(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のいずれかで示されるＤＮＡ。
（１）グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性を有していて、アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４または５に示されるアミノ酸配列であるポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
（２）ホウレンソウ由来のグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼと比較して不飽和脂肪酸エステルに対する基質選択性が高い酵素活性を有していて、アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４または５に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加したアミノ酸配列であるポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項２】
ポリペプチドをコードする塩基配列が配列番号１、２、３、４または５に示されている塩基配列またはその縮重異性体である、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
請求の範囲第１〜２項のいずれか１項に記載のＤＮＡが組み込まれたベクター。
【請求項４】
請求の範囲第１〜２項のいずれか１項に記載のＤＮＡ、または請求の範囲第３項に記載のベクターが組み込まれて発現している微生物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ホウレンソウ（Spinacea oleracea L.）とカボチャ（Cucurbita moschata Duch.）が産生するような２種類のグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（以下ＡＴａｓｅという）の間のキメラＡＴａｓｅの生物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖に関するものである。
背景技術
植物の生体膜を構成する脂質は、外界温度の低下により液晶状態から固体状態に変化する。それに伴い生体膜の性質が変化する。固体状態では物質透過の選択性がなくなるため、本来の機能を果たせなくなり、その結果、細胞に傷害が生ずると考えられている。脂質のうち、ホスファチジル・グリセロール（以下ＰＧという）は液晶状態から固体状態に変化する温度が高く、高温で固まりやすい脂質である。従ってＰＧの性質により生体膜の温度感受性が大きく変化する。ところで、ＰＧの固まり易さは、それを構成している脂肪酸の種類により決定される。グリセロール−３−リン酸（以下Ｇ−３−Ｐという）への脂肪酸の転移は葉緑体のＧ−３−Ｐアシルトランスフェラーゼ（以下ＡＴａｓｅという）により行なわれる。即ち、脂肪酸とアシルキャリアータンパク（以下ＡＣＰという）の複合体から脂肪酸の部分がＧ−３−Ｐへ転移する反応をＡＴａｓｅが触媒する。
植物では、脂肪酸合成は専ら葉緑体内で起こり、ＡＴａｓｅの基質となる脂肪酸とＡＣＰの複合体は主にパルミトイルーＡＣＰ（以下１６：０−ＡＣＰという）及びオレオイルーＡＣＰ（以下１８：１−ＡＣＰという）の２種類である。ＡＴａｓｅがそのいずれの基質を選択するかはＡＴａｓｅ自体の性質、即ちＡＴａｓｅの基質選択性に依存する。ＡＴａｓｅの基質選択性については、種々の植物で調べられている。例えば、低温耐性植物であるホウレンソウおよびエンドウのＡＴａｓｅは１８：１−ＡＣＰに対する基質選択性が高く、これらの植物のＰＧは比較的低温でも液晶状態である[ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Eur.J.Biochem.129(1983)629-636)]。それに対して、低温感受性植物、例えばカボチャのＡＴａｓｅは、１６：０ーＡＣＰと１８：１ーＡＣＰとを区別せず、それぞれの脂肪酸をほぼ同じ割合で転移するため、カボチャのＰＧは比較的高温で固化する（詳細後述）。なお、基質選択性測定の際、脂肪酸チオエステルは、ＡＣＰ及びＣｏＡ（Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ）いずれを用いた場合でも選択性を調べることができる[プラント・フィジオロジー(Plant Physiol.83(1987)676-680])。
低温耐性植物のＡＴａｓｅのうち、全アミノ酸配列が解明されているのは、シロイヌナズナ（（特開平４−０１１８９１号公報）特願平２ー４７８２号明細書）、エンドウ[プラント・モレキュラー・バイオロジー(Plant Mol.Biol.17(1991)1067-1076)]、及び本発明者が明らかにしたホウレンソウ（ＷＯ  ９５／１４０９４号公報）（国際出願ＰＣＴ／ＪＰ９４／０１９５６号）のみである。
低温耐性植物のシロイヌナズナ、または低温感受性植物のカボチャ由来のATase遺伝子を、温度感受性が中間程度の植物のタバコに、遺伝子工学的に組み込む事により、タバコの温度感受性をシロイヌナズナの場合には、より低温耐性に、カボチャの場合には、より低温感受性に変化させることができることが明らかになっている（特表平６−５０４４３９号公報（特願平４−５０２７９２号明細書））。
発明の開示
ホウレンソウＡＴａｓｅの不飽和脂肪酸エステル（１８：１ーＡＣＰ）に対する基質選択性は、エンドウやシロイヌナズナよりも高いことが知られている。また、それ以外の植物からでは、低温耐性ではないが、カボチャ、キュウリ、ベニバナ由来のＡＴａｓｅのアミノ酸配列が報告されている。低温感受性植物に耐冷性能を付与するうえで、従来知られているものよりも１８：１ーＡＣＰに対する基質選択性が高い遺伝子が作出できれば、それを植物に導入する事により、より強い耐冷性を植物に付与できるものと期待できる。
本発明は、膜脂質のＰＧの性質をより強い耐冷性のものに変換するのに有用なＡＴａｓｅの生物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖を提供するものである。
本発明者らは、代表的な低温耐性植物であるホウレンソウと低温感受性植物であるカボチャのＤＮＡ及びアミノ酸配列を比較し、これら２種の遺伝子を繋ぎ合わせて両者が混合された遺伝子（キメラ遺伝子）を作成し、天然に存在するホウレンソウ由来のＡＴａｓｅよりも不飽和脂肪酸エステルを基質とする反応性の更に高いキメラＡＴａｓｅ遺伝子が得ることができた。本発明は、上記のような知見をもとに完成されるに至った。
すなわち、本発明によるグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼの生物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖は、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性を有していて、アミノ酸配列が実質的に配列番号：１、２、３、４または５に示されるアミノ酸配列であるポリペプチドをコードする塩基配列を有すること、を特徴とするものである。
