(57)【要約】  本発明は、変性抗体が有する非天然型立体構造を模した分子であって、変性抗体の定量的な評価に用いることのできる分子を提供する。  具体的には、本発明は、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のC末端欠失CH3ドメイン：（ｉ）配列番号１〜７のいずれかに示されるアミノ酸配列において、C末端側から5〜20残基の範囲内でアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるC末端欠失CH3ドメイン、または、（ｉｉ）配列番号１〜７のいずれかに示されるアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は、付加したアミノ酸配列において、C末端側から5〜20残基の範囲内でアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなり、かつ、AF.2A1ポリペプチドが特異的に結合するC末端欠失CH3ドメインを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のC末端欠失CH3ドメイン：
（ｉ）配列番号１〜７のいずれかに示されるアミノ酸配列において、C末端側から5〜20残基の範囲内でアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるC末端欠失CH3ドメイン、または、
（ｉｉ）配列番号１〜７のいずれかに示されるアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は、付加したアミノ酸配列において、C末端側から5〜20残基の範囲内でアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなり、かつ、AF.2A1ポリペプチドが特異的に結合するC末端欠失CH3ドメイン。
【請求項２】
請求項１に記載のC末端欠失CH3ドメインであって、
AF.2A1ポリペプチドとの解離定数が10μM以下である、C末端欠失CH3ドメイン。
【請求項３】
請求項１または２に記載のC末端欠失CH3ドメインであって、
（ｉ）’上記（ｉ）に記載のC末端欠失CH3ドメインが、配列番号１〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列において、C末端側から5〜20残基の範囲内でアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなり、
（ｉｉ）’上記（ｉｉ）に記載のC末端欠失CH3ドメインが、配列番号１〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は、付加したアミノ酸配列において、C末端側から5〜20残基の範囲内でアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなり、かつ、AF.2A1ポリペプチドが特異的に結合するものである、C末端欠失CH3ドメイン。
【請求項４】
C末端側から5〜10残基の範囲内でアミノ酸が欠失している、請求項１〜３のいずれか一項に記載のC末端欠失CH3ドメイン。
【請求項５】
C末端側から5残基のアミノ酸が欠失している、請求項１〜３のいずれか一項に記載のC末端欠失CH3ドメイン。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のC末端欠失CH3ドメインを含むFc領域フラグメント。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のC末端欠失CH3ドメインを含む抗体。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のC末端欠失CH3ドメインを含むタンパク質。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のC末端欠失CH3ドメイン、請求項６に記載のFc領域フラグメント、請求項７に記載の抗体、および請求項８に記載のタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、変性抗体の評価キット。
【請求項１０】
さらにAF.2A1ポリペプチドを含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
試料中に含まれる変性抗体を定量的に測定する方法であって、
AF.2A1ポリペプチドと前記試料中に含まれる変性抗体との結合量を測定する工程と
AF.2A1ポリペプチドと請求項１〜５のいずれか一項に記載のC末端欠失CH3ドメイン、請求項６に記載のFc領域フラグメント、請求項７に記載の抗体、または請求項８に記載のタンパク質との結合量を測定する工程と、
前記C末端欠失CH3ドメイン、前記Fc領域フラグメント、前記抗体、または前記タンパク質とAF.2A1ポリペプチドとの結合量から前記試料中の変性抗体の量を算出する工程と
を含む測定方法。
【請求項１２】
変性抗体に対する親和性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
請求項１〜５のいずれか一項に記載のC末端欠失CH3ドメイン、請求項６に記載のFc領域フラグメント、請求項７に記載の抗体、または請求項８に記載のタンパク質と試験化合物との相互作用を測定する工程を含む、スクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のC末端欠失CH3ドメイン、または前記C末端欠失CH3ドメインを含むFc領域フラグメント、抗体もしくはタンパク質を参照物質として含有する、変性抗体の定量用参照試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の参照］
本出願は、日本特許出願２０１８−４３５０５（２０１８年３月９日出願）に基づく優先権を主張しており、この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
［技術分野］
本発明は、変性抗体を模倣するポリペプチドに関する。特に、C末端のアミノ酸が欠失したCH3ドメインであって、変性抗体を特異的に認識するプローブと特異的に結合可能なものに関する。また本発明は、当該ポリペプチドを用いた変性抗体の測定方法および当該ポリペプチドを用いた変性抗体に特異的に相互作用する化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、生体中において物質変換の触媒やシグナル情報伝達等を高度に制御する機能を持った物質群である。タンパク質は特定の立体構造を形成することでこれらの機能を発現する。ひとたびその構造が損なわれる(変性する)と、機能が失われるだけでなく、生体の恒常性を擾乱する要因になりうる。【０００３】
バイオ医薬品として生体に投与される抗体分子も例外ではない。抗体は、製造工程において、化学的・物理的ストレスを受け、その一部は非天然型の立体構造へと変化して凝集体を形成する(以降の記述では、非天然型立体構造を有する抗体およびそれらの凝集体を総じて「変性抗体」と呼ぶ)。この凝集体が一定の割合以上で含まれた製剤を投与すると生体内で免疫応答が惹起され、結果として中和抗体の発生による薬効の低下や、アナフィラキシーショック様の症状が発生しうる(非特許文献１)。【０００４】
そのため、抗体医薬品の製造管理において、変性抗体の混入量を検出することは極めて重要である。現在のところ、分子サイズに基づく変性抗体の検出評価が一般的であり、異なる分子サイズに適した種々の分析技術（サイズ排除クロマトグラフィ、動的光散乱、ナノ粒子トラッキング、フィールドフローフラクショネーション、マイクロフローイメージング等）を利用して評価している(非特許文献２)。【０００５】
一方で、変性抗体と特異的に結合するプローブを利用したアッセイ法の開発も近年進んでいる(非特許文献３〜５および特許文献１、２)。非変性の抗体を標的として結合分子を探索して、結果的に抗体試料中に僅かに含まれる変性抗体に結合する分子が獲得された報告(非特許文献３、４)と、ストレスを加えて変性させた抗体を標的として結合分子を探索して、変性抗体に結合する分子が獲得された報告(非特許文献５)とがある。但し、これらの先行研究では、(1) プローブが認識する変性構造が何であるかは明示されておらず、(2) アッセイ法において参照物質として利用される変性抗体について規定されていない。【０００６】
タンパク質は変性に伴って疎水的な領域が外部に露出することが知られる。露出した疎水的な領域に非特異的に結合する分子(例えば1,8-アニリノナフタレンスルホン酸)を利用した測定は、タンパク質の構造評価に実施される(非特許文献６)。翻って、変性タンパク質とプローブの相互作用は、非特異的な現象であるという理解が一般的である。【０００７】
非特許文献３〜５および特許文献１、２で開示される技術は、それらのプローブが変性抗体と特異的に結合するという点で、従来の変性タンパク質認識プローブと異なる。ここで述べる「特異的に結合する」とは、非変性の抗体とは結合しないということ、そして抗体以外のタンパク質に結合しないということを表す。このような結合特性が実現される上で、変性抗体が共通して保持する“特定の非天然型立体構造”をプローブが厳密に認識していることが推測される。【０００８】
抗体がストレスを受けて引き起こす構造変化については、近年詳細な解析が進んでいる(非特許文献７および８)。これらの先行研究では、天然型立体構造では頑強な立体構造を保持していた領域が、ストレスによって立体構造が崩れてフレキシブルな構造状態に変化する現象を観察している。しかし、立体構造が崩壊することに言及する一方で、その結果として生じる“特定の非天然型立体構造”に関する記述はない。また、酵素消化で得られたC末端欠失Fc断片が、コンフォーメーション変化により、IgGの多量体化を低減させるとの報告もあるが（非特許文献９）、変化に関連した“特定の非天然型立体構造”に関する記述はない。【０００９】
また、定量的なアッセイ法を確立する上で、安定な参照物質は欠かせない。しかし、ストレスを受けて生じた変性抗体は天然型の抗体との混合物であり、混合物中の変性抗体の比率を制御することは難しい。また変性抗体は多様な会合状態の凝集物であり、会合状態は経時的に変化する。総合すると、ストレスを受けて生じた変性抗体を参照物質として利用することは、非常に困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第2014/115229号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2008/054030号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Lowe, D., Dudgeon, K., Rouet, R., Schofield, P., Jermutus, L., and Christ, D. (2011) “Aggregation, stability, and formulation of human antibody therapeutics.” Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 84, 41-61.
