(57)【要約】  以下の（１）及び（２）の性質を有する蛍光色素で標識された抗体又は抗体断片を提供する、（１）抗原の非存在下において、蛍光色素は消光され、抗原の存在下において、蛍光色素の消光は解除される、（２）蛍光色素は、抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物に含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光色素で標識された抗体又は抗体断片であって、蛍光色素は、以下の（１）及び（２）の性質を有することを特徴とする蛍光標識抗体又は抗体断片、
（１）抗原の非存在下において、蛍光色素は消光され、抗原の存在下において、蛍光色素の消光は解除される、
（２）蛍光色素は、抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物に含まれる。
【請求項２】
抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物が、下記の一般式（I)〜(VIII)
【化１】
2020026733.tif 000017
〔式中、Aは共役環を表し、Lは末端に蛍光色素を有するリンカーを表し（但し、LがA上に存在する場合LはA上の任意の位置に存在してよい。）、R1は水素原子を表すか、又はA上の任意の位置に存在する１個若しくは２個のアミノ基、アセトアミド基、ヒドロキシ基、アルキル基、若しくはアルコキシ基を表し、R2、R3、R4、及びR5は、それぞれ水素原子、アルキル基、置換基を有していてもよい芳香族基を表す。〕
で表される化合物であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片。
【請求項３】
抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物が、抗体又は抗体断片中のチロシン残基と結合する化合物であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片。
【請求項４】
抗体又は抗体断片中のチロシン残基と結合する化合物が、下記の一般式（I)〜(VI)
【化２】
2020026733.tif 000018
〔式中、Aは共役環を表し、Lは末端に蛍光色素を有するリンカーを表し（但し、LがA上に存在する場合LはA上の任意の位置に存在してよい。）、R1は水素原子を表すか、又はA上の任意の位置に存在する１個若しくは２個のアミノ基、アセトアミド基、ヒドロキシ基、アルキル基、若しくはアルコキシ基を表し、R2及びR3は、それぞれ水素原子、アルキル基、置換基を有していてもよい芳香族基を表す。〕
で表される化合物であることを特徴とする請求項３に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片。
【請求項５】
抗体又は抗体断片中のチロシン残基と結合する化合物が、下記の一般式（Ia)
【化３】
2020026733.tif 000019
〔式中、Lはベンゼン環上の任意の位置に存在し、末端に蛍光色素を有するリンカーを表す。〕
で表される化合物であることを特徴とする請求項３に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片。
【請求項６】
蛍光色素が、4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセンを基本骨格として有する蛍光色素であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片。
【請求項７】
抗体又は抗体断片が軽鎖及び重鎖を含み、蛍光色素は軽鎖又は重鎖の可変領域に結合していることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片。
【請求項８】
抗体又は抗体断片が、前記蛍光色素に対するクエンチャーと結合しており、クエンチャーは、前記蛍光色素が結合している鎖とは別の鎖の可変領域に結合していることを特徴とする請求項７に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片。
【請求項９】
抗体又は抗体断片が、前記蛍光色素とFRETペアを形成する別の蛍光色素と結合しており、前記別の蛍光色素は、前記蛍光色素が結合している鎖とは別の鎖の可変領域に結合していることを特徴とする請求項７に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片。
【請求項１０】
抗体又は抗体断片が、疾患のマーカーとなる物質に対する抗体又は抗体断片であることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか一項に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片。
【請求項１１】
請求項１０に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片を含むことを特徴とする疾患の診断薬。
【請求項１２】
以下の工程（１）及び（２）を含むことを特徴とする蛍光標識抗体又は抗体断片の製造方法、
（１）抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物であって、クリック反応に用いられる官能基を含む化合物を、抗体又は抗体断片と反応させ、抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合させる工程、
（２）蛍光色素を抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物中のクリック反応に用いられる官能基と反応させ、この官能基と結合させる工程。
【請求項１３】
抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物が、下記の一般式（Ib)〜(VIIIb)
【化４】
2020026733.tif 000020
〔式中、Aは共役環を表し、Lbは末端にクリック反応に用いられる官能基を有するリンカーを表し（但し、LbがA上に存在する場合LbはA上の任意の位置に存在してよい。）、R1は水素原子を表すか、又はA上の任意の位置に存在する１個若しくは２個のアミノ基、アセトアミド基、ヒドロキシ基、アルキル基、若しくはアルコキシ基を表し、R2、R3、R4、及びR5は、それぞれ水素原子、アルキル基、置換基を有していてもよい芳香族基を表す。〕
で表される化合物であることを特徴とする請求項１２に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片の製造方法。
【請求項１４】
抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物が、抗体又は抗体断片中のチロシン残基と結合する化合物であることを特徴とする請求項１２に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片の製造方法。
【請求項１５】
抗体又は抗体断片中のチロシン残基と結合する化合物が、下記の一般式（Ib)〜(VIb)
【化５】
2020026733.tif 000021
〔式中、Aは共役環を表し、Lbは末端にクリック反応に用いられる官能基を有するリンカーを表し（但し、LbがA上に存在する場合LbはA上の任意の位置に存在してよい。）、R1は水素原子を表すか、又はA上の任意の位置に存在する１個若しくは２個のアミノ基、アセトアミド基、ヒドロキシ基、アルキル基、若しくはアルコキシ基を表し、R2及びR3は、それぞれ水素原子、アルキル基、置換基を有していてもよい芳香族基を表す。〕
で表される化合物であることを特徴とする請求項１４に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片の製造方法。
【請求項１６】
抗体又は抗体断片中のチロシン残基と結合する化合物が、下記の一般式（Iab)
【化６】
2020026733.tif 000022
〔式中、Lbはベンゼン環上の任意の位置に存在し、末端にクリック反応に用いられる官能基を有するリンカーを表す。〕
で表される化合物であることを特徴とする請求項１４に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片の製造方法。
【請求項１７】
蛍光色素が、4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセンを基本骨格として有する蛍光色素であることを特徴とする請求項１２乃至１６のいずれか一項に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片の製造方法。
