(57)【要約】  本発明によれば、抗体と薬物とがリンカーを介して連結した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の製造方法が提供される。本発明によれば、例えば、抗体と薬物とがリンカーを介して連結した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）または当該ＡＤＣを含む医薬の製造方法であって、トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）とＴＣＥＰによる還元反応中のＩｇＧ抗体を含む溶液と、ＴＣＥＰに対して化学量論的に過剰量のＴＣＥＰの阻害剤を含む溶液と、をマイクロリアクターを用いて混合することを含む、方法が提供される。
2020075817.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体と薬物とがリンカーを介して連結した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）または当該ＡＤＣを含む医薬の製造方法であって、
抗体のジスルフィド結合を還元する還元剤と当該還元剤による還元反応中の部分的に還元されたＩｇＧ抗体とを含む溶液と、当該還元剤に対する阻害剤および／または還元停止剤を含む溶液とを、マイクロリアクターを用いて混合すること
を含む、方法。
【請求項２】
抗体と薬物とがリンカーを介して連結した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）または当該ＡＤＣを含む医薬の製造方法であって、
（ｂ）トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）とＴＣＥＰによる還元反応中の部分的に還元されたＩｇＧ抗体を含む溶液と、ＴＣＥＰに対して化学量論的に過剰量のＴＣＥＰの阻害剤を含む溶液と、をマイクロリアクターを用いて混合すること
を含む、方法。
【請求項３】
（ａ）ＩｇＧ抗体を含む溶液とトリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む溶液とをマイクロリアクターを用いて混合して、部分的に還元された抗体を生成させること
をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｃ）部分的に還元された抗体と、抗体のＳＨ基と反応する官能基を有するリンカーとを反応させてリンカーと連結した抗体を生成させることをさらに含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
抗体と薬物とがリンカーを介して連結した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）または当該ＡＤＣを含む医薬の製造方法であって、
（ａ）ＩｇＧ抗体を含む溶液とトリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む溶液とをマイクロリアクターを用いて混合して、部分的に還元された抗体を生成させることと、
（ｂ）トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）とＴＣＥＰによる還元反応中の部分的に還元されたＩｇＧ抗体を含む溶液と、ＴＣＥＰに対して化学量論的に過剰量のＴＣＥＰの阻害剤を含む溶液と、をマイクロリアクターを用いて混合することと、
（ｃ）部分的に還元された抗体と、抗体のＳＨ基と反応する官能基を有するリンカーとを反応させてリンカーと連結した抗体を生成させることと
を含む、方法。
【請求項６】
前記ＴＣＥＰの阻害剤を含む溶液が、前記リンカーをさらに含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記（ｃ）の前に、前記（ｂ）で得られた溶液と前記リンカーを含む溶液とをマイクロリアクターを用いて混合することをさらに含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項８】
ＴＣＥＰの阻害剤が、４−アジド安息香酸および２−アジドエチル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドからなる群から選択される１以上の阻害剤である、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
部分的に還元された抗体が、４つのＳＨ基を有する抗体である、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
抗体のＳＨ基と反応する官能基が、マレイミド基である、請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
リンカーが、薬物と連結したリンカーである、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
リンカーが、薬物と連結し、かつ抗体のＳＨ基と反応する官能基が、マレイミド基である、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体薬物複合体の製造方法に関する。【０００２】
背景技術
モノクローナル抗体は、がん等の疾患の標的療法として有用である。モノクローナル抗体のがん細胞等に対する細胞傷害性を増強する目的で、モノクローナル抗体と薬物（例えば、細胞傷害剤）とを連結した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）が開発されている（特許文献１等）。【０００３】
臨床試験におけるほとんどのＡＤＣに関して、抗体分子に対する薬物の結合数（薬物結合数；ＤＡＲ）の平均は、３〜４個であり、この個数は最適値であると考えられている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００５／１１７９８６号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Debaene F. et al., Analytical Chemistry, 86: 10674-10683, 2014
【発明の簡単な説明】
【０００６】
本発明は、抗体薬物複合体の製造方法を提供する。
【０００７】
本発明によれば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の調製工程において、トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）によって還元されている抗体に対して、マイクロリアクターを用いてＴＣＥＰの阻害剤を混合することによって、ＡＤＣにおける薬物結合数（ＤＡＲ）を制御することができ、ＤＡＲが制御されたＡＤＣを製造し得る。本発明によれば、特に抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の調製工程において、マイクロリアクターを用いて抗体とトリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）を混合して還元し、その後、トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）によって還元されている抗体に対して、マイクロリアクターを用いてＴＣＥＰの阻害剤を混合することによって、ＡＤＣにおける薬物結合数（ＤＡＲ）を制御することができ、ＤＡＲが制御されたＡＤＣを製造し得る。
【０００８】
本発明によれば、例えば、下記の発明が提供され得る。
（１）抗体と薬物とがリンカーを介して連結した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）または当該ＡＤＣを含む医薬の製造方法であって、
抗体のジスルフィド結合を還元する還元剤と当該還元剤による還元反応中の部分的に還元されたＩｇＧ抗体とを含む溶液と、当該還元剤に対する阻害剤および／または還元停止剤を含む溶液とを、マイクロリアクターを用いて混合すること
を含む、方法。
（２）抗体と薬物とがリンカーを介して連結した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）または当該ＡＤＣを含む医薬の製造方法であって、
（ｂ）トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）とＴＣＥＰによる還元反応中の部分的に還元されたＩｇＧ抗体を含む溶液と、ＴＣＥＰに対して化学量論的に過剰量のＴＣＥＰの阻害剤を含む溶液と、をマイクロリアクターを用いて混合すること
を含む、方法。
（３）（ａ）ＩｇＧ抗体を含む溶液とトリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む溶液とをマイクロリアクターを用いて混合して、部分的に還元された抗体を生成させること
をさらに含む、上記（２）に記載の方法。
（４）（ｃ）部分的に還元された抗体と、抗体のＳＨ基と反応する官能基を有するリンカーとを反応させてリンカーと連結した抗体を生成させることをさらに含む、上記（２）または（３）に記載の方法。
（５）抗体と薬物とがリンカーを介して連結した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）または当該ＡＤＣを含む医薬の製造方法であって、
