(57)【要約】本発明は、標的の細胞に対して選択的にアポトーシスを誘導し得るペプチド薬剤を提供することを課題とする。本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる、エンドソームエスケープペプチドとアポトーシス誘導ペプチドとの融合ペプチドを有する、細胞殺傷剤、及び、細胞の異常増殖に起因する疾患の治療剤である、前記記載の細胞殺傷剤である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有する、細胞殺傷剤。
【請求項２】
前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが、
全てＤ−アミノ酸からなるペプチド、
配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１〜１４番目のアミノ酸までがＤ−アミノ酸からなり、１５〜１９番目のアミノ酸までがＬ−アミノ酸からなるペプチド、
配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１〜１４番目のアミノ酸までがＬ−アミノ酸からなり、１５〜１９番目のアミノ酸までがＤ−アミノ酸からなるペプチド、又は
全てＬ−アミノ酸からなるペプチドである、請求項１に記載の細胞殺傷剤。
【請求項３】
細胞の異常増殖に起因する疾患の治療剤である、請求項１又は２に記載の細胞殺傷剤。
【請求項４】
前記疾患が、癌である、請求項３に記載の細胞殺傷剤。
【請求項５】
細胞の異常増殖に起因する疾患を発症している動物に対して、有効量の請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞殺傷剤を投与する工程を有する、細胞の異常増殖に起因する疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的の細胞に対して選択的にアポトーシスを誘導し得るペプチド薬剤に関する。
本願は、２０１８年１月９日に、日本に出願された特願２０１８−００１０６３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品の有効成分は、その大きさから、低分子薬（低分子化合物薬）と、抗体医薬と、低分子化合物よりも大きく抗体よりも小さい中分子薬と、に分類される。中分子薬には、例えば、ペプチド薬剤が含まれる。低分子薬、中分子薬、抗体医薬は、それぞれ利点や問題点がある。例えば低分子薬は、分子量が小さいため、細胞膜を通過して標的の細胞の内部に入り込むことができるが、タンパク質同士の結合を阻害することはできない。また、製造コストが比較的安価であるとの利点があるが、スクリーニングが長年行われてきており、新規分子の検索が困難な状況である。一方で、抗体医薬は、標的分子への特異性や結合力が高く、また、タンパク質同士の結合を阻害できるが、分子量が大きいために細胞膜を通過できず、標的細胞の内部に入ることができない。また、製造コストが高いことが大きなデメリットである。中分子薬は、低分子薬と抗体医薬の利点を併せ持つ。すなわち、標的分子への特異性や結合力が高いことに加えて、細胞膜を通過して細胞内の標的分子に作用することができる。また、一般的に化学合成が可能であるため、製造コストが抗体医薬よりも安く、かつ純度の高い薬剤を合成することができる。【０００３】
一方で、アポトーシスは、多細胞生物の細胞死のうち、増殖制御機構として管理・調節された細胞死である。多細胞生物においては、発生や再生過程で生じた不要な細胞や有害な細胞の排除を、これらの細胞にアポトーシスを誘導することによって行っている。また、アポトーシスを疾患の原因となる細胞に誘導させて排除することにより、病態の改善が期待できることから、アポトーシスを誘導する活性を持つ物質を医薬用途へ利用することも行われている。例えば、癌細胞に対してアポトーシスを誘導させることにより、癌を寛解又は治癒することが期待できる。【０００４】
疾患の原因となる細胞にアポトーシスを誘導するペプチド薬剤としては、例えば、子宮内膜症細胞（子宮内膜以外に存在する子宮内膜細胞）の細胞表面に特異的に発現しており、腹膜表面には発現していない分子であるＣＮＧＢ３（cyclic nucleotide-gated channel beta 3）に特異的に結合するＺ１３ペプチドとエンドソームエスケープペプチドとの融合ペプチドと、Ｚ１３ペプチドとアポトーシス誘導ペプチドとの融合ペプチドとを含むペプチド組成物が報告されている（特許文献１参照。）。両ペプチドを、Ｚ１３ペプチド部分により子宮内膜症細胞に共に取り込ませることにより、子宮内膜症細胞に対して選択的にアポトーシスを誘導させることができる。実際に、子宮内膜症を発症しているヒヒに、Ｚ１３ペプチドとエンドソームエスケープペプチドとの融合ペプチドと、Ｚ１３ペプチドとアポトーシス誘導ペプチドとの融合ペプチドとを含むペプチド組成物を、腹腔鏡を介して腹膜に投与したところ、子宮内膜症の病変の細胞のみ選択的にアポトーシスが誘導され、隣接するその他の細胞ではアポトーシスは誘導されなかった（非特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１６／１４５３０８号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Sugihara，et al.，NATURE COMMUNICATIONS、２０１４年、第５巻、記事番号４４７８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、標的の細胞に対して選択的にアポトーシスを誘導し得るペプチド薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、特定のペプチド配列からなるエンドソームエスケープペプチドと特定のペプチド配列からなるアポトーシス誘導ペプチドとの融合ペプチドが、高い選択性で効率よく、癌細胞に対してアポトーシスを誘導できることを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の細胞殺傷剤及び細胞の異常増殖に起因する疾患の治療方法を提供するものである。
