(57)【要約】  本発明は、神経系、特にBBB機構により薬剤送達が阻まれる中枢神経系へ効率的に送達され、かつ送達場所で標的転写産物に対してアンチセンス効果をもたらす核酸剤、及びそれを含む組成物を提供することを課題とする。  標的転写産物の一部にハイブリダイズし、標的転写産物に対してアンチセンス効果を有する第１核酸鎖と、第１核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、トコフェロール若しくはその類縁体、コレステロール若しくはその類縁体、又は置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基、若しくは置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基、若しくは置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルコキシ基と結合している第２核酸鎖がアニールしてなる二本鎖の核酸複合体を提供する。
2019182109.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１核酸鎖と第２核酸鎖とを含む核酸複合体であって、
該第１核酸鎖は、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的転写産物に対してアンチセンス効果を有し、
該第２核酸鎖は、該第１核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、
（１）トコフェロール若しくはその類縁体、
（２）コレステロール若しくはその類縁体、又は
（３）置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基、若しくは置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基、若しくは置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルコキシ基
と結合しており、
該第１核酸鎖は、該第２核酸鎖にアニールしている、核酸複合体。
【請求項２】
前記トコフェロール又はその類縁体が、下式（I）：
【化１】
2019182109.tif 000131
（式中、Ｒ１は、置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基又は置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０アルケニル基を表す）
で表される、請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項３】
前記コレステロール又はその類縁体が、下式（II）、（V）、（VI）、及び（VII）：
【化２】
2019182109.tif 000132
（式中、
環Ａは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキサン又は置換された若しくは置換されていないベンゼンを表し、
環Ｂは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキセン、置換された若しくは置換されていないシクロヘキサン又は置換された若しくは置換されていないシクロヘキサジエンを表し、
環Ｃは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキセン又は置換された若しくは置換されていないシクロヘキサンを表し、
Ｒ２は、水素原子、置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基、置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基、置換された若しくは置換されていないＣ１〜６アルキル−カルボニル基、置換された若しくは置換されていないＣ１〜６アルキル−カルボニル−オキシ基、又はオキソ基を表し、
Ｒ３は、水素原子を表し、
Ｒ２及びＲ３は、一緒になって、置換された若しくは置換されていない１，６−ジオキサスピロ［４．５］デカン環を形成してもよく、
Ｌ１は、−Ｏ−、−ＮＨ−、
【化３】
2019182109.tif 000133
、又は
【化４】
2019182109.tif 000134
を表す）、
【化５】
2019182109.tif 000135
（式中、Ｒ４は、置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基、又は置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基を表す）、
【化６】
2019182109.tif 000136
（式中、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基、又は置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基を表す）、並びに
【化７】
2019182109.tif 000137
（式中、Ｒ７は、ヒドロキシ基、置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０アルキル−カルボニル−オキシ基、又は置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０アルケニル−カルボニル−オキシ基を表す）
から成る群より選択される式で表される、請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項４】
前記コレステロール又はその類縁体が、下式（IIa）：
【化８】
2019182109.tif 000138
（式中、
環Ａは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキセン、置換された若しくは置換されていないシクロヘキサン又は置換された若しくは置換されていないシクロヘキサジエンを表し、
Ｒ１は、置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基、置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基、置換された若しくは置換されていないＣ１〜６アルキル−カルボニル基、置換された若しくは置換されていないＣ１〜６アルキル−カルボニル−オキシ基、又はオキソ基を表し、
Ｌ１は、−Ｏ−、−ＮＨ−、
【化９】
2019182109.tif 000139
、又は
【化１０】
2019182109.tif 000140
を表す）
で表される、請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項５】
前記コレステロール又はその類縁体が、下式（IIa-1）、（IIa-2）、（IIa-3）、及び（IIa-4）：
【化１１】
2019182109.tif 000141
（IIa-1）、
2019182109.tif 000142
（IIa-2）、
2019182109.tif 000143
（IIa-3）、
2019182109.tif 000144
（IIa-4）
（式中、
Ｌ１は、−Ｏ−、−ＮＨ−、
【化１２】
2019182109.tif 000145
、又は
【化１３】
2019182109.tif 000146
を表す）、
から成る群より選択される式で表される、請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項６】
第２核酸鎖が、下式（VIII）：
【化１４】
2019182109.tif 000147
（式中、
Ｌ２は、置換された若しくは置換されていないＣ１〜１２のアルキレン基、置換された若しくは置換されていないＣ３〜８シクロアルキレン基、−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−、又はＣＨ（ＣＨ２−ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−を表し、
Ｌ３は、−ＮＨ−又は結合を表し、
Ｌ４は、置換された若しくは置換されていないＣ１〜１２のアルキレン基、置換された若しくは置換されていないＣ３〜８のシクロアルキレン基、−（ＣＨ２）２−［Ｏ−（ＣＨ２）２］ｍ−、又は結合を表し、ここで、ｍは１〜２５の整数を表し、
Ｌ５は、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−、又は結合を表す）
で表されるリンカーを介して、
（１）トコフェロール若しくはその類縁体、
（２）コレステロール若しくはその類縁体、又は
（３）置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基、若しくは置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基
と結合している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸複合体。
【請求項７】
前記第１核酸鎖が、少なくとも４個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸複合体。
【請求項８】
前記第１核酸鎖が、ギャップマーである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸複合体。
【請求項９】
前記第２核酸鎖が、前記第１核酸鎖中の少なくとも４個の連続するデオキシリボヌクレオシドに相補的な、少なくとも４個の連続するリボヌクレオシドを含む、請求項７又は８に記載の核酸複合体。
【請求項１０】
前記第１核酸鎖が、ミックスマーである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸複合体。
【請求項１１】
前記第１核酸鎖が、１３〜２０塩基長である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸複合体。
【請求項１２】
前記第２核酸鎖が天然リボヌクレオシドを含まない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸複合体。
【請求項１３】
前記第２核酸鎖の核酸部分が修飾若しくは非修飾のヌクレオシド間結合により連結されたデオキシリボヌクレオシド及び／又は糖修飾ヌクレオシドから成る、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸複合体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の核酸複合体を含む、被験体の中枢神経系において標的転写産物の発現又は編集を調節するための組成物。
【請求項１５】
被験体の中枢神経系疾患治療用である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記中枢神経系疾患が、免疫性中枢神経系疾患である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の核酸複合体を含む、被験体の中枢神経系に薬剤を送達するための組成物。
【請求項１８】
前記中枢神経系が、大脳皮質、大脳基底核、大脳白質、間脳、脳幹、小脳、及び脊髄からなる群から選択される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記中枢神経系が、前頭葉、側頭葉、海馬、海馬傍回、頭頂葉、後頭葉、線条体、淡蒼球、前障、視床、視床下核、中脳、黒質、橋、延髄、小脳皮質、小脳核、頸髄、胸髄及び腰髄からなる群から選択される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
静脈内投与用又は皮下投与用である、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
１回の投与量中に５ｍｇ／ｋｇ以上の前記核酸複合体を含む、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記核酸複合体が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記免疫性中枢神経疾患が、ミクログリア関連疾患である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ミクログリア関連疾患が、アルツハイマー病、多発性硬化症、ＡＬＳ、または神経障害性痛である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
ミクログリアにおける標的転写産物の発現又は編集を調節するための、請求項１４〜２４のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経系、特に中枢神経系においてアンチセンス効果をもたらし得る核酸複合体又はその塩、及びそれを含む組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、核酸医薬と呼ばれる医薬品の現在進行中の開発において、オリゴヌクレオチドが関心を集めており、また特に、標的遺伝子の高い選択性及び低毒性の点から考えて、アンチセンス法を利用する核酸医薬の開発が積極的に進められている。アンチセンス法とは、標的遺伝子より転写されたmRNAやmiRNAの部分配列を標的センス鎖として、それに相補的なオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド：本明細書ではしばしば「ASO（AntiSense Oligonucleotide）」と表記する）を細胞に導入することによって、標的遺伝子によってコードされたタンパク質の発現やmiRNAの活性を選択的に改変又は阻害することを含む方法である。【０００３】
特許文献１では、第1オリゴマー化合物、及びコレステロール等の共役基を含む第2オリゴマー化合物からなり、肝外組織若しくは肝外細胞、又は肝組織若しくは肝細胞における標的核酸の量や活性を調節することのできる二本鎖核酸分子や、該二本鎖核酸分子からなるアンチセンス化合物が開示されている。【０００４】
ところで、脳を含む中枢神経系においてアンチセンス効果を発揮させるためには前記ASO等の核酸剤を中枢神経系に送達させる必要がある。しかし、脳には、血液を介して脳へ移行される物質を選択し、制限する血液脳関門（Blood Brain Barrier：以下、本明細書ではしばしば「BBB」と表記する）と呼ばれる機構が存在する。このBBB機構は、有害物質から脳を保護する一方で、脳への薬剤送達の障壁にもなっている。それ故に脳を含む中枢神経系へASO等の核酸剤を送達する方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第2017/053999号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、神経系、特にBBB機構により薬剤送達が阻まれる中枢神経系へ効率的に送達され、かつ送達場所で標的転写産物に対してアンチセンス効果をもたらす核酸剤、及びそれを含む組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、ASOと、トコフェロール若しくはコレステロール又はその類縁体等を結合させたASOの相補鎖とをアニールさせた核酸複合体が中枢神経系に効率的に送達され、そこで高いアンチセンス効果を示すことを見出した。これらの知見に基づき、本発明者らは本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の態様を包含する。【０００８】
［１］第１核酸鎖と第２核酸鎖とを含む核酸複合体又はその塩であって、
該第１核酸鎖は、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的転写産物に対してアンチセンス効果を有し、
該第２核酸鎖は、該第１核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、
（１）トコフェロール若しくはその類縁体、
（２）コレステロール若しくはその類縁体、又は
（３）置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基、置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基、若しくは置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルコキシ基
と結合しており、
該第１核酸鎖は、該第２核酸鎖にアニールしている、核酸複合体又はその塩。
［２］（１）トコフェロール若しくはその類縁体、
（２）コレステロール若しくはその類縁体、又は
（３）置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基、置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基、若しくは置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルコキシ基
と結合している核酸鎖であって、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的転写産物に対してアンチセンス効果を有する、前記核酸鎖又はその塩。
［３］前記トコフェロール又はその類縁体が、下式（I）：
【化１】
2019182109.tif 000003
（式中、Ｒ１は、置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基又は置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０アルケニル基を表す）
で表される、［１］又は［２］記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
［４］前記コレステロール又はその類縁体が、下式（II）、（V）、（VI）、及び（VII）：
【化２】
2019182109.tif 000004
（式中、
環Ａは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキサン又は置換された若しくは置換されていないベンゼンを表し、
環Ｂは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキセン、置換された若しくは置換されていないシクロヘキサン又は置換された若しくは置換されていないシクロヘキサジエンを表し、
環Ｃは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキセン又は置換された若しくは置換されていないシクロヘキサンを表し、
Ｒ２は、水素原子、置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基、置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基、置換された若しくは置換されていないＣ１〜６アルキル−カルボニル基、置換された若しくは置換されていないＣ１〜６アルキル−カルボニル−オキシ基、又はオキソ基を表し、
Ｒ３は、水素原子を表し、
Ｒ２及びＲ３は、一緒になって、置換された若しくは置換されていない１，６−ジオキサスピロ［４．５］デカン環を形成してもよく、
Ｌ１は、−Ｏ−、−ＮＨ−、
【化３】
2019182109.tif 000005
、又は
【化４】
2019182109.tif 000006
を表す）、
【化５】
2019182109.tif 000007
（式中、Ｒ４は、置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基、又は置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基を表す）、
【化６】
2019182109.tif 000008
（式中、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基、又は置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基を表す）、並びに【０００９】
【化７】
2019182109.tif 000009
（式中、Ｒ７は、ヒドロキシ基、置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０アルキル−カルボニル−オキシ基、又は置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０アルケニル−カルボニル−オキシ基を表す）
から成る群より選択される式で表される、［１］〜［３］のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
［５］前記コレステロール又はその類縁体が、下式（IIa）：
【化８】
2019182109.tif 000010
（式中、
環Ａは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキセン、置換された若しくは置換されていないシクロヘキサン又は置換された若しくは置換されていないシクロヘキサジエンを表し、
Ｒ１は、置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基、置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基、置換された若しくは置換されていないＣ１〜６アルキル−カルボニル基、置換された若しくは置換されていないＣ１〜６アルキル−カルボニル−オキシ基、又はオキソ基を表し、
Ｌ１は、−Ｏ−、−ＮＨ−、
【化９】
2019182109.tif 000011
、又は
【化１０】
2019182109.tif 000012
を表す）
で表される、［１］又は［２］記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
［６］前記コレステロール又はその類縁体が、下式（IIa-1）、（IIa-2）、（IIa-3）、及び（IIa-4）：
【化１１】
2019182109.tif 000013
（IIa-1）、
2019182109.tif 000014
（IIa-2）、
2019182109.tif 000015
（IIa-3）、
2019182109.tif 000016
（IIa-4）
（式中、
Ｌ１は、−Ｏ−、−ＮＨ−、
【化１２】
2019182109.tif 000017
、又は
【化１３】
2019182109.tif 000018
を表す）、
から成る群より選択される式で表される、［１］又は［２］記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
［７］第２核酸鎖が、下式（VIII）：
【化１４】
2019182109.tif 000019
（式中、
Ｌ２は、置換された若しくは置換されていないＣ１〜１２のアルキレン基、置換された若しくは置換されていないＣ３〜８シクロアルキレン基、−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−、又はＣＨ（ＣＨ２−ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−を表し、
Ｌ３は、−ＮＨ−又は結合を表し、
Ｌ４は、置換された若しくは置換されていないＣ１〜１２のアルキレン基、置換された若しくは置換されていないＣ３〜８のシクロアルキレン基、−（ＣＨ２）２−［Ｏ−（ＣＨ２）２］ｍ−、又は結合を表し、ここで、ｍは１〜２５の整数を表し、
Ｌ５は、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−、又は結合を表す）
で表されるリンカーを介して、
（１）トコフェロール若しくはその類縁体、
（２）コレステロール若しくはその類縁体、又は
（３）置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基、置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基、若しくは置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルコキシ基
と結合している、［１］〜［６］のいずれか記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
［８］前記第１核酸鎖が、少なくとも４個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含む、［１］〜［７］のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
［９］前記第１核酸鎖が、ギャップマーである、［１］〜［８］のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
［１０］前記第２核酸鎖が、前記第１核酸鎖中の少なくとも４個の連続するデオキシリボヌクレオシドに相補的な、少なくとも４個の連続するリボヌクレオシドを含む、［８］又は［９］に記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
［１１］前記第１核酸鎖が、ミックスマーである、［１］〜［７］のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
［１２］前記第１核酸鎖が、１３〜２０塩基長である、［１］〜［１１］のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
［１３］前記第２核酸鎖が天然リボヌクレオシドを含まない、［１］〜［１２］のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
［１４］前記第２核酸鎖の核酸部分が修飾若しくは非修飾のヌクレオシド間結合により連結されたデオキシリボヌクレオシド及び／又は糖修飾ヌクレオシドから成る、［１］〜［１３］のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
［１５］［１］〜［１４］のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩を含む、被験体の中枢神経系において標的転写産物の発現又は編集を調節するための組成物。
［１６］被験体の中枢神経系疾患治療用である、［１５］に記載の組成物。
［１７］前記中枢神経系疾患が、免疫性中枢神経系疾患である、［１６］に記載の組成物。
［１８］［１］〜［１４］のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩を含む、被験体の中枢神経系に薬剤を送達するための組成物。
［１９］前記中枢神経系が、大脳皮質、大脳基底核、大脳白質、間脳、脳幹、小脳、及び脊髄からなる群から選択される、［１５］〜［１８］のいずれかに記載の組成物。
［２０］前記中枢神経系が、前頭葉、側頭葉、海馬、海馬傍回、頭頂葉、後頭葉、線条体、淡蒼球、前障、視床、視床下核、中脳、黒質、橋、延髄、小脳皮質、小脳核、頸髄、胸髄及び腰髄からなる群から選択される、［１５］〜［１８］のいずれかに記載の組成物。
［２１］静脈内投与用又は皮下投与用である、［１５］〜［２０］のいずれかに記載の組成物。
［２２］１回の投与量中に５ｍｇ／ｋｇ以上の前記核酸複合体、核酸鎖、又はその塩を含む、［１５］〜［２１］のいずれかに記載の組成物。
［２３］前記核酸複合体、核酸鎖、又はその塩が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する、［１５］〜［２２］のいずれかに記載の組成物。
［２４］前記免疫性中枢神経疾患が、ミクログリア関連疾患である、［１７］に記載の組成物。
［２５］前記ミクログリア関連疾患が、アルツハイマー病、多発性硬化症、ALS、または神経障害性疼痛である、［２４］に記載の組成物。
［２６］ミクログリアにおける標的転写産物の発現又は編集を調節するための、［１５］〜［２５］のいずれかに記載の組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-055372号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、中枢神経系へ効率的に送達し、かつ送達場所でアンチセンス効果をもたらす核酸剤、及びそれを含む組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図1は、本発明で用いる核酸複合体の特定の実施形態の例を示す模式図である。この図では、第2核酸鎖におけるトコフェロール又はコレステロールの結合位置による4つの様式を示している。図1aは、第2核酸鎖の5'末端にトコフェロールが結合している核酸複合体を示す。図1bは、第2核酸鎖の5'末端にコレステロールが結合している核酸複合体を示す。図1cは、第2核酸鎖の3'末端にトコフェロールが結合している核酸複合体を示す。図1dは、第2核酸鎖の3'末端にコレステロールが結合している核酸複合体を示す。
【図２】図2は、アンチセンス法の一般的な機構の一例を示す図である。図中、「X」は遺伝子の発現から翻訳までの工程で抑制又は阻害する箇所を示す。破線内の図は、ヘテロ二本鎖部分がRNase Hによって認識され、標的遺伝子のmRNAが分解される模式図である。
【図３】図3は、様々な架橋核酸の構造を示す図である。
【図４】図4は、様々な天然ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドの構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の第１態様は、核酸複合体、より好ましくは血液脳関門通過型核酸複合体である。この核酸複合体は、第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む。第2核酸鎖は、第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含むヌクレオチド鎖である。核酸複合体において、第1核酸鎖は、第2核酸鎖にアニールしている。一実施形態では、第2核酸鎖は、（１）トコフェロール若しくはその類縁体、（２）コレステロール若しくはその類縁体、又は（３）置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基、置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基、若しくは置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルコキシ基と結合している（本明細書では、上記（１）〜（３）をまとめて、しばしば「トコフェロール若しくはコレステロール又はその類似体等」とも表記する）。
