(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌発現ＳＧＰ２８タンパク質の存在を検出する方法であって、個体由来の試験組織サンプル中の細胞により発現されるＳＧＰ２８タンパク質のレベルを決定する工程、およびこのように決定された該レベルを、対応する正常サンプル中の発現されるＳＧＰ２８のレベルと比較する工程を包含し、該正常サンプルに対して増加した該試験サンプル中のＳＧＰ２８タンパク質の存在が、該個体におけるこのような癌の存在を示す、方法。
【請求項２】
前記細胞により発現されるＳＧＰ２８タンパク質のレベルを決定する工程が、該細胞を、ＳＧＰ２８タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させることを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が、ポリクローナル抗体を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＳＧＰ２８遺伝子産物をモニタリングする方法であって、個体由来の試験組織サンプル中の細胞により発現されるＳＧＰ２８遺伝子産物の状態を決定する工程、およびこのように決定された該状態を、対応する正常サンプル中のＳＧＰ２８遺伝子産物の状態と比較する工程を包含し、該正常サンプルに対して該試験サンプル中のＳＧＰ２８遺伝子産物の変更された状態の存在が、該個体内の細胞成長の調節不全を示す、方法。
【請求項６】
調節不全細胞成長の形跡について生物学的サンプルを試験する方法であって、該生物学的サンプル中のＳＧＰ２８の状態を、対応する正常サンプル中のＳＧＰ２８の状態と比較する工程を包含し、ここで該生物学的サンプルにおけるＳＧＰ２８の状態の変更が、調節不全細胞成長と関連する、方法。
【請求項７】
前記生物学的サンプル中のＳＧＰ２８の状態が、ＳＧＰ２８ｍＲＮＡ発現のレベルまたはＳＧＰ２８タンパク質発現のレベルを試験することにより評価される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＳＧＰ２８の状態における変更が、ＳＧＰ２８発現細胞が通常存在しない組織由来の生物学的サンプル中の該ＳＧＰ２８発現細胞の存在により同定される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
個体における癌の存在を診断するためのキットであって、該個体から得られた試験サンプル中で発現されたＳＧＰ２８ｍＲＮＡのレベルを決定するための手段を備え、ここで、このように決定された該レベルは、比較可能な既知の正常組織サンプル中で発現されたＳＧＰ２８ｍＲＮＡのレベルと比較され、該正常組織サンプルに対して該試験サンプル中の増加したＳＧＰ２８ｍＲＮＡ発現の存在が、該癌の存在を示す、キット。
【請求項１０】
個体における癌の存在を診断するためのキットであって、該個体から得られた試験サンプル中で発現されたＳＧＰ２８タンパク質のレベルを決定するための手段を備え、ここで、このように決定された該レベルは、比較可能な既知の正常組織サンプル中で発現されたＳＧＰ２８タンパク質のレベルと比較され、該正常組織サンプルに対して該試験サンプル中の増加したＳＧＰ２８タンパク質の存在が、該癌の存在を示す、キット。
【請求項１１】
前記癌が、前立腺癌または結腸癌であり、そして前記試験組織サンプルおよび前記正常組織サンプルが、前立腺組織、結腸組織、リンパ組織、血清、血液または精液からなる群から選択される、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記試験サンプル中で発現されたＳＧＰ２８タンパク質のレベルを決定するための手段が、該サンプルを、ＳＧＰ２８タンパク質に特異的に結合する抗体である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
前記抗体が、ポリクローナル抗体を含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、米国特許仮出願第６０／１６２，６１０号（１９９９年１０月２８日出願）（本明細書においてその全体の内容が参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本明細書に記載される本発明は、癌（前立腺癌を含む）の診断および治療のための方法および組成物に関し、ヒトＳＧＰ２８／ＣＲＩＳＰ−３に対応するかまたはヒトＳＧＰ２８／ＣＲＩＳＰ−３と反応性である、単離されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および関連分子を利用する。
【０００３】
（発明の背景）
癌は、冠状動脈の疾患に次ぐ、ヒトの第２の死亡原因である。世界中で、数百万人が、毎年癌で死亡している。米国のみで、癌は、毎年５０万をゆうに越えるヒトの死亡原因であり、１４０万人が毎年新たに診断されている。心臓疾患による死亡は有意に減少しているが、一般的には癌による死亡は増大している。２１世紀の始めには、癌は第１の死亡原因になると予想される。
【０００４】
世界中で、いくつかの癌は、主だった死亡原因として突出している。特に、肺、前立腺、乳房、結腸、膵臓、および卵巣の癌腫は、癌による死亡の主な原因を代表する。これらおよび実質的に全ての他の癌腫は、共通する致死的な特徴を共有する。ごくわずかな例外をともなうが、癌腫による転移性の疾患は致命的である。さらに、当初は生存している初期の癌腫を有するこのような癌の患者についてもなお、共通する経験は、彼らの生存性が劇的に変更されることを示した。多くの癌患者は、再発の可能性または処置の失敗の自覚による強烈な不安を経験する。多くの癌患者は、処置後の身体の衰弱を経験する。多くの癌患者は、再発を経験する。
【０００５】
世界中で、前立腺癌は、男性における４番目の最も一般的な癌である。北アメリカおよび北ヨーロッパでは、これは、最も一般的な男性の癌であり、そして男性の癌による死亡の第２の原因である。米国のみで、４０，０００人をゆうに超える男性が、唯一肺癌に次いで、毎年この疾患によって死亡する。これらの数の多さにもかかわらず、転移性の前立腺癌についての有効な処置はなお存在していない。外科手術による前立腺切除、放射線治療、ホルモン離解治療、および化学療法が、主な処置の形態でありつづけている。残念なことに、これらの処置は多くについては不十分であり、そしてしばしば、所望されない結果を付随する。
【０００６】
診断の最前線においては、初期段階の局在化した腫瘍を正確に検出し得る前立腺の腫瘍マーカーが存在していないことが、この疾患の管理における有意な限界を残している。血清のＰＳＡアッセイが非常に有用なツールであるが、その特異性および一般的な有用性は、いくつかの重要な点を欠いていると広範に認識されている。
【０００７】
前立腺癌のさらなる特異的なマーカーを同定することにおける進歩は、マウスにおける疾患の種々の段階を要約し得る前立腺癌の異種移植片の作成によって改善されている。ＬＡＰＣ（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ）異種移植片は、重篤な複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス中の生存した継代を有する前立腺癌の異種移植片であり、そしてアンドロゲン依存性からアンドロゲン非依存性への移行および転移性の病巣の発達を含む、疾患の進行を模倣する能力を示した（Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：４０２）。より最近同定された前立腺癌のマーカーとしては、ＰＣＴＡ−１（Ｓｕら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７２５２）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（Ｒｅｉｔｅｒら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１７３５）、およびＳＴＥＡＰ（Ｈｕｂｅｒｔら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１４５２３）が挙げられる。
【０００８】
ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＣＴＡ、およびＰＳＣＡのような以前に同定されたマーカーが前立腺癌の診断および処置についての努力を促進したが、診断および治療をさらに改善するための、前立腺癌および関連する癌についてのさらなるマーカーおよび治療標的の同定が必要とされている。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、前立腺癌の診断および治療のための方法および組成物に関する。本発明の方法は、ヒトＳＧＰ２８に対応する単離されたポリヌクレオチド、ＳＧＰ２８遺伝子によりコードされるタンパク質およびそのフラグメント、ならびにＳＧＰ２８タンパク質を特異的に認識しかつ特異的に結合し得る抗体を利用する。本発明の方法は、部分的に、ＳＧＰ２８に同一でありかつヒト前立腺癌において高度に過剰発現される遺伝子の分子クローニングに基づく。本発明はさらに、免疫組織化学により決定される場合に、非常に高レベルのＳＧＰ２８タンパク質が、癌性前立腺の管腔ならびにＰＩＮ、非浸潤的前癌性前立腺病変、および骨転移およびリンパ節転移において発現されてそして分泌されるという発見に基づく。本明細書中に開示されるＳＧＰ２８の発現プロファイルは、ＳＧＰ２８が前立腺癌についての有用な診断マーカーおよび／または治療標的を提供するということを示す。さらに、ＳＧＰ２８のＰＩＮにおける発現は、それが前立腺癌の初期診断のためのマーカーであり得る（現在ＰＳＡを使用して利用可能なマーカーを超える改善が多く必要とされる）ことを示唆する。個々の臨床切片におけるＳＧＰ２８の発現パターンは、ＳＧＰ２８を使用して、別の処置様式に対してある処置様式により応答性である個々の患者を同定し得るということを示唆する。さらに、ＳＧＰ２８は、前立腺癌治療レジメンの有効性をモニタリングするための代理マーカーとして作用し得る。ＳＧＰ２８分子は、そのリンパ節および骨転移における発現に起因して、インビボ画像化方法における使用のための特に魅力的なマーカーを提供する。
【００１０】
ＳＧＰ２８ｍＲＮＡ発現は、前立腺および卵巣に限られ、そして前立腺腫瘍において顕著に上方調節される。ｍＲＮＡ検出方法およびタンパク質検出方法の両方を使用して、対応する正常前立腺／進行した前立腺癌の患者由来の腫瘍サンプルにおけるＳＧＰ２８の発現は、腫瘍組織における高度に上方調節された発現を示し、このことは、ＳＧＰ２８ｓが、前立腺癌検出のための有用なマーカーであることを示唆する。
【００１１】
ＳＧＰ２８は、細胞外可溶タンパク質であり、２９ｋＤａの推定分子量および８．０８のｐＩを有する。ＳＧＰ２８は、アミノ酸残基３２と３３との間で切断されるシグナルペプチドを有し、そして２つの細胞外タンパク質ＳＣＰモチーフ（プロサイト（ｐｒｏｓｉｔｅ）ドメインＰＤＯＣ００７７２）を含み、これら２つのうちの１つは、アミノ酸１５０〜１６０、もう１つはアミノ酸１７０〜１８２（両方とも配列番号３）にある。このタンパク質は、ディフェンシンタンパク質（特に、β−ディフェンシン）に強い相同性を有し、これらは、主に上皮細胞により産生される分泌産物である（Ｏ−Ｎｅｉｌら，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：  ６７１８−２４；Ｓｃｈｒｏｄｅｒら，１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，３１：６４５−５１）。ディフェンシンとして、ＳＧＰ２８タンパク質は、腫瘍細胞死を誘導する能力を有し得、そして／または化学誘導物質として作用し得る。ＳＧＰ２８はまた、細胞結合および／または細胞成長の誘導において役割を有し得る。
【００１２】
ＳＧＰ２８を発現する前立腺癌および他の癌の処置への多数の有効なアプローチが本明細書中に記載される。このタンパク質の細胞外および可溶性の性質は、ＳＧＰ２８およびその機能を標的にする分子、ならびにＳＧＰ２８と相互作用する他のタンパク質、因子およびリガンドを標的とする分子を使用する多数の治療的アプローチを提示する。これらの治療的アプローチとしては、抗ＳＧＰ２８抗体を用いる抗体治療、低分子治療、およびワクチン治療が挙げられる。さらに、前立腺癌において上方調節発現されるとすると、ＳＧＰ２８は、前立腺癌についての診断マーカー、病期判定（ｓｔａｇｉｎｇ）マーカーおよび／または予後判定マーカーとして有用であり、そして同様に、このタンパク質を発現するほかの癌についてのマーカーであり得る。
【００１３】
本発明は、本明細書中に記載されるようなＳＧＰ２８遺伝子の全てまたは一部に対応するかまたは相補的なポリヌクレオチド、ｍＲＮＡ、および／またはコード配列を、好ましくは単離された形態で提供し、これらとしては、ＳＧＰ２８タンパク質およびそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、および関連分子、ＳＧＰ２８遺伝子またはｍＲＮＡ配列もしくはその部分に相補的なポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、ならびにＳＧＰ２８遺伝子、ｍＲＮＡにかもしくはＳＧＰ２８コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドが挙げられる。ｃＤＮＡおよびＳＧＰ２８をコードする遺伝子を単離するための手段もまた提供される。ＳＧＰ２８ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子、このような分子で形質転換または形質導入された細胞、およびＳＧＰ２８遺伝子産物の発現のための宿主ベクター系もまた提供される。
【００１４】
本発明はさらに、ＳＧＰ２８タンパク質およびそのポリペプチドフラグメント、ならびにＳＧＰ２８タンパク質およびそのポリペプチドフラグメントに結合する抗体を提供する。本発明の抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、マウス抗体および他の哺乳動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体、検出可能なマーカーで標識される抗体、放射性核種に結合体化される抗体、トキシン、または他の治療的組成物が含まれる。
【００１５】
本発明はさらに、種々の生物学的サンプル中のＳＧＰ２８ポリヌクレオチドおよびタンパク質の存在を検出するための方法、ならびにＳＧＰ２８を発現する細胞を同定するための方法を提供する。本発明はさらに、種々の治療的組成物および治療ストラテジーを提供し、これらとしては、具体的には前立腺の癌を処置するための、抗体、ワクチンおよび低分子治療が含まれる。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、前立腺癌の診断および治療のための方法および組成物に関し、これらは、ヒトＳＧＰ２８遺伝子に対応する単離されたポリヌクレオチド、ＳＧＰ２８遺伝子によりコードされるタンパク質およびそのフラグメント、ならびにＳＧＰ２８タンパク質を特異的に認識し得るかまたは特異的に結合し得る抗体を利用する。本発明は、部分的に、抑制サブトラクティブ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）ハイブリダイゼーションクローニングによるＳＧＰ２８遺伝子に対応するｃＤＮＡフラグメントの単離に基づく。このｃＤＮＡ（３６Ｐ１Ｇ３と称する）を配列決定し、そして主要な公共のデータベースで公知の遺伝子およびＥＳＴに対する相同性について分析した。３６Ｐ１Ｇ３ｃＤＮＡは、ヒＳＧＰ２８遺伝子の報告された配列の一部に同一性を示した。次いで３６Ｐ１Ｇ３に対応する遺伝子を特異的に増幅するように設計されたプライマーを使用して、前立腺癌異種移植片、正常前立腺、および種々の他の正常組織におけるＳＧＰ２８の発現を特徴付けた。ＳＧＰ２８のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、報告されていた（Ｋｊｅｌｄｓｅｎら，１９９６，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８０：２４６−２５０；Ｋｒａｔｚｓｃｈｍａｒら，１９９６，ＥｕｒＪ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３６（３）：８２７−３６）。
【００１７】
ＳＧＰ２８の発現プロフィールは、これが前立腺癌の理想的な診断マーカーおよび治療マーカーを表し得ることを示唆する。ノーザンブロット発現分析によって決定される場合、正常組織におけるＳＧＰ２８ｍＲＮＡの発現は、前立腺、精巣および卵巣に高度に制限される（図１Ａ〜Ｂ）。非常に低いレベルの発現が膵臓において検出可能であった（図１Ａ）。興味深いことに、前立腺および卵巣は、２．４ｋｂの転写物を示すが、一方精巣は、１．６ｋｂのメッセージを発現する（この１．６ｋｂのメッセージは、別のＳＧＰ２８ファミリーメンバーを示し得る）。さらに、ＳＧＰ２８ｍＲＮＡ発現は、進行した転移期疾患由来の前立腺癌異種移植片において高度に上方調節される（図１Ｃ）。さらに、ＳＧＰ２８タンパク質は、高レベルでこれらの同じ前立腺癌異種移植片ならびに前立腺癌臨床切片において発現される（図２）。対応する正常／癌性前立腺癌臨床切片において、正常に比較してＳＧＰ２８タンパク質の高レベルの過剰発現が検出され、これは、ＳＧＰ２８が前立腺癌についての優秀な診断マーカーおよび／または治療標的を提供するということを示す。免疫組織化学的分析は、ＳＧＰ２８タンパク質が、癌性前立腺および前癌前立腺の管腔内ならびに転移性疾患において高レベルで発現および分泌されることを確立した。ＰＳＡと同様に、ＳＧＰ２８は、管腔内に分泌され、そして正常な構造が妨害される組織における血清に浸入する。
【００１８】
そうでないと規定されない限り、本明細書に使用される当該分野の全ての用語、表記法、およびその他の科学的用語法は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合には、一般的に理解される意味を有する用語は、明確さおよび／または容易な参照のために本明細書において定義され、そしてそのような定義を本明細書に含ませることは、当該分野で一般に理解されるものに対する実質的な差異を表すものと必ずしも解釈されるべきではない。本明細書において記載されそして参照される技術および手順は、一般に、十分に理解されており、そして当業者によって従来の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載される広汎に利用される分子クローニング法）を使用して一般に利用される。適切であれば、市販されるキットおよび試薬の使用を含む手順は、そうでないと注記されない限り、一般に、製造業者によって規定されるプロトコルおよび／またはパラメータに従って行われる。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「進行した前立腺癌」、「局所的に進行した前立腺癌」、「進行した疾患」、および「局所的に進行した疾患」は、前立腺嚢（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｐｓｕｌｅ）を通して拡張した前立腺癌を意味し、そしてアメリカ泌尿器科協会（ＡＵＡ）システムにおけるＣ段階の疾患、Ｗｈｉｔｍｏｒｅ−ＪｅｗｅｔｔシステムにおいてＣ１−Ｃ２段階の疾患、およびＴＮＭ（腫瘍、結節、転移）システムにおいてＴ３−Ｔ４段階およびＮ＋の疾患を含むことを意味する。一般に、外科は、局所的に進行した疾患を有する患者にとって推奨されておらず、そしてこれらの患者は、臨床的に局在化した（器官に限定された）前立腺癌を有する患者と比較して実質的により有利でない結果を有する。局所的に進行した疾患は、前立腺の側縁を超えての硬化または前立腺の基底部を超えての非対称もしくは効果の触診可能な証拠によって臨床的に同定される。局所的に進行した前立腺癌は、腫瘍が前立腺嚢を侵襲または貫通し、外科的余地に拡張するか、または精嚢を侵襲した場合、現在、過激な前立腺削除後に病理学的に診断される。
【００２０】
本発明において使用される場合、用語「転移性前立腺癌」および「転移性疾患」は、領域性のリンパ節または離れた部位に広がっている前立腺癌を意味し、そしてＡＵＡシステム下でのＤ段階の疾患およびＴＮＭシステム下でのＴｘＮｘＭ＋段階を含むことを意味する。局所的に進行した前立腺癌の場合と同様に、外科手術は、一般的に、転移性疾患を有する患者のために指示されておらず、そして体液性（アンドロゲン切除）治療は、好ましい処置態様である。転移性の前立腺癌を有する患者は、最終的には、処置の開始後１２〜１８ヶ月内にアンドロゲン抵抗性の状態を発症し、そしてこれらの患者の約半分がその後６ヶ月以内に死亡する。前立腺癌転移についての最も一般的な部位は、骨である。前立腺癌の骨転移は、全てを考慮して、特徴的には、溶骨性であるというよりむしろ造骨細胞的である（正味の骨形成を生じる）。骨転移は、脊椎において最も頻繁に見出され、続いて大腿、骨盤、胸郭、頭蓋骨、および上腕骨である。転移についての他の一般的な部位には、リンパ節、肺、肝臓、および脳が含まれる。転移性前立腺癌は、代表的には、オープンまたは腹腔鏡検査胎盤リンパ節切除、全身放射核種スキャン、骨格ラジオグラフィー、および／または骨病変生検によって診断される。
【００２１】
本明細書において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれかまたはいずれかの型のヌクレオチドの改変された形態の、少なくとも１０塩基または塩基対長のヌクレオチドのポリマー形態を意味し、そしてＤＮＡの一本鎖および二本鎖の形態を含むことを意味する。
【００２２】
本明細書中で使用される場合は、用語「ポリペプチド」は、少なくとも１０個のアミノ酸のポリマーを意味する。明細書を通じて、アミノ酸についての標準的な３文字または１文字の表記が、使用される。
【００２３】
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドの状況で使用される用語「ハイブリダイズ（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ）」などは、従来のハイブリダイゼーション条件、好ましくは、例えば、５０％ホルミルアミド／６×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ／１００μｇ／ｍｌ  ｓｓＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション（ここで、ハイブリダイゼーションの温度は、３７℃を超え、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおける洗浄についての温度は５５℃を超える）、そして最も好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件をいうことを意味する。
【００２４】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、そして一般的には、プローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存する経験的な計算である。一般的には、より長いプローブは、適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、一方、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般的には、それらの融解温度以下の環境下に相補鎖が存在する場合に、変性させられたＤＮＡが再度アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間での所望される相同性の程度が高ければ高いほど、使用され得る相対的な温度は高くなる。結果として、より高い相対的な温度が、反応条件をよりストリンジェントにし、一方、より低い温度はあまりそうではないという結果になる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９５）を参照のこと。
【００２５】
「ストリンジェントな条件」、または「高ストリンジェントな条件」は、本明細書中で定義される場合は、以下によって同定され得る：（１）洗浄のために低いイオン強度および高温（例えば、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、５０℃）を使用すること；（２）変性剤（例えば、ホルムアミド）をハイブリダイゼーションの間に使用する（例えば、０．１％のウシの血清アルブミンを有する５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを有するｐＨ６．５の５０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液、４２℃）を使用すること；または（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケの精子のＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％のデキストラン硫酸を４２℃で使用し、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で４２℃で、そして５０％のホルムアミド中で５５℃で洗浄し、続いて５５℃でＥＤＴＡを含有している０．１×ＳＳＣから構成される高ストリンジェンシーの洗浄をすること。
【００２６】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９によって記載されたように同定され得、そして洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、および％ＳＤＳ）の使用を含む。これは、上記に記載されたものよりもよりストリンジェントではない。中程度にストリンジェントな条件の例は、以下を含む溶液中での３７℃、一晩のインキュベーションである：２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡ、続いて約３７℃〜５０℃で１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する。当業者は、温度、イオン強度などを、因子（例えば、プローブ長など）を適応させるのに必要なように調整する方法を認識する。
【００２７】
アミノ酸比較の状況において、用語「同一性」は、同一である同じ相対的位置のアミノ酸残基のパーセンテージを表現するために使用される。この状況においてはまた、用語「相同性」は、ＢＬＡＳＴ分析の保存性アミノ酸の判断基準を使用して、当該分野において一般的に理解されるように、同一であるかまたは類似であるかのいずれかである、同じ相対位置でのアミノ酸残基のパーセンテージを表現するために使用される。例えば、同一性％の値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ）によって生成され得る。アミノ酸置換（これは、このような判断基準の下では保存性であると見なされる）に関するさらなる詳細は以下に提供される。
【００２８】
さらなる定義は、以下のサブセクションを通じて提供される。
【００２９】
（ＳＧＰ２８ポリヌクレオチド）
