(57)【要約】  コリオバクテリア科に属するエコール産生菌を効率よく増殖させるための培養方法を提供する。  アルギニンを含有する培地でコリオバクテリア科に属するエコール産生菌を培養する方法であって、以下のａ）又はｂ）のいずれか一方又は両方を行う、エコール産生菌の培養方法。    ａ）初発ｐＨを弱酸性に調整して培養する    ｂ）乳酸菌を混合して培養する【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギニンを含有する培地でコリオバクテリア科に属するエコール産生菌を培養する方法であって、以下のａ）又はｂ）のいずれか一方又は両方を行う、エコール産生菌の培養方法。
ａ）初発ｐＨを弱酸性に調整して培養する
ｂ）乳酸菌を混合して培養する
【請求項２】
培地中のアルギニン含有量が０．４〜２．５ｗ／ｖ％である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
初発ｐＨがｐＨ５．５〜６．５である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
乳酸菌がラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトコッカス・ラクチス及びストレプトコッカス・サーモフィルスから選ばれる１種以上である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
エコール産生菌がスラッキア属細菌である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
エコール産生菌がＳｌａｃｋｉａ  ｓｐ．ＹＩＴ  １１８６１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２３１）である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
乳酸菌がラクトバチルス・カゼイ  ＹＩＴ  ９０２９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３６６）、ラクトバチルス・アシドフィルス  ＹＩＴ  ０１９８（ＪＣＭ１０２８）、ラクトコッカス・ラクチス  ＹＩＴ  ２０２７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２２４）及びストレプトコッカス・サーモフィルス  ＹＩＴ  ２００１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５３８）から選ばれる１種以上である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エコール産生菌を効率的に増殖させるための培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大豆食品に多く含まれるイソフラボンは、不定愁訴等の更年期障害の改善や骨粗鬆症の予防、高脂血症や動脈硬化の予防、乳がんや前立腺がんの予防等に効果がある機能性成分として知られている。近年の研究により、イソフラボンの一つであるダイゼイン（Ｄａｉｄｚｅｉｎ）は、体内の腸内細菌によってエストロゲン作用や抗酸化作用がより強力なエコール（Ｅｑｕｏｌ）に代謝されることが明らかになり、エコールは体内で上記の作用を奏する主要な有効成分の一つとして注目されている。【０００３】
体内でのダイゼインからエコールへの産生は全てのヒトで一律に行われるのではなく、その産生能には個人差があり、３０〜５０％のヒトがエコール産生能を有することが報告されている（非特許文献１）。そこで、エコール産生能を有する腸内細菌の探索が精力的に行われており、エコール産生能を有する微生物として、バクテロイデス・オバタス、ストレプトコッカス・インターメディアス、ストレプトコッカス・コンステラータス（特許文献１）、ラクトコッカス・ガルビエ（特許文献２）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス  ＴＭ−１株、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＪＣＭ  １２７３（特許文献３）、プロピオニバクテリウム・フレウンデレッキ、ビフィドバクテリウム・ラクチス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトコッカス・ラクチス、エンテロコッカス・フェシウム、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・サリバリウス（特許文献４）が報告されている。