(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、有機カチオンを輸送する活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において10アミノ酸以内のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列
（ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）に記載のDNAがコードするタンパク質であって、有機カチオンを輸送する活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号：４に記載の塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号：４に記載の塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質をコードするDNA。
【請求項４】
請求項３に記載のDNAが挿入されたベクター。
【請求項５】
請求項３に記載のDNAを発現可能に保持する形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１または２に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項７】
請求項１または２に記載のタンパク質に結合する抗体。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、細胞外から細胞内へ、あるいは細胞内から細胞外への物質の輸送に関与するタンパク質であるトランスポーターに関する。
背景技術
栄養素や内因性物質の細胞内への取り込み機構において、生体膜に存在する多種の輸送担体（トランスポーター）の関与と、その輸送機構が最近明らかになりつつある（Ｔｓｕｊｉ，Ａ．ａｎｄ  Ｔａｍａｉ，Ｉ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１３，９６３−９７７，１９９６．）。これらのトランスポーターには、輸送される物質の構造認識能が備わっており、物質を選択的に輸送するが、比較的その構造認識が広いトランスポーターの場合、本来は生体異物である医薬品などについても誤認識し、積極的に細胞内へ輸送してしまうと考えられる。基本的に薬物の生体膜透過は、その分子サイズ、脂溶性、水素結合能などの物理化学的特性に依存する単純拡散に従っており、特にイオン性薬物の場合には、非解離型分子のみがｐＨ−分配仮説に従って生体膜を透過すると考えられていた。しかし、細胞内外の効率的な物質交換活性が必要な小腸、腎尿細管、胎盤、脳脈絡叢の上皮細胞や、肝実質細胞、血液脳関門などでは、多くの薬物は単純拡散以外の特異的機構、つまりトランスポーターによる能動的な輸送により細胞膜を透過することが明らかとなってきた（玉井郁巳、辻彰：ファルマシア、３１、４９３−４９７、１９９５．、齋藤秀之、乾賢一：医学のあゆみ、１７９、３９３−３９７、１９９６．、玉井郁巳：薬物動態、１１、６４２−６５０、１９９６．）。例えば、非エステル型の経口用β−ラクタム抗生物質は生理的ｐＨにおいては両性または負に荷電し、脂溶性は極めて低いにも関わらず、腸管からの吸収は良好であることが知られている。単離膜小胞系を用いた輸送研究により、これらの薬物の吸収過程には、刷子縁膜に局在するＨ＋駆動型ペプチドトランスポーターが関与していることが示されるようになった（Ｔｓｕｊｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２４１，５９４−６０１，１９８７．）。ペプチド輸送系は、ジあるいはトリペプチドを認識するが、テトラペプチド以上は認識できず、ペプチドサイズについては極めて厳密であるものの、非天然のアミノ酸からなるペプチドは認識するといった比較的広い基質認識性を持つ。β−ラクタム抗生物質のペプチドトランスポーターによる輸送も、やはりこの広い基質認識性ゆえの誤認識による輸送であり、臨床的にはそれを図らずも利用していたことになる（Ｔｓｕｊｉ，Ａ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（ｅｄｓ．Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．Ｄ．，Ａｍｉｄｏｎ，Ｇ．Ｌ．），Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１０１−１３４，１９９５．）。さらには、脂溶性の高い脂肪酸のような物質の生体膜透過においても、トランスポーターが関与している可能性が報告されている（Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊ．ａｎｄ  Ｌｏｄｉｓｈ，Ｈ．，Ｃｅｌｌ，７９，４２７−４３６，１９９４．）。
ところで、様々なトランスポーターは各臓器、細胞が持つ生理的役割に応じて備わっているはずであり、その分布や機能には臓器特異性が期待される。従って、薬物動態に臓器選択性をもたらす手法としてトランスポーターを利用することが期待できる。すなわち、トランスポーターを利用した臓器特異的薬物デリバリー（ＤＤＳ）が可能であると考えられる。また、脂溶性をあげることによる単純拡散に頼った薬物の吸収性改善は、肝臓における初回通過効果を増大させたり、臓器移行性を非特異的に増大させる可能性が高い。しかし、トランスポーターの基質特異性を利用したドラッグデザインを行うことにより、脂溶性とは無関係に薬物の吸収性を高めることも可能であると考えられる（林喜代美  他：Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、１１、２０５−２１３、１９９６．）。このような目的のためには、多くのトランスポーターを分子レベルで同定し、その性質についての詳細な解析を行うことが必須であるが、トランスポーターはその生化学的な取り扱いの難しさと、機能測定の複雑さから、膜生理学的な研究の多さに比較し、分子レベルでの同定が非常に遅れている。
最近になり、外来遺伝子発現系であるアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞を用いた発現クローニング法によりいくつかのトランスポーターのｃＤＮＡがクローニングされるようになり、構造上の類似性が存在することが明らかになってきた（Ｆｅｉ，Ｙ．−Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，５６３−５６６，１９９４．）。例えば、１９９４年にＫｏｅｐｓｅｌｌらによって、基底模型と推定される有機カチオントランスポーターＯＣＴ１が発現クローニング法によってクローニングされた（Ｇｒｕｎｄｅｍａｎｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７２，５４９−５５２，１９９４．）。その後、ＯＣＴ１の配列をもとにしたホモロジークローニングによってＯＣＴ２が同定された（Ｏｋｕｄａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２４，５００−５０７，１９９６．）。ＯＣＴ１とＯＣＴ２はお互いに６７％という非常に高い相同性を示す（Ｇｒｕｎｄｅｍａｎｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１０４０８−１０４１３，１９９７．）。両者とも腎臓に強い発現が見られるが、ＯＣＴ１の場合はそれ以外にも肝臓、結腸、小腸に発現が存在するのに対し、ＯＣＴ２は腎臓に特異的であり、組織分布も異なっている。
トランスポーターについての分子レベルでの同定については、これら報告例を含めわずかであり、いまだ臨床上有用な多くの未知のトランスポーターが存在していると考えられる。
発明の開示
本発明は、新規なトランスポーター遺伝子ファミリーおよびそれら遺伝子がコードするタンパク質、並びにそれらの用途を提供することを課題とする。
本発明者等は、胎児組織に特異的、あるいはより強く発現している遺伝子（ｆｅｔａｌ  ｇｅｎｅ）の中には、癌をはじめとする各種疾患に関与する遺伝子が存在するとの作業仮説のもと、サブトラクション法によって作製した胎児遺伝子（ｆｅｔａｌ  ｇｅｎｅ）ライブラリーのランダムシークエンシングによるスクリーニングを行ってきた。本発明者等はこの過程において、有機カチオントランスポーターＯＣＴ１およびＯＣＴ２と有意な相同性を示す未知の遺伝子の存在を見いだした。この遺伝子が新規のトランスポーターをコードしていることが予想されたことから、本発明者等は、その単離を試みた。その結果、ヒト胎児由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離することに成功した。さらに、本発明者等は、単離したヒト遺伝子がコードするタンパク質のトランスポーター活性につき検討を行った。その結果、該タンパク質が実際に種々の有機カチオンのトランスポーターとして機能することを見いだした。また、本発明者らは、単離したヒト遺伝子に対応するマウス遺伝子を単離することにも成功した。
