(57)【要約】以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか一つのタンパク質と刺激に応じて二量体化又は多量体化するタグタンパク質を含む融合タンパク質。（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ凝集体形成能を有するタンパク質；（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ凝集体形成能を有するタンパク質
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか一つのタンパク質と刺激に応じて二量体化又は多量体化するタグタンパク質を含む融合タンパク質。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ凝集体形成能を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ凝集体形成能を有するタンパク質
【請求項２】
更に標識タンパク質を含む請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の融合タンパク質、請求項３に記載の遺伝子若しくはその転写産物、或いは請求項４に記載のベクターを含む細胞。
【請求項６】
ｔａｒｄｐ遺伝子又はそのホモログ、及びｔａｒｄｐｌ遺伝子又はそのホモログの発現が抑制若しくは喪失している、又は、Ｔａｒｄｂｐタンパク質又はそのホモログ、及び、Ｔａｒｄｂｐｌタンパク質又はそのホモログの機能が抑制若しくは喪失している請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の融合タンパク質、請求項３に記載の遺伝子若しくはその転写産物、或いは請求項４に記載のベクターを含む非ヒト動物。
【請求項８】
ｔａｒｄｐ遺伝子又はそのホモログ、及びｔａｒｄｐｌ遺伝子又はそのホモログの発現が抑制若しくは喪失している、又は、Ｔａｒｄｂｐタンパク質又はそのホモログ、及び、Ｔａｒｄｂｐｌタンパク質又はそのホモログの機能が抑制若しくは喪失している請求項７に記載の非ヒト動物。
【請求項９】
請求項５又は６に記載の細胞、或いは、請求項７又は８に記載の非ヒト動物であり、刺激に応答して前記タンパク質が二量体又は多量体を形成する、ＴＤＰ−４３タンパク質変性症モデル。
【請求項１０】
筋萎縮性側索硬化症又は前頭側頭葉変性症モデルである請求項９に記載のＴＤＰ−４３タンパク質変性症モデル。
【請求項１１】
刺激の存在下で、請求項５又は６に記載の細胞、或いは、請求項７又は８に記載の非ヒト動物に、被検物質を接触させ、又は投与し、ＴＤＰ−４３タンパク質変性症の予防又は治療に有用な候補物質を選択する、スクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項５又は６に記載の細胞、或いは、請求項７又は８に記載の非ヒト動物を含む、ＴＤＰ−４３タンパク質変性症の予防薬又は治療薬スクリーニングキット。
【請求項１３】
請求項５又は６に記載の細胞、或いは、請求項７又は８に記載の非ヒト動物と、これらのいずれかを含むウェルプレートと、光照射装置と、を備えた、ＴＤＰ−４３タンパク質変性症の予防薬又は治療薬スクリーニング装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合タンパク質及びその利用に関する。
本願は、２０１８年１０月１日に、日本に出願された特願２０１８−１８６５６９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患である筋萎縮性側索硬化症（以下、ＡＬＳともいう。）や前頭側頭葉変性症（以下、ＦＴＬＤともいう。）では、変性によって失われる脳や脊髄の神経細胞の細胞質に、凝集したＲＮＡ結合タンパク質ＴＤＰ−４３（ＴＡＲ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ４３ｋＤａ）を主成分とする封入体が蓄積することが知られている。ＡＬＳやＦＴＬＤといった疾患群は、ＴＤＰ−４３タンパク質変性症と総称されている。【０００３】
ＴＤＰ−４３を主成分とする封入体の蓄積を主な根拠として、ＴＤＰ−４３がＴＤＰ−４３タンパク質変性症の発症や進行に密接に関与すると予想されており、ＴＤＰ−４３の機能操作、ＴＤＰ−４３の凝集の阻害、ＴＤＰ−４３凝集体の除去といった観点から、ＴＤＰ−４３タンパク質変性症の治療法が開発できるのではないかと期待されている。【０００４】
