(57)【要約】  本発明は、より的確にロタウイルスＡの遺伝子型を検出することが可能な、新たな遺伝子検出用プライマーと、これを用いた検出手段の提供することを課題し、（Ａ）ロタウイルスＡのＧ１型の基準株のＶＰ７遺伝子分節の塩基配列における１７４−８３４番目を塩基配列カウントの基準として：（１）８０２−８３４番目（Ｇ３型対応）、（２）７４７−７８９番目（ウマ様Ｇ３型対応）、（３）６０３−６３６番目（Ｇ９型対応）、及び、（４）６６６−７１１番目（Ｇ１２型対応）から選ばれる１−４種の塩基配列の領域に対してそれぞれに整合しているセンスプライマーを基本的な遺伝子増幅用のセンスプライマーとして用い、並びに、（Ｂ）上記の８８３−１０６２番目をカウントの基準として、当該塩基配列の領域に対してそれぞれに整合している遺伝子増幅用の共通アンチセンスプライマーとして用いる、ロタウイルスの遺伝子型の検出方法、これに用いる遺伝子増幅用プライマーセット、及び、遺伝子型検出用キットを提供する。
2020071419.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）  ロタウイルスＡのＧ１型の基準株（Ｗａ株/Ｋ０２０３３）のＶＰ７遺伝子分節（セグメント９）の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列におけるプラス鎖の塩基配列の１７４−８３４番目を塩基配列カウントの基準として：
（１）ロタウイルスＡのＧ３型（ヒトロタウイルス）の基準株（ＡＵ−１／Ｄ８６２７１）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の８０２−８３４番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上、
（２）ロタウイルスＡのウマ様Ｇ３型（ウマ様ロタウイルス）の基準株（Ｓ１３−３０／ＫＪ６３９０１７）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の７４７−７８９番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上、
（３）ロタウイルスＡのＧ９型の基準株（Ｂ３４５８／ＥＦ９９０７０８）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の６０３−６３６番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上、
（４）ロタウイルスＡのＧ１２型の基準株（Ｄｈａｋａ２５／ＤＱ１４６６５４）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の６６６−７１１番目の塩基配列（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上、
における上記（１）−（４）の１−４種から選ばれるセンスプライマー；並びに、
（Ｂ）  上記Ｇ１型の基準株のプラス鎖の塩基配列の８８３−１０６２番目をカウントの基準として、当該塩基配列の領域に対してそれぞれに整合している上記（１）−（４）において記載されたロタウイルスＡの基準株のプラス鎖、にハイブリダイズする共通アンチセンスプライマーから選ばれる１種又は２種以上；
上記（Ａ）のセンスプライマー及び（Ｂ）共通アンチセンスプライマー、を含めて遺伝子増幅用プライマーとして用いた遺伝子増幅手段を、検体から得られる遺伝子に対して施して得られる遺伝子増幅産物を用いてロタウイルスの遺伝子型を検出する、検出方法。
【請求項２】
前記（Ａ）（１）の、ロタウイルスＡのＧ３型（ヒトロタウイルス）の基準株（ＡＵ−１／Ｄ８６２７１）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の８０２−８３４番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号３で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記（Ａ）（２）の、ロタウイルスＡのウマ様Ｇ３型（ウマ様ロタウイルス）の基準株（Ｓ１３−３０／ＫＪ６３９０１７）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の７４７−７８６番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号４で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記（Ａ）（３）の、ロタウイルスＡのＧ９型の基準株（Ｂ３４５８／ＥＦ９９０７０８）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の６０３−６３６番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号７で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記（Ａ）（４）の、ロタウイルスＡのＧ１２型の基準株（Ｄｈａｋａ２５／ＤＱ１４６６５４）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の６６６−７１０番目の塩基配列（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号８で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記（Ａ）のセンスプライマーとして、さらに下記（５）−（８）から選ばれる１−４種を追加して用いる、請求項１又は２に記載の検出方法：
（５）ロタウイルスＡのＧ１型の基準株（Ｗａ株/Ｋ０２０３３）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の２９７−３３８番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上、
（６）ロタウイルスＡのＧ２型の基準株（ＫＵＮ/Ｄ５０１２４）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の３９９−４３８番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上、
（７）ロタウイルスＡのＧ４型の基準株（ＢｒＢ−９／ＧＵ５６５０９０）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の４６８−５０７番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上、
（８）ロタウイルスＡのＧ８型の基準株（ＮＰ−１３０／ＬＣ１６９９２３）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の１７４−２１０番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上。
【請求項４】
前記（Ａ）（５）の、ロタウイルスＡのＧ１型の基準株（Ｗａ株/Ｋ０２０３３）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の２９７−３３８番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号１で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記（Ａ）（６）の、ロタウイルスＡのＧ２型の基準株（ＫＵＮ/Ｄ５０１２４）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の４０１−４３８番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号２で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記（Ａ）（７）の、ロタウイルスＡのＧ４型の基準株（ＢｒＢ−９／ＧＵ５６５０９０）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の４６８−５０１番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号５で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記（Ａ）（８）の、ロタウイルスＡのＧ８型の基準株（ＮＰ−１３０／ＬＣ１６９９２３）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の１７４−２１０番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号６で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーである、請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
前記（Ｂ）の共通アンチセンスプライマーは、配列番号９で表される塩基配列の一部又は全部を含む共通アンチセンスプライマーである、請求項１−４のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項６】
前記遺伝子増幅手段は、Ｎｅｓｔｅｄ-ＰＣＲ法の第２の増幅工程であり、ＲＴ−ＰＣＲ法による第１の増幅工程において、（１）ロタウイルスＡのＧ１型の基準株（Ｗａ株/Ｋ０２０３３）のＶＰ７遺伝子分節（セグメント９）の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列におけるプラス鎖の塩基配列の１−７２番目を塩基配列カウントの基準として、当該塩基配列の全部又は一部のそれぞれに整合している、検出対象である遺伝子型が異なるロタウイルスＡの基準株のプラス鎖の塩基配列に対応するマイナス鎖、にハイブリダイズする共通アウターセンスプライマー、並びに、（２）上記Ｇ１型の基準株のプラス鎖の塩基配列の８８３−１０６２番目を塩基配列カウントの基準として、当該塩基配列の全部又は一部に整合している、検出対象である遺伝子型が異なるロタウイルスＡの基準株のプラス鎖の塩基配列に対してハイブリダイズする共通アウターアンチセンスプライマー、を遺伝子増幅用プライマーとして用いて得られた第１の増幅工程による遺伝子増幅産物を、上記第２の増幅工程における鋳型として用いる、請求項１−５のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項７】
ロタウイルスの遺伝子型の検出を目的とした、下記（１）−（４）の１−４種から選ばれるセンスプライマーを含む、遺伝子増幅用プライマーセット：
ロタウイルスＡのＧ１型の基準株（Ｗａ株/Ｋ０２０３３）のＶＰ７遺伝子分節（セグメント９）の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列におけるプラス鎖の塩基配列の１７４−８３４番目を塩基配列カウントの基準として：
（１）ロタウイルスＡのＧ３型（ヒトロタウイルス）の基準株（ＡＵ−１／Ｄ８６２７１）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の８０２−８３４番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上、
（２）ロタウイルスＡのウマ様Ｇ３型（ウマ様ロタウイルス）の基準株（Ｓ１３−３０／ＫＪ６３９０１７）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の７４７−７８９番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上、