【００１３】
前記核酸複合体の代表的な模式図を図1に示す。図1aは、第2核酸鎖の5'末端にトコフェロールが結合している核酸複合体を示す。図1bは、第2核酸鎖の5'末端にコレステロールが結合している核酸複合体を示す。図1cは、第2核酸鎖の3'末端にトコフェロールが結合している核酸複合体を示す。図1dは、第2核酸鎖の3'末端にコレステロールが結合している核酸複合体を示す。しかし、後述のように、トコフェロール若しくはコレステロール又はそれらの類縁体等は、第2核酸鎖の5'末端、3'末端又は両端に結合していてもよく、第2核酸鎖の内部のヌクレオチドに結合していてもよい。
【００１４】
一実施形態において、第1核酸鎖は、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含むヌクレオチド鎖である。特定の実施形態において、第1核酸鎖は、標的遺伝子の転写産物又は標的転写産物に対してアンチセンス効果を有するヌクレオチド鎖である。
【００１５】
一実施形態において、本発明は、（１）トコフェロール若しくはその類縁体、（２）コレステロール若しくはその類縁体、又は（３）置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基、置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基、若しくは置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルコキシ基と結合している一本鎖核酸鎖に関する。該核酸鎖は、前記核酸複合体の第1核酸鎖に相当するもので、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含むヌクレオチド鎖である。特定の実施形態において、該核酸鎖は、標的遺伝子の転写産物又は標的転写産物に対してアンチセンス効果を有するヌクレオチド鎖である。
【００１６】
（用語の定義）
本明細書において「標的転写産物」とは、本発明の核酸複合体の標的となり得、かつDNA依存性RNAポリメラーゼによって合成される任意のRNAをいう。一般的には標的遺伝子の転写産物が該当する。具体的には、標的遺伝子から転写されるmRNA（成熟mRNA、mRNA前駆体、塩基修飾を受けていないmRNA等を含む）、miRNA等のノンコーディングRNA(non-coding RNA、ncRNA)を含み得る。
【００１７】
本明細書において「標的遺伝子」は特に限定されないが、例えば、本発明に係る核酸複合体を導入する生物由来の遺伝子、例えば、様々な疾患において、その発現が増加する遺伝子が挙げられる。また、標的転写産物には、標的遺伝子をコードするゲノムDNAから転写されるmRNAであり、さらにまた、塩基修飾を受けていないmRNA、プロセシングされていないmRNA前駆体等を含む。「標的転写産物」は、mRNAだけでなく、miRNA等のノンコーディングRNA(non-coding RNA、ncRNA)も含み得る。さらに一般的に「転写産物」は、DNA依存性RNAポリメラーゼによって合成される任意のRNAであってよい。一実施形態では、「標的転写産物」は、例えば、スカベンジャー受容体B1(scavenger receptor B1：スカベンジャー受容体B1(scavenger receptor B1：本明細書ではしばしば「SR-B1 mRNA」と表記する)又は転移関連肺腺癌転写産物1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1：本明細書ではしばしば「Malat1」と表記する）ノンコーディングRNAであってもよい。配列番号３にマウスMalat1ノンコーディングRNAの塩基配列を、配列番号４にヒトMalat1ノンコーディングRNAの塩基配列を示す。また、配列番号５にマウスSR-B1 mRNAの塩基配列を、配列番号６にヒトSR-B1 mRNAの塩基配列を示す。そして、配列番号７にマウスDMPK mRNAの塩基配列を、配列番号８にヒトDMPK mRNAの塩基配列を示す。なお、配列番号１〜８は、いずれもmRNAの塩基配列をDNAの塩基配列に置き換えている。これらの遺伝子及び転写産物の塩基配列情報は、例えばNCBI(米国国立生物工学情報センター)データベース等の公知のデータベースから入手できる。
【００１８】
本明細書において「アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）」又は「アンチセンス核酸」とは、標的転写産物の少なくとも一部、例えば、任意の標的領域にハイブリダイズ可能な相補的塩基配列を含み、アンチセンス効果によってその標的遺伝子の転写産物の発現又は標的転写産物のレベルを抑制制御し得る一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。本発明の核酸複合体では、第１核酸鎖がASOとして機能し、その標的領域は、3'UTR、5'UTR、エクソン、イントロン、コード領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域、又は他のいずれの核酸領域を含んでいてもよい。標的転写産物の標的領域は、少なくとも8塩基長、例えば、10〜35塩基長、12〜25塩基長、13〜20塩基長、14〜19塩基長、又は15〜18塩基長とすることができる。
【００１９】
「アンチセンス効果」とは、ASOが標的転写産物（例えばRNAセンス鎖）にハイブリダイズすることによって、その標的転写産物にもたらされる発現又は編集を調節する効果をいう。「標的転写産物の発現又は編集を調節する」とは、標的遺伝子の発現又は標的転写産物の発現量（本明細書では、「標的転写産物の発現量」をしばしば「標的転写産物のレベル」と表記する）の抑制又は低下、翻訳の阻害、スプライシング機能改変効果（例えばエクソンスキッピング等）、又は転写産物の分解をいう。例えば、図２で示すように、翻訳の阻害では、オリゴヌクレオチド(例、RNA)がASOとして細胞に導入されると、ASOは標的遺伝子の転写産物であるmRNA等に結合して部分的二本鎖が形成される。この部分的二本鎖はリボソームによる翻訳を妨げるためのカバーとしての役割を果たし、それによって標的遺伝子にコードされたタンパク質の発現が翻訳レベルで阻害される（図２破線外×印）。一方、DNAを含むオリゴヌクレオチドがASOとして細胞に導入されると、部分的DNA-RNAヘテロ二本鎖が形成される。このヘテロ二本鎖構造がRNase Hによって認識される結果、標的遺伝子のmRNAが分解され、標的遺伝子にコードされたタンパク質の発現が発現レベルで阻害される(図２破線内)。これは、「RNase H依存性経路」と称される。さらに、特定の例において、アンチセンス効果は、mRNA前駆体のイントロンを標的化することによってもたらされ得る。アンチセンス効果はまた、miRNAを標的化することによってもたらされてもよく、この場合、当該miRNAの機能は阻害され、当該miRNAが通常発現を制御している遺伝子の発現は増加し得る。一実施形態で、標的転写産物の発現調節は、標的転写産物量の低下であってもよい。
【００２０】
本明細書中で使用される用語「核酸」又は「核酸分子」とは、モノマーであればヌクレオシド又はヌクレオチドを、オリゴマーであればオリゴヌクレオチドを、またポリマーであればポリヌクレオチド意味する。
【００２１】
「ヌクレオシド」とは、一般に塩基及び糖の組み合わせからなる分子をいう。ヌクレオシドの糖部分は、限定はしないが、通常、ペントフラノシル糖で構成され、その具体例としてリボースやデオキシリボースが挙げられる。ヌクレオシドの塩基部分（核酸塩基）は、通常は、複素環式塩基部分である。限定はしないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシルや、それ以外の修飾核酸塩基（修飾塩基）が挙げられる。
【００２２】
「ヌクレオチド」とは、前記ヌクレオシドの糖部分にリン酸基が共有結合した分子をいう。ペントフラノシル糖を含むヌクレオチドの場合、通常、糖の2'位、3'位、又は5'位のヒドロキシル基にリン酸基が連結されている。
【００２３】
「オリゴヌクレオチド」とは、隣接するヌクレオチド間で糖部分のヒドロキシル基とリン酸基が共有結合によって数個〜数十個連結することによって形成される直鎖状のオリゴマーをいう。また「ポリヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドよりも多数のヌクレオチドが前記共有結合によって数十個以上、好ましくは数百個以上連結することによって形成される直鎖状のポリマーをいう。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド構造の内部で、リン酸基は、一般にヌクレオシド間結合を形成するとみなされる。
【００２４】
本明細書中で使用される用語「核酸鎖」又は単なる「鎖」とは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを意味する。核酸鎖は、例えば自動合成装置を使用した化学的合成法により、又はポリメラーゼ、リガーゼ、又は制限反応による酵素的工程により全長鎖又は部分鎖を作製することができる。核酸鎖は、天然ヌクレオチド及び／又は非天然ヌクレオチドを含み得る。
【００２５】
本明細書において「天然ヌクレオシド」とは、自然界に存在するヌクレオシドをいう。例えば、リボースと前記アデニン、シトシン、グアニン、又はウラシル等の塩基からなるリボヌクレオシドや、デオキシリボースと前記アデニン、シトシン、グアニン、又はチミン等の塩基からなるデオキシリボヌクレオシドが挙げられる。なお、RNA中に見られるリボヌクレオシド、及びDNA中に見られるデオキシリボヌクレオシドを、それぞれ「DNAヌクレオシド」及び「RNAヌクレオシド」と称することもある。同様に、「天然ヌクレオチド」とは、自然界に存在するヌクレオチドで、前記天然ヌクレオシドの糖部分にリン酸基が共有結合した分子をいう。例えば、リボヌクレオシドにリン酸基が結合した、RNAの構成単位として知られるリボヌクレオチド、及びデオキシリボヌクレオシドにリン酸基が結合した、DNAの構成単位として知られるデオキシリボヌクレオチドが挙げられる。
【００２６】
本明細書において「非天然ヌクレオシド」とは、天然ヌクレオシド以外の任意のヌクレオシドをいう。例えば、修飾ヌクレオシド及びヌクレオシド模倣体を含む。本明細書において「修飾ヌクレオシド」とは、修飾糖部分及び／又は修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを意味する。非天然オリゴヌクレオチドを含む核酸鎖は、多くの場合、例えば、細胞取り込みの強化、核酸標的への親和性の強化、ヌクレアーゼ存在下での安定性の増加、又は阻害活性の増加等の望ましい特性により、天然型よりも好ましい。
【００２７】
本明細書において「模倣体」とは、糖、核酸塩基、及び／又はヌクレオシド間結合を置換する官能基を指す。一般に、模倣体は、糖又は糖−ヌクレオシド間結合の組み合わせの代わりに使用され、核酸塩基は、選択される標的に対するハイブリダイゼーションのために維持される。「ヌクレオシド模倣体」とは、オリゴマー化合物の一以上の位置において糖を置換するために、又は糖及び塩基を置換するために、又はオリゴマー化合物を構成するモノマーサブユニット間の結合等を置換するために使用される構造体を含む。「オリゴマー化合物」とは、核酸分子のある領域に少なくともハイブリダイズ可能な連結したモノマーサブユニットのポリマーを意味する。ヌクレオシド模倣体としては、例えば、モルホリノ、シクロヘキセニル、シクロヘキシル、テトラヒドロピラニル、二環式又は三環式糖模倣体、例えば、非フラノース糖単位を有するヌクレオシド模倣体が挙げられる。
【００２８】
本明細書において「二環式ヌクレオシド」とは、二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドをいう。二環式糖部分を含む核酸は、一般に架橋核酸(bridged nucleic acid、BNA)と称される。本明細書において、二環式糖部分を含むヌクレオシドは、「架橋ヌクレオシド」と称することもある。図３に架橋核酸を一部例示する。
【００２９】
二環式糖は、2'位の炭素原子及び4'位の炭素原子が2つ以上の原子によって架橋されている糖であってよい。二環式糖の例は当業者に公知である。二環式糖を含む核酸(BNA)の1つのサブグループは、4'-(CH2)p-O-2'、4'-(CH2)p-CH2-2'、4'-(CH2)p-S-2'、4'-(CH2)p-O CH2O-2'、4'-(CH2)n-N(R3)-O-(CH2)m-2'[式中、p、m及びnは、それぞれ1〜4の整数、0〜2の整数、及び1〜3の整数を表し；またR3は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、及びユニット置換基(蛍光若しくは化学発光標識分子、核酸切断活性を有する機能性基、細胞内又は核内局在化シグナルペプチド等)を表す]により架橋された2'位の炭素原子と4'位の炭素原子を有すると説明することができる。さらに、特定の実施形態によるBNAに関し、3'位の炭素原子上のOR2置換基及び5'位の炭素原子上のOR1置換基において、R1及びR2は、典型的には水素原子であるが、互いに同一であっても異なっていてもよく、さらにまた、核酸合成のためのヒドロキシル基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成のための保護基によって保護されているリン酸基、又はP(R4)R5[ここで、R4及びR5は、互いに同一であっても異なっていてもよく、それぞれヒドロキシル基、核酸合成のための保護基によって保護されているヒドロキシル基、メルカプト基、核酸合成のための保護基によって保護されているメルカプト基、アミノ基、1〜5個の炭素原子を有するアルコキシ基、1〜5個の炭素原子を有するアルキルチオ基、1〜6個の炭素原子を有するシアノアルコキシ基、又は1〜5個の炭素原子を有するアルキル基で置換されているアミノ基を表す]であってもよい。このようなBNAの非限定的な例としては、メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA(LNA(Locked Nucleic Acid(登録商標)、2',4'-BNAとしても知られている)、例えば、α-L-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA若しくはβ-D-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA、エチレンオキシ(4'-(CH2)2-O-2')BNA(ENAとしても知られている)、β-D-チオ(4'-CH2-S-2')BNA、アミノオキシ(4'-CH2-O-N(R3)-2')BNA、オキシアミノ(4'-CH2-N(R3)-O-2')BNA(2',4'-BNANCとしても知られている)、2',4'-BNAcoc、3'-アミノ-2',4'-BNA、5'-メチルBNA、(4'-CH(CH3)-O-2')BNA(cEt BNAとしても知られている)、(4'-CH(CH2OCH3)-O-2')BNA(cMOE BNAとしても知られている)、アミドBNA(4'-C(O)-N(R)-2')BNA(R=H、Me)(AmNAとしても知られている)、2'-O,4'-C-スピロシクロプロピレン架橋型核酸(scpBNAとしても知られている)及び当業者に公知の他のBNAが挙げられる。本明細書において、メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')架橋を有する二環式ヌクレオシドを「LNAヌクレオシド」と称することもある。
【００３０】
本明細書において「非天然ヌクレオチド」とは、天然ヌクレオチド以外の任意のヌクレオチドを指し、修飾ヌクレオチド及びヌクレオチド模倣体を含む。本明細書において「修飾ヌクレオチド」とは、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合、及び修飾核酸塩基のいずれか1つ以上を有するヌクレオチドを意味する。
【００３１】
「ヌクレオチド模倣体」とは、オリゴマー化合物の一以上の位置において、ヌクレオシド及び結合を置換するために使用される構造体を含む。ヌクレオチド模倣体としては、例えば、ペプチド核酸又はモルホリノ核酸(-N(H)-C(=O)-O-又は他の非ホスホジエステル結合によって結合されるモルホリノ)が挙げられる。ペプチド核酸(Peptide Nucleic Acid、PNA）は、糖の代わりにN-(2-アミノエチル)グリシンがアミド結合で結合した主鎖を有するヌクレオチド模倣体である。モルホリノ核酸の構造の一例を図４に示す。本明細書において非天然オリゴヌクレオチドを含む核酸鎖は、多くの場合、例えば、細胞取り込みの強化、核酸標的への親和性の強化、ヌクレアーゼ存在下での安定性の増加、又は阻害活性の増加等の望ましい特性を有する。したがって、天然ヌクレオチドよりも好ましい。
【００３２】
本明細書において「修飾ヌクレオシド間結合」とは、天然に存在するヌクレオシド間結合（すなわち、ホスホジエステル結合）からの置換又は任意の変化を有するヌクレオシド間結合をいう。修飾ヌクレオシド間結合には、リン原子を含むリン含有ヌクレオシド間結合とリン原子を含まない非リン含有ヌクレオシド間結合が含まれる。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合には、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アルキルチオホスホネート結合、ボラノホスフェート結合、及びホスホロアミデート結合等が挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロチオエート結合は、ホスホジエステル結合の非架橋酸素原子を硫黄原子に置換したヌクレオシド間結合である。リン含有及び非リン含有結合の調製方法は周知である。修飾ヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性が天然に存在するヌクレオシド間結合よりも高い結合であることが好ましい。
【００３３】
本明細書において「修飾核酸塩基」又は「修飾塩基」とは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシル以外のあらゆる核酸塩基を意味する。修飾核酸塩基の例としては、5-メチルシトシン、5-フルオロシトシン、5-ブロモシトシン、5-ヨードシトシン、N4-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、8-ブロモアデニン、N2-メチルグアニン、又は8-ブロモグアニンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい修飾核酸塩基は、5-メチルシトシンである。「非修飾核酸塩基」又は「非修飾塩基」とは、天然核酸塩基と同義であり、プリン塩基であるアデニン（A）及びグアニン（G）、並びにピリミジン塩基であるチミン（T）、シトシン（C）、及びウラシル（U）を意味する。
【００３４】
本明細書において「修飾糖」とは、天然糖部分（すなわち、DNA(2'-H)又はRNA(2'-OH)中に認められる糖部分）からの置換及び／又は任意の変化を有する糖を指す。本明細書において核酸鎖は、場合により修飾糖を含む1つ以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよい。糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の強化、結合親和性の増加、又は他の何らかの有益な生物学的特性を核酸鎖に付与し得る。ヌクレオシドは、化学修飾リボフラノース環部分を含んでいてもよい。化学修飾リボフラノース環の例としては、限定するものではないが、置換基(5'及び2'置換基を含む)の付加、非ジェミナル環原子の架橋形成による二環式核酸(架橋核酸、BNA)の形成、リボシル環酸素原子のS、N(R)、又はC(R1)(R2)(R、R1及びR2は、それぞれ独立して、H、C1-C12アルキル、又は保護基を表す)での置換、及びそれらの組み合わせが挙げられる。本明細書において、修飾糖部分を有するヌクレオシドの例としては、限定するものではないが、5'-ビニル、5'-メチル(R又はS)、4'-S、2'-F(2'-フルオロ基)、2'-OCH3(2'-OMe基若しくは2'-O-メチル基)、及び2'-O(CH2)2OCH3置換基を含むヌクレオシドが挙げられる。2'位の置換基はまた、アリル、アミノ、アジド、チオ、-O-アリル、-O-C1-C10アルキル、-OCF3、-O(CH2)2SCH3、-O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、及びO-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)から選択することができ、各Rm及びRnは、独立して、H又は置換若しくは非置換C1-C10アルキルである。本明細書において「2'-修飾糖」は、2'位で修飾されたフラノシル糖を意味する。
【００３５】
修飾糖の調製方法は、当業者に周知である。修飾糖部分を有するヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分(天然、修飾、又はそれらの組み合わせ)は、適切な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために維持されてよい。
【００３６】
一般的には、修飾は、同一鎖中のヌクレオチドが独立して異なる修飾を受けることができるように実施することができる。また、酵素的切断に対する抵抗性を与えるため、同一のヌクレオチドが、修飾ヌクレオシド間結合(例えば、ホスホロチオエート結合)を有し、さらに、修飾糖(例えば、2'-O-メチル修飾糖又は二環式糖)を有することができる。同一のヌクレオチドはまた、修飾核酸塩基(例えば、5-メチルシトシン)を有し、さらに、修飾糖(例えば、2'-O-メチル修飾糖又は二環式糖)を有することができる。
【００３７】
核酸鎖における非天然ヌクレオチドの数、種類及び位置は、本発明の核酸複合体によって提供されるアンチセンス効果等に影響を及ぼし得る。修飾の選択は、標的遺伝子等の配列によって異なり得るが、当業者であれば、アンチセンス法に関連する文献(例えば、WO 2007/143315、WO 2008/043753、及びWO 2008/049085)の説明を参照することによって好適な実施形態を決定することができる。さらに、修飾後の核酸複合体が有するアンチセンス効果が測定される場合、このようにして得られた測定値が修飾前の核酸複合体の測定値と比較して有意に低くない場合(例えば、修飾後に得られた測定値が、修飾前の核酸複合体の測定値の70％以上、80％以上又は90％以上である場合)、関連修飾を評価することができる。
【００３８】
本明細書中で使用される用語「相補的」とは、核酸塩基が水素結合を介して、いわゆるワトソン-クリック塩基対（天然型塩基対）又は非ワトソン-クリック塩基対（フーグスティーン型塩基対等）を形成し得る関係を意味する。本発明において、第1核酸鎖は、標的転写産物(例えば、標的遺伝子の転写産物)の少なくとも一部と完全に相補的であることは必ずしも必要ではなく、塩基配列が少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％(例えば、95％、96％、97％、98％、又は99％以上)の相補性を有していれば許容される。同様に、第2核酸鎖中の相補的領域は、第1核酸鎖の少なくとも一部と完全に相補的であることは必ずしも必要ではなく、塩基配列が少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％(例えば、95％、96％、97％、98％、又は99％以上)の相補性を有していれば許容される。
【００３９】
本明細書中で使用される用語「血液脳関門（BBB）」は、前述のように、脳へ移行する物質を選択及び制限する機構であり、脳を有害物質から保護する役割を担っている。
【００４０】
本明細書中で使用される用語「中枢神経系」とは、脳及び脊髄からなり、末梢神経系と共に神経系を構成する組織である。脳は、大脳(大脳皮質、大脳白質、大脳基底核)、間脳(視床、視床下核)、小脳(小脳皮質、小脳核)及び脳幹(中脳、黒質、橋、延髄)を含む。また、脊髄は、頸髄、胸髄、腰髄、仙髄及び尾髄を含む。本明細書における中枢神経系は、これらのいずれの領域であってもよいが、大脳皮質(前頭葉、側頭葉、頭頂葉、後頭葉)、小脳、線条体、淡蒼球、前障、海馬、海馬傍回、脳幹、頸髄、胸髄又は腰髄が好ましい。
【００４１】
本明細書において、「その塩」とは、本発明の核酸複合体の塩であって、本発明の核酸複合体の生理学的におよび製薬上許容される塩、すなわち、当該核酸複合体の所望される生物学的な活性を保持し、そこで望まれない毒物学的効果を与えない塩のことをいう。そのような塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩；ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩、ジオラミン塩、メグルミン塩 のようなアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩；酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩が挙げられる。
【００４２】
特定の実施形態において、本発明の核酸複合体は、核酸複合体の任意の薬学的に許容される塩、核酸複合体のエステル、または当該エステルの塩を包含する。好適な薬学的に許容される塩には、ナトリウム塩、カリウム塩及びメグルミン塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
（第1核酸鎖と第2核酸鎖の構成）
一態様において、本発明は、第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む核酸複合体に関する。
【００４４】
第1核酸鎖は、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、標的転写産物に対してアンチセンス効果をもたらす一本鎖オリゴヌクレオチド鎖である。
【００４５】
第2核酸鎖は、第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチド鎖である。第2核酸鎖は、トコフェロール若しくはコレステロール又はその類縁体等と結合している。核酸複合体において、第2核酸鎖は、相補的塩基対の水素結合を介して第1核酸鎖にアニールしている。
【００４６】
一実施形態において、本発明は、（１）トコフェロール若しくはその類縁体、（２）コレステロール若しくはその類縁体、又は（３）置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基、置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基、若しくは置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルコキシ基と結合している一本鎖核酸鎖に関する。該一本鎖核酸の構成は、トコフェロール若しくはコレステロール又はその類似体等と連結している以外は、第1核酸鎖と同一である。また、トコフェロール若しくはコレステロール又はその類似体等の構成、及びその核酸鎖との連結の形態は、本明細書において核酸複合体において記載する通りである。
【００４７】
第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基長は、通常、少なくとも8塩基長、少なくとも9塩基長、少なくとも10塩基長、少なくとも11塩基長、少なくとも12塩基長、少なくとも13塩基長、少なくとも14塩基長、又は少なくとも15塩基長であればよいが、特に限定されない。また、第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基長は、35塩基長以下、30塩基長以下、25塩基長以下、24塩基長以下、23塩基長以下、22塩基長以下、21塩基長以下、20塩基長以下、19塩基長以下、18塩基長以下、17塩基長以下、又は16塩基長以下であればよい。第1核酸鎖及び第2核酸鎖は、約100塩基長であってもよいし、又は、10〜35塩基長、12〜25塩基長、13〜20塩基長、14〜19塩基長、若しくは15〜18塩基長であってもよい。第1核酸鎖及び第2核酸鎖は、同じ長さであっても、異なる長さ（例えば、いずれか一方が1〜3塩基短い又は長い長さ）であってもよい。第1核酸鎖及び第2核酸鎖が形成する二本鎖構造は、バルジを含んでいてもよい。長さの選択は、例えば費用、合成収率などの他の因子の中でも特に、アンチセンス効果の強度と標的に対する核酸鎖の特異性とのバランスによって決定することができる。
【００４８】
第1核酸鎖及び第2核酸鎖におけるヌクレオシド間結合は、天然に存在するヌクレオシド間結合及び／又は修飾ヌクレオシド間結合であってよい。限定はしないが、第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖の末端（5'末端、3'末端若しくは両端）から少なくとも1個、少なくとも2個、又は少なくとも3個のヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合であることが好ましい。ここで、例えば核酸鎖の末端から2つのヌクレオシド間結合とは、核酸鎖の末端に最も近接するヌクレオシド間結合と、それに隣接し、かつ末端とは反対側に位置するヌクレオシド間結合を意味する。核酸鎖の末端領域における修飾ヌクレオシド間結合は、核酸鎖の望ましくない分解を抑制又は阻害できるために好ましい。一実施形態で、第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖の全てのヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合であってもよい。修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であってよい。
【００４９】
第2核酸鎖の3'末端から少なくとも1個（例えば3個）のヌクレオシド間結合は、RNase耐性の高いホスホロチオエート結合のような修飾ヌクレオシド間結合であってもよい。第2核酸鎖の3'末端にホスホロチオエート修飾等の修飾ヌクレオシド間結合を含む場合、二本鎖核酸複合体の遺伝子抑制活性が向上するので好ましい。
【００５０】
第2核酸鎖の5’末端及び3’末端において、トコフェロール若しくはコレステロール又はその類縁体等と未結合の末端の2〜6個の塩基のヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合（例えばホスホロチオエート結合)であってもよい。
