(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１のＡに示すアミノ酸配列において３１９番目および３２０番目におけるロイシン−ロイシンがアルギニン−セリンで置換されたタンパク質をコードするＤＮＡ分子を含有しているプラスミドによってトランスフェクトされていることにより腫瘍化可能性を有する、Ｒａｔ１細胞株。
【請求項２】
ＩκＢと結合していないＮＦκＢを含有している請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
ＣＲＥＢ欠損細胞である請求項１に記載の細胞株。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれかに記載の細胞株を用いることを特徴とする、ＮＦκＢタンパク質の活性を特異的に阻害する物質をスクリ−ニングするための方法。
【請求項５】
ＮＦＫＢ２前駆体が構成的にさらに発現している請求項１に記載の細胞株。
【請求項６】
請求項５に記載の細胞株を用いることを特徴とする、ＮＦＫＢ２前駆体の活性を特異的に阻害する物質をスクリ−ニングするための方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新たに作成した転写因子ＮＦκＢおよびＮＦＫＢ２前駆体を発現する細胞株を、抗癌剤、抗炎症剤、抗リウマチ剤などの新規な薬物をスクリ−ニングするために用いる技術に関する。
【０００２】
【発明の背景】
転写因子ＮＦκＢは細胞の細胞質に発現されている。ＮＦκＢ様タンパク質による遺伝子転写は、その活性化タンパク質が細胞質から核に移動する結果として誘導される。この移動はＩκＢと呼ばれる一連のインヒビタ−タンパク質の修飾によって制御されるが、このＩκＢは修飾を受けていない状態ではＮＦκＢと結合して複合体を形成し、それが細胞質に保持されるというメカニズムにより、ＮＦκＢを細胞質内に保持させる。適切なシグナルが細胞を刺激すると、ＩκＢが所定の修飾を受け、その結果、ＮＦκＢの遊離が起こる。ＮＦκＢが遊離されると、複雑なメカニズムを介して細胞はトランスフォ−ム（形質転換）され、癌が誘発される。
現在、腫瘍や炎症に対する新薬の開発にＮＦκＢタンパク質の活性を特異的に阻害する薬物のスクリ−ニングが行なわれている。しかし、ＮＦκＢを恒常的（構成的）に発現している細胞を使うことで生理的なシグナル伝達の状態を保持した系でスクリ−ニングを行なう手段はこれまで報告されていない。
【０００３】
そこで、鋭意研究を行なうことで、ＨＴＬＶ−Ｉのｔａｘ遺伝子によりＮＦκＢ遺伝子を強制発現できる系を見出し、本発明を完成した。このような細胞は試験管内にて形質転換（トランスフォ−ム）を起こす。この形質発現を阻害する低分子化合物をスクリ−ニングすればＮＦκＢを特異的に阻害する新薬の候補物質を検索できる。
さらに、ＮＦκＢの生理的阻害タンパク質であるＮＦＫＢ２前駆体をこの細胞に強制発現させると、その細胞は非トランスフォ−ム型に形質が転換する。従って、この場合、ＮＦＫＢ２前駆体のタンパク質の活性を特異的に阻害する低分子化合物のスクリ−ニングが可能となる。
【０００４】
【従来の技術および解決課題】
ウイルスが細胞を形質転換するメカニズムの説明は、正常な増殖制御の原理的メカニズムを理解するのに大いに貢献してきた（Nevins, 1992に総括されている)。ＤＮＡ腫瘍ウイルスのオンコタンパク質は、一般に、正常な増殖調節で中心 的な役割を有する細胞タンパク質を標的とする。例えば、アデノウイルスＥＩＡタンパク質、ＳＶ４０ラ−ジＴ抗原、ポリオーマウイルスラ−ジＴ抗原およびヒト・パヒローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ７タンパク質は、Ｅ２Ｆ転写因子に結合しかくしてそれを放出するための網膜芽細胞腫遺伝子産物を標的とする（Whyte et al., 1988; DeCaprio et al., 1988; Dyson et al., 1989; M殤ger et al., 1989, Chellappan et al., 1991）。アデノウイルスＥＩＢタンパク質、ＳＶ４ ０ラ−ジＴ抗原およびＨＰＶのＥ６タンパク質は、増殖制御についてのもう１つの重要な分子であるｐ５３に結合する（Lane et al., 1979; Sarnow et al., 1982; Werness et al., 1990）。ウイルスゲノムにコードされている産物の数はかなり制限されているので、感染細胞の増殖制御に重要な分子を標的化することによって、最大の効率で細胞挙動を変化させることが展開されるはずである。この意味で、いかにしてヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）が細胞を形質転換させるのかを理解するために設計した研究により、正常な増殖制御のもう１つの重要な分子メカニズムが発見された。
【０００５】
ＨＴＬＶ−Ｉは、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）ならびにＨＴＬＶ−Ｉ関連ミエロパシーに病因的に関連するレトロウイルスである（Poiesz et al., 1980; Yoshida et al., 1982; Gessain et al., 1985; Osame et al., 1986)。ＨＴＬＶ−Ｉゲノムは細胞プロトオンコジーンの相同配列を含有せず、患者間で好ましい組込み部位はなく、よってリューケモゲネシス（leukemogenesis)のメカニズムと して挿入突然変異誘発は排除される（Seiki et al., 1983および1984)。病気の 開始までに長い潜伏期があり、ＨＴＬＶ−Ｉ感染の後にＡＴＬが発病する率は比較的低いので、ＨＴＬＶ−Ｉによるリューケモゲネシスは多工程プロセスであると考えられていた（Okamoto et al., 1989)。ウイルスがコードするトランス作 用タンパク質ＴａｘおよびＲｅｘは、リューケモゲネシスに関与することが示唆されており、そこでは、それらは細胞遺伝子の発現を変調できるようである（Yoshida and Seiki, 1989）。
【０００６】
ＨＴＬＶ−Ｉロングターミナルリピート（ＬＴＲ）からの転写を大いに刺激するウイルス転写モジュレーターＴａｘに多くの注意が払われてきた（Sodroski et al., 1985; Seiki et al., 1986)。また、多数の細胞およびウイルス遺伝子がＴａｘによって上昇−調節（up-regulated) されている。それらの中には、ｃ−ｆｏｓ遺伝子、インターロイキン−２（ＩＬ−２）遺伝子、ＩＬ−２受容体α −鎖（ＩＬ−２Ｒα）遺伝子、ヒト免疫不全ウイルスＩ型遺伝子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子をコードする遺伝子および即時型初期応答遺伝子のいくつかがある（Miyatake et al., 1988aおよび1988b; Siekevitz et al., 1987aおよび1987b; Maruyama et al., 1987; Fujii et al., 1988; Alexander et al., 1991)。これらの増殖−関連遺伝子の異常発現はＨＴＬＶ−Ｉ関連増殖性発 病の確立に寄与することが示されている。事実、いくつかの最近の研究は、Ｔａｘのオンコジーン特性を示している。確立されたゲッ歯類繊維芽細胞系でＴａｘが発現された結果、そのオンコジーン形質転換が起こる（Tanaka et al., 1990 ）。Ｔａｘは活性化ＲＡＳと協同して、ラット胚細胞を形質転換する（Pozzatti et al., 1990）。トランスジーンとしてｔａｘ遺伝子を担持するトランスジェ ニックマウスは多重間葉腫瘍およびニューロフィブローマを起こす（Nerenberg et al., 1987）。Herpesvirus saimiriベクターによるヒト髄（cord）血液リン パ球および胸腺Ｔ細胞におけるｐＸ−遺伝子の発現の結果、不滅化されているが、その増殖はなおＩＬ−２に依存するＴ細胞クローンが得られる（Grassmann et al., 1989）。これらの知見は、Ｔａｘはリューケモゲネシスのプロセスにおいて基本的役割を果たし得ることを示唆する。
【０００７】
Ｔａｘ−媒介形質転換のメカニズムを調べるため、クローン化ゲッ歯類繊維芽細胞系を使用した。というのは、ゲッ歯類繊維芽細胞は、これまで、種々のウイルスおよび細胞オンコタンパク質のオンコジーン特性を研究するために有用な系を提供してきたからである。これらの中には、種々の核および細胞質オンコタンパク質による形質転換に感受性があり、かつ自然発生病巣のバックグラウンドが低いＲａｔ１細胞がある（Topp et al., 1981，Tanaka,A. et al., 1990)。さらに、このＲａｔ１細胞系により、活性化ｒａｓ遺伝子産物の効果を考慮することなく、Ｔａｘによる形質転換の生物学的経路を正確に分析することができた。