【非特許文献２】Rosenberg, A. S. (2006) Effects of protein aggregates: an immunologic perspective. AAPS J. 8, E501-7.
【非特許文献３】Watanabe, H., Yageta, S., Imamura, H., and Honda, S. (2016) Biosensing Probe for Quality Control Monitoring of the Structural Integrity of Therapeutic Antibodies. Anal. Chem. 88, 10095-10101.
【非特許文献４】Sakamoto, K., Ito, Y., Hatanaka, T., Soni, P. B., Mori, T., and Sugimura, K. (2009) Discovery and characterization of a peptide motif that specifically recognizes a non-native conformation of human IgG induced by acidic pH conditions. J. Biol. Chem. 284, 9986-9993.
【非特許文献５】Cheung, C. S. F., Anderson, K. W., Patel, P. M., Cade, K. L., Phinney, K. W., and Turko, I. V. (2017) A new approach to quantification of mAb aggregates using peptide affinity probes. Sci. Rep. 7, 42497.
【非特許文献６】Paul, A. J., Schwab, K., Prokoph, N., Haas, E., Handrick, R., and Hesse, F. (2015) Fluorescence dye-based detection of mAb aggregates in CHO culture supernatants. Anal. Bioanal. Chem. 407, 4849-4856.
【非特許文献７】Latypov, R. F., Hogan, S., Lau, H., Gadgil, H., and Liu, D. (2012) Elucidation of acid-induced unfolding and aggregation of human immunoglobulin IgG1 and IgG2 Fc. J. Biol. Chem. 287, 1381-1396.
【非特許文献８】Zhang, A., Singh, S. K., Shirts, M. R., Kumar, S., and Fernandez, E. J. (2012) Distinct aggregation mechanisms of monoclonal antibody under thermal and freeze-thaw stresses revealed by hydrogen exchange. Pharm. Res. 29, 236-250.
【非特許文献９】Rispens T, Himly M, Ooievaar-De Heer P, den Bleker TH, Aalberse RC. (2010) Traces of pFc' in IVIG interact with human IgG Fc domains and counteract aggregation. Eur J Pharm Sci. Apr 16;40(1):62-8.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
変性抗体を特異的に認識するプローブを使って定量的に評価する試みがなされているが、多くの生化学者にとって、変性タンパク質と変性タンパク質を認識するプローブとの相互作用は非特異的であることが常識であり、“変性タンパク質との特異的な結合”は、多くの生化学者にとって矛盾を孕んだ印象を与える。そして、変性抗体の定量的な評価のためには、参照物質の開発が望まれていた。
本発明は、変性抗体が有する非天然型立体構造を模したポリペプチドであって、変性抗体の定量的な評価に用いることのできるポリペプチドを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
抗体は、物理・化学的ストレスによりその一部のアミノ酸配列が天然型の立体構造を失い、特定の非天然型立体構造を有することになる。本発明者は、特許文献１に開示されるプローブが認識する“特定の非天然型立体構造”は、“構造変化によって露出した内部構造”に存在すると予想した。【００１４】
抗体の内部構造を露出させるにあたって、熱や酸によって構造変化を引き起こす方法は、純度・安定性を担保できないため不適である。本発明者らは、抗体のアミノ酸配列に欠失変異を加えることによって、目的の非天然型立体構造を創出することを着想した。【００１５】
特許文献１に開示されるプローブは、非天然型立体構造を有する抗体のFc領域に特異的に結合することが報告されている。そこで本発明者らは、当該プローブが認識する非天然型立体構造が、Fc領域のうちのCH2ドメインおよびCH3ドメインのいずれに存在するのかを検証し、CH3ドメインの非天然型立体構造に当該プローブが結合することを見出した。【００１６】
次いで、CH3ドメインの非天然型立体構造を模倣するポリペプチドをデザインするために、先行研究で示された構造変化領域について情報を整理した。まず、Latypovらの報告(Latypovら、Journal of Biological Chemistry、2012)では、ヒトIgG1のFc領域に酸ストレスを加えた試料のNMRスペクトルを評価している。pHを3.1まで下げることによって、重鎖のアミノ酸配列における366番目から380番目までおよび428番目から438番目までに相当するアミノ酸残基群のピークが消失したことを報告している。これらの残基群はCH2-CH3相互作用界面を形成する。次にZhangらの報告(Zhangら、Pharmaceutical Research、2012)では、ヒトIgG1全長に、凍結融解ストレス、熱ストレスを加えた試料の水素-重水素交換質量分析を実施している。塩酸グアニジンを加えて凍結融解ストレスを与えた実験では、重鎖の各ドメインで同時的に構造変化が生じていることを報告している。一方で、熱ストレスでは、Fab領域を形成するVHドメイン、CH1ドメインが主に構造変化し、CH3ドメインにおいては重鎖のアミノ酸配列における430番目から452番目までに相当するアミノ酸残基が構造変化することを報告している。【００１７】
これらの先行研究の内容をCH3ドメインに着目して鋭意検討を重ねた結果、発明者らは、CH3ドメインの非天然型立体構造を模倣するためには、C末端を特定の長さだけ欠失させる変異を加えることが有効であることを見出した。【００１８】
本発明は上記知見に基づくものであり、以下の〔１〕〜〔１３〕を含む：
〔１〕  下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のC末端欠失CH3ドメイン（C-terminal truncated CH3 domain）：
（ｉ）配列番号１〜７のいずれかに示されるアミノ酸配列において、C末端側から5〜20残基の範囲内でアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるC末端欠失CH3ドメイン、または、
（ｉｉ）配列番号１〜７のいずれかに示されるアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は、付加したアミノ酸配列において、C末端側から5〜20残基の範囲内でアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなり、かつ、AF.2A1ポリペプチド（配列番号９）が特異的に結合するC末端欠失CH3ドメイン。
〔２〕  〔１〕に記載のC末端欠失CH3ドメインであって、AF.2A1ポリペプチドとの解離定数が10μM以下である、C末端欠失CH3ドメイン。
〔３〕  〔１〕または〔２〕に記載のC末端欠失CH3ドメインであって、
