(57)【要約】新規造血促進剤を提供すること、及び、同造血促進剤を有効成分とする、貧血、特に難治性貧血の予防又は治療のための医薬を提供することを課題とする。本発明は、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質を含む、造血促進剤を提供する。
2019163994.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質を含む、造血促進剤。
【請求項２】
Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素がＭＡＴ２Ａである、請求項１に記載の造血促進剤。
【請求項３】
Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質がシクロロイシン、その誘導体、４Ｈ−ｓ−トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン誘導体及びそれらの薬学的に許容できる塩から選ばれる、請求項１又は２に記載の造血促進剤。
【請求項４】
Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質が３−アセチル−１１−ケト−β−ボスウェリック酸、その誘導体及びそれらの薬学的に許容できる塩から選ばれる、請求項１又は２に記載の造血促進剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の造血促進剤を含む、貧血の予防又は治療のための医薬。
【請求項６】
造血前駆細胞を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の造血促進剤存在下で培養する工程を含む、造血細胞の製造方法。
【請求項７】
造血促進剤の候補物質の存在下又は非存在下でＳ−アデノシルメチオニン合成酵素活性を測定する工程、及び、
造血促進剤の候補物質の存在下のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素活性の測定値が、非存在下の測定値よりも低い候補物質を選択する工程、
を含む、造血促進剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
造血促進剤の評価物質の存在下でＳ−アデノシルメチオニン合成酵素活性を測定する工程、及び、
造血促進剤の評価物質の存在下のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素活性の測定値を指標として、造血促進効果を評価する工程、
を含む、造血促進剤の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血促進剤、同造血促進剤を含む貧血の予防又は治療のための医薬、同造血促進剤を用いた造血細胞の製造方法等に関する。また、本発明は、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素活性の測定値を指標とした造血促進剤のスクリーニング方法、造血促進剤の評価方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、再生不良性貧血や骨髄異形成症候群などの難治性貧血においては赤血球造血を直接促す効果的な造血製剤がなく、免疫抑制療法や化学療法、造血幹細胞移植などの合併症リスクの高い治療法しか存在しなかった。また、上記治療法に抵抗性の症例や、年齢などにより適応とならない症例も多く存在している（非特許文献１及び２）。これまで造血促進剤として知られるエリスロポエチン製剤は腎性貧血には一定の効果が認められるものの、既に内在性のエリスロポエチン産生が促進している血液疾患に伴う貧血では効果が期待できない。そのため、最も効果的な対症療法の一つである赤血球輸血を必要とする症例も多いが、長期治療に伴うコストや鉄過剰症による臓器障害の問題があり、輸血依存からの脱却が難治性貧血疾患治療の目標の一つとなっている。【０００３】
一方、ＭＡＴはＳ−アデノシルメチオニン合成酵素であり、その阻害剤は癌の治療薬の候補とされている（非特許文献３及び４）。しかし、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素の阻害剤について、造血効果は全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Bacigalupo A., Blood 2017 Mar 16;129(11):1428-1436
【非特許文献２】Almeida A et al., Leuk Res 2017 Jan;52:50-57.
【非特許文献３】Jackson B. Hester, Jr., J. Med. Chem. 1980, 23, 392-402
【非特許文献４】Casey L Quinlan et al., Nature Chemical Biology 13, 785-792 (2017)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、従来の技術における上記状況に鑑みてなされたものであり、新規造血促進剤を提供すること、及び、同造血促進剤を有効成分とする、貧血、特に難治性貧血の予防又は治療のための医薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素ＭＡＴ（ＭＡＴ１およびＭＡＴ２の二つのアイソザイムが存在し、ＭＡＴ２はＭＡＴ２ＡおよびＭＡＴ２Ｂ二つのサブユニットから成る）はメチル基供与体であるＳ−アデノシルメチオニンをＡＴＰ及びメチオニンより合成し、エピジェネティック修飾等に重要な酵素であるが、本発明者等はＭＡＴ阻害物質のシクロロイシン（ＣＬＥＵ）がマウスの骨髄赤芽球の著明な成熟促進及び末梢血ヘモグロビン濃度の顕著な増加を惹起する知見を得た。本発明は、この様な知見に基づきなされたものである。すなわち、本発明は、ＭＡＴ阻害剤を用いた従来の造血促進剤では治療が困難であった血液疾患に伴う貧血の新たな治療薬を提供するものである。また、本発明は、ＭＡＴを標的とし、より臨床応用に適した種々の化合物をハイスループットスクリーニング系で同定し、得られたヒット化合物からリード化合物を合成することで、新たな造血促進剤を探索するハイスループットスクリーニング系、及び、新たな造血促進剤を提供するものである。【０００７】
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］  Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質を含む、造血促進剤。
［２］  Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素がＭＡＴ２Ａである、［１］に記載の造血促進剤。
［３］  Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質がシクロロイシン、その誘導体、４Ｈ−ｓ−トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン誘導体及びそれらの薬学的に許容できる塩から選ばれる、［１］又は［２］に記載の造血促進剤。
［４］  Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質が３−アセチル−１１−ケト−β−ボスウェリック酸、その誘導体及びそれらの薬学的に許容できる塩から選ばれる、［１］又は［２］に記載の造血促進剤。
［５］  ［１］〜［４］のいずれかに記載の造血促進剤を含む、貧血の予防又は治療のための医薬。