［１］  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有する、細胞殺傷剤。
［２］  前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが、
全てＤ−アミノ酸からなるペプチド、
配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１〜１４番目のアミノ酸までがＤ−アミノ酸からなり、１５〜１９番目のアミノ酸までがＬ−アミノ酸からなるペプチド、
配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１〜１４番目のアミノ酸までがＬ−アミノ酸からなり、１５〜１９番目のアミノ酸までがＤ−アミノ酸からなるペプチド、又は
全てＬ−アミノ酸からなるペプチドである、前記［１］の細胞殺傷剤。
［３］  細胞の異常増殖に起因する疾患の治療剤である、前記［１］又は［２］の細胞殺傷剤。
［４］  前記疾患が、癌である、前記［３］の細胞殺傷剤。
［５］  細胞の異常増殖に起因する疾患を発症している動物に対して、有効量の前記［１］〜［４］のいずれかの細胞殺傷剤を投与する工程を有する、細胞の異常増殖に起因する疾患の治療方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る細胞殺傷剤は、非常に効率よく、標的の細胞に対してアポトーシスを誘導できる。このため、当該細胞殺傷剤は、特に、癌等の細胞の異常増殖に起因する疾患の治療剤として有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１において、各ペプチドで処理したA431-CNGB3-myc細胞の相対ＡＴＰ量（％）の測定結果を示した図である。
【図２】実施例１において、各ペプチドで処理したOVCAR3-Luc細胞の相対ＡＴＰ量（％）の測定結果を示した図である。
【図３】実施例１において、各ペプチドで処理したOVCAR3-Luc細胞の相対ＡＴＰ量（％）の測定結果を示した図である。
【図４】実施例２において、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドを腹腔内に単回投与した子宮内膜症モデルマウスの腹膜の発光強度（RLU）の測定結果を示した図である。
【図５】実施例３において、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドを投与したOVCAR3-Lucマウスのｐｈｏｔｏｎ数の増大率（％）を経時的に測定した結果を示した図である。
【図６】実施例３において、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドを投与したOVCAR3-Lucマウスの腫瘍体積の増大率（％）を経時的に測定した結果を示した図である。
【図７】実施例３において、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドを投与したOVCAR3-Lucマウスの、腫瘍増大率が１０倍に達した場合を安楽死条件とした生存率の経時的変化を示した図である。
【図８】実施例３において、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドを投与したOVCAR3-Lucマウスの、腫瘍増大率が２０倍に達した場合を安楽死条件とした生存率の経時的変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜細胞殺傷剤＞
本発明に係る細胞殺傷剤は、配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫＨＬＡＨＬ）からなるペプチド（以下、「エフェクターペプチド」ということがある。）を有する。エフェクターペプチドは、アポトーシス誘導活性を有するペプチドとエンドソームエスケープ活性を有するペプチドがタンデムに連結されたペプチドである。本発明に係る細胞殺傷剤は、十分に小さいため、特段の取り込みシステムを介さなくても、標的細胞内へエンドサイトーシスにより取り込まれる。次いで、標的細胞内に取り込まれたエンドソームに内包された細胞殺傷剤は、エンドソームエスケープ活性を有するペプチド部位の作用によってエンドソーム膜が破壊される結果、標的細胞の細胞質へ放出される。細胞質へ放出された細胞殺傷剤は、アポトーシス誘導活性を有するペプチド部位の作用によって、ミトコンドリア膜を障害し、当該標的細胞のアポトーシスを誘導する。
【００１３】
本発明に係る細胞殺傷剤は、一分子中に、アポトーシス誘導活性を有するペプチド部分と、エンドソームエスケープ活性を有するペプチド部分とを含む。このため、アポトーシス誘導活性を有するペプチドと、エンドソームエスケープ活性を有するペプチドとをそれぞれ独立に含むペプチド組成物と比較して、非常に効率よく、標的細胞にアポトーシスを誘導することができる。
【００１４】
なお、本発明及び本願明細書において、「標的細胞」は、アポトーシスを誘導したい対象の細胞である。
