(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＣＡＭ−１の変異体又は類縁体であるＩＣＡＭ−１の機能性誘導体であって、少なくともＩＣＡＭ−１の細胞質ドメイン又はトランスメンブランドメインのいずれかを欠落し、Ｅ９０／Ｑ、Ｒ４９ＫＶ／ＥＫＬ、Ｋ３９ＫＥ／ＥＲＱ、Ｇ１５Ｓ／ＳＡ及びＱ１Ｔ／ＫＡからなる群から選ばれる置換を含有し、かつ、ＬＦＡ−１に結合する能力を保持する前記誘導体。
【請求項２】
ドメイン１（下記配列の残基１〜８８）、ドメイン１及び２（残基１〜１８５）、又はドメイン１、２及び３（残基１〜２８４）を含有する請求項１記載のＩＣＡＭ−１の機能性誘導体。
0003778922.tif 000027
0003778922.tif 000028
0003778922.tif 000029
【請求項３】
請求項２記載の配列を有するＩＣＡＭ−１のＶ４、Ｒ１３、Ｑ２７、Ｑ５８、Ｄ６０及びＳ６１残基が変異していない請求項１又は２記載のＩＣＡＭ−１の機能性誘導体。
【請求項４】
糖鎖形成部位Ｎ１０３及びＡ１５５Ｎが変異していない請求項１又は２記載のＩＣＡＭ−１の機能性誘導体。
【請求項５】
前記機能性誘導体が、ＩＣＡＭ−１のドメイン３に変異を含む請求項１又は２記載の記載のＩＣＡＭ−１の機能性誘導体。
【請求項６】
前記機能性誘導体が、免疫グロブリンのヒンジ領域に対する免疫グロブリン重鎖のちょうどＮ−末端に結合しているＩＣＡＭ−１ドメイン１及び２を含有する請求項１記載のＩＣＡＭ−１の機能性誘導体。
【請求項７】
前記免疫グロブリン重鎖が、ＩｇＧクラスのものである請求項６記載の機能性誘導体。
【請求項８】
前記機能性誘導体が、ＩｇＡ又はＩｇＭクラスの免疫グロブリン重鎖に結合しているＩＣＡＭ−１ドメイン１及び２を含有する請求項１記載のＩＣＡＭ−１の機能性誘導体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載のＩＣＡＭ−１の機能性誘導体を含有する、特異的又は非特異的防御系の応答に起因する炎症を治療するための医薬組成物。
【請求項１０】
移行するためにＬＦＡ−１ファミリーの機能性メンバーを必要とする造血腫瘍細胞の転移を抑制するための、請求項１〜８のいずれか１項記載のＩＣＡＭ−１の機能性誘導体を含有する医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項記載のＩＣＡＭ−１の毒素由来機能性誘導体を含有する、ＬＦＡ−１発現腫瘍細胞の成長を抑制するための医薬組成物。
【請求項１２】
（a）請求項１〜８のいずれか１項記載のＩＣＡＭ−１の機能性誘導体及び
（b）慣用の担体又は賦形剤
を含有する抗炎症用医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項記載のＩＣＡＭ−１の機能性誘導体を発現することができる組換えＤＮＡ分子。
【請求項１４】
ＩＣＡＭ−１の機能性誘導体の製造方法であって、
該誘導体を発現し培地中に分泌する条件下で、請求項１〜８のいずれか１項記載のＩＣＡＭ−１の機能性誘導体をコードする組換えベクターによりトランスホームした宿主微生物を培養すること、及び
その後、該誘導体を単離すること、
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はリンパ球の群が細胞基質を認識しそれに付着して炎症反応中に炎症部位に浸透し細胞と反応する過程で含まれるＩＣＡＭ−１のような細胞間粘着分子に関する。本発明はさらにそのような細胞間粘着分子に結合し得るリガンド分子、これらリガンドのスクリーニングアッセイ、および該細胞間粘着分子、該リガンド分子および該スクリーニングアッセイの使用に関する。
従来技術
白血球はホストをバクテリアまたはウイルスのような外敵に対して適切に防御するために細胞基質に付着し得なければならない。防御システムの優れた見解はEisen, H.W.により“Micro-biology,第３版、ペンシルバニア州フィラデルフィア、Harpe & Rows社刊、（１９８０）,２９０−２９５および３８１−４１８”において提示されている。白血球は内皮細胞に結合できて循環系から進行中の炎症部位に浸透できなければならない。さらにまた、白血球は抗原提供細胞に付着して正常な特異的免疫応答が起り得ねばならず、さらに、リンパ球は、適当なターゲット細胞に付着してウイルス感染または腫瘍細胞の分解が起り得ねばならない。
最近、そのような付着の仲介において含まれる白血球表面分子がハイブリドーマ技術を用いて同定された。要するに、ヒトＴ−細胞〔Davignon,D.等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78：４５３５−４５３９（１９８１）〕とマウスひ臓細胞〔Springer,T.等, Eur. J. Immunol. 9：３０１−３０６（１９７９）〕に対して向けられた各モノクローナル抗体は白血球表面に結合し、上述の付着関連機能を抑制しているものと同定された〔Springer,T.等,Fed. Proc. 44：２６６０−２６６３（１９８５）〕。これらの抗体により同定された分子はＭａｃ−１およびリンパ球機能会合抗原１（ＬＦＡ−１）と称される。Ｍａｃ−１はマクロファージ、顆粒球および顆粒状リンパ球上に見い出されたヘテロダイマーである。ＬＦＡ−１は大部分のリンパ球に見い出されるヘテロダイマーである〔Springer,T.A.等,Immunol. Rev. 68：１１１−１３５（１９８２）〕。これらの２つの分子、および第３分子ｐ１５０、９５（これはＭａｃ−１と同様な組織分布を有する）は細胞粘着においてある役割を発揮する〔Keizer,G.等、Eur. J. Immunol. 15：１１４２−１１４７（１９８５）〕。
上記の白血球分子は糖たん白質の関連群の１員であることが見い出された〔Sanchez-Madrid, F.等、J. Exper. Med. 158：１７８５−１８０３（１９８３）；Keizer, G.D.等、Eur. J. Immunol. 15：１１４２−１１４７（１９８５）〕。この糖たん白質群は１つのアルファー鎖と１つのベータ鎖を有するヘテロダイマーからなっている。抗原の各々のアルファー鎖は互いに異なるけれども、ベータ鎖は高度に保護されていることが判明している〔Sanchez-Madrid, F.等、J. Exper. Med. 158：１７８５−１８０３（１９８３）〕。糖たん白質群のベータ鎖（ある場合には“ＣＤ１８”と称す）は９５KDの分子量を有することが見い出され、一方アルファー鎖は１５０KD−１８０KDで変化することが見い出された〔Springer,T.等,Fed. Proc. 44：２６６０−２６６３（１９８５）〕。膜たん白質のアルファーサブユニットはベータサブユニットの有する広い相同性を有していないけれども、糖たん白質のアルファーサブユニットの近似分析は両者の間に実質的な類似性があることを示している。ＬＦＡ−１関連糖たん白質のアルファーおよびベータサブユニット間の類似性の検討はSanchez-Madrid, F.等によりなされている〔J. Exper. Med. 158：５８６−６０２（1983）；J. Exper. Med. 185：１７８５−１８０３（１９８３）〕。
白血球表面上に上記粘着たん白質群のいずれかの１員の正常量を発現することができない１群の人々が同定されている〔Anderson, D.C.等、Fed. Proc. 44：２６７１−２６７７（１９８５）；Anderson, D.C.等、J. Infect. Dis., 152：668 ６８９（１９８５）〕。これらの患者からのリンパ球は分子のＬＦＡ−１群が抗体により中和されている健常者に類似するインビボ欠陥を示していた。さらにまた、上記の患者は、彼らの細胞が細胞基質へ粘着できないために、正常な免疫応答を測定することができない〔Anderson, D.C.等、Fed. Proc. 44：２６７１−２６７７（１９８５）；Anderson, D.C.等、J. Infect. Dis., 152：668−６８９（１９８５）〕。これらのデータはリンパ球がＬＦＡ−１群の機能的粘着分子の欠如により正常な形で粘着できない場合に免疫反応が緩和されることを示している。
即ち、要約すれば、動物の健康および生命力を維持するリンパ球の能力はリンパ球が他の細胞（内皮細胞のような）に粘着できることを必要とする。この粘着はリンパ球の細胞表面上に存在する特異的レセプター分子を含む細胞−細胞接触を必要とすることが判明している。これらのレセプターはリンパ球が他のリンパ球または内皮および他の非血管細胞に粘着することを可能する。細胞表面レセプター分子は相互に高度に関連することが判明している。リンパ球が上記の細胞表面レセプター分子を欠損しているヒトは慢性で再発性の感染症、および欠陥抗体応答を含む他の臨床的症状を示す。
リンパ球粘着は外来組織が認識され拒絶される過程で起るので、この過程の理解が臓器移植、組織移植、アレルギーおよび腫瘍学の分野において著しく価値がある。
発明の内容
本発明は細胞間粘着分子−１（ＩＣＡＭ−１）およびその機能性誘導体（官能性誘導体；functional derivative）に関する。本発明はさらにＩＣＡＭ−１の機能を抑制し得る抗体および抗体フラグメント、およびＩＣＡＭ−１機能に対する他のインヒビター、並びにそのようなインヒビターを同定し得るアッセイに関する。本発明はさらに上記分子すべての診断および治療上の用途に関する。
さらに詳細には、本発明は実質的に天然不純物を含まない細胞間粘着分子ＩＣＡＭ−１またはその官能性誘導体を包含する。本発明はさらにリンパ球表面に存在する分子に結合し得るそのような分子に関する。
本発明はさらに検出可能に標識した細胞間粘着分子ＩＣＡＭ−１およびその誘導体に関する。
本発明はさらにＩＣＡＭ−１またはその官能性誘導体を発現し得る組換えＤＮＡ分子を包含する。
本発明はまた次の各工程を含む実質的に純粋な形でＩＣＡＭ−１を回収する方法を包含する：
(a)  ＩＣＡＭ−１を発現する細胞膜からＩＣＡＭ−１を可溶化して、可溶化ＩＣＡＭ−１調製物を調製すること、
(b)  上記可溶化ＩＣＡＭ−１調製物をＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体を含有するアフィニティマトリックスに導入すること、
(c)  ＩＣＡＭ−１を上記アフィニティマトリックスの抗体に結合させること、
(d)  上記マトリックスから抗体に結合し得ないすべての化合物を除去すること、および
(e)  ＩＣＡＭ−１を上記マトリックスから溶出させることによりＩＣＡＭ−１を実質的に純粋な形で回収すること。
本発明はさらにＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の官能性誘導体からなる群から選ばれた分子に結合し得る抗体を包含する。本発明はまたそのような抗体を産生し得るハイブリドーマ細胞を包含する。
本発明はさらにモノクローナル抗体Ｒ6−５−Ｄ6を産生し得るハイブリドーマ細胞を包含する。
本発明は、さらに、次の工程を含む、ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体を産生する所望のハイブリドーマ細胞の産生方法も包含する。
(a)  動物をＩＣＡＭ−１を発現する細胞で免疫すること、
(b)  上記動物のひ臓細胞をミエローマ細胞系と融合させること、
(c)  融合させたひ臓およびミエローマ細胞から抗体分泌性ハイブリドーマ細胞を調製すること、および
(d)  ハイブリドーマ細胞を所望のＩＣＡＭ−１結合性抗体を産生し得るハイブリドーマ細胞にスクリーニングすること。
本発明はまた上記方法で取得したハイブリドーマ細胞およびそのハイブリドーマ細胞から産生させた抗体も包含する。
本発明はまた細胞間粘着の非免疫グロブリンアンタゴニストの同定方法にも関し、その方法は次の工程よりなる：
(a)  細胞間粘着のアンタゴニストであり得る非免疫グロブリン剤を凝集可能な複数の細胞を含有するリンパ球調製物とインキュベートすること；および
(b)  上記リンパ球調製物を検査して上記非免疫グロブリン剤の存在がリンパ球調製物の細胞凝集を抑制するかどうかを測定すること；凝集抑制が上記非免疫グロブリン剤を細胞間粘着のアンタゴニストとして同定すること。
本発明はまた哺乳動物の特異的防御システムの応答に由来する炎症を治療する方法にも関し、その方法はそのような治療の必要な対象物に上記炎症を抑制するのに十分な量の抗炎症剤を与えることを含み、かつこの抗炎症剤はＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体、ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体のフラグメント、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１の官能性誘導体、およびＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストからなる群より選ばれる。
本発明はさらにＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストがＬＦＡ−１以外のＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストである上述の炎症治療方法を包含する。
本発明はまた浸透にＬＦＡ−１群の官能性一員を必要とする造血腫瘍細胞の転移を抑制する方法にも関し、この方法はそのような治療を必要とする患者に上記の転移を抑制するのに十分な量の抗炎症剤を与えることを含み、かつこの抗炎症剤はＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体、ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体のフラグメント、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１の官能性誘導体、およびＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストからなる群より選ばれる。
本発明はさらにＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストがＬＦＡ−１以外のＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストである上記造血腫瘍細胞の転移を抑制する方法も包含する。
本発明はまたＩＣＡＭ−１発現腫瘍細胞の成長を抑制する方法も包含し、その方法はそのような治療を必要とする患者に上記成長を抑制するのに十分な量の毒素を与えることを含み、この毒素はＩＣＡＭ−１に結合し得る毒素由来抗体、ICAM−１に結合し得る毒素由来抗体フラグメント、LFA−１群分子の毒素由来１員、およびＬＦＡ−１群分子の１員の毒素由来官能性誘導体からなる群から選ばれる。
本発明はまたＬＦＡ−１発現性腫瘍細胞の成長を抑制する方法にも関し、その方法はそのような治療を必要とする患者にかかる成長を抑制するのに十分な量の毒素を与えることを含み、この毒素は毒素由来ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の毒素由来官能性誘導体からなる群から選ばれる。
本発明はさらに炎症を有する懸念のある哺乳動物対象体の特異的防御系の応答に由来する炎症の存在および位置を診断する方法に関し、その方法は、
(a)  上記の対象体にＩＣＡＭ−１を発現する細胞を同定し得る検出可能に標識した結合性リガンドを含有する組成物を投与すること、および
(b)  上記結合性リガンドを検出すること、
を含む。
本発明はさらに炎症を有する懸念のある哺乳動物対象体の特異的防御系の応答に由来する炎症の存在および位置を診断する方法に関し、その方法は、
(a)  上記対象体の組織のサンプルをＩＣＡＭ−１を発現する細胞を同定し得る検出可能に標識した結合性リガンドを含有する組成物とインキュベートすること、および
(b)  上記結合性リガンドを検出すること、
を含む。
本発明はまたＩＣＡＭ−１発現性腫瘍細胞を有する懸念のある哺乳動物対象体のそのような細胞の存在および位置を診断する方法にも関し、その方法は、
(a)  上記対象体にＩＣＡＭ−１に結合し得る検出可能に標識した結合性リガンドを含有する組成物を投与すること、このリガンドは抗体およびＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体フラグメントからなる群より選ばれること、および
(b)  上記結合性リガンドを検出すること、
を含む。
本発明はまたＩＣＡＭ−１発現性腫瘍細胞を有する懸念のある哺乳動物対象体のそのような細胞の存在および位置を診断する方法にも関し、その方法は
(a)  上記対象体の組織のサンプルをＩＣＡＭ−１に結合し得る検出可能に標識した結合性リガンドを含有する組成物とインキュベートすること、このリガンドが抗体およびＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体フラグメントからなる群より選ばれること、および
(b)  上記結合性リガンドを検出すること、
を含む。
本発明はまたＬＦＡ−１群分子の１員を発現する腫瘍細胞を有する懸念のある対象体のそのような細胞の存在および位置を診断する方法にも関し、その方法は、
(a)  上記対象体にＬＦＡ−１群分子の１員に結合し得る検出可能に標識した結合性リガンドを含有する組成物を投与すること、このリガンドはＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の官能性誘導体からなる群より選ばれること、および
(b)  上記結合性リガンドを検出すること、
を含む。
本発明はまたＬＦＡ−１群分子の１員を発現する腫瘍細胞を有する懸念のある対象体のそのような細胞の存在および位置を診断する方法にも関し、その方法は、
(a)  上記対象体の組織のサンプルを分子のＬＦＡ−１群の１員に結合し得る検出可能に標識した結合性リガンドの存在下にインキュベートすること、このリガンドはＩＣＡＭ−１およびICAM−１の官能性誘導体からなる群より選ばれること、および
(b)  上記組織サンプル中に存在する分子のＬＦＡ−１群の１員に結合している上記結合性リガンドを検出すること、
を含む。
本発明は、さらに、
(a)  ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体、ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体のフラグメント、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１の官能性フラグメント、およびＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストからなる群より選ばれた抗炎症剤、および
(b)  デクサメセソン、アゼチオピリンおよびシクロスポリンＡから選ばれた少なくとも１つの免疫抑制剤
を含む製薬組成物も包含する。
好ましい実施態様
本発明の１つの局面はＬＦＡ−１に対しての天然結合性リガンドの発見に関する。ＬＦＡ−１群分子のような分子は、細胞間粘着の過程に含まれており、“粘着分子”と称されている。
本発明の天然結合性リガンドは“細胞間粘着分子−１（Intercellular Adhesion Molecule-1）”または“ＩＣＡＭ−１”と表示される。ＩＣＡＭ−１は７６−９７kdの糖たん白質である。ICAM−１はヘテロダイマーではない。本発明はＩＣＡＭ−１およびその“官能性誘導体”に関する。ICAM−１の“官能性誘導体”はＩＣＡＭ−１の生物学的活性に実質的に同様な生物学的活性（機能的または構造的に）を有する化合物である。“官能性誘導体”なる用語は分子の“フラグメント”、“変異体”、“同族体”または“化学誘導体”を包含するものとする。ＩＣＡＭ−１のような分子の“フラグメント”は分子の任意のポリペプチドサブセットを意味する。ＩＣＡＭ−１活性を有しかつ可溶性（即ち、膜結合していない）であるＩＣＡＭ−１のフラグメントは特に好ましい。ＩＣＡＭ−１のような分子の“変異体”とは全分子またはそのフラグメントと構造上または機能上実質的に同様である分子を称する。分子は他の分子と両分子が実質的に同様な構造を有するかあるいは両分子が同様に生物学的活性を有する場合に“実質的に同様”と称される。即ち、２つの分子が同様な活性を有する場合、これらの分子は変異体であるとみなされ、該用語は本明細書において分子の１つの構造が他の分子中に見い出されない場合あるいはアミノ酸残基配列が同じでない場合でも使用される。ＩＣＡＭ−１のような分子の“アナログ”、つまり“同族体”とは分子全体またはそのフラグメントに対し機能上実質的に同様である分子を称する。本明細書で使用するとき、分子が通常分子の１部でない追加の化学的成分を含む場合、その分子は他の分子の“化学的誘導体”であると称する。そのような成分は分子の溶解性、吸収性、生物学的半減期等を改善し得る。これらの成分はまた分子の毒性を低減させ、分子の望ましくない副作用等を消去または減衰させる。そのような作用を緩和させ得る成分は“Remington's Pharmaceutical Sciences（１９８０）”に記載されている。“毒素由来”分子は“化学誘導体”の特別のクラスを構成している。“毒素由来”分子は毒素成分を有する分子（ＩＣＡＭ−１または抗体のような）である。そのような分子の細胞への結合は細胞の極く近くに毒素成分を運びそれによって細胞死を促進する。任意の適当な毒素成分を使用できるが、例えば、リシン毒素、ジフテリア毒素、ラジオアイソトープ毒素、膜−チャンネル形成性毒素等の毒素を用いることが好ましい。そのような成分を分子に結合させる方法は当該技術において周知である。
ＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１群分子の１員のような抗原性分子はリンパ球表面に天然に発現している。即ち、そのような細胞の適当な動物への腹腔内注射等によるような導入はＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１群分子の１員に結合し得る抗体の産生をもたらすであろう。場合によっては、そのような動物の血清を取り出しこれら分子に結合し得るポリクローナル抗体の原料として使用することもできる。しかしながら、好ましいのはそのような動物からひ臓球（spleno cytes）を取り出し、かかるひ臓細胞をミエローマ細胞系と融合させ、得られた融合細胞からＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１群分子の１員に結合し得るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を確立することである。
上記の方法で得たハイブリドーマ細胞はICAM−１またはＬＦＡ−１群分子の一員のいずれかに結合し得る抗体を産生する所望のハイブリドーマ細胞を同定する種々の方法によってスクリーニングできる。１つの好ましいスクリーニングアッセイにおいては、そのような分子はそのエプスティン−バーウイルス形質転換細胞の凝集を抑制する能力によって同定される。そのような凝集を抑制し得る抗体をさらにスクリーニングしてこれら抗体がそのような凝集をＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１群分子の一員への結合によって抑制したかどうかを決定する。ＩＣＡＭ−１をＬＦＡ−１群分子から区別できる任意の手段をそのようなスクリーニングに用いることができる。例えば、抗体と結合した抗原は免疫沈降およびポリアクリルアミドゲル電気泳動によるようにして分析できる。結合抗原がＬＦＡ−１群の分子の一員である場合には、免疫沈降した抗原がダイマーとして見い出されるであろうし、一方、結合抗原がＩＣＡＭ−１である場合には、単一分子量種が免疫沈降して来るであろう。また、ＬＦＡ−１群分子の１員に結合する抗体はＩＣＡＭ−１に結合する抗体からＬＦＡ−１を発現するがＩＣＡＭ−１は発現しない顆粒球のような細胞に結合する抗体の能力をスクリーニングすることによっても区別できる。顆粒球に結合する抗体（細胞凝集を抑制することが知られている）の能力はその抗体がＬＦＡ−１に結合し得ることを示す。そのような結合のない場合はＩＣＡＭ−１を認識し得る抗体を示唆し得る。顆粒球のような細胞に結合する抗体の能力は通常の熟練者により普通に用いられる方法によっても検出し得る。そのような方法にはイムノアッセイ、細胞凝集、フィルター結合試験、抗体沈降等がある。
本発明の抗凝集抗体はまたそのＩＣＡＭ−１を発現する細胞（活性化内皮細胞のような）に特異的に結合する能力およびそのＩＣＡＭ−１を発現しない細胞に結合し得ない能力を測定することによっても同定し得る。当業者によって容易に理解されるように、上記の各アッセイは修正して即ち、異なる順序で行って種々の可能性あるスクリーニングアッセイを提供でき、これらアッセイの各々はＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体とＬＦＡ−１群分子の１員との間で同定および区別化を行い得るものである。