（ｉ）’上記（ｉ）に記載のC末端欠失CH3ドメインが、配列番号１〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列において、C末端側から5〜20残基の範囲内でアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなり、
（ｉｉ）’上記（ｉｉ）に記載のC末端欠失CH3ドメインが、配列番号１〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は、付加したアミノ酸配列において、C末端側から5〜20残基の範囲内でアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなり、かつ、AF.2A1ポリペプチドが特異的に結合するものである、C末端欠失CH3ドメイン。
〔４〕  C末端側から5〜10残基の範囲内でアミノ酸が欠失している、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のC末端欠失CH3ドメイン。
〔５〕  C末端側から5残基のアミノ酸が欠失している、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のC末端欠失CH3ドメイン。
〔６〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のC末端欠失CH3ドメインを含むFc領域フラグメント。
〔７〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のC末端欠失CH3ドメインを含む抗体。
〔８〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のC末端欠失CH3ドメインを含むタンパク質。
〔９〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のC末端欠失CH3ドメイン、〔６〕に記載のFc領域フラグメント、〔７〕に記載の抗体を含む、および〔８〕に記載のタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む変性抗体の評価キット。
〔１０〕  さらにAF.2A1ポリペプチド（配列番号９）を含む、〔９〕に記載のキット。
〔１１〕  試料中に含まれる変性抗体を定量的に測定する方法であって、
AF.2A1ポリペプチド（配列番号９）と前記試料中に含まれる変性抗体との結合量を測定する工程と
AF.2A1ポリペプチドと〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のC末端欠失CH3ドメイン、〔６〕に記載のFc領域フラグメント、〔７〕に記載の抗体、または〔８〕に記載のタンパク質との結合量を測定する工程と、
前記C末端欠失CH3ドメイン、前記Fc領域フラグメント、前記抗体、またはタンパク質とAF.2A1ポリペプチドとの結合量から前記試料中の変性抗体の量を算出する工程と
を含む測定方法。
〔１２〕  変性抗体に対する親和性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のC末端欠失CH3ドメイン、〔６〕に記載のFc領域フラグメント、〔７〕に記載の抗体、または〔８〕に記載のタンパク質と試験化合物との相互作用を測定する工程を含む、スクリーニング方法。
〔１３〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のC末端欠失CH3ドメイン、または前記C末端欠失CH3ドメインを含むFc領域フラグメント、抗体、もしくはタンパク質を参照物質として含有する、変性抗体の定量用参照試薬（参照試薬組成物）。
前記参照試薬において、C末端欠失CH3ドメインや前記C末端欠失ドメインを含む抗体もしくはそのフラグメントは均一であり、安定性を有し、変性抗体の定量的な評価を妨げるような会合・凝集状態にはない。C末端欠失CH3ドメイン、Fc領域フラグメント、または抗体には、参照物質として使用するために、Hisタグなどの有機化合物や無機化合物による修飾を付加してもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のC末端側のアミノ酸が欠失したCH3ドメインは、変性抗体が有する非天然型立体構造に特異的に結合するプローブにより特異的に認識される。これにより本発明のC末端側のアミノ酸が欠失したCH3ドメインは、変性抗体の定量的な評価において参照物質として用いることができ、従来困難であった変性抗体の定量的な評価を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１中、(A)はAF.2A1ポリペプチドとCH2ドメインの結合性を表すセンサグラムを示し、(B)はAF.2A1ポリペプチドとCH3ドメインの結合性を表すセンサグラムを示す。
【図２】図２(A)はFc領域のうち、C末端5残基を黒塗りで強調した立体構造モデル、図２(B)はFc領域のうち、C末端10残基を黒塗りで強調した立体構造モデル、図２(C)はFc領域のうち、C末端15残基を黒塗りで強調した立体構造モデル、図２(D)はFc領域のうち、C末端20残基を黒塗りで強調した立体構造モデルをそれぞれ示す。
【図３】AF.2A1ポリペプチドとC末端欠失改変体CH3ドメインとの結合割合を表すセンサグラムを示す。図３中、(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、(F)および、(G)はそれぞれ、C末端が2、3、4、5、10、15、または、20残基欠失したCH3ドメインとAF.2A1ポリペプチドとの結合割合を示す。図３中、(H)はCH3ドメインとAF.2A1ポリペプチドとの結合割合を示す。
【図４】図４中、(A)はAF.2A1ポリペプチドとC末端5残基を削除したCH3ドメインの結合親和性を表すセンサグラムを示し、(B)はAF.2A1ポリペプチドと酸ストレスを与えたFc領域の結合親和性を表すセンサグラムを示す。
【図５】図５中、(A)はC末端5残基を削除したCH3ドメインのAF.2A1に対する結合レスポンスの保存安定性を示すグラフである。図５中、(B)は酸処理によって非天然構造化させたヒトモノクローナルIgG1のAF.2A1に対する結合レスポンスの保存安定性を示すグラフである。
【図６】図６中、(A)はC末端5残基を削除したCH3ドメインの粒子サイズの時間変化を動的光散乱法で評価した自己相関関数である。図６中、(B)は酸処理によって非天然構造化させたヒトモノクローナルIgG1の粒子サイズの時間変化を動的光散乱法で評価した自己相関関数である。
【図７】AF.2A1ポリペプチドに対する結合レスポンスを縦軸に、C末端5残基欠失ドメインの濃度を横軸にとった検量線を示す。図７中、(A)は保管0日目のC末端5残基欠失ドメインを用いて作製した検量線である。○はC末端5残基欠失ドメイン、■は測定試料とした酸ストレスIgG1を表す。図７中、(B)は保管1日目のC末端5残基欠失ドメインを用いて作製した検量線である。図７中、（C）は保管0、１日目の酸ストレスIgG1を用いて作製した検量線である。□は保管0日目、■は保管1日目の酸ストレスIgG1を表す。
【図８】5残基欠失CH3ドメインとAF.2A1ポリペプチドとの親和性を等温滴定型熱量測定(ITC)法により評価した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、C末端側からアミノ酸が5〜20残基の範囲内で欠失しているCH3ドメイン（C末端欠失CH3ドメイン：C-terminal truncated CH3 domain）を提供する。
【００２２】
本明細書において「CH3ドメイン」とは、免疫グロブリンG(IgG)を形成するポリペプチドの１つである重鎖のC末端に位置する領域をいう。ヒトのIgGの場合、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4の4種類のサブクラスが挙げられ、それぞれ配列番号1〜4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとして特定される。CH3ドメインは非共有結合によってホモ二量体を形成する特性を持つ。特別な記載のない限り、CH3ドメインはホモ二量体を形成した分子を指す。
