(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタリルアシラーゼ（ＧＡ）遺伝子が、ＬａｃＩｑレプレッサー遺伝子が欠失しているか又は不活化されたＬａｃ−プロモーター−オペレーター機構を用いて発現ベクターから構成的に発現される、細菌においてＧＡを生産するための組換え方法。
【請求項２】
ＧＡ遺伝子を構成的に発現するためのプロモーターがリプレッサーを有しないかまたは非機能性レプレッサーを有するｔｒｃプロモーターまたはｔｒｃ等価プロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
発現ベクターが、細菌中に存在し、かつペリプラズム性でないタンパク質についてコードする選択遺伝子を更に含んでいる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ペリプラズム性でないタンパク質の発現が、その天然プロモーターと比較して減少している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
選択遺伝子がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）についてコードしている、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
細菌の醗酵中において、主培養中の炭素源供給速度が増加される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
供給速度が対数増殖期に増加される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
炭素源がグリセロールである、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
約１０〜５０ｇ／リットルの複合窒素源が細菌の醗酵中に用いられる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌がＥ  ｃｏｌｉ．である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、グルタリルアミダーゼ（以下、単に「ＧＡ」ということがある）を細菌において生産するための組換え方法に関し、詳細にはＧＡの組換え生産のための改善された発現ベクターに関する。
【０００２】
背景技術
セファロスポリンＣからの７‐アミノセファロスポラニン酸の酵素生産において、グルタリルアミダーゼ酵素はグルタリル側鎖を除去するために無条件で要求される。これに関連して、欧州特許出願ＥＰ‐Ａ‐０  ４６９  ９１９には、ＧＡの発現がｔａｃプロモーターにより誘導されるＧＡの組換え生産方法が記載されている。この方法によれば低収率のＧＡが得られるにすぎない。ＥＰ‐Ａ‐０５０４  ７９８には、高収率のＧＡ（７０００〜１００００Ｕ／培地リットル）が形質転換された大腸菌および特別に適合化された醗酵方法を用いてうまく得られる方法が記載されている。それは全体的プロセスを経済的にするこの方法の使用にすぎない。
【０００３】
【発明の概要】
意外にも、収率のそれ以上の改善は、ＧＡ遺伝子を構成的に発現させることにより、特に同様にプラスミドにコードされるｌａｃＩｑリプレッサーを不活化することにより、および／または細胞内活性選択マーカー、特にプラスミドにコードされる選択マーカーであるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、の発現を減少させることにより、得られ、それにより収率が約２〜２．５倍多くなることがわかった。
【０００４】
したがって、本発明はＧＡ遺伝子が発現ベクターから構成的に発現される、細菌でＧＡを生産するための方法に関する。好ましくは、ＧＡ遺伝子を構成的に発現するためのプロモーターは、いかなるリプレッサーも有しないかまたは非機能性リプレッサーを有するｔｒｃプロモーターまたはｔｒｃ等価プロモーターである。
【０００５】
ＧＡ遺伝子を構成的に発現するための発現ベクターが、細菌中に存在し、かつペリプラズム性でないタンパク質、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、についてコードする選択遺伝子を更に含むならば、特にこの選択タンパク質が単に弱く発現されるものであるならば、特に有利である。
