(57)【要約】【解決課題】  ウィルスによる遺伝子導入法を採用せずに，安全なGDNF遺伝子発現(mRNA)の増加を行う細胞培養方法を提供する。【解決手段】    ヒト皮膚由来幹細胞を，ＳＡＧ，パルモルファミン（Purmorphamine）及びソニック・ヘッジホッグ (Sonic hedgehog, SHH)タンパク質のいずれか１種又は２種以上を含む無血清培地で培養する培養工程を含む，グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)mRNAを含む培養細胞の製造方法であって、無血清培地は，Ｂ−２７サプリメント，ROCK阻害剤，ＥＧＦ，ＦＧＦ２をさらに含んでもよい。【選択図】図１
2019092939.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト皮膚由来幹細胞を，ＳＡＧを含む無血清培地で培養する培養工程を含む，グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)mRNA及びCD73タンパク質を含む培養細胞の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって，
前記無血清培地は，パルモルファミン（Purmorphamine）及びソニック・ヘッジホッグ (Sonic hedgehog, SHH)タンパク質のいずれか又は両方をさらに含む，方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって，
前記無血清培地は，Ｂ−２７サプリメントをさらに含む，方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって，
前記無血清培地は，ROCK阻害剤をさらに含む，方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって，
前記無血清培地は，ＥＧＦ又はＦＧＦ２をさらに含む，方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって，
前記無血清培地は，カルシウム・イオン濃度が0.03mM以上0.12mM以下である，方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって，
前記ヒト皮膚由来幹細胞は，採取されたヒト皮膚をディスパーゼ処理，トリプシン処理，及びコラゲナーゼ処理の順で処理して得られた細胞である，方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法を用いて培養細胞を製造する工程と，
前記培養細胞，前記培養工程において得られた培地，及び前記培養工程において得られた分泌物のいずれか１種又は２種以上を含む脊髄損傷疾患の治療剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は，ヒト皮膚組織から得られる細胞を培養して得られる，脊髄損傷疾患群を治療するための細胞の製造方法に関し，また，前記方法により得られる細胞または培養培地またはExosome等の分泌物を含有する脊髄損傷疾患群を治療する医療薬の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊髄損傷（Spinal Cord Injury）は，主として脊柱に強い外力が加えられることにより脊椎を損壊し，脊髄に損傷をうける病態である。また，脊髄腫瘍やヘルニアや頸椎脊髄症など内的原因によっても類似の障害が発生する。脊髄損傷の推定患者数は，日本では１０万人である。脊髄損傷の原因の大半は交通事や高所からの落下等による外傷である。【０００３】
脊髄を含む中枢神経系は，末梢神経と異なり，一度損傷すると修復・再生されることは無い。破壊された脊髄を再生し，再び機能を取り戻すことは全世界の脊損者の願いであり，様々な分野で研究が進められている。【０００４】
現在受傷直後では，米国において，受傷直後，48〜72時間以内であれば，大量にステロイド剤の投与が行われる。日本の関西医科大学において，やはり受傷直後の患者に対し，自分の骨髄液を培養して脊髄に注入したり，日本の慶応大学などのグループが事故などで脊髄を損傷して78時間以内に，肝細胞増殖因子（HFG）を投与するなどの試みが行われている。【０００５】
慢性期になった場合は，リハビリテーションが行われる。しかし，脊髄損傷のリハビリテーションは失われた機能を回復させることではない。神経が再生しない以上，それは不可能だからである。リハビリの目的は，「残された機能をいかにして使い，ADL（日常生活動作）を可能にするか」という点にある。更に慢性期になると褥瘡や尿路感染症などの合併症が発生し，介護は困難を極める。【０００６】
その慢性期でも有効な治療法として現在最も有望視されているのが，骨髄や神経の幹細胞を用いた神経再生の試みである。動物実験では部分的な効果が報告されているが，人体に応用し治療に役立つには未だ基礎研究の段階であり，研究の強力な推進が望まれている。主として人工多能性幹細胞，胚性幹細胞の使用が研究されているが，解決すべき課題も多い。例として，人工多能性幹細胞(iPS)を用いた場合，免疫反応は回避できると考えられるものの，腫瘍となる可能性が指摘されている。また，胚性幹細胞については，免疫反応や腫瘍化の問題に加え，倫理面での問題が指摘されている。【０００７】
しかし倫理面と免疫拒絶の問題をクリアーした遺伝子導入から造られたiPS細胞を用いた脊損動物への投与では脊髄内に腫瘍ができるとの報告が日本から２０１０年に発表されている（非特許文献１）。【０００８】
2005年現在，唯一臨床治療として行われているのが，中国の北京首都医科大学において，鼻臭覚粘膜細胞(OEG)を注入することで脊髄の再生を図るというものである。しかし同大からは長期にわたる治療効果の検証において，世界の研究者を納得させるデータの提出が無く，激しい疼痛やOEGの入手先（中絶胎児から採取）の問題や他家移植の問題が残されている。２０１４年に発表された自己の鼻粘膜を移植する日本の臨床試験でも劇的効果（歩行可能例）は報告されていない。【０００９】
2010年10月，アメリカのジェロン社が脊髄損傷の患者4人に対しES細胞を使用した臨床試験を開始したが，2011年11月に撤退を発表している。この原因は不明であるが，臨床効果が乏しかったか，或は免疫的な拒絶反応が現れたか，または脊髄内にTeratomaが発生した可能性が高い。
慶應大学の中村雅也准教授らのグループが京都市で開かれた日本再生医療学会で，脊髄損傷の患者に対するiPS細胞の臨床研究を2017年度に始める計画を発表した。対象は，事故から2〜4週間後で，患部の炎症が収まり傷口が固まり始める前の患者であり，慢性期の患者は適応外である。【００１０】
このように幹細胞治療が注目 されているが，上市済の再生医療製品は，米国で幹細胞に よるものは１品目，EUで 前進治療医薬品（Advanced Therapy Medicinal Product）として１品目のみである。しかしながら， 脊髄損傷に対して承認された再生医療製品は存在しない現状である。【００１１】
また，ヒト皮膚由来幹細胞（Mesenchymal stem cells）は，移植後に神経細胞に誘導し難く，軟骨細胞や骨細胞になってしまう可能性が高く，脳由来神経幹細胞は治療効果が低い等の欠点を有する（非特許文献１３）。【００１２】
一方，皮膚からの前駆細胞は脳からの神経幹細胞よりも脊損での治療効果が高いことが報告されている（非特許文献１４）。【００１３】
更に最近，井上＆熊谷らは，ヒト表皮keratinocytesにも脊髄損傷への治癒効果があることも報告している（非特許文献２）。【００１４】
しかしながら，未だに脊髄損傷に対し，治療効果のマーカーを特定し，それらを発現した細胞の培養調製法は存在しない。【００１５】
一方，サイトカインとしてはグリア細胞株由来神経栄養因子（Glial cell line−derived neurotrophic factor：GDNF）が脊髄損傷に効果が最も明確に示されているものである（非特許文献４−８）。【００１６】
そこで，更に脊髄損傷の治癒効果を上げるものを造ろうとする試みは治癒効果の期待される細胞に更にGDNFの遺伝子を導入する試みである（非特許文献８−１０）。  遺伝子を導入する細胞としては嗅覚受容細胞（Olfactory ensheathing cells）や，シュワン細胞（Schwann cells）等が使用されており，この細胞自身でも治癒効果を持つので，更なる治療効果の増大がある。【００１７】
しかし，この方法の欠点はウィルスを用いて遺伝子導入するため，生体に移植した時に癌化する可能性が高い。【００１８】
逆に，GDNFの蛋白そのものは不安定で取扱いが困難である（非特許文献１５）。【００１９】
また，GDNFは脊髄損傷の回復に必要な内因性因子としても報告されている（非特許文献１６）。【００２０】
さらに，GDNFは脊髄損傷患者を悩ます異痛症を抑制する効果も報告されている（非特許文献１７−１８）。【００２１】
脊髄損傷の治療の多くは慢性期に入った患者に対するものであり，慢性期にも効果のある治療法が最も望まれる。幸い，GDNFは慢性期の脊髄損傷にも効果が報告されている（非特許文献１９）。【００２２】
したがって，移植する細胞にGDNFを発現させることは，脊髄損傷の治療効果を画期的に高めることにつながる（非特許文献２０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】特開2012−29684号公報
