(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチンの調製での使用に適した、非感染性で突然変異されたシンドビスウイルスであって、該ウイルスが、Ｅ１蛋白質内で、保持されているシステイン・アミノ酸を別のアミノ酸で置換することによって突然変異され、該保持されているシステインがチオール−リダクターゼ／蛋白質ジスルフィド・イソメラーゼ活性に関与している上記ウイルス蛋白質の領域内に存在していることを特徴とするウイルス。
【請求項２】
突然変異されたシンドビスウイルスが突然変異されたＥ１−ＳＥＲ62である請求項１のウイルス。
【請求項３】
非感染性の突然変異されたシンドビスウイルスおよび細胞内でＤＮＡの表現に必要な規制要素をコード表現する組換えＤＮＡプラスミドであって、該ウイルスが、Ｅ１蛋白質内で、保持されているシステイン・アミノ酸を別のアミノ酸で置換することによって突然変異され、該保持されたシステインがチオール−リダクターゼ／蛋白質ジスルフィド・イソメラーゼ活性に関与している上記ウイルス蛋白質の領域内に存在していることを特徴としている組換えＤＮＡプラスミド。
【請求項４】
細胞が、バクテリア、イースト菌、昆虫および哺乳動物の細胞から選ばれるものである請求項３のプラスミド。
【請求項５】
イースト菌がサッカロミセス、ピキア、およびクルイベロミセスで構成されるグループから選択される請求項４のプラスミド。
【請求項６】
バクテリアが大腸菌、バシラス・サブチリス、サルモネラ・チフィムリウム、シュードモナス、ストレプトミセス、およびスタフィロコッカスで構成されるグループから選択される請求項４のプラスミド。
【請求項７】
哺乳動物の細胞がＢＨＫ−21、ＨeＬa、ＣＨＯおよびＶeroで構成されるグループから選択される請求項４のプラスミド。
【請求項８】
突然変異されたSindbisウイルスが突然変異体Ｅ１−ＳＥＲ62である請求項３のプラスミド。
【請求項９】
請求項３のプラスミドで構成されるトランスフェクションされた細胞。
【請求項１０】
請求項８のプラスミドで構成されるトランスフェクションされた細胞。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は一般的にはウイルス学、免疫学、および蛋白質化学に関するものである。より具体的には、本発明は新しい抗ウイルス剤、およびワクチンを調製するための新しい方法に関するものである。
関連技術の説明
ウイルスは遺伝子伝達システムとしての役割を果す複雑な三次元構造である。それらは１つの蛋白質構造を含む脂質と組み合わされた１つの蛋白質、あるいは薄膜二層構造を含む脂質と結びついた複数の蛋白質の組み合わせで構成された被膜内につつまれたＲＮＡあるいはＤＮＡゲノムで構成されている。自然の状態で保持されるために、ウイルス・ゲノムは適切な宿主細胞の生化学的機構を破壊しすることによって複製される。この感染プロセスは往々にして宿主細胞の死をもたらし、このプロセスが大規模に進行すると宿主植物または動物の疾病が発生する。この感染プロセスの最終的な結果は感染された細胞または組織からの他の細胞、組織、あるいは宿主を感染する能力を有する数百または数千の子孫ウイルス粒子の放出である。このウイルス遺伝物質はそれを取り巻いている被膜によって周辺の化学物質による破壊から保護されている。この被覆は環境因子による劣化に対しては抵抗性を示さなければならないが、同時にそのウイルスが宿主細胞に感染する場合にはその遺伝物質を放出するために分解しなければならない。
先行技術は一定のウイルスの拡散を抑制するための効果的な手段を欠いている。先行技術はまた、ワクチンとして用いられるウイルスの非感染性を保証するための有効な手段が欠けているという点でも不十分である。本発明はこの技術分野における長年のニーズおよび願望を達成するものである。
発明の要約
本発明の１つの実施態様において、ワクチンの調製に適した非感染性の、突然変異ウイルスで構成された物質の組成が提供される。
本発明の別の実施態様においては、非感染性突然変異ウイルスをコード表現するＤＮＡと、細胞内での該ＤＮＡの表現に必要な規制要素で構成された哺乳動物の細胞における表現に適した組換えプラスミドが提供される。
本発明のさらに別の実施態様においては、チオール・リダクターゼ／蛋白質イソメラーゼ活性に関連したウイルスが提供される。
本発明のさらに別の実施態様においては、該ウイルスを該ウイルス内のチオール−リダクターゼ／蛋白質ジスルフィド・イソメラーゼ活性を抑制する化合物と接触させるステップを含む、ウイルスの感染の拡大を抑制する方法が提供される。
本発明の別の実施態様においては、該ウイルス内のチオール−リダクターゼ／蛋白質ジスルフィド・イソメラーゼ活性を抑制する、ウイルスの感染の拡大を抑止する抗ウイルス剤が提供される。
本発明の他の、そしてさらなる側面、特徴、および利点は開示の目的のために提供される本発明の現時点で好ましい実施態様の以下の説明から明らかになるであろう。
図面の簡単の説明
上に述べた、および以下に明らかになるような発明の特徴、利点、および目的が得られ、さらに詳細に分かるように、以下に本発明を簡潔に要約して、添付図面に示すそのいくつかの実施態様を参照して具体的に説明する。これらの図面は明細書の一部を構成する。ただし、添付された図面は本発明の好ましい実施態様を説明するものであって、発明の範囲を限定しているとみなされるべきではない。