さらに、高いエコール産生能を有する微生物はコリオバクテリア科（Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に集中していることが知られており、アドレクロイチア・エクオリファシエンス、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス、スラッキア・エクオリファシエンス、Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐｐ．ＴＭ−３０株、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．Ｙ７９１８、ＳＮＵ−Ｊｕｌｏｎｇ７３２（非特許文献２）、ｇｒａｍ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏ０３（非特許文献３）が報告されている。また、本出願人は、ダイゼインからのエコール変換能が極めて高い微生物として、スラッキア（Ｓｌａｃｋｉａ）属細菌である、Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．ＹＩＴ  １１８６１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２３１）を見出している（特許文献５）。当該菌株を始めとするコリオバクテリア科に属するエコール産生菌は、その高い活性から、腸内でダイゼインをエコールへと効率的に変換することで上記疾患の予防に役立つ新たなプロバイオティクスとしての利用が期待される。さらには、エコールの効率的な製造にも利用できる。【０００４】
斯かるコリオバクテリア科のエコール産生菌をプロバイオティクスやエコールの製造に利用するためには、先ず当該菌体を多量に取得する方法の確立が必要となる。一般的に菌体を高い収率で得るためには液体培地を用いた培養が好ましい。しかしながら、コリオバクテリア科、特にスラッキア属のエコール産生菌は液体培地での増殖性が低いため、その多くが寒天培地により培養されている。加えて、スラッキア属細菌を含むコリオバクテリア科のエコール産生菌は菌体が増殖するまでにはおおよそ３日間、ときには７日間もの長い時間を要し、その産業上の利用性が著しく制限されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９９／７３９２号
【特許文献２】国際公開第２００５／４２号
【特許文献３】特開２００６−２０４２９６号公報
【特許文献４】特表２００６−５０４４０９号公報
【特許文献５】特許第５６３１８６２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Proc Soc Exp Biol Med、Vol.217、No.3、p335-339(1998)
【非特許文献２】Appl Environ Microbiol、Vol.71、p214-219(2005)
【非特許文献３】J Biosci Bioeng、Vol.102、p247-250(2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、コリオバクテリア科のエコール産生菌を効率よく増殖させるための培養方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、コリオバクテリア科のエコール産生菌が、アルギニンを含む培地で、初発ｐＨを弱酸性にして培養する、或いは乳酸菌と混合培養することにより、効率よく増殖できることを見出し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の１）〜７）に係るものである。
１）アルギニンを含有する培地でコリオバクテリア科に属するエコール産生菌を培養する方法であって、以下のａ）又はｂ）のいずれか一方又は両方を行う、エコール産生菌の培養方法。
ａ）初発ｐＨを弱酸性に調整して培養する
ｂ）乳酸菌を混合して培養する
２）培地中のアルギニン含有量が０．４〜２．５ｗ／ｖ％である、１）の方法。
３）初発ｐＨがｐＨ５．５〜６．５である、１）又は２）の方法。
４）乳酸菌がラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトコッカス・ラクチス及びストレプトコッカス・サーモフィルスから選ばれる１種以上である、１）〜３）のいずれかの方法。
５）エコール産生菌がスラッキア属細菌である、１）〜４）のいずれかの方法。
６）エコール産生菌がＳｌａｃｋｉａ  ｓｐ．ＹＩＴ  １１８６１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２３１）株である、１）〜５）のいずれかの方法。
