(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糞便を次の工程（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）糞便を洗浄する工程、
（ｂ）洗浄した糞便をフェノール及びビーズの存在下に攪拌する工程、
（ｃ）得られた処理物をゲル濾過に付して核酸画分を採取する工程
を行うことを特徴とする糞便からのＰＣＲ反応に使用する核酸の単離方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法により単離された核酸を、特異的プライマーを用いたＰＣＲにより同定することを特徴とする糞便中の菌叢の解析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は糞便等の微生物含有組成物から、ＰＣＲ反応に適した核酸試料を効率良く単離する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトや動物などの腸内細菌叢を解析することは、個体の健康状態の把握、腸管内の病理的研究などに非常に有用である。また、食中毒患者の臨床試料中にどのような病原性菌が検出されるかは適切な治療を行う上で、迅速かつ正確な診断が要求される。また、地質、水質等を把握するうえにおいても、その場所に存在している土壌細菌叢等を解析することが有効である。
【０００３】
現状では菌叢の解析手段として、対象となる試料（個体の糞便、土壌等）を希釈液で希釈し、これを種々の選択培地上に撒き、嫌気性培養を行う必要があった。しかし、培養の際には数日から数週間の時間を要することとなり、コロニー数のカウント等操作も煩雑であった。
【０００４】
これに対し、近年になって、分子生物学的手法を用いた系統分類・同定法が信頼できる手法として注目を集めている。各種遺伝子を標的とした、特異的なプローブ・プライマーによって、幅広い菌種の迅速かつ特異的な検出が可能となり、これらは微生物の検出において鍵となる技術になりつつある。特に特異的ＰＣＲプライマーを用いた方法は、簡便・迅速・正確に目的とする菌の検出・同定を行うことができるため、上記のような試料からＰＣＲに供しやすいＤＮＡを単離することが求められる。
【０００５】
微生物からのＤＮＡの単離は、これまでは、試料をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）等で洗浄し、塩化ベンジル法により菌体を破砕・蛋白質変性してアルコール沈殿することにより行われていた。しかしこの方法では、グラム陽性球菌などの一部の菌からはほとんどＤＮＡを回収できないことが指摘されている。
【０００６】
また、最近では、試料からのＤＮＡ単離の際、直径０．１mm程度のビーズを加えてフェノール存在下で激しく振とうすることにより菌体を破砕する方法が広く用いられるようになっており、この方法によれば、多岐にわたる菌種から効率よくＤＮＡを単離することができる（Wilson, K. H. and R. B. Blithington. 1996. Human colonic biota studied by ribosomal DNA sequence analysis. Appl. Environ. Microbiol. 62:2273-2278）。ところが、土壌、糞便等には、ＰＣＲにおいて、反応を阻害する物質（腐敗酸等）が含まれていることがわかっており、この方法ではこの阻害物質の除去に問題があると考えられている。
【０００７】
更に、ＤＮＡ単離用キットの市販品として、MagExtractor（東洋紡製）やQIAamp Stool DNA Isolation Kit(QIAGEN製)が販売されている。前者はビーズで菌体を破砕した後、ビーズに吸着したＤＮＡを磁気ビーズで回収するものであるが、ＤＮＡの収率が悪いという問題がある。一方、後者は加熱により菌体膜蛋白を変性させ、ＤＮＡを単離するものであるが、やはりこの方法によっても収率に問題がある。
【０００８】
このような収率の低下や特定の菌群への適応性の悪さは、直接作業性の悪化、解析コストの上昇につながる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、微生物を含む試料から効率良くＰＣＲ阻害物質を除去し、高収率でＤＮＡを単離する方法を確立すること、及び得られたＤＮＡを用いて該試料中の菌叢を簡便、迅速、正確に解析することのできる、菌叢の解析方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究を行った結果、微生物を含む試料を洗浄後、菌体をビーズにより破砕してＤＮＡを回収した後、ゲル濾過により精製することで、ＰＣＲの阻害物質が除去されＤＮＡが高収率で得られることを見出し本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、糞便を次の工程（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）糞便を洗浄する工程、
