(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養細胞高発現ペルオキシダーゼプロモーター(SWPA2)、TEV(tobacco
etch virus)リーダー配列、タバコ由来のカルレティキュリン(calreticulin)の信号配列、ラクトフェリン遺伝子及びCaMV 35S転写ターミネーター(transcription
terminator)を含む植物発現ベクターで形質転換されたアグロバクテリア(寄託番号 : KCTC 10217BP)。
【請求項２】
請求項１のアグロバクテリアが導入されヒトラクトフェリンを生産する形質転換体。
【請求項３】
上記形質転換体が、タバコまたはタバコ培養細胞である請求項２記載の形質転換体。
【請求項４】
上記形質転換体が、タバコ培養細胞である請求項３記載の形質転換体(寄託番号 : KCTC 10218BP)。
【請求項５】
上記形質転換体が、ウコギ科薬用植物または、ウコギ科薬用植物培養細胞である請求項２記載の形質転換体。
【請求項６】
上記ウコギ科薬用植物が、エゾウコギ、山蔘(野生の朝鮮人参)、たらの芽、黄漆の木(Dendropanax morbifera Lev.)及び朝鮮人参からなる群から選択される請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
上記形質転換体が、朝鮮人参培養細胞である請求項６記載の形質転換体(寄託番号 : KCTC 10219BP)。
【請求項８】
上記形質転換体が、エゾウコギ培養細胞である請求項６記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、培養細胞高発現ペルオキシダーゼプロモーター(SWPA2)を利用して目的蛋白質を生産する方法に関するものである。より詳細には、培養細胞高発現ペルオキシダーゼプロモーター(SWPA2)を使用して目的蛋白質を発現させる発現ベクターを製造し、該発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリア、該アグロバクテリアが導入され目的蛋白質を大量生産する形質転換体、及び上記形質転換体を利用して目的蛋白質を大量生産する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
韓国内で自生するウコギ科(朝鮮人参、エゾウコギ、黄漆の木(Dendropanax morbifera Lev.)等)薬用植物は、免疫機能及び生体抵抗力の強化、抗癌、抗酸化、抗脂質過酸化、抗微生物活性等の多様な生理活性がある。特に、韓国内で自生するウコギ科薬用植物は、生物活性に優れた色々な有用成分の含量が、他の国で栽培されたものに比べて飛び抜けて高い。
【０００３】
ヒトラクトフェリンは、哺乳動物の乳に高濃度で存在し、鉄が結合された糖蛋白質であり、分子量は80kDaで2個の葉(lobe)で構成されている。各葉(lobe)内に各々一個の鉄結合部位が存在している(メッツ-ボウティグ(Metz-Boutigue)等, Eur. J. Biochem., 1984年、第145巻、P.659-676)。ラクトフェリンは、殺菌作用、細胞増殖調節作用、過酸化脂質生成抑制作用、免疫系調節作用、鉄吸収調節作用、感染部位炎症発生制御作用、抗ウイルス作用、大腸菌の腸細胞付着防止、ビヒダス菌増殖作用等の多様な生体防御作用に関与し、有益な生理活性を持っている(ユ(Yu), Korean Dairy Techno., 1997年、第15巻、 P.83-89)。ラクトフェリンを含有した主要製品は、乳児用調製粉乳を始め、化粧品、食品添加物、抗下痢薬、腹膜透析用剤、臨床営養剤、女性衛生用品、眼薬製品、ガム等がある(ナム(Nam)等, Korean J. Dairy Sci., 1996年、第18巻、P.289-298)。
【０００４】
従来には、植物培養細胞での有用物質生産は、主に植物由来の低分子物質(タクソル、シコニン等)に限定されていたが、最近には植物生体反応器(Plant bioreactor)技術の発達により多様な分野に拡大した適用が可能になった。具体的な例として、日本の日東電工(株)で健康食品として開発された朝鮮人参培養細胞(20トンタンク培養)及びマイクロフレンズ社のエゾウコギ幼植物培養体(米国特許出願、出願番号 US09/578)がある。
【０００５】
また、本発明者らにより、さつま芋培養細胞でペルオキシダーゼの大量生産(大韓民国特許登録, 1997-117516)、培養細胞で高発現するペルオキシダーゼ遺伝子分離(大韓民国特許登録, 1998-176420)及び培養細胞高発現ペルオキシダーゼ SWPA2 プロモーター(PCT 出願/KR00/01231)が開発され、産業用培養細胞株開発並びに培養細胞からの有用物質生産が可能になった。
【０００６】
植物体及び植物培養細胞からのヒトラクトフェリン生産に関する報告としては、形質転換タバコ培養細胞でCaMV 35Sプロモーターを利用して分子量48kDaのヒトラクトフェリン-誘導体ペプチドが全水溶性蛋白質の1.8%を生産した報告があり(非特許文献１参照)、タバコ植物体の葉で全蛋白質の 0.3%を生産(非特許文献２参照)、 mas P2 プロモーターを利用してジャガ芋塊茎で全水溶性蛋白質の0.1%のヒトラクトフェリンを生産(非特許文献３参照)、CaMV 35S プロモーターを利用してさつま芋カルス及び貯蔵根、ジャガ芋塊茎、及びタバコ植物体から全水溶性蛋白質の0.04-0.07% ヒトラクトフェリンを生産(非特許文献４参照)、稲グルテリン(glutelin)プロモーター調節により500μg/g精米(polished rice)のヒトラクトフェリンを生産する稲(非特許文献５参照)等が報告された。しかし、培養細胞高発現プロモーターを利用した特定培養時期におけるヒトラクトフェリンの大量生産に対しては今まで報告されたことはない。
【０００７】
培養細胞高発現ペルオキシダーゼプロモーターは、酸化ストレスにより発現が誘導されるペルオキシダーゼプロモーター(SWPA2)で、さつま芋懸濁培養細胞で特に対数増殖後期に強く発現される(PCT 出願/KR00/01231)。上記プロモーターは、タバコ原形質体を利用したGUS蛋白質の一過性発現法(transient assay)でCaMV 35Sプロモーターより約30倍高い活性を示した。また、上記プロモーターは、タバコ植物体と培養細胞で発現する。特に、形質転換タバコ懸濁培養細胞で対数増殖後期に強く発現する。また、正常状態の植物体の葉では、全く発現しないけれど、傷、低温、オゾン等の酸化的ストレスを受けた時に発現が誘導される特性があり、すなわち、酸化的ストレスによって発現が誘導されるプロモーターである。
【０００８】
これらのことを鑑みて、本発明者らは、ヒトラクトフェリン等の有用蛋白質を大量生産する植物培養細胞を開発するために、培養細胞高発現ペルオキシダーゼ SWPA2 プロモーターを利用して目的蛋白質を細胞内小器官で発現させられる植物培養細胞を開発した。上記培養細胞が目的蛋白質を大量生産できることを明らかにして本発明を完成した。