【０００８】
活性転写因子／環状アデノシン一リン酸応答エレメント結合タンパク質（ＡＴＦ／ＣＲＥＢ）、ＮＦκＢ−様因子、Ｅｔｓ−１および血清応答因子などの細胞転写因子と協同してＴａｘがいかにして転写を調節するかについての知識が蓄積されたにも拘わらず、Ｔａｘの種々の生物学的活性のうちいずれが細胞形質転換に現実に必須であるは依然不明である（Fujisawa et al., 1986; Leung et al., 1988; Lowenthal et al., 1988; Bosselut et al., 1990; Fujii et al., 1992）。
【０００９】
突然変異分析は、種々のＴａｘトランス活性化が、Ｔａｘポリペプチドの区別される機能的ドメインを要するいくつかの細胞メカニズムに関与することを示している（Smith et al., 1990; Semmes et al., 1992および1995; Tsuchiya et al., 1994; Adya and Giam 1995; Yin et al., 1995）。Ｔａｘのアミノ末端領域はＣＲＥＢとの相互作用に重要であるらしく、一方、そのカルボキシ末端は基礎的転写装置との連絡に関与しているようである。本研究において、我々は、Ｔａｘの２つの代表的なトランス活性化機能、すなわち、ＨＴＬＶ−Ｉ ＬＴＲ−媒 介トランス活性化またはＮＦκＢ依存性のもののうちいずれがそのオンコジーン活性に必須であるかを分析した。
【００１０】
【発明の概要】
ここに、ＮＦκＢの構成的活性化はヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型Ｔａｘ蛋白質によるラット繊維芽細胞の形質転換に必須であることが示された。
ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）は、プロウイルスおよび細胞遺伝子双方の転写を調節し、かつラット繊維芽細胞を形質転換できる、４０ｋｄのトランス−作用蛋白質Ｔａｘをコードする。細胞形質転換におけるそのトランス−作用能力の機能的重要性を判断するために、我々は、Ｔａｘの突然変異分析によって、転写活性化の２つの代表的な経路（ＨＴＬＶ−Ｉのロングターミナルリピート（ＬＴＲ）媒介経路、およびＮＦκＢ−依存性経路）を調べた。従前の報告とは対照的に、ＮＦκＢ−依存性プロモーターを活性化する能力を欠く突然変異体はラット繊維芽細胞を形質転換せず、一方、ＨＴＬＶ−Ｉ ＬＴＲ−媒介 トランス−活性化を排除する突然変異は、細胞形質転換について野生型の能力を示した。形質転換能を有するＴａｘの安定な発現は、ラット繊維芽細胞においてＮＦκＢのＤＮＡ結合の増強を引き起こした。また、ＩκＢタンパク質のメンバーとして知られているＮＦＫＢ２前駆体と野生型Ｔａｘとの安定な共発現は、ＨＴＬＶ−Ｉ ＬＴＲ−媒介トランス−活性化を妨害することなく、形質転換をブ ロックし、ならびにＴａｘによる異常ＮＦκＢ活性化を減少させることが証明された。本明細書に記載している結果は、ＮＦκＢの構成的活性化がラット繊維芽細胞のＴａｘ−媒介形質転換に必須であることを示す。
このように、ＮＦκＢ単独で正常細胞の癌化が促されることが立証されたことから、本発明はＮＦκＢタンパク質の新規な用途を提供するものである。
【００１１】
本発明はひとつの態様として、ＮＦκＢを構成的に発現する、トランスフェクトされた細胞株に関する。本発明の細胞は数日〜数週で癌化する。細胞が癌化されるには遊離のＮＦκＢが存在しなければならないので、本発明は別の一面として、ＮＦκＢを構成的に発現するトランスフェクトされた細胞株であって、ＩκＢと結合していないＮＦκＢを含有する該細胞株に関する。また、本発明は、ＣＲＥＢ欠損細胞である細胞株も包含する。ＣＲＥＢとは活性転写因子／環状アデノシン一リン酸応答エレメント結合タンパク質（ＡＴＦ／ＣＲＥＢ）を意味し、これは単にＣＲＥＢあるいはＣＲＥＢ／ＡＴＦと呼称されている。
さらに、本発明は、図１の模式図で示されるＴａｘ突然変異体ｍ３１９タンパク質をコ−ドするＤＮＡ分子を含有しているプラスミドによってトランスフェクトされている細胞株に関する。
本発明は別の態様として、本発明の細胞株を用いることを特徴とする、ＮＦκＢタンパク質の活性を特異的に阻害する物質をスクリ−ニングするための方法に関する。
さらに、本発明は、ＮＦＫＢ２前駆体が構成的にさらに発現している上記の本発明細胞株であって、正常型に戻っている細胞株をも提供する。この細胞株は、ＮＦＫＢ２前駆体の活性を特異的に阻害する物質をスクリ−ニングするための方法に有用である。なお、ＮＦＫＢ２前駆体とはＩκＢの一種であり、本明細書中、ＮＦＫＢ２前駆体は「ＮＦＫＢ２（ｐ１００）」と称することもある。
また、本発明は別の態様として、図１の模式図で示されるＴａｘ突然変異体ｍ３１９タンパク質、該ｍ３１９タンパク質をコ−ドするＤＮＡ分子、および該ＤＮＡ分子を含有するプラスミドに関する。
【００１２】
上記本発明のＮＦκＢを構成的に発現するトランスフェクトされた細胞株を作成するために使用する細胞は動物細胞であれば何れの細胞でも用いることができる。例示すれば、ネズミ由来の細胞、例えばＲａｔ１、Ｒａｔ２、ならびにヒト由来の細胞、例えばヒト繊維芽細胞ＷＩ３８、ＨＬＦ−ａ（ＡＴＣＣ Ｎo.ＣＣ Ｌ−１９９）、Ｈｓ２７（ＡＴＣＣ Ｎo.ＣＲＬ−１６３４）、Ｈｓ６８（ＡＴ ＣＣ Ｎo.ＣＲＬ−１６３５）、Ｈｓ８８８Ｌｎ（ＡＴＣＣ Ｎo.ＣＣＬ−２１１）、ＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣ Ｎo.ＣＣＬ−１８６）、ＬＬ２４（ＡＴＣＣ Ｎo.ＣＣＬ−１５１）、ＭＲＣ−９（ＡＴＣＣ Ｎo.ＣＣＬ−２１２）、ＷＩ−２６ （ＡＴＣＣ Ｎo.ＣＣＬ−９５）、ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ Ｎo.ＣＣＬ−７５）、ＷＩ−１００３（ＡＴＣＣ Ｎo.ＣＣＬ−１５４）、およびヒト滑膜細胞株ＳＣ Ｃ、などがある。ヒト細胞を用いれば、ヒトでの生理的なシグナル伝達の状態が保持できるので、ヒト由来の細胞が好ましい。
【００１３】
図面の説明
図１：Ｔａｘ突然変異体の構造を示す。
（Ａ）ジデオキシヌクレオチド配列決定法により配列決定したｐＵＣｗｔａｘＤＮＡ配列から推定されるＴａｘタンパク質のアミノ酸配列である。
（Ｂ）各ｔａｘ遺伝子の模式図である。（１）野生型ｔａｘ、（２）ｍ１４８、（３）ｍ３１９、および（４）ｍ３５３ｖｐ。白帯はＨＴＬＶ−Ｉ配列を、黒帯は単純ヘルペスウイルスＶＰ１６の酸性活性化ドメインの配列を、ＡＴＧはＴａｘの翻訳開始コドンを、ＴＧＡまたはＴＡＧは翻訳終止コドンをそれぞれ示す。白帯の上にある数字は置換アミノ酸を意味する。ＴａｘおよびＶＰ１６間の境界に位置する、リンカ−コ−ド化ジペプチドであるアルギニン−セリンを図示している。
【００１４】
図２：突然変異型Ｔａｘタンパク質は別個のプロモ−タ−構築体を選択的にトランス活性化する。
レポ−タ−(Reporter)プラスミド（パネルＡではｐＨＬＣ−１、パネルＢではＩｇκｔｋＣＡＴ）１μｇ、エフェクタ−(Effector)プラスミド１μｇ、ｐＣＭＶβ ＤＮＡ１μｇおよび音波処理したサケ精子担持ＤＮＡ（ｓｓ−ＤＮＡ）３ μｇを、Ｒａｔ１細胞に一時的にトランスフェクトした。エフェクタ−プラスミドは上部に示している：レ−ンＡ−１およびＢ−１はｐＨ２Ｒｎｅｏベクタ−；レ−ンＡ−２およびＢ−２はｐＨ２Ｒｗｔａｘ；レ−ンＡ−３およびＢ−３はｐＨ２Ｒｍ１４８；レ−ンＡ−４およびＢ−４はｐＨ２Ｒｍ３１９；レ−ンＡ−５およびＢ−５はｐＨ２Ｒｍ３５３ｖｐである。各レ−ンの下に放射活性の量を％変換(％ conversion)として表わしている。刺激倍数(fold stimulation)は、ｐ Ｈ２Ｒｎｅｏベクタ−を用いて得られた活性と比較した、ＣＡＴ活性の上昇の程度を示している（値：１は（Ａ）では０．８６％変換を、（Ｂ）では２．６％変換を示している）。得られた数値は３回個別に行なった結果である。
【００１５】
図３：35Ｓ−標識Ｒａｔ１トランスフェクト体の免疫沈降である。
およそ同数（１．５×１０6）の35Ｓ−標識Ｒａｔ１トランスフェクト体から 調製した溶解物をＭＩ７３（抗−Ｔａｘモノクロ−ナル抗体）と免疫沈降させた。各レ−ンの上部には試験した細胞株の名称を付している。ネガティブ対照としてＮＲＲａｃｔ１−２細胞を使用した（レ−ン１）。Ｗ４細胞および４０Ｍ−３細胞は野生型Ｔａｘを発現した（レ−ン２および３）。別個に生起させた２つの細胞株を各突然変異体について分析した：レ−ン４および５，Ｍ１４８トランスフェクト体；レ−ン６および７，Ｍ３１９トランスフェクト体；レ−ン８および９，Ｍ３５３ＶＰトランスフェクト体。タンパク質は７．５％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルにて解析した。得られたゲルを螢光分析し、オ−トラジオグラフィ−にて視覚化した。Ｔａｘタンパク質の位置、Ｔａｘ−ＶＰ１６融合タンパク質の位置およびＮＦＫＢ１前駆体タンパク質の位置を示している。左側の数字は標準サイズマ−カ−の分子量を表わす。