（３）ロタウイルスＡのＧ９型の基準株（Ｂ３４５８／ＥＦ９９０７０８）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の６０３−６３６番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上、
（４）ロタウイルスＡのＧ１２型の基準株（Ｄｈａｋａ２５／ＤＱ１４６６５４）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の６６６−７１１番目の塩基配列（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上。
【請求項８】
前記（１）の、ロタウイルスＡのＧ３型（ヒトロタウイルス）の基準株（ＡＵ−１／Ｄ８６２７１）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の８０２−８３４番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号３で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記（２）の、ロタウイルスＡのウマ様Ｇ３型（ウマ様ロタウイルス）の基準株（Ｓ１３−３０／ＫＪ６３９０１７）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の７４７−７８６番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号４で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記（３）の、ロタウイルスＡのＧ９型の基準株（Ｂ３４５８／ＥＦ９９０７０８）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の６０３−６３６番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号７で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記（４）の、ロタウイルスＡのＧ１２型の基準株（Ｄｈａｋａ２５／ＤＱ１４６６５４）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の６６６−７１０番目の塩基配列（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号８で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーである、請求項７に記載の遺伝子増幅用プライマーセット。
【請求項９】
前記センスプライマーとして、さらに下記（５）−（８）から選ばれる１−４種が追加されてなる、請求項７又は８に記載の遺伝子増幅用プライマーセット：
（５）ロタウイルスＡのＧ１型の基準株（Ｗａ株/Ｋ０２０３３）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の２９７−３３８番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上、
（６）ロタウイルスＡのＧ２型の基準株（ＫＵＮ/Ｄ５０１２４）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の３９９−４３８番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上、
（７）ロタウイルスＡのＧ４型の基準株（ＢｒＢ−９／ＧＵ５６５０９０）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の４６８−５０７番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上、
（８）ロタウイルスＡのＧ８型の基準株（ＮＰ−１３０／ＬＣ１６９９２３）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の１７４−２１０番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上。
【請求項１０】
前記（５）の、ロタウイルスＡのＧ１型の基準株（Ｗａ株/Ｋ０２０３３）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の２９７−３３８番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号１で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記（６）の、ロタウイルスＡのＧ２型の基準株（ＫＵＮ/Ｄ５０１２４）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の４０１−４３８番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号２で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記（７）の、ロタウイルスＡのＧ４型の基準株（ＢｒＢ−９／ＧＵ５６５０９０）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の４６８−５０１番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号５で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記（８）の、ロタウイルスＡのＧ８型の基準株（ＮＰ−１３０／ＬＣ１６９９２３）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の１７４−２１０番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号６で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーである、請求項９に記載の遺伝子増幅用プライマーセット。
【請求項１１】
前記センスプライマーに関する（１）−（４）の全て、及び、（５）−（８）の１種又は２種以上、を含む、請求項７−１０のいずれか１項に記載の遺伝子増幅用プライマーセット。
【請求項１２】
前記センスプライマーと共に、ロタウイルスＡのＧ１型の基準株（Ｗａ株/Ｋ０２０３３）のＶＰ７遺伝子分節（セグメント９）の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列におけるプラス鎖の塩基配列の８８３−１０６２番目をカウントの基準として、当該塩基配列の領域に対してそれぞれに整合している上記ロタウイルスＡの基準株のプラス鎖、にハイブリダイズする１種又は２種以上の共通アンチセンスプライマー、を含む、請求項７−１１のいずれか１項に記載の遺伝子増幅用プライマーセット。
【請求項１３】
前記共通アンチセンスプライマーは、配列番号９で表される塩基配列の一部又は全部を含む共通アンチセンスプライマーである、請求項１２に記載の遺伝子増幅用プライマーセット。
【請求項１４】
前記遺伝子増幅用プライマーセットが、Ｎｅｓｔｅｄ-ＰＣＲ法の第２の増幅工程に用いるプライマーセットとして含まれ、かつ、（１）ロタウイルスＡのＧ１型の基準株（Ｗａ株/Ｋ０２０３３）のＶＰ７遺伝子分節（セグメント９）の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列におけるプラス鎖の塩基配列の１−７２番目を塩基配列カウントの基準として、当該塩基配列の全部又は一部のそれぞれに整合している、検出対象である遺伝子型が異なるロタウイルスＡの基準株のプラス鎖の塩基配列に対応するマイナス鎖、にハイブリダイズする共通アウターセンスプライマー、並びに、（２）上記Ｇ１型の基準株のプラス鎖の塩基配列の８８３−１０６２番目を塩基配列カウントの基準として、当該塩基配列の全部又は一部に整合している、検出対象である遺伝子型が異なるロタウイルスＡの基準株のプラス鎖の塩基配列に対してハイブリダイズする共通アウターアンチセンスプライマー、をＲＴ−ＰＣＲ法によるＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法の第１の増幅工程に用いるプライマーセットとして含まれる、請求項７−１３のいずれか１項に記載の遺伝子増幅用プライマーセット。
【請求項１５】
前記（１）の共通アウターセンスプライマーは、配列番号１０で表される塩基配列の一部又は全部を含む共通センスプライマーである、請求項１４に記載の遺伝子増幅用プライマーセット。
【請求項１６】
前記（２）の共通アウターアンチセンスプライマーは、配列番号１１で表される塩基配列の一部又は全部を含む共通アンチセンスプライマーである、請求項１４又は１５に記載の遺伝子増幅用プライマーセット。
【請求項１７】
全ての遺伝子増幅用プライマーは、１０−４０塩基長である、請求項７−１６のいずれか１項に記載の遺伝子増幅用プライマーセット。
【請求項１８】
請求項７−１７のいずれか１項に記載の遺伝子増幅用プライマーセットを含む、ロタウイルスの遺伝子型検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスの遺伝子型検出手段に関する発明であり、より具体的には、ロタウイルス、特にロタウイルスＡの遺伝子型検出方法と、これに用いる遺伝子増幅用プライマーセット、さらに当該プライマーセットを含んだ遺伝子型検出用キットに関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
ロタウイルスは、様々な哺乳動物や鳥類に急性胃腸炎を起こすウイルスで、レオウイルス科(Reoviriade family)に属している。さらにロタウイルスには、内殻蛋白ＶＰ６について血清学的な交差反応を示さない９種の群（Ａ−I）が存在する。これらのうち、検出頻度が最も高い群に属するロタウイルスは、ロタウイルスＡ（ＲＶＡ）である。【０００３】
ＲＶＡは、世界中の乳幼児の胃腸炎の主要な原因となっている。２０１６年における、ＲＶＡによる、５歳未満の子供の世界的な死亡者数は１２８，５００人であった（Troeger JAMA Pediatr. 2018 Aug 13. doi: 10.1001/jamapediatrics.2018.1960.）。ＲＶＡは、日本を含む先進国においても大きな問題となっている（Nakagomi et al., Jpn J InfectDis 2013, 66(4), 269-275）。【０００４】
ＲＶＡは、患者の糞便中に十分量のウイルスが存在するので、臨床的な診断にはイムノクロマト法による簡易検査キットで十分であるが、遺伝子型診断は、分子疫学的な研究や、ワクチン接種後の遺伝子型流行の変化等の調査のために必要である。【０００５】
既に、２つの弱毒化生ＲＶＡワクチンが日本で導入されている（Ｒｏｔａｒｉｘ：２０１１年１１月およびＲｏｔａＴｅｑ：２０１２年７月）。ＲＶＡワクチンは有効であるが（非特許文献１−４）、ワクチンの選択圧が流行株のシフトを誘発する可能性がある。従って、ＲＶＡの遺伝子型分布の変化の調査監視（サーベイランス）が、ますます重要になってきている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Lambert et al., Med J Aust 2009, 191(3), 157-160.
【非特許文献２】Leshem et al., Pediatrics 2014, 134(1), 15-23.
【非特許文献３】Karafillakis et al., Vaccine 2015, 33(18), 2097-2107.
【非特許文献４】Fujii et al., BMC Pediatr 2017, 17(1), 156.
【非特許文献５】Gouvea et al., J Clin Microbiol 1990, 28(2), 276-282.
