(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステロイドの免疫検定法のための対照（コントロール）試料であって、水性媒体中ステロイドおよびシクロデキストリンを含む前記試料。
【請求項２】
前記水性媒体が実質的に蛋白質を含まない水性マトリクスであることを特徴とする請求項１に記載の試料。
【請求項３】
前記シクロデキストリンがβ−シクロデキストリンであることを特徴とする請求項１に記載の試料。
【請求項４】
前記ステロイドがエストラジオールまたはプロゲステロンであることを特徴とする請求項１に記載の試料。
【請求項５】
ステロイドの免疫検定法のための対照試料であって、水性媒体中ステロイドおよびシクロデキストリンを含み、前記水性媒体が実質的にフィブリノーゲンを含まない水性マトリクスである前記試料。
【請求項６】
前記水性マトリクスが血漿以外のものであることを特徴とする請求項２または５に記載の試料。
【請求項７】
更に、ヒト血清およびウシ血清アルブミンから成る群から選ばれる蛋白質を含む請求項１または５に記載の試料。
【請求項８】
前記ヒト血清が活性炭処理されていることを特徴とする請求項７に記載の試料。
【請求項９】
前記ステロイドの濃度が２．５×１０-11ｇ／ｍｌから１．０×１０-7ｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１または５に記載の試料。
【請求項１０】
前記ステロイドの回収率が１００％であることを特徴とする請求項１また５に記載の試料。
【請求項１１】
対照試料を用いて免疫検定法をキャリブレーションまたは標準化するステロイドの免疫検定法であって、前記対照試料が水性媒体中ステロイドおよびシクロデキストリンを含むことを特徴とする前記方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
水性の蛋白質含有媒体中のステロイド化合物、特に、酸素による分解を受けやすい生物学的に活性なステロイド化合物は、シクロデキストリン類の添加により貯蔵安定性が増強される。
発明の背景
生物学的流体、例えば、ヒトの体液中の天然及び合成の生物学的に活性な化合物の存在または量を分析する広く用いられる方法は、免疫検定法によるものである。問題の分析物とこの分析物を認識する抗体との相互作用を測定する。これは、しばしば、所定の分析物の量を定量する比較的迅速且つあまり費用のかからない方法を提供する。分析物抗体反応は、種々の技法で測定することができる。一つの技法は、抗−分析物抗体を固相上に固定し、次いで、既知量の標識した分析物と分析物を含有すると考えられる試料の両方と反応させる競合測定法である。試料中の分析物は、次いで、固定化した抗体への結合に対して標識した分析物と競合する。固定化された抗体により捕獲された標識の量は、次いで、例えば或る型の逆の様式で、試料中に存在する分析物の量と関係する。
全ての分析的技法は、標準（スタンダード）との比較を必要とするが、このような比較は、免疫検定法では特に重要である。このような検定に用いる試薬としては、反応性を正確には再現できないが、所定の範囲内でのみ再現することのできる生物学的物質が挙げられる。更に、抗体とその分析物との間の免疫学的結合は、常に制御できるとは限らない微妙な因子により影響されるかもしれない。この点で、正確な再現性を得る非常に苛烈な試みは、迅速且つあまり費用のかからない測定法の目標と一致しない。
従って、免疫検定法の各実験に含まれる一つ以上の標準を提供する実験が発展した。例えば、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｔｏｒａｔｏｒｉｅｓ社により製造されたＩＭX▲Ｒ▼装置は、１回の実験で２０をこえる試料を分析することができる。変動性の尺度を提供するためには、各実験で既知量の分析物を有するいくつかの試料を含むのが一般的である。このような標準試料は、通常、対照（コントロール）として知られている。
更に、分析器をキャリブレート及び経時的に再キャリブレートするために、既知量の分析物を有する多数の試料を提供することも一般的なことである。このような標準試料を、通常、キャリブレータ（検定物質）と呼ぶ。
キャリブレータおよび対照の両方にとって、その分析物を測定しようとする体液のそれと類似した挙動を測定において示す希釈剤を用いることは、望ましいことであった。例えば、ヒトの血清を分析する場合、キャリブレータおよび対照は、両方とも、適切に処理した正常なヒト血清で調製することができる。あるいは、血清と類似した蛋白質含量を有する水性媒体、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の緩衝化溶液を用いることができる。
