(57)【要約】  高感度かつ高い特異性でヒトAD（アルツハイマー病）、FTLD（前頭側頭葉変性症）およびALS（筋萎縮性側索硬化症）からなる群から選択される神経変性疾患を検出する方法の提供。  以下の工程を含む、ヒトAD（アルツハイマー病）、FTLD（前頭側頭葉変性症）およびALS（筋萎縮性側索硬化症）からなる群から選択される神経変性疾患を検出する方法：(i)  被験体から採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質および非リン酸化MARCKSタンパク質を測定する工程；(ii)  (i)で得られた測定値から以下の式で表されるDO値を算出する工程；および[式１]2019172427.tif 000007[式中、「pSer46-MARCKS」は46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量を示し、「non-phosphorylated-MARCKS」は非リン酸化MARCKSタンパク質の量を示す](iii)  DO値を指標に神経変性疾患を検出する工程を含む方法。
2019172427.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、ヒトAD（アルツハイマー病）、FTLD（前頭側頭葉変性症）およびALS（筋萎縮性側索硬化症）からなる群から選択される神経変性疾患を検出する方法：
(i)  被験体から採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質および非リン酸化MARCKSタンパク質を測定する工程；
(ii)  (i)で得られた測定値から以下の式で表されるDO値を算出する工程；および
[式１]
2019172427.tif 000006
[式中、「pSer46-MARCKS」は46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量を示し、「non-phosphorylated-MARCKS」は非リン酸化MARCKSタンパク質の量を示す]
(iii)  DO値を指標に神経変性疾患を検出する工程
を含む方法。
【請求項２】
検体試料が脳脊髄液である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
「pSer46-MARCKS」および「non-phosphorylated-MARCKS」の測定を質量分析法により行う請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
式中の「pSer46-MARCKS」および「non-phosphorylated-MARCKS」が、検体試料中の全タンパク質量で正規化した値である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程(iii)において、被験体について算出されたDO値とあらかじめ定めたカットオフ値と比較し、カットオフ値より高い場合に、神経変性疾患が検出されたと判断する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
DO値のカットオフ値が、50〜55である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
以下の工程を含む、ヒトFTLD（前頭側頭葉変性症）、ALS（筋萎縮性側索硬化症）、PD（パーキンソン病）およびDLB（レビー小体型認知症）からなる群から選択される神経変性疾患を検出する方法：
(i)  被験体から採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質を測定する工程；
(ii)  被験体から採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量を健常人から採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量と比較する工程；および
(iii)  被験体から採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量が健常人から採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量よりも多い場合に、被験体において神経変性疾患が検出されたと判断する工程
を含む方法。
【請求項８】
検体試料が脳脊髄液である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の測定を質量分析法により行う請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量が、46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の測定値を、検体試料中の全タンパク質量または検体試料中の総MARCKSタンパク質量で正規化した値である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
以下の工程を含む、PD（パーキンソン病）およびDLB（レビー小体型認知症）からなる群から選択される神経変性疾患を検出する方法：
(i)  被験体の後頭葉および側頭葉からそれぞれ採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質を測定する工程；
(ii)  被験体の後頭葉および側頭葉からそれぞれ採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量を健常人の後頭葉および側頭葉からそれぞれ採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量と比較する工程；および
(iii)  被験体の側頭葉から採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量が健常人の側頭葉から採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量よりも多い場合に、被験体において神経変性疾患が検出されたと判断する工程
を含む方法。
【請求項１２】
検体試料が脳脊髄液である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の測定を質量分析法により行う請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量が、46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の測定値を、検体試料中の全タンパク質量または検体試料中の総MARCKSタンパク質量で正規化した値である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質イメージング用PETトレーサーを用い、46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の測定をPET（陽電子放射断層撮影）により行う請求項１１の方法。
【請求項１６】
46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質イメージング用PETトレーサーが、46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質に対する抗体をポジトロン核種でラベルした抗体PETトレーサーである請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、AD（アルツハイマー病）、FTLD（前頭側頭葉変性症）、ALS（筋萎縮性側索硬化症）、PD（パーキンソン病）およびDLB（レビー小体型認知症）の検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患の前臨床病理学は大きな注目を集めており、そのような早期病態を測定する定量的バイオマーカーが必要とされている。【０００３】
アルツハイマー病（AD）は、最も一般的な神経変性疾患であり、よく知られた認知症の原因である。【０００４】
ADの病因において最も支持されているモデルの1つは、アミロイドβペプチド（Aβ）の細胞外蓄積によって産生されるアミロイド原線維の細胞傷害性を前提とするアミロイド仮説である。【０００５】
この仮説に基づいて、AβはADの主要な治療ターゲットとして浮上した。バピネオズマブ（Bapineuzumab）やソラネズマブ（Solanezumab）のような抗体療法を含む治療戦略は、認知症発症後の臨床試験においてヒトAD患者の脳におけるAβ凝集を低下させたが、これまでの臨床的症状における認知症の回復は不十分であった。結果として、類似または新しい治療法がより効果的である可能性がある症状発生前のADの初期の分子事象に研究関心が移っている。【０００６】
本発明者らは、マウスADモデルおよびヒトAD患者からの脳組織の包括的なリン酸化タンパク質分析を行った。複数のADマウスモデルにおいて異常なリン酸化を有する17のコアタンパク質を同定した。興味深いことに、これらの変化は発症前に生じており、しかもAβ凝集がモデルマウスの脳において免疫組織学的に検出される前でさえ、いくつかのコアタンパク質において異常なリン酸化が検出され、AD病理の初期段階において重要な役割を果たすことが示唆された（非特許文献１を参照）。【０００７】
特に、定量的な質量分析では、Ser46でリン酸化されたMARCKS（ミリストイル化アラニンリッチCキナーゼ基質）の増加は、ADモデルマウスにおけるAβ凝集の組織学的検出の１ヶ月前に始まり、ヒトAD患者の死後も脳に残った（非特許文献１および２を参照）。MARCKSは、アクチン細胞骨格ネットワークとプロテインキナーゼC（PKC）の代表的な基質を固定するサブメンブランタンパク質である。抗pSer46-MARCKSを用いた免疫組織化学法により、ADモデルマウスにおいて症状の発症のはるか前の変性神経突起が検出され、またヒト剖検AD脳の老人斑を取り囲む変性神経突起が検出された（非特許文献２を参照）。さらに、Ser46でのMARCKSリン酸化が樹状突起棘を不安定化させ、神経突起変性を引き起こすことを明らかにした（非特許文献２を参照）。これらの結果は、pSer46-MARCKSが、ADの末期段階まで、そして恐らくは他の神経変性疾患において、超早期または前臨床段階から利用可能な神経突起変性の代用バイオマーカーであり得るという仮説を提供した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Tagawa, K. et al., Hum. Mol. Genet. 24, 540-58 (2015).
【非特許文献２】Fujita, K. et al., Sci. Rep. 6, 31895 (2016).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、高感度かつ高い特異性でヒトAD（アルツハイマー病）、FTLD（前頭側頭葉変性症）、ALS（筋萎縮性側索硬化症）、PD（パーキンソン病）およびDLB（レビー小体型認知症またはレビー小体病）からなる群から選択される神経変性疾患を検出する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記のように、本発明者らは以前に、アルツハイマー病（AD）マウスモデルにおける組織学的アミロイドβ（Aβ）凝集体の形成前でさえもリン酸化MARCKSが増加し、その変化がヒト死後AD脳で持続することを見出した。特に、Ser46でリン酸化されたMARCKS（pSer46-MARCKS）は、ヒト患者のマウスモデルおよび老人斑におけるAβ凝集体を取り囲む変性神経突起において検出された。【００１１】
本発明者らは、これらの知見に基づき、ヒトAD（アルツハイマー病）、FTLD（前頭側頭葉変性症）およびALS（筋萎縮性側索硬化症）の脳脊髄液（CSF）におけるpSer46-MARCKSの量を定量化した。予期せぬことに、最も顕著な変化が前頭側頭葉変性症（FTLD）で検出され、神経突起変性がpSer46-MARCKSの免疫組織化学法によって確認された。脳脊髄液（CSF）のpSer46-MARCKSに関する特異性は1.0であり、これは明らかに神経変性を正常な症例と区別することができた。【００１２】
また、MARCKSにおける同様の変化が、マウスモデルおよびヒト患者の両方において、パーキンソン病とレビー小体病による認知症で生じることがわかった。【００１３】
ヒトα-Syn-BAC-Tg/GBA-hetero-KOマウスが症状を示さない時点で、α-シヌクレイン凝集体形成の前にpSer46 - MARCKSレベルの上昇が始まり、老化の間持続し、ヒトの死後の脳のパターンと一致した。【００１４】
この結果は、ADおよびPD/DLB病変における前凝集神経突起変性の共通メカニズムを強く示唆している。【００１５】
また、パーキンソン病（PD）およびレビー小体型認知症（DLB）のマウスモデルおよびヒト患者の両方において同様の変化が確認された。【００１６】