図１は２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）の存在下で、pH5.3でＢＨＫ細胞内のワン・ステップ外部融合（fusion from without：ＦＦＷＯ）を示している。ウイルス細胞複合体を以下に示すような種々の濃度の還元剤２−ＭＥを含む低pH融合培養液に露出させた。融合は以下のようにカウントされた。
図２は、２−ＭＥに露出させたＢＨＫ細胞内でのツー・ステップＦＦＷＯの多重度（ＭＯＩ）依存性を示している。ウイルス細胞複合体を0.05nM ２−ＭＥ（四角で示したもの）を含んだ場合、あるいは２−ＭＥを含まない場合（三角で示したもの）の低pH融合培養液に５分間露出させ、その後中性pHに戻してから、以下に述べるように融合をカウントした。
図３はSindbisウイルスの非感染性に対するＤＴＮＢの直接的な影響を示している。ウイルスを１mM ＤＴＮＢに時間を変えて露出させ、残っている感染ウイルスをＢＨＫ単層上で滴定した。感染性ウイルスは未処理コントロールのそれに対するパーセンテージとして表現されている。
図４はSindbisウイルス膜透過および低pH誘導膜融合中のＥ１における立体配座上の変化を示している。図４Ａは成熟したウイルス粒子内のグリコプロテインがそれぞれ膜融合とエンベロープ融合とにそれぞれ関与する機能領域と構造領域を有していることを示している。図４Ｂはリセプター−ウイルス反応、あるいは低pHアンマスク臨界ジスルフィド・ブリッジへの露出によって誘導された立体配座の変化を示しており、後者の場合、ジスルフィド・ブリッジをその後で組み換える（reshuffle）のが好ましい。図４Ｃはエンベロープの蛋白質−蛋白質結合をの保持に関与する臨界ジスルフィド・ブリッジの減少が硬い蛋白質20面体格子を破断させ、その後に起きる細胞膜との融合を可能にしていることを示している。実線で示したボックスがＥ１−Ｅ１結合を示しており、斜線で示すボックスが融合ペプチドを示している。
図５はSindbis突然変異体Ｅ１−Ser62を示している。細胞を感染後５時間目に35Ｓ−メチオニン・システインでラベルして、シクロヘキシミドの存在下で０（レーン１）、５（レーン２）、10（レーン３）、20（レーン４）分間追跡調査した。細胞リゼイト（lysate）は生成ウイルスに対してつくられた抗血清で免疫沈降されたものである。Ser62はウイルス性蛋白質ＰＥ２，Ｅ１，Ｅ２およびＣをつくりだし、そのＰＥ２はＥ２に組み入れられ（chase）ている。この電子顕微鏡写真はトランスフェクションされた細胞の培養液から濃縮され、密度勾配遠心分離によって精製されたウイルス粒子を示している。放射線突然変異体ウイルスの蛋白質濃度はレーン５に示されている。
図６はモデル・コロナ・ウイルス、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）による細胞感染に対するチオール・ブロッキング剤ＤＴＮＢの効果を示している。
発明の詳細な説明
本発明においては、膜含有ウイルスSindbis（アルファ・ウイルスのプロトタイプ）を用いて、このウイルスがその２つの膜被覆結合グリコプロテインの１つの成分として、その構造および機能において、公知のチオール−リダクターゼ／蛋白質ジスルフィド・イソメラーゼ活性を有する蛋白質の同族体である蛋白質領域を有していることが示される。本発明はまた、モデル・コロナ・ウイルス（マウス肝炎ウイルス）がSindbisウイルスに関して述べられたのと類似した感染メカニズムを有しており、このメカニズムが他のウイルスによって宿主細胞を感染するために用いられていることを示す。
多くの動物ウイルスの表面蛋白質はその粒子を安定させる可能性があり、そして、感染プロセスおよびウイルス性ゲノムの放出を起こさせるために破壊される必要がある複雑な構造のジスルフィド・ブリッジを含んでいる。本発明は、これらのウイルスが宿主に感染する場合に起きる重要なプロセスを説明するメカニズムを確認した。このユニークでこれまで述べられたことがない活性は、ウイルス感染を制御し、ワクチンを調製するための新しい基本的な方針を説明するものである。
本発明は、ウイルス自体が適切な宿主細胞レセプターに取り付いた後、そのジスルフィド・ブリッジを減少させる能力を有していることを示している。ウイルスの構造蛋白質と宿主レセプターとの相互作用は還元的イベントが起きることを可能にする立体配座上の変化を開始させる。
本発明は、チオール−ジスルフィド交換がアルファおよびコロナ・ウイルスによる細胞の感染に重要な役割を果していることを示す。アルファ・ウイルスの場合、この還元的イベントはそのウイルス自体内に存在しているチオール−リダクターゼ／ジスルフィド・イソメラーゼ活性によって行われる。多くのウイルス（ＨＩＶを含む）は、そのウイルスの構造および集合にとって基本的に重要であることが示されているジスルフィド・ブリッジを含んでいる。そのウイルスの構造的一体性は宿主感染が進行するためには破壊されることが必要なこれらジスルフィド・ブリッジに依存している。本発明による突然変異体は、非感染性ウイルスをワクチンとして用いるための新しい方法を示している。本発明による突然変異体ウイルスは、化学物質または物理的な処理による非活性化を必要としないという点で、他のワクチンより優れている。したがって、これらのウイルスは感染性ウイルス粒子内に存在しているのと極めて類似した抗原を有する免疫システムを提供してくれる。本発明はまた、内発性チオール−リダクターゼ活性に干渉して、ウイルス感染の拡大を防ぐ薬品としての役割を果すことができる化学薬品を確認するための方法を示す。このウイルスと組み合わさったチオール−リダクターゼは公知の酵素のものと同族体である。したがって、１つのウイルスでこれらの活性の１つをブロッキングすることができる薬剤は他のウイルスにおいてもその活性をブロックするであろう。
