(57)【要約】  本発明の課題は、広範囲の注入対象の細胞核内に生体分子を含む溶液を高効率で直接注入できる注入器の提供であり、該課題を、注入器本体から、所定の構造物が注入対象内に挿入された状態での前記所定の構造物を介した注入を行うことなく、生体分子を含む溶液を前記注入対象に対して注入する注入器であって、生体分子を含む溶液を収容する収容部と、点火装置での点火薬の燃焼により加圧された前記生体分子を含む溶液が流れ、前記注入対象に対して射出される射出口を有するノズル部と、を備え、前記生体分子を含む溶液の射出開始時刻から時刻０．２０ミリ秒までの間の前記生体分子を含む溶液の最大射出速度が７５ｍ／秒以上１５０ｍ／秒以下であり、前記生体分子を含む溶液の射出速度が７５ｍ／秒以上１５０ｍ／秒以下で０．１１ミリ秒間以上継続する、注入器で解決する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
注入器本体から、所定の構造物が注入対象内に挿入された状態での前記所定の構造物を介した注入を行うことなく、生体分子を含む溶液を前記注入対象に対して注入する注入器であって、
生体分子を含む溶液を収容する収容部と、
点火装置での点火薬の燃焼により加圧された前記生体分子を含む溶液が流れ、前記注入対象に対して射出される射出口を有するノズル部と、
を備え、
前記生体分子を含む溶液の射出開始時刻から時刻０．２０ミリ秒までの間の前記生体分子を含む溶液の最大射出速度が７５ｍ／秒以上１５０ｍ／秒以下であり、前記生体分子を含む溶液の射出速度が７５ｍ／秒以上１５０ｍ／秒以下で０．１１ミリ秒間以上継続する、
注入器。
【請求項２】
請求項１に記載の注入器を用いて、注入対象の細胞核内に生体分子を含む溶液を注入する方法。
【請求項３】
請求項１に記載の注入器を用いて、注入対象の細胞核内に遺伝子を含むＤＮＡを含む溶液を注入する工程を含む、
注入対象において遺伝子を発現させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、注入器に関する。詳細には、本発明は、注入器、並びに、該注入器を用いた注入対象の細胞核内への生体分子を含む溶液の注入方法、及び、注入対象において遺伝子を発現させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体等に薬液を注入する注入器として、注射針を介して注射を行う有針注射器、注射針を介することなく注射を行う無針注射器のほか、薬液を注入対象に輸送するために注射針や駆動源を備えたカテーテルなどが存在する。
このうち無針注射器では、加圧ガスやバネ、電磁力により注射液が収容された収容室に対して圧力を加えることで注射成分を射出する構成が採られることがある。例えば、注射器本体の内部に複数のノズル孔が形成されるとともに、各ノズル孔に対応して射出時に駆動されるピストンを配置させる構成が採用されている（特許文献１）。この構成により、複数のノズル孔から注射液を同時に噴射させて対象への均一な注射を実現しようとしている。そして、ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドをラットに注射し、高効率に細胞移入できている。
また、無針注射器での注射液の射出動力源として、加圧ガスを利用する形態がある。例えば、射出初期に瞬間的に大きな加圧を行った後、40〜50msecかけて加圧力を徐々に低減させていく加圧形態が例示されている（特許文献２）。【０００３】
しかし、注入器により、広範囲の注入対象の細胞核内に生体分子を含む溶液を高効率で直接注入できることは報告されていない。