に有する２−アミノピリジン誘導体と末端が還元糖からなる単糖、オリゴ糖、多糖またはグリコサミノグリカンとを還元アミノ化反応により結合し、次いでアミノ保護基を脱離することを特徴とする糖の蛍光標識方法。
【請求項２】
アミノ保護基は、ウレタン型アミノ保護基またはトリハロアセチル基であることを特徴とする請求項１記載の糖の蛍光標識方法。
【請求項３】
アミノ保護基は、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基またはトリフルオロアセチル基であることを特徴とする請求項１記載の糖の蛍光標識方法。
【請求項４】
アミノ保護基の脱離反応は、酸性条件もしくは塩基性条件による処理、または還元反応により行われる請求項１〜３のいずれかに記載の糖の蛍光標識方法。
【請求項５】
酸性条件による処理は、トリフルオロ酢酸を用いて行われる請求項４記載の糖の蛍光標識方法。
【請求項６】
塩基性条件による処理は、ピペリジン水溶液を用いて行われる請求項４記載の糖の蛍光標識方法。
【請求項７】
還元反応は、接触還元により行われる請求項４記載の糖の蛍光標識方法。
【請求項８】
アミノ保護基を有するアミノアルキル基を６位に有する２−アミノピリジン誘導体と末端が還元糖からなる単糖、オリゴ糖、多糖またはグリコサミノグリカンとを還元アミノ化反応により結合し、次いでアミノ保護基を脱離して６位にアミノアルキル基を有する２−アミノピリジン誘導体と単糖、オリゴ糖、多糖またはグリコサミノグリカンとの結合物を得、次いで該結合物のピリジンの６位のアミノアルキル基の該アミノ基を、該アミノ基と結合し得る官能基を有する有機化合物と直接反応させるか、またはアミノ基と結合し得る官能基を有するスペーサーを介して有機化合物と反応させて、アミド結合反応、シッフ塩基形成反応、ウレタン結合反応、アルキル化反応、ジスルフィド結合反応、ジスルフィド交換反応、アミジン結合反応または炭素−炭素結合反応により結合させることを特徴とする人工複合糖質の製造法。
【請求項９】
有機化合物は、糖、蛋白質、ペプチド、アミノ酸、脂質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ビオチン、または合成高分子化合物である請求項８記載の人工複合糖質の製造法。
【請求項１０】
有機化合物またはスペーサーがカルボキシル基を有する化合物であり、該カルボキシル基を活性化してピリジンの６位のアミノアルキル基の該アミノ基と反応させる請求項８または９記載の人工複合糖質の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、糖の蛍光標識方法および人工複合糖質の製造法に関し、特に、２−アミノピリジン誘導体を用いた該方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、糖蛋白質等の複合糖質の構造とその機能の関係を研究するために、より高感度でしかも微量の試料で定量検定が可能な方法が種々提案されている。
例えば、糖鎖の微量分析の方法としては、還元末端を糖アルコールに変換する際にトリチウムを導入し、その放射活性を利用することが挙げられる。この検出感度は、ｐｍｏｌレベルであり、良好であるが、放射性物質であるために種々の制約がある。
【０００３】
この制約がない高感度検定法として、２−アミノピリジン等の有機化合物を蛍光標識剤として使用する方法が公知である（例えば、Ｓ．ハセ等、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、第９５巻、第１９７〜２０３頁（１９８４））。
これは、糖又は糖鎖の還元末端に該２−アミノ基を反応させてシッフ塩基とし、次いで還元して、蛍光により検出するものであり、感度は上述と同様にｐｍｏｌレベルであることが開示されている。
【０００４】