７）乳酸菌がラクトバチルス・カゼイ  ＹＩＴ  ９０２９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３６６）、ラクトバチルス・アシドフィルス  ＹＩＴ  ０１９８（ＪＣＭ１０２８）、ラクトコッカス・ラクチス  ＹＩＴ  ２０２７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２２４）及びストレプトコッカス・サーモフィルス  ＹＩＴ  ２００１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５３８）から選ばれる１種以上である、１）〜６）のいずれかの方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、コリオバクテリア科に属するエコール産生菌を、液体培地中で効率よく増殖させることができ、多量の生菌液を長期間に渡って供給することが可能となる。したがって、本発明は、コリオバクテリア科に属するエコール産生菌のプロバイオティクスとしての開発・研究等のために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＹＩＴ  １１８６１株の増殖性（アルギニンの影響）を示す図。
【図２】ＹＩＴ  １１８６１株の増殖性（アルギニン含有培地の初発ｐＨの影響）を示す図。
【図３】ＹＩＴ  １１８６１株の増殖性（アルギニン含有培地のアルギニン濃度の検討）を示す図。
【図４】ＹＩＴ  １１８６１株の増殖性（攪拌培養におけるｐＨ条件の比較）を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において、コリオバクテリア科に属するエコール産生菌（以下、「エコール産生菌」と称する）としては、ダイゼイン類（ダイゼイン配糖体、ダイゼイン、ジヒドロダイゼイン）を資化してエコールを生成するコリオバクテリア科に属する微生物であれば特に限定されず、例えば、アドレクロイチア属、エガセラ属、スラッキア属等に属する微生物が挙げられ、より具体的には、アドレクロイチア・エクオリファシエンス、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．Ｙ７９１８、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス、スラッキア・エクオリファシエンス、Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐｐ．ＴＭ−３０株、Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．ＹＩＴ  １１８６１等が挙げられる。このうち、スラッキア属細菌が好ましく、より好ましくは、Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．ＹＩＴ  １１８６１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２３１）である。
【００１３】
本発明において、培地中に含有されるアルギニンとしては、Ｌ体、Ｄ体、それらの混合物でもよいが、好ましくはＬ−アルギニンである。アルギニンは塩の形態をとっても良く、塩としては、例えば塩酸塩、グルタミン酸塩、クエン酸塩等を挙げることができ、好ましくは塩酸塩である。
培地中のアルギニン含有量は、下限が０．４ｗ／ｖ％、０．８ｗ／ｖ％又は１．２ｗ／ｖ％のいずれか一つから選択され、上限が１０．０ｗ／ｖ％、５．０ｗ／ｖ％、２．５ｗ／ｖ％、２．１ｗ／ｖ％又は１．７ｗ／ｖ％のいずれか一つから選択される、当該下限と上限との任意の組合せによって規定される含有量を指し、０．４〜２．５ｗ／ｖ％、好ましくは０．８〜２．１ｗ／ｖ％、より好ましくは１．２〜１．７ｗ／ｖ％である。尚、アルギニンの塩を使用した場合、アルギニンの含有量とは、遊離体のアルギニンに換算した量である。
【００１４】
本発明の方法において用いられる培地は、嫌気性微生物の生存に適した公知の培地を使用することができる。培地は、液体、半固体、固体であり得るが、好ましくは液体培地である。例えば、日水製薬社製のＧＡＭブイヨン培地や、変法ＧＡＭブイヨン培地、Ｄｉｆｃｏ社製のＢＨＩ培地等を使用することができる。
本発明で用いられる培地には、例えば、水溶性の有機物を炭素源として加えることができる。水溶性の有機物としては、グルコース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、キシロース、マンノース、ラムノース、リボース、ソルボース、トレハロース、セロビオース、ラクトース、マルトース、シュクロース、ラフィノース、メリビオース、メレジトース、ラクチュロース、グリコーゲン、エリスリトール、ソルビトール、アドニトール、マンニトール、イノシトール、ラクチトール、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、イヌリン、可溶性でんぷん等の糖類の他、ピルビン酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、吉草酸、イソ吉草酸、イソ酪酸、酪酸、プロピオン酸及び酢酸など有機酸類等の化合物を挙げることができる。
【００１５】