【０００９】
【非特許文献１】
ミトラ  アンド  ザング(Mitra and Zhang), Plant Physiol., 1994年、第106巻、Ｐ.977-981
【非特許文献２】
サルモン(Salmon)等, Protein Express. Purif., 1998年、第13巻、Ｐ.127-135
【非特許文献３】
チョン(Chong)等, Transgenic Res., 2000年、第9巻、Ｐ.71-78
【非特許文献４】
リュ(Liu)等、研究報告書、科学技術部、2000年
【非特許文献５】
アンザイ(Anzai)等, Lactoferrin: Structure, Function Appli., 2000年Ｐ.265-271
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、培養細胞高発現ペルオキシダーゼプロモーター(SWPA2)を発現プロモーターに使用して目的蛋白質を発現する発現ベクター、該発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリア、該アグロバクテリアが導入され目的蛋白質を大量生産する形質転換体及び上記形質転換体を利用して目的蛋白質を生産する方法を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は、培養細胞高発現ペルオキシダーゼプロモーター(SWPA2)を利用して目的蛋白質を発現させる発現ベクターを提供する。
【００１２】
また、本発明は、上記発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリア属微生物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、上記アグロバクテリア属微生物が導入され目的蛋白質を大量生産する形質転換体を提供する。
【００１４】
また、本発明は、上記形質転換体を利用して目的蛋白質を製造する方法を提供する。
【発明の実施の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、培養細胞高発現ペルオキシダーゼプロモーター(SWPA2)、及び目的蛋白質の遺伝子を含み、該培養細胞高発現ペルオキシダーゼプロモーター(SWPA2)により目的蛋白質を発現させる植物発現ベクターを提供する。
【００１６】
本発明では、ペルオキシダーゼを高生産するさつま芋培養細胞から分離した培養細胞高発現ペルオキシダーゼプロモーター(SWPA2)(PCT出願/KR00/01231)を使用した。上記プロモーターは、酸化ストレスによって発現が誘導される。また従来、植物発現ベクターのプロモーターに多く使用されているCaMV 35Sプロモーターに比べて目的蛋白質の発現活性が非常に高い。
【００１７】
本発明の実施例では、目的蛋白質にヒトラクトフェリンを発現させるために培養細胞高発現ペルオキシダーゼプロモーター(SWPA2)、TEV(tobacco etch virus)リーダー配列、カルレティキュリンの信号配列、ヒトラクトフェリンの遺伝子及びCaMV 35S 転写ターミネーター(Transcription terminator)を含む植物発現ベクターを提供する(図1参照)。
【００１８】
上記でカルレティキュリン信号配列は、目的蛋白質の遺伝子が細胞内で容易に発現できるようにするためにヒトラクトフェリンの遺伝子と連結して使用した。転写のターミネーターには、CaMV 35S転写ターミネーターを使用した。
【００１９】
また、本発明は、上記発現ベクターが導入され植物体または、培養細胞で目的蛋白質を生産できる形質転換体を製造するために、上記発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリアを提供する。
【００２０】
本発明の好ましい実施例には、ヒト ラクトフェリンを発現させるために培養細胞高発現ペルオキシダーゼプロモーター(SWPA2)、TEVリーダー配列、カルレティキュリンの信号配列、ヒトラクトフェリンの遺伝子及びCaMV 35S転写ターミネーターを含む植物発現ベクターをアグロバクテリア ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)に導入して培養細胞の形質転換に使用した。上記植物発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを「アグロバクテリア ツメファシエンスEHA101(SWPA2::hLf/pCGN1578)」と命名し、これを2002年4月3日付けで韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した(寄託番号 : KCTC 10217BP)。
【００２１】
また、本発明は、上記アグロバクテリアが導入され目的蛋白質を大量生産する形質転換体を提供する。
【００２２】
本発明では、アグロバクテリアを植物体または植物培養細胞と共同培養して目的蛋白質を大量生産できる形質転換体を製造する。
【００２３】
上記の植物体には、タバコまたはウコギ科薬用植物を使用でき、ウコギ科植物としては、エゾウコギ、朝鮮人参、山蔘(野生の朝鮮人参)、たらの芽及び黄漆の木(Dendropanax morbifera Lev.)からなる群から選択したものを使用することが好ましい。
【００２４】
本発明の実施例には、ヒトラクトフェリンを発現する発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリア(寄託番号 : KCTC 10217BP)をタバコまたはタバコ培養細胞と共同培養してヒトラクトフェリンを生産する形質転換体を製造した。該ヒトラクトフェリンを生産するタバコ培養細胞を「hLfタバコBY2細胞株(hLf tobacco BY2 cell line)」と命名し、これを2002年4月3日付けで韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した(寄託番号 : KCTC 10218BP)。
【００２５】
本発明の実施例で使用したタバコBY-2 培養細胞は、培養速度が速く、大量培養体系が確立されていて精製が容易な長所があり、植物培養細胞での組換え蛋白質生産のモデルに利用されている(フィスチャー(Fischer)等, Biotechnol. Appl. Biochem., 1999年、第30巻、Ｐ.109-112)。ゆえに、本発明の形質転換体は、培養速度が速いタバコBY-2培養細胞を使用してヒトラクトフェリンを大量生産でき、発現されたヒトラクトフェリンを精製するのが容易である。
【００２６】