（ａ）ＩｇＧ抗体を含む溶液とトリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む溶液とをマイクロリアクターを用いて混合して、部分的に還元された抗体を生成させることと、
（ｂ）トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）とＴＣＥＰによる還元反応中の部分的に還元されたＩｇＧ抗体を含む溶液と、ＴＣＥＰに対して化学量論的に過剰量のＴＣＥＰの阻害剤を含む溶液と、をマイクロリアクターを用いて混合することと、
（ｃ）部分的に還元された抗体と、抗体のＳＨ基と反応する官能基を有するリンカーとを反応させてリンカーと連結した抗体を生成させることと
を含む、方法。
（５’）抗体と薬物とがリンカーを介して連結した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）または当該ＡＤＣを含む医薬の製造方法であって、
（ａ）ＩｇＧ抗体を含む溶液とトリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む溶液とをマイクロリアクターを用いて混合して、部分的に還元された抗体を生成させることと、
（ｂ）トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）とＴＣＥＰによる還元反応中の部分的に還元されたＩｇＧ抗体を含む溶液と、ＴＣＥＰに対して化学量論的に過剰量のＴＣＥＰの阻害剤を含む溶液と、をマイクロリアクターを用いて混合することと、
（ｃ）部分的に還元された抗体と、抗体のＳＨ基と反応する官能基を有するリンカーとを反応させてリンカーと連結した抗体を生成させることと
を含む、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記ＴＣＥＰの阻害剤を含む溶液が、前記リンカーをさらに含む、上記（２）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記（ｃ）の前に、前記（ｂ）で得られた溶液と前記リンカーを含む溶液とをマイクロリアクターを用いて混合することをさらに含む、上記（４）または（５）に記載の方法。
（８）ＴＣＥＰの阻害剤が、４−アジド安息香酸および２−アジドエチル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドからなる群から選択される１以上の阻害剤である、上記（２）〜（７）のいずれかに記載の製造方法。
（９）部分的に還元された抗体が、４つのＳＨ基を有する抗体である、上記（２）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）抗体のＳＨ基と反応する官能基が、マレイミド基である、上記（４）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）リンカーが、薬物と連結したリンカーである、上記（４）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）リンカーが、薬物と連結し、かつ抗体のＳＨ基と反応する官能基が、マレイミド基である、上記（４）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、実施例１〜３の製造方法で得られた抗体薬物複合体（ＡＤＣ）それぞれのクロマトグラフを示す。図中のＤＡＲは、薬物結合数（すなわち、抗体当たりの薬物の結合数）を示す。例えば、ＤＡＲ０は、薬物結合比が０であるＡＤＣのピークを示す。
【図２】図２は、実施例５の製造方法で得られたＡＤＣのクロマトグラフを示す。
【図３】図３は、実施例６及び実施例７の製造方法で得られたＡＤＣのクロマトグラフを示す。
【図４】図４は、実施例７及び実施例８の製造方法で得られたＡＤＣのクロマトグラフを示す。
【図５】図５は、実施例８及び実施例９の製造方法で得られたＡＤＣのクロマトグラフを示す。
【発明の詳細な説明】
【００１０】
本明細書で用いられる「マイクロリアクター」は、液相に適用できる流路を備えたフロー型反応装置である。マイクロリアクターは、代表径において１ｍｍ以下の流路（例えば、幅および深さにおいて共に１ｍｍ以下であり得る）を備え得る。マイクロリアクターでは、１つの反応路に対して複数（例えば、２つ）の流路（すなわち、化学物質の供給路）を合流させ、反応路内で化合物を混合することによって反応を開始させることができる。マイクロリアクターを用いて反応を開始させた後には、マイクロリアクター内で、またはマイクロリアクターの外で（例えば、反応路から外に伸びるチューブ内で）反応をさらに進めることができる。溶液導入による流路の目詰まりが防がれるようにマイクロリアクターに適用する液相をフィルタリングし得る。
【００１１】
本明細書で用いられる「抗体」は、免疫グロブリンを意味する。抗体としては、各種動物の抗体、ヒト抗体、ヒトキメラ抗体、およびヒト化抗体が挙げられる。抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が挙げられる。抗体としては、モノスペシフィック抗体およびバイスペシフィック抗体が挙げられる。抗体薬物複合体としては、モノクローナル抗体が好ましく用いられ得る。抗体には、抗体の抗原結合断片（例えば、システイン数が元の抗体と同数のもの）が含まれる。本明細書では、完全長の抗体をインタクトな抗体ということがある。
ヒト抗体は、例えば、動物（例えば、マウス）の抗体遺伝子座をヒト抗体遺伝子座に置き換えることによって作製した動物に対して、抗原を免疫することで得ることができる。ヒト化抗体は、例えば、ヒト抗体に対して動物から得られた抗体の相補性決定領域をグラフトすることによって得られ得る。ヒトキメラ抗体は、動物から得られた抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をヒト抗体の可変領域と置き換えることによって得られ得る。
モノクローナル抗体は、例えば、抗体をミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを形成させ、クローニングされたハイブリドーマ株から得られ得る。
抗原結合断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、半抗体（ｒＩｇＧ）およびｓｃＦｖが挙げられる。抗原結合断片は、例えば、抗体を断片化する処理（例えば、パパインやペプシンなどのペプチダーゼによる処理）やジスルフィド結合の還元によって得られ得る。
【００１２】
本明細書で用いられる「抗体薬物複合体」（Antibody-Drug Conjugate）は、抗体に薬物（例えば、細胞傷害剤）がリンカーを介してまたは介さずに共有結合により連結した複合体を意味する。本明細書では、抗体薬物複合体を単に「ＡＤＣ」ということがある。ＡＤＣにおいては、抗体は、ＩｇＧ抗体を用いることができる。ＩｇＧ抗体としては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が挙げられ、ＡＤＣに用い得る。本明細書では、薬物と連結していない抗体を「裸の抗体」ということがある。本明細書では、特に断りの無い限り、抗体は、裸の抗体を意味する。
【００１３】
ＩｇＧ抗体は、２本の重鎖と２本の軽鎖から構成され、重鎖と軽鎖は、それぞれのシステイン残基間でジスルフィド結合（１箇所）を形成し、２本の重鎖は、それぞれのシステイン残基間でジスルフィド結合は、たとえば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４では２箇所、ＩｇＧ２では４箇所、ＩｇＧ３では１１個所存在し得る。ＡＤＣを作製する際には、還元剤によってジスルフィド結合を開裂させてＳＨ基を生成し、ＳＨ基と反応する官能基を有するリンカーを介して薬物と抗体とを連結させ得る。なお、ＩｇＧ抗体は、重鎖は、４つの鎖内ジスルフィド結合を有し、軽鎖は、２つの鎖内ジスルフィド結合を有し得る。
【００１４】
従って、ＡＤＣは、下記式（Ｉ）：
抗体−｛Ｌ−Ｄ｝ｍ          （Ｉ）
｛式中、Ｌは、リンカーを表し、Ｄは、薬物を表し、ｍは、１〜８の整数を表し得る｝で表され得る。本明細書では、ｍは、薬物結合数（ＤＡＲ）に対応し得る。
【００１５】
