(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターと、該プロモーターの下流に位置する翻訳開始コドンと、該翻訳開始コドンよりも下流に位置し、前記プロモーターの支配下にある製造遺伝子であって、それがコードするポリペプチドのＮ末端に他のポリペプチドが結合した融合ポリペプチドが、前記構造遺伝子によりコードされる前記ポリペプチドの機能に基づき検出可能であるレポーター遺伝子とを含むベクターに、上記翻訳コドンよりも下流であって、上記レポーター遺伝子の上流に、正常型ならば前記レポーター遺伝子のリーディングフレームが前記翻訳開始コドンと揃う被検核酸断片を挿入し、得られた組換えベクター中の該被検核酸断片及びその下流の前記レポーター遺伝子を宿主細胞中で発現させ、前記レポーター遺伝子がコードするポリペプチドの機能を有する融合ポリペプチドが生産されるか否かを調べることから成る、ナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異の検出方法。
【請求項２】
前記翻訳開始コドンは、前記レポーター遺伝子の上流に位置する、第２の構造遺伝子に含まれ、前記被検核酸断片は、該第２の構造遺伝子と上記レポーター遺伝子の間に挿入される請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記宿主細胞は栄養要求性であり、前記レポーター遺伝子は該栄養要求性を非要求性に変えるものである請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記レポーター遺伝子はＵＲＡ３遺伝子である請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記第２の構造遺伝子はヘマグルチニン遺伝子である請求項２又は４記載の方法。
【請求項６】
前記宿主細胞は酵母細胞である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記酵母はサッカロミセス・セレビシエである請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記被検核酸断片はＢＲＣＡ１遺伝子又はその断片である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記被検核酸断片はＡＰＣ遺伝子又はその断片である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記被検核酸断片はＢＲＣＡ２遺伝子又はその断片である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
被検核酸断片はｈＭＳＨ２遺伝子又はその断片である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異の検出方法に関する。
背景技術
構造遺伝子中にナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異が存在すると、正常なタンパク質が生産されない。すなわち、ナンセンス突然変異の場合には、その突然変異部位の下流に位置する領域がコードするアミノ酸配列が全く形成されず、正常なタンパク質よりも短いタンパク質が形成される。また、フレームシフト突然変異の場合には、突然変異部位の下流に位置する領域がコードするアミノ酸配列は正常なアミノ酸配列とは全く異なる配列になる。従って、構造遺伝子中にナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異が存在することは、一般に、疾病に関与すると考えられている。従って、構造遺伝子中のナンセンス突然変異及びフレームシフト突然変異を検出することは臨床上重要である。
構造遺伝子中のナンセンス突然変異及びフレームシフト突然変異を検出する１つの方法として、該遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を測定する方法がある。しかしながら、タンパク質の活性を測定することはしばしば煩雑な操作を必要とするし、測定可能な活性が存在しない正常タンパク質も少なくない。また、被検遺伝子の全塩基配列を調べることによってもナンセンス突然変異及びフレームシフト突然変異を検出することが可能であるが、操作が煩雑であり、被検遺伝子のサイズが大きい場合には特に手間がかかる。また、ＤＮＡの突然変異を鋭敏に検出できる方法としてＰＣＲ−ＳＳＣＰ(single-stranded conformation polymorphism)があるが、この方法では、電気泳動操作が必要であり、ナンセンス突然変異とそれ以外の点突然変異を識別することができない。また、サイズの大きいＤＮＡ断片には適用することができない。
発明の開示
従って、本発明の目的は、簡便な操作で、かつ、被検ＤＮＡのサイズが大きい場合でも適用可能な、ナンセンス突然変異及びフレームシフト突然変異の検出方法を提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、その機能に基づいて検出可能なポリペプチドをコードする構造遺伝子をレポーター遺伝子として用い、その上流に正常型ならば前記レポーター遺伝子のレーディングフレームがシフトしない被検核酸断片を挿入し、該被検核酸断片及びその下流の前記レポーター遺伝子を発現させ、前記レポーター遺伝子がコードするポリペプチドの機能を有する融合ポリペプチドが生産されるか否かを調べることによりナンセンス突然変異及びフレームシフト突然変異を検出できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、プロモーターと、該プロモーターの下流に位置する翻訳開始コドンと、該翻訳開始コドンよりも下流に位置し、前記プロモーターの支配下にある構造遺伝子であって、それがコードするポリペプチドのＮ末端に他のポリペプチドが結合した融合ポリペプチドが、前記構造遺伝子によりコードされる前記ポリペプチドの機能に基づき検出可能であるレポーター遺伝子とを含むベクターに、上記翻訳コドンよりも下流であって、上記レポーター遺伝子の上流に、正常型ならば前記レポーター遺伝子のリーディングフレームが前記翻訳開始コドンと揃う被検核酸断片を挿入し、得られた組換えベクター中の該被検核酸断片及びその下流の前記レポーター遺伝子を宿主細胞中で発現させ、前記レポーター遺伝子がコードするポリペプチドの機能を有する融合ポリペプチドが生産されるか否かを調べることから成る、ナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異の検出方法を提供する。
本発明により、簡便な操作で、ナンセンス突然変異及びフレームシフト突然変異のみを特異的に検出することができる方法が提供された。本発明によれば、電気泳動等の操作を要することなく検出ができるので、操作が非常に簡便である。また、酵母等の真核細胞を宿主として用いることにより、約３．５ｋｂ程度までの大きな被検核酸断片を検査することが可能になり、遺伝子を断片化する場合の断片数を減らすことができる。また、ＰＣＲプライマーの近傍の変異も検出できるので、断片間の重複領域も減らすことができる。さらに、ヘテロ接合の遺伝子変異も検出することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の実施例の方法に用いられるベクターの構造、被検ＤＮＡ断片の領域、操作手順及び結果を説明するための図である。