また、本発明の実施例では、ヒトラクトフェリンを発現する発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリア(寄託番号 : KCTC 10217BP)を朝鮮人参または朝鮮人参培養細胞と共同培養してヒトラクトフェリンを生産する形質転換体を製造した。
【００２７】
本発明者らは、ヒトラクトフェリンを生産する上記朝鮮人参培養細胞を「hLf朝鮮人参細胞株(hLf ginseng cell line)」と命名し、これを2002年4月3日付けで韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した(寄託番号 : KCTC 10219BP)。
【００２８】
本発明に使用した朝鮮人参は、免疫強化等の生理活性が優れた高付加価値薬用植物で、上記朝鮮人参にヒトラクトフェリンを追加に大量発現させ高付加価値の機能性食品の開発に有用に使用できる。
【００２９】
また、本発明の実施例では、ヒトラクトフェリンを発現する発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリア(寄託番号 : KCTC 10217BP)をエゾウコギ培養細胞と共同培養して、ヒトラクトフェリンを生産する形質転換体を製造した。該ヒトラクトフェリンを生産するエゾウコギ培養細胞を「hLfエゾウコギ細胞株(hLf Siberian ginseng cell line)」と命名した。本発明に使用したエゾウコギは、免疫強化等の生理活性が優れた高付加価値薬用植物で、上記エゾウコギにヒトラクトフェリンを追加に大量発現させ高付加価値の機能性健康食品の開発に有用に使用できる。
【００３０】
また、本発明は、上記ヒトラクトフェリンを生産する形質転換体を有効成分として含有する健康食品を提供する。
【００３１】
ラクトフェリンは、殺菌作用、細胞増殖調節作用、過酸化脂質生成抑制作用、免疫系調節作用、鉄吸収調節作用、感染部位炎症発生制御作用、抗ウイルス作用、大腸菌の腸細胞付着防止、ビヒダス菌増殖作用等の色々な活性を示す有用な蛋白質であるため、本発明のヒトラクトフェリンを生産する形質転換体の抽出物は、健康食品の製造に有用に使用できる。
【００３２】
形質転換体にウコギ科(朝鮮人参、エゾウコギ、黄漆の木(Dendropanax morbifera Lev.)等)薬用植物を使用する場合には、該薬用植物自体が持っている免疫機能及び生体抵抗力の強化、抗癌、抗酸化、抗脂質過酸化、抗微生物活性にラクトフェリンの活性をさらに含むことによって健康食品の製造に有用に使用できる。
【００３３】
本発明の形質転換体を水またはアルコール水溶液で抽出し、上記抽出物を食品に使用する場合、上記抽出物をそのまま添加するかまたは他の食品若しくは食品成分と一緒に使用し、通常的な方法にしたがって適切に使用できる。一般的に、本発明の抽出物を利用した食品または飲料の製造時、原料に対して0.001ないし50重量%、好ましくは、0.01ないし5重量%の量で添加できる。上記食品の種類には、特別な制限はない。上記物質を添加できる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤等がある。また、乳児用調製粉乳をはじめ化粧品、食品添加物、下痢止薬、腹膜透析用剤、臨床営養剤、女性衛生用品、眼薬製品等の製造にも有用に使用できる。
【００３４】
また、本発明は、
1) 目的蛋白質の遺伝子を含む植物発現ベクターを製造する段階、
2) 該発現ベクターで形質転換させたアグロバクテリアを製造する段階、
3) 該アグロバクテリアを植物体または培養細胞と共同培養して、目的蛋白質を発現する形質転換体を製造する段階、
4) 該形質転換体を培養する段階、及び
5) 該形質転換体または培養液から目的蛋白質を分離、精製する段階
からなる目的蛋白質の製造方法を提供する。
【００３５】
上記で植物発現ベクターは、培養細胞高発現ペルオキシダーゼプロモーター(SWPA2)を利用して目的蛋白質を発現させる植物発現ベクターを使用した。本発明の実施例では、目的蛋白質にヒトラクトフェリンを発現させるために培養細胞高発現ペルオキシダーゼプロモーター(SWPA2), TEV(tobacco etch virus)リーダー配列、カルレティキュリンの信号配列、ヒトラクトフェリンの遺伝子及びCaMV 35S転写ターミネーター(Transcription terminator)を含む植物発現ベクターを使用した。
【００３６】
上記で植物体には、タバコ、または、ウコギ科薬用植物を使用できる。ウコギ科植物としては、エゾウコギ、朝鮮人参、山蔘、たらの芽及び黄漆の木(Dendropanax morbifera Lev.)からなる群から選択することが好ましい。
【００３７】
本発明の実施例では、薬用植物培養細胞でヒトラクトフェリンを生産する培養細胞株を開発するために、ヒトラクトフェリン遺伝子が培養細胞高発現ペルオキシダーゼSWPA2プロモーターによって発現が調節できるように製作した植物発現ベクターを製作し、これをアグロバクテリアに形質転換させ、該アグロバクテリアをタバコBY-2、朝鮮人参またはエゾウコギと共同培養してヒトラクトフェリンを生産するタバコ培養細胞(寄託番号 : KCTC 10218BP)、朝鮮人参培養細胞(寄託番号 : KCTC 10219BP)及びエゾウコギ培養細胞を製造した。
【００３８】
上記培養細胞は、カナマイシン含有選択培地で抵抗性を保っている細胞を選抜してカルスで培養した後、PCR法で形質転換された細胞株を選別し(図2、図3参照)、ヒトラクトフェリン抗体を利用したELISA法で形質転換された細胞株でヒトラクトフェリンの生産量を調査した(図4)。生産されたヒトラクトフェリンの含量は、細胞株別に多様であり、カルス段階で全水溶性蛋白質の0.7%〜2.7%を占めた。その中の一部細胞株を対象にサザンブロット分析を遂行してヒトラクトフェリン遺伝子がタバコ染色体DNA内に導入されたことを確認し、ノーザンブロットでヒトラクトフェリン遺伝子が発現されたことを確認した。
【００３９】
また、ヒトラクトフェリン蛋白質がタバコ培養細胞株で生産されるかどうかの可否をウエスタンブロット分析で調査した結果、80kDaの完全なヒトラクトフェリンと40kDaの部分的なヒトラクトフェリン蛋白質を生産したことを確認した(図7参照)。液体培地で懸濁培養された培養細胞のヒトラクトフェリンの生産が全水溶性蛋白質の3〜5%に該当するヒトラクトフェリンを各々生産したことを確認した(図9、図10参照)。
【００４０】
また、カナマイシン抵抗性朝鮮人参培養細胞をタバコBY-2と同様な方法で選抜した後、PCR法で形質転換が確認された朝鮮人参培養細胞株からヒトラクトフェリン含量をカルス段階で調査した結果、生産されたヒトラクトフェリンの含量は、全水溶性蛋白質の0.07〜3.0%と多様に現れた(図12、図13参照)。その中の一部細胞株を対象にサザンブロット分析を遂行してヒトラクトフェリン遺伝子が朝鮮人参染色体DNA内に導入されたことを確認し、ノーザンブロットでヒトラクトフェリン遺伝子が発現されたことを確認した。
【００４１】