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Tsuji O, et al. : Therapeutic potential of appropriately evaluated self−induced pluripotent stem cells for spinal cord injury. PNAS 2010;107 (28), 12704−12709
【非特許文献２】Inoue H, et al. : Improvement of hind−paralysis following traumatic spinal cord injury in rats by grafting normal human keratinocytes: new cell−therapy strategy for nerve regeneration. J Artif Organs. 2011;14(4):375−80
【非特許文献３】Inoue H, et al. : Improvement of hind−limb paralysis following traumatic spinal cord injury in rats by grafting normal human keratinocytes: new cell−therapy strategy for nerve regeneration. J Artif Organs. 2011 ;14(4):375−80
【非特許文献４】Ansorena E, et al. : Injectable alginate hydrogel loaded with GDNF promotes functional recovery in a hemisection model of spinal cord injury. Int J Pharm. 2013 ;455(1−2):148−58.
【非特許文献５】Tang XQ, et al. : Adenovirus−mediated delivery of GDNF ameliorates corticospinal neuronal atrophy and motor function deficits in rats with spinal cord injury.Neuroreport. 2004;15(3):425−9.
【非特許文献６】Guzen FP, et al. : Glial cell line−derived neurotrophic factor added to a sciatic nerve fragment grafted in a spinal cord gap ameliorates motor impairments in rats and increases local axonal growth. Restor Neurol Neurosci. 2009;27(1):1−16.
【非特許文献７】Kao CH, et al. : Exogenous administration of glial cell line−derived neurotrophic factor improves recovery after spinal cord injury. Resuscitation. 2008 ;77(3):395−400.
【非特許文献８】Koelsch A, et al. : Transgene−mediated GDNF expression enhances synaptic connectivity and GABA transmission to improve functional outcome after spinal cord contusion. J Neurochem. 2010 ;113(1):143−52.
【非特許文献９】Cao L, et al. : Olfactory ensheathing cells genetically modified to secrete GDNF to promote spinal cord repair. Brain. 2004 Mar;127(Pt 3):535−49.
【非特許文献１０】Deng LX, et al. : A novel growth−promoting pathway formed by GDNF−overexpressing Schwann cells promotes propriospinal axonal regeneration, synapse formation, and partial recovery of function after spinal cord injury. J Neurosci. 2013 Mar 27;33(13):5655−67.
【非特許文献１１】Stephen J. A. Daviees, et al. : Transplantaion of specific human astrocytes promotes functional recovery after spinal cord injury. PLoS ONE 2011;6(3): e17328
【非特許文献１２】Sowa NA, et al. : Ecto−5'−nucleotidase (CD73) inhibits nociception by hydrolyzing AMP to adenosine in nociceptive circuits. J Neurosci. 2010 Feb 10;30(6):2235−2244.
【非特許文献１３】Kim MS, et al. : Perspectives on Tissue−Engineered Nerve Regeneration for the Treatment of Spinal Cord Injury.  Tissue Eng Part. 2014;20(13−14):1781−3
【非特許文献１４】Biemaskie J, et al. : Skin−derived precursors generate myelinating Schwann cells that promote remyelination and functional recovery after contusion spinal cord injury.  J Neuroscience. 2007;27(36):9545−9559.
【非特許文献１５】Zhao YZ, et al. : Thermosensitive heparin−poloxamer hydrogels enhance the effects of GDNF on neuronal circuit remodeling and neuroprotection after spinal cord injury. J Biomed Mater Res A. 2017;5(10):2816−2829
【非特許文献１６】Zhou HL, et al. : Changes in Glial cell line−derived neurotrophic factor expression in the rostral and caudal stumps of the transected adult rat spinal cord.Neurochem Res. 2008;33(5):927−37
【非特許文献１７】Chou AK, et al. : Adenoviral−mediated glial cell line−derived neurotrophic factor gene transfer has a protective effect on sciatic nerve following constriction−induced spinal cord injury. PLoS One. 2014;9(3): e92264
【非特許文献１８】Detloff MR, et al. : Acute exercise prevents the development of neuropathic pain and the sprouting of non−peptidergic (GDNF− and artemin−responsive) c−fibers after spinal cord injury. Exp Neurol. 2014;255:38−48.
【非特許文献１９】Dolbeare D, et al. : Restriction of axonal retraction and promotion of axonal regeneration by chronically injured neurons after intraspinal treatment with glial cell line−derived neurotrophic factor (GDNF). J Neurotrauma. 2003;20(11):1251−61.
【非特許文献２０】Lu Y, et al. : Glial cell line−derived neurotrophic factor−transfected placenta−derived versus bone marrow−derived mesenchymal cells for treating spinal cord injury. Med Sci Monit. 2017 ;23:1800−1811
【非特許文献２１】Codega P, et al. : Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 2014;82(3):545−59.
【非特許文献２２】DeCarolis NA, et al. : In vivo contribution of nestin−and GLAST−lineage cells to adult hippocampal neurogenesis. Hippocampus. 2013;23(8):708−719.