【００２３】
また、ヒト以外の哺乳類に由来するIgGにおいても同様の領域がCH3ドメインとして知られており、例えばマウス、ラット、ウサギに由来するIgGのCH3ドメインは、それぞれ配列番号5〜7に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとして特定される。由来の異なるCH3ドメインはアミノ酸配列上の相同性に関わらず、互いに類似した立体構造を保持することが一般に認められる。立体構造の類似性を表す指標の一つであるα炭素の平均二乗偏差（RMSD）を用いると、ヒト由来のCH3ドメインに対する平均二乗偏差は、マウスIgG、ラットIgG、ウサギIgG由来のCH3ドメインにおいて、それぞれ0.63、0.63、0.33 A（オングストローム；A=0.1nm）である。下記に例示として、ヒトIgG由来CH3ドメインと、マウスIgG、ラットIgG、または、ウサギIgG由来のCH3ドメインとのRMSDを示す。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
ドメインサイズのポリペプチドを比較した際に平均二乗偏差が2オングストローム未満であれば、互いの構造が高く類似しているといえる(Gan HHら、(2002) Biophys J., 2002、83(5) 2781-2791.)。以上より、ヒト由来のIgG CH3ドメインで認められる立体構造的な特性は、ヒト以外の哺乳類に由来するIgG CH3ドメインにおいても同様である可能性が高い。
【００２６】
本発明のC末端欠失CH3ドメインはそのアミノ酸配列において、少なくともN末端側から1〜87番目のアミノ酸残基を保持し、CH3ドメインのアミノ酸配列に従ってさらに0〜15残基のアミノ酸残基を保持するものである。好ましくは、N末端側から1〜87番目のアミノ酸残基に加えて、さらに5~15残基（5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,または15残基）の範囲内、より好ましくは10〜15残基の範囲内のアミノ酸残基を保持する。最も好ましくは、N末端側から1〜87番目のアミノ酸残基に加えて、さらに15残基を保持する、言い換えればCH3ドメインのアミノ酸配列において1~102番目のアミノ酸残基を保持するCH3ドメインである。
【００２７】
これらは、CH3ドメインのC末端に付加・欠失・挿入を持たない場合においては、C末端側からアミノ酸が5〜20残基の範囲内で欠失すると言い換えられる。好ましくは5〜15残基（5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,または15残基）の範囲内（例えば、6〜20、7〜20、6〜19、7〜19など、5〜15の範囲であればよい）、より好ましくは5〜10残基の範囲内（例えば、6〜10、7〜10、6〜9、7〜9など、5〜10の範囲であればよい）でアミノ酸が欠失している形態である。最も好ましくはC末端側からアミノ酸が5残基欠失しているCH3ドメインである。以下、CH3ドメインのC末端に付加・欠失・挿入を持たない場合に従って、C末端側からの欠失を数える表記法で記載する。
【００２８】
本発明のCH3ドメインはそのアミノ酸配列のC末端側からアミノ酸が5〜20残基の範囲内で欠失することにより、変性抗体がそのCH3ドメインに有する非天然型立体構造を模倣する。C末端側から5残基未満でアミノ酸が欠失する場合は特定の非天然型立体構造を形成せず、20残基を超えて欠失すると構造安定性の著しく低い分子となるため好ましくない。
【００２９】
また、例えば、CH3ドメインにおいてC末端側の20残基が欠失しているというとき、CH3ドメインのC末端にあるアミノ酸残基と当該アミノ酸残基から数えて20番目のアミノ酸残基の範囲（言い換えれば、CH3ドメインのアミノ酸配列における88〜107番目のアミノ酸残基、または、重鎖のアミノ酸配列における430〜449番目のアミノ酸残基）でアミノ酸が欠失していることをいう。ここで重鎖のアミノ酸番号は、配列番号8に記載のアミノ酸配列を元にしている。
【００３０】
本明細書において、「変性抗体」とは、酸、アルカリ、加熱、凍結融解、撹拌等によるストレスで抗体の全構造又は一部構造が変化したものを指す。また、変性抗体に対するストレスの付加により、その全構造又は一部構造が変化した後の構造状態を指して非天然型立体構造と呼ぶ。また、変性抗体は、非天然型立体構造への構造変化を端緒として会合体を形成した複数の変性抗体からなる凝集体となりうる。本明細書において「変性抗体」というとき、このような複数の変性抗体からなる凝集体を含む。
【００３１】
なお変性抗体は、非天然型立体構造を有するCH3ドメインを含む限り、その種類について特に限定はなく、例えば、免疫グロブリンのアイソタイプ(IgG、IgA、IgD、IgE、IgM等)及びそれらのアイソタイプのサブクラスが挙げられ、より具体的に、ヒトの免疫グロブリンとして、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgMの9種類のクラスが挙げられる。また、変性した抗体が由来する動物種について特に限定はなく、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等に由来する抗体が挙げられ、特にヒトに由来する抗体が好ましい。さらに、変性した抗体は、このような単一の動物種に由来する抗体に限らず、異なる動物種に由来する抗体の断片が結合されてなる抗体であってもよい。かかる抗体としては、例えば、キメラ抗体(ヒト抗体のFc領域と、他の動物に由来する抗体(例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体)に由来する配列(可変領域、CDR等)を含むキメラ抗体等)、ヒト化抗体であってもよい。また、本発明にかかる抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、Fc領域を含むキメラタンパク質であってもよい。
【００３２】
本発明のC末端欠失CH3ドメインは、変性抗体がそのCH3ドメインに有する非天然型立体構造を模倣するものであるが、好ましい一実施の形態においては、酸ストレスにより生じた変性抗体のCH3ドメインに生じた非天然型立体構造を模倣している。
【００３３】
また、好ましい一実施の形態において非天然型立体構造は、酸ストレスによりCH3ドメインに生じた立体構造の変性をいう。
【００３４】
ここで酸処理とは、限定するものではないが、好ましくはpH4.0以下、より好ましくはpH1.5〜2.0の条件下に曝露されることを意味する。例えば、免疫グロブリンGは、10mM Glycine-HCl,150mM NaCl,pH2.0の緩衝液で処理することによって通常の天然型構造とは異なるAlternatively folded state(AFS)と呼ばれる非天然型構造を形成することが報告されている(Bucher J. et al., (1991) Biochemistry, 30(28) 6922-6929、Thies MJ. et al,, (2001) J. Mol. Bio., 309(5) 1077-1085、Feige MJ. et al., (2010) J. Mol. Biol., 399(5) 719-730）。
ここで、本発明のC末端欠失CH3ドメインが変性抗体のCH3ドメインに生じる非天然型立体構造を模倣するとは、変性抗体の非天然型立体構造を特異的に認識するプローブが、C末端が欠失しているCH3ドメインに特異的に結合することを意味する。
【００３５】
本明細書において「非天然型立体構造を特異的に認識するプローブ」とは、変性抗体に生じた非天然型立体構造を特異的に認識するプローブをいい、特にAF.2A1ポリペプチドを挙げることができる。
【００３６】
好ましい実施の形態においては、本発明のC末端欠失CH3ドメインが変性抗体のCH3ドメインに生じる非天然型立体構造を模倣するというとき、AF.2A1ポリペプチドがC末端欠失CH3ドメインに対して量論比的に結合することを意味する。具体的には、C末端欠失CH3ドメイン１分子に対して、AF.2A1ポリペプチドが１分子結合するような状態が保持されることをいう。C末端欠失CH3ドメインが、係る特性を保持するためには、AF.2A1ポリペプチドとの結合界面が全分子に等しく形成されていること、そしてその結合界面が凝集体形成等によって損なわれないこと、の2点が重要である。
