(57)【要約】本開示は、炎症抑制用の組成物であって、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域におけるステムループ構造を破壊する少なくとも１つの物質を含み、ステムループ構造が、配列番号１の第２３１位〜第２４５位に相当する領域で形成される第１のステムループ構造および配列番号１の第４２４位〜第４４２位に相当する領域で形成される第２のステムループ構造から選択される少なくとも１つのステムループ構造である、組成物を提供する。
2019182055.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症抑制用の組成物であって、
レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域におけるステムループ構造を破壊する少なくとも１つの物質を含み、
ステムループ構造が、配列番号１の第２３１位〜第２４５位に相当する領域で形成される第１のステムループ構造および配列番号１の第４２４位〜第４４２位に相当する領域で形成される第２のステムループ構造から選択される少なくとも１つのステムループ構造である、組成物。
【請求項２】
レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域が配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ステムループ構造を破壊する少なくとも１つの物質が、
（ａ）第１のオリゴヌクレオチドであって、
（ａ−１）配列番号１の第２０６位〜第２４２位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第２３３位〜第２３５位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、１０個〜３０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、および、
（ａ−２）配列番号１の第２３４位〜第２７０位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第２４１位〜第２４３位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、１０個〜３０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、
から選択されるオリゴヌクレオチド、
（ｂ）第２のオリゴヌクレオチドであって、
（ｂ−１）配列番号１の第３９９位〜第４３９位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第４２６位〜第４２８位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、１０個〜３０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、および、
（ｂ−２）配列番号１の第４２７位〜第４６７位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第４３８位〜第４４０位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、１０個〜３０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、
から選択されるオリゴヌクレオチド、または、
（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの組合せ、
である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
ステムループ構造を破壊する少なくとも１つの物質が、
（ａ）第１のオリゴヌクレオチドであって、
（ａ−１）配列番号１の第２０６位〜第２４２位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第２３３位〜第２３５位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、配列番号７と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、および、
（ａ−２）配列番号１の第２３４位〜第２７０位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第２４１位〜第２４３位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、配列番号８と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド
から選択されるオリゴヌクレオチド、
（ｂ）第２のオリゴヌクレオチドであって、
（ｂ−１）配列番号１の第３９９位〜第４３９位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第４２６位〜第４２８位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、配列番号９と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、および、
（ｂ−２）配列番号１の第４２７位〜第４６７位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第４３８位〜第４４０位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、配列番号１０と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド
から選択されるオリゴヌクレオチド、または、
（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの組合せ、
である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
ステムループ構造を破壊する少なくとも１つの物質が、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの組合せである、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
自己免疫性疾患または敗血症性ショックを処置するための、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
多発性硬化症を処置するための、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症または間質性肺炎を処置するための、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
炎症抑制薬のスクリーニング方法であって、以下の工程
（ａ）レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域と連結したレポーター遺伝子およびレグナーゼ−１遺伝子を発現する細胞に、候補物質を導入する工程、
（ｂ）前記細胞におけるレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、および、
（ｃ）候補物質の非存在下において測定した発現量と比較して発現量を増加させる候補物質を、炎症抑制薬として選択する工程、
を含む、方法。
【請求項１０】
レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域が、配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、日本国特許出願第２０１８−０５４７８０号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
本願は、炎症抑制用の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は多くの疾患に関連し、中でも敗血症性ショックや自己免疫疾患において重要である。敗血症性ショックの重篤な症状として急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）が挙げられるが、その治療方法は、ステロイド剤の投与などに限られている。自己免疫疾患の治療に関しては、例えば慢性関節リウマチに対する免疫抑制剤メトトレキサートの使用や、ＴＮＦ、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１受容体などのサイトカインを標的とする抗体療法が近年開発された。しかし、サイトカイン抗体に対して不応答性の症例がしばしば存在し、全身性エリテマトーデスをはじめ、抗体療法の効果が認められない自己免疫疾患も多く存在する。多発性硬化症にはＩ型インターフェロンが効果を示すことが知られているが、その効果は十分ではない。【０００３】
ＲＮＡ分解酵素のレグナーゼ−１（Regnase-1；Ｒｅｇ１、Ｚｃ３ｈ１２ａまたはＭｃｐｉｐ１とも呼ばれる）は、マクロファージや樹状細胞などの自然免疫細胞において、インターロイキン（ＩＬ）−６などの炎症性サイトカインや炎症惹起に関わる分子をコードするｍＲＮＡを分解することにより、過剰な免疫応答を抑制している。また、レグナーゼ−１は、獲得免疫Ｔ細胞においても、Ｔ細胞活性化に関わる分子のｍＲＮＡを分解することにより、過剰なＴ細胞活性化を抑制している。【０００４】
レグナーゼ−１は、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に存在するステムループ構造を認識して、タンパク質翻訳が生じているｍＲＮＡを分解する（非特許文献１）。レグナーゼ−１のｍＲＮＡも１つのステムループ構造を持ち、レグナーゼ−１自身により認識され、分解されることが知られている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Mino, T. et al., Cell 161, 1058-1073 (2015)