本発明によるＤＮＡ鎖を種々の植物に導入・発現させることにより、そのＰＧの性質を変化、好ましい態様においてはホウレンソウ等の耐冷型である植物、またはそれ以上の耐冷型植物とする、すなわち低温耐性植物を得ることができる。ＤＮＡ鎖を植物へ導入・発現する技術は既にタバコ、ペチュニア、キク、カーネーション、ジャガイモ、イネなど多くの植物で実際に行なわれている普遍的な技術である。
本発明はまた、形質転換植物およびその製造方法にも関する。すなわち、本発明による形質転換植物およびその製造方法は下記に示すものである。
上記のＤＮＡが組み込まれ、このＤＮＡの発現によってこのグリセロールー３ーリン酸アシルトランスフェラーゼが産生されていることにより、脂質に結合した脂肪酸中の不飽和脂肪酸の含量が本来の組成に対して変化していることを特徴とする植物。
上記のＤＮＡを植物細胞に組み込み、植物体中でこのＤＮＡを発現させ、その結果としてこのグリセロールー３ーリン酸アシルトランスフェラーゼを産生させることにより、この植物の脂質に結合した脂肪酸中の不飽和脂肪酸の含量を本来の組成と変えることを特徴とする、植物の脂質中の脂肪酸組成を変化させる方法。
上記のＤＮＡを植物細胞に組み込み、植物体中でこのＤＮＡを発現させ、その結果としてこのグリセロールー３ーリン酸アシルトランスフェラーゼを産生させ、この植物の細胞の生体膜中に含まれているフォスファチジルグリセロールに結合した脂肪酸の組成を変化させて不飽和分子種含量を変えることを特徴とする、植物の低温に対する感受性を変化させる方法。
【図面の簡単な説明】
図１は、天然型のホウレンソウ（ＰＰＰ）、カボチャ（ＱＱＱ）、及び主なキメラＡＴａｓｅの略図である。
本願発明ＤＮＡ鎖により得られるキメラＡＴａｓｅはＱＰＱ、Ｑ（ＰＱ）ＱおよびＰＰＱである。キメラ作成に利用した制限酵素認識部位も併記した。
図２は、天然型及びキメラＡＴａｓｅの活性を、生のデータ（ａ）および１８：１−ＣｏＡのＧ−３−Ｐへの取り込み量の、１６：０−ＣｏＡと１８：１−ＣｏＡの全取り込み量に対する相対値（ｂ）で表示した説明図である。
図３は、キメラＡＴａｓｅ遺伝子（ＱＰＱ、Ｑ（ＰＱ）ＱおよびＰＰＱ）の制限酵素地図である。
矢印は翻訳の方向を示し、白色部はホウレンソウ、黒色部はカボチャ由来のＤＮＡ部分を示す。
発明を実施するための最良の形態
ＡＴａｓｅ遺伝子
＜定義＞
本発明によるＡＴａｓｅの生物学的産生能を有するＤＮＡ鎖、即ちＡＴａｓｅ遺伝子は、ＡＴａｓｅ活性を有していてアミノ酸配列が実質的に配列番号：１、２、３、４または５に示されるアミノ酸配列であるポリペプチドをコードする塩基配列を有するもの、である。ここで「ＤＮＡ鎖」とはある長さを有するポリデオキシリボ核酸鎖を意味するものである。そして、本発明ではこの「ＤＮＡ鎖」はそれがコードするポリペプチドのアミノ酸配列（後述する改変または修飾されたものを包含する）によって特定されるところ、このポリペプチドは上記のように有限のものであるから、この「ＤＮＡ鎖」（後述する縮重異性体を包含する）も有限のものである。しかし、この「ＤＮＡ鎖」は、ＡＴａｓｅをコードする遺伝子を含んでいてこのポリペプチドの生物工学的産生を行なわせるのに有用なものであるところ、この有限の長さのＤＮＡ鎖のみによって行なえるのでなく、その５’側上流及び３’側下流に適当な長さのＤＮＡ鎖が結合した状態でこのポリペプチドの生物工学的産生が可能となる訳である。
従って、本発明で「ＤＮＡ鎖」というときには、この特定の長さ（配列番号：１、２、３、４または５）のものの他に、この特定の長さのＤＮＡ鎖を構成員とする鎖状または環状ＤＮＡ鎖の形態にあるものを包含するものとする。
本発明によるＤＮＡ鎖の代表的存在形態は、プラスミドまたはファージＤＮＡの中に構成員の一部としてこのＤＮＡ鎖が挿入された形態、並びにプラスミドまたはファージあるいはゲノムＤＮＡの中に挿入された形で微生物（特に細菌）またはファージ粒子あるいは植物の中に存在する形態である。ここで言う細菌が、大腸菌やアグロバクテリウムを含むことは言うまでもない。
本発明によるＤＮＡ鎖の好ましい存在形態は、ＡＴａｓｅ遺伝子が植物中で安定に発現しうるように、プロモーター、翻訳調節領域をコードするＤＮＡ鎖、葉緑体への転移ペプチドをコードするＤＮＡ鎖、本発明によるＤＮＡ鎖、翻訳終止コドン、ターミネーターなどの発現用の要素とが一体に結合して、これがゲノムに挿入された形態で植物中に存在するものである。上記要素としてはプロモーター（たとえばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  プロモーター）、翻訳調節領域をコードするＤＮＡ鎖、葉緑体への転移ペプチドをコードするＤＮＡ鎖（リブロースニリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニットなど）、翻訳終止コドン、ターミネーター（たとえばノパリン合成酵素）など、公知のものを適宜組み合わせて用いる事ができる。
＜この遺伝子がコードするポリペプチド＞
上記のように、本発明によるＤＮＡ鎖は、これがコードするアミノ酸配列によって特定されている。このポリペプチドは、ＡＴａｓｅ活性を有していてアミノ酸配列が実質的に配列番号：１、２、３、４または５に示されるアミノ酸配列であるポリペプチドである。ここで「アミノ酸配列が実質的に配列番号：１、２、３、４または５に示されているアミノ酸配列である」ということは、このポリペプチドがＡＴａｓｅ活性を有する限りアミノ酸の幾つかについて欠失、置換、挿入、付加などの改変もしくは変化があってもよいことを示すものである。
本発明で対象とするＡＴａｓｅは、EC2.3.1.15で特定される酵素である。
＜ＤＮＡ鎖の塩基配列＞
本発明によるＡＴａｓｅをコードするＤＮＡ鎖は前記した通りであるが、その典型的な例は、配列番号：１、２、３、４または５に示す塩基配列をもつものまたはその縮重異性体、並びに上記のようなＡＴａｓｅのアミノ酸配列の変化に対応する塩基配列を持つものまたはその縮重異性体、である。ここで「縮重異性体」とは、縮重コドンにおいてのみ異なっていて同一のポリペプチドをコードすることのできるＤＮＡ鎖を意味する。例えば、配列番号：１、２、３、４または５の塩基配列をもつＤＮＡ鎖に対して、そのアミノ酸のどれかに対応するコドン、例えばＡｓｎに対応するコドン（ＡＡＣ）が、これと縮重関係にある例えばＡＡＴに変わったものを本発明では縮重異性体と呼ぶものとする。
本発明によるＤＮＡ鎖の好ましい具体例は、３’ー側末端に接して少なくとも一個の停止コドン（例えばＴＡＧ）を持つものである。また、本発明のＤＮＡ鎖の５’ー側上流および（または）３’ー側下流には、非翻訳領域としてのＤＮＡ鎖がある長さ続いてもよい。
＜ＤＮＡ鎖の取得＞
上記のＡＴａｓｅのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ鎖を取得する一つの方法は、核酸合成の方法に従ってそのＤＮＡ鎖の少なくとも一部を化学合成することである。
既知のＡＴａｓｅのアミノ酸残基数は少なくとも３６８個であり、このことを考えれば、この化学合成法よりも、ホウレンソウ及びカボチャの葉由来のｍＲＮＡから遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば岡山・バーグ法[モレキュラー・アンド・セル・バイオロジー(Molecular Cell Biol.2(1982)161-170)]によりｍＲＮＡに相補的なＤＮＡのライブラリーを取得し、これも慣用されている方法、例えば適当なプローブを用いた免疫学的方法による取得あるいはハイブリダイゼーション法により取得した後、その両植物に由来するＤＮＡを組み合わせたキメラ遺伝子を作出することが好ましいと言える。