上記のとおり、ＴＤＰ−４３タンパク質変性症の病態的特徴として、ＴＤＰ−４３凝集体の蓄積が挙げられ、かかる特徴を反映させた病態モデルが提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−１７１４２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ほとんどのＡＬＳ においてＴＤＰ−４３遺伝子内の変異や、ＴＤＰ−４３タンパク質の過剰発現が認められないことから、例えば特許文献１に記載の病態モデルなどにあるように、ＴＤＰ−４３へのアミノ酸置換変異の導入や、それによって作出された変異型ＴＤＰ−４３の過剰発現によって現れる病態モデルの表現型が、必ずしも病態を反映していない懸念があった。【０００７】
本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、ＴＤＰ−４３タンパク質変性症の病態を反映したＴＤＰ−４３タンパク質変性症モデル、係るモデルを作成するための融合タンパク質、遺伝子、ベクター、細胞、非ヒト動物、係るモデルを用いたスクリーニング方法、スクリーニングキット、及びスクリーニング装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＴＤＰ−４３タンパク質の会合状態や細胞内局在を検討した結果、生体内で、より病態生理学的状態に近い振る舞いを示す改変型ＴＤＰ−４３タンパク質を見出し、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明は以下の態様を含む。
［１］以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか一つのタンパク質と刺激に応じて二量体化又は多量体化するタグタンパク質を含む融合タンパク質。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ凝集体形成能を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ凝集体形成能を有するタンパク質。
［２］更に標識タンパク質を含む［１］に記載の融合タンパク質。
［３］［１］又は［２］に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
［４］［３］に記載の遺伝子を含むベクター。
［５］［１］又は［２］に記載の融合タンパク質、［３］に記載の遺伝子若しくはその転写産物、或いは［４］に記載のベクターを含む細胞。
［６］ｔａｒｄｐ遺伝子又はそのホモログ、及びｔａｒｄｐｌ遺伝子又はそのホモログの発現が抑制若しくは喪失している、又は、Ｔａｒｄｂｐタンパク質又はそのホモログ、及び、Ｔａｒｄｂｐｌタンパク質又はそのホモログの機能が抑制若しくは喪失している［５］に記載の細胞。
［７］［１］又は［２］に記載の融合タンパク質、［３］に記載の遺伝子若しくはその転写産物、或いは［４］に記載のベクターを含む非ヒト動物。
［８］ｔａｒｄｐ遺伝子又はそのホモログ、及びｔａｒｄｐｌ遺伝子又はそのホモログの発現が抑制若しくは喪失している、又は、Ｔａｒｄｂｐタンパク質又はそのホモログ、及び、Ｔａｒｄｂｐｌタンパク質又はそのホモログの機能が抑制若しくは喪失している［７］に記載の非ヒト動物。
［９］［５］又は［６］に記載の細胞、或いは、［７］又は［８］に記載の非ヒト動物であり、刺激に応答して前記タンパク質が二量体又は多量体を形成する、ＴＤＰ−４３タンパク質変性症モデル。
［１０］筋萎縮性側索硬化症又は前頭側頭葉変性症モデルである［９］に記載のＴＤＰ−４３タンパク質変性症モデル。
［１１］刺激の存在下で、［５］又は［６］に記載の細胞、或いは、［７］又は［８］に記載の非ヒト動物に、被検物質を接触させ、又は投与し、ＴＤＰ−４３タンパク質変性症の予防又は治療に有用な候補物質を選択する、スクリーニング方法。
［１２］［５］又は［６］に記載の細胞、或いは、［７］又は［８］に記載の非ヒト動物を含む、ＴＤＰ−４３タンパク質変性症の予防薬又は治療薬スクリーニングキット。
［１３］［５］又は［６］に記載の細胞、或いは、［７］又は［８］に記載の非ヒト動物と、これらのいずれかを含むウェルプレートと、光照射装置と、を備えた、ＴＤＰ−４３タンパク質変性症の予防薬又は治療薬スクリーニング装置。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＴＤＰ−４３タンパク質変性症の病態を反映したＴＤＰ−４３タンパク質変性症モデルを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本実施形態のスクリーニング装置の一例を示す概略構成図である。
【図２】本発明の融合タンパク質の一例を示す概略構成図である。
【図３】野生型ゼブラフィッシュ、並びに、ｔａｒｄｐ遺伝子及びｔａｒｄｐｌ遺伝子がノックアウトされたゼブラフィッシュ（tardbp -/-, tardbpl -/-）の写真である。
【図４】ｏｐｔｏＴＤＰ−４３による、ゼブラフィッシュ（tardbp -/-, tardbpl -/-）の心臓での血液循環の回復を示したグラフである。