本発明は、新規なトランスポーター遺伝子ファミリーおよびそれら遺伝子がコードするタンパク質、並びにそれらの用途に関し、より具体的には、
（１）  配列番号：１、３、２２若しくは２７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、またはこれらタンパク質中のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列からなり、有機カチオンを輸送する活性を有するタンパク質、
（２）  配列番号：２、４、２３若しくは２８に記載の塩基配列からなるＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質であって、有機カチオンを輸送する活性を有するタンパク質、
（３）  （１）または（２）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、
（４）  （３）に記載のＤＮＡが挿入されたベクター、
（５）  （３）に記載のＤＮＡを発現可能に保持する形質転換体、
（６）  （５）に記載の形質転換体を培養する工程を含む、（１）または（２）に記載のタンパク質の製造方法、
（７）  （１）または（２）に記載のタンパク質に結合する抗体、
（８）  配列番号：２、４、２３若しくは２８に記載の塩基配列からなるＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するＤＮＡ、に関する。
本発明者等が単離した新規なヒトトランスポーターｃＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号：２（「ヒトＯＣＴＮ１」と命名した）および配列番号：４（「ヒトＯＣＴＮ２」と命名した）に示す。また、これらｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１および配列番号：３に示す。本発明のトランスポータータンパク質に含まれるこれら２つのタンパク質のアミノ酸配列は全体に渡り、７６％程度という非常に高い相同性を示し、ともにグルコーストランスポーターなど様々なタイプのトランスポーターに存在するコンセンサス配列［Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｍｅｔ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ａｌａ，Ｇｌｙ］−［Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｇｌｙ］−Ｘａａ＜２＞−［Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｍｅｔ，Ｓｅｒ，Ａｌａ］−［Ａｓｐ，Ｇｌｕ］−Ｘａａ−［Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ａｌａ］−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−［Ａｒｇ，Ｌｙｓ］−Ｘａａ＜４−６＞−［Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ａｌａ］）（Ｍａｉｄｅｎ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２５，６４１−６４３，１９８７．）を保持していた。実際に、これらタンパク質は、様々な有機カチオンを輸送する活性を有していた（実施例６から８参照）。
また、本発明者らは、上記「ヒトＯＣＴＮ１」および「ヒトＯＣＴＮ２」に対応するマウス遺伝子を単離した。単離したｃＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号：２３（「マウスＯＣＴＮ１」と命名した）と配列番号：２８（「マウスＯＣＴＮ２」と命名した）に、これらｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：２２と配列番号：２７に示す。
本発明のトランスポータータンパク質としては、有機カチオンを輸送する活性を有すれば足り、該活性を有する限り有機カチオン以外の他の物質を輸送する活性をさらに有するものも含まれる。有機カチオンとしては、これらに制限されないが、例えば、ＴＥＡ、カルニチン、キニジン、ピリラミンが挙げられる。また、抗がん剤であるアクチノマイシンＤ、エトポシド、ビンブラスチン、ダウノマイシンなどが挙げられる。本発明のトランスポータータンパク質としては、細胞外から細胞内へ有機カチオンを輸送する活性を有するもののみならず、細胞内から細胞外へ有機カチオンを輸送する活性を有するものも含まれる。
本発明のトランスポータータンパク質は、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として、また天然のタンパク質として調製することができる。組換えタンパク質は、例えば、後述するように本発明のタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。一方、天然のタンパク質は、当業者に周知の方法、例えば、後述の本発明の抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、本発明のタンパク質の発現の高い腎臓やＨｅＬａ  Ｓ３などの癌細胞株から単離することが可能である。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体であれば、例えば、本発明のタンパク質をウサギなどの小動物に免疫し血清を得て、これを、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、本発明のタンパク質をカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。また、モノクローナル抗体であれば、本発明のタンパク質をマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞にし、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、本発明のタンパク質に対する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、本発明のタンパク質をカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。なお、得られた抗体を人体に投与する目的で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト型化抗体またはヒト抗体を用いると有効である。抗体をヒト型化する方法としては、モノクローナル抗体生産細胞から抗体遺伝子をクローニングし、その抗原決定部位を既存のヒト抗体に移植するＣＤＲグラフト法などが挙げられる。また、免疫系をヒトのものと入れ換えたマウスを免疫して、通常のモノクロナール抗体と同様に直接ヒト抗体を作製こともできる。
また、当業者であれば、公知の方法を用いて上記本発明のトランスポータータンパク質（「ヒトＯＣＴＮ１」、「ヒトＯＣＴＮ２」、「マウスＯＣＴＮ１」、「マウスＯＣＴＮ２」）中のアミノ酸の置換などを適宜行い、これらと同等の機能を有するタンパク質を調製することが可能である。また、タンパク質のアミノ酸の変異は天然においても生じうる。このようにアミノ酸の置換、欠失、付加により上記本発明のトランスポータータンパク質に対してアミノ酸配列が改変された改変体であって、これらタンパク質と同等の機能を有するタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。ここで［同等の機能を有する］とは、タンパク質が有機カチオンを輸送する活性を有することを指す。当業者に公知のアミノ酸を改変する方法としては、例えば、ＰＣＲによる部位特異的変異誘発システム（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異誘発法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ，ＨＪ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：３５０−３６７）、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６（１９８８））などが挙げられる。なお、アミノ酸の置換は、通常、１０アミノ酸以内であり、好ましくは６アミノ酸以内であり、さらに好ましくは３アミノ酸以内である。置換、欠失、付加がなされる部位は本発明のタンパク質の活性が保持される限り特に制限はない。タンパク質のトランスポーター活性は、例えば、後述の実施例６に記載の方法により検出することが可能である。
