(57)【要約】  本発明の課題は、多能性幹細胞を三次元培養する方法であって、培地交換の頻度を減少させても、多能性幹細胞が良好な増殖性を維持できる方法を提供することである。本発明によれば、多能性幹細胞を三次元培養する方法であって、多能性幹細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子を常時３５ｎｇ／ｍＬ以上含む培地中において、１．４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の細胞濃度になるまで培養する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を三次元培養する方法であって、
多能性幹細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子を常時３５ｎｇ／ｍＬ以上含む培地中において、１．４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の細胞濃度になるまで培養する方法。
【請求項２】
前記塩基性線維芽細胞成長因子が温度安定性塩基性線維芽細胞成長因子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培養中における塩基性線維芽細胞成長因子の濃度が、培養開始時の塩基性線維芽細胞成長因子の濃度の４０％以上に維持されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
培地、または特定の培地成分の交換または追添を２日間以上の間隔で行う、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
三次元培養の培養開始時における細胞濃度が、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
培養開始時における細胞数に対して、培養開始から４日後における細胞数が５倍以上である、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
多能性幹細胞が、多能性を維持した状態で増殖される、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞を三次元培養する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ；ｉＰＳ細胞とも言う）、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞とも言う）などが知られている。再生医療分野においては、特にｉＰＳ細胞の実用化に向けた研究が進められている。【０００３】
多能性幹細胞の実用化に際しては、多能性幹細胞の三次元大量培養システムを確立することが重要である。非特許文献１には、特定の３次元浮遊撹拌培養装置（バイオリアクター）を用い、適切な撹拌翼の回転数，ｐＨおよび溶存酸素濃度を設定することで、レトロウイルスベクターやエピソーマルベクターなど樹立方法の種類によらず、マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）またはＳＮＬフィーダー細胞上およびマトリゲル、ビトロネクチン、ラミニンＥ８フラグメント上で維持されたヒトｉＰＳ細胞を、単一細胞浮遊状態からｍＴｅＳＲ１（登録商標）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（商品名）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０３を用いて培養することにより、細胞凝集塊形成を介して４日で約５倍、１００ｍＬの培養槽あたり１×１０８個までの未分化細胞増幅が可能となったことが記載されている。【０００４】
また、特許文献１には、アスコルビン酸、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、異種成分不含血清代替物および脂質混合物を含む、無血清および異種成分不含の培地であって、多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持の不在下、未分化状態で維持する能力を有する培地が記載されている。特許文献２には、多能性幹細胞を上記の培地中で培養するステップを含む、多能性幹細胞を未分化状態で増殖・維持する方法が記載されている。さらに、特許文献２には、 塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β−３（ＴＧＦβ３）およびアスコルビン酸を含む、無血清および異種成分不含の培地であって、培地中の上記アスコルビン酸の濃度は、少なくとも約５０μｇ／ｍｌであり、かつここで培地は、多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持の不在下、未分化状態で維持するためのものである、培地が記載されている。特許文献２には、多能性幹細胞を上記の培地中で培養するステップを含む、多能性幹細胞を未分化状態で増殖・維持する方法が記載されている。特許文献３には、ヒト多能性幹細胞の大量生産のための機能ポリマーを含む三次元球状培養システムが記載されている。また、特許文献４には、線維芽細胞増殖因子の熱安定性変異体が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１３−５１０５６７号公報
【特許文献２】特開２０１７−２２５４５６号公報
【特許文献３】特表２０１５−５３０１０４号公報
【特許文献４】特開２０１４−５０７９５１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】生物工学、２０１４年、第９２巻、第９号、４８３−４８６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