【請求項１８】
工程（１）が、抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物と、抗体又は抗体断片とを含む溶液に電圧を印加する工程であることを特徴とする請求項１２乃至１７のいずれか一項に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光標識抗体又は抗体断片に関する。この蛍光標識抗体又は抗体断片は、蛍光強度の変化によって抗原を検出することが可能なので、疾患の診断薬などに利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
本発明者の一人である佐藤は、最近、抗体の抗原認識能を保持しつつ相補性決定領域のチロシン残基を特異的に化学修飾する技術を開発した（非特許文献１）。一方、本発明者の一人である上田は、抗体の可変領域部位の構造を有するタンパク質と蛍光分子を共役させた分子を開発している。この分子は、抗原非存在下では蛍光分子の蛍光は消光されているが、抗原存在下では消光が解除されるTurn-ON型の蛍光センサーであり、Q-bodyと名付けられている（非特許文献２、特許文献１、及び特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第5043237号公報
【特許文献２】国際公開2013/065314
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】松村雅喜、佐藤伸一、中村浩之、「チロシン残基ラベル化によるタンパク質機能化のための反応条件の検討」、日本化学会第98春季年会（2018）講演予稿
【非特許文献２】R. Abe, H. Ohashi, I. Iijima, M. Ihara, H. Takagi, T. Hohsaka and H.Ueda "“Quenchbodies”: quench-based antibody probes that show antigen-dependent fluorescence" J. Am. Chem. Soc. 133, 17386-17394 (2011).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Q-bodyは、固相化や洗浄工程を必要としないホモジニアスな抗原検出が可能であり、臨床診断や環境分析等の様々な分野で利用されている。しかし、Q-body作製を効率良く行うためには無細胞系のタンパク質合成系を必要とし、大量合成への応用が課題であった。【０００６】
本発明は、このような背景の下になされたものであり、Q-bodyの大量供給を可能にする手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記の抗体の相補性決定領域を化学修飾する技術を用いて、抗体を蛍光色素で修飾することにより、Q-bodyと同様に、抗原の非存在下において蛍光色素は消光され、抗原の存在下において蛍光色素の消光は解除されることを見出した。また、このとき使用する蛍光色素として、4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン（BODIPY）を基本骨格として有する蛍光色素を使用することにより、抗原の検出感度が向上することも見出した。更に、抗体を蛍光色素で修飾することは、電気化学的方法によっても行い得ることも見出した。本発明は、これらの知見に基づき、完成されたものである。【０００８】
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔１８〕を提供するものである。
〔１〕蛍光色素で標識された抗体又は抗体断片であって、蛍光色素は、以下の（１）及び（２）の性質を有することを特徴とする蛍光標識抗体又は抗体断片、
（１）抗原の非存在下において、蛍光色素は消光され、抗原の存在下において、蛍光色素の消光は解除される、
（２）蛍光色素は、抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物に含まれる。【０００９】
〔２〕抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物が、下記の一般式（I)〜(VIII)
【化１】
2020026733.tif 000002
〔式中、Aは共役環を表し、Lは末端に蛍光色素を有するリンカーを表し（但し、LがA上に存在する場合LはA上の任意の位置に存在してよい。）、R1は水素原子を表すか、又はA上の任意の位置に存在する１個若しくは２個のアミノ基、アセトアミド基、ヒドロキシ基、アルキル基、若しくはアルコキシ基を表し、R2、R3、R4、及びR5は、それぞれ水素原子、アルキル基、置換基を有していてもよい芳香族基を表す。〕
で表される化合物であることを特徴とする〔１〕に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片。【００１０】
〔３〕抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物が、抗体又は抗体断片中のチロシン残基と結合する化合物であることを特徴とする〔１〕に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片。【００１１】
〔４〕抗体又は抗体断片中のチロシン残基と結合する化合物が、下記の一般式（I)〜(VI)
【化２】
2020026733.tif 000003
〔式中、Aは共役環を表し、Lは末端に蛍光色素を有するリンカーを表し（但し、LがA上に存在する場合LはA上の任意の位置に存在してよい。）、R1は水素原子を表すか、又はA上の任意の位置に存在する１個若しくは２個のアミノ基、アセトアミド基、ヒドロキシ基、アルキル基、若しくはアルコキシ基を表し、R2及びR3は、それぞれ水素原子、アルキル基、置換基を有していてもよい芳香族基を表す。〕
で表される化合物であることを特徴とする〔３〕に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片。【００１２】
〔５〕抗体又は抗体断片中のチロシン残基と結合する化合物が、下記の一般式（Ia)
【化３】
2020026733.tif 000004
〔式中、Lはベンゼン環上の任意の位置に存在し、末端に蛍光色素を有するリンカーを表す。〕
で表される化合物であることを特徴とする〔３〕に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片。【００１３】
〔６〕蛍光色素が、4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセンを基本骨格として有する蛍光色素であることを特徴とする〔１〕乃至〔５〕のいずれかに記載の蛍光標識抗体又は抗体断片。【００１４】
〔７〕抗体又は抗体断片が軽鎖及び重鎖を含み、蛍光色素は軽鎖又は重鎖の可変領域に結合していることを特徴とする〔１〕乃至〔６〕のいずれかに記載の蛍光標識抗体又は抗体断片。【００１５】
〔８〕抗体又は抗体断片が、前記蛍光色素に対するクエンチャーと結合しており、クエンチャーは、前記蛍光色素が結合している鎖とは別の鎖の可変領域に結合していることを特徴とする〔７〕に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片。【００１６】
〔９〕抗体又は抗体断片が、前記蛍光色素とFRETペアを形成する別の蛍光色素と結合しており、前記別の蛍光色素は、前記蛍光色素が結合している鎖とは別の鎖の可変領域に結合していることを特徴とする〔７〕に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片。【００１７】
〔１０〕抗体又は抗体断片が、疾患のマーカーとなる物質に対する抗体又は抗体断片であることを特徴とする〔１〕乃至〔９〕のいずれかに記載の蛍光標識抗体又は抗体断片。【００１８】
〔１１〕〔１０〕に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片を含むことを特徴とする疾患の診断薬。【００１９】
〔１２〕以下の工程（１）及び（２）を含むことを特徴とする蛍光標識抗体又は抗体断片の製造方法、
（１）抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物であって、クリック反応に用いられる官能基を含む化合物を、抗体又は抗体断片と反応させ、抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合させる工程、