【００５１】
第2核酸鎖の3'末端から少なくとも1個（例えば3個）のヌクレオシドは、例えば、RNase耐性の高い2'F-RNA、2'-OMe等の修飾ヌクレオシドであってもよい。第2核酸鎖の3'末端に2'F-RNA、2'-OMe等の修飾ヌクレオシドを含む場合、二本鎖核酸複合体の遺伝子抑制活性が高まるために好ましい。
【００５２】
第2核酸鎖の5’末端及び3’末端において、トコフェロール若しくはコレステロール又はその類縁体等と未結合の末端の1〜5個のヌクレオシドは、例えば、RNase耐性の高い2'F-RNA等の修飾ヌクレオシドであってもよい。
【００５３】
第1核酸鎖及び第2核酸鎖におけるヌクレオシドは、天然ヌクレオシド(デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、若しくは両者)及び／又は非天然ヌクレオシドであってよい。
【００５４】
本明細書では、第1核酸鎖の塩基配列が標的転写産物の少なくとも一部の塩基配列に相補的であることから標的転写産物にハイブリダイズ（又はアニール）することができる。塩基配列の相補性は、BLASTプログラム等を使用することによって決定することができる。当業者であれば、鎖間の相補度を考慮して、2本の鎖がハイブリダイズし得る条件（温度、塩濃度等)を容易に決定することができる。さらに、当業者であれば、例えば標的遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、標的転写産物に相補的なアンチセンス核酸を容易に設計することもできる。
【００５５】
ハイブリダイゼーション条件は、例えば、低ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件等の様々なストリンジェントな条件であってもよい。低ストリンジェントな条件は、比較的低温で、かつ高塩濃度の条件、例えば、30℃、2×SSC、0.1％SDSであってよい。高ストリンジェントな条件は、比較的高温で、かつ低塩濃度の条件、例えば、65℃、0.1×SSC、0.1％SDSであってよい。温度及び塩濃度等の条件を変えることによって、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを調整できる。ここで、1×SSCは、150mM塩化ナトリウム及び15mMクエン酸ナトリウムを含む。
【００５６】
第1核酸鎖は、標的転写産物にハイブリダイズしている場合に、RNase Hによって認識される少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、又は少なくとも7個の連続するヌクレオシドを含むことができる。通常、4〜20塩基、5〜16塩基、又は6〜12塩基の連続するヌクレオシドを含む領域であればよい。RNase Hによって認識されるヌクレオシドとして、例えば天然型デオキシリボヌクレオシドを用いることができる。修飾されたデオキシリボヌクレオシド、及び他の塩基を含む好適なヌクレオシドは、当該分野において周知である。また、リボヌクレオシド等の、2'位にヒドロキシ基を有するヌクレオシドが、前記ヌクレオシドとして不適当であることも知られている。「少なくとも4個の連続するヌクレオシド」を含むこの領域への利用に関し、ヌクレオシドの適合性を容易に決定することができる。一実施形態で、第1核酸鎖は、少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含み得る。
【００５７】
一実施形態では、第1核酸鎖の全長は、天然リボヌクレオシドのみで構成されてはいない。第1核酸鎖の天然リボヌクレオシドは、全長の半数以下であるか、又は含まないことが好ましい。
【００５８】
一実施形態では、第2核酸鎖は、第1核酸鎖中の上記の少なくとも4個の連続するヌクレオシド(例えばデオキシリボヌクレオシド）に相補的な、少なくとも4個の連続するリボヌクレオシドを含んでいてもよい。第2核酸鎖が、第1核酸鎖と部分的DNA-RNAヘテロ二本鎖を形成し、RNaseHによって認識され切断されるようにするためである。第2核酸鎖中の少なくとも4個の連続するリボヌクレオシドは、好ましくは、天然に存在するヌクレオシド間結合、すなわちホスホジエステル結合によって連結される。
【００５９】
第2核酸鎖は、全てのヌクレオシドがリボヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシドから構成されていてもよい。第2核酸鎖の全てのヌクレオシドが、デオキシリボヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシドから構成されていてもよく、リボヌクレオシドを含まなくてもよい。
【００６０】
本発明の核酸複合体を構成する第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖は、ギャップマー（gapmer)であってもよい。本明細書において「ギャップマー」とは、中央領域（DNAギャップ領域）と、その5'末端及び3'末端の両側に配置された5'ウイング領域及び3'ウイング領域からなる一本鎖核酸をいう。ギャップマーにおける前記中央領域は少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含み、前記5'ウイング領域及び3'ウイング領域は非天然ヌクレオシドを含む。5'ウイング領域及び3'ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドが架橋ヌクレオシドを含む、又はそれからなる場合、前記ギャップマーを特に「BNA／DNAギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドがペプチド核酸を含む、又はそれからなる場合、前記ギャップマーを特に「ペプチド核酸ギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドがペプチド核酸を含む、又はそれからなる場合、前記ギャップマーを特に「モルホリノ核酸ギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域に含まれる架橋ヌクレオシドの数は、2又は3個であってもよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域に含まれる架橋ヌクレオシドは、5'ウイング領域及び3'ウイング領域内に連続又は非連続に存在していてもよい。架橋ヌクレオシドは、修飾核酸塩基(例えば、5-メチルシトシン）をさらに含むことができる。架橋ヌクレオシドがLNAヌクレオシドである場合、前記ギャップマーを「LNA／DNAギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域の塩基長は、それぞれ独立して、少なくとも2塩基長、例えば、2〜10塩基長、2〜7塩基長、又は3〜5塩基長であればよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域は、非天然ヌクレオシドを少なくとも1種含んでいればよく、天然ヌクレオシドをさらに含んでいてもよい。
【００６１】
前記ギャップマーを構成する第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖は、5'末端から順に、2〜7塩基長若しくは3〜5塩基長の架橋ヌクレオシド、4〜15塩基長若しくは8〜12塩基長のリボヌクレオシド又はデオキシリボヌクレオシド、及び2〜7塩基長若しくは3〜5塩基長の架橋ヌクレオシドから構成されていてもよい。
【００６２】
本発明の核酸複合体を構成する第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖は、ミックスマー（mixmer）であってもよい。本明細書において「ミックスマー」とは、周期的又は無作為セグメント長の交互型の天然ヌクレオシド及び非天然ヌクレオシドを含み、かつ4個以上の連続するデオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシドを含まない核酸鎖をいう。ミックスマーにおいて、前記非天然ヌクレオシドが架橋ヌクレオシドであり、かつ天然ヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドであるミックスマーを特に「BNA／DNAミックスマー」と称する。ミックスマーにおいて、前記非天然ヌクレオシドがペプチド核酸であり、かつ天然ヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドであるミックスマーを特に「ペプチド核酸／DNAミックスマー」と称する。ミックスマーにおいて、前記非天然ヌクレオシドがモルホリノ核酸であり、かつ天然ヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドであるミックスマーを特に「モルホリノ核酸／DNAミックスマー」と称する。ミックスマーは、2種のヌクレオシドのみを含むようには制限されない。ミックスマーは、天然若しくは修飾のヌクレオシド又はヌクレオシド模倣体であるか否かに関わらず、任意の数の種類のヌクレオシドを含むことができる。例えば、架橋ヌクレオシド(例えば、LNAヌクレオシド)により分離された1又は2個の連続するデオキシリボヌクレオシドを有してもよい。架橋ヌクレオシドは、修飾核酸塩基(例えば、5-メチルシトシン)をさらに含んでもよい。
【００６３】
第2核酸鎖の末端（5'末端、3'末端、又は両末端）から少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、又は少なくとも4個のヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドであってもよい。修飾ヌクレオシドは、修飾糖及び／又は修飾核酸塩基を含んでいてもよい。修飾糖は、2'-修飾糖（例えば、2'-O-メチル基を含む糖）であってよい。修飾核酸塩基は、5-メチルシトシンとすることもできる。
【００６４】
第2核酸鎖は、5'末端から順に、2〜7塩基長若しくは3〜5塩基長の修飾ヌクレオシド（例えば、2'-修飾糖を含む修飾ヌクレオシド）、4〜15塩基長若しくは8〜12塩基長の(場合により、修飾ヌクレオシド間結合で連結された)リボヌクレオシド又はデオキシリボヌクレオシド、及び2〜7塩基長若しくは3〜5塩基長の修飾ヌクレオシド（例えば、2'-修飾糖を含む修飾ヌクレオシド)から構成されていてもよい。この場合、第1核酸鎖は、ギャップマーであってもよい。
【００６５】
第1核酸鎖及び第2核酸鎖は、全部又は一部にヌクレオシド模倣体又はヌクレオチド模倣体を含んでもよい。ヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸及び／又はモルホリノ核酸であってもよい。第1核酸鎖は、修飾ヌクレオシドを少なくとも1つ含んでもいてもよい。修飾ヌクレオシドは、2'-修飾糖を含んでいてもよい。この2'-修飾糖は、2'-O-メチル基を含む糖であってもよい。
【００６６】
第1核酸鎖及び第2核酸鎖は、上記の修飾ヌクレオシド間結合及び修飾ヌクレオシドの任意の組み合わせを含んでいてもよい。
【００６７】
第2核酸鎖は、（１）トコフェロール若しくはその類縁体、（２）コレステロール若しくはその類縁体、又は（３）置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基、置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基、若しくは置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルコキシ基と結合している。トコフェロール若しくはコレステロール又はその類似体等は、当業者であれば自体公知の方法により、製造することができる。
【００６８】
本明細書において「類縁体(analog)」とは、同一又は類似の基本骨格を有する類似した構造及び性質を有する化合物を指す。類縁体は、例えば、生合成中間体、代謝産物等を含む。ある化合物が別の化合物の類縁体であるかどうかは、当業者であれば判定できる。
【００６９】
トコフェロールは、α-トコフェロール、β-トコフェロール、γ-トコフェロール、及びδ-トコフェロールからなる群から選択され得る。トコフェロールの類縁体としては、トコフェロールの種々の不飽和類縁体、例えば、α-トコトリエノール、β-トコトリエノール、γ-トコトリエノール、δ-トコトリエノールなどが挙げられる。好ましくは、トコフェロールは、α-トコフェロールである。
【００７０】
コレステロールの類縁体は、ステロール骨格を有するアルコールである、種々のコレステロール代謝産物及び類縁体などを指し、限定されるものではないが、コレスタノール、ラノステロール、セレブロステロール、デヒドロコレステロール、及びコプロスタノールなどを含む。
【００７１】
トコフェロール又はその類縁体と結合した第2核酸鎖は、以下の一般式(I)で示される基を有してもよい。
【００７２】
【化１５】
2019182109.tif 000020
[式中、R1は、置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基（例、メチル、4,8,12-トリメチルトリデシル）又は置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０アルケニル基（例、4,8,12-トリメチル-3,7,11-トリデカトリエン-1-イル）を表す(ここで、該置換は、好ましくはハロゲン原子によりなされる)。]
【００７３】
コレステロール又はその類縁体と結合した第2核酸鎖は、以下の一般式(II)、(V)、(VI)、及び(VII)から成る群から選択される基を有してもよい：
【化１６】
2019182109.tif 000021
（式中、
環Ａは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキサン又は置換された若しくは置換されていないベンゼンを表し、環Ｂは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキセン、置換された若しくは置換されていないシクロヘキサン又は置換された若しくは置換されていないシクロヘキサジエンを表し、環Ｃは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキセン又は置換された若しくは置換されていないシクロヘキサンを表し、Ｒ２は、水素原子、置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基（例、エチル、イソプロピル、1-メチルプロピル、1,5-ジメチルヘキシル、4-エチル-1,5-ジメチルヘキシル）、置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基（例、1,5-ジメチル-4-ヘキセン-1-イル、1,4,5-トリメチル-2-ヘキセン-1-イル、4-エチル-1,5-ジメチル-2-ヘキセン-1-イル）、置換された若しくは置換されていないＣ１〜６アルキル−カルボニル基（例、1-オキソエチル）、置換された若しくは置換されていないＣ１〜６アルキル−カルボニル−オキシ基（例、(1-オキソヘプチル)オキシ）、又はオキソ基を表し、Ｒ３は、水素原子を表し、Ｒ２及びＲ３は、一緒になって、置換された若しくは置換されていない１，６−ジオキサスピロ［４．５］デカン環を形成してもよい）。
【００７４】
式中、Ｌ１は、−Ｏ−、−ＮＨ−、
【化１７】
2019182109.tif 000022
、又は
【化１８】
2019182109.tif 000023
を表す）、
【化１９】
2019182109.tif 000024
（式中、Ｒ４は、置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基（例、1,5-ジメチルヘキシル）、又は置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基を表す）、
【化２０】
2019182109.tif 000025
（式中、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基（例、ブチル、1,5-ジメチルヘキシル）、又は置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基を表す）、並びに
【化２１】
2019182109.tif 000026
（式中、Ｒ７は、ヒドロキシ基、置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０アルキル−カルボニル−オキシ基（例、(1-オキソドデシル)オキシ）、又は置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０アルケニル−カルボニル−オキシ基（例、(1-オキソ-9-オクタデケニル)オキシ）を表す）。上記(II)、(V)、(VI)、及び(VII)から成る群から選択される基において、置換はいずれも、好ましくはハロゲン原子（例、フッ素原子）、Ｃ１〜３アルキル基（例、メチル）、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル−カルボニル基（例、1-オキソ-2-メチルプロピル）、1〜3個のハロゲン原子で置換された1〜5個のＣ１〜３アルキル基で置換されたフェニル基でモノまたはジ置換されたカルバモイル基（例、[3,5-ビス(トリフルオロメチル)ベンゾイル]アミノ）、又はＣ１〜６アルキル−カルボニル基（例、2-メチル-1-オキソプロピル）、によりなされる。
【００７５】
一実施形態において、第2核酸鎖は、置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基（例、ヘプタデシル、16-メチルヘプタデシル、ヘニコシル）、置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基（例、2,6-ジメチル-1,3,5,7-オクタテトラエン-1-イル、8-ヘプタデケン-1-イル、8,11-ヘプタデカジエン-1-イル、8,11,14-ヘプタデカトリエン-1-イル）、若しくは置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルコキシ基（例、ヘニコソキシ）、と結合している（ここで、該置換は、好ましくはハロゲン原子、又は1〜5個のＣ１〜３アルキル基で置換されたシクロヘキセニル基（例、2,6,6-トリメチル-1-シクロヘキセン-1-イル）によりなされる。）。
【００７６】
一実施形態において、トコフェロール又はその類縁体と結合した第2核酸鎖は、以下の式（IIa）で表される基を有してもよい。：
【化２２】
2019182109.tif 000027
（式中、
環Ａは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキセン、置換された若しくは置換されていないシクロヘキサン又は置換された若しくは置換されていないシクロヘキサジエンを表し、
Ｒ１は、置換された若しくは置換されていないＣ１〜３０のアルキル基（例えば、Ｃ2〜２０、Ｃ４〜１６、Ｃ６〜１２又はＣ８〜１０のアルキル基）、置換された若しくは置換されていないＣ２〜３０のアルケニル基（例えば、Ｃ2〜２０、Ｃ４〜１６、Ｃ６〜１２又はＣ８〜１０のアルケニル基））、置換された若しくは置換されていないＣ１〜６アルキル−カルボニル基、置換された若しくは置換されていないＣ１〜６アルキル−カルボニル−オキシ基、又はオキソ基を表し、
Ｌ１は、−Ｏ−、−ＮＨ−、
【化２３】
2019182109.tif 000028
、又は
【化２４】
2019182109.tif 000029
を表す）
【００７７】
一実施形態において、トコフェロール又はその類縁体と結合した第2核酸鎖は、以下の式（IIa-1）、（IIa-2）、（IIa-3）、及び（IIa-4）で表される基を有してもよい。
【化２５】
2019182109.tif 000030
（IIa-1）
2019182109.tif 000031
（IIa-2）
2019182109.tif 000032
（IIa-3）
2019182109.tif 000033
（IIa-4）
（式中、
Ｌ１は、−Ｏ−、−ＮＨ−、
【化２６】
2019182109.tif 000034
、又は
【化２７】
2019182109.tif 000035
を表す）、
から成る群より選択される。
【００７８】
一実施形態において、トコフェロール又はその類縁体と結合した第2核酸鎖は、以下の一般式(IIa-3)で示される基を有さない。
【化２８】
2019182109.tif 000036
【００７９】
トコフェロール若しくはコレステロール又はそれらの類縁体等は、第2核酸鎖の5'末端、又は3'末端、あるいは両端に連結されていてもよい。あるいは、トコフェロール若しくはコレステロール又はそれらの類縁体等は、第2核酸鎖の内部のヌクレオチドに連結されていてもよい。例えば、コレステロールは、第2核酸鎖の5'末端に結合されうる。他の実施形態において、第2核酸鎖は、トコフェロール若しくはコレステロール又はそれらの類縁体等を2つ以上含み、これらは第2核酸鎖の複数の位置に連結されていてもよく、及び/又は第2核酸鎖の1つの位置に一群として連結されていてもよい。トコフェロール若しくはコレステロール又はそれらの類縁体等は、第2核酸鎖の5'末端と3'末端にそれぞれ1つずつ連結されていてもよい。コレステロール又はその類縁体が、第2核酸鎖の5'末端と3'末端にそれぞれ1つずつ連結されていてもよい。
【００８０】
第2核酸鎖とトコフェロール若しくはコレステロール又はその類縁体等との結合は、直接結合及び間接結合を問わない。直接結合とは2つの分子が直接的に結合することをいう。間接結合とは、結合すべき2つの分子が別の物質を介在して結合することをいう。
【００８１】
一実施形態において、第2核酸鎖とトコフェロール若しくはコレステロール及び／又はその類縁体等との結合は、第2核酸鎖の5'末端、3'末端、又は第2核酸鎖の内部のヌクレオチドに、リン酸エステル結合又はホスホロチオエート結合を介して結合していてもよい。
【００８２】
一実施形態では、第2核酸鎖の5'末端に、リン酸エステル結合又はホスホロチオエート結合を介して結合している。
【００８３】
一実施形態では、第2核酸鎖の5'末端に、リン酸エステル結合を介して結合している。
【００８４】
第2核酸鎖とトコフェロール若しくはコレステロール又はその類縁体等が間接結合をする場合、連結基（本明細書では、しばしば「リンカー」と表記する）を介して結合していてもよい。リンカーは、第2核酸鎖の5'末端、3'末端、又は第2核酸鎖の内部のヌクレオチドに、リン酸エステル結合又はホスホロチオエート結合を介して結合していてもよい。
【００８５】
一実施形態では、リンカーは、第2核酸鎖の5'末端に、リン酸エステル結合又はホスホロチオエート結合を介して結合している。
【００８６】
一実施形態では、リンカーは、第2核酸鎖の5'末端に、リン酸エステル結合を介して結合している。
【００８７】
前記リンカーの一具体例として、以下の一般式（VIII）で表されるリンカーが挙げられる：
【化２９】
2019182109.tif 000037
（式中、
Ｌ２は、置換された若しくは置換されていないＣ１〜１２のアルキレン基（例、プロピレン、ヘキシレン、ドデシレン）、置換された若しくは置換されていないＣ３〜８シクロアルキレン基（例、シクロヘキシレン）、−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−、又はＣＨ（ＣＨ２−ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−を表し、Ｌ３は、−ＮＨ−又は結合を表し、Ｌ４は、置換された若しくは置換されていないＣ１〜１２のアルキレン基（例、エチレン、ペンチレン、へプチレン、アンデシレン）、置換された若しくは置換されていないＣ３〜８のシクロアルキレン基（例、シクロヘキシレン）、−（ＣＨ２）２−［Ｏ−（ＣＨ２）２］ｍ−、又は結合を表し、ここで、ｍは１〜２５の整数を表し、Ｌ５は、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−、又は結合を表す(ここで、該置換は、好ましくはハロゲン原子によりなされる）。
【００８８】
第2核酸鎖とトコフェロール若しくはコレステロール又はその類縁体等が間接結合をする場合、両者は切断可能なリンカーを介して結合していてもよい。「切断可能なリンカー」とは、生理学的条件下、例えば細胞内又は動物体内（例えば、ヒト体内）で切断され得る連結基をいう。切断可能なリンカーは、ヌクレアーゼ、ぺプチダーゼ等の内在性酵素、酸性条件、還元的環境下等によって選択的に切断されてもよい。そのような具体例として、例えば、アミド結合、エステル結合、リン酸エステル結合、ホスホジエステル結合の一方若しくは両方のエステル結合、カルバメート結合、及びジスルフィド結合、並びに天然DNAリンカー等のヌクレオチドリンカーが挙げられる。
【００８９】
反対に、第2核酸鎖とトコフェロール若しくはコレステロール又はその類縁体等が間接結合をする場合、両者は非切断性（uncleavable）リンカーを介して結合していてもよい。「非切断性リンカー」は、生理学的条件下では切断されない連結基をいう。そのような非切断性リンカーとして、例えば、ホスホロチオエート結合、及びホスホロチオエート結合で連結された修飾又は非修飾のデオキシリボヌクレオシド、又は修飾又は非修飾のリボヌクレオシドからなるリンカー等が挙げられる。
【００９０】
切断可能なリンカー又は非切断性リンカーの鎖長は、DNA等の核酸又はオリゴヌクレオチドの場合、特に限定はされないが、通常は1〜20塩基長、1〜10塩基長又は1〜6塩基長でよい。
【００９１】
特定の実施形態において、本発明の核酸複合体が、光学異性体、立体異性体、位置異性体、回転異性体を含有する場合には、これらも本発明の核酸複合体として含有されるとともに、自体公知の合成手法、分離手法によりそれぞれを単品として得ることができる。例えば、本発明の核酸複合体に光学異性体が存在する場合には、該化合物から分割された光学異性体も本発明の核酸複合体に包含される。
【００９２】
特定の実施形態において、本発明の核酸複合体は、プロドラッグ及び当該プロドラッグの薬学的に許容される塩を含む。本発明の核酸複合体のプロドラッグ及び当該プロドラッグの薬学的に許容される塩は、生体内における生理条件下で酵素、胃酸等による反応により本発明の核酸複合体に変換する化合物、すなわち酵素的に酸化、還元、加水分解等を起こして本発明の核酸複合体に変化する化合物、胃酸等により加水分解等を起こして本発明の核酸複合体に変化する化合物をいう。特定の実施形態において、核酸複合体のプロドラッグは、第1核酸鎖または第2核酸鎖に結合された、トコフェロール若しくはコレステロール又はその類似体等を１つ以上含む。
【００９３】
本発明の核酸複合体において、第1核酸鎖が有する標的転写産物に対するアンチセンス効果は、当該分野で公知の方法で測定できる。例えば、核酸複合体を細胞等に導入した後、ノーザンブロッティング、定量PCR、又はウェスタンブロッティング等の公知技術を使用することにより測定できる。具体的には、細胞内の標的遺伝子の発現量又は標的転写産物のレベル(例えば、mRNA量若しくはマイクロRNA等のRNA量、cDNA量、タンパク質量等)がアンチセンス効果によって低下することを前述の公知技術を用いて検証すればよい。
【００９４】
本発明の核酸複合体の中枢神経系におけるアンチセンス効果の測定、及び血液脳関門の通過の判定も当該分野で公知の方法で測定できる。限定はしないが、例えば、本発明の核酸複合体を被験体（例えばマウス）に投与し、数日後〜数ヶ月後（例えば2〜7日後又は1ヶ月後）に中枢神経系における標的遺伝子の発現量又は標的転写産物のレベルが抑制されるか否かを測定することで前記判定が可能となる。前記判定の基準は、標的遺伝子の発現量又は標的転写産物の測定値が、陰性対照(例えばビヒクル投与)の測定値と比較して、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、又は少なくとも40％減少している場合に、本発明の核酸複合体が血液脳関門を通過し、中枢神経系にアンチセンス効果をもたらしたと判定できる。また、血液脳関門の通過の判定は、本発明の核酸複合体を被験体(例えばマウス)に投与し、数日後〜数ヶ月後（例えば2〜7日後又は1ヶ月後）に、中枢神経系における本発明の核酸複合体の存在量(濃度)を測定することによって判定することができる。
【００９５】
上記のように、本発明の核酸複合体の例示的実施形態について説明したが、本発明の核酸複合体は上記の例示的実施形態に限定されない。さらに、当業者であれば、公知の方法を適切に選択することによって、本発明の様々な実施形態による核酸複合体を構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖を製造することができる。例えば、本発明の核酸分子は、標的転写産物の塩基配列（例えば、標的遺伝子の塩基配列）情報に基づいて各核酸分子を設計し、例えば、GE Healthcare社、Thermo Fisher Scientific社、Beckman Coulter社等の市販の自動核酸合成装置を使用して核酸を合成し、その後、得られたオリゴヌクレオチドに逆相カラム等を使用して精製することにより製造することができる。
【００９６】
第2核酸鎖は、ポリヌクレオチドに結合された少なくとも1つの機能性部分をさらに含んでいてもよい。機能性部分が、核酸複合体及び／又は機能性部分が結合している鎖に所望の機能を与える限り、特定の実施形態による「機能性部分」の構造について特定の限定はない。所望の機能としては、標識機能及び精製機能が挙げられる。標識機能を与える部分の例としては、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化合物が挙げられる。精製機能を与える部分の例としては、ビオチン、アビジン、Hisタグペプチド、GSTタグペプチド、FLAGタグペプチド等の化合物が挙げられる。機能性部分の第2核酸鎖における結合位置及び結合の種類は、トコフェロール若しくはコレステロール又はそれらの類縁体等と第2核酸鎖との結合について上に記載されるとおりである。
【００９７】
一実施形態では、機能性部分が結合している核酸複合体は、機能性部分が予め結合した核酸種を用いて、上記の合成、精製及びアニーリングを実施することによって製造することができる。例えば、トコフェロール若しくはコレステロール又はその類縁体等が予め結合された核酸種を用いて、上記の合成及び精製を実施することによって第2核酸鎖を製造することができる。
【００９８】