多能性幹細胞を三次元で大量培養する際には、通常、細胞数の増加に従い、完全培地に交換、または追添していく方法が行なわれている。完全培地とは、単独で多能性幹細胞を増殖・維持することが可能な培地である。しかしながら、多能性幹細胞の培養のための培地は高価であることから、上記の方法は高コストである。その解決策として、細胞が消費する成分のみを添加することでコストを低減することが行われている。即ち、この培養方法においては、細胞播種時のシード（Ｓｅｅｄ）培地と翌日以降に補給するフィード（Ｆｅｅｄ）培地とを組み合わせて使用する。しかし、多能性幹細胞を三次元で高い細胞濃度に培養するための手段としては、不十分な場合があった。【０００８】
本発明は、多能性幹細胞を三次元培養する方法であって、培地交換、または培地追添の頻度を減少させても、多能性幹細胞が良好な増殖性を維持できる方法を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、多能性幹細胞を三次元培養する際に、多能性幹細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を常時３５ｎｇ／ｍＬ以上含む培地中において、１．４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の細胞濃度になるまで培養することによって、多能性幹細胞の良好な増殖性を維持しつつ多能性幹細胞を三次元培養できることを見出した。本発明は、上記の知見に基づいて完成したものである。【００１０】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  多能性幹細胞を三次元培養する方法であって、
多能性幹細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子を常時３５ｎｇ／ｍＬ以上含む培地中において、１．４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の細胞濃度になるまで培養する方法。
（２）  上記塩基性線維芽細胞成長因子が温度安定性塩基性線維芽細胞成長因子を含む、（１）に記載の方法。
（３）  培養中における塩基性線維芽細胞成長因子の濃度が、培養開始時の塩基性線維芽細胞成長因子の濃度の４０％以上に維持されている、（１）または（２）に記載の方法。
（４）  培地、または特定の培地成分の交換または追添を２日間以上の間隔で行う、（１）から（３）の何れか一に記載の方法。
（５）  三次元培養の培養開始時における細胞濃度が、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である、（１）から（４）の何れか一に記載の方法。
（６）  培養開始時における細胞数に対して、培養開始から４日後における細胞数が５倍以上である、（１）から（５）の何れか一に記載の方法。
（７）  多能性幹細胞が、多能性を維持した状態で増殖される、（１）から（６）の何れか一に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明による多能性幹細胞を三次元培養する方法によれば、培地交換の頻度を減少させても、多能性幹細胞の良好な増殖性を維持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、培養日数と細胞の増殖率の関係を示す。
【図２】図２は、培養日数と培地中のｂＦＧＦ濃度との関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための形態を、詳細に説明する。
本発明による多能性幹細胞を三次元培養する方法は、多能性幹細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子を常時３５ｎｇ／ｍＬ以上含む培地中において、１．４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の細胞濃度になるまで培養する方法である。
【００１４】
＜多能性幹細胞＞
多能性幹細胞とは、３つの胚葉、すなわち、内胚葉、外胚葉および中胚葉の全てに分化する能力を有する細胞を示す。
多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が挙げられる。多能性幹細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が好ましい。
また、多能性幹細胞としては、ヒトまたは霊長動物（例えば、サル）由来の胚性幹細胞が好ましく、ヒト多能性幹細胞がより好ましい。
【００１５】
胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）としては、ヒト胚性幹細胞およびヒト人工多能性幹細胞を使用することが好ましい。
【００１６】
胚性幹細胞としては、妊娠後に形成される胚性組織から得られる細胞（例えば、着床前胚盤胞）、着床後期／原腸形成前期の胚盤胞から得られる拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）、および妊娠期間中の任意の時期、好ましくは妊娠の１０週以前に胎児の生殖器組織から得られる胚性生殖（ＥＧ）細胞が挙げられる。
【００１７】
胚性幹細胞は、周知の方法により入手することができる。例えば、ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚盤胞から単離することができる。ヒト胚盤胞は、ヒト体内着床前胚または体外受精（ＩＶＦ）胚から得られる。あるいは、単細胞ヒト胚は、胚盤胞期まで増殖させることができる。 拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）は、受精の少なくとも９日後の原腸形成前期の胚盤胞から入手することができる。また、胚性生殖（ＥＧ）細胞は、ヒト胎児の場合には妊娠から約８〜１１週目の胎児から得られる始原生殖細胞から調製することができる。
【００１８】
