(57)【要約】  がん細胞に対する認識を高めた細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法、該細胞傷害性Ｔ細胞を含むがん治療薬、ならびに該治療薬を用いた治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された末梢血単核球を
（１）ＩＬ−２、
（２）抗ＣＤ３抗体、ならびに
（３）２-ｄｅｏｘｙ-ｄ-ｇｌｕｃｏｓｅ（２ＤＧ）又はその誘導体
存在下でインビトロ培養することを含む、αβＴ加工細胞の製造方法。
【請求項２】
前記αβＴ加工細胞中、αβＴ細胞約７４％〜９０％およびおよびγδＴ細胞およびＮＫ細胞約１０％〜２６％を含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記αβＴ加工細胞中、ＣＤ８陽性メモリーＴ細胞が、７８％以上含まれる、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記αβＴ加工細胞中、ＩＬ−２Ｒ陽性αβＴ細胞が２５％以上および／または、パーフォリン陽性αβＴ細胞が１５％以上および／または、グランザイム陽性αβＴ細胞が２０％以上含まれる請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
２ＤＧの誘導体や類似体が、２−デオキシマンノース−６−リン酸、２−デオキシマンノース−１−リン酸およびＧＤＰ−２−デオキシマンノース、２−フルオロ−２−デオキシグルコース、２−フルオロデオキシグルコース、２−フルオロ−デオキシグルコース−６−リン酸、２−フルオロ−デオキシグルコース−１−リン酸、２−フルオロ−デオキシマンノース、２−フルオロ−デオキシマンノース−６−リン酸、２−フルオロ−デオキシマンノース−１−リン酸、またはガラクトースやマンノース等の六員環を有する糖およびその誘導体ならびにこれらの生理学的に許容される塩又は溶媒和物からなる群から選択される、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
２-ｄｅｏｘｙ-ｄ-ｇｌｕｃｏｓｅ（２ＤＧ）又はその誘導体で刺激されたαβＴ加工細胞を含む、がんを治療又は予防するための医薬組成物。
【請求項７】
前記がんがＮＫＧ２Ｄリガンドを発現している、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＮＫＧ２Ｄリガンドが、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＡＥＴ１ε、ＲＡＥＴ１α、ＲＡＥＴ１β、ＲＡＥＴ１γ、ＲＡＥＴ１δ、Ｍｕｌｔ１、Ｈ６０ａ、Ｈ６０ｂ、Ｈ６０ｃ、およびＵＬＢＰ１〜６からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現しているがんが骨肉種、乳がん、子宮頸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、肺がん、膵臓がん、結腸がん、前立腺がん、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、甲状腺がん、濾胞性甲状腺がん、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、線維肉腫、横紋筋肉腫、メラノーマ、ぶどう膜メラノーマ、奇形癌、神経芽腫、神経膠腫、神経膠芽腫、角化棘細胞腫、腎臓がん、未分化大細胞リンパ腫、食道扁平上皮細胞癌、肝細胞癌、濾胞性樹状細胞癌、腸がん、筋層浸潤がん、精巣がん、表皮癌、脾臓がん、頭頸部がん、胃がん、肝臓がん、骨がん、脳がん、網膜がん、胆道がん、小腸がん、唾液腺がん、子宮がん、精巣がん、結合組織がん、前立腺肥大症、脊髄形成異常、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、鼻咽腔がん、神経内分泌がん、中皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド、食道胃がん、ファローピウス管がん、腹膜がん、漿液性乳頭状ミュラー管がん、悪性腹水、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、リー・フラウメニ症候群からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
２-ｄｅｏｘｙ-ｄ-ｇｌｕｃｏｓｅ（２ＤＧ）又はその誘導体で刺激されたαβＴ加工細胞を含む、細菌又はウイルスの感染を治療又は予防するための医薬組成物。
【請求項１１】
前記細菌が、グラム陰性菌又はグラム陽性菌から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ウイルスが、サイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、エプスタイン・バーウイルス(ＥＢＶ)、アデノウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトＴリンパ好性ウイルス（ＨＴＬＶ）およびＨＩＶからなる群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
再生医療等製品の製造における、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法により製造されたαβＴ加工細胞の使用。
【請求項１４】
前記再生医療等製品が、がんを治療又は予防するための再生医療等製品である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記再生医療等製品が、細菌又はウイルスの感染を治療又は予防するための再生医療等製品である、請求項１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん細胞に対する傷害性を高めた細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法、該細胞傷害性Ｔ細胞を含むがん治療薬、該治療薬を用いた治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫細胞治療（Ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ）とは、患者から採取したＴ細胞をインビトロで増幅し、患者体内に戻すことにより、体内のがん細胞を免疫反応により治療することを目標とするがん免疫療法の１つである。免疫細胞治療は主として用いる細胞の種類により、以下に分類される：
１）樹状細胞ワクチン療法、２）αβＴ細胞療法、３）細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）療法、４）γδＴ細胞療法、５）ＮＫ細胞療法、などが盛んに行われている（非特許文献１）。【０００３】
樹状細胞ワクチン療法とは、末梢血液中の単球から分化させた樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ: ＤＣ）に、その標的となるがん細胞を貪食させて体内に戻し、がん細胞を傷害する能力のある細胞（主にＴ細胞）や抗体産生機能をもつＢ細胞にがんや病原体の目印（抗原）を伝える役割を担う「抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ: ＡＰＣ）」として機能させることにより、がんを治療する方法である。【０００４】
αβＴ細胞療法とは、末梢血液中に含まれるリンパ球を約２週間、インターロイキン−２（ＩＬ−２）と抗ＣＤ３抗体を用いて培養し、その全体を活性化・増殖させたのち体内に戻す治療法である。末梢血のＴリンパ球の大半がαβ型のＴ細胞受容体（Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＣＲ）を持つαβＴ細胞であり、増殖した細胞の多くもαβＴ細胞ということになる。【０００５】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）療法は、一般的に体外でがん細胞やがん抗原を取り込ませたＤＣを用いてＴ細胞を刺激することにより、がん抗原特異的な細胞傷害性をもつＴ細胞を増幅し、体内に戻す治療法である。しかしながら、血液中のがん特異的ＣＴＬはわずかであり、治療に十分な数を得ることは困難である。【０００６】
γδＴ細胞は、リンパ球ストレス（細胞傷害）監視機構（ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｓｔｒｅｓｓ−ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）と呼ばれる生体防御反応を担う中心的な細胞であり、γδＴ細胞療法とは、患者から採血した末梢血中にわずかに存在する（１〜５％）γδ型Ｔ細胞受容体（Ｖγ９Ｖδ２受容体）をもつγδＴ細胞を選択的に増殖させ、体内に戻す治療法である。γδＴ細胞はαβＴ細胞が認識する「抗原」とは別のがん細胞表面に比較的共通して発現する分子などを認識することでがんを殺傷する「抗原非特異的」な抗腫瘍効果が得られる（特許文献１および非特許文献２）。【０００７】
ＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ）細胞療法とは、末梢血中に含まれるＮＫ細胞などの異常細胞を傷害する能力の高い細胞を、ＩＬ−２など複数の刺激物質を用いて活性化、増殖させて体内に戻し、がんを治療する方法である。ＮＫ細胞は、自然免疫系を担うリンパ球の１種で、強い細胞傷害能を有しており、特に、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ分子が発現低下または消失した細胞を認識し殺傷する機構を有すること、および、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における主たるエフェクター細胞として機能することなどから、ウイルス感染細胞の排除に重要な細胞である。【０００８】
免疫細胞治療は、従来の外科治療、放射線治療、化学治療の三大療法に比べて副作用がほとんどないという利点を有しており、第４のがん治療法として実際の肺がん患者に対して先進医療としても施されている治療法である。しかしながら、がんに対するさらなる治療効果向上には、１）細胞傷害機能を増強し体内で長期間機能維持でき、２）がん特異性が高く、３）がん組織内でも機能低下を起こさない免疫細胞が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許３０５６２３０号
【特許文献２】国際公開２０１３／１５３８００号
【００１０】
【非特許文献１】ＨＵＭＡＮ ＣＥＬＬ ５巻３号(１９９２)
【非特許文献２】Ｂｌｏｍｅｄ & Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ (１９９３) ４７, ７３-７８
【非特許文献３】ＢＩＯＴＨＲＡＰＹ ４巻１０号(１９９０)
【非特許文献４】Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ. ２０１２ Ｆｅｂ １５;１８８(４):１８４７-５５.