［６］  造血前駆細胞を、［１］〜［４］のいずれかに記載の造血促進剤存在下で培養する工程を含む、造血細胞の製造方法。
［７］  造血促進剤の候補物質の存在下又は非存在下でＳ−アデノシルメチオニン合成酵素活性を測定する工程、及び、
造血促進剤の候補物質の存在下のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素活性の測定値が、非存在下の測定値よりも低い候補物質を選択する工程、
を含む、造血促進剤のスクリーニング方法。
［８］  造血促進剤の評価物質の存在下でＳ−アデノシルメチオニン合成酵素活性を測定する工程、及び、
造血促進剤の評価物質の存在下のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素活性の測定値を指標として、造血促進効果を評価する工程、
を含む、造血促進剤の評価方法。
［９］  造血促進を必要とする対象に、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質を投与することを含む、造血促進方法。
［１０］  造血促進への使用のためのＳ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、従来の造血促進剤であるエリスロポエチンとは全く作用機序の異なる、優れた造血促進効果を有する造血促進剤を提供することができる。また、本発明によれば、貧血、特に難治性貧血の予防又は治療のための医薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）合成は、赤芽球成熟中にダウンレギュレートされることを示す実験結果である。Ａ：骨髄から選別された各サブセット細胞におけるメチオニン、ＳＡＨ（Ｓ−アデノシルホモシステイン）、及びＳＡＭの存在量。これらの存在量は、質量分析を用いて定量分析を行った。Ｂ：各サブセットにおけるＳＡＭとメチオニンとの比。各サンプル中のＳＡＭ及びメチオニンの存在量を、非赤芽球サブセットにおけるそれらの存在量に調整した。Ｃ：ＲＴ−ＰＣＲによって分析したＭＡＴ２Ａ及びＭＡＴ２ＢのＲＮＡ発現レベル。発現レベルをＡｃｔｂによって標準化した。箱ひげ図に示されている各点は、個々のマウスサンプルを示す。アスタリスクは、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１として示す。
【図２】図２は、ＣＬＥＵによるＳＡＭの減少は、エリスロポエチン非依存的に有意な赤血球形成を誘発したことを示す実験結果である。Ａ：ＰＢＳ又はＣＬＥＵ処置で骨髄サブセットＩＩから選別した細胞のＳＡＭ存在量（２日目）。Ｂ：ＰＢＳ又はＣＬＥＵ処置後の指示日における末梢血ヘモグロビン濃度。Ｃ：ＰＢＳ又はＣＬＥＵ処置マウスにおける左右の大腿骨及び脛骨の総骨髄細胞（２日目）。Ｄ：ＰＢＳ又はＣＬＥＵ処置マウスの脛骨の代表的な画像（写真）（２日目）。Ｅ及びＦ：フローサイトメトリーによって分析した各群の骨髄成熟細胞（２日目）。フローサイトメトリー分析の代表的な結果をＥに示した。示された群の細胞数の累積結果をＦに示した。赤血球（Ｔｅｒ１１９＋Ｇｒ１-Ｂ２２０-ＣＤ４-ＣＤ８-）及びミエロイド（Ｇｒ１＋Ｔｅｒ１１９-Ｂ２２０-ＣＤ４-ＣＤ８-）。Ｂ細胞（Ｂ２２０＋Ｔｅｒ１１９-Ｇｒ１-ＣＤ４-ＣＤ８-）である。Ｇ及びＨ：フローサイトメトリーによって分析した各サブセットにおける骨髄赤芽球（２日目）。フローサイトメトリー分析の代表的な結果をＧに示した。示されたサブセットの細胞数の累積結果をＨに示した。Ｉ：ＰＢＳ又はＣＬＥＵ処置マウスにおける骨髄の赤芽球成熟指数（ＥＭＩ＝ＩＩＩ＋ＩＶ／Ｉ＋ＩＩ）（２日目）。Ｊ：ＰＢＳ又はＣＬＥＵ処置マウスにおける骨髄のヘマトキシリン及びエオシン染色画像（写真）（２日目）。Ｋ：ＰＢＳ又はＣＬＥＵ処置マウスからの末梢血塗抹標本のＭａｙ−Ｇｉｅｍｓａ染色画像（写真）（２日目）。Ｌ：ＥＬＩＳＡによって分析した血清エリスロポエチン値。箱ひげ図に示されている各点は、個々のマウスサンプルを示す。アスタリスクは、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１として示す。
【図３】図３は、ＣＬＥＵ処置は、骨髄赤芽球サブセットＩＩにおいてヘモグロビン関連遺伝子発現を強く誘発することを示す実験結果である。Ａ：マウスにおけるＰＢＳ又はＣＬＥＵ処置を受けた骨髄赤芽球サブセットＩＩのＲＮＡシークエンシング分析結果（２日目）（ＣＬＥＵ；ｎ＝４、ＰＢＳ；ｎ＝４）。（少なくとも２つの条件のうちの１つにおいて）ＦＰＫＭ＞１０及びＣＶ＜０．５で発現量の変動を認めた遺伝子（ｌｏｇ２ＦＣ＜０．５又はｌｏｇ２ＦＣ＞０．５、Ｐ＜０．０５）のみを点で表した。Ｂ：ＣＬＥＵ処置によって有意に誘発された遺伝子についてのＤＡＶＩＤ６．８．を用いる遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析。Ｃ：ＲＮＡシークエンシング発現レベルの確認のためにＲＴ−ＰＣＲによって分析した示された遺伝子のＲＮＡ発現レベルを、Ａｃｔｂによって標準化した。Ｄ：ＰＢＳ又はＣＬＥＵ処置を用いて示された骨髄の赤芽球サブセットにおける示された遺伝子のＲＮＡ発現レベル（２日目）。発現レベルをＡｃｔｂによって標準化した。箱ひげ図に示されている各点は、個々のマウスサンプルを示す。アスタリスクは、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１として示す。
【図４】図４は、エピジェネティックな脱メチル化は、赤芽球の最終成熟を誘発することを示す実験結果である。Ａ：マウスにおけるＣＬＥＵ又はＰＢＳ処置を受けた骨髄赤芽球サブセットＩＩのＷＧＢＳ（全ゲノムバイサルファイトシークエンシング）結果（２日目）（ＣＬＥＵ；ｎ＝２、ＰＢＳ；ｎ＝２）。Ｂ：発現された全ての遺伝子についての発現対プロモーターＣｐＧメチル化の差異（ＦＰＫＭ＞１０及びＣＶ＜０．５の少なくとも１つの条件のうちの１つ）。相関（Ｃｏｒ）は−０．０８であった。Ｃ：有意に発現が誘導された遺伝子についての発現対プロモーターＣｐＧメチル化の差異。相関（Ｃｏｒ）は−０．１１であった。Ｄ：マウスにおけるＣＬＥＵ又はＰＢＳ処置を受けた骨髄赤芽球サブセットＩＩのウェスタンブロット（ＷＢ）結果を示す画像（写真）（２日目）。Ｅ−Ｇ：ヒトＣＤ３４＋臍帯血細胞のインビトロ赤血球分化。Ｅ：代表的なフローサイトメトリー分析の結果。Ｆ：示された細胞集団の累積結果。Ｇ：ＣＤ３４  ＥＭＩの累積結果（ＣＤ３４赤血球成熟指数ＣＤ７１＋ＧｌｙＡ＋／ＣＤ７１＋ＧｌｙＡ-）。箱ひげ図に示されている各点は、技術的反復を示す。アスタリスクは、Ｐ＜０．００１として示す。
【図５】図５は、ＳＡＭ関連代謝物の存在量は、骨髄赤芽球の分化及び成熟中に変化しないことを示す実験結果である。Ａ及びＢ：骨髄から選別された各サブセット細胞における示された代謝物の存在量は、マススペクトロメトリーを用いて分析された。Ａ：シスタチオニン、Ｂ：ホモシステインである。箱ひげ図に示されている各点は、個々のマウスサンプルを示す。
【図６】図６は、ＣＬＥＵ又はＰＢＳで処置したマウスにおける完全な血球数を示す実験結果である。Ａ〜Ｄ：ＣＬＥＵ又はＰＢＳで処置したマウスにおける完全な末梢血球数（ＣＢＣ）（１日目〜６日目）。Ａ：白血球数（１０３／μＬ）。Ｂ：血小板数（１０５／μＬ）。Ｃ：赤血球数（１０６／μＬ）Ｄ：ヘマトクリット（％）。Ｅ：ＰＢＳ又はＣＬＥＵ処置マウスにおける骨髄赤芽球サブセットＩＩから選別した有核細胞のＭａｙ−Ｇｉｅｍｓａ染色画像（写真）（２日目）。Ｆ：図３Ａに示すＲＮＡシークエンシングデータの主要成分（ＰＣ）分析結果。