本発明の一つの局面は、ＳＧＰ２８遺伝子、ｍＲＮＡおよび／またはコード配列（好ましくは、ＳＧＰ２８タンパク質およびそのフラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドならびに関連分子をコードするポリヌクレオチド、ＳＧＰ２８遺伝子もしくはｍＲＮＡ配列またはその一部分に相補的な、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびにＳＧＰ２８遺伝子、ｍＲＮＡもしくはＳＧＰ２８をコードするポリヌクレオチド（集合的に、「ＳＧＰ２８ポリヌクレオチド」）にハイブリダイズする、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む単離形態における）のすべてもしくは一部分に対応するか、またはそのすべてもしくは一部分に相補的なポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、ＳＧＰ２８遺伝子およびタンパク質は、本明細書中で具体的に記載されるＳＧＰ２８遺伝子およびタンパク質、ならびに他のＳＧＰ２８タンパク質および前述の構造的に類似の改変体に対応する、遺伝子およびタンパク質を含むことが意味される。このような他のＳＧＰ２８タンパク質および改変体は、一般的に、ＳＧＰ２８コード配列に高度に相同なコード配列を有し、そして好ましくは、少なくとも約５０％のアミノ酸同一性、そして少なくとも約６０％のアミノ酸相同性を共有し（ＢＬＡＳＴ標準を使用して）、より好ましくは、７０％以上の相同性を共有する（ＢＬＡＳＴ標準を使用して）。
【００３０】
ＳＧＰ２８ポリヌクレオチドの１つの実施形態は、表１（配列番号２）に示される配列を有しているＳＧＰ２８ポリヌクレオチドである。ＳＧＰ２８ポリヌクレオチドは、表１（配列番号２）に示されるヒトのＳＧＰ２８のヌクレオチド配列を有しているポリヌクレオチド（ここで、ＴはまたＵでもあり得る）；ＳＧＰ２８タンパク質の全てまたは一部をコードするポリヌクレオチド；上記の配列に相補的である配列；または上記の任意の配列のポリヌクレオチドフラグメントを含み得る。別の実施形態は、ヌクレオチド残基数３〜ヌクレオチド残基数７７６の、表１（配列番号２）に示される配列を有するポリヌクレオチド（ここで、ＴはまたＵであり得る）を含む。
【００３１】
本明細書中で開示される本発明の典型的な実施形態は、タンパク質およびそのフラグメントをコードする配列のような、ＳＧＰ２８  ｍＲＮＡ配列の特異的な部分をコードするＳＧＰ２８ポリヌクレオチドを含む。例えば、本明細書中に開示される本発明の代表的な実施形態は以下を含む：表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質のおよそアミノ酸１からおよそアミノ酸１０をコードするポリヌクレオチド、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質のおよそアミノ酸２０からおよそアミノ酸３０をコードするポリヌクレオチド、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質のおよそアミノ酸３０からおよそアミノ酸４０をコードするポリヌクレオチド、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質のおよそアミノ酸４０からおよそアミノ酸５０をコードするポリヌクレオチド、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質のおよそアミノ酸５０からおよそアミノ酸６０をコードするポリヌクレオチド、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質のおよそアミノ酸６０からおよそアミノ酸７０をコードするポリヌクレオチド、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質のおよそアミノ酸７０からおよそアミノ酸８０をコードするポリヌクレオチド、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質のおよそアミノ酸８０からおよそアミノ酸９０をコードするポリヌクレオチド、および表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質のおよそアミノ酸９０からおよそアミノ酸１００をコードするポリヌクレオチドなど。この概要に従って、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質のアミノ酸１００〜２５８のアミノ酸配列の一部をコードするポリヌクレオチド（少なくとも１０個のアミノ酸）が、本発明の典型的な実施形態である。ＳＧＰ２８タンパク質のより大きな部分をコードするポリヌクレオチドもまた、意図される。例えば、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質のおよそアミノ酸１（または２０、または３０、または４０など）からおよそアミノ酸２０（または３０、または４０、または５０など）までをコードするポリヌクレオチドが、当該分野で周知の種々の技術によって作製され得る。
【００３２】
本明細書中に開示される本発明のさらなる例示的な実施形態として、ＳＧＰ２８タンパク質配列中に含まれる１つ以上の生物学的なモチーフをコードするＳＧＰ２８のポリヌクレオチドフラグメントが挙げられる。１つの実施形態においては、本発明の代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、β−ディフェンシンに対して相同性を示す、ＳＧＰ２８の１つ以上の領域をコードし得る。本発明の１つの実施形態において、代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、１つ以上の細胞外タンパク質ＳＣＰ／Ｔｐｘ−１／Ａｇ５／ＰＲ−１／Ｓｃ７サイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列をコードし得る。本発明のなお別の実施形態においては、代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、１つ以上のＳＧＰ２８選択的スプライシング改変体について特有である配列をコードし得る。
【００３３】
上記の段落のポリヌクレオチドは、多数の異なる特定の使用を有する。ＳＧＰ２８が前立腺癌において過剰発現されることが示されているので、これらのポリヌクレオチドは、正常な組織対癌性組織中でのＳＧＰ２８遺伝子産物の状態を評価する方法において使用され得る。代表的には、ＳＧＰ２８タンパク質の特異的な領域をコードするポリヌクレオチドは、ＳＧＰ２８遺伝子産物の特異的な領域中の混乱状態（例えば、欠失、挿入、点変異など）の存在を評価するために使用され得る。例示的なアッセイとして、ＲＴ−ＰＣＲアッセイおよび一本鎖の立体構造多型性（ＳＳＣＰ）分析（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（８）：３６９−３７８（１９９９）を参照のこと）の両方が挙げられる。これらの両方ともが、タンパク質中のこれらの領域を試験するために、タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドを利用する。単一ヌクレオチドの多型性を検出するために配列を分析するためのアッセイおよび方法もまた、利用可能である（Ｉｒｉｚａｒｒｙら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２６（２）：２２３−２３６）。
【００３４】
本明細書中に開示される本発明の他の特に意図される実施形態は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、リボザイム、およびアンチセンス分子（モルホリノアンチセンス分子を含む）、ならびに別の骨格に基づくかもしくは別の塩基を含有している核酸分子である。これらは、天然の供給源に由来するかまたは合成されるかには関係しない。例えば、アンチセンス分子は、ＲＮＡまたは他の分子であり得る。これらは、ホスホロチオエート誘導体のようなペプチド核酸（ＰＮＡ）または非核酸分子を含み、塩基対依存性の様式でＤＮＡまたはＲＮＡに対して特異的に結合する。当業者は、ＳＧＰ２８ポリヌクレオチドおよび本明細書中に開示されているポリヌクレオチド配列を使用して核酸分子のこれらのクラスを容易に得ることができる。
【００３５】
アンチセンス技術は、細胞内に配置された標的のポリヌクレオチドに結合する外因性のオリゴヌクレオチドの投与を必要とする。用語「アンチセンス」は、このようなオリゴヌクレオチドがそれらの細胞内標的（例えば、ＳＧＰ２８）に対して相補的であるという事実をいう。例えば、ＪａｃｋＣｏｈｅｎ，ＯＬＩＧＯＤＥＯＸＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９；およびＳｙｎｔｈｅｓｉｓ  １：１〜５（１９９８）を参照のこと。本発明のＳＧＰ２８アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｓ−オリゴヌクレオチド（ホスホロチオエート誘導体またはＳ−オリゴ、Ｊａｃｋ  Ｃｏｈｅｎ、前出を参照のこと）のような誘導体を含む。これは、増強された癌細胞の増殖阻害作用を示す。Ｓ−オリゴ（ヌクレオシドホスホロチオエート）は、オリゴヌクレオチド（Ｏ−オリゴ）の等電アナログであり、ここでは、リン酸基の非架橋酸素原子が、イオウ原子で置き換えられている。本発明のＳ−オリゴは、イオウ輸送試薬である、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキサイドでの対応するＯ−オリゴの処理によって調製され得る。Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：４６９３−４６９８（１９９０）；およびＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：１２５３−１２５４（１９９０）を参照のこと。その開示は本明細書中で参考として完全に引用されている。本発明のさらなるＳＧＰ２８アンチセンスオリゴヌクレオチドとして、当該分野で公知のモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる（例えば、Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、１９９６、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ６：１６９−１７５を参照のこと）。
【００３６】
本発明のＳＧＰ２８アンチセンスオリゴヌクレオチドは、代表的には、最初の１００個のＮ末端のコドンまたは最後の１００個のＣ末端のコドンに対して相補的でありそしてそれに対して安定にハイブリダイズするか、あるいはＳＧＰ２８ゲノムまたは対応するｍＲＮＡのＡＴＧ開始部位と重複している、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。完全な相補性は必要ではないが、高い程度の相補性が好ましい。この領域に対して相補的であるオリゴヌクレオチドの使用は、ＳＧＰ２８  ｍＲＮＡに対する選択的なハイブリダイゼーションを可能にし、そしてプロテインキナーゼの他の調節サブユニットを特定するｍＲＮＡに対してはそうではない。好ましくは、本発明のＳＧＰ２８アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＧＰ２８  ｍＲＮＡに対してハイブリダイズする配列を有しているアンチセンスＤＮＡ分子の１５〜３０マーのフラグメントである。必要に応じて、ＳＧＰ２８アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＧＰ２８の最初の１０個のＮ末端のコドンおよび最後の１０個のＣ末端のコドン中の領域に対して相補的である３０マーのオリゴヌクレオチドである。あるいは、アンチセンス分子は、ＳＧＰ２８の発現の阻害においてリボザイムを使用するように改変される。Ｌ．Ａ．Ｃｏｕｔｕｒｅ  ＆  Ｄ．Ｔ．Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １２：５１０−５１５（１９９６）。
【００３７】
本発明のこの局面のさらに特定の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドまたはその任意の特定の部分の特異的な増幅を可能にするプライマーおよびプライマーの対、ならびに本発明の核酸分子またはその任意の部分に対して選択的または特異的にハイブリダイズするプローブを含む。プローブは、検出可能なマーカー（例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、生体発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、または酵素のような）で標識され得る。このようなプローブおよびプライマーは、サンプル中のＳＧＰ２８ポリヌクレオチドの存在を検出するため、およびＳＧＰ２８タンパク質を発現する細胞を検出するための手段として、使用され得る。このようなブローブの例として、表１（配列番号２）に示されるヒトのＳＧＰ２８  ｃＤＮＡ配列の全てまたは一部を含有しているポリペプチドが挙げられる。ＳＧＰ２８  ｍＲＮＡを特異的に増幅し得るプライマーの対の例はまた、以下の実施例に記載される。ＳＧＰ２８  ｍＲＮＡを特異的に増幅し得るプライマーの対の例はまた、以下である：
５’−ＡＧＴＴＧＣＣＴＴＴＣＣＴＡＧＣＴＣＣＡＣＴＣＴ−３’（配列番号４）
５’−ＴＣＣＣＴＴＴＣＣＡＴＡＣＴＣＣＡＣＴＣＴＴＴＧ−３’（配列番号５）。
当業者によって理解されるように、多数の種々のプライマーおよびプローブが、本明細書中に提供される配列に基づいて調製され得、そしてＳＧＰ２８  ｍＲＮＡを増幅および／または検出するために有効に使用され得る。
【００３８】
本明細書中で使用される場合は、ポリヌクレオチドは、それが、ＳＧＰ２８遺伝子以外の遺伝子に対応するかもしくはそれら対して相補的である混入しているポリヌクレオチド、またはＳＧＰ２８遺伝子産物もしくはそのフラグメント以外のポリペプチドをコードする混入しているポリヌクレオチドから、実質的に分離されている場合に、「単離されている」といわれる。当業者は、単離されたＳＧＰ２８ポリヌクレオチドを得るための核酸の単離手順を容易に使用し得る。
【００３９】
本発明のＳＧＰ２８ポリヌクレオチドは、以下を含むがこれらに限定されない種々の目的のために有用である：ＳＧＰ２８遺伝子（単数または複数）、ｍＲＮＡ（単数または複数）、もしくはそれらのフラグメントの、増幅および／または検出のための、プローブおよびプライマーとしてのそれらの使用；前立腺癌および他の癌の診断および／または予後のための試薬としてのそれらの使用；特異的な前立腺細胞中へのカルシウムの侵入を阻害する分子を同定するためのツールとしてのそれらの使用；ＳＧＰ２８ポリペプチドの発現を指向し得るコード配列としてのそれらの使用；ＳＧＰ２８遺伝子（単数または複数）の発現および／またはＳＧＰ２８の転写物（単数または複数）の翻訳を調節または阻害するためのツールとしてのそれらの使用；ならびに治療薬としてのそれらの使用。
【００４０】
（ＳＧＰ２８の分子的特徴および生物学的特徴）
特異顆粒タンパク質２８（ＳＧＰ２８）は、ヒト好中球の特殊顆粒から同定され、ヒト好中球の特異顆粒において発現される分泌分子である（Ｋｊｅｌｄｓｅｎら、１９９６、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８０：２４６−２５０）。ＳＧＰ２８は、システインリッチ分泌タンパク質３（ＣＲＩＳＰ−３）として公知のタンパク質と同一である（Ｋｒａｔｚｓｃｈｍａｒら、１９９６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３６：８２７−３６）。ＳＧＰ２８／ＣＲＩＳＰ−３（本明細書中以後、ＳＧＰ２８と呼ぶ）は、いくつかのＣＲＩＳＰファミリーメンバータンパク質の間で保存される１６システイン残基を含むＣ末端システインリッチ配列を含む２５８アミノ酸の２９ｋＤタンパク質である。ＳＧＰ２８は、ヒト、ゲッ歯類動物、およびウマに存在するシステインリッチ分泌タンパク質のファミリーに属し、このファミリーは、ＣＲＩＳＰ−１（Ｂｒｏｏｋｓら、１９８６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６１：１３−１８；Ｈａｅｎｄｌｅｒら、１９９３、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３３：１９２−１９８；Ｋｒａｔｚｓｃｈｍａｒら、１９９６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３６：８２７−３６）、ＣＲＩＳＰ−２／ＴＰＸ−１（Ｋａｓａｈａｒａら、１９８９、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５：５２７−５３４；Ｍｉｚｕｋｉら、１９９２、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  ３：２７４−２８０）およびＣＲＩＳＰ−３／ＳＧＰ２８（Ｈａｅｎｄｌｅｒら、１９９３、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３３：１９２−１９８；Ｓｃｈａｍｂｏｎｙら、１９９８．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １３８７：２０６−２１６；Ｓｃｈｗｉｄｅｔｚｋｙ、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０９：８３１−８３６）を含む。
【００４１】
ヒトＳＧＰ２８は、好中球の顆粒において同定されており、そしてＳＧＰ２８の発現は、唾液腺、膵臓、前立腺、精巣上体、卵巣および結腸において検出されている（Ｋｒａｔｚｓｃｈｍａｒら、１９９６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３６：８２７−３６）。マウスＣＲＩＳＰファミリータンパク質の発現は、Ｂ細胞、唾液腺、涙腺、精巣上体、精巣、および粘膜細胞において検出され（Ｐｆｉｓｔｅｒｅｒら、１９９６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：６１６０−６１６８；Ｈａｅｎｄｌｅｒら、１９９９  Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １７８：３７１−３７８、Ｈａｅｎｄｌｅｒら、１９９７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５０：４４０−４４６）、そしてマウスＣＲＩＳＰ−２およびＣＲＩＳＰ−３は、アンドロゲン調節される（Ｈａｅｎｄｌｅｒら、１９９９  Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １７８：３７１−３７８、Ｈａｅｎｄｌｅｒら、１９９７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５０：４４０−４４６）。ＳＧＰ２８および他のＣＲＩＳＰファミリーメンバーは、非特異的な先天免疫においてある役割を有し得ることが示唆されている（Ｋｊｅｌｄｓｅｎら、１９９６、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８０：２４６−２５０；Ｐｆｉｓｔｅｒｅｒら、１９９６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：６１６０−６１６８、Ｈａｅｎｄｌｅｒら、１９９９  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １７８：３７１−３７８）。
【００４２】
以下の実施例にさらに記載されるように、ＳＧＰ２８遺伝子およびＳＧＰ２８タンパク質は、種々の方法で特徴付けられている。例えば、ヌクレオチドコード配列およびアミノ酸配列の分析が、ＳＧＰ２８配列中の保存された構造エレメント、トポロジーの特徴、翻訳後修飾、および関連する可能性のある分子を同定するために行われた。ＳＧＰ２８  ｍＲＮＡの発現のノーザンブロット分析が、種々のＳＧＰ２８メッセージを発現している正常な組織および癌性の組織の範囲を確立するために行われた。実験によってトランスフェクトされた細胞および組織ならびに癌細胞および癌組織におけるＳＧＰ２８タンパク質の発現のウェスタンブロットおよび免疫組織化学分析が、発現および分泌パターンを決定するために行われた。ＳＧＰ２８は、８．０８のｐＩおよび２９．０ｋＤａの計算された分子量を有する。
【００４３】
いくつかの分泌タンパク質が、前立腺癌において記載されており、これらのうちの多くが、腫瘍形成および進行のプロセスに関与することが示された（Ｉｎｏｕｅ  Ｋ．、２０００；Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６：２１０４−１９；Ｄｏｗ  ＪＫら、２０００、Ｕｒｏｌｏｇｙ  ５５：８００−６）。ＳＧＰ２８が、分泌タンパク質であり、その潜在的な機能の１つは、前立腺癌および転移性の疾患の微小環境を調節することである。この可能性を試験するために、ＳＧＰ２８は、組換えＧＳＴ−ＳＧＰ２８またはＳＧＰ２８−Ｍｙｃ／Ｈｉｓ形態として発現され得、そして精製され得る。次いで、精製された組換えＳＧＰ２８（例えば、ＧＳＴ−ＳＧＰ２８またはＳＧＰ２８−Ｍｙｃ／Ｈｉｓ）は、前立腺の環境を再利用する種々の細胞型（前立腺上皮細胞、前立腺腫瘍細胞株、前立腺間質細胞、前立腺内皮細胞および前立腺神経内分泌細胞を含む）とともにインキュベートされる。さらに、組換えＳＧＰ２８はまた、転移性部位（例えば、骨髄細胞および免疫系の細胞）において見出される細胞とともにインキュベートされる。ＳＧＰ２８のインタクトな細胞への結合は、ＦＡＣＳ分析によって、そして熱量アッセイによって検出される。この分析は、ＳＧＰ２８に結合し、そしてＳＧＰ２８に応答し得る細胞集団を同定するので、価値がある。さらに、標的細胞集団の同定は、ＳＧＰ２８レセプターを単離および同定する手段を提供し得る。
【００４４】
ＳＧＰ２８は、ディフェンシンタンパク質（特に、β−ディフェンシン）に強い相同性を有する。β−ディフェンシンは、上皮細胞によって主に産生される分泌産物である（Ｏ’Ｎｅｉｌ  ＤＡら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：６７１８−２４；Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ＪＭ、Ｈａｒｄｅｒ  Ｊ．、１９９９、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３１：６４５−５１）。ディフェンシンは、感染を予防する際、および上皮組織の免疫を保護する際に重要な役割を果たす。さらに、ヒトＨＮＰ１ディフェンシンは、インビトロでの腫瘍の死を誘導することが示されている。細胞死におけるＳＧＰ２８の役割を研究する場合、精製された組換えＳＧＰ２８は、上に列挙された種々の細胞型とともにインキュベートされ、そしてＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ染色細胞のＦＡＣＳ分析を使用してアポトーシス活性について分析される。ＳＧＰ２８はまた、化学誘因物質として機能し得、これは、他のディフェンシン分子について示されている（Ｙａｎｇ  Ｄら、Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．２０００；６８：９−１４、Ｙａｎｇ  Ｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９、２８６（５４３９）：５２５−８）。化学走性アッセイを使用して、種々の型の細胞（上皮細胞、間質細胞、内皮細胞、ならびに単球、リンパ球および樹状細胞を含む）の移動に対するＳＧＰ２８の効果を評価し得る。
【００４５】
（ＳＧＰ２８をコードする核酸分子の単離）
本明細書中に記載されているＳＧＰ２８  ｃＤＮＡ配列は、ＳＧＰ２８遺伝子産物（単数または複数）をコードする他のポリヌクレオチドの単離、ならびにＳＧＰ２８遺伝子産物のホモログをコードするポリヌクレオチドの単離、ＳＧＰ２８遺伝子産物の選択的スプライシングされたイソ型、対立遺伝子改変体、および変異形態の単離を可能にする。ＳＧＰ２８遺伝子をコードする全長のｃＤＮＡを単離するために使用され得る種々の分子クローニング方法が周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，９９５）。例えば、λファージクローニング方法論が、商業的に利用可能なクローニング系（例えば、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して便利に使用され得る。ＳＧＰ２８遺伝子のｃＤＮＡを含有しているファージクローンが、標識されたＳＧＰ２８  ｃＤＮＡまたはそのフラグメントでプローブすることによって同定され得る。例えば、１つの実施形態においては、ＳＧＰ２８  ｃＤＮＡ（表１；配列番号２）またはその一部が合成され得、そしてＳＧＰ２８遺伝子と重複しかつそれに対応する全長のｃＤＮＡを回収するためのプローブとして使用され得る。ＳＧＰ２８遺伝子自体が、ゲノムＤＮＡライブラリー、細菌の人工染色体ライブラリー（ＢＡＣ）、酵母の人工染色体ライブラリー（ＹＡＣ）などを、ＳＧＰ２８  ＤＮＡプローブまたはプライマーを用いてスクリーニングすることによって単離され得る。
【００４６】
（組換えＤＮＡ分子および宿主−ベクター系）
本発明はまた、ＳＧＰ２８ポリヌクレオチドを含有している組換えＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子（ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ならびに当該分野で周知の種々のウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含むがこれらに限定されない）、ならびにそのような組換えＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子で形質転換されたかまたはトランスフェクトされた細胞を提供する。本明細書中で使用される場合は、組換えＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、インビトロで分子操作に供されたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。このような分子を作製するための方法は周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（前出）を参照のこと）。
【００４７】
本発明はさらに、適切な原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞中に、ＳＧＰ２８ポリヌクレオチドを含有している組換えＤＮＡ分子を含有している、宿主−ベクター系を提供する。適切な真核生物宿主細胞の例として、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、または昆虫細胞（例えば、バキュロウイルスに感染可能な細胞（例えば、Ｓｆ９細胞））が挙げられる。適切な哺乳動物細胞の例として、種々の前立腺癌細胞株（例えば、ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３、ＤＵ１４５、ＬＡＰＣ−４、ＴｓｕＰｒ１、他のトランスフェクト可能または形質導入可能な前立腺癌細胞株）、ならびに組換えタンパク質の発現のために慣用的に使用される多数の哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞）が挙げられる。より詳細には、ＳＧＰ２８のコード配列を含有しているポリヌクレオチドが、日常的に使用されそして当該分野で広範に公知の任意の多数の宿主−ベクター系を使用して、ＳＧＰ２８タンパク質またはそのフラグメントを作製するために使用され得る。
【００４８】