本発明の抗炎症剤は、天然方法〔例えば、動物、植物、真菌、バクテリア等をＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストを産生するよう誘導することによってあるいは動物をＩＣＡＭ−１に結合し得るポリクローナル抗体を産生するよう誘導することによるような）により、合成方法〔例えば、ポリペプチド合成用のメリフィールド法を用いてＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１の官能性誘導体またはＩＣＡＭ−１のたん白質アンタゴニスト（免疫グロブリンまたは非免疫グロブリンのいずれか）を合成することによるような）により、ハイブリドーマ技術（例えば、ＩＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体を産生させるような）により、または組換え技術（例えば、本発明の抗炎症剤を種々の宿主（例えば、酵母、バクテリア、真菌、培養動物細胞等）中で、あるいは組換えベクターまたはウイルスベクターから産生させるような〕により得ることができる。用いる方法の選択は便宜さ、所望の収率等のファクターによる。上記の方法、手法または技術の１つのみを用いて特定の抗炎症剤を産生させる必要はなく、上記の方法、手法および技術は組合せて特定の抗炎症剤を得てもよい。
Ａ．ＬＦＡ−１結合性パートナー（ＩＣＡＭ−１）の同定
1.  ＬＦＡ−１依存凝集のアッセイ
多くのエプスタイン−バールウイルス形質転換細胞は凝集を示す。この凝集はホルボールエステルの存在下で促進できる。そのような同型（homotypic）の凝集（即ち、１種のみの細胞種を含む凝集）は抗ＬＦＡ−１抗体によってブロックされることが見い出された〔“Rothlein,R.等、J. Exper. Mes.１６３：１１３２−１１49（１９８６）”、該文献は参考として本明細書に引用する〕。即ち、ＬＦＡ−１依存性結合の度合は自発性またはホルボールエステル依存性凝集形成の度合を評価することによって決定できる。
ＬＦＡ−１依存性凝集を干渉する試剤は該試剤がエプスタイン−バールウイルス形質転換細胞の自発またはホルボールエステル依存のいずれの凝集を抑制するかどうかを測定し得るアッセイを用いることによって同定できる。殆んどのエプスタイン−バールウイルス形質転換細胞はこれら細胞がＬＦＡ−１レセプター分子を発現し得る限りそのようなアッセイに用い得る。そのような細胞は“Springer,T.A.等、J. Exper. Med.１６０：１９０１−１９１８（１９８４）”の方法によって調製できる。該文献は参考として本明細書に引用する。任意のそのような細胞を本発明のＬＦＡ−１依存性結合アッセイにおいて使用できるけれども、好ましいのはＪＹ細胞系の細胞を使用することである〔Terhost,C.T.等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ７３：９１０（１９７６）〕。これらの細胞は任意の適当な培養培地で培養できるが、最も好ましいのは１０％ウシ胎児血清および５０μｇ／mｌのゲンタマイシン（ギブコラボラトリーズ社、ニューヨーク）を加えたＲＭＰＩ１６４０培地中で細胞を培養することである。これらの細胞は動物細胞増殖に適する条件（即ち、一般に３７℃の温度で、５％ＣＯ2の雰囲気中で、９５％の相対湿度にてなど）下で培養すべきである。
2.  ＩＣＡＭ−１へのＬＦＡ−１の結合
リンパ球がＬＦＡ−１レセプター分子の群を欠損するヒト個人は同定されている〔Anderson, D.C.等、Fed. Proc.４４：２６７１−２６７７（１９８５）；Anderson, D.C.等、J. Infect. Dis.１５２：６６８−６８９（１９８５）〕。そのような人は白血球粘着欠損症（ＬＡＤ）をこうむると云われている。そのような人のEBV形質転換細胞は上述の凝集アッセイにおいて自発またはホルボールエステル存在下のいずれにおいても凝集しない。そのような細胞をＬＦＡ−１発現性細胞と混合したときは、凝集が観察される〔Rothlein, R.等、J. Exper. Med. 163：１１３２−１１４９（１９８６）〕（第１図）。重要なことは、これら凝集はこれらの細胞を抗ＬＦＡ−１抗体の存在下でインキュベートした場合には形成されなかったことである。即ち、凝集はＬＦＡ−１を必要としたが、ＬＦＡ−１欠損細胞のＬＦＡ−１含有細胞による凝集形成能力はＬＦＡ−１結合パートナーはＬＦＡ−１ではなくむしろ従来未発見の細胞間粘着分子であったことを示唆していた。第１図は細胞間粘着のメカニズムを示す。
Ｂ．細胞間粘着分子−１（ＩＣＡＭ−１）
新規な細胞間粘着分子ＩＣＡＭ−１は“Rothlein, R.等の手順〔J. Immunol. １３７：1270−1274（１９８６）、該文献は参考として本明細書に引用する〕によって最初同定された部分的に特徴付された。ＩＣＡＭ−１分子を検出するために、モノクローナル抗体をＬＦＡ−１発現が遺伝的に欠損しているヒトの細胞で免疫したマウスのひ臓細胞から調製した。得られた抗体をそのＬＦＡ−１発現細胞の凝集を抑制する能力についてスクリーニングした（第２図）。詳細には、ＩＣＡＭ−１分子マウスをＬＦＡ−１抗原を発現しないＬＡＤ患者からのＥＢＶ形質転換Ｂ細胞で免疫した。これら動物からのひ臓細胞を取り出し、ミエローマ細胞と融合させてモノクローナル抗体産生性ハイブリドーマ細胞になるようにした。次に、ＬＦＡ−１を発現する正常人からのＥＢＶ形質転換Ｂ細胞を上記ハイブリドーマ細胞のモノクローナル抗体の存在下でインキュベートしてＥＢＶ形質転換Ｂ細胞のホルボールエステル媒介、ＬＦＡ−１依存、自発性凝集を抑制し得る任意のモノクローナル抗体を同定した。上記のハイブリドーマ細胞はＬＦＡ−１抗原を全く含まない細胞から誘導したので、ＬＦＡ−１に対するモノクローナル抗体は産生されなかった。従って、凝集を抑制することが判った抗体はいずれも、ＬＦＡ−１ではないけれどもＬＦＡ−１粘着過程にかかわっていた抗原に結合し得るものでなければならない。そのようなモノクローナル抗体を取得する方法は任意の方法を使用できるけれども、好ましいのはＢＡＬＢ／ＣマウスをRothlein, R.等（J. Immunol. 137：１２７０−１２７４（１９８６））により開示された経路およびスケジュールを用いてＬＦＡ−１欠損者からのエプスタイン−バールウイルス形質転換末梢血単核細胞でもって免疫することによってＩＣＡＭ−１結合性モノクローナル抗体を得ることである。そのような細胞はSpringer, T. A.等により開示されている〔J. Exper. Med. 160：１９０１−１９１８（１９８４）〕。
ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体の産生および検出のための好ましい方法においては、マウスはＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１の両方を発現するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞によりあるいはより好ましくはＩＣＡＭ−１を発現するがＬＦＡ−１を発現しないＴＮＦ活性化内皮細胞により免疫する。抗ＩＣＡＭ−１抗体を産生するハイブリドーマ細胞を調製する最も好ましい方法においては、Ｂａｌｂ／ＣマウスをＪＹ細胞および特異化Ｕ９３７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９３）により順次免疫する。そのような動物からのひ臓細胞を取り出しミエローマ細胞と融合させ抗体産生性ハイブリドーマ細胞に発展させる。得られた抗体をそのLFA−１およびＩＣＡＭ−１の両方を発現するＪＹ細胞のようなＥＢＶ形質転換細胞系のＬＦＡ−１依存、ホルボールエステル誘起凝集を抑制する能力についてスクリーニングする。Rothlein, R.等（J. Immunol. １３７：１２７０−１２７４（１９８７）〕により開示されているように、そのような凝集を抑制し得る抗体をＳＫＷ3〔Dustin, M.等、J. Exper. Med.１６５：６７２−６９２（１９８７）、そのホルボールエステルの存在下で自発的に凝集する能力はＬＦＡ−１に結合し得る抗体によっては抑制されるが抗ICAM−１抗体によっては抑制されない〕のような細胞系のホルボールエステル誘起凝集を抑制する能力について試験する。ＪＹ細胞のような細胞のホルボールエステル誘起凝集を抑制し得るがＳＫＷ3のような細胞のホルボールエステル誘起凝集を抑制し得ない抗体は恐らく抗ＩＣＡＭ−１抗体である。また、ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体は、ＬＦＡ発現性細胞（ＪＹ細胞のような）のＬＦＡ−１依存性凝集を抑制し得るがＬＦＡ−１を発現するがＩＣＡＭ−１を殆んどまたは全く発現しない細胞（正常顆粒球のような）に結合し得ない抗体あるいはＩＣＡＭ−１を発現するがＬＦＡ−１を発現しない細胞（ＴＮＦ活性化内皮細胞のような）に結合し得る抗体のスクリーニングによっても同定し得る。
別の方法は、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１または両方を発現する細胞から、ＪＹ細胞のような細胞のＬＦＡ−１依存性凝集を抑制する抗体を用いて免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥあるいは等価の方法により抗体により沈降した分子のいくつかの分子特性を測定することである。その特性がＩＣＡＭ−１の特性と同じであるならば、その抗体は抗ＩＣＡＭ−１−抗体であるとみなし得る。上述の方法で調製したモノクローナル抗体を用いて、ＩＣＡＭ−１細胞表面分子を精製し特性付した。ＩＣＡＭ−１はヒト細胞または組織からモノクローナル抗体アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。そのような方法においては、ＩＣＡＭ−１と反応性のモノクローナル抗体を不活性カラムマトリックスに結合させる。そのような結合を行う任意の方法を使用できるが、好ましいのは“Oetthen, H. C.等、J. Biol. Chem. ２５９：１２０３４（１９８４）”の方法を用いることである。細胞溶解物を上記マトリックスに通したとき、存在するＩＣＡＭ−１分子はマトリックスに吸着され保持される。カラムのpHまたはイオン濃度を変えることにより、結合したICAM−１分子はカラムから溶出し得る。任意の適当なマトリックスを使用できるけれども、好ましいのはマトリックス材料としてセファローズ（ファルマシア）を用いることである。カラムマトリックスの作製およびそのたん白質精製での使用は当該技術において周知である。
当業者によって理解された方法において、上述のアッセイ法を用いて細胞粘着の速度または程度を減衰しあるいは抑制し得る化合物を同定することができる。
ＩＣＡＭ−１は血管内皮細胞、胸腺上皮細胞、ある種の他の上皮細胞、および繊維芽球のような非造血細胞上並びに組織マクロファージ、マイトジェン刺激Ｔリンパ芽球、へん桃腺内の胚中心Ｂ細胞および樹枝状細胞、リンパ節、およびパイエル板のような造血細胞上に発現した細胞表面糖たん白質である。ＩＣＡＭ−１はリンパ節および反応性増殖を示すへん桃腺内のＴ細胞領域の血管内皮細胞状に高度に発現される。ＩＣＡＭ−１は末梢血リンパ球上に少量発現される。ある骨ずい単球細胞系のホルボールエステル刺激特異化はＩＣＡＭ−１発現を大きく増大させる。即ち、ＩＣＡＭ−１は炎症部位に優先的に発現され静止状態の細胞には一般に発現されない。皮ふ繊維芽球上のＩＣＡＭ−１発現は１０μ／mｌのレベルのインターロイキン１またはガンアーインターフェロンによりそれぞれ４時間または１０時間以上で３倍〜５倍増大する。その誘発はたん白質およびｍＲＮＡ合成に依存し可逆的である。
ＩＣＡＭ−１は繊維芽球上での９７kd、骨ずい単球細胞系上での１１４Kd、およびＢリンパ芽球細胞ＪＹ上での９０Kdの分子量を有する異なる細胞種での分子量異種抗原性を示す。ＩＣＡＭ−１生合成は約７３Kdの細胞間プレカーサーを含むことが判っている。ツニカマイシン処理（グリコシン化を抑制する）から得られる非−Ｎ−グリコシル化形は分子量５５Kdを有する。
ホルボールエステル刺激Ｕ９３７細胞からあるいは繊維芽球細胞から単離したＩＣＡＭ−１は化学脱グリコシル化後６０Kdの分子量を有する同一の主要生成物を与える。ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体はフィトヘマグルチニン芽球のＬＦＡ−１欠損細胞系への粘着を干渉する。繊維芽球（リンパ球でない）のＩＣＡＭ−１に結合したモノクローナル抗体による前処理はリンパ球−繊維芽球粘着を抑制する。リンパ球のＬＦＡ−１に対する抗体による前処理（繊維芽球は行なわない）もリンパ球−繊維芽球粘着を抑制することが見い出されている。
従って、ＩＣＡＭ−１は白血球上のＣＤ１８複合体の結合性リガンドである。ＩＣＡＭ−１はＩＬ−１、ガンマーインターフェロンおよび腫瘍壊死因子のような炎症メディエーターによりインビトロで繊維芽球および内皮細胞上にインビボでの炎症領域中へのリンパ球の浸潤と時間枠的に一致して誘起可能である（Dustin, M. L.等、J. Immunol. １３７：２４５−２５４、（１９８６）：Prober, J. S.等、J. Immunol.１３７：1893−１８９６、（１９８６）〕。さらに、ＩＣＡＭ−１は血管内皮細胞、胸線上皮細胞、他の上皮細胞および繊維芽球のような非造血細胞上にまた組織マクロファージ、マイトジェン刺激Ｔリンパ芽球、へん桃腺内の胚中心Ｂ細胞および樹枝状細胞、リンパ節およびパイエル板のような造血細胞上にも発現される（Dustin, M. L.等、J. Immunol.１３７：２４５−２５４、（１９８６）〕。ＩＣＡＭ−１はアレルギー性湿疹、扁平苔癬、発疹、じんま疹および水疱性疾患のような良性炎症のケラチノサイト上にも発現される。アレルギー性である患者の皮ふへのハプテンの適用により誘発させたアレルギー性皮ふ反応もケラチノサイト上に多量のＩＣＡＭ−１発現を生じた。これに対して、皮ふ上の有毒パッチはケラチノサイト上にＩＣＡＭ−１発現を生じなかった。ＩＣＡＭ−１は種々の皮ふ学上の不整からの皮ふ傷害の生検からのケラチノサイト上に存在し、ＩＣＡＭ−１発現はアレルギーパッチ試験からの傷害において誘発されたが、毒性パッチ試験傷害からのケラチノサイトはＩＣＡＭ−１を発現しなかった。
ＩＣＡＭ−１は、従って、リンパ球が付着できる細胞基質であり、その結果、リンパ球は炎症部位に浸透し得および／またはこの炎症に貢献する各種のエフェクター機能を伝達し得る。そのような機能には抗体の産生、ウイルス感染ターゲット細胞の溶解等がある。本明細書で使用する“炎症”なる用語は特異的または非特異的防御系の反応を含むことを意味する。“特異的防御系”なる用語は特異的抗原の存在と反応する免疫系の成分を称するものとする。炎症は、特異的防御系の反応によって引き起され、媒介されあるいはそれに伴う場合には、特異的防御系の応答に由来するものといわれている。特異的防御系の応答に由来する炎症の例には風疹ウイルス、自己免疫疾患、Ｔ細胞によって仲介された遅延型過敏症（例えば、Mantaux試験で、“陽性”となる患者におけるような）、乾癬等がある。
“非特異的防御系反応”は免疫記憶のできない白血球により媒介される応答である。そのような細胞には顆粒球およびマクロファージがある。本明細書で使用するとき、炎症は、その炎症が非特異的防御系の反応によって引き起され、仲介されあるいはその反応に伴う場合には、非特異的防御系の応答に由来するものといわれる。少なくとも１部が非特異的防御系に由来する炎症の例には、喘息、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）または敗血症もしくは外傷の副次的な重複器官損症群、心筋または他の組織の再灌流（reperfusion）、損傷、急性糸球体腎炎、反応性関節炎、急性炎症成分による皮ふ炎、急性化膿性随膜炎または他の中枢神経系炎症疾患、熱傷、血液透析、ロイカフェレシス（leukapheresis）、潰瘍性大腸炎、クローン病、壊死性全腸炎、顆粒球輸血関連症候群、およびサイトカイン誘起毒性のような状態に伴う炎症がある。
本発明によれば、ＩＣＡＭ−１官能性誘導体、特に、ドメイン１、２および３を有するＩＣＡＭ−１のフラグメントまたは突然変異体を含むような誘導体を上記のような非特異的防御系反応の処置または治療にいて使用できる。そのような処置または治療においてより好ましいのはＩＣＡＭ−１のドメイン２を含有するＩＣＡＭ−１フラグメントまたは突然変異体である。そのような処置または治療において最も好ましいのはＩＣＡＭ−１のドメイン１を含有するＩＣＡＭ−１フラグメントまたは突然変異体である。
C.ＩＣＡＭ−１遺伝子のクローニング
任意の多くの方法を用いてＩＣＡＭ−１遺伝子をクローニングできる。そのような方法の１つはＩＣＡＭ−１遺伝子を含有する挿入物の存在についてｃＤＮＡ挿入物のシャトルベクターライブラリー（ＩＣＡＭ発現性細胞由来の）を分析することである。そのような分析は細胞を上記ベクターで移入し次いでＩＣＡＭ−１発現についてアッセイすることによって実施できる。この遺伝子をクローニングする好ましい方法はＩＣＡＭ−１分子のアミノ酸配列を決定することが含まれる。これを行うには、ＩＣＡＭ−１たん白質を精製して自動化シークエネーターにより分析できる。また、分子は臭化シアンによりあるいはパパイン、キモトリプシンまたはトリプシンのようなプロテアーゼによるようにして分解できる〔Oike, Y.等、J. Biol. Chem. ２５７：９７５１−９７５８（１９８２）；Liu, C.等、Int. J. Pept.Protein Res.２１：２０９−２１５（1983）〕。ＩＣＡＭ−１の全アミノ酸配列を決定できるけれども、好ましいのは分子のペプチドフラグメントの配列を決定することである。ペプチドが１０ケのアミノ酸より長い場合、その配列情報は一般にＩＣＡＭ−１の遺伝子のような遺伝子をクローニングするのに十分である。
ペプチド中のアミノ酸残基の配列は、普通用いられている３文字表示または１文字表示を用いて本明細書においても表示する。これら３文字および１文字表示の目録は“Biochemistry, Lehninger, A., Worth Publishers刊、ニューヨーク、（１９７０）”のような教科書において見い出される。そのような配列を縦に書くときには、アミノ末端基は列の頂部にあるようにし、カルボキシ末端基は列の底部にあるようにする。同様に、横方向に書くときには、アミノ末端は左にあるようにし、カルボキシ末端は右末端にあるようにする。ペプチド中のアミノ酸残基はハイホンによって分離できる。そのようなハイホンは単に配列の存在を容易にすることを意図しているだけである。単なる例示としては、
−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−
と表示したアミノ酸配列はＡｌａ残基がＧｌｙのカルボキシ基に結合していることおよびＳｅｒ残基がＡｌａ残基のカルボキシ基およびＰｈｅ残基のアミノ基に結合していることを示している。この表示はさらにアミノ酸配列がテトラペプチドＧｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅを含有していることも示している。この表示はアミノ酸配列をこの１つのテトラペプチドに限定するものではなく、(1)アミノまたはカルボキシに結合した１種以上のアミノ酸残基を有するテトラペプチド、(2)アミノおよびカルボキシ末端の両方に結合した１種以上のアミノ酸残基を有するテトラペプチド、(3)追加のアミノ酸残基を有していないテトラペプチドを包含するものとする。
１種以上の適当なペプチドフラグメントがシーケンシングされると、これらをコードし得るDNA配列を検査する。遺伝子コードは縮重するので、１種以上のコドンを用いて特定のアミノ酸をコードできる〔Watson, J. D.,Molecular Biology of the Gene,第３版、W. A. Benjamin社、カルホルニア  メンローパーク、（１９７７）、pp３５６−３５７〕。ペプチドフラグメントを分析して最低度の縮重性を有するオリゴヌクレオチドによってコードされ得るアミノ酸配列を同定する。これは好ましくは単一コドンのみによってコードされているアミノ酸を含有する配列を同定することによって行う。場合によっては、そのようなアミノ酸配列は単一オリゴヌクレオチドのみによってコードされ得るけれども、多くの場合、そのアミノ酸配列は任意の１セット（組）の同様なオリゴヌクレオチドによってコードされ得る。重要なのは、上記セットのすべてのメンバーがそのペプチドフラグメントをコードし得るオリゴヌクレオチドを含有し、かくしてそのペプチドフラグメントをコードする遺伝子として同じヌクレオチド配列を潜在的に含むのに対し、上記のセットの１メンバーのみはこの遺伝子のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含むことである。このメンバーは上記のセット内に存在し、上記セットの他のメンバーの存在においてさえもＤＮＡにハイブリッドし得るので、単一オリゴヌクレオチドを用いて上記ペプチドをコードする遺伝子をクローニングするのと同じ方法で分解していないオリゴヌクレオチドセットを用いることができる。
上述の方法と正確に同じ方法において、ペプチドフラグメントをコードし得るオリゴヌクレオチド配列または配列セットに相補的であるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチドのセット）を用い得る。
ＩＣＡＭ−１遺伝子のフラグメントをコードし得る適当なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセット（またはそのようなオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに相補性であるもの）を同定し（上述の手順を用いて）、DNAについて当該技術で周知の手段を用いて、好ましくはＩＣＡＭ−１遺伝子配列を発現し得るヒト細胞由来のｃＤＮＡ調製物により合成しハイブリッド化する。核酸ハイブリッド化技術はManiatis, T.等、により“Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Coldspring Harbor, NY（１９８２）”において、またHaymes, B. D.等により“Nucleic acid Hybrization, a Practical approach, IRL Press社、ワシントンD. C.（１９８５）”において開示されており、これら文献は参考として本明細書に引用する。使用するＤＮＡまたはcDNA源は好ましくはＩＣＡＭ−１配列に富む。そのような濃厚化はＩＣＡＭ−１合成を誘起する条件下で培養させた細胞（ホルボールエステルの存在下で増殖されたＵ９３７等のような）からＲＮＡを抽出することによって得たｃＤＮＡから最も容易になし得る。
上述した方法のようなあるいは同様な方法はヒト  アルデヒド  デヒドロゲナーゼの遺伝子〔Hsu, L. C.等、Proc, Natl, Acad, Sci, USA８２：３７７１−３７７５（１９８５）〕、フィブロネクチン〔Suzuki, S.等、Eur, Mol, Biol, Organ, J. ４：２５１９−２５２４（１９８５）〕ヒト  エストロゲン  レセプス−遺伝子〔Walter, P.等、Proc, Natl, Acad, Sci, USA８２：7889−７８９３（１９８５）〕、組織型プラスミノーゲン  アクチベータ〔Pennica, D.等、Nature 301：２１４−２２１（１９８３）〕およびヒト胎盤アルカリ  ホスファターゼ相補ＤＮＡ〔Kam, W.等、Proc, Natl, Acad, Sci, USA８２：８７１５−８７１９（１９８５）〕のクローニングを成功裏に可能にしている。
ＩＣＡＭ−１遺伝子をクローニングする別の好ましい方法においては、発現ベクターのライブラリーをＩＣＡＭ−１を発現ベクター中に発現できる細胞からＤＮＡまたは好ましくはｃＤＮＡをクローニングすることによって調製する。このライブラリーを次いで抗ＩＣＡＭ−１抗体に結合しＩＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−１フラグメントと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得るヌクレオチド配列を有するたん白質を発現し得るメンバーについてスクリーニングする。
上記方法により得られたクローニングＩＣＡＭ−１遺伝子は操作によって発現ベクターに結合させバクテリアまたは真核生物細胞に組み込んでＩＣＡＭ−１たん白質を産生させる。そのような操作技術はManiatis, T.等（前出）により開示され、当該技術において周知である。
D.ＬＦＡ−１依存性凝集のアッセイの使用
ＬＦＡ−１依存性凝集を測定し得る前述のアッセイを用いてＬＦＡ−１依存性凝集の度合を抑制するアンタゴニストとして作用する試剤を同定できる。そのようなアンタゴニストは凝集に関係するＬＦＡ−１またはＩＣＡＭ−１の能力を付与することによって作用し得る。即ち、そのような試剤はＬＦＡ−１またはＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体のような免疫グロブリンを包含する。さらに、非免疫グロブリン（即ち、化学）剤も、上記アッセイを用いてこれらがＬＦＡ−１凝集のアンタゴニストであるかどうかを決定し得る。
E.ＩＣＡＭ−１レセプターたん白質に結合し得る抗体の使用
1.抗炎症剤
