(57)【要約】【課題】タンパク質ナノファイバーを形成するための核として機能する、構造タンパク質微小体を提供すること。【解決手段】構造タンパク質から構成され、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうち少なくとも２つを満たす、構造タンパク質微小体。（ｉ）チオフラビンＴ染色による蛍光強度測定で、４８０〜５００ｎｍの範囲内にピークを有する。（ｉｉ）小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）のＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔにおいて、Ｑが０．１５以下の領域にピークを有する。（ｉｉｉ）２つ以上の構造タンパク質分子の会合体である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造タンパク質から構成され、  下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうち少なくとも２つを満たす、構造タンパク質微小体。（ｉ）チオフラビンＴ染色による蛍光強度測定で、４８０〜５００ｎｍの範囲内にピークを有する。（ｉｉ）小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）のＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔにおいて、Ｑが０．１５以下の領域にピークを有する。（ｉｉｉ）２つ以上の構造タンパク質分子の会合体である。
【請求項２】
前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の全てを満たす、請求項１に記載の構造タンパク質微小体。
【請求項３】
動的光散乱法によって測定される平均粒子径が、１〜５０ｎｍである、請求項１又は２に記載の構造タンパク質微小体。
【請求項４】
前記（ｉｉ）を満たし、  小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）のＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔにおいて、前記ピークの大きさが、Ｑが０．１５以上０．３以下の領域における平均値の１．１倍以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の構造タンパク質微小体。
【請求項５】
前記（ｉｉｉ）を満たし、  Ｇｕｉｎｉｅｒ解析により求められる重量濃度で規格化した原点散乱強度が、未会合の前記構造タンパク質分子の原点散乱強度の１．５倍以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の構造タンパク質微小体。
【請求項６】
前記構造タンパク質が、改変フィブロインを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の構造タンパク質微小体。
【請求項７】
前記構造タンパク質が、改変クモ糸フィブロインを含む、請求項６に記載の構造タンパク質微小体。
【請求項８】
構造タンパク質と可溶化剤とを含む構造タンパク質溶液を得る第一工程と、前記構造タンパク質の前記構造タンパク質溶液に対する溶解度を下げることにより、請求項１〜７のいずれか一項に記載の構造タンパク質微小体を形成させる第二工程と、を含む、構造タンパク質微小体の製造方法。
【請求項９】
前記第二工程が、温度の調節、水の添加、界面活性剤の添加、有機溶媒の添加及び無機塩の添加からなる群より選択される少なくとも１つの方法により、上記溶解度を下げる工程である、請求項８に記載の、構造タンパク質微小体の製造方法。
【請求項１０】
前記第二工程が、温度の調節、水の添加、界面活性剤の添加、有機溶媒の添加及び無機塩の添加からなる群より選択される２つ以上の方法を組み合わせて、上記溶解度を下げる工程である、請求項９に記載の、構造タンパク質微小体の製造方法。
【請求項１１】
前記第二工程が、上記構造タンパク質溶液に対してせん断応力を印加することにより、上記溶解度を下げる工程である請求項８に記載の、構造タンパク質微小体の製造方法。
【請求項１２】
前記可溶化剤が、ジメチルスルホキシド、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム及び過塩素酸塩からなる群より選択される少なくとも一種を含んでいる、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の、構造タンパク質微小体の製造方法。
【請求項１３】
遠心分離により前記構造タンパク質微小体を回収する第三工程を更に含む、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の、構造タンパク質微小体の製造方法。
【請求項１４】
前記構造タンパク質が、改変フィブロインを含む、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の、構造タンパク質微小体の製造方法。
【請求項１５】
前記構造タンパク質が、改変クモ糸フィブロインを含む、請求項１４に記載の、構造タンパク質微小体の製造方法。
【請求項１６】
タンパク質が溶解したタンパク質溶液を準備するＡ工程と、  前記タンパク質溶液と請求項１〜７のいずれか一項に記載の構造タンパク質微小体とを混合して、タンパク質ナノファイバーを得る第Ｂ工程と、を含む、ナノファイバーの製造方法。
【請求項１７】
前記タンパク質溶液が、第一の溶媒を含み、  前記第一の溶媒が、有機溶媒、塩溶液、酸性溶液、塩基性溶液及びカオトロピック溶液からなる群より選択される一つである、請求項１６に記載の、ナノファイバーの製造方法。
【請求項１８】
前記第一の溶媒が、有機溶媒、塩溶液、酸性溶液及び塩基性溶液からなる群より選択される一つである、請求項１７に記載の、ナノファイバーの製造方法。
【請求項１９】
前記第一の溶媒が、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール及びジメチルスルホキシドからなる群より選択される一つである、請求項１８に記載の、ナノファイバーの製造方法。
【請求項２０】
前記タンパク質が、構造タンパク質を含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の、ナノファイバーの製造方法。
【請求項２１】
前記構造タンパク質が、改変フィブロインを含む、請求項２０に記載の、ナノファイバーの製造方法。
【請求項２２】
前記構造タンパク質が、改変クモ糸フィブロインを含む、請求項２１に記載の、ナノファイバーの製造方法。
【請求項２３】
タンパク質構造体の製造方法であって、  タンパク質から構成された繊維状物質を含有する構造前駆体を準備する（ア）工程と、  前記構造前駆体に異方性応力を作用させることにより前記繊維状物質を一方向に配向させて、前記タンパク質構造体を得る（イ）工程と、を含み、前記繊維状物質が、請求項１〜７のいずれか一項に記載の構造タンパク質微小体とタンパク質ナノファイバーのうちの少なくともいずれか一方を含んでいる、タンパク質構造体の製造方法。
【請求項２４】
前記タンパク質ナノファイバーが、前記構造タ
ンパク質微小体を核としてタンパク質が自己組織化してなるものである、請求項２３に記載の、タンパク質構造体の製造方法。
【請求項２５】
前記タンパク質ナノファイバーが、アミロイド様結晶を有する、請求項２３又は請求項２４に記載の、タンパク質構造体の製造方法。
【請求項２６】
前記アミロイド様結晶が、前記繊維状物質の配向方向に対して垂直に配向している、請求項２５に記載の、タンパク質構造体の製造方法。
【請求項２７】
前記繊維状物質の太さが３ｎｍ以上である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の、タンパク質構造体の製造方法。
【請求項２８】
前記（イ）工程において、前記構造前駆体の一方向における両端を固定し、乾燥収縮させることで前記異方性応力を作用させる、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の、タンパク質構造体の製造方法。
【請求項２９】
前記構造前駆体が、ハイドロゲル、繊維、フィルムからなる群より選択される少なくとも一つである、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の、タンパク質構造体の製造方法。
【請求項３０】
前記タンパク質が、改変フィブロインを含む、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の、タンパク質構造体の製造方法。
【請求項３１】
前記タンパク質が、改変クモ糸フィブロインを含む、請求項３０に記載の、タンパク質構造体の製造方法。              
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、構造タンパク質微小体及びその製造方法とナノファイバーの製造方法とタンパク質構造体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
金属分子を用いたナノ構造体は、色素増感太陽電池（酸化チタン）、導電インク（銀ナノワイヤー）等実用化されている、あるいは実用化に近い状況にある。  【０００３】
バイオテクノロジー分野においてもナノ構造体は注目されており、タンパク質ナノファイバーは機械特性を望んだとおりにデザインした細胞の足場シート、生体分子デバイス、細胞工学デバイス、再生医療・組織工学、バイオセンサー・アクチュエーターとしての利用並びに軽量・高強度材料、グリーンナノハイブリッド、環境浄化材料、自己修復材料、フィルタ、紡糸、コーティング、構造・物性解析関連の高精度精密機器等の材料として期待されている。  【０００４】
しかしながら、タンパク質ナノファイバーは実用化には至っていない（非特許文献１）。  【０００５】
また、ナノファイバーからなる、高度に配向した高分子材料には、導電性、熱伝導性、耐摩耗性などにおいて優れた物性を示すものがあり、こうした材料は非常に有用性が高い。  【０００６】
例えば、天然のクモが作る糸については、その高度な配向性が原子間力顕微鏡ＡＦＭの測定により確認されている。しかし、人工的にこのような高度な配向性をタンパク質ナノファイバーに与えることは困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌ．  Ｗａｎｇ，  Ｙ．  Ｓｕｎ，  Ｚ．  Ｌｉ，  Ａ．  Ｗｕ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｗｅｉ，  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  （Ｂａｓｅｌ）．，  ｖｏｌ．  ９，  ｎｏ．  １，  ２０１６“Ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｏｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ”
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上述の事情を背景にして為されたものであって、その第１の課題とするところは、タンパク質ナノファイバーを形成するための核として機能する、構造タンパク質微小体を提供することにある。  【０００９】
本発明の第２の課題とするところは、上記のような特徴的な構造タンパク質微小体を有利に製造し得る方法を提供することにある。  【００１０】
本発明の第３の課題とするところは、タンパク質から構成されるナノファイバーを容易に製造可能な、ナノファイバーの製造方法を提供することにある。  【００１１】
本発明の第４の課題とするところは、複数のタンパク質ナノファイバーが高度に配向した構造体を製造可能な、タンパク質構造体の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記第１の課題を解決する本発明（第１の発明）は、例えば、以下の各発明に関する。［１−１］構造タンパク質から構成され、  下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうち少なくとも２つを満たす、構造タンパク質微小体。（ｉ）チオフラビンＴ染色による蛍光強度測定で、４８０〜５００ｎｍの範囲内にピークを有する。（ｉｉ）小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）のＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔにおいて、Ｑが０．１５以下の領域にピークを有する。（ｉｉｉ）２つ以上の構造タンパク質分子の会合体である。  【００１３】
このような構造タンパク質微小体は、タンパク質ナノファイバーを形成するための核として機能する。このため、例えば、上記構造タンパク質微小体をタンパク質溶液に添加することで、タンパク質ナノファイバーを容易に形成することができる。  【００１４】
［１−２］上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の全てを満たす、［１−１］に記載の構造タンパク質微小体。  【００１５】
［１−３］動的光散乱法によって測定される平均粒子径が１〜５０ｎｍである、［１−１］又は［１−２］に記載の構造タンパク質微小体。  【００１６】
［１−４］少なくとも上記（ｉｉ）を満たし、小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）のＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔにおいて、前記ピークの大きさが、Ｑが０．１５以上０．３以下の領域における平均値の１．１倍以上である、［１−１］〜［１−３］の何れか一つに記載の構造タンパク質微小体。  【００１７】
［１−５］少なくとも上記（ｉｉｉ）を満たし、Ｇｕｉｎｉｅｒ解析により求められる重量濃度で規格化した原点散乱強度は、未会合の上記構造タンパク質分子の原点散乱強度の１．５倍以上である、［１−１］〜［１−４］の何れか一つに記載の構造タンパク質微小体。  【００１８】
［１−６］上記構造タンパク質が、改変フィブロインを含む、［１−１］〜［１−５］の何れか一つに記載の構造タンパク質微小体。  【００１９】
［１−７］  上記構造タンパク質が、改変クモ糸フィブロインを含む、［１−６］に記載の構造タンパク質微小体。  【００２０】
上記第２の課題を解決する本発明（第２の発明）は、例えば、以下の各発明に関する。  【００２１】
［２−１］  構造タンパク質と可溶化剤とを含む構造タンパク質溶液を得る第一工程と、上記構造タンパク質の上記構造タンパク質溶液に対する溶解度を下げることにより、［１−１］〜［１−７］のいずれか一つに記載の構造タンパク質微小体を形成させる第二工程と、を含む、構造タンパク質微小体の製造方法。  【００２２】
このような製造方法によれば、タンパク質ナノファイバーを形成するための核として機能する構造タンパク質微小体を容易に製造することができる。  【００２３】
［２−２］  上記第二工程が、温度の調節、水の添加、界面活性剤の添加、有機溶媒の添加及び無機塩の添加からなる群より選択される少なくとも１つの方法により、上記溶解度を下げる工程である、［２−１］に記載の、構造タンパク質微小体の製造方法。  【００２４】
［２−３］  上記第二工程が、温度の調節、水の添加、界面活性剤の添加、有機溶媒の添加及び無機塩の添加からなる群より選択される２つ以上の方法を組み合わせて、上記溶解度を下げる工程である、［２−２］に記載の、構造タンパク質微小体の製造方法。  【００２５】
［２−４］  上記第二工程が、上記構造タンパク質溶液に対してせん断応力を印加することにより、上記溶解度を下げる工程である［２−１］に記載の、構造タンパク質微小体の製造方法。【００２６】
［２−５］上記可溶化剤が、ジメチルスルホキシド、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム及び過塩素酸塩からなる群より選択される少なくとも一種を含んでいる、［２−１］〜［２−４］の何れか一つに記載の、構造タンパク質微小体の製造方法。  【００２７】
［２−６］遠心分離により上記構造タンパク質微小体を回収する第三工程を更に含んでいる、［２−１］〜［２−５］の何れか一つに記載の、構造タンパク質微小体の製造方法。  【００２８】
［２−７］上記構造タンパク質が、改変フィブロインを含んでいる［２−１］〜［２−６］の何れか一つに記載の、構造タンパク質微小体の製造方法。  【００２９】
［２−８］上記構造タンパク質が、改変クモ糸フィブロインを含んでいる［２−７］に記載の、構造タンパク質微小体の製造方法。  【００３０】
上記第３の課題を解決する本発明（第３の発明）は、例えば、以下の各発明に関する。  【００３１】
［３−１］  タンパク質が溶解したタンパク質溶液を準備するＡ工程と、上記タンパク質溶液と［１−１］〜［１−７］のいずれか一つに記載の構造タンパク質微小体とを混合して、タンパク質ナノファイバーを得るＢ工程と、を含む、ナノファイバーの製造方法。  【００３２】
このような製造方法では、タンパク質溶液と構造タンパク質微小体とを混合することで、構造タンパク質微小体を核としてタンパク質が自己組織化し、タンパク質から構成されたナノファイバーを容易に形成することができる。【００３３】
［３−２］  上記タンパク質溶液が、第一の溶媒を含み、上記第一の溶媒が、有機溶媒、塩溶液、酸性溶液、塩基性溶液及びカオトロピック溶液からなる群より選択される一つである、［３−１］に記載の、ナノファイバーの製造方法。【００３４】
［３−３］  上記第一の溶媒が、有機溶媒、塩溶液、酸性溶液及び塩基性溶液からなる群より選択される一つである、［３−２］に記載の、ナノファイバーの製造方法。【００３５】
