(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列からなるアポトーシス誘導ペプチド、またはこのペプチドのＣ末端がアミド化またはアシル化された誘導体。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列からなるアポトーシス誘導ペプチド、このペプチドのＣ末端がアミド化またはアシル化された誘導体、このペプチドもしくはこのペプチドのＣ末端がアミド化またはアシル化された誘導体の薬理学的に許容される塩類、またはこれらの混合物を有効成分として含有するアポトーシス誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、特定のアミノ酸配列を含むアポトーシス誘導ペプチドまたはこのペプチドの誘導体、およびこれらを有効成分として含有するアポトーシス誘導剤に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、医薬品、特にエイズ、リウマチ等の治療、または制癌剤、癌転移抑制剤等として有用なアポトーシス誘導剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アポトーシスは、プログラムされた細胞死の一種であり、周囲の細胞との接触の欠乏、細胞質の濃縮化、エンドヌクレアーゼの活性に関連したクロマチンの凝縮および核凝縮、核の断片化、膜被包性球状小体化、隣接するマクロファージもしくは上皮細胞などによる球状小体の貪食、またはエンドヌクレアーゼ活性によりＤＮＡのヌクレオソーム単位が１８０〜２００塩基長のＤＮＡに断片化、といった現象が観察され、このような現象が認められるアポプティック体細胞の最終断片が隣接する細胞により貪食される機構として論じられている［イムノロジー・ツデー（Immunology Today）、第７巻、第115 〜119 ページ、1986年；サイエンス(Science) 、第245 巻、第301 〜305 ページ、1989年］。
【０００３】
従来の癌治療法（例えば、化学療法、放射線療法等）においては、腫瘍細胞の大部分はネクローシスにより細胞死が惹起されていた。ネクローシスはアポトーシスとは異なり、周囲組織に炎症反応を惹起するため、強い発熱、悪心、嘔吐等の症状を伴っていた。一方、アポトーシスは周囲組織に炎症反応を伴わないため前記の症状は極めて少ないと予想されている。従って、腫瘍細胞をアポトーシスにより細胞死に至らしめることが、臨床応用において効率の良い癌治療法を開発するために有効であると考えられている。
【０００４】
アポトーシスは、胚発生過程または細胞代謝回転が盛んな正常細胞（例えば、肝、副腎皮質、前立腺等）の生理的細胞死において確認されている［インターナショナル・レビュー・オブ・サイトロジー（International Review of Cytology）、第68巻、第251 〜306 ページ、1980年］。
また、アポトーシスは、グルココルチコイド、放射線照射、ＮＫ細胞、キラー細胞、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、またはリンフォトキシン（ＬＴ）等のサイトカイン類等によって誘導されることが報告されている［ネイチャー（Nature）、第284 巻、第555 〜556 ページ、1986年；インターナショナル・ジャーナル・オブ・ラジエーショナル・バイオロジー（International Journal of Radiational Biology）、第53巻、第65ページ、1988年；プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンセス・ユーエスエー（Proceeding of the National Academy of Sciences, USA ）、第83巻、第1881〜1885ページ、1986年；ジャーナル・オブ・イムノロジー（Journal of Immunology ）、第129 巻、第1782〜1787ページ、1982年；ジャーナル・オブ・イムノロジー（Journal of Immunology ）、第140 巻、第689 〜692 ページ、1988年；ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（European Journal of Immunology）、第17巻、第689 〜693 ページ、1987年］。
【０００５】
