(57)【要約】要約  アルツハイマー病を高精度に検出することを補助する、アルツハイマー病の検出を補助する方法が開示されている。アルツハイマー病の検出を補助する方法は、生体から分離された被検試料中に含まれる、塩基配列が配列番号１〜８５のいずれかで示されるmiRNA等の少なくとも１種の存在量を指標とする。塩基配列が配列番号１〜２２、６６〜７１のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA等の存在量が健常者よりも多いこと、又は塩基配列が配列番号２３〜６５、７２〜８５のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA等の存在量が健常者よりも少ないことが、アルツハイマー病を発症している可能性が大きいことを示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から分離された被検試料中に含まれる、塩基配列が配列番号１、３、１２、２、４〜１１、１３〜８５のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA若しくはMiscRNAの少なくとも１種の存在量を指標とするアルツハイマー病の検出を補助する方法であって、塩基配列が配列番号１〜２２、６６〜７１のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA若しくはMiscRNAの存在量が健常者よりも多いこと、又は塩基配列が配列番号２３〜６５、７２〜８５のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA若しくはMiscRNAの存在量が健常者よりも少ないことが、アルツハイマー病を発症している可能性が大きいことを示す、方法。
【請求項２】
塩基配列が配列番号１、３、１２、２、４〜１１、１３〜６５のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA又はMiscRNAの少なくとも１種の存在量を指標とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
塩基配列が配列番号１、３、１２、２、４〜１１、４６〜６５、８４、８５のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片、LincRNA又はMiscRNAの少なくとも１種の存在量を指標とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
塩基配列が配列番号１、３、１２、２、４〜１１、４６〜６５のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片又はMiscRNAの少なくとも１種の存在量を指標とする請求項２記載の方法。
【請求項５】
塩基配列が配列番号１、３、１２、１１のいずれかで示されるmiRNA、isomiR又はmiRNA前駆体の少なくとも１種の存在量を指標とする請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の検出を補助する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、認知症の過半数を占める代表的な認知症であり、今後の高齢化社会において患者数は益々増えると考えられている。アルツハイマー病は、進行性であり、現在の医学では、完治させたり進行を完全に食い止めることはできないが、進行を遅らせる医薬や療法は存在する。したがって、アルツハイマー病をできるだけ早期に検出することが望まれる。現在、アルツハイマー病の診断は、問診や脳のMRI画像等により行われているが、早期のアルツハイマー病を検出することは容易ではない。【０００３】
早期にアルツハイマー病を検出すべく、血液中のマイクロRNA（以下、「miRNA」）の存在量を指標とする方法が提案されている（特許文献１〜４、非特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2014-132863号公報
【特許文献２】特表2014-520529号公報
【特許文献３】EP 2733219 A1
【特許文献４】WO2016/148073
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Pavan Kumar et al., PLOS ONE, July 2013, Volume 8, Issue 7, e69807, pp.1-10
【非特許文献２】Petra Leindinger et al., Genome Biology 2013, 14:R78
【非特許文献３】Wang-Xia Wang et al., The Journal of Neuroscience, January 30, 2008, 28(5) 1213-1223
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の通り、種々のmiRNAが、アルツハイマー病検出のための指標として提案されているが、より正確にアルツハイマー病を検出することができれば有利であることは言うまでもない。【０００７】
