(57)【要約】  本発明の課題は、標的領域の精製を、簡便、短時間且つ精度よく行うことができる方法の提供することにある。  本発明は、「二本鎖ＤＮＡ中の標的領域の精製方法及び検出方法、並びに癌の判定方法」に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程１〜３を含む、二本鎖ＤＮＡ中の標的領域の精製方法：
（１）（ａ）末端に３’突出を生じさせる制限酵素Ａを１種以上及び（ｂ）末端に５’突出を生じさせる制限酵素Ｂを１種以上用いて、標的領域を有する二本鎖ＤＮＡから、（ｉ）標的領域を有しその両端が３’突出である、３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片並びに、（ｉｉ）標的領域を有さずその両端が５’突出である、５’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片又は／及び（ｉｉｉ）標的領域を有さずその両端がそれぞれ５’突出及び３’突出である、５’／３’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片を生じさせる工程１、ここで、当該制限酵素Ａは当該標的領域中の塩基配列を切断せず、当該制限酵素Ｂは当該３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片中の塩基配列を切断しないものである、
（２）前記工程１で生じた、（ｉ）３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片並びに、（ｉｉ）５’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片又は／及び（ｉｉｉ）５’／３’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片を、エキソヌクレアーゼＩＩＩで処理することにより、（ｉｉ）５’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片又は／及び（ｉｉｉ）５’／３’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片から、それぞれ（ｉｖ）標的領域を有さない一本鎖ＤＮＡ断片を生じさせる工程２、
（３）前記工程２で生じた、（ｉｖ）標的領域を有さない一本鎖ＤＮＡ断片及び（ｉ）３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片を、一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理することにより、（ｉ）３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片から、（ｖ）標的領域を有しその両端が平滑である、平滑標的二本鎖ＤＮＡ断片を生じさせる工程３。
【請求項２】
前記工程１において、制限酵素Ａ及び制限酵素Ｂを同時に用いる、請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
下記工程１〜５を含む、二本鎖ＤＮＡ中の標的領域の検出方法：
（１）（ａ）末端に３’突出を生じさせる制限酵素Ａを１種以上及び（ｂ）末端に５’突出を生じさせる制限酵素Ｂを１種以上用いて、標的領域を有する二本鎖ＤＮＡから、（ｉ）標的領域を有しその両端が３’突出である、３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片並びに、（ｉｉ）標的領域を有さずその両端が５’突出である、５’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片］又は／及び（ｉｉｉ）標的領域を有さずその両端がそれぞれ５’突出及び３’突出である、５’／３’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片を生じさせる工程１、ここで、当該制限酵素Ａは当該標的領域中の塩基配列を切断せず、当該制限酵素Ｂは当該３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片中の塩基配列を切断しないものである、
（２）前記工程１で生じた、（ｉ）３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片並びに、（ｉｉ）５’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片又は／及び（ｉｉｉ）５’／３’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片を、エキソヌクレアーゼＩＩＩで処理することにより、（ｉｉ）５’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片又は／及び（ｉｉｉ）５’／３’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片から、それぞれ（ｉｖ）標的領域を有さない一本鎖ＤＮＡ断片を生じさせる工程２、
（３）前記工程２で生じた、（ｉｖ）標的領域を有さない一本鎖ＤＮＡ断片及び（ｉ）３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片を、一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理することにより、（ｉ）３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片から、（ｖ）標的領域を有しその両端が平滑である、平滑標的二本鎖ＤＮＡ断片を生じさせる工程３、
（４）前記工程３で生じた、（ｖ）平滑標的二本鎖ＤＮＡ断片中の標的領域を増幅処理に付す工程４、
（５）前記工程４で生じた、増幅産物の有無を確認する工程５。
【請求項４】
前記工程１において、制限酵素Ａ及び制限酵素Ｂを同時に用いる、請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
下記工程１〜７を含む、癌の判定方法：
（１）（ａ）末端に３’突出を生じさせる制限酵素Ａを１種以上及び（ｂ）末端に５’突出を生じさせる制限酵素Ｂを１種以上用いて、標的領域を有する二本鎖ＤＮＡから、（ｉ）標的領域を有しその両端が３’突出である、３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片並びに、（ｉｉ）標的領域を有さずその両端が５’突出である、５’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片又は／及び（ｉｉｉ）標的領域を有さずその両端がそれぞれ５’突出及び３’突出である、５’／３’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片を生じさせる工程１、ここで、当該制限酵素Ａは当該標的領域中の塩基配列を切断せず、当該制限酵素Ｂは当該３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片中の塩基配列を切断しないものである、
（２）前記工程１で生じた、（ｉ）３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片並びに、（ｉｉ）５’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片又は／及び（ｉｉｉ）５’／３’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片を、エキソヌクレアーゼＩＩＩで処理することにより、（ｉｉ）５’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片又は／及び（ｉｉｉ）５’／３’突出非標的二本鎖ＤＮＡ断片から、それぞれ（ｉｖ）標的領域を有さない一本鎖ＤＮＡ断片を生じさせる工程２、
（３）前記工程２で生じた、（ｉｖ）標的領域を有さない一本鎖ＤＮＡ断片及び（ｉ）３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片を、一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理することにより、（ｉ）３’突出標的二本鎖ＤＮＡ断片から、（ｖ）標的領域を有しその両端が平滑である、平滑標的二本鎖ＤＮＡ断片を生じさせる工程３、
（４）前記工程３で生じた、（ｖ）平滑標的二本鎖ＤＮＡ断片を、メチル化感受性制限酵素で処理する工程４、
（５）前記工程４で処理された、（ｖ）平滑標的二本鎖ＤＮＡ断片中の標的領域を増幅処理に付す工程５、
（６）前記工程５で生じた、増幅産物の有無を確認する工程６、
（７）前記工程６の確認結果に基づいて、癌を判定する工程７。
【請求項６】
前記工程１において、制限酵素Ａ及び制限酵素Ｂを同時に用いる、請求項５に記載の判定方法。
【請求項７】
前記標的領域が配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列を含む塩基配列である、請求項５に記載の判定方法。
【請求項８】
前記工程１の制限酵素ＡがＰｓｔＩであって、制限酵素ＢがＭｂｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ又はＨｉｎｄＩＩＩである、請求項７に記載の判定方法。
【請求項９】
前記工程３の一本鎖特異的ヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼである、請求項７に記載の判定方法。
【請求項１０】
前記工程４のメチル化感受性制限酵素が、ＨａｐＩＩ、ＨｐａＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＢｓｔｕＩ、ＡｃｉＩ又はＦａｕＩである、請求項７に記載の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的領域の精製方法、検出方法及び癌の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液等の体液、細胞、組織等の試料に由来するDNA中の標的領域の精製は、標的領域を検出する上で重要な処理である。
これは、標的領域の精製が十分に行われないと、PCR等の核酸増幅反応により標的領域を増幅する際、プライマーが標的領域以外の領域（非標的領域）にアニーリングし、非標的領域が増幅されてしまうためである。その結果、標的領域の検出が困難となる。【０００３】
また、標的領域の精製は、試料中の希少細胞[例えば、血液中に存在する血中循環腫瘍細胞（CTC：Circulating Tumor Cell）等]に由来するDNA中の標的領域を検出する場合、特に重要な処理である。
これは、試料中に存在する希少細胞に由来するDNA中の標的領域を検出する場合、試料から多量のDNA（例えば、2μg〜100μg）を抽出する必要があり、この多量のDNAの存在により、プライマーが非標的領域に多数アニーリングし、非標的領域が多数増幅されてしまうためである。その結果、標的領域の検出が極めて困難となる。【０００４】
標的領域の精製方法としては、例えば、標的領域の一部又は全部に相補的な塩基配列を有するプローブ等を用いる方法が挙げられる（特許文献1）。
しかしながら、特許文献1の方法は適切なプローブを設計する必要があり、また、非標的領域を除去するために種々の工程を複数回繰り返す必要がある。そのため、特許文献1の方法は、煩雑且つ精度が低いものである。
従って、標的領域の精製を、簡便且つ高精度に行うことができる方法の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2002-223761
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、標的領域の精製を、簡便、短時間且つ精度よく行うことができる方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決する目的でなされたものであり、以下の構成よりなる。
［1］下記工程1〜3を含む、二本鎖DNA中の標的領域の精製方法：
（1）（a）末端に3’突出を生じさせる制限酵素Aを1種以上及び（b）末端に5’突出を生じさせる制限酵素Bを1種以上用いて、標的領域を有する二本鎖DNAから、（i）標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］並びに、（ii）標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］又は／及び（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程1、ここで、当該制限酵素Aは当該標的領域中の塩基配列を切断せず、当該制限酵素Bは当該3’突出標的二本鎖DNA断片中の塩基配列を切断しないものである、
（2）前記工程1で生じた、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片並びに、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片を、エキソヌクレアーゼIIIで処理することにより、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片から、それぞれ（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片を生じさせる工程2、
（3）前記工程2で生じた、（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片及び（i）3’突出標的二本鎖DNA断片を、一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理することにより、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片から、（v）標的領域を有しその両端が平滑である二本鎖DNA断片［平滑標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程3。
［2］前記工程1において、制限酵素A及び制限酵素Bを同時に用いる、［1］に記載の精製方法。
［3］下記工程1〜5を含む、二本鎖DNA中の標的領域の検出方法：
（1）（a）末端に3’突出を生じさせる制限酵素Aを1種以上及び（b）末端に5’突出を生じさせる制限酵素Bを1種以上用いて、標的領域を有する二本鎖DNAから、（i）標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］並びに、（ii）標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］又は／及び（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程1、ここで、当該制限酵素Aは当該標的領域中の塩基配列を切断せず、当該制限酵素Bは当該3’突出標的二本鎖DNA断片中の塩基配列を切断しないものである、
（2）前記工程1で生じた、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片並びに、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片を、エキソヌクレアーゼIIIで処理することにより、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片から、それぞれ（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片を生じさせる工程2、
（3）前記工程2で生じた、（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片及び（i）3’突出標的二本鎖DNA断片を、一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理することにより、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片から、（v）標的領域を有しその両端が平滑である二本鎖DNA断片［平滑標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程3、
（4）前記工程３で生じた、（v）平滑標的二本鎖DNA断片中の標的領域を増幅処理に付す工程４、
（5）前記工程４で生じた、増幅産物の有無を確認する工程５。
［4］前記工程1において、制限酵素A及び制限酵素Bを同時に用いる、［3］に記載の検出方法。
［5］下記工程1〜7を含む、癌の判定方法：
（1）（a）末端に3’突出を生じさせる制限酵素Aを1種以上及び（b）末端に5’突出を生じさせる制限酵素Bを1種以上用いて、標的領域を有する二本鎖DNAから、（i）標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］並びに、（ii）標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］又は／及び（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程1、ここで、当該制限酵素Aは当該標的領域中の塩基配列を切断せず、当該制限酵素Bは当該3’突出標的二本鎖DNA断片中の塩基配列を切断しないものである、
（2）前記工程1で生じた、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片並びに、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片を、エキソヌクレアーゼIIIで処理することにより、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片から、それぞれ（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片を生じさせる工程2、
（3）前記工程2で生じた、（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片及び（i）3’突出標的二本鎖DNA断片を、一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理することにより、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片から、（v）標的領域を有しその両端が平滑である二本鎖DNA断片［平滑標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程3、
（4）前記工程3で生じた、（v）平滑標的二本鎖DNA断片を、メチル化感受性制限酵素で処理する工程4、
（5）前記工程4で処理された、（v）平滑標的二本鎖DNA断片中の標的領域を増幅処理に付す工程5、
（6）前記工程5で生じた、増幅産物の有無を確認する工程6、
（7）前記工程6の確認結果に基づいて、癌を判定する工程7。
［6］前記工程1において、制限酵素A及び制限酵素Bを同時に用いる、［5］に記載の判定方法。
［7］前記標的領域が配列番号1又は配列番号2で表される塩基配列を含む塩基配列である、［5］又は［6］に記載の判定方法。
［8］前記工程1の制限酵素AがPstIであって、制限酵素BがMboI、BamHI、BglII又はHindIIIである、［5］〜［7］の何れかに記載の判定方法。