図２は、本発明の実施例２の方法を適用してそのＡＰＣ遺伝子について調べた６家族の家系図及び突然変異部位の近傍を増幅して解析した電気泳動において見られたバンドのサイズを示す図である。
図３は、本発明の実施例３において被検核酸断片として用いたＢＲＣＡ２遺伝子中の各遺伝子領域の配置及び制限酵素部位を示す図である。
図４は、本発明の実施例４において被検核酸断片として用いた、組換えベクターpCI-MS19及びpCI-MS20中の挿入断片の構造を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明の方法では、ベクターを用いる。このベクターは、レポーター遺伝子として用いられる構造遺伝子を有する。このレポーター遺伝子は、機能に基づいて検出可能なポリペプチドをコードするものであり、該ポリペプチドのＮ末端に他のポリペプチドが結合された融合ポリペプチドも、前記ポリペプチドの機能に基づいて検出可能なものである。このようなレポーター遺伝子の例として、栄養要求性を非要求性に変化させる遺伝子、薬剤耐性遺伝子、検出可能な酵素反応を行なう酵素遺伝子、温度感受性やｐＨ感受性を耐性に変化させる遺伝子等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。これらのうち、栄養要求性を非要求性に変化させる遺伝子及び薬剤耐性遺伝子は、単に形質転換体を所定の培地上で培養するだけで判定が可能であるので特に簡便であり、好ましい。下記実施例では、レポーター遺伝子として、酵母のオロチジン−５’−フォスフェート（ＯＭＰ）デカルボキシラーゼをコードするＵＲＡ３遺伝子（Alani E.et al.,Genetics 117,5-12(1987)）のコドン５以下の領域を用いている。この遺伝子を発現する細胞はウラシルを含まない培地上で生育可能であるが、この遺伝子を発現しない細胞はウラシルを含まない培地上では生育することができない。従って、ウラシル要求性の宿主を用い、ウラシルを含まない培地上で形質転換体を培養することにより、その形質転換体がＵＲＡ３遺伝子を発現しているか否かを容易に知ることができる。また、ＵＲＡ３遺伝子を発現する細胞は、５ＦＯＡ（５−フロロオロチン酸(5-fluoro-orotic acid)）を用いて容易にネガティブ選択することができる（すなわち、Ｕｒａ−は５ＦＯＡ耐性で、Ｕｒａ＋は５ＦＯＡ感受性である）。ＵＲＡ３遺伝子以外の好ましいレポーター遺伝子の例としてＧＦＰ（green fluorescent protein）遺伝子（Chalfie,M.et al.,Science 236,802-805,1994）、ＡＤＥ２遺伝子（酵母由来、Stotz,A.et al.,Gene 95,91-98,1990）、ＣＡＮ１遺伝子及びＣＹＨ２遺伝子（両者ともNature 387,29,May,1997）等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
レポーター遺伝子の上流には、レポーター遺伝子を支配するプロモーターが存在する。このプロモーターは、用いる宿主細胞内で、下流のレポーター遺伝子を発現できるものであればよく、公知のプロモーターを用いることができる。下記実施例では、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＫＧ）遺伝子のプロモーターを用いているが、これに限定されるものでないことは言うまでもない。ＰＫＧ遺伝子のプロモーター以外の好ましいプロモーターの例としてＡＤＨ１遺伝子（出芽酵母）プロモーター（Ammever,G.,Methods in Enzymology,vol.101,p.192）、ＧＡＬ１−ＧＡＬ１Ｄ遺伝子プロモーター及びＰＨＯ５遺伝子プロモーター（両者ともBroach,J.R.et al.,"Experimental Manipulation of Gene Expression"Academic Press 1983）等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
このプロモーターよりも下流であって、上記レポーター遺伝子の上流には翻訳開始コドンが存在する。上記レポーター遺伝子は、この翻訳開始コドンを翻訳開始コドンとして翻訳される。翻訳開始コドンは単独で存在してもよいが、前記レポーター遺伝子の上流に位置する、第２の構造遺伝子に含まれていてもよい。この場合には、該第２の構造遺伝子がコードするポリペプチドを免疫測定法やウェスタンブロッティング等の適宜の方法で検出することにより、前記プロモーターの支配下にあるＤＮＡ領域が正しく発現されたか否かを知ることができる。なぜなら、被検核酸断片は、後述のようにこの第２の構造遺伝子の下流に挿入されるので、被検核酸断片がナンセンス突然変異を含む場合であっても、発現が正常に行なわれた場合には、少なくともこの第２の構造遺伝子は発現されるからである。第２の構造遺伝子は、いずれのものでもよく、下記実施例ではヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を用いているがもちろんこれに限定されるものではない。
本発明の方法に用いられるベクターは、大腸菌や枯草菌のような細菌用のベクターでもよいが、サイズの大きな遺伝子断片が挿入可能な真菌細胞用ベクター、特に酵母用ベクターが好ましい。
ベクターは、宿主細胞内で複製される必要があるから、当然、その宿主細胞内での複製を可能にする複製開始点を有する。また、前記レポーター遺伝子の下流にはターミネーター配列を有することが好ましい。さらに、形質転換体を選択するための、薬剤耐性遺伝子や栄養要求性を非要求性に変える遺伝子等の選択マーカー（下記実施例ではロイシン要求性を非要求性に変えるＬＥＵ２遺伝子を使用）を有することが好ましい。さらに、酵母用ベクターの場合には、小さなコピー数での複製を安定化するためのＣＥＮ遺伝子やＡＲＳ遺伝子を有することが好ましい。
本発明の方法では、上記翻訳コドンよりも下流であって、上記レポーター遺伝子の上流に被検核酸断片を挿入する。なお、上記第２の構造遺伝子が存在する場合には、該第２の構造遺伝子と上記レポーター遺伝子の間に被検核酸断片が挿入される。被検核酸断片の挿入は、レポーター遺伝子の上流に存在する制限酵素部位に、常法により被検核酸断片を挿入することにより行なうことができる。従って、レポーター遺伝子の上流には制限酵素部位が存在する必要がある。もっとも、発現ベクターにレポーター遺伝子や第２の構造遺伝子を挿入して本発明で用いるベクターを構築して行く場合には、制限酵素部位を使用してこれらの遺伝子の挿入が行なわれるので、通常、被検核酸断片の挿入に必要な制限酵素部位は別段の操作を行なわなくても存在している。もっとも、被検核酸断片の挿入に必要な制限酵素部位は常法により容易に作出することも可能である。