【００１６】
図４：Ｒａｔ１トランスフェクト体の形態。
Ｒａｔ１トランスフェクト体の単層培養物の位相差顕微鏡写真である（×１００）：（Ａ）ＮＲＲａｔｃ１−２細胞；（Ｂ）Ｗ４細胞；（Ｃ）４０Ｍ−３細胞；（Ｄ）Ｍ１４８−８細胞；（Ｅ）Ｍ３１９−１２細胞；（Ｆ）Ｍ３５３ＶＰ−１１細胞。
【００１７】
図５：Ｒａｔ１トランスフェクト体にて安定に発現している突然変異型Ｔａｘタンパク質によるトランス活性化の種々の表現型。
Ｒａｔ１トランスフェクト体により産生されるＣＡＴ活性をグラフ化したものである。レポ−タ−プラスミドは（Ａ）ｐＨＬＣ−１または（Ｂ）ＮＦκＢ応答性ＩｇκｔｋＣＡＴである。各実験には、レポ−タ−プラスミド１μｇ、ｐＣＭＶβ ＤＮＡ１μｇおよびｓｓ−ＤＮＡ４μｇを含ませ、β−ガラクトシダ−ゼ活 性について正規化した細胞溶解物の検定の一次範囲内にＣＡＴ活性が測定できるようにした。１．０に設定されたＮＲＲａｔｃ１−２細胞のＣＡＴ活性と比較してＲａｔ１トランスフェクト体にて誘導されるＣＡＴ活性を各プロモ−タ−構築体について示している。得られた結果は４から５個の独立した実験の平均である。
【００１８】
図６：野生型ＴａｘおよびＭ３１９は、ＮＦＫＢ１およびＲｅｌＡを含有する核κＢ ＤＮＡ結合タンパク質を安定なトランスフェクト体にて誘導する。
（Ａ）放射線標識−野生型κＢ−オリゴヌクレオチドおよび表記した細胞系から抽出した核抽出物の電気泳動シフト検定（ＥＭＳＡ）である。レ−ン１，タンパク質加えず；レ−ン２，対照ＮＲＲａｔｃ１−２細胞由来の抽出物；レ−ン３および４，野生型Ｔａｘを発現する細胞由来の抽出物；レ−ン５および６，Ｍ１４８を発現する細胞由来の抽出物；レ−ン７および８，Ｍ３１９を発現する細胞由来の抽出物；レ−ン９および１０，Ｍ３５３ＶＰを発現する細胞由来の抽出物。矢印は特定の核タンパク質−ＤＮＡ複合体の位置を示している。
（Ｂ）核タンパク質−ＤＮＡ複合体に特徴的なＥＭＳＡ。レ−ン１−６で使用している32Ｐ−標識ＤＮＡプロ−ブは野生型κＢ−オリゴヌクレオチドであり、レ−ン７では突然変異体オリゴヌクレオチドである。Ｗ４細胞抽出物を直接かけるか（レ−ン１および７）、またはプレインキュベ−トの後に以下のように行なった：レ−ン２，野生型κＢ−オリゴヌクレオチドの２０モル濃度過剰；レ−ン３，突然変異型κＢ−オリゴヌクレオチドの２０モル濃度過剰；レ−ン４，前免疫したウサギ血清２μｌ；レ−ン５，抗−ＮＦＫＢ１抗体１μｌ；レ−ン６，抗−ＲｅｌＡ抗体１μｌ。白抜き矢印はス−パ−シフトしたバンドの位置を示す。
【００１９】
図７：ＮＦＫＢ２前駆体の安定な発現はＴａｘの細胞下局所化分布を有意に変化させない。
（Ａ）Ｒａｔ１トランスフェクト体におけるＮＦＫＢ２タンパク質レベルの免疫ブロット分析。７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にて全細胞抽出物（各レ−ンについてタンパク質約１００μｇ）を解析し、125Ｉ−プロテインＡ（Amersham）を用いて、ＮＦＫＢ２前駆体（ｐ１００）および抗−ＮＦＫＢ２抗体 によって検出されるそのプロセッシング型（ｐ５２）を視覚化した。
（Ｂ）Ｒａｔ１トランスフェクト体から調製した核および細胞質画分の免疫ブロット分析。Ｗ４細胞（レ−ン１および２）、Ｗ４−２０細胞（レ−ン３および４）、４０Ｍ−３細胞（レ−ン５および６）、４０Ｍ−３−Ｈ４細胞（レ−ン７および８）、ＴＫＢ２−６２細胞（レ−ン９および１０）、およびＴＫＢ２−７３細胞（レ−ン１１および１２）から核（奇数レ−ン）および細胞質（偶数レ−ン）画分を調製し、各画分の等量細胞エクイバレントを抗−Ｔａｘモノクロ−ナル抗体（ＭＩ７３）および125Ｉ−プロテインＡを使用する免疫ブロット分析にか けた。
【００２０】
図８：ＴａｘおよびＮＦＫＢ２前駆体の安定な共発現は、ＨＴＬＶ−Ｉ ＬＴ Ｒ媒介トランス活性化に影響を与えることなく、異常型ＮＦκＢ活性を減少させる。
ＴａｘおよびＮＦＫＢ２の両者を安定に発現するＲａｔ１細胞から産生されるＣＡＴ活性のグラフである。図５にて説明した手法により検定を行なった。Ｒａｔ１細胞の活性を１．０に設定してＣＡＴ活性を示している。各レポ−タ−プラスミドを、対照ベクタ−を含有するＲａｔ１細胞にトランスフェクトすると、Ｒａｔ１細胞の活性と実質的に同等なＣＡＴ活性が得られた（デ−タは示さず）。少なくとも３つの実験による平均値を示している。
【００２１】
図９：ＴａｘおよびＮＦＫＢ２の共発現の形態。
ＮＦＫＢ２トランスフェクト体の単層培養物の位相差顕微鏡写真である（倍率×１００）。（Ａ）Ｗ４−２０細胞；（Ｂ）４０Ｍ−３−Ｈ４細胞；（Ｃ）ＴＫＢ２−６２細胞；（Ｄ）ＴＫＢ２−７３細胞。
【００２２】
【発明の詳しい説明】
Ｔａｘ突然変異体の構築
３つのｔａｘ突然変異体を用い、Ｔａｘ−依存性トランス活性化と細胞形質転換との間の関係を調べた（図１）。Ｔａｘで形質転換したＲａｔ１細胞系の化学的突然変異誘発によって細胞変異体を得ようとする試みにて単離された平坦な(flat)復帰突然変異体細胞系（ＥＡ４と命名）からまず突然変異体ｍ１４８ 遺伝 子をクローン化した。
我々は、ＥＡ４細胞は野生型Ｔａｘによる再形質転換に感受性であり、ＨＴＬＶ−ＩＬＴＲの制御下、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のＥＡ４細胞への一時的導入の結果、このＣＡＴ遺伝子が強力に活性化されることを発見した（データは示さず）。これらの観察は、ＥＡ４細胞は、細胞形質転換に欠陥を有するが、ＨＴＬＶ−ＩＬＴＲをトランス活性化する能力を保持する突然変異型Ｔａｘタンパク質を発現できることを示す。ＥＡ４細胞またはＴａｘ−形質転換Ｒａｔ１細胞である４０ＭＲａｔｃｌ−１細胞（Tanaka et al., 1990）から調製したゲノムＤＮＡのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増 幅によって、ｔａｘ遺伝子をクローン化し、配列決定した。ＥＡ４細胞由来のｔａｘ遺伝子の全コ−ド領域を含む１.４断片は、コドン１４８におけるＧＧＡか ら同位置におけるＧＴＡへの単一塩基変更を示し、その結果グリシンからバリンへのアミノ酸置換が起こっている（図１）。
【００２３】
他の２つの突然変異型ｍ３１９およびｍ３５３ｖｐは、以下の「材料および方法」の項に記載した４０ＭＲａｔｃｌ−１細胞からクローン化した野生型ｔａｘ遺伝子をＰＣＲ突然変異誘発することによって作成した。ｍ３１９は、Smith et al.(1990)が作成したＭ４７ Ｔａｘ突然変異体に対応するロイシン−ロイシン からアルギニン−セリンという３１９および３２０コドンにおける２つのアミノ酸の変更を指令する。ｍ３５３ｖｐは、野生型ｔａｘ遺伝子の全コ−ド領域を、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６の酸性活性化ドメインをコードするＤＮＡ断片０.２４ｋｂ（アミノ酸４１３−４９０）（Sadowski et al., 1988)に連結するこ とによって構築した。すべての野生型および突然変異型ｔａｘ遺伝子を、センス向きにて、真核生物発現ベクターｐＨ２Ｒｎｅｏ（Tanaka et al., 1990)に移し、得られたプラスミドをそれぞれｐＨ２Ｒｗｔａｘ、ｐＨ２Ｒｍ１４８、ｐＨ２Ｒｍ３１９およびｐＨ２Ｒｍ３５３ｖｐと命名した。コードされたＴａｘタンパク質は、各々、野生型Ｔａｘ、Ｍ１４８、Ｍ３１９およびＭ３５３ＶＰと命名した。
【００２４】
突然変異体は区別されるトランス活性化表現型を示す
これらの突然変異が、２つの代表的なプロモーターＨＴＬＶ−Ｉ ＬＴＲおよ びＮＦκＢ−依存性プロモータ−のＴａｘ−媒介転写活性化にいかに影響を与えるかをテストするために、Ｔａｘ発現構築体と、ＨＴＬＶ−Ｉ ＬＴＲ（ｐＨＬ Ｃ−１）またはヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子プロモーターに連結したネズミ免疫グロブリンκ軽鎖エンハンサーコア配列（ＩｇκＢ）の７コピー（ＩｇκｔｋＣＡ）いずれかを含有するＣＡＴレポータープラスミドとによって一時的に共トランスフェクトした（図２）。各トランスフェクション実験には、サイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶβ）の制御下で細菌ｌａｃ−Ｚ遺伝子を発現するプラスミドを内部対照として含ませた。予測されたように、野生型Ｔａｘは、ＨＴＬＶ−ＩＬＴＲおよびκＢモチーフを含有するプロモーター双方からの転写を効果的に刺激した（図２、レーン２）。突然変異型Ｍ１４８およびＭ３５３ＶＰは野生型Ｔａｘと同程度効果的にＨＴＬＶ−ＩＬＴＲをトランス活性化したが、κＢ部位依存性転写は増進させなかった（図２、レーン３および５）。逆に、Ｍ３１９は、κＢ部位依存性プロモーターについて十分に活性であったが、ＨＴＬＶ−ＩＬＴＲをほとんど活性化しなかった（図２、レーン４）。従って、一時的アッセイ条件下では、これらの３つのＴａｘ突然変異体はＨＴＬＶ−Ｉ ＬＴＲまたはκＢ部位依存性プロモーターいずれかを単独でトラ ンス活性化した。