（ｂ）洗浄した糞便をフェノール及びビーズの存在下に攪拌する工程、
（ｃ）得られた処理物をゲル濾過に付して核酸画分を採取する工程
を行うことを特徴とする糞便からのＰＣＲ反応に使用する核酸の単離方法を提供するものである。
【００１２】
また、本発明は、上記の方法により単離された核酸を、特異的プライマーを用いたＰＣＲにより同定することを特徴とする糞便中の菌叢の解析方法を提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明において、微生物含有組成物とは、微生物の遺伝子解析（主にＰＣＲ）を行うための微生物含有被検試料であり、具体的には、（ヒト）糞便試料、血液、口腔・鼻腔洗浄液、活性汚泥、土壌、海洋水などが挙げられる。中でも、ヒト糞便試料、活性汚泥、土壌に対し本発明の単離（抽出）方法を適用した場合には、従来の単離（抽出）法に比べＰＣＲ阻害物質の除去効率が顕著に高まるため好ましい。特に糞便試料を用いた場合には、除去効率の向上が著しく、また、従来の問題点であった糞便提供者の個人差に依存したＰＣＲ反応効率のばらつきも改善されるため好ましい。
【００１４】
本発明においては、まず、試料（微生物含有組成物）の洗浄を行う［工程（ａ）］この工程は試料に含まれる微生物以外の成分を除去するものである。洗浄は公知の方法を用いて行えばよい。すなわち、試料に種々の緩衝液や滅菌水等の水性媒体を１００〜１０００倍量程度加え、浮遊、遠心回収を繰り返して行えばよい。用いる水性媒体は特に限定されないが、菌体細胞膜の保護の点からリン酸緩衝液（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーが好ましい。
【００１５】
次いで、得られた洗浄後の試料、すなわち洗浄された微生物含有組成物を有機溶媒及びビーズの存在下で物理的に破砕する［工程（ｂ）］。工程（ｂ）は、ビーズ存在下での攪拌により微生物菌体を破砕し、菌体内から核酸を抽出するとともに、有機溶媒層に核酸以外の夾雑物を移行させる。このとき用いるビーズの素材は、菌体を破砕し得る程度の硬度を有するものであれば特に限定されず、ガラス、シリコン、ジルコニウム（zirconium）等を例示できるが、入手の容易性やコストの点からガラスビーズを用いることが好ましい。また、ビーズの形状は、球状或いは楕円球状であることが破砕効率の点から好ましく、その粒子径としては、長径が０．０１mm〜１mm、特に０．０８mm〜０．５mm程度であることが菌体の破砕効率の点から好ましい。
【００１６】
なお、物理的破砕処理には、公知の方法や装置、例えば、FastPrep FP120(BIO 101 社製)、Mini Bead Beater(Biospec Products社製)等を用いれば良い。この物理的破砕は、撹拌が弱すぎると菌体の破砕が不十分であり、撹拌が強すぎたりするとＤＮＡの断片化が起きてＰＣＲが上手くいかない恐れがあるので試料により最適化が必要であるが、一般には４０００〜６０００rpmで１０秒〜３分、特に２０秒〜１分が好ましい条件である。
【００１７】
具体的には、Fast Prepを用いた場合であれば、パワーレベル４．０から６．０で２０秒から３分、特に糞便サンプルを試料に用いたときはパワーレベル５．０で２０〜３０秒程度反応するのが望ましい。またMini Bead Beaterを用いた場合、４２００rpmから５０００rpmで２０秒から５分、特に糞便サンプルを試料に用いた時は、５０００rpmにて３０秒から３分間程度反応するのが望ましい。
【００１８】
より具体的な条件としては、例えば試料を０．５mL程度のＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーに浮遊し、０．３ｇ程度のビーズ及び０．５mL程度の有機溶媒の存在下で攪拌することにより、微生物の菌体から核酸を放出させる方法が挙げられる。
【００１９】
また、有機溶媒は、蛋白質変性作用を有するものであれば特に限定されないが、抽出効率等の点からＴＥ（又は水）飽和フェノール、ベンジルクロライドが好ましく、特にフェノールが好ましい。
【００２０】
