(57)【要約】  凍結ブロックから薄切りして作製した標本を染色した際に、バックグランドの少ない包埋剤を提供する。  凍結切片作製用の包埋剤であって、該包埋剤は、凍結包埋剤と、合成コラーゲンと、を含む、包埋剤で課題を解決できる。
2019163657.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結切片作製用の包埋剤であって、該包埋剤は、
凍結包埋剤と、
合成コラーゲンと、
を含む、包埋剤。
【請求項２】
凍結切片の薄切性を改善するためのカルボン酸、
を更に含む、請求項１に記載の包埋剤。
【請求項３】
前記合成コラーゲンが、下記式（１）で表される、
−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−  （１）
請求項１または２に記載の包埋剤。
【請求項４】
前記合成コラーゲンが、下記式（２）で表される、
−（Ｐｒｏ−Ｚ−Ｇｌｙ）ｎ−  （２）
請求項１または２に記載の包埋剤。
【請求項５】
前記式（２）中のＺが、プロリン残基（Ｐｒｏ）又はヒドロキシプロリン残基（Ｈｙｐ）から選択される、請求項４に記載の包埋剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は包埋剤に関し、特に、合成コラーゲンを含む包埋剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療の現場では、手術中に生体組織を採取し、良性か悪性か、また、切除断端への浸潤・リンパ節転移の有無を迅速に検査することが求められている。手術中に当該検査を行うことで、手術中に術式を変更したり切除範囲を適切に決定することができ、手術の精度を上げることができる。【０００３】
手術中の生体組織の検査は、迅速性や抗原性の保持が優れていることから、一般的には、凍結組織標本を作製し、顕微鏡観察で行われている。凍結組織標本は、採取した生体組織を凍結包埋剤で包埋→凍結（以下、生体組織を凍結包埋剤で包埋して凍結したものを、「凍結ブロック」と記載することがある。）→薄切→染色することで作製できる。凍結包埋剤としては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリマーを用いたものが知られており、凍結包埋剤として市販されている。【０００４】
しかしながら、市販されている凍結包埋剤を用いて薄切すると、シワ、破れ等が発生し易く、きれいな薄膜（切片）を得ることが困難な場合がある。特に、多くの病院・研究機関では、凍結包埋剤としてＯ．Ｃ．Ｔコンパウンドが使用されているが、生体組織がＯ．Ｃ．Ｔコンパウンドとなじみが悪い場合は、薄切が難しいという問題がある。更に、凍結組織標本は、薄切した生体組織の切片をスライドガラスに接着して作製するが、従来の凍結包埋剤を用いた場合は、スライドガラスから剥がれやすいという問題がある。【０００５】
本発明者らは、水溶液とした際に１５℃〜２５℃では液体状態で且つ４℃では固体状態となるゼラチンを標本作製用包埋剤として用いる、又は、公知の凍結包埋剤に前記ゼラチンを添加することで、上記問題を解決できることを見出し、特許出願をしている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１９９１９５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、ゼラチンは動物性蛋白質のため、標本を作製する生体組織に馴染みやすい。更に、ゼラチンは粘着性を有する。そのため、特許文献１に記載のゼラチンからなる包埋剤、或いは、凍結包埋剤にゼラチンを添加した包埋剤は、生体組織に入り込んだゼラチンが残渣として残ることから、硬化性基材非浸透標本を作製する際に、生体組織の支持体への密着性が向上するというメリットがある。しかしながら、硬化性基材非浸透標本をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）等を用いて染色した場合、残渣として支持体上に残ったゼラチンも染色される。そのため、染色した標本を画像解析ソフトにより解析する場合、染色されたゼラチンも含めて解析されることから、解析精度が落ちるという問題がある。【０００８】