【図５】青色光照射によるＴＤＰ−４３タンパク質の細胞質への移行の観察結果である。
【図６】脊髄ニューロン特異的に融合タンパク質を発現させたゼブラフィッシュにおける、青色光照射によるＴＤＰ−４３タンパク質の細胞質への移行の観察結果である。
【図７】脊髄ニューロン特異的に融合タンパク質を発現させたゼブラフィッシュにおける、青色光照射による軸索の伸長の観察結果である。
【図８Ａ】脊髄運動ニューロンのみにｏｐｔｏＴＤＰ−４３が発現するゼブラフィッシュの軸索側枝の観察結果である。
【図８Ｂ】脊髄運動ニューロンのみにｏｐｔｏＴＤＰ−４３が発現するゼブラフィッシュの軸索側枝の枝数を示すグラフである。
【図８Ｃ】脊髄運動ニューロンのみにｏｐｔｏＴＤＰ−４３が発現するゼブラフィッシュにおける前シナプス及び後シナプスの局在を示す観察結果である。
【図９Ａ】ほぼ全ての運動ニューロンにｏｐｔｏＴＤＰ−４３を発現するゼブラフィッシュにおける、青色光照射によるｏｐｔｏＴＤＰ−４３の細胞質における凝集の誘導を示す観察結果である。
【図９Ｂ】ほぼ全ての運動ニューロンにｏｐｔｏＴＤＰ−４３を発現するゼブラフィッシュにおける、青色光照射によるｏｐｔｏＴＤＰ−４３及び内在性ＴＤＰ−４３の細胞質における凝集の誘導を示す観察結果である。
【図１０Ａ】ほぼ全ての運動ニューロンにｏｐｔｏＴＤＰ−４３Ａ３１５Ｔを発現するゼブラフィッシュにおける、青色光照射による浮き袋の形成不全を示す観察結果である。
【図１０Ｂ】ほぼ全ての運動ニューロンにｏｐｔｏＴＤＰ−４３Ａ３１５Ｔを発現するゼブラフィッシュにおける、青色光照射による浮き袋の形成不全形成の割合を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜＜融合タンパク質＞＞
本発明の融合タンパク質は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか一つのタンパク質と刺激に応じて二量体化又は多量体するタグタンパク質を含む。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ凝集体形成能を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ凝集体形成能を有するタンパク質
【００１３】
配列番号１で表されるアミノ酸配列は、ゼブラフィッシュＴａｒｄｂｐタンパク質のアミノ酸配列である。ゼブラフィッシュＴａｒｄｂｐタンパク質は、ヒトＴＤＰ−４３タンパク質のホモログである。ヒトＴＤＰ−４３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２で表される。
ゼブラフィッシュにおいては、ＴａｒｄｂｐとＴａｒｄｂｐｌの２つのホモログが存在し、ゼブラフィッシュＴａｒｄｂｐｌタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３で表される。
ゼブラフィッシュＴａｒｄｂｐタンパク質とヒトＴＤＰ−４３タンパク質とのアミノ酸レベルでの同一性は、７３％であり、ゼブラフィッシュＴａｒｄｂｐタンパク質とゼブラフィッシュＴａｒｄｂｐｌタンパク質とのアミノ酸レベルでの同一性は、７８％である。（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか一つのタンパク質には、配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質も含まれる。
【００１４】
（Ｂ）において、係る同一性としては、７５％以上がより好ましく、８０％以上が更に好ましく、８５％以上が特に好ましく、９０％以上が最も好ましい。
【００１５】
（Ｃ）において欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸の数としては、１ 〜１２０個が好ましく、１〜６０個がより好ましく、１〜２０個が更に好ましく、１〜１０個が特に好ましく、１〜５個が最も好ましい。
【００１６】
本発明において、「凝集体形成能」とは、二量体以上の多量体の形成という中間段階を経て形成されたと予想される、共焦点レーザー顕微鏡などの光学顕微鏡を用いて検出可能な不定形の塊状の細胞成分、あるいは細胞抽出物中に不溶画分として検出される細胞成分を形成する能力をいう。
【００１７】
刺激に応じて二量体化又は多量体化するタグタンパク質とは、光照射下や化合物存在下で二量体又は多量体を形成するタンパク質の機能ドメインを含むものをいう。
光照射下でヘテロ二量体を形成するタグタンパク質のセットとしては、ＰｈｙＢとＰＩＦのセット、ＦＫＦ１とＧＩのセット、ＣＲＹ２とＣＩＢ１のセット、ＵＶＲ８とＣＯＰ１のセット、ＶＶＤとＷＣ１のセット、ＰｈｙＢとＣＲＹ１のセット、ＲｐＢｐｈＰ１とＲｐＰｐｓＲ２のセットが挙げられる。