【０００６】
【発明の具体的説明】
ｌａｃＩｑリプレッサー遺伝子の不活化は、大腸菌株の増殖が妨げられたりせずに、または細胞溶解が過剰発現の結果として起きたりせずに、ＧＡ酵素の強い連続的な発現および選択を結果として生ずる。
したがって、ＧＡを発現する上で、他の構成性プロモーター、即ち誘導により調節されないプロモーター、の使用を考えることも可能である。Ｔ３６３大腸菌クローンとは対照的に、対応組換えクローンではもはやＩＰＴＧで誘導される必要がなく、プロセスの一層の簡素化を行える。
【０００７】
ＥＰ‐Ａ‐０  ５０４  ７９８では発現プラスミドＴ３６３の構築と、大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０中へのその形質転換について記載している。この特許はプラスミドｐＣＭ１４５についても記載し、これはブダペスト条約に従い寄託番号：ＤＳＭ６４０９でDeutsche Sammlung fur Mikroorganismen （微生物のドイツ寄託機関）に既に寄託されており、これは既知低コピープラスミドｐＡＣＹＣ１８４(A.C.Y.Chang and S.N.Cohen,J.Bact.,134(1978),1141-1156) の複製起点とPseudomonas ＧＡの完全遺伝子を含んでいる。図２は、クローニングに重要な制限酵素開裂部位の列挙と一緒に、プラスミドｐＣＭ１４５の制限地図を示している。
【０００８】
ベクターｐＴｒｃ９９Ａ(E.Amann et al.,Gene,69(1988),301-315)中へのＧＡ遺伝子のクローニングでは下記の合成リンカーの使用を要する：
0003813216.tif 000002
【０００９】
０．５７kbＢａｍＨＩ（４）‐ＳｔｙＩ（２）断片はＳｔｙＩおよびＢａｍＨＩ酵素での切断後にプラスミドｐＣＭ１４５から単離される（公表されたＤＮＡ配列において、ＳｔｙＩ開裂部位はアミノ酸１１〜１３の領域に位置する）。この断片と上記リンカーはＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断されたプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ中に結合されて、ＮｃｏＩ開裂部位を失ったプラスミドＴ２９７を与える。
【００１０】
加えて、１．５kbＳａｌＩ断片（ＳａｌＩ（６）‐ＳａｌＩ（９））と０．３４kbＢａｍＨＩ‐ＳａｌＩ断片がプラスミドｐＣＭ１４５から単離され、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで開環されたベクターｐＵＣ１８中に結合される。これによりＳａｌＩ（６‐９）断片の正確な向きについて試験されたプラスミドＴ３０６を得る。２．１kb断片（ＢａｍＨＩ（４）部位〜ＳａｌＩ（９）部位の断片を含む）はＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII 酵素を用いてプラスミドＴ３０６から単離される。この断片はＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII 酵素で開環されたベクターＴ２９７中に結合されて、プラスミドＴ３０７を与える（図３）。２８℃で２日間の醗酵後に、このプラスミドで形質転換された大腸菌集団は２６０Ｕ／リットル以内でＧＡを生産する。醗酵条件が変わると、この収率は７８０Ｕ／リットル以上に増加することがある。
【００１１】
３７℃でＩＰＴＧによる系の誘導は、高コピー数ベクターＴ３０７の使用と、同様に分泌されるβ‐ラクタマーゼの同時共発現との明らかな結果として、形質転換された大腸菌株にとり致死的である。したがって、誘導は約３０℃以下の温度で行われる。
【００１２】