また、市販の胚性幹細胞を使用することも可能である。ヒト胚性幹細胞は、例えば、ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）ヒト胚性幹細胞レジストリー（ＮＩＨ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｇｉｓｔｒｙ）（ｗｗｗ．ｅｓｃｒ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から購入することができる。
【００１９】
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、体細胞に初期化因子を導入することにより得られる多能性幹細胞である。
【００２０】
体細胞としては、特に限定されず、任意の体細胞を利用することができる。例えば、胎児期の体細胞のほか、成熟した体細胞を用いてもよい。体細胞としては、例えば、（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）線維芽細胞（皮膚細胞等）、上皮細胞、肝細胞、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞）、内皮細胞、筋肉細胞、毛細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞、皮膚細胞等の分化した細胞が挙げられる。
【００２１】
体細胞の由来となる生体としては、特に限定されないが、例えば、ヒト、非ヒト動物（例えば、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス）が挙げられる。好ましくは、ヒトである。
【００２２】
体細胞に導入される初期化因子としては特に限定されないが、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ２、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ５、Ｌｉｎ２８、Ｔｅｒｔ、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−１、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、β−カテニン、ＥＣＡＴ１、Ｅｓｇ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌｌ４、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、Ｇｒｂ２、Ｐｒｄｍ１４、Ｎｒ５ａ１、Ｎｒ５ａ２、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎが挙げられる。ここで、これらの遺伝子群の中から２以上の遺伝子を選択して任意に組み合わせて導入することができる。なかでも、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃを少なくとも有する組み合わせ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびＬ−Ｍｙｃを少なくとも有する組み合わせ、またはＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８を少なくとも有する組み合わせが好ましい。
【００２３】
また、導入する遺伝子の種は、導入先の細胞の種と同一であることが好ましい。例えば、ヒト由来の細胞へ導入される遺伝子はヒト遺伝子であることが好ましい。例えば、ヒト由来の体細胞へ導入される遺伝子としては、ヒトＯｃｔ３／４、ヒトＳｏｘ２、ヒトＫｌｆ４およびヒトｃ−Ｍｙｃを少なくとも有する組み合わせ、ヒトＯｃｔ３／４、ヒトＳｏｘ２、ヒトＫｌｆ４およびヒトＬ−Ｍｙｃを少なくとも有する組み合わせ、またはヒトＯｃｔ３／４、ヒトＳｏｘ２、ヒトＮａｎｏｇおよびヒトＬｉｎ２８を少なくとも有する組み合わせが好ましい。
【００２４】
初期化因子の遺伝子は、遺伝子発現ベクターを用いて体細胞に導入することができる。遺伝子発現ベクターとしては、特に限定されないが、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、人工染色体ベクター、トランスポゾンベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、センダイウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。
【００２５】
体細胞に初期化因子を導入して得られる未分化細胞であって、特定の分化細胞に分化する能力が相対的に低い細胞は、体細胞に初期化因子を導入することによって自ら作製してもよいが、研究機関や企業から提供または販売されている細胞を入手してもよい。即ち、本発明における第一の工程は、人工多能性幹細胞バンクから人工多能性幹細胞を得る工程でもよい。
【００２６】
例えば、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社から提供されているｉＰＳ細胞を入手して使用することができる。
また、京都大学ｉＰＳ細胞研究所から提供されている２０１Ｂ７、２５３Ｇ１、２５３Ｇ４、１２０１Ｃ１、１２０５Ｄ１、１２１０Ｂ２、１２３１Ａ３、１３８３Ｄ２、１３８３Ｄ６、ｉＰＳ−ＴＩＧ１２０−３ｆ７、ｉＰＳ−ＴＩＧ１２０−４ｆ１、ｉＰＳ−ＴＩＧ１１４−４ｆ１、ＣｉＲＡ０８６Ａｉ−ｍ１、ＣｉＲＡ１８８Ａｉ−Ｍ１、またはｉＲＡ１８８Ａｉ−Ｗ１を入手して、使用することができる。
【００２７】
さらに、ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）やＣａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂａｎｋ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ等が作成しているｉＰＳ細胞バンクから入手することもできる。
【００２８】
＜三次元培養＞