ＡＤＣにおいて、リンカーとしては、抗体が有するＳＨ基に反応する官能基を有するリンカー（開裂性リンカーまたは非開裂性リンカー）を用い得る。ＳＨ基に反応する官能基としては、例えば、マレイミド基が挙げられる。従って、本発明では、抗体とマレイミド基を有するリンカーとを反応させ得る。開裂性リンカーとしては、ヒドラゾン結合を有するリンカー、プロテアーゼによる切断部位を有するリンカー（例えば、カテプシンＢ切断部位、カテプシンＣ切断部位、またはカテプシンＤ切断部位を有するリンカー）が挙げられ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、およびＰｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇを用い得る｛ここで、上記アミノ酸の三文字表記は、通常用いられる意味で用いられている｝。また、リンカーとしては、例えば、マレイミドカプロイル；マレイミドカプロイル−ｐ−アミノベンジルカルバメート；マレイミドカプロイル−ペプチド−アミノベンジルカルバメート（例えば、ペプチドは、ペプチダーゼによる開裂部位であり得、例えば、マレイミドカプロイル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−リシン−ｐ−アミノベンジルカルバメートおよびマレイミドカプロイル−Ｌ−バリン−Ｌ−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバメート（ｖｃ））；Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）；［Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）；Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；［Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＥＭＣＳ）；Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）；およびｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）が挙げられ、本発明でリンカーとして用い得る。
【００１６】
薬物の例としては、抗癌剤または化学療法剤（例えば、ヒトにおける新生物（特に、癌腫、肉腫、リンパ腫、または白血病などの病変）の発症または進行を阻害する作用物質；新生物の転移または新脈管形成の阻害する作用物質；細胞傷害剤；細胞増殖抑制剤（細胞成長および／または細胞の増殖を阻害または抑制する作用物質））が挙げられる。
細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤の例としては、代謝拮抗薬（例えば、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ）、シトシンアラビノシド（シタラビン）、メトトレキセート、トリメトプリム、ピリメタミン、ペメトレキセド）；アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、メクロレタミン、ウラムスチン、メルファラン、クロラムブシル、チオテパ／クロラムブシル、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、ジブロモマンニトール、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、トリプラチンテトラニトレート、プロカルバジン、アルトレタミン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミド）；アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン）；抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン、ストレプトゾトシン、グラミシジンＤ、マイトマイシン類（例えば、マイトマイシンＣ）、デュオカルマイシン類（例えば、ＣＣ−１０６５）、カリケアマイシン類）；有糸分裂阻害剤（メイタンシノイド類（例えば、メイタンシン）、アウリスタチン（例えば、アウリスタチンＥ、アウリスタチンフェニルアラニンフェニレンジアミン（ＡＦＰ）、モノメチルアウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＤ、およびモノメチルアウリスタチンＦ）、ドラスタチン類、クリプトフィシン類、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、タキサン類（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、または新規なタキサン（例えば、国際特許出願公開ＷＯ０１／３８３１８を参照）、およびコルヒチン類；トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、テニポシド、ミザントロン）；およびプロテアソーム阻害剤（例えば、ペプチジルボロン酸）；またはそれらの薬学的に許容される塩（具体的には、ヒスチジンの塩の具体例として後に挙げられる塩と同種の塩）であり得る。
治療剤としては、有糸分裂阻害剤が好ましく；メイタンシノイド類またはアウリスタチンがより好ましく；メイタンシンまたはアウリスタチン（特に、モノメチルアウリスタチン）がさらに好まく；モノメチルアウリスタチンＥ（本明細書中、ＭＭＡＥと称することがある）またはモノメチルアウリスタチンＤ（本明細書中、ＭＭＡＤと称することがある）がさらにより好ましい。
【００１７】
本発明によれば、抗体と薬物とがリンカーを介して連結した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）または当該ＡＤＣを含む医薬の製造方法であって、
ＩｇＧ抗体のジスルフィド結合を還元する還元剤と当該還元剤による還元反応中の部分的に還元されたＩｇＧ抗体を含む溶液と、当該還元剤に対して化学量論的に過剰量の阻害剤（または還元反応停止剤）を含む溶液とをマイクロリアクターを用いて混合すること
を含む、方法が提供される。この方法は、ＩｇＧ抗体を含む溶液と、ＩｇＧ抗体のジスルフィド結合を還元する還元剤とを含む溶液と、を混合して、部分的に還元された抗体を生成させることをさらに含み得る。この方法はまた、部分的に還元された抗体と、抗体のＳＨ基と反応する官能基を有するリンカーとを反応させてリンカーと連結した抗体を生成させることをさらに含み得る。還元剤としては、トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン、システイン塩酸塩、およびジチオスレイトール並びにこれらの塩（例えば、塩酸塩）などの様々な還元剤が挙げられ、ジスルフィド結合を還元することに用いることができる。阻害剤としては、それぞれ還元剤に対する阻害剤を適宜用いることができる。還元反応停止剤としては、還元反応を停止させる薬剤を用いることができる。本発明の好ましい態様では、還元剤は、ＴＣＥＰであり、かつ、阻害剤は、４−アジド安息香酸および２−アジドエチル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドからなる群から選択される１以上の阻害剤であり、より好ましい態様では、阻害剤は、２−アジドエチル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドである。
【００１８】
本発明によれば、抗体と薬物とがリンカーを介して連結した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）または当該ＡＤＣを含む医薬の製造方法であって、
（ｂ）トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）とＴＣＥＰによる還元反応中の部分的に還元されたＩｇＧ抗体を含む溶液と、ＴＣＥＰに対して化学量論的に過剰量のＴＣＥＰの阻害剤を含む溶液と、をマイクロリアクターを用いて混合すること
を含む、方法が提供される。
本発明によれば、上記製造方法は、
（ａ）ＩｇＧ抗体を含む溶液とトリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む溶液とを混合して、部分的に還元された抗体を生成させること｛ここで、混合は、マイクロリアクターを用いても用いなくてもよいが、好ましくはこの混合はマイクロリアクターを用いて行うことができる｝
をさらに含み得る。
本発明によれば、上記製造方法は、
（ｃ）部分的に還元された抗体と、抗体のＳＨ基と反応する官能基を有するリンカーとを反応させてリンカーと連結した抗体を生成させること
をさらに含み得る。
【００１９】
従って、本発明によれば、抗体と薬物とがリンカーを介して連結した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）または当該ＡＤＣを含む医薬の製造方法であって、
（ａ）ＩｇＧ抗体を含む溶液とトリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む溶液とを混合して、部分的に還元された抗体を生成させること｛ここで、混合は、マイクロリアクターを用いても用いなくてもよいが、好ましくはこの混合はマイクロリアクターを用いて行うことができる｝と、
（ｂ）トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）とＴＣＥＰによる還元反応中の部分的に還元されたＩｇＧ抗体を含む溶液と、ＴＣＥＰに対して化学量論的に過剰量のＴＣＥＰの阻害剤を含む溶液と、をマイクロリアクターを用いて混合することと、
（ｃ）部分的に還元された抗体と、抗体のＳＨ基と反応する官能基を有するリンカーとを反応させてリンカーと連結した抗体を生成させることと
を含む、方法が提供される。
【００２０】
本発明のある態様では、
抗体と薬物とがリンカーを介して連結した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）または当該ＡＤＣを含む医薬の製造方法であって、
（ａ）ＩｇＧ抗体を含む溶液とトリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む溶液とを混合して、部分的に還元された抗体を生成させること｛ここで、混合は、マイクロリアクターを用いても用いなくてもよいが、好ましくはこの混合はマイクロリアクターを用いて行うことができる｝と、