【非特許文献２】Iwasaki H., Takeuchi O. et al., Nat Immunol. 12, 1167-1175 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本願は、新たな炎症抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに、種間で保存された２つのステムループ構造が存在することを見出し、これらのステムループ構造を破壊すると、レグナーゼ−１によるレグナーゼ−１ ｍＲＮＡの分解が抑制され、レグナーゼ−１タンパク質が増加することを明らかにした。レグナーゼ−１はいくつかの炎症性サイトカインのｍＲＮＡを分解するので、その増加は炎症の抑制をもたらす。【０００８】
従って、ある態様では、本願は、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域におけるステムループ構造を破壊する少なくとも１つの物質を含む、炎症抑制用の組成物を提供する。【０００９】
また別の態様では、本願は、炎症抑制薬のスクリーニング方法であって、以下の工程
（ａ）レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域と連結したレポーター遺伝子およびレグナーゼ−１遺伝子を発現する細胞に、候補物質を導入する工程、
（ｂ）前記細胞におけるレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、および、
（ｃ）候補物質の非存在下において測定した発現量と比較して発現量を増加させる候補物質を、炎症抑制薬として選択する工程、
を含む、方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本開示により、対象におけるレグナーゼ−１の活性化による炎症抑制が可能になる。あるいは、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域による遺伝子発現の制御を指標として、炎症抑制薬として使用し得る物質をスクリーニングし得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】代表的なヒトおよびマウスのレグナーゼ−１のアミノ酸配列を示す。
【図２】代表的なヒトのレグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３'非翻訳領域のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。ステムループ構造を形成する領域を実線で囲み、ステムループのループ部分を形成する領域を斜体で示す。２３１−２４５ＭＯおよび４２４−４４２ＭＯが結合するヌクレオチド配列を下線で示す。配列番号１の第２０６位〜第４６７位（配列番号５）のヌクレオチド配列を破線で囲む。
【図３】代表的なマウスのレグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３'非翻訳領域のヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。ステムループ構造を形成する領域を実線で囲み、ステムループのループ部分を形成する領域を斜体で示す。１９１−２１０ＭＯおよび３７８−３９２ＭＯが結合するヌクレオチド配列を下線で示す。配列番号２の第１７１位〜第４１６位（配列番号６）のヌクレオチド配列を破線で囲む。
【図４】実施例１の実験に使用したレポーターコンストラクトの模式図およびレポーターアッセイの結果を示す。
【図５】マウスレグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ全長を含むルシフェラーゼレポータープラスミドを用いる、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲのステムループを標的とするモルフォリノオリゴ（ＭＯ）存在下でのレポーターアッセイの結果を示す。
【図６】ＭＯで処理したマウス骨髄マクロファージ（ＢＭＭ）における、ＬＰＳ刺激後の各種サイトカインおよびレグナーゼ−１のｍＲＮＡの量、並びに、レグナーゼ−１タンパク質の量を示す。
【図７】ＭＯを気管内投与したマウスにＬＰＳを気管内投与し、肺組織における各種サイトカインおよびレグナーゼ−１のｍＲＮＡの量を測定した結果を示す。
【図８】実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスにおける、体重、ＥＡＥスコアおよび生存率に対する頭蓋内ＭＯ投与の効果を示す。矢印はＭＯ投与の時点を示す。
【図９】ＭＯで処理したヒトＴＨＰ−１細胞における、ＬＰＳ刺激後の各種サイトカインおよびレグナーゼ−１のｍＲＮＡの量を示す。
【図１０】アンチセンスオリゴＤＮＡ（ＡＳＯ）で処理したＴＨＰ−１細胞における、ＬＰＳ刺激後の各種サイトカインおよびレグナーゼ−１のｍＲＮＡの量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８〜２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０〜３０」は、「１８〜３３」を含むものとする。
【００１３】
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
【００１４】
本願発明者らは、レグナーゼ−１が、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに存在する２つのステムループ構造を認識して、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡを分解することを見出した。本願実施例では、これらのステムループ構造の一方または両方を破壊することにより、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの分解が抑制されること、さらに、それによりレグナーゼ−１の量が増加し、レグナーゼ−１の標的であるＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＩＬ−１β等の炎症性サイトカインのｍＲＮＡの分解が促進されることが立証された。また、インビボモデルにおいても、同様に炎症性サイトカインのｍＲＮＡの分解が促進された。これらの結果は、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおけるステムループ構造を破壊することにより、炎症を抑制し得ることを示す。
【００１５】
レグナーゼ−１はいかなる種のものであってもよく、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）、特にヒトおよびマウスのレグナーゼ−１である。レグナーゼ−１の代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１３１０４７９．１（ヒト、配列番号３）およびＮＰ＿６９４７９９．１（マウス、配列番号４）として登録されている。本開示に関して、「レグナーゼ−１」は、レグナーゼ−１の機能が維持されている限り、配列番号３または４のアミノ酸配列と、少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％以上の同一性を有するタンパク質を含む。
【００１６】
「レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域」または「レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ」は、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡのうち、３’側の翻訳されない領域を意味する。本願に関して、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡには、上記で定義されるレグナーゼ−１をコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡがすべて包含され、３’非翻訳領域のヌクレオチド配列は限定されない。レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲのヌクレオチド配列の例として、少なくとも配列番号５（ヒト）または配列番号６（マウス）で示される配列を含む配列が挙げられる。例えば、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号１（ヒト）または配列番号２（マウス）で示されるヌクレオチド配列を含む。ある実施態様では、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号１、２、５または６のヌクレオチド配列と、少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％以上の同一性を有する配列を含む。
【００１７】
本開示において、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の同一性とは、タンパク質またはオリゴヌクレオチド間の配列の類似の程度を意味し、比較対象の配列の領域にわたって最適な状態（アミノ酸またはヌクレオチドの一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）は両方の配列に存在する同一のアミノ酸またはヌクレオチドを決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内のアミノ酸またはヌクレオチドの総数で割り、得られた数値に１００をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなど）が挙げられる。配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定され得る。
【００１８】
