(57)【要約】  本発明は、（１）天然より分離されたバクテロイデス・ブルガタスの生菌を含む組成物と、（２）天然より分離されたバクテロイデス・ドレイの生菌を含む組成物との組み合わせ物を提供する。
2019156251.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）天然より分離されたバクテロイデス・ブルガタスの生菌を含む組成物と、
（２）天然より分離されたバクテロイデス・ドレイの生菌を含む組成物と
の組み合わせ物。
【請求項２】
前記（１）の組成物と前記（２）の組成物とが同一物である、請求項１に記載の組み合わせ物。
【請求項３】
医薬品又は医薬品添加物である、請求項１又は２に記載の組み合わせ物。
【請求項４】
食品もしくは飼料又はそのための添加物である、請求項１又は２に記載の組み合わせ物。
【請求項５】
血中又は腸内リポ多糖レベルの亢進と関連する疾患の予防及び／又は改善のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項６】
前記疾患が循環器系疾患、炎症性疾患又は代謝性疾患である、請求項５に記載の組み合わせ物。
【請求項７】
前記疾患が、心房細動、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、狭心症、高血圧症、動脈硬化症、大動脈瘤、大動脈解離、閉塞性動脈硬化症、大動脈弁狭窄症からなる群より選択される循環器系疾患である、請求項５に記載の組み合わせ物。
【請求項８】
前記疾患が、肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、脂肪肝、肝癌、腸管炎症、過敏性腸症候群、胃炎、膠原病、慢性関節リウマチ、慢性腎炎、IgA腎症、気管支喘息、間質性肺炎、薬剤性肺障害、好酸球性肺浸潤症候群、非定型性抗酸菌症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎及び敗血症からなる群より選択される炎症性疾患である、請求項５に記載の組み合わせ物。
【請求項９】
前記疾患が、糖尿病、肥満、メタボリックシンドローム、生活習慣病、脂質異常症及び骨粗鬆症からなる群より選択される代謝性疾患である、請求項５に記載の組み合わせ物。
【請求項１０】
天然より分離されたバクテロイデス・ブルガタスの生菌と、天然より分離されたバクテロイデス・ドレイの生菌とを経口摂取することを含む、血中又は腸内リポ多糖レベルの亢進と関連する疾患の予防及び／又は改善方法。
【請求項１１】
前記疾患が循環器系疾患、炎症性疾患又は代謝性疾患である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
被験者の腸内細菌叢におけるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの存在量を測定することを含む、血中又は腸内リポ多糖レベルの亢進と関連する疾患の検査方法。
【請求項１３】
前記疾患が循環器系疾患、炎症性疾患又は代謝性疾患である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（１）配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、及び
（２）配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子
を検出することを含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を検出し得るプライマーセット又はプローブを含む、血中又は腸内リポ多糖レベルの亢進と関連する疾患の発症リスクの検査用試薬。
【請求項１６】
前記疾患が循環器系疾患、炎症性疾患又は代謝性疾患である、請求項１５に記載の試薬。
【請求項１７】
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が、
（１）配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、及び
（２）配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列
を含む、請求項１５又は１６に記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポ多糖（以下、「ＬＰＳ」と略記する場合がある。）制御性腸内細菌及びその用途に関する。より詳細には、本発明は、腸内細菌によるＬＰＳ産生及びその血中への移行を制御し得る２種の特定のバクテロイデス属に属する細菌（即ち、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイ）の組み合わせ、該組み合わせを含んでなる医薬、食品等、特にＬＰＳが関与する疾患（例、循環器系疾患、炎症性疾患、代謝性疾患）の予防及び／又は改善剤、腸内細菌叢における該細菌の存在量を指標とした上記疾患の診断方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸内細菌叢と宿主の代謝及び免疫におけるその役割の理解が進んだことで、多くの疾患に対する腸内細菌叢に関連した診断及び治療ターゲットの開発に、かつてない関心が注がれている。次世代シーケンサー技術や統合オミクス解析の普及は、微生物界に関する我々の知識を劇的に拡げた。腸内細菌叢と心血管疾患との間の強い関係を示唆する証拠が増えている。例えば、食餌性ホスファチジルコリンの腸内細菌叢による代謝物であるトリメチルアミン（ＴＭＡ）及びトリメチルアミン−Ｎ−オキシド（ＴＭＡＯ）は、心血管疾患、特に動脈硬化のプロセスと関連することが知られている。
しかし、最近の臨床試験の結果、魚の摂取が血中ＴＭＡＯレベルを一時的ではあるが劇的に増加させるという矛盾する結果が示されており、食餌と腸内細菌叢との関係に関する現在の当該分野の理解に限界があることを浮き彫りにしている。【０００３】
バクテロイデス属（Bacteroides）は、ヒトにおいて優勢ないくつかの腸内細菌を含み、健常な腸内生態系の維持に重要な役割を果たしていることが知られている。バクテロイデス属が低レベルであることにより特徴づけられるエンテロタイプ３に分類される個体は、症候性動脈硬化の発症頻度が高い（非特許文献１）。さらに、バクテロイデス属の存在量は、動脈硬化性の虚血性脳梗塞及び一過性脳虚血発作患者において減少していることが明らかとなった（非特許文献２）。これらの観察と一致して、末端制限断片長多型（Ｔ−ＲＦＬＰ）解析を用いた本発明者らの以前の研究により、バクテロイデス門（Bacteroidetes）の存在量は、冠動脈疾患(ＣＡＤ)患者において、動脈硬化のリスクファクターを有するが動脈硬化性疾患を発症していない患者や健常ボランティアよりも、低いことが確認された（非特許文献３、４）。さらに、ショットガンシーケンス法による腸内細菌メタゲノム解析により、やはりＣＡＤ患者でのバクテロイデス菌種の減少が示され（非特許文献５）、これらの知見は、バクテロイデス属とＣＡＤとの関係を強く示唆している。
しかし、どの特定のバクテロイデス種が関与し、ＣＡＤにおけるそれらの真の役割が何なのかについては未だ不明のままである。【０００４】
グラム陰性菌の細胞壁外膜成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）は、マクロファージ等の免疫細胞を活性化することが知られており、代謝性エンドトキシン血症は、慢性炎症や、糖尿病、動脈硬化等の心血管−代謝性疾患に関与することが示されている（非特許文献６）。本発明者らは以前、無菌ＡｐｏＥ欠損マウスでは、コンベンショナルな条件下で飼育された同マウスに比べて、大動脈洞の動脈硬化病変の形成が抑制されること、また、それに付随して、血中ＬＰＳレベルやマクロファージ及び大動脈における炎症性サイトカインレベルが低値を示すことを見出した（非特許文献７）。
その一方で、特許文献１には、バクテロイデス・ブルガタス（Bacteroides vulgatus）を含む３種のバクテロイデス属の細菌由来の成分（例、ＬＰＳ）を含む経口投与用のカプセル組成物が開示されており、種々の炎症性疾患や自己免疫疾患等の治療及び発症遅延に使用できることが記載されている。但し、それらの組成物が実際に当該効能を有することは実証されていない。
また、非特許文献８には、バクテロイデス・ドレイ（Bacteroides dorei）由来のＬＰＳは大腸菌由来のＬＰＳとは構造が異なり、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）刺激能が弱く、自然免疫を誘導しにくいことが記載されている。【０００５】
しかしながら、バクテロイデス属の細菌が、他の腸内細菌を含めた腸内でのＬＰＳ産生全般に対して影響を及ぼすとの報告は皆無である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表2013-527240号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Karlsson, F.H. et al. Nat Commun. 3, 1245 (2012).
【非特許文献２】Yin, J. et al. J Am Heart Assoc. 4, E002699 (2015).
【非特許文献３】Emoto, T. et al. J Atheroscler Thromb. 23, 908-921 (2016).
【非特許文献４】Emoto, T. et al. Heart Vessels. 32, 39-46 (2017).
【非特許文献５】Jie, Z. et al. Nat Commun. 18, 845 (2017).
【非特許文献６】Patel, P.N. et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 35, 525-534 (2015).
【非特許文献７】Kasahara, K. et al. J Lipid Res. 58, 519-528 (2017).
【非特許文献８】Vatanen, T. et al. Cell. 165, 842-853 (2016).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
過去１０年間のスタチン治療の普及にもかかわらず、ＣＡＤは未だ世界中で主たる死因の１つである。本発明の目的は、新規かつ安価なＣＡＤの予防及び／又は治療戦略のターゲットとなり得る腸内細菌叢の特定の細菌種を同定することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく、まず１６Ｓ リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子ランダムシーケンシングを行ってＣＡＤ患者と非ＣＡＤ患者における腸内細菌叢を比較した。その結果、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイがＣＡＤ患者において減少していることを見出した。さらに、本発明者らは、動脈硬化傾向を示すＡｐｏＥ欠損マウスにおける一連の解析により、これらのバクテロイデス種と動脈硬化とを繋ぐ根底にある作用メカニズムを解明した。即ち、これらのバクテロイデス種は腸内細菌のＬＰＳ産生を顕著に抑制するとともに、腸管バリアのタイトジャンクションを強化することにより該バリアの透過性を低下させ、ＬＰＳの血中への移行（即ち、エンドトキシン血症の誘起）を抑制することで、炎症誘発性免疫応答を抑制し、動脈硬化病変の形成を阻害することを見出した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、バクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイの摂取は、動脈硬化をはじめとする循環器系疾患や、炎症性疾患、代謝性疾患の予防及び／又は改善に有用であり、また、腸内細菌叢における該バクテロイデス種の存在量を指標として前記疾患の診断が可能であると結論して、本発明を完成するに至った。【００１０】
即ち、本発明は以下のものを提供する。
［１］
（１）天然より分離されたバクテロイデス・ブルガタスの生菌を含む組成物と、
（２）天然より分離されたバクテロイデス・ドレイの生菌を含む組成物と
の組み合わせ物。
［２］前記（１）の組成物と前記（２）の組成物とが同一物である、［１］に記載の組み合わせ物。
［３］医薬品又は医薬品添加物である、［１］又は［２］に記載の組み合わせ物。
［４］食品もしくは飼料又はそのための添加物である、［１］又は［２］に記載の組み合わせ物。
［５］血中又は腸内リポ多糖レベルの亢進と関連する疾患の予防及び／又は改善のための、［１］〜［４］のいずれかに記載の組み合わせ物。
［６］前記疾患が循環器系疾患、炎症性疾患又は代謝性疾患である、［５］に記載の組み合わせ物。
［７］前記疾患が、心房細動、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、狭心症、高血圧症、動脈硬化症、大動脈瘤、大動脈解離、閉塞性動脈硬化症、大動脈弁狭窄症からなる群より選択される循環器系疾患である、［５］に記載の組み合わせ物。
［８］前記疾患が、肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、脂肪肝、肝癌、腸管炎症、過敏性腸症候群、胃炎、膠原病、慢性関節リウマチ、慢性腎炎、IgA腎症、気管支喘息、間質性肺炎、薬剤性肺障害、好酸球性肺浸潤症候群、非定型性抗酸菌症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎及び敗血症からなる群より選択される炎症性疾患である、［５］に記載の組み合わせ物。
［９］前記疾患が、糖尿病、肥満、メタボリックシンドローム、生活習慣病、脂質異常症及び骨粗鬆症からなる群より選択される代謝性疾患である、［５］に記載の組み合わせ物。
［１０］天然より分離されたバクテロイデス・ブルガタスの生菌と、天然より分離されたバクテロイデス・ドレイの生菌とを経口摂取することを含む、血中又は腸内リポ多糖レベルの亢進と関連する疾患の予防及び／又は改善方法。
［１１］前記疾患が循環器系疾患、炎症性疾患又は代謝性疾患である、［１０］に記載の方法。
［１２］被験者の腸内細菌叢におけるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの存在量を測定することを含む、血中又は腸内リポ多糖レベルの亢進と関連する疾患の検査方法。
［１３］前記疾患が循環器系疾患、炎症性疾患又は代謝性疾患である、［１２］に記載の方法。
［１４］（１）配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、及び
（２）配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子
を検出することを含む、［１２］又は［１３］に記載の方法。
［１５］バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を検出し得るプライマーセット又はプローブを含む、血中又は腸内リポ多糖レベルの亢進と関連する疾患の発症リスクの検査用試薬。
［１６］前記疾患が循環器系疾患、炎症性疾患又は代謝性疾患である、［１５］に記載の試薬。
［１７］１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が、
（１）配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、及び
（２）配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列
を含む、［１５］又は［１６］に記載の試薬。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、大量に発酵生産可能な微生物の経口摂取（プロバイオティクス）を通じて、動脈硬化をはじめとする循環器系疾患や、慢性炎症を伴う疾患、糖脂質代謝等の代謝異常を伴う代謝性疾患の予防及び／又は改善が可能となるため、それらの疾患の安価かつ簡便な制御戦略が提供され、高齢化社会における医療経済にも資する。また、本発明によれば、糞便中のマイクロバイオーム解析を通じて、前記疾患の診断・発症リスク予測が可能となり、非侵襲性の臨床検査手法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＣＡＤ患者又は非ＣＡＤ患者における腸内微生物の変化を示す図である。  ３０人の対照（ＣＡＤを発症していないが、冠状動脈のリスクファクターを有している）患者及び３０人のＣＡＤ患者由来の糞便サンプルにおいて、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ３−Ｖ４領域をシーケンスした。（ａ）腸内微生物叢における属の存在量に基づいて、参加者を３つのクラスターに分類した。（ｂ）クラスター間の各主要属の分布。各属のクラスター間分布を比較するために、Ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡを使用した。（ｃ）各クラスターにおける対照及びＣＡＤ患者の分布。３つのクラスターを比較するために、カイ二乗検定を用いた。（ｄ）対照及びＣＡＤ患者におけるバクテロイデス属の相対的存在量  （全腸内微生物叢のパーセンテージ）。（ｅ）対照及びＣＡＤ患者におけるバクテロイデス種の相対的存在量（全バクテロイデス属に対するパーセンテージ）。（ｆ）バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ブルガタスの相対的存在量（全腸内微生物叢のパーセンテージ）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。統計的有意性を決定するために、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を用いた（ｂ，ｄ，ｆ）。データは、中央値±四分位範囲（第１〜第３四分位範囲）で示す（ｂ，ｄ，ｆ）。