これまでにホウレンソウ、カボチャをはじめとして６種の植物からＡＴａｓｅ遺伝子が単離され、そのＤＮＡ構造が明らかにされている。本発明者らは、ホウレンソウ及びカボチャのｃＤＮＡをクローニングし、その両者の間に共通なＤＮＡ配列中に存在する制限酵素認識部位で、その２種の遺伝子を組換えることにより、両者の間のキメラ遺伝子を作成した。
具体的には、ホウレンソウおよびカボチャ由来のｃＤＮＡを、２種の制限酵素ＫｐｎＩおよびHind IIIを用いてほぼ３等分に分割し、これらの分割断片を用いて両ｃＤＮＡ間における種々の組合せのキメラ遺伝子を作成した。本発明者らは種々のキメラ遺伝子の内で、カボチャｃＤＮＡの中央約１／３分割断片をホウレンソウｃＤＮＡの対応断片と入れ替えたキメラ遺伝子（配列番号２に相当：ＱＰＱ）およびホウレンソウｃＤＮＡの３′側末端の分割断片をカボチャｃＤＮＡの対応断片と入れ替えたキメラ遺伝子（配列番号１に相当：ＰＰＱ）、並びに、配列番号２のキメラ遺伝子（ＱＰＱ）の内部のホウレンソウｃＤＮＡに由来する部分の内、アミノ末端側の半分のみホウレンソウ由来とし、残りの部分をカボチャ由来としたもの（配列番号３：Ｑ（ＰＱ）Ｑ）が、不飽和脂肪酸に対して基質特異性の高いＡＴａｓｅタンパク質を発現することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
カボチャ由来のＡＴａｓｅのｃＤＮＡの構造および取得方法は公知であり、その方法に従い取得することができる（特開平１−２３５５９４号公報）。また、ホウレンソウ由来のＡＴａｓｅのｃＤＮＡの構造および取得方法は、本発明者らにより明らかにされており、この方法に従って取得することができる（ＷＯ  ９５／１４０９４号公報）（ＰＣＴ／ＪＰ９４／０１９５６号）。
なお、遺伝子断片同士の連結を含む一般的なキメラ遺伝子の作成法については、たとえばMolecular Cloning,Second edition,Sambrook et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989を参照することができるが、本発明キメラ遺伝子の作成に関しては下記の実施例にその具体例が示されている。
形質転換
上述のように、本発明によりホウレンソウとカボチャ由来のキメラＡＴａｓｅコードするＤＮＡ鎖が提供された。このＤＮＡ鎖を発現させてそれがコードするポリペプチド（ＡＴａｓｅ）を産生させるためには、本発明によるＤＮＡ鎖の他に適当なプロモーター、葉緑体への転移ペプチドをコードするＤＮＡ鎖、翻訳終止コドン及びターミネーターなどの発現調節配列が一体に結合した形で植物細胞に導入される必要がある。プロモーターとしては、例えばカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター、リブロースー１、５ー二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニットのプロモーターなど、ターミネーターとしては、ノパリン合成酵素のターミネーター、オクトピン合成酵素のターミネーターなどを適宜組み合わせて用いて、公知の方法により本発明ＤＮＡ鎖を植物細胞に導入（形質転換）し、培養することにより形質転換植物体を得ることができる。葉緑体への転移ペプチドをコードするＤＮＡ鎖は公知のもの、例えばエンドウのリブロースー１、５ー二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット遺伝子の物を用いることもできる。
後述するように、本発明ＤＮＡ鎖を植物に導入することにより、植物種あるいは株における遺伝子の発現の違いによってＰＧの脂肪酸中の不飽和脂肪酸の含量を変化（増加または低下）させることができ、この不飽和脂肪酸含量を増加させることにより低温に対して耐性の植物を得ることができる。
本発明ＤＮＡ鎖の導入の対象となる植物は低温感受性植物、低温耐性植物、その中間の植物のいずれでもありうるが、低温感受性植物が特に有用である。
低温感受性植物としては、穀類ではイネ、トウモロコシ、イモ類ではサトイモ、サツマイモ、野菜類ではキュウリ、ピーマン、ナス、カボチャ、果樹ではバナナ、メロン、花卉類ではベンケイソウ、シクラメン、ユリ、バラ、特用作物ではヒマ、ヘチマなどを例示することができ、また低温耐性植物および中間の植物としてはオオムギ、ホウレンソウ、エンドウ、シロイヌナズナ、および、トマト、タバコなどを例示することができる。
植物に外来遺伝子を導入する方法としては、既に報告され確立されている種々の方法、例えばアグロバクテリウムのＴｉプラスミドをベクターとして用いる方法や、植物プロトプラストにエレクトロポレーションで遺伝子を導入する方法等を、遺伝子を導入しようとする植物に応じて適宜用いる事ができる（例えば、'Plant Molecular Biology Manual'Second edition、S.B.Gelvin and R.A.Schilperoort,Kluwer Academic Publishers,1995参照）。外来遺伝子導入のための植物材料としては、葉片、茎片、塊茎片、プロトプラスト、カルス、花粉、花粉管などの中から適当なものを選ぶことができる。
本発明の好ましい態様において、フォスファチジルグリセロールの飽和分子種、即ち生体膜の相分離を引き起こし植物の低温傷害の原因となる脂質分子種を大幅に減じ（不飽和分子種もしくは不飽和脂肪酸の含量を増やし）、その結果低温に耐性の植物を得ることができる。
例
以下、実施例をあげて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例  キメラＡＴａｓｅ遺伝子の作成
カボチャ及びホウレンソウ由来のｃＤＮＡは、上記（特開平１−２３５５９４号およびＷＯ  ９５／１４０９４号：ＰＣＴ／ＪＰ  ９４／０１９５６号）の方法に従って取得し、ｐＴＺ１８ＲのEco RIサイトにクローニングした。
（１）カボチャＡＴａｓｅ遺伝子の調製
（ｉ）  ＲＮＡの取得
カボチャの種子を暗所，３０℃で５日間発芽させた後、１２時間白色光を照射して得た約１０ｇの子葉よりシャーグウイン（Chirgwin）らの方法〔バイオケミストリー（Biochemistry 18(1979)5294-5299）〕にしたがって全ＲＮＡを得た。この全ＲＮＡをもとにアビブ（Aviv）らの方法〔プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69(1972)1408-1412）〕に従ってポリＡを有するＲＮＡを分離した。
(ii)  ＲＮＡに相補的なＲＮＡのライブラリーの作成
上記のポリＡを有するＲＮＡにたいして相補的なＤＮＡをガブラー（Gubler）らの方法〔ジーン（Gene,25(1983)263-269）〕に従って合成した。この際プライマーとして、オリゴ（ｄＴ）およびランダムオリゴヌクレオチドを使用した。合成した２本鎖からなるＤＮＡはＥｃｏＲＩメチラーゼで制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位をメチル化した後、ＥｃｏＲＩリンカー（ｄＧＧＡＡＴＴＣＣ；宝酒造株式会社製）を両末端に付けた。更に制限酵素ＥｃｏＲＩで余分なリンカー部分を切断し、遊離のリンカーをゲルろ過法でｃＤＮＡ画分から除き、ｃＤＮＡとファージλｇｔ１１アームとを連結した。さらに、このＤＮＡを試験管内パッケイジング法（GIGAPACK GOLD;STRATAGENE）でλファージ粒子にパッケイジングし、λｇｔ１１でのライブラリーを得た。
