(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
0003787265.tif 000028
［式中：Ｑは、その１位で糖部分と結合しているピリミジン塩基または２−Ｓピリミジン塩基であり；Ｒ1 は、置換または非置換Ｃ1 〜Ｃ30アルキル、Ｃ1 〜Ｃ30アルケニル、Ｃ1〜Ｃ30アルキニル、Ｃ6 〜Ｃ14アリールまたはＣ7 〜Ｃ30アラルキルであり、ここで該置換基はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルである；およびＲ2 およびＲ3 は、独立して水素またはヒドロキシル保護基である］の２' −Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドの合成法であって、２−２' −アンヒドロピリミジンヌクレオシドを提供し；式Ｒ1 −ＯＨのアルコールを選択し；そして該２−２' −アンヒドロピリミジンヌクレオシドおよび該アルコールを該２' −Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドを得るのに有効な時間、温度および圧力の条件下、ルイス酸で処理する；の各工程を含む方法。
【請求項２】
該２' −Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドが式：
【化２】
0003787265.tif 000029
［式中：Ｒ1 、Ｒ2 およびＲ3 は、請求項１に定義した通りであり；Ｘ' は、ＯまたはＳであり；Ｒ5 およびＲ6 は、独立してＨ、Ｃ1 〜Ｃ30ヒドロカルビルまたは置換Ｃ1 〜Ｃ30ヒドロカルビルである］の化合物であり；そして、該２−２' −アンヒドロピリミジンヌクレオシドが式：
【化３】
0003787265.tif 000030
［式中：Ｒ2 、Ｒ3 、Ｘ' 、Ｒ5 およびＲ6 は、先に定義した通りである］の化合物である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該２−２' −アンヒドロピリミジンヌクレオシドおよび該アルコールが圧力封入容器内で処理される請求項第１項に記載の方法。
【請求項４】
該ルイス酸がホウ酸エステルである請求項第１項に記載の方法。
【請求項５】
該ホウ酸エステルの式がＢ( ＯＲ1)3である請求項第４項に記載の方法。
【請求項６】
該Ｂ( ＯＲ1)3のＲ1が、Ｃ1 〜Ｃ30アルキル、Ｃ1 〜Ｃ30アルケニル、Ｃ1〜Ｃ30アルキニル、Ｃ6 〜Ｃ14アリールまたはＣ7 〜Ｃ30アラルキルである請求項第５項に記載の方法。
【請求項７】
該Ｂ( ＯＲ1)3のＲ1が、Ｃ1 〜Ｃ30アルキルである請求項第６項に記載の方法。
【請求項８】
該式Ｂ( ＯＲ1)3で表されるホウ酸エステルが水素化ホウ素を式ＨＯ−Ｒ1 のアルコールで処理して製造される請求項第５項に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ1 がＣ1 〜Ｃ10アルキルである請求項第１項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ1 がＣ6 〜Ｃ14アリールである請求項第１項に記載の方法。
【請求項１１】
該処理が約１２０℃から約２００℃での加熱を含む請求項第１項に記載の方法。
【請求項１２】
該ピリミジンヌクレオシドがウリジンまたは５−メチルウリジンである請求項第１項に記載の方法。
【請求項１３】
式：
【化４】
0003787265.tif 000031
［式中：Ｘ' は、ＯまたはＳであり；Ｒ1 は、置換または非置換Ｃ1 〜Ｃ30アルキル、Ｃ1 〜Ｃ30アルケニル、Ｃ1〜Ｃ30アルキニル、Ｃ6 〜Ｃ14アリールまたはＣ7 〜Ｃ30アラルキルであり、ここで該置換基はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルである；Ｒ2 およびＲ3 は、独立して水素またはヒドロキシル保護基であり；Ｒ5 およびＲ6 は、独立してＨ、Ｃ1 〜Ｃ30ヒドロカルビルまたは置換Ｃ1 〜Ｃ30ヒドロカルビルである］の２' −Ｏ−置換シチジンヌクレオシドの合成法であって、式：
【化５】
0003787265.tif 000032
の２−２' −アンヒドロウリジンヌクレオシドを提供し；式Ｒ1 −ＯＨのアルコールを選択し；該２−２' −アンヒドロウリジンヌクレオシドおよび該アルコールを該２' −Ｏ−置換ウリジンヌクレオシドを得るのに有効な時間、温度および圧力の条件下、ルイス酸で処理し；そして該２' −Ｏ−置換ウリジンヌクレオシドを該２' −Ｏ−置換シチジンヌクレオシドへアミノ化する；の各工程を含む方法。
【請求項１４】
該２−２' −アンヒドロウリジンヌクレオシドおよび該アルコールが圧力封入容器内で処理される請求項第１３項に記載の方法。
【請求項１５】
該ルイス酸がホウ酸エステルである請求項第１３項に記載の方法。
【請求項１６】
該ホウ酸エステルの式がＢ( ＯＲ1)3である請求項第１５項に記載の方法。
【請求項１７】
該Ｂ( ＯＲ1)3のＲ1が、Ｃ1 〜Ｃ30アルキル、Ｃ1 〜Ｃ30アルケニル、Ｃ1〜Ｃ30アルキニル、Ｃ6 〜Ｃ14アリールまたはＣ7 〜Ｃ30アラルキルである請求項第１６項に記載の方法。
【請求項１８】
該Ｂ( ＯＲ1)3のＲ1が、Ｃ1 〜Ｃ30アルキルである請求項第１７項に記載の方法。
【請求項１９】
該式Ｂ( ＯＲ1)3で表されるホウ酸エステルが水素化ホウ素を式ＨＯ−Ｒ1 のアルコールで処理して製造される請求項第１６項に記載の方法。
【請求項２０】
Ｒ1 がＣ1 〜Ｃ10アルキルである請求項第１３項に記載の方法。
【請求項２１】
Ｒ1 がＣ6 〜Ｃ14アリールである請求項第１３項に記載の方法。
【請求項２２】
該処理が約１２０℃から約２００℃での加熱を含む請求項第１３項に記載の方法。
【請求項２３】
該２' −Ｏ−置換シチジンヌクレオシドが２' −Ｏ−メチル−５−メチルシチジンである請求項第１３項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオチドおよびこれらのヌクレオチドを含むオリゴマー化合物の合成のための改良法に関する。本発明は２，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドまたは２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドを弱い求核試薬およびルイス酸で処理することを特徴としている。本方法は現在使用されている方法と比較して経済的な利点を持ち、大規模合成に応用できる。本発明はまた、糖の２’−Ｏ−位およびピリミジンの５位が修飾された少なくとも一つの修飾ピリミジン単量体サブユニットを持つオリゴマー化合物を特徴としている。本発明のオリゴマー化合物は核酸に対する増加した結合親和性および増加したヌクレアーゼ耐性を示す。
【０００２】
【背景技術】
２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドはそれ自体オリゴヌクレオチドおよび関連する化合物の製造に有用である。２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドは例えば、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖｉｒｇｉｎｉａのような会社から市販品として購入可能であり、商業的商品と考えられる。本発明は２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドの製造のための新規かつ有用な方法に関している。
【０００３】
オリゴヌクレオチドおよびそれらの類似体は、分子生物学においてプローブ、プライマー、リンカー、アダプターおよび遺伝子フラグメントとしての使用を含む種々の使用のために開発されてきた。これらの方法で使用されるオリゴヌクレオチドへの修飾には、フルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、アルカリ性ホスファターゼまたは他のレポーター分子のような非放射性標識による標識化が含まれる。生じる類似体のヌクレアーゼ安定性を増加させるためにリボースリン酸主鎖へも修飾がなされた。これらの修飾にはメチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート結合および２’−Ｏ−メチルリボース糖ユニットの使用が含まれる。他の修飾はオリゴヌクレオチドの取り込みおよび細胞分布に関している。診断および治療の両方の使用におけるこれらのオリゴヌクレオチドの成功は改良されたオリゴヌクレオチド類似体に対するさらなる要望を創り出した。
【０００４】
多細胞系生物体の身体状態のほとんどは（ほとんどの疾患状態を含む）蛋白質により影響される。直接的に働くにしても、またはその酵素的またはその他の機能を通して働くにせよ、そのような蛋白質は動物またはヒトにおける多くの疾患および制御的機能に主な比率で寄与している。疾患状態に対して、古典的治療では一般的にそのような蛋白質の疾患を引き起こすまたは疾患を悪くする機能を和らげようとしてそのような蛋白質との相互作用に焦点が合わされてきた。より新しい治療方法においては、そのような蛋白質の実際の産生を調節することが望まれている。蛋白質の産生を妨害することにより、最小の副作用で最大の治療効果が得られるであろう。そのような治療法の一般的な目的は、望まれない蛋白質形成を導くであろう遺伝子発現を妨害、さもなくば調節することである。
【０００５】
特定の遺伝子発現を阻害する一つの方法はオリゴヌクレオチド、特に特定の標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列に相補的であるオリゴヌクレオチドの使用である。そのような使用のため、いくつかのオリゴヌクレオチドが現在臨床試験されている。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは現在種々の疾患状態のためのヒト臨床試験におけるアンチセンス剤（抗ウイルス剤としての使用を含む）として使用されている。
転写因子は転写の制御において二本鎖ＤＮＡと相互作用する。オリゴヌクレオチドは転写因子の競合阻害剤として働き、転写因子の作用を調節することができる。いくつかの最近の報告はそのような相互作用を記載している（Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ，Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２５０，９９７〜１０００；およびＷｕ，Ｈ．ら、Ｇｅｎｅ，１９９０，８９，２０３〜２０９を参照されたい）。
【０００６】
蛋白質の間接的および直接的両方の制御に加え、オリゴヌクレオチドには例えば、体液、組織、無傷の細胞または単離された細胞成分を含む材料の診断試験における使用もまた見いだされている。遺伝子発現阻害のように、診断応用は核酸の相補鎖とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力を利用している。ハイブリダイゼーションとはＲＮＡまたはＤＮＡへのワトソン−クリックおよび／またはフーグスティーン塩基対によるオリゴヌクレオチドの配列特異的水素結合である。そのような塩基対の塩基はお互いに相補的であると言われている。
【０００７】
オリゴヌクレオチドはまた研究用試薬として広く使用されている。それらは生物学的分子の機能を調べる研究、ならびに生物学的分子の調製において特に有用である。例えば、ＰＣＲ反応におけるプライマーとしての天然および合成の両オリゴヌクレオチドの使用は商業的製造工業の拡大をもたらした。ＰＣＲは商業的および研究的実験室の大黒柱となっており、ＰＣＲの応用は増加してきた。例えば、現在ＰＣＲ技術は法廷、古生物学、進化的研究および遺伝学的相談の分野での使用がみられる。商業化は、ＰＣＲの応用において分子生物学の訓練を受けていない人を助けるキットの開発を導いた。
【０００８】
オリゴヌクレオチドはまた他の実験室操作でも使用される。これらの使用のいくつかはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３のような一般の実験室マニュアルに記載されている。そのような使用の代表的なものは、合成オリゴヌクレオチドプローブ、抗体およびオリゴヌクレオチドによるスクリーニング発現ライブラリー、ＤＮＡシークエンシング、ポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡのインビトロ増幅およびクローン化ＤＮＡの部位特異的突然変異誘発（上記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＭａｎｕａｌのＢｏｏｋ２参照）およびＤＮＡ−蛋白質相互作用およびポリメラーゼ連鎖反応（上記Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙの第２巻参照）である。
【０００９】
オリゴヌクレオチドは所望の使用に適合するように調整されたあつらえた特性を持つように合成できる。従って、診断において、研究試薬としておよび治療物質としてのそれらの有用性を増加させるために多数の化学修飾が導入された。それらの修飾には、標的鎖への結合性を高くするため（すなわち、それらの融解温度、Ｔm を高くする）、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド−標的複合体の同定を助けるため、細胞侵入を増加させるため、オリゴヌクレオチドの構造または活性を分解または妨害するヌクレアーゼおよびその他の酵素に対して安定化させるため、標的へ配列特異的結合した後の破壊（終了事象）の様式を提供するため、およびオリゴヌクレオチドの薬動力学的特性を改良するために設計された修飾が含まれる。
【００１０】
Ｇｉｂｓｏｎ，Ｋ．Ｊ．、およびＢｅｎｋｏｖｉｃ，Ｓ．Ｊ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８７，１５，６４５５〜６４６７はオリゴヌクレオチド内へ取り込まれたフタルイミド保護５−（３−アミノプロピル）−２’−デオキシウリジン  ヌクレオシドプローブを報告している。
Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８７，１５，４８５７〜４８７６はオリゴヌクレオチド内へ取り込まれたＣ−５置換デオキシウリジンを報告している。置換基はマスクされた一級脂肪族アミノ基を有しており、これをさらに種々の基で置換することができる。
【００１１】
１９９３年１月２２日に出願され、１９９４年８月４日に公開されたＰＣＴ出願第ＷＯ９４／１７０９４号は５−置換ピリミジン（シトシンまたはウラシル）塩基（ここで、５−置換基はＣ3-14ｎ−アルキル、Ｃ2-8 （Ｅ）−ｎ−１−アルケニル、エチニルまたはＣ4-12  ｎ−１−アルキル基である）、および一つまたはそれ以上の修飾５−置換ピリミジン塩基を持つオリゴヌクレオチドの合成を報告している。
１９９２年１１月２４日に出願され、１９９３年６月１０日に公開されたＰＣＴ出願第ＷＯ９３／１０８２０号は５−（１−プロピニル）ウラシルおよび５−（１−プロピニル）シトシンまたは関連類似体、および一つまたはそれ以上の修飾５−置換ピリミジン塩基を持つオリゴヌクレオチドの合成を報告している。
１９９２年１１月２４日出願されたＰＣＴ出願第ＷＯ９３／１０８２０号は塩基の５’位へ結合された炭素原子のパイ結合連結を持つオリゴヌクレオチド内へ取り込まれた２’−および５−置換ピリミジンヌクレオチドを報告している。
【００１２】
【発明の要旨】
本発明は核酸に対する改良された親和性を持ちおよび構造Ｉの単量体ユニットを少なくとも一つ持つオリゴマー化合物を提供する：
【００１３】
【化６】
0003787265.tif 000002
【００１４】
［式中：
Ｘはヒドロキシルまたはアミノであり；
ＲはハロまたはＣ1 〜Ｃ6 アルキルまたは置換Ｃ1 〜Ｃ6 アルキル（ここで該置換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルである）であり；
Ｌは酸素または硫黄であり；
ＺはフルオロまたはＯ−Ｒ1 Ｘ1 （式中、Ｒ1 はＣ1 〜Ｃ6 アルキル、Ｃ6 〜Ｃ10アリール、またはＣ7 〜Ｃ18アルカリールであり、およびＸ1 はＨ、ＮＨ2 またはイミダゾールである）であり；および
Ｑ1 およびＱ2 の一つは共有結合でヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドに結合されており、および該Ｑ1 およびＱ2 の他方はヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性化固相支持体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、オリゴ−ヌクレオチド／ヌクレオシド、活性化ホスフェート、ホスフェート、活性化ホスファイトまたはホスファイトである］。
【００１５】
本発明の一つの好適な態様において、Ｌは酸素である。別の態様において、ＺはＦである。
本発明のさらに別の態様において、オリゴマー化合物は約５から２００サブユニットの長さである。本発明のより好適な態様において、オリゴマー化合物は約５から５０サブユニットの長さである。さらにより好適な態様において、オリゴマー化合物は約１０から２０サブユニットの長さである。
別の態様においては、オリゴマー化合物における本発明の単量体サブユニットとヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシド間の共有結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェンホスホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホスホノチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホスホロアミデートから選択される。
【００１６】
本発明のさらに別の態様において、オリゴマー化合物は構造Ｉの複数の単量体サブユニットを持つように製造される。好適な態様において、構造Ｉの複数の単量体サブユニットを持つオリゴマー化合物は、前もって選択された場所に位置する単量体サブユニットを持つように製造される。本発明の特別な態様に含まれているのは構造IIの単量体サブユニットを少なくとも一つ持つオリゴマー化合物である：
【００１７】
【化７】
0003787265.tif 000003
【００１８】
［式中：
Ｘはヒドロキシルまたはアミノであり；
ＲはハロまたはＣ1 〜Ｃ6 アルキルまたは置換Ｃ1 〜Ｃ6 アルキル（ここで該置換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルである）であり；
Ｌは酸素または硫黄であり；および
Ｑ1 およびＱ2 の一つは連結残基を通してヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドに結合されており、および該Ｑ1 およびＱ2 の他方はヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性化固相支持体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、オリゴ−ヌクレオチド／ヌクレオシド、活性化ホスフェート、ホスフェート、活性化ホスファイトまたはホスファイトである］。
【００１９】
本発明の好適な態様において、ＬはＯである。
さらに別の態様において、本発明のオリゴマー化合物は約５から５０サブユニットの長さである。
別の態様において、オリゴマー化合物における本発明の単量体サブユニットとヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシド間の共有結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェンホスホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホスホノチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホスホロアミデートから選択される。
【００２０】
本発明のさらに別の態様において、オリゴマー化合物は構造IIの複数の単量体サブユニットを持つように製造される。好適な態様において、構造IIの複数の単量体サブユニットを持つオリゴマー化合物は前もって選択された場所に位置する単量体サブユニットを持つように製造される。本発明の特別な態様に含まれているのは構造III の単量体サブユニットを少なくとも一つ持つオリゴマー化合物である：
【００２１】
【化８】
0003787265.tif 000004
【００２２】
［式中：
Ｘはヒドロキシルまたはアミノであり；
ＲはハロまたはＣ1 〜Ｃ6 アルキルまたは置換Ｃ1 〜Ｃ6 アルキル（ここで該置換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルである）であり；
Ｌは酸素または硫黄であり；
Ｒ1 はＣ1 〜Ｃ6 アルキル、Ｃ6 〜Ｃ10アリール、Ｃ7 〜Ｃ18アルカリールであり、およびＸ1 はＨ、ＮＨ2 またはイミダゾールであり；および
Ｑ1 およびＱ2 の一つは連結残基を通してヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドに結合されており、および該Ｑ1 およびＱ2 の他方はヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性化固相支持体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、オリゴ−ヌクレオチド／ヌクレオシド、活性化ホスフェート、ホスフェート、活性化ホスファイトまたはホスファイトである］。
【００２３】
本発明の好適な態様において、ＬはＯである。
さらに別の態様において、本発明のオリゴマー化合物は約５から５０サブユニットの長さである。