【図７】図７は、ＣＬＥＵ処置は、リボヌクレオチド及び赤血球転写因子関連遺伝子を含む遺伝子束を誘発することを示す実験結果である。Ａ−Ｃ：ＣＬＥＵ処置によって有意に誘発された遺伝子についてのＤＡＶＩＤ６．８．を用いる遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析。Ａ：ＤＮＡ／核関連ＧＯターム。Ｂ：クロマチン関連ＧＯターム。Ｃ：ＲＮＡ関連ＧＯターム。Ｄ：示されたサンプル中の個々の遺伝子のＲＮＡシークエンシング結果。各サンプル中の各遺伝子発現は、８サンプル中の各遺伝子のＦＰＫＭ平均によって標準化した。Ｅ：ＰＢＳ又はＣＬＥＵ処理された骨髄の示された赤芽球サブセット中の個々の遺伝子のＲＮＡ発現レベル（２日目）。発現レベルを、Ａｃｔｂによって標準化した。箱ひげ図に示されている各点は、個々のマウスサンプルを示す。アスタリスクは、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１として示す。
【図８】図８は、ＣＬＥＵ処置は、造血幹／前駆細胞関連遺伝子を含む遺伝子束を誘発することを示す実験結果である。Ａ：示されたサンプル中の示された遺伝子のＲＮＡシークエンシング結果。各サンプル中の各遺伝子発現は、８サンプル中の各遺伝子のＦＰＫＭ平均によって標準化した。Ｂ：ＲＮＡシークエンシング．発現レベルの確認のためにＲＴ−ＰＣＲによって分析した示された遺伝子のＲＮＡ発現レベルを、Ａｃｔｂによって標準化した。箱ひげ図に示されている各点は、個々のマウスサンプルを示す。アスタリスクは、Ｐ＜０．００１として示す。Ｃ：示されたサンプル中のＡｌａｓ２のＲＮＡシークエンシング結果。各サンプル中の各遺伝子発現は、８サンプル中の各遺伝子のＦＰＫＭ平均によって標準化した。
【図９】図９は、ヒストンメチルトランスフェラーゼは、ＣＬＥＵ処置によりダウンレギュレートされたことを示す実験結果である。示されたサンプル中の示された遺伝子のＲＮＡシークエンシング結果。各サンプル中の各遺伝子発現は、８サンプル中の各遺伝子のＦＰＫＭ平均によって標準化した。
【図１０】図１０は、ＰＦ９３６６による赤芽球成熟の促進を示す実験結果である。Ａ及びＢ：フローサイトメトリーによって分析した各サブセットにおける骨髄赤芽球（２日目）。フローサイトメトリー分析の代表的な結果をＡに示した。示されたサブセットの細胞数の累積結果をＢに示した。Ｃ：赤芽球成熟指数を示す。アスタリスクは、＊Ｐ＜０．０５として示す。
【図１１】図１１は、メチオニンサイクルを示す模式図である。
【図１２】図１２は、ＡＫＢＡによる赤芽球成熟の促進を示す実験結果である。フローサイトメトリーによって分析した各サブセットにおける骨髄赤芽球（２日目）。フローサイトメトリー分析の代表的な結果を左図に示した。示されたサブセットの細胞数の累積結果を右図に示した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明について説明する。
【００１１】
本明細書中で使用する主な略号は以下のとおりである。
ＭＡＴ：Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素
ＥＰＯ：エリスロポエチン
ＳＡＭ：Ｓ−アデノシルメチオニン
ＳＡＨ：Ｓ−アデノシルホモシステイン
ＣＬＥＵ：シクロロイシン
ＡＫＢＡ：３−アセチル−１１−ケト−β−ボスウェリック酸（CAS Number: 67416-61-9）
【００１２】
（造血促進剤）
本発明の一態様は、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質を含む、造血促進剤に関する。上述のとおり、本発明の造血促進剤は、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質による、造血促進作用を発揮するものである。
【００１３】
本明細書における「Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素」とは、メチオニンとＡＴＰを基質としたＳ−アデノシルメチオニンの生合成を触媒する酵素であれば、特に限定されない。また、「Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素」は、一般には、「アデノシルメチオニン合成酵素」又は「メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ」と称されることもあるが、本明細書中、いずれも同義である。
【００１４】
Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素として、具体的には、例えば、ＭＡＴＩ／ＩＩＩ（活性サブユニットであるＭＡＴ１Ａから構成される。一般的には、「ＭＡＴ１Ａ」と称されることもあるが、本明細書中、いずれも同義である）、ＭＡＴＩＩ（活性サブユニットであるＭＡＴ２Ａと調節サブユニットであるＭＡＴ２Ｂから構成される。一般的には、「ＭＡＴ２Ａ」、「ＭＡＴ２」と称されることもあるが、本明細書中、いずれも同義である）等が挙げられる。Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素として、好ましくは、ＭＡＴ２Ａである。
【００１５】
また、本明細書における「メチオニン」とは、特に記載した場合を除き、Ｌ−メチオニンをいう。
【００１６】
また、本明細書における「Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質」とは、哺乳動物においてＳ−アデノシルメチオニン合成酵素を阻害する作用を有するものであれば、特に限定されない。好ましくは、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質は、いずれかの哺乳動物細胞（好ましくは造血幹細胞、骨髄系前駆細胞、赤血球前駆細胞、前赤芽球、赤芽球等）においてＳ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害作用を有する物質である。Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害作用の機序は、特に限定されず、例えば、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾等のいずれかの段階におけるＳ−アデノシルメチオニン合成酵素の発現に対する抑制；Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素タンパク質の上記以外の発現阻害、競争阻害、サブユニットの会合阻害等の非競争阻害、不競争阻害等の酵素阻害等であってよい。
【００１７】