また、ヒトラクトフェリン蛋白質が朝鮮人参培養細胞株で生産されるかどうかの可否をウエスタンブロット分析で調査した結果、80kDaの完全なヒトラクトフェリンと40kDaの部分的なヒトラクトフェリン蛋白質を生産したことを確認した(図16参照)。
【００４２】
また、カナマイシン抵抗性エゾウコギ培養細胞をタバコ、朝鮮人参培養細胞と同様な方法で形質転換させて選抜した後、PCR法で形質転換が確認されたエゾウコギ培養細胞株からヒトラクトフェリン含量をカルス段階で調査した(図18、図19参照)。
【００４３】
その結果、生産されたヒトラクトフェリンの含量は、全水溶性蛋白質の0.5〜1.7%と多様に現れた。その中の一部細胞株を対象にサザンブロット分析を遂行してヒトラクトフェリン遺伝子がエゾウコギ染色体DNA内に導入されたことを確認した。ノーザンブロットでヒトラクトフェリン遺伝子が発現されたことを確認した。
【００４４】
また、ヒトラクトフェリン蛋白質がエゾウコギ培養細胞株で生産されるかどうかの可否をウエスタンブロット分析で調査した結果、タバコ、朝鮮人参の場合と同様に80kDaの完全なヒトラクトフェリンと40kDaの部分的なヒトラクトフェリン蛋白質を生産したことを確認した(図22参照)。液体培地で懸濁培養された培養細胞のエゾウコギのヒトラクトフェリンの生産が全水溶性蛋白質の5%に該当するヒトラクトフェリンを各々生産したことを確認した(図24参照)。
【００４５】
また、本発明の培養細胞高発現ペルオキシダーゼプロモーターであるSWPA2プロモーターを使用してヒトラクトフェリンを生産する方法とCaMV 35Sプロモーターを使用してヒトラクトフェリンを生産する方法を比較してみると、本発明のSWPA2プロモーターを使用してヒトラクトフェリンを生産する方法は、CaMV 35Sプロモーターを使用して全水溶性蛋白質の1.8%のヒトラクトフェリンを生産した形質転換タバコ培養細胞株(非特許文献１参照)と0.3%のヒトラクトフェリンを生産したタバコ植物体(非特許文献２参照)、または、mas P2プロモーターを利用して全水溶性蛋白質の0.1%を生産した形質転換ジャガ芋(非特許文献３参照)に比べて飛び抜けて高い含量のヒトラクトフェリンを生産することが分かる(表1参照)。
【００４６】
上記のように、本発明では、培養細胞高発現ペルオキシダーゼプロモーターを利用してヒトラクトフェリンを高生産するタバコBY-2培養細胞と薬用植物の朝鮮人参、エゾウコギ培養細胞株を開発した。これは、現在までの報告に比べて高い含量のヒトラクトフェリンを生産する形質転換植物培養細胞株である。本発明のヒトラクトフェリン高生産植物培養細胞株は、ヒトラクトフェリンを生産する産業用植物培養細胞株及び新機能性免疫強化健康食品等の用途に有用に使用できる。
【００４７】
【実施例】
以下、本発明を詳細に説明する。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
但し、下記実施例は、本発明を例示するだけのものであり、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００４８】
<実施例 1> ヒトラクトフェリンを発現する植物発現ベクター及び形質転換アグロバクテリアの製造
本発明者らは、培養細胞高発現ペルオキシダーゼプロモーター(SWPA2)を利用してヒトラクトフェリンを大量発現できる植物発現ベクター及び形質転換体を製造した。
【００４９】
まず、ヒトラクトフェリン遺伝子が細胞内で発現されるようにタバコの小胞体(ER)蛋白質と報告されているカルレティキュリン(calreticulin)の信号ペプチド(signal peptide)をコーディングする塩基配列をPCR法でクローニングした。上記PCRを遂行するために配列番号1及び配列番号2で記載されるプライマーを使用した。鋳型には、タバコcDNAライブラリを使用した。プライマーには、NcoI及びSalI制限酵素切断部位が含まれていたためクローニングが容易であった。
【００５０】
ヒトラクトフェリン蛋白質は、N-末端に分泌信号が存在するため、ヒトラクトフェリン自体の分泌信号を除去して上記で製造したカルレティキュリンの信号配列と連結した。そのためにヒトラクトフェリンcDNA(U07643)の149番塩基で始まる配列番号3で記載されるプライマー及び配列番号4で記載される3'-末端プライマーを使用してPCRを遂行した。増幅された約2.1kbの切片をpGEM-T Easyベクター(Promega, USA)にクローニングした。塩基配列分析によってヒトラクトフェリン遺伝子が正確に増幅されたことを確認し、プライマーに存在する制限酵素切断部位を利用してSalI及びXbaIで切断した。
【００５１】
上記切片及び培養細胞高発現プロモーター(SWPA2)を利用して(既存特許PCT KR00/01231から由来したもの)ヒトラクトフェリンを発現できる遺伝子コンストラクトを製造した(図1)。上記遺伝子コンストラクトをHindIIIで切断し、同じ制限酵素で切断したpCGN1578(マグブリド  アンド  サマーフェルト(McBride and Summerfelt), Plant Mol. Biol., 1990年、第14巻、Ｐ.269-276)に挿入して、ヒトラクトフェリンを大量発現できる植物発現ベクターを製造した。
【００５２】
本発明者らは、上記植物発現ベクターをアグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) EHA101に導入して培養細胞の形質転換に使用し、上記植物発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを「アグロバクテリアツメファシエンス EHA101(SWPA2::hLf/pCGN1578)」と命名し、これを2002年4月3日付けで韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した(寄託番号 : KCTC 10217BP)。
【００５３】
<実施例 2> アグロバクテリアと植物材料の共同培養
本発明者らは、上記実施例1で製造した形質転換アグロバクテリアを植物体または培養細胞と共同培養して、ヒトラクトフェリンを大量生産する植物体または培養細胞を製造した。
【００５４】
詳細には、カナマイシン50mg/Lが添加された5ml LB培地で28℃の震盪培養器(shaking incubator)で一日培養したアグロバクテリア培養液100μlと継代培養4日目のタバコ懸濁培養細胞並びに朝鮮人参接合子胚の子葉切片体及びエゾウコギ培養細胞を10ml液体培地が入っているペトリ皿に各々入れて良く混ぜた後、25℃、暗条件で2日間共同培養した。アグロバクテリアを除去するために共同培養した培養細胞及び子葉切片体を15ml遠心分離用チューブに移して遠心分離(1000rpm, 5min, 25℃)して上澄み液を除去した後、新しくMS培地(ムラシゲ  アンド  スコーグ(Murashige and Skoog), Physiol. Plant., 1962年、第15巻、Ｐ.473-497)に入れて遠心分離(1000rpm, 5min, 25℃)して細胞を4回洗浄した。共同培養したタバコ培養細胞と朝鮮人参材料及びエゾウコギ培養細胞をカナマイシンが150mg/L(タバコ、エゾウコギの場合)または200mg/L(朝鮮人参の場合)、クラフォラン250mg/L、2-4-D 0.1mg/L(朝鮮人参、エゾウコギの場合1mg/L)添加されたMS培地(選択培地)に置床した後、25℃、暗条件で培養した。