被検核酸断片は、それが正常型であるならば、前記レポーター遺伝子のリーディングフレームが前記翻訳開始コドンと一致するサイズを有する。すなわち、被検核酸断片を挿入する前の状態で、レポーター遺伝子のリーディングフレームが前記翻訳開始コドンと一致している場合には、挿入される被検核酸断片のヌクレオチド数は、それが正常型の場合には３の倍数になる。なぜなら、挿入される被検核酸断片のヌクレオチド数が３の倍数ならば、フレームシフトが起きないからである。もっとも、正常型のＤＮＡ断片が挿入された後の状態でレポーター遺伝子のリーディングフレームが前記翻訳開始コドンと一致していればよい。従って、正常型の被検核酸断片のヌクレオチド数が３の倍数でないものについても本発明の方法を適用することが可能である。この場合には、正常型の被検核酸断片が挿入された後の状態でレポーター遺伝子のリーディングフレームが前記翻訳開始コドンと一致するように、被検核酸断片挿入前の状態では翻訳開始コドンとレポーター遺伝子のリーディングフレームを予めずらしておく。
被検核酸断片は、何ら限定されるものでなく、ナンセンス突然変異及びフレームシフト突然変異が起きているか否かを調べようとするいかなる核酸断片（ＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片）であってもよい。下記実施例では、ＢＲＣＡ１遺伝子及びＡＰＣ遺伝子について検査を行なっているが、もちろんこれらに限定されるものではない。なお、ＢＲＣＡ１遺伝子は、これが不活性化された場合に家族性乳癌及び卵巣癌の原因となり得る遺伝子（Miki Y.et al.,Science 266,66-71(1994)、乳癌患者の７５％にこの遺伝子の異常が見られる）であり、ＡＰＣ遺伝子は、これが不活性化された場合に家族性腺腫様多様ポリープの原因となる遺伝子（Kinzler K.W.et al.,Science 253,661-5(1991)、患者の９３％にこの遺伝子の異常が見られる）である。なお、被検核酸断片は、その塩基配列が不明のものであってもよいが、上記のように、正常型の場合には挿入後にレポーター遺伝子のリーディングフレームが上記翻訳開始コドンと一致する必要があるから、正常型のヌクレオチド数（又は少なくともヌクレオチド数を３で割った場合の余り）はわかっている必要がある。従って、被検核酸断片としては、通常、既知の遺伝子又はその一部の領域をＰＣＲ等の核酸増幅法により増幅されたものや制限酵素で切り出されたものが用いられる。ＰＣＲ等の核酸増幅法により被検核酸断片を調製すると、大量に断片が得られ、検出感度が高くなるので好ましい。
被検核酸断片を挿入後、得られた組換えベクターで宿主細胞を形質転換する。形質転換の方法自体はこの分野において周知である。あるいは、被検核酸断片を挿入すべき制限酵素部位で開裂しているギャップベクターと、被検核酸断片で宿主細胞を共形質転換し、宿主細胞内での相同組換えにより、被検核酸断片が挿入された所望の組換えベクターが形成されるようにしてもよい（下記実施例参照）。ここで、ギャップベクターとは、被検核酸断片を挿入する前の上記のベクターの、被検核酸断片を挿入すべき制限酵素部位に被検核酸断片の両端部分の領域を連結したものである。このようなギャップベクターと被検核酸断片とで宿主を共形質転換すると、被検核酸断片の両端部分と、ギャップベクターの上記制限酵素部位に結合された領域とが相同であるので、細胞内において相同組換えが起き、被検核酸断片が挿入された組換えベクターが細胞内で生じる。このようなギャップベクターは、下記実施例に示されるように、被検核酸断片を挿入した組換えベクターを先ず作製し、これを鋳型としてＰＣＲにより、被検核酸断片の両端部以外の領域が欠落したものを増幅することにより調製することができる。このようなギャップベクターを予め大量に調製しておけば、検査は共形質転換と培養だけで行なうことができるので簡便であり、多数の検体についても効率良く臨床検査を行なうことができるので好ましい。また、被検核酸断片をベクターに組み込んだライゲーション混合物をそのまま形質転換に用いる場合に比べてＵｒａ−のバックグランドが低く、この意味でも好ましい。なお、形質転換体は、ベクターの選択マーカー等に基づき選択することができる。
次いで、得られた形質転換体を培養し、前記プロモーターにより支配される、前記翻訳開始コドン（第２の構造遺伝子が含まれる場合には該遺伝子）及びその下流の挿入被検核酸断片及びレポーター遺伝子を発現させる。
上記のように、被検核酸断片は、これが正常型の場合には、これが挿入された状態でレポーター遺伝子が前記翻訳開始コドンとリーディングフレームが一致するサイズを有する。従って、もし、被検核酸断片が正常型であるか又はナンセンス突然変異及びフレームシフト突然変異以外の突然変異を有するものである場合には、レポーター遺伝子がコードする正常なポリペプチドを含む融合ポリペプチドが生産される。一方、被検核酸断片がナンセンス突然変異を有する場合には、突然変異部位の下流にある領域は発現されないから、レポーター遺伝子は全く発現されない。また、被検核酸断片がフレームシフト突然変異を有する場合には、突然変異部位よりも下流の領域ではフレームシフトが起きるので、レポーター遺伝子がコードするポリペプチドは正常型とは全く異なるアミノ酸配列を有し、正常型のポリペプチドが有する機能は当然有さない。従って、レポーター遺伝子がコードする正常なポリペプチドが有する機能を、発現されたポリペプチドが有するか否かを調べることにより、被検ＤＮＡ断片がナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異を有するか否かを知ることができる。
レポーター遺伝子がコードする正常なポリペプチドが有する機能を、発現されたポリペプチドが有するか否かは、該レポーター遺伝子の性質に応じた適宜の方法により調べることができる。すなわち、該レポーター遺伝子が、栄養要求性を栄養非要求性に変化させるものであるならば、宿主として栄養要求性の株を用い、該栄養を含まない培地上で形質転換体を培養することにより調べることができる。また、レポーター遺伝子が薬剤耐性遺伝子である場合には、該薬剤に対して感受性の宿主を用い、該薬剤を含む培地上で形質転換体を培養することにより調べることができる。レポーター遺伝子が、検出可能な酵素反応を行なう酵素をコードする場合には、該酵素の基質を加えて酵素反応を行なわせることにより調べることができる。レポーター遺伝子が、温度感受性やｐＨ感受性を非感受性に変化させるものである場合には、宿主として感受性株を用い、形質転換体を感受性株が増殖できない温度又はｐＨ下で培養することにより調べることができる。レポーター遺伝子が蛍光発生タンパク質をコードする場合には、形質転換体を特定波長光で励起し、蛍光波長特性の変化を測定することにより調べることができる。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１  ＢＲＣＡ１遺伝子中のナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異の検出
(1)ギャップベクターの構築
ＵＲＡ３遺伝子のコドン５から天然の停止コドンまでのコード領域を含むプラスミドｐＲＳ３１６（Sikorski,R.S.et al.,Genetics 122,19-27(1989)、GenBank U03442、入手先：Robert S.Sikorski,Johns Hopkins University）のヌクレオチド番号４２３〜１２３９ｎｔの領域を、BamHI部位又はBglII部位を５’末端に有するプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅した。増幅されたBamHI/BglII断片を、プラスミドｐＲＳＰＧＫ（Ishioka et al.,Oncogene 10,1485-92(1995)、入手先：石岡千加史、東北大学加齢医学研究所）のBamHI部位にフレームを揃えて挿入し、プラスミドpCI-HA(URA3)を得た。このベクターをNsiIとPstIとで消化し、自己連結してプラスミドpCI-HA(URA3)-2を得た（図１のａ）。