しかしながら、該蛍光標識剤は、糖鎖の構造解析には有効であるが、一官能性であるため、他の生体物質、例えば、蛋白質、ペプチド、アミノ酸、脂質、核酸、合成高分子等と糖との複合体等を形成させることはできず、従ってそれらを総合的に解析するには、十分であるとは言えなかった。
そこで、本出願人は特開平５−２５５２５３号公報に６位に前記生体物質と反応し得る官能基を導入した２−アミノピリジン誘導体を開示し、種々の人工複合糖質が合成できることを示した。
【０００５】
しかし、２−アミノピリジン誘導体にシアノ基を導入したものを使用して標識した糖鎖を分離精製後、シアノ基の還元で生成するアミノ基を介して人工複合糖質を合成する方法は、該シアノ基の還元においては、濃アンモニア水中、Ｐｄを用いて長時間の加圧接触還元しなければならないという問題が生じた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第一の目的は、温和な条件で糖に２−アミノピリジン誘導体を導入する蛍光標識方法を提供すると共に人工複合糖質の合成に使用し得る反応剤としての２−アミノピリジン誘導体と糖との結合物を容易に製造する方法を提供することであり、第２に該反応剤を用いた人工複合糖質の製造法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
１）  アミノ保護基を有するアミノアルキル基を６位に有する２−アミノピリジン誘導体と末端が還元糖からなる単糖、オリゴ糖、多糖またはグリコサミノグリカンとを還元アミノ化反応により結合し、次いでアミノ保護基を脱離することを特徴とする糖の蛍光標識方法、
２）  アミノ保護基は、ウレタン型アミノ保護基またはトリハロアセチル基であることを特徴とする前記１）記載の糖の蛍光標識方法、
３）  アミノ保護基は、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基またはトリフルオロアセチル基であることを特徴とする前記１）記載の糖の蛍光標識方法、
４）  アミノ保護基の脱離反応は、酸性条件もしくは塩基性条件による処理、または還元反応により行われる前記１）〜３）のいずれかに記載の糖の蛍光標識方法、
５）  酸性条件による処理は、トリフルオロ酢酸を用いて行われる前記４）記載の糖の蛍光標識方法、
６）  塩基性条件による処理は、ピペリジン水溶液を用いて行われる前記４）記載の糖の蛍光標識方法、
７）  還元反応は、接触還元により行われる前記４）記載の糖の蛍光標識方法、
８）  アミノ保護基を有するアミノアルキル基を６位に有する２−アミノピリジン誘導体と末端が還元糖からなる単糖、オリゴ糖、多糖またはグリコサミノグリカンとを還元アミノ化反応により結合し、次いでアミノ保護基を脱離して６位にアミノアルキル基を有する２−アミノピリジン誘導体と単糖、オリゴ糖、多糖またはグリコサミノグリカンとの結合物を得、次いで該結合物のピリジンの６位のアミノアルキル基の該アミノ基を、該アミノ基と結合し得る官能基を有する有機化合物と直接反応させるか、またはアミノ基と結合し得る官能基を有するスペーサーを介して有機化合物と反応させて、アミド結合反応、シッフ塩基形成反応、ウレタン結合反応、アルキル化反応、ジスルフィド結合反応、ジスルフィド交換反応、アミジン結合反応または炭素−炭素結合反応により結合させることを特徴とする人工複合糖質の製造法、
９）  有機化合物は、糖、蛋白質、ペプチド、アミノ酸、脂質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ビオチン、または合成高分子化合物である前記８）記載の人工複合糖質の製造法、
１０）有機化合物またはスペーサーがカルボキシル基を有する化合物であり、該カルボキシル基を活性化してピリジンの６位のアミノアルキル基の該アミノ基と反応させる前記８）または９）記載の人工複合糖質の製造法である。