ＳＧＰ２８タンパク質またはそのフラグメントの発現に適切な広範な宿主−ベクター系が、利用可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（前出）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５（前出）を参照のこと。哺乳動物での発現に好ましいベクターとして以下が挙げられるが、これらに限定されない：ｐｃＤＮＡ  ３．１  ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９１、ＭＣＢ  １１：１７８５）。これらの発現ベクターを使用して、ＳＧＰ２８は好ましくは、いくつかの前立腺癌および非前立腺細胞株（例えば、２９３、２９３Ｔ、ｒａｔ−１、３Ｔ３、ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ、およびＴｓｕＰｒ１を含む）中で発現され得る。本発明の宿主−ベクター系は、ＳＧＰ２８タンパク質またはそのフラグメントの産生に有用である。このような宿主−ベクター系は、ＳＧＰ２８およびＳＧＰ２８変異の機能的な特性を研究するために使用され得る。
【００４９】
ＳＧＰ２８遺伝子によってコードされるタンパク質、またはそのフラグメントは、以下を含むがこれらに限定されない、種々の用途を有する：抗体を生成すること、ならびにＳＧＰ２８遺伝子産物に結合するリガンドおよび他の試薬および細胞構成成分を同定するための方法における使用。ＳＧＰ２８タンパク質またはそのフラグメントに対して惹起された抗体は、診断アッセイおよび予想アッセイ、画像化方法論（特に、癌の画像化を含む）、およびＳＧＰ２８タンパク質の発現によって特徴付けられるヒトの癌（前立腺癌を含むがこれに限定されない）の管理における治療方法において有用であり得る。ＳＧＰ２８タンパク質の検出に有用な種々の免疫学的アッセイが、意図される。これは、種々の型のラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）、免疫細胞化学的方法などを含むが、これらに限定されない。このような抗体は標識され得、そして前立腺細胞を検出し得る免疫学的な画像化試薬として使用され得る（例えば、放射性シンチグラフィー画像化方法において）。ＳＧＰ２８タンパク質はまた、以下にさらに記載されるように、癌のワクチンを作製することにおいても特に有用であり得る。
【００５０】
（ＳＧＰ２８タンパク質）
本発明の別の局面は、ＳＧＰ２８タンパク質およびそのポリペプチドフラグメントを提供する。本発明のＳＧＰ２８タンパク質は、本明細書中で特に同定されるもの、ならびに、以下に概説される方法に従って過度の実験を行うことなく単離／生成されそして特徴付けられ得る程度の、対立遺伝子改変体、保存的置換改変体、およびホモログを含む。種々のＳＧＰ２８タンパク質またはそのフラグメントの一部を組合せた融合タンパク質、ならびにＳＧＰ２８タンパク質と異種ポリペプチドとの融合タンパク質もまた、含まれる。このようなＳＧＰ２８タンパク質は、まとめて、ＳＧＰ２８タンパク質、本発明のタンパク質、またはＳＧＰ２８と呼ばれる。本明細書中で使用される場合は、用語「ＳＧＰ２８ポリペプチド」は、少なくとも１０アミノ酸の、好ましくは少なくとも１５アミノ酸の、ポリペプチドフラグメントまたはＳＧＰ２８タンパク質をいう。
【００５１】
ＳＧＰ２８タンパク質の特定の実施形態は、表２（配列番号３）に示されるヒトのＳＧＰ２８のアミノ酸配列（その中に示されているアミノ酸残基番号１からおよそアミノ酸残基番号２５８まで）を有しているポリペプチドを含む。ＳＧＰ２８タンパク質の別の特定の実施形態は、表２（配列番号３）に示されるヒトのＳＧＰ２８のアミノ酸配列（その中に示されているおよそアミノ酸残基番号３３からおよそアミノ酸残基番号２５８まで）を有しているポリペプチドを含む。ＳＧＰ２８フラグメントの特定の実施形態は、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８のタンパク質配列のアミノ酸１〜３２、またはアミノ酸残基１５０〜１６０（ＶＶＧＨＹＴＱＶＶＷＹ；配列番号６）およびアミノ酸残基１７０〜１８２（ＹＹＶＣＱＹＣＰＡＧＮＷ；配列番号７）の細胞外タンパク質ＳＣＰモチーフの一方もしくは両方を含む群より選択されるペプチドを含む。
【００５２】
一般的には、ヒトＳＧＰ２８の天然に存在している対立遺伝子改変体は、高い程度の構造的な同一性および相同性を共有する（例えば、９０％以上の同一性）。代表的には、ＳＧＰ２８タンパク質の対立遺伝子改変体は、本明細書中に記載されるＳＧＰ２８配列中に保存的なアミノ酸置換を含むか、またはＳＧＰ２８ホモログ中の対応する位置からのアミノ酸の置換を含む。ＳＧＰ２８対立遺伝子改変体の１つのクラスは、特定のＳＧＰ２８アミノ酸配列の少なくとも小さな領域と高い程度の相同性を共有するが、その配列からの極端な逸脱（例えば、非保存的置換、短縮挿入、またはフレームシフト）をさらに含む、タンパク質である。
【００５３】
保存的なアミノ酸の置換は、しばしば、そのタンパク質の立体構造または機能のいずれをも変更することなく、タンパク質中で行われ得る。このような変化は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ）のいずれかをこれらの疎水性アミノ酸の他の任意の代わりに用いること；グルタミン酸（Ｅ）に代えてのアスパラギン酸（Ｄ）での置換およびその逆；アスパラギン（Ｎ）に代えてのグルタミン（Ｑ）での置換およびその逆；ならびにスレオニン（Ｔ）に代えてのセリン（Ｓ）での置換およびその逆が挙げられる。他の置換もまた、特定のアミノ酸の環境およびタンパク質の三次元構造におけるその役割に依存して、保存的であると考えられ得る。例えば、グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）は、アラニン（Ａ）とバリン（Ｖ）がそうであり得るように、しばしば、互換可能であり得る。メチオニン（Ｍ）（これは、比較的疎水性である）は、頻繁にロイシンおよびイソロイシンと互換可能であり得、そして時にバリンと互換可能であり得る。リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）は頻繁に、アミノ酸残基の重要な特性がその変化でありそしてこれらの２つのアミノ酸残基の異なるｐＫが重要ではない位置において、互換可能である。なお他の変化が、特定の環境下では「保存的である」と考えられ得る。
【００５４】
ＳＧＰ２８タンパク質（改変体を含む）は、表２（配列番号３）のアミノ酸配列を有しているＳＧＰ２８タンパク質と共通している少なくとも１つのエピトープを含む。その結果、ＳＧＰ２８タンパク質または改変体に対して特異的に結合する抗体もまた、表２（配列番号３）のアミノ酸配列を有しているＳＧＰ２８タンパク質に対して特異的に結合する。１つのクラスのＳＧＰ２８タンパク質改変体は、表２（配列番号３）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を共有する。ＳＧＰ２８タンパク質改変体のより特定のクラスは、上記の細胞外タンパク質ＳＣＰモチーフを含む。好ましいＳＧＰ２８タンパク質改変体は、本明細書中に記載されるデフェンシン機能の１つ以上を示し得る。これは例えば、腫瘍死を誘導するか、または化学誘引および／もしくは細胞の移動を誘導する能力を含む。
【００５５】
ＳＧＰ２８タンパク質は、多くの形態（好ましくは、単離された形態）で具体化され得る。本明細書中で使用される場合は、タンパク質は、物理的、機械的、または化学的方法が、通常はそのタンパク質と会合している細胞構成成分からＳＧＰ２８タンパク質を取り出すために使用される場合に、「単離される」といわれる。当業者は、単離されたＳＧＰ２８タンパク質を得るための標準的な精製方法を容易に使用し得る。精製されたＳＧＰ２８タンパク質分子は、抗体または他のリガンドに対するＳＧＰ２８の結合を損なう他のタンパク質または分子を実質的に含まない。単離および精製の性質および程度は、意図される使用に依存する。ＳＧＰ２８タンパク質の実施形態は、精製されたＳＧＰ２８タンパク質および機能的であり可溶性であるＳＧＰ２８タンパク質を含む。１つの形態においては、このような機能的であり可溶性であるＳＧＰ２８タンパク質またはそのフラグメントは、抗体または他のリガンドに結合する能力を保持している。
【００５６】
本発明はまた、ＳＧＰ２８アミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメントを含有しているＳＧＰ２８ポリペプチド（例えば、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８のアミノ酸配列の一部に対応するポリペプチド）を提供する。本発明のこのようなポリペプチドは、ＳＧＰ２８タンパク質の特性（例えば、ＳＧＰ２８タンパク質に関連するエピトープに特異的に結合する抗体の生成を誘発する能力）を示す。
【００５７】
本明細書中に開示される本発明の実施形態として、アミノ酸の挿入、欠失、および置換を有しているポリペプチドのような、広範な種々の当該分野で受容されるＳＧＰ２８の改変体を含む。ＳＧＰ２８改変体は、部位特異的変異誘発、アラニンスキャニング、およびＰＣＲ変異誘発のような、当該分野で公知の方法を使用して作製され得る。部位特異的変異誘発［Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７）］、カセット変異誘発［Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ、３４：３１５（１９８５）］、制限選択変異誘発［Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ，３１７：４１５（１９８６）］または他の公知の技術が、ＳＧＰ２８改変体ＤＮＡを産生するためにクローン化されたＤＮＡに対して行われ得る。スキャニングアミノ酸分析もまた、連続している配列にそって１つ以上のアミノ酸を同定するために使用され得る。中でも、好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性のアミノ酸である。このようなアミン酸として、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが挙げられる。アラニンは、代表的には、この群の中で好ましいスキャニングアミノ酸である。なぜなら、アラニンは、β炭素の後の側鎖を排除し、そして改変体の主鎖の立体構造を変更する可能性が少ないからである。アラニンはまた、それが最も一般的なアミノ酸であるので、典型的に好ましい。さらに、アラニンは、埋没した部位および露出した部位の両方において頻繁に見出される［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９７６）］。アラニン置換が十分な量の改変体を生じない場合には、等配電子のアミノ酸が使用され得る。
【００５８】
上記に議論されるように、請求される発明の実施形態として、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質の２５８個未満のアミノ酸配列を含有しているポリペプチドが挙げられる。例えば、本明細書中に開示される発明の代表的な実施形態として、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質のおよそアミノ酸１からおよそアミノ酸１０からなるポリペプチド、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質のおよそアミノ酸２０からおよそアミノ酸３０からなるポリペプチド、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質のおよそアミノ酸３０からおよそアミノ酸４０からなるポリペプチド、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質のおよそアミノ酸４０からおよそアミノ酸５０からなるポリペプチド、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質のおよそアミノ酸５０からおよそアミノ酸６０からなるポリペプチド、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質のおよそアミノ酸６０からおよそアミノ酸７０からなるポリペプチド、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質のおよそアミノ酸７０からおよそアミノ酸８０からなるポリペプチド、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質のおよそアミノ酸８０からおよそアミノ酸９０からなるポリペプチド、および表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質のおよそアミノ酸９０からおよそアミノ酸１００からなるポリペプチドなどが挙げられる。この概要に従って、ＳＧＰ２８タンパク質のアミノ酸１００〜２５８のアミノ酸配列の一部をからなるポリペプチドが、本発明の典型的な実施形態である。ＳＧＰ２８タンパク質のより大きな部分をからなるポリペプチドもまた、意図される。例えば、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８タンパク質のおよそアミノ酸１（または２０、または３０、または４０など）からおよそアミノ酸２０（または３０、または４０、または５０など）からなるポリペプチドが、当該分野で周知の種々の技術によって作製され得る。
【００５９】
本明細書中で開示される発明のさらなる例示的な実施形態として、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８ポリペプチド配列中に含まれる生物学的なモチーフの１つ以上のアミノ酸残基を含有しているＳＧＰ２８ポリペプチドが挙げられる。これらのモチーフまたは本明細書中に記載の目的の他の選択領域の１つ以上を含むＳＧＰ２８ポリペプチドは、代表的には、選択されたモチーフの一方または両方の側に隣接ＳＧＰ２８タンパク質配列のさらなる５〜２５またはそれより多くのアミノ酸残基を含む。１つの実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、デフェンシンに対して相同性を示す、ＳＧＰ２８の領域の１つ以上を含み得る。別の実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、ＳＧＰ２８  Ｎ−グリコシル化部位（例えば、ＮＣＳＮ（配列番号８）（残基２５２〜２５５（配列番号３に示される最初のアミノ酸残基からの番号））の１つ以上を含み得る。別の実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、ＳＧＰ２８プロテインキナーゼＣリン酸化部位（例えば、ＳＬＫ（残基１０６〜１０８および／または２３１〜２３３））の１つ以上を含み得る。別の実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、ＳＧＰ２８カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位（例えば、ＳＷＦＤ（残基１２８〜１３１）（配列番号９）および／またはＳＣＰＤ（残基２０６〜２０９）（配列番号１０））の１つ以上を含み得る。別の実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、チロシンキナーゼリン酸化部位（例えば、ＫＣＧＥＮＬＹ（残基１０８〜１１４）（配列番号１１））の１つ以上を含み得る。別の実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、Ｎ−ミリストイル化部位（例えば、ＧＬＬＰＳＦ（残基２６〜３１）（配列番号１２）、ＧＣＣＮＡＹ（残基１６４〜１６９）（配列番号１３）、ＧＮＷＡＮＲ（残基１８８〜１９３）（配列番号１４）、ＧＡＰＣＡＳ（残基２０１〜２０６）（配列番号１５）、および／またはＧＬＣＴＮＧ（残基２１４〜２１９（配列番号１６））の１つ以上を含み得る。別の実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、細胞外タンパク質ＳＣＰ記号配列（例えば、配列番号３のアミノ酸残基１５０〜１６０および／または配列番号３のアミノ酸残基１７９〜１９０）の１つ以上を含み得る。別の実施形態においては、本発明の代表的なポリペプチドは、ＳＧＰ２８の１つ以上の推定ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチド（例えば、アミノ酸２〜１０（ＴＬＦＰＶＬＬＦＬ；配列番号１７）、アミノ酸６〜１４（ＶＬＬＦＬＶＡＧＬ；配列番号１８）、アミノ酸３０〜３８（ＡＬＬＴＴＱＴＱＶ；配列番号１９）、アミノ酸１４２〜１５０（ＶＶＷＹＳＳＹＬＶ；配列番号２０）、アミノ酸２２２〜２３０（ＴＬＴＣＫＨＱＬＶ；配列番号２１）、アミノ酸１７５〜１８３（ＧＮＷＡＮＲＬＹＶ；配列番号２２）、アミノ酸７〜１５（ＬＬＦＬＶＡＧＬＬ；配列番号２３）、アミノ酸１４１〜１４９（ＱＶＶＷＹＳＳＹＬ；配列番号２４）、アミノ酸１３４〜１４２（ＡＶＶＧＨＹＴＱＶ；配列番号２５）、およびアミノ酸２１１〜２１９（ＤＬＹＳＮＣＫＳＬ；配列番号２６）を含み得る。これらの発明の関連する実施形態は、上���に議論される種々のモチーフの組合せを含有しているポリペプチドを含み、好ましい実施形態は、これらのポリペプチドのモチーフ内または介在している配列内のいずれかに挿入、欠失、または置換を含まない。
【００６０】
ＳＧＰ２８ポリペプチドは、本明細書中に開示されるヒトのＳＧＰ２８タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、標準的なペプチド合成技術を使用して、または当該分野で周知の化学的な切断方法を使用して、生成され得る。あるいは、組換え方法が、ＳＧＰ２８タンパク質のポリペプチドフラグメントをコードする核酸分子を作製するために使用され得る。これに関して、本明細書中に記載されるＳＧＰ２８をコードする核酸分子は、ＳＧＰ２８タンパク質の定義されるフラグメントを作製するための手段を提供する。ＳＧＰ２８ポリペプチドは、ドメイン特異的抗体（例えば、ＳＧＰ２８タンパク質の細胞外エピトープまたは細胞内エピトープを認識する抗体）を作製しそして特徴付けることにおいて、ＳＧＰ２８またはその特定の構造ドメインに結合する薬剤または細胞性因子を同定することにおいて、そして癌のワクチンを含むがこれに限定されない種々の治療の状況において、特に有用である。特に興味深い構造を含有しているＳＧＰ２８ポリペプチドが、以下を含む当該分野で周知の種々の分析技術：例えば、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ，Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｔｚ、もしくはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析の方法を使用して、または免疫原性に基づいて、推定され得、そして／または同定され得る。このような構造を含有しているフラグメントは、サブユニット特異的抗ＳＧＰ２８抗体を作製すること、またはＳＧＰ２８に結合する細胞性因子を同定することにおいて、特に有用である。
【００６１】
以下の実施例に記載されている特定の実施形態においては、ＳＧＰ２８の分泌された形態は、Ｃ末端の６×ＨｉｓおよびＭＹＣタグを有しているＳＧＰ２８をコードするＣＭＶによって駆動される発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨＩＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞中で簡便に発現され得る。培養培地中に分泌されたＨＩＳタグ化ＳＧＰ２８は、ニッケルカラムおよび標準的な技術を使用して精製され得る。あるいは、ＡＰタグ系が使用され得る。ＳＧＰ２８の発現のための種々の構築物が、以下の実施例に記載される。
【００６２】
共有結合改変のようなＳＧＰ２８の改変が、本発明の範囲内に含まれる。共有結合改変の１つの型として、ＳＧＰ２８の選択された側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端の残基と反応し得る有機誘導試薬との、ＳＧＰ２８ポリペプチドの標的化されたアミノ酸残基の反応が挙げられる。本発明の範囲内に含まれるＳＧＰ２８ポリペプチドの共有結合改変の別の型は、ポリペプチドのネイティブなグリコシル化パターンを変更することを含む。「ネイティブなグリコシル化パターンを変更する」とは、ネイティブの配列のＳＧＰ２８中に見出される１つ以上の炭水化物部分を欠失させること（根本的なグリコシル化部位を除去することか、または化学的および／もしくは酵素的な手段によってグリコシル化を欠失させることのいずれかによる）、ならびに／あるいは、ネイティブの配列のＳＧＰ２８中には存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味するように、本明細書中の目的のために意図される。さらに、この句は、存在する種々の炭水化物部分の性質および比率を変化させることを含む、ネイティブタンパク質のグリコシル化における質的変化を含む。ＳＧＰ２８の共有結合改変の別の型は、種々の非タンパク質性のポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）の１つに対して、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号；または同第４，１７９，３３７号に記載される様式で、ＳＧＰ２８ポリペプチドを連結することを含む。
【００６３】
本発明のＳＧＰ２８はまた、別の、異種のポリペプチドまたはアミノ酸の配列に対して融合されたＳＧＰ２８を含む、キメラ分子を形成するように改変され得る。１つの実施形態においては、このようなキメラ分子は、ポリヒスチジンエピトープタグとのＳＧＰ２８の融合体を含む。これは、固定化されたニッケルが選択的に結合し得るエピトープを提供する。エピトープタグは、一般的には、ＳＧＰ２８のアミノ末端またはカルボキシ末端に配置される。別の実施形態においては、キメラ分子は、イムノグロブリンまたはイムノグロブリンの特定の領域との、ＳＧＰ２８の融合体を含み得る。２価の形態のキメラ分子（「免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）」とも呼ばれる）については、このような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対してであり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりに、ＳＧＰ２８ポリペプチドの可溶性の（膜貫通ドメインを欠失させられたかまたは不活化された）形態の置換を含む。特に好ましい実施形態においては、イムノグロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子の、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域、またはヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む。イムノグロブリン融合体の産生については、１９９５年６月２７日に発行された、米国特許第５，４２８，１３０号をもまた参照のこと。
【００６４】
（ＳＧＰ２８抗体）
本発明の別の局面は、ＳＧＰ２８タンパク質およびポリペプチドに結合する抗体を提供する。最も好ましい抗体は、ＳＧＰ２８タンパク質に対して選択的に結合し、そして非ＳＧＰ２８タンパク質およびポリペプチドに対しては結合しない（または弱く結合する）。特に意図される抗ＳＧＰ２８抗体として、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびにこれらの抗体の抗原結合ドメインおよび／または１つ以上の相補性決定領域を含有しているフラグメントが挙げられる。本明細書中で使用される場合は、抗体フラグメントは、その標的（すなわち、抗原結合領域）に対して結合する免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部として定義される。
【００６５】
いくつかの適用については、特定のＳＧＰ２８タンパク質および／または特定の構造ドメイン中のエピトープと特異的に反応する抗体を作製することが所望され得る。例えば、癌の治療および診断用の画像化の目的に有用である好ましい抗体は、癌細胞中で発現されるＳＧＰ２８タンパク質の細胞外領域中のエピトープと反応する抗体である。このような抗体は、本明細書中に記載されているＳＧＰ２８タンパク質を使用して作製され得るか、または免疫原としてその推定される細胞外ドメインに由来するペプチドを使用して作製され得る。これに関して、図１に示されるＳＧＰ２８タンパク質配列を参照して、膜貫通ドメインに対してアミノ末端の配列の領域が選択され得、そして細胞外特異的ＳＧＰ２８抗体を惹起および選択するための適切な免疫原およびスクリーニング試薬を設計するために使用され得る。
【００６６】
本発明のＳＧＰ２８抗体は、特に、前立腺癌の治療ストラテジー、診断および予後アッセイ、ならびに画像化方法論において有用であり得る。同様に、このような抗体は、他の癌の処置、診断、および／または予後において、ＳＧＰ２８がまた他の型の癌において発現されるかまたは過剰発現される範囲で、有用であり得る。本発明は、ＳＧＰ２８、ならびに変異体ＳＧＰ２８タンパク質およびポリペプチドの検出および定量に有用な種々の免疫学的アッセイを提供する。このようなアッセイは、一般的には、ＳＧＰ２８または変異体ＳＧＰ２８タンパク質を認識し得そして結合し得る１つ以上のＳＧＰ２８抗体を含み、そして適切である場合には、以下を含むがこれらに限定されない当該分野で周知の種々の免疫学的アッセイの形式で行われ得る：種々の型のラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）など。さらに、以下を含むがこれらに限定されない、前立腺癌を検出し得る免疫学的な画像化方法が本発明によって提供される：標識されたＳＧＰ２８抗体を使用する放射性シンチグラフィー画像化方法。このようなアッセイは、前立腺癌（特に、進行した前立腺癌）の検出、モニタリング、および予後において臨床的に使用され得る。
【００６７】
ＳＧＰ２８抗体はまた、ＳＧＰ２８および変異体ＳＧＰ２８タンパク質およびポリペプチドを精製するため、ならびにＳＧＰ２８ホモログおよび関連する分子を単離するための方法においても使用され得る。例えば、１つの実施形態においては、ＳＧＰ２８タンパク質を精製する方法は、固体のマトリックスに対して結合されているＳＧＰ２８抗体を、ＳＧＰ２８を含有している溶解物または他の溶液とともに、ＳＧＰ２８抗体がＳＧＰ２８に結合することを可能とする条件下でインキュベートする工程；固体のマトリックスを不純物を排除するために洗浄する工程；および結合した抗体からＳＧＰ２８を溶出させる工程を包含する。本発明のＳＧＰ２８抗体の他の用途として、ＳＧＰ２８タンパク質を模倣する抗イディオタイプ抗体を作製することが挙げられる。
【００６８】
ＳＧＰ２８抗体はまた、例えば、ＳＧＰ２８タンパク質の生物学的活性を調節もしくは阻害すること、またはＳＧＰ２８タンパク質を発現する癌細胞を標的化しそして崩壊させることによって、治療的にも使用され得る。前立腺癌および他の癌の抗体治療は、以下の別の章により詳細に記載される。
【００６９】
抗体の調製のための種々の方法は、当該分野で周知である。例えば、抗体は、ＳＧＰ２８タンパク質、ペプチド、またはフラグメントを、単離された形態または免疫結合形態で使用して、適切な哺乳動物宿主を免疫することによって調製され得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９８８）；Ｈａｒｌｏｗ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８９））。タンパク質免疫原の例として、組換えＳＧＰ２８（バキュロウイルス系、哺乳動物系などにおいて発現される）、ＳＧＰ２８細胞外ドメイン、ＡＰ−タグ化ＳＧＰ２８などが挙げられる。さらに、ＳＧＰ２８の融合タンパク質（例えば、ＳＧＰ２８と、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｉｓＭａｘ−ＴＯＰＯ、またはＭｙｃＨｉｓとの融合物（下記の実施例を参照のこと））もまた、使用され得る。
【００７０】