さらに、本発明者らは、ADのヒト患者および質量分析による他の神経変性疾患からの脳脊髄液（CSF）のpSer46-MARCKSおよび非リン酸化MARCKSを定量した。pSer46-MARCKSはそれ自身で感度・特異度ともに十分に高いが、本発明者らは、さらに診断パラメータとしての価値を高めるために、pSer46-MARCKSと非リン酸化MARCKSの統合に基づく新しいパラメータを開発した。そのパラメータにより、高感度かつ高い特異性で、複数の神経変性疾患を健常対照と区別することができた。さらに、病理学的分析により、pSer46-MARCKSが神経変性疾患全体の神経突起変性を反映することが明らかになった。これらの結果より、pSer46-MARCKSと非リン酸化MARCKSの統合により、すべての神経変性疾患のより感受性の高い決定的なバイオマーカーとして、「DO（Distance from origin)」と呼ばれる新しいパラメータを開発した。【００１７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  以下の工程を含む、ヒトAD（アルツハイマー病）、FTLD（前頭側頭葉変性症）およびALS（筋萎縮性側索硬化症）からなる群から選択される神経変性疾患を検出する方法：(i)  被験体から採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質および非リン酸化MARCKSタンパク質を測定する工程；
(ii)  (i)で得られた測定値から以下の式で表されるDO値を算出する工程；および
[式１]
2019172427.tif 000003
[式中、「pSer46-MARCKS」は46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量を示し、「non-phosphorylated-MARCKS」は非リン酸化MARCKSタンパク質の量を示す]
(iii)  DO値を指標に神経変性疾患を検出する工程
を含む方法。
[２]  検体試料が脳脊髄液である、[１]の方法。
[３]  「pSer46-MARCKS」および「non-phosphorylated-MARCKS」の測定を質量分析法により行う[１]又は[２]の方法。
[４]  式中の「pSer46-MARCKS」および「non-phosphorylated-MARCKS」が、検体試料中の全タンパク質量で正規化した値である、[１]〜[３]のいずれかの方法。
[５]  工程(iii)において、被験体について算出されたDO値とあらかじめ定めたカットオフ値と比較し、カットオフ値より高い場合に、神経変性疾患が検出されたと判断する、[１]〜[４]のいずれかの方法。
[６]  DO値のカットオフ値が、50〜55である、[５]の方法。
[７]  以下の工程を含む、ヒトFTLD（前頭側頭葉変性症）、ALS（筋萎縮性側索硬化症）、PD（パーキンソン病）およびDLB（レビー小体型認知症）からなる群から選択される神経変性疾患を検出する方法：
(i)  被験体から採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質を測定する工程；
(ii)  被験体から採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量を健常人から採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量と比較する工程；および
(iii)  被験体から採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量が健常人から採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量よりも多い場合に、被験体において神経変性疾患が検出されたと判断する工程
を含む方法。
[８]  検体試料が脳脊髄液である、[７]の方法。
[９]  46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の測定を質量分析法により行う[７]又は[８]の方法。
[１０]  46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量が、46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の測定値を、検体試料中の全タンパク質量または検体試料中の総MARCKSタンパク質量で正規化した値である、[７]〜[９]のいずれかの方法。
[１１]  以下の工程を含む、PD（パーキンソン病）およびDLB（レビー小体型認知症）からなる群から選択される神経変性疾患を検出する方法：
(i)  被験体の後頭葉および側頭葉からそれぞれ採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質を測定する工程；
(ii)  被験体の後頭葉および側頭葉からそれぞれ採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量を健常人の後頭葉および側頭葉からそれぞれ採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量と比較する工程；および
(iii)  被験体の側頭葉から採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量が健常人の側頭葉から採取した検体試料中の46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量よりも多い場合に、被験体において神経変性疾患が検出されたと判断する工程
を含む方法。
[１２]  検体試料が脳脊髄液である、[１１]の方法。
[１３]  46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の測定を質量分析法により行う[１１]又は[１２]の方法。
[１４]  46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量が、46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の測定値を、検体試料中の全タンパク質量または検体試料中の総MARCKSタンパク質量で正規化した値である、[１１]〜[１３]のいずれかの方法。
[１５]  46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質イメージング用PETトレーサーを用い、46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の測定をPET（陽電子放射断層撮影）により行う[１１]の方法。
[１６]  46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質イメージング用PETトレーサーが、46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質に対する抗体をポジトロン核種でラベルした抗体PETトレーサーである[１５]の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-043641号、2018-138785号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の方法により、ヒトAD（アルツハイマー病）、FTLD（前頭側頭葉変性症）、ALS（筋萎縮性側索硬化症）、PD（パーキンソン病）およびDLB（レビー小体型認知症）からなる群から選択される神経変性疾患を高感度かつ高い特異性で検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１−１】脳脊髄液（CSF）のpSer46-MARCKSの診断のためのバイオマーカーとしての評価結果を示す図である。図１−１Ａは各神経変性疾患群におけるpSer46-MARCKSの量を全タンパク質により正規化した値で示す。図１−１Ｂは感度および特異性を示す。
【図１−２】脳脊髄液（CSF）のpSer46-MARCKSの診断のためのバイオマーカーとしての評価結果を示す図である。図１−２Ａは各神経変性疾患群におけるpSer46-MARCKSの量を総MARCKSタンパク質により正規化した値で示す。図１−２Ｂは感度および特異性を示す。
【図２−１】脳脊髄液（CSF）の非リン酸化MARCKSの診断のためのバイオマーカーとしての評価結果を示す図である。図２−１Ａは各神経変性疾患群における非リン酸化MARCKSの量を全タンパク質により正規化した値で示す。図２−１Ｂは感度および特異性を示す。
【図２−２】脳脊髄液（CSF）の非リン酸化MARCKSの診断のためのバイオマーカーとしての評価結果を示す図である。図２−２Ａは各神経変性疾患群における非リン酸化MARCKSの量を総MARCKSタンパク質により正規化した値で示す。図２−２Ｂは感度および特異性を示す。
【図３−１】AD、FTLDおよびALS患者におけるpSer46-MARCKS量を示す図である。図３−１Ａは全タンパク質で正規化した量を示し、図３−１Ｂは総MARCKS量で正規化した値を示す。
【図３−２】AD、FTLDおよびALS患者における非リン酸化MARCKS量を示す図である。図３−２Ａは全タンパク質で正規化した量を示し、図３−２Ｂは総MARCKS量で正規化した値を示す。
【図４−１】AD、FTLDおよびALS患者における、全タンパク質量で正規化したときのpSer46-MARCKSと非リン酸化MARCKSとの関係を示す図であり、各疾患群ごとに示す（Ａ：対照、Ｂ：AD、Ｃ：FTLD、Ｄ：ALS）。
【図４−２】図４−１のＡ〜Ｄの関係を全て表した図である。
【図４−３】AD、FTLDおよびALS患者における、総MARCKS量で正規化したときのpSer46-MARCKSと非リン酸化MARCKSとの関係を示す図であり、各疾患群ごとに示す（Ａ：対照、Ｂ：AD、Ｃ：FTLD、Ｄ：ALS）。
【図４−４】図４−３のＡ〜Ｄの関係を全て表した図である。
【図５−１】脳脊髄液（CSF）におけるHMGB1とpSer46-MARCKSとの関係を示す図である（全タンパク質量に対するpSer46-MARCKS）。
【図５−２】脳脊髄液（CSF）におけるHMGB1とpSer46-MARCKSとの関係を示す図である（総MARCKS量に対するpSer46-MARCKS）。
【図６−１】ヒトFTLDのpTDP-43染色像を示す図である。
【図６−２】ヒトFTLDの脳の抗pSer46-MARCKS抗体による免疫組織化学染色の結果を示す図である。
【図６−３】ヒトFTLD後頭葉(後頭皮質）におけるMAP2およびpSer46-MARCKSの共染色の結果を示す図である。
【図７】ヒトFTLDにおける前頭葉(前頭皮質）および後頭葉（後頭皮質）のニューロンの消失および海綿状の変性を示す図である。
【図８−１】数値シミュレーションにより最良の「DOの正常の上限」を探索した結果を示す図である。
【図８−２】各疾患におけるDO値を示す図である。
【図８−３】コントロール、AD、FTLD、ALS群で異常と判断された症例数、対象スコアとDO範囲での最大限の最適化時の感度と特異度の値を示す図である。
【図９】臨床症状におけるDOと疾患重症度との相関を示す図である。
【図１０Ａ】死後のヒトADおよびDLB脳の総合的なホスホプロテオーム解析の結果を示す図であり、独立したリン酸化部位をADとDLBとで比較した結果を示す図である。
【図１０Ｂ】死後のヒトADおよびDLB脳の総合的なホスホプロテオーム解析の結果を示す図であり、ヒトDLB患者とAD患者との間のMARCKS [Ser27 / Ser27、Ser46 / Ser46、Ser145 / Ser138、およびThr150 / Thr143（ヒト/マウス）]における4つの異なるリン酸化部位における変化の比較を示す図である。
【図１１Ａ】ヒトDLB脳の免疫組織化学を示し、pSer46-MARCKSのMAP2との同時染色の結果を示す図である。非DLB対照患者（非DLB患者）（女性5人）およびヒトDLB患者（女性5人）からの側頭葉の低倍率像（左端のパネル）および高倍率像（右２列のパネル）を示す。Olympus FV1200 IX83共焦点顕微鏡法で画像を取得した。全ての棒グラフは平均値及びS.E.Mを示す。各患者において、対応する領域から無作為に選択した10視野（100×100μm）において、信号強度（平均ピクセル強度）の定量分析を行った。統計分析は、スチューデントのt検定を用いて行った。**はp <0.01を示す。
【図１１Ｂ】ヒトDLB脳の免疫組織化学を示す図である。pSer129-α-Synの染色は、同じ患者群の複数の細胞質封入体（レビー小体）を明らかにした。
【図１１Ｃ】ヒトDLB脳の免疫組織化学を示す図であり、pSer129-α-Synによるユビキチンの同時染色の結果を示す図である。
【図１１Ｄ】ヒトDLB脳の免疫組織化学を示す図であり、pSer46-MARCKSとpSer129-α-Synとの共染色の結果を示す図である。
【図１１Ｅ】ヒトDLB脳の免疫組織化学を示し。非DLB対照患者由来の後頭葉およびpSer46-MARCKS、全MARCKSおよびβ-アクチンに対する抗体を有するDLB患者のウエスタンブロット分析の結果を示す図である。グラフは、5人の患者および5人の非神経学的疾患対照からのpSer46-MARCKSの定量的結果を示す。バンド強度をβ-アクチンに対して正規化した。統計分析は、スチューデントのt検定を用いて行った。*はp <0.05を示す。
【図１２】ヒトにおけるpSer46-MARCKSの時系列変化を示す図である。α-Syn-BAC-Tg / GBA-ヘテロKOマウスpSer46-MARCKSおよびpSer129-α-Synは1、6、および24ヶ月齢（各時点で3匹の雄マウス）のヒト正常α-Syn-BAC-Tg /グルコセレブロシダーゼ（GBA） - ヘテロ-KOマウスで同時染色した。画像はオリンパスFV1200 IX83共焦点顕微鏡法により得た。全ての棒グラフは平均値及びS.E.Mを示す。3匹のマウスを各群に用い、無作為に脳領域から選択した各10個の視野（100×100μm）において、シグナル強度（平均ピクセル強度）の定量分析を行った。統計的解析は、2元ANOVAとそれに続くスチューデントのt検定を用いて行った。*はp <0.05を示し、**はp <0.01を示す。リン酸化の増加は、嗅球および前頭皮質で最初に検出され、続いて側頭および後頭皮質が検出された。pSer46-MARCKSのシグナル強度は、側頭および後頭部領域において急速に増加し、複数の脳領域の中で最も顕著になった。
