(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表配列番号83の、塩基番号第1番〜第1206番または塩基番号第64番〜第1206番からなる塩基配列で示されるcDNA。
【請求項２】
配列表配列番号83の、塩基番号第1番〜第1206番または塩基番号第64番〜第1206番からなる塩基配列がコードするアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項３】
配列表配列番号62のアミノ酸番号第−21番〜第380番または第１番〜第380番からなるアミノ酸配列をコードする塩基配列で示されるcDNA。
【請求項４】
請配列表配列番号86の、塩基番号第1番〜第1206番または塩基番号第64番〜第1206番からなる塩基配列で示されるcDNA。
【請求項５】
配列表配列番号86の、塩基番号第1番〜第1206番または塩基番号第64番〜第1206番からなる塩基配列がコードするアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項６】
配列表配列番号65のアミノ酸番号第−21番〜第380番または第1番〜第380番からなるアミノ酸配列をコードする塩基配列で示されるcDNA。
【請求項７】
配列表配列番号87の、塩基番号第1番〜第1206番または塩基番号第64番〜第1206番からなる塩基配列で示されるcDNA。
【請求項８】
配列表配列番号87の、塩基番号第1番〜第1206番または塩基番号第64番〜第1206番からなる塩基配列がコードするアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項９】
配列表配列番号66のアミノ酸番号第−21番〜第380番または第1番〜第380番からなるアミノ酸配列をコードする塩基配列で示されるcDNA。
【請求項１０】
配列表配列番号92の、塩基番号第1番〜第981番または塩基番号第64番〜第981番からなる塩基配列で示されるcDNA。
【請求項１１】
配列表配列番号92の、塩基番号第１番〜第981番または塩基番号第64番〜第981番からなる塩基配列がコードするアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項１２】
配列表配列番号71のアミノ酸番号第−21番〜第305番または第1番〜第305番からなるアミノ酸配列をコードする塩基配列で示されるcDNA。
【請求項１３】
配列表配列番号94の、塩基番号第１番〜第1200番または塩基番号第64番〜第1200番からなる塩基配列で示されるcDNA。
【請求項１４】
配列表配列番号94の、塩基番号第１番〜第1200番または塩基番号第64番〜第1200番からなる塩基配列がコードするアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項１５】
配列表配列番号73のアミノ酸番号第−21番〜第378番または第1番〜第378番からなるアミノ酸配列をコードする塩基配列で示されるcDNA。
【請求項１６】
配列表配列番号95の、塩基番号第1番〜第1056番または塩基番号第64番〜第1056番からなる塩基配列で示されるcDNA。
【請求項１７】
配列表配列番号95の、塩基番号第1番〜第1056番または塩基番号第64番〜第1056番からなる塩基配列がコードするアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項１８】
配列表配列番号74のアミノ酸番号第−21番〜第330番または第1番〜第330番からなるアミノ酸配列をコードする塩基配列で示されるcDNA。
【請求項１９】
配列表配列番号96の、塩基番号第1番〜第819番または塩基番号第64番〜第819番からなる塩基配列で示されるcDNA。
【請求項２０】
配列表配列番号96の、塩基番号第1番〜第819番または塩基番号第64番〜第819番からなる塩基配列がコードするアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項２１】
配列表配列番号75のアミノ酸番号第−21番〜第251番または第1番〜第251番からなるアミノ酸配列をコードする塩基配列で示されるcDNA。
【請求項２２】
配列表配列番号97の、塩基番号第1番〜第594番または塩基番号第64番〜第594番からなる塩基配列で示されるcDNA。
【請求項２３】
配列表配列番号97の、塩基番号第1番〜第594番または塩基番号第64番〜第594番からなる塩基配列がコードするアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項２４】
配列表配列番号76のアミノ酸番号第−21番〜第176番または第1番〜第176番からなるアミノ酸配列をコードする塩基配列で示されるcDNA。
【請求項２５】
配列表配列番号100の、塩基番号第１番〜第1182番または塩基番号第64番〜第1182番からなる塩基配列で示されるcDNA。
【請求項２６】
配列表配列番号100の、塩基番号第1番〜第1182番または塩基番号第64番〜第1182番からなる塩基配列がコードするアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項２７】
配列表配列番号79のアミノ酸番号第−21番〜第372番または第1番〜第372番からなるアミノ酸配列をコードする塩基配列で示されるcDNA。
【請求項２８】
配列表配列番号101の、塩基番号第1番〜第966番または塩基番号第64番〜第966番からなる塩基配列で示されるcDNA。
【請求項２９】
配列表配列番号101の、塩基番号第1番〜第966番または塩基番号第64番〜第966番からなる塩基配列がコードするアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項３０】
配列表配列番号80のアミノ酸番号第−21番〜第300番または第1番〜第300番からなるアミノ酸配列をコードする塩基配列で示されるcDNA。
【請求項３１】
配列表配列番号5で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
【請求項３２】
下記(1)乃至(4）のいずれか一つのcDNAが挿入されたベクター：
(1)  配列表配列番号4で示されるアミノ酸配列をコードするcDNA；
(2)  配列表配列番号5で示されるアミノ酸配列をコードするcDNA；
(3)  配列表配列番号6の塩基配列で示されるcDNA；
(4)  形質転換大腸菌pBK/01F10(FERM BP-5267)が保有するプラスミドベクターpBKOCIFに挿入され、且つ、破骨細胞の分化および／又は成熟を抑制する活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
【請求項３３】
形質転換大腸菌pBK/01F10(FERM BP-5267)が保有する、請求項32記載のベクター。
【請求項３４】
請求項32又は33に記載のベクターが導入された宿主細胞。
【請求項３５】
下記の工程(I)および(II)を含むことからなる、次の理化
学的性質(a)〜(d)をもち、破骨細胞の分化及び／又は成熟抑制活性のある蛋白質の製造方法。
(a)  分子量（SDS-PAGEによる）；約60kD（還元条件下）、約60kD及び約120kD
（非還元条件下）。
(b)  親和性；  陽イオン交換体及びヘパリン親和性を有する。
(c)  熱安定性；  70℃、10分間又は56℃、30分間の加熱処理により破骨細胞の分化・成熟抑制活性が低下し、90℃、10分間の過熱処理により破骨細胞の分化・成熟抑制活性が失われる。
(d)  アミノ酸配列；内部アミノ酸配列として配列表配列番号１〜3のアミノ酸配列をもつ。
(I) 請求項34に記載の宿主細胞を培養する工程；
(II)該培養液から、上記の理化学的性質(a)〜(d)をもち、破骨細胞の分化及び／又は成熟抑制活性のある蛋白質を回収する工程。
【請求項３６】
請求項33記載の方法により得られる次の理化学的性質(a)
〜(d)をもち、破骨細胞の分化及び／又は成熟抑制活性のある蛋白質。
(a)  分子量（SDS-PAGEによる）；約60kD（還元条件下）、約60kD及び約120kD
（非還元条件下）。
(b)  親和性；  陽イオン交換体及びヘパリン親和性を有する。
(c)  熱安定性；  70℃、10分間又は56℃、30分間の加熱処理により破骨細胞の分化・成熟抑制活性が低下し、90℃、10分間の過熱処理により破骨細胞の分化・成熟抑制活性が失われる。
(d)  アミノ酸配列；内部アミノ酸配列として配列表配列番号１〜3のアミノ酸配列をもつ。
【請求項３７】
配列表配列番号9の、アミノ酸番号第−21番〜第373番またはアミノ酸番号第1番〜第373番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項３８】
配列表配列番号8の塩基番号第64番〜1185番からなる塩基配列で示されるcDNA。
【請求項３９】
配列表配列番号8の塩基番号第1番〜第1185番または第64番〜第1185番からなる塩基配列がコードするアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項４０】
配列表配列番号11の、アミノ酸番号第−21番〜第341番またはアミノ酸番号第1番〜第341番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項４１】
配列表配列番号10の塩基番号第64番〜1089番からなる塩基配列で示されるcDNA。
【請求項４２】
配列表配列番号10の塩基番号第1番〜第1089番または第64番〜第1089番からなる塩基配列がコードするアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項４３】
配列表配列番号13の、アミノ酸番号第−21番〜第133番またはアミノ酸番号第1番〜第133番からなるアミノ酸で示される蛋白質。
【請求項４４】
配列表配列番号12の塩基番号第64番〜465番からなる塩基配列で示されるcDNA。
【請求項４５】
配列表配列番号12の塩基番号第1番〜第465番または第64番〜第465番からなる塩基配列がコードするアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項４６】
配列表配列番号15の、アミノ酸番号第−21番〜第124番またはアミノ酸番号第1番〜第124番からなるアミノ酸で示される蛋白質。
【請求項４７】
配列表配列番号14の塩基番号第64番〜438番からなる塩基配列で示されるcDNA。
【請求項４８】
配列表配列番号14の塩基番号第１番〜第438番または第64番〜第438番からなる塩基配列がコードするアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項４９】
配列表配列番号62のアミノ酸番号第−21番〜第380番またはアミノ酸番号第1番〜第380番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項５０】
配列表配列番号65のアミノ酸番号第−21番〜第380番またはアミノ酸番号第1番〜第380番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項５１】
配列表配列番号66のアミノ酸番号第−21番〜第380番またはアミノ酸番号第1番〜第380番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項５２】
配列表配列番号71のアミノ酸番号第−21番〜第305番またはアミノ酸番号第1番〜第305番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項５３】
配列表配列番号73のアミノ酸番号第−21番〜第378番またはアミノ酸番号第1番〜第378番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項５４】
配列表配列番号74のアミノ酸番号第−21番〜第330番またはアミノ酸番号第1番〜第330番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項５５】
配列表配列番号75のアミノ酸番号第−21番〜第251番またはアミノ酸番号第1番〜第251番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項５６】
配列表配列番号76のアミノ酸番号第−21番〜第176番またはアミノ酸番号第1番〜第176番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項５７】
配列表配列番号79のアミノ酸番号第−21番〜第372番またはアミノ酸番号第1番〜第372番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項５８】
配列表配列番号80のアミノ酸番号第−21番〜第300番またはアミノ酸番号第1番〜第300番からなるアミノ酸配列で示される蛋白質。
【請求項５９】
破骨細胞の分化および／又は成熟を抑制する活性を有する蛋白質をコードするcDNAが挿入されたプラスミドベクターpOBKOCIFを保有する形質転換大腸菌pBK/01F10(FERM BP-5267)。
【請求項６０】
請求項2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、31、36、37、38、40、42、43、45、46、および48〜58からなる群より選択される一つに記載の蛋白質を含有する医薬組成物。
【請求項６１】
請求項2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、31、36、37、38、40、42、43、45、46、および48〜58からなる群より選択される一つに記載の蛋白質を含有する骨粗鬆症の予防または治療剤。
【請求項６２】
請求項2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、31、36、37、38、40、42、43、45、46、および48〜58からなる群より選択される一つに記載の蛋白質を含有する骨量減少症の予防または治療剤。
【請求項６３】
請求項2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、31、36、37、38、40、42、43、45、46、および48〜58からなる群より選択される一つに記載の蛋白質を含有する骨代謝異常症の予防または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、破骨細胞の分化及び／又は成熟を抑制する活性を示す新規な蛋白質、即ち破骨細胞形成抑制因子（Osteoclastogenesis Inhibitory Factor; OCIF）及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
人の骨は絶えず吸収と再形成を繰り返しているが、この過程で中心的な働きをしている細胞が、骨形成を担当する骨芽細胞と骨吸収を担当する破骨細胞である。これらの細胞が担当している、骨代謝の異常により発生する疾患の代表として、骨粗鬆症が挙げられる。この疾患は、骨芽細胞による骨形成を、破骨細胞による骨吸収が上回ることにより発生する疾患である。この疾患の発生メカニズムについては未だ完全には解明されていないが、この疾患は骨の疼痛を発生し、骨の脆弱化による骨折の原因となる疾患である。高齢人口の増加に伴い、骨折による寝たきり老人の発生の原因となるこの疾患は社会問題にもなっており、その治療薬の開発が急務となっている。このような骨代謝異常による骨量減少症は骨吸収の抑制、骨形成の促進、或いはこれらのバランスの改善により治療することが期待される。
【０００３】
骨形成は、骨形成を担当する細胞の増殖、分化、活性化を促進すること、或いは骨吸収を担当する細胞の増殖、分化、活性化を抑制することにより促進することが期待される。近年、このような活性を有する生理活性蛋白質（サイトカイン）への関心が高まり、精力的な研究が行われている。骨芽細胞の増殖或いは分化を促進するサイトカインとして、線維芽細胞増殖因子ファミリー(fibroblast growth factor ; FGF、非特許文献１)、インシュリン様増殖因子−I(insulin like growth factor-I ;IGF-I、非特許文献２)、インシュリン様増殖因子−II(IGF-II、非特許文献３)、アクチビンＡ（Activin A、非特許文献４）、トランスフォーミング増殖因子−β（transforming growth factor-β、非特許文献５）、バスキュロトロピン（Vasculotropin、非特許文献６）、及び異所骨形成因子ファミリー(bone morphogenetic protein ; BMP : BMP-2、非特許文献７, OP-1、非特許文献８及び９) 等のサイトカインが報告されている。
【０００４】
一方、破骨細胞形成、即ち破骨細胞の分化及び／又は成熟を抑制するサイトカインとしては、トランスフォーミング増殖因子−β（transforming growth factor- β、非特許文献１０）やインターロイキン−４(interleukin-4、非特許文献１１) 等が報告されている。又、破骨細胞による骨吸収を抑制するサイトカインとしては、カルシトニン(calcitonin、非特許文献１２)、マクロファージコロニー刺激因子(macrophage colony-stimulating factor;、非特許文献１３)、インターロイキン−4（非特許文献１４）、及びインターフェロン-γ(interferon-γ、非特許文献１５) 等が報告されている。
【０００５】
これらのサイトカインは、その骨形成の促進や骨吸収の抑制作用による骨量減少症の改善剤となることが期待され、インシュリン様増殖因子−I や異所骨形成因子ファミリーのサイトカイン等、上記のサイトカインの一部については骨代謝改善剤として臨床試験が実施されている。又、カルシトニンは、骨粗鬆症の治療薬、疼痛軽減薬として既に市販されている。
【０００６】
現在、骨に関わる疾患の治療及び治療期間の短縮を図る医薬品として、臨床では活性型ビタミンD3、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン製剤、イプリフラボン、ビタミンK2（メナテトレノン）又はカルシウム製剤等が使用されている。しかし、これらの薬剤を用いた治療法はその効果並びに治療結果において必ずしも満足できるものではなく、これらに代わる新しい治療薬の開発が望まれていた。前述したように、骨代謝は骨形成と骨吸収のバランスによって調節されており、破骨細胞の分化・成熟を抑制するサイトカインは、骨粗鬆症等の骨量減少症の治療薬となることが期待される。
【０００７】
【従来の技術】
【非特許文献１】
Rodan S.B. et al., Endocrinology vol. 121, p1917, 1987
【非特許文献２】
Hock J.M. et al., Endocrinology vol. 122, p254, 1988
【非特許文献３】
McCarthy T. et al., Endocrinology vol.124, p301, 1989
【非特許文献４】
Centrella M. et al., Mol. Cell. Biol. vol. 11, p250, 1991
【非特許文献５】
Noda M., The Bone, vol. 2, p29, 1988
【非特許文献６】
Varonique M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. vol.199, p380,1994
【非特許文献７】
Yamaguchi, A et al., J. Cell Biol. vol. 113, p682, 1991
【非特許文献８】
Sampath T. K. et al., J. Biol. Chem. vol. 267, p20532,
1992
【非特許文献９】
Knutsen R. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. vol.194, p1352, 1993
【非特許文献１０】
Chenu C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.85, p5683, 1988
【非特許文献１１】
Kasano K. et al., Bone-Miner., vol.21, p179, 1993
【非特許文献１２】
Bone-Miner., vol.17, p347,1992
【非特許文献１３】
Hattersley G. et al. J.Cell. Physiol. vol.137, p199, 1988
【非特許文献１４】
Watanabe, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. vol. 172, p1035, 1990
【非特許文献１５】
Gowen M. et al., J. Bone Miner. Res., vol. 1, p469, 1986
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこのような観点からなされたものであって、新規な破骨細胞形成抑制因子(OCIF)及びその効率的な製造方法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような現状に鑑み鋭意探索の結果、ヒト胎児肺線維芽細胞IMR-90(ATCC寄託−受託番号CCL186)の培養液に破骨細胞形成抑制活性、即ち破骨細胞の分化・成熟を抑制する活性を有する蛋白質OCIFを見出すに至った。
又、細胞培養の担体としてアルミナセラミック片を使用すると本発明の破骨細胞形成抑制因子OCIFを培地中に高濃度に蓄積せしめ、効率よく精製できることを見出した。
さらに、本発明者らは、前記培養液をイオン交換カラム、アフィニティーカラム及び逆相カラムで順次処理して吸着及び溶出をくり返すことによって前記蛋白質OCIFを効率よく精製する方法を確立した。
【００１０】
次に本発明者らは、得られた天然型OCIF蛋白質のアミノ酸配列の情報に基づき、この蛋白質をコードするcDNAのクローニングに成功した。さらに本発明者らは、このcDNAを用いて遺伝子工学的手法により破骨細胞の分化及び／又は成熟抑制活性のある蛋白質を生産する方法を確立するに至った。
【００１１】
本発明は、ヒト胎児肺線維芽細胞に由来し、還元条件下SDS‐PAGEにおける分子量が約60kD、非還元条件下SDS‐PAGEにおける分子量が約60kDa及び約 120kDであり、陽イオン交換体及びヘパリンカラムに親和性を有し、70℃、10分間又は56℃、30分間の加熱処理により破骨細胞の分化・成熟を抑制する活性が低下し、90℃、10分間の加熱処理により破骨細胞の分化・成熟抑制活性が失われることを特徴とする蛋白質に関する。本発明の蛋白質OCIFのアミノ酸配列は、既知の破骨細胞形成抑制因子とは明確に相違する。
【００１２】
また、本発明は、ヒト線維芽細胞を培養し、培養液をヘパリンカラム処理し、吸着画分を溶出し、この画分を陽イオン交換カラムにかけ吸着・溶出し、さらにアフィニティーカラム、逆相カラムによって精製して前記蛋白質を採取する、蛋白質OCIFの製造方法に関する。本発明におけるカラム処理は、単に培養液等をヘパリンセファロースカラム等に流下させるものばかりではなく、バッチ法で培養液をヘパリンセファロース等と混合し、カラム処理した場合と同等の効果を奏するものも包含する。本発明で使用されるアフィニティーカラムは、ヘパリンカラム及びブルーカラムが挙げられる。ブルーカラムは、特に好ましくはシバクロンブルーカラムが挙げられる。このシバクロンブルーカラムの充填剤としては、親水性合成高分子を担体とし色素シバクロンブルーF3GAを結合させたものが例示され、このカラムは通常ブルーカラムと呼ばれる。
さらに、本発明は、アルミナセラミック片を担体として使用して細胞培養を行なって効率よく前記蛋白質を製造する方法に関する。
【００１３】
本発明の蛋白質OCIFは、ヒト線維芽細胞の培養液から効率良く且つ高収率で単離精製することができる。この原料からの本発明蛋白質OCIFの単離、精製は、生物試料からの蛋白性物質の精製に汎用される通常の方法を用いて、目的とする蛋白質OCIFの物理的、化学的性質を利用した各種の精製操作に従い実施することができる。この濃縮手段として限外濾過、凍結乾燥、及び塩析等の通常の生化学的処理手段が挙げられる。又、精製手段としては、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、調製用電気泳動等を用いた通常の蛋白性物質の精製に利用される各種の手法を組み合わせて用いることができる。特に好ましくは、原料として用いるヒト線維芽細胞としてヒト胎児肺線維細胞IMR-90(ATCC-CCL 186)を用いることが望ましい。そして原料となるヒト胎児肺線維芽細胞IMR-90の培養は、ヒト胎児肺線維芽細胞IMR-90をアルミナセラミック片に付着させ、５％ウシ新生児血清を添加したDMEM培地を培養液として用い、ローラーボトル中で一週間から10日程度静置培養することにより得たものを使用するとよい。又、精製処理を実施する際に界面活性剤として0.1 ％CHAPS（3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate） を添加して精製を行うのが望ましい。
【００１４】
本発明の蛋白質OCIFは、先ず培養液をヘパリンカラム（ヘパリン−セファロースCL-6B、ファルマシア社）にかけ、2M NaCl を含む10mM Tris-HCl 緩衝液、pH7.5 で溶出させ、ヘパリン吸着性のOCIF画分を得、この画分をＱ・陰イオン交換カラム（HiLoad-Q/FF 、ファルマシア社）にかけ、その非吸着画分を集めることにより、ヘパリン吸着性で塩基性のOCIF画分として得ることができる。得られたOCIF活性画分はＳ・陽イオン交換カラム（HiLoad-S/HP 、ファルマシア社）、ヘパリンカラム（ヘパリン-5PW、トーソー社）、シバクロンブルーカラム（ブルー-5PW、トーソー社）、逆相カラム（BU-300 C4 、パーキンエルマー社）にかけることにより単離・精製することができ、この物質は前述した性質によって特定される。
【００１５】
さらに、本発明は、このようにして得られた天然型OCIF蛋白質のアミノ酸配列に基づいてこの蛋白質をコードするcDNAをクローニングし、このcDNAを用いて遺伝子工学的手法で破骨細胞の分化及び／又は成熟抑制活性のある蛋白質OCIFを得る方法に関する。
【００１６】
即ち、本発明の方法に従って精製したOCIF蛋白質をエンドプロテアーゼ  （例えばリシルエンドペプチダーゼ）で処理後、生ずるペプチドのアミノ酸配列を決定し、得られた内部アミノ酸配列をコードし得るオリゴヌクレオチドの混合物を作製する。
次に、作製したオリゴヌクレオチド混合物をプライマーとし、PCR法（好ましくはRT-PCR法）を利用してOCIFcDNA断片を取得する。このOCIFcDNA断片をプローブとして、cDNAライブラリーよりOCIFの全長cDNA  をクローニングする。得られたOCIFcDNAを発現ベクターに挿入してOCIF発現プラスミドを作製し、これを各種の細胞又は菌株に導入して発現させることにより、組み換え型OCIFを製造することができる。
【００１７】
本発明はまた、上述の活性を有する本発明OCIF蛋白質の類縁体（バリアント）である新規蛋白質 OCIF2, OCIF3, OCIF4, OCIF5 に関する。
これらの類縁体は、IMR-90細胞のポリ(A)+ RNAを用いて作成したcDNAライブラリーをOCIFcDNA断片をプローブとしてハイブリダイズすることによって得られる。これらのOCIF類縁体のcDNAを発現ベクターに挿入し、そのOCIF類縁体発現ベクターを通常の宿主で発現し、常法で精製することにより、目的とする類縁体蛋白質を得ることができる。
【００１８】
又、本発明はOCIF変異体に関する。
これらの変異体はOCIFの二量体形成に関与する可能性のあるCys 残基をSer残基に置換したもの、又は天然型OCIFに欠失変異を導入したものである。PCR法或いは制限酵素による切断により、OCIFcDNAに置換或いは欠失変異を導入する。このcDNAを適当な発現プロモーターを有したベクターに挿入し、哺乳動物細胞等の真核細胞にトランスフェクトし、この細胞を培養してその培養液から常法により精製することにより、目的とするOCIF変異体が得られる。
【００１９】
又、本発明は抗OCIFポリクローナル抗体、及びそれを用いたOCIFの測定方法に関する。
抗OCIFポリクローナル抗体は、OCIFを免疫原として常法により作製される。この時用いる抗原（免疫原）としては、IMR-90培養液より得られる天然型OCIF、及びOCIFcDNAを用いて微生物や真核細胞を宿主として生産された遺伝子組み換え型OCIF、あるいはOCIFのアミノ酸配列に基づいて設計した合成ペプチドや、OCIFの加水分解部分ペプチドを用いることができる。これらの抗原を用いて、また必要ならば免疫アジュバントを併用して、適当な哺乳動物を免疫し、その血清から常法により精製することにより、抗OCIFポリクローナル抗体を得ることができる。得られた抗OCIFポリクローナル抗体をアイソトープや酵素で標識することにより、ラジオイムノアッセイ(RIA) やエンザイムイムノアッセイ(EIA) の測定系に使用することができる。この測定系を用いることにより、血液や腹水などの生体試料や細胞培養液などのOCIF濃度を容易に測定することができる。
【００２０】
又、本発明は抗OCIFモノクローナル抗体、及びそれを用いたOCIFの測定方法に関する。
抗OCIFモノクローナル抗体は、OCIFを免疫原として、常法により作成される。抗原としては、IMR-90培養液より得られる天然型OCIF、及びOCIFcDNAを用いて微生物や真核細胞を宿主として生産された遺伝子組み換え型OCIF、或いはOCIFのアミノ酸配列に基づいて設計した合成ペプチドや、OCIFの加水分解部分ペプチドでもよい。これらの抗原を用いて哺乳動物を免疫するか、或いはインビトロ法により免疫した細胞を、哺乳動物の骨髄腫細胞 (ミエローマ) などと融合させハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマよりOCIFを認識する抗体を産生するクローンを選択し、このクローンを培養することにより目的とする抗体が得られる。ハイブリドーマの作製にあたっては、哺乳動物を使用する場合、マウスやラットなどの小動物を使用した例が一般的である。
免疫は、OCIFを生理食塩水などにより適当な濃度に希釈し、この溶液を静脈内や腹腔内に投与し、これに必要に応じて免疫アジュバントを併用投与し、動物に2-20日毎に2-5 回投与する。このようにして免疫された動物を、解剖し、脾臓を摘出し脾細胞を免疫細胞として使用する。
【００２１】
免疫細胞と細胞融合させるマウス由来のミエローマとしては、例えばP3/x63-Ag8, p3-U1, NS-1, MPC-11, SP-2/0, FO, P3x63Ag8. 653, S194などが例示できる。
また、ラット由来の細胞としてはR-210 などの細胞株を例示できる。ヒト型の抗体を生産する場合にはヒトＢリンパ球をインビトロ法により免疫し、ヒトミエローマ細胞やEBウイルスにより形質転換した細胞株を親株として使用することによりヒト型の抗体を生産するハイブリドーマを得ることができる。
【００２２】
免疫細胞とミエローマ細胞株の融合は公知の方法、例えばKoehler とMilsteinらの方法 (Koehle, G. et al. Nature vol. 256, 495-497, 1975) 、或いは電気パルス法などが挙げられる。免疫細胞とミエローマ細胞株は、細胞培養に用いられている培地 (FBS不含) に、通常行われている細胞数の比に混合し、ポリエチレングリコールを添加して融合処理を行い、HAT選択培地で培養を行い融合細胞を選択することができる。
【００２３】
抗OCIF抗体生産株を選別するには、ELISA法、プラーク法、オクタロニー法、凝集法など、通常の抗体検出に使用されている方法を用いて選択することができる。このようにして選別されたハイブリドーマは、通常の培養方法により継代培養可能であり、必要に応じて凍結保存できる。ハイブリドーマを常法により培養するか、または哺乳動物の腹腔内に移植することにより、抗体を生産することができる。抗体は塩析、ゲル濾過やアフィニティークロマトグラフィーなどの通常の方法により精製できる。
【００２４】
得られた抗体はOCIFに特異的に反応し、OCIFの測定や精製に使用できる。OCIFの測定に使用する場合は、抗体をアイソトープや酵素によりラベルすることにより、ラジオイムノアッセイ(RIA) やエンザイムイムノアッセイ(EIA)の測定系に使用することができる。特に本発明により得られる抗体は、その抗原認識部位がそれぞれ異なっているので、サンドイッチイムノアッセイに使用することができるという特徴を有する。この測定系を用いることにより、血液や腹水などの生体試料や細胞培養液などのOCIF濃度を容易に測定することができる。
【００２５】
OCIF活性は、久米川正好らの方法（蛋白質・核酸・酵素,  Vol.34, p999(1989)）及びTakahashi N. et al. の方法（Endocrinology, Vol.122, p1373   (1988)）に従い測定することができる。即ち、生後約17日のマウス骨髄細胞を標的細胞として用い、活性型ビタミンＤ３(Calcitriol) 存在下での破骨細胞の形成抑制を、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ活性の誘導の抑制で試験することができる。
【００２６】
本発明の蛋白質である破骨細胞形成抑制因子OCIFは、骨粗鬆症等の骨量減少症、リウマチ又は変形性関節症等の骨代謝異常疾患、或いは多発性骨髄腫等の骨代謝異常疾患の治療及び改善を目的とした医薬組成物として、或いはこのような疾患の免疫学的診断を確立するための抗原として有用である。本発明の蛋白質は、製剤化して経口或いは非経口的に投与することができる。即ち、本発明の蛋白質を含む製剤は、破骨細胞形成抑制因子OCIFを有効成分として含む医薬組成物としてヒト及び動物に対して安全に投与されるものである。
【００２７】
医薬組成物の形態としては、注射用組成物、点滴用組成物、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤等が挙げられる。注射用組成物の場合は、本発明の破骨細胞形成抑制因子の薬理学的有効量及び製薬学的に許容しうる担体の混合物であり、その中にはアミノ酸、糖類、セルロース誘導体、及びその他の有機／無機化合物等の一般的に注射用組成物に添加される賦形剤／賦活剤を用いることもできる。又、本発明の破骨細胞形成抑制因子OCIFとこれらの賦形剤／賦活剤を用い注射剤を調製する場合は、必要に応じてpH調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤等を添加して常法によって各種注射剤とすることができる。
【００２８】
【発明の実施の形態】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。しかしこれらは単に例示するのみであり、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
ヒト線維芽細胞ＩＭＲ−90培養液の調製
ヒト胎児肺線維芽細胞IMR-90 (ATCC-CCL186)は、ローラーボトル(490cm2、110 ×171mm 、コーニング社）中で80gのアルミナセラミック片（アルミナ99.5％、東芝セラミック社）に付着させ培養した。培養には60個のローラーボトルを使用し、ローラーボトル１個当たり５％子牛血清を添加した10mMHEPES緩衝液添加DMEM培地（ギブコBRL社）500mlを用い、37℃、5％CO2存在下で 7〜10日間静置培養した。培養後培養液を回収し、新たな培地を添加することにより１回の培養で 301のIMR-90培養液を得た。得られた培養液を試料１とした。
【００２９】
【実施例２】
破骨細胞形成抑制活性の測定法
本発明の蛋白性破骨細胞形成抑制因子の活性測定は久米川正好らの方法（蛋白質・核酸・酵素 Vol.34 p999(1989)） 及びTakahashi N. et al. の方法(Endocrinology vol.122 p1373 (1988))に従い測定した。即ち、生後約17日のマウスより分離した骨髄細胞を用い、活性型ビタミンD3存在下での破骨細胞形成を酒石酸耐性酸性ホスファターゼ活性の誘導を指標として試験し、その抑制活性を測定することによって行った。即ち、96ウェルマイクロプレートに２×10-8M活性型ビタミンD3及び10％牛胎児血清を含むα-MEM培地（ギブコＢＲＬ社）で希釈したサンプル 100μlを入れ、生後約17日のマウスから得た骨髄細胞３×105個を 100μlの10％牛胎児血清を含むα-MEM培地に懸濁させて播種し、５％CO2、37℃、湿度 100％にて一週間培養した。培養３日目と５日目に、培養液 160μｌを廃棄し、１×10-8M活性型ビタミンD3 及び10％牛胎児血清を含むα-MEM培地で希釈したサンプル160μｌを添加した。培養７日後にリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄した後エタノール／アセトン（１：１）溶液で細胞を室温にて１分間固定し、破骨細胞形成を酸性ホスファターゼ活性測定キット（Acid Phosphatase,Leucocyte 、カタログNo.387-A、シグマ社）を用いた染色で検出した。酒石酸存在下での酸性ホスファターゼ活性陽性細胞の減少をOCIF活性とした。
【００３０】
【実施例３】
OCIFの精製
ｉ）ヘパリン・セファロ−スCL-6Bによる精製
約90ｌのIMR-90培養液（試料１）を、0.22μm のフィルター（親水性ミリディスク、2,000cm2、ミリポア社）で濾過した後、３回に分けて 0.3M NaClを含む10mM Tris-HCl 緩衝液（以下、Tris-HClという)、pH7.5 で平衡化させたヘパリン・セファロースCL-6B カラム(5×4.1cm 、ゲル容量80ml）にかけた。流速500ml/hrにて、10mM  Tris-HCl、 pH7.5 で洗浄した後、2M NaCl を含む10mM    Tris-HCl 、 pH7.5で溶出を行い、ヘパリン・セファロースCL-6B 吸着画分900mlを得、得られた画分を試料２とした。
【００３１】
ii）HiLoad-Q/FFによる精製
ヘパリン・セファロース吸着画分（試料2)を 10mM Tris-HCl、pH7.5 に対して透析した後、0.1 ％になるようにCHAPSを加え４℃で一晩放置したものを２回に分けて0.1 ％CHAPSを含む50mM Tris-HCl、pH7.5 で平衡化した陰イオン交換カラム(HiLoad-Q/FF、2.6 ×10cm、ファルマシア社)にかけ、非吸着画分1000mlを得た。得られた画分を試料３とした。
【００３２】
iii) HiLoad-S/HPによる精製
HiLoad−Ｑ非吸着画分（試料３）を、0.1 ％CHAPSを含む50mM Tris-HCl,pH7.5で平衡化した陽イオン交換カラム(HiLoad-S/HP、2.6 ×10cm、ファルマシア社)にかけた。0.1 ％CHAPSを含む50mM Tris-HCl, pH7.5で洗浄した後、100分間でNaClを１M にする直線勾配、流速8ml/分にて溶出を行い、12ml／フラクションにて分取を行った。フラクション１〜40を10フラクションづつ４つの画分にまとめ、それぞれ 100μｌを用いてOCIF活性を測定した。OCIF活性はフラクション11〜30に認められた（図１：図中、＋＋は破骨細胞形成が80％以上抑制される活性を、＋は破骨細胞形成が30〜80％抑制される活性を、−は活性が検出されないことをそれぞれ示す）。より比活性の高いフラクション21〜30を試料４とした。
【００３３】
iv) アフィニティーカラム（ヘパリン-5PW）による精製
120ml の試料４を240ml の0.1 ％CHAPSを含む50mM Tris-HCl, pH7.5で希釈した後、0.1 ％CHAPSを含む50mM Tris-HCl, pH7.5で平衡化したアフィニティーカラム（ヘパリン-5PW、0.8）へかけた。0.1 ％CHAPSを含む50mM Tris-HCl, pH7.5で洗浄した後、60分間でNaClを２M にする直線勾配、流速0.5ml/分にて溶出を行い、0.5ml/フラクションにて分取を行った。各フラクション50μｌを用いてOCIF活性を測定し、約0.7 〜1.3M NaCl で溶出されるOCIF活性画分10mlを得、試料５とした。
【００３４】
ｖ）アフィニティーカラム（ブルー-5PW）による精製
10mlの試料５を 190mlの0.1％CHAPSを含む50mM Tris-HCl, pH7.5で希釈した後、0.1％CHAPSを含む50mM Tris-HCl, pH7.5で平衡化したアフィニティーカラム（ブルー-5PW、0.5×5.0cm、トーソー社）にかけた。0.1％CHAPSを含む50mM Tris-HCl, pH7.5で洗浄した後、60分間でNaClを２Mにする直線勾配、流速0.5ml/分にて溶出を行い、0.5ml/フラクションにて分取を行った。各フラクション25μｌを用いてOCIF活性を測定し、約1.0 〜1.6M  NaClで溶出されるOCIF活性フラクション49〜70を得た（図２図中、＋＋は破骨細胞形成が80％以上抑制される活性を、＋は破骨細胞形成が30〜80％抑制される活性を示す）。
【００３５】
vi) 逆相カラムによる精製
得られたフラクション49〜50mlに、10μｌの25％TFA（トリフルオロ酢酸）を加えた後、0.1％TFAを含む25％アセトニトリルで平衡化した逆相カラム   (BU−300 、C4、2.1 ×220mm 、パーキンエルマー社)にかけ、60分間でアセトニトリルを55％にする直線勾配、流速0.2ml/分にて溶出を行い、各ピークを分取した（図３）。各ピークフラクションの 100μｌを用いてOCIF活性を測定し、ピ−ク６及びピ−ク７に濃度依存的に活性を検出した。結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
0003793180.tif 000002
（表中、＋＋は破骨細胞形成が80％以上抑制される活性を、＋は破骨細胞形成が30〜80％抑制される活性を、−は活性が検出されないことを示す。）
【００３７】
【実施例４】
OCIFの分子量測定
