(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
沈降度が６５〜８６、含水率が６７％以下で、かつ冷凍耐性または冷蔵耐性を有する３または４倍体酵母サッカロミセス・セルビシェ。
【請求項２】
沈降度が６５〜８６、含水率が６７％以下、成型量が０．９〜１．３（ｋｇ／ｈ）で、かつ冷凍耐性または冷蔵耐性を有する３または４倍体酵母サッカロミセス・セルビシェ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のサッカロミセス・セルビシェを含有する生地。
【請求項４】
請求項３に記載のサッカロミセス・セルビシェを含有する生地を用いるパンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はパン酵母およびこれを含有する生地ならびに該生地を用いるパンの製造法に関する。該パン酵母は３または４倍体酵母であり、冷凍耐性または冷蔵耐性に優れた酵母である。
【０００２】
【従来の技術】
近年、製パン業界では、省力化による製造工程の合理化や焼きたてパンに対する消費者のニーズなどに応えるため、冷凍生地製パン法または冷蔵生地製パン法が行われている。
冷凍生地製パン法とは、一部発酵させた生地を−20〜−30℃の冷凍庫に貯蔵しておき、それを必要なときに解凍させ、発酵、ホイロをとって焼成するものである。また、冷蔵生地製パン法とは、一部発酵させた生地を、発酵を抑さえながら低温に貯蔵した後、必要なときに発酵、ホイロをとって焼成するものである。これらの製パン法は、いずれも特殊なパン酵母を用いて行われる。即ち、冷凍生地製パン法には、生地中で長期間の凍結に耐え、解凍後にも正常なパン生地膨張力をもつ、いわゆる、「冷凍耐性酵母」が使用されている。また、冷蔵生地製パン法には、生地中で低温貯蔵されている間は発酵が抑制され、発酵およびホイロの温度帯では正常にパン生地膨張力を回復する、いわゆる、「冷蔵耐性酵母」が使用されている。これらの特殊なパン酵母には、通常のパン酵母以上に、高性能を保つための配慮が必要である。
【０００３】
酵母細胞の大きさは倍数性によって変わることは周知のことであり、倍数性が上がるにつれて細胞の体積は増加する。このことを利用して、トルラスポラ・デルブルッキに属する１倍体の冷凍耐性酵母を２倍体にし、細胞を大きくすることは知られている（特開昭60ー221079 号公報) 。
パン製造に使用されているサッカロミセス・セレビジエの冷凍耐性酵母は、通常、２倍体が使用されている。これまで、サッカロミセス属の冷凍耐性酵母については、凍結、解凍後の発酵力や製パン適性の向上を目的として酵母の改良が行われている（例えば、特公昭59-25584号公報、特公昭59-48607号公報、特開昭59-203442号公報、特開昭62-208273号公報、特開昭63-294778号公報、特開平3-285673号公報、特公平4-20595号公報）が、その酵母の倍数性を３倍体以上に上げてパン酵母製造工程の改善とパン酵母の品質向上を図った具体例は知られていない。
【０００４】
また、サッカロミセス属の冷蔵耐性酵母も、通常、２倍体が使用されており、低温貯蔵後の発酵力や製パン適性の向上を目的として酵母の改良が行われている（例えば、特開平4-234939号公報、特開平5-76348号公報、特開平5-284896号公報、特開平5-336872号公報、特開平7-79767号公報）が、その酵母の倍数性を３倍体以上に上げてパン酵母製造工程の改善とパン酵母の品質向上を図った具体例は知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、３または４倍体酵母で、冷凍耐性または冷蔵耐性に優れた酵母サッカロミセス・セルビシェを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、沈降度が６５以上、含水率が６７％以下、成型量が０．９（ｋｇ／ｈ）以上で、かつ冷蔵耐性または冷凍耐性を有する３または４倍体酵母サッカロミセス・セルビシェおよびこれを含有する生地ならびに該生地を用いるパンの製造法に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明に使用される酵母、即ち沈降度が６５以上、好ましくは６５〜１００、含水率が６７％以下、好ましくは５０〜６７％、成型量が０．９（ｋｇ／ｈ）以上、好ましくは０．９〜１．５（ｋｇ／ｈ）、で、かつ冷蔵耐性または冷凍耐性を有する３または４倍体酵母は、例えば、自然界からの分離菌株、研究機関等の保存菌株、細胞融合株から選択してもよいが、通常は交雑株が選択される。