【図１３Ａ】ヒトα-Syn-BAC-Tg / GBA-ヘテロKOマウスの嗅球におけるpSer46-MARCKSおよびpSer129-α-synの共染色の結果を示す図である（１ヶ月齢）。
【図１３Ｂ】ヒトα-Syn-BAC-Tg / GBA-ヘテロKOマウスの嗅球におけるpSer46-MARCKSおよびpSer129-α-synの共染色の結果を示す図である（６ヶ月齢）。
【図１３Ｃ】ヒトα-Syn-BAC-Tg / GBA-ヘテロKOマウスの嗅球におけるpSer46-MARCKSおよびpSer129-α-synの共染色の結果を示す図である（２４ヶ月齢）。
【図１３Ｄ】ヒトα-Syn-BAC-Tg / GBA-ヘテロKOマウスの嗅球におけるユビキチンの染色を示す。ユビキチンは、細胞のサブセット（黄色の矢印）にドット様構造または細胞質凝集体として共染色されたが、pSer129-α-Syn陽性/ユビキチン陰性のドットまたは凝集体も観察された。
【図１４Ａ】α-Syn-BAC-Tg / GBA-ヘテロKOマウスの頭頂葉の免疫組織化学を示す。pSer46-MARCKSおよびpSer129-α-Synは、24ヶ月齢で外部および内部ピラミッド細胞層に共染色された。pSer46-MARCKSは頂端の樹状突起および細胞体の両方で染色されたが、pSer129-α-Synは細胞質の凝集体で染色された。
【図１４Ｂ】α-Syn-BAC-Tg / GBA-ヘテロKOマウスの頭頂葉の免疫組織化学を示し、ヒトα-Syn-BAC-Tg / GBA-ヘテロKOマウス由来の壁側皮質組織の染色を示す。1、6および24ヶ月齢でpSer129-α-SynおよびpSer46-MARCKSまたはユビキチンについて共染色した。嗅球におけるものと同様の共染色パターンが頭頂葉で確認された。
【図１５】複数の時点でのα-Syn-BAC-Tg / GBA-ヘテロKOマウスの嗅球のウエスタンブロット分析の結果を示す図である。左パネル（３列）は、pSer46-MARCKS、pSer129-α-Synおよびユビキチンに対する抗体を用いた全皮質（各時点で3匹の雄）のウエスタンブロットの結果を示す。右のグラフは、pSer46-MARCKS、pSer129-α-Synおよびユビキチンについての3つの独立したブロットの定量分析の結果を示す。バンド強度をβ-アクチンに対して正規化した。統計的解析は、2元ANOVAに続いてスチューデントのt検定;スチューデントのt検定; * p <0.05、** p <0.01。
【図１６】MARKCSとα-synとの相互作用を示す図である。図１６Ａは、α-Syn-BAC-Tg / GBA-ヘテロKOマウスの脳サンプルからの抗-pSer46-MARCKSまたは抗-pSer129-α-Syn抗体による免疫沈降物を1、6および24ヶ月目に抗pSer129-α-Synまたは抗-pSer46-MARCKS抗体でブロットした結果を示し、図１６Ｂは、ヒトDLB患者の後頭葉皮質からの同様の共沈殿物を調べた結果を示す。
【図１７Ａ】マウスPD / DLBモデルおよびヒトDLB患者の皮質ニューロンにおけるErk1 / 2の活性化を示す図である。α-Syn-BAC-Tg / GBA-ヘテロKO（Tg）または1、6および24ヶ月齢の非トランスジェニック兄弟対照（非Tg）マウスからの後頭皮質914組織の共染色Erk1 / 2活性型（pThr202 / Tyr204-Erk1およびpThr185 / Tyr187-Erk2）に対する抗体およびpSer46-MARCKSに対する抗体によって同定された。右のグラフは、3匹のマウス（各マウスの平均値について10視野）におけるpErk1 / 2シグナル強度の定量分析を示す。統計的解析は、2元ANOVAとそれに続くスチューデントのt検定を用いて行った。 * p <0.05、** p <0.01。
【図１７Ｂ】マウスPD / DLBモデルおよびヒトDLB患者の皮質ニューロンにおけるErk1 / 2の活性化を示す図であり、マウス皮質におけるpSer46-MARCKSのMAP2またはGFAPとの同時染色の結果を示す。
【図１７Ｃ】マウスPD / DLBモデルおよびヒトDLB患者の皮質ニューロンにおけるErk1 / 2の活性化をし、DLB患者および非DLB対照患者（非DLB患者）からのヒト後頭葉におけるpErk1 / 2およびpSer46-MARCKSの同様の同時染色の結果を示す図である。
【図１７Ｄ】マウスPD / DLBモデルおよびヒトDLB患者の皮質ニューロンにおけるErk1 / 2の活性化を示し、1、6および24ヶ月齢の、抗-Pyrk1 / 2および-Erk1 / 2抗体によるα-Syn-BAC-Tg / GBA-ヘテロKO（Tg）または非トランスジェニック兄弟対照（非Tg）マウスからの全皮質組織のウエスタンブロット分析の結果を示す図である。
【図１７Ｅ】マウスPD / DLBモデルおよびヒトDLB患者の皮質ニューロンにおけるErk1 / 2の活性化を示し、ヒトDLB患者由来の後頭葉の同様のウエスタンブロット分析の結果を示す図である。
【図１８】１ヶ月齢のヒトα-Syn-BAC-Tg / GBA-ヘテロKOマウス中のpSer46-MARCKSを示す図である。pSer46-MARCKSおよびpSer129-α-Synを１ヶ月齢のヒト正常α-Syn-BAC-Tg /グルコセレブロシダーゼ-ヘテロKOマウス（各群３匹）中で共染色した。シグナル強度は黄色の領域で有意に高かった。
【図１９】６ヶ月齢のヒトα-Syn-BAC-Tg / GBA-ヘテロKOマウス中のpSer46-MARCKSを示す図である。pSer46-MARCKSおよびpSer129-α-Synを１ヶ月齢のヒト正常α-Syn-BAC-Tg /グルコセレブロシダーゼ-ヘテロKOマウス（各群３匹）中で共染色した。シグナル強度は黄色の領域で有意に高かった。
【図２０】２４ヶ月齢のヒトα-Syn-BAC-Tg / GBA-ヘテロKOマウス中のpSer46-MARCKSを示す図である。pSer46-MARCKSおよびpSer129-α-Synを１ヶ月齢のヒト正常α-Syn-BAC-Tg /グルコセレブロシダーゼ-ヘテロKOマウス（各群３匹）中で共染色した。シグナル強度は黄色の領域で有意に高かった。
【図２１】６ヶ月齢のα-Syn-BAC-Tg / GBA-ヘテロKO（Tg）マウスまたは非トランスジェニック兄弟対照（非Tg）マウスの末梢血細胞（PBC）および全大脳皮質（脳）の間でのpSer46-MARCKSのタンパク質レベルの比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本発明は、神経変性疾患を検出する方法である。本発明において、神経変性疾患の検出とは、被験体が神経変性疾患に罹患していると判断すること、あるいは、被験体が神経変性疾患を発症するリスクがあると判断することをいう。
【００２２】
また、本発明は、神経変性疾患を検出するための補助的データを取得する方法も含む。  本発明において、神経変性疾患は、アルツハイマー病（AD：Alzheimer disease)、前頭側頭葉変性症（FTLD：Frontotemporal lobar degeneration）、筋萎縮性側索硬化症（ALS：Amyotrophic lateral sclerosis）、パーキンソン病（PD：Parkinson's disease）およびレビー小体型認知症（DLB：dementia with Lewy body）を含む。
【００２３】
「アルツハイマー病」とは、アルツハイマー型認知症とも称される神経変性疾患であり、遺伝子の変異に起因する「家族性アルツハイマー病」および「遺伝性アルツハイマー病」や、生活習慣やストレスといった環境因子による「孤発性アルツハイマー病」も含まれる。
【００２４】
「前頭側頭葉変性症」とは、FTLDとも称される、早期には前頭葉・側頭葉に萎縮を呈し、晩期には脳全体の萎縮に至る、非アルツハイマー病型の神経変性疾患のことである。すなわち、前頭側頭葉変性症には、臨床的特徴上分類される３種の疾患、前頭側頭型認知症（FTD）、進行性非流暢性失語（PNFA）および意味性認知症（SD）が含まれ、また病理学上においては、細胞内に異常タンパク質として蓄積されるタンパク質の種類に応じ、FTLD-Tau、FTLD-TDP、FTLD-UPSおよびFTLD-FUSに分類される４種の疾患が含まれる。
【００２５】
さらに、FTLD-Tauは、細胞内に優位に蓄積されるtauタンパク質中の微小管結合領域のリピート数に応じ、3R Tau型、4R Tau型および3/4R Tau型に分類される。また、3R Tau型には、Pick球を伴うFTLD（ピック病）、MAPT（微小管関連蛋白tau）遺伝子変異を伴うFTLD(FTLD-17)等が含まれ、4R Tau型には、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、認知症を伴う多系統タウオパチー、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀顆粒病）、MAPT遺伝子変異を伴うFTLD(FTLD-17)等が含まれ、3/4R Tau型には、神経原線維変化型認知症、MAPT遺伝子変異を伴うFTLD（FTLD-17）等が含まれる。一方、tauが陰性であり、ユビキチン陽性封入体を有するFTLD群は、FTLD-Uと称され、上記FTLD-TDP、FTLD-UPSおよびFTLD-FUSが含まれる。
【００２６】
FTLD-TDPは、FTLD-Uのうち、TDP-43が陽性の疾患を意味し、該疾患には、PGRN（progranulin(プログラニュリン）遺伝子）変異を伴うFTLD、孤発性のFTLD-TDP/FTLD-U、TARDBP（TDP-43遺伝子）変異を伴うFTLD、VCP（valosin含有蛋白遺伝子）変異を伴うFTLD、９番染色体に連鎖するFTLD等が含まれる。また、FTLD-FUSは、FTLD-Uのうち、TDP-43が陰性であり、FUS(fused in sarcoma)が陽性の疾患を意味し、該疾患には、神経細胞性中間径フィラメント封入体病、非典型的FTLD-U、好塩基性封入体病、FUS変異を伴うFTLD等が含まれる。
【００２７】
また、「TLD-UPSは、TDP-43が陰性であるFTLD-Uの１種であり、該疾患には、CHMP2B（荷電多発空胞体蛋白２Ｂ遺伝子）変異を伴うFTLD等が含まれる。
【００２８】
「筋萎縮性側索硬化症」とは、運動ニューロン病の一種であり、重篤な筋肉の委縮と筋力低下を特徴とする神経変性疾患である。筋萎縮性側索硬化症の原因遺伝子として約20種類の遺伝子が報告されており、また、TDP-43の異常蓄積が原因とされている。
【００２９】
「パーキンソン病」とは、黒質のドーパミン神経細胞の変性を主体とする進行性変成疾患である。中脳の黒質・青斑核の色素脱失がみられ、黒質や青斑、迷走神経背側核、視床下部、交感神経節などの神経細胞脱落が生じて伝達物質ドーパミンが不足する。残存神経細胞やその突起の一部にレビー小体(Lewy body)という特徴的な封入体が認められる。
【００３０】
「レビー小体型認知症」とは、大脳皮質全体にレビー小体が現れるもので、進行性の認知機能障害に加えて、幻視症状とパーキンソン症候群を示す変性性認知症である。
【００３１】
プロテイン凝集は、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性（FTLD）、ハンチントン病（HD）、脊髄小脳失調（SCA）、および筋萎縮性側索硬化症（ALS）を含む神経変性障害の広く認められた特徴である。一般に、疾患関連タンパク質はミスフォールド構造をとると考えられ、その後、β-シートを含む凝集しやすい構造に変換される。
【００３２】
しかし、これらの構造の年代的および/または確率的変化の詳細は、ほとんど知られておらず、真の毒性種の正体と、凝集タンパク質または可溶性タンパク質が毒性であるかどうかについての議論を引き起こす。
【００３３】
AD治療の臨床試験は、これらの議論に大きな影響を与えてきた。抗Aβ抗体による受動免疫は、脳における細胞外Aβプラークの存在量を減少させることに大いに成功している。
【００３４】
しかしながら、これらの試験においては、Aβ-PET（陽電子放射断層撮影）の改善と臨床症状の改善との間に相違があることが報告されている。
【００３５】
したがって、早期段階の病態の解明は、ADの病因の解明と治療法の開発にとって緊急の課題であり、状況はPD / DLBを含む他の神経変性疾患においてほぼ同様である。
マウスADモデルおよびヒトAD患者からの脳サンプルの包括的なリンタンパク質分析は、細胞外Aβプラークが組織学的に検出可能になる前にいくつかのタンパク質のリン酸化の変化が開始されることを明らかにした（Tagawa et al. (2015)  Hum Mol Genet 24:540-558）。
【００３６】
Ser46でのMARCKSのリン酸化は、TLR4を介した損傷関連分子パターン（DAMP）、特にHMGB1によって誘発される（Fujita et al, (2016) Sci Rep 6:31895）。
【００３７】
今回、グルコセレブロシダーゼ（GBA） - ヘテロ接合ノックアウト（KO）バックグラウンド（ヒトα-Syn-BAC-T細胞）中のヒト正常α-シヌクレイン（α-Syn）を過剰発現するBAC-Tgマウスにおいて、ヒトDLB患者における観察と同様のSer46でのMARCKSのリン酸化を検出した。セリン46（pSer46-MARCKS）上のMARCKSのリン酸化の組織学的特徴および脳における時系列進行は、ADおよびPD / DLBにおいて同様であった。興味深いことに、神経変性のこのマーカーは、組織学的に検出可能なα-Syn凝集体の形成前に陽性になった。
【００３８】
これらの結果は、ニューロン変性とタンパク質凝集との間の関係を明示し、神経突起変性の開始がタンパク質凝集体の形成に先行することを明らかにした。
