(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロプレートの底面側から前記マイクロプレートの複数のウェル内の試料に励起光を照射し、その試料による蛍光を前記マイクロプレートの底面側で検出する蛍光測定装置において、
前記励起光を発生する励起光発生装置と、
前記励起光発生装置から入射される励起光を前記複数のウェルに応じて分配する複数本の励起光照射用光ファイバと、
前記複数のウェル内の試料から入射される蛍光を伝送する蛍光取得用光ファイバと、
前記蛍光取得用光ファイバによって伝送された蛍光を検出する蛍光検出装置と、
前記マイクロプレートの底面側に前記複数のウェルに対応して設けられ且つそれぞれが前記励起光照射用光ファイバの出射端部と前記蛍光取得用光ファイバの入射端部を束ねて構成される複数の光ファイババンドル部を、その光ファイババンドル部の端面と前記マイクロプレートの底面との間の距離を増減させるように移動させるファイバ移動機構と、
を備えることを特徴とする蛍光測定装置。
【請求項２】
前記複数のウェル内に試薬を分注する試薬分注装置と、前記マイクロプレートを振動させるマイクロプレート振動機構とを更に備えることを特徴とする請求項１に記載の蛍光測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光測定装置に関し、より詳細には、マイクロプレートの複数のウェル内に収容した細胞などからの蛍光を測定する蛍光測定装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来からある蛍光測定装置として、マイクロプレートの複数のウェルに試料を収容して、各試料からの蛍光を測定する蛍光測定装置が知られている。例えば特開昭６０−４０９５５号公報には、マイクロプレートの複数のウェルに対応して主光ファイバから途中で分岐し光源からの光を複数のウェルに伝送する複数本の分岐光ファイバと、その分岐した複数本の分岐光ファイバにそれぞれ束ねられた蛍光検出用光ファイバとを有し、マイクロプレートの底面側で、複数のウェルに対応して分岐光ファイバ及び蛍光検出用光ファイバの端部が固定された蛍光測定装置が開示されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特開昭６０−４０９５５号公報の蛍光測定装置においては、細胞などからの蛍光を検出する場合に、細胞によってはその蛍光を十分に検出できない場合があった。
【０００４】
そこで、本発明は、上記事情に鑑み、試料の種類にかかわらず試料からの蛍光を十分に検出できる蛍光測定装置を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記従来の蛍光測定装置について鋭意検討した結果、細胞にはウェルの底面に付着する付着性細胞と、ウェル内で浮遊する浮遊性細胞があり、これら細胞の性状によって細胞からの蛍光強度が十分に検出できたりできなかったりする場合があることを見い出し、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、請求項１に係る発明は、マイクロプレートの底面側からマイクロプレートの複数のウェル内の試料に励起光を照射し、その試料による蛍光をマイクロプレートの底面側で検出する蛍光測定装置において、励起光を発生する励起光発生装置と、励起光発生装置から入射される励起光を複数のウェルに応じて分配する複数本の励起光照射用光ファイバと、複数のウェル内の試料から入射される蛍光を伝送する蛍光取得用光ファイバと、蛍光取得用光ファイバによって伝送された蛍光を検出する蛍光検出装置と、マイクロプレートの底面側に複数のウェルに対応して設けられ且つそれぞれが励起光照射用光ファイバの出射端部と蛍光取得用光ファイバの入射端部を束ねて構成される複数の光ファイババンドル部を、その光ファイババンドル部の端面とマイクロプレートの底面との距離を増減させるように移動させるファイバ移動機構とを備えることを特徴とする。
【０００７】
