(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）の性質を有するデルマタン硫酸又はその塩。
（ａ）ウベローデ型粘度管を用いる測定法で、溶媒として0.2M塩化ナトリウム溶液を使用して30±0.1℃で測定したときの極限粘度が0.8〜2.0  100mL/gである、
（ｂ）酵素分解および高速液体クロマトグラフィーを用いる測定法によって測定した構成２糖組成のうち、△Di-OSが2%以上7%以下である、
（ｃ）ヘパリン又はヘパラン硫酸分解酵素と高速液体クロマトグラフィーを用いる測定法によって測定したヘパリン又はヘパラン硫酸の含量が0.15%以下、アンチトロンビンIIIの存在下で活性型第X因子の阻害作用を測定する方法によってウシ腸由来ヘパリンを標準物質として測定したヘパリン又はヘパラン硫酸の含量が0.07%以下、あるいはアンチトロンビンIIIの存在下で活性型第II因子の阻害作用を測定する方法によってウシ腸由来ヘパリンを標準物質として測定したヘパリン又はヘパラン硫酸の含量が0.05%以下である。
【請求項２】
鶏冠由来のデルマタン硫酸である請求項１に記載のデルマタン硫酸又はその塩。
【請求項３】
平均分子量が2.5万ダルトン以上10万ダルトン以下
(Biochim.Biophys.Acta,1117,60-70,1992に記載されたゲル濾過法による)を示す請求項１又は２に記載のデルマタン硫酸又はその塩。
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｃ）の性質を有するデルマタン硫酸又はその薬理的に許容される塩を有効成分とする抗血栓剤。
（ａ）ウベローデ型粘度管を用いる測定法で、溶媒として0.2M塩化ナトリウム溶液を使用して30±0.1℃で測定したときの極限粘度が0.8〜2.0  100mL/gである、
（ｂ）酵素分解および高速液体クロマトグラフィーを用いる測定法によって測定した構成２糖組成のうち、△Di-OSが2%以上7%以下である、
（ｃ）ヘパリン又はヘパラン硫酸分解酵素と高速液体クロマトグラフィーを用いる測定法によって測定したヘパリン又はヘパラン硫酸の含量が0.15%以下、アンチトロンビンIIIの存在下で活性型第X因子の阻害作用を測定する方法によってウシ腸由来ヘパリンを標準物質として測定したヘパリン又はヘパラン硫酸の含量が0.07%以下、あるいはアンチトロンビンIIIの存在下で活性型第II因子の阻害作用を測定する方法によってウシ腸由来ヘパリンを標準物質として測定したヘパリン又はヘパラン硫酸の含量が0.05%以下である。
【請求項５】
デルマタン硫酸又はその薬理的に許容される塩が鶏冠由来のデルマタン硫酸又はその薬理的に許容される塩である請求項４に記載の抗血栓剤。
【請求項６】
デルマタン硫酸の平均分子量が2.5万ダルトン以上10万ダルトン以下
(Biochim.Biophys.Acra,1117,60-70,1992に記載されるゲル濾過法による)を示す請求項４又は５に記載の抗血栓剤。
【請求項７】
組織プラスミノーゲンアクチベータをさらに含む請求項４〜６のいずれかに記載の抗血栓剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は血栓の伸展を妨げ、溶解あるいはそれを促進する抗血栓剤に関する。
背景技術
血栓症は、本来血管内では流動性を保っていなければならない血液が血小板や凝固、線溶系のバランスの乱れにより生体の血管内で凝固する疾病である。血栓が心臓の冠動脈内に生ずることにより心筋梗塞がおき、下肢の静脈系等に生ずれば深部静脈血栓症が発症する。重症感染症や、腫瘍の影響等で凝固系が異常に活性化されれば全身の微細血管に血栓が多発する汎発性血管内凝固症候群（以下、DICという）と呼ばれる病態が出現する。このうち重症感染症等に起因するDICは、多臓器不全をしばしば合併し予後は極めて重篤である。このように血栓症は発症する部位により極めて多彩な病態をとるため様々な治療法が開発されてきた。薬物では、心筋梗塞症や深部静脈血栓症にはウロキナーゼや組織プラスミノーゲンアクチベータ（以下、t-PAという）あるいはヘパリン等が用いられ、DICにはやはりヘパリン等が用いられている。しかしながらウロキナーゼにはフィブリンに対する親和性が低いという問題があり、またt-PAは値段が高く半減期が極めて短い、あるいは経皮冠動脈内血栓溶解療法や直接末梢静脈内にt-PAを投与する再開通療法では、再閉塞をおこし易い等の問題がある。ヘパリンはその薬効を発揮するためには一定濃度以上のアンチトロンビンIII濃度を必要とする等の問題がある。加えてこういった薬剤に共通している点は極めて重篤な出血という副作用を引き起こすことである。これを解決するために合成抗プロテアーゼ薬も開発されてきているが、出血という副作用が充分に解決されたわけではなく、半減期も極めて短い等の問題点がのこっている。
デルマタン硫酸には、従来からヘパリンコファクターIIを介しての抗凝固活性が報告されてきているが、線溶活性については、デルマタン硫酸が、t-PAの遊離を促すという報告（Abbadini M.et al.,Blood 1987 70,1858-1860）がある一方、デルマタン硫酸はt-PA量や線溶活性になんら影響を与えない（Tripodi A.et al.,Thromb Res.1991 62,663-672）という報告もあり、線溶系にあたえる影響はさだかでない。
