(57)【要約】  急性腎障害を特異的に診断可能なバイオマーカーを提供する。急性腎障害特異的バイオマーカーは、主に血液中に存在するｍｉＲＮＡである。このｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−５１００である。さらに、急性腎障害の診断方法として、ｍｉＲＮＡ−５１００を用いることが可能である。この診断では、血液中において、ｍｉＲＮＡ−５１００の発現が低下している場合、急性腎障害と診断する。急性腎障害の検査用キットとして、ｍｉＲＮＡ−５１００を測定する試薬を含ませることも可能である。
2020071518.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性腎障害特異的バイオマーカーであって、
ｍｉＲＮＡ−５１００である
ことを特徴とする急性腎障害特異的バイオマーカー。
【請求項２】
請求項１に記載の急性腎障害特異的バイオマーカーを用いる
ことを特徴とする急性腎障害の診断方法。
【請求項３】
前記ｍｉＲＮＡ−５１００の発現が低下している場合、急性腎障害と診断する
ことを特徴とする請求項２に記載の急性腎障害の診断方法。
【請求項４】
ｍｉＲＮＡ−５１００を測定する試薬を含む
ことを特徴とする急性腎障害の検査用キット。
【請求項５】
ヒト以外の動物の治療方法であって、
ｍｉＲＮＡ−５１００の機能活性を調整する
ことを特徴とする動物治療方法。
【請求項６】
ｍｉＲＮＡ−５１００の機能活性調整剤を含む
ことを特徴とする急性腎障害用医薬。
【請求項７】
前記機能活性調整剤は、
前記ｍｉＲＮＡ−５１００の機能活性亢進剤を含む
ことを特徴とする請求項６に記載の急性腎障害用医薬。
【請求項８】
前記機能活性亢進剤は、前記ｍｉＲＮＡ−５１００に対応したｍｉＲＮＡミミックである
ことを特徴とする請求項７に記載の急性腎障害用医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマーカー、診断方法、検査用キット、動物治療方法、及び医薬に係り、特に急性腎障害特異的バイオマーカー、急性腎障害の診断方法、急性腎障害の検査用キット、動物治療方法、及び急性腎障害用医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性腎障害（Ａｃｕｔｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｊｕｒｙ、ＡＫＩ）は、感染症、薬剤摂取、外科手術後等に生じる急性の腎機能障害であり、患者の生命予後に大きく関与している。
急性腎障害（ＡＫＩ）は、数時間から数日という短期間で急激に腎機能が低下する病態である。尿から老廃物を排泄できなくなったり、溢水になったりする。透析が必要になる場合もあり得る。【０００３】
従来、ＫＤＩＧＯ（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ）から急性腎障害に関する診断のガイドラインが提供されている。このＫＤＩＧＯ分類では、急性腎不全は血清クレアチニン濃度上昇及び尿量減少にもとづいて診断されている。【０００４】
具体的には、（急性腎障害のためのＫＤＩＧＯ診療ガイドラインでは、ＡＫＩの病期（ステージ）分類は、以下のいずれかにより定義される：
１．  ４８時間以内に血清クレアチニン値が０．３ｍｇ／ｄｌ以上上昇した場合
２．  血清クレアチニン値がそれ以前７日以内に判っていたか予想される基礎値
より１．５倍以上の増加があった場合
３．  尿量が６時間にわたって０．５ｍｌ／ｋｇ／時間に減少した場合【０００５】
しかしながら、この基準ではすでに治療介入のタイミングを逸していることが多い。このため、急性腎障害用のバイオマーカーの開発が望まれている。【０００６】
ところで、近年、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）が多様な病態に関与し、疾病早期診断のバイオマーカーとして有効であることが報告されている。
特許文献１を参照すると、従来のバイオマーカーの一例として、慢性的な糖尿病の状態の指標を示すｍｉＲＮＡが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１３−５１４２７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１のバイオマーカーは、急性腎障害を診断できるものではなかった。【０００９】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の急性腎障害特異的バイオマーカーは、急性腎障害特異的バイオマーカーであって、ｍｉＲＮＡ−５１００であることを特徴とする。
本発明の急性腎障害の診断方法は、前記急性腎障害特異的バイオマーカーを用いることを特徴とする。
本発明の急性腎障害の診断方法は、前記ｍｉＲＮＡ−５１００の発現が低下している場合、急性腎障害と診断することを特徴とする。
本発明の検査用キットは、ｍｉＲＮＡ−５１００を測定する試薬を含むことを特徴とする。
本発明の動物治療方法は、ヒト以外の動物の治療方法であって、ｍｉＲＮＡ−５１００の機能活性を調整することを特徴とする。
本発明の急性腎障害用医薬は、ｍｉＲＮＡ−５１００の機能活性調整剤を含むことを特徴とする。
本発明の急性腎障害用医薬は、前記機能活性調整剤は、前記ｍｉＲＮＡ−５１００の機能活性亢進剤を含むことを特徴とする。
本発明の急性腎障害用医薬は、前記機能活性亢進剤は、前記ｍｉＲＮＡ−５１００に対応したｍｉＲＮＡミミックであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ｍｉＲＮＡ−５１００を用いることで、急性腎障害を特異的に診断可能なバイオマーカーを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施例１に係る急性腎障害モデルマウスの施術の概念図である。
【図２Ａ】本発明の実施例１に係るマイクロアレイ解析（虚血再灌流モデル）の結果を示す写真である。
【図２Ｂ】本発明の実施例１に係るマイクロアレイ解析（ＬＰＳ投与モデル）の結果を示す写真である。
【図３】本発明の実施例１に係るｍｉＲＮＡ−５１００の発現量の変化を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例１に係るｍｉＲＮＡ−５１００のＲＯＣ曲線を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例１に係る急性腎障害マウスでのｍｉＲＮＡ−５１００の過剰発現について説明する概念図である。
【図６】本発明の実施例１に係るｍｉＲＮＡ−５１００の過剰発現時における実際の発現量を示すグラフである。
【図７】本発明の実施例１に係るｍｉＲＮＡ−５１００の過剰発現時における腎腫大を示すグラフである。
【図８Ａ】本発明の実施例１に係るｍｉＲＮＡ−５１００の過剰発現時における急性腎障害の治療効果（ＮＧＡＬ）を示すグラフである。
【図８Ｂ】本発明の実施例１に係るｍｉＲＮＡ−５１００の過剰発現時における急性腎障害の治療効果（ＫＩＭ−１）を示すグラフである。
【図８Ｃ】本発明の実施例１に係るｍｉＲＮＡ−５１００の過剰発現時における急性腎障害の治療効果（Ｌ−ＦＡＢＰ）を示すグラフである。
【図８Ｄ】本発明の実施例１に係るｍｉＲＮＡ−５１００の過剰発現時における急性腎障害の治療効果（ＩＬ−１８）を示すグラフである。
【図９】本発明の実施例２に係るｍｉＲＮＡ−５１００の過剰発現時における小胞体ストレス応答遺伝子の発現変化を示すグラフである。