また、広範囲の注入対象の細胞核内に生体分子を含む溶液が高効率で直接注入されるために必要な、注入器からの生体分子を含む溶液の射出条件に着目した報告はなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−３５８２３４号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／００１０１６８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はこの様な状況下でなされたものであり、広範囲の注入対象の細胞核内に生体分子を含む溶液を高効率で直接注入できる注入器の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討した結果、点火薬による点火装置を用い、生体分子を含む溶液を収容した注入器において、該注入器から射出される生体分子を含む溶液の射出開始時刻から所定時間内の該生体分子を含む溶液の射出速度に着目した結果、下記の注入器が上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。本発明は以下に示すとおりである。【０００７】
〔１〕注入器本体から、所定の構造物が注入対象内に挿入された状態での前記所定の構造物を介した注入を行うことなく、生体分子を含む溶液を前記注入対象に対して注入する注入器であって、生体分子を含む溶液を収容する収容部と、点火装置での点火薬の燃焼により加圧された前記生体分子を含む溶液が流れ、前記注入対象に対して射出される射出口を有するノズル部と、を備え、前記生体分子を含む溶液の射出開始時刻から時刻０．２０ミリ秒までの間の前記生体分子を含む溶液の最大射出速度が７５ｍ／秒以上１５０ｍ／秒以下であり、前記生体分子を含む溶液の射出速度が７５ｍ／秒以上１５０ｍ／秒以下で０．１１ミリ秒間以上継続する、注入器。
〔２〕〔１〕に記載の注入器を用いて、注入対象の細胞核内に生体分子を含む溶液を注入する方法。
〔３〕〔１〕に記載の注入器を用いて、注入対象の細胞核内に遺伝子を含むＤＮＡを含む溶液を注入する工程を含む、注入対象において遺伝子を発現させる方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、広範囲の注入対象の細胞核内に生体分子を含む溶液を高効率で直接注入できる注入器を提供できる。
また、前記注入器を用いて広範囲の注入対象の細胞核内に生体分子を含む溶液を高効率で直接注入する方法、及び、前記注入器を用いて広範囲の注入対象において高効率で遺伝子を発現させる方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の第一の発明の一実施態様に係る注入器の概略構成を示す図である。
【図２】本発明の第一の発明の一実施態様に係る、充填した水の射出速度の時間経過を示すグラフである。
【図３】本発明の第二の発明の一実施態様に係る、哺乳動物個体（生体）内の細胞核と哺乳動物個体（生体）内に導入されたＤＮＡの分布を示す図である（図面代用写真）。
【図４】本発明の第三の発明の一実施態様に係る、ラットへルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ溶液を投与した後、外側サンプルの発光強度（ＲＬＵ）を中心サンプルの発光強度（ＲＬＵ）で除し、百分率表示した数値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、注入器の発明（第一の発明）、前記注入器を用いて注入対象の細胞核内に生体分子を含む溶液を注入する方法の発明（第二の発明）、及び、前記注入器を用いて注入対象において遺伝子を発現させる方法の発明（第三の発明）を含む。
【００１１】
＜第一の発明＞
本発明の第一の発明は、注入器本体から、所定の構造物が注入対象内に挿入された状態での前記所定の構造物を介した注入を行うことなく、生体分子を含む溶液を前記注入対象に対して注入する注入器であって、生体分子を含む溶液を収容する収容部と、点火装置での点火薬の燃焼により加圧された前記生体分子を含む溶液が流れ、前記注入対象に対して射出される射出口を有するノズル部と、を備え、前記生体分子を含む溶液の射出開始時刻から時刻０．２０ミリ秒までの間の前記生体分子を含む溶液の最大射出速度が７５ｍ／秒以上１５０ｍ／秒以下であり、前記生体分子を含む溶液の射出速度が７５ｍ／秒以上１５０ｍ／秒以下で０．１１ミリ秒間以上継続する、注入器である。
【００１２】