ＣＤ18複合体の各１員に対するモノクローナル抗体は内皮への結合〔Haskard, D.等、J. Immunol.１３７：２９０１−２９０６（１９８６）〕、ホモタイプ粘着〔Rothlein, R.等、J. Exp. Med.１６３：１１３２−1149（１９８６）〕リンパ球の抗原およびマイトジェン誘起増殖〔Davigon, D.等、Proc, Natl, Acad, Sci, USA７８：４５３５−４５３９（１９８１）〕、抗体形成〔Fisher, A.等、J. Immunol. １３６：３１９８−３２０３（１９８６〕、および細胞毒性Ｔ細胞〔Krensky, A. M.等、J. Immunol. １３２：２１８０−２１８２（１９８４）〕、マクロファージ〔Strassman, G.等、J. Immunol. 136：４３２８−４３３３（１９８６）〕、および抗体依存性細胞毒反応に含まれるすべての細胞〔Kohi, S.等、J. Immunol. １３３：２９７２−２９７８（１９８４）〕の溶解活性のようなすべての白血球のエフェクター機能を包含する白血球の多くの粘着依存性機能を抑制する。これら機能のすべてにおいて、上記抗体は白血球の適当な細胞基質への粘着能力（この能力は最終結果を抑制する）を抑制する。
前述したように、ＩＣＡＭ−１分子のＬＦＡ−１群分子の１員への結合は細胞粘着において極めて重要である。粘着の過程において、リンパ球は外来抗原の存在について動物を連続的にモニターし得るものである。これらの過程は通常は望ましいものであるけれども、これらの過程はまた臓器移植拒絶、組織移植拒絶、および多くの自己免疫患者の原因でもある。従って、細胞粘着を減衰または抑制できる何らかの手段が臓器移植、組織移植の受け入れ者または自己免疫患者に大いに望まれている。
ＩＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体は哺乳動物の抗炎症剤として極めて適している。明らかに、そのような薬剤は粘着を選択的に抑制でき通常の薬剤で見い出し得るネフロ毒性のような他の副作用を示さない点で一般の抗炎症剤と異なっている。従って、ＩＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体を用いて哺乳動物においてそのような副作用の恐れなしに臓器または組織の拒絶反応を防止しあるいは自己免疫応答を修正できる。
重要なことは、ＩＣＡＭ−１を認識し得るモノクローナル抗体の使用はＨＬＡ不均衡を有する個々人においてさえも臓器移植を行うことができるということである。
2.  遅延型過敏反応のサプレッサー
ＩＣＡＭ−１分子は殆んど遅延型過敏反応に含まれる部位のような炎症部位に発現するので、ＩＣＡＭ−１分子に結合し得る抗体（特にモノクローナル抗体）はそのような反応の減衰または排除において治療的潜在力を有する。この潜在的治療用途は２つの方法のいずれかで活用できる。第１は、ＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体を含有する組成物を遅延型過敏反応を呈する患者に投与できる。例えば、そのような組成物は毒キツダ、毒オーク等の抗原と接触した人に投与できるであろう。第２の態様においては、ＩＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体を抗原と共に患者に投与してその後の炎症反応を防止する。即ち、抗原とＩＣＡＭ−１結合性モノクローナル抗体との共投与は上記抗原の投与後に人に一時的に許容し得る。
3.慢性炎症疾患の治療
ＬＦＡ−１を欠損するＬＡＤ患者は炎症応答を示さないので、ＬＦＡ−１の天然リガンド、ＩＣＡＭ−１の拮抗作用もまた炎症応答を抑制するものと信じている。ＩＣＡＭ−１に対する抗体の炎症を抑制する能力は円板状エリスマトーデス、自己免疫甲状腺炎、実験的アレルギー性脳脊ずい炎（ＥＡＥ）、多発性硬化症、糖尿病レイナード症候群のある態様、リウマチ様関節炎等の慢性炎症および自己免疫疾患の治療における治療用途の基本を与える。一般に、ＩＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体はステロイド療法により現在治療可能な疾患の治療に用い得る。
4.診断および判定的用途
ＩＣＡＭ−１は殆んど炎症部分に発現するので、ＩＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体は患者の感染および炎症部位を画像化または可視化する手段として使用できる。そのような用途においては、モノクローナル抗体はラジオアイソトープ、アフィニティラベル（ビオチン、アビジン等のような）、螢光ラベル、常磁性原子等の使用により検出可能に標識化する。そのような標識化を行う手順は当該技術において周知である。画像診断における抗体の臨床的応用は“Grossman, H. B.,Urol, Clin, North Amer. １３：４６５−４７４（１９８６）”、“Unger, E. C.等、Invest, Radiol, ２０：６９３−７００（１９８５）”および“Khaw, B. A.等、Science ２０９：２９５−２９７（１９８０）”により検討されている。
炎症の存在はまたＩＣＡＭ−１を発現する細胞のＩＣＡＭ−１遺伝子配列にまたはＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡ配列に結合するｍＲＮＡ、cDNAまたはＤＮＡのような結合性リガンドの使用によっても検出できる。そのようなハイブリッド化アッセイを行う技術はManiatais, T.（前出）によって開示されている。
そのような検出可能に標識した抗体の病巣の検出は炎症または腫瘍発現部位を示し得る。１つの実施態様においては、この炎症検査は組織または血液のサンプルを取り出しそのようなサンプルを上記検出可能に標識した抗体の存在下にインキュベートすることによって行う。好ましい実施態様においては、この方法を磁性画像診断、フルオログラフィ等を用いて非侵略的方法で行う。そのような診断試験は臓器移植受け入れ者を潜在的な組織拒絶の早期発見のためにモニターするのに用い得る。そのようなアッセイはまたリウマチ様関節炎または他の慢性炎症疾患に対する個々人の対応を決定するにも実施し得る。
5.  治療または診断目的で投与する抗原物質の導入の補佐
例えば、ウシインシュリン、インターフェロン、組織型プラズミノーゲンアクチベーターまたはマウスモノクローナル抗体のような治療または診断剤への免疫応答はそのような薬剤の治療または診断価値を実質的に減少させ、実際に、血清病のような疾患を生じ得る。そのような事情は本発明の抗体を用いて改善できる。この実施態様においては、そのような抗体を治療剤または診断剤と組合せて投与する。抗体の添加は受け入れ者を上記薬剤の認識から防止し、従って、受け入れ者が薬剤に対する免疫応答を開始するのを防止する。そのような免疫応答がないことは患者の治療剤または診断剤の追加の投与を受け入れる能力をもたらす。
F.細胞間粘着分子−１（ＩＭＡＣ−１）の使用
ＩＣＡＭ−１はＬＦＡ−１の結合パートナーである。かくして、ＩＣＡＭ−１またはその官能性誘導体は疾患の治療においてＬＦＡ−１に結合し得る抗体と相互変化的に使用できる。即ち、可溶化形において、そのような分子は炎症、臓器拒絶、移植拒絶等を抑制するのに用い得る。ＩＣＡＭ−１またはその官能性誘導体は抗ＩＣＡＭ抗体と同じ方法で用いて治療剤または診断剤の免疫原性を減少させ得る。
ＩＣＡＭ−１、その官能性誘導体、およびそのアンタゴニストを用いて表面上にＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１を発現する腫瘍細胞の転移または増殖をブロックし得る。種々の方法がそのような目的を達成するのに用い得る。例えば、造血細胞の浸透はＬＦＡ−１−ＩＣＡＭ−１結合を必要とする。従って、そのような結合のアンタゴニストは上記の浸透を抑制し白血球由来の腫瘍細胞の転移をブロックする。また、ＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１群分子の１員に結合し得る毒素由来分子も患者に投与し得る。そのような毒素由来分子がＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１群分子の１員と結合する場合、毒素の存在が腫瘍細胞を殺しそれによって腫瘍の増殖を抑制する。
G.ＩＣＡＭ−１依存性粘着の非免疫グロブリンアンタゴニストの使用
ＩＣＡＭ−１依存性粘着はＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１に結合し得る非免疫グロブリンアンタゴニストにより抑制し得る。ＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストの１つの例はＬＦＡ−１である。ＬＦＡ−１に結合する非免疫グロブリンアンタゴニストの例はＩＣＡＭ−１である。前述のアッセイを使用することによって、追加の非免疫グロブリンアンタゴニストを同定し精製できる。ＩＣＡＭ−１依存粘着の非免疫グロブリンアンタゴニストはＬＦＡ−１に対する抗体またはＩＣＡＭ−１に対する抗体と同じ目的で使用できる。
H.本発明の組成物の投与
ＩＣＡＭ−１の治療効果は患者に全ＩＣＡＭ−１−またはその任意の治療上活性なペプチドフラグメントを投与することによって得られる。
ＩＣＡＭ−１およびその官能性誘導体は組換えＤＮＡを用いて合成的にあるいはたん白質分解により取得できる。ＩＣＡＭ−１の治療上の利点は追加のアミノ酸残基を有してキャリヤーに対する結合性を改善しあるいはＩＣＡＭ−１の活性を改善したＩＣＡＭ−１の官能性誘導体の使用により増強され得る。本発明の範囲はさらにある種のアミノ酸残基を欠損しあるいは別のアミノ酸残基を含むＩＣＡＭ−１の官能性誘導体もそのような誘導体が細胞粘着に作用する能力を示す限り包含するものとする。
本発明の抗体およびＩＣＡＭ−１分子は、これらを含有する調製物がこれらの生成物と共に通常天然に見出される物質を実質的に含まない場合、“天然不純物を実質的に含まない”といえる。
本発明はＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体およびその生物学的活性を有するフラグメント（ポリクローナルまたはモノクローナル）にも及ぶ。そのような抗体は動物、組織培養または組換えＤＮＡ手段により調製できる。
患者にＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体またはそのフラグメントを投与するには、あるいは、ＩＣＡＭ−１（またはそのフラグメント、変異体または誘導体）を受け入れ患者に投与するには、その投与量は患者の年令、体重、身長、性別、一般的医療条件、病歴等のファクターによる。一般には、患者に約１Pg／kg〜１０mg／kg（患者体重）の範囲の抗体投与量で投与することが望ましいが、それにより低量または高量の投与量も投与できる。ＩＣＡＭ−１分子またはその官能性誘導体を患者に投与するときは、同じく約１Pg／kg〜１０mg／kg（患者の体重基準）の範囲の投与量でそのような分子を投与することが好ましいが、それより低量または高量の投与量も使用できる。後述するように、上記の有効投与量は抗ＩＣＡＭ−１抗体を抗ＬＡＭ−１投与と共投与する場合は少なくすることができる。本発明においては、１つの化合物は第２の化合物と、その２つの化合物の投与がこれら両化合物を患者血清中で同時に検出できるような条件にある場合において患者に共投与できると云える。
ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体及びＩＣＡＭ−１自体の両者は患者に静注、筋注、皮下、腸内または非経口的に投与できる。抗体またはＩＣＡＭ−１を注射により投与するときは、投与は連続注入によりあるいは１回または多数回ボーラスにより行い得る。
本発明の抗炎症剤は炎症を抑制するのに十分な量で受け入れ対象体に投与するものである。その量は、薬剤の投与量、投与経路等が炎症を減衰させあるいは防止するに十分である場合において炎症を“抑制”するに十分であると云える。
本発明の抗炎症剤は炎症の発症前（予想される炎症を抑制するために）または炎症発症後のいずれにおいても投与できる。
抗ＩＣＡＭ−１抗体またはそのフラグメントは単独または１種以上の追加の免疫抑制剤と組合せて投与できる（特に、臓器または組織移植の受け入れ者に対して）。そのような化合物の投与は“予防”または“治療”目的のいずれかであり得る。予防的に投与する場合には、これらの免疫抑制剤は炎症応答または症候の前に投与する（例えば、臓器または組織の移植前、移植中または移植直後で臓器拒絶症候の前）。これら化合物の予防的投与は後の何らかの炎症応答（例えば、移植臓器または組織の拒絶等）を防止または低減するのに役立つ。治療的に投与する場合には、これらの免疫抑制化合物は実際の炎症の症候（例えば、臓器または組織拒絶のような）の発症時（またはその直後）に投与する。これら化合物の治療的投与は何らかの実際の炎症（例えば、移植臓器または組織の拒絶のような）を低減するのに役立つ。かくして、本発明の抗炎症剤は炎症の発症前（予想される炎症を抑制するように）または炎症の開始後のいずれかで投与できる。
組成物はその投与が受け入れ患者に許容される場合に“薬学上受け入れ可能である”と云える。そのような薬剤はその投与量が生理学上有意である場合に“治療上有効な量”で投与されると云える。薬剤はその存在が受け入れ患者の生理に検知可能な変化をもたらす場合に生理学上有意である。
本発明の抗体およびＩＣＡＭ−１分子は薬学上有用な組成物を調製する公知の方法によって処方でき、それによってこれらの物質またはその官能性誘導体を薬学上許容できるキャリヤーベヒクルと混合物として組合せ得る。適当なベヒクルおよびその調製物（例えば、他のヒトたん白質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、“Remington's Pharmaceutical Sciences（第１６版、Dsol, A.編、マーク・イーストン（PA）、（１９８０）”に記載されている。有効な投与に適する薬学上許容し得る組成物を調製するためには、そのような組成物は適当量のキャリヤーベヒクルと共に有効量の抗ＩＣＡＭ−１抗体またはＩＣＡＭ−１分子、またはその官能性誘導体を含有する。
追加の薬学的方法を用いて活性の持続を制御することができる。制御放出性製剤は抗ＩＣＡＭ−１抗体またはＩＣＡＭ−１、またはこれらの官能性誘導体を複合体化しあるいは吸収するポリマーを使用することによって得ることができる。制御された伝達は適当なマクロ分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン−酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはプロタミン硫酸塩）および該マクロ分子の濃度並びに放出を制御するための混入方法を選択することによって達成できる。制御放出製剤により活性持続を制御するもう１つの可能性ある方法は抗ＩＣＡＭ−１抗体またはＩＣＡＭ−１分子、またはこれらの官能性誘導体をポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリラクトン酸またはエチレン−酢酸ビニルコポリマーのような高分子物質の粒子に混入させることである。また、これら薬剤を高分子粒子に混入させる代りに、これらの薬剤を例えばコアセルベーション法によりあるいは界面重合法により調製したマイクロカプセル例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよび（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、あるいはコロイド状薬物伝達系例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノパーティクル、ナノカプセルまたはマクロエマルジョン中に内包させることも可能である。そのような方法も“Remington's Pharmaceutical Sciences（１９８０）”中に記載されている。
実施例
これまで本発明を一般的に説明して来たが、以下の実施例は本発明をより容易に理解できるであろう。これらの実施例は例示を目的とするものであり本発明を限定するものではない。
実施例１
動物細胞の培養
一般に、本発明のＥＢＶ形質転換およびハイブリドーマ各細胞は２０ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／mｌのジェンタマイシン、および１０％のウシ胎児血清を加えたＲＭＰＩ１６４０培地中に保存した。細胞は３７℃で、５％CO2、９５％湿度雰囲気下で培養した。
エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）形質転換体を確立するために、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および５０μｇ／mｌのジェンタマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地中の１０6個のＴ細胞放血末梢単核細胞／mｌを１６時間Ｂ９５−８細胞のＥＢＶ含有上清でインキュベートした〔Thorley-Lawson、D. A.等、J. Exper. Med.１４６：４９５（１９７７）〕。０．２mｌ細胞アリコートを１０マイクロタイターウェルに入れた。培地をＲＰＭＩ１６４０培地（２０％ウシ胎児血清および５０μｍ／ｌジンタマイシンを加えた）で細胞増殖が見られるまで置換えた。細胞は殆んどのウェルで増殖し同じ培地中に拡った。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）芽球を１：800希釈ＰＨＡ−Ｐ（Difco Laboratories社、デトロイト、ＭＩ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（２０％ウシ胎児血清加）中１０6細胞／mｌで確立した。ＰＨＡ系はインターロイキン２（ＩＬ−２）調整培地で拡がりＰＨＡにより弱く脈動した〔Cantrell, D. A.等、J. Exper. Med. 158：１８９５（１９８３）〕。上記手順は“Springer、T.等、J. Exper. Med.１６０：１９０１−1918（１９８４）”により開示されており、その記載は参考として本明細書に引用する。上記手順で得た細胞を次いで抗ＬＦＡ−１抗体でスクリーニングしてこれらがＬＦＡ−１抗原を発現するかどうかを決定した。そのような抗体は“Sanchey Madrid、F.等、J. Exper. Med.１５８：１７８５（１９８３）”に開示されている。
実施例２
細胞凝集および粘着のアッセイ
細胞粘着の度合を評価するために、凝集アッセイを用いた。かかるアッセイに用いた細胞系は５ｍＭのHepesバッファー（Sigma Chemical社、セントルイス）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄し２×１０6細胞／mｌの濃度に再懸濁させた。平底９６ウェルマイクロタイタープレート（No.３５９６；Coastar社、ケンブリッジ、ＭＡ）に５０μｌの適当なモノクローナル抗体上清、５０μｌの精製モノクローナル抗体を含むまたは含まない完全培地、５０μｌの２００ng／mｌホルボールエステルホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）含有完全培地および１００μｌの完全培地中２×１０6細胞／mｌ濃度の細胞を加えた。これは５０ng／mｌＰＭＡと２×１０5細胞／ウェルの最終濃度を与えた。細胞を自然に沈降させ、凝集度を各時点で計数した。度数は０〜５+の範囲にあった。ここで０は密集中に本質的に細胞がないことを示し；１+は１０％以下の細胞が凝集物中にあり；２+は５０％以下の細胞が凝集していることを示し；３+は１００％までの細胞が小さいゆるやかな密集中にあったことを示し；４+は１００％までの細胞が大密集中に凝集したことを示し；５+は１００％の細胞が大きい極めて密な凝集物中にあったことを示す。細胞粘着のより定量的な評価を得るために、試剤および細胞を上記と同じ順序で５mｌポリスチレンチューブに加えた。チューブを３７℃でグリラトリーシェーカー上の台中に置いた。約２００rpmで１時間後に、１０μｌの細胞懸濁液をヘモサイトメーター中に入れ遊離細胞の数を定量した。％凝集を次の等式によって決定した。
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上記等式中の入れた細胞の数はインキュベートしていない細胞と完全培地のみを含有するコントロールチューブ中のmｌ当りの細胞数である。上記等式中の遊離細胞の数は試験チューブからのmｌ当りの非凝集細胞の数に等しい。上記の手順は“Rothlein, R.等、J. Exper. Med.１６３：１１３２−１１４９（１９８６）”によって開示されている。
実施例３
ＬＦＡ−１依存性細胞凝集
実施例２で記載した定量的凝集アッセイをエプスタイン−バールウイルス形質転換細胞系ＪＹを用いて行った。マイクロタイタープレート中の培地にＰＭＡを加えて、細胞凝集を観察した。時間経過ビデオ記録計はマイクロタイターウェル底部のＪＹ細胞が動いており活性な膜波動および仮足運動を示していた。隣接細胞の仮足間の接触はしばしば細胞−細胞粘着をもたらした。粘着が持続した場合、細胞接触領域は尾脚（uropod）に移動した。接触は激しい細胞運動および反対方向への細胞の引っ張り合いにも依らず維持できた。PMA処理および未処理細胞間の主な違いは１度形成された上記接触の安定性において現われていた。ＰＭＡにおいては、細胞密集が出現し、その周りに粘着した追加の細胞として粘度の成長があった。
粘着を測定する第２の手段としては、実施例２で記載した定量的アッセイを用いた。細胞懸濁液を２時間、２００rpmで振り、ヘモサイトメーターに移し、凝集物中に含まれない細胞を計数した。ＰＭＡの不存在では、４２％（ＳＤ＝２０％、Ｎ＝６）のＪＹ細胞が２時間後、凝集物中にあったが、５０μｇ／mｌのＰＨＡと共に同じ条件下でインキュベートしたＪＹ細胞は凝集物中に８７％（ＳＤ＝８％、Ｎ＝６）の細胞を有していた。凝集の動力学的検討はＰＭＡがすべての試験時間で凝集速度および強度を促進していることを示した（第３図）。
実施例４
抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体を用いての細胞の凝集抑制
ＰＭＡ誘起細胞凝集への抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体の効果を試験するために、そのような抗体を実施例２の定量凝集アッセイに従ってインキュベートした細胞に加えた。このモノクローナル抗体はＰＭＡの存在または不存在下のいずれにおいても細胞凝集の形成を抑制していることが判った。ＬＦＡ−１のアルファー鎖に対するモノクローナル抗体のF（ab′）2およびFab′フラグメントは双方とも細胞凝集を抑制できた。一方、本質的に１００％の細胞が抗ＬＦＡ−１抗体の不存在下では凝集を形成し、抗体を加えたときは２０％以下の細胞が凝集物中に見い出された。この実験の結果はRothlein, R.等により開示された〔J. Exper. Med. １６３：１１３２−１１４９（１９８６）〕。
実施例５
細胞凝集はＬＦＡ−１レセプターを必要とする：
ＥＢＶ形質転換リンパ芽球細胞を実施例１で記載した方法により患者から調製した。この細胞をＬＦＡ−１を認識し得るモノクローナル抗体に対してスクリーニングし、細胞がＬＦＡ−１欠損であることを見い出した。
実施例２で記載した定量凝集アッセイを上記ＬＦＡ−１欠損細胞を用いて行った。この細胞はＰＭＡの存在においても自発的に凝集しなかった。
実施例６
ＩＣＡＭ−１の発見
実施例５のＬＦＡ−１欠損細胞をカルボキシフルオレスセインジアセテートで標識した〔Patarroyo, M.等、Cell. Immunol.６３：237−２４８（１９８１）〕。標識細胞を同原またはＪＹ細胞と１：１０の比で混合し凝集物中のフルオレスセイン標識細胞の割合を“Rothlein, R.等、J. Exper. Med.１６３：１１３２−１１４９（１９８６）”の方法に従って測定した。ＬＦＡ−１欠損細胞はＬＦＡ−１発現性細胞と共凝集し得ることを見い出した（第４図）。
ＬＦＡ−１が凝集形成またはその維持にのみに重要であるかどうかを決定するために、ＬＦＡ−１に結合し得る抗体を上記の前以って形成させた凝集に加えた。抗体の添加は上記の前以って形成させた凝集を強く分裂させることが判った。時間経過ビデオ記録計は前以って形成させた凝集へのモノクローナル抗体の添加が２時間以内で分裂を生じ始めることを示した（第１表）。ＬＦＡ−１に対するモノクローナル抗体の添加後、凝集中の個々の細胞の促足運動および形状変化は変らないまま続いた。個々の細胞は凝集物の周囲から次第に解離し、８時間までに細胞は殆んど分散した。ビデオ時間経過によれば、ＬＦＡ−１モノクローナル抗体による前以って形成させた凝集の分裂は時間を逆のぼって行ったＬＦＡ−１モノクローナル抗体の不存在下での凝集過程と等価であった。
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実施例７
ＬＦＡ−１依存性凝集における２価イオンの必要性
細胞毒性Ｔ細胞とターゲット間のＬＦＡ−１依存性粘着はマグネシウムの存在を必要とする〔Martz, E.,J. Cell., Boll. ８４：５８４、５９８（１９８０）〕、ＰＭＡ誘起ＪＹ細胞凝集を２価カチオン依存性について試験した。ＪＹ細胞はカルシウムまたはマグネシウムイオンを含まない培地中では凝集しなかった（実施例２のアッセイを用いて）。２価マグネシウムの添加は０．３ｍＭ程の低い濃度で凝集を行った。カルシウムイオン単独の添加は殆んど効果がなかった。しかしながら、カルシウムイオンはマグネシウムイオンのＰＭＡ誘起凝集を補佐する能力を増強することが判った。１．２５ｍＭのカルシウムイオンを培地に加えたときは、０．０２ｍＭ程の低いマグネシウムイオン濃度で凝集を補佐することが判った。これらのデータは細胞のＬＦＡ−１依存性凝集がマグネシウムイオンを必要とすること、およびカルシウムイオンがそれ自体は不十分であるけれどもマグネシウムイオンと共に凝集を増大させることを示している。