プラスミドＴ３０７はβ‐ラクタマーゼ遺伝子を有しており、その遺伝子産物のβ‐ラクタマーゼ酵素は組換えクローンを選択するために用いられる。ＧＡと同様に、β‐ラクタマーゼも分泌されてペリプラズムに位置する酵素である。β‐ラクタマーゼ構造遺伝子、特にそのシグナルペプチド領域、をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子に置き換えることにより収率を更に改善することができた。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼはもっぱら細胞質に位置し、したがってペリプラズム空間に分泌されない。実施された構築からプラスミドＴ３６３（図４）を得たが、これも欧州出願ＥＰ‐Ａ‐０  ５０４  ７９８で記載されている。
【００１３】
例えばＣＡＴ遺伝子産物の発現が減少するならば、ＧＡを回収する上で特に有利である。ベクターＴ３６３でその天然プロモーターにより発現されるとき、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼは破壊物質中で多量に存在するタンパク質である。その発現の減少は大腸菌タンパク質対ＧＡの比率をＧＡの方に有利に著しく改善し、それにより分離カラム充填量を増加させて、単位時間当たりでより多くのＧＡを精製することを可能にできる。ＣＡＴ発現が減少する対応ベクター構築物Ｔ３９６、Ｔ４０６およびＴ４１５は、図５〜７で示されている。
【００１４】
したがって、本発明は用いられる選択タンパク質が好ましいことに単に弱く発現される方法にも関する。
【００１５】
醗酵方法について以下で説明される最適化によって、酢酸の蓄積なしに、細菌、好ましくは大腸菌、の増殖期を延長できることが更にわかった。しかも、これはバイオマス収率を増加させる。
【００１６】
主培養期、好ましくは対数増殖期、中の炭素源供給速度を増加させることにより醗酵方法を最適化することができた。使用できる炭素源の例は糖、アルコールまたは有機酸、好ましくはグルコースまたはグリセロール、特にグリセロール、である。使用できる複合窒素源の例は酵母エキス、肉ペプトン、カゼインペプトンおよび当業者に知られる他の複合窒素源である。主培地中における複合窒素源の濃度は約１０〜５０ｇ／リットル、特に２０〜４０ｇ／リットル、好ましくは約４０ｇ／リットルである。
【００１７】
下記例は、収率を増加させるために要求される発現ベクターの構築および醗酵測定について更に詳細に記載している。クローニングに用いられる酵素はNew England Biolabs またはGibco/BRL から得られ、製造業者の指示に従い用いられた。プラスミドの大きさに関するすべての値（bp）は大体である。
【００１８】
【実施例】
実施例１ ＣＡＴ遺伝子の発現減少（プラスミドＴ３９６）
ＣＡＴ発現を減少させるために、プロモーターのないＣＡＴ遺伝子をβ‐ラクタマーゼプロモーターの後にクローニングした。この目的のため、単離されたＴ３０７プラスミドＤＮＡ（図３）を制限酵素ＳｓｐＩおよびＤｒａＩで完全に切断し、得られた断片を０．６％アガロースゲルで分別した。次いで、ＧＡ遺伝子を含む約３２００bpＳｓｔＩ断片と、ｌａｃＩｑ遺伝子およびベクターの複製起点を含む約２６００bpＳｓｔＩ‐ＤｒａＩ断片とを電気溶出（electroelution）により単離した。
【００１９】
プロモーターのないＣＡＴ遺伝子を下記のようにプラスミドｐＣＭ４(T.Close and R.Rodriguez,Gene,20(1982),305-316) から得た。単離されたｐＣＭ４プラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで完全に切断し、突出末端をＡＴＰ、ＴＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼＩにより補充し、それにより平滑末端断片にした。１．２％アガロース中で切断混合物のアガロースゲル電気泳動後に、ＣＡＴ遺伝子を含んだ大きさが約７８０bpの断片を電気溶出により単離した。
【００２０】
次いで、この断片とＴ３０７からの２つの３２００bpおよび２６００bp断片をＤＮＡリガーゼを用いて結合用混合物中で一緒に結合させた。結合用混合物を大腸菌Ｗ３１１０Ｍ中に形質転換し、低濃度のクロラムフェニコール（１２．５μg/ml）の存在下のみで最適に増殖してグルタリルアミダーゼ形成を示すそれらの組換えクローンを単離した。単離されたクロラムフェニコール耐性クローンは３つの断片を含むプラスミドを保有していて、そこでは２６００bp断片が２方向に存在していた。最高の産物収率はプラスミドＴ３９６を用いて得た。Ｔ３６３の場合（２５μg/ml）と比較して低レベルの耐性は、ＣＡＴ遺伝子がβ‐ラクタマーゼプロモーターと最適な状態で並べられていないためである。ＣＡＴ遺伝子とβ‐ラクタマーゼプロモーター配列の残基との結合は図１に示される通りであった。
