(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブのアレーを生成する方法であって、
（ａ）それぞれが３′末端に不変配列および５′末端にランダム配列を含む核酸の第一セットを合成し；
（ｂ）それぞれが第一核酸セットの不変配列に相補的な配列を含む第二核酸セットを合成し；そして
（ｃ）該第一セットを該第二セットとハイブリッド形成させて該プローブのアレーを生成し、ここで、該アレー中のプローブが、二本鎖領域および一本鎖領域を有し、ここで該一本鎖領域が該ランダム配列を含む、
工程を含む方法。
【請求項２】
第一セットの核酸の長さがそれぞれ１５〜３０ヌクレオチドであり且つ第二セットの核酸の長さがそれぞれ１０〜２５ヌクレオチドである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該不変配列が７〜２０ヌクレオチドであり、且つ該ランダム配列が３〜５ヌクレオチドである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該ランダム配列の長さがＲである場合に、該アレーが４Rの異なるプローブを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
固体支持体に固定されたプローブのアレーを生成する方法であって、
（ａ）それぞれが３′末端に不変配列および５′末端にランダム配列を含む核酸の第一セットを合成し；
（ｂ）該第一セットを、共有結合または非共有結合によって固体支持体に固定し；
（ｃ）それぞれが該第一セットの不変部分に相補的な配列を含む核酸の第二セットを合成し；そして
（ｄ）該第一セットの核酸を該第二セットとハイブリッド形成させて該アレーを生成し、ここで該アレー中のプローブが、二本鎖領域および一本鎖領域を有し、そしてここで、該一本鎖領域が該ランダム配列を含む、
工程を含む方法。
【請求項６】
該固体支持体が、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ゲル、膜およびチップからなる群より選択される、請求項５の方法。
【請求項７】
プローブのアレーを生成する方法であって、
（ａ）それぞれが３′末端に不変配列、５′末端に別の不変配列、および制限酵素の開裂部位に隣接されたランダム内部配列を含む一本鎖核酸のセットを合成し；
（ｂ）それぞれが３′末端の不変配列の一部分に対して相補的なプライマーのセットを合成し、；
（ｃ）該２セットを一緒にハイブリッド形成させ、ハイブリッドを形成させ；
（ｄ）核酸の配列を鋳型として用いる重合によって各プライマーの配列を伸長し；そして
（ｅ）伸長されたハイブリッドを制限酵素によって開裂して、一方の末端に二本鎖部分と、反対側の末端にランダム配列を含む一本鎖部分を有するプローブのアレーを生成する工程を含む方法。
【請求項８】
核酸の長さがそれぞれ１０〜５０ヌクレオチドである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該ランダム配列が３〜５ヌクレオチドの長さである請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
制限酵素が、５′突出部分を生じる制限酵素および３′突出部分を生じる制限酵素から成る群より選択される請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）の後に、該第一のセットの核酸の３’末端に不変配列を、固体支持体に固定する工程をさらに含む、請求項７の方法であって、ここで、該固体支持体が、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ゲル、膜およびチップから成る群より選択される方法。
【請求項１２】
プローブのアレーを生成する方法であって、
（ａ）それぞれが３′末端に不変配列、５′末端に別の不変配列、および制限酵素の開裂部位に隣接されたランダム内部配列を含む一本鎖核酸のセットを合成し；
（ｂ）それぞれが、３′末端の不変配列の部分に対して相補的であるプライマーのセットを合成し；
（ｃ）二つのセットを互いにハイブリッド形成させてハイブリッドを生成し；
（ｄ）核酸を鋳型として用いてプライマーを酵素によって伸長して完全長さのハイブリッドを生成し；
（ｅ）完全長さのハイブリッドをベクター中にクローン化し；
（ｆ）クローン化配列を多重ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し；そして
（ｇ）増幅された配列を制限酵素によって開裂して、一方の末端に二本鎖部分および反対側の末端にランダム配列を含む一本鎖部分を有するプローブのアレーを生成する工程を含む方法。
【請求項１３】
プローブのアレーが、５′突出部分または３′突出部分を有する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ａ）の後に、第一核酸セットを、固体支持体に共有結合または非共有結合によって固定し、固体支持体が、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ポリマー、フィルム、ゲル、膜およびチップから成る群より選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
生物学的試料中の核酸を検出する方法であって、
（ａ）請求項６に記載の方法にしたがって固体支持体に固定されたプローブのアレーを生成し；
（ｂ）生物学的試料の核酸を検出可能な標識で標識し；
（ｃ）標識された核酸を該アレーに対してハイブリッド形成させ；そして
（ｄ）核酸の配列を、該アレー上の標識の結合パターンから検出する工程を含む方法。
【請求項１６】
プローブを生成する方法であって、
（ａ）複数の第一核酸並びに、それぞれがランダム末端ヌクレオチド配列および該第一核酸の配列に相補的な配列を含む複数の第二核酸を合成し；
（ｂ）第一核酸を第二核酸とハイブリッド形成させて、二本鎖部分および一本鎖部分を有し、その一本鎖部分中にランダム配列を含む部分二重らせんを生成し；
（ｃ）標的核酸を部分二重らせんに対してハイブリッド形成させ；
（ｄ）ハイブリッド形成された標的を部分二重らせんの第一核酸に対して連結し；
（ｅ）連結された標的を、ランダム配列を含むオリゴヌクレオチドセットとハイブリッド形成させ；
（ｆ）ハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドを第二核酸に連結し；
（ｇ）オリゴヌクレオチドを連結した第二核酸を単離し；そして
（ｈ）別の複数の第一核酸を合成し且つ第一核酸と単離された第二核酸とをハイブリッド形成させてプローブを生成する工程を含む方法。
【請求項１７】
第一核酸の長さがそれぞれ１５〜２５ヌクレオチドであり、第二核酸の長さがそれぞれ２０〜３０ヌクレオチドであり、そしてオリゴヌクレオチドの長さがそれぞれ４〜２０ヌクレオチドである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
標的を１種類のセットのハイブリッド形成条件下で部分二重らせんに対してハイブリッド形成させる請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ハイブリッド形成条件が、２２〜３７℃の温度、０．０５〜０．２Ｍの塩濃度および１〜１４時間の時間を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
部分二重らせんが酵素認識部位を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
プローブを生成する方法であって、
（ａ）複数の第一核酸並びにランダム末端ヌクレオチド配列および該第一核酸の配列に相補的な配列を含む多数の第二核酸を合成し；
（ｂ）第一核酸を第二核酸にハイブリッド形成させて、二本鎖部分および一本鎖部分を有し、その一本鎖部分中にランダムヌクレオチド配列を含む部分二重らせんを生成し；
（ｃ）標的核酸を部分二重らせんに対してハイブリッド形成させ；
（ｄ）ハイブリッド形成された標的を部分二重らせんの第一核酸に対して連結し；
（ｅ）標的を鋳型として用いて第二核酸を酵素によって伸長し；
（ｆ）伸長された第二核酸を単離し；そして
（ｇ）別の第一核酸を合成し、そして該第一核酸と単離され且つ伸長された第二核酸とをハイブリッド形成させて、二本鎖領域および一本鎖領域を含むプローブを生成する工程を含む方法。
【請求項２２】
第一核酸の長さがそれぞれ１５〜２５ヌクレオチドであり且つ第二核酸の長さがそれぞれ２０〜３０ヌクレオチドである請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
標的を１種類のセットのハイブリッド形成条件下で部分二重らせんに対してハイブリッド形成させる請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ハイブリッド形成条件が、２２〜３７℃の温度、０．０５〜０．２Ｍの塩濃度および１〜１４時間の時間を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
二本鎖部分が酵素認識部位を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
標的核酸が、動物組織試料、環境物質並びに製品および副製品から成る群より選択される生物学的試料から得られる請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
ハイブリッド形成によって標的核酸のヌクレオチド配列を決定する方法であって、
（ａ）それぞれのプローブが二本鎖部分、一本鎖部分、該二本鎖部分中の不変領域、および該一本鎖部分中のランダム領域を有する、核酸プローブのセットを生成し、
（ｂ）少なくとも一部が一本鎖である核酸標的を、１または2以上の核酸プローブとハイブリッド形成させ、
（ｃ）標的の、いずれかのプローブの一本鎖領域へのハイブリッド形成を検出し、そして
（ｄ）当該ハイブリッド形成した標的のヌクレオチド配列を決定する、
工程を含む方法。
【請求項２８】
該ハイブリッド形成した標的を該プローブへ連結させる工程をさらに含む、請求項２７の方法。
【請求項２９】
工程（ｃ）の後に、テンプレートとしてハイブリッド形成した標的を使用して、プローブの鎖を酵素的に伸長させる工程をさらに含む、請求項２７の方法。
【請求項３０】
該プローブを、真核細胞または原核細胞ポリメラーゼによって酵素的に伸長させる、請求項２９の方法。
【請求項３１】
該プローブを、単一のデオキシヌクレオチド三リン酸またはジデオキシヌクレオチド三リン酸を使用してポリメラーゼによって酵素的に伸長させる、請求項２９の方法。
【請求項３２】
該核酸標的が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡからなる群より選択される、請求項２７の方法。
【請求項３３】
核酸プローブのセットが固体支持体に固定される、請求項２７の方法。
【請求項３４】
該固体支持体が、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ゲル、膜およびチップからなる群より選択される、請求項３３の方法。
【請求項３５】
該固体支持体が、多重プローブ結合部位を有する二次元または三次元マトリックスである、請求項３３の方法。
【請求項３６】
該標的核酸またはプローブが、検出可能標識で標識される、請求項２７の方法。
【請求項３７】
該検出可能標識が、放射性同位体、安定同位体、酵素、蛍光化学物質、発光化学物質、染色化学物質、および金属からなる群より選択される、請求項３６の方法。
【請求項３８】
アレイ中のプローブのそれぞれが二本鎖領域および一本鎖領域を有し、
それぞれのプローブの二本鎖領域はアレイの全てのプローブに共通の不変配列を含み、
一本鎖領域は３〜２０ヌクレオチドの長さであり、ランダム配列を含み、
ランダム配列はアレイのそれぞれのプローブで異なる、
核酸プローブのアレイ。
【請求項３９】
不変配列が３′末端にあり、そして
ランダム配列が５′末端にある、
請求項３８のプローブのアレイ。
【請求項４０】
不変配列が一方の末端にあり、
ランダム配列が反対側の末端にある、
請求項３８のプローブのアレイ。
【請求項４１】
一本鎖領域が末端にあり、
ランダムヌクレオチド配列が該一本鎖部分内にあり、
該ランダムヌクレオチド配列の長さはＲであり、そして、
アレイは４Rの異なる核酸プローブを含む、
請求項３８のプローブのアレイ。
【請求項４２】
それぞれのプローブが、一方の末端に一本鎖部分、反対側の末端に二本鎖部分、および該一本鎖部分内にランダム核酸配列を含む、核酸プローブのアレイであって、
ここで、該プローブの群を４つのサブセットに別け、それぞれのサブセットでは、１つの核酸塩基が選択され、それぞれのプローブ中の所定の位置を占め、そして選択された核酸塩基以外の核酸塩基が残りの位置を占めている、
該核酸プローブのアレイ。
【請求項４３】
プローブが固体支持体に固定化されている、請求項３８−４２の何れかのプローブのアレイ。
【請求項４４】
プローブが、共有結合または非共有結合によって固体支持体に固定され、そして、
該固体支持体が、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ポリマー、フィルム、ゲル、膜並びに二次元および三次元マトリックスからなる群より選択される、
請求項４３のプローブのアレイ。
【請求項４５】
不変配列が３′末端にあり、そして
不変配列が、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ゲル、膜およびチップからなる群より選択される固体支持体に固定化されている、
請求項３８のプローブのアレイ。
【請求項４６】
固体支持体が、マイクロタイタープレート、ビーズおよびマイクロビーズ、セラミックス、金属、磁気ビーズ、樹脂、ゲル、ポリマーおよび他のフィルム、膜、二および三次元配列決定用チップのうちから選択される、請求項４３のプローブのアレイ。
【請求項４７】
該二本鎖部分が３〜２０ヌクレオチドである請求項３８から４４の何れかに記載のプローブのアレー。
【請求項４８】
二本鎖部分が１０から３０ヌクレオチドの長さであり、
一本鎖部分が４から２０ヌクレオチドの長さであり、そして
ランダム配列が４から２０ヌクレオチドの長さである、
請求項３８から４６の何れかに記載のプローブのアレイ。
【請求項４９】
不変配列が７から２０ヌクレオチドの長さであり、
ランダム配列が３から１０ヌクレオチドの長さである、
請求項３８から４６の何れかに記載のプローブのアレイ。
【請求項５０】
固体支持体が複数のプローブ結合部位を有する二次元または三次元マトリックスである、請求項４３のアレイ。
【請求項５１】
プローブが検出可能な標識で標識されている、請求項３８−５０の何れかのアレイ。
【請求項５２】
検出可能な標識が放射性同位体、安定な同位体、酵素、抗体、蛍光化学物質、発光化学物質、染色化学物質、および金属からなる群から選択される、請求項５１のアレイ。
【請求項５３】
核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質核酸（ＰＮＡ）、またはその組合せである、請求項３８−５２の何れかのアレイ。
【請求項５４】
請求項４３〜５３のいずれかのアレー、該アレーが固体支持体上に固定化されている該固体支持体、検出可能標識、および生物学的サンプルを含む、生物学的サンプル中の標的核酸を検出するための診断用補助物。
【請求項５５】
生物学的試料中の標的核酸を識別する方法であって、
（ａ）固体支持体に請求項４３〜５３の何れかに記載の核酸プローブのアレーを提供し；
（ｂ）生物学的試料の標的を検出可能な標識で標識し；
（ｃ）標識された標的を該アレーに対してハイブリッド形成させ；そして
（ｄ）該アレー上の標識の結合パターンから標的を識別する工程を含む方法。
【請求項５６】
検出可能な標識が、放射性同位体、安定な同位体、酵素、蛍光および発光化学物質、染色化学物質、金属、電荷並びに立体化学から成る群より選択される請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
識別される核酸が、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌および酵母に由来する核酸から成る群より選択される請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
結合パターンが核酸フィガープリントである請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
生物学的試料が、動物組織、環境物質並びに製品および副製品から成る群より選択される請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
動物組織がヒトから得られる請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
識別された標的核酸を精製する工程を更に含む請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
１．  発明の分野
本発明は、位置ハイブリッド形成による核酸の配列決定法並びにこれらの方法と、一層慣用的な配列決定技術およびＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技法で用いられる技術を含む他の分子生物学技術とを組合せた方法に関する。有用な用途としては、生物学的試料中の標的核酸を検出し、識別し、精製し、そして配列決定するためのプローブおよびプローブのアレー（ａｒｒａｙｓ）の生成がある。本発明は、更に、プローブアレーの複製のための新規の方法；複製されたアレー；標的核酸および核酸変異について生物学的試料をスクリーニングするのに有用な核酸プローブおよびアレーを含む診断用補助物に関する。
２．  背景の説明