したがって、本発明の目的は、アルツハイマー病を高精度に検出することを補助する、アルツハイマー病の検出を補助する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、アルツハイマー病において存在量が増大又は減少するmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR）、非コードRNA(ncRNA)、転移ＲＮＡ断片(tRF)、LincRNA及びMiscRNAを新たに見出し、これらを指標とすることにより、高精度にアルツハイマー病が可能になることを見出し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
(1)生体から分離された被検試料中に含まれる、塩基配列が配列番号１、３、１２、２、４〜１１、１３〜８５のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA若しくはMiscRNAの少なくとも１種の存在量を指標とするアルツハイマー病の検出を補助する方法であって、塩基配列が配列番号１〜２２、６６〜７１のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA若しくはMiscRNAの存在量が健常者よりも多いこと、又は塩基配列が配列番号２３〜６５、７２〜８５のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA若しくはMiscRNAの存在量が健常者よりも少ないことが、アルツハイマー病を発症している可能性が大きいことを示す、方法。
(2)塩基配列が配列番号１、３、１２、２、４〜１１、１３〜６５のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA又はMiscRNAの少なくとも１種の存在量を指標とする、(1)記載の方法。
(3)塩基配列が配列番号配列番号１、３、１２、２、４〜１１、４６〜６５、８４、８５のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片、LincRNA又はMiscRNAの少なくとも１種の存在量を指標とする(1)記載の方法。
(4)塩基配列が配列番号配列番号１、３、１２、２、４〜１１、４６〜６５のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片又はMiscRNAの少なくとも１種の存在量を指標とする(3)記載の方法。
(5)塩基配列が配列番号１、３、１２、１１のいずれかで示されるmiRNA、isomiR又はmiRNA前駆体の少なくとも１種の存在量を指標とする(1)記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、高精度に、かつ、それでいて簡便にアルツハイマー病を検出することが可能であるので、アルツハイマー病の検出に大いに寄与する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
上記の通り、本発明の方法では、生体から分離された被検試料中に含まれる特定のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA又はMiscRNA（以下、便宜的に「miRNA等」と呼ぶことがある）の存在量を指標とする。これらのmiRNA等（以下、便宜上、例えば「塩基配列が配列番号１で示されるmiRNA等」を単に「配列番号１のmiRNA等」や「配列番号１のもの」と呼ぶことがある）自体は公知であり、その塩基配列は配列表に示すとおりである。本発明の方法に用いるmiRNA等の一覧を下記表１に示す。
【００１２】
【表１−１】
2019117306.tif 000002
【００１３】
【表１−２】
2019117306.tif 000003
【００１４】
【表１−３】
2019117306.tif 000004
【００１５】
【表１−４】
2019117306.tif 000005
【００１６】
下記表２に示されるように、これらのmiRNA等のほとんどは、アルツハイマー病患者の血清中の存在量と、健常者の血清中の存在量との比の対数（底が２の対数で「log FC」（FCは、fold change)と呼ばれる）の絶対値が1.0超のものであり（すなわち、比が２倍以上又は２分の１以下）、統計学的に有意(t検定でp<0.05)のものである。
【００１７】
配列番号１〜２２、６６〜７１のmiRNA等は、アルツハイマー病患者中の存在量が健常者中の存在量よりも多いものであり、配列番号２３〜６５、７２〜８５のmiRNA等は、アルツハイマー病患者中の存在量が健常者中の存在量よりも少ないものである。
【００１８】
これらの中でも、配列番号１、３、１１、１２、２、４〜１０、４６〜６５、８４、８５のmiRNA等は、log FCの絶対値が1.5以上のものであり、特に感度の高い指標となるものであり、好ましい。
【００１９】