特定の実施形態においては、表２（配列番号３）のアミノ酸配列のオープンリーディングフレームの全てまたはほとんどを含有しているＧＳＴ融合タンパク質が産生され得、そして適切な抗体を作製するための免疫原として使用され得る。ＳＧＰ２８を発現するかまたは過剰発現する細胞もまた、免疫のために使用され得る。同様に、ＳＧＰ２８を発現するように操作された任意の細胞が、使用され得る。このようなストラテジーは、内因性のＳＧＰ２８を認識する、増強された能力を有するモノクローナル抗体の産生を生じ得る。別の有用な免疫原は、ヒツジの赤血球の原形質膜に連結されたＳＧＰ２８ペプチドを含む。
【００７１】
表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８のアミノ酸配列は、抗体を作製するためのＳＧＰ２８タンパク質の特定の領域を選択するために使用され得る。例えば、ＳＧＰ２８アミノ酸配列の疎水性および親水性分析が、ＳＧＰ２８構造中の親水性領域を同定するために使用され得る。免疫原性の構造を示すＳＧＰ２８タンパク質の領域、ならびに他の領域およびドメインが、当該分野で公知の種々の他の方法（例えば、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ，Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｔｚ、またはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析）を使用して容易に同定され得る。ＨＬＡ−Ａ２に結合すると推定されるＳＧＰ２８のペプチドが、抗体の生成のために選択され得る。このような推定ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＳＧＰ２８のアミノ酸２〜１０（ＴＬＦＰＶＬＬＦＬ；配列番号１７），アミノ酸６〜１４（ＶＬＬＦＬＶＡＧＬ；配列番号１８），アミノ酸３０〜３８（ＡＬＬＴＴＱＴＱＶ；配列番号１９），アミノ酸１４２〜１５０（ＶＶＷＹＳＳＹＬＶ；配列番号２０），アミノ酸２２２〜２３０（ＴＬＴＣＫＨＱＬＶ；配列番号２１），アミノ酸１７５〜１８３（ＧＮＷＡＮＲＬＹＶ；配列番号２２），アミノ酸７〜１５（ＬＬＦＬＶＡＧＬＬ；配列番号２３），アミノ酸１４１〜１４９（ＱＶＶＷＹＳＳＹＬ；配列番号２４），アミノ酸１３４〜１４２（ＡＶＶＧＨＹＴＱＶ；配列番号２５），およびアミノ酸２１１〜２１９（ＤＬＹＳＮＣＫＳＬ；配列番号２６）。以下の実施例で議論されるように、免疫原性は、ＳＧＰ２８を用いて、実証されている。これらは、それぞれ、ウサギおよびマウスを使用してポリクローナルおよびモノクローナル抗体を生成するために使用された。このＢ細胞の応答（抗体の産生）は、ＳＧＰ２８の免疫原性部分によって惹起される最初のＴ細胞応答の結果である。
【００７２】
免疫原としての使用のため、およびＢＳＡ、ＫＬＨ、または他のキャリアタンパク質のようなキャリアを有するタンパク質の免疫原性結合体を調製するために、タンパク質またはポリペプチドを調製する方法が、当該分野で周知である。いくつかの状況において、例えば、カルボジイミド試薬を使用する直接的な結合体が、使用され得る；他の例においては、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｌｄ，ＩＬによって供給されるような架橋剤が有効であり得る。ＳＧＰ２８免疫原の投与は、一般的には、適切な期間にわたる注射によって、そして一般的に当該分野で理解されている適切なアジュバントの使用を伴って行われる。免疫スケジュールの間に、抗体の力価が、抗体の形成の適切性を決定するために行われ得る。
【００７３】
ＳＧＰ２８モノクローナル抗体が好ましく、そして当該分野で周知の種々の手段によって産生され得る。例えば、所望されるモノクローナル抗体を分泌する不死化された細胞株が、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的なハイブリドーマ技術、または一般的に公知であるＢ細胞を産生するように不死化する改変を使用して、調製され得る。所望された抗体を分泌する不死化された細胞株は、抗原がＳＧＰ２８タンパク質またはＳＧＰ２８フラグメントであるイムノアッセイによってスクリーニングされる。所望される抗体を分泌する適切な不死化された細胞培養物が同定された場合には、その細胞を増殖し得、そしてインビトロの培養物または腹水液のいずれかから抗体が産生され得る。
【００７４】
抗体またはフラグメントはまた、組換え手段による現在の技術を使用しても産生され得る。ＳＧＰ２８タンパク質の所望される領域に対して特異的に結合する領域もまた、複数の種起源のキメラまたはＣＤＲグラフト（ｇｒａｆｔｅｄ）抗体の状況において産生され得る。ヒト化またはヒトＳＧＰ２８抗体もまた産生され得、そして治療の状況における使用に好ましい。１つ以上の非ヒト抗体のＣＤＲを、対応するヒト抗体の配列で置きかえることによる、マウスおよび他のヒト抗体をヒト化するための方法は、周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎら、１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６を参照のこと）。Ｃａｒｔｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５およびＳｉｍｓら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６をもまた参照のこと。完全なヒトのモノクローナル抗体を産生するための方法として、ファージディスプレイおよびトランスジェニック動物技術が挙げられる（概要については、Ｖａｕｇｈａｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：５３５−５３９を参照のこと）。
【００７５】
完全なヒトのＳＧＰ２８モノクローナル抗体は、大きなヒトＩｇ遺伝子コンビナトリアルライブラリーを使用するクローニング技術（すなわち、ファージディスプレイ）を使用して作製され得る（ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｒｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｎ．Ｃｌａｒｋ，Ｍ．（編）、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ａｃａｄｅｍｉｃ、４５〜６４頁（１９９３）；ＢｕｒｔｏｎおよびＢａｒｂａｓ、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．同上、６５〜８２頁）。完全ヒトＳＧＰ２８モノクローナル抗体はまた、以下に記載されているように、ヒトの免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニックマウスを使用して産生され得る：１９９７年１２月３日に公開された、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９８／２４８９３号、ＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９８、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  ７（４）：６０７−６１４をもまた参照のこと）。この方法は、ファージディスプレイ技術を用いて必要とされるインビトロでの操作を回避し、そして高い親和性の確実なヒト抗体を効率よく産生する。
【００７６】
ＳＧＰ２８抗体とＳＧＰ２８タンパク質との反応性は、ウェスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、およびＦＡＣＳ分析を含む多数の周知の手段によって、適切なように、ＳＧＰ２８タンパク質、ペプチド、ＳＧＰ２８を発現する細胞またはその抽出物を使用して、確立され得る。
【００７７】
本発明のＳＧＰ２８抗体またはそのフラグメントは、検出可能なマーカーで標識され得るか、または第２の分子（例えば、細胞毒素または他の治療薬）に対して結合させられ得、そしてＳＧＰ２８ポジティブ細胞に対して第２の分子を標的化するために使用され得る（Ｖｉｔｅｔｔａ，Ｅ．Ｓ．ら、１９９３、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ、ＤｅＶｉｔａ、Ｊｒ．，Ｖ．Ｔ．ら編、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、第４版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、２６２４−２６３６）。細胞毒性の試薬の例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、エチジウムブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レトストリクトシン（ｒｅｔｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、カリヒマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、およびグルココルチコイド、ならびに他の化学療法剤、ならびに放射性同位元素（例えば、212Ｂｉ、131Ｉ、131Ｉｎ、90Ｙ、および186Ｒｅ）。適切な検出マーカーとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない：放射性同位元素、蛍光化合物、生体発光化合物、化学発光化合物、金属キレート化剤、または酵素。抗体はまた、プロドラッグをその活性な形態に転換し得る、抗癌プロドラッグ活性化酵素に結合体化され得る。例えば、米国特許第４，９７５，２８７号を参照のこと。
【００７８】
さらに、２つ以上のＳＧＰ２８エピトープについて特異的な二重特異的抗体が、当該分野で一般的に公知の方法を使用して作製され得る。さらに、抗体エフェクター機能が、癌細胞に対するＳＧＰ２８抗体の治療効果を増強するために改変され得る。例えば、システイン残基が、Ｆｃ領域中に操作され得、それによって鎖間ジスルフィド結合の形成およびホモ二量体の生成を可能にし、これはインターナリゼーション、ＡＤＣＣ、および／または補体によって媒介される細胞の殺傷についての能力を増強させ得る（例えば、Ｃａｒｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５；Ｓｈｏｐｅｓ，１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２を参照のこと）。ホモ二量体抗体はまた、当該分野で公知の架橋技術によって作製され得る（例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２５６０−２５６５を参照のこと）。
【００７９】
（ＳＧＰ２８トランスジェニック動物）
ＳＧＰ２８またはその改変された形態をコードする核酸はまた、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを作製するために使用され得る。次いでこれは、治療的に有用な試薬の開発およびスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物（例えば、マウスまたはラット）は、トランスジーンを含む細胞を有している動物である。トランスジーンは、動物またはその動物の祖先に、出産前（例えば、胚の段階）に導入された。トランスジーンは、トランスジェニック動物が生じる細胞のゲノム中に組み込まれるＤＮＡである。１つの実施形態においては、ＳＧＰ２８をコードするｃＤＮＡは、ＳＧＰ２８をコードするＤＮＡを発現する細胞を含有しているトランスジェニック動物を作製するために使用される確立された技術およびゲノム配列に従って、ＳＧＰ２８をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用され得る。
【００８０】
トランスジェニック動物（特に、マウスまたはラットのような動物）を作製するための方法は、当該分野で一般的であり、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号に記載されている。代表的には、特定の細胞が、組織特異的エンハンサーを伴うＳＧＰ２８トランスジーンの取り込みのために標的化される。胚の段階で動物の生殖系に導入されたＳＧＰ２８をコードする１コピーのトランスジーンを含むトランスジェニック動物は、ＳＧＰ２８をコードするＤＮＡの増大させられた発現の効果を試験するために使用され得る。このような動物は、保護形態（例えば、その過剰発現に関連する病理学的状態）を付与すると考えられる試薬についてのテスター動物として使用され得る。本発明のこの局面に従うと、動物は試薬で処置され、そして、トランスジーンを保有している未処置の動物と比較して病理学的状態の減少した指標は、その病理学的状態についての有望な治療的な介入を示す。
【００８１】
あるいは、ＳＧＰ２８の非ヒトホモログが、ＳＧＰ２８「ノックアウト」動物を構築するために使用され得る。これは、ＳＧＰ２８をコードする内因性の遺伝子と、動物の胚性の細胞中に導入された変更されたＳＧＰ２８をコードするゲノムＤＮＡとの間での相同組換えの結果としての、欠損しているかまたは変更されたＳＧＰ２８をコードする遺伝子を有する。例えば、ＳＧＰ２８をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従ってＳＧＰ２８をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用され得る。ＳＧＰ２８をコードするゲノムＤＮＡの一部が、欠失させられ得るか、または、組込みをモニターするために使用され得る選択マーカーをコードする遺伝子のような別の遺伝子と置き換えられ得る。
【００８２】
代表的には、変更されていない隣接しているＤＮＡ（５’および３’末端の両方）の数キロ塩基がベクター中に含まれる（相同組換えベクターの説明については、例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、１９８７、Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照のこと）。ベクターは、胚性の幹細胞株中に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入され、そして導入されたＤＮＡが内因性のＤＮＡと相同組換えされた細胞が選択される（例えば、Ｌｉら、１９９２、Ｃｅｌｌ  ６９：９１５を参照のこと）。次いで、選択された細胞は、動物（例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞中に注入されて、凝集キメラを形成する（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７、１１３〜１５２頁を参照のこと）。
【００８３】
次いで、キメラ胚が、適切な擬妊娠させた雌性の養母（ｆｏｓｔｅｒ）動物中に移植され得、そして胚は「ノックアウト」動物を作製するための期間に入る。それらの生殖細胞中に相同組換えされたＤＮＡを保有している子孫が、標準的な技術によって同定され得、そして動物の全ての細胞が相同組換えされたＤＮＡを含む動物を育種させるために使用され得る。ノックアウト動物は、例えば、特定の病理学的状態に対して防御するそれらの能力、およびＳＧＰ２８ポリペプチドの非存在に起因する病理学的状態のそれらの発症について、特徴付けられ得る。
【００８４】
（循環中および排泄されたＳＧＰ２８についてのアッセイ）
癌性および前癌性前立腺におけるＳＧＰ２８の高レベル管腔発現に関する出願人の免疫組織化学的証拠に基づいて、前立腺腫瘍は、脈管構造中にＳＧＰ２８を分泌するか、および／または尿もしくは精液中にＳＧＰ２８を分泌し、ここでこのタンパク質が、分子診断分野において周知のアッセイおよび技術を使用して検出および定量され得ることが予期される。循環中および排泄されたＳＧＰ２８のレベルを検出および定量することは、前立腺癌の診断、病期分類、および予後において多数の用途を有することが予期される。血清、尿、および精液中のタンパク質の検出および定量のための多数の異なる技術的アプローチが、当該分野において周知である。ＳＧＰ２８は、前立腺および結腸の癌、そして恐らく他の癌において発現される分泌タンパク質であるので、血液または血清中のＳＧＰ２８を検出および定量するためのアッセイは、個体におけるＳＧＰ２８発現腫瘍の検出、診断、予後、および／または病期分類のために有用であることが予期される。例えば、正常組織中のＳＧＰ２８  ｍＲＮＡ発現は、前立腺および卵巣において優先的に見出される。しかし、高レベルのタンパク質発現は、前立腺癌ならびにＰＩＮにおいて検出される。従って、血清ＳＧＰ２８タンパク質の検出は、前立腺腫瘍の存在の指標を提供し得る。癌の診断は、この情報および／または他の情報に基づいてなされ得る。前立腺癌に関して、例えば、このような他の情報としては、血清ＰＳＡ測定、ＤＲＥおよび／または超音波検査が挙げられ得る。さらに、血清中において検出されるＳＧＰ２８のレベルは、病期分類または予後において有用な情報を提供し得る。例えば、血清中の非常に高レベルのＳＧＰ２８タンパク質は、より大きなおよび／またはより攻撃的な腫瘍を示唆し得る。
【００８５】
さらに、末梢血を、ＳＧＰ２８タンパク質および／またはＳＧＰ２８発現癌細胞（前立腺癌が挙げられるが、これに限定されない）の存在について、ＳＧＰ２８発現を検出するためのＲＴ−ＰＣＲを使用して、従来的にアッセイし得る。ＲＴ−ＰＣＲで増幅可能なＳＧＰ２８  ｍＲＮＡの存在は、癌の存在の指標を提供する。末梢血における腫瘍細胞についてのＲＴ−ＰＣＲ検出アッセイは、現在、多数のヒト固形腫瘍の診断および管理において使用するために評価されている。前立腺癌の分野において、これらには、ＰＳＡおよびＰＳＭを発現する細胞の検出のためのＲＴ−ＰＣＲアッセイが挙げられる（Ｖｅｒｋａｉｋら，１９９７，Ｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．２５：３７３−３８４；Ｇｈｏｓｓｅｉｎら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３：１１９５−２０００；Ｈｅｓｔｏｎら，１９９５，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１：１６８７−１６８８）。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、当該分野において周知である。
【００８６】
１つの実施形態では、捕捉ＥＬＩＳＡを使用して、血清、尿または精液中のＳＧＰ２８を検出および定量する。ＳＧＰ２８についての捕捉ＥＬＩＳＡは、一般的に、ＳＧＰ２８タンパク質の別個のエピトープを認識する異なるアイソタイプの少なくとも２つのモノクローナル抗体、または１つの抗ＳＧＰ２８モノクローナル抗体と、異なる種（例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ハムスターなど）に由来する特異的ポリクローナル血清とを含む。このアッセイでは、１つの試薬が捕捉（またはコーティング）抗体として供され、そして他の試薬が検出抗体として供される。
【００８７】
以下に詳細に考察するように、ＳＧＰ２８のレベル（ＳＧＰ２８血清レベルを含む）を使用して、ＳＧＰ２８発現腫瘍の存在、程度、および攻撃性の指標を提供し得る。留意されるように、上記のＳＧＰ２８は、ＰＳＡ（これは、前立腺における最も重要で、正確で、かつ臨床的に有用な生化学マーカーである）と多数の特徴を共有する。前立腺の正常な構築を破壊する任意のプロセスによって、間質および微小血管中へのＰＳＡの拡散が可能となる。結果として、血清の前立腺特異的抗原レベルにおける臨床的に重要な増加が、前立腺癌で見出される。特に、より多数の悪性細胞、および癌に関連した間質の破壊は、血清の前立腺特異的抗原レベルの増加を説明する。この状況下では、血清の前立腺特異的抗原レベルは、臨床的病期、腫瘍体積、組織学的段階、ならびに莢膜穿孔および精嚢侵襲の存在と、正に相関する。例えば、Ｂｏｓｔｗｉｃｋ，Ｄ．Ｇ．，１９９４，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１０２（４  補遺１）：Ｓ３１−Ｓ３７を参照のこと。
【００８８】
最良の類似性分子としてＰＳＡを使用すると、癌で発生する悪性細胞の漸増負荷および間質破壊は、血清ＳＧＰ２８抗原レベルを、１以上の臨床的に関連する因子（例えば、臨床的病期、腫瘍体積、組織学的段階、ならびに莢膜穿孔および精嚢侵襲の存在）と正に相関させるようである。なぜなら、ＳＧＰ２８もまた、組織発現の制限されたパターン（前立腺を含む）を示す分泌分子であるからである。経時的な血清ＳＧＰ２８測定は、さらなる情報を提供することが予期され、ここでＳＧＰ２８の増加は進行を反映することが予期され、そして増加速度は、攻撃性と相関することが予期される。同様に、血清ＳＧＰ２８の減少は、緩徐に増殖している腫瘍または退行している腫瘍を反映することが予期される。血清中におけるＳＧＰ２８の同定は、腫瘍の開始および初期の病気を検出するために有用であり得る。外科手術または治療を経験した患者において、血清ＳＧＰ２８レベルは、処置応答および潜在的再発をモニタリングするために有用である。
【００８９】
（ＳＧＰ２８およびその産物の状態のモニタリング）
個体におけるＳＧＰ２８遺伝子およびＳＧＰ２８遺伝子産物の状態を評価するアッセイは、この個体に由来する生物学的サンプルの増殖または腫瘍能力に関する情報を提供し得る。例えば、ＳＧＰ２８  ｍＲＮＡは、正常組織に比べて前立腺癌においてかなり多く発現されるので、生物学的サンプル中のＳＧＰ２８  ｍＲＮＡ転写物またはタンパク質の相対レベルを評価するアッセイは、ＳＧＰ２８調節不全と関連する疾患（例えば、癌）を診断するために使用され得、そして適切な治療選択肢を規定するに有用である予後情報を提供し得る。同様に、生物学的サンプルにおけるＳＧＰ２８ヌクレオチドおよびアミノ配列の完全性を評価するアッセイもまた、この状況において使用され得る。
【００９０】
ＳＧＰ２８  ｍＲＮＡが前立腺癌においてかなり多く発現され、そして正常組織においてほとんど発現されないという知見は、この遺伝子が細胞増殖の調節不全に関連するという証拠を提供し、それによってこの遺伝子およびその産物を、当業者がＳＧＰ２８調節不全に関連する疾患を有することが疑われる個体由来の生物学的サンプルを評価するために使用し得る標的として同定する。別の例において、ＳＧＰ２８の発現が通常、前立腺および卵巣に限定されるので、転移の指標としてＳＧＰ２８発現を検出するために、他の組織から採取した生物学的サンプルを評価し得る。この状況において、ＳＧＰ２８遺伝子およびその産物の発現状態の評価は、組織サンプルに潜在的な疾患に関する情報を得るために使用され得る。この状況における用語「発現状態」は、遺伝子およびその産物の発現、機能および調節（例えば、ｍＲＮＡ発現レベル、発現された遺伝子産物（例えば、核酸およびアミノ酸配列）の完全性、ならびにこれらの分子に対する転写改変および翻訳改変）に関与する種々の因子を広範にいうために使用される。
【００９１】
ＳＧＰ２８の発現状態は、特定の疾患の状態、進行および／または腫瘍攻撃性に対する感受性を推定するために有用な情報を提供し得る。本発明は、ＳＧＰ２８発現状態を決定し、そしてＳＧＰ２８を発現する癌（例えば、前立腺癌）を診断するための方法およびアッセイを提供する。患者のサンプルにおけるＳＧＰ２８発現状態は、当該分野で周知の多数の手段（免疫組織化学的分析、インサイチュハイブリダイゼーション、レーザ捕捉マイクロ精査（ｍｉｃｒｏ−ｄｅｓｓｅｃｔｅｄ）サンプルに対するＲＴ−ＰＣＲ分析、臨床サンプルおよび細胞株のウエスタンブロット分析、ならびに組織アレイ分析が挙げられるがこれらに限定されない）によって分析され得る。ＳＧＰ２８遺伝子および遺伝子産物の発現状態を評価するための代表的なプロトコルは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔｓ  ２［Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ］，４［Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ］，１５［Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ］および１８［ＰＣＲ  Ａｎａｌｙｓｉｓ］，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｕｌら（編）（１９９５）に見出され得る。
【００９２】
１つの局面において、本発明は、細胞増殖の調節不全と関連する疾患（例えば、過形成または癌）を有すると疑われる個体に由来する試験組織サンプル中の細胞によって発現されるＳＧＰ２８遺伝子産物の状態を決定して、次いでそのように決定された状態を、対応する正常サンプル中のＳＧＰ２８遺伝子産物の状態に対して比較することによってＳＧＰ２８遺伝子産物をモニタリングするための方法を提供し、ここで正常サンプルと比較した試験サンプルにおける異常または改変されたＳＧＰ２８遺伝子産物の存在は、この個体の細胞において細胞増殖の調節不全の存在を指標を提供する。
【００９３】
本発明はさらに、調節不全細胞成長の証拠について生物学的サンプルを試験する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、生物学的サンプル中のＳＧＰ２８の状態を、対応する正常サンプル中のＳＧＰ２８の状態を比較する工程を包含し、ここで生物学的サンプル中のＳＧＰ２８の状態の変更が、調節不全細胞成長と関連する。生物学的サンプル中のＳＧＰ２８の状態は、例えば、ＳＧＰ２８ｍＲＮＡ発現またはＳＧＰ２８タンパク質発現のレベルを試験することにより評価され得る。１つの実施形態において、ＳＧＰ２８の状態の変更は、ＳＧＰ２８発現細胞が通常は存在しない組織由来の生物学的サンプル中のＳＧＰ発現細胞の存在により同定される。
【００９４】
別の局面において、本発明は、個体における癌の存在の決定に有用なアッセイを提供する。このアッセイは、対応する正常細胞または組織における発現レベルと比べて、試験細胞サンプルまたは組織サンプルにおけるＳＧＰ２８  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現における有意な増加を検出する工程を包含する。ＳＧＰ２８  ｍＲＮＡの存在は、例えば、組織サンプル（結腸、肺、前立腺、膵臓、膀胱、乳房、卵巣、頸部、精巣、頭部および首、脳、胃、骨などが挙げられるが、これらに限定されない）において評価され得る。任意のこれらの組織におけるＳＧＰ２８の有意な発現の存在は、これらの癌の発生、存在および／または重篤度、または別の組織に起源を有する癌の転移を示すために有用であり得る。なぜなら、対応する正常組織は、ＳＧＰ２８  ｍＲＮＡを発現しないか、またはこれを低レベルで発現するからである。
【００９５】
関連する実施形態において、ＳＧＰ２８発現状態は、核酸レベルではなくタンパク質レベルで決定され得る。例えば、このような方法またはアッセイは、試験組織サンプル中の細胞によって発現されるＳＧＰ２８タンパク質のレベルを決定する工程、およびそのように決定されたレベルを、対応する正常サンプルにおいて発現されるＳＧＰ２８のレベルに対して比較する工程を包含する。１つの実施形態において、ＳＧＰ２８タンパク質の存在は、例えば、免疫組織化学方法を使用して評価される。ＳＧＰ２８タンパク質発現を検出し得るＳＧＰ２８抗体または結合パートナーが、この目的のために、当該分野で周知の種々のアッセイ形式で使用され得る。
【００９６】