実施例８
抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体を発現し得るハイブリドーマ細胞の単離
ＩＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体を“Rothlein, R.等、J. Immunol. １３７：1270−１２７４（１９８６）”の方法に従って単離した。該文献は参考として本明細書に引用する。即ち、３匹のＢＡＬＢ／ＣマウスをＬＦＡ−１欠損患者からのＥＢＶ形質転換末梢血単核細胞で腹腔内免疫した（Springer, T. A.等、J. Exper. Med.１６０：１９０１（１９８４））。１mｌＲＰＭＬ１６４０培地中約１０7個の細胞を各免疫に用いた。免疫はひ臓細胞をマウスから取り出す前の４５日、２９日および４日で行い所望のハイブリドーマ細胞系を産生させた。ひ臓細胞の取り出し前３日に、マウスに追加の０．１５mｌ培地中１０7細胞を投与した（静注）。
上記の動物からの単離ひ臓細胞をＰ３×７３Ag８．６５３ミエローマ細胞と４：１の比率で“Galfre, G.等、Nature２６６：５５０（1977）”のプロトコールに従って融合させた。得られたハイブリドーマ細胞の各アリコートを９６ウェルマイクロタイタープレートに入れた。各ハイブリドーマ上清を凝集抑制についてスクリーニングし、１つの抑制ハイブリドーマ（６００以上のすべてのウェル試験のうちから）をクローニングし限定稀釈によりサブクローニングした。このサブクローンはＲＰ１／１．１．１．と表示した（以後“ＲＰ１／１”と表示する）。
モノクローナル抗体ＲＰ１／１はＬＦＡ−１発現性細胞系ＪＹのＰＭＡ刺激凝集を一貫して抑制することを見い出した。ＲＰ１／１モノクローナル抗体はいくつかのＬＦＡ−１αまたはβサブユニットに対するモノクローナル抗体よりも等価かわずかに小さく凝集を抑制した。これに対し、コントロールのＨＬＡに対するモノクローナル抗体（これはＪＹ細胞上に多量に発現する）は凝集を抑制しなかった。モノクローナル抗体ＲＰ１／１と結合した抗原は細胞間粘着分子−１（ＩＣＡＭ−１）と定義する。
実施例９
ＩＣＡＭ−１を特性決定するための抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体の使用
ＩＣＡＭ−１の性質を限定するために、特にＩＣＡＭ−１がＬＦＡ−１と異なるかどうかを決定するために、細胞たん白質をモノクローナル抗体ＲＰ１／１を用いて免疫沈降させた。免疫沈降は“Rothlein, R.等の方法に従って行った〔J. Immunol.１３７：１２７０−１２７４（1986）〕。ＪＹ細胞を新たに１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド、０．２単位／mｌのトリプシンインヒビターアプロチニンを加えた１％トリトンＸ−１００、０．１４ｍのNaCｌ、１０ｍＭのトリス、pH８．０（溶解バッファー）中で５×１０7細胞／mｌで２０分間、４℃で溶解させた。溶解物を１０，０００ｘｇで１０分間遠心しＣＮＢｒ活性化グリシン抑制セファローズＣｌ−４Ｂの５０％懸濁液５０mｌで１時間、４℃で前処理した。１mｌの溶解物をセファローズＣｌ−４Ｂに結合させたモノクローナル抗体（１mg／mｌ）の５０％懸濁液の２０μｌで４℃で一夜免疫沈降させた〔Springer, T. A.等、J. Exper. Med.１６０：１９０１（１９８４）〕。セファローズ結合モノクローナル抗体は“March, S.等、の方法に従って炭酸塩バッファー中のセファローズＣｌ−４ＢのＣＮＢｒ活性化法を用いて調製した〔Anal.Biochem.６０：１４９（１９７４）〕。洗浄した免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色に“Morrissey, J. H. Anal. Biochem. １１７：３０７（１９８１）”の手順に従って供した。
ＳＤＳサンプルバッファー〔ＨＤ、M. K.等、J. Biol. Chem.２５８：６３６（１９８３）〕による１００℃でのたん白質溶出後、各サンプルを半分に分けて還元（第５Ａ図）または非還元（第５Ｂ図）の各条件下で電気泳動（ＳＤＳ−８％ＰＡＧＥ）に供した。分子量５０Kdおよび２５Kdを有するバンドはモノクローナル抗体セファローズからの免疫グロブリンの長鎖および短鎖に相当した（第５Ａ図、レーン３）。２５〜５０Kd分子量範囲の可変量の他のバンドも観察したが、ヘアリー白血病細胞からの沈降物中では見られず、この白血病細胞は９０Kd分子量バンドのみを与えた。ＬＦＡ−１の１７７Kdαサブユニットおよび９５Kdβサブユニットは還元（第５Ａ図、レーン２）および非還元（第５Ｂ図、レーン２）の両条件下でＩＣＡＭ−１とは異なって浸透した。
ＰＨＡ−リンパ芽球凝集に対してのモノクローナル抗体ＲＰ１／１の効果を測定するために、実施例２で記載した定量凝集アッセイを用いた。即ち、Ｔ細胞芽球細胞をＰＨＡで４日間刺激し、十分に洗浄し、次いで１Ｌ−２状態調節培地の存在下に６日間培養した。ＰＨＡはこの６日間培養で取り込まれ凝集アッセイに寄与しなかった。異なるＴ細胞芽球調製物による３種のアッセイにおいて、ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体は一貫して凝集を抑制した（第２表）。
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ＬＦＡ−１モノクローナル抗体はＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体よりも一貫して抑制的であり、一方ＨＬＡ−Ａ、ＢおよびＬＦＡ−３モノクローナル抗体は効果なしであった。これらの結果は試験したモノクローナル抗体のうち、ＬＦＡ−１またはＩＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体のみが細胞粘着を抑制し得ることを示している。
実施例１０
ＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体の調製
免疫
Balb／ｃマウスをＲＰＭＩ培地中の２×１０7ＪＹ細胞０．５mｌで融合前の１０３日および２４日で腹腔内（i.p.）免疫した。融合前４日および３日に、マウスを０．５mｌのＲＰＭ１培地中のＰＭＡ分化Ｕ９３７細胞でi.p.免疫した。
Ｕ９３７細胞の分化
Ｕ９３７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９３）を１０％のウシ胎児血清、１％グルタミンおよび５０mｌの２ng／mｌホルボール−１２−ミリステートアセテート（ＰＭＡ）含有ジエタマイシン（完全培地）を含むＲＰＭＩ中５×１０5／mｌで滅菌ポリプロピレン容器中でインキュベートすることによって分化した。このインキュベーションの第３日で、1/2容量の培地を除去し新しいＰＭＨ含有完全培地で置き換えた。４日目で、細胞を取り出し、洗浄して免疫用に調製した。
融合
免疫マウスからのひ臓細胞をGalfre等に従ってＰ３×６３Ag８．６５３ミエローマ細胞と４：１の比で融合させた〔Nature２６６：５５０（１９７７）〕。融合後、細胞を９６ウェル平底マイクロタイタープレートに１０5ひ臓細胞／ウェルで入れた。
抗ＩＣＡＭ−１陽性細胞の選択
１週間後、５０μｌの上清を凝集用細胞系としてＪＹおよびＳＫＷ−３の両方を用いて実施例２の定量凝集アッセイでスクリーニングした。ＪＹ細胞凝集を抑制するがＳＫＷ−３凝集は抑制しない上清からの細胞を選択し限定稀釈を用いて２回クローニングした。
この実験により、抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体を産生する３種のハイブリドーマ系の同定およびクローニングができた。これらのハイブリドーマ系により産生した抗体は、それぞれ、IgG2a、IgG2bおよびIgMであった。IgG2a抗ICAM−１抗体を産生するハイブリドーマ細胞系は表示Ｒ６′５′Ｄ６′Ｅ９′Ｂ２とした。この好ましいハイブリドーマ細胞系により産生した抗体はＲ６′５′Ｄ６′Ｅ９′Ｂ２と表示した（以下、“Ｒ６−５−Ｄ６”と称する）。
実施例１１
ＩＣＡＭ−１の発現と規格化
ＩＣＡＭ−１発現を測定するために、ラジオイムノアッセイを行った。このアッセイにおいては、精製ＲＰ１／１をイオドゲンを用いて１０μCi／μｇの特定の活性にヨー素化した。内皮細胞を９６ウェルプレート中で増殖させ各実験で述べたようにして処理した。各プレートを直接氷上ではなく冷室に０．５〜１時間置くことによって４℃に冷却した。各単一層を冷完全培地で３回洗浄し次いで４℃で３０分間125Ｉ  ＲＰ１／１でインキュベートした。次いで、単一層を完全培地で３回洗浄した。結合125Ｉを０．１Ｎ NaOHを用いて放出し計数した。125Ｉ  ＲＰ１／１の特異活性を未標識ＲＰ１／１を用いて調整して本試験において用いる抗原密度範囲に亘って直線状シグナルを得た。非特異結合を１，０００倍過剰の未標識ＲＰ１／１の存在下で測定し総結合から差引き特異性結合を得た。
上述のラジオイムノアッセイを用いて測定したＩＣＡＭ発現はヒトヘソ帯静脈内皮細胞（HUVEC）およびヒト伏状静脈内皮細胞（ＨＳＶＥＣ）上で１Ｌ−１、ＴＮＦ−、ＬＰＳおよびＩＮＦガンマーにより増大する（第３表）。伏状静脈内皮細胞は本試験においては成人組織由来の培養大静脈内皮細胞中のヘソ帯静脈内皮細胞からの結果を確認するために用いた。ＩＣＡＭ−１の基礎的発現はヘソ帯静脈内皮細胞よりも伏状静脈内皮細胞上で２倍高い。ヘソ帯静脈内皮細胞の組換えＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、およびＴＮＦへの露出はＩＣＡＭ発現を１０〜２０倍増大させる。ＩＬ−１アルファ、ＴＮＦおよびＬＰＳは最大効力インデューサーであり、ＩＬ−１は重量基準および応答の飽和濃度では効力はそれより小さい（第３表）。１００ng／mｌでのＩＬ−１ベータはＩＣＡＭ−１発現をＨＵＶＥＣ上で９倍、ＨＳＶＥＣ上で７．３倍増大させ、半−最高増加は１５ng／mｌで起った。５０ng／mｌのｒＴＮＦはＩＣＡＭ−１発現をＨＵＶＥＣ上で１６倍、ＨＳＶＥＣ上で１１倍増大させ、半−最高効果は０．５ng／mｌであった。インターフェロンガンマーはＩＣＡＭ−１発現において１０，０００Ｕ／mｌでＨＵＶＥＣ上で５．２倍またはＨＳＶＥＣ上で３．５倍の有意の増大を示した。１０μｇ／mｌでのＬＰＳの効果はｒＴＮＦの効果と強さにおいて同じようであった。これら媒介物の対の組合せはＩＣＡＭ−１発現において追加の効果または追加の効果よりもわずかに小さい効果をもたらした（第３表）。ｒＴＭＦとｒＩＬ−１ベータまたはｒＩＦＮガンマーとの交差滴定は次善または最善の濃度での効果において共働作用を示さなかった。
ＬＰＳは培地中でときどき見い出される基準で内皮細胞上でのＩＣＡＭ−１発現を増大させたので、基礎的ＩＣＡＭ−１発現がＬＰＳに基づき得る可能性を試験した。いくつかの血清バッチを試験したとき、低エンドトキシン血清が２５％までの低ＩＣＡＭ−１基礎発現を与えることを見い出した。ここで示した結果はすべて低エンドトキシン血清中で増殖させた内皮細胞のものであった。しかしながら、ＬＰＳ中和性抗生物質ポリミキシンＢの１０μｇ／mｌでの添加はＩＣＡＭ１発現をわずかに追加の２５％に減少させた（第３表）。ＩＬ−１またはＴＮＦによる処理時のＩＣＡＭ−１発現の増大はこれらの調製物中の低エンドトキシン値と一致させた１０μｇ／mｌポリミキシンＢの存在によっては効果はなかった（第３表）。
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ＨＶＥＣおよびＨＳＶＥＣ−ＨＵＶＥＣまたはＨＳＶＥＣ上のＩＣＡＭ−１発現の上方規格化（upregulation）は９６ウェルプレートに１：３で融合性単一層から種付し融合状に増殖させた。次いで細胞を各物質または培地で１６時間処理しＲＩＡを方法的に行った。すべての数値は４回繰返しで行った。
実施例１２
ＩＣＡＭ−１のインターロイキン１およびガンマーインターフェロン誘起の動力学
皮ふ繊維芽細胞上でのＩＣＡＭ−１発現へのインターロイキン−１およびガンマーインターフェロン効果の動力学をDustin, M. L.等の125Ｉヤギ抗マウスIgG結合アッセイを用いて測定した〔J. Immunol. １３７：２４５−２５４（1986）；該文献は参考として本明細書に引用する。〕この結合アッセイを行うために、ヒト皮ふ繊維芽球を９６ウェルマイクロタイタープレート中で２〜８×１０4細胞／ウェル（０．３２cm2）に増殖させた。細胞を実施例１で記載したようにして補充したＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した。細胞をさらにハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．０５％ NaN3および１０％の熱不活化ウシ胎児血清で１回洗浄した。この結合用バッファーでの洗浄は４℃で行った。各ウェルに上記の結合用バッファー５０μｌおよびＸ６３およびＷ６／３２による適当なハイブリドーマ上清５０mｌを、それぞれ陰性および陽性コントロールとして加えた。３０分間、４℃でのインキュベーション後、ウェルを２回結合用バッファーで洗浄し、第２の抗体125Ｉ−ヤギ抗マウスIgGを１００μｌ中５０nCiで加えた。125Ｉ−ヤギ抗マウス抗体はイオドゲン（Pierce社）を用いてFraker, P. J.等の方法に従って調製した〔Biochem. Biophys. Res. Commun.８０：８４９（１９７８）〕。４℃で３０分後、ウェルを２回２００μｌの結合用バッファーで洗浄し、細胞層を１００μｌの０．１Ｎ NaOHを加えることによって可溶化した。この処理および１００μｌ洗浄はベックマン５５００ガンマーカウンター中で計数した。分当り結合の特異的カウントを〔モノクローナル抗体によるcpm〕−〔Ｘ６３によるcpm〕として計算した。特異的試剤による誘起を含むすべての工程は４回繰返しで行った。
ＩＣＡＭ−１誘起における半減期２時間を有するインターロイキン１の効果は半減期３．７５時間を有するガンマーインターフェロンの効果よりも急速であった（第６図）。ＩＣＡＭの静止レベルに戻る時間は細胞サイクルまたは細胞増殖によっているようであった。静止状態細胞においては、インターロイキン１およびガンマーインターフェロン効果は２〜３日安定であり、一方対数期培養においては、ＩＣＡＭ−１発現はこれら誘起剤の除去後２日で基本線に近い。
組換えマウスおよびヒトインターロイキン１によるＩＣＡＭ−１誘起および組換えガンマーインターフェロンによるＩＣＡＭ−１誘起のドーズレスポンス曲線を第７図に示す。ガンマーインターフェロンおよびインターロイキン１は１ng／mｌで殆んど同一の効果を有する同じような濃度依存性を有することが判った。ヒトおよびマウス組換えインターロイキン１も同様な曲線を有するが、ＩＣＡＭ−１発現の誘起においてヒトインターロイキン１製剤よりもかなり低い効果を示している。
シクロヘキシミド（たん白質合成のインヒビター）およびアクチノマイシンＤ（ｍＲＮＡ合成のインヒビター）は繊維芽球上でのＩＣＡＭ−１発現におけるインターロイキン１およびガンマーインターフェロンの効果を壊滅させる（第４表）。さらにまた、ツニカマイシン（Ｎ結合グリコシル化のインヒビター）のみはインターロイキン１効果を４３％まで抑制した。これらの結果はたん白質およびｍＲＮＡ合成がＩＣＡＭ−１発現におけるインターロイキン１およびガンマーインターフェロン誘起増大において必要であるがＮ−結合グリコシル化の方はそれを必要としないことを示している。
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実施例１３
ＩＣＡＭ−１の組織分布
組織化学試験をヒト器官の凍結組織上で行い胸線、リンパ節、腸、皮ふ、じん臓および肝臓中のＩＣＡＭ−１の分布を測定した。そのような分析を行うために、正常ヒト組織の凍結組織切片（４μｍ厚さ）をアセトン中で１０分間固定しモノクローナル抗体、ＲＲ１／１でCerf−Bensussan, N.等により開示されたアビジン−ビオチンコンプレックス法（Vector Laboratories社、バーリンゲーム、ＣＡ）を用いたイムノパーオキシダーゼ法により染色した〔J. Immunol. １３０：2615（１９８３）〕。抗体とのインキュベーション後、切片をビオチン化ウマ抗マウスIgGおよびアビチン−ビオチン化パーオキシダーゼ複合体で順次インキュベートした。各切片は最終的には３−アミノ−９−エチル−カルバゾール（アルドリッチケミカル社、ミルウォーキー、ＷＩ）を含有する溶液に浸して呈色反応を行った。次いで、各切片を４％ホルムアルデヒド中で５分間固定させてヘマトキシリンで対向染色（counterstain）させた。コントロール（対照）はＲＲ１／１抗体の代りに無関係のモノクローナル抗体でインキュベートした切片を含んでいた。
ＩＣＡＭ−１は主要組織親和性コンプレックス（ＭＨＣ）クラスII抗原の分布と殆んど同じ分布を有していることが判った。すべての組織中の血管（大および小共に）の殆んどはＩＣＡＭ−１抗体による内皮細胞染色を示した。管内皮染色はじん臓、肝臓および正常皮ふ中の血管に較べてリンパ節、へん桃腺およびパイヤー班中の小胞間（パラコーチカル）領域でより強い。肝臓においては、染色は殆んど洞様毛細血管ライニング細胞に限定され、門静脈および動脈の殆んどをライニングしているヘパトサイトおよび内皮細胞は染色されなかった。
胸線ずい質においては、大細胞の拡散染色および樹木染色模様がみられた。皮質においては、染色像は巣状であり主として樹木状であった。胸腺細胞は染色されてなかった。末梢リンパ球組織においては、２次リンパ濾胞の胚中心細胞は強く染色していた。あるリンパ濾胞においては、染色像は殆んど樹木状であり、リンパ球の認識し得る染色はなかった。マントル領域の細胞のかすかな染色も観察された。さらに、細胞質拡大（指間小網細胞）を有する樹木状細胞および小胞内またはパラコーチカル領域のリンパ球の小数はＩＣＡＭ−１結合性モノクローナル抗体で染色していた。
細胞様マクロファージはリンパ節および小腸の薄膜プロプリア内で染色されていた。試験した器官の殆んどのストローマ内に拡散している繊維芽球様細胞（スピンドル形細胞）はＩＣＡＭ−１結合性抗体により染色していた。外皮中のランゲルハンス／不定細胞中では染色は認められなかった。平滑筋組織中でも染色は観察されなかった。
外皮細胞の染色はへん桃線の粘膜中で一貫して見られた。肝細胞、肝管外皮、腸外皮細胞、およびじん臓中の管状外皮細胞は殆んどの情況において染色されなかったが、じん細胞がん腫を有するじん摘出片からの正常じん臓組織の切片はICAM−１の多くの隣接管状細胞の染色を示した。これらの管状外皮細胞はまた抗ＨＬＡ−ＤＲ結合性抗体によっても染色していた。
要するに、ＩＣＡＭ−１は管状外皮細胞のような非造血細胞上、および組織マクロファージおよびマイトジエン刺激Ｔリンパ芽球のような造血細胞上に発現する。ＩＣＡＭ−１は末梢血リンパ球に少量発現することが判った。
実施例１４
モノクローナル抗体アフィニティクロマトグラフィーによるＩＣＡＭ−１の精製
一般的精製手順
ＩＣＡＭ−１をヒト細胞または組織からモノクローナル抗体アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。ＩＣＡＭ−１と反応性のモノクローナル抗体ＲＲ１／１を最初に精製して不活性カラムマトリックスに結合させた。この抗体は“Rothlein, R.等、J. Immunol. １３７：1270−１２７４（１９８６）”および“Dustin, M. L.等、J. Immunol. １３７：２４５（１９８６）”に記載されている。ＩＣＡＭ−１を細胞膜から細胞を非イオン性清浄剤トリトンＸ−１００中で近中性pHで溶解することによって可溶化した。可溶化ＩＣＡＭ−１を含有する細胞溶解物をカラムマトリックス材料に非特異的に結合する物質を除去するように設計されたプレカラムに通し、次いでモノクローナル抗体カラムマトリックスに通してＩＣＡＭ−１を抗体に結合させた。抗体カラムをpHをpH１１．０まで上昇させた一連の洗浄剤洗浄バッファーで洗浄した。これらの洗浄中、ＩＣＡＭ−１は抗体マトリックスに結合したままであり、結合してないまた弱く結合している不純物は除去された。次いで、結合ＩＣＡＭ−１をpH１２．５の洗浄剤バッファーを適用することによってカラムから特異的に溶出させた。
モノクローナル抗体ＲＲ１／１の精製およびセファローズＣＬ−４Ｂへの共有結合
抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体ＲＲ１／１をハイブリドーマ含有マウスの腹水またはハイブリドーマ培養上清から標準の硫酸アンモニウム沈降法およびプロティンＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した〔Ey等、Immunochem. １５：４２９（１９７８）〕。精製IgGまたはラットIgG（シグマケミカル社、セントルイス、ＭＯ）をセファローズＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社、スウェーデン）にMarch等の方法〔Anal. Biochem.６０：１４９（１９７４）〕の修正法を用いて共有結合させた。要するに、セファローズＣＬ−４Ｂを蒸留水中で洗浄し、５ＭのK2HPO4（pH約１２）中の４０mg／mｌのＣＮＢｒで５分間活性化し、次いで０．１ｍＭ HCｌで４℃にて長く洗浄した。濾過し活性化したセファローズを等容量の精製抗体（０．１Ｍ NaHCO3、０．１Ｍ NaCｌ中２〜１０mg／mｌ）で再懸濁させた。懸濁液を４℃で１８時間ゆるやかな端から端までの回転によりインキュベートした。次いで、上清を未結合抗体について２８０nmの吸収によりモニターし、活性化セファローズの残りの反応部位をグリシンを０．０５Ｍに加えることによって飽和させた。結合効率は通常９０％以上であった。
ヒトひ臓から調製した膜の洗浄剤可溶化
すべての手順を４℃で行った。ヘアリー細胞発血病の患者からの凍結ヒトひ臓（２００ｇフラグメント）を氷上で１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、０．２Ｕ／mｌのアプロチニンおよび５ｍＭのイオドアセタミドを含有する２００mｌトリス−塩水（５０ｍＭのTris、０．１４ＭのNaCｌ、４℃でpH７．４）中に溶解させた。組織を小片に切断し４℃でテクマー強力ホモジナイザーで均質化した。容量をトリス−塩水で３００mｌとし、トリス−塩水中１０％トウィーン４０（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート）１００mｌを加え最終濃度２．５％トウィーン４０を得た。
膜を調製するため、均質化物を３ストロークのドンス（Dounce）またはより好ましくはテフロンポッターエルブジャムホモジナイザーを用いて抽出し、次いで１０００ｘｇで１５分間遠心した。上清を残し、ペレットをトリス−塩水中の２．５％トウィーン４０の２５０mｌで再抽出した。1000ｘｇで１５分間の遠心後、両抽出物からの上清を一緒にし１５０，０００ｘｇで１時間遠心して膜をペレット化した。膜を２００mｌのトリス−塩水中に再懸濁させることによって洗浄し、150,000ｘｇで１時間遠心した。膜ペレットを２００mｌのトリス−塩水中に再懸濁させ、モーター駆動ホモジナイザーおよびテフロンペストルで懸濁液が濃密になるまで均質化した。容量を次いでトリス−塩水で９００mｌまでにし、Ｎ−ラウロイルサルコシンを最終濃度１％になるよう加えた。４℃で３０分の攪拌後、洗浄剤溶解物中の不溶性物質を１５０，０００ｘｇ、１時間での遠心により除去した。トリトンＸ−１００を上清に最終濃度２％に加え、溶解物を４℃で１時間攪拌した。
ＪＹＢ−リンパ芽球細胞の洗浄剤可溶化
ＥＢＶ形質転換Ｂ−リンパ芽球細胞系ＪＹを１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有するＲＰＭＩ１６４０中で０．８〜１．０×１０6細胞／mｌの密度に増殖させた。ＩＣＡＭ−１の細胞表面発現を増大させるため、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）を細胞を収穫する前に２５ng／mｌで８〜１２時間で加えた。バナジン酸ナトリウム（５０μＭ）もこの時間中に培養物に加えた。細胞を５００ｘｇで１０分間遠心することによってペレット化しハンス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で再懸濁および遠心することによって２回洗浄した。細胞（５ｌの培養物当り約５ｇ）を５０mｌの溶解バッファー（０．１４Ｍ NaCｌ、５０ｍＭ Tris、pH８．０、１％トリトンＸ−１００、０．２μ／mｌアプロチニン、１ｍＭＰＭＳＦ、５０μＭのバナジン酸ナトリウム）中に４℃で３０分間攪拌することによって溶解させた。未溶解核および不溶性片を１０，０００ｘｇで１５分間の遠心、次いで１５０，０００ｘｇでの１時間の上清の遠心および上清のワットマン３mmフィルター紙による濾過により除去した。
構造検討のためのＩＣＡＭ−１のアフィニティークロマトグラフィー