【００１５】
特許文献１に開示されているように、ＫＬＡＫの４アミノ酸の繰り返しからなるアミノ酸配列（以下、「ＫＬＡＫ配列」ということがある。）からなるペプチド（以下、「ＫＬＡＫペプチド」ということがある。）は、ミトコンドリア膜を障害してアポトーシスを誘導する作用（アポトーシス誘導活性）を有する。ＨＬＡＨの４アミノ酸の繰り返しからなるアミノ酸配列（以下、「ＨＬＡＨ配列」ということがある。）からなるペプチド（以下、「ＨＬＡＨペプチド」ということがある。）は、エンドソームの膜を破壊する作用（エンドソームエスケープ活性）を有する。ＫＬＡＫペプチドとＨＬＡＨペプチドを連結したペプチドは、エンドソームエスケープ活性とアポトーシス誘導活性を有するが、その活性の強さは、それぞれのペプチドのアミノ酸の長さと、両ペプチドの連結の順番に影響を受ける。
【００１６】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるエフェクターペプチドは、１４アミノ酸からなるＫＬＡＫ配列の下流に、５アミノ酸からなるＨＬＡＨ配列が連結されたペプチドである。すなわち、配列番号１のアミノ酸配列のうち、１〜１４番目のアミノ酸までがアポトーシス誘導活性を有する部位であり、１５〜１９番目のアミノ酸までがエンドソームエスケープ活性を有する部位である。このエフェクターペプチドは、標的細胞にエンドサイトーシスで取り込まれた場合に、最も高いアポトーシス誘導活性が得られるように、ＫＬＡＫ配列の長さ、ＨＬＡＨ配列の長さ、及びＫＬＡＫ配列とＨＬＡＨ配列の連結の順番が最適化されたペプチドである。このエフェクターペプチドを有しているため、本発明に係る細胞殺傷剤は、非常に高いアポトーシス誘導活性を持つ。
【００１７】
本発明に係る細胞殺傷剤が有するエフェクターペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであれば特に限定されるものではなく、Ｌ−アミノ酸からなるペプチドであってもよく、Ｄ−アミノ酸からなるペプチドであってもよく、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸からなるペプチドであってもよい。エンドソーム内における安定性が高く、より高いアポトーシス誘導活性が得られることから、エフェクターペプチドは、少なくとも一部にＤ−アミノ酸を含むペプチドであることが好ましく、ＫＬＡＫ配列（配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１〜１４番目のアミノ酸）とＨＬＡＨ配列（配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１５〜１９番目のアミノ酸）の少なくとも一方がＤ−アミノ酸からなるペプチドであることがより好ましく、全てＤ−アミノ酸からなるペプチドであることが特に好ましい。
【００１８】
本発明に係る細胞殺傷剤は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるエフェクターペプチドの効果を損なわない限りにおいて、当該エフェクターペプチドに、その他の生体分子が連結されていてもよい。その他の生体分子としては、ペプチドが挙げられる。ただし、細胞殺傷剤全体の大きさが、特段の取り込みシステムを介さなくても、エンドサイトーシスによって細胞内へ取り込まれ得る大きさであることが好ましい。具体的には、当該エフェクターペプチド以外の部分は、１〜１５個が好ましく、１〜１０個程度のペプチドがより好ましい。本発明に係る細胞殺傷剤が配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるエフェクターペプチド以外の部分を含む場合、当該エフェクターペプチド以外の部分は、当該エフェクターペプチドのＮ末端側にあってもよく、Ｃ末端側にあってもよい。
【００１９】
本発明に係る細胞殺傷剤は、異常増殖に起因する疾患の治療剤として有効であり、特に癌や子宮内膜症の治療剤として好ましい。本発明に係る細胞殺傷剤の治療対象となる癌の種類は、特に限定されるものではなく、例えば、子宮癌、子宮頸癌、骨盤腔癌、卵巣癌、乳癌、腹壁腫瘍、大網腫瘍、食道癌、胃癌、小腸癌、結腸癌、直腸癌、盲腸癌、胆嚢癌、膵臓癌、肝臓癌、脾臓癌、腎臓癌、舌癌、咽頭癌、鼻癌、耳下腺癌、甲状腺癌、悪性リンパ腫、骨腫瘍、皮膚癌、肺癌、縦隔癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、脳腫瘍等が挙げられる。また、原発癌であってもよく、転移性癌であってもよい。
【００２０】
後記実施例に示すように、本発明に係る細胞殺傷剤は、異常増殖を起こしている細胞に対して優先的に、かつ非常に効率よくアポトーシスを誘導できる。この理由は明らかではないが、以下の通り推察される。異常増殖を起こしている細胞は、一般的に、細胞自体の活性が高く、エンドサイトーシスによる外部からの各種物質の取り込み活性も高い。このため、生体内に投与された本発明に係る細胞殺傷剤は、正常細胞よりも異常増殖を起こしている細胞に優先的に取り込まれ、アポトーシスを誘導すると考えられる。
【００２１】
本発明に係る細胞殺傷剤を医薬として使用する場合、投与経路は特に限定されるものではなく、標的細胞及びそれを含む組織に応じて適宜決定される。例えば、本発明に係る細胞殺傷剤の投与経路としては、経口投与、経静脈投与、腹腔内投与、注腸投与等が挙げられる。
【００２２】