ある種の目的の分析物、ステロイド類は、このような緩衝化水性蛋白質含有媒体中で時間の経過とともに分解する傾向を示す。この傾向は、活性炭処理した（charcoal stripped）ヒト血清中およびＢＳＡの水性溶液中の両方で観察されてきた。この点で、キャリブレータまたは対照のマトリクスまたは担体としての用途を意図したヒト血清は、活性炭処理して、存在するかもしれない内因性ステロイドを除去する。従って、最初のステロイド含量は、処理血清に秤量した量を単純に加えることにより正確に調節することができる。
しかしながら、活性炭処理プロセスは、分析物の分解を触媒する更なる金属イオンをマトリクス中に導入する。活性炭は、取り除くことが非常に困難であり、その除去には数回の濾過を必要とする。多くの前処理は、非常に収率が悪い。その結果できたマトリクスは、しばしば非常に高価で、分析物安定性に関してやや予想不可能で、バイオハザードが生じ、ときどき入手性の問題を受けやすい。
キャリブレータ中のステロイド類の安定性を改善することを示した唯一の他の方法は、冷凍であった。この方法は、不幸なことには、顧客利便性および、解凍により形成する（しばしば分界と呼ばれる）微粒子に起因する測定パフォーマンス上の問題を起こす。
従って、通常の現場条件下で拡大した貯蔵安定性を示すステロイド免疫検定法用キャリブレータおよび対照溶液の必要性が存する。特に、約２から８℃の温度で長期間貯蔵した場合に著しく分解しないこのような溶液の必要性が存する。このような溶液は、特に、６ヶ月以上安定であることが望ましい。
免疫検定法に関する他の問題は、分析物の回収率問題である。回収率は、典型的には、実測した濃度／実際の濃度×１００％と等しいと定義される。不運なことには、ステロイド類を含有する緩衝化した無蛋白質溶液は、典型的には、しばしば２００％以上もの倍数に匹敵する過度の回収率データを示す。このことから、蛋白質を含有するマトリクスから離れるのは不本意であった。従って、更には、許容することのできる回収率データ、特に約１００％に等しい回収率を示す免疫検定法に用いるステロイド類用安定化対照溶液の必要性も当業界に存する。
発明の目的
従って、本発明の目的は、免疫検定法に用いるステロイド類の長期貯蔵性および安定性を提供することである。
本発明の他の目的は、ステロイド免疫検定法用キャリブレータおよび対照溶液中にシクロデキストリンを用いることである。
本発明の更なる目的は、シクロデキストリンを用いた生物学的に活性なステロイド化合物の安定化である。
他の目的は、約２から８℃の範囲の温度で数ヶ月間貯蔵安定性を示すステロイド免疫検定法用キャリブレータおよび対照溶液を提供することである。
本発明の更に別の目的は、ステロイドの回収率データに不利に影響しない成分を用いる免疫検定法用ステロイド類の長期貯蔵のための手段を提供することである。
発明の簡単な説明
ステロイド化合物を、シクロデキストリン類の添加により更に貯蔵安定にする。本発明の一部として特に好ましいものは、水性溶液中で酸化による分解を受けやすくヒト体液の免疫検定法の標準化に好適である生物学的に活性なステロイド化合物である。特に興味のあるステロイド類としては、例えば、エストラジオールおよびプロゲステロンのような天然に存在するホルモンステロイド類が挙げられる。問題の水性媒体は、約６から９のｐＨに緩衝化してもよい。特に興味のある溶液としては、約２．５×１０-11から１．０×１０-7ｇ／ｍｌのステロイド濃度および約０．１ｍＭを超える、好ましくは約０．２から２５ｍＭのシクロデキストリン濃度を有するものが挙げられる。
シクロデキストリン類で安定化した、ステロイドキャリブレータおよび対照溶液を用いた免疫検定法の回収率データも卓越している。
図の簡単な説明
図１は、プロゲステロン回収に対するアルファ、ベータおよびガンマシクロデキストリンの影響のグラフである。
図２は、種々のマトリクスにおけるベータ−シクロデキストリン回収の影響のグラフである。
図３は、エストラジオール測定におけるスパイク回収に対するベータ−シクロデキストリン濃度の影響のグラフである。
図４Ａは、血清および、ベータ−シクロデキストリンを含有する種々のマトリクス中のプロゲステロンの５６℃での安定性のグラフである。
図４Ｂは、血清および、ベータ−シクロデキストリンを含有する種々のマトリクス中のプロゲステロンの４５℃での安定性のグラフである。
図４Ｃは、血清および、ベータ−シクロデキストリンを含有する種々のマトリクス中のプロゲステロンの３７℃での安定性のグラフである。
図５Ａは、２−８℃で貯蔵したキャリブレータを用いて測定した冷凍パネルのプロゲステロン濃度（０−３５ｎｇ／ｍｌ）のグラフである。