（ｂ）トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）とＴＣＥＰによる還元反応中の部分的に還元されたＩｇＧ抗体を含む溶液と、ＴＣＥＰに対して化学量論的に過剰量のＴＣＥＰの阻害剤を含む溶液と、をマイクロリアクターを用いて混合することと、
（ｃ）部分的に還元された抗体と、抗体のＳＨ基と反応する官能基を有するリンカーとを反応させてリンカーと連結した抗体を生成させることと
を含み、
部分的に還元された抗体が、４つのＳＨ基を有する抗体であり、ＴＣＥＰの阻害剤が４−アジド安息香酸および２−アジドエチル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドからなる群から選択される１以上の阻害剤（より好ましくは２−アジドエチル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド）であり、抗体のＳＨ基と反応する官能基がマレイミド基である、
方法が提供される。
【００２１】
本発明のある態様では、
抗体と薬物とがリンカーを介して連結した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）または当該ＡＤＣを含む医薬の製造方法であって、
（ａ）ＩｇＧ抗体を含む溶液とトリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む溶液とを混合して、部分的に還元された抗体を生成させること｛ここで、混合は、マイクロリアクターを用いても用いなくてもよいが、好ましくはこの混合はマイクロリアクターを用いて行うことができる｝と、
（ｂ）トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）とＴＣＥＰによる還元反応中の部分的に還元されたＩｇＧ抗体を含む溶液と、ＴＣＥＰに対して化学量論的に過剰量のＴＣＥＰの阻害剤を含む溶液と、をマイクロリアクターを用いて混合することと、
（ｃ）部分的に還元された抗体と、抗体のＳＨ基と反応する官能基を有するリンカーとを反応させてリンカーと連結した抗体を生成させることと
を含み、
部分的に還元された抗体が、４つのＳＨ基を有する抗体であり、ＴＣＥＰの阻害剤が４−アジド安息香酸および２−アジドエチル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドからなる群から選択される１以上の阻害剤であり（より好ましくは２−アジドエチル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド）、前記ＴＣＥＰの阻害剤を含む溶液が、抗体のＳＨ基と反応する官能基を有するリンカーを更に含み、かつ、抗体のＳＨ基と反応する官能基がマレイミド基であり、リンカーは、マレイミド基とは異なる部分（例えば、マレイミド基とは異なる末端）で１以上の薬物と連結している、
方法が提供される。
【００２２】
以下、上記（ａ）〜（ｃ）、および（ｂ’）並びに本発明が追加的に含み得る工程について説明する。
【００２３】
（ａ）ＩｇＧ抗体を含む溶液とトリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む溶液とを混合して、部分的に還元された抗体を生成させること
上記（ａ）では、抗体のペプチド鎖間を連結するシステイン残基間のジスルフィド結合を還元する。還元剤としては、ジスルフィド結合をＳＨ基に還元するＴＣＥＰを用いることができる。
【００２４】
上記（ａ）では、混合は、マイクロリアクターを用いても用いなくてもよいが、好ましくは、混合は、マイクロリアクターを用いて行う。上記（ａ）においてマイクロリアクターを用いる場合、マイクロリアクターとしては、第１の供給路と第２の供給路および該供給路が合流する合流路を備えたマイクロリアクターを用い得る。マイクロリアクターの上記流路は、例えば、代表径（例えば、幅および深さ）が１０μｍ〜１ｍｍ、または１００μｍ〜１ｍｍの範囲となるように設計し得る。上記（ａ）では、第１の供給路からＩｇＧ抗体を含む溶液を導入し、第２の供給路からトリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む溶液を導入し、合流路においてこれらの溶液が混合されるように設定し得る。
【００２５】
抗体を含む溶液における抗体の濃度は、例えば、１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬとし得る。抗体の抗原は、特に限定されない。
ＴＣＥＰを含む溶液におけるＴＣＥＰの濃度は、例えば、１ｍＭ〜１００ｍＭとし得る。
ＴＣＥＰは、例えば、抗体に対して過剰な量で混合させ得る。ＴＣＥＰはまた、抗体に対して１〜５０倍モル当量、例えば、２〜３０倍モル当量、例えば、５〜２０倍モル当量、例えば、７〜１３倍モル当量、例えば、４〜３０倍モル当量、例えば、１０倍モル当量で混合することができる。混合比は、混合する溶液中での抗体および／またはＴＣＥＰの濃度や、流速によって制御し得る。
【００２６】
本発明では、上記（ａ）において、部分的に還元された抗体を得る。
抗体は、上記２つの溶液が混合され、抗体と還元剤とが接触すると還元される。抗体の還元の程度は、得られるＡＤＣにおける薬物結合数と関連する。抗体は、鎖間で４つのジスルフィド結合を有するため、これらが完全に還元されると８つのＳＨ基をもつこととなる。従って、鎖間のジスルフィド結合を還元して得られるＡＤＣにおける薬物結合数は、０〜８の範囲の整数であり得る。
部分的に還元された抗体は、２〜６つのＳＨ基を有し得る。本発明の好ましい態様では、部分的に還元された抗体は、４つのＳＨ基を有し得る。本発明の好ましい態様では、４つのＳＨ基を有する抗体の割合は、処理された抗体のうちの３０%以上、３１%以上、３２%以上、３３%以上、３４%以上、３５%以上、３６%以上、３７%以上、３８%以上、３９%以上、４０%以上、４１%以上、４２%以上、４３%以上、４４%以上、４５%以上、４６%以上、４７%以上、４８%以上、４９%以上、または５０%以上であり得る。本発明の好ましい態様では、４つのＳＨ基を有する抗体の割合は、処理された抗体のうちの６０%以上、７０%以上、８０%以上、または９０%以上であり得る。
【００２７】
抗体の還元は、マイクロリアクター内の流路中で行ってもよいし、マイクロリアクターに接続した管（チューブ）またはマイクロ流路プレート内の流路で行ってもよい。チューブやマイクロ流路プレートは、反応時間に合わせて流速と流路長を決定することができる。抗体の還元は、タンパク質が変性しない程度（例えば、室温〜３７℃の範囲の温度）に加温して行うことができる。還元時間は、添加するＴＣＥＰの量に応じて適宜調整し得る。ここで、ＳＨ基を４つ有する抗体および／または薬物結合数が４であるＡＤＣの割合が増加するように処理時間を設定し得る。例えば、ＴＣＥＰを抗体の１０倍モル当量用いる場合には還元時間を数秒〜５分、例えば、数秒〜２分程度とし得、好ましくは１分〜５分、より好ましくは、１分〜２分程度である。マイクロ流路を用いた混合により、混合に必要な時間が極めて短縮されるので、抗体の還元反応が均質になり得、また、還元時間が短時間である場合にも、マイクロリアクターを好適に用いることができる。用いるＴＣＥＰの濃度と還元時間は、目的とするＡＤＣが有するべき目標ＤＡＲの値により当業者であれば適宜調整することができるであろう。
【００２８】
（ｂ）トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）とＴＣＥＰによる還元反応中の部分的に還元されたＩｇＧ抗体を含む溶液と、ＴＣＥＰに対して化学量論的に過剰量のＴＣＥＰの阻害剤を含む溶液と、をマイクロリアクターを用いて混合すること
以下、上記（ｂ）について説明する。
本発明では、部分的に還元された抗体の溶液は、前記（ａ）で混合したＴＣＥＰを含んでいる。上記（ｂ）では、トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）とＴＣＥＰによる還元反応中の部分的に還元されたＩｇＧ抗体を含む溶液と、ＴＣＥＰに対して化学量論的に過剰量のＴＣＥＰの阻害剤を含む溶液と、をマイクロリアクターを用いて接触させる。
【００２９】
ＴＣＥＰの阻害剤としては、特に限定されないが例えば、アジド化合物、およびジアジド化合物が挙げられ、例えば、４−アジド安息香酸、アジド−ＰＥＧ３−アジド、５−アジドペンタン酸、２−アジドエチル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド、エチルアジドアセタート、およびトリメチルシリルアジド等の様々なＴＣＥＰの阻害剤が挙げられ、本発明で用いることができる。本発明のある態様では、ＴＣＥＰの阻害剤は、４−アジド安息香酸および２−アジドエチル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドからなる群から選択される１以上の阻害剤であり得、中でも２−アジドエチル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドが好ましい。さらなる別の態様では、ＴＣＥＰの阻害剤は、４−アジド安息香酸であり得る。
【００３０】