【図２】アテローム性動脈硬化症及びプラーク炎症の発症における、生きたバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイを伴った胃管栄養の影響を示す図である。  生きたバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株、又はビヒクル（対照）で処理した６週齢の雌Ａｐｏｅ−／−マウスを、１６週齢で屠殺し、アテローム性動脈硬化症による病変を評価した。（ａ）大動脈洞におけるアテローム性動脈硬化症による病変領域のオイルレッドＯ染色の代表的な顕微鏡写真及び定量分析（グループ当たり８−９サンプル）。黒棒は２００μｍを表わす。（ｂ）大動脈のアテローム硬化性プラーク領域のオイルレッドＯ染色の代表的な顕微鏡写真及び定量分析（グループ当たり７−９サンプル）。白棒は１．５ｍｍを表わす。（ｃ）大動脈洞における、マクロファージの代表的な蛍光染色及びＭＯＭＡ−２陽性染色の定量分析  （グループ当たり７サンプル）。黒棒は１００μｍを表わす。（ｄ）大動脈洞における、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の代表的な切片及び定量分析（グループ当たり８−９サンプル）。黒棒は５０μｍを表わす。（ｅ）アテローム硬化性大動脈におけるｍＲＮＡレベル。データは、ハウスキーピングＧＡＰＤＨ遺伝子に対して標準化し、平均値で示す（グループ当たり４−５サンプル）。（ｆ）実験期間を通しての体重変化（グループ当たり８−９サンプル）。（ｇ）血漿脂質プロファイルの比較（グループ当たり８−９サンプル）。ＬＢ：生きたバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株で処理した；Ｔ−Ｃｈｏ：総コレステロール；ＴＧ：トリグリセリド；ＬＤＬ：低密度リポタンパク質コレステロール；ＨＤＬ：高密度リポタンパク質コレステロール。＊Ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定。データは、平均±平均の標準誤差で示す。
【図３】腸の免疫応答における変化及び腸内微生物のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）産生を示す図である。  結腸及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮｓ）を、バクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株、又はビヒクル（対照）で処理した１６週齢の雌Ａｐｏｅ−／−マウスから切除した。（ａ）結腸における、免疫細胞マーカー及びケモカイン／ケモカインレセプターのｍＲＮＡ発現レベル（グループ当たり７−８サンプル）。（ｂ）結腸における、炎症誘発性サイトカインのｍＲＮＡ発現レベル（グループ当たり７−８サンプル）。（ｃ）ＭＬＮにおける特異的細胞マーカーのフローサイトメトリー分析（グループ当たり４−５サンプル）。（ｄ）ＭＬＮにおけるサイトカインのｍＲＮＡ発現レベル（グループ当たり５サンプル）。（ｅ）カブトガニ変形細胞ライセートアッセイによる糞便  ＬＰＳレベルの定量（グループ当たり７−８サンプル）。（ｆ）カブトガニ変形細胞ライセートアッセイによる血漿ＬＰＳレベルの定量（グループ当たり５サンプル）。（ｇ）サイトカイン・ビーズアレイによる、血漿サイトカインレベルの定量（グループ当たり４−５サンプル）。ＬＢ：生きたバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株で処理した；ＭＦＩ：平均蛍光強度。２グループ間の有意差を検出するために、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を用いた。データは、平均±平均の標準誤差で表す（ａ−ｇ）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図４】密着結合形成における、生きたバクテロイデス処理の影響を示す図である。（ａ）マウスの経口胃管栄養後４時間における、血清のフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識デキストラン濃度の測定（グループ当たり４−５サンプル）。（ｂ）マウス結腸における、密着結合遺伝子のｍＲＮＡ発現レベル（グループ当たり７−８サンプル）。（ｃ）免疫蛍光染色によって可視化した密着結合タンパク質ＺＯ−１（グループ当たり４−５サンプル）。白棒は、２５０μｍを表わす。（ｄ）糞便上清で刺激したＨＴ２９細胞における密着結合遺伝子のｍＲＮＡレベル（グループ当たり５サンプル）。（ｅ）糞便上清で刺激したＨＴ２９細胞における、ＺＯ−１発現のウェスタン・ブロット分析（βアクチンに対して標準化）（グループ当たり８サンプル）。ＬＢ：生きたバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株で処理した；ＬＰＳ：リポポリサッカライド；ＭＦＩ：平均蛍光強度。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定。データは、平均±平均の標準誤差で表す。
【図５】ＣＡＤを有する又は有しない患者における腸内微生物ＬＰＳ産生を示す図である。（ａ）１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングに使用したものと同じサンプルにおいて、カブトガニ変形細胞ライセートアッセイによって糞便ＬＰＳレベルを定量した（グループ当たり２９−３０サンプル）。有意性を決定するために、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を用いた。＊Ｐ＜０．０５。データは、中央値±四分位範囲（第１〜第３四分位範囲）で示す。（ｂ）バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの糞便ＬＰＳレベル及び相対的な量の間での統計的相関について、Ｐｅａｒｓｏｎの相関係数を決定することにより、単純な線形相関を計算した（５９サンプル；２９人の対照及び３０人のＣＡＤ）。ＣＡＤ：冠動脈疾患患者
【図６】ＣＡＤ患者又は非ＣＡＤ患者における、腸内微生物叢プロファイルを示す図である。腸内微生物叢の分布を比較するために、種レベルでの主成分分析を実施した。主成分においてより重い種を示す。
【図７】アテローム性動脈硬化症傾向のあるマウスの腸内微生物叢における、生きたバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイを伴った胃管栄養の影響を示す図である。１０週間、通常の飼料、並びに生きたバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株、又はビヒクルで処理した飼料を摂食した雌のＡｐｏｅ−／−マウスから糞便を採取した。細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ３−Ｖ４領域をシーケンスした。（ａ）処理前後における、最も存在量が多い１５の微生物属の相対的存在量。（ｂ）属レベルでの主成分分析（ＰＣＡ）スコア・プロット。（ｃ）Ｓｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒ指標の観点から決定した腸内微生物の多様性。（ｄ）処理後のグラム陰性株に対するグラム陽性株の比。（ｅ）処理後のバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイＤＮＡの糞便中の存在量の相対的増加（グループ当たりｎ＝３）。ＬＢ：生きたバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株を伴った胃管栄養；ｂｅｆｏｒｅ：実験前；ａｆｔｅｒ：胃管栄養後１０週。
【図８】マウス糞便上清でのｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激による、細胞増殖及びサイトカイン産生の阻害を示す図である。ＲＡＷ２６４．７細胞を、１０週間、生きたバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株、又はビヒクル（対照）で処理したマウス由来の糞便上清で刺激した。（ａ）代表的なフローサイトメトリーのヒストグラム（左パネル）及びＫｉ−６７発現の定量分析（右パネル）（グループ当たり５サンプル）。（ｂ）対照ｓｉＲＮＡ又はＴＬＲ４ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＲＡＷ２６４．７細胞を、マウスの各グループ由来の糞便上清で刺激した。サイトカインレベルを、サイトカイン・ビーズアレイによって定量した（グループ当たり７サンプル）。ＬＢ：生きたバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株で処理した；ＭＦＩ：平均蛍光強度。２グループ間の有意差を検出するために、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定（ａ）又はＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定（ｂ）を用いた。データは、平均±平均の標準誤差（ａ）、又は中央値±四分位範囲（第１〜第３四分位範囲）（ｂ）で表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図９】生きたバクテロイデス処理及び脾臓における免疫応答を示す図である。  バクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株、又はビヒクル（対照）で処理した１６週齢Ａｐｏｅ−／−マウスから脾細胞を採取した。（ａ）脾細胞における、表示の免疫細胞のパーセンテージ（グループ当たり４−５サンプル）。（ｂ）ＣＤ１１ｃｈｉｇｈ抗原提示細胞における免疫細胞マーカーの発現（グループ当たり４−５サンプル）。（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞数。（ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞数における、免疫細胞マーカー（グループ当たり５サンプル）。（ｅ）ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＴｒｅｇｓにおけるＣＴＬＡ４発現（グループ当たり５サンプル）。ＬＢ：生きたバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株で処理した；Ｔｒｅｇｓ：制御性Ｔ細胞；ＭＦＩ：平均蛍光強度。＊Ｐ＜０．０５。２グループ間の有意差を検出するために、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を用いた。データは、平均±平均の標準誤差で表す。
【図１０】ＡｐｏＥ欠損マウスに及ぼす生きたバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株又はバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株の単独投与の効果を示す図である。対照群にはビヒクルのみを経口摂取させた。上段左は、大動脈洞の動脈硬化病変の大きさを、上段右は、腸管内（糞便中）ＬＰＳ濃度を示す。下段左上は、大腸におけるタイトジャンクション関連遺伝子の発現、下段右上は、大腸におけるサイトカイン遺伝子の発現、下段左下は、血中サイトカイン濃度をそれぞれ示す。
【図１１】バクテロイデス・ブルガタス ATCC 8482T株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とバクテロイデス・ドレイ JCM 13471T株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とのアラインメントを示す図である。
【図１２】バクテロイデス・ブルガタス（ATCC 8482T株（ｖ）及びNTZ002株（Ｎｖ））とバクテロイデス・ドレイ（DSM 17855T株（ｄ）及びNTZ001株（Ｎｄ））との種々の組み合わせによる動脈硬化マウスモデルにおける糞便中ＬＰＳレベルの改善効果を示す図である。
【図１３】バクテロイデス・ブルガタス ATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株の生菌又は死菌を投与した動脈硬化マウスにおける腸内ＬＰＳレベルを示す図である。図中左側及び右側は、それぞれバクテロイデスを投与したマウスの糞便中及び盲腸便中のＬＰＳレベルを示し、中央は、抗生物質（ＡＶＮＭ）を投与したマウスの糞便中ＬＰＳレベルを示す。
【図１４−１】図１４−１及び図１４−２は、バクテロイデス・ブルガタス ATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株（Ｂ）又はバクテロイデス・ブルガタスNTZ002株及びバクテロイデス・ドレイNTZ001株（ＮＢ）の生菌を投与した肥満マウスモデルにおける肥満の諸症状の改善を示す。Ａは、各群の投与プロトコルを模式的に示す。Ｂ及びＣは、それぞれマウスの体重の推移及び体重増加量の推移を示す。Ｄは、ＯＧＴＴ試験の結果（左から血糖値、血糖値のＡＵＣ及びインスリン抵抗性（ＨＯＭＡ−ＩＲ））を示す。
【図１４−２】Ｅは、精巣上体脂肪標本のＨＥ、ＭＡＣ３及びシリウスレッド染色像（左）、並びに、上から脂肪細胞の大きさ、単位細胞あたりの王冠様構造の数、及び線維化領域の割合（右）を示す。Ｆは、精巣上体周囲の脂肪における炎症細胞マーカー又はマクロファージマーカーのｍＲＮＡ発現（左）及びサイトカインＩＦＮγ及びＴＮＦαのｍＲＮＡ発現を示す。
【図１５−１】図１５−１及び図１５−２は、バクテロイデス・ブルガタス ATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株の生菌を投与したＮＡＳＨマウスモデルにおけるＮＡＳＨの諸症状の改善を示す。上パネルは、１７週齢における肝臓切片のＨＥ染色像を示す。中パネルは、ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）、下パネルは、左から血中ＡＳＴレベル及びＡＳＴ／ＡＬＴ比を示す。
【図１５−２】切除した肝臓の全体像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．リポ多糖（ＬＰＳ）制御性腸内細菌
本発明は、バクテロイデス属に属する細菌であるバクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイとの組み合わせ物（以下、「本発明の組み合わせ物」ともいう。）を提供する。ここで「組み合わせ物」とは、両者が混合された１つの組成物として存在してもよいし、あるいは、それぞれ別個の組成物として存在するが、ある目的（例、医薬、食品もしくは食品添加物、飼料もしくは飼料添加物）のために組み合わせて使用される、キット化された状態のものであってもよいことを意味する。本発明の組み合わせ物は、ヒトや他の動物の腸内で共存することにより、腸内のＬＰＳレベルを低減させ、腸管バリアのタイトジャンクションを強化して血中ＬＰＳレベルを低減させ、腸内、血管内、及び臓器内での炎症応答・免疫応答を抑制し得る（本明細書においては、これらの作用効果を「リポ多糖（ＬＰＳ）制御性」と包括的にいう場合がある）。
【００１４】
より具体的には、「本発明の組み合わせ物」は、
（１）天然より分離されたバクテロイデス・ブルガタスの生菌を含む組成物と、
（２）天然より分離されたバクテロイデス・ドレイの生菌を含む組成物と
を組み合わせてなる。
【００１５】
バクテロイデス属（Bacteroides）は、バクテロイデス門、バクテロイデス綱、バクテロイデス目、バクテロイデス科の真正細菌に分類されるグラム陰性の偏性嫌気性非芽胞形成桿菌であり、現在９２種と５亜種が知られている。バクテロイデス属は、ヒトにおいて優勢ないくつかの腸内細菌を含み、健常な腸内生態系の維持に重要な役割を果たしていると考えられている。