【００２５】
Ｍ３１９はＲａｔ１細胞の安定な形質転換を誘導するが、Ｍ１４８およびＭ３５３ＶＰは誘導しない
細胞形質転換における２つの独立したトランス活性化機能の機能的重要性を調べるために、我々は、突然変異型Ｔａｘタンパク質を安定に発現するＲａｔ１細胞を樹立させた。Ｔａｘ構築体ｐＨ２Ｒｗｔａｘ、ｐＨ２Ｒｍ１４８、ｐＨ２Ｒｍ３１９およびｐＨ２Ｒｍ３５３ｖｐの各々を、リン酸カルシウム沈殿技術によってＲａｔ１細胞に導入した。トランスフェクションの１０ないし１４日後に、Ｇ４１８抗生物質でトランスフェクトした細胞を選択して、多数の薬剤−耐性コロニーを得た（各プラスミド１μｇ当たり６×１０2コロニー以上）。２０ない し３０のコロニーを単離し、増殖させて各構築体についての細胞系とし、Ｔａｘ発現を調べた（図３）。残りの細胞を収集し、プールした集団として増殖させた（Ｗmix、Ｍ１４８mix、Ｍ３１９mixおよびＭ３５３ＶＰmix）。ＮＲＲａｔｃｌ−２は、ｐＨ２Ｒｎｅｏベクターのみを含有するＮＲＲatmix（Tanaka et al.) から単離されたＧ４１８耐性Ｒａｔ１細胞クローンのうちの１つである。Ｔａｘの各形態について、適当なレベルのＴａｘを発現する２つの独立した細胞クローンを選択し、それらについて説明する。少なくとも５つの独立した細胞クローンの中では実質的に同様の生物学的表現型がＴａｘの各形態について観察された（データは示さず）。Ｗ４細胞は、ｐＨ２Ｒｗｔａｘ構築体から比較的大量の野生型Ｔａｘを発現し、一方、４０Ｍ−３細胞はもう１つのＴａｘ発現構築体ｐＨ２Ｒ４０Ｍ（Tanaka et al.)から比較的少量の野生型Ｔａｘを発現した。Ｍ１４８−５およびＭ１４８−８細胞は共にｐＨ２Ｒｍ１４８構築体から比較的高レベルのＭ１４８を発現した。Ｍ３１９−５およびＭ３１９−１２細胞は、ｐＨ２Ｒｍ３１９構築体から比較的低いレベルのＭ３１９を発現した。Ｍ３５３−１１またはＭ３５３ＶＰ−１９細胞は、４０Ｍ−３またはＭ３１９−５細胞のものと匹敵するレベルで、ｐＨ２Ｒｍ３５３ｖｐ構築体からＭ３５３ＶＰを発現した。
【００２６】
図４は、いくつかのトランスフェクト体の形態を示す。我々の従前の報告（Tanaka et al., 1990)と合致して、野生型ＴａｘはＲａｔ１細胞を効率的に形質転換し；野生型Ｔａｘを発現する細胞（図４、ＢおよびＣ）は、ｐＨ２Ｒｎｅｏベクター単独でトランスフェクトした対照細胞（図４Ａ）と比較して、細胞屈折性および細胞密度の顕著な増加を示した。Ｍ３１９を発現するＲａｔ１細胞（図４Ｅ）は野生型Ｔａｘを発現するものからほとんど区別できなかった。興味深いことには、Ｍ１４８（図４Ｄ）またはＭ３５３ＶＰ（図４Ｆ）を発現する細胞は、細胞単層の渦巻きの低下および密集時の細胞密度の中程度の増加を特徴的に示した。トランスフェクト体の生物学的特性を表１にまとめる。野生型またはＭ３１９トランスフェクト体は同様の形質転換表現型を示し；それらは単層を越えて増殖し、軟アガロースでコロニーを生成し、ヌードマウスで腫瘍を増加させた。対照的に、Ｍ１４８トランスフェクト体およびＭ３５３ＶＰトランスフェクト体は、密集時に一定の阻害を受け、軟アガロース中で増殖できず、接種６週間後にヌードマウスで腫瘍を誘導しなかった。しかしながら、ｐＨ２Ｒｗｔａｘ構築体がＭ１４８または３５３ＶＰトランスフェクト体の形質転換を誘導することから（データを示さず）、これらの突然変異体はトランス優性ネガティブな様式では形質転換を抑制できないことが示される。実質的に同一の結果が、他の確立されたラット繊維芽細胞、正常ラット腎臓細胞（ＮＲＫ４９Ｆ）（de-Larco et al., 1978)およびＲａｔ２細胞（Topp et al., 1981)(データは示さず）の形質転換ア ッセイ系で得られた。我々は、Ｍ３１９は形質転換活性を十分保有し、一方、Ｍ１４８およびＭ３５３ＶＰはＲａｔ１細胞の形質転換活性を完全に欠くと結論した。
【００２７】
突然変異体は安定な細胞系でトランス活性化の異なる表現型を発現する
一時的発現実験（図２）で観察されたＴａｘのトランス活性化特性によっては、Ｒａｔ１トランスフェクト体におけるＴａｘの長期安定発現下での標的遺伝子の構成的転写活性を必ずしも確信できない。事実、従来の報告は、ジャーカットＴ−リンパ系細胞におけるＴａｘの長期発現後のＮＦκＢ活性の選択的抑制を示しており、これは、Ｔａｘ発現の短期および長期の効果が細胞環境に応じてかなり異なり得ることを意味する（Ruben and Rosen, 1990)。細胞形質転換に対するＴａｘ−依存性トランス活性化の機能的寄与を調べるためには、以下の表１にリストしたＲａｔ１トランスフェクト体における転写活性化の現実の条件を知るのが必須である。従って、我々は、２つのレポータープラスミドを用いてＲａｔ１トランスフェクト体におけるＣＡＴ活性をアッセイした（図５）。野生型Ｔａｘを発現するＲａｔ１トランスフェクト体Ｍ１４８またはＭ３５３ＶＰへのＨＴＬＶ−１ＬＴＲＣＡＴ（ｐＨＬＣ−１）遺伝子によるトランスフェクションは、対照細胞によって達成されたものの＞２０倍のＣＡＴ活性を誘導した。しかしながら、Ｍ３１９トランスフェクト体は、有意なＣＡＴ活性化を与えなかった。他方、κＢ−依存性ＣＡＴレポーター構築体は、Ｍ１４８およびＭ３５３ＶＰトランスフェクト体双方において実質的に不活性であった。このレポーター構築体は、野生型ＴａｘまたはＭ３１９トランスフェクト体ではＣＡＴ活性の＞１６倍の刺激を示した。かくして、各突然変異型Ｔａｘタンパク質の安定な発現は、Ｒａｔ１トランスフェクト体において、予測される適当な標的遺伝子を構成的に転写活性化させる。
【００２８】
【表１】
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注：ａ）約１×１０5個の細胞を６０ｍｍプラスチック皿に接種し、３日ごとに 栄養供給(refeed)し、接種後１４日目に観察した。
ｂ）０．３３％アガロ−スに接種後、１４日目に６０μｍ以上の大きさのコロニ−を形成した試験細胞のパ−センテイジである。
ｃ）各細胞系について５×１０6個の細胞を注射した後に計数したヌ−ドマウ スの発癌性である。
数字は、接種後６週目に腫瘍を有しているマウスの数／注射したマウスの数、を示している。
ｄ）成長期間は腫瘍が直径０．８ｍｍに成長するまでの週を示している。
【００２９】
野生型ＴａｘおよびＭ３１９は、安定な細胞系においてＮＦκＢのＤＮＡ結合を増強させる
構成的ＮＦκＢ ＤＮＡ結合活性は、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞（Leung et al., 1988; Lowenthal et al., 1988; Li et al., 1993; Lanoix et al., 1994)、Ｔａｘタンパク質を安定にまたは条件的に発現するジャーカットＴリンパ系細胞（Ballard et al., 1988; B喇nlein et al., 1989; Lacoste et al.1991; Arima et al., 1991; Li et al., 1993; Lanoix et al., 1994; Kanno et al., 1994a）およびＴａｘ−形質転換ネズミ繊維芽細胞（Kitajima et al., 1992)で報告されている。Ｔａｘ突然変異体に対するネズミＩｇκＢモチーフを含有するプロモーターの異なる応答性の分子的基礎を理解するために、Ｔａｘによって誘導されてκＢ配列に結合するタンパク質を電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によって分析した（図６）。核抽出物は、対照ＮＲＲａｔｃｌ−２細胞から、または野生型または突然変異型Ｔａｘを安定に発現する細胞から調製し、ネズミＩｇκＢモチーフの単一コピーを含有する一本鎖ＤＮＡプローブへの結合についてその核抽出物をテストした。トランス活性化アッセイに合致して、野生型ＴａｘまたはＭ３１９いずれかを発現する細胞からの核抽出物は、高レベルのＮＦκＢＤＮＡ結合活性を示し、一方、対照細胞、Ｍ１４８またはＭ３５３ＶＰトランスフェクト体からのものは、同等に低いレベルのＮＦκＢＤＮＡ結合活性を示した。バンドは過剰の未標識ＩｇκＢオリゴヌクレオチドと競合したが（図６Ｂ、レーン２）、単一の塩基置換を含有する過剰の突然変異ＩｇκＢプローブとは競合せず（図６Ｂ、レーン３）、これは、結合の特異性を示す。突然変異プローブは特異的遅延バンドを与えなかった（図６Ｂ、レーン７）。