バイオマーカーの精度を示す指標としてROC曲線下面積(AUC(Area Under Curve))が用いられており、一般的にAUCが0.7以上のものがバイオマーカーとして有効であると言われている。AUCが0.90以上のものは高精度であり、0.97以上は非常に高精度、0.98以上は極めて高精度、1.00で完璧（偽陽性及び偽陰性が全くない）である。したがって、本発明においても、AUCが0.90のものが好ましく、さらに0.97以上のものが好ましく、さらに0.98以上のものが好ましく、さらに0.99以上のものが最も好ましい。配列番号１、３、１１、１２のmiRNA等がAUC 0.97以上で好ましく、これらのうち、配列番号１、３のmiRNA等がAUC0.98以上でさらに好ましく、配列番号１のmiRNAがAUC 1.00で最も好ましい。
【００２０】
被検試料としては、miRNAを含む体液であれば特に限定されないが、通常、血液試料（血漿、血清及び全血を包含する）が好ましく用いられる。血清又は血漿を被検試料とすることが簡便で好ましい。
【００２１】
各miRNA等の存在量の測定（定量）は、次世代シーケンサーを用いて行うことが好ましい。次世代シーケンサーのように配列を読む機器であれば、機種は限定されない。下記実施例に具体的に記載されるように、本発明の方法では、定量するmiRNA等には、例えば、通常の成熟型miRNAの5'末端及び／又は3'末端からわずか１塩基以上が欠失又は付加されているだけのisomiRを、基本となるmiRNAと区別して定量する必要があるので、精度の観点から、miRNAの定量に広く用いられている定量的逆転写ＰＣＲ(qRT-PCR)よりも次世代シーケンサーを用いて行うことが好ましい。具体的には下記実施例において詳細に記載するが、簡単に述べると、この定量方法は、例えば次のようにしておこなうことができる。血清又は血漿中に存在するRNAが一定である場合、それらを用いた次世代シークエンス解析において読まれたリード数のうち、ヒト由来のシーケンスを100万リード数に換算して、100万リード数当たりのそれぞれのisomiRや成熟型miRNAのリード数を測定値とする。疾患によって健常人に比較して血清中または血漿中のRNAが変化する場合は、血清及び血漿中で存在量の変動が少ないmiRNAを用いる場合がある。なお、血清又は血漿中のmiRNA等を定量する場合には、血清及び血漿中で存在量の変動が少ないmiRNAであるlet-7g-5p、miR-425-3p及びmiR-425-5pから成る群より選ばれる少なくとも１種のmiRNAを内部標準として用いることが好ましい。
【００２２】
判定に用いる、各miRNA等の存在量のカットオフ値としては、各miRNA等について、健常者に対する統計学的有意差(t検定で、p<0.05、好ましくはp<0.01、さらに好ましくはp<0.001)の有無を基準とすることが好ましい。具体的には、好ましくは、例えば、偽陽性率が最良の値（最も低くなる値）なるプロット点におけるlog2リード数（カットオフ値）を各miRNA等について設定することができ、例えば、いくつかの各miRNA等におけるカットオフ値(log2リード数)は表２に示すとおりである。なお、表２に示されるカットオフ値は、単なる例に過ぎず、統計学的有意差が出る限り、他の値をカットオフ値として採用することができる。また、データを採取する患者及び健常者の集団が異なれば、最良のカットオフ値も異なる。もっとも、通常、表２に示されるカットオフ値の±２０％の範囲内、特には±１０％の範囲内でカットオフ値を設定することができる。
【００２３】
また、基本型が同一のmiRNA等であっても、miRNAと各種isomiRとでは、患者と健常者の間で存在量が異なる。したがって、一人の患者における、基本型が同一のmiRNAやisomiRを測定し、その比に基づいてアルツハイマー病の検出を補助することができる。なお、このように、あるmiRNA及びそのisomiRの存在量を測定する場合には、微妙な塩基配列の違いを的確に区別する必要があるため、通常miRNAの定量に用いられている定量的逆転写ＰＣＲ(qRT-PCR)よりも次世代シーケンサーを用いて行うことが好ましい。
【００２４】
なお、上記した各miRNA等は、アルツハイマー病患者と健常者の間でそれぞれ統計学的有意差を持つので、単独で指標として用いることもできるが、複数のmiRNA等を組み合わせて指標としてもよく、その場合にはさらに正確なアルツハイマー病検出の補助が可能になる。
【００２５】
また、アルツハイマー病が疑われるか又はアルツハイマー病に罹患するヒトの被検試料中のmiRNA等の存在量を検出する方法も提供される。すなわち、
アルツハイマー病が疑われるか又はアルツハイマー病に罹患するヒトの被検試料中の塩基配列が配列番号１、３、１１、１２、２、４〜１０、１３〜８５のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA若しくはMiscRNAの少なくとも１種の存在量を検出する方法であって、
ヒトから血液試料を得る工程、及び
次世代シーケンサーまたはqRT-PCRを用いて、前記血液試料内のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA若しくはMiscRNAの存在量を測定する工程を含み、
ここで、塩基配列が配列番号１〜２２、６６〜７１のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA若しくはMiscRNAの存在量が健常者よりも多い、又は塩基配列が配列番号２３〜６５、７２〜８５のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA若しくはMiscRNAの存在量が健常者よりも少ない、方法、も提供される。