構造検討に使用するＩＣＡＭ−１の大規模精製として、１０mｌのＲＲ１／１−セファローズＣＬ−４Ｂのカラム（２．５mgの抗体／ゲルのmｌで結合）、およびＣＮＢｒ−活性化、グリシン安定化セファローズＣＬ−４ＢおよびラットIgG結合セファローズＣＬ−４Ｂ（２mg／mｌ）の２種のプレカラムを用いた。各カラムを直列につなぎ、１０カラム容量の溶解バッファー、１０カラム容量のpH１２．５バッファー（５０ｍＭトリエチルアミン、０．１％トリトンＸ−１００、４℃でpH１２．５）で予備洗浄し次いで１０カラム容量の溶解バッファーで平衡させた。１ｌのヒトひ臓の洗浄剤溶解物を０．５〜１．０mｌ／分の流速で負荷させた。２つのプレカラムはＲＲ１／１−セファローズカラムに通す前の溶解物から非特異結合物質を除去するのに用いた。
負荷後、ＲＲ１／１−セファローズのカラムおよび結合ＩＣＡＭ−１を(1)溶解バッファー、(2)２０ｍＭ Tris pH８．０／０．１４Ｍ Nacｌ／０．１％トリトンＸ−１００、(3)２０ｍＭグリシンpH10.0/０．１％トリトンＸ−１００、および(4)５０ｍＭトリエチルアミンpH１１．０／０．１％トリトンＸ−１００の各々最低５カラム容量で１mｌ／分の流速で順次洗浄した。すべての洗浄バッファーは１ｍＭのＰＭＳＦと０．２μ／mｌのアプロチニンを含んでいた。洗浄後、残留結合ＩＣＡＭ−１を５カラム容量の溶出バッファー（５０ｍＭトリエチルアミン／０．１％トリトンＸ−１００／４℃でpH１２．５）により１mｌ／３分の流速で溶出させた。溶出ＩＣＡＭ−１を１mｌフラクションに集め直ちに０．１mｌの１Ｍトリス、pH６．７を加えて中和させた。ＩＣＡＭ−１を含有するフラクションを１０μｌのアリコートのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動〔Springer等、J. Exp. Med.１６０：１９０１（１９８４）〕により次いで銀染色〔Morrissey, J. H.,Anal. Biochem.１１７：３０７（１９８１）〕によって同定した。これらの条件下で、ＩＣＡＭ−１のバルクが約１カラム容量に溶出し、銀染色電気泳動から判断して９０％以上の純度であった（アフィニティーマトリックスから漏出した少量のIgGが主要不純物であった）。ＩＣＡＭ−１を含有するフラクションをプールしセントリコン−３０マイクロコンセントレーター（アミコン社、デンバース、ＭＡ）を用いて約２０倍に濃縮した。精製ＩＣＡＭ−１をプールのエタノール沈降アリコートのローリー（Lowry）たん白質アッセイにより定量した。約５００μｇの純ＩＣＡＭ−１を２００ｇのヒトひ臓から調製できた。
約２００μｇの精製ＩＣＡＭ−１を分離用SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により第２段階の精製に供した。ＩＣＡＭ−１を示すバンドはゲルを１Ｍ KCｌ中にソーキングすることによって可視化させた。ＩＣＡＭ−１を含むゲル領域を検査して“Hunkapiller等、Meth. Enzymol.９１：２２７−２３６（１９８３）”の方法によって電気溶出させた。精製たん白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色で判断したとき９８％以上の純度であった。
官能試験のためのＩＣＡＭ−１のアフィニティ精製
官能性試験用のＩＣＡＭ−１を前述したようなＪＹ細胞からの洗浄剤溶解物から精製したが、小スケール（１mｌのＲＲ１／１−セファローズカラム）で次の修正を加えて行った。すべての溶液は５０μＭバナジン酸ナトリウムを含んでいた。カラムを０．１％トリトンＸ−１００含有pH１１．０バッファーで洗浄後、カラムを０．１％トリトンＸ−１００に代えて１％のｎ−オクチル−ベーター−Ｄ−グルコピラノサイド（オクチルグルコシド）含有の同じバッファー５カラム容量で再洗浄した。オクチルグルコシド洗浄剤はＩＣＡＭ−１に結合したトリトンＸ−１００を除去し、トリトンＸ−１００と異なりその後透析により除去できる。次いで、ＩＣＡＭ−１を０．１％トリトンＸ−１００の代りに１％のオクチルグルコシドを含むpH１２．５バッファーで溶出させ、分析し、上述のようにして濃縮した。
実施例１５
精製ＩＣＡＭ−１の特性
ヒトひ臓から精製したＩＣＡＭ−１はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中でＭｒ７２，０００〜９１，０００の広いバンドとして浸透する。ＪＹ細胞から精製したＩＣＡＭ−１もＭｒ７６，５００〜９７，０００の広いバンドとして浸透する。これらＭｒは種々の細胞源から免疫沈降させたＩＣＡＭ−１の報告された範囲にある：ＪＹ細胞からのＭＲ＝９０，０００、骨ずい単球細胞系Ｕ９３７上の１１４，０００、および繊維芽球上の９７，０００〔Dustin等、J. Immunol. １３７：２４５（１９８６）〕。Ｍｒのこの広い範囲は広汎であるが変化し得る度合のグリコシル化に貢献する。非グリコシル化プレカーサーはＭｒ５５，０００を有する（Dustin等）。ＪＹ細胞またはヒトひ臓から精製したたん白質は、その元のアフィニティカラムへの再結合能力によりまたＲＲ１／１セファローズによる免疫沈降およびＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により明らかなように、その抗原活性を保持している。
ＩＣＡＭ−１のペプチドフラグメントを調製するためには、約２００μｇを２ｍＭジチオスレイトール／２％ＳＤＳで還元し、次いで５ｍＭの沃化酢酸でアルキル化した。たん白質をエタノールで沈降させ、０．１Ｍ NH4CO3／０．１mM CaCｌ2／０．１％双性イオン剤（Zwittergent）３−１４（カルビオケミ社）中に再溶解させ、１％ w/wトリプシンで３７℃、４時間消化し、次いで１％トリプシンで３７℃、１２時間の追加の消化を行った。トリプシンペプチドを逆相ＨＰＬＣにより０．４×１５cmＣ４カラム（Vydac社）を用いて精製した。ペプチドは０．１％トリフルオロ酢酸中で０％〜６０％アセトニトリルの直線勾配によって溶出した。選択したペプチドをガス相マイクロシーケネーター（アプライドバイオシステムズ社）での配列分析に供した。この試験から得られた配列情報を第５表に示す。
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実施例１６
ＩＣＡＭ−１遺伝子のクローニング
ＩＣＡＭ−１の遺伝子は任意の種々の手順を用いてクローニングできる。例えば、ＩＣＡＭ−１のトリプシンフラグメントのシーケンシング（第５表）から得られたアミノ酸配列情報を用いてＩＣＡＭ−１遺伝子に相当するオリゴヌクレオチド配列を同定し得る。また、ＩＣＡＭ−１遺伝子は抗ＩＣＡＭ−１抗体を用いてＩＣＡＭ−１を産生するクローンを検出することによってもクローニングできる。
オリゴヌクレオチドプローブを用いることによるＩＣＡＭ−１遺伝子のクローニング
遺伝子コード〔Waston, J. D., Molecular Biology of the Gene,第３版、W. A.ベンジャミン社、メロノパーク、ＣＡ（１９７７）〕を用いて、１種以上の異なるオリゴヌクレオチドを同定でき、その各々はＩＣＡＭ−１トリプシンペプチドをコードし得るものである。特定のオリゴヌクレオチドが実際に現実のＩＣＡＭ−１コード配列を構成する可能性は異常な塩基対関係および特定のコドンを現実に真核細胞に用いて（特定のアミノ酸をコードする）頻度を考慮することによって評価できる。そのような“コドン利用法則”は“Lathe, R.等、J. Melec. Biol. １８３：１〜１２（１９８５）”により開示されている。Latheの“コドン利用法則”を用いて、理論的に“最も可能性のある”ＩＣＡＭ−１トリプシンペプチド配列をコードし得るヌクレオチド配列（即ち、最低の不要物を有するヌクレオチド配列）を含有する単一オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットを同定する。
ＩＣＡＭ−１フラグメントをコードし得る理論的に“最も可能性のある”配列を含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットを用いて“最も可能性ある”配列または配列のセットにハイブリッド化し得る相補オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットの配列を同定する。そのような相補配列を含むオリゴヌクレオチドはＩＣＡＭ−１遺伝子を同定し単離するプローブとして使用できる〔Maniatis, T.等、Molecular Cloning A Laboratory Manual,コールド  スプリング  ハーバー  プレス社、コールド  スプリング、ＮＹ（１９８２）〕。
上記文献のセクションＣに記載されているように、ＩＣＡＭ−１遺伝子を含有する可能性ある真核ＤＮＡ調製物からＩＣＡＭ−１遺伝子をクローニングすることは可能である。ＩＣＡＭ−１たん白質をコードする遺伝子を同定しクローニングするためには、ＤＮＡライブラリーをその上記のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド化する能力についてスクリーニングする。正常な二倍体細胞中にはＩＣＡＭ−１の遺伝子のほんの２つのコピーしか存在しないようであるので、またICAM−１遺伝子はクローニングが望まれない大きな非転写介在配列（イントロン）を有し得る可能性があるので、好ましいのはゲノムＤＮＡよりはむしろＩＣＡＭ−１産生性細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーからＩＣＡＭ−１コード配列を単離することである。適当なＤＮＡまたはｃＤＮＡ調製物は酵素的に開裂させ、ランダムにせん断し、連結反応させて組換えベクターとする。次いで、これら組換えベクターの上述のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド化する能力を測定する。ハイブリッド化の手順は、例えば、“Maniatis, T., Molecular Cloning A Laboratory Manual,コールド  スプリング  ハーバー  プレス社、コールド  スプリング  ハーバー、ＮＹ（１９８２）”または“Haymes, B. T.等、Nucleic Acid Hybridization a Practical Approach,ＩＲＬプレス社、オックスフォード、英国（１９８５）”において開示されている。そのようなハイブリッド化ができることが判っているベクターを分析してベクターが含有するICAM−１配列の程度および性質を分析する。純粋に仮説的な考察によれば、ＩＣＡＭ−１分子をコードするような遺伝子はほんの１８ケのヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを用いて明確に同定できるであろう（ハイブリッド化スクリーニングにより）。
即ち、要約すれば、ＩＣＡＭ−１ペプチド配列の現実の同定により、そのようなペプチドをコードし得る理論的に“最も可能性ある”ＤＮＡ配列またはそのような配列のセットの同定ができる。この理論的配列に相補性のオリゴヌクレオチドを構築することにより（あるいは“最も可能性ある”オリゴヌクレオチドのセットに相補的なオリゴヌクレオチドのセットを構築することにより）、ＩＣＡＭ−１遺伝子を同定し単離するプローブとして機能し得るＤＮＡ分子（またはＤＮＡ分子のセット）が得られる。
第５表のＩＣＡＭ−１ペプチド配列を用いて、ＡＡおよびＪペプチドをコードし得るオリゴヌクレオチドの“最も可能性ある”配列の配列を決定した（それぞれ、第６表および第７表）。これら配列に相補性のオリゴヌクレオチドを合成し精製してＩＣＡＭ−１遺伝子配列を単離するプローブとした。適当なサイズ選定ｃＤＮＡライブラリーをＰＭＡ誘起ＨＬ−６０細胞からおよびｐｓ刺激へそ帯静脈内皮細胞からのポリ（Ａ）+ＲＮＡから調製した。サイズ選定ｃＤＮＡライブラリーは“Gubler, U.等〔Gene ２５：２６３−２６９（１９８３）〕およびCorbi, A.等〔ＥＭＢＯ  J.６：４０２３−４０２８（１９８７）〕の方法に従ってＰＭＡ誘起ＨＬ−６０細胞からのポリ（Ａ）+ＲＮＡを用いて調製した。これらの文献は参考として本明細書に引用する。
サイズ選定ｃＤＮＡライブラリーはＰＳ５μｇ/mｌで４時間刺激したへそ帯静脈内皮細胞からのポリ（Ａ）+を用いて調製した。ＲＮＡは上記細胞を４Ｍグアニジニウムイソシアネート中で均質化し上清をCsCｌ勾配により超遠心に供することによって抽出した〔Chirgwin, J. M.等、Biochem.１８：５２９４−５２９９（１９７９）〕。ポリ（Ａ）+ＲＮＡは全ＲＮＡスペイシスの混合物からオリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィー（タイプ３、コラボラティブ  リサーチ社）を用いて単離した〔Aviv, H.等、Proc. Natl. Acad. Sci.（ＵＳＡ）６９：１４０８−１４１２（１９７２）〕。
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第１のストランドｃＤＮＡを８μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡ、トリ骨ずい芽球症ウイルス逆転写酵素（ライフサイエンス社）およびオリゴ（ｄＴ）プライマーと用いて合成した。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドはラナーゼＨ（ＢＲＬ社）で消化、第２ストランドはＤＮＡポリメラーゼＩ（ニューイングランド  バイオラブス社）を用いて合成した。生成物をＥｃｏＲＩリンカー（ニューイングランド  バイオラブス社）でメチル化し、ＥｃｏＲＩリンカー（ニューイングランド  バイオラブス社）にブラントエンド連結反応させ、ＥｃｏＲＩで消化し低融点アガロースゲル上でサイズ選定した。５００ｂｐより大きいｃＤＮＡを前以てＥｃｏＲＩ消化させ脱リン酸化させているλｇｔ１０に連結反応させた（ストラタジーン）。連結反応生成物を次いでパッケージンクした（ストラタジーンゴールド）。
次に、へそ帯静脈内皮細胞およびＨＬ−６０ｃＤＮＡライブラリーを２０，０００ＰＦμ／150mmプレートに塗布した。組換えＤＮＡを複製中でニトロセルロースフィルターに移し、０．５Ｍ NaOH／１．５Ｍ NaCｌ中で変性し１Ｍトリス、pH７．５／１．５Ｍ NaCｌ中で中和し、８０℃で２時間ベーキングした〔Benton, W. D.等、Science １９６：１８０−１８２（１９７７）〕。フィルターをプレハイブリッド化し、５×Denhardt溶液、５０ｍＭ NaPO4および１μｇ／mｌのサケ精子ＤＮＡを含む５×ＳＳＣ中でハイブリッド化した。プレハイブリッド化は４５℃で１時間行なった。
ハイブリッド化は３２ｂｐ（′５−ＴＴＧＧＧＣＴＧＧＴＣＡＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＡＣ）または４７ｂｐ（５′−ＧＡＧＧＴＧＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣ）抗感覚オリゴヌクレオチドを上述の方法で、それぞれ、ＩＣＡＭ−１トリプシンペプチドＪおよびＡＡ（第６表および第７表）上で用いて行なった〔Lathe, R. J. Melec. Biol. １８３：１−１２（１９８５）〕。オリゴヌクレオチドはｒ−（32Ｐ）ＡＴＰでＴ4ポリヌクレオチドキナーゼおよび製造者（ニューイングランド  バイオラブス社）に推奨される条件を用いて末端標識した。オーバーナイトハイブリッド化に続いて、フィルター２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで３０分間、４５℃で２回洗浄した。ファージをハイブリッド化を示すプラーグから単離し、連続再塗布および再スクリーニングにより精製した。
抗ＩＣＡＭ−１抗体の使用によるＩＣＡＭ−１の遺伝子のクローニング
ＩＣＡＭ−１の遺伝子を別法として抗ＩＣＡＭ−１抗体の使用によりクローニングできる。DNAまたはより好ましくはｃＤＮＡをＩＣＡＭ−１を発現し得る細胞から抽出し精製する。精製cDNAをフラグメント化し（せん断化、エンドヌクレアーゼ消化等により）ＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントのプールを調製する。このプールからのＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントを発現ベクターにクローニングして各々のメンバーが特異的クローン化ＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントを含有する発現ベクターの遺伝子ライブラリーを調製する。
実施例１７
ｃＤＮＡクローンの分析
陽性クローンからのファージＤＮＡをEcoRIで消化し、１つのクローンからのｃＤＮＡをプローブとして用いてサウサーン分析により試験した。交差ハイブリッド化した最大サイズｃＤＮＡ挿入物をプラスミドベクターｐＧＥＭ４Ｚ（プロメガ社）のＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングした。両配向でｃＤＮＡを含むＨＬ−６０サブクローンをエンドヌクレアーゼIII消化〔Henikoff, s., Gene ２８：３５１−３５９（１９８４）〕により製造者の推奨（エラスーアーベース、ブロメガ社）に従って欠落させた。漸次的に欠落させたｃＤＮＡを次いでクローニングしてジデオキシヌクレオチド鎖終端シーケンシングに製造者の推奨（シーケナーゼ、Ｕ．Ｓ．バイオケミカル社）に従って供した〔Sanger, F.等、Proc. Natl. Acad. Sci（ＵＳＡ）７４：５４６３−５４６７（１９７７）〕。ＨＬ−６０ｃＤＮＡ５′およびコード領域を両ストランド上で完全にシーケンシングし、３′領域を両ストランド上で約７０％シーケンシングした。代表的な内皮ｃＤＮＡをその長さの殆どに亘って４ｂｐ認識制限酵素フラグメントのショトガンクローニングによりシーケンシングした。
１種のＨＬ−６０および１種の内皮細胞cDNAのｃＤＮＡ配列を確立した（第８図）、３０２３ｂｐ配列は短い５′未ほん訳領域と位置２９６６に共通ポリアデヒル化シグナルを有する１．３ｋｂ３′未ほん訳領域を含む。最長開放読み枠は位置５８の第１ＡＴＧで始まり位置１６５３のＴＧＡ終端トリプレットで終る。ほん訳アミノ酸配列と合計９１個のアミノ酸の８種の異なるトリプシンペプチドから決定した配列（第８図中でアンダーラインを施している）との間の同一性は信頼できるＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡクローンが単離されたことを確認した。ＩＣＡＭ−１トリプシンペプチドのアミノ酸配列を第８表に示す。
0003778922.tif 000011
疎水性分析〔Kyte, J.等、J. Melec. Biol. １５７：１０５−１３２（１９８２）〕は２７残基シグナル配列の存在を示唆している。＋１グルタミンの役目は３種のＩＣＡＭ−１たん白質調製物上にＮ−末端配列を本発明で得ることができないことと一致しており；グルタミンはフイログルタミン酸に環状化しブロックしたＮ−末端をもたらす。１〜４５３のほん訳配列は主として親水性であり２４残基の疎水性の推定トランスメンブランドメインが続く。トランスメンブランドメインはその後すぐに２７残基の推定細胞質ドメイン内に含まれた数個の荷電残基が続く。
成熟ポリペプチド鎖の予示サイズは５５，２１９ダルトンであり、脱グリコシル化ＩＣＡＭ−１の観察されたサイズ５５，０００と良好に一致している〔Dustin, M. L.等、J. Immunol. １３７：２４５−２５４（１９８６）〕。８個のＮ−結合グリコシル化部位が予示される。これらの部位の２つのトリプシンペプチド配列中のアスパラギンの不存在はそれらのグリコシル化とそれらの細胞外配向を確認している。高マンノースＮ−結合カルボハイドレート当り２，５００ダルトンを想定すると、７５，０００ダルトンのサイズがＩＣＡＭ−１プレカーサーについて予示され、観察されたサイズ７３，０００ダルトン〔Dustin, M. L.等、J. Immunol. １３７：２４５−２５４（１９８６）〕に匹敵する。高マンノースのコンプレックスカルボハイドレートへの転換後、成熟ＩＣＡＭ−１糖たん白質は細胞の種類により７６〜１１４Kdである〔Dustin, M. L.等、J. Immunol. １３７：２４５−２５４（１９８６）〕。即ち、ＩＣＡＭ−１は高度にグリコシル化されているが典型的な完全膜たん白質である。
実施例１８
ＩＣＡＭ−１は免疫グロブリン超遺伝子群のインテグリン結合性１員である：
ＩＣＡＭ−１内部繰返し配列をミクロジーニ（Microgenie）たん白質配列プログラム〔Queen, C.等、Nucl. Acid Res. １２：５８１−５９９（１９８４）〕を用い次いで検査することによって行なった。ＩＣＡＭ−１のＩｇＭ、Ｎ−ＣＡＭおよびＭＡＧへの配列をミクロジーニおよびＡＬＩＧＮプログラム〔Daypoff, M. O.等、Meth. Enzmol. ９１：５２４−５４５（１９８３）〕を用いて行なった。ナショナル  バイオメデカル  リサーチ  ファンデーション（National Biomedical Research Foundation）に保管されている４種のたん白質配列データベースをWilliamsとPearsonのＦＡＳＴＰプログラムを用いてたん白質配列の類似性について調査した〔Lipman, D. J.等、Science ２２７：１４３５−１４３９（１９８５）〕。
ＩＣＡＭ−１はインテグリンのリガンドであるので、免疫グロブリン超遺伝子群の１員であることは予期されなかった。しかしながら、ＩＣＡＭ−１配列の調査はその配列が免疫グロブリン超遺伝子群中の身内関係に提唱されたすべての規準を満たすことを示している。これらの基準を以下に説明する。
ＩＣＡＭ−１の全細胞外ドメインを第９Ａ図に配列して示した５つの相同性免疫グロブリン様ドメインから構築する。ドメイン１−４はそれぞれ８８、９７、９９および９９の残基長であり、かくして典型的なＩｇドメインサイズを有しており；ドメイン５は６８個の残基中で切り取られている。ＦＡＳＴＰプログラムを用いてのＮＢＲＦデータベースの調査はＩｇＭとＩｇＧ  Ｃドメインを包含する免疫グロブリン超遺伝子群の１員、Ｔ細胞レセプターαサブユニット可変ドメイン、およびアルファ１ベータ糖たん白質と有意の相同性を示していた（第９Ｂ−Ｄ図）。
上記の情報を用いて、ＩＣＡＭ−１のアミノ酸配列を免疫グロブリン超遺伝子群の他の１員のアミノ酸配列と比較した。
Ｉｇ超遺伝子群ドメインの３つのタイプであるＶ、Ｃ１およびＣ２は分化されている。ＶとＣの両ドメインは内部ドメインジスルフィド結合により一緒に結合している２β−シートから構築されており；Ｖドメインは９つの抗平行β−ストランドを有しＣドメインは７つ有している。定常ドメインを第９Ａ図に示した特徴的残基に基づいてＣ１およびＣ２−セットに分割した。Ｃ１−セットは抗原認識中に含まれるたん白質を含んでいる。Ｃ２−セットは数個のＦcレセプターとＣＤ２、ＬＦＡ−３、ＭＡＧおよびＮＣＡＭを包含する細胞粘着中に含まれるたん白質とを含んでいる。ＩＣＡＭ−１ドメインはこのセット中でＩＣＡＭ−１と置き変っているＣ２−セットのドメインと最も強い相同性を有することが判った；このことは第９図のβ−ストランドＢ−Ｆについて示されているようにＣ１ドメインよりもＣ２中の保持残基により強く類似している点にも反映されている。また、ＩＣＡＭ−１ドメインはＶおよびＣ１ドメイン中の上記ストランドとよりもＣ２ドメインのβストランドＡおよびＧとより一層良好に列んでおり、全Ｃ２ドメイン強度を横切って良好な配列を可能としている。ＮＣＡＭ、ＭＡＧおよびアルファ１−β糖たん白質からのＣ２ドメインとの配列は第９Ｂ図および第９Ｃ図に示されており；同一性は２８〜３３％の範囲であった。Ｔ細胞レセプターＶα２７％同一性およびＩｇＭ  Ｃドメイン３  ３４％同一性との配列も示されている（第９Ｂ、９Ｄ図）。
免疫グロブリンドメインの最も重要な特徴の１つはβシートサンドイッチを安定化するＢおよびＦβストランドを架橋するジスルフィド結合システィンであり；ＩＣＡＭ−１においてはシスティンはすべての場合に保持されているが、ドメイン４のストランドｆにおいては、上記サンドイッチに面しかついくつかの他のＶ−およびＣ２−セットドメインにおいて提案されたような接触を安定化しているロイシンが見い出される。システィン（４３、５０、５２および３７残基）間の距離はＣ２セットについて述べたとおりである。
ＩＣＡＭ−１中の鎖間ジスルフィド結合の存在について試験するために、内皮細胞ＩＣＡＭ−１を還元および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。内皮細胞ＩＣＡＭ−１はこれがＪＹまたは毛状ひ臓細胞ＩＣＡＭ−１よりも小さいグリコシル化異種原性を示しＭｒ中のシフトにより大きな感応性を示すことから使用した。従って、ICAM−１を１６時間ＬＰＳ（５μｇ／mｌ）刺激ヘソ帯静脈内皮細胞培養物から前述したようなイノムアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。アセトン沈降ＩＣＡＭ−１を０．２５％２−メルカプトエタノールまたは２５ｍＭイオドアセタミド含有のサンプルバッファー〔Laemmli, U. K., Nature ２２７：６８０−６８５（１９７０）〕中に再懸濁させ１００℃に５分間もたらした。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ４６７０および銀染色４６１３に供した。内皮細胞ＩＣＡＭ−１は還元条件下で１００ｋｄの見掛けのＭｒをまた非還元条件下で９６ｋｄを示し天然ＩＣＡＭ−１中の鎖間ジスルフィドの存在を強く示唆していた。
二次構造を予想するための一次配列の使用