【非特許文献６】Mitui et al., Virol J 2012, 9, 144
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ロタウイルスＡ（ＲＶＡ）の遺伝子型分布のサーベイランスを行う手段として、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法により得られた遺伝子増幅産物の解析による遺伝子型別検出法が用いられている。特に、まず第１段階のＲＴ-ＰＣＲで得られた、検体中のＲＶＡの遺伝子増幅産物を、さらに、ＲＶＡの遺伝子型特異的プライマーを用いて、第２段階のＰＣＲを行って、ＲＶＡの遺伝子型特異的遺伝子を増幅するネステッド(nested)ＰＣＲ法が用いられている。この第２段階のＰＣＲに用いられる遺伝子増幅用プライマーとして、Gouveaらが１９９０年に報告したＶＰ７プライマーセットが、今もなお世界中で使用されている（非特許文献５）。しかしながら、現在に至るまでプライマー配列はほとんど改善されていないことから、このプライマーセットによってＲＶＡ株が誤判定される遺伝子型も存在することが報告されている（Mitui et al., Virol J 2012, 9, 144）。上記のように、ＲＶＡワクチンの接種が行われて流行株が変動しつつあり、より的確にＲＶＡの遺伝子型を検出することが可能な、新たな遺伝子検出用プライマーの提供が必要となっている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題の解決に向けて検討を行った結果、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法を用いたＲＶＡの遺伝子型検出において、ＲＶＡの遺伝子型各々に対する特異性が高く、すなわち、所望の遺伝子型以外と交差反応を起こさず誤判定を起こさずに、サンプル中のＲＶＡの遺伝子型を的確に検出可能な遺伝子増幅用プライマーをデザインすることが可能なＲＶＡの遺伝子小領域を、それぞれ対応するＲＶＡ遺伝子型と共に見出し、当該遺伝子増幅用プライマーを用いるＲＶＡの遺伝子型検出方法と、当該遺伝子検出用プライマーセットを提供することに成功した。【０００９】
本発明は、（１）ＲＶＡの遺伝子型検出方法（本発明の検出方法ともいう）、（２）当該検出方法に用いるための遺伝子増幅用プライマーセット（本発明のプライマーセットともいう）、及び、（３）当該プライマーセットを含むＲＶＡの遺伝子型検出用キット（本発明のキットともいう）、を含んでいる。【００１０】
＜本発明の検出方法＞
本発明の検出方法は、下記の「センスプライマー（Ａ）」と「共通アンチセンスプライマー（Ｂ）」を用いるロタウイルスの遺伝子型の検出方法である。【００１１】
センスプライマー（Ａ）は、
（Ａ）  ロタウイルスＡのＧ１型の基準株（Ｗａ株/Ｋ０２０３３）のＶＰ７遺伝子分節（セグメント９）の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列におけるプラス鎖の塩基配列の１７４−８３４番目を塩基配列カウントの基準として、
（１）ロタウイルスＡのＧ３型（ヒトロタウイルス）の基準株（ＡＵ−１／Ｄ８６２７１）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の８０２−８３４番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上；
（２）ロタウイルスＡのウマ様Ｇ３型（ウマ様ロタウイルス）の基準株（Ｓ１３−３０／ＫＪ６３９０１７）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の７４７−７８９番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上；
（３）ロタウイルスＡのＧ９型の基準株（Ｂ３４５８／ＥＦ９９０７０８）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の６０３−６３６番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上；
（４）ロタウイルスＡのＧ１２型の基準株（Ｄｈａｋａ２５／ＤＱ１４６６５４）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の６６６−７１１番目の塩基配列（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上；
であり、並びに、
共通アンチセンスプライマー（Ｂ）は、
（Ｂ）  上記Ｇ１型の基準株のプラス鎖の塩基配列の８８３−１０６２番目をカウントの基準として、当該塩基配列の領域に対してそれぞれに整合している上記（１）−（４）において記載されたロタウイルスＡの基準株のプラス鎖、にハイブリダイズする共通アンチセンスプライマーから選ばれる１種又は２種以上である。【００１２】
本発明の検出方法は、上記（Ａ）のセンスプライマー及び（Ｂ）共通アンチセンスプライマー、を含めて遺伝子増幅用プライマーとして用いた遺伝子増幅手段を、検体から得られる遺伝子に対して施して得られる遺伝子増幅産物を用いてロタウイルスの遺伝子型を検出する検出方法である。【００１３】
本発明の検出方法においては、上記の（１）−（４）に加えて、さらに下記（５）−（８）から選ばれる１−４種を追加してセンスプライマー（Ａ）として用いることができる（以下、これらを「追加のセンスプライマー」ともいう）。
（５）ロタウイルスＡのＧ１型の基準株（Ｗａ株/Ｋ０２０３３）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の２９７−３３８番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上；
（６）ロタウイルスＡのＧ２型の基準株（ＫＵＮ/Ｄ５０１２４）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の３９９−４３８番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上；
（７）ロタウイルスＡのＧ４型の基準株（ＢｒＢ−９／ＧＵ５６５０９０）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の４６８−５０７番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上；
（８）ロタウイルスＡのＧ８型の基準株（ＮＰ−１３０／ＬＣ１６９９２３）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の１７４−２１０番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上。【００１４】
ＲＶＡのＧ１型基準株は、上記の「Ｗａ株/Ｋ０２０３３」により規定される。「Ｗａ株」は株の名称であり、「Ｋ０２０３３」は当該株のＲＶＡのＶＰ７遺伝子のＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号である。本明細書中の他の遺伝子型のＲＶＡ基準株も同様の形式で開示した。ＧｅｎＢａｎｋにおける当該塩基配列は、いずれの遺伝子型もｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡ（プラス鎖）であり、塩基のＵ（ウラシル）は便宜上Ｔ（チミン）として記載されている。例えば、サイト「https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/」において、上記「K02033」（半角）を検索すれば、Ｗａ株のＶＰ７遺伝子の塩基配列がヒットして、その塩基配列を特定することができる。【００１５】
「塩基配列カウントの基準」とは、他の遺伝子型のＲＶＡ基準株を含めて塩基配列の番号を数える基準とすることであり、検出対象として選択されたＧ１型以外のＲＶＡ基準株の塩基配列は、Ｇ１型基準株のＶＰ７遺伝子の塩基配列に対して整合（アライメント）された状態で特定される。Ｇ１型基準株のＶＰ７遺伝子の塩基配列に対する、塩基の欠失や挿入が伴う場合には、それらを含んで塩基配列番号がカウントされる。例えば、ＲＶＡのＧ９型基準株（Ｂ３４５８／ＥＦ９９０７０８）は、Ｇ１型の１０２８番目の塩基に相応する塩基が欠失しており、塩基配列が整合されたＧ１型の８８３−１０６２番目の塩基配列領域に対応するＧ９型の塩基配列領域は、８８３−１０６１番目として特定される。この場合、Ｇ９型の８８３−１０２７番目の領域の塩基は、Ｇ１型の８８３−１０２７番目の塩基にそのまま整合されている。しかしながら、Ｇ１型の１０２８番目の塩基に対応するＧ９型の塩基（欠失）はスキップされて、Ｇ９型の１０２８番目の塩基がＧ１型の１０２９番目の塩基に整合され、以降、Ｇ９型の１０２８−１０６１番目の塩基が、Ｇ１型の１０２９−１０６２番目の塩基に整合する。なお、この「塩基配列カウントの基準」は、カウントの相対的な方式であり、カウントの基準株としてＧ１型以外を用いることも可能であり、その場合も、本発明の実質的な内容は全く同一である。【００１６】
所定の基準株の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡに対するハイブリダイズとは、対象となるプライマーが、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法における遺伝子増幅用プライマーとして働くように、鋳型となる対象核酸にハイブリダイズするという意味である。完全に相補的である場合は当然に含まれるが、概ね１５％以内（例えば、２０塩基長の遺伝子増幅用プライマーであれば３塩基以内）の非相補的な塩基があっても許容される。対象核酸にＲＮＡが含まれるのは、いずれの遺伝子増幅方法を用いる場合でも、初発の鋳型となる対象核酸はＲＶＡの二本鎖ＲＮＡとなるからであり、例えば、ＰＣＲ法を基礎とする遺伝子増幅手段を用いる場合は、初発の遺伝子増幅手段はＲＴ−ＰＣＲ法となるからである。【００１７】