また、蛋白合成阻害剤であるシクロヘキシミド（Cycloheximide)またはＲＮＡ合成阻害剤であるアクチノマイシンＤ（Actinomycin D ）が、ヒト白血病細胞ＨＬ−６０に対してアポトーシスを誘導することも報告されている［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Journal of Immunology ）、第145 巻、第1859〜1867ページ、1990年］。
【０００６】
さらに、最近では、免疫細胞のアポトーシスに関与する細胞膜分子であるＦａｓ抗原に対する抗Ｆａｓモノクローナル抗体が調製され、この抗Ｆａｓ抗体が種々のヒト細胞に対し致死活性を示すことが報告され［ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Journal of Experimental Medicine）、第169 巻、第1747ページ、1989年］、抗Ｆａｓ抗体の医薬への応用については種々の研究がなされており、例えば、エイズ、腫瘍、リウマチの治療剤等が報告されている［特開平２−２３７９３５号公報、特表平５−５０３２８１号公報；特開平８−２０８５１５号公報］。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、従来から、アポトーシス誘導活性を示す蛋白質等が知られているが、これらの蛋白質は高分子であることから、その抗原性、熱に対する安定性および化学合成の困難性等の問題を有していた。
従って、抗原性等の副作用を示さず、かつ熱にも安定なアポトーシス誘導剤の発見が望まれていた。特に、腫瘍細胞に選択的に作用し、周囲の組織に有害な炎症反応を惹起しないアポトーシス誘導剤が強く望まれていた。また、安価かつ大量に化学合成による供給が可能で、実用性が高い低分子のアポトーシス誘導ペプチドの発見が望まれていた。
【０００８】
この発明は、以上のとおりの従来技術の現状に鑑みてなされたものであり、副作用を示さず、熱にも安定であり、腫瘍細胞を選択的に細胞死させるアポトーシス誘導ペプチド、このペプチドの誘導体、およびこれらを有効成分として含有するアポトーシス誘導剤を提供することを目的としている。
また、この発明は、安価かつ大量に化学合成による供給が可能で、実用性が高いアポトーシス誘導ペプチドとその誘導体を提供することを目的としている。
【0009】
【課題を解決するための手段】
この発明は、前記の課題を解決するものとして、配列番号１のアミノ酸配列からなるアポトーシス誘導ペプチド、またはこのペプチドのＣ末端がアミド化またはアシル化された誘導体を提供する。また、この発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるアポトーシス誘導ペプチド、このペプチドのＣ末端がアミド化またはアシル化された誘導体、このペプチドもしくはこのペプチドのＣ末端がアミド化またはアシル化された誘導体の薬理学的に許容される塩類、またはこれらの混合物を有効成分として含有するアポトーシス誘導剤を提供する。
【００１０】
以下、発明の実施の形態について詳しく説明する。なお、以下の説明において百分率（％）の表示は特に断りのない限り重量による値である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
この発明のアポトーシス誘導ペプチドは、５から２０個のアミノ酸からなり、その配列中のいずれかの位置に配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とするものである。このよなアポトーシス誘導ペプチドまたはその誘導体は、固相法、液相法等の公知の方法によって化学的に合成することができる。
【００１２】
固相法による場合は、ペプチド合成用固相樹脂を使用して、アミノ酸ブロックを順次縮合させ、ペプチド鎖を延長して、ペプチドを合成する。アミノ酸ブロックとして、Ｎ末端および側鎖の反応性基を９−フルオレニルメトキシカルボニル（以下、Fmocと略記する）基等の保護基で保護したアミノ酸誘導体を使用し、Ｃ末端側からの縮合反応およびＮ末端側の脱保護基反応を反復して目的のペプチド鎖を合成する。次いで、Ｎ末端および側鎖の反応性基が保護されたペプチドを樹脂から切断して取り出し、脱保護反応を行うことにより、目的とするペプチドを得ることができる。
【００１３】
また、アポトーシス誘導ペプチドの誘導体は、アポトーシス誘導ペプチドの一部置換体または付加化合物等のペプチドの誘導体であり、Ｃ末端がアミド化またはアシル化されたペプチドの誘導体を例示することができる。