本明細書における開示は、上記従来の問題を解決するためになされたものであり、鋭意研究を行ったところ、（１）公知の凍結包埋剤への添加剤として合成コラーゲンを用いると、凍結ブロックの薄切性が向上すること、（２）合成コラーゲンは０℃〜常温で液体であることから、標本作製時の水の温度が低くても洗い流しやすく、生体組織を染色した時のバックグラウンドを減少できること、を新たに見出した。【０００９】
すなわち、本明細書における開示の目的は、公知の凍結包埋剤の薄切性を改善でき、生体組織を染色した時のバックグラウンドが少ない包埋剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書における開示は、以下に示す包埋剤に関する。【００１１】
［１］凍結切片作製用の包埋剤であって、該包埋剤は、
凍結包埋剤と、
合成コラーゲンと、
を含む、包埋剤。
［２］凍結切片の薄切性を改善するためのカルボン酸、
を更に含む、上記［１］に記載の包埋剤。
［３］前記合成コラーゲンが、下記式（１）で表される、
−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−  （１）
上記［１］または［２］に記載の包埋剤。
［４］前記合成コラーゲンが、下記式（２）で表される、
−（Ｐｒｏ−Ｚ−Ｇｌｙ）ｎ−  （２）
上記［１］または［２］に記載の包埋剤。
［５］前記式（２）中のＺが、プロリン残基（Ｐｒｏ）又はヒドロキシプロリン残基（Ｈｙｐ）から選択される、
上記［４］に記載の包埋剤。
【発明の効果】
【００１２】
本明細書で開示する包埋剤は、合成コラーゲンの添加により、包埋剤を用いて作製した凍結ブロックの薄切性を向上できる。また、支持体上に生体組織を貼着した後、合成コラーゲンを水で洗い流すことができるので、染色した時のバックグランドが少なくなる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、図面代用写真で、図１Ａは、実施例１及び２、並びに、比較例１の包埋剤を用いて作製した凍結ブロックの写真である。また、図１Ｂは、凍結ブロックを薄切した凍結切片の写真である。
【図２】図２は、図面代用写真で、図２Ａは、実施例３及び４、並びに、比較例２の包埋剤を用いて作製した凍結ブロックの写真である。また、図２Ｂは、凍結ブロックを薄切した凍結切片の写真である。
【図３】図３は、図面代用写真で、図３Ａは、実施例５で作製したＨＥ染色標本の写真である。図３Ｂは、比較例３で作製したＨＥ染色標本の写真である。
【図４】図４は、図面代用写真で、図４Ａは実施例６で作製した凍結ブロックの写真、図４Ｂは凍結ブロックを薄切りした凍結切片の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、包埋剤の実施形態について詳しく説明する。
【００１５】
本明細書で開示する包埋剤は、凍結包埋剤及び合成コラーゲンを少なくとも含んでいる。なお、本明細書において「合成コラーゲン」とは、発酵や合成から生成したアミノ酸のみを使用して合成した非動物由来型の高分子コラーゲンを意味する。
【００１６】
牛、豚、魚等の動物から抽出して得られた動物由来コラーゲンは、臭い成分などの不純物が混入しているため、無臭化することは非常に困難であると言われている。そのため、原料の違いにより、不純物等の比率が異なり、製品間の品質を均質化することは難しい。一方、合成コラーゲンは合成により製造されるため、臭い成分等の不純物が混入することはない。また、合成条件を一定にすることで、所期の分子量の合成コラーゲンを得ることもできる。
【００１７】
更に、動物由来の材料には夾雑物が混入する恐れがある。そのため、動物由来の材料を含む包埋剤を用いて標本を作製すると、染色の際に夾雑物も染色されバックグラウンドとなる可能性がある。一方、合成コラーゲンには夾雑物が混入する恐れがないことから、染色の際に、包埋剤に起因するバックグラウンドの発生を抑えることができる。
【００１８】