三次元培養とは、細胞を播種後に立体的に培養する方法であり、シャーレなどの容器平面上に細胞を接着させて培養する二次元培養とは異なる。三次元培養では、細胞は自発的に立体的な細胞塊、もしくはスフェロイドを形成することができるが、細胞外マトリクスやマイクロキャリアなどの外部基質を介する方法を使用することもできる。三次元培養では細胞塊は液体培地中に浮遊している。浮遊培養とは、多能性幹細胞が、基質の表面に付着するのではなく、培地中に懸濁されている状態での培養である。即ち、浮遊培養においては、浮遊力を得るために培地を撹拌したり、培地中に浮遊力を獲得するためのポリマーを添加することもできる。例えば特許文献３には、セルソースナノフィブリルを含む培地中で、多能性幹細胞を無撹拌状態で三次元培養する方法が開示されている。
【００２９】
＜塩基性線維芽細胞成長因子＞
本発明においては、塩基性線維芽細胞成長因子を常時３５ｎｇ／ｍＬ以上含む培地中において多能性幹細胞の培養を行う。
塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２またはＦＧＦ−βと表記される場合もある）は、線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバーである。
【００３０】
塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２またはＦＧＦ−βとしても既知）は、線維芽細胞成長因子ファミリーに属する一種のサイトカインであり、創傷時における線維芽細胞の増殖や血管新生等の機能を有する。本発明においては細胞の未分化維持に寄与する作用を有している。本発明で使用するｂＦＧＦとしては、天然由来のｂＦＧＦ、化学合成したｂＦＧＦ、または遺伝子組換えｂＦＧＦの何れでもよい。例えば、ヒトｂＦＧＦのアミノ酸配列および塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１９９７．５およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２００６．４として登録されている。ｂＦＧＦは、各種の市販品を使用することもできる。
なお、本発明において使用する培地については後記するが、市販の培地にｂＦＧＦが既に含まれている場合には、そのような市販の培地をそのまま使用すればよい。
【００３１】
本発明においては、塩基性線維芽細胞成長因子としては、温度安定性塩基性線維芽細胞成長因子を含むことが好ましい。温度安定性塩基性線維芽細胞成長因子とは、温度安定性、即ち耐熱性を有する塩基性線維芽細胞成長因子である。天然ｂＦＧＦは３７℃の培養環境下では速やかに分解するが、アミノ酸配列の一部に変異を導入することによって温度安定性を付与した塩基性線維芽細胞成長因子を作製できることが知られている。例えば特許文献４には、ｂＦＧＦの特定のアミノ酸を置換（Ｑ６５Ｌ、Ｑ６５Ｉ、Ｑ６５Ｖ、Ｎ１１１Ａ、Ｎ１１１Ｇ、Ｃ９６Ｓ、およびＣ９６Ｔ）した変異体を作成することで、温度安定性を付与することができることが開示されている。
【００３２】
「塩基性線維芽細胞成長因子を常時３５ｎｇ／ｍＬ以上含む」とは、培養期間中において、塩基性線維芽細胞成長因子の濃度が、常に３５ｎｇ／ｍＬ以上に保たれていることを意味し、塩基性線維芽細胞成長因子が消費、または分解されることにより３５ｎｇ／ｍＬ未満になる状態が存在しないことを意味する。本発明においては、培地中における塩基性線維芽細胞成長因子の濃度が常時３５ｎｇ／ｍＬ以上であることにより、即ち、培地中における塩基性線維芽細胞成長因子の濃度が３５ｎｇ／ｍＬ未満になる状態を生じさせないことにより、多能性幹細胞が良好な増殖性を示すことができるようになる。
【００３３】
塩基性線維芽細胞成長因子を常時、好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ以上、最も好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ以上含む培地中において多能性幹細胞の培養を行う。なお、培地中の塩基性線維芽細胞成長因子の濃度の上限は特に限定されないが、一般的には、３００ｎｇ／ｍＬ以下であり、好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ以下であり。より好ましくは１５０ｎｇ／ｍＬ以下である。
【００３４】
培地中の塩基性線維芽細胞成長因子の濃度は、多能性幹細胞の培養液を一部サンプリングし、Ｈｕｍａｎ  ｂＦＧＦ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ社）などを用いて定量することができる。
【００３５】
本発明においては、培養中における塩基性線維芽細胞成長因子の濃度が、培養開始時の塩基性線維芽細胞成長因子の濃度の４０％以上に維持されていることが好ましく、５０％以上に維持されていることがより好ましく、６０％以上に維持されていることがさらに好ましく、７０％以上に維持されていることが特に好ましく、８０％以上に維持されていることが最も好ましい。
【００３６】
＜培地、または特定の培地成分の交換または追添＞
本発明においては、培地、または特定の培地成分の交換または追添を２日間以上実施しないことが好ましく、３日間以上実施しなくてもよく、４日間以上実施しなくてもよい。本発明においては、培地、または特定の培地成分の交換または追添を、好ましくは２日間以上、より好ましくは３日間以上、さらに好ましくは４日間以上の間隔で行うことができる。特定の培地成分としては、特に限定されないが、例えば、塩基性線維芽細胞成長因子を挙げることができる。
【００３７】
＜細胞濃度および細胞数＞