また、従来種々の実験に使用され、あるいは医薬として開発中のデルマタン硫酸は豚あるいは牛の腸あるいは皮膚由来のものであり（Fareed J. et al. Recent Advances in Blood Coagulation, 1993, 6, 169-187）、その他の起源のデルマタン硫酸の活性についてはまったく知られていない。
発明の開示
本発明者らは、デルマタン硫酸の線溶系に与える影響を検討したところ、デルマタン硫酸がこの化合物の存在しないときに比べて血栓溶解作用を増強する作用があることを見いだした。また生体に投与された場合は、抗凝固及び線溶活性の双方からなると考えられる抗血栓作用、即ち血栓の形成抑制、溶解促進作用等の総合作用は、デルマタン硫酸の中でも極限粘度が0.8 100mL/g以上である特定のデルマタン硫酸、あるいは鶏冠由来の特定のデルマタン硫酸、あるいは構成2糖組成のうちΔDi-OSが２％以上７％以下である特定のデルマタン硫酸、あるいは後述の測定法で求めた平均分子量が2.5万ダルトン以上10万ダルトン以下のデルマタン硫酸、あるいは特にこれらの前記のデルマタン硫酸であってヘパリンまたはヘパラン硫酸含量が極めて低い特定のデルマタン硫酸に極めて強いことを見出し本発明をなすに至った。
本発明は、上記したようなデルマタン硫酸を有効成分とする抗血栓剤、あるいはデルマタン硫酸と組織プラスミノーゲンアクチベータとを併用した抗血栓剤に関する。
デルマタン硫酸は、N-アセチル-D-ガラクトサミン-4-硫酸とL-イズロン酸から成る二糖の繰返し構造が主であるが、少量のD-グルクロン酸も含まれ、動物種及び臓器などによって硫酸含量、硫酸等の結合位置、D-グルクロン酸含量等が異っている。
デルマタン硫酸は、通常は、ウシ、ブタ等の哺乳類等の腸粘膜、皮膚または鶏冠等の生原料から製造される。
本発明者らは、これらの原料から得られたデルマタン硫酸あるいはその薬理学的に許容される塩がそれが存在しないときに比べて、一本鎖または二本鎖t-PAによるプラスミノーゲンの活性化を高めることを見いだした。また生体内に投与された場合は、本発明の特定のデルマタン硫酸、すなわち、極限粘度が0.8 100mL/g以上、好ましくは0.9〜2.0 100mL/gであるデルマタン硫酸、あるいは鶏冠由来のデルマタン硫酸、あるいは構成２糖組成のうちΔDi-OSが２％以上７％以下、好ましくは３％以上６％以下のデルマタン硫酸、あるいは後述のBiochim. Biophys. Acta, 1117, 60-70,1992に記載されたゲル濾過法による測定法で求めた平均分子量が2.5万ダルトン以上10万ダルトン以下、好ましくは３万ダルトン以上６万ダルトン以下のデルマタン硫酸、あるいは特にこれら前記のデルマタン硫酸であってヘパリンまたはヘパラン硫酸含量の極めて低い特定のデルマタン硫酸またはその薬理学的に許容される塩が、それ以外のデルマタン硫酸に比し血中に長く保持され、線溶活性のみならず、抗凝固作用も加えた総合的な抗血栓作用において有効な薬理効果を示すことを見い出した。
デルマタン硫酸の薬理学的に許容される塩には、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩などがあるが、通常はナトリウム塩の形で投与される。t-PAは、内因性あるいは外因性であっても、一本鎖あるいは二本鎖であっても、さらに天然型あるいは遺伝子組換え型であってもよい。また、その一部のアミノ酸が欠缺していてもあるいはアミノ酸が付加されていてもプラスミノーゲン活性化作用がある限り用いることができる（EP-A-112122参照）。
デルマタン硫酸またはその薬理的に許容される塩（以下、DSということもある）は単独、単回投与、或いは単独、持続投与しても充分にその薬理活性を示す。その投与経路は静脈内注射、動脈内注射、冠動脈内注射でも良いし、皮下注射や筋肉注射も可能である。さらにまたDSをt-PAと併用する場合はDSをt-PAと同ルートで同時に投与してもよいし、また別々に投与してもよい。
さらに、DSの血中濃度と血中t-PA濃度とが有効濃度以上になることが予想される場合には、前記した冠動脈内投与、静脈内投与のほかに筋肉内投与、皮下投与等を行ってもよい。
また、これらの製剤を調製するさいは、医薬上許容される通常の安定剤、乳化剤、あるいは浸透圧調整剤、pH調整剤等の補助剤を適宜用いることができる。
投与量は、DSを単独に成人に対し用いる場合は、一日総量50〜3000mgで、これをt-PAと併用するときはDS50〜3000mg、t-PA10000〜500000I.U.（国際単位）を使用するとよい。これらの有効成分は一日に単回あるいは適当な間隔をあけて２回乃至数回に分けて投与することができる。また数日にわたり持続静注することもできる。
