(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜硫酸パルプ廃液で培養したトルラ酵母又はサッカロ酵母の酵母菌体を加熱失活後、細胞壁溶解酵素及びプロテアーゼを同時に１５時間〜１８時間作用させ蛋白質を溶出させた後、遠心分離して残査を除いて得られる上清に含まれる蛋白成分であって、該蛋白成分が、酵母菌体内全蛋白量の８５重量％以上であって、かつ、該蛋白成分が分子量２万〜４０万の蛋白質である蛋白成分を有効成分とすることを特徴とする免疫増強剤を０．０５〜１０重量％含有する甲殻類、魚類及び家畜用飼料。
【請求項２】
亜硫酸パルプ廃液で培養したトルラ酵母又はサッカロ酵母の酵母菌体を加熱失活後、細胞壁溶解酵素及びプロテアーゼを同時に１５時間〜１８時間作用させ蛋白質を溶出させた後、遠心分離して残査を除き上清を得ることを特徴とする免疫増強剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は免疫増強剤並びにそれを含有する甲殻類、魚類及び家畜用飼料に関し、詳しくは酵母の蛋白質を利用した免疫増強剤並びにそれを含有する甲殻類、魚類及び家畜用飼料に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及びその問題点】
甲殻類、魚類、家畜及び家禽類の幼若期は一般に免疫機能が十分発達しておらず、そのため消化管系・呼吸器系の感染症が発生し易い。又、一度この様な感染症が発生すると、一般的に甲殻類、魚類、家畜及び家禽類の飼育は、生産効率向上のため高密度で行われている関係から非常に蔓延し易く、経済的損失は極めて大きく特に水畜産業界においては重要な問題点となっている。
【０００３】
現在これらの感染症の予防・治療には、抗生物質をはじめとした種々の薬剤が使用されている。しかしながら、これら薬剤の効果は十分でない上に、新たに薬剤の体内残留・薬剤耐性菌の出現といった問題が生じ、薬剤の使用は制限される方向にある。
【０００４】
これらに代わる新たな方法として、免疫増強物質を投与して感染症に対する抵抗力をつける方法などが検討されている。免疫増強物質としてはキノコ由来の多糖類が知られており、例えばシイタケから熱水抽出されたレンチナンやスエヒロタケが生産するシゾフィラン等が開発上市されており、その効果についても数多く報告されている（特開平２−２１８６１５号、特開平４−２４７０３２号等）。
【０００５】
又、酵母菌体を用いた免疫増強剤としては、酵母菌の細胞壁構成成分であるβ−グルカンやマンナン、β−グルカンを含むザイモザン等が知られている。
【０００６】
しかしながらこれらの免疫増強剤は、いずれも活性が十分でなく製造工程が煩雑で収量も低いためにコスト高となり、飼料添加物として広く利用するには問題があった。
【０００７】
一方、生体の体液性免疫を利用して、不活性化した病原菌をワクチンとして投与する方法も知られている（特公昭５６−５３２８６号等）。しかしながらこの方法は、適応可能な生物や疾病が限定されると共に経口投与では十分に効果を発揮できないといった問題点を有していた。
【０００８】
酵母菌体は栄養価及び嗜好性に優れるため、酵母菌体そのものを飼料添加物として使用することが従来から行われている。しかしながら酵母菌体をそのまま摂取しても免疫増強効果は期待できないため、これまで免疫増強剤として使用されていなかった。
【０００９】
本発明者らは以前に、酵母菌体をアルカリ抽出して免疫増強活性を有する蛋白質成分を得る方法を発明しているが、この方法ではアルカリ性下で蛋白質が変性を起こし活性の面でまだ改善の余地が残されていた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、予め加熱して菌体内酵素を全て失活させた後に、細胞壁溶解酵素及びプロテアーゼを作用させると、免疫増強作用が非常に優れた免疫増強剤が得られることを発見し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
【００１２】
本発明で使用する酵母は、食用又は飼料用のものであれば特に制限はなく、ビール酵母，パン酵母，アルコール酵母，清酒用酵母など一般に食品工業で用いられているものを使用することが出来る。このような酵母の例としては、原料入手のしやすさの点で特にトルラ酵母 (Candida utilis) 並びにビール酵母やパン酵母といったサッカロ酵母を使用することが好ましい。