この発明によれば、励起光発生装置からの励起光を励起光照射用光ファイバを通して伝送し、マイクロプレートの複数のウェル内の試料に照射すると、各試料からの光が蛍光取得用光ファイバを通して伝送され、蛍光検出装置で試料からの蛍光が検出される。ここで、試料として付着性細胞や浮遊性細胞を含有する液体などを用いる場合、これら細胞の性状に応じ、ファイバ移動機構によってあらかじめ光ファイババンドル部の端面をマイクロプレートの底面に対して近づけたり遠ざけたりしておくと、細胞の性状にかかわらず、適切な強度の蛍光が検出される。
【０００８】
また、上記蛍光測定装置は、複数のウェル内に試薬を分注する試薬分注装置と、マイクロプレートを振動させるマイクロプレート振動機構とを更に備えることが好ましい。
【０００９】
この発明によれば、試薬分注装置によってマイクロプレートのウェル内に試薬を分注すると、液面のゆれなどによる試料中の細胞分布の変化により蛍光強度が変化することがあるが、試薬分注前後にかけてマイクロプレート振動機構によってマイクロプレートを振動させておくと、試薬を分注しても蛍光の強度がほとんど変化することがない。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面と共に本発明の蛍光測定装置の好適な実施形態について説明する。なお、全図中、同一又は相当する構成要素には同一符号を付する。
【００１１】
図１は、本発明の蛍光測定装置の基本構成を示す概略図である。図１に示すように、蛍光測定装置１はマイクロプレート４を用いる。マイクロプレート４には、その表面４ｂ側に複数のウェル３が形成され、例えばウェル３は９６個形成され、これらは８列１２行で配列されている。このマイクロプレート４は、その底面４ａから入射される光を透過できるように光学的に透明な材料又はウェル３の底部のみが透明な材料で作られる。なお、試料Ｓとしては、蛍光指示薬（例えばＦｕｒａ２）を負荷した細胞が用いられ、細胞は細胞培養液などに浸漬される。蛍光測定装置１は、これら複数の試料Ｓに対し、暗箱２内でマイクロプレート４の底面４ａ側から励起光を照射し、複数の試料Ｓから出射される蛍光を同時一括に測定する。
【００１２】
蛍光測定装置１は、励起光を発生する励起光発生装置５を備えている。励起光発生装置５は、光源７から出射される光を集光レンズ８を通して波長選択装置６を通過させることにより所望の波長の励起光を取り出すものである。波長選択装置６は、透過波長域の異なる複数（例えば２枚）の励起光選択フィルタ（例えば透過波長３４０ｎｍ，３８０ｎｍ）９，１０が円周に沿って嵌め込まれた円板１１を有している。この円板１１を回転モータ１２により中心回りに回転させると、光源７から出射された光が集光レンズ８で集光された後、励起光選択フィルタ９又は１０を通過し、所望波長の励起光が取り出される。なお、波長選択装置６には、励起光選択フィルタ９，１０の位置を識別するセンサ系が設けられている。このセンサ系からの信号に基づきパーソナルコンピュータ２４からコントローラ５０に制御信号ＣＮ１が送出され、コントローラ５０によって回転モータ３３の回転が制御される。
【００１３】
この励起光発生装置５からは、励起光を伝送するための９６本の励起光照射用光ファイバ１３が延びている。これらの励起光照射用光ファイバ１３の入射端部１３ａは円筒管１４内に収容されて励起光発生装置５に接続されている。また、図２、図３に示すように、出射端部１３ｂは、マイクロプレート４のウェル３に対応して例えば８列１２行で１本ずつ分配され、これら出射端部１３ｂの光軸は、マイクロプレート４の底面４ａに直交する方向となっている。これら複数の励起光照射用光ファイバ１３のそれぞれの出射端部１３ｂの周囲には、各試料Ｓから出射される光を伝送するための６本の蛍光取得用光ファイバ１５の入射端部１５ａが配置されている。そして、複数のウェル３のそれぞれに対応する１本の出射端部１３ｂと、その周囲の６本の蛍光取得用光ファイバ１５の入射端部１５ａは、円筒管１６内に収納されている。このようにして、光ファイババンドル部１７が構成される。
【００１４】