［３−４］  上記第一の溶媒が、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール及びジメチルスルホキシドからなる群より選択される一つである、［３−３］に記載の、ナノファイバーの製造方法。【００３６】
［３−５］  上記タンパク質が、構造タンパク質を含む、［３−１］〜［３−４］のいずれか一つに記載の、ナノファイバーの製造方法。  【００３７】
［３−６］  上記構造タンパク質が、改変フィブロインを含む、［３−５］に記載の、ナノファイバーの製造方法。【００３８】
［３−７］  上記構造タンパク質が、改変クモ糸フィブロインを含む、［３−６］に記載の、ナノファイバーの製造方法。  【００３９】
上記第４の課題を解決する本発明（第４の発明）は、例えば、以下の各発明に関する。［４−１］  タンパク質構造体の製造方法であって、タンパク質から構成された繊維状物質を含有する構造前駆体を準備する（ア）工程と、上記構造前駆体に異方性応力を作用させることにより上記繊維状物質を一方向に配向させて、上記タンパク質構造体を得る（イ）工程と、を含み、上記繊維状物質が、［１−１］〜［１−７］のいずれか一つに記載の構造タンパク質微小体とタンパク質ナノファイバーのうちの少なくともいずれか一方を含んでいる、タンパク質構造体の製造方法。  【００４０】
このような製造方法によれば、タンパク質ナノファイバーが高度に配向したタンパク質構造体を容易に製造することができる。  【００４１】
［４−２］  上記タンパク質ナノファイバーが、上記構造タンパク質微小体を核としてタンパク質が自己組織化してなるものである、［４−１］に記載の、タンパク質構造体の製造方法。  【００４２】
［４−３］  上記タンパク質ナノファイバーが、アミロイド様結晶を有する、［４−１］又は［４−２］に記載の、タンパク質構造体の製造方法。  【００４３】
［４−４］  上記アミロイド様結晶が、上記繊維状物質の配向方向に対して垂直に配向している、［４−３］に記載の、タンパク質構造体の製造方法。  【００４４】
［４−５］  上記繊維状物質の太さが３ｎｍ以上である、［４−１］〜［４−４］のいずれか一項に記載の、タンパク質構造体の製造方法。  【００４５】
［４−６］  上記（イ）工程において、上記構造前駆体の一方向における両端を固定し、乾燥収縮させることで上記異方性応力を作用させる、［４−１］〜［４−５］のいずれか一項に記載の、タンパク質構造体の製造方法。  【００４６】
［４−７］  上記構造前駆体が、ハイドロゲル、繊維、フィルムからなる群より選択される少なくとも一つである、［４−１］〜［４−６］のいずれか一項に記載の、タンパク質構造体の製造方法。  【００４７】
［４−８］  上記タンパク質が、改変フィブロインを含む、［４−１］〜［４−７］のいずれか一項に記載の、タンパク質構造体の製造方法。  【００４８】
［４−９］  上記タンパク質が、改変クモ糸フィブロインを含む、［４−８］に記載の、タンパク質構造体の製造方法。
【発明の効果】
【００４９】
第一の発明によれば、タンパク質ナノファイバーを形成するための核として機能する、構造タンパク質微小体を提供することができる。  【００５０】
第二の発明によれば、タンパク質ナノファイバーを形成するための核として機能する、構造タンパク質微小体の有利な製造方法を提供することができる。  【００５１】
第三の発明によれば、タンパク質から構成されるナノファイバーを容易に製造可能な、ナノファイバーの製造方法を提供することができる。  【００５２】
第四の発明によれば、複数のタンパク質ナノファイバーが高度に配向した構造体を製造可能な、
タンパク質構造体の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】タンパク質の構造の変化を示す模式図である。（ａ）は溶解したタンパク質を示し、（ｂ）は円柱状のナノファイバーを形成したタンパク質を示す。
【図２】図２は、ＳＡＸＳ測定の測定原理を説明するための図である。
【図３】図３は、構造タンパク質微小体のＴｈＴ染色による蛍光強度測定の結果の一例を示す図である。
【図４】図４は、構造タンパク質微小体のＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔの一例を示す図である。
【図５】図５は、改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。
【図６】図６は、天然由来のフィブロインのｚ／ｗ（％）の値の分布を示す図である。
【図７】図７は、天然由来のフィブロインのｘ／ｙ（％）の値の分布を示す図である。
【図８】図８は、改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。
【図９】図９は、改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。
【図１０】図１０は、ナノファイバーの形成を確認するための蛍光強度測定の結果の一例を示す図である。
【図１１】図１１は、ナノファイバーの形成を確認するための蛍光強度測定の結果の別の例を示す図である。
【図１２】図１２（ａ）は、実施例４のタンパク質構造体の製造工程を説明するための図であり、図１２（ｂ）は、比較例２のタンパク質構造体の製造工程を説明するための図である。
【図１３】図１３は、実施例４のタンパク質構造体の２次元Ｘ線回折プロファイルを示す図である。
【図１４】比較例２のタンパク質構造体の２次元Ｘ線回折プロファイルを示す図である。
【図１５】図１５（ａ）は、実施例４のタンパク質構造体のＡＦＭ像を示す図であり、図１５（ｂ）は、比較例２のタンパク質構造体のＡＦＭ像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。  
【００５５】
（構造タンパク質微小体）  本実施形態に係る構造タンパク質微小体は、タンパク質から構成されており、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうち少なくとも２つ（好ましくは３つ全て）を満たすことを特徴とする。（ｉ）チオフラビンＴ染色による蛍光強度測定で、４８０〜５００ｎｍの範囲内にピークを有する。（ｉｉ）小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）のＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔにおいて、Ｑが０．１５以下の領域にピークを有する。（ｉｉｉ）２つ以上の構造タンパク質分子の会合体である。  
【００５６】
本実施形態に係る構造タンパク質微小体は、タンパク質ナノファイバーを形成するための核として機能する。このため、例えば、本実施形態に係る構造タンパク質微小体とタンパク質溶液とを混合することで、タンパク質ナノファイバーを容易に形成することができる。以下、（ｉ）〜（ｉｉｉ）について詳述する。  
【００５７】
＜（ｉ）チオフラビンＴ染色（ＴｈＴ染色）による蛍光強度測定＞  チオフラビンＴ（ＴｈＴ）はβシート構造に強く反応する蛍光色素であり、構造タンパク質微小体をＴｈＴで染色し、蛍光強度を測定することで、構造タンパク質微小体中のβシート構造の有無を確認することができる。  
【００５８】
蛍光強度は、蛍光光度計により測定することができる。蛍光光度計としては、例えば、ＪＡＳＣＯ  ＦＰ−８２００（日本分光株式会社製）等が挙げられる。測定は機器付属のマニュアルに準じて行えばよい。  
【００５９】
蛍光強度の測定は、具体的には、以下の条件で行うことができる。なお、測定試料には、構造タンパク質微小体を分散液（６Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩）、５ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）の水溶液、ｐＨ７．０）中に、５ｍｇ／ｍＬの濃度で分散させ、更にＴｈＴを４μＭとなるように添加したものを用いる。また、３回の測定の平均値を測定値とする。    測定機器：ＪＡＳＣＯ  ＦＰ−８２００（日本分光株式会社製）    測定範囲：４４０〜６００ｎｍ    励起波長：４５０ｎｍ    スキャンスピード：Ｍｅｄｉｕｍ    測定回数：３回  
【００６０】
なお、蛍光強度の測定には、プレートリーダー（例えば、ＳＹＮＥＲＧＹ  ＨＴＸ（バイオテック株式会社））を用いることもできる。プレートリーダーにより、蛍光強度の経時変化を追うことができる。測定は機器付属のマニュアルに準じて行えばよい。  
【００６１】
本実施形態では、ＴｈＴによる蛍光強度測定で得られる蛍光強度スペクトルにおいて、４８０〜５００ｎｍの範囲内にピークがあることが好ましい。この場合、構造タンパク質微小体がβシート構造を有しており、このような構造タンパク質微小体は、タンパク質ナノファイバーを形成するための核として特に機能しやすい。  
【００６２】
図３は、構造タンパク質微小体のＴｈＴ染色による蛍光強度測定の結果の一例を示す図である。図３のＡ１（図３に実線で示したグラフ）は、測定試料として、構造タンパク質微小体を第一の分散液（６Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ及び５ｍＭ  ＤＴＴの水溶液、ｐＨ７．０）中に５ｍｇ／ｍＬの濃度で分散させたものを用いた測定結果である。図３のＡ１は、４８０〜５００ｎｍの範囲内にピークを有しており、これにより、構造タンパク質微小体がβシート構造を有していることが確認される。  
【００６３】
なお、図３のＸ１（図３に破線で示したグラフ）は、測定試料として、構造タンパク質微小体を第二の分散液（５Ｍ  ＧｄｍＳＣＮ（グアニジンチオシアン酸）、１０ｍＭ  ｔｒｉｓＨＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴの水溶液、ｐＨ７．０）中に５ｍｇ／ｍＬの濃度で分散した後、透析により第二の分散液を第一の分散液に置換したものを用いた測定結果である。本発明者の知見によれば、構造タンパク質微小体は、第一の分散液中では、その構造を維持できるが、第二の分散液中では、その構造が維持されず、溶解して、未会合のランダムコイルの構造タンパク質分子として振る舞う。このため、図３のＸ１では、４８０〜５００ｎｍの範囲内にピークが無く、この結果から、第二の分散液中にβシート構造を有する構造タンパク質微小体が存在していないことが分かる。  
【００６４】
＜（ｉｉ）小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）のＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔ＞  ＳＡＸＳの測定は、具体的には、以下の条件で行うことができる。なお、測定試料には、構造タンパク質微小体を分散液（６Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ及び５ｍＭ  ＤＴＴの水溶液、ｐＨ７．０）中に、５ｍｇ／ｍＬの濃度で分散させたものを用いる。    測定装置：Ｘ線小角散乱測定装置ＮＡＮＯ−Ｖｉｅｗｅｒ  （リガク社製）、Ｘ線発生装置ＭｉｃｒｏＭＡＸ００７（リガク社製）、検出器ＰＩＬＡＴＵＳ  ２００Ｋ（ＤＥＣＴＲＩＳ社製）    測定条件：Ｘ線波長１．５４１８Å（ＣｕＫα）、室温（２０℃）、露光時間３０分  
【００６５】
上記条件での測定後、円周平均を行い、１次元プロファイルを得る。１次元プロファイルを、ＩｇｏｒＰｒｏソフトウェア（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ社製）を用いて解析することで、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔを得ることができる。なお、本明細書中、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔとは、横軸をＱ（＝４πｓｉｎθ／λ）（単位：Å−１）、縦軸をＩ（Ｑ）×Ｑ５／３（単位：無次元）、としてグラフ化したものを示す。  
【００６６】
本実施形態において、「Ｑが０．１５以下の領域にピークが存在する」という特徴は、構造タンパク質微小体が、電子密度の高い球状コア部を有していることを示すと考えられる。このことから、上記（ｉｉ）を満たす構造タンパク質微小体は、電子密度が高いコア部を有していると考えられる。このような構造タンパク質微小体は、タンパク質ナノファイバーを形成するための核として特に機能しやすい。  
【００６７】
本実施形態において、構造タンパク質微小体のＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔは、Ｑが０．１５以上０．３以下の領域における変化幅が±１０％以下であることが好ましい。このような特徴は、構造タンパク質微小体が、自己排除ランダムウォーク鎖（Ｓｅｌｆ−ａｖｏｉｄｉｎｇ  ｒａｎｄｏｍ  ｗａｌｋ  ｃｈａｉｎ）を有していることを示すと考えられる。すなわち、上記（ｉｉ）とこの特徴とを併せ持つ構造タンパク質微小体は、電子密度が高いコア部と、当該コア部を囲むように配置されたランダムコイルと、から構成されていると考えられる。このような構造タンパク質微小体は、タンパク質ナノファイバーを形成するための核として特に機能しやすい。  
【００６８】
本実施形態において、小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）のＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔにおける上記ピークの大きさは、Ｑが０．１５以上０．３以下の領域における平均値の１．１倍以上であることが好ましく、１．１５倍以上であることがより好ましい。また、上記ピークの大きさは、例えば、Ｑが０．１５以上０．３以下の領域における平均値の２倍以下であってよい。  
【００６９】
図４は、構造タンパク質微小体のＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔの一例を示す図である。図４のＡ２（図４に実線で示したグラフ）は、測定試料として、構造タンパク質微小体を第一の分散液（６Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ及び５ｍＭ  ＤＴＴの水溶液、ｐＨ７．０）中に５ｍｇ／ｍＬの濃度で分散させたものを用いた測定結果である。図４のＡ２は、Ｑが０．１５以下の領域にピークを有している。また、Ｑが０．１５以上０．３以下の領域における変化幅が±１０％以下となっている。この結果から、構造タンパク質微小体が、電子密度が高いコア部と、当該コア部を囲むように配置されたランダムコイルと、を備えていることが確認される。  
【００７０】
なお、図４のＸ２（図４に破線で示したグラフ）は、測定試料として、構造タンパク質微小体を第二の分散液（５Ｍ  ＧｄｍＳＣＮ（グアニジンチオシアン酸）、１０ｍＭ  ｔｒｉｓＨＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴの水溶液、ｐＨ７．０）中に５ｍｇ／ｍＬの濃度で分散した後、透析により第二の分散液を第一の分散液に置換したもの用いた測定結果である。本発明者の知見によれば、構造タンパク質微小体は、第一の分散液中では、その構造を維持できるが、第二の分散液中では、その構造が維持されず、溶解して、未会合のランダムコイルの構造タンパク質分子として振る舞う。このため、図４のＸ２では、Ｑが０．１５以下の領域にピークが無く、電子密度が高いコア部を備える構造タンパク質微小体が存在していないことが分かる。
【００７１】
＜（ｉｉｉ）構造タンパク質分子の会合＞  本実施形態の構造タンパク質微小体は、２つ以上の構造タンパク質分子が会合した会合体であることが好ましい。構造タンパク質微小体における構造タンパク質分子の会合数は、好ましくは２〜１０であり、より好ましくは２〜５であり、更に好ましくは３である。  
【００７２】
構造タンパク質微小体における会合数は、例えば、未会合の構造タンパク質分子の分子量と、会合体の分子量とを比較することで確認することができる。具体的には、例えば、Ｇｕｉｎｉｅｒ解析により求められる重量濃度で規格化した原点散乱強度によって、構造タンパク質微小体における会合数を確認することができる。原点散乱強度は、測定試料の分子量に比例することが知られているため、例えば、構造タンパク質微小体の原点散乱強度が、未会合の構造タンパク質分子の原点散乱強度の２．５倍以上３．５倍未満であれば、構造タンパク質微小体の会合数は３となる。  
【００７３】
すなわち、本実施形態において、構造タンパク質微小体のＧｕｉｎｉｅｒ解析により求められる原点散乱強度は、未会合の構造タンパク質分子の原点散乱強度の１．５倍以上であることが好ましく、１．５倍以上１０．５倍未満であることがより好ましく、１．５倍以上５．５倍未満であることが更に好ましく、２．５倍以上３．５倍未満であってもよい。  
【００７４】
なお、Ｇｕｉｎｉｅｒ解析は、具体的には、以下の方法で行うことができる。  まず、第一の測定
試料群として、構造タンパク質微小体を第一の分散液（６Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ及び５ｍＭ  ＤＴＴの水溶液、ｐＨ７．０）中に、２ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で分散させたものを準備する。  次いで、第二の測定試料群として、構造タンパク質微小体を第二の分散液（５Ｍ  ＧｄｍＳＣＮ（グアニジンチオシアン酸）、１０ｍＭ  ｔｒｉｓＨＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴの水溶液、ｐＨ７．０）中に分散した後、透析により第二の分散液を第一の分散液に置換して、２ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬの濃度の測定試料を準備する。  第一の測定試料群及び第二の測定試料群について、それぞれ、以下の測定装置及び測定条件により、ＳＡＸＳ測定を行う。    測定装置：Ｘ線小角散乱測定装置ＮＡＮＯ−Ｖｉｅｗｅｒ  （リガク社製）、Ｘ線発生装置ＭｉｃｒｏＭＡＸ００７（リガク社製）、検出器ＰＩＬＡＴＵＳ  ２００Ｋ（ＤＥＣＴＲＩＳ社製）    測定条件：Ｘ線波長１．５４１８Å（ＣｕＫα）、室温（２０℃）、露光時間３０分  