【００２１】
一方、初期乳癌患者９人の、ＥＢＶで不死化したリンパ球及びコントロールとして健常人のリンパ球からゲノムＤＮＡ及び／又は全ＲＮＡを常法により単離した。なお、これらの患者及び健常人のＢＲＣＡ１遺伝子のコード領域の塩基配列は予めわかっている（FitzGerald,M.G.et al.,New Engl.J.Med.334,143-9(1996);GenBank U14680）。市販のｃＤＮＡ合成キット（First-Strand cDNA Synthesis kit（ファルマシア社製））を用いてｃＤＮＡを合成した。このようにして得られたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより被検ＤＮＡ断片を増幅した。増幅した被検ＤＮＡ断片は、ＢＲＣＡ１遺伝子の９６〜９０８ｎｔ（ＢＲＣＡ１ａ）、７８９〜４２１４ｎｔ（ＢＲＣＡ１ｂ）、４０８９〜５７０８ｎｔ（ＢＲＣＡ１ｃ）である（図１のｂ参照）。ＢＲＣＡ１ａ及びＢＲＣＡ１ｃはｃＤＮＡを鋳型として増幅し、ＢＲＣＡ１ｂはｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡのそれぞれを鋳型として増幅した。ＢＲＣＡ１ａの増幅に用いたプライマーの塩基配列は、5'-GAAAGTTCATTGGAACAGAAAGAA-3'及び5'-ACCCTGATACTTTTCTGGATG-3'であった。ＢＲＣＡ１ｂの増幅に用いたプライマーの塩基配列は、5'-CCCAGATCTGCTGCTTGTGAATTTTCTGAG-3'及び5'-CCCAGATCTTAAGTTTGAATCCATGCTTTG-3'であった。ＢＲＣＡ１ｃの増幅に用いたプライマーの塩基配列は、5'-ATGAGGCATCAGTCTGAAAGC-3'及び5'-GTAGTGGCTGTGGGGGATCT-3'であった。ＰＣＲは宝酒造社製の市販のキットを用い、９４℃、４分間の変性工程後、９４℃、１分間の変性工程、６０℃、１分間のアニーリング工程、７２℃、３．５分間の伸長工程から成るサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃、４分間の伸長工程を行なうことにより行なった。
健常人由来の増幅ＢＲＣＡ１ａ、ＢＲＣＡ１ｂ及びＢＲＣＡ１ｃ断片をpCI-HA(URA3)-2のBamHI部位に挿入してプラスミドpCI-BR1E、pCI-BR1D及びpCI-BR1Gをそれぞれ得た（図１のｂ参照）。これらの組換えベクターでサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＹＰＨ４９９（後述）を常法により形質転換したところ、形質転換体は全てＵＲＡ＋（ウラシルを含まない培地上で生育する）であった。
得られた組換えベクターを鋳型として用い、ＰＣＲによりギャップベクターを調製した（図１のｂ）。ギャップベクターpCI-BR1Fは、プラスミドpCI-BR1Eの挿入断片中の１８３〜８２７ｎｔをユニークな（すなわち、ベクター中に１個しか存在しない）BglII部位に変えたものである。ギャップベクターpCI-BR1Cは、プラスミドpCI-BR1Dの挿入断片中の８８８〜４１１１ｎｔをユニークなStuI/BamHI/SmaI部位に変えたものである。ギャップベクターpCI-BR1Hは、プラスミドpCI-BR1Gの挿入断片中の４２１５〜５６０９ｎｔをユニークなBglII部位に変えたものである。なお、これらの塩基配列は、GenBank U14680に記載されている。ＰＣＲは、先に得られた、挿入断片を含む完全長の組換えベクターを鋳型として、宝酒造社製の市販のキットを用いて行なった。ギャップベクターpCI-BR1Fの調製のために用いたプライマーの塩基配列は、5'-GAAGATCTGATTTTCTGCATAGCATTAATGAC-3'及び5'-GAAGATCTGAACATCATCAACCCAGTAATAATG-3'であり、ギャップベクターpCI-BR1Cの調製のために用いたプライマーの塩基配列は、5'-CCCGGATCCCGGGAGTTGGTCTGAGTGACA-3'及び5'-CCCGGATCCAGGCCTCTCAGCTGCACGCTTC-3'であり、ギャップベクターpCI-BR1Hの調製のために用いたプライマーの塩基配列は、5'-GAAGATCTCCTGTGGTGACCCGAGAGTGGGTG-3'及び5'-GAAGATCTATTATTTTCTTCCAAGCCCGTTCC-3'であった。また、ＰＣＲは、９４℃、２分間の変性工程後、９４℃、２０秒間の変性工程、６８℃、１０分間のアニーリング工程兼伸長工程から成るサイクルを３０回繰り返し、最後に６８℃、４分間の伸長工程を行なうことにより行なった。
(2)形質転換体の作出
宿主細胞としては、ロイシン及びウラシル要求性である酵母サッカロミセス・セレビシエYPH499株（Stratagene社より市販）を用いた。コンピーテントな酵母細胞は、ＹＰＤ液体培地中で培養した細胞に酢酸リチウム(LiOAc)処理を行なうことにより調製した（Ishioka C.et al.,Nature Genet.5,124-129(1993)）。得られたコンピーテントな酵母細胞は使用時まで５％ＤＭＳＯの存在下で−８０℃で貯蔵した。なお、凍結したコンピーテントな酵母細胞は、その高い形質転換能を少なくとも３カ月間は維持する。次いで、先に得られた、増幅被検ＤＮＡ断片（未精製）約２００ｎｇと、上記各ユニークな制限酵素部位で開裂した、上記ギャップベクター約３０ｎｇとを公知のLiOAc法（Ito H.,J.Bacteriol.153,163-168(1983)記載の方法をIshioka H.et al.,1993（前掲）に記載したように修飾した方法）により共形質転換した。なお、ＢＲＣＡ１ａ、ＢＲＣＡ１ｂ、ＢＲＣＡ１ｃ断片の検査のために、ギャップベクターpCI-BR1F（BglII消化物）、pCI-BR1C（BamHI/SmaI消化物）及びpCI-BR1H（BglII消化物）をそれぞれ用いた。
形質転換体は、ロイシンを含まない合成完全培地上で選択した。得られた形質転換体からそれぞれ２５コロニーずつ選び、ロイシン及びウラシルを含まない完全合成培地上で３０℃で培養することにより、ウラシル要求性を調べた。８５％を超える形質転換体がＵＲＡ＋であれば、被検ＤＮＡ断片はナンセンス突然変異及びフレームシフト突然変異を含まないものと判断した。全ての形質転換体がＵＲＡ−であれば被検ＤＮＡ断片はナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異を含むものと判断した。ＵＲＡ＋の割合が小さい場合（通常４０〜５０％）は、被検ＤＮＡ断片はナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異を含むものと含まないものとのヘテロ接合であると判断した。
(3)結果