一実施形態では、上記の合成及び精製を実施することによって製造された第2核酸鎖に、自体公知の方法によりトコフェロール若しくはコレステロール又はその類縁体等を結合させることができる。機能性部分を核酸に連結するための方法は当該技術分野において周知である。この方法で製造した核酸を適切な緩衝溶液中で混合し、約90℃〜98℃で数分間（例えば5分間）変性させ、その後核酸を約30℃〜70℃で約1〜8時間アニールして、本発明の核酸複合体の一つを製造することができるまた、核酸鎖は、塩基配列並びに修飾部位及び種類を指定して、各種メーカー(例えば、株式会社ジーンデザイン)に注文し、入手することもできる。上記アニール工程は、室温（約10℃〜約35℃）に約5〜60分間静置することで、行うことができる。
【００９９】
第1核酸鎖及び第2核酸鎖をそれぞれ、約70℃〜98℃の緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）又は水中で溶解し、得られた2つの溶液を混合し、混合液を約70℃〜98℃で数分間（例えば5分間)保持し、その後、混合液を約30℃〜70℃（又は30℃〜50℃）で約1〜8時間保持して、本発明の一部の実施形態の核酸複合体を調製してもよい。第1核酸鎖及び第2核酸鎖はそれぞれ、室温（約10℃〜約35℃）で緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）又は水中で溶解することもできる。
【０１００】
ただし、核酸複合体の作製時におけるアニーリングの条件（時間及び温度）は、上記条件に限定されない。また、核酸鎖のアニーリングを促進するのに適した条件は、当該技術分野において周知である。
【０１０１】
（核酸複合体の効果）
本発明の核酸複合体は、被験体の中枢神経系において標的miRNAの効果を阻害することができる。例えば、具体的には、第1核酸鎖は、標的miRNAの少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、その標的miRNAに対してアンチセンス効果を有し、第2核酸鎖は、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、トコフェロール若しくはコレステロール又はその類縁体等と結合しており、第1核酸鎖と第2核酸鎖に互いにアニールしている核酸複合体が挙げられる。この核酸複合体によって標的miRNAの効果を阻害することにより、当該標的miRNAが通常ダウンレギュレートしている遺伝子の発現をアップレギュレートすることができる。
【０１０２】
本発明の核酸複合体は、被験体の中枢神経系において標的RNAの発現又は編集を調節することができる。例えば、具体的には、第1核酸鎖は、標的RNAの少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的RNAに対してアンチセンス効果を有し、第2核酸鎖は、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、トコフェロール若しくはコレステロール又はその類縁体等と結合しており、第1核酸鎖と第2核酸鎖は互いにアニールしている核酸複合体が挙げられる。ここで、「標的RNAの発現調節」とは、例えば、発現量の上方制御及び下方制御を含む。また「標的RNAの編集調節」とは、RNA編集によるスプライシングの調節、例えば、エクソンスキッピングやエクソンインクルージョンを含む。標的RNAは、ウイルス若しくは細菌のRNA、又は毒性のRNA(Toxic RNA)であってもよい。
【０１０３】
本発明の核酸複合体は、被験体の中枢神経系において標的mRNAの翻訳を阻害することができる。例えば、具体的には、第1核酸鎖は、標的mRNAの少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的mRNAに対してアンチセンス効果を有し、第2核酸鎖は、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、トコフェロール若しくはコレステロール又はその類縁体等と結合しており、第1核酸鎖と第2核酸鎖が互いにアニールしている核酸複合体が挙げられる。この核酸複合体によって第1核酸鎖が標的mRNAに結合することにより、ステリックブロックが生じ、mRNAの翻訳が阻害される。
【０１０４】
なお、本発明の核酸複合体は、それに限定されるものではないが、中枢神経系のミクログリア（小膠細胞）における標的転写産物の発現又は編集の調節において有効に使用することができる。
【０１０５】
＜組成物＞
本発明の第２態様は組成物である。本発明の組成物は、前記第1態様の核酸複合体又は一本鎖核酸鎖を有効成分として、及び／又は薬剤送達分子として包含する。前記第1態様の核酸複合体又は一本鎖核酸鎖は、BBBを通過し、中枢神経系にて標的転写産物の発現量をアンチセンス効果によって調節する(例えば、発現量を減少させる)ことができる。したがって、本発明の組成物は、被験体に投与することで、核酸複合体を送達し、被験体を治療する組成物であってもよく、また医薬組成物であってもよい。なお、本発明の組成物は、それに限定されるものではないが、中枢神経系のミクログリア（小膠細胞）における標的転写産物の発現又は編集の調節において有効に使用することができる。
【０１０６】
また、本発明の一実施形態では、核酸複合体を含む組成物を投与することで各中枢神経系疾患を治療する治療方法に関する。
【０１０７】
（製剤化）
本明細書において、組成物は自体公知の方法により製剤化することができる。例えば、本組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、微粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、解膠剤(peptizer)、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、コーティング剤、軟膏、硬膏剤(plaster)、パップ剤(cataplasm)、経皮剤、ローション剤、吸入剤、エアロゾル剤、点眼剤、注射剤及び坐剤の形態で、経口的に又は非経口的に使用することができる。
【０１０８】
これらの製剤の製剤化に関して、薬学的に許容可能な担体若しくは溶媒又は食品及び飲料品として許容可能な担体若しくは溶媒を適切に組み込むことができる。そのような担体又は溶媒として、具体的には滅菌水、生理食塩水、植物性油、基剤、乳化剤、懸濁化剤、界面活性剤、pH調整剤、安定化剤、香味料、香料、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、鎮静剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、増粘剤、矯味剤、溶解助剤、及び他の添加剤が挙げられる。
【０１０９】
（投与形態・投与量）
本明細書において、組成物の好ましい投与形態には特定の限定はない。例えば、経口投与又は非経口投与であればよい。非経口投与の具体例として、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気管／気管支投与、直腸投与、及び筋肉内投与、並びに輸血による投与が挙げられる。筋肉内注射投与、静脈内点滴投与、又は埋め込み型持続皮下投与で投与することもできる。皮下投与は、患者自身による自己注射が可能であるので好適である。また、静脈内投与の場合、組成物1回の投与量中に含まれる核酸複合体の量、すなわち核酸複合体の単回投与量は、例えば、0.001mg/kg以上、0.005mg/kg以上、0.01mg/kg以上、00.25mg/kg以上、0.5mg/kg以上、1mg/kg以上、2.5mg/kg以上、5mg/kg以上、10mg/kg以上、20mg/kg以上、30mg/kg以上、40mg/kg以上、50mg/kg以上、75mg/kg以上、100mg/kg以上、150mg/kg以上、200mg/kg以上、300mg/kg以上、400mg/kg以上、若しくは500mg/kg以上とすることができる。例えば、0.001mg/kg〜500mg/kgの範囲に含まれる任意の量（例えば、0.001mg/kg、0.01mg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、若しくは200mg/kg）を適宜選択することができる。
【０１１０】
（被検体・適用対象）
本明細書で「被検体」とは、本発明の組成物を適用する対象をいう。被検体は、個体の他、器官、組織、及び細胞を含む。被検体が個体の場合、本発明の組成物は、ヒトを含むあらゆる動物に適用することができる。ヒト以外の対象としては、例えば、様々な家畜、家禽、ペット、実験動物等が適用対象となり得る。被験体は、中枢神経系で標的転写産物の発現量を減少させることが必要な個体や、中枢神経系疾患の治療が必要な個体であってもよい。
【０１１１】
本発明の組成物は、包含する第１態様の核酸複合体又は一本鎖核酸鎖のBBB通過作用及びアンチセンス効果により、中枢神経系における標的転写産物の発現量を減少させることができる。
【０１１２】
本発明の組成物を中枢神経系疾患の治療用として適用する場合、適用対象疾患は、遺伝子発現の増加又は減少に関連する中枢神経系疾患、特に標的転写産物又は標的遺伝子の発現の増加に関連する疾患(腫瘍等)が好ましい。限定されないが、例えば、脳腫瘍、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、ハンチントン病等が挙げられる。
【０１１３】
一実施形態において、本発明の組成物は、免疫性中枢神経系疾患の治療用として適用される。免疫性中枢神経系疾患の例としては、例えばミクログリア関連疾患が挙げられ、ミクログリア関連疾患としては例えば、アルツハイマー病、多発性硬化症、ALS、神経障害性疼痛などが挙げられる。
【０１１４】
本発明の組成物の送達部位、より具体的には組成物中に含まれる有効成分の送達部位は、特に限定はしないが、各疾患に応じて適切な部位に送達されることで、より効果的な結果が得られ得る。具体例を挙げると、アルツハイマー病の治療では、海馬及び／又は頭頂葉への薬剤送達が有効となり得る。また、前頭側頭型認知症（FTD）（前頭側頭葉変性症（FTLD）、意味性認知症（SD）、進行性非流暢性失語（PNFA）等を含む）、及びピック病の治療では、前頭葉、側頭葉及び／又は黒質への薬剤送達が有効となり得る。さらに、パーキンソン病認知症の治療では、後頭葉、黒質及び／又は線条体への薬剤送達が有効となり得る。また、パーキンソン病の治療では、黒質及び／又は線条体への薬剤送達が有効となり得る。皮質基底核変性症（CBD）の治療では、前頭葉、頭頂葉、大脳基底核及び／又は黒質への薬剤送達が有効となり得る。進行性核上性麻痺（PSP）の治療では、前頭葉、大脳基底核及び／又は黒質への薬剤送達が有効となり得る。筋萎縮性側索硬化症の治療では、前頭葉、頭頂葉、大脳基底核及び／又は黒質への薬剤送達が有効となり得る。脊髄小脳変性症（SCD）SCA1型〜SCA34型までの治療では、脳幹及び／又は小脳への薬剤送達が有効となり得る。歯状核赤核淡蒼球ルイ体変性症（DRPLA）の治療では、大脳基底核、脳幹及び／又は小脳への薬剤送達が有効となり得る。球脊髄性萎縮症（SBMA）の治療においては、脳幹及び／又は脊髄への薬剤送達が有効となり得る。フリードライヒ失調症（FA）の治療では、脳幹及び/又は小脳への薬剤送達が有効となり得る。ハンチントン病の治療では、線条体、前頭葉、頭頂葉及び／又は大脳基底核への薬剤送達が有効となり得る。プリオン病(狂牛病、GSSを含む)の治療では、大脳皮質、大脳白質、大脳基底核及び/又は黒質への薬剤送達が有効となり得る。大脳白質性脳症の治療では、大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。脳炎（ウイルス性、細菌性、真菌性、結核性を含む）、髄膜炎（ウイルス性、細菌性、真菌性、結核性を含む）の治療では、脳全体への薬剤送達が有効となり得る。代謝性脳症、中毒性脳症、栄養障害性脳症の治療では、脳全体への薬剤送達が有効となり得る。大脳白質性脳症の治療では、大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、もやもや病、無酸素脳症の治療では、脳全体への薬剤送達が有効となり得る。大脳白質性脳症の治療では、大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。びまん性軸索損傷（Diffuse axonal injury）の治療では、大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。頭部外傷の治療では、脳全体への薬剤送達が有効となり得る。多発性硬化症（MS）、視神経脊髄炎（NMO）の治療では、大脳白質、大脳皮質、視神経及び／又は脊髄への薬剤送達が有効となり得る。筋緊張型ジストロフィー症（DM1, DM2）の治療では、骨格筋、心筋、大脳皮質及び／又は大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。家族性痙性対麻痺（HSP）の治療では、頭頂葉及び／又は脊髄への薬剤送達が有効となり得る。福山型筋ジストロフィーの治療では、骨格筋、大脳皮質及び／又は大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。レビー小体型認知症（DLB）の治療では、黒質、線条体、後頭葉、前頭葉及び／又は頭頂葉への薬剤送達が有効となり得る。多系統萎縮���（MSA）の治療では、線条体、大脳基底核、小脳、黒質、前頭葉及び／又は側頭葉への薬剤送達が有効となり得る。アレキサンダー病の治療では、大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。CADASIL、CARASILの治療においては、大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。
【０１１５】
組成物が投与又は摂取により適用される場合、投与量又は摂取量は、被験体の年齢（月齢、週齢を含む）、体重、症状及び健康状態、組成物の種類（医薬品、食品及び飲料品等）等に従って適切に選択すればよい。本発明の組成物の被検体への摂取有効量は、例えば、包含する核酸複合体が0.00001mg/kg/日〜10000mg/kg/日、又は0.001mg/kg/日〜100mg/kg/日となるようにすればよい。組成物は、単回投与でも、複数回投与であってもよい。複数回投与の場合、毎日若しくは適当な時間間隔で（例えば1日、2日、3日、1週間、2週間、1ヶ月の間隔で）、例えば2〜20回等投与することもできる。上記の核酸複合体の1回の投与量は、例えば、0.001mg/kg以上、0.005mg/kg以上、0.01mg/kg以上、00.25mg/kg以上、0.5mg/kg以上、1mg/kg以上、2.5mg/kg以上、0.5mg/kg以上、1.0mg/kg以上、2.0mg/kg以上、3.0mg/kg以上、4.0mg/kg以上、5mg/kg以上、10mg/kg以上、20mg/kg以上、30mg/kg以上、40mg/kg以上、50mg/kg以上、75mg/kg以上、100mg/kg以上、150mg/kg以上、200mg/kg以上、300mg/kg以上、400mg/kg以上、若しくは500mg/kg以上とすることができ、例えば、0.001mg/kg〜500mg/kgの範囲に含まれる任意の量（例えば、0.001mg/kg、0.01mg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、若しくは200mg/kg）を適宜選択することができる。
【０１１６】
本発明の核酸複合体は、0.01〜10mg/kg（例えば約6.25mg/kg）の用量で週2回の頻度で4回投与してもよい。また、核酸複合体は、0.05〜30mg/kg（例えば約25mg/kg）の用量で週1〜2回の頻度で2〜4回、例えば週2回の頻度で2回投与してもよい。このような投与レジメン（分割投与）の採用により、より高用量の単回投与に比べて、毒性を下げ、被検体への負荷を低減することができる。
【０１１７】
核酸複合体の単回投与によるBBB通過量、BNB通過量には制限（上限）があるが、反復投与でも抑制効果は細胞内において相加的に働くと考えられる。すなわち、BBB通過、BNB通過の制限以上の高用量（例えば25mg/kg以上）では1回の投与量の増量では有効性の増強は低減するが、ある程度の投与間隔（例えば、半日以上）をおいた反復投与により有効性を向上させることができると考えられる。
【０１１８】
（薬剤送達）
本発明の組成物は、有効成分として含有する第1態様の核酸複合体又は一本鎖核酸鎖がBBBを通過し、中枢神経系に効率的に送達され得ることを利用して、特定の薬剤を第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖に結合させることによって、その薬剤を神経系、特に中枢神経系に送達することができる。神経系に送達される薬剤は、特に限定されないが、ペプチド、タンパク質又は核酸薬剤、あるいはその他の有機化合物等、例えば抗腫瘍薬、ホルモン薬、抗生物質、抗ウイルス剤、抗炎症薬等が挙げられる。薬剤は、好ましくは、小分子薬剤である。「小分子薬剤」とは、当該技術分野において十分に理解されている。小分子薬剤は、典型的には、1,000ダルトン未満の分子量を有する薬剤を指す。薬剤は、親油性薬剤であってもよい。核酸薬剤としては、特に限定されないが、ASO、アンタゴmiR、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、アプタマー、一本鎖siRNA、マイクロRNA、プレ-マイクロRNA等が挙げられる。薬剤の第2核酸鎖における結合位置及び結合の種類は、トコフェロール若しくはコレステロール又はその類縁体等と第2核酸鎖との結合について上に記載される通りである。
【０１１９】
本発明の組成物は、以下の実施例で開示される通り、高効率に中枢神経系に送達され、標的遺伝子の発現又は標的転写産物のレベルを効果的に改変又は抑制することができる。したがって、被験体の中枢神経系において標的転写産物の発現量を減少させる方法であって、上記の核酸複合体を含む組成物を被験体に投与することを含む、方法が提供される。当該方法は、被験体の中枢神経系疾患を治療する方法であってもよい。また、被験体の中枢神経系に薬剤を送達する方法であって、上記の核酸複合体を含む組成物を被験体に投与することを含む、薬剤送達方法も提供される。
【実施例】
【０１２０】
本発明は、更に以下の参考例及び実施例によって詳しく説明されるが、これらは本発明を限定するものではなく、また本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させてもよい。【０１２１】
以下の実施例中の「室温」は通常約１０℃〜約３５℃を示す。混合溶媒において示した比は、特に断らない限り容量比を示す。％は、特に断らない限り重量％を示す。【０１２２】
実施例のカラムクロマトグラフィーにおける溶出は、特に言及しない限り、ＴＬＣ（Ｔｈｉｎ  Ｌａｙｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，薄層クロマトグラフィー）による観察下に行った。ＴＬＣ観察においては、ＴＬＣプレートとしてメルク（Ｍｅｒｃｋ）社製の６０  Ｆ２５４を用い、展開溶媒として、カラムクロマトグラフィーで溶出溶媒として用いた溶媒を用いた。また、検出にはＵＶ検出器を採用した。分取ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）において、Ｃ１８と記載した場合はオクタデシル結合シリカゲルを用いた。溶出溶媒において示した比は、特に断らない限り容量比を示す。
１Ｈ  ＮＭＲの解析にはＡＣＤ／ＳｐｅｃＭａｎａｇｅｒ（商品名）ソフトウエアなどを用いた。水酸基やアミノ基などのプロトンピークが非常に緩やかなピークについては記載していないことがある。【０１２３】
以下に、実施例で用いた略語の意味を示す。
Ｍ：モル濃度
Ｎ：規定度
ＣＤＣｌ３：重クロロホルム
ＤＭＳＯ−ｄ６：重ジメチルスルホキシド
１Ｈ  ＮＭＲ：プロトン核磁気共鳴  
ＬＣ／ＭＳ：液体クロマトグラフ質量分析計  
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＨＡＴＵ：Ｏ―（７―アザベンゾトリアゾール―１―イル）―Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’―テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸塩
ＮＭＰ：Ｎ−メチル−２−ピロリドン
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＴＥＡＡ：トリエチルアミンアセタート
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン【０１２４】
以下の実施例で用いるオリゴヌクレオチドの構造を表１にまとめて示す。実施例で用いるオリゴヌクレオチドのうちASO(Malat1)、Y61-cRNA(Malat1)、Y62-cRNA(Malat1)、Y63-cRNA(Malat1)、Y64-cRNA(Malat1)、Y59-cRNA(Malat1)、Y60-cRNA(Malat1)及びChol-cRNA(Malat1)は、株式会社ジーンデザイン（大阪、日本）によって合成された。【０１２５】
【表１】
2019182109.tif 000038
2019182109.tif 000039
2019182109.tif 000040
2019182109.tif 000041
2019182109.tif 000042
【０１２６】
表１に示すオリゴヌクレオチドY61-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１２７】
【化３０】
2019182109.tif 000043
【０１２８】
表１に示すオリゴヌクレオチドY62-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１２９】
【化３１】
2019182109.tif 000044
【０１３０】
表１に示すオリゴヌクレオチドY63-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１３１】
【化３２】
2019182109.tif 000045
【０１３２】
表１に示すオリゴヌクレオチドY64-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１３３】
【化３３】
2019182109.tif 000046
【０１３４】
表１に示すオリゴヌクレオチドY1-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１３５】
【化３４】
2019182109.tif 000047
【０１３６】
表１に示すオリゴヌクレオチドY3-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１３７】
【化３５】
2019182109.tif 000048
【０１３８】
表１に示すオリゴヌクレオチドY4-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１３９】
【化３６】
2019182109.tif 000049
【０１４０】
表１に示すオリゴヌクレオチドY5-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１４１】
【化３７】
2019182109.tif 000050
【０１４２】
表１に示すオリゴヌクレオチドY6-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１４３】
【化３８】
2019182109.tif 000051
【０１４４】
表１に示すオリゴヌクレオチドY7-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１４５】
【化３９】
2019182109.tif 000052
【０１４６】
表１に示すオリゴヌクレオチドY8-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１４７】
【化４０】
2019182109.tif 000053
【０１４８】
表１に示すオリゴヌクレオチドY9-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１４９】
【化４１】
2019182109.tif 000054
【０１５０】
表１に示すオリゴヌクレオチドY10-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１５１】
【化４２】
2019182109.tif 000055
【０１５２】
表１に示すオリゴヌクレオチドY11-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１５３】
【化４３】
2019182109.tif 000056
【０１５４】
表１に示すオリゴヌクレオチドY12-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１５５】
【化４４】
2019182109.tif 000057
【０１５６】
表１に示すオリゴヌクレオチドY13-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１５７】
【化４５】
2019182109.tif 000058
【０１５８】
表１に示すオリゴヌクレオチドY14-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１５９】
【化４６】
2019182109.tif 000059
【０１６０】
表１に示すオリゴヌクレオチドY15-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１６１】
【化４７】
2019182109.tif 000060
【０１６２】
表１に示すオリゴヌクレオチドY16-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１６３】
【化４８】
2019182109.tif 000061
【０１６４】
表１に示すオリゴヌクレオチドY17-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１６５】
【化４９】
2019182109.tif 000062
【０１６６】
表１に示すオリゴヌクレオチドY18-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１６７】
【化５０】
2019182109.tif 000063
【０１６８】
表１に示すオリゴヌクレオチドY19-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１６９】
【化５１】
2019182109.tif 000064
【０１７０】
表１に示すオリゴヌクレオチドY20-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１７１】
【化５２】
2019182109.tif 000065
【０１７２】
表１に示すオリゴヌクレオチドY59-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１７３】
【化５３】
2019182109.tif 000066
【０１７４】
表１に示すオリゴヌクレオチドY60-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１７５】
【化５４】
2019182109.tif 000067
【０１７６】
表１に示すオリゴヌクレオチドY21-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１７７】
【化５５】
2019182109.tif 000068
【０１７８】
表１に示すオリゴヌクレオチドY22-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１７９】
【化５６】
2019182109.tif 000069
【０１８０】
表１に示すオリゴヌクレオチドY23-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１８１】
【化５７】
2019182109.tif 000070
【０１８２】
表１に示すオリゴヌクレオチドY24-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１８３】
【化５８】
2019182109.tif 000071
【０１８４】
表１に示すオリゴヌクレオチドY25-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１８５】
【化５９】
2019182109.tif 000072
【０１８６】
表１に示すオリゴヌクレオチドY26-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１８７】
【化６０】
2019182109.tif 000073
【０１８８】
表１に示すオリゴヌクレオチドY27-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１８９】
【化６１】
2019182109.tif 000074
【０１９０】
表１に示すオリゴヌクレオチドY28-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１９１】
【化６２】
2019182109.tif 000075
【０１９２】
表１に示すオリゴヌクレオチドY29-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１９３】
【化６３】
2019182109.tif 000076
【０１９４】
表１に示すオリゴヌクレオチドY30-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１９５】
【化６４】
2019182109.tif 000077
【０１９６】
表１に示すオリゴヌクレオチドY31-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１９７】
【化６５】
2019182109.tif 000078
【０１９８】
表１に示すオリゴヌクレオチドY32-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０１９９】
【化６６】
2019182109.tif 000079
【０２００】
表１に示すオリゴヌクレオチドY33-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２０１】
【化６７】
2019182109.tif 000080
【０２０２】
表１に示すオリゴヌクレオチドY34-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２０３】
【化６８】