上記したように、DSあるいはその薬理的に許容される塩は、線溶活性を賦活し、有用な血栓溶解促進剤として利用される。特に本発明の特定のDS、すなわち、極限粘度が0.8 100mL/g以上2.0 100mL/g以下であるDS、あるいは鶏冠由来のDS、あるいは構成２糖組成のうちΔDi-OSが２％以上７％以下であるDS、あるいは後述の測定法で求めた平均分子量が2.5万ダルトン以上10万ダルトン以下であるDS、あるいは特にこれら前記DSであってヘパリンまたはヘパラン硫酸含量が極めて低い特定のDSあるいはその薬理的に許容される塩はその効果が顕著である。なお、極限粘度が2.0 100mL/gを越えるか、平均分子量が10万ダルトン以上を越えたものは、特に高濃度で使用した場合粘稠度が増し、血液の流れを悪くするおそれがあり好ましくない。さらに上記DSあるいはその薬理的に許容される塩とt-PAとを併用すると血栓を溶解する作用を著しく高め、t-PAの用量を減少させることができ、有用な血栓溶解剤として血栓症の治療及び予防に用いることができる。
特に、前記した本発明の特定のDSあるいはその薬理的に許容される塩等は、生体内に投与された場合、それ以外のDSあるいはその薬理的に許容される塩に比し、有効血中濃度が長く維持され、血栓の伸展予防、成長抑制、あるいは溶解促進効果を示し、汎発性血管内凝固症候群や、多発血栓に伴う多臓器不全、深部静脈血栓症等に優れた効果を発揮する。またこの効果は前述した疾患のみならず、動脈系、毛細血管系、静脈系を問わずあらゆるタイプの血栓症で発揮され治療、予防に用いることが出来るほか、腎透析等の体外循環時に用いて血液の凝固を防止する目的に使用できる。
またDS中に混在するヘパリン（以下Hep）あるいはヘパラン硫酸（以下HS）（以下HS）を除去したDS（以下DS-H(-)ともいう）は注射薬として血管内あるいは皮下や筋肉に注射した場合、出血等の副作用の出現がより抑えられる。特にDS-H(-)は血小板や、凝固因子の低下した出血傾向をもった患者に投与された場合、出血等副作用の出現はより低く、安全性が高い。
【図面の簡単な説明】
第１図は、鶏冠由来のデルマタン硫酸ナトリウム（参考例１参照）（RCDS）とウシ小腸由来のデルマタン硫酸ナトリウム（参考例２参照）（BIDS）を投与したラットにおけるデルマタン硫酸ナトリウムの血中持続時間を示す（実施例１参照）。
●はBIDS投与、○はRCDS投与、▲はBIDS-H(-)、□はRCDS-H(-)、Ｘは●○▲□が重なっていることを示す。
第２図は、一本鎖組織プラスミノーゲンアクチベータ(sc-tPA)によるプラスミノーゲン活性化に対するBIDSの促進効果を促進率として示す。
第３図は、二本鎖組織プラスミノーゲンアクチベータ(tc-tPA)によるプラスミノーゲン活性化に対するBIDSの促進効果を促進率として示す。
第４図は、sc-tPAによるプラスミノーゲン活性化に対するRCDSの促進効果を促進率として示す。
第５図は、tc-tPAによるプラスミノーゲン活性化に対するRCDSの促進効果を促進率として示す。
第６図は、BIDSのヒト血漿塊に対する溶解促進作用を示す。
発明を実施するための最良の形態
次に参考例及び実施例を示して本発明を具体的に説明する。
参考例１
（１）鶏冠からDSの調製
鶏冠１kgをミンチした後煮沸し、その残渣にプロナーゼ（科研製薬（株），商品名）５ｇを加え、50℃で12時間消化した。消化液を珪藻土濾過し、濾液のpHをpH5.8〜6.3に調整し、ストレプトミセス属由来のヒアルロニダーゼ（生化学工業(株)）を1000TRU加え、50℃で3時間消化した。その液に食塩を添加し、0.65Ｍに調整し、0.5Ｍ食塩溶液で平衡化したDiaion HPA-10（三菱化成工業（株），商品名）アニオン交換樹脂カラム（3×20cm）にかけた。0.65Ｍ食塩溶液0.5L及び1.1Ｍ食塩溶液0.3Lの順でカラムを洗浄後、1.8Ｍ食塩溶液にて溶出した画分を集め、減圧濃縮した。濃縮液は、蒸留水にて一晩透析し、10mLに濃縮後５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を加え終濃度を0.5Ｍに調整した。このアルカリ溶液を37℃で90分間保温した後、冷却後酢酸を加えて中和した。中和液に２倍量のエタノールを加え、生じた沈澱を70％エタノール、純エタノール及びエーテルの順で洗浄後、五酸化リン存在下で減圧乾燥した。
乾燥物５ｇを水125mL中で一晩放置後、少量の不溶物を遠心（10℃、10000rpm15分）にて除いた。これに10％酢酸ナトリウム水溶液を125mLを加え、氷浴中にて終濃度45％になるようにエタノールを加えた。４℃で20時間放置後遠心し、沈澱を90％エタノール、純エタノール及びエタノールの順で洗浄し、五酸化リン存在下で減圧乾燥してDSナトリウム塩の精製品（以下、RCDSという）を得た。
なお鶏冠からのデルマタン硫酸の分離精製は上記方法に限定されることなく特公昭60−9042、特公昭61-21241に従って行うこともできる。
（２）DSからのヘパリン(Hep)およびヘパラン硫酸(HS)の除去DS中に微量に混入してくるHepおよびHSの除去は以下のいずれかの方法で行った。
１）イオン交換クロマトグラフィー法