【００３７】
一方で、C末端欠失CH3ドメインが、AF.2A1ポリペプチドとは異なる変性抗体プローブと結合する可能性を排除しない。
【００３８】
本発明のC末端欠失CH3ドメインに対して、酸、アルカリ、加熱、凍結融解、撹拌等による処理によって得られた変性抗体は、一般に量論比的な結合を示しづらい。理由としてはまず、天然型の非変性抗体との混合状態であり、全抗体分子の高々数十%程度であると見積もられる。また、変性抗体は凝集体を形成し、一部の抗体分子は凝集体内部に埋没するためAF.2A1ポリペプチドに補足されない。さらには、非変性抗体と変性抗体の比率、変性抗体のうち凝集体内部に埋没する分子の比率は、変性処理の条件や変性処理後の保存条件、保存期間によって大きく変化する。これらの特性は、変性処理によって得られた変性抗体と変性抗体認識プローブとの結合の量論比を制御することを困難にする。
【００３９】
「AF.2A1ポリペプチド」は公知であり、例えば、国際公開第2014/115229号パンフレットなどに開示される。「AF.2A1ポリペプチド」は、上述のように、非天然型構造を形成したFc領域への特異的な結合活性を有することが報告されており、また、本発明者らはCH3ドメイン内の非天然型立体構造への特異的な結合活性を有することを見出している。本明細書において、「AF.2A1ポリペプチド」は、前記活性に加えて、非天然型立体構造を有する抗体またはFc領域含有タンパク質を含む凝集体に対する結合活性も有する。また、AF.2A1ポリペプチドは、非天然型立体構造を有する抗体またはFc領域含有タンパク質を含む凝集体への結合活性を有するが、天然型のヒト抗体Fc領域には結合しない。
【００４０】
AF.2A1ポリペプチドは、配列番号9に記載のアミノ酸配列により特定することができる。また、AF.2A1ポリペプチドは、配列番号9に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列により特定することもできる。例えば、AF.2A1ポリペプチドは、配列番号10に記載の塩基配列によりコードされるポリペプチドからなる。
【００４１】
本明細書においてAF.2A1ポリペプチドにはその類似体を含む。AF.2A1の類似体とは、AF.2A1ポリペプチドと類似のポリペプチドからなり、AF.2A1ポリペプチドと同様の機能（すなわち、非天然型立体構造を有するCH3ドメインまたは当該CH3ドメインを含む抗体やそのフラグメントから形成される凝集体に対する結合活性）を有するポリペプチドをいう。
【００４２】
一実施の形態において、AF.2A1ポリペプチドの類似体は、非天然型立体構造を有するCH3ドメインに対する結合活性が損なわれない範囲で、配列番号9に記載のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、付加、または、欠失しているアミノ酸配列からなるポリペプチドと特定することができる。ここで、数個のアミノ酸とは、例えば、１〜８個、１〜６個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１個または２個のアミノ酸をいう。なお、配列番号9に記載のアミノ酸配列を含み、上記結合活性を有する限りにおいて、ポリペプチド配列のアミノ酸残基数に制限はない。AF.2A1ポリペプチドの類似体の具体例としては、以下に限定されないが、例えば、配列番号11〜33に記載のアミノ酸配列をからなるものを挙げることができる。
【００４３】
本発明のC末端欠失CH3ドメインが由来する抗体については特に限定はなく、例えば、免疫グロブリンのアイソタイプ(IgG、IgA、IgD、IgE、IgM等)及びそれらのアイソタイプのサブクラスが挙げられ、より具体的に、ヒトの免疫グロブリンとして、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgMの9種類のクラスが挙げられる。また、CH3ドメインが由来する抗体の動物種についても特に限定はなく、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等に由来する抗体が挙げられ、特にヒトに由来する抗体が好ましい。
【００４４】
一実施の形態において、本発明のC末端欠失CH3ドメインは、配列番号1〜7に示されるアミノ酸配列により特定することができる。
【００４５】
より具体的には、本発明のC末端欠失CH3ドメインは一実施の形態において下記のように特定できる：
（ｉ）配列番号1〜7のいずれかに示されるアミノ酸配列において、C末端側から5〜20残基の範囲内でアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるC末端欠失CH3ドメイン（C-terminal truncated CH3 domain）、または、
（ｉｉ）配列番号1〜7のいずれかに示されるアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が置換、欠失（deletion）、挿入、及び／又は、付加したアミノ酸配列において、C末端側から5〜20残基の範囲内でアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなり、かつ、AF.2A1ポリペプチドが特異的に結合するC末端欠失CH3ドメイン。
【００４６】
ここで、数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたというとき、数個は、例えば2〜10であり、好ましくは2〜8個であり、より好ましくは2〜6個であり、さらに好ましくは2~3個である。なお、本発明のC末端欠失CH3ドメインは、配列番号１〜７のいずれかに示されるアミノ酸配列におけるC末端のアミノ酸が特定の残基数で欠失しているものであるため、「１又は数個のアミノ酸の付加」には当該アミノ酸配列のC末端への付加を含まない。
【００４７】
本発明のC末端欠失CH3ドメインは、アミノ酸の変異とは別に、Hisタグなどの精製タグを含めた付加配列がN末端またはC末端に付加されることを排除しない。
【００４８】
「AF.2A1ポリペプチドが特異的に結合する」とは、AF.2A1ポリペプチドが変性抗体および非変性抗体が存在する溶液中において変性抗体の非天然型立体構造に特異的に結合するのと同様に、C末端欠失CH3ドメインに対しても非変性抗体の存在下、特異的に結合することをいう。
【００４９】
一実施の形態において、本発明のC末端欠失CH3ドメインは、AF.2A1が10μM以下の解離定数で結合するものである。好ましくは1μM以下、より好ましくは100 nM以下の解離定数で結合する。
【００５０】
本発明は変性抗体が有する非天然型立体構造を模倣するポリペプチドとして、C末端側からアミノ酸が5〜20残基の範囲内で欠失しているCH3ドメインを提供する。このC末端欠失CH3ドメインの作製は公知の方法に従い実施することができる。
【００５１】
また、このような変性抗体を模倣するポリペプチドを設計する戦略として、アミノ酸配列に変異を加えることは有効である。即ち、抗体の一部のアミノ酸配列に欠失・挿入・置換を加えることによって、非天然型の立体構造を安定的に実現しうる。但し、このような変異を加えるに際して、分子全体の安定性が損なわれないように留意する必要がある。
【００５２】
変異を加える領域を選抜する上では、抗体の変性メカニズムを記述した先行研究を参考にすることができる。ドメインサイズにおける変性の機序に関しては、示差走査型熱量測定(DSC)等による安定性試験が利用される(Ejimaら、Proteins. 2007 Mar 1;66(4):954-962.)。昇温に伴って、まずヒンジ領域を含むCH2ドメインが、次いでFab領域が、最後にCH3ドメインが構造変化することが知られる。また、残基サイズにおける変性の機序に関しては、水素-重水素交換質量分析や核磁気共鳴法等による高次構造解析が利用される(Latypovら、J. Biol. Chem. 2012, 287, 1381-1396.,Zhangら、Pharm. Res. 2012, 29, 236-250.)。酸、熱、凍結融解等のストレスによる構造変化を検出した報告例が知られる。
【００５３】