【図１０】本発明の実施例２に係るｍｉＲＮＡ−５１００の過剰発現時における小胞体ストレス応答遺伝子の発現変化を示すグラフである。
【図１１】本発明の実施例２に係るｍｉＲＮＡによる急性腎障害の進展抑制の推定機序を示す概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜実施の形態＞
従来の急性腎障害のバイオマーカー候補は、臨床的に真に有効か否かは未だ不明であり、急性腎障害の特異的治療法は全く実用化されていなかった。
このため、本発明者らは、多様な病態に関与していることが知られてきたｍｉＲＮＡに着目した。ｍｉＲＮＡは人を含む哺乳類で２０００種類程度あることがわかっており、その塩基配列は、公共のデータベース（ｍｉＲＢａｓｅ等）に登録されている。
しかしながら、急性腎障害のバイオマーカーとして有用なｍｉＲＮＡは知られていなかった。
【００１４】
そこで、本発明者らは、鋭意実験を繰り返し、急性腎障害に特異的なバイオマーカーとなり得るｍｉＲＮＡを探索した。
具体的には、後述の実施例１で詳細を説明するように、本発明者らは、二種類の急性腎障害モデルマウスの腎臓と血液で変化しているｍｉＲＮＡをマイクロアレイ法、及びリアルタイムＰＣＲの一種であるｑＲＴ−ＰＣＲ法で網羅的に解析し、同定した。さらに、同定したｍｉＲＮＡ発現変化をヒトの血清サンプルについて、ｑＲＴ−ＰＣＲで、健常人及び急性腎障害患者で比較検討し、急性腎障害患者の血清で特異的に変化するｍｉＲＮＡを同定し、診断方法として使用可能にした。
さらに、このｍｉＲＮＡを過剰発現させることで、医薬として用いる際の効果が得られることを急性腎障害モデルマウスで確認し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
〔バイオマーカー〕
より詳細に説明すると、本発明の実施の形態に係る急性腎障害特異的バイオマーカーは、急性腎障害患者のｍｉＲＮＡであることを特徴とする。
ｍｉＲＮＡは、タンパク質へ翻訳されないＲＮＡであり、機能性のノンコーディングＲＮＡの一種である。ｍｉＲＮＡは、真核生物のゲノム上にコードされ、多段階的な生成過程を経て、最終的に２０〜２５塩基程度の一本鎖ＲＮＡとなり、遺伝子の転写後発現調節に関与する。ｍｉＲＮＡは、転写後発現調節により、発生、増殖、分化、アポトーシス、代謝といった広範な生物学的プロセスに重要な働きをする。
【００１６】
具体的には、本発明の実施の形態に係る急性腎障害特異的バイオマーカーは、ｍｉＲＮＡ−５１００であることを特徴とする。
このうち、マウスの成熟型ｍｉＲＮＡ−５１００（ｍｉＲｂａｓｅ  Ｎｏ：ＭＩ００１８００８）の配列を以下に示す：
５’−ｕｃｇａａｕｃｃｃａｇｃｇｇｕｇｃｃｕｃｕ−３’    （配列番号１）
【００１７】
ヒトの成熟型ｍｉＲＮＡ−５１００（ｍｉＲｂａｓｅ  Ｎｏ：ＭＩ００１９１１６）の配列を以下に示す：
５’−ｕｕｃａｇａｕｃｃｃａｇｃｇｇｕｇｃｃｕｃｕ−３’  （配列番号２）
【００１８】
本実施形態のｍｉＲＮＡ−５１００として、マウス及びヒト以外の真核生物、具体的には各種動物において、相同性のあるｍｉＲＮＡを用いることが可能である。この動物は特に限定されず、例えば、家畜動物種、野生動物等を含む。各ｍｉＲＮＡは、哺乳類で、ほぼ同じ塩基配列であるため、相同性を基に検索して用いることが可能である。この相同性としては、８０％以上であることが好適であり、９０％以上であることが更に好適である。さらに、これらの配列と相補的な配列、又は、ハイブリダイズ可能な程度に同一な配列を含んでいてもよい。
【００１９】
加えて、本実施形態の各ｍｉＲＮＡ及び後述する機能活性調整剤は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｉＲＮＡ、初期転写産物）又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｍｉＲＮＡ、前駆体）として提供されてもよい。この場合、本実施形態のｍｉＲＮＡは、一本鎖ではなくてもよく、ステム及びループ構造等により、二本鎖部分を形成していてもよい。
さらに、本実施形態の各ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ等をコードするＲＮＡ、ＤＮＡ等の核酸分子であってもよい。また、この核酸分子は、人工核酸分子、例えば、ペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ、ＰＮＡ）、ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ、ＬＮＡ）等も含む。
【００２０】
本実施形態の各ｍｉＲＮＡ、及び機能活性調整剤の製造は、当業者に一般的な化学合成法、又は組換え手法等で製造することが可能である。この組み換え手法では、上述のような成熟（ｍａｔｕｒｅ）型のｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのいずれか又はこれらをコードするＤＮＡの塩基配列が、適切なベクターに含まれるようにしてもよい。このベクターは、例えば、真核生物において、核酸の発現に適した発現ベクターである。このベクターに含まれる核酸分子は、各ｍｉＲＮＡ分子の転写、ｍｉＲＮＡに成熟するまでの前駆体又は一次転写産物を標的としていてもよい。さらに、各ｍｉＲＮＡのゲノム上のコピー等を変更するような配列、転写調製配列等を含んでいてもよい。
【００２１】
〔診断方法〕
本発明の実施の形態に係る急性腎障害の診断方法は、上述の急性腎障害特異的バイオマーカーを用いることを特徴とする。
本発明の実施の形態に係る急性腎障害の診断方法では、主に、患者の血清中又は血漿（以下、単に「血液」という。）に存在するｍｉＲＮＡレベルを検出することで、急性腎障害であることを診断する。すなわち、本実施形態の急性腎障害の診断方法は、急性腎障害の検査方法としても用いることが可能である。
【００２２】
具体的には、本実施形態においては、ｍｉＲＮＡ−５１００の発現が低下している場合、急性腎障害と診断することが可能である。
このｍｉＲＮＡ−５１００の発現量の低下は、例えば、患者の血液中に存在する発現量を測定し、得られた数値について、統計的に有意差があるか否かを検定する。
さらに、ｍｉＲＮＡ−５１００の発現の低下と他の診断とを組み合わせて、急性腎障害と診断することが可能である。この他の診断は、例えば、ＫＤＩＧＯで開示された急性腎障害の早期バイオマーカー候補分子であってもよい。この分子としては、例えば、ＮＧＡＬ（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ）、ＫＩＭ−１（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）、脂肪酸結合タンパクであるＬ−ＦＡＢＰ（Ｌｉｖｅｒ−ｔｙｐｅ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を含んでいてもよい。
【００２３】