【０００８】
交雑株は、例えば希少交配法によって得られる。この方法は、２倍体細胞中に発生するａ接合型細胞またはα接合型細胞と１倍体細胞との交雑を行わせ、生じた３倍体交雑株を選択するものである。または、２倍体細胞中に発生するａ接合型細胞と同じくα接合型細胞との交雑を行わせ、生じた４倍体交雑株を選択するものである。その場合に、例えば、一方の親株を栄養要求性に、他方の親株を呼吸欠損性にしておくなど、それぞれの親株に異なるマーカーを付与することによって、交雑株の選択を容易にすることができる。
【０００９】
具体的な酵母としては、ブダペスト条約に基づいて平成８年２月１５日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されているサッカロミセス・セルビシェＦＴ３−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５３９７）、ＦＴ４−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５３９８）、ＲＺ３−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５３９９）、ＲＺ４−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４００）等があげられる。
【００１０】
本発明でいう冷凍耐性とは、酵母を含むパン生地を凍結保存（例えば、−２０℃、７〜３０日間）し、それを解凍した後でも商品価値のあるパンが焼ける酵母の能力をいう。また、冷蔵耐性とは、酵母を含むパン生地を、それが凍結しない範囲の低温（例えば、０〜１０℃）で貯蔵（例えば、４〜１０日間）された後でも、商品価値のあるパンが焼ける酵母の能力をいう。
【００１１】
以下に、希少交配法による交雑株の取得法について説明する。
希少交配法による交雑株の選択を容易にするために、例えば、一方の親株には栄養要求性を付与し、他方の親株には呼吸欠損性を付与する。
栄養要求性変異株の分離は、例えば次のように行う。まず、細胞集団を常法どおり紫外線照射等によって変異誘発処理を行った後、栄養培地、例えば、YPDU培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース、0.005％ウラシル）で１２時間培養する。それを集菌、洗浄し、FOA培地（0.1％フルオロオロチン酸、0.005 ％ウラシル、0.67％イースト・ナイトロジェン・ベース、２％グルコース、２％寒天）に塗布した後、30℃で３〜５日間培養し、コロニーを形成させる。そのコロニーを最少培地（0.67％イースト・ナイトロジェン・ベース、２％グルコース、２％寒天）にレプリカし、そのなかからウラシル要求性を示すコロニーを選択する。
【００１２】
一方、呼吸欠損性変異株の分離は、例えば、次のように行う。酵母細胞をエチジウム・ブロマイド含有培地（５μg ／mlエチジウム・ブロマイド、１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース、２％寒天）に塗布し、30℃で3 日間培養してコロニーを形成させる。そのなかからコロニーの形が小さめで、色白のものを選択する。それが呼吸欠損性であることは、グリセロール培地（0.67％イースト・ナイトロジェン・ベース、３％グリセロール、２％寒天）等に成育できないことから確認できる。
【００１３】