【非特許文献５】Ｃｕｒｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ. ２００９ Ｆｅｂ;５(１):２２-３４.
【非特許文献６】ＢＬＯＯＤ, １５ ２００４  ｖｏｌ１０３(８)  ３０６５-３０７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
免疫細胞治療のうち、従来から実施されているαβＴ細胞療法に着目し、よりがんに対する攻撃性を有する免疫細胞治療を提供する。さらに、他の細胞ストレスを引き起こす障害（例えばウイルス感染、細菌感染、薬剤ストレス、酸化ストレスなど）に対しても、有効な免疫細胞治療を提供する（非特許文献５）。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記のように、αβＴ細胞は、樹状細胞などからがん抗原を提示され、その抗原を目印にがん細胞に攻撃を加える。しかしながら、それに加えて抗原非特異的ながん細胞傷害活性を持つ機構があることがわかっている。（非特許文献６）。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、αβＴ細胞をインビトロ培養する際、細胞培養液中に、マンノース代謝を介してタンパク質の糖鎖修飾（Ｎ−結合型糖鎖）を変化させる化合物 [２-ｄｅｏｘｙ-ｄ-ｇｌｕｃｏｓｅ (以下、２ＤＧとする)]を添加すると、調製した免疫細胞は、従来のαβＴ加工細胞に比べて、抗原非特異的な強い抗腫瘍効果（エフェクター機能）を獲得することを発見した。
【発明の効果】
【００１３】
２ＤＧは、従来医薬としてそのまま、投与されることもあった。しかしながら、２ＤＧは同時にがん細胞に対しても作用し免疫細胞の標的分子であるＮＫＧ２Ｄリガンドの細胞表面の発現を阻害するため、がん細胞がＮＫ細胞やＴ細胞の認識から逃れる可能性があった（非特許文献４）。それに対して、本願発明は免疫細胞のインビロト培養時に２ＤＧを用いることにより、特定のＮＫＧ２Ｄリガンドを発現しているがんに対して、特異的かつ選択的にがん免疫療法を提供することができる。さらに、αβＴ細胞の細胞表面上の糖鎖修飾を変えることにより、体内に投与された場合、がん細胞によるエフェクター機能抑制を回避することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの分布を示すＦＡＣＳプロット。図の数字は各象限における細胞のパーセンテージを示す。ｃｏｎｔ：抗ＣＤ３抗体刺激、ＩＬ−２添加培地で培養；２ＤＧ：抗ＣＤ３抗体刺激、ＩＬ２および２ＤＧ添加培地で培養。
【図２Ａ】２ＤＧなし（ｃｏｎｔ）又は２ＤＧ存在下（２ＤＧ）で培養したαβＴ加工細胞をＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳ培地に置換し、２４時間後の培養上清中のサイトカインの量。由来するドナーごとに線を結んだ。量はＢｉｏ−ｐｌｅｘで測定した。ｃｏｎｔ：抗ＣＤ３抗体刺激、ＩＬ−２添加培地で培養；２ＤＧ：抗ＣＤ３抗体刺激、ＩＬ２および２ＤＧ添加培地で培養。
【図２Ｂ】２ＤＧなし（ｃｏｎｔ）又は２ＤＧ存在下（２ＤＧ）で培養したαβＴ加工細胞をＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳ培地に置換し、ＰＭＡ／イオノマイシン刺激２４時間後の培養上清中のパーフォリンおよびグランザイムの量。量はＥＬＩＳＡ法で測定した。
【図２Ｃ】がん細胞に対する２ＤＧなし（ｃｏｎｔ）又は２ＤＧ存在下（２ＤＧ）で培養したαβＴ加工細胞の細胞傷害活性。活性の割合は、蛍光標識したがん細胞とαβＴ加工細胞を共培養し、傷害を受けたがん細胞の蛍光減衰量、１％ＮＰ４０処置した最大蛍光減衰量、がん細胞のみの自然減衰量から計算された。ＮＳ：有意差なし；＊Ｐ＜０．０１
【図２Ｄ】αβＴ加工細胞をがん細胞と共培養した場合の脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａを有するＣＤ８＋Ｔ細胞の割合。２ＤＧなし（ｃｏｎｔ）又は２ＤＧ存在下（２ＤＧ）で培養したαβＴ加工細胞。
【図３Ａ】２ＤＧなし（ｃｏｎｔ）又は２ＤＧ存在下（２ＤＧ）で培養したαβＴ加工細胞のＮＫＧ２Ｄの発現量。ＮＳ：有意差なし
【図３Ｂ】がん細胞表面上のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現。
【図３Ｃ】抗ＮＫＧ２Ｄ抗体による細胞傷害活性の抑制。２ＤＧなし（ｃｏｎｔ）又は２ＤＧ存在下（２ＤＧ）で培養したαβＴ加工細胞。ＮＳ：有意差なし；＊Ｐ＜０．０１
【図４Ａ】解糖系阻害剤で培養したαβＴ加工細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの分布を示すＦＡＣＳプロット。図の数字は各象限における細胞のパーセンテージを示す。
【図４Ｂ】２ＤＧ、オキサメートまたはブロモピルベートの解糖系への影響。ＮＳ：有意差なし；＊Ｐ＜０．０１
【図４Ｃ】がん細胞に対する解糖系阻害剤（±）で培養したαβＴ加工細胞の細胞傷害活性。ＮＳ：有意差なし；＊Ｐ＜０．０１
【図５Ａ】細胞表面糖鎖のＬＣ−ＭＳ質量分析解析。
【図５Ｂ】２ＤＧ存在下αβＴ細胞培養へのＤ−マンノース添加による細胞傷害活性の抑制。２ＤＧなし（ｃｏｎｔ）、２ＤＧ存在下（２ＤＧ）、２ＤＧとＤ−マンノース存在下（２ＤＧ＋Ｄ-Ｍａｎ）又は２ＤＧとＬ−マンノース存在下（２ＤＧ＋Ｌ-Ｍａｎ）で培養したαβＴ加工細胞。ＮＳ：有意差なし；＊Ｐ＜０．０１
【図５Ｃ】２ＤＧ存在下αβＴ細胞培養へのＤ−マンノース添加による細胞内パーフォリン産生抑制。２ＤＧなし（ｃｏｎｔ）、２ＤＧ存在下（２ＤＧ）、２ＤＧとＤ−マンノース存在下（２ＤＧ＋Ｄ-Ｍａｎ）又は２ＤＧとＬ−マンノース存在下（２ＤＧ＋Ｌ-Ｍａｎ）で培養したαβＴ加工細胞。
【図５Ｄ】２ＤＧで培養したαβＴ加工細胞のＩＬ−２受容体発現のＦＡＣＳプロット。図の数字は各象限における細胞のパーセンテージを示す。２ＤＧなし（ｃｏｎｔ）、２ＤＧ存在下（２ＤＧ）、２ＤＧとＤ−マンノース存在下（２ＤＧ＋Ｄ-Ｍａｎ）又は２ＤＧとＬ−マンノース存在下（２ＤＧ＋Ｌ-Ｍａｎ）で培養したαβＴ加工細胞。
【図５Ｅ】２ＤＧ存在下（２ＤＧ）で培養したαβＴ加工細胞のＩＬ−２再刺激によるＩＦＮγ産生の上昇。量はＥＬＩＳＡ法で測定した。２ＤＧなし（ｃｏｎｔ）、２ＤＧ存在下（２ＤＧ）、２ＤＧとＤ−マンノース存在下（２ＤＧ＋Ｄ-Ｍａｎ）又は２ＤＧとＬ−マンノース存在下（２ＤＧ＋Ｌ-Ｍａｎ）で培養したαβＴ加工細胞。＊Ｐ＜０．０１
【図５Ｆ】αβＴ加工細胞のＩＬ−２受容体のｍＲＮＡ発現量の比較。発現量はリアルタイムＰＣＲ法を用いて測定した。２ＤＧなし（ｃｏｎｔ）、２ＤＧ存在下（２ＤＧ）、２ＤＧとＤ−マンノース存在下（２ＤＧ＋Ｄ-Ｍａｎ）又は２ＤＧとＬ−マンノース存在下（２ＤＧ＋Ｌ-Ｍａｎ）で培養したαβＴ加工細胞。
【図６Ａ】２ＤＧ存在下（２ＤＧ）で培養したαβＴ加工細胞のガレクチン−３結合能の低下。２ＤＧなし（ｃｏｎｔ）又は２ＤＧ存在下（２ＤＧ）で培養したαβＴ加工細胞。
【図６Ｂ】２ＤＧ存在下（２ＤＧ）で培養したαβＴ加工細胞のガレクチン−３による、αβＴ加工細胞のアポトーシス（ＰＩ＋／Ａｎｎｅｘｉｎ＋）誘導の抑制。２ＤＧなし（ｃｏｎｔ）又は２ＤＧ存在下（２ＤＧ）で培養したαβＴ加工細胞。
【図７Ａ】２ＤＧ処理αβＴ細胞によるｉｎ−ｖｉｖｏ抗腫瘍効果。２ＤＧなし（ｃｏｎｔ）又は２ＤＧ存在下（２ＤＧ）で培養したαβＴ加工細胞、およびＰＢＳ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）を静脈注射したマウスの腫瘍サイズイメージング。