（１）で得られたRCDS，50ｇを1.1MNaClで平衡化しておいたDiaion HPA11（三菱化成工業（株）、商品名）アニオン交換樹脂カラム（4.5x27cm）にのせ1.1MNaCl，8Lにて洗浄後、1.5MのNaCl，8Lで溶出した画分を集め、ロータリーエバポレーターで濃縮後、透析し、42%のエタノールで沈澱させるか、凍結乾燥させ、HepおよびHSが除去されたRCDSの標品（RCDS-H(-)）を得た。
２）亜硝酸分解法
ShivelyとConradの方法(Biochemistry 15, 3932-3942, 1976)の方法に準拠して行った。即ち、-10℃で亜硝酸バリウム・一水和物0.124mg/mL，400mLと1N硫酸400mLを混ぜ3000rpm2分間遠心後、上清を500mLとった。0.1mg/mLの濃度のRCDS500mLに前述の上清500mLを加えて混和し、室温に10分間放置した。このものに炭酸ナトリウム溶液を適宜加えて中和し、濃縮以降の操作は１）と同様に行いHepおよびHSが除去されたRCDSの標品（RCDS-H(-)）を得た。
参考例２
ウシ小腸粘膜からのDSの調製
ウシ小腸10kgを切断し、糞及び脂肪を除去後、粘膜を回収した。これに水酸化ナトリウムを加え、2.5Ｎ，３Lに調整して、37℃で２時間抽出した。この抽出液を中和後珪藻土濾過し、濾液を透析して生じた不溶物を遠心除去した。上清に等量のエタノール及び５ｇの酢酸ナトリウムを加えて、沈澱物を得た。この沈澱物を0.65Ｍ食塩溶液に溶かし、以後参考例１と同様にアニオン交換樹脂に負荷し、0.65Ｍ及び1.1Ｍ食塩溶液で順次洗浄後、1.5Ｍ食塩溶液で溶出した。溶出画分を蒸留水を用いて透析し、透析内液に酢酸カルシウム及び酢酸を加え、それぞれ終濃度５％及び0.5Ｍに調整した。この液にエタノールを加え、15〜30％(V/V)で沈澱する画分を集めた。沈澱物を、イオン交換樹脂を用いてナトリウム塩に交換し、参考例１と同様の方法により洗浄及び乾燥してDSナトリウム塩（以下、BIDSという）を得た。
参考例１（２）２）と同様の方法でBIDSからHepあるいはHSを除去し、BIDS-H(-)を得た。
またデルマタン硫酸の性状比較のため、ブタ腸粘膜由来デルマタン硫酸、ブタ皮膚由来デルマタン硫酸は各々、Celsus Lab Inc製（販売、コスモバイオ）、生化学工業製（販売、同）を用いて検討した。
参考例３
由来の異なる各種デルマタン硫酸の物理化学的性状比較
（１）平均分子量の測定
DSの平均分子量はAraiらの方法（Biochim. Biophys. Acta, 1117, 60-70, 1992）に準拠して求めた。即ち既知の分子量のグリコサミノグリカンを標準品として高速液体クロマトグラフィーを用いたゲルろ過での溶出位置により決定した。カラムはTSKgelG4000PWXL、G3000PWXL及びG2500PWXL（いずれも300x7.8mm内径、東ソー社製）を三連結したものを用い溶媒は0.2M塩化ナトリウム溶液を流速0.6ml/minで用い検出は示差屈折を用いた。
（２）二糖組成分析
DSの硫酸基位置の分析は、新生化学実験講座３、糖質II、p49〜62の記載に準拠して行った。すなわち、DSをコンドロイチナーゼABCで消化し、生成した不飽和結合を含む二糖（不飽和二糖）群をそのままHPLCで分析した結果と、前述の不飽和二糖群をさらにコントロ-6-スルファターゼ処理し、HPLCで分析した結果を比較してもとめた。コンドロイチナーゼＡＢＣによる消化、コンドロ-6-スルファターゼによる脱硫酸化、およびHPLC分析の条件は下記に記した。
a）コンドロイチナーゼＡＢＣによる消化
Yoshidaの方法〔Anal. Biochem.77,327-332,(1989)］によりDSの水溶液（10mg/mL）20μLに、0.4Ｍトリス−塩酸（pH8.0）20μL、0.4Ｍ酢酸ナトリウム20μL、0.1％ウシ血清アルブミン20μL及び水120μLを加え、コンドロイチナーゼＡＢＣ（5U/mL）を20μL加えて、37℃で２時間反応させた。
b）コンドロ-6-スルファターゼによる消化
上記のコンドロイチナーゼＡＢＣ消化物100μLに、20mMトリス酢酸緩衝液（pH7.0）に溶解したコンドロ-6-スルファターゼ（5U/mL）を20μL加えて37℃2時間反応させた。
c）HPLCによる分析
コンドロイチナーゼＡＢＣ酵素消化を行った後の溶液あるいはそれをコンドロ-6-スルファターゼで消化した溶液50μLを、HPLC（日立製作所）を用いて分析した。イオン交換カラム（YMC-Pack PA-120-S5カラム，250×2.6mm内径）を使用し、232nmでの吸光度を測定した。流速1.5mL/分で、800mMリン酸水素ナトリウムを60分間に0％から100％まで上昇させて溶出した。溶出した種々の位置の硫酸基を有する不飽和二糖のピークを同定した。
（３）極限粘度の測定
DSの極限粘度の測定は第12改正日本薬局方に準拠して行った。測定装置には自動粘度測定装置（離合社製、形式VMC-052）を用いた。溶媒は0.2M塩化ナトリウム溶液を用い、ウベローデ型粘度管の流下時間の測定にも同じ溶液を用いた。粘度の測定は30±0.1℃で行い、流下時間の差が３回連続して0.1秒以内である測定値を極限粘度算出に用いた。流下時間は百分の１秒を四捨五入し、測定値とした極限粘度の算出には以下の式を用いた。
ただし、溶液の流下速度：ts，溶媒の流下速度:t0，試料濃度（重量％）：C.