核酸が遺伝コードの担い手として認識されて以来、そのコードの配列をそれが見出される多数の形で決定することにほぼ多くの関心が集まっている。二つの特徴的な研究は、大部分の実験室で実施された一般的で且つ比較的迅速な方法である、少なくともＤＮＡを用いる核酸配列決定法を生み出した。第一は、末端に標識されたＤＮＡ分子を１種類の塩基反復のところで化学的に開裂される方法を記載している（Ａ．Ｍ．マキサム（Ｍａｘａｍ）およびＷ．ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５６０〜５６４，１９７７年）。次に、核酸配列中の各塩基位置を、部分開裂によって生じたフラグメントの分子量から決定する。個々の反応は、グアニンのところで、アデニンのところで、シトシンおよびチミンのところで並びにシトシンのところのみで優先的に開裂するように考案された。これら４種類の反応生成物が、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分子量によって分割される場合、ＤＮＡ配列は、分割されたゲル上のフラグメントパターンから読み取ることができる。
第二の研究は、プラス・マイナス法の変法を用いてＤＮＡを配列決定する方法を記載している（Ｆ．サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３〜６７，１９７７年）。この方法は、ジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）の鎖終結能力および、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）であるＤＮＡポリメラーゼの天然基質としてほぼ等しく忠実にｄｄＮＴＰを包含するＤＮＡポリメラーゼの能力を利用する。プライマー、通常はオリゴヌクレオチドおよび鋳型ＤＮＡを、有用な濃度の全４種類のｄＮＴＰおよびある限られた量の１種類のｄｄＮＴＰの存在下で一緒にインキュベートする。ＤＮＡポリメラーゼは、時々、鎖伸長を終結するジデオキシヌクレオチドを包含している。ジデオキシヌクレオチドは３′−ヒドロキシルを有していないので、ポリメラーゼ酵素の開始点を欠いている。重合は、いずれも同一の３′末端を有する種々の寸法のフラグメントの混合物を生じる。ポリアクリルアミドゲル電気泳動などによる混合物の分別は、核酸中の各塩基の存在および位置を示すパターンを生じる。４種類のｄｄＮＴＰそれぞれとの反応は、当業者が分割されたゲルから完全な核酸配列を読取ることを可能にする。
それらの利点にもかかわらず、これらの方法は、メガベースの配列情報を得ることが望まれる場合、厄介であり且つ実用的でない。更に、これらの方法は、いずれの実用目的にも、配列決定用ＤＮＡに限定される。変法は開発されたが、どの方法を用いてもなお、配列情報を任意の他の形の核酸から直接的に得ることは不可能である。
配列情報が多数の別々のパッケージで得られる現在の方法論に関係したいくつかの問題を克服する新規の配列決定法が開発された。特定の核酸の配列決定された１種類の塩基を一度に有する代わりに、隣接する塩基群をハイブリッド形成によって同時に決定する。増加した速度、低減した費用およびより顕著な正確さを含む多数の利点がある。
ハイブリッド形成によって配列決定する二つの一般的なアプローチが示唆された。それらの実用性は予備実験で実証された。一つの方式において、長さｎを有する４nのヌクレオチドの完全なセットを固体支持体上に順序付けられたアレーとして固定し、そして未知のＤＮＡ配列をこのアレーに対してハイブリッド形成させる（Ｋ．Ｒ．クラプコ（Ｋｈｒａｐｋｏ）ら、Ｊ．ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｐｐｉｎｇ  １：３７５〜８８，１９９１年）。得られたハイブリッド形成パターンは、配列中の全ｎ組の語を与える。これは、単純なタンデム反復を除く短い配列を決定するのに十分である。
第二の方式において、固定された試料のアレーを１種類の短いオリゴヌクレオチドと一度にハイブリッド形成させる（Ｚ．ストレゾスカ（Ｓｔｒｅｚｏｓｋａ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０，０８９〜９３，１９９１年）。長さｎの各オリゴヌクレオチドを４n回反復した場合、全部の固定試料の大部分の配列が決定されるであろう。両方のアプローチにおいて、方法の本質的な能力は、多数の配列決定される部分を平行して決定することである。実際に、アレー寸法は約１０4〜１０5である。
方法のもう一つの有力な態様は、特に、核酸プローブの寸法が増加すると、得られた情報が極めて過剰であることである。数学的シミュレーションは、方法が極めて耐実験誤差性であることおよび、信頼しうる配列データを決定するためには全部よりもはるかに少ないプローブしか必要でないことを示した（Ｐ．Ａ．ペヴズナー（Ｐｅｖｚｎｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．＆  Ｄｙｎ．９：３９９〜４１０，１９９１年；Ｗ．バインズ（Ｂａｉｎｓ）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １１：２９５〜３０１，１９９１年）。
全体的に楽観的な見通しにもかかわらず、ハイブリッド形成による配列決定の実施にはなお多数の潜在的に苛酷な障害がある。何よりもまず第一に、オリゴヌクレオチドプローブ全部の化学合成を実際に考えるならば、４nは急に極めて大きな数になるということがある。この合成をオートメーション化し且つ製品を縮小して小規模なアレーである配列決定用チップにする様々なスキームが提案されてきた。
第二の障害は、正しくハイブリッド形成されて完全に対合した二重らせんと末端誤対合との識別の程度が不十分であることである。幾分は、これらの障害は、クラプコら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２５６：１１８〜２２，１９８９年）によって報告されたような連続スタッキングハイブリッド形成法によって少なくとも小さくなってきている。連続スタッキングハイブリッド形成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを二本鎖オリゴヌクレオチドに隣接してハイブリッド形成させた場合、二つの二重らせんが、それらの間のスタッキング接触のために並んで位置しているかのように相互に安定化するという観察に基づいている。相互作用の安定性は、ヌクレオチド置換、ギャップまたは末端誤対合によってスタッキングが破壊されるにつれて有意に減少する。内部誤対合は、それらの熱力学的安定性が完全な対合よりはるかに小さいので、おそらく無視しうる。有望ではあるが、弱いが正しい二重らせん形成と、基本的な支持体マトリックスに対するプローブの非特異的吸着などの単純な背景とを区別することができない関連の問題が生じる。
第三の障害は、検出が単色であることである。分離用逐次陽性および陰性対照は、正しいハイブリッド形成対合と誤対合と背景とを区別するように実験されるべきである。
第四の障害は、配列反復のために、数百の塩基対よりも長い配列を読取る場合にアンビギュイティーが生じることである。例えば、プローブと同様の長さの配列が標的中において３回反復した場合、配列部分を独自に決定することはできない。これらの配列アンビギュイティーの位置を分岐点と称する。
第五の障害は、標的核酸の二次構造の作用である。これは、二次構造が相補鎖で生じるよりも安定である場合に、判読できない配列ブロックをもたらすことがある。
最後の障害は、若干のプローブが異常な挙動を有し、そして何かの理由で、最終的にどのような標準的設定条件を用いたとしてもハイブリッド形成させにくい可能性である。これの簡単な例は、Ｇ／Ｃ含量に富むプローブに適合した条件を見出すことの難しさである。更に複雑な例は、三重らせんを形成する傾向か強い配列であろう。これらの可能性を厳密に追求する唯一の方法は、選択された特定の方式および条件下において、長さｎの可能なオリゴヌクレオチド全部との広範なハイブリッド形成実験を実施することである。これは、多数のセットの条件が必要とされる場合、明らかに実用的ではない。
ハイブリッド形成による配列決定の論及が示された初期の公報の内、Ｅ．Ｍ．サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）（１９８９年１１月１６日公開のＰＣＴ出願ＷＯ８９／１０９７７号明細書；本明細書中に参考として具体的に包含されている）は、未知のすなわち標的核酸を標識し、固体支持体上の選択された長さのヌクレオチドのセットにハイブリッド形成させ、そして標的のヌクレオチド配列を、少なくとも部分的には結合したフラグメントの配列情報および観察されたハイブリッド形成パターンから決定するための方法を記載している。有望ではあるが、実際問題として、この方法には多数の欠点がある。プローブは完全に一本鎖であり、結合安定性は二重らせんの寸法に依る。しかしながら、プローブの更に別のヌクレオチドはいずれも、そのもっともらしい使用を厳しく制限する二分法を生じる４層のひだによってアレーの寸法を必然的に増加させる。更に、標的の分岐点アンビギュイティーまたは二次構造を処理することはできないし、ハイブリッド形成条件は、要求通りに適応される必要があるしまたは何とかしてそれぞれの結合結果を明らかにする必要がある。
Ｒ．ドルマナク（Ｄｒｍａｎａｃ）ら（米国特許第５，２０２，２３１号明細書；参考として具体的に包含される）は、ランダム配列を有するオリゴヌクレオチドプローブセットを用いるハイブリッド形成によって配列決定する方法に関して記載している。これらのプローブは、有用ではあるが、サザン（１９８９年）の方法論と同様のいくつかの欠点に悩まされ、サザンと同様、スタッキング相互作用の利点を認識することができない。
Ｋ．Ｒ．クラプコら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２５６：１１８〜２２，１９８９年；およびＪ．ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｐｐｉｎｇ  １：３５７〜８８，１９９１年）は、連続スタッキングハイブリッド形成と称する技術を用いてこれらの問題のいくつかに取り組むことを試みている。連続スタッキングを用いると、概念上は、標的核酸の完全な配列を決定することができる。基本的には、標的をプローブのアレーに対してハイブリッド形成させ、再度一本鎖にし、アレーから変性させ、そして変性の解離速度論を分析して標的配列を決定する。更に所望であるが、対合と誤対合（および単純な背景）との識別は低く、更に、ハイブリッド形成条件が各二重らせんに対して一定でないのと同様に、識別は標的が複雑になるにつれてますます低下する
発明の概要
本発明は、現行の方策および設計に関係した問題および欠点を克服し、そして本明細書中に記載のハイブリッド形成による位置配列決定法によって核酸のヌクレオチド配列を迅速且つ正確に決定する新規の方法を提供する。
本発明の一つの実施態様は、各プローブが、長さＤの二本鎖部分、長さＳの末端一本鎖部分、および長さＲの一本鎖部分中のランダムヌクレオチド配列を含むＲ4の異なる核酸プローブのアレーに関する。これらのアレーは、固体支持体に対して結合することができ、しかも未知の核酸のヌクレオチド配列の決定に並びに生物学的試料中の標的核酸の検出、識別および精製に有用である。
本発明のもう一つの実施態様は、プローブのアレーを生成する方法であって、それぞれが３′末端に長さＣの不変配列および５′末端に長さＲのランダム配列を含む核酸の第一セットを合成し、それぞれが第一核酸の不変配列に相補的な配列を含む核酸の第二セットを合成し、そして第一セットと第二セットとをハイブリッド形成させて該アレーを生成する工程を含む上記方法に関する。
本発明のもう一つの実施態様は、プローブのアレーを生成する方法であって、それぞれが、制限酵素の開裂部位によって隣接された長さＲのランダム内部配列を含む核酸のセットを合成し、それぞれが核酸の非ランダム配列に相補的なプライマーのセットを合成し、二つの組を互いにハイブリッド形成させてハイブリッドを生成し、核酸を鋳型として用いる重合によってプライマー配列を伸長し、そしてハイブリッドを制限酵素によって開裂して、二本鎖部分および一本鎖部分を含み且つ一本鎖部分中にランダム配列を含むプローブのアレーを生成する工程を含む上記方法に関する。
本発明のもう一つの実施態様は、複製されたアレーおよび好ましくは固体支持体上でプローブのアレーを複製する方法であって、それぞれが３′末端に長さＣの不変配列および５′末端に長さＲのランダム配列を含む核酸のアレーを合成し、該アレーを第一固体支持体に対して固定し、それぞれが該アレーの不変部分に対して相補的な配列を含む核酸のセットを合成し、該セットの核酸を該アレーとハイブリッド形成させ、該アレーのランダム配列を鋳型として用いて該セットの核酸を酵素によって伸長し、伸長された核酸の該セットを変性させ、そして該セットの変性された核酸を第二固体支持体に対して固定してプローブの複製されたアレーを生成する工程を含む上記方法に関する。複製されたアレーは一本鎖または二本鎖であってよいし、それは固体支持体に対して固定されていてよいしまたは溶液中に遊離していてよいし、そしてそれは標的核酸を配列決定し、検出しまたは簡単に識別するのに有用である。
該アレーは、更に、後の識別および／または配列決定のために複合体混合物から核酸を精製するのに有用である。精製用アレーは、ハイブリッド形成するのに十分な多数のプローブを含み、それによって複合体試料から標的配列を効果的に捕捉する。ハイブリッド形成されたアレーを洗浄して非標的核酸および存在しうる任意の他の物質を除去し、そして標的配列を変性によって溶離する。溶離によって，精製されたまたは半精製された標識配列を得且つ採取する。次に、この標的配列の採取物は、通常の配列決定法を行なうかまたは本明細書中に記載の方法によって配列決定することができる。
本発明のもう一つの実施態様は、核酸プローブおよび核酸プローブの生成法であって、多数の一本鎖第一核酸および多数のより長い一本鎖第二核酸を合成し、ここにおいて各第二核酸はそれぞれランダム末端配列および第一核酸の配列に相補的な配列を含み、第一核酸を第二に対してハイブリッド形成させて、二本鎖部分および一本鎖部分を有し、その一本鎖部分中にランダム配列を含む部分二重らせんを生成し、標的核酸を該部分二重らせんに対してハイブリッド形成させ、場合によりハイブリッド形成された標的を該部分二重らせんの第一核酸に対して連結し、連結された二重らせんから第二核酸を単離し、それぞれが第二核酸の不変配列に対して相補的な多数の第三核酸を合成し、そして第三核酸と単離された第二核酸とをハイブリッド形成させて核酸プローブを生成する工程を含む上記方法に関する。或いは、部分二重らせんの生成後、標的を前の通りに連結し且つランダム配列を含むオリゴヌクレオチドのセットとハイブリッド形成させる。これらのオリゴヌクレオチドを第二核酸に対して連結し、第二核酸を単離し、別の多数の第一核酸を合成し、そして該第一核酸を、オリゴヌクレオチドを連結した第二核酸に対してハイブリッド形成させてプローブを生成する。連結反応は、ハイブリッド形成が１種類のセットのハイブリッド形成条件下で実施されることを可能にする。プローブは固体支持体に対して固定されていてよいし、更に、それらの配列中に酵素認識部位を含んでいてよい。
本発明のもう一つの実施態様は、生物学的試料中の標的核酸の検出および識別のためにプローブアレーを用いる診断用補助物および方法並びに生物学的試料をスクリーニングするための診断用補助物の使用法に関する。記載の診断用補助物は、識別された標的の精製のためにおよび所望ならばそれらの配列決定のためにも有用である。これらの補助物質は、プローブ、固体支持体、標識、必要な試薬および生物学的試料を含む。
本発明の他の利点を一部分は以下の明細書中に記載し、一部分は本明細書から明らかであるしまたは本発明の実施により理解することができる。本明細書中に包含され且その一部分を構成している添付図面は、本発明を例証し且つ本明細書と共にその理論の説明に役立つ。
【図面の簡単な説明】
図１  スタッキングハイブリッド形成のエネルギー論。構造は、長い標的および長さｎのプローブから成る。上の三つの試料は通常のハイブリッド形成であり、下の三つはスタッキングハイブリッド形成である。
図２  （Ａ）標的の５′突出部分を生成する標的核酸とプローブとのハイブリッド形成を示す、ハイブリッド形成による位置配列決定のための基本的スキームの第一工程。
（Ｂ）プローブの３′突出部分を生成する標的核酸とプローブとのハイブリッド形成を示す、ハイブリッド形成による位置配列決定のための別のスキームの第一工程。
図３  標的核酸のハイブリッド形成が（Ａ）５′突出部分または（Ｂ）３′突出部分を生じるハイブリッド形成による位置配列決定の連結反応工程の図示。
図４  ランダムプローブアレーの製造。
図５  ＤＮＡポリメラーゼおよび１種類のジデオキシヌクレオチドを用いて標的核酸とハイブリッド形成されたプローブの単一ヌクレオチド伸長。
図６  エキソヌクレアーゼＩＩＩによって部分消化された標識標的核酸を用いる嵌め合された標的セットの製造。
図７  内部標識対末端標識の比率を用いる位置情報の決定。
図８  （Ａ）鋳型としてのハイブリッド形成された標的を１種類のデオキシヌクレオチドと一緒に用いる、プローブの一方の鎖の伸長。
（Ｂ）標的と固定プローブとのハイブリッド形成に続く標的に対するプローブの連結。
図９  ３種類の標識ヌクレオシド三リン酸および１種類の非標識鎖終結因子を用いるプローブの３′末端の配列伸長についての四色分析。
図１０  重合を妨げるように３′ブロックされたペンタヌクレオチドの連結反応による核酸プローブの伸長。
図１１  最初の標的核酸中に存在していた１０塩基対配列を含む特注プローブの製造。
図１２  ハイブリッド形成による位置配列決定の一般的な方法の図示。
図１３  位置配列決定の連結反応効率を示すグラフ。示されているのは、反応中の標識総量を越えて残留する標識の量対ＮａＣｌ濃度の関係である。
図１４  相補的なマスタービーズアレーの構築の図示。
発明の説明
本発明は、現行の方策および設計に関係した問題および欠点を克服し、そして標的核酸を検出し、識別し、精製し、そして配列決定するための新規の方法およびプローブ、新規の診断用補助物および該診断用補助物の使用法、並びに新規のプローブアレーおよびプローブアレーを生成する方法を提供する。本発明の核酸としては、天然源から単離しうる、組換えによって製造しうる、または人工的に合成しうるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の配列がある。本発明の好ましい実施態様は、伝統的な化学合成を用いて、より迅速なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、またはこれらの二つの方法を併用して合成されたプローブである。