また、当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）などを用いて、上記本発明のトランスポータータンパク質（「ヒトＯＣＴＮ１」、「ヒトＯＣＴＮ２」、「マウスＯＣＴＮ１」、「マウスＯＣＴＮ２」）をコードするＤＮＡ配列またはその一部を基に、これと相同性の高いＤＮＡを単離して、該ＤＮＡから本発明のトランスポータータンパク質と同等の機能を有するタンパク質を得ることも常套手段である。これら本発明のトランスポータータンパク質と同等の機能を有するタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。ここで「同等の機能を有する」とは、タンパク質が有機カチオンを輸送する活性を有することを指す。ハイブリダイズするＤＮＡを他の生物から単離する場合には、ヒトやマウス以外に、例えば、ラット、ウサギ、ウシなどが用いられ、特に腎臓などの組織が単離に適している。このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離されるＤＮＡは、通常、上記本発明のトランスポータータンパク質をコードするＤＮＡと高い相同性を有する。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、少なくとも７０％以上、好ましくは少なくとも８０％以上、さらに好ましくは少なくとも９０％以上の配列の同一性を指す。配列の相同性を決定するには、文献（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
このようなＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件の例を示せば、以下の如くである。即ち、「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、５５℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、３７℃から５５℃で１時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、次いで、１ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を１回行う。より好ましい条件としては、「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、６０℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、６０℃で１時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、次いで、１ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行う。さらに好ましい条件としては、「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、６８℃で１時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、次いで、０．１ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行う。
また、本発明は、上記本発明のトランスポータータンパク質をコードするＤＮＡに関する。本発明のＤＮＡは、ｃＤＮＡであっても、ゲノムＤＮＡでもよく、また合成ＤＮＡであってもよい。本発明のＤＮＡは、例えば、本発明のタンパク質を組換えタンパク質として生産するために利用しうる。即ち、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：２、４、２３、２８に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入して得た形質転換体を培養し、発現させたタンパク質を精製することにより本発明のタンパク質を組換えタンパク質として調製することが可能である。組換えタンパク質の生産に用いる細胞としては、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などの哺乳類細胞、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞、酵母細胞、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が挙げられる。また、細胞内で組換えタンパク質を発現させるためのベクターは、宿主細胞に応じて変動するが、例えば、哺乳類細胞のベクターとしてはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）やｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）などが、昆虫細胞のベクターとしては「ＢＡＣ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）などが、酵母細胞のベクターとしては「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などが、大腸菌のベクターとしてはｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（Ｑｉａｇｅｎ社製）などが挙げられる。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリポソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクロポレーション法、塩化カルシウム法など用いて行うことができる。得られた形質転換体からの組換えタンパク質の精製は、常法、例えば、文献「Ｔｈｅ  Ｑｉａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ  ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ」記載の方法を用いて行うことが可能である。
また、本発明は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するＤＮＡに関する。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションが有意に生じないことを指す。このようなＤＮＡは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを検出、単離するためのプローブとして、また増幅するためのプライマーとして利用可能である。
本発明の応用としては、本発明のトランスポータータンパク質を利用した、薬物の体内吸収、体内動態の制御が挙げられる。本発明のトランスポータータンパク質の基質特異性を詳細に解析することにより、このトランスポーターによって輸送され得る薬剤のドラッグデザインが可能であり、これにより本発明のトランスポータータンパク質を介して薬物の体内吸収を高めることができると考えられる。デザインされる薬物には従来の脂溶性をあげるような修飾は不要であるため、水溶性の扱いやすい薬物が迅速かつ効率的に開発できるようになると考えられる。また開発された薬物の吸収は基本的に本発明のトランスポータータンパク質の生体内分布に従うと考えられるため、臓器特異的な薬物の送達が可能である。特に本発明のトランスポータータンパク質の体内分布が、標的臓器と一致するような薬物の場合、理想的なドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）となると考えられる。また、他のトランスポーターによる薬物の吸収を期待しているが、本発明のトランスポータータンパク質による吸収は望ましくない場合、本発明のトランスポータータンパク質の基質特異性を考慮に入れたドラッグデザインを行うことにより、他のトランスポータータンパク質に選択的な薬物の創造が行えると考えられる。本発明のトランスポータータンパク質は腎臓に存在するため、逆に本発明のトランスポータータンパク質によって体外へ排出されやすい薬物を設計することにより、腎毒性等を軽減することも可能である。