また、遺伝子増幅用プライマーのハイブリダイズする領域は、当該プライマーの全部であっても一部分であってもよい。例えば、選択される遺伝子増幅手段に適したタグ配列等の修飾が遺伝子増幅プライマーに対して施されていてもよい。【００１８】
追加のセンスプライマーを加えたセンスプライマー（Ａ）について規定された、上記の８箇所の塩基配列領域における、ＲＶＡの遺伝子型の基準株に対応するセンスプライマーは１種又は２種以上であり、同一領域に２種以上のセンスプライマーを対応させて用いることも可能である。例えば、センスプライマー中の特定の塩基を多様化させた（例えば、特定の塩基をＡ又はＧとする）、ミックスプライマーとして、同一の基準株に対応する複数種類のセンスプライマーを同一塩基配列領域に対応させて用いることができる。【００１９】
本発明の検出方法において用いられる「遺伝子増幅手段」は限定されず、例えば、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ法、さらにこれらの遺伝子増幅法を基礎とした方法が挙げられる。現在、提供されている遺伝子増幅法にも限定されず、本発明を適用可能な将来において提供される遺伝子増幅方法も、本発明の「遺伝子増幅手段」に含まれる。本発明を適用する具体的な遺伝子増幅手段に応じた特有の条件と共に、本発明の検出方法を行うことができる。【００２０】
本発明においては、ＰＣＲ法を基礎とした遺伝子増幅手段は好適に用いられる態様の一つである。具体的に例示すれば、ＰＣＲ法とＲＴ−ＰＣＲ法を用いることが可能であり、さらに、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法、Ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を好適に用いることが可能であるがこれらに限定されるものではない。また、本発明の検出方法は、各々が対応するＲＶＡの遺伝子型に対する特異性は非常に高く、複数のＲＶＡの遺伝子型に対応する２種以上の、追加のセンスプライマーを含み得るセンスプライマー（Ａ）と共通アンチセンスプライマー（Ｂ）を、サーマルサイクラー中で一緒に反応させるマルチプレックス（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲ法として実行しても、感度良くＲＶＡの遺伝子型の検出を行うことができる。【００２１】
一般的に、マルチプレックスＰＣＲ法において用いられる遺伝子増幅用プライマーの種類が多いほど、的確な遺伝子型の検出は、誤検出の危険性が相乗的に高まり困難である。本発明の検出方法において用いられる遺伝子増幅用プライマーは、ＲＶＡのそれぞれ対応する遺伝子型に対する特異性が高く、複数、例えば３−８種の異なるＲＶＡの遺伝子型に対応するセンスプライマーを用いるマルチプレックスＰＣＲ法を行っても、誤検出の危険性を低く抑えることができる。特に、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法（Ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を含む）の第２の増幅工程において、追加のセンスプライマーを含み得るセンスプライマー（Ａ）をネステッドセンスプライマーとして、共通アンチセンスプライマー（Ｂ）を共通ネステッドアンチセンスプライマーとして用いる場合には、好適に本発明の検出方法を行うことができる。【００２２】
遺伝子増幅法としてＮｅｓｔｅｄ-ＰＣＲ法（Ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を含む）を用いず、ＲＶＡ遺伝子（二本鎖ＲＮＡ）に対して直接に遺伝子増幅法を行う場合には、上記の「追加のセンスプライマーを含み得るセンスプライマー（Ａ）」と「共通アンチセンスプライマー（Ｂ）」のセット、を用いたＲＴ−ＰＣＲ法を実行することで、本発明の検出方法を行うことができる。【００２３】
遺伝子増幅法としてＮｅｓｔｅｄ-ＰＣＲ法（Ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を含む）を用いる場合について、さらに具体的に述べる。この場合は、上記の「追加のセンスプライマーを含み得るセンスプライマー（Ａ）」と「共通アンチセンスプライマー（Ｂ）」のセットをＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法（Ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を含む）の第２の増幅工程に用いて、センスプライマー（Ａ）をネステッドセンスプライマーとして、共通アンチセンスプライマー（Ｂ）を共通ネステッドアンチセンスプライマーとして用いることは上述した通りである。【００２４】
そして、ＲＴ−ＰＣＲ法による第１の増幅工程において、（１）ロタウイルスＡのＧ１型の基準株（Ｗａ株/Ｋ０２０３３）のＶＰ７遺伝子分節（セグメント９）の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列におけるプラス鎖の塩基配列の１−７２番目を塩基配列カウントの基準として、当該塩基配列の全部又は一部のそれぞれに整合している、検出対象である遺伝子型が異なるロタウイルスＡの基準株のプラス鎖の塩基配列に対応するマイナス鎖、にハイブリダイズする共通アウターセンスプライマー、並びに、（２）上記Ｇ１型の基準株のプラス鎖の塩基配列の８８３−１０６２番目を塩基配列カウントの基準として、当該塩基配列の全部又は一部に整合している、検出対象である遺伝子型が異なるロタウイルスＡの基準株のプラス鎖の塩基配列に対してハイブリダイズする共通アウターアンチセンスプライマー、を遺伝子増幅用プライマーとして用いて得られた第１の増幅工程による遺伝子増幅産物を、上記第２の増幅工程における鋳型として用いることで、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法（Ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を含む）を本発明の検出方法に対して適用することができる。【００２５】
本発明の検出方法において、ハイブリダイズの確認のために選択されるべきＲＶＡの基準株の種類は特に限定されず、例えば、Ｇ３型（ヒトロタウイルス）の基準株（ＡＵ−１／Ｄ８６２７１）、ウマ様Ｇ３型（ウマ様ロタウイルス）の基準株（Ｓ１３−３０／ＫＪ６３９０１７）、Ｇ９型の基準株（Ｂ３４５８／ＥＦ９９０７０８）、Ｇ１２型の基準株（Ｄｈａｋａ２５／ＤＱ１４６６５４）が例示され、さらに、Ｇ１型の基準株（Ｗａ株/Ｋ０２０３３）、Ｇ２型の基準株（ＫＵＮ/Ｄ５０１２４）、Ｇ４型の基準株（ＢｒＢ−９／ＧＵ５６５０９０）、Ｇ８型の基準株（ＮＰ−１３０／ＬＣ１６９９２３）等が例示される。【００２６】
これらの中でも、少なくとも「Ｇ３型（ヒトロタウイルス）、ウマ様Ｇ３型（ウマ様ロタウイルス）、Ｇ９型、及びＧ１２型」、さらに絞り込むとすれば、「Ｇ３型（ヒトロタウイルス）、ウマ様Ｇ３型（ウマ様ロタウイルス）、及びＧ９型」を、検出対象となるＲＶＡの基準株の選択の基礎とすることが、本発明の検出方法の基本的な実施形態のうち好適なものである。そして、これらに「Ｇ１型、Ｇ２型、Ｇ４型、及びＧ８型」、さらに絞り込むとすれば「Ｇ１型、Ｇ２型、及びＧ８型」を加えて、ＲＶＡの基準株として選択することも好適な態様である。可能な限り幅広く効率的にＲＶＡの遺伝子型の検出をする、という観点から、実施例に開示したように、「Ｇ３型（ヒトロタウイルス）、ウマ様Ｇ３型（ウマ様ロタウイルス）、Ｇ９型、Ｇ１２型、Ｇ１型、Ｇ２型、Ｇ４型、及びＧ８型」と全ての遺伝子型の基準株を選択することも、好適な態様である。【００２７】
共通アンチセンスプライマーの作出において共通ハイブリダイズが確認されるべきＲＶＡの基準株は、上記のセンスプライマーにおいて選択された基準株と一致する。【００２８】
上述した、全ての遺伝子増幅用プライマーは、遺伝子増幅手段がＰＣＲ法を基礎とする方法の場合、１０−４０塩基長であることが好適であり、さらに好適には１５−３０塩基長である。ＰＣＲ法以外の遺伝子増幅方法を用いる場合には、当該他の遺伝子増幅方法に適した遺伝子増幅用プライマーの塩基長を選択することができる。【００２９】
本発明の検出方法を適用するべき検体は、ロタウイルスが存在する可能性のある、生体から分離されたサンプルや、培養細胞等で増幅・維持されたウイルスを含む研究用培地等であり、具体的には、糞便、吐瀉物、血液、髄液、母乳、研究用培地、環境中（食品、食器、衣服、おむつ、下水、河川水等）等からのサンプルが例示される。これらのサンプルは、いずれも生体とは分離している。【００３０】
＜本発明のプライマーセット＞
本発明のプライマーセットは、上述した本発明の検出方法を行うための遺伝子増幅用プライマーセットである。具体的には、下記の態様があるが、それぞれの態様は、上述した本発明の検出方法に用いられる遺伝子増幅用プライマーとして用いることができる。【００３１】
（Ｉ）−１：基本的なセンスプライマーセット
ロタウイルスの遺伝子型の検出を目的とした、下記（Ａ）（１）−（４）の１−４種から選ばれるセンスプライマーを含む、遺伝子増幅用プライマーセットである。【００３２】