図５Ｂは、２−８℃で貯蔵したキャリブレータを用いて測定した冷凍パネルのプロゲステロン濃度（０−７ｎｇ／ｍｌ）のｙ軸を拡大したグラフである。
図６は、ベータ−シクロデキストリン含有および非含有のPlasma Diagnostic Base中のプロゲステロンの３７℃での安定性のグラフである。
発明の詳細な説明
本発明の用途に好適なステロイド類は、例えば、ステロール類、および胆汁酸、多数のホルモン、ジギタリス化合物のような特定の天然の薬物ならびに特定のビタミンの前駆体を含む、１７個の炭素原子を骨格として有する多数の天然に存在する脂溶性有機化合物のいずれか一つ以上である。
本発明に関して特に興味のあるものは、ヒトにおいて生物学的活性を示し、生物学的流体のような水性媒体中で酸化的分解を受ける傾向があるステロイド類である。これらのステロイド類は、免疫検定法の標的であり得、その結果としてこのような測定法の標準として用い得る。このような標準は、免疫検定法を行おうとしている生物学的流体、例えば体液と類似した媒体中の測定物に対する比較（reference）ステロイドを提供するために、代表的には、水性媒体を用いる。これらのステロイド類の中には、天然に存在するホルモン性ステロイド類があり、特に興味のあるものは、正常な生物学的水準が女性ホルモンのように変動するものである。この群の中に含まれるものは、プロゲステロン、エストロンおよびエストラジオールである。興味のある他のステロイドとしては、コルチゾールおよびテストステロンが挙げられる。免疫検定法に用いる更に他のステロイド類は、当業者等には自明であり、従って、それらも本発明の範囲内に入る。
トウモロコシの副産物としてのシクロデキストリン類は、免疫検定法に好適な水性条件下で前述のステロイド類を安定化するのに非常に好ましい。特に好ましいものは、ベータ−、ガンマ−および改質したベータ−シクロデキストリンである。当業者等は、改質したベータ−シクロデキストリンが２−ヒドロキシ−プロピルベータ−シクロデキストリンであると認識するであろう。前述の化合物の中で、ベータ−シクロデキストリンは、特に好ましい。
通常のシクロデキストリン類、特にβ−シクロデキストリン分子の環構造は、熱塩基性溶液中での安定性、ほとんどの有機酸及びいくつかのアルファアミラーゼ類による加水分解に対する抵抗性、酵母発酵およびベータアミラーゼ加水分解に対する完全な抵抗性、ならびに３００℃の著しく高い分解温度等の、類似した分子量の範囲の非環式炭水化物のそれとは異なる性質を付与する。分子配列およびその配列と関係した性質は、前述のシクロデキストリン類、特にβ−シクロデキストリンにユニークな特性：取り込まれる分子をそれらの中に包接し、保護し、その性質のいくつかを変化さえさせる包接複合体を形成する能力を与える。β−シクロデキストリンの疎水性内部は、例えば、ステロイド分子がその実際の構造を変化させることなく複合化のために入っていくことができるようなものである。従って、β−シクロデキストリン分子は、ステロイド類のための長期貯蔵メカニズムを提供し、免疫検定法に用いられる準備ができた時にステロイド類は、その物理的構造をそのまま現わす。これが、おそらく、β−シクロデキストリンが本発明の用途に特に好ましいシクロデキストリンである一つの理由である。
本発明の一部してのシクロデキストリン類は、水性媒体、特に実質的に蛋白質を含まない水性媒体中に含まれるのが非常に好ましい。免疫検定法の標準は、血清のようなヒトの体液の挙動と類似した又はそれをまねた媒体中に含まれることがしばしば望ましいかもしれないが、ある場合には、測定しようとするヒトの体液のそれと劇的に異なる蛋白質含量を用いることが必要である。これは、体液の他の特徴の調整を可能にする。
水性媒体は、実質的にフィブリノーゲンを含まないことが好ましい。従って、血漿以外の媒体を用いることが、より望ましい。この点で、微粒子を形成する成分を含有する媒体を避けることも好ましい。
蛋白質に基づく媒体を用いるいくぶん好ましくない態様において、蛋白質濃度は、血清では約５０ｍｇ／ｍｌが典型的であることから、約１０から３００ｍｇ／ｍｌまたは約１から３０％の範囲であることが望ましい。２．５から２５％の濃度範囲が更に好ましく、約２．５から５％が特に好ましい。この蛋白質含量は、例えば正常なヒト血清中に自然に存在してもよいし、又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の水性溶液容量当たりの重量で５％になるように加えてもよい。次に活性炭処理されるPlasma Diagnostic Base(PDB)のような商業的に入手可能な製剤も、Sera Sub(TM)と同様に用いることができる。