【００１３】
また、酵母菌体は培地で培養し洗浄することにより得られたものの他、これらの酵母菌体を乾燥した乾燥酵母菌体、核酸やグルタチオン等を抽出した残渣酵母等であっても良いが、特に亜硫酸パルプ排液培地で培養した酵母が、安価である上活性が高いので、本発明の酵母源としては最適である。
【００１４】
加熱失活は、８０〜１２０℃好ましくは９０〜１００℃で加熱し、菌体内酵素の完全失活を行う。加熱時間は１０分程で十分である。
【００１５】
次に細胞壁溶解酵素を０．２〜３％程度、プロテアーゼを０．２〜３％程度添加して、１〜３０時間反応させる。この範囲の時間内においては、細胞壁溶解酵素が作用して蛋白質を溶出させると共に、プロテアーゼが作用して十分な免疫増強活性を有する分子量の蛋白質を得ることが出来る。反応時間が短いと蛋白質の溶出が不十分で、反応時間が長いと極度の低分子化が生じ、免疫活性が低下してしまう。
【００１６】
使用する細胞壁溶解酵素剤としてはグルカナーゼ，マンナナーゼを含有し、酵母細胞壁を溶解するに十分な活性を有するものであればかまわないが、例えば市販の細胞壁溶解酵素としては、ＹＬ−５（天野製薬（株）製），ツニカーゼ（大和化成（株）製），キタラーゼ（クミアイ化学（株）製）などがあげられる。
【００１７】
使用するプロテアーゼとしては細胞壁溶解酵素により溶出された蛋白質を分解するに十分な活性を有するものであればかまわないが、例えば市販のプロテアーゼとしてはアマノＳ（天野製薬（株）製），プロチンＦＮ（大和化成（株）製），ニュートラーゼ（ノボノルディスク社製）などがあげられる。これらの酵素添加量、酵素反応温度、ｐＨは特に限定するものではなく、各々の酵素の最適条件下で行えばよい。
【００１８】
このようにして得られた免疫増強剤の溶出された蛋白質の分子量をゲル濾過法により求めたところ、２万〜４０万の分子量を有する蛋白質に強い免疫増強作用があることが判明した。
【００１９】
反応終了後、反応液は９０℃に加熱し酵素を失活させた後、酵母菌体から溶出された蛋白質は残渣と共に、又は活性をより増強させるために、抽出残渣を除去した上澄液を濃縮した後乾燥する。なお、乾燥方法としては、噴霧乾燥等の公知の乾燥方法を用いることができる。
【００２０】
このようにして得られる本発明の免疫増強剤は、動物用の飼料に添加して経口投与することができ、甲殻類、魚類や家畜の免疫力を著しく高めることができる。
【００２１】
これは、通常酵母細胞壁が強固なため、それをそのままの状態で経口投与しても、消化酵素が十分に作用せず免疫活性がある蛋白質が生成しないため免疫増強効果が発現しないのに対し、酵母菌体から特定の条件下で抽出された酵母蛋白は、それ自身が強い免疫増強効果を有するので、甲殻類、魚類や家畜に経口投与することによって免疫増強効果が発現するためであると考えられる。
【００２２】
本発明品を抽出残渣を除去することなく免疫増強剤として用いる場合には、抽出残渣によって免疫活性成分が希釈されるため、少なくとも１５％以上の酵母菌体内蛋白質を抽出することが、免疫効果を得る観点から好ましい。
【００２３】
酵母菌体からの抽出率は以下の計算式により求めることができる。
抽出率（％）＝（抽出上清中のＮ含量／抽出される前の全酵母菌体中のＮ含量）×100
但し、Ｎ含量は、ケルダール（Ｋｊｅｌｄａｈｌ）法にて測定する。
【００２４】
なお、式中における抽出上清は、酵母菌体を抽出した後、遠心分離により抽出残渣と上清に分け、更に抽出残渣を２回蒸留水にて洗滌した後、洗滌液を先の抽出上清に加えたものとする。
【００２５】
本発明の抽出物質には、特に甲殻類、魚類及び家畜の生体防御能すなわち免疫能を増強する作用があり、その結果、甲殻類、魚類及び家畜を細菌又はウィルスの感染から守ることができる。又、不活性化した細菌やウイルスを主体としたワクチンの感染防御効果も増強させることができる。
【００２６】
従って、本発明の物質またはこの物質を有効成分として含む飼料を食餌させることによって、甲殻類、魚類及び家畜の生体防御能を高め、感染症に対する予防効果を発揮させることができる。
【００２７】
本発明品が添加される飼料としては一般に市販されている飼料で良く、とうもろこし、小麦、ひえ、あわ等の穀類、あるいは穀類の副産物として得られるフスマ、ヌカ、豆類、あるいは魚粉、脱脂粉乳といった動植物性素材、ビタミン、無機質等の栄養素材等の原料からなる物である。以下に添加する飼料組成の一例を上げるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００２８】