〔Chon, P. Y.等、Biochem. 13：２１１−２４５（１９７４）〕は、第９Ａ図上方にａ−ｇと表示され、免疫グロブリンドメインについての予想を正確に満たしまた免疫グロブリン中のストランドＡ−Ｈの各位置（第９Ａ図下方）に相応する各ＩＣＡＭ−１ドメイン中の７つの予期されたβ−ストランドを示していた。ドメイン５はＡおよびＣストランドを欠損しているが、これらはシートの端部を形成しているので、各シートは依然として恐らくはストランドＤによって形成しておりいくつかの他のＣ２ドメインで提案されたようにストランドＣの代理をしており；またＢおよびＦストランド間の特徴的ジスルフィド結合は影響を受けないであろう。即ち、ドメインサイズ、配列相同性、推定ドメイン間ジスルフィド結合を形成する保持システィン、ジスルフィド結合の存在、および予想βシート構造の基準はすべて免疫グロブリン超遺伝子群中でのＩＣＡＭ−１の内在を満たしている。
ＩＣＡＭ−１はＣ２セットのＮＣＡＭおよびＭＡＧ糖たん白質と最も強く相同性であることが判明した。このことはＮＣＡＭとＭＡＧが共に細胞−細胞粘着を媒介するので特に興味深い。NCAMはニューロン−ニューロンおよび神経−筋相互作用において重要であり〔Cunningham, B. A.等、Science ２３６：７９９−８０６（１９８７）〕、またＭＡＧはミエリン化（myelination）中のニューロン−オリゴデントロサイトおよびオリゴデントロサイト−オリゴデントロサイト相互作用において重要である〔Poltorak, M.等、J. Cell. Biol. １０５；１８９３−１８９９（１９８７）〕。ＮＣＡＭとＭＡＧの細胞表面発現は神経系形成およびミリエン化中に、それぞれ、炎症におけるＩＣＡＭ−１の調整された誘起と類似して発展的に調整される〔Springer, T.A.等、Ann. Rev. Immunol. 5：２２３−２５２（１９８７）〕。ＩＣＡＭ−１、ＮＣＡＭ〔Cunningham, B. A.等、Science ２３６：７９９−８０６（１９８７）〕、およびＭＡＧ〔Salzer, J. L.等、J. Cell. Biol. １０４：９５７−９６５（１９８７）〕は全体構造において類似しまた相同性である、何故ならば、各々はＮ末端細胞外領域を形成する５つのＣ２ドメインから構成された完全膜糖たん白質であるからである。ただし、ＮＣＡＭにおいては、ある追加の非Ｉｇ様配列が最後のＣ２ドメインとトランスメンブランドメイン間に存在する。ICAM−１はトランスメンブランと細胞質ドメインを含むその全体長に亘ってＭＡＧと２１％の同一性を有して列んでおり；同一％の同一性がＩＣＡＭ−１とＮＣＡＭ−１の５つのドメインを比較したとき見出される。ＩＣＡＭ−１とＭＡＧの二次構造の図式的比較は第１０図に示している。ドメイン対ドメインの比較はＩＣＡＭ−１とＮＣＡＭ分子内のドメイン間の相同性のレベル（それぞれ、×±s.d.２１±２．８％および１８．６±３．８％）はＩＣＡＭ−１ドメインをＮＣＡＭおよびＭＡＧドメインと比較したときの相同性のレベル（それぞれ、２０．４±３．７および２１．９±２．７）と同じであることを示している。ＮＣＡＭ〔Cunningham, B. A.等、Science ２３６：７９９−８０６（１９８７）〕；Barthels, D.等、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：９０７−９１４（１９８７）〕およびＭＡＧ〔Lai, C.等、Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）８４：４３７７−４３４１（１９８７）〕のＣ−末端領域における別の接合の証拠は存在するけれども、これが内皮またはＨＬ−６０ＩＣＡＭ−１クローンのシーケンシングのおいてあるいは種々のタイプのＩＣＡＭ−１たん白質バックボーンおよびプレカーサーの研究〔Dustin, M. L.等、J. Immunol. １３７：２４５−２５４（１９８６）〕において見出されたという証拠はない。
ＩＣＡＭ−１は多くの種々の細胞種とのリンパ球相互作用におけるＬＦＡ−１用のリガンドとして機能する。リンパ球は人工膜２重層に含まれたＩＣＡＭ−１と結合し、これはリンパ球上にLFA−１を必要としＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１の相互作用を直接示唆している（Marlin, S. D.等、Cell ５１：８１３−８１９（１９８７）〕。
ＬＦＡ−１は白血球インテグリンであり免疫グロブリン様特徴を有しない。白血球インテグリンは１種のインテグリン亜族を含む。他の２つの亜族は細胞マトリックス相互作用を媒介し、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンおよびフィフリノーゲンを包含するそのリガンド内の配列ＲＧＤを認識する〔Hynes, R.O., Cell ４８：５４９−５５４（１９８７）〕；Ruoslahti, E.等、Science ２３８：４９１−４９７（１９８７）〕。白血球インテグリンは白血球上のみに発現し、細胞−細胞相互作用に含まれ、わずかに公知のリガンドはＩＣＡＭ−１とｉＣ３ｂ（即ち免疫グロブリン様特徴を示さない補体成分Ｃ３のフラグメント）であり、Ｍａｃ−１によって認識される〔Kishimoto, T. K.等、Leukocyte Typing III, ＭｃＭｉ Chael, M.編、スプリンガー  ベルラーグ、ニューヨーク（１９８７）；Springer, T.A.等, Ann. Rev. Immunol. 5：２２３−２５２（１９８７）；Anderson, D. C.等、Ann. Rev. Med. ３８：１７５−１９４（１９８７）〕。配列分析により、ＬＦＡ−１により認識されるICAM−１配列内の潜在的ペプチドは第９表に示す。
0003778922.tif 000012
ＩＣＡＭ−１はインテグリンに結合する免疫グロブリン超遺伝子群の１員の最初の例である。これらの群の両方は細胞粘着において重要な役割を発揮するけれども、両者間の相互作用は以前には予期されてなかった。これに対し、免疫グロブリン超遺伝子群内の相互作用は全く一般的である。インテグリンと免疫グロブリン群との間の相互作用のさらなる例が発見されるであろうことは全く可能である。ＬＦＡ−１はＩＣＡＭ−１とは異なるリガンドを認識し〔Springer, T.A.等、Ann. Rev. Immunol. ５：２２３−２５２（1987）〕、白血球インテグリンMac−１は好中球−好中球粘着のＣ３biと異なるリガンドを認識する〔Anderson, D.C.等、Ann. Rev. Med. ３８：１７５−１９４（１９８７）〕。さらにまた、精製したＭＡＧ含有ベシクル（小胞）はＭＡＧであるニューリット（neurites）に結合し、かくしてＭＡＧは異種レセプターと異好性相互作用可能でなければならない〔Poltorak, M.等、J. Cell. Biol. １０５：１８９３−１８９９（１９８７）〕。
神経−神経および神経−筋肉細胞相互作用におけるＮＣＡＭの役割は同種親和性ＮＣＡＭ−ＮＣＡＭ相互作用に基づくことは示唆されている〔Cunningham, B.A.等、Science ２３６：７９９−８０６（１９８７）〕。ミエリン鞘形成中に軸索を取り込むシュヴアン細胞の隣近回転ループ間の相互作用におけるＭＡＧの重要な役割は異種レセプターとの相互作用または同種親和性ＭＡＧ−ＭＡＧ相互作用に基づき得る。ＮＣＡＭとの相同性および免疫グロブリン超遺伝子群内でのドメイン−ドメイン相互作用の頻繁な出現はＩＣＡＭ−１が同種親和性相互作用並びにＩＣＡＭ−１−ＬＦＡ−１異好性相互作用に係わり得る可能性を引き起こす。しかしながら、同様な密度のＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−１を共発現するＢリンパ芽球細胞の人工または細胞単一層中のＩＣＡＭ−１への結合はＢ−リンパ芽球のＬＦＡ−１  ＭＡｂによる前処理によって完全に抑制され得るが、粘着はＩＣＡＭ−１  ＭＡｂによるＢ−リンパ芽球前処理によって影響されない。ＩＣＡＭ−１  Ｍａｂによる単一層の前処理は結合を完全に壊滅させている〔Dustin, M.L.等、J. Immunol. １３７：２４５−２５４（１９８６）；Marlin, S.D.等、Cell, ５１：８１３−８１９（１９８７）〕。これらの知見は、ＩＣＡＭ−１同種親和性相互作用が全く起った場合、その作用がＬＦＡ−１との異好性相互作用よりもかなり弱くなければならないことを示している。
白血球インテグリンが基本的に異なる方法でリガンドを認識する可能性はリガンド結合において重要でありＲＧＤ認識性インテグリン中には存在しないそれらのαサブユニット中の１８０残基配列の存在と一致する〔Corbi, A.等、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：４０２３−４０２８（１９８７）〕。Ｍａｃ−１はｉＣ３ｂ５０８６中に存在するＲＧＤ配列を認識することが提示されているけれども、ＩＣＡＭ−１中にはＲＧＤ配列はない（第８図）。これはフィブロネクチンペプチドＧＲＧＤＳＰとコントロールペプチドＧＲＧＥＳＰがＩＣＡＭ−１−ＬＦＡ−１粘着を抑制できないことと一致している〔Marlin, S.D.等、Cell. ５１：８１３−８１９（１９８７）〕。しかしながら、PRGGSおよびＲＧＥＫＥのような関連配列はＩＣＡＭ−１中に、それぞれ、ドメイン２のβ−ストランドａとｂおよびドメイン２のｃとｄ間のループに予示される領域において存在しており（第９図）、従って、認識について受け入れられ得る。興味あることは相同性ＭＡＧ分子がドメイン１と２の間にＲＧＤ配列を含むことである〔Poltorak, M.等、J. Cell. Biol. １０５：１８９３−１８９９（１９８７）；Salzer, J.L.等、J. Cell. Biol. １０４：９５７−９６５（１９８７）〕。
実施例１９
サウサーンおよびノウサーンブロット
サウサーンブロットを３種の細胞系から抽出した５μｇの遺伝子ＤＮＡを用いて行なった：ＢＬ２、バーキットリンパ腫細胞系（Dr. Gilbert Lenoirから供与）；ＪＹおよびＥｒ−ＬＣＬのＥＢＶ形質転換Ｂ−リンパ腫様細胞系。
各ＤＮＡを５×製造者が推奨する量のＢamＨ１とＥcoＲＩエンドヌクレアーゼ（ニューイングランド  バイオラブス社）で消化した。０．８％アガロースゲルによる電気泳動に続いて、ＤＮＡをナイロン膜（ゼータプローブ、バイオラド社）に移した。フィルターをプレハイブリッド化およびα−（32P）d ＸＴＰ’ｓで標識したＨＬ−６０からのＩＣＡＭ  ｃＤＮＡを用いての標準手法に従ってランダムプライミングによりハイブリッド化した。ノウサーンブロット２０μｇの全ＤＮＡまたは６μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡを用いて行なった。ＲＮＡは変性し１％アガローズ−ホルムアルデヒドゲルにより電気泳動し、ゼータプローブに電気移動させた。各フィルターをプレハイブリッド化し32Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブ（前述の）ＨＬ−６０ｃＤＮＡプローブを用いて前述したようにしてハイブリッド化した（Stauton, D.E.等、Embo J. ６：３６９５−３７０１（１９８７）〕。
３ｋｂ  ｃＤＮＡプローブおよびＢamＨ１とＥcoＲ１で消化した遺伝子ＤＮＡを用いたサウサーンブロットはそれぞれが単一遺伝子を示しまたコード化情報の殆どが８ｋｂ内に存在することを示す２０および８ｋｂの単一主要ハイブリッド化性フラグメントを示した。３種の細胞系のブロットにおいては、制限フラグメント多形性の証拠はなかった。
実施例２０
ＩＣＡＭ−１遺伝子の発現
“発現ベクター”は、（適当な転写性および／またはほん訳性コントロール配列の存在に基づき）ベクターにクローニングされるＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）を発現し得、それによってポリペプチドまたはたん白質を産生し得るベクターである。クローニングした配列の発現は発現ベクターを適当なホスト細胞に組み込んだときに起る。原核細胞発現ベクターを用いる場合は、適切なホスト細胞はクローニングした配列を発現し得る任意の原核細胞であろう。同様に、真核発現ベクターを用いる場合、適切なホスト細胞はクローニングした配列を発現し得る任意の真核細胞である。重要なことは、真核ＤＮＡは介在配列を含み得るので、またそのような配列は原核細胞中では正確に加工できないので、原核ゲノム発現ベクターライブラリーを産生するためには、ＩＣＡＭ−１を発現し得る細胞からのｃＤＮＡを用いることが好ましい。ｃＤＮＡを調製する方法およびゲノムライブラリーを産生する方法はManiatis, J.等により開示されている〔Molecular Cloning：A Laboratory Manual,コールド  スプリング  ハーバー  プレス社、コールド  スプリング  ハーバー、ＮＹ（１９８２）〕。
上述の発現ベクター遺伝子ライブラリーを用いてホスト細胞のバンクを作る（その各々はライブラリーの１員を含む）。発現ベクターはホスト細胞に任意の種々の手段（即ち、形質転換、トランスフェクション、原形質体融合、エレクトロポーレーション等）によって組み込み得る。発現ベクター含有細胞のバンクはクローン的に増殖させ、その各員は個々にアッセイして（イムノアッセイを用いて）これらが抗ＩＣＡＭ−１抗体に結合し得るたん白質を産生するかどうかを測定する。
抗ＩＣＡＭ−１抗体に結合し得るたん白質を産生する細胞の発現ベクターはさらに分析してこれらのベクターが全ＩＣＡＭ−１遺伝子を発現（または含有）するかどうか、ＩＣＡＭ−１遺伝子のフラグメントのみを発現（または含有）するかどうかあるいは生成物が免疫学的にＩＣＡＭ−１に関係したとしてもＩＣＡＭ−１ではない遺伝子を発現（または含有）するかどうかを決定する。そのような分析は任意の都合の良い方法で行なってよいけれども、好ましいのは発現ベクターにクローニングされるＤＮＡまたはｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定することである。そのようなヌクレオチド配列を検査してＩＣＡＭ−１のトリプシン消化フラグメント（第５表）と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得るかどうかを決定する。
ＩＣＡＭ−１遺伝子をコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子を含む発現ベクターは、かくして、（ｉ）抗ＩＣＡＭ−１抗体に結合し得るたん白質の発現を行なう能力；および（ii）ＩＣＡＭ−１のトリプシンフラグメントの各々をコードし得るヌクレオチド配列の存在によって認識し得る。そのような発現ベクターのクローニングＤＮＡ分子は発現ベクターから取り出して純粋な形で単離できる。
実施例２１
精製ＩＣＡＭ−１の機能活性
細胞中では、ＩＣＡＭ−１は細胞膜と会合した表面たん白質として通常は機能する。従って、精製ＩＣＡＭ−１の機能は分子を人工脂質膜（リポソームまたはベシクル）中にたん白質を洗浄剤可溶化脂質中に溶解し次いで洗浄剤を透析により除去することによって再構成させたのち試験した。ＪＹ細胞から精製し洗浄剤オクチルグリコシド中に上述のようにして溶出したＩＣＡＭ−１をベシクル中に再構成し、ＩＣＡＭ−１含有ベシクルをガラスカバースリップまたはプラスチック培養ウェルに融合させてたん白質に結合する細胞の検出をできるようにした。
平坦膜およびプラスチック結合ベシクルの調製
ベシクルはＧay等の方法により調製した〔J. Immunol, １３６：２０２６（１９８６）〕。即ち、たまごホスファチジルクロリンとコレステロールをクロロホルム中に溶解し７：２のモル比で混合した。脂質混合物をチッ素ガス流下に回転させながら薄膜に乾燥させ、次いで１時間で凍結乾燥させてすべての痕跡量のクロロホルムを除去した。脂質膜を１％オクチルグリコシド／０．１４Ｍ NaCｌ／２０ｍＭトリス（ｐＨ７．２）中にホスファチジルクロリン最終濃度０．１ｍＭに溶解した。約１０μｇの精製ＩＣＡＭ−１またはコントロール膜糖たん白質としてのヒトグリコホリン（シグマケミカル社、セントルイス、ＭＯ）を溶解脂質の各mｌに加えた。たん白質−脂質−洗浄剤溶液を２００容量の２０ｍＭトリス／０．１４Ｍ NaCｌ、ｐＨ７．２の３回交換およびＨＢＳＳの１回交換に対して４℃で透析した。
平坦膜はBrian等の方法により調製した〔Proc. Natl. Acad. Sci. ８１：６１５９（１９８４）〕。ガラスカバースリップ（直径１１mm）を１７×洗浄剤（Linbro）の１：６希釈液中で１５分間煮沸し、一夜蒸留水中で洗浄し、７０％エタノール中に浸し、風乾させた。ＩＣＡＭ−１またはクリコホリンのいずれかを含有するベシクル懸濁液の８０μｌ小滴を２４ウェルクルスタープレートのウェル底部に入れ、上記で調製したガラスカバースリップを静かに頂部に浮かした。室温での２０〜３０分のインキュベーション後、各ウェルをＨＢＳＳで満し、カバースリップをひっくり返して平坦面を上向きにした。次いでウェルをHBSSで十分洗浄して未結合ベシクルを除去した。平坦膜表面は全く空気にさらさなかった。
ガラス表面に融合させた平坦膜による実験途中で、ＩＣＡＭ−１を含むベシクルはマルチウェル組織培養プレートのプラスチック表面に直接結合し、特異的細胞結合により明らかなような機能活性を保持していることが判明した。そのようなベシクルは以後“プラスチック結合ベシクル（PBV）と称する。というのは、プラスチックに結合した脂質ベシクルの性質を測定するのではないからである。プラスチック結合ベシクルは３０μｌのベシクル懸濁液を直接９６ウェル組織培養トレイ（ファルコン社）中のウェル底部に加え次いで平坦膜について述べたようにしてインキュベーションおよび洗浄を行うことによって調製した。
細胞粘着アッセイ
平坦膜またはプラスチック結合ベシクルを用いた細胞粘着アッセイの両方を本質的に同じ方法で行ったが、ＰＢＶアッセイの細胞数および容量は平坦膜アッセイで用いたものの１／５に減じた。
正常コントロールおよびＬＦＡ−１を発現できない白血球粘着欠損（ＬＡＤ）患者〔Anderson, D.C.等、J. Infect. Dis. １５２：668（1985）〕からのＴリンパ球を、１μｇ／mｌのコンカナバリン−Ａ（Con-A）を含む末梢血単核細胞RPMI−１６４０＋２０％ＦＣＳ中で５×１０5細胞／mｌで３日間培養することによって調製した。次いで、細胞をＲＰＭＩで２回；５ｍＭメチル−アルファ−ｂ−マノフィラノシドで１回洗浄して残留レクチンを細胞表面から除去した。細胞を１ng／mｌの組換えＩＬ−２を含むＲＰＭＩ／２０％ＦＣＳ中で増殖させ、培養開始後１０および２２日の間で使用した。
平坦膜またはＲＢＶに結合する細胞を検出するため、Con A芽球、Ｔ−リンパ腫ＳＫＷ−３、ＥＢＶ形質転換Ｂ−リンパ腫様細胞系ＪＹ（LFA−１陽性）およびＬＦＡ−１欠損リンパ腫様細胞系（ＢＢＮ）〔患者１由来、Springer, T.A.等、J. Exper. Med. １６０：１９０１−１９１８（１９８６）〕を１mｌのＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＣＳ中の１×１０7細胞を１００μＣｉのNa51CrO4で３７℃、１時間インキュベートし、次いでＲＰＭＩ−１６４０で４回洗浄し未結合標識を除去することによって放射性標識させた。モノクローナル抗体ブロッキング試験においては、細胞またはプラスチック結合ベシクルはＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＣＳ中の２０μｇ／mｌの精製抗体で４℃にて３０分間前処理し、次いで４回洗浄して未結合抗体を除去した。細胞結合に関しての２価イオンの効果の実験においては、細胞をＣa2+、Ｍg2+を含まないＨＢＳＳ＋１０％透析ＦＣＳで１回洗浄し、CaCｌとMgCｌを決められた濃度に加えた。すべての実験において、細胞および平坦膜またはＰＢＶは適当な温度（４℃、２２℃または３７℃）で適当なアッセイバッファー中で予備平衡させた。
精製ＩＣＡＭ−１に結合する細胞を測定するために、51Ｃr標識細胞（平坦膜アッセイでの５×１０5ＥＢＶ形質転換体；ＰＢＶアッセイでの１×１０5ＥＢＶ形質転換体またはＳＫＷ−３細胞、２×１０5Ｃon−Ａ芽球）を平坦膜またはＰＢＶ上で２５Ｘgで２分間遠心し、次いで４℃、２２℃または３７℃で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、未結合細胞を適当な温度での予備平衡させたバッファーによる充填、吸引の８回のサイクルによって除去した。結合細胞はウェル内容物の0.1N NaOH／１％トリトンＸ−１００による可溶化およびガンマーカウンターでの計数によって定量した。％細胞結合は結合細胞からのcpmを入力細胞のcpmで割ることによって決定した。平坦膜アッセイにおいては、入力cpmはカバースリップの表面積を培養ウェルの表面積と比較した比に対して集めた。
これらのアッセイにおいて、ＥＢＶ形質転換Ｂ−リンパ腫細胞、ＳＫＷ−３Ｔ−リンパ腫細胞、およびＣon−A Ｔリンパ芽球は人工膜中のICAM−１に特異的に結合した（第１１図および第１２図）。結合は、細胞が等価の量の他のヒト細胞表面糖たん白質グリコホリンを含んだコントロールの平坦膜またはベシクルに極めて貧弱にしか結合しなかったことから特異的であった。さらにまた、ＬＦＡ−１陽性ＥＢＶ形質転換体およびＣon Ａ芽球も結合したが、それらのＬＦＡ−１陰性等価物は何ら有意の程度に結合せず、結合が細胞上のＬＦＡ−１の存在に依存していることを示した。
細胞結合の特異性および細胞ＬＦＡ−１への依存性の両方はモノクローナル抗体のブロッキング試験において確認した（第１３図）。ＪＹ細胞の結合はＩＣＡＭ−１含有ＰＢＶを抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体ＲＲ１／１前処理したとき９７％まで抑制できた。同じ抗体による細胞の前処理は殆んど効果がなかった。逆に、抗ＬＦＡ−モノクローナル抗体ＲＳ１／１８は９６％まで結合を抑制したがＰＢＶでなく細胞を前処理したときはわずかであった。ＬＦＡ−３と反応性のコントロール抗体ＴＳ２／９（異なるリンパ球表面抗原）は細胞またはＰＢＶのいずれを前処理したときも有意の抑制効果はなかった。この実験は人工膜の若干量の不純物のないＩＣＡＭ−１自体が観察された細胞粘着を媒介していることおよび粘着は結合性細胞上のＬＦＡ−１に依存していることを示している。
人工膜中のＩＣＡＭ−１への細胞の結合はまたＬＦＡ−１依存性粘着系の２つの他の特性：温度依存性と２価カチオンの必要性を示した。第１４図に示すように、Ｃon−Ａ芽球はＰＢＶ中のICAM−１に３７℃で最も効果的に、２２℃で部分的に、４℃で極めて貧弱に結合した。第１５図に示すように、結合は完全に２価カチオンの存在に依存している。生理学上の濃度においては、Ｍg2+は単独で最高の細胞結合を示したが、Ｃa2+の単独は極めて低レベルの結合を示した。しかしながら、Ｃ2+と組合せた通常濃度の１／１０のＭg2+は相乗効果を有し最高の結合を示した。
要約すれば、人工膜中に含有させた精製ICAM−１に対する細胞結合の特異性、モノクローナル抗体による特異的抑制、および温度および２価カチオンの必要性はＩＣＡＭ−１がＬＦＡ−１依存性の粘着系の特異的リガンドであることを示している。
実施例２２
アレルギーおよび毒性パッチ試験反応におけるＩＣＡＭ−１とＨＬＡ−ＤＲの発現
５人の正常人の皮ふ生検をそのＩＣＡＭ−１およびＨＬＡ−ＤＲ発現について行った。ある血管中の内皮細胞は通常ＩＣＡＭ−１を発現するけれども、正常皮ふからのケラチン細胞にはＩＣＡＭ−１は発現しないことが判った。正常皮ふ生検からの任意ケラチン細胞上のＨＬＡ−ＤＲの染色は観察されなかった。ＩＣＡＭ−１とクラスII抗原の発現動力学をアレルギー性および毒性皮ふ傷害の生検の細胞において検討した。検討した６人の対象者の半分がハプテンの適用後４時間でICAM−１を発現したケラチン細胞を有していることが判った（第１０表）。ハプテンへの露出時間によりケラチン細胞上にＩＣＡＭ−１を発現する人の割合が増大し、また４８時間までにケラチン細胞当りより多くのＩＣＡＭ−１発現を示す染色強度も増大した。事実、この時点で、すべての生検のケラチン細胞の部分がＩＣＡＭ−１に対して陽性に染色した。７２時間（ハプテン除去後２４時間）で、８人の対象者の７人がケラチン細胞にICAM−１を発現しており、１人の対象者のＩＣＡＭ−１発現は４８〜７２時間の間に弱くなった。
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組織学上、ハプテンの適用後４時間で採取した生検からのケラチン細胞上のＩＣＡＭ−１の染色像は通常小群生状であった。４８時間後、ICAM−１はケラチン細胞の大部分の表面上に発現し、傷害の中心および周辺間に差異はなかった。染色強度はケラチン細胞が爪角質層に近づいたとき減少した。これは傷害の中心および周辺から採られた生検において見い出された。また、この時間でも、パッチ試験は陽性であった（湿潤、紅斑、小胞）。異なるハプテンを感受性個々人に適用してもICAM−１発現における差異は見られなかった。ケラチン細胞以外にも、ＩＣＡＭ−１は傷害部位でいくつかの単核細胞および内皮細胞上にも発現した。
アレルギー皮ふ傷害のケラチン細胞上でのHLA−ＤＲの発現はＩＣＡＭ−１の発現よりも頻度は小さかった。検討した対象者のうち、ハプテン適用後２４時間までにＨＬＡ−ＤＲに陽性に染色したケラチン細胞による傷害を有するものはなかった。事実、わずかに４人の生検サンプルがＨＬＡ−ＤＲを発現したケラチン細胞を有するに過ぎず、ＨＬＡ−ＤＲに陽性でＩＣＡＭ−１に陽性でないケラチン細胞を有する生検はなかった（第１０表）。