特に、Ｃ末端がアミド化されたペプチドの誘導体を合成する場合には、前記のとおり、Ｎ末端および側鎖の反応性基が保護されたペプチドを樹脂から切断して取り出した後、このペプチドのＣ末端のアミド化を行い、さらに脱保護反応を行い、目的とするペプチドの誘導体を得ることができる。
【００１４】
また、Ｃ末端がアミド化されたペプチド誘導体を合成する場合には、通常の固相樹脂の代わりにＣ末端アミドペプチド合成用固相樹脂［例えば、パーキン・エルマー（Perkin Elmer）社製。Fmocアミドレジン］を使用することもできる。この場合には、保護基の選択によって、脱樹脂および脱保護を同時に実施できるので便利である。
【００１５】
以上の操作を機械化、自動化したペプチド自動合成装置［例えば、パーキン・エルマー社製。Model 433A］を使用して実施することもできる。
液相法による場合は、Ｎ末端、Ｃ末端、および側鎖の反応性基を保護基で保護したアミノ酸誘導体をアミノ酸ブロックとし、これを使用して縮合反応、およびＮ末端またはＣ末端の脱保護基反応を反復して目的のペプチド鎖を合成する。さらに、液相法においてはＣ末端側またはＮ末端側から順次ペプチド鎖を延長する逐次鎖長延長法に代えて、目的とするペプチド鎖を適当なフラグメントに分割し、各フラグメント鎖を合成した後、各フラグメント鎖を縮合させて目的とするペプチド鎖を合成するフラグメント法を適用することもできる。
【００１６】
次に、この発明のアポトーシス誘導剤について説明する。この発明のアポトーシス誘導剤は、前記のとおり化学合成されたアポトーシス誘導ペプチド、このペプチドの誘導体、このペプチドまたはその誘導体の薬理学的に許容される塩類（以下、これらをまとめて「ペプチド類」と記載することがある。）、またはそれらの混合物を有効成分として含有している。
【００１７】
このアポトーシス誘導剤の有効成分として使用することのできるアポトーシス誘導ペプチドの薬理学的に許容される塩類、またはこのペプチド誘導体の薬理学的に許容される塩類は、無毒性の塩であり、具体的には酸付加塩、金属錯体、カルボン酸塩等である。前記酸付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、りん酸塩、タンニン酸塩、シュウ酸塩、フマール酸塩、グルコン酸塩、アルギン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩等を例示することができる。また、前記金属錯体としては、例えば、亜鉛、鉄、カルシウム、マグネシウムまたはアルミニウム等の錯体を例示することができる。さらに、前記カルボン酸塩としては、例えば、アルカリ金属とのナトリウム塩、カリウム塩等、アルカリ土金属とのカルシウム塩、マグネシウム塩等、アンモニウム塩等を例示することができる。
【００１８】
この発明のアポトーシス誘導剤は、ペプチド類から選択された任意の１種の化合物または２種以上の混合物を有効成分として含有していることが必要であるが、この有効成分の他に、公知のアポトーシス誘導性物質を含有していてもよい。この発明のアポトーシス誘導剤は、一般的な医薬製剤の形態でヒトまたは動物に投与することができ、例えば、静注、皮下注、または経口によりヒトまたは動物に投与することができる。
【００１９】
この発明のアポトーシス誘導剤の有効成分であるペプチド類は、毒性が極めて低く、ＬＤ50は100mg/体重kg以上であるため、ヒトまたは動物に対して安全に使用することができる。
この発明のアポトーシス誘導剤は、ペプチド類、またはそれらの２種以上の混合物を有効成分として５mg/g以上の濃度で含有させ、その他の成分とともに製剤化することができる。その他の成分としては、医薬製造分野で通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤の希釈剤、賦形剤等を例示することができる。また、剤形としては、各種の形態が治療目的に応じて選択可能であり、その代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）等を例示することができる。
【００２０】
例えば、錠剤に成形する場合、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥デンプン、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を適宜使用することができる。また、錠剤は必要に応じて通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸用被錠フィルムコーティング錠または二重錠、多層錠とすることもできる。
【００２１】