上述のとおり、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害効果と造血促進の関係に強い相関が確認されたため、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素活性を指標として、種々のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質をスクリーニングし、同阻害物質を造血促進剤として適用することができる。すなわち、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質は、ＭＡＴ阻害効果を有する限り、特定の化合物には限定されず、低分子化合物、ペプチド、抗体、核酸（アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNAを含む）、エキス等であってもよい。Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質は、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質として知られる公知化合物でもよいし、スクリーニングすることにより得られる化合物でもよい。具体的には、限定されないが、例えば、シクロロイシン及びその誘導体、４Ｈ−ｓ−トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン誘導体、３−アセチル−１１−ケト−β−ボスウェリック酸及びその誘導体、又はそれらの塩等が挙げられる。Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質は、市販のものでもよく、通常の有機合成手法により合成されたものでもよい。Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質は、一種を用いてもよく、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１８】
シクロロイシンの誘導体としては、シクロロイシンから化学的に誘導される反応性誘導体であって、人体内においてシクロロイシンと同様の作用効果を示す化合物をいう。限定されないが、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−バリン、３−アミノプロピオン酸、３−（カルボキシメチル）−２−（２−ペンテニル）シクロペンタノン、Ｄ−プロリン、その他の非天然アミノ酸等が挙げられる。人体に対する副作用がないか又はほとんど認められない薬学的に非毒性の化合物が好ましい。誘導体は、シクロロイシンのプロドラッグを含むこともできる。４Ｈ−ｓ−トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン誘導体としては、限定されないが、ＰＦ９３６６（2-(7-Chloro-5-phenyl-[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinolin-1-yl)-N,N-dimethylethan-1-amine）（非特許文献３、４）等が挙げられる。３−アセチル−１１−ケト−β−ボスウェリック酸の誘導体としては、限定されないが、１１−ケト−β−ボスウェリック酸やMediterranean Journal of Chemistry 2017, 6(5), 180-190、Nat Prod Res. 2019 Jan 29:1-8、Anticancer Agents Med Chem. 2017;17(8):1153-1167等の文献に開示された化合物が挙げられる。
【００１９】
Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質としては、さらに、Zhang et al,ACS Chem Biol,2013,8(4):796-803に記載されたフッ素化N,N-ジアルキルアミノスチルベン化合物、Sviripa et al,J Med Chem,2014,57:6083-6091に記載された2',6'-ジハロスチリルアニリン、ピリジン、またはピリミジン化合物、WO2012103457に記載された化合物などであってもよい。
【００２０】
薬学的に許容できる塩としては、具体的には、限定されないが、例えば、無機塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩；カルシウム塩、マグネシウム塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩；アンモニウム塩等）、各種有機塩、ハロゲン化水素酸塩、無機酸塩、有機酸塩及びアミノ酸塩等が挙げられる。
【００２１】
Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害作用の測定は、公知の方法に基づいて行うことができる。例えば、インビトロの酵素活性測定系において、測定することができる。
具体的には、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素（以下、ＭＡＴ２Ａを例として説明する）がＡＴＰ及びメチオニンからＳ−アデノシルメチオニンを合成するという反応（図１１）を用いてＭＡＴ２Ａ阻害活性を測定することができる。すなわち、限定されないが、例えば、ＭＡＴ２Ａの酵素活性を上記反応後に残存するＡＴＰ濃度のルシフェラーゼアッセイ系等の測定系により評価し、測定対象物質の阻害活性を測定する。阻害物質としてのポジティブコントロールは、例えばシクロロイシンを用いることができる。
【００２２】
本発明に用いるＳ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質は、限定されないが、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素活性に対して、例えばＩＣ５０が１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、１００μＭ以下又は１０μＭ以下である物質を好ましく用いることができる。
【００２３】
また、本明細書における「造血促進」とは、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質により造血前駆細胞（骨髄系前駆細胞、赤血球前駆細胞、前赤芽球、赤芽球等）からの造血細胞（前赤芽球、赤芽球、赤血球等）の分化誘導を惹起することにより、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質の投与前に対し、投与後に生じる造血細胞数の増加、造血細胞数の増加に対応する数値の向上等が認められることを意味する。造血促進効果は、血算測定、フローサイトメトリー等の常法の生物学的手法、分子生物学的手法等を用いて測定することができる。造血促進作用を有するとは、限定されないが、コントロール（造血促進剤の不存在）に対して造血細胞数が、例えば１．２〜５０倍、好ましくは１．２〜５倍、より好ましくは１．２〜１．５倍増加することであり得る。
【００２４】
（医薬、飲食品）
本発明のさらなる一態様は、本発明の造血促進剤を含む、貧血の予防又は治療のための医薬に関する。上述のとおり、本発明の造血促進剤は、造血前駆細胞からの造血細胞の分化誘導による造血促進作用を有するため、失血、造血機能の低下等に起因する疾患の予防又は治療のための医薬として好適に用いることができる。また、造血機能低下の改善のために（上記疾患の予防を含む）、日常的に摂取される飲食品、研究目的のための試薬等として好適に用いることができる。
【００２５】
ここで、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質は、後記実施例に示すとおり、従来の造血促進剤であるエリスロポエチン製剤とは全く作用機序の異なる新たな造血促進剤となりうると考えられる。血液疾患による難治性貧血は多くがエリスロポエチン製剤不応性であり、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害により赤血球造血を促す本知見は、輸血依存に伴う合併症や社会的コストの大幅な削減につながる事が期待される。
【００２６】
失血、造血機能の低下に起因する疾患としては、限定されないが、例えば、腎性貧血（好ましくはエリスロポエチン不応答性腎性貧血）、鉄欠乏性貧血、抗がん剤治療による貧血、難治性貧血（再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、赤芽球癆、発作性夜間ヘモグロビン尿症、自己免疫性溶血性貧血、先天性骨髄不全症候群等）、溶血性貧血、失血性貧血等が挙げられる。