【非特許文献２３】Sufan Wu, et al. : Bone marrow stromal cells enhance differentiation of cocultured neurosphere cells and promote regeneration of injured spinal cord.   J Neurosci Res. 2003;72(3):343−51.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明は，ウィルスによる遺伝子導入法を採用せずに，安全なGDNF遺伝子発現(mRNA)の増加を行う細胞培養方法を提供することを目的とする。【００２６】
本発明は，神経幹細胞のマーカーなど種々のマーカーをも発現する細胞培養方法を提供することを目的とする。【００２７】
本発明は，脊髄損傷疾患の治療剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明は，基本的には，ヒト皮膚由来幹細胞を，ＳＡＧ，パルモルファミン（Purmorphamine）及びソニック・ヘッジホッグ (Sonic hedgehog, SHH)タンパク質のいずれか１種又は２種以上を含む無血清培地で培養することで，グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)mRNAを高発現（例えば，通常培養の１０倍以上発現）させることができるという実施例による知見に基づく。【００２９】
本発明の第１の側面は，グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)mRNAを含む培養細胞の製造方法に関する。この方法は，ヒト皮膚由来幹細胞を，ＳＡＧ，パルモルファミン（Purmorphamine）及びソニック・ヘッジホッグ (Sonic hedgehog, SHH)タンパク質のいずれか１種又は２種以上を含む無血清培地で培養する培養工程を含む。この方法は，グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)mRNAが高発現する。【００３０】
ヒト皮膚由来幹細胞は，患者本人の皮膚細胞に由来するものが好ましい。特に，採取時に組織への損傷が軽度で回復が早い皮膚組織からの細胞を採取し，培養細胞を得ることが好ましい。幹細胞の培養方法は公知であるから，基本的には本明細書に記載された方法と，公知の方法（例えば特許第5409359号公報や特許第6041270号公報に記載された方法）に従って細胞を培養すればよい。ヒト皮膚由来幹細胞の製造方法も，上記の公報に記載されているほか公知技術である。【００３１】
ＳＡＧは，ＣＡＳ番号３６４５９０−６３−６で知られ，化学物質名がＮ−メチル−Ｎ’−（３−ピリジニルベンジル）−Ｎ’−（３−クロロベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボニル）−１，４−ジアミノシクロヘキサン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｂｅｎｚｙｌ）−Ｎ’−（３−ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−２−ｃａｒｂｏｎｙｌ）−１,４−ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ）である化合物である。【００３２】
ＳＡＧは，国際公開ＷＯ２０１４−０８４０８５号パンフレットに開示される通り，ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）を活性化させるタンパク質である。ＳＡＧ１．１は，化学物質名がＮ−メチル−Ｎ’−（３−（４−ベンゾニトリル）−４−メトキシベンジル）−Ｎ−（３−クロロベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボニル）−１，４−ジアミノシクロヘキサン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−（３−（４−ｂｅｎｚｏｎｉｔｒｉｌｅ）−４−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）−Ｎ’−（３−ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−2−ｃａｒｂｏｎｙｌ）−１,４−ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ））である。ＳＡＧについては文献Ｓｉｎｈａ Ｓ, Ｃｈｅｎ ＪＫ. Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ. ２００６ Ｊａｎ;２（１）：２９−３０.及びＣｈｅｎ ＪＫ, Ｔａｉｐａｌｅ Ｊ, Ｙｏｕｎｇ ＫＥ, Ｍａｉｔｉ Ｔ, Ｂｅａｃｈｙ ＰＡ. Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ. ２００２ Ｏｃｔ ２９；９９（２２）：１４０７１−６.に詳しい。同様に，ＳＡＧ1.1については文献Ｃｈｅｎ, Ｗ., Ｒｅｎ, Ｘ. Ｒ., Ｎｅｌｓｏｎ, Ｃ. Ｄ., Ｂａｒａｋ, Ｌ. Ｓ., Ｃｈｅｎ, Ｊ. Ｋ., Ｂｅａｃｈｙ, Ｐ. Ａ.,ｄｅ Ｓａｕｖａｇｅ, Ｆ. ＆ Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ, Ｒ. Ｊ. (２００４) Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６,（５７０５） ２２５７−２２６０に詳しい。【００３３】
パルモルファミン（Purmorphamine）は，（９−シクロヘキシル−Ｎ− ［４−（４−モルホリニル）フェニル］  −２−（１−ナフタレニルオキシ）−９Ｈ−プリン−６−アミン））（(9-Cyclohexyl-N-[4-(4-morpholinyl)phenyl]-2-(1-naphthalenyloxy)-9H-purin-6-amine)）の一般名である。パルモルファミンは，プルモルファミンともよばれるスムーズンドアゴニストであり，特許6210881号公報，及び特許5620821号公報(2uMが培地に添加されている)に記載されている。【００３４】
ソニック・ヘッジホッグ (Sonic hedgehog, SHH)タンパク質は，公知のタンパク質であり，例えば特許4900587号公報では，２００〜４００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨタンパク質が無血清培地に添加されている。【００３５】
無血清培地
本発明の培地は，無血清培地であり，公知の培地における成分を適宜含んでもよい。また，例えば，特許第４３８５０７６号公報及び特開２０１２−１５７２６３号公報には動物細胞を無血清培養するための培地が開示されている。このように公知の文献に記載される要素を適宜本発明の培地に添加してもよい。【００３６】
本発明の培地は，基本培地として公知のものを適宜用いてもよい。そのような基本培地の例は，ＭＥＭ培地，ダルベッコＭＥＭ（登録商標）培地，MCDB153，ハムＦ１２（登録商標）培地，マッコイ５Ａ（登録商標）培地，１９９培地ア―ル液（登録商標），ＲＰＭＩ１６４０（登録商標）培地，Ｆ―１０ハム培地，ＭＥＭ−α培地，ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地，ＭＣＤＢ１３１，MCDB153及びＭＣＤＢ２０１である。【００３７】