本発明の核酸は、更に、ポリアミド核酸（ＰＮＡ）または、塩基対に対する能力を有するか若しくは相補的な化学構造とハイブリッド形成する化学主鎖によって結合した一般的に塩基と称される任意の配列を包含する。ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡの塩基は、化学主鎖に対して直線的に結合したプリンおよびピリミジンである。共通の化学主鎖構造は、デオキシリボースリン酸およびリボースリン酸である。最近の研究は、多数の更に別の構造、例えば、ＰＮＡのポリアミド主鎖も有効でありうることを実証した（Ｐ．Ｅ．ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、Ｓｃｉ．２５４：１４９７〜１５００，１９９１年）。
ＤＮＡおよびＲＮＡ両方に見られるプリンはアデニンおよびグアニンであるが、存在することが知られている他のものは、キサンチン、ヒポキサンチン、２−および１−ジアミノプリン並びに他の更に修飾された塩基である。ピリミジンは、ＤＮＡおよびＲＮＡ両方に共通しているシトシン、主としてＲＮＡに見られるウラシル、そして独占的にＤＮＡに存在するチミジンである。若干のより非定型的なピリミジンとしては、メチルシトシン、ヒドロキシメチルシトシン、メチルウラシル、ヒドロキシメチルウラシル、ジヒドロキシペンチルアラシルおよび他の塩基修飾がある。これらの塩基は相補的な様式で相互作用して、例えば、グアニンとシトシンおよびアデニンとチミジンのような塩基対を生成する。しかしながら、本発明は、更に、ある種のｔＲＮＡ分子で識別されて且つ三重らせんに存在すると仮定されたフーグスティーン型塩基対合のような非伝統的塩基対合が存在する状況を包含する。
本発明の一つの実施態様は、位置ハイブリッド形成によってヌクレオチド配列を決定する方法であって、（ａ）それぞれのプローブが、二本鎖部分、一本鎖部分、および決定しうる一本鎖部分中のランダム配列を有する核酸プローブのセットを生成し、（ｂ）少なくとも一部分は一本鎖である核酸標的を該核酸プローブセットに対してハイブリッド形成させ、そして（ｃ）任意のプローブの一本鎖部分に対してハイブリッド形成した標的のヌクレオチド配列を決定する工程を含む方法に関する。核酸プローブのセットおよび標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはそれらの任意の組合せを含むことができ、しかも天然源、組換え体源に由来しうるしまたは合成によって製造しうる。核酸プローブセットの各プローブは、好ましくは長さ約１０〜３０ヌクレオチドの二本鎖部分、好ましくは長さ約４〜２０ヌクレオチドの一本鎖部分、および好ましくは長さ約４〜２０ヌクレオチド、更に好ましくは長さ約５ヌクレオチドの一本鎖部分中のランダム配列を有する。このプローブの理論上の利点はその構造にある。標的核酸のハイブリッド形成は、プローブの隣接する二本鎖の存在によって確定された好ましい熱力学的条件のために促進される。完全なプローブセットは、あらゆる可能なランダムヌクレオチド配列の少なくとも一つの例を含む。
例として、ランダム部分が、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンの４種類のヌクレオチド配列（Ｒ＝４）から成る場合、可能な組合せ総数（４R）は４4すなわち２５６の異なる核酸プローブであろう。ランダム配列中のヌクレオチド数が５である場合、セット中の異なるプローブ数は４5すなわち１，０２４であろう。これは、実際に２０ヌクレオチドまたはそれ以上の配列を考える場合、極めて大きな数になる。
しかしながら、核酸標的の完全な配列を決定するために、プローブのセットは、本発明の方法によって包含されるランダム配列のヌクレオチドの可能な組合せを全て含む必要はない。本発明のこの変更は、Ｓ．Ｃ．マセヴィツ（Ｍａｃｅｖｉｃｚ）（１９８９年公開および本明細書中に具体的に包含された国際特許出願ＵＳ８９−０４７４１号明細書）によって提唱された縮重プローブの理論に基づいている。プローブを四つのサブセットに分割する。それぞれにおいて、４種類の塩基の一つを規定数の位置で用い、その一つを除く他の塩基全部を残りの位置に用いる。第一サブセットからのプローブは、二つの要素であるＡおよび非Ａ（Ａ＝アデノシン）を含む。長さｋの核酸配列のためには、４kではなく４（２k−１）のプローブが存在する。ｋ＝８である場合、プローブのセットは６５，３５６の完全なセットではなく１０２０のみの異なるメンバーから成ると考えられる。時間および費用がかなり節約されると考えられる。更に、ランダムヌクレオチド配列がギャップ付きセグメントを含んでいる、または任意のヌクレオチドと対を作るか若しくは隣接する塩基対合を少なくとも妨害しないランダム配列に沿って位置しているプローブを用いることも本発明の方法である。
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡの組合せの相補的な塩基間のハイブリッド形成は、温度、塩濃度、静電強度および緩衝組成物の変化などの広範囲の条件下で起こる。これらの条件およびそれらを適用する方法の例は、本明細書中に参考として具体的に包含されているＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｂ．Ｄ．ヘイムズ（Ｈａｍｅｓ）およびＳ．Ｊ．ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）監修、ＩＲＬプレス、１９８５年）に記載されている。ハイブリッド形成は、ハイブリッド形成される配列の性状およびその長さに応じて、約０℃〜約７０℃で約５分間〜何時間かの時間行なわれることが好ましい。例えば、２種類の２０マーの混合物のための典型的なハイブリッド形成条件は、混合物を２マイクロリットル中において６８℃にし且つ室温（２２℃）まで５分間または２℃のよな極めて低い温度で冷却させることである。更に、核酸間のハイブリッド形成は、塩類溶液、トリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）、トリス−ＨＣｌおよび他の水溶液などの緩衝液、ある種の試薬並びに化学物質を用いて促進されることが好ましい。これらの試薬の好ましい例としては、一本鎖結合タンパク質、例えば、Ｒｅｃ  Ａタンパク質、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）一本鎖結合タンパク質および主または小核酸溝結合タンパク質がある。他の試薬および化学物質の好ましい例としては、二価イオン、多価イオン並びに挿入物質、例えば、臭化エチジウム、アクチノマイシンＤ、ソラレンおよびアンゲリシンがある。
各プローブのランダム部分のヌクレオチド配列は、当該技術分野において周知の方法によって決定しうる。核酸プローブの配列を決定するための二つの方法は、両方とも本明細書中に参考として具体的に包含されているマキサムおよびギルバート（１９７７年）によって開示されたような化学的開裂、並びにサンガーら（１９７７年）によって開示されたようなｄｄＮＴＰを用いる鎖伸長による。或いは、プローブのヌクレオチド配列を決定するためのもう一つの方法は、プローブセットの各メンバーを個々に合成することである。完全なセットは、セットのランダム部分またはそれより若干小さい部分中にあらゆる可能な配列を含むと考えられる。次に、本発明の方法を、セットの各メンバーを用いて実施しうる。もうひとつの手順は、固体支持体上で１セットまたはそれ以上の核酸プローブを同時に合成することであろう。固体支持体の好ましい例としては、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ゲルおよび膜がある。更に好ましい実施態様は、両方とも本明細書中に参考として具体的に包含されているペヴズナーら（Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．＆  Ｄｙｎ．９：３９９〜４１０，１９９１年）並びにマスコス（Ｍａｓｋｏｓ）およびサザン（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：１６７９〜８４，１９９２年）によって記載されたようなハイブリッド形成用チップなどの多数のプローブ結合部位を有するゲルなどの二次元または三次元マトリックスを含む。核酸は、結合剤を用いる結合などによる共有結合によって、または静電相互作用若しくは抗体−抗原結合のような非共有結合によって固体支持体に対して結合される。典型的な結合剤としては、ビオチン／ストレプトアビジン、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ／ＩｇＧ抗体Ｆcフラグメントおよびストレプトアビジン／プロテインＡキメラがある（Ｔ．サノ（Ｓａｎｏ）およびＣ．Ｒ．カンター（Ｃａｎｔｏｒ）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７８〜８１，１９９１年）。
ハイブリッド形成用チップは、標的核酸と引続きハイブリッド形成する極めて大型のプローブを構築するのに用いることができる。チップのハイブリッド形成パターンの分析は、標的ヌクレオチド配列の即時フィンガープリント識別を提供する。パターンは手動によるかまたは計算機分析しうるが、ハイブリッド形成による位置配列決定それ自体が計算機分析およびオートメーションに適合することは明らかである。アルゴリズムおよびソフトウェアは、本明細書中に記載の方法に適用しうる配列再構築のために開発されてきた（両方とも本明細書中に参考として具体的に包含されているＲ．ドルマナクら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．＆  Ｄｙｎ．５：１０８５〜１１０２，１９９１年；Ｐ．Ａ．ペヴズナー、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．＆  Ｄｙｎ．７：６３〜７３，１９８９年）。
好ましくは、標的核酸を検出可能な標識で標識する。標識は、核酸の長さの範囲内の５′末端部位、３′末端部位または内部部位に包含されることができる。好ましい検出可能な標識としては、放射性同位体、安定な同位体、酵素、蛍光化学物質、発光化学物質、染色化学物質、金属、電荷または立体構造がある。当業者が検出可能標識を核酸中に包含させることができる多数の方法が存在する。例えば、分子生物学において用いられる酵素は、放射性同位体で標識された基質を核酸中に包含する。これらとしては、ポリメラーゼ、キナーゼおよびトランスフェラーゼがある。標識用同位体は、好ましくは、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃまたは125Ｉである。
標識は、シンチレーション流体すなわちホスホルイメージャー（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ）、染色若しくは蛍光標識または質量分析法を用いて直接的にまたは間接的に検出しうる。他の更に進歩した検出法としては、例えば、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって販売されたＢＩＡＣＯＲＥセンサーまたは他の適当なバイオセンサーによる金などの薄い金属薄膜標識の表面プラスモン共鳴の消失性波検出がある。或いは、プローブを標識することができ、標識プローブとの相互作用から標的核酸を検出し、識別し、そしておそらくは配列決定することができる。例えば、標識されたプローブまたはプローブアレーを固体支持体に対して固定することができる。核酸を含む生物学的試料とのハイブリッド形成後に観察された結合の分析から、標的核酸を識別する。
本発明のもう一つの実施態様は、核酸の配列を決定する方法であって、核酸の末端部位を第一検出可能標識で標識し、核酸の内部部位を第二検出可能標識で標識し、核酸部分のヌクレオチド配列を識別し、核酸に対するヌクレオチド配列部分の関係を第一検出可能標識および第二検出可能標識の比較によって決定し、そして核酸のヌクレオチド配列を決定する工程を含む方法に関する。末端および内部両方に標識された標的核酸のフラグメントは、それぞれのフラグメント中の各標識の相対量に基づいて区別することができる。第一検出可能標識で末端に標識された標的核酸のフラグメントは、標識された末端を含むフラグメントと同量の標識を有する。しかしながら、これらのフラグメントは、それらの寸法または末端への距離に直接的に比例する可変量の内部標識を有する。それぞれのフラグメント中の第一標識相対量対第二標識相対量を比較することにより、当業者は、全核酸中のフラグメントの位置またはそのフラグメントのヌクレオチド配列の位置を決定することができる。
本発明のもう一つの実施態様は、ハイブリッド形成によってヌクレオチド配列を決定する方法であって、それぞれのプローブが二本鎖部分、一本鎖部分、および決定しうる一本鎖部分中のランダム配列を有する核酸プローブのセットを生成し、少なくとも一部分は一本鎖である核酸標的を該セットに対してハイブリッド形成させ、ハイブリッド形成された標的をプローブに連結し、そして任意のプローブの一本鎖部分に対してハイブリッド形成している標的の核酸配列を決定する工程を含む方法に関する。この実施態様は、ハイブリッド形成された標的をプローブに対して連結する工程を加える。相補的プローブに対する標的核酸の連結反応は、ハイブリッド形成の忠実性を増大させ且つ誤ってハイブリッド形成された標的が正しくハイブリッド形成された標的から容易に洗浄されることを可能にする（図１１）。更に重要なことは、連結反応工程の追加は、ハイブリッド形成が１種類のセットのハイブリッド形成条件下で行なわれることを可能にする。例えば、ハイブリッド形成温度は、好ましくは約２２〜３７℃であり、有用な塩濃度は、好ましくは約０．０５〜０．５Ｍであり、そしてハイブリッド形成時間は約１〜１４時間である。これは、連結反応工程を用いない現行の手順の方法論を用いると不可能であり、極めて実質的な改良を示している。連結反応は、真核性由来または原核性由来リガーゼを用いて達成することができる。好ましいのは、Ｔ４  ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼである。これらのおよび他の核酸修飾酵素の使用法は、本明細書中に参考として具体的に包含されているＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら監修、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、１９８９年）に記載されている。
連結反応工程の包含には多数の独特の利点がある。何よりもまず第一に、ハイブリッド形成のために同一のハイブリッド形成条件を用いることができることである。塩基組成に基づくハイブリッド形成条件の変更は、高Ａ／ＴまたはＧ／Ｃ含量の核酸が同様の効率で連結するので、もはや適当ではない。したがって、識別は、対合と誤対合の間で極めて著しく、Ｇ／Ｃ含量の効果が高濃度の第四または第三アミン（例えば、ドルマナクら、１９９３年の場合の３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム）中で幾分中和されたにすぎないサザン（１９８９年）などの他の方法論を用いて達成されたよりもはるかに高い。
本発明のもう一つの実施態様は、ハイブリッド形成によってヌクレオチド配列を決定する方法であって、それぞれのプローブが二本鎖部分、一本鎖部分、および決定しうる一本鎖部分中のランダム配列を有する核酸プローブのセットを生成し、少なくとも一部分は一本鎖である核酸標的を該核酸プローブセットに対してハイブリッド形成させ、ハイブリッド形成された標的を鋳型として用いてプローブ鎖を酵素によって伸長し、そして標的核酸の一本鎖部分のヌクレオチド配列を決定する工程を含む方法に関する。本発明のこの実施態様は、本明細書中に大まかに記載されたように前の実施態様と同様であり、そこに記載された態様および利点を全て包含する。別の実施態様は、更に、ハイブリッド形成された標的をプローブに対して連結させる工程を含む。連結反応は、ハイブリッド形成の忠実性を増大させ、しかも誤ってハイブリッド形成された非連結標的を除去することができるより緊縮である洗浄工程を可能にし、そして更に、１種類のセットのハイブリッド形成条件を用いることを更に可能にすする。サザン（１９８９年）、ドルマナクら（１９９３年）およびクラプコら（１９８９年および１９９１年）を含む大部分の非連結技術は、それぞれの相互作用のＧ／Ｃ含量によって変化する最適条件下でハイブリッド形成が行なわれる場合にそのように正確であるにすぎないし且つ最低限であるにすぎない。好ましい条件は、約２２〜３７℃のハイブリッド形成温度、約０．０５〜０．５Ｍの塩濃度および約１〜１４時間のハイブリッド形成時間を含む。
ハイブリッド形成は、標的核酸の５′突出部分かまたは３′突出部分を生じる。５′突出部分が存在する場合、３−ヒドロキシルは、ヌクレオチド付加を開始することができるプローブの一方の鎖で利用可能である。このプロセスに好ましい酵素としては、真核性若しくは原核性ポリメラーゼ、例えば、Ｔ３若しくはＴ７ポリメラーゼ、クレノウフラグメントまたはＴａｑポリメラーゼがある。これらの酵素はそれぞれ、それらの使用法と同様、当業者に容易に利用可能である（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）。
ハイブリッド形成されたプローブは、更に、予め決定された長さに酵素によって伸長することができる。例えば、１種類のｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰを基質として用いる反応条件を達成することができる。包含されるべき第一ヌクレオチドが標的配列に対して相補的であるハイブリッド形成プローブのみが伸長され、したがってより一層のハイブリッド形成忠実性および標的のヌクレオチド配列に関する更に別の情報が得られる。標的配列データを更に提供するであろうサンガー（１９７７年）またはマキサムおよびギルバート（１９７７年）の配列決定を実施することができる。或いは、プローブに対する標的のハイブリッド形成は、標的核酸の３′伸長を生じることができる。ハイブリッド形成プローブは、ヌクレオシド二リン酸基質または５′末端に連結している短い配列を用いて伸長することができる。
本発明のもう一つの実施態様は、ハイブリッド形成によって標的のヌクレオチド配列を決定する方法であって、それぞれのプローブが二本鎖部分、一本鎖部分、および決定しうる一本鎖部分中のランダムヌクレオチド配列を有する核酸プローブのセットを生成し、多数の核酸標的を開裂して、少なくとも一部分は一本鎖である種々の長さのフラグメントを生成し、フラグメントの一本鎖部分をプローブの一本鎖部分とハイブリッド形成させ、フラグメントのハイブリッド形成された部分のヌクレオチド配列を識別し、そして識別されたヌクレオチド配列を比較して標的のヌクレオチド配列を決定する工程を含む方法に関する。別の実施態様は、ハイブリッド形成されたフラグメントをプローブに対して連結した後に、フラグメントのハイブリッド形成部分のヌクレオチド配列を識別する追加の工程を含む。本明細書中に記載のように、連結反応工程の追加は、ハイブリッド形成が１種類のセットのハイブリッド形成条件下で行なわれることを可能にする。