いずれの蛋白質溶液も実質的に内因性ステロイドがないことが好ましい。従って、蛋白質溶液が正常なヒトの血清である必要があるならば、活性炭処理して天然に存在するステロイド類を除去することが最も好ましい。他方、商業的に入手可能なステロイド非含有の活性炭処理をしていないＢＳＡのような、他の技法によりステロイド類が除去されている蛋白質製剤を、ある場合には用いることができる。これらの中には、有機相を用いた洗浄により得られるものがある。活性炭処理は、鉄のような望ましくない遷移金属に寄与するかもしれないと考えられる。蛋白質それ自体が、しばしば、望ましくない遷移金属源であるかもしれないと考えられる。蛋白質は金属と複合化して、遷移金属を含まない蛋白質を得ることを困難にすることが公知である。
必ずしも必要ではないが、水性媒体は、ヒトの体液のそれと同様のｐＨを有することが好ましい。水性媒体は、約６から９のｐＨを有することが特に好ましく、７から８．５のｐＨが更に好ましい。水性媒体のｐＨは、通常ＴＲＩＳとして知られるトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンのような、生物学的物質に用いる、一般的緩衝剤のいずれかで容易に調整される。例として、０．１Ｍ濃度のＴＲＩＳを用いることができる。当業者等は、これまで詳細に示さなかった濃度範囲に従って他の緩衝剤を手に入れることができる。
問題の水性溶液のステロイド濃度は、ヒトの体液測定において遭遇するステロイド濃度の範囲にわたるべきである。代表的には、種々のステロイド類は、ｍｌ当たり約５ピコグラムからｍｌ当たり１００ナノグラムのレベルで測定する。特に興味があるのは、ｍｌ当たり約５×１０-11から４×１０-8グラムの濃度である。
本発明の一部としてのシクロデキストリン類は、水性ステロイド溶液の酸化的分解を阻止するのに効果的な量で用いるべきである。約０．１ｍＭの過剰量でそれらを用いることが好ましく、約０．２から２５ｍＭの量でそれらを用いることが特に好ましい。少なくとも約１ｍＭのシクロデキストリン濃度を用いることが特に有利である。約２５ｍＭ過剰のシクロデキストリン濃度を用いることは、限られた有利性があると考えられる。しかしながら、費用を除いては、より高濃度を用いるのにさほど不利益性があるとは考えられない。
本発明に用いるシクロデキストリンの特に好ましい濃度は、約２ｍＭから６ｍＭの範囲である、好ましくは約２．５ｍＭから５ｍＭである。多数の態様において、ステロイド調製物を安定化させるために約２．４ｍＭから約２．７ｍＭのシクロデキストリンを用いることが特に望ましい。前述の濃度は、非常にしばしばステロイド特異的であり、従って、当業者等は、それら自身の特定の要件に最も適した他の濃度を発見することができ、用いる特定のステロイドに依存していくぶん変化させることができる。非常にしばしば、用いるシクロデキストリンの非常に好ましい量は、本明細書で更に考察するように、ステロイドの１００％回収を可能にするものである。
本発明の一部として用いるシクロデキストリンの濃度は、免疫検定法で問題とする特定のステロイドの回収データを損なうべきではない。対応するキャリブレータ溶液に用いるシクロデキストリンの特定の濃度に基づいてステロイドが約１００％回収されることは、きわめて好ましい。ベータ−およびガンマ−シクロデキストリンは、ステロイドの１００％回収を可能にし、従って、更に、ステロイドを貯蔵する蛋白質含有マトリクスの必要性を緩和する。蛋白質は、ステロイドの分解に寄与することから、しばしば、この媒体を用いない明白な有利性が存する。しかしながら、蛋白質に基づく媒体は、多くの場合、尚も、許容することのできる又は卓越でさえある回収データを示すことができる。
シクロデキストリン類、特にβ−シクロデキストリンにより達成される酸化的分解の阻止は、種々の時間高温で水性ステロイド溶液にストレスをかけ、免疫検定法により検出可能なステロイド含量の損失を観察することにより容易に評価することができる。高温試験により得られた結果は、低温で保たれたステロイド溶液の長期安定性を予測させる。
免疫検定法用のステロイド標準は、代表的には、２から８℃の温度で維持され、好ましいことには約６ヶ月以上の安定性を有する、即ち、６ヶ月以内には著しく分解を示さない。標準は、免疫検定法で約１０パーセント未満のシグナル損失を示すことが特に望ましく、好ましくは約５パーセント未満、更に好ましくは約１パーセント未満である。
このような安定性は、約３７℃以上で例えば２から５週間にわたる熱老化から容易に抜け出すことができる。４週間で約１０％未満の損失を示す組成物は、約６ヶ月以上安定性を有すると予想される。約２．５週後に約５％の損失を示す組成物には同様の結果を期待することができる。