【０００８】
本発明の糖の蛍光標識方法は、アミノ保護基を有するアミノアルキル基を６位に有する２−アミノピリジン誘導体（以下、保護基含有２−アミノピリジン誘導体と略すこともある。）と末端が還元糖からなる単糖、オリゴ糖、多糖またはグリコサミノグリカン（以下、糖化合物ともいう）とを還元アミノ化反応により結合し、次いでアミノ保護基を脱離するものである。本発明は、この脱離により結果的に６位にアミノアルキル基を有した２−アミノピリジン誘導体と糖化合物との結合物が得られ、この結合物は、他の任意の有機化合物を６位のアミノ基に結合させて人工複合糖質を得るための蛍光標識反応剤としての機能を有するものであるから、本発明の方法は、蛍光標識反応剤の製造法を提供するものでもある。
【０００９】
本発明に使用される保護基含有２−アミノピリジン誘導体としては、下記一般式（１）で表される化合物（以下、化合物１ともいう）を挙げることができる。
【００１０】
【化３】
0003821494.tif 000002
【００１１】
式中、Ｒは、有機基である保護基を示し、ｎは、２〜２０、好ましくは２〜８の整数である。該保護基としては、ウレタン型アミノ保護基またはトリハロアセチル基が例示され、ウレタン型アミノ保護基としてｔ−ブトキシカルボニル基（以下、Ｂｏｃと記す）またはベンジルオキシカルボニル基（以下、Ｚと記す）が特に好ましく、トリハロアセチル基としてはトリフルオロアセチル基（以下、Ｔｆａと記す）が特に好ましいが、これに制限されるものではない。
【００１２】
また、式中、３〜５位の水素は、任意の有機基、好ましくは炭化水素基、特に好ましくは炭素数１〜４の低級アルキル基により置換されていてもよい。化合物１と糖化合物との還元アミノ化反応は、化合物１の２位のアミノ基と糖化合物とを縮合させて、シッフ塩基を形成し、次いでこれを還元することにより−ＣＨ２ＮＨ−結合を形成させることである。得られる化合物１と糖化合物との反応生成物（結合物）を糖残基含有化合物１とも言う。
【００１３】
得られた糖残基含有化合物１は、６位のアミノ保護基を脱離する反応に供される。この脱離反応は、特に制限はないが、好ましくは以下の方法が挙げられる。
▲１▼  トリフルオロ酢酸、無水塩化水素、蟻酸等を用いて酸性条件で糖残基含有化合物１を処理する方法。特に、保護基がＢｏｃの場合に好適である。
▲２▼  水素を常圧または加圧下、Ｐｄ（パラジウム）等の触媒存在下、糖残基含有化合物１を接触還元する方法、あるいはＰｄ存在下、有機水素供与体を用いた接触水素移動還元する方法。特に、保護基がＺの場合に好適である。
▲３▼  塩基、例えば、ピペリジン、アンモニア、水酸化ナトリウム等の水溶液により塩基性条件で糖残基含有化合物１を処理する方法が挙げられる。特に、保護基がＴｆａの場合に好適である。
【００１４】
▲１▼でトリフルオロ酢酸を使用して保護基を脱離する場合の条件は、糖残基含有化合物１のトリフルオロ酢酸溶液を室温、具体的には１０〜２５℃で、１０〜３０分間攪拌し、その後、窒素ガスを吹きつけながらトリフルオロ酢酸を除くことが挙げられる。
▲２▼でＰｄ触媒を用いて保護基を脱離する場合の条件は、糖残基含有化合物１の水溶液にＰｄを加え、１〜１０気圧の水素雰囲気下、室温で３０〜９０分間攪拌することが挙げられる。
【００１５】
▲３▼でピペリジンを用いて保護基を脱離する場合の条件は、糖残基含有化合物１の０．２〜２Ｍピペリジン水溶液を０〜１０℃で０．５〜２時間攪拌することが挙げられる。
上記▲１▼〜▲３▼の反応で得られた６位がアミノアルキル基である糖残基含有２−アミノピリジン誘導体（以下、「糖残基含有化合物１ｒ」とも記す）は、任意の方法で精製され得るが、好ましくは水溶液としてＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により高収率（約９５％以上）で高度精製、単離することができる。上記本発明の方法は、極めて温和な方法であるため上記高収率を達成したものである。