これらを総合すると、変性においては各ドメイン内で同時多発的に微細な構造変化が生じており、各ドメインに対して変性抗体を模倣するポリペプチドを設計することが可能と考えられる。翻って、参照物質として利用することを目的とするならば、当該プローブが認識するドメインを特定した上で、そのドメイン内で構造変化を起こしやすい領域に適切な変異を加えることが有効であると考えられる。
【００５４】
変性抗体を模倣したポリペプチドの特性評価においては、プローブ（例えば、AF.2A1ポリペプチド）との結合レスポンスを評価する。プローブとの結合レスポンスを評価するためには、ELISA、表面プラズモン共鳴法(SPR)、バイオレイヤー干渉法(BLI)等の利用が可能である。特に、SPRではサンプル溶液中に存在する結合分子の濃度を、標準物質を使わずに決定する手法(Calibration-free concentration analysis；CFCA)が確立されている。CFCAは夾雑分子を含む試料中で活性物質の濃度を決定する場合に強力な手法である(Pascaleら、Anal Biochem. 1997 Jul 1;249(2):165-73.)。CFCAを利用することによって変性抗体を模倣したポリペプチドの割合を評価することができる。具体的には、CFCAからプローブに結合する変性抗体を模した構造を保持する分子の濃度を決定し、吸光度等から決定した濃度で除することによって、変性抗体を模倣するポリペプチドの割合を評価することができる。
【００５５】
また、変性抗体を模倣するポリペプチドの安定性を評価するには、動的光散乱法(DLS)を利用した分子サイズ評価が有効である。DLSはタンパク質の単量体(1~10nm)から凝集体(<1000nm)までのサイズの分子を測定可能である。同様の目的でサイズ排除クロマトグラフィ等も利用可能である。
【００５６】
本発明の別の態様は、上述する本発明のC末端欠失CH3ドメインを含むFc領域フラグメントまたは抗体を提供する。Fc領域および抗体を構成するC末端欠失CH3ドメイン以外の領域は、C末端欠失CH3ドメインに対して同一の動物種由来やアイソタイプ（サブクラスを含む）とすることもできるし、異なる動物種由来、アイソタイプ（サブクラスを含む）であってもよい。本明細書において、抗体はCH3ドメインを含む限り、そのフラグメントであってもよい。
【００５７】
本発明の別の態様は、上述する本発明のC末端欠失CH3ドメインを含むタンパク質を提供する。上記タンパク質は、C末端欠失CH3ドメインを含み、AF.2A1ポリペプチドと特異的に結合しうる限り、特に限定されない。本発明のタンパク質の具体例としては、例えば、検出用の酵素（例えば、ルシフェラーゼ、アスカリフォスファターゼ、西洋わさびペルオキシダイーゼなど）、タグタンパク質（例えば、GFP、MBP、GST、チオレドキシンタグなど）、抗体断片（例えば、Fab、Fab'、(Fab')2、scFv、diabody、dsFvなど）をC末端欠失CH3ドメインに融合したタンパク質を挙げることができる。
【００５８】
また本発明は一態様において、変性抗体を評価するためのキットを含む。本発明の変性抗体の評価キットは、上述するC末端欠失CH3ドメイン、または、当該C末端欠失CH3ドメインを含むFc領域フラグメント、抗体もしくはタンパク質を含む。当該評価キットには、その他変性抗体の評価に用いられる試薬や器具を含むことができる。好ましい一実施の形態において、本発明の評価キットはAF.2A1ポリペプチドをさらに含む。
【００５９】
また本発明は一態様において、試料中に含まれる変性抗体を定量的に測定する方法を提供する。ここで本発明の変性抗体の測定方法は、AF.2A1ポリペプチドと試料中に含まれる変性抗体との結合量を測定する工程と、AF.2A1ポリペプチドと、上述するC末端欠失CH3ドメインまたは当該C末端欠失CH3ドメインを含むFc領域フラグメント、抗体もしくはタンパク質との結合量を測定する工程と、C末端欠失CH3ドメイン、Fc領域フラグメント、または、抗体とAF.2A1との結合量から前記試料中の変性抗体の量を算出する工程とを含む。
【００６０】
AF.2A1ポリペプチドと試料中に含まれる変性抗体との結合量の測定の手法は特に制限されず、公知の方法に従って行うことができる。例えば、AF.2A1ポリペプチドを固定化したフローセルを用いた表面プラズモン共鳴法（SPR）を用いて測定することができる。また、AF.2A1ポリペプチドと、C末端欠失CH3ドメインまたは当該C末端欠失CH3ドメインを含むFc領域フラグメントもしくは抗体との結合量の測定も同様にして行うことができる。
【００６１】
変性抗体の量を算出する方法は、AF.2A1ポリペプチドと、C末端欠失CH3ドメインまたは当該C末端欠失CH3ドメインを含むFc領域フラグメントもしくは抗体との結合量の測定結果から検量線を作成し、当該検量線を用いて求めることができる。すなわち、得られた検量線と、AF.2A1ポリペプチドおよび試料中に含まれる変性抗体の結合量の測定値とを比較することにより変性抗体の量を求めることができる。
【００６２】
このように本明細書において、「変性抗体を定量的に測定する」とは、本発明のC末端欠失CH3ドメイン等を参照物質として用いた検量線に対する換算値を求めることを意味する。
【００６３】
また本発明は一態様において、変性抗体に対する親和性を有する化合物をスクリーニングする方法を提供する。ここで本発明のスクリーニング方法は、上述するC末端欠失CH3ドメインまたは当該C末端欠失CH3ドメインを含むFc領域フラグメントもしくは抗体と、試験化合物との相互作用を測定する工程を含む。
【００６４】
C末端欠失CH3ドメイン等と試験化合物との相互作用を測定する手法は特に制限されず、公知の手法を用いることができる。例えば、上述する表面プラズモン共鳴法（SPR）を挙げることができる。
【００６５】
C末端欠失CH3ドメインは変性抗体の非天然型立体構造を模しているため、本発明のスクリーニング方法によりC末端欠失CH3ドメイン等と相互作用を示した化合物は変性抗体に対する親和性を有する候補化合物である。
【００６６】
本発明は一態様において、変性抗体の定量用参照試薬（試薬組成物）を提供する。前記参照試薬は、本発明のC末端欠失CH3ドメインまたは当該C末端欠失CH3ドメインを含むFc領域フラグメントもしくは抗体もしくはタンパク質を参照物質として含有する。含有されるC末端欠失CH3ドメイン、Fc領域フラグメントまたは抗体またはタンパク質は均一であり、安定であり、変性抗体の定量的な評価を妨げるような会合・凝集を生じず、プローブであるAF.2A1ポリペプチドと特異的に結合することで、変性抗体の定量的な評価における参照物質として機能する。C末端欠失CH3ドメイン、Fc領域フラグメントまたは抗体には、参照物質として使用するために修飾が付加されていてもよい。
【００６７】
修飾に用いられる物質としては、ヒスチジンタグ、ビオチン、フルオレセイン等の蛍光性有機化合物、安定同位体、リン酸基、アシル基、アミド基、エステル基、エポキシ基、ポリエチレングリコール（PEG）、脂質、糖鎖、核酸、量子ドット等の蛍光性無機化合物、金コロイドなどを挙げることができる。
【００６８】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。また、本明細書に引用する特許文献および非特許文献の開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００６９】
(実施例１．AF.2A1ポリペプチドが認識するドメインの特定)
本実施例では、まずAF.2A1ポリペプチドが認識するドメインを、バイオレイヤー干渉法(BLI法)を使った親和性評価によって特定した。なお、BLI法は生体高分子間の特異的相互作用を測定する手法であり、特に凝集体を形成しうるような試料を安定に評価することのできる優れた方法であることが認識されているものである。【００７０】
本発明者は、N末端にヒスチジンタグを有する配列番号34に示されるアミノ酸配列からなるヒトIgG1のCH2ドメインおよび配列番号35に示されるアミノ酸配列からなるヒトIgG1のCH3ドメインを、大腸菌を宿主とする大量発現系を用いて調製し、ニッケルキレートアフィニティクロマトグラフィとサイズ排除クロマトグラフィを用いて精製した。これによりCH2ドメインまたはCH3ドメインを含む精製試料をそれぞれ得た。【００７１】