【００２１】
誘導条件下で２日間の細胞増殖の後において、大腸菌株Ｗ３１１０により形成されたタンパク質（Ｔ３９６）の１０〜１７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおける分析から、同条件下で培養された株Ｗ３１１０のタンパク質バンド（Ｔ３６３、図４）と比較して、ＣＡＴタンパク質が８０％以上減少したことが確認された。このため、ＧＡ酵素の収率は２つの株で非常に類似しているが、細胞破壊後における溶解ＧＡの量対全可溶性タンパク質の量の比率は有意に改善されており、ＧＡに対して少ない量の外来タンパク質のために、グルタリルアミダーゼの回収が著しく簡素化される。
【００２２】
実施例２ ｌａｃＩｑリプレッサー遺伝子の不活化（プラスミドＴ４１５）
振盪培養実験および醗酵では、ＧＡの合成が、期待されていたように、ＧＡ形成に用いられたいずれのプラスミドおよび大腸菌株においてもＩＰＴＧによる誘導前に大きくスイッチ・オフされないことが示された。更に、ＩＰＴＧ依存性ｌａｃ誘導系について記載された誘導速度は文献中の値と違っていた。ＩＰＴＧのようなインデューサーの使用に全く依存せずにＧＡの発現を行うために、ｌａｃＩｑリプレッサーについてコードする読取り枠を破壊した。これで不活化リプレッサーを得て、それによりインデューサー不在下における遺伝子読取りの障害をなくした。
【００２３】
単離されたＴ３９６プラスミドＤＮＡ（図５）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII で切断し、ＣＡＴ遺伝子とＣＡＴ遺伝子発現を減少させるβ‐ラクタマーゼプロモーターとの連結領域を含んだ約７５０bp断片を電気溶出により単離した。次いでこのインサートを、プラスミドＴ３６３から同様に単離された約６０００bpＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII 断片と一緒に結合した。これで発現ベクターＴ４０６を得る（図６）。意外にも、ベクターＴ４０６は醗酵中にＴ３９６よりも安定であることがわかった。
【００２４】
ｌａｃＩｑ遺伝子を不活化するために、単離されたＴ４０６プラスミドＤＮＡを制限酵素ＢｓｔＥIIで完全に切断した。そのベクターにおける唯一の開裂部位はリプレッサーについての構造遺伝子中に位置している。突出末端をｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼを用いて補充し、ベクターをＤＮＡリガーゼの存在下で再結合させた。このステップでは機能性ｌａｃＩｑリプレッサーが形成されないように２つの塩基対で読取り枠を移動させる。プラスミドＴ４１５が得られる（図７）。振盪培養において、組換え大腸菌Ｗ３１１０（Ｔ４１５）クローンは、２日後の約５１０Ｕ／リットル（インデューサーのあるＴ３６３）からインデューサーが加えられていないＴ４１５の場合の１５９０Ｕ／リットルまでのＧＡ形成の増加を示す。コントロール実験において、収率はＴ４１５系にインデューサーを加えても改善されない。
【００２５】
ベクターＴ３９６を保有する大腸菌株について証明された回収利点は、プラスミドＴ４１５保有大腸菌にも等しくあてはまる。
【００２６】
ｌａｃＩｑリプレッサー遺伝子の不活化が有利であるとわかったため、ＧＡを構成的に発現する構築物を作る上で、大腸菌で複製してかつ最初からｌａｃＩｑ遺伝子を欠くベクターの使用も考えることができる。ｌａｃプロモーター／オペレーター系が用いられたときに、ｌａｃ野生型リプレッサーまたはその変異体の発現がないかまたは低レベルで生じる、ＧＡ生産用の大腸菌株を用いることも可能と思われる。
【００２７】
実施例３ 大腸菌Ｔ４１５の醗酵
ＥＰ‐Ａ‐０  ５０４  ７９８による大腸菌クローンＴ３４７およびＴ３６２／３３とは対照的に、グルタリルアミダーゼ（ＧＡ）は構築物Ｔ４１５の場合でＩＰＴＧによりもはや誘導される必要がない。最適醗酵の説明を以下に示す。