炭素源として培地に加える有機物の濃度は、効率的に培地中のエコール産生菌を発育させるために適宜調節することができる。一般的には、０．０５〜５ｗ／ｖ％の範囲から添加量を選択することができる。
【００１６】
上記の炭素源に加えて、培地には、窒素源を加えることができる。好ましい無機窒素源としては、アンモニウム塩や硝酸塩が挙げられ、例えば、硫安、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、クエン酸アンモニウム、硝酸カリウム、硝酸ソーダ等が挙げられる。有機窒素源としては、アミノ酸類、酵母エキス、ペプトン類、肉エキス、肝臓エキス、消化血清末等が挙げられ、好ましくは、アルギニン、シトルリン、オルニチン、リジン、酵母エキス、ペプトン類等が挙げられる。
【００１７】
更に、炭素源や窒素源に加えて、エコール産生菌の培養に適した他の有機物あるいは無機物、例えばビタミンなどの補因子や各種の塩類等の無機化合物を培地に加えることもできる。無機化合物としては、例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、塩化コバルト、塩化カルシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、明ばん、モリブデン酸ソーダ、塩化カリウム、ホウ酸、塩化ニッケル、タングステン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、硫酸第一鉄アンモニウム等が挙げられる。
また、ビタミン類としては、例えば、ビオチン、葉酸、ピリドキシン、チアミン、リボフラビン、ニコチン酸、パントテン酸、ビタミンＢ１２、チオオクト酸、ｐ−アミノ安息香酸が挙げられる。
また、ポルフィリン化合物であるヘミンを添加することも可能である。
【００１８】
本発明において、コリオバクテリア科に属するエコール産生菌の培養は、一態様として、ａ）初発ｐＨを弱酸性に調整して培養することが挙げられる。
ここで、「弱酸性」とは、下限がｐＨ５．５、５．７又は６のいずれか一つから選択され、上限がｐＨ６．５、６．３又は６のいずれか一つから選択される、当該下限と上限との任意の組合せによって規定されるｐＨ条件を指し、ｐＨ５．５〜６．５、より好ましくはｐＨ５．５〜６の条件を指す。
ｐＨ調整は、塩酸、硫酸等の酸を添加することにより行われる。
【００１９】
上記培地へのエコール産生菌の播種量は、例えば０．０１〜５０ｖ／ｖ％、好ましくは０．１〜５ｖ／ｖ％、より好ましくは０．５ｖ／ｖ％程度とすればよい。
【００２０】
培養は、嫌気雰囲気下で行われる。嫌気雰囲気を構成する嫌気性ガスとしては、窒素ガス単独、窒素ガスと二酸化炭素の混合ガス、又は窒素ガスと二酸化炭素と水素の混合ガスが挙げられるが、窒素ガスが好ましく、窒素ガスと二酸化炭素と水素の混合ガスを用いるのがより好ましい。混合ガスは、水素ガスの割合が０．１〜８０％であるのが好ましく、１〜１０％であるのがより好ましい。例えば、３種混合ガス（窒素：炭酸ガス：水素＝８８％：５％：７％）を用いることができる。
【００２１】
培養温度は、２５〜４２℃とするのが好ましく、３０〜４０℃がより好ましく、３５〜３９℃がより好ましい。
また、培養時間は、５〜９６時間とするのが好ましく、１０〜７２時間がより好ましく、１２〜４８時間がより好ましい。
【００２２】
また、培養は静置培養でも良いが、攪拌するのが好ましく、５０〜６５０ｒｐｍ程度の撹拌速度で行うのがより好ましい。
【００２３】
本発明におけるコリオバクテリア科に属するエコール産生菌の培養は、上記のａ）の態様に加えて、又は別の一態様として、ｂ）乳酸菌を混合して培養することが挙げられる。
ここで用いられる乳酸菌としては、例えばラクトバチルス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ブヒネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・ガリナラム（Ｌ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ラクトバチルス・アミロボラス（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ラムノーザス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ケフィア（Ｌ．ｋｅｆｉｒ）、ラクトバチルス・クルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ゼアエ（Ｌ．ｚｅａｅ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｌｉｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・デルブルッキィ  サブスピーシーズ．ブルガリカス（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブルッキィ  サブスピーシーズ．