また、他の本発明の応用としては、本発明のトランスポータータンパク質を標的とした薬物の開発が考えられる。栄養物質や薬物の吸収機構として、あるいは薬物や生体内代謝物の排泄機構としてのトランスポーターの重要性を考えると、その機能が損なわれること、または異常に亢進することに起因する疾患が存在すると考えられる。そのような疾患に対しては、本発明のトランスポータータンパク質の機能を阻害、あるいは亢進する化合物や、本発明のトランスポーター遺伝子の発現量や、タンパク量を調節するするような化合物を薬剤として用いると効果的であると考えられる。さらに、本発明のＤＮＡを利用して、本発明のタンパク質の活性異常や発現量異常に起因する疾患に対する遺伝子治療を行うことも考えられる。遺伝子治療に用いる場合には、本発明のＤＮＡをアデノウイルスベクター（例えば、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）やレトロウィルスベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）などに挿入して、生体内に投与する。投与方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ  ｖｉｖｏ法であってもよい。また、アンチセンス合成ＤＮＡを生体内に直接、または上記ベクターに挿入して投与して治療を行うことも考えられる。
特に、本発明のトランスポータータンパク質に含まれる「ＯＣＴＮ２」は、カルニチンを効率よく輸送する活性を有するため、低カルニチン血症を原因とする脂肪肝、心筋症、骨格筋症などの病態に対し、「ＯＣＴＮ２」の活性を制御する化合物による治療、あるいは「ＯＣＴＮ２」遺伝子を用いた遺伝子治療等が有効であると考えられる。
本発明のトランスポータータンパク質は種々の癌細胞株において発現しており、腫瘍細胞において本発明のトランスポータータンパク質が薬物を細胞内へ輸送し得る可能性がある。この場合には、本発明のトランスポータータンパク質によってより吸収されやすい抗腫瘍薬が創造できると考えられる。あるいは逆に、本発明のトランスポータータンパク質による物質の細胞外へ輸送、排出する機構が、腫瘍細胞においては抗腫瘍剤の排出として働き、腫瘍細胞が薬剤に対する抵抗性を獲得する可能性も考えられる。本発明のトランスポータータンパク質が腫瘍の薬剤耐性機構に関与しているならば、本発明のトランスポータータンパク質阻害剤を抗腫瘍剤と併用することにより、抗腫瘍効果を強化できると考えられる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］  サブトラクションライブラリーの作製
サブトラクションライブラリーはＰＣＲ−ＳｅｌｅｃｔＴＭ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、Ｌｕｄａ  Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏらの方法（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，６０２５−６０３０，１９９６．）に基本的に従って作製した。
まずヒト胎児肝臓由来ｐｏｌｙＡ＋  ＲＮＡ及びヒト成人肝臓由来ｐｏｌｙＡ＋  ＲＮＡよりＭＭＬＶ逆転写酵素を用いた標準的な方法で二本鎖ｃＤＮＡを合成した。つぎにＴ４  ＤＮＡポリメラーゼによりこのｃＤＮＡ末端を平滑化し、さらにＲｓａＩにより切断した。胎児肝臓由来ｃＤＮＡ（テスター）の一部を２分割し、アダプター１とアダプター２（表１）をそれぞれ別々にライゲートした。これにそれぞれ１２０倍量の成人肝臓由来ｃＤＮＡ（ドライバー）を加え、熱変性を行ったあと６８℃で８時間の１次ハイブリダイゼーションを行った。つぎにこれを熱変性せずに混合し、さらに熱変性した過剰量のドライバーを加え６８℃で約１６時間の２次ハイブリダイゼーションを行った。これを希釈用バッファーにて希釈し、７５℃で７分インキュベートし、アダプターの短い方の鎖を取り除いたものをＰＣＲの鋳型として用いた。アダプターに対応するプライマーであるＰＣＲプライマー１（５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’／配列番号：５）、２（５’−ＴＧＴＡＧＣＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＧＡＡ−３’／配列番号：６）を用いたＰＣＲを行うことにより、両端に異なるアダプターを持ったｃＤＮＡ（サブトラクトされたｃＤＮＡ）のみを選択的に増幅した（サプレッションＰＣＲ）。この一部を鋳型とし、ＰＣＲプライマー１、２のさらに内側に位置するプライマーであるＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲプライマー１（５’−ＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＴ−３’／配列番号：７）と２（５’−ＡＧＧＧＣＧＴＧＧＴＧＣＧＧＡＧＧＧＣＧＧＴ−３’／配列番号：８）を用いたＰＣＲを行うことにより、さらに選択性を増した生成物を得た。この生成物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にＴＡクローニング法によりクローニングし、サブトラクションライブラリーとした。
【表１】
0003778545.tif 000002
［実施例２］  ｃＤＮＡクローニング
胎児遺伝子の解析を目的に、胎児肝臓由来サブトラクションライブラリーの、ランダムシークエンジングによるスクリーニングを行った。得られたＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ）のホモロジーサーチ（Ｂｌａｓｔｘ）による解析から、既知の有機カチオントランスポーターであるＯＣＴ１（Ｇｒｕｎｄｅｍａｎｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７２，５４９−５５２，１９９４．）、ＯＣＴ２（Ｏｋｕｄａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２４，５００−５０７，１９９６．）と有意な相同性を示すアミノ酸配列をコードするクローン、「ＯＣＴＮ１（ｆｌｓ６３１）」（２９２ｂｐ）が見いだされた。このクローンの配列は新規なものであり、新規のトランスポーター遺伝子由来の断片である可能性が推測されたことから、この遺伝子の全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｃＤＮＡのクローニングを行った。
胎児肝臓由来サブトラクションライブラリーより得られた「ＯＣＴＮ１」オリジナルクローンをプローブとし、ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ５’−ｓｔｒｅｔｃｈ  ｃＤＮＡライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）のスクリーニングを行った。「ＯＣＴＮ」オリジナルクローンのインサートを、Ｍ１３  Ｐ４−２２とＭ１３  Ｐ５−２２を用いたＰＣＲにより増幅し、これをＲｅａｄｙ−ｔｏ  Ｇｏ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｂｅａｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いたランダムプライマー法により［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰでラベルし、プローブとした。ハイブリダイゼーションはＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）中、６８℃で、メーカー推奨の方法に従い行った。また、最終的な洗浄は、０．１  Ｘ  ＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳ、５０℃で行った。約５ｘ１０５個のファージクローンをスクリーニングしたところ、最終的に７個の陽性クローンが単離された。これらのクローンのインサートｃＤＮＡをλｇｔ１０ベクターの配列より設計したベクタープライマー（ＧＴ１０  Ｓ１  ５’−ＣＴＴＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴ−３’／配列番号：９，ＧＴ１０  Ａ１  ５’−ＡＧＡＧＧＴＧＧＣＴＴＡＴＧＡＧＴＡＴＴＴＣＴＴ−３’／配列番号：１０）、あるいは解読されたｃＤＮＡの配列より設計したプライマーを用いたＰＣＲによって増幅し、その産物を直接シークエンジングすることにより、塩基配列を決定した。一部の増幅が困難な領域については７−ｄｅａｚａ  ｄＧＴＰを基質塩基として用いたＰＣＲによる増幅を行った（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６，９８６９，１９８８．）。