他の関連する局面において、これらの分子の構造における混乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定するために、生物学的サンプル中のＳＧＰ２８ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得る。このような実施形態は、有用である。なぜなら、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における混乱は、増殖調節不全の表現型と関連する多くのタンパク質で観察されるからである（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（８）：３６９〜３７８（１９９９）を参照のこと）。この状況において、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における混乱を観察するための広範な種々のアッセイが、当該分野において周知である。例えば、ＳＧＰ２８遺伝子産物の核酸配列またはアミノ酸配列のサイズおよび構造は、本明細書中で議論されるノーザン、サザン、ウエスタン、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定プロトコルによって観察され得る。さらに、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における混乱を観察するための他の方法（例えば、一本鎖高次構造多型分析）が、当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，３８２，５１０号および同第５，９５２，１７０号を参照のこと）。
【００９７】
別の実施形態において、生物学的サンプル中のＳＧＰ２８遺伝子のメチル化状態を試験し得る。遺伝子の５’調節領域におけるＣｐＧ島の異常な脱メチル化および／または過メチル化（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）はしばしば、不死化され形質転換された細胞において生じ、そして様々な遺伝子の改変された発現を生じ得る。例えば、パイクラスのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（正常な前立腺において発現されるが、前立腺癌の９０％より多くでは発現されないタンパク質）のプロモーターの過メチル化は、この遺伝子の転写を永久的に止めるようであり、前立腺癌において最も頻繁に検出されるゲノム変化である（Ｄｅ  Ｍａｒｚｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５（６）：１９８５〜１９９２）。さらに、この変化は、高度な前立腺上皮新形成（ＰＩＮ）の場合の少なくとも７０％の場合に存在する（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．，１９９８，７：５３１〜５３６）。
【００９８】
別の例において、ＬＡＧＥ−Ｉ腫瘍特異的遺伝子（これは、正常な前立腺において発現しないが、２５〜５０％の前立腺癌において発現する）の発現は、リンパ芽球腫細胞中のデオキシアザシチジンによって引き起こされ、このことは腫瘍発現が脱メチル化に起因することを示唆している（Ｌｅｔｈｅら、１９９８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７６（６）：９０３〜９０８）。この状況において、遺伝子のメチル化状態を試験するための様々なアッセイが、当該分野で周知である。例えば、サザンハイブリダイゼーションアプローチにおいて、ＣｐＧ島の全メチル化状態を評価するために、メチル化ＣｐＧ部位を含む配列を切断し得ないメチル化感受性制限酵素を使用し得る。
【００９９】
さらに、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）は、所定の遺伝子のＣｐＧ島に存在する全てのＣｐＧ部位のメチル化状態を迅速にプロフィールし得る。この手順は、重亜硫酸ナトリウムによるＤＮＡの最初の改変（これは、全てのメチル化されていないシトシンをウラシルに変換する）、続いてメチル化されていないＤＮＡに対してメチル化されたＤＮＡに特異的なプライマーを使用する増幅を包含する。メチル化の妨害を包含するプロトコルはまた、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔｓ  １２，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５の実施例に見出され得る。
【０１００】
別の関連する実施形態において、本発明は、個体における癌の存在の決定に有用なアッセイを提供する。このアッセイは、対応する正常細胞または組織における発現レベルに対して、試験細胞サンプルまたは組織サンプル中に発現されるＳＧＰ２８交互スプライシング改変体における有意な変化を検出する工程を包含する。ＳＧＰ２８交互スプライシング改変体のモニタリングは、有用である。なぜなら、タンパク質の交互スプライシングの変化は、癌の進行を引き起こす一連の事象における段階の１つとして示唆されるからである（例えば、Ｇａｒｓｔｅｎｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５（２５０：３０５９〜３０６５（１９９７）を参照のこと）。
【０１０１】
遺伝子増幅は、ＳＧＰ２８の状態を評価するさらなる方法を提供する。遺伝子増幅は、サンプルにおいて、例えば、本明細書中に提供される配列に基づいて、適切な標識プローブを使用して、従来のサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するノーザンブロッティング［Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１〜５２０５（１９８０）］、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインサイチュハイブリダイゼーションによって直接的に測定され得る。あるいは、特定の二重鎖（ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む）を認識し得る抗体が、用いられ得る。次いで、この抗体が、標識され得、そしてアッセイ（ここで二重鎖が表面に結合され、その結果、この表面上での二重鎖の形成により、二重鎖に結合した抗体の存在が検出され得る）が、行われ得る。
【０１０２】
上記で議論される組織に加えて、末梢血が、ＳＧＰ２８発現を検出するためにＲＴ−ＰＣＲを使用して、癌細胞（前立腺癌を含むがこれに限定されない）の存在について従来通りにアッセイされ得る。ＲＴ−ＰＣＲにより増幅可能なＳＧＰ２８  ｍＲＮＡの存在は、癌の存在の指標を提供する。末梢血中の腫瘍細胞についてのＲＴ−ＰＣＲ検出アッセイは、多数のヒト固形腫瘍の診断および管理における使用について現在評価されている。前立腺癌の分野において、これらは、ＰＳＡおよびＰＳＭを発現する細胞の検出のためのＲＴ−ＰＣＲアッセイを含む（Ｖｅｒｋａｉｋら、１９９７、Ｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．２５：３７３〜３８４：Ｇｈｏｓｓｅｉｎら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３：１１９５〜２０００；Ｈｅｓｔｏｎら，１９９５，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１：１６８７〜１６８８）。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、当該分野で周知である。
【０１０３】
本発明の関連する局面は、個体における癌の発症の感受性の推定に関する。１つの実施形態において、癌に対する感受性を推定するための方法は、組織サンプル中のＳＧＰ２８  ｍＲＮＡまたはＳＧＰ２８タンパク質を検出する工程であって、その存在が、癌に対する感受性を示し、ここで存在するＳＧＰ２８  ｍＲＮＡ発現の程度が感受性の程度に比例する、工程を提供する。特定の実施形態において、前立腺組織中のＳＧＰ２８の存在が、試験され、ここでこのサンプル中のＳＧＰ２８の存在は、前立腺癌の感受性（または前立腺腫瘍の発生もしくは存在）の指標を提供する。密接に関連する実施形態において、これらの分子の構造における混乱（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定するために、生物学的サンプルにおけるＳＧＰ２８ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得、ここでサンプル中のＳＧＰ２８遺伝子産物における１以上の混乱の存在が、癌の感受性（または腫瘍の発生もしくは存在）の指標を提供する。
【０１０４】
本発明のなお別の関連する局面は、腫瘍攻撃性を測定するための方法に関する。１つの実施形態において、腫瘍の攻撃性を測定するための方法は、腫瘍サンプル中の細胞によって発現されるＳＧＰ２８  ｍＲＮＡまたはＳＧＰ２８タンパク質のレベルを決定する工程、そのように決定されたレベルを、同じ個体から採取された対応する正常組織または正常組織参照サンプル中に発現されるＳＧＰ２８  ｍＲＮＡまたはＳＧＰ２８タンパク質のレベルに対して比較する工程であって、ここで正常サンプルに対する腫瘍サンプルにおけるＳＧＰ２８  ｍＲＮＡまたはＳＧＰ２８タンパク質発現の程度が、攻撃性の程度を示す、工程を包含する。特定の実施形態において、前立腺腫瘍の攻撃性は、ＳＧＰ２８が腫瘍細胞中に発現される程度を決定することによって評価され、ここでより高い発現レベルは、より攻撃性の腫瘍を示す。密接に関連する実施形態において、これらの分子の構造における混乱（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定するために、生物学的サンプルにおけるＳＧＰ２８ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得、ここで１以上の混乱の存在は、より攻撃性の腫瘍を示す。
【０１０５】
本発明のなお別の関連する局面は、個体の悪性疾患の進行を経時的に観察するための方法に関する。１つの実施形態において、個体における悪性疾患の進行を経時的に観察するための方法は、腫瘍サンプル中の細胞によって発現されるＳＧＰ２８  ｍＲＮＡまたはＳＧＰ２８タンパク質のレベルを決定する工程、そのように決定されたレベルを、同じ個体から異なる時点に採取された等価な組織サンプル中に発現されるＳＧＰ２８  ｍＲＮＡまたはＳＧＰ２８タンパク質のレベルに対して比較する工程であって、ここで腫瘍サンプルにおける経時的なＳＧＰ２８  ｍＲＮＡまたはＳＧＰ２８タンパク質発現の程度が、癌の進行に関する情報を提供する、工程を包含する。特定の実施形態において、癌の進行は、腫瘍細胞におけるＳＧＰ２８発現が変化する程度を経時的に決定することによって評価され、ここでより高い発現レベルは、癌の進行を示す。密接に関連する実施形態において、これらの分子の構造における混乱（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定するために、生物学的サンプル中のＳＧＰ２８ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得、ここで１以上の混乱の存在は、癌の進行を示す。
【０１０６】
上記の診断アプローチは、当該分野で公知の広範な種々の予後プロトコルおよび診断プロトコルのいずれか１つと組み合わされ得る。例えば、本明細書中に開示される本発明の別の実施形態は、組織サンプルの状態を診断し、かつ予後を判定する手段として、ＳＧＰ２８遺伝子およびＳＧＰ２８遺伝子産物の発現（またはＳＧＰ２８遺伝子およびＳＧＰ２８遺伝子産物における混乱）と、悪性疾患に関連する因子との間の一致を観察するための方法に関する。この状況において、悪性疾患に関連する広範な種々の因子（例えば、そうでなければ悪性疾患と関連する遺伝子の発現（ＰＳＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＭ発現を含む））および細胞学的肉眼観察（例えば、Ｂｏｃｋｉｎｇら，Ａｎａｌ  Ｑｕａｎｔ  Ｃｙｔｏｌ．６（２）：７４〜８８（１９８４）；Ｅｐｔｓｅｉｎ，Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９５年２月；２６（２）２２３〜９（１９９５）；Ｔｈｏｒｓｏｎら，Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９８；１１（６）：５４３〜５１；Ｂａｉｓｄｅｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ．２３（８）：９１８〜２４（１９９９）を参照のこと）が、利用され得る。ＳＧＰ２８遺伝子およびＳＧＰ２８遺伝子産物の発現（またはＳＧＰ２８遺伝子およびＳＧＰ２８遺伝子産物における混乱）と、悪性疾患に関連するさらなる因子との間の一致を観察するための方法が、有用である。なぜなら、例えば、一致する一連のまたは一群の特定の因子の存在は、組織サンプルの状態を診断し、かつ予後を判定するために重要な情報を提供するからである。
【０１０７】
代表的な実施形態において、ＳＧＰ２８遺伝子およびＳＧＰ２８遺伝子産物の発現（またはＳＧＰ２８遺伝子およびＳＧＰ２８遺伝子産物における混乱）と、悪性疾患に関連する因子との間の一致を観察するための方法は、組織サンプルにおいて、ＳＧＰ２８  ｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現を検出する工程、組織サンプルにおいてＰＳＡ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現を検出する工程、ならびにＳＧＰ２８  ｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現とＰＳＡ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現との一致を観察する工程を包含する。特定の実施形態において、前立腺組織におけるＳＧＰ２８  ｍＲＮＡおよびＰＳＡ  ｍＲＮＡの発現が、試験される。好ましい実施形態において、サンプルにおけるＳＧＰ２８  ｍＲＮＡ過剰発現とＰＳＡ  ｍＲＮＡ過剰発現との一致は、前立腺癌、前立腺癌感受性、または前立腺腫瘍の発生もしくは存在の指標を提供する。
【０１０８】
ＳＧＰ２８  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を検出および定量するための方法が、本明細書中に記載され、そして標準的な核酸およびタンパク質の検出技術および定量技術の使用が、当該分野において周知である。ＳＧＰ２８  ｍＲＮＡの検出および定量のための標準的な方法としては、標識されたＳＧＰ２８リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、ＳＧＰ２８ポリヌクレオチドプローブを使用するノーザンブロットおよび関連する技術、ＳＧＰ２８に特異的なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ分析、ならびに他の増幅型検出方法（例えば、分岐ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）が挙げられる。特定の実施形態において、半定量的ＲＴ−ＰＣＲが、以下の実施例に記載されるように、ＳＧＰ２８  ｍＲＮＡ発現を検出および定量するために使用され得る。ＳＧＰ２８を増幅し得る任意の数のプライマー（本明細書中に詳細に記載される種々のプライマーセットを含むがこれらに限定されない）が、この目的のために使用され得る。タンパク質の検出および定量のための標準的な方法が、この目的のために使用され得る。特定の実施形態において、野生型ＳＧＰ２８タンパク質と特異的に反応するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が、生検組織の免疫組織化学的アッセイにおいて使用され得る。ＳＧＰ２８タンパク質に対する抗体はまた、従来の技術（例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）および／またはＥＬＩＳＡを使用して、患者検体（例えば血液、尿、精液または他のサンプル）におけるＳＧＰ２８を検出するために使用され得る。、
（ＳＧＰ２８と相互作用する分子の同定）
本明細書中に開示されるＳＧＰ２８タンパク質配列により、当業者は、種々の当該分野で受け入れられるプロトコルのいずれか１つを通じて、ＳＧＰ２８と相互作用するタンパク質、低分子およびその他の因子ならびにＳＧＰ２８により活性化される経路を同定し得る。例えば、種々のいわゆる相互作用捕捉系（「ツーハイブリッドアッセイ」ともいわれる）のうちの１つを利用し得る。このような系において、相互作用する分子は、転写因子およびレポーター遺伝子の直接的な発現を再構成し、次いで、その発現をアッセイする。代表的な系は、真核生物転写アクチベーターの再構成を通じて、インビボでタンパク質間相互作用を同定し、そして例えば、米国特許第５，９５５，２８０号、同第５，９２５，５２３号、同第５，８４６，７２２号および同第６，００４，７４６号に開示されている。
【０１０９】
あるいは、ペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって、ＳＧＰ２８タンパク質配列と相互作用する分子を同定し得る。このような方法において、選択されたレセプター分子（例えば、ＳＧＰ２８）に結合するペプチドが、アミノ酸の無作為または制御された収集物をコードするライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。このライブラリーによってコードされるペプチドは、バクテリオファージコートタンパク質の融合タンパク質として発現され、次いで、バクテリオファージ粒子が、目的のレセプターに対してスクリーニングされる。それによって、広範な種々の用途（例えば、治療用試薬または診断用試薬）を有するペプチドが、予期されるリガンド分子またはレセプター分子の構造に関する任意の予備情報を必要することなく同定され得る。ＳＧＰ２８タンパク質配列と相互作用する分子を同定するために使用され得る代表的なペプチドライブラリーおよびスクリーニング方法が、例えば、米国特許第５，７２３，２８６号および同第５，７７３，７３１号に開示されている。
【０１１０】
あるいは、ＳＧＰ２８を発現する細胞株が、ＳＧＰ２８によって媒介されるタンパク質間相互作用を同定するために使用され得る。この可能性は、他の研究者によって示されるような免疫沈降技術（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＢＪら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９，２６１：６４６〜５１）を使用して試験され得る。代表的には、ＳＧＰ２８タンパク質は、抗ＳＧＰ２８抗体を使用して、ＳＧＰ２８を発現している前立腺癌細胞株から免疫沈降され得る。あるいは、Ｈｉｓタグに対する抗体が、ＳＧＰ２８を発現するように操作された細胞株において使用され得る（上記のベクター）。免疫沈降した複合体は、ウエスタンブロッティング、タンパク質の35Ｓ−メチオニン標識、タンパク質微量配列決定、銀染色および２次元ゲル電気泳動のような手順によってタンパク質の結合に対して試験され得る。
【０１１１】
ＳＧＰ２８と相互作用する低分子は、このようなスクリーニングアッセイにより同定され得る。例えば、ＳＧＰ２８の機能を増害する低分子（ＳＧＰ２８の細胞に結合する能力ならびに／または腫瘍形成、進行、移動および／もしくはアポトーシスを調節する能力を妨害する分子を含む）が同定され得る。代表的な方法は、例えば、米国特許第５，９２８，８６８号に議論されており、そして少なくとも１つのリガンドが低分子であるハイブリッドリガンドを形成するための方法が挙げられる。例示的な実施形態において、このハイブリッドリガンドは、細胞中に導入され、次いでこの細胞は、第１および第２の発現ベクターを含む。各発現ベクターは、転写モジュールについてのコード配列に連結された標的タンパク質をコードするハイブリッドタンパク質を発現するためのＤＮＡを含む。細胞は、レポーター遺伝子をさらに含み、その発現は、第１および第２のハイブリッドタンパク質の互いに対する近接性の条件下に置かれており、ハイブリッドリガンドが、両方のハイブリッドタンパク質上の標的部位に結合する場合のみに、事象が生じる。レポーター遺伝子を発現するそれらの細胞が選択され、そして未知の低分子または未知のハイブリッドタンパク質が、同定される。
【０１１２】
本発明の代表的な実施形態は、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８アミノ酸配列と相互作用する分子についてスクリーニングする方法からなる。この方法は、分子集団とＳＧＰ２８アミノ酸配列とを接触させる工程、相互作用を促進する条件下で、分子集団とＳＧＰ２８アミノ酸配列とを相互作用させる工程、ＳＧＰ２８アミノ酸配列と相互作用する分子の存在を決定する工程、次いでＳＧＰ２８アミノ酸配列と相互作用する分子からＳＧＰ２８アミノ酸配列と相互作用しない分子を分離する工程を包含する。特定の実施形態において、この方法はさらに、ＳＧＰ２８アミノ酸配列と相互作用する分子を精製する工程を包含する。好ましい実施形態において、ＳＧＰ２８アミノ酸配列は、ペプチドのライブラリーと接触される。ＳＧＰ２８の機能を調節する分子を同定するためのさらなるアッセイは、以下の実施例に記載される。
【０１１３】
（治療方法および組成物）
ＳＧＰ２８の前立腺癌タンパク質としての同定は、前立腺癌の処置に対する多くの治療アプローチを開放する。上記で議論したように、ＳＧＰ２８は、分泌タンパク質であり、かつ他の細胞および分子とのその相互作用は、前立腺環境の調節および癌の開始、発生および／または進行において役割を果たすようである。ＳＧＰ２８は、ＳＧＰ２８タンパク質の活性の阻害、ＳＧＰ２８タンパク質の他の細胞および分子との結合もしくは会合の阻害、ＳＧＰ２８の転写もしくは翻訳の阻害を目的としたアプローチ、ならびに／またはＳＧＰ２８に基づく癌ワクチンの使用による治療のために標的化され得る。従って治療ストラテジーは、この分子の機能を阻害するかまたはＳＧＰ２８分子事態を標的化するように設計され得る。
【０１１４】
ＳＧＰ２８の発現プロフィールは、ＭＡＧＥ、ＰＳＡ、およびＰＭＳＡを暗示し、ＭＡＧＥ、ＰＳＡ、およびＰＭＳＡは、黒色腫および他の癌にて上方調節される、組織特異的遺伝子である（Ｖａｎ  ｄｅ  ＥｙｎｄｅおよびＢｏｏｎ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｒｅｓ．２７：８１〜８６、１９９７）。癌におけるその組織特異的発現および高レベル発現に起因して、これらの分子は、癌ワクチンについての標的として現在調査されている（Ｄｕｒｒａｎｔ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ８：７２７〜７３３、１９９７；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７２：９７２〜９７６、１９９７）。ＳＧＰ２８の発現パターンは、ＳＧＰ２８が同様に、前立腺癌に対する癌ワクチンアプローチのための潜在的標的であるという証拠を提供する。なぜなら、その発現が大部分の正常な組織で検出されないからである。潜在的レセプターとしてのその構造的特徴もまた、ＳＧＰ２８が、低分子標的であり得ること、ならびに抗体に基づく治療ストラテジーのための標的であり得ることの証拠を提供する。この治療ストラテジーは、分子のカルシウム輸送機能を阻害するかまたはＳＧＰ２８分子自体を標的化するように設計され得る。
【０１１５】
従って、ＳＧＰ２８の特定のモチーフを標的とする治療アプローチまたはＳＧＰ２８タンパク質の活性を阻害することを目指す治療アプローチが、前立腺癌、およびＳＧＰ２８を発現する他の癌に罹患する患者に有用であることが予期される。ＳＧＰ２８タンパク質の活性を阻害することを目指す治療アプローチは、一般的に、２つの種類に分類される。１つの種類は、その結合パートナーまたは他のタンパク質との、ＳＧＰ２８タンパク質の結合または会合を阻害するための、種々の方法を包含する。別の種類は、ＳＧＰ２８遺伝子の転写またはＳＧＰ２８  ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための、種々の方法を包含する。
【０１１６】
（抗体に基づく治療のための標的としてのＳＧＰ２８）
ＳＧＰ２８分子は、抗体に基づく治療ストラテジーのための魅力的な標的である。ＳＧＰ２８は大部分の正常な細胞では発現されず、癌細胞にて発現されるので、ＳＧＰ２８免疫反応性組成物の全身投与は、非標的器官および非標的組織へのその免疫治療分子の結合により引き起こされる、毒性効果、非特異的効果および／または非標的効果のない、良好な感受性を示すことが予期される。ＳＧＰ２８と特異的に反応性である抗体は、毒素または治療薬剤との結合体、あるいは結合パートナーとのＳＧＰ２８の相互作用を阻害し得る裸の抗体のいずれかとして、ＳＧＰ２８を発現する癌を全身的に処置するために有用であり得る。
【０１１７】
ＳＧＰ２８抗体は、この抗体が循環性微小転移、および／または樹立された転移において、原発腫瘍においてＳＧＰ２８に結合し、かつＳＧＰ２８機能を排除するように、患者に導入され得る。腫瘍血管化の程度は、送達アプローチが推奨される誘導を提供し得る。同様に、疾患の悪性度分類および／または病期は、この点において有用な情報を提供すると期待される。例えば、より高い悪性度分類、より進行した腫瘍は、より多く転移の因子を供給するようであり得、転移の発生を処置または予防するために、全身投与を示唆する。
【０１１８】
抗ＳＧＰ２８抗体を使用する癌の免疫治療は、以下を含むがこれらに限定されない他の型の癌の処置において良好に使用されている種々のアプローチから生成される教示に従い得る：結腸癌（Ａｒｌｅｎら、１９９８、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１３３−１３８）、多発性骨髄腫（Ｏｚａｋｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ  ９０：３１７９−３１８６；Ｔｓｕｎｅｎａｒｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ  ９０：２４３７−２４４４）、胃癌（Ｋａｓｐｒｚｙｋら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：２７７１−２７７６）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：９３−１０１）、白血病（Ｚｈｏｎｇら、１９９６、Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．２０：５８１−５８９）、結腸直腸癌（Ｍｏｕｎら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：６１６０−６１６６）；Ｖｅｌｄｅｒｓら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：４３９８−４４０３）、および乳癌（Ｓｈｅｐａｒｄら、１９９１、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１１７−１２７）。いくつかの治療アプローチは、毒素に対する裸の抗体の結合化（例えば、抗ＣＤ２０抗体に対する１３１Ｉの結合化（例えば、Ｂｅｘｘａｒ、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）が挙げられるが、一方、他のアプローチは、抗体および他の治療薬の同時の投与（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  ＴＭ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）とパクリタキセル（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．））を含む。前立腺癌の処置については、例えば、ＳＧＰ２８抗体は、照射、化学療法、またはホルモンの除去と組合せて、投与され得る。
【０１１９】