「ステムループ構造」とは、一本鎖核酸において、分子内の離れた２つの領域に存在する相補的な配列が結合してステム部分を形成し、その２つの領域に狭まれた配列がループ部分を形成している構造を意味する。ある実施態様では、ステムループ構造は、任意のレグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域において、配列番号１（ヒト）の第２３１位〜第２４５位に相当する領域で形成される第１のステムループ構造、および／または、配列番号１の第４２４位〜第４４２位に相当する領域で形成される第２のステムループ構造である。ある実施態様では、ステムループ構造は、任意のレグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域において、配列番号２（マウス）の第１９６位〜第２１０位に相当する領域で形成される第１のステムループ構造、および／または、配列番号２の第３７８位〜第３９２位に相当する領域で形成される第２のステムループ構造である。
【００１９】
第１のヌクレオチド配列におけるある領域に相当する第２のヌクレオチド配列における領域とは、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列を最適な状態にアラインメントしたときに、第１のヌクレオチド配列の当該領域と一致する第２のヌクレオチド配列における領域を意味する。
【００２０】
「ステムループ構造を破壊する物質」は、ステムループ構造内の相補的結合を阻害する物質であれば、特に限定されない。少なくとも１対、２対または３対のヌクレオチド間の相補的結合を阻害する物質であればよい。例えば、ステムループ構造を形成するヌクレオチド配列に結合するオリゴヌクレオチド（アンチセンス核酸）、または、ステムループ構造を形成するヌクレオチド配列をゲノム編集技術により改変するための物質が挙げられる。
【００２１】
ある実施態様では、ステムループ構造を破壊する物質は、アンチセンス核酸である。アンチセンス核酸は、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域におけるステムループ構造を形成する領域の少なくとも一部、例えば、ステムループ構造のステム部分を形成する少なくとも１個、２個または３個のヌクレオチドに結合することにより、ステムループ構造内の相補的結合を阻害し得る。例えば、アンチセンス核酸は、ステムループ構造のステム部分を形成する少なくとも２個または３個、例えば３個の連続するヌクレオチドを含む配列に相補的な配列を含む。当該連続するヌクレオチドは、ステムループ構造のループ部分に隣接するものであり得、例えば、配列番号１では、第２３３位〜第２３５位、第２４１位〜第２４３位、第４２６位〜第４２８位および第４３８位〜第４４０位に相当し得る。アンチセンス核酸は、それ自体がステムループ構造、ヘアピン構造、または二量体などの多量体を形成しないものが好ましい。アンチセンス核酸は、例えば１０個〜３０個、１５〜２７個、１８〜２５個または２０〜２３個のヌクレオチドからなる一本鎖核酸である。
【００２２】
ある実施態様では、アンチセンス核酸は、
（ａ−１）配列番号１の第２０６位〜第２４２位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第２３３位〜第２３５位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、１０個〜３０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、および、
（ａ−２）配列番号１の第２３４位〜第２７０位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第２４１位〜第２４３位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、１０個〜３０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、
から選択される。
【００２３】
ある実施態様では、（ａ−１）のオリゴヌクレオチドは、配列番号７（5'-AATGTGTATCAACAGGGTGATCG-3'）と、少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％以上の配列同一性を有する。別の実施態様では、（ａ−１）のオリゴヌクレオチドは、配列番号７のヌクレオチド配列において、１個または数個、例えば、２個もしくは３個のヌクレオチドが欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなる。ある実施態様では、（ａ−１）のオリゴヌクレオチドは、配列番号７と約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。ある実施態様では、（ａ−１）のオリゴヌクレオチドは、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。ある実施態様では、（ａ−１）のオリゴヌクレオチドは、配列番号７のヌクレオチド配列からなる。
【００２４】
ある実施態様では、（ａ−２）のオリゴヌクレオチドは、配列番号８（5'-CTTAAACTACAGAGATACAATGT-3'）と、少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％以上の配列同一性を有する。別の実施態様では、（ａ−２）のオリゴヌクレオチドは、配列番号８のヌクレオチド配列において、１個または数個、例えば、２個もしくは３個のヌクレオチドが欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなる。ある実施態様では、（ａ−２）のオリゴヌクレオチドは、配列番号８と約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。ある実施態様では、（ａ−２）のオリゴヌクレオチドは、配列番号８のヌクレオチド配列を含む。ある実施態様では、（ａ−２）のオリゴヌクレオチドは、配列番号８のヌクレオチド配列からなる。
【００２５】
ある実施態様では、アンチセンス核酸は、
（ｂ−１）配列番号１の第３９９位〜第４３９位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第４２６位〜第４２８位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、１０個〜３０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、および、
（ｂ−２）配列番号１の第４２７位〜第４６７位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第４３８位〜第４４０位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、１０個〜３０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、
から選択される。
【００２６】
ある実施態様では、（ｂ−１）のオリゴヌクレオチドは、配列番号９（5'-ACGGTGCCCAACTAGCCAG-3'）と、少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％以上の配列同一性を有する。別の実施態様では、（ｂ−１）のオリゴヌクレオチドは、配列番号９のヌクレオチド配列において、１個または数個、例えば、２個もしくは３個のヌクレオチドが欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなる。ある実施態様では、（ｂ−１）のオリゴヌクレオチドは、配列番号９と約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。ある実施態様では、（ｂ−１）のオリゴヌクレオチドは、配列番号９のヌクレオチド配列を含む。ある実施態様では、（ｂ−１）のオリゴヌクレオチドは、配列番号９のヌクレオチド配列からなる。
【００２７】
ある実施態様では、（ｂ−２）のオリゴヌクレオチドは、配列番号１０（5'-GGCCCTTGGAGGGCAGGCA-3'）と、少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％以上の配列同一性を有する。別の実施態様では、（ｂ−２）のオリゴヌクレオチドは、配列番号１０のヌクレオチド配列において、１個または数個、例えば、２個もしくは３個のヌクレオチドが欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなる。ある実施態様では、（ｂ−２）のオリゴヌクレオチドは、配列番号１０と約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。ある実施態様では、（ｂ−２）のオリゴヌクレオチドは、配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。ある実施態様では、（ｂ−２）のオリゴヌクレオチドは、配列番号１０のヌクレオチド配列からなる。
【００２８】
炎症抑制用の組成物は、１種またはそれ以上のアンチセンス核酸を含み得る。２種類以上のアンチセンス核酸を用いる場合は、すべてのアンチセンス核酸を含む組成物としてもよく、各々１種またはそれ以上のアンチセンス核酸を含む２種以上の組成物を併用してもよい。１つの組成物に２種類以上のアンチセンス核酸が含まれる場合は、アンチセンス核酸間で相補的結合を形成しないことが好ましい。ある実施態様では、上記（ａ−１）および（ａ−２）から選択される１種のアンチセンス核酸と、上記（ｂ−１）および（ｂ−２）から選択される１種のアンチセンス核酸の組合せを用いる。例えば、上記（ａ−１）と（ｂ−１）のアンチセンス核酸の組合せ、上記（ａ−１）と（ｂ−２）のアンチセンス核酸の組合せ、上記（ａ−２）と（ｂ−１）のアンチセンス核酸の組合せ、または、上記（ａ−２）と（ｂ−２）のアンチセンス核酸の組合せを用いる。
【００２９】
ある実施態様では、アンチセンス核酸は、
（ａ−１’）配列番号２の第１７１位〜第２０７位のヌクレオチド配列のうち、配列番号２の第１９８位〜第２００位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、１０個〜３０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、および、