（２）蛍光色素を抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物中のクリック反応に用いられる官能基と反応させ、この官能基と結合させる工程。【００２０】
〔１３〕抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物が、下記の一般式（Ib)〜(VIIIb)
【化４】
2020026733.tif 000005
〔式中、Aは共役環を表し、Lbは末端にクリック反応に用いられる官能基を有するリンカーを表し（但し、LbがA上に存在する場合LbはA上の任意の位置に存在してよい。）、R1は水素原子を表すか、又はA上の任意の位置に存在する１個若しくは２個のアミノ基、アセトアミド基、ヒドロキシ基、アルキル基、若しくはアルコキシ基を表し、R2、R3、R4、及びR5は、それぞれ水素原子、アルキル基、置換基を有していてもよい芳香族基を表す。〕
で表される化合物であることを特徴とする〔１２〕に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片の製造方法。【００２１】
〔１４〕抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物が、抗体又は抗体断片中のチロシン残基と結合する化合物であることを特徴とする〔１２〕に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片の製造方法。【００２２】
〔１５〕抗体又は抗体断片中のチロシン残基と結合する化合物が、下記の一般式（Ib)〜(VIb)
【化５】
2020026733.tif 000006
〔式中、Aは共役環を表し、Lbは末端にクリック反応に用いられる官能基を有するリンカーを表し（但し、LbがA上に存在する場合LbはA上の任意の位置に存在してよい。）、R1は水素原子を表すか、又はA上の任意の位置に存在する１個若しくは２個のアミノ基、アセトアミド基、ヒドロキシ基、アルキル基、若しくはアルコキシ基を表し、R2及びR3は、それぞれ水素原子、アルキル基、置換基を有していてもよい芳香族基を表す。〕
で表される化合物であることを特徴とする〔１４〕に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片の製造方法。【００２３】
〔１６〕抗体又は抗体断片中のチロシン残基と結合する化合物が、下記の一般式（Iab)
【化６】
2020026733.tif 000007
〔式中、Lbはベンゼン環上の任意の位置に存在し、末端にクリック反応に用いられる官能基を有するリンカーを表す。〕
で表される化合物であることを特徴とする〔１４〕に記載の蛍光標識抗体又は抗体断片の製造方法。【００２４】
〔１７〕蛍光色素が、4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセンを基本骨格として有する蛍光色素であることを特徴とする〔１２〕乃至〔１６〕のいずれかに記載の蛍光標識抗体又は抗体断片の製造方法。【００２５】
〔１８〕工程（１）が、抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物と、抗体又は抗体断片とを含む溶液に電圧を印加する工程であることを特徴とする〔１２〕乃至〔１７〕のいずれかに記載の蛍光標識抗体又は抗体断片の製造方法。【００２６】
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2018-142089の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明は、新規な蛍光標識抗体又は抗体断片を提供する。この蛍光標識抗体又は抗体断片は、蛍光強度の変化によって抗原を検出することが可能なので、疾患の診断薬などに利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】変性剤存在又は非存在下におけるリツキシマブと結合しているDBCO-PEG4-TAMRAの蛍光スペクトル。
【図２】変性剤存在又は非存在下におけるリツキシマブと結合していないDBCO-PEG4-TAMRAの蛍光スペクトル。
【図３】細胞ライセート存在下におけるリツキシマブと結合しているDBCO-PEG4-TAMRAの蛍光スペクトル。細胞ライセートは、リツキシマブの抗原を発現する細胞のライセート（左）とリツキシマブの抗原を発現しない細胞のライセート（右）を用いている。
【図４】細胞ライセート存在下におけるリツキシマブと結合しているDBCO- TAMRAの蛍光スペクトル。細胞ライセートは、リツキシマブの抗原を発現する細胞のライセート（左）とリツキシマブの抗原を発現しない細胞のライセート（右）を用いている。
【図５】実施例３で使用した蛍光色素の構造及び励起波長と蛍光波長を示す図。
【図６】電気化学的タンパク質修飾法を模式的に表した図。
【図７】電気化学的な方法によって作製された蛍光標識リツキシマブの蛍光スペクトル。変性剤存在（denatured）及び非存在（in PBS）下におけるスペクトルが示されている。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ａ）定義
本発明において「炭素数１〜２０のアルキル基」とは、炭素数が１以上２０以下の直鎖又は分枝鎖アルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、iso-プロピル基、n-ブチル基、iso-ブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、iso-ペンチル基、neo-ペンチル基、ヘキシル基、iso-ヘキシル基、ヘプチル基、iso-ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基などである。
【００３０】
本発明において「炭素数１〜１０のアルキル基」とは、炭素数が１以上１０以下の直鎖又は分枝鎖アルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、iso-プロピル基、n-ブチル基、iso-ブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、iso-ペンチル基、neo-ペンチル基、ヘキシル基、iso-ヘキシル基、ヘプチル基、iso-ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基などである。
【００３１】
本発明において「炭素数１〜３のアルキル基」とは、炭素数が１以上３以下の直鎖又は分枝鎖アルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、iso-プロピル基などである。
【００３２】
本発明において「炭素数１〜２０のアルコキシ基」とは、炭素数が１以上２０以下の直鎖又は分枝鎖アルコキシ基であり、例えば、メトキシ基、エトキシ基、n-プロポキシ基、iso-プロポキシ基、n-ブトキシ基、iso-ブトキシ基、sec-ブトキシ基、tert-ブトキシ基、ペンチルオキシ基、iso-ペンチルオキシ基、neo-ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、iso-ヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基、iso-ヘプチルオキシ基、オクチルオキシ基、ノニルオキシ基、デシルオキシ基、ウンデシルオキシ基、ドデシルオキシ基、トリデシルオキシ基、テトラデシルオキシ基、ペンタデシルオキシ基、ヘキサデシルオキシ基、ヘプタデシルオキシ基、オクタデシルオキシ基、ノナデシルオキシ基、イコシルオキシ基などである。
【００３３】
本発明において「炭素数１〜１０のアルコキシ基」とは、炭素数が１以上１０以下の直鎖又は分枝鎖アルコキシ基であり、例えば、メトキシ基、エトキシ基、n-プロポキシ基、iso-プロポキシ基、n-ブトキシ基、iso-ブトキシ基、sec-ブトキシ基、tert-ブトキシ基、ペンチルオキシ基、iso-ペンチルオキシ基、neo-ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、iso-ヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基、iso-ヘプチルオキシ基、オクチルオキシ基、ノニルオキシ基、デシルオキシ基などである。
【００３４】
本発明において「炭素数１〜３のアルコキシ基」とは、炭素数が１以上３以下の直鎖又は分枝鎖アルコキシ基であり、例えば、メトキシ基、エトキシ基、n-プロポキシ基、iso-プロポキシ基などである。
【００３５】