これらの実施態様において、標的核酸を部分的に開裂して、種々の長さの多数の核酸フラグメントである嵌め合されたセットを生成し、次にこれをプローブに対してハイブリッド形成させる。開裂は、酵素的、化学的または物理的手段によって生じるのが好ましい。部分開裂に好ましい酵素は、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ＤＮアーゼＩ、Ｂａｌ  ３１、マングビーンヌクレアーゼ、Ｐ１ヌクレアーゼ、λエキソヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼおよびＲＮアーゼＩである。化学的開裂に好ましい手段は、紫外線誘導開裂、臭化エチジウム誘導開裂および酸または塩基に誘導される開裂である。機械的開裂に好ましい手段は、かき回すなどの直接的撹拌による剪断または多重サイクルの凍結融解である。酵素的、化学的または物理的開裂の手順は、例えば、本明細書中に参考として具体的に包含されているＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｔ．マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら監修、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、１９８９年）に開示されている。
フラグメントの標的核酸は、ハイブリッド形成されたフラグメントのヌクレオチド配列が標的核酸の完全な配列を含むように十分に広範な末端配列の分布を有する。好ましい方法は、核酸プローブのセットを固定支持体に固定することである。好ましい固定支持体は、プラスチック、セラミック、金属若しくは磁気物質、樹脂、フィルム若しくは他のポリマー、ゲルまたは膜であり、固体支持体が、Ｋ．Ｒ．クラプコら（Ｊ．ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｐｐｉｇ  １：３５７〜８８，１９９１年）によって記載されたようなハイブリッド形成用チップなどの多数のプローブ結合部位を有するゲルなどの二次元または三次元マトリックスであることが一層好ましい。更に、標的核酸が、放射性同位体、安定な同位体、酵素、蛍光化学物質、発光化学物質、染色化学物質、金属、電荷または立体構造などの検出可能な標識を有することが好ましい。
この手順の延長として、更に、本明細書中に記載の方法を用いて未知の標的配列とハイブリッド形成する１種類またはそれ以上のプローブのヌクレオチド配列を決定することは可能である。例えば、フラグメントの標的を末端にまたは内部に標識し、核酸プローブセットとハイブリッド形成させ、そしてプローブのハイブリッド形成された配列を決定することができる。この態様は、完全な標的の配列を決定するのが厄介であり且つその配列のより小さい部分だけが目的である場合に有用でありうる。
本発明のもう一つの実施態様は、標的核酸が末端部位に第一検出可能標識および内部部位に第二検出可能標識を有する方法に関する。標識は、それぞれを好ましくは同一の検出法によって識別することができる限りにおいて、同一種類の標識であってよいしまたは異なる種類であってよい。第一および第二検出可能標識は、質量分析法によって検出可能な染色または蛍光化学物質または分子であることが好ましい。質量分析法による分析と連結された二重標識法の使用は、ハイブリッド形成により配列決定に組み入れられる極めて迅速且つ正確な配列決定方法論を提供し、それ自体極めて十分にオートメーションおよび計算機制御に適合する。
本発明のもう一つの実施態様は、核酸プローブを生成する方法であって、多数の一本鎖第一核酸と、ランダム末端ヌクレオチド配列を含む第一核酸に相補的なより長い一本鎖第二核酸のアレーとを合成し、第一核酸を第二核酸に対してハイブリッド形成させて、二本鎖部分および一本鎖部分を有し、その一本鎖部分中にランダムヌクレオチド配列を含むハイブリッドを生成し、一本鎖核酸標的を該ハイブリッドに対してハイブリッド形成させ、ハイブリッド形成された標的をハイブリッドの第一核酸に対して連結し、第二核酸を単離し、そして工程の第一核酸と単離された第二核酸とをハイブリッド形成して核酸プローブを生成する工程を含む方法に関する。この方式で生成されたプローブを本明細書中において特注プローブと称する。
好ましい特注プローブは、長さ約１５〜２５ヌクレオチドの第一核酸および長さ約２０〜３０ヌクレオチドの第二核酸を含む。更に、二本鎖部分は、利用の柔軟性を増加させ且つクローン化を容易にする酵素認識部位を含むことが好ましく、ある点で、１種類またはそれ以上のプローブをクローン化することが望ましくなるべきである。それは、特注プローブを、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、フィルム若しくは他のポリマー、ゲルまたは膜、或いはおそらくはチップまたはマイクロチップなどの二または三次元アレーなどの固体支持体に固定した場合に更に好ましい。
本発明の方法によって生成された特注プローブは広範囲に用いられる。これらのプローブは、まず第一に、突出部分と相同である配列のみを識別し且つそれに結合するのに構造的に有用である。第二に、これらのプローブの突出部分は目的のヌクレオチド配列を有する。目的の配列を別の構造に運ぶための追加の操作は必要とされない。したがって、特注プローブそれ自体が、生物学的試料の遺伝学的スクリーニングのための診断用補助物などでの使用に大いに適合する。
本発明のもう一つの実施態様は、それぞれのプローブが、長さＤの二本鎖部分、長さＳの末端一本鎖部分、および長さＲの一本鎖部分中のランダムヌクレオチド配列を含む核酸プローブアレーに関する。好ましくは、Ｄは約３〜２０ヌクレオチドであり且つＳは約３〜２０ヌクレオチドであり、そして完全なアレーは、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ポリマーおよび他のフィルム、ゲル、膜並びに二次元および三次元マトリックス、例えば、ハイブリッド形成用チップまたはマイクロチップから成りうる固体支持体に固定される。プローブアレーは、アレーの全プローブの固体支持体上の配列および／または位置が知られているまたは知られていない場合の配列決定および診断用途に有用である。どちらの場合にも、標的核酸についての情報を得ることができ、そして本明細書中に記載の方法において記載されたように、標的核酸を検出し、識別し、そして配列決定することができる。アレーは、長さＲのランダム配列の全メンバーを示す４Rの異なるプローブを含むが、４R未満のアレーも本発明に包含される。
本発明のもう一つの実施態様は、プローブアレーを生成する方法であって、それぞれが３′末端に長さＣの不変配列および５′末端に長さＲのランダム配列を含む核酸の第一セットを合成し、それぞれが第一核酸のそれぞれの不変配列に相補的な配列を含む核酸の第二セットを合成し、そして第一セットと第二セットとをハイブリッド形成して該アレーを生成する工程を含む方法に関する。好ましくは、第一セットの核酸はそれぞれ長さが約１５〜３０ヌクレオチドであり、第二セットの核酸はそれぞれ長さが約１０〜２５ヌクレオチドである。更に好ましいのは、Ｃが約７〜２０ヌクレオチドであり且つＲが約３〜１０ヌクレオチドであることである。
アレーは、約４Rの異なるプローブを含んでいてよいが、ある種の用途においては、可能な配列全部の完全なアレーは必要がなく、不完全なアレーを用いることができる。例えば、不完全なアレーは、非特異的ハイブリッド形成が問題であるとは考えられないごく希な標的核酸のスクリーニング法に用いることができる。更に、より小さい核酸を検出するまたは配列決定する場合に、ある種のヌクレオチドの組合わせを必要とする可能性が実際には存在しないほど低い場合、アレーの全メンバーを必要としなくてもよい。固体支持体に固定されているアレーは最も有用であると考えられるが、溶液中のアレーにも多数の用途がある。有用である固体支持体としては、プラスチック、例えば、微量滴定プレート、ビーズおよびマイクロビーズ；セラミック；レジリエンスが望まれる場合の金属または単離の容易さのための磁気ビーズ；樹脂；ゲル；ポリマーおよび他のフィルム；膜；またはチップ、例えば、配列決定技術で用いられる二および三次元配列決定用チップがある。
或いは、一本鎖であるプローブアレーを製造することもできる。これらのアレーは、好ましくは固体支持体上で、基本的には記載のように、それぞれ３′末端に長さＣの不変配列および５′末端に長さＲのランダム配列を含む核酸のアレーを合成し、そして該アレーを第一固体支持体に固定することによって生成される。この方式で生成されたアレーは、複製されたアレーの不変配列に相補的な配列を用いる核酸セットの合成およびハイブリッド形成によって速やかに且つ容易に二本鎖列に転換されて二本鎖の複製アレーを生成することができる。しかしながら、それらの存在状態において、一本鎖アレーはアレーの複製のための鋳型として極めて有効である。
最も有用なアレイを含む非常に多数のプローブにより、単なるアレイ作成に多大な時間を費やす。核酸合成はアレイの各メンバーを作成するために多くの時間を必要とし、そして組織化した方式でアレイを、上記のもののような任意の固体支持体上に乗せる操作に多くの時間を必要とする。マスターアレイを一旦作成すると、核酸ポリメラーゼの迅速且つ正確という利点を有する本発明の方法により、複製されたアレイまたはスレーブが迅速且つ容易に作成され得る。本質的に固体支持体上に一本鎖プローブのアレイを複製する方法は、それぞれが３’末端に長さＣの不変配列および５’末端に長さＲのランダム配列を含む核酸のアレイを合成し、該アレーを第一固体支持体に対して固定し、それぞれが不変配列に対して相補的な配列を含む核酸のセットを合成し、該セットの核酸を該アレーとハイブリッド形成させ、該アレーのランダム配列を鋳型として用いて該セットの核酸を酵素によって伸張し、伸張された核酸の該セットを変性させ、そして該セットの変性された核酸を第二固体支持体に対して固定して一本鎖プローブの複製されたアレーを生成する工程を含む。
該アレイの変性は、アレイを例えば９０°−１００℃で２−１５分間加熱するか、水酸化ナトリウムの添加のような高アルカリ条件下に晒すことにより行う。変性は、アレイの変性を促進する有機溶媒、核酸結合タンパク質または酵素を添加することによっても行い得る。好ましくは、固体支持体はストレプトアビジンのような基質およびビオチンと共役した核酸試薬で被覆する。部分二重らせんの変性により、核酸を固体支持体に結合させる。
本発明のもう一つの実施態様は、プローブのアレーを生成する方法であって、それぞれが３′末端に不変配列、５′末端に別の不変配列、および（片側または両側の）制限酵素の１個または複数の開裂部位に隣接された長さＲのランダム内部配列を含む一本鎖核酸のアレーを合成し、それぞれが３′末端の不変配列の一部分に対して相補的なプライマーのアレーを合成し、二つのアレーを互いにハイブリッド形成させてハイブリッドを生成し、核酸の配列を鋳型として用いる重合によって各プライマーの配列を伸長し、そして伸長されたハイブリッドを制限酵素によって開裂して、一方の末端に二本鎖部分、反対側の末端にランダム配列を含む一本鎖部分を有するプローブのアレーを生成する工程を含む方法に関する。好ましくは、核酸は、それぞれ長さ約１０〜５０ヌクレオチドであり、Ｒは長さ約３〜５ヌクレオチドである。開裂後に３′−または５′突出部分を生じる制限酵素はいずれも、アレーを製造するための使用に適している。この点で有用であるいくつかの制限酵素およびそれらの認識配列を表１に示す。
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更に好ましいのは、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ポリマー、ゲル、フィルム、膜またはチップなどの固体支持体にアレーを固定することである。固定は、合成用の試薬を特異的結合タンパク質または他の同様の物質と結合させ且つ支持体表面を結合対応物（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン、Ｆc／プロテインＡ、核酸／核酸結合タンパク質）で被覆することによって達成することができる。
或いは、プローブのアレーを生成するもう一つの同様の方法であって、それぞれが３′末端に不変配列、５′末端に別の不変配列、および（片側または両側の）制限酵素の１個または複数の開裂部位に隣接された長さＲのランダム内部配列を含む一本鎖核酸のアレーを合成し、３′末端の不変配列に対して相補的な配列を含むプライマーのアレーを合成し、二つのアレーを互いにハイブリッド形成させてハイブリッドを生成し、核酸を鋳型として用いてプライマーを酵素によって伸長して完全長さのハイブリッドを生成し、完全長さのハイブリッドをプラスミドまたはファージなどのベクター中にクローン化し、プラスミドをコンピテント細菌またはファージ中にクローン化し、クローン化プラスミドＤＮＡを再度単離し、クローン化配列を多重ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し、そして増幅された配列を制限酵素によって開裂して、一方の末端に二本鎖部分および反対側の末端にランダム配列を含む一本鎖部分を有するプローブのアレーを生成する工程を含む方法。この方法を用いると、プローブのアレーは、制限酵素の開裂特異性に応じて５′−または３′突出部分を有することができる（例えば、表１）。プローブのアレーは、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ポリマー、フィルム、ゲル、膜およびチップなどの固体支持体に固定することができる。好ましくは、ＰＣＲ増幅中に、試薬プライマーを、ストレプトアビジン被覆表面に対する最終的な結合を促進するビオチンと共役させる。
本発明のもう一つの実施態様は、生物学的試料の特異的核酸配列についてスクリーニングするための診断用補助物において、本明細書中に記載の特注プローブ、アレーおよび複製アレーを用いる方法に関する。診断用補助物および診断用補助物の使用法は、ＤＮＡなどの特定の遺伝子座の配列情報が望まれる場合に極めて有用であろう。単一ヌクレオチド突然変異またはより複雑な核酸フィンガープリントは、速やかに、効率よく、そして容易に識別し且つ分析することができる。このようなアプローチは、疾病を引き起こすような遺伝した突然変異についての個体および家系遺伝変異、ＤＮＡ依存正常表現型変異、ＤＮＡ依存体細胞変異並びに異種核酸配列の存在の検出に直ちに有用であろう。
特に有用なのは、プローアレーを含む診断用補助物である。これらのアレーは、生物学的試料からの核酸の検出、識別および配列決定を例外的に速やかにすることができ、１回の検査を実施後に単一試料から多数の情報を得ることを可能にする。生物学的試料中の核酸を検出するおよび／または識別する方法は、本明細書中に記載の固体支持体に固定されたプローブのアレーを生成し、生物学的試料の核酸を検出可能な標識で標識し、標識された核酸をアレーに対してハイブリッド形成させ、そして核酸の配列を、アレー上の標識の結合パターンから検出する工程を含む。プローブアレーを生成するためのおよび診断用補助物などのためのこのようなアレーを速やかに且つ効率よく複製するためのこれらの方法は、多数のアレーの製造および商業的用途を可能にする。
記載のように、これらの診断用補助物は、ウイルス、細菌、真菌または酵母による感染の検出用におよびある種の寄生生物の検出用に、ヒト、他の動物、そして植物にとっても有用である。これらの検出法および補助物は、更に、飼料および食品工業において並びに環境分野において、環境源から並びに製品および副製品から得られた試料に関係した核酸の検出、識別および配列決定に有用である。
診断用補助物は、生物学的試料を加えられる固体支持体に対して固定された特異的核酸プローブを含む。標的核酸のハイブリッド形成は、ハイブリッド形成された標的のみを特異的に認識する標識抗体などの検出可能な標識を加えることによって確認されるか、或いは、ハイブリッド形成されなかった標的を洗浄除去し且つ標識された標的に特異的な抗体を加える。どちらの場合にも、固体支持体上の標識の出現は、プローブに対してハイブリッド形成された核酸標的の存在、したがって生物学的試料中の存在を示す。
特注プローブは、更に、それがハイブリッド形成する核酸標的に対して薬剤、抗原または他の物質を向けることによって予防または治療において有用であることを証明しうる。集中させるための物質は、可能なハイブリッド形成の妨げとならないようにプローブに対して結合することができる。例えば、プローブをウイルス核酸標的に集中させた場合、有効な抗ウイルス性物質はプローブに結合することができ、次に、それが感染細胞に対して抗ウイルス性物質を特異的に運ぶことができる。これは、その処理が正常細胞にとって有害であり且つ抗力のために正確な集中が必要とされる場合に特に有用であると考えられる。
本発明のもう一つの実施態様は、核酸プローブを生成する方法であって、多数の一本鎖第一核酸と、ランダム末端ヌクレオチド配列を含む第一核酸に相補的なより長い一本鎖第二核酸のアレーとを合成し、第一核酸を第二核酸に対してハイブリッド形成させて、二本鎖部分および一本鎖部分を有し、その一本鎖部分中にランダムヌクレオチド配列を含むハイブリッドを生成し、一本鎖核酸標的を該ハイブリッドに対してハイブリッド形成させ、ハイブリッド形成された標的をハイブリッドの第一核酸に対して連結し、連結されたハイブリッドと、ランダムヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドのアレーとをハイブリッド形成させ、ハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドを、連結されたハイブリッドの第二核酸に対して連結し、第二核酸を単離し、そして別の第一核酸と、単離された第二核酸とをハイブリッド形成させて核酸プローブを生成する工程を含む方法に関する。好ましいのは、第一核酸が長さ約１５〜２５ヌクレオチドであること、第二核酸が長さ約２０〜３０ヌクレオチドであること、不変部分が酵素認識部位を含むこと、そしてオリゴヌクレオチドがそれぞれ長さ約４〜２０ヌクレオチドであることである。プローブは、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ゲルまたは膜などの固体支持体に対して固定することができる。固体支持体は、ハイブリッド形成用チップなどの多数のプローブ結合部位を有する二次元または三次元マトリックスであるのが好ましい。本発明の方法で生成された核酸プローブは、生物学的試料をその核酸配列の遺伝学的変異についてスクリーニングするための診断用補助物において有用である。