培地のｐＨは，５％濃度ＣＯ２環境で平衡化された際にｐＨ６．８−７．８の範囲で調整され，ｐＨ７．２（±０．１）であることがより好ましい。緩衝材（例えば，重炭酸ナトリウム）や塩酸及び水酸化ナトリウムといったｐＨ調整剤を用いて，基本培地の酸性度を適宜調整してもよい。【００３８】
本発明の培地は，様々な低分子化合物を適宜含んでもよい。たとえば，本発明の培地は，抗酸化剤を含むことが好ましい。抗酸化剤の例は，メラトニン（Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ），ｎ−アセチル−Ｌ−システイン，還元型グルタチオン及びアスコルビン酸からなる群から選択される１または２以上の成分である。本発明の培地は，リン脂質（例えば，フォスファチジルセリン，フォスファチジルエタノールアミン，及びフォスファチジルコリンなど）や脂肪酸（例えば，リノール酸，オレイン酸，リノレイン酸，アラキドン酸，ミリスチン酸，パルミトイル酸，パルミチン酸，及びステアリン酸）を適宜含んでもよい。本発明の培地に添加してもよい。他の成分の例は，トランスフェリン，セレン酸塩，グルコース，Ｄ−ビオチン，Ｄ−パントテン酸カルシウム，塩化コリン，葉酸，ミオイノシトール，ニコチンアミド，ｐ−アミノ安息香酸，ピリドキサール塩酸，塩酸ピリドキシ，リボフラビン，塩酸チアミン，ビタミンＢ１２，ピルビン酸ナトリウム，チミジン，ヒポキサンチン，亜セレン酸ナトリウム，硫酸ストレプトマイシン，ペニシリンＧカリウム塩，及びフェノールレッドなどである。【００３９】
上記の培養細胞の製造方法は，無血清培地が，Ｂ−２７サプリメントをさらに含むことが好ましい。無血清培地がＢ−２７サプリメントを含むと，実施例において示された通り，ネスチンｍＲＮＡが高発現する。ネスチン遺伝子は，神経幹細胞のマーカーである。Ｂ−２７サプリメントは，例えば，特許6185907号公報，及び特許6137626号公報において培地に添加されるように公知の要素である。【００４０】
上記の培養細胞の製造方法は，無血清培地が，ＲOCK阻害剤をさらに含むことが好ましい。無血清培地がＲＯＣＫ阻害剤を含むと，幹細胞の安定性が維持される。ROCK阻害剤は，Rho-キナーゼ(ROCK)のキナーゼ活性を阻害する物質として定義され，例えば，Y-27632(4-[(1R)-1-アミノエチル]-N-ピリジン-4-イルシクロヘキサン-1-カルボキサミド)又はその2塩酸塩（例えば，Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)；Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照），Fasudil/HA1077(1-(5-イソキノリンスルホニル)ホモピペラジン)又はその2塩酸塩（例えば，Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)参照），H-1152((S)-(+)-2-メチル-1-[(4-メチル-5-イソキノリニル)スルホニル]-ヘキサヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン)又はその2塩酸塩（例えば，Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照），Wf-536((+)-(R)-4-(1-アミノエチル)-N-(4-ピリジル)ベンズアミド1塩酸塩)（例えば，Nakajima et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照）及びそれらの誘導体，並びにROCKに対するアンチセンス核酸，RNA干渉誘導性核酸（例えば，siRNA），ドミナントネガティブ変異体，及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また，ROCK阻害剤としては他の低分子化合物も知られているので，本発明においてはこのような化合物又はそれらの誘導体も使用できる（例えば，米国特許出願公開第20050209261号，同第20050192304号，同第20040014755号，同第20040002508号，同第20040002507号，同第20030125344号，同第20030087919号，及び国際公開第2003/062227号，同第2003/059913号，同第2003/062225号，同第2002/076976号，同第2004/039796号参照）。本発明では，少なくとも1種のROCK阻害剤が使用され得る。ROCK阻害剤は，一般的に100nM〜50μMの範囲で用いられている。【００４１】
上記の培養細胞の製造方法は，無血清培地が，ＥＧＦをさらに含むことが好ましい。無血清培地がＥＧＦを含むと，神経幹細胞が維持され, NestinのmRNAが高発現する。【００４２】
ＥＧＦは，上皮増殖因子（ＥＧＦ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）ファミリーから選択される増殖因子である。例えば，特許6191694号公報では，培地に対するＥＧＦの含有量が，終濃度で，０．５〜２００ｎｇ／ｍＬとされている。【００４３】
ＧＦＡＰ
GFAP遺伝子は，脊損への移植に適しているとされる成体神経幹細胞（adult neural stem cell）または星状細胞（astrocytes）のマーカーである（非特許文献１，２０，２２）。【００４４】
上記の培養細胞の製造方法は，無血清培地が，ＦＧＦ２をさらに含むことが好ましい。無血清培地がＲＯＣＫ阻害剤を含むと，実施例において示された通り，ＥＧＦのmRNAが高発現し，さらにＣＤ７３タンパク質が発現する。ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）２は，ＦＧＦ−２とも表記される。例えば，特許5856029号公報において，ＦＧＦ２は，０．１〜５０ｎｇ／ｍＬ，より好ましくは１〜１０ｎｇ／ｍＬ，最も好ましくは５ｎｇ／ｍＬの濃度において，培地に添加されることとされている。ＣＤ７３(エクト−５‘−ヌクレオチダーゼ：Ｅｃｔｏ−５’−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ)は，脊損患者に特有な疼痛を緩和する可能性が高いとされている。【００４５】
上記の培養細胞の製造方法は，無血清培地が，のカルシウム・イオン濃度が0.03mM以上0.12mM以下であることが好ましい。この範囲に，カルシウム・イオン濃度を維持することで，幹細胞の分化を抑制できる。【００４６】
なお，上記の好ましいとされた態様は，適宜組み合わせることができる。上記したＳＡＧ，パルモルファミン，ソニック・ヘッジホッグ (SHH)タンパク質，Ｂ−２７サプリメント，ＲＯＣＫ阻害剤，ＥＧＦ，ＦＧＦ２などの添加物は，それらの物質の性質を考慮し，適切な量を培地に添加すればよい。これらの物質は，培地に添加されるものとして公知であるから，公知の資料に基づき，添加量を適宜調整すればよい。たとえば，それぞれ培地に０．１ｎｇ／ｍＬ以上２０μｇ／ｍＬ以下（又は０．２ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下）となるように添加すればよい。これらは精製の程度や必要量に応じて適宜調整して添加すればよい。【００４７】
上記の培養細胞の製造方法は，ヒト皮膚由来幹細胞が，採取されたヒト皮膚をディスパーゼ処理，トリプシン処理，及びコラゲナーゼ処理の順で処理して得られた細胞であることが好ましい。ディスパーゼ処理，トリプシン処理，及びコラゲナーゼ処理は，いわゆる酵素処理である。酵素処理条件は，生理学的に許容されるｐＨ，例えば約６〜８，好ましくは約７．２〜７．６に緩衝された等張の塩溶液，例えばトリプシンの場合はＰＢＳやハンクスのバランス塩溶液中で，例えばディスパーゼ，コラゲナーゼの場合は例えばＭＥＭ培地中で，約４〜４０℃，好ましくは約４〜３９℃で，結合組織を分解するために十分な時間，例えば約１〜１０００分間，好ましくは５〜７２０分間で，そのために十分な濃度，例えば約０．０００１〜５％ｗ／ｖ，好ましくは約０．００１％〜０．５％ ｗ／ｖであり得る。【００４８】