【００３９】
pSer46-MARCKSは、超早期（前凝集/前臨床）段階でPD / DLBにおける分子病理を検出することができるバイオマーカーとして利用できる。
【００４０】
１．46位のセリンでリン酸化されたMARCKS（pSer46-MARCKS）の量に基づいた神経変性疾患の検出
本発明においては、ヒト生体試料中のMARCKSのリン酸化を指標にして、被験体がAD、FTLDまたはALSに罹患しているかどうかを検出する。「検出する」を「判定する」、「評価する」ともいう。
【００４１】
MARCKSとは、ミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質（myristoylated alanine rich protein kinase C substrate）であり、RefSeq ID:NP_002347(NP_002347.5)で特定されるヒト由来のタンパク質が挙げられる。また、MARCKSをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、RefSeq ID:NM_002356(NM_002356.6)に記載のコーディング領域（CDS）を含む核酸が挙げられる。
【００４２】
検体試料として用いる生体試料としては、被験体の身体から採取した体液、組織、細胞等（例えば、脳脊髄液、脳神経組織（特に神経学的生検組織）、血液、血漿、漿液、リンパ液、尿、唾液）が挙げられ、この中でも脳脊髄液が好ましい。
【００４３】
本発明においては、MARCKSの46位のセリン（Ser)のリン酸化を指標にする。
リン酸化MARCKSの検出法は限定されず、公知のいかなる方法も用い得る。例えば、質量分析法、免疫学的測定法が挙げられる。
【００４４】
質量分析法は、質量分析計を用いて行うことができる。質量分析計は、試料導入部、イオン化室、分析部、検出部、記録部等を含む。イオン化法としては、matrix-assisted laser desorption ionization（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化（ESI）法等を用いればよい。分析部は、二重収束質量分析計、四重極型質量分析計(QMS）、飛行時間型質量分析計（TOF)、フーリエ変換質量分析計（FT)、イオンサイクロトロン質量分析計（ICR)等が用いられる。精密な分析のために質量分析計を２台結合した、タンデム質量分析計（MS/MS）を用いることもできる。質量分析計は単独で用いられてもよいし、液体クロマトグラフィーなどの分離機器や測定機器などと接続してもよく、高速液体クロマトグラフィーと組み合わせた液体クロマトグラフ質量分析（LC/MS、LC/MS/MS）で分析することができる。
【００４５】
免疫学的測定法は、46位のセリンでリン酸化されたMARCKS（pSer46-MARCKS）を認識し得る抗pSer46-MARCKS抗体を用いた免疫学的測定法により行うことができる。免疫学的測定法としては、例えば、固相免疫測定法（RIA、EIA、FIA、CLIA等）、ドット・ブロッティング法、ラテックス凝集法（LA：Latex Agglutination-Turbidimetric Immunoassay）、イムノクロマト法などが挙げられる。抗体は基板上に固定化し用いることができる。この中でも、定量性の観点からEIA(Enzyme Immunoassay)法の１種であるELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法が好ましい。ELISA法では、抗体を固相化したマイクロタイタープレートのウェルに検体を添加し、抗原・抗体反応を行わせ、さらに酵素標識した抗体を添加し、抗原・抗体反応をさせ、洗浄後、酵素基質と反応・発色させ、吸光度を測定してサンプル中のマーカータンパク質または部分ペプチドを検出すると共に、その測定値から検体中のタンパク質または部分ペプチド濃度を算出することができる。また、蛍光標識した抗体を用いて、抗原抗体反応をさせた後に蛍光を測定してもよい。抗原抗体反応は4℃〜45℃、より好ましくは20℃〜40℃、さらに好ましくは25℃〜38℃で行うことができ、また、反応時間は、10分〜18時間、より好ましくは10分〜1時間、さらに好ましくは30分〜1時間程度である。免疫学的方法において用いられる抗体は、モノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体のFab、F(ab')、F(ab')2等の結合活性断片を用いることもできる。
【００４６】
さらに、46位のセリンでリン酸化されたMARCKS（pSer46-MARCKS）をPET（陽電子放射断層撮影）により検出することもできる。PETで検出する場合、pSer46-MARCKSをイメージングするためのトレーサーを被験体に投与し、被験体中のpSer46-MARCKSをPET（陽電子放射断層撮影）により検出すればよい。pSer46-MARCKSをイメージングするためのトレーサーとしては、例えば、46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質に対する抗体をポジトロン核種でラベルした抗体PETトレーサーが挙げられる。
【００４７】
本発明においては、健常人から採取した検体を陰性対照として同時に測定してもよい。ここで、「健常」とは、被験体がアルツハイマー病（AD)、前頭側頭葉変性症（FTLD）、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、PD（パーキンソン病）およびDLB（レビー小体型認知症）等の神経変性症に罹患していない状態をいう。この場合、被験体がアルツハイマー病（AD)、前頭側頭葉変性症（FTLD）、筋萎縮性側索硬化症（ALS）またはパーキンソン病（PD）およびレビー小体型認知症（DLB）等の神経変性症に罹患しているか、神経変性疾患を発症するリスクがある場合、被験体の検体中のMARCKSの46位のセリンにおけるリン酸化の程度が健常人に比べ高くなる。すなわち、被験体の検体中のpSer46-MARCKSの量が健常人に比べ高くなる。従って、被験体の検体中のMARCKSの46位のセリンにおけるリン酸化の程度が健常人よりも高い場合、pSer46-MARCKSは陽性と判断され、被験体においてアルツハイマー病（AD)、前頭側頭葉変性症（FTLD）または筋萎縮性側索硬化症（ALS）等の神経変性症が検出された、すなわち、被験体がアルツハイマー病（AD)、前頭側頭葉変性症（FTLD）、筋萎縮性側索硬化症（ALS）またはパーキンソン病（PD）およびレビー小体型認知症（DLB）等の神経変性症に罹患しているか、あるいは神経変性疾患を発症するリスクがあると判断することができる。
【００４８】
この際、上記の方法により、pSer46-MARCKSを定量し、得られた定量値を正規化して判断してもよい。正規化は、例えば、pSer46-MARCKS濃度を検体中の全タンパク質濃度で除すればよい。この場合、例えば、pSer46-MARCKS量を全タンパク質量に対する濃度（ppm）で表すことができる。また、pSer46-MARCKS濃度を定量し、検体中の総MARCKS（リン酸化MARCKSと非リン酸化MARCKSの総量）で除してもよい。この場合、pSer46-MARCKS量を総MARCKSに対する％で表すことができる。
【００４９】
例えば、被験体の検体中のpSer46-MARCKSの値が健常人の検体中の量の1.3倍以上、好ましくは1.5倍以上、さらに好ましくは2.0倍以上、特に好ましくは3.0倍以上の場合に被験体において、アルツハイマー病（AD)、前頭側頭葉変性症（FTLD）、筋萎縮性側索硬化症（ALS）またはパーキンソン病（PD）およびレビー小体型認知症（DLB）等の神経変性症が検出されたと判断することができる。
【００５０】
また、あらかじめ健常人の検体中のpSer46-MARCKSの量を測定しておき、該測定値に基づいてpSer46-MARCKS量の測定値についてカットオフ値(閾値）を定めておいてもよい。該カットオフ値を基準とし、カットオフ値を超えた場合に、被験体から採取した検体試料中のpSer46-MARCKS量が健常人から採取した検体試料中のpSer46-MARCKS量よりも多いと判断し、該被験体において、アルツハイマー病（AD)、前頭側頭葉変性症（FTLD）、筋萎縮性側索硬化症（ALS）またはパーキンソン病（PD）およびレビー小体型認知症（DLB）等の神経変性症が検出されたと判断することができる。
【００５１】
カットオフ値は、例えば、健常人対照群の平均+2SDに設定し、この値を超えたときに被験体において、アルツハイマー病（AD)、前頭側頭葉変性症（FTLD）、筋萎縮性側索硬化症（ALS）またはパーキンソン病（PD）およびレビー小体型認知症（DLB）等の神経変性症が検出されたと判断することができる。
【００５２】
２．DO（Distance from origin)値に基づいた神経変性疾患の検出
さらに、本発明においては、pSer46-MARCKSと非リン酸化MARCKSの統合により得られた新しいパラメータであるDO（Distance from origin)値を指標として、アルツハイマー病（AD)、前頭側頭葉変性症（FTLD）または筋萎縮性側索硬化症（ALS）等の神経変性疾患を検出する。DOは、pSer46-MARCKSと非リン酸化MARCKS量を統合して、両者を指標とするパラメータである。DOはpSer46-MARCKSの量と非リン酸化MARCKSタンパク質の量を(x、y）座標上にプロットしたときのプロットした点の座標の原点からの距離を反映した値であり、DOはpSer46-MARCKS量の２乗と非リン酸化MARCKS量の２乗を足した値の平方根、すなわち以下の式で表される。
[式１]
2019172427.tif 000004
式中、「pSer46-MARCKS」は46位でリン酸化されたMARCKSタンパク質の量を示し、「non-phosphorylated-MARCKS」は非リン酸化MARCKSタンパク質の量を示す。
【００５３】
DO値は、pSer46-MARCKSのみを指標とした場合よりも、より高感度かつ高い特異性でアルツハイマー病（AD)、前頭側頭葉変性症（FTLD）または筋萎縮性側索硬化症（ALS）等の神経変性疾患を検出することができる。DO値は、図８−１に示すように、数値シミュレーションを行うことにより、感度および特異性が良好となる正常の上限値（カットオフ値）を定めることができる。図８−１に示す数値シミュレーションのように、アルツハイマー病（AD)、前頭側頭葉変性症（FTLD）および筋萎縮性側索硬化症（ALS）の３つの疾患の感度（各疾患において最大= 1.0、したがって3つの疾患において最大=3.0）と３つの疾患に共通する特異性（３つの疾患の代表として最大=1.0）の合計である「客観的スコア」という別のパラメータを使用し、最も高い客観的スコアを生成するDOの範囲を選択すればよい。例えば、pSer46-MARCKSおよび非リン酸化MARCKSの量として、検体中の全タンパク質濃度で正規化した値を用いる場合、DO値のカットオフ値は、50〜55（ppm）となり、感度は、0.8〜1.0となり、特異性は0.8以上、好ましくは0.8となる。
【００５４】
また、あらかじめ健常人の検体中の検体中のpSer46-MARCKSの量と非リン酸化MARCKSの量を測定しておき、健常人についてDO値を算出し、該算出値に基づいてDO値についてカットオフ値(閾値）を定めておいてもよい。該カットオフ値を基準としDO値がカットオフ値を超えた場合に、該被験体においてアルツハイマー病（AD)、前頭側頭葉変性症（FTLD）または筋萎縮性側索硬化症（ALS）等の神経変性症が検出されたと、すなわち、該被験体は神経変性疾患に罹患しているか、あるいは神経変性疾患を発症するリスクがあると判断することができる。
【００５５】
さらに、アルツハイマー病（AD)および前頭側頭葉変性症（FTLD）において、疾患の重篤度とDO値は関連しており、DO値が高いほど疾患の重篤度が高いと判断することができる。
【００５６】
PD（パーキンソン病）およびDLB（レビー小体型認知症）においても、アルツハイマー病（AD）および前頭側頭葉変性症（FTLD）と同様に脳組織中のpSer46 -MARCKSレベルは上昇する。従って、PD（パーキンソン病）およびDLB（レビー小体型認知症）においても検体中のpSer46 -MARCKSレベル上昇により、神経変性を検出し、重症度を反映できる。
【００５７】
３．神経変性疾患の治療
本発明の方法で神経変性疾患が検出された場合、アルツハイマー病（AD)、前頭側頭葉変性症（FTLD）、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、パーキンソン病（PD）またはレビー小体型認知症（DLB）は以下の方法により治療あるいは症状の改善ができる可能性がある。
【００５８】
アルツハイマー病（AD)
ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、メマンチンなどのニューロン間の情報伝達を促進する医薬の投与、脳からアルツハイマー病の原因とされるアミロイドβを除去し得るバピネオズマブ（Bapineuzumab）やソラネズマブ（Solanezumab）のような抗体医薬の投与等による治療。
【００５９】
前頭側頭葉変性症（FTLD）
選択的セロトニン再取り込み阻害薬の投与、原因遺伝子とされるタウ遺伝子、TDP-43遺伝子、プログラニュリン遺伝子などの遺伝子を標的とした治療。
【００６０】
筋萎縮性側索硬化症（ALS）
リルゾール、エダラボン、メチルコバラミン、レチガビン、BIIB067、MN-166などの医薬の投与、原因遺伝子として報告されているSOD1遺伝子、TDP-43遺伝子、FUS遺伝子、C9orf72遺伝子等の遺伝子を標的とした治療、ヒト多能性幹細胞を用いて神経細胞を再生させる再生治療等による治療。