本発明のもう一つの実施態様は、核酸プローブを生成する方法であって、（ａ）多数の一本鎖第一核酸と、ランダム末端ヌクレオチド配列を含む第一核酸に相補的なより長い一本鎖第二核酸のセットとを合成し、（ｂ）第一核酸を第二核酸に対してハイブリッド形成させて、二本鎖部分および一本鎖部分を有し、その一本鎖部分中にランダムヌクレオチド配列を含むハイブリッドを生成し、（ｃ）一本鎖核酸標的を該ハイブリッドに対してハイブリッド形成させ、（ｄ）ハイブリッド形成された標的をハイブリッドの第一核酸に対して連結し、（ｅ）標的を鋳型として用いて第二核酸を酵素によって伸長し、（ｆ）伸長された第二核酸を単離し、そして（ｇ）工程（ａ）の第一核酸と、単離された第二核酸とをハイブリッド形成させて核酸プローブを生成する工程を含む方法に関する。第一核酸は長さ約１５〜２５ヌクレオチドであること、第二核酸は長さ約２０〜３０ヌクレオチドであること、そして二本鎖部分は酵素認識部位を含むことが好ましい。プローブは、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ゲルまたは膜などの固体支持体に固定されることが更に好ましい。好ましい固体支持体は、ハイブリッド形成用チップなどの多数のプローブ結合部位を有する二次元または三次元マトリックスである。本発明のもう一つの実施態様は、本明細書中に記載のように生物学的試料をスクリーニングするための、生成された核酸プローブを含む診断用補助物および該診断用補助物の使用法である。
この手順の延長として、本明細書中に記載の方法を用いて、未知の標的配列とハイブリッド形成する１種類またはそれ以上のプローブのヌクレオチド配列を決定することも可能である。例えば、サンガーのジデオキシヌクレオチド配列決定法は、鋳型としての標的および標識された基質を用いて第二核酸を酵素によって伸長させる場合に用いることができ、伸長された生成物はポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分割することができ、そしてプローブのハイブリッド形成された配列はゲルから容易に読み取ることができる。この態様は、標的全体の配列を決定するのが厄介であり且つその配列のより小さい部分のみが目的である場合に有利でありうる。
以下の実施例は、本発明の実施態様を例証するが、本発明の範囲を制限すると見るべきではない。
実施例
実施例１
固相状態のＤＮＡの操作。ストレプトアビジン（またはアビジン）とビオチンとの複合体は、多量の固相状態ＤＮＡ配列決定または他のＤＮＡ操作が行なわれる標準的な方法、およびＤＮＡの非放射性検出が実施される標準的な方法の一つを示す。過去数年間にわたって、ストレプトアビジン−ビオチン技術はいくつかの方法で発展してきた。数年前に、ストレプトアビジンの遺伝子がクローン化され且つ配列決定された（Ｃ．Ｅ．アーガラナ（Ａｒｇａｒａｎａ）ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．１４：１８７１，１９８６年）。更に最近になって、スタディア（Ｓｔｕｄｉｅｒ）Ｔ７システムを用いて大腸菌におけるプロテインの過剰発現が達成された（Ｔ．サノおよびＣ．Ｒ．カンター、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１４２，１９９０年）。昨年、改良された溶解性および固体支持体に対するより堅固な結合のために修飾された突然変異ストレプトアビジンが更に発現された（Ｔ．サノおよびＣ．Ｒ．カンター、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７８〜８１，１９９３年）。これらの内で最も適切なのは、Ｃ末端に結合した５システイン残基を含む（外来Ｎ−およびＣ末端ペプチドが除去された十分に活性なタンパク質）コアストレプトアビジンである。ブドウ球菌性Ａタンパク質の二つのＩｇＧ結合ドメインに対するストレプトアビジンの活性タンパク質融合も生じた（Ｔ．サノおよびＣ．Ｒ．カンター、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７８〜８１，１９９１年）。これは、ビオチニル化ＤＮＡを、任意の共有化学を必要とすることなく特異的免疫グロブリンＧ分子に対して結合させ、そしてそれが、抗原を検出するための極めて敏感な方法である免疫ＰＣＲの発展をもたらした（Ｔ．サノら、Ｓｃｉ．２５８：１２０〜２９，１９９２年）。
ストレプトアビジンとメタロチオネインとのタンパク質融合は最近組織化された（Ｔ．サノら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２年）。このタンパク質融合の両パートナーは十分に活性であり、これらのストレプトアビジン−ビオチン相互作用は、磁気マイクロビーズ上の二重らせんＤＮＡの三重らせんに媒介された捕捉（Ｔ．イトー（Ｉｔｏ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４９５〜９８，１９９２年）およびアガロース中のＤＮＡの親和性捕捉電気泳動（Ｔ．イトーら、Ｇ．Ａ．Ｔ．Ａ．，１９９２年）を含むＤＮＡの精製のための新規の方法を開発するのに用いられる。
スタッキングハイブリッド形成の潜在的な利点についての実験は、計算および先行実験両方によって行なわれた。完全なおよび誤対合二重らせんについてのいくつかの計算Ｔmを図１に示す。これらは平均塩基組成に基づく。計算は、Ｊ．Ｇ．ウェトマー（Ｗｅｔｍｅｒ）（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：２２７〜５９，１９９１年）によって与えられた方程式を用いて行なった。オリゴヌクレオチドスタッキングの場合、これらの研究者は、第二オリゴマーを検査する条件下において第一二重らせんが十分に生成されると仮定したが、実際には、これは必ずしもその場合でなくてよい。しかしながら、それは図１に示された配置の場合である。計算は、スタッキングハイブリッド形成についての多数の興味深い特徴を示す。予め生成された二重らせんの隣の第二オリゴマーの結合は、第２塩基対と同等の特別な安定性を与えるということに注目されたい。更に興味深いことは、誤対合が、通常のハイブリッド形成での場合よりもスタッキングハイブリッド形成において重大な結果を与えるらしいということである。これは、ある種の誤対合についてＫ．Ｒ．クラプコら（Ｊ．ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｐｐｉｎｇ  １：３７５〜８８，１９９１年）によって観察された極めて大きな効果と一致する。他の種類の誤対合はあまり脱安定化されていないが、これらは連結反応工程を必要とすることによって排除することができる。標準的なＳＢＨにおいて、末端誤対合は最小の脱安定化の例であり、したがって、最大のアンビギュイティーおよびバックグラウンド源をもたらす。オクタヌクレオチド複合体の場合、平均的末端誤対合はＴmを６℃低下させる。スタッキングハイブリッド形成の場合、既存の二重らせんから離れた側の末端誤対合は、最小の脱安定化の例である。五量体の場合、これは１０℃のＴm降下をももたらす。これらの考察は、完全な二重らせんに有利なスタッキングハイブリッド形成の識別力が通常のＳＢＨよりも大であるらしいことを示している。
実施例２
位置ハイブリッド形成による末端配列決定。ハイブリッド形成スキームによる基本的配列決定を図２に示す。それは、３′末端付き一本鎖突出部分を有する二重らせんオリゴヌクレオチドアレーを用いるので、他のいずれとも異なる。示された各ＤＮＡの二重らせん部分は不変である。突出部分のみが変化し、理論上、長さｎの可能な突出部分全部を示すのに４nのプローブのアレーを必要とする。このようなアレーの利点は、予め生成されたＤＮＡ二重らせんと新たに生成された二重らせんとの塩基スタッキングのために、標的ＤＮＡの５′末端ヌクレオチドを検出する場合にそれが配列緊縮を増大させることである。
一つの変数は一本鎖突出部分の長さである。突出部分が短いほど、潜在的に使用可能なプローブアレーは短い。５個および６個の突出部分が首尾よく用いられた。オリゴヌクレオチドを結合している支持体表面の性状、その結合手段およびオリゴヌクレオチド二重らせんの長さもまた重要な変数である。最初に、プローブ二重らせんの５′末端がビオチニル化された一方の鎖を固体表面に結合する。その技法は、固体支持体、例えば、ストレプトアビジン被覆磁気マイクロビーズおよび薄層ゲルシステムのような膜に対する核酸の結合のために既に十分に開発されている。
もう一つの変数は、プローブの固定されたスポットの核酸容量である。これは、必要な検出感度を決定し、そして更に、所望の標識ＤＮＡ生成物と競合してハイブリッド形成しうる非標識ＤＮＡが存在しうる場合に重要である。図２Ａで示したように、アレーの３′突出部分は、標的ＤＮＡの３′末端配列を検出することができる。これらは、ベクターから切断された既知のＤＮＡ配列の５′末端に標識された制限フラグメントに由来するので、固定されたプローブの標的は３′末端か、その丁度内部かまたは完全に内部である。いくつかの引続きの実施例において、ハイブリッド形成が３′末端に絶対的に特異的であるかどうかは問題ではない。
或いは、５′末端一本鎖突出部分のハイブリッド形成による位置配列決定は、同様に有効であると考えられる（図２Ｂ）。これは、標的ＤＮＡの５′末端配列の読取りを可能にする。しかしながら、このアプローチは、それが、読取られた配列の長さおよび正確さを増大させるためのポリメラーゼの使用を許さないので、万能ではない。
実施例３
モデルアレーの製造。図２に示したスキーム後に、１回の合成で、不変１８塩基ストークに続いて可変５塩基伸長を有する全部で１０２４の可能な一本鎖プローブを生成することができる。１８塩基伸長は、二つの制限酵素切断部位を含むように設計される。ＨｇＩは、可変塩基Ｎ5から成る５′突出部分である５塩基を生じる。ＮｏｔＩは、オリゴヌクレオチドの不変末端にある５′突出部分である４塩基を生じる。合成２３マー混合物を相補的１８マーとハイブリッド形成させて二重らせんを生成した後、それを酵素によって伸長して全部で１０２４の２３マー二重らせんを生成することができる。これらは、例えば、平滑末端連結によって、ＮｏｔＩ部位を欠いたプラスミド中にクローン化することができる。クローン化された２３塩基インサートを含むコロニーを選択することができる。それぞれが１種類の独特の配列のクローンであるべきである。ＤＮＡミニプレプをストークの不変末端で切断し、ビオチニル化ピリミジンをフィルインした後、ストークの可変末端で切断して５塩基５′突出部分を生じることができる。得られた核酸をキアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）カラム（核酸精製用カラム）で分別して高分子量物質を捨てることができ、そして次に、核酸プローブをストレプトアビジン被覆表面に対して結合させる。この方法は、ベックマン・バイオメク（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｃ）または同等の化学ロボットで容易にオートメーション化されて多数の同一のプローブアレーを生じうる。
最初のアレーは約１０００のプローブを含む。アレー中の任意の位置での具体的な配列は知られていない。しかしながら、アレーは、異なるハイブリッド形成条件下の異なる標的分子についてのシグナル対ノイズ比および配列識別を統計学的に評価するのに用いることができる。既知の核酸配列とのハイブリッド形成は、アレーの具体的な要素の識別を可能にする。一連の十分なハイブリッド形成は、何等かの次の配列決定作業のためのアレーを整えると考えられる。アレーは、それらが望ましい性質を有するまで、部分的に特徴付けられる。例えば、オリゴヌクレオチド二重らせんの長さ、表面に対するその結合様式、および用いられるハイブリッド形成条件は全て、クローン化ＤＮＡプローブの最初のセットを用いて変更することができる。最もよく働くアレーの種類がいったん決定されたら、次に、完全なおよび十分に特性決定されたアレーを通常の化学合成によって構築することができる。
実施例４  特異的プローブアレー（ａｒｒａｙ）の調製
ＳＢＨの部分配列を決定するために主に取り組むことは、現実にプローブアレーを構築し、予想に従って実際に行う配列画分を試験する事である。塩基組成および塩基配列がハイブリダイゼーションの効率に依存することは、これらの方法を成功に導くための最大の障害となるであろう。ここで実施可能な酵素処理を用いると、結果として生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）の広範囲のＤＮＡ配列が研究の対象になるように酵素が働くために、これらの問題は単純化されるであろう。ＳＢＨ部分配列と共に、いくつかの変異を着実に補うために可能なトリックの一つは、隣接した二重らせんを変化させることである。例えば、Ａ＋Ｔ含有率の高い突出部分のために、Ｇ＋Ｃ含有率の高い重層二重らせんを用いることができ、逆も可能である。
アレーを作成するための４種類の方法を試験し、主に２つのことを目標として評価した。第一に、幾つかの主要なＳＢＨ部分配列を試験するためのアレーを迅速かつ安価に作成すること。第二に、ＳＢＨ部分配列を含むシークエンシングを行うために必要なアレー全体を自動的に調製する効果的な方法を開発することである。最初の研究で５塩基の突出部分があれば充分であることが示されたため、アレーはわずか１０２４種類で良い。これらの化合物をすべて作成するためのコストは実際に至極妥当である。自動ＤＮＡ合成法によって、プローブの定常部は一度に作成することができ、その後、平行して伸長させることができる。最も単純な場合、１０２４の化合物の各々にわずか５塩基のみの付加が必要であり、この場合、一塩基当たりの典型的な化学コストは２ドルであり、全体で約１０，０００ドルになる。
適当な密度のアレーは、典型的なｘ−ｙロボットを用いて、ストレプトアビジンでコートした表面上に個々にビオチニリル化した化合物をスポットすることによって作ることができる。この様なロボットを用いると、１００から４００ｃｍ2のわずかな表面に２ｘ１０4のサンプルのアレーを作ることが可能である。Ｔアレーは、望ましくは、１０ｃｍ2内に取り付けるべきであるが、予測できない技術的な理由により、１０倍または５０倍までも低い濃度のアレーを用いなければならなかったとしても、ＴアレーはＳＢＨ部分配列の変異の本質および変化の多くを試験するのに非常に適しているであろう。商品として入手可能なストレプトアビジンをコーティングしたビーズは、プラスチックを最初にトリエチルアミンのような有機溶媒に晒して短時間処理することによって、ポリスチレンのようなプラスチックと永久に粘着させることができる。得られたプラスチック表面は非常に高い表面積を持つために、非常に高いビオチン結合能力を持つ。
蛍光標識したサンプルに対して、そのようなビーズに飽和したサンプルから散乱するバックグラウンドが邪魔をするかもしれない。この様な場合には、ストレプトアビジンを結合させたガラスまたはプラスチック表面（Ｂｉｏｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓより商品として入手可能）を利用しても良い。表面は、商品として入手可能なアミン含有表面を用いて、さらにペプチドの結合を安定なものにするために商品として入手可能なビオチン含有Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて、作成される。得られた表面は、一つのビオチン結合サイト（または最大で二つであるが、おおよそ２２２のタンパク質の対称がこれを妨げるゆえにそれ以上ではない）にストレプトアビジンを結合し、ビオチニル化したオリゴヌクレオチドとの結合に利用できる他のサイトを残すであろう。
ある実験では、表面にオリゴヌクレオチドを付加する必要性がまったくなくなり、オリゴヌクレオチドはパイロット実験ですでに行われているようにストレプトアビジンでコートした磁気マイクロビーズに付加した。ビーズはマイクロタイタープレート（ｍａｉｃｒｏｔｉｔｒｅ  ｐｌａｔｅ）内で取り扱うことができる。最近入手可能になった圧縮プレートを含むその様なプレートに適切な磁気分離器を用いることが可能である。１８／２４穴のプレート（Ｇｅｎｅｔｉｘ，Ｌｔｄ．；ＵＳＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ）では全アレーを３プレートで扱うことができる；このフォーマットは化学ロボットを用いるとうまく扱える。より圧縮した３６／４８穴のフォーマットを用いることが望ましく、そうすると全アレーが１枚のプレートで扱える。全実験においてのこの研究方法の有利な点は、表面効果による任意の潜在的な複雑さを避けうることであり、以前から行われている液体操作、熱制御、および画像処理法は全実験に用いることができる。その結果、器械、道具、およびチップを組み立てる時間並びに労力を投資する前にＳＢＨ部分配列の多くの姿を特徴付けることができる。
最後にアレーをプリントするための迅速で効率の高い方法が開発された。レプリカまたは適切な相補的アレーを調製するためにマスターアレーが作成される。マスターアレーは特別注文のＤＮＡ配列のセットを所望のパターンでサンプリングし、こうしてできた配列をレプリカに輸送することによって、手動で（または高精度ロボットによって）作成される。マスターアレーはちょうど１０２４−４０９６の全化合物のセットである。それを多頭ピペットでプリントし、オフセットによって圧縮する。より良い可能な研究方法を第１４図に示す。マスターアレーが作成され、これを用いて、配列特異的方法でレプリカ成分を輸送する。輸送される配列をデサインすると、それらは唯一の１５塩基ＤＮＡ配列に隣接した所望の５または６塩基の５’可変突出部を含んでいた。