（甲殻類飼料）
魚粉                ３０．０％
オキアミミール      １５．０
イカミール          ２３．３
小麦粉              １５．０
コーングルテンミル  １０．０
ビール酵母            ３．０
コレステロール        ０．４
ミネラル混合物        ３．０
ビタミン混合物        ０．３
計                １００
（魚類用飼料）
魚粉                ３３．０％
イカミール          １７．０
大豆粕                ７．５
トウモロコシ粕      １２．５
小麦粉              ２２．０
フィードオイル        ５．０
ビタミン混合物        ２．０
ミネラル混合物        １．０
計                １００
（牛用飼料）
小麦                ４０．０％
魚粉                  ５．０
脱脂粉乳            ３３．３
ぶどう糖            １５．０
ビタミン混合物        １．０
ミネラル混合物        ０．５
抗生物質              ０．２
牛脂脂肪酸            ５．０
計                １００
（豚用飼料）
大豆粕              ２７．０％
小麦粉              ６０．７
脱脂粉乳              ５．０
ホエイ                ２．０
大豆油                ２．０
炭カル                ０．５
リンカル              ０．７５
食塩                  ０．３
ビタミン混合液        ０．２５
ミネラル混合液        ０．１
抗生物質              ０．３
Ｌ−リジン            ０．１
計                １００
【００２９】
この効果を有効なものとするためには、飼料中に含有させる本発明品の含有量が０．０５〜１０重量％の範囲であることが好ましい。含有量が０．０５重量％未満では十分な免疫増強活性が発現されず、１０重量％を超えると免疫抑制の作用が心配される。従って効果及びコストを考慮した場合、特に含有量が０．２〜５重量％の範囲であることが好ましい。
【００３０】
本発明における甲殻類としては、商業的に重要な甲殻類、例えばクルマエビ、ウシエビ、コウライエビ、イセエビ、ロブスター、タラバガニ等が挙げられる。又、本発明における魚類としては、ブリ類、タイ類、アジ類、サケ類、ヒラメ、フグ類、カンパチ等の海水魚、コイ、ウナギ、アユ、ティラピア等の淡水魚が挙げられる。それらの感染症としてはビブリオ病、連鎖球菌、類結節病、エドワジエラ病、Bpistylis sp.,Zoothamnium sp. 等の寄生症、あるいはLagenidium sp.,Siropidium sp. 等の真菌症、並びにバキュロウイルス感染症等が挙げられる。本発明における家畜としては豚、牛、馬、羊等が挙げられる。
【００３１】
【発明の効果】
本発明の免疫増強剤は、酵母菌体を酵素処理することにより、酵母菌体内に存在していた不活性な蛋白質を、免疫増強能を有する活性な蛋白質の形で取り出したものであり、高いマクロファージ機能活性化作用及び細菌感染防御作用等を有するにもかかわらず、比較的安価であり、甲殻類、魚類及び家畜の飼料用免疫増強剤として広く使用することができる。
【００３２】
【実施例】
以下、実施例に従って本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【００３３】
実施例１
サッカロマイセス・セレビシェ（ＩＦＯ  １９５４）を５％糖蜜培地を用いて培養し、集菌洗浄後酵母スラリー（菌体濃度１５％）１０００ｍｌを調製した。反応後９０℃、１０分加熱し菌体内酵素を失活させた後に、細胞壁溶解酵素（商品名：ＹＬ−５（天野製薬（株）製））を１. ５ｇ、プロテアーゼ（商品名：アマノＳ（天野製薬（株）製））を０．５ｇ添加し５５℃にて１８時間反応させた。酵素を加熱失活後常法により処理し１４２ｇの本発明品を得た。