【００６１】
パーキンソン病（PD）
薬物治療、外科治療、理学療法があり、薬物治療としてL-ドパとドパミンアゴニストの内服、外科治療として脳深部刺激療法（視床下核刺激術、淡蒼球刺激術、視床刺激術）と定位的破壊術（視床破壊術、淡蒼球破壊術）または脳深部刺激療法（DBS）。
【００６２】
レビー小体型認知症（DLB）
ドネペジルなどの医薬の投与。
【実施例】
【００６３】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００６４】
[実施例１]  アルツハイマー病（AD）、前頭側頭葉変性症（FTLD）および筋萎縮性側索硬化症（ALS）についての検討
方法
ヒト患者
名古屋大学および東北大学において、臨床症状、電気生理学的検査、MRI、SPECTおよびPETを含む神経イメージングにより診断された８人のAD患者、7人のFTLD患者および10人のALS患者からの脳脊髄液を使用した。【００６５】
対照被験体は、男性６名（平均年齢72.6歳、55〜83歳）および女性４名（平均年齢75.5歳、69〜79歳）であった。ミニメンタルステート検査（MMSE）スコアは、脳脊髄液（CSF）を採取した時点で25以上（平均28.3、26〜30）であった。AD患者は男性２名（54歳および80歳）および女性６名（平均64.5歳、57〜75歳）であった。これらの患者のMMSEスコアは25を超えず（平均17.1、４〜25）、FABスコアの平均および範囲は9.3および６〜13であった。FTLD患者は男性５人、女性２人であった。これらの患者のMMSEスコアの平均および範囲は18.1および７〜30であり、FABスコアの平均および範囲は8.6および３〜16であった。ALS患者は男性８人、女性２人であった。これらの患者のALSFR-Rスコアの平均および範囲は40.5および24〜47であった。9例のALS症例が「確定」と診断され、1例が「可能性のある」ALS症例と診断された。【００６６】
サンプルの調製
プロテオーム分析のために、脳脊髄液（CSF）から試料を調製した。すなわち、ヒト患者由来の脳脊髄液50μlを、100mM Tris-HCl（pH7.5）、2％SDSおよび1mM DTTを含有する5μlの緩衝液に添加し、100℃で15分間インキュベートした。【００６７】
サンプル溶液を16,000g、4℃で10分間遠心分離し、上清を0.22μmPVDFフィルター（Millipore）を用いて濾過した。アリコート（55μL）を25μLの1Mトリエチルアンモニウム重炭酸塩（TEAB）（pH8.5）、0.75μLの10％SDSおよび7.5μLの50mMトリス-2-カルボキシエチルホスフィンに添加し、60℃で1時間インキュベートした。システイン残基を10mMメチルメタンチオスルホネートを用いて10分間25℃でブロックした。次いで、サンプルを24mM CaCl2中の1.5μgのトリプシン（10：1＝タンパク質：酵素、w/w）で37℃で24時間消化し、C18スピンカラム（MonoSpin C18、GL Sciences Inc.）により脱塩し、乾燥させ、0.1％ギ酸35μlに溶解した。【００６８】
SWATH-脳脊髄液の質量分析
溶液A（0.1％ギ酸）を含むC18カラム（0.1mm×100mm、KYA Technologies Corporation）に30μlのアリコートを２〜41％の溶液AおよびBの勾配（99.9％アセトニトリルおよび0.1％ギ酸）中で300nl /分の流速でEksigent NanoLC-Ultra 1D Plusシステム（Sciex Inc.）で分析し、2.3kVのイオンスプレー電圧でTriple TOF 5600システム（Sciex）に供した。IDA（information-dependent acquisition）は、２〜５回の荷電で400〜1000m/zに設定し、生成イオンのMS/MSスキャン範囲は100〜1600Daであり、スペクトルライブラリーの蓄積時間は100msであった。SWATH（登録商標）(sequential window acquisition of all theoretical mass spectra)は、400Daから1000Daにまたがる25Daの24の連続ウィンドウによって行われた。MS/MSスペクトルデータのSWATH取得をAnalyst TF1.6ソフトウェア（Sciex Inc.）により100ms /ウィンドウで行い、MS/MSスペクトルライブラリーをProtein Pilotソフトウェア（バージョン4.5）により調製した。MS/MSスペクトルデータは、Peakviewソフトウェア（バージョン1.2.0.3、Sciex Inc.）を用いて、ペプチドデータおよびLC保持時間と相関させた。同じペプチドからのMS/MS生成物イオンを合計し、ペプチドの量として使用した。【００６９】
質量データ分析
PeavView1.2ソフトウェアのSWATH 1.0アプリケーションを使用して、抽出されたイオンクロマトグラム（XIC）抽出ウィンドウの5分間およびXIC幅の0.01Daの条件で、MS/MSスペクトル生データを処理し、明確に同定された種のスペクトルを抽出した。XICは、小さなm/z範囲において、LC保持時間および相対イオン強度のグラフに示される曲線として示された。フラグメントイオンXICを合計してペプチドピーク領域を得、タンパク質当たりの複数のペプチドの面積を合計してタンパク質面積を得た。ペプチドの質量スペクトルデータは、個々の被験体ごとに、検出されたすべてのタンパク質の総量またはMARCKSタンパク質と相関するペプチドの総量によって正規化された（これらはそれぞれ、「全タンパク質」または「総MARCKS」と呼ぶ）。感度および特異性を計算するために、異常なリン酸化を対照群の平均量±2SDにより判定した。【００７０】
免疫組織化学法
免疫組織化学法のために、パラフィン包埋したヒト脳切片を脱パラフィンし、再水和させ、10mMクエン酸緩衝液（pH6.0、100℃）中で５回マイクロ波処理し、次いでPBSで５分間、２回洗浄した。ブロッキング（10％FBS、60分間）後、切片を2％FBSおよび0.1％Triton X-100を含有するPBSおよび一次抗体：ウサギ抗ホスホ-TDP43（pS409 / 410-2）（1：4000、Cosmo Bio Co.，LTD、TIP-PTD-P02）、ウサギ抗ホスホ-MARCKS（Ser46）（1：1000、GL Biochem（Shanghai）Ltd.）、マウス抗MAP2（AP20）（1：100、Santa Cruz Biotechnology）と4℃で一晩または二晩、最後に二次抗体：Alexa Fluor 488標識抗マウスIgG（1：1000、Invitrogen）、Cy3標識抗ウサギIgG（1：500、Jackson ImmunoResearch）、ビオチン化抗ウサギIgG（1：200、Vector Laboratories、BA-10009)、ビオチン化抗マウスIgG（1：200、Vector Laboratories、BA-2000）と室温（RT）で60分間、インキュベートした。pSer46-MARCKS抗体を作製した。同様の宿主種（ウサギ抗ホスホ-MARCKSおよび抗ホスホ-TDP43抗体）由来の一次抗体を、Zenon Rabbit IgG Labeling Kits（Thermo Fisher Scientific、IL）によって標識し、二重免疫染色に使用した。ホスホ-TDP43またはMAP2の酵素的検出のために、VECTASTAIN Elite ABC標準キット（Vector Laboratories、PK-6100 CA）およびDABペルオキシダーゼ基質キット（Vector Laboratories、SK-4100）を使用した。DAB染色の場合、切片を、Carrazzi's Hematoxylin溶液（1.15938.0025、Merck）を用いて室温で10分間対比染色し、水道水で10分間洗浄し、室温で5分間エオシン溶液（80％エタノールで希釈した0.25％エオシン、Wako）で染色し、エタノールで脱水した。キシレンで洗浄した後、切片を覆った。核はDAPI（同仁研究所、D523）で染色した。画像は、共焦点顕微鏡（Olympus、FV1200 IX83）および光学顕微鏡（Olympus、BX53）により得られた。【００７１】
Nissl染色
ヒト脳のパラフィン包埋切片を脱パラフィンし、再水和した。蒸留水で洗浄した後、切片をクレシルバイオレット溶液（300mLの0.1％クレシルバイオレットを蒸留水に5滴の10％酢酸溶液と共に加え、次いで使用前に濾過した）を37℃で15分間浸漬した。次いで、切片をエタノールで脱水し、キシレンで洗浄し、カバーガラスで覆った。画像は光学顕微鏡（Olympus、BX53）により得た。【００７２】
数値シミュレーション
正常の上限の数値シミュレーションで最大化するためのパラメータとして、3つの疾患（各疾患において最大= 1.0、3つの疾患において最大= 3.0）からの感度値および3つの疾患（3つの疾患の代表として最大= 1.0）によって共有される特異値の3つの疾患の合計を採用した。また、Rプログラム言語（バージョン3.4.0、R統計学コンピューティング、https://www.R-project.org/)を使用したオリジナルの数値シミュレーションプログラムを開発し、パラメータを最大化する正常の上限を最適化した。DO値とそのカテゴリーの主部をプログラムに入れた。最初の試行では、本質的な解析範囲を決定するためにプログラムを実行し、3つの疾患の感度スコアが0になったときのシミュレーションのDOの上限を1,000と決定した。この範囲内で、数値シミュレーションを繰り返して客観的スコアを最大化する最適なDOを見出した。【００７３】
統計的解析
疾患群と対照群との間の生物学的距離をウィルコクソンの順位和検定によって試験した。各被験体におけるpSer46と非リン酸化ペプチドとの間の相関を評価するために、ピアソンの相関係数を算出した。Pearsonの相関係数を用いて、各被験体におけるHMGB1濃度とpSer46-MARCKSシグナルとの相関も算出した。【００７４】
結果
神経変性疾患の脳脊髄液（CSF）におけるpSer46-MARCKS
質量分析を用いて、ヒトの患者から、アルツハイマー病（AD）、前頭側頭葉変性症（FTLD）および筋萎縮性側索硬化症（ALS）の３つの神経変性疾患のヒト患者由来の脳脊髄液（CSF）のpSer46-MARCKSを定量した、ならびに対照から定量化した。疾患群または個々の被験体におけるリン酸化ペプチドの相対量を比較するために、各被験体について、質量分析で検出された全タンパク質の量または総MARCKSタンパク質によって量を正規化した。ペプチドは、95％以上の信頼性で決定された。【００７５】
脳脊髄液（CSF）のpSer46-MARCKSを診断のためのバイオマーカーとして評価するために、３つの疾患群における全タンパク質（図１−１ＡおよびＢ）または総MARCKSタンパク質（図１−２ＡおよびＢ）によって正規化されたpSer46-MARCKSの感度および特異性を計算した。図１−１ＡはpSer46-MARCKSの値を各疾患群ごとにプロットした図であり、値はそれぞれの被験体の全タンパク質量により正規化してある。図１−２ＡはpSer46-MARCKSの値を各疾患群ごとにプロットした図であり、値はそれぞれの被験体の総MARCKSタンパク質量により正規化してある。図１−１Ａおよび図１−２Ａの下の長方形のボックス部分は対照群の平均数±2SDを示し、ボックス中の線は健常対照の平均を示す。図１−１Ｂおよび１−２Ｂは、感度および特異性を示す。患者の値が対照群の平均+ 2SDを超えたときに異常と判断した。この状態では、神経変性疾患の３つのグループすべてにおいてpSer46-MARCKSの特異性が非常に高いことが判明した（図１−１Ｂおよび図１−２Ｂ）。これは、pSer46-MARCKSが対照の平均+ 2SDを上回った場合、被験体は確実に異常であることを意味する。【００７６】
一方、診断のためのpSer46-MARCKSの感度は、すべての疾患群において比較的低かった。pSer46-MARCKSがタンパク質全体で正規化された場合、感度はADでは0.50、FTLDでは0.57、ALSでは0.40であった（図１−１Ｂ）。総MARCKSにより正規化されたpSer46-MARCKSの場合、値はより小さかった（図１−２Ｂ）。したがって、この分析段階では、疾患特異的バイオマーカーまたはスクリーニングバイオマーカーではなく進行バイオマーカーのように、pSer46-MARCKSの使用を制限することが適切であると考えられた。【００７７】
同様の方法で、３つの神経変性疾患（図２−１および２−２）のヒト患者由来の脳脊髄液（CSF）の非リン酸化MARCKSを定量した。図２−１Ａは各疾患群の非リン酸化MARCKSの量をプロットした図であり、値は全タンパク質により正規化してある。図２−２Ａは各疾患群の非リン酸化MARCKSの量をプロットした図であり、値は総MARCKSタンパク質量により正規化してある。図２−１Ａおよび図２−２Ａの下の長方形のボックス部分は対照群の平均数±2SDを示し、ボックス中の線は健常対照の平均を示す。図２−１Ｂおよび２−２Ｂは、感度および特異性を示す。この場合、ADおよびALSでは特異性が100％に達しておらず、感度は0であった。したがって、非リン酸化MARCKS単独は、明らかに診断バイオマーカーには適していなかった。【００７８】
脳脊髄液（CSF）のpSer46-MARCKSのAD、FTLDおよびALSにおける上昇