本発明の第一の発明に係る注入器では、上記火薬の燃焼エネルギーを射出エネルギーとして利用する。本発明の第一の発明に係る注入器は、生体分子を含む溶液の射出開始時刻から時刻０．２０ミリ秒までの間の前記生体分子を含む溶液の最大射出速度が７５ｍ／秒以上１５０ｍ／秒以下であり、前記生体分子を含む溶液の射出速度が７５ｍ／秒以上１５０ｍ／秒以下で０．１１ミリ秒間以上継続することにより、広範囲の注入対象の細胞核内に生体分子を含む溶液を高効率で直接注入することができる。
詳細には、例えば、注入対象が哺乳動物個体（生体）内の細胞である場合、生体分子を含む溶液の射出開始時刻から時刻０．２０ミリ秒までの間の前記生体分子を含む溶液の最大射出速度が７５ｍ／秒以上であることにより、生体分子を含む溶液が哺乳動物個体（生体）の表皮を貫通し、真皮に注入される際にせん断力により細胞が変形すると期待され、その結果、生体分子を含む溶液が哺乳動物個体（生体）内の細胞の細胞核内に高効率で直接注入される。該最大射出速度は、好ましくは９０ｍ／秒以上である。
また、生体分子を含む溶液の射出開始時刻から時刻０．２０ミリ秒までの間の前記生体分子を含む溶液の最大射出速度が１５０ｍ／秒以下であることにより、注入方向（深さ方向）に射出しすぎない、例えば、注入対象が哺乳動物個体（生体）であって、該哺乳動物が雌性ラット（１０週齢）等である場合に、生体分子を含む溶液が該ラットの筋膜を貫通しないことが期待される。該最大射出速度は、好ましくは１３０ｍ／秒以下である。
また、前記生体分子を含む溶液の射出速度が７５ｍ／秒以上１５０ｍ／秒以下で０．１１ミリ秒間以上継続することにより、生体分子を含む溶液が、注入方向（深さ方向）ではなく、その周辺領域に広がることが期待され、広範囲の注入対象の細胞核内に生体分子を含む溶液が高効率で直接注入される。例えば、注入対象が哺乳動物個体（生体）内の細胞である場合、哺乳動物個体（生体）の表皮を貫通して真皮に注入された前記生体分子を含む溶液が、注入方向（深さ方向）ではなく、その周辺領域に広がることが期待され、哺乳動物個体（生体）内の広範囲の細胞の細胞核内に生体分子を含む溶液が高効率で直接注入される。
【００１３】
本発明の第一の発明における、注入対象の細胞核内に注入される生体分子とは、注入対象の細胞核内に注入された際に該注入対象の細胞核内又は細胞内において機能するものであれば特に制限されない。また、該生体分子は天然物であってもよいし、人工的に合成されたものであってもよい。例えば、核酸又はその誘導体；ヌクレオシド、ヌクレオチド、又はそれらの誘導体；アミノ酸、ペプチド、タンパク質、又はそれらの誘導体；脂質又はその誘導体；金属イオン；低分子化合物、又はその誘導体；抗生物質；ビタミン又はその誘導体等が挙げられる。核酸であれば、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、それらは遺伝子を含んでもよい。後述の実施例では、生体分子として、遊離のＣｙ３標識プラスミドＤＮＡを用いている。
注入対象の細胞核内に注入される生体分子は、生体分子が安定して存在し、また、注入される注入対象や注入対象の細胞核を破壊するなどの悪影響がなければ、遊離の形態でもナノ粒子等の担体に固定されている形態でもよく、修飾されていてもよく、溶媒を含め、その態様は特に限定されない。
ＤＮＡが遺伝子を含む場合には、発現カセットや発現ベクターに該遺伝子が含まれた形態で設計されること等が挙げられる。さらに、例えば、ＤＮＡが注入される注入対象の種類および注入部位に適したプロモーターの制御下に遺伝子が配置されていてもよい。すなわち、いずれの態様においても公知の遺伝子工学的手法を用いることができる。
【００１４】
本発明の第一の発明に係る注入器において、「先端側」とは、注入器から生体分子を含む溶液が射出される射出口が配置されている側を意味し、「基端側」とは、注入器において先端側とは反対の側を意味するものであり、これらの文言は、特定の箇所や位置を限定的に指すものではない。
【００１５】