ＴＣＥＰの阻害剤は、溶液中のＴＣＥＰに対して、化学量論的に過剰量とすることができ、これにより、ＴＣＥＰによる抗体の更なる還元を停止させ得る。化学量論的な過剰量としては、ＴＣＥＰに対して、２倍モル当量以上、３倍モル当量以上、４倍モル当量以上、５倍モル当量以上、６倍モル当量以上、７倍モル当量以上、８倍モル当量以上、９倍モル当量以上、または１０倍モル当量以上が挙げられる。混合比は、混合する溶液中でのＴＣＥＰおよび／または阻害剤のそれぞれの濃度や流速によって制御することができる。これによって、抗体の還元を迅速に停止させ得る。
本発明の別の態様では、添加するＴＣＥＰの阻害剤が４−アジド安息香酸である場合、抗体の還元時間は１分〜５分、好ましくは、１分〜２分程度とし得る。また、本発明の別の態様では、添加するＴＣＥＰの阻害剤が２−アジドエチル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドである場合、抗体の還元時間は数秒〜１分間、好ましくは数秒〜２０秒、より好ましくは１０秒前後であり得る。添加するＴＣＥＰの阻害剤の濃度と反応時間は、当業者であれば適宜調整することができるであろう。ＴＣＥＰの阻害剤は、抗体の還元を停止させて、そのときの抗体の還元状態を確定することに用いるものであるため、用いる阻害剤の種類、濃度、および反応時間は、当業者であれば適宜調節することができるであろう。
ＡＤＣのＤＡＲの均質化と関連するのは、還元剤の濃度、還元時間、還元剤の阻害剤の種類と濃度であると考えられ、ＤＡＲの大小と関連するのは、還元剤の種類、濃度、および還元時間であると考えられる。還元反応は、還元剤の基質の過剰量を抗体溶液と混合することによっても実施し得る。このような還元剤の基質は、還元停止剤として好ましく用いられ得る。その他、本発明では、当業者に知られている還元停止剤を用いて、抗体の還元反応を停止させることができる。好ましいＤＡＲは、薬物や抗体の違いによっても変わることを当業者は理解する。従って、当業者は好ましいＤＡＲに適合するように、本発明の（ａ）を実施することができる。また、本発明の（ｂ）は、いずれの場合にも過剰量の阻害剤を十分な時間混合することが好ましいことが理解されよう。
【００３１】
後述する（ｃ）では、還元された抗体とリンカーとを反応させて、リンカーと連結した抗体を生成させる。
本発明のある態様では、リンカー（例えば、薬物と連結したリンカー）は、ＴＣＥＰの阻害剤と同時に添加することができる。この態様では、ＴＣＥＰの阻害剤を含む溶液は、リンカーを更に含むものとすることができる。また、本発明のある態様では、リンカー（例えば、薬物と連結したリンカー）は、ＴＣＥＰの阻害剤を混合した後に、
（ｂ２）抗体を含む溶液とリンカーを含む溶液とをマイクロリアクターを用いて混合すること
を含んでいてもよい。リンカーについては前述のリンカーを用い得る。
【００３２】
上記（ａ）と（ｂ）とは、別々のマイクロリアクターを用いて実施することができるが、当該別々のマイクロリアクターは、１つのチップまたは基板に組み込まれていてもよく、または、別々のチップまたは基板に組み込まれていてもよい。上記（ａ）で用いるマイクロリアクターと上記（ｂ）で用いるマイクロリアクターが１つのチップまたは基板に組み込まれている場合には、マイクロリアクター間は、流路（ここで、抗体の還元反応が進み得る）で連結されていてもよい。上記（ａ）で用いるマイクロリアクターと上記（ｂ）で用いるマイクロリアクターが別々のチップまたは基板に組み込まれている場合には、マイクロリアクター間は、チューブ（ここで、抗体の還元反応が進み得る）で連結されていてもよい。
同様に、（ｂ）と（ｂ２）とは、別々のマイクロリアクターを用いて実施することができるが、当該別々のマイクロリアクターは、１つのチップまたは基板に組み込まれていてもよく、または、別々のチップまたは基板に組み込まれていてもよい。上記（ｂ）で用いるマイクロリアクターと上記（ｂ２）で用いるマイクロリアクターが１つのチップまたは基板に組み込まれている場合には、マイクロリアクター間は、流路（ここで、抗体の還元反応が進み得る）で連結されていてもよい。上記（ｂ）で用いるマイクロリアクターと上記（ｂ２）で用いるマイクロリアクターが別々のチップまたは基板に組み込まれている場合には、マイクロリアクター間は、チューブ（ここで、抗体の還元反応が進み得る）で連結されていてもよい。
【００３３】
処理量を増加させる観点で、上記（ａ）、（ｂ）、および（ｂ２）の少なくとも１つまたは全ては、それぞれ並列に行われてもよい。また、上記（ａ）、（ｂ）、および（ｂ２）は、タンデムに連結されたマイクロリアクターを用いて一連の流れとして実施し得る。
【００３４】
（ｃ）部分的に還元された抗体と、抗体のＳＨ基と反応する官能基を有するリンカーとを反応させてリンカーと連結した抗体を生成させること
上記（ｃ）では、部分的に還元された抗体（すなわち、ＳＨ基を有する抗体）と、抗体のＳＨと反応する官能基を有するリンカーとを反応させる。これにより、リンカーと連結した抗体を生成させ得る。リンカーは、例えば、還元された抗体のＳＨ基の数に対して化学量論的に過剰量を抗体と接触させ得る。
【００３５】
（ｃ）では、還元された抗体とリンカーとを反応させて、リンカーと連結した抗体を生成させる。
本発明のある態様では、リンカー（例えば、薬物と連結したリンカー）は、上記（ｂ）においてＴＣＥＰの阻害剤と同時に添加することができる。この態様では、ＴＣＥＰの阻害剤を含む溶液は、リンカーを更に含むものとすることができる。
また、本発明のある態様では、リンカー（例えば、１以上の薬物と連結したリンカー）は、ＴＣＥＰの阻害剤を混合した後に、
（ｂ２）抗体を含む溶液とリンカーを含む溶液とをマイクロリアクターを用いて混合すること
を含んでいてもよい。リンカーについては前述のリンカーを用い得る。
【００３６】
上記（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は、この順番で実施する、またはこの順番で実施し得る。上記（ｂ）以外は、マイクロリアクターを用いずに行ってもよい。例えば、上記（ａ）、（ｃ）、並びに（ａ）および（ｃ）は、マイクロリアクターを用いずに行ってもよい。マイクロリアクターの構造については、上記（ａ）で説明した通りである。
【００３７】
リンカーは、薬物と連結していなくてもよいが、好ましくは薬物と連結したものであり得る。部分的に還元された抗体に、例えば、還元反応を阻害した後に４つのＳＨ基を有する抗体を過剰量のリンカーとを反応させることで、薬物結合数が４である抗体を多く産生させ得る。リンカーが薬物と連結していない場合は、リンカーは、薬物と連結させるための官能基を有し得、後から薬物と連結させることができるものであり得る（例えば、クリックケミストリー、スルフヒドリル基とマレイミド基との反応、およびアミノ基とスクシンイミジル基との反応等により得る）。
【００３８】
得られたＡＤＣにおける抗体群の薬物結合数は、例えば、公知のクロマトグラフィーによって分析することができる。ＡＤＣを分析して得られたクロマトグラムの各ピークの面積を計算することによって、各薬物結合数のＡＤＣの相対的な比率を求め得る。
【００３９】
本発明の方法は、
（ｄ）上記（ｃ）で得られたＡＤＣを精製すること
をさらに含んでいてもよい。ＡＤＣの精製は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、ＡＤＣの精製は、イオン交換カラム、疎水相互作用カラム、ゲル濾過カラム、脱塩カラムや限外ろ過を用いて行うことができる。
【００４０】
本発明の方法は、
（ｅ）精製されたＡＤＣに薬学的に許容可能な賦形剤を添加すること
をさらに含んでいてもよい。
薬学的に許容可能な賦形剤としては、塩、緩衝剤、充填剤、キレート剤、抗酸化剤、等張剤、希釈剤、安定化剤、界面活性剤（例えば、非イオン性界面活性剤）、保存剤等が挙げられる。
【００４１】
本発明の方法で得られたＡＤＣは、ろ過滅菌等によって滅菌され得る。本発明の方法で得られたＡＤＣは、凍結乾燥製剤（例えば、凍結乾燥製剤と希釈剤との組合せ、またはキットの形態）または液剤の形態（例えば、単回投与に好適な量のＡＤＣが充填されたシリンジの形態）で提供され得る。従って、本発明の方法は、
（ｆ）ＡＤＣを含む凍結乾燥製剤と希釈剤との組合せ若しくはキット、またはＡＤＣを含む液剤が充填されたシリンジ若しくはバイアルを提供すること
をさらに含んでいてもよい。
【００４２】
本発明によれば、抗体と薬物とがリンカーを介して連結したＡＤＣまたは当該ＡＤＣを含む医薬の製造において、薬物結合数が所定の値であるＡＤＣの収率を増加させる方法であって、
（ｂ）トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）とＴＣＥＰによる還元反応中の部分的に還元されたＩｇＧ抗体を含む溶液と、ＴＣＥＰに対して化学量論的に過剰量のＴＣＥＰの阻害剤を含む溶液と、をマイクロリアクターを用いて混合すること
を含む、方法が提供される。
本発明のこの側面における方法はさらに、
（ａ）ＩｇＧ抗体を含む溶液とトリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む溶液とを混合して、所定の値のＳＨ基を有する抗体を生成させることをさらに含み得る｛ここで、混合は、マイクロリアクターを用いても用いなくてもよいが、好ましくはこの混合はマイクロリアクターを用いて行うことができる｝。
本発明のこの側面における方法はさらに、
（ｃ）部分的に還元された抗体と、抗体のＳＨ基と反応する官能基を有するリンカーとを反応させてリンカーと連結した抗体を生成させること