【００２６】
また、上記した本願発明の方法により、アルツハイマー病が検出された場合、アルツハイマー病が検出された患者に有効量のアルツハイマー病治療薬を投与することにより、アルツハイマー病を治療することができる。アルツハイマー病治療薬としては、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、メマンチン等を挙げることができる。
【００２７】
以下、本発明を実施例及び比較例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１〜８５
１．  材料及び方法
(1)  臨床検体
アルツハイマー病患者４３例、健常者３２例の血漿を用いた。
【００２９】
(2)  血清中のＲＮＡの抽出
血清中 RNA の抽出は、miRNeasy Mini kit (QIAGEN) を用いて行った。
1) 凍結した血清サンプルを融解し、10000 rpm で 5 分間、室温で遠心し、凝集タンパク質や血球成分を沈殿させた。
2) 上清 200 μＬ を新しい 1.5 mL チューブ に移した。
3) 1000 μＬ の QIAzol Lysis Reagent を加えて十分に混和し、タンパク質成分を変性した。
4) RNA 抽出のコントロール RNA として 0.05 nM cel-miR-39 を 10 μＬ 加え、ピペッティングで混和した後、室温で 5 分間静置した。
5) 水層と有機溶媒層の分離促進のため、200μＬのクロロホルムを加え、十分に混和し、室温で 3 分間静置した。
6) 12000 xg、15分間、4℃で遠心し、上層の水層650μＬを新しい2mLチューブ に移した。
7) RNA を析出させるため、975μＬの 100% エタノールを加え、ピペッティングで混和した。
8) 650 μＬ の 7) を miRNeasy Mini spin column (以下、カラム) に移し、室温で 1 分間静置後、8000 xg、15 秒間、室温で遠心し、RNA をカラムのフィルターに吸着させた。カラムから通過した溶液は廃棄した。
9) 7) の溶液を全てカラムに通すまで 8) を繰り返し、全ての RNA をフィルターに吸着させた。
10) フィルターに付着した夾雑物の除去のため、650 μＬ の Buffer RWT をカラムに加え、 8000 xg、15 秒間、室温で遠心した。 カラムから通過した溶液は廃棄した。
11) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μＬ のBuffer RPE をカラムに加え、8000 xg、15 秒間、室温で遠心した。カラムから通過した溶液は廃棄した。
12) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μＬ のBuffer RPE をカラムに加え、8000 xg、2 分間、室温で遠心した。 カラムから通過した溶液は廃棄した。
13) フィルターに付着している溶液を完全に除去するため、カラムを新しい 2 mL collection チューブ に移し、10000 xg、1 分間、室温で遠心した。
14) カラムを 1.5 mL チューブ に移し、50 μＬ の RNase-free water を加え、室温で 1 分間静置した。
15) 8000 xg、1 分間、室温で遠心し、フィルターに吸着した RNA を溶出した。溶出した RNAは、そのまま次の実験に用い、残りは -80 ℃ で保存した。
【００３０】
(4)  miRNA等の定量
miRNA等の定量は、次のようにして行った。二群等でmiRNA等の定量を行う場合は、同様の方法で回収した細胞外小胞(エクソソームを含む)を用いて同様の方法でRNAを精製してcDNAライブラリーを作成して次世代シークエンス解析を行った。なお、次世代シークエンス解析は、配列を読む機器であれば機器は限定されない。
【００３１】
２．  結果
結果を表２に示す。
【００３２】
【表２−１】
2019117306.tif 000006
【００３３】
【表２−２】
2019117306.tif 000007
【００３４】
【表２−３】
2019117306.tif 000008
【００３５】
【表２−４】
2019117306.tif 000009
【００３６】
【表２−５】
2019117306.tif 000010
【００３７】
これらの結果からわかるように、これらの配列のうち、配列番号１〜２２、６６〜７１のmiRNA等はアルツハイマー病患者中の存在量が健常者中の存在量よりも有意に多く、配列番号２３〜６５、７２〜８５のmiRNA等は、アルツハイマー病患者中の存在量が健常者中の存在量よりも有意に少なかった。また、実施例１〜８５のt検定によるp値はいずれも0.05未満であり、アルツハイマー病の検出に有効であることが示された。
【配列表】
2019117306000001.app
【国際調査報告】
2019117306.tif 000011
2019117306.tif 000012
2019117306.tif 000013
2019117306.tif 000014
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