合成コラーゲンは、上記の通り、発酵や合成から生成したアミノ酸のみを使用して合成した非動物由来型の高分子コラーゲンであれば、特に制限はない。例えば、一型コラーゲン分子は、式（１）で表す三アミノ酸残基の繰り返しを含む一次構造を有する。このポリペプチドは、同じ向きに３本寄り集って形成された三重らせんの三次構造をとることが知られている。
−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−  （１）
【００１９】
上記式（１）中、Ｘ及びＹは、夫々独立して以下のアミノ酸残基から選択される。
Ａｌａ：Ｌ−アラニン残基、
Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン残基
Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン残基
Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸残基
Ｃｙｓ：Ｌ−システイン残基
Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン残基
Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸残基
Ｈｉｓ：Ｌ−ヒスチジン残基
Ｈｙｐ：Ｌ−ヒドロキシプロリン残基
Ｉｌｅ：Ｌ−イソロイシン残基
Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン残基
Ｌｙｓ：Ｌ−リジン残基
Ｍｅｔ：Ｌ−メチオニン残基
Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン残基
Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン残基
Ｓａｒ：サルコシン残基
Ｓｅｒ：Ｌ−セリン残基
Ｔｈｒ：Ｌ−トレオニン残基
Ｔｒｐ：Ｌ−トリプトファン残基
Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン残基
Ｖａｌ：Ｌ−バリン残基
【００２０】
上記の通り、Ｘ、Ｙは任意の組み合わせであるが、ＸがＰｒｏ、ＹがＨｙｐの場合が好ましい。式（１）で表される合成コラーゲンは、公知の製造方法により製造すればよい。例えば、−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）−の繰り返し単位を含むペプチドオリゴマーを、ジメチルスルホキシド中やエチレンジアミンを含む水系溶媒等中で縮合反応させることで合成できる。なお、水系溶媒中で縮合反応を行う場合、溶媒中のリン酸イオン濃度を調節することで、分子量を調整できる（特開２０１７−８０９４号公報参照）。また、合成コラーゲンの側鎖がアミノ基を持つ場合は、必要に応じて、公知の方法によりサクシニル化、フタル化、アセチル化してもよい。遊離アミノ基を無くすことで、合成コラーゲンが固まり難くなる。
【００２１】
また、式（１）以外の合成コラーゲンとしては、以下の式（２）で表す三アミノ酸残基の繰り返しからなるものも知られている。
−（Ｐｒｏ−Ｚ−Ｇｌｙ）ｎ−  （２）
【００２２】
上記式（２）中、Ｚはプロリン残基（Ｐｒｏ）又はヒドロキシプロリン残基（Ｈｙｐ）から選択される。つまり、上記式（２）で表される合成コラーゲンは、
（Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）単位からなる、ポリ（Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）、
（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）単位からなる、ポリ（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）、
（Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）単位、及び、（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）単位が、任意の順番で縮合したポリ（Ｐｒｏ−Ｐｒｏ又はＨｙｐ−Ｇｌｙ）、