ロタウイルスＡのＧ１型の基準株（Ｗａ株/Ｋ０２０３３）のＶＰ７遺伝子分節（セグメント９）の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列におけるプラス鎖の塩基配列の１７４−８３４番目を塩基配列カウントの基準として、
（Ａ）（１）ロタウイルスＡのＧ３型（ヒトロタウイルス）の基準株（ＡＵ−１／Ｄ８６２７１）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の８０２−８３４番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上；
（Ａ）（２）ロタウイルスＡのウマ様Ｇ３型（ウマ様ロタウイルス）の基準株（Ｓ１３−３０／ＫＪ６３９０１７）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の７４７−７８９番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上；
（Ａ）（３）ロタウイルスＡのＧ９型の基準株（Ｂ３４５８／ＥＦ９９０７０８）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の６０３−６３６番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上；
（Ａ）（４）ロタウイルスＡのＧ１２型の基準株（Ｄｈａｋａ２５／ＤＱ１４６６５４）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の６６６−７１１番目の塩基配列（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上。【００３３】
（Ｉ）−２：追加のセンスプライマーを含み得るセンスプライマーセット
上記の基本的センスプライマーセットに、さらに下記（Ａ）（５）−（８）から選ばれる１−４種のセンスプライマー（追加のセンスプライマー）が追加されてなる遺伝子増幅用プライマーセットである。【００３４】
（Ａ）（５）ロタウイルスＡのＧ１型の基準株（Ｗａ株/Ｋ０２０３３）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の２９７−３３８番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上；
（Ａ）（６）ロタウイルスＡのＧ２型の基準株（ＫＵＮ/Ｄ５０１２４）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の３９９−４３８番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上；
（Ａ）（７）ロタウイルスＡのＧ４型の基準株（ＢｒＢ−９／ＧＵ５６５０９０）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の４６８−５０７番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上；
（Ａ）（８）ロタウイルスＡのＧ８型の基準株（ＮＰ−１３０／ＬＣ１６９９２３）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の１７４−２１０番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの１種又は２種以上。【００３５】
上記の追加のセンスプライマーを加えたセンスプライマー（Ａ）について規定された、上記の８箇所の塩基配列領域における、ＲＶＡの遺伝子型の基準株に対応するセンスプライマーは１種又は２種以上であり、同一領域に２種以上のセンスプライマーを対応させたものをセンスプライマーセットの構成として用いることも可能である。例えば、センスプライマー中の特定の塩基を多様化させた（例えば、特定の塩基をＡ又はＧとする）、ミックスプライマーとして、同一の基準株に対応する複数種類のセンスプライマーを同一塩基配列領域に対応させて揃えたセンスプライマーセットを用いることができる。【００３６】
上記した中でも、少なくとも「Ｇ３型（ヒトロタウイルス）、ウマ様Ｇ３型（ウマ様ロタウイルス）、Ｇ９型、及びＧ１２型」、さらに絞り込むとすれば、「Ｇ３型（ヒトロタウイルス）、ウマ様Ｇ３型（ウマ様ロタウイルス）、及びＧ９型」を、検出対象となるＲＶＡの基準株の選択の基礎とすることが、センスプライマーセットとしての基本的な実施形態のうち好適なものである。そして、これらに「Ｇ１型、Ｇ２型、Ｇ４型、及びＧ８型」、さらに絞り込むとすれば「Ｇ１型、Ｇ２型、及びＧ８型」を加えて、ＲＶＡの基準株として選択したセンスプライマーセットとすることも好適である。可能な限り幅広く効率的にＲＶＡの遺伝子型の検出をする、という観点から、実施例に開示したように、「Ｇ３型（ヒトロタウイルス）、ウマ様Ｇ３型（ウマ様ロタウイルス）、Ｇ９型、Ｇ１２型、Ｇ１型、Ｇ２型、Ｇ４型、及びＧ８型」と全ての遺伝子型の基準株に対して対応可能なセンスプライマーセットも、好適である。【００３７】
上記のセンスプライマーセット（Ｉ）−１と（Ｉ）−２は、適切なアンチセンスプライマーと組み合わせて、本発明の検出方法を行うために用いることができる。【００３８】
（II）センスプライマーとアンチセンスプライマーのセット
上記（Ｉ）−１の「基本的なセンスプライマーセット」、又は（Ｉ）−２の「追加のセンスプライマーを含み得るセンスプライマーセット」と、アンチセンスプライマー（Ｂ）を組み合わせたプライマーセットである。【００３９】
具体的には、上記（Ｉ）−１又は（Ｉ）−２のセンスプライマーセットと共に、ロタウイルスＡのＧ１型の基準株（Ｗａ株/Ｋ０２０３３）のＶＰ７遺伝子分節（セグメント９）の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列におけるプラス鎖の塩基配列の８８３−１０６２番目をカウントの基準として、当該塩基配列の領域に対してそれぞれに整合している上記ロタウイルスＡの基準株のプラス鎖、にハイブリダイズする１種又は２種以上の共通アンチセンスプライマー（Ｂ）、を組み合わせて含む遺伝子増幅用プライマーセットである。【００４０】
上記のセンスプライマーとアンチセンスプライマーのセット（II）は、本発明の検出方法を行うために用いることができる。【００４１】
（III）Ｎｅｓｔｅｄ-ＰＣＲ法を行う場合に用いるプライマーセット
ＲＶＡの遺伝子型検出手段としてＮｅｓｔｅｄ-ＰＣＲ法を行う場合に用いられるプライマーセットである。【００４２】
具体的には、上記（Ｉ）−１、（Ｉ）−２、又は（II）の遺伝子増幅用プライマーセットが、Ｎｅｓｔｅｄ-ＰＣＲ法の第２の増幅工程に用いるプライマーセットとして含まれ、かつ、（１）ロタウイルスＡのＧ１型の基準株（Ｗａ株/Ｋ０２０３３）のＶＰ７遺伝子分節（セグメント９）の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列におけるプラス鎖の塩基配列の１−７２番目を塩基配列カウントの基準として、当該塩基配列の全部又は一部のそれぞれに整合している、検出対象である遺伝子型が異なるロタウイルスＡの基準株のプラス鎖の塩基配列に対応するマイナス鎖、にハイブリダイズする共通アウターセンスプライマー、並びに、（２）上記Ｇ１型の基準株のプラス鎖の塩基配列の８８３−１０６２番目を塩基配列カウントの基準として、当該塩基配列の全部又は一部に整合している、検出対象である遺伝子型が異なるロタウイルスＡの基準株のプラス鎖の塩基配列に対してハイブリダイズする共通アウターアンチセンスプライマー、をＲＴ−ＰＣＲ法によるＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法の第１の増幅工程に用いるプライマーセットとして含まれる遺伝子増幅用プライマーセットである。【００４３】
上記の本発明のプライマーセット（III）は、Ｎｅｓｔｅｄ-ＰＣＲ法を用いる本発明の検出方法を行うために用いることができる。【００４４】
上記（Ｉ）−１、（Ｉ）−２、（II）、又は（III）の本発明のプライマーセットにおける全ての遺伝子増幅用プライマーは、遺伝子増幅手段がＰＣＲ法を基礎とする方法の場合、１０−４０塩基長であることが好適であり、さらに好適には１５−３０塩基長である。ＰＣＲ法以外の遺伝子増幅方法を用いる場合には、当該他の遺伝子増幅方法に適した遺伝子増幅用プライマーの塩基長を選択することができる。【００４５】
＜本発明のキット＞
本発明のキットは、本発明のプライマーセットを用いて本発明の検出方法を行うための、本発明のプライマーセットをその構成要素として含む検出用キットである。本発明のキットには、本発明の検出方法の具体的な態様に応じて他の構成要素を組み入れることができる。具体的には、例えば、遺伝子増幅手段がＰＣＲ法を基礎とする方法の場合、ＰＣＲ用の酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）、逆転写酵素、バッファー（緩衝液）、酵素の補因子となる金属イオン（マグネシウムイオン等）、ＤＮＡ増幅の基質となるデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ＴＴＰの混合物））、希釈用の水等を他の構成要素として組み入れることが可能である。
【発明の効果】
【００４６】
本発明により、ＲＶＡ（ロタウイルスＡ）の遺伝子型を、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法に基づいて確度良く検出する手段が、検出方法、遺伝子増幅用プライマーセット、及び、検出用キットとして提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１Ａ】比較例（試験系１）のプライマーセットを用いた場合のロタウイルスＡの遺伝子型毎の泳動型を示す図面である。