（ａ−２’）配列番号２の第１９９位〜第２３５位のヌクレオチド配列のうち、配列番号２の第２０６位〜第２０８位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、１０個〜３０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、
から選択される。
【００３０】
ある実施態様では、アンチセンス核酸は、
（ｂ−１’）配列番号２の第３５４位〜第３８８位のヌクレオチド配列のうち、配列番号２の第３８１位〜第３８３位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、１０個〜３０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、および、
（ｂ−２’）配列番号２の第３８２位〜第４１６位のヌクレオチド配列のうち、配列番号２の第３８７位〜第３８９位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、１０個〜３０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、
から選択される。
【００３１】
上記（ａ−１’）、（ａ−２’）、（ｂ−１’）および（ｂ−２’）は、各々、上記（ａ−１）、（ａ−２）、（ｂ−１）および（ｂ−２）に準じて定義される。
ある実施態様では、（ａ−１’）、（ａ−２’）、（ｂ−１’）および（ｂ−２’）のオリゴヌクレオチドは、各々、配列番号１１（5'-aatgtgtatcaacagggtgatca-3'）、配列番号１２（5'-cttaaatgacagagatacaatgt-3'）、配列番号１３（5'-atggtgcctaactagccggt-3'）、配列番号１４（5'-cctcagagagcaggcacatg-3'）と、少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％以上の配列同一性を有する。別の実施態様では、（ａ−１’）、（ａ−２’）、（ｂ−１’）および（ｂ−２’）のオリゴヌクレオチドは、各々、配列番号１１〜１４のヌクレオチド配列において、１個または数個、例えば、２個もしくは３個のヌクレオチドが欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなる。ある実施態様では、（ａ−１’）、（ａ−２’）、（ｂ−１’）および（ｂ−２’）のオリゴヌクレオチドは、各々、配列番号１０〜１４と約９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。ある実施態様では、（ａ−１’）、（ａ−２’）、（ｂ−１’）および（ｂ−２’）のオリゴヌクレオチドは、各々、配列番号１１〜１４のヌクレオチド配列を含む。ある実施態様では、（ａ−１’）、（ａ−２’）、（ｂ−１’）および（ｂ−２’）のオリゴヌクレオチドは、各々、配列番号１１〜１４のヌクレオチド配列からなる。
【００３２】
アンチセンス核酸は、天然のヌクレオチドで構成されてもよく、人工のヌクレオチドで構成されてもよく、１個またはそれ以上の天然のヌクレオチドと１個またはそれ以上の人工ヌクレオチドで構成されてもよい。天然のヌクレオチドは、例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。人工ヌクレオチドは、天然のヌクレオチドと異なる構造を有し、ヌクレアーゼ耐性や標的配列との結合親和性を高めるものを選択し得る。例えば、出典明示により本明細書の一部とする Deleavey, G. F., & Damha, M. J. (2012). Designing chemically modified oligonucleotides for targeted gene silencing. Chemistry & biology, 19(8), 937-954 に記載の人工ヌクレオチドを使用し得る。人工ヌクレオチドの例には、例えば、無塩基（abasic）ヌクレオシド；アラビノヌクレオシド、２'−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシド；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスフェート基が結合したペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、架橋型人工核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ,４'−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、拘束エチル（ｃＥｔ）、モルフォリノ核酸等が挙げられる。糖修飾を有する人工ヌクレオチドには、２'−Ｏ−メチルリボース、２'−Ｏ−メトキシエチルリボース、２'−デオキシ−２'−フルオロリボース、３'−Ｏ−メチルリボース等の置換五単糖；１'，２'−デオキシリボース；アラビノース；置換アラビノース糖；六単糖およびアルファ−アノマーの糖修飾を有するものが含まれる。修飾された塩基を有する人工ヌクレオチドとしては、例えば、５−ヒドロキシシトシン、５−メチルシトシン、５−フルオロウラシル、４−チオウラシル等のピリミジン；６−メチルアデニン、６−チオグアノシン等のプリン；および他の複素環塩基等を有するものが挙げられる。アンチセンス核酸中の人工ヌクレオチドは、すべて同じ種類のものであってもよく、２種類以上の異なる人工ヌクレオチドであってもよい。
【００３３】
ある実施態様では、アンチセンス核酸は、モルフォリノオリゴである。モルフォリノオリゴは、下記の構造が繰り返し連結した構造を有する：
【化１】
2019182055.tif 000003
（式中、Ｂは、アデニン、シトシン、グアニンまたはチミンであり、
破線は隣接する構造との結合点である）。
ある実施態様では、アンチセンス核酸は一本鎖ＤＮＡである。
【００３４】
アンチセンス核酸は、アンチセンス核酸の活性または細胞への取り込みを増強する１以上の成分またはコンジュゲートと結合していてもよい。そのような成分としては、以下に限定されないが、コレステロール成分、コール酸、チオエーテル（例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）、チオコレステロール、脂肪族鎖（例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基）、リン脂質（例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル成分、またはオクタデシルアミン、ヘキシルアミノ−カルボニル−ｔオキシコレステロールもしくはオクタグアニジンデンドリマー成分などが挙げられる。このような成分を含むオリゴヌクレオチドおよびそのようなオリゴヌクレオチドを調製する方法は、当分野で公知である。
【００３５】
本組成物は、炎症を抑制することができ、従って、炎症を伴う疾患の処置および／または予防のために用いることができる。炎症を伴う疾患には、例えば、敗血症性ショック、自己免疫性疾患および移植片拒絶が含まれる。敗血症性ショックには、例えば、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、特発性肺線維症および間質性肺炎、特に急性呼吸窮迫症候群が含まれる。自己免疫疾患には、例えば、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチまたは全身性エリテマトーデス、特に多発性硬化症が含まれる。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、「処置する」または「処置」は、疾患を有する対象において、疾患の原因を軽減または除去すること、その進行を遅延または停止させること、および／または、その症状を軽減、緩和、改善または除去することを意味する。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、「予防する」または「予防」は、対象において、特に、疾患を発症する可能性が高いが、未だ発症していない対象において、疾患の発症を防止すること、または、疾患を発症する可能性を低減することを意味し、ここで、疾患の発症には再発が含まれる。敗血症性ショックを発症する可能性があるが、未だ発症していない対象には、例えば、細菌、特に薬剤耐性菌の感染が疑われる対象、菌血症を患う対象、心臓弁の異常を有する対象、カテーテル、チューブ、人工関節、人工心臓弁等の医療器具を体内で使用または留置している対象が含まれる。自己免疫性疾患を発症する可能性があるが、未だ発症していない対象には、例えば、自己免疫性疾患の遺伝的素因を有する対象が含まれる。
【００３８】
疾患の処置または予防の対象としては、動物、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）、特にヒトが挙げられる。
【００３９】
本組成物の投与経路は、経口投与または非経口投与を含み、特に限定されない。適用部位や対象とする疾患に応じて公知の各種投与形態を採用できる。例えば、非経口投与は、全身投与でも局所投与でもよく、より具体的には、例えば、気管内投与、髄腔内投与、くも膜下腔投与、頭蓋内投与、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、口腔内投与等が挙げられる。ある実施態様では、本組成物を静脈内投与する。ある実施態様では、本組成物を気管内投与する。ある実施態様では、本組成物を、くも膜下腔内、髄腔内または頭蓋内に投与する。
【００４０】
剤形としては、顆粒剤、細粒剤、粉剤、被覆錠剤、錠剤、坐剤、散剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、チュアブル剤、液剤、懸濁剤、乳濁液などが挙げられる。活性物質の放出を延長する剤形を採用してもよい。注射または点滴用の剤形としては、水性および非水性の注射溶液（抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、等張化剤等を含んでもよい）；ならびに水性および非水性の注射懸濁液（懸濁剤、増粘剤等を含んでもよい）が挙げられる。これらの剤形は、密閉したアンプルやバイアル中に液体として提供されてもよく、凍結乾燥物として提供され、使用直前に滅菌液体（例えば、注射用水）を加えて調製してもよい。注射溶液または懸濁液を、粉末、顆粒または錠剤から調製してもよい。