OCIF活性の認められたピーク6及びピーク7各40μlを用い、還元条件下と非還元条件下でSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。即ち、各ピークフラクション20μｌづつを２本のチューブに分取し減圧濃縮した後、１mMEDTA、2.5 ％SDS、及び0.01％ブロモフェノールブルーを含む10mM Tris-HCl, pH8 1.5μlで溶解し、それぞれを非還元条件下及び還元条件下(5％ 2-メルカプトエタノール存在下)で37℃で一晩放置後、それぞれの１μｌをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に負荷した。電気泳動は10-15％アクリルアミドのグラジエントゲル(ファルマシア社)を使用し、電気泳動装置Phast System（ファルマシア社）を用いて行った。分子量マーカーとして、ホスホリラーゼｂ（94kD) 、ウシ血清アルブミン(67kD)、オボアルブミン(43kD)、カルボニックアンヒドラーゼ(30kD)、トリプシンインヒビター(20.0kD)、α−ラクトアルブミン (14.4kD) を用いた。電気泳動終了後、Phast Gel Silver Stain Kit（ファルマシア社）を用いて銀染色を行った。結果を図４に示す。
その結果、ピーク６については還元条件下、非還元条件下で約60kDの蛋白質のバンドが検出された。又、ピーク７については、還元条件下で約60kD、非還元条件下で約120kDaの蛋白質のバンドが検出された。従って、ピーク７はピーク６の蛋白質のホモダイマーであると考えられる。
【００３８】
【実施例５】
OCIFの熱安定性試験
ブルー５ＰＷフラクション51〜52を混合したサンプルから20μｌずつを取り、10mMリン酸塩緩衝生理食塩水、pH7.2 30μｌを加えた後、70℃及び90℃にて10分間、又は56℃にて30分間熱処理を行った。このサンプルを用い、実施例２記載の方法に従いOCIF活性を測定した。結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】
OCIFの熱安定性
0003793180.tif 000003
（表中、＋＋は破骨細胞形成が80％以上抑制される活性を、＋は破骨細胞形成が30〜80％抑制される活性を、−は活性が検出されないことを示す。）
【００４０】
【実施例６】
内部アミノ酸配列の決定
ブルー-5PWフラクション51〜70について、２フラクションづつを混合して１mlとし、それぞれの試料に10μｌの25％TFAを加えた後、１mlずつ10回にわけて0.1％TFAを含む25％アセトニトリルで平衡化した逆相カラム (BU-300、C4、2.1×220mm 、パーキンエルマー社)にかけ、60分間でアセトニトリルを55％にする直線勾配、流速 0.2 ml/分にて溶出を行い、ピーク６とピーク７を集めた。得られたピーク６とピーク７の一部について、それぞれプロテインシーケンサー（プロサイス、494 型、パーキンエルマー社）を用い、Ｎ末端アミノ酸配列分析を行ったが、分析不能でありこれらの蛋白質のＮ末端はブロックされている可能性が示唆された。そこで、これらの蛋白質の内部アミノ酸配列を解析した。即ち、ピーク６とピーク７のそれぞれを遠心濃縮した後、それぞれに100μg ジチオスレイトール、10mM EDTA、7M塩酸グアニジン、及び１％CHAPSを含む 0.5M Tris-HCl, pH8.5 50μl を加えて室温で４時間放置し還元した後、0.2μｌの４−ビニルピリジンを加え、室温暗所で一晩放置しピリジルエチル化した。これらのサンプルに１μlの25％TFAを加え、0.1％TFAを含む20％アセトニトリルで平衡化した逆相カラム(BU-300, C4, 2.1×30mm, パーキンエルマー社)にかけ、30分間でアセトニトリル濃度を50％にする直線勾配、流速0.3 ml/ 分で溶出を行い、還元ピリジルエチル化OCIFサンプルを得た。還元ピリジルエチル化したサンプルのそれぞれを遠心濃縮し、8M尿素及び0.1％ Tween80を含む0.1M Tris-HCl, pH9 25 μl で溶解した後、73μl の0.1M Tris-HCl, pH9 で希釈し、0.02μg のAP1(リシルエンドプロテアーゼ、和光純薬社)を加え、37℃で15時間反応させた。反応液に１μｌの25％TFAを加え、0.1％TFAで平衡化した逆相カラム(RP-300, C8, 2.1×220mm 、パーキンエルマー社)にかけ、70分間でアセトニトリル濃度を50％にする直線勾配、流速0.2 ml/ 分で溶出を行い、ペプチドフラグメントを得た（図５）。得られたペプチドフラグメント (P1〜P3)について、プロテインシーケンサーを用いアミノ酸配列分析を行った。結果を配列表  配列番号１〜３に示す。
【００４１】
【実施例７】
cDNA配列の決定
i) IMR-90細胞からのポリ(A)+ RNA の単離
IMR-90細胞のポリ(A)+RNA は、ファストトラックmRNAアイソレーションキット（インヴィトロージェン社）を用い、そのマニュアルに準じて単離した。この方法により1X108個のIMR-90細胞より約10μg のポリ(A)+RNAを取得した。
【００４２】
ii) ミックスプライマーの作製
先に得られたペプチド（配列表  配列番号２及び３）のアミノ酸配列をもとに、次の２種のミックスプライマーを合成した。即ち、ペプチドP2の６番目(Gln)から12番目(Leu) までのアミノ酸配列をコードしうるすべての塩基配列を持つオリゴヌクレオチドの混合物（ミックスプライマー，No.2F）を合成した。又、ペプチドのＰ3 の６番目(His) から１２番目(Lys) までのアミノ酸配列をコードしうるすべての塩基配列に対する相補的オリゴヌクレオチドの混合物（ミックスプライマー，No.3R）を合成した。用いたミックスプライマーの塩基配列を、表３に示す。
【００４３】
【表３】
0003793180.tif 000004
【００４４】
iii) OCIFcDNA断片のPCR による増幅
実施例７−i)で得たポリ(A)+RNA、1Mgを鋳型としてスーパースクリプトIIcDNA合成キット（ギブコBRL社） を用いて、同社のプロトコールに従って一本鎖cDNAを合成し、このcDNAと実施例７−ii） で示したプライマーを用いて、PCRを行い、OCIFcDNA断片を取得した。以下に条件を示す。
【００４５】
10X Ex Taqバッファー（宝酒造社）  5   μl
2.5 mM dNTP                       4   μl
cDNA溶液                          1   μl
Ex Taq (宝酒造社）              0.25  μl
蒸留水                         29.75  μl
40μM プライマーNo.2F             5   μl
40μM プライマーNo.3R             5   μl
【００４６】
上記の溶液を微量遠心チューブ中で混合後、以下の条件でPCRを行った。95℃で3 分前処理後、95℃30秒、50℃30秒、70℃2 分の3 段階の反応を30回繰り返したのち、70℃５分保温した。反応液の一部をアガロース電気泳動し約400bp の均一なDNA断片が得られたことを確認した。
【００４７】
【実施例８】
PCR により増幅されたOCIFcDNA断片のクローニング及び塩基配列決定
実施例７−iii)で得られたOCIFcDNA断片を、Marchuk, Dらの方法(Nucleic AcidRes., Vol.19, p1154, 1991)によってプラスミドpBluescript II SK-(ストラタジーン社)にDNAライゲーションキット Ver.2（宝酒造社）を用いて挿入し、大腸菌 DH5α(ギブコBRL社)の形質転換を行った。得られた形質転換株を増殖させ、約 400bpのOCIFcDNA断片が挿入されたプラスミドを常法に従い精製した。このプラスミドをpBSOCIFと名付け、このプラスミドに挿入されているOCIFcDNAの塩基配列をタックダイデオキシターミネーターサイクルシークエンシングキット(Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit; パーキンエルマー社)を用いて決定した。このOCIFcDNAの大きさは、397 bpであった。この塩基配列から予測される132 個のアミノ酸からなるアミノ酸配列中に、ミックスプライマーを設計するのに用いたOCIFの内部アミノ酸配列（配列表配列番号２及び３）をそれぞれＮ末側、Ｃ末側に見出すことができた。又、OCIFの内部アミノ酸配列（配列番号１）を、この 132個のアミノ酸からなるアミノ酸配列中に見出すことができた。以上の結果より、クローニングした397 bpのcDNAは、OCIFcDNA断片であることが確認された。
【００４８】
【実施例９】
DNAプローブの作製
実施例８で作成された397bp のOCIFcDNA断片が挿入されたプラスミドを鋳型にして実施例７−iii)の条件でPCRを行なうことにより、このOCIFcDNA断片を増幅した。アガロース電気泳動により397bp のOCIFcDNA断片を分離後、QIAEX ゲルエクストラクションキット（キアゲン社）を用いて精製した。このDNAをメガプライムDNAラベリングキット（アマシャム社） を用いて [α32P]dCTP で標識し、全長のOCIFcDNAをスクリーニングするためのプローブとして用いた。
【００４９】
【実施例１０】
cDNAライブラリーの作成
実施例７−i)で得られたポリ(A)+RNA 、2.5μgを鋳型としてグレートレングスcDNA合成キット(クロンテック社) を用いて同社のプロトコールに従い、oligo(dT)primer を用いてcDNAの合成、EcoRI-SalI-Not-Iアダプター付加、cDNAサイズフラクショネーションを行いエタノール沈殿の後10μlのTEバッファーに溶解した。得られたアダプター付加cDNA、0.1μgをT4DNA リガーゼを用いてあらかじめEcoRIで切断した1μgのλZAP エクスプレスベクター（ストラタジーン社）に挿入した。このようにして得られたcDNA組み換えファージDNA 溶液をギガパックゴールドII（ストラタジーン社） を用いてインヴィトロパッケージング反応に供し、λZAP エクスプレス組み換えファージを作成した。
【００５０】
【実施例１１】
組み換えファージのスクリーニング
実施例１０で得られた組み換えファージを37℃で15分間大腸菌 XL1-Blue MRF'（ストラタジーン社）に感染させたのち、50℃に加温した0.7 ％の寒天を含むNZY 培地に添加し、NZY 寒天培地プレートに流しこんだ。37℃で一晩培養後、プラークの生じたプレート上にハイボンドN（アマシャム社）を約30秒密着させた。このフィルターを常法に従いアルカリ変性の後、中和し、2XSSC 溶液に浸したのちUVクロスリンク（ストラタジーン社） によりDNA をフィルターに固定化した。得られたフィルターを100 μg/mlのサケ精子DNA を含むハイブリダイゼーションバッファー（アマシャム社）に浸漬し65℃で4 時間前処理した後、熱変性した上記DNA プローブ(2X105cpm/ml) を添加した上記バッファ−に移し替え65℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。反応後フィルターを2XSSC で2 回、0.1XSSC,0.1％ SDS溶液で2回それぞれ65℃で10分間洗浄した。得られたいくつかの陽性クローンを、さらに2 回スクリーニングを行うことにより純化した。それらの中から約1.6kb のインサートを持つものを以下に用いた。この純化したファージをλOCIFと名付けた。純化したλOCIFをλZAP エクスプレスクローニングキット（ストラタジーン社）のプロトコールに従い、大腸菌XL1-Blue MRF' に感染させたのち、ヘルパーファージExAssist（ストラタジーン社） で多重感染を行い、その培養上清を大腸菌XLOLR(ストラタジーン社) に感染させたのちカナマイシン耐性株を拾うことによりpBKCMV（ストラタジーン社） に上述の1.6kb のインサートが挿入されたプラスミドpBKOCIF をもつ形質転換株を得た。この形質転換株はpBK/01F10 として、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）に受託番号FERM BP-5267（平成７年10月25日にFERM P-14998の原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託に移管）として寄託してある。このプラスミドをもつ形質転換株を増殖させ、常法によりプラスミドを精製した。
【００５１】
【実施例１２】
OCIFの全アミノ酸配列をコードするcDNAの塩基配列の決定
実施例１１で得られたOCIFcDNAの塩基配列をタックダイデオキシターミネーターサイクルシークエンシングキット（パーキンエルマー社) を用いて決定した。用いたプライマーはT3, T7  プライマー（ストラタジーン社）及びOCIFcDNAの塩基配列に基づいて設計された合成プライマーであり、その配列を配列表配列番号16〜29に示す。
決定されたOCIFの塩基配列を配列番号６に、その配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号５にそれぞれ示す。
【００５２】
【実施例１３】
293/EBNA細胞による組み換え型OCIFの生産
i) OCIFcDNAの発現プラスミドの作製
実施例１１で得られた約1.6kb のOCIFcDNAが挿入されたプラスミドpBKOCIF を制限酵素BamHI 及びXhoIで消化し、OCIFcDNAを切り出し、アガロース電気泳動によって分離後、QIAEX  ゲルエクストラクションキット（キアゲン社）を用いて精製した。このOCIFcDNAを、あらかじめ制限酵素BamHI 及びXhoIで消化しておいた発現プラスミドpCEP4（インヴィトロージェン社）に、ライゲーションキット Ver.2（宝酒造社）を用いて挿入し、大腸菌DH5 α(ギブコBRL社）の形質転換を行った。得られた形質転換株を増殖させ、OCIFcDNAが挿入された発現プラスミドpCEPOCIFをキアゲンカラム（キアゲン社） を用いて精製した。OCIF発現プラスミドpCEPOCIFをエタノールによって沈澱させた後、無菌蒸留水に溶解し以下の操作に用いた。
【００５３】
ii)  OCIFcDNAのトランジエントな発現及びその活性の測定
実施例13-i)で得られたOCIF発現プラスミドpCEPOCIFを用いて、以下に述べる方法で組み換えOCIFを発現させ、その活性を測定した。8×105個の293/EBNA細胞（インヴィトロージェン社）を６ウェルプレートの各ウェルに10％牛胎児血清（ギブコBRL社）を含むIMDM培地（ギブコBRL社）を用いて植え込み、翌日、培地を除いた後、無血清IMDM培地で細胞を洗った。トランスフェクション用試薬リポフェクタミン（ギブコBRL社）添付のプロトコールに従い、あらかじめOPTI-MEM培地（ギブコBRL社）を用いて希釈しておいたpCEPOCIFとリポフェクタミンを混合した後、この混合液を各ウェルの細胞に加えた。用いたpCEPOCIF及びリポフェクタミンの量はそれぞれ３μg及び12μlであった。38時間後、培地を除き１mlの新しいOPTI-MEM培地を加え、さらに30時間後、培地を回収し、これをOCIF活性測定用サンプルとした。OCIFの活性測定は以下のようにして行った。生後約17日のマウス骨髄細胞からの活性型ビタミンD3存在下での破骨細胞形成を酒石酸耐性酸性ホスファターゼ活性の誘導で試験し、その抑制活性を測定し、OCIFの活性とした。すなわち、96ウェルマイクロプレートに２×10‐8M活性型ビタミンD3及び10％牛胎児血清を含むα-MEM培地（ギブコBRL社）で希釈したサンプル100μl を入れ、生後約17日のマウス骨髄細胞３×105個を 100μl の10％牛胎児血清を含むα-MEM培地に懸濁させて播種し、5 ％CO2、37℃、湿度 100％にて一週間培養した。培養３日目と５日目に、培養液160μl を廃棄し、１×10-8M活性型ビタミンD3及び10％牛胎児血清を含むα-MEＭ培地で希釈したサンプル160μlを添加した。培養７日後にリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄した後エタノール／アセトン（１：１）溶液で細胞を室温にて１分間固定し、破骨細胞形成を酸性ホスファターゼ活性測定キット（Acid Phosphatase, Leucocyte 、カタログ No.387- A、シグマ社）を用いた染色で検出した。酒石酸存在下での酸性ホスファターゼ活性陽性細胞の減少をOCIF活性とした。その結果、表４に示すように、先にIMR-90の培養液から得られた天然型OCIFと同様の活性をこの培養液が有することが確認された。
【００５４】
【表４】
0003793180.tif 000005
（表中、＋＋は破骨細胞形成が80％以上抑制される活性を、＋は破骨細胞形成が30〜80％抑制される活性を、−は活性が検出されないことを示す。）
【００５５】
iii) 293/EBNA細胞由来組み換え型OCIFの精製
実施例13−ii)に記載した293/EBNA細胞を大量培養して得た培養液1.8lに0.1 ％になるようにCHAPSを加え、0.22μm のフィルター（ステリベックスGS、ミリポア社）で濾過した後、10mM Tris-HCl, pH7.5で平衡化させた50mlのヘパリン・セファロースCL-6Bカラム(2.6×10cm、ファルマシア社)にかけた。0.1 ％CHAPSを含む10mMTris-HCl, pH7.5で洗浄した後、100 分間でNaClを2Mにする直線勾配、流速４ml／分にて溶出を行い、8ml/フラクションにて分取を行った。各フラクション150μlを用いて実施例２の方法に従ってOCIF活性を測定し、約 0.6〜1.2M NaClで溶出されるOCIF活性画分 112mlを得た。
【００５６】
得られたOCIF活性画分 112mlを0.1 ％CHAPSを含む 10mM Tri s-HCl,pH7.5 で1000mlに希釈した後、0.1 ％CHAPSを含む 10mM Tris-HCl, pH7.5で平衡化させたアフィニティカラム（ヘパリン -5PW, 0.8×7.5 cm、トーソー社）にかけた。0.1％CHAPSを含む 10mM Tris-HCl, pH7.5 で洗浄した後、60分間でNaClを2Mにする直線勾配、流速0.5ml/分にて溶出を行い、0.5ml/フラクションにて分取を行った。
【００５７】
得られたフラクション各４μlを用いて実施例４の方法に従って還元及び非還元条件下でSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。その結果、フラクション30〜32には還元条件下で約60kD、非還元条件下で約60kDと約 120kDのOCIFバンドのみが検出されたので、フラクション30〜32を集め純化293/EBNA細胞由来組み換え型OCIF( rOCIF(E)) 画分とした。BSAをスタンダードとして用いたローリー法による蛋白定量の結果、535μg/mlのrOCIF(E)1.5ml が得られたことが明らかになった。
【００５８】
【実施例１４】
CHO細胞による組み換え型OCIFの生産
i) OCIFの発現プラスミドの作製
実施例11で得られた約1.6kb のOCIFcDNAが挿入されたプラスミドpBKOCIF を制限酵素SalI及びEcoRV で消化し、約1.4kb のOCIFcDNA断片を切り出し、アガロース電気泳動によって分離後、QIAEX  ゲルエクストラクションキット（キアゲン社）を用いて精製した。又、発現ベクターpcDL-SR α296 （Molecular and Cellular Biology, Vol.8, pp466-472, 1988） を制限酵素PstI及びKpnIで消化し、約3.4kb の発現ベクターDNA 断片をアガロース電気泳動によって分離後、QIAEXゲルエクストラクションキット（キアゲン社）を用いて精製した。DNAブランティングキット（宝酒造社）を用いて、これらの精製したOCIFcDNA断片と発現ベクターDNA断片の末端を平滑化した。次に、ライゲーションキット Ver.2（宝酒造社）を用いて、平滑化された発現ベクターDNA断片にOCIFcDNA断片を挿入し、大腸菌DH5α(ギブコBRL社）の形質転換を行い、OCIF発現プラスミドpSR αOCIFをもつ形質転換株を得た。
【００５９】
ii) 発現プラスミドの調製
実施例１３−i)で得られたOCIF発現プラスミドpSR αOCIFをもつ形質転換株及びWO92/01053号公報に示されるマウスDHFR遺伝子発現プラスミドpBAdDSV をもつ形質転換株をそれぞれ常法を用いて増殖させ、Maniatisら（Molecular cloning, 2nd edition） の方法に従いアルカリ法及びポリエチレングリコール法で処理し、塩化セシウム密度勾配遠心法により精製した。
【００６０】
iii) CHOdhFr- 細胞の蛋白質不含培地への馴化
10％牛胎児血清（ギブコBRL社）を含むIMDM培地（ギブコBRL社）で継代されていたCHOdhFr- 細胞(ATCC-CRL9096)は、無血清培地 EX-CELL301（JRHバイオサイエンス社）で馴化後、さらに蛋白質不含培地EX-CELL PF CHO（JRHバイオサイエンス社）で馴化させた。
【００６１】
iv) OCIF発現プラスミド及びDHFR発現プラスミドのCHOdhFr- 細胞への導入
実施例14-ii) で調製したOCIF発現プラスミド pSRαOCIF及びDHFR発現プラスミドpBAdDSV を用いて実施例14-iii)で調製したCHOdhFr- 細胞を下記に示すエレクトロポレーション法により形質転換した。pSR αOCIFプラスミド 200μｇとpBAdDSV プラスミド20μｇを無菌的に10％牛胎児血清（ギブコBRL社）を含むIMDM培地（ギブコBRL社）0.8ml に溶解後、この0.8ml を用いて 2×107個のCHOdhFr- 細胞を浮遊させた。この細胞浮遊液をキュベット(バイオラッド社)に入れ、ジーンパルサー(バイオラッド社)を用いて、360V、960 μFの条件でエレクトロポレーション法により形質転換を行った。10mlのEX-CELL PF CHO培地の入った浮遊細胞用Ｔフラスコ（住友ベークライト社）にエレクトロポレーション済の細胞浮遊液を移し、CO2インキュベーター中で２日間培養した。EX-CELL PF CHO培地を用いて5000cells/wellの濃度で96ウェルマイクロプレートにまき、約２週間培養した。EX-CELL PF CHO培地は核酸を含まず、この培地では親株のCHOdhFr- は増殖できないので、DHFRを発現する細胞株だけが選択されてくる。OCIF発現プラスミドをDHFR発現プラスミドの10倍量用いているので、DHFRを発現する細胞株の大部分はOCIFを発現する。得られたDHFRを発現する細胞株から培養上清中のOCIF活性の高い細胞株を、実施例２で示した測定法によってスクリーニングした。得られたOCIF高生産株につきEX-CELL PF CHO培地を用いて限界希釈法により細胞のクローニングを行い、得られたクローンについて培養上清中のOCIF活性の高い細胞株をスクリーニングし、OCIF高生産クローン5561を得た。
【００６２】
v)  組み換え型OCIFの生産
組み換えOCIF(rOCIF) の生産するため、EX-CELL 301 培地3lに形質転換CHO細胞（5561）を１×105cells/ml となるように接種し、スピナーフラスコを用いて37℃で4、5日培養した。細胞の濃度が約１×106cells/ml になったところで、約2.7lの培地を回収した。約2.7lのEX-CELL 301 培地を加え、培養を繰り返した。３基のスピナーフラスコを用い、約20l の培養液を採取した。
【００６３】
vi) CHO細胞由来組み換え型OCIFの精製
実施例14-(v) で得られた培養液１l に0.1％になるようにCHAPSを加え、0.22μm のフィルター（ステリベックスGS、ミリポア社）で濾過した後、10mM Tris-HCl, pH7.5で平衡化させた50mlのヘパリン・セファロースFFカラム(2.6×10cm、ファルマシア社)にかけた。0.1％CHAPSを含む10mM Tris-HCl,pH7.5 で洗浄した後、100 分間でNaClを2Mにする直線勾配、流速４ml／分にて溶出を行い、8ml/フラクションにて分取を行った。各フラクション 150μl を用いて実施例２の方法に従ってOCIF活性を測定し、約 0.6〜1.2Mで溶出されるOCIF活性画分 112mlを得た。
【００６４】
得られたOCIF活性画分 112mlを0.1 %CHAPSを含む 10mM Tris-HCl,pH7.5 で1200mlに希釈した後、0.1 ％CHAPSを含む 10mM Tris-HCl, pH7.5で平衡化させたアフィニティカラム（ブルー -5PW, 0.5×5cm 、トーソー社）にかけた。0.1 ％CHAPSを含む 10mM Tris-HCl, pH7.5 で洗浄した後、90分間でNaClを3Mにする直線勾配、流速0.5ml/分にて溶出を行い、0.5ml/フラクションにて分取を行った。
【００６５】
得られたフラクション各４μl を用いて実施例４の方法に従って還元及び非還元条件下でSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。その結果、フラクション30〜38には還元条件下で約60kD、非還元条件下で約60kDと約 120kDのOCIFバンドのみが検出されたので、フラクション30〜38を集め精製CHO細胞由来組み換え型OCIF〔ｒOCIF(C)〕画分とした。BSAをスタンダードとしたローリー法による蛋白定量の結果、113 μg/mlのｒOCIF(C)4.5mlが得られたことが明らかになった。
【００６６】
【実施例１５】
組み換え型OCIFのＮ末端構造解析
３μｇの精製rOCIF(E)及びrOCIF(C)を、プロスピン（ProSpin,パーキンエルマー社) を用いてポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜に固定し、20％メタノールで洗浄した後、プロテインシーケンサー（プロサイス、492 型、パーキンエルマー社）を用いてＮ末端アミノ酸配列分析を行った。結果を配列表配列番号７に示す。
rOCIF(E)と rOCIF(C) のＮ末端アミノ酸は、配列表配列番号５に記載したアミノ酸配列の翻訳開始点 Metから22番目の Gluで、Met から Glnまでの21アミノ酸はシグナルペプチドであることが明らかになった。又、IMR-90培養液から精製し得られた天然型OCIFのＮ末端アミノ酸配列が分析不能であったのは、Ｎ末端のGlu が培養中又は精製中にピログルタミン酸に変換したためと考えられた。
【００６７】
【実施例１６】
組み換え型(r)OCIF及び天然型(n)OCIFの生物活性
i)  マウス骨髄細胞系での、ビタミンD3で誘導される破骨細胞形成の抑制
96ウェルマイクロプレートに、2×10‐8M活性型ビタミンD3及び10％牛胎児血清を含むα-MEM培地（ギブコBRL社）で250ng/mlから連続的に二分の一希釈した精製rOCIF(E)及び nOCIF 100μl を入れた。このウェルに生後約17日のマウス骨髄細胞３×105個を 100μl の10％牛胎児血清を含むα-MEM培地に懸濁させて播種し、5％ CO2、37℃、湿度 100％にて一週間培養した。培養７日後に、実施例２の方法に従って酸性ホスファターゼ活性測定キット(Acid Phosphatase, Leucocyte 、カタログNo.387-A，シグマ社)を用いた染色を行い破骨細胞形成を検出した。酒石酸存在下での酸性ホスファターゼ活性陽性細胞の減少をOCIF活性とした。酸性ホスファターゼ活性陽性細胞の減少率は、染色した細胞の色素を可溶化し、その吸光度を測定することにより算出した。即ち、細胞を固定し染色した各ウェルに0.1N水酸化ナトリウム−ジメチルスルフォキシド混合液（１：１） 100μl を加えよく振盪した。色素を十分に溶解させた後、マイクロプレートリーダー（イムノリーダーNJ-2000、インターメッド社）を用い、測定波長 590nm、対照波長 490nmにて吸光度を測定した。又、吸光度を測定する際のブランクウェルとして、ビタミンD3未添加のウェルを用いた。結果は、OCIF未添加のウェルでの吸光度値を 100とした百分率値で表し、表５に示す。
ｎOCIFと同様にrOCIF(E)にも、16ng/ml 以上の濃度で用量依存的な破骨細胞形成抑制活性が見られた。
【００６８】
【表５】
0003793180.tif 000006
【００６９】
ii) ストローマ細胞とマウス脾臓細胞の共培養系でのビタミンD3で誘導される破骨細胞形成の抑制
ビタミンD3 で誘導されるストローマ細胞とマウス脾臓細胞の共培養系での破骨細胞形成の試験は、宇田川らの方法(Endocrinology,Vol.125, p1805-1813,1989) に従って行った。即ち、96ウェルマイクロプレートに２×10‐8M活性型ビタミンD3、２×10‐7でデキサメサゾン及び10％牛胎児血清を含むα-MEM培地(ギブコBRL社)で、連続的に希釈した精製 rOCIF(E)、 rOCIF(C) 及びnOCIF100μlを入れた。このウェルにマウス骨髄由来ストローマ細胞株ＳT2細胞 (RIKEN Cell Bank-RCB0224) 5×103個と生後約８週間の ddyマウス脾臓細胞１×105個を 100μl の10％牛胎児血清を含むα-MEM培地に懸濁させて播種し、５％CO2、37℃、湿度 100％にて５日間培養した。培養５日後にリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄した後、エタノール／アセトン（１：１）溶液で細胞を室温にて１分間固定し、破骨細胞形成を酸性ホスファターゼ活性測定キット(Acid Phosphatase, Leucocyte、カタログNo.387-A, シグマ社)を用いた染色で検出した。酒石酸存在下での酸性ホスファターゼ活性陽性細胞の減少をOCIF活性とした。又、酸性ホスファターゼ活性陽性細胞数の減少率は実施例16−i)に記載した方法に従って染色された細胞の色素を溶解させて算出した。rOCIF(E)とrOCIF(C)を用いて試験した結果を表６に、rOCIF(E)とnOCIF を用いて試験した結果を表７に、それぞれ示す。
nOCIFと同様にrOCIF(E)及びrOCIF(C)についても、6〜16mg/ml以上の濃度で容量依存的な破骨細胞形成抑制活性が見られた。
【００７０】
【表６】
0003793180.tif 000007
【００７１】
0003793180.tif 000008
【００７２】
iii) PTHで誘導される破骨細胞形成の抑制
PTHで誘導される破骨細胞形成の試験は、高橋らの方法 (Endocrinology,  Vol.122, p1373-1382, 1988)に従って行った。即ち、96ウェルマイクロプレートに２×10‐8MPTH及び10％牛胎児血清を含むα-MEM培地（ギブコ社）で、125ng/mlから連続的に希釈したｎOCIF及び精製rOCIF(E) 100μl を入れた。このウェルに生後約17日のマウス骨髄細胞３×105個を100μlの10％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地に懸濁させて播種し、５％ CO2、37℃、湿度100 ％にて５日間培養した。培養５日後にリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄した後エタノール／アセトン（１：１）溶液で細胞を室温にて１分間固定し、破骨細胞形成を酸性ホスファターゼ活性測定キット（Acid Phosphatase, Leucocyte 、カタログ No.387-A,シグマ社）を用いた染色で検出した。酒石酸存在下での酸性ホスファターゼ活性陽性細胞の減少をOCIF活性とした。又、酸性ホスファターゼ活性陽性細胞数の減少率は実施例16-i)に記載した方法に従って染色された細胞の色素を溶解させて算出した。結果を表８に示す。
nOCIF と同様にrOCIF(E)についても、16ng/ml 以上の濃度で容量依存的な破骨細胞形成抑制活性が見られた。
【００７３】
【表８】
0003793180.tif 000009
【００７４】
iv) IL-11で誘導される破骨細胞形成の抑制
IL-11 で誘導される破骨細胞形成の試験は、田村らの方法 (Proc. Natl. Acad.Sci.USA, Vol.90, p11924-11928, 1993)に従って行った。即ち、96ウェルマイクロプレートに 20ng/ml IL-11及び10％牛胎児血清を含むα-MEM培地（ギブコBRL社製）で希釈したnOCIF 及び精製rOCIF(E) 100μl を入れた。このウェルにマウス新生児頭蓋骨由来前脂肪細胞株 MC3T3-G2/PA6 細胞(RIKEN Cell Bank-RCB1127)５×103個と生後約８週間の ddyマウス脾臓細胞１×105個を 100μlの10％牛胎児血清を含むα-MEM培地に懸濁させて播種し、5％ CO2、37℃、湿度100 ％にて５日間培養した。培養５日後にリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄した後エタノール／アセトン（１：１）溶液で細胞を室温にて１分間固定し、破骨細胞形成を酸性ホスファターゼ活性測定キット（Acid Phosphatase, Leucocyte 、カタログ No.387-A,  シグマ社）を用いた染色で検出した。酒石酸存在下での酸性ホスファターゼ活性陽性細胞数を計測し、その減少をOCIF活性とした。結果を表９に示す。
nOCIF 及びrOCIF(E)とも、2ng/ml以上の濃度で容量依存的にIL-11 で誘導される破骨細胞形成を抑制する活性が見られた。
【００７５】
【表９】
0003793180.tif 000010
【００７６】
このように種々の標的細胞を用いた破骨細胞形成の試験系において、OCIFはビタミンD3、PTH、及びIL-11 等の破骨細胞形成誘導因子による破骨細胞の形成をほぼ同じ濃度で抑制することが明らかになった。従って、OCIFはこのような様々な骨吸収促進物質で誘導される異なるタイプの骨量減少症の治療に、効果的に使用出来る可能性が示唆された。
【００７７】
【実施例１７】
モノマー型及びダイマー型OCIFサンプルの調製
rOCIF(E)及びrOCIF(C)それぞれ 100μgを含むサンプルに、1/100容量の25％TFA(トリフルオロ酢酸)を加えた後、0.1％TFAを含む30％アセトニトリルで平衡化した逆相カラム(PROTEIN-RP、2.0×250mm、ワイエムシー社)にかけ、50分間でアセトニトリルを55％にする直線勾配、流速0.2ml/分にて溶出を行い、各OCIFピークを分取した。得られたピーク画分を凍結乾燥することにより、モノマー型OCIF及びダイマー型OCIFを得た。
【００７８】
【実施例１８】
組み換え型OCIFの分子量測定
実施例３−vi) の方法で逆相カラムを用いて精製したモノマー型及びダイマー型ｎOCIFと実施例１７記載の方法で精製したモノマー型及びダイマー型ｒOCIF約1μgを含むサンプルを減圧濃縮した。これらのサンプルにつき、実施例４の方法でSDS処理、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動、及び銀染色を行った。非還元条件下及び還元条件下で電気泳動した結果を、図６及び図７にそれぞれ示す。
【００７９】
その結果、非還元条件下では、何れのモノマー型サンプルでも60kDの蛋白質バンドが検出され、又、何れのダイマー型サンプルでも 120kDの蛋白質バンドが検出された。又、還元条件下では何れのサンプルでも約60kDの蛋白質バンドのみが検出された。従って、IMR-90細胞由来 nOCIF、293/EBNA細胞由来組み換え型OCIF、及びCHO細胞由来組み換え型OCIFの各々のモノマー型とダイマー型の分子量はほぼ同一であることが示された。
【００８０】
【実施例１９】
ＩＭＲ−90細胞由来天然型OCIFと組み換え型OCIFのＮ−結合型糖鎖の除去と分子量測定
実施例３−vi) の方法で逆相カラムを用いて精製したモノマー型及びダイマー型ｎOCIFと実施例１７記載の方法で精製したモノマー型及びダイマー型ｒOCIFの各々を約５μｇ含むサンプルを減圧濃縮した。これらのサンプルに100mM 2−メルカプトエタノールを加えた50mMリン塩緩衝液、pH8.6, 9.5μl を加えて溶解させ、更に250U/ml Ｎ−グリカナーゼ溶液（生化学工業社）0.5 μl を加え37℃で一日放置した。これらのサンプルに2mM MEDTA、５％SDS、及び0.02％ブロモフェノールブルーを含む 20mM Tris-HCl, pH8.0, 10μl を加え、100 ℃で５分間加熱した。これらのサンプルの１μl を実施例４の方法でSDS-ポリアクリルアミド電気泳動した後、銀染色した。結果を図８に示す。
【００８１】
その結果、Ｎ−グリカナーゼ処理によりＮ−結合糖鎖を除去したOCIF蛋白質の還元条件下での分子量は、いずれも約40kDであることが示された。糖鎖除去の処理を行っていないIMR-90細胞由来ｎOCIF，293/EBNA細胞由来ｒOCIF、及びCHO細胞由来ｒOCIFの各々の還元条件下での分子量はいずれも約60kDであることから、これらのOCIFはその分子内にＮ−結合糖鎖を含有する糖蛋白質であることが明らかになった。
【００８２】
【実施例２０】
OCIF類縁体（バリアント）cDNAのクローニング及び塩基配列の決定
実施例10及び11で示したように、純化したいくつかの陽性ファージのひとつからpBKCMV（ストラータジーン社）にOCIF cDNAが挿入されたプラスミドpBKOCIF を持つ形質転換株を得たが、その際、他のいくつかの陽性ファージからも長さの異なるインサートが挿入されたプラスミドを持つ形質転換株が得られた。これらのプラスミドを持つ形質転換株を増殖させ、常法によりプラスミドを精製した。これらのインサートDNA の塩基配列をタックダイデオキシターミネーターサイクルシークエンシングキット（パーキンエルマー社）を用いて決定した。用いたプライマーはT3,T7プライマー（ストラータジーン社）及びOCIFcDNAの塩基配列に基づいて設計された合成プライマーを用いた。オリジナルタイプのOCIF以外に、OCIFバリアントは全部で４種類（OCIF2, 3, 4, 5） 存在した。決定されたOCIF2cDNAの塩基配列を配列番号８にその配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号９に示す。決定されたOCIF3 cDNAの塩基配列を配列番号10にその配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号11 に示す。決定されたOCIF4 cDNAの塩基配列を配列番号12にその配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号13に示す。決定されたOCIF5 cDNAの塩基配列を配列番号１４にその配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号15に示す。これらのOCIFバリアントの構造の特徴を、図９〜12及び以下の記載をもって、簡単に説明する。
【００８３】
OCIF２
OCIFcDNAの塩基配列（配列番号６）の 265番目のグアニンから285 番目のグアニンまでの21bpの欠失があり、アミノ酸配列ではOCIFのアミノ酸配列（配列表配列番号５）の68番目のグルタミン酸（Glu）から74番目のグルタミン（Gln）までの７アミノ酸の欠失がある。
【００８４】
OCIF３
OCIFcDNAの塩基配列（配列番号６）の９番目のシチジンがグアニンに変換していて、アミノ酸配列ではOCIFのアミノ酸配列（配列表配列番号５）の−19番目のアスパラギン(Asn)がリジン(Lys)に変わっている。但し、これはシグナル配列の中のアミノ酸置換であり、分泌されるOCIF３には影響しないと思われる。
OCIFcDNAの塩基配列（配列番号６）の872番目のグアニンから988番目のグアニンまでの 117bpの欠失があり、アミノ酸配列ではOCIFのアミノ酸配列（配列表配列番号５）の 270番目のスレオニン(Thr)から308 番目のロイシン(Leu)までの39アミノ酸の欠失がある。
【００８５】
OCIF４
OCIFcDNAの塩基配列（配列番号６）の９番目のシチジンがグアニンに変換していて、アミノ酸配列ではOCIFのアミノ酸配列（配列表配列番号５）の−19番目のアスパラギン(Asn)がリジン(Lys)に変わっている。又、22番目のグアニンがチミジンに変換していて、アミノ酸配列ではOCIFのアミノ酸配列（配列表配列番号５）の−14番目のアラニン(Ala)がセリン(Ser)に変わっている。但し、これらはシグナル配列の中のアミノ酸置換であり、分泌されるOCIF４には影響しないと思われる。
OCIFcDNAの塩基配列（配列番号６）の 400番目と 401番目の間に約 4kbのイントロン２の挿入があり、オープンリーリングフレームがその中で止まる。アミノ酸配列ではOCIFのアミノ酸配列（配列表配列番号５）の 112番目のアラニン（Ａｌａ）の後に21アミノ酸からなる新規なアミノ酸配列が付加されている。
【００８６】
OCIF５
OCIFcDNAの塩基配列（配列番号６）の９番目のシチジンがグアニンに変換していて、アミノ酸配列ではOCIFのアミノ酸配列（配列表配列番号５）の−19番目のアスパラギン(Asn)がリジン(Lys)に変わっている。但し、これはシグナル配列の中のアミノ酸置換であり、分泌されるOCIF５には影響しないと思われる。
OCIFcDNAの塩基配列（配列番号６）の400番目と401番目の間に約1.8 kbのイントロン２の後半部分の挿入があり、オープンリーリングフレームがその中で止まる。アミノ酸配列ではOCIFのアミノ酸配列（配列表配列番号５）の 112番目のアラニン(Ala)の後に１２アミノ酸からなる新規なアミノ酸配列が付加されている。
【００８７】
【実施例２１】
OCIF類縁体（バリアント）の生産
i) OCIFバリアントcDNAの発現プラスミドの作製
実施例20で得られたOCIFバリアントcDNAのうち、OCIF 2, 3 のcDNAがそれぞれ挿入されたプラスミドpBKOCIF2、pBKOCIF3を制限酵素XhoI及びBamHI(宝酒造社）で消化し、OCIF 2及び3 のcDNAをそれぞれ切り出し、アガロース電気泳動によって分離後、QIAEX  ゲルエクストラクションキット（キアゲン社）を用いて精製した。これらのOCIF 2及び3 のcDNAを、あらかじめ制限酵素XhoI及びBamHI （宝酒造社）で消化しておいた発現プラスミドpCEP4(インヴィトロージェン社) に、ライゲーションキット Ver.2（宝酒造社) を用いて挿入し、大腸菌 DH5α（ギブコBRL社）の形質転換を行った。
又、実施例20で得られたOCIFバリアントcDNAのうち、OCIF4 のcDNAをが挿入されたプラスミドpBKOCIF4を制限酵素SpeI及びXhoI（宝酒造社）で消化し、アガロース電気泳動によって分離後、QIAEX  ゲルエクストラクションキット（キアゲン社）を用いて精製した。この OCIF4のcDNAを、あらかじめ制限酵素NheI及びXhoI (宝酒造社)で消化しておいた発現プラスミドpCEP4(インヴィトロージェン社) に、ライゲーションキット Ver.2（宝酒造社）を用いて挿入し、大腸菌DH5α（ギブコBRL社）の形質転換を行った。