デルブルッキィ（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ．ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ．クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）等のラクトコッカス属細菌等が挙げられ、このうちラクトバチルス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃ．ｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）が好ましい。また、ラクトバチルス・カゼイとしては、好ましくは、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０１８（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６５）、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６６）、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ １０００３（ＦＥＲＭ ＢＰ−７７０７）が挙げられ、このうちラクトバチルス・カゼイ  ＹＩＴ  ９０２９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６６）がより好ましい。ラクトコッカス・ラクチスとしては、好ましくは、ラクトコッカス・ラクチス  ＹＩＴ  ２０２７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２２４）が挙げられる。ストレプトコッカス・サーモフィルスとしては、好ましくは、ストレプトコッカス・サーモフィルス  ＹＩＴ  ２００１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５３８）が挙げられる。これらの菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現在は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター）に寄託されている。ラクトバチルス・アシドフィルスとしては、好ましくは、ラクトバチルス・アシドフィルス  ＹＩＴ  ０１９８（ＪＣＭ１０２８）が挙げられる。この菌株は、微生物材料開発室（ＪＣＭ）に寄託されている。斯かる乳酸菌は、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いても良い。
【００２４】
乳酸菌は、予めＭＲＳ培地等の培地で前培養し、当該前培養物を、上述したエコール産生菌を播種した培地に添加して培養される。
乳酸菌の播種量は、例えば０．０１〜５０ｖ／ｖ％、好ましくは０．０５〜５ｖ／ｖ％、より好ましくは０．５ｖ／ｖ％程度とすればよい。
【００２５】
エコール産生菌と乳酸菌を混合して行われる培養は、嫌気条件もしくは微好気条件で行われ、培養温度は２５〜４２℃とするのが好ましく、３０〜４０℃がより好ましく、３５〜３９℃がより好ましい。
また、培養時間は、５〜９６時間とするのが好ましく、１０〜７２時間がより好ましく、１２〜４８時間がより好ましい。
また、培養は静置培養でも良いが、５０〜６５０ｒｐｍ程度の撹拌速度で行っても良い。
【実施例】
【００２６】
（Ａ）接種菌液の調製
嫌気グローブボックス内で１．０ｗ／ｖ％グルコース添加変法ＧＡＭ（Ｇｉｆｕ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｍｅｄｉｕｍ）平板培地（日水製薬）にＳｌａｃｋｉａ  ｓｐ．ＹＩＴ  １１８６１株（以下「ＮＡＴＴＳ株」とも称する）の凍結菌株（分散媒  ２０％グリセロール溶液）を２００μＬ接種し、３７℃で２４時間培養した。生育したコロニーを平板１枚あたり１．０ｗ／ｖ％グルコース添加変法ＧＡＭ培地（日水製薬）２ｍＬに懸濁し、接種菌液とした。【００２７】
（Ｂ）増殖性の評価
培養開始０時間、２４時間後のＯＤ６００を測定し、０時間からのΔＯＤ６００を求めて増殖の指標とした。【００２８】
（Ｃ）ＮＡＴＴＳ株・乳酸菌の菌数測定