バクテロイデス・ブルガタス（Bacteroides vulgatus）は、ヒト消化管から最もよく分離される細菌であり、一般的に有益な片利共生菌と考えられている。バクテロイデス・ドレイ（Bacteroides dorei）は、２００６年に、ヒト糞便から分離され１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングによりバクテロイデス・ブルガタスに最も近縁な（約９６％の同一性を有する）新菌種として同定された（Int J Sys Evol Microbiol. 56, 1639-1643, 2006）。
【００１６】
本明細書において「天然より分離された」とは、自然界に元来存在する状態よりも菌体密度が高くなるように、人為的操作を施されたものであることを意味し、完全に純化（単離精製）されたものだけでなく、他の夾雑物を含んだ状態のものも包含される。一方、糞便や盲腸内容物等のような天然物を単に採取しただけの場合は、「天然より分離された」ものに含まれない。
【００１７】
本発明の組み合わせ物の活性成分であるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイは、天然より分離されたものである限り、いかなる方法によって提供されてもよいが、例えば、天然の分離源（例、糞便、盲腸等の消化管内容物、土壌、水）より新たに分離したものを用いることができる。分離源としては、好ましくはヒト又は他の哺乳動物の糞便である。例えば、糞便サンプルを無菌のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等に懸濁し、得られる懸濁液を白金耳などを用いて、バクテロイデス属細菌の培養に適した平板培地にプレーティングし、出現したコロニーの菌学的特徴（形態学的特徴、生化学的特徴等）から、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイのコロニーを選択することができる。以下に、両菌種の代表的な菌学的特徴を示す。
【００１８】
（１）肉眼的特徴
（１−１）５％ウマ血液添加Eggerth Gagnon（ＥＧ）寒天培地上で、円形で白色の凸状に隆起したコロニーを形成する。
（１−２）顕微鏡学的特徴：桿菌で運動性はなく、芽胞を形成しない。
（２）生育条件
（２−１）温度：２５〜４０℃で生育する。至適温度は３７℃
（２−２）偏性嫌気性
（３）生理学的・生化学的特徴
（３−１）グラム染色性：陰性
（３−２）他の生化学的特徴を表１に示す［表中、１はバクテロイデス・ドレイ JCM13471T株、２はバクテロイデス・ドレイJCM13472株、３はバクテロイデス・ブルガタス JCM5826T株をそれぞれ示す。生化学的試験は、API 20 A及びAPI rapid ID 32 Aストリップ（bioMerieux）を用いて行った。］（Int J Sys Evol Microbiol. 56, 1639-1643, 2006より抜粋）
【００１９】
【表１】
2019156251.tif 000003
【００２０】
分離源から分離された細菌がバクテロイデス・ブルガタス又はバクテロイデス・ドレイに属する菌株か否かは、例えば、該菌株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全部又は一部をＰＣＲ増幅し、該増幅断片のヌクレオチド配列を決定して、既知のバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの配列データと比較し、系統解析を行うことにより判別することができる。系統解析及び系統樹の作製方法は、例えば以下の手順に従って行うことができる。
【００２１】
まず細菌から鋳型となるゲノムＤＮＡを抽出する。細菌からＤＮＡを抽出する方法は公知であり、いずれの方法を使用してもよい。一般的には、細胞をリゾチームなどの細胞壁分解酵素で処理する方法、ガラスビーズによる物理的破壊方法、凍結融解を繰り返す処理方法などが使用される。また市販のＤＮＡ抽出用の試薬も使用することができる。ゲノムＤＮＡは必ずしもインタクトな状態で抽出されなくてもよい。従って、試料のコンタミネーションの可能性が低く、操作が簡単で、迅速に行なうことのできる方法を適宜選択することができる。
【００２２】
次にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする標的ＤＮＡを増幅する。ＰＣＲにおいて使用されるプライマーの配列は、少なくともバクテロイデス・ブルガタス及び／又はバクテロイデス・ドレイに属する全ての既知細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする標的ＤＮＡが増幅されるよう適宜設計することができるが、通常、生物種を超えて保存された配列からなるプライマー（ユニバーサルプライマー；例えば、Ｖ１〜Ｖ２領域の約３５０塩基を増幅する２７Ｆと３５７Ｒのプライマーセットや、後述の実施例で使用されるＶ３〜Ｖ４領域の約４６０塩基を増幅する３４２Ｆと８０６Ｒのプライマーセット等）が使用される。またＰＣＲの条件は特に限定されず、通常用いられる範囲内で適宜選択することができる。市販のＰＣＲ用試薬を使用して、添付の説明書に従って反応を行うことができる。
【００２３】
ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片は、必要に応じてスピンカラムなどを用いて精製されたのち、その塩基配列が決定される。塩基配列の決定は定法に従って行なうことができる。
【００２４】
決定された塩基配列は、適当な遺伝子配列データベース及び相同性検索プログラムを用いて、既知の細菌１６ＳリボソームＤＮＡ配列とのホモロジー検索を行うことにより、最も高いホモロジーを示す既知配列を抽出することができる。例えば、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のホームページを通じて、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡが利用できる。プログラムとしてｂｌａｓｔｎやｆａｓｔａを選択し、決定された塩基配列をクエリーとし、検索対象データベースとして１６Ｓ ｒＲＮＡ（Prokaryotes）を選択して検索を実施すれば、高いホモロジーを示す既知配列が抽出され出力される。細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータセットを含む限り、いかなる他の遺伝子配列データベースも利用することができる（例えば、RDP(http://rdp.cme.msu.edu)、Silva(http://www.arb-silva.de)等）。また、上記以外の自体公知のホモロジー検索プログラムを用いることもできる。
【００２５】
一般に、細菌については、属レベルでの同定には９５％以上、種レベルでの同定には９８％以上の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の同一性が必要とされる（Science 2005, 307, 1915-1920）。従って、ホモロジー検索の結果、単離された細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列が、バクテロイデス・ブルガタス又はバクテロイデス・ドレイに属する細菌の既知配列と９８％以上の同一性を有する場合、当該細菌をこれらのいずれかのバクテロイデス種に属する細菌として同定することができる。
【００２６】
判別の基準となる既知の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列としては、バクテロイデス・ブルガタスの場合、例えば、GenBankにアクセッション番号NR_074515にて登録されているバクテロイデス・ブルガタス ATCC 8482T株由来の配列（配列番号１）、アクセッション番号NR_112946にて登録されているバクテロイデス・ブルガタス JCM5826T株由来の配列（配列番号２）等が挙げられるが、それらに限定されない。一方、バクテロイデス・ドレイの既知１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列としては、例えば、GenBankにアクセッション番号AB242142にて登録されているバクテロイデス・ドレイ JCM13471T株由来の配列（配列番号３）、アクセッション番号AB242143にて登録されているバクテロイデス・ドレイ JCM13472株由来の配列（配列番号４）等が挙げられるが、それらに限定されない。
従って、前記ＰＣＲ増幅断片のヌクレオチド配列が、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有する場合、分離された細菌はバクテロイデス・ブルガタスに属する細菌であると同定することができる。また、前記増幅断片のヌクレオチド配列が、配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有する場合、分離された細菌はバクテロイデス・ドレイに属する細菌であると同定することができる。
【００２７】
また、増幅したＤＮＡの塩基配列に基づき分子進化系統樹を推定し、単離された細菌の分類学的位置を特定することもできる。分子進化系統樹解析ソフトはインターネット等でも公開されており、それらを利用することができる（ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ等）。系統樹解析の結果、単離された細菌がバクテロイデス・ブルガタス又はバクテロイデス・ドレイに属する細菌と同じクラスター内に位置づけられた場合、当該細菌をいずれかのバクテロイデス種に属する細菌として同定することができる。
【００２８】
あるいは、本発明の組み合わせ物に用いるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイは、既に単離され、市販されているか、寄託機関に保存され分譲可能な菌株であってもよい。そのような菌株としては、バクテロイデス・ブルガタスの場合、例えばATCC 8482T株、DSM 1447T株、JCM 5826T株、NBRC 14291T株、NCTC 11154T株、NTZ002株等が挙げられ、バクテロイデス・ドレイの場合、例えばDSM 17855T株、JCM 13471T株、JCM 13472株、NTZ001株等が挙げられるが、それらに限定されない。NTZ002株及びNTZ001株は、2019年1月15日付で、それぞれNITE BP-02863及びNITE BP-02862の受託番号を付され、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に国際寄託されている。
【００２９】
本発明の組み合わせ物に用いるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイは、ヒトや他の動物の腸内で共存することにより、腸内のＬＰＳレベルを低減させ、腸管バリアのタイトジャンクションを強化して血中ＬＰＳレベルを低減させ、腸内、血管内及び臓器内での炎症応答・免疫応答を抑制し得る（即ち、ＬＰＳ制御性を有する）限り、いかなる菌株の組み合わせであってよい。好ましい一実施態様においては、バクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株又はNTZ002株とバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株又はNTZ001株との組み合わせが挙げられるが、それに限定されない。
【００３０】
本発明の組み合わせ物に用いるバクテロイデス・ブルガタス又はバクテロイデス・ドレイは、それぞれ併用菌であるバクテロイデス・ドレイ又はバクテロイデス・ブルガタスと組み合わせた場合に、ＬＰＳ制御性を発揮し得る限り、上記のいずれかの手段により得られる天然の分離源からの分離株（野生株）のみならず、それらに変異誘発処理を施して得られる変異体であってもよい。変異誘発処理としては、例えば、ニトロソ化合物（例、ニトロソアミン、ニトロソグアニジン）、アルキル化剤（例、メタンスルホン酸エチル (ＥＭＳ)）等の化学物質に曝露する方法や、紫外線照射、放射線照射等が挙げられるが、それらに限定されない。得られた変異株が、併用菌と組み合わせた場合にＬＰＳ制御性を示すか否かは、例えば、該変異株と併用菌とを疾患動物モデル（例、ＡｐｏＥ欠損動脈硬化マウスモデル、肥満マウスモデル、NASHマウスモデル等）に投与して、症状の改善、各種パラメータ（例、血中又は腸内ＬＰＳレベル、血中サイトカインレベル、腸管バリア機能、体重、臓器重量、病理組織検査等）の改善が認められた場合に、該変異株はＬＰＳ制御性を有すると判定することができる。あるいは、該動物モデルの糞便上清でマクロファージ等の免疫細胞を刺激した場合に、該変異株と併用菌とを添加し、該細胞の増殖や炎症性サイトカインの産生抑制作用を示した場合に、該変異株はＬＰＳ制御性を有すると判定することができる。
【００３１】
このようにして得られたバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイは、自体公知の培養条件にて培養し、維持増幅することができる。
培地としては、ＡＴＣＣ Ｍｅｄｉｕｍ ２１０７（ペプトン１０ｇ、牛肉エキス１０ｇ、酵母エキス３ｇ、デキストロース５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、可溶性デンプン１ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．５ｇ、酢酸ナトリウム３ｇ、０．０２５％ Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ ４ｍＬ、蒸留水１Ｌ）、ＡＴＣＣ Ｍｅｄｉｕｍ ２６０（トリプトン１５ｇ、ソイトン５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、脱線維素ヒツジ血５０ｍＬ、蒸留水９５０ｍＬ）、５％ウマ血添加ＥＧ培地等を用いることができる。これらの培地は液体培地としても、例えば１．５％寒天を添加して固形培地としても使用できる。
【００３２】
バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイは偏性嫌気性細菌であるので、培養は、嫌気条件下（酸素濃度１ｐｐｍ以下）で行われる。例えば、嫌気ガスチャンバー内で、１０％ ＣＯ２、１０％ Ｈ２及び８０％ Ｎ２混合ガス雰囲気下で培養することができる。培養温度は２５〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養期間としては、例えば１２〜７２時間、好ましくは２４〜４８時間が挙げられるが、特に制限はない。
【００３３】
バクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイとは、互いに生育や生物活性に悪影響を及ぼさない限り、同一培地中で混合培養することもできる。また、本発明の組み合わせ物に含まれるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイは、それぞれ単一の菌株であってもよいし、２以上の菌株の混合物であってもよい。
【００３４】
このようにして得られたバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの培養物は、使用時まで、例えば、自体公知の手法でグリセロールストックとして−８０℃以下で凍結保存するか、自体公知の手法で凍結乾燥し、２〜８℃で保存することができる。
【００３５】
２．本発明の組み合わせ物
バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイは、生きた状態（生菌）である限り、上記培養物（菌体）をそのまま、あるいは、該培養物から自体公知の方法、例えば、遠心分離、ろ過、磁性分離等の方法により回収した湿菌体もしくはその洗浄物（滅菌水、培地、PBS等により洗浄することができる）又はそれらの凍結乾燥粉末等の「菌体処理物」の状態で、それらを含む組成物中に配合することができる。尚、本明細書において、以下、特にことわらない限り、「菌体」もしくは「菌体処理物」は、死菌や菌体破砕物、菌体抽出物、菌体成分等の「生きていない」状態のものを包含しない意味で用いられる。
【００３６】
バクテロイデス・ブルガタスの菌体もしくは菌体処理物、及びバクテロイデス・ドレイの菌体もしくは菌体処理物は、それら単独で、あるいは、医薬上又は食品もしくは飼料加工上許容される添加物とともに製剤化することができる。あるいは、該菌体もしくは菌体処理物は、医薬品添加物又は食品もしくは飼料添加物として、医薬組成物又は食品もしくは飼料中に配合することができる。本発明の組み合わせ物において、バクテロイデス・ブルガタスの菌体もしくは菌体処理物と、バクテロイデス・ドレイの菌体もしくは菌体処理物とは、別個の組成物として製剤化され、キット製剤として使用されてもよいが、好ましくは、同一組成物中に配合され、単一の製剤として使用され得る。