【００７５】
ＳＡＸＳ測定により得られた各試料の散乱曲線をＧｕｉｎｉｅｒ解析し、その結果から濃度０ｍｇ／ｍｌでの濃度で規格化した原点散乱強度（Ｉ（０））を求める。第一の測定試料群から求められた濃度で規格化した原点散乱強度と、第二の測定試料群から求められた濃度で規格化した原点散乱強度と、を比較することで、構造タンパク質微小体における会合数が確認できる。なお、第一の測定試料群から求められた濃度で規格化した原点散乱強度が、構造タンパク質微小体の分子量に相当し、第二の測定試料群から求められた濃度で規格化した原点散乱強度が、未会合の構造タンパク質分子の分子量に相当する。  
【００７６】
本発明者の知見によれば、構造タンパク質微小体は、第一の分散液中では、その構造を維持できるが、第二の分散液中では、その構造が維持されず、溶解して、未会合のランダムコイルの構造タンパク質分子として振る舞う。このため、上記方法によって、構造タンパク質微小体における会合数を確認することができる。  
【００７７】
以下、Ｘ線小角散乱（ＳＡＸＳ）、Ｇｕｉｎｉｅｒ解析及びＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔについて詳述する。  
【００７８】
ＳＡＸＳ測定  ＳＡＸＳ測定は、Ｘ線を物質に照射して散乱したＸ線のうち、２θ＜１０°以下の小角側に現れるものを測定し、物質の構造を評価することができる手法である。  
【００７９】
図２は、ＳＡＸＳ測定の測定原理を説明するための図である。１つの物体からの散乱を考えた場合、図２で示すＡ点で散乱されたＸ線とＢ点で散乱されたＸ線が散乱角（入射方向と散乱方向の間の角度）２θの方向でどのように強めあうかは、光路長の差と波長の関係で決定される。入射ベクトルをＱ０、散乱角２θ方向のベクトルをＱ１とすると、光路長による位相差はｒ・Ｑ０−ｒ・Ｑ１で表される。弾性散乱の場合、波長は不変であるため、    
【数１】
2020241769.tif 000002
である。  散乱ベクトルを    
【数２】
2020241769.tif 000003
と定義すると、    
【数３】
2020241769.tif 000004
となり、２つの波の位相差はｒＱとなる。  タンパク質溶液は水に対して電子密度が高いので、タンパク質溶液からの散乱から水の散乱を差し引くと、タンパク質構造のみに起因する散乱を得ることができる。溶液散乱の場合、タンパク質は溶液中で等方的に存在するので、散乱は同心円状となる。  
【００８０】
物体１個からの散乱振幅Ｆ１（Ｑ）は、物体内ｒ点での水の電子密度との差をΔρ（ｒ）とすると、    
【数４】
2020241769.tif 000005
となる。すなわち散乱振幅は電子密度のフーリエ変換である。溶液中では粒子が不規則に存在するために、全配向について平均化された個々の粒子からの散乱が等方的な散乱強度として観測される。個々の粒子からの散乱強度をｉ１（Ｑ）、Ｎ個の粒子からの散乱をＩ（Ｑ）とすると、    
【数５】
2020241769.tif 000006
【数６】
2020241769.tif 000007
となる。理想的な単分散系では、Ｎ個の蛋白質分子からの散乱は空間平均された１分子からの散乱強度のＮ倍となる。    
【数７】
2020241769.tif 000008
【００８１】
φ（ｒ）のフーリエ変換ＦＴ［φ（ｒ）］とΨ（ｒ）のフーリエ変換ＦＴ［Ψ（ｒ）］の積ＦＴ［φ（ｒ）］・ＦＴ［Ψ（ｒ）］はφ（ｒ）とΨ（ｒ）のコンボリューションφ（ｒ）＊Ψ（ｒ）のフーリエ変換ＦＴ［φ（ｒ）＊Ψ（ｒ）］と等しい（ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｈｅｏｒｅｍ）ことから、１分子の散乱強度ｉ１（Ｑ）を次のように表すことができる。    
【数８】
2020241769.tif 000009
【００８２】
ここで自己相関関数γ（ｒ）    
【数９】
2020241769.tif 000010
を導入すると、    
【数１０】
2020241769.tif 000011
となり、更に、    
【数１１】
2020241769.tif 000012
【数１２】
2020241769.tif 000013
と表される。式（Ａ−１）のＰ（ｒ）関数を動径分布関数という。  
【００８３】
タンパク質1分子からの散乱を、タンパク質を構成する原子の散乱の総和と考えると、    
【数１３】
2020241769.tif 000014
ここでｆｉ（Ｑ）はｉ番目の原子からの散乱で、空間平均された散乱はＤｅｂｙｅにより、    
【数１４】
2020241769.tif 000015
である。連続的な電子密度を考えると、    
【数１５】
2020241769.tif 000016
と表現できる。  
【００８４】
Ｇｕｉｎｉｅｒ解析  Ｇｕｉｎｉｅｒプロットは、散乱ベクトルの二乗に対して散乱強度の対数をプロットするもので、小角領域では直線近似できる。  式（Ａ−１）において、散乱角が非常に小さな領域を考える。    
【数１６】
2020241769.tif 000017
というようにＴａｙｌｏｒ展開でき、    
【数１７】
2020241769.tif 000018
と近似される。ここで、    
【数１８】
2020241769.tif 000019
である。  
【００８５】
同様に、式（Ａ−２）ついて、溶液中の構造タンパク質分子全体からの散乱に拡張したＩ（Ｑ）に関してＴａｙｌｏｒ展開を行うと、    
【数１９】
2020241769.tif 000020
となり、この場合、    
【数２０】
2020241769.tif 000021
である。  
【００８６】
座標を交換してｒ０を原点とすると、    
【数２１】
2020241769.tif 000022
と計算できる。ｒ０は分子の重心と一致させることができるため、上式第２項はゼロとなり、    
【数２２】
2020241769.tif 000023
となる。従って、    
【数２３】
2020241769.tif 000024
を得る。これをＧｕｉｎｉｅｒの法則という。式（Ａ−３）で回転半径Ｒｇ２を次のように定義した。    
【数２４】
2020241769.tif 000025
式（Ａ−３）で両辺の自然対数をとると、    
【数２５】
2020241769.tif 000026
となる。  
【００８７】
横軸にＱ２、縦軸にｌｎ［Ｉ（Ｑ）］をプロットしたものをＧｕｉｎｉｅｒプロットと呼ぶ。散乱曲線の小角領域には直線領域が存在し、その傾きから慣性半径Ｒｇ２を、その直線を原点に外挿して得られるＹ切片から原点散乱強度Ｉ（０）が求められる。  式（Ａ−１）においてＱ＝０すなわち原点での散乱強度は、    
【数２６】
2020241769.tif 000027
である。  
【００８８】
水よりも電子密度の高いタンパク質電子数の総和に関する式となるから、    
【数２７】
2020241769.tif 000028
となる。ここでｍ、ｍ０はタンパク質１分子の占める体積内のタンパク質と水の電子数、Ｍ、νｐはそれぞれタンパク質の分子量と偏比容、ρ、ρ０はそれぞれタンパク質と水の電子密度である。  Ｘ線の照射体積Ｖ（ｍｌ）中にＮ個の構造タンパク質分子が存在する系からの散乱では、下記式：    
【数２８】
2020241769.tif 000029
のタンパク質濃度ｃを用いて、    
【数２９】
2020241769.tif 000030
となる。  標準試料と目的タンパク質の原点散乱強度を濃度で規格化し比較することで、構造タンパク質分子の見かけの分子量を見積もることができる。このことから、溶液中の構造タンパク質の会合数を求めることも可能である。  
【００８９】
Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔ  Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔは、Ｑ２に散乱強度Ｉ（Ｑ）をかけたものＩ（Ｑ）・Ｑ２を、Ｑに対してプロットするものである。コンパクトな球状構造からの散乱曲線は、Ｉ（Ｑ）がＱ−４に従う領域を持つ（Ｐｏｒｏｄ則）、すなわちＩ（Ｑ）・Ｑ２がＱ−２に従う領域が存在し、Ｋｒａｔｋｙプロットには必ずピークが現れる。より小角側に存在するピークはより大きな慣性半径を、より中角領域側に存在するピークの存在はより小さな慣性半径を示す。また、良溶媒中に存在する理想的なランダムコイル（ガウス鎖）からの散乱曲線はＱ−２に従うようになる。よってそのＫｒａｔｋｙプロットは横軸に平行な直線に漸近する。実際のランダムな鎖状分子内には持続長と呼ばれる直線にみなすことのできるセグメントが存在する。故に広角側の散乱曲線は針状分子からの散乱曲線Ｉ（Ｑ）∝Ｑ−１に比例し、Ｋｒａｔｋｙプロットは原点を通る直線に漸近する。  タンパク質のＫｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔを比較することで、タンパク質の球状性やコンパクトさについて観測することができる。  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  ｐｌｏｔは自己排除ランダムウォーク鎖（Ｓｅｌｆ−ａｖｏｉｄｉｎｇ  ｒａｎｄｏｍ  ｗａｌｋ  ｃｈａｉｎ）を考慮したＫｒａｔｋｙプロットである。自己排除ランダムウォーク鎖の場合、広角領域はＱ−５／３に比例する。例えばＤｅｎｄｒｉｍｅｒやＳｔａｒ  ｐｏｌｙｍｅｒのような電子密度が高いコア部分とそれを囲むようにランダムコイルが配置された構造持つ高分子のＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  ｐｌｏｔでは、小角領域にピークが、広角領域には水平な領域が観測される。  
【００９０】
本実施形態に係る構造タンパク質微小体の平均粒子径は、１〜５０ｎｍであることが好ましく、３〜３０ｎｍであることがより好ましく、９〜１５ｎｍであることが更に好ましい。  
【００９１】
なお、本明細書中、構造タンパク質微小体の平均粒子径は、動的散乱法によって測定
される体積平均径を示す。より具体的には、構造タンパク質微小体の平均粒子径は、以下の方法で測定される。
【００９２】
まず、測定試料群として、構造タンパク質微小体を第一の分散液（６Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ及び５ｍＭ  ＤＴＴの水溶液、ｐＨ７．０）中に、２ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で分散させたものを準備する。  次いで、各測定試料について、以下の条件で動的光散乱法による粒度分布の測定を行い、体積平均径を求める。    測定装置：ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ  ｎａｎｏ−ＺＳ（マルバーン社製）    測定温度：２０℃  各測定試料について５回ずつ上記測定を行い、得られた測定値の平均値を求める。  各測定試料の濃度及び測定値（平均値）から、濃度に対する平均粒子径のプロットを取り、分子間相互作用を排除した０濃度外挿を行う。０濃度外挿により得られた値を、構造タンパク質微小体の平均粒子径とする。  
【００９３】
構造タンパク質微小体を構成する構造タンパク質について、以下に詳述する。  
【００９４】
構造タンパク質としては、天然構造タンパク質と改変構造タンパク質（人工構造タンパク質）とを挙げることができる。また、改変構造タンパク質としては、工業規模での製造が可能な任意の構造タンパク質を挙げることができる。そのような構造タンパク質の具体例としては、スパイダーシルク、カイコシルク、ミノムシシルク、ホーネットシルク、ケラチン、コラ−ゲン、エラスチン及びレシリン、並びにこれら由来のタンパク質等を挙げることができる。  
【００９５】
構造タンパク質微小体を構成する構造タンパク質としては、フィブロイン様タンパク質（以下、単に「フィブロイン」ともいう。）が好ましく、改変フィブロインがより好ましく、改変クモ糸フィブロインが更に好ましい。  
【００９６】
（改変フィブロイン）  本実施形態に係る改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。改変フィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。  
【００９７】
本明細書において「改変フィブロイン」とは、人為的に製造されたフィブロイン（人造フィブロイン）を意味する。改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるフィブロインであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列と同一であるフィブロインであってもよい。本明細書でいう「天然由来のフィブロイン」もまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。  
【００９８】
「改変フィブロイン」は、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列をそのまま利用したものであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列に依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のフィブロインに依らず人工的に設計及び合成したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。  
【００９９】
本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、アミノ酸残基数は２〜２７である。（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、２〜２０、４〜２７、４〜２０、８〜２０、１０〜２０、４〜１６、８〜１６、又は１０〜１６の整数であってよい。また、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されてもよい。ＲＥＰは２〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。ｍは２〜３００の整数を示し、１０〜３００の整数であってもよい。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。  
【０１００】
本実施形態に係る改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列に対し、例えば、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行うことで得ることができる。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。  
【０１０１】
天然由来のフィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質であり、具体的には、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ  ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ  Ｃｙｎｔｈｉａ  ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、及びスズメバチ（Ｖｅｓｐａ  ｓｉｍｉｌｌｉｍａ  ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。  
【０１０２】
昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、及びＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。  
【０１０３】
クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、クモ目（Ａｒａｎｅａｅ）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。より具体的には、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）、ＡｃＳｐ、ＰｙＳｐ、Ｆｌａｇ等が挙げられる。  
【０１０４】
クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ−３（ａｄｆ−３）［Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ−４（ａｄｆ−４）［Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  ２［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  ２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕ
ｌｌａｔｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ  ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。  
【０１０５】