【００８８】
又、実施例20で得られたOCIFバリアントcDNAのうち、OCIF5 のcDNAをが挿入されたプラスミドpBKOCIF5を制限酵素Hind III（宝酒造社）で消化し、OCIF5cDNA のコーディング領域の5'領域を切り出し、アガロース電気泳動によって分離後、QIAEX  ゲルエクストラクションキット(キアゲン社)を用いて精製した。実施例13‐i)で得られたOCIF発現プラスミドpCEPOCIFを制限酵素Hind III(宝酒造社)で消化し、OCIFcDNAのコーディング領域の5'領域を取り除き、pCEPプラスミドとOCIFcDNAの3'領域を含んだDNA断片pCEPOCIF-3' をアガロース電気泳動によって分離後、QIAEX ゲルエクストラクションキット（キアゲン社）を用いて精製した。この OCIF5 cDNA のHind III断片をpCEPOCIF-3' にライゲーションキット Ver.2（宝酒造社) を用いて挿入し、大腸菌DH5α（ギブコBRL社）の形質転換を行った。
得られた形質転換株を増殖させ、OCIF2, 3, 4, 5のcDNAが挿入された発現プラスミドpCEPOCIF 2, 3, 4, 5 を、キアゲンカラム（キアゲン社） を用いて精製した。OCIFバリアント発現プラスミドをエタノールによって沈澱させた後、無菌蒸留水に溶解し以下の操作に用いた。
【００８９】
ii) OCIFバリアントcDNAのトランジエントな発現及びその活性の測定
実施例21−i)で得られたOCIFバリアント発現プラスミドpCEPOCIF 2, 3, 4, 5 を用いて、実施例13−ii) で述べた方法でOCIFバリアントをトランジエントに発現させ、それらの活性を調べた。その結果、これらのOCIFバリアントに弱い活性を認めた。
【００９０】
【実施例２２】
OCIF変異体の作製
i) OCIF変異体cDNAサブクローニング用プラスミドベクターの作製
実施例11記載のプラスミドベクター5μg を、制限酵素BamHI 及びXhoI（宝酒造社）で切断した。切断したDNAを調製用アガロースゲル電気泳動に供した。
OCIFcDNA全長を含む約 1.6キロベースペア(kb)のDNA断片を単離し、QIAEX  ゲルエクストラクションキット（キアゲン社）により精製し、20μl の滅菌蒸留水に溶解したDNA溶液１を得た。次に、pBluescript IISK+（ストラータジーン社）３μg を制限酵素BamHI 及びXhoI（宝酒造社）で切断した。切断したDNAを調製用アガロースゲル電気泳動に供した。約3.0 kbのDNA断片を単離し、QIAEX  ゲルエクストラクションキット（キアゲン社）により精製し、20μl の滅菌蒸留水に溶解したDNA溶液２を得た。１μl のDNA溶液２と４μl のDNA溶液１を混合し、５μl のDNAライゲーションキットver.2 Ｉ液（宝酒造社）を添加し混合後、16℃で30分間保温し、ライゲーション反応を行った。尚、以下のライゲーション反応は全て16℃30分の保温条件で行った。
【００９１】
このライゲーション反応液を用い、以下の条件で大腸菌の形質転換を行った。尚、以後大腸菌の形質転換は以下の条件で行った。このライゲーション反応液５μl と大腸菌DH5αコンピテント細胞（ギブコBRL社）100 μl とを15ml用滅菌チューブ（岩城ガラス社）中で混合し、氷水中30分放置した。42℃45秒保温後、250 μl のＬ培地 (１％トリプトン、0.5 ％イーストエキストラクト、１％ NaCl)を添加し攪拌しながら37℃で培養した。50μl の菌液を50μg/mlアンピシリンを含む２mlのＬ寒天培地上にスプレッドした。37℃で一晩培養し、生育してきたコロニー６種を２mlのＬアンピシリン液体培地でさらに一晩培養し、各株が持つプラスミドの構造を調べた。pBluescript IISK+のBamHI XhoI切断部位にOCIFcDNA全長を含む約1.6kb のDNA断片が挿入された構造を持つプラスミド（以後 pSK+-OCIF と呼ぶ）を得た。
【００９２】
ii) ＣｙｓをＳｅｒに置換した変異体の作製
(1) 変異の導入
配列表配列番号４に記載のアミノ酸配列中、174, 181, 256, 298及び379 番の Cys残基を Ser残基に置換した変異体を作製した。174CysをSer に置換した変異体をOCIF-C19S 、181CysをSer に置換した変異体をOCIF-C20S 、256Cysを Serに置換した変異体をOCIF-C21S 、298CysをSer に置換した変異体をOCIF-C22S 、379 Cysを Serに置換した変異体をOCIF-C23S2と、それぞれ名付けた。変異体作製のためにまず、各Cys 残基をコードする塩基配列をSer 残基をコードする塩基配列に置換した。変異導入は二段階のPCR(polymerase chain reaction) により行った。以後、二段階PCR反応と呼ぶ。第一段階は２つのPCR反応より成る（PCR1及びPCR2）。
【００９３】
PCR1反応液
10X Ex Taq  バッファー（宝酒造社）                  10  μl
2.5 mM dNTP 溶液                                     8  μl
実施例１１記載のプラスミドベクター（8ng/ml）         2  μl
滅菌蒸留水                                          73.5μl
２０μM プライマー１                                 5  μl
１００μM プライマー２（変異導入用）                 １ μl
Ex Taq  （宝酒造社）                                 0.5μl
【００９４】
PCR2反応液
10X Ex Taqバッファー（宝酒造社）                    10  μl
2.5 mM dNTP 溶液                                     8  μl
実施例１１記載のプラスミドベクター（8ng/ml）         2  μl
滅菌蒸留水                                          73.5μl
20μM プライマー３                                   5  μl
100μM プライマー４（変異導入用）                    1  μl
Ex Taq  （宝酒造社）                                 0.5μl
【００９５】
各変異導入時には、プライマーの種類だけを変え、他の反応組成は同一とした。各反応で用いたプライマーを表10に、その配列を配列表配列番号20、23、27、30〜40に示す。PCR1反応液及びPCR2反応液をそれぞれ別の微量遠心チューブに入れ混合後、以下の条件でPCRを行った。97℃で３分処理後、95℃１分、55℃１分、72℃３分の３段階の反応を25回繰り返したのち、70℃５分保温した。反応液の一部をアガロース電気泳動に供し、目的の長さのDNA断片が合成されていることを確認した。第一段階PCR反応終了後、アミコンマイクロコン（アミコン社）により反応液からプライマーを除去し、滅菌蒸留水により最終液量を50μl に調製し、得られたDNA断片を用いさらに第２段階PCR反応(PCR3)を行った。
【００９６】
PCR3反応液
10X Ex Taqバッファー（宝酒造社）                  10  μl
2.5 mM dNTP 溶液                                  8   μl
PCR1により得られたDNA断片                         5   μl
PCR2により得られたDNA断片                         5   μl
滅菌蒸留水                                       61.5 μl
20μＭ  プライマー 1                              5   μl
20μM プライマー 3                                5   μl
Ex Taq (宝酒造社)                                 0.5 μl
【００９７】
【表１０】
0003793180.tif 000011
【００９８】
上記の溶液を微量遠心チューブに入れ混合後、PCR1、PCR2と同一の条件でPCRを行った。反応液の一部をアガロース（１％或いは1.5 ％）電気泳動に供し、目的の長さのDNA断片が合成されていることを確認した。PCRにより得られたDNAをエタノールにより沈殿させ、真空中で乾燥させ、40μl の滅菌蒸留水に溶解した。C19S変異DNA断片を含む溶液を溶液Ａ、C20S変異DNA断片を含む溶液を溶液Ｂ、C21S変異DNA断片を含む溶液を溶液Ｃ、C22S変異DNA断片を含む溶液を溶液Ｄ、C23S変異DNA断片を含む溶液を溶液Ｅと名付けた。
【００９９】
溶液Ａ20μl 中のDNA断片を制限酵素NdeI及びSphI（宝酒造社）により切断した。調製用電気泳動により約400bp のDNA断片を分離・精製し20μl の蒸留水に溶解した（DNA溶液３）。次に、２μg のpSK+-OCIFを制限酵素NdeI及びSphI（宝酒造社）により切断し、調製用電気泳動により約4.2kb のDNA断片を分離・精製し20μl の滅菌蒸留水に溶解した(DNA溶液４)。２μl のDNA溶液３と3μl のDNA溶液４を混合し、さらにDNAライゲーションキットver.2 I液5μl を添加しライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μl を用い、大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、DNA構造の解析により目的のプラスミドDNAを持つ株を選びだした。DNA構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドDNAをpSK-OCIF-C19S と名付けた。
【０１００】
溶液Ｂ20μl 中のC20S変異DNA断片を制限酵素NdeI及びSphI(宝酒造社)により切断した。調製用電気泳動により約400bp のDNA断片を分離・精製し20μlの蒸留水に溶解した（DNA溶液５）。2μl のDNA溶液５と3μl のDNA溶液４を混合し、さらにDNAライゲーションキットver.2 I液5μl を添加しライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液5μl を用い、大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、DNA構造の解析により目的のプラスミドDNAを持つ株を選びだした。DNA構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドDNAをpSK-OCIF-C20S と名付けた。
【０１０１】
溶液Ｃ20μl 中のDNA断片を制限酵素NdeI及びSphI（宝酒造社）により切断した。調製用電気泳動により約 400bpのDNA断片を分離・精製し20μl の蒸留水に溶解した（DNA溶液６）。2μl のDNA溶液６と3μl のDNA溶液４を混合し、さらにDNAライゲーションキットver.2 I液5μl を添加しライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液5μl を用い、大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、DNA構造の解析により目的のプラスミドDNAを持つ株を選びだした。DNA構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドDNAをpSK-OCIF-C21S と名付けた。
【０１０２】
溶液Ｄ20μl 中のDNA断片を制限酵素NdeI及びBstPI（宝酒造社）により切断した。調製用電気泳動により約600bp のDNA断片を分離・精製し20μlの蒸留水に溶解した（DNA溶液７）。次に、2μgのpSK+-OCIF を制限酵素NdeI及びBstPI （宝酒造社）により切断し、調製用電気泳動により約4.0kb のDNA断片を分離・精製し20μlの蒸留水に溶解した（DNA溶液８）。2μl のDNA溶液７と3μl のDNA溶液８を混合し、さらにDNAライゲーションキットver.2 Ｉ液５μl を添加しライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μl を用い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、DNA構造の解析により目的のプラスミドDNAを持つ株を選びだした。DNA構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドDNAをpSK-OCIF-C22S と名付けた。
【０１０３】
溶液Ｅ20μl 中のDNA断片を制限酵素BstPI 及びEcoRV (宝酒造社)により切断した。調製用電気泳動により約120bp のDNA断片を分離・精製し20μl の滅菌蒸留水に溶解した（DNA溶液９）。次に、2μg のpSK+-OCIF を制限酵素BstEII及びEcoRV （宝酒造社）により切断し、調製用電気泳動により約4.5kbのDNA断片を分離・精製し20μl の蒸留水に溶解した（DNA溶液10）。2μlのDNA溶液９と3μl のDNA溶液10を混合し、さらにDNAライゲーションキットver.2 Ｉ液5μl を添加しライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μl を用い、大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、DNA構造の解析により目的のプラスミドDNAを持つ株を選びだした。DNA構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドDNAをpSK-OCIF-C23S と名付けた。
【０１０４】
(2) 変異体発現ベクターの構築
得られた目的のプラスミドDNA(pSK-OCIF-C19S, pSK-OCIF-C20S pSK-OCIF-C21S,pSK-OCIF-C22S,pSK-OCIF-C23S)を制限酵素BamHI 及びXhoI（宝酒造社）で切断し、OCIFcDNA全長を含む約1.6kb のDNA断片（目的の変異も含む） を分離・精製し、滅菌蒸留水20μl に溶解した。それぞれC19SDNA 溶液、C20SDNA 溶液、C21SDNA 溶液、C22SDNA 溶液、C23SDNA 溶液と名付けた。次に、発現ベクターpCEP4(インヴィトロージェン社)5μg を制限酵素BamHI 及びXhoI(宝酒造社)で切断し、約10 kb のDNAを分離・精製し滅菌蒸留水40μl に溶解した（pCEP4DNA溶液）。pCEP4DNA溶液1μl と各6μl のC19SDNA 溶液、C20SDNA 溶液、C21SDNA溶液、C22SDNA 溶液、C23SDNA 溶液を別々に混合し、各混合液に7μl のDNAライゲーションキット Ver.2 I液を添加し、ライゲーション反応を行った。反応終了後、７μl の反応液を用い、大腸菌DH5αコンピテント細胞液100ml を形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、pCEP4のXhoI、BamHI部位に約1.6kb の各DNA断片が挿入された目的の構造のプラスミドDNAを持つ株計５種を選びだし、それぞれ、pCEP4-OCIF-C19S, pCEP4-OCIF-C20S,pCEP4-OCIF-C21S,pCEP4-OCIF-C22S,pCEP4-OCIF-C23S と名付けた。
【０１０５】
ii) ドメイン欠失変異体の作製
(1) ドメイン欠失変異の導入
配列番号４に記載したアミノ酸中、２番のTyr から42番のAla まで、43番のProから84番の Cysまで、85番のGlu から 122番のLys まで、123番のArg から 164番の Cysまで、177番のAsp から 251番のGln まで、253番のIle から326 番のHis までを、それぞれ欠失させた変異体を作製した。２番のThr から42番のAlaまでを欠失させた変異体をOCIF-DCR1 、43番のPro から84番の Cysまでを欠失させた変異体をOCIF-DCR2 、85番のGlu から122番のLys までを欠失させた変異体をOCIF-DCR3 、123 番のArg から164番のCysまでを欠失させた変異体をOCIF-DCR4、177番のAspから251番のGln までを欠失させた変異体をOCIF-DDD1、253番Ile から 326番のHis までを欠失させた変異体をOCIF-DDD2 と、それぞれ名付けた。ドメイン欠失変異の導入も、実施例22−ii) に記載の二段階PCR法によって行った。各変異導入反応時に用いたプライマーを表11に、その配列を配列表配列番号19、25、40〜53、及び54に示す。
【０１０６】
【表１１】
0003793180.tif 000012
【０１０７】
PCRにより得られたDNAをエタノールにより沈殿させ真空中で乾燥させ、40μlの滅菌蒸留水に溶解した。 DCR1変異DNA断片を含む溶液を溶液Ｆ、DCR2変異DNA断片を含む溶液を溶液Ｇ、DCR3変異DNA断片を含む溶液を溶液Ｈ、DCR4変異DNA断片を含む溶液を溶液Ｉ、DDD1変異DNA断片を含む溶液を溶液Ｊ、DDD2変異DNA断片を含む溶液を溶液Ｋと名付けた。
【０１０８】
溶液Ｆ20μl 中のDNA断片を制限酵素NdeI及びXhoI（宝酒造社）により切断した。調製用電気泳動により約500bp のDNA断片を分離・精製し20μl の滅菌蒸留水に溶解した（DNA溶液11）。次に、２μg のpSK+-OCIF を制限酵素NdeI及びXhoI（宝酒造社）により切断し、調製用電気泳動により約4.0kb のDNA断片を分離・精製し20μl の滅菌蒸留水に溶解した（DNA溶液12）。2μl のDNA溶液11と３μlのDNA溶液12を混合し、さらにDNAライゲーションキットver.2 Ｉ液５μl を添加しライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μl を用い、大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、DNA構造の解析により、OCIFcDNAに目的の変異の導入されたプラスミドDNAを持つ株を選びだした。DNA構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドDNAをpSK-OCIF-DCR1と名付けた。
【０１０９】
溶液Ｇ20μl 中のDNA断片を制限酵素NdeI及びXhoI（宝酒造社）により切断した。調製用電気泳動により約500bp のDNA断片を分離・精製し20μl の滅菌蒸留水に溶解した（DNA溶液13）。２μl のDNA溶液13と３μl のDNA溶液12を混合し、さらにDNAライゲーションキットver.2 Ｉ液を５μl 添加し、ライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μl を用い、大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、DNA構造の解析により目的のプラスミドDNAを持つ株を選びだした。DNA構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドDNAをpSK-OCIF-DCR2 と名付けた。
【０１１０】
溶液Ｈ20μl 中のDNA断片を制限酵素NdeI及びXhoI（宝酒造社）により切断した。調製用電気泳動により約500bp のDNA断片を分離・精製し20μl の滅菌蒸留水に溶解した（DNA溶液14）。２μl のDNA溶液14と３μl のDNA溶液12を混合し、さらにDNAライゲーションキットver.2 Ｉ液を５μl 添加し、ライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μl を用い、大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、DNA構造の解析により、OCIFcDNAに目的の変異の導入されたプラスミドDNAを持つ株を選びだした。DNA構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドDNAをpSK-OCIF-DCR3 と名付けた。
【０１１１】
溶液Ｉ20μl 中のDNA断片を制限酵素XhoI及びSphI（宝酒造社）により切断した。調製用電気泳動により約900bp のDNA断片を分離・精製し20μl の滅菌蒸留水に溶解した（DNA溶液15）。次に、２μg のpSK+-OCIF を制限酵素XhoI及びSphI（宝酒造社）により切断し、調製用電気泳動により約3.6kb のDNA断片を分離・精製し20μl の滅菌蒸留水に溶解した（DNA溶液16）。２μlのDNA溶液15と３μlのDNA溶液16を混合し、さらにDNAライゲーションキットver.2 Ｉ液５μl を添加し、ライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μl を用い、大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、DNA構造の解析により目的のプラスミドDNAを持つ株を選びだした。DNA構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドDNAをpSK-OCIF-DCR4 と名付けた。
【０１１２】
溶液Ｊ20μl 中のDNA断片を制限酵素BstPI 及びNdeI（宝酒造社）により切断した。調製用電気泳動により約 400bpのDNA断片を分離・精製し20μlの滅菌蒸留水に溶解した（DNA溶液17）。2μlのDNA溶液17と3μl のDNA溶液８を混合し、さらにDNAライゲーションキットver.2 Ｉ液を5μl 添加し、ライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μl を用い、大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、DNA構造の解析により目的のプラスミドDNAを持つ株を選びだした。DNA構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドDNAをpSK-OCIF-DDD1 と名付けた。
【０１１３】
溶液K20μl 中のDNA断片を制限酵素BstPI 及びNdeI(宝酒造社)により切断した。調製用電気泳動により約400bpのDNA断片を分離・精製し20μlの滅菌蒸留水に溶解した(DNA溶液18)。２μlのDNA溶液18と３μlのDNA溶液８を混合し、さらにDNAライゲーションキットver.2 Ｉ液を5μl添加し、ライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μl を用い、大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、DNA構造の解析により目的のプラスミドDNAを持つ株を選びだした。DNA構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドDNAをpSK-OCIF-DDD2 と名付けた。
【０１１４】
(2) 変異体発現ベクターの構築
得られた目的のプラスミドDNA（pSK-OCIF-DCR1, pSK-OCIF-DCR2,pSK-OCIF-ＸR3,pSK-OCIF-DCR4,pSK-OCIF-DDD1,pSK-OCIF-DDD2）を制限酵素BamHI 及びXhoI（宝酒造社）で切断しOCIFcDNA全長を含む約1.4-1.5 kbのDNA断片（目的の変異も含む）を分離・精製し、滅菌蒸留水20μl に溶解した。それぞれをDCR1DNA溶液、DCR2DNA 溶液、DCR3DNA 溶液、DCR4DNA 溶液、DDD1DNA 溶液、DDD2DNA 溶液と名付けた。実施例22−ii) に記載のpCEP4 DNA 溶液１μl と各６μl のDCR1DNA 溶液、DCR2DNA 溶液、DCR3DNA 溶液、DCR4DNA 溶液、DDD1DNA 溶液、DDD2DNA溶液を別々に混合し、各混合液に７μl のDNAライゲーションバッファーを添加し、ライゲーション反応を行った。反応終了後、７μl の反応液を用い、大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞からpCEP4BamHI XhoI部位に各1.4-1.5kb 断片が挿入された構造のプラスミドDNAを持つ株計６種を選びだした。目的の構造を持つプラスミドをそれぞれpCEP4-OCIF-DCR1 、pCEP4-OCIF-DCR2 、pCEP4-OCIF-DCR3 、pCEP4-OCIF-DCR4 、pCEP4-OCIF-DDD1 、pCEP4-OCIF-DDD2 と名付けた。
【０１１５】
iii)  Ｃ末端ドメイン欠失変異体の作製
(1) Ｃ末端ドメイン欠失変異の導入
配列番号４に記載したアミノ酸中、379 番の Cysと380 番のLeu 、331番のSerから380番のLeu まで、252番のAspから380番のLeu まで、177番のAsp から 380番のLeu まで、123 番のArg から 380番のLeu まで、86番のCysから380番のLeu までを、それぞれ欠失させた変異体を作製した。379番のCysと380 番のLeu を欠失させた変異体をOCIF-CL、331番のSerから380番のLeu までを欠失させた変異体をOCIF-CC 、252番のAsp から 380番のLeu までを欠失させた変異体をOCIF-CDD2、177番のAsp から380番のLeu までを欠失させた変異体をOCIF-CDD1、123番のArg から380番のLeu までを欠失させた変異体をOCIF-CCR4 、86番の Cysから 380番のLeu までを欠失させた変異体をOCIF-CCR3 と、それぞれ名付けた。
【０１１６】
変異体OCIF-CL の作製用の変異導入は、実施例22−ii) に記載の二段階PCR法によって行った。変異導入反応時に用いたプライマーを表１２に、その塩基配列を配列表配列番号23、40、55及び56に示す。PCRにより得られたDNAをエタノールにより沈殿させ、真空中で乾燥させ、40μl の滅菌蒸留水に溶解した （溶液Ｌ）。
【０１１７】
溶液Ｌ20μl 中のDNA断片を制限酵素BstPI 及びEcoRV （宝酒造社）により切断した。調製用電気泳動により約100bp のDNA断片を分離・精製し20μlの滅菌蒸留水に溶解した（DNA溶液19）。次に、２μl のDNA溶液９と３μlの実施例22−ii) 記載のDNA溶液10を混合し、さらにDNAライゲーションキットver.2 Ｉ液を５μl 添加し、ライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液５μl を用い、大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、DNA構造の解析により目的のプラスミドDNAを持つ株を選びだした。DNA構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドDNAをpSK-OCIF-CLと名付けた。変異体OCIF-CC 、変異体OCIF-CDD2 、変異体OCIF-CDD1 、変異体をOCIF-CCR4 、変異体OCIF-CCR3 作製用の変異導入には、一段階のPCR法を用いた。以下に反応条件を示す。
【０１１８】
Ｃ末端ドメイン欠失変異導入用PCR  反応液
10X Ex Taq バッファー(宝酒造社)                    10  μl
2.5 mM dNTP 溶液                                    8  μl
実施例11記載のプラスミドベクター(8ng/ml)            2  μl
滅菌蒸留水                                        73.5μl
20μM プライマー OCIF Xho F                         5  μl
100μM 変異導入用プライマー                         1  μl
Ex Taq (宝酒造社)                                  0.5 μl
【０１１９】
【表１２】
0003793180.tif 000013
【０１２０】
各変異導入時には、プライマーの種類だけを変え、他の反応組成は同一とした。
各反応での変異導入用プライマーを表13に、その配列を配列表配列番号57〜61に示す。PCR反応液を微量遠心チューブに入れ混合後、以下の条件でPCRを行った。97℃で３分処理後、95℃30秒、50℃30秒、70℃３分の３段階の反応を25回繰り返したのち、70℃５分保温した。反応液の一部をアガロース電気泳動に供し、目的の長さのDNA断片が合成されていることを確認した。反応液からアミコン・マイクロコンによりプライマーを除去し、DNAをエタノールにより沈殿させ真空中で乾燥させ、40μl の滅菌蒸留水に溶解した。各変異DNA断片を含む溶液20μl 中のDNA断片を制限酵素XhoI及びBamHI によりDNAを切断した。酵素切断終了後、DNAをエタノールにより沈殿させ真空中で乾燥させ、20μl の滅菌蒸留水に溶解した。溶液をそれぞれCCDNA 溶液、CDD2DNA 溶液、CDD1DNA 溶液、CCR4DNA 溶液、CCR3DNA 溶液と名付けた。
【０１２１】
【表１３】
0003793180.tif 000014
【０１２２】
(2) 変異体発現ベクターの構築
pSK-OCIF-CL を制限酵素BamHI 及びXhoI（宝酒造社）で切断し、OCIFcDNAを含む約1.5 kbのDNA断片(目的の変異も含む）を分離・精製し、滅菌蒸留水20μlに溶解した（CLDNA 溶液)。実施例22−ii) に記載のpCEP4 DNA 溶液１μl と各６μl のCLDNA 溶液、CCDNA 溶液、CDD2DNA 溶液、CDD1DNA 溶液、CCR4DNA 溶液、CCR3DNA 溶液を別々に混合し、７μl のDNAライゲーションキット Ver.2 I液を添加し、ライゲーション反応を行った。反応終了後、7μl の反応液を用い、大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から目的の変異を持つOCIF cDNA断片がpCEP4 のXhoI-BamHI部位に挿入された構造のプラスミドDNAを持つ株計６種を選びだした。目的の構造を持つプラスミドをそれぞれ、pCEP4-OCIF-CL, pCEP4-OCIF-CC，pCEP4-OCIF-CDD2，pCEP4-OCIF-CDD1，pCEP4-OCIF-CCR4，pCEP4-OCIF-CCR3と名付けた。
【０１２３】
iv) Ｃ末端欠失変異体の作製
(1) Ｃ末端欠失変異の導入
配列番号４に記載したアミノ酸中、371 番Gln から 380番Leu までを欠失させLeu-Val の２残基を付加した変異体（OCIF-CBst）、298番 Cysから 380番Leuまでを欠失させSer-Leu-Asp の残基を付加した変異体（OCIF-CSph）、167番Asnから 380番Leu までを欠失させた変異体（OCIF-CBsp）、62番 Cysから 380番Leuまでを欠失させLeu-Val の２残基を付加した変異体（OCIF-CPst）を作製した。各２μg のpSK+-OCIF を制限酵素BstPI 、SphI、PstI（宝酒造社）、及びBspEI(New England Biolab社)で切断し、フェノール処理、エタノール沈殿によりDNAを精製し、10μl の滅菌蒸留水に溶解した。各２μl の溶液を用いDNAブランティングキット（宝酒造社）により各DNAの末端を平滑化した（最終容量5μl）。この反応液に、アンバーコドンを含むXbaIリンカー（5'-CTAGTCTAGACTAG-3'）１μg(１μl)と、６μl のDNAライゲーションキットver.2 Ｉ液を添加し、ライゲーション反応を行った。反応後のライゲーション溶液６μl を用い、大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から、DNA構造の解析により目的のプラスミドDNAを持つ株を選びだした。DNA構造は、制限酵素切断により得られる断片の長さの測定及び塩基配列の決定により解析した。得られた目的のプラスミドDNAをpSK-OCIF-CBst、pSK-OCIF-CSph、pSK-OCIF-CBsp 、pSK-OCIF-CPst と名付けた。
【０１２４】
(2) 変異体発現ベクターの構築
得られたプラスミドDNA(pSK-OCIF-CBst、pSK-OCIF-CSph、pSK-OCIF-CBsp、pSK-OCIF-CPst)を制限酵素BamHI 及びXhoI（宝酒造社）で切断し、OCIFcDNA全長を含む約1.5 キロベースペア(kb)のDNA断片（目的の変異も含む）を分離・精製し、滅菌蒸留水20μl に溶解した（それぞれCBstDNA 溶液、CSphDNA 溶液、CBspDNA 溶液、CPstDNA 溶液と名付けた）。
実施例22−ii）に記載のpCEP4 DNA 溶液１μl と各６μl のCBstDNA 溶液、CSphDNA 溶液、CBspDNA 溶液、CPstDNA 溶液を別々に混合し、各混合液に７μl のDNAライゲーションキット Ver.2 I液を添加し、ライゲーション反応を行った。反応終了後、７μl の反応液を用い、大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換細胞から目的の変異を持つOCIFcDNA断片がpCEP4 のXhoI BamHI部位間に挿入された構造のプラスミドDNAを持つ株計５種を選びだした。目的の構造を持つプラスミドをそれぞれ、pCEP4-OCIF-CBst, pCEP4-OCIF-CSph,pCEP4-OCIF-CBsp,pCEP4-OCIF-CPstと名付けた。
【０１２５】
v)  変異体発現ベクターの調製
変異体発現ベクターを持つ大腸菌（計21種類）を増殖させ、各種変異体発現ベクターをキアゲンカラム（キアゲン社）を用いて精製した。各発現ベクターはエタノールによって沈殿させた後、滅菌蒸留水に溶解し以下の操作に用いた。
【０１２６】
vi）  変異体cDNAのトランジェントな発現及びその活性の測定
実施例22−v)で精製した各種OCIF変異体発現プラスミドを用い、実施例13の方法に従いOCIF変異体を発現させた。以下に変更した点のみを記する。DNA導入には24ウェルプレートを用いた。２×105個の293/EBNA細胞を10％牛胎児血清を含むIMDM培地を用いて各ウェルに植え込んだ。DNA導入の際用いた変異体発現ベクターとリポフェクタミンの量は、それぞれ１μg 及び４μl であった。OPTI-MEM培地（ギブコBRL社）で希釈し最終容量を0.5ml とした。変異体発現ベクターとリポフェクタミンの混合液を細胞に添加し、24時間37℃で CO２インキュベーター中で培養した後混合液を除去し、0.5ml のEx-cell 301 培地（JSR社）を加え、さらに48時間37℃で CO2インキュベーター中で培養した。培地を回収し、これを変異体活性測定用サンプルとした。得られた各変異体の塩基配列を配列表配列番号83〜103 に、その配列から推定されるアミノ酸配列を配列表配列番号62〜82に、それぞれ示す。OCIFの活性測定は実施例13に従った。また、実施例24に記載のEIA法により、OCIFの抗原量を定量した。表14に未改変OCIFと比較した抗原量当たりの活性を示す。
【０１２７】
【表１４】
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【０１２８】
vi) ウェスタンブロッティング解析
活性測定に用いたサンプルの10μl をウェスタンブロット解析に供した。サンプル10μl に10μl のSDS‐PAGE用サンプルバッファー(0.5M Tris-HCl、20％グリセロール、４％SDS、20μg/mlブロムフェノール  ブルー(pH 6.8)）を加え、100 ℃で３分煮沸し非還元状態で10％SDSポリアクリルアミド電気泳動を行った。泳動終了後、セミドライブロッティング装置（バイオラッド社）によりPVDFメンブレン（ProBlottＲ、パーキンエルマー社）に蛋白質をブロッティングした。そのメンブレンをブロッキング後、実施例24に記載のEIA用西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗OCIF抗体とともに、37℃で２時間保温した。
洗浄後ECLシステム（アマシャム社）により抗OCIF抗体に結合する蛋白質を検出した。OCIFでは、約120 キロダルトン（kD）及び60kDのバンドが検出された。  一方、OCIF-C23S 、OCIF-CL 、OCIF-CC では、ほとんど60kDのバンドのみが検出された。また、OCIF-CDD2 及びOCIF-CDD1 ではそれぞれ約40−50kD及び30−40kD のバンドが主要なバンドとして検出された。以上の結果より、OCIFでは、配列表配列番号４のアミノ酸配列にける 379番目のCys残基が二量体形成に係わっていること、単量体でも活性を保持していること、及び177 番Aspから 380番Leu までの残基を欠失させても活性を保持してることが明らかとなった。
【０１２９】
【実施例２３】
ヒトOCIFゲノムDNAの分離
I)  ヒトゲノムDNAライブラリーのスクリーニング
ヒト胎盤の染色体DNAとλFIX IIベクターを用いて作製されたゲノム・ライブラリーをストラタジーン社から購入し、これをOCIFcDNAをプローブとしてスクリーニングした。スクリーニングは、基本的にはゲノム・ライブラリーに添付されているプロトコールに従って実施したが、ファージ、大腸菌、DNAを扱う一般的方法はMolecular Cloning:A Laboratory Manual に従って行った。
購入したゲノムDNAライブラリーのタイターを検定したのち、１×106 pfuのファージを大腸菌XL1-Blue MRAに感染させ、20枚のプレート(9×13cm) にプレート当たり９mlのトップ・アガロースとともに蒔いた。プレートを一夜37℃でインキュベートしたのち、Hybond-Nナイロン膜（アマシャム社）をアガープレート上に乗せてファージを転写した。ファージの転写したナイロン膜を1.5M NaCl/0.5M NaOH溶液で湿らせた濾紙上に１分間乗せ、その後1M Tris-HCl(pH7.5)と1.5M NaCl/0.5M Tris-HCl (pH7.5)でそれぞれ１分ずつ処理して中和したのち、最後に２XSSCで湿らせた濾紙の上に移した。その後、このナイロン膜にストラタリンカー（ストラタジーン社）を用いて1200マイクロジュールのＵV を照射することによってファージDNAを膜に固定した。次に、このナイロン膜をラピッドハイブリダイゼーション・バッファー（アマシャム社）に浸漬してプレハイブリダイゼーションを行った。１時間のプレハイブリダイゼーションの後、32Ｐ標識したOCIFcDNAを加え、65℃にて一夜ハイブリダイゼーションを行った。このcDNAプローブは、実施例11で得られた1.6kb のOCIFcDNAを有するプラスミドpBKOCIFを、制限酵素BamHI 及びXhoIを用いて切断し、OCIFcDNAをアガロースゲル電気泳動によって単離したのち、このOCIFcDNAをメガプライムDNAラベリングシステム（アマシャム社）を用いて32Ｐで標識することによって作製した。標識は、ラベリングシステムに添付されたプロトコールに従って行った。
【０１３０】
ハイブリダイゼーションには、ハイブリダイゼーション・バッファー１ml当たりおよそ５×105cpmのプローブを使用した。ハイブリダイゼーションの後、ナイロン膜を室温にて２XSSCで５分間洗浄し、その後65℃において0.5 XSSC/0.1％SDSで４回、それぞれ20分ずつ洗浄した。４回目の洗浄ののちナイロン膜を乾燥させ、富士フィルム社製Ｘ腺フィルム、スーパーHR-Hと増感スクリーンとを用いて−80℃にてオートラジオグラフィーを行った。オートラジオグラム上に６個のシグナルが検出されたので、それぞれのシグナルに相当するアガープレート上の位置からトップ・アガロースを切り出し、１％のクロロホルムを添加した0.5ml のＳＭバッファーにそれぞれ浸漬して一夜放置し、ファージを抽出した。それぞれのファージ抽出液をＳＭバッファーで1000倍に希釈し、その中から１μl と20μl を取り、再び上記大腸菌に感染させ、トップ・アガロースとともに上記の方法でアガープレートに蒔いた。ファージをナイロン膜に転写後、上記の方法でプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、洗浄、乾燥、オートラジオグラフィーを行った。このファージ純化の操作を当初オートラジオグラフィーで検出された６個のシグナル全部について行い、アガープレート上のすべてのファージプラークがcDNAプローブとハイブリダイズするまで繰り返した。純化されたファージのプラークを切り出し、１％クロロホルムを含むSMバッファー0.5ml に浸漬し、４℃で保存した。こうして得られた６種の純化ファージを、それぞれλOIF3,λOIF8, λOIF9, λOIF11,λOIF12,λOIF17 と名付けた。
【０１３１】
II) 制限酵素消化及びサザンブロット・ハイブリダイゼーションによるヒトOCIFゲノムDNAクローンの分析
純化された６種のファージのDNAを、Molecular Cloning:A Laboratory Manualに書かれた方法に従ってプレートリシス法によって精製した。これらのDNAを制限酵素によって消化し、得られたフラグメントをアガロース電気泳動によって分離した。またアガロース・ゲルで分離されたフラグメントを、一般的な方法でナイロン膜に転移させたのち、OCIFcDNAをプローブとしてサザンブロット・ハイブリダイゼーションを行った。これらの分析の結果、それぞれ純化された６種のファージは異なったクローンであることが判明した。制限酵素消化によって得られたDNAフラグメントのうち、OCIFcDNAとハイブリダイズするものについては、プラスミドベクターにサブクローンした後に下記の方法で塩基配列の分析を行った。
【０１３２】
iii)  ゲノムDNAクローンから制限酵素消化によって得られたDNAフラグメントのプラスミド・ベクターへのサブクローニングと塩基配列の決定