【００３０】
κＢ−特異的複合体のポリペプチド組成を調べるため、我々は、スーパーシフトアッセイのためにＮＦκＢサブユニット−特異的抗体を用いた。Ｗ４細胞に由来する核抽出物に関し、ＮＦＫＢ１−特異的抗体はκＢ−特異的バンドを完全にスーパーシフトした（図６Ｂ、レーン５）。また、ＲｅｌＡ−特異的抗体は、完全ではないが、バンドをスーパーシフトした（図６Ｂ、レーン６）。ＮＦＫＢ２−特異的またはｃ−Ｒｅｌ−特異的抗体はいずれもκＢ−特異的複合体の形成に影響しなかった（データは示さず）。これらの観察は、ＮＦＫＢ１およびＲｅｌＡ(恐らくは、ＮＦＫＢ１(ｐ５０)／ＲｅｌＡヘテロダイマー）はＴａｘ−形質 転換Ｒａｔ１細胞における主要ＮＦκＢサブユニットであることを示す。
【００３１】
ＮＦＫＢ２(ｐ１００)の安定な共発現はＴａｘによる形質転換をブロックした
細胞形質転換におけるＮＦκＢの役割をさらに確認するために、我々は、野生型Ｔａｘを発現する細胞においてＮＦκＢ活性化を選択的に排除しようと試みた。選択的サプレッサーの候補として、ＮＦＫＢ２（ｐ１００）を選択したが、これは、一時的アッセイ条件において、Ｔａｘと相互作用し、Ｔａｘ−媒介ＮＦκＢ活性化を効果的に妨げることが最近報告されている（Beraud et al., 1994; Lanoix et al., 1994; Watanabe et al., 1994; Kanno et al., 1994b; Murakami et al., 1995）。プラスミドｐＫＣＲｂ-ｗｔａｘ、ブラスティシジンＳ−耐性遺伝子およびプラスミドｐＣｎ１００を含有するＴａｘ発現ベクター、Ｇ４１８−耐性遺伝子を含有するＮＦＫＢ２（ｐ１００）発現ベクターでＲａｔ１細胞を共トランスフェクトした。両薬剤でトランスフェクト体を選択し、得られた細胞クローンをＴａｘおよびＮＦＫＢ２双方の発現について分析した。安定なＮＦＫＢ２発現は得るのが比較的困難であるが、調べた５０のクローンのうち、独立したトランスフェクションに由来するＴＫＢ２−６２およびＴＫＢ２−７３と命名した２つの細胞クローンは、有意量のＴａｘおよびＮＦＫＢ２タンパク質を発現することが判明した（図７Ａおよび７Ｂ）。加えて、もう１つのＮＦＫＢ２発現ベクターである、Ｇ４１８耐性遺伝子の代わりにブラスティシジンＳ−耐性遺伝子を含有するｐＣｂ１００による、野生型Ｔａｘ発現細胞クローンＷ４または４０Ｍ−３のトランスフェクションにより、Ｗ４−２０および４０Ｍ−３−Ｈ４と命名した細胞系が生じ、そこでは、Ｔａｘの発現が維持されつつＮＦＫＢ２は安定に過剰発現される。興味深いことには、ＣＯＳ細胞においてＮＦＫＢ２と共に一時的に過剰発現された場合、Ｔａｘは細胞質に支配的に再分配されることが既に報告されているにも拘わらず（Beraud et al., 1994; Pepin et al., 1994)、生物化学的分画実験は、これらの細胞におけるＮＦＫＢ２との安定な共発現は、Ｔａｘの細胞下局所化（subcellular localization)を明らかに変化させなかっ たことを示した（Goh et al., 1985; Kiyokawa et al., 1985)（図７Ｂ）。ＴａｘおよびＮＦＫＢ２を安定に共発現する細胞におけるＨＴＬＶ−Ｉ ＬＴＲまた はκＢ−依存性プロモーターからの転写のアッセイは、前者のプロモーターは十分に活性化されたが、後者のプロモーターはこれらの細胞ではほとんど不活性であることを示した（図８）。さらに、ＲｅｌＡ発現ベクターおよびκＢ−依存性ＣＡＴ構築体でのこれらの細胞のトランスフェクションはＣＡＴ活性の有意な上昇を導き、一方、Ｔａｘ発現ベクターおよびκＢ−ＣＡＴ構築体での共トランスフェクションはＣＡＴ活性をほとんど上昇させず、これは、内因性ＮＦκＢは、ＮＦＫＢ２発現細胞におけるさらなるＴａｘによってもはや活性化され得ないことを示す（データは示さず）。図９は、単層培養についてのＴａｘおよびＮＦＫＢ２を共発現する細胞の形態を示す。Ｔａｘ突然変異体を発現する細胞についての結果と合致して、これらの細胞は、表現型が正常であるように見えた。５×１０6細胞の注射の後６週間にわたって、それらは０.３３％軟アガロース中で増殖せず、ヌードマウスで腫瘍を誘導しなかった。前記観察は、ＮＦκＢの構成的活性化はラット繊維芽細胞のＴａｘ−媒介形質転換に必須であることを強く示す。
【００３２】
検  討
我々は、核において活性ＮＦκＢの誘導を排除したＴａｘの突然変異は形質転換を完全に無くし、一方、ＨＴＬＶ−Ｉ ＬＴＲのトランス活性化の喪失は形質 転換に影響しないことを示した。さらに、ＮＦＫＢ２の安定な共発現は、形質転換表現型の復帰を伴って構成的ＮＦκＢ活性化を喪失させた。我々の結果は、候補物ＨＴＬＶ−Ｉ ＬＴＲをトランス活性化するＴａｘの能力は形質転換にとっ て重要でなく、その代わり、ＮＦκＢの永続的な活性化は形質転換に必須であることを示している。これらの結果はSmith and Greene(1991）による従前の観察 とは対照的である、彼らは、ＮＦκＢの誘導はＲａｔ２細胞を形質転換するのに必要でなく十分でもなく、たＡＴＦ／ＣＲＥＢ−応答性ＨＴＬＶ−ＩＬＴＲをトランス活性化する能力がこれらの細胞の形質転換で中心的な役割を演ずることを示していた。現時点では、我々は、この矛盾を説明できない。Ｍ１４８およびＭ３５３ＶＰがＲａｔ１細胞を形質転換できないことは、タンパク質の不十分な発現によるものではない。何故ならば、これらのｔａｘ突然変異体を持つ安定なトランスフェクト体は４０Ｍ−３細胞と比較して同等またはより多い量のＴａｘを発現するからである（図３）。また、我々は、トランスフェクト体で安定に発現されたＴａｘによって、標的遺伝子の構成的転写活性化を確認した（図５）。さらに、野生型ＴａｘまたはＭ３１９はＲａｔ２およびＮＲＫ細胞を容易に形質転換したが、Ｍ１４８およびＭ３５３ＶＰは形質転換されなかった。Ｔａｘ突然変異体の異なるトランス活性化表現型の基礎となるメカニズムは調査中である。
【００３３】
Willemsら（1992)は、候補物ＬＴＲ−依存性トランス活性化を排除するウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）Ｔａｘタンパク質における突然変異は、Ｈ−ｒａｓオンコジーンと協同してラット胚繊維芽細胞を形質転換するＢＬＶ Ｔａｘの能力を 妨害しないことを以前示している。彼らは、ＢＬＶ−ＬＴＲをトランス活性化するＢＬＶ Ｔａｘの能力は細胞形質転換とは独立していると結論した。我々の考 えは、さらに、転写的に活性なＮＦκＢ発現はＴａｘ−誘導悪性表現型の維持に必要であり得ることを示すKitajimaら(1992)による実験によって支持される。ＲｅｌＡに向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＮＦκＢ発現の阻害は、ＨＴＬＶ−Ｉ−形質転換リンパ球系ならびにｔａｘ−トランスジェニックマウスで発生した繊維芽細胞腫瘍から確立されたＴａｘ−形質転換細胞の増殖を阻害した。最近、Higginsら(1993)は、種々の形質転換細胞系を用いて、ＲｅｌＡ のアンチセンス阻害は腫瘍化をブロックし、腫瘍退縮を引き起こすことを報告した。我々の現在の観察と共にこれらの報告は、細胞形質転換における活性ＮＦκＢの核発現についての必須の役割を強く支持する。しかし、依然として以下の可能性は排除できない。まず、ＮＦκＢを活性化する能力以外に、野生型ＴａｘおよびＭ３１９のみが、Ｔａｘのいくつかの知られていない形質転換に必須の生物学的活性を偶然共に有していることもある。例えば、Ｔａｘ−媒介トランス活性化に関与するもう１つの細胞転写因子はＣＡｒＧボックスに結合する血清応答因子（ＳＲＦ）である（Norman et al., 1988; Fuji et al., 1988; Alexandre et al., 1991)。Ｔａｘはin vitroおよびin vivoにおいてＳＲＦと相互反応し、その転写活性を異常に活性化すると報告されている（Fujii et al.)。しかしなが ら、ＳＲＦ−応答性ＣＡＴレポータープラスミドでの、図５にリストしたＲａｔ１トランスフェクト体へのトランスフェクションは形質転換表現型を持つ細胞においてＣＡＴ活性を選択的に上昇させないので、トランス活性化のＳＲＦ経路は、ラット繊維芽細胞のＴａｘ−形質転換に必須ではないようであった（データは示さず）。第２に、ＤＮＡ腫瘍ウイルスのオンコタンパク質のように、形質転換は、ある種の細胞腫瘍サプレッサー遺伝子産物の相互作用または不活性化に関与し得る。Ｔａｘは網膜芽細胞腫感受性遺伝子産物またはｐ５３と物理的に関連していないようである（データは示さず）。同様に、野生型Ｔａｘ発現は、Ｅ２Ｆ転写因子の結合活性において有意な増加を引き起こさなかった（データは示さず）。それはほとんど予測されなかった。何故ならば、ＨＴＬＶ−Ｉは組み込まれた形態で複製するレトロウイルスであり、一方、ＤＮＡ腫瘍ウイルスはその効果的な複製のための細胞Ｓ相活性の維持に共通の要件を有するからである。しかしながら、Ｔａｘはまだ知られていない腫瘍サプレッサー遺伝子産物と相互作用し得る可能性が依然ある。