天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ  ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。  
【０１０６】
本実施形態に係る改変フィブロインは、改変絹（シルク）フィブロイン（カイコが産生する絹タンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、改変クモ糸フィブロイン（クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）であってもよい。改変フィブロインとしては、難燃性により優れることから、改変クモ糸フィブロインが好ましい。  
【０１０７】
改変フィブロインの具体的な例として、クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロイン（第１の改変フィブロイン）、グリシン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第２の改変フィブロイン）、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第３の改変フィブロイン）、グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン（第４の改変フィブロイン）、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有する改変フィブロイン（第５の改変フィブロイン）、並びにグルタミン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第６の改変フィブロイン）が挙げられる。  
【０１０８】
第１の改変フィブロインとしては、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。第１の改変フィブロインにおいて、（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、３〜２０の整数が好ましく、４〜２０の整数がより好ましく、８〜２０の整数が更に好ましく、１０〜２０の整数が更により好ましく、４〜１６の整数が更によりまた好ましく、８〜１６の整数が特に好ましく、１０〜１６の整数が最も好ましい。第１の改変フィブロインは、式１中、ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の数は、１０〜２００残基であることが好ましく、１０〜１５０残基であることがより好ましく、２０〜１００残基であることが更に好ましく、２０〜７５残基であることが更により好ましい。第１の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列中に含まれるグリシン残基、セリン残基及びアラニン残基の合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して、４０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることが更に好ましい。  
【０１０９】
第１の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドであってもよい。  
【０１１０】
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７、ＮＣＢＩ）のアミノ酸配列のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号３に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。  
【０１１１】
第１の改変フィブロインのより具体的な例として、（１−ｉ）配列番号４（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＤＦ３ＫａｉＬａｒｇｅＮＲＳＨ１）で示されるアミノ酸配列、又は（１−ｉｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。  
【０１１２】
配列番号４で示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１〜１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と同一である。  
【０１１３】
（１−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。  
【０１１４】
第２の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第２の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。  
【０１１５】
第２の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中のＧＧＸ及びＧＰＧＸＸ（但し、Ｇはグリシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）から選ばれる少なくとも一つのモチーフ配列において、少なくとも１又は複数の当該モチーフ配列中の１つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。  
【０１１６】
第２の改変フィブロインは、上述のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、１０％以上であってもよい。  
【０１１７】
第２の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の全ＲＥＰに含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが３０％以上、４０％以上、５０％以上又は５０．９％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。  
【０１１８】
第２の改変フィブロインは、ＧＧＸモチーフの１つのグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換することにより、ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合を高めたものであることが好ましい。第２の改変フィブロインは、ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が３０％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、１０％以下であることが更に好ましく、６％以下であることが更により好ましく、４％以下であることが更によりまた好ましく、２％以下であることが特に好ましい。ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合は、下記ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合（ｚ／ｗ）の算出方法と同様の方法で算出することができる。  
【０１１９】
ｚ／ｗの算出方法を更に詳細に説明する。まず、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる全てのＲＥＰから、ＸＧＸからなるアミノ酸配列を抽出する。ＸＧＸを構成するアミノ酸残基の総数がｚである。例えば、ＸＧＸからなるアミノ酸配列が５０個抽出された場合（重複はなし）、ｚは５０×３＝１５０である。また、例えば、ＸＧＸＧＸからなるアミノ酸配列の場合のように２つのＸＧＸに含まれるＸ（中央のＸ）が存在する場合は、重複分を控除して計算する（ＸＧＸＧＸの場合は５アミノ酸残基である）。ｗは、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる総アミノ酸残基数である。例えば、図５に示したドメイン配列の場合、ｗは４＋５０＋４＋１００＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝２３０である（最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフは除いている。）。次に、ｚをｗで除すことによって、ｚ／ｗ（％）を算出することができる。  
【０１２０】
ここで、天然由来のフィブロインにおけるｚ／ｗについて説明する。まず、上述のように、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、６６３種類のフィブロイン（このうち、クモ類由来のフィブロインは４１５種類）が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、フィブロイン中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が６％以下である天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、ｚ／ｗを算出した。その結果を図６に示す。図６の横軸はｚ／ｗ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図６から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるｚ／ｗは、いずれも５０．９％未満である（最も高いもので、５０．８６％）。  
【０１２１】
第２の改変フィブロインにおいて、ｚ／ｗは、５０．９％以上であることが好ましく、５６．１％以上であることがより好ましく、５８．７％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、８０％以上であることが更によりまた好ましい。ｚ／ｗの上限に特に制限はないが、例えば、９５％以下であってもよい。  
【０１２２】
第２の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、グリシン残基をコードする塩基配列の少なくとも一部を置換して別のアミノ酸残基をコードするように改変することにより得ることができる。このとき、改変するグリシン残基として、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフにおける１つのグリシン残基を選択してもよいし、またｚ／ｗが５０．９％以上になるように置換してもよい。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記態様を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中のグリ
シン残基を別のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。  
【０１２３】
上記の別のアミノ酸残基としては、グリシン残基以外のアミノ酸残基であれば特に制限はないが、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、メチオニン（Ｍ）残基、プロリン（Ｐ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びトリプトファン（Ｗ）残基等の疎水性アミノ酸残基、グルタミン（Ｑ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基、リシン（Ｋ）残基及びグルタミン酸（Ｅ）残基等の親水性アミノ酸残基が好ましく、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びグルタミン（Ｑ）残基がより好ましく、グルタミン（Ｑ）残基が更に好ましい。  
【０１２４】
第２の改変フィブロインのより具体的な例として、（２−ｉ）配列番号６（Ｍｅｔ−ＰＲＴ３８０）、配列番号７（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ−ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号９（Ｍｅｔ−ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（２−ｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。  
【０１２５】
（２−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１０（Ｍｅｔ−ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、配列番号６で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号７の分子量とほぼ同じとなるようにＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端に所定のヒンジ配列とＨｉｓタグ配列が付加されたものである。  
【０１２６】
配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）におけるｚ／ｗの値は、４６．８％である。配列番号６で示されるアミノ酸配列、配列番号７で示されるアミノ酸配列、配列番号８で示されるアミノ酸配列、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ５８．７％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。また、配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のギザ比率（後述する）１：１．８〜１１．３におけるｘ／ｙの値は、それぞれ１５．０％、１５．０％、９３．４％、９２．７％及び８９．８％である。  
【０１２７】
（２−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。  
【０１２８】
（２−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２−ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。  
【０１２９】
（２−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。  
【０１３０】
第２の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。  
【０１３１】
タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｍｅｔａｌ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含むアミノ酸配列）が挙げられる。  
【０１３２】
また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。  
【０１３３】
さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。  
【０１３４】
さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。  
【０１３５】
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（２−ｉｉｉ）配列番号１２（ＰＲＴ３８０）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（２−ｉｖ）配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。  
【０１３６】
配列番号１６（ＰＲＴ３１３）、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。  
【０１３７】
（２−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。  
【０１３８】
（２−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２−ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。  
【０１３９】
（２−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。  
【０１４０】
第２の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。  
【０１４１】
第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第３の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。  
【０１４２】
第３の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインから（Ａ）ｎモチーフを１０〜４０％欠失させたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。  
【０１４３】
第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって１〜３つの（Ａ）ｎモチーフ毎に１つの（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。  
【０１４４】
第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つ連続した（Ａ）ｎモチーフの欠失、及び１つの（Ａ）ｎモチーフの欠失がこの順に繰り返されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。  