［9］前記工程3の一本鎖特異的ヌクレアーゼが、S１ヌクレアーゼである、［5］〜［8］の何れかに記載の判定方法。
［10］前記工程４のメチル化感受性制限酵素が、HapII、HpaII、SacII、BstuI、AciI又はFauIである、［5］〜［9］の何れかに記載の判定方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の二本鎖DNA中の標的領域の精製方法及び検出方法によれば、標的領域の精製及び検出を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。
また、本発明の二本鎖DNA中の標的領域の精製方法及び検出方法を利用した、本発明の癌の判定方法によれば、癌の判定を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ヒト由来のFOXB2遺伝子プロモーター領域内の配列番号1で表される塩基配列からなる領域（267塩基対）について、実験例1におけるメチル化状態の確認領域を示した図である。
【図２】ヒト由来のFOXB2遺伝子プロモーター領域内の配列番号2で表される塩基配列からなる領域(149塩基対)について、実験例1におけるメチル化状態の確認領域を示した図である。
【図３】実験例1におけるヒト人工多能性幹細胞、ヒト正常全血及び大腸癌細胞の塩基配列解読結果について、メチル化状態の確認領域であるCpG配列を含む配列（CCGG及びGCGG）のシトシンがメチル化シトシン又は非メチル化シトシンの何れであるかを示した図である。
【図４】実施例1において、ヒト人工多能性幹細胞及び大腸癌細胞を用いてFOXB2遺伝子のPCR増幅産物を電気泳動した結果を示した図である。
【図５】実施例2において、ヒト正常全血を用いてFOXB2遺伝子のPCR増幅産物を電気泳動した結果を示した図である。
【図６】実施例3において、膵臓癌患者由来の全血及びヒト正常全血を用いてFOXB2遺伝子及びGAPDH遺伝子の特定領域をデジタルPCR法により増幅・検出した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜本発明の二本鎖DNA中の標的領域の精製方法＞
本発明の二本鎖DNA中の標的領域の精製方法（以下、本発明の精製方法と略記する場合がある。）は、
（1）（a）末端に3’突出を生じさせる制限酵素Aを1種以上及び（b）末端に5’突出を生じさせる制限酵素Bを1種以上用いて、標的領域を有する二本鎖DNAから、（i）標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］並びに、（ii）標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］又は／及び（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程1、ここで、当該制限酵素Aは当該標的領域中の塩基配列を切断せず、当該制限酵素Bは当該3’突出標的二本鎖DNA断片中の塩基配列を切断しないものである、
（2）前記工程1で生じた、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片並びに、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片を、エキソヌクレアーゼIIIで処理することにより、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片から、それぞれ（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片を生じさせる工程2、
及び
（3）前記工程2で生じた、（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片及び（i）3’突出標的二本鎖DNA断片を、一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理することにより、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片から、（v）標的領域を有しその両端が平滑である二本鎖DNA断片［平滑標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程3を含むことを特徴とするものである。
【００１１】
［二本鎖DNA］
本発明に係る二本鎖DNAは、後述の本発明に係る工程1における制限酵素A及び制限酵素Bの作用により、(i)標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］並びに、(ii)標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］又は／及び（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’ ／3’突出非標的二本鎖DNA断片］を生じ得るものであればよく、（1）その両端がそれぞれ突出（3’突出又は／及び5’突出）、（2）その両端がそれぞれ平滑、（3）一方の端が突出（3’突出又は5’突出）且つもう一方の端が平滑、又は（4）環状、の何れであってもよい。
即ち、本発明に係る二本鎖DNAは、後述の標的領域、2ヶ所以上の制限酵素Aの認識配列及び制限酵素Bの認識配列を有するものである。また、本発明に係る二本鎖DNAにおける、標的領域、制限酵素Aの認識配列及び制限酵素Bの認識配列の位置関係は、下記模式図に示す通り、当該標的領域を中心とした場合、当該標的領域の外側に当該制限酵素Aの認識配列が存在し、更に当該制限酵素Aの認識配列の外側に当該制限酵素Bの認識配列が存在する（末端−制限酵素Bの認識配列−制限酵素Aの認識配列−標的領域−制限酵素Aの認識配列−制限酵素Bの認識配列−末端）ものである。
尚、制限酵素Aの認識配列及び制限酵素Bの認識配列が3ヶ所以上存在する場合には、上記位置関係は、標的領域、標的領域に最も近い制限酵素Aの認識配列及び標的領域に最も近い制限酵素Bの認識配列を示す。
また、少なくとも、標的領域に最も近い制限酵素Aの認識配列と制限酵素Bの認識配列とは重複しないものである。
2019163602.tif 000002
【００１２】
本発明に係る二本鎖DNAは、当該DNAを含む試料から抽出すればよく、当該抽出は、自体公知のDNAの抽出方法に基づいてなされればよい。当該DNAの抽出方法としては、具体的には、例えば、試料と界面活性剤（コール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム等）との混合液を物理的処理（撹拌、ホモジナイズ、超音波処理等）に付し、試料に含まれるDNAを当該混合液中に遊離させることによりDNAを抽出する方法、フェノール・クロロホルムを用いて試料からDNAを抽出する方法、カラム抽出法等が挙げられる。中でも、フェノール・クロロホルムを用いて試料からDNAを抽出する方法又はカラム抽出法が好ましく、カラム抽出法がより好ましい。
【００１３】
フェノール・クロロホルムを用いて試料からDNAを抽出する方法は、試料中に含まれるタンパク質を変性させる作用を有するフェノールの性質と、当該作用を促進させるクロロホルムの性質とに基づいて、試料中に存在するタンパク質を除き、DNAを抽出することによりなされる。
具体的な方法は、自体公知の方法に基づいてなされればよく、市販のキット［例えば、Phase Lock Gel(QTB（株）製)等］を用いて行ってもよい。
【００１４】
カラム抽出法は、メンブレン等を内部に備えたカラム等の筒状の容器に試料を添加し、物質の大きさ、吸着力、電荷、疎水性等の違いを利用して、試料からDNAを抽出することによりなされる。
具体的な方法は、自体公知の方法に基づいてなされればよく、市販のキット［例えば、QuickGene SP kit DNA tissue(倉敷紡績（株）製)、MagMAX（商標） Cell-Free DNA Isolation Kit（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製）Nucleo Spin（商標） Plasma XS（マッハライ・ナーゲル（株）製）等］を用いて行ってもよい。
【００１５】
上記試料としては、具体的には、例えば、全血、血清、血漿、尿等の体液、組織、細胞等が挙げられ、全血、血清又は血漿が好ましく、全血がより好ましい。
【００１６】
尚、上記試料を用いた場合の本発明に係る二本鎖DNAとしては、具体的には、例えば、全血、血清、血漿、尿等の体液中に存在する、循環癌（腫瘍）細胞（CTC：Circulating Tumor Cell）由来の二本鎖DNA、癌（腫瘍）細胞、白血球等の血液細胞、各組織由来の細胞等の死滅に由来する二本鎖DNA（cf DNA：cell free DNA）、エクソソーム（エキソソーム）由来の二本鎖DNA、組織、細胞、全血、尿等の中に存在する細胞由来の二本鎖DNA等が挙げられ、CTC由来の二本鎖DNAが好ましい。
【００１７】
［標的領域］
本発明に係る標的領域は、本発明に係る二本鎖DNA中の特定の既知の二本鎖DNA部分である。
【００１８】
本発明に係る標的領域の大きさ（塩基対数）は、通常50〜1000塩基対であり、50〜700塩基対が好ましく、50〜500塩基対がより好ましい。
尚、本明細書において「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
本発明に係る標的領域としては、具体的には、例えば、表1に示す（i）〜（iii）が挙げられ、（i）又は（ii）が好ましく、（ii）がより好ましい。
【００１９】
【表１】
2019163602.tif 000003
【００２０】
［工程１］
本発明に係る工程１は、（1）（a）末端に3’突出を生じさせる制限酵素Aを1種以上及び（b）末端に5’突出を生じさせる制限酵素Bを1種以上用いて、標的領域を有する二本鎖DNAから、（i）標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］並びに、（ii）標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］又は／及び（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程である。
【００２１】
本発明に係る工程１における制限酵素Aは、下記（i）及び（ii）の性質を有するものである。
（i）二本鎖DNAの末端に3’突出を生じさせる制限酵素。即ち、二本鎖DNAを、「3’突出末端を有する断片」に切断し得る制限酵素。
（ii）標的領域中の塩基配列を切断しない制限酵素。
本発明に係る工程１における制限酵素Aの具体例としては、具体的には、例えば、AatII、ApaI、BanII、BbeI、Bsp1286I、EcoT22I、HaeII、KpnI、PstI、PvuI、SacI、SacII、Sse8387I等が挙げられる。
本発明に係る工程1における制限酵素Aは、標的領域及び本発明に係る二本鎖DNAの塩基配列に応じて適宜選択されればよいが、標的領域として上記表1の（i）〜（iii）を選択する場合には、PstIが好ましい。
本発明に係る工程１における制限酵素Aのユニット数は、通常、DNA1〜100μgに対して、1〜150ユニット／μLであり、5〜100ユニット／μLが好ましい。また、複数種の制限酵素Aを用いた場合の本発明に係る工程１における制限酵素Aのユニット数についても上記と同様であり、通常、DNA1〜100μgに対して、それぞれ1〜150ユニット／μLであり、5〜100ユニット／μLが好ましい。
本発明に係る工程１における制限酵素Aによる処理は、通常、20〜50℃で、好ましくは35〜45℃で、通常40〜150分間、好ましくは60〜120分間反応を行えばよい。
また、本発明に係る工程１における制限酵素Aによる処理は、pH6〜10の下でなされることが好ましく、ここで用いられる緩衝液としては、例えば、MES、ADA、PIPES、ACES、MOPS、BES、TES、HEPES、TRINCE、BICINE等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等を用いればよい。
【００２２】
本発明に係る工程１における制限酵素Bは、下記（i）及び（ii）の性質を有するものである。
（i）二本鎖DNAの末端に5’突出を生じさせる制限酵素。即ち、二本鎖DNAを、「5’突出末端を有する断片」に切断し得る制限酵素。
（ii）本発明に係る工程1における制限酵素Aの作用により生じる、標的領域を有しその両端が3’突出である、3’突出標的二本鎖DNA断片中の塩基配列を切断しない制限酵素。
尚、制限酵素Aを用いた後に、制限酵素Bを用いる場合には、制限酵素Bによる処理の際、上記3’突出標的二本鎖DNA断片は既に生じているが、制限酵素Bを用いた後に、制限酵素Aを用いる場合、制限酵素Bによる処理の際、上記3’突出標的二本鎖DNA断片は生じていない。そのため、本発明に係る工程1における制限酵素Bは、(iii)本発明に係る工程1における制限酵素Aの作用により生じる、標的領域を有しその両端が3’突出である、3’突出標的二本鎖DNA断片に「対応する」領域中の塩基配列を切断しない、という性質も有する。ここで言う3’突出標的二本鎖DNAに「対応する」領域とは、3’突出標的二本鎖DNA断片において、3’突出の塩基の相補塩基を補った塩基配列を意味する。
本発明に係る工程１における制限酵素Bの具体例として、例えば、AccI、AccIII、AflII、Aor13HI、ApalI、AvaI、AvaII、BamHI、BcnI、BglII、BlnI、BmeT110I、BmgT120I、Bpu1102I、BspT104I、Bsp1407I、BssHII、Cfr10I、Cfr13I、ClaI、CpoI、EaeI、EcoO109I、EcoRI、EcoT14I、Eco52I、Eco81I、FbaI、HapII、HindIII、Hin1I、MboI、MflI、MluI、MunI、MvaI、NcoI、NheI、NotI、PshBI、Psp1406I、RspRSII、SalI、Sau3AI、SpeI、TaqI、XbaI、XhoI、XspI等が挙げられる。
本発明に係る工程1における制限酵素Bは、標的領域及び本発明に係る二本鎖DNAの塩基配列に応じて適宜選択されればよいが、標的領域として上記表1の（i）〜（iii）を選択する場合には、MboI、又はBamHI及びBglIIが好ましい。
本発明に係る工程１における制限酵素Bのユニット数は、通常、DNA1〜100μgに対して、1〜150ユニット／μLであり、5〜100ユニット／μLが好ましい。また、複数種の制限酵素Bを用いた場合の本発明に係る工程１における制限酵素Bのユニット数についても上記と同様であり、通常、DNA1〜100μgに対して、それぞれ1〜150ユニット／μLであり、5〜100ユニット／μLが好ましい。
本発明に係る工程１における制限酵素Bによる処理は、通常、20〜50℃で、好ましくは35〜45℃で、通常40〜150分間、好ましくは60〜120分間反応を行えばよい。
また、本発明に係る工程１における制限酵素Bによる処理は、pH6〜10の下でなされることが好ましく、ここで用いられる緩衝液としては、例えば、MES、ADA、PIPES、ACES、MOPS、BES、TES、HEPES、TRINCE、BICINE等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等を用いればよい。
【００２３】
本発明に係る工程1における制限酵素A及び制限酵素Bによる処理を行った場合に生じるDNA断片について、以下に説明する。
【００２４】
上述の通り、本発明に係る二本鎖DNAにおける、標的領域、制限酵素Aの認識配列及び制限酵素Bの認識配列の位置関係は、［末端−制限酵素Bの認識配列−制限酵素Aの認識配列−標的領域−制限酵素Aの認識配列−制限酵素Bの認識配列−末端］である。
また、制限酵素Aの認識配列及び制限酵素Bの認識配列が3ヶ所以上存在する場合には、上記位置関係は、［末端−（標的領域に最も近い）制限酵素Bの認識配列−（標的領域に最も近い）制限酵素Aの認識配列−標的領域−（標的領域に最も近い）制限酵素Aの認識配列−（標的領域に最も近い）制限酵素Bの認識配列］である。
そのため、本発明に係る工程1における制限酵素Aの作用により、標的領域を有する二本鎖DNAから、(i)標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］が生じることとなる。
2019163602.tif 000004
一方、本発明に係る工程1における制限酵素Bの作用により、標的領域を有する二本鎖DNAにおける(i)3’突出標的二本鎖DNA断片に対応する領域以外の部分から、少なくとも(ii)標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］又は／及び（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’/3’突出非標的二本鎖DNA断片］が生じることとなる。また、
【００２５】
また、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片に対応する領域以外の部分における制限酵素Aの認識配列の数、制限酵素Bの認識配列の数及び制限酵素Aの認識配列と制限酵素Bの認識配列の順序や、本発明に係る二本鎖DNAの両端の形状（3’突出、5’突出、平滑）等によって、更に種々の二本鎖DNA断片が生じることとなる。
【００２６】
・制限酵素の認識配列の数及び順序の違いによる二本鎖DNA断片の種類
上述の通り、制限酵素Aの認識配列の数、制限酵素Bの認識配列の数及び制限酵素Aの認識配列と制限酵素Bの認識配列の順序によって種々の二本鎖DNA断片が生じることとなる。
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従って、標的領域を有する二本鎖DNAにおける(i)3’突出標的二本鎖DNA断片に対応する領域以外の部分のうち、末端を除く部分については、例えば、下記模式図（1）〜（11）に示すように、制限酵素Aの認識配列の数、制限酵素Bの認識配列の数及び制限酵素Aの認識配列と制限酵素Bの認識配列の順序の違いにより種々の二本鎖DNA断片が生じる。
尚、下記模式図には、標的領域を中心として本発明に係る二本鎖DNAの左側（上流）部分のみを示すが、右側（下流）部分も同様である。
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【００２７】
・二本鎖DNA両端の形状（3’突出、5’突出、平滑）の違いによる二本鎖DNA断片の種類
標的領域を有する二本鎖DNAにおける(i)3’突出標的二本鎖DNA断片に対応する領域以外の部分のうち、末端部分については、例えば、下記模式図（12）〜（17）に示すように、両端の形状（3’突出、5’突出、平滑）と両端に近接する制限酵素A又は制限酵素Bの種類によって種々の二本鎖DNA断片が生じる。尚、下記模式図には、標的領域を中心として本発明に係る二本鎖DNAの左側（上流）部分のみを示すが、右側（下流）部分も同様である。
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【００２８】