ＳＧＰ２８抗体治療は、全てのステージの癌について有用であり得るが、抗体治療は、進行したかまたは転移性の癌において特に適切であり得る。本発明の抗体治療を用いる処置は、以前に１回以上の化学療法を受けた患者について示され得、一方、本発明の抗体治療と化学療法または照射のレジメンとの組合せが、化学療法による処置を受けていない患者について好ましくあり得る。さらに、抗体治療は、付随する化学療法の減少した投与量の使用を可能にし得、特に、化学療法薬の毒性に寛容ではない患者について、非常に良好である。
【０１２０】
何人かの癌患者については、好ましくは、腫瘍組織の免疫組織化学的な評価、定量的なＳＧＰ２８の画像化、またはＳＧＰ２８の発現の存在および程度を確実に示し得る他の技術を使用して、ＳＧＰ２８の発現の存在およびその発現のレベルを評価することが所望され得る。腫瘍の生検または外科的な標本の免疫組織化学的な分析が、この目的のために好ましくあり得る。腫瘍組織の免疫組織化学的分析のための方法は、当該分野で周知である。
【０１２１】
前立腺および他の癌を処置することにおいて有用である抗ＳＧＰ２８モノクローナル抗体として、腫瘍に対する強力な免疫応答を開始し得るもの、および直接細胞傷害性であり得るものが挙げられる。これに関して抗ＳＧＰ２８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、補体によって媒介される細胞の細胞傷害性または抗体依存性の細胞の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の機能（これらの両方ともが、エフェクター細胞のＦｃレセプター部位または補体タンパク質との相互作用のために、イムノグロブリン分子のインタクトなＦｃ部分を必要とする）のいずれかによって、腫瘍細胞の溶解を誘発し得る。さらに、腫瘍の増殖に対して直接的な生物学的効果を発揮する抗ＳＧＰ２８  ｍＡｂが、本発明の実施において有用である。このような直接的な細胞傷害性のｍＡｂが作用し得る可能性のある機構として、細胞の増殖の阻害、細胞の分化の調節、腫瘍の血管形成因子のプロフィールの調節、およびアポトーシスの誘導が挙げられる。特定の抗ＳＧＰ２８  ｍＡｂが抗腫瘍効果を発揮する機構は、ＡＤＣＣ、ＡＤＭＭＣ、補体によって媒介される細胞の溶解などを決定するように設計されたかなり多数のインビトロでのアッセイを使用して、当該分野で一般的に公知であるように評価され得る。
【０１２２】
マウスもしくは他の非ヒトモノクローナル抗体、またはヒト／マウスのキメラｍＡｂの使用は、いくつかの患者において、中程度〜強力な免疫応答を誘導し得る。いくつかの例においては、これは、循環からの抗体のクリアランスおよび減少した効率を生じる。最も重篤な例においては、このような免疫応答は、腎不全を生じ得る可能性のある免疫複合体の多量の形成を導き得る、従って、本発明の治療方法の実施において使用される好ましいモノクローナル抗体は、完全なヒトまたはヒト化されたもののいずれかであり、そして高い親和性で標的のＳＧＰ２８抗原に対して特異的に結合するが、患者において低い抗原性を示すかまたは抗原性を示さないものである。
【０１２３】
本発明の治療方法は、単一の抗ＳＧＰ２８  ｍＡｂの、ならびに種々のｍＡｂの組合せまたは混合物の投与を意図する。このようなｍＡｂの混合物は、それらが種々のエピトープを標的化し、種々のエフェクター機構を利用するか、または免疫エフェクター機能に依存するｍＡｂと細胞傷害性のｍＡｂとを直接結合するｍＡｂを含む限りにおいて、特定の利点を有し得る。組合せ中のこのようなｍＡｂは、相乗的治療効果を示し得る。さらに抗ＳＧＰ２８  ｍＡｂの投与は、以下を含むがこれらに限定されない他の治療薬と組合せられ得る：種々の化学療法剤、アンドロゲンブロッカー、および免疫調節因子（例えば、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）抗ＳＧＰ２８  ｍＡｂは、それらの「裸の」形態または結合していない形態で投与され得るか、あるいはそれらに対して結合体化した治療薬を有し得る。
【０１２４】
抗ＳＧＰ２８抗体処方物は、腫瘍部位へ抗体を送達し得る任意の経路を通じて投与され得る。可能性のある有効な投与経路として、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内などが挙げられるが、これらに限定されない。処置は一般的には、静脈内注射（ＩＶ）（代表的には、約０．１から約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量）のような受容可能な投与経路を通じる、抗ＳＧＰ２８抗体調製物の繰り返しの投与を含む。１週間あたりで１０〜５００ｍｇの範囲のｍＡｂの用量が、有効であり得、そして十分に寛容化され得る。
【０１２５】
転移性の乳癌の処置におけるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ  ｍＡｂでの臨床試験に基づいて、約４ｍｇ／ｋｇ患者体重のＩＶの最初の負荷用量、続く約２ｍｇ／ｋｇＩＶの抗ＳＧＰ２８  ｍＡｂ調製物の毎週の用量が、受容可能な用量レジメンを示し得る。好ましくは、最初の負荷用量は、９０分以上の注入として投与される。期間維持用量は、最初の用量が十分に寛容化される場合は、３０分以上の注入として投与され得る。しかし、当業者によって理解されるように、種々の因子が、特定の症例における理想的な投与レジメンに影響を与える。このような因子として、例えば、結合親和性および使用されるＡｂまたはｍＡｂの半減期、患者におけるＳＧＰ２８の発現の程度、循環している破棄された（ｓｈｅｄ）ＳＧＰ２８抗原の程度、所望される定常状態の抗体濃度レベル、処置の頻度、ならびに本発明の処置方法と組合せて使用される化学療法剤の影響が挙げられ得る。
【０１２６】
必要に応じて、患者は、最も有効な投与レジメンおよび関連する因子の決定を補助するために、血清中の循環している破棄されたＳＧＰ２８抗原のレベルについて評価されるべきである。このような評価はまた、治療を通じて目的のものをモニタリングするために使用され得、そして他のパラメーター（例えば、前立腺癌治療における血清ＰＳＡレベル）を評価することと組合せて良好である計測治療に有用であり得る。
【０１２７】
（ＳＧＰ２８タンパク質機能の阻害）
本発明は、ＳＧＰ２８のその結合パートナーまたはリガンドに対する結合を阻害する種々の方法および組成物、またはＳＧＰ２８機能を阻害するための他のタンパク質（単数または複数）および方法とのその組合せを含む。
【０１２８】
（組換えタンパク質でのＳＧＰ２８の阻害）
１つのアプローチにおいては、ＳＧＰ２８に結合し得、それによってＳＧＰ２８がその結合パートナー（単数または複数）に対して会合／結合すること、または他のタンパク質（単数または複数）と会合することを妨げ得る、組換え分子が、ＳＧＰ２８機能を阻害するために使用される。このような組換え分子は、例えば、ＳＧＰ２８特異的抗体分子の反応性の部分（単数または複数）を含み得る。特定の実施形態においては、ＳＧＰ２８結合パートナーのＳＧＰ２８結合ドメインが、ヒトのＩｇＧ（例えば、ヒトのＩｇＧ１）のＦｃ部分に対して連結された２つのＳＧＰ２８リガンド結合ドメインを含有している二量体の融合タンパク質中に操作され得る。このようなＩｇＧ部分は、例えば、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、ならびにヒンジ領域を含み得るが、ＣＨ１ドメインは含まない。このような二量体の融合タンパク質は、可溶性の形態で、ＳＧＰ２８の発現に関連している癌（前立腺癌を含むがこれらに限定されない）を罹患している患者に対して投与され得る。ここでは、二量体の融合タンパク質はＳＧＰ２８に特異的に結合し、それによって結合パートナーとのＳＧＰ２８の相互作用をブロックする。このような二量体の融合タンパク質はさらに、公知の抗体連結技術を使用して多量体のタンパク質へと結合させられ得る。
【０１２９】
（細胞内抗体を用いるＳＧＰ２８の阻害）
別のアプローチにおいては、ＳＧＰ２８に特異的に結合する単鎖抗体をコードする組換えベクターが、遺伝子導入技術を通じてＳＧＰ２８を発現する細胞中に導入され得る。ここでは、コードされる単鎖の抗ＳＧＰ２８抗体は、細胞内で発現され、ＳＧＰ２８タンパク質に結合し、そしてそれによってその機能を阻害する。このような細胞内単鎖抗体を操作するための方法は、周知である。このような細胞内抗体はまた、「イントラボディー（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）」としても公知であり、細胞内の特定の部分に対して特異的に標的化され得、それによって処置の阻害活性が集められる場所にわたって制御を提供する。この技術は、当該分野で良好に適用されている（概要については、ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＭａｒａｓｃｏ、１９９５、ＴＩＢＴＥＣＨ、第１３巻）。イントラボディーは、他の豊富な細胞表面レセプターの発現を実質的に排除することが示されている。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：３１３７−３１４１；Ｂｅｅｒｌｉら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：２３９３１−２３９３６；Ｄｅｓｈａｎｅら、１９９４、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：３３２−３３７を参照のこと。
【０１３０】
単鎖抗体は、可撓性のリンカーポリペプチドによって連結された重鎖および軽鎖の可変ドメインを含み、そして単一のポリペプチドとして発現される。必要に応じて、単鎖抗体が、軽鎖の定常領域に対して連結された単鎖の可変領域フラグメントとして発現され得る。周知の細胞内輸送シグナルが、所望される細胞内部分に対して発現されたイントラボディーを正確に標的化するために、このような単鎖抗体をコードする組換えのポリヌクレオチドベクター中に操作され得る。例えば、小胞体（ＥＲ）に対して標的化されたイントラボディーは、リーダーペプチドを、そして必要に応じて、ＫＤＥＬアミノ酸モチーフのようなＣ末端のＥＲ保持シグナルを取り込むように操作され得る。核内で活性を発揮するように意図されたイントラボディーは、核局在化シグナルを含むように操作され得る。脂質部分は、形質膜の細胞質ゾル側にイントラボディーを鎖でつなぐように、イントラボディーに対して連結され得る。イントラボディーはまた、細胞質ゾル中で機能を発揮するように標的化され得る。例えば、細胞質ゾルのイントラボディーは、細胞質ゾル中の因子を隔離するために使用され得、それによってそれらを、それらの天然の細胞性の目的地に対して輸送されることから妨げる。
【０１３１】
１つの実施形態においては、ＳＧＰ２８イントラボディーは、特定のＳＧＰ２８ドメインに対して特異的に結合するように設計される。例えば、ＳＧＰ２８タンパク質に特異的に結合する細胞質ゾルのイントラボディーは、ＳＧＰ２８に関連する分子が核に対する接近を得ることを防止するために使用され得、それによって、それが核内で任意の生物学的活性を発揮することを防止する。
【０１３２】
このような特定の腫瘍細胞について特異的なイントラボディーの発現を指向するために、イントラボディーの転写が、適切な腫瘍特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーの調節制御下に配置され得る。前立腺について特異的なイントラボディーの発現を標的化するために、例えば、ＰＳＡプロモーターおよび／またはプロモーター／エンハンサーが利用され得る（例えば、米国特許第５，９１９，６５２号を参照のこと）。
【０１３３】
（ＳＧＰ２８の転写または翻訳の阻害）
別のクラスの治療アプローチにおいては、本発明は、ＳＧＰ２８遺伝子の転写を阻害するための種々の方法および組成物を提供する。同様に、本発明はまた、タンパク質へのＳＧＰ２８  ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための方法および組成物を提供する。
【０１３４】
１つのアプローチにおいては、ＳＧＰ２８遺伝子の転写を阻害する方法は、ＳＧＰ２８遺伝子をＳＧＰ２８アンチセンスポリヌクレオチドと接触させることを含む。別のアプローチにおいては、ＳＧＰ２８  ｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法は、アンチセンスポリヌクレオチドとＳＧＰ２８  ｍＲＮＡを接触させることを含む。別のアプローチにおいては、ＳＧＰ２８特異的リボザイムが、ＳＧＰ２８メッセージを切断するために使用され得、それによって翻訳が阻害される。このようなアンチセンスおよびリボザイムに基づく方法はまた、ＳＧＰ２８遺伝子の調節領域（例えば、ＳＧＰ２８プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメント）に対して指向され得る。同様に、ＳＧＰ２８遺伝子の転写因子を阻害し得るタンパク質が、ＳＧＰ２８  ｍＲＮＡの転写を阻害するために使用され得る。上記の方法において有用である種々のポリヌクレオチドおよび組成物が、上記に記載されている。転写および翻訳を阻害するためのアンチセンスおよびリボザイム分子の使用は当該分野で周知である。
【０１３５】
ＳＧＰ２８転写活性を妨害することを通じてＳＧＰ２８の転写を阻害する他の因子もまた、ＳＧＰ２８を発現する癌の処置のために有用であり得る。同様に、ＳＧＰ２８のプロセシングを妨害し得る因子が、ＳＧＰ２８を発現する癌の処置に有用であり得る。このような因子を利用する癌の処置方法もまた、本発明の範囲内である。
【０１３６】
（治療ストラテジーについての一般的な考察）
遺伝子導入および遺伝子治療技術が、ＳＧＰ２８を合成する腫瘍細胞に対して治療用のポリヌクレオチド分子（すなわち、アンチセンス、リボザイム、イントラボディーをコードするポリヌクレオチド、および他のＳＧＰ２８阻害分子）を送達するために使用され得る。多数の遺伝子治療アプローチが当該分野で公知である。ＳＧＰ２８アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＳＧＰ２８の転写を妨害し得る因子などをコードする組換えベクターが、このような遺伝子治療アプローチを使用して腫瘍細胞を標的化するために送達させられ得る。
【０１３７】
上記の治療アプローチは、広範の種々の化学療法または放射線治療レジメンの任意の１つと組合せられ得る。これらの治療アプローチもまた、化学療法の減少した投与量および／またはより少ない頻度の投与の使用を、特に、化学療法剤の毒性を十分に寛容化しない患者において可能にし得る。
【０１３８】
特定の組成物（例えば、アンチセンス、リボザイム、イントラボディー）の抗腫瘍活性、またはこのような組成物の組合せが、種々のインビトロおよびインビボでのアッセイシステムを使用して評価され得る。治療能力を評価するためのインビトロでのアッセイとして、細胞増殖アッセイ、軟らかい寒天アッセイ、および腫瘍促進活性を示す他のアッセイ、治療組成物が結合パートナーに対するＳＧＰ２８の結合を阻害する程度を決定し得る結合アッセイなどが挙げられる。
【０１３９】
インビボでは、ＳＧＰ２８治療組成物の効果は、適切な動物モデルにおいて評価され得る。例えば、異種の前立腺癌のモデル（ここでは、ヒトの前立腺癌細胞の移植片または継代された異種移植片組織が、免疫和解された動物（例えば、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウス）中に導入される）が、前立腺癌に対する関係において適切であり、そして記載されている（Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：４０２−４０８）。例えば、１９９８年４月２３日に公開された、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９８／１６６２８号、Ｓａｗｙｅｒｓらは、初代の腫瘍の発達、微小な転移、および後期の疾患の特徴である骨芽細胞の転移の形成を要約し得るヒトの前立腺癌の種々の異種移植片モデルを記載している。効率は、腫瘍形成、腫瘍の退行、または転移などの阻害を測定するアッセイを使用して推定され得る。以下の実施例をもまた参照のこと。
【０１４０】
インビボでのアッセイにおいては、アポトーシスの促進のクオリファイもまた、可能性のある治療組成物を評価することにおいて有用であり得る。１つの実施形態においては、治療組成物で処置された生存しているマウスに由来する異種移植片が、アポトーシス性の病巣の存在について試験され得、そして処置されていないコントロールの異種移植片を保有しているマウスに対して比較され得る。アポトーシス性の病巣が処置されたマウスの腫瘍中で見出される程度は、組成物の治療効率の指標を提供する。
【０１４１】
上記の方法の実施において使用される治療用組成物は、所望される送達方法のための適切なキャリアを含有している薬学的組成物（ワクチン組成物を含む）中に処方され得る。適切なキャリアとして、治療組成物とともに混合された場合に、治療組成物の抗腫瘍機能を保持し、そして患者の免疫システムと反応しない任意の材料が挙げられる。例として、滅菌のリン酸緩衝化生理食塩水、静菌水などのような、任意の多数の標準的な薬学的キャリアなどが挙げられるがこれらに限定されない（一般的には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ａ．Ｏｓａｌ．編、１９８０を参照のこと）。
【０１４２】
治療用処方物は可溶化され得、そして、腫瘍部位に治療用組成物を送達し得る任意の経路を通じて投与され得る。可能性のある有効な投与経路として、静脈内、非経口、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内、器官内、正常位などが挙げられるが、これらに限定されない。静脈内注射のための好ましい処方物として、保存された静菌水、滅菌の保存されていない水、および／または０．９％の注射のための滅菌の塩化ナトリウム（ＵＳＰ）を含有しているポリビニルクロライドもしくはポリエチレンバッグ中に稀釈された溶液中の治療用組成物が挙げられる。治療用タンパク質調製物は、凍結乾燥させられ得、そして滅菌の散剤として、好ましくは、減圧下で保存され、次いで、注射の前に、例えば、ベンジルアルコール保存料を含有している静菌水中でまたは滅菌水中で再構成され得る。
【０１４３】
以下の方法を使用する癌の処置のための投与量および投与プロトコールは、方法および標的の癌によって変化し、そして、当該分野で示されている多数の他の因子に一般に依存する。
【０１４４】
（癌のワクチン）
本発明はさらに、ＳＧＰ２８タンパク質またはそのフラグメントからなる癌のワクチン、ならびにＤＮＡに基づくワクチンを提供する。前立腺および腫瘍に制限されたＳＧＰ２８の発現に関して、ＳＧＰ２８の癌ワクチンは、標的以外の組織に対して非特異的な影響を生じることなく、ＳＧＰ２８を発現する癌を特異的に予防しそして／または処置することにおいて有効であると予想される。抗癌治療における使用のための体液によっておよび細胞によって媒介される免疫性を作成するためのワクチンにおける腫瘍抗原の使用は、当該分野で周知であり、そしてヒトのＰＳＭＡおよびげっ歯類のＰＡＰ免疫原を使用して、前立腺癌において使用されている（Ｈｏｄｇｅら、１９９５、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６３：２３１−２３７；Ｆｏｎｇら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３１１３−３１１７）。このような方法は、ＳＧＰ２８タンパク質もしくはそのフラグメント、またはＳＧＰ２８をコードする核酸分子、およびＳＧＰ２８免疫原を発現し得そしてＳＧＰ２８免疫原を適切に提示し得る組換えベクターを使用することによって、容易に行われ得る。
【０１４５】
例えば、ウイルス遺伝子送達システムは、ＳＧＰ２８をコードする核酸分子を送達するために使用され得る。本発明のこの局面の実施において使用され得る種々のウイルス遺伝子送達システムとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ワクシニア、鶏痘、カナリアポックス、アデノウイルス、インフルエンザ、ポリオウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、およびシンドビスウイルス（Ｒｅｓｔｉｆｏ、１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５８−６６３）。非ウイルス送達システムもまた、抗腫瘍応答を誘導するために患者に（例えば、筋肉内で）導入されるＳＧＰ２８タンパク質またはそのフラグメントをコードする裸のＮＤＡを使用することによって使用され得る。１つの実施形態においては、全長のヒトのＳＧＰ２８  ｃＤＮＡが使用され得る。
【０１４６】
１つの実施形態においては、ＳＧＰ２８癌ワクチンは、表２（配列番号３）に示されるＳＧＰ２８のアミノ酸配列内の免疫原性ペプチドの同定に基づく。以下の実施例においてさらに議論されるように、ＳＧＰ２８は、ＴおよびＢ細胞応答を誘導することが示されている。ＳＧＰ２８（表２；配列番号３）ＯＲＦを含有している組換えＨＩＳタグ化タンパク質は、モノクローナル抗体の産生のためにマウス中で免疫応答を生じさせるために使用されている。ＳＧＰ２８のアミノ酸９３〜１０７（ＣＮＹＲＨＳＮＰＫＤＲＭＴＳＬ；配列番号２７）は、ポリクローナル抗体の産生のためにウサギ中で免疫応答を生じさせるために使用されている。従って、ＳＧＰ２８のこれらの特異的部分、およびこれらの部分をコードするポリヌクレオチドが、癌ワクチンの産生のために選択され得る。
【０１４７】
別の実施形態においては、特異的細胞毒性のＴリンパ球（ＣＴＬ）エピトープをコードするＳＧＰ２８核酸分子が使用され得る、ＣＴＬエピトープは、特定されたＨＬＡ対立遺伝子に最適に結合し得るＳＧＰ２８タンパク質中のペプチドを同定するための、特異的なアルゴリズム（例えば、Ｅｐｉｍｅｒ、Ｂｒｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用して決定され得る。１つの適切なアルゴリズムは、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ）ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で利用可能な、ＨＬＡ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｏｔｉｆ  Ｓｅａｒｃｈアルゴリズムである。このアルゴリズムは、ＨＬＡクラスＩ分子の溝、および特に、ＨＬＡ−Ａ２中の特異的なペプチド配列の結合に基づく（Ｆａｌｋら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：２９０−６；Ｈｕｎｔら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１２６１−３；Ｐａｒｋｅｒら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７；Ｐａｒｋｅｒら、１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３−７５）。ＨＬＡ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｏｔｉｆ  Ｓｅａｒｃｈアルゴリズムは、ＨＬＡ−Ａ２ならびに他のクラスＩ分子に対する推定される結合のための完全なタンパク質配列に由来する、８マー、９マー、および１０マーのペプチドの位置決定およびランキングを可能にする。ほとんどのＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドが９マーであり、好ましくは、２位にロイシン、そして９位にバリンまたはロイシンを含有する（Ｐａｒｋｅｒら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７）。ＨＬＡ−Ａ２へのペプチドの実際の結合は、抗原プロセシング欠損細胞株Ｔ２上でのＨＬＡ−Ａ２の発現の安定化によって評価され得る（Ｘｕｅら、１９９７、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３０：７３−８；Ｐｅｓｈｗａら、１９９８、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３６：１２９−３８）。特異的なペプチドの免疫原性は、樹状細胞の存在下でのＣＤ８＋  ＣＴＬの刺激によってインビトロで評価され得る（Ｘｕｅら；Ｐｅｓｈｗａら、前出）。
【０１４８】
ＨＬＡ−Ａ２に結合すると予想され、そして癌ワクチンでの使用に好ましい特定のＳＧＰ２８ペプチドは、以下に対応するペプチドを含む：アミノ酸配２−１０（ＴＬＦＰＶＬＬＦＬ；配列番号１７）、アミノ酸６−１４（ＶＬＬＦＬＶＡＧＬ；配列番号１８）、アミノ酸３０−３８（ＡＬＬＴＴＱＴＱＶ；配列番号１９）、アミノ酸１４２−１５０（ＶＶＷＹＳＳＹＬＶ；配列番号２０）、アミノ酸２２２−２３０（ＴＬＴＣＫＨＱＬＶ；配列番号２１）、アミノ酸１７５−１８３（ＧＮＷＡＮＲＬＹＶ；配列番号２２）、アミノ酸７−１５（ＬＬＦＬＶＡＧＬＬ；配列番号２３）、アミノ酸１４１−１４９（ＱＶＶＷＹＳＳＹＬ；配列番号２４），アミノ酸１３４−１４２（ＡＶＶＧＨＹＴＱＶ；配列番号２５）、およびアミノ酸２１１−２１９（ＤＬＹＳＮＣＫＳＬ；配列番号２６）（表２に示されるＳＧＰ２８タンパク質配列）。
【０１４９】
種々のエキソビボストラテジーがまた、用いられ得る。１つのアプローチは、患者の免疫系にＳＧＰ２８抗原を呈示するための樹状細胞の使用を包含する。樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、Ｂ７副刺激因子（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）、およびＩＬ−１２を発現し、そして従って高度に特化された抗原提示細胞である。前立腺癌では、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のペプチドでパルスされた自己樹状細胞が、第Ｉ相臨床試験において、前立腺癌患者の免疫系を刺激するために使用されている（Ｔｊｏａら、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２８：６５−６９；Ｍｕｒｐｈｙら、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２９：３７１−３８０）。樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の関連においてＴ細胞に対してＳＧＰ２８ペプチドを提示するために使用され得る。１つの実施形態では、自己樹状細胞は、ＭＨＣ分子に結合し得るＳＧＰ２８ペプチドでパルスされる。別の実施形態では、樹状細胞は、完全ＳＧＰ２８タンパク質でパルスされる。さらに別の実施形態は、当該分野で公知の種々の実行ベクター（例えば、アデノウイルス（Ａｒｔｈｕｒら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：１７−２５）、レトロウイルス（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３７６３−３７７０）、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＤＮＡトランスフェクション（Ｒｉｂａｓら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：２８６５−２８６９）、および腫瘍由来ＲＮＡトランスフェクション（Ａｓｈｌｅｙら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１７７−１１８２））を用いて樹状細胞におけるＳＧＰ２８遺伝子の過剰発現を操作することを含む。ＳＧＰ２８を発現する細胞はまた、免疫調節因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するように操作され得、そして免疫剤として使用され得る。
【０１５０】