図１に示すように、蛍光取得用光ファイバ１５の出射端部１５ｂから出射される光がそれぞれ蛍光選択フィルタ（例えば４００ｎｍ以上の光を透過する干渉フィルタ）１８を通過すると蛍光が取り出され、この蛍光は、光電子増倍管１９で検出される。そして、これら蛍光選択フィルタ１８と光電子増倍管１９とで蛍光検出装置２０が構成されている。なお、光電子増倍管１９は、高圧電源２１および独立したアンプ回路２２に接続され、各アンプ回路２２はアナログデータ処理装置２３を介してパーソナルコンピュータ２４に接続されている。従って、各光電子増倍管１９から出力された信号はアンプ回路２２で増幅され、その増幅された各信号はアナログデータ処理装置２３でディジタル値に変換され、パーソナルコンピュータ２４で各データの収集、解析等が行われる。
【００１５】
以上の構成により、マイクロプレート４が複数の光ファイババンドル部１７の上方に配置されると、複数の光ファイババンドル部１７から出射される励起光はそれぞれマイクロプレート４の複数のウェル３に照射され、複数の試料Ｓから出射される光がそれぞれ光ファイババンドル部１７の蛍光取得用光ファイバ１５の入射端部１５ａに入射され、蛍光取得用光ファイバ１５から出射された光が蛍光選択フィルタ１８を経ることで蛍光が取り出され、その蛍光が光電子増倍管１９で検出される。
【００１６】
図２に示すように、光ファイババンドル部１７は、平板状のファイバホルダ２５に固定されている。ファイバホルダ２５には、マイクロプレート４のウェル３に対応して形成された８列１２行の開口部２５ａを貫通させて固定されている。図４に示すように、このファイバホルダ２５は、Ｕ字型のガイド部材２６で支持されている。ガイド部材２６は、図５にも示すように、支持板２７と、その支持板２７の両側に直交して設けられる一対の支持腕２８，２８とで構成され、支持板２７および一対の支持腕２８，２８によってファイバホルダ２５が支持される。支持板２７には、ボールねじ２９がねじ係合され、このボールねじ２９は昇降用ステッピングモータ３０に接続されている。このようにしてファイバ移動機構が構成される。
【００１７】
そして、昇降用ステッピングモータ３０を作動させると、ボールねじ２９が回転し、ガイド部材２６が上昇する。従って、光ファイババンドル部１７の上方にマイクロプレート４が配置されると、光ファイババンドル部１７の端面１７ａがマイクロプレート４の底面４ａに近づく。また、ボールねじ２９を逆回転させると、ガイド部材２６が下降し、光ファイババンドル部１７の端面１７ａがマイクロプレート４の底面４ａから遠ざかる。
【００１８】
ところで、試料Ｓとして用いる細胞には、マイクロプレート４のウェル３の底面に付着する付着性細胞（図６（ａ）参照）と、ウェル３内の細胞培養液中で浮遊する浮遊性細胞（図６（ｂ）参照）とがある。付着性細胞は、ウェル３内の定位置にあるため、遠い位置から励起光を照射すると蛍光が十分に取得できない場合がある。一方、浮遊性細胞は細胞培養液中で浮遊しているため、近い位置から励起光を照射すると蛍光が十分に得られない場合がある。
【００１９】
従って、付着性細胞に励起光を照射する場合には、図７（ａ）に示すように、光ファイババンドル部１７の端面１７ａをマイクロプレート４の底面４ａに近づけることで蛍光が十分に得られ、浮遊性細胞に励起光を照射する場合には、図７（ｂ）に示すように、光ファイババンドル部１７の端面１７ａをマイクロプレート４の底面４ａから遠ざけることで蛍光が十分に得られる。例えば、付着性細胞については、光ファイババンドル部１７の端面１７ａとマイクロプレート４の底面４ａとの距離を１ｍｍとすると十分な蛍光強度が得られるが、４ｍｍとすると、蛍光強度は、１ｍｍの場合に得られる蛍光強度のおよそ１／２となる。このように細胞の性状に応じて光ファイババンドル部１７の端面１７ａとマイクロプレート４の底面４ａとの間の距離をあらかじめ調節することにより細胞の性状にかかわらず十分な強度の蛍光が確実に得られる。なお、ファイバホルダ２５の位置は、細胞の性状に応じて、パーソナルコンピュータ２４から昇降用ステッピングモータ３０にパルス入力信号を送ることで制御される。
【００２０】