バクテロイデス・ブルガタスの菌体もしくは菌体処理物と、バクテロイデス・ドレイの菌体もしくは菌体処理物とが、別個の組成物として提供される場合、それらの組成物は、同時に又は時間差をおいて、同一経路又は別経路で接種され得る。
【００３７】
本発明の組み合わせ物が医薬品又は医薬品添加物として提供される場合、該医薬品又は該添加物を配合する医薬品は、例えば、散剤、顆粒剤、丸剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤、懸濁剤、坐剤、注入剤等に製剤化することができる。
【００３８】
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる添加物、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を含有していてもよい。賦形剤としては、例えば大豆油、サフラー油、オリーブ油、胚芽油、ひまわり油、牛脂、いわし油等の動植物性油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール等の多価アルコール、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル等の界面活性剤、精製水、乳糖、デンプン、結晶セルロース、D−マンニトール、レシチン、アラビアガム、ソルビトール液、糖液等が挙げられる。結合剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン、アルファー化デンプン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポピドン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、トウモロコシデンプン等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、タルク、水素添加植物油、ロウ類、軽質無水ケイ酸等の天然物由来及びその誘導体等、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム等が挙げられる。
【００３９】
上記組成物には、さらに、甘味料、着色料、pH調整剤、香料、各種アミノ酸等を添加することもできる。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。液体製剤であれば、服用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。
【００４０】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注入剤、坐剤等が用いられる。注入剤の調製方法としては、例えば、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの菌体又は菌体処理物を、通常注入剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に懸濁または乳化することによって調製できる。注入用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられる。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられる。直腸投与に用いられる坐剤は、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの菌体又は菌体処理物を、通常の坐薬用基剤に混合することによって調製され得る。
【００４１】
さらに、医薬品又は医薬品添加物として提供される場合、本発明の組み合わせ物は、対象疾患に応じて、他の薬剤、例えば、抗炎症薬、抗動脈硬化薬、抗糖尿病薬などと併用してもよい。本発明の組み合わせ物と併用剤とは、単一の組成物（合剤）として製剤化してもよいし、別個の組成物として提供されてもよい。別個の組成物として提供される場合、本発明の組み合わせ物と併用剤とは、同時に又は時間差をおいて、同一経路又は別経路で対象に投与することができる。
【００４２】
本発明の組み合わせ物が食品（もしくは飼料）又は食品添加物（もしくは飼料添加物）として提供される場合、該食品（もしくは飼料）又は該添加物を配合する食品（もしくは飼料）は、溶液、懸濁物、粉末、固体成形物等、経口摂取可能な形態であればよく、特に限定されない。具体例としては、サプリメント（散剤、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤等）、飲料（炭酸飲料、乳酸飲料、スポーツ飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、栄養飲料、アルコール飲料等）、乳製品（ヨーグルト、バター、チーズ、アイスクリーム等）、菓子（グミ、ゼリー、ガム、チョコレート、クッキー、キャンデー、キャラメル、和菓子、スナック菓子等）、即席食品類（即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品等）、油、油脂食品（マヨネーズ、ドレッシング、クリーム、マーガリン等）、小麦粉製品（パン、パスタ、麺、ケーキミックス、パン粉等）、調味料（ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、つゆ類等）、畜産加工品（畜肉ハム・ソーセージ等）が挙げられる。
【００４３】
上記食品（もしくは飼料）には、必要に応じて各種栄養素、各種ビタミン類（ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ等）、各種ミネラル類（マグネシウム、亜鉛、鉄、ナトリウム、カリウム、セレン等）、食物繊維、分散剤、乳化剤等の安定剤、甘味料、呈味成分（クエン酸、リンゴ酸等）、フレーバー、ローヤルゼリー、プロポリス、アガリクス等を配合することができる。
【００４４】
本発明の組み合わせ物中に含まれるバクテロイデス・ブルガタスおよびバクテロイデス・ドレイの生菌数としては、１日あたりの摂取量として、例えば１０４〜１０１２コロニー形成ユニット（ｃｆｕ）、好ましくは１０６〜１０１０ｃｆｕである。
【００４５】
本発明の組み合わせ物には、他の有用な微生物の菌体もしくは菌体処理物をさらに配合することもできる。そのような他の微生物としては、例えば、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属等に属する乳酸菌、酵母、バチルス(Bacillus）属、酪酸菌（Clostridium butyricum）、麹菌等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの併用微生物は、有効性が認められる限り、生菌の状態のみならず、死菌又は菌体破砕物、菌体抽出物、菌体成分などの形態で、本発明の組み合わせ物中に配合することもできる。
併用微生物の配合量としては、１日あたりの摂取量として、例えば１０４〜１０１２コロニー形成ユニット（ｃｆｕ）、好ましくは１０６〜１０１０ｃｆｕである。
【００４６】
３．本発明の組み合わせ物の用途
上述のとおり、バクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイとは、腸内で共存することにより、腸内のＬＰＳレベルを低減させ、腸管バリアのタイトジャンクションを強化して血中ＬＰＳレベルを低減させ、腸内、血管内、及び臓器内での炎症応答・免疫応答を抑制し得る（即ち、ＬＰＳ制御性を有する）ので、腸内細菌叢において両菌種を富化することにより、血中又は腸内のＬＰＳレベルの亢進と関連する疾患を予防及び／又は改善することができる。したがって、本発明の組み合わせ物は、これらの疾患を予防及び／又は改善するための、医薬品又は医薬品添加物、あるいは、機能性食品（もしくは飼料）又は食品（もしくは飼料）添加物として有用である。
【００４７】
血中又は腸内のＬＰＳレベルの亢進と関連する疾患としては、例えば、心房細動、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、狭心症、高血圧症、動脈硬化症、大動脈瘤、大動脈解離、閉塞性動脈硬化症、大動脈弁狭窄症等の循環器系疾患、あるいは、例えば、肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、脂肪肝、肝炎の進行による肝癌、腸管炎症、過敏性腸症候群、胃炎、膠原病、慢性関節リウマチ、慢性腎炎、IgA腎症、気管支喘息、間質性肺炎、薬剤性肺障害、好酸球性肺浸潤症候群、非定型性抗酸菌症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、敗血症等の炎症性疾患、あるいは、糖尿病、肥満、メタボリックシンドローム、生活習慣病、脂質異常症、骨粗鬆症などの代謝性疾患などが挙げられる。
【００４８】
本発明の組み合わせ物は、ヒト、又は他の哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、サル等）に対して、上記の１日あたりの摂取量を、１日１回、又は数回に分けて、経口的に摂取させることができ。あるいは直腸投与することもできる。
【００４９】
本発明の組み合わせ物が食品として提供される場合、該食品は、血中又は腸内のＬＰＳレベルの亢進と関連する疾患の予防及び／又は改善のために用いられる旨の表示を付して販売することができる。ここで「表示」とは、需要者に対して上記用途を知らしめるための全ての行為を意味し、上記用途を想起・類推させうるような表示であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、すべて本発明における「表示」に該当する。しかしながら、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により表示することが好ましい。具体的には、本発明の食品に係る商品又は商品の包装に上記用途を記載する行為、商品又は商品の包装に上記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的（インターネット等）方法により提供する行為、等が例示できる。
【００５０】
一方、表示としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示）であることが好ましく、特に包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ等の販売現場における宣伝材、その他の書類等への表示が好ましい。
【００５１】
また、例えば、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、栄養機能食品、医薬用部外品等としての表示を例示することができ、その他厚生労働省によって認可される表示、例えば、特定保健用食品、これに類似する制度にて認可される表示を例示できる。後者の例としては、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク低減表示等を例示することができ、詳細にいえば、健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）、及びこれに類する表示が、典型的な例として挙げられる。
【００５２】
４．本発明の検査方法及びそのための試薬
本発明はまた、被験者の腸内細菌叢におけるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの存在量を測定することを含む、血中又は腸内ＬＰＳレベルの亢進と関連する疾患（以下、「ＬＰＳ関連疾患」ともいう。）の発症リスクの検査方法（以下、「本発明の検査方法」ともいう。）及びそのための試薬（以下、「本発明の検査薬」ともいう。）を提供する。後述の実施例でも示されるとおり、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイは、冠動脈疾患（ＣＡＤ）患者の腸内細菌叢において存在量が有意に減少しており、また、動脈硬化マウスモデルに両菌種を経口摂取させると、動脈硬化の症状を改善するとともに、腸内のＬＰＳレベルを低減させ、腸管バリアのタイトジャンクションを強化して血中ＬＰＳレベルを低減させ、腸内及び血管内での炎症応答・免疫応答を抑制し得る（即ち、ＬＰＳ制御性を有する）。さらに、肥満マウスモデルに両菌種を経口摂取させると、肥満の症状を改善するとともに、臓器内での炎症応答・免疫応答を抑制し得る。さらに、非アルコール性脂肪肝炎モデルマウスに両菌種を経口摂取させると、非アルコール性脂肪肝炎の症状を改善するとともに、臓器内での炎症応答・免疫応答を抑制し得る。従って、被験者の腸内細菌叢におけるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの存在量を測定し、正常値と比較することにより、該被験者がＬＰＳ関連疾患を発症しているか、あるいは将来発症するリスクが高いと判定することができる。尚、本明細書において「発症リスクの検査」とは、将来の発症する蓋然性の高さを予測するだけでなく、既に発症していることを診断するための検査をも包含する意味で用いられる。また、本明細書において「検出」なる用語は、そう解釈することが明らかに誤りである場合を除き、目的の細菌の存在の有無を判定するだけでなく、その存在量を定量的に測定することも包含する意味で用いられる。
【００５３】
本発明の検査方法の検査対象となる被験者は特に制限されない。例えば、臨床所見で循環器系疾患や炎症性疾患、代謝性疾患等のＬＰＳ関連疾患の疑いのある者や、既にこれらの疾患に罹患していることが判明している患者も含まれ得る。腸内細菌叢においてバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの存在量が減少していることが分かれば、腸内細菌叢における該菌種の富化が、該患者の治療標的の１つとなり得るからである。尚、本検査のための被験者由来の試料としては、採取の容易さから糞便が好ましいが、該被験者の腸内細菌叢を反映し得る試料であれば特に制限されず、例えば、腸内容物（例、盲腸内容物）等であってもよい。
【００５４】
バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの検出は、例えば、当該菌種が有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、具体的には、バクテロイデス・ブルガタスの場合、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、また、バクテロイデス・ドレイの場合、配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を検出することにより行うことができる。
【００５５】
バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の検出にあたっては、まず試料から全ＤＮＡを回収する。被験者の糞便試料からＤＮＡを単離／精製する方法は当該技術分野において公知であり、例えば、フェノール・クロロホルムによる抽出、市販のＤＮＡ抽出試薬を用いる抽出、又は市販のカラムキットによる精製などにより行うことができる。
【００５６】
試料から回収されたＤＮＡは、適切な緩衝液、例えばＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）等に溶解され、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の検出に供される。
【００５７】
一態様においては、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の検出は、バクテロイデス・ブルガタスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、即ち、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、及び／又はバクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、即ち、配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を、特異的に増幅し得るプライマーを用いて、試料から回収されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なうことにより実施される。
【００５８】
上記プライマーは、上記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部又は全部の領域を特異的にＰＣＲ増幅し得るように設計されたものであればいかなるものであってもよい。ここで「特異的に」とは、プライマーが、バクテロイデス・ブルガタス及び／又はバクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部又は全部の領域をＰＣＲ増幅するが、当該菌種以外の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ増幅しないことを意味する。
【００５９】