【００５５】
<実施例 3> ヒトラクトフェリン生産形質転換タバコ培養細胞株の製造
本発明者らは、上記実施例2と同様な方法を使用してヒトラクトフェリンを大量生産する形質転換タバコ培養細胞株を製造した。
【００５６】
詳細には、上記実施例1で製造したアグロバクテリアと共同培養したタバコBY-2細胞は、選択培地(MS培地、カナマイシン150mg/L、クラフォラン250mg/L、2-4-D 0.1mg/L)で培養3〜4週後に細胞塊(cluster)を形成し始め形成された細胞塊を新しい選択培地に継代培養して増殖するクローンを選抜した(図２)。
【００５７】
カナマイシン抵抗性を示した各々のカルスから染色体DNAを分離した後、カナマイシン抵抗性(nptII)及びヒトラクトフェリン(hLf)遺伝子の特異プライマーを使用してPCR分析により形質転換の可否を確認した。PCR分析の為に、カナマイシン抵抗性遺伝子の場合には、配列番号5及び配列番号6で記載されるプライマーを使用し、ヒトラクトフェリンの場合には、配列番号7及び配列番号8で記載されるプライマーを使用してPCRを遂行した。
【００５８】
その結果、カナマイシン抵抗性を示した各々のカルスからカナマイシン抵抗性及びヒトラクトフェリン遺伝子の特異バンドが0.7kb及び2.1kbで各々観察された(図３)。
【００５９】
<実施例 4> 形質転換タバコ培養細胞株のヒトラクトフェリン含量の分析
本発明者らは、上記実施例3で製造したヒトラクトフェリン遺伝子の導入が確認された13個の形質転換タバコ細胞株を対象に固体培地で継代培養21日目にヒトラクトフェリン含量を調査した。ヒトラクトフェリン含量分析は、形質転換されたタバコカルスからリン酸緩衝液(pH7.0)を利用して水溶性蛋白質を抽出した後、バイオキシテック・ ラクトf-EIATM 分析キット(Bioxytech・ Lactof-EIATM Assay Kit(Oxis International, Inc.))を利用して製造会社の指針にしたがって分析した。
【００６０】
その結果、ヒトラクトフェリン含量は、細胞株別に多様に現れ、そのなかで#12細胞株が54.5μg/g fr wt(形質転換 BY-2 細胞1グラムで生産されたヒトラクトフェリンの含量が54.5μgであることを意味する)のヒトラクトフェリンを生産し、最も高い含量を示した。続いて#18細胞株が49.5μg/g fr wt、#13細胞株が33.6μg/g fr wtを示した(図4)。
【００６１】
<実施例 5> ヒトラクトフェリン生産形質転換タバコBY-2培養細胞株の特性分析
<5-1> サザンブロットによる分析
本発明者らは、上記実施例3で製造した形質転換されたタバコBY-2培養細胞株6種(#9、#12、#13、#15、#18、#20)を対象に外来遺伝子導入をサザンブロット(Southern blot)分析で確認した。タバコBY-2培養細胞株からデラポータ（デラポータ(Dellaporta), Newsletter, 1983年、第57巻、Ｐ.26-29）にしたがい抽出したゲノムDNA15μgを制限酵素EcoRIで切断してアガロースゲルで電気泳動を遂行した。上記ゲル上のゲノムDNAをナイロン膜に転写した後、ヒトラクトフェリン遺伝子部分約1kbを32Pで標識した遺伝子断片をプローブに使用して混成化反応を遂行した。
【００６２】
その結果、形質転換されたタバコBY-2培養細胞株は、導入させたヒトラクトフェリン遺伝子が1個ずつのバンドで存在することを確認し、これによりヒトラクトフェリン遺伝子がタバコBY-2ゲノム内に安定的に導入されたことが分かった(図5)。
【００６３】
<5-2> ノーザンブロットによる分析
形質転換されたタバコBY-2 培養細胞株6種(#9、#12、#13、#15、#18、#20)を対象にヒトラクトフェリン遺伝子の発現を確認する為にノーザンブロット(northern blot) 分析を実施した。
【００６４】
詳細には、タバコBY-2培養細胞株からTRIzolTM (GIBCO/BRL)試薬を利用して全RNAを抽出した後、15μg RNAをアガロースゲルで電気泳動を遂行した。上記ゲル上のゲノムDNAをナイロン膜に転写した後、ヒトラクトフェリン遺伝子部分約1 kbを32Pで標識した遺伝子断片をプローブに使用して混成化反応を遂行した。
【００６５】
その結果、形質転換されたタバコBY-2培養細胞株で2.3kbのヒトラクトフェリン転写物(transcript)が確認され、その中の#9、#12、#15、及び#18細胞株は、強く発現し、他の細胞株の場合は、弱く発現した(図6)。
【００６６】
<5-3> ウエスタンブロットによる分析
本発明者らは、形質転換が確認されたタバコBY-2培養細胞株のヒトラクトフェリン蛋白質生産を確認する為に、ウエスタンブロット(Western blot)分析を遂行した。
【００６７】
詳細には、全水溶性蛋白質を抽出した後、変性させて10%ポリアクリルアミドゲル(polyacrylamide gel)で電気泳動後、ニトロセルロース膜(nitrocellulose membrane)に固定させた。その後、膜をペルオキシダーゼ(peroxidase)が結合したヒトラクトフェリン抗体(Rabbit anti-Human Lactoferrin, BIODESIGN International)と反応させた後、ECLプラスウセストンブロッティング検索システム(Amersham Pharmacia Biotech UK Limited)を利用してヒトラクトフェリン生産を確認した。
【００６８】
その結果、#9、#12、及び#18細胞株で80kDa及び40kDaのヒトラクトフェリンが生産されていた(図7)。
【００６９】
ヒトラクトフェリンが導入された形質転換植物体及び培養細胞は、完全な大きさのヒトラクトフェリンを生産するかまたは一つ以上の部分的なヒトラクトフェリンを生産することが報告され、タバコカルスの場合には、48kDaの部分的なヒトラクトフェリン蛋白質が作られ(非特許文献１参照)、じゃが芋では、80kDaのヒトラクトフェリンが生産され(非特許文献３参照)、タバコ植物体では、80kDaと53kDaヒトラクトフェリン蛋白質が(非特許文献２参照)、タバコ、じゃが芋では、80 kDa以外に42、38kDaの部分的なヒトラクトフェリン蛋白質が生産されることが報告されている(非特許文献４参照)。
【００７０】