図８は、本実施形態に係る蛍光測定装置１の構成をより詳細に示す概略図である。図８に示すように、蛍光測定装置１には、暗箱２内でマイクロプレート４の複数のウェル３に試薬を分注する試薬分注装置３１が更に設けられ、この試薬分注装置３１は、暗箱２内でガイドレール３２，３２の上方に試薬分注器３３を備えている。この試薬分注器３３は、試薬を貯留する貯留タンク３４から複数の分注ノズル３５を通して試薬を分注するものであり、分注ノズル３５は、マイクロプレート４の複数のウェル３に対応して８列１２行で配列されている。従って、これら分注ノズル３５を通して各ウェル３に試薬が同時一括に注入される。この試薬分注器３３は、暗箱２内でガイドレール３２，３２の上方でこれらと平行に延びる一対のガイドレール３６，３６に懸架される。また、ガイドレール３６，３６には、試薬分注器３３とほぼ同一構成の試薬分注器３７が懸架されている。なお、試薬分注器３３，３７はそれぞれパーソナルコンピュータ２４から送出される入力指示信号ＣＢに基づき駆動制御部３８から送出される分注指示信号Ｂ１，Ｂ２によって制御され、これによって試薬の分注量や分注タイミング等が制御される。
【００２１】
図９は、前述した試薬分注装置３１を用いてマイクロプレート４の複数の試料Ｓに分注ノズル３５から試薬を分注する前後における細胞培養液中の付着性細胞の分布状態の変化を示す図であり、図１０は、試薬分注前後の付着性細胞の分布状態の変化をマイクロプレート４の表面側から見た図である。これらの図に示すように、試薬分注前では、励起光が十分な数の細胞に照射されているのに対し、試薬分注後では、試薬の分注により液面がゆれたり細胞が舞い上がったりする場合があるため、励起光に照射される細胞の数が減少する。従って、試薬分注後で蛍光強度が減少する場合がある。図１１は、付着性細胞に３４０ｎｍ，３８０ｎｍの２種類の波長の励起光をそれぞれ試薬分注前後にかけて試料Ｓに照射したときの蛍光強度の変化の一例を示しており、試薬を分注すると蛍光強度が急激に減少していることが分かる。このように蛍光強度が変化すると、蛍光強度の変化が試薬分注による細胞自体の変化によるものか否かが分からず、細胞の動態が的確に把握できなくなり好ましくない。
【００２２】
そこで、蛍光測定装置１には、マイクロプレート４を振動させるマイクロプレート４のウェル３内の細胞が試薬分注前後にかけて運動した状態を維持するようにマイクロプレート振動機構が設けられている。
【００２３】
図１２は、このマイクロプレート振動機構の一例を示す平面図であり、図１３は、図１２のＸＩＩＩ−ＸＩＩＩ線に沿った断面図である。これらの図に示すように、マイクロプレート振動機構３９は、例えばガイドレール３２，３２に沿って往復移動可能な矩形状の可動枠４０を備えており、この可動枠４０上には一対の支柱４１，４１を介してマイクロプレートホルダ４２が支持されている。マイクロプレートホルダ４２は、マイクロプレート４を支持するためのものであり、マイクロプレート４の底面４ａ側から励起光を照射できるように矩形状の開口部４２ａが形成されている。また、マイクロプレートホルダ４２には１つの貫通孔４３が形成され、この貫通孔４３には円板４４が回転可能に嵌め込まれ、この円板４４にはその中心Ｃから離れた位置に回転軸４５が貫通し、回転軸４５は振動用モータ４６に接続されている。振動用モータ４６は可動枠４０上に固定されている。
【００２４】
このようなマイクロプレート振動機構３９を作動させるにあたっては、まず、複数の光ファイババンドル部１７の端面１７ａがそれぞれマイクロプレート４の対応する複数のウェル３に対向するように配置される。そして、光ファイババンドル部１７の端面１７ａとマイクロプレート４の底面４ａとの間の間隔が細胞の性状に応じてあらかじめ調節される。このような状態で、振動用モータ４６を作動させると、円板４４の中心Ｃが回転軸４５回りに回転し、これに伴ってマイクロプレートホルダ４２が振動する。マイクロプレートホルダ４２は、ガイドレール３２，３２に沿った方向で振動し、かつガイドレール３２，３２に直交する方向でも振動する。
【００２５】