酵母から溶出された蛋白質の溶出率は８５％であった。又、上清区分の蛋白質の分子量をゲル濾過法で求めたところ、４万〜１０万であった。
【００３４】
実施例２
トルラ酵母を３％亜硫酸パルプ排液培地を用いて培養し、集菌洗浄後酵母スラリー（菌体濃度１５％）１０００ｍｌを調製した。９５℃、１０分加熱し菌体内酵素を失活させた後、細胞壁溶解酵素（商品名：ツニカーゼ（大和化成（株）製））を１. ８ｇ，プロテアーゼ（商品名：アマノＭ（天野製薬（株）製））を０．５ｇ添加し５０℃にて１５時間反応させた。酵素を加熱失活後、常法により処理し１４０ｇの本発明品を得た。
酵母から溶出された蛋白質の溶出率は９０％であった。又、上清区分の蛋白質の分子量をゲル濾過法で求めたところ、３万〜１２万であった。
【００３５】
以上の実施例１及び２で得られた免疫増強剤を用いて以下のようなマクロファージ活性化試験、カーボンクリアランステスト及び細菌感染防御試験をマウスで調べた。
【００３６】
・マクロファージ活性化試験
チオグリコレート培地で誘導したマウス腹腔内浸出細胞に各試料を添加し、２４時間後の培養上清中のグルコース量を定量し、その消費量からマクロファージに対する活性化作用を測定した。
なお、比較のために市販免疫増強剤についても同時にマクロファージ活性化試験を行った。その結果を図１に示す。
【００３７】
・カ−ボンクリアランステスト
試料を投与したＣＤＦ１マウス（雌６〜７週齢、体重１８〜２３ｇ）の尾静脈中に、２５倍に希釈したカーボン粒子（ロットリングインキで代用）を注入し、注入後１，３及び５分経過した後に、眼底静脈より採取した５０μｌの血液を３ｍｌの０．１％炭酸ナトリウム溶液と混合し、６７５ｎｍの吸光度を測定したときのカーボン粒子の血中消失を指標として食作用係数（Ｋ値）を算出することにより、肝臓と脾臓のマクロファージ機能の測定を行った。
なお、比較のために市販免疫増強剤についても同時にカーボンクリアランステストを行った。その結果を表１に示す。
【００３８】
・細菌感染防御試験
ＣＤＦ１マウス（雌６〜７週齢、体重１８〜２２ｇ）に試料を１２日間経口投与した後、病原性大腸菌（１千万／マウス）を腹腔内に接種し、感染１０日目の生存匹数を求めた。
なお、比較のために市販免疫増強剤についても、同時に本細菌感染防御試験を行った。その結果を表２に示す。
【００３９】
【表１】
0003744020.tif 000002
【００４０】
【表２】
0003744020.tif 000003
【００４１】
実施例３．（クルマエビ血球の貧食活性）
平均体重２０ｇのクルマエビを２０尾ずつ３区に分けた。試験区には、実施例１及び実施例２で得られた試料を市販の飼料に１重量％添加した本発明の飼料を、対照区には実施例１及び２により得られた試料を含まない市販飼料を、いずれも日間給餌率１％の割合で６日間毎日給餌した。尚、使用した市販の飼料の組成は、カゼインが５４重量％、ビール酵母が６重量％、魚粉が５重量％、イカ肝油が３重量％、イカミールが２重量％、グルテンが５重量％、ミネラル混合物が２１重量％、及びビタミン混合物が４重量％であった。
給餌開始前および給餌開始６日後に、抗凝固剤としてのＬ−システインを含む改変１９９培地を用いてエビの心臓と胸洞から採血し、血球を分離した。次いで、得られた血球と蛍光色素をラベルしたラテックスビーズを、２５℃で３０分間反応させ、血球細胞内に取込まれたビーズの数を蛍光顕微鏡で計数し、貧食率、１血球細胞当りの平均取込数、及び、貧食指数を以下の数式から求めて貧食活性値とした。結果は表３に示した通りである。
貧食率＝（ビーズを取込んだ血球数／観察血球総数）×１００
貧食指数＝貧食率×（血球に取込まれたビーズ数／観察したビーズ取込み血球総数）
表３に示した結果から、本発明の飼料を給餌した試験区では、対照区の場合に比較して高い貧食活性が認められた。
【００４２】
【表３】
0003744020.tif 000004
【００４３】
実施例４．（ビブリオ感染防御試験）
平均体重８ｇのクルマエビを２０尾ずつ３区に分けた。２つの試験区には実施例１及び実施例２で得られたものを市販の飼料に１重量％含有させた本発明の飼料を、対照区には実施例１及び２により得られた試料を含まない市販飼料を、いずれも日間給餌率１％の割合で感染開始日の７日前より毎日、日没後に給餌した。