(iii)  ＡＴａｓｅ遺伝子保持株のスクリーニング
上記のようにして得たファージ・ライブラリーよりカボチャＡＴａｓｅ３に特異的な抗血清に反応する株を選び出すことによりＡＴａｓｅ遺伝子保持株を得た。
まず、得られたｃＤＮＡライブラリーを大腸菌Ｙ１０９０株に感染させ、１プレート当り１万個のプラークを形成させた約１５０枚のプレートを、ヒーン（Huynh）らの方法〔ＤＮＡクローニング（１９８５）ＩＲＬ，オックスフォード、第１巻、４９−７８〕により、探索した。各プレートはイソプロピルβ-Ｄ-チオガラクトピラノシドにあらかじめ漬けておいたニトロセルロースフィルターと３７℃で２時間密着保持した後、０．１５Ｍ  ＮａＣｌと０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．８）で各２０分間３回洗浄した。次にマウスから得た抗血清を上記バッファーで１，０００倍に希釈し、この中にニトロセルロースフィルターを４℃下で１晩漬けて振とうした。次に、上記バッファーで３回洗浄した後、西洋ワサビ由来のパーオキシダーゼを結合した二次抗体と室温で２時間反応させ、上記と同様に３回洗浄した。その後、４-クロロ-１-ナフトールおよび過酸化水素を基質として発色処理し、強く発色した形質導入株を取り出し、更に抗体による二次選抜を行った。まず各々の形質導入株が特異的に産生するタンパク質をニトロセルロースフィルター上に固定し、そのタンパクに抗血清を反応させた。洗浄後のフィルターに残った抗体は、形質導入株が特異的に産生するタンパクにのみ反応するものである。この抗体を５ｍＭグリシン-ＨＣｌ（ｐＨ２．３）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌの液でフィルターから解離させた後、精製したＡＴａｓｅ３をＳＤＳ・電気泳動後、ブロットしたフィルターと反応させた。精製したＡＴａｓｅ３と反応する抗体が得られた形質導入株がＡＴａｓｅ産生形質導入株と判断された。この株からファージを大量調製し、そのＤＮＡから制限酵素ＥｃｏＲＩにより外来ＤＮＡを切り出したところ、その大きさは約４００ｂｐであった。
このクローンを32Ｐ-ｄＡＴＰ（宝酒造株式会社）によりニックトランスレーションして、約１０7ｄｐｍ／μｇのプローブを得た。このプローブを用いて、相補的なＤＮＡのライブラリーの再選抜を行った。ファージを吸着したフィルターを５０％ホルムアミド、５×デンハート液（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％牛血清アルブミン）、５×ＳＳＰＥ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４），０．１％ＳＤＳおよび１００μｇ／mlのサケ精子ＤＮＡを含む液中で４２℃、１晩保持した。32ＰでラベルしたＤＮＡプローブを加えて、さらに２４時間ハイブリダイゼイションした。フィルターは常法にしたがい洗浄し、プローブと強くハイブリダイズするファージを選抜した。このファージ中には、１１８８ｂｐのオープンリーディングフレームが存在する１４２６ｂｐの外来ＤＮＡが含まれ、ここにはアミノ酸３９６個、分子量約４４，０００のタンパク質がコードされていると推定される。この１４２６ｂｐからなるＤＮＡをプラスミドベクターｐＴＺ１８Ｒ（Pharmacia製）にクローニングして得た組換体プラスミドｐＡＴ-０３を形質導入して得た大腸菌（ＡＴ-０３と命名）が、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現在の工業技術院生命工学工業技術研究所）（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託されていて、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ-３０９４を与えられている（寄託日：昭和６３年３月１１日）。
（２）ホウレンソウATase遺伝子の調製
（ｉ）  ホウレンソウcDNAライブラリーの作製
約１０ｇのホウレンソウ（Spinacia oleracea L.var.grabra Viroflay／渡辺採種場（宮城県）より入手）の子葉よりシャーグウイン(Chirgwin)らの方法[Biochemistry,18(1979)5294-5299]に従って全RNAを得た。この全RNAからアビブ(Aviv)らの方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69(1972)1408-1412]に従ってポリAを有するRNA[poly(A)+RNA]を分離した。
上記のpoly(A)+RNAに対して相補的なDNA(cDNA)をガブラー(Gubler)らの方法[Gene,25(1983)263-269]に従って合成した。この際、プライマーとしてオリゴ(dT)およびランダムオリゴヌクレオチドを使用した。合成した二本鎖cDNAをEcoRIメチラーゼで処理して制限酵素EcoRIの切断部位をメチル化した後、EcoRIリンカー(dGGAATTCC；宝酒造製)を両末端に付加した。次に制限酵素EcoRIで余分なリンカーを切断除去し、遊離のリンカーをゲルろ過でcDNA画分から除き、cDNAとファージλgt11のアームとを連結した。続いて、このDNAをλファージ粒子(Gigapack Gold;Stratagene製)にパッケージングし、λgt11でのホウレンソウcDNAライブラリーを得た。
（ii）  ライブラリースクリーニング用プローブの調製
カボチャおよびシロイヌナズナATaseのcDNAをプローブとして、ホウレンソウmRNAをノーザン解析した。mRNAの調製は、上記の方法に従った。カボチャ、ホウレンソウ、オオムギ、イネおよびエンドウのpoly(A)+RNA各５μｇをグリオキサールで変性後、1.5%アガロースゲルで電気泳動し、分離したpoly(A)+RNAをナイロンメンブレン（GeneScreen Plus;DuPont製）へ転写させ、上記cDNAをプローブとしてハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーションは、6×SSPE[１×SSPEは10mMリン酸緩衝液(pH7.0),1mM EDTA,0.15M NaCl]、0.2% SDSおよび100μg/mlニシン精子DNAから成る液中で60℃、１６時間行なった。その後、メンブレンを２×SSC（１×SSCは0.15M NaCl、15mMクエン酸ナトリウム）液中で室温、１５分を２回、次いで４２℃、１５分を２回振とうして洗った。その結果、カボチャおよびシロイヌナズナATaseのcDNAをプローブとするとカボチャおよびエンドウmRNA中に約２kbのバンドが検出されるが、ホウレンソウmRNA中にはバンドが何も検出されなかった。従って、カボチャおよびシロイヌナズナATaseのcDNAをプローブとするスクリーニングではホウレンソウATaseのcDNAを取得することは困難と判断した。