次に、疾患群と対照との間のpSer46-MARCKSの値を比較した。図３−１に各被験体のpSer46-MARCKSの量を、図３−２に各被験体の非リン酸化MARCKSの量を示す。図３−１Ａおよび３−２Ａの量は全タンパク質量により正規化し、図３−１Ｂおよび３−２Ｂの量は総MARCKS量で正規化した。図中の線は各群の中央値を示す。疾患群で認められた以上に高い値を考慮し、各群の値を比較するためにノンパラメトリックなウィルコクソンの順位和検定を行い、AD患者と対照（p = 0.02941）、FTLDと対照（p = 0.00358）、およびALSと対照（p = 0.0007）の間に統計的な差があることを見出した（図３−１Ａ）。pSer46-MARCKSの正規化の方法によって結果は変わったが、pSer46-MARCKSを総MARCKS（図３−１Ｂ）で正規化すると、FTLD患者と対照（p = 0.0128）の差は維持された。さらに、非リン酸化MARCKSの値は、AD患者と対照（p = 0.0455）およびALS患者と対照（p = 0.0212）の間で、全タンパク質によって値が正規化された場合にも統計的に差があることがわかった（図３−２Ａ）。さらに、総MARCSによって値が正規化された場合にFTLD患者と対照（p = 0.0217）との間で統計的に差があることがわかった（図３−２Ｂ)。【００７９】
pSer46-MARCKSと非リン酸化MARCKSの関係
次に、各群におけるpSer46-MARCKSと非リン酸化MARCKSとの関係（比）を解析した（図４−１〜４−３）。図４−１はAD、FTLDおよびALS疾患群のそれぞれについて、全タンパク質量で正規化した値をプロットした図であり、図４−２は図４−１のそれぞれのプロットをマージした図である。図４−３はAD、FTLDおよびALS疾患群のそれぞれについて、総MARCKS量で正規化した値をプロットした図であり、図４−４は図４−３のそれぞれのプロットをマージした図である。対照群は、pSer46-MARCKSと非リン酸化MARCKS（図４−１および４−３）との間に明らかな正の関係を示したが、AD群は弱い負の関係を示し、FTLDおよびALS群はいずれの関係も示さなかった。この結果は、Ser46におけるMARCKSのリン酸化が、ADおよびFTLDにおいて病理学的に影響を受けることを意味し得る。【００８０】
もう1つの注目すべき点は、疾患群のプロットが、ほとんどが座標グラフ（x、y =非リン酸化MARCKS、pSer46-MARCKS）の対照群から決定された回帰直線の上に位置することであった（図４−２および４−４）。これは、pSer46-MARCKSが全タンパク質または全MARCKS（図４−１〜４−４）のどちらによって正規化されたかどうかにかかわらず、AD、FTLDおよびALS患者において、非リン酸化MARCKSに対するpSer46-MARCKSの比が増加する傾向を有することを意味する。これらの分析に基づいて、非リン酸化MARCKSに対するpSer46-MARCKSの比が病理学的変化のバイオマーカーとなり得るかどうかを試験した。しかし、群間の差は統計的に有意ではなかった（図４−１〜４−４）。スコアの相違が大きかったので（図４−１〜４−４）、これは、初期および後期の疾患相が混在した患者群の不均一性に起因する可能性がある。【００８１】
脳脊髄液（CSF）におけるHMGB1とpSer46-MARCKSとの関係
本発明者らは以前に、ダメージ関連分子パターン（DAMP）に属する代表的な分子であるHMGB1が、TLR4のシグナル伝達経路の下流のSer46でMARCKSリン酸化を誘発し、HMGB1に対する抗体がAD13の発症を遅らせる可能性があることを明らかにした。一連のアイデアに基づき、以前のデータを用いて、AD患者の脳脊髄液（CSF）におけるHMGB1とpSer46-MARCKSとの関係を試験した（図５−１および５−２）。図５−１は全タンパク質量に対するpSer46-MARCKSであり、図５−２は総MARCKS量に対するpSer46-MARCKSである。HMGB1およびpSer46-MARCKSに関する仮説が実際にインビボで適用されるかどうかを知るために、以前に公表されたデータ（別の試験者による）による遡及分析は非バイアス試験でなければならない。【００８２】
HMGB1-ELISA感度の閾値という技術的限界があり、HMGB1値はほとんどの患者で検出レベル以下であったが、AD患者の脳脊髄液（CSF）とPSER46-MARCKSの間に明らかに予想したよりも大きな正の相関が見られた（図５−１および５−２）。【００８３】
ヒトFTLDの変性神経突起中でのpSer46-MARCKSの上昇
次に、ADマウスモデルおよびADヒト患者において、変性神経突起のようなヒトFTLD脳における神経突起においてpSer46-MARCKSが増加したかどうかを試験した（Fujita, K. et al.，Sci. Rep. 6, 31895 (2016))。病理学的に診断されたヒトFTLDの脳（図６−１）を抗pSer46-MARCKS抗体による免疫組織化学法に用いた（図６−２ＡおよびＢ）。図６−１はヒトFTLDのpTDP-43染色像であり、TDP43染色により、TDP43の異常な分布およびTDP43の細胞質封入が明らかになった。また、図６−２ＡおよびＢは、抗pSer46-MARCKS抗体による免疫組織化学法を示す。図６−２Ａに示すように、FTLD後頭葉(後頭皮質）および前頭葉（前頭皮質）における神経突起変性が認められた（第IV層）。また、後頭葉の頂端の樹状突起および細胞体はよく染色されていた。しかし、図６−２Ｂに示すように、最も重篤に冒された前頭葉では染色はほとんど認められなかった。抗pSer46-MARCKS抗体と二次Cy3標識抗ウサギIgG抗体を用いて単一染色した後、552nmの励起光および570nmの蛍光で可視であったが、498nmの励起光および520nmの蛍光（図６−２Ｂ）、または552nmの励起光および520nmの蛍光（データは示されていない）では可視でなく、これは、これは染色が特異的であり、自己蛍光が発せられなかったことを示している。染色パターンは先の報告（Fujita, K. et al.， Sci. Rep. 6, 31895 (2016)）におけるヒトADの染色に非常に類似していた。FTLDにおいては比較的免れていた後頭葉において、pSer46-MARCKS陽性神経突起が頻繁に観察されたが、最も強く影響を受けた前頭葉ではほとんど観察されなかった。この議論を引き起こす発見は、pSer46-MARCKSは初期段階特異的マーカーであり、病期が進むと消失することを示している。図６−３ＡはヒトFTLD後頭葉におけるMAP2およびpSer46-MARCKSの共染色の結果を示し、抗pSer46-MARCKS抗体によってニューロンが染色された。ヒトFTLDの脳において、pSer46-MARCKSによって染色された突起および細胞体は、MAP2についても陽性であり、このことはそれらがニューロンおよび神経突起であることを示している（図６−３Ａ）。次に、pSer46-MARCKS陽性細胞が、凝集体を有するニューロンまたはTDP43の異常な細胞質分布を示すことを確認した。すなわち、図６−３Ｂは、細胞質リン酸化TDP43を有するニューロンはpSer46-MARCKと共染色されたことを示す。興味深いことに、pSer46-MARCKSおよびリン酸TDP43は、細胞質凝集体で共染色された（図６−３Ｃ）。【００８４】
ヒトFTLDのニッスル（Nissl）染色では、前頭葉のニューロンをほとんど検出できず、液胞塊では海綿状の変性しか認められなかった（図７Ａ）。一方、後頭葉には染色質融解や無色素などの異常な特徴を持つニューロンが認められた（図７Ｂ）。神経変性疾患ではない対照の脳では、ニューロン密度および神経網の形態等について、このような異常な変化は見られなかった（図７Ｃ）。【００８５】
バイオマーカーとしてのpSer46-MARCKSと非リン酸化MARCKSの統合値
プロットグラフ（図４−２および４−４）を見ると、対照被験体の（x、y）座標位置は原点（0,0）に比較的近いことがわかる。したがって、pSer46-MARCKSと非リン酸化型MARCKSを統合した変化の程度が、病理学的変化を正常対照と区別すると予測し、対照および疾患におけるpSer46-MARCKSの２乗+非リン酸化MARCKSの２乗の平方根（DO：Distance from origin）を算出した（図８−１）。すなわち、対照群と比較して３つの神経変性疾患群でDO値が統計的に増加し、Wilcoxson検定による差異が確認された（図８−２）。例外的に、一人の対照被験体は大きなDOを有していた。被験体は、ADASスコアの急激な低下（-3.216949153 /年）から判断すると、認知症の前臨床段階にある可能性がある。【００８６】
病理学的DO値を正常DO値と効率的に区別するために、最大感度および特異性の両方を生み出すことができる「DOの正常の上限」が必要であった。数値シミュレーションにより最良の「DOの正常の上限」を探索した（図８−１）。ここでは、３つの疾患の感度（各疾患において最大= 1.0、したがって3つの疾患において最大=3.0）と３つの疾患に共通する特異性（３つの疾患の代表として最大=1.0）の合計である「客観的スコア（objective score）」という別のパラメータを使用し、最も高い客観的スコアを生成するDOの範囲を見つけようとした（図８−１）。図８−１のグラフは、０〜1000までのDOの客観的スコアを示している。その結果、上限値が50.26から54.24の場合のDOにおいて、3.532という最高の客観的スコアが得られることがわかった（図８−１および８−２）。図８−２は、各疾患におけるDO値を示す。図中、DO値をボックスプロットで示した。正常の上限は数値シミュレーションによって決定した。各グループのボックスは、下位から上位の値を表わす。中央値もボックス内に表示されている。図８−３はコントロール、AD、FTLD、ALS群で異常と判断された症例数、対象スコアとDO範囲での最大限の最適化時の感度と特異度の値を示す。図８−１の閾値は、50.262のDOで一時的に示されたが、50.262から54.239のDOの範囲では感度および特異度は変化しなかった。図８−３に示すように、正常値の上限を50.26に設定することで、AD、FTLD、ALSにおいて0.875、0.857、1.00の感度で異常値を判定することができた（図８−３、図９）。特異性はすべての疾患において0.800であった（図８−３、図９）。特異度は、コントロール群から異常例を判断することにより、急速な認知低下を伴う症例を除外すると、0.889まで上昇した（図８−３の括弧内）。【００８７】
DOと疾患の重症度との相関
最後に、臨床症状におけるDOと疾患重症度との相関を調べた（図９）。AD（図９ＡおよびＢ）およびFTLD（図９ＣおよびＤ）では、MMSEとDO（図９ＡおよびＣ）またはFAB（Frontal Assessment Battery）とDO（図９ＢおよびＤ）では負の相関が認められ、これはDOがこれらの認知症における臨床症状の重篤度を反映することを示している。しかし、ALS機能評価スケール-R（ALSFRS-R）とDO（図９Ｅ）との間にALSにおける相関は検出されなかった。その理由は明らかではないが、ADとFTLDよりも速いALSの急速な進行が関連している可能性がある。例えば、病理学における実際の進行速度は、ALSの特定の時点における運動障害の重症度を反映しないことがある。【００８８】
本実施例の結果より以下のことが判明した。
Ser46でのMARCKSのリン酸化は、ADの非常に初期の段階で、近傍の細胞内Aβの細胞内蓄積を伴うニューロンから放出されるダメージ警告分子HMGB1によって誘導されるHMGB1-TLR4シグナル伝達経路を介して神経突起に起こることが報告されている（Fujita, K. et al.、Sci. Rep. 6, 31895 (2016))。本実施例では、これまでの知見に基づいて、AD、FTLDおよびALSの３つの脳脊髄液（CSF）において、初期の病理学的段階において利用可能な神経突起の変性の指標となるバイオマーカーとなることを期待して、Ser46でリン酸化されたMARCKSを評価した。【００８９】
すべての神経変性疾患において、脳脊髄液（CSF）のpSer46-MARCKSは非常に特異的であったが、感度はそれほどでもなかった（図１−１および１−２）。バイオマーカーとしてのpSer46-MARCKSの困難性を克服するために、非リン酸化MARCKSとpSer46-MARCKSの値を統合し、DOという新しいパラメータを生み出した（図８−１）。DOが高感度および高特異性の両方を有する良好なパラメータであり、DOはADおよびFTLDにおいて疾患重症度を良好に反映することを確認した。数値シミュレーションを用いて、３つの神経変性疾患における感度と特異度を最適化するために、DOの正常上限値の最良値をさらに検索した。その結果、50.26〜54.24の「正常のDOの上限」を用いて、AD、FTLD、ALSの感度はそれぞれ0.875、0.857、1.00となり、すべての疾患において0.800の特異性が得られた（図８−１〜８−３および図９）。【００９０】
意外にも、DOは複数の神経変性疾患において共通して変化した。また、DOとpSer46-MARCKSそれ自体はADよりもFTLDにおいて高かった。この結果は、DOおよびpSer46-MARCKSが疾患特異的マーカーではないが、それらは３つの神経変性疾患にわたる共通の病理学的プロセスの指標であることを示している。以前の研究は、組織学的Aβ凝集体の形成前でさえも、pSer46-MARCKSが異常に増加していることを明らかにしたので（Tagawa, K. et al., Hum. Mol. Genet. 24, 540-58 (2015); Fujita, K. et al.、Sci. Rep. 6, 31895 (2016))、ADおよびFTLDおよびALSの早期段階でDOおよびpSer46-MARCKSはおそらく神経突起変性を反映している。【００９１】
より良いバイオマーカーを生成するために非リン酸化MARCKSの値が統合されるべきである生物学的意味は明確ではない。しかし、pSer46-MARCKSと非リン酸化MARCKSの両方が分解された神経突起から放出され、MARCKSの活性リン酸化は末端段階のニューロンでは起こらないので、非リン酸化MARCKSとの統合で得られるDO値はより良いマーカーはpSer-MARCKS単独よりも良好なマーカーである。【００９２】