ここで、マイクロプレートホルダ２４は、ウェル３内の試料Ｓから出射される光が、振動中、同一の光ファイババンドル部１７の端面１７ａに入射されるように振動される。このとき、マイクロプレート４のウェル３内の細胞が動いた状態を維持される。このため、試薬分注器３３，３６から試薬が分注されても、試薬分注前後にかけてウェル３内の細胞が動かされることとなるので、試薬分注によりウェル３内の静止細胞が動き出すことで生じる蛍光強度の変化が十分に防止される。このため、試薬分注による蛍光強度の変化が細胞自体の変化によるものとなり、試薬分注直後における細胞の動態をも的確に把握されることとなる。
【００２６】
なお、振動用モータ４６には回転速度制御回路４７が接続され、この回転速度制御回路４７により回転軸４５の回転速度が制御され、この回転速度制御回路４７には振動モータ４６のＯＮ／ＯＦＦを制御するスイッチが接続されている。
【００２７】
また、図８に示すように、暗箱２の側面２ａには複数枚のマイクロプレート４を収納する収納ボックス４８が設けられ、これらマイクロプレート４は、マイクロプレート送出機構（図示せず）によって収納ボックス４８からガイドレール３２，３２上に順次送り出される。また、暗箱２の側面２ａと反対の側面２ｂには、ガイドレール３２，３２上から送られるマイクロプレート４が収納ボックス４９内に収容され、マイクロプレート４は、リフト機構（図示せず）によって順次上方に移動される。なお、マイクロプレート送出機構およびリフト機構はそれぞれパーソナルコンピュータ２４から送出される入力指示信号ＣＢに基づき駆動制御部３８から送出される指示信号ＣＬ，ＣＳによって制御され、また、ガイドレール３２，３２に沿って往復移動可能な可動枠４０はパーソナルコンピュータ２４から送出される入力指示信号ＣＢに基づき駆動制御部３８から送出される指示信号ＣＣによって制御される。
【００２８】
次に、以上のような構成を有する蛍光測定装置１の使用方法の一例について簡単に説明する。
【００２９】
まず、例えば１０枚のマイクロプレート４をあらかじめ収納ボックス４８内に収納しておく。そして、あらかじめ測定すべき細胞が付着性細胞であるか浮遊性細胞であるか、また、試薬分注によって動きやすい細胞であるかどうかなどの細胞の性状や測定条件をパーソナルコンピュータ２４に入力する。
【００３０】
このようにして測定開始指示がなされると、駆動制御部３８からの制御信号ＣＬによってマイクロプレート送出機構を作動させ、マイクロプレート４を暗箱２内のガイドレール３２，３２の一端部（初期位置）に設置する。次に、駆動制御部３８からの制御信号ＣＣによって可動枠４０を移動させることによりマイクロプレート４を光ファイババンドル部１７の上方に配置する。
【００３１】
ここで、あらかじめ入力された細胞の性状にしたがって、付着性細胞では例えば４ｍｍ、浮遊性細胞では例えば１ｍｍ程度となるように昇降用ステッピングモータ３０を制御し、マイクロプレート４の底面４ａと光ファイババンドル部１７の端面１７ａとの間隔を設定する。また、浮遊性細胞あるいは付着性細胞でも試薬分注によって動きやすいものについてはマイクロプレート振動機構３９の振動用モータ４６を作動させる。
【００３２】
次に、パーソナルコンピュータ２４からの分注制御信号ＣＢにより試薬分注器３６をマイクロプレート４に対向する位置まで移動させる。次に、分注指示信号Ｂ１を試薬分注器３６へ出力することにより、分注指示信号Ｂ１に応じてあらかじめ予定された量の第一試薬を試薬分注器３６から複数のウェル３内に同時に一括して分注する。
【００３３】
試薬分注器３６での分注が完了したならば、試薬分注器３６をもとの位置に戻し、続いて試薬分注器３３をマイクロプレート４に対向する位置まで移動させる。そして、第一試薬の分注の場合と同様にして第二試薬を複数のウェル３内に同時一括して分注する。
【００３４】
測定が終了したマイクロプレート４は、駆動制御部３８からの制御信号ＣＣによって可動枠４０を移動させ、マイクロプレート４を駆動制御部３８からの制御信号ＣＳによってリフト機構を作動させることで１枚ずつ収納ボックス４９内に収納する。以下、未測定のマイクロプレート４についても、同様にして測定を行う。
【００３５】