菌体破砕後は遠心分離等の手段により水層と有機溶媒層を分離し、ＤＮＡ等核酸の含まれる水層を回収する。このとき、回収物について、更に前記蛋白質変性能を有する有機溶媒で処理すると、有機溶媒層に核酸以外の狭雑物の多くが有機溶媒層に溶出されるため好ましい。用いる有機溶媒としては、フェノール、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（25：24：1）、塩化ベンジル等が挙げられ、特にフェノールとフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（25：24：1）処理を組み合わせて行うことで、ＰＣＲ阻害物質を効率よく除去することができるため好ましい。得られた核酸は、最終的にはアルコール（エタノール等）沈殿等により回収する。
【００２１】
次に、回収された核酸について、ゲル濾過カラムを用いて精製を行う。本発明者の知見によれば、試料中或いは菌体内に存在するＰＣＲの阻害物質は、核酸と比べ低分子であると考えられるため、ゲル濾過により試料（組成物）中から、ＰＣＲ阻害物質を含まない微生物由来の核酸を効率よく回収することができるのである。用いるカラムはMicro Spin Column S-400(Pharmacia社製)などが好ましいが、同様の充填剤であれば、特にこれらに限定されない。
【００２２】
このようにして得られた核酸、例えばＤＮＡは、特異的プライマーを用いたＰＣＲ反応により、目的とする菌属、菌種等が試料中に存在していたかを定性的に解析することができる。
このような特異的プライマーとして、例えばビフィドバクテリウムBifidobacterium属細菌種特異的プライマー(特開平11-123903号)を用いれば、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス(Bifidobacterium adolescentis)、ビフィドバクテリウム・アンギュラータム(B.angulatum)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(B.bifidum)、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(B.breve)、ビフィドバクテリウム・カテヌラーダム(B.catenuatum)グループ、ビフィドバクテリウム・ロンガム(B.longum)、ビフィドバクテリウム・インファンティス(B.infantis)、ビフィドバクテリウム・デンティウム(B.dentium)、ビフィドバクテリウム・ガリカム(B.gallicum)の特異的検出や、分離株の菌種同定を容易に行うことができる。
【００２３】
また、その他ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・カゼイ(L.casei)、ラクトバチルス・デルブルッキィー(L.delbueckii)、ラクトバチルス・ガセリ(L.gasseri)、ラクトバチルス・ヘルベティカス(L.helveticus)、ラクトバチルス・ジョンソニー(L.Johnsonii)、ラクトバチルス・ラムノーサス(L.rhamnosus)、ラクトバチルス・ゼアエ(L.zeae)、ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ．クレモリス(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ．ラクチス(Lc.lactis subsp.Lactis)等の乳酸菌菌種特異的プライマー(特開平11-151097号)や、バクテロイデス・エガーシィー(Bacteroides eggerthii)、バクテロイデス・フラジリス(B.fragilis)、バクテロイデス・オバタス(B.ovatus)、バクテロイデス・セタイオタオミクロン(B.thetaiotaomicron)、バクテロイデス・ユニフォルミス(B.uniformis)、バクテロイデス・ブルゲイタス(B.vulgatus)等のバクテロイデス属細菌菌種特異的プライマー(特開平11-296815号)、ルミノコッカス・グナバス(Ruminococcus gnavus)、ルミノコッカス・ハンセニー(R.hasenii)、ルミノコッカス・ハイドロゲノトロフィクス(R.hydrogenotrophicus)、ルミノコッカス・ラクチス(R.lactaris)、ルミノコッカス・オベウム(R.obeum)、ルミノコッカス・プロダクタス(B.productus)、ルミノコッカス・スチンキー(R.schinkii)、ルミノコッカス・トルクエス(R.torques)等のルミノコッカス属細菌菌種特異的プライマー(特開平11-299306号)、ビフィドバクテリウム属細菌、バクテロイデス属細菌、クロストリジウム(Clostridium)属細菌、プレボテラ(Prevotella)属細菌等の腸内フローラ最優勢の菌属特異的プライマー(特開平11-296815号)等を用いれば、それぞれの菌種、菌属に特異的な検出や同定を容易に行うことができる。