培養液２００μＬを４００μＬのＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ）と混合し、１０分間室温で静置した。その後、４℃のもと１２，０００ｒｐｍで５分間遠心して上清をデカンテーションで除去した後、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。凍結保存したペレットは融解後、定法［１）Tsuji, H. et al. Isolation and characterization of the equol-producing bacterium Slackia sp. strain NATTS. Arch Microbiol. 192, 279-87 (2010)、２）Matsuda, K et al. Establishment of an analytical system for the human fecal microbiota, based on reverse transcription-quantitative PCR targeting of multicopy rRNA molecules. Appl Environ Microbiol. 75:1961-1969 (2009)］に従ってＲＮＡ抽出を行い、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によりＮＡＴＴＳ株の菌数を測定した。使用したプライマーは表１のとおりである。
乳酸菌の菌数は、上記のＲＮＡを鋳型に用い、定法[２）Matsuda, K. et al. Establishment of an analytical system for the human fecal microbiota, based on reverse transcription-quantitative PCR targeting of multicopy rRNA molecules. Appl Environ Microbiol. 75, 1961-1969 (2009)、３）Kubota, H. et al. Detection of human intestinal catalase-negative, gram-positive cocci by rRNA-targeted reverse transcription-PCR. Appl Environ Microbiol. 76, 5440-5451 (2010)]に従って測定した。使用したプライマーは表２のとおりである。【００２９】
【表１】
2019189388.tif 000002
【００３０】
【表２】
2019189388.tif 000003
【００３１】
試験例１  アルギニンの添加効果
（１）アルギニン塩酸塩を最終濃度が１．０ｗ／ｖ％（遊離体のアルギニン量に換算すると、０．８ｗ／ｖ％）となるように変法ＧＡＭ培地に添加し、１１５℃で１５分間オートクレーブした後、嫌気グローブボックス（ＣＯＹ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ）内において予め２日以上嫌気置換し、試験培地を調製した。嫌気ガスは窒素、炭酸ガス及び水素の３種混合ガス（窒素：炭酸ガス：水素＝８８％：５％：７％）を使用した。
アルミキャップ付き試験管に分注した試験培地４ｍＬに上記（Ａ）に従い調製した菌液を１／２００量接種し、嫌気グローブボックス内で３７℃、２４時間培養した。その際、対照として、アルギニン塩酸塩を添加しない変法ＧＡＭ培地（０．１％アルギニンを含む）を使用した。菌体の増殖性を上記（Ｂ）に記載の方法に従って評価した。【００３２】
（２）結果
１．０ｗ／ｖ％アルギニン塩酸塩を変法ＧＡＭ培地に添加した結果、非添加と比べてΔＯＤ６００値が約２．６倍増加した（図１）。【００３３】
試験例２  初発ｐＨ及びアルギニン濃度の検討
（１）初発ｐＨの影響
アルギニン塩酸塩を１．０ｗ／ｖ％（遊離体のアルギニン量に換算すると、０．８％ｗ／ｖ％）添加した変法ＧＡＭ培地（０．１％アルギニンを含む）、又はアルギニン塩酸塩を添加しない変法ＧＡＭ培地について、塩酸を用いて初発ｐＨを５．０、５．５、６．０及び６．５に調整し、１１５℃で１５分間オートクレーブした後、嫌気グローブボックス（ＣＯＹ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ）内において予め２日以上嫌気置換し、試験培地を調製した。嫌気ガスは窒素、炭酸ガス及び水素の３種混合ガス（窒素：炭酸ガス：水素＝８８％：５％：７％）を使用した。その際、対照としてアルギニン塩酸塩を添加しないｐＨ未調整の変法ＧＡＭ培地を使用した。
アルミキャップ付き試験管に分注した試験培地４ｍＬに、上記（Ａ）に従い調製した菌液を１／２００量接種し、嫌気グローブボックス内で３７℃、２４時間培養した。菌体の増殖性は上記（Ｂ）に記載の方法に従って評価した。【００３４】
その結果、初発ｐＨが５．５、６．０及び６．５においてｐＨ未調整（ｐＨ６．９）の培地と比べてΔＯＤ６００値がそれぞれ１．２、１．３倍及び１．１倍増加した（図２）。なかでも初発ｐＨが６．０の場合が最も高いΔＯＤ６００値を示した。一方、ｐＨ５．０では増殖が著しく抑制された。一方、アルギニン塩酸塩非添加の条件では、対照と比べてΔＯＤ６００値にほとんど差はなかった。【００３５】
（２）アルギニン濃度の検討