以下の実施例は、本発明を具体的に説明するものであり、請求の範囲で明確にするような本発明の範囲を制限するものと解釈すべきものではない。当業者は、本発明の概念を応用することのできる多数の他の装置および使用法を思いつくことができると考えられる。
実施例１：ＩＭｘ▲Ｒ▼エストラジオール測定
Abbott Laboratories ＩＭｘ▲Ｒ▼使い捨てカートリッジ付属の以下のフォーマットを用いＩＭｘ▲Ｒ▼装置によりエストラジオール測定を実施した。７５マイクロリットル（７５μｌ）の血清試料を、３５μｌの５アルファジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）緩衝液、抗−エストラジオール抗体で被覆した５０μｌの微粒子および９０μｌのＩＭｘ▲Ｒ▼緩衝液と混合した。反応混合物を３５℃で２７．５分間インキュベートした。ＤＨＴ緩衝液は、２μｇ／ｍｌの５−アルファジヒドロテストステロン、０．７５％（ｗ／ｖ）のサポニン、０．５Ｍのグリシン、０．２５ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび０．１２％のメチルイソチアゾリノンから成り、全てはｐＨ４．５であった。抗−エストラジオール抗体で被覆した微粒子（０．００５−０．０２％固形分）を、０．１Ｍのビス−（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、０．１Ｍの塩化ナトリウム、１３．６％の蔗糖、０．１％のアジ化ナトリウムおよび０．２ｍｇ／ｍｌの正常なラビットＩｇＧから成る全てｐＨ６．５の微粒子緩衝液に懸濁した。ＩＭｘ▲Ｒ▼緩衝液は、０．３ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、０．１％のアジ化ナトリウムから成り、全てはｐＨ７．５であった。ＩＭｘ▲Ｒ▼エストラジオール試薬（ＤＨＴ緩衝液、ラビット抗−エストラジオール抗体で被覆した微粒子、エストロゲン結合物および燐酸メチルウンベリフェロン基質を含む）、ＩＭｘ▲Ｒ▼緩衝液、ＩＭｘ▲Ｒ▼使い捨てカートリッジ、およびＩＭｘ▲Ｒ▼装置は、Abbott Laboratories, Abbott Park, ILから商業的に入手可能であり、ＵＳ  ３，３４２，７６０、ＥＰ−Ａ−２８８  ７９３およびFiore等，Clin. Chem. 34/9:1726-1732, 1988に述べられており、それらの全てを参照より本明細書に含めるものとする。
１７５マイクロリットル（１７５μｌ）の反応混合物を、ＩＭｘ▲Ｒ▼使い捨てカートリッジのファイバーマトリクスに移した。ファイバーマトリクスは、ＩＭｘ▲Ｒ▼カートリッジの吸収パッド上に位置している。微粒子は、ファイバーマトリクスにより捕獲され、溶液は、吸収パッドにより吸収された。微粒子を、次いで、ＩＭｘ▲Ｒ▼緩衝液で洗浄した。６０マイクロリットル（６０μｌ）のステロイド−アルカリホスファターゼ結合物をマトリクスに加え、３７℃で１２秒間インキュベートし、次いで、ＩＭｘ▲Ｒ▼緩衝液で再度洗浄した。結合物（２−８μｇ／ｍｌアルカリホスファターゼ）は、０．１ＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、０．５Ｍの塩化ナトリウム、１％カゼイン、１ｍＭの塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、０．１％のアジ化物から成る全てｐＨ６．５の結合緩衝液中に存在する。
０．１Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液（ｐＨ９）中の燐酸４−メチルウンベリフェロンの１．２ｍＭ溶液の６５マイクロリットル（６５μｌ）をマトリクスに加え、４メチルウンベリフェロン形成率を蛍光反射率により測定した。光源として水銀アーク灯を用いる蛍光分析計を具備したＩＭｘ▲Ｒ▼装置で蛍光を測定した（Fiore等，Clin，Chem．34/9:1726-1732，1988に述べられているように。その内容を、参照により本明細書に含めるものとする）。
実施例２：ＩＭｘ▲Ｒ▼でのプロゲステロン測定
以下の改変を除いては実施例１のエストラジオール測定と同様のフォーマットを用いＩＭｘ▲Ｒ▼装置によりＩＭｘ▲Ｒ▼使い捨てカートリッジでプロゲステロン測定を実施した。
３０マイクロリットル（３０μｌ）の血清試料を、５０μｌの抗−プロゲステロン／アルカリホスファターゼ結合物試薬、および４９μｌのＩＭｘ▲Ｒ▼緩衝液と混合した。反応混合物を３５℃で１０．２分間インキュベートした。抗−フルオレセイン抗体で被覆した微粒子５１μｌ、５０μｌのビハプテン試薬、および３μｌのＩＭｘ▲Ｒ▼緩衝液を反応物に加え、インキュベーションを３５℃で１０．２分間継続した。１８０マイクロリットル（１８０μｌ）の反応混合物を、ＩＭｘ▲Ｒ▼使い捨てカートリッジのファイバーマトリクスに移した。複合体を、次いで、ＩＭｘ▲Ｒ▼緩衝液で洗浄し、３５℃で１０．２分間インキュベートした。燐酸４−メチルウンベリフェロンの添加および４メチルウンベリフェロン形成率の定量化は、実施例１で述べた通りであった。