結果を下記表１に示す。表１に示されるように、上記の方法によって得られた結果は、被検ＤＮＡ断片の塩基配列解析の結果と完全に一致しており、本発明の方法によりナンセンス突然変異及びフレームシフト突然変異を検出できることが確認された。また、患者Ｐｔ．９９（表１参照）についての結果を図１のｄの左側に模式的に示す。シャーレの右半分は健常人由来のＤＮＡ断片を挿入したコントロールであり、左半分が患者Ｐｔ．９９についての結果である。
0003793237.tif 000002
実施例２  ＡＰＣ遺伝子中のナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異の検出
実施例１と同様な方法により、家族性腫腺様多発ポリープ患者の６家族のＡＰＣ遺伝子のＮ末端側（全遺伝子の約６１％）の領域について検査を行なった。なお、上記の癌の患者の約９３％がＡＰＣ遺伝子の突然変異を有していることがわかっている（Nakamura Y.et al.,New Strategies for Treatment of Hereditary Colorectal Cancer,Ed.S.Baba et al.,1996,pp.93-98）。また、これらの突然変異のほとんどのものが上記Ｎ末端側領域に存在している。
被検ＤＮＡ断片は、新鮮な患者リンパ球又は健常人リンパ球由来のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型として調製した。増幅した被検ＤＮＡ断片は、ＡＰＣ遺伝子の１９〜１９７７ｎｔ（ＡＰＣａ）、１９７８〜５２５６ｎｔ（ＡＰＣｂ）、１９７８〜３５７０ｎｔ（ＡＰＣｃ）、３５７１〜５２５６ｎｔ（ＡＰＣｄ）であった（図１のｂ参照）。ＡＰＣａ断片の増幅のために用いたプライマーの塩基配列は、5'-ATGGCTGCAGCTTCATATGAT-3'及び5'-CTGTGGTCCTCATTTGTAGC-3'であった。ＡＰＣｂ断片の増幅のために用いたプライマーの塩基配列は、5'-CAAATCCTAAGAGAGAACAAC-3'及び5'-GTCCATTATCTTTTTCACACG-3'であった。ＡＰＣｃ断片の増幅のために用いたプライマーの塩基配列は、5'-CAAATCCTAAGAGAGAACAA-3'及び5'-GGCATATTTTAAACTATAATC-3'であった。ＡＰＣｄ断片の増幅のために用いたプライマーの塩基配列は、5'-ACAGATATTCCTTCATCACAG-3'及び5'-GTCCATTATCTTTTTCACACG-3'であった。ＰＣＲは実施例１と同じ条件で行なった。
健常人由来の増幅ＡＰＣａ、ＡＰＣｂ及びＡＰＣｃ断片をpCI-HA(URA3)-2のBamHI部位に挿入してプラスミドpCI-APC6、pCI-APC10及びpCI-APC7をそれぞれ得た（図１のｂ参照）。これらの組換えベクターでサッカロミセス・セレビシエＹＰＨ４９９を常法により形質転換したところ、形質転換体は全てＵＲＡ＋であった。
得られた組換えベクターを鋳型として用い、ＰＣＲによりギャップベクターを調製した（図１のｂ）。ギャップベクターpCI-APC8は、プラスミドpCI-APC6の挿入断片中の１０９〜１８９９ｎｔをユニークなBglII部位に変えたものである。ギャップベクターpCI-APC5は、プラスミドpCI-APC10の挿入断片中の２０５４〜５２０１ｎｔをユニークなNsiI部位に変えたものである。ギャップベクターpCI-APC9は、プラスミドpCI-APC7の挿入断片中の２０８６〜３４８９ｎｔをユニークなBglII部位に変えたものである。なお、これらの塩基配列は、GenBank M74088に記載されている。ギャップベクターpCI-APC8の調製のために用いたプライマーの塩基配列は、5'-CGAAGATCTATTATCTTCTAGCTCTTGTCGAAG-3'及び5'-CGAAGATCTACTTTAGCCATTATTGAAGTGGA-3'であり、ギャップベクターpCI-APC9の調製のために用いたプライマーの塩基配列は、5'-CGAAGATCTTGCTGAGAGATTCCACAAAGTTCC-3'及び5'-CGAAGATCTAGACCAACAAATTATAGCATAAAATAT-3'であった。ＰＣＲは、先に得られた、挿入断片を含む完全長の組換えベクターを鋳型として、実施例１と同じ条件で行なった。なお、ギャップベクターpCI-APC5は、pCI-APC10中のＡＰＣｂ中の２つのNsiI部位をNsiIで切断することにより調製した。
これらのギャップベクターを、前記ユニークな制限酵素部位で切断したものと、先に調製した被検ＤＮＡ断片を用い、実施例１と同じ方法により酵母サッカロミセス・セレビシエYPH499を共形質転換し、形質転換株を選択し、ナンセンス突然変異及びフレームシフト突然変異の有無について検査を行なった。
結果を下記表２及び３に示す。また、検査した６家族の家系図を図２に示す。図２中、黒く塗りつぶされているヒトが、ナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異が検出されたヒトである。表２及び３に示されるように、上記の方法によって得られた結果は、被検ＤＮＡ断片の塩基配列解析の結果と完全に一致しており、本発明の方法によりナンセンス突然変異及びフレームシフト突然変異を検出できることが確認された。また、家族Ａの患者II-2（表２参照）についての結果を図１のｄの右側に模式的に示す。シャーレの右半分は健常人由来のＤＮＡ断片を挿入したコントロールであり、左半分が家族Ａの患者II-2についての結果である。
0003793237.tif 000003
0003793237.tif 000004
さらに、突然変異部位の周辺領域をＰＣＲで増幅し、１６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド染色により可視化して分析した。各家族について得られたバンドのサイズが図２の家系図の各家族の下側に記載されている。以下、各家族の結果について説明する。
家族Ａ
ＡＰＣ遺伝子の２７６１〜２８７７ｎｔ（GenBank M74088）を増幅すると、患者の兄弟II-2及びII-3において、正常なサイズ（１０７ｂｐ）の断片に加え、異常に短い（１０３ｂｐ）断片が生じた。これは、ヘテロ接合している一方の遺伝子が２８０５ｎｔにおいて４ｂｐの欠失（2805del4）を生じているからである。II-1では１０７ｂｐの断片のみが生じた。
家族Ｂ
家族Ａと同じ領域のＰＣＲ増幅産物をAflIIで消化した。親I-1では、正常な１０７ｂｐの断片に加え、７１ｂｐの断片が生じた。これは、２８３１ｎｔにおいてＴが挿入され（2831insT）、AflII部位CTTAAGが生じたからである。この７１ｂｐのバンドはII-1及びII-2では見られなかった。
家族Ｃ
ＡＰＣ遺伝子の３７４４〜３８２７ｎｔを増幅した。親I-7及びその子供の患者３人（II-1,II-2及びII-3）では、正常なサイズの８４ｂｐの断片に加え、異常に短い８２ｂｐのバンドが生じた。これは、ヘテロ接合している一方の遺伝子が３７６５ｎｔにおいて２ｂｐ欠失している（3765del2）からである。この８２ｂｐのバンドは、他の患者以外のヒトでは見られなかった。
家族Ｄ及びＥ