上記プライマーとしては、例えば、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列）の相補配列の連続する部分配列、及び／又は配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列）の相補配列の連続する部分配列にハイブリダイズする、約１５〜約５０塩基、好ましくは約１８〜約３０塩基のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、このハイブリダイゼーション部位より３’側の上記ヌクレオチド配列の連続する部分配列にハイブリダイズする、約１５〜約５０塩基、好ましくは約１８〜約３０塩基のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとの組み合わせであり、それらによって増幅される核酸の断片長が約５０〜約１，０００塩基、好ましくは約１００〜約５００塩基である、一対のポリヌクレオチドが挙げられる。
【００６０】
プライマーは、好ましくは、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列）及び／又は配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列）の連続する１５〜５０塩基（好ましくは１８〜３０塩基）の部分配列、あるいはそれらの相補配列の連続する１５〜５０塩基（好ましくは１８〜３０塩基）の部分配列を含む。
【００６１】
特異性の観点から、好適なプライマーセットとしては、少なくともその一方が、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列及び／又は配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列中、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子内に含まれる菌種間で配列が異なる９か所の可変領域（Ｖ１〜Ｖ９）のいずれかに位置するヌクレオチド配列、あるいはその相補鎖配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有するものである。
【００６２】
本発明の検査方法においては、バクテロイデス・ブルガタスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と、バクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とを区別して検出してもよいし、両者を区別せずに一括で検出してもよい。後述の比較例に示されるように、バクテロイデス・ブルガタス又はバクテロイデス・ドレイのいずれかを単独で、動脈硬化マウスモデルに経口摂取させても、動脈硬化の症状は改善傾向ではあったものの有意差は認められず、また、腸内ＬＰＳレベルを低下させることはできなかった。従って、バクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイとを区別して検出することが望ましいが、腸内細菌叢においていずれか一方の存在量のみが顕著に変動することは現実的には考えにくいので、両者を一括して検出したとしても、判定結果に実質的な影響を及ぼすことはない。
【００６３】
例えば、バクテロイデス・ブルガタス ATCC 8482T株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（配列番号１）と、バクテロイデス・ドレイ JCM 13471T株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（配列番号３）とをＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）を用いてデフォルト条件でアラインさせると、図１１のとおりである（Ｑｕｅｒｙが配列番号１、Ｓｂｊｃｔが配列番号３を示す）。両配列は１４９３ヌクレオチド（配列番号１の１２〜１４９７位、配列番号３の１〜１４９０位；ギャップ数１０）にわたってオーバーラップし、約９７％（１４４９／１４９３）同一という高いホモロジーを示す。そのため、バクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を区別して増幅可能なバクテロイデス・ブルガタス特異的プライマー及びバクテロイデス・ドレイ特異的プライマーの設計領域は限定される。例えば、配列番号１の１８１〜２１０位は、配列番号３の対応する領域と約７３％（２２/３０）の同一性しか有さず、また、配列番号１の１００１〜１０２８位は、配列番号３の対応する領域と約６０％（１８／３０）の同一性しか有さないので、これらの領域内にいずれか一方又は両方のプライマーを設計することにより、バクテロイデス・ブルガタスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と、バクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とを区別して増幅することが可能である。
【００６４】
一方、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を一括して増幅する場合、例えば、光岡知足編「腸内フローラの分子生態学的検出・同定」p109-121（2000年）にバクテロイデス・ブルガタス特異的プライマーとして記載される（当時バクテロイデス・ドレイは未同定）プライマーセット（配列番号１の１３６〜６０８位、配列番号３の１２５〜５９９位を増幅する）を用いれば、両菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を一括して、かつ他の腸内細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅することなく、増幅することができる。
さらに、このプライマーセットを用いた場合、配列番号１の増幅断片にはＴａｑＩ制限部位（ＴＣＧＡ；配列番号１の２８８〜２９１位）が１か所存在するが、配列番号３の増幅断片にはＴａｑＩ制限部位が存在しないので、増幅断片をＴａｑＩで消化して電気泳動すれば、仮にバクテロイデス・ブルガタスしか存在しない場合には、１５３ｂｐと３２０ｂｐの２本のバンドが検出されるが、バクテロイデス・ドレイしか存在しない場合には、４７５ｂｐの１本のバンドが検出される。両菌種が存在する場合には、上記３本のバンドが検出される。従って、バクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を一括増幅できるプライマーに、ＲＦＬＰ分析を組み合わせることにより、両菌種を区別して検出することもできる。
【００６５】
ＰＣＲにおける温度設定、反応時間及びサイクル数は、使用する鋳型ＤＮＡの量、プライマーの種類等に応じて適宜設定することができる。ＰＣＲにおけるアニーリングの温度は、プライマーのＧＣ含量に基づき適宜設定することができる。
【００６６】
得られたＰＣＲ産物は、電気泳動（例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等）により分離される。電気泳動後、ゲルがエチジウムブロマイド溶液等の自体公知の染色液により染色され、トランスイルミネーター等を用いてＰＣＲ産物が検出される。そして、特異的ＰＣＲ産物の有無や量を指標として、試料中のバクテロイデス・ブルガタス及び／又はバクテロイデス・ドレイの存在の有無や存在量が判定される。
【００６７】
本発明の検査方法において用いられるＰＣＲは、定量的ＰＣＲであってもよい。定量的ＰＣＲは、公知の方法により行なうことができるが、２つの解析方法が知られている。１つ目は、ＰＣＲ反応で反応生成物がある程度の量までは指数関数的に増加し、その後プラトーに達するという特徴を利用し、指数関数的増加期に反応生成物量を解析し、初期鋳型量を算出する方法である。２つ目は、反応生成物をリアルタイムでモニタリングすることにより、反応生成物量がある一定の値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を超えるＰＣＲサイクル数（Ｃｔ）を決定する方法である。いずれの解析方法も、既知濃度のＤＮＡ量を変化させＰＣＲを行ない、各サイクル数における反応生成物を解析し、そのカイネティクスから定量性のあるＰＣＲサイクル数範囲を決定することが必要である。その結果をふまえて、未知の試料中の目的遺伝子の存在量を概算する。それにより試料中のバクテロイデス・ブルガタス及び／又はバクテロイデス・ドレイの存在量を定量することができ、目的遺伝子が被検試料中に１コピーでも含まれると概算された場合、目的の細菌が存在すると判定することができる。
【００６８】
別の一態様において、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の検出は、バクテロイデス・ブルガタスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、即ち、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、及び／又はバクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、即ち、配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を特異的にハイブリダイズし得るプローブを、試料中の全ＤＮＡ又は全ＲＮＡに接触させ、該ハイブリッドを検出することにより行われ得る。接触の条件は、プローブが１６Ｓ ｒＲＮＡ又はそれをコードする遺伝子とハイブリダイズして核酸複合体を形成するよう適宜設定される。そして当該複合体は、バクテロイデス・ブルガタス及び／又はバクテロイデス・ドレイの存在を示すものとして検出される。
【００６９】
上記プローブは、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列）及び／又は配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列）に含まれる、約１５塩基以上、好ましくは約１８〜約５００塩基、より好ましくは約１８〜約２００塩基、いっそう好ましくは約１８〜約５０塩基の連続したヌクレオチド配列又はその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
【００７０】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。ストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）中４５℃でのハイブリダイゼーション反応の後、０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中６５℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
【００７１】
好ましくは、プローブは、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列）及び／又は配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列と９８％以上の同一性を有するヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列）に含まれる、約１５塩基以上、好ましくは約１８〜約５００塩基、より好ましくは約１８〜約２００塩基、いっそう好ましくは約１８〜約５０塩基の連続したヌクレオチド配列又はその相補配列を含む核酸である。
【００７２】
特異性の観点から、好適なプローブとしては、配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列、あるいは配列番号３又は４で表されるヌクレオチド配列中、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子内に含まれる菌種間で配列が異なる９か所の可変領域（V1〜V9）のいずれかに位置するヌクレオチド配列又はその相補配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸が挙げられる。具体的には、図１１に示される配列番号１と配列番号３のアラインメントにおいて、比較的ホモロジーが低いと認められる、上記プライマーの設計領域について例示した領域が同様に挙げられる。あるいは、バクテロイデス・ブルガタスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とバクテロイデス・ドレイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とを、特異的かつ一括増幅可能なプライマーとして例示した領域を含む核酸を、同様にバクテロイデス・ブルガタスおよびバクテロイデス・ドレイを特異的に検出し得るプローブとして挙げることができる。
【００７３】
本発明の検査薬を構成するプライマー又はプローブは、特異的検出に支障を生じない範囲で付加的配列（検出対象のポリヌクレオチドと相補的でないヌクレオチド配列）を含んでいてもよい。
【００７４】
前記プライマー又はプローブとして使用されるポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リボ核酸の場合、ヌクレオチド配列におけるチミジン残基（Ｔ）は、適宜ウリジン残基（Ｕ）と読み替えられる。また任意の位置のＴをＵに変えて合成したウリジン残基を含むＤＮＡであってもよい。同様に任意の位置のＵをＴに変えて合成したチミジン残基を含むＲＮＡであってもよい。また、ハイブリダイゼーションの特異性を低下させない限り、ポリヌクレオチド中に欠失、挿入又は置換などの点突然変異や、修飾ヌクレオチドが存在してもよい。
【００７５】
また、プライマー又はプローブは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ等）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）、ビオチンなどで標識されていてもよい。
【００７６】
前記プライマー又はプローブとして使用される核酸は、例えば汎用のＤＮＡ合成装置を用いて化学的に合成することができる。該核酸は、当該技術分野においてよく知られる他の方法のいずれかを用いて合成してもよい。
【００７７】
本発明の検査薬は、更に他の成分として核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）、その他の酵素、酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰなど）などを含んでもよい。また標識検出物質や緩衝液なども含んでもよい。
【００７８】
別の一実施態様において、バクテロイデス・ブルガタス及び／又はバクテロイデス・ドレイの検出は、該細菌を特異的に認識する抗体（以下、「本発明の抗体」ともいう。）を用いて、自体公知の免疫学的手法により行うこともできる。バクテロイデス・ブルガタス及び／又はバクテロイデス・ドレイを特異的に認識する抗体とは、該細菌の細胞表層に特異的に存在する表面抗原を認識し結合する抗体をいう。そのような表面抗原としては、例えば、細胞壁に存在する多糖、ペプチドグリカン若しくはタンパク質等が挙げられる。あるいは、表面抗原に限らず、バクテロイデス・ブルガタス及び／又はバクテロイデス・ドレイに特異的な構成成分を認識し結合する抗体であってもよい。そのような特異的抗体は、バクテロイデス・ブルガタス又はバクテロイデス・ドレイ又はその菌体処理物を免疫原として、自体公知の製造方法によってポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を作製し、得られた抗体クローンの中から、バクテロイデス・ブルガタス及び／又はバクテロイデス・ドレイ以外の近縁種と交差反応しないクローンを選択することにより得ることができる。本発明の抗体は天然型抗体の他、特異的結合活性を有する抗体フラグメント、具体的には、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ等を包含する。抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧ又はＩｇＭであり、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはＩｇＧである。
【００７９】
本発明の抗体を用いることで、免疫学的手法によりバクテロイデス・ブルガタス及び／又はバクテロイデス・ドレイの検出、定量等を行なうことができる。免疫学的手法としては、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（RIA法）、ELISA法（Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)）、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００８０】