本発明の第一の発明に係る注入器は、注入器本体から、所定の構造物が注入対象内に挿入された状態での前記所定の構造物を介した注入を行うことなく、生体分子を含む溶液を前記注入対象に対して注入するものである。本発明の第一の発明に係る注入器は、例えば、注入器本体から注入対象までの距離が大きい場合等に、生体分子を含む溶液を注入器本体から注入対象まで誘導するもの、例えば、カテーテル等のような所定の構造物を含んでもよい。したがって、本発明の第一の発明に係る注入器とは、そのような所定の構造物を含んでも含まなくてもよいが、所定の構造物を含む場合には、該所定の構造物が注入対象内に挿入された状態で生体分子を含む溶液が該注入対象に注入されるものではない。
【００１６】
本発明の第一の発明に係る注入器において、駆動部は、点火装置によって点火される火薬の燃焼エネルギーを射出エネルギーとして採用する。すなわち、加圧は、点火装置での点火薬の燃焼により生じる加圧される。なお、火薬の燃焼エネルギーを射出エネルギーとして利用する場合、火薬としては、例えば、ジルコニウムと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＺＰＰ）、水素化チタンと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＴＨＰＰ）、チタンと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＴｉＰＰ）、アルミニウムと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＡＰＰ）、アルミニウムと酸化ビスマスを含む火薬（ＡＢＯ）、アルミニウムと酸化モリブデンを含む火薬（ＡＭＯ）、アルミニウムと酸化銅を含む火薬（ＡＣＯ）、アルミニウムと酸化鉄を含む火薬（ＡＦＯ）のうち何れか一つの火薬、又はこれらのうち複数の組み合わせからなる火薬であってもよい。これらの火薬の特徴としては、その燃焼生成物が高温状態では気体であっても常温では気体成分を含まないため、点火後燃焼生成物が直ちに凝縮を行う。
また、ガス発生剤の発生エネルギーを射出エネルギーとして利用する場合、ガス発生剤としては、シングルベース無煙火薬や、エアバッグ用ガス発生器やシートベルトプリテンショナ用ガス発生器に使用されている各種ガス発生剤を用いることも可能である。
【００１７】
本発明の第一の発明に係る注入器では、充填室には当初から生体分子を含む溶液が収容されているのではなく、射出口を有するノズルを介して生体分子を含む溶液を充填室内に吸引することにより収容する。このように、充填室への充填操作を必要とする構成を採用することで、必要とする任意の生体分子を含む溶液を注入することが可能となる。そのため、本発明の第一の発明に係る注入器では、シリンジ部は着脱可能に構成されている。
【００１８】
以下に、図面を参照して本発明の第一の発明における一実施形態に係る注入器の例として、注射器１（無針注射器）について説明する。なお、以下の実施形態の構成は例示であり、本発明の第一の発明はこの実施の形態の構成に限定されるものではない。なお、注射器１の長手方向における相対的な位置関係を表す用語として、「先端側」及び「基端側」を用いる。当該「先端側」は、後述する注射器１の先端寄り、すなわち射出口３１ａ寄りの位置を表し、当該「基端側」は、注射器１の長手方向において「先端側」とは反対側の方向、すなわち駆動部７側の方向を表している。また、本例示は、ＤＮＡ溶液を、生体分子を含む溶液として用いる例示であるが、本発明の第一の発明はこれに限定されるものではない。
【００１９】
（注射器１の構成）
図１は、注射器１の概略構成を示す図であり、注射器１のその長手方向に沿った断面図でもある。注射器１は、シリンジ部３とプランジャ４とで構成されるサブ組立体と、注射器本体６とピストン５と駆動部７とで構成されるサブ組立体とが一体に組み立てられた注射器組立体１０が、ハウジング（注射器ハウジング）２に取り付けられることで構成される。
【００２０】