ＡＰＣ遺伝子の３８８１〜３９６４ｎｔを増幅した。親I-1（家族ＤとＥの両方とも）及びその子供の患者のII-2（家族Ｅ）においては、正常なサイズの８４ｂｐの断片に加え、異常に短い７９ｂｐの断片が生じていた。これは、ヘテロ接合している一方の遺伝子が３９４５ｎｔにおいて５ｂｐ欠失している（3945del5）からである。II-1（家族ＤとＥの両方とも）、II-2（家族Ｄ）及びII-3（家族ＤとＥの両方とも）では、正常なサイズの産物のみが見られた。
家族Ｆ
ミスマッチプライマーを用いてＡＰＣ遺伝子の３８８１〜４００４ｎｔを増幅した。ミスマッチプライマーは、5'-TGCTGTGACACTGCTGGAGC-3'（下線を引いたＧがミスマッチヌクレオチド）の塩基配列を有し、３９８６ｎｔでＴをＣに変える変異を生じる。次いで、得られた増幅産物をSacIで消化した。親I-1においては、正常なサイズの１２４ｂｐの断片に加え、１０７ｂｐの断片が生じた。これは、３９８３ｎｔにおいて１ｂｐの欠失が生じており（3983delA）、さらに上記ＴからＣへの変異のためにSacI部位、GAGCTCを生じたからである。この１０７ｂｐのバンドはII-1では見られなかった。
実施例３  BRCA２遺伝子中のナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異の検出
（１）BRCA 2ギャップベクターの構築
URA３遺伝子のコドン５から天然の停止コドンまでのコード領域を含むプラスミドpRS３１６（Sikorski,R.S.et al.,Genetics122,19-27(1989),GenBank U03442,入手先：Robert S.Sikorski,Johns Hopkins University）のヌクレオチド番号423〜1239ntの領域をBamHI部位又はBgl II部位を5'末端に有するプライマーセットを用いてPCRにより増幅した。増幅されたBamH I/Bgl II断片を、プラスミドpRSPGK（Ishioka et al.,Oncogene 10,1485-1492(1995)、入手先：石岡千加史、東北大学加齢医学研究所）のBamH I部位にフレームを揃えて挿入しプラスミドpCI-HA（URA3）を得た。このベクターをNsi IとPst Iとで消化し、自己連結してプラスミドpCI-HA(URA3)-2を得た。
一方、健常人由来BR2a、BR2b、BR2c、BR2d及びBR2e断片を下記のPCR条件で増幅を行った。なお、ＢＲＣＡ２遺伝子中の各遺伝子領域の配置及び制限酵素部位を図３に示す。増幅したDNA断片は、BRCA2遺伝子の219〜2358nt(BR2a)、2149〜4815nt(BR2b)、4639〜6708nt(BR2c)、6493〜8439nt(BR2d)、8251〜10476nt(BR2e)であった。BR2a断片の増幅のために用いたプライマーの塩基配列は5'-GGAAGATCTATGCCTATTGGATCCAAAGAGAG-3'及び5'-GGAAGATCTTGACAGAATCAGCTTCTGGGG-3'であった。BR2b断片の増幅のために用いたプライマーの塩基配列は5'-CGGGATCCTCTTCTGTGAAAAGAAGCTGTTCAC-3'及び5'-CGGGATCCCCCGCTAGCTGTATGAAAACCC-3'であった。BR2c断片の増幅のために用いたプライマーの塩基配列は5'-CGGGATCCAGAAAGAACAAAATGGACATTCTAAG-3'及び5'-CGGGATCCTTGTTGAAATTGAGAGAGATATGGAG-3'であった。BR2d断片の増幅のために用いたプライマーの塩基配列は5'-GGAAGATCTGAGCATAGTCTTCACTATTCACCTAC-3'及び5'-GGAAGATCTTAAGAGGGGAGGATCTAACTGG-3'であった。BR2e断片の増幅のために用いたプライマーの塩基配列は5'-CGGGATCCGATAGAAGCAGAAGATCGGCTATAA-3'及び5'-CGGGATCCGATATATTTTTTAGTTGTAATTGTGTCCTG-3'であった。また、BR2aのPCRは、94℃、４分間の変性工程後、94℃、30秒間の変性工程、68℃、３分間（ただし、１サイクル毎に、前アニーリング兼伸長工程に４秒間ずつ時間を延ばしていく）のアニーリング工程兼伸長工程から成るサイクルを35回繰り返し、最後に72℃、5分間の伸長工程を行うことにより行った。BR2b及びBR2cのPCRは、94℃、４分間の変性工程後、94℃、30秒間の変性工程後、60℃、15秒間のアニーリング工程、72℃3分間+DT4秒間の伸長工程から成るサイクルを27回繰り返し、最後に72℃、5分間の伸長工程を行うことにより行った。BR2dのPCRは、94℃、４分間の変性工程後、94℃、30秒間の変性工程後、60℃、15秒間のアニーリング工程、72℃3分間+DT4秒間の伸長工程から成るサイクルを35回繰り返し、最後に72℃、5分間の伸長工程を行うことにより行った。BR2eのPCRは、94℃、2分間の変性工程後、94℃、30秒間の変性工程後、58℃、３０秒間のアニーリング工程、72℃3分間+DT4秒間の伸長工程から成るサイクルを35回繰り返し、最後に72℃、5分間の伸長工程を行うことにより行った。
健常人由来の増幅BR2a、BR2b、BR2c、BR2d及びBR2e断片をpCI-HA(URA3)-2のBamH I部位に挿入してpBR2a、pBR2b、pBR2c、pBR2d及びpBR2eをそれぞれ得た。これらの組換えベクターでサッカロミセス・セレビシエYPH499を常法により形質転換したところ、形質転換体は全てURA+であった。
pBR2aのギャップベクターは、制限酵素Pst IとXba IIで組換えベクターpBR2aを消化し挿入断片中央部365〜2239ntを抜き去ったものである。pBR2bのギャップベクターは、制限酵素Xba IとSpe Iで組換えベクターpBR2bを消化し挿入断片中央部2239〜4734ntを抜き去ったものである。pBR2cのギャップベクターは、制限酵素Spe IとPst Iで組換えベクターpBR2cを消化し挿入断片中央部4734〜6603ntを抜き去ったものである。pBR2dのギャップベクターは、制限酵素Pst IとSpe Iで組換えベクターpBR2dを消化し挿入断片中央部6603〜8350ntを抜き去ったものである。pBR2eのギャップベクターは、制限酵素Spe IとBcl Iで組換えベクターpBR2eを消化し挿入断片中央部8350〜10397ntを抜き去ったものである。なお、これらの塩基配列は、GenBank U43746に記載されている。
（２）BRCA２SCアッセイ
若年発症乳癌患者２名及び健常人のBRCA2遺伝子のオープンリーディングフレームの全領域について検査を行った。