[実施例２]  パーキンソン病（PD)およびレビー小体型認知症（DLB）における検討
方法
マウスPD / DLBモデル
正常ヒトα-Syn-BAC-TgマウスをYamakado et al (2012) Neurosci Res 73:173-177に記載の方法で作製した。【００９３】
具体的には、BAC-Tg構築物（PAC AF163864およびBAC AC097478、全部のヒト遺伝子に加えて、28kbの5'-フランキング配列および50kbの3'-フランキング配列を含む）をC57BL6 / J卵子にマイクロインジェクションしたホモ接合型α-Syn-Tgマウスを産生した。GBA-ヘテロKOマウスをThe Jackson Laboratory（B6.129S6-Gbatm1Nsb / J、ストック番号003321）から購入し、ヒトα-Syn-BAC-Tgマウスと交配させた。得られた正常ヒトα-Syn-BAC-Tg/GBA-hetero-KO（ホモ/ヘテロ）マウスを系統として維持した。【００９４】
α-Syn-BAC-Tg/GBA-hetero-KOマウスを10世代以上交配し、免疫組織化学および生物学的分析のために1、6および24ヶ月齢（N = 3）で使用した。【００９５】
免疫組織化学
免疫組織化学のために、マウスまたはヒトの脳を4％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。【００９６】
パラフィン包埋された脳切片を脱パラフィンし、再水和し、抗原を活性化し（10mMクエン酸緩衝液、pH6.0、100℃で5分間マイクロ波処理した。このプロセスを3回繰り返した）、室温（RT）に冷却した。ホスホ-α-Synに対する染色のために、切片を室温で5分間98％ギ酸（WAKO、066-00461）によってさらに活性化した。【００９７】
切片をPBST（0.1％Tween-20を含むPBS）で5分間2回洗浄し、0.5％Triton X-100を含有するPBSで20分間処理した後、PBSTで5分間3回洗浄した。ブロッキング（10％FBSにより37％℃で30分間）後、切片を、2％FBSおよび0.1％Triton X-100、一次抗体(マウス抗ホスホ-α-Syn（Ser129）（1 ：2000、WAKO、015-25191）)と共に37℃で60分間；マウス抗α-Syn（1：1000、Abcam、ab27766）と共に4℃で12時間；ウサギ抗ホスホ-MARCKS（Ser46）（1：1000、GL Biochem（Shanghai）Ltd.）、またはマウス抗ユビキチン抗体（1：1000、Cell Signaling Technology、3936S）と共に37℃で120分間；マウスThr203 / Tyr205-ERK1 / Thr183 / Tyr185-ERK2およびヒトThr202 / Tyr204-ERK1 / Thr185 / Tyr187-ERK2（1：250、Cell Signaling Technology、＃4370）を検出するウサギ抗ホスホ-ERK1 /2、マウス抗MAP2（1：100、santa cruz、sc-32791）またはマウス抗GFAP（1：2000、sigma、C9205）と共に4℃で12時間 、そして二次抗体(Alexa Fluor標識抗マウスIgG（1：1000、Invitrogen）またはCy3標識抗ウサギIgG（1：500、Jackson ImmunoResearch）を用いてRTで60分間、連続的にインキュベートした。 pSer46-MARCKS抗体が生成され、Fujita et al.,(2016) Sci Rep 6:31895に記載の方法で品質を評価した。【００９８】
pSer129-α-Synおよびユビキチンの二重標識のために、抗pSer129-α-Syn抗体をZenon Alexa Fluor 488マウスIgG1標識キット（Z-25002、Invitrogen）で標識した。核はDAPI（同仁研究所、D523）で染色した。共焦点顕微鏡法により画像を取得した：Olympus FV1200 IX83（オリンパス）。【００９９】
ウエスタンブロッティング
マウス大脳皮質およびヒト側頭葉組織を、2％SDS、1mM DTT、および10mM Tris-HCl（pH7.5）を含有する抽出緩衝液に溶解し、20ストロークのDounceガラスホモジナイザーを用いて氷上でホモジナイズした。この粗製抽出物を、16,000gで4℃で10分間遠心分離し、等容積のサンプル緩衝液（0.1M Tris-HCl pH7.5,4％SDS、20％グリセロール、12％ β-メルカプトエタノール、および1％ SDS-PAGEで分離し、セミドライ法を用いてポリビニリデンジフルオライド膜（Immobilon-P、Merck Millipore）に移し、5％ミルクまたは2％ブロスでブロックした。TBST（10mM Tris / HCl pH8.0,150mM NaCl、および0.05％Tween-20）中のBSA（％BSA）に溶解し、Can Get Signal溶液（東洋紡）で希釈した次の一次および二次抗体と反応させた。一次および二次抗体を以下のように希釈した：マウス抗ホスホ-α-Syn（Ser129）（1：5000、WAKO、015-25191）; マウス抗-α-Syn（1：5000、Abcam、ab27766）4℃で12時間; ウサギ抗ホスホ-MARCKS（Ser46）（1：200,000、GL Biochem（Shanghai）Ltd.）37℃で120分間; マウス抗ユビキチン抗体（1：5000、Cell Signaling Technology、3936S）4℃で12時間; ウサギ抗ホスホ-ERK1 / 2（Thr203 / Tyr205（マウス）-ERK1 / Thr183 / Tyr185（マウス）-ERK2、Thr202 / Tyr204（ヒト）-ERK1 / Thr185 / Tyr187（ヒト）-ERK2）（1：10,000、Cell Signaling Technology、＃4370）;またはウサギ抗ERK1 / 2（1：5,000、Cell Signaling Technology、＃4695S）; 抗マウスIgG HRP conjugate（1：3000、GE Healthcare、NA931VA）および抗ウサギIgG （1：3000、GE Healthcare、NA934VS）。LAS4000（GE Healthcare）を使用してバンドを検出するために、ECLプライム（GEヘルスケア、RPN2232）またはSCLセレクト（GEヘルスケア、RPN2235）を使用した。【０１００】
免疫沈降
マウスおよびヒト脳試料をTNE緩衝液（10mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM NaCl、1mM EDTA、1％NP-40、0.5％プロテアーゼ阻害剤カクテル、0.5％ホスファターゼ阻害剤カクテル）で溶解した。アリコートをプロテインGセファロースビーズ（GEヘルスケア）の50％スラリーとインキュベートし、続いて3分間遠心分離（2000×g）した。上清を1μgのウサギ抗-pSer46-MARCKSまたはウサギ抗-pSer129-τ-シヌクレイン抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。プロテインGセファロースビーズ（GEヘルスケア）と共に4時間インキュベートし、TNE緩衝液で洗浄し、サンプルバッファーで溶出した。【０１０１】
ADモデルマウスからの末梢血細胞の収集
Polymorphprep溶液（Alere Technologies AS）を使用して、製造業者のプロトコールに従って、末梢血細胞（多形核白血球（PMN）および単核細胞（MC））を収集した。簡潔には、EDTA（最終濃度2.0mM）を含む1mLの静脈血を、15mLのチューブ中の1mLのPolymorphprep上に注意深く重層した。室温で500×gで30分間遠心分離した後、血漿を除去し、PMNおよびMCを含む層を得た。収集したアリコートを0.45％NaClで希釈し、400×gで10分間の遠心分離によって細胞ペレットを得た。ペレットを溶解緩衝液（10mM Tris-HCl（pH7.5）、0.2％SDS、0.5％プロテアーゼ阻害剤カクテル、および0.5％ホスファターゼ阻害剤カクテル）で溶解し、62.5mM Tris-HCl、pH6.8、2 SDS、2.5％（v / v）2-メルカプトエタノール、5％（v / v）グリセロールおよび0.0025％（w / v）ブロモフェノールブルーの混合物に添加し、SDS-PAGEを行った。【０１０２】
質量分析
リンタンパク質分析のために、Fujita et al.,(2016) Sci Rep 6:31895やTagawa et al., (2015) Hum Mol Genet 24:540-558に記載された方法でリン酸化ペプチドを調製した。【０１０３】
具体的には、マウスおよびヒト大脳皮質由来の脳抽出物を界面活性剤および熱処理によって変性させ、次いでシステイン残基を還元し、アルキル化によりブロックした。タンパク質試料をトリプシンで消化した。【０１０４】
iTRAQ Reagentマルチプレックスキット（SCIEX Ins.）を用いて標識し、強力な陽イオン交換クロマトグラフィーで分画して、Titansphere Phos-TiOキット（GL Sciences Inc.）を用いてホスホペプチドを富化させた。LC-MS / MSシステム（Triple TOF 5600システム、Eksigent LCシステム、SCIEX Ins.）およびC18カラム（0.1×100mm; KYA Technologies Corporation）を用いて各画分を分析した。イオン噴霧電圧は2.3kVであり、IDA(information dependent acquisition）設定は400-1250m / zであった。【０１０５】
データ分析
ペプチドの質量スペクトルデータを取得し、Analyst TF（バージョン1.6）（AB SCIEXA）によって分析した。結果に対応するタンパク質は、UniProtKB / Swiss-Prot（2010年6月22日にhttp://www.uniprot.orgからダウンロード）を検索し、Paragonアルゴリズムを採用したProteinPilot（バージョン4）（AB SCIEX） （Shilov et al. (2007) Mol421 Cell Proteomics 6:1638-1655）。【０１０６】
ProteinPilotによるペプチド検索の許容差は、MSについては0.05Da、MS / MS分析については0.10Daに設定した。冗長に同定されたタンパク質はPro Groupアルゴリズム（AB SCIEX）を用いて除外した。【０１０７】
タンパク質またはペプチド同定の信頼スコアは、ProteinPilotによって計算され、信頼閾値として用いられた。検出のための閾値は95％の信頼度に設定され、> 95％の信頼性を有するペプチドは同定されたペプチドとして受け入れられた。【０１０８】
タンパク質の定量は、質量分析計におけるフラグメンテーション時に生成されたMS / MSスペクトルにおけるiTRAQレポーター基の分析を介して行った。ペプチドおよびタンパク質の定量のために、各iTRAQからのシグナルの合計量が等しくなければならないと仮定して、異なるiTRAQレポーター間でシグナルを正規化するためにバイアス補正を用いた。ペプチドの定量のために、異なるiTRAQシグナルを正規化するためにバイアス補正オプションを使用した。【０１０９】
ペプチド比は、バイアス補正後の対照モデルに対する疾患モデルにおけるレポーターシグナルの比として計算した。この製剤の詳細は、AB SCIEXのマニュアルに記載されている。【０１１０】
ProteinPilotからのペプチドサマリーの結果は、さらなるデータ分析のためのExcelファイルとして出力された。ペプチド断片の量を、リン酸化部位を含む複数のMS / MS断片のシグナル強度の幾何平均として計算した。【０１１１】
すべての疾患群について、対照群との生物学的差異をウェルチの試験によって評価した。複数試験の補正のために、Benjamini-Hochberg手順を用いてp値を調整した。【０１１２】
複数の疾患群で変化したホスホペプチドを同定し、さらなる分析のために選択した。
人間の脳プロテオーム解析に使用された側頭極および後頭極のヒト脳サンプルを、5人のAD、5人のDLBおよび5人の年齢適合正常対照患者から解剖し、死亡後1時間以内に深冷凍した（-80℃）。【０１１３】
結果
ヒトADおよびDLBのリン酸化プロテオームにおけるpSer46-MARCKSレベルの上昇
ADマウスモデルおよびヒトAD患者からの脳サンプルの以前の分析（Tagawa et al., (2015) Hum Mol Genet 24:540-558）に続いて、死後のヒトDLB患者を用いて包括的なリン酸化タンパク質分析を行った。病理学的に純粋なAD（5人の男性）およびDLB（5人の女性）の脳の後頭部および側頭部の先端を用いた。【０１１４】
この場合、純粋な病理を有する死後の脳を選択したが、細胞内α-Syn凝集体はニューロン内にあるが、細胞外Aβ凝集体または細胞質タウ/ TDP43病変はなかった。この比較により、ADサンプルとDLBサンプルとの間でリン酸化部位が共有されることが明らかになった。【０１１５】
このような修飾の1つであるpSer46 -MARCKSは、ADマウスモデルおよび死後ヒトAD脳（Fujita et al.,(2016) Sci Rep 6:31895）（図１０Ａ）において上昇した。【０１１６】
興味深いことに、pSer46-MARCKSレベルはDLBの後頭葉ではなく側頭葉で上昇したが、AD（図１０Ｂ）では逆のパターン（すなわち、後頭葉ではあるが側頭葉ではない）で上昇した。5×FADマウスでは、疾患の初期段階（前臨床/前凝集段階）でのpSer46-MARCKSレベルの上昇は後期段階で正常化した（Fujita et al.,(2016) Sci Rep 6:31895）。【０１１７】