注射剤を調製する場合は、液剤、乳剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であるのが好ましく、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用することができる。なお、この場合、等張性の溶液を調製するに充分な量の食塩、ブドウ糖、グリセリン等を含有させることも可能であり、また、溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を配合することもできる。
【００２２】
前記各形態の医薬製剤には、さらに必要に応じて慣用される着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等を配合することができ、また、他の医薬品有効成分を含有させることもできる。
さらに、この発明のアポトーシス誘導ペプチド、このペプチドの誘導体、またはアポトーシス誘導剤は、必要に応じて、他のアポトーシス誘導性物質、例えば癌化学療法剤として公知の各種制癌剤と併用して使用することもでき、また、放射線療法と併用して使用することもできる。この結果、この発明のアポトーシス誘導ペプチド、このペプチドの誘導体、またはアポトーシス誘導剤は、優れた制癌効果も奏し得ることから、併用した他の制癌剤の効果を一層助長し、相乗効果を発揮させることができる。従って、併用した制癌剤の使用量を通常の使用量より少量とした場合でも、十分な癌治療効果が得られるので、併用する制癌剤の副作用の軽減化を図ることもできる。
【００２３】
次に、試験例を示してこの発明の作用効果を詳しく説明する。
試験例１
この試験は、この発明のアポトーシス誘導ペプチドがアポトーシスを誘導するか否かを調べるために行った。
（１）試料の調製
実施例１と同一の方法により、化学合成した配列番号１のアミノ酸配列を有するアポトーシス誘導ペプチドを、ダルベッコリン酸緩衝液［ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Journal of Experimental Medicine）、第99巻、第167 〜182 ページ、1954年］に、それぞれ0.3 μg/mlおよび３μg/mlの各濃度で溶解し、試料溶液として使用した。
【００２４】
また、アポトーシス誘導ペプチド無添加（０μg/ml）のダルベッコリン酸緩衝液を対照溶液として使用した。
（２）試験方法
この試験は、ＭＴＴ法［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Journal of Immunological Methods）、第65巻、第55ページ、1983年］に従って次のとおり実施した。
【００２５】
ヒト赤芽球性白血病細胞（Ｋ562 ）をＧＩＴ培地（日本製薬社製）で１×106 個/ml の濃度に調整した後、この細胞溶液10μl 、D-MEM およびHam's F12 混合培地［D-MEM 基礎培地（ギブコ社製）10.2g 、Ham's F12 基礎培地（ギブコ社製）10.86g、炭酸水素ナトリウム（和光純薬社製）4.8g、HEPES (2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid。同仁化学社製）7.33g 、硫酸ストレプトマイシン（200mg/ml。明治製菓社製）1.02ml、およびペニシリンＧカリウム（20万単位／ml。明治製菓社製）1.02mlを精製水に溶解し、全量１リットルにメスアップしたもの。］50μl 、および試料溶液または対照溶液50μl を96ウェル培養プレート（ヌンク社製）の各ウェルに添加した後、5 ％炭酸ガス存在下で37℃の温度条件にて48時間培養した。培養終了後、ダルベッコリン酸緩衝液に 5mg/ml の濃度で溶解したＭＴＴ（3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide。シグマ社製）溶液10μl を各ウェルに添加し、さらに４時間培養した後、0.04Ｎ塩酸−２−プロパノール溶液を100 μl 添加し、十分混合し、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）により各ウェルの吸光度（595nm ）を測定した。
【００２６】
なお、前記試験において使用したヒト赤芽球性白血病細胞（Ｋ562 ）は、ヒト白血病細胞株で、その細胞の性質は文献［ブラッド（Blood ）、第45巻、第321 〜322 ページ、1979年］に記載されており、細胞寄託機関［アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託番号ＡＴＣＣNo.CCL-243として寄託されており、分譲可能である。