本発明は、ワクチンの調製のための使用に適している非感染性の突然変異したウイルスによって構成された物質の組成に向けられたものである。一般的に、ウイルスはアミノ酸を保存用システイン・アミノ酸と置換することによって突然変異される。この分野の当業者なら、本発明の方法および組成物においてシステインとの置換が可能な少数のアミノ酸が存在することは容易に分かるであろう。例えば、本発明の方法および組成物は特定のアミノ酸システインをセリンと置換する。好ましくは、本発明による突然変異されたウイルスをつくるために置換されたアミノ酸はチオール−リダクターゼ／蛋白質ジスルフィド・イソメラーゼ活性に関与しているウイルス蛋白質の１つの領域に存在しているこれら保存用システインである。
本発明の方法および本発明によって提供される組成物はいずれの公知のウイルスでもそれを内部に含んでいたり、関与させてもよいことが意図されている。好ましくは、突然変異されたウイルスはアルファウイルスとコロナ・ウイルスで構成されたグループから選択されたウイルスの突然変異体であることが望ましい。アルファウイルスの代表的な実例はSindbisウイルスである。また、コロナ・ウイルスの代表的な実例はマウス肝炎ウイルスである。突然変異されたSindbisウイルスの代表的な実例は突然変異体Ｅ１−ＳＥＲ62である。
本発明は非感染性突然変異ウイルスをコード表現する組換えＤＮＡと細胞内で該ＤＮＡの表現に必要な規制因子で構成された細胞内での表現に適合した新しいプラスミドを提供する。本発明によるプラスミドはバクテリア、イースト菌、昆虫、および哺乳動物の細胞における表現に適する場合もある。イースト菌の代表的な例はサッカロミセス属（酵母菌）、フィシア、およびクルイベロミセス属である。バクテリア細胞の代表的な実例は大腸菌、バシラス・サブチリス、サルモネラ・ネズミチフス菌、シュードモナス菌、ストレプトミセス、およびストフィロコッカスである。哺乳動物細胞の代表的な実例はＢＨＫ−21、ＶeroおよびＨeＬa、そしてチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
本発明のプラスミドは本発明による突然変異されたウイルスを含んでいる。好ましくは、そのウイルスはアルファウイルスおよびコロナ・ウイルスである。突然変異されたアルファウイルスの代表的な実例は突然変異されたSindbisウイルスである。突然変異されたSindbisウイルスの代表的な実例は突然変異体Ｅ１−ＳＥＲ62である。
本発明はまた、新しいトランスフェクションされた細胞を提供する。トランスフェクションされた細胞の代表的な実例は、請求項７のプラスミドを含むトランスフェクション細胞および請求項14のプラスミドを含むトランスフェクション細胞を含んでいる。加えて、本発明はまた、本発明によるトランスフェクション細胞によってつくりだされる非感染性、突然変異ウイルスも開示している。
本発明はまた、該ウイルス内のチオール−リダクターゼ／蛋白質ジスルフィド・イソメラーゼ活性を抑制する化合物に該ウイルスを接触させるステップを含む、ウイルスの感染の拡大を抑制する方法も含んでいる。また、該ウイルス内のチオール−リダクターゼ／蛋白質ジスルフィド活性を抑制することを特徴とするウイルスの感染の拡大を抑制する抗ウイルス剤も提供する。本発明の教示に従えば、当業者は問題のウイルスのチオール−リダクターゼ／蛋白質ジスルフィド・イソメラーゼ活性を抑制する別の化合物を容易に考案できるであろう。
以下の実施例は本発明の種々の実施態様を示す目的で述べられるものであり、いかなる意味でも本発明を限定することを意味していない。
実施例１
細胞、ウイルス、および培養液
ＢＨＫ−21細胞を、10％仔ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ）、５％トリプトース・ホスフェート・ブロス、および２mM Ｌ−グルタミンで補強したイーグルズ最少基本培養液（ＭＥＭ）内で37℃の温度下で培養した。最初にE. Pfefferkorn（Darmouth Medical College）が提唱した耐熱性Sindbisウイルス（ＳＶＨＲ）を低多重度で通過させて、RenzおよびBrownがJ. Virol. 19：775−781（1976）に述べた方法によりＢＨＫ−21細胞上で滴定した。
実施例２
Sindbisウイルスで媒介したＦＦＷＯ