の態様が含まれる。
【００２３】
式（１）及び（２）の繰り返し数ｎは、目的の分子量や、共存する配列に応じて適宜設定することができる。例えば、繰り返し数ｎの下限値は、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上等が挙げられ、上限値は、５００００以下、５０００以下、１０００以下、７５０以下、５００以下、２５０以下等が挙げられる。
【００２４】
合成コラーゲンは、公知の方法を用いて製造してもよいし、市販されているものを用いてもよい。市販されている合成コラーゲンとしては、ハイブリッドコラーゲン（ユニクス株式会社製）、ピュアコラ（ＪＮＣ株式会社製）等が挙げられる。
【００２５】
本明細書で開示する包埋剤に含まれる凍結包埋剤としては、公知の凍結包埋剤を用いればよい。例えば、Ｏ.Ｃ.Ｔコンパウンド（サクラファインテック社製）、ホワイトティシュコート（ユーアイ化成社製）、ＦＳＣ２２（ライカ社製）、クリオマウント（低粘度及び高粘度；武藤化学社製）、クリオマトリックス(サーモフィッシャーサイエンティフィック)、ＳＣＡＭ（ＳＥＣＴＩＯＮ−ＬＡＢ）等が挙げられる。
【００２６】
合成コラーゲンを凍結包埋剤に添加することで、凍結ブロックの薄切性を向上することができる。また、凍結ブロックから凍結切片を作製した後は、凍結切片中の合成コラーゲンは、水で簡単に流すことができる。したがって、凍結包埋剤に対する合成コラーゲンの添加量は、所期の薄切性能が得られ、凍結包埋剤の凍結包埋機能を喪失しない範囲内であれば特に制限はない。特に制限はされないが、例えば、凍結包埋剤１００重量部に対し、合成コラーゲンは、０．００１〜１．０重量％程度添加されていればよい。
【００２７】
本明細書で開示する包埋剤を用いて生体組織を包埋し、凍結・薄切することで「硬化性基材浸透標本」及び「硬化性基材非浸透標本」を作製することができる。「硬化性基材浸透標本」とは、標本上の組織が長期間保存しても壊れないように永久的に固定するため、ホルマリン、パラフォルムアルデヒド、グルタルアルデヒド等の公知の固定液により固定化した生体組織を脱脂・脱水などの処理をした後に、パラフィン、エポキシ樹脂、メタクリレート、アルカリ系ポリエステル等の硬化性基材を、組織の内部まで浸透させて生体組織を硬化した標本を意味する。代表的なものとしてパラフィン標本が挙げられる。標本は公知の方法により作製すればよい。
【００２８】
そして、「硬化性基材非浸透標本」とは、上記「硬化性基材」を使用せずに作製した標本を意味する。例えば、上記の固定液で固定化した生体組織、または、未固定生体組織を、包埋剤等を用いて硬度を持たせ、薄切して得られた切片を支持体に貼着した標本が挙げられる。代表的なものとして凍結標本が挙げられる。
【００２９】
硬化性基材非浸透標本を用いて病理検査を行う例として、（１）水で硬化性基材非浸透標本を洗うことで、支持体上に付着している包埋剤を洗い流し、（２）ＨＥ染色、脂肪染色等の染色法、又は、酵素抗体法（ＤＡＢ）、蛍光抗体法等の免疫染色法等、公知の方法で染色し、（３）顕微鏡観察する、手順が挙げられる。当該手順（１）において、包埋剤（或いは薄切性改善剤）としてゼラチンを用いた場合、水で洗いきれずに残渣として付着したゼラチンが染色されるという問題があった。一方、合成コラーゲンは０℃〜常温で液体である。そのため、水の温度が低くても、支持体上に残渣として付着する合成コラーゲンが少なくなり、染色時のバックグラウンドを低くできる。
【００３０】
なお、「硬化性基材非浸透標本」を作製する際には、薄切して得られた切片を支持体に貼着した後に、固定液で生体組織を固定する場合がある。その際に、固定液として遊離アミノ基を架橋するアルデヒド系固定液（例えば、ホルマリン）を用いるとゼラチンも固定され、固定化工程後にゼラチンを洗い流すことはできなかった。一方、遊離アミノ基を有しない合成コラーゲンを用いた場合は、アルデヒド系固定液で固定されない。したがって、遊離アミノ基を有しない合成コラーゲンを用いると、合成コラーゲンを含んだ状態で生体組織をアルデヒド系固定液による固定化工程を行った場合でも、固定化工程後に合成コラーゲンを洗い流すことができ、染色のバックグラウンドを低くできる。