別の態様において、オリゴマー化合物における本発明の単量体サブユニットとヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシド間の共有結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェンホスホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホスホノチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホスホロアミデートから選択される。
【００２４】
本発明のさらに別の態様において、オリゴマー化合物は構造III の複数の単量体サブユニットを持つように製造される。好適な態様において、構造III の複数の単量体サブユニットを持つオリゴマー化合物は前もって選択された場所に位置する単量体サブユニットを持つように製造される。
本発明に従うと、式：
【００２５】
【化９】
0003787265.tif 000005
【００２６】
［式中：
Ｑはピリミジン塩基または２−Ｓピリミジン塩基であり；
Ｒ1 は置換または非置換Ｃ1 〜Ｃ30アルキル、Ｃ1 〜Ｃ30アルケニル、Ｃ1 〜Ｃ30アルキニル、Ｃ6 〜Ｃ14アリールまたはＣ7 〜Ｃ30アラルキルであり、ここで該置換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルであり；および
Ｒ2 およびＲ3 は独立して水素またはヒドロキシル保護基である］
の２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシド合成のための改良法も提供され、該方法は以下の工程を含む：
【００２７】
２−２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドを提供し；
式Ｒ1 −ＯＨのアルコールを選択し；および
該２−２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドおよび該アルコールを該２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドを得るのに有効な時間、温度および圧力の条件下、ルイス酸で処理する。
本発明に従うと、式：
【００２８】
【化１０】
0003787265.tif 000006
【００２９】
〔式中：
Ｘ’はＯまたはＳであり；
Ｒ1 は置換または非置換Ｃ1 〜Ｃ30アルキル、Ｃ1 〜Ｃ30アルケニル、Ｃ1 〜Ｃ30アルキニル、Ｃ6 〜Ｃ14アリールまたはＣ7 〜Ｃ30アラルキルであり、ここで該置換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルである；
Ｒ2 およびＲ3 は独立して水素またはヒドロキシル保護基であり；
Ｒ5 およびＲ6 は独立してＨ、Ｃ1 〜Ｃ30ヒドロカルビルまたは置換Ｃ1 〜Ｃ30ヒドロカルビルである〕
の２’−Ｏ−置換シチジンヌクレオシド合成のための改良法も提供され、該方法は以下の工程を含む：
式：
【００３０】
【化１１】
0003787265.tif 000007
【００３１】
の２−２’−アンヒドロウリジンヌクレオシドを提供し；
式Ｒ1 −ＯＨのアルコールを選択し；および
該２−２’−アンヒドロウリジンヌクレオシドおよび該アルコールを該２’−Ｏ−置換ウリジンヌクレオシドを得るのに有効な時間、温度および圧力の条件下、ルイス酸で処理し；および
該２’−Ｏ−置換ウリジンヌクレオシドを該２’−Ｏ−置換シチジンヌクレオシドへアミノ化する。
本発明の好適な態様において２−２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドおよび式Ｒ1 −ＯＨのアルコールは、反応容器として例えば、高圧容器のような圧力封入容器中で処理される。好適には反応容器は約１２０℃から約２００℃で加熱される。
【００３２】
本発明のより好適な態様において、ルイス酸はホウ酸エステル（ｂｏｒａｔｅ）、特にホウ酸トリアルキルである。好適には、ホウ酸トリアルキルのアルキル基はアルコールのＲ基と同一のものであり、従って、ホウ酸エステルの式はＢ（ＯＲ1 ）3 である。ホウ酸トリアルキルは好適には水素化ホウ素（ｂｏｒａｎｅ）をアルコールで処理することにより製造される。好適には、２−２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドの処理に使用されるアルコールはまたホウ酸トリアルキルの製造にも使用され、好ましくは式ＨＯ−Ｒ1 のアルコールである。
本発明のいくつかの好適な態様において、Ｒ1 はＣ1 〜Ｃ30アルキルであり、より好ましくはＣ1 〜Ｃ10アルキルである。別の好適な態様において、Ｒ1 はＣ6 〜Ｃ14アリールである。
【００３３】
本発明の一つの好適な態様において、本方法により製造されるピリミジンヌクレオシドはウリジンまたは５−メチルウリジンである。
本発明の別の好適な態様において、本方法により製造される２’−Ｏ−置換シチジンヌクレオシドはウリジンまたは２’−Ｏ−メチル−５−メチルシチジンである。
本発明に従うと、少なくとも一つの構造IVの単量体サブユニットを含むオリゴマー化合物が提供される：
【００３４】
【化１２】
0003787265.tif 000008
【００３５】
［式中：
Ａはヒドロキシルまたはアミノであり；
ＲはハロまたはＣ1 〜Ｃ6 アルキルまたは置換Ｃ1 〜Ｃ6 アルキル（ここで該置換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルである）であり；
Ｌは酸素または硫黄であり；
Ｚ’は置換または非置換Ｃ1 〜Ｃ30アルキル、Ｃ1 〜Ｃ30アルケニル、Ｃ1 〜Ｃ30アルキニル、Ｃ6 〜Ｃ14アリールまたはＣ7 〜Ｃ30アラルキルであり、ここで該置換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルであり；および
Ｑ1 およびＱ2 の一つは結合残基を通してヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドに結合されており、および該Ｑ1 およびＱ2 の他方はヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性化固相支持体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、オリゴ−ヌクレオチド／ヌクレオシド、活性化ホスフェート、ホスフェート、活性化ホスファイトまたはホスファイトである］。
【００３６】
本発明の好適な態様において、ＬがＯである単量体サブユニットを少なくとも一つ持つオリゴマー化合物が提供される。本発明のさらに好適な態様において、Ｚ’が置換アルキルである単量体サブユニットを少なくとも一つ持つオリゴマー化合物が提供される。より好適な態様において、Ｚ’はメトキシエチル（ＣＨ3 ＯＣＨ2 ＣＨ2 −）である。
一つの態様において、本発明のオリゴマー化合物は５から２００の単量体サブユニットを含んでいる。より好適な態様において、本発明のオリゴマー化合物は５から５０の単量体サブユニットを含んでいる。さらにより好適な態様において、本発明のオリゴマー化合物は１０から２０のサブユニットを含んでいる。
【００３７】
別の態様において、Ｑ1 およびＱ2 の一つは連結残基を通してヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドに結合されており、ここで連結残基はホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェンホスホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホスホノチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホスホロアミデートを含んでいる。
本発明のさらに別の態様において、オリゴマー化合物は上記の式の複数の単量体サブユニットを持つように提供される。より好適な態様では、オリゴマー化合物は前もって選択された場所に単量体サブユニットが位置するように提供される。
【００３８】
【好適な態様の説明】
本発明の好適なオリゴマー化合物は少なくとも一つの構造Ｉの単量体サブユニットを持っている。構造Ｉは２’位が置換され、１’がグリコシル結合を通して５−置換ピリミジンの１へ結合されたβ−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル糖である。単量体サブユニットの５’および３’末端は、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドまたは混合オリゴ−ヌクレオチド／ヌクレオシドへ結合でき、またはオリゴマー化合物の３’または５’終結末端でありうる。
【００３９】
本発明の化合物の製造に使用される単量体サブユニットはヌクレオチドおよびヌクレオシドを含んでいる。ヌクレオチドはリン結合残基を含んでおり、一方、ヌクレオシドはリン結合残基を含んでいないが、各々ともグリコシル結合を通して核酸塩基へ結合されたリボフラノシル残基を有する。
本発明の単量体サブユニットは連結残基を用いて結合されている。連結残基には、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェンホスホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホスホノチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート、ケトン、スルホン、カーボネートおよびチオアミデートが含まれる。アルキルホスホノチオエート結合はＷＯ９４／０２４９９号に開示されている。他のそのような残基もまた使用することができる。
【００４０】
本発明の一つの態様において、２’−Ｆ−５−アルキル−ウリジン（および５−ハロ類似体）単量体サブユニットは、最初にヌクレオシドの５−位に適当なアルキル基を置換することにより製造される。５−ハロ基の場合、５−Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩウラシルがＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能である。ウラシルのＣ−５でのアルキル、アルケニルおよびアルキニルの置換は１９９２年１１月２４日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／１０１１５号に開示されており、アルキル置換の例はさらにＭａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣｒｏｏｋｅおよびＬｅｂｌｅｕ編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，１９９３に記載されている。
【００４１】
５−アルキル化ウリジンはＤＭＦ中で炭酸ジフェニルおよび炭酸水素ナトリウムで処理し、続いて精製することにより、２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−アルキルウリジン］へ変換される。２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−アルキルウリジン］は適当な溶媒中（例えばジオキサン）、ＨＦ／ピリジンでさらに処理されて１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−アルキルウリジンを与える。この化合物は標準的な方法および技術に従ってＤＭＴ／アミダイトへ変換され、１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−フルオロ−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−アルキルウリジンを与える。１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−フルオロ−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−アルキルウリジンはオリゴマー化合物合成において単量体サブユニット前駆体として使用される。
【００４２】
５−アルキル化−２’−Ｆ−ウリジンの５−アルキル化−２’−Ｆ−４−Ｎ−保護（例えばベンゾイル）シチジンへの変換は１，２，４−トリアゾールを用いる既知の方法および技術により達成される。５−Ｏ−アルキル化ウリジンは最初、３’および５’位が保護される。この保護は無水酢酸により達成できる。塩基存在下（例えば、トリエチルアミン）、適当な溶媒（例えばアセトニトリル）中で１，２，４−トリアゾールを低温にてＰＯＣｌ3 で処理する。保護された５−Ｏ−アルキル化−２’−Ｆ−ウリジンを適当な溶媒に溶解し、トリアゾール／ＰＯＣｌ3 を含む溶液に加える。十分な時間が経過した後、続いて後処理および精製を行うとトリアジン−１−（３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−アルキルウリジンが得られる。この化合物はアンモニア処理することにより５−アルキル−１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−シトシンへ変換される。環外アミノ基は例えば、適当な溶媒（例えば、ピリジン）中で無水安息香酸で処理することにより保護される。
【００４３】
この化合物は標準的な方法および技術に従ってＤＭＴ／アミダイトへ変換され、４−Ｎ−保護−５−アルキル−１−（２−フルオロ−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−シトシンが得られる。４−Ｎ−保護−５−アルキル−１−（２−フルオロ−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−シトシンはオリゴマー化合物合成において単量体サブユニット前駆体として使用される。
【００４４】
５位の置換基に対しアルキルより複雑な基（例えば、ハロまたは置換Ｃ1 〜Ｃ6 アルキル、ここで該置換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルである）を用いる５−置換−２’−Ｆ−ピリミジンの製造では、適当な保護基を用いて、アンヒドロ化合物の製造に先立ってその基が保護されることが必要である。５位に保護基を持つ化合物の全合成は飽和アルキル基の代わりにこれらの置換アルキル基の一つの取り込みに対して前に記載したものと同一である。
【００４５】
本発明の別の態様において、２’−Ｏ−置換−５−置換ウリジン単量体サブユニットは、アンヒドロ体の開裂にアルコール（例えば、フェニル置換基に対してフェノール、またはＯ−プロピル置換基に対してプロパノール）が使用されることを除いては上記の２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−アルキルウリジン］の方法を用いて製造される。
生じる化合物は標準的な方法および技術に従ってＤＭＴ／アミダイトへ変換され、１−（２−Ｏ−置換−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−置換ウリジンが得られる。ＤＭＴ／アミダイトはオリゴマー化合物合成において単量体サブユニット前駆体として使用される。
【００４６】
１−（２−Ｏ−置換−５−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−置換ウリジンは１，２，４−トリアゾールを用いる既知の方法および技術によりシチジン類似体に変換される。５−置換−２’−Ｏ−置換ウリジンはまず、適当な保護基（例えば、無水酢酸）を用いて３’位が保護される。本物質は後処理後に精製される。塩基存在下（例えば、トリエチルアミン）、適当な溶媒（例えばアセトニトリル）中で１，２，４−トリアゾールを低温にてＰＯＣｌ3 で処理する。保護された５−置換−２’−Ｏ−置換−３’−Ｏ−保護ウリジンを適当な溶媒に溶解し、トリアゾール／ＰＯＣｌ3 を含む溶液に加える。十分な時間が経過した後、続いて後処理および精製を行うと１−（２−Ｏ−置換−３−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−４−トリアゾロ−５−置換ピリミジンが得られ、これはアンモニアで処理することによりシチジン類似体へ変換される。環外アミノ基（Ｎ−４）は例えば、ピリジンまたはＤＭＦのような適した溶媒中で無水安息香酸で処理することにより保護され、前に例示したようにＤＭＴ／アミダイトへさらに変換される。得られる１−（２−Ｏ−置換−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−４−Ｎ−ベンゾイル−５−置換シチジンはオリゴマー化合物合成において単量体サブユニット前駆体として使用される。
【００４７】
本発明の別の態様において、２’−置換−５−置換ピリミジンの２−Ｓ類似体が製造される。２’−Ｏ−置換−２−チオ−５−置換ウリジンは２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイルリボース糖から出発し、グリコシル化工程を経て２−チオ−５−置換ピリミジンと結合させる１つの方法により製造される。種々の２−チオ−５−置換ピリミジンの合成はＶｏｒｂｒｕｇｇｅｎ，Ｐ．ら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，１９６９，８，９７６〜９７７およびＶｏｒｂｒｕｇｇｅｎ，Ｐ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，１９７３，１０６，３０３９〜３０６１に記載されている。２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイルリボース糖および５−置換−２−チオウラシルは適当な溶媒に溶解し、Ｎ−Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミドおよびトリメチルシリル  トリフレートで処理される。生じた２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−２−チオ−５−置換ウリジンを適当な溶媒中でナトリウムメトキシドを用いて脱保護すると２−チオ−５−置換ウリジンが得られる。２−チオ−５−置換ウリジンを適当な溶媒に溶解し、酸化ジブチルスズおよびヨウ化テトラブチルアンモニウム、続いてハロゲン化アルキル（例えば、ヨウ化メチル）で処理すると、２’−Ｏ−置換−２−チオ−５−置換ウリジンが得られる。
【００４８】
２’−Ｏ−置換−２−チオ−５−置換ウリジンは標準的な方法および技術に従ってＤＭＴ／アミダイトへ変換され、１−（２−Ｏ−置換−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−２−チオ−５−置換ウリジンが得られる。ＤＭＴ／アミダイトはオリゴマー化合物合成において単量体サブユニット前駆体として使用される。
【００４９】
本発明のさらに別の態様において、２’−Ｆ−５−置換ピリミジンの２−Ｓ類似体が製造される。２’−Ｆ−２−チオ−５−置換ピリミジンを製造する一つの方法は２’−Ｆ−２−置換−５−置換ピリミジンの製造に使用される方法と類似した方法を使用するものである。この方法では官能基を選択的に保護し、上記のＯ−２および２’間で形成されるアンヒドロ結合と同様に、Ｓ−２および２’間にアンヒドロ結合を形成させる。
【００５０】
２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−２−チオ−５−メチル−ウリジンは２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイルリボースおよび５−置換−２−チオウリジン間のグリコシル化により形成される。適当な溶媒中、ナトリウムメトキシドで脱保護して精製した後、得られた５−メチル−２−チオウリジンは標準的方法および技術を用いて５’位がＤＭＴで保護される。次に、適当な溶媒中、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリドで処理して２’位がｔ−ブチルジメチルシリル基で保護される。
【００５１】
得られた５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチル−ジメチルシリル−５−置換−２−チオウリジンは適当な溶媒に溶解し、メタンスルホニルクロリドで処理すると５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチル−ジメチルシリル−２’−メタンスルホニル−５−置換−２−チオウリジンが得られる。５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチル−ジメチルシリル−２’−メタンスルホニル−５−置換−２−チオウリジンを適当な溶媒中、ナトリウムメトキシドでさらに処理すると５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチル−ジメチルシリル−２−２’−チオアンヒドロ−５−置換−２−チオウリジンが得られる。この化合物をジオキサン中、ＨＦ／ピリジンでさらに処理すると２’−フルオロ−３’−ｔ−ブチル−ジメチルシリル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−置換−２−チオウリジンが得られる。
【００５２】
２’−フルオロ−３’−ｔ−ブチル−ジメチルシリル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−置換−２−チオウリジンは標準的な方法および技術を用いてアミダイトへ変換され１−（２−フルオロ−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−２−チオ−５−置換ウリジンが得られる。ＤＭＴ／アミダイトはオリゴマー化合物合成において単量体サブユニット前駆体として使用される。
【００５３】
２’−フルオロ−３’−ｔ−ブチル−ジメチルシリル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−置換−２−チオウリジンのシチジン類似体への変換は１，２，４−トリアゾールを用いる１−（２−Ｏ−置換−５−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−置換ウリジンのそのシチジン類似体への変換のための上記の方法を用いて達成される。２−Ｓ化合物の変換のためにはこの基はまた適当な保護基（例えば、トルオイル）を用いて保護されなければならない。