マスターアレーはストレプトアビジンビーズを飽和させたプラスチックでコーティングした金属ピンからなり、その各々は、そのチップに、５または６塩基の可変セグメント＋１５塩基の不変セグメントからなる固定化したビオチニル化ＤＮＡ鎖を含んでいる。この表面の占領されていない任意のサイトは過剰の遊離ビオチンで満たされている。レプリカチップを作製するために、ビオチンで５’をラベルした１５塩基の不変配列の相補鎖と共にマスターアレーをインキュベーションする。次に、ＤＮＡポリメラーゼを用いて５または６塩基の可変配列の相補鎖を合成する。その後、湿らせたピンアレーをストレプトアビジンでコーティングしたレプリカの表面に接触させ、マスターアレー複合体のＴm以上の温度に保つ。ピンアレーから有効なサンプルを輸送するために十分な液体がもたらされないならば、まず初めに、レプリカアレーを（凹状の空洞内に保つか、または多頭ピペッターで加えるかのいずれかで）間隔を開けた溶媒の小滴で被覆した。輸送後、レプリカチップを１５塩基の不変配列の相補鎖と共にインキュベーションしてアレーの二本鎖部分を再形成させる。この方法が基本的に有利である点は、実現することが出来るならば、マスターアレーと輸送化合物が一度に作成され、次いで、レプリカアレーの製造がほとんど際限なく進行する事である。
実施例５  オリゴヌクレオチドアレーへのＤＮＡ連結反応
第３図Ａおよび第３図Ｂに示した略図に従って、大腸菌およびＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて標的核酸を適切な固定化オリゴヌクレオチドプローブにハイブリッド形成させ共有結合させることができる。これは非常に正確で有効な方法である。リガーゼは必ず正確に塩基対になった３’末端を必要とするため、リガーゼは標的核酸の３’末端配列のみを読むであろう。連結反応後、得られた二重らせんは２３塩基対の長さであり、かなり緊縮である洗浄条件を用いてハイブリッド形成しなかった未連結の標的核酸を除去することができるであろう。３’突出部に隣接した５’末端リン酸が欠損したアレー（このようなプローブは標的とする核酸と連結反応しない）のように、適切に選んだ正および負の対照によって、この方法の力が実証される。
連結反応段階には多数の利点がある。物理的特異性は酵素特異性によってとって変わられる。標的核酸の３’末端に焦点を合わせることもまた、標的ＤＮＡの安定な二次構造からくる問題を最小限にする。第３図Ｂに示すような連結反応は、標的ＤＮＡの５’末端配列を検出する適合度を強めるために用いられる。
また、ＤＮＡリガーゼを用いると、標的ＤＮＡは正確に固定化オリゴヌクレオチドプローブにハイブリッドを形成し共有結合する。第３図に示すような連結反応法の可能性について幾つかの試験を行った。ビオチニル化プローブをストレプトアビジンでコーティングした磁気マイクロビーズに付着させ、より短い相補的不変配列とアニーリングし、５または６塩基の一本鎖突出部と二重らせんを形成させる。実際に用いた配列のセットを実施例１４に示している。32Ｐで末端を標識した標的をプローブとハイブリダイゼーションした。未反応標的はビーズを磁器分離器で捕獲することによって除去した。ＤＮＡリガーゼを加え、連結反応をいろいろな塩濃度で行った。サンプルを室温で洗浄し、再び固定化化合物を磁気分離器で処理した。この操作で連結反応していない物質は除去されるはずである。最後に、サンプルを二重らせんのＴm以上の温度でインキュベーションし、溶離した一本鎖は磁気分離器によって除去した後のサンプルの残査に取り残された。この時点での溶出液は結合反応物質からなるはずである。連結反応物のフラクションは、［高温洗浄で回収された32Ｐ量］／［高温及び低温の両方の洗浄での回収量］で評価した。得られた結果を第１３図に示す。連結反応が５または６塩基突出部と完全に一致して有効に進行し，Ｇ−Ｔ誤対合を起こさない塩条件を見つけうることを示している。
同様の実験をより広範囲のセットで行った結果を表２から表４に示す。表２では位置による誤対合への影響を考察し、表３では［完全な対合］／［弱く不安定な誤対合］の識別比率における塩組成の影響について調べている。これらのデータは：（１）完全な対合と単一の誤対合との識別は試験した５塩基突出部の全てで有効に行われている；（２）連結反応の量または対合／誤対合の識別効率に対して、いかなる塩基組成の影響も僅かである。本来のＳＢＨにみられるような安定性と塩基組成の影響との関係の重要な問題は部分的ＳＢＨに関しては問題ないことが明らかである；及び（３）予想されるように、最悪の誤対合は連結反応で形成されたリン酸ジエステル結合から最も遠い末端に位置する。しかしながら、この位置に残存する任意の誤対合は、ここに記載されているように、シークエナーゼバージョン２のような、３’エンドヌクレアーゼ活性またはターミナルトランスフェラーゼを持たないポリメラーゼを使えば、ポリメラーゼの伸長反応によって排除される；（４）ゲル電気泳動分析では、これらの試験で認められると推定される連結反応生成物が、現存する生成物として本当に合成されていることが確認された。
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正しい配列の識別能力は、外側の誤対合（識別が最も難しい）では内側の誤対合ほど大きくはない（表４）。連結反応部位での誤対合では、多分可能な最高の識別力が提供される。少なくとも、示された結果は非常に有望である。既に、５または６塩基のみの突出部による識別力の程度は８塩基の突出部を持つ従来のＳＢＨで見られる識別力より高い。また、リガーゼ鎖反応による対立遺伝子特異的増幅も極めてうまくいくと思われる（Ｆ．Ｂａｒａｎａｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，１８９−１９３，１９９１）。
実施例６ ＤＮＡサンプルの一連のセットとのハイブリダイゼーションによる部位的シークエンシング
前に記載したアレーは、単一な標的核酸を唯一の単一なプローブで検出するため、非常に利用効率が悪かった。これはアレーから本来得られる潜在的な情報のほとんどを明らかに浪費している。方法を変えるとアレーをより良く効率的に利用できるであろう。このことを第６図に図示している。ここでは、プローブアレーにハイブリダイゼーションする前に、５’を標識した（または未標識の）標的核酸をエキソヌクレアーゼＩＩＩのような酵素で部分分解する。分解によって、共通の５’末端を持つがいろいろな３’末端を持つ多数の分子が、ある鎖長の範囲で生成される。次いで、こうしてできた核酸のファミリー全体をプローブアレーとハイブリダイゼーションする。３’末端の分布が十分に広いと仮定すれば、ハイブリダイゼーションパターンは、任意の枝別れ部位の曖昧さという条件でも、標的全体の配列が読まれることとなる。単一なエキソヌクレアーゼ条件では幅広い十分な分解が得られなくても、サンプルを種々の異なった条件下で結合し調製できる。
部位的ＳＢＨに適した一連の欠失ＤＮＡを作り出すための方法は少なくとも３通りある。最も簡単な、但し、結局ほとんど満足できない方法は、エキソヌクレアーゼＩＩＩのようなエキソヌクレアーゼで用いることであり、本来のシークエンシングにおける一連の欠失クローニングの類推によっている（Ｓ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｇｅｎｅ，２８，３５１−３５８，１９８４）。これらの酵素の難点は、目的とするサンプル全体を代表する化合物が十分な収率で得られない事である。例えば、酵素が相対的早く動いた領域の配列パターンが現れ、一方、相対的に遅く動いた領域のパターンが現れる。従来のＤＮＡシークエンシング用ポリアクリルアミドゲル上で、直接、分解されたフラグメントの長さを見ることによって、何種類かの商品として入手可能な酵素を試験することができる。
一連のサンプルを作成する第二の方法は、普通のＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔのシークエンシング用の化学法を用いることである。この化学分解で得られる５’−リン酸化フラグメントを結合することは可能である。実際、これは結合法による染色体ＤＮＡのシークエンシングのために用いられている原理である（Ｇ．Ｐ．Ｐｆｉｅｆｅｒら、Ｓｃｉ．，２４６，８１０−８１３，１９８９）。非対象ＰＣＲ、または、線形増幅は相補的な、結合可能な、一連の鎖をつくるために用いることができる。この方法の副利益は、後に切断される塩基を前もって選択できること、そして、これがそのＤＮＡ配列について付加的な情報を提供することである。
一連のサンプルを作成するための第３の方法は、プラス／マイナス−シークエンシングに変異を用いることである。例えば、ジデオキシ−ｐｐｐＮターミネーターを用いたＳａｎｇｅｒのシークエンシングを行うことによって完全な二重鎖のＤＮＡシークエンシングラダーを作成することができる。こうすると、連結可能末端は生成されない。しかしながら、この末端は、まだ本来の鋳型上にある間に、特定の塩基が末端にない状態でのＤＮＡポリメラーゼＩが３’校正エンドヌクレアーゼ活性でｄｄｐｐｐＮを最初に除去することによって、連結可能な末端に置き換えることができる。これによって、価値ある２つの事柄が成し遂げられることは注目に値する。除去された塩基の同定を前もって行えるので、連結可能な末端を持つラダーを生成するのみならず、ＤＮＡ配列情報にさらなるヌクレオチド情報が提供される。４種類の別々の反応には単色検出法を、または結局、４種類の別々の反応の結果生じたものを混合した４色検出法をハイブリダイゼーションする前に用いることができる。この方法が成功すれば、それはラダー化とハイブリダイゼーションとを結び付けたより精巧な変異を受け入れる。これらの方法の各々は、ＳＢＨの平行プロセシングとラダーシークエンシングの力の幾らかを結び付けていることに注目されたい。
さらに、基質となる塩基の一つ、例えばＤＮＡなら４種類のｄＮＴＰの一つ、の量を制限することなしに重合するといったような、所望のサンプルを調製する二者択一的な方法もある。標準的なＳａｎｇｅｒまたはＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔのシークエンシングの方法では、３’に連結可能末端が生じないために、この方法を用いて、ＤＮＡフラグメントラダーを作ることは出来ない。これに対して、本発明の方法によるシークエンシングは、ラダーシークエンシング力の技術と利点をハイブリダイゼーションによる部位的シークエンシングの平行プロセッシング力と結び付けている。
連結反応は、標的ＤＮＡの３’末端塩基の検出の忠実さを確立する。プローブと標的ＤＮＡとの間に形成された二重らせんの５’末端で同様に検出の忠実さを確立するため、プローブ−標的二重らせんを連結反応した後、一つのヌクレオチド、例えば標識したｄｄＮＴＰ、を用いて伸長させることができる（第５図）。これは主に２つの利点を有する。第一に、ＤＮＡポリメラーゼのクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントによる伸長には正確な塩基対の３’−プライマー末端が必要とされるため、特異性が増加する。第二に、標識したｄｄＮＴＰを一度に、または異なる４色で標識した４つ全ての混合物を同時に用いて、第５図に示すように、標的核酸のさらなる一つのヌクレオチドの同定を行うことができる。この様に、わずか１０２４のプローブアレーは、４０９６のヘキサマーアレーのシークエンシングの力、換言すれば、用いた任意の長さに相応して４倍の利益、を持つ。さらに、ポリメラーゼは、ここに提案された型に非常に類似した固相シークエンシング法においても、良く働く。
実施例７
ハイブリダイゼーションによるシークエンシングでの位置情報の保持
ハイブリダイゼーションした配列と既知の関連箇所との間の間隔についての情報が得られる可能性は、標的核酸の３’末端配列の検出に固有のものである。既知の関連箇所は任意であって良いが、未処理標的の５’末端は用いられたものである。所望の間隔は、従って、ちょうどアレーの各々のプローブにハイブリダイゼーションしたＤＮＡフラグメントの長さである。原則として、この長さを決定する方法は２通りある。その一つは、ハイブリダイゼーション、連結および任意のポリメラーゼによる伸長の、前または後に（５’標識した）ＤＮＡの長さを分画することである。単一のＤＮＡ配列を用いることもできるが、任意の単一な５’末端を表す一色、および、その他にランダムな内部ラベルで、二重に標識した標的を、同時にまたは二者択一的に用いた、多数のＤＮＡ標的をプールすると効果的であろう。例えば、標的内に混入させた分画量、例えば、１％のビオチニル化（またはジゴキシゲニンで標識した）ピリミジンであり、これは後に蛍光検出のために用いる。最近、内部標識は、従来のラダー型ＤＮＡシークエンシングにとって、高感度で効果的であることが示された。内部標識と末端標識の比率は標識フラグメントの長さに比例する。任意の各々のサンプルにとって、比率は不定であるかも知れないが、関係は一定である。従って、間隔はプリンまたはピリミジンの極端な配列によって時折曲解されるが、常に、正しい順序で得られる。必要であれば、二通りの準独立的な内部標識方法を用いることも可能である。
上記に概説した、ポリメラーゼ伸長を用いた方法は、異なる６色の標識：２色は標的（５’及び内部）、そして４色はプローブの伸長（四つのｄｄＮＴＰ）：を必要とするであろう。しかしながら、伸長した３’末端が同じ情報を提供する（ＤＮＡポリメラーゼ反応は化学量論的である）ため、５’標識は不必要である。必要であれば、ｄｄＮＴＰは同時に用いることができる。それ故、この方法は、必要であれば、二色検出で進めることもでき（第７図）、三色あれば確かに十分であろう。
第７図に示した方法と相補的な方法は、３’末端標識に加えて内部標識した標的核酸の５’末端配列を読むのと同様に、位置情報を保持しているであろう。ここでは、第３図Ｂに示したような、５’突出部をもつプローブアレーを用いたが、ポリメラーゼ伸長は不可能であろう。
実施例８  枝別れ部位の曖昧さの解決
現在のＳＢＨでは、配列の繰り返しに起因する枝別れ部位もが曖昧さのため、標的ＤＮＡのサイズは、事実上、数百塩基対に制限される。６節に記載した位置情報は、この様な曖昧さの多くを解決するであろう。配列の繰り返しが起こっている場合には、完全なＤＮＡラダーをサンプルとして用いても、２あるいはそれより多い数の標的が同じプローブとハイブリダイゼーションするであろう。単一のヌクレオチドの付加は、二つの標的が同一プローブに結合している場合の３／４に有効であろう；そうすることによって、得られたプローブが二つの異なる標的を含んでいることが示され、繰り返しの外側に一つの塩基の配列が示されるであろう。二つの繰り返し配列を位置付ける最も簡単な方法は、ＤＮＡラダーの、より長い、または、より短い構成員を排除し、残った種をプローブアレーとハイブリダイゼーションすることである。この方法は、部位的ＳＢＨのルーチン的な特徴にとって、十分に有力な方法である。わずか５または６塩基の突出部でも繰り返しは大変繁雑になるであろうが、セグメント化したラダーを用いると、繁雑さの大部分は解決され率直な方法になるであろう。ラダー状になったＤＮＡ種を物理的に分画する事は必要ではない（が、必要であれば、当然分拡することは出来る）。その代わりとして、末端標識したラダーを制限ヌクレアーゼで切断することができる。有効な戦略として、７種類の４塩基特異的酵素を単独でまたは組み合わせで用いるとよい。
実施例７に記載したポリメラーゼを用いた一塩基の伸長によって、ペンタヌクレオチド配列の繰り返しにとって付加的な情報が得られる。４つの例の内の３つまでは、一つの付加した塩基は二つの繰り返し配列とは異なるであろう。それ故、繰り返しが起こっていることは明らかになるであろう。
位置情報の真の力は、繰り返し配列への適用ではなく、周囲の独特の配列への適用で発揮される。それが中程度の正確さの位置情報であったとしても、それらの順序は明確に決定され、それ故、枝別れ部位の影響は排除されるであろう。例えば、二重に標識した２００塩基対の標的の強度比率が１０％の正確さを持つと、２０塩基対の位置が正確に分かるであろう。このことは最も並外れた繰り返しを除いて、全ての繰り返しを解決するのにおそらく十分であろう。
枝別れ部位の曖昧さは配列の繰り返しに起因し、実際上、標的核酸の大きさを数百塩基対に制限する。しかしながら、実施例７から導かれる位置情報は、これらの曖昧さのほとんど全てを解決するであろう。配列が繰り返される場合、一つ以上の標的フラグメントがハイブリダイゼーションするが、別の方法で単一の固定化プローブに連結させ、伸長させることによって、配列の繰り返しが検出されるであろう。標的の明白な位置は繰り返し配列のその平均であろう。ちょうど二度繰り返されている配列では、その真の位置はみかけの位置の回りに相対的に存在する。例えば、標的の５’末端から５０及び１００塩基の位置で起こっている繰り返し配列のみかけの位置は末端から７５塩基であろう。しかしながら、ハイブリダイゼーションによる位置シークエンシングのパターンを試験する場合、その場所に位置すると推定される配列は５’末端から５０塩基及び１００塩基の付近に接触して重なっていることが示されるであろう。この事は繰り返しが起こっていることを示すであろう。
実施例９  標的の３’配列の伸長
第８図に示されているスキームを用いると、オリゴヌクレオチドアレー上のそのハイブリダイゼーション位置によって示される、標的の既知配列の３’塩基の同定を行うことが可能である。例えば、図に示すように、ＮＡＧＣＴＡ３’型の４n個の一本鎖突出部をもつアレーが作り出され、この中のｎは長さがｎ＋１の突出部の既知の塩基の数である。標的は第３図に示す方法で５’標識を用いて調製される。次いで、ＤＮＡポリメラーゼのクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントを用い、重合鎖ターミネーターとして単一のｄｐｐｐＮｐ（またはその代わりに、ｄｄｐｐｐＮターミネーター＋結合可能末端）を加える。ハイブリダイゼーション前に、得られた３’末端のリン酸をアルカリフォスファターゼによって除去する。こうすることによって、次に標的はプローブアレーへ連結するであろう。４色による５’標識を一色ずつ連続して行うこと、または４つの異なる色で色付けした鎖を混合すること（それぞれの色は特定の鎖ターミネーターに相当する）のどちらかによって、配列ＡＧＣＴＡの隣のＮと対をつくる塩基の本体を推論することができる。５’末端を標識することは連結反応段階での蛍光塩基誘導体による干渉を最小限にする。おそらく、簡単に調製することの出来るｄｐｐｐＮｐまたはリボｐｐｐＮｐを提供すると、シークエナーゼＩＩまたはその他の既知のポリメラーゼがこれらを基質として用いるであろう。この方法の重要段階は、重合鎖ターミネーターとして単一のｄｐｐｐＮｐを加えることである。ハイブリダイゼーション前に、得られた３’末端リン酸をアルカリフォスファターゼで除去する。こうすることによって、次に、標的をプローブアレーに連結できる。代わりに、連結可能末端で置換したｄｄｐｐｐＮｐターミネーターを用いることもできる。４色による５’標識を一色ずつ連続して行うこと、または４つの異なる色で色付けした鎖を混合すること（それぞれの色は特定の鎖ターミネーターに相当する）のどちらかによって、配列ＡＧＣＴＡの隣のＮと対をつくる塩基を推論することができる。連結反応段階での蛍光塩基誘導体による干渉を最小限にするため、５’末端を標識する。