をさらに含み得る。
本発明のこの側面における（ａ）〜（ｃ）の各工程は、本発明の上記製造方法の（ａ）〜（ｃ）と同様である。
本発明において、上記所定の値は、１〜７であり得、２〜６であり得、３〜４であり得、または４であり得る。
【００４３】
本発明の方法で用いられる化合物は、マイクロリアクターの流路を目詰まりさせる粒子が取り除かれた状態で提供され得る。本発明では、ＴＣＥＰを含む抗体を還元することに用いる組成物であって、フィルタリング処理された組成物が提供される。本発明では、ＴＣＥＰの阻害剤（特に、４−アジド安息香酸および２−アジドエチル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドからなる群から選択される１以上の阻害剤が好ましく、中でも２−アジドエチル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドが好ましい。）を含む抗体の還元を停止させることに用いる組成物であって、フィルタリング処理された組成物が提供される。本発明では、ＴＣＥＰの阻害剤（特に、４−アジド安息香酸および２−アジドエチル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドからなる群から選択される１以上の阻害剤が好ましく、中でも２−アジドエチル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドが好ましい。）を含む抗体の還元をマイクロリアクターを用いて停止させることに用いる組成物であって、フィルタリング処理された組成物が提供される。
【００４４】
本発明によれば、ＴＣＥＰの阻害剤（特に、４−アジド安息香酸および２−アジドエチル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドからなる群から選択される１以上の阻害剤が好ましく、中でも２−アジドエチル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドが好ましい。）の使用であって、抗体の還元をマイクロリアクターを用いて停止させる使用が提供される。本発明によれば、ＴＣＥＰの阻害剤（特に、４−アジド安息香酸および２−アジドエチル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドからなる群から選択される１以上の阻害剤が好ましく、中でも２−アジドエチル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドが好ましい。）の使用であって、抗体と薬物とがリンカーを介して連結したＡＤＣまたは当該ＡＤＣを含む医薬のマイクロリアクターを用いた製造において、薬物結合数が所定の値であるＡＤＣの収率を増加させる使用が提供される。
【００４５】
上記本発明の製造方法はいずれも、実生産スケールでのＡＤＣの製造に適し得る。実生産スケールとは、医薬品としてのＡＤＣの生産スケールを意味し、例えば、抗体産生細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）を含む培養液約１０００Ｌ〜約１００００Ｌまたはそれ以上の培養液中に産生される抗体（例えば、約１ｋｇ〜約１０ｋｇまたはそれ以上）の処理であり得る。
【実施例】
【００４６】
実施例１：抗体薬物複合体（Antibody-Drug Conjugate; ＡＤＣ）の製造（バッチ法）
本実施例では、バッチ法を用いて抗体に薬物をコンジュゲートさせた。【００４７】
抗体への薬物は、抗体のシステイン残基を還元して得られるＳＨ基と薬物を連結したリンカーの置換基とを反応させることによって連結することができる。本実施例では、薬物を連結したリンカーのマレイミド基と抗体のＳＨ基とを反応させてＡＤＣを作製するスキームを採用した。【００４８】
実施例では、抗体としては、ヒトモノクローナルIgG1抗体を用いた。IgG1抗体は、ADCによく利用されるサブクラスであり、上記のように鎖間に4ヵ所のジスルフィド結合を有する。実施例ではまた、薬物としては、ADCによく利用される抗がん剤である、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）を用いた。また、薬物が連結した上記リンカーとしては、上記薬物が連結したマレイミドカプロイル−Ｖａｌ−Ａｌａ−ｐ−アミノ−ベンゾイルオキシカルボニル−ＭＭＡＤ（MC-VA-PAB-MMAD）を用いた。このリンカーは、還元された抗体が有するＳＨ基とマレイミド基を介して共有結合を生成する。【００４９】
反応容器に20.625 mgの抗体A (IgG1, Kappa) を含む反応溶液（125 mM Tris, 6.25 mM EDTA, 37.5 mM ヒスチジン, 75 mM アルギニン, pH7.2）を0.5 mL添加し、35℃に加温した。還元剤10 mM トリカルボキシエチルホスフィン（TCEP）を抗体の2.1倍モル当量添加し、攪拌しながら15分間、還元処理した。次にMC-VA-PAB-MMAD (Levena Biopharma, San Diego, CA)を10 mM濃度の濃度で含むジメチルアセトアミド（DMA）を抗体の5倍モル等量添加し、35℃で攪拌して、コンジュゲーション反応を15分間行った。反応終了後、30 mM N-アセチルシステイン（富士フィルム和光純薬株式会社）を抗体の5倍モル等量添加、1分間攪拌し、抗体とリンカーとの反応を停止させて抗体薬物複合体（ADC）を得た。TCEPを用いたADCの一般的な合成方法については、例えば、Katherine R. Kozak et al., 2013, Bioconjugate Chemistry, 24: 772-779参照。【００５０】
次に得られたＡＤＣを精製した。脱塩カラム  SpinOUT-GT1200, 3 mL (GBioscience) を15 mLチューブに入れ、バッファー（10mM Histidine, 7.5% w/v Sucrose,0.08% w/v Polysolbate 20, pH5.2）を3 mLを5回繰り返し添加して平衡化した。バッファーを除いた後、新しい15 mLチューブに脱塩カラムを入れ、上記で得られたADC 0.5 mLを添加し、1000 g で6分間遠心し、精製したADC（ろ液画分）を取得した。【００５１】
実施例２：抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の製造（マイクロリアクター法）
本実施例では、マイクロリアクターを用いてＡＤＣを合成した。【００５２】
マイクロリアクターとしては、ＷＯ２０１７−１７９３５３（Ａ１）に記載される、２つの流路（供給路）が合流する合流路を備え、２つの流路の端から溶液をそれぞれ導入すると、合流路において溶液が混合されるように設計されたものを用いた。マイクロリアクターは、シースフロー型とした。マイクロリアクターは、タンデムに複数を連結して、第１のマイクロリアクターで抗体と還元剤とを混合し、第２のマイクロリアクターで還元された抗体と薬物を連結したリンカーとを混合し、第３のマイクロリアクターで抗体と薬物との反応を停止させる試薬をさらに混合した。マイクロリアクター間はチューブで連結し、チューブ内でも反応が進むように設計した。本実施例で用いたマイクロリアクターの流路および反応路は、幅0.2 mm及び深さ0.2 mmを有した。【００５３】
実施例１と同様に調製した抗体溶液（pH7.2, 35℃）を2 mL/minの流速で、還元剤 10 mM TCEPを0.12 mL/min の流速（抗体の2.1倍モル当量）でマイクロリアクターのそれぞれの流路に導入して反応路において混合させ、混合液はマイクロリアクターに接続したチューブ内で15分間還元反応させた。反応液は、引き続き10 mM MC-VA-PAB-MMADと0.29 mL/min の流速（抗体の5倍モル当量）でマイクロリアクターを用いて混合し、混合液は15分間チューブ内でコンジュゲーション反応した。反応終了後、直ちに反応液をサンプリングし30 mM N-アセチルシステイン（富士フィルム和光純薬株式会社）を抗体の5倍モル等量添加し、1分間攪拌し、ADCを得た。なお、マイクロリアクター及びチューブは、35℃に水浴で加温して、上記の反応を実施した。ADCの精製は実施例１と同様に行った。【００５４】
実施例３：抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の製造（マイクロリアクター法）
本実施例では、マイクロリアクターを用いてＡＤＣを合成した。【００５５】
マイクロリアクターとしては、流路および反応路は、幅0.5 mm及び深さ0.5 mmを有する以外は、実施例２で記載した通りのマイクロリアクターを用いた。【００５６】
実施例１と同様に調製した抗体溶液（pH7.2, 35℃）を22 mL/minの流速で、還元剤 10 mM TCEPを1.3 mL/min の流速（抗体の2.1倍モル当量）でマイクロリアクターを用いて混合し、混合液は15分間チューブ内で反応させた。反応液は、引き続き10 mM MC-VA-PAB-MMADを3.1 mL/min の流速（抗体の5倍モル当量）でマイクロリアクターを用いて混合し、混合液は15分間チューブ内で反応させた。還元およびコンジュゲーションは35℃で行った。引き続き、反応液は、30 mM N-アセチルシステインを1.0 mL/min の流速（抗体の5モル当量）でマイクロリアクターを用いて混合し、混合液は室温、1分間チューブでクエンチング反応させ、ADCを得た。ADCの精製は実施例１と同様に行った。【００５７】