本発明においては、多能性幹細胞を１．４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の細胞濃度になるまで培養する。多能性幹細胞は、好ましくは１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、より好ましくは１．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、さらに好ましくは２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、さらに好ましくは２．３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、さらに好ましくは２．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、さらに好ましくは３．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、さらに好ましくは３．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の細胞濃度になるまで培養することができる。
多能性幹細胞の細胞濃度の上限は特に限定されないが、一般的には、１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であり、好ましくは、５．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である。
【００３８】
本発明においては、必要とする多能性幹細胞の細胞数に応じて、培養量は適宜選択することができる。
三次元培養の培養開始時における細胞濃度は、好ましくは１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であり、より好ましくは５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である。
【００３９】
細胞濃度および細胞数は以下の方法で測定することができる。培養容器内の細胞塊を一部回収し、Ｄ−ＰＢＳ（ダルベッコＰＢＳ；ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水を示す）で洗浄した後、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（商品名）を添加して３７℃、５分処理して細胞をシングルセルに分離し、常法にて細胞濃度を計測する。培養ボリュームからフラスコ内の細胞数を求めることができる。
【００４０】
＜増殖率＞
本発明においては、培養開始時（Ｄａｙ０）における細胞数に対して、培養開始から４日後（Ｄａｙ４）における細胞数が５倍以上であることが好ましく、１０倍以上であることが好ましく、１３倍以上であることがより好ましく、１４倍以上であることがさらに好ましく、２０倍以上であることがさらに好ましく、２３倍以上であることがさらに好ましい。
【００４１】
本発明においては、培養開始時（Ｄａｙ０）における細胞数に対して、培養開始から８日後（Ｄａｙ８）における細胞数が５倍以上であることが好ましく、１００倍以上であることが好ましく、２００倍以上であることがより好ましく、３００倍以上であることがさらに好ましく、４００倍以上であることがさらに好ましく、５００倍以上であることがさらに好ましい。
【００４２】
＜培地＞
本発明で用いる培地としては、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）などの市販の培地を使用することができる。但し、温度安定性塩基性線維芽細胞成長因子が含まれているという点から、ＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）を使用することが好ましい。
あるいは、例えば、基礎培地として、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭとＦ１２の混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＝１：１）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商品名）Ｄ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを使用してもよい。上記した基礎培地を使用する場合には、代替血清（ＫＳＲ；Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商品名）Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、Ｌ−グルタミン、２−メルカプトエタノール、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン、ピューロマイシン、マイトマイシン）等の添加成分を任意に組み合わせて上記の基礎培地に添加し、さらに塩基性線維芽細胞成長因子（好ましくは、温度安定性塩基性線維芽細胞成長因子）を添加した培地を使用することができる。温度安定性塩基性線維芽細胞成長因子は、例えばＦＧＦ-Ｂａｓｉｃ−ＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ；ＨｕｍａｎＺｙｍｅ）を使用できるが、これに限定されない。
【００４３】
本発明で用いる培地の条件としては、好ましくは、無血清培地であり、かつ無フィーダー細胞培地である。
【００４４】
＜培養条件＞
本発明における多能性幹細胞の培養条件としては、３７℃、５％ＣＯ２条件下などが好ましいが、特に限定されない。また、培養は、攪拌培養が好ましく、回転数は特に限定されないが、好ましくは１０ｒｐｍ〜１００ｒｐｍであり、より好ましくは２０ｒｐｍ〜６０ｒｐｍであり、さらに好ましくは３０ｒｐｍ〜５０ｒｐｍである。
【００４５】
多能性幹細胞を三次元培養するために使用される培養容器は、特に限定されず、任意の組織培養容器を使用することができるが、培養容器の中で培養される多能性幹細胞が内部表面に接着または付着できないように設計された内部表面を有する容器を使用してもよい。
【００４６】
多能性幹細胞の三次元培養は、温度、撹拌速度、ｐＨ、およびＣＯ２濃度などの培養パラメータが制御された培養系において行うことができる。好ましくは、上記培養パラメータの制御は、好適なデバイスを使用して自動的に実行することができる。培養容器としては、特に限定されないが、３０ｍＬシングルユースバイオリアクターまたは１００ｍＬシングルユースバイオリアクター（エイブル社）等を使用することができる。