上記のいずれかの方法により、被験者の腸内細菌叢におけるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの存在量が、正常値（例、健常者集団の腸内細菌叢における該細菌の量をもとに決定されるカットオフ値（例えば、平均値−２ＳＤ等））よりも低い量の該細菌の存在が確認された場合、該被験者はＬＰＳ関連疾患を発症しているか、将来該疾患を発症するリスクが高いと判定することができる。逆にこれら２菌種がカットオフ値以下であった場合は、該被験者はＬＰＳを発症しておらず、将来発症するリスクも少ないと判定することもできる。
ここで、ＬＰＳ関連疾患としては、例えば、心房細動、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、狭心症、高血圧症、動脈硬化症、大動脈瘤、大動脈解離、閉塞性動脈硬化症、大動脈弁狭窄症等の循環器系疾患、あるいは、例えば、肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、脂肪肝、肝炎の進行による肝癌、腸管炎症、過敏性腸症候群、胃炎、膠原病、慢性関節リウマチ、慢性腎炎、IgA腎症、気管支喘息、間質性肺炎、薬剤性肺障害、好酸球性肺浸潤症候群、非定型性抗酸菌症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、敗血症等の炎症性疾患、あるいは、糖尿病、肥満、メタボリックシンドローム、生活習慣病、脂質異常症、骨粗鬆症などの代謝性疾患などが挙げられる。
【００８１】
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示にすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００８２】
材料及び方法
ＣＡＤ患者及び対照の募集採用
すべての参加者は、登録後に書面によるインフォームド・コンセントを提供した。研究はヘルシンキ宣言のガイドラインに則り実施した。本研究は神戸大学の倫理委員会の承認（承認番号１５９５）を得て、ＵＭＩＮ臨床試験レジストリに登録された（試験登録番号000015703, URL: http://www.umin.ac.jp/ctr/）。
３０名のＣＡＤ患者と、３０名の冠状動脈のリスクファクターを有する非ＣＡＤ対照を、２０１４年１０月から２０１５年７月にかけて神戸大学附属病院にて募集採用した。ＣＡＤ群は、安定狭心症患者、及び本研究の少なくとも６か月前に経皮冠動脈インターベンション又は冠動脈バイパス移植術を受けた、保存された左室駆出率（＞４０％）を有する陳旧性心筋梗塞患者を含んだ。急性冠動脈症候群患者は除外した。一枝疾患か多枝疾患かは、診断的冠動脈造影において７５％を超える狭窄を示す主要な冠状動脈の数という観点で定義した。
高血圧、糖尿病及び／又は脂質異常症等の冠状動脈のリスクファクターを有するが、冠動脈疾患又は他の血管の疾患を現在も既往歴も有しない３０名の患者を年齢及び性別の合致した対照として募集採用した。冠動脈疾患又は他の血管の疾患の既往歴は、確認された血管疾患、狭心症を示す症状、陳旧性心筋梗塞又は狭心症を示す心電図上の異常、あるいは胸部Ｘ線上の異常として定義した。
肝疾患、腎疾患（血清クレアチニンレベル＞２．０ｍｇ／ｄＬ）、コラーゲン疾患又はがんを含む全身性疾患を有する患者は研究から除外した。抗生物質で治療した患者も除外した。糖尿病は、全米グリコヘモグロビン標準化プログラムの指標により、糖化ヘモグロビン値 ＞６．５％、経口抗糖尿病薬の使用、又はインスリン治療を受けている場合、糖尿病と定義した。血圧 ＞１４０／９０ｍｍＨｇ又は降圧薬の使用を高血圧症と定義した。日本動脈硬化学会が発行するガイドラインにより、低密度リポタンパク質コレステロールレベル ＞１４０ｍｇ/ｄＬ、トリグリセリドレベル ＞１５０ｍｇ／ｄＬ又は抗脂質異常症薬の使用を脂質異常症と定義した。【００８３】
糞便サンプルからのＤＮＡ抽出
被験者を入院させ、病院食を摂取させながら、被験者由来の糞便サンプルを採取した。マウス由来の糞便サンプルは、６週齢及び１６週齢時に採取した。糞便サンプルは−８０℃で保存した。糞便サンプルからのＤＮＡ抽出は、以前に確立した手順（Appleid and Environmental Microbiology 63, 2802-2813 (1997); Appl Environ Microbiol 71, 4153-4155 (2005); FEMS Microbiology Ecology 68, 351-362 (2009)）に従って、日本遺伝子研究所により実施された。各サンプルについて、０．２〜０．３ｇの糞便材料から、Ｇ’ＮＯＭＥｓキット（ＢＩＯ １０１，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用い、製造者の指示に従いつつ少し改変して、細胞ＤＮＡを抽出した。簡単にいえば、提供された細胞懸濁液中で糞便サンプルをホモジナイズした後、細胞溶解／変性溶液を加えてサンプルを５５℃で３０分間インキュベートした。細胞溶解を向上させるため、７５０ｍＬのシリカビーズ（直径０．１ｍｍ）を添加し、ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ装置（ＢｉｏＳｐｅｃ，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）内で最大速度で１０分間振とうした。ポリビニルピロリドン（１５ｍｇ）を添加し、その後の定量的ＰＣＲを阻害し得るポリフェノールのコンタミの除去を確実にした。サンプルをボルテックスし、２０，０００ｇで３分間遠心し、上清を回収した。残渣のペレットを４００ｍＬのＴＥＮＰバッファー（５０ｍＭ トリスバッファー，ｐＨ８、２０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ポリビニルポリピロリドン）で洗浄し、２０，０００ｇで３分間遠心した。洗浄工程をもう1回繰り返し、得られた上清をプールした。等容のイソプロパノールを加えて核酸を沈澱させ、−２０℃で１０分間保存した後、２０，０００ｇで５分間遠心した。ペレットを４００ｍＬの蒸留水と１００ｍＬの塩析剤混合液に再懸濁し、４℃で１０分間インキュベートした。サンプルを２０，０００ｇで１０分間遠心し、ＤＮＡを含む上清を清潔な１．５ｍＬ遠心管に移した。２倍容の１００％エタノールを加え、室温で５分静置してＤＮＡを沈澱させた後、２０，０００ｇで５分間遠心した。ＤＮＡを１５０ｍＬのＴＥバッファーに再溶解し、該ＤＮＡ溶液を後の分析まで−２０℃で保存した。【００８４】
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子増幅及びパイロシーケンシング
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部（Ｖ３−Ｖ４領域、大腸菌ナンバリングシステムの３４２〜８０６位に相当）を、３４２Ｆと８０６Ｒの非変性ユニバーサルプライマーセット（表２）を用いてＰＣＲ増幅した（プライマーセット及びＰＣＲ条件の詳細はDNA Res. 21, 217-227 (2014)を参照）。シーケンシングアダプターを付加した後、Illumina MiSeq platform (Illumina Inc., San Diego, CA) 用い、製造者のプロトコルに従い、タカラバイオ社にてアンプリコンをシーケンシングした。
USEARCH version 10.0.240（Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010)）version 0.33（パラメータ：LEADING:17 TRAILING:17 AVGQUAL:25 MINLEN:100）を用いて、細菌組成マトリクスを作成した。また、以前のプロトコルを用い、Trimmomatic（Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014)）を用いて生成した高品質な１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子アンプリコン配列を選択した。残りのリードは、USEARCHの-fastq_mergepairsコマンド（パラメータ：デフォルト値）を用いた。次に、Tagcleaner（BMC Bioinformatics. 11, 341 (2010)）version 0.16（パラメータ：-tag5 CTACGGGGGGCAGCAG -mm5 3 -tag3 AGATACCCCGGTAGTCC -mm3 3 -nomatch 3）を用いて、プライマー領域のない配列を除いた。その後、内部のpython scriptを用いて、Nを有する配列を除いた。USEARCHの-filter_phixコマンドを用いて、Phixリードを除いた。USEARCHのコマンド-sort_by_length（パラメータ：-minseqlength 300）を用いて、短い配列を除いた。最後に、UPARSEアルゴリズム (-fastx_uniqueコマンド及びotu_clusterコマンド（パラメータ：-minsize 1)）を用いて、OTUテーブルを生成した（Nat Meth. 10, 996-998 (2013)）。各OTUの代表的な配列を、RDP Classifier version 2.12を用い、ブートストラップ値?0.5で、細菌の属にアノテーションした（Appl Environ Microbiol. 73, 5261-5267 (2007)）。さらに、各OTUの各代表的な配列を、BLASTN version 2.2.25を用い、identity threshold ?97% 及び coverage ?80%で、参照データベースsilva Living Tree Project version 123（Syst Appl Microbiol. 31, 241-250 (2008)）にアノテーションした。【００８５】
糞便サンプル中の短鎖脂肪酸の分析
被験者が病院内で病院指定の食事を摂るようになった後に糞便サンプルを採取した。該サンプルを、内部コントロールとして２−エチル酪酸を含む滅菌水で希釈した後、YMC-Pack FA kit (#XSRFAR01, YMC, Kyoto, Japan) を用いて、２−ニトロフェニルヒドラジンで標識した。該サンプル中の短鎖脂肪酸を液体クロマトグラフィー (Prominence LC-20AD; Shimadzu, Kyoto, Japan) により定量した。【００８６】
動物
すべてのアポリポ蛋白質Ｅ欠損（Ａｐｏｅ−／−）マウスはＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドのものを用いた。すべてのマウスは、神戸大学の研究所内のＳＰＦグレードの動物施設で飼育した。動物には、厳密な１２時間明期サイクル下で、通常食（日本クレア）を与え、自由摂水させた。６週齢マウスを３つの処置群に分け、対照群のマウスには培地を経口摂取させ、バクテロイデス属生菌群のマウスには生きたバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイを、バクテロイデス属菌加熱死菌群のマウスには熱殺菌したバクテロイデス・ブルガタスおよびバクテロイデス・ドレイを、それぞれ2.5×109 cfu/100 μlの用量で週５回経口摂取させた。すべての実験は、神戸大学医学部で有効な動物実験に関するガイドライン（ガイドラインＮｏ．Ｐ１６０７０１）に従って実施した。
肥満マウスモデル及び非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）マウスモデルは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー社）を用い、後で詳述する方法にて作製した。【００８７】
バクテロイデス・ブルガタスおよびバクテロイデス・ドレイの培養及び調製
バクテロイデス・ブルガタス(#8482; American Type Culture Collection, Manassas, VA、及びNTZ002株（受託番号：NITE BP-02863）) 及びバクテロイデス・ドレイ（#17855; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, Germany、及びNTZ001株（受託番号：NITE BP-02862））は、DifcoTM reinforced clostridial medium (#218081; BD Bioscience, San Jose, CA) 中で、３７℃で嫌気的に培養した。１０％ ＣＯ２、１０％ 水素及び８０％ 窒素を含む嫌気チャンバー（Coy Laboratory Products, Grass Lake, MI）を、すべての嫌気的な微生物工程に使用した。バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイは１２１℃で１５分間処理して熱殺菌した。熱殺菌が首尾よく行われたことを、加熱処理した細菌をプレーティングし、生育しないことにより確認した。【００８８】
血漿中の生化学的パラメータ及びサイトカインレベルの評価
動物を一晩絶食させ、麻酔下の心穿刺によりヘパリン管に血液を採取した。血液サンプルを４℃で１０分間、３，０００ｒｐｍで遠心し、測定まで−８０℃で保存した。総コレステロール、高密度リポタンパク質コレステロール、低密度リポタンパク質コレステロール、及びトリグリセリドの血漿中濃度を、自動化化学分析装置（ＳＲＬ社）を用いて酵素的に測定した。血漿中サイトカインレベルは、サイトメトリックビーズアレイキット（ＢＤバイオサイエンス）を用いて、製造者の指示に従って分析した。【００８９】
動脈硬化病変の評価
マウスに麻酔し、大動脈を生理食塩水で潅流し、左室中央から腸骨動脈の分岐点までを切除した。大動脈基部の病変を分析するため、近位上行大動脈部分から大動脈洞にかけてのサンプルを得た。該サンプルを、凍結組織切片作製様包埋剤ＯＣＴコンパウンド（#4583, Tissue-Tek; Sakura Finetek, 東京）に包埋した。大動脈洞の５５０μｍにわたる５枚の連続切片（厚さ１０μｍ）を各マウスから採取し、オイルレッドＯ（#154-02072; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）又はヘマトキシリン（#3000; 武藤化学，東京）で染色した。染色切片をオールインワン蛍光顕微鏡（#BZ-8000; Keyence, 大阪）を用いてデジタル処理でキャプチャーした。動脈硬化の程度を定量的に解析するため、ImageJ（登録商標）ソフトウェアを既報のとおり用いて（Circulation. 120, 1996-2005 (2009)）、各マウスから得た５つの別個の切片について全病変面積を算出した。ｅｎ ｆａｃｅ病変解析のために、近位上行大動脈から総腸骨動脈分岐までにわたる大動脈断片を切除し、１０％ ホルマリン緩衝液中で固定した。外膜組織を注意深く除去した後、大動脈を縦方向に切開し、オイルレッドＯで染色し、黒ワックス表面上にピン留めしてデジタルカメラを用いてキャプチャーした。染色病変面積を全面積に対するパーセンテージとして示し、既報に記載のとおり（Circulation. 120, 1996-2005 (2009)）、ImageJ（登録商標）ソフトウェアを用いて測定を行った。【００９０】
動脈硬化病変の免疫組織化学分析
マクロファージ検出用抗体（MOMA-2, #T-2029, 1:400; BMA Biomedicals, Augst, Switzerland）及びＴ細胞検出用抗体（CD4, #550278, 1:100; BD Biosciences）を用いて、動脈硬化病変の免疫組織化学分析を、アセトン固定又はホルマリン固定したマウス大動脈基部の１０μｍ凍結切片上で実施した。ビオチン化二次抗体（#ab102250, 1:500; abcam, Cambridge, UK）及びストレプトアビジン標識西洋ワサビペルオキシダーゼ（#P0397, 1:500; Dako Co., Carpinteria, CA）を用いて検出を行った。染色した切片を、オールインワン蛍光顕微鏡を用いてデジタル処理でキャプチャーした。ＭＯＭＡ−２染色においては、全動脈硬化病変面積に対する染色面積のパーセンテージを算出した。ＣＤ４陽性Ｔ細胞の定量は、各切片中の染色細胞数を計数することにより実施した。【００９１】
マウス結腸の組織学的解析
各マウスにおいて、１６週齢時に上行結腸を切除し、ＯＣＴコンパウンド中に包埋した。タイトジャンクションタンパク質を検出する抗体（anti-ZO-1, #sc-33725, 1:100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）を用いて、アセトン固定した１０μｍ凍結切片上で免疫蛍光染色を実施したＣｙ３をコンジュゲートした二次抗体（#405408, 1:200; BioLegend, San Diego, CA）を用いて検出を行った。ＤＡＰＩ（#H-1200; Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA）を用いて核染色を行った。染色した切片を、オールインワン蛍光顕微鏡を用いてデジタル処理でキャプチャーした。ＺＯ−１の発現強度はImageJ（登録商標）ソフトウェアを用いて解析した。【００９２】