λOIF8 DNAを制限酵素EcoRI とNotIによって消化し、生じたフラグメントを0.7％アガロースゲルに供与して分離した。5.8kb のEcoRI/NotIフラグメントをQIAEXII Gel Extraction Kit(キアゲン社)を用いて添付されたプロトコールに従ってゲルから抽出した。このフラグメントを、前もってEcoRI とNotIによって切断しておいたpBluescriptII SK+ ベクター（ストラタジーン社）とReady-To-Go T4Ligase（ファルマシア社）を用いて添付のプロトコールに従ってライゲーションした。得られたリコンビナント・プラスミドを、コンピテントDH5α大腸菌（アマシャム社）に導入した後、50μg/mlのアンピシリンを含有するアガロースプレート上に蒔いてプラスミドを有する大腸菌を選択した。以上のようにして作製された5.8kb EcoRI/NotIフラグメントを有するリコンビナント・プラスミドを、pBSG8-5.8 と命名した。次に、pBSG8-5.8 を制限酵素HindIII で消化して生ずる0.9 kbのDNAフラグメントをアガロースゲルで分離し、上記の方法にしたがって抽出した後、HindIII で前もって切断しておいたpBluescriptII SK-(ストラタジーン社)に挿入して、上記の方法に従ってクローニングした。この0.9kbのHindIII フラグメントを有するリコンビナント・プラスミドを、pBS8H0.9と命名した。一方、λOIF11のDNAをEcoRIを用いて消化して生ずる６kb、3.6kb、及び2.6kbのフラグメントをそれぞれ単離したのち、上記と同様の方法に従ってpBluescriptII SK+ベクターに挿入してクローニングした。こうして作製した６kb、3.6 kb、及び2.6kb のEcoRI フラグメントを有するリコンビナント・プラスミドを、それぞれpBSG11-6、pBSG11-3.6、pBSG11-2.6と命名した。
【０１３３】
さらに、pBSG11-6を制限酵素HindIII によって消化することによって生ずる、2.2kb、1.1kb、1.05kbの３種のフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分離し、それぞれpBluescriptII SK-のHindIII サイトに挿入してクローニングした。これら2.2kb 、1.1kb 、1.05 kb のHindIII フラグメントを有するリコンビナント・プラスミドを、それぞれpBS6H2.2、pBS6H1.1、pBS6H1.05 と命名した。ゲノムDNAの塩基配列の分析には、ABI Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit （パーキンエルマー社）と373 DNA Sequencing System（アプライドバイオシステムズ社）を使用した。Molecular Cloning:A Laboratory Manual に書かれた方法に従ってpBSG8-5.8 、pBS8H0.9、pBSG11-6、pBSG11-3.6、pBSG11-2.6、pBS6H2.2、pBS6H1.1、pBS6H1.05 を調製し、塩基配列決定用の鋳型として用いた。ヒトOCIFゲノムDNAの塩基配列を配列表配列番号104 及び105 に示す。エクソン１とエクソン２の間に介在する塩基の配列は必ずしも全部は決定されておらず、配列表配列番号104 及び105 に示された塩基配列の間に、およそ17kbのヌクレオチドが介在することが確認されている。
【０１３４】
【実施例２４】
EIAによるOCIFの定量
i)  ウサギ抗OCIF抗体の調製
雄性日本白色ウサギ（体重2.5 〜3.0kg 、北山ラベス社より入手）３羽に、ｒOCIF200 μg/mlをフロイント完全アジュバント(DIFCO社)と等量混合してエマルジョンとしたものを、１回１mlずつ皮下免疫した。免疫は１週間隔で合計６回行い、最終免疫後10日目に全採血を行った。分離した血清から抗体を以下の様に精製した。即ち、PBSにて２倍希釈した抗血清に最終濃度40w/v ％となるように硫酸アンモニウムを添加して４℃１時間放置後、8000×ｇで20分間遠心分離を行い、沈殿を得た。沈殿を少量のPBSに溶解し、PBSに対して４℃で透析した後、Protein G-Sepharose カラム（ファルマシア社）に負荷した。PBSにて洗浄後、0.1Mグリシン塩酸緩衝液(pH3.0) にて吸着した免疫グロブリンＧを溶出し、直ちに1.5 Mトリス塩酸緩衝液(pH8.7) で中性pHとした。溶出蛋白質画分をPBSに対して透析後、280nm における吸光度を測定し、その濃度を決定した（E1%13.5）。西洋ワサビパーオキシダーゼ標識した抗OCIF抗体は、マレイミド活性化パーオキシダーゼキット（ピアス社）を用いて作製した。即ち、１mgの精製抗体に80μｇのＮ−スクシンイミド-S-アセチルチオ酢酸を添加し、室温で30分間反応させた。これに5mgのヒドロキシルアミンを添加して脱アセチル化した後、修飾された抗体をポリアクリルアミド脱塩カラムにて分画した。蛋白質画分を1mgのマレイミド活性化パーオキシダーゼと混合し、室温で１時間反応させ酵素標識抗体を得た。
【０１３５】
ii) サンドイッチEIAによるOCIFの定量
９６ウェルのマイクロタイタープレート（MaxiSorp Immunoplate, Nunc社）の各ウェルに、100μl のウサギ抗OCIF抗体(2μg/ml、50mM  炭酸緩衝液(pH9.6)）を添加し４℃にて一晩静置して、抗体を固相化した。ＰＢＳにて調製した25％ブロックエース（雪印乳業社）を300μlずつ各ウェルに添加し、37℃で１時間放置してブロッキングした後、検体(100μl/ウェル）を添加し室温で２時間反応させた。0.05％ Tween20を含むＰＢＳ(PBST)にて３回洗浄した後、10000 倍希釈した西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗OCIF抗体を 100μl ずつ添加し室温で２時間インキュベートした。PBSTにて３回洗浄した後、100μl の酵素基質溶液（TMB、ScyTek社）を加え室温で発色させた後、反応を停止した。 450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（イムノリーダー  NJ2000、日本インターメッド社）を用いて測定し、精製した組み換えOCIFを標準とした検量線から、検体のOCIF濃度を定量した。OCIFの検量線を図13に示す。
【０１３６】
【実施例２５】
抗OCIFモノクローナル抗体
i)  ヒトOCIF抗体産生ハイブリドーマの調製
ヒト線維芽細胞IMR-90を培養し、その培養液から実施例11記載の方法でOCIFを精製した。精製OCIFを10μg/100μl の濃度になるようにPBSに溶解し、この溶液を２週間おきにBALB/ｃマウスに腹腔内投与し免疫した。初回及び２回目の免疫においては、等量のフロインド完全アジュバントの混合物を投与した。最終の免疫から３日目に脾臓を摘出し、Ｂリンパ球を分離し、マウスミエローマ細胞P3x63-AG8.653 とを通常用いられているポリエチレングリコール法により細胞融合させた。ついで融合細胞を選択するためにＨＡＴ培地で培養を行うことにより、ハイブリドーマ細胞をセレクションした。次に、セレクションされた細胞がOCIF特異的抗体を産生しているか否かを確認するために、0.1M 重曹溶液に溶解したOCIF溶液 (10μg/ml)100μl を、96穴マイクロプレート（Nunc社） に加えて作製したソリッドフェーズELISAを用いて、ハイブリドーマ培養液中のOCIF特異的抗体の測定を行った。抗体生産が認められたハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングを３−５回繰り返し行い、その都度上記ELISAにより抗体産生量をチェックした。得られた抗体生産株の中から、抗体生産量の高いクローンを選別した。
【０１３７】
ii) モノクローナル抗体の生産  
実施例25−i)で得た抗体生産株を、それぞれ1 ×106を予めプリスタン (アルドリッチケミカル社) を接種しておいたBALB/c系マウスの腹腔内に移植した。移植２週間後、蓄積した腹水を採取し、本発明のモノクローナル抗体を含む腹水を得た。この腹水より、アフィゲルプロテインＡセファロース( バイオラッド社製) を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製抗体を得た。即ち、腹水を等量のバインディングバッファー（バイオラッド社） で希釈し、プロテインＡカラムに負荷した後、充分量の同バッファーで洗浄した。IgGの溶出は、エリューションバッファー（バイオラッド社）で行った。得られた溶出液を水で透析した後、凍結乾燥を行った。得られた精製抗体をSDS‐PAGEにより純度検定を行ったところ、分子量約150,000 の位置に均一なバンドを認めた。
【０１３８】
iii) OCIFに対して高親和性を有するモノクローナル抗体の選択
実施例25−ii) で得た抗体をPBSに溶解し、ローリー法により蛋白定量を行った。ついで、各抗体を蛋白濃度が一定になるようにPBSに溶解し、この溶液を段階希釈法により希釈した。実施例25−ii) に記載のソリッドフェーズELISAを用いて、高い希釈段階までOCIFと反応するモノクローナル抗体を選別した。その結果、A1G5、E3H8、及びD2F4の３種の抗体が得られた。
【０１３９】
iv) 抗体のサブクラスの検定
実施例25−iii)で選択した本発明の抗体のクラス及びサブクラスを、イムノグロブリンクラス及びサブクラス分析キット (アマシャム社) を用いて検定した。検定は、キットに指示されているプロトコールに従って実施した。結果を表15に示す。E3H8、A1G5、及びD2F4は、それぞれIgG１、IgG2a、及びIgG2b であった。
【０１４０】
【表１５】
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【０１４１】
v) OCIFのELISAによる測定方法
実施例25−iv) で得たA1G5、E3H8、及びD2F4の３種のモノクローナル抗体を、それぞれ固相抗体と標識抗体とした。それぞれの組み合わせにより、サンドイッチＥＬＩＳＡを構築した。抗体の標識は、マレイミド活性化パーオキシダーゼキット（ピアス社）を用いて行った。各々の抗体を10μg/mlの濃度になるように0.1M 重曹溶液に溶解し、96穴イムノプレート(Nunc 社)の各ウエル当たり 100μlづつそれぞれ分注し、室温で一晩放置した。次いで、各々のプレートを1/2 濃度のブロックエース (雪印乳業社) でブロックし、0.1 ％のTween20 を含むPBS（洗浄バッファー）で３回洗浄した。各濃度のOCIFを第一次反応バッファー(1/2.5濃度のブロックエース及び0.1 ％Tween20 を含む0.2Mトリス塩酸緩衝液、pH 7.4)で調製した。
【０１４２】
調製した各濃度のOCIF溶液 100μl づつ各ウエルに加え、37℃で３時間放置し、次いで洗浄バッファーで３回洗浄した。標識抗体の希釈には、第二次反応バッファー (1/4 濃度のブロックエース及び 0.1％の Tween20を含む0.1Mトリス塩酸緩衝液、pH 7.4) を用いた。各標識抗体を第２次反応バッファーで400 倍に希釈し、その各々 100μl づつを各ウエルにそれぞれ添加した。各々のプレートを37℃で２時間放置し、次いで３回洗浄した後、基質溶液（0.4mg/mlのオルトフェニレンジアミン塩酸、0.006 ％過酸化水素を含む0.1Mクエン酸−リン酸バッファー、pH 4.5） 100 μl を各ウエルに添加した。37℃で15分間暗室に放置した後、６Ｎ硫酸50μl を各ウエルに添加することにより酵素反応を停止させ、イムノリーダー (NJ2000，日本インターメッド社)を用いて 492nmの吸光度を測定した。３種の抗体をそれぞれ固相抗体或いは標識抗体としたいずれの組み合わせにおいても良好な測定結果が得られ、３種の抗体はそれぞれOCIFの異なるエピトープを認識することを認めた。代表例として、A1G5を固相抗体としE3H8を標識抗体としたときの検量線を図１４に示す。
【０１４３】
vi) ヒト血清中のOCIFの測定
健常人５名の血清中のOCIFを実施例25−(v) の図14のELISA系で測定した。即ち、A1G5を実施例25−(v) と同様にイムノプレートに固相化し、各ウエルに第１次反応バッファーを50μl 加え、次いで各ヒト血清50μl を加えて37℃で３時間放置した。洗浄バッファーで３回洗浄した後、第２次反応バッファーで400 倍に希釈したE3H8の標識抗体100 μl を各ウエルに加えて、37℃で２時間放置した。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄後、上記基質溶液 100μl を各ウエルに添加し、37℃で15分間反応させた。各ウエルに６Ｎ硫酸50μl づつ添加して酵素反応を停止させ、イムノリーダーで492nm の吸光度を測定した。既知量のOCIFを含む第１次反応バッファーについても同様に操作し、図14に示すようなOCIFの検量線を作成し、血清試料の吸光度から血清中のOCIF量を求めた。結果を表16に示す。
【０１４４】
【表１６】
0003793180.tif 000017
【０１４５】
【実施例２６】
骨粗鬆症に対する治療効果
神経切除による不動性の骨萎縮モデルに対するOCIFの治療効果を確認した。
Fischer 系雄ラットを用い、６週齢（体重約120g）で左上腕神経叢を切除することにより、左前肢の不動化を惹起して骨萎縮モデルを作成した。OCIFは0.01％Tween80 を含むPBS(-)で調整し、翌日から５μg/kg及び50μg/kgの用量で12時間間隔で１日２回、２週間連日静脈内投与した。正常群には偽手術を施し、対照群には0.01％Tween80 を含むPBS(-）を同様に投与した。投与終了後、左上腕を摘出し骨強度を測定した。結果を図15に示す。
この結果、正常群に比べ対照群では骨強度の低下が観察されたが、OCIF50μg/kg投与群において改善が認められた。
【０１４６】
【発明の効果】
本発明により、新規な破骨細胞形成抑制活性を有する蛋白質及びその効率的な
製造方法が提供される。本発明の蛋白質は破骨細胞形成抑制活性を有し、骨粗鬆
症等各種の骨量減少性疾患の治療剤として或いはこれらの疾患の免疫学的診断の
ための抗原等として利用することができる。
【配列表】
SEQUENCELISTING
<110> Sankyo Co., Ltd
<120> Novel protein and methods for theproduction of the same
<130> 2003-119SW
<140>
<141>
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<151> 1995-2-20
<150> JP H07-207508
<151> 1995-7-21
<150> PCT/JP96/00374
<151> 1996-2-20
<160>  105
<170> PatentIn version 3.1.2
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> human OCIF
<220>
<221> Xaa
<222> 1
<223> Inventor:Goto, Masaaki
Inventor:Tsuda, Eisuke
Inventor:Mochizuki, Shin'ichi
Inventor:Yano, Kazuki
Inventor:Kobayashi, Fumie
Inventor:Shima, Nobuyuki
Inventor:Yasuda,Hisataka
Inventor:Nakagawa, Nobuaki
Inventor:Morinaga, Tomonori
Inventor:Ueda, Masatsugu
Inventor:Higashio, Kanji
<400> 1
Xaa Tyr His Phe Pro Lys
1               5
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> human OCIF
<220>
<221> Xaa
<222> 1
<400> 2
Xaa Gln His Ser Xaa Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Xaa Lys
1               5                  10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> human OCIF
<220>
<221> Xaa
<222> 1
<400> 3
Xaa Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys
1                 5                  10
<210> 4
<211> 380
<212> PRT
<213> human OCIF
<400> 4
Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser
1               5                  10                  15
His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys
20                  25                  30
Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro
35                  40                  45
Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu
50                  55                  60
Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu
65                  70                  75
Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg
80                  85                  90
Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro
95                  100                 105
Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val
110                 115                 120
Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser
125                 130                 135
Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu
140                 145                 150
Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser
155                 160                 165
Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu
170                 175                 180
Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr
185                 190                 195
Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys
200                 205                 210
Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile Lys Arg Gln His Ser Ser
215                 220                 225
Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu Trp Lys His Gln Asn
230                 235                 240
Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile Ile Gln Asp Ile Asp Leu
245                 250                 255
Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala Asn Leu Thr
260                 265                 270
Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly Lys Lys
275                 280                 285
Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys Pro
290                 295                 300
Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn
305                 310                 315
Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His
320                 325                 330
Ser Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys
335                 340                 345
Lys Thr Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr
350                 355                 360
Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val
365                 370                 375
Lys Ile Ser Cys Leu
380
<210> 5
<211> 401
<212> PRT
<213> human OCIF
<400> 5
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                 -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5              -1   1              5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
85                  90                  95
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr
100                 105                 110
Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe
115                 120                 125
Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
130                 135                 140
Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr
145                 150                 155
His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys
160                 165                 170
Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala
175                 180                 185
Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val Asp
190                 195                 200
Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile
205                 210                 215
Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys
220                 225                 230
Leu Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile
235                 240                 245
Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile
250                 255                 260
Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu
265                 270                 275
Ser Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr
280                 285                 290
Ile Lys Ala Cys Lys Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser
295                 300                 305
Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu
310                 315                 320
Met His Ala Leu Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr
325                 330                 335
Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu His Ser Phe
340                 345                 350
Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile Gly
355                 360                 365
Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu
370                 375                 380
<210> 6
<211> 1206
<212> DNA
<213> human OCIF
<400> 6
atgaacaact tgctgtgctg cgcgctcgtg tttctggaca tctccattaa gtggaccacc 60
caggaaacgt ttcctccaaa gtaccttcat tatgacgaag aaacctctca tcagctgttg 120
tgtgacaaat gtcctcctgg tacctaccta aaacaacact gtacagcaaa gtggaagacc 180
gtgtgcgccc cttgccctga ccactactac acagacagct ggcacaccag tgacgagtgt 240
ctatactgca gccccgtgtg caaggagctg cagtacgtca agcaggagtg caatcgcacc 300
cacaaccgcg tgtgcgaatg caaggaaggg cgctaccttg agatagagtt ctgcttgaaa 360
cataggagct gccctcctgg atttggagtg gtgcaagctg gaaccccaga gcgaaataca 420
gtttgcaaaa gatgtccaga tgggttcttc tcaaatgaga cgtcatctaa agcaccctgt 480
agaaaacaca caaattgcag tgtctttggt ctcctgctaa ctcagaaagg aaatgcaaca 540
cacgacaaca tatgttccgg aaacagtgaa tcaactcaaa aatgtggaat agatgttacc 600
ctgtgtgagg aggcattctt caggtttgct gttcctacaa agtttacgcc taactggctt 660
agtgtcttgg tagacaattt gcctggcacc aaagtaaacg cagagagtgt agagaggata 720
aaacggcaac acagctcaca agaacagact ttccagctgc tgaagttatg gaaacatcaa 780
aacaaagacc aagatatagt caagaagatc atccaagata ttgacctctg tgaaaacagc 840
gtgcagcggc acattggaca tgctaacctc accttcgagc agcttcgtag cttgatggaa 900
agcttaccgg gaaagaaagt gggagcagaa gacattgaaa aaacaataaa ggcatgcaaa 960
cccagtgacc agatcctgaa gctgctcagt ttgtggcgaa taaaaaatgg cgaccaagac 1020
accttgaagg gcctaatgca cgcactaaag cactcaaaga cgtaccactt tcccaaaact 1080
gtcactcaga gtctaaagaa gaccatcagg ttccttcaca gcttcacaat gtacaaattg 1140
tatcagaagt tatttttaga aatgataggt aaccaggtcc aatcagtaaa aataagctgc 1200
ttataa                                                            1206
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> human OCIF
<400> 7
Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser
1               5                   10                  15
<210> 8
<211> 1185
<212> DNA
<213> OCIF2
<400> 8
atgaacaact tgctgtgctg cgcgctcgtg tttctggaca tctccattaa gtggaccacc 60
caggaaacgt ttcctccaaa gtaccttcat tatgacgaag aaacctctca tcagctgttg 120
tgtgacaaat gtcctcctgg tacctaccta aaacaacact gtacagcaaa gtggaagacc 180
gtgtgcgccc cttgccctga ccactactac acagacagct ggcacaccag tgacgagtgt 240
ctatactgca gccccgtgtg caaggagtgc aatcgcaccc acaaccgcgt gtgcgaatgc 300
aaggaagggc gctaccttga gatagagttc tgcttgaaac ataggagctg ccctcctgga 360
tttggagtgg tgcaagctgg aaccccagag cgaaatacag tttgcaaaag atgtccagat 420
gggttcttct caaatgagac gtcatctaaa gcaccctgta gaaaacacac aaattgcagt 480
gtctttggtc tcctgctaac tcagaaagga aatgcaacac acgacaacat atgttccgga 540
aacagtgaat caactcaaaa atgtggaata gatgttaccc tgtgtgagga ggcattcttc 600
aggtttgctg ttcctacaaa gtttacgcct aactggctta gtgtcttggt agacaatttg 660
cctggcacca aagtaaacgc agagagtgta gagaggataa aacggcaaca cagctcacaa 720
gaacagactt tccagctgct gaagttatgg aaacatcaaa acaaagacca agatatagtc 780
aagaagatca tccaagatat tgacctctgt gaaaacagcg tgcagcggca cattggacat 840
gctaacctca ccttcgagca gcttcgtagc ttgatggaaa gcttaccggg aaagaaagtg 900
ggagcagaag acattgaaaa aacaataaag gcatgcaaac ccagtgacca gatcctgaag 960
ctgctcagtt tgtggcgaat aaaaaatggc gaccaagaca ccttgaaggg cctaatgcac 1020
gcactaaagc actcaaagac gtaccacttt cccaaaactg tcactcagag tctaaagaag 1080
accatcaggt tccttcacag cttcacaatg tacaaattgt atcagaagtt atttttagaa 1140
atgataggta accaggtcca atcagtaaaa ataagctgct tataa                 1185
<210> 9
<211> 394
<212> PRT
<213> OCIF2
<400> 9
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5                  1               5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Cys
55                  60                  65
Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr
70                  75                  80
Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly
85                  90                  95
Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys
100                 105                110
Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys
115                 120                125
Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu
130                 135                140
Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly
145                150                155
Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys
160                 165                170
Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro
175                 180                185
Asn Trp Leu Ser Val Leu Val Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val
190                 195                200
Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile Lys Arg Gln His Ser Ser Gln
205                210                215
Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu Trp Lys His Gln Asn Lys
220                225                230
Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys
235                240                245
Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala Asn Leu Thr Phe
250                255                260
Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly Lys Lys Val
265                 270                275
Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys Pro Ser
280                285                290
Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly
295                300                305
Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser
310                315                320
Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys
325                330                335
Thr Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln
340                345                350
Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys
355                360                365
Ile Ser Cys Leu
370
<210> 10
<211> 1089
<212> DNA
<213> OCIF3
<400> 10
atgaacaagt tgctgtgctg cgcgctcgtg tttctggaca tctccattaa gtggaccacc   60
caggaaacgt ttcctccaaa gtaccttcat tatgacgaag aaacctctca tcagctgttg 120
tgtgacaaat gtcctcctgg tacctaccta aaacaacact gtacagcaaa gtggaagacc 180
gtgtgcgccc cttgccctga ccactactac acagacagct ggcacaccag tgacgagtgt 240
ctatactgca gccccgtgtg caaggagctg cagtacgtca agcaggagtg caatcgcacc 300
cacaaccgcg tgtgcgaatg caaggaaggg cgctaccttg agatagagtt ctgcttgaaa 360
cataggagct gccctcctgg atttggagtg gtgcaagctg gaaccccaga gcgaaataca 420
gtttgcaaaa gatgtccaga tgggttcttc tcaaatgaga cgtcatctaa agcaccctgt 480
agaaaacaca caaattgcag tgtctttggt ctcctgctaa ctcagaaagg aaatgcaaca 540
cacgacaaca tatgttccgg aaacagtgaa tcaactcaaa aatgtggaat agatgttacc 600
ctgtgtgagg aggcattctt caggtttgct gttcctacaa agtttacgcc taactggctt 660
agtgtcttgg tagacaattt gcctggcacc aaagtaaacg cagagagtgt agagaggata 720
aaacggcaac acagctcaca agaacagact ttccagctgc tgaagttatg gaaacatcaa 780
aacaaagacc aagatatagt caagaagatc atccaagata ttgacctctg tgaaaacagc 840
gtgcagcggc acattggaca tgctaacctc agtttgtggc gaataaaaaa tggcgaccaa 900
gacaccttga agggcctaat gcacgcacta aagcactcaa agacgtacca ctttcccaaa 960