【図７Ｂ】２ＤＧ処理αβＴ細胞によるｉｎ−ｖｉｖｏ抗腫瘍効果。２ＤＧなし（ｃｏｎｔ）又は２ＤＧ存在下（２ＤＧ）で培養したαβＴ加工細胞、およびＰＢＳ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）を静脈注射したマウスの生存率比較。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
従って、本発明は本発明の構成は以下の［１］から［１５］の通りである：
［１］単離された末梢血単核球を
（１）ＩＬ−２、
（２）抗ＣＤ３抗体、ならびに
（３）２-ｄｅｏｘｙ-ｄ-ｇｌｕｃｏｓｅ（２ＤＧ）又はその誘導体
存在下でインビトロ培養することを含む、αβＴ加工細胞の製造方法；
［２］前記αβＴ加工細胞中、αβＴ細胞約７４％〜９０％；γδＴ細胞およびＮＫ細胞約１０％〜２６％を含む、［１］に記載の製造方法；
［３］前記αβＴ加工細胞中、ＣＤ８陽性メモリーＴ細胞が、７４、７５、７６、７７、７８％以上含まれる、［１］に記載の製造方法；
［４］前記αβＴ加工細胞中、ＩＬ−２Ｒ陽性αβＴ細胞が２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８  ２９或いは３０％以上および／または、パーフォリン陽性αβＴ細胞が１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９或いは２０％以上および／または、グランザイム陽性αβＴ細胞が１５、１６、１７、１８，１９、２０、２１、２２、２３、２４或いは２５％以上含まれる［１］に記載の製造方法；
［５］２ＤＧの誘導体や類似体が、２−デオキシマンノース−６−リン酸、２−デオキシマンノース−１−リン酸およびＧＤＰ−２−デオキシマンノース、２−フルオロ−２−デオキシグルコース、２−フルオロデオキシグルコース、２−フルオロ−デオキシグルコース−６−リン酸、２−フルオロ−デオキシグルコース−１−リン酸、２−フルオロ−デオキシマンノース、２−フルオロ−デオキシマンノース−６−リン酸、２−フルオロ−デオキシマンノース−１−リン酸、またはガラクトースやマンノース等の六員環を有する糖およびその誘導体ならびにこれらの生理学的に許容される塩又は溶媒和物からなる群から選択される、
［１］〜［４］のいずれか一項に記載の製造方法。
【００１６】
［６］２-ｄｅｏｘｙ-ｄ-ｇｌｕｃｏｓｅ（２ＤＧ）又はその誘導体で刺激されたαβＴ加工細胞を含む、がんを治療又は予防するための医薬組成物；
［７］前記がんがＮＫＧ２Ｄリガンドを発現している、［６］に記載の医薬組成物；
［８］ＮＫＧ２Ｄリガンドが、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＡＥＴ１ε、ＲＡＥＴ１α、ＲＡＥＴ１β、ＲＡＥＴ１γ、ＲＡＥＴ１δ、Ｍｕｌｔ１、Ｈ６０ａ、Ｈ６０ｂ、Ｈ６０ｃ、およびＵＬＢＰ１〜６ＭＩＣＡからなる群から選択される、［７］に記載の医薬組成物；
［９］ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現しているがんが骨肉種、乳がん、子宮頸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、メラノーマ、膀胱がん、肺がん、膵臓がん、結腸がん、前立腺がん、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、甲状腺がん、濾胞性甲状腺がん、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、線維肉腫、横紋筋肉腫、メラノーマ、ぶどう膜メラノーマ、奇形癌、神経芽腫、神経膠腫、神経膠芽腫、角化棘細胞腫、腎臓がん、未分化大細胞リンパ腫、食道扁平上皮細胞癌、肝細胞癌、濾胞性樹状細胞癌、腸がん、筋層浸潤がん、精巣がん、表皮癌、脾臓がん、頭頸部がん、胃がん、肝臓がん、骨がん、脳がん、網膜がん、胆道がん、小腸がん、唾液腺がん、子宮がん、精巣がん、結合組織がん、前立腺肥大症、脊髄形成異常、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、鼻咽腔がん、神経内分泌がん、中皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド、食道胃がん、ファローピウス管がん、腹膜がん、漿液性乳頭状ミュラー管がん、悪性腹水、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、リー・フラウメニ症候群からなる群から選択される、［７］に記載の医薬組成物。
【００１７】
［１０］２-ｄｅｏｘｙ-ｄ-ｇｌｕｃｏｓｅ（２ＤＧ）又はその誘導体で刺激されたαβＴ加工細胞を含む、細菌又はウイルスの感染を治療又は予防するための医薬組成物；
［１１］前記細菌が、グラム陰性菌又はグラム陽性菌から選択される、［１０］に記載の医薬組成物；
［１２］前記ウイルスが、サイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、エプスタイン・バーウイルス(ＥＢＶ)、アデノウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトＴリンパ好性ウイルス（ＨＴＬＶ）およびＨＩＶからなる群から選択される、［１０］に記載の医薬組成物。
【００１８】
［１３］再生医療等製品の製造における、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法により製造されたαβＴ加工細胞の使用；
［１４］前記再生医療等製品が、がんを治療又は予防するための再生医療等製品である、［１３］に記載の使用；
［１５］前記再生医療等製品が、細菌又はウイルスの感染を治療又は予防するための再生医療等製品である、［１３］に記載の使用。
【００１９】
＜１．αβＴ加工細胞の製造方法＞
まず、αβＴ細胞の細胞源となるＰＢＭＣｓを準備する。ここで「末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）」とは、末梢血から分離された、リンパ球（ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞など）、単球などを含む細胞集団を意味する。ＰＢＭＣｓを準備する方法は、特に限定されない。たとえば、採血により得られた末梢血を密度勾配遠心することで、ＰＢＭＣｓを得ることができる。１回の採血量は、αβＴ細胞療法を行う患者に応じて適宜設定すればよいが、例えば２４〜７２ｍＬ程度である。
また、多量の細胞を確保する必要がある場合には、成分採血装置を用いて単核球成分を採取することが可能である。
【００２０】
採取したＰＢＭＣｓは培養液（培地）に懸濁し、得られた細胞懸濁液にＩＬ−２、抗ＣＤ３抗体、ならびに２ＤＧを添加して、αβＴ細胞を培養する。ＰＢＭＣｓをＩＬ−２および抗ＣＤ３抗体の存在下で培養することにより、αβＴ細胞を選択的に増殖および活性化させて、活性化αβＴ細胞を高純度に含む細胞集団を調製することができる。２ＤＧ添加を含まない従来のαβＴ加工細胞の製造では、約９４％がＴ細胞、約６％がＮＫ細胞であり、Ｔ細胞のうちαβＴ細胞約８６％（ＣＤ８陽性Ｔ細胞約６９％＋ＣＤ４陽性Ｔ細胞約３１％）；γδＴ細胞約１４％を含む細胞集団が調製された。
抗ＣＤ３抗体は培地中に添加しても、培養容器に固相化してもよいが、抗ＣＤ３抗体を固相化したフラスコ等の培養容器にリンパ球を播種することで、より好適に培養できることが知られている（例えば、特許３０５６２３０号）。ＩＬ−２の濃度は培地中に１００〜２０００ＩＵ／ｍＬの濃度となるように添加することが好ましい。