Sindbisウイルスによって仲介されたＦＦＷＯの変化は、４℃の温度下、60分間で、ＢＨＫ単層に対して、細胞１個あたりＳＶＨＲの1,000ＰＦＵであった。つぎに、このウイルス接種材料を、種々の濃度の２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を含んだ、およびそれを含まない、pHを5.3に調整した10mM ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸）、10mM ＭＥＳ［２（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸］、および重炭酸塩を含まないイーグルズＭＥＭで構成された37℃の融合培養液と置換した。融合のアッセイは37℃の温度で５時間培養した後に位相差顕微鏡で行われ、スコアは以下のように表示した。−：融合なし、＋：25％以下の細胞が融合、++：25％が融合。要約して言うと、低pHでのＦＦＷＯは50％までの融合した細胞への吸着によって行われ；+++は融合した細胞の50〜95％、++++は95％以上の融合細胞への吸着を示している。融合の程度は１−（細胞数／核数）によって計算した。２段階pHステップＦＦＷＯは、種々の多重度のＳＶＨＲが用いられたこと、融合培養液は0.05nM ２−ＭＥを含んでいたこと、そしてウイルス−細胞複合体が低pH融合培養液内で５分間培養した後に成長培養液に戻されたことを除いては、上に述べたのと同様の方法で行われた。
実施例３
薬剤
ＤＴＮＢは血清を含まないＭＥＭ内で可溶可化された。［3Ｈ］ウリジンのトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）−沈殿性細胞ＲＮＡへの取り込み、トリパン・ブルー排出、または中性レッド摂取によって評価した結果では、最高５mMまでのＤＴＮＢ濃度でも細胞の成長可能性に対する影響は認められなかった。Sindbisウイルスの感染性に対する直接の影響は、その試薬をウイルスで時間を変えて培養し、３％仔ウシ胎仔血清を含むリン酸緩衝液に連続的に希釈し、RenzおよびBrownがJ. Virol. 19：775−781（1976）によって述べられたような標準プラーク検定でＢＨＫ細胞上に滴定することによって培養を終わらせることによって判定した。
実施例４
透過アッセイ
ウイルスによるＲＮＡ合成の評価は、感染させる前に90分間１mlあたり４μｇのダクチノマイシンで処理し、反応全期間中ダクチノマイシン内に保持されたＢＨＫ細胞内での［3Ｈ］ウリジンのＴＣＡ−沈殿性物質内への取り込みを測定することによって行われた。等しい数のＢＨＫ細胞の単層を、１mM ＤＴＮＢで37℃の温度下で30分間処理した後、３つの異なった時刻に４℃で細胞１個あたりのＳＶＨＲの５ＰＦＵの一時間吸着を調べた。吸着後、すべての単層を血清を含まないＭＥＭで洗浄して、37℃の温度で培養して、吸着されたウイルスが透過できるようにした。30分間のＤＴＮＢ処理は吸着の直前、37℃での透過期間中、あるいは透過期間直後のいずれかに行われた。ＤＴＮＢ処理後、単層を洗浄した。透過期間後、［3Ｈ］ウリジン（10μCi/ml）を90分間付加し、５時間後にナトリム・ドデシル・スルフェートで単層を溶解させた後、10％氷冷ＴＣＡで沈殿させ、放射性をカウントした。透過の評価は上に述べた処理条件下で60分間１mM ＤＴＮＢに露出させたＢＨＫ単層上でのプラーク形成によって行われた。プラーク形成は、RenzおよびBrownがJ. Virol. 19：775−781（1976）内に述べた方法に従って判定された。
実施例５
低pHでのＦＦＷＯ
Sindbisウイルスによって媒介されたＦＦＷＯの速度は、EdwardsおよびBrownがJ. Gen Virol., 67：377−380（1986）に述べているように低pHへの露出後に細胞が戻されるpHに依存している。pHが高いと融合は速く進み、中性に戻した後の融合条件を確立するために必要な5.3の低pH閾値では起きなくなる。チオール−ジスルフィド交換反応も、その反応速度がpHによって直接影響され、FeenerらによってJ. Biol. Chem. 265：18780−18785（1990）に示されたようにアルカリ性から中性の環境の下でのみ効率的に起きるという点で、同様にpHに依存している。膜融合を行う前に固いエンベロープ蛋白質格子を破壊するために臨界ウイルス性ジスルフィド・ブリッジの還元が必要な場合、それは低pHでブロックされるであろう。
ＢＨＫ細胞のSindbisウイルス仲介ＦＦＷＯにおけるそうした還元的イベントの役割を説明するために、還元剤２−ＭＥの存在下で低pHで融合を試みた。ＤＴＴおよびシステインの場合とは違って、２−ＭＥはpH5.0以上では効果的な還元剤である（Torchinskii, Sulfhydryl and Disulfide Groups of Proteins, Plenum Publishing, N. Y. 1974）。広い濃度での２−ＭＥによる処理は、この濃度範囲は変化するとはいえ、pH5.3でＦＦＷＯを誘導することが確認された。低pHで２−ＭＥによって誘導された融合は細胞の透過数、および単層の融合（confluency）度などを含む多数のファクターに対して非常に敏感な反応を示すが、これらの因子は中性pHに戻った後の融合のプロセスにおいては、それ程重要な役割は果さない。ウイルスが存在しない状態で単層を２−ＭＥで処理した場合、および２−ＭＥが存在しない状態でpH5.3でウイルス細胞複合体を培養した場合、融合は誘導されない。ＦＦＷＯを起こすのに必要な還元剤の濃度が非常に低い場合は、還元される臨界ジスルフィド・ブリッジの張力が非常に強いことを意味している。高濃度の２−ＭＥが必ずしも融合を促進するとは限らないのは、恐らくはウイルスのエンベロープが融合イベントが起きる前に破壊されるからである。Sindbisウイルスによって仲介されるＦＦＷＯが低濃度の２−ＭＥが存在している状態で低pHで起きるという事実は、ウイルス−細胞融合にとって重要な臨界ウイルス性ジスルフィド・ブリッジの還元という事実との一貫性を示している。さらに、そのことはＦＦＷＯが行われるためには中性pH環境に戻ることの必要性を説明しているのかもしれない。