アレルギーパッチ試験傷害と対照的に、はず油またはラウリル硫酸ナトリウムで誘発させた毒性パッチ試験傷害は試験のすべての時点でその表面にＩＣＡＭ−１を殆んど示さないケラチン細胞を有していた（第１１表）。実際に、パッチ適用後４８時間で、これはアレルギー性パッチ試験対象者における最適の時点であるが、１４人の毒性パッチ試験対象者のうちの１人が傷害中にＩＣＡＭ−１を発現するケラチン細胞を有していた。また、アレルギー性パッチ試験生検と対照的に、毒性パッチ試験傷害のケラチン細胞上にＨＬＡ−ＤＲは発現しなかった。
これらのデータはＩＣＡＭ−１が免疫系炎症中で発現し毒性系炎症では発現しないことを示しており、かくして、ＩＣＡＭ−１の発現は、疾患が免疫抑制治療剤の拒絶または尿毒性によるのかどうかの判断が難しい賢移植患者における急性腎疾患のような免疫系および毒性系炎症を区別するのに使用できる。腎生検およびＩＣＡＭ−１発現の向上の評価が免疫系拒絶と非免疫系毒性反応の区別を可能にするであろう。
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実施例２３
良性皮ふ病中のＩＣＡＭ−１とＨＬＡ−ＤＲの発現
種々のタイプの炎症性皮ふ病を有する患者からの傷害の皮ふ生検からの細胞をそのＩＣＡＭ−１とＨＬＡ−ＤＲの発現について検討した。アレルバー性接触湿疹、天疱瘡、および扁平苔癬の生検中のケラチン細胞の１部はＩＣＡＭ−１を発現した。扁平苔癬は４８時間アレルギー性パッチ試験生検で見られた結果と同等か幾分強い像により最も強く染色を示した（第１２表）。アレルギー性パッチ試験の結果と同様に、最も強いＩＣＡＭ−１染色は高単核細胞浸潤部位で見られた。さらにまた、試験した１１の扁平苔癬生検のうちの８つはケラチン細胞上でＨＬＡ−ＤＲ発現について陽性であった。
発疹とじんま疹を有する患者の皮ふ生検からのケラチン細胞上のＩＣＡＭ−１の発現は少なかった。これらの疾患を有する試験した７人の患者のうち４人のみが傷害部位でＩＣＡＭ−１を発現したケラチン細胞を有していた。ＨＬＡ−ＤＲ発現は１人の患者においてのみであり、これはICAM−１と関連していた。
試験した良性炎症皮ふ病のすべてからの内皮細胞および単核細胞浸潤の部分は変化度合でICAM−１を発現していた。
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実施例２４
乾癬皮ふ病のケラチン細胞上でのＩＣＡＭ−１発現
乾癬を有する５例の患者からの皮ふ生検中のＩＣＡＭ−１発現をＰＵＶＡ治療の開始前および治療途中で周期的に検討した。生検は組織学によって確認した古典的乾癬を有する５例の患者から得た。生検はＰＵＶＡ治療の前および指示された時間中に連続的に採取した。ＰＵＶＡは週に３〜４回投与した。生検は５例の患者の乾癬斑の周辺から採取し、生検以外に、これら患者の４人の臨床的に正常な皮ふからも採取した。
各新鮮皮ふ生検試料を凍結し、液体チッ素中に保存した。６ミクロンの保存切片を一夜室温で風乾し、アセトン中で１０分間固定し、直ちに染色しまたはアルミニウムホイルで包み染色するまで−８０℃で保存した。
染色は次の方法で作った。切片をモノクローナル抗体でインキュベートし、ジアミノベンジジンH2O2、基質を用いて３段階イムノパーオキシダーゼ法により染色した〔Stein, H.等、Adv. Cancer Res. ４２：６７−１４７、（１９８４）〕。へん桃腺およびリンパ節を抗ＩＣＡＭ−１およびＨＬＡ−ＤＲ染色用の陽性コントロールとして用いた。一次抗体の不存在下で染色した組織は陰性コントロールであった。
ＨＬＡ−ＤＲに対するモノクローナル抗体をBecton Dickinson社（カリホルニア州マウンテンビュー）から購入した。抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体はＲ６−５−Ｄ６であった。パーオキシダーゼ接合ウサギ抗マウスＩｇおよびパーオキシダーゼ接合ブタ抗ウサギＩｇはスウェーデン、コペンハーゲンのDAKAPATTSより購入した。ジアミノベンジジン−テトラヒドロクロリドはシグマ社（セントルイス）より得た。
試験の結果は数種の血管の内皮細胞が疾患および正常皮ふの両方でＩＣＡＭ−１を発現していることを示したが、染色強度およびＩＣＡＭ−１を発現する血管の数は乾癬皮ふ病変内で増大した。さらに、５例の患者からの未治療乾癬皮ふ病変のケラチン細胞中のＩＣＡＭ−１の発現像はわずかに小群の細胞染色から多数のケラチン細胞が染色されているまでに変化した。ＰＵＶＡ治療の途中では、２例の患者（患者２と３）のＩＣＡＭ−１発現は臨床的軽快に先行してあるいは同時に著しい低減を示した。患者１、４および５は、それぞれ、臨床的軽快あるいは悪化に相関してＰＵＶＡ治療中にＩＣＡＭ−１発現を減少あるいは増大させた。ＰＵＶＡ治療前後の正常皮ふからのケラチン細胞上ではＩＣＡＭ−１発現はなかった。このことはＰＵＶＡは正常皮ふからのケラチン細胞上にＩＣＡＭ−１を誘起しないことを示している。
注目すべきことは単核細胞浸潤密度はケラチン細胞上のＩＣＡＭ−１発現量と相関していることであった。このことはＩＣＡＭ−１発現も弱まったときＰＵＶＡ治療中の傷害中の単核細胞の数も減少することおよびケラセン細胞上のＩＣＡＭ−１発現がより顕著になったときＰＵＶＡ治療中の単核細胞の数が増大することの両方に関係している。内皮細胞および皮ふ単核細胞もまたＩＣＡＭ−１陽性である。臨床的に正常な皮ふにおいては、ＩＣＡＭ−１発現はケラチン細胞の標識化なしで内皮細胞に確認された。
ケラチン細胞上のＨＬＡ−ＤＲの発現は可変的であった。ＩＣＡＭ−１陽性でないＨＬＡ−ＤＲ陽性生検は存在しなかった。
要約すれば、これらの結果は、治療前では、ＩＣＡＭ−１発現はケラチン細胞上で高く、単核細胞浸潤密度と相関していることを示している。ＰＵＶＡ治療中は、ＩＣＡＭ−１染色の著しい減少が臨床的改善と平行して見られる。組織学的には、皮ふ浸潤は消失していた。臨床的悪化が治療中に見られる場合には、ケラチン細胞上のICAM−１の発現並びに皮ふ浸潤密度も増大した。臨床的軽快が治療中に見られたときは、ケラチン細胞上のＩＣＡＭ−１染色の同時の減少並びに皮ふ浸潤の減少があった。即ち、ケラチン細胞上のICAM−１の発現は皮ふの単核細胞浸潤密度に相応していた。これらのデータはＰＵＶＡ治療に対する臨床的応答は単核細胞のよりおだやかな下降と平行してケラチン細胞上のＩＣＡＭ−１発現の促進された減少をもたらすことを示している。このことはケラチン細胞上のＩＣＡＭ−１発現が皮ふ浸潤の開始および持続に応答性であること、およびＰＵＶＡ治療がＩＣＡＭ−１を下方調整し皮ふ浸潤および炎症応答を緩和していることを示している。データはまたＰＵＶＡ治療中のケラチン細胞上のＨＬＡ−ＤＲが発現が変化性であったことも示している。
乾癬傷害のケラセン細胞上のＩＣＡＭ−１発現は傷害臨床上の厳正さおよび皮ふ浸潤の大きさと相関している。即ち、ＩＣＡＭ−１は乾癬において中心的役割を発揮し、その発現の抑制および／またはその単核細胞上でのＣＤ１８コンプレックスとの相互作用の抑制は本病変の有効な治療となるであろう。さらにまた、ケラチン細胞上のICAM−１発現をモニターすることは乾癬の診断、予防、および治療経過を評価するための有効な手段となるであろう。
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実施例２５
悪性皮ふ病中のＩＣＡＭ−１とＨＬＡ−ＤＲの発現
良性皮ふ状態の病変とは異なり、悪性皮ふ傷害からのケラチン細胞上のＩＣＡＭ−１の発現は変化に富んでいた（第１４表）。試験した皮ふＴ−細胞リンパ腫２３例のうち、ＩＣＡＭ−１陽性ケラチン細胞は１４例のみにおいて同定された。菌状息肉腫病変の生検からのケラチン細胞では、病気の進行がより前の段階に進むにつれてそのICAM−１発現を消化する傾向にあった。しかしながら、ＩＣＡＭ−１発現は皮ふＴ細胞リンパ腫病変の殆んどからの変化割合の単核細胞浸潤上に見られた。試験した残りのリンパ腫のうちでは、８つのうち４つがＩＣＡＭ−１を発現したケラチン細胞を有していた。試験した悪性皮ふ病を有する２９人の患者のうち、５例はＩＣＡＭ−１を発現することなしにＨＬＡ−ＤＲを発現したケラチン細胞を有していた（第１４表）。
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実施例２６
ヒト末梢血単核細胞の増殖上の抗ＩＣＡＭ−１抗体の効果
ヒト末梢血単核細胞を抗原またはマイトジェンの存在および認識より誘起させ増殖させる。マイトジェン、コンカナバリンＡまたはＴ細胞結合性抗体ＯＫＴ3のようなある種の分子は末梢血単核細胞の非特異的増殖を引き起こす。
ヒト末梢血単核細胞はこれらが特異的抗原を認識し得る細胞の細個体群（subpopulation）からなる点で不均質である。特定の特異抗原を認識し得る末梢血単核細胞がその抗原に出会った場合、単核細胞の上記細個体群の増殖は誘起される。破傷風トキソイドおよびキーホールリンペットヘモシアニンは末梢単核細胞の細個体群により認識される抗原の例であるが感応化した個体中のすべての末梢単核細胞によって認識されるものではない。
細胞−細胞粘着を必要とすることが知られている系中でのヒト末梢血単核細胞の増殖的応答を抑制する抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体Ｒ６−５−Ｄ６の能力を試験した。
末梢血単核細胞をフィコール−ペーグ（Ficoll-Paqua、ファルマシア社）勾配で製造者が推奨するようにして精製した。界面を集めたのち、細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し平底９６ウェルマイクロタイタープレート中で１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよびジェンタマイシン（５０μg／mｌ）を加えたＲＰＭＩ１６４０培地中で１０6細胞／mｌの濃度で培養した。
抗原、Ｔ−細胞マイトジェン、コンカナバリンＡのいずれか（０．２５μｇ／mｌ）；Ｔ−細胞結合性抗体ＯＫＴ3（０．００１μｇ／mｌ）；キーホールリンペットヘモシアニン（１０ｇ／mｌ）または破傷風トキソイド（供給源からの１：１00希釈物）を上記のようにして培養した細胞中に抗ＩＣＡＭ−１抗体（Ｒ６−５−Ｄ６；最終濃度５ｇ／mｌ）の存在または不存在下に加えた。細胞はアッセイが終了する前の３．５日（コンカナバリンＡ試験）、２．５日（ＯＫＴ3試験）、または５．５日（キーホールリンペットヘモシアニンおよび破傷風トキソイド試験）で培養した。アッセイ終了前１８時間で、２．５μＣｉの3Ｈ−チミジンを培養物に加えた。細胞増殖を末梢血単核細胞によるＤＮＡへのチミジンの取り込みを測定することによってアッセイした。取り込まれたチミジンを集め液体シンチレーションカウンター中で計数した〔Merluzzi等、J. Immunol. １３９：１６６−１６８（１９８７）〕。これらの実験の結果は第１６図（コンカナバリンＡ試験）、第１７図（ＯＫＴ3試験）、第１８図（キーホールリンペットヘモシアニン試験）、および第１９図（破傷風トキソイド試験）に示す。
抗ＩＣＡＭ−１抗体は単核細胞中の非特異Ｔ−細胞マイトジェン、ＣonＡ；非特異的Ｔ−細胞会合抗原、ＯＫＴ−３；および特異抗原、キーホールリンペットヘモシアニンおよび破傷風トキソイドに対する増殖的応答を抑制することが判明した。抗ＩＣＡＭ−１抗体による抑制は抗ＬＦＡ−１抗体の抑制効果と匹敵し、ＩＣＡＭ−１はＬＦＡ−１の官能性リガンドであることおよびＩＣＡＭ−１のアンタゴニストは特異的防御系応答を抑制するであろうことを示唆している。
実施例２７
混合リンパ球反応についての抗ＩＣＡＭ−１の効果
前述したように、ＩＣＡＭ−１はＬＦＡ−１依存性細胞粘着より媒介された免疫応答中の有効な細胞相互作用のために必要である。免疫応答または炎症疾患中のＩＣＡＭ−１の誘起は白血球の相互または内皮細胞との相互作用を可能にする。
２例の無関係の個人からのリンパ球を各互いの存在下で培養したときは、芽球形質転換およびリンパ球の細胞増殖が観察される。１つの集団の白血球を第２集団の白血球の存在へのこの応答は混合リンパ球反応（ＭＬＲ）として公知であり、リンパ球のマイトジェンの添加に対する応答と同類である〔Immunology The Science of Self-Nonself Discrimination, Klein, J. John Wiley & Sons社、ＮＹ（１９８２）、ｐｐ４５３−４５８〕。
抗ＩＣＡＭモノクローナル抗体のヒトＭＬＲに対する効果について試験した。これらの実験は次のようにして行った。末梢血を正常な健康ドナーから静脈穿刺により採取した。血液をヘパリン化チューブに集め、室温でPunk's G（GIBCO社）平衡塩溶液（ＢＳＳ）で１：１に希釈した。血液混合物（２０mｌ）を１５mｌのFicoll/Hypaque密度勾配（ファルマシア社、密度１．０７８、室温）上に層化し、１０００Ｘgで２０分間遠心した。次いで界面を集め、Punk's G中で３回洗浄した。細胞をヘマシトメーター上で計数し、０．５％のジェンタマイシ、１mM Ｌ−グルタミン（GIBCO社）および５％加熱不活化（５６℃、３０分）ヒトＡＢ血清（フローラボラトリーズ社）とを含むRPMI−１６４０培地（GIBCO社）（以下、ＲＰＭＩ培地と呼ぶ）中に再懸濁させた。
マウス抗−ＩＣＡＭ−１（Ｒ６−５−Ｄ６）をこの実験で用いた。すべてのモノクローナル抗体（ジャックソンイムノリサーチラボラトリーズ社、ボストン、ＭＡにより腹水から調製された）を精製ＩｇＧ調製物として用いた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）はリンブロ（Linbro）丸底マイクロタイタープレート（＃７６−０１３−０６）中で６．２５×１０5細胞／mｌで培地中で培養した。別々のドナーからのスチミュレーター細胞を1000Ｒで照射し、レスポンダー細胞と同じ濃度で培養した。培養当りの総容量は０．２mｌであった。コントロールはレスポンダー細胞単独およびスチミュレーター細胞単独を含んでいた。培養プレートを３７℃で５％ＣＯ2−湿潤空気雰囲気中で５日間インキュベーとした。各ウェルを０．５μＣｉのトリチウム化チミジン（3ＨＴ）（ニューイングランドニュクレア社）で培養の最後の１８時間脈動させた。ある場合には、２経路（two-way）MLRを行った。そのプロトコールは第２ドナー細胞を照射により不活化しなかった以外は同じであった。
細胞をガラス繊維フィルター上に自動化マルチプルサンプルハーベスタ（Skatron社、ノルウェー）を用いて採取し、水およびメタノールですすいだ。フィルターをオーブン乾燥させ、アクアゾル中でベッグマン（ＬＳ−３８０１）液体シンチレーションカウンターで計数した。結果は６例の個々の培養物について平均ＣＰＭ±標準誤差として示している。
第１５表は精製抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体が２０ng／mｌで明らかな有意の抑制でもって投与量依存の形でＭＬＲを抑制していた。精製マウスＩｇＧは殆んどあるいは全く抑制効果を示さなかった。抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体によるＭＬＲの抑制は抗体を培養の最初の２４時間以内で加えたとき生じる（第１６表）
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要約すれば、ＩＣＡＭ−１に対する抗体のMLRを抑制する能力はＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体が急性移植拒絶に治療的利用性を有していることを示している。ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体はまたＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１調整細胞−細胞相互作用に依存する関連免疫媒介不整における治療的利用性を有している。
上記の実験はＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体の添加が反応の最初２４時間中に加えたときに混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を抑制することを示している。さらにまた、ＩＣＡＭ−１はインビトロ培養中のヒト末梢血単核細胞について状態向上なる。
さらにまた、ＩＣＡＭ−１は静止ヒト末梢血リンパ球または単核細胞上には発現しないことが見い出された。ＩＣＡＭ−１は単独培養細胞または混合リンパ球反応での無関係ドナー細胞との共培養細胞の単核細胞上で、通常のフローサイトメトリック分析を用いることにより状態向上される。単核細胞上でのこのＩＣＡＭ−１の状態向上は炎症の指示剤として、特に、ＩＣＡＭ−１が急性または慢性炎症を有するヒトの新鮮単核細胞上で発現する場合に使用できる。
活性化単核細胞に対するＩＣＡＭ−１の特異性およびＩＣＡＭ−１に対する抗体のＭＬＲを抑制する能力はＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体が急性移植拒絶および細胞−細胞相互作用を必要とする関連免疫媒介不整における診断上および治療上の潜在力を有し得ることを示している。
実施例２８
抗ＩＣＡＭ−１および抗ＬＦＡ−１抗体の混合投与の相乗効果
実施例２７で示したように、ＭＬＲは抗ICAM−１抗体によって抑制される。ＭＬＲはまた抗ＬＦＡ−１抗体によっても抑制できる。抗ICAM−１および抗ＬＦＡ−１抗体の組合せ投与が促進されたあるいは相乗的効果を有するかどうかを決定するために、ＭＬＲアッセイ（実施例２７に記載したようにして行った）を２つの抗体の種々の濃度の存在下で行った。
このＭＬＲアッセイは抗ＩＣＡＭ−１＋抗LFA−１の組合せが、抗体単独では劇的にＭＬＲを抑制しない濃度において、ＭＬＲ応答を抑制するのに著しい効力があることを示した（第１７表）。この結果は抗ＩＣＡＭ−１抗体（またはそのフラグメント）と抗ＬＦＡ−１抗体（またはそのフラグメント）を共投与することを含む治療が改善された抗炎症治療を与える能力を有することを示している。そのような改善された治療は治療上有効である他の方法よりもより低い抗体投与量の投与を可能にし、また高濃度の個々の抗体が抗イデオタイプ応答を誘起するような場合に重要性を示す。
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実施例２９
ＭＬＲにおける抗ＩＣＡＭ−１と他の免疫抑制剤との次善投与量での混合投与の付加的効果
実施例２８で示すように、ＭＬＲは抗ＩＣＡＭ−１抗体と抗ＬＦＡ−１抗体の組合せによって抑制される。抗ＩＣＡＭ−１と他の免疫抑制剤〔デキサメタソン、アゼチオピリン、シクロスポリンＡまたはステロイド（例えば、プレドニソン等の）のような〕との混合投与も改善された効果を有するかどうかを見るために、ＭＬＲアッセイを、実施例２７のプロトコールによるようにして、他の免疫抑制剤と組合せたＲ６−５−Ｄ６の次善濃度（即ち、薬剤を単独で対象物に対して投与する最適濃度よりも低いであろう濃度）を用いて行った。
データはＲ６−５−Ｄ６の抑制効果が次善投与量のデキサメタソン（第１８表）、アゼチオピリン（第１９表）およびシクロスポリンＡ（第２０表）の抑制効果を少なくとも付加されていることを示している。このことは抗ＩＣＡＭ−１が公知の免疫抑制剤の必要投与量の低減、即ち、その有毒副作用の低減において有効であり得ることを意味する。抗ＩＣＡＭ−１抗体（またはそのフラグメント）を用いてそのような免疫抑制を得るのに、この抗体（またはそのフラグメント）と単一の追加の免疫抑制剤または２種以上の追加の免疫抑制剤の組合せとの投与を行うことが可能である。
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実施例３０
移植した同種異系臓器の拒絶を抑制するのにおける抗ＩＣＡＭ−１抗体の効果
同種異系移植臓器の拒絶を抑制するのにおける抗ＩＣＡＭ−１抗体の効果を示すために、カニクイザルにCosimi等の方法〔Transplant. Proc. １３：４９９−５０３（１９８１）〕に従って同種異系の腎臓を移植した、ただし、麻酔薬としてバリウム（valium）とケタミンを用いる修正を加えた。
即ち、腎臓移植を本質的に次のようにして行った。異型腎アログラフトを３〜５kgのカニクイザルに、バリウムとケタミンによる麻酔の誘起後、本質的にMarquetにより開示されたようにして行った〔Marquet等、Medical Primatology, Part II、Basel, Karger, p. １２５（１９７２）〕。大動脈または大動脈のパッチ上のドナー腎臓の末端−側面アナストモーシス（anastpmoses）を７−０プロレン（Prolene）縫合線を用いて構築した。ドナー尿管をスパチュラ処理し外のう的方法によってブラッダー中に埋め込んだ〔Taguchi, Y.等、Dausset等編、Advances in Transplantation、バルチモア、ウィリアムス  アンド  ウィルキンス、ｐ３９３（１９６８）〕。腎機能を１週間毎にまたは２週間毎の血清クリアチニン測定によって評価した。さらに、頻ぱんなアログラフト生検を組織病理学検査用に採取し、完全解剖をすべての死んだ受容体で行った。殆んどの受容体において、両側性腎摘出を移植時に行い、その後の尿毒症死をアログラフト生存の終点とみなした。いくつかの受容体においては、片側の生腎摘出と対側尿管ライゲーションを移植時点で行った。アログラフト拒絶が生じたとき、同原尿管上のライゲーチュアを除去し、正常腎機能の再生と受容動物の免疫学的モニターを続ける機会を得た。
モノクローナル抗体Ｒ６−５−Ｄ６を１２日間毎日投与したが、移出前２日から１〜２mg／kg／日の投与量で開始した。クレアチニンの血清量を周期的に試験して拒絶をモニターした。同種異系腎の免疫系拒絶に対する抗ＩＣＡＭ−１抗体の効果は第２１表に示す。
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上記の結果はＲ６−５−Ｄ６が同種異系移植を受け入れたサルの寿命延長に有効であることを示している。
実施例３１
移植臓器の急性拒絶を抑制するのにおける抗ＩＣＡＭ−１抗体の効果
抗ＩＣＡＭ−１抗体が移植拒絶の急性モデルにおいて有効であることを示すために、Ｒ６−５−Ｄ６を治療中のまたは急性腎拒絶モデルにおいても試験した。このモデルにおいて、サル腎臓を移植し（実施例３０のプロトコールを用いて）、15mg／kgのシクロスポリンＡ（ＣｙＡ）を筋注で組織周辺的に安定な腎機能が得られるまで投与した。次に、ＣｙＡ投与量を血液クレアチニン値の上昇で示されるような拒絶が生じるまで２．５mg／kg増分量で２週間毎に低減した。この時点で、Ｒ６−５−Ｄ６は１０日投与し、生存時間をモニターした。重要なことは、このプロトコールにおいては、ＣｙＡの投与量が急性拒絶状態が生ずると同時に変化しないので次善のまゝであるということに留意することである。このモデルにおいては、抗体援助を有しない組織学的対照（Ｎ＝５）は拒絶状態の開始から５〜１４日間生存する。これまで、６匹の動物をこのプロトコールにおいてＲ６−５−Ｄ６を用いて試験した（第２２表）。これら動物の２匹はまだ生存している（Ｒ６−５−Ｄ６の投与後にＭ１２：３１日間、およびＭ５：４７日間）。２匹の動物はＲ６−５−Ｄ６治療開始後３８日および５５日間生き、２匹の動物は急性拒絶以外の原因で死亡した（一匹はＣｙＡ毒性で死亡し、一匹は麻酔下でＲ６−５−Ｄ６を投与している間に死亡した）。このモデルはＲ６−５−Ｄ６を最初から用いた臨床状態とより密接に近似している。
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実施例３２
ＩＣＡＭ−１の末端切取り誘導体の遺伝子構築および発現
天然状態において、ＩＣＡＭ−１は５つの免疫グロブリン様ドメインの細胞外領域トランスメンブランドメインおよび細胞質ドメインを含有する細胞膜結合たん白質である。望ましいのはICAM−１から分泌した可溶物を発現できる点でトランスメンブランドメインおよび／または細胞質ドメインを欠落するＩＣＡＭ−１の官能性誘導体を構築することであった。これらの官能性誘導体はＩＣＡＭ−１遺伝子のオリゴヌクレオチド関連変異誘発およびその後の変異遺伝子による投入後のサル細胞中での発現により構築した。
アミノ酸置換および／または末端切取り（Truncated）誘導体を与えるＩＣＡＭ−１遺伝子の突然変異はKunkel, T.の方法により発生させた〔Proc. Natl. Acad. Sci.（U.S.A.）８２：４８８−４９２（１９８５）〕。上記のようにして調製したＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡを制限エンドヌクリアーゼＳal１およびKpm１で消化し、得られた１．８kb ＤＮＡフラグメントをプラスミドベクターＣＤＭ８にサブクローン化した〔Seed, B.等、Proc. Natl. Acad. Sci.（U.S.A.）８４：3365−３３６９（１９８７）〕。次に、E. Coli（ＢＷ３１３／Ｐ３）のdut-、ung-株をｐＣＤ１．８Ｃと表示する上記構築物で形質転換した。単一ストランドウラシル含有鋳型を形質転換体からヘルパーファージＲ４０８（ストレータジーンＲ）で感染させることによって救援（rescue）した。次いで、変異体ＩＣＡＭ−１ cＤＮＡを不整合ベースを有するオリゴヌクレオチドとの第２ストランド合成および引き続くung+宿主（ＭＣ1061／Ｐ３）の得られたヘテロ二本鎖体による形質転換を開始することによって産生させた。変異体を上記変異オリゴヌクレオチドを導入した新たに創生したエンドヌクレアーゼ制限サイトについてスクリーニングすることによって単離した。変異体ＩＣＡＭ−１たん白質は標準ＤＥＡＥ−デキストラン法〔Selden, R.F.等、Current Protocols in Molecular Biology（Ausebel, F.M.等編集）、９．２．１−９．２．６（１９８７）〕を用いて真核発現ベクターＣＤＭ８中で上記変異体ＤＮＡによるＣos−７細胞の移入によって発現させた。