本発明の第２の側面は，脊髄損傷疾患の治療剤の製造方法をも提供する。脊髄は脊椎の中を通る中枢神経であり，この神経を修復するために用いられるのが脊髄損傷疾患の治療剤である。この方法は，上記の方法を用いて培養細胞を製造する。その後，培養細胞，培養工程において得られた培地，及び培養工程において得られた分泌物（エクソソーム等）のいずれか１種又は２種以上を有効成分とした脊髄損傷疾患の治療剤（本発明の剤）を製造する。分泌物（エクソソーム等）は培養上清由来のものであってもよい。また，培地は培養上清のみを用いてもよい。【００４９】
本発明の剤は，当業者に公知の方法で製造すればよい。本発明の剤は，経口用製剤および非経口用製剤として製造することができるが，好ましくは非経口用製剤である。このような非経口用製剤は，液剤（水性液剤，非水性液剤，懸濁性液剤，乳濁性液剤など）としてもよいし,固形剤（粉末充填製剤，凍結乾燥製剤など）としてもよい。また，本発明の剤は，徐放製剤としてもよい。生きた細胞を剤とする場合の剤形としては液剤が好ましく，細胞の部分成分もしくは死細胞全体を剤とする場合の剤形としては，液剤も固形剤も選択できる。【００５０】
本発明の剤の主成分は，培養されたヒト皮膚由来幹細胞，培養工程において得られた培地，及び培養細胞からの分泌物（エクソソーム等）のいずれか１種又は２種以上である。いずれにせよ例えば，細胞の数を指標として，有効量を設計すればよい。最終的な剤には，幹細胞が除かれていてもよい。また分泌物は培養上清に含まれるものであってもよい。1回当たりの投与量と投与回数，投与の頻度は，投与する対象，年齢，症状などによって変化する。一般的には，１日のヒト皮膚由来幹細胞剤の投与量の例は，静脈内注射１投与単位として，１×１０５細胞以上１×１０9細胞であり，好ましくは１×１０6細胞以上５×１０8細胞であり，より好ましくは１×１０7細胞以上2×１０8細胞である。または，体重１ｋｇ当たりのヒト皮膚由来幹細胞の１日の投与量の例は，１×１０４細胞以上１×１０８細胞であり，好ましくは１×１０５細胞以上５×１０７細胞であり，より好ましくは１×１０６細胞以上２×１０７細胞である。本発明の剤は，３日に1回の投与で合計８回投与しても良いし，連日投与を一週間継続しても良い。また，様々な頻度の投与期間に組合せにおいての使用もできる。1回で症状の改善が認められた著効例においては，初回のみの投与で終了しても良い。このように，本発明の剤は，疾患や症状の背景によって，多種多様な使用が可能であり，さらには，それぞれの投与における移植細胞数は，上述の範囲において，任意に設定が可能である。【００５１】
本発明は，脊髄損傷の治療剤を製造するための上記した本発明のヒト皮膚由来幹細胞の使用をも提供する。【００５２】
本発明は脊髄損傷の治療方法をも提供する。各種疾患の治療方法は，脊髄損傷に罹患した患者に上記のように製造された本発明の剤を，有効量投与する工程を含む。
【発明の効果】
【００５３】
本発明は，ウィルスによる遺伝子導入法を採用せずに，安全なGDNF遺伝子発現(mRNA)の増加を行う細胞培養方法を提供できる。【００５４】
本発明は，神経幹細胞のマーカーなど種々のマーカーをも発現する細胞培養方法を提供できる。【００５５】
本発明は，脊髄損傷疾患の治療剤の製造方法を提供できる。【００５６】
本発明の方法では，ヒトの組織の中でもとりわけ採取しやすい皮膚から脊髄損傷の治療用細胞を無血清・無フィーダー細胞培養法で得ることができる。本発明の方法では，脊髄損傷の治療に最も必須とされるGDNFの発現量を１０倍あげる方法を見出し，これと共に，神経幹細胞のマーカーのネスチンを発現させ，脊髄損傷の治療に有効とされるGFAPを発現させ，更に脊髄損傷で起こる痛覚過敏を防ぐCD73も発現させた脊髄損傷治癒に効果の高い細胞を遺伝子導入無しで得ることが確認された。本発明の方法で得られた細胞は，ラット脊髄損傷モデルで治癒効果が確認された。また，この細胞は発癌性試験で陰性であった。更に，この細胞を月２回腰椎穿刺法で投与することにより２年以上脊髄損傷(Th3)で歩けなかった47歳の患者を投与１か月後に歩行可能となる結果を得ることが出来た。一方，2014年のTRIシンポジウムで発表された日本での臭粘膜移植では35歳以下下肢完全麻痺(Th4~7)4例に対し1例の歩行可能例もなかった。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は，GDNF mRNAの発現量増加効果  (実験例２)を示す図面に替わるグラフである。
【図２】図２は，Nestin mRNAの発現  (実験例３) を示す図面に替わるグラフである。
【図３】図３は，GFAP mRNAの発現  (実験例４) を示す図面に替わるグラフである。
【図４】図４は，CD73の発現（CD発現プロフィル）(実験例５) を示す図面に替わるグラフである。
【図５】図５は，ラット脊髄損傷モデルでの効果（BBB score）（実験例６）を示す図面に替わるグラフである。
【図６】図６は，発癌性の評価を示す図面に替わるグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
以下，本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。
【００５９】
本発明は，ヒト皮膚から皮膚を採取し，組織を除菌する組織採取工程：
細胞採取播種工程：
細胞増殖工程：
継代工程：
分化誘導工程：
移植・加工工程：
以上の工程で脊髄損傷に効果の高い細胞を得て，直接に投与する細胞を提供する方法または他の基剤と結合させた医療機器のための細胞を提供する方法を提供する。さらに以上の工程で得た培養後培地成分を投与する方法を提供する。
【００６０】
以下，各工程について，その詳細を例をもって説明する。以下の説明は例であり，本発明は以下の例に限定されるものではなく，当業者にとって自明な範囲で条件を適宜変化させたものも含まれる。なお，ｕはマイクロを意味する場合がある。
【００６１】
（組織採取工程）
本工程で採取される皮膚は首から上の部位が望ましく，更に採取後の美容上の観点からは耳介後部の皮膚が最も望ましい。皮膚の性別や年齢は問われなく，７０歳代までは可能である。以下の工程は全て無菌操作で行う。採取組織の除菌は0.1um pore sizeの除菌フィフターで芽胞を取り除いた７０％エタノール水にて行う。
【００６２】
（細胞採取播種工程）
カットした組織を10uM Y−27632の入りのDispase溶液（PBS(−)）に，４℃で１晩浸漬する。この組織を次に10uM Y−27632の入りのTrypsin溶液（PBS(−))に３７℃，２０分浸漬する。さらに，この組織をコラゲナーゼ溶液（DMEM）に浸漬し，３７℃，１〜２時間スターラーで撹拌して皮膚を消化する。この撹拌後の懸濁液を100umのメッシュを通して残渣を取り除く。この液をPBS(−)にて３回遠心・洗浄して酵素を除き，細胞を得る。この細胞をTrypsin Inhibitor中に入れ１０分静置する。この細胞から遠心してInhibitorを除いた後，10uM Y−27632の入った培地に懸濁し，培養皿に播種する。
【００６３】
（細胞増殖工程）
播種６日までは，培地交換は行わず，培地添加のみとする。その後の培地交換はconditioned medium中に増殖浮遊する細胞を遠心して回収し，新培地に懸濁した細胞を培養系に戻す培地交換を行う。
【００６４】
（継代工程）