【００２４】
また、Light Cyclar(Roche社製)やABI Prizm 7700、7900(PE Biosystems)、Ｉ−サイクラー（BIO-RAD社製）などを用い、増幅産物の量をサイバーグリーンやタックマンプローブ、モレキュラービーコンなどの蛍光量として検出することで、目的とする菌種が試料中に存在していたかを定量的に解析することができる。
【００２５】
更に、本発明の方法により得られた核酸は、ＤＮＡチップによるハイブリダイゼーションや、クローンライブラリー法、変性グラジェンドゲル電気泳動法（DGGE法）、温度グラジェンドゲル電気泳動法（TGGE）法、ＳＳＣＰ法により、微生物含有組成物中の微生物叢を構成する微生物を特異的に検出・同定することができる。
【００２６】
クローンライブラリー法は、試料から直接ＤＮＡを抽出し、１６Ｓ  ｒＤＮＡを標的とした細菌共通のプライマーによりＰＣＲを行い、得られた増幅産物をベクターにクローニングしてそれぞれのクローニングされた塩基配列を解析して群集解析する方法である。この手法では、得られたクローンの構成比が元のフローラの構成を反映していると考えられるので、培養できない菌についても１６Ｓ  ｒＤＮＡ情報を得ることができる。
【００２７】
また、変性グラジェンドゲル電気泳動法（TGGE）法は、クローンライブラリー法を更に応用した解析法で、共通プライマーにより増幅された増幅産物を変性剤の濃度及び温度勾配のあるゲルを用いた電気泳動を行い、得られたバンドを異なった菌由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡとして同定、解析する方法である。この方法でも従来の技術では培養できなかった菌について調べることができる。
【００２８】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２９】
１．ＤＮＡの単離・精製
以下に示す各種の方法によりＤＮＡを単離し、ＤＮＡの収率、ＰＣＲ阻害物質の除去能を比較した。なお、比較例１及び実施例１の単離方法では、精製処理が施されていないため、ゲル濾過(MicrospinTM S-400HR columns、アマシャムファルマシア製)により精製を行った。
【００３０】
（試料）
単離法の比較には健康成人６名の糞便試料を用いた。これらの試料中にはBacteroides属細菌が含まれていることが確認された。試料を１００〜１０００倍容のＰＢＳバッファーに懸濁・遠心回収を３〜４回繰り返して試料を洗浄し、−７０℃で凍結保存した。
【００３１】
（ＤＮＡの収量の測定）
DU640 Spectophotometer(BECKMAN)を用いて紫外線領域(260nm, 280nm)の吸光度を測定し、ＤＮＡ量をクリスチャン−ワールブルクの計算式より算出し、収量を見積もった。
【００３２】
（ＰＣＲ阻害物質の有無の確認）
Bacteroides属特異的プライマーによるＰＣＲ反応を行い（特開平11-296815号）、ＰＣＲ産物が得られるかを指標とした。反応は総量を２５μｌとし、１０mM Tris-HCl（pH８．３）、５０mM KCl、２．５mM MgCl2、２００μM dNTP mixture、各２５μMの特異的プライマー、０．９U Taq ＤＮＡ polymerase(Perkin Elmer)、１μlの鋳型ＤＮＡを含む反応液で行った。ＰＣＲのプログラムは、９４℃で３分加熱した後、９４℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃３０秒を３５サイクルで行い、最後に７２℃で３分間反応した。
【００３３】
比較例１（塩化ベンジル法）
２５mgの試料をＤＮＡ Extractionバッファー（100mM Tris-HCl, 40mM EDTA, pH9.0）に懸濁して総量を２５０μｌとし、５０μｌの１０％ＳＤＳ、１５０μｌの塩化ベンジルを加えた。Microlncubator(TAI-TECK)を用いて５０℃で３０分間激しく振とうした。遠心分離の後上清を別にチューブに移し、イソプロパノール沈殿、７０％エタノールで洗浄して風乾し、最後に１００μｌのＴＥに溶解した。更に、このＤＮＡ試料をゲル濾過により精製した。
【００３４】
比較例２（MagExtractor法）
この方法では、カオトロピック塩の存在下でＤＮＡがビーズに吸着する性質を利用してＤＮＡの抽出を行う。上述のビーズ破砕後、２５mgの糞便試料について、添付のプロトコールに従ってＤＮＡを抽出・精製した。すなわち、菌体破砕液（100μｌ）対し、７５０μｌの溶解・吸着液と４０μｌの磁気ビーズを加えて１０分間攪拌し、上清を捨て、９００μｌの洗浄液で２回、９００μｌの７０％エタノールで２回洗浄した。風乾後、１００μｌの滅菌水でＤＮＡを溶出した。操作はマニュアル、又は自動ＤＮＡ抽出装置「MagExtractor MFX-2000(デモ機)」を用いて行った。