ｍｉＲＮＡ−５１００の血液中の発現量の測定としては、例えば、ヒト等の患者から採血をし、その上澄みを遠心し、血球を除いた血清又は血漿からトータルＲＮＡを抽出する。トータルＲＮＡの抽出方法としては、例えば、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ  Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法、当業者に一般的なＲＮＡ抽出用カラム等を用いることが可能である。この上で、抽出されたトータルＲＮＡ中から、本実施形態の各ｍｉＲＮＡの発現量を測定する。この測定は、例えば、ノーザンブロット、マイクロアレイ、ＱＣＭ（Ｑｕａｒｔｚ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ）センサ測定法、ｑＲＴ−ＰＣＲを含むリアルタイムＰＣＲ法等、当業者に一般的な方法を用いて実現することが可能である。リアルタイムＰＣＲ法を用いる場合、内在性コントロール（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ）ｍｉＲＮＡを用いた発現補正を行うことが可能である。この際の内在性コントロールは、以前に内在性コントロールとして適切と報告されている配列から、健常と病気で変化しないものを当業者が適切に選択することが好適である。
【００２４】
その後、測定された発現量から統計的な有意差を検定する場合、健常者に由来するサンプルから得られたｍｉＲＮＡの発現量と比較し、例えば、５％有意（ｐ＜０．０５）であるか否かを統計検定する。この検定は、例えば、Ｔ検定、Ｆ検定、カイ二乗検定等の手法をデータ量やデータの性質等に対応して、適宜用いることが可能である。
検定の結果、統計的に有意であれば、当該患者は、急性腎障害であると診断され得る。逆に、統計的に有意でなければ、当該患者は、急性腎障害ではないと診断され得る。この場合、他の指標等から、急性腎障害ではない、別の腎症の患者であると診断することも可能である。
このような診断方法により、発症初期の段階でも、高い信頼性をもって急性腎障害であることを判定することができる。これにより、治療方針の決定に対して重要な情報を提供することができる。
【００２５】
本発明の実施の形態に係る診断方法についてまとめると、本実施形態の診断方法は、急性腎障害の疑いのある患者から血液を採取する工程、採取した血液についてｍｉＲＮＡ−５１００の発現量を測定する工程、測定されたｍｉＲＮＡ−５１００の発現量と健常者のｍｉＲＮＡ−５１００の発現量（標準量）とを比較する工程、ｍｉＲＮＡ−５１００の発現量が標準量よりも低いこと検出する工程、及び検出された患者は急性腎障害であるリスクが高いと決定する工程、を含む急性腎障害の診断方法であることを特徴とする。
【００２６】
〔検査用キット〕
本発明の実施の形態に係る急性腎障害の検査用キットは、上述の急性腎障害特異的バイオマーカーとなるｍｉＲＮＡを測定する試薬を含むことを特徴とする。
このようなｍｉＲＮＡ測定用の試薬としては、例えば、ノーザンブロット、マイクロアレイ、ＱＣＭセンサ測定法、リアルタイムＰＣＲ法等の検出用の方式に対応したものを含む。すなわち、本実施形態の各ｍｉＲＮＡ検出用のプローブやプライマー等、各種酵素類、緩衝液、洗浄液、溶解液等も含まれる。これに加えて、上述の方式によりｍｉＲＮＡを検出するための資材、器材等を含んでもよい。
【００２７】
さらに、本実施形態の急性腎障害の検査用キットは、診断結果を解析するために、コンピュータ上で検査結果を判断し、データ処理し、可視化するためのプログラム、当該コンピュータを備えた装置及びシステム等を含んでいてもよい。このような装置及びシステム等は、当業者に一般的な技術、方式等を用いて開発可能である。このような装置及びシステム等により、ハイスループットでの検査が可能となり、患者の診断が容易となる。
【００２８】
〔急性腎障害用医薬〕
本実施形態の急性腎障害用医薬（医療用組成物）は、ｍｉＲＮＡの発現量を増加又は低下させる組成物を含むことを特徴とする。
具体的には、本実施形態の医療用組成物は、ｍｉＲＮＡ−５１００の機能活性調整剤を含むことを特徴とする。この機能活性調整剤は、ｍｉＲＮＡの発現を調節する作用を有する組成物である。
【００２９】
本実施形態においては、ｍｉＲＮＡ−５１００に対する機能活性調整剤は、機能活性亢進剤を用いる。この機能活性亢進剤は、ｍｉＲＮＡ−５１００に対応した塩基配列のｍｉＲＮＡミミックを含む。このｍｉＲＮＡミミックは、合成されたｍｉＲＮＡを含む組成物であってもよい。すなわち、ｍｉＲＮＡミミックにより、急性腎障害の腎臓内のｍｉＲＮＡの濃度を増加させる（過剰発現）ことで、ｍｉＲＮＡ−５１００に対する細胞の機能の活性を亢進させる。
【００３０】
本実施形態のｍｉＲＮＡ−５１００に対応したｍｉＲＮＡミミックは、マウスの場合、以下の配列のものを用いることが可能である：
５’−ＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＧＣＧＧＵＧＣＣＵＣＵ−３’  （配列番号３）
【００３１】
ヒトのｍｉＲＮＡ−５１００に対応したｍｉＲＮＡミミックも、ヒトのｍｉＲＮＡ−５１００に対応した同様のものを用いることが可能である。
この場合、投与量として、例えば、腎臓の細胞内において、健常人に対してｍｉＲＮＡ−５１００を投与した際の発現量の１．５〜２．５倍になるような量のｍｉＲＮＡ−５１００ミミック等を用いることが可能である。このうち、２．０倍前後となるような量が特に好適である。
【００３２】
加えて、本実施形態の急性腎障害用医薬は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）又はインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で所望の標的細胞に導入される当業者に一般的な方式で、患者の細胞に導入される。このため、本実施形態の医療用組成物は、当業者に一般的な各種媒体を含んで提供されてもよい。
この媒体としては、例えば、プラスミドやウイルスベクターを用いてもよい。このウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス等の当業者に一般的なウイルスを用いて構成されてもよい。
【００３３】
また、本発明の実施の形態に係る急性腎障害用医薬は、任意の製剤上許容しうる担体を含んでいてもよい。この担体は、例えば、リポソーム担体、コロイド金粒子、ポリペプチド、リポ多糖類、多糖類、脂質膜等であってもよい。これらの中で、機能活性調整剤の発現調整効果を向上させる担体を用いることが好適である。たとえば、ｍｉＲＮＡインヒビターやｍｉＲＮＡミミックについては、リポソーム、特にカチオン性リポソームを用いることが好適である。
【００３４】
さらに、製薬上許容される担体としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等を含んでいてもよい。さらに、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０等と共に投与することが可能である。また、適切な賦形剤等を更に含んでもよい。
【００３５】
また、本実施形態の急性腎障害用医薬は、製剤上許容しうる担体を調製するために、適切な薬学的に許容可能なキャリアを含んでいてもよい。このキャリアは、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン等の生体親和性材料を含んでもよい。また、キャリアは、乳濁液として提供されてもよい。さらには、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、乳化剤、可塑剤等の製剤用添加物のいずれか又は任意の組み合わせを含有させてもよい。
【００３６】
本発明に係る医薬組成物の投与経路は、特に限定されず、非経口的又は経口的に投与を行うことが可能である。非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内、腹腔内の投与、又は、腎臓等への直接投与が可能である。
本発明の実施の形態に係る急性腎障害用医薬は、非経口的又は経口的の投与に適した投与形態において、当該分野で周知の製剤上許容しうる担体を用いて処方され得る。