上述の通り、本発明に係る工程1においては、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片並びに、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片が生じ、本発明に係る工程1における制限酵素A及び制限酵素Bの認識配列の数、制限酵素Aの認識配列と制限酵素Bの認識配列の順序、並びに本発明に係る二本鎖DNAの末端の形状の違いによって、下記模式図の通り、種々の二本鎖DNA断片が生じることとなる。例えば、点線内の3’突出非標的二本鎖DNA断片、平滑／5’突出非標的二本鎖DNA断片、平滑／3’突出非標的二本鎖DNA断片等が生じる。以下、模式図では同様に記載する。
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【００２９】
本発明に係る工程１においては、制限酵素Aと制限酵素Bは（i）同時に用いても、（ii）制限酵素Aを用いた後、制限酵素Bを用いても、又は（iii）制限酵素Bを用いた後、制限酵素Aを用いてもよい。
言い換えれば、（i）本発明に係る二本鎖DNAを制限酵素Aと制限酵素Bとで同時に処理しても、（ii）本発明に係る二本鎖DNAを制限酵素Aで処理した後、処理物を更に制限酵素Bで処理しても、又は（iii）本発明に係る二本鎖DNAを制限酵素Bで処理した後、処理物を更に制限酵素Aで処理してもよい。
尚、処理に要する時間等を考慮すると、上記（i）が好ましい。
【００３０】
以下に、上記（i）、（ii）又は（iii）による処理を行った場合の、本発明に係る工程１の模式図を示す。
【００３１】
（i）制限酵素Aと制限酵素Bを同時に用いる場合
制限酵素A及び制限酵素Bによる処理を同時に行った場合、標的領域を有する二本鎖DNAから、（i）標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］（ii）標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］、（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片］等が同時にそれぞれ生じることとなる。
尚、前述の通り、制限酵素Aの認識配列の数、制限酵素Bの認識配列の数及び制限酵素Aの認識配列と制限酵素Bの認識配列の順序や、標的領域を有する二本鎖DNAの両端の形状（3’突出、5’突出、平滑）等によって、更に種々の二本鎖DNA断片が生じる場合がある。
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【００３２】
（ii）制限酵素Aを用いた後、制限酵素Bを用いる場合
制限酵素Aによる処理の後、制限酵素Bによる処理を行った場合、まずは、制限酵素Aの作用により、標的領域を有する二本鎖DNAから、（i）標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］、標的領域を有さずその両端が3’突出である二本鎖DNA［3’突出非標的二本鎖DNA断片］等がそれぞれ生じる。
次いで、制限酵素Bの作用により、制限酵素Bの認識配列を有する、3’突出非標的二本鎖DNA断片が生じ、平滑／3’突出非標的二本鎖DNA断片等から、（ii）標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］、（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片］等がそれぞれ生じる。
尚、前述の通り、制限酵素Aの認識配列の数、制限酵素Bの認識配列の数及び制限酵素Aの認識配列と制限酵素Bの認識配列の順序や、標的領域を有する二本鎖DNAの両端の形状（3’突出、5’突出、平滑）等によって、更に種々の二本鎖DNA断片が生じる場合がある。
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【００３３】
（iii）制限酵素Bを用いた後、制限酵素Aを用いた場合
制限酵素Bによる処理の後、制限酵素Aによる処理を行った場合、まずは、制限酵素Bの作用により、標的領域を有する二本鎖DNAから、標的領域を有しその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出標的二本鎖DNA断片］、（ii）標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA［5’突出非標的二本鎖DNA断片］等がそれぞれ生じる。
次いで、制限酵素Aの作用により、制限酵素Aの認識配列を有する、5’突出標的二本鎖DNA断片、平滑／5’突出非標的二本鎖DNA断片等が生じ、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片等から、（i）標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］、（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片］等がそれぞれ生じる。
尚、前述の通り、制限酵素Aの認識配列の数、制限酵素Bの認識配列の数及び制限酵素Aの認識配列と制限酵素Bの認識配列の順序や、標的領域を有する二本鎖DNAの両端の形状（3’突出、5’突出、平滑）等によって、更に種々の二本鎖DNA断片が生じる場合がある。
2019163602.tif 000028
【００３４】
更に、本発明に係る工程１の後、本発明に係る工程１により生じた各DNA断片を精製するのが好ましい。尚、上記精製の詳細は、［精製工程］の項で詳述する。
【００３５】
このように本発明に係る工程１を行うことにより、標的領域を有する二本鎖DNAから、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片並びに、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片を生じさせることができる。
結果として、後述する、本発明に係る工程２におけるエキソヌクレアーゼIIIによる処理を効率よく進めることができる。
【００３６】
［工程2］
本発明に係る工程2は、工程1で生じた、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片並びに、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片を、エキソヌクレアーゼIIIで処理することにより、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片から、（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片をそれぞれ生じさせる工程である。
以下に、本発明に係る工程2の模式図を示す。
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【００３７】
本発明に係る工程2におけるエキソヌクレアーゼIIIは、二本鎖DNA特異的ヌクレアーゼの一種であり、二本鎖DNAの3’陥没末端より作用し、二本鎖DNAから一本鎖DNAを生成する酵素である。
本発明に係る工程2におけるエキソヌクレアーゼIIIのユニット数は、通常、DNA1〜10μgに対して、1〜300ユニット／μLであり、5〜250ユニット／μLが好ましい。
本発明に係る工程2におけるエキソヌクレアーゼIIIによる処理は、通常、15〜50℃で、好ましくは20〜45℃で、通常40〜120分間、好ましくは60〜100分間反応を行えばよい。
また、本発明に係る工程2におけるエキソヌクレアーゼIIIによる処理は、pH6〜10の下でなされることが好ましく、ここで用いられる緩衝液としては、例えば、MES、ADA、PIPES、ACES、MOPS、BES、TES、HEPES、TRINCE、BICINE等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等を用いればよい。
【００３８】
更に、本発明に係る工程2の後、本発明に係る工程2により生じたDNA断片を精製するのが好ましい。尚、上記精製の詳細は、［精製工程］の項で詳述する。
【００３９】
このように、本発明に係る工程2を行うことにより、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片並びに、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片のうち、3’陥没末端を有する（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片から、（iv）標的領域有さない一本鎖DNA断片をそれぞれ生じさせることができる。
即ち、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片の3’陥没末端からエキソヌクレアーゼIIIが作用し、二本鎖DNAの片側をそれぞれ消化し、標的領域を有さない一本鎖DNA断片をそれぞれ生じさせることができる。
結果として、後述する、本発明に係る工程3における一本鎖特異的ヌクレアーゼによる処理を効率よく進めることができる。
【００４０】
［工程3］
本発明に係る工程3は、工程2で生じた、（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片及び（i）3’突出標的二本鎖DNA断片を、一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理することにより、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片から、（v）標的領域を有しその両端が平滑である、平滑標的二本鎖DNA断片を生じさせる工程である。
以下に、本発明に係る工程3の模式図を示す。
2019163602.tif 000030
【００４１】
本発明に係る工程3における一本鎖特異的ヌクレアーゼは、一本鎖DNA及び二本鎖DNAの一本鎖の領域を分解する酵素である。
本発明に係る工程3における一本鎖特異的ヌクレアーゼとしては、具体的には、例えば、S1ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼI、マングビーンヌクレアーゼ等が挙げられる。
ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の特定領域（配列番号1：267塩基対）、ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の特定領域（配列番号2：149塩基対）又はイヌ由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の特定領域（配列番号3：433塩基対）を標的領域とする場合、本発明に係る工程3における一本鎖特異的ヌクレアーゼとしては、S1ヌクレアーゼが好ましい。
本発明に係る工程3における一本鎖特異的ヌクレアーゼのユニット数は、通常、DNA1〜10μgに対して、1〜300ユニット／μLであり、5〜250ユニット／μLが好ましい。
本発明に係る工程3における一本鎖特異的ヌクレアーゼによる処理は、通常、10〜37℃で、好ましくは15〜25℃で、通常5〜30分間、好ましくは10〜25分間反応を行えばよい。
また、本発明に係る工程3における一本鎖特異的ヌクレアーゼによる処理は、pH4〜6の下でなされることが好ましく、ここで用いられる緩衝液としては、例えば、酢酸ナトリウム緩衝液等の酢酸緩衝液等を用いればよい。
【００４２】
更に、本発明に係る工程3の後、本発明に係る工程3により生じたDNA断片を精製するのが好ましい。尚、上記精製の詳細は、［精製工程］の項で詳述する。
【００４３】
このように、本発明に係る工程3を行うことにより、本発明に係る工程2で生じた（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片、及び（i）3’突出標的二本鎖DNA断片から、（v）平滑標的二本鎖DNA断片を生じさせることができる。
即ち、一本鎖特異的ヌクレアーゼにより、（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片、及び（i）3’突出標的二本鎖DNA断片中の一本鎖の領域がそれぞれ消化されることにより、（v）平滑標的二本鎖DNA断片を生じさせることができる。
【００４４】
［精製工程］
本発明に係る精製工程は、DNAを精製する工程のことである。これにより、引き続き行われる処理や工程の前に不純物を取り除くことができるため、当該精製工程を行うことが好ましい。
本発明に係る精製工程は、本発明に係る工程1の後且つ本発明に係る工程2の前、及び本発明に係る工程2の後且つ本発明に係る工程3の前に行うことが好ましい。
また、本発明に係る工程1の後且つ本発明に係る工程2の前に精製工程を行う場合、工程1における制限酵素A、制限酵素Bの処理の順に応じて、以下のようになされる。
（i）本発明に係る工程1において制限酵素Aによる処理と制限酵素Bによる処理を同時に行う場合は、制限酵素A及び制限酵素Bによる処理の後且つ本発明に係る工程2の前に精製工程を行う。
（ii）本発明に係る工程1において制限酵素Aによる処理の後、制限酵素Bによる処理を行う場合は、制限酵素Aによる処理の後且つ制限酵素Bによる処理の前、及び制限酵素Bによる処理の後且つ本発明に係る工程2の前にそれぞれ精製工程を行う。
（iii）本発明に係る工程1において制限酵素Bによる処理の後、制限酵素Aによる処理を行う場合は、制限酵素Bによる処理の後且つ制限酵素Aによる処理の前、及び制限酵素Aによる処理の後且つ本発明に係る工程2の前にそれぞれ精製工程を行う。
【００４５】
本発明に係る精製工程は、通常この分野でなされる自体公知の精製方法であれば、特に制限されない。具体的には、例えば、アルコール沈殿法、カラム精製法等が挙げられ、ハイスループットに適用できる点から、カラム精製法が好ましい。
【００４６】
アルコール沈殿法は、DNA含有溶液にナトリウム塩、アンモニウム塩等の塩を添加した後、アルコールを添加し、DNAを沈殿させることでDNAを精製することによりなされる。アルコール沈殿法により精製を行う場合は、例えば、以下のように行えばよい。
即ち、DNA含有溶液 10〜200μLに、1〜5M 酢酸ナトリウム 10〜50μL、アルコール 50〜100μL及び緩衝液 30〜100μLを加え、10000〜25000×gで1〜30分間遠心分離し、沈殿物を回収することにより、精製されたDNAが得られる。
上記アルコールとしては、イソプロパノール、エタノール、ブタノール等が挙げられ、イソプロパノール又はエタノールが好ましく、イソプロパノールがより好ましい。
上記緩衝液としては、MES、ADA、PIPES、ACES、MOPS、BES、TES、HEPES、TRINCE、BICINE等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられ、トリス緩衝液又はリン酸緩衝液が好ましく、トリス緩衝液がより好ましい。尚、上記緩衝液の濃度、pHは通常この分野で用いられる範囲であればよい。
【００４７】
また、上記アルコール沈殿法は、市販のキットを用いて行ってもよい。
【００４８】
カラム精製法は、シリカゲル、ポリアクリルアミドゲル、セファクリル等の充填剤を内部に備えたカラム等の筒状の容器［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）、Mobi Spin s-4000（モレキュラーバイオテクノロジー（株）製）等］にDNA含有溶液を添加し、DNAと充填剤との親和性の違いを利用してDNAを精製することによりなされる。カラム精製法により精製を行う場合は、例えば、以下のように行えばよい。
即ち、DNA含有溶液 10〜200μLに、タンパク質変性剤 100〜700μL又は／及び緩衝液100〜700μLを加えて混合し、例えば、充填剤を充填したカラム［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）］に移し、1000〜20000×g、室温で1〜5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。次いで、緩衝液100〜700μL及びアルコール 100〜700μLを加え、1000〜20000×g、室温で1〜5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。更に、1000〜20000×g、室温で1〜10分間遠心分離し、新しいチューブに交換し、緩衝液又は滅菌水 10〜100μLを加え、1000〜20000×g、室温で1〜5分間遠心分離し、フロースルー液を回収することにより、精製されたDNAが得られる。
上記タンパク質変性剤としては、グアニジン塩酸塩、ホルムアミド、尿素等が挙げられ、グアニジン塩酸塩が好ましい。
上記アルコールとしては、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等が挙げられ、エタノール又はイソプロパノールが好ましく、エタノールがより好ましい。
上記緩衝液としては、MES、ADA、PIPES、ACES、MOPS、BES、TES、HEPES、TRINCE、BICINE等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられ、トリス緩衝液又はリン酸緩衝液が好ましく、トリス緩衝液がより好ましい。尚、上記緩衝液の濃度、pHは通常この分野で用いられる範囲であればよい。
【００４９】
また、上記カラム精製法は、市販のキットを用いて行ってもよい。
【００５０】
［本発明の精製方法の具体例］
本発明の精製方法の具体例を、以下に説明する。
【００５１】
（1）DNAの抽出
例えば、核酸抽出キット［例えば、NucleoSpin（商標）Plasma XS（マッハライ・ナーゲル（株）製）、MagMAX（商標） Cell-Free DNA Isolation Kit（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製）又はQuickGene SP kit DNA tissue（倉敷紡績(株)製）］により、試料（例えば、全血）から、標的領域（例えば、配列番号2で表される塩基配列）を有する二本鎖DNAを抽出する。
（2）本発明に係る工程1
上記（1）で得たDNAに、本発明に係る工程1における緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 5〜20μL、1〜150ユニット／μLの制限酵素A（例えば、PstI） 0.5〜4μL及び1〜150ユニット／μLの制限酵素B（例えば、MboI、又はBamHI及びBglII） 0.5〜4μLを加え、滅菌水で50〜200μLに調製する。
その後、20〜50℃で60〜150分間反応させて本発明に係る工程1で処理された溶液を得る。
更に、必要に応じて、本発明に係る工程1で処理された溶液を、以下のように本発明に係る精製工程に付してもよい。
即ち、上記本発明に係る工程1で処理された溶液に、タンパク質変性剤（例えば、グアニジン塩酸塩） 100〜700μL及び緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 100〜700μLをそれぞれ加えて混合し、充填剤を充填したカラム［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）］に移し、1000〜20000×g、室温で1〜5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。その後、緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 100〜700μL及びアルコール（例えば、エタノール） 100〜700μLをそれぞれ加え、1000〜20000×g、室温で1〜5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。更に、1000〜20000×g、室温で1〜10分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 10〜100μLを加え、1000〜20000×g、室温で1〜5分間遠心分離し、フロースルー液を回収する。