実施例６
ＦＦＷＯのための多重性条件に対する２−ＭＥの影響
低pHで２−ＭＥが融合を誘導する事実は、Sindbisウイルスによって誘導されたＦＦＷＯの効率が還元性イベントに依存していることを示している。図２は典型的なSindbisウイルスによって仲介されたＦＦＷＯの多重度条件に対する２−ＭＥの影響を示している。この還元剤は、ウイルス−細胞複合体をＦＦＷＯ中、低pHに短時間露出させる期間中に存在している場合は、中性に戻った後、融合の効率を増大させた。２−ＭＥで処理した単層における最適な融合は100ＰＦＵ/細胞程度の低い多重度で得られたのに対して、２−ＭＥによる処理が行われない場合は、500〜1,000ＰＦＵ/細胞の範囲の多重度が必要であった。ＦＦＷＯのために高い多重度が必要であるということは、一部には取りつくウイルス粒子が多重細胞接触を形成する頻度、細胞−ウイルス融合イベントの立体的必要条件を反映しているに違いない。この融合現象がチオール−ジスルフィド交換反応に依存しているのであれば、高い多重度が必要であることは臨界ウイルス性ジスルフィド・ブリッジが適切なチオール・ドナーと結びつく頻度も反映している可能性がある。外来の還元剤である２−ＭＥによるチオールの利用性の増大が、最高度の細胞−細胞融合をつくりだすのに必要なウイルス粒子の数を減らすのであろう。このことは、２−ＭＥに短時間露出した後の最高度の融合に必要な多重度が減る事実によっても裏づけられている。
実施例７
ＢＨＫ細胞のSindbisウイルス透過におけるチオール−ジスルフィド交換反応
本発明は、侵入時の膜融合にとって、Sindbisウイルスの固いエンベロープ蛋白質格子におけるジスルフィド・ブリッジの還元が必要であることを示す。ＤＴＮＢはチオール・ジスルフィド反応経由でスルフヒドリルを共有原子価を修正する膜浸透可能スルフヒドリル・ブロッキング剤である。それはSindbisウイルスの感染性（図３）又はＢＨＫ細胞の成長可能性に直接影響を及ぼすものではないので、ＤＴＮＢはSindbisウイルス透過時の細胞膜に起きるチオール−ジスルフィド交換反応を示すための優れた試薬である。
実施例８
ウイルス透過に対するＤＴＮＢの影響
感染が低多重度の場合のウイルス透過に対するＤＴＮＢの影響を実施例４および表１に示すような３種の処理条件の下でウイルス性ＲＮＡへの［3Ｈ］ウリジンの取り込みによって評価した。ダクチノマイシンの存在下で、ＢＨＫ細胞を１mMのＤＴＮＢを用いて、４℃の温度下でのウイルスの吸着を行う前、37℃の温度下でのウイルスの透過時、あるいは透過期間の直後のいずれかに30分間処理した。各ケースで、ウイルス性ＲＮＡのアセスメントは［3Ｈ］ウリジンのＴＣＡ沈殿性物質への取り込みを測定することによって透過期間から５時間目に行われた。感染前の細胞のＤＴＮＢのよる処理はウイルス性ＲＮＡ合成に低度の抑制効果を示したが、ウイルス透過期間中に処理すると、コントロール・レベルの約40％程度までＲＮＡ生産が抑止された。感染前の細胞の処理において見られるＲＮＡ合成の減少は、感染前に薬剤をすべて取り除くことができないことに起因しているらしい。透過の初期段階が経過した後のＤＴＮＢによる処理は限定的な抑制効果を示す。しかしながら、この処理後のＲＮＡ合成の抑制はSindbisウイルスが細胞の浸透性を増大させ、その結果として膜を通過できない試薬が細胞液に直接アクセスして、そこで二次的な影響を及ぼすことができるという事実に基づいているのかもしれない。
Sindbisウイルス透過に対するＤＴＮＢの影響は表１に示すようなプラーク形成のアセスメントによっても判定された。表１に示されている調査で、ウイルスは４℃の温度下で１時間、等しい数のＢＨＫ細胞に吸着され、暖かいＭＥＭ内に置かれ、そして透過できるように37℃の温度下で培養された。細胞はその培養時に１mM ＤＴＮＢによって30分間（Ａ）または60分間（Ｂ）処理された。次に、それら単層を洗浄してＤＴＮＢを含まない培養液内で37℃の温度下でさらに培養する前に薬剤を取り除いた。その結果は５回の独立した実験の平均値＋または−標準偏差で示してある。ウイルス性ＲＮＡの総数は細胞が37℃に暖められて透過が開始されてから５時間目に測定された。感染から48時間後に、単層の上にアガロースを重ねて中性レッドで染色した。
ＤＴＮＢで細胞を前処理した場合、プラーク形成に対する低度の抑制が示されたが、透過期間中の処理はプラーク形成を処理しなかったコントロール・レベルの約46％程度まで抑制される。この場合も、単層をＤＴＮＢで感染前に処理した場合に認められるプラーク形成の形成が感染前に試薬のすべてを取り除くことができないことに起因している可能性はある。感染後のＤＴＮＢによる処理はプラーク形成に対して抑制効果は示さないが、このことは、感染後のＤＴＮＢ処理によるＲＮＡレベルの低下がウイルスの透過に対する直接の影響によるものではないこととの一貫性を示している。矛盾しているが、感染後に処理された細胞培養物内に認められるやや多めのプラークは非常に繁殖性が高い。