【００２８】
（１）培養条件
変動させたパタメーターを除いて、すべての培養は下記条件下で行った：
株を好ましくは下記ＹＴ／グリセロール培地中−１８℃で保った：
グリセロール                  １７．０％
酵母エキス                      ０．７％
バクトトリプトン                ０．４％
ＮａＣｌ                        ０．４％
クロラムフェニコール          １２．５μg/ml
同培地の寒天プレートをこの懸濁液から作り、２８℃で２４時間インキュベートし、前培養物（ＰＣ）を単一コロニーで接種した。
【００２９】
0003813216.tif 000003
３００mlエルレンマイヤーフラスコ中この栄養溶液１００mlを接種し、その後２８℃、２２０rpm で１６〜２４時間インキュベートした。培養物はその時６．０〜８．０のＯＤ578nm を有していた。
【００３０】
下記主培養物（ＭＣ）をこのＰＣ５〜１０％（ＯＤ578nm ＝３．０のＰＣに基づく）で接種した：
0003813216.tif 000004
【００３１】
0003813216.tif 000005
【００３２】
0003813216.tif 000006
【００３３】
実施例４ ＧＡの発現がＩＰＴＧに依存しないことの証明
この目的のため、クローンＴ４１５を醗酵槽中において上記条件下で培養し、２つのエルレンマイヤーフラスコを各々の場合に異なる時間に培養溶液５０mlで充填した。１つのフラスコは１mMＩＰＴＧで誘導したが、他方はしなかった。下記ＧＡ容量活性を測定した：
0003813216.tif 000007
実験はＩＰＴＧがＧＡを誘導する上でもはや要求されないことを明らかに証明している。
【００３４】
実施例５ 大腸菌Ｔ４１５の醗酵
ＧＡ８２００Ｕ／リットル培養溶液（ＣＳ）を上記条件下で７３時間の醗酵後に得た。比活性は約７０Ｕ／ｇ湿潤重量であった。バイオマス収率は約１２０ｇ湿潤重量／リットルであった。
【００３５】
実施例６ 修正ＭＣ培地を用いた醗酵
ＭＣ培地中酵母エキスの濃度を２０から４０ｇ／リットルに倍増させることで増殖の速度を速めて、バイオマス収率を約１４０ｇ／リットルに増加させた。ＧＡ容量活性は７３時間後に９６００Ｕ／ＣＳリットルに上がった。８０００Ｕ／リットルにはわずか４８時間後に達したが、これは醗酵時間の１日短縮を示している。
【００３６】
実施例７ 修正流加バッチ供給を用いた醗酵
ＧＡ発現のＩＰＴＧ依存性調節の解消は、ＭＣ培地をうまく増幅させる可能性について試験するだけでなく（実施例６）、酢酸の形成のために以前制限されていたグリセロールの供給速度を変えることも可能にした。例えば、供給速度が醗酵の５時間目から８時間目まで連続的に３．４ml/l/hから６．６ml/l/hに増加して、その後醗酵の最後まで一定のままであったならば、これは急速な最適増殖期を延長し、その結果としてクローンが７３時間目まで一定の高い合成速度で酵素を形成し、最終的に１８８００Ｕ／ＣＳリットルまで生産された。このためＧＡの７Ｕ／タンパク質mgの比活性を考慮すれば、２．５ｇ以上の酵素がＣＳリットル当たりで形成された。バイオマス収率は約２００ｇ／ＣＳリットルであった。単に３〜４ｇ／リットルの少量の酢酸が中間体としてなお形成された。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＡＴ遺伝子が発現される速度を減少させるためのＣＡＴ遺伝子プロモーター結合領域を示した図である。
【図２】発現ベクターｐＣＭ１４５を示した図である。
【図３】発現ベクターＴ３０７を示した図である。
【図４】発現ベクターＴ３６３を示した図である。
【図５】発現ベクターＴ３９６を示した図である。
【図６】発現ベクターＴ４０６を示した図である。
【図７】発現ベクターＴ４１５を示した図である。
【図１】
0003813216.tif 000008
【図２】
0003813216.tif 000009
【図３】
0003813216.tif 000010
【図４】
0003813216.tif 000011
【図５】
0003813216.tif 000012
【図６】
0003813216.tif 000013
【図７】
0003813216.tif 000014