上記で得られた、本発明に係る工程1で処理された溶液又はフロースルー液を、本発明に係る工程2に付す。
（3）本発明に係る工程2
上記本発明に係る工程１で処理された溶液又はフロースルー液 10〜50μLに、1〜300ユニット／μLのエキソヌクレアーゼIII 1〜5μL及びエキソヌクレアーゼIII処理用緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 1〜10μLを加え、滅菌水で50〜200μLに調製する。その後、15〜50℃で40〜120分間反応させ、反応停止液（例えば、EDTA） 0.5〜1.5μLを加えることで本発明に係る工程2で処理された溶液を得る。
更に、必要に応じて、本発明に係る工程2で処理された溶液を、以下のように本発明に係る精製工程に付してもよい。
即ち、上記本発明に係る工程2で処理された溶液に、タンパク質変性剤（例えば、グアニジン塩酸塩） 100〜700μL及び緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 100〜700μLをそれぞれ加えて混合し、充填剤を充填したカラム［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）］に移し、1000〜20000×g、室温で1〜5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。その後、緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 100〜700μL及びアルコール（例えば、エタノール） 100〜700μLをそれぞれ加え、1000〜20000×g、室温で1〜5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。更に、1000〜20000×g、室温で1〜10分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 10〜100μLを加え、1000〜20000×g、室温で1〜5分間遠心分離し、フロースルー液を回収する。
上記で得られた、本発明に係る工程2で処理された溶液又はフロースルー液を、本発明に係る工程3に付す。
（4）本発明に係る工程3
上記本発明に係る工程2で処理された溶液又はフロースルー液 10〜50μLに、1〜300ユニット／μLの一本鎖特異的ヌクレアーゼ（例えば、S1ヌクレアーゼ） 1〜5μL及び一本鎖特異的ヌクレアーゼ用緩衝液（例えば、酢酸緩衝液） 1〜10μLを加え、滅菌水で50〜200μLに調製する。その後、10〜37℃で5〜30分間反応させることで、本発明に係る工程3で処理された溶液を得る。
更に、必要に応じて、本発明に係る工程3で処理された溶液を、以下のように本発明に係る精製工程に付してもよい。
即ち、上記本発明に係る工程3で処理された溶液に、タンパク質変性剤（例えば、グアニジン塩酸塩） 100〜700μL及び緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 100〜700μLをそれぞれ加えて混合し、充填剤を充填したカラム［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）］に移し、1000〜20000×g、室温で1〜5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。その後、緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 100〜700μL及びアルコール（例えば、エタノール） 100〜700μLをそれぞれ加え、1000〜20000×g、室温で1〜5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。更に、1000〜20000×g、室温で1〜10分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 10〜100μLを加え、1000〜20000×g、室温で1〜5分間遠心分離し、フロースルー液を回収する。
【００５２】
＜本発明の二本鎖DNA中の標的領域の検出方法＞
本発明の二本鎖DNA中の標的領域の検出方法（以下、本発明の検出方法と略記する場合がある。）は、本発明の精製方法により精製された標的領域を有する二本鎖DNA中の標的領域を検出するものである。
即ち、上記本発明の精製方法に引き続いて、標的領域を増幅処理に付し、目的の増幅産物の有無を確認することにより標的領域を検出するものであり、下記工程1〜5を含むことを特徴とする。
（1）（a）末端に3’突出を生じさせる制限酵素Aを1種以上及び（b）末端に5’突出を生じさせる制限酵素Bを1種以上用いて、標的領域を有する二本鎖DNAから、（i）標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］並びに、（ii）標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］又は／及び（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程1、ここで、当該制限酵素Aは当該標的領域中の塩基配列を切断せず、当該制限酵素Bは当該3’突出標的二本鎖DNA断片に対応する領域中の塩基配列を切断しないものである、
（2）前記工程1で生じた、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片並びに、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片を、エキソヌクレアーゼIIIで処理することにより、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片から、それぞれ（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片を生じさせる工程2、
（3）前記工程2で生じた、（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片及び（i）3’突出標的二本鎖DNA断片を、一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理することにより、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片から、（v）標的領域を有しその両端が平滑である二本鎖DNA断片［平滑標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程3、
（4）前記工程３で生じた、（v）平滑標的二本鎖DNA断片中の標的領域を増幅処理に付す工程4、
及び
（5）前記工程４で生じた、増幅産物の有無を確認する工程5
尚、標的領域を増幅処理に付す工程の前までの工程1〜3は、前述の本発明の精製方法における工程1〜3と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
また、［二本鎖DNA］及び［標的領域］は、本発明の精製方法における［二本鎖DNA］及び［標的領域］と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
尚、本発明の検出方法においても、各工程に引き続いて精製工程を行ってもよく、その具体例、好ましい例等は、本発明の精製方法における［精製工程］で説明した通りである。
【００５３】
［本発明の検出方法に係る工程4］
本発明の検出方法に係る工程4は、本発明の検出方法に係る工程3で生じた、（v）平滑標的二本鎖DNA断片中の標的領域を増幅処理に付す工程である。
本発明の検出方法に係る工程4における増幅産物は、標的領域そのものであっても、標的領域以外の塩基配列（例えば、プライマー配列等）を含むものであってもよい。
本発明の検出方法に係る工程4における増幅産物の大きさ（塩基対数）としては、通常、50〜1100塩基対であり、50〜800塩基対が好ましく、50〜600塩基対がより好ましい。
本発明の検出方法に係る工程4における増幅産物としては、具体的には、例えば、表2に示すものが挙げられ、（i）又は（ii）が好ましく、（ii）がより好ましい。
【００５４】
【表２】
2019163602.tif 000031
【００５５】
本発明の検出方法に係る工程4における標的領域を増幅する方法は、特に制限されず、自体公知の方法に基づいてなされればよい。このような自体公知の増幅方法としては、具体的には、例えば、PCR（Polymerase Chain Reaction）法、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法等が挙げられ、PCR法が好ましい。
【００５６】
上記PCR法は、プライマー、核酸合成酵素、核酸合成基質、緩衝液、要すればプローブ等を用いて公知の方法により行えばよい。具体的には、例えば、Nucleic Acids Research, 1991, Vol.19, 3749、 BioTechniques, 1994, Vol.16, 1134-1137や「目的別で選べるPCR実験プロトコール, 2011, p.p. 56-73, 120-131」に記載の方法に基づいてなされればよい。
【００５７】
上記PCR法としては、全血、血漿、尿等の体液中に存在する、CTC由来のDNA中の標的領域、cfDNA中の標的領域又はエクソソーム（エキソソーム）由来のDNA中の標的領域を増幅する場合、デジタルPCR法が好ましい。
【００５８】
上記デジタルPCR法は、PCR反応液を、多数の小区画にDNA断片が1分子になるように分割してPCR反応を実施し、増幅産物が検出された小区画の数に基づいてターゲットDNAを検出、定量することによりなされる。
上記デジタルPCR法は、具体的には、例えば、以下のようになされればよい。
即ち、鋳型となるDNA含有溶液、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマー対、プローブ、核酸合成基質、核酸合成酵素等を含むデジタルPCR用反応液を調製する。次いで、ドロップレット作製装置[例えば、QX200 Droplet Generator(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製)、Automated Droplet Generator(バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製)等]により上記デジタルPCR用反応液を多数のドロップレット（1サンプルにつき5000〜4万個）に分割する。その後、核酸増幅装置[例えば、サーマルサイクラ―（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）、Droplet Digital PCR（バイオ・ラッドラボラトリーズ(株)製）、QuantStudio 3D Digital PCR System（サーモフィッシャーサイエンティフィック(株)製）等]によりPCR反応を行う。
【００５９】
上記PCR法におけるフォワードプライマー及びリバースプライマー（以下、本発明に係るプライマーと略記する場合がある。）からなるプライマー対（以下、本発明に係るプライマー対と略記する場合がある。）は、本発明に係る標的領域を増幅するように設計されたものであれば何れでもよい。
本発明に係るプライマーの大きさ（塩基数）としては、通常10〜50塩基であり、10〜35塩基が好ましく、15〜35塩基がより好ましく、20〜30塩基が特に好ましい。
各種標的領域を増幅する場合に用いられる、本発明に係るプライマー対を以下表3に記載する。
【００６０】
【表３】
2019163602.tif 000032
【００６１】
また、本発明に係るプライマー対は、本発明に係るプライマー対をそのまま用いることが好ましいが、フォワードプライマー又はリバースプライマーの何れか一方或いは両方を標識物質で標識したプライマーからなるものであってもよい。
【００６２】
本発明に係るプライマーを標識物質で標識する方法としては、特に制限されず、自体公知の方法に基づいてなされればよい。
本発明に係るプライマーを標識物質で標識するために用いられる標識物質としては、蛍光物質、放射性同位体、酵素、発光物質など公知の標識物質が挙げられ、蛍光物質が好ましい。
蛍光物質としては、例えば、TAMRA（商標）（シグマアルドリッチ（株）製）、Alexa555、Alexa647（インビトロジェン（株）製）、Cyanine  Dye系のCy3、Cy5（アマシャムバイオサイエンス（株）製）、フルオレセイン等が挙げられる。放射性同位体としては、例えば、32P、33P、35S等が挙げられる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等が挙げられる。また、発光物質としては、例えば、Acridinium Easterを含む化学発光試薬等が挙げられる。
【００６３】
本発明に係るプライマーを蛍光物質で標識する方法としては、例えば、フルオレセイン標識したヌクレオチドを自体公知の方法に基づいて、プライマーに取り込ませる方法、リンカーアームを有するヌクレオチドを配列のオリゴヌクレオチド中に置換する方法（Nucleic Acids Res., 1986年、第14巻、p.6115）等が挙げられる。
【００６４】
本発明に係るプライマーを放射性同位体で標識する方法としては、プライマーを合成する際に、放射性同位体で標識されたヌクレオチドを取り込ませることによって、プライマーを標識する方法、プライマーを合成した後、放射性同位体で標識する方法等が挙げられる。具体的には、一般的に用いられるランダムプライマー法、ニックトランスレーション、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによる5’末端標識法、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによる3’末端標識法等が挙げられる。
【００６５】
本発明に係るプライマーを酵素で標識する方法としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素分子を、標識するプライマーに直接共有結合させる等の直接標識法が挙げられる。
【００６６】
本発明に係るプライマーを発光物質で標識する方法としては、自体公知の方法に基づいて、ヌクレオチドを発光標識する方法が挙げられる。
【００６７】
また、「ビオチン−アビジン反応を利用した検出システム」に従って、上述の標識物質を本発明に係るプライマーに結合させてもよく、その場合には、自体公知の方法に基づいてなされればよい。
【００６８】
上記PCR法におけるプローブ（以下、本発明に係るプローブと略記する場合がある。）は、本発明に係るプライマー対を用いてPCR等を行った場合に増幅される領域にハイブリダイズするように設計されたものであり、その5’末端がレポーター蛍光色素で標識され、3’末端がクエンチャー蛍光色素で標識されたものであれば何れでもよい。
本発明に係るプローブの大きさ（塩基数）としては、通常10〜50塩基であり、15〜40塩基が好ましく、20〜30塩基がより好ましい。
ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の特定領域（配列番号2：149塩基対）を標的領域として増幅する場合に用いる、本発明に係るプローブは以下の通りである。
cacagaatctctccgcactccgttc（配列番号10、GenBank Accession No. AL353637：107065-107089）
【００６９】
本発明に係るプローブの5’末端をレポーター蛍光色素で、3’末端をクエンチャー蛍光色素で標識する方法としては、上述の本発明に係るプライマー対を標識物質で標識する方法で説明した通りである。
【００７０】
本発明に係るプローブをレポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素により標識するために用いられるレポーター蛍光色素としては、FAM、HEX、VIC等が挙げられ、クエンチャー蛍光色素としては、TAMRA（商標）、BHQ1、BHQ２等が挙げられる。
尚、本発明に係るプローブとして配列番号10で表される塩基配列からなるものを用いた場合、レポーター蛍光色素としてはFAMが好ましく、クエンチャー蛍光色素としてはBHQ1が好ましい。
【００７１】
また、上記PCR法における核酸合成酵素としては、Taq  DNAポリメラーゼ、KOD  DNAポリメラーゼ等が挙げられ、核酸合成基質としては、dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）等が挙げられ、緩衝液としては、MES、ADA、PIPES、ACES、MOPS、BES、TES、HEPES、TRINCE、BICINE等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられるが、通常この分野で用いられているものであれば何れでもよい。
更に、上記PCR用反応液中に、MgCl2、KCl、(NH4)2SO4等の塩、ポリエチレングリコール、Triton（ユニオンカーバイド（株）製）、Nohidet（シェルケミカルズ（株）製）、CHAPS（（株）同仁化学製）等の界面活性剤、プロクリン300（シグマアルドリッチ（株）製）等の防腐剤、HapII、HpaII、SacII、FauI、AciI、BstuI等のメチル化感受性制限酵素等が含まれていてもよい。
【００７２】
このように本発明の検出方法に係る工程4を行うことにより、本発明の検出方法に係る工程3で生じた、（v）平滑標的二本鎖DNA断片中の標的領域を特異的に増幅させることができる。
【００７３】
［本発明の検出方法に係る工程5］
本発明の検出方法に係る工程5は、本発明の検出方法に係る工程4で生じた増幅産物の有無を確認する工程である。
【００７４】
本発明の検出方法に係る工程5における増幅産物の有無を確認する方法は、通常、この分野でなされている方法であれば、特に制限されず、自体公知の方法に基づいてなされればよい。
具体的には、例えば、（a）電気泳動により確認する方法、（b）蛍光リーダーにより確認する方法等が挙げられる。
【００７５】
（a）電気泳動により確認する方法
電気泳動により確認する方法とは、本発明の検出方法に係る工程4で得られた増幅産物を、電気泳動に付し、その泳動度（移動度等）に基づいて確認する方法であり、具体的な方法としては、（a-1）標識プライマー法、（a-2）インターカレーター法、（a-3）標識プローブ法等が挙げられる。
【００７６】
（a-1）標識プライマー法
標識プライマー法とは、『本発明に係るプライマーの少なくとも一方を標識物質で標識した標識プライマーを含むプライマー対を用い、本発明の検出方法に係る工程4を行う。次いで、得られた増幅産物を電気泳動に付し、当該増幅産物中の標識を検出することにより、本発明の検出方法に係る工程4で得られた増幅産物の有無を確認する』方法である。
尚、標識物質で標識した標識プライマーについては、本発明の検出方法に係る工程4で説明した通りである。