【０１４５】
第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。  
【０１４６】
第３の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。  
【０１４７】
ｘ／ｙの算出方法を図５を参照しながら更に詳細に説明する。図５には、改変フィブロインからＮ末端配列及びＣ末端配列を除いたドメイン配列を示す。当該ドメイン配列は、Ｎ末端側（左側）から（Ａ）ｎモチーフ−第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第３のＲＥＰ（１０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフという配列を有する。  
【０１４８】
隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットは、重複がないように、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、順次選択する。このとき、選択されない［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニッ
トが存在してもよい。図５には、パターン１（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第３のＲＥＰと第４のＲＥＰの比較）、パターン２（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン３（第２のＲＥＰと第３のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン４（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較）を示した。なお、これ以外にも選択方法は存在する。  
【０１４９】
次に各パターンについて、選択した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニット中の各ＲＥＰのアミノ酸残基数を比較する。比較は、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときの、他方のアミノ酸残基数の比を求めることによって行う。例えば、第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）と第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第１のＲＥＰを１としたとき、第２のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、１００／５０＝２である。同様に、第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）と第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第４のＲＥＰを１としたとき、第５のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、３０／２０＝１．５である。  
【０１５０】
図５中、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となる［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの組を実線で示した。本明細書中、この比をギザ比率と呼ぶ。よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８未満又は１１．３超となる［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの組は破線で示した。  
【０１５１】
各パターンにおいて、実線で示した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの全てのアミノ酸残基数を足し合わせる（ＲＥＰのみではなく、（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数もである。）。そして、足し合わせた合計値を比較して、当該合計値が最大となるパターンの合計値（合計値の最大値）をｘとする。図５に示した例では、パターン１の合計値が最大である。  
【０１５２】
次に、ｘをドメイン配列の総アミノ酸残基数ｙで除すことによって、ｘ／ｙ（％）を算出することができる。  
【０１５３】
第３の改変フィブロインにおいて、ｘ／ｙは、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、６５％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、７５％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、例えば、１００％以下であってよい。ギザ比率が１：１．９〜１１．３の場合には、ｘ／ｙは８９．６％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．８〜３．４の場合には、ｘ／ｙは７７．１％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９〜８．４の場合には、ｘ／ｙは７５．９％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９〜４．１の場合には、ｘ／ｙは６４．２％以上であることが好ましい。  
【０１５４】
第３の改変フィブロインが、ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフの少なくとも７つがアラニン残基のみで構成される改変フィブロインである場合、ｘ／ｙは、４６．４％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、５５％以上であることが更に好ましく、６０％以上であることが更により好ましく、７０％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、１００％以下であればよい。  
【０１５５】
ここで、天然由来のフィブロインにおけるｘ／ｙについて説明する。まず、上述のように、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、６６３種類のフィブロイン（このうち、クモ類由来のフィブロインは４１５種類）が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列で構成される天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、ｘ／ｙを算出した。ギザ比率が１：１．９〜４．１の場合の結果を図８に示す。  
【０１５６】
図７の横軸はｘ／ｙ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図７から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるｘ／ｙは、いずれも６４．２％未満である（最も高いもので、６４．１４％）。  
【０１５７】
第３の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように（Ａ）ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。  
【０１５８】
第３の改変フィブロインのより具体的な例として、（３−ｉ）配列番号１７（Ｍｅｔ−ＰＲＴ３９９）、配列番号７（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ−ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号９（Ｍｅｔ−ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（３−ｉｉ）配列番号１７、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。  
【０１５９】
（３−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号１７で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１０（Ｍｅｔ−ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列は、第２の改変フィブロインで説明したとおりである。  
【０１６０】
配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）のギザ比率１：１．８〜１１．３におけるｘ／ｙの値は１５．０％である。配列番号１７で示されるアミノ酸配列、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、いずれも９３．４％である。配列番号８で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、９２．７％である。配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、８９．８％である。配列番号１０、配列番号１７、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ４６．８％、５６．２％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。  
【０１６１】
（３−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。  
【０１６２】
（３−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３−ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。  
【０１６３】
（３−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３（ギザ比率が１：１．８〜１１．３）となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。  
【０１６４】
第３の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方に上述したタグ配列を含んでいてもよい。  
【０１６５】
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（３−ｉｉｉ）配列番号１８（ＰＲＴ３９９）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（３−ｉｖ）配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。  
【０１６６】
配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。  
【０１６７】
（３−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。  
【０１６８】
（３−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３−ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。  
【０１６９】
（３−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。  
【０１７０】
第３の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。  
【０１７１】
第４の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたことに加え、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有するものである。第４の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに加え、更に少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。すなわち、第４の改変フィブロインは、上述した第２の改変フィブロインと、第３の改変フィブロインの特徴を併せ持つ改変フィブロインである。具体的な態様等は、第２の改変フィブロイン、及び第３の改変フィブロインで説明したとおりである。  
【０１７２】
第４の改変フィブロインのより具体的な例として、（４−ｉ）配列番号７（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０）、配
列番号８（Ｍｅｔ−ＰＲＴ５２５）、配列番号９（Ｍｅｔ−ＰＲＴ７９９）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（４−ｉｉ）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインの具体的な態様は上述のとおりである。  
【０１７３】
第５の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列を有するものであってよい。  
【０１７４】
局所的に疎水性指標の大きい領域は、連続する２〜４アミノ酸残基で構成されていることが好ましい。  
【０１７５】
上述の疎水性指標の大きいアミノ酸残基は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましい。  
【０１７６】
第５の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に、天然由来のフィブロインと比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。  
【０１７７】
第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。  
【０１７８】
第５の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であるアミノ酸配列を有してもよい。  
【０１７９】
アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ  Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  Ｒ（１９８２）“Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５−１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、以下「ＨＩ」とも記す。）は、下記表１に示すとおりである。  
【０１８０】
【表１】
2020241769.tif 000031
【０１８１】
ｐ／ｑの算出方法を更に詳細に説明する。算出には、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列（以下、「配列Ａ」とする）を用いる。まず、配列Ａに含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値を算出する。疎水性指標の平均値は、連続する４アミノ酸残基に含まれる各アミノ酸残基のＨＩの総和を４（アミノ酸残基数）で除して求める。疎水性指標の平均値は、全ての連続する４アミノ酸残基について求める（各アミノ酸残基は、１〜４回平均値の算出に用いられる。）。次いで、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域を特定する。あるアミノ酸残基が、複数の「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」に該当する場合であっても、領域中には１アミノ酸残基として含まれることになる。そして、当該領域に含まれるアミノ酸残基の総数がｐである。また、配列Ａに含まれるアミノ酸残基の総数がｑである。  
【０１８２】
例えば、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が２０カ所抽出された場合（重複はなし）、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、連続する４アミノ酸残基（重複はなし）が２０含まれることになり、ｐは２０×４＝８０である。また、例えば、２つの「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が１アミノ酸残基だけ重複して存在する場合、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、７アミノ酸残基含まれることになる（ｐ＝２×４−１＝７。「−１」は重複分の控除である。）。例えば、図８に示したドメイン配列の場合、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が重複せずに７つ存在するため、ｐは７×４＝２８となる。また、例えば、図８に示したドメイン配列の場合、ｑは４＋５０＋４＋４０＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝１７０である（Ｃ末端側の最後に存在する（Ａ）ｎモチーフは含めない）。次に、ｐをｑで除すことによって、ｐ／ｑ（％）を算出することができる。図８の場合２８／１７０＝１６．４７％となる。  