【図１Ｂ】実施例（試験系１）のプライマーセットを用いた場合のロタウイルスＡの遺伝子型毎の泳動型を示す図面である。
【図２】実施例（試験系２）のプライマーセットを用いた場合のロタウイルスＡの遺伝子型毎の泳動型を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明の実施の形態の一例を挙げるが、本例は、上述した本発明の概念の一態様に過ぎない。
【００４９】
＜センスプライマー（Ａ）＞
センスプライマー（Ａ）としては、下記（１）−（８）のマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーが例示される。塩基を示す記号のうち「R」はグアニン又はアデニンであることを示している。
【００５０】
（Ａ）（１）ロタウイルスＡのＧ３型（ヒトロタウイルス）の基準株（ＡＵ−１／Ｄ８６２７１）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の８０２−８３４番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマー。この例として、CAAGGGAAAACGTRGCAGTTA（配列番号３）の一部又は全部を含むセンスプライマーが挙げられる。
【００５１】
（Ａ）（２）ロタウイルスＡのウマ様Ｇ３型（ウマ様ロタウイルス）の基準株（Ｓ１３−３０／ＫＪ６３９０１７）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の７４７−７８９番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマー。この例として、CTAGATGTTACTACGGCTAC（配列番号４）の一部又は全部を含むセンスプライマーが挙げられる。
【００５２】
（Ａ）（３）ロタウイルスＡのＧ９型の基準株（Ｂ３４５８／ＥＦ９９０７０８）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の６０３−６３６番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマー。この例として、GATGGGACARTCTTGTACCATA（配列番号７）の一部又は全部を含むセンスプライマーが挙げられる。
【００５３】
（Ａ）（４）ロタウイルスＡのＧ１２型の基準株（Ｄｈａｋａ２５／ＤＱ１４６６５４）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の６６６−７１１番目の塩基配列（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマー。この例として、TACRACAACCGACGTCACA（配列番号８）の一部又は全部を含むセンスプライマーが挙げられる。
【００５４】
（Ａ）（５）ロタウイルスＡのＧ１型の基準株（Ｗａ株/Ｋ０２０３３）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の２９７−３３８番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマー。この例として、GTATTATCCAACTGAAGCAAGTAC（配列番号１）の一部又は全部を含むセンスプライマーが挙げられる。
【００５５】
（Ａ）（６）ロタウイルスＡのＧ２型の基準株（ＫＵＮ/Ｄ５０１２４）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の３９９−４３８番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマー。この例として、 TTAAAGACTACAATGATATTACTACATT（配列番号２）の一部又は全部を含むセンスプライマーが挙げられる。
【００５６】
（Ａ）（７）ロタウイルスＡのＧ４型の基準株（ＢｒＢ−９／ＧＵ５６５０９０）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の４６８−５０７番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマー。この例として、TTCGCTTCTGGTGAGGAGTTG（配列番号５）の一部又は全部を含むセンスプライマーが挙げられる。
【００５７】
（Ａ）（８）ロタウイルスＡのＧ８型の基準株（ＮＰ−１３０／ＬＣ１６９９２３）のＶＰ７遺伝子分節の二本鎖ＲＮＡ又はその相補的なＤＮＡの塩基配列の１７４−２１０番目（プラス鎖の番号）に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマー。この例として、TTACRCCATTTGTAAATTCACAG（配列番号６）の一部又は全部を含むセンスプライマーが挙げられる。
【００５８】
＜共通アンチセンスプライマー（Ｂ）＞
上記の共通アンチセンスプライマー（Ｂ）は、ACTTGCCACCATTTTTTCCA（配列番号９）の一部又は全部を含む共通アンチセンスプライマーであることが好適である。
【００５９】
＜Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法への適用の態様＞
上述した本発明のプライマーセットは、Ｎｅｓｔｅｄ-ＰＣＲ法（Ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を含む）の第２の増幅工程において、ネステッドセンスプライマー及び共通ネステッドアンチセンスプライマーとして用いる。そして、ＲＴ−ＰＣＲ法による第１の増幅工程における共通アウターセンスプライマーとしては、CTCCTTTTAATGTATGGTATTGAATATACC（配列番号１０）の一部又は全部を含む共通アウターセンスプライマーが挙げられ、当該共通アウターアンチセンスプライマーとしては、GTATAAAANACTTGCCACCATTTTTTCCA（配列番号１１）の一部又は全部を含む共通アウターアンチセンスプライマーが挙げられる。
【００６０】
なお、既知のＲＶＡ検出用のプライマー、例えば、非特許文献５に記載されたプライマー（具体的には、下記配列番号１２−２０の塩基配列のプライマー）を、必要に応じて本発明のプライマーセット中に組み入れて用いることも可能であり、この態様も本発明の実施態様である。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明の実施例を記載する。【００６２】
［試験系１の構築］
（１）サンプルの調製
マルチプレックスＰＣＲ法の評価のため、予めシークエンス解析により遺伝子型が判明しているＲＶＡ株の中から、以下の１１種類の代表的な株を選択して、これらのＲＶＡ株がそれぞれ含まれていることが既知の検体を選択して用いた。【００６３】
Human-wt/JPN-Hokkaido /SP15-09/2015/G1 lineage 1 (Wa様)
Human-wt/JPN-Kyoto/NT036/2013/G1 lineage 2 (Wa様)
Human-wt/JPN-Hokkaido /SP15-06/2015/G1 lineage 1 (DS-1様)
Human-wt/JPN-Hokkaido/To16-04/2016/G2
Human-wt/JPN-Aichi/KN105/2013/G3 (Wa様)
Human-wt/JPN-Hokkaido/To16-01/2016/G3 (equine-like, DS-1様)
Human-wt/JPN-Okayama/OH279/2002/G4
Human-wt/JPN-Hokkaido/TA15-07/2015/G8
Human-wt/JPN-Hokkaido/To14-25/2014/G9 lineage 3
Human-wt/JPN-Hokkaido/To16-02/2016/G9 lineage 6
Human-wt/JPN-Hokkaido/NS17-5/2017/G12【００６４】
上記のＲＶＡ株が含まれている検体は、それぞれ急性胃腸炎で入院した患者から採取した便を、ＰＢＳ（１０ｍＭ，ｐＨ７．２）を用いて１０％便懸濁液として調製したものである。ウイルスＲＮＡはＤｉｒｅｃｔ−ｚｏｌ  ＲＮＡ  ＭｉｎｉＰｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を用いて説明書の指示に従って抽出した。要約すると、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）ＬＳ試薬２４０μＬに、上記便懸濁液８０μＬを添加し、ボルテックスにより混和した。これを室温で５分間インキュベートした後、３２０μＬのエタノールを加え、その混合物を上記キットのスピンカラムに直接投入した。このカラムを１２，０００×ｇで１分間遠心分離し、洗浄した。精製ＲＮＡは４０μＬのＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水で溶出した。【００６５】
（２）セミネステッドマルチプレックスＰＣＲによる遺伝子型判定法
下記のGouveaのプライマーセット（比較例）：
１ｓｔ  Beg 9 : GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG（配列番号１９）
End 9 : GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG（配列番号２０）