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感染期間中、試薬が存在している場合にSindbisウイルスの透過がＤＴＮＢによって最も効果的に抑制されるという興味深い観察結果は、ウイルスとそのレセプターとの間の共同的な相互作用を通じて、標的とされるチオール・グループが侵入時にアンマスクされる可能性を示唆している。この相互作用の共同的で、しかも迅速に行われる性格は、ＤＴＮＢがチオール−ジスルフィド交換反応を受けているウイルス性ジスルフィド・ブリッジと効果的に競合できないような状況をつくりだすのかも知れない。それらの反応は、pH8.0で10-6秒程度の非常に高い反応速度を有しており、臨界チオールのアルキレート化の非効率性がSindbisウイルスの透過を完全に阻止できないようにしているのであろう。
図４はSindbisウイルスの膜透過中のＥ１における立体配座上の変化と低pHで誘導される膜融合を示している。図４Ａは成熟したウイルス粒子内のグリコプロテインが膜融合およびエンベロープ一体性（integrity）にそれぞれ関与する機能領域と構造領域をそれぞれ有していることを示している。図４Ｂはレセプター−ウイルス相互作用、または後でジスルフィド・ブリッジをリシャフル（reshuffle）することが好ましい低pHアンマスク臨界ジスルフィド・ブリッジへの露出によって誘導される立体配座上の変化を示している。図４Ｃは、エンベロープの蛋白質−蛋白質結合（association）の保持に関与する臨界ジスルフィド・ブリッジの減少が、固い蛋白質20面体格子を破断し、その後での細胞膜との融合を可能にしていることを示している。実線のボックスはＥ１−Ｅ１結合と、そして斜線のボックスは融合ペプチドを示す。
透過中に起きるウイルスと細胞膜との融合は細胞内、および細胞間融合イベントである。エンベロープ蛋白質Ｅ１ないの融合領域の露出はアルファウイルスと細胞膜との融合に関与している。さらに、本発明は膜融合が起きるためには、ジスルフィド・ブリッジで安定されたＥ１−Ｅ１結合が破断されねばならないことを示す。透過中のSindbisウイルス・エンベロープ蛋白質−蛋白質相互作用の分解にかかわる最も可能性の高いメカニズムは、チオール−ジスルフィド交換反応経由でのこれら安定化ジスルフィド・ブリッジの減少であろう。
チオール・ジスルフィド交換反応はジスルフィド・ブリッジに対するイオン化チオールの求核的攻撃によって起き、周囲のpH、チオールのpKa、および立体的障害に高度に依存していることを示している。システインによって仲介されたチオール−ジスルフィド交換反応は、したがって、中性からアルカリ領域のpHを必要とする。SindbisウイルスのＨＲ系によって仲介されるＦＦＷＯは、融合を起こすために、pH5.3への露出および、その後での６以上のpHへの戻しを必要とする。ウイルス−細胞複合体が戻されるpHが増大すると、融合の速度が増大し、融合に必要な低pH閾値では融合は起こらない。同様に、ＤＴＴによるウイルス・エンベロープの急速な分解は、pH5.3への短時間の露出と、その後での中性pHへの戻しを必要とする。こうした観察結果は、チオール−ジスルフィド交換反応における中性pH環境の明確な役割を示唆している。本発明による教示は、ウイルス−細胞融合のために、チオール−ジスルフィド交換反応が融合プロセスにとって極めて重要であることを示している。
低pHによって仲介されるプロセスは、このプロセスがウイルスの高い多重度を必要としており、蛋白質リセプターに依存している点で感染のプロセスとは異なっている。しかしながら、両方のプロセスは融合前にエンベロープ蛋白質格子を破断するためのメカニズムを提供しなければならない。本発明は、両方のイベントとも、同様にチオール・ジスルフィド交換反応に依存していることを示す。非常に低い濃度の還元剤２−ＭＥ（ＤＴＴおよび生物学的チオールとは違って、pH5.3で効果的に還元を行う）を加えると、酸性環境の下での細胞融合が促進されるが、このことは臨界ジスルフィド・ブリッジの化学的な減少が、他の場合には好ましくない繁殖環境の下で融合を誘導することができることを示している。この融合を促進するために非常に低い濃度の２−ＭＥが必要な事実は、還元される臨界ジスルフィド・ブリッジが非常にひずみの多い立体構造であることを示している。低pHで誘導されるエンベロープ蛋白質内における立体配座上の変化がこれらひずみのある臨界ジスルフィド・ブリッジの露出に関与している可能性があり、低pHでの露出に続いて行われるイン・ビトロでのＤＤＴ仲介ウイルス分解の速度が非常に急速に行われている理由を説明しているのかもしれない。
宿主細胞のSindbisウイルスによる透過プロセスがリセプターに依存しており、いくつか可能なリセプターが確認されている。ウイルスと細胞表面リセプターとの中性pHでの相互作用はウイルスのグリコプロテイン内で立体配座上の変化を引き起こし、この変化が透過を促進する。本発明はリセプターとウイルス間の相互作用が立体配座上の変化を誘導し、この変化がチオール−ジスルフィド交換反応によってエンベロープ蛋白質内部での臨界ジスルフィド・ブリッジの減少を可能にする。リセプターによって誘導された立体配座上の変化からエンベロープ蛋白質格子の破断および融合への進行は非常に急激に進行する。安定化ジスルフィド・ブリッジおよび臨界チオールがＤＴＴやＤＴＮＢなどの分子には天然の状態にある場合はアクセスできないという事実は、リセプターによって誘導された立体配座上の変化の後に起きる還元的イベントの非常に速い速度と合わせて、このプロセスを阻止する上澄液でのＤＴＮＢの非効率性を説明しているのかもしれない。この還元的イベントを仲介するチオールはリセプター蛋白質とウイルス自体内部のいずれに存在していてもよい。後者の場合、取り付き後のジスルフィド・ブリッジのリシャッフリングを行うことによりエンベロープ蛋白質格子の破断が起きるのであろう。こうしたモデルにおいては、ウイルスと適切なリセプターとの間の相互作用がＥ１の立体配座を変え、このことがチオール−ジスルフィド交換反応を介してのジスルフィド・ブリッジのリシャッフリングを好ましいものとしているのである。このジスルフィド・ブリッジのリシャッフリングはエンベロープ内の固い蛋白質−蛋白質結合の破断を導き、その後での細胞膜とウイルス・エンベロープとの融合を可能にしているのである。