多色検出法のために十分な色があるならば、この標的の３’の伸長は、複雑な４nのアレーのうちのｎ＋２の塩基を読むために、プローブの３’の伸長と組み合わせることができる。これはもしかすると極めて実質的な改良であるかも知れない。それはシークエンシングの力を損失させること無く、１６の因子によって必要とされるアレーの大きさを減少させる。しかしながら、必要とされる色の数は幾分か威圧的になり始めている。原則として、各々の３’伸長について４色、および標的の長さについて１色の一般的な内部標識、の少なくとも９色が要求されるであろう。しかしながら、共鳴イオン化分光（ＲＩＳ）検出法を用いれば、８色がちょうど単一型の金属原子で得られ、より多くの色もほんの２つの金属で得ることができた。
実施例１０  標的の５’配列の伸長
実施例５では、ポリメラーゼによってプローブの３’末端を伸長することによって、連結反応後に、標的のヌクレオチドをさらに一つ決定できることを例示した。この方法では、鎖ターミネーターのみを用いた。また、ＤＮＡポリメラーゼ及びその他のＤＮＡ代謝酵素の基質として供される蛍光標識ｄＮＴＰも作ることができる。例えば、３つの標識ｄＮＴＰおよび４番目に標識していない鎖ターミネーター、をそれぞれ連結反応させたプローブ−標的複合体は蛍光標識したｄＮＴＰｓを用いて伸長させることができた。これは、各々の可能な鎖ターミネーターで連続的に繰り返すことができる。異なる標識の強度の比率をかなり正確に測定することが出来るならば、少なからぬ量の配列情報がさらに得られるであろう。絶対的強度を計ることができたならば、本質的にはオリゴヌクレオチドアレーのそれぞれのサイトを少量の４色でＤＮＡシークエンシングすることができるため、この方法の能力はかなり実質的であると思われる。例えば、第９図に示すように、配列（Ｐｕ）4Ｔでは、そのような方法は１６の可能な配列から１２を明白に示し、残りはそれぞれ二つの曖昧な対に分けられる。別法として、ひとたびプローブアレーが標的ＤＮＡを捕らえれば、完全なプラス−マイナスＤＮＡシークエンシング反応を全ての標的で行うことができた。また、その様に高度に平行して行うのに適した単一のヌクレオチドＤＮＡを付加する方法も記載されている。
実施例１１
ハイブリダイゼーションによる部分シークエンシングに於けるサンプルのプール
典型的な２００塩基対の標的は５塩基からなる１０２４のプローブアレーのうちの１９６プローブのみを検出するであろう。このことは、それぞれの場合にプローブの半数を検出できる単一色のサンプリングの理想的状態から遠くない。しかしながら、方法は単一色に制限されないので、アレーは必ずしもこの様に小さくなくても良い。オクタヌクレオチドアレーを用いると、ハイブリダイゼーションまたはここに記載した増強法の一つによる従来の部分的シークエンシングでは、標的は固定プローブの１／３２を検出するのみである。効率を上げるために、１６種の標的の混合物を二通りの方法で増強して用いることができる。第一に、聡明に構築したプローブの直交性プールは、ハイブリダイゼーションさせてマッピングのために用いることができる。この様なプールを用いたハイブリダイゼーションによるシークエンシングは、明瞭であろう。標的のプール、プローブのプール、または、その両方のプールを用いることができる。
第二に、２ｘ１０4個のプローブアレーのハイブリダイゼーションによる従来のシークエンシングによる分析では、それぞれを８ｘ１０3個のプローブを含む２４と同じぐらい少ない数のプールに分けると、多量の重複がある。枝別れ位置を排除すると、２４のハイブリダイゼーション物から全ての標的の全ての核酸配列を決定することができた。しかしながら、ＲＩＳ検出を用いると２４色より多く存在する。それ故、過剰な全てのプローブよりはるかに高く標的の濃度を保つような濃度の核酸サンプルが提供されるならば、全てのハイブリダイゼーション物に加えて適当な対照を同時に配列決定することができた。単一のハイブリダイゼーションによる実験では４ｘ１０6塩基対の配列情報が得られた。実力のある研究室では、一日にそれぞれ２５のハイブリダイゼーション物を作り出すことができ、結果として一日当たり１０8塩基対の配列を決定することができる。このことは大腸菌のＤＮＡポリメラーゼによる重合速度に匹敵する。
実施例１２  標的ハイブリダイゼーション後のオリゴヌクレオチド連結反応
連結反応していない積み重ね状態のハイブリダイゼーションは、単純なフォーマットで説明される。八量体のオリゴヌクレオチドを標的にアニールし、その後隣接した五量体とアニールし、読むことのできる配列を８から１３塩基に伸長した。このことは、八量体のみを用いたハイブリダイゼーションによって本来のシークエンシングを既に行った配列データの曖昧さを解決するために特別に選択した五量体のわずかなプールを用いて行われる。この方法は極めて旨く働くように見えるが、五量体の特製プールはそれぞれの特別な状況で扱うために特別に作られなくてはならないため、厄介である。対照的に、ここで用いた研究方法（第９図）は、プローブに標的を連結反応した後、多色標識した直交性プールに配置した五量体の混合物を連結反応する。例えば、ｐＡＴＧＣＡｐまたはｐＡＴＧＣｄｄＡの形の五量体を用いると、単独の連結反応がそれぞれのプローブ−標的複合体と起こるだけであろう。これらは、リガーゼとの干渉を排除するため３’が標識されているであろう。１０種のプールのみが五量体のバイナリーシーブ分析に必要とされる。実際には、余分を取り入れてもっと多く、言わば１６量体を用いることを了解するであろう。例えば４色のみが利用できるならば、それらは４回の連続したハイブリダイゼーションを必要とするであろう。例えば、１６色を用いることができるならば、一度にハイブリダイゼーションできるであろう。このスキームの結果、４10のプローブを用いるのと等価のアレーの一サイト当たり１０の塩基を読むことができるが、２ｘ４5のみのプローブを作成すればよいだけである。この方法での効率の増加はハイブリダイゼーションによる従来のシークエンシングに５００倍の効率でまさる。
実施例１３  特製プローブアレーの合成
特注のプローブアレーは、選択前の配列の大母集団の中での任意の一つの塩基の変化と言ったような、核酸配列の変化を検出するのに有効である。このことは突然変異の検出、シークエンシングの比較、および新規の珍しいかも知れない多形成を発見するためにに重要である。一セットの標的配列は、核酸プローブの最初の一般的なアレーのプローブを、特別な配列または一連の配列の任意の変化を特異的に検出するためのプローブに変えて、特別に製作することができる。最初に行った実験は、３’をブロックした五量体が標識されていないことを除いて、実施例４に概要を記載した実験と同じである。連結反応後、最初の核酸標的ストランドをそれに付着した１８ヌクレオチドと共に除去し、新規の連結反応していない１８ヌクレオチドストークを固定化したアレーの各々のエレメントにアニールした（第１１図）。その歴史から、アレーのエレメントの多く（理想的に言えば５０％またはそれ以上）は、３’側の伸長が５塩基から１０塩基に代わったと言う違いがある。これらは可能な４10個の十量体の全てを意味するものではないが、代わりに本来のサンプルに存在する十量体を表している。対照サンプルもまた、デカヌクレオチド二重らせん内の唯一のミスマッチを検出するような条件下で、新規のアレーとハイブリダイゼーションさせることができる。ハイブリダイゼーションできない任意のサンプルは作り替えられた塩基を持つのではないかと考えられる。
大規模ＤＮＡシークエンシング診断での問題は、患者からの多数のサンプルを扱うことである。ここに略述した研究方法を用いると、１／３または１／４周期のオリゴヌクレオチド連結反応で、標的サンプルに特異的な２０量体のアレーを作り出すことができた。その様にして作られたアレーは、曲がりなりにも配列に特異的な唯一の染色体ＤＮＡセグメントを吊り上げる能力、および類似サンプル中の任意の差異を検出する能力がある。各々のアレーは、任意のＤＮＡ配列を決定すること無く、任意の新規のオリゴヌクレオチドを合成することなく、個々に特別に設計することができる。発癌または環境からの傷害を原因とするような個々のＤＮＡに於ける任意の後天性の変化を簡単に検出できるであろう。
実施例１４  ハイブリダイゼーションによる位置シークエンシング
５および６塩基対の突出部を持つプローブを用いて、５塩基対対合、５塩基対誤対合、６塩基対対合、および６塩基対誤対合についてハイブリダイゼーションを行った。これらの配列を表５に示す。
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ビオチニル化した二本鎖プローブは、ＴＦバッファー中で、相補的な一本鎖と共に、６８Ｃで５分間、アニーリングし、次いで、室温までゆっくり冷やすことによって調製した。５倍過剰量のストレプトアビジンでコーティングしたポリスチレン−コーティングの磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を分散させて、二本鎖のプローブに加え、次いで、室温で３０分間攪拌しながらインキュベーションした。連結反応後、サンプルはＴＦバッファー中で二度低温（４℃）洗浄し、次いで一度高温（９０℃）洗浄した（第１２図）。32Ｐ総量に対する高温洗浄上澄み液中32Ｐの比率を定量した（第１３図）。高ＮａＣｌ濃度では、不適正の標的配列はアニールしない、または低温洗浄で除去されるかのどちらかであった。同条件下で、適正標的配列はプローブとアニールし、連結反応した。最終の高温洗浄ではビオチニル化されていないプローブのオリゴヌクレオチドが除去された。標的がプローブと連結反応していた場合には、このオリゴヌクレオチドは標識された標的を含んでいる。
実施例１５  塩基組成による変異の補正
ＳＢＨのすべての配列を完成させる上での主な問題は、Ｔmが塩基組成、および、ある場合には塩基配列に依存することである。ハロゲン化テトラメチルアンモニウムまたはベタイン（Ｗ．Ａ．Ｒｅｅｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，１３７−１４４，１９９３）のようなふだん余り用いられない塩を用いると、この様な変化を最小限にする研究方法が提供される。代わりに、２，６−ジアミノプリンおよび５−ブロモＵのような塩基アナログをそれぞれＡおよびＴの変わりに用いるとＡ−Ｔ塩基対の安定性を増加させることができ、７デアザＧのような誘導体を用いるとＧ−Ｃ塩基対の安定性を減少させることができる。第２表に示した最初の実験は、酵素を用いると、塩基配列による多くの複雑さが除去されるであろうことを示している。この研究方法は、各々の核酸について異なる条件を必要とする、およびＧＣ含有量に非常に左右される非酵素的方法以上に、非常に重大な利益をもたらす。
安定性の差を補正するその他の方法は、重層部位の隣の塩基を変化させることである。実験は、すべてのハイブリダイゼーションの識別、さらに関係する連結反応の識別に関するこの位置での４塩基全ての相対的な影響を試験するために行われた。ｄＵ（デオキシウリジン）および７−デアザＧのような塩基アナログもまた、標的ＤＮＡの成分として試験され、それらが二次構造の影響を抑制するかどうかに付いて調べた。一本鎖結合タンパク質もまたこの点で有用であろう。
実施例１６  データの測定、処理および解釈
ハイブリダイゼーションから隣接するＤＮＡ配列の生データの取り扱い及び一般化に関する高度に自動化された方法が、データの分析のために必要である。データを獲得するための二つの方法、蛍光標識でのＣＣＤカメラおよび放射能標識サンプルでの画像板分析器、が以前ＳＢＨに用いられてきた。アレーの均一サンプリングで問題のない後者の方法が好都合である。しかしながら、その方法は実質上、ＤＮＡサンプルに35Ｓおよび32Ｐを用い、銅箔を通して区別して画像処理することによる二色のみの分析に制限される。この方法とは対照的に、ＣＣＤカメラは余り良く発達していないが、適当な励起源およびフィルターを用いることによって多色検出が可能である。プライマーまたはターミネーターを用いた従来の蛍光ＤＮＡシークエンシングでは４色が利用できる。赤外線による染色を用いれば４色以上を用いることができる。しかしながら、蛍光アレーの均一な励起を提供することは平凡な問題ではない。両方の検出計画が用いられ、画像処理分析器が必ず働く。計画に記載したような多色標識計画の幾らかが何時か実現されるならば、ＣＣＤカメラの研究開発が必要になるであろう。標識は、５’を標識するためには５’標識ＰＣＲプライマーを、内部標識するためにはアルファ32Ｐ標識したトリフォスフェートまたは蛍光標識した塩基アナログを、および３’を標識するためにはずれたＤＮＡ末端を満たす同様の化合物を用いるような一般的な酵素法によって、標識を標的に導入するであろう。
分子力学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）画像板分析器および光度測定ＣＣＤカメラは、両者共、同じＴＩＦＦ８ビットデータフォーマットで扱うことができる。この様に、いずれかの機器のために発達したソフロウエアは、両方の機器で測定したデータを処理するために使用できる。これによってソフトウエアを操作する多量の不必要なデータの重複が減るであろう。配列を解釈するためのソフトウエアはシークエンシングチップデータを読むために開発することができ、それを隣接する配列に組み立てることはモスクワのアルゴンネ  ナショナル  ラボラトリー（Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）および私的機関ですでに進行中である。その様なソルトウエアは一般的に興味を持つ使用者団体に役に立つ。このソフトウエアの最も有効な実施例は、多色検出、位置情報の結合、およびスキームのプールを含む、この研究開発に特別に特異的な必要性に適合するように特別に作成することができる。最後に使われるサンプルの直交性プールを構築および解読するための特別なソフトウエアの開発は、増強した物理的マッピング法にも必要であるため、進んでいる。
実施例１７  マスタービーズの生産
マスタービーズを生産する一般的な方法は第１４図に示されている。４０μｌのダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄ）Ｍ−２８０ストレプトアビジンを８０μｌのＴＥ（ビーズ濃度５ｍｇ／ｍｌ）で二回洗浄した。ビーズの最終濃度は全量８０μｌ、４０μｇのビーズ当たり、約５−１０ｐＭのビオチニル化オリゴであった。それぞれの試験オリゴは、５’−ビオチン−Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5−10bp−３’の形で、濃度が１０ｐＭ／４０μｌ（２５０ｎＭ）になるようにＴＥに溶解した。８０μｌのオリゴを加え、混合物を低速渦巻き攪拌で１５分間穏やかに振とうした。
0003793570.tif 000007
チューブをＤｙｎａｌＭＰＣ装置内におき、上澄み液を除去した。ストレプトアビジンの未結合サイトを水中で２００μＭの未反応ビオチン５μｌでシールした。ビーズを８０μｌのＴＥで数回洗浄した。これらのビーズは、４℃で数週間、この状態で貯蔵できる。
５’をビオチニル化した１８塩基の核酸（定常領域の相補鎖）２５０ｎＭをプローブ領域の酵素伸長のためのプライマーとして供給した。チューブは６８℃に加熱し、室温まで冷却した。ビーズは穏やかにチッピングすることによって懸濁状態に保った。上澄みを除去し、４０μｌのＴＥで数回洗浄した。チューブを磁石から取り除き、ビーズを４０μｌのＴＥに再懸濁して過剰の相補鎖を取り除いた。ビーズの懸濁液を４本のチューブに等しく分け、ストックチューブは同様にチューブに分けた洗浄液で洗浄した。上澄液を取り除き、水で洗浄した。各々のチューブは約２−５ｐＭのＤＮＡ（２８−７２ｎｇ、第６表を参照されたい）を含んでいた。
ポリメラーゼＩによる伸長を、各々のチューブのＤＮＡを用いて全量１３μｌで次の通りに（第７表を参照されたい）行った：ＮＥＢ緩衝液濃度は１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５、５ｍＭ−ＭｇＣｌ2、７．５ｍＭ−ＤＴＴ；３３μＭ−ｄ（Ｎ−Ｎi）ＴＰ混合物；Ｎi塩基の一つに相補的な２μＭの32Ｐ-dＮiＴＰ；およびポリメラーゼＩの大フラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ）である。最初に、穴にｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰを３３μＭの濃度で加えた。32Ｐ-dＡＴＰを３μＭの濃度で加えた。６．３μｌのｄＮＴＰ、５μｌの２００μＭ−ｄＮＴＰ、および４３μｌの水を加えた標識ヌクレオチド（例えば、チューブＡはＣ、Ｇ、およびＴを含む）を欠く２００μＭのｄＮＴＰ保存溶液をプールした。２μｌ［α32Ｐ］ｄＮＴＰ、５μｌの２００μＭ−ｄＮＴＰ、および４３μｌの水から、放射能標識した（*ｄＮＴＰ）保存溶液２０μＭを調製した。
0003793570.tif 000008
チューブは、２５℃で１５分間インキュベーションした。酵素による伸長の収率を最適化するために、より高濃度のｄＮＴＰｓおよびより長い反応時間が要求されて良い。反応は、４μｌの５０ｍＭ−ＥＤＴＡを最終濃度が１１μＭになるように加えて停止した。上澄みを除去し、ビーズを４０μｌのＴＥ緩衝液で数回リンスし、３５μｌのＴＥに再懸濁した。全チューブをカウントし、加えた標識の約８％の取り込みがあると予想された。
合成したオリゴの転移を試験するために、磁気ビーズを５０μｌの０．１Ｍ−ＮａＯＨに懸濁し、室温で１０分間インキュベーションした。各々のチューブから上澄み液を取り除き、新しいチューブに移した。ビーズを５０μｌの０．１Ｍ−ＮａＯＨと共にもう一度インキュベーションした。カウントの多くが残っているようなので、最初にセットしたビーズは、より多くのカウントが浸出するように、５０μｌのＮａＯＨ中、６８℃に加熱した。各々の塩基を１Ｍ−ＨＣｌ、次いで５０μｌのＴＥで中和した。新たなＤｙｎａｂｅａｄを融解ストランドに加え、室温で１５分間、穏やかに振とうしながらインキュベーションした。上澄み液を除去し、カウントするために貯えた。ビーズを数回ＴＥで洗浄した。結果を表８に示す。
0003793570.tif 000009
転移は新規のビーズに捕獲された合成ストランドを示す。非結合はビーズに捕獲されなかった合成ストランドを示し、非融解は従来のビーズ上に取り残されたカウントを示す。観察されるように、新たに合成されたストランドの約４３％から５８％が首尾よく転移し、その様なストランドのアレーは幸運にも複製されたことが示された。