また、上記「標識を検出する」とは、標識物質の性質に基づいて標識物質を直接又は間接的に測定することを意味する。
標識プライマー法における電気泳動としては、物質の荷電強度に依存して異なる速度で移動又は異なる距離を移動する方法に基づくものであればよく、具体的には、例えば、アガロースゲル電気泳動法、アクリルアミドゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法等が挙げられ、アガロースゲル電気泳動法又はキャピラリー電気泳動法がより好ましい。
尚、上記アガロースゲル電気泳動法は、例えば、「バイオ実験イラステッドII遺伝子解析の基礎， 2006, p.p. 53-56」に記載の方法に基づいてなされればよい。また、上記キャピラリー電気泳動法は、例えば、WO2007/027495、WO2011/118496、WO2008/075520等に記載の方法に基づいてなされればよい。
【００７７】
（a-2）インターカレーター法
インターカレーター法とは、『本発明に係るプライマー対を用い、本発明の検出方法に係る工程4を行い、得られた増幅産物を電気泳動に付す。次いで、当該増幅産物をインターカレーターで染色し、当該インターカレーター由来の蛍光を検出することにより、本発明の検出方法に係る工程4で得られた増幅産物の有無を確認する』方法である。
インターカレーター法における電気泳動としては、（a-1）標識プライマー法に記載のものと同じものが挙げられ、その具体例、好ましい例等も同じである。
また、インターカレーター法におけるインターカレーターとしては、通常、この分野で用いられているインターカレーターであれば何れでもよい。具体的には、例えば、（1）〜（5）のインターカレーター並びに下記（6）及び（7）のインターカレーター類似物質が挙げられる。
（1）エチジウム化合物［例えば、エチジウムブロマイド、エチジウムホモダイマー1（EthD-1）、エチジウムホモダイマー2（EthD-2）、臭化エチジウムモノアジド（EMA）、ジヒドロエチジウム等］、
（2）アクリジン色素（例えば、アクリジンオレンジ等）、
（3）ヨウ素化合物（ヨウ素化プロピジウム、ヨウ素化ヘキシジウム等）、シアニンダイマー系色素［例えば、POPO-1、BOBO-1、YOYO-1、TOTO-1、JOJO-1、POPO-3、LOLO-1、BOBO-3、YOYO-3、TOTO-3（何れもモレキュラープローブ（株）製）等］、
（4）シアニンモノマー系色素［例えば、PO-PRO-1、BO-PRO-1、YO-PRO-1、TO-PRO-1、JO-PRO-1、PO-PRO-3、LO-PRO-1、BO-PRO-3、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5（何れもモレキュラープローブ（株）製）等］、
（5）SYTOX（商標）系色素［例えば、SYBR Gold（商標）、SYBR Green I（商標）、SYBR Green II（商標）、SYTOX Green（商標）、SYTOX Blue（商標）、SYTOX Orange（商標）（何れもモレキュラープローブ（株）製）等］、GelRed（商標）系色素［例えば、GelRed（商標）核酸ゲル染色液（富士フイルム和光純薬（株）製）等］、
（6）DNA二重らせんのマイナーグルーブに結合するもの［例えば、4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI：モレキュラープローブ（株）製）等］、
（7）アデニン−チミン（A-T）配列に特異的に結合するもの［例えば、ペンタハイドレ−ト（ビス−ベンズイミド）（Hoechst 33258：モレキュラープローブ（株）製）、トリヒドロクロライド（Hoechst 33342：モレキュラープローブ（株）製）、ビスベンズイミド色素（Hoechst 34580：モレキュラープローブ（株）製）等］
上記した中でも、SYTOX（商標）系色素［例えば、SYBR Gold（商標）、SYBR Green I（商標）、SYBR Green II（商標）、SYTOX Green（商標）、SYTOX Blue（商標）、SYTOX Orange（商標）（何れもモレキュラープローブ（株）製）等］、GelRed（商標）系色素［例えば、GelRed（商標）核酸ゲル染色液（富士フイルム和光純薬（株）製）等］が好ましく、GelRed（商標）系色素［例えば、GelRed（商標）核酸ゲル染色液（富士フイルム和光純薬（株）製）等］がより好ましい。
【００７８】
（a-3）標識プローブ法
標識プローブ法とは、『本発明に係るプライマー対を用い、本発明の検出方法に係る工程4を行い、得られた増幅産物を電気泳動に付す。次いで、上記増幅産物を熱処理に付すことにより、一本鎖にする。次いで、標識物質で標識された、上記増幅産物の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブをハイブリダイズさせることで、ハイブリッド体を得て、当該ハイブリッド体中の標識を検出することにより、本発明の検出方法に係る工程4で得られた増幅産物の有無を確認する』方法である。
尚、標識物質で標識した標識プローブとしては、本発明の検出方法に係る工程4に記載のものと同じものが挙げられ、その具体例、好ましい例等も同じである。
また、標識プローブ法における電気泳動としては、（a-1）標識プライマー法に記載のものと同じものが挙げられ、その具体例、好ましい例等も同じである。
【００７９】
（b）蛍光リーダーにより検出する方法
蛍光リーダーにより検出する方法とは、『本発明に係るプライマー対及びプローブを用いた本発明の検出方法に係る工程4を行う。次いで、各ドロップレット由来の蛍光を蛍光リーダーにより検出することにより、本発明の検出方法に係る工程4で得られた増幅産物の有無を確認する』方法である。
蛍光リーダーにより検出する方法における蛍光リーダーとしては、核酸増幅装置に付属のもの［例えば、QX200 Droplet Reader（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）等］を用いればよい。
【００８０】
［本発明の検出方法の具体例］
（1）DNAの抽出、(2)本発明の検出方法に係る工程1、(3)本発明の検出方法に係る工程2及び（4）本発明の検出方法に係る工程3の具体例については、前述の［本発明の精製方法の具体例］で説明した通りである。本発明の検出方法に係る工程4及び本発明の検出方法に係る工程5の具体例について、以下に説明する。
（5）本発明の検出方法に係る工程4
本発明の検出方法に係る工程3で処理された溶液又はフロースルー液 1〜50μLに、核酸合成基質、核酸合成酵素等を含むデジタルPCR用試薬［例えば、ddPCR（登録商標）Supermix for probes（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）］ 5〜15μL、1〜20μM フォワードプライマー（例えば、h149-f-fox） 0.5〜1.5μL、1〜20μM リバースプライマー（例えば、h149-r-fox） 0.5〜1.5μL及び1〜20μM プローブ（例えば、h149-p-fox） 0.5〜1.5μLを加え、滅菌水で15〜100μLに調製し、デジタルPCR用反応液とする。
次いで、上記デジタルPCR用反応液を核酸増幅装置［例えば、サーマルサイクラ―（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株））製］にセットし、30〜40℃で15〜60分間インキュベートする。その後、ドロップレット作製装置［例えば、QX 200 Droplet Generator（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）又はAutomated Droplet Generator（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）］にてドロップレットを作製する。次いで、上記ドロップレットをウェルプレート（例えば、96ウェルプレート）に分注した後、核酸増幅装置［例えば、サーマルサイクラ―（バイオ・ラッド（株）製）］を用いて、90〜97℃で1〜15分間加熱した後、（1）90〜97℃で5〜35秒間、（2）60〜70℃で10〜90秒間を1サイクルとして、30〜50サイクル加熱することにより、標的領域（例えば、配列番号2で表される塩基配列）を増幅させることができる。
(6)本発明の検出方法に係る工程5
各ドロップレットにおける上記本発明の検出方法に係る工程4で増幅された増幅産物中の蛍光を、蛍光リーダー［例えば、QX200 Droplet Reader（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）等］により検出することにより、上記本発明の検出方法に係る工程4で増幅された増幅産物の有無を確認することができる。
【００８１】
＜本発明の癌の判定方法＞
本発明の癌の判定方法（以下、本発明の判定方法と略記する場合がある。）は、本発明の精製方法により精製された標的領域を有する二本鎖DNA等に対して、メチル化感受性制限酵素による処理を行い、次いで、標的領域を増幅し、その結果に基づいて癌であるか否か判定をするものであり、下記工程1〜7を含むことを特徴とする。
（1）（a）末端に3’突出を生じさせる制限酵素Aを1種以上及び（b）末端に5’突出を生じさせる制限酵素Bを1種以上用いて、標的領域を有する二本鎖DNAから、（i）標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］並びに、（ii）標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］又は／及び（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片を生じさせる工程1、ここで、当該制限酵素Aは当該標的領域中の塩基配列を切断せず、当該制限酵素Bは当該3’突出標的二本鎖DNA断片中の塩基配列を切断しないものである、
（2）前記工程1で生じた、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片並びに、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片を、エキソヌクレアーゼIIIで処理することにより、（ii）5’突出非標的二本鎖DNA断片又は／及び（iii）5’／3’突出非標的二本鎖DNA断片から、それぞれ（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片を生じさせる工程2、
（3）前記工程2で生じた、（iv）標的領域を有さない一本鎖DNA断片及び（i）3’突出標的二本鎖DNA断片を、一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理することにより、（i）3’突出標的二本鎖DNA断片から、（v）標的領域を有しその両端が平滑である二本鎖DNA断片［平滑標的二本鎖DNA断片］を生じさせる工程3、
（4）前記工程3で生じた、（v）平滑標的二本鎖DNA断片を、メチル化感受性制限酵素で処理する工程4、
（5）前記工程4で処理された、（v）平滑標的二本鎖DNA断片中の標的領域を増幅処理に付す工程5、
（6）前記工程5で生じた、増幅産物の有無を確認する工程6、
及び
（7）前記工程6の確認結果に基づいて、癌を判定する工程7を含むことを特徴とするものである。
尚、メチル化感受性制限酵素による処理を行う前までの工程1〜3は前述の本発明の精製方法における工程1〜3と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。また、標的領域を増幅する工程5及び増幅産物の有無を確認する工程6については、前述の本発明の検出方法における工程4及び工程5と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
［二本鎖DNA］、［標的領域］、［癌］、［工程4］及び［工程7］について以下に詳述する。
尚、本発明の判定方法においても、各工程に引き続いて精製工程を行ってもよく、その具体例、好ましい例等は、本発明の精製方法における［精製工程］で説明した通りである。
【００８２】
［本発明の判定方法に係る二本鎖DNA］
本発明の判定方法に係る二本鎖DNAは、CpG配列（−CG−）を含む二本鎖DNAであって、且つ本発明に係る工程1における制限酵素A及び制限酵素Bの作用により、(i)標的領域を有しその両端が3’突出である二本鎖DNA断片［3’突出標的二本鎖DNA断片］並びに、(ii)標的領域を有さずその両端が5’突出である二本鎖DNA断片［5’突出非標的二本鎖DNA断片］又は／及び（iii）標的領域を有さずその両端がそれぞれ5’突出及び3’突出である二本鎖DNA断片［5’ ／3’突出非標的二本鎖DNA断片を生じ得るものであればよく、（1）その両端がそれぞれ突出（3’突出又は／及び5’突出）、（2）その両端がそれぞれ平滑、（3）一方の端が突出（3’突出又は5’突出）且つもう一方の端が平滑、又は（4）環状、の何れであってもよい。
尚、本発明の判定方法に係る二本鎖DNAにおける、標的領域、制限酵素Aの認識配列及び制限酵素Bの認識配列の位置関係、並びに本発明の判定方法に係る二本鎖DNAの抽出については、前述の本発明の精製方法における［二本鎖DNA］と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
【００８３】
［本発明の判定方法に係る標的領域］
本発明の判定方法に係る標的領域としては、本発明の判定方法に係る二本鎖DNA中に存在するシトシンがメチル化されたCpG配列を含む連続した特定の二本鎖DNA部分である。
尚、上記メチル化とは、DNAメチラーゼによる塩基修飾のことであり、シトシンの次にグアニンが現れる2塩基配列であるCpG配列のシトシン塩基の5位等にメチル基が付加した状態を意味する。
本発明の判定方法に係る標的領域の具体例、好ましい例等は、前述の本発明の精製方法における［標的領域］で説明した通りである。
【００８４】
［本発明の判定方法に係る癌］
本発明の判定方法に係る癌とは、制御不能な細胞分裂又は／及び浸潤を通しての隣接組織への直接的な増殖又は／及び転移等に特徴付けられる、疾病又は疾患のことである。本発明の判定方法により判定される癌の具体例としては、細胞癌、腺癌、リンパ腫、白血病、肉腫、中皮腫、神経腫、骨肉腫、胚細胞腫、前立腺癌、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、胃腸癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌、メラノーマ、脳癌、精巣癌、腎臓癌、皮膚癌、甲状腺癌、頭頸部癌、肝臓癌、食道癌、胃癌、大腸癌、骨髄癌、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫等が挙げられ、肺癌、乳癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌又は大腸癌が好ましく、膵臓癌又は大腸癌がより好ましい。
【００８５】
［本発明の判定方法に係る工程4］
本発明の判定方法に係る工程4は、本発明の判定方法に係る工程3で生じた、（v）平滑標的二本鎖DNA断片を、メチル化感受性制限酵素で処理する工程である。
本発明の判定方法に係る工程4におけるメチル化感受性制限酵素とは、認識配列中におけるCpG配列中のシトシンがメチル化されているか否かにより切断活性が変化する制限酵素のことである。
即ち、メチル化感受性制限酵素とは、認識配列がメチル化されたシトシン塩基を含むCpG配列を有する場合、当該認識配列を切断できないが、認識配列がメチル化されたシトシン塩基を含むCpG配列を有さない場合、当該認識配列を切断することができる制限酵素のことである。
本発明の判定方法に係る工程4におけるメチル化感受性制限酵素は、認識する塩基配列が標的領域内に存在するものであれば、何れでもよい。即ち、標的領域に応じて適宜選択されればよい。
本発明の判定方法に係る工程4におけるメチル化感受性制限酵素としては、具体的には、例えば、AatII、AccI、AccII、AciI、AfaI、Aor13HI、Aor51HI、ApaI、ApalI、BglI、BmgT120I、BspT104I、BssHII、BstuI、Cfr10I、ClaI、CpoI、EaeI、Eco52I、FauI、HaeII、HapII、HpaII、HhaI、MluI、NaeI、NheI、NotI、NruI、NsbI、PmaCI、Psp1406I、PvuI、SacII、SalI、Sau3AI、SmaI、SnaBI、VpaK11BI等が挙げられる。
ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の特定領域（配列番号1：267塩基対）、ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の特定領域（配列番号2：149塩基対）又はイヌ由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の特定領域（配列番号3：433塩基対）を標的領域とした場合、本発明の判定方法に係る工程4におけるメチル化感受性制限酵素としては、HapII、HpaII、BstUI、AciI又は／及びFauIが好ましい。
本発明の判定方法に係る工程4におけるメチル化感受性制限酵素のユニット数は、通常、目的のDNA1〜10μgに対して、1〜150ユニット／μLであり、5〜100ユニット／μLが好ましく、10〜50ユニット／μLがより好ましい。
また、複数種のメチル化感受性制限酵素を用いた場合の本発明の判定方法に係る工程4におけるメチル化感受性制限酵素のユニット数についても上記と同様であり、目的のDNA1〜10μgに対して、1〜150ユニット／μLであり、5〜100ユニット／μLが好ましく、10〜50ユニット／μLがより好ましい
本発明の判定方法に係る工程4におけるメチル化感受性制限酵素による処理は、通常20〜50℃で、好ましくは35〜45℃で、通常30〜150分間、好ましくは30〜120分間反応を行えばよい。
また、本発明の判定方法に係る工程4におけるメチル化感受性制限酵素による処理は、pH6〜10の条件の下なされることが好ましく、ここで用いられる緩衝液としては、例えば、MES、ADA、PIPES、ACES、MOPS、BES、TES、HEPES、TRINCE、BICINE等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等を用いればよい。
【００８６】
更に、本発明の判定方法に係る工程4の後、DNA断片を精製するのが好ましい。尚、上記精製については、本発明の精製方法における[精製工程]と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
【００８７】
このように、本発明の判定方法に係る工程4におけるメチル化感受性制限酵素による処理を行うことにより、メチル化されている二本鎖DNAの標的領域は切断されず、メチル化されていない二本鎖DNAの標的領域が切断されるため、本発明の判定方法に係る工程5において、メチル化されている二本鎖DNAの標的領域を特異的且つ高感度に増幅することができる。
【００８８】
［本発明の判定方法に係る工程7］
本発明の判定方法に係る工程7は、本発明の判定方法に係る工程6の結果に基づいて、癌の判定を行う工程である。即ち、本発明の判定方法に係る工程5で増幅された増幅産物の有無の確認の結果に基づいてなされる。