2019182109.tif 000081
【０２０４】
表１に示すオリゴヌクレオチドY35-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２０５】
【化６９】
2019182109.tif 000082
【０２０６】
表１に示すオリゴヌクレオチドY36-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２０７】
【化７０】
2019182109.tif 000083
【０２０８】
表１に示すオリゴヌクレオチドY37-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２０９】
【化７１】
2019182109.tif 000084
【０２１０】
表１に示すオリゴヌクレオチドY38-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２１１】
【化７２】
2019182109.tif 000085
【０２１２】
表１に示すオリゴヌクレオチドY39-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２１３】
【化７３】
2019182109.tif 000086
【０２１４】
表１に示すオリゴヌクレオチドY40-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２１５】
【化７４】
2019182109.tif 000087
【０２１６】
表１に示すオリゴヌクレオチドY41-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２１７】
【化７５】
2019182109.tif 000088
【０２１８】
表１に示すオリゴヌクレオチドY42-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２１９】
【化７６】
2019182109.tif 000089
【０２２０】
表１に示すオリゴヌクレオチドY43-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２２１】
【化７７】
2019182109.tif 000090
【０２２２】
表１に示すオリゴヌクレオチドY44-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２２３】
【化７８】
2019182109.tif 000091
【０２２４】
表１に示すオリゴヌクレオチドY45-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２２５】
【化７９】
2019182109.tif 000092
【０２２６】
表１に示すオリゴヌクレオチドY46-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２２７】
【化８０】
2019182109.tif 000093
【０２２８】
表１に示すオリゴヌクレオチドY47-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２２９】
【化８１】
2019182109.tif 000094
【０２３０】
表１に示すオリゴヌクレオチドY48-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２３１】
【化８２】
2019182109.tif 000095
【０２３２】
表１に示すオリゴヌクレオチドY49-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２３３】
【化８３】
2019182109.tif 000096
【０２３４】
表１に示すオリゴヌクレオチドY50-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２３５】
【化８４】
2019182109.tif 000097
【０２３６】
表１に示すオリゴヌクレオチドY51-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２３７】
【化８５】
2019182109.tif 000098
【０２３８】
表１に示すオリゴヌクレオチドY52-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２３９】
【化８６】
2019182109.tif 000099
【０２４０】
表１に示すオリゴヌクレオチドY53-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２４１】
【化８７】
2019182109.tif 000100
【０２４２】
表１に示すオリゴヌクレオチドY54-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２４３】
【化８８】
2019182109.tif 000101
【０２４４】
表１に示すオリゴヌクレオチドY55-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２４５】
【化８９】
2019182109.tif 000102
【０２４６】
表１に示すオリゴヌクレオチドY57-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２４７】
【化９０】
2019182109.tif 000103
【０２４８】
表１に示すオリゴヌクレオチドChol-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。【０２４９】
【化９１】
2019182109.tif 000104
【０２５０】
参考例１
IY1の合成
6-アミノヘキサン酸(146 mg)のピリジン溶液(5567 μL)にトリメチルシリルクロリド(569 μL)を0℃で加えた。反応混合物を窒素雰囲気下、30分室温で攪拌した。クロロぎ酸 コレステロール(500  mg)を0 ℃で加え、反応混合物を窒素雰囲気下、30分室温で攪拌した。反応混合物に1規定塩酸水溶液を0 ℃で加えて中和し、酢酸エチルで抽出した。有機層を分離し、水、続いて飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、濃縮乾固した。得られた固体をジイソプロピルエーテルで洗浄し、表題化合物を200 mg得た。【０２５１】
参考例１と同様の方法により、参考例7、8、14及び15の化合物を製造した。【０２５２】
以下の表２に、参考例1、7、8、14及び15の化合物の化学構造式及びNMRデータを示す。【０２５３】
【表２】
2019182109.tif 000105
2019182109.tif 000106
【０２５４】
参考例9
IY9の合成
エストラジオールエナンタート(200 mg)とピリジン(535 μL)のTHF溶液(5 mL)にニトロフェニルカルボノクロリダート(210 mg)を0 ℃で加えた。反応混合物を室温で3時間反応させた。沈殿物をセライトろ過で除去し、ろ過物をジイソプロピルエーテルで洗浄した。ろ液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル/ヘキサン) で精製して標題化合物を80 mg得た。【０２５５】
参考例9と同様の方法により、参考例10、36、39及び40の化合物を製造した。
以下の表３に、参考例9、10、36、39及び40の化合物の化学構造式及びNMRデータを示す。【０２５６】
【表３】
2019182109.tif 000107
【０２５７】
参考例11
IY11の合成
A)IY11-1の合成
クロロぎ酸コレステロール(300 mg)と3-(2-アミノエトキシ)プロパン酸(89 mg)を用いて参考例１と同様の方法により表題化合物を得た。この化合物は精製せずに次工程で用いた。【０２５８】
B)IY11の合成
工程Aで得られたIY11-1のテトラヒドロフラン溶液 (6700 μL)にビス(ペンタフルオロフェニル) カルボナート(528 mg) を加え、反応混合物を窒素雰囲気下室温で1時間攪拌した。反応混合物を室温で水に加え、酢酸エチルで抽出した。抽出液を水と飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を127 mg得た。【０２５９】
参考例11の工程A)と同様の方法により、参考例16のIY16-1及び参考例17のIY17-1を製造した。参考例11の工程B)と同様の方法により、参考例16のIY16及び参考例17のIY17を製造した。【０２６０】
以下の表４に、IY11-1、IY11、IY16-1、IY16、IY17-1及びIY17の化学構造式及びNMRデータを示す。【０２６１】
【表４】
2019182109.tif 000108
2019182109.tif 000109
【０２６２】
参考例18
IY18の合成【０２６３】
【化９２】
2019182109.tif 000110
【０２６４】
クロロぎ酸コレステロール(49.1 mg)のTHF溶液（3 mL）にIY18-1(138 mg)の水酸化ナトリウム水溶液（0.1規定、2.4 mL）を氷冷下で加え、室温で5時間撹拌した。1規定塩酸で反応溶液を酸性とし、反応混合物をTHF-酢酸エチル(1:1)で抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、濃縮乾固し、表題化合物を151 mg得た。【０２６５】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.68 (3H, s), 0.80-1.69 (37H, m), 1.73-2.07 (6H, m), 2.18-2.71 (11H, m), 3.27-3.46 (3H, m), 3.47-3.73 (80H, m), 3.78 (2H, t, J = 6.1 Hz), 4.39-4.66 (1H, m), 5.24 (1H, brs), 5.37 (1H, d, J = 5.4 Hz), 6.98 (1H, s).【０２６６】
参考例19
IY19の合成
ジオスゲニン(445 mg)、ビス(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル) カルボナート(1650 mg)、トリエチルアミン(2.244 mL)およびアセトニトリル(10 mL)の混合物を超音波条件下3時間反応させた。反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で希釈下後、酢酸エチルとジエチルエーテルの混合溶媒で抽出した。抽出液を水と飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を55 mg得た。【０２６７】
参考例19と同様の方法により、参考例20、21、22、24、25、28、29、32、33、34、35、43、44、48、51及び52の化合物を製造した。【０２６８】
以下の表５に、参考例19、20、21、22、24、25、28、29、32、33、34、35、43、44、48、51及び52の化合物の化学構造式及びNMRデータを示す。【０２６９】
【表５】
2019182109.tif 000111
2019182109.tif 000112
2019182109.tif 000113
2019182109.tif 000114
2019182109.tif 000115
【０２７０】
参考例23
IY-23の合成
【化９３】
2019182109.tif 000116
A)IY23-2の合成
IY23-1(300 mg)のジクロロメタン溶液(10 mL)にイミダゾール(152 mg)、DMAP(91 mg)を室温で加え、15分撹拌した。tert-ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホナート(0.34 mL)を加え、室温で16時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を150 mg得た。【０２７１】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ -0.01 (6H, s), 0.67 (3H, s), 0.66 - 0.96 (15H, m), 0.91 - 1.14 (9H, m), 1.11 - 1.40 (8H, m), 1.42 (2H, dd, J = 8.0, 4.6 Hz), 1.44 - 1.53 (6H, m), 1.77 - 1.89 (3H, m), 1.91 - 2.05 (2H, m), 2.17 - 2.33 (2H, m), 3.34 (1H, dd, J = 9.7, 6.8 Hz), 3.42 (1H, dd, J = 9.6, 6.0 Hz), 3.47 - 3.57 (1H, m), 5.34 (1H, d, J = 4.8 Hz).【０２７２】
B)IY23の合成
工程Aで得られたIY23-1を用いて参考例19と同様の方法により、標題化合物を得た。
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.04 (s, 6 H) 0.68 (s, 3 H) 0.77 - 1.63 (m, 38 H) 1.67 - 2.18 (m, 6 H) 2.48 (d, J = 7.54 Hz, 2 H) 2.83 (s, 4 H) 3.28 - 3.51 (m, 2 H) 4.51 - 4.70 (m, 1 H) 5.42 (d, J = 4.14 Hz, 1 H) 【０２７３】
参考例27
IY27の合成
【化９４】
2019182109.tif 000117
A)IY27-2の合成
ラウリン酸(148 mg)のジクロロメタン溶液(15 mL)にジシクロヘキシルカルボジイミド(226 mg)、IY27-1(250 mg)、DMAP(26.7 mg)を加え、室温で16時間撹拌した。ジクロロメタン(50 mL)で反応溶液を希釈し、有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を230 mg得た。【０２７４】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ0.68 (3H, s), 0.87 (3H, t, J = 5.5 Hz), 0.95 (3H, d, J = 6.1 Hz), 1.01(3H, s), 1.05 - 1.18 (3H, m), 1.25 (16H, s), 1.36-1.65 (14H, m), 1.80 - 1.89 (4H, m), 1.91 - 2.04 (2H, m), 2.21 - 2.33 (4H, m), 2.34 - 2.45 (1H, m), 2.46 - 2.59 (1H, m), 4.55 - 4.65 (1H, m), 5.27 (2H, s), 5.36 (1H, d, J = 2.8 Hz), 7.62 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.77 (2H, d, J = 8.5 Hz).【０２７５】
B)IY27の合成
工程Aで得られたIY27-2(180 mg)のジクロロメタン溶液(10 mL)に酢酸(10 mL)、亜鉛粉末(113 mg)を加え、室温で16時間撹拌した。反応混合物をセライトでろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を100 mg得た。【０２７６】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.67 (3H, s), 0.86 (3H, d, J = 6.9 Hz), 0.93 (3H, d, J = 6.3 Hz), 1.01(3H, s), 1.06 - 1.19 (3H, m), 1.24 (14H, s), 1.36 - 1.65 (14H, m), 1.80 - 1.88 (5H, m), 1.91 - 2.02 (2H, m),2.27 (7H, dt, J = 15.1, 7.3 Hz), 4.53 - 4.67 (1H, m), 5.36 (1H, d, J = 5.8 Hz).【０２７７】
参考例37
IY37の合成
【化９５】
2019182109.tif 000118
A）IY37-2の合成
IY37-1(1.0 g)のDMF溶液(10 mL)にイミダゾール(460 mg)とDMAP(275 mg)を室温で加え、15分間撹拌した。tert-ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホナート(1.03 mL)を加え、室温で16時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を1 g得た。【０２７８】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.04 (6H, d, J = 4.6 Hz), δ 0.66 (3H, s), 0.81 - 0.93 (17H, m), 0.95 - 1.17 (12H, m), 1.22 - 1.39 (6H, m), 1.39 - 1.54 (4H, m), 1.71 - 1.91 (5H, m), 1.94 - 2.06 (4H, m), 2.31 (2H, q, J = 7.5 Hz), 3.93 (1H, d, J = 7.9 Hz), 4.54 - 4.66 (1H, m), 5.29 (1H, s).【０２７９】
B)IY37-3の合成
工程Aで得られたIY37-2(1 g)のエタノール(4 mL)、ジクロロメタン(2 mL)溶液に水酸化ナトリウム水溶液(10%、2.86 mL)を加え、室温で3時間撹拌した。溶媒を減圧下留去し、残渣に酢酸エチルを加え、水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、標題化合物を800 mg得た。【０２８０】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ -0.04 - 0.09 (6H, m), 0.66 (3H, s), 0.82 - 0.93 (18H, m), 0.94 - 1.16 (12H, m), 1.24 (1H, d, J = 7.3 Hz), 1.28 - 1.41 (4H, m), 1.52 (6H, d, J = 32.7 Hz), 1.73 - 1.86 (4H, m), 1.95 - 2.05 (1H, m), 2.24 (2H, d, J = 10.9 Hz), 3.47 - 3.58 (1H, m), 3.93 (1H, d, J = 7.6 Hz), 5.26 (1H, s).【０２８１】
C)IY37-4の合成
工程Bで得られたIY37-3(800 mg)のアセトニトリル(4 mL)、ジクロロメタン(4 mL)溶液にトリエチルアミン(3.26 mL)とビス(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル) カルボナート(2.38 g)を加え、45 ℃で16時間撹拌した。反応混合物をセライトでろ過し、5%クエン酸溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を800 mg得た。【０２８２】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.05 (6H, d, J = 4.6 Hz), 0.66 (3H, s), 0.84 - 0.92 (17H, m), 0.95 - 1.16 (12H, m), 1.21 - 1.37 (6H, m), 1.40 - 1.55 (3H, m), 1.70 - 1.82 (3H, m), 1.89 (1H, d, J = 13.8 Hz), 1.95 - 2.06 (3H, m), 2.47 (2H, d, J = 7.8 Hz), 2.82 (4H, s), 3.92 (1H, d, J = 7.5 Hz), 4.53 - 4.67 (1H, m), 5.31 (1H, d, J = 15.7 Hz).【０２８３】
D)IY37の合成
工程Cで得られたIY37-4(800 mg)のTHF(8 mL)溶液にトリエチルアミン・3フッ化水素塩 (2.64 mL)を0℃で加え、室温で16時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を110 mg得た。【０２８４】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.68 (3H, s), 0.86 (6H, d, J = 5.0 Hz), 0.91 (3H, d, J = 6.2 Hz), 0.98 - 1.17 (11H, m), 1.22 - 1.43 (8H, m), 1.41 - 1.53 (3H, m), 1.70 - 1.83 (2H, m), 1.84 - 1.96 (2H, m), 2.04 (2H, s), 2.51 (2H, t, J = 9.1 Hz), 2.83 (4H, s), 3.85 (1H, s), 4.55 - 4.69 (1H, m), 5.35 (1H, s).【０２８５】
参考例 38
IY38の合成
【化９６】
2019182109.tif 000119
5α-コレスタン-3β,5α,6β-トリオールを用いて、参考例37の工程Ｃと同様の方法により標題化合物を合成した。【０２８６】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.63 (3H, s), 0.86 (8H, dd, J = 16.0, 5.6 Hz), 0.94 - 1.38 (21H, m), 1.44 - 1.69 (6H, m), 1.71 - 1.81 (1H, m), 1.82 - 1.97 (2H, m), 2.15 (1H, t, J = 12.0 Hz), 2.80 (4H, s), 3.38 (1H, s), 4.13 (1H, s), 4.64 (1H, d, J = 4.0 Hz), 5.03 - 5.14 (1H, m)【０２８７】
参考例41
IY41の合成
【化９７】
2019182109.tif 000120
【０２８８】
A)IY41-2の合成
8規定水酸化ナトリウム水溶液 (2.92 mL)と過酸化水素水 (14.3 mL)をIY41-1 (1.8 g)のメタノール溶液(3.12 mL)-ヘキサン(6.24 mL)混合溶液に加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌した。過酸化水素水 (1.43 mL) を加えた。尿素・過酸化水素(1.32 g)を加え1時間撹拌した。反応混合物を6規定塩酸水溶液で中和し、チオ硫酸ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を分離し、1規定塩酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、続いて飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を立体異性体混合物（4α,5αエポキシ体及び4β,5βエポキシ体）として700 mg得た。【０２８９】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.64-0.73 (3H, m), 0.80-0.93 (9H, m), 0.94-2.47 (31H, m), 2.98 (1H, s, 4-H beta), 3.03 (1H, 2, 4-H alpha).【０２９０】
B)IY41-3の合成
工程Aで得られたIY41-2 (700 mg)の酢酸（10 mL）とTHF（10 mL）の混合溶液にp-トルエンスルホニル ヒドラジド(342 mg)を小分けにして加えた反応混合物を室温で4時間撹拌した。反応混合物に飽和食塩水(30 mL)を加え、有機層を分離した。水層を酢酸エチルで抽出し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を560 mg得た。 【０２９１】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.73 (3H, s), 0.82-0.95 (9H, m), 0.96-1.08 (3H, m), 1.09 (3H, s), 1.10-2.39 (25H, m), 2.44-2.62 (1H, m).【０２９２】
C)IY41-4の合成
工程Bで得られたIY41-3(560 mg)のメタノール溶液（10 mL）に水素化ホウ素ナトリウム(110 mg)を室温で加えた。反応混合物を室温で30分撹拌した後、酢酸エチルで希釈した。有機層を分離し、水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物）を立体異性体混合物（5α及び5βヒドロシキ体）として560 mg得た。 【０２９３】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.65 (9H, d, J = 3.4 Hz), 0.74-2.36 (35H, m), 3.43-3.56 (1H, m, 5-H alpha), (1H, d, J = 2.4 Hz, 5-H alpha).【０２９４】
D)IY41-5の合成
工程Cで得られたIY41-4(540 mg)のエタノール溶液（7 mL）にパラジウム/炭素（7.4 mg）を加え、水素雰囲気下終夜撹拌した。反応混合物をアミノシリカパッドでろ取し、溶媒を留去し、標題化合物を立体異性体混合物（5α及び5βヒドロキシ体）として540 mg得た。【０２９５】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.61-0.69 (3H, m), 0.80 (3H, s), 0.81-1.91 (42H, m), 1.92-2.03 (1H, m), 3.43-3.55 (1H, m, 5-H alpha), 3.63 (1H, brs, 5-H beta).【０２９６】
E)IY41の合成
工程Dで得られたIY41-5を用いて参考例9と同様の方法により、標題化合物を単一異性体として得た。本反応条件下未反応であったIY41-5のαヒドロキシ体は精製の過程において取り除かれた。【０２９７】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.66 (4H, s), 0.73-2.07 (47H, m), 4.72 (1H, dd, J = 11.2, 4.2 Hz), 7.36 (2H, d, J = 8.9 Hz), 8.28 (2H, d, J = 8.3 Hz).【０２９８】
参考例42
IY42の合成
【化９８】
2019182109.tif 000121
A)IY42-2の合成
IY42-1 (3.03 g)のピリジン溶液(30 mL)にp-トルエンスルホニルクロリド(2.40 g)を室温で加えた。反応混合物を3時間撹拌した後、p-トルエンスルホニルクロリド(2.40 g)を加え、終夜撹拌した。反応混合物に1規定塩酸水溶液を室温で加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を分離し、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣をジイソプロピルエーテルで洗浄し標題化合物を1.45g得た。粗生成物は精製せずに次の工程に用いた。【０２９９】
B)IY42-3の合成
工程Aで得られたIY42-2 (377 mg)のDMF (3 mL)にアジ化ナトリウム(238 mg)を室温で加え、70度で4時間撹拌した。反応混合物を水に室温で加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を分離し、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣をジイソプロピルエーテルで洗浄し標題化合物を310 mg得た。粗生成物は精製せずに次の工程に用いた。 【０３００】
C)IY42-5の合成       
工程Bで得られたIY42-3 (493 mg)のTHF (10 mL)と水 (1 mL)の混合溶媒にポリマー担持トリフェニルホスフィン (3 mmol/g) (1.32 g)を加え、70℃で3時間撹拌した。不溶固体をろ過し、さらに酢酸エチルで洗浄した。ろ液に飽和食塩水を加え、有機層を分離、硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣をピリジン(10  mL)に溶解させ、3,5-ビス(トリフルオロメチル)-ベンゾイル クロリド（0.241 mL）を室温で加えた。反応混合物を終夜撹拌後、1規定塩酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を分離し、水、次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を370 mg得た。 【０３０１】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.81 (3H, s), 0.94-1.74 (22H, m), 1.74-2.12 (5H, m), 2.33 (2H, d, J = 7.3 Hz), 4.20-4.38 (1H, m), 4.62 (1H, brs), 5.39 (1H, brs), 5.96 (1H, d, J = 8.9 Hz), 8.00 (1H, s), 8.16 (2H, s). 【０３０２】
D)IY42-6の合成
工程Cで得られたIY49-5 (370 mg)をメタノール(3 mL)−THF (3 mL)に溶解後、炭酸カリウム(256 mg)を加え、室温で2時間撹拌した。反応混合物の溶媒を留去して得られた残渣に1規定塩酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。水層を０℃で飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を用いて中和し、酢酸エチルで抽出した。有機層を分離し、水、次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を183 mg得た。 【０３０３】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.80 (3H, s), 0.90-2.12 (25H, m), 2.16-2.65 (2H, m), 3.53 (1H, brs), 4.25 (1H, d, J = 6.8 Hz), 5.36 (1H, brs), 6.08 (1H, d, J =8.7 Hz), 7.99 (1H, s), 8.16 (2H, s). 【０３０４】