培養は、３４〜３８℃、好ましくは３７℃で、２〜１０％、好ましくは５％のＣＯ２条件下で行い、培養期間は１日〜２０日、特に１〜２週間程度が好ましい。
使用する培地は特に限定されないが、ＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン）、ＲＰＭＩ−１６４０培地（インビトロジェン）、ダルベッコ改変イーグル培地（インビトロジェン）、イスコフ培地（インビトロジェン）、ＫＢＭ培地（コージンバイオ）、ＡＬｙＳ培地（細胞科学研究所）等細胞培養に使用されている市販の培地を使用することができる。あらかじめＩＬ−２が含まれた、ヒト末梢血Ｔ細胞用培地（例えば、ＡＬｙＳ５０５Ｎ；細胞科学研究所）であってもよい。また、必要に応じて５〜２０％の牛血清、牛胎児血清、ヒト血清、ヒト血漿等を添加することができる。
【００２１】
本発明において、２-ｄｅｏｘｙ-ｄ-ｇｌｕｃｏｓｅとは以下の式で表される化合物、あるいはその薬物学的に許容できる塩又は溶液を指す。
【化１】
2019156145.tif 000002
【００２２】
２ＤＧと同等に用いることの出来る化合物として、公知の２ＤＧの誘導体や類似体が挙げられる。これに限定しないが、２−デオキシマンノース−６−リン酸、２−デオキシマンノース−１−リン酸およびＧＤＰ−２−デオキシマンノース、２−フルオロ−２−デオキシグルコース、２−フルオロデオキシグルコース、２−フルオロ−デオキシグルコース−６−リン酸、２−フルオロ−デオキシグルコース−１−リン酸、２−フルオロ−デオキシマンノース、２−フルオロ−デオキシマンノース−６−リン酸、２−フルオロ−デオキシマンノース−１−リン酸、またはガラクトースやマンノース等の六員環を有する糖およびその誘導体等が挙げられる。上記化合物は、フリー体であってもよく、その生理学的に許容される塩又は溶媒和物であってもよい。さらに、水和物であっても非水和物であってもよい。塩は限定されないが、塩酸塩等の無機塩や酢酸塩、クエン酸塩、ギ酸塩等の有機酸塩を含む。
【００２３】
ＰＢＭＣｓの培養時に添加する薬剤の濃度は、５ｍＭ以下が好ましく実施例においては２ｍＭで用いている。
【００２４】
以上の手順により、αβＴ加工細胞を大量に含む細胞集団を得ることができる。得られた細胞集団は、後述するようにαβＴ細胞療法において患者に投与する細胞として利用することができる。また、再生医療等製品としても用いることができる。
【００２５】
「再生医療等製品」とは、
１）（ｉ）人又は動物の体の構造又は機能の再建、修復又は形成、或いは
（ｉｉ）人又は動物の疾病の治療又は予防、
に使用されることが目的とされている物のうち、人又は動物の細胞に培養その他の加工を施したもの；或いは
２）人又は動物の疾病の治療に使用されることが目的とされている物のうち、人又は動物の細胞に導入され、これらの体内で発現する遺伝子を含有させたもの
を指す。特に限定しないが、
１） ヒト細胞加工製品
ア ヒト体細胞加工製品
イ ヒト体性幹細胞加工製品
ウ ヒト胚性幹細胞加工製品
エ ヒト人工多能性幹細胞加製品
２）動物 細胞加工製品
ア 動物体細胞加工製品
イ 動物体性幹細胞加工製品
ウ 動物胚性幹細胞加工製品
エ 動物人工多能性幹細胞加製品
３）遺伝子治療用製品
ア プラスミドベクター製品
イ ウイルスベクター製品
ウ 遺伝子発現治療製品（ア・イを除く。）
が挙げられ、本願発明のαβＴ加工細胞を大量に含む細胞集団はヒト体細胞加工製品に該当する。
【００２６】
ＮＫＧ２Ｄ（別名ＣＤ３１４；又はＫｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｅｃｔｉｎ Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｋ１（ＫＬＲＫ１））はＮＫＧ２Ｄファミリーの細胞表面レセプター（タイプＩＩ型膜貫通タンパク質）で、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋αβＴ細胞およびγδＴ細胞に発現している。ＮＫＧ２Ｄは、リガンドが結合した際には、会合しているアダプタータンパク質ＤＡＰ１０やＤＡＰ１２等を介して、ＮＫ細胞の細胞傷害活性や、特定のＴ細胞集団の共役刺激を誘導する。ＮＫＧ２Ｄのリガンドは、ストレス誘導性のＭＨＣクラスＩ関連分子ＭＩＣ Ａ、ＭＩＣ Ｂ、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４などであり、これらは主に上皮系の細胞や数多くのがん細胞において発現している。ＮＫＧ２Ｄリガンドはがん細胞以外の細胞ストレスによって細胞表面に発現誘導される。従って、がん細胞だけでなく、他の細胞ストレス、例えば細菌感染、ウイルス感染などでも誘導され、細菌感染又はウイルス感染した細胞は、本願発明に係るαβＴ加工細胞の標的たりうる（非特許文献５）。
【００２７】
これに限定しないが、ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現しているがん細胞は、骨肉種、乳がん、子宮頸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、肺がん、膵臓がん、結腸がん、前立腺がん、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、甲状腺がん、濾胞性甲状腺がん、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、線維肉腫、横紋筋肉腫、メラノーマ、ぶどう膜メラノーマ、奇形癌、神経芽腫、神経膠腫、神経膠芽腫、角化棘細胞腫、腎臓がん、未分化大細胞リンパ腫、食道扁平上皮細胞癌、肝細胞癌、濾胞性樹状細胞癌、腸がん、筋層浸潤がん、精巣がん、表皮癌、脾臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、胃がん、肝臓がん、骨がん、脳がん、網膜がん、胆道がん、小腸がん、唾液腺がん、子宮がん、精巣がん、結合組織がん、前立腺肥大症、脊髄形成異常、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、鼻咽腔がん、神経内分泌がん、骨髄異形成症候群、中皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド、食道胃がん、ファローピウス管がん、腹膜がん、漿液性乳頭状ミュラー管がん、悪性腹水、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、リー・フラウメニ症候群が挙げられる。
【００２８】
これに限定しないが、感染によってＮＫＧ２Ｄリガンドを誘導する細菌は、大腸菌のようなグラム陰性菌やマイコバクテリウムのようなグラム陽性菌が挙げられる。
【００２９】
これに限定しないが、感染によってＮＫＧ２Ｄリガンドを誘導するウイルスは、サイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、エプスタイン・バーウイルス(ＥＢＶ)、アデノウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトＴリンパ好性ウイルス（ＨＴＬＶ）およびＨＩＶなどが挙げられる。
【００３０】
＜２．αβＴ加工細胞を含む医薬＞
本発明の医薬は、上述の本発明の製造方法により製造されたαβＴ加工細胞を含む、がんを治療・予防するための医薬である。
【００３１】