還元粘度（ηred=（ts/t0-1）/C）を縦軸に濃度を横軸にプロットして求めた直線を濃度０に補外したときの縦軸の切片から極限粘度を求めた。
（４）結果
表１に（１）〜（３）の結果をまとめた。鶏冠由来のDSの平均分子量は38,000ダルトンであり、極限粘度も1.2に対し、残りの３者は平均分子量が14,000ダルトンから16,000ダルトンの範囲にあり、極限粘度も0.44かから0.68の間にあって鶏冠由来のDSが際だって異なった性状を持つことが判明した。なお、牛、豚腸管由来のDSの平均分子量に関しては、25,000（Thromb.Res.71, 417-422, 1993）あるいは35,700（Blood 74, 1577-1582, 1989）との報告があるが発明者らの方法では、表１に記したようにそれぞれ16,000ダルトン、18,500ダルトンであった。
0003813169.tif 000002
0003813169.tif 000003
つぎに具体的な事例を示し発明の詳細な説明を行う。
参考例４
DS中のHepあるいはHSの定量
１）実験方法
DS中のHepあるいはHSの定量は以下の三通りの方法で行った。
ａ）酵素消化法
下記の三つの酵素はHepあるいはHSのみを消化するが、DSは消化しない（新生化学実験講座３、糖質II、p.244〜249）。この性質を利用して求めた。即ち参考例１あるいは参考例２で得られたDS500μgに、20mMトリス塩酸緩衝液、10mMCaCl2（pH7.0）10μlに溶解した三つの酵素、ヘパリチナーゼI，20mUおよびヘパリチナーゼII，20mU及びヘパリチナーゼIV，50mUを加え、37℃で２時間反応させたものを平均分子量を求めた時と同じ条件でHPLC分析し、生成した不飽和二糖を230nmで検出定量した。
ｂ）HepあるいはHSのアンチトロンビンIII活性化作用による活性型第Ｘ因子の阻害作用を測定する方法
HepあるいはHSにはアンチトロンビンIIIを活性化して凝固因子の一つである第Ｘ因子の活性化（Xa）を阻害する作用（以下抗Xa作用という）があるのに対してDSにはない（Tollfsen, In "Heparin", pp.257-273. Eds: David A. Lane and Ulf Lindahl, Edward Arnold, London 1989）。この性質を利用して種々の濃度のHepを用い、抗Xa活性を測定し、阻害活性とHepの用量との用量依存性のある範囲を求め、さらに阻害が最大となるHepの最少用量を求め、このときの阻害率を100％、Hepのない状態でアンチトロンビンIIIのみの時の阻害率を0%とし関係をプロットし、検量線を求る。本発明のDS標品でも同様の測定をし、検量線に照らし合わせ、得られた抗Xa活性からHepあるいはHSに換算し、定量した。
具体的には以下のごとくの操作を行った。50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）,150mMNaCl,10mMCaCl2を0.3mL、アンチトロンビンIII（牛由来、シグマ社製）1U/mLを0.1mL、0.03〜2μg/mLのHep（牛腸由来、シンテックス社製）、或いは50〜100μg/mLの前述したHep或いはHSを除去したDS標品、0.1mLを４℃で混和した後、37℃２分間保温した。その後Xa（7.1nkat/mL、牛由来、クロモジェニックスAB社製、生化学工業販）0.1mLを添加、37℃5分反応させた後、合成基質Boc-ILe-Glu-Gly-Arg-MCA（code 3094V, ペプチド研）100μMを0.1mL加え37℃3分反応させた。30％酢酸、0.3mLを加え反応を停止し、さらに前述の緩衝液と30%酢酸を7:3の比率で混和した液を1mL加え測定試料とした。蛍光光度計（日本分光FP-777）を用い測定した。励起波長350nm，蛍光波長444nmを用いた。尚この測定条件下では、HepあるいはHSの存在しない場合のアンチトロンビンIIIそれ自身の抗Xa活性はほとんど無視できることを確認してある。阻害率の算出は下記の式で行った。
0003813169.tif 000004
Ａ；HepあるいはDSの入ったサンプルの測定値
Ｂ；前述の操作でアンチトロンビンIII、HepあるいはDS及びXaを入れずかわりに緩衝液を入れた場合の測定値
Ｃ；前述の操作でアンチトロンビンIIIのみを入れずかわりに緩衝液を入れた場合の測定値
ｃ）HepあるいはHSのアンチトロンビンIII活性化作用による活性型第II因子の阻害作用を測定する方法
HepあるいはHSにはアンチトロンビンIIIを活性化して凝固因子の一つである第II子の活性型（IIa）を阻害する作用、即ち抗トロンビン作用（以下抗IIa作用という）があるのに対してDSにはない（Tollfsen, In "Heparin", pp.257-273. Eds:David A. Lane and Ulf Lindahl, Edward Arnold, London 1989）。この性質を使用して種々の濃度のHepを用い、抗IIa活性を測定し、阻害活性とHepの用量との用量依存性のある範囲を求め、さらに阻害が最大となるHepの最少用量を求め、このときの阻害率を100％、Hepのない状態でアンチトロンビンIIIのみの時の阻害率を０％とし関係をプロットし、検量線を求める。本発明のDS標品でも同様の測定をし、検量線に照らし合わせ、得られた抗IIa活性からHepあるいはHS量に変換し、定量した。