異常増殖に起因する疾患の治療は、細胞の異常増殖に起因する疾患を発症している動物に対して、本発明に係る細胞殺傷剤を有効量投与することにより行うことができる。当該細胞殺傷剤の有効量は、投与された動物に対し、投与されていない場合に比べて動物体内の標的細胞（異常増殖を起こしている細胞）の量を低減させられる量であればよく、当該細胞殺傷剤により重篤な副作用が生じない量であることが好ましい。当該細胞殺傷剤の有効量は、標的細胞の種類、投与対象の動物の種類、投与方法等を考慮して実験的に求めることができる。例えば、癌等の細胞の異常増殖に起因する疾患を発症している動物に対して投与した場合に、当該動物の体内の異常増殖を起こしている細胞の量を、投与していない動物と比べて、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７５％以下、よりさらに好ましくは５０％以下にできる量を、有効量と規定することもできる。
【００２３】
本発明に係る細胞殺傷剤は、通常の方法によって、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、チュアブル剤、徐放剤などの経口用固形剤、溶液剤、シロップ剤などの経口用液剤、注射剤、注腸剤、スプレー剤、貼付剤、軟膏剤などに製剤化することができる。
【００２４】
本発明に係る細胞殺傷剤は、製剤上の必要に応じて、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、流動化剤、溶剤、溶解補助剤、緩衝剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤等を配合して製剤化される。 
【００２５】
賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトールなどの糖類、デンプン、結晶セルロースなどのセルロース類、エリスリトール、ソルビトール、キシリトールなどの糖アルコール類、リン酸二カルシウム、炭酸カルシウム、カオリンなどが挙げられる。結合剤としては、α化デンプン、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、Ｄ−マンニトール、トレハロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。滑沢剤としては、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、タルク、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊剤としては、クロスポビドン（架橋ポリビニルピロリドン）、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウムなどが挙げられる。流動化剤としては、ケイ酸、無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム化合物、酸化アルミニウム、水酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウムなどが挙げられる。溶剤としては、精製水、生理的食塩水などが挙げられる。溶解補助剤としては、デキストラン、ポリビニルピロリドン、安息香酸ナトリウム、エチレンジアミン、サリチル酸アミド、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体などが挙げられる。緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム水和物、酢酸ナトリウム水和物、炭酸水素ナトリウム、トロメタモール、ホウ酸、ホウ砂、リン酸水素ナトリウム水和物、リン酸二水素ナトリウムなどが挙げられる。懸濁化剤あるいは乳化剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、アラビアゴム、ゼラチン、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。等張化剤としては、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトールなどの糖類、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、尿素などが挙げられる。安定化剤としては、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどが挙げられる。防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、クロロクレゾール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。抗酸化剤としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。矯味矯臭剤としては、医薬及び食品分野において通常に使用される甘味料、香料などが挙げられる。着色剤としては、医薬及び食品分野において通常に使用される着色料が挙げられる。
【００２６】
本発明に係る細胞殺傷剤は、そのまま使用してもよく、その他の成分も含む医薬用組成物として使用することもできる。当該医薬用組成物に含まれるその他の成分としては、例えば、前記の賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、流動化剤、溶剤、溶解補助剤、緩衝剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤等が挙げられる。また、当該医薬用組成物は、本発明に係る細胞殺傷剤以外の他の有効成分を含有していてもよい。
【００２７】