なお、本発明は、前述した実施形態に限定されるものではない。例えば、ファイバ移動機構は、光ファイバホルダ１７の端面１７ａをマイクロプレート４の底面４ａに直交する方向に移動させる機構であれば、上記実施形態の構成に限定されるものではない。
【００３６】
また、マイクロプレート振動機構３９は、マイクロプレート４を振動させる機構である限り、マイクロプレート４を上下方向に移動させる機構であっても、一方向にのみ移動させる機構であってもよい。
【００３７】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、励起光発生装置からの励起光を励起光照射用光ファイバを通して伝送し、マイクロプレートの複数のウェル内の試料に照射すると、各試料からの光が蛍光取得用光ファイバを通して伝送され、蛍光検出装置で試料からの蛍光が検出される。ここで、試料として付着性細胞や浮遊性細胞を含有する液体などを用いる場合、これら細胞の性状に応じ、ファイバ移動機構によってあらかじめ光ファイババンドル部の端面をマイクロプレートの底面に対して近づけたり遠ざけたりしておくと、細胞の性状に応じて適切な強度の蛍光が十分に検出される。その結果、細胞の性状にかかわらず試料から十分な強度の蛍光を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による蛍光測定装置の一実施形態の基本構成を示す概略断面図である。
【図２】光ファイババンドル部とマイクロプレートの位置関係を示す側面図である。
【図３】図２のＩＩＩ−ＩＩＩ線に沿った断面図である。
【図４】ファイバ移動機構の一例を示す側面図である。
【図５】図４のファイバ移動機構を示す平面図である。
【図６】（ａ）はウェルの底面に付着する付着性細胞を示す断面図、（ｂ）は細胞培養液中に浮遊する浮遊性細胞を示す断面図である。
【図７】（ａ）は、付着性細胞に励起光を照射する場合の光ファイババンドル部の適切な位置を示す断面図、（ｂ）は、浮遊性細胞に励起光を照射する場合の光ファイババンドル部の適切な位置を示す断面図である。
【図８】図１の蛍光測定装置の構成をより詳細に示す概略図である。
【図９】試薬分注前後の細胞分布の変化を示す図である。
【図１０】図９の試薬分注による細胞分布の変化をマイクロプレートの表面側から見た図である。
【図１１】図１１は、付着性細胞に２種類の波長の励起光をそれぞれ試薬分注前後にかけて試料に照射したときの蛍光強度の変化を示すグラフである。
【図１２】図１２は、マイクロプレート振動機構の一例を示す平面図である。
【図１３】図１３は、図１２のＸＩＩＩ−ＸＩＩＩ線に沿った断面図である。
【符号の説明】
１…蛍光測定装置、３…ウェル、４…マイクロプレート、４ａ…底面、５…励起光発生装置、７…光源（励起光発生装置）、８…集光レンズ、９，１０…励起光選択フィルタ（励起光発生装置）、１３…励起光照射用光ファイバ、１３ｂ…出射端部、１５…蛍光取得用光ファイバ、１５ａ…入射端部、１７…光ファイババンドル部、１７ａ…端面、１８…蛍光選択フィルタ（蛍光検出装置）、１９…光電子増倍管（蛍光検出装置）、２５…ファイバホルダ（ファイバ移動機構）、２６…ガイド部材（ファイバ移動機構）、２７…支持板（ファイバ移動機構）、２８…支持腕（ファイバ移動機構）、２９…ボールねじ（ファイバ移動機構）、３０…昇降用ステッピングモータ（ファイバ移動機構）、３３，３６…試薬分注器（試薬分注装置）、３５…分注ノズル（試薬分注装置）、３６…ガイドレール（試薬分注装置）、４０…可動枠（マイクロプレート振動機構）、４１…支柱（マイクロプレート振動機構）、４２…マイクロプレートホルダ（マイクロプレート振動機構）、４４…円板（マイクロプレート振動機構）、４５…回転軸（マイクロプレート振動機構）、４６…振動用モータ（マイクロプレート振動機構）、４７…回転速度制御回路（マイクロプレート振動機構）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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