光照射下でホモ二量体を形成するタグタンパク質としては、ＵＶＲ８、ＥＬ２２２、ｂＰａｃ、ＲｓＬＯＶ、ＰＹＰ、Ｈ-ＮＯＸＡ、ＹｔｖＡ、ＮｉｆＬ、ＦｉｘＬ、ＲｐＢｐｈＰ１、ＣＲＹ２等が挙げられる。
化合物存在下でヘテロ二量体を形成するタグタンパク質のセットとしては、ラパマイシン存在下におけるＦＫＢＰ（ＦＫ５０６-ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）とＦＲＢ（ＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ｆｒａｇｍｅｎｔ）のセット、ジベレリン（化合物）とその結合タンパク質（ＧＡＩ/ＧＩＤ１）を用いたシステム、フシコクシン（化合物）とその結合タンパク質（ＣＴ５２Ｍ１/Ｔ１４−３−３ｃΔＣ−Ｍ２）を用いたシステム、アブシジン酸（化合物）とその結合タンパク質（ＰＹＬ/ＡＢＩ）を用いたシステム、ｒＣＤ１/ＦＫ５０６（化合物）とその結合タンパク質（ＦＫＢＰ/ＳＮＡＰ）を用いたシステム等が挙げられる。
【００１８】
上述したタグタンパク質の中で、例えば青色光を吸収して自己会合する活性をもつシロイヌナズナ由来のクリプトクロームＣＲＹ２の変異型断片が挙げられる。
クリプトクロームＣＲＹ２の変異型断片としては、以下の（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれか一つのアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
（Ｄ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｅ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、青色光を吸収して自己会合する活性を有するタンパク質；
（Ｆ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、青色光を吸収して自己会合する活性を有するタンパク質
【００１９】
（Ｅ）において、係る同一性としては、８５％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が特に好ましい。
【００２０】
（Ｆ）において欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸の数としては、１ 〜１００個が好ましく、１〜６０個がより好ましく、１〜２０個が更に好ましく、１〜１０個が特に好ましく、１〜５個が最も好ましい。
【００２１】
本発明の融合タンパク質は、更に標識タンパク質を含むことが好ましい。標識タンパク質は、細胞内での上記融合タンパク質の発現を確認できるものであれば特に限定されない。例えば、標識タンパク質としては、抗体のエピトープ配列や蛍光タンパク質が挙げられ、細胞を生きたまま観察する観点から、蛍光タンパク質が好ましい。
蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）等が挙げられる。
標識タンパク質を含む融合タンパク質としては、例えば、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【００２２】
＜＜融合タンパク質をコードする遺伝子＞＞
本発明の遺伝子は、上記本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子である。
係る遺伝子としては、以下の（Ｇ）〜（Ｋ）のいずれか一つの塩基配列からなり、且つ、かつ凝集体形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子と刺激に応じて二量体化又は多量体化するタグタンパク質をコードする遺伝子を含むものが挙げられる。
（Ｇ）配列番号６で表される塩基配列、
（Ｈ）配列番号６で表される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されている塩基配列、
（Ｉ）配列番号６で表される塩基配列において、同一性が７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、特に好ましくは、９０％以上である塩基配列、
（Ｊ）配列番号６で表される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
（Ｋ）前記（Ｇ）〜（Ｊ）の塩基配列の縮重異性体
【００２３】
（Ｈ）において、欠失、置換、挿入、又は付加されてもよい塩基の数としては、１ 〜３７０個が好ましく、１〜１８０個がより好ましく、１〜６０個が更に好ましく、１〜１３０個が特に好ましく、１〜１５個が最も好ましい。
【００２４】