【００１６】
ＨＰＬＣを用いた精製は、例えば、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ（登録商標）５Ｃ１８−ＡＲを用いた逆相ＨＰＬＣあるいはＴＳＫ  ｇｅｌ（登録商標）  Ａｍｉｄｅ−８０を用いたイオン交換ＨＰＬＣを用いて行うことができる。
この糖残基含有化合物１ｒは、６位に反応性のアミノ基を有しているので、他の任意の有機化合物を標識する蛍光標識剤の機能を有していると共に人工複合糖質を作成するための反応剤の機能を有している。
【００１７】
この人工複合糖質の製造条件としては、特に、制限はないが、具体的には以下の方法が例示できる。
ａ．所望の糖残基構造を有する糖残基含有化合物１ｒのアミノ基と反応する官能基（例えば、カルボキシル基、ホルミル基等）を有する所望の有機化合物とを結合させることにより所望の人工複合糖質を得る方法。
ｂ．ａ．の有機化合物として糖残基含有化合物１ｒのアミノ基と反応する官能基以外に他の有機化合物と反応する官能基を有した化合物（例、スペーサー）を選択し、得られた糖残基含有化合物１ｒ誘導体（例、糖残基含有化合物１ｒ−スペーサー結合物）と所望の有機化合物とを反応させて人工複合糖質を得る方法。糖残基含有化合物１ｒ誘導体は官能基を複数有することができ、これに反応する有機化合物も複数であってもかまわない。
【００１８】
複数の官能基を有するスペーサーとしては、グリオキサール、ジスクシンイミジルスベラート、スクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、スクシンイミジル  ６−マレイミドヘキサノエート等に由来するものが例示される。
ｃ．ｂで得られた人工複合糖質に導入もしくは予め存在する官能基に所望の有機化合物を結合させる方法。
【００１９】
ａにおける糖残基含有化合物１ｒと有機化合物との反応としては、アミド結合反応、シッフ塩基形成反応、ウレタン結合反応、アルキル化反応等を挙げることができる。
ｂにおける糖残基含有化合物１ｒ誘導体は、一種の人工複合糖質あるいは他の人工複合糖質を作成するための反応剤として機能する。この反応剤を得るための有機化合物は単に他の有機化合物を結合するためのスペーサーとしてのみの機能を有したものであっても他の有用な作用を有する化合物であってもよい。また、この糖残基含有化合物１ｒ誘導体において、導入される有機化合物を選定することにより、それ自体で有用な試薬となり得るものを合成することができる。例えば、有機化合物として、ビオチン誘導体を選択すれば、標識化アビジン等を用いて行うレクチン等の解析（ＥＬＩＳＡ等）に有用な試薬が得られる。
【００２０】
ここで、糖残基含有化合物１ｒと有機化合物との反応により糖残基含有化合物１ｒ誘導体に導入される官能基としては、有機化合物と前記ａの結合反応が生じるような官能基の他、ジスルフィド結合反応、ジスルフィド交換反応、アミジン結合反応、炭素−炭素結合反応などが生じる官能基、例えば、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、ジスルフィド基、アクリロイル基等を挙げることができる。
【００２１】
なお、上記ａ〜ｃの反応において、官能基を予め活性化して反応に供することができる。例えば、官能基がカルボキシル基である場合、スクシンイミド基によって活性化することができ、メルカプト基の場合、３−ニトロ−２−ピリジルスルフェニル基によって活性化することができる。
前記、ａ〜ｃにおける有機化合物としては、任意であるが、特に、糖、蛋白質、ペプチド、アミノ酸、脂質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ビオチン、または合成高分子（そのモノマーを含む）が好ましく、種々、有用な人工複合糖質を容易に得ることができる。