具体的には以下のごとくの操作を行った。20mMトリス塩酸緩衝液（pH7.4）,150mM NaCl,10mM CaCl2，0.1%牛血清アルブミンを0.35mL、アンチトロンビンIII（牛由来、シグマ社製）1U/mLを0.1mL、0.3〜20μg/mLのHep（牛腸由来、シンテックス社製）、或いは50〜100μg/mLの前述してHep或いはHSを除去したDS、0.1mLを４℃で混和した後、37℃2分間保温した。その後IIa（50mU/mL、牛由来、ベーリンガー社製）0.05mLを添加、37℃５分反応させた後、合成基質Boc-Val-Pro-Arg-MCA（code 3093V，ペプチド研）70μMを0.1mL加え37℃3分反応させた。30％酢酸、0.3mLを加え反応を停止し、さらに前述の緩衝液と30％酢酸を7:3の比率で混和した液を1mL加え測定試料とした。蛍光光度計（日本分光FP-777）を用い測定した。励起波長350nm，蛍光波長444nmを用いた。尚この測定条件下では、HepあるいはHSの存在しない場合のアンチトロンビンIIIそれ自身の抗IIa活性はほとんど無視できることを確認してある。阻害率の算出は下記の式で行った。
0003813169.tif 000005
Ａ；HepあるいはDSの入ったサンプルの測定値
Ｂ；前述の操作でアンチトロンビンIII、HepあるいはDS及びIIaを入れずかわりに緩衝液を入れた場合の測定値
Ｃ；前述の操作でアンチトロンビンIIIのみを入れずかわりに緩衝液を入れた場合の測定値
２）結果
上記の三つの方法で得られた結果を表３に示す。
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実施例１
ラットへの投与後のRCDS，BIDSとRCDS-H(-)，BIDS-H(-)の血中持続時間の違いを検討した。
（１）実験方法
動物は6.5〜7.5週齢のSD(Sprague-Dawley)系雄性ラット(チャールスリーバー)を用いた。被検薬にはRCDS、BIDS及びRCDS-H(-),BIDS-H(-)の４種を用いた。ラットをエーテル麻酔後、各被検薬を10mg/kgの用量で尾静脈に投与した。投与５及び120分後にエーテル麻酔後下大静脈より3.2％クエン酸1/10用量で採血し、血漿を遠心分離した。血漿中のDS量を「新生化学実験講座」３、糖質II，p.175-179に従い測定した。即ち血漿をPD-10Rカラム(Pharmacia)で脱塩後凍結乾燥し、残渣をコンドロイチナーゼABCで消化し、分子量5000カットの膜で限外濾過後、得られた濾液をHPLCで分析した。
（２）結果
結果は０タイムに対する百分率（残存率）で第１図に示した。投与５分後のDS残存率は、RCDS及びRCDS-H(-)はBIDS及びBIDS-H(-)に比べ各々約２倍高かった。投与120分後には、RCDS及びRCDS-H(-)がまだ10％残存していたのに対しBIDSではほとんど検出できなかった。RCDSとRCDS-H(-)ではわずかではあるが、後者の方の残存率が５分,120分ともに高かった。
実施例２
DSの血栓形成抑制に及ぼす影響についてラット下大静脈血栓モデルを用いて検討した。
（１）実験材料
動物は6.5〜7.5週齢のSD(Sprague-Dawley)系雄性ラット（チャールスリーバー）を用いた。DSはRCDSとBIDSの二種類を用いた。
（２）実験方法
1）血栓モデルの作製
ラット血栓モデルはReyers〔Thromb. Res 18, 669-674(1980)〕らの方法に準じて作製した。すなわち、ラットをネンブタールR（ダイナポット社，大日本製薬（株）販売）麻酔下で開腹し、下大静脈の左腎静脈枝直下を外科用絹糸(No.7、φ0.48〜0.56mm：進栄医科)で結紮した。被験薬はRCDS，BIDSを用い結紮１分前に１、３、10mg/kgの用量で尾静脈より投与した。対照には生理食塩水を投与した。結紮３時間後にラットをエーテル麻酔下で開腹し、静脈を開いて血栓を摘出し、37℃で一晩放置後、乾燥重量を測定した。得られたデータの統計処理にはNewman-Keuls法を用いた。
（３）結果
結果を表４に示す。対照群の乾燥血栓重量に対する相対重量は、両DSとも1mg/kg投与の段階で60％と抑制されていたが、3mg/kg及び10mg/kg以上ではRCDSが血栓重量を対照の各々2.4％、0.0％にまで低下させるのに対し、BIDSでは、各々34.1％、2.4％低下させるにとどまりRCDSの有用性が示された。
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なお、対照群は１４例、DS群は二種とも各投与群６例づつ行い平均値を求めた。
実施例３
DSの血栓成長及び血栓溶解に及ぼす影響についてラット下大静脈血栓モデルを用いて検討した。
（１）実験材料
動物は6.5〜7.5週齢のSD(Sprague-Dawley)系雄性ラット（チャールスリーバー）を用いた。DSはRCDSとBIDSの二種類を用いた。
（２）実験方法
1）血栓モデルの作製
ラット血栓モデルは実施例２と同様の操作を行い下大静脈を結紮した。被験薬は結紮6時間後に0.5mL/kg(3、10、30mg/kg)の用量で尾静脈より投与した。対照には生理食塩水を投与した。結紮６時間後(対照群のみ)および被験薬の投与2時間後(結紮８時間後)にラットをエーテル麻酔下で開腹し、採血した後、静脈を開いて血栓を摘出し、37℃で一晩放置後、乾燥重量を測定した。得られたデータの統計処理にはNewman-Keuls法を用いた。
2）ユーグロブリン画分の調製
血漿0.5mLをプラスチック試験管にとり、十分に氷冷した0.01N酢酸緩衝液（pH4.85）9.5mLを加え、冷蔵庫中に1時間静置し、3000r.p.m.で5分間遠心分離後、ユーグロブリン画分を得た。この沈澱物にトリス塩酸緩衝液(pH7.4)0.5mLを加え完全に溶解した。
3）線溶活性の測定
フィブリン平板の検体孔にユーグロブリン画分を10μL入れ、37℃でインキュベーター中に18時間放置後、フィブリン溶解面積（直径の自乗）を求めた。この溶解面積の大きさはプラスミン活性の強さに比例する。線溶におけるデータの統計処理にはNewman-Keuls法を用いた。