本発明において「置換基を有していてもよい芳香族基」とは、置換基を有していない芳香族基又は少なくとも一つの置換基を有している芳香族基を意味する。ここで、「芳香族基」とは、芳香族化合物から一個の水素原子を除いた基をいい、例えば、フェニル基、1-ナフチル基、2-ナフチル基、ピリジン-2-イル基、ピリジン-3-イル基、ピリジン-4-イル基、ピリミジン-2-イル基、ピリミジン-4-イル基、ピリミジン-5-イル基、ピラジン-2-イル基、ピラジン-3-イル基、ピリダジン-3-イル基、ピリダジン-4-イル基、フラン-2-イル基、フラン-3-イル基、チオフェン-2-イル基、チオフェン-3-イル基、ピロール-1-イル基、ピロール-2-イル基、ピロール-3-イル基、ピラゾール-1-イル基、ピラゾール-3-イル基、ピラゾール-4-イル基、ピラゾール-5-イル基、イミダゾール-1-イル基、イミダゾール-2-イル基、イミダゾール-4-イル基、イミダゾール-5-イル基などである。置換基としては、メチル基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヒドロキシ基、及びメトキシ基などからなる群から選択することができる。少なくとも一つの置換基を有している芳香族基の好適な例としては、少なくとも一つの置換基を有しているフェニル基を挙げることができ、その具体例としては、2-メチルフェニル基、3-メチルフェニル基、4-メチルフェニル基、2,3-ジメチルフェニル基、2,4-ジメチルフェニ基、2,5-ジメチルフェニル基、2,6-ジメチルフェニル基、3,4-ジメチルフェニル基、3,5-ジメチルフェニル基、2-フルオロフェニル基、3-フルオロフェニル基、4-フルオロフェニル基、2,3-ジフルオロフェニル基、2,4-ジフルオロフェニル基、2,5-ジフルオロフェニル基、2,6-ジフルオロフェニル基、3,4-ジフルオロフェニル基、3,5-ジフルオロフェニル基、2-クロロフェニル基、3-クロロフェニル基、4-クロロフェニル基、2,3-ジクロロフェニル基、2,4-ジクロロフェニル基、2,5-ジクロロフェニル基、2,6-ジクロロフェニル基、3,4-ジクロロフェニル基、3,5-ジクロロフェニル基、2-ブロモフェニル基、3-ブロモフェニル基、4-ブロモフェニル基、2,3-ジブロモフェニル基、2,4-ジブロモフェニル基、2,5-ジブロモフェニル基、2,6-ジブロモフェニル基、3,4-ジブロモフェニル基、3,5-ジブロモフェニル基、2-ヒドロキシフェニル基、3-ヒドロキシフェニル基、4-ヒドロキシフェニル基、2-メトキシフェニル基、3-メトキシフェニル基、4-メトキシフェニル基などを挙げることができる。
【００３６】
本発明において「クリック反応に用いられる官能基」とは、例えば、アジド基やエチニル基である。
【００３７】
本発明において「共役環」とは、共役二重結合を有する環をいう。共役環は、芳香環であっても、非芳香環であってもよい。また、共役環は、炭素原子のみからなる環であっても、炭素以外の原子、例えば、窒素、酸素、硫黄などの原子を含む複素環であってもよい。共役環の具体例としては、ベンゼン環、1,3-シクロヘキサジエン環、ピリジン環、ピリミジン環、ピラジン環、ピリダジン環、トリアジン環などの６員環、シクロペンタジエン環、フラン環、チオフェン環、ピロール環、ピラゾール環、イミダゾール環などの５員環などを挙げることができる。
【００３８】
（Ｂ）蛍光標識抗体又は抗体断片
本発明の蛍光標識抗体又は抗体断片は蛍光色素で標識されており、この蛍光色素は、Q-bodyにおける蛍光色素と同様に、抗原の非存在下において消光され、抗原の存在下においてその消光が解除される。このような消光及びその解除は、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に存在するトリプトファン残基との相互作用によるものなので、蛍光色素は、これらのトリプトファン残基との相互作用できるような位置に存在することが好ましい。具体的には、蛍光色素は、リンカーを介して、抗体又は抗体断片中の重鎖又は軽鎖の可変領域と結合することが好ましく、抗体又は抗体断片中の重鎖又は軽鎖の相補性決定領域と結合することがより好ましい。なお、相補性決定領域は、抗原の認識能に関与するので、このような領域に蛍光色素を結合させると、抗原認識能が失われるとこれまで考えられていたが、本発明者は、抗原認識能が失われないことを確認している。
【００３９】
また、蛍光色素は、抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物に含まれ、このような化合物が抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合することにより、抗体又は抗体断片は蛍光色素で標識される。
【００４０】
抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物としては、例えば、下記の一般式(I)〜(VIII)で表される化合物を挙げることができる。
【化７】
2020026733.tif 000008
【００４１】
一般式(I)、(II)、(VII)、及び(VIII)においてAは共役環を表す。Aは共役環であればよいが、一般式(I)、(II)、及び(VII)においてはベンゼン環であることが好ましく、一般式(VIII)においてはピリジン環であることが好ましい。
【００４２】
一般式(I)及び(II)においてR1は水素原子を表すか、又はA上の任意の位置に存在する１個若しくは２個のアミノ基、アセトアミド基、ヒドロキシ基、アルキル基、若しくはアルコキシ基を表す。ここで、アルキル基及びアルコキシ基の炭素数は特に限定されないが、炭素数が１〜２０であることが好ましく、炭素数が１〜１０であることが更に好ましく、炭素数が１〜３であることが特に好ましい。R1は、前記した基であればよいが、水素原子、又は１個のアミノ基、アセトアミド基、若しくはメトキシ基であることが好ましく、水素原子、又は１個のメトキシ基であることが更に好ましい。上記の置換基が２個存在する場合、各置換基は同一であっても、異なっていてもよい。置換基は共役環上の任意の位置に存在してよいが、合成上の容易さなどから、隣接する複素環から離れた位置に存在することが好ましい。
【００４３】
一般式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VII)、及び(VIII)においてR2は水素原子、アルキル基、置換基を有していてもよい芳香族基を表す。ここで、アルキル基の炭素数は特に限定されないが、炭素数が１〜２０であることが好ましく、炭素数が１〜１０であることが更に好ましく、炭素数が１〜３であることが特に好ましい。R2は、前記した基であればよいが、一般式(I)においては水素原子、メチル基、又はフェニル基であることが好ましく、メチル基であることが更に好ましく、一般式(II)においては水素原子又はメチル基であることが好ましく、メチル基であることが更に好ましく、一般式(III)においては水素原子、メチル基、フェニル基、メトキシ基を有するフェニル基、フッ素原子を有するフェニル基であることが好ましく、メチル基であることが更に好ましく、一般式(IV)、(V)、(VII)においては水素原子又はメチル基であることが好ましく、一般式(VIII)においては水素原子であることが好ましい。
【００４４】
一般式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VII)、及び(VIII)においてR3は水素原子、アルキル基、置換基を有していてもよい芳香族基を表す。ここで、アルキル基の炭素数は特に限定されないが、炭素数が１〜２０であることが好ましく、炭素数が１〜１０であることが更に好ましく、炭素数が１〜３であることが特に好ましい。R3は、前記した基であればよいが、一般式(I)、(II)、及び(III)においては水素原子であることが好ましく、一般式(IV)及び(V)においては水素原子又はメチル基であることが好ましく、一般式(VII)及び(VIII)においては水素原子であることが好ましい。
【００４５】
一般式(VII)及び(VIII)においてR4は水素原子、アルキル基、置換基を有していてもよい芳香族基を表す。ここで、アルキル基の炭素数は特に限定されないが、炭素数が１〜２０であることが好ましく、炭素数が１〜１０であることが更に好ましく、炭素数が１〜３であることが特に好ましい。R4は前記した基であればよいが、一般式(VII)においては水素原子又はメチル基であることが好ましく、一般式(VIII)においては水素原子であることが好ましい。
【００４６】
一般式(VII)においてR5は水素原子、アルキル基、置換基を有していてもよい芳香族基を表す。ここで、アルキル基の炭素数は特に限定されないが、炭素数が１〜２０であることが好ましく、炭素数が１〜１０であることが更に好ましく、炭素数が１〜３であることが特に好ましい。R5は前記した基であればよいが、水素原子であることが好ましい。