本発明の判定方法に係る工程7における癌の判定とは、本発明の判定方法に係る工程1〜6の結果により得られたデータを用いてなされる。即ち、本発明の判定方法に係る工程5で増幅された目的の増幅産物を検出し、当該増幅産物が検出されたという結果に基づき、癌の判定をすることである。
【００８９】
上記癌の判定対象は、標的領域を含むDNA由来の試料に基づく。
例えば、標的領域を含むDNA由来の試料が組織、細胞等の場合、癌の判定対象は、当該組織、細胞等自体、更には、当該組織、細胞等が由来する動物である。
即ち、当該組織、細胞等自体が癌（化）されているか否かが判定されるのみではなく、当該組織、細胞等が由来する動物が癌に罹患しているか又は当該動物に癌細胞が存在しているか否かも判定される。
一方、標的領域を含むDNA由来の試料が全血、血清、血漿、尿等の体液である場合、癌の判定対象は、以下（i）及び（ii）の通りである。
（i）標的領域を含むDNAが上記全血、血清、血漿、尿等の体液中の細胞（白血球等の血液細胞、各組織由来の細胞、CTC等）に由来する場合には、当該細胞自体、更には、当該細胞が由来する動物である。
即ち、当該細胞自体が癌（化）されているか否かが判定されるのみではなく、当該細胞が由来する動物が癌に罹患しているか又は当該動物に癌細胞が存在しているか否かも判定される。
（ii）標的領域を含むDNAが上記全血、血清、血漿、尿等の体液中のcfDNA、エクソソーム（エキソソーム）等に由来する場合には、癌の判定対象は、上記全血、血清、血漿、尿等の体液に由来する動物である。
即ち、上記全血、血清、血漿、尿等の体液に由来する動物が癌に罹患しているか又は当該動物に癌細胞が存在しているか否かが判定される。
【００９０】
癌の判定対象が癌に罹患している又は当該対象中に癌細胞が存在している場合、本発明の判定方法に係る工程5において、当該標的領域が増幅されるため、増幅産物が得られる。一方、癌の判定対象が癌に罹患していない又は当該対象中に癌細胞が存在していない場合、本発明の判定方法に係る工程5において、標的領域が増幅されないため、増幅産物が検出されない。これは、本発明の判定方法に係る工程4におけるメチル化感受性制限酵素の性質によるものである。
つまり、標的領域がメチル化されている場合、メチル化感受性制限酵素で処理しても、標的領域は切断されないため、本発明の判定方法に係る工程5の増幅処理において標的領域が増幅され、本発明の判定方法に係る工程6において増幅産物が確認される。
一方、標的領域がメチル化されていない場合、メチル化感受性制限酵素により標的領域が切断されるため、本発明の判定方法に係る工程5の増幅処理において標的領域が増幅されず、本発明の判定方法に係る工程6において増幅産物が確認されない。
従って、本発明の判定方法に係る工程6において（a）電気泳動により確認する方法を行った場合、（i）増幅産物が確認された場合、当該標的領域由来の癌の判定対象は癌に罹患している又は当該対象中に癌細胞が存在していると判定することができ、（ii）増幅産物が確認されなかった場合、当該標的領域由来の癌の判定対象は、癌に罹患していない又は当該対象中に癌細胞が存在していないと判定することができる。
一方、本発明の判定方法に係る工程6において（b）蛍光リーダーにより確認する方法を行った場合、（i）予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが少なくとも1つ確認された場合、当該標的領域由来の癌の判定対象は癌に罹患している又は当該対象中に癌細胞が存在していると判定することができ、（ii）予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが確認されなかった場合、当該標的領域由来の癌の判定対象は、癌に罹患していない又は当該対象中に癌細胞が存在していないと判定することができる。
尚、上記閾値については、上記蛍光リーダー［例えば、QX200 Droplet Reader（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）］の閾値設定機能に従って決定してもよく、標的領域を増幅した結果から決定してもよい。
【００９１】
このように本発明の判定方法に係る工程7によれば、増幅産物の有無を確認するのみで、癌の判定を行うことができる。
【００９２】
［本発明の判定方法の具体例］
本発明の判定方法の具体例を、以下に説明する。
尚、（1）DNAの抽出、（2）本発明の判定方法に係る工程1、(3)本発明の判定方法に係る工程2及び(4)本発明の判定方法に係る工程3については、［本発明の精製方法の具体例］で説明した通りである。また、（6）本発明の判定方法に係る工程5及び(7)本発明の判定方法に係る工程6については、［本発明の検出方法の具体例］で説明した通りである。本発明の判定方法に係る工程4及び本発明の判定方法に係る工程7の具体例について、以下に説明する。
【００９３】
（5）本発明の判定方法に係る工程4
本発明の判定方法に係る工程3で処理された溶液又はフロースルー液 5〜50μLに、1〜150ユニット／μLのメチル化感受性制限酵素（例えば、HapII、HpaII、SacII、BstUI、AciI又は／及びFauI） 0.5〜3μL、メチル化感受性制限酵素処理用緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 2.5〜15μLを加え、滅菌水で25〜100μLに調製する。次いで、20〜50℃で30〜150分間反応させることで本発明の判定方法に係る工程４で処理された溶液を得る。
更に、必要に応じて、本発明の判定方法に係る工程4で処理された溶液を、以下のように本発明に係る精製工程に付してもよい。
即ち、上記本発明の判定方法に係る工程4で処理された溶液に、タンパク質変性剤（例えば、グアニジン塩酸塩） 100〜700μL及び緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 100〜700μLをそれぞれ加えて混合し、充填剤を充填したカラム［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）］に移し、1000〜20000×g、室温で1〜5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。その後、緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 100〜700μL及びアルコール（例えば、エタノール） 100〜700μLをそれぞれ加え、1000〜20000×g、室温で1〜5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去する。更に、1000〜20000×g、室温で1〜10分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、緩衝液（例えば、トリス緩衝液） 10〜100μLを加え、1000〜20000×g、室温で1〜5分間遠心分離し、フロースルー液を回収する。
（8）本発明の判定方法に係る工程7
本発明の判定方法に係る工程6の増幅産物の有無の確認の結果、予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが少なくとも１つ確認された場合、「その標的領域由来の癌の判定対象は、癌に罹患している又は当該対象中に癌細胞が存在している。」と判定することができる。一方、予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが確認されなかった場合、「その標的領域由来の癌の判定対象は、癌に罹患していない又は当該対象中に癌細胞が存在していない。」と判定することができる。
【００９４】
＜本発明に係る癌の判定用試薬＞
本発明に係る癌の判定用試薬は、制限酵素A、制限酵素B、エキソヌクレアーゼIII、一本鎖特異的ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素を含むことを特徴とするものである。
本発明に係る癌の判定用試薬に用いられる制限酵素A、制限酵素B、一本鎖特異的ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素については、＜本発明の精製方法＞、＜本発明の検出方法＞及び＜本発明の癌の判定方法＞で説明した通りであり、その具体例及び好ましい例等も同じである。
本発明に係る癌の判定用試薬は、更に、この分野で通常用いられる下記のような試薬類何れか1種以上が含まれていてもよい。
a）DNA精製用のカラム［例えば、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）等］、
b）核酸増幅反応用試薬［例えば、1種又は2種以上のプライマー、プローブ、核酸合成基質、核酸合成酵素等］、
c）核酸増幅産物確認用試薬［例えば、アガロースゲル、ローディング緩衝液、染色用試薬（GeL Red（商標）系染色液、臭化エチジウム等）］、
d）DNA抽出用試薬［例えば、QuickGene SP kit DNA tissue（倉敷紡績（株）製）、NucleoSpin（商標） Plasma XS（マッハライ・ナーゲル（株）製）、MagMAX（商標） Cell-Free DNA Isolation Kit（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製）等］
また、本発明に係る癌の判定用試薬には、本発明の判定方法を実施するための説明書等を含ませておいてもよい。当該「説明書」とは、本発明の判定方法における特徴、原理及び操作手順などが文章又は図表等により実質的に記載されている本発明に係る癌の判定用試薬の取扱い説明書、添付文章或いはパンフレット（リーフレット）等を意味する。
このように本発明に係る癌の判定用試薬により、本発明の判定方法を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。
【００９５】
＜本発明に係る癌の判定を行うためのデータを得る方法＞
本発明に係る癌の判定を行うためのデータを得る方法（以下、本発明に係るデータを得る方法と略記する場合がある。）は、本発明の精製方法により精製された標的領域を有する二本鎖DNAに対して、メチル化感受性制限酵素による処理を行い、次いで、標的領域を増幅し、その結果に基づいて癌であるか否かが判定される対象について、癌の判定を下すためのデータを取得するものである。
即ち、本発明の精製方法に引き続いて、メチル化感受性制限酵素により処理する工程、標的領域を増幅する工程及び増幅産物の有無を確認する工程を行うものであり、具体的には、本発明の判定方法における工程1〜6を行うものである。
尚、メチル化感受性制限酵素による処理を行う前までの工程工程1〜3は、前述した本発明の精製方法における工程1〜3と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
標的領域を増幅する工程5及び増幅産物の有無を確認する工程6は、前述の本発明の検出方法における工程4及び工程5と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
メチル化感受性制限酵素による処理の工程4は、前述の本発明の判定方法における工程4と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
［二本鎖DNA］、［標的領域］及び［癌］は、本発明の判定方法における［本発明の判定方法に係る二本鎖DNA］、［本発明の判定方法に係る標的領域］及び［本発明の判定方法に係る癌］と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
また、本発明に係るデータを得る方法におけるデータとしては、（i）本発明に係るデータを得る方法に係る工程6で得られた結果値（例えば、蛍光強度、電気泳動図等）、（ii）当該結果値を更に多重ロジスティック回帰分析、判別分析、ポアソン回帰分析、重回帰分析、コックスの比例ハザードモデル、パス解析等の多変量解析に付して得られる値、（iii）本発明に係るデータを得る方法に係る工程6で得られた結果値と、基準値（例えば、カットオフ値等）との比較データ（例えば、大小関係を示すデータ）（iv）前述の、標的領域由来の癌の判定対象は癌に罹患している、又は当該対象中に癌細胞が存在しているとを示すデータ等が挙げられ、（i）又は（iii）が好ましく、（i）がより好ましい。
尚、本発明に係るデータを得る方法においても、各工程に引き続いて精製工程を行ってもよく、その具体例、好ましい例等は、本発明の精製方法における［精製工程］で説明した通りである。
このように本発明に係るデータを得る方法によれば、癌の判定を精度よく行うためのデータを取得することができる。
【００９６】
＜本発明に係る癌の判定を行うためのマーカー＞
本発明に係る癌の判定を行うためのマーカー（以下、本発明に係るマーカーと略記する場合がある。）は、本発明の精製方法により精製された標的領域を有する二本鎖DNA等に対して、メチル化感受性制限酵素による処理を行い、次いで、標的領域を増幅することにより得られる増幅産物である。即ち、本発明に係るマーカーの有無によって標的領域由来の癌の判定対象について、癌の判定をすることができるものである。
具体的には、本発明の精製方法に引き続いて、メチル化感受性制限酵素により処理する工程及び標的領域を増幅する工程を行うことにより得られるものであり、上述の本発明の判定方法における工程1〜5を行うことによって得られるものである。
尚、メチル化感受性制限酵素を行う前までの工程1〜3は、前述の本発明の精製方法における工程1〜3と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
標的領域を増幅する工程5は、前述の本発明の検出方法における工程4と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
メチル化感受性制限酵素による処理の工程4は、前述の本発明の判定方法における工程4と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
また、［二本鎖DNA］、［標的領域］及び［癌］は、本発明の判定方法における［本発明の判定方法に係る二本鎖DNA］、［本発明の判定方法に係る標的領域］及び［本発明の判定方法に係る癌］と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
尚、本発明に係るマーカーを得るための各工程においても、精製工程を行ってもよく、その具体例、好ましい例等は、本発明の精製方法における［精製工程］で説明した通りである。
本発明に係るマーカーとしては、具体的には、（i）配列番号1で表される塩基配列であって、該塩基配列における少なくとも1つのシトシンがメチル化されている塩基配列、（ii）配列番号2で表される塩基配列であって、該塩基配列における少なくとも1つのシトシンがメチル化されている塩基配列及び（iii）配列番号3で表される塩基配列であって、該塩基配列における少なくとも1つのシトシンがメチル化されている塩基配列が挙げられ、（i）又は（ii）が好ましく、（ii）がより好ましい。
尚、上記（i）〜（iii）におけるシトシンは、当該塩基配列における何れのシトシンでもよいが、CpG配列由来のシトシンであることが好ましい。
このように本発明に係るマーカーを用いることにより、本発明の判定方法を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。
【００９７】
＜本発明に係るメチル化判定方法＞
本発明に係るメチル化判定方法は、本発明の精製方法により精製された標的領域を有する二本鎖DNA等に対して、メチル化感受性制限酵素による処理を行い、次いで、標的領域を増幅し、その結果に基づいて標的領域がメチル化されているか否かを判定するものである。
即ち、本発明の精製方法に引き続いて、メチル化感受性制限酵素により処理する工程、標的領域を増幅する工程、増幅産物の有無を確認する工程及びメチル化を判定する工程を行うものであり、本発明の判定方法における工程1〜6及び
（7）工程6の結果に基づいて、標的領域がメチル化されているか否かを判定する工程7を含むことを特徴とするものである。
尚、メチル化感受性制限酵素による処理を行う前までの工程1〜3は、前述の本発明の精製方法における工程1〜3と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
標的領域を増幅する工程5及び増幅産物の有無を確認する工程6は、前述の本発明の検出方法における工程4及び工程5と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
メチル化感受性制限酵素による処理の工程4は、前述の本発明の判定方法における工程4と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
また、［二本鎖DNA］及び［標的領域］は、本発明の判定方法における［本発明の判定方法に係る二本鎖DNA］及び［本発明の判定方法に係る標的領域］と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
尚、本発明に係るメチル化判定方法においても、各工程に引き続いて精製工程を行ってもよく、その具体例、好ましい例等は、本発明の精製方法における［精製工程］で説明した通りである。
［工程7］について以下に詳述する。
【００９８】
［本発明に係るメチル化判定方法における工程7］
本発明に係るメチル化判定方法における工程7は、本発明に係るメチル化判定方法における工程6の結果に基づいて標的領域がメチル化されているか否かの判定を行う工程である。
即ち、本発明に係るメチル化判定方法における標的領域がメチル化されているか否かの判定は、本発明に係るメチル化判定方法における工程5で増幅された増幅産物の有無の確認の結果に基づいてなされる。標的領域がメチル化されている場合、本発明に係るメチル化判定方法における工程5において、当該標的領域が増幅されるので、増幅産物が得られる。一方、標的領域がメチル化されていない場合、本発明に係るメチル化判定方法における工程5において、当該標的領域が増幅されないので、増幅産物が得られない。これは、本発明に係るメチル化判定方法における工程4におけるメチル化感受性制限酵素の性質によるものである。
つまり、標的領域がメチル化されている場合、メチル化感受性制限酵素で処理しても、標的領域は切断されないので、本発明に係るメチル化判定方法における工程5の増幅反応において標的領域が増幅され、本発明に係るメチル化判定方法における工程6において増幅産物が確認される。
一方、標的領域がメチル化されていない場合、メチル化感受性制限酵素により標的領域が切断されるので、本発明に係るメチル化判定方法における工程5において標的領域が増幅されず、本発明に係るメチル化判定方法における工程6において増幅産物が確認されない。
従って、本発明に係るメチル化判定方法における工程6において（a）電気泳動により確認する方法を行った場合、（i）増幅産物が確認された場合、当該標的領域はメチル化されていると判定することができ、（ii）増幅産物が確認されなかった場合、当該標的領域はメチル化されていないと判定することができる。
一方、本発明に係るメチル化判定方法における工程6において（b）蛍光リーダーにより確認する方法を行った場合、（i）予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが少なくとも１つ確認された場合、当該標的領域はメチル化されていると判定することができ、（ii）予め設定した閾値を超える蛍光を発するドロップレットが確認されなかった場合、当該標的領域はメチル化されていないと判定することができる。