そこで、４種（その後、新たに２種の植物由来ATaseのDNA構造が明らかになったため）の植物由来ATaseのアミノ酸配列を比較すると、比較的相同性が高い領域が幾つかあることが明らかとなった。そこで、シロイヌナズナとカボチャに加え、エンドウとキュウリの４種の植物において相同性の高い領域からそれぞれDNAを合成し、それらを２つずつ組み合わせてプライマーとし、プライマーで挟まれた部分のDNAをＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)により取得することを試みた。対応するプライマーDNAを合成し(Model 394 DNA/RNA Synthesizer;Applied Biosystems製),それぞれをプライマー１〜６と呼び、以下にその配列を示す。
0003778938.tif 000002
このうち１〜３がセンス鎖、４〜６がアンチセンス鎖に対応する。ＰＣＲ反応では、それぞれのグループから１つずつ選んだプライマーセット（９セット）を使用した。ＰＣＲ反応に用いる鋳型としてゲノムDNA、cDNAライブラリー由来DNA等も考えられるが、ここでは、mRNAを鋳型として逆転写酵素によってcDNAを合成し、cDNA/mRNAハイブリッドを形成させこれを鋳型として用いた。この反応は、Gene AmpTMRNA PCR Kit（宝酒造製）に拠った。１本鎖目cDNAの合成反応液は、50mM Tris-HCl(pH8.3),50mM KCl,4mM DTT,80mM MgCl2,0.8mM dNTPs,20μg/mlの6mer random oligo DNA,20 U RNase inhibitor,2μg/ml poly(A)+RNA,50 U逆転写酵素の計20μlの液からなり、ミネラルオイルを100μl重層し、42℃で１時間反応した。なお、ホウレンソウmRNAと並行してコントロールとしてカボチャmRNAも鋳型として使用した。反応終了後95℃で５分間処理することにより逆転写酵素を不活化させた。続いて、１本鎖目cDNAの合成反応液に前述したプライマーをそれぞれ20μM入れ２本鎖目を合成した。この際、PCRは95℃（１分）,55℃（１分）,72℃（２分）を１サイクルとして３５サイクル行なった。反応終了後100μlのクロロホルムでミネラルオイルを抽出して水層を回収し、次いで100μlのエーテルでクロロホルムを除去して得た水層から、10μlを取り出し1%アガロースゲル電気泳動により合成したDNAを分離後解析した。その結果、３と６のプライマーセットのみでホウレンソウおよびカボチャのmRNAから、共に約300bpの増幅されたDNA断片が観察された。一方、他の8種類の組み合わせでは、カボチャmRNA由来の増幅されたDNA断片と大きさが一致するバンドは、ホウレンソウmRNA由来のDNA中には認められなかった。この増幅されたDNA断片は、両端をKlenowフラグメントで平滑化した後、プラスミドpTZ18R（Pharmacia製）のSmaI部位にクローニングした。
(iii)  ATase cDNA保持株のスクリーニングとcDNAの単離
上記のようにして得られたDNA断片をプローブとして、cDNAライブラリーのスクリーニングを行なった。まず、ホウレンソウcDNAを含む組換体ファージを大腸菌Y1090(r-)株に感染させ、直径約15cmのプレートに約３万個のプラークを形成させた４０枚のプレートを調製し、ファージをナイロンメンブレン(Hybond-N+;Amersham製)に転写した。プローブDNAはMultiprime DNA labelling Kit（Amersham製）を用いて32P-dCTPで標識した。ハイブリダイゼーションは前述(ii)と同一組成のハイブリダイゼーション液で、６５℃、１６時間行ない、最終洗浄は0.1×SSCで５０℃、２０分を２回振とうして行なった。１回めのスクリーニングで陽性であったファージを、再び同様にスクリーニングすることにより、３種の陽性ファージを得、ファージを純化後ファージDNAを得た。これらのファージDNAをEcoRIで切断し、cDNAをプラスミドpTZ18R(Pharmacia製)にサブクローニングし塩基配列を決定した。得られた３種のcDNAクローン(SpAT#1〜3)のうち、SpAT#1は長さ約1.5kbpで、そのオープンリーディングフレームのアミノ酸配列を他の植物のATaseのアミノ酸配列と比較すると、Ｎ末側のアミノ酸が欠けていることが明らかになった。そこでSpAT#1をプローブとしてホウレンソウcDNAライブラリーをスクリーニングし、約600bpのcDNAクローン（SpAT#4）を得た。この両クローンを合わせたcDNAクローン（SpAT#14）の長さは、1,656bpであり、その中に1,413bpのオープンリーディングフレームが存在するが、ここにはアミノ酸４７２個、分子量52,177のタンパク質がコードされていると推定される。
（３）キメラＡＴａｓｅ遺伝子の作成
カボチャおよびホウレンソウ由来のｃＤＮＡの間の塩基配列をＤＮＡ等の配列を解析するソフトウエアー（DNASIS ver.3.0）を使って比べてみると、全体では約７０％の塩基配列が共通であった。共通配列の中には制限酵素の認識部位が幾つか見いだされたが、その中でもHind IIIとKpn Iのサイトは全体をほぼ３等分する場所に存在していた（図１）。ベクター上のｃＤＮＡのクローニングサイトであるEco RIと上記の２種の制限酵素の計３種の酵素の内の２種を組み合わせて使用することによって、ＡＴａｓｅ遺伝子の一部を得ることが出来た。これをもう一方の遺伝子に置き換える事により、一部が他の植物由来の遺伝子に変わった遺伝子（キメラ遺伝子）を作成した。ここで、キメラ遺伝子の表示法として、ホウレンソウ（Spinach;Pと表す）及びカボチャ（Squash;Qと表す）由来の遺伝子を３分の１ずつ、３つ組み合わせてＮ末側から順に表示することにする。その表記法に従って記述すると、ホウレンソウ及びカボチャ由来の天然型の遺伝子をＰＰＰとＱＱＱとし、Ｎ末側３分の１を相互に入れ替えたものをＱＰＰとＰＱＱ、中央部を相互に入れ替えたものをＰＱＰ及びＱＰＱ、Ｃ末側のみを相互に入れ替えたものをＰＰＱ及びＱＱｐ等とした（図１）。
実際の作成例としては、ホウレンソウ及びカボチャ由来の遺伝子をそれぞれEco RIで切断すると夫々約1.7弱および1.4kbpのｃＤＮＡ断片が得られるが、この断片を更にHind IIIで切断するとＮ末側から約３分の１のところでもう１箇所切断される。この部分を相互に入れ替えることにより、Ｎ末側の約３分の１が他の植物由来の遺伝子に置き変わったキメラ遺伝子（ＱＰＰ及びＰＱＱ）が得られた。
このようにして得られた６種のキメラ遺伝子及び天然型の２種の遺伝子（ＰＰＰ及びＱＱＱ）を大腸菌での発現用のベクターpET17b(Novagen社)にクローニングし、トランジット配列を除去するにあたり、それぞれ２種のＤＮＡを合成した（アプライド・バイオシステム社）。ホウレンソウの場合には、以下の２種のＤＮＡを合成した。