上記の通り、注射器組立体１０は、ハウジング２に対して脱着自在となるように構成されている。注射器組立体１０に含まれるシリンジ部３とプランジャ４との間に形成される充填室３２にはＤＮＡ溶液が充填され、そして、当該注射器組立体１０は、ＤＮＡ溶液の射出を行う度に使い捨てられるユニットである。一方で、ハウジング２側には、注射器組立体１０の駆動部７に含まれる点火器７１に電力供給するバッテリ９が含まれている。バッテリ９からの電力供給は、ユーザがハウジング２に設けられたボタン８を押下する操作を行うことで、配線を介してハウジング２側の電極と、注射器組立体１０の駆動部７側の電極との間で行われることになる。なお、ハウジング２側の電極と注射器組立体１０の駆動部７側の電極とは、注射器組立体１０がハウジング２に取り付けられると、自動的に接触するように両電極の形状および位置が設計されている。またハウジング２は、バッテリ９に駆動部７に供給し得る電力が残っている限りにおいて、繰り返し使用することができるユニットである。なお、ハウジング２においては、バッテリ９の電力が無くなった場合には、バッテリ９のみを交換しハウジング２は引き続き使用してもよい。
【００２１】
また、図１に示す注射器本体６内には、特に追加的な火薬成分は配置されていないが、ピストン５を介してＤＮＡ溶液にかける圧力推移を調整するために、点火器７１での火薬燃焼によって生じる燃焼生成物によって燃焼しガスを発生させるガス発生剤等を、点火器７１内や注射器本体６の貫通孔内に配置することもできる。点火器７１内にガス発生剤を配置する構成は、国際公開公報０１−０３１２８２号や特開２００３−２５９５０号公報等に開示されているように既に公知の技術である。また、ガス発生剤の一例としては、ニトロセルロース９８質量％、ジフェニルアミン０．８質量％、硫酸カリウム１．２質量％からなるシングルベース無煙火薬が挙げられる。また、エアバッグ用ガス発生器やシートベルトプリテンショナ用ガス発生器に使用されている各種ガス発生剤を用いることも可能である。貫通孔内に配置されるときのガス発生剤の寸法や大きさ、形状、特に表面形状を調整することで、該ガス発生剤の燃焼完了時間を変化させることが可能であり、これにより、ＤＮＡ溶液にかける圧力推移を所望の推移、すなわち注入対象にＤＮＡ溶液が適切に注入され得る推移とすることができる。本発明の第一の発明では、必要に応じて使用されるガス発生剤なども駆動部７に含まれるものとする。
【００２２】
（注入対象）
本発明の第一の発明におけるは、注入対象は、細胞、細胞シート内の細胞、組織内の細胞、器官（臓器）内の細胞、器官系内の細胞、個体（生体）内の細胞のいずれであってもよく制限はない。好ましい注入対象としては、哺乳動物由来の前記注入対象が挙げられる。より好ましくは、哺乳動物個体（生体）内の細胞であり、さらに好ましくは皮膚内の細胞であり、よりさらに好ましくは、皮内、皮下及び皮筋からなる群から選択される一以上の組織内の細胞である。この場合、注入器から哺乳動物個体（生体）の皮膚表面に生体分子を含む溶液を射出し、該皮膚表面から該皮膚内の皮内、皮下及び皮筋からなる群から選択される一以上の組織内の細胞に注入する方法を採用できる。
また、注入器から注入対象に生体分子を含む溶液を注入する場合の系としては、in vitro系、in vivo系、ex vivo系をはじめ、いずれであってもよい。
また、哺乳動物としては特に制限されないが、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サル、イヌ、ネコ等が挙げられる。また、注入対象によっては、哺乳動物としてヒトを除く態様も挙げられる。
【００２３】
（広範囲の注入対象の細胞核内に生体分子を含む溶液が直接注入されたことを確認する方法）
広範囲の注入対象の細胞核内に生体分子を含む溶液が直接注入されたことを確認する方法は、特に制限されず、公知の生物学的手法を用いることができる。例えば、生体分子を予め蛍光標識しておき、注入対象の細胞核内に注入した後に蛍光顕微観察する方法などが挙げられる。後述の実施例では、哺乳動物個体（生体）内の細胞の細胞核に直接注入されるＤＮＡとしてＣｙ３標識プラスミドＶ７９０５（Ｍｉｒｕｓ社製）を用い、核染色色素としてＤＡＰＩを用いている。サンプルは、例えば、ＤＮＡを注入後に直ちに組織を取得し、切片化して調製することができる。このとき、ＤＡＰＩ染色を同時に行ってもよい。Ｃｙ３標識プラスミドＶ７９０５が注入された位置では赤色の蛍光を発し、細胞核の位置ではＤＡＰＩにより青色の蛍光を発することから、蛍光顕微観察により、青紫色の蛍光を発する位置が、細胞核内に直接注入されたＣｙ３標識プラスミドＶ７９０５の位置であると同定できる。