E)IY42の合成
工程Dで得られたIY42-6を用いて参考例19と同様の方法により標題化合物を合成した。【０３０５】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.81 (3H, s), 0.90-1.24 (7H, m), 1.32 (3H, d, J = 6.4 Hz), 1.41-2.16 (14H, m), 2.49 (2H, d, J = 7.0 Hz), 2.84 (4H, s), 4.27 (1H, s),4.62 (1H, s), 5.42 (1H, d, J = 4.7 Hz), 5.92 (1H, d, J = 9.4 Hz), 8.00 (1H, s), 8.15 (2H, s).【０３０６】
参考例46
IY46の合成
【化９９】
2019182109.tif 000122
【０３０７】
参考例42の工程Bで得られたIY42-3 (830 mg)とトリフェニルホスフィン(577 mg)のTHF(10mL)と水(1mL)の混合物を70℃で1時間撹拌した。反応混合物を1規定塩酸水溶液に加え、不溶性固体をろ取した。有機層を分離し、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣にTHF（20 mL）、トリエチルアミン（0.562 mL）、及びトリホスゲン(598 mg)を0℃で加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を0℃で加えて中和し、酢酸エチルとTHFの混合溶媒で抽出した。有機層を分離し、水、次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を485 mg得た。 【０３０８】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.67 (3H, s), 0.78-2.12 (38H, m), 2.35 (2H, d, J = 8.3 Hz), 3.24 (1H, d, J = 9.0 Hz), 5.37 (1H, d, J = 5.1 Hz).【０３０９】
参考例47
IY47の合成
【化１００】
2019182109.tif 000123
【０３１０】
参考例42の工程Bで得られたIY42-3 (570 mg) 、ヘプタ-6-イン酸(0.226 mL)、硫酸銅(II)5水和物(346 mg)、エタノール(5 mL)、水(5 mL)とTHF (10 mL)の混合物にアスコルビン酸ナトリウム(1920 mg)を室温で加え、終夜撹拌した。不溶固体をろ過し、ろ液の溶媒を減圧下留去した。残渣に1規定塩酸水溶液を加え、酢酸エチル-THF(4:1)を加えた。有機層を分離し、水、次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を188 mg得た。 【０３１１】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.69 (3H, s), 0.79-2.19 (43H, m), 2.27-2.89 (6H, m), 4.34 (1H, brs), 5.45 (1H, brs), 7.32 (1H, s).【０３１２】
参考例49
IY49の合成
【化１０１】
2019182109.tif 000124
【０３１３】
参考例42の工程Bで得られたIY42-3 (200 mg)と(1R,9S)-ビシクロ[6.1.0]ノナ-4-イン-9-イルメチル (2,5-ジオキソピロリジン-1-イル) カルボナート(142 mg)とTHF(15 mL)の混合物を室温で2時間撹拌した。反応混合物を水に加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を分離し、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を134 mg得た。 【０３１４】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) - 0.70 (3H, s), 0.80-1.66 (36H, m), 1.70-2.12 (6H, m), 2.17-2.51 (4H, m), 2.68 (1H, ddt, J = 16.0, 10.0, 3.2 Hz), 2.85 (4H, s),2.89-3.27 (4H, m), 4.01 (1H, tt, J = 12.2, 3.9 Hz), 4.29-4.44 (1H, m), 4.47-4.61 (1H, m), 5.42 (1H, d, J = 1.9 Hz).【０３１５】
参考例50
IY50の合成
【化１０２】
2019182109.tif 000125
【０３１６】
A)IY50-2の合成
IY50-1(1.02 g)を出発原料として、参考例42の工程Aと同様の方法により標題化合物を825 mg得た。【０３１７】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.64 (3H, s), 0.81-2.39 (33H, m), 2.45 (3H, s), 3.50 (2H, brs), 3.67-4.06 (3H, m), 4.71 (1H, brs), 5.33 (1H, brs), 7.34 (2H, d, J = 7.5 Hz), 7.78 (2H, d, J = 7.9 Hz).【０３１８】
B)IY50-3の合成
工程Aで得られたIY50-2(411 mg)を出発原料として、参考例42の工程Bと同様の方法により標題化合物を258 mg得た。【０３１９】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ ppm 0.69 (3H, s), 0.82-2.43 (33H, m), 3.04 (1H, dd, J = 11.8, 7.4 Hz), 3.28-3.68 (3H, m), 3.81-4.03 (1H, m), 4.72 (1H, brs), 5.35(1H, brs).【０３２０】
C)IY50-5の合成
工程Bで得られたIY50-3 (258 mg)を出発原料として、参考例42の工程Cと同様の方法により標題化合物を190 mg得た。 【０３２１】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.73 (3H, s), 0.87-1.43 (22H, m), 1.63-2.14 (8H, m), 2.37 (1H, s), 3.03-4.03 (7H, m), 4.72 (1H, brs), 5.36 (1H, s), 6.13 (1H, s), 8.01 (1H, s), 8.20 (2H, s).【０３２２】
D)IY50-6の合成
工程Cで得られたIY50-5 (190 mg)、パラトルエンスルホン酸ピリジニウム(101 mg)とメタノール(5 mL)の混合物を加熱還流下1時間撹拌した。減圧条件下溶媒を留去し、残渣を水に加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を分離し、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去し、標題化合物を170 mgを得た。粗生成物は精製せずに次の工程に用いた。【０３２３】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.74 (3H, s), 0.86-2.45 (28H, m), 3.10-3.33 (1H, m), 3.41-3.69 (2H, m), 5.35 (1H, brs), 6.15 (1H, brs), 8.01 (1H, s), 8.20 (2H, s).【０３２４】
E)IY50の合成
工程Dで得られたIY53-6を用いて参考例19と同様にして標題化合物を得た。【０３２５】
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.74 (3H, s), 0.88-2.21 (25H, m), 2.49 (2H, d, J = 7.9 Hz), 2.84 (4H, s), 3.09-3.32 (1H, m), 3.59 (1H, d, J = 12.8 Hz), 4.60 (1H,
brs), 5.43 (1H, brs), 6.15 (1H, brs), 8.01 (1H, s), 8.20 (2H, s).【０３２６】
その他の実施例で用いる化合物を下表に示した。それぞれ市販品をそのまま用いてもよく、また、自体公知の方法あるいはそれに準じた方法により製造することもできる。【０３２７】
【表６】
2019182109.tif 000126
2019182109.tif 000127
【０３２８】
実施例１
A)5' 末端にY1-を結合させたcRNA(Y1-cRNA(Malat1))の合成
IY1の50 mM NMP溶液(800 μL)、HATUの75 mM NMP溶液(800 μL)、DIPEA の150 mM NMP溶液(800 μL)をエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、室温で30分反応させた。そこに、表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(2000 nmol)、NMP(2100 μL)、蒸留水 (153 μL)、DIPEA (63 μL) を加え、撹拌、沈降した後、室温で、1時間反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過（Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により脱塩処理行った。得られた溶液に1 M メグルミンアセテートを10倍量加えてよく攪拌し、5分放置することでイオン交換を行った。その後、限外ろ過（Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により脱塩処理行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を690 nmol得た。B)二本鎖核酸剤Y1-HDOの合成
転移関連肺腺癌転写産物（Malat1）ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー（ASO(Malat1)）は、5'末端の3個及び3'末端の3個のLNAヌクレオシド、並びにそれらの間の10個のDNAヌクレオシドを含む。このLNA/DNAギャップマーは、マウスのMalat1ノンコーディングRNA（GenBankアクセッション番号NR_002847、配列番号3）の1316〜1331に相補的な塩基配列を有する。 ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY1-cRNA(Malat1)（第２鎖）とを等モル量で混合し、混合液を70℃で5分加熱した。その後室温に徐冷し、上記の二本鎖核酸剤であるY1結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y1-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y1-HDO）を調製した。【０３２９】
実施例３
A)5' 末端にY3-を結合させたcRNA(Y3-cRNA(Malat1))の合成
IY3の50 mM DMSO溶液(240 μL)、HATUの75 mM NMP溶液 (240 μL)、DIPEA (240 μL) の150 mM NMP溶液(240 μL)をエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、室温で15分反応させた。そこに、表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(253 μL, 1200 nmol)、DMSO(1980 μL)、蒸留水 (47.4 μL)、DIPEA (38 μL) を加え、撹拌、沈降した後、室温で、1時間反応させた。反応用液をNMP濃度が10v/v%になるように蒸留水で希釈した後、酢酸エチルで抽出し、水層を限外ろ過（Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により精製した。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を定量的に得た。 
B) 二本鎖核酸剤Y3-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY3-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY3結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y3-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y3-HDO）を調製した。【０３３０】
実施例４
A) 5' 末端にY4-を結合させたcRNA(Y4-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（2000 nmol）及びIY4を用いて実施例1の工程Aと同様にして標題化合物を590 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y4-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY4-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY4結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y4-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y4-HDO）を調製した。【０３３１】
実施例５
A) 5' 末端にY5-を結合させたcRNA(Y5-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（1000 nmol）及びIY5を用いて実施例３の工程Aと同様にして標題化合物を776 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y5-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY5-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY5結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y5-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y5-HDO）を調製した。【０３３２】
実施例６
A) 5' 末端にY6-を結合させたcRNA(Y6-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（1000 nmol）及びIY6を用いて実施例３の工程Aと同様にして標題化合物を880 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y6-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY6-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY6結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y6-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y6-HDO）を調製した。【０３３３】
実施例７
A)5' 末端にY7-を結合させたcRNA(Y7-cRNA(Malat1))の合成
IY7の50 mM NMP溶液(1200 μL)、HATUの75 mM NMP溶液(1200 μL)、DIPEA の150 mM NMP溶液(1200 μL)をエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、室温で30分反応させた。そこに、表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(548 μL, 3000 nmol)、NMP(3150 μL)、蒸留水 (202 μL)、DIPEA (94 μL) を加え、撹拌、沈降した後、室温で、1時間反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過（Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により脱塩処理行った。得られた溶液を凍結乾燥した後、蒸留水で溶解することにより、標題化合物を780 nmol得た。 
B)二本鎖核酸剤Y7-HDOの合成
転移関連肺腺癌転写産物（Malat1）ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー（ASO(Malat1)）は、5'末端の3個及び3'末端の3個のLNAヌクレオシド、並びにそれらの間の10個のDNAヌクレオシドを含む。このLNA/DNAギャップマーは、マウスのMalat1ノンコーディングRNA（GenBankアクセッション番号NR_002847、配列番号3）の1316〜1331に相補的な塩基配列を有する。ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY1-cRNA(Malat1)（第２鎖）とを等モル量で混合し、混合液を70℃で5分加熱した。その後、混合液を室温に徐冷した。さらにBT AG 50W-X8 Resinを用いてナトリウム塩へとイオン交換した後、凍結乾燥し蒸留水を加えることで二本鎖核酸剤であるY7結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y1-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y7-HDO）を調製した。【０３３４】
実施例８
A) 5' 末端にY8-を結合させたcRNA(Y8-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（3000 nmol）及びIY8を用いて実施例７の工程Aと同様にして標題化合物を630 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y8-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY8-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例7の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY8結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y8-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y8-HDO）を調製した。【０３３５】
実施例９
A) 5' 末端にY9-を結合させたcRNA(Y9-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA (Malat1))の水溶液(260 μL, 1500 nmol)にIY9の50 mM NMP溶液(900 μL)、蒸留水(190 μL)、NMP(2100 μL)、Borate Buffer, pH 8.5+/-0.2, 5X Concentrate (375 μL)、の順にエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、室温で、2時間反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過（Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により脱塩処理行った。得られた溶液を凍結乾燥し、標題化合物を578 nmol得た。 
B) 二本鎖核酸剤Y9-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY9-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例７の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY9結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y9-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y9-HDO）を調製した。【０３３６】
実施例１０
A) 5' 末端にY10-を結合させたcRNA(Y10-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA (Malat1))の水溶液(421 μL, 2000 nmol)にIY10の50 mM NMP溶液(800 μL)、蒸留水(79 μL)、NMP(3200 μL)、Borate Buffer, pH 8.5+/-0.2, 5X Concentrate (500 μL)の順にエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、室温で1時間反応させた。反応用液をNMP濃度が10v/v%になるように蒸留水で希釈した後、限外ろ過（Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により濃縮及びNMP等の低分子試薬の除去を行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を1185 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y10-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY10-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY10結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y10-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y10-HDO）を調製した。【０３３７】
実施例１１
A) 5' 末端にY11-を結合させたcRNA(Y11-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA (Malat1))の水溶液(173.5 μL, 1000 nmol)にIY11の50 mM NMP溶液(400 μL)、蒸留水(76.5 μL)、NMP(1600 μL)、×10 PBS (250 μL)、DIPEA (31 μL)の順にエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、70℃で、1時間反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過（Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により脱塩処理行った。得られた溶液に1 M メグルミンアセテートを10倍量加えてよく攪拌し、5分放置することでイオン交換を行った。その後、限外ろ過（Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により脱塩処理行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を592 nmol得た。B) 二本鎖核酸剤Y11-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY11-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY11結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y11-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y11-HDO）を調製した。【０３３８】
実施例１２
A) 5' 末端にY12-を結合させたcRNA(Y12-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（3000 nmol）及びIY12を用いて実施例７の工程Aと同様にして標題化合物を1770 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y12-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY12-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例７の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY12結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y12-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y12-HDO）を調製した。【０３３９】
実施例１３
A) 5' 末端にY13-を結合させたcRNA(Y13-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（3000 nmol）及びIY13を用いて実施例７工程Aと同様にして標題化合物を1230 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y13-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY13-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例７の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY13結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y13-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y13-HDO）を調製した。【０３４０】
実施例１４
A) 5' 末端にY14-を結合させたcRNA(Y14-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（3000 nmol）及びIY14を用いて実施例1の工程Aと同様にして標題化合物を1650 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y14-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY14-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY14結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y14-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y14-HDO）を調製した。【０３４１】
実施例１５
A) 5' 末端にY15-を結合させたcRNA(Y15-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（210 μl nmol, 1000 nmol）及びIY15を用いて実施例３の工程Aと同様にして標題化合物を900 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y15-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY15-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY15結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y15-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y15-HDO）を調製した。【０３４２】
実施例１６
A) 5' 末端にY16-を結合させたcRNA(Y16-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（176 μL, 1000 nmol）及びIY16を用いて実施例１１の工程Aと同様にして標題化合物を532 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y16-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY16-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY16結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y16-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y16-HDO）を調製した。【０３４３】
実施例１７
A) 5' 末端にY17-を結合させたcRNA(Y17-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（176 μL, 1000 nmol）及びIY17を用いて実施例１１の工程Aと同様にして標題化合物を686 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y17-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY17-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY17結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y17-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y17-HDO）を調製した。【０３４４】
実施例１８