若年発症乳癌患者２名のEBVで不死化したリンパ球及びコントロールとして健常人のリンパ球からゲノムDNA及び／又は全RNAを常法により単離した。なお、これらの患者及び健常人のBRCA２遺伝子のコード領域の塩基配列は予めわかっている。市販のcDNA合成キット（First−Strand cDNA Synthesis kit（ファルマシア社製））を用いてcDNAを合成した。このようにして得られたゲノムDNA又はcDNAを鋳型として、PCRにより被検DNA断片を増幅した。増幅した被検DNA断片は、BRCA2遺伝子の219〜2358nt(BR2a)、2149〜4815nt(BR2b)、4639〜6708nt(BR2c)、6493〜8439nt(BR2d)、8251〜10476nt(BR2e)であった。BR2a断片の増幅のために用いたプライマーの塩基配列は5'-ATGCCTATTGGATCCAAAGAGAG-3'及び5'-TGACAGAATCAGCTTCTGGGG-3'であった。BR2b断片の増幅のために用いたプライマーの塩基配列は5'-TCTTCTGTGAAAAGAAGCTGTTCAC-3'及び5'-CCCGCTAGCTGTATGAAAACCC-3'であった。BR2c断片の増幅のために用いたプライマーの塩基配列は5'-AGAAAGAACAAAATGGACATTCTAAG-3'及び5'-TTGTTGAAATTGAGAGAGATATGGAG-3'であった。BR2d断片の増幅のために用いたプライマーの塩基配列は5'-TCTGAGCATAGTCTTCACTATTCACCTAC-3'及び5'-TCTTAAGAGGGGAGGATCTAACTGG-3'であった。BR2e断片の増幅のために用いたプライマーの塩基配列は5'-GATAGAAGCAGAAGATCGGCTATAA-3'及び5'-GATATATTTTTTAGTTGTAATTGTGTCCTG-3'であった。また、BR2aのPCRは、94℃、４分間の変性工程後、94℃、30秒間の変性工程後、68℃、３分間+DT4秒間のアニーリング工程兼伸長工程から成るサイクルを35回繰り返し、最後に72℃、5分間の伸長工程を行うことにより行った。BR2b及びBR2cのPCRは、94℃、４分間の変性工程後、94℃、30秒間の変性工程後、60℃、15秒間のアニーリング工程、72℃3分間+DT4秒間の伸長工程から成るサイクルを27回繰り返し、最後に72℃、5分間の伸長工程を行うことにより行った。BR2dのPCRは、94℃、４分間の変性工程後、94℃、30秒間の変性工程後、60℃、15秒間のアニーリング工程、72℃3分間+DT4秒間の伸長工程から成るサイクルを35回繰り返し、最後に72℃、5分間の伸長工程を行うことにより行った。BR2eのPCRは、94℃、４分間の変性工程後、94℃、30秒間の変性工程後、58℃、３０秒間のアニーリング工程、72℃3分間+DT4秒間の伸長工程から成るサイクルを35回繰り返し、最後に72℃、5分間の伸長工程を行うことにより行った。
（３）検出
ギャップベクターを、前記ユニークな制限酵素で切断したものと、先に調製した被検DNA断片を用い、実施例１、２と同じ方法により酵母サッカロミセス・セレビシエYPH499を共に形質転換し、形質転換株を選択して、ナンセンス突然変異フレームシフト突然変異について検査を行った。形質転換株の選択には、ウラシル要求性の宿主を用い、１）ウラシルを含まない培地上で形質転換体を培養することによるポジティブ選択、と２）５FOA（５−フロロオロチニン酸（5-fluoro−orotic acid））を含む培地上で形質転換体を培養することによるネガティブ選択により行った。
（４）結果
結果を表４に示す。患者１及び患者２についてDNAシーケンス解析を行った。患者１は、ヘテロ接合性で5146delTTTA(4bp欠失)をBR２c断片内に検出した。患者２は、ヘテロ接合性で6697delTC(2bp欠失)をBR２d断片内に検出した。従って、上記の方法によって得られた結果は、被検DNA断片の塩基配列解析の結果と完全に一致しており、本発明の方法によりナンセンス突然変異及びフレームシフト突然変異を検出することが確認された。
0003793237.tif 000005
実施例４  hMSH２遺伝子のナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異の検出
（１）hMSH 2ギャップベクターの構築
健常人由来のPCR増幅hMSH 2 ORF全長（GenBankＵ03911のnt.4〜2805）をpCI-HA(URA3)-2のBamH I部位に挿入してpCI-MS19を得た。これらの組換えベクターでサッカロミセス・セレビシエYPH499を常法により形質転換したところ、形質転換体は全てURA+、5FOA感受性であった。
ギャップベクターpCI-MS20は、制限酵素Bgl IIで組換えベクターpCI-MS19を消化し挿入断片中央部97〜2730ntを抜き去ったものである。なお、被検核酸断片として用いた、組換えベクターpCI-MS19及びpCI-MS20中の挿入断片の構造を図４に示す。
（２）hMSH２SCアッセイ
遺伝性非ポリポーシス性大腸癌患者１名及び健常人２名のhMSH2遺伝子のオープンリーディングフレームの全領域について検査を行った。
遺伝性非ポリポーシス性大腸癌患者１名及びコントロールとして健常人２名のリンパ球から全RNAを常法により単離した。なお、これらの患者及び健常人のhMSH２遺伝子のコード領域の塩基配列は予めわかっている。市販のcDNA合成キット（First−Strand cDNA Synthesis kit（ファルマシア社製））を用いてcDNAを合成した。このようにして得られたcDNAを鋳型として、PCRにより被検DNA断片を増幅した。増幅した被検DNA断片は、hMSH2遺伝子の4〜2805ntであった。前述断片の増幅のために用いたプライマーの塩基配列は5'-ATGGCGGTGCAGCCGAAGGAGACGC-3'及び5'-CGTAGTAACTTTTATTCGTGAAATGATTTCATT-3'であった。また、このPCR条件は、94℃、４分間の変性工程後、94℃、30秒間の変性工程後、60℃、30秒間のアニーリング工程、72℃3分間の伸長工程から成るサイクルを32回繰り返し、最後に72℃、5分間の伸長工程を行うことにより行った。
（３）検出
ギャップベクターを、前記ユニークな制限酵素で切断したものと、先に調製した被検DNA断片を用い、実施例１、２及び３と同じ方法により酵母サッカロミセス・セレビシエYPH499を共に形質転換し、形質転換株を選択して、ナンセンス突然変異フレームシフト突然変異について検査を行った。形質転換株の選択には、ウラシル要求性の宿主を用い、１）ウラシルを含まない培地上で形質転換体を培養することによるポジティブ選択、と２）５FOA（５−フロロオロチニン酸（5-fluoro−orotic acid））を含む培地上で形質転換体を培養することによるネガティブ選択により行った。
（４）結果
結果を表５に示す。患者１についてDNAシーケンス解析を行った。患者１は、ヘテロ接合性で2297delC(1bp欠失)をhMSH2断片内に検出した。従って、上記の方法によって得られた結果は、被検DNA断片の塩基配列解析の結果と完全に一致しており、本発明の方法によりナンセンス突然変異及びフレームシフト突然変異を検出することが確認された。
0003793237.tif 000006
配列表
配列番号：1
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000007
配列番号：2
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000008
配列番号：3
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000009
配列番号：4
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000010
配列番号：5
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000011