抗イディオタイプ抗ＳＧＰ２８抗体もまた、抗癌療法において、ＳＧＰ２８タンパク質を発現する細胞に対する免疫応答を惹起するためのワクチンとして使用され得る。詳細には、抗イディオタイプ抗体の生成は、当該分野で周知であり、そしてＳＧＰ２８タンパク質上のエピトープを模倣する抗イディオタイプ抗ＳＧＰ２８抗体を生成するように容易に適合され得る（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、１９９７、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：３３−４０；Ｆｏｏｎら、１９９５、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９６：３３４−３４２；Ｈｅｒｌｙｎら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ４３：６５−７６を参照のこと）。このような抗イディオタイプ抗体は、癌ワクチンストラテジーにおいて使用され得る。
【０１５１】
遺伝子免疫法は、ＳＧＰ２８を発現する癌細胞に対する予防的または治療的な体液性免疫応答および細胞性免疫応答を生成するために使用され得る。ＳＧＰ２８タンパク質／免疫原をコードするＤＮＡおよび適切な調節配列を含む構築物は、個体の筋肉または皮膚に直接的に注射され得、それにより、筋肉または皮膚の細胞が、この構築物を取り込み、そしてコードされたＳＧＰ２８タンパク質／免疫原を発現する。ＳＧＰ２８タンパク質免疫原の発現は、前立腺癌および他のＳＧＰ２８発現癌に対する予防的または治療的な体液性免疫および細胞性免疫の生成を生じる。当該分野で公知の種々の予防的および治療的遺伝子免疫技術が使用され得る（検討のために、インターネットアドレスｗｗｗ．ｇｅｎｗｅｂ．ｃｏｍで公開されている情報および参考文献を参照のこと）。
【０１５２】
（診断組成物およびキット）
上記で記載または示唆された診断適用および治療適用における使用のために、本発明によって、キットもまた提供される。このようなキットは、１つ以上のコンテナ手段（例えば、バイアル、チューブなど）を厳重に閉じ込めて受容するように区画化されるキャリア手段を備え得る。コンテナ手段のそれぞれは、本方法において、使用されるべき別々の要素の１つを含む。例えば、コンテナ手段の１つは、検出可能に標識された、または検出可能に標識され得るプローブを含み得る。このようなプローブは、それぞれＳＧＰ２８タンパク質もしくはＳＧＰ２８遺伝子またはメッセージに特異的な抗体またはポリヌクレオチドであり得る。キットが、標的核酸配列を検出するために核酸ハイブリダイゼーションを利用する場合、キットはまた、標的核酸配列の増幅用のヌクレオチドを含むコンテナ、および／またはレポーター分子（例えば、酵素標識、蛍光標識、または放射性同位体標識）に結合されるレポーター手段（例えば、ビオチン結合タンパク質（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン）を含むコンテナを有し得る。
【０１５３】
本発明のキットは、代表的には、上記コンテナ、および使用説明書と共に、市販および使用者の観点で所望の材料（緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、シリンジ、およびパッケージ挿入物を含む）を含む１つ以上の他のコンテナを含む。表示は、組成物が、特定の治療または非治療適用について使用されることを示し、そしてまたインビボまたはインビトロのいずれかの使用（例えば、上記の使用）についての説明を示し得るために、コンテナ上に存在し得る。
【０１５４】
従って、本発明はまた、ＳＧＰ２８−関連分子を含む診断組成物を提供する。このような分子としては、本明細書中に記載される、種々のＳＧＰ２８ポリヌクレオチド、プライマー、プローブ、タンパク質、フラグメント、抗体が挙げられる。診断組成物に含まれる分子は、検出可能なマーカーで必要に応じて標識され得る。ＳＧＰ２８の診断組成物は、適切な緩衝液、希釈液、および所望される他の成分をさらに含み得る。
【０１５５】
（実施例）
本発明の種々の局面を、以下に続くいくつかの例によってさらに記載および例示する。これらはいずれも、本発明の範囲の制限を意図するものではない。
【０１５６】
（実施例１：ＳＧＰ２８遺伝子のｃＤＮＡフラグメントのＳＳＨ生成単離）
（材料および方法）
（ＬＡＰＣ異種移植片）
ＬＡＰＣ異種移植片を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｓａｗｙｅｒｓ博士（ＵＣＬＡ）から入手し、記載のように生成した（Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．３：４０２−４０８；Ｃｒａｆｔら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：５０３０−５０３６）。アンドロゲン依存性ＬＡＰＣ−４異種移植片およびアンドロゲン非依存性ＬＡＰＣ−４異種移植片（それぞれＬＡＰＣ−４  ＡＤおよびＡＩ）ならびにアンドロゲン依存性ＬＡＰＣ−９異種移植片およびアンドロゲン非依存性ＬＡＣＰ−９異種移植片（それぞれＬＡＣＰ−９  ＡＤおよびＡＩ）をそれぞれインタクトな雄ＳＣＩＤマウスまたは雄去勢マウスにおいて増殖させ、そしてレシピエント雄に小組織塊として継代させた。ＬＡＰＣ−４  ＡＩ異種移植片を、ＬＡＰＣ−４  ＡＤ腫瘍から誘導し、ＬＡＰＣ−９  ＡＩ異種移植片は、ＬＡＰＣ−９  ＡＤ腫瘍から誘導した。ＡＩ異種移植片を生成するために、ＬＡＰＣ  ＡＤ腫瘍を有する雄マウスを去勢し、そして２〜３ヶ月間飼育した。ＬＡＰＣ腫瘍が再増殖した後、この腫瘍を採集し、そして去勢雄ＳＣＩＤマウスにおいてまたは雌ＳＣＩＤマウスにおいて継代させた。
【０１５７】
ＬＡＰＣ−４  ＡＤ異種移植片を、以下のように脛骨内で増殖させた。皮下で増殖させたＬＡＰＣ−４  ＡＤ異種移植片腫瘍組織を、１〜２ｍｍ3切片に細かく切り、一方で、この組織を、１×Ｉｓｃｏｖｅ培地中に入れ、次いで、細かく切った組織を１．３Ｋ  ｒｐｍで４分間遠心分離し、この上清を１０ｍｌの氷冷１×Ｉｓｃｏｖｅ培地中に再懸濁させ、そして１．３Ｋｒｐｍで４分間遠心分離した。次いで、このペレットを、１％のプロナーゼＥを含む１×Ｉｓｃｏｖｅ中で再懸濁させ、そして温和な揺り攪拌で室温で２０分間インキュベートし、続いて２〜４分間氷上でインキュベートした。濾液を１．３Ｋ  ｒｍｐで４分間遠心分離し、そしてプロナーゼを１０ｍｌのＩｓｃｏｖｅ中で再懸濁し、そして再遠心分離することで吸引したペレットから除去した。次いで、細胞のクランプをＰｒＥＧＭ培地中でプレート化し、そして一晩かけて増殖させた。次いで、この細胞を採取し、濾過し、２×ＲＰＭＩで洗浄し、そして計数した。約５０，０００個の細胞を、氷上の等容量の氷冷Ｍａｔｒｉｇｅｌとともに混合し、そして２７ゲージ針を介してＳＣＩＤマウスのほぼ脛骨骨幹端に外科的に注射した。１０〜１２週間後に、骨髄中で増殖したＬＡＰＣ−４腫瘍を回収した。
【０１５８】
（細胞株）
ヒト細胞株（例えば、ＨｅＬａ）を、ＡＴＣＣから入手し、そして５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で維持した。
【０１５９】
（ＲＮＡ単離）
腫瘍組織および細胞株を、１０ｍｌ／ｇ組織または１０ｍｌ／１０8細胞を用いてＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）においてホモジナイズし、総ＲＮＡを単離した。ポリＡ  ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ’ｓ  Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  ｍＲＮＡ  ＭｉｎｉキットおよびＭｉｄｉキットを用いて総ＲＮＡから精製した。総ＲＮＡおよびｍＲＮＡを、分光光度計分析（Ｏ．Ｄ．  ２６０／２８０ｎｍ）によって定量し、そしてゲル電気泳動によって分析した。
【０１６０】
（オリゴヌクレオチド）
以下のＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドを使用した。
【０１６１】
【化１】
0003779926.tif 000002
（抑制サブトラクティブ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）ハイブリダイゼーション）
抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）を使用して、前立腺癌において示差的に発現され得る遺伝子に対応するｃＤＮＡを同定した。このＳＳＨ反応は、異なる２種の環境（すなわち、皮下（「ＬＡＰＣ−４  ＡＤ  ＳＱ」）および脛骨内（「ＬＡＰＣ−４  ＡＤ  ＩＴ」）増殖環境）下で増殖するＬＡＰＣ−ＡＤ異種移植片由来のｃＤＮＡを使用し（ここで、ＬＡＰＣ−４  ＡＤ  ＳＱ異種移植片は、「ドライバー（ｄｉｒｉｖｅｒ）」ｃＤＮＡの供給源として使用した）、一方ここで、ＬＡＰＣ−４  ＡＤ  ＳＱ異種移植片を、「テスター（ｔｅｓｔｅｒ）」ｃＤＮＡの供給源として使用し、「ドライバー」ｃＤＮＡの供給源として使用した。
【０１６２】
テスターおよびドライバーｃＤＮＡに対応する二本鎖ｃＤＮＡを、ＣＬＯＮＴＥＣＨのＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔおよびプライマーとして１ｎｇのオリゴヌクレオチドＤＰＮＣＤＮを使用して、上記のように、異種移植片組織から単離された２μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡから合成した。第一鎖および第二鎖合成を、キットの使用者マニュアルプロトコル（ＣＬＯＮＴＥＣＨプロトコール番号ＰＴ１１１７−１、カタログ番号Ｋ１８０４−１）に記載のように実施した。得られたｃＤＮＡをＤｐｎＩＩで３７℃で３時間消化した。消化したｃＤＮＡをフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出し、そしてエタノール沈殿した。
【０１６３】
ドライバーｃＤＮＡを、１：１比で、関連異種移植片供給源（上記）由来のＤｐｎＩＩ消化ｃＤＮＡを、ヒト良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、およびヒト細胞株ＨｅＬａ、２９３、Ａ４３１、Ｃｏｌｏ  ２０５、およびマウス肝臓由来の消化ｃＤＮＡの混合物と組み合わせることにより生成した。
【０１６４】
テスターｃＤＮＡを、５μｌの水中に１μｌの関連異種移植片供給源（上記）由来のＤｐｎＩＩ消化ｃＤＮＡ（４００ｎｇ）を希釈することにより生成した。次いで、希釈したｃＤＮＡ（２μｌ、１６０ｎｇ）を、総容量１０μｌで１６℃で一晩、４００ｕのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて、別の連結反応中で、２μｌのアダプター１およびアダプター２（１０μＭ）に連結した。連結を、１μｌの０．２Ｍ  ＥＤＴＡで、そして７２℃で５分間加熱して終結させた。
【０１６５】
第一のハイブリダイゼーションは、１．５μｌ（６００ｎｇ）のドライバーｃＤＮＡを、１．５μｌ（２０ｎｇ）のアダプター１連結のおよびアダプター２連結のテスターｃＤＮＡを含む２つの各チューブに添加することにより実施した。４μｌの最終容量で、サンプルに鉱油を重層し、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  サーマルサイクラー中で、９８℃で１．５分間変性し、次いで、６８℃で８時間ハイブリダイズさせた。次いで、２つのハイブリダイゼーションを、さらなる１μｌの新鮮な変性ドライバーｃＤＮＡと一緒に混合し、そして６８℃で一晩ハイブリダイズさせた。次いで、第二のハイブリダイゼーションを、２００μｌの２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ中で希釈し、７０℃で７分間加熱し、そして−２０℃で貯蔵した。
【０１６６】
（ＳＳＨから生成した遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅、クローニング、および配列決定）
ＳＳＨ反応から生じる遺伝子フラグメントを増幅するために、２つのＰＣＲ増幅を行った。第一のＰＣＲ反応において、１μｌの希釈最終ハイブリダイゼーション混合物を、最終容量２５μｌの１μｌのＰＣＲプライマー１（１０μＭ）、０．５μｌ  ｄＮＴＰ混合物（１０μＭ）、２．５μｌの１０×反応緩衝液（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、および０．５μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に添加した。ＰＣＲ１を、以下の条件を用いて実施した：７５℃で５分、９４℃で２５秒、次いで２７サイクルの９４℃で１０秒、６６℃で３０秒、７２℃で１．５分。５つの別の第一のＰＣＲ反応を各実験について行った。産物をプールし、そして水で１：１０に希釈した。第二のＰＣＲ反応については、プールし、そして希釈した第一のＰＣＲ反応物からの１μｌを、プライマーＮＰ１およびＮＰ２（１０μＭ）をＰＣＲプライマー１の代わりに使用したことを除き、ＰＣＲ１について用いたものと同じ反応混合物に添加した。ＰＣＲ２を、１０〜１２サイクルの９４℃で１０秒、６８℃で３０秒、７２℃で１．５分を用いて実施した。ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。
【０１６７】
ＰＣＲ産物を、Ｔ／Ａベクタークローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＲ２．１に挿入した。形質転換Ｅ．ｃｏｌｉを青／白およびアンピシリン選択に供した。白色コロニーを釣り上げ、９６ウェルプレート中に並べ、そして液体培養中で一晩増殖させた。挿入物を同定するために、ＰＣＲ増幅をＰＣＲ１の条件ならびにプライマーとしてＮＰ１およびＮＰ２を用いて１ｍｌの細菌培養物において実施した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。
【０１６８】
９６ウェルフォーマットで２０％グリセロール中に細菌クローンを貯蔵した。プラスミドＤＮＡを調製し、配列決定し、そしてＧｅｎＢａｎｋ、ｄＢｅｓｔ、およびＮＣＩ−ＣＧＡＰデータベースの核酸相同性検索に供した。
【０１６９】
（結果）
前出の材料および方法において記載したＳＳＨ実験により、そして多数の候補遺伝子フラグメントクローン（ＳＳＨ  クローン）の単離がもたらされた。すべての候補クローンを配列決定し、そして主要な公の遺伝子およびＥＳＴのデータベースにおけるすべての配列に対して相同性分析を行って、対応する遺伝子の同一性についての情報を提供し、そして示差的発現のための特定の遺伝子を分析するための決定をガイドすることを支援した。一般に、検索した任意のデータベースにおける任意の公知配列に何ら相同性を有せず、従って新規遺伝子をあらわすと考えられる遺伝子フラグメント、およびこれまでに配列決定された発現配列タグ（ＥＳＴ）に対して相同性を示す遺伝子フラグメントを、ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはノーザン分析による示差的発現分析にかけた。
【０１７０】
ＳＳＨクローンの一つは、特定の顆粒タンパク質２８（ＳＧＰ２８）（Ｋｊｅｌｄｓｅｎら（１９９６）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８０，２４６−２５０）またはシステイン富化分泌タンパク質（ＣＲＩＳＰ−３）（Ｋｒａｔｚｓｃｈｅｍａら（１９９６）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ２３６（３）：８２７−３６）として公知の分泌分子の対応する配列と同定した。このクローンの配列（３６Ｐ１Ｇ３）は、以下の通りである：
【０１７１】
【化２】
0003779926.tif 000003
（配列番号１）。
【０１７２】
（実施例２：全長ＳＧＰ２８  ＳＧＰ２８コードｃＤＮＡの単離）
７７４ｂｐの全長ｃＤＮＡ（クローン１；表１）を、２５８アミノ酸のＯＲＦを露出する、前立腺ライブラリーから単離した（表２）。本明細書において同定された配列は、２本の核酸（コード配列の核酸および５’ＵＴＲの核酸）における開示されたＳＧＰ２８配列（Ｋｊｅｌｄｓｅｎら（１９９６）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８０（３）：２４６−５０）と異なる。これらの差異は、タンパク質配列を変化させない。
【０１７３】
（表１：全長３６Ｐ１Ｇ３／ＳＧＰ２８  ｃＤＮＡ（配列番号２））
【０１７４】
【表１】
0003779926.tif 000004
0003779926.tif 000005
（表２：３６Ｐ１Ｇ３／ＳＧＰ２８オープンリーディングフレーム（配列番号３））
【０１７５】
【表２】
0003779926.tif 000006
（実施例３：ＳＧＰ２８遺伝子発現分析）
正常ヒト組織（プローブとして標識した３６Ｐ１Ｇ３  ｃＤＮＡ（実施例１におけるような配列）を使用する、全部で１６個の異なる正常ヒト組織を含む）におけるＳＧＰ２８  ｍＲＮＡ発現は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から得られた２つの多重組織ブロットをノーザンブロットすることによってまず実施した。ＲＮＡサンプルを、β−アクチンプローブを用いて定量的に標準化した。この結果を図１Ａ〜Ｂに示し、そして試験した１６種の組織内のＳＧＰ２８が、前立腺、精巣および卵巣で排他的に発現されることを示す。興味深いことに、この前立腺および卵巣は、２．４ｋｂの転写を示すが、精巣は、１．６ｋｂメッセージ（この１．６メッセージは、別のＳＧＰ２８ファミリーメンバーを示す）を発現する。正常の精巣における低分子量は、おそらく、ＣＲＩＳＰ２メッセージに対するプローブ（ＳＳＨフラグメント）のクロスハイブリダイゼーションに起因する。同一の転写を、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用する正常パネル上のＣＲＩＳＰ２で確認した（Ｋｒａｔｚｓｃｈｍａｒ，Ｊ．ら（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３６：８２７−８３６）。
【０１７６】
さらに、ヒト癌組織および細胞株におけるＳＧＰ２８発現を分析するために、ＬＡＰＣ−４ヒト前立腺癌異種移植片から誘導されたＲＮＡを、３６Ｐ１Ｇ３プローブを使用するノーザンブロットによって分析した。全ＲＮＡサンプルを、エチジウムブロミド染色および標識したβ−アクチンプローブを用いた配列分析によって定量的に標準化した。この分析の結果を、図１Ｃに示し、そしてＬＡＰＣ異種移植片の全てにおける２．４ｋｂ  ＳＧＰ２８転写物の非常に高いレベルの発現を示す。
【０１７７】
前立腺癌組織におけるＳＧＰ２８を分析するために、ノーザンブロットを、一致した正常隣接前立腺組織を用いた、３種の前立腺腫瘍サンプルから誘導されたＲＮＡ上で実施した。この結果は、ＳＧＰ２８ｍＲＮＡ発現は、試験された３種の腫瘍検体のうち全３つにおいて、そして３種のうち２つにおいて非常に高いレベルの発現を検出されることを示す。
【０１７８】
（実施例４：ＳＧＰ２８に対するポリクローナル抗体の産生）
ＳＧＰ２８に対するポリクローナル血清を産生するために、ＳＧＰ２８タンパク質のアミノ酸９３−１０７（ＣＮＹＲＨＳＮＰＫＤＲＭＴＳＬ；配列番号２７）に対応するペプチドを、合成した。ペプチド配列を、Ｋｅｙｈｏｌｅ吸着ヘモシアニン（ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍａｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）に連結し、そして以下のようにウサギを免疫するために使用した。このウサギを、フロイント完全アジュバント中で混合した２００μｇのペプチド−ＫＬＨを用いて最初に免疫した。次いで、このウサギに、フロイント不完全アジュバンド中の２００μｇのペプチド−ＫＬＨを２週間置きに注射した。血液を、各免疫の約７〜１０日後に採血した。ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット分析を使用して、免疫ペプチドおよびＳＧＰ２８タンパク質それぞれに対するウサギ血清の特異性および力価を決定した。Ａｆｆｉｇｅｌ１０（ＢｉｏＲａｄ）に対して共有結合させたＳＧＰ２８ペプチド（ＣＮＹＲＨＳＮＰＫＤＲＭＴＳＬ；配列番号２７）から構成したアフィニティーカラム内を免疫ウサギ由来の粗血清を通過させることによって、アフィニティー精製したＳＧＰ２８ポリクローナル抗体を調製した。ＰＢＳを用いたこの基質の大規模な洗浄後に、ＳＧＰ２８ペプチドに特異的な抗体を低ｐＨのグリシン緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ２．５）を用いて溶出し、迅速に中和し、そしてＰＢＳに対して大規模に透析した。
【０１７９】
ＳＧＰ２８タンパク質との反応性についてウサギ血清を試験するために、全長ＳＧＰ２８  ｃＤＮＡを、カルボキシル末端（ｐＣＤＮＡ  ３．１  ｍｙｃ−ｈｉｓ，Ｉｎ  Ｖｉｒｔｏｇｅｎ）で６Ｈｉｓ  ｔａｇを提供する発現ベクターにクローニングした。得られたＭＹＣ／ＨＩＳ  ＳＧＰ２８構築物を、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＬＡＰＣ４細胞およびＭＹＣ／ＨＩＳ  ＳＧＰ２８で一過的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の全細胞溶解物および上清ならびにＬＡＰＣ４およびＬＡＰＣ９異種移植片溶解物を、アフィニティー精製したウサギ抗−ＳＧＰ２８ｐＡｂ（１μｇ／ｍｌ）を使用するウエスタンブロッティングに供した。ＳＧＰ２８の免疫反応性結合を、ＨＲＰ結合抗ウサギ第２抗体を用いたブロットのインキュベーションによって視覚化し、次いで増加した化学ルミネセンス検出によって視覚化した。この結果を図３に示し、そしてこの抗−ＳＰＧ２８ポリクローナル抗体が、ＬＡＰＣ４およびＬＡＰＣ９異種移植片溶解物中のＳＧＰ２８タンパク質ならびにＬＡＰＣ４およびトランスフェクトされた２９３Ｔの細胞株上清中のＳＧＰ２８タンパク質と同一であることを示す。
【０１８０】
（実施例５：哺乳動物細胞における組換えＳＧＰ２８タンパク質の発現）
（ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ構築物）
哺乳動物細胞中で３６Ｐ１Ｇ３を発現するために、７７４ｂｐ（２５８アミノ酸）の３６Ｐ１Ｇ３  ＯＲＦをｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）へとクローニングした。タンパク質発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから駆動される。組換えタンパク質は、Ｃ末端に融合したｍｙｃおよび６つのヒスチジンを有する。このｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクターはまた、ラージＴ抗原を発現する細胞株におけるエピソーム複製および単純ベクターレスキューのためのＳＶ４０起源に加えて、ｍＲＮＡの安定性を増大するためのウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。ネオマイシン耐性遺伝子は、このタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起源は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるこのプラスミドの選択および維持を可能にする。
【０１８１】
（ｐＡＰｔａｇ構築物）
シグナル配列（アミノ酸３３〜２５８）を有さない３６Ｐ１Ｇ３／ＳＧＰ２８タンパク質を、ｐＡＰｔａｇ−５（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）中にクローニングした。この構築物は、３６Ｐ１Ｇ３タンパク質のＣ末端でのアルカリホスファターゼ融合を生じ、その上ＩｇＧＫシグナル配列をＮ末端に融合する。得られた組換え３６Ｐ１Ｇ３タンパク質を、トランスフェクトされた哺乳動物細胞の培養物中に分泌するために最適化し、そして３６Ｐ１Ｇ３タンパク質と相互作用するタンパク質（例えば、リガンドまたはレセプター）を同定するために使用し得る。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターから駆動され、そして組換えタンパク質はまた、アルカリホスファターゼのＣ末端に融合したｍｙｃおよび６つのヒスチジンを含む。ゼオシン耐性遺伝子は、このタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるこのプラスミドの選択を可能にする。
【０１８２】
（ｐｔａｇ５構築物）
シグナル配列（アミノ酸３３〜２５８）を有さない３６Ｐ１Ｇ３タンパク質をまた、ｐＴａｇ−５中にクローニングした。このベクターは、ｐＡＰＴａｇと同様であるが、アルカリホスファターゼ融合を伴わない。
【０１８３】
（ｐＳＲａ構築物）
構成的に３６Ｐ１Ｇ３を発現する哺乳動物細胞株を作製するために、７７４ｂｐ（２５８アミノ酸）ＯＲＦをｐＳＲａ構築物にクローニングした。アンホトロピックおよびエコトロピックなレトロウイルスを、ｐＳＲａ構築物の２９３Ｔ−１０Ａ１パッケージング株へのトランスフェクション、またはｐＳＲａとヘルパープラスミド（j−）の２９３細胞中への同時トランスフェクションによって、それぞれ作製する。レトロウイルスは、種々の哺乳動物細胞株を感染させるために使用し得、それによってクローン化した遺伝子である３６Ｐ１Ｇ３の宿主細胞株中への組込みを生じる。タンパク質の発現は、長末端反復（ＬＴＲ）から駆動される。ネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質およびアンピシリン耐性遺伝子を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてＣｏｌＥ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのプラスミドの選択および維持を可能にする。抗ＦＬＡＧ抗体を使用する検出を可能にするためにＣ末端にＦＬＡＧタグを融合させたさらなるｐＳＲａ構築物を作製した。ＦＬＡＧ配列（５’ｇａｔ  ｔａｃ  ａａｇ  ｇａｔ  ｇａｃ  ｇａｃ  ｇａｔ  ａａｇ  ３’）（配列番号３６）をＯＲＦの３’末端のクローニングプライマーに付加した。
【０１８４】
Ｎ末端およびＣ末端の両方のＧＦＰ、ならびに全長の３６Ｐ１Ｇ３タンパク質のｍｙｃ／６  ＨＩＳ融合タンパク質を生じるために、さらなるｐＳＲａ構築物を構築し得る。
【０１８５】
（実施例６：昆虫細胞における組換えＳＧＰ２８タンパク質の発現）
（ｐＭｅｌＢａｃ  ａ）
シグナル配列（アミノ酸３３〜２５８）を有さない３６Ｐ１Ｇ３タンパク質をまた、Ｓｆ９昆虫細胞においてこのタンパク質を発現および分泌するために、ｐＭｅｌＢａｃ（カタログ番号Ｖ１９５０−２０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）にクローニングした。このｐＭｅｌＢＡＣ  Ａベクターは、細胞外培地への分泌経路を介して組換えタンパク質を直接発現するために設計されたバキュロウイルス移入ベクターである。ミツバチメリチン（高度に発現され、そして高効率で分泌されるタンパク質）についてのシグナル配列を、組換え３６Ｐ１Ｇ３タンパク質の直接分泌のために使用する。タンパク質の発現は、ポリヘドリンプロモーター下で駆動される。Ｃ末端ｍｙｃ−ｈｉｓタグ化構築物をまた、組換え３６Ｐ１Ｇ３タンパク質の検出および精製を可能にするためにｐＭｅｌＢａｃ  Ａ中に作製した。
【０１８６】
（ｐＩＺＴ／Ｖ５Ｈｉｓ）
３６Ｐ１Ｇ３タンパク質を、Ｓｆ９昆虫細胞中にこのタンパク質を発現するために、ｐＩＺＴ／Ｖ５Ｈｉｓ（カタログ番号ｖ８０１０−０１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）中にクローニングした。この発現ベクターは、一過性であり、そして安定な組換えタンパク質の発現を可能にする。タンパク質の発現は、高レベルの構成的な発現について、ＯｐＩＥ２プロモーターによって駆動される。ゼオシン耐性遺伝子は、ＯｐＩＥｌプロモーターの制御下である。