本発明の医薬は、例えば、本発明の製造方法により製造されたαβＴ加工細胞を医薬品として利用可能な液体（例えば、生理食塩水）に懸濁させた注射剤（細胞懸濁液）である。この注射剤は、静脈内や皮内、皮下などに注射されてもよいし、病変部に直接注入されてもよいし、点滴として全身投与されてもよい。生理学的に許容できる担体または賦形剤を含んでもよい。
【００３２】
本発明の医薬は、必須成分として本発明の製造方法により製造されたαβＴ細胞を含むが、任意成分としてその他の成分を含んでいてもよい。例えば、ＩＬ−２などのサイトカインを含んでもよく、抗がん剤などを含んでもよい。これらの薬剤は同時投与であってもよく、一定時間の間隔を空けての連続投与であってもよい。
【００３３】
上記抗がん剤はこれに限定されないが、例えば、ゲムシタビン、５−ＦＵ、シスプラチン、ドセタキセル、パクリタキセル、ゾレドロン酸、免疫チェックポイント阻害剤等が挙げられる。
【００３４】
本発明の医薬に含まれるαβＴ加工細胞の数は、投与方法や疾患の種類、患者の症状などに応じて適宜設定されうる。通常は、１０８〜１０１２個／人（好ましくは１０９個／人）となるように設定すればよい。
【００３５】
本発明の医薬の製造方法は、特に限定されない。例えば、本発明の医薬は、１）本発明のαβＴ加工細胞の製造方法により得られたαβＴ加工細胞を遠心分離などにより回収し；２）回収したαβＴ加工細胞を洗浄液（例えば、生理食塩水やＰＢＳなど）で洗浄し；３）洗浄したαβＴ加工細胞を遠心分離などにより回収し；４）回収したαβＴ加工細胞を医薬品として利用可能な液体（例えば、生理食塩水）に懸濁させることで、経静脈投与が可能な点滴剤として製造されうる。
【００３６】
以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【００３７】
実施例１．２ＤＧ存在下でのαβＴ加工細胞の調製
血液のサンプルは、すべての協力機関の倫理審査委員会の承認後に採取した。末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を、健常人ボランティアドナーの血液から単離した。ＰＢＭＣｓを、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ヤンセンファーマ株式会社）を固相化した培養容器で、ＩＬ−２を１７５ＩＵ／ｍｌ含むＡＬｙＳ培地（細胞科学研究所）中にて２週間自家血漿または血清を補って培養した。２ＤＧ（ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社）は２ｍＭを加えた。【００３８】
実施例２．フローサイトメトリーを用いたＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの分布解析
実施例１で調製したαβＴ加工細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、解析した。細胞をＰＢＳで洗浄後、遠心して、細胞を２％ＦＢＳ＋５ｍＭ  ＥＤＴＡ入りのＰＢＳに再懸濁し、セルストレーナーに通して凝集物を除去した。氷上で１時間、ＰＥ標識抗ＣＤ８抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）、ＦＩＴＣ標識抗ＣＣＲ７抗体、ＰＥ／Ｃｙ５標識抗ＣＤ４５ＲＯ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）と共にインキュベートし、洗浄後、計測した。データは、Ｋａｌｕｚａ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）ソフトウェアを用いて解析した（図１）。【００３９】
その結果、２ＤＧ処理したαβＴ加工細胞は、メモリーＴ細胞（ＣＣＲ７±ＣＤ４５ＲＯ＋）の表現型を示した。
未熟なＴ細胞（ナイーブＴ細胞）は、未だ抗原刺激を受けていない、ＣＤ４５ＲＡ抗原を細胞表面に発現しているリンパ球細胞であり、樹状細胞などの抗原提示細胞と遭遇することにより活性化され、エフェクターＴ細胞となる。
エフェクターＴ細胞はＣＤ４５ＲＡ抗原の代わりにＣＤ４５ＲＯ抗原を細胞表面に発現している。また活性化されたＴ細胞（エフェクターＴ細胞）は、病原体などの抗原が排除された後には一部の細胞が、メモリーＴ細胞となる。
メモリーＴ細胞は、特異的刺激か非特異的刺激かを問わず、既に抗原刺激を受けてＣＤ４５ＲＯ抗原を発現しているリンパ球細胞であり、長期に体内で特異的又は非特異的抗原の記憶を維持しながら保存される。メモリーＴ細胞はさらにエフェクターメモリー（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ；ＥＭ）Ｔ細胞（ＣＣＲ７陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性）とセントラルメモリー（ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ；ＣＭ）Ｔ細胞（ＣＣＲ７陽性ＣＤ４５ＲＯ陽性）に分けることができる。  
したがって、メモリーＴ細胞群を主成分として含有する製剤は、体内で長期に維持され、免疫細胞治療において高い治療効果が得られる可能性が高い。【００４０】
実施例３．２ＤＧ処理したαβＴ加工細胞の細胞傷害活性
３．１．サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γならびにＴＮＦα）ならびにパーフォリンおよびグランザイムＢの分泌
実施例１で調製したαβＴ加工細胞のサイトカイン産生能をＢｉｏ−ｐｌｅｘ「ヒトサイトカインＧ１  ２７ｐｌｅｘパネル」（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて測定した（図２Ａ）。具体的には、実施例１で調製したαβＴ細胞をＩＬ−２なしのＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳ添加培地に置換して培養し、２４時間後の培養上清を回収して測定した。
さらにＰＭＡ（５ｎｇ／ｍｌ）とイオノマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）刺激による脱顆粒後の培養上清中のパーフォリンおよびグランザイムＢをそれぞれＨｕｍａｎ  Ｐｅｒｆｏｒｉｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（ａｂｃａｍ社）を用いて測定した（図２Ｂ）。【００４１】
その結果健常人サンプル４例のうち３例でサイトカイン、パーフォリンおよびグランザイムＢの分泌はいずれも、２ＤＧ処理により増加した。
ＩＬ−２はＴ細胞を活性化し、ＩＦＮ−γやＴＮＦαはＴ細胞からも産生され、抗腫瘍効果を発揮する。パーフォリンはキラーＴ細胞やＮＫ細胞の細胞質内顆粒中に存在する糖タンパク質であり、標的細胞の膜脂質中に入り込み穴を開けることによって細胞傷害をもたらす。グランザイムＢはセリンプロテアーゼの一種で、パーフォリン経由で標的細胞内部に侵入してカスパーゼカスケードを活性化し、標的細胞にアポトーシスやネクローシスを誘導する。
従って、２ＤＧ処理したαβＴ加工細胞の細胞傷害活性は従来法に較べて高い細胞傷害活性を有することが示唆された。【００４２】
３．２．培養細胞に対するインビトロでの細胞傷害活性