1 mg/mLに希釈した各精製試料3mLを、300mLの酸処理バッファ(100mM グリシン−塩酸(pH2.0))に対して一晩透析することで、酸ストレスを与えた。次に、各透析試料100μLに対して、中和バッファ(10mM クエン酸−水酸化ナトリウムバッファ(pH6.0)、150mM 塩化ナトリウム、0.05%(v/v) Tween20)を1.9mL加えて50μg/mLへと希釈し、酸ストレスを加えたCH2ドメインまたはCH3ドメインを含む試料を得た。【００７２】
センサー表面にストレプトアビジンを有するバイオセンサーSA(Pall Fortebio)に、ストレプトアビジン-ビオチン相互作用を介して、N末端にビオチンを付加したAF.2A1ポリペプチドを固定化した。試料中の酸ストレスを加えたCH2またはCH3ドメインとAF.2A1ポリペプチドとの親和性をBLIで測定した。BLIの測定はOctet RED 96 (Pall Fortebio)を用い、反応温度30℃で行った。観測結果は、Octet Data Analysis 8.0で解析した。【００７３】
観測の結果、酸ストレスを与えたCH3ドメインはAF.2A1ポリペプチドと結合すること、酸ストレスを与えたCH2ドメインはAF.2A1ポリペプチドと結合しないことが判明した(図１)。即ち、AF.2A1ポリペプチドの認識する領域はCH3ドメインであることが判明した。【００７４】
(実施例２．CH3ドメイン改変体群の非天然型立体構造としての評価)
次に、CH3ドメインの非天然型立体構造を模倣するためには、C末端を適当な長さだけ欠失させる変異を加えることが有効であると推察した。そこで、ヒトIgG1のCH3ドメインのN末端側から106番目以降（重鎖のアミノ酸配列N末端側から448番目以降に相当）のアミノ酸を2残基、105番目以降（重鎖のアミノ酸配列N末端側から447番目以降に相当）のアミノ酸を3残基、104番目以降（重鎖のアミノ酸配列N末端側から446番目以降に相当）のアミノ酸を4残基、103番目以降（重鎖のアミノ酸配列N末端側から445番目以降に相当）のアミノ酸を5残基、98番目以降（重鎖のアミノ酸配列N末端側から440番目以降に相当）のアミノ酸を10残基、93番目以降（重鎖のアミノ酸配列N末端側から435番目以降に相当）のアミノ酸を15残基、または、88番目以降（重鎖のアミノ酸配列N末端側から430番目以降に相当）のアミノ酸を20残基欠失させた改変体（以下、例えば、CH3ドメインの428番目以降5残基欠失させた改変体を5残基欠失CH3ドメインという）を調製し、各C末端欠失改変体とAF.2A1ポリペプチドとの相互作用を表面プラズモン共鳴(SPR)法により評価した(図２)。【００７５】
なお、SPR法は、生体高分子間の特異的相互作用を経時的に測定し、定量的に解釈できる優れた方法であることが認識されているものであり、特に標準試料を用いることなく結合分子の濃度を計測できる優れた方法であることが認識されているものである。【００７６】
SPRの測定にはBiacore T200(GE Health care)を使用した。まず、センサーチップCM5(GE Health care)のフローセルにアミドカップリング反応を用いてAF.2A1ポリペプチドを固定化した。ランニング緩衝液には、HBS-P(10mM HEPES-NaOH pH7.4、150mM NaCl、0.05% v/v Surfactant P20)を使用し、反応温度25℃で測定した。【００７７】
CH3ドメインのC末端欠失改変体は、CH3ドメインと同様の手法で調製した。吸光度をもとに0.1mg/mLにランニング緩衝液で希釈し、さらに終濃度50nmol/Lとなるように希釈した試料を実験に供した。流速は5、20、100μL/minの3点で測定した(図３)。観測結果の解析にはBiacore T200 evaluation software version 2.0を使用した。2、3、4残基欠失変異体においては結合レスポンスが得られず、5、10、15、20残基欠失変異体では結合レスポンスが得られた。得られた結合分子の濃度を、吸光度をもとにして算出した試料中のCH3ドメインのC末端欠失改変体濃度で除した割合は、5、10、15、20残基欠失変異体においてそれぞれ、92%、84%、36%、36%であった(表２)。CH3ドメインにおいては、定量下限以下のレスポンスであった。以上の結果からC末端のアミノ酸残基を5〜20個欠失したCH3ドメインは、AF.2A1と結合することを示した。また、本実施例において5残基を欠失させた改変体が変性抗体を模倣した分子として最も適当であった。【００７８】
【表２】
2019172401.tif 000003
【００７９】
(実施例３．5残基欠失CH3ドメインのAF.2A1ポリペプチドに対する親和性の評価)
5残基欠失CH3ドメインとAF.2A1ポリペプチドの親和性をSPR法により評価した。
SPRの測定にはBiacore T200 (GE Health care)を使用した。まず、センサーチップCM5(GE Health care)のフローセルにアミドカップリング法を用いて5残基欠失CH3ドメインを固定化した。比較対象として、実施例１に記載の酸処理と同じ条件で酸ストレスを与えたFc領域を調整し、当該酸ストレスFc領域を固定化したセンサーチップを作製した。ランニング緩衝液には、HBS-P(10mM HEPES-NaOH pH7.4、150mM NaCl、0.05% v/v Surfactant P20)を使用し、反応温度25℃で測定した。【００８０】
アナライト試料には、AF.2A1ポリペプチドをランニング緩衝液で溶解したものを公比2倍の希釈系列で200nmol/Lから12.5nmol/Lまで調製したものを使用した(図４)。観測結果の解析にはBiacore T200 evaluation software version 2.0を使用して解離定数を算出した。その結果、5残基欠失CH3ドメインまたは酸ストレスFc領域のAF.2A1ポリペプチドに対する結合は濃度依存的に上昇した。また、5残基欠失CH3ドメインおよび酸ストレスFc領域における結合の速度論パラメータ(解離定数、結合速度定数、解離速度定数)は同程度の値となった。5残基欠失CH3ドメインが酸ストレスを付加したFc領域と同様の非天然型立体構造を保持することが確認された(表３)。【００８１】
【表３】
2019172401.tif 000004
【００８２】
(実施例４．5残基欠失CH3ドメインのAF.2A1ポリペプチドに対する結合レスポンスの安定性、酸ストレスIgG1との比較)
5残基欠失CH3ドメインと酸ストレスIgG1を低温条件(4℃)で保管し、AF.2A1ポリペプチドに対する親和性の経時的変化をSPR法により評価した。【００８３】
5残基欠失CH3ドメインは、実施例2に記載の手法と同様に調製し、HBS-P (10mM HEPES-NaOH pH7.4、150mM NaCl、0.05% v/v Surfactant P20)で希釈して濃度を1mg/mLに調整した。酸ストレスIgG1は、市販のモノクローナルIgG1抗体(10mg/mL) 1mLに対して、酸処理バッファ(100mM グリシン−塩酸(pH2.0))を100mL添加し一晩透析することで、酸ストレスを与えた。次に、各透析試料90μLに対して、中和バッファ(1M トリス(pH未調整))を10μL加えて中和し、さらに0.8mLのHBS-Pを加えて希釈し、酸ストレスを加えた酸ストレスIgG1を含む試料を得た。いずれも調製は氷上で実施し、4℃で保管した。【００８４】
SPRの測定にはBiacore T200 (GE Health care)を使用した。まず、センサーチップCM5(GE Health care)のフローセルにアミドカップリング法を用いてAF.2A1ポリペプチドを固定化した。ランニング緩衝液には、HBS-Pを使用し、反応温度25℃で測定した。【００８５】
アナライト試料には、0、1、3、5日間保管した5残基欠失CH3ドメインまたは酸ストレスIgG1をランニング緩衝液で溶解したものを1μg/mLまで調製したものを使用した(図５)。観測結果の解析にはBiacore T200 evaluation software version 2.0を使用して結合レスポンスを算出した。その結果、5残基欠失CH3ドメインのAF.2A1ポリペプチドに対する結合は保管した5日間で著しい変化は観察されなかった。一方で、酸ストレスIgGは、0日保管試料と1日保管試料との間で著しい結合の低下が観察された。5残基欠失CH3ドメインは、酸ストレスIgG1と比較して、AF.2A1ポリペプチドに対する結合レスポンスにおける保存安定性が高いことが示された。【００８６】