【００３５】
比較例３（QIAamp Stool Mini KitによるＤＮＡ抽出）
２００mgの試料を用い、添付のプロトコールに従って行った。すなわち、秤量した試料に１．４mLのＡＳＬバッファーを加えて攪拌後、菌体を破砕することを目的に１００℃で５分間反応した。遠心分離後、上清にInhibitEX Tabletを加えて阻害物質を吸着させた。２００μｌのＤＮＡ画分（総量の８分の１、試料２５mgに相当する量）をとって２００μｌのＡＬバッファー、１５μｌのProteaseKを加えて７０℃で１０分間反応し、２００μｌのエタノールを加えた。QIAamp spin columnにアプライし、ＡＷ１、ＡＷ２バッフーで洗浄後、２００μｌのＡＢバッファーでＤＮＡを溶出・回収した。
【００３６】
実施例１（ビーズ・フェノール法）
２５mgの試料をＤＮＡ Extractionバッファーに懸濁して総量を４５０μｌとし、５０μｌの１０％ＳＤＳ、５００μｌのＴＥ飽和フェノール、３００mgのビーズ（直径０．１mm）を加えた。FastPrepを用いてスピード５．０で３０秒間激しく振とうし、菌体を破砕した（ビーズ破砕）。上清を別のチューブに移し、フェノール・クロロホルム処理、イソプロパノール沈殿、７０％エタノールでの洗浄を順に行い、風乾して最後に１００μｌのＴＥに溶解した。更に、このＤＮＡ試料をゲル濾過により精製した。
【００３７】
２．結果
塩化ベンジル法によるＤＮＡの抽出
６サンプルから塩化ベンジル法によりＤＮＡを抽出したところ、３４〜７５μｇ（平均５８μｇ）のＤＮＡを回収できた（表１）。また、このＤＮＡ試料をゲル濾過により精製し、Bacteroides属特異的プライマーg-BactによるＰＣＲ増幅を試みて阻害物質の有無を調べたところ、４試料から増幅産物が得られたが、２試料からは増幅産物が得られず、阻害物質が完全には除去されていないことが示唆された（表２）。
【００３８】
MagExtractorによるＤＮＡ抽出
６試料からMagExtractor Nucleic Acid Purification KitによりＤＮＡを抽出したところ、０．７〜１．８μｇ（平均１．２μｇ）のＤＮＡが回収された（表１）。阻害物質の有無を調べたところ、すべての試料で増幅産物が得られ、阻害物質が除去されていることがわかった（表２）。
【００３９】
QIAamp Stool Mini Kitを用いたＤＮＡ抽出
５試料からQIAamp Stool Mini KitによりＤＮＡを抽出したところ、６．１〜４１μｇ（平均２６μｇ）のＤＮＡを回収できた（表１）。阻害物質の有無を調べたところ、４試料からは増幅産物が得られたが、試料Ｅからは増幅産物が得られず、阻害物質が完全に除去されていないことが示唆された（表２）。
【００４０】
ビーズ・フェノール法によるＤＮＡの抽出
６試料からビーズ・フェノール法によりＤＮＡを抽出したところ、３３〜１４０μｇ（平均９５μｇ）のＤＮＡを回収できた（表１）。ゲル濾過による精製の後、Bacteroides属特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅を試みたところ、すべての試料で増幅産物が得られたことから、阻害物質が効率よく除去されていることがわかった（表２）。
【００４１】
以上のように、ＤＮＡの収量、ＰＣＲ阻害物質の除去能が共に優れていたのは、ビーズ・フェノール法による単離を行った後、ゲル濾過で精製した場合のみであった。
【００４２】
【表１】
0003779888.tif 000002
【００４３】
【表２】
0003779888.tif 000003
【００４４】
実施例２
表３に示す菌の属特異的プライマー（特開平11-296815号）を用い、実施例１の方法にて健常成人４５名の糞便試料から抽出したＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、増幅産物が得られるかを指標として属特異的検出を試みた。その結果、Bifidobacterium、Bacteroides、ClostridiumクラスターXIVはすべての個体から、Prevotella属は５３％の個体から検出された（表４）。
【００４５】
【表３】
0003779888.tif 000004
【００４６】
【表４】
0003779888.tif 000005
【００４７】
【発明の効果】
本発明方法によれば、糞便などの多くの夾雑物を含む微生物試料から、ＰＣＲ阻害物質を含まないＰＣＲ用検体として良好な核酸が、効率良く得られる。従って、本発明により得られた核酸を用いたＰＣＲを行えば、正確かつ効率的な微生物の遺伝子解析が可能となる。