２ｎｄ  RVG 9 : GGTCACATCATACAATTCT （配列番号１８）
aAT8(G8) : GTCACACCATTTGTAAATTCG（配列番号１２）
aBT1(G1) : CAAGTACTCAAATCAATGATGG（配列番号１３）
aCT2(G2) : CAATGATATTAACACATTTTCTGTG（配列番号１４）
aDT4(G4) : CGTTTCTGGTGAGGAGTTG（配列番号１５）
aET3(G3) : CGTTTGAAGAAGTTGCAACAG（配列番号１６）
aFT9(G9) : CTAGATGTAACTACAACTAC（配列番号１７）
及び、下記の実施例のプライマーセット：
１ｓｔ  VP7 C-040F : CTCCTTTTAATGTATGGTATTGAATATACC（配列番号１０）
VP7 C-941R : GTATAAAANACTTGCCACCATTTTTTCCA（配列番号１１）
２ｎｄ  VP7 C-932R : ACTTGCCACCATTTTTTCCA（配列番号９）
G1-297F :GTATTATCCAACTGAAGCAAGTAC （配列番号１）
G2-401F : TTAAAGACTACAATGATATTACTACATT（配列番号２）
G3-809F : CAAGGGAAAACGTRGCAGTTA（配列番号３）
G3e-757F : CTAGATGTTACTACGGCTAC（配列番号４）
G4-478F : TTCGCTTCTGGTGAGGAGTTG（配列番号５）
G8-179F : TTACRCCATTTGTAAATTCACAG（配列番号６）
G9-606F : GATGGGACARTCTTGTACCATA（配列番号７）
G12-669F : TACRACAACCGACGTCACA（配列番号８）
を用いて、上記の「１ｓｔ」として示したアウタープライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ（１次ＰＣＲ）、及び、「２ｎｄ」として示したネステッドプライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲ（２次ＰＣＲ）を行った。なお、「G3e」は、ウマ様(Equine-like)であることを示しており、ウマ様Ｇ３に関するプライマーを示している。【００６６】
ＲＴ−ＰＣＲはＴａＫａＲａ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（ＡＭＶ）（Ｔａｋａｒａ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて、１μＬのＲＮＡ検体を使って行った。反応前に、ＲＮＡサンプルを１次プライマー（アウタープライマー）（それぞれ１０ｐｍｏｌ）と混合し、５分間６５℃でインキュベートした。そして、ＧｅｎＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２７００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、５０℃で３０分間（逆転写反応）に引き続き、９４℃で２分間の反応を行った後、４０サイクルの増幅反応（９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で９０秒）を行い、最後に７２℃で５分間の延長反応を行った。これにより得られた１次ＰＣＲ産物をＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水で５０倍に希釈し、２μＬの希釈溶液を２次ＰＣＲに使用した。【００６７】
２次ＰＣＲは、第２のプライマー（ネステッドプライマー）（それぞれ５ｐｍｏｌ）及びＰｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（Ｔａｋａｒａ）、を用いて行った。変性処理を９４℃で３０秒間行い、続いて２０サイクルの増幅反応（９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で６０秒）を行い、最後に７２℃で５分間の延長反応を行った。【００６８】
これにより得られたＰＣＲ増幅産物のサイズは、１．５％アガロースゲル電気泳動とエチジウムブロマイド染色により分析した。また、ＤＮＡサイズマーカーとして１００ｂｐのＤＮＡラダー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用した。【００６９】
なお、１次ＰＣＲの代替の試薬キットとして、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM  ＩＩ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｔａｋａｒａ）を用いた。その際の反応条件は、ＲＴ−ＰＣＲは４５℃で１０分間の逆転写反応に引き続き、９８℃で１０秒間反応を行った後、続いて４０サイクルの増幅反応（９８℃で１０秒、５０℃で１５秒、６８℃で２０秒）を行い、最後に６８℃で３分間の延長反応を行った。【００７０】
ＰＣＲ増幅産物のサイズの分析は、上記の基本の増幅反応系により得られたＰＣＲ増幅産物と同様に行った。【００７１】
（３）ウイルス株とプライマーの配列比較
ＲＶＡ基準株のＶＰ７ヌクレオチド配列をＧｅｎＢａｎｋから入手し、ＭＥＧＡソフトウェアパッケージバージョン７．０．１８に含まれる、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ、及び、ＭＡＦＦＴ多重配列アラインメントソフトウェアプログラム  バージョン７．０（Ｋａｔｏｈ  et al.,２００９）を用いてアライメントを行った。最終的な編集は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１０ソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ、ＵＳＡ）によって行った。【００７２】
［試験系１の結果］
（１）Ｇｏｕｖｅａのプライマーセットの評価（比較例）
日本国内で採取されたＲＶＡの１０株（Ｇ１lineage 1（Ｗａ様）、Ｇ１lineage 2（Ｗａ様）、Ｇ１lineage 1（ＤＳ−１様）、Ｇ２、Ｇ３（Ｗａ様）、ウマ様（Equine-like）Ｇ３（ＤＳ−１様）、Ｇ４、Ｇ８、Ｇ９ lineage 3及びＧ９ lineage 6）を用いて、上記のGouveaのプライマーセットによるマルチプレックスＰＣＲ法を、基本の増幅反応系において評価した。【００７３】
その結果、Wa-like Ｇ１ lineage 1、Wa-like Ｇ１ lineage 2、DS-1-like Ｇ１、Ｇ２、Wa-like Ｇ３、Ｇ４では問題なく遺伝子型が判定できたが、以下の３種類のウイルスで誤判定あるいは判定困難となる事が判明した（図１Ａ）。図１Ａは、基本の反応系における結果を示しており、図中、判定困難箇所は↑で示した。まず、ウマ様Ｇ３のサンプルではＧ１（749 bp）に近いサイズのバンドが得られた。また、Ｇ８ではＧ３（374 bp）の位置にバンドが得られた。日本国で流行しているＧ９型ウイルスは系統解析によりlineage 3とlineage 6に大別されるが、このうちのlineage 3ではバンドが検出されない、あるいはバンドが非常に薄いため判定が困難であった。更にＧ９ lineage 6では、Ｇ１（749 bp）とＧ８（885 bp）の間に、弱い非特異的なバンドが見られた。この結果は、５検体以上を用いた場合も同様であった。【００７４】
（２）実施例のプライマーセットの評価
上記（１）の比較例に対して、実施例のプライマーセット（上記；Ｇ１２対応のプライマーを含む）を用いた場合に、Ｇ１、Ｇ２、ヒトＧ３、ウマ様Ｇ３、Ｇ４、Ｇ８及びＧ９、これにＧ１２を加えた全ての株で、遺伝子型を正確に判定できることが基本の増幅反応系において確認された（図１Ｂ）。すなわち、ウマ様Ｇ３とＧ１のバンドは明確に異なっており、Ｇ８とＧ３のバンドも明確に異なっていた。また、Ｇ９ lineage 3のバンドが明確に検出された。更にＧ９ lineage 6において認められた非特異的なバンドは認められなかった。このように比較例では検出が困難であった部分が明確に検出されると共に、さらに新たに加えたＧ１２のバンドも、区別可能な明確な形で認められた。この結果は、２検体以上を用いた場合も同様であり、さらに、各検体において上記の基本の増幅反応系を用いた場合も、代替の試薬キットに付属している増幅反応系を用いた場合も同様であった。【００７５】
［試験系２の構築］
（１）試験系２の内容
試験系２では、特にＲＶＡ株である、ヒトＧ３、ウマ様Ｇ３、Ｇ９、及びＧ１２について、それぞれの株に割り当てられている遺伝子対応領域の両端近傍での当該遺伝子型の検出性能を、試験系１と同様のセミネステッドマルチプレックスＰＣＲを用いて検討した。【００７６】
（２）サンプルの調製
用いた検体は、Ｇ１、Ｇ２、ヒトＧ３、ウマ様Ｇ３、Ｇ４，Ｇ８、Ｇ９、及びＧ１２のそれぞれについて、試験系１で用いたものと同一の糞便検体である。【００７７】
（３）セミネステッドマルチプレックスＰＣＲによる遺伝子型判定法
下記のプライマーセット：
１ｓｔ  VP7 C-040F : CTCCTTTTAATGTATGGTATTGAATATACC（配列番号１０）
VP7 C-941R : GTATAAAANACTTGCCACCATTTTTTCCA（配列番号１１）
２ｎｄ  VP7 C-932R : ACTTGCCACCATTTTTTCCA（配列番号９）
G1-297F :GTATTATCCAACTGAAGCAAGTAC （配列番号１）
G2-401F : TTAAAGACTACAATGATATTACTACATT（配列番号２）