細胞を３０分以上10uM Y−27632処理を行い，EDTAとTrypLEx Expressで細胞をdishより回収する。次にTrypsin Inhibitor中に入れ１０分静置する。細胞から遠心してInhibitorを除いた後，10uM Y−27632の入った培地に懸濁し，元の４〜５倍の面積のdishに播種する。継代1代目に5枚の100mm２ dishに培養し，confluenceに達したら，その3枚を移植に用いるか，移植まで凍結保存する。残り2枚を更に6枚の100mm２ dishに継代培養し，confluenceに達したら因子添加誘導工程に移る。
【００６５】
(因子添加誘導工程)
因子添加誘導工程は，移植前３日目に必要な細胞に薬物処理を行い必要な因子を添加し培養する工程である。
本工程によって，GDNFmRNAを高発現した細胞，例えば，通常培養の１０倍以上発現した細胞が得られる。また，本工程によって，CD13が陰性の細胞（ＣＤ１３（−））が得られる。また，本工程によって，CD34が陰性の細胞（ＣＤ３４（−））が得られる。また，本工程によって，CD45が陰性の細胞（ＣＤ４５（−））が得られる。また，本工程によって，CD90が陰性の細胞が得られる（ＣＤ９０（−））。また，本工程によって， CD73が陽性の細胞（ＣＤ７３（＋））が得られる。培養細胞のうち，ＣＤ７３が陽性の細胞（ＣＤ７３（＋））の割合（細胞数）の例は，２０％以上１００％以下でもよいし，４０％以上１００％以下でもよいし，６０％以上９９％以下でもよいし，８０％以上９９％以下でもよい。因子添加誘導工程を終えた細胞は3日後に移植に用いるか，移植まで凍結保存することが好ましい。
(移植・加工工程)
各行程を経て治療必要数に達した細胞を３０分以上10uM Y−27632処理を行い，EDTAとTrypLEx Expressで細胞をdishより回収する。次にTrypsin Inhibitor中に入れ１０分静置する。細胞から遠心してInhibitorを除いた後，脊髄穿刺で移植する場合は，107 cell/ml濃度で臨床用輸液に懸濁して用いる。この細胞は他の基剤や細胞との加工に供する。
【００６６】
以下，実施例を用いて本発明を具体的に説明する。本発明は，以下の実施例に基づいて当業者が公知の技術を用いて適宜調整できる範囲も含む。
【実施例１】
【００６７】
（ヒト皮膚からの皮膚幹細胞の採取・培養）
（組織の採取）
５６歳女性のリフト・アップ美容整形手術時に顔部から切除廃棄された約２cm2の皮膚組織の全層部分を用いた。以下の工程は全て無菌操作で行った。この採取組織を0.1um （ミクロン）ポアサイズ（pore size）の除菌フィフターで除菌された７０％エタノール水に３０秒間浸漬して，直ちにリン酸緩衝食塩水（Phosphate buffer saline）(PBS(−))にて３回洗浄してエタノールを洗浄した。この組織から毛根が存在する箇所を残して皮下脂肪及び真皮結合織を可及的に鋏で除き，次にメスで1mm2程度の大きさにカットした。【００６８】
（細胞採取播種工程1）
カットした組織を10uM Y−27632の入りの予備冷却したディスパーゼ（Dispase）溶液（25 units/ml of PBS(−)）5mlに，４℃で１晩浸漬した。【００６９】
（細胞採取播種工程２）
これを遠心して上清を除いた後に,10uM Y−27632の入りのTrypLE Express溶液（5x希釈PBS(−))に３７℃，２０分浸漬した。【００７０】
（細胞採取播種工程３）
この組織を遠心して上清を除いた後に，20mlのcollagenase溶液（GIBCO: type I）（1400 units/ ml DMEM培地）に浸漬し，３７℃，1.5時間スターラーで撹拌した。【００７１】
（細胞採取播種工程４）
撹拌後の懸濁液を100umのメッシュを通して未消化の残渣を取り除いた。この液をPBS(−)にて３回遠心・洗浄して酵素を除き，細胞を得た。【００７２】
（細胞採取播種工程５）
この細胞を大豆トリプシン阻害剤（Soy bean Trypsin Inhibitor）（0.25%/PBS(−)）5ml中に入れ１０分静置した。【００７３】
（細胞採取播種工程６）
細胞から遠心してInhibitorを除いた後，10uM Y−27632添加培養培地に懸濁し，培養皿に播種した。出発組織の広さ（１〜2 cm２）から，１枚の6 well plate (CellBind :COSTAR)の全wellに播種した。【００７４】
（培地調製工程）
培養培地は以下のとおり調製された。すなわち，基本培地のMCDB153培地（Sigma：Stemline Keratinocyte Basal Medium）中に，インスリン（10mg/L）, ホロ・トランスフェリン (5.5mg/L), セレニウム（6.7ug/L）,エタノールアミン(2mg/L), ビタミンＣ(L−Ascorbic acid 2−phosphate semimagnesium salt) (50ug/L), KGF (10ug/L), 脂質（脂肪酸混合物：アラキドン酸(20ug/L)，コレステロール(2.2mg/L), DL−a−Tocopherol−acetate (700ug/L), リノール酸（100ug/L），リノレン酸(100ug/L），ミリスチン酸(100ug/L），オレイン酸(100ug/L），パルミトレイン酸(100ug/L），パルミチン酸(100ug/L），ステアリン酸(100ug/L），Tween80(22mg/L), Pluronic F−68(1000mg/L), EGF(20ug/L), FGF(10ug/L),Y−27632(1uM), １％B−27 supplement XenoFree CTS (Invitrogen)を添加して調製した。【００７５】
（細胞増殖工程１）
初代培養は，培養７日までは培地交換をすることなく1/3量の割合で培地添加しつつ馴化培養を行った。その後は２日毎に培地交換しながら培養を行った。この培地交換では，古い培地を遠心し，その2/3量を捨て，残った1/3量の培地と遠心で沈殿した浮遊細胞を混ぜて2/3量の新しい培地をさらに加えて培養皿に戻した。１００％コンフルエンスに達するまでに１０日間を要した。【００７６】
（継代工程）
培養された細胞の培地にY−27632 を10uM濃度で入れて，３０分，３７℃で静置した。次に培地を全て除き，0.05%EDTA/PBS(−)を2ml/well加えてを１０分，３７℃で静置した。さらにPBS(−)にて5倍希釈したTrypLEx Expressを0.5ml/well加えてを５分，３７℃で静置した。次にピペッティングで細胞をwellより剥離した。ここに2.5ml/wellのTrypsin Inhibitor（0.05%/PBS(−)）を加えて回収された細胞を遠心した。上清を除き，2.5mlのTrypsin Inhibitor（0.25%/PBS(−)）を入れて細胞を懸濁し１０分静置した。細胞から遠心してInhibitorを除いた後，10uM Y−27632の入った培地に懸濁し，培養皿に元の５倍の面積の6 well plate (CellBind :COSTAR)５枚に播種した。１週間後に１００％コンフルエンスに達したので，以下の実施例の実験の材料とした。
【実施例２】
【００７７】
（GDNF (Glial cell−derived neurotrophic factor) mRNAの発現量増加法）