本発明者らは、上記ヒトラクトフェリンを生産する(#12)タバコ培養細胞を「hLfタバコBY2細胞株(hLf tobacco BY2 cell line)」と命名し、これを2002年4月3日付けで韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した(寄託番号 : KCTC 10218BP)。
【００７１】
<実施例 6> 懸濁培養タバコBY-2培養細胞のヒトラクトフェリン生産
本発明者らは、タバコ培養細胞でヒトラクトフェリンを大量生産するために、 カルス段階でヒトラクトフェリン含量が高い3種の細胞株(#9、#12、#18)を懸濁培養した。懸濁培養は、20mlの液体培地に0.4gの細胞を収集して11日間実施した。培養の間、2日間隔で細胞を収集して細胞を減圧ろ過した。培養細胞と培養培地を対象にリン酸緩衝液(pH7.0)を利用して水溶性蛋白質を抽出した後、バイオキシテック・ ラクトf-EIATM 分析キット(Bioxytech・ Lactof-EIATM Assay Kit(Oxis International, Inc.))でヒトラクトフェリン含量を測定した。
【００７２】
懸濁培養細胞株#9、#12細胞株の細胞成長は、培養11日目に、#18の場合は培養7日目に各々6.7g、6.7g、6.4gと最大成長を示した(図8)。一方、形質転換させていないタバコBY-2培養細胞株は、#9及び#12細胞株と似た細胞成長パターンを示した。懸濁培養中に生産されたヒトラクトフェリンの含量は、細胞培養が進行するほど漸次増加する傾向を示し、#9細胞株の場合は33.0μg/mg蛋白質、#12細胞株は38.7μg/mg蛋白質、 #18細胞株は43.6μg/mg蛋白質のヒトラクトフェリン蛋白質を生産した(図9)。
【００７３】
形質転換に使用した培養細胞高発現ペルオキシダーゼプロモーターのSWPA2プロモーターは、細胞培養後期に至って高い発現を誘導する特徴があるが(PCT出願/KR00/01231)、形質転換タバコ培養細胞株の場合、形質転換に利用したプロモーターの発現特性のように細胞培養静止期に至って最大を示した。フラスコ全体当り生産されたヒトラクトフェリンの含量は、#9、#12、#18細胞株で各々0.4mg/フラスコ、0.3mg/フラスコ、0.6mg/フラスコだった(図10)。これは、全水溶性蛋白質の3.6%、4.3%、及び4.7%に各々該当する。
【００７４】
<実施例 7> ヒトラクトフェリン生産朝鮮人参培養細胞株の製造
本発明者らは、上記実施例2の方法を使用してヒトラクトフェリンを大量生産する形質転換朝鮮人参培養細胞株を製造した。
【００７５】
詳細には、朝鮮人参種子を表面消毒した後、接合子胚(zygotic embryo)を取りだし子葉切片を上記実施例4と同様な方法でアグロバクテリアと共同培養した。カナマイシン抵抗性培養細胞株を選抜する為に選択培地(MS培地、カナマイシン200mg/L、クラフォラン250mg/L、2,4-D 1mg/L)で培養した結果、培養4週経過後からカルスが誘導され始めた(図11)。誘導されたカルスを選抜して染色体DNAを分離した後、配列番号9及び配列番号10で記載されるヒトラクトフェリン遺伝子のプライマーを使用してPCRを遂行した。その結果、大部分の細胞株で780bpのDNAが合成されヒトラクトフェリン遺伝子が含まれていることを確認した(図12)。
【００７６】
<実施例 8> ヒトラクトフェリン高生産朝鮮人参培養細胞株の分析
本発明者らは、ヒトラクトフェリン遺伝子の導入が確認された20種の形質転換朝鮮人参培養細胞株を対象に継代培養21日目にヒトラクトフェリン蛋白質含量をスクリーニングした。ヒトラクトフェリン蛋白質含量は、タバコBY-2培養細胞株におけるのと同様な方法で調査した。形質転換朝鮮人参培養細胞株は、タバコ培養細胞に比べて全体的に生成されたヒトラクトフェリンの含量が高く、100μg/g fr wt以上の細胞株が11種だった。この中で最も含量が高い細胞株は、#19細胞株で、155.5μg/g fr wtを示した。#15細胞株の場合は142.5μg/g fr wt、#7細胞株は130.7μg/g fr wtだった。これらは、全水溶性蛋白質の2.5%、2.7%、及び3.0%を各々示した(図13)。
【００７７】
本発明者らは、上記でヒトラクトフェリンを生産する(#19)朝鮮人参培養細胞を「hLf 朝鮮人参細胞株(hLf ginseng cell line)」と命名し、これを2002年4月3日付けで韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した(寄託番号 : KCTC 10219BP)。
【００７８】
<実施例 9> ヒトラクトフェリン生産形質転換朝鮮人参培養細胞株の特性分析
<9-1> サザンブロットによる分析
本発明者らは、上記実施例7で製造した6種類の形質転換された朝鮮人参培養細胞株(#3、#4、#7、#14、#18、#19)を対象に上記実施例5-1の方法を使用して外来遺伝子導入をサザンブロット(Southern blot)分析で確認した。朝鮮人参培養細胞株からデラポータの方法(Dellaporta, Newsletter, 1983年、第57巻、Ｐ.26-29)にしたがって抽出したゲノムDNA 15μgを制限酵素EcoRIで切断してアガロースゲルで電気泳動を遂行した。上記ゲル上のゲノムDNAをナイロン膜に転写した後、ヒトラクトフェリン遺伝子 部分約1kbを32Pで標識した遺伝子断片をプローブに使用して混成化反応を遂行した。
【００７９】
その結果、形質転換された朝鮮人参培養細胞株は、導入させたヒトラクトフェリン遺伝子が1個ずつのバンドで存在することを確認することによってヒトラクトフェリン遺伝子が朝鮮人参ゲノム内に安定的に導入されたことが分かった(図14)。
【００８０】
<9-2> ノーザンブロットによる分析
形質転換された6種類の朝鮮人参培養細胞株(#3、#4、#7、#14、#18、#19)を対象にヒトラクトフェリン遺伝子の発現を確認する為に上記実施例<5-2>の方法でノーザンブロット分析を実施した。詳細には、朝鮮人参培養細胞株からTRIzolTM(GIBCO/BRL)試薬を利用して全RNAを抽出した後、15μgRNAをアガロースゲルで電気泳動を遂行した。上記ゲル上のゲノムDNAをナイロン膜に転写した後、ヒトラクトフェリン遺伝子部分約1kbを32Pで標識した遺伝子断片をプローブに使用して混成化反応を遂行した。
【００８１】
その結果、形質転換された朝鮮人参培養細胞株で2.3kbのヒトラクトフェリン転写物(transcript)が確認され、その中の#3、#7、#14、#18細胞株は強く発現し、他の細胞株の場合は弱く発現した(図15)。
【００８２】
<9-3> ウエスタンブロットによる分析
本発明者らは、形質転換が確認された朝鮮人参培養細胞株のヒトラクトフェリン蛋白質生産を確認する為に上記実施例<5-3>の方法によりウエスタンブロット(Western blot)分析を遂行した。
【００８３】