A) 5' 末端にY18-を結合させたcRNA(Y18-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（274 μL, 1500 nmol）及びIY18を用いて実施例３の工程Aと同様にして標題化合物を1398 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y18-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY18-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY18結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y18-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y18-HDO）を調製した。【０３４５】
実施例１９
A) 5' 末端にY19-を結合させたcRNA(Y19-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA (Malat1))の水溶液(210.5 μL, 1000 nmol)にIY19の50 mM NMP溶液(400 μL)、蒸留水(39.5 μL)、NMP(1600 μL)、×10 PBS (250 μL)、DIPEA (31 μL)の順にエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、室温で、1時間反応させた。反応用液をNMP濃度が10v/v%になるように蒸留水で希釈した後、限外ろ過（Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により濃縮及びNMP等の低分子試薬の除去を行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を927 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y19-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY19-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY19結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y19-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y19-HDO）を調製した。【０３４６】
実施例２０
A) 5' 末端にY20-を結合させたcRNA(Y20-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（260 μL, 1500 nmol）及びIY19を用いて実施例１１の工程Aと同様にして標題化合物を686 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y20-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY20-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY20結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y20-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y20-HDO）を調製した。【０３４７】
実施例２１
A) 5' 末端にY21-を結合させたcRNA(Y21-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA (Malat1))の水溶液(260 μL, 1500 nmol)にIY21の50 mM NMP溶液(300 μL)、蒸留水(115 μL)、NMP(2400 μL)、×10 PBS (375 μL)、50 mM DMAP (300 μL)の順にエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、70℃で、1時間反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過（Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により脱塩処理行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を917 nmol得た。 
B) 二本鎖核酸剤Y21-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY21-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY21結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y21-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y21-HDO）を調製した。【０３４８】
実施例２２
A) 5' 末端にY22-を結合させたcRNA(Y22-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（365 μL, 2000 nmol）及びIY22を用いて実施例２１の工程Aと同様にして標題化合物を1253 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y22-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY22-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY22結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y22-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y22-HDO）を調製した。【０３４９】
実施例２３
A) 5' 末端にY23-を結合させたcRNA(Y23-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA (Malat1))の水溶液(382 μL, 2200 nmol)にIY23の50 mM NMP溶液(440 μL)、蒸留水(168 μL)、NMP(3520 μL)、×10 PBS (550 μL)、50 mM DMAP (440 μL)の順にエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、70℃で、1時間反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過（Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により脱塩処理行った。得られた溶液を1000 μLに蒸留水で希釈し、蒸留水(200 μL)、NMP(400 μL)、メタノール（4400 μL）、50 mM フッ化水素のDMSO溶液(2000 μL)の順にエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、室温で、1時間反応させた。反応液に300 mMトリメチルエトキシシランのDMSO溶液 (2000 μL)を加えた。反応混合物をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過（Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により脱塩処理行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を1114 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y23-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY23-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例７の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY23結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y23-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y23-HDO）を調製した。【０３５０】
実施例２４
A) 5' 末端にY24-を結合させたcRNA(Y24-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（174 μL, 1000 nmol）及びIY24を用いて実施例21の工程Aと同様にして標題化合物を870 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y24-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY24-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例７の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY24結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y24-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y24-HDO）を調製した。【０３５１】
実施例２５
A) 5' 末端にY25-を結合させたcRNA(Y25-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（274 μL, 1500 nmol）及びIY25を用いて実施例１１の工程Aと同様にして標題化合物を760 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y25-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY25-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY25結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y25-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y25-HDO）を調製した。【０３５２】
実施例２６
A) 5' 末端にY26-を結合させたcRNA(Y26-cRNA(Malat1))の合成
IY26の50 mM THF溶液(400 μL)、HATUの75 mM NMP溶液(400 μL)、DIPEA の150 mM NMP溶液(400 μL)をエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、室温で30分反応させた。そこに、表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(315 μL, 2000 nmol)、NMP(1450 μL)、THF(1850 μL)、蒸留水 (184 μL)、DIPEA (63 μL) を加え、撹拌、沈降した後、室温で、1時間反応させた。さらに、IY26の50 mM THF溶液(400 μL)、HATUの75 mM NMP溶液(400 μL)、DIPEA の150 mM NMP溶液(400 μL)をファルコンチューブ中で混合し15分静置した後に、反応液に合わせ、DIPEA (125 μL) を加え室温で2時間反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過（Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により脱塩処理行った。得られた溶液に1 M メグルミンアセテートを10倍量加えてよく攪拌し、5分放置することでイオン交換を行った。その後、限外ろ過（Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により脱塩処理行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を237 nmol得た。 
B) 二本鎖核酸剤Y26-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY26-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY26結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y26-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y26-HDO）を調製した。【０３５３】
実施例２７
A) 5' 末端にY27-を結合させたcRNA(Y27-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（312 μL, 2000 nmol）及びIY27を用いて実施例１１の工程Aと同様にして標題化合物を705 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y27-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY27-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY27結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y27-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y27-HDO）を調製した。【０３５４】
実施例２８
A) 5' 末端にY28-を結合させたcRNA(Y28-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（346 μL, 2530 nmol）及びIY28を用いて実施例１１の工程Aと同様にして標題化合物を1046 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y28-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY28-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY28結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y28-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y28-HDO）を調製した。【０３５５】
実施例２９
A) 5' 末端にY29-を結合させたcRNA(Y29-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y62-cRNA(Malat1))の水溶液（369 μL, 1500 nmol）及びIY29を用いて実施例２１の工程Aと同様にして標題化合物を903nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y29-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY29-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例７の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY29結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y29-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y29-HDO）を調製した。【０３５６】
実施例３０
A) 5' 末端にY30-を結合させたcRNA(Y30-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y63-cRNA(Malat1))の水溶液（358 μL, 1500 nmol）及びクロロギ酸コレステロールを用いて実施例１１の工程Aと同様にして標題化合物を1228 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y30-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY30-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY30結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y30-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y30-HDO）を調製した。【０３５７】
実施例３１
A) 5' 末端にY31-を結合させたcRNA(Y31-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y64-cRNA(Malat1))の水溶液（355 μL, 1400 nmol）及びIY29を用いて実施例２１の工程Aと同様にして標題化合物を657 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y31-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY31-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例７の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY31結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y31-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y31-HDO）を調製した。【０３５８】
実施例３２
A) 5' 末端にY32-を結合させたcRNA(Y32-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（315 μL, 2000 nmol）及びIY32を用いて実施例１１の工程Aと同様にして標題化合物を864 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y32-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY32-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY32結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y32-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y32-HDO）を調製した。【０３５９】
実施例３３
A) 5' 末端にY33-を結合させたcRNA(Y33-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA (Malat1))の水溶液(365 μL, 2000 nmol)にIY33の50 mM NMP溶液(400 μL)、蒸留水(135 μL)、NMP(3200 μL)、×10 PBS (500 μL)、50 mM DMAP (400 μL)の順にエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、70℃で、1時間反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過（Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により脱塩処理行った。得られた溶液に1 M メグルミンアセテートを10倍量加えてよく攪拌し、5分放置することでイオン交換を行った。その後、限外ろ過（Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により脱塩処理行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を963 nmol得た。B) 二本鎖核酸剤Y33-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY33-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY33結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y33-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y33-HDO）を調製した。【０３６０】
実施例３４
A) 5' 末端にY34-を結合させたcRNA(Y34-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（365 μL, 2000 nmol）及びIY34を用いて実施例３３の工程Aと同様にして標題化合物を1083 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y34-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY34-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY34結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y34-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y34-HDO）を調製した。【０３６１】
実施例３５
A) 5' 末端にY35-を結合させたcRNA(Y35-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（315 μL, 2000 nmol）を用いて実施例３３の工程Aと同様にして標題化合物を830 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y35-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY35-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY35結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y35-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y35-HDO）を調製した。【０３６２】
実施例３６
A) 5' 末端にY36-を結合させたcRNA(Y36-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（329 μL, 2000 nmol）及びIY36を用いて実施例３３の工程Aと同様にして標題化合物を830 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y36-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY36-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY36結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y36-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y36-HDO）を調製した。【０３６３】
実施例３７
A) 5' 末端にY37-を結合させたcRNA(Y37-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（400 μL, 2000 nmol）及びIY37を用いて実施例３３の工程Aと同様にして標題化合物を1189 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y37-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY37-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY37結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y37-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y37-HDO）を調製した。【０３６４】
実施例３８
A) 5' 末端にY38-を結合させたcRNA(Y38-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（329 μL, 2000 nmol）及びIY38を用いて実施例３３の工程Aと同様にして標題化合物を1032 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y38-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY38-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY38結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y38-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y38-HDO）を調製した。【０３６５】
実施例３９
A) 5' 末端にY39-を結合させたcRNA(Y39-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA (Malat1))の水溶液(329 μL, 2000 nmol)にIY39の50 mM NMP溶液(800 μL)、蒸留水(270 μL)、NMP(2800 μL)、Borate Buffer, pH 8.5+/-0.2, 5X Concentrate (500 μL)、の順にエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、室温で、1時間反応させた。さらに、IY39の50 mM NMP溶液(400 μL)を追加して室温で1時間反応させた。さらに、IY39の50 mM NMP溶液(400 μL)、Borate Buffer, pH 8.5+/-0.2, 5X Concentrate (100 μL)を追加して室温で終夜反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過（Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により脱塩処理行った。得られた溶液に1 M メグルミンアセテートを10倍量加えてよく攪拌し、5分放置することでイオン交換を行った。その後、限外ろ過（Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により脱塩処理行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を1554 nmol得た。 
B) 二本鎖核酸剤Y39-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY39-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY39結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y39-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y39-HDO）を調製した。【０３６６】
実施例４０
A) 5' 末端にY40-を結合させたcRNA(Y40-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（364 μL, 2000 nmol）及びIY40を用いて実施例３９の工程Aと同様にして標題化合物を607 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y40-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY40-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY40結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y40-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y40-HDO）を調製した。【０３６７】
実施例４１
A) 5' 末端にY41-を結合させたcRNA(Y41-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（329 μL, 2000 nmol）及びIY41を用いて実施例３９の工程Aと同様にして標題化合物を1400 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y41-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY41-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY41結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y41-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y41-HDO）を調製した。【０３６８】
実施例４２