尚、上記閾値については、上記蛍光リーダー［例えば、QX200 Droplet Reader（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）］の閾値設定機能に従って決定してもよく、標的領域を増幅した結果から決定してもよい。
【００９９】
このように、本発明に係るメチル化判定方法における工程7によれば、増幅産物の有無を確認するのみで、メチル化の判定を行うことができる。
従って、本発明に係るメチル化判定方法は、標的領域がメチル化されているか否かの判定を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。
【０１００】
＜本発明に係るメチル化されたDNAの増幅方法＞
本発明に係るメチル化されたDNAの増幅方法は、本発明の精製方法により精製された標的領域を有する二本鎖DNA等に対して、メチル化感受性制限酵素による処理を行い、次いで、標的領域を増幅するものである。
即ち、本発明の精製方法に引き続いて、メチル化感受性制限酵素により処理する工程及び標的領域を増幅する工程を行うものであり、本発明の判定方法における工程1〜5を行うものである。
尚、メチル化感受性制限酵素による処理を行う前までの工程1〜3は、前述の本発明の精製方法における工程1〜3と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
標的領域を増幅する工程5は、前述の本発明の検出方法における工程4と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
メチル化感受性制限酵素による処理の工程4は、前述の本発明の判定方法における工程4と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
また、［二本鎖DNA］、及び［標的領域］は、本発明の判定方法における［本発明の判定方法に係る二本鎖DNA］及び［本発明の判定方法に係る標的領域］と同じであり、その具体例、好ましい例等も同じである。
尚、本発明に係るメチル化されたDNAの増幅方法においても、各工程に引き続いて精製工程を行ってもよく、その具体例、好ましい例等は、本発明の精製方法における［精製工程］で説明した通りである。
このように、本発明に係るメチル化されたDNAの増幅方法により、メチル化されたDNAの増幅を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。
【０１０１】
＜本発明に係るメチル化判定用試薬＞
本発明に係るメチル化判定用試薬は、制限酵素A、制限酵素B、エキソヌクレアーゼIII、一本鎖特異的ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素を含むことを特徴とするものであり、その具体例、好ましい例等は＜本発明に係る癌の判定用試薬＞で説明した通りである。
また、本発明に係るメチル化判定用試薬には、本発明に係るメチル化判定方法を実施するための説明書等を含ませておいてもよい。当該「説明書」とは、本発明に係るメチル化判定方法における特徴、原理及び操作手順などが文章又は図表等により実質的に記載されている本発明に係るメチル化判定用試薬の取扱い説明書、添付文章或いはパンフレット（リーフレット）等を意味する。
このように本発明に係るメチル化判定用試薬により、本発明に係るメチル化判定方法を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。
【０１０２】
以下に、実施例等により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等により何等限定されるものではない。
【実施例】
【０１０３】
実験例１  各種DNAのメチル化状態の確認
後述の実施例で使用する試料に由来するDNAについて、バイサルファイト法によるメチル化状態の確認を行った。【０１０４】
（1）条件の設定
下記の通りに、試料及びメチル化状態の確認領域を設定した。
＜試料＞
・ヒト人工多能性幹細胞（正常細胞）
・ヒト正常全血
・大腸癌細胞（癌細胞）
＜メチル化状態の確認領域＞
・図1で表されるヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の、配列番号１で表される塩基配列からなる領域（267塩基対）のうち、四角で囲まれた3つの、CpG配列を含む配列（CCGG）
・図2で表されるヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の、配列番号2で表される塩基配列からなる領域（149塩基対）のうち、四角で囲まれた７つの、CpG配列を含む配列（CCGG及びGCGG）【０１０５】
（2）DNAの抽出
上記試料（ヒト人工多能性幹細胞、ヒト正常全血及び大腸癌細胞）より、QuickGene SP kit DNA tissue（倉敷紡績（株）製）を使用して、DNAをそれぞれ抽出した。【０１０６】
（3）バイサルファイト反応
上記（2）で得たDNA 400ngそれぞれを、10μLの滅菌水に溶解した。
その後、Episight Bisulfite Conversion kit（富士フイルム和光純薬（株）製）を使用して、当該溶液それぞれをキット記載の方法に準じてバイサルファイト反応に付した。【０１０７】
（4）PCR増幅反応
上記（3）で得たバイサルファイト反応産物含有溶液 1μLそれぞれに、滅菌水 17.3μL、10×バッファー for Blend Taq（東洋紡（株）製） 2.5μL、2.5ユニット/μL Blend Taq−Plus（東洋紡（株）製） 0.2μL、2mM dNTPs（東洋紡（株）製） 2μL、10μM フォワードプライマー［GGAATTAGTGGGGGCAGCCAGGCCCCAGG（配列番号11）］ 1μL及び10μM リバースプライマー［CCCAAAAACTACCCTTACCAAACTAATC（配列番号12）］ 1μLを加えて混合し、これをPCR用反応液とした。
次いで、上記PCR用反応液それぞれを、サーマルサイクラ―（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）にセットし、下記反応条件でPCR増幅反応を行った。
※反応条件
94℃  2分間
↓
94℃  10秒間→55℃  10秒間→72℃  20秒間を1サイクルとして36サイクル
↓
72℃  2分間
尚、上記PCR増幅反応により得られる増幅産物は、ヒト由来のFOXB2遺伝子のプロモーター領域内の、配列番号13で表される塩基配列からなる領域（355塩基対）であり、配列番号1及び2で表される塩基配列の一部を有するものである。【０１０８】
（5）PCR増幅産物のクローニング
上記（4）で得たPCR増幅産物それぞれを、1.5％アガロースゲルにて電気泳動した。次いで、GeLRed核酸ゲル染色液（富士フイルム和光純薬（株）製）で染色し、QIAquick  Gel  Extraction  kit（（株）キアゲン製）を使用して、PCR増幅産物をそれぞれ回収した。【０１０９】
（6）PCR増幅産物に制限酵素認識部位を付加するためのPCR増幅反応
上記（5）で得たPCR増幅産物含有溶液 1μLそれぞれに、蒸留水17.3μL、10×バッファー for Blend Taq（東洋紡（株）製） 2.5μL、2.5ユニット/μL Blend Taq−PLus（東洋紡（株）製） 0.2μL、2mM dNTPs（東洋紡（株）製） 2μL、10μM フォワードプライマー 1μL及び10μM リバースプライマー 1μLを加えて混合し、これをPCR用反応液とした。
尚、上記フォワードプライマーは、上記（4）のフォワードプライマーに制限酵素（HindIII）認識部位（配列中の括弧内）を付加したものであり、下記塩基配列からなる。また、上記リバースプライマーは、上記（4）のリバースプライマーに制限酵素（BamHI）認識部位（配列中の括弧内）を付加したものであり、下記塩基配列からなる。
フォワードプライマー：（TTACCATAAGCTT）GGAATTAGTGGGGGCAGCCAGGCCCCAGG（配列番号14）
リバースプライマー：（TAATTAAGGATCC）CCCAAAAACTACCCTTACCAAACTAATC（配列番号15）
次いで、上記PCR用反応液それぞれを、サーマルサイクラ―（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）にセットし、下記反応条件でPCR増幅反応を行った。
※反応条件
94℃  2分間
↓
94℃  10秒間→55℃  10秒間→72℃  20秒間を1サイクルとして12サイクル
↓
72℃  2分間
次いで、PCR増幅産物含有溶液  25μLそれぞれに、6×Loading Buffer Double Dye（（株）ニッポンジーン製） 5μLを加えて混合し、1.5％アガロースゲルにて電気泳動した。次いで、GelRed核酸ゲル染色液（富士フイルム和光純薬（株）製）で染色し、QIAquick Gel Extraction Kit（（株）キアゲン製）を使用して、PCR増幅産物それぞれを回収した。【０１１０】
（7）制限酵素処理
上記（6）で得たPCR増幅産物含有溶液 43μLそれぞれに、10×Bバッファー（（株）ニッポンジーン製） 5μL、20ユニット/μL HindIII（（株）ニッポンジーン製） 1μL及び20ユニット/μL BamHI（（株）ニッポンジーン製） 1μLを混合した後、37℃で1時間反応させた。同様にpUC19（（株）ニッポンジーン製） 500ngに蒸留水を加えて43μLに調製し、20ユニット/μL HindIII（（株）ニッポンジーン製） 1μL及び20ユニット/μL BamHI（（株）社ニッポンジーン製） 1μLを加えた後、37℃で1時間反応させた。次いで、5.5M グアニジン塩酸塩（富士フイルム和光純薬（株）製）を250μLそれぞれ加えて混合した後、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、12000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。次いで、2mM Tris−HCL pH7.5（（株）ニッポンジーン製）を500μLそれぞれ加え、12000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、12000×g、室温で1分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、2mM Tris−HCL pH8.0（（株）ニッポンジーン製）を25μLそれぞれ加え、12000×g、室温で１分間遠心分離することにより、制限酵素（HindIII及びBamHI）により処理した各PCR増幅産物及びpUC19をそれぞれ回収した。【０１１１】
（8）形質転換
上記（7）で得たPCR増幅産物含有溶液 1μLそれぞれに、制限酵素により処理したpUC19 1μL、DNA Ligation Kit Mighty Mix（タカラバイオ（株）製） 2μLを加えて混合し、16℃で1時間反応させた。次いで、全量4μLそれぞれをECOS（商標）CompetentE. coli DH5α（（株）ニッポンジーン製）に形質転換し、アンピシリン添加LB寒天培地にスプレッドした。その後、コロニーをアンピシリン添加LB培地において、37℃で16時間培養した。その後、プラスミドキットSII（倉敷紡績（株）製）を使用して、プラスミドをそれぞれ抽出した。次いで、得られたプラスミドを用いて、タカラバイオ（株）のシークエンス受託サービスにて塩基配列をそれぞれ解読した。
その結果を図3に示す。【０１１２】
図3は、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト正常全血及び大腸癌細胞の塩基配列解読結果について、メチル化状態の確認領域である、CpG配列を含む配列（CCGG及びGCGG）のシトシンがメチル化シトシン又は非メチル化シトシンの何れかであるかを表したものである。
図3中の丸1〜丸3は、図１及び2中の丸1〜丸3に該当する。また、図3中の丸4〜7は、図2中の丸4〜7に該当する。
尚、図3中の○は、CpG配列のシトシンが非メチル化シトシンであることを、●は、CpG配列のシトシンがメチル化シトシンであること表す。
図3の結果から明らかな通り、ヒト人工多能性幹細胞及びヒト正常全血のメチル化状態の確認領域である、CpG配列を含む配列（CCGG及びGCGG）のシトシンは、非メチル化シトシンであることが分かった。
一方、大腸癌細胞のメチル化状態の確認領域である、CpG配列を含む配列（CCGG及びGCGG）のシトシンは、メチル化シトシンであることが分かった。【０１１３】
実施例１  正常細胞及び癌細胞のFOXB2遺伝子の解析
正常細胞及び癌細胞に由来するDNAについて、FOXB2遺伝子の解析を行った。【０１１４】
（1）条件の設定
実施例1に用いた試料、当該試料に由来する鋳型DNA量及び標的領域は表4に示す通りである。【０１１５】
【表４】
2019163602.tif 000033
【０１１６】
（2）DNAの抽出
QuickGene SP kit DNA tissue（倉敷紡績（株）製）により、その現品説明書に従ってヒト人工多能性幹細胞及び大腸癌細胞に由来するDNA（100μg及び3μg）をそれぞれ抽出した。【０１１７】
（3）制限酵素A（PstI）及び制限酵素B（MboI）による処理並びに精製
上記（2）で得たDNAそれぞれに、10×CutSmart Buffer（ニュー・イングランド・バイオラボ（株）製） 20μL、100ユニット/μLのPstI（ニュー・イングランド・バイオラボ（株）製） 1μL及び10ユニット/μLのMboI（タカラバイオ（株）製） 5μLを加え、滅菌水で200μLに調製した。その後、37℃で1時間反応させた。
次いで、5.5M グアニジン塩酸塩（富士フイルム和光純薬（株）製） 500μL及び20mM Tris−HCL（pH7.0）（（株）ニッポンジーン製） 500μLをそれぞれ加えて混合した後、600μLずつ2回に分けてエコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、25000×g、室温で2分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。その後、2mM Tris−HCL（pH7.5）（（株）ニッポンジーン製） 600μL及び80％ エタノール（富士フイルム和光純薬（株）製） 600μLをそれぞれ加え、12000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、12000×g、室温で5分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、2mM Tris−HCL（pH8.0）（（株）ニッポンジーン製） 30μLをそれぞれ加え、12000×g、室温で1分間遠心分離することにより、制限酵素A（PstI）及び制限酵素B（MboI）により処理したDNAをそれぞれ得た。【０１１８】
（4）エキソヌクレアーゼIIIによる処理並びに精製
上記（3）で得たDNA含有Tris−HCL溶液 30μLそれぞれに、10×エキソヌクレアーゼIIIバッファー（タカラバイオ（株）製） 10μL及び200ユニット／μLのエキソヌクレアーゼIII（タカラバイオ（株）製） 2μLを加え、滅菌水で100μLに調製した。その後、37℃で1時間反応させた後、0.5M EDTA（（株）ニッポンジーン製） 1μLをそれぞれ加えた。
次いで、5.5M グアニジン塩酸塩（富士フイルム和光純薬（株）製） 500μL及び20mM Tris−HCL（pH7.0）（（株）ニッポンジーン製） 500μLをそれぞれ加えて混合した後、600μLずつ2回に分けてエコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、25000×g、室温で2分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。その後、2mM Tris−HCL（pH7.5）（（株）ニッポンジーン製） 600μL及び80％ エタノール（富士フイルム和光純薬（株）製） 600μLをそれぞれ加え、12000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、12000×g、室温で5分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、2mM Tris−HCL（pH8.0）（（株）ニッポンジーン製） 30μLをそれぞれ加え、12000×g、室温で1分間遠心分離することにより、エキソヌクレアーゼIIIにより処理したDNAをそれぞれ得た。【０１１９】
（5）一本鎖特異的ヌクレアーゼ（S1ヌクレアーゼ）による処理並びに精製
上記（4）で得たDNA含有Tris−HCL溶液 30μLそれぞれに、10×S1ヌクレアーゼバッファー（タカラバイオ（株）製） 10μL及び180ユニット/μLのS1ヌクレアーゼ 2μLを加え、滅菌水で100μLに調製した。その後、23℃で20分間反応させた後、0.5M EDTA（（株）ニッポンジーン製） 1μLをそれぞれ加えた。
次いで、5.5M グアニジン塩酸塩（富士フイルム和光純薬（株）製） 500μL及び20mM Tris−HCL（pH7.0）（（株）ニッポンジーン製） 500μLをそれぞれ加えて混合した後、600μLずつ2回に分けてエコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、25000×g、室温で2分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。その後、2mM Tris−HCL（pH7.5）（（株）ニッポンジーン製） 600μL及び80％ エタノール（富士フイルム和光純薬（株）製） 600μLをそれぞれ加え、12000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、12000×g、室温で5分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、2mM Tris−HCL（pH8.0）（（株）ニッポンジーン製） 30μLをそれぞれ加え、12000×g、室温で1分間遠心分離することにより、一本鎖特異的ヌクレアーゼ（S1ヌクレアーゼ）により処理したDNAをそれぞれ得た。【０１２０】
（6）メチル化感受性制限酵素（HapII）による処理並びに精製
上記（5）で得たDNA含有Tris−HCL溶液 30μLそれぞれに、10×Lバッファー（タカラバイオ（株）製） 10μL及び50ユニット/μLのHapII（タカラバイオ（株）製） 2μLを加え、滅菌水で100μLに調製した。その後、37℃で2時間反応させた。
次いで、5.5M グアニジン塩酸塩（富士フイルム和光純薬（株）製） 500μL及び20mM Tris−HCL（pH7.0）（（株）ニッポンジーン製） 500μLをそれぞれ加えて混合した後、600μLずつ2回に分けてエコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、25000×g、室温で2分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。その後、2mM Tris−HCL（pH7.5）（（株）ニッポンジーン製） 600μL及び80％ エタノール（富士フイルム和光純薬（株）製） 600μLをそれぞれ加え、12000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、12000×g、室温で5分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、2mM Tris−HCL（pH8.0）（（株）ニッポンジーン製） 30μLをそれぞれ加え、12000×g、室温で1分間遠心分離することにより、メチル化感受性制限酵素（HapII）により処理したDNAをそれぞれ得た。