（Ｊ）において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ 塩化ナトリウム，０．３Ｍ クエン酸溶液，ｐＨ７．０）、０．１重量％ Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％フォルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００２５】
メチオニンとトリプトファン以外のアミノ酸は、１つのアミノ酸に対して複数のコドンが対応する。このことを遺伝暗号の縮重という。（Ｋ）において、塩基配列の縮重異性体とは、ある塩基配列がコードするアミノ酸に対応する他の塩基配列を意味する。
【００２６】
刺激に応じて二量体化又は多量体化するタグタンパク質をコードする遺伝子としては、上述したタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。係る遺伝子としては、例えば青色光を吸収して自己会合する活性をもつシロイヌナズナ由来のクリプトクロームをコードする遺伝子の変異型断片が挙げられる。
クリプトクロームをコードする遺伝子の変異型断片としては、以下の（Ｌ）〜（Ｐ）のいずれか一つの塩基配列からなり、且つ、青色光を吸収して自己会合する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
（Ｌ）配列番号７で表される塩基配列、
（Ｍ）配列番号７で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されている塩基配列、
（Ｎ）配列番号７で表される塩基配列において、同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは、９５％以上である塩基配列、
（Ｏ）配列番号７で表される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
（Ｐ）前記（Ｌ）〜（Ｏ）の塩基配列の縮重異性体
【００２７】
更に標識タンパク質を含む融合タンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号８で表される塩基配列からなるものが挙げられる。
【００２８】
＜＜ベクター＞＞
本発明のベクターは、上記本発明の遺伝子を含む。
ベクターとしては、特に限定されず、プラスミドベクター、ウイルスベクター等、従来公知のものを用いることができる。プラスミドベクターとしては、例えば、ＣＡＧロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーター、ＨＳＶ−ｔｋプロモーター等の動物細胞における発現用のプロモーター等を有するベクターが挙げられる。
ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、EBウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクター等が挙げられる。
【００２９】
＜＜細胞・非ヒト動物＞＞
本発明の細胞は、上記本発明の融合タンパク質、又は上記本発明の遺伝子若しくはその転写産物、或いは上記本発明のベクターを含む。
【００３０】
本発明の細胞の由来となる生物としては、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット、ハムスター等の哺乳動物が挙げられる。更に、脊椎動物全般が挙げられ、魚類、両生類、鳥類、爬虫類が挙げられる。またショウジョウバエ等の無脊椎動物や、酵母等も挙げられる。
【００３１】
本発明の細胞に用いられる宿主としては、グリア細胞、神経細胞、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞等の神経系細胞が挙げられる。
【００３２】
また、宿主として幹細胞から分化させた神経系細胞であってもよい。幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞である。幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、がん幹細胞、毛包幹細胞等が挙げられる。
【００３３】
宿主への、上記本発明の融合タンパク質、又は上記本発明の遺伝子若しくはその転写産物、或いは上記本発明のベクターの導入方法としては、使用する生細胞に適した方法で行うことができ、エレクトロポレーション法、ヒートショック法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法、ウイルスを用いた方法や、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標） ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）等の市販のトランスフェクション試薬を用いた方法等を挙げることができる。