A) 5' 末端にY42-を結合させたcRNA(Y42-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（365 μL, 2000 nmol）及びIY42を用いて実施例３９の工程Aと同様にして標題化合物を1061 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y42-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY42-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY42結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y42-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y42-HDO）を調製した。【０３６９】
実施例４３
A) 5' 末端にY43-を結合させたcRNA(Y43-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（329 μL, 2000 nmol）及びIY43を用いて実施例３９の工程Aと同様にして標題化合物を820 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y43-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY43-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY43結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y43-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y43-HDO）を調製した。【０３７０】
実施例４４
A) 5' 末端にY44-を結合させたcRNA(Y44-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（329 μL, 2000 nmol）及びIY44を用いて実施例３９の工程Aと同様にして標題化合物を969 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y44-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY44-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY44結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y44-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y44-HDO）を調製した。【０３７１】
実施例４５
A) 5' 末端にY45-を結合させたcRNA(Y45-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（164 μL, 1000 nmol）及びIY45を用いて実施例１の工程Aと同様にして標題化合物を653 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y45-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY45-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY45結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y45-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y45-HDO）を調製した。【０３７２】
実施例４６
A) 5' 末端にY46-を結合させたcRNA(Y46-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA (Malat1))の水溶液(312 μL, 2000 nmol)にIY46の50 mM NMP溶液(400 μL)、蒸留水(188 μL)、NMP(3200 μL)、×10 PBS (500 μL)、50 mM DMAP (400 μL)の順にエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、70 ℃で、1時間反応させた。さらに、IY46の50 mM NMP溶液(400 μL)及び50 mM DMAP (400 μL)を加え、70℃で1時間、室温で終夜反応させた。さらに、IY46の50 mM NMP溶液(400 μL)及び150 mM DIPEA (400 μL)を加えて70 ℃で1時間反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過（Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により脱塩処理行った。得られた溶液に1 M メグルミンアセテートを10倍量加えてよく攪拌し、5分放置することでイオン交換を行った。その後、限外ろ過（Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により脱塩処理行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を980 nmol得た。  
B) 二本鎖核酸剤Y46-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY46-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY46結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y46-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y46-HDO）を調製した。【０３７３】
実施例４７
A) 5' 末端にY47-を結合させたcRNA(Y47-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（315 μL, 2000 nmol）及びIY47を用いて実施例１の工程Aと同様にして標題化合物を569nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y47-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY47-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY47結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y47-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y47-HDO）を調製した。【０３７４】
実施例４８
A) 5' 末端にY48-を結合させたcRNA(Y48-cRNA(Malat1))の合成
IY48の50 mM NMP溶液(800 μL)、HATUの75 mM NMP溶液(800 μL)、DIPEA の150 mM NMP溶液(800 μL)をエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、室温で30分反応させた。そこに、表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(2000 nmol)、NMP(2100 μL)、蒸留水 (153 μL)、DIPEA (63 μL) を加え、撹拌、沈降した後、室温で、1時間反応させた。反応用液をNMP濃度が10v/v%になるように蒸留水で希釈した後、限外ろ過（Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により濃縮及びNMP等の低分子試薬の除去を行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を1085 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y48-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY48-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY48結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y48-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y48-HDO）を調製した。【０３７５】
実施例４９
A) 5' 末端にY49-を結合させたcRNA(Y49-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（329 μL, 2000 nmol）及びIY49を用いて実施例３９の工程Aと同様にして標題化合物を1176 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y49-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY49-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY49結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y49-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y49-HDO）を調製した。【０３７６】
実施例５０
A) 5' 末端にY50-を結合させたcRNA(Y50-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（315 μL, 2000 nmol）及びIY50を用いて実施例１の工程Aと同様にして標題化合物を674 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y50-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY50-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY50結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y50-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y50-HDO）を調製した。【０３７７】
実施例５１
A) 5' 末端にY51-を結合させたcRNA(Y51-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（315 μL, 2000 nmol）及びIY51を用いて実施例３９の工程Aと同様にして標題化合物を827 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y51-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY51-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY51結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y51-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y51-HDO）を調製した。【０３７８】
実施例５２
A) 5' 末端にY52-を結合させたcRNA(Y52-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（164 μL, 1000 nmol）及びIY52を用いて実施例１の工程Aと同様にして標題化合物を653 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y52-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY52-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY52結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y52-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y52-HDO）を調製した。【０３７９】
実施例５３
A) 5' 末端にY53-を結合させたcRNA(Y53-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（313 μL, 2000 nmol）及びIY53を用いて実施例１の工程Aと同様にして標題化合物を865 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y53-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY53-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY53結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y53-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y53-HDO）を調製した。【０３８０】
実施例５４
A) 5' 末端にY54-を結合させたcRNA(Y54-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（313 μL, 2000 nmol）及びIY54を用いて実施例１の工程Aと同様にして標題化合物を1165 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y54-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY54-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY54結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y54-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y54-HDO）を調製した。【０３８１】
実施例５５
A) 5' 末端にY55-を結合させたcRNA(Y55-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（313 μL, 2000 nmol）及びIY55を用いて実施例１の工程Aと同様にして標題化合物を1401 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y55-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY55-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY55結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y55-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y55-HDO）を調製した。【０３８２】
実施例５７
A) 5' 末端にY57-を結合させたcRNA(Y57-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液（394 μL, 2500 nmol）及びIY57を用いて実施例１の工程Aと同様にして標題化合物を641 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y57-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と前工程Aで得られたY57-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY57結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y57-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y57-HDO）を調製した。【０３８３】
実施例５８
二本鎖核酸剤Y59-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と表1に示すY59-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY59結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y59-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y59-HDO）を調製した。【０３８４】
実施例５９
二本鎖核酸剤Y60-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と表1に示すY60-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY60結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y60-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y60-HDO）を調製した。【０３８５】
実施例６０
二本鎖核酸剤Chol-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１鎖）と表1に示すChol-cRNA(Malat1)（第２鎖）を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるChol結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Chol-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Chol-HDO）を調製した。【０３８６】
実施例６１
（Ａ）in vivo実験
実験動物には、7週齢の雄性C57BL/6Jマウス（日本チャールズリバー）を使用し、一群あたり2-4匹を実験に供した。実験群では、核酸を含む溶液をマウスの尾静脈から5mL/kgの投与量で静脈内に単回投与した。また、比較対象群では、核酸溶液の調製に用いた溶媒（5%ブドウ糖液）を実験群と同様の手順でマウスに静脈内投与した。【０３８７】
（Ｂ）発現解析
核酸溶液投与して72時間後に、ペントバルビタールを50mg/kgで前記マウスに腹腔内投与によって麻酔して、採血及び屠殺し、脳(大脳皮質)を摘出した。脳組織からの全RNA抽出は、RNA抽出用試薬ISOGEN（ニッポン・ジーン社）を用いた。ISOGEN溶液中で摘出した脳組織を破砕した後、クロロホルムでRNA画分として分離した。その後に、核酸分離システムQuickGene RNA tissue kit SII(倉敷紡績社)で実施した。全RNAからのcDNA合成は、ReverTra Ace qPCR RT Kit（東洋紡社）を用い、THUNDERBIRD qPCR Mix（東洋紡社）による定量PCRを実施した。定量PCRには蛍光プローブ法を採用し、蛍光プローブにはマウスMalat1（Integrated DNA Technologies社）及びマウスGapdh（Thermo Fisher Scientific社）を用いた。定量PCRの遺伝子断片増幅反応条件は、上記THUNDERBIRD qPCR Mix（東洋紡社）のプロトコルに従った。マウスMalat1及びGapdh（内部標準遺伝子）の発現量を相対検量線によって算出し、相対発現レベルをMalat1/Gapdhとして計算した。一群あたり2-4匹のマウスの結果から、相対発現レベルの平均値を算出した。比較対象群の相対発現レベルの平均値を100%とした場合の実験群の相対発現レベルの平均値の割合を、相対的Malat1 ncRNA発現レベルとして算出した。【０３８８】
（Ｃ）結果
実施例61の結果を表７に示す。表中、投与量はASO(Malat1)の量を示す。【０３８９】
二本鎖番号1、3〜55、57、59及び60は、いずれも大脳皮質におけるMalat1ノンコーディングRNAの発現を抑制した。この結果から、本発明の核酸複合体は、脳に送達され、そこでアンチセンス効果をもたらし得ることが立証された。【０３９０】
【表７】
2019182109.tif 000128
2019182109.tif 000129
【０３９１】
実施例６２
（Ａ）in vivo実験
実験動物には、10週齢の雄性C57BL/6Jマウス（日本チャールズリバー）を使用し、一群あたり3匹を実験に供した。実験群では、核酸を含む溶液をマウスの尾静脈から5mL/kgの投与量で静脈内に単回投与した。また、比較対象群では、核酸溶液の調製に用いた溶媒（生理食塩水）を実験群と同様の手順でマウスに静脈内投与した。【０３９２】
（Ｂ）ミクログリア単離
核酸溶液を投与して72時間後に、イソフルラン麻酔下でマウスを開腹し横隔膜を切開して心臓を露出させ、左心室より生理食塩水を注射針にて注入し、右心房を切開して放血させた後、脳を摘出した。脳をNeural Tissue Dissociation Kits (Miltenyi Biotec社)を用いて、プロトコルに従い酵素処理を行い、Debris Removal Solution (Miltenyi Biotec社)を用いてDebris除去を行い、脳細胞液を調製した。ミクログリアの単離にはCD11b (Microglia) Microbeads (Miltenyi Biotec社)を用いて、プロトコルに従い、脳細胞液からミクログリアを単離した。【０３９３】
（Ｃ）発現解析
単離したミクログリアからの全RNA抽出は、RNeasy Micro Kit(QIAGEN)を用いた。全RNAからのcDNA合成は、High Capacity cDNA RT Kit（Thermo Fisher Scientific社）を用い、TaqMan Fast Advanced Master Mix（Thermo Fisher Scientific社）による定量PCRを実施した。定量PCRには蛍光プローブ法を採用し、蛍光プローブにはマウスMalat1（Thermo Fisher Scientific社）及びマウスGapdh（Thermo Fisher Scientific社）を用いた。定量PCRの遺伝子断片増幅反応条件は、上記TaqMan Fast Advanced Master Mix（Thermo Fisher Scientific社）のプロトコルに従った。マウスMalat1及びGapdh（内部標準遺伝子）の発現量を比較Ct法にて算出し、相対発現レベルをMalat1/Gapdhとして計算した。一群あたり3匹のマウスの結果から、相対発現レベルの平均値を算出した。比較対象群の相対発現レベルの平均値を100%とした場合の実験群の相対発現レベルの平均値の割合を、相対的Malat1 ncRNA発現レベルとして算出した。【０３９４】
（Ｄ）結果
実施例62の結果を表8に示す。表中、投与量はASO(Malat1)の量を示す。
二本鎖番号58は、ミクログリアにおけるMalat1ノンコーディングRNAの発現を抑制した。この結果から、本発明の核酸複合体は、脳に送達され、ミクログリアにおいてもアンチセンス効果をもたらし得ることが立証された。【０３９５】
【表８】
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本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2019182109.tif 000148
【図２】
2019182109.tif 000149
【図３】
2019182109.tif 000150
【図４】
2019182109.tif 000151
【配列表】
2019182109000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月28日(2019.10.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
第１核酸鎖と第２核酸鎖とを含む核酸複合体であって、
該第１核酸鎖は、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的転写産物に対してアンチセンス効果を有し、
該第２核酸鎖は、該第１核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、コレステロールの類縁体と結合しており、
前記コレステロールの類縁体が、下式（ＩＩａ）：
【化８】
2019182109.tif 000152
（式中、
環Ａは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキセンを表し、Ｒ１は、置換された若しくは置換されていないＣ８〜１０のアルケニル基を表すか、あるいは、
環Ａは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキサジエンを表し、Ｒ１は、置換された若しくは置換されていないＣ８〜１０のアルキル基、又は置換された若しくは置換されていないＣ８〜１０のアルケニル基を表し、
Ｌ１は、−Ｏ−、−ＮＨ−、
【化９】
2019182109.tif 000153
【化１０】
2019182109.tif 000154
で表され、
該第１核酸鎖は、該第２核酸鎖にアニールしている、核酸複合体。
【請求項５】
前記コレステロールの類縁体が、下式（ＩＩａ−１）、（ＩＩａ−２）、及び（ＩＩａ−４）：
【化１１】
2019182109.tif 000155
（式中、
Ｌ１は、−Ｏ−、−ＮＨ−、
【化１２】
2019182109.tif 000156
【化１３】
2019182109.tif 000157
から成る群より選択される式で表される、請求項４に記載の核酸複合体。
【請求項６】
第２核酸鎖が、下式（ＶＩＩＩ）：
【化１４】
2019182109.tif 000158
（式中、
Ｌ２は、置換された若しくは置換されていないＣ１〜１２のアルキレン基、置換された若しくは置換されていないＣ３〜８シクロアルキレン基、−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−、又はＣＨ（ＣＨ２−ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−を表し、
Ｌ３は、−ＮＨ−又は結合を表し、
Ｌ４は、置換された若しくは置換されていないＣ１〜１２のアルキレン基、置換された若しくは置換されていないＣ３〜８のシクロアルキレン基、−（ＣＨ２）２−［Ｏ−（ＣＨ２）２］ｍ−、又は結合を表し、ここで、ｍは１〜２５の整数を表し、Ｌ５は、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−、又は結合を表す）
で表されるリンカーを介して、
コレステロールの類縁体
と結合している、請求項４又は５に記載の核酸複合体。
【請求項７】
前記第１核酸鎖が、少なくとも４個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の核酸複合体。
【請求項８】
前記第１核酸鎖が、ギャップマーである、請求項４〜７のいずれか一項に記載の核酸複合体。
【請求項９】
前記第２核酸鎖が、前記第１核酸鎖中の少なくとも４個の連続するデオキシリボヌクレオシドに相補的な、少なくとも４個の連続するリボヌクレオシドを含む、請求項７又は８に記載の核酸複合体。
【請求項１０】
前記第１核酸鎖が、ミックスマーである、請求項４〜６のいずれか一項に記載の核酸複合体。
【請求項１１】
前記第１核酸鎖が、１３〜２０塩基長である、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の核酸複合体。
【請求項１２】
前記第２核酸鎖が天然リボヌクレオシドを含まない、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の核酸複合体。
【請求項１３】
前記第２核酸鎖の核酸部分が修飾若しくは非修飾のヌクレオシド間結合により連結されたデオキシリボヌクレオシド及び／又は糖修飾ヌクレオシドから成る、請求項４〜１２のいずれか一項に記載の核酸複合体。
【請求項１４】
請求項４〜１３のいずれか一項に記載の核酸複合体を含む、被験体の中枢神経系において標的転写産物の発現又は編集を調節するための組成物。
【請求項１５】
被験体の中枢神経系疾患治療用である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記中枢神経系疾患が、免疫性中枢神経系疾患である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項４〜１３のいずれか一項に記載の核酸複合体を含む、被験体の中枢神経系に薬剤を送達するための組成物。
【請求項１８】
前記中枢神経系が、大脳皮質、大脳基底核、大脳白質、間脳、脳幹、及び小脳からなる群から選択される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記中枢神経系が、前頭葉、側頭葉、海馬、海馬傍回、頭頂葉、後頭葉、線条体、淡蒼球、前障、視床、視床下核、中脳、黒質、橋、延髄、小脳皮質、及び小脳核からなる群から選択される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
静脈内投与用又は皮下投与用である、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
１回の投与量中に５ｍｇ／ｋｇ以上の前記核酸複合体を含む、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記核酸複合体が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記免疫性中枢神経疾患が、ミクログリア関連疾患である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ミクログリア関連疾患が、アルツハイマー病、多発性硬化症、ＡＬＳ、または神経障害性痛である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
ミクログリアにおける標的転写産物の発現又は編集を調節するための、請求項１４〜２４のいずれかに記載の組成物。
【国際調査報告】
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