【００２４】
＜第二の発明＞
本発明の第二の発明は、第一の発明の注入器を用いて、注入対象の細胞核内に生体分子を含む溶液を注入する方法である。
本発明の第二の発明における注入器、注入対象、生体分子を含む溶液については、上記した本発明の第一の発明の説明を援用する。
【００２５】
＜第三の発明＞
本発明の第三の発明は、第一の発明の注入器を用いて、注入対象の細胞核内に遺伝子を含むＤＮＡを含む溶液を注入する工程を含む、注入対象において遺伝子を発現させる方法である。  
本発明の第三の発明における注入器、注入対象、遺伝子を含むＤＮＡを含む溶液については、上記した本発明の第一の発明の説明を援用する。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を逸脱しない限り、下記の実施例に限定されるものではない。【００２７】
（注入器の射出速度の評価）
［実施例１］
図１に示す注入器（ノズル径：直径０．１ｍｍ）に、１００μＬの水を充填し、点火薬の燃焼による水の射出開始時刻からの前記水の射出速度を評価した。火薬として、ジルコニウムと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＺＰＰ）を３５ｍｇ用い、ガス発生剤は用いなかった。水の射出速度は、高速カメラ（Photoron社製、FASTCAM SA-X2）で注入器の先端を撮影し、射出された水の変位と時間から算出した。【００２８】
図２と表１は、それぞれ、実施例１における、水の射出速度の時間経過を示すグラフと表である。尚、表１においては、ある時刻の射出速度は、その１つ前に記載した時刻の水の変位と、その１つ後に記載した時刻の水の変位との差をその時間で除したものである。例えば、時刻０．０１３ミリ秒欄の射出速度は、時刻０．０００ミリ秒における水の変位と時刻０．０２０ミリ秒における水の変位との差をその時間０．０２０ミリ秒間で除したものである。【００２９】
【表１】
2019156237.tif 000003
【００３０】
（哺乳動物個体（生体）内の細胞の細胞核内へのＤＮＡ溶液の注入試験）
［実施例２］
上記実施例１で用いた注入器に、火薬として、ジルコニウムと過塩素酸カリウムを含む火薬（ＺＰＰ）を３５ｍｇ、ガス発生剤として、シングルベース無煙火薬を４０ｍｇ用い、Ｃｙ３標識プラスミドＶ７９０５を含む溶液３０μＬ（溶媒：エンドトキシンフリーＴＥバッファ）、終濃度：０．１ｍｇ／ｍＬ）を充填し、雌性ＳＤラット（１０週齢）の腰背部の皮膚に注入した。尚、上記の通り、実施例１ではガス発生剤を用いなかったが、本実施例ではガス発生剤を使用した。これは、ガス発生剤の有無は、本発明で規定される初期の射出速度に影響を及ぼさないと考えられるからである。
注入後直ちに採皮し、ＯＣＴコンパウンド（凍結組織切片作製用包埋剤（ティシュー・テックO.C.T.コンパウンド）、サクラファインテックジャパン社製）中でドライアイスにより凍結した。クライオスタット（ライカ社製）を用いて注入部断面を６μｍの厚さで薄切しＤＡＰＩ入り封入剤で封入した。作成した試料をオールインワン蛍光顕微鏡（Ｚ−Ｘ７００、キーエンス社製）で蛍光観察し、Ｃｙ３の赤色蛍光画像とＤＡＰＩの青色蛍光画像を０．１〜０．４μｍ厚みで取得した。注入領域での注入分布を得るために複数の視野での画像を取得した。その結果を図３に示す。スケールバーは０．７３ｍｍを示す。
ＤＮＡが直接注入された細胞数の割合を、ハイブリッドセルカウント機能を用いて次のように算出した。すなわち、各解析対象領域（図３における白枠で囲われた各領域）内の各細胞について、細胞の面積に対して、青色蛍光と赤色蛍光とが重なった紫色蛍光の面積が５０％以上である細胞を、ＤＮＡが直接注入された細胞と定義し、その細胞数を数えた（これを細胞数Ａとする。）。一方で、各解析対象領域内の全細胞数を細胞核の個数を指標にして数えた（これを細胞数Ｂとする。）。図３の各解析対象領域に記載した割合は、細胞数Ｂに対する細胞数Ａの割合である。尚、Ｃｙ３の赤色蛍光がほとんど観察されない表皮と毛包については解析対象から除外した。【００３１】