（３）試験結果
この試験の結果は表１に示すとおりである。表１から明らかなとおり、細胞のＭＴＴ還元能力［ＭＴＴ−フォルマザン(MTT formazan)量］は、アポトーシス誘導ペプチド無添加群と比較して、添加群において有意に減少しており、アポトーシス誘導活性が確認された。
【００２７】
また、表１は、この発明のアポトーシス誘導ペプチドが、0.3 μg/mlという極めて低い濃度で白血病細胞の増殖抑制効果を有することも示している。
【００２８】
【表１】
0003782209.tif 000002
試験例２
この試験は、この発明のアポトーシス誘導ペプチドのアポトーシス誘導率を調べるために行った。
（１）試料の調製
試験例１と同一の方法により、試料溶液および対照溶液を調製した。
（２）試験方法
この試験は、アポプ・タグ in situ  アポプトシス検出キット（オンコア社製。以下、キットと略記する）を使用し、次のとおり実施した。
【００２９】
ヒト赤芽球性白血病細胞（Ｋ562 ）をＧＩＴ培地（日本製薬社製）で１×106 個/ml の濃度に調整し、この細胞溶液10μl 、試験例１に記載のD-MEM およびHam's F12 混合培地50μl 、および試料溶液または対照溶液50μl を96ウェル培養プレート（ヌンク社製）の各ウェルに添加し、５％炭酸ガス存在下で37℃の温度条件にて48時間培養した。
【００３０】
培養終了後、ウェル中の培養液をサイトスピン２システム（シャンドン社製）を使用して、牛胎児血清（ギブコ社製）で表面を処理したスライドグラス（マツナミガラス社製。白縁磨フロストNo.2、76×26mm）に細胞を回収し、直ちに乾燥させ、スライドグラス上に細胞を固定した。0.2 Ｍ塩化ナトリウム（和光純薬社製）を含有する50 mＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4 ：リン酸ナトリウムは和光純薬社製。以下、ＰＢＳと略記する）でスライドグラス上の細胞（以下、検体と記載する）を５分間洗浄し、さらにＰＢＳを２回交換して各回５分間ずつ細胞を洗浄した。
【００３１】
次いで、室温条件下、２％過酸化水素（和光純薬社製）を含むＰＢＳ溶液で検体を５分間処理し、内在性のペルオキシダーゼを不活性化させた。続いて、ＰＢＳを使用して検体を５分間洗浄し、さらにＰＢＳを交換し、５分間検体を洗浄し、検体周囲の余分な水分を慎重に紙タオルで吸い取り、直ちに検体上にキット添付の平衡緩衝液108 μl を直接滴下し、室温条件下、１０分間放置した。その後、余分な平衡緩衝液を廃棄し、検体周囲の水分を紙タオルで吸い取り、キット添付のターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ（以下、ＴｄＴと略記する）酵素溶液54μl をピペットで検体上に滴下し、37℃で１時間保持し、酵素反応処理を行った。
【００３２】
酵素反応処理後、キット添付の反応停止・洗浄緩衝液中に検体を浸漬し、37℃で30分間保持した。次いで、ＰＢＳにより検体を５分間洗浄し、さらにＰＢＳを３回交換して各回５分間ずつ検体を洗浄し、キット添付の抗ジゴキシゲニン・ペルオキシダーゼ溶液２滴を検体に滴下して室温で30分間保持した。
その後、ＰＢＳにより検体を５分間洗浄し、さらにＰＢＳを３回交換して各回５分間ずつ室温で検体を洗浄した。
【００３３】
ＰＢＳ中に0.05％ジアミノベンジジン（ナカライテスク社製。以下、ＤＡＢと略記する）を含有するＤＡＢ基質溶液に0.02％濃度で過酸化水素水を添加した溶液を、洗浄直後の検体を完全に覆うために十分な量を滴下し、室温で６分間染色した。その後、蒸留水により検体を１分間洗浄し、さらに蒸留水を３回交換して各回１分間ずつ検体を洗浄した。次いで、0.5 ％メチルグリーン0.1 Ｍ酢酸ナトリウム溶液（pH4.0 ：メチルグリーンおよび酢酸ナトリウムはいずれも和光純薬社製）で室温条件下10分間検体を対比染色した。
【００３４】
染色後、蒸留水で検体を洗浄し、さらに 100％ブタノール（和光純薬社製）により洗浄し、キシレン（和光純薬社製）により検体を脱水し、エンテランニュー（メルク社製。登録商標）中に検体を固定し、カバーグラスで覆い、試料プレパラートを作成した。
前記試料プレパラートを光学顕微鏡を使用して観察し、メチルグリーンで緑色に染色され、アポトーシスを惹起していない細胞数Ｘと、ＤＡＢで黒褐色に染色され、アポトーシスを惹起した細胞（凝集細胞）数Ｙとを計数し、次式によりアポトーシス誘導率を算出した。