【００３７】
本発明の実施の形態に係る急性腎障害用医薬を上述の治療に用いる際に、投与間隔及び投与量は、疾患の状況、さらに対象の状態等の種々の条件に応じて適宜選択及び変更することが可能である。
本発明の実施の形態に係る急性腎障害用医薬の１回の投与量及び投与回数は、投与の目的により、更に、患者の年齢及び体重、症状及び疾患の重篤度等の種々の条件に応じて適宜選択及び変更することが可能である。
投与回数及び期間は、１回のみでもよいし、１日１回〜数回、数週間程度投与し、疾患の状態をモニターし、その状態により再度又は繰り返し投与を行ってもよい。
【００３８】
加えて、本発明の組成物は、他の組成物等と併用することも可能である。また、他の組成物と同時に本発明の組成物を投与してもよく、また間隔を空けて投与してもよいが、その投与順序は特に問わない。
また、本発明の実施の形態において、疾患が改善または軽減される期間は特に限定されないが、一時的な改善または軽減であってもよいし、一定期間の改善または軽減であってもよい。
【００３９】
〔治療法〕
本発明の実施の形態に係る動物治療方法は、動物の治療方法であって、ｍｉＲＮＡ−５１００の機能活性を調整することを特徴とする。
具体的には、本発明の実施の形態に係る急性腎障害用医薬は、動物の治療を行う動物治療にも用いることが可能である。この動物は、特に限定されるものではなく、脊椎動物及び無脊椎動物を広く含む。脊椎動物としては、魚類、両生類、は虫類、鳥類、及び哺乳類を含む。具体的には、例えば、哺乳類は、例えば、マウス、ラット、フェレット、ハムスター、モルモット、又はウサギ等のげっ歯類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、又は非ヒューマンのトランスジェニック霊長類等、及びヒトを含んでいてもよい。また、野生動物としては、哺乳類の他にも、魚類、家禽を含む鳥類、爬虫類等を含む。また、エビや昆虫等を含む甲殻類、その他のイカ等の無脊椎動物等も広く含む。
すなわち、本発明の実施の形態に係る急性腎障害用医薬は、ヒトの治療の他に、各種動物の治療、家畜の発育増進等の方法にも用いることができる。このため、本実施形態の患者は、ヒト、及び、上述のヒト以外の動物も含む。
【００４０】
本発明の実施の形態に係る治療方法についてまとめると、本実施形態の治療方法は、急性腎障害の疑いのある患者から血液を採取する工程、採取した血液についてｍｉＲＮＡ−５１００の発現量を測定する工程、測定されたｍｉＲＮＡ−５１００の発現量と健常者のｍｉＲＮＡ−５１００の発現量（標準量）とを比較する工程、ｍｉＲＮＡ−５１００の発現量が標準量よりも低いこと検出する工程、及び検出された患者に対して急性腎障害の治療を行う工程とを含む急性腎障害の治療方法であることを特徴とする。
そして、この急性腎障害の治療は、ｍｉＲＮＡ−５１００の機能活性を調整する治療を含むことを特徴とする。加えて、このｍｉＲＮＡ−５１００の機能活性を調整する治療は、上述の急性腎障害用医薬を投与すること含むことを特徴とする。
【００４１】
具体的には、本実施形態では、病態（病因）、病期等に依らず、急性腎障害に特異的な治療として、ｍｉＲＮＡ−５１００の機能活性を調整することで、急性腎障害の治療を行うことが可能である。特に、上述した急性腎障害用医薬を投与する等して、ｍｉＲＮＡ−５１００を過剰発現させる補充療法等により、急性腎不全を治療することが可能となる。この際、例えば、上述のリポソームのようなＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）等でｍｉＲＮＡ−５１００ミミックを投与することが可能である。
さらに、下記に示すような、当業者により実行される典型的な治療法を組み合わせることで、より効果的に急性腎障害を治療することが可能となる。
【００４２】
ここで、急性腎障害は、病態により、腎前性、腎性、腎後性の病因に分類される。
このうち、腎前性の急性腎障害は、腎臓への血流が低下する場合であり、脱水、血圧低下等で生じる。また、腎性の急性腎障害は、腎臓そのものに障害がある場合に生じる。この腎性の急性腎障害は、原疾患別に、コレステロール塞栓症、腎梗塞等による血管性の急性腎障害、急性糸球体腎炎、ループス腎炎、ＡＮＣＡ関連血管炎等による糸球体性の急性腎障害、及び、急性間質性腎炎、急性尿細管壊死、薬剤等による尿細管、間質性の急性腎障害に、更に細分化される。一方、腎後性の急性腎障害は、尿路の狭窄又は閉塞により生じる。これは、両側水腎症などで発生する。
【００４３】
典型的な病態（病因）別の急性腎障害の治療では、腎前性の急性腎障害では補液、腎性の急性腎障害では原疾患の治療、腎後性の急性腎障害では、尿路狭窄や閉塞の解除等の治療を行う。
さらに、急性腎障害のためのＫＤＩＧＯ診療ガイドラインによれば、典型的な急性腎障害の病期別治療は、「高リスク」状態では、可能な限り腎毒性物質を中止する、体液量と還流圧を担保する、機能的血液動態モニタリングを考慮する、血清クレアチン値と尿量とをモニターする、高血糖を防ぐ、造影剤を用いない代替策を考慮するといった療法を行う。この上で、レベル１では、これらに加え、非侵襲的精密検査を行い、侵襲的精密検査も考慮する。レベル２では、これらに更に加え、腎機能に応じて薬剤投与量を調整する、腎代替療法を考慮する、ＩＣＵへの入室を考慮するといった療法を行う。レベル３では、更に、可能なら鎖骨下カテーテルを避けるようにする。
【００４４】
加えて、本発明の実施の形態に係る急性腎障害用医薬は、動物の体内の一部分、又は動物から摘出または排出された臓器や組織等についても、治療用の対象とすることができる。さらに、この治療は広義の治療であり、バイオリアクター、モデル動物での培養、人体移植様の培養臓器の培養等にも適用可能である。
【００４５】
以上のように構成することで、以下のような効果を得ることができる。
急性腎障害は、ＫＤＩＧＯ分類において、血清クレアチニン値上昇及び尿量減少等に基づいて診断されている。しかし、この基準ではすでに治療介入のタイミングを逸していることも少なくなかった。加えて、腎予後の予測については、ＫＤＩＧＯ診断基準を用いることができるかどうか明らかではなかった。
このため、近年、尿中ＮＧＡＬ、Ｌ−ＦＡＢＰ等の急性腎障害の早期バイオマーカー候補分子も報告されてきていた。
【００４６】
具体的には、従来の急性腎障害の早期バイオマーカー候補分子であるＮＧＡＬは、尿中の好中球ゼラチナーゼ結合性リポカインの測定を行うもので、急性腎障害（ＡＫＩ）の診断補助として用いることが可能である。ＮＧＡＬのＲＯＣ曲線下面積は０．５０−０．９８であり、７５％（１２／１６）の研究で０．７０以上と中等度以上の診断精度であった（ＡＫＩ診療ガイドライン２０１６参照）。
一方、Ｌ−ＦＡＢＰは、ヒト近位尿細管の細胞質に局在する１４ｋｄの蛋白質であり、尿細管への虚血、酸化ストレスによって尿中に排出されるため、尿細管機能障害の早期診断に用いられる。Ｌ−ＦＡＢＰのＲＯＣ曲線下面積は０．７０−０．９５であり、すべての研究で０．７０以上と中等度以上の診断精度であった（ＡＫＩ診療ガイドライン２０１６参照）。
【００４７】
しかしながら、これらのバイオマーカー候補は、臨床的に真に有効か否かは未だ不明であった。これは、複数の測定方法が存在し標準化がなされておらず、測定のタイミングが定まっていないためであった。さらに、Ｌ−ＦＡＢＰにおいては、カットオフ値も定まっていなかった。すなわち、これらの従来のバイオマーカーによる診断が真に有用か否かは分からなかった。
また、そもそも、特許文献１に記載されたようなｍｉＲＮＡについては、急性腎障害特異的なｍｉＲＮＡの解析ではなかった。
【００４８】