これらのクローンのインサートｃＤＮＡの塩基配列を決定した結果、「ヒトＯＣＴＮ１」遺伝子は、５５１アミノ酸（推定分子量約６２，０００）からなるＯＲＦをコードし得る配列を持つことが明らかとなった。この全アミノ酸配列を用いてデーターベースサーチを行ったところ、全体に渡ってＯＣＴ１及びＯＣＴ２と有意な相同性（約３４％）を示すことが確認された。また、Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの計算式（Ｋｙｔｅ，Ｊ．ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７，１０５−１３２，１９８２．）によって得られる疎水性プロフィールは、ＯＣＴ１およびＯＣＴ２のものと非常に類似しており、１１−１２個の膜貫通領域と思われる疎水性領域が認められた（図１）。また、この配列中には１個の糖トランスポーターのコンセンサス配列（［Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｍｅｔ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ａｌａ，Ｇｌｙ］−［Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｇｌｙ］−Ｘａａ＜２＞−［Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｍｅｔ，Ｓｅｒ，Ａｌａ］−［Ａｓｐ，Ｇｌｕ］−Ｘａａ−［Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ａｌａ］−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−［Ａｒｇ，Ｌｙｓ］−Ｘａａ＜４−６＞−［Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ａｌａ］）が存在した（１６０−１７５）。このコンセンサス配列は、哺乳類細胞におけるグルコースのトランスポーターであるＧＬＵＴ１〜ＧＬＵＴ７に存在するコンセンサス配列であり、グルコーストランスポーター以外にも、様々なタイプのトランスポーターに存在することが知られている（Ｍａｉｄｅｎ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２５，６４１−６４３，１９８７．）。「ヒトＯＣＴＮ１」のアミノ酸配列中には、さらに、Ｎ型糖鎖が付加され得る配列（Ｎ−Ｘ−［ＳＴ］）が４箇所（５７−５９，６４−６６，９１−９３，３０４−３０６）見られる。また、プロテインキナーゼＣによるリン酸化を受け得るサイト（［ＳＴ］−Ｘ−［ＲＫ］）も５箇所（１６４−１６６，２２５−２２７，２８０−２８２，２８６−２８８，５３０−５３２）存在した。さらに、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合サイトのコンセンサス配列（［Ａｌａ，Ｇｌｙ］−Ｘａａ（４）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−［Ｓｅｒ，Ｔｈｒ］）も存在する。このＡＴＰ／ＧＴＰ結合サイトのコンセンサス配列はキナーゼやｒａｓファミリータンパク等のＡＴＰ結合タンパク、あるいはＧＴＰ結合タンパク質に存在し、この部位にＡＴＰ，ＧＴＰが結合することが知られている（Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．，１，９４５−９５１，１９８２）。また、ＡＢＣ（ＡＴＰ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）型トランスポーターと呼ばれるトランスポーターにはこの配列が存在し、ＡＴＰを加水分解することによるエネルギーを用いて物質を輸送していることが示されている（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｃ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．，２２，５７１−５９２，１９９０；Ｕｒｂａｔｓｃｈ，Ｉ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２６９５６−２６９６１，１９９５））。このコンセンサス配列の存在により、「ＯＣＴＮ１」タンパク質がＡＴＰあるいはＧＴＰ依存的な輸送を行���トランスポーターである可能性も考えられる。
なお、塩基配列の決定は、アルカリＳＤＳ法によって調製したプラスミドＤＮＡ、またはコロニーＰＣＲなどによるＰＣＲ産物を鋳型とし、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｙＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＦＳを用いたサイクルシークエンシング法により行い、ＡＢＩ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）により解読した。コロニーＰＣＲは、ベクタープライマーであるＭ１３  Ｐ４−２２（５’−ＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’／配列番号：１１）及びＭ１３  Ｐ５−２２（５’−ＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’／配列番号：１２）を含むＰＣＲ反応溶液の中に、組み換え体を持つコロニーを直接懸濁することにより行った。ＰＣＲ反応後、増幅されたインサートＤＮＡから、ゲル濾過法などにより未反応のプライマー、ヌクレオチド等を除き、シークエンジングの鋳型として用いた。
［実施例３］  ノーザン解析
「ヒトＯＣＴＮ１」の組織分布をノーザン解析により調べた（図２）。「ヒトＯＣＴＮ１」の３’側断片（約１，１００番目の塩基より後半）を、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ  Ｇｏ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｂｅａｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いたランダムプライマー法により［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰでラベルし、プローブとして用いた。Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ）Ｂｌｏｔ−Ｈｕｍａｎ，Ｈｕｍａｎ  ＩＩＩ，Ｈｕｍａｎ  ＩＶ，Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  ＩＩ，Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）中で、メーカー推奨の方法に従い、６８℃でハイブリダイゼーションを行った。最終的な洗浄は、０．１  Ｘ  ＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳ、５０℃で行った。その結果、胎児では肝臓に、そして成人由来の臓器では、腎臓、骨髄、気管に約２．５ｋｂの強い発現が観察された。それ以外には胎児の腎臓、肺、そして成人の骨格筋、肺、胎盤、前立腺、脾臓、脊髄に弱い発現が見られた。また、腫瘍細胞株においてもＨｅＬａ  Ｓ３、Ｋ５６２、ＳＷ４８０、Ａ５４９に発現が認められ、特にＨｅＬａ  Ｓ３においては非常に強く発現していることが明らかとなった。
［実施例４］  「ヒトＯＣＴＮ２」のｃＤＮＡクローニング