【００２２】
本発明における還元アミノ化反応による結合とは、糖化合物の還元末端に化合物１の２位のアミノ基を反応させてシッフ塩基を形成させ、次いで還元することによって−ＣＨ２ＮＨ−結合を形成させるものであり、前期反応により得られた糖残基含有化合物１を、必要に応じて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の分別手段によって分別し、紫外線もしくは蛍光スペクトルによって検出することにより、目的とする糖残基含有化合物１を検出すると共に分離精製することができる。
【００２３】
なお、上記シッフ塩基形成反応及びそれに続く還元反応は、公知の方法（例えば、特開昭６４−１０１７７号、特開平１−１４１３５６号、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第９５巻，第１９７〜２０３頁（１９８４）、「蛋白質  核酸  酵素」第３６巻、第１号、第６３〜６８頁（１９９１年）参照）に従って行うことができる。すなわち、塩酸、フッ化水素酸等の無機酸もしくは酢酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸及びピリジン等の有機溶媒中、常温〜１００℃、数分〜数時間（好ましくは、約９０℃、１〜３時間、ｐＨ３〜６．４）の反応条件下、糖類に対して２０〜１００当量程度の化合物１を使用して反応させることによってシッフ塩基を生成させることができる。シッフ塩基の還元には、通常シッフ塩基の還元に使用されている還元剤を使用することができ、とりわけ揮発性のボランコンプレックス（例えば、ボランジメチルアミンコンプレックス（ＢＨ3 ・Ｍｅ2 ＮＨ）、ボラントリエチルアミンコンプレックス、ボランピリジンコンプレックス等）、ナトリウムボロハイドライド、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ3 ＣＮ）等が好ましい。還元反応は、常温〜１００℃、１時間〜１０時間（好ましくは約８０〜９０℃、１時間程度）で完了する。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明の実施例を具体的に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
合成例１  化合物１−１（ｎ＝３、Ｒ＝Ｂｏｃ）の合成
２−トリチルアミノ−６−（２−シアノエチル）ピリジンをＬｉＡｌＨ4 により還元して得られる２−トリチルアミノ−６−（３−アミノプロピル）ピリジンを（Ｂｏｃ）2 Ｏ（ジ−第３ブチル  ジカーボネート）と反応して得られる２−トリチルアミノ−６−（３−ｔ−ブトキシカルボニルアミノプロピル）ピリジン（２．００ｇ、４．０５ｍｍｏｌ）の酢酸−蒸留ＭｅＯＨ〔１：１（ｖ／ｖ）〕、１４ｍｌ〕の溶液を５０℃で５時間半攪拌した。減圧濃縮し、残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー〔シリカゲル５０ｇ、クロロホルム−メタノール（１５：１）〕で精製した。一部が酢酸塩となっていたため、脱塩のために酢酸エチルを加えて溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で順次洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾去後、減圧濃縮して淡黄色オイルを得た。そのオイルを２週間冷蔵庫に放置して針状晶の標記化合物１−１を得た。収量９３１ｍｇ（２−トリチルアミノ−６−（３−ｔ−ブトキシカルボニルアミノプロピル）ピリジンよりの収率９１．６％）、ｍｐ  ７２−７４℃。1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3 ）で化合物１−１の構造を確認した。また、Ｃ13Ｈ21Ｏ2 Ｎ3 の計算値、Ｃ  ６２．１３；Ｈ  ８．４２；Ｎ  １６．７２において、実測値、Ｃ  ６１．９０；Ｈ  ８．４８；Ｎ  １６．５９であった。