【００３４】
この点において、Ｔａｘは、そのプロセッシングがＮＦκＢ誘導（Baeuerle, 1991)で重要な役割を演じ得るＮＦＫＢ１前駆体およびＮＦＫＢ２前駆体（Hirai et al., 1992および1994; Beraud et al., 1994; Lanoix et al., 1994)と物理的に相互作用することは注目すべきである。最近の実験は、in vivoで他のＲｅ ｌ／ＮＦκＢファミリーメンバーとで可能性として安定な複合体を形成し、それらを細胞質に維持し、かくして、Ｒｅｌ／ＮＦκＢメンバーの核トランスローケーションを制御するＮＦＫＢ１およびＮＦＫＢ２前駆体のＩκＢ−様機能を示している（Rice et al., 1992; Mercurio et al., 1993; Naumann et al., 1993a,b）。我々の免疫沈降実験において、我々は、Ｒａｔ１細胞からのＴａｘで共免 疫沈降させた１１０ｋｄの見掛けの分子量を持つ細胞ポリペプチドを検出した（図３）。特異的抗体での免疫化学的分析は、さらに、このポリペプチドがほとんどＮＦＫＢ１前駆体であるが、ＮＦＫＢ２前駆体ではないことを突き止めた（データは示さず）。Hiraiら(1992および1994)によって以前に報告されているごと く、各Ｔａｘ変異体とのＮＦＫＢ１前駆体の共免疫沈降の効率はκＢ−応答性プロモーターのトランス活性化の程度に相関するようであり（図３および５）、この相互作用はＲａｔ１細胞におけるＮＦκＢ誘導で機能的に重要であることを示す。最近の報告は、ＴａｘとＮＦＫＢ２前駆体との相互作用は、発現されたその相対的量に応じて、ＴａｘのＮＦκＢ誘導活性を阻害するか、あるいはＮＦＫＢ２前駆体を含めたＩκＢ分子からの転写的活性ＮＦκＢの放出に導くことを示している（Beraud et al., 1994; Watanabe et al., 1994; Munoz et al., 1994; Kanno et al., 1994b; Murakami et al., 1995）。一時的トランスフェクション実験は、これまで、ＮＦＫＢ１前駆体ではなくＮＦＫＢ２前駆体がＲｅｌ／ＮＦκＢ−依存性プロモーターのＴａｘ−誘導トランス活性化を効果的に抑制することを示している（Beraud et al., 1994; Watanabe et al., 1994; Murakami et al., 1995)。これは、部分的には、Ｔａｘの存在下におけるこれらの前駆体の異なるプロセッシングによるものであろう。ＮＦＫＢ１前駆体のプロセッシングはＴａｘによって顕著に増強されるが、ＮＦＫＢ２前駆体のそれはＴａｘの存在下または不存在下でかなりゆっくりと起こる（Mercurio et al., 1993; Watanabe et al., 1993, 1994; Lanoix et al., 1994)。これは、過剰に発現された場合は、ＮＦＫＢ２前駆体が、他のＩκＢ分子から放出された遊離ＮＦκＢのＴａｘ−誘導トランスローケーションをブロックすることを可能とするであろう。これらの観察は、我々が、Ｔａｘ−誘導ＮＦκＢ活性化を排除するために、Ｔａｘ−発現細胞がＮＦＫＢ２前駆体を安定に過剰発現させるようにすることを促進した。ＴａｘおよびＮＦＫＢ２前駆体を共に安定に発現するＲａｔ１細胞は、構成的ＮＦκＢ活性ならびに形質転換表現型を欠き、一方、ＨＴＬＶ−Ｉ ＬＴＲはＴａ ｘによって十分にトランス活性化できる（図７および８）。従って、これらの細胞におけるＴａｘの局所化（核−対−細胞質）は、有意には変更されなかった（図７Ｂ）。これらの結果は２つの重要な意味を有する。まず、もしＮＦＫＢ２がＲｅｌ／ＮＦκＢ転写経路の調節に排他的に従事するならば、構成的ＮＦκＢ活性化はＴａｘによるＲａｔ１細胞の形質転換に必須であると結論できる。第２に��Ｔａｘ−誘導構成的ＮＦκＢ活性の排除は、ＮＦＫＢ２前駆体によるＴａｘ自体のキレート化合物形成または不活性化を必ずしも必要としないが、ＮＦＫＢ２前駆体の強力なＩκＢ活性によって達成できる。Ｔａｘ発現は内因性ＮＦＫＢ２の増大した発現を誘導するようである（図７Ａ）が、ＮＦＫＢ２が異所的に過剰発現されるまでＴａｘ−媒介ＮＦκＢ活性化を破壊できないであろう。Ｔａｘ−ＮＦＫＢ２相互作用の機能的コンセンサスに関する従前の説明は、一時的トランスフェクション実験から導かれたものである。細胞のより生理学的状態を表す安定な細胞系からの我々の結果は、ＮＦＫＢ２前駆体は、恐らくは、そのＩκＢ活性を介するＴａｘ−誘導ＮＦκＢ活性化を排除できることを示す。興味深いことには、ＮＦＫＢ２の安定な発現はＲａｔ１細胞における腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α−媒介ＮＦκＢ活性化もブロックでき（未発表データ）、これは、ＴａｘおよびＴＮＦ−αは、少なくとも一部分は、ＮＦκＢ活性化の共通の経路を有し得ることを示す。これはＮＦκＢ活性化がＩκＢタンパク質の安定な発現によって排除できるという最初の証明であるので、それはＮＦκＢの生物学的役割を分析するための優れたモデルとなり得る。
【００３５】
ＮＦκＢの永続的な活性化は、これまで、他の天然に生じるヒト新生物で稀にしか報告されていないという事実は、多重調節システムによるＲｅｌ／ＮＦκＢ活性の厳格な制御を反映し得る。事実は、ＮＦκＢの一時的活性化は種々の刺激での処理によって多くの細胞で観察できるが（Baeuerle, 1991)、ＮＦＫＢ１（ ｐ５０）およびＲｅｌＡの核発現は、細胞が特異的に誘導されてそれらが核に移動されるまで内因性ＩκＢタンパク質の量を増加させる（Brown et al., 1993; Scott et al., 1993; Sun et al., 1993)。矛盾なく、ＲｅｌＡまたはその欠失 突然変異体の安定な過剰発現は、ラット繊維芽細胞の形質転換に導くことができなかった（Grimm and Baeuerle, 1994)（データは示さず）。従って、Ｔａｘ単 独の安定な発現はＮＦκＢの構成的活性化を達成するのは注目に値する。最近の報告は、ＴａｘはＩκＢ−αのリン酸化およびタンパク質分解を誘導することを示している（Kanno et al., 1994; Sun et al., 1995; Lacoste et al., 1995; Suzuki et al., 1995)。ＩκＢ−β（最近クローン化されているもう１つのＩκＢイソ形態）（Thompson et al., 1995)に対するＴａｘの効果は現在知られていないが、Ｔａｘが、これまでに、ＮＦκＢを核へトランスローケートし、その結果構成的活性が得られることが調べられているすべての細胞質ＩκＢタンパク質を標的とするのはかなり合理的であろう。
【００３６】
その増殖がＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαシグナル伝達経路から独立している、ラット繊維芽細胞のＴａｘ−媒介細胞形質転換における永続的なＮＦκＢ活性化についての必須の役割の証拠は、正常の増殖制御に関与する未知の重要な調節プロセスをＮＦκＢが支配しているかも知れないという考えを生起させる。繊維芽細胞増殖制御におけるＲｅｌ／ＮＦκＢフアミリーについての役割を示す２つの観察は、マウス繊維芽細胞におけるＧ０ないしＧ１転移の間にＮＦκＢ ＤＮＡ −結合活性が誘導され、その結果、ｃ−ｍｙｃ ＮＦκＢ結合部位を含有するプロモ ーターの転写活性が得られるということ（Baldwin et al., 1991)およびＴＮＦ −αは、フェルボル１２−ミリステート１３−アセテート−独立経路を通じてマウス繊維芽細胞において分裂促進事象を開始するということである（Cornelius et al., 1990)。最も最近には、Mosialosら(1995）は、エプスタン−バールウイルスの潜在的膜タンパク質Ｉ（ＬＭＰ−１）とＴＮＦ受容体ファミリー関連タンパク質との相互作用を報告しており、これは、ＴＮＦ受容体ファミリーからのシグナル形質導入のＬＭＰ−１媒介形質転換への連結を示し、これは、Ｒａｔ１細胞におけるＮＦκＢ活性化と密接に関連するようである（Huen et al., 1995)。Ｌｙｔ１０、ｖ−ＲｅｌおよびＢｃｌ−３を含めたいくつかのＲｅｌ／ＮＦκＢファミリーメンバーについてオンコジーンの可能性が報告されている（Wilhelmsen et al., 1984; Ohno et al., 1990; Neri et al., 1991)。かくして、転写因子のＲｅｌ／ＮＦκＢファミリーは免疫機能には限定されない種々の遺伝子の発現を制御し得、細胞挙動に重要な影響を与える。Ｔａｘ−媒介形質転換におけるＮＦκＢについての細胞標的遺伝子の同定は、ＮＦκＢがいかにして細胞増殖制御に関与するかを理解する糸口を提供するであろう。
【００３７】