実施例４：ＡＤＣに対する薬物結合数（Drug to Antibody Ratio: DAR）の分析
得られたＡＤＣに対する薬物結合数（Drug to Antibody Ratio: DAR）は以下の通りに分析した。疎水クロマトグラフィーカラム TSKgel Butyl-NPR カラム(4.6 mm I.D. x 10 cm, 2.5 μm, Tosoh Bioscience LLC, Japan ) をWaters alliance HPLCシステムに接続して、A液 (25mM Sodium phosphate monobasic monohydrate/1.5M Ammonium Sulfate, pH7) から B液 (75% 25mM Sodium phosphate monobasic monohydrate, pH7/25% IPA) にグラジエントをかけて分析した。UV280nmでピークを検出し、得られた各ピークの面積値から各DAR値および平均薬物結合数（Average DAR: Ave. DAR）を算出した。
Ave. DARは、各ピークの薬物結合数（0, 1, 2, 3, 4, 6, 8）とピーク面積%を掛け、ADC産物を集計して100で割ることによって決定した（ピーク面積%は、保持時間（分）に対してプロットされたUV280nmにおける光学密度のピークの下の測定面積により決定された、ピーク面積パーセントである。）。【００５８】
実施例１〜３で得られたＡＤＣのクロマトグラムはそれぞれ図１で示される通りであった。図１に示されるように、バッチ法では、薬物結合数ＤＡＲが０、２、４、６および８であるピークが観察された。マイクロリアクターを用いた方法でも同様に、薬物結合数ＤＡＲが０、２、４、６および８であるピークが観察された。【００５９】
また、実施例１〜３で得られたＡＤＣのＤＡＲ分析結果はそれぞれ表１で示される通りであった。【００６０】
【表１】
2020075817.tif 000003
※バッチ法におけるAve. DARの計算式は下記となる：{(0 x 3.9) + (1 x 4.6) + (2 x 16.4) + (3 x 3.8) + (4 x 39.6) + (6 x 23.3) + (8 x 8.5)}/100 = 4.2。【００６１】
表１に示されるように、Ave. DARおよび各DARのピークのDARの割合において、マイクロリアクター法は、バッチ法と同等の結果であった。【００６２】
このことから、マイクロリアクター法でも、バッチ法と同様にＡＤＣを合成することが可能であった。また、特にＤＡＲ３〜４のＡＤＣの収率において、バッチ法とマイクロリアクター法とで大きな違いは認められなかった。【００６３】
実施例５：ＡＤＣの製造（マイクロリアクター法）
マイクロリアクターとしては、実施例２に記載のマイクロリアクターを用いた。
抗体溶液(27.5 mg/mLの実施例1と同じ抗体, 30mM ヒスチジン, 50mM アルギニン, 3.8% w/v スクロース, 0.04% w/v ポリソルベート20) 30mLにバッファー (25mM EDTA, 0.5M Tris, pH7.8) 10 mLを添加して調製した抗体溶液（pH7.2, 35℃）を2 mL/minの流速で、還元剤 10 mM TCEPを0.29mL/min の流速（抗体の10倍モル当量）でマイクロリアクターを用いて混合し、通過液は室温で、1.5分間チューブ内で反応させた。反応液は、引き続き14 mM MC-VA-PAB-MMADとTCEPの阻害剤としての70 mM ４−アジド安息香酸（4-ABA）の混合液を0.2 mL/min の流速（MC-VA-PAB-MMADは抗体の10倍モル当量、4-ABAは抗体の50倍モル当量）でマイクロリアクターを用いて混合し、室温で、30分間チューブ内で反応させた。コンジュゲーション反応終了後、反応液をサンプリングし30 mM N-アセチルシステイン（富士フィルム和光純薬株式会社）を抗体の5倍モル等量添加し、1分間攪拌し、クエンチング反応をさせ、ADCを得た。ADCの精製は、実施例１と同様に実施し、DAR値の分析は実施例４と同様に実施した。クロマトグラムを図２に、DAR分析結果を表２に示す。【００６４】
図２に示されるように、実施例５のマイクロリアクター法では、ＤＡＲ４のＡＤＣのピークが他のＤＡＲを有するＡＤＣのピークよりも相対的に大きくなった。【００６５】
【表２】
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【００６６】
表２に示されるように、実施例５のマイクロリアクター法では、実施例１〜３の方法と比較して、例えば、ＤＡＲ４のＡＤＣの割合が、他のＤＡＲを有するＡＤＣの割合よりも有意に大きくなった。表２によれば、マイクロリアクターを用いてＴＣＥＰを混合することではＤＡＲ４のＡＤＣを割合を大きく変動させるには至らなかったが、還元反応中の抗体に対してＴＣＥＰの阻害剤をマイクロリアクターを用いて過剰量混合することによって抗体の還元を停止させると、ＤＡＲの分布が大きく変動した。従って、還元中の抗体に対して、還元の抑制剤をマイクロリアクターを用いて混合することが、ＤＡＲ分布に影響すること、および、ＤＡＲ４のＡＤＣの収率を向上させうることが明らかとなった。また、実施例５に記載のマイクロリアクターでは、反応終了後の流路内に目詰まりは確認されなかった。【００６７】
実施例６：抗体薬物複合体（Antibody-Drug Conjugate; ＡＤＣ）の製造（バッチ法）
本実施例では、バッチ法を用いて抗体に薬物をコンジュゲートさせた。【００６８】
抗体への薬物は、抗体のシステイン残基を還元して得られるＳＨ基と薬物を連結したリンカーの置換基とを反応させることによって連結することができる。本実施例では、薬物を連結したリンカーのマレイミド基と抗体のＳＨ基とを反応させてＡＤＣを作製するスキームを採用した。【００６９】
実施例では、抗体としては、ヒトモノクローナルIgG1抗体（ハーセプチン）を用いた。IgG1抗体は、ADCによく利用されるサブクラスであり、上記のように鎖間に4ヵ所のジスルフィド結合を有する。実施例ではまた、薬物としては、ADCによく利用される抗がん剤である、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）を用いた。また、薬物が連結した上記リンカーとしては、上記薬物が連結したマレイミドカプロイル−Ｖａｌ−Ａｌａ−ｐ−アミノ−ベンゾイルオキシカルボニル−ＭＭＡＤ（MC-VA-PAB-MMAD）を用いた。このリンカーは、還元された抗体が有するＳＨ基とマレイミド基を介して共有結合を生成する。【００７０】
反応容器に10.15 mgのハーセプチンを含む反応溶液（125 mM Tris, 6.25 mM EDTA, 37.5 mM ヒスチジン, 75 mM アルギニン）を0.5 mL添加した。還元剤10 mM トリカルボキシエチルホスフィン（TCEP）を抗体の2.４倍モル当量添加し、攪拌しながら60分間、還元処理した。次にMC-VA-PAB-MMAD (Levena Biopharma, San Diego, CA)を10 mM濃度の濃度で含むジメチルアセトアミド（DMA）を抗体の5倍モル等量添加し、コンジュゲーション反応を60分間行った。反応終了後、30 mM N-アセチルシステイン（富士フィルム和光純薬株式会社）を抗体の10倍モル等量添加、1分間攪拌し、抗体とリンカーとの反応を停止させて抗体薬物複合体（ADC）を得た。TCEPを用いたADCの一般的な合成方法については、例えば、Katherine R. Kozak et al., 2013, Bioconjugate Chemistry, 24: 772-779参照。【００７１】
次に得られたＡＤＣを精製した。脱塩カラム  SpinOUT-GT1200, 3 mL (GBioscience) を15 mLチューブに入れ、バッファー（10mM Histidine, 7.5% w/v Sucrose,0.08% w/v Polysolbate 20, pH5.2）3 mLを5回繰り返し添加して平衡化した。バッファーを除いた後、新しい15 mLチューブに脱塩カラムを入れ、上記で得られたADC 0.5 mLを添加し、1000 g で6分間遠心し、精製したADC（ろ液画分）を取得した。【００７２】
実施例７：ＡＤＣの製造（マイクロリアクター法）
マイクロリアクターとしては、実施例２と同じマイクロリアクターを用いた。
抗体溶液(20.3 mg/mLのハーセプチン, 30mM ヒスチジン, 50mM アルギニン, 3.8% w/v スクロース, 0.04% w/v ポリソルベート20) 60mLにバッファー (25mM EDTA, 0.5M Tris, pH7.8) 20 mLを添加して調製した抗体溶液を1.5 mL/minの流速で、還元剤 10 mM TCEPを0.15mL/min の流速（抗体の10倍モル当量）でマイクロリアクターを用いて混合し、通過液は室温で、2分間チューブ内で反応させた。反応液は、引き続き14 mM MC-VA-PAB-MMADおよびTCEPの阻害剤としての70 mM ４−アジド安息香酸（4-ABA）の混合液と0.11 mL/min の流速（MC-VA-PAB-MMADは抗体の10倍モル当量、4-ABAは抗体の50倍モル当量）でマイクロリアクターを用いて混合し、室温で、35分間チューブ内で反応させた。コンジュゲーション反応終了後、反応液をサンプリングし30 mM N-アセチルシステイン（富士フィルム和光純薬株式会社）を抗体の5倍モル等量添加し、1分間攪拌し、クエンチング反応をさせ、ADCを得た。ADCの精製は、実施例１と同様に実施し、DAR値の分析は実施例４と同様に実施した。クロマトグラムを図３に、DAR分析結果を表３に示す。【００７３】