actgtcactc agagtctaaa gaagaccatc aggttccttc acagcttcac aatgtacaaa 1020
ttgtatcaga agttattttt agaaatgata ggtaaccagg tccaatcagt aaaaataagc 1080
tgcttataa                                                         1089
<210> 11
<211> 362
<212> PRT
<213> OCIF3
<400> 11
Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5                 1               5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                 20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                 35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
85                  90                  95
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr
100                105                 110
Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe
115                120                 125
Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
130                135                 140
Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr
145                150                155
His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys
160                165                 170
Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala
175                180                 185
Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val Asp
190                195                200
Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile
205                210                215
Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys
220                225                230
Leu Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile
235                240                245
Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile
250                255                260
Gly His Ala Asn Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gln
265                 270                275
Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser Lys Thr
280                285                290
Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr Ile
295                300                305
Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu
310                315                320
Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser
325                330                335
Cys Leu
340
<210> 12
<211> 465
<212> DNA
<213> OCIF4
<400> 12
atgaacaagt tgctgtgctg ctcgctcgtg tttctggaca tctccattaa gtggaccacc   60
caggaaacgt ttcctccaaa gtaccttcat tatgacgaag aaacctctca tcagctgttg 120
tgtgacaaat gtcctcctgg tacctaccta aaacaacact gtacagcaaa gtggaagacc 180
gtgtgcgccc cttgccctga ccactactac acagacagct ggcacaccag tgacgagtgt 240
ctatactgca gccccgtgtg caaggagctg cagtacgtca agcaggagtg caatcgcacc 300
cacaaccgcg tgtgcgaatg caaggaaggg cgctaccttg agatagagtt ctgcttgaaa 360
cataggagct gccctcctgg atttggagtg gtgcaagctg gtacgtgtca atgtgcagca 420
aaattaatta ggatcatgca aagtcagata gttgtgacag tttag                  465
<210> 13
<211> 154
<212> PRT
<213> OCIF4
<400> 13
Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ser Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5                  1               5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
85                  90                  95
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr
100                 105                 110
Cys Gln Cys Ala Ala Lys Leu Ile Arg Ile Met Gln Ser Gln Ile
115                 120                 125
Val Val Thr Val
130
<210> 14
<211> 438
<212> DNA
<213> OCIF5
<400> 14
atgaacaagt tgctgtgctg cgcgctcgtg tttctggaca tctccattaa gtggaccacc  60
caggaaacgt ttcctccaaa gtaccttcat tatgacgaag aaacctctca tcagctgttg 120
tgtgacaaat gtcctcctgg tacctaccta aaacaacact gtacagcaaa gtggaagacc 180
gtgtgcgccc cttgccctga ccactactac acagacagct ggcacaccag tgacgagtgt 240
ctatactgca gccccgtgtg caaggagctg cagtacgtca agcaggagtg caatcgcacc 300
cacaaccgcg tgtgcgaatg caaggaaggg cgctaccttg agatagagtt ctgcttgaaa 360
cataggagct gccctcctgg atttggagtg gtgcaagctg gatgcaggag aagacccaag 420
ccacagatat gtatctga                                               438
<210> 15
<211> 145
<212> PRT
<213> OCIF5
<400> 15
Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5                  1               5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
85                  90                  95
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Cys
100                 105                 110
Arg Arg Arg Pro Lys Pro Gln Ile Cys Ile
115                 120                 125
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer T3
<400> 16
aattaaccct cactaaaggg                                               20
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer T7
<400> 17
gtaatacgac tcactatagg gc                                            22
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer IF1
<400> 18
acatcaaaac aaagaccaag                                               20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer IF2
<400> 19
tcttggtctt tgttttgatg                                               20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer IF3
<400> 20
ttattcgcca caaactgagc                                               20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer IF4
<400> 21
ttgtgaagct gtgaaggaac                                               20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer IF5
<400> 22
gctcagtttg tggcgaataa                                               20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer IF6
<400> 23
gtgggagcag aagacattga                                               20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer IF7
<400> 24
aatgaacaac ttgctgtgct                                               20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer IF8
<400> 25
tgacaaatgt cctcctggta                                               20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer IF9
<400> 26
aggtaggtac caggaggaca                                               20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer IF10
<400> 27
gagctgccct cctggatttg                                               20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer IF11
<400> 28
caaactgtat ttcgctctgg                                               20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer IF12
<400> 29
gtgtgaggag gcattcttca                                               20
<210> 30
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer C19SF
<400> 30
gaatcaactc aaaaaagtgg aatagatgtt ac                                 32
<210> 31
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer C19SR
<400> 31
gtaacatcta ttccactttt ttgagttgat tc                                 32
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer C20SF
<400> 32
atagatgtta ccctgagtga ggaggcattc                                    30
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer C20SR
<400> 33
gaatgcctcc tcactcaggg taacatctat                                    30
<210> 34
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer C21SF
<400> 34
caagatattg acctcagtga aaacagcgtg c                                  31
<210> 35
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer C21SR
<400> 35
gcacgctgtt ttcactgagg tcaatatctt g                                  31
<210> 36
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer C22SF
<400> 36
aaaacaataa aggcaagcaa acccagtgac c                                  31
<210> 37
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer C22SR
<400> 37
ggtcactggg tttgcttgcc tttattgttt t                                  31
<210> 38
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer C23SF
<400> 38
tcagtaaaaa taagcagctt ataactggcc a                                  31
<210> 39
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer C23SR
<400> 39
tggccagtta taagctgctt atttttactg a                                  31
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer IF 14
<400> 40
ttggggttta ttggaggaga tg                                            22
<210> 41
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer DCR1F
<400> 41
accacccagg aaccttgccc tgaccactac tacaca                             36
<210> 42
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer DCR1R
<400> 42
gtcagggcaa ggttcctggg tggtccactt aatgga                             36
<210> 43
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer DCR2F
<400> 43
accgtgtgcg ccgaatgcaa ggaagggcgc tacctt                             36
<210> 44
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer DCR2R
<400> 44
ttccttgcat tcggcgcaca cggtcttcca ctttgc                             36
<210> 45
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer DCR3F
<400> 45
aaccgcgtgt gcagatgtcc agatgggttc ttctca                             36
<210> 46
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer DCR3R
<400> 46
atctggacat ctgcacacgc ggttgtgggt gcgatt                             36
<210> 47
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer DCR4F
<400> 47
acagtttgca aatccggaaa cagtgaatca actcaa                             36
<210> 48
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer DCR4R
<400> 48
actgtttccg gatttgcaaa ctgtatttcg ctctgg                             36
<210> 49
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer DDD1F
<400> 49
aatgtggaat agatattgac ctctgtgaaa acagcg                             36
<210> 50
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer DDD1R
<400> 50
agaggtcaat atctattcca catttttgag ttgatt                             36
<210> 51
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer DDD2F
<400> 51
agatcatcca agacgcacta aagcactcaa agacgt                             36
<210> 52
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer DDD2R
<400> 52
gctttagtgc gtcttggatg atcttcttga ctatat                             36
<210> 53
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer XhoI F
<400> 53
ggctcgagcg cccagccgcc gcctccaag                                     29
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer IF 16
<400> 54
tttgagtgct ttagtgcgtg                                               20
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer CL F
<400> 55
tcagtaaaaa taagctaact ggaaatggcc                                    30
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer CL R
<400> 56
ggccatttcc agttagctta tttttactga                                    30
<210> 57
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer CC R
<400> 57
ccggatcctc agtgctttag tgcgtgcat                                     29
<210> 58
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer CCD2 R
<400> 58
ccggatcctc attggatgat cttcttgac                                     29
<210> 59
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer CCD1 R
<400> 59
ccggatcctc atattccaca tttttgagt                                     29
<210> 60
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer CCR4 R
<400> 60
ccggatcctc atttgcaaac tgtatttcg                                     29
<210> 61
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCRprimer CCR3 R
<400> 61
ccggatcctc attcgcacac gcggttgtg                                     29
<210> 62
<211> 401
<212> PRT
<213> OCIF-C19S
<400> 62
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                 -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5              -1   1              5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
85                  90                  95
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr
100                 105                 110
Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe
115                 120                 125
Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
130                 135                 140
Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr
145                 150                 155
His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Ser
160                 165                 170
Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala
175                 180                 185
Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val Asp
190                 195                 200
Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile
205                 210                 215
Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys
220                 225                 230
Leu Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile
235                 240                 245
Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile
250                 255                 260
Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu
265                 270                 275
Ser Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr
280                 285                 290
Ile Lys Ala Cys Lys Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser
295                 300                 305
Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu
310                 315                 320
Met His Ala Leu Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr
325                 330                 335
Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu His Ser Phe
340                 345                 350
Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile Gly
355                 360                 365
Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu
370                 375                 380
<210> 63
<211> 401
<212> PRT
<213> OCIF-C20S
<400> 63
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                 -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5              -1   1              5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
85                  90                  95
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr
100                 105                 110
Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe
115                 120                 125
Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
130                 135                 140
Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr
145                 150                 155
His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys
160                 165                 170
Gly Ile Asp Val Thr Leu Ser Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala
175                 180                 185
Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val Asp
190                 195                 200
Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile
205                 210                 215
Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys
220                 225                 230
Leu Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile
235                 240                 245
Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile
250                 255                 260
Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu
265                 270                 275
Ser Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr
280                 285                 290
Ile Lys Ala Cys Lys Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser
295                 300                 305
Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu
310                 315                 320
Met His Ala Leu Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr
325                 330                 335
Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu His Ser Phe
340                 345                 350
Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile Gly
355                 360                 365
Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu
370                 375                 380
<210> 64
<211> 401
<212> PRT
<213> OCIF-C21S
<400> 64
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                 -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5              -1   1              5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
85                  90                  95
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr
100                 105                 110
Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe
115                 120                 125
Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
130                 135                 140
Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr
145                 150                 155
His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys
160                 165                 170
Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala
175                 180                 185
Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val Asp
190                 195                 200
Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile
205                 210                 215
Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys
220                 225                 230
Leu Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile
235                 240                 245
Ile Gln Asp Ile Asp Leu Ser Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile
250                 255                 260
Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu
265                 270                 275
Ser Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr
280                 285                 290
Ile Lys Ala Cys Lys Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser
295                 300                 305
Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu
310                 315                 320
Met His Ala Leu Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr
325                 330                 335
Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu His Ser Phe
340                 345                 350
Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile Gly
355                 360                 365
Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu
370                 375                 380
<210> 65
<211> 401
<212> PRT
<213> OCIF-C22S
<400> 65
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                 -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5              -1   1              5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
85                  90                  95
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr
100                 105                 110
Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe
115                 120                 125
Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
130                 135                 140
Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr
145                 150                 155
His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys
160                 165                 170
Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala
175                 180                 185
Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val Asp
190                 195                 200
Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile
205                 210                 215
Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys
220                 225                 230
Leu Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile
235                 240                 245
Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile
250                 255                 260
Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu
265                 270                 275
Ser Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr
280                 285                 290
Ile Lys Ala Ser Lys Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser
295                 300                 305
Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu
310                 315                 320
Met His Ala Leu Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr
325                 330                 335
Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu His Ser Phe
340                 345                 350
Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile Gly
355                 360                 365
Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu
370                 375                 380
<210> 66
<211> 401
<212> PRT
<213> OCIF-C23S
<400> 66
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                 -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5              -1   1              5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
85                  90                  95
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr
100                 105                 110
Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe
115                 120                 125
Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
130                 135                 140
Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr
145                 150                 155
His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys
160                 165                 170
Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala
175                 180                 185
Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val Asp
190                 195                 200
Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile
205                 210                 215
Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys
220                 225                 230
Leu Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile
235                 240                 245
Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile
250                 255                 260
Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu
265                 270                 275
Ser Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr
280                 285                 290
Ile Lys Ala Cys Lys Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser
295                 300                 305
Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu
310                 315                 320
Met His Ala Leu Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr
325                 330                 335
Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu His Ser Phe
340                 345                 350
Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile Gly
355                 360                 365
Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Ser Leu
370                 375                 380
<210> 67
<211> 360
<212> PRT
<213> OCIF-DCR1
<400> 67
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                 -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr
-5              -1   1              5
Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val
10                  15                  20
Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His
25                  30                  35
Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu
40                  45                  50
Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val
55                  60                  65
Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro
70                  75                  80
Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg
85                  90                  95
Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys
100                 105                 110
Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser
115                 120                 125
Thr Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe
130                 135                 140
Phe Arg Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser
145                 150                 155
Val Leu Val Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser
160                 165                 170
Val Glu Arg Ile Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe
175                 180                 185
Gln Leu Leu Lys Leu Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile
190                 195                 200
Val Lys Lys Ile Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val
205                 210                 215
Gln Arg His Ile Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg
220                 225                 230
Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp
235                 240                 245
Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys Pro Ser Asp Gln Ile Leu
250                 255                 260
Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gln Asp Thr
265                 270                 275
Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser Lys Thr Tyr His
280                 285                 290
Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr Ile Arg Phe
295                 300                 305
Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu
310                 315                 320
Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu
325                 330                 335
<210> 68
<211> 359
<212> PRT
<213> OCIF-DCR2
<400> 68
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                 -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5              -1   1              5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe
40                  45                  50
Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln
55                  60                  65
Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp
70                  75                  80
Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys
85                  90                  95
His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly
100                 105                 110
Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr
115                 120                 125
Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe
130                 135                 140
Arg Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val
145                 150                 155
Leu Val Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val
160                 165                 170
Glu Arg Ile Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln
175                 180                 185
Leu Leu Lys Leu Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val
190                 195                 200
Lys Lys Ile Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln
205                 210                 215
Arg His Ile Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser
220                 225                 230
Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile
235                 240                 245
Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys
250                 255                 260
Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gln Asp Thr Leu
265                 270                 275
Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe
280                 285                 290
Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu
295                 300                 305
His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu Glu
310                 315                 320
Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu
325                 330                 335
<210> 69
<211> 363
<212> PRT
<213> OCIF-DCR3
<400> 69
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                 -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5              -1   1              5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala
85                  90                  95
Pro Cys Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu
100                 105                 110
Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn
115                 120                 125
Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu
130                 135                 140
Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn
145                 150                 155
Trp Leu Ser Val Leu Val Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn
160                 165                 170
Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu
175                 180                 185
Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu Trp Lys His Gln Asn Lys Asp
190                 195                 200
Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys Glu
205                 210                 215
Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu
220                 225                 230
Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly
235                 240                 245
Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys Pro Ser Asp
250                 255                 260
Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp
265                 270                 275
Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser Lys
280                 285                 290
Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr
295                 300                 305
Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys
310                 315                 320
Leu Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile
325                 330                 335
Ser Cys Leu
340
<210> 70
<211> 359
<212> PRT
<213> OCIF-DCR4
<400> 70
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                 -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5              -1   1              5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
85                  90                  95
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr
100                 105                 110
Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr
115                 120                 125
Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe
130                 135                 140
Arg Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val
145                 150                 155
Leu Val Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val
160                 165                 170
Glu Arg Ile Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln
175                 180                 185
Leu Leu Lys Leu Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val
190                 195                 200
Lys Lys Ile Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln
205                 210                 215
Arg His Ile Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser
220                 225                 230
Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile
235                 240                 245
Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys
250                 255                 260
Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gln Asp Thr Leu
265                 270                 275
Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe
280                 285                 290
Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu
295                 300                 305
His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu Glu
310                 315                 320
Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu
325                 330                 335
<210> 71
<211> 326
<212> PRT
<213> OCIF-DDD1
<400> 71
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                 -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5              -1   1              5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
85                  90                  95
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr
100                 105                 110
Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe
115                 120                 125
Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
130                 135                 140
Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr
145                 150                 155
His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys
160                 165                 170
Gly Ile Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile
175                 180                 185
Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu
190                 195                 200
Ser Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr
205                 210                 215
Ile Lys Ala Cys Lys Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser
220                 225                 230
Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu
235                 240                 245
Met His Ala Leu Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr
250                 255                 260
Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu His Ser Phe
265                 270                 275
Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile Gly
280                 285                 290
Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu
295                 300                 305
<210> 72
<211> 327
<212> PRT
<213> OCIF-DDD2
<400> 72
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                 -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5              -1   1              5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
85                  90                  95
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr
100                 105                 110
Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe
115                 120                 125
Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
130                 135                 140
Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr
145                 150                 155
His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys
160                 165                 170
Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala
175                 180                 185
Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val Asp
190                 195                 200
Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile
205                 210                 215
Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys
220                 225                 230
Leu Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile
235                 240                 245
Ile Gln Asp Ala Leu Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys
250                 255                 260
Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu His Ser
265                 270                 275
Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile
280                 285                 290
Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu
295                 300                 305
<210> 73
<211> 399
<212> PRT
<213> OCIF-CL
<400> 73
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                 -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5              -1   1              5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
85                  90                  95
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr
100                 105                 110
Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe
115                 120                 125
Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
130                 135                 140
Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr
145                 150                 155
His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys
160                 165                 170
Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala
175                 180                 185
Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val Asp
190                 195                 200
Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile
205                 210                 215
Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys
220                 225                 230
Leu Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile
235                 240                 245
Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile
250                 255                 260
Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu
265                 270                 275
Ser Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr
280                 285                 290
Ile Lys Ala Cys Lys Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser
295                 300                 305
Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu
310                 315                 320
Met His Ala Leu Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr
325                 330                 335
Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu His Ser Phe
340                 345                 350
Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile Gly
355                 360                 365
Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser
370                 375
<210> 74
<211> 351
<212> PRT
<213> OCIF-CC
<400> 74
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                 -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5              -1   1              5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
85                  90                  95
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr
100                 105                 110
Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe
115                 120                 125
Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
130                 135                 140
Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr
145                 150                 155
His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys
160                 165                 170
Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala
175                 180                 185
Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val Asp
190                 195                 200
Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile
205                 210                 215
Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys
220                 225                 230
Leu Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile
235                 240                 245
Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile
250                 255                 260
Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu
265                 270                 275
Ser Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr
280                 285                 290
Ile Lys Ala Cys Lys Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser
295                 300                 305
Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu
310                 315                 320
Met His Ala Leu Lys His
325                 330
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<211> 272
<212> PRT
<213> OCIF-CDD2
<400> 75
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
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Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5              -1   1              5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
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Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
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Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
85                  90                  95
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr
100                 105                 110
Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe
115                 120                 125
Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
130                 135                 140
Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr
145                 150                 155
His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys
160                 165                 170
Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala
175                 180                 185
Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val Asp
190                 195                 200
Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile
205                 210                 215
Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys
220                 225                 230
Leu Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile
235                 240                 245
Ile Gln
250
<210> 76
<211> 197
<212> PRT
<213> OCIF-CDD1
<400> 76
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                 -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5              -1   1              5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
85                  90                  95
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr
100                 105                 110
Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe
115                 120                 125
Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
130                 135                 140
Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr
145                 150                 155
His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys
160                 165                 170
Gly Ile
175
<210> 77
<211> 143
<212> PRT
<213> OCIF-CCR4
<400> 77
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                 -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5              -1   1              5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
85                  90                  95
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr
100                 105                 110
Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys
115                 120
<210> 78
<211> 106
<212> PRT
<213> OCIF-CCR3
<400> 78
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                 -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5              -1   1              5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Glu
85
<210> 79
<211> 393
<212> PRT
<213> OCIF-CBst
<400> 79
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                 -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5              -1   1              5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
85                  90                  95
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr
100                 105                 110
Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe
115                 120                 125
Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
130                 135                 140
Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr
145                 150                 155
His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys
160                 165                 170
Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala
175                 180                 185
Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val Asp
190                 195                 200
Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile
205                 210                 215
Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys
220                 225                 230
Leu Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile
235                 240                 245
Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile
250                 255                 260
Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu
265                 270                 275
Ser Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr
280                 285                 290
Ile Lys Ala Cys Lys Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser
295                 300                 305
Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu
310                 315                 320
Met His Ala Leu Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr
325                 330                 335
Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu His Ser Phe
340                 345                 350
Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile Gly
355                 360                 365
Asn Leu Val
370
<210> 80
<211> 321
<212> PRT
<213> OCIF-CSph
<400> 80
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                 -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5              -1   1              5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
85                  90                  95
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr
100                 105                 110
Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe
115                 120                 125
Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
130                 135                 140
Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr
145                 150                 155
His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys
160                 165                 170
Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala
175                 180                 185
Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val Asp
190                 195                 200
Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile
205                 210                 215
Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys
220                 225                 230
Leu Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile
235                 240                 245
Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile
250                 255                 260
Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu
265                 270                 275
Ser Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr
280                 285                 290
Ile Lys Ala Ser Leu Asp
295                 300
<210> 81
<211> 187
<212> PRT
<213> OCIF-CBsp
<400> 81
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                 -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5              -1   1              5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu
55                  60                  65
Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys
70                  75                  80
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
85                  90                  95
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr
100                 105                 110
Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe
115                 120                 125
Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn
130                 135                 140
Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr
145                 150                 155
His Asp Asn Ile Cys Ser Gly
160                 165
<210> 82
<211> 84
<212> PRT
<213> OCIF-CPst
<400> 82
Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser
-20                 -15                 -10
Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His
-5              -1   1              5
Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro
10                  15                  20
Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr
25                  30                  35
Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His
40                  45                  50
Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Leu Val
55                  60
<210> 83
<211> 1206
<212> DNA
<213> OCIF-C19S
<400> 83
atgaacaact tgctgtgctg cgcgctcgtg tttctggaca tctccattaa gtggaccacc 60
caggaaacgt ttcctccaaa gtaccttcat tatgacgaag aaacctctca tcagctgttg 120
tgtgacaaat gtcctcctgg tacctaccta aaacaacact gtacagcaaa gtggaagacc 180
gtgtgcgccc cttgccctga ccactactac acagacagct ggcacaccag tgacgagtgt 240
ctatactgca gccccgtgtg caaggagctg cagtacgtca agcaggagtg caatcgcacc 300
cacaaccgcg tgtgcgaatg caaggaaggg cgctaccttg agatagagtt ctgcttgaaa 360
cataggagct gccctcctgg atttggagtg gtgcaagctg gaaccccaga gcgaaataca 420
gtttgcaaaa gatgtccaga tgggttcttc tcaaatgaga cgtcatctaa agcaccctgt 480
agaaaacaca caaattgcag tgtctttggt ctcctgctaa ctcagaaagg aaatgcaaca 540
cacgacaaca tatgttccgg aaacagtgaa tcaactcaaa aaagtggaat agatgttacc 600
ctgtgtgagg aggcattctt caggtttgct gttcctacaa agtttacgcc taactggctt 660
agtgtcttgg tagacaattt gcctggcacc aaagtaaacg cagagagtgt agagaggata 720
aaacggcaac acagctcaca agaacagact ttccagctgc tgaagttatg gaaacatcaa 780
aacaaagacc aagatatagt caagaagatc atccaagata ttgacctctg tgaaaacagc 840
gtgcagcggc acattggaca tgctaacctc accttcgagc agcttcgtag cttgatggaa 900
agcttaccgg gaaagaaagt gggagcagaa gacattgaaa aaacaataaa ggcatgcaaa 960
cccagtgacc agatcctgaa gctgctcagt ttgtggcgaa taaaaaatgg cgaccaagac 1020
accttgaagg gcctaatgca cgcactaaag cactcaaaga cgtaccactt tcccaaaact 1080
gtcactcaga gtctaaagaa gaccatcagg ttccttcaca gcttcacaat gtacaaattg 1140
tatcagaagt tatttttaga aatgataggt aaccaggtcc aatcagtaaa aataagctgc 1200
ttataa                                                            1206
<210> 84
<211> 1206
<212> DNA
<213> OCIF-C20S
<400> 84
atgaacaact tgctgtgctg cgcgctcgtg tttctggaca tctccattaa gtggaccacc 60
caggaaacgt ttcctccaaa gtaccttcat tatgacgaag aaacctctca tcagctgttg 120
tgtgacaaat gtcctcctgg tacctaccta aaacaacact gtacagcaaa gtggaagacc 180
gtgtgcgccc cttgccctga ccactactac acagacagct ggcacaccag tgacgagtgt 240
ctatactgca gccccgtgtg caaggagctg cagtacgtca agcaggagtg caatcgcacc 300
cacaaccgcg tgtgcgaatg caaggaaggg cgctaccttg agatagagtt ctgcttgaaa 360
cataggagct gccctcctgg atttggagtg gtgcaagctg gaaccccaga gcgaaataca 420
gtttgcaaaa gatgtccaga tgggttcttc tcaaatgaga cgtcatctaa agcaccctgt 480
agaaaacaca caaattgcag tgtctttggt ctcctgctaa ctcagaaagg aaatgcaaca 540
cacgacaaca tatgttccgg aaacagtgaa tcaactcaaa aatgtggaat agatgttacc 600
ctgagtgagg aggcattctt caggtttgct gttcctacaa agtttacgcc taactggctt 660
agtgtcttgg tagacaattt gcctggcacc aaagtaaacg cagagagtgt agagaggata 720
aaacggcaac acagctcaca agaacagact ttccagctgc tgaagttatg gaaacatcaa 780
aacaaagacc aagatatagt caagaagatc atccaagata ttgacctctg tgaaaacagc 840
gtgcagcggc acattggaca tgctaacctc accttcgagc agcttcgtag cttgatggaa 900
agcttaccgg gaaagaaagt gggagcagaa gacattgaaa aaacaataaa ggcatgcaaa 960
cccagtgacc agatcctgaa gctgctcagt ttgtggcgaa taaaaaatgg cgaccaagac 1020
accttgaagg gcctaatgca cgcactaaag cactcaaaga cgtaccactt tcccaaaact 1080
gtcactcaga gtctaaagaa gaccatcagg ttccttcaca gcttcacaat gtacaaattg 1140
tatcagaagt tatttttaga aatgataggt aaccaggtcc aatcagtaaa aataagctgc 1200
ttataa                                                            1206
<210> 85
<211> 1206
<212> DNA
<213> OCIF-C21S
<400> 85
atgaacaact tgctgtgctg cgcgctcgtg tttctggaca tctccattaa gtggaccacc 60
caggaaacgt ttcctccaaa gtaccttcat tatgacgaag aaacctctca tcagctgttg 120
tgtgacaaat gtcctcctgg tacctaccta aaacaacact gtacagcaaa gtggaagacc 180
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aacaaagacc aagatatagt caagaagatc atccaagata ttgacctctg tgaaaacagc 840
gtgcagcggc acattggaca tgctaacctc accttcgagc agcttcgtag cttgatggaa 900
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cccagtgacc agatcctgaa gctgctcagt ttgtggcgaa taaaaaatgg cgaccaagac 1020
accttgaagg gcctaatgca cgcactaaag cactga                           1056
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cacaaccgcg tgtgcgaatg caaggaaggg cgctaccttg agatagagtt ctgcttgaaa 360
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aaacggcaac acagctcaca agaacagact ttccagctgc tgaagttatg gaaacatcaa 780
aacaaagacc aagatatagt caagaagatc atccaatga                        819
<210> 97
<211> 594
<212> DNA
<213> OCIF-CDD1
<400> 97
atgaacaact tgctgtgctg cgcgctcgtg tttctggaca tctccattaa gtggaccacc 60
caggaaacgt ttcctccaaa gtaccttcat tatgacgaag aaacctctca tcagctgttg 120
tgtgacaaat gtcctcctgg tacctaccta aaacaacact gtacagcaaa gtggaagacc 180
gtgtgcgccc cttgccctga ccactactac acagacagct ggcacaccag tgacgagtgt 240
ctatactgca gccccgtgtg caaggagctg cagtacgtca agcaggagtg caatcgcacc 300
cacaaccgcg tgtgcgaatg caaggaaggg cgctaccttg agatagagtt ctgcttgaaa 360
cataggagct gccctcctgg atttggagtg gtgcaagctg gaaccccaga gcgaaataca 420
gtttgcaaaa gatgtccaga tgggttcttc tcaaatgaga cgtcatctaa agcaccctgt 480
agaaaacaca caaattgcag tgtctttggt ctcctgctaa ctcagaaagg aaatgcaaca 540
cacgacaaca tatgttccgg aaacagtgaa tcaactcaaa aatgtggaat atga       594
<210> 98
<211> 432
<212> DNA
<213> OCIF-CCR4
<400> 98
atgaacaact tgctgtgctg cgcgctcgtg tttctggaca tctccattaa gtggaccacc 60
caggaaacgt ttcctccaaa gtaccttcat tatgacgaag aaacctctca tcagctgttg 120
tgtgacaaat gtcctcctgg tacctaccta aaacaacact gtacagcaaa gtggaagacc 180
gtgtgcgccc cttgccctga ccactactac acagacagct ggcacaccag tgacgagtgt 240
ctatactgca gccccgtgtg caaggagctg cagtacgtca agcaggagtg caatcgcacc 300
cacaaccgcg tgtgcgaatg caaggaaggg cgctaccttg agatagagtt ctgcttgaaa 360
cataggagct gccctcctgg atttggagtg gtgcaagctg gaaccccaga gcgaaataca 420
gtttgcaaat ga                                                     432
<210> 99
<211> 321
<212> DNA
<213> OCIF-CCR3
<400> 99
atgaacaact tgctgtgctg cgcgctcgtg tttctggaca tctccattaa gtggaccacc 60
caggaaacgt ttcctccaaa gtaccttcat tatgacgaag aaacctctca tcagctgttg 120
tgtgacaaat gtcctcctgg tacctaccta aaacaacact gtacagcaaa gtggaagacc 180
gtgtgcgccc cttgccctga ccactactac acagacagct ggcacaccag tgacgagtgt 240
ctatactgca gccccgtgtg caaggagctg cagtacgtca agcaggagtg caatcgcacc 300
cacaaccgcg tgtgcgaatg a                                           321
<210> 100
<211> 1182
<212> DNA
<213> OCIF-CBst
<400> 100
atgaacaact tgctgtgctg cgcgctcgtg tttctggaca tctccattaa gtggaccacc 60
caggaaacgt ttcctccaaa gtaccttcat tatgacgaag aaacctctca tcagctgttg 120
tgtgacaaat gtcctcctgg tacctaccta aaacaacact gtacagcaaa gtggaagacc 180
gtgtgcgccc cttgccctga ccactactac acagacagct ggcacaccag tgacgagtgt 240
ctatactgca gccccgtgtg caaggagctg cagtacgtca agcaggagtg caatcgcacc 300
cacaaccgcg tgtgcgaatg caaggaaggg cgctaccttg agatagagtt ctgcttgaaa 360
cataggagct gccctcctgg atttggagtg gtgcaagctg gaaccccaga gcgaaataca 420
gtttgcaaaa gatgtccaga tgggttcttc tcaaatgaga cgtcatctaa agcaccctgt 480
agaaaacaca caaattgcag tgtctttggt ctcctgctaa ctcagaaagg aaatgcaaca 540
cacgacaaca tatgttccgg aaacagtgaa tcaactcaaa aatgtggaat agatgttacc 600
ctgtgtgagg aggcattctt caggtttgct gttcctacaa agtttacgcc taactggctt 660
agtgtcttgg tagacaattt gcctggcacc aaagtaaacg cagagagtgt agagaggata 720
aaacggcaac acagctcaca agaacagact ttccagctgc tgaagttatg gaaacatcaa 780
aacaaagacc aagatatagt caagaagatc atccaagata ttgacctctg tgaaaacagc 840
gtgcagcggc acattggaca tgctaacctc accttcgagc agcttcgtag cttgatggaa 900
agcttaccgg gaaagaaagt gggagcagaa gacattgaaa aaacaataaa ggcatgcaaa 960
cccagtgacc agatcctgaa gctgctcagt ttgtggcgaa taaaaaatgg cgaccaagac 1020
accttgaagg gcctaatgca cgcactaaag cactcaaaga cgtaccactt tcccaaaact 1080
gtcactcaga gtctaaagaa gaccatcagg ttccttcaca gcttcacaat gtacaaattg 1140
tatcagaagt tatttttaga aatgataggt aacctagtct ag                    1182
<210> 101
<211> 966
<212> DNA
<213> OCIF-CSph
<400> 101
atgaacaact tgctgtgctg cgcgctcgtg tttctggaca tctccattaa gtggaccacc 60
caggaaacgt ttcctccaaa gtaccttcat tatgacgaag aaacctctca tcagctgttg 120
tgtgacaaat gtcctcctgg tacctaccta aaacaacact gtacagcaaa gtggaagacc 180
gtgtgcgccc cttgccctga ccactactac acagacagct ggcacaccag tgacgagtgt 240
ctatactgca gccccgtgtg caaggagctg cagtacgtca agcaggagtg caatcgcacc 300
cacaaccgcg tgtgcgaatg caaggaaggg cgctaccttg agatagagtt ctgcttgaaa 360
cataggagct gccctcctgg atttggagtg gtgcaagctg gaaccccaga gcgaaataca 420
gtttgcaaaa gatgtccaga tgggttcttc tcaaatgaga cgtcatctaa agcaccctgt 480
agaaaacaca caaattgcag tgtctttggt ctcctgctaa ctcagaaagg aaatgcaaca 540
cacgacaaca tatgttccgg aaacagtgaa tcaactcaaa aatgtggaat agatgttacc 600
ctgtgtgagg aggcattctt caggtttgct gttcctacaa agtttacgcc taactggctt 660
agtgtcttgg tagacaattt gcctggcacc aaagtaaacg cagagagtgt agagaggata 720
aaacggcaac acagctcaca agaacagact ttccagctgc tgaagttatg gaaacatcaa 780
aacaaagacc aagatatagt caagaagatc atccaagata ttgacctctg tgaaaacagc 840
gtgcagcggc acattggaca tgctaacctc accttcgagc agcttcgtag cttgatggaa 900
agcttaccgg gaaagaaagt gggagcagaa gacattgaaa aaacaataaa ggctagtcta 960
gactag                                                            966
<210> 102
<211> 564
<212> DNA
<213> OCIF-CBsp
<400> 102
atgaacaact tgctgtgctg cgcgctcgtg tttctggaca tctccattaa gtggaccacc 60
caggaaacgt ttcctccaaa gtaccttcat tatgacgaag aaacctctca tcagctgttg 120
tgtgacaaat gtcctcctgg tacctaccta aaacaacact gtacagcaaa gtggaagacc 180
gtgtgcgccc cttgccctga ccactactac acagacagct ggcacaccag tgacgagtgt 240
ctatactgca gccccgtgtg caaggagctg cagtacgtca agcaggagtg caatcgcacc 300
cacaaccgcg tgtgcgaatg caaggaaggg cgctaccttg agatagagtt ctgcttgaaa 360
cataggagct gccctcctgg atttggagtg gtgcaagctg gaaccccaga gcgaaataca 420
gtttgcaaaa gatgtccaga tgggttcttc tcaaatgaga cgtcatctaa agcaccctgt 480
agaaaacaca caaattgcag tgtctttggt ctcctgctaa ctcagaaagg aaatgcaaca 540
cacgacaaca tatgttccgg ctag                                        564
<210> 103
<211> 255
<212> DNA
<213> OCIF-CPst
<400> 103
atgaacaact tgctgtgctg cgcgctcgtg tttctggaca tctccattaa gtggaccacc 60
caggaaacgt ttcctccaaa gtaccttcat tatgacgaag aaacctctca tcagctgttg 120
tgtgacaaat gtcctcctgg tacctaccta aaacaacact gtacagcaaa gtggaagacc 180
gtgtgcgccc cttgccctga ccactactac acagacagct ggcacaccag tgacgagtgt 240
ctatacctag tctag                                                  255