【００４７】
一般式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、及び(VIII)においてLは、末端に蛍光色素を有するリンカーを表す。また、LがA上に存在する場合LはA上の任意の位置に存在してよい。リンカーは、蛍光色素の機能を失わせないような構造であればどのような構造でもよいが、アルキレン基であることが好ましい。但し、アルキレン基の１以上の-CH2-は、-O-、-S-、-NH-、又は-CO-で置換されていてもよい。また、本発明においては、通常、クリック反応を利用して蛍光色素を結合させるので、クリック反応（アジド基とエチニル基との反応）によって生じる1H-1,2,3-トリアゾール-1,4-ジイル基で-CH2-が置換されていてもよい。アルキレン基の炭素数は特に限定されないが、５〜２０であることが好ましく、５〜１５であることがより好ましい。なお、アルキレン基中の-CH2-を、他の基で置換した場合も、この他の基も１つの炭素を持つものとして、前記した「アルキレン基の炭素数」に含める。
【００４８】
抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物は、上記の一般式(I)〜(VIII)で表される化合物に限定されるものではなく、例えば、下記の化合物も包含される。
【化８】
2020026733.tif 000009
上記の化合物におけるLは一般式(I)〜(VIII)におけるLと同じ意味であり、Xは酸素原子又は硫黄原子を表し、RはXが酸素原子を表す場合は水素原子又はメチル基を表し、Xが硫黄原子を表す場合は水素原子を表す。
【００４９】
抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物の中では、抗体又は抗体断片中のチロシン残基と結合する化合物が好ましい。一般式(I)〜(VI)で表される化合物は、いずれもチロシン残基と結合することができる。即ち、一般式(I)で表される化合物（特開2016-108266号公報、WO2017/061288）はチロシン残基と結合し、一般式(II)及び(III)で表される化合物（S. Sato et al., Chem. Commun. 54, 5871-5874 (2018)）もチロシン残基と結合する。また、一般式(IV)で表される化合物（S. Sato et al., Angew. Chem. Int. Ed. 52, 8681-8684 (2013)）、一般式(V)で表される化合物（K. L. Seim et al., J. Am. Chem. Soc. 133, 16970-16976 (2011)）、一般式(VI)で表される化合物（J. S. Rees et al., Mol Cell Proteomics. 14(11):2848-2856 (2015)）は、チロシン残基、トリプトファン残基、遊離システイン残基、ヒスチジン残基などの電子の豊富なアミノ酸残基と結合する。
【００５０】
上記のように、一般式(I)〜(III)で表される化合物は、抗体又は抗体断片中のチロシン残基に特異的に結合し、一般式(VI)〜(VI)で表される化合物も、抗体又は抗体断片中のチロシン残基と結合することができる。抗体の相補性決定領域には、表面に露出したチロシン残基が多数存在するので、一般式(I)〜(VI)で表される化合物を使用することにより、抗体又は抗体断片の相補性決定領域に部位特異的に蛍光色素を結合させることができる。
【００５１】
抗体又は抗体断片中のチロシン残基と結合する化合物としては、一般式（I)〜(VI)で表される化合物のいずれを使用してもよいが、一般式(I)で表される化合物を使用することが好ましい。また、一般式(I)で表される化合物の中でも、下記の一般式(Ia)
【化９】
2020026733.tif 000010
で表される化合物を使用するのが好ましい。ここで、Lはベンゼン環上の任意の位置に存在してよいが、フタル酸ヒドラジド上の６位又は７位に存在することが好ましい。また、一般式(Ia)で表される化合物は、一種類の化合物だけ使用してもよいが、二種類以上の化合物の混合物を使用してもよい。例えば、Lが６位に存在する化合物とLが７位に存在する化合物の混合物を使用してもよい。
【００５２】
蛍光色素は、従来のQ-bodyにおいて使用されていた蛍光色素、例えば、WO2013/065314の明細書に記載されている蛍光色素を使用することができる。具体的には、ローダミン、クマリン、Cy、EvoBlue、オキサジン、Carbopyronin、naphthalene、biphenyl、anthracene、phenenthrene、pyrene、carbazole、BODIPY（4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン）などを基本骨格として有する蛍光色素やその蛍光色素の誘導体を例示することができる。蛍光色素の具体例としては、CR110：carboxyrhodamine 110：Rhodamine Green（商標名）、TAMRA：carbocytetremethlrhodamine：TMR、Carboxyrhodamine 6G：CR6G、ATTO655（商標名）、BODIPY FL（商標名）：4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、BODIPY 493/503（商標名）：4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-8-propionicacid、BODIPY R6G（商標名）：4,4-difluoro-5-(4-phenyl-1,3-butadienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、BODIPY 558/568（商標名）：4,4-difluoro-5-(2-thienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、BODIPY 564/570（商標名）：4,4-difluoro-5-styryl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、BODIPY 576/589（商標名）：4,4-difluoro-5-(2-pyrrolyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、BODIPY 581/591（商標名）：4,4-difluoro-5-(4-phenyl-1, 3-butadienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、BODIPY TMR（商標名）、Cy3（商標名）、Cy3B（商標名）、Cy3.5（商標名）、Cy5（商標名）、Cy5.5（商標名）、EvoBlue10（商標名）、EvoBlue30（商標名）、MR121、ATTO 390（商標名）、ATTO 425（商標名）、ATTO 465（商標名）、ATTO488（商標名）、ATTO 495（商標名）、ATTO 520（商標名）、ATTO 532（商標名）、ATTO Rho6G（商標名）、ATTO 550（商標名）、ATTO 565（商標名）、ATTO Rho3B（商標名）、ATTO Rho11（商標名）、ATTO Rho12（商標名）、ATTO Thio12（商標名）、ATTO 610（商標名）、ATTO 611X（商標名）、ATTO 620（商標名）、ATTO Rho14（商標名）、ATTO 633（商標名）、ATTO 647（商標名）、ATTO 647N（商標名）、ATTO 655（商標名）、ATTO Oxa12（商標名）、ATTO 700（商標名）、ATTO 725（商標名）、ATTO 740（商標名）、Alexa Fluor 350（商標名）、Alexa Fluor 405（商標名）、Alexa Fluor 430（商標名）、Alexa Fluor 488（商標名）、Alexa Fluor 532（商標名）、Alexa Fluor 546（商標名）、Alexa Fluor 555（商標名）、Alexa Fluor 568（商標名）、Alexa Fluor 594（商標名）、Alexa Fluor 633（商標名）、Alexa Fluor 647（商標名）、Alexa Fluor 680（商標名）、Alexa Fluor 700（商標名）、Alexa Fluor 750（商標名）、Alexa Fluor 790（商標名）、Rhodamine Red-X（商標名）、Texas Red-X（商標名）、5(6)-TAMRA-X（商標名）、5TAMRA（商標名）、SFX（商標名）を挙げることができる。これらの中でも、ローダミン系蛍光色素であるCR110やTAMRA、オキサジン系蛍光色素であるATTO655、BODIPY系蛍光色素であるBODIPY FLやBODIPY R6GやBODIPY 558/568やBODIPY 581/591やBODIPY TMRを特に好適な蛍光色素として例示することができる。