【００４１】
これらの剤形は、常法により製剤化することによって製造される。さらに製剤上の必要に応じて、医薬的に許容し得る各種の製剤用物質を配合することができる。製剤用物質は製剤の剤形により適宜選択することができるが、例えば、緩衝化剤、界面活性剤、安定化剤、防腐剤、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤等が挙げられる。
【００４２】
本組成物の投与量および投与回数は、有効量の有効成分が対象に投与されるように、投与対象の動物種、投与対象の健康状態、年齢、体重、投与経路、投与形態等に応じて当業者が適宜設定できる。ある状況での有効量は、日常的な実験によって容易に決定することができ、通常の臨床医の技術および判断の範囲内である。例えば、有効成分がアンチセンス核酸である場合、約０.０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０.０５〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、または、約０.１〜約５ｍｇ／ｋｇ体重のアンチセンス核酸を投与し得る。
【００４３】
本組成物は、単独で、または、１種またはそれ以上のさらなる有効成分、特に、炎症または炎症を伴う疾患の処置または予防のための有効成分と併用できる。成分を「併用する」ことは、全成分を含有する投与剤形の使用および各成分を別個に含有する投与剤形の組合せの使用のみならず、それらが炎症の抑制または炎症を伴う疾患の処置および／または予防のために使用される限り、各成分を同時に、連続的に、または、いずれかの成分を遅延して投与することも意味する。２種またはそれ以上のさらなる有効成分を併用することも可能である。併用に適する有効成分には、例えば、抗炎症剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、免疫抑制剤、分子標的薬等が含まれる。
【００４４】
ある態様では、炎症の抑制を必要としている対象に、有効量のレグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域におけるステムループ構造を破壊する少なくとも１つの物質を投与することを含む、炎症の抑制方法が提供される。
ある態様では、炎症を抑制するための、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域におけるステムループ構造を破壊する少なくとも１つの物質が提供される。
ある態様では、炎症を抑制するための、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域におけるステムループ構造を破壊する少なくとも１つの物質の使用が提供される。
ある態様では、炎症を抑制するための医薬組成物の製造における、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域におけるステムループ構造を破壊する少なくとも１つの物質の使用が提供される。
【００４５】
ある態様では、炎症を伴う疾患の処置および／または予防を必要としている対象に、有効量のレグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域におけるステムループ構造を破壊する少なくとも１つの物質を投与することを含む、炎症を伴う疾患の処置および／または予防方法が提供される。
ある態様では、炎症を伴う疾患を処置および／または予防するための、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域におけるステムループ構造を破壊する少なくとも１つの物質が提供される。
ある態様では、炎症を伴う疾患を処置および／または予防するための、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域におけるステムループ構造を破壊する少なくとも１つの物質の使用が提供される。
ある態様では、炎症を伴う疾患を処置および／または予防するための医薬組成物の製造における、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域におけるステムループ構造を破壊する少なくとも１つの物質の使用が提供される。
【００４６】
また別の態様では、本願は、炎症抑制薬のスクリーニング方法を提供する。スクリーニング方法の工程（ａ）では、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域と連結したレポーター遺伝子およびレグナーゼ−１遺伝子を発現する細胞に、候補物質を導入する。
【００４７】
レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域は、上記の通りである。レポーター遺伝子は、検出可能な標識を直接的または間接的に生成するものであればいずれも使用可能であり、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、その他のマーカー遺伝子が挙げられる。レポーター遺伝子の下流にレグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域を連結する。ある実施態様では、配列番号５または６のヌクレオチド配列を含むレグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域を使用する。ある実施態様では、配列番号１または２のヌクレオチド配列を含むレグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域を使用する。
【００４８】
レグナーゼ−１遺伝子は、上記のレグナーゼ−１をコードする遺伝子を意味する。レグナーゼ−１遺伝子は、上記方法に用いる細胞が生来的に有するものであってもよく、遺伝子組換え技術により細胞に導入されてもよい。
【００４９】
上記方法に用いる細胞は、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域と連結したレポーター遺伝子、および、必要に応じてレグナーゼ−１遺伝子を発現し得るものであれば、限定されない。例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＣＯＳ−７細胞などが挙げられる。核酸の導入のためのベクターの構築、形質転換等は、公知の方法により行うことができる（Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【００５０】
「候補物質」には、タンパク質、アミノ酸、核酸、脂質、糖質、低分子化合物などの、あらゆる物質が包含される。候補物質は、典型的には、精製、単離されているものを使用できるが、未精製、未単離の粗精製品であってもよい。候補物質は、化合物ライブラリー、核酸ライブラリー、ランダムペプチドライブラリーなどの形態で提供されてもよく、また、天然物として提供されてもよい。候補物質を、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に存在するステムループ構造に基づいて設計してもよい。候補物質の細胞への導入は、候補物質の種類に応じて、公知の方法により行うことができる。
【００５１】
上記方法の工程（ｂ）では、前記細胞におけるレポーター遺伝子の発現量を測定する。レポーター遺伝子の発現量は、各レポーター遺伝子に応じて公知の方法により測定すればよい。
上記方法の工程（ｃ）では、候補物質の非存在下において測定した発現量と比較して発現量を増加させる候補物質を、炎症抑制薬として選択する。レポーター遺伝子の発現を、候補物質の非存在下において測定した発現量と比較して、例えば、約１０％以上、好ましくは約２０％以上、より好ましくは約３０％以上、さらに好ましくは約５０％以上増加させる候補物質を、炎症抑制薬として選択し得る。
【００５２】
本願は、例えば、下記の実施態様を提供する。
［１］レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域におけるステムループ構造を破壊する少なくとも１つの物質を含む、炎症抑制用の組成物。
［２］炎症を伴う疾患を処置および／または予防するための、第１項に記載の組成物。
［３］レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域におけるステムループ構造を破壊する少なくとも１つの物質を含む、炎症を伴う疾患を処置および／または予防するための組成物。
［４］炎症を伴う疾患を処置するための、第２項または第３項に記載の組成物。
［５］炎症を伴う疾患が自己免疫性疾患、敗血症性ショックまたは移植片拒絶である、第２項〜第４項のいずれかに記載の組成物。
［６］炎症を伴う疾患が自己免疫性疾患である、第２項〜第５項のいずれかに記載の組成物。
［７］自己免疫性疾患が、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチまたは全身性エリテマトーデスである、第６項に記載の組成物。
［８］自己免疫性疾患が多発性硬化症である、第６項または第７項に記載の組成物。
［９］炎症を伴う疾患が敗血症性ショックである、第２項〜第５項のいずれかに記載の組成物。
［１０］敗血症性ショックが急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症または間質性肺炎である、第９項に記載の組成物。
［１１］敗血症性ショックが急性呼吸窮迫症候群である、第９項または第１０項に記載の組成物。
【００５３】
［１２］ステムループ構造が、配列番号１の第２３１位〜第２４５位に相当する領域で形成される第１のステムループ構造および配列番号１の第４２４位〜第４４２位に相当する領域で形成される第２のステムループ構造から選択される少なくとも１つのステムループ構造である、第１項〜第１１項のいずれかに記載の組成物。
［１３］レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域が配列番号５のヌクレオチド配列を含む、第１項〜第１２項のいずれかに記載の組成物。