アルギニン塩酸塩を最終濃度が０．５、１．０、１．５、２．０、２．５及び３．０ｗ／ｖ％（遊離体のアルギニンに換算すると、０．４、０．８、１．２、１．７、２．１及び２．５ｗ／ｖ％）となるように変法ＧＡＭ培地に添加し、塩酸で初発ｐＨを５．５もしくは６．０に調整した後、１１５℃で１５分間オートクレーブした後、嫌気グローブボックス（ＣＯＹ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ）内において予め２日以上嫌気置換し、試験培地を調製した。嫌気ガスは窒素、炭酸ガス及び水素の３種混合ガス（窒素：炭酸ガス：水素＝８８％：５％：７％）を使用した。
アルミキャップ付き試験管に分注した試験培地４ｍＬに、上記（Ａ）に従い調製した菌液を１／２００量接種し、嫌気グローブボックス内で３７℃、２４時間培養した。菌体の増殖性は上記（Ｂ）に記載の方法に従って評価した。【００３６】
その結果、アルギニン塩酸塩濃度が０．５ｗ／ｖ％以上で未添加と比べて有意な増殖促進効果が認められ（図３）、初発ｐＨ５．５及び６．０の条件とも２．０％の添加効果が最も高かった。【００３７】
試験例３  撹拌の影響
アルギニン塩酸塩を２．０ｗ／ｖ％（遊離体のアルギニン量に換算すると、１．７ｗ／ｖ％）添加した変法ＧＡＭ培地（初発ｐＨ５．５もしくは６．０）２００ｍＬ（５００ｍｌコルベンを使用）を１１５℃で１５分間オートクレーブした後、嫌気グローブボックス（ＣＯＹ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ）内において予め２日以上嫌気置換し、試験培地を調製した。嫌気ガスは窒素、炭酸ガス及び水素の３種混合ガス（窒素：炭酸ガス：水素＝８８％：５％：７％）を使用した。
試験培地に上記（Ａ）に従い調製した菌液を１／２００量接種し、７５０ｒｐｍの攪拌速度で攪拌子を回転させながら、嫌気グローブボックス内で３７℃、２４時間培養した。
また、上記と同じ組成の培地で回転を加えずに静置培養したものを対照とした。なお、攪拌培養の回転速度は、気相のガスを培地全体に拡散させることができ、かつ２４時間安定して回転させることができる速度に設定した。菌体の増殖性は上記（Ｂ）に記載の方法に従って評価した。【００３８】
その結果、どちらのｐＨ条件においても静置培養と比べて攪拌培養を行うことで増殖性の向上が見られた（図４）。攪拌条件下で初発ｐＨ５．５と６．０を比べた場合、ｐＨ６．０よりもｐＨ５．５の条件がより高いΔＯＤ６００値を示し、ｐＨ５．５では同じ培地組成の静置培養と比べて約１．７倍に増加した。【００３９】
試験例４  乳酸菌との混合培養
（１）乳酸菌株
・Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＹＩＴ０１９８、Ｌ．  ｃａｓｅｉ  ＹＩＴ９０２９（ＬｃＳ）
・Ｌａｃ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｓ．ｌａｃｔｉｓ  ＹＩＴ２０２７、
・Ｓｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＹＩＴ２００１【００４０】
（２）ＮＡＴＴＳ株の接種菌液は、上記（Ａ）と同様に調製した。各種乳酸菌は、菌体を吸着させたマイクロバンク（イワキ）凍結ビーズを４ｍＬのＭＲＳ培地に接種し、３７℃で２４時間好気培養した。試験培地は窒素ガスを飽和させてブチル栓で試験管に密封した０．５ｗ／ｖ％グルコース／１．５ｗ／ｖ％アルギニン塩酸塩添加−変法ＧＡＭ（ｐＨ未調整）１０ｍＬとした。試験培地に乳酸菌とＮＡＴＴＳ株との組み合わせ、もしくはそれぞれ単独で０．５％接種し、３７℃で２４時間嫌気培養した。なお、ＮＡＴＴＳ単独培養には乳酸菌培養液の代わりにＭＲＳ培地を、乳酸菌単独培養にはＮＡＴＴＳ株の培養液の代わりに変法ＧＡＭ培地を加えた。
培養２４時間後に培養液について、前記（Ｃ）に記載の方法によりＮＡＴＴＳ株及び各乳酸菌の菌数を測定した。【００４１】
（３）結果
Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＹＩＴ０１９８、Ｌａｃ．ｌａｃｔｉｓ  ＹＩＴ２０２７、Ｓｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＹＩＴ  ２００１及びＬｃＳを混合培養した際、培養２４時間後のＮＡＴＴＳ株の菌数がＮＡＴＴＳ株単独培養と比べて高くなり、特にＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＹＩＴ０１９８及びＬｃＳを混合培養した際、有意に高くなった（表２，ｐ＜０．０５）。特にＬｃＳと混合培養した際のＮＡＴＴＳ株の菌数は最も高く、これまでに確立した至適培地で培養した際の菌数とほぼ同等であった（表３）。また、ＬｃＳの菌数についても単独培養と比較してＮＡＴＴＳ株と混合培養した場合に有意に高かった（表３，ｐ＜０．０５）。【００４２】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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