本発明に係る細胞殺傷剤は、哺乳動物に投与されるものであることが好ましく、ヒトや、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、サル、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、ロバ、イヌ、ネコ等の家畜や実験動物に投与されるものであることがより好ましく、ヒトに投与されるものであることがさらに好ましい。
【実施例】
【００２８】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００２９】
以下の実験で用いた子宮内膜症モデル細胞及び子宮内膜症モデルマウスは、下記の通りにして作製した。【００３０】
＜子宮内膜症モデル細胞（A431-CNGB3-myc細胞）＞
A431細胞（ヒト上皮様細胞癌由来細胞株）に、Ｃ末端にｍｙｃタグを融合させたヒトＣＮＧＢ３をコードする遺伝子を導入して強制発現させた形質転換細胞（A431-CNGB3-myc細胞）を、子宮内膜症モデル細胞として調製した。【００３１】
A431-CNGB3-myc細胞の培養は、DMEM High Glucose培地（GIBCO社製）に１０％の非働化ＦＢＳ（ウシ胎児血清、Corning社製）と１％のpenicillin-streptomycin（Invitrogen社製）を含有させた培地を培養培地として、３７℃、５容量％二酸化炭素環境下で行った。継代は２〜３日ごとに行った。【００３２】
＜子宮内膜症モデルマウス＞
免疫不全マウス（NOD/ShiJic-scid Jcl系統、日本クレア社より供給）の腹腔に、A431-CNGB3-myc細胞を移植して、子宮内膜症モデルマウスを作製した。
具体的には、凍結保存してあるA431-CNGB3-myc細胞を解凍した後、１０ｃｍディッシュ（Lot No. F3BAXQ103：Thermo Fisher Scientific社製）を用いて２回継代した。この細胞を１×１０６cells／０．５ｍＬ／bodyとなるように培養培地を加えて調製した細胞液を、投与液とした。この投与液を、調製後可及的速やかに、７週齢の雌の免疫不全マウスに腹腔内投与することにより、A431-CNGB3-myc細胞を移植した。【００３３】
なお、マウスは、ポリカーボネートケージ（W×D×H＝270×440×187（mm））内で５〜１０匹／ケージを、１９．８〜２７．１℃、湿度３２〜７５％、１２時間照明の環境下で飼育した。飼料（滅菌済CRF-１（固型）、オリエンタル酵母工業社製）と飲料水（滅菌済水道水）は自由摂取させた。【００３４】
モデル作製の確認は、腹膜腫瘤の観察及び採材によって行った。A431-CNGB3-myc細胞移植から１〜３週間後に、各週２匹ずつに対して剖検を行い、腹膜に腫瘤（１ｍｍ程度の粒状）が認められるかを目視で確認し、写真撮影を行った。その後、腹膜を採材し、４カ所（腹部・背部の各左右）を切り出して、それぞれ１０％中性緩衝ホルマリンに浸漬して固定し、冷蔵保存した。ホルマリン固定後の腹膜に対して、抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いて免疫組織化学染色し、播種の状態を調べた。【００３５】
A431-CNGB3-myc細胞移植後のマウスの目視確認の結果、１回目の実験では、移植から１週間後では、目視で腫瘤が確認されたものの、腹膜播種は見られなかったが、移植から２又は３週間後には、目視で腫瘤及び腹膜播種が確認された。２回目の実験では、移植から１週間後でも、目視で腹膜播種が確認された。また、移植後マウスの腹膜組織片のｃ−ｍｙｃ染色の結果、移植から１週間後には既に腹膜播種していることが確認された。【００３６】
＜ルシフェラーゼ遺伝子導入卵巣癌担癌皮下腫瘍マウス（OVCAR3-Lucマウス）＞
マウスに移植する腫瘍組織は、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した卵巣癌細胞株（OVCAR3-Luc細胞、他施設より移譲）を培養したものを用いた。OVCAR3-Luc 細胞の培養は、RPMI medium 1640（11875-093：Gibco社製）に１０％の非働化ＦＢＳ（Corning社製）を含有させた培地を培養培地として、３７℃、５容量％二酸化炭素環境下で行った。継代は２〜３日ごとに行った。【００３７】
OVCAR3-Luc細胞株をトリプシン処理にて剥離し、５×１０５cells／１００μL／body となるように培養培地を加えて調製した細胞液を投与液とした。この投与液を、調製後可及的速やかに、８〜１０週齢の雌のＳＣＩＤマウスの背部に皮下投与することにより、OVCAR3-Luc細胞を皮下移植した皮下腫瘍モデルマウスを作製した。【００３８】
［実施例１］
細胞増殖能が亢進している２種類の癌細胞（A431-CNGB3-myc細胞とOVCAR3-Luc細胞）に対して、それぞれ、各ペプチドの細胞殺傷活性を調べた。使用したペプチドのアミノ酸配列を表１に示す。表１に記載のペプチドのうち、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドは、全てＤ−アミノ酸から構成された、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。Ｋ１４Ｄペプチドは、全てＤ−アミノ酸から構成されたＫＬＡＫペプチドであり、Ｈ５Ｄペプチドは、全てＤ−アミノ酸から構成されたＨＬＡＨペプチドである。Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄ−Ｚ１３ペプチドは、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５ＤペプチドのＣ末端に、Ｌ−アミノ酸から構成されたＺ１３ペプチドを付加したものである。Ｋ７Ｄ−Ｈ１８Ｄペプチドは、全てＤ−アミノ酸から構成された、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。【００３９】