【００２７】
本発明における医薬は、公知の製剤学的方法により、様々な医薬製剤の形態に製剤化することができる。例えば、経口投与、腹腔内投与、経皮投与、皮下投与、経静脈投与、吸入投与等の投与形態に好適な製剤に製剤化して使用することができる。製剤化においては、薬学上許容される各種担体、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、流動性促進剤、着色剤、香料等と適宜組み合わせることができる。
【００２８】
また、本発明における飲食品は、公知の飲食品の製造方法により、様々な飲食品の形態に製造することができる。
本発明の医薬及び飲食品においては、貧血の予防や治療に用いられる公知の医薬成分を併用してもよい。また、公知の他の薬学的有効成分をも含有させることができる。
【００２９】
本発明の造血促進剤、医薬及び飲食品は、ヒトを含む哺乳動物を対象として使用することができるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物などを対象とすることができる。
【００３０】
本発明の造血促進剤、医薬及び飲食品を投与又は摂取する場合、その投与量又は摂取量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬、飲食品等）等に応じて、適宜選択される。例えば、１回当たりの本発明の造血促進剤、医薬及び飲食品の投与量又は摂取量は、限定されないが、造血促進剤量として、例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００３１】
本発明のさらなる一形態は、本発明の造血促進剤、医薬又は飲食品を、対象に投与又は摂取させることを含む、対象における造血促進方法に関する。また、本発明のさらなる一形態は、本発明の造血促進剤、医薬又は飲食品を、対象に投与又は摂取させることを含む、対象における貧血の予防又は治療方法に関する。
【００３２】
（製造方法）
本発明のさらなる一形態は、造血前駆細胞を、本発明の造血促進剤存在下で培養する工程を含む、造血細胞の製造方法に関する。同方法は、換言すれば、造血前駆細胞を、本発明の造血促進剤存在下で培養する工程を含む、造血細胞の分化誘導方法である。
【００３３】
造血前駆細胞としては、骨髄系前駆細胞、赤血球前駆細胞、前赤芽球、赤芽球等が挙げられる。造血前駆細胞としては、動物由来のものに限られず、ｉＰＳ細胞等から分化誘導させて得られたもの等も用いることができる。本発明の造血細胞の製造方法における培養方法は、本発明の造血促進剤を添加する以外は、造血前駆細胞（好ましくは骨髄系前駆細胞、赤血球前駆細胞、前赤芽球、赤芽球）、赤血球が維持・生存でき、造血前駆細胞が維持・生存・分化可能である培養方法であれば、特に制限されず、常法の細胞の培養方法により、行うことができる。
【００３４】
造血前駆細胞の培養液は、具体的には、特に限定されないが、例えばＭＥＭα、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２、ＩＭＤＭ等が挙げられる。培養液には通常の細胞培養で使用される添加剤等を、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されず使用することができる。特に、血清や、血清代替品を使用することが好ましい。添加剤としてさらに、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム、アミノ酸、抗生物質、Ｎ−アセチルシステイン等が挙げられる。
【００３５】
造血前駆細胞の培養液には、造血細胞の分化誘導剤となるＳ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質、すなわち、本発明の造血促進剤を添加する。培養液における造血促進剤濃度は、細胞源、細胞数、培養液量等に応じて適宜変更でき、限定されないが、通常１〜１００００μｇ／ｍＬ、好ましくは１〜５０００ｎｇ／ｍＬ程度である。
【００３６】
培養に使用するインキュベーターは、一般に動物細胞培養に使用されるものであればよい。培養条件は、例えば３７℃〜３９℃、５％炭酸ガス９５％空気の気相で、高湿度条件等が挙げられ、このような条件を設定可能なインキュベーターを使用する。
【００３７】
培養期間中、２〜４日に一度、培養液の一部を新鮮なものに交換することが好ましい。培養期間は、使用する動物種及び採取した細胞の状態等により変更可能であるが、一般的に数日から１週間程度である。
【００３８】
培養中あるいは培養後に、造血細胞が分化誘導されていることを、血算測定、フローサイトメトリー等により確認することも好ましい。なお、造血細胞の分化誘導の程度に応じて培養期間を変えることも可能である。
【００３９】
（スクリーニング方法）
本発明の更なる一形態は、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害剤の候補物質の存在下又は非存在下でＳ−アデノシルメチオニン合成酵素活性を測定する工程、及び、酵素阻害剤の候補物質の存在下のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素活性の測定値が、非存在下の測定値よりも低い候補物質を選択する工程、を含む、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害剤のスクリーニング方法に関する。
【００４０】
また、本発明の更なる一形態は、造血促進剤の候補物質の存在下又は非存在下でＳ−アデノシルメチオニン合成酵素活性を測定する工程、及び、造血促進剤の候補物質の存在下のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素活性の測定値が、非存在下の測定値よりも低い候補物質を選択する工程、を含む、造血促進剤のスクリーニング方法に関する。すなわち、上述のとおり、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害効果と造血促進の関係に強い相関が得られたことが確認されたため、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素活性を指標として、造血促進剤をスクリーニングすることができる。
なお、「Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害剤（又は造血促進剤）の候補物質の存在下又は非存在下でＳ−アデノシルメチオニン合成酵素活性を測定する工程」は、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害剤（又は造血促進剤）の候補物質の存在下又は非存在下でＳ−アデノシルメチオニン合成酵素を発現させた後、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素発現量やＳ−アデノシルメチオニン合成酵素活性を測定する態様であってもよい。
【００４１】