３倍体の菌体を作成するための交雑は、例えば、次のように行う。栄養要求性をもつ２倍体の親株と呼吸欠損性をもつ１倍体の親株とを、YPDU培地等の栄養培地に、ほぼ１対１の割合で接種し、30℃で１日間培養する。それを殺菌水で適当に希釈し、グリセロール培地に塗布した後、２日間培養し、生育した３倍体コロニーを分離する。それが３倍体の交雑株であることは、必要によっては、常法どおりパルスフィールド電気泳動によって染色体DNAの分離パターンを調べ、または、細胞核のDNAをプロピヂウム・イオダイド等を用いて蛍光染色した後、フローサイトメトリーで細胞当りのDNA含有量を測定し、親株と比較することによって判定することができる。なお、親株の組み合わせが栄養要求性の１倍体と呼吸欠損性の２倍体に変わっても、同じ目的が達成できる。
【００１４】
一方、４倍体の菌株を作成するための交雑も親株を２倍体の栄養要求性変異株と２倍体の呼吸欠損変異株とに変えるだけで、上記と同様に行うことができる。
次に、酵母菌体の沈降度、含水率、成型量の測定に用いる酵母は、次のようにして得ることができる。即ち、５Lジャーファーメンターに水1.8L、塩化アンモニウム42g、燐酸一カリウム14g、硫酸マグネシウム3.1gを加え、120℃で20分間の殺菌を行う。冷却後、酵母の種培養400mlを接種し、120℃で5分間殺菌した糖蜜培地（全糖濃度48%）800mlを用いて、30℃で30時間の流加培養を行う。培養中のpHはアンモニア水で5.0に調整する。培養液を遠心分離した後、菌体を集め、これを洗浄後、脱水して得られる。
【００１５】
（１）酵母細胞の大きさ（相対値）の測定は、次のように行う。
酵母をＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース）に30℃で36時間、好気的に培養する。得られた酵母細胞を脱イオン水に懸濁し、超音波発振機（トミー精工製ウルトラソニック・デイスラプター）にかけてよく分散させ、40μmのナイロンメッシュで濾過した後、それをフローサイトメーター（コールター社製エッピクス・エリート）にかけ、前方散乱光を測定して粒度分布図を得る。その分布図に基づいて最大度数を与える目盛り（Ｍ値）を求める。なお、対照として、サッカロミセス・セレビジエX2180-1B株（1倍体）［イースト・ジェネテック・ストック・センター（米国）より入手］およびサッカロミセス・セレビジエX2180D株（2倍体）［サッカロミセス・セレビジエX2180-1A株（１倍体）（イースト・ジェネテック・ストック・センターより入手）とサッカロミセス・セレビジエX2180-1B株（1倍体）との交雑株］の菌株についても、同様に測定する。
【００１６】
その結果を表１す。
【００１７】
【表１】
0003821507.tif 000002
【００１８】
表から、後述する実施例で得られるFT3-1 、RZ3-1 、FT4-1 およびRZ4-1 はFRZ およびREIZO にくらべて明らかに大きなＭ値を与え、細胞が大型であることがわかる。
（２）酵母菌体の沈降度の測定は、次のように行う。
各菌体の培養液10mlをガラス製遠心管にとり、遠心分離機（トミー精工製LCO6-SP）にかけ、1000rpmで２分30秒間遠心分離する。遠心分離後、上部液の液面から４mlをピペットにとり、その吸光度OD660（Ｂ）を測定する。あらかじめ、遠心分離前の吸光度（Ａ）を測定しておき、次式に従って沈降度を求める。それぞれの吸光度の測定は脱イオン水で５００倍に希釈した後行う。
【００１９】
【数１】
0003821507.tif 000003
【００２０】
なお、比較のためダイヤイーストＦＲＺおよびダイヤイーストＲＥＩＺＯについても、同様に求める。
その結果を表２に示す。
【００２１】
【表２】
0003821507.tif 000004
【００２２】
（３）酵母菌体の含水率の測定は、次のように行う。
各菌体の培養液400mlを遠心分離機（日立製CR20B2）にかけ、3000rpmで５分間遠心分離する。その菌体を脱イオン水で２回洗浄した後、脱イオン水に懸濁し、その懸濁液の細胞濃度が1000倍に希釈した後で0.3の吸光度（OD660）を示すように調整する。その８mlを、１５０℃で２４時間乾燥した後、室温まで冷却した乾燥素焼板（面積：１５０ｍｍ×１５０ｍｍ、厚さ：７．５ｍｍ）に乗せて10分間脱水し、得られた湿菌体の約３g（Ａ）を秤量し、105℃で20時間乾燥する。その乾物重量（Ｂ）を測定し、次式によって含水率(％) を求める。