フローサイトメトリー
腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）細胞、脾細胞及びＲＡＷ２６４．７細胞を抗ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（clone 2.4G2; #553142; BD Biosciences）とインキュベートし、Ｆｃレセプターをブロッキングした。表面抗原の検出のため、２％ 胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５０μＬ中の１０×１０５個のＭＬＮ細胞又は脾細胞を、以下の抗体（(BD Biosciences又はeBioscience）：
・抗ＣＤ４(clone RM4-5; Cat 557871)
・抗ＣＤ１１ｂ (clone M1/70; #557396)
・抗ＣＤ１１ｃ (clone HL3; #558079)
・抗ＣＤ４４ (clone IM7; #553134)
・抗ＣＤ６２Ｌ (clone MEL-14; #553150)
・抗ＣＤ６９ (clone FN50; #555533)
・抗ＣＤ８０ (clone 16-10A1; #560016)
・抗ＣＤ８６ (clone GL1; #553692)
・抗ＣＤ２７３ (clone TY25; #560086)
・抗ＣＤ２７４ (clone MIH5; #558091)
・抗Ｆ４／８０ (clone BM8; #17-4801-82)
・抗Ｌｙ６Ｇ (clone RB6-8C5; #12-5931-82)
・抗ＴＬＲ４ (clone MTS510, #17-9924-82) 
を用いて染色した。Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (#00-5523-00, eBioscience, San Diego, CA) 又はFixation/Permeabilization Solution Kit (#554714, BD Biosciences)、抗Ｆｏｘｐ３抗体（clone FJK-16; #17-5773-82; eBioscience）及び抗ＣＴＬＡ−４抗体（clone UC10; BD Biosciences; #553720）を用い、製造者の指示に従って細胞内染色を実施した。アイソタイプが一致する抗体を対照として使用した。ＲＡＷ２６４．７細胞の増殖を、anti-Ki67 set (clone B56; #556027) を用い、製造者の指示に従って試験した。フローサイトメトリー解析は、Attune（登録商標）acoustic focusing cytometer (Life Technologies, Grand Island, NY) とFlowJo software (Tree Star, Inc., Ashland, OR) を用いて実施した。【００９３】
インビボ腸透過性アッセイ
一晩絶食後、マウスにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識デキストラン（FD4, 500 mg/kg of body weight; Sigma-Aldrich）を経口摂取させた。４時間後、血漿中ＦＤ４濃度を、蛍光分光光度計（EnSpire; PerkinElmer, Inc., Waltham, MA）を、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍで用いて測定した。【００９４】
糞便上清の調製
ＬＰＳ測定と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングには、同じヒト糞便サンプルを用いた。マウス糞便サンプルは、１６週齢の対照マウス及びバクテロイデス属菌処理マウス、あるいは６週齢の抗生物質（ＡＶＮＭ）投与マウスから、最後の経口摂取の２４時間後に採取した。既報のプロトコル（PLoS One. 7, e47713 (2012); Gut. 63, 1069-1080 (2014); BMC Microbiol. 16, 9 (2016)）を少し改変して、糞便上清を得た。簡単にいうと、糞便サンプルを、５０ｍｇ／５００μＬの濃度となるように無菌ＰＢＳ中に懸濁し、細菌細胞が破砕しないように穏かにボルテックスした。３，０００ｒｐｍで１５分間遠心した後、上清を回収し、０．４５μｍのフィルター、次いで０．２２μｍのフィルターで濾過して滅菌し、７０℃で１５分間インキュベートして不活性化した後−８０℃で保存した。また、マウス盲腸便サンプルは、１６週齢の対照マウス及びバクテロイデス属菌処理マウスから、常法により採取した。【００９５】
血漿及び糞便上清中のＬＰＳレベルの解析
Limulus Amebocyte Lysate アッセイキット（#K50-643J; Lonza Inc., Basel, Switzerland）を用い、製造者の指示に従って、血漿中及び糞便中のＬＰＳレベルを測定した。パイロジェンフリー水中に、血漿は１０倍、糞便上清は１０，０００倍希釈し、７０℃で１５分間不活性化した。ＬＳＰ測定は、パイロジェンフリーのガラス管、エッペンドルフチューブ及びプレート中で実施した。【００９６】
インビトロでの糞便上清刺激及びｓｉＲＮＡアッセイ
ＲＡＷ２６４．７マクロファージを１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。増殖のために、ＲＡＷ２６４．７細胞（１×１０５個）を２４−ウェル平底プレート（Corning Costar, Corning, NY）に播種し、糞便上清の存在下、３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気中で５時間インキュベートした。サイトカイン産生解析のため、ＴＬＲ４に対するｓｉＲＮＡ（#4390771; Invitrogen, Carlsbad, CA）を用い、RNAiMAX reagent (#13778030, Invitrogen) によりＴＬＲ４のノックダウンを行った。SilencerTM Select Negative Control No. 1 siRNA (#4390843, Invitrogen) を対照として用いた。ＨＴ２９ヒト腸管上皮細胞をAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）から購入し、１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。このＨＴ２９細胞を２４−ウェル平底プレートに播種し、糞便上清の存在下、３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気中で２４時間インキュベートした。【００９７】
ＲＮＡ抽出及びリアルタイムＰＣＲ解析
ＴＲＩｚｏｌTM試薬（#15596018; Thermo Scientific, Waltham, MA）を用い、製造者の指示に従って、全ＲＮＡを組織又は細胞サンプルから抽出した。PrimeScript reverse transcription reagent kit (#RR037A; Takara, 滋賀) を用いてｃＤＮＡを合成した。SYBER Premix Ex Taq (#RR820; Takara) 及びLightCycler（登録商標）96 System (#05815916001; Roche, Mannheim, Germany) を用い、製造者の指示に従って定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。各遺伝子に特異的なプライマーを表２に示す。発現データは対照ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨで補正し、ΔΔＴ法により解析した。【００９８】
【表２】
2019156251.tif 000004
【００９９】
ウェスタンブロッティング
Sci. Rep. 7, 12989 (2017) において詳述したようにして、ウェスタンブロット分析を実施した。簡単に言うと、細胞をＰＢＳで２回リンスし、氷冷した溶解バッファー（20 mM HEPES, pH 7.4; 1% NP40; 1% SDS; 及び150 mM NaCl）中に集めた。全溶解物から抽出したタンパク質を６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、iBlot（登録商標）Gel Transfer Device（Thermo Scientific）を用いて、ポリビニリデンジフルオライドメンブレン（#IB401002; Thermo Scientific）上に転写した。該メンブレンを５％ミルク（#31149-75; ナカライテスク, 京都）でブロッキングし、一次抗体と４℃で一晩インキュベートした後、西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートした二次抗体と室温で１時間インキュベートした。Immobilon Western HRP Substrate (#WBKLS0500; Merck Millipore, Billerica, MA) とインキュベーションした後、V3 Western Workflow system (Bio-Rad, Hercules, CA) を用いてシグナルを検出した。本実験では以下の一次抗体を使用した。
・抗ＺＯ−１ (#8193, 1:1,000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA)
・抗β−アクチン (#A5441, 1:5,000; Sigma-Aldrich)
バンド強度はImageJ（登録商標）ソフトウェアを用いて定量した。【０１００】
統計解析
R software, version 3.1.0 (http://www.r-project.org/)、JMP version 10 (SAS Institute, Cary, NC) 及びPrism version 7.0 (GraphPad Software; San Diego, CA) を用いて、統計解析を行った。Shapiro-Wilk検定を用いてデータが正規分布を示すか否かを決定した。結果は、正規分布データについては、平均値±該平均値の標準誤差、又は平均値±正規分布データの標準偏差で、非正規分布データについては、中間値±四分位範囲（第１〜第３四分位範囲）で表した。正規分布データについてはStudentの両側t-検定を、非正規分布データについてはMann-Whitney U-検定を用いて、２群間の有意差を評価した。Fisherの正確確率検定又はカイ二乗検定を用いて、カテゴリー変数を比較した。すべての検定について、P<0.05の数値を統計学的に有意であるとみなした。２つのパラメータ間の統計学的相関を評価するため、最小二乗法を用いて単回帰・単相関を計算し、結果をPearsonの相関係数で表現した。一元配置分散分析（ANOVA）を用いて３群間の有意差を検出した。Benjamini-Hochberg法を用いてq値を算出し、多重比較のp値を調整した。３０名のＣＡＤ患者と３０名の対照からのデータのクラスタリングは、Arthritis Rheumatol. 68, 2646-2661 (2016) に記載されるようにして、属レベルで実施した。【０１０１】
結果
ＣＡＤ患者における腸内細菌叢プロファイル
３０名のＣＡＤ患者、並びに年齢及び性別が合致する、高血圧、糖尿病もしくは脂質異常症等の冠状動脈のリスクファクターを有する３０名の非ＣＡＤ患者を、被験者として募集採用した。糞便サンプルにおける１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングを用い、これらの被験者の腸内細菌プロファイルを詳細に比較した。被験者の背景を表３に示す。【０１０２】
【表３】
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【０１０３】
被験者の腸内細菌プロファイルを解析すべく、既報（Nature. 473, 174-180 (2011)）の手順に従い、サンプルを属レベルで３つのクラスターに分類した（図１ａ）各クラスターは、以下に示す特定の属が豊富に存在することによって特徴づけられた（図１ｂ）。
クラスター１：バクテロイデス属
クラスター２：プレボテラ属
クラスター３：フィーカリバクテリウム属、ルミノコッカス属又はビフィドバクテリウム属
非ＣＡＤ対照は、クラスター１により多くカテゴライズされたのに対し、ＣＡＤ患者はほとんどこのクラスターにカテゴライズされなかった（図１ｃ）。α多様性、バクテロイデス門／ファーミキューテス門比、グラム陽性菌／グラム陰性菌比及び糞便中短鎖脂肪酸濃度は両群間で有意差はなかった。ＣＡＤ群と非ＣＡＤ群との間で、属及び種レベルで存在量を網羅的に比較した結果、バクテロイデス属の相対存在量が、対照に比べてＣＡＤ患者において低い傾向にあることが分かった（図１ｄ）。主成分解析の結果、両群は腸内マイクロバイオームの主要種の存在量が異なっており、ＣＡＤ患者では、バクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイが相対的に減少し、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ及びプレボテラ・コプリが富化していることが明らかとなった（図６）。以前の報告で、動脈硬化症患者においてバクテロイデス属の存在量が低いことが示されているのを考慮し、本発明者らは、バクテロイデス種であるバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイに焦点を当てた。これらの種は、抗炎症応答に関与し（Cell. 165, 842-853 (2016)）、バクテロイデス属の中で最も豊富に存在する種であり（図１ｅ）、それらの存在量はＣＡＤ患者において有意に低かった（図１ｆ）。これら２種は類似の１６Ｓ ｒＲＮＡシーケンシングパターンを有するため（Int J Syst Evol Microbiol. 56, 1639-1643 (2006)）、本発明者らが用いた方法論では両者を区別できなかった。そこで、本発明者らは、動脈硬化の傾向を示すマウスにバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイを経口摂取させたマウスモデルを構築し、それを用いて、これらの種と動脈硬化との因果関係を確認し、その根底にあるメカニズムを解明しようとした。【０１０４】
バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの生菌の経口摂取は動脈硬化性プラークの形成を抑制する
動脈硬化の発症に及ぼすバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの効果を判定すべく、６週齢の雌性アポリポタンパク質Ｅ欠損（Ａｐｏｅ−／−））マウスに、１週間あたり５回、１０週間バクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株の生菌又は加熱死菌を経口摂取させた。対照マウスには、同じプロトコルに従ってビヒクル（培地）のみを与えた。１６週齢時にマウスを安楽死させ、いくつかの分析を行って動脈硬化及び腸内細菌叢を評価した。対照マウスに比べて、バクテロイデス属の生菌を経口摂取したマウスは、体重（図２ｆ）又は血漿コレステロールレベル（図２ｇ）に有意な差はなかったが、大動脈基部及び胸部大動脈のｅｎ ｆａｃｅ解析において、病変サイズが有意に減少した（図２ａ、ｂ）。加熱殺菌したバクテロイデス属を経口摂取したマウスでは、対照マウスに比べて動脈硬化病変サイズに有意差は認められなかった。さらに、大動脈洞における動脈硬化病変の免疫組織染色とその後の形態学的解析の結果、対照と比較して、バクテロイデス属を経口摂取したマウスにおいて、マクロファージ及びＣＤ４陽性Ｔ細胞が顕著に減少することが明らかとなった（図２ｃ、ｄ）。次に、マウスの動脈硬化性大動脈における免疫細胞マーカー及びケモカイン／ケモカイン受容体のｍＲＮＡ発現を評価すべく、定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した。その結果、いくつかのアテローム形成性の免疫細胞マーカー及びケモカイン／ケモカイン受容体が、バクテロイデス属を経口摂取したマウスで減少していた（図２ｅ）。これらの結果は、経口摂取による生きたバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの補充がプラークの炎症を低減し、それによって動脈硬化病変の形成を抑制することを示唆するものである。