【００３４】
また、本発明の非ヒト動物は、上記本発明の融合タンパク質、又は上記本発明の遺伝子若しくはその転写産物、或いは上記本発明のベクターを含む。
非ヒト動物としては、哺乳動物又は魚類が好ましい。非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコが挙げられ、マウス、ラット等のげっ歯類が好ましい。魚類としては、ゼブラフィッシュが好ましい。
【００３５】
実施例において後述するように、本発明の融合タンパク質は、野生型ＴＤＰ−４３の機能を補完できることが確認されている。そのため、より生理的条件に近いという観点から  本発明の細胞又は非ヒト動物は、ｔａｒｄｐ遺伝子又はそのホモログ、及びｔａｒｄｐｌ遺伝子又はそのホモログの発現が抑制若しくは喪失している、又は、Ｔａｒｄｂｐタンパク質又はそのホモログ、及び、Ｔａｒｄｂｐｌタンパク質又はそのホモログの機能が抑制若しくは喪失していることが好ましい。
【００３６】
Ｔａｒｄｂｐタンパク質及びＴａｒｄｂｐｌタンパク質の機能が抑制されているとは、Ｔａｒｄｂｐタンパク質及びＴａｒｄｂｐｌタンパク質が本来有する機能が部分的に失われている状態のことをいう。
Ｔａｒｄｂｐタンパク質及びＴａｒｄｂｐｌタンパク質の機能が喪失しているとは、Ｔａｒｄｂｐタンパク質及びＴａｒｄｂｐｌタンパク質が本来有する機能が完全に失われている状態のことをいう。
【００３７】
Ｔａｒｄｂｐタンパク質及びＴａｒｄｂｐｌタンパク質の機能の抑制又は喪失は、ｔａｒｄｐ遺伝子及びｔａｒｄｐｌ遺伝子の発現が抑制されることによって、又は喪失することによっても生じ得る。
【００３８】
ｔａｒｄｐ遺伝子及びｔａｒｄｐｌ遺伝子の発現が抑制しているとは、本発明の細胞又は動物において、コントロールとなる野生型の細胞又は動物と比較して、ｔａｒｄｐ遺伝子産物及びｔａｒｄｐｌ遺伝子産物の量が抑制されていることをいう。
ｔａｒｄｐ遺伝子及びｔａｒｄｐｌ遺伝子の発現の抑制は、ｔａｒｄｐ遺伝子及びｔａｒｄｐｌ遺伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイムなどの発現を生じさせる核酸配列を、細胞又は動物に導入し、遺伝子ノックダウン等により生じさせることができる。
【００３９】
ｔａｒｄｐ遺伝子及びｔａｒｄｐｌ遺伝子の発現が喪失しているとは、細胞又は動物において、ｔａｒｄｐ遺伝子産物及びｔａｒｄｐｌ遺伝子産物が喪失していることをいう。
遺伝子産物である、Ｔａｒｄｂｐタンパク質及びＴａｒｄｂｐｌタンパク質の機能の喪失は、例えばｔａｒｄｐ遺伝子及びｔａｒｄｐｌ遺伝子に変異を導入し、ｔａｒｄｐ遺伝子及びｔａｒｄｐｌ遺伝子を破壊することにより生じさせることができる。
変異は、ｔａｒｄｐ遺伝子及びｔａｒｄｐｌ遺伝子、又はこれら遺伝子の発現調節領域における一部又は全部の欠失、置換、任意の配列の挿入等により生じさせることができる。これらの変異の導入は、例えば、変異原性物質による処理、紫外線照射、相同組み換え技術等による遺伝子ターゲッティング、遺伝子ノックアウト、Ｃｒｅ-ｌｏｘＰ系等による条件的ノックアウト等の手法を用いて行うことができる。また、遺伝子ターゲティング、遺伝子ノックアウトについては、ゲノム編集技術を用いてもよい。
【００４０】
本発明の細胞又は非ヒト動物は、刺激に応答して前記タンパク質が二量体又は多量体を形成し、細胞質で凝集体を形成するため、ＴＤＰ−４３タンパク質変性症モデルとして有用である。ＴＤＰ−４３タンパク質変性症モデルとしては、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症モデル、パーキンソン病モデル、アルツハイマー病モデルが挙げられ、筋萎縮性側索硬化症又は前頭側頭葉変性症モデルが好ましい。
【００４１】
＜＜スクリーニング方法＞＞
本発明のスクリーニング方法は、刺激の存在下で、本発明の細胞、又は、本発明の非ヒト動物に、被検物質を接触させ、又は投与し、ＴＤＰ−４３タンパク質変性症の予防又は治療に有用な候補物質を選択する方法である。
【００４２】
例えば、化合物ライブラリを培地に添加し、細胞又はゼブラフィッシュに青色光を照射し、細胞の増殖、又はゼブラフィッシュの生育に対する影響を検討することが挙げられる。より具体的には、例えば、ウェルプレートに本発明の細胞を播種し、又は本発明の非ヒト動物としてゼブラフィッシュを導入し、青色光の照射下、ＴＤＰ−４３タンパク質の二量体形成を促進させつつ、化合物ライブラリの存在下で１〜１０日間程度培養、又は飼育する。その後、細胞については、例えばテトラゾリウム塩の還元による発色により生細胞数を解析する。テトラゾリウム塩としては、市販の３−［４，５−ジメチルチアゾル−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（ＭＴＴ）等を利用することができる。ゼブラフィッシュについては、ゼブラフィッシュの生死や活動状態を確認することが挙げられる。ＴＤＰ−４３タンパク質の二量体形成により、徐々に細胞毒性が生じるところ、細胞の増殖を維持又は増強する化合物は、ＴＤＰ−４３タンパク質変性症予防剤又は治療剤の候補である。