図３より、実施例２においては、注入口直下の狭い範囲ではなく、注入口を中心に広範囲の細胞の細胞核内に高い割合でＤＮＡが直接注入されていた。【００３２】
（ラットを用いた遺伝子発現評価）
［実施例３］
上記実施例１で用いた注入器に、ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドpGL3-control vector（プロメガ社製）溶液３０μＬ（溶媒：エンドトキシンフリーＴＥバッファ、終濃度：１．０ｍｇ／ｍＬ）を充填し、雌性ＳＤラット（１０週齢）の腰背部の皮膚に注入した。
尚、上記の通り、実施例１ではガス発生剤を用いなかったが、本実施例ではガス発生剤を使用した。これは、ガス発生剤の有無は、本発明で規定される初期の射出速度に影響を及ぼさないと考えられるからである。
注入後の該ラットを飼育環境に戻し２４時間後、安楽死させた後に注入口を中心に直径１ｍｍφの円形に皮内から皮筋（すなわち、皮内、皮下及び皮筋）までの組織を摘出し、これを「中心サンプル」とした。また、注入口から１．５〜２ｍｍ程度離れた位置を中心に直径１ｍｍφの円形に皮内から皮筋（すなわち、皮内、皮下及び皮筋）までの組織を摘出し、これを「外側サンプル」とした。外側サンプルは注入口を中心に点対称となるような位置で２箇所採取した。
Luciferase assay system（プロメガ社）の「Cell Culture Lysis×５」を５倍希釈して２ｍＬマイクロチューブに０．１ｍＬ入れた溶解液を準備し、中心サンプルを該溶解液へ添加した。次に、該マイクロチューブをドライアイス雰囲気に約１５分入れて凍結した。凍結したことを確認し、室温下に約２０分放置し解凍した。この凍結と解凍を計３回繰り返し、細胞の破壊を促した。その後、サンプルを５分間静置し、上清を取得した。
また、２箇所の外側サンプルについても各々実施した。【００３３】
ルシフェラーゼアッセイはルミテスターＣ１００（キッコーマンバイオケミファ株式会社製）を用いて行った。まず、Luciferase assey systemのLuciferase Assay Substrateを室温に戻して開封し、その中に室温に戻したLuciferase Assay Bufferを１０ｍＬ加えた。泡立てないように軽く振りまぜ、溶解していることを確認した。これをルミチューブに１００μＬ添加し、測定する上清サンプルを２０μＬ添加し、均一になるよう数回ピペッティングした。約２０秒以内にルミテスターの測定室にサンプルを入れて測定をし、発光強度を取得した。外側サンプルについては、２箇所の外側サンプルの発光強度の平均値をもって、外側サンプルの発光強度とした。該発光強度（ＲＬＵ）は、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量と相関する。尚、該ラットに対してＤＮＡ溶液の注入範囲が狭いために外側サンプルを取得するのに不十分であると判断されたものは除外して解析した。【００３４】
実施例３で得られた発光強度（ＲＬＵ）について、外側サンプルのＲＬＵを中心サンプルのＲＬＵで除した数値を百分率表示した結果を、図４に示す。図４において、ひし形のプロットは各数値、横棒が平均値を示す。
図４より、実施例３においては、外側サンプルにおいても比較的高い遺伝子発現が観測されており、注入口を中心とした狭い範囲のみでなく注入口を中心に広範囲の組織において効率的な遺伝子の発現が得られた。
【符号の説明】
【００３５】
１・・・・注射器
２・・・・ハウジング
３・・・・シリンジ部
４・・・・プランジャ
５・・・・ピストン
６・・・・注射器本体
７・・・・駆動部
８・・・・ボタン
９・・・・バッテリ
１０・・・・注射器組立体
３１・・・・ノズル部
３１ａ・・・射出口
３２・・・・充填室
７１・・・・点火器
【図１】
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【図２】
2019156237.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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