抗−プロゲステロン抗体／アルカリホスファターゼ結合物試薬は、子ウシ腸アルカリホスファターゼ（Boehringer Mannheim, ドイツから入手可能）およびモノクローナル抗−プロゲステロン抗体（Surrey大学,英国）を用いて調製した。このホスファターゼを、イミノチオラン（Ｔｒａｕｔの試薬）で改質し、この２つの蛋白質をマレイミド／スクシンイミド異種二官能性リンカーで結合した。結合物試薬は、１００ｍＭのＴＲＩＳ  ｐＨ７．５、５００ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、１％（ｗ／ｖ）カゼイン、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、および０．５ｍｇ／ｍｌのヒツジ血清を含有する。結合物の代表的作用濃度は、抗体に関して約０．３μｇ／ｍｌである。
抗−フルオレセイン微粒子試薬を、カルボキシルで改質したラテックス微粒子（Seradyne, Indianapolis, INから入手可能）およびモノクローナル抗フルオレセイン抗体（Abbott）を用いて調製した。抗体を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いて微粒子に共有結合により結合させた。微粒子試薬は、１５０ｍＭのＴＲＩＳ  ｐＨ７．２、２００ｍＭの塩化ナトリウム、１３．６％（ｗ／ｖ）の蔗糖、０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（ＴＭ）２０、および０．１ｍｇ／ｍｌのマウスＩｇＧを含有する。微粒子の代表的作用濃度は、約０．０２％ラテックス固形分である。
ビハプテン試薬は、１００ｍＭのＴＲＩＳ  ｐＨ７．５、５００ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、１％（ｗ／ｖ）カゼイン、１ｍＭの塩化マグネシウム、および０．１ｍＭの亜鉛を含有する緩衝液中にプロゲステロン−１１アルファ−ヘミスクシナート−５−（アミノアセトアミド）フルオレセインを含有する。ビハプテンの代表的作用濃度は、５ｎＭである。
実施例３：ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼プロゲステロン測定
以下の改変を除いては実施例２のＩＭｘ▲Ｒ▼測定と同様のフォーマットを用いＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼装置によりＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼使い捨てカートリッジでプロゲステロン測定を実施した。
４２マイクロリットル（４２μｌ）の血清試料を、７６μｌの抗−プロゲステロン／アルカリホスファターゼ結合物試薬、および蛋白質添加物を含有するＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼プロゲステロン測定用緩衝液６８μｌと混合した。反応混合物を３１℃で１０分間インキュベートした。１２０μｌの反応物を、次いで、実施例２から得た微粒子およびビハプテン試薬の両方を等量含有する試薬９５μｌに加えた。３１℃で９．２分間インキュベーションを継続した。１３５マイクロリットル（１３５μｌ）の反応混合物をＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼使い捨てカートリッジのファイバーマトリクスに移した。次いで、複合体をＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼緩衝液で洗浄し、５０μｌの燐酸４−メチルウンベリフェロンを加え、４メチルウンベリフェロン形成率を定量化した。
抗−プロゲステロン抗体／アルカリホスファターゼ結合物試薬を、組み換えアルカリホスファターゼ（Abbott）を用いたことを除いては実施例２で述べた通りに調製した。結合試薬は、１５０ｍＭのＴＲＩＳ  ｐＨ６．２、２００ｍＭの塩化ナトリウム、１８％（ｗ／ｖ）の蔗糖、０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（ＴＭ）２０、および０．１ｍｇ／ｍｌのマウスＩｇＧを含有する緩衝液中に実施例２で述べたものと同様の微粒子およびビハプテンを含有する。