(実施例５．5残基欠失CH3ドメインの分子サイズの安定性、酸ストレスIgG1との比較)
5残基欠失CH3ドメインと酸ストレスIgG1を低温条件(4℃)で保管し、分子サイズの経時的変化をDLSにより評価した。
なおDLSはタンパク質の単量体(1〜10nm)から凝集体(<1000nm)までのサイズの分子を測定可できる優れた方法であることが認識されているものである。【００８７】
5残基欠失CH3ドメインと酸ストレスIgG1は実施例４に記載の手法と同様に調製した。
DLSの測定にはZetaSizer Nano S (Malvern)を使用した。測定温度30℃で測定した。5残基欠失CH3ドメインと酸ストレスIgG1を1mg/mLのまま実験に供した。解析結果の解析にはZetaSizer softwear version 7.02を使用して自己相関関数を算出した(図６)。その結果、5残基欠失CH3 ドメインの分子サイズは保管した5日間で著しい変化は観察されなかった。一方で、酸ストレスIgG1は、1日保管した試料において著しい分子サイズの増大が観察された。5残基欠失CH3ドメインは、酸ストレスIgG1と比較して、分子サイズにおける保存安定性が高いことが示された。【００８８】
なお、1、3、5日保管した酸ストレスIgG1の平均粒子径はそれぞれ2.1、4.4、4.4μmと算出された。実施例４において、AF.2A1ポリペプチドに対する結合レスポンスが著しく低下した原因は、センサーチップ上のリガンドとの結合が立体障害によって阻害されたためと考えられる。【００８９】
(実施例６．5残基欠失CH3ドメインを参照物質として用いた変性抗体の定量)
5残基欠失CH3ドメイン、または酸ストレスIgG1を参照物質として、横軸に参照物質濃度、縦軸にAF.2A1ポリペプチドに対する結合レスポンスをとった検量線を作製して、試料中に含まれる変性抗体濃度を定量する例を以下に示す。【００９０】
AF.2A1ポリペプチドに対する結合レスポンスの評価にはSPRを使用した。SPRの測定にはBiacore T200 (GE Health care)を使用した。まず、センサーチップCM5(GE Health care)のフローセルにアミドカップリング法を用いてAF.2A1ポリペプチドを固定化した。ランニング緩衝液には、HBS-P(10mM HEPES-NaOH pH7.4、150mM NaCl、0.05% v/v Surfactant P20)を使用し、反応温度25℃で測定した。【００９１】
5残基欠失CH3ドメインと酸ストレスIgG1は実施例４に記載の手法と同様に調製した。それぞれ0日保管、1日保管の試料を実験に用いた。【００９２】
検量線用のアナライト試料には、5残基欠失CH3ドメインまたは酸ストレスIgG1をランニング緩衝液で溶解したものを1、0.3、0.1、0.03、0.01 μg/mLに調製して用いた 。観測結果の解析にはBiacore T200 evaluation software version 2.0を使用して結合レスポンスを算出した(図７)。【００９３】
0日保管の5残基欠失CH3ドメインの測定結果を用いて作成した検量線を図７(A)、1日保管の5残基欠失CH3ドメインの測定結果を用いて作成した検量線を図７(B)に示す。また同様にして酸ストレスIgG1（0日保管および1日保管）の測定結果を用いて作成した検量線を図７(C)に示す。【００９４】
これらの検量線を用いて、試料中に含まれる変性抗体濃度を定量すると以下のようになる。同センサーチップを用いて測定した未知試料の結合レスポンスが200 RUであるとする。この測定値を、0日保管の5残基欠失CH3ドメインの測定結果を用いて作成した検量線に当てはめると、試料中の変性抗体濃度は5残基欠失CH3ドメイン換算で0.205μg/mLと求められる。また、1日保管の5残基欠失CH3ドメインの測定結果を用いて作成した検量線に当てはめると、試料中の変性抗体濃度は5残基欠失CH3ドメイン換算で0.172μg/mLと求められる。一方で、同試料を、酸ストレスIgG1を参照物質とした検量線で定量すると、0日保管の酸ストレスIgG1の測定結果を用いて作成した検量線に当てはめると、試料中の変性抗体濃度は酸ストレスIgG1換算で0.910μg/mLと求められる。しかし、1日保管した酸ストレスIgG1の測定結果を用いると、測定結果は検量線範囲に収まらず、外挿値で8.18μg/mLとなる。以上を総合すると、5残基欠失CH3ドメインを参照物質として用いることで、酸処理IgG1を参照物質としても用いる場合よりも、未知試料の示す測定結果を再現性の高い定量値として扱うことが可能となる。【００９５】
(実施例７．5残基欠失CH3ドメインとAF.2A1ポリペプチドの親和性評価)
5残基欠失CH3ドメインとAF.2A1ポリペプチドの親和性を等温滴定型熱量測定(ITC)法により評価した。
ITCの測定にはNano ITC (TA Instruments)を使用した。5残基欠失CH3ドメイン1mLを、HBS(10mM HEPES-NaOH pH7.4、150mM NaCl) 100mLを外液とする一晩の透析によって溶媒置換した。その後、外液のHBSを用いて200μmol/Lに濃度を調製した。AF.2A1ポリペプチドは、外液のHBSを用いて30μmol/Lになるように溶解した。シリンジに充填した5残基欠失CH3ドメインを、セルに充填したAF.2A1ポリペプチドに対して段階的に滴下し、結合に伴う反応熱を測定した。反応温度25℃で測定した。AF.2A1ポリペプチドの代わりにHBSを充填したセルを使った測定により、5残基欠失CH3ドメインの希釈熱を測定した。希釈熱を差し引いた結合に伴う反応熱を分析に用いた。【００９６】
観測結果の解析にはNanoAnalyze software (TA Instruments)を使用した(図８)。その結果、5残基欠失CH3ドメインとAF.2A1ポリペプチドの結合量論比は、およそ1:1であることが確認できた(n=0.86)。これは、5残基欠失CH3ドメインのホモ二量体に対して、2分子のAF.2A1ポリペプチドが結合していることを示している。また、結合はエンタルピー駆動であることが確認できた(ΔH=-48.1 kJ/mol)。これは、相互作用が特異的な水素結合の形成などによるものであり、非特異的な疎水的な吸着によるものではないことを示している。総じて、ITCの結果は、5残基欠失CH3ドメインが変性抗体の有する特定の非天然型立体構造を模倣した分子であることを示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明により提供されるCH3ドメインは、バイオ医薬品、特に抗体医薬品の品質管理技術において変性抗体の定量的な評価に用いることができる。具体的には、変性抗体の検出装置における参照物質として用いられることが想定される(例えば、産総研バイオメディカルRI分子細胞育種RGが開発した変性抗体認識プローブAF.2A1を利用したアフィニティベースの検出装置への適用)。また本発明により提供されるCH3ドメインは、AF.2A1と同様の認識機構を有する化合物(例えば低分子化合物やオリゴ核酸)を取得する際のスクリーニング方法に利用することができる。【００９８】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中に取り入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【００９９】
配列番号9：化学合成
配列番号10：化学合成
配列番号11：化学合成
配列番号12：化学合成
配列番号13：化学合成
配列番号14：化学合成
配列番号15：化学合成
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配列番号27：化学合成
配列番号28：化学合成
配列番号29：化学合成
配列番号30：化学合成
配列番号31：化学合成
配列番号32：化学合成
配列番号33：化学合成
配列番号34：化学合成
配列番号35：化学合成
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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