実施例９
突然変異体Ｅ１−ＳＥＲ62の生産
公知のチオール−リダクターゼ／蛋白質ジスルフィド・イソメラーゼ活性を有している蛋白質の構造を遺伝子バンクから集めた。これらの蛋白質の機能領域に絶対的に保存されているアミノ酸配列は存在していなかったが、正の電荷を持ったアミノ酸を含む蛋白質領域内には常に『ドナー』システインが存在していた。実際、これらの蛋白質のチオール−リダクターゼ活性はこの領域の総正電荷を増大することによって増大させることができる。すべての知られているアルファウイルスのＥ１グリコプロテインのアミノ酸配列についての検査が行われた。この検査によって、公知のチオール−リダクターゼ活性の正電荷領域に保持、配置されている２つのシステイン（62および79）が明らかになった。したがって、これらのシステインの１つをなくすような突然変異はこれらの領域に関連したチオール−リダクターゼ活性をなくすことによってウイルスを非感染性にする。
SindbisウイルスのＥ１グルコプロテインの配列内のポジション62のセリンへのシステインの変異はLiuおよびBrownがJ. Cell. Biol., 120：877−883（1993）に述べているようなメガプライマーＰＣＲ突然変異誘導によってつくりだされた。Sindbis Toto 1101内のヌクレオチド配列内の配列9760−9779（プライマーＡ）およびヌクレオチド10445から10436（プライマーＢ）を示す２つのプライマーが『エンド・プライマー』として構成された。
プライマーＡ＝5′−CGATGATGATTGGCGTAACT−3′
プライマーＢ＝5′−CGAAAAATCAAATCCTGCGGCTCC−3′
ＧからＣへの塩基変化を含んだ『突然変異体プライマー』はヌクレオチド10236−10259で構成されていた。
5′−CCAAAAATCAAATCCTGC−3′
Ｇ（野生タイプ）
メガプライマーは突然変異体プライマーおよびプライマーＢをテンプレートTotoに加えて、最初の生成物である突然変異および10381にＳＰＬ Ｉ切断箇所を含んだヌクレオチド10236−10445をつくりだすことによってつくられた。
この突然変異体メガプライマーを延長して、第一のＰＣＲ反応の生成物とプライマーＡを組み合わせることによって第二の制限酵素箇所を組み込んだ。テンプレートは制限酵素ＳＴＵ ＩおよびＳＰＬ Ｉによる消化によってつくりだされたヌクレオチド8571−10381によって構成されたToto 1101の精製されたフラグメントである。第二の生成物は必要な突然変異、ＢＳＩＷ（ＮＴ9804、およびＳＰＬ Ｉ（ＮＴ10381）切断箇所を有するヌクレオチド9760から10445である。
ＮＴ9804−10381形態のToto 1101および第二のＰＣＲ生成物を切断するために、酵素ＢＳＩＷおよびＳＰＬ  Ｉが用いられた。上に述べた突然変異体生成物が野生タイプの配列に代えて結合された結果、ポジション62にセリンがシステインと入れ替わったSindbisウイルス配列を含むプラスミドがもたらされた。このプラスミドを大腸菌内で増幅して、イン・ビトロ転写で上記プラスミドからつくりだされたＲＮＡを用いてＢＨＫ−21（哺乳動物のもの）細胞をトランスフェクションして、図５に示すウイルスをつくりだした。
本発明によるこのクローンは、そのクローンがイン・ビトロ転写反応をプログラムする場合に用いられる完全なウイルスのＲＮＡとまったく同じクローンからメッセンジャーＲＮＡをつくりだすためにＳＰ６プロモータを用いる。この反応によるＲＮＡ生成物が培養された哺乳動物の細胞にトランスフェクションされた場合、感染が完全なウイルスでつくりだされたものと同じ形態で進行した（図５参照）。正常なウイルスから構造的にも生化学的にも区別のつかない（セリン置換を例外として）成熟したウイルスがつくりだされた。しかしながら、これらのウイルス粒子は標準アッセイ手順でまったく非感染性であることが認められた。
本発明はウイルスの膜グリコプロテインの構造における立体配座上の変化が、ウイルスが細胞の表面リセプターと反応した場合に起きることを示している。この立体配座上の変化は膜透過プロセスの不可欠の前提条件である。立体配座上の変化はチオール・ブロッキング剤であるジチオニトロベンゼンと化学的に反応させることができるチオール基を露出させる。この試薬とチオールとの反応がウイルスの透過を阻止する。標的となる臨界チオールは細胞表面のリセプター蛋白質かウイルス膜グリコプロテインのいずれかに存在している。
本発明は、チオール・ドナーおよびジスルフィド標的の両方がウイルス性グルコプロテインＥ１内に存在しており、Ｅ１配列内のシステイン62を取り囲み、それを含んでいる蛋白質領域が公知のチオール−リダクターゼ／蛋白質イソメラーゼのそれと類似している活性を有していることを示している。
実施例10