ここで、「Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害剤（又は造血促進剤）の候補物質の存在下のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素活性の測定値が、非存在下の測定値よりも低い」とは、限定されないが、例えば、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害剤（又は造血促進剤）の候補物質の存在下のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素活性の測定値が、非存在下の測定値の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下又は１０％以下であってよい。
【００４２】
Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素活性を測定する方法としては、例えば、インビトロの酵素活性測定系において、測定することができる。
具体的には、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素（以下、ＭＡＴ２Ａを例として説明する）がＡＴＰ及びメチオニンからＳ−アデノシルメチオニンを合成するという反応（図１１）を用いてＭＡＴ２Ａ阻害物質を同定することができる。すなわち、限定されないが、例えば、造血促進剤の候補物質添加後のマウスリコンビナントＭＡＴ２Ａの酵素活性を上記反応後に残存するＡＴＰ濃度のルシフェラーゼアッセイ系等の測定系により評価し、候補物質の阻害活性を評価する。本方法でＭＡＴ２Ａ阻害作用を有する化合物をハイスループットスクリーニング系で同定することができる。
【００４３】
ＭＡＴ２Ａはメチオニン及びＡＴＰよりＳ−アデノシルメチオニンを合成するため、その阻害効果は試験管内のＡＴＰ残存量をＡＴＰ依存性酵素であるルシフェラーゼ活性により測定する事で評価可能である。ここで、ＭＡＴ２Ａは、天然型又は遺伝子組み換え型のいずれを用いることも可能であるが、本発明者等はリコンビナントＭＡＴ２Ａを既に作成済みであり、ルシフェラーゼアッセイ系を用いた３８４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでのハイスループットスクリーニングは広く行われているため、スクリーニング系は迅速に確立可能であると考えられる。阻害物質としてのポジティブコントロールは、例えばシクロロイシン、ＰＦ９３６６、３−アセチル−１１−ケト−β−ボスウェリック酸を用いることができる。スクリーニングによって得られた造血促進剤について、造血促進活性及び安全性を確認することも好ましい。造血促進活性の測定方法としては、例えば、上述の造血促進効果の測定方法を適用することができる。
【００４４】
（評価方法）
本発明の更なる一形態は、造血促進剤の評価物質の存在下でＳ−アデノシルメチオニン合成酵素活性を測定する工程、及び、造血促進剤の評価物質の存在下のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素活性の測定値を指標として、造血促進効果を評価する工程、を含む、造血促進剤の評価方法に関する。すなわち、上述のとおり、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害効果と造血促進の関係に強い相関が得られることが確認されたため、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害活性を指標として、造血促進剤の評価物質の造血促進効果の有無、又は程度を評価することが可能である。
【００４５】
Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素活性の測定方法としては、本発明のスクリーニング方法において、上記した方法を適用することができる。阻害物質としてのポジティブコントロールは、例えばシクロロイシン、ＰＦ９３６６、３−アセチル−１１−ケト−β−ボスウェリック酸を用いることができる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、これらの実施例に限定されるものではない。【００４７】
＜材料及び方法＞
（マウス）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊを遺伝的背景とした野生型マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．から購入した。８〜１４週齢のマウスを分析した。ＣＬＥＵ処置（５０ｍｇ／身体）のために、シクロロイシン（ＣＬＥＵ）（Ｓｉｇｍａ）をＰＢＳ（５０ｍｇ／ｍｌ）で希釈してＣＬＥＵ溶液を調製した後、１ｍｌのＣＬＥＵ溶液を腹腔内投与した。ＡＫＢＡ処置（２ｍｇ／身体）のために、２ｍｇ  ＡＫＢＡ（Enzo Life Sciences）／２０％  ＤＭＳＯ／１ｍＬ  ＰＢＳ溶液を腹腔内投与した。ＡＫＢＡを含まない溶媒を対照とした。末梢血完全血球数については、顔面静脈から末梢血を採取し、自動動物血球計数器（ｍｉｃｒｏｓｅｍｉ  ＬＣ−６６２）を用いて計数した。本研究で実施した全ての実験は、東北大学環境安全委員会の動物実験委員会により承認を受けた。【００４８】
（フローサイトメトリー及び細胞選別）
通常の方法で、ＢＭ細胞及び脾臓細胞を採取し、特異的な抗体の組み合わせで染色して、赤芽球及び成熟細胞を同定した。抗体、及びストレプトアビジン−ペリジニンクロロフィルタンパク質−シアニン５．５で視覚化。本研究で用いた抗体は以下の通りであった：抗ＣＤ３ｅ（１４５−２Ｃ１１），抗ＣＤ４（ＧＫ１．５又はＲＭ４．５），抗ＣＤ８ａ（５３−６．７），抗Ｇｒ−１（ＲＢ６−８Ｃ５），抗Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２），抗Ｔｅｒ−１１９（ＴＥＲ−１１９），抗ＣＤ７１（Ｒ１７２１７又はＣ２）。ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）染色を行って、分析のために死細胞を除外した。フローサイトメトリー分析及び細胞選別は、ＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩ（ＢＤ）を用いて製造業者のプロトコールに従って行い、得られたデータをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて分析した。【００４９】
（ＲＮＡシークエンシングデータサンプリング及び分析）
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて骨髄サブセットＩＩ赤芽球の選別サンプルから単離した（ＰＢＳ；ｎ＝４、ＣＬＥＵ；ｎ＝４）。２１００  ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して単離されたＲＮＡのクオリティ（ＲＩＮ＞０．８）を確認し、２５０ｎｇのＲＮＡを、ＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｍＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して製造業者の指示書に従って、ライブラリー調製のための投与量として使用した。ハイスループットシークエンシング（５１ｂｐ、シングルエンド）は、Ｈｉｓｅｑ２５００  Ｒａｐｉｄ  ｍｏｄｅ  ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて行った。ｂｏｗｔｉｅ２バージョン２．２．５及びｔｏｐｈａｔバージョン２．１．０を使用することにより、シークエンシングされたリードを参照マウスゲノム（ｍｍ９）にマッピングし、次いで、ｃｕｆｆｌｉｎｋｓバージョン２．２．１を使用して、転写物の量を推定した。遺伝子の発現レベルを、百万のマッピングされたリード当たりの転写物のキロベース当たりの断片（ＦＰＫＭ）の平均値によって標準化した。（少なくとも２つの条件のうちの１つにおいて）ＦＰＫＭ＞１０及びＣＶ＜０．５である個別に発現された遺伝子（ｌｏｇ２ＦＣ＜０．５又はｌｏｇ２ＦＣ＞０．５、条件間でＰ＜０．０５）のみをさらなる分析に使用した。有意にアップレギュレート又はダウンレギュレートされた遺伝子が豊富な遺伝子オントロジータームを見つけるために、ＤＡＶＩＤ  ６．８ウェブツールを使用した。【００５０】