【００４３】
＜＜スクリーニングキット＞＞
本発明のＴＤＰ−４３タンパク質変性症の予防薬又は治療薬スクリーニングキットは、本発明の細胞、又は、本発明の非ヒト動物を含むキットである。
本発明のキットは、本発明の細胞、又は、本発明の非ヒト動物に加えて、マルチウェルプレート等、スクリーニングに必要なものを含んでいてもよい。
【００４４】
＜＜スクリーニング装置＞＞
本発明のＴＤＰ−４３タンパク質変性症の予防薬又は治療薬スクリーニング装置は、本発明の細胞、又は、本発明の非ヒト動物と、これらのいずれかを含むウェルプレートと、光照射装置と、を備えた装置である。
【００４５】
図１は、本実施形態のスクリーニング装置の一例を示す概略構成図である。本実施形態のスクリーニング装置の各構成について、図１を参照しながら詳細に説明する。
図１に示すスクリーニング装置１００は、ＴＤＰ−４３タンパク質変性症モデルゼブラフィッシュ１（以下、ゼブラフィッシュ１）と、ウェルプレート２と、制御部３と、光照射装置４とを備える。
ゼブラフィッシュ１は、青色光を吸収して自己会合する活性をもつシロイヌナズナ由来のクリプトクロームＣＲＹ２の変異型断片と、ゼブラフィッシュＴａｒｄｂｐタンパク質とを含む融合タンパク質を、体内で発現している。
ウェルプレート２の各ウェルには、化合物ライブラリ由来の化合物が含まれており、延長３ｍｍのゼブラフィッシュ１が、ウェルに満たされた水中を泳いでいる。
光照射装置４は、制御部３からの指令に基づいて青色光をウェルに照射する。
青色光の照射下、ゼブラフィッシュ１内のＴａｒｄｂｐタンパク質の二量体形成を促進させつつ、化合物ライブラリの存在下で１〜１０日間程度飼育する。
Ｔａｒｄｂｐタンパク質の二量体又は多量体の形成により、徐々に神経毒性が生じるところ、活動に影響の無いゼブラフィッシュ１が生育しているウェル中に存在する化合物は、ＴＤＰ−４３タンパク質変性症予防剤又は治療剤の候補である。
【００４６】
また、図示していないが、スクリーニング装置１００は、ゼブラフィッシュ１の観察用に顕微鏡を備えていてもよい。
また、別の実施形態として、ゼブラフィッシュの代わりにＴＤＰ−４３タンパク質変性症モデル培養細胞を用いてもよい。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４８】
［融合タンパク質発現系の構築］
青色光を吸収すると自己会合する活性を有する、シロイヌナズナ由来のクリプトームの変異型断片（ＣＲＹ２ｏｌｉｇ）と、赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ１）を、ゼブラフィッシュ由来のＴＤＰ−４３（Ｔａｒｄｂｐ）タンパク質に付加した融合タンパク質を発現する遺伝子コンストラクトを作製した（図２参照。）。この融合タンパク質をｏｐｔｏＴＤＰ−４３と称する。ｏｐｔｏＴＤＰ−４３のアミノ酸配列は、配列番号５で表され、ｏｐｔｏＴＤＰ−４３をコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号８で表される。【００４９】
［融合タンパク質の機能検定］
ｔａｒｄｐ遺伝子及びｔａｒｄｐｌ遺伝子がノックアウトされたゼブラフィッシュ（tardbp -/-, tardbpl -/-）を作製し、血液循環が損なわれる表現型を示すことを確認した。このダブルノックアウトゼブラフィッシュに、ゼブラフィッシュ由来のＴＤＰ−４３（Ｔａｒｄｂｐ）タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡ及びｏｐｔｏＴＤＰ−４３をコードする遺伝子のｍＲＮＡをそれぞれインジェクションした。ＴＤＰ−４３（Ｔａｒｄｂｐ）をコードする遺伝子のｍＲＮＡを導入したゼブラフィッシュ、及び、ｏｐｔｏＴＤＰ−４３をコードする遺伝子のｍＲＮＡを導入し、暗闇下で飼育されたゼブラフィッシュでは、血液循環の回復が観察された。しかしながら、ｏｐｔｏＴＤＰ−４３をコードする遺伝子のｍＲＮＡを導入し、青色光照射下で飼育されたゼブラフィッシュでは、心臓での血液循環の回復が観察されなかった（図４参照。）。このことから、構築したｏｐｔｏＴＤＰ−４３がＴＤＰ−４３としての機能を備えており、青色光照射の有無により、その機能を制御可能なことが確認された。【００５０】
［青色光照射によるＴＤＰ−４３タンパク質の細胞質への移行の観察］