【０１８３】
第５の改変フィブロインにおいて、ｐ／ｑは、６．２％以上であることが好ましく、７％以上であることがより好ましく、１０％以上であることが更に好ましく、２０％以上であることが更により好ましく、３０％以上であることが更によりまた好ましい。ｐ／ｑの上限は、特に制限されないが、例えば、４５％以下であってもよい。  
【０１８４】
第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインのアミノ酸配列を、上記のｐ／ｑの条件を満たすように、ＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列に改変することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記のｐ／ｑの条件を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当する改変を行ってもよい。  
【０１８５】
疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、特に制限はないが、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）が好ましく、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）がより好ましい。  
【０１８６】
第５の改変フィブロインのより具体的な例として、（５−ｉ）配列番号１９（Ｍｅｔ−ＰＲＴ７２０）、配列番号２０（Ｍｅｔ−ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号２１（Ｍｅｔ−ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又は（５−ｉｉ）配列番号１９、配列番号２０若しくは配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。  
【０１８７】
（５−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号１９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０）で示されるアミノ酸配列に対し、Ｃ末端側の端末のドメイン配列を除いて、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、かつＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号２０で示されるアミノ酸配列は、配列番号８（Ｍｅｔ−ＰＲＴ５２５）で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を１カ所挿入したものである。配列番号２１で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入したものである。  
【０１８８】
（５−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。  
【０１８９】
（５−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５−ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。  
【０１９０】
（５−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。  
【０１９１】
第５の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。  
【０１９２】
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（５−ｉｉｉ）配列番号２２（ＰＲＴ７２０）、配列番号２３（ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号２４（ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又は（５−ｉｖ）配列番号２２、配列番号２３若しくは配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。  
【０１９３】
配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４で示されるアミノ酸配列は
、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。  
【０１９４】
（５−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。  
【０１９５】
（５−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５−ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。  
【０１９６】
（５−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。  
【０１９７】
第５の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。  
【０１９８】
第６の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。  
【０１９９】
第６の改変フィブロインは、ＲＥＰのアミノ酸配列中に、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフから選ばれる少なくとも一つのモチーフが含まれていることが好ましい。  
【０２００】
第６の改変フィブロインが、ＲＥＰ中にＧＰＧＸＸモチーフを含む場合、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、通常１％以上であり、５％以上であってもよく、１０％以上であるのが好ましい。ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の上限に特に制限はなく、５０％以下であってよく、３０％以下であってもよい。  
【０２０１】
本明細書において、「ＧＰＧＸＸモチーフ含有率」は、以下の方法により算出される値である。  式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるＧＰＧＸＸモチーフの個数の総数を３倍した数（即ち、ＧＰＧＸＸモチーフ中のＧ及びＰの総数に相当）をｓとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率はｓ／ｔとして算出される。  
【０２０２】
ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としているのは、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列」（ＲＥＰに相当する配列）には、フィブロインに特徴的な配列と相関性の低い配列が含まれることがあり、ｍが小さい場合（つまり、ドメイン配列が短い場合）、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出結果に影響するので、この影響を排除するためである。なお、ＲＥＰのＣ末端に「ＧＰＧＸＸモチーフ」が位置する場合、「ＸＸ」が例えば「ＡＡ」の場合であっても、「ＧＰＧＸＸモチーフ」として扱う。  
【０２０３】
図９は、改変フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。図９を参照しながらＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出方法を具体的に説明する。まず、図９に示した改変フィブロインのドメイン配列（「［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフ」タイプである。）では、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図９中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、ｓを算出するためのＧＰＧＸＸモチーフの個数は７であり、ｓは７×３＝２１となる。同様に、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図９中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、当該配列から更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数ｔは５０＋４０＋１０＋２０＋３０＝１５０である。次に、ｓをｔで除すことによって、ｓ／ｔ（％）を算出することができ、図９の改変フィブロインの場合２１／１５０＝１４．０％となる。  
【０２０４】
第６の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましく、７％以下であることがより好ましく、４％以下であることが更に好ましく、０％であることが特に好ましい。  
【０２０５】
本明細書において、「グルタミン残基含有率」は、以下の方法により算出される値である。  式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図９の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるグルタミン残基の総数をｕとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、グルタミン残基含有率はｕ／ｔとして算出される。グルタミン残基含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。  
【０２０６】
第６の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、又は他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってよい。  
【０２０７】
「他のアミノ酸残基」は、グルタミン残基以外のアミノ酸残基であればよいが、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基であることが好ましい。アミノ酸残基の疎水性指標は表１に示すとおりである。  
【０２０８】
表１に示すとおり、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）及びヒスチジン（Ｈ）から選ばれるアミノ酸残基を挙げることができる。これらの中でも、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましく、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びフェニルアラニン（Ｆ）から選ばれるアミノ酸残基であることが更に好ましい。  
【０２０９】
第６の改変フィブロインは、ＲＥＰの疎水性度が、−０．８以上であることが好ましく、−０．７以上であることがより好ましく、０以上であることが更に好ましく、０．３以上であることが更により好ましく、０．４以上であることが特に好ましい。ＲＥＰの疎水性度の上限に特に制限はなく、１．０以下であってよく、０．７以下であってもよい。  
【０２１０】
本明細書において、「ＲＥＰの疎水性度」は、以下の方法により算出される値である。  式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図９の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をｖとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＲＥＰの疎水性度はｖ／ｔとして算出される。ＲＥＰの疎水性度の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。  
【０２１１】
第６の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。  
【０２１２】
第６の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失させること、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。  
【０２１３】
第６の改変フィブロインのより具体的な例として、（６−ｉ）配列番号２５（Ｍｅｔ−ＰＲＴ８８８）、配列番号２６（Ｍｅｔ−ＰＲＴ９６５）、配列番号２７（Ｍｅｔ−ＰＲＴ８８９）、配列番号２８（Ｍｅｔ−ＰＲＴ９１６）、配列番号２９（Ｍｅｔ−ＰＲＴ９１８）、配列番号３０（Ｍｅｔ−ＰＲＴ６９９）、配列番号３１（Ｍｅｔ−ＰＲＴ６９８）、配列番号３２（Ｍｅｔ−ＰＲＴ９６６）、配列番号４１（Ｍｅｔ−ＰＲＴ９１７）若しくは配列番号４２（Ｍｅｔ−ＰＲＴ１０２８）で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロイン、又は（６−ｉｉ）配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１若しくは配列番号４２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインを挙げることができる。  
【０２１４】
（６−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号２５で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。配列番号２６で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱ
を全てＴＳに置換し、かつ残りのＱをＡに置換したものである。配列番号２７で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。配列番号２８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＩに置換し、かつ残りのＱをＬに置換したものである。配列番号２９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。  
【０２１５】
配列番号３０で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ５２５）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。配列番号３１で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。  
【０２１６】
配列番号３２で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０）中に存在する２０個のドメイン配列の領域を２回繰り返した配列中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。  
【０２１７】
配列番号４１で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ９１７）は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＬＩに置換し、かつ残りのＱをＶに置換したものである。配列番号４２で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ１０２８）は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＩＦに置換し、かつ残りのＱをＴに置換したものである。  
【０２１８】
配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１及び配列番号４２で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率は９％以下である（表２）。  
【０２１９】
【表２】
2020241769.tif 000032
【０２２０】
（６−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１又は配列番号４２で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。  
【０２２１】
（６−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１又は配列番号４２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６−ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。  
【０２２２】
（６−ｉｉ）の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６−ｉｉ）の改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。  
【０２２３】
第６の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。  
【０２２４】