【００５４】
”プロテインキナーゼＣのオリゴヌクレオチド調節”と題し、１９９５年７月９日に出願された米国特許出願第０８／０８９，９９６号（代理人書類番号ＩＳＩＳ−１１５４、本出願と共通して譲渡されており、その開示は本明細書に援用される）において、ギャップを持つオリゴヌクレオチド（Ｄｅａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２３，１６４１６を参照されたい）が合成され、その効力を決定するためプロテインキナーゼＣで試験されている。良好な効力を持つオリゴヌクレオチドの一つの例は配列ＩＤ番号：２７であり、それは２０ｍｅｒデオキシホスホロチオエートである。このオリゴヌクレオチドは上記のアッセイにおいて、小さい方の転写体の約８０％の減少、および大きい方の転写体の９０％以上の減少を与えた。
【００５５】
本発明の一つの態様において、少なくとも一つの構造Ｉの単量体ユニットを持つオリゴマー化合物が合成され、ＰＫＣ−α蛋白質合成の阻害に使用された。配列ＩＤ番号：２７と類似の配列を持つ二つのオリゴヌクレオチドが合成された：オリゴヌクレオチド配列ＩＤ番号：２８、この配列は完全に修飾されたホスホロチオエートであり、１−６および１５−２０位に２’−フルオロ、および２、３、５および１６−１８位のチミンの代わりにウラシルを持つ；オリゴヌクレオチド配列ＩＤ番号：２９、この配列は完全に修飾されたホスホロチオエートであり、２、３、５および１６−１８位のチミンの代わりに２’−フルオロ−５−メチルウリジンを持ち、さらに１、４、６、１５、１９および２０位に２’−フルオロを持っている。これらの二つのオリゴヌクレオチド（配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：２９）は上記のアッセイで評価され、その結果は配列ＩＤ番号：２７の結果と比較された。
【００５６】
配列ＩＤ番号：２８および配列ＩＤ番号：２９は配列ＩＤ番号：２７と比較して約１０倍の効力の増加を示した。配列ＩＤ番号：２９はまた配列ＩＤ番号：２８と比較して測定できるほどの効力の増加を示した。
上記の結果から期待されるようにこれら三つのオリゴヌクレオチドのＴm は配列ＩＤ番号：２９＞配列ＩＤ番号：２８＞配列ＩＤ番号：２７の順であった。
【００５７】
【表１】
0003787265.tif 000009
本発明の一つの態様において、本発明のオリゴマー化合物は式IVの複数の単量体サブユニットを有する。
【００５８】
【化１３】
0003787265.tif 000010
【００５９】
〔式中、置換基Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｑ1 、Ｑ2 およびＺ' は前に定義した通りである〕
本発明の別の態様において、構造Ｉ−IVの複数の単量体サブユニットを持つ本発明のオリゴマー化合物は前もって決められた配列を持っている。オリゴマー化合物の活性を増加させるため、本発明の単量体サブユニットは前もって決められた配列のオリゴマー化合物中の前もって決められた場所に位置することができる。
【００６０】
本発明の一つの態様において、ヌクレオシドダイマーが本発明の化合物内へ取り込まれる。本発明の化合物内へ混合オリゴ−ヌクレオチド／ヌクレオシドを取り込むための一つの方法は、標準オリゴヌクレオチド合成プロトコールを用い、オリゴマー化合物内へ前もって決められた順番でヌクレオチド、ヌクレオシドダイマーおよび構造Ｉ〜IVの単量体サブユニットを取り込ませることである。本発明の一つの態様において、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシドおよびヌクレオシドダイマーは”ヒドラジンに基づいた、およびヒドロキシルアミンに基づいたオリゴヌクレオシド結合およびその二方向性合成法”と題して１９９３年１２月２８日に出願された米国特許出願第０８／１７４，３７９号（代理人書類番号ＩＳＩＳ−０７１６としても同定される）；”主鎖修飾オリゴヌクレオチド類似体および基結合によるその製造”と題して１９９３年３月３１日に出願された米国特許出願第０８／０４０，９３３号（代理人書類番号ＩＳＩＳ−０７１７としても同定される）；および”主鎖修飾オリゴヌクレオチド類似体および基結合によるその製造”と題して１９９３年３月３１日に出願された米国特許出願第０８／０４０，９０３号（代理人書類番号ＩＳＩＳ−０７１８としても同定される）（本出願と共通して譲渡されており、その開示は本明細書において援用される）の開示に従って製造される。
【００６１】
本発明の目的のためのオリゴ−ヌクレオチド／ヌクレオシドは、非リン酸結合により共有結合で結合された少なくとも二つのヌクレオシドを持ち、前に定義したような単量体サブユニットとのリン含有共有結合を形成する混合主鎖オリゴマーである。オリゴ−ヌクレオチド／ヌクレオシドはリン含有およびリンを含まない結合を通して結合された複数のヌクレオチドおよびヌクレオシドを持つことができる。
【００６２】
本発明の方法は２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドの合成に有用である。２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドはオリゴヌクレオチドおよび関連化合物の合成に日常的に使用される重要な化合物である。市販品として入手可能な代表的な２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドには２’−Ｏ−メチルウリジンおよび２’−Ｏ−メチルシチジンが挙げられる。
本発明の目的には、ピリミジンヌクレオシドはウリジンおよびシチジンのような天然に存在するピリミジン塩基、ならびに２Ｓ類似体および５−および６−置換ウリジンおよびシチジンのような天然に存在しないピリミジンを含んでいる。Ｎ３置換ピリミジン、および例えば４および／または５位に結合されたヘテロ環構造を持つピリミジンも含まれる。本発明に利用できる多くの修飾ピリミジンが本分野で知られている（例えば、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １  ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．１９８８を参照されたい）。本明細書で定義されるように、２Ｓピリミジン塩基とはその２位に結合された硫黄を持つピリミジン塩基である。
【００６３】
本発明に従う核酸塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、ウリジンおよびチミンのようなプリンおよびピリミジン、ならびにキサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびその他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル，８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシおよびその他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよびその他の５−置換ウラシルおよびシトシン，７−メチルグアニンのような他の合成および天然の核酸塩基が含まれる。さらに別のプリンおよびピリミジンには米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８５８〜８５９ページ，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０に記載されているもの、およびＥｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  １９９１，３０，６１３に記載されているものが含まれる。
【００６４】
本明細書に定義されるように、２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドはピリミジン環の２位とヌクレオシドの糖の２’−酸素を連結する単結合を持つピリミジンヌクレオシドである。２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドは、本明細書で定義されるようにピリミジン環の２位とヌクレオシドの糖の２’位が間に入る硫黄原子により結合されているピリミジンヌクレオシドである。
いくつかの好適な態様において、２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドまたは２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドは一般式：
【００６５】
【化１４】
0003787265.tif 000011
【００６６】
［式中：
Ｘ' はＯまたはＳであり；
Ｒ2 およびＲ3 は独立して水素またはヒドロキシル保護基であり；および
Ｒ5 およびＲ6 は独立してＨ、Ｃ1 〜Ｃ30ヒドロカルビルまたは置換Ｃ1 〜Ｃ30ヒドロカルビルである］
を持っている。
【００６７】
本発明の方法における使用に適した２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドおよび２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドには無置換のものならびにピリミジン環に置換基を持つものが含まれる。種々のそのように置換されたピリミジン置換が本分野で知られている（例えば、５位でのアルキル化）。例えば、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １、上記文献、を参照されたい。そのような置換２，２’および２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドは天然に存在するヌクレオシドから製造でき、２，２’または２Ｓ，２’結合形成の前または後に修飾できる。従って、本発明の一つの態様では、２，２’または２Ｓ，２’結合形成の後で２，２’または２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドへ置換基が結合され、本発明の別の態様では２，２’または２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシド形成に先立ってピリミジンヌクレオシドのピリミジン環へ置換基が結合される。
【００６８】
本発明の方法は２’−Ｏ−置換ピリミジンの製造において著しい経済的利点を提供する。例えば、修飾オリゴヌクレオチドおよび関連化合物の合成の重要な中間体である化合物２’−Ｏ−メチルウリジンは、本発明の方法を用いると市販品として入手可能なものの約１０分の１の経費で製造できる。修飾オリゴヌクレオチドおよび関連化合物の合成に有用な別の有用な中間体、２’−Ｏ−メチルシチジンは、本発明の方法を用いると市販品として入手可能なものの約５分の１の経費で製造できる。これらの経費は大規模合成で以前に得られた収率、出発材料の価格および必要とされる労働時間に基づいている。
【００６９】
２，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドはピリミジンヌクレオシドをＤＭＦまたは他の伝統的な溶媒中で、炭酸ジフェニルおよび炭酸水素ナトリウムで処理し、続いて精製することにより製造することができる。例えば、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｌｅｒｏｙ  Ｂ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８８を参照されたい。得られた２，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドは加熱しながら弱い求核試薬（例えば、アルコール）およびルイス酸（例えば、ホウ酸トリアルキル）で処理すると、対応する２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドが得られる。本発明の好適な態様において、２Ｓ，２’または２，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドは弱い求核試薬の存在下、式Ｒ1 −ＯＨのアルコールで処理され、各々２’−Ｏ−Ｒ1 −ピリミジンヌクレオシドまたは２Ｓ類似体が得られる。本方法は２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドの小規模および大規模合成の両方に使用できる。
【００７０】
２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドは例えば、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｌｅｒｏｙ  Ｂ．（上記文献）の方法に従ってピリミジンヌクレオシドから製造できる。Ｕｅｄａ，Ｔ．，Ｔａｎａｋａ，Ｈ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｙｋｙｏ），１９７０，１８，１４９もまた参照されたい。２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドは次に本発明の方法に従って弱い求核試薬（例えば、アルコール）およびルイス酸（例えば、ホウ酸トリアルキル）で処理でき、対応する２’−Ｏ−置換  ２Ｓ−ピリミジンヌクレオシドが得られる。
【００７１】
２’−Ｏ−置換ピリミジンおよび２’−Ｏ−置換２Ｓ−ピリミジンヌクレオシドは標準的方法および技術に従って各々ＤＭＴ／アミダイトへ変換でき、１−［５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−置換−（３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト）］ピリミジンヌクレオシドまたは１−［５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−置換−（３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト）］−２Ｓ−ピリミジンヌクレオシドが得られ、その各々はオリゴマー化合物合成において単量体サブユニット前駆体として使用できる。
【００７２】
特定の理論に縛られるのは望まないが、アンヒドロピリミジンヌクレオシド環の開裂機構には弱い求核試薬による２’−炭素への求核的攻撃が含まれていると考えられる。求核攻撃は架橋酸素へのルイス酸の複合体形成により容易になっていると考えられる。得られる複合体は２’−炭素を弱い求核試薬による求核的攻撃に対して活性化していると考えられる。適用できるであろう別の理論は、ルイス酸が５’および３’ヒドロキシル基へ複合し、分子のコンホメーション変化を起こして弱い求核試薬による攻撃を可能にして生成物を与えることである。
本発明の一つの態様では、使用されるルイス酸はホウ酸トリアルキルである。ホウ酸トリアルキルは購入でき、またはホウ酸のアルキル基が求核試薬のアルキル基と同一となるように製造できる。例えば、２’−Ｏ−メチルウリジンが製造される場合、ホウ酸トリメチルが好適なルイス酸であろうし、メタノールが好適な求核試薬であろう。ホウ酸トリメチル、トリエチルおよびトリプロピルはＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎから市販品として入手可能である。
【００７３】
もしくは、ホウ酸トリアルキルは前に示したように水素化ホウ素および２’位の所望の置換基に対応するアルコールから製造できる。典型的には、水素化ホウ素（ＴＨＦ中、１．０Ｍ溶液として利用可能である）を各々のアルコールの３当量と反応させる。水素の発生が完了したら、溶液を濃縮してＴＨＦを除去する。得られた溶液は所望のアルコールに所望のホウ酸トリアルキルを含んでおり、前に説明したように本方法においてアンヒドロ環の開裂を達成するために使用できる。
【００７４】
本発明の一つの態様において、ピリミジンがウリジンまたは置換ウリジンである２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドは、既知の方法および技術により、例えば、１，２，４−トリアゾールを用いて対応するシチジン類似体へ変換（アミノ化）できる。典型的には、２’−Ｏ−置換ウリジンヌクレオシドは最初に例えば無水酢酸のような伝統的な保護基で３’−Ｏおよび５’−Ｏ位が保護される。１，２，４−トリアゾールは伝統的な溶媒（例えば、アセトニトリル）中、塩基（例えば、トリエチルアミン）存在下でＰＯＣｌ3 にて低温で処理する。保護２’−Ｏ−置換ウリジンヌクレオシドを伝統的な溶媒に溶解し、トリアゾール／ＰＯＣｌ3 含有溶液へ加える。十分な時間が経過後、後処理し精製すると、トリアジン−１−（３，５−ジ−Ｏ−保護−２−置換）ピリミジンヌクレオシドが得られる。この化合物はアンモニアで処理することによりシチジン類似体へ変換できる。環外アミノ基は、例えば、伝統的な溶媒（例えば、ピリジン）中で無水安息香酸で処理することにより保護できる。
【００７５】
本発明のさらに別の態様において、ピリミジンがウリジンまたは置換ウリジンである２’−Ｏ−置換−２Ｓ−ピリミジンヌクレオシドは既知の方法および技術により、例えば、１，２，４−トリアゾールを用いて対応するシチジン類似体へ変換できる。トリアゾールでの処理に先立って２Ｓ基が適当な保護基（例えば、トルオイル）で保護されることを除いて前に示した方法に従う。
得られた２’−Ｏ−置換ウリジンおよび２’−Ｏ−置換２Ｓ−ウリジンは標準的方法および技術に従って各々ＤＭＴ／アミダイトへ変換でき４−Ｎ−保護−１−（２−Ｏ−置換−（３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメチキシトリチル）シチジンまたはその２Ｓ類似体が得られる。４−Ｎ−保護−１−（２−Ｏ−置換−（３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメチキシトリチル）シチジンまたはその２Ｓ類似体はオリゴマー化合物合成において単量体サブユニット前駆体として使用できる。
【００７６】
本発明の一つの態様において２’−Ｏ−置換−５−置換ウリジン単量体サブユニットは、上記のように合成された５−置換ウリジンから出発して製造される。この化合物は適当な溶媒（例えば、メタノール）中で酸化ジブチルスズで処理して、精製する。得られた１−（２’，３’−ジ−Ｏ−ブチルスズ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−置換ウリジンは適当な溶媒中でハロアルキル、保護ハロアルキルアミノまたはハロアルキルイミダゾ化合物（例えば、ヨードプロパン）で処理すると各々２’−Ｏ−置換体が得られる。アラルキルおよびアリール基もまたアルキル基の代わりに使用できる。
【００７７】
種々の置換を持つピリミジン（即ち、置換基を持つピリミジン）が本分野で知られている。本発明の方法で使用できるそのような置換基の代表的なものには、アルキルまたは置換アルキル、アルケニルまたは置換アルケニル、アルキニルまたは置換アルキニル、炭素環式アルキル、炭素環式アルケニル、炭素環式アラルキル、アリール、アラルキルまたは置換アラルキルのようなヒドロカルビル基が含まれる。好適には、アルキル、アルケニルおよびアルキニル置換基は１から３０の炭素を持っており、１から約１０の炭素が特に好適である。好適には、アリール基は６から約１４の炭素を持ち、アラルキル基は７から約３０の炭素を持っている。上に掲げた置換基はそれら自身アルコキシ、アルコール、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、またはアルキル、アリール、アルケニルまたはアルキニル基およびエーテルのような置換基を持つことができる。
【００７８】
ウラシルのＣ−５でのアルキル、アルケニルおよびアルキニル基の置換は１９９２年１１月２４日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／１０１１５に報告されており、アルキル置換の例はさらにＭａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３に記載されている。さらに別の置換はＴｏｗｎｓｅｎｄ，Ｌ．Ｂ，（同上）により報告されている。
【００７９】
本発明の方法において、２Ｓ，２’または２，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドは式Ｒ1 −ＯＨのアルコールで処理される。代表的なＲ1 基にはアルキルまたは置換アルキル、アルケニルまたは置換アルケニル、アルキニルまたは置換アルキニル、炭素環式アルキル、炭素環式アルケニル、炭素環式アラルキル、アリール、アラルキルまたは置換アラルキルが含まれる。好適には、アルキル、アルケニルおよびアルキニルＲ基は１から３０の炭素を持っており、１から約１０の炭素が特に好適である。好適には、アリール基は６から約１４の炭素を持ち、アラルキル基は７から約３０の炭素を持っている。上に掲げたＲ1 基はそれら自身アルコキシ、アルコール、アミノ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、エーテル、またはさらにアルキル、アリール、アルケニルまたはアルキニル基のような置換基を持つことができる。
【００８０】
本発明の方法に従って製造された２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドおよび２’−Ｏ−置換２Ｓ−ピリミジンヌクレオシド（置換ピリミジンヌクレオシド）は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、混合オリゴ−ヌクレオチド／ヌクレオシドおよび本分野で知られている関連化合物を含む種々の化合物の製造に使用できる。
本発明の文脈において、用語”オリゴヌクレオチド”とは二つまたはそれ以上のヌクレオチドサブユニットを含むオリゴマーまたはポリマーを含む。本明細書において使用される場合、ヌクレオチドとは天然に存在する糖、核酸および糖間（主鎖）結合ならびに同様に機能する天然には存在しない部分を含んでいてもよい。例えば、促進された細胞取り込みおよびヌクレアーゼ存在下での増加した安定性のような特性のため、そのような化学的に修飾されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドは天然の形よりもしばしば好適である。