給餌開始８日後から３日間、クルマエビのビブリオ病の病原菌Vibrio sp. PJ の筋肉内接種によってへい死したエビの筋肉を、供試エビ１尾当り０．１ｇとなるように給餌の２時間後に与え、菌を経口感染させた。感染開始から１５日後の生存率を表４に示した。
表４に示した結果から、本発明の飼料を給餌した試験区では、対照区の場合に比較して高い生存率を示すことが実証された。
【００４４】
【表４】
0003744020.tif 000005
【００４５】
実施例５．（コイ頭腎好中球の貧食活性）
平均体重２５ｇのコイを８尾ずつ４区に分けた。試験区には、養鯉用配合飼料に実施例１及び実施例２で得られた試料並びに市販免疫増強剤を１重量％含有させた本発明の飼料を、対照区には実施例１及び２により得られた試料を含まない市販飼料を、いずれも日間給餌率１％の割合で７日間毎日給餌した。投与終了翌日、頭腎より密度勾配遠心により食細胞を単離した。次いで、得られた食細胞と酵母とを２５℃で６０分間反応させ、貧食細胞内に取込まれた酵母数を光学顕微鏡で計数し、貧食率、１貪食細胞当りの平均取込数、及び、貧食指数を以下の数式から求めて貧食活性値とした。結果は表５に示した通りである。
貧食率＝（酵母を取込んだ食細胞数／観察した食細胞総数）×１００
貧食指数＝貧食率×（取込まれた酵母数／観察した食細胞総数）
表５に示した結果から、本発明の飼料を給餌した試験区では、対照区の場合に比較して高い貧食活性が認められた。
【００４６】
【表５】
0003744020.tif 000006
【００４７】
実施例６．（哺乳期子豚白血球の化学発光）
市販哺乳期用豚飼料に、実施例１及び２で得られた本発明品並びに市販免疫増強剤を、投与量が１００ｍｇ／ｋｇ／日になるように添加した飼料を調製した。離乳ランドレース子豚（４週齢）２８頭を７頭ずつ４区に分けて飼育ゲージに収容し、各試料が添加された飼料を１４日間経口投与により摂食させた。なお、対照区は免疫増強剤が添加されていない市販飼料のみを１４日間経口投与により摂食させた。投与終了後頚静脈よりヘパリン加静脈血を採血し、化学発光測定装置（biolumat LB9505)を用いて化学発光（ＣＬ）を測定した。分画した白血球液（２×１０6 ／ｍｌ）１００μｌとルミスフェア分散液（東レテクノ（株）製）１０μｌとをキュベットに入れ、刺激剤としてザイモザンを添加して２０分間化学発光を測定し、２０分間の積算値を求めた。活性は２０分間のＣＬ積算値で評価し、対照を１００としたＣＬ activity で表した。
ＣＬ activity ＝（試験区のＣＬ積算値／対照区のＣＬ積算値）×１００
結果は表６に示した通りである。
表６に示した結果から、本発明品を投与した試験区では高い化学発光がみられ、食細胞の殺菌能が向上していることが確認された。
【００４８】
【表６】
0003744020.tif 000007
【００４９】
実施例７．（哺乳期子牛白血球の化学発光）
市販離乳期子牛用配合飼料に、実施例１及び２で得られた本発明品並びに市販免疫増強剤を投与量が１００ｍｇ／ｋｇ／日になるように添加した飼料を調製した。
母畜から離された３週齢のホルンスタイン幼牛２０頭を５頭ずつ４区に分けて飼育ゲージに収容し、各試料が添加された飼料を１４日間経口投与により摂食させた。なお、対照区は免疫増強剤が添加されていない市販飼料のみを１４日間経口投与により摂食させた。投与終了後頚静脈よりヘパリン加静脈血を採血し、化学発光測定装置（biolumat LB9505)を用いて化学発光（ＣＬ）を測定した。分画した白血球液（２×１０6 ／ｍｌ）１００μｌとルミスフェア分散液（東レテクノ（株）製）１０μｌとをキュベットに入れ、刺激剤としてザイモザンを添加して２０分間化学発光を測定し、２０分間の積算値を求めた。活性は２０分間のＣＬ積算値で評価し、対照を１００としたＣＬ activity で表した。
ＣＬ activity ＝（試験区のＣＬ積算値／対照区のＣＬ積算値）×１００
結果は表７に示した通りである。
表７に示した結果から、本発明品を投与した試験区では高い化学発光がみられ、食細胞の殺菌能が向上していることが確認された。
【００５０】
【表７】
0003744020.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】マクロファージ活性化試験結果
【図１】
0003744020.tif 000009