これに対して、本発明の実施の形態に係る急性腎障害特異的バイオマーカーは、血液中に存在するｍｉＲＮＡであり、ｍｉＲＮＡ−５１００を用いることで、急性腎障害の診断に用いることが可能となる。
すなわち、本実施形態のバイオマーカーにより、予後の悪い腎疾患である急性腎障害を早期に正確に診断でき、また治療効果が期待できる。
加えて、本発明の実施の形態に係る急性腎障害の診断方法では、腎症のうち急性腎障害であることを早期に、被侵襲的に診断することが可能になる。
さらに、下記の実施例２で示したように、本実施形態のバイオマーカーは、従来のＮＧＡＬ及びＬ−ＦＡＢＰよりも急性腎障害を早いステージ（ステージ１）で診断可能である。
【００４９】
加えて、従来の急性腎障害の早期バイオマーカー候補分子であるＮＧＡＬ及びＬ−ＦＡＢＰは、測定時の試料が尿なので、尿がでない患者では測定できないことがあった。
これに対して、本実施形態のバイオマーカーは、血液（血清）を試料として測定可能であるため、尿がでない患者でも確実に測定することが可能である。
【００５０】
一方、急性腎障害の特異的治療法は全く実用化されていかった。すなわち、急性腎障害の治療では、特異的な治療薬が存在しなかった。
【００５１】
具体的には、従来の急性腎障害のガイドラインでは、低用量心房性ナトリウム利尿ペプチドの投与、ループ利尿薬の投与、低用量ドーパミンの投与、血液浄化療法が、薬剤、透析療法として取り上げられていた。しかしながら、急性腎障害の予防及び治療において、低用量心房性ナトリウム利尿ペプチドの投与のエビデンスは、不十分であった。さらに、急性腎障害の予防を目的としてループ利尿薬の投与は推奨されておらず、更に、体液過剰を補正する目的での使用を除き、急性腎障害の治療としてループ利尿薬を投与しないことが提案されていた。また、急性腎障害の予防及び治療に低用量ドーパミンの投与は推奨されていなかった。加えて、急性腎障害に対して早期の血液浄化療法開始が予後を改善するエビデンスは乏しく、臨床症状や病態を広く考慮して開始の時期が決定されていた。
このように、急性腎障害において、確立された治療薬や治療法はなく、輸液や原因薬物を避ける等の対症療法に限られていた。
【００５２】
これに対して、ｍｉＲＮＡ−５１００の機能活性調整剤を用いることで、新規の急性腎障害用医薬を提供でき、上述の診断と合わせて早期治療が可能となる。
特に、ＤＤＳ等でｍｉＲＮＡ−５１００ミミックを投与する等して、ｍｉＲＮＡ−５１００を過剰発現させる補充療法等により、尿管細胞等のアポトーシスを抑制し、急性腎障害の発症、進展による腎機能の低下を予防し、抑えることが可能となる。
具体的には、腎臓の尿細管の壊死と尿細管腔内に蛋白性円柱の充満等を抑えることができる。さらに、急性腎障害の発生時、発生予想時に、予防的に投与することで、急性腎障害の発症、進展を抑制することが期待できる。
【００５３】
なお、上述の実施の形態において、急性腎障害の検査方法として、血液からｍｉＲＮＡを取得する例について記載した。
しかしながら、ｍｉＲＮＡは血液以外、例えば、尿中にも安定して存在している。このため、血液以外の組織、体液、尿等から取得されたｍｉＲＮＡの量により、急性腎障害であると検出するように構成することも可能である。
【００５４】
さらに、本実施形態の診断方法は、早期診断のために予備的な診断する診断方法としても用いることが可能である。すなわち、急性腎障害では、上述のように、従来の診断では手遅れとなることもあった。このため、急性腎障害を早期に診断することで、的確な早期治療を可能とし、治療効果を向上させることができる。
【００５５】
加えて、急性腎障害用医薬となる、ｍｉＲＮＡ−５１００の機能活性調整剤として、ｍｉＲＮＡミミック以外のものを用いることも可能である。
さらに、ｍｉＲＮＡ−５１００の発現調整の対象となる遺伝子、遺伝子産物、アゴニスト／アンタゴニスト、その他のパスウェイに対する作用を介した組成物を、機能活性調整剤として用いることも可能である。
【００５６】
さらに、急性腎障害用医薬としてのｍｉＲＮＡ−５１００の機能活性調整剤として、その他のｍｉＲＮＡの転写調節因子を用いたり、各種ベクターによる発現調節、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ等による遺伝子治療等を行ったりすることも可能である。
加えて、ｍｉＲＮＡ−５１００が発現調整の対象とする遺伝子やパスウェイに対する作用を介した遺伝子治療を行うことも可能である。
【００５７】
また、本発明の実施の形態に係る医薬は、他の組成物等と併用することも可能である。本発明の組成物を、他の組成物と同時に投与、散布、塗布等をしてもよい。
【００５８】
加えて、ｍｉＲＮＡ−５１００の機能活性調整剤を、医薬以外の用途に用いることも可能である。さらに、この機能活性調整剤として、ｍｉＲＮＡインヒビター等の活性抑制剤を用いてもよい。これにより、動物での急性腎障害における作用機序の実験やモデル等に用いることも可能である。
このｍｉＲＮＡインヒビターは、例えば、成熟型のｍｉＲＮＡの生成を阻害、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを切断等して、発現を抑制するアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、リボザイム等の核酸分子を含む各種組成物を用いることが可能である。
【実施例１】
【００５９】
以下で、本発明の実施の形態に係る急性腎障害特異的バイオマーカーについて、具体的な実験を基にして、実施例としてさらに具体的に説明する。しかしながら、この実施例は一例にすぎず、これに限定されるものではない。【００６０】
〔材料と方法〕
（マイクロアレイ分析）
ｍｉＲＮＡ発現の分析は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ及びＨｙｂキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ社製）を用いて、北海道システムサイエンス社（北海道、日本）に外注して実行した。１００ｎｇのトータルＲＮＡを、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて３７℃で３０分間脱リン酸化し、１００℃で７分間、１００％ジメチルスルホキシドを用いて変性させた。次いで、このサンプルを氷上で２分間冷却した。次いで、サンプルにＴ４リガーゼを用いて１６℃で、２時間インキュベーションさせｐＣｐ−Ｃｙ３で標識した。その後ｐＣｐ−Ｃｙ標識サンプルを８×１５ＫフォーマットＡｇｉｌｅｎｔマウスｍｉｃｒｏＲＮＡアレイ上でハイブリダイズさせた。その後プレートを洗浄し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙスキャナーを用いて３μｍの分解能でスキャンした。データは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアバージョン１０．７．３．１を使用して解析した。【００６１】
（マイクロアレイデータ処理及び統計解析）
ＡｇｉｌｅｎｔデータをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にインポートし、チップあたり９０パーセンタイルに正規化した。  一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて異なる群間の差異を解析した。ＡＮＯＶＡによって統計的有意性が検出された場合、２つの異なる群の平均を比較するためにポストホック検定としてＴｕｋｅｙ検定を行った。Ｐ＜０．０５を有意差ありと判定した。【００６２】