細胞のGDNF (Glial cell−derived neurotrophic factor) mRNA発現を増加させる化合物またはサイトカインを見出すために可能性のある以下の6個のものを検討した。Valproic acid (VA) , Platelete−derived growth factor (PDGF), SAG(又はPurmorphamine or rh−Sonic Hedgehog (PeproTech)), Bone morphogenic protein 4 (BMP4) これら６個のものを以下の組合せで実施例１コンフルエントになった７wellに添加した。（１）Control（無添加）（２）VA(1uM) （３）VA(1uM) + PDGF(10ng/ml)  （４）VA(1uM)+SAG(0.3uM)  （５）PDGF(10ng/ml) （６） SAG(0.3uM) （７）MBP−4(10ng/ml)：添加後７２時間後に各wellからTRIzol法にてtotal RNAを抽出した。PCR用cDNA合成キット「ReverTra Ace（登録商標）qPCR RT Kit」を用いて，ReverTra Ace（登録商標） qPCR RT Kitの10μl反応系に対して，各 total RNAを0.5ug でそれぞれ添加し，各cDNA合成を行った。
これらのcDNAサンプルでのGDNF mRNAの発現比較をヒトGDNF リアルタイムPCRプライマーセット(Roche 5326257)を用いてリアルタイムPCR法にてアプラ イドバイオシステムズ社のABI PRISM（登録商標）7700を用いたインターカレーターアッセイ法で行った。qRT−PCR反応はTOYOBOのSYBR（登録商標） Green Realtime PCR Master Mix −Plus− を用いて反応液を調製した。  
反応液の調製  
蒸留水                                             11 μL 
SYBR（登録商標） Green Realtime PCR Master Mix −Plus−      25 μL 
Plus solution                                       5μL 
プライマー 1 (10μM)                               2 μL 
プライマー 2 (10μM)                               2 μL 
サンプル溶液                                       5 μL 
合計液量                                          50 μL
反応液を96 well plateの各wellに入れてＰＣＲ反応を行った。
PCRサイクルは3ステップ法で，アニール 60℃／伸長 72℃を条件とし（１）〜（２）を40 cycle行った。最後のステップで融解曲線(Melting Curve)解析を行い，primer dimerの形成が見られないことを確認した。
95℃ 60秒  
（１）↓
（２）95℃ 15秒  
（３）60℃ 15秒 
（４）72℃ 45秒(data collection)  
また，同時にGAPDHmRNAの検出を行い，GDNFmRNAの発現量を，GDNFmRNA/ GAPDHmRNAとして補正した。その結果，（６）SAGのみが（１）コントロールの１０倍以上のGDNFmRNA発現が得られた。（６）のSAGの代わりにPurmorphamine(1.5uM)や, rh−Sonic Hedgehog(10ng/ml)でも同様に１０倍近くのGDNFmRNA発現が得られた。（図−１）GAPDHのprimer 配列は以下の配列で合成した。
Forward primer:ATCTTCTTTTGCGTCGCC  （配列番号１）
Reverse primer:GATGACAAGCTTCCCGTTC （配列番号２）
発現鎖長：250bp【００７８】
図１は，実施例２におけるGDNF mRNAの発現量の測定結果を示す図面に替わるグラフである。
【実施例３】
【００７９】
(Nestin mRNAの神経分化誘導による発現変化)
実施例１でコンフルエンスに達した３wellsのうち2 wellsに神経前駆細胞の分化同定用キット Human/Mouse/Rat Neural Progenitor Cell Functional Identification Kit（R&D Systems SC082）の分化用培地(medium for NPC differentiation)で7日間培養した。もう一つのwellには発明の維持培地で同日間培養した。7日目に実施例２と同様にtotal RNAを抽出後，cDNAを調製した。このcDNAを用いて神経幹細胞のマーカーであるNestin mRNAの発現比較をRT−PCRにてGAPDH mRNAを基底状態として測定した。Nestin のPrimerはForward CGTTGGAACAGAGGTTGGAG（配列番号３）とReverse TCCTGAAAGCTGAGGGAAG（配列番号４）であり，発現鎖長は262bpであった。GAPDHのprimerは実施例２と同様のものを用いた。
その結果を図２に示す。【００８０】
図２は，実施例３におけるNestin mRNAの発現量を示す図面に替わるグラフである。図２に示されるように，分化培地に変えるとNestinの発現量（Nestin mRNA/GAPDH mRNA）は分化前の1/7程度に減少した。この結果は発明者の増殖培地は神経幹細胞を維持させ，分化培地は神経幹細胞を減少させることを示した。
【実施例４】
【００８１】
（GFAP mRNAの神経分化誘導による発現変化）
実施例１でコンフルエンスに達した３wellsのうち2 wellsに神経前駆細胞の分化同定用キット Human/Mouse/Rat Neural Progenitor Cell Functional Identification Kit（R&D Systems SC082）の分化用培地(medium for NPC differentiation)で7日間培養した。もう一のwellには発明の維持培地で同日間培養した。7日目に実施例２と同様にtotal RNAを抽出後，cDNAを調製した。このcDNAを用いてAstrocytes又はAdult neural stem cellsのマーカーであるGFAP mRNAの発現比較をRT−PCRにてGAPDH mRNAを基底状態として測定した。GFAP のPrimerはForward :ACATCGAGATCGCCACCTAC（配列番号５）とReverse :ACATCACATCCTTGTGCTCC（配列番号６）であり，発現鎖長は219bpであった。GAPDHのprimerは実施例２と同様のものを用いた。その結果を図３に示す。【００８２】
図３は，実施例４におけるGFAP mRNAの発現量を示す図面に替わるグラフである。図４に示されるように，分化培地に変えるとGFAPの発現量（GFAP mRNA/GAPDH mRNA）は分化前より僅かに増加した。この結果は発明者の増殖培地は神経幹細胞を維持させ，その中のGFAPの発現も維持させることを示した。
【実施例５】
【００８３】
（フローサイトメトリーによるCD抗原発現検討）
培養されてコンフルエントになった細胞を培養皿からtrypsin−EDTA溶液を用いて剥離・単離した。次に３％ＢＳＡ/PBS(−)溶液で３０分間置くことによりブロッキングを行い，非特異的吸着を防いだ。更に4%パラホルムアルデヒドで１０分固定後，0.5% Triton X−100/PBS(−)に５分，4℃インキュベートした。この細胞をCD73に対するモノクローナル抗体CD73−PE (BD 561014)にて4℃オーバーナイトでインキュベートした。この細胞を５回洗浄液で洗浄して結合しなかった抗体を除去し，フローサイトメトリーはSONY EC800を用いて抗原の発現を解析した。その結果を図４に示す。【００８４】
図４は，実施例５における  CD73の発現（CD発現プロフィル）を示す図面に替わるグラフである。図４に示されるように，CD13,CD34, CD45がネガティブなことから，この細胞は非血液系細胞であることが示された。また，CD90もネガティブなことから，ヒト皮膚由来間葉系幹細胞でないことも示された。また，CD73が強く発現していることが，この細胞の最もはっきりしたCDの特徴であった。