【００２５】
合成例２  化合物１−２（ｎ＝３、Ｒ＝Ｚ）の合成
２−トリチルアミノ−６−（２−シアノエチル）ピリジンをＬｉＡｌＨ4 により還元して得られる２−トリチルアミノ−６−（３−アミノプロピル）ピリジンをＺＯＳｕ（ベンジル  Ｎ−スクシンイミジル  カーボネート）と反応して得られる２−トリチルアミノ−６−（３−ベンジルオキシカルボニルアミノプロピル）ピリジン（６９７ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）の酢酸−ＭｅＯＨ〔１：１（ｖ／ｖ）、１０ｍｌ〕の溶液を５０℃で１８時間半攪拌した。減圧濃縮し、残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー〔シリカゲル１０ｇ、クロロホルム−メタノール（１５：１）〕で精製した。一部が酢酸塩となっていたため、合成例１と同様にして淡黄色オイルの標記化合物１−２を得た。収量３６１ｍｇ（２−トリチルアミノ−６−（３−ベンジルオキシカルボニルアミノプロピル）ピリジンよりの収率９６．２％）。1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3 ）で化合物１−２の構造を確認した。また、Ｃ16Ｈ19Ｏ2 Ｎ3 の計算値、Ｃ  ６５．８３；Ｈ  ６．８１；Ｎ  １４．３８において、実測値、Ｃ  ６５．８３；Ｈ  ６．７２；Ｎ１４．３８であった。
【００２６】
合成例３  化合物１−３（ｎ＝３、Ｒ＝Ｔｆａ）の合成
２−トリチルアミノ−６−（２−シアノエチル）ピリジンをＬｉＡｌＨ4 により還元して得られる２−トリチルアミノ−６−（３−アミノプロピル）ピリジンを（Ｔｆａ）2 Ｏ（トリフルオロ酢酸無水物）と反応して得られる２−トリチルアミノ−６−（３−トリフルオロアセチルアミノプロピル）ピリジン（１４０ｍｇ、２８５μｍｏｌ）の酢酸−ＭｅＯＨ〔１：１（ｖ／ｖ）〕、４ｍｌ〕の溶液を５０℃で２２時間攪拌した。減圧濃縮し、残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー〔シリカゲル８ｇ、ジクロロメタン−メタノール（２０：１）〕で精製した。一部が酢酸塩となっていたため、合成例１と同様にして淡黄色針状晶の標記化合物１−３を得た。収量６１．４ｍｇ（２−トリチルアミノ−６−（３−トリフルオロアセチルアミノプロピル）ピリジンよりの収率９６．２％）。1Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3 ）で化合物１−３の構造を確認した。また、Ｃ10Ｈ12ＯＮ3 Ｆ3 の計算値、Ｃ  ４８．５８；Ｈ  ４．８９；Ｎ  １７．００において、実測値、Ｃ  ４８．６２；Ｈ  ４．８１；Ｎ  １６．８７であった。
【００２７】
実施例１−１〜３
乾燥した糖化合物（表１に記載のもの）（５．５５μｍｏｌ）に化合物１−１〜３（２７．８μｍｏｌ、表１記載）と酢酸−ピリジン〔１：１７（ｖ／ｖ）、４８．０μＬ〕を加え、封管して９０℃で、３時間加熱し、放冷した後、還元反応溶液〔ＢＨ３・Ｍｅ２ＮＨ（６．５５ｍｇ、１１１μｍｏｌ）の酢酸（３３．５μＬ）溶液〕（Ｍｅ：メチル基）を加え、封管して８０℃で１時間加熱した。放冷後、水を加えて、ＨＰＬＣ〔カラム：コスモシール（登録商標）５Ｃ１８−ＡＲ  ２０ｍｍＩＤ×２５０ｍｍＬ；溶出溶媒：アセトニトリル−０．１Ｍ蟻酸アンモニウム（ｐＨ４．５）；濃度勾配：〔０−６０％アセトニトリル（２％／分）〕；流速：８ｍＬ／分；検出：ＵＶ  ３００ｎｍ〕によって各糖残基含有化合物１を精製後、凍結乾燥を行った。各収率を表１に示した。