蛍光染色法による細胞傷害活性試験を、テラスキャンＶＰＣ２（ＭＩＮＥＲＶＡ  ＴＥＣＨ社）を用いて行った。がん細胞株Ｋ５６２（白血病細胞株）、Ｄａｕｄｉ（バーキットリンパ腫細胞株）および、ＨＯＳ（骨肉種細胞株）およびＤＬＤ１（大腸がん細胞株）を蛍光色素ＣｅｌｌｓｔａｉｎＲ−Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（同仁化学研究所）２．５５〜５μｇ／ｍＬで３０分間標識した。標識したがん細胞とαβＴ加工細胞を１：２５の割合で混合してＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ（ＩＬ−２の添加なし）で２〜４時間インキュベートした。細胞傷害活性は、１％ＮＰ４０（界面活性剤）で処理した時の蛍光減衰率を１００％として、αβＴ加工細胞を共培養したがん細胞の蛍光強度の変化を指標に計算した（図２Ｃ）。【００４３】
その結果、２ＤＧ処理したαβＴ加工細胞は従来法に較べて、Ｄａｕｄｉ細胞以外の細胞に対する細胞傷害活性が有意に上昇することが示された。【００４４】
実施例４．細胞傷害性と脱顆粒の関係
上記のように２ＤＧ処理したαβＴ加工細胞は、サイトカイン、パーフォリンおよびグランザイムＢ等のエフェクター因子の分泌が促進され、細胞傷害活性が亢進していた。細胞傷害性Ｔ細胞やＮＫ細胞のエフェクター因子の放出には細胞内小胞に局在するＣＤ１０７ａの細胞表面への露出が脱顆粒の指標となることから、細胞傷害性の異なるがん細胞との共培養によるＣＤ１０７ａの細胞表面上の露出を検出した。
ＡＰＣ標識抗ＣＤ１０７ａ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）存在下、αβＴ加工細胞とがん細胞を２５：１の割合で混合し、６時間培養した。細胞を洗浄後、ＰＥ標識抗ＣＤ８抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で染色した。フローサイトメーターＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて測定を行い、データは、Ｋａｌｕｚａ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）ソフトウェアを用いて解析した（図２Ｄ）。【００４５】
その結果、２ＤＧ処理したことにより細胞傷害活性が上昇したＫ５６２細胞と混合したαβＴ加工細胞では、ＣＤ１０７ａの細胞表面への露出（すなわちＣＤ８＋Ｔ細胞の脱顆粒）が促進し、細胞傷害活性が上昇しなかったＤａｕｄｉ細胞と混合したαβＴ加工細胞では、ＣＤ１０７ａの細胞表面への露出が促進していなかった。【００４６】
実施例５．ＮＫＧ２ＤとＮＫＧ２Ｄリガンドの影響
上記細胞傷害活性と脱顆粒の関係から、２ＤＧ処理によってがん細胞を直接認識した細胞傷害活性が亢進している可能性が考えられた。そこでＴ細胞に発現するＮＫＧ２Ｄとがん細胞側に発現するＮＫＧ２Ｄリガンドを介した細胞傷害について確認した。【００４７】
５．１．ＮＫＧ２Ｄの発現量
フローサイトメーターＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてＣＤ８＋Ｔ細胞表面上のＮＫＧ２Ｄの発現を解析した。細胞をＰＢＳで洗浄後、遠心して、細胞を２％ＦＢＳ＋５ｍＭ  ＥＤＴＡ入りのＰＢＳに再懸濁し、セルストレーナーに通して凝集物を除去した。氷上で１時間ＰＥ標識抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体、ＰＣ５標識抗ＣＤ８抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）と共にインキュベートし、洗浄後、計測した。データは、Ｋａｌｕｚａ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）ソフトウェアを用いて解析した(図３Ａ)。【００４８】
その結果、２ＤＧ処理（±）のαβＴ加工細胞のＮＫＧ２Ｄ発現には差が認められなかった。【００４９】
５．２．がん細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの発現
フローサイトメーターＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、および各種がん細胞表面におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を解析した。各がん培養細胞をＰＢＳで洗浄後、遠心して、細胞を２％ＦＢＳ＋５ｍＭ  ＥＤＴＡ入りのＰＢＳに再懸濁し、セルストレーナーに通して凝集物を除去した。氷上で１時間抗ＭＩＣ  Ａ／Ｂ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、抗ＵＬＢＰ１抗体、抗ＵＬＢＰ２／５／６抗体、および抗ＵＬＢＰ３抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）と共にインキュベートし、洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を氷上で３０分間反応させ、洗浄後計測した。データは、Ｋａｌｕｚａ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）ソフトウェアを用いて解析した(図３Ｂ)。【００５０】
その結果、Ｄａｕｄｉ細胞以外で、ＮＫＧ２Ｄリガンドが高発現をしており、ＮＫＧ２ＤとＮＫＧ２Ｄリガンドの結合が、細胞傷害活性に関係していることが示唆された。【００５１】
５．３．抗ＮＫＧ２Ｄ抗体による細胞傷害活性の抑制
がんに対する細胞傷害能にαβＴ加工細胞上のＮＫＧ２Ｄが関与するか調べるため、αβＴ加工細胞をがん細胞と共培養する前に６０分間抗ヒトＮＫＧ２Ｄブロッキング抗体（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社）又はコントロールとしてアイソタイプ抗体であるマウスＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）と反応させた。細胞傷害活性の測定方法は３．２に準じて行った(図３Ｃ)。【００５２】
その結果、ＮＫＧ２Ｄをブロックすることにより、２ＤＧ処理したαβＴ加工細胞の細胞傷害活性は、Ｄａｕｄｉ細胞以外では顕著に減少した。【００５３】
実施例６．細胞傷害活性と解糖系制御の関係
２ＤＧの効果がαβＴ加工細胞の解糖系阻害によるものなのか検証するため、２ＤＧ以外の解糖系阻害剤であるオキサメートならびに、ブロモピルベート（ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社）を加え、２ＤＧと同様の効果を有するかを検証した。【００５４】
６．１．解糖系阻害剤を添加した際のＦＡＣＳ解析
解糖系阻害剤である、オキサメート（２ｍＭ）またはブロモピルベート（１０μＭ）を実施例１のαβＴ加工細胞調製の際、２ＤＧの代わりに添加して、αβＴ加工細胞を調製した。調製したαβＴ加工細胞を実施例２に記載の方法でＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの分布解析を行った。【００５５】
その結果、解糖系阻害剤であるオキサメート（２ｍＭ）またはブロモピルベート（１０μＭ）処理したαβＴ加工細胞では、２ＤＧのような表現型は示さなかった（図４Ａ）。【００５６】
６．２．解糖能の評価
２ＤＧは解糖系の阻害剤であることから、２ＤＧ以外の解糖系阻害剤であるオキサメートまたはブロモピルベートをαβＴ加工細胞調製の際、２ＤＧの代わりに添加して、αβＴ加工細胞を調製し、それらの細胞の解糖能を評価した。【００５７】