【００３１】
遊離アミノ基を有しない合成コラーゲンを得るためには、上記のとおり、遊離アミノ基をサクシニル化、フタル化、アセチル化すればよい。或いは、式（２）の合成コラーゲンを用いればよい。なお、アルコール固定等、固定液として遊離アミノ基を架橋しない固定液を用いる場合は、遊離アミノ基がある合成コラーゲンでもよい。したがって、合成コラーゲンとしては、遊離アミノ基の有無に関係なく用いることができるが、多様な標本作成方法に対応できるとの観点からは、遊離アミノ基を有しない合成コラーゲンを用いることが好ましい。
【００３２】
本明細書で開示する包埋剤は、必要に応じて、水溶性物質を加えてもよい。例えば、糖類、塩類、エキス類、ビタミン類、ｐＨ調整剤類、色素類、界面活性剤類からなる群から選択される水溶性物質が挙げられる。
【００３３】
前記水溶性物質についてより具体的に記載すると、糖類（例えば、アガロース、スクロース、ソルビト−ル、マルチト−ル、水飴、乳糖、果糖、オリゴ糖等）；加工澱粉類（例えば、焙焼デキストリン、酵素変性デキストリン等のデキストリン）；塩類（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム等）；エキス類（例えば、牛、豚、貝、野菜由来のエキス等）；ビタミン類（例えば、ビタミンＣ、ビタミンＣナトリウム、ビタミンＢ１塩酸塩等）；ｐＨ調整剤類（例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、コハク酸、フタル酸、塩酸、硫酸、酢酸、リンゴ酸、酒石酸等）；色素類（例えば、赤色２号，３号，１０２号，１０５号，１０６号、黄色４号，５号、青色２号等）；界面活性剤類（例えば、蔗糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコ−ル脂肪酸エステル等）が挙げられ、それぞれ単独で用いても良いし２種以上併用しても良い。
【００３４】
標本を作製する際の支持体としては、薄切した生体組織の切片を貼着し顕微鏡観察できるものであれば特に制限は無く、スライドガラスや光透過性の樹脂フィルム等が挙げられる。
【００３５】
作製した硬化性基材非浸透標本を用いての病理検査は、上記のとおりである。また、作製した硬化性基材浸透標本を用いて病理検査する場合は、ＨＥ染色、ＰＡＳ染色、アルシアン青染色、等の染色法、又は、酵素抗体法（ＤＡＢ）、蛍光抗体法等の免疫染色法等、公知の方法で染色し、顕微鏡観察すればよい。
【００３６】
また、標本作製用試料が脂肪組織の場合、脂肪組織が凍結する温度まで冷却しても凍結ブロックの良好な薄切性が得られる必要がある。その場合、必要に応じて、包埋剤にカルボン酸を添加してもよい。カルボン酸化合物としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸等のモノカルボン酸化合物；シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸等のジカルボン酸化合物；クエン酸等のトリカルボン酸化合物；安息香酸、フタル酸等の芳香族カルボン酸化合物；乳酸、リンゴ酸等のヒドロキシ酸化合物；クロロ酢酸等のハロゲンで置換されたカルボン酸化合物；等が挙げられる。カルボン酸化合物の添加量は、薄切性が改善する量であれば特に制限は無く、包埋剤やカルボン酸化合物の種類に応じて適宜調整すればよい。
【００３７】
以下に実施例を掲げ、包埋剤の実施形態を具体的に説明するが、この実施例は単に実施形態の具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は、発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
【実施例】
【００３８】
［包埋剤の作製］
＜実施例１＞