【００３５】
アポトーシス誘導率（％）＝Ｙ／（Ｘ＋Ｙ）×１００
（３）試験結果
この試験の結果は表２に示すとおりである。表２から明らかなとおり、アポトーシス誘導ペプチド無添加群に比較して、添加群においてアポトーシス誘導率は有意に上昇しており、アポトーシス誘導促進効果が確認された。
【００３６】
また、表２は、この発明のアポトーシス誘導ペプチドが、0.3 μg/mlという極めて低い濃度で白血病細胞に対するアポトーシス誘導効果を有することも示している。
【００３７】
【表２】
0003782209.tif 000003
次に実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
【００３８】
【実施例】
実施例１
ペプチド自動合成装置（パーキン・エルマー社製。Model 433A）を使用し、シェパード等［ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー・パーキンＩ（Journal of Chemical Society Perkin I）、第538 ページ、1981年］による固相法および同装置の使用説明書に基づいてペプチドを次のとおり合成した。
【００３９】
ペプチド合成用固相樹脂としてＨＭＰ樹脂（パーキン・エルマー社製）500mg （0.25mmol）を使用し、前記ペプチド自動合成装置の合成プログラムにより脱保護基反応および縮合反応を反復してペプチド鎖を延長した。詳しくは、20％ピペリジン含有Ｎ−メチルピロリドン（パーキン・エルマー社製。以下、Ｎ−メチルピロリドンをＮＭＰと略記する）により、上記固相樹脂のアミノ保護基であるFmoc基を切断除去し、ＮＭＰで洗浄した後、Fmoc−アミノ酸［具体的には、Fmoc-L-Arg(Pmc)-OH（パーキン・エルマー社製）］をFastMoc ［登録商標］リージェントキット（パーキン・エルマー社製）を使用して縮合させ、ＮＭＰで洗浄する。以下、前記Fmoc基の切断、各Fmoc−アミノ酸の縮合、および洗浄までの操作を反復した。
【００４０】
Fmoc−アミノ酸として、Fmoc-L-Pro-OH 、Fmoc-L-Leu-OH 、Fmoc-L-Val-OH 、およびFmoc-L-Ala-OH （いずれもパーキン・エルマー社製）を順次使用した。ペプチド鎖の伸長反応が完了した後、20％ピペリジン含有ＮＭＰによりＮ末端のFmoc基を切断し、ＮＭＰおよびジクロロメタン（パーキン・エルマー社製）で洗浄し、真空乾燥して保護ペプチド樹脂を約513mg 得た。
【００４１】
なお、縮合反応条件および脱保護条件は、フィードバックモニタリングシステムにより自動的に制御した。
前記保護ペプチド樹脂 510mgにエタンジチオール（渡辺化学工業社製）0.5ml 、結晶フェノール（東京化成工業社製）1.5g、チオアニソール（渡辺化学工業社製）1.0ml 、および精製水1.0ml を添加して室温で15分間撹拌し、のち氷冷し、さらに10分間撹拌した。これにトリフルオロ酢酸（渡辺化学工業社製。以下、ＴＦＡと略記する）20mlを添加して1.5 時間撹拌し、グラスフィルターで樹脂を瀘去し、瀘液を手早く減圧濃縮し、残渣に予め冷却した無水ジエチルエーテル（国産化学社製）を添加し、ペプチドを白色粉末化した。白色粉末化したペプチドを遠沈管に移し、冷ジエチルエーテルを新たに添加して十分撹拌し、遠心分離（2500rpm で10分間）し、上清を廃棄した。さらに冷ジエチルエーテルを新たに添加して十分撹拌し、遠心分離する操作を３回反復し、ペプチド沈殿物を真空乾燥し、水に溶解して凍結乾燥し、粗製ペプチド約105mg を得た。
【００４２】
前記粗製ペプチドの全量を精製水に溶解し、遠心分離（15000rpmで５分間）し、上清を0.45μm フィルターで瀘過し、この瀘液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりペプチドの精製を行なった。ＨＰＬＣは、ガリバーPU-986高圧グラジエントシステム（日本分光社製）を使用し、カラムは逆相系のLichrospher100RP-18(e) 250×10mm（メルク社製）を使用した。溶離液は0.1 ％ＴＦＡ／精製水をＡ液、80％アセトニトリル／Ａ液をＢ液とし、Ａ液からＢ液への濃度直線勾配により溶出した。得られたクロマトグムは、ほぼ単一のピークであり、ピークに相当する画分を分取した。この分取操作を数回反復し、得られた画分を凍結乾燥し、精製ペプチド約38.6mgを得た。
【００４３】