実施例４：種々のシクロデキストリンによるＩＭｘ▲Ｒ▼プロゲステロン測定における回収率の調整
プロゲステロンの回収率に対するシクロデキストリンの影響を、図１にまとめた実験で調査した。プロゲステロンを、最終濃度４ｎｇ／ｍｌになるように血清および種々のシクロデキストリン溶液に加えた。シクロデキストリン溶液は、１００ｍＭのＴＲＩＳ  ｐＨ８中に０−１０ｍＭのアルファ、ベータ（３つのロット、２つの販売会社）、またはガンマシクロデキストリンを含有した（シクロデキストリンは、Sigma Chemical Co., St. Louis, MO and ICN, Irvine, CAから入手可能である）。これらの試料の見掛けのプロゲステロン濃度を、ＩＭｘ▲Ｒ▼装置（実施例２）でプロゲステロン測定法を用いて測定した。血清試料中のプロゲステロン（４．０８ｎｇ／ｍｌ）の観察された濃度は、１００％の回収率を表す。ベータおよびガンマシクロデキストリン試料からのプロゲステロンの回収率は、２０から１９０％までばらついた（回収率＝測定値／４．０８×１００％）。この実験に基づくと、２．７ｍＭのベータシクロデキストリンまたは１．３ｍＭのガンマシクロデキストリンの溶液は、血清で観察されたそれと同等の回収率を示すであろう。アルファシクロデキストリンは、この研究で調査したシクロデキストリン濃度にわたってはプロゲステロン回収率に顕著に影響しない。
実施例５：βシクロデキストリンによるＩＭｘ▲Ｒ▼プロゲステロン測定における種々の合成マトリクスでの回収率の調整
種々の合成キャリブレータマトリクスにおけるプロゲステロンの回収に対するシクロデキストリンの影響を、図２にまとめた実験で調査した。プロゲステロンを、最終濃度２０ｎｇ／ｍｌになるように血清および、０−１０ｍＭのベータシクロデキストリンを含有する種々の合成キャリブレータマトリクスに加えた。合成マトリクスは、２．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Miles Pentex, Kankakee, ILから入手可能）およびＳｅｒａＳｕｂ  ＴＭ（Creative Scientific Technology, Inc, Great Neck, NYから入手可能）を含有する１００ｍＭのＴＲＩＳ  ｐＨ８を含有した。これらの試料の見掛けのプロゲステロン濃度を、ＩＭｘ▲Ｒ▼装置（実施例２）でプロゲステロン測定法を用いて測定した。２０ｎｇ／ｍｌのプロゲステロンの観察された濃度は、１００％の回収率を表す。シクロデキストリン試料からのプロゲステロンの回収率は、２０から３３０％までばらついた（回収率＝測定値／２０×１００％）。１００％の回収率を達成するのに必要なシクロデキストリン濃度は、蛋白質を含有しないマトリクス（１００ｍＭのＴＲＩＳ  ｐＨ８、ＳｅｒａＳｕｂ  ＴＭ）と非常に類似している。蛋白質の存在下でのプロゲステロンの１００％回収には、より低濃度のシクロデキストリンを必要とする。回収率の変化に対する蛋白質およびシクロデキストリンの影響は、付加的である。高濃度の蛋白質（＞１２％）では、１００％回収にシクロデキストリンを必要としない（データは示さず）。
実施例６：β−シクロデキストリンによるＩＭｘ▲Ｒ▼エストラジオール測定における回収率の調整
エストラジオールの回収に対するシクロデキストリンの影響を、図３にまとめた実験で調査した。エストラジオールを、最終濃度１ｎｇ／ｍｌになるように血清および、０−１０ｍＭのベータシクロデキストリンを含有する１００ｍＭのＴＲＩＳｐＨ８溶液に加えた。これらの試料の見掛けのエストラジオール濃度を、ＩＭｘ▲Ｒ▼エストラジオール測定法（実施例１）を用いて測定した。２種のエストラジオール測定フォーマットを、図３において調査した。これらのフォーマットは、微粒子試薬中で用いるラビット抗−エストラジオール源（ラビット５８３またはラビット５８１、Abbott）が異なった。シクロデキストリン試料からのエストラジオールの回収率は、５から３３０％までばらついた（回収率＝測定値（シクロデキストリン）／測定値（血清）ｘ１００％）。この実験に基づくと、約１．５から１．７５ｍＭのベータシクロデキストリン溶液は、血清で観察されたのと同等の回収率を示すであろう。
実施例７：種々の貯蔵条件（５６、４５、３７℃）下でのＩＭｘ▲Ｒ▼プロゲステロン測定におけるβ−シクロデキストリンによるプロゲステロンの安定化