ＸＦ解糖ストレスキット（アジレントテクノロジーズ社）を用いて、細胞の主要なエネルギー代謝経路である解糖能を評価した。測定には細胞外の水素イオン濃度（ｍｐＨ／ｍｉｎ）の変化をモニターすることでて解糖系≒細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）として算出する細胞外フラックスアナライザーＸＦ（アジレントテクノロジーズ社）を用いた。解析にはＷａｖｅ（アジレントテクノロジーズ社）ソフトウェアを用いた。
１）Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ：定常状態における解糖能を示した。
２）Ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ Ｃａｐａｃｉｔｙ：細胞が有する最大限の解糖能を示した。【００５８】
その結果、２ＤＧ処理したαβＴ加工細胞と各阻害剤で処理したαβＴ加工細胞の解糖系は、同様に阻害されていることを確認した（図４Ｂ）。【００５９】
６．３．培養細胞に対するインビトロでの細胞傷害活性
実施例３の３．２．の方法を用いて、解糖系阻害剤であるオキサメート（２ｍＭ）またはブロモピルベート（１０μＭ）処理したαβＴ加工細胞の各がん細胞に対する傷害活性を調べた。【００６０】
その結果、オキサメートおよびブロモピルベートで処理したαβＴ加工細胞は、２ＤＧ処理していない細胞と比較して細胞傷害活性の増強は認められなかった（図４Ｃ）。
従って２ＤＧ処理によるαβＴ加工細胞の細胞傷害活性の増強には解糖系阻害以外の機構の関与が示唆された。【００６１】
実施例７．細胞傷害活性と糖鎖修飾の関係
２ＤＧはマンノースと類似の構造を有することによってＮ結合型糖鎖を構成するマンノースの付加反応を阻害することが知られている。そこで２ＤＧの効果がαβＴ加工細胞の糖鎖修飾への影響によるものなのか検証するため、２ＤＧ処理によるαβＴ加工細胞の糖鎖の変化ならびに、マンノースを加えて２ＤＧの効果が抑制されるか検証した。【００６２】
７．１．細胞表面糖鎖のＬＣ−ＭＳ質量分析解析
αβＴ加工細胞から、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（住友ベークライト社）を用いて糖鎖を精製、ラベル化し、ＬＣ−ＭＳ質量分析解析を行った（図５Ａ）。ピークの番号の細胞あたりの糖鎖量（ｆｍｏｌ）と糖鎖の推定構造を表１に示す。
【表１】
2019156145.tif 000003
【００６３】
糖鎖解析の結果、２ＤＧ処理の効果は、Ｎグリカンの前駆体である、(Ｈｅｘ)３(Ｍａｎ)９(ＧｌｃＮＡｃ)２の合成抑制というよりも、主として、デオキシへソース（Ｄｅｏｘｙｈｅｘｏｓｅ）が導入された成熟分枝Ｎグリカンが異常に増えていることが示された。従って、２ＤＧで処理されたαβＴ加工細胞のＮグリコシル化された表面タンパク質は、様々なリガンドに対する親和性が変化していることが示唆された。【００６４】
７．２．Ｄ−マンノースによる２ＤＧ処理αβＴ加工細胞の細胞傷害活性の抑制
２ＤＧは糖鎖修飾の際のマンノース付加を競合的に阻害することが報告されている。それ故、２ＤＧ処理αβＴ細胞加工にＤ−マンノースを追加することで細胞傷害活性能が抑制されるか検討した。
実施例１の調製の際、Ｄ−マンノース（ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社）またはＬ−マンノース（東京科成工業）を２ｍＭ添加してαβＴ加工細胞を調製し、３．２の方法で、細胞傷害活性を測定した。【００６５】
その結果、Ｄ−マンノースを加えると２ＤＧの効果が減じることがわかった。一方でＤ−マンノースの異性体であるＬ−マンノースを添加しても２ＤＧの細胞傷害活性に影響はなかった（図５Ｂ）。【００６６】
７．３．Ｄ−マンノースによる２ＤＧ処理αβＴ加工細胞の細胞内パーフォリン産生抑制
次にマンノースが２ＤＧ処理αβＴ加工細胞の細胞内パーフォリン量の増加を阻害するか検証した。実施例１の調製の際、Ｄ−マンノース（ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社）またはＬ−マンノース（東京科成工業）を２ｍＭ添加してαβＴ加工細胞を調製し、細胞をＩｎｔｒａＰｒｅｐ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）にて処理し、細胞内パーフォリンの発現量をＡＰＣ標識抗パーフォリン抗体を用いて染色した。フローサイトメーターＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にて測定を行い、データは、Ｋａｌｕｚａ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）ソフトウェアを用いて解析した。Ｍｅａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＭＦＩ）値は平均蛍光強度で発現量を反映する。【００６７】
その結果、Ｄ−マンノースを加えると２ＤＧの効果が減じることがわかった。一方でＬ−マンノース添加による影響は無かった。（図５Ｃ）。また、データは示さないが細胞内グランザイムＢについても同様の結果であった。【００６８】
７．４．２ＤＧによるＩＬ−２受容体発現誘導
エフェクター細胞の細胞内パーフォリン、グランザイムＢはＴ細胞上のＩＬ−２受容体からの刺激によって発現誘導されることが知られている。そこでＩＬ−２受容体の発現を確認した。７．３．で調製したαβＴ加工細胞をＰＢＳで洗浄後、遠心して、細胞を２％ＦＢＳ＋５ｍＭ  ＥＤＴＡ入りのＰＢＳに再懸濁し、セルストレーナーに通して凝集物を除去した。氷上で１時間ＰＥ／Ｃｙ５標識抗ＩＬ−２Ｒ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）およびＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）と共にインキュベートし、洗浄後、フローサイトメーターＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にて測定を行った。データは、Ｋａｌｕｚａ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）ソフトウェアを用いて解析した。【００６９】
その結果、２ＤＧ処理したαβＴ加工細胞はＩＬ−２受容体の細胞表面への発現が上昇しており、Ｄ−マンノースによりその発現が抑えられることが示唆された（図５Ｄ）。【００７０】
７．５．インターフェロンγの分泌誘導
２ＤＧで培養したαβ加工細胞のＩＬ−２受容体発現が上昇していたことから、ＩＬ−２を介した細胞応答も上昇するのか確認した。２ＤＧなし（ｃｏｎｔ）、２ＤＧ存在下（２ＤＧ）、２ＤＧとＤ−マンノース存在下（２ＤＧ＋Ｄ-Ｍａｎ）又は２ＤＧとＬ−マンノース存在下（２ＤＧ＋Ｌ-Ｍａｎ）で培養したαβＴ加工細胞を回収し、ＩＬ−２なしのＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ＦＣＳにて２４時間前培養した後、再度ＩＬ−２（０、５０、２５０ＩＵ／ｍｌ、ニプロ社）添加ＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ＦＣＳにて培養した。２４時間後の培養上清を回収し、ＩＦＮ−γ産生量をＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ａｂｃａｍ社）で測定した（図５Ｅ）。【００７１】
７．６．２ＤＧによるＩＬ−２受容体遺伝子発現誘導