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次にこれらのＤＮＡを等モル量アニーリングした後、４種のdNTP存在下でDNAポリメラーゼKlenow断片を用いてFill in反応を行ない、Nhe Iサイトを内部に有するアダプターを作成した。また、Sph Iを有する後者の短い合成ＤＮＡを使う場合には、これとPst Iを有する合成DNAとを組み合わせて、ホウレンソウ遺伝子（ＰＰＰ）のｃＤＮＡを鋳型にするＰＣＲ反応のプライマーとして用い、４種のｄＮＴＰ存在化でＴａｑポリメラーゼによりＤＮＡ断片の増幅を行った。これらいずれの場合もSph I及びPst Iで切断し、同一の制限酵素のセットで切断したＡＴａｓｅを含有するプラスミドに挿入し、Nhe Iサイトが導入されたプラスミドを選択した。この結果、ホウレンソウＡＴａｓｅの成熟酵素のＮ末端付近のアミノ酸配列は、Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＡｒｇからＭｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ（Ａｒｇ）に変わった（４アミノ酸の変更）。
他方、カボチャＡＴａｓｅをＮ末端に有する遺伝子については、ＰＣＲ反応を使ってＡＴａｓｅの成熟酵素近傍に制限酵素Nhe Iサイトを導入した。即ち、以下の２種のＤＮＡを合成した後、９５℃（１分）、５５℃（１分）、７２℃（２分）からなる反応を３０回繰り返すことによって片側にSph I及びNhe Iサイト、もう片方にPst Iサイトを有する約１００ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。
0003778938.tif 000004
得られたＤＮＡ断片をSph I及びPst Iで切断し、同一の制限酵素のセットで切断したＡＴａｓｅを含有するプラスミドに挿入し、Nhe Iサイトが導入されたプラスミドを選択した。この結果、カボチャＡＴａｓｅの成熟酵素のＮ末端付近のアミノ酸配列は、Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＨｉｓからＭｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓに変わった（３アミノ酸の変更）。
次に、キメラＰＱＰのＱ部位の中央にはSac Iサイトがあり、このサイトを使って中央部については更に細かなキメラを作成した。ホウレンソウの遺伝子の中央付近に対応する部位からアンチセンスで以下のＤＮＡを合成した。
0003778938.tif 000005
合成ＤＮＡ１と３を組み合わせ、ＰＰＰ（天然型のホウレンソウ遺伝子）を鋳型にして上記の実施例に記述してあるのと同じ条件でＰＣＲを行なったのち、生産されたＤＮＡ断片をHind IIIとSac Iのセットで切断するとホウレンソウ由来の遺伝子の中央部のうち人為的に新たに導入したSac IからHindIIIに至る断片が得られた。またカボチャ遺伝子を鋳型にしたＰＣＲを同様に行なった後、Hind IIIとSac Iにより切断して両酵素の認識サイトで挟まれたＤＮＡが得られ、これを回収した。これらのＤＮＡ断片と、ＰＱＰからHind IIIとSac Iの制限酵素のセットで切断してその間の断片を除いたプラスミドを組み合わせる事により、それぞれＰ（ＰＱ）Ｐ及びＰ（ＱＰＱ）Ｐが作成できた。なお、この結果得られる、後者のキメラ遺伝子の中央に存在するホウレンソウ由来配列は、ＰＣＲ反応に使ったプライマーに対応する配列である。また、Ｐ（ＰＱ）Ｐを制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩとＫｐｎ  Ｉで切断することによって得られるキメラ体の中央部の断片を、同じ制限酵素の組でＱＰＱを切断することによってＰの部分を除去し（ＰＱ）に置き換えることによってＱ（ＰＱ）Ｑを得ることができた。
以上のようにして作成した種々のキメラ遺伝子及び天然型のホウレンソウとカボチャの遺伝子のＮ末端にNhe Iサイトを導入したプラスミドをNhe I及びEcoRIで切断し、同一制限酵素の組で切断したpET17bに導入した。
実験例１  キメラＡＴａｓｅ遺伝子の大腸菌での発現
上記のようにして得たプラスミドを常法（Molecular Cloning pp.250-251;1982）に従って調製した大腸菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)のコンピテントセルに導入し、アンピシリン耐性による選別によって形質転換株を得た。キメラ遺伝子または元のプラスミドpET17bのみを含む大腸菌を１００μｍ／ｍｌのアンピシリン及び３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが入ったＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で３７℃で６００ｎｍの吸光度が０、７になるまで培養し、イソプロピルチオガラクトシド（IPTG）の濃度が０、４ｍＭになるように添加し、更に３時間培養を続けた。細胞は、遠心分離により回収し、使用時までー２０℃で保存した。なお、この冷凍庫での保存を数日間行なっても、酵素活性には変化がないことを後述の方法により活性測定することによって確かめた。
凍結保存してあった細胞を氷上で溶かし、20mM Tris HCl(pH8.0),20mM dithiothreitol,10mM MgCl2,1μg/ml DNase Iからなる液で溶解し、４℃で１時間保持した。この実験に使用した大腸菌株BL21(DE3)pLysSは、元々Ｔ７のリゾチームを生産しているので、４℃で保持することによって十分に溶菌させることができた。この溶菌物を３万ｇで１０分間遠心分離した上清を、更に１０万ｇで１時間遠心して得た上清を酵素活性測定用のサンプルとした。
これらの試料について一部をＳＤＳ電気泳動に供試し、タンパクの発現量を調べたところ、いずれの組換え体も試料タンパクの約５％に達しており、キメラおよび天然型の遺伝子の間でタンパク質の発現量に顕著な差はなかった。
実験例２  酵素活性の測定
ＡＴａｓｅの標準的な活性測定は、ＢｅｒｔｒａｍｓとＨｅｉｎｚの方法[プラント・フィジオロジー(Plant Physiol.68(1981):653-657)]に従って、アシルーＣｏＡから[U−14C]グリセロール−３−リン酸への転移速度を測定した。標準的な測定液は、80μlからなり0.25M Hepes(pH7.4),6μg/mlウシ血清アルブミン,0.3mM[U-14C]グリセロール−３−リン酸(0.9Ci/mol)及び約1μgの大腸菌抽出液に0.4mMのパルミトイル−ＣｏＡまたはオレオイル−ＣｏＡを加えて２４℃で行なった。８分後、２．３ｍｌのクロロホルム：メタノール混液（１：１）と１ｍｌの1M KClと0.2M H3PO4を加えて良く攪拌して反応を止めた。遠心分離後、０．９ｍｌの下層（有機層）を回収し液体シンチレーションカウンターのカクテル（Aquasol-2）と混合して取り込み量を測定した。なお、反応に加えるタンパク質の量は、あらかじめ何段階かの量について測定し、最大取り込み量を示すタンパク量の３０％になるように調製した。この結果、pET17bのみを含む大腸菌の場合には活性は検出できなかったが、各種のキメラ及び天然型のＡＴａｓｅ遺伝子を含む場合には、顕著な酵素活性が検出できた（図２（ａ））。まず、天然型の遺伝子であるＰＰＰとＱＱＱは、それぞれ不飽和脂肪酸エステル（１８：１−ＣｏＡ）、または飽和脂肪酸エステル（１６：０−ＣｏＡ）を活性測定に用いた時に高い活性を示した。また、全般的に、中央部３分の１にホウレンソウ由来の配列（Ｐ）がある遺伝子（ＰＰＱ、ＰＰＰ、ＱＰＱ、Ｐ（ＰＱ）Ｐ、Ｑ（ＰＱ）Ｑ）が、相対的に不飽和脂肪酸を用いた時の活性が高く、この配列は不飽和脂肪酸を基質とする反応に重要と思われた。次に、驚くべきことに、その中で特に、ＱＰＱは、天然の遺伝子（ＰＰＰ）に比べ２倍以上の活性を示し、このキメラ遺伝子の酵素反応速度が遺伝子の組換えにより高まっていた。