（３）結果
結果を表５に示した。
結果を表５の対照−６時間は、静脈結紮後６時間時に麻酔下で開腹し、採血、血栓をとりだした群、対照−８時間は、静脈結紮後６時間で生理食塩水を投与し、その２時間後に採血、血栓をとりだした群を意味する。
1）血栓成長抑制及び溶解に及ぼす影響
全ての群で血栓はみられたが、表５に示すように各群の間には顕著な差がみられた。RCDS及びBIDS投与群とも、対照−８時間群に比し、その血栓重量は用量依存的に減少した。さらに対照−６時間群の血栓重量値に比較し、BIDSを30mg/kg投与した群及びRCDSを10mg/kg以上投与した群の血栓重量値が小さいことから血栓形成抑制効果のみならず血栓溶解作用が確認された。すなわち、RCDSの方がBIDSよりも少量で強い血栓成長抑制及び溶解作用を示した。
2）線溶系に及ぼす影響
RCDSおよびBIDSをそれぞれ3mg/kg、10mg/kgおよび30mg/kg投与し、２時間後（静脈結紮８時間後）の血漿中のプラスミン活性を測定した。この結果を表５に示した。プラスミン活性はRCDSでは10mg/kg投与したとき、BIDSでは30mg/kg以上を投与したとき、対照群に比べ有意に高かった。この実験からもRCDSのすぐれた効果が示された。
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なお、血栓重量は対照８時間群のものを、100％とした時の相対率で求めた。対照-8時間群は16例、他の群は８〜９例ずつ実験を行い、各々平均値を求めた。
実施例４
エンドトキシン誘発ラットDICモデルに及ぼすDSの抗血栓効果比較試験
（１）実験方法
動物は5.5〜6.5週齢のSD(Sprague-Dawley)系雄性ラット（チャールスリーバー）を用いた。ラットにネンブタールR腹腔内注射し麻酔後左側大腿部を切開し、ポリエチレンカニューレ（PE-10，イマムラ）を同部位から腹部大静脈より4cmの所へ逆行的に挿入し固定した。ラットが覚醒後、エンドトキシン(Escherichia coli 055:B5, Difco社)をインフュージョンポンプ(Model-22M,HARVARD)に装着した注射筒を通して3.75mg/kg/hの割合で４時間持続投与した。被検薬［RCDS-H(-)とBIDS-H(-)を用いる］は右側静脈カニューレよりエンドトキシンと同時に４時間持続投与した。それぞれの投与液量に相当した生理食塩水を４時間投与したものを正常群とした。
（２）検査項目
エンドトキシン投与終了後、血液及び腎臓を採取し以下の項目につき測定した
1)  血小板数：血液中の血小板数を自動血球計算器（Celltac MEK-4500:日本電工）を用い測定した。
2)  フィブリノーゲン：血漿を分離してフィブリノーゲン測定用試薬（サンアッセイＦｉｂR、発売：三光純薬、製造：日東紡績）を用いて測定した。
3)  フィブリノーゲン−フィブリン分解産物(FDP)：血清を分離しFDP測定用ラテックス試薬（FPDLRテスト，帝国臓器製薬（株）製造、販売）を用いて測定した。
4)  腎糸球体フィブリン沈着率（%GFD）：腎臓を10％中性緩衝ホルマリン溶液で固定、パラフィン包埋し薄切後、リンタングステン酸ーヘマトキシリン染色を施した。鏡検下で腎標本の全視野の腎糸球体を観察しフィブリン沈着像のみられた個数を百分率で表した。データの統計処理はNewman-Kleus法を用いた。
（３）結果
結果を表６に示す。正常群では、血小板は、75x104μL、フィブリノーゲンは、216mg/dL、FDPは、2.5μg/mL以下、％GFDは検出されないが、エンドトキシン誘発DICラット群では各々、4x104μL、35mg/dL、34.3μg/mL、61％と異常値を示した。
DS-H(-)投与群では、この数値はいずれも改善されているが、RCDS-H(-)では各項目ともBIDS-H(-)による改善を上回り、特に腎不全の原因となる％GFDではRCDS-H(-)が１％にまで下がり改善が著しいのに対し、BIDS-H(-)では16.1％に留まっており、RCDS-H(-)の有用性が示された。
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正常群１９例、対照群２０例、DS投与群各７例ずつ実験を行いその平均値を求めた。
実施例５
t-PAによるGlu-プラスミノーゲン（天然のプラスミノーゲン、以下、単にプラスミノーゲンという）活性化反応に対するDSの促進効果
（１）実験方法
種々の濃度のDS（BIDS，RCDS）あるいはコンドロイチン硫酸（対照）50μL、1.6μMのプラスミノーゲン25μL、20nMの各々一本鎖あるいは二本鎖t-PAを25μL、及び0.6mMの合成基質S-2251(H-D-Val-L-Leu-L-Lys-p-ニトロアニリド・二塩酸塩)を100μL混和後、自動マイクロタイタープレート読みとり機にかけ、２分毎に405nmの吸収値を測定した。反応は37℃で行い、ツィーンR80を含む50mMトリス塩酸緩衝液に溶解して用いた。
プラスミノーゲンの活性化の初速度は、時間tの時の405nmの吸収値A405と時間の自乗のプロットの傾き（ΔA405/Δt2）を40,000で除して得(Chibber, B.A.K. et al., Biochemistry, 1985, 3429-3434)、促進率は、DSやコンドロイチン硫酸の無い場合の初速度を１とし、それに対する相対比でみた。
（２）結果