凍結包埋剤として、Ｏ．Ｃ．Ｔコンパウンド（サクラファインテック社製）を用い、合成コラーゲンとして、０．５％ハイブリッドコラーゲン（ユニクス社製）を用いた。そして、凍結包埋剤：合成コラーゲンを、９：１の割合で混合することで包埋剤を作製した。なお、０．５％ハイブリッドコラーゲンに含まれる合成コラーゲンの量は０．５重量％である。したがって、Ｏ．Ｃ．Ｔコンパウンドに対する合成コラーゲンの添加量は、９：０．００５となり、凍結包埋剤１００重量部に対する合成コラーゲンの添加量は、０．０５６重量となる。【００３９】
＜実施例２＞
実施例１で作製した包埋剤１ｇに、酢酸（Ｗａｋｏ社製）３０μｌを添加することで、酢酸を添加した包埋剤を作製した。【００４０】
＜実施例３＞
Ｏ．Ｃ．Ｔコンパウンド（サクラファインテック社製）に代え、ホワイトティシュコートＦＬ（ユーアイ化成社製）を用いた以外は、実施例１と同様の手順で包埋剤を作製した。【００４１】
＜実施例４＞
実施例３で作製した包埋剤１ｇに、酢酸（Ｗａｋｏ社製）３０μｌを添加することで、酢酸を添加した包埋剤を作製した。【００４２】
＜比較例１＞
合成コラーゲンを添加していないＯ．Ｃ．Ｔコンパウンドのみを、比較例１の包埋剤とした。【００４３】
＜比較例２＞
合成コラーゲンを添加していないホワイトティシュコートＦＬのみを、比較例２の包埋剤とした。【００４４】
［凍結切片の作製］
次に、実施例１〜４及び比較例１〜２の包埋剤を用いて、以下の手順で凍結切片を作製した。
（１）予め、アルミブロック超低温層Ｍｉｃｒｏ  Ｃｏｏｌ  ＭＣ−１００（ＴＯＭＹ社製）内に、銅ブロック（７０×１１０×３０ｍｍ）、凍結切片作製用金属チャック、及び、金属重りを、−５０℃で冷却した。
（２）試料としてヒト脂肪を用い、作製した包埋剤を気泡が入らないように試料に馴染ませた。
（３）クリオモルド３号（サクラファインテックジャパン社製）の底部をくり抜いたものを銅ブロック上に置き、上記（２）の試料と包埋剤をクリオモルド３号内に置いた。次に、凍結切片作製用金属チャックを被せ、さらに金属重りを載せて、Ｍｉｃｒｏ  Ｃｏｏｌの蓋をし、試料及び包埋剤の凍結ブロックを作製した。
（４）金属重り及びクリオモルドを外し、クライオスタットミクロトーム（ライカ社製ＣＭ３０５０）を用いて凍結ブロックの薄切を行い、厚さ約５μｍの凍結切片を得た。【００４５】
図１Ａは、実施例１及び２、並びに、比較例１の包埋剤を用いて作製した凍結ブロックの写真である。また、図１Ｂは、凍結ブロックを薄切りした凍結切片の写真である。【００４６】
図２Ａは、実施例３及び４、並びに、比較例２の包埋剤を用いて作製した凍結ブロックの写真である。また、図２Ｂは、凍結ブロックを薄切りした凍結切片の写真である。【００４７】
図１Ｂ及び図２Ｂの写真から明らかなように、比較例１及び２の凍結包埋剤のみで作製した凍結切片は、試料部分の抜けが多かった。一方、合成コラーゲンを添加した実施例１〜４の包埋剤を用いて作製した凍結切片は、比較例１及び２より、試料の抜けは少なかった。更に、凍結包埋剤に合成コラーゲン及び酢酸を添加した方が、試料の抜けが少なくなると共に、凍結切片のしわが少なくなった。以上の結果より、凍結包埋剤に合成コラーゲンを添加することで、凍結ブロックの薄切性、特に、試料部分の薄切性が向上し、更に酢酸を添加することで、試料部分の薄切性がより向上することが明らかとなった。【００４８】
［染色性の比較］
＜実施例５＞
試料としてマウスの腎臓、包埋剤として実施例１の包埋剤を用い、液体窒素で冷却したイソペンタンにて凍結ブロックを作製後、クライオスタットで薄切をし、凍結切片を得た。次に、以下の手順で染色を行った。
（ａ）得られた凍結切片を、スライドガラスを押し当て貼着することで硬化性基材非浸透標本を作製した。
（ｂ）得られた硬化性基材非浸透標本を水道水で濯ぐことで、スライドガラス上の合成コラーゲンを洗い流した。次いでヘマトキシリン・エオジン（メルク社製）を用い、ＨＥ染色を行った。図３Ａは、実施例５で作製したＨＥ染色標本の写真である。【００４９】
＜比較例３＞
包埋剤として、魚由来のゼラチンであるＭＡＸ−Ｆ（株式会社ニッピ社製）水溶液（濃度は５重量％）とＯ．Ｃ．Ｔコンパウンドを１：１の割合で混合したものを用いた以外は、上記＜実施例５＞と同様の手順で、ＨＥ染色した硬化性基材非浸透標本を作製した。図３Ｂは、比較例３で作製したＨＥ染色標本の写真である。【００５０】