トランスメンブランドメインおよび細胞質ドメインを欠落するが５つの免疫グロブリン様ドメインのすべてを含有するＩＣＡＭ−１の末端切取り官能性誘導体を調製した。３０bp変異体オリゴヌクレオチド（CTC TCC CCC CGG TTC TAG ATT GTC ATC ATC）を用いて位置４５２および４５３のアミノ酸チロシン（Ｙ）およびグルタミン酸（Ｅ）のコドンを、それぞれ、フェニルアラニン（Ｆ）およびほん訳停止コドン（ＴＡＧ）に形質転換した。変異体はその特異的Ｘba１制限サイトにより単離し、Ｙ452Ｅ／Ｆ、ＴＡＧと表示した。
変異体たん白質を発現させるために、ＣＯＳ細胞に３種の変異体サブクローン（♯２、♯７および♯８）を移入した。これら３種の変異体サブクローンによる移入の３日後、培養上清および細胞溶解物を抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体ＲＲ１／１による免疫沈降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＩＣＡＭ−１は変異体サブクローン♯２および♯８を移入した細胞の培養上清からは沈降したがこれら細胞の清浄剤溶解物からは沈降しなかった。培養上清中に見い出されるICAM−１の分子量はＩＣＡＭ−１の膜体に比し約６kd低下していたが、これは変異体ＤＮＡから予想した大きさに一致する。即ち、このＩＣＡＭ−１の官能性誘導体は可溶性たん白質として分泌している。これに対し、ＩＣＡＭ−１は対照の天然ICAM−１を移入した細胞の培養上清からは免疫沈降せず、ＩＣＡＭ−１の膜体はＣＯＳ細胞からは発現しなかったことを示していた。さらにまた、ICAM−１は陰性対照の偽移入細胞からの培養上清または細胞溶解物からは免疫沈降してこなかった。
移入細胞から分泌した末端切取りＩＣＡＭ−１をＩＣＡＭ−１特異性抗体（Ｒ６−５−Ｄ６）によるイムノアフィニティクロマトグラフによって精製し、細胞結合アッセイでの官能活性について試験した。清浄剤オクチルグルコサイドの存在下での精製後、天然ＩＣＡＭ−１または末端切取り型分泌体を含有する調製物を０．２５％オクチルグルコサイドの最終濃度に希釈した（清浄剤の臨界ミセル濃度以下の濃度）。ＩＣＡＭ−１のこれら調製物をプラスチック９６−ウェルプレート（Nunc社）の表面に結合させて固相に結合したＩＣＡＭ−１を調製した。未結合物を洗い出したのち、表面上にＬＦＡ−１を含有するＳＫＷ−３細胞の約７５〜８０％および約８３〜８５％が、それぞれ、ＩＣＡＭ−１の天然体および末端切取り体に特異的に結合した。これらのデータは分泌型の末端切取り可溶性ＩＣＡＭ−１官能性誘導体が免疫学的反応性および天然ＩＣＡＭ−１の特徴であるICAM−１依存性粘着を仲介する能力の両方を保持していることを示している。
細胞質ドメインのみを欠落するＩＣＡＭ−１の官能性誘導体を同様な方法で調製した。２５bpオリゴヌクレオチド（TC AGC ACG TAC CTC TAG AAC CGC CA）を用いてアミノ酸４７６（Ｙ）のコドンをＴＡＧほん訳停止コドンに変えた。この変異体はＹ476／ＴＡＧと表示した。この変異体を移入したＣos細胞の免疫沈降分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥは陰性ＩＣＡＭ−１よりも約３kd小さい分子量を有するＩＣＡＭ−１の膜結合体を検出した。上記変異体移入Ｃos細胞の間接免疫螢光分析はＬＰＳ刺激ヒト内皮細胞上に発現した天然ＩＣＡＭ−１と同様な点状染色像を示した。また、上記変異体ＤＮＡを移入した細胞は天然ＩＣＡＭ−１ＤＮＡを移入したＣos細胞と同じような形でプラスチック表面上の精製ＬＦＡ−１に特異的に結果した（第２３表）。
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実施例３３
ＩＣＡＭ−１官能性ドメインのマッピング
ＩＣＡＭ−１の研究はその分子が７とのドメインを有することを見い出した。これらドメインのうちの５つは細胞外であり（ドメイン５は細胞表面に最も近く、ドメイン１は細胞表面から最も遠い）、１つのドメインはトランスメンブランドメインであり、１つのドメインは細胞質である（即ち、細胞内に存在する）。どのドメインがICAM−１のＬＦＡ−１に結合する能力に貢献するかをみるために、エピトープマッピング（地図作製）試験を用いた。そのような試験を行うためには異なる欠落変異体を作製し、そのＬＦＡ−１を結合する能力について特徴決定した。別に、ＩＣＡＭ−１のＬＦＡ−１に結合する能力を干渉することが知られている抗ＩＣＡＭ抗体を用いた試験を行った。かかる抗体の適当な例にはＲＲ１／１〔Rothlein, R.等、J. Immunol. １３７：1270−１２７４（１９８６）〕、Ｒ６．５（Springer, T.A.等、米国特許出願第０７／２５０，４４６号）、ＬＢ−２〔Clark, E.A.等、Leukocyte Typing I（A. Bernard等編集）、Springer-Verlag、３３９−３４６（１９８４）〕、またはＣＬ203〔Staunton, D.E.等、Cell. ５６：８４９−８５３（１９８９）〕がある。
ＩＣＡＭ−１の欠落変異体は種々の任意の方法によって調製できる。しかしながら、そのような変異体は部位特異的変異誘発によりまたは他の組換え手段（特定のたん白質領域をコードする配列を欠落させたＩＣＡＭ−１発現性遺伝子配列を構築することによるような）により産生させるのが好ましい。そのような変異体を産生するのに適する手順は当該技術において周知である。そのような手順を用いて、３つのＩＣＡＭ−１欠落変異体を調製した。第１の変異体はアミノ酸残基F185〜Ｐ２８４を欠落する（即ち、ドメイン３の欠落）。第２の変異体はアミノ酸残基Ｐ２８４〜Ｒ４５１を欠落する（即ち、ドメイン４および５の欠落）。第３の変異体はＹ４７６より後のアミノ酸残基を欠落する（即ち、細胞質ドメインの欠落）。そのような試験の結果はドメイン１、２および３が抗ＩＣＡＭ−１抗体およびＬＦＡ−１とのＩＣＡＭ−１相互作用中に主として含まれていることを示す。
実施例３４
ＬＦＡ−１結合に対してのＩＣＡＭ−１変異の効果
ＩＣＡＭ−１がＬＦＡ−１に反応し結合する能力はＩＣＡＭ−１分子のドメイン１中に存在するＩＣＡＭ−１アミノ酸残基によって仲介される（第８、９および１０図）。しかしながら、そのような反応はＩＣＡＭ−１のドメイン２および３中に存在するアミノ酸の貢献によって促進される。即ち、本発明の好ましい官能性誘導体の内には、ＩＣＡＭ−１のドメイン１、２および３を含有するＩＣＡＭ−１分子の可溶性はフラグメントが存在する。より好ましいのはＩＣＡＭ−１のドメイン１および２を含有するＩＣＡＭ−１分子の可溶性フラグメントである。最も好ましいのはICAM−１のドメイン１を含有するＩＣＡＭ−１の可溶性フラグメントである。第１ＩＣＡＭ−１ドメイン内の幾つかのアミノ酸残基はＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１の反応中に含まれている。これらアミノ酸の他のアミノ酸による置換はＩＣＡＭ−１のＬＦＡ−１に結合する能力を変化させる。これらのアミノ酸残基およびその置換体を第２５図に示す。第２５図は得られた変異体ＩＣＡＭ−１分子のＬＦＡ−１に結合する能力についてのそのような変異の効果を示す。第２３〜２５図においては、各残基はアミノ酸の１文字コードについて記載し、次いでＩＣＡＭ−１分子中のその残基の位置を示している。即ち、例えば“Ｅ９０”はＩＣＡＭ−１の位置９０でのグルタミン酸残基を称す。同様に、“Ｅ９０Ｖ”は位置９０のグルタミン酸残基と位置９１のバリン残基とからなるジペプチドを示す。置換配列はスラッシュ（“／”）マークの右に示されている。ＩＣＡＭ−１のＶ４、Ｒ１３、Ｑ２７、Ｑ５８およびＤ６０Ｓ６１残基はＬＦＡ−１結合中に含まれる。
これらアミノ酸の置換はＩＣＡＭ−１のＬＦＡ−１への結合能力を変化させる。例えば、Ｖ４のＧによる置換はＬＦＡ−１により少なくしか結合しない変異体ＩＣＡＭ−１分子の形成をもたらす（第２５図）。ＩＣＡＭ−１のＲ１３残基のＥによる置換は実質的に小さいＬＦＡ−１への結合能力を有する変異体分子の形成を与える（第２５図）。ＩＣＡＭ−１のＱ５８残基のＨによる置換は実質的に通常のＬＦＡ−１への結合能力を有する変異体分子を与える（第２５図）。ＩＣＡＭ−１のＤ６０Ｓ残基のＫＬによる置換は実質的に小さいＬＦＡ−１への結合能力を有する変異体分子を与える（第２５図）。
第２ドメイン中のグリコシル化部位もまたLFA−１結合中に含まれる（第２３図）。Ｎ１０３のＫによるまたはＡ１５５ＮのＳＶによる置換はＬＦＡ−１を実質的に結合し得ない変異体ICAM−１分子の形成をもたらす。対照的に、グリコシル化部位Ｎ１７５のＡによる置換はその変異体ＩＣＡＭ−１のＬＦＡ−１結合能に実質的に影響しないようであった。
第３ＩＣＡＭ−１ドメインの変異はＩＣＡＭ−１−ＬＦＡ−１結合性を認知し得る程変化させないようであった（第２４図）。
実施例３５
増大した生物学的半減アフィニティとクリアランス能力を有するＩＣＡＭ−１の多量体形
ＩＣＡＭ−１のドメイン１と２をその免疫グロブリン長鎖のヒンジ領域に結合させたキノラ分子を構築する。好ましい構築物はＩＣＡＭ−１ドメイン２のＣ末端をヒンジ領域対しての丁度Ｎ−末端の免疫グロブリン長鎖のセグメントに結合させて、ヒンジ領域により付与されたセグメントフレキシビリティを可能にする。ＩＣＡＭ−１ドメイン１と２はかくして抗体のＦabフラグメントを置換するであろう。ＩｇＧ類の長鎖への結合および動物細胞の生成はキメラ分子の産生をもたらすであろう。ＩｇＡまたはＩｇＭに由来する長鎖を含有する分子の生成は２〜１２個のＩＣＡＭ−１分子を含有するより高多量体の分子の産生をもたらすであろう。ＩＣＡＭ−１長鎖キメラ分子を産生する動物細胞中での丁鎖遺伝子の共発現は４〜６ケのＩＣＡＭ−１分子を含有するＩｇＡ分子と約１０ケのＩＣＡＭ−１分子を含有するＩｇＭのケースとを主として与えるＩｇＡとＩｇＭ多量体の適当な集合体を与えるであろう。これらのキメラ分子は幾つかの利点を有する。第１は、Ｉｇ分子を循環系中で長く滞在するよう設計し、これにより生物学的半減期を改善できる。
さらにまた、これら加工分子の多量体性は、治療情状のいかんによって、これら分子がより高い結合活性によってライノウイルス並びに細胞表面ＬＦＡ−１と反応できるようにし、かくして有効投与量を与えるべき投与に必要な組換えたん白質の量を大いに低減させる。ＩｇＡおよびＩｇＭは鼻におけるような粘膜部位の分泌物中に通常存在する高グリコシル化分子である。その高親水性は粘膜中で結合する微生物およびウイルスを保持するのを助長して細胞への結合を防止しまた上皮細胞膜バリヤーの交差を防止する。即ち、これらの分子は増大した治療効力を有する。ＩｇＭと特にＩｇＡとは粘膜環境で安定でありＩＣＡＭ−１構築物の安定性を増大させる。そのようなＩＣＡＭ−１官能性誘導体を血液流中に投与する場合、この誘導体も生物学的半減期を増大する。ＩｇＡは補体を固定せず、従って、それが有害である用途において理想的であろう。ＩｇＧのＨ鎖キメラを望む場合には、補体への結合並びにＦｃレセプターとの反応中に含まれる領域を変異させることが可能であろう。
実施例３６
ＩＣＡＭ−１変異体の発現
オリゴヌクレオチド特異性変異誘発
１．８kb Ｓal１−Ｋpm１フラグメント中のICAM−１ cＤＮＡのコード領域を発現ベクターCDMB中にサブクローニングした〔Seed, B.等、Proc. Natl. Acad. Sci.（U.S.A.）８４：３３６５〜３３６９（１９８７）〕。Kunkel, T.の方法〔Proc. Natl. Acad. Sci.（U.S.A.）８２：488−４９２（１９８５）〕およびStaunton D.等の変法（Staunton D.E.等、Cell ５２：９２５−９３３（１９８８）〕に従って、この構築物（pＣＤ１．８）を用いてオリゴヌクレオチド特異性変異誘発で使用する単一ストランドウラシル含有鋳型を調製した。
要するに、E. Coli株ＸＳ１２７をpＣＤ１．８で形質転換した。単一コロニーを１３μｇ／mｌのアンピシリンと８μｇ／mｌのテトラサイクリンを含有する１mｌのルリア  ブロス（ＬＢ）培地（Difco社）中で近飽和まで増殖させた。100μｌの培養物をＲ４０８ヘルパーファージ（Strategene社）で１０の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させ、アンピシリンとテトラサイクリンを含む１０mｌのＬＢ培地を３７℃で１６時間培養で加えた。１０，０００rpmで１分間の遠心および上清の０．２２μm濾過の後、ファージ懸濁液をE. Coli ＢＷ３１３／Ｐ３を感染し、次いで、これをアンピシリンおよびテトラサイクリンを加えたＬＢ寒天（Difco社）プレート上に塗布した。コロニーを採取し、アンピシリンとテトラサイクリンを含む１mｌのＬＢ培地中で近飽和に増殖させ、ヘルパーファージでＭＯＩ１０で感染させた。次いで、培養容量を２５０mｌに増大させ、細胞を一夜培養した。単一ストランドＤＮＡを標準のファージ抽出により単離した。
変異体オリゴヌクレオチドをリン酸化し、第２ストランド合成反応にpＣＤ１．８鋳型と共に用いた〔Staunton D.E.等、Cell ５２：９２５−９３３（１９８８）〕。
移  入
ＣＯＳ細胞を１６〜２４時間で５０％の集密性となるように１０cmの組織培養プレート中にシード付けした。次いで、ＣＯＳ細胞をＴＢＳで１度洗浄し、１０％のＮu血清（Collaborative社）、５μｇ／mｌのクロロキーネ（chloroquine）、３μｇの変異プラスミドおよび２００μｇ／mｌのＤＥＡＥ−デキストラン  サルフェートを含有する４mｌのＲＰＭＩで４時間培養した。細胞をその後１０％のＤＭＳＯ／ＰＢＳ次いでＰＢＳで洗浄し、培養培地中で１６時間培養した。培養培地を新鮮培地で入れ替え、４８時間で、後移入ＣＯＳ細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ（Gibco社）処理により懸濁し、ＨＲＶ結合用の２、１０cmプレート並びに２４ウェル組織培養プレート中に細分した。７２時間で、細胞を１０cmプレートから５mM ＥＤＴＡ／ＨＢＳＳで採集し、ＬＦＡ−１コーティングプラスチックへの粘着および免疫螢光分析用に加工した。
ＬＦＡ−１およびＨＲＶ結合性
ＬＦＡ−１をＳＫＷ−３からＴＳ２／４ＬＦＡ−１ mＡbセファローズ上でイムノアフィニティクロマトグラフにより精製し、２mMのMgCｌ2および１％のオクチルグルコシドの存在下にpＨ１１．５で溶出させた。ＬＦＡ−１（１０μｇ／２００μｌ／６cmプレート）を微生物学的ペトリ皿に２mMのMgCｌ2を含むＰＢＳ（リン酸塩緩衝塩水）中でオクチルグルコシドを０．１％に希釈し４℃で一夜インキュベートすることによって結合させた。各プレートを１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）でブロックし、２mMのMgCｌ2、０．２％ＢＳＡ、０．０２５％のアザイド、および５０μｇ／mｌのジェンタマイシンを含有するＰＢＳ中で保存した。
５％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）、２mMのMgCｌ2、０．０２５％のアザイドを含有するＰＢＳ（バッファー）中の51Ｃr標識ＣＯＳ細胞をＬＦＡ−１コーティングマイクロタイタープレート中で５μｇ／mｌのＲＲ１／１およびＲ６．５の存在または不存在下に２５℃、１時間インキュベートした。粘着してない細胞をバッファーで３回洗浄することにより除去した。粘着細胞はＥＤＴＡの添加により１０mMに溶出し、γ−計算した。
結  果
ＲＲ１／１、Ｒ６．５、ＬＢ−２、またはＣＬ２０３のような抗ＩＣＡＭ−１抗体は同定されている。これら抗体がＩＣＡＭ−１機能を抑制し得るならば、これらの抗体はＩＣＡＭ−１分子の特定の部位（これがまたＩＣＡＭ−１機能に重要である）に結合し得なければならない。即ち、前述のICAM−１の欠落変異体を調製し、上記の抗ICAM−１抗体が上記欠落体に結合し得る程度を測定することによって、欠落ドメインが機能上重要であるかどうかを見ることができる。
ＩＣＡＭ−１は複合膜たん白質であり、その細胞外ドメインは５つのＩｇ様Ｃ−ドメインからなるものと予測される。ＬＦＡ−１を結合するのに含まれるドメインを同定するには、ドメイン３、およびドメイン４と５（カルボキシル末端）をオリゴヌクレオチド特異性変異誘発により欠落させ、ＣＯＳ細胞中で発現後官能的に試験した。さらに、全細胞質ドメインを欠落させてＩＣＡＭ−１反応へのその潜在的影響を確認した。期待したように、細胞質ドメイン欠落体、Ｙ４７６／*はＲＲ1/1、Ｒ６．５、ＬＢ−２およびＣＬ２０３の反応性の喪失を示さないのに対し、ドメイン３の欠落体Ｆ１８４−Ｒ４５１はＣＬ２０３反応性の減少および喪失をもたらした（第２０図）。即ち、ＣＬ２０３エピトープはドメイン４中に存在するようであるが、ＲＲ１／１、Ｒ６．５およびＬＢ−２は２ケのアミノ末端ドメイン中に存在するようである。
３つの欠落変異体はすべてＬＦＡ−１に対し野生型レベルの粘着性を示した（第２１図）。ドメイン１、２および３中の予測β−ターンでのアミノ酸置換体も調製しＣＯＳ細胞中での発現後機能性試験した。Ｒ６．５エピトープはドメイン２の配列Ｅ１１１ＧＧＡに局在化しまたドメイン１中にＥ３９を含み得るが、ＲＲ１／１とＬＢ−２は共にドメイン１のＲ１３に依存している（第２２図）。さらに、ＲＲ１／１結合性は配列Ｄ７１ＧＯＳ中での変異により減少した。Ｎ１０３およびＮ163のＮ−結合グリコシル化部位を削減する変異はＲＲ１／１、Ｒ６．５とＬＢ−２、ＬＦＡ−１ HRV結合性を減少させた。これらの変異はＩＣＡＭ−１ダイマーを発生させるような加工を行うようである。
ドメイン２または３の他の変異は変化型ＬＦＡ−１粘着をもたらさなかった（第２３および２４図）。ドメイン１のアミノ酸、Ｒ１３とＤ６０の両方はＬＦＡ−１と結合することによって含まれる（第２５図）。
即ち、ＬＦＡ−１およびＨＲＶ結合性はICAM−１のアミノ末端Ｉｇ様ドメインの機能であるようである。第２６図はＩＣＡＭ−１末端ドメインの配列を示す。
本発明をその特定の実施態様について説明して来たが、更なる修正が可能であることは理解し得ることであり、本出願は、一般に、本発明の原理に従いかつ本発明が関係する技術内での公知または慣用的実施に含まれるようなまた特許請求するような本質的な特徴に適用し得るような本明細書の記載からの回避を包含するすべての変形、用途または適用を含むものとする。
【図面の簡単な説明】
第１図は正常細胞とＬＦＡ−１欠損細胞間の粘着を図式的に示す。
第２図は正常細胞／正常細胞粘着過程を図式的に示す。
第３図は５０ng／mｌのＰＭＡの不存在（×）または存在（○）下の細胞凝集の動力学を示す。
第４図はＬＦＡ−１-細胞とＬＦＡ−１+細胞間の凝集を示す。図中に示すようにカルボキシフルオレスセインジアセテート標識ＥＢＶ−形質転換細胞（１０4）を１０5未標識同元細胞（黒枠）またはＪＹ細胞（白枠）とＰＭＡの存在下に混合した。１．５時間後、凝集物中または遊離の標識細胞を実施例２の定量アッセイを用いて計数した。凝集物中の標識細胞の％を示す。２つの内の１つの代表的な試験を示している。
第５図はＪＹ細胞からのＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１の免疫沈降を示す。ＪＹ細胞のトリトンＸ−１００溶解物（レーン１および２）または対照溶解バッファー（レーン３および４）をＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体（レーン１および３）またはＬＦＡ−１に結合し得る抗体（レーン２および４）で免疫沈降させた。パネルＡは還元条件下での結果を示し、パネルＢは非還元条件下で得られた結果を示す。分子量標準物はレーンＳに示した。
第６図はヒト皮ふ繊維芽細胞上のＩＣＡＭ−１発現に対してのＩＬ−１とガンマーインターフェロンの効果の動力学を示す。ヒト皮ふ繊維芽細胞は８×１０4細胞／０．３２cm2ウェルの密度に増殖させた。ＩＬ−１（１０μ／mｌ、黒丸）または組換えガンマーインターフェロン（１０μ／mｌ、白四角）を加え、図中に示した時間で、４℃に冷却し間接結合アッセイを実施した。標準偏差は１０％を越えなかった。
第７図はＩＣＡＭ−１へのＩＬ−１とガンマーインターフェロン効果の濃度依存性を示す。ヒト皮ふ繊維芽細胞は８×１０4細胞／０．３２cm2／ウェルの密度に増殖させた。ＩＬ−２（白丸）、組換えヒトＩＬ−１（白四角）、組換マウスＩＬ−１（黒四角）および組換えベータインターフェロン（白三角）を図中に示した稀釈率で４時間（ＩＬ−１）または１６時間（ベータおよびガンマーインターフェロン）インキュベートした。示した結果は４回測定の平均を示し、標準偏差は１０％を越えなかった。
第８図はＩＣＡＭ−１ cＤＭＡのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。第１ＡＴＧは位置５８にある。ＩＣＡＭ−１トリプシンペプチドに相当する翻訳配列はアンダーラインを施してある。疎水性推定シグナルペプチドおよびトランスメンブラン配列は肉太アンダーラインを施している。Ｎ−結合グリコシル化部位は囲っている。位置２９７６のポリアデニリル化シグナルAATAAAはオーバーラインを施している。図示した配列はＨＬ−６０ cＤＮＡクローン用である。内皮細胞cＤＮＡはその長さの大部分に亘ってシーケンシングし小さな差異のみを示した。
第９図はＩＣＡＭ−１相同ドメインおよび免疫グロブリン超遺伝子群への相関を示す。（Ａ）５つの相同ドメインの配列（Ｄ1-5）：列んだ２以上の同じ残基は囲っている。ＮＣＡＭドメインに２回以上含まれる残基、およびセットＣ2およびＣ1のドメイン中に含まれる残基はＩＣＡＭ−１内部繰返しによって配列している。ＩＣＡＭ−１のドメイン中の予想βストランドの位置は棒線および配列上の小文字でマークしており、また免疫グロブリンｃドメイン中のβ−ストランドの公知の位置は棒線および配列下の大文字でマークしている。ＩＣＡＭ−１ドメイン内の推定ジスルフィド架橋の位置はＳ−Ｓによって記している。ICAM−１に相同性のたん白質ドメインの（Ｂ−Ｄ）配列：各たん白質はＦＡＳＴＰプログラムを用いてＮＢＲＦデータベースを調査することによって先ず配列する。各たん白質配列はＭＡＧ、ＮＣＡＮ、Ｔ細胞レセプターαサブユニットＶドメイン、ＩｇＭμ鎖およびα−１−Ｂ−糖たん白質である。
第１０図はＩＣＡＭ−１とＭＡＧの二次構造の比較図である。
第１１図は平坦膜中でＩＣＡＭ−１に結合しているＬＦＡ−１陽性ＥＢＶ−形質転換Ｂ−リンパ芽球腫（lymphoblastoid）細胞を示す。
第１２図はプラスチック結合ベシクル中のICAM−１に結合しているＬＦＡ−１陽性Ｔ−リンパ芽球およびＴ−リンパ球を示す。
第１３図はプラスチック結合ベシクル中のICAM−１に結合しているＪＹ  Ｂ−リンパ芽球腫の細胞またはベシクルのモノクローナル抗体による前処理による結合抑制を示す。
第１４図はプラスチック結合ベシクル中のICAM−１へのＴ−リンパ芽球の結合に対しての温度の効果を示す。
第１５図はプラスチック結合ベシクル中のICAM−１へのＴ−リンパ芽球の結合における二価のカチオンの必要性を示す。
第１６図は末梢血液単核細胞がＴ−細胞会合抗原ＯＫＴ３の認識に応答して増殖する能力に及ぼす抗粘着性抗体の効果を示す。“ＯＫＴ３”は抗原の添加を示す。
第１７図は、末梢血液単核細胞が、非特異的Ｔ−細胞分裂促進物質である、コンカナバリンＡの認識に応答して増殖する能力に及ぼす抗粘着性抗体の効果を示す。“ＣＯＮＡ”はコンカナバリンＡの添加を示す。
第１８図は、末梢血液単核細胞が、鍵穴カサガイヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）抗原の認識に応答して増殖する能力に及ぼす抗粘着性抗体の効果を示す。“ＫＬＨ”は、鍵穴カサガイヘモシアニンの、細胞への添加を示している。
第１９図は末梢血液単核細胞が、破傷風菌トキソイド抗原の認識に応答して増殖する能力に及ぼす抗粘着性抗体の効果を示す。“ＡＧＮ”は破傷風菌トキソイド抗原の、細胞への添加を示す。
第２０図はＩＣＡＭ−１欠落変異体へのモノクローナル抗体ＲＲ１／１、Ｒ６．５、ＬＢ２、およびＣＬ２０３の結合を示す。
第２１図はＩＣＡＭ−１欠落変異体のＬＦＡ−１への結合を示す。
第２２図は抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体ＲＲ１／１、Ｒ６．５、ＬＢ２、およびＣＬ２０３により認識したエピトープを示す。
第２３図はＬＦＡ−１へのＩＣＡＭ−１ドメイン２変異体の結合能力を示す。
第２４図はＬＦＡ−１へのＩＣＡＭ−１ドメイン３変異体の結合能力を示す。
第２５図はＬＦＡ−１へのＩＣＡＭ−１ドメイン１の結合能力を示す。
第２６図はＩＣＡＭアミノ末端ドメインの配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８（１）】
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【図８（２）】
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【図８（３）】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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