したがって、2つの葉の間のpSer46 -MARCKSレベルの相違は、各疾患の神経変性の葉の優先を反映している可能性がある。質量分析結果は、ADおよびPD / DLBヒト脳において共通の変化が起こったことを示唆しており、pSer46-MARCKSがPD / DLBにおける前臨床/前凝集段階を反映するかどうかの調査が必要であることを示した。【０１１８】
ヒトDLBの免疫組織化学におけるpSer46-MARCKSの増加
次に、ヒト死後DLB脳においてpSer46-MARCKSが上昇したかどうかを調べた。この目的のために、本発明者らは、DLB患者から後頭葉サンプルを染色し、MAP2でマークされた頂端の樹状突起がpSer46-MARCKSによって共染色されたことを見出した（図１１Ａ）。【０１１９】
一方、この脳領域には、ほとんどがユビキチン化されたpSer129-α-Syn細胞質封入体（図１１Ｂ）が含まれることが確認された（図１１Ｃ）。pSer46-MARCKSの細胞質染色は凝集物のように思われたため（図１１Ａ）、それらがα-Syn凝集体であるかどうかを調べ、ニューロンの細胞質pSer46-MARCKS陽性構造の半分がpSer129-α-Synで染色されていることを見出した、黄色の矢印）。しかし、それらのもう半分は、pSer129-α-Synで強く染色されなかった（図１１Ｄ、赤矢印）。【０１２０】
pSer46-MARCKS陽性/ pSer129-α-Syn陰性細胞は、pSer129-α-Synを蓄積する損傷ニューロンから放出されたHMGB1によって間接的に影響される周囲ニューロンに対応し得、DLBの末期においてさえもヒトの脳において病理が進行し続けることを示唆する。【０１２１】
免疫組織化学の上記の結果を確認するために、本発明者らは、ヒト死後DLB患者および非DLB対照患者の後頭葉とのpSer46-MARCKSおよび全MARCKSのウエスタンブロッティングを行った（図１１Ｅ）。pSer46-298 MARCKSレベルはDLB患者で増加した。【０１２２】
ヒト化α-Syn-TgマウスにおけるpSer46 -MARCKSの増加
脳におけるpSer46-MARCKSの増加の初期時点を決定するために、動物が運動機能障害または行動異常を示さなかった1、6および24ヶ月齢のヒトα-Syn-BAC-Tg/GBA-hetero-KOマウスを分析した。【０１２３】
マウスは、嗅球、前頭皮質、および頭頂皮質におけるpSer46 -MARCKSのシグナルを1ヶ月でわずかに上昇させた（図１２、図１８）。その後、pSer46 -MARCKS陽性染色の面積は、6ヶ月で頭頂および後頭皮質に拡大したが（図１２、図１９）、24ヶ月前では海馬で増加しなかった（図１２、図２０）。【０１２４】
24ヶ月齢まで内胚葉層および嗅球の僧帽細胞層のニューロンにおいて、抗リン酸化α-Syn（pSer129-α-Syn）抗体によって染色された明確な細胞質α-Syn凝集物は検出されなかった（図１３Ａ〜Ｃ）。図１３Ａ〜Ｃは、pSer46-MARCKSおよびpSer129-α-Synに対する抗体で共染色したヒトα-Syn-BAC-Tg / GBA-ヘテロKOマウスの嗅球の高倍率像を示す。１ヶ月齢からpSer46-MARCKS（白矢印）およびpSer129-α-Syn（星印）のドット様染色の細胞質染色が検出されたが、pSer129-α-Synの細胞質凝集物は24ヶ月でのみ検出された。α-Syn-skein- またはLewy神経突起-様構造は、1ヶ月齢からこれらの層に存在し、高齢化の過程で豊富に増加した。これらの構造は1ヶ月で抗ユビキチン抗体で同時染色されなかったが、6ヶ月後から共染色が明白であった（図１３Ｄ）。【０１２５】
興味深いことに、pSer46 -MARCKS陽性神経突起はp-α-Syn-共染色神経突起よりも多かった。【０１２６】
まとめると、これらの結果は、少なくともこのPD / DLBマウスモデルにおいて、pSer46 -MARCKSによって検出された神経突起変化がα-Synのユビキチン陽性凝集体の形成に先行することを示した（表1）。【０１２７】
24ヶ月齢では、細胞質α-Syn凝集体も壁側皮質で検出された（図１４Ａ）。老化中の皮質ニューロンにおけるpMARCKSとp-α-Syn、p-α-Synとユビキチンの関係は、嗅覚ニューロンと同様であった（図１４Ｂ）。【０１２８】
これらの結果を確認するために、本発明者らは、1、6、および24ヶ月齢の大脳皮質組織を有するpSer46 -MARCKS、pSer129-α-Synおよびユビキチンのウエスタンブロット分析を行った（図１５）。リン酸化されたMARCKSのレベルは、1、6、および24ヶ月齢で上昇したが、6ヶ月後にリン酸化されたα-Synおよびユビキチンが発生し、十分に増加した（図１５）。【０１２９】
本発明者はまた、末梢血細胞中のpSer46-MARCKSのレベルを試験し、脳のそれよりもはるかに低いことを見出した（図２１）。【０１３０】
DLB脳におけるMARKCSとα-Synとの相互作用
細胞質凝集体の半分がpSer46-MARCKSおよびpSer129-α-Syn（図１１Ｄ）に対して二重陽性であることを考慮して、本発明者らは2つのリンタンパク質の生化学的相互作用を調べた。24ヶ月齢のα-Syn-BAC-Tg / GBA-ヘテロKOマウス（図１６Ａ）の脳サンプル（全大脳皮質）（図１６Ａ）およびヒトDLB患者（図１６Ｂ）からの抗pSer46-MARCKSとpSer129-a-Synとの同時沈降による免疫沈降を行った。抗pSer129-a-Syn抗体による逆沈殿はまた、マウスモデルおよびヒト患者の両方においてpSer46-MARCKSを共沈させた（図１６ＡおよびＢ）。この結果は、2つのリンタンパク質の生化学的相互作用を示す。【０１３１】
DLB脳における上流キナーゼの活性化
最後に、Ser46でMARCKSをリン酸化する上流のキナーゼを調べた。MARCKSは、ミリストイル化アラニンリッチCキナーゼ基質として知られているPKCの代表的な基質である。PKAαはSer159、Ser163およびSer170をリン酸化することが報告されている。一方、PKCの代わりにErk1 / Erk2（= MAPK3 / MAPK1）がSer46においてMARCKSをリン酸化することが明らかになった。一貫して、別のグループはまた、MAPKが海馬ニューロンにおいてMARCKSをリン酸化することを示したが、MAPKによる正確なリン酸化部位はそれらの研究で決定された。【０１３２】
したがって、Thr202 / Tyr204でのErk1リン酸化およびThr185 / Tyr187でのErk2リン酸化を検出するウサギモノクローナル抗体を用いて、免疫組織化学およびウエスタンブロットによるErk1 / 2の活性化を調べた（図１７Ａ）。【０１３３】
予想通り、pErk1 / 2の免疫染色は、α-Syn-BAC-Tg / GBA-ヘテロKOマウス（図１７Ａ）の大脳皮質において増加した。細胞はMAP2で同時染色されたが、GFAPでは共染色されず、ニューロンであることが示された（図１７Ｂ）。pErk1 / 2の染色は、それらの酵素 - 基質の関係と一貫して同じニューロン（図8A）中のpSer46-MARCKSと共局在した。DLB患者の後頭葉皮質において、pSer46-MARCKSおよびpErk1 / 2の増加した同様の共染色が確認された（図１７Ｃ）。ウエスタンブロット分析はまた、α-Syn-BAC-Tg / GBA-ヘテロKOマウス（図１７Ｄ）およびDLB患者（図１７Ｅ）の大脳皮質におけるpErk1 / 2の増加を確認した。これらの分析は、PD / DLB病理の下でErk1 / 2リン酸化の異常な増加および皮質ニューロンにおける年齢依存性増強をまとめて明らかにした（図１７Ａ〜Ｅ）。【０１３４】
上記実施例の結果より以下のことが判明した。
AD病理の前凝集段階における神経突起変性の特徴であるpSer46でリン酸化されたMARCKSのレベルもマウスモデルとヒト患者両方においてPD / DLB病状において上昇することを明らかにした。【０１３５】
pSer46 -MARCKSの免疫組織化学的染色パターンも、ADおよびPD / DLB病変において類似していた。マウスモデルでは、pSer46 -MARCKSによって明らかにされた神経突起変性が、嗅球において最初に検出され、その後、後頭部および側頭皮質において顕著になった（表1）。表１は、ヒトα-Syn-BAC-Tg / GBA-ヘテロKOマウスにおけるpSer46-MARCKS、pSer129-α-synおよびユビキチン染色パターンのまとめを示す。「+/-」は、バックグラウンドマウスでは陽性染色が細胞の10％未満で観察されなかったことを示し、「+」は、Tgマウスの細胞の10〜50％において陽性染色が観察されたことを示し、「++」は、陽性染色がTgマウスの細胞の50％以上で観察されたことを示す。【０１３６】
このパターンは、ヒトPD / DLB病理における神経変性の提案された進行と一致し、最も初期の病変が嗅球に現れ、後頭葉が最終的に優勢である。【０１３７】
【表１】
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【０１３８】
この研究の第2の重要な結論は、神経突起変性が、組織学的レベルで疾患関連タンパク質凝集に先行することである。マウスモデルにおいて、pSer46 -MARCKSの増加は、ユビキチン化α-Syn凝集物の形成に先行した（表1）。【０１３９】
pSer46 -MARCKSが組織学的凝集体形成に先行するPD / DLBマウスモデルの時系列は、pSer46 -MARCKSがニューロンの細胞質および神経突起で検出されたADモデルマウスにおける以前の観察と類似していた細胞外Aβ凝集体の染色が明らかになる。【０１４０】
このモデルを用いて、本発明者らは生化学レベルでpSer46 -MARCKSの重要性を確認した。これらの結果は、凝集体よりむしろ単量体またはオリゴマー形態の細胞内ミスフォールドα-Synが神経突起変性の開始においてより重要な役割を果たすことを強く示唆している。【０１４１】
興味深いことに、ヒト死後の脳において、pSer46 -MARCKSは、重篤な影響を受けた領域（DLBの後頭葉、ADの側頭葉）ではなく、疾患（DLBの側頭葉、ADの後頭葉）に比較的影響されない脳領域において上昇した。【０１４２】
この理由はまだ決定されていない。1つの可能性は、重篤な脳領域の神経突起が代謝的に「燃え尽きており、高レベルのpSer46-MARCKSを維持できない」ということである。【０１４３】
これらの観察に基づいて、超早期（前凝集/前臨床）段階でPD / DLBにおける分子病理を検出することができるバイオマーカーとしてpSer46 -MARCKSを開発することは価値がある。【０１４４】
さらに、質量分析に基づくアッセイおよびELISAに基づくアッセイおよび/またはPETを開発することが有用であろう。このように高感度のアッセイシステムが利用可能になると、神経変性疾患のリスクのある人々の超早期病態の検出に直接つながると考えられる。【０１４５】
予備的に、本発明者らは、赤血球、顆粒細胞またはリンパ球などの末梢血細胞（PBC）がpSer46-MARCKSを発現するかどうかウエスタンブロットによって調べた。そうであれば、PBC由来のpSer46-MARCKS由来の脳由来の識別が困難になり、脳外診断用のバイオマーカーとしてpSer46-MARCKSを使用するには、いくつかの追加のトリックが必要となる。幸いにも、PBCは、5xFADマウスの脳組織に匹敵する検出可能なレベルのpSer46-MARCKSを発現しなかった（図２１）。pSer46-MARCKSを血液バイオマーカーとして開発する可能性を支持している。【０１４６】
本発明者らは、pSer46-MARCKSおよびpSer129-α-Synの細胞質凝集体（図１３、図１４Ａ、図１４Ｂ）および生化学的相互作用（図１６）における共局在を見出した。興味深いことに、α-SynとMARCKSの両方が本質的に無秩序なタンパク質（IDP）と思われる。以前の研究では、α-Synが自然に変性する性質を有することが明らかになった。【０１４７】
一方、利用可能なアルゴリズム（RONN v3.2、https://www.strubi.ox.ac.uk/RONNおよびIUPred、http://iupred.enzim.hu）によるバイオインフォマティクス分析は、MARCKSがIDPであると予測した以前のいくつかの報告は構造生物学実験によってこの考えを支持した。α-SynとMARCKSの同様の変性傾向は、それらの生化学的相互作用の基礎をなしている可能性がある。また、α-SynとMARCKSの両方が変性神経突起に局在していることも注目されている軸索成長およびアクチンネットワーク調節のような軸索末端機能において重要である。【０１４８】
脳の全てのニューロンが壊死するまで、神経変性疾患を患う脳では神経突起変性から細胞死への病理学的サイクルが繰り返し起こるので、pSer46-MARCKSおよびDOの上昇は、神経変性のインビボ活性の定量的バイオマーカーとしても使用することができる、疾患特異的ではないが多発性肝疾患における肝細胞障害の一般的な定量的指標であるGOTおよびGPTと同様に、症候性患者および恐らく非症候性被験体においても同様である。本実施例は、神経変性疾患の神経突起変性を反映する新しいバイオマーカーを提供している。
【産業上の利用可能性】
【０１４９】
本発明の方法は、ヒトAD（アルツハイマー病）、FTLD（前頭側頭葉変性症）、ALS（筋萎縮性側索硬化症）、PD（パーキンソン病）およびDLB（レビー小体型認知症）からなる群から選択される神経変性疾患の検出のために利用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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