コロナ・ウイルス
モデル・コロナ・ウイルス、マウス肝炎ウイルスによる細胞の感染に対するチオール・ブロッキング剤ＤＴＢＮの影響を図６に示す。組織培養細胞を、上に述べたようにウイルスによる感染前、感染中、および感染後にＤＴＮＢで処理した。ウイルスＲＮＡを抽出して、ゲル電気泳動で等しい数の細胞からウイルスＲＮＡを分離した。デンシトメータによるトレーシングの結果では、ＤＴＮＢが存在している場合、６つの種類のウイルスＲＮＡが減少したが、感染は起きたことを示している。ＤＴＮＢはＤＴＮＢを加えなかったコントロール（一番右のレーン）と比較して、処理前および処理後につくりだされるＲＮＡの量を大幅には変化させなかった。したがって、マウス肝炎ウイルスはSindbisウイルスの場合に認められたのと同様で、コロナ・ウイルスを含んだ膜による細胞の感染にとってチオール・ジスルフィド交換反応にとって極めて重要であることを示している。
本明細書で取り上げられているすべての特許および出版物は本発明が関連する技術分野の当業者には理解できるレベルである。すべての特許および出版物は、個々の出版物が具体的かつ個別的に組み込まれるのと同様に明細書に組み込まれている。
当業者なら、本発明が上に述べたような課題を実行し、目的および利点、およびそれらと本質的に関連している目的や利点を達成するのに適合していることは容易に理解できるであろう。ここに示された実施例は、方法、手順、措置、分子、および具体的な化合物も含めて好ましい実施態様の現段階での代表であり、具体例であって、本発明の範囲の限定は意図していない。当業者なら、特許請求の範囲に定義されているような本発明の精神の範囲内で変更や、その他の使用法を容易に思いつくであろう。
配列リスト
(1)  一般的情報
(ｉ)  出  願  人：Brown, Dennis
(ii)  発明の名称：新しい突然変異ウイルス、抗ウイルス性化合物、およびワクチン作成方法
(iii)  配列の数：３
(iv)  通信のための住所：
(Ａ)  住  所：james F. Weiler, Attorney-at-Law
(Ｂ)  ストリート：One Riverway, Suite 1560
(Ｃ)    市  ：Houston
(Ｄ)    州  ：Texas
(Ｅ)    国  ：米国
(Ｆ)  ＺＩＰ：77056
(ｖ)  コンピュータで読み取り可能な書式
(Ａ)  媒体タイプ：フロッピー・ディスク
(Ｂ)  コンピュータ：IBM PCと互換性があるもの
(Ｃ)  オペレーティング・システム：PC-DOS/MS-DOS
(Ｄ)  ソフトウエア：ワードパーフェクト6.0
(vi)  現行出願データ：
(Ａ)  出願番号：
(Ｂ)  出願日：3-21-95
(Ｃ)  分  類：
(viii)  弁理士／事務所に関する情報：
(Ａ)  名  称：Weiler, James F.
(Ｂ)  登録番号：16,040
(Ｃ)  参照／事案番号：D-5712 PCT
(ix)  通信に関する情報
(Ａ)  電話番号：713−626−8646
(Ｂ)  テレファックス：713−963−5853
(2)  配列ＩＤ番号１に関する情報：
(ｉ)  配列特性：
(Ａ)  長  さ：20
(Ｂ)  タイプ：核酸
(Ｃ)  鎖  性：二重
(Ｄ)  トポロジー：線形
(ii)  分子タイプ：
(Ａ)  記    述：他の核酸
(iii)  仮    定：No
(iv)  抗センス：No
(vi)  オリジナル・ソース：
(Ｂ)  系    統：
(Ｃ)  個別分離集団：
(Ｄ)  開発段階：
(Ｆ)  組織タイプ：
(Ｇ)  細胞タイプ：
(Ｈ)  細胞系統：
(xi)  配列記述：配列ＩＤ  NO：１：
0003821484.tif 000003
(3)  配列ＩＤ番号２に関する情報：
(ｉ)  配列特性：
(Ａ)  長    さ：34
(Ｂ)  タイプ：核酸
(Ｃ)  鎖    性：二重
(Ｄ)  トポロジー：線形
(ii)  分子タイプ：
(Ａ)  記述：他の核酸
(iii)  仮    定：NO
(iv)  抗センス：NO
(vi)  オリジナル・ソース：
(Ｂ)  系    統：
(Ｃ)  個別分離集団：
(Ｄ)  開発段階：
(Ｆ)  組織タイプ
(Ｇ)  細胞タイプ：
(Ｈ)  細胞系統：
(xi)  配列記述：配列ＩＤ  NO：２：
0003821484.tif 000004
(4)  配列ＩＤ番号３に関する情報：
(ｉ)  配列特性：
(Ａ)  長    さ：18
(Ｂ)  タイプ：核酸
(Ｃ)  鎖    性：二重
(Ｄ)  トポロジー：線形
(ii)  分子タイプ：
(Ａ)  記    述：他の核酸
(iii)  仮    定：Ｎ９
(iv)  抗センス：NO
(vi)  オリジナル・ソース：
(Ｂ)  系    統：
(Ｃ)  個別分離集団：
(Ｄ)  開発段階：
(Ｆ)  組織タイプ：
(Ｇ)  細胞タイプ：
(Ｈ)  細胞系統：
(ix)  特    徴：
(Ａ)  その他：
(xi)  配列記述：配列ＩＤ  NO：３：
0003821484.tif 000005
【図１】
0003821484.tif 000006
【図２】
0003821484.tif 000007
【図３】
0003821484.tif 000008
【図４】
0003821484.tif 000009
【図５】
0003821484.tif 000010
【図６】
0003821484.tif 000011