【００２３】
【数２】
0003821507.tif 000005
【００２４】
なお、比較のためダイヤイーストＦＲＺおよびダイヤイーストＲＥＩＺＯについても、同様に求める。
その結果を表３に示す。
【００２５】
【表３】
0003821507.tif 000006
【００２６】
（4 ）酵母菌体の成形量の測定は、例えば、次のように行う。
本発明で造成される酵母菌体の成型量を調べるために、二軸押出成型機（神戸製鋼所製TCO-30）を用いて試験を行う。酵母菌体の成形量の測定は、スクリュー回転数300rpm、フラットダイ（厚さ2mm）を用いた条件での成型量（kg/h）で行う。
【００２７】
なお、比較のためダイヤイーストFRZおよびダイヤイーストREIZOについても、同様に測定する。
その結果を表４に示す。
【００２８】
【表４】
0003821507.tif 000007
【００２９】
本発明に係わる生地、即ち冷蔵または冷凍パン生地は、通常小麦粉に本発明の酵母、食塩、水さらに必要に応じて砂糖、脱脂粉乳、卵、イーストフード、ショートニング等を加え混捏した後、フロアタイム、分割、ベンチタイムをとり、成形した生地を−２〜１５℃で冷蔵または−１０〜−３０℃で凍結して得られる。
代表的なパン生地の製造法には、ストレート法と中種法があり、前者は全原料を最初から混合する方法で、後者は、まず小麦粉の一部に酵母と水を加え中種をつくり、発酵後に残りの原料を合わせる方法である。
【００３０】
前記パン生地を用いて常法（ホイロ、焼成）により製パンしパンを得る。
【００３１】
【実施例】
以下に、実施例を示す。
実施例１：３倍体の冷凍耐性酵母の製造法
一方の親株としてサッカロミセス・セレビジエMOY15-16を選抜し、前記の方法によりその呼吸欠損変異株を分離した。また、他方の親株としてサッカロミセス・セレビジエX2180-1Bを選抜し、そのウラシル要求性変異株を分離した。その両変異株を希少交配法によって交雑し、その交雑株のなかから細胞形が大きく、沈降度、含水率、成型量が優れ、かつ冷凍耐性が市販のダイヤイーストFRZ並に優れ、冷凍生地製パン法に適した交雑株としてサッカロミセス・セレビジエFT3-1株を得た。
【００３２】
実施例２：４倍体の冷凍耐性酵母の製造法
一方の親株としてサッカロミセス・セレビジエRZ16 を選抜し、そのウラシル要求性変異株を分離した。また、他方の親株としてサッカロミセス・セレビジエRZ16 由来の呼吸欠損性変異株を選抜した。その両変異株を希少交配法によって交雑し、その交雑株のなかから細胞形が大きく、沈降度、含水率、成型量が優れ、かつ冷凍耐性が市販のダイヤイーストFRZ並に優れ、冷凍生地製パン法に適した交雑株としてサッカロミセス・セレビジエFT4-1株を得た。
【００３３】
実施例３：３倍体の冷蔵耐性酵母の製造法
一方の親株にダイヤイーストREIZOを選抜し、そのウラシル要求性変異株を分離した。また、他方の親株としてサッカロミセス・セレビジエYOY655csf1を選抜し、その呼吸欠損変異株を分離した。その両変異株を希少交配法によって交雑し、その交雑株のなかから細胞形が大きく、沈降度、含水率、成型量が優れ、かつ冷蔵耐性が市販のダイヤイーストREIZO並に優れ、冷蔵生地製パン法に適した交雑株としてサッカロミセス・セレビジエRZ3-1 株を得た。
【００３４】
実施例４：４倍体の冷蔵耐性酵母の製造法
一方の親株にダイヤイーストREIZO由来のウラシル要求性変異株を、また、他方の親株としてダイヤイーストREIZO由来の呼吸欠損変異株を選抜し、その両変異株を希少交配法によって交雑し、その交雑株のなかから細胞形が大きく、沈降度、含水率、成型量が優れ、かつ冷蔵耐性が市販のダイヤイーストREIZO並に優れ、冷蔵生地製パン法に適した交雑株としてサッカロミセス・セレビジエRZ4-1 株を得た。
【００３５】
【発明の効果】
本発明は、３または４倍体酵母で、冷凍耐性または冷蔵耐性に優れた酵母サッカロミセス・セルビシェを提供する。