【００８１】
本発明のために意図されるいくつかの好適なオリゴヌクレオチドの特定の例には、ホスホジエステル糖間結合（主鎖）に加えて、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環式糖間結合のような修飾糖間結合が含まれる。
【００８２】
本明細書で使用される場合、用語オリゴヌクレオシドは非リン結合残基を持つ二つまたはそれ以上のヌクレオシドサブユニットを含むオリゴマーまたはポリマーを含む。本発明に従ったオリゴヌクレオシドはグリコシル結合を通して核酸塩基に結合されたリボフラノース残基を持っている。本発明の目的のためのオリゴ−ヌクレオチド／ヌクレオシドは、非リン酸結合により共有結合で結合された少なくとも二つのヌクレオシドおよびヌクレオチドとの少なくとも一つのリン含有共有結合を持ち、ここで単量体ヌクレオチドまたはヌクレオシドユニットの少なくとも一つは本発明の方法を用いて製造された２’−Ｏ−置換化合物である。オリゴ−ヌクレオチド／ヌクレオシドはさらにリン含有および／または非リン含有結合を通して結合された複数のヌクレオチドおよびヌクレオシドを持つことができる。
【００８３】
本発明の方法を用いて製造される２’−Ｏ−置換化合物を結合する方法には、ホスホロアミダイトへの変換、続いての液相または固相化学が含まれる。代表的な液相技術は１９９３年５月１１日に公開され、本発明と共通して譲渡されている米国特許第５，２１０，２６４号に記載されている。代表的な固相合成は標準ホスホロアミダイト化学を利用するＤＮＡおよびＲＮＡ合成に典型的に用いられている技術である。（例えば、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９３を参照されたい。）好適な合成的固相合成は活性化リン酸としてホスホロアミダイトを利用する。ホスホロアミダイトはＰIII 化学を利用する。中間体ホスファイト化合物は続いて既知の方法を用いてＰV 状態へ酸化される。これは、選択された酸化条件に依存してホスホジエステルまたはホスホロチオエートリン酸結合を含む結合の合成を可能とする。他のリン酸結合もまた発生させることができる。適した結合の代表的な例には、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェンホスホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホスホノチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート、ケトン、スルフォン、カルボネート、チオアミデートおよび本分野で知られているその他のそのような残基が含まれる。アルキルホスホノチオエート結合はＷＯ  ９４／０２４９９に開示されている。
【００８４】
オリゴヌクレオチド合成の結合効率を増加させるために使用される標準的方法および技術には３’および／または５’官能基の活性化が含まれる。いくつかの一般的に活性化される基はリン酸および亜リン酸基であり、それらは対応する活性化リン酸および活性化亜リン酸基を与える（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．，Ｇａｉｔ  Ｍ．Ｊ．，Ｅｄｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＩＬ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０，第３章，ｐ．９８を参照されたい）。多くの他の基が知られており、本発明で使用できる。
【００８５】
本明細書の目的のためには、アルキル基には置換および無置換直鎖、分岐鎖および脂環式炭化水素、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシルおよびその他のより高級な炭素アルキル基が含まれるが、それらに制限されるわけではない。さらなる例としては２−メチルプロピル、２−メチル−４−エチルブチル、２，４−ジエチルプロピル、３−プロピルブチル、２，８−ジブチルデシル、６，６−ジメチルオクチル、６−プロピル−６−ブチルオクチル、２−メチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシルおよびその他の分岐鎖基が含まれる。
【００８６】
本発明に有用なアルケニル基には、ビニル、アリルおよびクロチルのような、一つまたはそれ以上の炭素−炭素二重結合を含む上記のアルキル基から誘導される残基が含まれるが、それらに制限されるわけではない。
本発明に有用なアルキニル基には、プロパルギルのような、一つまたはそれ以上の炭素−炭素三重結合を含む上記のアルキル基から誘導される残基が含まれるが、それらに制限されるわけではない。
用語アリールとは例えば、フェニル、ナフチル、キシリル、ピロールおよびフリル基を含む単環式および多環式芳香族基を示すことを企図している。アリール基は少ない場合は３つの炭素原子を含むことができるが（例えば、イミダゾ基）、好適なアリール基は６から約１４の炭素原子、より好適には６から約１０炭素原子を持っている。
【００８７】
用語アラルキルはアルキルおよびアリール部分の両方を含む基を示すことを企図しており、ここでそのような基の結合点はそのアルキル部分を通している。ベンジル基はアラルキル基の一つの例である。
多くの置換基が本発明の化合物内へ保護された（ブロックされた）形で導入でき、続いて脱保護されて最終的な所望の化合物が形成される。置換基にはピリミジン環および上記のアルコールＲ1 −ＯＨのＲ1 基へ共有結合で結合された基が含まれる。一般に、保護基は特定の反応条件に対して化学官能性を不活性にし、実質的に分子の残りの部分に障害を与えることなく分子のそのような官能性に付加し、およびそれから除去することができる。例えば、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１を参照されたい。例えば、アミノ基はフタルイミド基または９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基として保護でき、カルボキシル基はフルオレニルメチル基として保護できる。代表的なヒドロキシル保護基はＢｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９２，４８，２２２３により記載されている。好適なヒドロキシル保護基はトリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメチルトリチルのように酸に不安定である。
【００８８】
本発明に従った固相支持体には、調節細孔ガラス（ＣＰＧ）、オキサリル調節細孔ガラス（例えば、Ａｌｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９１，１９，１５２７を参照されたい）、ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓｕｐｐｏｒｔ−アミノポリエチレングリコール誘導化支持体（例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９３，３４，３３７３を参照されたい）またはＰｏｒｏｓ−ポリスチレン／ジビニルベンゼンの共重合体が含まれる。多くの他の固相支持体が市販品として入手可能であり、本発明に使用できる。
【００８９】
本発明の文脈における活性化固相支持体とは、得られる活性化固相支持体が本発明の単量体サブユニットまたはヌクレオシドダイマーとの反応に対して化学的に活性であるように、官能基で誘導化されているかまたは反応性残基で処理されている固相支持体である。
いくつかの好適な態様において、本発明の方法は２’−Ｏ−置換−５−ハロピリミジンヌクレオシドの製造に使用される。２’−Ｏ−置換−５−ハロウリジンはＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能な５−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒおよび−Ｉウラシルから製造することができる。２’−Ｏ−置換−５−ハロウリジンは以下のようにシチジン類似体へ変換できる。
【００９０】
本発明の方法において、アルコール、ルイス酸およびアンヒドロピリミジンヌクレオシドは反応容器中で処理される。反応容器は反応に適している本分野で既知の任意の容器であり、その中で反応物は加熱される。好適には、反応容器は圧力密封容器であり、より好適には高圧容器である。
好適な態様において、アルコール、ルイス酸およびアンヒドロピリミジンヌクレオシドはジオキサンのような適した溶媒中で約１２０℃から約２００℃で加熱することにより処理される。特に好適な態様において、アルコール、ルイス酸およびアンヒドロピリミジンヌクレオシドおよび溶媒は圧力密封容器中で加熱される。高圧容器が特に好適である。
【００９１】
本明細書で使用される場合、用語ルイス酸とは分子またはイオンとしてのその通常の意味を持っており、それは第二の分子またはイオンからの二つの電子と共有結合を形成することにより別の分子またはイオンと結合できる。本発明の方法での使用において、ルイス酸は一対の電子を受け取ることができる電子欠乏種であると考えられる。特に好適なものは二価および三価の硬酸である。より好適なものはマグネシウム、カルシウム、アルミニウム、亜鉛、クロム、銅、ホウ素、スズ、水銀、鉄、マンガン、カドミウム、ガリウムおよびバリウムを含む二価および三価の金属の二価および三価陽イオンおよびその錯体である。それらの錯体にはヒドロキシド、アルキル、アルコキシド、ジおよびトリハライド（特にトリクロリドおよびトリフルオリド）およびアセテートのような有機酸リガンドが含まれるであろうが、それらに制限されるわけではない。本方法で有用な特に好適であるルイス酸の例はホウ酸エステル、特にホウ酸アルキルである。
２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を阻害するその能力、ならびに相補的ＲＮＡへのそのハイブリダイゼーション親和性を算定するための研究で評価された。２’−デオキシギャップを含む２’−修飾オリゴヌクレオチドおよび均一に修飾された２’−修飾オリゴヌクレオチドを用いたそのような研究の一つ（Ｍｏｎｉａ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，２６８，１４５１４〜１４５２２参照）は、２’−修飾オリゴヌクレオチドは対応する非修飾２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりも相補的ＲＮＡに対する高い親和性を持つことを示している。２’−デオキシギャップを含む２’−修飾オリゴヌクレオチドもまた細胞中のＨａ−ｒａｓ癌遺伝子の発現に対する活性を示した。
【００９２】
均一に修飾された２’−Ｏ−置換オリゴリボヌクレオチドを含む別の研究において、ヌクレアーゼ安定性および融解温度（Ｔm ）が２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−プロピルおよび２’−Ｏ−ペンチルヌクレオチドを含む完全修飾オリゴリボヌクレオチド配列について比較された。２’−Ｏ−ペンチルを除いて修飾は相補的ＲＮＡと形成されたデュープレックスのＴm を増加させることが観察された。修飾ホモデュープレックスは以下のＴm 順で著しく高いＴm を示した：２’−フルオロ：２’−フルオロ＞  ２’−Ｏ−プロピル：２’−Ｏ−プロピル＞２’−Ｏ−メチル：２’−Ｏ−メチル＞ＲＮＡ：ＲＮＡ＞ＤＮＡ：ＤＮＡ。２’−修飾オリゴリボヌクレオチドのヌクレアーゼ安定性は蛇毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ）およびヌクレアーゼＳ１を用いて試験された。２’−修飾により与えられる安定性が修飾の大きさに相関して観察された。二次構造を形成する能力を持つオリゴリボヌクレオチドにおいてはヌクレアーゼ安定性のレベルが追加されたが、それは２’修飾オリゴリボヌクレオチドのみであり、２’−デオキシオリゴリボヌクレオチドでは観察されなかった。
本発明の他の目的、利点および新規な特色は以下に提供される実施例を調べることにより当業者には明らかになるであろう。
【００９３】
【実施例】
実施例１
２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン］
５−メチルウリジン（リボシルチミン、Ｙａｍａｓａ，Ｃｈｏｓｈｉ，Ｊａｐａｎを通して市販品として入手可能）（７２．０ｇ，０．２７９ｍｏｌ）ジフェニルカーボネート（９０．０ｇ，０．４２０ｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（２．０ｇ，０．０２４ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（３００ｍＬ）に加えた。混合物は攪拌しながら加熱還流し、二酸化炭素ガスの発生が制御された様式で行った。一時間後、わずかに色が濃くなった溶液は減圧下で濃縮した。得られたシロップは攪拌したジエチルエーテル（２．５Ｌ）に注いだ。エーテルはデカントし、残渣は最少量のメタノール（約４００ｍＬ）に溶解した。この溶液を上記のように新しいエーテル（２．５Ｌ）に注ぐと堅いゴム状物が得られた。エーテルをデカントしゴム状物を真空オーブン中で乾燥すると（６０℃、１ｍｍＨｇで２４時間）固形物が得られ、それを粉砕するとうすい黄褐色の粉末（５７ｇ，８５％の粗収率）が得られた。ＮＭＲは構造と、フェノールおよびそのナトリウム塩の混入（約５％）に一致した。この物質は環開裂にそのまま使用された。この物質は酢酸エチル中、メタノールの濃度勾配（１０〜２５％）を用いるカラムクロマトグラフィーによりさらに精製でき、白色固形物が得られた、ｍｐ２２２〜４℃。
【００９４】
実施例２
１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントロフラノシル）−５−メチルウリジン
２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン］（７１ｇ，０．３２ｍｍｏｌ）およびジオキサン（７００ｍＬ）を２リットルのステンレス鋼高圧容器に入れ、ＨＦ／ピリジン（１００ｇ，７０％）を加えた。混合物を１２時間、１２０〜１２５℃で加熱し、その後氷浴で冷却した。高圧容器を開け、混合物を３リットルの氷に注いだ。この混合物に注意深く炭酸水素ナトリウム（３００ｇ）および飽和炭酸水素ナトリウム溶液（４００ｍＬ）を加えた。混合物を濾過し、フィルターケーキを水（２ｘ１００ｍＬ）およびメタノール（２ｘ５００ｍＬ）で洗浄した。水およびメタノール洗液は真空下濃縮して乾固させた。メタノール（２００ｍＬ）および粗シリカゲル（８０ｇ）を残渣に加え、混合物を真空下蒸発乾固させた。得られた物質はシリカゲル上に濃縮し、酢酸エチルおよびメタノールの濃度勾配（１００：０から８５：１５）を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。生成物分画をプールし濃縮すると３６．９ｇ（５１％，２工程収率）の表記化合物を得た。
【００９５】
またこの反応から１−（２−フェニル−β−Ｄ−エリスロ−ペントロフラノシル）−５−メチルウリジン（１０．３ｇ）も単離された。この物質は高圧容器反応が不純な物質を用いて実施された場合、フェノールおよび上記無水反応からのナトリウム塩から形成される。無水物が精製されている場合この生成物は形成されない。形成された１−（２−フェニル−β−Ｄ−エリスロ−ペントロフラノシル）−５−メチルウリジンは２’−フルオロ体と同じ反応条件を用いてそのＤＭＴ／ホスホロアミダイトへ変換された。
【００９６】
実施例３
１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジン
１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントロフラノシル）−５−メチルウリジン（３１．１５ｇ，０．１２ｍｏｌ）をピリジン（１５０ｍＬ）に懸濁し、ジメトキシトリチルクロリド（４４．６２ｇ，０．１２ｍｏｌ）を加えた。この混合物は密閉されたフラスコ内で２時間攪拌し、メタノール（３０ｍＬ）を加えた。混合物は真空下濃縮し、生じた残渣は飽和炭酸水素ナトリウム溶液（５００ｍＬ）と酢酸エチル（３ｘ５００ｍＬ）に分配した。酢酸エチル分画をプールし、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過して真空下で濃縮すると粘張な油状物が得られた。油状物はジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解し、シリカゲルカラムにのせ酢酸エチル：ヘキサン：トリエチルアミン（６０／３９／１から７５／２４／１２まで増加する）で溶出する。生成物分画をプールし真空下で濃縮すると５９．９ｇ（８９％）の表記化合物があわ状物として得られた。
【００９７】
実施例４
１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−フルオロ−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジン
１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジン（５９．８ｇ，  ０．１０６  ｍｏｌ）をジクロロメタンに溶解し２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（４６．９ｍＬ，０．１４８ｍｏｌ）およびジイソプロピルアミンテトラゾリド（５．４６ｇ，０．３当量）を加えた。混合物は１６時間攪拌した。混合物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１Ｌ）で洗浄し、炭酸水素溶液はジクロロメタン（５００ｍＬ）で逆抽出した。合併した有機層は食塩水（１Ｌ）で洗浄し、食塩水はジクロロメタン（１００ｍＬ）で逆抽出した。合併した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し濾過後、約２００ｍＬの容量まで濃縮した。得られた物質はヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン（６０／４０／１）を用いた。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。生成物分画を真空下濃縮し、アセトニトリル（５００ｍＬ）に溶解し、濾過後真空下で濃縮して乾燥するとあわ状物が得られた。あわ状物を砕き２４時時間乾燥させると一定の重さになり６８．２ｇ（８４％）の表記化合物が得られた。1 Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ3 ）δ  ０．９〜１．４（ｍ，１４Ｈ，４ｘＣＨ3 ，２ｘＣＨ），２．３〜２．４（ｔ，１Ｈ，ＣＨ2 ＣＮ），２．６〜２．７（ｔ，１Ｈ，ＣＨ2 ＣＮ），３．３〜３．８（ｍ，１３Ｈ，２ｘＣＨ3 ＯＡｒ，５’ＣＨ2 ，ＣＨ2 ＯＰ，Ｃ−５  ＣＨ3 ），４．２〜４．３（ｍ，１Ｈ，４’），４．３５〜５．０（ｍ，１Ｈ，３’），４．９〜５．２（ｍ，１Ｈ，２’），６．０〜６．１（ｄｄ，１Ｈ，１’），６．８〜７．４（ｍ，１３Ｈ，ＤＭＴ），７．５〜７．６（ｄ，１Ｈ，Ｃ−６），８．８（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ）。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）；１５１．４６８，１５１．６０９，１５１．７９０，１５１．９０４。
【００９８】
実施例５
１−（３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジン
実施例２の方法に従って製造された１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジン（２２．４ｇ，９２  ｍｍｏｌ，８５％純度）をピリジン（２ｘ１５０ｍＬ）と共蒸留し、ピリジン（２５０ｍＬ）に溶解した。無水酢酸（５５ｍＬ，．５８ｍｏｌ）を加え混合物は１６時間攪拌した。メタノール（５０ｍＬ）を加え攪拌を３０分間継続した。混合物を蒸発させるとシロップ状物が得られた。シロップ状物を最少量のメタノールに溶解し、シリカゲルカラムに加えた。生成物分画を溶出するためにヘキサン／酢酸エチル（１：１）が用いられた。精製により１９．０ｇ（７４％）の表記化合物が得られた。
【００９９】
実施例６
４−トリアジン−１−（３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジン
１，２，４−トリアゾール（１０６ｇ，１．５３ｍｏｌ）をアセトニトリル（１５０ｍＬ）に溶解し続いてトリエチルアミン（２５７ｍＬ，１．８４ｍｏｌ）を加えた。混合物は氷浴を用いて０から１０℃の間に冷却した。ＰＯＣｌ3 （３４．５ｍＬ，．３７５ｍｏｌ）を滴加ロートを通してゆっくりと加え、混合物はさらに４５分間攪拌した。別のフラスコには１−（３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジン（５６．９ｇ，  ．１４４  ｍｏｌ）をアセトニトリル（１５０ｍＬ）に溶解した。１−（３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジンを含む溶液をカニューレを通してトリアゾール溶液にゆっくりと加えた。氷浴を除き、反応混合物を１時間放置して室温まで暖めた。アセトニトリルを真空下除去し、残渣を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（４００ｍＬ）およびジクロロメタン（４ｘ４００ｍＬ）に分配した。有機層を合併し真空下濃縮した。得られた残渣を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解すると固形物の沈殿が始まった。ヘキサン（３００ｍＬ）を加えると更に固形物が沈殿した。固形物を濾過して集め、ヘキサン（２ｘ２００ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させると６３．５ｇの生成物が得られ、それは更に精製することなくそのまま使用された。