【実施例】
材料および方法
細胞培養
Ｒａｔ１細胞に由来するすべての細胞は、湿潤５％ＣＯ2雰囲気中、３７℃に て、１０％加熱不活化胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニ シリン（１ｍｌ当たり５０ユニット）およびストレプトマイシン（１ｍｌ当たり５０μｇ）を加えたダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に維持した。
【００３８】
プラスミドの構築およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）
ｐＨＬＣ−１およびｐＣＭＶβ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）は既に記載されている（Mori et al., 1987; MacGregor and Caskey, 1989)。ＩｇκｔｋＣＡＴを構築するために、ＥＭＳＡでプローブに使用され、ネズミ免疫グロブリンκ軽鎖エンハンサーの単一κＢ結合モチーフを含有する二本鎖オリゴヌクレオチドの７コピーを、ｐＢＬＣＡＴ２のＸｂａＩ部位（Luckow and Schutz, 1987)とｐＢＬＣＡＴ２内のヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子プロモーター（McKnight and Kingsbury, 1982)のヌクレオチド−８５の間に入れた。野生型ｔａｘお よびｍ１４８の暗号配列を以下のごとくにＰＣＲによって増幅した。既に記載されているごとくに（Sakurai et al., 1992)、特異的プライマーＭＴａｘＩＩ、 ＭＴ ＡＸ０１、ＭＴａｘ１およびＭＴＡＸ０と共にGene Amp キット（Takara, 京都）を用い、４０ＭＲａｔｃｌ−１細胞（Tanaka et al., 1990)から、またはＥ４Ａ細胞から調製したゲノムＤＮＡを２工程のＰＣＲに付した。ＰＣＲの各サイクルは、９４℃における２０秒間の変性、５２℃における３０秒間のプライマーアニーリング、および７２℃における９０秒間の延長／合成よりなるものであった。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離精製し、ｐＵＣ１１９のＨｉｎｃＩＩ部位にサブクローンし、ｐＵＣｗｔａｘおよびｐＵＣｍ１４８を得た。ＰＣＲ産物を含有するｐＵＣｗｔａｘおよびｐＵＣｍ１４８のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をセンス向きにてｐＨ２Ｒｎｅｏベクター（Tanaka et al., 1990）内の唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部位に移行させることによってｐＨ２Ｒｗ ｔａｘおよびｐＨ２Ｒｍ１４８を構築した。ｔａｘ遺伝子に唯一のＢｇｌＩＩ部位を導入し、その結果コドン３１９および３２０におけるロイシン−ロイシンに代わりにジペプチドのアルギニン−セリンで置換することによるＰＣＲ突然変異誘発（Ho, et al., 1989）によってｍ３１９を得た。単純ヘルペスウイルスＶＰ１６（Sadowski et al., 1988)の酸性活性化ドメイン（アミノ酸４１３−４９０）をコードする０.２４ｋｂ ＤＮＡ断片に全ｔａｘ暗号配列をインフレーム融合することによってｍ３５３ｖｐを得た。アミノ酸アルギニン−セリンをコードする２つのリンカーを融合ポリペプチドの境界に挿入した。引き続いて、ｐＨ２Ｒｍ３１９およびｐＨ２Ｒｍ３５３ｖｐをｐＨ２Ｒｗｔａｘと同様に構築した。突然変異はSequenase(United States Biochemicals)でのジデオキシヌクレオチド 配列決定によって確認した。もう１つの野生型Ｔａｘ発現ベクターｐＫＣＲｂ−ｗｔａｘを以下のごとくに構築した。プラスミドｐＳＶ２ｂｓｒ（Izumi et al., 1991)をＢａｍＨＩで消化し、クレノウ酵素で処理し、さらにＰｖｕＩＩで消 化した。ブラスティシジンＳ−耐性遺伝子を含有する得られた断片をプラスミドｐＫＣＲＨ２（Mishina et al., 1984)のユニークＰｖｕＩＩ部位にクローン化 し、ｐＫＣＲｂベクターを得た。ｐＫＣＲｂ−ｗｔａｘを構築するために、野生型ｔａｘ ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＨ２Ｒｗｔａｘからの１.４ｋｂＥｃｏＲＩ断片をｐＫＣＲｂベクターのＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。正しい向きは制限酵素切断パターンによって決定した。Ｇ４１８−耐性遺伝子またはブラスティシジンＳ−耐性遺伝子いずれかを含有する２つのＮＦＫＢ２発現ベクターｐＣｎ１００またはｐＣｂ１��０を以下のようにして構築した。Inder M. Verma博士から提供されたＮＦＫＢ２のｃＤＮＡ（Schmid et al., 1991)をｐＣＭＶ−Ｎｅｏ−Ｂａｍベクター（Baker et al., 1990)（Bert Vogelstein 博士 から入手）のＢａｍＨＩ部位にサブクローンしてｐＣｎ１００を得るか、あるいはｐＣＭＶ−Ｂｓｒ−ＢａｍベクターのＧ４１８−耐性遺伝子をプラスミドｐＳＶ２ｂｓｒからのブラスティシジンＳ−耐性遺伝子で置き換えることによってｐＣｂ１００を得た。
【００３９】
細胞のトランスフェクション、免疫ブロッティングおよびＣＡＴアッセイ
すべてのトランスフェクションはリン酸カルシウム沈殿法（Graham and van der Eb, 1973)によって行った。Ｒａｔ１細胞（１×１０6）をｔａｘ−もしくは ＮＦＫＢ２−発現プラスミドＤＮＡ２０μｇでトランスフェクトし、１ｍｌ当たり６００μｇのＧ４１８（Sigma)または１ｍｌ当たり５μｇのブラスティシジンＳ−（Funakoshi,東京,日本）の存在下で安定な発現について選択した。薬剤− 耐性細胞のプールした集団は、生成したコロニーの９０％以上を収集することによって確立した。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ７.５］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Nonidet P-40(NP-40)、０.１％ドデシル硫酸ナトリウ ム（ＳＤＳ）、１ｍＭジチオトレイトールおよび１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含有する溶解緩衝液で細胞を溶解した以外は、従前に記載されているごとくに（Mori et al., 1987; Yamaoka et al., 1990)、抗−Ｔａｘ抗体（ＭＩ−７３）で免疫ブロッティングすることによって細胞クローンをＴａｘ発現についてスクリーンニングした。ＮＦＫＢ２の発現は、Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA)から購入した抗−ＮＦＫＢ２抗体（ｓｃ−２ ９８）で免疫ブロッティングすることによって判断した。ＣＡＴアッセイについては、Ｒａｔ１細胞（４×１０5）を１μｇのＴａｘ発現ベクター、１μｇのレ ポーターＣＡＴプラスミド、１μｇのｐＣＭＶβＤＮＡおよびび３μｇの超音波処理サケ精子担体ＤＮＡ（ｓｓ−ＤＮＡ）でトランスフェクトした。Ｒａｔ１由来安定トランスフェクト体（４×１０5）を１μｇのレポーターＣＡＴプラスミ ド、１μｇのｐＣＭＶβ ＤＮＡおよび４μｇのｓｓ−ＤＮＡでトランスフェク トした。トランスフェクション後４８時間に細胞を収穫し、β−ガラシトシダーゼ活性について正規化された細胞溶解物についてアッセイの直線範囲内でＣＡＴ活性を測定した（Gorman et al., 1982)。ＣＡＴ活性は、放射能分析イメージングシステム（Fuji BAS 2000）を用い、クロラムフェニコールの非アセチル化お よびアセチル化形態双方における放射能の合計量に対するクロラムフェニコールのアセチル化形態の放射能の合計量を比較することによって定量した。アッセイは、３ないし５の独立したトランスフェクションによって得られた溶解物で行った。
【００４０】
細胞の標識化および免疫沈降