図３Ｂから明らかなように、ゼラチンを含む包埋剤を用いて作製したＨＥ染色標本は、組織周辺がＨＥにより染色されていた。これは、硬化性基材非浸透標本を水道水で濯いだ際に、水で流れずに残ったゼラチンの影響と考えられる。一方、図３Ａから明らかなように、合成コラーゲンを含む包埋剤を用いて作製したＨＥ染色標本は、組織周辺にＨＥ染色のバックグラウンドは確認されなかった。【００５１】
以上の結果より、合成コラーゲンはゼラチンと同様、凍結包埋剤に添加することで、凍結ブロックから凍結切片を作製する際に、生体組織部分も含めた薄切性を向上するという効果を有することが明らかとなった。一方、硬化性基材非浸透標本後に水道水で濯いだ際に、ゼラチンと比較して合成コラーゲンは非常に流れやすい。その結果、合成コラーゲンを凍結包埋剤に添加すると、凍結ブロックの薄切性の向上に加え、染色によるバックグラウンドを低減できるという顕著な効果を奏することが明らかとなった。【００５２】
［シュウ酸を用いた包埋剤］
＜実施例６＞
凍結包埋剤として、ホワイトティシュコートＦＬ（ユーアイ化成社製）を９．５ｇ、合成コラーゲンとして、０．５％ハイブリッドコラーゲン（ユニクス社製）を０．５ｇ、１０％シュウ酸（片山化学工業株式会社製）を３００μｌ混合することで、包埋剤を作製した。次に、生体組織としてヒト脂肪を用い、作製した包埋剤を用いて、上記［凍結切片の作製］と同様の手順で、凍結切片を作製した。図４Ａは凍結ブロックの写真、図４Ｂは凍結ブロックを薄切りした凍結切片の写真である。図４Ｂから明らかなように、シュウ酸を用いた場合も、生体試料部分の薄切性が良好な凍結切片が得られた。実施例２、４、及び６の結果より、凍結包埋剤及び合成コラーゲンに加え、カルボン酸化合物を更に添加することで、脂肪組織が凍結する温度まで凍結ブロックの温度を下げても、凍結切片の薄切性を向上できることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本明細書で開示する包埋剤を用いると、作製した標本を染色した際のバックグラウンドが低くなる。したがって、手術中の迅速病理診断のみならず、医療機関や大学医学部などの研究機関、一般病院等において、硬化性基材非浸透標本及び硬化性基材浸透標本の作製に有用である。
【図１】
2019163657.tif 000003
【図２】
2019163657.tif 000004
【図３】
2019163657.tif 000005
【図４】
2019163657.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月17日(2019.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結切片作製用の包埋剤であって、該包埋剤は、
凍結包埋剤と、
合成コラーゲンと、
を含む、包埋剤。
【請求項２】
前記合成コラーゲンが、三重らせんの三次構造をとる
請求項１に記載の包埋剤。
【請求項３】
前記合成コラーゲンが、発酵や合成から生成したアミノ酸のみを使用して合成した非動物由来型の高分子コラーゲンである、
請求項１または２に記載の包埋剤。
【請求項４】
凍結切片の薄切性を改善するためのカルボン酸、
を更に含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の包埋剤。
【請求項５】
前記合成コラーゲンが、下記式（１）で表される、
−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−  （１）
請求項１から４の何れか一項に記載の包埋剤。
【請求項６】
前記合成コラーゲンが、下記式（２）で表される、
−（Ｐｒｏ−Ｚ−Ｇｌｙ）ｎ−  （２）
請求項１から４の何れか一項に記載の包埋剤。
【請求項７】
前記式（２）中のＺが、プロリン残基（Ｐｒｏ）又はヒドロキシプロリン残基（Ｈｙｐ）から選択される、請求項６に記載の包埋剤。
【国際調査報告】
2019163657.tif 000007
2019163657.tif 000008
2019163657.tif 000009