［１４］レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域が配列番号１のヌクレオチド配列を含む、第１項〜第１３項のいずれかに記載の組成物。
［１５］ステムループ構造を破壊する物質が、ステムループ構造を形成するヌクレオチド配列に結合するオリゴヌクレオチドである、第１項〜第１４項のいずれかに記載の組成物。
【００５４】
［１６］ステムループ構造を破壊する少なくとも１つの物質が、
（ａ）第１のオリゴヌクレオチドであって、
（ａ−１）配列番号１の第２０６位〜第２４２位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第２３３位〜第２３５位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、１０個〜３０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、および、
（ａ−２）配列番号１の第２３４位〜第２７０位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第２４１位〜第２４３位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、１０個〜３０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、
から選択されるオリゴヌクレオチド、
（ｂ）第２のオリゴヌクレオチドであって、
（ｂ−１）配列番号１の第３９９位〜第４３９位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第４２６位〜第４２８位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、１０個〜３０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、および、
（ｂ−２）配列番号１の第４２７位〜第４６７位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第４３８位〜第４４０位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、１０個〜３０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、
から選択されるオリゴヌクレオチド、または、
（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの組合せ、
である、第１項〜第１５項のいずれかに記載の組成物。
【００５５】
［１７］ステムループ構造を破壊する少なくとも１つの物質が、
（ａ）第１のオリゴヌクレオチドであって、
（ａ−１）配列番号１の第２０６位〜第２４２位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第２３３位〜第２３５位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、配列番号７と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、および、
（ａ−２）配列番号１の第２３４位〜第２７０位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第２４１位〜第２４３位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、配列番号８と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド
から選択されるオリゴヌクレオチド、
（ｂ）第２のオリゴヌクレオチドであって、
（ｂ−１）配列番号１の第３９９位〜第４３９位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第４２６位〜第４２８位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、配列番号９と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、および、
（ｂ−２）配列番号１の第４２７位〜第４６７位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第４３８位〜第４４０位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、配列番号１０と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド
から選択されるオリゴヌクレオチド、または、
（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの組合せ、
である、第１項〜第１６項のいずれかに記載の組成物。
【００５６】
［１８］ステムループ構造を破壊する少なくとも１つの物質が、
（ａ）第１のオリゴヌクレオチドであって、
（ａ−１）配列番号１の第２０６位〜第２４２位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第２３３位〜第２３５位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、配列番号７において１個、２個または３個のヌクレオチドが欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド、および、
（ａ−２）配列番号１の第２３４位〜第２７０位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第２４１位〜第２４３位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、配列番号８において１個、２個または３個のヌクレオチドが欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド、
から選択されるオリゴヌクレオチド、
（ｂ）第２のオリゴヌクレオチドであって、
（ｂ−１）配列番号１の第３９９位〜第４３９位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第４２６位〜第４２８位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、配列番号９において１個、２個または３個のヌクレオチドが欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド、および、
（ｂ−２）配列番号１の第４２７位〜第４６７位のヌクレオチド配列のうち、配列番号１の第４３８位〜第４４０位を含む連続する１０個〜３０個のヌクレオチドからなる配列に結合する、配列番号１０において１個、２個または３個のヌクレオチドが欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド、
から選択されるオリゴヌクレオチド、または、
（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの組合せ、
である、第１項〜第１６項のいずれかに記載の組成物。
【００５７】
［１９］ステムループ構造を破壊する少なくとも１つの物質が、
（ａ）第１のオリゴヌクレオチドであって、
（ａ−１）配列番号７のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、および、
（ａ−２）配列番号８のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド
から選択されるオリゴヌクレオチド、
（ｂ）第２のオリゴヌクレオチドであって、
（ｂ−１）配列番号９のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、および、
（ｂ−２）配列番号１０のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド
から選択されるオリゴヌクレオチド、または、
（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの組合せ、
である、第１項〜第１８項のいずれかに記載の組成物。
【００５８】
［２０］ステムループ構造を破壊する少なくとも１つの物質が、
（ａ）第１のオリゴヌクレオチドであって、
（ａ−１）配列番号７のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド、および、
（ａ−２）配列番号８のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド
から選択されるオリゴヌクレオチド、
（ｂ）第２のオリゴヌクレオチドであって、
（ｂ−１）配列番号９のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド、および、
（ｂ−２）配列番号１０のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド
から選択されるオリゴヌクレオチド、または、
（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの組合せ、
である、第１項〜第１９項のいずれかに記載の組成物。
【００５９】
［２１］オリゴヌクレオチドが１０個〜３０個のヌクレオチドからなる、第１５項〜第２０項のいずれかに記載の組成物。
［２２］オリゴヌクレオチドが１５個〜２７個のヌクレオチドからなる、第１５項〜第２１項のいずれかに記載の組成物。
［２３］オリゴヌクレオチドが１８個〜２５個のヌクレオチドからなる、第１５項〜第２２項のいずれかに記載の組成物。
［２４］オリゴヌクレオチドが２０個〜２３個のヌクレオチドからなる、第１５項〜第２３項のいずれかに記載の組成物。
【００６０】
［２５］第１のオリゴヌクレオチドが、（ａ−１）のオリゴヌクレオチドである、第１６項〜第２４項のいずれかに記載の組成物。
［２６］第１のオリゴヌクレオチドが、（ａ−２）のオリゴヌクレオチドである、第１６項〜第２４項のいずれかに記載の組成物。