【００２８】
【表１】
0003821494.tif 000003
【００２９】
次に実施例１−３で得られた次に示す３種の糖残基含有化合物１（ａ〜ｃ）、即ち
【００３０】
【化４】
0003821494.tif 000004
【００３１】
の保護基を次のように脱離した。
（１）化合物ａのＢｏｃ除去
化合物ａ（１．１８ｍｇ、１．６０μｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸（２００μＬ）溶液を室温で３０分間攪拌した。その後、窒素ガスを吹きつけてトリフルオロ酢酸を除き、残渣に水を加えて溶かし、ＨＰＬＣで分離精製後、凍結乾燥を行いＢｏｃがＨで置換された次式で示される化合物ａｒを得た。収率はＨＰＬＣ分析により、定量的で略１００％であった。
【００３２】
【化５】
0003821494.tif 000005
【００３３】
（２）化合物ｂのＺの除去
化合物ｂ（１．３１ｍｇ、１．６９μｍｏｌ）に水（５００μＬ）を加えて溶かし、パラジウム黒（１１．２ｍｇ）を加え、４気圧の水素雰囲気下室温で９０分間攪拌した。その後、ＨＰＬＣで分離精製後、凍結乾燥を行いＺがＨで置換された化合物ａｒを得た。収率はＨＰＬＣ分析により、定量的で略１００％であった。
（３）化合物ｃのＴｆａ除去
化合物ｃ（０．１５ｍｇ、０．２μｍｏｌ）の１Ｍピペリジン水溶液（２５０μＬ）溶液を０℃で１時間攪拌した。その後、ＨＰＬＣで分離精製後、凍結乾燥を行いＴｆａがＨで置換された化合物ａｒを得た。収率はＨＰＬＣ分析により、定量的で略１００％であった。
【００３４】
比較例
化合物ａｒにおいて、ピリジン環の６位がシアノエチル基である化合物３２μｍｏｌを２５％アンモニア水溶液（１４ｍＬ）中パラジウム黒（５０ｍｇ）の存在下、水素を９ｋｇ／ｃｍ２の条件で室温下６６時間水素化し、化合物ａｒを合成した。この触媒を濾別し、濾過物を濃縮した。その濃縮残渣を水（１０ｍＬ）に溶解し、ＨＰＬＣ〔カラム：コスモシール（登録商標）５Ｃ１８−ＡＲ、２０ｍｍ×２５０ｍｍ；溶媒：ＭｅＣＮ−０．１Ｍ  ＣＨ３ＣＯ２ＮＨ４（ｐＨ６．９）；勾配：５％ＭｅＣＮ−５０％ＭｅＣＮ（１．５％／ｍｉｎ）；流速：８ｍＬ／ｍｉｎ；検知：ＵＶ  ３０７ｎｍ〕で精製した。化合物ａｒを含む分画を凍結乾燥し、その得られた粉末を水（１０ｍＬ）に溶解した。この溶液に混在するアンモニウム塩を除くためにＨＰＬＣ〔カラム：コスモシール（登録商標）５Ｃ１８−ＡＲ、２０ｍｍ×２５０ｍｍ；溶媒：１５％ＭｅＣＮ−０．０１％ＴＦＡ；流速：８ｍＬ／ｍｉｎ；検知：ＵＶ３０７ｎｍ〕で再精製した。収率は、７７％であった。
【００３５】
実施例２
実施例２−１  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と化合物ａｒとからなる人工複合糖質の合成
下記化４に示す合成ルートにより標記人工複合糖質を合成した。
【００３６】
【化６】
0003821494.tif 000006
【００３７】
化合物ａｒとスクシンイミジル  ３−（３−ニトロ−２−ピリジルジチオ）プロピオネート（１）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）−水（２：１）のＴＥＡ（トリエチルアミン）溶液（ｐＨ９）中で結合させ、逆相ＨＰＬＣ（カラム：コスモシール（登録商標）５Ｃ１８−ＡＲ、溶媒：ＭｅＣＮ−０．１％ＴＦＡ水溶液）により化合物（２）を得た。化合物（２）は２トリフルオロ酢酸塩として得られた。
【００３８】