【００４７】
＜本発明の具体例＞
多能性幹細胞（好ましくはｉＰＳ細胞、より好ましくはヒトｉＰＳ細胞）を、増殖用培地であるｍＴｅＳＲ１（登録商標）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、およびＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コートしたプレート上で、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内で培養する。培地は播種翌日を除き、毎日新しい培地に交換する。なお、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コートしたプレートの代わりに、フィーダー細胞をコートしたプレートを使用してもよい。フィーダー細胞としては、特に限定されないが、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）、マウス胎児繊維芽細胞（ＳＴＯ細胞）が挙げられる。
【００４８】
上記の方法で培養した多能性幹細胞を、プロテアーゼ（例えば、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）など）で処理することにより、細胞をシングルセルまで分離する。細胞数を測定した後、ｂＦＧＦ（好ましくは、温度安定性ｂＦＧＦ）を含む培地（特に好ましくは、ＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）中に０．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好ましくは０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、例えば、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるように細胞を調整する。得られた細胞懸濁液を、培養容器に添加し、攪拌培養する。回転数は１０〜１００ｒｐｍに設定し、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内で培養する。
【００４９】
上記のようにして撹拌培養を開始した後、培地の交換は適当なスケジュールで行うことができる。但し、上記した通り、本発明においては、培地、または特定の培地成分の交換または追添を２日間以上実施しないことが好ましく、３日間以上実施しなくてもよく、４日間以上実施しなくてもよい。
【００５０】
培地交換する場合には、所定の細胞数（一例としては、１．５×１０６ｃｅｌｌｓ分）の細胞塊を回収し、遠心分離にて培地を除去する。多能性幹細胞塊を酵素的に消化するための酵素（例えば、Ｇｅｎｔｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｓｉａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を添加して処理した後、処理液を濾過器（例えば、３７μｍ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社））に所定のスピードで投入し、物理的に細胞塊を細分化することができる。遠心分離にて上清を分離した後、新しい培地を添加して再懸濁し、適当な細胞濃度（０．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好ましくは０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、例えば、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）になるように細胞を調整する。上記により得られた培養液を再度、培養容器内に添加して培養することができる。
【００５１】
＜多能性の維持＞
本発明によれば、多能性幹細胞を、多能性を維持した状態で（即ち、未分化状態で）増殖することができる。
本発明においては、多能性幹細胞をモニタリングして、多能性を評価してもよい。
多能性（または分化状態）の評価は、例えば、形態学的評価、および／または多能性（未分化）マーカーの発現解析（ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）、ｃＤＮＡマイクロアレイ分析、フローサイトメトリー、免疫組織化学など）などの手法により行うことができる。
【００５２】
例えば、培養中の細胞を一部サンプリングすることにより得た細胞からＲＮＡを回収し、回収したＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することにより得られたｃＤＮＡを用いてリアルタイム定量ＰＣＲにより遺伝子発現量を評価することができる。
【００５３】
多能性（未分化）マーカー（多能性関連遺伝子）の具体例としては、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＰＯＵ５Ｆ１、ＤＮＭＴ３ＢおよびＬＩＮ２８などを挙げることができるが、特に限定されない。
マーカー名は以下を示す。
Ｓｏｘ：ＳＲＹ−ｂｏｘｅｓ
ＰＯＵ５Ｆ１：ＰＯＵ  ｄｏｍａｉｎ，  ｃｌａｓｓ  ５，  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １
ＤＮＭＴ３Ｂ：ＤＮＡ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ−５−）−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ３  ｂｅｔａ
【００５４】
本発明の方法で培養された多能性幹細胞における上記した多能性（未分化）マーカーの発現量は、未分化対照と数倍程度の変動にとどまり、発現レベルはほとんど変動していないことが、後記する実施例において確認された。