次に、以上の図２（ａ）の結果を両基質への相対値で示した（図２（ｂ））。その結果、意外にも、キメラＰＰＱは、実質的にほぼ不飽和脂肪酸のみを基質とし、天然の遺伝子（ＰＰＰ）よりも更に不飽和脂肪酸への反応速度が早くなっていた。同様に、キメラＱＰＱ及びＱ（ＰＱ）Ｑも不飽和脂肪酸を基質とする反応が、天然の遺伝子（ＰＰＰ）よりも速くなっていた。特に、最後のキメラＱ（ＰＱ）Ｑの結果から、不飽和脂肪酸への選択性上、中央部のアミノ末端側半分が不飽和脂肪酸を基質とする反応上重要と考えられた。また、いずれもキメラもＣ末端３分の１はカボチャ由来の遺伝子になっており、中央部のホウレンソウ由来遺伝子とＣ端末のカボチャ由来の遺伝子の組み合わせが最適と考えられた。
なお図３は、キメラＡＴａｓｅ遺伝子（ＱＰＱおよびＰＰＱ）の制限酵素地図を示すものである。図中、矢印は翻訳の方向を示し、白色部はホウレンソウ、黒色部はカボチャ由来のＤＮＡ部分を示す。
実験例３
キメラＡＴａｓｅの一種（ＰＰＱ）のタバコ細胞への導入
キメラＡＴａｓｅの一種（ＰＰＱ）のＤＮＡを以下のようにしてタバコ細胞へ導入した。
（１）植物発現用ベクタープラスミドの構築
植物発現用バイナリープラスミドpBI121(Clontech)を制限酵素SacIとSmaIで切断し、Klenowフラグメントで切断端を平滑末端とした後、T4 DNAライゲースを用いて両末端を連結した。こうして得たプラスミドpBI121(-GUS)は、β-Glucuronidase遺伝子（GUS遺伝子）を含まず、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターとノパリン合成酵素（NOS）ターミネーターの間に制限酵素XbaIとBamHIのサイトをユニークサイトとして有する。
実施例１で得たキメラＡＴａｓｅ（ＰＰＱ）を含むプラスミドを制限酵素EcoRIで切断し、低融点アガロースゲル電気泳動によりベクタープラスミドpTZ18RとキメラATaseのDNAを分離し、DNAをゲルから切り出して調整した。更にKlenowフラグメントで切断端を平滑末端とした。一方上記で得たプラスミドpBI121(-GUS)を制限酵素BamHIで切断後、上記と同様に処理して両末端を平滑末端とした。こうして得たキメラATaseのDNAとプラスミドpBI121(-GUS)をT4 DNAライゲースを用いて連結することにより、35Sプロモーター、キメラATaseのDNA、NOSターミネーターを含むプラスミドpBI121-35SPPQを得た。このプラスミドの35SプロモーターをNOSプロモーターに入れ替えるためXbaIで完全に切断後、不足量のHindIIIで部分的に分解処理をすることにより、約800bpの35Sプロモーターを取り除いた。一方、NOSプロモーターは以下の２つのプライマーをpBI121を鋳型として使ったＰＣＲ反応によって取得した。なお、プライマーの設計に当たりpBIN19中のNOSプロモーターの塩基配列をデータベース(アクセッション番号；U09365)から得た。
0003778938.tif 000006
ここで下線部はそれぞれHindIIIとXbaIに当たり、約300bpの反応産物を両酵素で処理した後、低融点アガロースゲル電気泳動によりプロモーターＤＮＡを精製した。このＤＮＡ断片と上記の35Sプロモーターを取り除いたプラスミドをT4 DNAライゲースを用いて連結することにより、NOSプロモーター、キメラATaseのDNA、NOSターミネーターを含むプラスミドpBI121-NOSPPQを得た。
（２）pBI121-NOSPPQのアグロバクテリウムへの導入
Agrobacterium tumefaciens LBA 4404(Clontech)を、50mlのYEB培地（1l当たりビーフエキス5g、2mM MgSO4,pH7.4）に接種し、28℃で24時間培養後、培養液を3000rpm、４℃、２０分の遠心で集菌した。菌体を10mlの1mM HEPES(pH7.4)で３回洗った後、３mlの10%グリセロールで１回洗い、最終的に3mlの10%グリセロールに懸濁してDNA導入用アグロバクテリウム菌液とした。
上記のアグロバクテリウム菌液50μlおよび前記のプラスミドpBI121-NOSPPQを1μgキュベットに入れ、エレクトロポレーション装置（Gene Pulser;BioRad）を用いて25μF、2500V、200Ωの条件で電気パルスをかけ、プラスミドDNAをアグロバクテリウムに導入した。この菌液をエッペンドルフチューブに移し、800μlのSOC培地（1l当たりトリプトン20g、酵母エキス5g、NaCl 0.5g、2.5mM KCl、pH7.0）を加え、28℃で1.5時間静置培養した。この培養液50μlを、100ppmのカナマイシンを含むYEB寒天培地（寒天1.2%）上にまき、28℃で２日間培養した。得られたコロニー群からシングルコロニーを選び、このコロニーからアルカリ法でプラスミドDNAを調整した。このプラスミドDNAを適当な制限酵素で消化後1%アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、32PでラベルしたキメラATaseDNAをプローブとしたサザン分析により、確認した。このアブロバクテロウムをALBNSPTと呼ぶ。
（３）タバコの形質転換
上記のようにして得られたALBNSPTを50ppmのカナマイシンを含むLB液体培地で28℃、２４時間振とう培養した。培養液1.5mlを10,000rpm、３分間遠心して集菌後、カナマイシンを除くために1mlのLB培地で洗浄した。さらに10,000rpm、３分間遠心して集菌後、1.5mlのLB液体培地に再懸濁し感染用菌液とした。
次に、タバコの葉にアグロバクテリウムを感染させるために、若いタバコの葉を採取し、0.5%次亜塩素酸ナトリウム水溶液に１０分間浸せき後、滅菌水で３回洗い、滅菌済みの濾紙の上で水を拭って感染用の葉とした。この葉を１片が1cm2になるようにメスで無菌的に切断し、アグロバクテリウムの菌液上に葉の裏を上にして置き、２分間静かに振とうした後、滅菌済み濾紙上に葉を置いて過剰のアグロバクテリウムを除いた。シャーレ内のMS-B5培地（ベンジルアデニン1.0ppm、ナフタレン酢酸0.1ppmおよび寒天0.8%を含む）(T.Murashige and F.Skoog,Plant Physiol.,15:473,1962)上に、1mlのタバコ（品種：Xanthi-nc）の懸濁培養細胞を広げ、その上にワットマンNo.1濾紙（直径7.0cm）を置き、この濾紙に裏を上にして葉を置いた。シャーレをパラフィルムでシールし、16時間明、８時間暗の光周期で25℃、２日間培養した。次いでクラホラン（ヘキスト）250ppmを含むMS-B5培地上に移し、同様に10日間培養してアグロバクテリウムを除去した。このカルスをクラホラン250ppmおよびカナマイシン100ppmを含むMS-B5培地上に移し、更に３０日間培養した。この間に葉片の周囲がカルス化し、一部のカルスから幼植物が再分化した。この幼植物をクラホラン250ppmおよびカナマイシン100ppmを含むMS-B5培地（植物ホルモンを含まない）上に移し再分化個体を生育させ、更に土に順化させて温室で栽培した。その温室での栽培タバコを、以下の試験の材料として用いた。