【０１００】
実施例７
５−メチル−１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−シトシン
ステンレス鋼高圧容器中、４−トリアジン−１−（３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−チミン（７５．５ｇ，．１９８ｍｏｌ）をアンモニア（４００ｍＬ）に溶解し、一夜密封した。高圧容器を冷却し、開放してアンモニアを蒸発させた。フラスコへ物質を移すためにメタノールを加え、約１０容量のエチルエーテルを加えた。混合物は１０間攪拌した後濾過した。固形物をエチルエーテルで洗浄し、乾燥すると５１．７ｇ（８６％）の表記化合物を得た。
【０１０１】
実施例８
４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチル−１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−シトシン
５−メチル−１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−シトシン（５４．６ｇ，０．２１ｍｏｌ）をピリジン（７００ｍＬ）に懸濁し、無水安息香酸（７０ｇ，．３０９ｍｏｌ）を加えた。混合物は４８時間室温で攪拌した。ピリジンを蒸発させて除去し、メタノール（８００ｍＬ）を加え混合物を攪拌した。形成された沈殿を濾過し、メタノール（４ｘ５０ｍＬ）およびエーテル（３ｘ１００ｍＬ）で洗浄し、真空オーブン中４５℃で乾燥させると４０．５ｇの表記化合物が得られた。濾液は真空下で濃縮し、高圧容器中室温で一夜飽和メタノール性アンモニアで処理した。混合物を真空下で濃縮し、得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。回収された出発物質は上記のように再び処理するとさらに４．９ｇの表記化合物が得られ、合計で４５．４ｇ（６１％）の表記化合物が得られた。
【０１０２】
実施例９
４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチル−１−（２−フルオロ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−シトシン
４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチル−１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−シトシン（４５．３ｇ，．１２４ｍｏｌ）を２５０ｍＬの乾燥ピリジンに溶解し、ジメトキシトリチルクロリド（４６．４ｇ，．１３７ｍｏｌ）を加えた。反応混合物は室温で９０分間攪拌し、メタノール（２０ｍＬ）を加えた。混合物は真空下で濃縮し、酢酸エチル（２ｘ１Ｌ）および飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１Ｌ）に分配した。酢酸エチル層を合併し、硫酸マグネシウムで乾燥して真空下蒸発させた。得られた油状物はジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解し、酢酸エチル／ヘキサン／トリエチルアミン（５０：５０：１）を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。生成物分画をプールし、真空濃縮して乾燥させると６３．６ｇ（７６．６％）の表記化合物が得られた。
【０１０３】
実施例１０
４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチル−１−（２−フルオロ−３−Ｏ−Ｎ, Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−シトシン
４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチル−１−（２−フルオロ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−シトシン（６１．８ｇ，９２．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３００ｍＬ）、２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（４０．９ｍＬ，．１３０ｍｏｌ）およびジイソプロピルアミン  テトラゾリド（４．７６ｇ，０．３当量）と室温で１７時間攪拌した。混合物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１Ｌ）で洗浄し、炭酸水素ナトリウム溶液はジクロロメタン（５００ｍＬ）で逆抽出した。合併した有機層は食塩水（１Ｌ）で洗浄し、食塩水はジクロロメタン（１００ｍＬ）で逆抽出した。合併した有機層は硫酸ナトリウムで乾燥し濾過後約２００ｍＬの容量まで濃縮した。得られた物質はヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン（６０／４０／１）を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。生成物分画を真空下で濃縮し、アセトニトリル（５００ｍＬ）に溶解し濾過して真空下で濃縮して乾燥させるとあわ状物が得られた。あわ状物を砕き一定の重量となるまで２４時間乾燥させると７２．４ｇ（９０％）の表記化合物が得られた。1 Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ3 ）δ  １．１７〜１．３（ｍ，１２Ｈ，４ｘＣＨ3 ），１．５〜１．６（ｍ，２Ｈ，２ｘＣＨ），２．３〜２．４（ｔ，１Ｈ，ＣＨ2 ＣＮ），２．６〜２．７（ｔ，１Ｈ，ＣＨ2 ＣＮ），３．３〜３．９（ｍ，１３Ｈ，２ｘＣＨ3 ＯＡｒ，５’ＣＨ2 ，ＣＨ2 ＯＰ，Ｃ−５  ＣＨ3 ），４．２〜４．３（ｍ，１Ｈ，４’），４．３〜４．７（ｍ，１Ｈ，３’），５．０〜５．２（ｍ，１Ｈ，２’），６．０〜６．２（ｄｄ，１Ｈ，１’），６．８〜６．９（ｍ，４Ｈ，ＤＭＴ），７．２〜７．６（ｍ，１３Ｈ，ＤＭＴ，Ｂｚ），７．８２〜７．８６（ｄ，１Ｈ，Ｃ−６），８．２〜８．３（ｄ，２Ｈ，Ｂｚ）。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）；ｂｓ，１５１．７０６；ｂｓ，１５１．９４１。
【０１０４】
実施例１１
１−（２，３−ジ−Ｏ−ブチルスズ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジン
５−メチルウリジン（７．８ｇ，３０．２ｍｍｏｌ）および酸化ジブチルスズ（７．７ｇ，３０．９ｍｍｏｌ）をメタノール（１５０ｍＬ）に懸濁し、１６時間加熱還流した。反応混合物を室温まで冷却して濾過し、固形物をメタノール（２ｘ１５０ｍＬ）で洗浄した。得られた固形物を乾燥させると１２．２ｇ（８０．３％）の表記化合物が得られた。この物質は続いての反応に更に精製することなく使用された。ＮＭＲは構造と一致した。
【０１０５】
実施例１２
１−（２−Ｏ−プロピル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジン
１−（２，３−ジ−Ｏ−ブチルスズ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジン（５．０ｇ，１０．２ｍｍｏｌ）およびヨードプロパン（１４．７ｇ，７２．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中、１００℃で２日攪拌した。反応混合物を室温まで冷却し、濾過後濃縮した。残っているＤＭＦはアセトニトリルと共蒸留した。残渣を乾燥させると２．４０ｇ（７８％）の表記化合物および３’−Ｏ−プロピル異性体が粗混合物として得られた。この物質は更に精製することなく続いての反応に使用された。
【０１０６】
実施例１３
１−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジン
粗混合物としての１−（２−Ｏ−プロピル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジンおよび３’−Ｏ−プロピル異性体（２．４ｇ，８．４ｍｍｏｌ）をピリジン（２ｘ４０ｍＬ）と共蒸留し、ピリジン（６０ｍＬ）に溶解した。溶液はアルゴン下、１５分間室温で攪拌し、ジメトキシトリチルクロリロ（４．２７ｇ，１２．６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を周期的にｔｌｃで検査し、３時間で反応が完了した。メタノール（１０ｍＬ）を加え、混合物を１０分間攪拌した。反応混合物は真空下で濃縮し、得られた残渣は１％トリエチルアミンを含むヘキサン／酢酸エチル（６０：４０）を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。適切な分画を集めて濃縮すると１．３２ｇ（２６％）の表記化合物が得られた。
【０１０７】
実施例１４
１−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−Ｎ, Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジン
１−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジン（５０．０ｇ，８６ｍｍｏｌ）、２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（３８ｍＬ，８６ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルアミンテトラゾリド（４．４５ｇ，２５．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５００ｍＬ）に溶解し、室温で４０時間攪拌した。反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２ｘ４００ｍＬ）および食塩水（１ｘ４００ｍＬ）で洗浄した。水溶液層はジクロロメタンで逆抽出した。ジクロロメタン層を合併し、硫酸ナトリウムで乾燥し濾過後、真空下濃縮した。得られた残渣は酢酸エチル／ヘキサン（４０：６０）および１％トリエチルアミンを用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。適切な分画を集めて濃縮し、高真空下で乾燥すると４３ｇ（６７％）の生成物が得られた。
【０１０８】
実施例１５
１−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジン
１−（２−Ｏ−プロピル−５−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジン（１０．０ｇ，１６．６ｍｍｏｌ）をピリジン（５０ｍＬ）に溶解し、無水酢酸（４．７  ｍｌ，５２．７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物は１８時間攪拌し、過剰の無水酢酸はメタノール（１０ｍＬ）で中和した。混合物は真空下で濃縮し、得られた残渣は酢酸エチル（１５０ｍＬ）に溶解した。酢酸エチルは飽和ＮａＨＣＯ3 （１５０ｍＬ）で洗浄し、飽和ＮａＨＣＯ3 は酢酸エチル（５０ｍＬ）で逆抽出した。酢酸エチル層を合併し、真空下で濃縮すると１１．３ｇの白色あわ状物が得られた。粗収率は１００％以上であり、ＮＭＲは表記化合物の構造から予期されるものと一致した。この物質は更に精製されることなく続いての反応に使用された。
【０１０９】
実施例１６
１−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−４−トリアゾロ−５−メチルピリミジン
トリアゾール（１０．５ｇ，１５２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１２０ｍｌ）およびトリエチルアミン（２３ｍＬ）に溶解し、無水条件下で攪拌した。得られた溶液をドライアイスアセトン浴で冷却し、５分以上かけてオキシ塩化リン（３．９ｍＬ，４１ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。混合物を更に１０分攪拌すると、生成物形成の指標となる薄いスラリー状となった。１−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジン（１１．２ｇ，１６５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル１５０ｍＬに溶解し、ドライアイスアセトン浴の温度を保ちながら上記スラリーへ加えた。反応混合物を３０分攪拌し次に放置して室温まで温め、更に２時間攪拌した。混合物はフリーザー中、０℃で１８時間放置した後取り出し室温まで温めた。混合物の酢酸エチル／ヘキサン（１：１）でのｔｌｃは出発物質の完全な変換を示した。反応混合物は真空下で濃縮し酢酸エチル（３００ｍＬ）に再溶解しし、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２ｘ４００ｍＬ）および食塩水（４００ｍＬ）で抽出した。水溶液層は酢酸エチル（２００ｍＬ）で逆抽出した。酢酸エチル層を合併し、硫酸ナトリウムで乾燥し真空下で濃縮した。粗収率は１１．３ｇ（９５％）であった。ＮＭＲは表記化合物の構造から予期されるものと一致した。この物質は更に精製されることなく続いての反応に使用された。
【０１１０】
実施例１７
１−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルシチジン
１−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−４−トリアゾロ−５−メチルピリミジン（１１．２ｇ，１６．１ｍｍｏｌ）をドライアイスアセトン温度で１００ｍＬの高圧容器中で液体アンモニア（５０ｍＬ）に溶解した。高圧容器は放置して室温まで温め、１８時間後ドライアイスアセトン温度まで再冷却した。高圧容器内容物をビーカーに移し、メタノール（５０ｍＬ）を加えた。混合物は放置してほとんど乾固するまで蒸発させた。酢酸エチル（３００ｍＬ）を加え、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２ｘ２５０ｍＬ）での洗浄に先立ち固形物を濾過して除いた。酢酸エチル層は硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して先ほど濾過して除いた固形物と合わせ、真空下濃縮すると１０．１ｇの物質が得られた。粗収率は１００％以上であり、ＮＭＲは表記化合物の構造から予期されるものと一致した。この物質は更に精製されることなく続いての反応に使用された。
【０１１１】
実施例１８
１−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチルシチジン
１−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルシチジン（７．２８ｇ，１０．１ｍｍｏｌ）および無水安息香酸（４．５ｇ，２０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（６０ｍＬ）に溶解し室温で１８時間攪拌した。反応混合物は真空下で濃縮し、酢酸エチル（３００ｍＬ）に再溶解した。酢酸エチル溶液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２ｘ４００ｍＬ）で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥して濾過し、真空下濃縮した。残渣は酢酸エチル／ヘキサン（１：２）および１％トリエチルアミンを用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。適切な分画を集めて濃縮し、高真空下で乾燥させると５．１ｇ（１−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジンから出発する４工程に対して５９％）の生成物を得た。
【０１１２】
実施例１９
１−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチルシチジン
１−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチルシチジン（５．０ｇ，７ｍｍｏｌ）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ−イソプロピルホスホロジアミダイト（３．６ｍＬ，１１．３ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルアミノテトラゾリド（０．４２ｇ，２．４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（８０ｍＬ）に溶解し、室温で４０時間攪拌した。反応混合物は飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２ｘ４０ｍＬ）および食塩水（１ｘ４０ｍＬ）で洗浄した。ジクロロメタン層を合併し、硫酸ナトリウムで乾燥して濾過し、真空下で濃縮した。得られた残渣は酢酸エチル／ヘキサン（４０：６０）および１％トリエチルアミンを用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。適切な分画を集めて濃縮し、高真空下で乾燥させると７．３ｇ（９８％）の生成物を得た。
【０１１３】
実施例２０
２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン
方法１：
ステンレス鋼製高圧容器（１００ｍＬ容量）内で粗２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１０．０ｇ，０．０４１６ｍｏｌ）をメタノール（８０ｍＬ）に溶解した。ホウ酸トリメチル（５．６  ｍＬ，０．０４９ｍｏｌ）を加えた（注１）。高圧容器を密封し１５０℃の油浴に浸すと約５気圧の圧力を発生した。４０時間後、高圧容器を氷で冷やして開いた後、内容物を減圧下で濃縮すると黄褐色のあわ状物が１２ｇ得られた。粗生成物のＮＭＲは出発物質中の不純物が混入した生成物および痕跡量のチミンおよび出発物質と一致した（注２）。生成物はそのまま次の工程で使用された。
ホウ酸トリアルキルは水素化ホウ素の溶液（例えば１Ｍ  ＴＨＦ溶液）に所望のアルコールを加え水素ガスを発生させることにより都合よく生じさせることができることに注目されたい。また、ヌクレオシドはこの時点で酢酸エチル中のメタノールノ濃度勾配（０〜１０％）を用いたカラムクロマトグラフィーおよび無水エタノールからの生成物の再結晶により精製でき、白色針状晶、ｍｐ１９２〜１９３℃（ｍｐ１９７〜１９８℃）が得られることに注目されたい。この化合物の融点に関する参考文献はＯｏｔｓｕｋａ，Ｈ．Ｉｎｏｕｅ，日本特許第８９−８５４５６号（１９８９年４月４日）に含まれている。
【０１１４】
方法２：
ステンレス鋼製高圧容器（１００ｍＬ容量）内で、純粋な２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１．０ｇ，４．１６ｍｍｏｌ）およびホウ酸トリメチル（０．５６ｍＬ，４．９ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解した。高圧容器は１５０℃の油浴に浸した。８０時間後、ＴＬＣは反応がほとんど完全であることを示している。溶媒を除去すると白色のあわ状物が得られた．ＮＭＲは生成物と出発物質の比が９３：７であり、他の不純物が含まれていないことを示した。残渣は酢酸エチル中メタノールの濃度勾配（０−１０％）を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製され、８５０ｍｇ（７５％）の純粋な生成物および２５０ｍｇの未だに不純な生成物が得られた。分析的に純粋な試料がＮＭＲのために調製された。1 Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：δ  １．７９（ｓ，３Ｈ，５−ＣＨ3 ），３．３５（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ3 ），３．５〜３．７（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’），３．７〜３．９（ｍ，２Ｈ，Ｈ−３’，４’），４．１５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’），５．１７（ｍ，２Ｈ，３’，５’−ＯＨ），５．８７（ｄ, Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’），７．８０（ｓ，１Ｈ，Ｈ−６），１１．３７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ）。元素分析：Ｃ11Ｈ16Ｎ2 Ｏ6 （２７２．２６）として計算値：Ｃ，４８．５２；Ｈ，５．９２；Ｎ，１０．２９。実測値：Ｃ，４８．５６；Ｈ，５．８８；Ｎ，１０．２２。
【０１１５】
方法３：
純粋な２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１０．０ｇ，４１．６ｍｍｏｌ）、ホウ酸トリメチル（１０．０ｍＬ，８５ｍｍｏｌ）、ＮａＨＣＯ3 （３０ｍｇ）およびＭｅＯＨ（７０ｍＬ）を高圧容器中、約１７５℃で６０時間加熱した。高圧容器を室温まで冷却し、内容物を真空下で蒸発させると白色あわ状物が得られた。得られたあわ状物はエーテル（１００ｍＬ）で磨砕し、生じる白色固形物を濾過により集め, ５０℃で４時間真空下で乾燥させると表記化合物１０７ｇ（１００％）が得られた。ＮＭＲ分析は約３％の不純物が出発物質チミンおよびアラ−５−メチルウリジンとして同定されることを示している。
【０１１６】
実施例２１
５’−Ｏ−ジメトキシトリフェニルメチル−２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン
粗２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン（１２ｇ）をピリジン（２ｘ５０ｍＬ）と共沸させ、乾燥ピリジン（５０ｍＬ）に溶解した。ジメトキシトリフェニルメチルクロリド（１８．１ｇ，０．０５４ｍｏｌ）を加えた。フラスコに栓をし４５分間室温で放置した。反応停止させるためにメタノール（１０ｍＬ）を加え溶液は減圧下で油状物となるまで濃縮した。残渣を酢酸エチル（２ｘ４００ｍＬ）および飽和炭酸水素ナトリウム溶液（５００ｍＬ）に分配した。有機層を合併し乾燥後（硫酸ナトリウム）濾過して黄色泡状物となるまで濃縮した。泡状物はメチレンクロリド（６０ｍＬ）に溶解し、シリカゲルカラム（３００ｇ）上にのせ、酢酸エチル−ヘキサン−トリエチルアミン（６０：４０：１）で溶出した。生成物含有分画を合併し、濃縮して乾燥アセトニトリル（２ｘ５０ｍＬ）と共沸した。得られた残渣は１ｍｍＨｇで２４時間乾燥させると堅くてもろい白色泡状物を得た、１７．０ｇ（５−メチルウリジンからの三工程で６０．４％）。
【０１１７】
実施例２２
２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−２−チオ−５−メチルウリジン
２５０ｍｌの３頸丸底フラスコ中で１−Ｏ−アセチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイルリボース（０．５００ｇ，１ｍｍｏｌ）および５−メチル−２−チオ−ウラシル（０．１５６ｇ，１．１ｍｍｏｌ）を真空下一夜乾燥させた。これらの成分を１０ｍＬの乾燥アセトニトリルに溶解し８０℃まで加熱した。この温かい溶液にＮ−Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（０．５０９ｇ，２．５ｍｍｏｌ）を加え、反応液は８０℃で１時間攪拌した。反応混合物の加熱を止め放置して室温まで冷却し、トリメチルシリルトリフレート（０．３３４ｇ，１．５ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合物は次に５０℃まで加熱し、４時間攪拌した。反応混合物は酢酸エチル／ヘキサン（１：１）を用いるＴＬＣにより検査され、反応が完了していることが示された。溶液を室温まで冷却し、５０ｍＬジクロロメタンのおよび５０ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液に分配した。水溶液層はジクロロメタンで２回以上抽出し、有機層を合併し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮すると淡黄色の泡状物が得られた。この泡状物は更に精製することなく使用された。
【０１１８】
実施例２３
２−チオ−５−メチルウリジン
粗２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−２−チオ−５−メチルウリジン（２０ｇ，３７ｍｍｏｌ）を５００ｍＬのメタノールに溶解した。この溶液にナトリウムメトキシド（２．０ｇ，３７ｍｍｏｌ）を加え、反応液は２時間攪拌した。反応液を酢酸エチル／ヘキサン（１：１）および酢酸エチル／メタノール（９：１）を用いるＴＬＣにより検査すると、反応が完了していることが示された。溶液がｐＨ試験紙により溶液が中性になるまでＤｏｗｅｘ  ５０  Ｈ+ 樹脂を加え、樹脂は濾過した。樹脂は次に１００ｍｌの別のメタノールで洗浄し、合併した濾液を濃縮すると表記化合物８．５ｇ（８４％）を淡黄色泡状物として得た。
【０１１９】
実施例２４
２’−Ｏ−メチル−５−メチル−２−チオウリジン
５−メチル−２−チオウリジン（０．５００ｇ，１．８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液を攪拌し、酸化ジブチルスズ（０．５００ｇ，２．０ｍｍｏｌ）、ヨウ化テトラブチルアンモニウム（０．７３８ｇ，２ｍｍｏｌ）およびヨウ化メチル（１．０２２ｇ，７．２ｍｍｏｌ）を加えた。反応フラスコを封じ５０℃で１６時間加熱した。混合物を冷却し更にヨウ化メチルを加え（１．０２２ｇ，７．２ｍｍｏｌ）反応液は更に１６時間加熱した。この時間が終了すると反応混合物を室温まで冷却し、メチレンクロリドで希釈し、メチレンクロリド／メタノール濃度勾配を用いてクロマトグラフィーを行った。適切な分画を集めて濃縮すると２’−Ｏ−メチル−５−メチル−２−チオウリジンが得られた。
【０１２０】
実施例２５
２’−Ｏ−プロピル−５−メチル−２−チオウリジン
表記化合物はヨウ化メチルをヨウ化プロピル（１．２２ｇ，７．２  ｍｍｏｌ）に置換することにより実施例２４の方法に従って製造される。
【０１２１】
実施例２６
２’−Ｏ−フタルイミドプロピル−５−メチル−２−チオウリジン
表記化合物はヨウ化メチルをブロモ−プロピルフタルイミド（０．６７ｇ，２．５ｍｍｏｌ）に置換し、２日目に追加（０．３００ｇ）を加える実施例２４の方法従って製造される。
【０１２２】
実施例２７
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−プロピルアミン−５−メチル−２−チオウリジン
２’−Ｏ−フタルイミドプロピル−５−メチル−２−チオウリジン（２．６ｇ，３．６ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジンに溶解し２回共沸させた。得られた泡状物は２５ｍＬの乾燥ピリジンに溶解し、ジメトキシトリチルクロリド（１．８ｇ，５．５ｍｍｏｌ）および続いて４，４−ジメチルアミノピリジン（０．０５０ｇ，０．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応液は室温で一夜攪拌させた。反応混合物へ１ｍＬのメタノールを加えた。この溶液は７５ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液および５０ｍＬのクロロホルムに分配した。水溶液層を２回新しいクロロホルムで抽出し、有機層を併せて硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過して乾燥剤を除去した後、濾液を濃縮するとオレンジ色の油状物となり、シリカゲルを中和するために加えられた０．５％のピリジンを含むメタノール／クロロホルム濃度勾配を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製された。
【０１２３】
実施例２８
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−プロピルアミン−５−メチル−２Ｓ−トルオイル−２−チオウリジン
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−プロピルアミン−５−メチル−２−チオウリジン（１ｇ，１．６ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解し０℃まで冷却した。この溶液にトリエチルアミン（０．３００ｇ，３ｍｍｏｌ）を加え、続いてトルオイルクロリド（０．３００ｇ，１．９２ｍｍｏｌ）を５分以上かけて滴加する。反応液は次に放置して室温まで温め、一夜攪拌する。反応が完了したらメタノールで反応を停止させ、油状物になるまで濃縮する。この油状物は次に２５０ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム／クロロホルム（１：１）の溶液に分配する。水溶液層を更に７５ｍＬのクロロホルムで２回抽出し、有機層を乾燥して油状物を得るまで乾燥する。保護ヌクレオシドはヘキサン／酢酸エチル濃度勾配を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製する。所望の生成物はＮ−３トルオイルおよびＳ−２トルオイル化合物の混合物として集められる。この混合物はホスフィチル化工程に使用される。
【０１２４】
実施例２９
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−プロピルアミン−３’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエトキシホスファイト］−５−メチル−２−Ｓ−トルオイル−２−チオウリジン
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−プロピルアミン−５−メチル−２Ｓ−トルオイル−２−チオウリジン（１６．０１ｇ，２２ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１０ｍｌ）のＴＨＦ（２００ｍｌ）溶液に、０℃でクロロ−β−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィン（５．６ｍｌ，２５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物は室温で２４時間攪拌する。反応液を濃縮し、残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製される。酢酸エチル／ヘキサン濃度勾配により溶出し（その間１％トリエチルアミンを維持する）、適切な分画を集めて蒸発させると、表記化合物が得られるであろう。
【０１２５】
実施例３０
２’−Ｏ−アミノプロピル−５−メチル−２−チオウリジン
５００ｍＬのフラスコ中で、２’−Ｏ−フタルイミドプロピル−５−メチル−２−チオウリジン（５．０ｇ，１５．８ｍｍｏｌ）を１００ｍｌノメタノールに溶解した。ヒドラジン（２．０２ｇ，６３．２ｍｍｏｌ）を加え、混合物は攪拌しながら１４時間加熱還流（６０〜６５℃）する。溶媒を真空下蒸発させ、残渣をジクロロメタン（１５０ｍＬ）に溶解し、等量のＮＨ4 ＯＨで２回抽出する。有機層を蒸発させると粗生成物が得られる。ＮＭＲが生成物純度の検定に使用される。本生成物は更に精製することなく続いての反応に使用される。
【０１２６】
実施例３１
２’−Ｏ−トリフルオロアセチルアミノプロピル−５−メチル−２−チオウリジン
２’−Ｏ−アミノプロピル−５−メチル−２−チオウリジンをＭｅＯＨに溶解し５当量のトリエチルアミン、続いて１０当量のエチルトリフルオロ酢酸を加える。表記化合物が精製後に単離される。
【０１２７】
実施例３２
２’−Ｏ−トリフルオロアセチルアミノプロピル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−２−チオウリジン
２’−Ｏ−トリフルオロアセチルアミノプロピル−５−メチル−２−チオウリジン（２．５ｇ，３．６ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジンに溶解して２回共沸させる。得られた黄色泡状物を２５ｍＬの乾燥ピリジンに溶解しジメトキシトリチルクロリド（１．８ｇ，５．５ｍｍｏｌ）および続いて４，４−ジメチルアミノピリジン（０．０５０ｇ，０．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応液は室温で一夜攪拌させた。反応混合物へ１ｍＬのメタノールを加えた。この溶液は７５ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液および５０ｍＬのクロロホルムに分配した。水溶液層を２回新しいクロロホルムで抽出し、有機層を併せて硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過して乾燥剤を除去した後、濾液を濃縮すると油状物となり、シリカゲルを中和するために加えられた０．５％のピリジンを含むメタノール／クロロホルム濃度勾配を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製され、表記化合物が得られる。
【０１２８】
実施例３３
２’−Ｏ−トリフルオロアセチルアミノプロピル−３’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエトキシホスファイト］−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−２−チオウリジン
表記化合物は実施例３２の表記化合物を用いて実施例２９の方法に従って製造される。
【０１２９】
実施例３４
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−チオ−５−メチルウリジン
２−チオ−５−メチルウリジン（１ｇ，３．６ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジンに溶解して２回共沸させた。得られた黄色泡状物を２５ｍＬの乾燥ピリジンに溶解しジメトキシトリチルクロリド（１．８ｇ，５．５ｍｍｏｌ）および続いて４，４−ジメチルアミノピリジン（０．０５０ｇ，０．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応液は室温で一夜攪拌させた。反応混合物へ１ｍＬのメタノールを加えた。この溶液は７５ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液および５０ｍＬのクロロホルムに分配した。水溶液層を２回新しいクロロホルムで抽出し、有機層を併せて硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過して乾燥剤を除去した後、濾液を濃縮するとオレンジ色の油状物となり、シリカゲルを中和するために加えられた０．５％のピリジンを含むメタノール／クロロホルム濃度勾配を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製される。
【０１３０】
実施例３５
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−メチル−２−チオウリジン
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−チオ−５−メチルウリジン（１ｇ，１．７３ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦと２回共沸し、乾燥ＤＭＦに溶解してイミダゾール（０．１４１ｇ，２．０８ｍｍｏｌ）続いてｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（０．３１３ｇ，２．０８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物は一夜攪拌した。反応液は酢酸エチル／ヘキサン１：１を用いるＴＬＣで検査すると、反応がすでに完了していることを示した。反応混合物を５％炭酸水素ナトリウム内へ注ぎクロロホルムで３回抽出した。合併した有機溶液は硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮すると油状物が得られた。得られた油状物はメタノール／クロロホルム濃度勾配を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製され、２’および３’シリル保護ヌクレオシドが別々に単離された。
【０１３１】
実施例３６
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチルジメチルシリル−２’−メタンスルホニル−５−メチル−２−チオウリジン
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−メチル−２−チオウリジン（１．０ｇ，１．４５ｍｍｏｌ）をピリジンに溶解し０℃まで冷却した。この溶液にメタンスルホニルクロリド（０．１８３ｇ，１．６ｍｍｏｌ）を滴加した。反応液はＴＬＣにより反応の完了が示されるまで攪拌した。反応混合物はメタノールで中和し、濃縮して油状物とした。表記化合物は続いての反応にそのまま使用された。
【０１３２】
実施例３７
５’−ＤＭＴ−３’−ｔ−ブチルジメチルシリル−２，２’チオアンヒドロ−５−メチル−２−チオウリジン
実施例３６で観察されたメチル化ヌクレオシドを５当量のナトリウムムメトキシドを用いて室温で処理し、チオアンヒドロ化合物の形成が完了するまで攪拌した。溶液は次にＤｏｗｅｘ  ５０Ｗ（Ｈ+ 型）で中和し、樹脂は濾過して除き、得られた溶液を濃縮すると表記化合物が得られる。
【０１３３】
実施例３８
２’−フルオロ−３’−ｔ−ブチルジメチルシリル−５’−ＤＭＴ−５−メチル−２−チオウリジン
実施例３７のチオアンヒドロヌクレオシドを無水ジオキサンに溶解した。この溶液に６当量のＨＦ／ピリジン複合体を加え、反応液はＴＬＣにより反応が完了するまで攪拌した。反応混合物は次に等量の氷に注ぎ、中性になるまで炭酸カルシウムを加えた。固形物を濾過して除き、炉液を濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製され、表記化合物が得られる。
【０１３４】
実施例３９
２’−フルオロ−３’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエトキシホスファイト］−５’−ＤＭＴ−５−メチル−２−チオウリジン
２’−フルオロ−３’−ｔ−ブチルジメチルシリル−５’−ＤＭＴ−５−メチル−２−チオウリジンを実施例２９の方法に従って処理すると表記化合物が得られる。
【０１３５】
実施例４０
２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラロシル）−５−メチルウリジン］
５−メチルウリジン（リボシルチミン  Ｙａｍａｓａ，Ｃｈｏｓｈｉ，Ｊａｐａｎを通して市販品として入手可能）（７２．０ｇ，０．２７９ｍｏｌ）ジフェニルカーボネート（９０．０ｇ，０．４２０ｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（２．０ｇ，０．０２４ｍｏｌ）をＤＭＦ（３００ｍＬ）に加えた。混合物は攪拌しながら加熱還流し、攪拌することにより放出されるべき二酸化炭素ガスの発生を制御された様式に抑えた。一時間後、わずかに色が濃くなった溶液は減圧下で濃縮した。得られたシロップは攪拌しながらジエチルエーテル（２．５Ｌ）に注いだ。エーテルはデカントし、残渣は最少量のメタノール（約４００ｍＬ）に溶解した。この溶液を新しいエーテル（２．５Ｌ）に注ぐと堅いゴム状物が得られた。エーテルをデカントしゴム状物を真空オーブン中で乾燥すると（６０℃、１ｍｍＨｇで２４時間）固形物が得られ、それを粉砕するとうすい黄褐色の粉末（５７ｇ，８５％の粗収率）が得られた。この物質は続いての反応にそのまま使用された。
【０１３６】
実施例４１
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン
２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５ｇ，０．８１Ｍ）、トリス（２−メトキシエチル）ボレート（２３１ｇ，０．９８Ｍ）および２−メトキシエタノール（１．２Ｌ）を２Ｌのステンレス鋼製圧力容器に加え、１６０℃の前もって加熱されている油浴に浸した。１５５〜１６０℃で４８時間加熱した後、容器を開け、溶液を蒸発乾固させてＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で摩砕した。残渣は熱アセトン（１Ｌ）に懸濁した。不溶性塩を濾過し、アセトン（１５０ｍＬ）で洗浄した後、濾液を蒸発させた。残渣（２８０ｇ）をＣＨ3 ＣＮ（６００ｍＬ）に溶解し、蒸発させた。０．５％のＥｔ3 ＮＨを含むＣＨ2 Ｃｌ2 ／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）でシリカゲルカラム（３ｋｇ）を充填した。カラムに加える前に残渣をＣＨ2 Ｃｌ2 （２５０ｍＬ）に溶解してシリカ（１５０ｇ）に吸着させた。生成物を充填溶媒で溶出すると１６０ｇ（６３％）の生成物が得られた。
【０１３７】
実施例４２
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ，０．５０６Ｍ）をピリジン（２５０ｍＬ）と共蒸留し、乾燥残渣をピリジン（１．３Ｌ）に溶解した。最初のジメトキシトリチルクロリド（９４．３ｇ，０．２７８Ｍ）を加え室温で１時間撹拌した。第二のジメトキシトリチルクロリド（９４．３ｇ，０．２７８Ｍ）を加え、さらに室温で１時間撹拌した。次に反応を停止させるためにメタノール（１７０ｍＬ）を加えた。ＨＰＬＣは約７０％の生成物の存在を示した。溶媒を留去し、ＣＨ3 ＣＮ（２００ｍＬ）と摩砕した。残渣はＣＨＣｌ3 （１．５Ｌ）に溶解して２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ3 および２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。有機相はＮａ2 ＳＯ4 で乾燥し、濾過後蒸発させた。２７５ｇの残渣が得られた。残渣は０．５％のＥｔ3 ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）で充填および溶出するシリカゲルカラム（３．５ｋｇ）で精製した。純粋な分画を蒸発させると１６４ｇの生成物が得られた。約２０ｇの追加の生成物が不純な分画から得られ、全収量は１８３ｇ（５７％）であった。
【０１３８】
実施例４３
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（１０６ｇ，０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２ｍＬのＤＭＦおよび１８８ｍＬのピリジンから作製された７５０ｍＬの３：１混合物）および無水酢酸（２４．３８ｍＬ，０．２５８Ｍ）を混ぜ、室温で２４時間撹拌した。ｔｌｃ試料を最初にＭｅＯＨで反応停止させることによりｔｌｃで反応をモニターした。反応完了後（ｔｌｃで判断された）、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を加え、３５℃で混合物を蒸発させた。残渣をＣＨＣｌ3 （８００ｍＬ）に溶解し、２ｘ２００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウムおよび２ｘ２００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。水層は２００ｍＬのＣＨＣｌ3 で逆抽出した。合併した有機層は硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させると１２２ｇの残渣（約９０％の生成物）を与えた。残渣は３．５ｋｇのシリカゲルカラムで精製され、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）で溶出した。純粋な分画を蒸発させると９６ｇ（８４％）が得られた。