【００５５】
＜多能性幹細胞の分化＞
本発明の方法により培養された多能性幹細胞は、その培養後に、多能性幹細胞の胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ：ＥＢ）への分化に適した培養条件下に置くことができる。
【００５６】
本発明の方法により培養された多能性幹細胞は、その培養物から取り出され、血清または血清代替物を含有しかつ分化阻害因子を含有しない培地の存在下で浮遊培養することにより、ＥＢを形成させることができる。
【００５７】
ＥＢの形成のモニタリングは、常法により、形態学的評価（例えば組織学的染色）および分化特異的マーカーの発現の判定により、実施できる。分化特異的マーカーの発現の判定は、免疫学的測定またはＲＮＡ発現分析（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ｃＤＮＡマイクロアレイ）により行うことができる。
【００５８】
ＥＢの細胞はさらに、系統特異的細胞の分化および／または増殖に適した培養条件下に置くことにより、系統特異的細胞を得ることができる。「系統特異的細胞の分化および／または増殖に適した培養条件」は、培養系（例えば、フィーダー細胞層、無フィーダーマトリックスまたは浮遊培養の何れか）と、系統特異的細胞の分化および／または増殖に適した培地との組み合わせにより構築することができる。なお、系統特異的細胞とは、外胚葉、内胚葉または中胚葉の何れかの細胞種である。
【００５９】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６０】
＜実施例１＞
（１）ｉＰＳ細胞の培養１
ヒトｉＰＳ細胞（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社より分譲）は、増殖用培地であるｍＴｅＳＲ１（登録商標）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、およびＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コートしたプレート上で、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内で培養した。培地は播種翌日を除き、毎日新しい培地に交換した。培養４日後に継代を行った。継代操作は、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）で７〜８分程度処理して細胞を剥離し、ピペッティング操作にて細胞を適切なサイズに分離することで実施した。継代操作後、さらに４日間培養を行った。【００６１】
（２）ｉＰＳ細胞の培養２
上記の方法で培養したｉＰＳ細胞に対し、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（商品名）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）を添加して３７℃、５分処理し、細胞をシングルセルまで分離した。常法にて細胞数を測定した後、終濃度１ｍｍｏｌ／ＬのＹ−２７６３２（和光純薬工業社）を含むｍＴｅＳＲ１（登録商標）培地、もしくはＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）中に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるように細胞を調整した。なお、ｍＴｅＳＲ１（登録商標）培地中に含まれるｂＦＧＦは天然型ｂＦＧＦの配列を模倣したリコンビナントタンパク質であり、ＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）中に含まれるｂＦＧＦは温度安定性を付与する改変を加えたリコンビナントタンパク質である。これらの細胞懸濁液を３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（エイブル社）内に１５ｍＬ添加し、専用の６チャンネルマグネチックスターラーで撹拌培養した。回転数は４０ｒｐｍに設定し、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内で培養した。【００６２】
（３）ｉＰＳ細胞の培養３
撹拌培養開始以降、表１に記載のスケジュールで培地を全量交換した。培養開始４日後、フラスコ内の細胞塊を一部回収し、下記に示す方法で細胞数を計測した。まずＤ−ＰＢＳ（ダルベッコＰＢＳ；ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水を示す）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）で洗浄した後、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（商品名）を添加して３７℃、５分処理して細胞をシングルセルに分離した。常法にて細胞濃度を計測した後、培養ボリュームからフラスコ内の細胞数を計算した。得られた細胞濃度の情報から１．５×１０６ｃｅｌｌｓ分の細胞塊を回収し、遠心分離にて培地を除去した。Ｇｅｎｔｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｓｉａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を添加して室温で７分処理した後、処理液を３７μｍ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に１ｍＬ／分のスピードで投入し、物理的に細胞塊を細分化した。遠心分離にて上清を分離した後、終濃度１ｍｍｏｌ／ＬのＹ−２７６３２を含むｍＴｅＳＲ１培地、もしくはＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）培地を１５ｍＬ添加して再懸濁し、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度になるように細胞を調整した。同培養液を再び３０ｍｌシングルユースバイオリアクター内に３０ｍＬ添加し、上記の「（２）ｉＰＳ細胞の培養２」と同様に培養した。【００６３】