【００５３】
蛍光色素は、通常、アジド基などのクリック反応に用いられる基を介して一般式（I)〜(VI)で表される化合物に結合させる。従って、蛍光色素は、アジド基と結合する構造、例えば、エチニル基やシクロアルキンなどを有していることが好ましい。より具体的には、蛍光色素は、ジベンジルシクロオクチン（DBCO）などを有していることが好ましい。蛍光色素は、DBCOなどの化合物に、リンカーを介して結合していてもよく、リンカーを介さずに結合していてもよい。
【００５４】
使用する抗体は特に限定されず、例えば、抗CD20抗体であるリツキシマブ、抗HER2抗体であるトラスツズマブなどを使用することができる。また、Q-bodyは、低分子化合物を検出対象としているが（WO2013/065314）、本発明の蛍光標識抗体又は抗体断片も低分子化合物を検出対象とするため、低分子化合物に対する抗体を使用してもよい。ここでいう低分子化合物とは、例えば、アンフェタミン、メタンフェタミン、モルヒネ、ヘロイン、コデインなどの覚せい剤や麻薬類、アフラトキシン、ステリグマトシスチン、ネオソラニオール、ニバレノール、フモニシン、オクラトキシン、エンドファイト産生毒素などのカビ毒、テストステロンやエストラジオールなどの性ホルモン、クレンブテロールやラクトパミンなどの飼料に不正に用いられる添加物、PCB、ゴシポール、ヒスタミン、ベンツピレン、メラミン、アクリルアミド、ダイオキシンなどの有害物質、アセタミプリド、イミダクロプリド、クロルフェナピル、マラチオン、カルバリル、クロチアニジン、トリフルミゾール、クロロタロニル、スピノサド、ランネート、メタミドホス、クロルピリホスなどの残留農薬、ビスフェノールAなどの環境ホルモンなどである。更に、本発明の蛍光標識抗体又は抗体断片を疾患の診断薬として使用する場合は、疾患のマーカーとなる物質に対する抗体を使用することができる。
【００５５】
抗体断片は、上記の抗体の断片を使用することができる。また、抗体断片は、全長抗体と同様に、断片と結合した蛍光色素が抗原の非存在下において消光され、抗原の存在下においてその消光が解除される断片であればどのようなものでもよい。蛍光色素がこのような変化を示すためには、抗体断片は軽鎖可変領域と重鎖可変領域を有することが通常必要なので、抗体断片は、これら二つの領域を含むことが好ましい。このような軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む抗体断片の具体例としては、Fab断片、F(ab')2断片、scFv（single-chain variable fragment）などを挙げることができる。
【００５６】
蛍光色素の消光時の蛍光強度の減少及び消光解除時の蛍光強度の増加をより大きくするため、蛍光色素に対するクエンチャーやFRET（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用することもできる（R. Abe et al., Scientific Reports 4, 4640 (2014) 、WO2013/065314）。
【００５７】
クエンチャーを利用する方法としては、蛍光色素が結合している鎖（軽鎖又は重鎖）と別の鎖の可変領域にクエンチャーを結合させる方法を例示できる。このような位置にクエンチャーを結合させることにより、抗原非存在下ではクエンチャーは蛍光色素と近接し、消光効果を示すが、抗原存在下ではクエンチャーは蛍光色素と離れ、消光効果を示さなくなる。これにより、蛍光色素の消光時の蛍光強度の減少及び消光解除時の蛍光強度の増加をより大きくすることができる。
【００５８】
使用するクエンチャーは、蛍光色素に対して消光効果を示すものであれば特に限定されない。このようなクエンチャーとしては、NBD:7-nitrobenzofurazan、DABCYL、BHQ、ATTO、QXL、QSY、Cy、Lowa Black、IRDYE等を基本骨格とする消光色素やその消光色素の誘導体を例示することができ、具体的には、NBD、DABCYL、BHQ-1（商標名）、BHQ-2（商標名）、BHQ-3（商標名）、ATTO540Q（商標名）、ATTO580Q（商標名）、ATTO612Q（商標名）、QXL490（商標名）、QXL520（商標名）、QXL570（商標名）、QXL610（商標名）、QXL670（商標名）、QXL680（商標名）、QSY-35（商標名）、QSY-7（商標名）、QSY-9（商標名）、QSY-21（商標名）、Cy5Q（商標名）、Cy7Q（商標名）、Lowa Black FQ（商標名）、Lowa Black RQ（商標名）、IRDYE QC-1（商標名）を挙げることができるが、これらの中でも、NBDが好ましい。また、本発明の蛍光標識抗体又は抗体断片における蛍光色素とクエンチャーの組み合わせは、抗原非存在下でクエンチャーが蛍光色素を効果的に消光し、抗原存在下においては蛍光色素の発光を阻害しない組み合わせを適宜選択することができ、蛍光色素TAMRAとNBDの組み合わせを例示することができる。
【００５９】
抗体又は抗体断片へのクエンチャーの結合は、上述した抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物（例えば、一般式(I)〜(VIII)で表される化合物）利用する方法を改変した方法、即ち、抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物に含まれる蛍光色素をクエンチャーに置き換えた化合物を利用する方法によって行ってもよいが、他の方法で行ってもよい。
【００６０】
FRETを利用する方法としては、蛍光色素が結合している鎖（軽鎖又は重鎖）と別の鎖の可変領域に前記蛍光色素とFRETペアを形成する別の蛍光色素を結合させる方法を例示できる。
【００６１】
このような位置にFRETペアを形成する別の蛍光色素を結合させることにより、抗原非存在下では別の蛍光色素は蛍光色素と近接し、FRETを生じるが、抗原存在下では別の蛍光色素は蛍光色素と離れ、FRETを生じなくなる。これにより、蛍光色素の消光時の蛍光強度の減少及び消光解除時の蛍光強度の増加をより大きくすることができる。
【００６２】
このようなFRETペアを形成する蛍光色素としては、CR110とTAMRAの組み合わせを挙げることができる。
【００６３】
抗体又は抗体断片への別の蛍光色素の結合は、上述した抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物（例えば、一般式(I)〜(VIII)で表される化合物）利用する方法によって行ってもよいが、他の方法で行ってもよい。
【００６４】
本発明の蛍光標識抗体又は抗体断片は、以下のような利点を有する。
１）抗体の相補性決定領域に選択的に存在しているチロシン残基を効率的（ほぼ100%）にラベル化できるため、抗体医薬などの作製法が確立されている製剤をQ-body化することが可能である。
２）化学反応に立脚した手法により合成でき、遺伝子工学的な手法を必要としないため、大量合成が可能である。
３）従来は困難であったポリクローナル抗体のQ-body化も可能になる。
【００６５】
（Ｃ）診断薬
本発明の疾患の診断薬は、上述した本発明の蛍光標識抗体又は抗体断片を含むものであって、抗体又は抗体断片が疾患のマーカーとなる物質に対する抗体又は抗体断片であることを特徴とするものである。
【００６６】
疾患のマーカーとなる物質に対する抗体としては、例えば、上述したリツキシマブやトラスツズマブを挙げることができる。リツキシマブは、悪性リンパ腫のマーカーであるCD20に対する抗体であり、トラスツズマブは乳がん、食道がん、胃がんのマーカーであるHER2に対する抗体である。疾患のマーカーとなる物質に対する抗体は、これら以外にも数多く知られており、それらの大部分は市販されている。本発明の疾患の診断薬においては、このような公知の抗体や市販されている抗体を使用することができる。疾患のマーカーとなる物質に対する抗体の具体例としては、例えば、肺がんなどのマーカーとなるEGFRに対する抗体、肝臓がんのマーカーとなるα-フェトプロテイン（AFP）に対する抗体、甲状腺髄様がんのマーカーとなるカルシトニンに対する抗体、乳がんのマーカーとなるCA15-3に対する抗体、胆管がんのマーカーとなるCA19-9に対する抗体、白血病のマーカーとなるCD45に対する抗体、横紋筋肉腫のマーカーとなるMyo D1に対する抗体、胎児性がんのマーカーとなるPLAPに対する抗体、前立腺がんのマーカーとなるPSAに対する抗体、甲状腺がんのマーカーとなるTTF1に対する抗体、アルツハイマー病のマーカーとなるアミロイドβやタウタンパク質に対する抗体などを挙げることができる。