【表３】
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【００７４】
図３に示されるように、実施例７のマイクロリアクター法では、実施例６のバッチ法と比較してＤＡＲ４のＡＤＣのピークが他のＤＡＲを有するＡＤＣのピークよりも相対的に大きくなった。【００７５】
表３に示されるように、実施例７のマイクロリアクター法では、実施例６の方法と比較して、例えば、ＤＡＲ４のＡＤＣの割合が、他のＤＡＲを有するＡＤＣの割合よりも有意に大きくなった。表３によれば、還元反応中の抗体に対してＴＣＥＰの阻害剤をマイクロリアクターを用いて過剰量混合することによって抗体の還元を停止させると、ＤＡＲの分布が大きく変動した。従って、還元中の抗体に対して、還元の抑制剤をマイクロリアクターを用いて混合することが、ＤＡＲ分布に影響すること、および、ＤＡＲ４のＡＤＣの収率を向上させうることが明らかとなった。実施例５と実施例７では異なる抗体を用いたが、いずれの抗体もTCEP阻害剤の過剰混合によって、DARの分布が変化することが明らかになった。また、実施例７に記載のマイクロリアクターでは、反応終了後の流路内に目詰まりは確認されなかった。【００７６】
実施例８：ＡＤＣの製造（マイクロリアクター法）
マイクロリアクターとしては、２つの流路（供給路）が合流する合流路を備え、２つの流路の端から溶液をそれぞれ導入すると、合流路において溶液が混合されるように設計されたYMC社製マイクロリアクターSpica（Static型）を用いた。マイクロリアクターは、タンデムに複数を連結して、第１のマイクロリアクターで抗体と還元剤とを混合し、次いで、第２のマイクロリアクターで還元された抗体と薬物を連結したリンカーおよびTCEP阻害剤とを混合した。マイクロリアクター間はチューブで連結し、チューブ内でも反応が進むように設計した。本実施例で用いたマイクロリアクターの流路は、幅0.2 mm及び深さ0.2 mmを有した。
抗体溶液(20.3 mg/mLのハーセプチン, 30mM ヒスチジン, 50mM アルギニン, 3.8% w/v スクロース, 0.04% w/v ポリソルベート20) 60mLにバッファー (25mM EDTA, 0.5M Tris, pH7.8) 20 mLを添加して調製した抗体溶液を1.5 mL/minの流速で、還元剤 10 mM TCEPを0.15mL/min の流速（抗体の10倍モル当量）でマイクロリアクターを用いて混合し、通過液は室温で、2分間チューブ内で反応させた。反応液は、引き続き14 mM MC-VA-PAB-MMADおよびTCEPの阻害剤としての70 mM ４−アジド安息香酸（4-ABA）の混合液と0.11 mL/min の流速（MC-VA-PAB-MMADは抗体の10倍モル当量、4-ABAは抗体の50倍モル当量）でマイクロリアクターを用いて混合し、室温で、35分間チューブ内で反応させた。コンジュゲーション反応終了後、反応液をサンプリングし30 mM N-アセチルシステイン（富士フィルム和光純薬株式会社）を抗体の5倍モル等量添加し、1分間攪拌し、クエンチング反応をさせ、ADCを得た。ADCの精製は、実施例１と同様に実施し、DAR値の分析は実施例４と同様に実施した。クロマトグラムを図４に、DAR分析結果を表４に示す。【００７７】
【表４】
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【００７８】
図４に示されるように、実施例８のマイクロリアクター法では、実施例７のマイクロリアクター法と同様に、実施例６のバッチ法と比較してＤＡＲ４のＡＤＣのピークが他のＤＡＲを有するＡＤＣのピークよりも相対的に大きくなった。【００７９】
実施例７と実施例８では異なるマイクロリアクターを用いてTCEP阻害剤の過剰混合を実施した結果を示すものである。表４に示されるように、実施例７と実施例８のマイクロリアクター法を比較して同等のＤＡＲを有するADC化合物が得られることが示された。また、実施例８に記載のマイクロリアクターでは、反応終了後の流路内に目詰まりは確認されなかった。【００８０】
実施例９：ＡＤＣの製造（マイクロリアクター法）
マイクロリアクターとしては、実施例７と同じマイクロリアクターを用いた。本実施例で用いたマイクロリアクターの流路は、幅0.2 mm及び深さ0.2 mmを有した。
抗体溶液(20.3 mg/mLのハーセプチン, 30mM ヒスチジン, 50mM アルギニン, 3.8% w/v スクロース, 0.04% w/v ポリソルベート20) 59mLにバッファー (25mM EDTA, 0.5M Tris, pH7.8) 19.7 mLを添加して調製した抗体溶液を1.5 mL/minの流速で、還元剤 10 mM TCEPを0.11mL/min の流速（抗体の7倍モル当量）でマイクロリアクターを用いて混合し、通過液は室温で、10秒間チューブ内で反応させた。反応液は、引き続き14 mM MC-VA-PAB-MMADおよびTCEPの阻害剤としての140 mM 2-アジドエチル2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシド（AADG）の混合液と0.11 mL/min の流速（MC-VA-PAB-MMADは抗体の10倍モル当量、4-ABAは抗体の100倍モル当量）でマイクロリアクターを用いて混合し、室温で、20分間チューブ内で反応させた。コンジュゲーション反応終了後、反応液をサンプリングし30 mM N-アセチルシステイン（富士フィルム和光純薬株式会社）を抗体の5倍モル等量添加し、1分間攪拌し、クエンチング反応をさせ、ADCを得た。ADCの精製は、実施例１と同様に実施し、DAR値の分析は実施例４と同様に実施した。クロマトグラムを図５に、DAR分析結果を表５に示す。【００８１】
【表５】
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【００８２】
図５に示されるように、実施例９のマイクロリアクター法では、実施例８のマイクロリアクターと比較して、ＤＡＲ４のＡＤＣのピークが他のＤＡＲを有するＡＤＣのピークよりも相対的に大きくなった。【００８３】
表５に示されるように、実施例９のマイクロリアクター法では、実施例８のマイクロリアクター法と比較して、例えば、ＤＡＲ４のＡＤＣの割合が、他のＤＡＲを有するＡＤＣの割合よりも有意に大きくなった。表５によれば、TCEP還元剤であるアジド化合物、４−アジド安息香酸（4-ABA）と2-アジドエチル2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシド（AADG）は共にDAR4の割合を大きくすることに効果があることが示された。また、2-アジドエチル2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシド（AADG）は、４−アジド安息香酸（4-ABA）と比較してDAR４の割合を大きくする効果が大きいことが示された。また、実施例９に記載のマイクロリアクターでは、反応終了後の流路内に目詰まりは確認されなかった。【００８４】
このように、抗体を還元剤を用いて還元し、部分的な還元状態の抗体が得られたときに、マイクロ流路と混合流路を備えたマイクロリアクター内で、上記部分的な還元状態の抗体と上記還元剤に対する阻害剤を混合することで、抗体の還元反応を適切なタイミングで停止させることによって、抗体の還元状態の程度を制御することができることが明らかになった。これによって、ＳＨ基と反応する基を有するリンカーおよびペイロード（薬物）が、抗体に対して還元状態に応じた比率で結合することとなる。従って、本実施例で例示した方法では、目的のＤＡＲを有するＡＤＣの収率が高めることが可能である。本実施例では、例えば、ＤＡＲが４であるＡＤＣの製造効率を高める方法を例示したが、ＤＡＲは、４以外にも調整することが可能であろう。例えば、ＩｇＧサブタイプ毎に好ましいＤＡＲに分布させるために本発明の方法は用い得るであろう。また、還元阻害剤として、様々な還元阻害剤を用いることができ、その中で、製造物の目的に合わせて還元阻害剤を適宜選択すればよいことも明らかとなった。本実施例では、ＡＤＣの製造効率を高める方法において、４−ＡＢＡとＡＡＤＧの有用性を明らかにした。本発明では、還元反応を停止させる溶液を還元反応中の抗体溶液と混合させるプロセスにおける、マイクロリアクターの有用性を明らかにした。本発明ではまた、還元反応を開始させる溶液を抗体溶液と混合させるプロセスにおける、マイクロリアクターの有用性も明らかである。【００８５】
産業上の利用可能性
マイクロリアクターを用いた抗体の還元反応の阻害または停止は、ＡＤＣのＤＡＲ値を制御または改変する手法（特に、ＤＡＲ４であるＡＤＣを製造する方法、またはＤＡＲ４であるＡＤＣの収率を向上させる方法）として有用であり得る。本発明の製造方法は、特に実生産スケールでのＡＤＣの製造方法として有用であり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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