尚、HapIIが認識する配列は、図1で表されるヒト由来のFOXB2遺伝子プロモーター領域内の配列番号1で表される塩基配列からなる領域（267塩基対）のうち、四角で囲まれた3つ（丸1、丸2及び丸3）の、CpG配列を含む配列（CCGG）である。【０１２１】
（7）増幅反応
上記（6）で得たDNA含有Tris−HCL溶液 1μLそれぞれに、10×KOD−Plus−Ver. 2 Buffer（東洋紡（株）製） 1.5μL、1ユニット/μLのKOD−Plus−Ver. 2（東洋紡（株）製） 0.2μL、2mM dNTPs（東洋紡（株）製） 1.5μL、5μM フォワードプライマー（h267-f-fox） １μL及び5μM リバースプライマー（h267-r-fox）を加え、滅菌水で15μLに調製し、これをPCR用反応液とした。
尚、上記プライマーにより得られる増幅産物の大きさ（塩基対数）は、267塩基対（配列番号1）である。
また、鋳型として上記（5）で得たものを用いた以外は、上記と同様にしてPCR用反応液を調整し、これをコントロールとした。
上記PCR用反応液それぞれをサーマルサイクラ―（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）にセットし、下記反応条件でPCRを行った。
※反応条件
94℃  2分間
↓
96℃  5秒間→68℃  20秒間を1サイクルとして40サイクル
↓
68℃  2分間【０１２２】
（8）電気泳動
上記（7）で得た増幅産物含有溶液 15μLそれぞれに、6×Loading Buffer Double Dye（（株）ニッポンジーン製） 3μLを加えて混合した後、該混合物を2％アガロースゲルにて電気泳動した。次いで、GeLRed核酸ゲル染色液（富士フイルム和光純薬（株）製）で染色し、UV照射装置により増幅産物をそれぞれ確認した。また、その結果を図4に示す。【０１２３】
また、図4の各レーンにおける試料、試料に由来する鋳型DNA量及び標的領域を表5にまとめた。【０１２４】
【表５】
2019163602.tif 000034
【０１２５】
図4の結果より、ヒト人工多能性幹細胞に由来するDNA（100μg）を、制限酵素A、制限酵素B、エキソヌクレアーゼIII、一本鎖特異的ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素により処理し、本発明に係るプライマー対を用いてPCR増幅反応を行った場合（レーン2）、何れも目的の増幅産物［ヒト由来のFOXB2遺伝子の特定領域（267塩基対、配列番号1）］は確認されず、標的領域は得られていないことが分かった。
従って、標的領域はメチル化感受性制限酵素により切断されており、「標的領域はメチル化されていない。」と判定することができた。また、「試料（ヒト人工多能性幹細胞）は、正常細胞である。」と判定することもできた。
一方、大腸癌細胞に由来するDNA（3μg）をメチル化感受性制限酵素により処理し、本発明に係るプライマー対を用いてPCR増幅反応を行った場合（レーン4）、目的の増幅産物［ヒト由来のFOXB2遺伝子のうちの特定領域（267塩基対、配列番号1）］は確認され、標的領域は得られていることが分かった。
従って、標的領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、「標的領域はメチル化されている。」と判定することができた。また、「試料（大腸癌細胞）は、癌細胞である。」と判定することもできた。【０１２６】
実施例1の結果より、本発明の方法によれば、試料（細胞）が癌細胞であるか否かの判定を簡便且つ精度よく行えることが分かった。【０１２７】
実施例2  ヒト正常全血におけるFOXB2遺伝子の解析
試料、試料に由来する鋳型DNA量及び標的領域を表6の通りに設定し、実施例1と同様の方法により、増幅産物の確認を行った。その結果を図5に示す。【０１２８】
【表６】
2019163602.tif 000035
【０１２９】
図5の結果より、ヒト正常全血由来のDNA（60.5μg）を、制限酵素A、制限酵素B、エキソヌクレアーゼIII、一本鎖特異的ヌクレアーゼ及びメチル化感受性制限酵素により処理し、本発明に係るプライマー対を用いてPCR増幅反応を行った場合（レーン2）、目的の増幅産物［ヒト由来のFOXB2遺伝子のうちの特定領域（267塩基対、配列番号1）］は確認されず、標的領域は得られていないことが分かる。
従って、標的領域はメチル化感受性制限酵素により切断されており、「標的領域はメチル化されていない。」と判定することができた。また、「試料（ヒト正常全血）中に癌細胞は存在しない。」又は「試料（ヒト正常全血）に由来する対象（ヒト）は癌に罹患していない。」と判定することもできた。【０１３０】
実施例3  癌患者全血及びヒト正常全血におけるFOXB2遺伝子の解析
膵臓癌患者（ステージIV）全血及びヒト正常全血に由来するDNAについて、FOXB2遺伝子の解析を行った。【０１３１】
（1）条件の設定
実施例3に用いた試料、当該試料に由来する鋳型DNA量及び標的領域は表7に示す通りである。【０１３２】
【表７】
2019163602.tif 000036
【０１３３】
（2）DNAの抽出
NucleoSpin（商標） Plasma XS（マッハライ・ナーゲル（株）製）により、その現品説明書に従って、膵臓癌患者由来の全血及びヒト正常全血よりDNA 2μgをそれぞれ抽出した。【０１３４】
（3）制限酵素A（PstI）及び制限酵素B（BamHI及びHindIII）による処理並びに精製
（2）で得たDNAそれぞれに、10×CutSmart Buffer（NEB（株）製） 10μL、100ユニット/μL PstI（NEB（株）製） １μL、100ユニット/μL BamHI（NEB（株）製） 1μL及び100ユニット/μL HindIII（NEB（株）製） 1μLを加え、滅菌水で全量100μLにした。その後、37℃で2時間反応させた。次いで、5.5M グアニジン塩酸塩（富士フイルム和光純薬（株）製） 500μL及び20mM Tris−HCL pH7.0（（株）ニッポンジーン製） 500μLをそれぞれ加えて混合した後、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、13000×g、室温で2分間遠心し、チューブ内の溶液を除去した。次いで、2mM Tris−HCL pH7.5（（株）ニッポンジーン製） 600μL及び80％エタノール（富士フイルム和光純薬（株）製） 600μLをそれぞれ加え、13000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、13000×g、室温で3分間遠心分離した後、それぞれ新しいチューブに交換し、滅菌水 50μLをそれぞれ添加し、13000×g、室温で1分間遠心分離することにより、制限酵素A（PstI）及び制限酵素B（BamHI及びHindIII）により処理したDNAをそれぞれ得た。【０１３５】
（4）エキソヌクレアーゼIIIによる処理及び精製
上記（3）で得たDNA含有Tris−HCL溶液 50μLに、10×エキソヌクレアーゼIIIバッファー（タカラバイオ（株）製） 10μL及び200ユニット／μLのエキソヌクレアーゼIII（タカラバイオ（株）製） 1μLを加え、滅菌水で100μLに調製した。その後、23℃で1時間反応させた後、0.5M EDTA（（株）ニッポンジーン製） 1μLをそれぞれ加えた。
次いで、5.5M グアニジン塩酸塩（富士フイルム和光純薬（株）製） 500μL及び20mM Tris−HCL（pH7.0）（（株）ニッポンジーン製） 500μLをそれぞれ加えて混合した後、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、3000×g、室温で2分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。その後、2mM Tris−HCL（pH7.5）（（株）ニッポンジーン製） 600μL及び80％ エタノール（富士フイルム和光純薬（株）製） 600μLをそれぞれ加え、13000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、13000×g、室温で5分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、滅菌水 50μLをそれぞれ加え、13000×g、室温で1分間遠心分離することにより、エキソヌクレアーゼIIIにより処理したDNAをそれぞれ得た。【０１３６】
（5）一本鎖特異的ヌクレアーゼ（S1ヌクレアーゼ）による処理並びに精製
上記（3）で得たDNA含有滅菌水 50μLそれぞれに、10×S1ヌクレアーゼバッファー（タカラバイオ（株）製） 10μL及び180ユニット/μLのS1ヌクレアーゼ 1μLを加え、滅菌水で100μLに調製した。その後、23℃で15分間反応させた。
次いで、5.5M グアニジン塩酸塩（富士フイルム和光純薬（株）製） 500μL及び20mM Tris−HCL（pH7.0）（（株）ニッポンジーン製） 500μLをそれぞれ加えて混合した後、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、3000×g、室温で2分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。その後、2mM Tris−HCL（pH7.5）（（株）ニッポンジーン製） 600μL及び80％  エタノール（富士フイルム和光純薬（株）製） 600μLをそれぞれ加え、13000×g、室温で1分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、13000×g、室温で5分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、滅菌水 50μLを加え、13000×g、室温で1分間遠心分離することにより、一本鎖特異的ヌクレアーゼ（S1ヌクレアーゼ）により処理したDNAをそれぞれ得た。【０１３７】
（6）メチル化感受性制限酵素（HpaII及びAciI）による処理並びに精製
上記（5）で得たDNA含有滅菌水 50μLそれぞれに、10×CutSmart Bufferバッファー（NEB（株）製） 10μL、50ユニット/μL HpaII（NEB（株）製） 1μL及び10ユニット/μL AciI（NEB（株）製）を加え、滅菌水で100μLに調製した。その後、37℃で1時間反応させた。
次いで、5.5M グアニジン塩酸塩（富士フイルム和光純薬（株）製） 500μL及び20mM Tris−HCL（pH7.0）（（株）ニッポンジーン製） 500μLをそれぞれ加えて混合した後、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、3000×g、室温で2分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。その後、2mM Tris−HCL（pH7.5）（（株）ニッポンジーン製） 600μL及び80％  エタノール（富士フイルム和光純薬（株）製） 600μLをそれぞれ加え、13000×g、室温で5分間遠心分離し、チューブ内の溶液を除去した。更に、12000×g、室温で5分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、滅菌水 50μLをそれぞれ加え、13000×g、室温で1分間遠心分離することにより、メチル化感受性制限酵素（HpaII及びAciI）により処理したDNAをそれぞれ得た。
尚、HpaIIが認識する配列は、図2で表されるヒト由来のFOXB2遺伝子プロモーター領域内の配列番号2で表される塩基配列からなる領域（149塩基対）のうち、四角で囲まれた3つ（丸1、丸2及び丸3）の、CpG配列を含む配列（CCGG）である。
また、AciIが認識する配列は、図2で表されるヒト由来のFOXB2遺伝子プロモーター領域内の配列番号2で表される塩基配列からなる領域（149塩基対）のうち、四角で囲まれた4つ（丸4、丸5、丸6及び丸7）の、CpG配列を含む配列（5’-CCGC-3’, 3’-GGCG-5’）である。【０１３８】
（7）増幅反応
上記（6）で得たDNA含有滅菌水  3μLに、20μM フォワードプライマー（h149-f-fox） 1μL、20μM リバースプライマー（h149-r-fox） 1μL、10μM プローブ[h149-p-fox（5’末端をFAM、3’末端をBHQ1で標識）] 0.6μL、20μM フォワードプライマー（配列番号16で表される塩基配列Genbank Accession No. NG_007073、7259-7283）1μL、20μM リバースプライマー（配列番号17で表される塩基配列：Genbank Accession No. NG_007073、7383-7407） 1μL、10μM プローブ［配列番号18で表される塩基配列（5’末端をHEX、3’末端をBHQ1で標識）：Genbank Accession No. NG_007073、7342-7366］ 0.6μM、ddPCR（登録商標）Supermix for Probes（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製） 11μL及び50ユニット/μL HpaII 0.3μLを加え、滅菌水で全量22μLに調製し、これをデジタルPCR用反応液とした。その後、上記デジタルPCR用反応液をサーマルサイクラー（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）にセットし、37℃で30分間反応させた。次いで、Automated Droplet Generator（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）にてドロップレットを作成し、このドロップレットを96ウェルプレートに分注した後、サーマルサイクラー（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）にて下記反応条件でデジタルPCR法による増幅反応を行った。
下記反応条件でPCRを行った。
※反応条件
95℃  10分間
↓
94℃  30秒間→62℃  1分間を1サイクルとして40サイクル
↓
98℃  10分間
尚、上記配列番号16及び17で表される塩基配列からなるプライマー、並びに配列番号18で表される塩基配列からなるプローブは、内在性コントロールとして選択したGAPDH遺伝子の特定領域（配列番号19：Genbank Accession No. NG_007073、7259-7407）を増幅するためのものである。【０１３９】
（8）蛍光リーダーによる増幅産物の確認
上記(7)で得た増幅産物を含有する各ドロップレット由来の蛍光を、QX200 Droplet Reader（バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製）にて検出することにより、増幅産物の確認を行った。
FOXB2遺伝子の解析結果を図6のAに、GAPDH遺伝子の解析結果を図6のBにそれぞれ示す。
尚、図6のA及びBにおける縦軸は蛍光強度を、横軸はドロップレット数を示す。
また、陽性又は陰性の判定の基準となる閾値については、FOXB2遺伝子の解析については、FOXB2遺伝子の解析結果より、蛍光強度8000とした。また、GAPDH遺伝子の解析については、GAPDH遺伝子の解析結果より、蛍光強度4000とした。
従って、FOXB2遺伝子の解析については、蛍光強度8000を超えるドロップレットが少なくとも1つあった場合、陽性（目的の増幅産物が得られた）と判定し、蛍光強度8000を超えるドロップレットが存在しなかった場合、陰性（目的の増幅産物が得られなかった）と判定した。また、GAPDH遺伝子の解析については、蛍光強度4000を超えるドロップレットが少なくとも1つあった場合、陽性（目的の増幅産物が得られた）と判定し、蛍光強度4000を超えるドロップレットが存在しなかった場合、陰性（目的の増幅産物が得られなかった）と判定した。
図６における試料、標的領域、陽性ドロップレット数、陰性ドロップレット数、総ドロップレット数及び閾値について、表8並びに表9に示す。【０１４０】
【表８】
2019163602.tif 000037
【０１４１】
【表９】
2019163602.tif 000038
【０１４２】
図6のA及び表8より、膵臓癌患者由来の全血を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認できたことから、目的の増幅産物［FOXB2遺伝子の特定領域：配列番号2で表される塩基配列からなる領域（149塩基対）］が得られていることが分かった。
また、ヒト正常全血を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認できたことから、目的の増幅産物[FOXB2遺伝子の特定領域：配列番号2で表される塩基配列からなる領域（149塩基対）]が得られていないことが分かった。【０１４３】
図6のB及び表9より、膵臓癌患者由来の全血及びヒト正常全血を用いた場合、閾値を超える蛍光を発する陽性ドロップレットが確認できたことから、目的の増幅産物［GAPDH遺伝子の特定領域：配列番号19で表される塩基配列からなる領域（149塩基対）］が得られていることが分かった。【０１４４】
従って、膵臓癌患者由来の全血については、標的領域はメチル化感受性制限酵素により切断されておらず、「標的領域はメチル化されている。」と判定することができた。また、「試料（膵臓癌患者由来の全血）に由来する対象（膵臓癌患者）は、癌に罹患している又は当該対象（膵臓癌患者）中に癌細胞が存在している」と判定することもできた。
一方、ヒト正常全血については、標的領域はメチル化感受性制限酵素により切断されており、「標的領域はメチル化されていない。」と判定することができた。また、「試料（ヒト正常全血）に由来する対象（ヒト）は、癌に罹患していない又は当該対象（ヒト）中に癌細胞が存在していない」と判定することもできた。【０１４５】
実施例2及び3の結果より、本発明の方法によれば、試料における癌細胞の有無の判定、試料に由来する対象が癌に罹患しているか否かの判定等を精度よく行えることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明の標的領域の精製方法、標的領域の検出方法及び癌の判定方法によれば、標的領域の精製及び検出並びに癌の判定を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。
【図１】
2019163602.tif 000039
【図２】
2019163602.tif 000040
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2019163602000001.app
【国際調査報告】
2019163602.tif 000045
2019163602.tif 000046
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