細胞（約１.５×１０6細胞）をメチオニンおよびシステインを含まない培地中で３０分間インキュベート（３７℃）し、プレート当たり、Tran 35−Ｓ−標識 （ＩＣＮ）の２５０μＣｉで４時間標識した。標識した細胞を、溶解緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ７.５］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、４ｍＭ ＥＤＴＡ、０.５ｍＭ ＮａＦ、０.５ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム 、１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１ｍｌ当たり１μｇのロイペプチン）１ｍｌ中、１５ 分間氷上で溶解した。１２,０００×ｇにおける５分間の遠心によって細胞夾雑 物を除去した。正常マウスＩｇＧで被覆したプロテインＡ−セファロ−ス（Pharmacia)で得られた溶解物を予備清浄化し、上清を引き続いて４℃にて抗−Ｔａｘモノクローナル抗体（ＭＩ７３）と共に６０分間、４℃にてプロテインＡ−セファロ−スと共にインキュベートした。沈殿を溶解緩衝液で３回、高塩洗浄緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ７.５］、５００ｍＭＮａＣｌおよび１％ＮＰ −４０）で２回、および低塩緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ７.５］、 ５０ｍＭＮａＣｌおよび１％ＮＰ−４０）で１回洗浄した。９５℃で５分間加熱しつつ１×Laemmli試料緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ６.８］、２％ＳＤＳ、０.１％ブロモフェノールブルー、１０％グリセロールおよび５％メルカ プトエタノール）中にてタンパク質を溶出させた後、試料を７.５％ＳＤＳポリ アクリルアミドゲルで分画し、ゲルをフルオログラフィーによって加工し、オートラジオグラフィーによって可視化した。
【００４１】
抽出物の調製および電気泳動移動度シフトアッセイ
核抽出物は記載されているごとくに（Schreiber et al., 1989)、指数関数的 に増殖する細胞から調製した。タンパク質の濃度は、各結合反応が当量（約１０μｇ）のタンパク質で行われるようにＢＣＡタンパク質アッセイ（Pierce)で測 定した。用いた野生型κＢプローブは、ネズミ免疫グロブリンκ軽鎖エンハンサー（Kitajima et al., 1992)に由来する単一のκＢモチーフを含有する二本鎖オリゴヌクレオチド：
5’-AGCTTCAACAGAGGGGACTTTCCGAGAGGCTCGA-3’
であった。突然変異κＢプローブは、下線を施した部位においてＧの代わりにＣで単一塩基置換を含有する二本鎖オリゴヌクレオチド：
5’-AGCTTCAACAGAGGCGACTTTCCGAGAGGCTCGA-3’
であった。32Ｐ−放射性標識プローブは反応当たり２×１０4ｃｐｍで用いた。 抽出物は、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、５０ｍＭＮａＣｌ、０.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍｌ当たり０.１ｍｇウシ血清アルブミン、４％グリセロールおよび２μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）を含有する緩衝液中、氷上で２０分間プレインキュベートした。反応物を32Ｐ−標識プローブと共に３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、５％非変性ポリアクリルアミドゲルに負荷し、０.５×トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液で電気泳動に付した。スーパー シアトアッセイについては、放射能標識プローブの添加２０分前に、抽出物を氷上のサブユニット−特異的抗体１μｌと共にプレインキュベートした。抗−ＮＦＫＢ１（ｐ５０）抗体（ｓｃ−１１４Ｘ）、抗−ＲｅｌＡ抗体（ｓｃ−１０９Ｘ）、抗−ＮＦＫＢ２（ｐ５２）抗体（ｓｃ−２９８Ｘ）および抗−ｃ−Ｒｅｌ抗体（ｓｃ−７０Ｘ）はSanta Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA)から購 入した。
【００４２】
細胞分画
細胞分画は記載されているごとくに（Schreiber et al., 1989)行った。略言 すれば、約１×１０7の細胞を緩衝液Ａ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７.９］、 １０ｍＭ ＫＣｌ、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ジチオトレイトールおよび０.５ｍＭ ＰＭＳＦ）４００μｌに懸濁させた。細胞を氷上で１５分間膨潤させ、次いで、ＮＰ−４０の１０％溶液２５μｌを添加した。１５秒間撹拌混合した後、溶解物は、４℃における１２０００ｇでの９０秒間の遠心によって核を除き、上清を細胞質画分として用いた。ペレット化した核を緩衝液Ａで洗浄し、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７.９］、０.４Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭジチオトレイトールおよび１ｍＭＰＭＳＦ）１００μｌに再懸濁し、激しく撹拌し、４℃で３０分間かき混ぜた 。夾雑物を１２０００ｇにおける５分間の遠心によって除去し、上清を核画分として用いた。核および細胞質画分のイクォール細胞等量を免疫ブロット分析に付した。
【００４３】
軟寒天におけるコロニー形成およびヌードマウスにおける腫瘍化のアッセイ
固定−独立細胞増殖(anchorage-independent cell growth)の分析は、０.３３％低融点アガロース（Sea Plaque)１.５ｍｌ中の約１×１０4細胞の単細胞懸濁 液を０.５％アガロースベースを含有する６０ｍｍ組織培養皿上に重ねることに よって記載されているごとくに（Tanaka et al., 1990)行った。すべてのアガロース培地は１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭで作成した。二連のプレートを各テスト細胞系について調製し、３７℃における１４日間のインキュベーション後にコロニー形成について観察した。サイズが６０μｍを越える大きさのコロニーを陽性であるとスコア取りした。腫瘍化可能性は、細胞を４ないし６週齢のＢａｌｂ／ｃ無胸腺ヌードマウスに注入することによって記載されているごとくに（Tanaka et al., 1990)評価した。滅菌リン酸緩衝化生理食塩水０.１ｍｌに懸濁し た細胞（５×１０6）をマウスに皮下接種した。動物を６週間にわたって腫瘍形 成について規則的間隔でモニターし、腫瘍の直径が８ｍｍを越える場合に陽性とスコア化した。
【００４４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  各種Ｔａｘ突然変異体の模式図を示す。
【図２】  各種突然変異型Ｔａｘタンパク質が別個のプロモ−タ−構築体を選択的にトランス活性化することを示す図面に代わる写真である。％ conversionは ％変換を、fold stimulationは刺激倍数を示している。
【図３】  35Ｓ−標識Ｒａｔ１トランスフェクト体の免疫沈降の結果を示す図面に代わる写真である。
【図４】  位相差顕微鏡写真によるＲａｔ１トランスフェクト体の形態を示す図面に代わる写真である：（Ａ）ＮＲＲａｔｃ１−２細胞；（Ｂ）Ｗ４細胞；（Ｃ）４０Ｍ−３細胞；（Ｄ）Ｍ１４８−８細胞；（Ｅ）Ｍ３１９−１２細胞；（Ｆ）Ｍ３５３ＶＰ−１１細胞。
【図５】  Ｒａｔ１トランスフェクト体により産生されるＣＡＴ活性を示すグラフである。
【図６】  （Ａ）種々の細胞系から抽出した核抽出物および放射線標識−野生型κＢ−オリゴヌクレオチドの電気泳動シフト検定（ＥＭＳＡ）の結果を示す図面に代わる写真である。（Ｂ）核タンパク質−ＤＮＡ複合体に特徴的なＥＭＳＡの結果を示す図面に代わる写真である。
【図７】  （Ａ）Ｒａｔ１トランスフェクト体におけるＮＦＫＢ２タンパク質レベルの免疫ブロット分析の結果を示す図面に代わる写真である。（Ｂ）Ｒａｔ１トランスフェクト体から調製した核および細胞質画分の免疫ブロット分析の結果を示す図面に代わる写真である。
【図８】  ＴａｘおよびＮＦＫＢ２の両者を安定に発現するＲａｔ１細胞から産生されるＣＡＴ活性のグラフである。
【図９】図９：位相差顕微鏡写真によるＴａｘおよびＮＦＫＢ２を共発現するトランスフェクト体の形態を示す図面に代わる写真である。
【図１】
0003778983.tif 000003
【図２】
0003778983.tif 000004
【図３】
0003778983.tif 000005
【図４】
0003778983.tif 000006
【図５】
0003778983.tif 000007
【図６】
0003778983.tif 000008
【図７】
0003778983.tif 000009
【図８】
0003778983.tif 000010
【図９】
0003778983.tif 000011