分析用カラム［Lichrospher100RP-18(e) 250×4.6mm （メルク社製）］を使用し、得られた精製ペプチドのＨＰＬＣ分析を行ない、精製物が単一であることをさらに確認した。また、精製ペプチドのアミノ酸配列等を、常法のアミノ酸分析、アミノ酸配列分析、元素分析、質量分析により確認し、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有する５残基のアミノ酸配列からなるペプチドが得られていることを確認した。
【００４４】
この実施例で得られた精製ペプチドは試験例１および試験例２に記載されるとおり、アポトーシス誘導活性を有していた。
実施例２
固相樹脂として、ＨＭＰ樹脂（パーキン・エルマー社製）500mg （0.25mmol）に変えてＣ末端アミドペプチド合成用固相樹脂であるFmocアミドレジン（パーキン・エルマー社製）397mg （0.25mmol）を使用したことを除き、実施例１と同一の方法によりペプチド自動合成装置でＣ末端がアミド化された精製ペプチド誘導体約34.6mgを得た。
【００４５】
分析用カラム［Lichrospher100RP-18(e) 250×4.6mm （メルク社製）］を使用し、得られた精製ペプチド誘導体のＨＰＬＣ分析を行ない、精製物が単一であることをさらに確認した。また、精製ペプチドのアミノ酸配列等を、常法のアミノ酸分析、アミノ酸配列分析、元素分析、質量分析により確認し、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有する５残基のアミノ酸配列からなるＣ末端がアミド化されたペプチドの誘導体が得られていることを確認した。
【００４６】
この実施例で得られた精製ペプチドの誘導体は、試験例１および試験例２に記載の方法でアポトーシス誘導活性を試験した結果、有意なアポトーシス誘導活性を有することが確認された。
実施例３
次の組成の注射剤を常法により製造した。なお、アポトーシス誘導ペプチド以外の成分はいずれも市販品である。
【００４７】
実施例１と同一の方法により得たアポトーシス誘導ペプチド      0.5 (%)
塩化ナトリウム                                              0.9
注射用蒸留水                                               98.6
実施例４
次の組成の注射剤を常法により製造した。なお、アポトーシス誘導ペプチド誘導体以外の成分はいずれも市販品である。
【００４８】
0003782209.tif 000004
実施例５
１錠あたりの組成が次の組成の錠剤を常法により製造した。なお、アポトーシス誘導ペプチド以外の成分はいずれも市販品である。
【００４９】
実施例１と同一の方法により得たアポトーシス誘導ペプチド      1.0 (mg)
アクチノマイシンＤ                                          0.02
乳糖                                                      162.98
結晶セルロース                                             30.0
ポリビニルピロリドン                                        5.0
ステアリン酸マグネシウム                                    1.0
実施例６
１錠あたりの組成が次の組成の錠剤を常法により製造した。なお、アポトーシス誘導ペプチド誘導体以外の成分はいずれも市販品である。
【００５０】
0003782209.tif 000005
【００５１】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明は新規なアポトーシス誘導ペプチドおよびアポトーシス誘導剤に関するものであり、この発明によって奏せられる効果は次のとおりである。
１）この発明のアポトーシス誘導ペプチドは、副作用が無く、少量で、特定の白血病細胞に対して選択的にアポトーシス誘導効果を示す。
２）この発明のアポトーシス誘導ペプチドは、安価かつ大量に化学合成による供給が可能であり、実用性が高く商業規模での提供が容易である。
３）この発明のアポトーシス誘導ペプチドは、ヒト正常細胞に対してはアポトーシス誘導効果を示さない。
４）この発明のアポトーシス誘導ペプチドは、従来の化学療法、放射線療法等の癌治療に伴う周囲組織の炎症反応を惹起することなく、腫瘍細胞をアポトーシスにより細胞死に至らしめることができるという利点を有している。
【００５２】
【配列表】
0003782209.tif 000006