（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
（マウス腎臓）
ガラスホモジナイザー及びフィルターカラムシュレッダー（ＱＩＡシュレッダー、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ製）を用いて、マウス腎臓をホモジナイズした。その後、ｍｉＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、均質化した腎臓サンプルからｍｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを単離した。次に、ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、単離された１μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを逆転写した。次に、ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を行った。ｑＲＴ−ＰＣＲの条件はＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  １２Ｋ  Ｆｌｅｘ  Ｆｌｅｘ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍを用いて、９５℃で１５分間のプレインキュベーション、次いで、（１）９４℃で１５秒間の変性、（２）５５℃で３０秒間のアニーリング、（３）７０℃で３０秒間の伸長のサイクルを４０サイクル行い、結果は、ＲＮＵ６−２（ＱＵＩＡＧＥＮ社製）をｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｃｏｎｔｒｏｌとして用いて、２−ΔΔＣＴ  ｍｅｔｈｏｄで解析した。【００６３】
（ヒト血清）
ヒト血清のｍｉＲＮＡレベル解析は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｐｌａｓｍａカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、ＰＡ、ＵＳＡ製）を用いて４００μｌの血清からトータルＲＮＡを単離した。次に、単離したトータルＲＮＡをｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて逆転写した。次に、ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。ｑＲＴ−ＰＣＲの条件はＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ−１２Ｋ  Ｆｌｅｘ  Ｆｌｅｘ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍを用いて、９５℃で１５分間のプレインキュベーション、次いで（１）９４℃で１５秒間の変性、（２）５５℃で３０秒間のアニーリング、（３）及び７０℃で３０秒間の伸長のサイクルを４０サイクル行い、結果は、ｍｉＲＮＡ−４２３−３ｐをｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌとして用いて、２−ΔΔＣＴ  ｍｅｔｈｏｄで解析した。【００６４】
以下のプライマーを用いた。
マウスｍｉＲＮＡ−５１００  ＰＣＲに使用したプライマー（ＱＩＡＧＥＮ社製）：
５’−ＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＧＣＧＧＵＧＣＣＵＣＵ−３’（配列番号４）【００６５】
ヒトｍｉＲＮＡ−５１００  ＰＣＲに使用したプライマー（ＱＩＡＧＥＮ社製）：
５’−ＵＵＣＡＧＡＵＣＣＣＡＧＣＧＧＵＧＣＣＵＣＵ−３’（配列番号５）【００６６】
（急性腎障害モデルマウス）
図１により、試験に用いた急性腎障害モデルマウスについて説明する。本実施例１においては、虚血再灌流モデルマウス（ＩＲＩ  Ｍｏｄｅｌ）、及びリポポリサッカライド（ＬＰＳ）投与モデルマウス（ＬＰＳ  Ｍｏｄｅｌ）を用意した。
虚血再灌流モデルマウスは、Ｃ５７／Ｂ６  ｍｉｃｅ（９週齢、雄）の右腎臓を摘出後、左腎動脈を４５分間クランプして腎血流を遮断し、急性腎不全を誘導し２４時間後に解剖した。
ＬＰＳ投与モデルマウスは、Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ、１０μｇ／ｇ）ＰＢＳ水溶液を：Ｃ５７／Ｂ６  ｍｉｃｅ（９週齢  雄）に単回投与し急性腎不全を誘導し２４時間後に解剖した。
これらの基になったマウス、その他のコントロールマウスは、動物繁殖研究所より購入した。【００６７】
（ｍｉｃｒｏＲＮＡ−５１００の過剰発現）
（ｍｉＲＮＡ−５１００ミミック及びコントロールｍｉＲＮＡ）
マウスでの過剰発現（Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）用のｍｉＲＮＡ−５１００ミミック、及びコントロールのｍｉＲＮＡは、株式会社ジーンデザインから購入した。
ｍｉＲＮＡ−５１００ミミック（株式会社ジーンデザイン製）の配列は、上述の配列番号３と同様である。
コントロールのｍｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔｒｏｌ−ｍｉＲＮＡ）は、ｍｉＲＢａｓｅに登録されているｍｉＲＮＡと相同しない合成配列であり、ネガティブコントロールである。【００６８】
（ｍｉＲＮＡ−５１００  ｍｉｍｉｃ−ＰＥＩ−ＮＰの調製）
ｍｉＲＮＡ−５１００を投与する際の非ウイルス性キャリアとして、ナノサイズのリポソームであるＬｉｎｅａｒ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ＰＥＩ−ＮＰ）を使用した。ＰＥＩ−ＮＰは、生体適合性、安定性、トランスフェクション能力に優れているため、ｍｉＲＮＡの投与について好適に用いられる。本実施例１では、ＰＥＩ−ＮＰとして、ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社製）を用いた。
具体的には、ｍｉＲＮＡ−５１００ミミックを濃度５０μＭの５％グルコース溶液に溶解した。ＰＥＩ−ＮＰは、５％グルコース溶液に溶解した。ｍｉＲＮＡミミック及びＰＥＩ−ＮＰを混合し、室温で１５分間インキュベートして、ｍｉＲＮＡ−５１００  ｍｉｍｉｃ−ＰＥＩ−ＮＰｓを調整した。これにより、凝縮したｍｉＲＮＡ−５１００ミミックは、リポソームでカプセル化される。
同じ方式を用いて、コントロールのｍｉＲＮＡにＰＥＩ−ＮＰＰを混合させたｃｏｎｔｒｏｌ−ｍｉＲＮＡ−ＰＥＩ−ＮＰｓを調製した。【００６９】
〔結果〕
（マイクロアレイ解析及びｑＲＴ−ＰＣＲ結果）
本実施例１では、急性腎障害で変化するｍｉＲＮＡの解析とバイオマーカーとしての可能性の検討を行った。このため、外科手技、薬物投与そのもの等の実験的因子の影響を除外するため、機序の異なる確立された２種類の急性腎障害モデルマウスを用いて、急性腎障害腎臓で変化するｍｉＲＮＡをマイクロアレイ法で網羅的に解析した。
このうち、虚血再灌流モデルマウスは、外科手術後等の虚血による急性腎障害モデルマウスである。一方、ＬＰＳ投与モデルマウスは、敗血症での急性腎障害モデルマウスである。【００７０】
まず、急性腎障害で共通して変化するマイクロＲＮＡをマイクロアレイ法で網羅的に解析した。図２Ａ、図２Ｂに、マイクロアレイ解析の結果を示す。図２Ａは、虚血再灌流モデルマウスでの結果である。図２Ｂは、ＬＰＳ投与モデルマウスでの結果である。