マウス糞便サンプルの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングの結果、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの経口摂取に応答して、腸内細菌叢の組成が大きく変化することが明らかとなった（図７ａ、ｂ）。さらに、腸内細菌の多様性は、対照マウスで低下していたが、生きたバクテロイデス属を経口摂取したマウスでは維持されていた（図７ｃ）。驚くべきことに、グラム陽性菌／グラム陰性菌比は、対照マウスよりも生きたバクテロイデス属を経口摂取したマウスにおいて高い傾向があった（図７ｄ）。バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの存在量は、生きたバクテロイデス属を経口摂取したマウスにおいて大幅に高かった（図７ｅ）。【０１０５】
生きたバクテロイデス処理により結腸リポ多糖（ＬＰＳ）レベルは低下した結果、腸管及び全身の免疫応答が低下した
本発明者らは以前、腸管免疫応答の調節により動脈硬化を予防し得ることを報告していたので（Circulation. 120, 1996-2005 (2009);.Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 2495-2503 (2010)）、バクテロイデス処理がプラーク形成を減少させるメカニズムを調べるために、本発明者らはまず、バクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株の経口摂取の腸管免疫に及ぼす影響を試験した。その結果、対照マウスと比べて、バクテロイデス属を経口摂取したマウスでは、ある特定の抗原提示細胞マーカー（ＣＤ１１ｃ、共刺激分子ＣＤ８０）及び炎症誘発性サイトカインの結腸におけるｍＲＮＡ発現が実質的に低下していた（図３ａ、ｂ）さらに、腸管固有層から腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）への抗原提示細胞の移動に決定的に重要なＣＣＲ７のｍＲＮＡ発現が、バクテロイデス属を経口摂取したマウスにおいて有意に低下していた（図３ａ）。そこで、本発明者らは次に、ＭＬＮにおける自然免疫応答を試験した。ＭＬＮのフローサイトメトリー解析により、バクテロイデス属を経口摂取したマウスでは、ＣＤ１１ｃ高発現細胞の存在量が有意に低いだけでなく、ＣＤ１１ｃ高発現細胞におけるＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）、ＭＨＣクラスＩＩ及びＣＤ８０の発現も有意に低下していた（図３ｃ）。ＭＬＮにおけるサイトカインｍＲＮＡの発現もまた、対照マウスよりもバクテロイデス属を経口摂取したマウスにおいて低い傾向にあった（図３ｄ）。これらの結果は、生きたバクテロイデス処理がＴＬＲ４発現の下方制御と関連した抗原提示細胞の活性化阻害を通じて、腸管免疫応答を抑制することを示唆している。【０１０６】
ＬＰＳは、ＴＬＲ４を通じて細胞を刺激し、抗原提示細胞上の共刺激分子を上方制御するので、本発明者らは、腸内細菌叢による結腸ＬＰＳ産生の指標として、糞便中ＬＰＳレベルを測定した。驚くべきことに、糞便中ＬＰＳレベルは、対照マウスよりも、バクテロイデス属を経口摂取したマウスにおいて劇的に低かった（図３ｅ）。さらに、本発明者らは、糞便上清を用いてインビトロ刺激アッセイを行い、生きたバクテロイデス属処理後の結腸ＬＰＳ濃度の低下が結腸の炎症レベルに直接反映されているか否かを調べた。ＲＡＷ２６４．７マクロファージを糞便上清で刺激したところ、バクテロイデス属を経口摂取したマウス由来の糞便上清で処理した細胞の増殖が有意に阻害された（図８ａ）。さらに、ＬＰＳ／ＴＬＲ４シグナルが結腸の炎症を制御する主要経路であるか否かを検証すべく、ｓｉＲＮＡを導入してＴＬＲ４をノックダウンしたＲＡＷ２６４．７マクロファージを作製し、該細胞を糞便上清で刺激した。その結果、非特異的ｓｉＲＮＡの導入により、炎症誘発性サイトカインＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αの分泌は、対照マウス由来の糞便上清で処理したＲＡＷ２６４．７マクロファージよりも、生きたバクテロイデス属で処理したマウス由来の糞便上清で処理したマクロファージにおいて顕著に低下した。ＴＬＲ ｓｉＲＮＡを導入したＲＡＷ２６４．７マクロファージは、非常に少量の炎症誘発性サイトカインしか分泌せず、非特異的ｓｉＲＮＡを導入したＲＡＷ２６４．７マクロファージと比べて有意に低かった（図８ｂ）。これらの知見は、結腸ＬＰＳ濃度が、ＬＰＳ／ＴＬＲ４依存性シグナリングを介して結腸の炎症を制御していることを示唆している。【０１０７】
エンドトキシン血症は全身性の炎症を惹起し、自然免疫及び適応免疫の破綻と動脈硬化の発症を引き起こすことが知られている（Nat Commun.7, 13436 (2016); Circulation. 133, 2434-2446 (2016); Nat Immunol. 12, 204-212 (2011)）。実際に、対照マウスと比べて、バクテロイデス属で処理したマウスでは、血漿ＬＰＳ濃度が有意に低下し（図３ｆ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１７Ａ、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α等のアテローム形成性サイトカインの血漿中濃度も低下していた（図３ｇ）。さらに、本発明者らは、脾細胞のフローサイトメトリーアッセイを通じて、これらのサイトカインのソースを調べた。その結果、ＣＤ１１ｂ高発現・Ｆ４／８０高発現マクロファージ、ＣＤ１１ｂ高発現・Ｌｙ６Ｇ高発現好中球及びＣＤ１１ｃ高発現樹状細胞の割合は２群間で有意差はなかったが（図９ａ）、バクテロイデス属を経口摂取したマウスは、ＭＨＣクラスＩＩと共刺激分子ＣＤ８６の発現低下、並びに脾ＣＤ１１ｃ高発現樹状細胞上での共阻害分子ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １（ＰＤ−Ｌ１）及びＰＤ−Ｌ２の発現上昇を認めた（図９ｂ）。脾ＣＤ１１ｃ高発現樹状細胞上でのＴＬＲ４発現は２群間で有意差はなかった。樹状細胞の高度な寛容原性と一致して、生きたバクテロイデス属で処理したマウスでは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数もまた低下していた（図９ｃ）。生きたバクテロイデス属を経口摂取したマウスでは、エフェクターＣＤ４４高発現・ＣＤ６２Ｌ低発現・ＣＤ４陽性Ｔ細胞の数が低下していたが、高レベルの細胞内ＣＴＬＡ４を有するＣＤ４陽性・ＣＤ２５陽性・Ｆｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞の割合は有意に高かった（図９ｄ、ｅ）。このことは、免疫バランスが抑制方向にシフトしていることを示す。これらのデータは、全身性の自然免疫細胞の活性化と、動脈硬化の発症機序に関与するＴｈ１駆動性炎症の抑制が、生きたバクテロイデス属処理により誘起される血漿ＬＰＳ濃度の低下により引き起こされることを示唆している。【０１０８】
生きたバクテロイデス処理はインビトロ及びインビボで腸バリアを強化した
腸の漏出性に続いて腸内細菌叢組成が変化するとエンドトキシン血症や動脈硬化を促進するので（Circulation. 133, 2434-2446 (2016)）、本発明者らは次に、生きたバクテロイデス属処理が腸のタイトジャンクション透過性に効果があるか否かを調査した。その結果、バクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株を経口摂取したマウスは、対照マウスに比べて、ＦＩＴＣ標識デキストランの腸透過性の有意な低下（図４ａ）と、タイトジャンクション遺伝子ｚｏ１のｍＲＮＡ発現の有意な上昇（図４ｂ）を示し、それは結腸におけるＺＯ−１の平均蛍光強度の上昇（図４ｃ）に反映されていた。これらのデータは、生きたバクテロイデス属処理が、対照マウスにおける状態と比べて、タイトジャンクションのバリアを強化することを示している。結腸ＬＰＳ濃度の変化がタイトジャンクション形成に影響があるか否かを明らかにするため、本発明者らは、糞便上清を用いて、上皮細胞の形態を有するＨＴ２９ヒト結腸直腸腺がん細胞を刺激した。その結果、インビボでの結果と一致して、対照マウス由来の糞便上清で刺激したＨＴ２９細胞よりも、生きたバクテロイデス属で処理したマウス由来の糞便上清で刺激したＨＴ２９細胞において、（ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルで）有意に高いｚｏ１（ＺＯ−１）の発現レベルが観察された（図４ｄ、ｅ）。これらの結果は、腸内細菌叢により誘起される結腸ＬＰＳ濃度の変化が、タイトジャンクションを介した傍細胞透過性に直接影響する可能性を示唆している。【０１０９】
糞便中ＬＰＳレベルはＣＡＤ患者において上昇していた
ＣＡＤ発生率とヒトにおける腸内細菌によるＬＰＳ産生との関係をさらに調査すべく、本発明者らは、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングに用いたのと同じ糞便サンプルにおけるＬＰＳレベルを測定した。その結果、ＣＡＤ患者における糞便中ＬＰＳレベルは、非ＣＡＤ対照におけるレベルより有意に高かった（図５ａ）。興味深いことに、バクテロイデス種の存在量は、糞便中ＬＰＳレベルと有意に負相関していた（Ｒ＝−０．３０，Ｐ＝０．０２３）。さらに、糞便中ＬＰＳレベルとバクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの％存在量との間に有意な負相関が認められた（Ｒ＝−０．２９，Ｐ＝０．０２７）（図５ｂ）。これらの結果は、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイが腸内細菌によるＬＰＳ産生を制御しており、それらの活性がヒトにおける動脈硬化の進展に影響を及ぼし得ることを強く示唆している。【０１１０】
比較例  バクテロイデス・ブルガタス又はバクテロイデス・ドレイの単独投与は動脈硬化マウスモデルの症状及び腸内ＬＰＳレベルを有意に改善しなかった
上記２菌種併用投与の場合と同様の方法により、Ａｐｏ−／−マウスにバクテロイデス・ブルガタスATCC 8482T株又はバクテロイデス・ドレイDSM 17855T株をそれぞれ単独で経口摂取させた。
結果を図１０に示す。いずれの単独投与群でも、対照（ビヒクル投与）群と比較して、大動脈洞における動脈硬化病変は改善傾向にあったが、有意差はみとめられなかった。さらに、糞便中（腸内）ＬＰＳレベルはいずれの菌種の単独投与によっても低下しなかった。バクテロイデス・ドレイ単独投与群では、大腸のタイトジャンクション関連遺伝子の発現が対照群に比べて増大傾向にあり、バクテロイデス・ブルガタス単独投与群では、大腸でのサイトカイン遺伝子の発現が対照群に比べて低下していたが、血中サイトカイン濃度については、いずれの投与群でも有意な差は認められなかった。
以上の結果は、バクテロイデス・ブルガタスとバクテロイデス・ドレイとは、それぞれが異なる作用機序により、腸内に共存した場合にそれらの効果が相乗的に作用して、顕著なＬＰＳ制御性を発揮することを示唆している。【０１１１】
バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・ドレイの種々の組み合わせは、いずれも動脈硬化マウスモデルにおける腸内ＬＰＳレベルを改善した
それぞれの菌の組み合わせ（生菌２．５×１０９  ＣＦＵ／１００μｌずつ）を、Ａｐｏｅ−／−♀マウスあるいＡｐｏｅ−／−♂マウスに、それぞれ週５回経口投与した。Ａｐｏｅ−／−♀マウスには、６週齢〜１６週齢まで１０週間投与して、１６週齢の糞便中ＬＰＳを測定した。Ａｐｏｅ−／−♂マウスには６週齢〜１３週齢まで７週間投与して、１３週齢の糞便中ＬＰＳを測定した。
結果を図１２に示す。基準株（ｖ，ｄ）だけでなく、ＮＴ株（Ｎｖ，Ｎｄ）も糞便中ＬＰＳ量を低下させた。【０１１２】
動脈硬化マウスモデルにおいて、生きたバクテロイデス処理は腸内ＬＰＳレベルを改善した
バクテロイデス・ブルガタスATCC8482T及びバクテロイデス・ドレイDSM 17855Tの菌の組み合わせ（生菌あるいは死菌。生菌として２．５×１０９  ＣＦＵ／１００μｌずつ）を、Ａｐｏｅ−／−♀マウスにそれぞれ週５回経口投与した。６週齢〜１６週齢まで１０週間投与して、１６週齢の糞便中及び盲腸便中のＬＰＳを測定した。また、５週齢〜６週齢までＡＶＮＭ（アンピシリン，バンコマイシン，ネオマイシン，メトロニダゾール）投与して、６週齢の糞便中ＬＰＳを測定した。
結果を図１３に示す。図中右側及び左側が、バクテロイデス処理したＡｐｏｅ−／−♀マウスの、それぞれ糞便中及び盲腸便中ＬＰＳレベルを示す。また、図中中央は、抗生物質を投与したＡｐｏｅ−／−♀マウスの糞便中ＬＰＳレベルを示す。糞便中及び盲腸便中にて、生菌投与の場合ＬＰＳ量が低下したが、死菌投与の場合はコントロール（ＮＣ）と変化は無かった。【０１１３】
肥満マウスモデルにおいて、バクテロイデス処理は肥満の諸症状を改善した
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ♂マウスに６週齢〜１８週齢の１２週間、週５回投与した。ＮＣ群は通常食を投与し、Ｃｔｒｌ群は高脂肪食ＨＦＤ（オリエンタル酵母工業製；６０％脂肪を含む）及びバクテロイデス・ブルガタスあるいはバクテロイデス・ドレイを培養する際に用いる液体培地を２００μｌ／回経口投与し、Ｂ群は高脂肪食及び生菌バクテロイデス・ブルガタスATCC8482T及び生菌バクテロイデス・ドレイDSM 17855Tを投与し、ＮＢ群は高脂肪食及び生菌バクテロイデス・ブルガタスNTZ002株及び生菌バクテロイデス・ドレイNTZ001株を投与した（図１４−１Ａ）。
その結果、高脂肪食に加えて基準株の２菌（Ｂ）あるいはＮＴ株の２菌（ＮＢ）を投与した方が、Ｃｔｒｌ群と比較して体重増加が抑制された（図１４−１Ｂ，Ｃ）。
１ｇ ＯＧＴＴ試験を実施したところ、基準株の２菌（Ｂ）あるいはＮＴ株の２菌（ＮＢ）を投与した方が、負荷後の血糖値の急激な上昇が抑えられ（図１４−１Ｄ左）、ＡＵＣ値が低く（図１４−１Ｄ中央）、インスリン抵抗性（ＨＯＭＡ−ＩＲ）が低く（図１４−１Ｄ右）、耐糖能の改善が確認できた。
精巣上体脂肪をＨＥ染色、ＭＡＣ３染色、あるいはシリウスレッド染色したところ（図１４−２Ｅ左）、基準株の２菌（Ｂ）あるいはＮＴ株の２菌（ＮＢ）を投与した方が、脂肪細胞の大きさが小さく、王冠様構造の数が少なく、繊維形成率が少なかった（図１４−２Ｅ右）。
内臓脂肪（精巣上体周囲脂肪）のｍＲＮＡ量を測定したところ、基準株の２菌（Ｂ）あるいはＮＴ株の２菌（ＮＢ）を投与した方が、炎症細胞マーカーであるＭＣＰ１、Ｆ４／８０、ｉＮＯＳ、ＣＣＲ５、ＴＬＲ４のｍＲＮＡ発現はＣｔｒｌ群と比べて低下し（図１４−２Ｆ左）、Ｆｉｚｚｉ１（Ｍ２マクロファージマーカーで高い方が抗炎症とされている）のｍＲＮＡ発現量は増加傾向であった（図１４−２Ｆ左）。さらに、サイトカインＩＦＮγ及びＴＮＦαのｍＲＮＡ発現は低下した（図１４−２Ｆ右）。【０１１４】
ＮＡＳＨマウスモデルにおいて、バクテロイデス処理はＮＡＳＨの諸症状を改善した
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ♂マウスに８週齢〜１７週齢の間、週５回投与した。Ｃｔｒｌ群は餌として超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量食（ＥＰＳ益新株式会社製ＮＡＳＨモデル作製用飼料）を投与、Bacteroides群はさらに生菌バクテロイデス・ブルガタスATCC8482T及び生菌バクテロイデス・ドレイDSM 17855Tを投与した。
１７週齢で解剖し、肝臓をＨＥ染色した結果、Ｃｔｒｌ群では脂肪肝と炎症細胞浸潤と肝細胞の風船様腫大を認めたが、基準株の２菌投与群では炎症細胞浸潤が著明に抑制され、風船様腫大は認めなかった（図１５−１上）。基準株の２菌投与群ではさらにＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）の改善、血中ＡＳＴ、ＡＳＴ／ＡＬＴ比の有意な低下を認め、肝障害が著明に抑制された（図１５−１中央、下、及び図１５−２）。【０１１５】
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明である。
ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。【０１１６】
本出願は、2018年2月9日付で日本国に出願された特願2018-022578を基礎としており、ここで言及することにより、その内容はすべて本明細書に包含されるものである。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明の組み合わせ物は、動脈硬化をはじめとする循環器系疾患や、慢性炎症を伴う疾患、糖脂質代謝等の代謝異常を伴う代謝性疾患の予防及び／又は改善のための医薬もしくは機能性食品として有用である。また、本発明の検査方法及び検査薬は、糞便中のマイクロバイオーム解析を通じて、前記疾患の診断・発症リスク予測を可能とすることから、非侵襲性の臨床検査手法を提供する点で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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