実施例１８  ＰＣＲによる複合アレーの作成法
１０２４の五量体プローブの全てを別々に合成する必要がなく、ＳＢＨの新規の研究方法の大部分を試験するための、わずかに複雑ではあるが、かなり改良された計画が展開した。この方法は、５’−および／または３’−突出部を持つアレーを作成し、ＰＣＲを用いて、ビオチンで簡単に標識される、ハイブリダイゼーションに用いる最終プローブを調製する。また、各々のプローブ配列の同一性の一部または全てを確かめる方法を構築する。
化学合成を用いて以下の配列を作成した：
0003793570.tif 000010
次に、高濃度のｄＮＴＰ存在下でＤＮＡポリメラーゼを用いた酵素による適当なプライマーの伸長を利用して相補的二重らせんを作製した。上記の配列のうち、Ｎは４つの塩基全ての当モル混合物を表し；ＲはＡおよびＧの当モル混合物；並びにＹはＴおよびＣの当モル混合物である。下線部の配列は、ＢｓｔＸＩおよびＨｇａＩの認識部位である。；
0003793570.tif 000011
第２図Ａに示すように、部分的ＳＢＨの型を用いた５塩基からなる３’突出部（以下を参照のこと）に変化させることが出来る、相補的な４塩基からなる３’突出部の一本鎖の誘発を許す、内部にＢｓｔＸＩ切断サイトをもつ配列を設計した。
0003793570.tif 000012
ＨｇａＩ切断サイトはＢｓｔＸＩ切断サイトと異なり、５塩基からなる５’突出部一本鎖の誘発を許す。これは、第２図Ｂに示すような部分的ＳＢＨの型に必要とされる構造であり、続いて、プライマーの伸長による突出部のシークエンシングにも使うことができる。
0003793570.tif 000013
ストランド（ａ）の５’−および３’−末端配列もまた、それぞれＳａｌＩおよびＮｈｅＩの認識サイトであり，ストランド（ｂ）の関連配列は、それぞれＸｈｏＩおよびＸｍａＩの認識サイトである：
0003793570.tif 000014
配列５’−ＹＮＮＮＮＲ−３’および５’−ＲＮＮＮＮＹ−３’によると思われる縮退をもっていても、これらの酵素がプローブ領域を切断しないようなクローニングサイトが選ばれた。クローニングのために、二重らせん（ａ）をＳａｌＩおよびＮｈｅＩの両方の制限酵素で、または二重らせん（ｂ）をＸｈｏＩおよびＸｍａＩで、切断した。得られた消化生成物は適当なベクター（例えば、プラスミド、ファージ等）に直接クローニングし、そのベクターで好適な細胞を形質転換し、コロニーを平板培養した。それぞれのクローンを選び取り、それらのＤＮＡは、プライマーとしてクローン化した配列から下流および上流のベクター配列を用いてＰＣＲによって増幅した。このことは、ＰＣＲ生成物の長さを延ばしてこれらの生成物の取扱いを容易にするために行った。個々のクローンからのプローブ領域は基部ストランドの５’塩基に関連するビオチニル化プライマーと共にＲＣＲで増幅させた。ＰＣＲを分離するために、ビオチンの位置を逆にした。各々の場合に、得られたＰＣＲ生成物をＢｓｔＸＩで切断し、ビオチン標識した生成物はストレプトアビジンのビーズまたは表面に捕らえられた。ＤＮＡ精製のかわりにＰＣＲ増幅を用いることによって、各々のクローンを別々に精製およびビオチニル化する必要性もまた除去される。
並行して、ＰＣＲ生成物の全てを、ランダム配列からなる５’−突出部を誘発するＨｇａＩによって切断した。次いで、ＨｇａＩ切断で得られた２つのＤＮＡをそれぞれ別々にプライマーで伸長することによって、それぞれのクローンの同一性を決定した。同じクローンから誘導されるそれぞれの配列の対に関しては、突出部は相補的であるはずである。それ故、それぞれのフラグメン鎖の３塩基をシークエンシングすると、２つのプローブの完全な構造が得られるであろう。このプラス／マイナスシークエンシングはミクロタイタープレート内ででき、容易に自動化される。鎖の５’−ＲＮＮＮＮＹ−３’が（ｂ）ＨｇａＩの認識サイトである５’−ＧＡＣＧＣ−３’を含むわずかの場合にのみ、失敗するであろう。必要とされる多くのプライマーの伸長反応は、より多くの制限酵素認識部位を持つ配列のプールを合成することによって減ずることができる。例えば、一つの特別な位置を占める塩基の４つのプールを用いることは、５’−ＹＮＮＡＮＲ−３’のように、以前から知られている。
部分的ＳＢＨに必要なプローブを作製するために（第２図Ａを参照のこと）、二本鎖ＰＣＲ生成物を最初にストレプトアビジンを通して固体に付着させる。次いで、それらをＢｓｔＸＩで切断し、次の対生成物を作り出す：
0003793570.tif 000015
部分的ＳＢＨに必要な５塩基からなる３’突出部は１塩基短い不変鎖で（ビオチニル化されていない）相補鎖を置換することによって作成される。
0003793570.tif 000016
これによって、第２図ＡおよびＢに示した連結反応段階の後にシークエナーゼ、バージョン２．０で伸長されやすい５塩基からなる３’突出部が誘発される。５，１２０（５Ｘ適用）のランダムに選んだアレーは、全ての配列（＞９９％）が存在することを確認するために必要であるが、このアレーは最適アレーより随分と長い。実際問題として、ライブラリーは配列のおおよそ６３％を提供することが必要であり、もし必要であれば、直接合成によって失われたクローンに付け加えることができる。
本発明のその他の実施態様および使用は、ここに記載した本発明の明細書の研究および実施により、当業者に明らかであろう。明細書および実施例は、以下の請求の範囲によって示される本発明の真の範囲および精神と共に、模範としてのみ考慮されるであろう。
配列表
（2）配列番号１の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:15塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  １:
0003793570.tif 000017
（2）配列番号２の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:18塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  2:
0003793570.tif 000018
（2）配列番号３の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:23塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  3:
0003793570.tif 000019
（2）配列番号４の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:23塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  4:
0003793570.tif 000020
（2）配列番号５の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:23塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  5:
0003793570.tif 000021
（2）配列番号６の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:23塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  6:
0003793570.tif 000022
（2）配列番号７の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:23塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  7:
0003793570.tif 000023
（2）配列番号８の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:23塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  8:
0003793570.tif 000024
（2）配列番号９の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:23塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  9:
0003793570.tif 000025
（2）配列番号１０の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:23塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  10:
0003793570.tif 000026
（2）配列番号１１の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:23塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  11:
0003793570.tif 000027
（2）配列番号１２の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:23塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  12:
0003793570.tif 000028
（2）配列番号１３の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:24塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  13:
0003793570.tif 000029
（2）配列番号１４の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:24塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  14:
0003793570.tif 000030
（2）配列番号１５の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:41塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  15:
0003793570.tif 000031
（2）配列番号１６の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:41塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  16:
0003793570.tif 000032
（2）配列番号１７の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:12塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  17:
0003793570.tif 000033
（2）配列番号１８の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:41塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  18:
0003793570.tif 000034
（2）配列番号１９の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:12塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  19:
0003793570.tif 000035
（2）配列番号２０の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:41塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  20:
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（2）配列番号２１の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:12塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  21:
0003793570.tif 000037
（2）配列番号２２の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:12塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  22:
0003793570.tif 000038
（2）配列番号２３の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:15塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  23:
0003793570.tif 000039
（2）配列番号２４の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:15塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  24:
0003793570.tif 000040
（2）配列番号２５の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:25塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  25:
0003793570.tif 000041
（2）配列番号２６の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:21塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  26:
0003793570.tif 000042
（2）配列番号２７の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:20塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  27:
0003793570.tif 000043
（2）配列番号２８の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:16塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  28:
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（2）配列番号２９の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:25塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  29:
0003793570.tif 000045
（2）配列番号３０の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:21塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  30:
0003793570.tif 000046
（2）配列番号３１の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:20塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  31:
0003793570.tif 000047
（2）配列番号３２の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:16塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  32:
0003793570.tif 000048
（2）配列番号３３の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:20塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  33:
0003793570.tif 000049
（2）配列番号３４の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:15塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  34:
0003793570.tif 000050
（2）配列番号３５の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:20塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  35:
0003793570.tif 000051
（2）配列番号３６の情報:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:15塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:配列番号  36:
0003793570.tif 000052
【図１】
0003793570.tif 000053
【図２Ａ】
0003793570.tif 000054
【図２Ｂ】
0003793570.tif 000055
【図３Ａ】
0003793570.tif 000056
【図３Ｂ】
0003793570.tif 000057
【図４】
0003793570.tif 000058
【図５】
0003793570.tif 000059
【図７】
0003793570.tif 000060
【図６】
0003793570.tif 000061
【図８】
0003793570.tif 000062
【図９】
0003793570.tif 000063
【図１０】
0003793570.tif 000064
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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