上記ダブルノックアウトゼブラフィッシュ（tardbp -/-, tardbpl -/-）に、ｏｐｔｏＴＤＰ−４３をコードする遺伝子のｍＲＮＡを導入したゼブラフィッシュに青色光を照射し続け、ｍＲＦＰ１の蛍光を指標に、筋肉細胞でのｏｐｔｏＴＤＰ−４３の細胞内局在を観察した。図５に示すように、時間依存的に細胞質へのｏｐｔｏＴＤＰ−４３の移行が確認された。更に、細胞質では赤色蛍光がドット状を示していることから、ｏｐｔｏＴＤＰ−４３が凝集体を形成していることが確認された。【００５１】
［脊髄運動ニューロン特異的に融合タンパク質を発現させたゼブラフィッシュにおける、青色光照射によるＴＤＰ−４３タンパク質の細胞質への移行、及び、軸索の伸長の観察］
野生型に対して、ｍｎｒ２ｂ遺伝子のプロモーター下にｏｐｔｏＴＤＰ-４３を組み込んだＢａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ （ＢＡＣ）を遺伝子導入することで、脊髄運動ニューロンのみにｏｐｔｏＴＤＰ−４３が発現するゼブラフィッシュを構築した（Protocadherin-Mediated Cell Repulsion Controls the Central Topography and Efferent Projections of the Abducens Nucleus. Asakawa K, Kawakami K. Cell Reports. 2018 24:p1562-1572.参照。）。このゼブラフィッシュに、青色光を照射し続け、ｍＲＦＰ１の蛍光を指標に、脊髄運動ニューロンでのｏｐｔｏＴＤＰ−４３の移行を観察した。図６に示すように、時間依存的に、核に局在するｏｐｔｏＴＤＰ−４３の量が減り、ｏｐｔｏＴＤＰ−４３が細胞質へ移行していることが確認された。
この青色光の照射によってｏｐｔｏＴＤＰ−４３の細胞質への移行を促進したゼブラフィッシュを、再び暗条件下で飼育し、その後の軸索の伸長を観察したところ、軸索の伸長が阻害されていた（図７参照）。したがって、ｏｐｔｏＴＤＰ−４３の細胞質への移行を一過的に促進することが、脊髄運動ニューロンに毒性をもたらすことが確認された。【００５２】
［脊髄運動ニューロン特異的に融合タンパク質を発現させたゼブラフィッシュにおける、青色光照射による、一旦形成された神経筋シナプスの観察］
更に、脊髄運動ニューロンのみにｏｐｔｏＴＤＰ−４３が発現するゼブラフィッシュを用いて、運動ニューロンの側枝が形成された受精後５６時間の稚魚に対して、３時間青色光を照射し、その後、１３時間暗所で飼育し、軸索側枝、及び神経筋シナプスの変化を観察した。図８Ａに示すように、軸索側枝の数を計測した。その結果を図８Ｂに示す。【００５３】
図８Ｂに示すように、ｏｐｔｏＴＤＰ−４３の光刺激を経験した運動ニューロンは、軸索の末端数が減少する割合が増加することが確認された。また、前シナプスと後シナプスの局在を確認したところ、神経筋接シナプスの崩壊も促進されていることが確認された（図８Ｃ参照。）。【００５４】
［運動ニューロン特異的に融合タンパク質を発現させたゼブラフィッシュにおける、青色光照射による、ｏｐｔｏＴＤＰ−４３及びＴＤＰ−４３の凝集の観察］
上述したｏｐｔｏＴＤＰ−４３を組み込んだＢＡＣ系統を用いて、ほぼ全ての運動ニューロンにｏｐｔｏＴＤＰ−４３を発現するゼブラフィッシュ系統を構築し、これを青色ＬＥＤ光パネルの上で飼育し、ｏｐｔｏＴＤＰ−４３及びＴＤＰ−４３の凝集を観察した。図９Ａに示すように、長期の光刺激によって、ｏｐｔｏＴＤＰ−４３の細胞質における凝集の誘導が確認された。図９Ｂに示すように、この時、内在性のＴＤＰ−４３も凝集に巻き込まれており、凝集の伝播性が確認された。【００５５】
［運動ニューロン特異的に変異型（Ａ３１５Ｔ）融合タンパク質を発現させたゼブラフィッシュにおける、青色光照射による、運動障害誘発の観察］
家族性ＡＬＳに見出されたＡ３１５Ｔ変異を導入したｏｐｔｏＴＤＰ−４３Ａ３１５Ｔをほぼ全ての運動ニューロンで発現する系統を樹立し、青色光照射による運動能の変化を観察した。図１０Ａに示すように、Ａ３１５Ｔ変異の導入によって、浮き袋の形成不全が確認された。図１０Ｂに示すように、ｏｐｔｏＴＤＰ−４３と比較して、ｏｐｔｏＴＤＰ−４３Ａ３１５Ｔにおいて、浮き袋の形成不全の増加が確認された。浮き袋の形成には正常な運動能の発達が必要であることから、光照射によって運動障害が誘発されているといえる。  【００５６】
このように、ｏｐｔｏＴＤＰ−４３が、培養細胞から非ヒト動物に至るまで幅広く利用されることで、時間的空間的に制御された病態の再現やＴＤＰ−４３毒性を緩和する薬剤の開発に応用可能なことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明により、ＴＤＰ−４３タンパク質変性症の病態を反映したＴＤＰ−４３タンパク質変性症モデルを提供できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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