［２７］第２のオリゴヌクレオチドが、（ｂ−１）のオリゴヌクレオチドである、第１６項〜第２６項のいずれかに記載の組成物。
［２８］第２のオリゴヌクレオチドが、（ｂ−２）のオリゴヌクレオチドである、第１６項〜第２６項のいずれかに記載の組成物。
［２９］第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの組合せを含む、第１６項〜第２８項のいずれかに記載の組成物。
［３０］第１のオリゴヌクレオチドを含む第１６項〜第２８項のいずれかに記載の組成物と、第２のオリゴヌクレオチドを含む第１６項〜第２８項のいずれかに記載の組成物の組合せ。
［３１］（ａ−１）のオリゴヌクレオチドと（ｂ−１）のオリゴヌクレオチドを含む、第２９項に記載の組成物または第３０項に記載の組合せ。
［３２］（ａ−１）のオリゴヌクレオチドと（ｂ−２）のオリゴヌクレオチドを含む、第２９項に記載の組成物または第３０項に記載の組合せ。
［３３］（ａ−２）のオリゴヌクレオチドと（ｂ−１）のオリゴヌクレオチドを含む、第２９項に記載の組成物または第３０項に記載の組合せ。
［３４］（ａ−２）のオリゴヌクレオチドと（ｂ−２）のオリゴヌクレオチドを含む、第２９項に記載の組成物または第３０項に記載の組合せ。
【００６１】
［３５］炎症抑制薬のスクリーニング方法であって、以下の工程
（ａ）レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域と連結したレポーター遺伝子およびレグナーゼ−１遺伝子を発現する細胞に、候補物質を導入する工程、
（ｂ）前記細胞におけるレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、および、
（ｃ）候補物質の非存在下において測定した発現量と比較して発現量を増加させる候補物質を、炎症抑制薬として選択する工程、
を含む、方法。
［３６］炎症を伴う疾患の処置および／または予防薬のスクリーニング方法であって、以下の工程
（ａ）レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域と連結したレポーター遺伝子およびレグナーゼ−１遺伝子を発現する細胞に、候補物質を導入する工程、
（ｂ）前記細胞におけるレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、および、
（ｃ）候補物質の非存在下において測定した発現量と比較して発現量を増加させる候補物質を、炎症を伴う疾患の処置および／または予防薬として選択する工程、
を含む、方法。
［３７］炎症を伴う疾患が自己免疫性疾患、敗血症性ショックまたは移植片拒絶である、第３６項に記載のスクリーニング方法。
［３８］炎症を伴う疾患が自己免疫性疾患である、第３６項または第３７項に記載のスクリーニング方法。
［３９］自己免疫性疾患が、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチまたは全身性エリテマトーデスである、第３８項に記載のスクリーニング方法。
［４０］自己免疫性疾患が多発性硬化症である、第３８項または第３９項に記載のスクリーニング方法。
［４１］炎症を伴う疾患が敗血症性ショックである、第３６項に記載のスクリーニング方法。
［４２］敗血症性ショックが急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症または間質性肺炎である、第４１項に記載のスクリーニング方法。
［４３］敗血症性ショックが急性呼吸窮迫症候群である、第４１項または第４２項に記載のスクリーニング方法。
［４４］レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域が、配列番号５のヌクレオチド配列を含む、第３５項〜第４３項のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［４５］レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域が、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、第３５項〜第４４項のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［４６］レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に存在するステムループ構造に基づいて候補物質を設計する工程をさらに含む、第３５項〜第４５項のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００６２】
本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本発明を説明するためだけに供されるものである。
【実施例１】
【００６３】
レグナーゼ−１介在抑制を担うマウスレグナーゼ−１（Ｚｃ３ｈ１２ａ）３’ＵＴＲにおけるステムループ領域の同定
配列番号２のヌクレオチド配列を有するマウスレグナーゼ−１（Ｚｃ３ｈ１２ａ）３’ＵＴＲを使用した。図４に示す通り、３’ＵＴＲのステムループ非形成配列（配列番号２の第２４４位〜第３７９位または第４００位〜第７３１位）またはステムループ形成配列（配列番号２の第１９１位〜第２１１位または第３７８位〜第３９２位）の断片と、その下流にｂ−グロビンの３’ＵＴＲを含むｐＧＬ３ルシフェラーゼレポータープラスミド（Promega）を作製した。
次いで、各ｐＧＬ３レポータープラスミドを、レグナーゼ−１（Ｒｅｇ−１）もしくはそのヌクレアーゼ活性欠損変異体（Ｄ１４１Ｎ）の発現プラスミド、または空のプラスミド（対照）と共に、ＨｅＬａ細胞に導入した。２４時間培養した後、細胞を溶解し、溶解物のルシフェラーゼ活性を Dual-luciferase Reporter Assay system（Promega）で測定した。内部対照として、ウミシイタケルシフェラーゼをコードする遺伝子を同時に導入した。【００６４】
結果を図４に示す。レグナーゼ−１ ３’ＵＴＲのステムループ形成配列（第１９１位〜第２１１位または第３７８位〜第３９２位）を含むプラスミドによるルシフェラーゼレポーターの発現は、レグナーゼ−１発現プラスミドを同時に導入すると低下したが、Ｄ１４１Ｎ発現プラスミドを導入しても低下しなかった。レグナーゼ−１ ３’ＵＴＲのステムループ非形成配列（２４４位〜第３７９位または第４００位〜第７３１位）を含むプラスミドによるルシフェラーゼレポーターの発現は、レグナーゼ−１発現プラスミドを導入しても、Ｄ１４１Ｎ発現プラスミドを導入しても、低下しなかった。これらの結果から、レグナーゼ−１がレグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに存在するステムループ構造を認識して、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡを分解することが示唆される。
【実施例２】
【００６５】
レグナーゼ−１ ３’ＵＴＲのステムループ形成配列を標的とするモルフォリノオリゴ（ＭＯ）は、マウスレグナーゼ−１ ３’ＵＴＲを含むルシフェラーゼレポータープラスミドによるルシフェラーゼ活性を高める
ＨＥＫ２９３細胞に、マウスレグナーゼ−１の３’ＵＴＲ全長を有するｐＧＬ３ルシフェラーゼレポータープラスミドおよび図５に示すＭＯ（GeneTools）を、Endo-Porter（GeneTools）を使用して導入した。導入の２４時間後に細胞を回収し、細胞溶解物のルシフェラーゼ活性を Dual-luciferase Reporter Assay system（Promega）で測定した。内部対照として、ウミシイタケルシフェラーゼをコードする遺伝子を同時に導入した。【００６６】
各ＭＯは、以下のヌクレオチド配列を有した。１９１−２１０ＭＯのヌクレオチド配列は、配列番号２（マウスレグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲのヌクレオチド配列）の第２０１位〜第２２３位に相補的であり、３７８−３９２ＭＯのヌクレオチド配列は、配列番号２の第３８４位〜第４０３位に相補的であった。
【表１】
2019182055.tif 000004
【００６７】
結果を図５に示す。レポータープラスミドと１９１−２１０ＭＯまたは３７８−３９２ＭＯを細胞に同時に導入すると、ＭＯなし（MOCK）、または対照ＭＯを導入した場合と比較して、ルシフェラーゼ活性は高かった。１９１−２１０ＭＯおよび３７８−３９２ＭＯの両方（Both MO）を導入すると、ルシフェラーゼ活性はさらに高かった。この結果は、レグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおけるステムループ構造を破壊すると、レグナーゼ−１によるレグナーゼ−１ ｍＲＮＡの分解が抑制されることを示す。また、２つのステムループ構造は独立してレグナーゼ−１に認識されることが示唆される。
【実施例３】
【００６８】
マウス骨髄マクロファージ（ＢＭＭ）のＭＯ処理、および、サイトカインおよびレグナーゼ−１のｍＲＮＡレベルの測定
（Ａ）ＢＭＭを１２ウェルプレートに播種し、実施例２に記載の１９１−２１０ＭＯおよび３７８−３９２ＭＯ（各ＭＯにつき、２μＭ）を、Endo-porter（６μｌ／ウェル）（Gene Tools, LLC）を使用して導入した。２４時間後、細胞をＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）でそれぞれ２時間処理した。細胞を回収し、ＲＮＡを抽出した。ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、レグナーゼ−１のｍＲＮＡ量をＱＰＣＲにより測定した。
（Ｂ）上記の通りＭＯで処理し、ＬＰＳまたはＴＮＦαで処理したＢＭＭを溶解し、抗レグナーゼ−１抗体を用いるウェスタンブロットにより、レグナーゼ−１タンパク質のレベルを測定した。【００６９】