詳細には、全水溶性蛋白質を抽出した後、変性させて10%ポリアクリルアミドゲル(polyacrylamide gel)で電気泳動後、ニトロセルロース膜(nitrocellulose membrane)に固定させた。その後、膜をペルオキシダーゼ(peroxidase)が結合したヒトラクトフェリン抗体(Rabbit anti-Human Lactoferrin, BIODESIGN International)と反応させた後、ECLプラスウセストンブロッティング検索システム(Amersham Pharmacia Biotech UK Limited)を利用してヒトラクトフェリン生産を確認した。
【００８４】
その結果、#7、#14、及び#18細胞株で80kDa及び40kDaのヒトラクトフェリンが生産されていた(図16)。
【００８５】
ヒトラクトフェリンが導入された形質転換植物体及び培養細胞は、完全な大きさのヒトラクトフェリンを生産するかまたは一個以上の部分的なヒトラクトフェリンを生産することが報告されたことがある。
【００８６】
<実施例 10> ヒトラクトフェリン生産エゾウコギ培養細胞株の製造
本発明者らは、上記実施例2の方法を使用してヒトラクトフェリンを大量生産する形質転換エゾウコギ培養細胞株を製造した。
【００８７】
詳細には、エゾウコギ培養細胞を上記実施例2と同様な方法でアグロバクテリアと共同培養した。カナマイシン抵抗性培養細胞株を選抜する為に選択培地(MS培地、カナマイシン200mg/L、クラフォラン250mg/L、2,4-D 1mg/L)で培養した結果、培養4週経過後からカルスが誘導され始めた(図17)。誘導されたカルスを選抜して染色体DNAを分離した後、配列番号9及び配列番号10で記載されるヒトラクトフェリン遺伝子のプライマーを使用してPCRを遂行した。その結果、大部分の細胞株で780bpのDNAが合成され、ヒトラクトフェリンが含有されていることを確認した(図18)。
【００８８】
<実施例 11> ヒトラクトフェリン高生産エゾウコギ培養細胞株の分析
本発明者らは、ヒトラクトフェリン遺伝子の導入が確認された形質転換エゾウコギ培養細胞株を対象に継代培養21日目にヒトラクトフェリン蛋白質含量を調査した。ヒトラクトフェリン蛋白質含量は、タバコBY-2、朝鮮人参培養細胞株におけるのと同様な方法で調査した。その結果、形質転換エゾウコギ培養細胞株の場合は#5番細胞株が140μg/g fr wtを示し、#23細胞株は120μg/g fr wtのヒトラクトフェリンを生産した(図19)。
【００８９】
<実施例 12>   ヒトラクトフェリン生産形質転換エゾウコギ培養細胞株の特性分析
<12-1> サザンブロットによる分析
本発明者らは、上記実施例10で製造した6種類の形質転換されたエゾウコギ培養細胞株(#5、#6、#23、#25、#27、#28)を対象に外来遺伝子導入をサザンブロット(Southern blot)分析で確認した。
【００９０】
詳細には、エゾウコギ培養細胞株から実施例<9-1>のデラポータの方法(Dellaporta, Newsletter, 57, 26-29, 1983)にしたがって抽出したゲノムDNA 15μgを制限酵素EcoRIで切断してアガロースゲルで電気泳動を遂行した。上記ゲル上のゲノムDNAをナイロン膜に転写した後、ヒトラクトフェリン遺伝子部分約1kbを32Pで標識した遺伝子断片をプローブに使用して混成化反応を遂行した。
【００９１】
その結果、形質転換されたエゾウコギ培養細胞株は、導入させたヒトラクトフェリン遺伝子が1個ずつのバンドで存在することを確認することによってヒトラクトフェリン遺伝子がエゾウコギゲノム内に安定的に導入されたことが分かった(図20)。
【００９２】
<12-2> ノーザンブロットによる分析
形質転換された3種のエゾウコギ培養細胞株(#5、#6、#23)を対象にヒトラクトフェリン遺伝子の発現を確認する為にノーザンブロット(northern blot)分析を実施した。
【００９３】
詳細には、エゾウコギ培養細胞株からTRIzolTM(GIBCO/BRL)試薬を利用して全RNAを抽出した後、15μgRNAをアガロースゲルで電気泳動を遂行した。上記ゲル上のゲノムDNAをナイロン膜に転写した後、ヒトラクトフェリン遺伝子部分約1kbを32Pで標識した遺伝子断片をプローブに使用して混成化反応を遂行した。
【００９４】
その結果、形質転換されたエゾウコギ培養細胞株で2.3kbのヒトラクトフェリン転写物(transcript)が確認され、発現の程度は#5と#6細胞株に比べて#23細胞株でさらに高かった(図21)。
【００９５】
<12-3> ウエスタンブロットによる分析
本発明者らは、形質転換が確認されたエゾウコギ培養細胞株のヒトラクトフェリン蛋白質生産を確認する為にウエスタンブロット(Western blot)分析を遂行した。
【００９６】
詳細には、全水溶性蛋白質を抽出した後、変性させて10%ポリアクリルアミドゲル(polyacrylamide gel)で電気泳動後、ニトロセルロース膜(nitrocellulose membrane)に固定させた。その後、膜をペルオキシダーゼ(peroxidase)が結合したヒトラクトフェリン抗体(Rabbit anti-Human Lactoferrin, BIODESIGN International)と反応させた後、ECLプラスウセストンブロッティング検索システム(Amersham Pharmacia Biotech UK Limited)を利用してヒトラクトフェリン生産を確認した。
【００９７】
その結果、ノーザンブロット結果と似た発現を示し、#23細胞株が最も高い発現をし、#5と#6細胞株はこれより低い水準で発現した。タバコ、朝鮮人参培養細胞株の場合と同様に80kDa及び40kDaのヒトラクトフェリンが生産された(図22)。
【００９８】
<実施例 13> 懸濁培養エゾウコギ培養細胞のヒトラクトフェリン生産
本発明者らは、エゾウコギ培養細胞でヒトラクトフェリンを大量生産するために、カルス段階でヒトラクトフェリン含量が高い#23細胞株を懸濁培養した。懸濁培養は、20mlの液体培地に0.4gの細胞を接種して21日間実施した。培養の間、3日間隔で細胞を収集して細胞を減圧ろ過し、培養細胞と培養培地を対象にリン酸緩衝液(pH7.0)を利用して水溶性蛋白質を抽出した後、バイオキシテック・ ラクトf-EIATM 分析キット(Bioxytech・ Lactof-EIATM Assay Kit(Oxis International, Inc.))でヒトラクトフェリン含量を測定した。
【００９９】
その結果、懸濁培養細胞株の細胞成長は、培養9日目まで速い速度で増加し、培養18日目に最大成長を示した(図23)。懸濁培養中に生産されたヒトラクトフェリンの含量は、細胞培養が進行するほど漸次増加するパターンであり、速い細胞成長を見せた培養9日目までは徐々に増加した。細胞成長が静止期に至る培養12日以後にヒトラクトフェリンの含量は、急激に増加し培養15日目に最大値を示した。これは、ヒトラクトフェリンの含量が全水溶性蛋白質の5%以上生産された結果である(55μg/mg蛋白質)(図24)。このような結果は、タバコ懸濁培養の時と同様に形質転換に使用した培養細胞高発現ペルオキシダーゼプロモーターのSWPA2プロモーターは、細胞培養後期に至って高い発現を誘導する特徴を良く反映したものである(PCT出願/KR00/01231)。