【表１】
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【００４０】
＜細胞殺傷活性の評価＞
各ペプチドの細胞殺傷活性の評価は、CellTiter-Glo（登録商標）アッセイキット（プロメガ社製）を用いて、各ペプチドで処理した細胞のＡＴＰ量を測定して行った。【００４１】
具体的には、まず、３〜４回継代後のA431-CNGB3-myc細胞又はOVCAR3-Luc細胞を、９６ウェルプレート（Corning/Costar社製、Lot No. 00515003）に、１×１０４cells／wellになるように細胞の濃度を調製して播種した。播種から２日間培養した後、各ウェルに、各ペプチドをそれぞれ、終濃度が０（ペプチド無添加）、２．３４、４．６９、９．３８、１８．８、３７．５、７５．０、１５０．０、又は３００．０μＭになるよう添加し、２４時間培養した。なお、Ｋ１４Ｄペプチドは、Ｈ５Ｄペプチドと組み合わせて、両ペプチドの混合物を各ウェルに添加した。その後、各ウェルから培養上清を除去し、残った細胞にCellTiter-Glo bufferを加えてホモジナイズした後、遠心により上清を回収し、これをライセートとした。このライセートに２倍量のＰＢＳ及びライセートと同量の２×CellTiterGlo Reagentを加えて撹拌したものを反応溶液として調製し、この反応溶液を１０分間室温で静置した。室温静置後の各反応溶液の発光強度（Luminescence）（RLU：RELATIVE LIGHT UNITS）を、Synergy H1 ハイブリッドマルチモードマイクロプレートリーダー（BioTek社製）を用いて測定した。反応溶液の発光強度はＡＴＰ量の指標である。反応溶液の発光強度が小さいほど、ＡＴＰ量が少なく、投与されたペプチドの細胞殺傷活性が強いことを示す。全ての試行はtriplicateで測定し、その平均を各反応溶液の発光強度（RLU）とした。【００４２】
ペプチド無添加の反応溶液の発光強度（RLU）を１００％とした場合の各反応溶液の相対発光強度（％）を相対ＡＴＰ量（％）として算出した。各ペプチドで処理したA431-CNGB3-myc細胞の相対ＡＴＰ量（％）を図１に、各ペプチドで処理したOVCAR3-Luc細胞の相対ＡＴＰ量（％）を図２及び３に、それぞれ示す。図中、「Ｋ１４Ｄ＋Ｈ５Ｄ」は、Ｋ１４ＤペプチドとＨ５Ｄペプチドの両方を添加した反応溶液の相対ＡＴＰ量（％）を示す。【００４３】
図１及び２に示すように、いずれの癌細胞に対しても、Ｋ１４ＤペプチドとＨ５Ｄペプチドの両方を添加した場合には、各ペプチドの添加量が３００μＭであっても、細胞殺傷活性は観察されなかった。これに対して、ＫＬＡＫペプチドとＨＬＡＨペプチドの融合ペプチドであるＫ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチド及びＫ７Ｄ−Ｈ１８Ｄペプチドは、添加量依存的に相対ＡＴＰ量が低下しており、細胞殺傷活性があることが示された。いずれの癌細胞に対しても、Ｋ７Ｄ−Ｈ１８ＤペプチドよりもＫ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドのほうが明らかに細胞殺傷活性は強かった。また、図３に示すように、細胞表面にＣＮＧＢ３を有していないOVCAR3-Luc細胞に対する、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５ＤペプチドとＫ１４Ｄ−Ｈ５Ｄ−Ｚ１３ペプチドの細胞殺傷活性が同程度であった。すなわち、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドにその他のペプチドを連結させたペプチドであっても、エンドサイトーシスによる取り込みが可能な程度の大きさであれば、細胞殺傷活性を有することが確認された。【００４４】
＜ＴＵＮＥＬ染色＞
３００μＭのＫ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドで処理したA431-CNGB3-myc細胞と、ペプチド未処理のA431-CNGB3-myc細胞について、ＴＵＮＥＬ（TdT-mediated dUTP nick end labeling）染色を行った。この結果、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドで処理したA431-CNGB3-myc細胞は、ほぼ全ての細胞の核が褐色に染色されており（ＴＵＮＥＬ陽性）、かつ、ペプチド未処理のA431-CNGB3-myc細胞に比べて明らかに細胞が少なかった。これに対して、ペプチド未処理のA431-CNGB3-myc細胞では、核が褐色に染色された細胞はみつからなかった。これらの結果から、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドは、アポトーシスを誘導し、細胞殺傷効果を示すことが確認された。【００４５】
［実施例２］
子宮内膜症モデルマウスに、実施例１で用いたＫ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドを投与し、子宮内膜細胞に対する細胞殺傷活性を調べた。【００４６】
＜ペプチドの腹腔内への単回投与＞