G3-beg-802F(19) : TTAGGACCAAGGGAAAACG（配列番号２１）
G3-end-812F(23) : GGGAAAACGTAGCAGTTATACAG（配列番号２２）
G3e-beg-747F(21) : CAATCATAAACTAGATGTTAC（配列番号２３）
G3e-end-771F(19) : GGCTACTTGTACGATCAGA（配列番号２４）
G4-478F : TTCGCTTCTGGTGAGGAGTTG（配列番号５）
G8-179F : TTACRCCATTTGTAAATTCACAG（配列番号６）
G9-beg-603F(23) : ATCGATGGGACARTCTTGTACCA（配列番号２５）
G9-end-613F(24) : CAATCTTGTACCATAAAAGTGTGC（配列番号２６）
G12-beg-666F(19) : ATGTACGACAACCGACGTC（配列番号２７）
G12-end-689F(23) : CATTTGAAGAGGTAGCAAATGCG（配列番号２８）
を用いて、上記の「１ｓｔ」として示したアウタープライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ（１次ＰＣＲ）、及び、「２ｎｄ」として示したネステッドプライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲ（２次ＰＣＲ）を行った。なお、「G3e」は、ウマ様(Equine-like)であることを示しており、ウマ様Ｇ３に関するプライマーを示していることは、試験系１と同様である。【００７８】
ＲＴ−ＰＣＲはＴａＫａＲａ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（ＡＭＶ）（Ｔａｋａｒａ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて、１μＬのＲＮＡ検体を使って行った。反応前に、ＲＮＡサンプルを１次プライマー（アウタープライマー）（それぞれ１０ｐｍｏｌ）と混合し、５分間６５℃でインキュベートした。そして、ＧｅｎＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２７００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、５０℃で３０分間（逆転写反応）に引き続き、９４℃で２分間の反応を行った後、４０サイクルの増幅反応（９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で９０秒）を行い、最後に７２℃で５分間の延長反応を行った。これにより得られた１次ＰＣＲ産物をＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水で５０倍に希釈し、２μＬの希釈溶液を２次ＰＣＲに使用した。【００７９】
２次ＰＣＲは、第２のプライマー（ネステッドプライマー）（それぞれ５ｐｍｏｌ）及びＰｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（Ｔａｋａｒａ）、を用いて行った。変性処理を９４℃で３０秒間行い、続いて２０サイクルの増幅反応（９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で６０秒）を行い、最後に７２℃で５分間の延長反応を行った。【００８０】
これにより得られたＰＣＲ増幅産物のサイズは、１．５％アガロースゲル電気泳動とエチジウムブロマイド染色により分析した。また、ＤＮＡサイズマーカーとして１００ｂｐのＤＮＡラダー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用した。【００８１】
なお、１次ＰＣＲの代替の試薬キットとして、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM  ＩＩ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｔａｋａｒａ）を用いた。その際の反応条件は、ＲＴ−ＰＣＲは４５℃で１０分間の逆転写反応に引き続き、９８℃で１０秒間反応を行った後、続いて４０サイクルの増幅反応（９８℃で１０秒、５０℃で１５秒、６８℃で２０秒）を行い、最後に６８℃で３分間の延長反応を行った。【００８２】
ＰＣＲ増幅産物のサイズの分析は、上記の基本の増幅反応系により得られたＰＣＲ増幅産物と同様に行った。【００８３】
（４）ウイルス株とプライマーの配列比較
ＲＶＡ基準株のＶＰ７ヌクレオチド配列をＧｅｎＢａｎｋから入手し、ＭＥＧＡソフトウェアパッケージバージョン７．０．１８に含まれる、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ、及び、ＭＡＦＦＴ多重配列アラインメントソフトウェアプログラム  バージョン７．０（Ｋａｔｏｈ  et al.,２００９）を用いてアライメントを行った。最終的な編集は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１０ソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ、ＵＳＡ）によって行った。【００８４】
［試験系２の結果］
本発明の検出方法における、より基本的な要素であるヒトＧ３、ウマ様Ｇ３、Ｇ９、及びＧ１２の基準株に対応する遺伝子領域の両端に対応するプライマー、すなわち、ヒトＧ３については、Ｇ３−ｂｅｇ−８０２Ｆ（５'側：図２のG3h-begに対応）とＧ３−ｅｎｄ−８１２Ｆ（５'側：図２のG3h-endに対応）; ウマ様Ｇ３については、Ｇ３ｅ−ｂｅｇ−７４７Ｆ（５'側：図２のG3e-begに対応）とＧ３ｅ−ｅｎｄ−７７１Ｆ（５'側：図２のG3e-endに対応）; Ｇ９については、Ｇ９−ｂｅｇ−６０３Ｆ（５'側：図２のG9-begに対応）とＧ９−ｅｎｄ−６１３Ｆ（５'側：図２のG9-endに対応）;Ｇ１２については、Ｇ１２−ｂｅｇ−６６６Ｆ（５'側：図２のG12-begに対応）とＧ１２−ｅｎｄ−６８９Ｆ（５'側：図２のG12-endに対応）;それぞれについて、本発明において追加可能なＧ１、Ｇ２、Ｇ４、及びＧ８の基準株に対応するプライマーとマルチプレックスＰＣＲを行った結果、バンドの濃淡の差は認められるものの、各々の基本的な基準株に対応する遺伝子領域の両端のプライマーの組について、他と明確に区別が可能な明確なバンドが認められた。従って、本発明においてそれぞれの基準株について規定された遺伝子領域全体について、本発明の検出方法を行うことが可能であることが明らかになった。また、この結果から、追加可能なプライマーについても同様に、規定された遺伝子領域全体において本発明の検出方法に適用可能と考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
ロタウイルスＡ（ＲＶＡ）のＶＰ７遺伝子分節における遺伝子型（Ｇタイプ）において、迅速かつ的確に決定することは、以下の観点から産業上重要である。【００８６】
（１）  ロタウイルスのＶＰ７蛋白質は、生体防御において最も重要なウイルス蛋白質である。すなわち、ＶＰ７蛋白質はロタウイルス粒子の最も外側を構成している蛋白質なので、生体はロタウイルス蛋白質の中でもＶＰ７を認識しやすく、ロタウイルス感染時には、ＶＰ７蛋白質に対する抗体が優先的に産生される。その反面、ＶＰ７における遺伝子型が異なると過去に産生された抗体が効かない又は効きにくくなる。従って、ロタウイルスにおいてＶＰ７の遺伝子型単位の流行状態を把握することが、そのロタウイルスの流行地域のヒトの免疫状況を推測するための鍵であり、今後の流行予測やワクチンの効果を評価する上でも重要である。【００８７】
（２）  ロタウイルスのゲノムは１１本の遺伝子分節で構成されており、それぞれの遺伝子に多数の型が存在するために、単純にはその遺伝子型同士の組合せは膨大になるとも考えられる。しかしながら、実際にはロタウイルス株毎の遺伝子型構成のパターンは概ね固定されており、ＶＰ７遺伝子分節における遺伝子型（Ｇタイプ）が決まれば、他の遺伝子型についても概ね予測を付けることができる。従って、通常の臨床検査現場においては、ロタウイルスのＶＰ７の遺伝子型を決定する他に、他の遺伝子分節の遺伝子型を決定する必要性に乏しい。【００８８】
（３）  ＲＶＡ以外にヒトに対して感染可能なロタウイルスとしては、現状ではロタウイルスＢ（ＲＶＢ）とロタウイルスＣ（ＲＶＣ）が挙げられる。しかしながら著しくＲＶＡの検出頻度が高いことと共に、ＲＶＢとＲＶＣの流行株の種類が限定されており、ＲＶＢとＲＶＣにおいてわざわざ遺伝子型を決定する必要性に乏しい。従って、ＲＶＡのＶＰ７遺伝子分節における遺伝子型（Ｇタイプ）のみを決定することで、通常の臨床検査現場におけるロタウイルスの現状を把握するには事足りている。【００８９】
上記（１）−（３）において述べたように、ＲＶＡのＶＰ７遺伝子分節における遺伝子型（Ｇタイプ）を決定することは、ロタウイルスに対する本質的な作業であり、これを迅速かつ的確に行うことができる本発明は、産業上極めて重要性が高いものといえる。
【図１Ａ】
2020071419.tif 000003
【図１Ｂ】
2020071419.tif 000004
【図２】
2020071419.tif 000005
【配列表】
2020071419000001.app
【国際調査報告】
2020071419.tif 000006
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2020071419.tif 000008
2020071419.tif 000009