<210> 104
<211> 1317
<212> DNA
<213> human OCIF genome
<220>
<221> exon
<222> 1173..1193
<400> 104
ctggagacat ataacttgaa cacttggccc tgatggggaa gcagctctgc agggactttt   60
tcagccatct gtaaacaatt tcagtggcaa cccgcgaact gtaatccatg aatgggacca 120
cactttacaa gtcatcaagt ctaacttcta gaccagggaa ttaatggggg agacagcgaa 180
ccctagagca aagtgccaaa cttctgtcga tagcttgagg ctagtggaaa gacctcgagg 240
aggctactcc agaagttcag cgcgtaggaa gctccgatac caatagccct ttgatgatgg 300
tggggttggt gaagggaaca gtgctccgca aggttatccc tgccccaggc agtccaattt 360
tcactctgca gattctctct ggctctaact accccagata acaaggagtg aatgcagaat 420
agcacgggct ttagggccaa tcagacatta gttagaaaaa ttcctactac atggtttatg 480
taaacttgaa gatgaatgat tgcgaactcc ccgaaaaggg ctcagacaat gccatgcata 540
aagaggggcc ctgtaatttg aggtttcaga acccgaagtg aaggggtcag gcagccgggt 600
acggcggaaa ctcacagctt tcgcccagcg agaggacaaa ggtctgggac acactccaac 660
tgcgtccgga tcttggctgg atcggactct cagggtggag gagacacaag cacagcagct 720
gcccagcgtg tgcccagccc tcccaccgct ggtcccggct gccaggaggc tggccgctgg 780
cgggaagggg ccgggaaacc tcagagcccc gcggagacag cagccgcctt gttcctcagc 840
ccggtggctt ttttttcccc tgctctccca ggggacagac accaccgccc cacccctcac 900
gccccacctc cctgggggat cctttccgcc ccagccctga aagcgttaat cctggagctt 960
tctgcacacc ccccgaccgc tcccgcccaa gcttcctaaa aaagaaaggt gcaaagtttg 1020
gtccaggata gaaaaatgac tgatcaaagg caggcgatac ttcctgttgc cgggacgcta 1080
tatataacgt gatgagcgca cgggctgcgg agacgcaccg gagcgctcgc ccagccgccg 1140
cctccaagcc cctgaggttt ccggggacca ca atg aac aag ttg ctg tgc tgc   1193
Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys
-20                 -15
gcg ctc gtg gtaagtccct gggccagccg acgggtgccc ggcgcctggg           1242
ala leu val
gaggctgctg ccacctggtc tcccaacctc ccagcggacc ggcggggaaa aaggctccac 1302
tcgctccctc ccaag                                                  1317
<210> 105
<211> 10190
<212> DNA
<213> human OCIF genome
<220>
<221> exon
<222> 131..499
<220>
<221> exon
<222> 4504..4694
<220>
<221> exon
<222> 5043..6939
<220>
<221> exon
<222> 8960..9347
<400> 105
gcttactttg tgccaaatct cattaggctt aaggtaatac aggactttga gtcaaatgat     60
actgttgcac ataagaacaa acctattttc atgctaagat gatgccactg tgttcctttc    120
tccttctag ttt ctg gac atc tcc att aag tgg acc acc cag gaa acg ttt    171
Phe Leu Asp Ile Ser Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe
-10                  -5              -1  +1
cct cca aag tac ctt cat tat gac gaa gaa acc tct cat cag ctg ttg      219
Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu
5                  10                  15
tgt gac aaa tgt cct cct ggt acc tac cta aaa caa cac tgt aca gca      267
Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala
20                  25                  30                  35
aag tgg aag acc gtg tgc gcc cct tgc cct gac cac tac tac aca gac      315
Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp
40                  45                  50
agc tgg cac acc agt gac gag tgt cta tac tgc agc ccc gtg tgc aag      363
Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys
55                  60                  65
gag ctg cag tac gtc aag cag gag tgc aat cgc acc cac aac cgc gtg      411
Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val
70                  75                  80
tgc gaa tgc aag gaa ggg cgc tac ctt gag ata gag ttc tgc ttg aaa      459
Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys
85                  90                  95
cat agg agc tgc cct cct gga ttt gga gtg gtg caa gct g gtacgtgtca     509
His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala
100                 105                 110
atgtgcagca aaattaatta ggatcatgca aagtcagata gttgtgacag tttaggagaa    569
cacttttgtt ctgatgacat tataggatag caaattgcaa aggtaatgaa acctgccagg    629
taggtactat gtgtctggag tgcttccaaa ggaccattgc tcagaggaat actttgccac    689
tacagggcaa tttaatgaca aatctcaaat gcagcaaatt attctctcat gagatgcatg    749
atggtttttt tttttttttt taaagaaaca aactcaagtt gcactattga tagttgatct    809
atacctctat atttcacttc agcatggaca ccttcaaact gcagcacttt ttgacaaaca    869
tcagaaatgt taatttatac caagagagta attatgctca tattaatgag actctggagt    929
gctaacaata agcagttata attaattatg taaaaaatga gaatggtgag gggaattgca    989
tttcattatt aaaaacaagg ctagttcttc ctttagcatg ggagctgagt gtttgggagg   1049
gtaaggacta tagcagaatc tcttcaatga gcttattctt tatcttagac aaaacagatt   1109
gtcaagccaa gagcaagcac ttgcctataa accaagtgct ttctcttttg cattttgaac   1169
agcattggtc agggctcatg tgtattgaat cttttaaacc agtaacccac gttttttttc   1229
tgccacattt gcgaagcttc agtgcagcct ataacttttc atagcttgag aaaattaaga   1289
gtatccactt acttagatgg aagaagtaat cagtatagat tctgatgact cagtttgaag   1349
cagtgtttct caactgaagc cctgctgata ttttaagaaa tatctggatt cctaggctgg   1409
actccttttt gtgggcagct gtcctgcgca ttgtagaatt ttggcagcac ccctggactc   1469
tagccactag ataccaatag cagtccttcc cccatgtgac agccaaaaat gtcttcagac   1529
actgtcaaat gtcgccaggt ggcaaaatca ctcctggttg agaacagggt catcaatgct   1589
aagtatctgt aactatttta actctcaaaa cttgtgatat acaaagtcta aattattaga   1649
cgaccaatac tttaggttta aaggcataca aatgaaacat tcaaaaatca aaatctattc   1709
tgtttctcaa atagtgaatc ttataaaatt aatcacagaa gatgcaaatt gcatcagagt   1769
cccttaaaat tcctcttcgt atgagtattt gagggaggaa ttggtgatag ttcctacttt   1829
ctattggatg gtactttgag actcaaaagc taagctaagt tgtgtgtgtg tcagggtgcg   1889
gggtgtggaa tcccatcaga taaaagcaaa tccatgtaat tcattcagta agttgtatat   1949
gtagaaaaat gaaaagtggg ctatgcagct tggaaactag agaattttga aaaataatgg   2009
aaatcacaag gatctttctt aaataagtaa gaaaatctgt ttgtagaatg aagcaagcag   2069
gcagccagaa gactcagaac aaaagtacac attttactct gtgtacactg gcagcacagt   2129
gggatttatt tacctctccc tccctaaaaa cccacacagc ggttcctctt gggaaataag   2189
aggtttccag cccaaagaga aggaaagact atgtggtgtt actctaaaaa gtatttaata   2249
accgttttgt tgttgctgtt gctgttttga aatcagattg tctcctctcc atattttatt   2309
tacttcattc tgttaattcc tgtggaatta cttagagcaa gcatggtgaa ttctcaactg   2369
taaagccaaa tttctccatc attataattt cacattttgc ctggcaggtt ataattttta   2429
tatttccact gatagtaata aggtaaaatc attacttaga tggatagatc tttttcataa   2489
aaagtaccat cagttataga gggaagtcat gttcatgttc aggaaggtca ttagataaag   2549
cttctgaata tattatgaaa cattagttct gtcattctta gattcttttt gttaaataac   2609
tttaaaagct aacttaccta aaagaaatat ctgacacata tgaacttctc attaggatgc   2669
aggagaagac ccaagccaca gatatgtatc tgaagaatga acaagattct taggcccggc   2729
acggtggctc acatctgtaa tctcaagagt ttgagaggtc aaggcgggca gatcacctga   2789
ggtcaggagt tcaagaccag cctggccaac atgatgaaac cctgcctcta ctaaaaatac   2849
aaaaattagc agggcatggt ggtgcatgcc tgcaacccta gctactcagg aggctgagac   2909
aggagaatct cttgaaccct cgaggcggag gttgtggtga gctgagatcc ctctactgca   2969
ctccagcctg ggtgacagag atgagactcc gtccctgccg ccgcccccgc cttccccccc   3029
aaaaagattc ttcttcatgc agaacatacg gcagtcaaca aagggagacc tgggtccagg   3089
tgtccaagtc acttatttcg agtaaattag caatgaaaga atgccatgga atccctgccc   3149
aaatacctct gcttatgata ttgtagaatt tgatatagag ttgtatccca tttaaggagt   3209
aggatgtagt aggaaagtac taaaaacaaa cacacaaaca gaaaaccctc tttgctttgt   3269
aaggtggttc ctaagataat gtcagtgcaa tgctggaaat aatatttaat atgtgaaggt   3329
tttaggctgt gttttcccct cctgttcttt ttttctgcca gccctttgtc atttttgcag   3389
gtcaatgaat catgtagaaa gagacaggag atgaaactag aaccagtcca ttttgcccct   3449
ttttttattt tctggttttg gtaaaagata caatgaggta ggaggttgag atttataaat   3509
gaagtttaat aagtttctgt agctttgatt tttctctttc atatttgtta tcttgcataa   3569
gccagaattg gcctgtaaaa tctacatatg gatattgaag tctaaatctg ttcaactagc   3629
ttacactaga tggagatatt ttcatattca gatacactgg aatgtatgat ctagccatgc   3689
gtaatatagt caagtgtttg aaggtattta tttttaatag cgtctttagt tgtggactgg   3749
ttcaagtttt tctgccaatg atttcttcaa atttatcaaa tatttttcca tcatgaagta   3809
aaatgccctt gcagtcaccc ttcctgaagt ttgaacgact ctgctgtttt aaacagttta   3869
agcaaatggt atatcatctt ccgtttacta tgtagcttaa ctgcaggctt acgcttttga   3929
gtcagcggcc aactttattg ccaccttcaa aagtttatta taatgttgta aatttttact   3989
tctcaaggtt agcatactta ggagttgctt cacaattagg attcaggaaa gaaagaactt   4049
cagtaggaac tgattggaat ttaatgatgc agcattcaat gggtactaat ttcaaagaat   4109
gatattacag cagacacaca gcagttatct tgattttcta ggaataattg tatgaagaat   4169
atggctgaca acacggcctt actgccactc agcggaggct ggactaatga acaccctacc   4229
cttctttcct ttcctctcac atttcatgag cgttttgtag gtaacgagaa aattgacttg   4289
catttgcatt acaaggagga gaaactggca aaggggatga tggtggaagt tttgttctgt   4349
ctaatgaagt gaaaaatgaa aatgctagag ttttgtgcaa cataatagta gcagtaaaaa   4409
ccaagtgaaa agtctttcca aaactgtgtt aagagggcat ctgctgggaa acgatttgag   4469
gagaaggtac taaattgctt ggtattttcc gtag ga acc cca gag cga aat aca    4523
gly thr pro glu arg asn thr
115
gtt tgc aaa aga tgt cca gat ggg ttc ttc tca aat gag acg tca tct     4571
Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser
120                 125                 130                 135
aaa gca ccc tgt aga aaa cac aca aat tgc agt gtc ttt ggt ctc ctg     4619
Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu
140                 145                 150
cta act cag aaa gga aat gca aca cac gac aac ata tgt tcc gga aac     4667
Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn
155                 160                 165
agt gaa tca act caa aaa tgt gga ata g gtaattacat tccaaaatac         4715
Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys Gly Ile
170                 175
gtctttgtac gattttgtag tatcatctct ctctctgagt tgaacacaag gcctccagcc   4775
acattcttgg tcaaacttac attttccctt tcttgaatct taaccagcta aggctactct   4835
cgatgcatta ctgctaaagc taccactcag aatctctcaa aaactcatct tctcacagat   4895
aacacctcaa agcttgattt tctctccttt cacactgaaa tcaaatcttg cccataggca   4955
aagggcagtg tcaagtttgc cactgagatg aaattaggag agtccaaact gtagaattca   5015
cgttgtgtgt tattactttc acgaatgtct gtattattaa ctaaagtata tattggcaac   5075
taagaagcaa agtgatataa acatgatgac aaattaggcc aggcatggtg gcttactcct   5135
ataatcccaa cattttgggg ggccaaggta ggcagatcac ttgaggtcag gatttcaaga   5195
ccagcctgac caacatggtg aaaccttgtc tctactaaaa atacaaaaat tagctgggca   5255
tggtagcagg cacttctagt accagctact cagggctgag gcaggagaat cgcttgaacc   5315
caggagatgg aggttgcagt gagctgagat tgtaccactg cactccagtc tgggcaacag   5375
agcaagattt catcacacac acacacacac acacacacac acacattaga aatgtgtact   5435
tggctttgtt acctatggta ttagtgcatc tattgcatgg aacttccaag ctactctggt   5495
tgtgttaagc tcttcattgg gtacaggtca ctagtattaa gttcaggtta ttcggatgca   5555
ttccacggta gtgatgacaa ttcatcaggc tagtgtgtgt gttcaccttg tcactcccac   5615
cactagacta atctcagacc ttcactcaaa gacacattac actaaagatg atttgctttt   5675
ttgtgtttaa tcaagcaatg gtataaacca gcttgactct ccccaaacag tttttcgtac   5735
tacaaagaag tttatgaagc agagaaatgt gaattgatat atatatgaga ttctaaccca   5795
gttccagcat tgtttcattg tgtaattgaa atcatagaca agccatttta gcctttgctt   5855
tcttatctaa aaaaaaaaaa aaaaaaatga aggaaggggt attaaaagga gtgatcaaat   5915
tttaacattc tctttaatta attcattttt aattttactt tttttcattt attgtgcact   5975
tactatgtgg tactgtgcta tagaggcttt aacatttata aaaacactgt gaaagttgct   6035
tcagatgaat ataggtagta gaacggcaga actagtattc aaagccaggt ctgatgaatc   6095
caaaaacaaa cacccattac tcccattttc tgggacatac ttactctacc cagatgctct   6155
gggctttgta atgcctatgt aaataacata gttttatgtt tggttatttt cctatgtaat   6215
gtctacttat atatctgtat ctatctcttg ctttgtttcc aaaggtaaac tatgtgtcta   6275
aatgtgggca aaaaataaca cactattcca aattactgtt caaattcctt taagtcagtg   6335
ataattattt gttttgacat taatcatgaa gttccctgtg ggtactaggt aaacctttaa   6395
tagaatgtta atgtttgtat tcattataag aatttttggc tgttacttat ttacaacaat   6455
atttcactct aattagacat ttactaaact ttctcttgaa aacaatgccc aaaaaagaac   6515
attagaagac acgtaagctc agttggtctc tgccactaag accagccaac agaagcttga   6575
ttttattcaa actttgcatt ttagcatatt ttatcttgga aaattcaatt gtgttggttt   6635
tttgtttttg tttgtattga atagactctc agaaatccaa ttgttgagta aatcttctgg   6695
gttttctaac ctttctttag at gtt acc ctg tgt gag gag gca ttc ttc agg    6747
Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg
180                 185
ttt gct gtt cct aca aag ttt acg cct aac tgg ctt agt gtc ttg gta     6795
Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val
190                 195                 200
gac aat ttg cct ggc acc aaa gta aac gca gag agt gta gag agg ata     6843
Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile
205                 210                 215
aaa cgg caa cac agc tca caa gaa cag act ttc cag ctg ctg aag tta     6891
Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu
220                 225                 230                 235
tgg aaa cat caa aac aaa gac caa gat ata gtc aag aag atc atc caa g   6940
Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile Ile Gln
240                 245                 250
gtaattacat tccaaaatac gtctttgtac gattttgtag tatcatctct ctctctgagt   7000
tgaacacaag gcctccagcc acattcttgg tcaaacttac attttccctt tcttgaatct   7060
taaccagcta aggctactct cgatgcatta ctgctaaagc taccactcag aatctctcaa   7120
aaactcatct tctcacagat aacacctcaa agcttgattt tctctccttt cacactgaaa   7180
tcaaatcttg cccataggca aagggcagtg tcaagtttgc cactgagatg aaattaggag   7240
agtccaaact gtagaattca cgttgtgtgt tattactttc acgaatgtct gtattattaa   7300
ctaaagtata tattggcaac taagaagcaa agtgatataa acatgatgac aaattaggcc   7360
aggcatggtg gcttactcct ataatcccaa cattttgggg ggccaaggta ggcagatcac   7420
ttgaggtcag gatttcaaga ccagcctgac caacatggtg aaaccttgtc tctactaaaa   7480
atacaaaaat tagctgggca tggtagcagg cacttctagt accagctact cagggctgag   7540
gcaggagaat cgcttgaacc caggagatgg aggttgcagt gagctgagat tgtaccactg   7600
cactccagtc tgggcaacag agcaagattt catcacacac acacacacac acacacacac   7660
acacattaga aatgtgtact tggctttgtt acctatggta ttagtgcatc tattgcatgg   7720
aacttccaag ctactctggt tgtgttaagc tcttcattgg gtacaggtca ctagtattaa   7780
gttcaggtta ttcggatgca ttccacggta gtgatgacaa ttcatcaggc tagtgtgtgt   7840
gttcaccttg tcactcccac cactagacta atctcagacc ttcactcaaa gacacattac   7900
actaaagatg atttgctttt ttgtgtttaa tcaagcaatg gtataaacca gcttgactct   7960
ccccaaacag tttttcgtac tacaaagaag tttatgaagc agagaaatgt gaattgatat   8020
atatatgaga ttctaaccca gttccagcat tgtttcattg tgtaattgaa atcatagaca   8080
agccatttta gcctttgctt tcttatctaa aaaaaaaaaa aaaaaaatga aggaaggggt   8140
attaaaagga gtgatcaaat tttaacattc tctttaatta attcattttt aattttactt   8200
tttttcattt attgtgcact tactatgtgg tactgtgcta tagaggcttt aacatttata   8260
aaaacactgt gaaagttgct tcagatgaat ataggtagta gaacggcaga actagtattc   8320
aaagccaggt ctgatgaatc caaaaacaaa cacccattac tcccattttc tgggacatac   8380
ttactctacc cagatgctct gggctttgta atgcctatgt aaataacata gttttatgtt   8440
tggttatttt cctatgtaat gtctacttat atatctgtat ctatctcttg ctttgtttcc   8500
aaaggtaaac tatgtgtcta aatgtgggca aaaaataaca cactattcca aattactgtt   8560
caaattcctt taagtcagtg ataattattt gttttgacat taatcatgaa gttccctgtg   8620
ggtactaggt aaacctttaa tagaatgtta atgtttgtat tcattataag aatttttggc   8680
tgttacttat ttacaacaat atttcactct aattagacat ttactaaact ttctcttgaa   8740
aacaatgccc aaaaaagaac attagaagac acgtaagctc agttggtctc tgccactaag   8800
accagccaac agaagcttga ttttattcaa actttgcatt ttagcatatt ttatcttgga   8860
aaattcaatt gtgttggttt tttgtttttg tttgtattga atagactctc agaaatccaa   8920
ttgttgagta aatcttctgg gttttctaac ctttctttag at att gac ctc tgt      8974
Asp Ile Asp Leu Cys
255
gaa aac agc gtg cag cgg cac att gga cat gct aac ctc acc ttc gag     9022
Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu
260                 265                 270
cag ctt cgt agc ttg atg gaa agc tta ccg gga aag aaa gtg gga gca     9070
Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly Ala
275                 280                 285
gaa gac att gaa aaa aca ata aag gca tgc aaa ccc agt gac cag atc     9118
Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys Pro Ser Asp Gln Ile
290                 295                 300
ctg aag ctg ctc agt ttg tgg cga ata aaa aat ggc gac caa gac acc     9166
Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gln Asp Thr
305                 310                 315                 320
ttg aag ggc cta atg cac gca cta aag cac tca aag acg tac cac ttt     9214
Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe
325                 330                 335
ccc aaa act gtc act cag agt cta aag aag acc atc agg ttc ctt cac     9262
Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu His
340                 345                 350
agc ttc aca atg tac aaa ttg tat cag aag tta ttt tta gaa atg ata     9310
Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile
355                 360                 365
ggt aac cag gtc caa tca gta aaa ata agc tgc tta taactggaaa          9356
Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu
370                 375                 380
tggccattga gctgtttcct cacaattggc gagatcccat ggatgagtaa actgtttctc
9416aggcacttga ggctttcagt gatatctttc tcattaccag tgactaattt tgccacaggg
9476tactaaaaga aactatgatg tggagaaagg actaacatct cctccaataa accccaaatg
9536gttaatccaa ctgtcagatc tggatcgtta tctactgact atattttccc ttattactgc
9596ttgcagtaat tcaactggaa attaaaaaaa aaaaactaga ctccactggg ccttactaaa
9656tatgggaatg tctaacttaa atagctttgg gattccagct atgctagagg cttttattag
9716aaagccatat ttttttctgt aaaagttact aatatatctg taacactatt acagtattgc
9776tatttatatt cattcagata taagatttgg acatattatc atcctataaa gaaacggtat
9836gacttaattt tagaaagaaa attatattct gtttattatg acaaatgaaa gagaaaatat
9896atatttttaa tggaaagttt gtagcatttt tctaataggt actgccatat ttttctgtgt
9956ggagtatttt tataatttta tctgtataag ctgtaatatc attttataga aaatgcatta 10
016tttagtcaat tgtttaatgt tggaaaacat atgaaatata aattatctga atattagatg 100
76ctctgagaaa ttgaatgtac cttatttaaa agattttatg gttttataac tatataaatg 1013
6acattattaa agttttcaaa ttatttttta ttgctttctc tgttgctttt attt        1019
0
【図面の簡単な説明】
【図１】HiLoad-Q/FF 非吸着画分粗精製製品（試料3)をHiLoad-S/HP カラムにかけた時の溶出プロファイルを示す。
【図２】ヘパリン-5PW粗精製製品 (試料5)をブルー-5PWカラムにかけた時の溶出プロファイルを示す。
【図３】ブルー-5PW溶出フラクション49〜50を逆相カラムにかけた時の溶出プロファイルを示す。
【図４】最終精製品の還元条件下と非還元条件下におけるSDS‐PAGEの結果を示す。
【符号の説明】
レーン１、４；分子量マーカー
レーン２、５；ピーク６
レーン３、６；ピーク７
【図５】還元ピリジルエチル化後、リシルエンドプロテアーゼ処理したピーク７を逆相カラムにかけた時の溶出プロファイルを示す。
【図６】天然(n) 及び組み換え型(r) OCIFの、非還元条件下におけるSDS‐PAGEの結果を示す。又、(E) は293/ＥＢＮＡ細胞で生産したものを、(C) はCHO細胞で生産したものをそれぞれ示す。
【符号の説明】
レーン１；分子量マーカー
レーン２；モノマー型ｎOCIF
レーン３；ダイマー型ｎOCIF
レーン４；モノマー型ｒOCIF(E)
レーン５；ダイマー型ｒOCIF(E)
レーン６；モノマー型ｒOCIF(C)
レーン７；ダイマー型ｒOCIF(C)
【図７】天然型(n)及び組み換え型(r)OCIFの、還元条件下におけるSDS‐PAGEの結果を示す。又、(E)は293/EBNA細胞で生産したものを、(C) CHO細胞で生産したものをそれぞれ示す。
【符号の説明】
レーン８；分子量マーカー
レーン９；モノマー型ｎOCIF
レーン10；ダイマー型ｎOCIF
レーン11；モノマー型ｒOCIF(E)
レーン12；ダイマー型ｒOCIF(E)
レーン13；モノマー型ｒOCIF(C)
レーン14；ダイマー型ｒOCIF(C)
【図８】Ｎ−結合型糖鎖を除去した天然型(n) 及び組み換え型(r) OCIFの、還元条件下におけるSDS‐PAGEの結果を示す。又、(E) は293/EBNA細胞で生産したものを、(C) はCHO細胞で生産したものをそれぞれ示す。
【符合の説明】
レーン15；分子量マーカー
レーン16；モノマー型ｎOCIF
レーン17；ダイマー型ｎOCIF
レーン18；モノマー型ｒOCIF(E)
レーン19；ダイマー型ｒOCIF(E)
レーン20；モノマー型ｒOCIF(C)
レーン21；ダイマー型ｒOCIF(C)
【図９】OCIFとOCIF２の、アミノ酸配列の比較を示す。
【図１０】  OCIFとOCIF３の、アミノ酸配列の比較を示す。
【図１１】OCIFとOCIF４の、アミノ酸配列の比較を示す。
【図１２】OCIFとOCIF５の、アミノ酸配列の比較を示す。
【図１３】抗OCIFポリクローナル抗体を用いた時の、OCIFの検量線を示す。
【図１４】抗OCIFモノクローナル抗体を用いた時の、OCIFの検量線を示す。
【図１５】OCIFの骨粗鬆症に対する治療効果を示す。
【図１】
0003793180.tif 000018
【図２】
0003793180.tif 000019
【図３】
0003793180.tif 000020
【図４】
0003793180.tif 000021
【図５】
0003793180.tif 000022
【図６】
0003793180.tif 000023
【図７】
0003793180.tif 000024
【図８】
0003793180.tif 000025
【図９】
0003793180.tif 000026
【図１０】
0003793180.tif 000027
【図１１】
0003793180.tif 000028
【図１２】
0003793180.tif 000029
【図１３】
0003793180.tif 000030
【図１４】
0003793180.tif 000031
【図１５】
0003793180.tif 000032