（全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（ＷＧＢＳ）データのサンプリング及び分析）
フェノール／クロロホルム抽出法を用いて、骨髄サブセットＩＩ赤芽球の選別サンプルからＤＮＡを単離した（ＰＢＳ；ｎ＝２、ＣＬＥＵ；ｎ＝２）。ＤＮＡクオリティコントロール、バイサルファイト変換、ライブラリー調製、ハイスループットシークエンシング、及びデータマッピングを、Ｍａｃｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃで実施した。簡単に説明すると、ＴｒｕＳｅｑ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ及びＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｇｏｌｄ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ及びＺｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、製造業者のプロトコール（ＴｒｕＳｅｑ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎライブラリー調製ガイド）に従いライブラリー調製に使用し、次いでハイスループットシークエンシングをＨｉｓｅｑＸ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によって行った。シークエンシング後、生の配列リードをクオリティに基づいてフィルタリングし、アダプター配列をトリミングする。残ったリードを、ＳＯＡＰ（ショートオリゴアライメントプログラム）に基づくＢＳＭＡＰを用いて参照ゲノム（ｍｍ９）にマッピングする。ＳＡＭＢＡＭＢＡバージョン０．５．９を使用してインデックス及びＰＣＲ複製物を除去して、修飾したリードだけを選別する。全ての単一シトシンのメチル化率を、ＢＳＭＡＰバージョン２．８７を用いるマッピング結果から計算する。＞＝５のリードを有するシトシン位置のみを、さらなる分析に使用した。【００５１】
（ヒトＣＤ３４＋臍帯血細胞のインビトロ赤血球分化）
ヒトＣＤ３４＋臍帯血細胞を、関東甲信越ブロック血液センター（日本，東京）から入手した。研究のための臍帯血サンプルの使用は、東北大学の倫理委員会によって承認された。この方法の技術的詳細は以前に記載されている。簡単に説明すると、ＣＤ３４＋臍帯血細胞を増殖培地で５日間培養し、次いで、細胞（１×１０５／ｍｌ）を分化培地で７日間培養した。ＣＬＥＵ処置では、濃度は２．５ｍｇ／ｍｌであった。増殖培地は、ＳｔｅｍＭＡＣＳ  ＨＳＣ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  ヒト（ＭＡＣＳ）含むＳｔｅｍＭＡＣＳ  ＨＳＣ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ  ＸＦヒト（ＭＡＣＳ）であった。分化培地は、ｈＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ｈＦＬＴ３−Ｌ（３３．３ｎｇ／ｍｌ；  Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ｈＩＬ３（１３．３ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ｈＢＭＰ４（１３．３ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ｈＥＰＯ（２．６７ＩＵ／ｍｌ；協和発酵キリン株式会社）、及びヒドロコルチゾン（１μＭ；Ｓｉｇｍａ）を含むＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）であった。【００５２】
本発明者等は、以下のように考えた。エピジェネティックな修飾は、血球の発生において中心的な役割を果たす。赤芽球の成熟は、赤芽球が核の凝集及び除核を含む著しい形態変化を経る動的過程である。これまでに、赤芽球の成熟の間、全体的なＤＮＡ脱メチル化及び翻訳後のヒストン修飾が起こっていることが明らかになり、適切なエピジェネティックな修飾が赤芽球成熟に不可欠である。ＤＮＡ及びヒストンのメチル化のためには、有力なメチル供与体としてＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）が必要である。したがって、メチオニン及びＡＴＰからＳＡＭを触媒するＳＡＭ及びメチオニンアデノシルトランスフェラーゼ（ＭＡＴ）は、赤芽球の成熟に重要な役割を果たす。
しかしながら、この過程におけるこれらの因子の機能についてはほとんど知られていない。したがって、これらの因子の機能を明らかにすべく、本発明者等は以下の実験を行った。【００５３】
＜実施例１＞
骨髄（ＢＭ）における赤芽球成熟中のＳＡＭ関連代謝物の存在量の変化を調べた。質量分析により、メチオニン及び他の関連アミノ酸は特に差がなかったが、赤芽球成熟中にＳＡＭの存在量は徐々に減少していたことが明らかになった（図１のＡ）。したがって、ＳＡＭ合成は、赤芽球成熟中に減少すると考えられた（図１のＢ）。一貫して、肝臓以外の組織中のＭＡＴの主要アイソザイムであるＭＡＴ２Ａ及びその補因子ＭＡＴ２Ｂは、赤芽球成熟中に減少した（図１のＣ）。したがって、ＳＡＭ合成は、赤芽球成熟中に負に調節される。【００５４】
＜実施例２＞
次に、赤血球形成におけるＳＡＭの重要性を明らかにするために、マウスをＭＡＴ阻害剤シクロロイシン（ＣＬＥＵ；５０ｍｇ／身体）で処置した。ＣＬＥＵは、赤芽球におけるＳＡＭの存在量を実際に減少させることができた（図２のＡ）。白血球数及び血小板数には特に一貫した差はなかったが、驚いたことに、ＣＬＥＵ処置によるヘモグロビン値、赤血球、及びヘマトクリットの顕著な増加があった（図２のＢ、図６のＡ〜Ｄ）。ＢＭ細胞数は有意に増加し、ＢＭの色はＣＬＥＵ処置により赤色になった（図２のＣ〜Ｄ）。フローサイトメトリー分析により、この表現型の原因は、ＢＭ中の赤血球系細胞が特に増加したことであることが明らかになった（図２のＥ〜Ｆ）。さらに、Ｔｅｒ１１９／ＣＤ７１二重染色により、赤芽球がサブセットＩＩから増加し始め、赤芽球成熟がＣＬＥＵ処置によって有意にアップレギュレートされることが明らかになった（図２のＧ〜Ｉ）。ＢＭ及び末梢血の病理所見もこれらの知見を裏付ける（図２のＪ〜Ｋ）。興味深いことに、血清エリスロポエチン値は、ＣＬＥＵ処置によって有意にダウンレギュレートされ（図２のＬ）、これはネガティブフィードバックに起因する可能性がある。まとめると、ＣＬＥＵ処置は、ＢＭにおける赤芽球成熟をエリスロポイエチン非依存的様式で有意に増加させ、ＳＡＭ合成及びエリスロポエチンを減少させる。【００５５】
さらに、マウスにおけるＭＡＴ阻害剤ＰＦ９３６６（ＰＦ）投与の影響を検討した。溶媒（ＤＭＳＯ）（コントロール（Ｃｔｒｌ））又は１０ｍＭ  ＰＦ９３６６を４０μｌ／４０ｍｌ（水）にして飲水ボトルに入れた（０ｈ）。また、０ｈ及び２４ｈに溶媒（ＤＭＳＯ）又は１０ｍＭ  ＰＦ９３６６  ８０μｌを１ｍｌ  ＰＢＳに溶解して腹腔内投与する。２日目（４８ｈ）時点で解析した。赤芽球がサブセットＩＩＩから増加し始め、赤芽球成熟がＰＦ処置によって有意にアップレギュレートされることが明らかになった（図１０のＡ〜Ｂ）。また、赤芽球成熟指数においても有意差が認められた（図１０のＣ）。【００５６】