A431-CNGB3-myc細胞を腹腔内に移植してから７日後の子宮内膜症モデルマウスに対して、イソフルラン麻酔下で、腹腔内に、３７℃に温めた生理的食塩液０．５ｍＬを入れてマッサージした直後に、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドを生理食塩水に溶解させた溶液を腹腔内投与した。Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドは、マウスの体重当たりの投与量が０ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇ（対照）（ｎ＝７）、５ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇ（ｎ＝８）、又は１０ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇ（ｎ＝８）となるように投与した。【００４７】
＜腹膜の採取（採材）＞
Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドを投与した子宮内膜症モデルマウスは、ペプチド投与から２４時間後に、イソフルラン麻酔下で放血死させ、腹膜を採取した。ＡＴＰ測定用腹膜は、液体窒素で凍結後、測定までディープフリーザで保管した。病理標本作製用腹膜は、１０％中性緩衝ホルマリンに浸漬して固定した後、冷蔵で保管した。【００４８】
＜体重の測定＞
各マウスは、A431-CNGB3-myc細胞を腹腔内に移植してから７日後のＫ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチド投与前と放血死させる前に、体重を測定した。【００４９】
Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドのマウスの体重当たりの投与量が０ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇであるマウス群をＧ１群、５ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇであるマウス群をＧ２群、１０ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇであるマウス群をＧ３群とした。各群の測定結果（平均値±標準誤差）を表２に示す。表中、「体重」欄の「７日目」は、A431-CNGB3-myc細胞を腹腔内に移植してから７日後のＫ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチド投与前の体重であり、「８日目」は、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチド投与後２４時間後の体重である。【００５０】
【表２】
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【００５１】
表２に示す通り、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドの投与量依存的に若干体重が低減する傾向が観察されたが、この低減量は小さかった。この結果から、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドの正常細胞への影響は小さく、当該ペプチドが比較的安全に動物に投与できることが示唆された。【００５２】
＜ＡＴＰ量測定＞
ＡＴＰ量測定は、CellTiter-Glo（登録商標）アッセイキット（プロメガ社製）を用いて行った。凍結した腹膜の重量を測定し、凍結組織の１０倍量のCellTiter-Glo bufferを加えてホモジナイズした後、遠心により上清を回収し、これをライセートとした。このライセートに２倍量のＰＢＳ及びライセートと同量の２×CellTiterGlo Reagentを加えて撹拌したものを反応溶液とし、この反応溶液を１０分間室温で静置した。室温静置後の反応溶液の発光強度（RLU）を、Synergy H1 ハイブリッドマルチモードマイクロプレートリーダー（BioTek社製）を用いて測定した。全ての試行はtriplicate（ｎ＝３）で測定し、その平均を各反応溶液の発光強度（RLU）の測定値とした。【００５３】
各群のＡＴＰ量の測定結果（平均値±標準誤差）を図４に示す。投与したＫ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドの量依存的に腹膜の発光強度（RLU）が低下しており、腹膜のＡＴＰ量が低下したことが確認された。腹膜のＡＴＰ量の低下は、腹膜に移植されたA431-CNGB3-myc細胞の生存細胞数の減少を意味する。これらの結果から、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドにより、腹腔内のA431-CNGB3-myc細胞が殺傷されること、すなわち、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドは、生体内環境において細胞殺傷効果を発揮することが確認できた。【００５４】
［実施例３］
OVCAR3-Lucマウスに対して、実施例１で用いたＫ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドを経静脈投与し、癌細胞に対する細胞殺傷活性作用を調べた。【００５５】
＜ペプチドの経尾静脈投与＞