【０１３９】
実施例４４
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン
第一の溶液として３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ｇ，０．１４４Ｍ）をＣＨ3 ＣＮ（７００ｍＬ）に溶解して取っておく。トリエチルアミン（１８９ｍＬ，１．４４Ｍ）をトリアゾール（９０ｇ，１．３Ｍ）のＣＨ3 ＣＮ（１Ｌ）溶液に加え、−５℃に冷却してオーバーヘッド撹拌機を用いて０．５時間撹拌した。０〜１０℃に維持されている撹拌溶液に３０分以上かけてＰＯＣｌ3 を滴加し、得られた混合物はさらに２時間撹拌した。この溶液に４５分以上かけて第一の溶液を滴加した。得られた反応混合物は低温室に一夜貯蔵した。反応混合物から塩を濾去し、溶液は蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に溶解し、不溶性固形物は濾過して除いた。濾液は１ｘ３００ｍＬのＮａＨＣＯ3 および２ｘ３００ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃと摩砕すると表記化合物が得られた。
【０１４０】
実施例４５
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ｇ，０．１４１Ｍ）のジオキサン（５００ｍＬ）およびＮＨ4 ＯＨ（３０ｍＬ）溶液を室温で２時間撹拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残渣はＭｅＯＨ（２ｘ２００ｍＬ）と共沸させた。残渣はＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に溶解し２リットルのステンレス鋼圧力容器に移した。ＮＨ3 ガスで飽和させたＭｅＯＨ（４００ｍＬ）を加え、容器は１００℃で２時間加熱した（ｔｌｃは完全な変換を示した）。容器内容物を蒸発乾固させ、残渣はＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で一度洗浄した。有機層は硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発させると８５ｇ（９５％）の表記化合物が得られた。
【０１４１】
実施例４６
Ｎ4 −ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（８５ｇ，０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）に溶解し、無水安息香酸（３７．２ｇ，０．１６５Ｍ）を撹拌しながら加えた。３時間撹拌後、ｔｌｃは反応が約９５％完了していることを示した。溶媒を蒸発させ、残渣はＭｅＯＨ（２００  ｍＬ）と共沸させた。残渣をＣＨＣｌ3 （７００ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ3 （２ｘ３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２ｘ３００ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ4 で乾燥してて蒸発させると残渣（９６ｇ）が得られた。残渣には０．５％のＥｔ3 ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を用いる１．５ｋｇのシリカカラムでクロマトグラフィーを行った。純粋な生成物分画を蒸発させると９０ｇ（９０％）の表記化合物が得られた。
【０１４２】
実施例４７
Ｎ4 −ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３’−アミダイト
Ｎ4 −ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（７４ｇ，０．１０Ｍ）をＣＨ2 Ｃｌ2 （１Ｌ）に溶解した。テトラゾール  ジイソプロピルアミン（７．１ｇ）および２−シアノエトキシ−テトラ（イソプロピル）ホスファイト（４０．５ｍＬ，０．１２３Ｍ）を窒素雰囲気下で撹拌しながら加えた。得られた混合物は室温で２０時間撹拌した（ｔｌｃは反応が約９５％完了していることを示した）。反応混合物は飽和ＮａＨＣＯ3 （１ｘ３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（１ｘ３００ｍＬ）で抽出した。水性洗浄液はＣＨ2 Ｃｌ2 （３００ｍＬ）で逆抽出し、抽出物を合併してＭｇＳＯ4 で乾燥して濃縮した。得られた残渣はＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を溶出溶媒として用いる１．５ｋｇのシリカカラムでクロマトグラフィーを行った。純粋な分画を蒸発させると９０．６ｇ（８７％）の表記化合物が得られた。
【０１４３】
評価
方法１
２’−Ｏ−置換オリゴリボヌクレオチド
ヌクレアーゼ安定性
２’−Ｏ−メチルホスホロアミダイトはＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡから購入された。２’−Ｏ−プロピルおよび２’−Ｏ−ペンチルホスホロアミダイトはＬｅｓｎｉｋ，Ｅ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，３２，７８３２〜７８３８；Ｇｕｉｎｏｓｓｏら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９１，１０，２５９〜２６２に記載されているように製造した。２’−Ｏ−置換ヌクレオシドで誘導体化されたＣＰＧはＤａｍｈａ，Ｍ．Ｊ．，Ｇｉａｎｎａｒｉｓ，Ｐ．Ａ．およびＺａｂａｒｙｌｏ，Ｓ．Ｖ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３８１３〜３８２１により記載されているように製造した。固相ＤＮＡ合成のためのその他の試薬は市販品が購入された。オリゴマーはＡＢＩモデル３８０Ｂ  ＤＮＡ合成機により固相化学を用いて合成された。オリゴマーはポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製され、続いてＰｏｌｙ−ｐａｋカートリッジ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）で脱塩された。オリゴリボヌクレオチドは［ｇ−32Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチド  キナーゼを用いて５’末端標識された。標識反応後、Ｔ４ポリヌクレオチド  キナーゼは３分間９５℃で熱不活性化され、オリゴマーはさらに精製することなく使用された。
ヌクレアーゼ耐性研究のために合成されたオリゴリボヌクレオチド配列は表１に示されている。１２−ｍｅｒ系列内への異なった２’−Ｏ−アルキル残基の取り込みはエレクトロスプレー質量分析法により確認され、計算された質量と測定された質量は０．０１％以内で一致した。
【０１４４】
蛇毒ホスホジエステラーゼ（μｇＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）アッセイは１μＭオリゴマーを用い、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、７２ｍＭＮａＣｌおよび１４ｍＭ  ＭｇＣｌ2 の緩衝液中、３７℃にて酵素濃度５ｘ１０-2μｇ／ｍｌまたは５ｘ１０-3μｇ／ｍｌで実施された。本酵素はこれらの条件下、少なくとも２４時間その活性を維持することが示された。ヌクレアーゼＳ１（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）アッセイは、１μＭのオリゴマーを用い、３７℃にて３０ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ４．５、５０ｍＭ
【０１４５】
ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＺｎＣｌ2 中で実施された。ヌクレアーゼＳ１は１．９μｇ／ｍｌまたは１．９ｘ１０6 μｇ／ｍｌで使用された。ヌクレアーゼ安定性試験反応液の一部を指定された時間に採り、探知色素を含む等量の８０％ホルムアミドゲル負荷緩衝液の添加により反応を停止させ、９５℃で２分間加熱し、変性ポリアクリルアミド電気泳動による分析まで−２０℃で保存した。定量はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で実施した。
【０１４６】
【表２】
0003787265.tif 000012
【０１４７】
１７−ｍｅｒ系列のヌクレアーゼ安定性が蛇毒ホスホジエステラーゼを用いて試験された。完全長物質の量をその最初の値の５０％へ減少させるのに必要な時間（ｔ1/2 ）が表４に示されている。相対的ヌクレアーゼ安定性は観察されたｔ1/2 値を非修飾化合物のｔ1/2 時間で割ることにより計算された。１７−ｍｅｒ系列の２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−プロピル類似体の両方とも５ｘ１０-3μｇ／ｍｌの酵素濃度で非修飾対照物よりも７４倍安定であった。この系列の２’−Ｏ−メチルと２’−Ｏ−プロピル類似体とのヌクレアーゼ安定性の相違を区別するため酵素濃度を増加させた。５ｘ１０-2μｇ／ｍｌの酵素濃度でＳＶＰＤアッセイを実施すると、約２．５分で完全長２’−デオキシホスホジエステルオリゴマーの５０％の分解が起こった。同一の反応条件下、２’−Ｏ−メチルホスホジエステル、２’−Ｏ−プロピルホスホジエステルおよび２’デオキシホスホロチオエート類似体は２’−デオキシホスホジエステル対照物より１２０、１６０および３５０倍安定であった（表２）。これらの類似体の変性ポリアクリルアミドゲル分析は、完全に修飾されたオリゴリボヌクレオチドは最初のいくつかの３’−ヌクレオチドを著しく超えては分解が進行しないことを示し、一方、非修飾オリゴマーは分解生成物のラダーを示した。定性的には、本分析は２’−Ｏ−ペンチル類似体が２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−プロピルオリゴマーよりもエキソヌクレアーゼ分解に対してより耐性があることを示唆している（データは示されていない）。２’−Ｏ−ペンチル類似体の定量的分析は二つの理由により困難であった。第一に、２’−Ｏ−ペンチルオリゴマーはポリヌクレオチドキナーゼには適さない基質であるため、有効な標識ができない。第二に、非常にたびたび標識２’−Ｏ−ペンチルオリゴマーの大部分はゲルの頂上で捕捉される。１７−ｍｅｒのこの系列については、安定性の順序は以下のように思われる：２’−デオキシホスホロチオエート＞２’−Ｏ−ペンチルホスホジエステル＞２’−Ｏ−プロピルホスホジエステル＞２’−Ｏ−メチルホスホジエステル＞２’−デオキシホスホジエステル。
【０１４８】
１２−ｍｅｒ系列の相対的ヌクレアーゼ安定性もまた蛇毒ホスホジエステラーゼを用いて決定された。この１２−ｍｅｒ系列は３’末端残基を含む全ての位置に２’−Ｏ−アルキル糖修飾を含む。２’−Ｏ−メチルホスホジエステル、２’−Ｏ−プロピルホスホジエステルおよび２’デオキシホスホロチオエート類似体は非修飾対照体より７、１０および８９倍安定であった（表２）。完全修飾２’−Ｏ−ペンチル１２−ｍｅｒオリゴリボヌクレオチドについて観察された安定性は定性的には１７−ｍｅｒ  ２’−Ｏ−ペンチル類似体と同程度である。安定性の順序は１７−ｍｅｒ系列と同じであった。しかしながら１７−ｍｅｒ  ２’−Ｏ−アルキル類似体の単純な分解パターンとは対照的に、１２−ｍｅｒ系列は分解生成物のラダーを示した（データは示されていない）。１２−ｍｅｒの安定性の整列順は１７−ｍｅｒと同一であるが、定量的な相対安定性は二つの系列で異なっていた。１２−ｍｅｒ系列の２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−プロピル類似体は非修飾対照より３から１０倍以上蛇毒ホスホジエステラーゼに耐性であり、１７−ｍｅｒ系列ではこれらの類似体は非修飾対照と比較して７０から１６０倍の安定性の増加を示した。
【０１４９】
２’−Ｏ−修飾オリゴマーの１２−ｍｅｒ系列の安定性もまたＳ１ヌクレアーゼ（一本鎖エンドヌクレアーゼ）を用いて調べられた。１．９μｇ／ｍｌの酵素濃度では２’−Ｏ−メチルホスホジエステルまたは２’−Ｏ−プロピルホスホジエステルの１２−ｍｅｒでは分解は観察されなかった。同一条件下、２’デオキシホスホジエステルおよび２’デオキシホスホロチオエートは各々２および１３分のｔ1/2 を持っていた（表２）。２’−Ｏ−メチル対２’−Ｏ−プロピル修飾の安定性における相違は１０5 倍高いＳ１ヌクレアーゼ濃度で観察された。１．９ｘ１０5 μｇ／ｍｌの酵素濃度では、２’−Ｏ−メチル類似体のｔ1/2 は９０分であったが、２’−Ｏ−プロピルオリゴマーの分解は観察されなかった。
【０１５０】
【表３】
0003787265.tif 000013
【０１５１】
【表４】
0003787265.tif 000014
【０１５２】
【表５】
0003787265.tif 000015
1 配列および修飾は表１に与えられている。
2 このオリゴマーは５’残基が２’−デオキシＣであることを除いて完全に修飾された２’−Ｏ−ペンチル  １２−ｍｅｒである。
ＮＤ3 ＝決定されていない。
【０１５３】
方法２
ハイブリダイゼーション安定性の決定
Ｍｏｎｉａ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７，１９９５４〜１９９６２に記載されているように、デュープレックスの吸光度対温度の曲線が１００ｍＭ  Ｎａ+ 、１０  ｍＭリン酸、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７中４ｍＭの鎖濃度（デュープレックス）または６ｍＭ鎖濃度（一本鎖の研究）で測定された。融解温度（Ｔm ）およびデュープレックス形成の自由エネルギーが直線勾配ベースラインを用いた二状態モデルへデータを適合させて得られた（Ｆｒｅｉｅｒ，Ｓ．Ｍ．，Ａｌｂｅｒｇｏ，Ｄ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｔｕｒｎｅｒ，Ｄ．Ｈ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，１９８３，２２，１１０７〜１１３１）。デュープレックス形成の自由エネルギーは、Ｆｒｅｉｅｒ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ，Ｃ．Ｆ．Ｆｏｘ編者，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１，１９９２，ｐｐ．９５〜１０７により示されているように、Ｔm より熱力学的安定性のより正当な測定である。しかしながら、実験誤差はＴm よりＤＧ°37における方がより大きい。従って、表３にはＴm 値が報告されている。
【０１５４】
【表６】
0003787265.tif 000016
1  Ｔｍは℃で示され、１００ｍＭ  Ｎａ+ 、１０ｍＭリン酸、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０中、４ｍＭの鎖濃度でＲＮＡ相補体に対して測定された。（Ｐ＝Ｏ、ホスホジエステル、Ｐ＝Ｓ、ホスホロチオエート）
2  ＮＤ  ＝決定されていない
3  Ｔｍは相補鎖なしで１００ｍＭ  Ｎａ+ 、１０ｍＭリン酸、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０中、４ｍＭの鎖濃度で測定された。
【０１５５】
【表７】
0003787265.tif 000017
【０１５６】
方法３
ｒａｓ  ＲＮＡによるＲＮａｓｅ  ＯＮＥフットプリンティング  アッセイ
ｒａｓ  ４７−ｍｅｒステム／ループＲＮＡを３〜３０ｐＭの濃度で標的上の好適なハイブリダイゼーション部位に相補的であるオリゴヌクレオチドとインキュベートした。これらのオリゴヌクレオチドは市販品として入手可能な（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）２’−Ｏ−メチルアミダイトを５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 を含む１０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ  ８）中、１０μＭの濃度で用いて合成した。ハイブリダイゼーションは３７℃にて少なくとも１６時間実施した。ＲＮａｓｅ  ＯＮＥ（１０μｇ／μＬ，Ｐｒｏｍｅｇａ）は１：２０００から１：１００，０００の希釈で加え、２５℃で５分間インキュベートし、急速冷凍により反応を停止させた。ＲＮａｓｅ  Ｔ１を用いる”Ｇ”マップおよび５０ｍＭ  Ｎａ2 ＣＯ3 緩衝液（ｐＨ  ９）を用いる塩基ラダーを調製した。分解生成物は、１０μＭでのＲＮａｓｅ  ＯＮＥフットプリントを示す少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを同定するためシークエンシングＰＡＧＥにより分離された。次に問題とするオリゴヌクレオチドのＫd が、そのオリゴヌクレオチド（１００ｐＭから１０μＭの範囲の濃度で）をＲＮａｓｅ  ＯＮＥで滴定することにより決定された。分解生成物はシークエンシングＰＡＧＥにより分離され、オリゴヌクレオチドにより与えられた保護のパーセントがオリゴヌクレオチド濃度の関数としてプロットされた。５０％保護が観察されるオリゴヌクレオチド濃度が問題とするオリゴヌクレオチドのＫd である。この方法を用い、標的ｒａｓ  ＲＮＡに対して増強された親和性および特異性を持つオリゴヌクレオチドが同定された。
【０１５７】
方法４
ｒａｓ−ルシフェラーゼ  レポーター遺伝子組立て
この研究で記載されるｒａｓ−ルシフェラーゼ  レポーター遺伝子はＰＣＲ技術を用いて組み立てられた。突然変異体（コドン１２）および非突然変異体（野生型）ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子両方のエキソン１の５’領域のＰＣＲクローニングのプライマーとして使用するため、オリゴヌクレオチドプライマーが合成された。ｃ−Ｈ−ｒａｓ１活性化癌遺伝子（コドン１２、ＧＧＣ→ＧＴＣ）を含むｐＴ２４−Ｃ３、およびｃ−Ｈ−ｒａｓ原癌遺伝子を含むｐｂｃ−Ｎ１はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から得られた。１．９ｋｂホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＴ３／Ｔ７  ｌｕｃはＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から得られた。オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーは、鋳型として突然変異体および非突然変異体Ｈ−ｒａｓ遺伝子を用いる標準ＰＣＲ反応で使用された。これらのプライマーはＮｈｅＩおよびＨｉｎｄIII 制限エンドヌクレアーゼ部位が隣接する、正常および突然変異体Ｈ−ｒａｓの配列−５３から＋６５（翻訳開始部位に関して）に対応する１４５塩基対のＤＮＡ生成物を生成する。ＰＣＲ生成物は標準法を用いてゲルで精製し、沈澱させ、洗浄して水に再懸濁した。
【０１５８】
Ｐ．ピラリス（ｐｙｒａｌｉｓ）（ホタル）ルシフェラーゼ遺伝子のクローニングのためのＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ生成物がアミノ末端メチオニン残基を除いて（それは二つのアミノ酸で置き換えられるであろう、アミノ末端リジンおよび続いてロイシン残基）完全長ルシフェラーゼ蛋白質をコードするように設計された。このルシフェラーゼ遺伝子のクローニングのために用いられたオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む市販品として入手可能なプラスミド（ｐＴ３／Ｔ７−Ｌｕｃ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いる標準ＰＣＲ反応において鋳型として使用された。これらのプライマーは独特のＨｉｎｄIII およびＢｓｓＨII制限エンドヌクレアーゼ部位が隣接し、ルシフェラーゼ遺伝子に対応する約１．９ｋｂの生成物を与える。この断片は標準法を用いてゲルで精製し、沈澱させ、洗浄して水に再懸濁した。
【０１５９】
ｒａｓ−ルシフェラーゼ融合レポーター遺伝子の組立を完成させるため、ｒａｓおよびルシフェラーゼＰＣＲ生成物は適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ、ＨｉｎｄIII およびＢｓｓＨIIを用いてステロイド−誘導可能マウス乳癌ウイルスプロモーターＭＭＴＶを含む発現ベクター内への三部分連結によりクローン化した。得られたクローンではホタルルシフェラーゼ遺伝子の読み枠内へ融合されたＨ−ｒａｓ５’配列（−５３から＋６５）の挿入がもたらされる。得られた発現ベクターはステロイド−誘導可能ＭＭＴＶプロモーターの制御下で発現されるｒａｓ−ルシフェラーゼ融合生成物をコードしている。これらのプラスミド構築物はホタルルシフェラーゼをコードする配列の読み枠内へ融合された活性化（ＲＡ２）または正常（ＲＡ４）Ｈ−ｒａｓ蛋白質のアミノ酸１〜２２をコードしている配列を含む。ｒａｓ−ルシフェラーゼ融合ｍＲＮＡの翻訳開始は天然のＨ−ｒａｓ  ＡＵＧコドンに依存する。突然変異体および正常Ｈ−ｒａｓルシフェラーゼ融合構築物の両方が標準法を用いるＤＮＡ配列分析により確認された。
【０１６０】
方法５
プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション
トランスフェクションは以下の修正を加えＧｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｅ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．ＳｅｉｄｍａｎおよびＫ．Ｓｔｒａｈｌ，編），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載されているように実施した。ヒーラー細胞を６０ｍｍの培養皿に５ｘ１０5 細胞／皿で播種した。各々の皿に全部で１０μｇまたは１２μｇのＤＮＡを加え、その１μｇは構成性ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターの制御下のグルココルチコイドレセプターを発現するベクターであり、残りはｒａｓ−ルシフェラーゼレポータープラスミド（実施例４３）であった。リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈澱物は、３ｍＭ  ＥＧＴＡを含むトリス緩衝食塩水［５０ｍＭ  トリス−Ｃｌ（ｐＨ  ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ］で洗浄することにより１６〜２０時間後に除去した。次に１０％ウシ胎児血清を補給した新鮮な培地を細胞に加えた。この時点で、デキサメタゾンによるレポーター遺伝子発現の活性化に先だって細胞はオリゴヌクレオチドで前もって処理された。
【０１６１】
方法６
細胞のオリゴヌクレオチド処理
プラスミドトランスフェクション（実施例４４）に続いて、細胞は前もって３７℃に温めたリン酸緩衝食塩水で洗浄し、５μｇ／ｍＬのＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭを各々のプレートに添加した（ウェル当たり１．０  ｍｌ）。５０μＭ貯蔵液からオリゴヌクレオチドを各々のプレートに加え、３７℃で４時間インキュベートした。培地を除き、１０％ウシ胎児血清および指定された濃度の適当なオリゴヌクレオチドを含むＤＭＥＭで置換し、細胞は３７℃で２時間さらにインキュベートしたのち、０．２μＭの最終濃度のデキサメタゾンで細胞を処理することによりレポーター遺伝子発現を活性化した。デキサメタゾン刺激１５時間後に細胞を採取し、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。
【０１６２】
方法７
ルシフェラーゼアッセイ
Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｅ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．ＳｅｉｄｍａｎおよびＫ．Ｓｔｒａｈｌ編），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載されているように、界面活性剤トリトンＸ−１００で溶解させることにより細胞からルシフェラーゼを抽出した。Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＭＬ１０００ルミノメーターを使用して６２５μＭのルシフェリン（Ｓｉｇｍａ）の添加によるピークルミネセンスを測定した。各々の抽出物について、データがアッセイの直線的範囲に集まることを確かにするため異なった量の抽出物を使用して多数回ルシフェラーゼアッセイを実施した。
【０１６３】
方法８
融解曲線
ＩＢＭ  ＰＣコンピューターと接続したＧｉｌｆｏｒｄ  ２６０分光光度計およびＧｉｌｆｏｒｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ＩＩ分光光度計を用いて２６０ｎｍで吸光度対温度の曲線を測定した。緩衝液は１００ｍＭＮａ+ 、１０ｍＭリン酸および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７を有した。オリゴヌクレオチド濃度は各々の鎖で４μＭであり、８５℃での吸光度および、ＰｕｇｌｉｓｉおよびＴｉｎｏｃｏ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８９，１８０，３０４〜３２５に従って計算された吸光係数から決定された。Ｔm 値、デュープレックス形成の自由エネルギーおよび付随する定数は直線状スロープ基線の二状態モデルへのデータの適合から得られた。Ｐｅｔｅｒｓｈｅｉｍ，Ｍ．およびＴｕｒｎｅｒ，Ｄ．Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８３，２２，２５６〜２６３。報告されているパラメーターは少なくとも３回の実験の平均である。いくつかのオリゴヌクレオチドに対し、Ｔm -1対ｌｏｇ10（濃度）のプロットからデュープレックス形成の自由エネルギーも得られた。Ｂｏｒｅｒ，Ｐ．Ｎ．，Ｄｅｎｇｌｅｒ，Ｂ．，Ｔｉｎｏｃｏ，Ｉ．，Ｊｒ．およびＵｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ．Ｃ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９７４，８６，８４３〜８５３。
【０１６４】
方法９
２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドを持つオリゴヌクレオチドの活性
方法５〜８を用いて、オリゴマー化合物の相補的ＲＮＡへのハイブリダイゼーション親和性および細胞内でのＨａ−ｒａｓ癌遺伝子に対する活性が試験された。均一に２’−Ｏ−修飾されたオリゴマーおよび２’−Ｏ−修飾領域および２’−デオキシ領域の両方を持つキメラオリゴマーが試験された。２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−プロピルおよび２’−Ｏ−ペンチルを含む均一に２’−Ｏ−修飾されたオリゴマーは非修飾２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりもＲＮＡへの高い親和性を示した。２’−Ｏ−修飾領域および２’−デオキシ領域の両方を持つキメラオリゴマーは非修飾２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりもＲＮＡに対する高い親和性を示し、また非修飾均一デオキシホスホロチオエートと比較して著しいＨａ−ｒａｓ遺伝子発現の阻害も示した（Ｍｏｎｉａ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，２６８，１４５１４〜１４５２２を参照されたい）。
【０１６５】
実施例４８
ＰＫＣ−α  ｍＲＮＡ発現のオリゴヌクレオチド阻害アッセイ
Ａ５４９細胞をＴ−７５フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）に播種し、２４〜４８時間後（この時８０〜９０％コンフルエント）以下の組成を持つ３つのオリゴヌクレオチドで処理した。
【０１６６】
【表８】
0003787265.tif 000018
【０１６７】
配列ＩＤ番号：２７は完全に修飾されたデオキシホスホロチオエートであり、配列ＩＤ番号：２８は１−６および１５−２０位に２’−フルオロを持つ完全に修飾されたデオキシホスホロチオエートであり、および配列ＩＤ番号：２９は２、３、５および１６−１８位に２’−フルオロ−５−メチルウリジンおよび１、４、６、１５、１９および２０位に２’−フルオロを持つ完全に修飾されたデオキシホスホロチオエートである。
【０１６８】
細胞は１０ｍｌのＤＭＥＭで２回洗浄し、２０μｇ／ｍｌのＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ溶液（リポフェクチン）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む５ｍｌのＤＭＥＭを加えた。次に１０μＭの貯蔵溶液から必要とされる濃度までオリゴマー化合物を加え、皿を渦まかせることにより溶液を混合させた。細胞は３７℃で４時間インキュベートし、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ溶液を除くために１回ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで洗浄し、続いて追加の２０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％  ＦＣＳを加え、細胞はさらに２０時間放置して回復させた。
【０１６９】
Ａ５４９細胞を２５、５０、１００、２００および４００ｎＭ濃度のオリゴマー化合物で処理し、全細胞ＲＮＡを４Ｍグアニジウムイソチオシアネート中での溶解、続いての塩化セシウム濃度勾配により単離した。全ＲＮＡ（１５〜３０μｇ）を１．１％ホルムアルデヒド含有１．２％アガロースゲルで分離し、ナイロン膜へ移した。ブロットは次にＡＴＣＣ（Ｂｅｔｈｓｄａ，ＭＤ）から得られたウシＰＫＣ−α  ｃＤＮＡとハイブリダイズさせた（Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、１９８６）。ｃＤＮＡプローブは市販品として入手可能なキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、その使用説明書に従うランダムプライマー標識により［α−32Ｐ］ｄＣＴＰで32Ｐ放射標識された。フィルターはＱｕｉｋｈｙｂ溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中、６８℃で６０分ハイブリダイズされた。続いて室温で弱いストリンジェンシー洗浄が２回（２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ）、および６０℃で強いストリンジェンシー洗浄が２回（０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ）行われた。ハイブリダイズしたバンドはＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを用いて可視化および定量された。ブロットは次に沸騰させることにより放射活性を取り除き、等量のＲＮＡが負荷されたことを確認するため32Ｐ標識グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼプローブ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で再探査された。
２’−フルオロ−５−メチルウリジン含有オリゴマー化合物である配列ＩＤ番号：２９は、同一の場所にチミジンを含むオリゴマー化合物である配列ＩＤ番号：２７と比較すると１０倍の効力の増加を示した。配列ＩＤ番号：２９はまた配列ＩＤ番号：２８と比較すると測定できるほどの効力の増加を示した。
【０１７０】
実施例４９
インビトロＨＩＶ阻害アッセイ
ＨＩＶ  ｒｅｖ蛋白質の発現を阻害するオリゴヌクレオチドを同定するためにインビトロトランスフェクションアッセイが使用された。このアッセイの時間は４日間である。マウス胎児線維芽細胞株（３Ｔ３）を１０％ウシ胎児血清、グルタミンおよび抗生物質を補充したＤＭＥＭ（高グルコース）中で対数増殖期に維持した。
【０１７１】
プラスミド構築：ｐＨＩＶ  ｅｎｖ−ｌｕｃは以下のように構築された。ヒト免疫不全ウイルス  タイプ１エンベロープ遺伝子を含むｐＢＨ１０（２０）の３．１Ｋｂ  Ｓａｌｌ／Ｘｈｏｌ断片（単離物ＢＨ１０）（ヌクレオチド５１２０〜８２６０）をｐＭＡＭＢａｍプラスミドのＸｈｏｌ部位へ結合させてｐＭＡＭＨＩＶｅｎｖを得た。ｐＭＡＭＢａｍベクターは８．３Ｋｂ  ｐＭＡＭｎｅｏプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＢａｍＨＩ消化物をゲル精製することにより得られた。ＢａｍＨＩ部位は４つのｄＮＴＰ全ての存在下でクレノーポリメラーゼで末端を充填し、続いて結合させることにより破壊された。ｐＭＡＭＨＩＶ−ｅｎｖは独特のＢａｍＨＩ部位で切断され、４つのｄＮＴＰ全ての存在下でクレノーポリメラーゼで末端が充填され、再結合された。この過程はｅｎｖ遺伝子のＲｅｖコード部分を不活性化するフレームシフト突然変異を導入する。最後に、ＳａｌＩ／ＳａｌＩルシフェラーゼコード化レポーター遺伝子がＨＩＶ配列の上流の独特なＳａｌＩ部位へクローン化され、突然変異したｒｅｖ遺伝子を有する最終構築物ｐＨＩＶ  ｅｎｖ−ｌｕｃが得られた。
【０１７２】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼで哺乳類細胞およびインビトロの両方でｒｅｖ蛋白質を発現するｐＳＧ５−ｒｅｖプラスミドの構築のため、ｐＣＶ１からのＰＣＲによりＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ  ｒｅｖ  ｃＤＮＡが調製された。ＰＣＲ断片はＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで切断され、ベクターｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ部位へサブクローン化された。ＰＣＲプライマーは下記のものであった：
【０１７３】
【表９】
5'-GCT CGG GAA TTC ATG GCA GGA AGA AGC GGA
5'-CTG GGA GAT CTC TAT TCT TTA GCT CCT GAC TC
【０１７４】
Ｒｅｐ６は、構成性ＲＳＶ  ＬＴＲの制御下で完全長グルココルチコイド  レセプターを発現するプラスミドであり、Ｍｉｅｓｆｅｌｄ，Ｒ．ら、Ｃｅｌｌ，１９８６，４６，３８９〜３９９にしたがって調製された。
１日目：３Ｔ３細胞を洗浄し、トリパンブルー排除により計数し、６−ウェルマイクロタイタープレートの各々のウェルにウェル当たり８．５Ｘ１０4 細胞で播種した。
２日目：三つの組換え体プラスミド、ｐＳＧ５、ｐＨＩＶ  ｅｎｖ−ｌｕｃおよびＲｅｐ０６を標準ＣａＰＯ4 沈澱プロトコール（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ａ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９７３，５２，４５６〜４６７）を用いて沈澱させた。ＣａＰＯ4 沈澱ＤＮＡはマウス胎児線維芽細胞へ加え、細胞は３７℃で７時間インキュベートした。細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、１０％ウシ胎児血清、グルタミンおよび抗生物質を補充したＤＭＥＭ、および決められた濃度のオリゴヌクレオチドおよび一連の半対数希釈で３７℃にて一夜インキュベートした。
【０１７５】
３日目：細胞をＯＰＴｉｍｅｎ培地で２回洗浄し、ウェル当たりＯＰｔｉｍｅｍ培地中２．５ｍｇ／ｍｌのリポフェクチンおよびオリゴヌクレオチドで３７℃にて４時間処理した。リポフェクチン／オリゴヌクレオチド溶液を完全培地に置き換え、細胞は３７℃にて２時間回復させた。オリゴヌクレオチド処理細胞は次にデキサメタゾンで処理された。
４日目：デキサメタゾン処理して２４時間後、細胞を溶解させルシフェラーゼアッセイが実施される（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ）。溶解試料の蛋白質濃度はブラッドフォード蛋白質アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７６，７２，２４８）を用いて決定される。
【０１７６】
実施例５０
オリゴヌクレオチド８４６９のインビボ活性
皮下（ｓ．ｃ．）移植ヒト肺腺癌Ａ５４９を持つメスＢａｌｂ／ｃヌードマウスがオリゴヌクレオチド８４６９−３、配列ＩＤ番号：３およびベヒクル（食塩水）で処理された。処理は９日で始め、一日一回３３日間続けられた。二つの用量投与計画で研究された：一つは６．０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．およびもう一つは０．６ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．である。
連続的に経過した（３＋回）皮下腫瘍の生存能力のある断片（２５〜５０ｍｇ）を套管針により一つのわき腹に皮下で研究動物内へ再移植する。断片が約１００ｍｇに達したら（５〜１５日後）処理を始める。対照腫瘍が１グラムの大きさに達するまで（すなわち、２〜４週間）動物を週当たり３から７回静脈内（ｉ．ｖ．）で処理する。腫瘍の大きさは週に１または２回、カリパスで測定する。
結果は二つの用量投与計画で腫瘍増殖の著しい減少を示しており、６．０ｍｇ／ｋｇは０．６ｍｇ／ｋｇよりも遅い増殖速度を与える。
【０１７７】
実施例５１
ＰＫＣ−α  ｍＲＮＡレベルに対するオリゴマー化合物の影響
Ａ５４９細胞を上記のようにオリゴマー配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２および配列ＩＤ番号：３を用い、陽イオン性脂質ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ存在下、１００から４００Ｎｍの用量で４時間処理し、洗浄してさらに２０時間回復させる。全ＲＮＡを抽出し、各々の２０μｇを１．２％ゲルで分離し、ナイロン膜へ移した。これらのブロットは32Ｐ放射性標識ＰＫＣ−α  ｃＤＮＡプローブで探査し、次に取り除き、等量のＲＮＡ負荷を確認するため放射性標識Ｇ３ＰＤＨプローブで再探査した。ＰＫＣ−α転写体はＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）で試験し定量した。ＰＫＣ−αに対して活性であることが知られているホスホロチオエートオリゴヌクレオチド標品はこのアッセイにおいて約１７５ｎＭのＩＣ50を持っている。改良された活性を示す化合物は試験標品よりも高い活性、例えば１７５ｎＭより低いＩＣ50を持つであろう。ＰＫＣ−α配列への試験化合物の高い特異的結合はまた、ベータ、ガンマおよびデルタアイソザイムのような他のＰＫＣアイソザイムのｍＲＮＡからＰＫＣ−α  ｍＲＮＡを区別するのに使用できる。
【０１７８】
実施例５２
インビボでのｒａｓ発現のノーザンブロット分析
上記のように２．５μＬのＤＯＴＭＡを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ減少血清培地中で、細胞をオリゴマー配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２および配列ＩＤ番号：３で処理する。オリゴマーは所望の濃度まで加えられる。処理して４時間後、培地をオリゴヌクレオチドを含まない培地に置き換える。オリゴマー処理して４８時間後に細胞を採取し、標準ＣｓＣｌ精製法を用いてＲＮＡを単離する。Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．ＳｅｉｄｍａｎおよびＫ．Ｓｔｒａｈｌ編），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄＳｏｎｓ，ＮＹ。
【０１７９】
ＲＮＡは各々のＲＮＡの１０μｇを用いるノーザンハイブリダイゼーション分析により分析する。ＲＮＡは１．２％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで電気泳動され、標準法を用いて一夜ＧｅｎｅＢｉｎｄ  ４５ナイロン膜（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）へ移される。Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．ＳｅｉｄｍａｎおよびＫ．Ｓｔｒａｈｌ編），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮＹ。ＲＮＡは膜へＵＶ−架橋された。二本鎖32Ｐ標識プローブがＰｒｉｍｅａ  Ｇｅｎｅ標識キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を用いて合成される。ｒａｓプローブは活性化（突然変異体）Ｈ−ｒａｓ  ｍＲＮＡのｃＤＮＡクローンのＳａｉＩ−ＮｈｅＩ断片であり、コドン１２でのＧＧＣ−から−ＧＴＣの突然変異を持っている。対照プローブはＧ３ＰＤＨである。ブロットは６８℃にて１５分、ＱｕｉｃｋＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で前ハイブリダイゼーションさせた。１００μＬの１０ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡと混合した熱変性放射活性プローブ（２．５ｘ１０6 カウント／２ｍｌハイブリダイゼーション溶液）を加え、膜は６８℃にて１時間ハイブリダイズさせた。ブロットは２回室温で１５分２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで、および１回６０℃で３０分０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。ブロットのオートラジオグラフィーを行い、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて信号の強度を定量した。ノーザンブロットはｒａｓプローブと最初にハイブリダイズされ、０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で１５分煮沸することにより取り除いた後、正確な試料負荷を検査するために対照Ｇ３ＰＤＨプローブで再ハイブリダイズされた。
【０１８０】
本明細書で述べられている公表された文献は、本明細書においてその全文が援用される。
当業者は本発明の好適な態様に対して多くの変更および修正ができること、およびそのような変更および修正が本発明の精神から離れることなくなされることを理解するであろう。従って、付随する特許請求の範囲はすべての均等な変形を本発明の真の精神および範囲にあるとして包摂することが意図されている。
【配列表】
0003787265.tif 000019
0003787265.tif 000020
0003787265.tif 000021
0003787265.tif 000022
0003787265.tif 000023
0003787265.tif 000024
0003787265.tif 000025
0003787265.tif 000026
0003787265.tif 000027