【０１００】
<比較例 1> ヒトラクトフェリン発現量の比較
本発明者らは、本発明の培養細胞高発現ペルオキシダーゼプロモーターのSWPA2プロモーターを使用してヒトラクトフェリンを生産する方法とCaMV 35Sプロモーターを使用してヒトラクトフェリンを生産する方法を比較してみた。
【０１０１】
その結果、本発明のSWPA2プロモーターを使用してヒトラクトフェリンを生産する方法は、CaMV 35Sプロモーターを使用して全水溶性蛋白質の1.8%のヒトラクトフェリンを生産した形質転換タバコ培養細胞株(非特許文献１参照)と0.3%のヒトラクトフェリンを生産したタバコ植物体(非特許文献２参照)、またはmas P2プロモーターを利用して全水溶性蛋白質の0.1%を生産した形質転換じゃが芋(非特許文献３参照)と比べてずっと高い含量のヒトラクトフェリンを生産したことを確認した(表1)。
【０１０２】
【表１】
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【０１０３】
【発明の効果】
上記で詳しく見たように、本発明では、培養細胞高発現ペルオキシダーゼプロモーター(SWPA2)を利用してヒトラクトフェリンを高生産する形質転換植物体を製造した。上記植物体を利用してヒトラクトフェリンを生産する朝鮮人参またはタバコ培養細胞株だけではなく、エゾウコギ、山蔘、たらの芽、黄漆の木(Dendropanax morbifera Lev.)等、他の食用可能なウコギ科薬用植物を使用して高付加価値の植物を製造できる。また、上記植物体の抽出物を有効成分とする健康食品の製造に有用に使用できる。
グラフである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトラクトフェリン蛋白質を植物培養細胞で発現させる為の本発明による形質転換ベクターの模式図である。
SWPA2 プロモーター : 培養細胞高発現ペルオキシダーゼプロモーター
TEV : TEV(tobacco etch virus)リーダー配列 ER : カルレティキュリン(calreticulin)の信号配列
35S 3' : CaMV 35S転写ターミネーター(transcription terminator)
【図２】本発明で開発した形質転換タバコ培養細胞がカナマイシン選択培地で細胞塊(cluster)に培養される様子を示した写真である。
【図３】カナマイシン及びヒトラクトフェリン遺伝子の導入をPCRで確認した写真である。
【図４】形質転換が確認されたタバコ培養細胞のカルス段階でヒトラクトフェリンの含量を分析したグラフである。
【図５】本発明のタバコ培養細胞株のヒトラクトフェリン遺伝子導入をサザンブロット(Southern blot)で分析した結果である。
9、12、13、15、18、20 : 形質転換されたタバコBY-2細胞株
C : 非形質転換 タバコBY-2細胞株
【図６】本発明のタバコ培養細胞株のヒトラクトフェリン遺伝子発現をノーザンブロット(northern blot)で分析した結果である。
9、12、13、15、18、20 : 形質転換されたタバコBY-2細胞株
C : 非形質転換 タバコBY-2細胞株
【図７】本発明のタバコ培養細胞株のヒトラクトフェリン蛋白質生産をウエスタンブロット(Western blot)で分析した結果である。
9、12、13、15、18、20 : 形質転換されたタバコBY-2細胞株
C : 非形質転換タバコBY-2細胞株、Pは、ヒトラクトフェリン標準蛋白質(Sigma)
【図８】本発明の形質転換タバコ培養細胞株の懸濁培養中の細胞成長を示したグラフである。
【図９】タバコ懸濁培養細胞が生産するヒトラクトフェリンの含量を示したグラフである。
【図１０】タバコ懸濁培養細胞と培地に分泌されたものを合わせた全体ヒトラクトフェリンの含量を示したグラフである。
【図１１】本発明の形質転換朝鮮人参培養細胞がカナマイシン選択培地で細胞塊(cluster)に培養される様子を示したグラフである。
【図１２】ヒトラクトフェリン遺伝子の導入をPCRで確認した写真である。
【図１３】形質転換された朝鮮人参培養細胞のカルス段階でヒトラクトフェリンの含量を分析したグラフである。
【図１４】本発明の朝鮮人参培養細胞株のヒトラクトフェリン遺伝子導入をサザンブロットで分析した結果である。
3、4、7、14、18、19：形質転換された朝鮮人参細胞株、
C : 非形質転換 朝鮮人参細胞株、
【図１５】本発明の朝鮮人参培養細胞株のヒトラクトフェリン遺伝子発現をノーザンブロットで分析した結果である。
3、4、7、14、18、19：形質転換された朝鮮人参細胞株
C : 非形質転換 朝鮮人参細胞株
【図１６】本発明の朝鮮人参培養細胞株のヒトラクトフェリン蛋白質生産をウエスタンブロットで各々分析した結果を示した電気泳動写真である。
3、4、7、14、18、19：形質転換された朝鮮人参細胞株
C : 非形質転換 朝鮮人参細胞株
P : ヒトラクトフェリン標準蛋白質(sigma)
M : マーカー(marker)
【図１７】本発明の形質転換エゾウコギ培養細胞がカナマイシン選択培地で細胞塊(cluster)に培養される様子を示した写真である。
【図１８】形質転換エゾウコギ培養細胞株でヒトラクトフェリン遺伝子の導入をPCRで確認した電気泳動写真である。
【図１９】カルス段階でヒトラクトフェリンの含量を分析したグラフである。
【図２０】本発明のエゾウコギ培養細胞株のヒトラクトフェリン遺伝子導入をサザンブロットで分析した結果を示した電気泳動写真である。
5、6、23、25、27、28 : 形質転換されたエゾウコギ細胞株、
C : 非形質転換エゾウコギ細胞株、
【図２１】本発明のエゾウコギ培養細胞株のヒトラクトフェリン遺伝子発現をノーザンブロットで分析した結果を示した電気泳動写真である。
5、6、23：形質転換されたエゾウコギ細胞株、
C : 非形質転換エゾウコギ細胞株、
【図２２】本発明のエゾウコギ培養細胞株のヒトラクトフェリン蛋白質生産をウエスタンブロットで各々分析した結果を示した電気泳動写真である。
5、6、23：形質転換されたエゾウコギ細胞株
C : 非形質転換エゾウコギ細胞株
M : マーカー(marker)
P : ヒト ラクトフェリン標準蛋白質(Sigma)
【図２３】本発明の形質転換エゾウコギ培養細胞株の懸濁培養中の細胞成長を示したグラフである。
【図２４】懸濁培養細胞が生産するヒトラクトフェリンの含量を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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