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（６−ｉｉｉ）配列番号３３（ＰＲＴ８８８）、配列番号３４（ＰＲＴ９６５）、配列番号３５（ＰＲＴ８８９）、配列番号３６（ＰＲＴ９１６）、配列番号３７（ＰＲＴ９１８）、配列番号３８（ＰＲＴ６９９）、配列番号３９（ＰＲＴ６９８）、配列番号４０（ＰＲＴ９６６）、配列番号４３（ＰＲＴ９１７）若しくは配列番号４４（ＰＲＴ１０２８）で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロイン、又は（６−ｉｖ）配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３若しくは配列番号４４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインを挙げることができる。  
【０２２５】
配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３及び配列番号４４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１及び配列番号４２で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。Ｎ末端にタグ配列を付加しただけであるため、グルタミン残基含有率に変化はなく、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３及び配列番号４４で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率が９％以下である（表３）。  
【０２２６】
【表３】
2020241769.tif 000033
【０２２７】
（６−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。  
【０２２８】
（６−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６−ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。  
【０２２９】
（６−ｉｖ）の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６−ｉｖ）の改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。  
【０２３０】
第６の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。  
【０２３１】
改変フィブロインは、第１の改変フィブロイン、第２の改変フィブロイン、第３の改変フィブロイン、第４の改変フィブロイン、第５の改変フィブロイン、及び第６の改変フィブロインが有する特徴のうち、少なくとも２つ以上の特徴を併せ持つ改変フィブロインであってもよい。  
【０２３２】
改変フィブロインとしては、親水性改変フィブロインであってもよく、疎水性改変フィブロインであってもよい。本明細書において、「親水性改変フィブロイン」とは、改変フィブロインを構成する全てのアミノ酸残基の疎水性指標（ＨＩ）の総和を求め、次にその総和を全アミノ酸残基数で除した値（平均ＨＩ）が０以下である改変フィブロインである。疎水性指標は表１に示したとおりである。また、「疎水性改変フィブロイン」とは、平均ＨＩが０超である改変フィブロインである。親水性改変フィブロインは、特に難燃性に優れている。疎水性改変フィブロインは、特に吸湿発熱性及び保温性に優れている。  
【０２３３】
親水性改変フィブロインとしては、例えば、配列番号４で示されるアミノ酸配列、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列、配列番号１８、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列、配列番号１７、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインが挙げられる。  
【０２３４】
疎水性改変フィブロインとしては、例えば、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３又は配列番号４３で示されるアミノ酸配列、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインが挙げられる。  
【０２３５】
本実施形態に係るタンパク質は、当該タンパク質をコードする核酸を使用して、常法により製造することができる。当該タンパク質をコードする核酸は、塩基配列情報に基づいて、化学合成してもよく、ＰＣＲ法等を利用して合成してもよい。  
【０２３６】
（構造タンパク質微小体の製造方法）  本実施形態に係る構造タンパク質微小体の製造方法は、構造タンパク質と可溶化剤とを含む構造タンパク質溶液（構造タンパク質含有溶液）を得る第一工程と、構造タンパク質溶液のタンパク質に対する溶解度を下げることにより、構造タンパク質微小体を形成させる第二工程と、を含む。この製造方法によれば、上述の構造タンパク質微小体を効率良く製造することができる。  
【０２３７】
なお、第一工程で、構造タンパク質と可溶化剤とを含む構造タンパク質溶液を得る具体的方法は特に限定されるものではない。すなわち、例えば、所定の溶媒に可溶化剤が溶解する溶解液を用い、この溶解液に構造タンパク質を添加（投入）して溶解させる方法や、所定の溶媒に構造タンパク質を添加した後、それに可溶化剤を添加して、可溶化剤と構造タンパク質とを溶解させる方法、更には所定の溶媒に構造タンパク質と可溶化剤とを同時に加えて、それらを溶解させる方法等が挙げられる。  
【０２３８】
第一工程で得られる構造タンパク質溶液は、構造タンパク質がランダムコイル構造を有するように溶解されていることが好ましい。すなわち、構造タンパク質は、溶液中でランダムコイル構造を形成するものであることが好ましい。また、構造タンパク質と共に構造タンパク質溶液に溶解するか可溶化剤は、構造タンパク質を、ランダムコイル構造を形成させ得るように、溶媒に溶解させ得るものであることが好ましい。更に、溶媒は、構造タンパク質をランダムコイル構造が形成されるように溶解し得るものであることが好ましい。これにより、第二工程でタンパク質微小体がより効率良く形成される。  
【０２３９】
また、第一工程で得られる構造タンパク質溶液は、構造タンパク質が、単量体（会合体を形成していない状態）となるように溶解されていることが好ましい。すなわち、構造タンパク質は、溶液中で、単量体（会合体を形成していない状態）として溶解されるものであることが好ましい。また、可溶化剤は、構造タンパク質を単量体となるように、溶媒に溶解させ得るものであることが好ましい。更に、溶媒は、構造タンパク質をラ単量体となるように溶解し得るものであることが好ましい。これにより、第二工程でタンパク質微小体がより効率良く形成される。  
【０２４０】
ここで、構造タンパク質溶液の溶媒は、特に限定されないが、タンパク質の溶解性を調整しやすい観点から、水が好ましい。すなわち、第一工程は、可溶化剤を含む水溶液にタンパク質を溶解させる工程であることが好ましい。  
【０２４１】
また、かかる溶媒としては、構造タンパク質が、可溶化剤によって、十分に且つランダムコイル構造を形成するように溶解するものが、好適に用いられる。これは、以下の理由による。
【０２４２】
すなわち、特別な可溶化剤なしで構造タンパク質を容易に且つ十分に溶解し得る溶媒、所謂良溶媒を用いる場合、構造タンパク質がランダムコイル構造を形成するように溶解されるものの、第二工程での構造タンパク質微小体の効率的な形成が難しくなる場合があることが、本発明者等の研究により判明した。具体的には、例えば、構造タンパク質として改変フィブロインを用いる場合、第一工
程で、ジメチルスルホキシドや、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、ギ酸等のような、改変フィブロインに対する良溶媒を用いてタンパク質溶液を形成すると、第二工程で、目的とする構造タンパク質微小体を形成することが容易でなくなる可能性があることが分かったのである。従って、第一工程では、溶媒として、構造タンパク質に対する貧溶媒を用いることが好適に用いられるのである。このような溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシドや、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、ギ酸を除く有機溶媒、或いは水等が挙げられる。これらの溶媒は、構造タンパク質として改変フィブロインや改変クモ糸フィブロインが用いられる場合に、特に好適に使用される。  
【０２４３】
原料構造タンパク質は、上述の構造タンパク質微小体を構成する構造タンパク質として例示した構造タンパク質であってよい。原料構造タンパク質の形態は特に限定されない。溶解性の観点からは、原料構造タンパク質は、粉末状、液状等であることが好ましい。  
【０２４４】
可溶化剤は、構造タンパク質を可溶化できるものであればよい。可溶化剤としては、ランダムコイル構造が形成されるように構造タンパク質を可溶化できるものが好ましく、また、単量体として溶解されるように構造タンパク質を可溶化できるものが好ましい。このような可溶化剤としては、例えば、ジメチルスルホキシド、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸塩、尿素等を好適に用いることができる。構造タンパク質を効率的に単量体とするためには凝集して溶けにくくなった状態の構造タンパク質をも溶かすことが望ましく、可溶化剤として、ジメチルスルホキシド、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸塩が特に好ましい。  
【０２４５】
可溶化剤の量は特に限定されない。溶解液中の可溶化剤の濃度は、例えば１Ｍ〜８Ｍであってよく、好ましくは３Ｍ〜７Ｍであり、より好ましくは４Ｍ〜６Ｍである。  
【０２４６】
構造タンパク質の溶解方法は特に限定されず、公知の方法から適宜選択してよい。例えば、タンパク質の溶解は、振とう、撹拌、超音波処理、加熱等により行ってよい。  
【０２４７】
構造タンパク質溶液中の構造タンパク質の濃度は、例えば０．１〜７００ｍｇ／ｍＬとしてよく、好ましくは１〜５００ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは３〜３００ｍｇ／ｍＬである。  
【０２４８】
以下、可溶化剤としてチオシアン酸グアニジンを用いた場合を例にとり、第一工程を具体的に説明する。まず、構造タンパク質の粉末１００ｍｇに、５Ｍチオシアン酸グアニジン水溶液を１０００μＬ加え、５分間振とう（１８００ｒｐｍ）させる。必要に応じて超音波処理（例えば、２０〜３０％、１０秒、４〜５回、インターバル５〜１０分）を行ってもよい。構造タンパク質が溶解しているか否かは、例えば、紫外・可視吸収測定等により確認できる。  
【０２４９】
第一工程では、構造タンパク質の溶解後、フィルタ濾過等によって不純物を除去してもよい。フィルタ濾過の方法は特に限定されないが、例えば、フィルタ（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ−ＧＶ、Ｄｕｒａｐｏｒｅ  ＰＶＤＦ  ０．２２μｍ）を用いた濾過を挙げることができる。目詰まりを避けるため、フィルタ濾過での処理は、例えば５０μＬ／秒以下で行ってよい。  
【０２５０】
＜第二工程＞  第二工程では、構造タンパク質溶液の構造タンパク質に対する溶解度を下げることにより、構造タンパク質微小体を形成させる。ここで、構造タンパク質微小体の形成メカニズムは必ずしも明らかではないが、構造タンパク質溶液の溶解度が低下することで、構造タンパク質溶液中に含まれる構造タンパク質（特に、ランダムコイル構造を有する構造タンパク質）が会合し、その会合体によって構造タンパク質微小体が形成されると推察される。  
【０２５１】
第二工程で、構造タンパク質溶液の構造タンパク質に対する溶解度を下げる方法としては、例えば、構造タンパク質溶液の温度を低下乃至上昇させるように調節する方法、或いは水や界面活性剤、有機溶媒、無機塩等を構造タンパク質溶液に添加する方法等が例示できる。  
【０２５２】
また、別の方法としては、構造タンパク質溶液中の可溶化剤の濃度を低下させることにより、構造タンパク質に対する溶解度を下げることが好ましい。なお、水の添加、有機溶媒の添加等によって、可溶化剤の濃度を低下させることができる。  
【０２５３】
第二工程は、上記した温度の調節、水の添加、界面活性剤の添加、有機溶媒の添加及び無機塩の添加からなる群より選択される２つ以上の方法を組み合わせて、構造タンパク質溶液の構造タンパク質に対する溶解度を下げることが好ましい。このように、複数の方法を組み合わせることで、溶解度をより細かく調整でき、上述の構造タンパク質微小体が得られやすくなる。より具体的には、溶解度の下げ幅が小さすぎると得られる構造タンパク質微小体の量が少なく、溶解度の下げ幅が大きすぎると凝集によって得られる構造タンパク質微小体の量が少なくなることから、溶解度をより細かく調整できる上記の方法が好ましい。第二工程では、水の添加、界面活性剤の添加、有機溶媒の添加及び無機塩の添加のうち２つ以上の方法を組み合わせることがより好ましく、少なくとも水の添加及び有機溶媒の添加を行うことが更に好ましい。  
【０２５４】
有機溶媒は、構造タンパク質溶液中の溶媒（例えば水）と相溶性のある溶媒であることが好ましい。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、２−プロパノール等のアルコール類；アセトン、２−ブタノン等のケトン類；テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン等のエーテル類；アセトニトリル等のニトリル類が挙げられる。  
【０２５５】
無機塩としては、例えば、硫酸アンモニウム、酢酸カリウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。  
【０２５６】
界面活性剤としては、例えば、オクチルフェノールエトキシレート（例えば、シグマ・アルドリッチ社製の「Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００」等）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等が挙げられる。  
【０２５７】
上述の水、界面活性剤、有機溶媒及び無機塩は、溶解抑制剤と総称することもできる。溶解抑制剤の添加量は、例えば、目的とする構造タンパク質微小体の生成量がより大きくなるように、構造タンパク質溶液中の構造タンパク質の濃度、可溶化剤の濃度、可溶化剤の種類、溶解抑制剤の種類、溶解抑制剤の種類等に応じて適宜調整してよい。  
【０２５８】
溶解抑制剤の添加後は、撹拌、振とう等によって溶液を均一にさせることが好ましい。例えば、溶解抑制剤の添加後、１８００ｒｐｍ、５分間の条件で振とうさせて、溶液を均一化することができる。また、均一化後の溶液は、所定時間、静置することで、より構造タンパク質微小体が形成されやすくなる。静置時間は特に限定されないが、例えば、一日程度であってよい。  
【０２５９】
構造タンパク質溶液の構造タンパク質に対する溶解度が下がることで、構造タンパク質微小体が形成され、構造タンパク質微小体を含む分散液が得られる。  
【０２６０】
第二工程で、構造タンパク質溶液の構造タンパク質溶解度を低下させる方法としては、上述の方法の他に、例えば、構造タンパク質溶液に対して、剪断応力や圧縮応力等の物理的な力を印加する方法も例示できる。このような剪断応力や圧縮応力等を印加する手法では、例えば、上述した抑制剤を用いる場合とは異なって、後の工程で溶解抑制剤を除去する必要がなく、より簡便に構造タンパク質微小体を得ることができる。  
【０２６１】
構造タンパク質溶液に剪断応力を印加する手法は特に限定されないが、例えば構造タンパク質溶液を、ボルテックスミキサー等を用いて、高速旋回させ強く攪拌してもよく、溶液を攪拌羽で回転させ強く攪拌してもよく、また、溶液をキャピラリー（毛細管）等狭い空間内で速度を与えて通過させてよい。なお、構造タンパク質溶液を高速回転させることでせん断応力を印加する場合には、回転数が高い程、回転時間を短縮することができるが、例えば、構造タンパク質溶液を５００ｒｐｍ以上、７８時間以上回転させることが好ましく、１８００ｒｐｍ以上、２時間以上回転させることがより好ましく、３４００ｒｐｍ以上、３０分間以上回転させることが更に好ましい。  
【０２６２】
なお、構造タンパク質微小体の形成の有無は、例えば、ＴｈＴ染色による蛍光強度測定により確認できる。具体的には、例えば、構造タンパク質溶液にＴｈＴを添加したものを測定試料として、蛍光光度計により蛍光強度を測定することで、構造タンパク質溶液中の構造タンパク質微小体の形成状況を確認することができる。  
【０２６３】
ＴｈＴの添加量は、例えば、４μＭとなる量であってよい。  
【０２６４】
蛍光強度測定の条件は、例えば、上述の＜（ｉ）チオフラビンＴ染色（ＴｈＴ染色）による蛍光強度測定＞で示した条件であってよい。  
【０２６５】
プレートリーダーにより、蛍光強度の経時変化を追うことができる。プレートリーダーとしては、例えば、ＳＹＮＥＲＧＹ  ＨＴＸ（バイオテック株式会社製）等を用いて行うことができる。測定は機器付属のマニュアルに準じて行えばよい。  
【０２６６】
βシート構造の形成に基づくチオフラビンＴの蛍光強度の上昇を蛍光光度計により確認することで、構造タンパク質微小体の形成が確認される。また、βシート構造の経時的な形成をプレートリーダーで追うこともできる。さらに、この解析により最適な希釈条件を決定することもできる。  
【０２６７】
形成された構造タンパク質微小体は、分散液中で分散又は沈殿しており、遠心分離、フィルタ濾過等の公知の方法で回収することができる。すなわち、本実施形態に係る製造方法は、構造タンパク質微小体を含む分散液から、構造タンパク質微小体を回収する回収工程を更に含んでいてよい。  