「ヒトＯＣＴＮ１」の全塩基配列を用いたデータベースサーチより、ヒト５番染色体ｑ領域由来Ｐ１ファージクローン（Ｐ１  Ｈ２４クローン。ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ４３４０７，Ｌ４３４０８，Ｌ４６９０７，Ｌ８１７７３，Ｌ４３４０９）の塩基配列の一部に、「ヒトＯＣＴＮ１」の配列と非常に類似した配列が含まれていることを見いだした。「ヒトＯＣＴＮ１」の塩基配列と類似性がある部分は、全く類似性を持たない配列によって分断されているが、これを「ヒトＯＣＴＮ１」の配列を参考にすることにより連結してみると、「ヒトＯＣＴＮ１」と広い領域に渡って高い相同性を持つ配列になることがわかった。このことから、「ＯＣＴＮ１」ホモローグが存在することが示唆された。しかしデータベースに登録されているゲノム配列は全コーディング領域をカバーしていない不完全なものであったため、この配列からだけでは、そこにコードされるタンパク質の完全な構造を知ることは不可能であった。そこでこの「ＯＣＴＮ１」ホモローグ遺伝子（「ＯＣＴＮ２」）のｃＤＮＡクローニングを行い、コードされるタンパクの構造を決定した。まず、これらのＰ１ファージクローンの配列より６３１Ｒ  Ｓ４プライマー（５’−ＧＴＧＣＴＧＴＴＧＧＧＣＴＣＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡ−３’／配列番号：１３）及び６３１Ｒ  Ａ１プライマー（５’−ＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＡＧＡＧＡＡＧＧＡＣＡＣＴＧ−３’／配列番号：１４）を作製し、ヒト成人腎臓由来ｐｏｌｙＡ＋  ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）より合成したｃＤＮＡを鋳型に、９４℃で３分、「９４℃で３０秒、５８℃で１分、７２℃で２分」を３５サイクル、７２℃で１０分という条件によるＰＣＲを行ったところ、約９００ｂｐの断片が増幅された。この断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にＴＡクローニング法によりサブクローニングし、塩基配列を決定したところ、全体に渡り「ヒトＯＣＴＮ１」と非常に高い相同性を有することが明らかとなった。そこでこの遺伝子を「ヒトＯＣＴＮ２」と命名し、さらに長いｃＤＮＡのクローニングを行った。
このクローンのインサートをプローブとして用い、「ヒトＯＣＴＮ１」ｃＤＮＡクローニングの場合と同様な方法でヒト腎臓由来ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、より長いクローンを単離していく操作、及びＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）法（Ｃｈｅｎｃｈｉｋ，Ａ．，Ｍｏｑａｄａｍ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｓｉｅｂｅｒｔ，Ｐ．（１９９５）ＣＬＯＮＴＥＣＨｎｉｑｕｅｓ  Ｘ，５−８）等により、「ヒトＯＣＴＮ２」の全コーディング領域を含むｃＤＮＡをクローニングしその構造を決定した（配列番号：４）。ＲＡＣＥ法は具体的には、次のように行った。６３１Ｒ  Ｓ６プライマー（５’−ＡＧＣＡＴＣＣＴＧＴＣＴＣＣＣＴＡＣＴＴＣＧＴＴ−３’／配列番号：１５）を作製し、ヒト成人腎臓由来Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を鋳型として、９４℃で２分、「９４℃で３０秒、６０℃で１分、７２℃で３分」を３５サイクル、７２℃で１０分という条件のＰＣＲを行ったところ、約１．７ｋｂｐの３’側ｃＤＮＡ断片が増幅され、これをｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＴベクターにＴＡクローニング法によりサブクローニングし、構造を決定した。
「ヒトＯＣＴＮ２」は５５７アミノ酸からなるＯＲＦをコードしていることが明らかとなった。「ヒトＯＣＴＮ１」と「ヒトＯＣＴＮ２」のアミノ酸配列の比較を図３に示す。両者は全体に渡り、約７６％という非常に高い相同性を示した。また「ヒトＯＣＴＮ２」アミノ酸配列中には「ヒトＯＣＴＮ１」と同様に１個の糖トランスポーターのコンセンサス配列（１６０−１７６）が存在した。これらのことより、「ＯＣＴＮ２」は「ＯＣＴＮ１」と構造上の関連を持った新規トランスポーターである可能性が示唆された。また、「ヒトＯＣＴＮ２」アミノ酸配列中にも、「ヒトＯＣＴＮ１」と同様にＡＴＰ／ＧＴＰ結合サイトのコンセンサス配列（２１８−２２５）が存在した。
［実施例５］  ノーザン解析
６３１Ｒ  Ｓ４プライマー（５’−ＧＴＧＣＴＧＴＴＧＧＧＣＴＣＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡ−３’／配列番号：１３）及び６３１Ｒ  Ａ１プライマー（５’−ＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＡＧＡＧＡＡＧＧＡＣＡＣＴＧ−３’／配列番号：１４）を用いたＰＣＲによって得られた約９００ｂｐの「ヒトＯＣＴＮ２」ｃＤＮＡをプローブとし、「ヒトＯＣＴＮ１」と同様にノーザン解析を行った。その結果を図４に示す。発現パターンは「ヒトＯＣＴＮ１」のパターンと重複している部分があるが、胎児組織において腎臓に非常に強い発現が見られる点が特に異なっていた。また、「ヒトＯＣＴＮ２」もまたＫ−５６２，ＨｅＬａＳ３，ＳＷ４８０等の癌細胞株で強く発現していることが判明した。これらの癌細胞において、「ＯＣＴＮ１」、「ＯＣＴＮ２」が抗癌剤などの物質の輸送に関与している可能性が示唆される。
［実施例６］  「ヒトＯＣＴＮ１」のヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）での強制発現と活性測定
プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングによって得られた陽性ファージクローンより、ＱＩＡＧＥＮ  Ｌａｍｂｄａ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてファージＤＮＡを抽出した。インサートＤＮＡをｐＵＣ１８ベクターにサブクローニングした後、ＳｍａＩ及びＥｃｏＲＩで切り出される全ＯＲＦを含むｃＤＮＡを、哺乳類細胞用の発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＩサイトと、平滑末端化したＨｉｎｄＩＩＩサイトとの間へ組み込み、発現用プラスミドＤＮＡ、「ｐｃＤＮＡ３／ＯＣＴＮ１」を得た。プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ  ＰＬＡＳＭＩＤ  ＭＡＸＩ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いたアルカリ−ＳＤＳ法で調製した。
ｐｃＤＮＡ３／ＯＣＴＮ１、及びコントロールとしてインサートを含まないｐｃＤＮＡ３ベクターを、リン酸カルシウム法によりヒト胎児腎臓由来細胞株ＨＥＫ２９３細胞に導入した。すなわち、プラスミドＤＮＡ１０μｇ、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＫＣｌ，０．７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，３６ｍＭ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ，２１ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．１）１ｍｌ、２Ｍ  ＣａＣｌ２  ６２．５μｌを混合し、３０分以上室温で静置することによりリン酸カルシウム共沈物を生成させた。１０ｃｍプレート１枚あたり１．５ｘ１０６個の細胞を蒔き、２４時間培養した後、、先のリン酸カルシウム共沈物を加え２４時間培養し、その後ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）でプレートを洗浄し、培地を加えさらに２４時間培養した。
プラスミドＤＮＡを導入した細胞、あるいは未処理の細胞を用いて以下の手順に従ってトランスポート実験を行った。プレートからラバーポリスマンを用いて細胞をはがし、トランスポート緩衝液（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ，４．８ｍＭ  ＫＣｌ，５．６ｍＭ（＋）−ｇｌｕｃｏｓｅ，１．２ｍＭ  ＣａＣｌ２，１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４）に懸濁し、２０分間プレインキュベーションを行った。ついで各種基質のラベル体（［１４Ｃ］ＴＥＡ＜テトラエチルアンモニウム＞（ＮＥＮ）、［３Ｈカルニチン＜Ｌ−カルニチン  ヒドロクロリド＞（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）、［３Ｈ］ＰＣＧ＜ベンジルペニシリン＞（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、［３Ｈ］キニジン（ＡＲＣ）、［３Ｈ］ピリラミン＜メピラミン＞（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製））を適当量添加し、３７℃にて一定時間インキュベートを行った。これを、３Ｍ  ＫＣｌ層の上にシリコンオイルと液体パラフィンの混合物（比重＝１．０２２）を重層して作製したシリコンレイヤー上に重層し、遠心することにより細胞を分離した。細胞の放射活性を測定し、細胞内へのトランスポート能とした。なお、この際、１ｘ１０６個の細胞を１ポイントとして用いた。また、ＨＥＫ２９３細胞の培養は、ダルベッコＭＥＭ，１０％  ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を培地とし、５％  二酸化炭素中、３７℃で行った。