実験例４
キメラＡＴａｓｅの内の一種の遺伝子（ＰＰＱ）を導入したタバコの脂肪酸分析
実施例３で得た形質転換植物および対照植物（pBI121によりGUS遺伝子を導入したタバコ）から、以下の方法によりフォスファチジルグリセロール（ＰＧ）を調整し、その脂肪酸を分析した。
脂質の抽出はBligh-Dyer法(Can.J,Biochem.Physiol.,37:911,1959)で行なった。0.1%のブチルヒドロキシトルエンを含むイソプロパノール5mlを80℃に温めておき、そこに湿重量2gの細胞をメスで裁断して素早く入れ、80℃で５分間処理後、室温に冷やした。これに20mlのクロロホルム：メタノール（１：２、体積比）を加え、ホモジナイザーで細胞を破砕後、１５分間静置した。これにクロロホルム12mlおよび蒸留水12mlを加え激しく混合した後、3,000rpm、４℃、30分間の遠心で水層と有機層の２層に分け、有機層（下層）を回収した。これに適当量のエタノールを加えて、ロータリーエバポレーターを用い、30℃減圧下で溶媒を除いた。これを2mlのクロロホルム：メタノール（１：４、体積比）に溶かし、全脂質抽出物とした。
脂質を分画するため、DEAE-Toyopearl 650C（東ソー）の懸濁液25ml 1M酢酸ナトリウム水溶液(pH7.0)25mlと混ぜ酢酸型にした。これを蒸留水、メタノールで順次洗浄し、最後にメタノールに懸濁して、内径2cmのカラムに高さ1.5cmまで詰め、さらに50mlのクロロホルム：メタノール（１：４、体積比）で洗浄した。
全脂質抽出物をカラムにのせ、50mlのクロロホルム：メタノール（１：４、体積比）、50mlの酢酸、15mlのクロロホルム：メタノール（１：４、体積比）で順に洗浄し、夾雑する大部分の脂質を除いた後、50mlの10M酢酸アンモニウム水溶液（20:80:0.2、体積比）でＰＧを含む脂質の画分を得た。これに15mlのエタノールを加え、減圧下で溶媒を除いた。これを200μlのクロロホルム：メタノール（２：１、体積比）に溶かした。この脂質をシリカゲルーＴＬＣプレート＃５７２１（メルク）で分離した。展開溶媒にはクロロホルム：メタノール：酢酸：水（５０：２０：１０：１５：５、体積比）を用いた。ＴＬＣで分離後、プリムロンを噴霧して紫外光下で蛍光発色させ、標準となるＰＧと同じ移動度を示すＰＧの画分をシリカゲルごと削り取り、ネジ栓付き試験管に入れた。この中に2.5mlのメタノール性5%塩酸を加え、85℃で２時間半反応させ脂肪酸をメチル化した。生じた脂肪酸メチルエステルを2.5mlのヘキサンで４回抽出し、減圧下で溶媒を除去して濃縮した。脂肪酸メチルの分析には、ガスクロマトグラフィーを用いた。島津製作所のガスクロGC-17AAWFWで分画し、脂肪酸メチルの同定は標準脂肪酸メチルとの保持時間を比較して行なった。定量にはクロマトパックC-R7A plus（島津製作所）を用いた。結果を表１に示す。
0003778938.tif 000007
ＰＧに結合した脂肪酸中の飽和脂肪酸（16:0+16:1t+18:0）の含量は、対照のタバコでは７０、９％であるのに対し、キメラATase（ＰＰＱ）を導入したタバコでは、高くなる個体（＃１および＃２）ならびに低くなる個体（＃３、＃４および＃５）があり、キメラATaseを発現させることにより不飽和脂肪酸の含量を増やす方向と、減らす方向の両方が可能になることが示された。中でも、特に不飽和脂肪酸含量を減らす方では、＃３の個体の飽和脂肪酸含量が対照に比べ７％以上も低下し、飽和分子種も２８％以下にまで低下していた。
産業上の利用可能性
本発明によれば、代表的な低温耐性植物であるホウレンソウと低温感受性植物であるカボチャのＤＮＡ及びアミノ酸配列を比較し、これら２種の遺伝子を特定の領域同士で繋ぎ合わせて両者が混合された遺伝子（キメラ遺伝子）を作成することにより、天然に存在するホウレンソウ由来のＡＴａｓｅよりも不飽和脂肪酸エステルを基質とする反応性の更に高いキメラＡＴａｓｅ遺伝子が得ることができた（低温耐性植物由来の遺伝子と低温感受性植物由来の遺伝子の組合せによるキメラ遺伝子から得られたＡＴａｓｅが、低温耐性植物のものより不飽和脂肪酸に対する基質選択性が増強されたということは全く予測されない意外な結果であった）。
従って、本発明によるＤＮＡ鎖は、それを植物に導入することによって、より強い低温耐性を植物に付与することが可能な遺伝子として有用である。
配列表
配列番号：１（略称：ＰＰＱ）
配列の長さ：１１０４
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ（キメラ）
起源：
生物名：ホウレンソウ及びカボチャ
株名：Spinacia oleracea L.var.grabra ViroflayおよびCucurbita moscata Duch.
配列：
0003778938.tif 000008
0003778938.tif 000009
0003778938.tif 000010
0003778938.tif 000011
配列番号：２（略称：ＱＰＱ）
配列の長さ：１１０４
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ（キメラ）
起源：
生物名：ホウレンソウ及びカボチャ
株名：Spinacia oleracea L.var.grabra ViroflayおよびCucurbita moscata Duch.
配列：
0003778938.tif 000012
0003778938.tif 000013
0003778938.tif 000014
0003778938.tif 000015
配列番号：３（略称；Ｑ（ＰＱ）Ｑ）
配列の長さ：１１０４
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ（キメラ）
起源：
生物名：ホウレンソウ及びカボチャ
配列：
0003778938.tif 000016
0003778938.tif 000017
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配列番号：４（略称：ＰＰＱ）
配列の長さ：１１０４
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ（キメラ）
起源：
生物名：ホウレンソウ及びカボチャ
株名：Spinacia oleracea L.var.grabra ViroflayおよびCucurbita moscata Duch.
配列：
0003778938.tif 000019
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0003778938.tif 000021
配列番号：５（略称：ＱＰＱ）
配列の長さ：１１０４
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ（キメラ）
起源：
生物名：ホウレンソウ及びカボチャ
株名：Spinacia oleracea L.var.grabra ViroflayおよびCucurbita moscata Duch.
配列：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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