【実施例６】
【００８５】
（ラット脊髄損傷モデルでのBBB score法による効果検討）
SAG処理等でGDNFを増加させていない培養細胞を酵素Accutase(GIBCO A11105)を用いて培養皿から剥離した。この剥離細胞１x10５個を200ulの培養液に懸濁し，１週間前に脊髄に錘で損傷を与え，かつ免疫抑制剤を投与したラットの脊髄損傷部位に注入移植した。対照のラットには同量の培養培地のみを注入するsham operationを行った。細胞移植群は5匹，対照群は４匹のラットを実験に用いた。脊髄損傷の治療効果は動物の動きをビデオ装置で観察して点数化するBBB Score法で測定した。結果を図に示す。図中，横軸は細胞移植後の日数，縦軸はBBB Scoreを示す。実線は上記細胞を移植した結果，点線は対照の結果を示し，＊はStudent T testによる有意差検定の結果P<0.05, ＊＊はP<0.01, ＊＊＊はP<0.001であることを示す。投与後3日から対照群に比較して細胞移植群はBBB Scoreで2点差の付く統計的に有意な効果(P<0.05)を示した。移植後35日を過ぎると，対照群に比較して細胞移植群はBBB Scoreで４点差の付く統計的に有意な効果(P<0.001)を示した。骨髄間質細胞移植の報告（非特許文献23）では，有意差がつくまで2週間近くかかっている。また，iPSから誘導した神経幹細胞移植（非特許文献１）では有意差がつくまで3週間を要している。これらに比べ今回の結果は劇的に早く，3日からの効果が見られた。しかも骨髄間質細胞移植では4週間経過しても，有意差はP<0.05であるが，本発明は同時期にP<0.001とより優位であった。この結果は本発明で得られる細胞が脊髄損傷の治療に非常に効果的であることを示している。
【実施例７】
【００８６】
（造腫瘍性の評価）
動物及び試験法
実験にはNOD/Shi−scid, IL−2Rγnull(登録商標)系統のマウス（6週齢，♀，公共財団法人  実験動物中央研究所）を用いた。1週間の順化期間の後，汎用群分けシステム（株式会社ヴィジョンズ）を用いて，可能な限り体重の平均値が同じくなるようにして3群に群分けした. それぞれの群のマウスの右側腹部に，実施例１と同じ方法で培養した（細胞Aとする），陰性対照細胞として培養液，陽性対照細胞としてのHeLa S3(DSファーマバイオメディカル株式会社)をそれぞれシリンジ（マイジェクター（登録商標），針仕様：27G）により移植（いずれも0.2 mL/個体）した。それぞれの群を細胞A群（10個体），培養液群（10個体），HeLa S3群（5個体）とする。なお，細胞Aは，実施例１と同じ方法で培養した細胞を3系統用意し，α−MEM培地にそれぞれ1x10７ cells/mLで懸濁し，空気を含まないように2 mlのクライオチューブに分注した。分注のおよそ3時間後，α−MEM培地を除いて培養培地液に再懸濁し，3系統を等量の細胞数ずつ混合して5x10７ cells/mLの懸濁液を調製し，移植まで4℃にて保存し，調製開始後2時間以内に移植を行った。なお，直前に計測した3系統を混合した検体の移植後の生存率は７５％であった。
それぞれの群のマウスは，「公益財団法人実験動物中央研究所・本所における実験動物の飼育管理に関する作業基準」に準拠して移植から13週飼育し，一般状態観察，体重測定および結節の観察・サイズ測定を週1回行った。結節を観察する際は，被験物質移植部位を指で触診し，硬い感触のある場合に結節の形成が確認されたものとし，長径(L)と短径(W)をノギスで測定した。結節体積(V)は「ヌードマウスと抗癌剤評価」（野口達次，櫻井欽夫，稲葉實編著，蟹書房，1991年6月）の腫瘍体積簡易計算式を用い，計算式V=LW２/2で算出した（単位は長径と短径はmm,  体積はmm３）. なお，HeLaS3群の個体は，観察期間中に結節重量（比重を１として体積より計算）が体重の1/10を超えたことが確認されたため，第5週〜第8週の時点で人道的エンドポイントとして観察を終了し安楽死処分した。
安楽死処分の際，マウスはイソフルラン麻酔下で全放血により安楽死させ，胸腔内，腹
腔内諸臓器を観察した。また移植部位皮膚を皮下組織を含めて採材し，10%中性緩衝ホル
マリン液で固定した。ホルマリン固定標本は常法にてパラフィン包埋後薄切しHE染色，抗HLA(Human Leucocyte Antigen)免疫染色を行い，光学顕微鏡で観察した。【００８７】
結果
その結果を図６に示す。図６は，発癌性の評価を示す図面に替わるグラフである。HeLa S3群においては，移植後3週で100％（5/5例）の個体に結節の形成が認められたが，培養液群及び細胞A群では観察終了時まで結節の形成は認められなかった。HeLa S3群の全例で結節が形成された。この結節は連続した体積増加を示し低分化型癌の組織像と共に抗HLA反応を示したため，HeLa S3細胞に由来する腫瘍であると判断された。細胞A群では病理組織検査により6/10例に抗HLA反応陽性を示す繊維増殖が確認され，移植細胞が残存したものと判断された。しかし，全観察期間を通じて全例で結節の形成は認められず，病理組織検査におけるHE染色像において過形成変化あるいは腫瘍性変化を認める所見は認められなかった。この結果は，本試験の条件下では細胞Aは造腫瘍性を示さないことを示している。
【実施例８】
【００８８】
（ヒト脊髄損傷患者での効果検討：GDNFの効果）
自己細胞を各自己皮膚より培養し，SAG等を用いたGDNFを増加させない培養細胞を酵素Accutase(GIBCO A11105)を用いて培養皿から剥離した。事前に腰椎穿刺で1 mlの脊髄液を採取した後に，1 mlの注射用生理食塩液に懸濁した剥離細胞１ｘ１０７個を穿刺跡に自家移植した。この症例１〜７の脊損患者7名は年齢は32〜51歳で，男性6名，女性1名であった。投与回数は2~3回で，投与間隔は1〜3か月であった。損傷から投与までの期間は3〜23年，Ｃ４〜７の頚髄損傷で，四肢麻痺であった。副作用は投与日の頭痛・発熱が見られた。7名中3名には治療効果はなかった。他の4名は治療効果が認められ，腕の発汗，皮膚感覚回復，尿の貯留改善，握力アップ，指の動き改善等の自覚症状があった。症例８のみ細胞のSAG処理を行い，GDNF mRNAを増加させた細胞を移植した。上記と同じ細胞数を1か月以内に2回投与した。症例８の患者は47歳男性で，胸髄Th3損傷で，損傷から投与までの期間は２年半，下肢麻痺であった。副作用は投与時の頭痛があった。治療効果は投与1か月後に現れ，補助下での立位歩行が可能となった。症例８は症例１〜７に比較して下肢麻痺と軽症で投与までの2年半と短かったが効果は劇的でまた回復時間も短かった。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明は医薬産業において利用されうる。
【配列表フリーテキスト】
【００９０】
配列番号１：プライマー
配列番号２：プライマー
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
【図１】
2019092939.tif 000003
【図２】
2019092939.tif 000004
【図３】
2019092939.tif 000005
【図４】
2019092939.tif 000006
【図５】
2019092939.tif 000007
【図６】
2019092939.tif 000008
【配列表】
2019092939000001.app
【国際調査報告】
2019092939.tif 000009
2019092939.tif 000010
2019092939.tif 000011
2019092939.tif 000012