【表１】
2019181999.tif 000002
【００６４】
培養８日後、上記の「（３）ｉＰＳ細胞の培養３」と同様の方法で細胞濃度、および細胞数を計測し、培養５日後（Ｄａｙ４）の細胞数の結果とあわせて増殖曲線を作成した。培養開始時点での細胞数を１とした時の相対細胞数を増殖率として計算した結果を図１に、培養過程の細胞濃度と細胞数の推移の結果を表２に示す。また一部サンプリングした細胞に対してＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＲＮＡを回収し、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。得られたｃＤＮＡをＴａｑｍａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）、および表３に記載のＴａｑｍａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いてｑＰＣＲにより遺伝子発現量を評価した。表３のAssay IDに示すものは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社のＴａｑｍａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙにて、ある遺伝子のＰＣＲを行うためのＰｒｏｂｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔのコード名である。比較は△△ＣＴ法（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ＣＴ法）にて行い、撹拌培養開始前のｉＰＳ細胞をリファレンスとして定量した（未分化対照）。また未分化を逸脱した対照群として、ｉＰＳ細胞をＥｓｓｅｎｔｉａｌ６（商品名）培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）で２週間培養し、自発的分化を促した細胞を使用した（分化対照）。結果を表４に示す。表４における数値は、未分化対照における遺伝子発現量を１．０００とした場合の相対発現量を示す。【００６５】
【表２】
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【００６６】
【表３】
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【００６７】
【表４】
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【００６８】
図１および表２の結果から、ｍＴｅＳＲ１（登録商標）培地中で培養したｉＰＳ細胞は培地交換の頻度を下げることで増殖性が減少していく傾向にあるのに対し、ＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）培地中で培養したｉＰＳ細胞はいずれも良好な増殖性を示し、培地交換を実施しなかった実施例３は、ｍＴｅＳＲ１（登録商標）で毎日培地交換した比較例１と比較して、より増殖性が高いことが明らかとなった。またＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）中で培養した細胞塊は最終的に最大３．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬという非常に高い細胞濃度の細胞培養液が得られることがわかった。【００６９】
また表４の結果から、これらの条件で培養したｉＰＳ細胞の細胞塊の多能性関連遺伝子（ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＰＯＵ５Ｆ１、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＬＩＮ２８）の発現量は未分化対照と数倍程度の変動にとどまり、発現レベルはほとんど変動していないことが確認された。【００７０】
以上から、温度安定性を付与したｂＦＧＦを含むＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）培地でｉＰＳ細胞を浮遊培養することによって、培地交換の頻度を減少させても良好な増殖性を示し、かつｉＰＳ細胞としての性質を維持したまま高い細胞濃度の細胞培養液が得られることがわかった。【００７１】
＜実施例２＞培地中のｂＦＧＦの定量
上記の「（２）ｉＰＳ細胞の培養２」および「（３）ｉＰＳ細胞の培養３」の方法で培養したｉＰＳ細胞の培養液を一部サンプリングし、Ｈｕｍａｎ  ｂＦＧＦ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ社）を用いて培地中のｂＦＧＦ量を定量した。結果を図２に示す。【００７２】
図２の結果から、ｍＴｅＳＲ１（登録商標）中のｂＦＧＦは培養１日で２０ｎｇ／ｍＬ以下に低下してしまうことがわかる。これは天然型ｂＦＧＦの培地中での安定性が低いことが要因であり、フラスコ内のｉＰＳ細胞はｂＦＧＦによる増殖刺激を常時受けられていないと考えられる。一方、ＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）中のｂＦＧＦはいずれの条件においても常時３５ｎｇ／ｍＬ以上の濃度を維持しており、フラスコ内のｉＰＳ細胞が持続的にｂＦＧＦによる増殖刺激を受け続けていると考えられる。以上から、ｂＦＧＦを培養中常時３５ｎｇ／ｍＬ以上の濃度に維持することが、ｉＰＳ細胞の増殖改善に有効であることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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