配列番号：6
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000012
配列番号：7
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000013
配列番号：8
配列の長さ：33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000014
配列番号：9
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000015
配列番号：10
配列の長さ：31
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000016
配列番号：11
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000017
配列番号：12
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000018
配列番号：13
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000019
配列番号：14
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000020
配列番号：15
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000021
配列番号：16
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000022
配列番号：17
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000023
配列番号：18
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000024
配列番号：19
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000025
配列番号：20
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000026
配列番号：21
配列の長さ：33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000027
配列番号：22
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000028
配列番号：23
配列の長さ：33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000029
配列番号：24
配列の長さ：36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000030
配列番号：25
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000031
配列番号：26
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000032
配列番号：27
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000033
配列番号：28
配列の長さ：33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000034
配列番号：29
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000035
配列番号：30
配列の長さ：34
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000036
配列番号：31
配列の長さ：34
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000037
配列番号：32
配列の長さ：35
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000038
配列番号：33
配列の長さ：31
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000039
配列番号：34
配列の長さ：33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000040
配列番号：35
配列の長さ：38
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000041
配列番号：36
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000042
配列番号：37
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000043
配列番号：38
配列の長さ：25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000044
配列番号：39
配列の長さ：22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000045
配列番号：40
配列の長さ：36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000046
配列番号：41
配列の長さ：36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000047
配列番号：42
配列の長さ：29
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000048
配列番号：43
配列の長さ：25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000049
配列番号：44
配列の長さ：25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000050
配列番号：45
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000051
配列番号：46
配列の長さ：25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000052
配列番号：47
配列の長さ：33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
0003793237.tif 000053
【図１】
0003793237.tif 000054
0003793237.tif 000055
0003793237.tif 000056
0003793237.tif 000057
【図２】
0003793237.tif 000058
【図３】
0003793237.tif 000059
【図４】
0003793237.tif 000060