【００６７】
本発明の疾患の診断薬は、ヒトなどの生物からの採取物（例えば、血液、髄液、唾液、尿、糞便、皮膚など）中のマーカー物質を調べる体外診断薬として使用できる。また、ヒトなどの生物に投与し、生物中の臓器、組織、又は細胞に存在するマーカー物質を調べる体内診断薬としても使用できる。
【００６８】
（Ｄ）蛍光標識抗体又は抗体断片の製造方法
本発明の蛍光標識抗体又は抗体断片の製造方法は、下記の工程（１）及び（２）を含むものである。
【００６９】
工程（１）では、抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物であって、クリック反応に用いられる官能基を含む化合物を、抗体又は抗体断片と反応させ、抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合させる。
【００７０】
抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物としては、例えば、下記の一般式(Ib)〜(VIIIb)で表される化合物を挙げることができる。
【化１０】
2020026733.tif 000011
【００７１】
一般式（Ib)〜(VIIIb)におけるA、R1、R2、R3、R4、及びR5は、一般式（I)〜(VIII)におけるA、R1、R2、R3、R4、及びR5と同じ意味である。
【００７２】
一般式（Ib)〜(VIIIb)においてLbは、末端にクリック反応に用いられる官能基を有するリンカーを表す。また、LbがA上に存在する場合LbはA上の任意の位置に存在してよい。リンカーは、クリック反応に用いられる官能基の機能を失わせないような構造であればどのような構造でもよいが、アルキレン基であることが好ましい。但し、アルキレン基の１以上の-CH2-は、-O-、-S-、-NH-、又は-CO-で置換されていてもよい。アルキレン基の炭素数は特に限定されないが、５〜２０であることが好ましく、５〜１５であることがより好ましい。なお、アルキレン基中の-CH2-を、他の基で置換した場合も、この他の基も１つの炭素を持つものとして、前記した「アルキレン基の炭素数」に含める。
【００７３】
抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物は、上記の一般式（Ib)〜(VIIIb)で表される化合物に限定されるものではなく、例えば、下記の化合物も包含される。
【化１１】
2020026733.tif 000012
上記の化合物におけるLbは一般式(Ib)〜(VIIIb)におけるLbと同じ意味であり、Xは酸素原子又は硫黄原子を表し、RはXが酸素原子を表す場合は水素原子又はメチル基を表し、Xが硫黄原子を表す場合は水素原子を表す。
【００７４】
抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物の中では、抗体又は抗体断片中のチロシン残基と結合する化合物が好ましい。このような化合物としては、一般式（Ib)〜(VIb)で表される化合物を挙げることができる。
【００７５】
一般式（Ib)〜(VIb)で表される化合物の中では、一般式(Ib)で表される化合物を使用することが好ましい。また、一般式(Ib)で表される化合物の中では、下記の一般式(Iab)
【化１２】
2020026733.tif 000013
で表される化合物を使用するのが好ましい。ここで、Lbはベンゼン環上の任意の位置に存在してよいが、フタル酸ヒドラジド上の６位又は７位に存在することが好ましい。また、一般式(Iab)で表される化合物は、一種類の化合物だけ使用してもよいが、二種類以上の化合物の混合物を使用してもよい。例えば、Lbが６位に存在する化合物とLbが７位に存在する化合物の混合物を使用してもよい。
【００７６】
抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物と抗体又は抗体断片は、通常、HRP（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）などの触媒及び過酸化水素などの酸化剤の存在下で反応させるが、このような触媒や酸化剤を使用せず、電気化学的に反応させてもよい。
【００７７】
(a)触媒と酸化剤を使用した反応
この反応に使用する抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物の量は特に限定されないが、一般式（Ib)で表される化合物を使用する場合は、抗体又は抗体断片1molに対して、通常、１〜1000molであり、好適には、10〜100molである。
【００７８】
この反応に使用する溶媒は反応を阻害しないものであれば特に限定されず、例えば、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシドなどを用いることができる。
【００７９】
反応時のpHは特に限定されないが、通常、3〜11であり、好適には、6〜8である。
【００８０】
反応温度は特に限定されないが、通常、4〜50℃であり、好適には、10〜30℃である。
【００８１】
反応時間は特に限定されないが、通常、5〜240分であり、好適には、30〜60分である。
【００８２】
HRPを触媒として使用する場合、その量は特に限定されないが、抗体又は抗体断片1molに対して、通常、0.001〜10molであり、好適には、0.001〜0.005molである。
【００８３】
過酸化水素を酸化剤として使用する場合、その量は特に限定されないが、抗体又は抗体断片1molに対して、通常、1〜100molであり、好適には、1〜10molである。
【００８４】
(b)電気化学的反応
抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物と抗体又は抗体断片は、両者を含む溶液に電圧を印加し、電気化学的に反応させてもよい。
【００８５】
使用する溶媒は、導電性で、抗体や抗体断片に悪影響を及ぼさないようなものであれば特に限定されない。例えば、Tris-HCl緩衝液、リン酸緩衝液（例えば、リン酸カリウム緩衝液）などの電解質溶液を溶媒として使用することができる。溶液のpHは特に限定されないが、好ましくは、5〜9であり、より好ましくは、6〜8である。
【００８６】
抗体又は抗体断片中のアミノ酸残基と結合する化合物の溶液中の濃度は、使用する化合物の種類によって適宜設定されるが、一般式(Ib)で表される化合物を使用する場合は、好ましくは、50〜1000μMであり、より好ましくは、100〜500μMである。
【００８７】
抗体又は抗体断片の溶液中の濃度は特に限定されないが、好ましくは、0.1〜100μMであり、より好ましくは、1〜10μMである。
【００８８】
電圧の印加は、例えば、電解槽に溶液を入れ、この溶液中に電極を挿入し、電極間に外部から電圧を印加して行うことができる。このような電圧の印加は、市販のバルク電気分解用セルなどを用いて行うことができる。電極は、一般的な電気化学的反応において使用されるものと同様のものでよく、例えば、カーボン電極、白金電極、銀電極、銅電極などを電極として使用することができる。カーボン電極としては、表面積の大きい多孔性カーボン電極を使用するのが好ましい。
【００８９】
電解方式は、定電流方式、定電圧方式のいずれでもよいが、定電圧方式が好ましい。定電圧方式とする場合は、市販のポテンシオスタットを使用するのが好ましい。
【００９０】
定電圧方式で電圧を印加する場合、その電圧は特に限定されないが、好ましくは、0.1〜5.0Vであり、より好ましくは、0.1〜2.0Vである。
【００９１】
電圧の印加時間（累計時間）は特に限定されないが、好ましくは、1秒〜120分であり、より好ましくは、1〜60分である。
【００９２】
上記の(a)又は(b)の反応終了後、目的とする生成物（一般式（Ib)〜(VIIIb)で表される化合物と結合した抗体又は抗体断片など）以外の物質を、クロマトグラフィーなどを用いて除去してもよい。
【００９３】
工程（２）では、蛍光色素を一般式（Ib)〜(VIb)で表される化合物中のクリック反応に用いられる官能基と反応させ、この官能基と結合させる。
【００９４】
工程（２）は、工程（１）と連続的に行ってもよいし、非連続的に行ってもよい。
【００９５】
工程（２）の反応は、クリック反応としてよく知られた反応であり、当業者であればその条件を適宜設定できる。
蛍光色素は、「（Ｂ）蛍光標識抗体又は抗体断片」に記載したものと同様のものを使用できる。