プロゲステロンの安定性に対するベータシクロデキストリンの影響を、図４Ａ−Ｃにまとめた実験で調査した。プロゲステロンを、最終濃度４ｎｇ／ｍｌになるように血清および、２．５ｍＭのベータシクロデキストリンを含有する２つの合成キャリブレータマトリクスに加えた。合成マトリクスは、１００ｍＭのＴＲＩＳ  ｐＨ８およびＳｅｒａＳｕｂ（ＴＭ）であった。これらの試料を一部とり、１７日間に至るまで５６、４５、３７または−２０℃でインキュベートした。指示された時点で、これらの試料の見掛けのプロゲステロン濃度を、ＩＭｘ▲Ｒ▼装置（実施例２）でプロゲステロン測定法を用いて測定した。これらの実験では、試験の一部として行った同じ測定法に０ｎｇ／ｍｌの血清試料を含めた。熱ストレスをかけた又は冷凍した試料から得たＩＭｘ▲Ｒ▼装置比率シグナルを０ｎｇ／ｍｌの試料から得たシグナルで割り、前にこの測定法のために開発した置換曲線［比率（キャリブレータ）／比率（０ｎｇ／ｍｌ）対濃度］上に結果をプロットすることにより、各試験試料の濃度を決定した。損失パーセントは、冷凍およびストレス条件間の差異を冷凍アリコートで得られた濃度で割ることにより決定する。結果は、損失パーセント、即ち［（冷凍したもの−ストレスをかけたもの）／冷凍したもの］×１００％として示す。
シクロデキストリンを含有する試料で観察された損失パーセントは、血清で観察されたそれよりも著しく少ない。５６℃では、９８％のプロゲステロンを血清試料から失ったが、一方、ＴＲＩＳおよびＳｅｒａＳｕｂ  ＴＭ試料は、実質的に損失を示さなかった。
シクロデキストリン試料の組成を、これらの試料が血清のそれと同等の回収を示すように設計した。このような条件下では過回収、可溶性および、容器壁へのステロイドの付着に関する問題があることから、これらの実験において、シクロデキストリンを含有しない０．１ＭのＴＲＩＳまたはＳｅｒａＳｕｂ  ＴＭの対照としての使用は不適当であった。
実施例８：種々の貯蔵条件下でのＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼プロゲステロン測定におけるβ−シクロデキストリンによるプロゲステロンの安定化
プロゲステロンの長期安定性に対するベータシクロデキストリンの影響を、図５ＡおよびＢにまとめた実験で調査した。ベータシクロデキストリンキャリブレータを、１００ｍＭのＴＲＩＳ  ｐＨ８中に０、０．７、２．０、７．０、２０、および４０ｎｇ／ｍｌで調製し、２−８℃で貯蔵した。血清に基づくパネルを、プロゲステロンが安定である条件で、約１．３（低）、６（中）、および２２（高）ｎｇ／ｍｌで調製し、次いで、冷凍した。指示された時点で、これらのパネルのプロゲステロン濃度を、ＡｘＳＹＭ▲Ｒ▼プロゲステロン測定装置（実施例３）を用いて貯蔵したキャリブレータで測定した。図５Ａおよび５Ｂのデータは、パネル濃度が時間中に一定のままであることを示す。２−８℃で貯蔵したキャリブレータ中のプロゲステロンの損失があったならば、冷凍したパネル中のプロゲステロンの見掛けの濃度は、上向きになったであろう。（注、１６週時点に用いたキャリブレータは、冷凍して貯蔵した、他の全ての時点に用いたキャリブレータは、２−８℃で貯蔵した。）（誤差棒は、２つの標準偏差を表す、ｎ＝各時点で１８）
実施例９：蛋白質を含有するマトリクスにおける３７℃でのＩＭｘ▲Ｒ▼プロゲステロン測定におけるβ−シクロデキストリンによるプロゲステロンの安定化
蛋白を含有するマトリクス中のプロゲステロンの安定性に対するベータシクロデキストリンの影響を、図６にまとめた実験で調査した。活性炭処理したPlasma Diagnostic Base （PDB, Intergen Co，ニューヨーク）単独、および１．５ｍＭのβ−シクロデキストリンを含有する活性炭処理したＰＤＢにプロゲステロンを最終濃度４ｎｇ／ｍｌになるように加えた。この二番目のマトリクスでは、ＰＤＢを僅かに希釈してプロゲステロンの回収に対するβ−シクロデキストリンの影響を相殺した。これらの試料を一部とり、２８日間まで３７または−２０℃でインキュベートした。指示された時点で、これらの試料の見掛けのプロゲステロン濃度を、ＩＭｘ▲Ｒ▼装置（実施例２）でプロゲステロン測定法を用いて測定した。プロゲステロンの濃度および損失％を算定するのに用いた方法は、実施例７と同じであった。プロゲステロンの損失％は、ＰＤＢ単独よりもβ−シクロデキストリンを含有するＰＤＢが著しく少ない。３７℃での２８日にわたるインキュベーションで、β−シクロデキストリンを含有しないＰＤＢの５６％に対して、プロゲステロンの元の濃度の僅かに１３％しか失っていない。この実施例は、シクロデキストリン類、特にβ−シクロデキストリンを用いて蛋白質含有媒体中のステロイド配合組成物を安定化することができることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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