まず、ＴＥＡを基質として用い、ｐｃＤＮＡ３／ＯＣＴＮ１を導入した細胞と、未処理の細胞におけるトランスポーター能を測定した（図５）。その結果、反応時間に依存した明らかな「ヒトＯＣＴＮ１」導入細胞内へのＴＥＡの取り込みが観察された。この取り込みは、未処理細胞においては見られなかった。次に、この系にラベル体ではないＴＥＡを添加することによるコールドインヒビションの実験を行った（図６）。加えるコールドのＴＥＡの濃度に応じて明らかな見かけ上の取り込みの低下が観察された。この実験においてはインサートを含まないｐｃＤＮＡ３ベクターを導入した細胞（Ｍｏｃｋ）をコントロールとしたが、未処理の細胞を用いた場合と同様に、ほとんど細胞内への基質の取り込みは認められず、この取り込み現象が「ヒトＯＣＴＮ１」を導入したことによることが明らかとなった。次に、「ヒトＯＣＴＮ１」のＴＥＡに対するＫｍ（ミカエリス定数）値を求めるために、様々な濃度の［１４Ｃ］ＴＥＡを加えた場合の取り込み量を測定した（図７）。「ヒトＯＣＴＮ１」を導入した細胞における取り込み量からＭｏｃｋの取り込み量を差し引いた正味の取り込み量をＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ逆数プロットすることにより、Ｋｍ値は０．４４±０．０４ｍＭであることが求められた。また反応の最大速度Ｖｍａｘは６．６８±０．３４（ｎｍｏｌ／３  ｍｉｎ／ｍｇ）であることが求められた。次に、ＴＥＡ以外の物質に対する輸送能を検討した（図８）。有機カチオンであるカルニチン、キニジン、ピリラミンのラベル体を用い輸送能を測定したところ、Ｍｏｃｋに対し明らかに有意な取り込み量の増加が観察され、これらの有機カチオンは「ヒトＯＣＴＮ１」の基質になりうることが明らかとなった。しかし、有機アニオンであるＰＣＧ（ベンジルペニシリン）に対しては取り込み量の有意な増加は認めらなかった。
［実施例７］  Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞を用いた「ヒトＯＣＴＮ１」の活性測定
ｐｃＤＮＡ３／ＯＣＴＮ１を鋳型とし、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによりｃＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した。これを０．３ｎｇ／ｎｌに希釈し、５０ｎｌ（１５ｎｇ）を一つの卵母細胞にインジェクションした。対照としては、蒸留水５０ｎｌをインジェクションした。この卵母細胞を３日間培養し、トランスポート実験に用いた。アップテイク緩衝液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４）中、２５℃で２０分卵母細胞をプレインキュベートした後、０．５ｍｌのラベル体を含むアップテイク緩衝液中に移し、取り込みを開始した。２５℃、１時間インキュベートした後、氷冷したアップテイク緩衝液で３回洗浄することにより反応を止めた。５％  ＳＤＳで卵母細胞を可溶化した後、クリアゾルＩ（液体シンチレーションカウンター用カクテル）３ｍｌと混合し、放射活性を測定した。また、インキュベーション時のラベル体を含んだアップテイク緩衝液（外部液）１０μｌの放射活性も同様に測定した。卵母細胞中の放射活性（ｄｐｍ値）と、外部液中の放射活性（ｄｐｍ値）の比を取り込み活性とした。
Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞を用いたトランスポート実験の結果、この系においても「ヒトＯＣＴＮ１」はＴＥＡの輸送能を示すことが明らかとなった（図９）。また、ＴＥＡ以外にもキニジン、メピラミン、カルニチンといった有機カチオンを輸送する能力があることが判明した。
次に、抗癌剤などに対する輸送能を検討した。その結果、「ヒトＯＣＴＮ１」はアクチノマイシンＤ、エトポシド、ビンブラスチン、ダウノマイシンを輸送する活性があることが明らかとなった（図１０）。これらは実際に臨床において抗癌剤として使用されている薬剤であるが、これらの薬剤の細胞内への移行メカニズム（細胞への吸収メカニズム）において「ＯＣＴＮ１」が関与している可能性があることが強く示唆される。このことから、「ＯＣＴＮ１」により認識されやすいといった、このトランスポーターの基質特異性を利用した薬剤を設計、スクリーニングすることにより、より細胞内への吸収性が高い、有用な薬剤を効率よく開発することが可能になると考えられる。
［実施例８］  「ヒトＯＣＴＮ２」のＨＥＫ細胞での強制発現と活性測定
「ヒトＯＣＴＮ２」の哺乳類細胞における発現用プラスミドＤＮＡは以下のようにして作製した。ヒト胎児腎臓由来ｐｏｌｙＡ＋  ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）より、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）逆転写酵素を用い、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。これを鋳型とし、以下の条件でＰＣＲを行い、それぞれ「ヒトＯＣＴＮ２」の５’側断片、及び３’側断片を増幅した。
「ヒトＯＣＴＮ２」の５’側断片（約８００ｂｐ）の増幅には、ＯＣＮ２  ３プライマー（５’−ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＧＡＣＧＧＴＣＴＴＧＧＧＴＣＧＣＣＴＧＣＴＧ−３’／配列番号：１６）およびＯＣＮ２  ４プライマー（５’−ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＡＴＡＧＴＴＧＧＡＧＡＴ−３’／配列番号：１７）を用いた。ＤＮＡポリメラーゼ−ＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ）およびｄＮＴＰとして「１５０μＭ  ７−ｄｅａｚａ  ｄＧＴＰ，５０μＭ  ｄＧＴＰ，２００μＭ  ｄＡＴＰ，２００μＭ  ｄＴＴＰ，２００μＭ  ｄＣＴＰ」を用い、９４℃で２分、「９４℃で３０秒、６３℃で１分、７２℃で２分」を３５サイクル、７２℃で１０分の条件でＰＣＲを行った。また、「ヒトＯＣＴＮ２」３’側断片（約１．２ｋｂｐ）の増幅には、ＯＣＮ２  ７プライマー（５’−ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＡＧＡＣＡＧＧＣＴＴＣＡＧＣ−３’／配列番号：１８）およびＯＣＮ２  ８プライマー（５’−ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＡＧＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＡＣＴ−３’／配列番号：１９）を用いた。ＤＮＡポリメラーゼ−ＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ社製）およびｄＮＴＰとして「２００μＭ  ｄＧＴＰ，２００μＭ  ｄＡＴＰ，２００μＭ  ｄＴＴＰ，２００μＭ  ｄＣＴＰ」を用い、９４℃で２分、「９４℃で３０秒、６３℃で３０秒、７２℃で２分」を３５サイクル、７２℃で１０分の条件でＰＣＲを行った。
これらの断片をアガロースゲル電気泳動後にゲルから切り出して精製し、それぞれｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔベクターにサブクローニングした。シークエンジングすることによりＰＣＲエラーのないクローンを選び、両クローンを、重複する領域に存在するＰｓｔＩサイトによって連結した。これを最終的にｐｃＤＮＡ３ベクターのＢａｍＨＩサイトに組み込み、発現用プラスミドＤＮＡ「ｐｃＤＮＡ３／ＯＣＴＮ２」とした。
ｐｃＤＮＡ３／ＯＣＴＮ２を、インサートを含まないｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｍｏｃｋ）及びｐｃＤＮＡ３／ＯＣＴＮ１と共に実施例６で示した方法によりＨＥＫ細胞に導入し、トランスポート実験を行った。その結果、「ヒトＯＣＴＮ２」はカルニチンを非常に効率よく輸送する活性を持つことが判明した（図１１）。一方「ヒトＯＣＴＮ２」は、「ヒトＯＣＴＮ１」が効率よく輸送するＴＥＡをほとんど輸送せず、両者には明らかな基質特異性があることが明らかとなった。