図２から３にBIDSの結果を示した。これらの図に示されるように、DSは、一本鎖t-PA(sc-tPA)の場合は1.5〜4.5倍、二本鎖t-PA(tc-tPA)の場合は1.5〜3.5倍それぞれプラスミノーゲンの活性化を用量依存的に促進した。DSにくらべて対照として用いたコンドロイチン硫酸では、一本鎖t-PA存在下では最大2.5倍、二本鎖t-PA存在下では最大1.5倍とDSにくらべてその促進率は弱かった。図４と図５にRCDSの結果を示した。このものも一本鎖t-PA(sc-tPA)で2.0〜4.5倍、二本鎖t-PA(tc-tPA)で2.0〜4.0倍各々プラスミノーゲンの活性化を促進した。
実施例６
（１）試験方法
DSのラット線溶系に及ぼす影響について検討した。
DS(BIDS)40mg/kgを、ソムノペンチルR（共立商事）で麻酔した９〜11週齢のウイスター系雄性ラット背部に皮下注射後、1，６，12，24時間後にクエン酸採血した。実施例３と同様の操作で、血漿からユーグロブリン画分を調製し、フィブリン平板法にて線溶活性を評価した。得られたデータの統計処理にはNewman-Kleus法を用いた。
また血漿、ユーグロブリン画分中のDS量を測定した〔新生化学実験講座３、糖質II、p175〜179〕。対照としては生理食塩水を用いた。これらの実験は、ラット凝固線溶活性の日内変動を考慮し、すべて一定時間に行った。
（２）結果
得られた結果を表７及び表８に示した。
表７に示した様に、DSは投与後12時間まで線溶活性を示した。表８に示した様に、血漿中のDSの約70〜80％はユーグロブリン画分に存在し、このものが線溶活性を示していることが判明した。RCDSについても同様の結果が得られた。
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対照群、DS群とも各々４から５例ずつ実験を行いその平均値を求めた。
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対照群、DS群とも各々４から５例ずつ実験を行いその平均値を求めた。
実施例７
DSのヒト血漿塊に対する溶解促進効果について検討した。
（１）実験方法
96穴マイクロプレートに各種濃度のDS（BIDS）40μL（終濃度50.0〜200μg/mL）、一本鎖t-PA（終濃度166.7U）20μL、トロンビン40μL（終濃度20U/mL）及びヒト血漿100μLを加えて混和し、その直後と10分毎に波長340nmで吸光度を測定し、その吸光度が最小（Min）となったところまで測定した。線溶活性は最大吸光度（Max）とMinの和を２で割ったPLT 1/2(分)を用いDSを加えた場合の値DS-PLT 1/2と対照のCont-PLT 1/2との比で示した。
（２）結果
結果を図６に示した。図６に示す様にDSは、用量依存的に血漿塊溶解活性を促進した。RCDSについても同様の結果が得られた。
実施例８
デルマタン硫酸のマウスにおける単回静脈内投与毒性試験
（１）実験方法
動物は雌雄の５週齢のCrj;CD-1マウス（日本チャールス・リバー社）を用いた。RCDS-H(-)及びBIDS-H(-)の溶液を各々等張液となるよう無菌蒸留水及び無菌生理食塩水を用い調製し、2000mg/kgをマウス尾静脈からガラス製注射筒を用い各々を単回投与し、その後14日間観察した。
（２）結果
表９に示すようにいずれのDSでも2000mg/kgの高投与量で死亡例はみられなかった。本試験条件下における致死量は2000mg/kg以上と推定された。
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実施例９
製剤
（１）参考例１によって得られた鶏冠DSナトリウム塩（RCDSあるいは(RCDS-H(-))500〜5000mgを無菌処理し無菌生理食塩水及び無菌蒸留水を等張液となるように適宜加え調製し100mLとし、10mLずつアンプルに注入した。血管注射、皮下注射あるいは筋肉注射に用いられる。
（２）参考例１によって得られた鶏冠DSナトリウム塩（RCDSあるいは(RCDS-H(-))250mg及びt-PA 1000000 I.U.を個々に包装し、溶解液に溶解して用いる用時溶解型の注射用剤を調製した。冠動脈注射あるいは静脈内注射に用いられる。
産業上の利用の可能性
デルマタン硫酸あるいはその薬理的に許容される塩は、線溶活性を賦活し、血栓溶解促進剤として用いられる。
また、これを組織プラスミノーゲンアクチベータと併用すると血栓を溶解する作用を著しく高め、組織プラスミノーゲンアクチベータの用量を減少させることができる。
さらに、本発明の特定のデルマタン硫酸、すなわち、極限粘度が0.8 100mL/g以上であるデルマタン硫酸、あるいは鶏冠由来のデルマタン硫酸、あるいは構成２糖組成のうち、ΔDi-OSを２％以上７％以下、あるいは後述の測定法（Biochim. Biophys. Acta, 1117, 60-70, 1992に記載されたゲル濾過法）で求めた平均分子量が2.5万ダルトン以上10万ダルトン以下のデルマン硫酸、あるいは特にこれら前記のデルマタン硫酸であってヘパリンまたはヘパラン硫酸含量が極めて低い特定のデルマタン硫酸あるいはその薬理的に許容される塩を用いると有効血中濃度が長く維持され、血栓の伸展予防、成長抑制等の効果を示す。
従って、本発明の抗血栓剤は心筋梗塞、汎発性血管内凝固症候群、多発血栓を伴なう多臓器不全、深部静脈血栓症等の治療あるいは予防に有用である。さらに、腎透析等の体外循環時に用いて血液の凝固を防止することができる。また、DSはHepと比し出血等の副作用が少ないが、さらにDSからHepを除去したDS-H(-)ではより出血等の副作用が少なく、安全性が高まるため、出血傾向のある血小板や凝固因子の低下している患者に使用した場合より有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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