次に６個のシステイン残基を有するＢＳＡ（３）および化合物（２）を種々のモル比〔化合物（２）：ＢＳＡ＝１〜６：１〕で０．５Ｍトリス−０．００５ＭＥＤＴＡナトリウム塩緩衝液（ｐＨ７．５）に共に溶解して４℃でＢＳＡの−ＳＨ基と化合物（２）のジスルフィド基の交換反応に供し、人工複合糖質（４）を得た。得られる人工複合糖質（４）は、ゲル濾過ＨＰＬＣ〔カラム：アサヒパックＧＳ−５１０、溶媒：３０％ＭｅＣＭ−０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）〕により化合物（２）より分離した。
【００３９】
実施例２−２  ビオチンと化合物ａｒとからなる人工複合糖質の合成
下記化５に示す合成ルートにより標記人工複合糖質を合成した。
【００４０】
【化７】
0003821494.tif 000007
【００４１】
化合物ａｒ（１５．０ｍｇ、１６．６μｍｏｌ）の０．５％ＮａＨＣＯ３水溶液−ＤＭＦ〔１：１（ｖ／ｖ），５００μＬ〕水溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン（５）（４０．０ｍｇ、１１７μｍｏｌ）を加え、この混合物を室温で３．５時間攪拌した。その後、化合物（５）（２４．０ｍｇ、７０．４ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を濾過し、かつその濾過物をＨＰＬＣ〔カラム：コスモシール（登録商標）５Ｃ１８−ＡＲ、２０ｍｍ×２５０ｍｍ；溶媒：ＭｅＣＮ−０．１Ｍ  ＨＣＯ２ＮＨ４（ｐＨ６．３）；勾配：５％ＭｅＣＮ−５０％ＭｅＣＮ（１．５％／ｍｉｎ）；流速：８ｍＬ／ｍｉｎ；検知：ＵＶ  ３００ｎｍ〕にかけた。２０．９分後に溶出した分画を集め、凍結乾燥し、無色の粉末である化合物（６）を得た（収量９．３ｍｇ（収率６５％））。化合物（６）は、１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）で確認され、かつポジティブＦＡＢ−ＭＳでｍ／ｚ８６６．７〔（Ｍ＋Ｈ）＋〕に擬分子イオンピークを示した。
【００４２】
実施例２−３  アクリル酸と化合物ａｒとからなる人工複合糖質の合成
下記化６に示す合成ルートにより標記人工複合糖質を合成した。
【００４３】
【化８】
0003821494.tif 000008
【００４４】
化合物ａｒ（１５ｍｇ、１６．６μｍｏｌ）および４−アクリロイルオキシフェニルジメチルスルホニウムメチルスルフェイト（７）（２０．０ｍｇ、６２．５μｍｏｌ）を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（３００μＬ）に加え、この溶液を室温で５．５時間攪拌し、該化合物（７）１５．０ｍｇの水（１００μＬ）水溶液１６．６μＬを追加した。この混合物を更に一晩攪拌し、次いで濾過した。この濾過物をＨＰＬＣ〔カラム：コスモシール（登録商標）５Ｃ１８−ＡＲ、２０ｍｍ×２５０ｍｍ；溶媒：ＭｅＣＮ−０．１Ｍ  ＨＣＯ２ＮＨ４（ｐＨ６．３）；勾配：５％ＭｅＣＮ−５０％ＭｅＣＮ（１．５％／ｍｉｎ）；流速：８ｍＬ／ｍｉｎ；検知：ＵＶ  ３００ｎｍ〕にかけた。１８．７分後に溶出した分画を集め、凍結乾燥し、無色の粉末である化合物（８）を得た（収量９．２ｍｇ（収率８０％））。化合物（８）の構造は、１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）で確認され、かつポジティブＦＡＢ−ＭＳでｍ／ｚ６９４．４〔（Ｍ＋Ｈ）＋〕に擬分子イオンピークを示した。化合物（８）は、アクリルアミドとともに容易にコポリマー化して高分子化合物とすることができる。
【００４５】
【発明の効果】
本発明の糖の蛍光標識方法は、極めて温和な条件で２位が還元糖残基に結合した６位にアルキルアミノ基を有する糖のピリジン誘導体、即ち、蛍光標識剤を収率よく製造でき、かつ６位のアミノ基と所望の蛋白質、脂質、糖、核酸等の生体物質を結合させることにより、容易に蛍光標識された人工複合糖質が生成できるので、各種物質の同定、定量、調製、精製等に極めて有用な手段を提供することができる。