【００９６】
この反応に使用する蛍光色素の量は特に限定されないが、蛍光色素としてDBCO-TAMRAを使用する場合は、抗体又は抗体断片1molに対して、通常、1〜100molであり、好適には、1〜10molである。
【００９７】
この反応に使用する溶媒は反応を阻害しないものであれば特に限定されず、例えば、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシドなどを用いることができる。
【００９８】
反応時のpHは特に限定されないが、通常、3〜11であり、好適には、6〜8である。
【００９９】
反応温度は特に限定されないが、通常、4〜50℃であり、好適には、25〜40℃である。
【０１００】
反応時間は特に限定されないが、通常、5〜720分であり、好適には、5〜60分である。
【実施例】
【０１０１】
以下に、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【０１０２】
〔実施例１〕  変性剤による消光の解除
抗ヒトCD20抗体であるリツキシマブ（中外製薬）をTBS Tris Buffered Saline (100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7.4) に5μMの濃度で溶解させ、HRP及び下記の構造のNMeLuminol-N3をそれぞれ終濃度45 nM及び300μMの濃度になるように添加した。
【化１３】
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【０１０３】
H2O2を終濃度25μMの濃度になるように添加し、撹拌後、1時間室温で静置した。リツキシマブに未結合のNMeLuminol-N3をSephadex-G25カラムで除去した。【０１０４】
N3基で修飾されたリツキシマブに、DBCO-PEG4-TAMRA（Aldrich）を終濃度10μMになるように加え、37℃で30分反応させた。低分子化合物はSephadex-G25カラムで除去した。【０１０５】
リツキシマブの終濃度が50 nMになるようにし、変性剤存在下及び非存在下での蛍光を分光蛍光光度計(日本分光  FP-8300）で測定した（図１）。変性剤としては、グアニジンを使用し、濃度は7 Mになるようにした。また、比較のため、リツキシマブと結合していないDBCO-PEG4-TAMRAの蛍光も測定した（図２）【０１０６】
図に示すように、リツキシマブと結合させることにより、DBCO-PEG4-TAMRAの蛍光強度は減少した。一方、リツキシマブと結合したDBCO-PEG4-TAMRAの蛍光強度は、変性剤の添加により増加した。【０１０７】
〔実施例２〕  CD20を発現する細胞のライセートによる消光の解除
実施例１と同様の方法で、DBCO-PEG4-TAMRAと結合したリツキシマブを作製した。リツキシマブの終濃度が50 nMになるようにし、各濃度の細胞ライセート存在下での蛍光を分光蛍光光度計(日本分光  FP-8300）で測定した。細胞ライセートとしては、抗原（CD20）を発現する細胞であるSU-DHL-4細胞（ATCC）のライセート（図３左）及び抗原を発現しない細胞であるSK-BR-3細胞（ATCC）のライセート（図３右）を使用した。【０１０８】
図に示すように、SK-BR-3細胞のライセートを添加した場合は蛍光強度がほとんど増加しなかったのに対し、SU-DHL-4細胞のライセートを添加した場合は蛍光強度がライセートの濃度に依存して増加した。【０１０９】
〔実施例３〕  リンカーの消光解除への影響
DBCO-PEG4-TAMRAの代わりにDBCO-TAMRAを用い、他は実施例２と同様に、SU-DHL-4細胞のライセート（図４左）又はSK-BR-3細胞のライセート（図４右）存在下での蛍光を分光蛍光光度計(日本分光  FP-8300）で測定した。DBCO-TAMRAは、DBCO-PEG4-TAMRAのリンカーとなるPEG4が除かれており、DBCOとTAMRAが近接している。【０１１０】
図３と図４を比較すると、DBCO-TAMRAを用いた方が、抗原発現細胞のライセート添加時の蛍光強度の増加が大きく、DBCOとTAMRA間のリンカーが短い方が、抗原の検出に適していると考えられる。【０１１１】
〔実施例３〕  様々な蛍光色素を結合させた修飾抗体の作製
DBCO-amine (Aldrich)の100 mM DMF溶液（2当量）、N,N-diisopropylethylamine（2等量）とNHS結合型蛍光色素（1等量）をDMF中で一時間反応させ、反応混合物をDBCO結合型蛍光色素分子（1等量）として終濃度10μMになるように、N3基で修飾されたリツキシマブもしくはN3基で修飾されたトラスツヅマブに加え、37℃で30分反応させた。低分子化合物はSephadex-G25カラムで除去した。N3基で修飾されたトラスツヅマブはN3基で修飾されたリツキシマブと同様の操作（実施例１）で作製した。
【化１４】
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【０１１２】
検討に用いた蛍光色素はTAMRAを含むRhodamine色素、Fluorescein色素、Carbopyronin色素、Coumarin色素、NBD色素、Acridine色素、BODIPY色素の計20種である（図５）。これらの蛍光色素で修飾した抗体について、消光状態(Quenching)における蛍光強度と脱消光状態(De-Quenching)における蛍光強度を求め、両者の比（De-Quenching intensity/Quenching intensity）を応答比（Res. Ratio）とした。上記の蛍光色素で修飾した抗体の応答比を下表に示す。なお、脱消光状態は、抗原の添加ではなく、変性剤の添加により、生じさせた。
【表１】
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【０１１３】
Rituximabを用いた場合、Rhodamine色素のTAMRA、ATTO 488、ATTO 520、ATTO565、ATTO 590、 Carbopyronin色素のATTO 610、Coumarin色素のATTO 425、Acridine色素のATTO 495 、BODIPY色素のBODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 558、BODIPY TMR、BODIPY 581が良好な応答比を示した。一方、Trastuzumabを用いた場合、Rhodamine色素のATTO 520、Carbopyronin色素のATTO 610、Coumarin色素のATTO 425、BODIPY色素のBODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 558、BODIPY TMR、BODIPY 581が良好な応答比を示した。【０１１４】
〔実施例４〕  電気化学的な修飾リツキシマブの作製方法
抗ヒトCD20抗体であるリツキシマブ（中外製薬）をTris Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4) に5μMの濃度で溶解させ、NMeLuminol-N3を300μMの濃度になるように添加した。図６に示すような電気化学反応装置（正極、対極：RVC電極（IKA）、参照電極：Ag/AgCl（IKA））で行った。400rpmの攪拌速度で、電圧印加はHSV-110（北斗電工）で行った。0.7 Vの定電圧で、30分の電圧印加後、低分子化合物はSephadex-G25カラムで除去した。【０１１５】
N3基で修飾されたリツキシマブ5μMに対して、DBCO-TAMRAを蛍光色素として終濃度10μMになるように加え、37℃で30分反応させた。低分子化合物はSephadex-G25カラムで除去した。【０１１６】
このようにして作製したTAMRA標識リツキシマブの消光状態（変性剤非存在下）及び脱消光状態（変性剤存在下）における蛍光スペクトルを図７に示す。図７に示すように、電気化学的な方法によって作製された蛍光標識リツキシマブは、HRP及びH2O2を使用して作製された蛍光標識リツキシマブと同様に、変性剤の添加により、脱消光が起きた。【０１１７】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明の蛍光標識抗体又は抗体断片は、種々の疾患の診断薬として使用できるので、そのような診断薬の製造に関連する産業分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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