それぞれ、各急性腎障害マウス（４匹）と正常マウス（コントロールマウス）（４匹）の腎臓で、１８８１種類のｍｉＲＮＡのマイクロアレイ解析を行った。
結果として、１８８１種類のｍｉＲＮＡのなかから、虚血再灌流急性腎障害マウス及びＬＰＳ投与急性腎障害マウス腎臓で共通して１．２倍以上上昇しているｍｉＲＮＡを１８種類と、１．２倍以上低下しているｍｉＲＮＡを１９種類、合計３７種類を選出した。【００７１】
（ヒトでのｑＲＴ−ＰＣＲ結果）
マウスの血清で特異的に変化するｍｉＲＮＡについて、ヒトにおいて、血清で健常人と比較し急性腎障害患者で変化するｍｉＲＮＡを検索し、急性腎障害のバイオマーカーとなるｍｉＲＮＡを同定した。
急性腎障害モデルマウスの腎臓で有意に発現変化していた３７種類のｍｉＲＮＡについて、急性腎障害患者（３１例）（ＫＤＩＧＯ分類で診断）、健常人（２３例）の血清からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  ｍｉＲＮＡ  Ｐｌａｓｍａ  ｋｉｔを用いてｍｉＲＮＡを抽出し、ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ  Ｋｉｔ（登録商標）を用いて、ｃＤＮＡを作成し、ｑＲＴ−ＰＣＲでｍｉＲＮＡの発現を比較検討した。
これにより、急性腎障害患者の血清でのみ特異的に発現減少するｍｉＲＮＡである、ｍｉＲＮＡ−５１００を同定した。【００７２】
（ｍｉＲＮＡ−５１００の発現解析）
次に、図３により、ｍｉＲＮＡ−５１００の発現量の変化について説明する。
図３は、健常人を１として正規化し、ｑＲＴ−ＰＣＲによる発現量の差をみたグラフである。ｍｉＲＮＡ−５１００の発現量は、Ｐ＜０．０５で有意に低下していた。
この解析結果について、下記の表１に平均及び標準偏差を示す。【００７３】
【表１】
2020071518.tif 000003
【００７４】
図４は、ｍｉＲＮＡ−５１００についてのＲＯＣ曲線による精度評価（信用性）を示すグラフである。ここでは、急性腎障害患者１５例と、健常人２０例に分けた合計３５例での解析を行った。ＡＵＣは０．７６２となり、Ｐ＜０．０５で特異的なマーカーであった。
この曲線の下の領域積についての検定結果を、下記の表２に示す。【００７５】
【表２】
2020071518.tif 000004
【００７６】
（ｍｉＲＮＡ−５１００の急性腎障害の医薬としての検討）
次に、急性腎障害モデルマウスで、ｍｉＲＮＡ−５１００による急性腎障害の医薬としての効果について検討した。
具体的には、ｍｉＲＮＡ−５１００ミミックを、ＰＥＩ−ＮＰを用いて投与し、腎臓へ到達させ、腎臓でのｍｉＲＮＡ−５１００の発現量、腎重量、腎障害を反映して上昇する分子の量の測定を行って、効果を評価した。【００７７】
図５によると、実際の投与では、株式会社ジーンデザインのプロトコルに従って、各マウスに合計２００μＬのｍｉＲＮＡ−５１００−ＰＥＩ−ＮＰ（ｍｉＲＮＡ：５ｎｍｏｌ、Ｎ／Ｐ比＝６）を尾静脈から静脈注射した。
ここで、虚血再灌流モデルマウスにｍｉＲＮＡ−５１００  ｍｉｍｉｃ−ＰＥＩ−ＮＰｓを投与したものを投与群とした。これに対するコントロールとして、虚血再灌流モデルマウスの施術をせずＰＥＩ−ＮＰも投与しない群（偽手術、Ｓｈａｍ）、ＰＥＩ−ＮＰを投与しない虚血再灌流モデルマウス群（ＩＲＩ）、虚血再灌流モデルマウスにｃｏｎｔｒｏｌ−ｍｉＲＮＡ−ＰＥＩ−ＮＰｓを投与した群（コントロールｍｉＲＮＡ投与群）を用いた。【００７８】
図６は、腎でのｍｉＲＮＡ−５１００の発現量の結果を示すグラフである。各グラフにおいて、ｔ検定後ｓｈａｍの値を１にした相対的なｍｉＲＮＡ−５１００の発現量を示している。「※」はｐ＜０．０５、「※※」は、ｐ＜０．０１で有意であることを示す。
結果として、投与群（ｍｉＲＮＡ−５１００  ｍｉｍｉｃ−ＰＥＩ−ＮＰｓ）では、各コントロールに対して、腎中のｍｉＲＮＡ−５１００の相対的な発現量が統計的に有意に増加した。【００７９】
図７は、各群における両側腎重量（ｍｇ）／体重（ｇ）を示すグラフである。各グラフにおいて、ｔ検定後ｓｈａｍの値を１にしている。
結果として、ｍｉＲＮＡ−５１００投与群（ｍｉＲＮＡ−５１００  ｍｉｍｉｃ−ＰＥＩ−ＮＰｓ）は、最も腎腫大を認めた。予備的な実験において、急性腎障害においては、腎重量がより増加することで、腎臓へのダメージが抑えられると推測されている。【００８０】
次に、図８Ａ〜図８Ｄにより、ｍｉＲＮＡ−５１００ミミックの投与による、腎障害を反映して上昇する分子の量の測定結果について説明する。この分子としては、ＫＤＩＧＯ急性腎障害治療に関するガイドライン（ＫＤＩＧＯ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  Ａｃｕｔｅ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｊｕｒｙ）において紹介されたバイオマーカー「候補」分子である、ＮＧＡＬ、ＫＩＭ−１（Ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｊｕｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）、Ｌ−ＦＡＢＰ、ＩＬ−１８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １８）を用いた。図８Ａは、ＮＧＡＬの相対発現量を各群について示したグラフである。図８Ｂは、ＫＩＭ−１の相対発現量を各群について示したグラフである。図８Ｃは、Ｌ−ＦＡＢＰの相対発現量を各群について示したグラフである。図８Ｄは、ＩＬ−１８の相対発現量を各群について示したグラフである。各図は、ｔ検定後ｓｈａｍの値を１にした相対的な発現量を示す。【００８１】
ＮＧＡＬ、ＫＩＭ−１、Ｌ−ＦＡＢＰについては、ｍｉＲＮＡ−５１００投与群（ｍｉＲＮＡ−５１００  ｍｉｍｉｃ−ＰＥＩ−ＮＰｓ）において、虚血再灌流モデルマウス群（ＩＲＩ）及びコントロールｍｉＲＮＡ投与群（ｃｏｎｔｒｏｌ−ｍｉＲＮＡ−ＰＥＩ−ＮＰｓ）に対して、それぞれｐ＜０．０５で有意に発現が減少した。すなわち、ｍｉＲＮＡ−５１００の腎での過剰発現は急性腎障害で腎障害を反映して上昇する分子を有意に抑制した。
このように、ｍｉＲＮＡ−５１００は急性腎障害の治療薬になる可能性があることが効果として示された。【００８２】
なお、ＩＬ−１８に関しては、ｍｉＲＮＡ−５１００投与群は、虚血再灌流モデルマウス群及びコントロールｍｉＲＮＡ投与群に対して統計検定で有意とならなかった。しかしながら、虚血再灌流モデルマウス群とコントロールｍｉＲＮＡ投与群とに対する検定では、ｐ＜０．０５となった。このため、虚血再灌流モデルマウスの施術後におけるｍｉＲＮＡの投与による何らかの機序により、ＩＬ−１８の発現量が変化する可能性が示唆される。すなわち、外科手術後等の虚血による急性腎障害において、ＩＬ−１８のバイオマーカーとしての特異性が低い可能性が推測される。
【実施例２】
【００８３】
〔ヒトの診断結果〕
（ｍｉＲＮＡ−５１００の従来のＡＫＩマーカーとの比較）
実際の急性腎障害患者（１４例）について、従来のＡＫＩマーカーである尿中ＮＧＡＬ値、尿中Ｌ−ＦＡＢ値と、ｍｉＲＮＡ−５１００の発現低下による診断との比較を行った。
ｍｉＲＮＡ−５１００の発現低下による診断は、上述の実施例１と同様である。
尿中ＮＧＡＬは、患者から採尿後、４００Ｇ以上で５分間遠心分離し、上清を採取し、株式会社ＳＲＬに提出し、ＣＬＩＡ法で測定した。
尿中Ｌ−ＦＡＢＰは、採取した尿を冷蔵保存し、株式式会社ＳＲＬにて、ＣＬＥＩＡ法で測定した。
この結果について、下記の表３に示す。【００８４】
【表３】