【０１８７】
（実施例７：ＳＧＰ２８に対するモノクローナル抗体の作製）
ＳＧＰ２８に対するｍＡＢを作製するために、２９３Ｔ組織培養物の上清から精製した組換えＨＩＳタグ化ＳＧＰ２８タンパク質を、５匹の雌性のＢａｌｂ  Ｃマウスを免疫するために使用した。最初の免疫化を、フロイント完全アジュバント中に混合した５０μｇの精製ＳＧＰ２８タンパク質を用いて行った。次いで、ブーストを、フロイント不完全アジュバント中に混合した５０μｇのＳＧＰ２８タンパク質を用いて、２週間の間隔で投与した。各免疫化の７〜１０日後に採取した試験採血の反応性および特異性を、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロッティング手順によって決定した。免疫原に対する試験採血の特異性の力価は、少なくとも２×１０6であった。３匹のマウスを引き続いて屠殺し、そして標準的手順（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８）使用して融合およびハイブリドーマ作製を行うために、脾臓を使用した。次いで、１１の陽性ウェルを、ＳＧＰ２８特異的モノクローナルハイブリドーマを作製するためにサブクローニングに供した。サブクローニングが完了したハイブリドーマの１つ（４Ｇ６（ＩｇＧｌアイソタイプ）と名付けた）は、前立腺癌細胞溶解物および上清中に存在するＳＧＰ２８タンパク質を特異的に認識し、そして臨床的前立腺癌組織におけるＳＧＰ２８タンパク質と著しく反応したが、同じ患者の正常な隣接組織には反応しなかった（図４）。
【０１８８】
図４は、抗ＳＧＰ２８モノクローナル抗体が、前立腺癌細胞株および上清、前立腺癌異種移植片、ならびに臨床的前立腺癌組織中のＳＧＰ２８タンパク質を特異的に検出することを示す。ＬＡＰＣ４前立腺癌細胞株由来の細胞溶解物および馴化培地、ならびにＬＡＰＣ４およびＬＡＰＣ９前立腺癌異種移植片由来の溶解物、ならびに一致した正常および癌性前立腺の臨床試料由来の溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてニトロセルロースへと移した。次いでこのブロットを、４Ｇ６抗ＳＧＰ２８モノクローナル抗体上清の１：２希釈を用いてウエスタン分析に供した。次いで、特異的なＳＧＰ２８免疫反応性バンドを、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体第二抗体と共にインキュベートし、そして増大した化学発光を用いる発生およびオートラジオグラフィーのフィルムへの暴露によって可視化した。ＳＧＰ２８免疫反応性タンパク質の二重線が矢印で示される。
【０１８９】
（実施例９：ＳＧＰ２８タンパク質発現のウエスタン分析）
前立腺癌および正常な隣接組織の一致した臨床的組織溶解物、ならびにＬＡＰＣ４細胞株およびＬＡＰＣ−４異種移植片の正常な組織溶解物を、１μｇ／ｍｌの親和性精製したウサギ抗ＳＧＰ２８ポリクローナル抗血清を用いるウエスタンブロッティングに供した。ＨＲＰ結合体化抗ウサギ第二抗体を用いるこのブロットのインキュベーション、続いて増大した化学発光の検出によって、ＳＧＰ２８免疫反応性バンドを可視化する。この結果（図５Ａ〜Ｂ）は、ＳＧＰ２８の、前立腺癌サンプルにおける高レベルの発現（隣接する正常な組織では発現しない）、およびＬＡＰＣ異種移植片における高レベルの発現を示す。低レベルの発現を、正常な精巣および肺において検出した。
【０１９０】
（実施例１０：前立腺癌、ＰＩＮおよび前立腺癌転移部におけるＳＧＰ２８の免疫組織化学的検出）
Ｇｌｅａｓｏｎスコア７の前立腺癌試料、ならびに高グレードのＰＩＮ試料におけるＳＧＰ２８の発現を、以下のようにＳＧＰ２８発現の免疫組織化学的分析に供した。組織切片をこのサンプルから調製し、１０％ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋し、そして標準的プロトコルに従って切片化した。切片を、抗ＳＧＰ２８ポリクローナル抗体で染色した（上記のように）。この結果を、図６Ａ〜Ｂに示す。強い染色を、前立腺の上皮細胞（特に、管腔の境界）において観察した。染色をまた、この管腔内で観察し、これは、前立腺癌およびＰＩＮにおけるＳＧＰ２８の高レベルの発現および分泌を示す。
【０１９１】
同様に、ポリクローナル抗ＳＧＰ２８を、前立腺癌転移部におけるＳＧＰ２８発現を検出する能力を評価するために使用した。図７Ａ〜Ｂは、骨（図７Ａ）およびリンパ節（図７Ｂ）への前立腺癌転移におけるＳＧＰ２８タンパク質の発現を示す免疫組織化学的分析の結果を示す。
【０１９２】
前立腺癌およびＰＩＮにおけるＳＧＰ２８の高い発現を、免疫組織化学を使用してさらに実証し、そしてこの結果を図８Ａ〜Ｄに示す。図８Ａは、２００×の倍率での前立腺癌におけるＳＧＰ２８の免疫組織化学的検出を示し；図８Ｂは、８００×での検出を示す。ＰＩＮにおけるＳＧＰ２８の発現を、２００×で図８Ｃに示し、そして８００×で図８Ｄに示す。前立腺癌およびＰＩＮについての免疫組織化学的分析の結果の要旨を表３に示し、そして組織の広範囲について表４に示す。試験した広範囲の組織（正常な前立腺を含む）中での免疫組織化学的に検出可能な発現の欠如は、前立腺癌およびＰＩＮにおける強い染色と組み合わせて、ＳＧＰ２８が、抗体ベースの診断（生検試料の評価およびインビボ画像化を含む）についての特に適切な標的であることを示す。
【０１９３】
【表３】
0003779926.tif 000007
【０１９４】
【表４】
0003779926.tif 000008
（実施例１１：可能性のあるシグナル伝達経路の同定）
ＳＧＰ２８が細胞中の公知のシグナル伝達経路を直接または間接的に活性化するか否かを決定するために、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に基づく転写レポーターアッセイを、ＳＧＰ２８を発現する細胞中で行う。これらの転写レポーターは、十分に特徴付けられたシグナル伝達経路の下流に存在する公知の転写因子についてのコンセンサスな結合部位を含む。レポーターおよびそれらの会合する転写因子の例、シグナル伝達経路、および活性化の刺激を以下に列挙する。
【０１９５】
１．ＮＦｋＢ−ｌｕｃ、ＮＦｋＢ／Ｒｅｌ；Ｉｋ−キナーゼ／ＳＡＰＫ；増殖／アポトーシス／ストレス
２．ＳＲＥ−ｌｕｃ、ＳＲＦ／ＴＣＦ／ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ；増殖／分化
３．ＡＰ−１−ｌｕｃ、ＦＯＳ／ＪＵＮ；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ／ＰＫＣ；増殖／アポトーシス／ストレス
４．ＡＲＥ−ｌｕｃ、アンドロゲンレセプター；ステロイド／ＭＡＰＫ；増殖／分化／アポトーシス
５．ｐ５３−ｌｕｃ、ｐ５３；ＳＡＰＫ；増殖／分化／アポトーシス
６．ＣＲＥ−ｌｕｃ、ＣＲＥＢ／ＡＴＦ２；ＰＫＡ／ｐ３８；増殖／アポトーシス／ストレス
ＳＧＰ２８によって媒介される効果を、ｍＲＮＡの発現を示す細胞中でアッセイし得る。ルシフェラーゼレポータープラスミドを、脂質によって媒介されるトランスフェクション（ＴＦＸ−５０、Ｐｒｏｍｅｇａ）によって導入し得る。ルシフェラーゼ活性（相対的な転写活性の指標）を、ルシフェリン基質との細胞の抽出物のインキュベーションによって測定し、そして反応物の発光を、ルミノメーターでモニターする。
【０１９６】
（実施例１２：ＳＧＰ２８機能のインビトロアッセイ）
前立腺癌中でのＳＧＰ２８の発現プロフィールは、腫瘍の開始、進行および／または維持における機能的な役割を示唆する。ＳＧＰ２８の機能を、インビトロでのアプローチを使用して哺乳動物細胞中で評価し得る。哺乳動物での発現のために、ＳＧＰ２８を多数の適切なベクター（ｐｃＤＮＡ  ３．１  ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇおよびレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９１、ＭＣＢ  １１：１７８５）を含む）中にクローン化し得る。このような発現ベクターを使用して、ＳＧＰ２８を、いくつかの癌細胞株（例えば、ＰＣ−３、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＬＮＣａＰ、および２９３Ｔを含む）中で発現させ得る。ＳＧＰ２８の発現を、抗ＳＧＰ２８抗体を使用してモニターし得る。
【０１９７】
ＳＧＰ２８を発現する哺乳動物細胞株を、いくつかのインビトロおよびインビボのアッセイ（組織培養物中での細胞の増殖、アポトーシスシグナルの活性化、ＳＣＩＤマウス中での原発性および転移性の腫瘍の形成、および膜侵襲培養系（ＭＩＣＳ）（Ｗｅｌｃｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４３：４４９−４５７）を使用するインビトロでの侵襲を含む）において試験し得る。ＳＧＰ２８細胞表現型を、ＳＧＰ２８の発現を欠く細胞の表現型と比較する。さらに、外因的に添加されたＳＧＰ２８タンパク質ありおよびなしで処置された細胞を、改変された増殖パラメーターについて分析し得る。
【０１９８】
ＳＧＰ２８を発現する細胞株をまた、マトリゲルでコーティングした多孔質膜チャンバー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を通じる細胞の通過を測定することによって、侵襲性および移動の特性の変化についてアッセイし得る。膜を通じる反対側への細胞の通過を、蛍光アッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃４２８）を使用して、指示細胞を充填したｃａｌｃｅｉｎ−Ａｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、モニターする。分析した細胞株は、親、およびＳＧＰ２８を過剰発現するＰＣ３細胞、３Ｔ３細胞、およびＬＮＣａＰ細胞を含む。ＳＧＰ２８が化学誘引特性を有するか否かをアッセイするために、親の指示細胞を、コントロール培地に対して比較して、ＳＧＰ２８の馴化培地の勾配に対する多孔質膜を通した通過をモニターする。このアッセイをまた、候補の癌治療組成物によるＳＧＰ２８によって誘導される影響の特異的な中和の定性および定量のために使用し得る。
【０１９９】
ＳＧＰ２８が、前立腺癌細胞および他の癌細胞または正常細胞中で発現される細胞タンパク質に結合するか否かを確証するために、２つのアプローチを用い得る。最初のアプローチにおいて、種々の細胞株に結合する組換えＨＩＳタグ化ＳＧＰ２８につていのインビトロアッセイを使用する。別のアプローチにおいて、ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ，カタログ＃Ｑ２０２）からのＡＰ−ＴＡＧ系、および記載されるような（ＣｈｅｎｇおよびＦｌａｎａｇａｎ，１９９４，Ｃｅｌｌ  ７９：１５７−１６８）種々の前立腺癌細胞株へのＳＰＧ２８の結合を試験するために使用されるＡＰ−ＴＡＧ融合物を使用して、組換えアルカリホスファターゼＳＧＰ２８融合タンパク質を作製する。この細胞の洗浄およびＡＰ基質ＢＣＩＰの添加後（これは、脱リン酸化の際に不溶性青色沈殿を形成する）、ＳＧＰ２８の結合を、光学顕微鏡下で青色に染色する細胞を同定することによって決定する。種々の癌細胞株（種々の前立腺癌細胞株（例えば、ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３、ＤＵ１４５、ＴＳＵＰＲ、ＬＡＰＣ４）が挙げられるがこれらに限定されない）を試験し得る。他の細胞株（例えば、ＰＲＥＣ前立腺細胞株、２９３Ｔ、ＰＩＮ細胞、およびＮＩＨ  ３Ｔ３など）をまた、試験し得る。さらに、ＬＡＰＣおよび他の前立腺癌異種移植片を試験し得る。平衡解離速度定数を、結合相互作用の強度を評価するために算出し得る。さらに、細胞当たりの細胞表面レセプターの数を決定し得る。ＳＧＰ２８に対する最も高い結合能力を有する細胞株または組織は、ＳＧＰ２８レセプターまたは他の結合パートナーのクローニングのために好ましい。
【０２００】
別の機能的アッセイにおいて、ＳＧＰ２８を安定に発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、軟寒天においてコロニーを形成するその能力について分析し得る。これらの実験において、このような手順で使用された細胞（例えば、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞）を、ＳＧＰ２８の形質転換能力を評価するために、ＳＧＰ２８またはｎｅｏまたは活性化されたＲａｓ（それぞれ試験遺伝子、ネガティブコントロール、およびポジティブコントロールとして）を安定に発現するようにトランスフェクトし得る。代表的に実験を二連で行い、そしてこのアッセイを、細胞のプレーティングの約４週間後に評価した。ＳＧＰ２８が、ネガティブコントロール（例えば、ｎｅｏ）と比較してコロニー形成における増加を誘導するということを実験的観察が実証する場合、このような結果は、ＳＧＰ２８が有意な形質転換能力を有することを示す。
【０２０１】
（実施例１３：ＳＧＰ２８腫瘍増殖促進についてのインビボアッセイ）
ＳＧＰ２８タンパク質の腫瘍細胞増殖に対する影響は、腫瘍保有マウスにおける遺伝子過剰発現によりインビボで評価され得る。例えば、ＳＣＩＤマウスは、それぞれの側腹部上に、ｔｋＮｅｏ空ベクターまたはＳＧＰ２８を含む１×１０6の前立腺細胞株をＳＱで注射され得る。少なくとも２つのストラテジーが使用され得る：（１）ＬＴＲプロモーターの調節下での構成性ＳＧＰ２８発現、および（２）誘導性ベクター系（例えば、ｅｃｄｙｓｏｎｅ、ｔｅｔなど）の制御下での調節された発現。次いで、腫瘍容積を触知可能な腫瘍の外観でモニターし、次いでＳＧＰ２８発現細胞がより早い速度で成長するか否かを経時的に測定する。さらに、マウスに１×１０5の同じ細胞を同所移植して、ＳＧＰ２８が標的組織（すなわち前立腺）における局所成長または細胞の（特に肺、リンパ節、肝臓、骨髄などに）転移する能力に対する効果を有するか否かを決定し得る。ＳＧＰ２８の骨腫瘍形成および成長に対する効果を、実施例１に記載されるように、前立腺腫瘍細胞を、脛骨内に注射することにより評価し得る。
【０２０２】
これらのアッセイはまた、候補治療組成物（例えば、ＳＧＰ２８抗体、ＳＧＰ２８アンチセンス分子およびリボザイム）のＳＧＰ２８抑制効果を決定するために有用である。
【０２０３】
（実施例１４：ＳＧＰ２８の細胞への結合についての機能的アッセイ）
いくつかの分泌タンパク質が前立腺癌において記載されており、これらの多くは、腫瘍形成および進行のプロセスに関与することが示された（Ｉｎｏｕｅ  Ｋ．，２０００，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６：２１０４−１９，Ｄｏｗ  ＪＫ，ｄｅＶｅｒｅ  Ｗｈｉｔｅ  ＲＷ，２０００，Ｕｒｏｌｏｇｙ  ５５：８００−６）。ＳＧＰ２８は分泌タンパク質であるので、その潜在的な機能の１つは、前立腺癌および転移性疾患の微小環境を調節することである。この可能性を試験するために、ＳＧＰ２８を、組換えタンパク質（例えば、ＧＳＴ−ＳＧＰ２８またはＳＧＰ２８−Ｍｙｃ／Ｈｉｓ）として発現および精製し得る。次いで精製された組換えＳＧＰ２８（ＧＳＴ−ＳＧＰ２８またはＳＧＰ２８−Ｍｙｃ／Ｈｉｓのいずれか）を、前立腺の環境を反復する種々の細胞型（前立腺上皮細胞、前立腺腫瘍細胞株、前立腺間質細胞、前立腺内皮細胞および前立腺神経内分泌細胞を含む）と共にインキュベートする。さらに、組換えＳＧＰ２８をまた、転移部位において見出される細胞（例えば、骨髄細胞および免疫系の細胞）と共にインキュベートする。ＳＧＰ２８のインタクトな細胞への結合を、ＦＡＣＳ分析および熱量計アッセイにより検出する。この分析は、ＳＧＰ２８に結合して応答し得る細胞集団を用いて同定するので価値がある。さらに、標的細胞集団の同定は、ＳＧＰ２８レセプターの単離および同定の手段を提供し、それによりＳＧＰ２８媒介事象を調節するさらなる手段を提供する。
【０２０４】
（実施例１５：ＳＧＰ２８のディフェンシン様活性についてのアッセイ）
ＳＧＰ２８は、ディフェンシンタンパク質、特にβ−ディフェンシンに対して強い相同性を有する。β−ディフェンシンは、主に上皮細胞により産生される分泌産物である（Ｏ’Ｎｅｉｌ  ＤＡら，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：  ６７１８−２４；Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ＪＭ，Ｈａｒｄｅｒ  Ｊ．，１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３１：  ６４５−５１）。ディフェンシンは、感染の予防および上皮組織の免疫の保護において重要な役割を果たし得る。さらに、ヒトＨＮＰ１ディフェンシンは、インビトロで腫瘍細胞死を誘導することが示された。ＳＧＰ２８の細胞死における役割を調べて、精製された組換えＳＧＰ２８を、上記に列挙された種々の細胞型と共にインキュベートし、そしてアネキシンＶ染色細胞のＦＡＣＳ分析を使用してアポトーシス活性について分析する。ＳＧＰ２８はまた、他のディフェンシン分子について示されたように、化学誘引物質として機能し得る（Ｙａｎｇ  Ｄら，２０００，Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６８：９−１４；Ｙａｎｇ  Ｄら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６（５４３９）：５２５−８）。走化性アッセイを使用して、種々の型の細胞（上皮細胞、間質細胞、内皮細胞ならびに単球、リンパ球、および樹状細胞を含む）の移動に対するＳＧＰ２８の影響を評価し得る。
【０２０５】
（実施例１６：ＳＧＰ２８ペプチドのＨＬＡ−Ａ２への推定結合）
ヒトＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ２に結合することが推測されるＳＧＰ２８ペプチドを同定するために、ＳＧＰ２８タンパク質の完全アミノ酸配列を、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  （ＢＩＭＡＳ）ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に見出されるＨＬＡペプチドモチーフ検索アルゴリズムに入力した。ＳＧＰ２８推定結合ペプチドの結果を表５に示す。上位１０にランクする候補を、その位置、各特定ペプチドのアミノ酸配列、および推定結合スコアと共に示す。結合スコアは、そのペプチドを含む複合体の３７℃ｐＨ６．５における解離の推定半減期に対応する。最も高い結合スコア有するペプチド（すなわちＳＧＰ２８ペプチド２について９９９．９）を、細胞表面上のＨＬＡクラスＩに最も密接に結合し、従ってＴ細胞認識についての最も良好な面原性標的を表わすと推定する。ペプチドのＨＬＡ−Ａ２への実際の結合は、抗原プロセシング欠損細胞株Ｔ２条でのＨＬＡ−Ａ２発現の安定化により評価され得る（Ｘｕｅら，１９９７，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３０：７３−８；Ｐｅｓｈｗａら，１９９８，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３６：１２９−３８）。特定のペプチドの免疫原性は、樹状細胞の存在下でのＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の刺激によりインビトロで評価され得る（Ｘｕｅら，１９９７，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３０：７３−８；Ｐｅｓｈｗａら，１９９８，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３６：１２９−３８）。
【０２０６】
【表５】
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本出願全体を通して、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本明細書によりその全体が本明細書中に参考として援用される。
【０２０７】
本発明は、本明細書中に開示される実施形態によりその範囲を限定されず、これらの実施形態は、本発明の個々の局面の単一の例示として意図され、かつ機能的等価物のいずれも本発明の範囲内である。本明細書中に記載されるモデルおよび方法に加えて、本発明のモデルおよび方法に対する種々の改変は、上述の説明および教示から当業者に明らかとなり、そして同様に本発明の範囲内であることが意図される。このような改変または他の実施形態は、本発明の真の範囲および精神から逸脱することなく、実施され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ〜Ｃは、正常組織におけるＳＧＰ２８ｍＲＮＡ発現（図１Ａおよび１Ｂ）および前立腺癌異種移植片高レベル上方調節された発現（パネルＣ）のノーザンブロット分析を示す。正常精巣における低分子量のシグナルは、おそらくプローブ（ＳＳＨフラグメント）のＣＲＩＳＰ２／ＴＲＸ−１メッセージに対する交差ハイブリダイゼーションに起因する。同一転写物は、Ｋｒａｔｚｓｃｈｍａｒら，１９９６，ＥｕｒＪ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３６（３）：８２７−３６に記載されるような遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用して、この正常パネルでＣＲＩＳＰ２について見られた。図１Ａにおいて、レーン１は、心臓であり、レーン２は、脳であり、レーン３は、胎盤であり、レーン４は、肺であり、レーン５は、肝臓であり、レーン６は、骨格筋であり、レーン７は、腎臓であり、そしてレーン８は、膵臓である。図１Ｂにおいて、レーン１は、脾臓であり、レーン２は、胸腺であり、レーン３は、前立腺であり、レーン４は、精巣であり、レーン５は、卵巣であり、レーン６は、小腸であり、レーン７は、結腸であり、そしてレーン８は、リンパ球である。図１Ｃにおいて、レーン１は、前立腺であり、レーン２は、ＬＡＰＣ−４  ＡＤであり、レーン３は、ＬＡＰＣ−４  ＡＩであり、レーン４は、ＬＡＰＣ−９  ＡＤであり、そしてレーン５は、ＬＡＰＣ−９  ＡＩである。
【図２】  図２は、前立腺腫瘍（レーン２、４、６）と正常隣接組織（レーン１、３、５）との３つの対のパネルにおけるＳＧＰ２８／３６Ｐ１Ｇ３ｍＲＮＡのノーザンブロット分析であり、３つの腫瘍切片のうち３つにおける上方調節を示す。
【図３】  図３は、抗ＳＧＰ２８ポリクローナル抗体が、ＬＡＰＣ４およびＬＡＰＣ９異種移植片溶解産物中のＳＧＰ２８タンパク質、ならびにＬＡＰＣ４細胞株およびトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞株の上清中のＳＧＰ２８タンパク質を同定することを実証するウェスタンブロットである。全細胞溶解産物（ＷＣＬ）ならびにＬＡＰＣ４細胞およびＭＹＣ／ＨＩＳ  ＳＧＰ２８で一時的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の上清、ならびにＬＡＰＣ４およびＬＡＰＣ９の異種移植片溶解産物を、アフィニティ精製されたウサギ抗ＳＧＰ２８ｐＡｂ（１μｇ／ｍｌ）を使用するウエスタンブロットにかけた。ＳＧＰ２８免疫反応性バンドを、これらのブロットをＨＲＰ結合体化抗ウサギ二次抗体とのインキュベーション、次いで増強化学発光検出により可視化した。
【図４】  図４は、抗ＳＧＰ２８／ＣＲＩＳＰ−３モノクローナル抗体が、前立腺癌細胞株および上清、前立腺癌異種移植片、ならびに臨床的前立腺癌組織においてＳＧＰ２８／ＣＲＩＳＰ−３タンパク質を特異的に検出するということを示すウエスタンブロット分析である。ＬＡＰＣ４前立腺癌細胞株由来の細胞溶解産物および馴化培地、ならびにＬＡＰＣ４およびＬＡＰＣ９前立腺癌異種移植減由来の溶解産物および対応する正常前立腺および癌性前立腺の臨床切片由来の溶解産物を、ＳＤ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてニトロセルロースに移した。次いでブロットを４Ｇ６抗ＳＧＰ２８／ＣＲＩＳＰ−３モノクローナル抗体上清の１：２希釈を用いてウエスタン分析にかけた。次いで特異的ＳＧＰ２８／ＣＲＩＳＰ−３免疫反応性バンドを、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体化二次抗体とのインキュベーションおよび増強化学発光およびオートラジオグラフフィルムへの露光による現像により可視化した。
【図５Ａ】  図５Ａは、前立腺癌臨床サンプルおよびＬＡＰＣ異種移植片におけるＳＧＰ２８の高レベルの発現を示すウエスタンブロット分析である。前立腺癌（ＰＣａ）および正常隣接組織（ＮＡＴ）の対応する臨床組織溶解産物ならびにＬＡＰＣ４異種移植片の対応する臨床組織溶解産物を、１μｇ／ｍｌのアフィニティ精製されたウサギ抗ＳＧＰ２８ｐＡｂを用いるウエスタンブロットにかけた。ＳＧＰ２８免疫反応性バンドを、これらのブロットをＨＲＰ−結合体化抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートし、次いで増強化学発光検出することにより可視化した。ＳＧＰ２８／ＣＲＩＳＰ−３免疫反応性タンパク質の二本のバンド（ｄｏｕｂｌｅｔ）が矢印で示される。
【図５Ｂ】  図５Ｂは、ＬＡＰＣ異種移植片におけるＳＧＰ２８の高レベルの発現、ならびに正常精巣および正常肺における低レベルの発現を示すウエスタンブロット分析である。脾臓、精巣、腎臓、肝臓および肺の正常組織溶解産物、ならびにＬＡＰＣ４細胞株および異種移植片を、図５Ａについて記載されるようにウエスタンブロットにかけた。ＳＧＰ２８／ＣＲＩＳＰ−３免疫反応性タンパク質の二本のバンドが矢印で示される。
【図６Ａ】  図６Ａは、Ｇｌｅａｓｏｎスコア７の前立腺癌（図６Ａ）におけるＳＧＰ２８タンパク質の免疫組織化学的分析であり、アフィニティ精製されたポリクローナル抗体を使用して、前立腺の管腔内へのＳＧＰ２８の高レベルの発現および分泌を示す。強い染色が、前立腺の上皮細胞、特に管腔縁において上皮細胞で観察された。染色はまた管腔内で観察され、前立腺癌およびＰＩＮにおけるＳＧＰ２８の高レベルの発現および分泌を示す。
【図６Ｂ】  図６Ｂは、高異型度（ｇｒａｄｅ）ＰＩＮ（図６Ｂ）におけるＳＧＰ２８タンパク質の免疫組織化学的分析であり、アフィニティ精製されたポリクローナル抗体を使用して、前立腺の管腔内へのＳＧＰ２８の高レベルの発現および分泌を示す。強い染色が、前立腺の上皮細胞、特に管腔縁において上皮細胞で観察された。染色はまた管腔内で観察され、前立腺癌およびＰＩＮにおけるＳＧＰ２８の高レベルの発現および分泌を示す。
【図７Ａ】  図７Ａは、骨への前立腺癌転移におけるＳＧＰ２８タンパク質の発現を実証する免疫組織化学的分析である。
【図７Ｂ】  図７Ｂは、リンパ節への前立腺癌転移におけるＳＧＰ２８タンパク質の発現を実証する免疫組織化学的分析である。
【図８Ａ】  図８は、前立腺癌およびＰＩＮにおけるＳＧＰ２８タンパク質の免疫組織化学的分析である。図８Ａは、２００倍の倍率での前立腺癌におけるＳＧＰ２８の免疫組織化学的検出を示す。
【図８Ｂ】  図８は、前立腺癌およびＰＩＮにおけるＳＧＰ２８タンパク質の免疫組織化学的分析である。図８Ｂは、８００倍の倍率における図８Ａと同じものを示す。
【図８Ｃ】  図８は、前立腺癌およびＰＩＮにおけるＳＧＰ２８タンパク質の免疫組織化学的分析である。図８Ｃは、２００倍でのＰＩＮにおけるＳＧＰ２８発現を示す。
【図８Ｄ】  図８は、前立腺癌およびＰＩＮにおけるＳＧＰ２８タンパク質の免疫組織化学的分析である。図８Ｄは、８００倍でのＰＩＮにおけるＳＧＰ２８発現を示す。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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