２ＤＧによるＩＬ−２受容体の発現量の変化がタンパク質発現レベルで制御を受けているのか遺伝子発現レベルで制御されているのかを確認した。２ＤＧなし（ｃｏｎｔ）、２ＤＧ存在下（２ＤＧ）、２ＤＧとＤ−マンノース存在下（２ＤＧ＋Ｄ-Ｍａｎ）又は２ＤＧとＬ−マンノース存在下（２ＤＧ＋Ｌ-Ｍａｎ）で培養したαβＴ加工細胞からＲＮＡを抽出し、逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）でｃＤＮＡを合成した。各条件のｃＤＮＡを用いてＩＬ−２受容体αの遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲシステム  ＶｉｉＡ７（アプライドバイオシステムズ社）にて測定した。各サンプルのＩＬ−２受容体αの発現量は内在性コントロールβ−アクチンで補正した後、ｃｏｎｔを１として相対値をグラフ化した（図５Ｆ）。【００７２】
実施例８．ガレクチン-３による細胞傷害活性の抑制
ガレクチン-３はβ-ガラクトシドに親和性を持つ糖認識ドメインを１つ以上有するガレクチンファミリーの１つであり、がん細胞から分泌され、血管新生を誘導するだけでなくＣＤ８陽性Ｔ細胞上の糖鎖修飾受容体に結合して細胞の不応答またはアポトーシスを誘導する。２ＤＧの効果がαβＴ加工細胞の細胞表面上の糖鎖修飾を変化させるものであるため、２ＤＧ処理したαβＴ加工細胞に対する、ガレクチン-３の影響に変化があるかを調べた。【００７３】
８．１．ガレクチン−３結合能
２ＤＧ処理（±）のαβＴ加工細胞がガレクチン−３と結合するか検証した。０〜４ｍＭの２ＤＧ添加で培養したαβＴ加工細胞にリコンビナントガレクチン−３（ＢＢＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）を加え、４℃で３０分、インキュベート後、抗ガレクチン−３抗体（ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社）と反応させ、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）でガレクチン−３結合能を検出した。尚、ガレクチン−３結合の実験コントロールとしてガレクチンの糖鎖への結合を阻害するラクトース（ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社）０．１Ｍ添加条件をおいた。フローサイトメーターＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にて測定を行い、データはＫａｌｕｚａ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）ソフトウェアを用いて解析した。【００７４】
その結果、２ＤＧ処理ののαβＴ加工細胞は２ＤＧなし（ｃｏｎｔ）と比べてガレクチンの結合能が低下しており、２ＤＧの濃度依存的にガレクチン−３との結合能が減少することが示唆できた(図６Ａ)。【００７５】
８．２．ガレクチン−３によるアポトーシス誘導
０．１Ｍラクトース（ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社）（±）の条件下で、αβＴ加工細胞を３μＭリコンビナントガレクチン−３（ＢＢＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）で刺激した。細胞をＰＢＳで洗浄後、ＡＮＮＥＸＩＮ  Ｖ−ＦＩＴＣ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ナカライテスク社）を用いてＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ (ＰＩ)（死細胞検出用）とＦＩＴＣ標識ＡｎｎｅｘｉｎＶ（アポトーシス検出用）で染色した。フローサイトメーターＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にて測定を行い、データはＫａｌｕｚａ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）ソフトウェアを用いて解析した。蛍光標識（ＦＩＴＣ）−ＡｎｎｅｘｉｎＶは細胞膜の内側に存在する膜リン脂質（フォスファチジルセリン：ＰＳ）と強い親和性を有するするため、アポトーシスによってＰＳが細胞膜表面に露出するとＡｎｎｅｘｉｎＶが結合する。ＤＮＡと結合するＰＩは細胞膜の損傷がない場合、細胞内に取り込まれない。後期のアポトーシス細胞はＡｎｎｅｘｉｎＶとＰＩの両方に染まる。【００７６】
その結果、ガレクチン−３によるアポトーシス誘導が２ＤＧ処理したαβＴ加工細胞では起こりにくいことが示唆された(図６Ｂ)。従って、２ＤＧ処理したαβＴ加工細胞は腫瘍環境においてもガレクチンを介したがん細胞の免疫からのエスケープ機能を回避することが期待でき、従来のαβＴ加工細胞より、腫瘍内において抗腫瘍効果を発揮することが期待できる。【００７７】
実施例９．免疫不全マウスモデルを用いたｉｎ−ｖｉｖｏ抗腫瘍作用
免疫不全マウス（ＮＯＧマウス）（６〜８週齢）を日本チャールズリバーより購入し、大阪大学動物実験委員会のガイドラインに従って、特定の病原体を含まない条件下で飼育した。０日目に、ＰＢＳ２００μｌ中の２００万個のヒトがん細胞（Ｋ５６２−Ｌｕｃ）を全マウスに尾静脈注射した。続いて、２ＤＧ処理したαβＴ加工細胞（図７の２ＤＧ群：７匹のＮＯＧマウス）、又は２ＤＧ処理していないαβＴ加工細胞（図７のｃｏｎｔ群：６匹のＮＯＧマウス）を、マウスあたり２０００万個細胞の用量で週一回（０日目、７日目、１４日目、２１日目（図７Ｂの▲））静脈内注射した。Ｖｅｈｉｃｌｅ群（６匹のＮＯＧマウス）には、ＰＢＳ２００μｌを０日目、７日目、１４日目、２１日目に静脈内注射した。
腫瘍のサイズは、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ）（住商ファーマ社）にて２８日目に測定し、比較検討した（図７Ａ）。なお、Ｃｏｎｔ群において２７日目にマウス１匹が死亡したため、Ｃｏｎｔ群のＩＶＩＳ測定は５匹で行った。また、生存期間についても比較検討した(図７Ｂ）。なお、２８日目以降のＣｏｎｔ群とＶｅｈｉｃｌｅ群の生存率変化は同じ動向を示し、３２日目に生存率０となった。【００７８】
２ＤＧ処理したαβＴ加工細胞を注入したマウス（２ＤＧ群）は、ＰＢＳで処理したＮＯＧマウス（Ｖｅｈｉｃｌｅ群）よりも有意に低い腫瘍サイズを示した（図７Ａ）。さらに、２ＤＧ処理したαβＴ加工細胞の注入は、２ＤＧ処理していないαβＴ加工細胞（Ｃｏｎｔ）およびＰＢＳ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）で処置したマウスと比較してＮＯＧマウスの生存を有意に延長した（図７Ｂ）。したがって、２ＤＧ処理したαβＴ加工細胞はＩｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍細胞効果を促進した（図７Ａ、図７Ｂ）。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本願発明を用いることにより、直接薬剤を投与するよりも、特定のＮＫＧ２Ｄリガンドを発現しているがんに対して、特異的かつ選択的にがん免疫療法を提供することができる。さらに、αβＴ加工細胞の細胞表面上の糖鎖修飾を変化させることにより、体内に投与された場合、腫瘍環境におけるエフェクター機能抑制を回避することが期待できる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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