2020071518.tif 000005
【００８５】
上述の表３において、無尿のためＮＧＡＬ、Ｌ−ＦＡＢＰ測定できなかった３名は、除外して比較している。
結果として、ｍｉＲＮＡ−５１００の発現低下は、ＮＧＡＬ、Ｌ−ＦＡＢＰが変化していない早いステージ（ｓｔａｇｅ  １）の急性腎障害においても認められた。これにより、ｍｉＲＮＡ−５１００は、急性腎障害のバイオマーカーとしてＮＧＡＬ、Ｌ−ＦＡＢＰより優位性があると考えられる。【００８６】
〔急性腎障害進展抑制の推定機序〕
上述の実施例１では、ｍｉＲＮＡ−５１００ミミックの投与による過剰発現時に、尿細管間質細胞の障害マーカーであるＮＧＡＬとＫＩＭ−１が抑制されたことを示した。これらは、小胞体ストレス（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  Ｓｔｒｅｓｓ、ＥＲストレス）時におけるＡＴＦ−６経路、ＰＥＲＫ経路、ＩＲＥ−１経路の３つの経路のうち、ＡＴＦ−６経路、ＰＥＲＫの経路のｍＲＮＡに関与している可能性があると考えられた。このため、上述の実施例１と同様にして、ＡＴＦ−６経路、ＰＥＲＫの経路の遺伝子について、別途、ｍｉＲＮＡ−５１００ミミックの投与後の発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲで測定した。【００８７】
その結果、ＡＴＦ−６、ＢＩＤ、ＩＰ３Ｒ、Ｐ５３の発現が有意に変化していた。このうち、ＡＴＦ−６（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ６）は、ＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーに属する膜結合型転写因子である。小胞体ストレス応答（Ｕｎｆｏｌｄｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、ＵＰＲ）タンパク質の発現を活性化させる。ＢＩＤは、アポトーシス促進性のＢｃｌ−２ファミリータンパク質の一つである。ＩＰ３Ｒは、細胞内の小胞体膜に組み込まれているイノシトールトリスリン酸受容体（Ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）である。Ｐ５３は、アポトーシスに関連するガン抑制遺伝子である。【００８８】
図９及び図１０に、これらの分子の相対発現量を各群について示したグラフを示す。図９（ａ）は、ＡＴＦ−６の相対発現量を各群について示したグラフである。図９（ｂ）は、ＢＩＤの相対発現量を各群について示したグラフである。各図は、ｔ検定後ｓｈａｍの値を１にした相対的な発現量を示す。
ＡＴＦ−６及びＢＩＤは、いずれもｍｉＲＮＡ−５１００ミミックの投与により、発現が減少していた。これらの遺伝子は、小胞体ストレス応答のＡＴＦ−６経路に関連している。すなわち、ｍｉＲＮＡ−５１００ミミックの投与で、これらの遺伝子の発現が低下することにより、当該経路の下流のＢｉＰ／ＧＲＰ７８やＧＲＰ９４を抑制し、ＸＢＰ−１やＣＨＯＰも抑制することで、アポトーシスを抑制できると考えられる。【００８９】
図１０（ａ）は、ＩＰ３Ｒの相対発現量を各群について示したグラフである。図１０（ｂ）は、Ｐ５３の相対発現量を各群について示したグラフである。これらの図も、ｔ検定後ｓｈａｍの値を１にした相対的な発現量を示す。
ＩＰ３Ｒは、ｍｉＲＮＡ−５１００ミミックの投与により、発現が有意に上昇していた。一方、Ｐ５３は、ｍｉＲＮＡ−５１００ミミックの投与により、発現が減少していた。これらの遺伝子は、小胞体ストレス応答のＰＥＲＫ経路に関連している。具体的には、ＩＰＲが発現上昇すると、小胞体へのＣａ流入低下が抑制され、アポトーシスが抑制される。さらに、Ｐ５３が発現減少すると、アポトーシスが抑制される。【００９０】
図１１にこれらの遺伝子により、急性腎障害の進展が抑制された機序の推定についてまとめたものを示す。
すなわち、ｍｉＲＮＡ−５１００ミミックの投与で、ＡＴＦ−６、ＢＩＤ、ＩＰ３Ｒ、Ｐ５３の発現が変化し、腎臓の小胞体ストレスを抑制し、腎臓のアポトーシスを抑制して、結果として、急性腎障害の発症及び進展を抑制すると考えられる。【００９１】
なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明によれば、血液中に存在するｍｉＲＮＡを急性腎障害特異的バイオマーカーとして用いることで、急性腎障害の早期診断と治療用の医薬の提供が期待でき、産業上利用可能である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月16日(2020.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性腎障害特異的バイオマーカーとしてｍｉＲＮＡ−５１００を用い、
ステージ１以降の急性腎障害を診断する
ことを特徴とする急性腎障害の診断方法。
【請求項２】
前記ステージ１は、ＮＧＡＬ、Ｌ−ＦＡＢＰが変化していない早いステージである
ことを特徴とする請求項１に記載の急性腎障害の診断方法。
【請求項３】
前記ｍｉＲＮＡ−５１００の発現が低下している場合、急性腎障害と診断する
ことを特徴とする請求項２に記載の急性腎障害の診断方法。
【請求項４】
ｍｉＲＮＡ−５１００を測定する試薬を含む
ことを特徴とする急性腎障害の検査用キット。
【請求項５】
ヒト以外の動物の治療方法であって、
ｍｉＲＮＡ−５１００の機能活性を調整し、
急性腎障害を治療する
ことを特徴とする動物治療方法。
【請求項６】
ｍｉＲＮＡ−５１００の機能活性調整剤を含む
ことを特徴とする急性腎障害用医薬。
【請求項７】
前記機能活性調整剤は、
前記ｍｉＲＮＡ−５１００の機能活性亢進剤を含む
ことを特徴とする請求項６に記載の急性腎障害用医薬。
【請求項８】
前記機能活性亢進剤は、前記ｍｉＲＮＡ−５１００に対応したｍｉＲＮＡミミックである
ことを特徴とする請求項７に記載の急性腎障害用医薬。
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月19日(2020.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性腎障害特異的バイオマーカーとしてｍｉＲＮＡ−５１００を用い、
ステージ１の急性腎障害を診断する
ことを特徴とする急性腎障害の診断方法。
【請求項２】
前記ステージ１は、ＮＧＡＬ、Ｌ−ＦＡＢＰが変化していない早いステージである
ことを特徴とする請求項１に記載の急性腎障害の診断方法。
【請求項３】
前記ｍｉＲＮＡ−５１００の発現が低下している場合、急性腎障害と診断する
ことを特徴とする請求項２に記載の急性腎障害の診断方法。
【請求項４】
ｍｉＲＮＡ−５１００を測定する試薬を含む
ことを特徴とする急性腎障害の検査用キット。
【請求項５】
ヒト以外の動物の治療方法であって、
ｍｉＲＮＡ−５１００の機能活性を調整し、
少なくともｐ５３の発現量を減少させ、急性腎障害を治療する
ことを特徴とする動物治療方法。
【請求項６】
ｍｉＲＮＡ−５１００の機能活性調整剤を含み、
少なくともｐ５３の発現量を減少させる
ことを特徴とする急性腎障害用医薬。
【請求項７】
前記機能活性調整剤は、
前記ｍｉＲＮＡ−５１００の機能活性亢進剤を含む
ことを特徴とする請求項６に記載の急性腎障害用医薬。
【請求項８】
前記機能活性亢進剤は、前記ｍｉＲＮＡ−５１００に対応したｍｉＲＮＡミミックである
ことを特徴とする請求項７に記載の急性腎障害用医薬。
【国際調査報告】
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