OVCAR3-Luc細胞を皮下移植してから１４日後のOVCAR3-Lucマウスに対して、１日１回、６日間連続して、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドを生理食塩水に溶解させた溶液５０μＬを尾静脈から投与した。Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドは、マウスの体重当たりの投与量が０μｍｏｌ／ｋｇ／ｄａｙ（対照）、又は１．１７μｍｏｌ／ｋｇ／ｄａｙとなるように投与した。【００５６】
＜腫瘍組織の大きさの測定＞  
各マウスに対して発光イメージング検査を行い、背中の腫瘤のｐｈｏｔｏｎ数と腫瘍組織の大きさを経時的に測定した。【００５７】
（１）Ｐｈｏｔｏｎ数の測定
ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光機構を利用し、in vivo発光イメージング装置を用いて測定した。まず、OVCAR3-Lucマウスをイソフルラン吸入麻酔にて沈静化させた後、腹腔内に、１００μＬのＤ−ルシフェリンカリウム溶解液（Ｄ−ルシフェリンカリウム（126-05116：和光純薬工業社製）を終濃度３０ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解させた溶液）を投与した。投与から１５分後に、当該マウスをin vivo発光イメージング装置で測定し、Ｐｈｏｔｏｎ数を計測した。in vivo発光イメージング装置としては、超高感度冷却ＣＣＤカメラによる光定量化in vivoイメージング機器であるIVIS Imaging System（IVIS200：住商ファーマインターナショナル社製）を用いた。【００５８】
（２）腫瘍体積の測定
各OVCAR3-Lucマウスの背部の推定腫瘍体積（ｍｍ３）は、腫瘍の長径と短径から、下記式により求めた。なお、腫瘍の長径（ｍｍ）と短径（ｍｍ）は、ノギスを用いて測定した。【００５９】
［推定腫瘍体積(mm3)］＝［長径(mm)］×［短径(mm)］×［短径(mm)］×１／２【００６０】
図５に、各マウスの背中の腫瘤のｐｈｏｔｏｎ数の増大率（％）の経時的変化を示し、図６に、各マウスの背中の腫瘍体積（ｍｍ３）の増大率（％）の経時的変化を示す。ｐｈｏｔｏｎ数の増大率及び腫瘍体積の増大率はいずれも、ペプチド溶液を投与開始日の前日の値を基準（１００％）とした。図中、「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」は、ペプチド溶液を経静脈投与した処理期間を示す。また、両図中、エラーバーは、標準誤差（ＳＥＭ）を上方片側で示している。図５に示すように、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドを投与したマウスでは、ｐｈｏｔｏｎ数がほとんど増大せず、また、腫瘍体積も、ほとんど増大しなかった。これらの結果から、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドの投与により、生体内の腫瘍組織を殺傷することができ、当該ペプチドは抗癌剤として有用であるといえた。【００６１】
＜生存率の測定＞  
ペプチド投与前日の測定値を比較対象とした場合のＰｈｏｔｏｎ数測定による腫瘍増大が、１０倍又は２０倍に達した場合を安楽死条件として、各マウスの生存率の算出を行った。観察は２０日間行い、生存曲線は、カプランマイヤー法により分析した。【００６２】
腫瘍増大率が１０倍に達した場合を安楽死条件とした生存率の経時的変化を図７に、腫瘍増大率が２０倍に達した場合を安楽死条件とした生存率の経時的変化を図８に、それぞれ示す。図７及び図８に示すように、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドの投与により、OVCAR3-Lucマウスの生存率が大幅に改善しており、Ｋ１４Ｄ−Ｈ５Ｄペプチドに顕著な抗腫瘍効果が認められた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月8日(2019.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有する（ただし、前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのＣ末端がアラニンと結合するものを除く）、細胞殺傷剤。
【請求項２】
前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが、
全てＤ−アミノ酸からなるペプチド、
配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１〜１４番目のアミノ酸までがＤ−アミノ酸からなり、１５〜１９番目のアミノ酸までがＬ−アミノ酸からなるペプチド、
配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１〜１４番目のアミノ酸までがＬ−アミノ酸からなり、１５〜１９番目のアミノ酸までがＤ−アミノ酸からなるペプチド、又は
全てＬ−アミノ酸からなるペプチドである、請求項１に記載の細胞殺傷剤。
【請求項３】
細胞の異常増殖に起因する疾患の治療剤である、請求項１又は２に記載の細胞殺傷剤。
【請求項４】
前記疾患が、癌である、請求項３に記載の細胞殺傷剤。
【請求項５】
細胞の異常増殖に起因する疾患を発症している動物に対して、有効量の請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞殺傷剤を投与する工程を有する、細胞の異常増殖に起因する疾患の治療方法。
【国際調査報告】
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