次にトランスポート緩衝液中のＮａイオンをＫに変更した緩衝液を用い、「ヒトＯＣＴＮ２」のカルニチン輸送におけるＮａ依存性を調べた（図１２）。その結果、「ヒトＯＣＴＮ２」のカルニチンの輸送は完全にＮａの存在に依存していることが明らかとなった。このことから、「ＯＣＴＮ２」はＮａと基質を共輸送するタイプのトランスポーターであることが示唆された。
［実施例９］  「マウスＯＣＴＮ１」のクローニング
「ヒトＯＣＴＮ１」ｃＤＮＡ配列を用いデータベースサーチを行ったところ、これと非常に高い相同性を有するいくつかのマウス由来ＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇｓ）が見いだされた。これらのＥＳＴの配列からＭＯＮＬ  １プライマー（５’−ＣＧＣＧＣＣＧＡＡＴＣＧＣＴＧＡＡＴＣＣＴＴＴＣ−３’／配列番号：２０）およびＭＯＮＡ  ４プライマー（５’−ＡＧＧＣＴＴＴＴＧＡＴＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＡＧ−３’／配列番号：２１）を作製し、マウス腎臓由来ｐｏｌｙＡ＋  ＲＮＡより作製したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、約２ｋｂｐの断片が増幅され、これをアガロース電気泳動後切り出して精製し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ法によってサブクローニングした。複数のクローンをシークエンジングし、「マウスＯＣＴＮ１」の配列を決定した。決定したｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：２３に、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２２に示す。
［実施例１０］  「マウスＯＣＴＮ２」のクローニング
まず、「ヒトＯＣＴＮ２」ｃＤＮＡの配列よりＭＯＮＢ  ２０プライマー（５’−ＣＣＣＡＴＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＣＡＡＡＡＡＧＣ−３’／配列番号：２４）を作製し、マウス腎臓由来Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を鋳型とした５’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）により、このプライマーより５’側上流をクローニングした。次に、「ヒトＯＣＴＮ２」配列を用いデータベースサーチをすることにより、これと非常に高い相同性を有するマウス由来ＥＳＴをいくつか見いだし、これらのＥＳＴの配列からＭＯＮＢ  ２６プライマー（５’−ＡＣＡＧＡＡＣＡＧＡＡＡＡＧＣＣＣＴＣＡＧＴＣＡ−３’／配列番号：２５）を作製した。５’−ＲＡＣＥによって得られた配列からＭＯＮＢ  ６プライマー（５’−ＴＧＴＴＴＴＴＣＧＴＧＧＧＴＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧ−３’／配列番号：２６）を作製し、これとＭＯＮＢ  ２６プライマーを用いたＰＣＲにより、３’側断片をマウス腎臓由来ｐｏｌｙＡ＋  ＲＮＡより作製したｃＤＮＡより増幅した。それぞれの断片をサブクローニングした後、あるいは直接にシークエンシングすることにより「マウスＯＣＴＮ２」の配列を決定した。決定したｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：２８に、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２７に示す。
［実施例１１］  「マウスＯＣＴＮ１」および「マウスＯＣＴＮ１」の組織発現解析
「マウスＯＣＴＮ１」および「マウスＯＣＴＮ２」遺伝子の各組織における発現量をマウスＭＴＣ（Ｍａｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ）パネル（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いたＲＴ−ＰＣＲ法により調べた（図１３）。用いたプライマーは、「マウスＯＣＴＮ１」については「ＭＯＮＬ  １」および「ＭＯＮＡ  ４」、「マウスＯＣＴＮ２」については「ＭＯＮＢ  ６」および「ＭＯＮＢ  ２６」である。その結果、「マウスＯＣＴＮ１」は腎臓や肝臓に、「マウスＯＣＴＮ２」は腎臓、肝臓および７日目の胚に高い発現が認められた。
産業上の利用の可能性
本発明により、有機カチオンを輸送する新規なトランスポーター遺伝子ファミリーおよびこれら遺伝子がコードするタンパク質が提供された。本発明のトランスポータータンパク質は、これを介して輸送される新規なデザインの薬物の開発や、その機能異常などに起因する疾患の治療薬の開発などに有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、「ヒトＯＣＴＮ１」と「ヒトＯＣＴＮ２」の疎水性プロットを示す。Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの計算式による。Ｗｉｎｄｏｗサイズは９アミノ酸である。数字は予想される膜貫通領域を示す。
図２は、「ヒトＯＣＴＮ１」のノーザン解析の結果を示す電気泳動像である。
図３は、「ヒトＯＣＴＮ１」と「ヒトＯＣＴＮ２」のアミノ酸配列の比較を示す。一致するアミノ酸は影付きで表す。糖トランスポーターのコンセンサス配列に一致する配列を「＋」で、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合サイトのコンセンサス配列に一致する配列を「＊」で示す。
図４は、「ヒトＯＣＴＮ２」のノーザン解析の結果を示す電気泳動像である。
図５は、「ヒトＯＣＴＮ１」のＴＥＡの吸収活性を示す。白丸は未処理の細胞、黒丸は「ヒトＯＣＴＮ１」を導入した細胞を示す。
図６は、図５の実験系に対するコールドＴＥＡの添加による影響を示す。図中の黒丸は「ヒトＯＣＴＮ１」を導入した細胞、白丸はインサートを含まないベクターを導入した細胞、白三角は黒丸の値から白丸の値を差し引いた、正味の「ヒトＯＣＴＮ１」による取り込み量を指す。
図７は、「ヒトＯＣＴＮ１」におけるＴＥＡ吸収活性のＴＥＡ濃度依存性を示す。
図８は、「ヒトＯＣＴＮ１」を導入した細胞におけるＴＥＡ以外の物質の吸収活性を示す図である。
図９は、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞を用いたトランスポート実験の結果を表す。「ＯＣＴＮ１」、「Ｗａｔｅｒ」と示したバーはそれぞれ、「ヒトＯＣＴＮ１」ｃＲＮＡをインジェクトした場合、及びｃＲＮＡを含まない水をインジェクトした場合の取り込み活性を示す。「ヒトＯＣＴＮ１」ｃＲＮＡをインジェクトした卵母細胞へのＴＥＡ、カルニチン、メピラミン、及びキニジン及びアクチノマイシンＤの取り込みが観察された。一方、ｃＲＮＡを含まない水をインジェクトした卵母細胞はほとんど取り込み活性を示さなかった。
図１０は、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞を用いた抗癌剤のトランスポート実験の結果を表す。「ＯＣＴＮ１」、「Ｗａｔｅｒ」と示したバーはそれぞれ、「ヒトＯＣＴＮ１」ｃＲＮＡをインジェクトした場合、及びｃＲＮＡを含まない水をインジェクトした場合の取り込み活性を示す。「ヒトＯＣＴＮ１」ｃＲＮＡをインジェクトした卵母細胞へのアクチノマイシンＤ、エトポシド、ビンブラスチン、及びダウノマイシンの取り込みが観察された。
図１１は、ＨＥＫ２９３細胞における「ヒトＯＣＴＮ１」と「ヒトＯＣＴＮ２」のトランスポート実験の結果を表す。「ヒトＯＣＴＮ１」はＴＥＡを、また「ヒトＯＣＴＮ２」はカルニチンを効率よく輸送する活性を持つことがわかる。
図１２は、「ヒトＯＣＴＮ２」のカルニチン輸送活性に対するＮａの依存性を調べた結果を示す。「ヒトＯＣＴＮ２」はＮａ存在下、時間に依存したカルニチンの輸送活性を示す（白丸）が、この活性はＮａ非存在下には全く見られず（黒丸）、「ヒトＯＣＴＮ２」のカルニチン輸送活性はＮａの存在に依存していることがわかる。
図１３は、「マウスＯＣＴＮ１」および「マウスＯＣＴＮ２」遺伝子の発現を各組織においてＲＴ−ＰＣＲによって検出した図である。Ｇ３ＰＤＨはコントロールであり、各ｃＤＮＡ量がそろっていることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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