＜実施例３＞
ＣＬＥＵ処置により誘発される赤芽球成熟の機序を明らかにするために、ＢＭ赤芽球サブセットＩＩのＲＮＡシークエンシング分析を行った。両方の条件からの有核細胞では特に形態学的相違がないが（図６のＥ）、著しい遺伝子発現の変化が起こり（図６のＦ）、興味深いことに、個別に制御される遺伝子のほとんどがダウンレギュレートされた（図３のＡ）。これらのダウンレギュレートされた遺伝子の遺伝子オントロジー解析により、ＤＮＡ／核関連遺伝子及び／又はクロマチン関連遺伝子が有意に多く含まれていたことが明らかになり（図７のＡ〜Ｂ）、これらの遺伝子変化は、赤血球芽が最終的な除核のための最終成熟中に経る動的クロマチンリモデリングに関与することが示唆される。さらに、ＲＮＡ関連遺伝子もまた、これらのダウンレギュレートされた遺伝子に多く含まれ（図４のＣ）、ＲＮＡプロセシングが赤芽球成熟において重要な役割を果たすことが示唆される。さらに、Ｇａｔａ１、Ｔａｌ１、及びＫｌｆ１などの赤血球形成に重要な転写因子も有意にダウンレギュレートされ（図７のＤ）、これは、最終的な赤芽球の成熟を支配する他の重要な因子が存在する可能性があることを示している。一方、７２個の遺伝子が、有意にアップレギュレートされた遺伝子として同定された（図８のＡ）。グロビン遺伝子は、ＣＬＥＵ処置した赤芽球において最も大量に発現された（図３のＡ）。これらのアップレギュレートされた遺伝子の遺伝子オントロジー分析により、ヘモグロビン関連遺伝子及び赤血球発生関連遺伝子だけでなく、細胞外マトリックス及び免疫系関連遺伝子も有意に多く含まれていたことが明らかになり（図３のＢ）、これらの因子の寄与が有効な赤芽球成熟に必要であったことが示唆される。例えば、検証解析により、ヘモグロビン関連遺伝子だけでなく、ＣＤ１６３（ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体の高親和性スカベンジャー受容体）及びＡｐｏｅも有意にアップレギュレートされたことが確認された（図３のＣ）。赤血球形成におけるそれらの寄与的役割を示す以前の報告によると、赤芽球成熟中のヘムの適切な使用及び／又は脂質膜合成には、ＣＤ１６３及び／又はＡｐｏｅのアップレギュレーションが不可欠である。さらに、造血幹／前駆細胞の分化における重要な転写因子として知られているＭｙｂ及びＣｉｔｅｄ２の発現ならびにリンカーヒストン成分Ｈ１ｆ０の発現も、ＣＬＥＵ処置によって有意にアップレギュレートされ（図８のＢ）、最終的な赤芽球の成熟における明らかにされていない機能を示唆する。興味深いことに、サブセットＩＩのヘモグロビン関連遺伝子発現は、サブセットＩＩＩの発現と比較してもＣＬＥＵ処置によって有意にアップレギュレートされ、これらの遺伝子には、ＰＢＳとＣＬＥＵ処理の間の発現レベルの差が比較的小さいために上記で同定されたアップレギュレートされた遺伝子に含まれていないＡｌａｓ２も含まれ（図８のＣ）、これらの遺伝子のアップレギュレーションが赤芽球成熟の自然経過よりも強力であることを示した。グロビン遺伝子の異常がサラセミアなどで赤芽球の成熟欠陥を引き起こすという事実を考慮すると、これらの遺伝子のアップレギュレーションは、他方で、最終的な赤芽球の成熟の原動力となり得る。【００５７】
＜実施例４＞
上記で観察された全体的な転写変化は、細胞内ＳＡＭ存在量の減少によって引き起こされるエピジェネティックな修飾変化に由来する可能性があるので（図２のＡ）、誘発された赤芽球成熟中のＤＮＡメチル化変化を明らかにするために全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（ＷＧＢＳ）を行った。予想通り、ＣＬＥＵ処置は全体として約２％のＤＮＡ  ＣｐＧメチル化を減少させ（図４のＡ）、ＣｐＧメチル化の減少は高度にメチル化されたゲノム領域でより顕著であった（図４のＡ、赤色ボックス）。高度にメチル化されたゲノム領域は、以前に観察されたように、赤芽球の最終成熟中の脱メチル化に対してより感受性である可能性があった。ＤＮＡメチル化が遺伝子発現を抑制するという考えと一致して、ＲＮＡ発現の差異は、遺伝子プロモーターＣｐＧメチル化とわずかだが、負の相関があった（図４のＢ）。これらの相関は、β−グロビン遺伝子及びＨｍｏｘ１などの有意にアップレギュレートされた遺伝子においても観察された（図４のＣ）。さらに、典型的なヒストンメチル化マーカーであるＨ３Ｋ９のトリメチル化は、ＣＬＥＵ処置によって減少した（図４のＤ）。いくつかのヒストンメチルトランスフェラーゼ発現レベルもＣＬＥＵ処置によって有意にダウンレギュレートされたことを考慮すると（図９）、ＳＡＭの減少及びヒストンメチルトランスフェラーゼの抑制もまた、全体的な転写変化に寄与した可能性があった。【００５８】
＜実施例５＞
最後に、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞のＣＬＥＵインビトロ赤血球細胞分化条件の効果を調べた。このモデルでは、ＣＬＥＵは、赤血球分化だけでなく、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞からの成熟も誘発することができた（図４のＥ〜Ｇ）。この観察は、赤芽球の成熟に対するＣＬＥＵの直接的効果及びこの機序が、ヒト赤血球形成に適合し得ることを示す。【００５９】
＜実施例６＞
マウスをＭＡＴ阻害剤３−アセチル−１１−ケト−β−ボスウェリック酸（ＡＫＢＡ；２ｍｇ／身体）を０時間、２４時間後に腹腔内投与し、４８時間後に解析した。Ｔｅｒ１１９／ＣＤ７１二重染色により、赤芽球成熟がＡＫＢＡ処置によって有意にアップレギュレートされることが明らかになった（図１２）。ＣＬＥＵ、ＰＦ−９３６６に加えてＡＫＢＡでも赤血球成熟が誘導され構造の異なる３剤で同様の結果を得たことからＭＡＴ２Ａ阻害剤が赤血球造血を促進することが示唆された。【００６０】
まとめると、本研究では、赤芽球の最終成熟はエピジェネティックな修飾を伴う細胞内ＳＡＭレベルによって制御されることが明らかになった。この系を利用することにより、エリスロポエチン非依存的様式でＣＬＥＵ等のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素阻害物質の処置により赤血球形成を誘発することが可能である。これらの発見は、貧血疾患を克服するための赤血球形成に関する将来の研究のための新しい道を開く。【００６１】
以上のとおり、ＭＡＴ２Ａ阻害剤が従来の造血促進剤では治療が困難であった血液疾患に伴う貧血の新たな治療薬となりうる事が示された。シクロロイシン以外にも、ＭＡＴ２Ａを標的とし、より臨床応用に適した化合物をハイスループットスクリーニング系で同定し、得られたヒット化合物からリード化合物を合成し、実際にマウスに投与してその赤血球造血促進作用及び安全性を検証することで、さらなる造血促進剤が得られる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は医薬や飲食品等に有用な造血促進剤に関する。
本研究により難治性貧血の新たな治療法が開発されたため、難治性貧血による赤血球輸血依存症患者数やそれに伴う鉄過剰症患者数の減少及び輸血医療に伴う社会的コストの削減につながると期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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