結果を図６に示す。ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１βのｍＲＮＡ量はＬＰＳ処理により増加し、その増加はレグナーゼ−１ ３’ＵＴＲのステムループ形成配列を標的とするＭＯにより抑制された。一方、レグナーゼ−１のｍＲＮＡ量は、ＭＯ処理およびＬＰＳ処理により増加した。ＬＰＳまたはＴＮＦαでそれぞれ２時間処理したＢＭＭにおけるレグナーゼ−１タンパク質の発現も、ＭＯ処理により増加した。これらの結果は、レグナーゼ−１によるレグナーゼ−１ ｍＲＮＡの分解がＭＯにより抑制された結果、レグナーゼ−１タンパク質の量が増加し、レグナーゼ−１によるＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１βのｍＲＮＡの分解が促進されたことを示唆する。
【実施例４】
【００７０】
ＬＰＳにより誘導される急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）マウスモデルにおける気管内ＭＯ処理の効果
ペントバルビタールの腹腔内注射により、マウスを麻酔した。次いで、実施例２に記載の１９１−２１０ＭＯおよび３７８−３９２ＭＯと同じヌクレオチド配列を有するビボ−モルフォリノオリゴ（ＭＯ）（GeneTools）を、マウスに２５μｇ／ＭＯ／匹（２０μｌ／注入）で気管内投与した。２４時間後に、ペントバルビタールの腹腔内注射によりマウスを再度麻酔し、ＬＰＳ（１０μｇ／２０μｌ ＰＢＳ；リン酸緩衝生理食塩水）を気管内投与した。８時間後に、マウスを安楽死させた。ＲＮＡの分析のために、肺のサンプルを、RNAlater (Qiagen) 中、−８０℃で使用時まで保存した。ＲＮＡを Trizol (Thermo Fisher Scientific) により調製し、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１βとレグナーゼ−１のｍＲＮＡ量をＱＰＣＲ分析により測定した。【００７１】
結果を図７に示す。気管内ＬＰＳ投与により急性肺損傷を受けたマウスは、ＡＲＤＳのモデルとして使用できる。ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１βのｍＲＮＡ量はＬＰＳ処理により増加し、その増加はレグナーゼ−１ ３’ＵＴＲのステムループ形成配列を標的とするＭＯにより抑制された。一方、レグナーゼ−１のｍＲＮＡ量は、ＭＯ処理およびＬＰＳ処理により増加し、ＭＯ処理とＬＰＳ処理を両方行うと、さらに増加した。これらの結果は、インビボで、レグナーゼ−１によるレグナーゼ−１ ｍＲＮＡの分解がＭＯにより抑制された結果、レグナーゼ−１タンパク質の量が増加し、レグナーゼ−１によるＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１βのｍＲＮＡの分解が促進されたことを示唆する。
【実施例５】
【００７２】
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスにおける頭蓋内ＭＯ処理の効果
ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチド (35-55) (ANASPEC Inc) を、ＰＢＳ中で２μｇ／ｕＬの濃度に希釈した。完全フロイントアジュバント (Sigma) と希釈したＭＯＧを、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ中で１：１の比で混合した。マイクロチップ付のソニケーターを使用して、超音波処理により乳液を生成させた。乳液の形成は、ビーカーの水面に乳液を一滴落とし、それが拡散せず沈むことにより確認した。形成が不十分である場合は、チューブを氷上で２〜３分間冷却し、超音波処理を繰り返した。この乳液２００μＬを、各マウスの免疫処置に使用した。【００７３】
各マウスを、両前肢の間および両後肢の間の背中側で、２箇所の皮下注射（１００μＬ／ボーラス）により免疫した。各マウスに２００ｎｇの１ｎｇ／μＬ ＰＴｘ（Sigma) を腹腔内投与した。最初の投与の４８時間後に、さらに２００ｎｇのＰＴｘを腹腔内投与した。【００７４】
免疫処置の１０日後に、マウスをペントバルビタールの腹腔内投与により麻酔した。頭部の毛をバリカンと除毛クリームで除去した。ブレグマの位置を見定め、７μｇ／ＭＯ／匹の実施例４に記載の２種類のビボ−モルフォリノオリゴ（１０μＬ／注射）またはＰＢＳを、ブレグマの１ｍｍ右側または左側に頭蓋内投与した（ｎ＝１０）。ＭＯＧペプチドによる免疫処置の７日後に、体重と臨床症状スコア（ＥＡＥスコア）の記録を開始し、毎日継続した。【００７５】
体重、臨床症状スコア（ＥＡＥスコア）および生存率の結果を図８に示す。自己免疫性脳脊髄炎を誘導されたマウスは、多発性硬化症のモデルとして確立されている。ＥＡＥマウスでは、免疫化の後に体重が低下し、ＥＡＥの症状の重篤度を示す臨床症状スコアが上昇したが、いずれもレグナーゼ−１ ３’ＵＴＲのステムループ形成配列を標的とするＭＯにより抑制された。また、ＭＯ処置されたＥＡＥマウスの生存率は高かった。これらの結果は、レグナーゼ−１ ３’ＵＴＲのステムループ形成を阻害することにより、自己免疫性脳脊髄炎および多発性硬化症を処置し得ることを示唆する。
【実施例６】
【００７６】
ＰＭＡ（Phorbol-Myristate-Acetate）により分化されたヒトマクロファージセルラインＴＨＰ−１細胞における、ＬＰＳに誘導されるサイトカイン遺伝子発現に対する、ヒトレグナーゼ１を標的とするモルフォリノオリゴの効果
ヒト単球様セルラインＴＨＰ−１細胞を１２ウェルプレートに播種し、ＰＭＡ（５ｎｇ／ｍｌ）で４８時間処理し、マクロファージへ分化させた。その後、表２に記載の２３１−２４５ＭＯおよび４２４−４４２ＭＯ（各ＭＯにつき、２μＭ）を、Endo-porter（６μｌ／ウェル）（Gene Tools, LLC）を使用して導入した。２４時間後、細胞をＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で４時間処理した。細胞を回収し、ＲＮＡを抽出した。ヒトＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、レグナーゼ−１（Ｚｃ３ｈ１２ａ）のｍＲＮＡ量をＱＰＣＲにより測定した。【００７７】
各ＭＯは、以下のヌクレオチド配列を有した。２３１−２４５ＭＯは、配列番号１（ヒトレグナーゼ−１ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲのヌクレオチド配列）の第２３６位〜第２５８位に相補的であり、４２４−４４２ＭＯのヌクレオチド配列は、配列番号１の第４１４位〜第４３２位に相補的であった。
【表２】
2019182055.tif 000005
【００７８】
結果を図９に示す。ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１βのｍＲＮＡ量はＬＰＳ処理により増加し、その増加はレグナーゼ−１ ３’ＵＴＲのステムループ形成配列を標的とするＭＯにより抑制された。一方、レグナーゼ−１のｍＲＮＡ量は、ＭＯ処理およびＬＰＳ処理により増加し、ＭＯ処理とＬＰＳ処理を両方行うと、さらに増加した。これらの結果は、ヒト細胞においても、レグナーゼ−１によるレグナーゼ−１ ｍＲＮＡの分解がＭＯにより抑制された結果、レグナーゼ−１タンパク質の量が増加し、レグナーゼ−１によるＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１βのｍＲＮＡの分解が促進されたことを示唆する。
【実施例７】
【００７９】
ＴＨＰ−１細胞を１２ウェルプレートに播種し、表１に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド１９１−２１０ＡＳＯおよび３７８−３９２ＡＳＯを、Lipofectamin2000を使用して導入した。４８時間後、細胞をＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で４時間処理した。細胞を回収し、ＲＮＡを抽出した。ヒトＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、Ｐｔｇｓ２（プロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ２）、レグナーゼ−１（Ｚｃ３ｈ１２ａ）のｍＲＮＡ量をＱＰＣＲにより測定した。【００８０】
結果を図１０に示す。ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、Ｐｔｇｓ２のｍＲＮＡ量はＬＰＳ処理により増加し、その増加はレグナーゼ−１ ３’ＵＴＲのステムループ形成配列を標的とするＡＳＯにより抑制された。一方、レグナーゼ−１のｍＲＮＡ量は、ＡＳＯ処理およびＬＰＳ処理により増加し、ＡＳＯ処理とＬＰＳ処理を両方行うと、さらに増加した。これらの結果は、ＭＯと同様に、ＡＳＯによっても、レグナーゼ−１によるレグナーゼ−１ ｍＲＮＡの分解が抑制され、レグナーゼ−１タンパク質の量が増加し、レグナーゼ−１によるＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、Ｐｔｇｓ２のｍＲＮＡの分解が促進されたことを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本開示により、レグナーゼ−１の３’ＵＴＲを介する自己抑制機構を応用した炎症抑制法が提供される。これは従来にない作用機序による方法であり、既存の治療方法では治療できなかった疾患を治療し得る可能性がある。また、従来の治療法と併用することにより、より効果的なさらなる治療法の開発も期待される。
【図１】
2019182055.tif 000006
【図２】
2019182055.tif 000007
【図３】
2019182055.tif 000008
【図４】
2019182055.tif 000009
【図５】
2019182055.tif 000010
【図６】
2019182055.tif 000011
【図７】
2019182055.tif 000012
【図８】
2019182055.tif 000013
【図９】
2019182055.tif 000014
【図１０】
2019182055.tif 000015
【配列表】
2019182055000001.app
【国際調査報告】
2019182055.tif 000016
2019182055.tif 000017
2019182055.tif 000018
2019182055.tif 000019