【０２６８】
回収工程は、分散液を、構造タンパク質微小体と上清とに分離する工程であってよい。上清には、構造タンパク質微小体を形成しなかったタンパク質が、ランダムコイルとして含まれていてよい。  
【０２６９】
回収工程は、遠心分離、フィルタ濾過等の公知の方法で行うことができる。回収工程における条件は特に限定されない。回収工程を遠心分離で行う場合の一例として、遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ  ３７４０、株式会社久保田製作所製）を用い、２０℃、１４５００ｒｐｍの条件で、３０分間遠心分離して、構造タンパク質微小体と上清とを分離し、構造タンパク質微小体を回収できる。  
【０２７０】
回収された構造タンパク質微小体は、乾燥させて、分散媒中に分散させて保存してもよい。分散媒としては、例えば、尿素水溶液等を好適に用いることができる。  
【０２７１】
（ナノファイバーの製造方法）  本実施形態に係る構造タンパク質微小体は、タンパク質ナノファイバーを形成するための核として機能する。このため、例えば、構造タンパク質微小体とタンパク質が溶解した溶液とを接触させることで、構造タンパク質微小体を核としてタンパク質が自己組織化して、タンパク質ナノファイバーが形成される。すなわち、本実施形態に係るナノファイバーの製造方法は、タンパク質が溶解したタンパク質溶液を準備するＡ工程と、タンパク質溶液と上述のタンパク質微小体とを混合して、タンパク質ナノファイバーを得るＢ工程と、を含む。  
【０２７２】
図１に示すように、構造タンパク質は、完全に溶解している状態では立体構造を形成しておらず、構造タンパク質同士が部分的に接触（図１（ａ）の破線による丸で示した箇所）しているにすぎない。構造タンパク質微小体の存在下で自己組織化させることで、図１（ｂ）に示すような円柱状のナノファイバーが形成されると考えられる。  
【０２７３】
なお、本明細書中、ナノファイバーとは、直径が１ｎｍ〜１００ｎｍ、長さが直径より大きい（例えば長さが直径の１０倍以上）の繊維状物質を意味する。ナノファイバーは、フィブリル、ナ
ノロッド等と称される場合もある。  
【０２７４】
Ａ工程は、タンパク質を第一の溶媒に溶解させて、タンパク質溶液を得る工程であってよい。また、Ａ工程は、既存のタンパク質溶液を準備する工程であってもよい。ここで用いられるタンパク質としては、上述の構造タンパク質微小体を構成する構造タンパク質が挙げられる。また、かかる構造タンパク質に加えて、工業用又は医療用に利用できるタンパク質が挙げられる。そのようなタンパク質の具体例としては、酵素、制御タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、サイトカイン、膜又は輸送タンパク質、予防接種に使用する抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、完全長抗体又は抗体フラグメント若しくは誘導体を挙げることができる。第一の溶媒は、タンパク質を溶解可能な溶媒であればよく、例えば、有機溶媒、塩溶液、酸性溶液、塩基性溶液、カオトロピック溶液等であってよい。  
【０２７５】
有機溶媒としては、例えば、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン等が挙げられる。  
【０２７６】
塩溶液は、例えば、塩を含有する水溶液であってよい。塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化亜鉛、塩化リチウム等が挙げられる。  
【０２７７】
酸性溶液は、例えば、酸を含有する水溶液であってよい。酸としては、例えば、塩酸、酢酸等が挙げられる。  
【０２７８】
塩基性溶液は、例えば、塩基を含有する水溶液であってよい。塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア等が挙げられる。  
【０２７９】
カオトロピック溶液は、例えば、カオトロピック剤を含有する水溶液であってよい。カオトロピック剤としては、例えば、尿素、塩酸グアニジン、グアニジンチオシアン酸等が挙げられる。  
【０２８０】
タンパク質溶液におけるタンパク質の濃度は特に限定されない。タンパク質溶液におけるタンパク質の濃度は、例えば０．０１質量％以上であってよく、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。また、タンパク質溶液におけるタンパク質の濃度は、例えば５０質量％以下であってよく、好ましくは３０質量％以下、より好ましくは２５質量％以下である。  
【０２８１】
Ｂ工程では、タンパク質溶液とタンパク質微小体とが混合され、これにより、タンパク質微小体を核としてタンパク質が自己組織化し、ナノファイバーが形成される。  
【０２８２】
Ｂ工程において、混合方法は特に限定されない。Ｂ工程は、例えば、タンパク質溶液と粉末状のタンパク質微小体とを混合する工程であってよく、タンパク質溶液とタンパク質微小体を含有する分散液とを混合する工程であってもよい。  
【０２８３】
Ｂ工程において、タンパク質溶液中のタンパク質の含有量Ｃ０に対する、タンパク質微小体の含有量Ｃ１の質量比（Ｃ１／Ｃ０）は、例えば０．０１以上であってよく、好ましくは０．０５以上、より好ましくは０．１以上である。また、質量比（Ｃ１／Ｃ０）は、例えば１００以下であってよく、好ましくは１０以下、より好ましくは１以下である。  
【０２８４】
Ｂ工程では、タンパク質溶液とタンパク質微小体とを混合した混合液を所定時間静置してもよい。これにより、ナノファイバーの収率がより向上する。静置する時間は特に限定されず、例えば３分以上であってよく、好ましくは１０分以上である。  
【０２８５】
Ｂ工程では、タンパク質溶液とタンパク質微小体とを混合した混合液を必要に応じて静置した後、当該混合液中に溶解抑制剤を加えてもよい。これにより、ナノファイバーが沈殿しやすくなり、ナノファイバーの回収がより容易となる。溶解抑制剤としては、例えば、エタノール、硫酸アンモニウム等が挙げられる。  
【０２８６】
Ｂ工程において、混合液中に形成されたナノファイバーを回収する方法は特に限定されない。例えば、ナノファイバーは、遠心分離、フィルターろ過等の方法により回収することができる。  
【０２８７】
（タンパク質構造体の製造方法）  本実施形態に係るタンパク質構造体の製造方法は、タンパク質から構成された繊維状物質を含有する構造前駆体を準備する（ア）工程と、構造前駆体に異方性応力を作用させて、タンパク質構造体を得る（イ）工程と、を含む。このような製造方法によれば、一方向に配向した複数のタンパク質ナノファイバーを含有するタンパク質構造体を容易に製造することができる。  
【０２８８】
繊維状物質は、（ａ）上述した構造タンパク質微小体からなるものであってもよく、（ｂ）かかる構造タンパク質微小体を核としてタンパク質が自己組織化したものからなるものであってよく、或いはそれら（ａ）と（ｂ）の両方を含むものであってもよい。換言すれば、繊維状物質は、タンパク質ナノファイバー（上記（ｂ）に相当する）であってよく、タンパク質ナノファイバーの前駆体（上記（ａ）に相当する）であってもよく、それらの両方を含んでいてもよい。繊維状物質がタンパク質ナノファイバーの前駆体である場合、繊維状物質に更にタンパク質が凝集・自己組織化することで、タンパク質ナノファイバーが形成される。
【０２８９】
なお、上記（ｂ）繊維状物質を構成する、構造タンパク質微小体を核として自己組織化するタンパク質や、繊維状物質に更に凝集・自己組織化するタンパク質は、前述した構造タンパク質微小体を構成する構造タンパク質と、それに加えて、前述した、工業用又は医療用に利用できるタンパク質が挙げられる。  
【０２９０】
構造タンパク質微小体は、繊維状物質を形成するための核として機能するものであればよい。例えば、構造タンパク質微小体とタンパク質が溶解した溶液とを接触させることで、構造タンパク質微小体を核としてタンパク質が自己組織化して、繊維状物質が形成される。また、構造タンパク質溶液中に構造タンパク質微小体を生じさせることで、当該構造タンパク質微小体を核とする繊維状物質を形成させることもできる。  
【０２９１】
（構造前駆体）  （ア）工程では、繊維状物質を含有する構造前駆体を準備する。構造前駆体は、異方性応力を作用させることが可能な形態であれば特に制限はなく、例えば、ハイドロゲル、繊維、凝集体、フィルム等であってよい。  
【０２９２】
構造前駆体は、異方性応力を容易に作用させることができる観点から、経時的に収縮するものであることが好ましい。  
【０２９３】
以下に、構造前駆体として、繊維状物質を含有するハイドロゲルを得る方法について詳述する。  
【０２９４】
ハイドロゲルは、例えば、タンパク質含有溶液（好ましくは、上述のタンパク質微小体の製造方法の（ア）工程におけるタンパク質含有溶液）を、透析によって希釈することで、作製することができる。  
【０２９５】
透析における希釈には、可溶化剤の濃度がタンパク質含有溶液より低い低濃度溶液、可溶化剤を含まない希釈液、等を用いることができる。低濃度溶液及び希釈液は、いずれも、バッファー（緩衝液）であってよい。  
【０２９６】
タンパク質含有溶液を透析により段階的に希釈させていく過程で、ハイドロゲルが形成される。このとき、タンパク質含有溶液中には希釈によって、タンパク質微小体を核として繊維状物質が形成される。  
【０２９７】
ハイドロゲルは、繊維状物質を含む。また、ハイドロゲルは、自己組織化していないランダムコイル状のタンパク質を更に含んでいてもよい。  
【０２９８】
（イ工程）  （イ）工程では、構造前駆体に異方性応力を作用させる。これにより、複数のタンパク質ナノファイバーが一方向に配向したタンパク質構造体が形成される。  
【０２９９】
異方性応力を作用させる方法は特に限定されないが、例えば、経時的な収縮を利用する方法、引張試験機を用いる方法、延伸機を用いる方法等が挙げられる。  
【０３００】
経時的な収縮を利用する場合、例えば、構造前駆体の一方向における両端を固定して、固定を維持したまま構造前駆体を収縮させることで、構造前駆体に異方性応力を作用させることができる。  
【０３０１】
例えば、構造前駆体がハイドロゲルである場合、ハイドロゲルの一方向における両端を固定した状態で乾燥させることで、ハイドロゲルが収縮し、ハイドロゲルに異方性応力が作用する。  
【０３０２】
（イ）工程で形成されたタンパク質構造体は、広角Ｘ線回折ＸＲＤによって、構造体中のタンパク質ナノファイバーの配向状態を確認することができる。タンパク質ナノフィバーの配向によって、１次元Ｘ線回折プロファイルではシャープなピークが観察され、２次元Ｘ線回折プロファイルではシャープな回折線が観察される。また、特定の回折角に対して円環積した強度の方位角度分布から、特定の方位角にピークが観察される。当該ピークによって、タンパク質構造体中のタンパク質の結晶構造等を確認することができる。  
【０３０３】
広角Ｘ線回折ＸＲＤの測定は、例えば、以下の条件で行うことができる。測定装置：Ｘ線発生装置ＭｉｃｒｏＭＡＸ００７（リガク社製）、Ｒ−ＡＸＩＳ−ＩＶ（リガク社製）    測定条件：Ｘ線波長１．５４１８Å（ＣｕＫα）、室温（２０℃）、カメラ長８０ｍｍ、露光時間１５分  
【０３０４】
また、タンパク質構造体中のタンパク質ナノファイバーの配向状態は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて観察することもできる。換言すると、本実施形態に係る製造方法によれば、ＡＦＭで観察できる水準で、高度にタンパク質ナノファイバーが配向したタンパク質構造体を得ることができる。  
【０３０５】
本実施形態において、タンパク質構造体中のタンパク質ナノファイバーは、アミロイド様結晶を有していてよい。タンパク質ナノファイバーがアミロイド様結晶を有していることは、タンパク質構造体のＸＲＤ測定によって確認することができる。具体的には、タンパク質構造体中のタンパク質ナノファイバーがアミロイド様結晶を有している場合、ＸＲＤ測定による回折強度プロファイルにおいて、アミロイド線維と近いピーク（例えば、２θ＝８°〜１０°、１８°〜１９．５°のピーク）が観測される。  
【０３０６】
また、本実施形態において、タンパク質構造体中のタンパク質ナノファイバーは、ｐｏｌｙ−Ａｌａ様結晶を有していてよい。タンパク質ナノファイバーがｐｏｌｙ−Ａｌａ様結晶を有していることは、タンパク質構造体のＸＲＤ測定によって確認することができる。具体的には、タンパク質構造体中のタンパク質ナノファイバーが、ｐｏｌｙ−Ａｌａ様結晶を有している場合、ＸＲＤ測定による回折強度プロファイルにおいて、ｐｏｌｙ−Ａｌａ様結晶の特徴的なピーク（例えば、２θ＝１５°〜１７、１８．５°〜２０．５°、２２．５°〜２５．５°のピーク）が観測され、且つ、アジマス角強度プロファイルにおいてそれぞれピーク（例えば、β＝７５°〜１０５°、２５５°〜２８５°、β＝７５°〜１０５°、２５５°〜２８５°、β＝３０°〜６０°、１２０°〜１５０°、２１０°〜２４０°、３００°〜３３０°のピーク）が観測される。  
【０３０７】
タンパク質ナノファイバーがアミロイド様結晶を有している場合、当該アミロイド様結晶中のβストランドは、タンパク質ナノファイバーの配向方向に対して垂直に配向していることが好ましい。また、タンパク質ナノファイバーがｐｏｌｙ−Ａｌａ様結晶を有している場合、当該ｐｏｌｙ−Ａｌａ様結晶中のβストランドは、タンパク質ナノファイバーの配向方向に対して平行に配向していることが好ましい。このような構造となっていることは、例えば、ＸＲＤ測定の２次元回折像における、特定の回折角に対して円環積した強度の方位角度分布により確認することができる。  
【０３０８】
タンパク質構造体中のタンパク質ナノファイバーの太さ（直径）は、例えば１ｎｍ以上であってよく、好ましくは３ｎｍ以上である。また、タンパク質ナノファイバーの太さ（直径）は、例えば１０００ｎｍ以下であってよく、好ましくは５００ｎｍ以下である。  
【０３０９】
タンパク質構造体中のタンパク質ナノファイバーの長さは、例えば１０ｎｍ以上であってよく、好ましくは３０ｎｍ以上である。  
【０３１０】
なお、タンパク質構造体中、タンパク質ナノファイバーは互いに連結して長繊維化していてもよく、互いに結着して繊維束を形成していてもよい。  
【０３１１】
本実施形態に係る製造方法により製造されたタンパク質構造体は、例えば、細胞シート、生体分子デバイス、フィルタ、紡糸、化粧品等の様々な分野に適用することができる。  
【０３１２】
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
【実施例】
【０３１３】
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。  【０３１４】
（実施例１）  配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含むフィブロインの粉末試料を準備した。粉末試料３００ｍｇに、チオシアン酸グアニジンバッファー（５Ｍチオシアン酸グアニジン、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．０）を３ｍＬ加え、５分間振とう（１８００ｒｐｍ）させ、構造タンパク質溶液（フィブロイン溶液）を得た。得られたフィブロイン溶液の紫外・可視吸収を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）で測定した。測定の結果、紫外・可視吸収スペクトルは２８０ｎｍを極大とする吸収スペクトルを示し、顕著な散乱は見られなかった。この結果から、フィブロインが完全に溶解していることが確認された。  【０３１５】
次いで、構造タンパク質溶液に、終濃度が７５体積％となるように（すなわち、４倍希釈となるように）、ボルテックスミキサーで撹拌（１８００ｒｐｍ、５分間）しながらエタノール９ｍＬを加えた。これにより、溶液中に構造タンパク質微小体が形成された。遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ３７４０、株式会社久保田製作所製）を用いて、１５０００ｇ、１０分、２０℃の条件で遠心分離を行い、構造タンパク質微小体を沈殿画分として回収した。その後、超純水で洗浄し、凍結乾燥を行って、２５３．８ｍｇの構造タンパク質微小体を得た。  【０３１６】
得られた構造タンパク質微小体について、以下の方法で、ＴｈＴ染色による蛍光強度測定、小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）の解析、Ｇｕｉｎｉｅｒ解析、動的光散乱法による平均粒子径の測定を行った。  【０３１７】
＜ＴｈＴ染色による蛍光強度測定＞  測定試料として、構造タンパク質微小体を分散液（６Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴの水溶液、ｐＨ７．０）中に、５ｍｇ／ｍＬの濃度で分散させ、更にＴｈＴを４μＭとなるように添加したものを用いた。測定条件は、以下のとおりとした。    測定機器：ＪＡＳＣＯ  ＦＰ−８２００（日本分光株式会社製）    測定範囲：４４０〜６００ｎｍ    励起波長：４５０ｎｍ    スキャンスピード：Ｍｅｄｉｕｍ    測定回数：３回  【０３１８】
ＴｈＴ染色による蛍光強度測定の結果を、図３にＡ１（実線）として示す。図３のＡ１は、４８０〜５００ｎｍの範囲内にピークを有しており、これにより、実施例１で得られた構造タンパク質微小体がβシート構造を有していることが確認された。  【０３１９】
＜ＳＡＸＳの測定＞  測定試料として、構造タンパク質微小体を分散液（６Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴの水溶液、ｐＨ７．０）中に、５ｍｇ／ｍＬの濃度で分散させ、更にＴｈＴを４μＭとなるように添加したものを用いた。測定条件は、以下のとおりとした。    測定装置：Ｘ線小角散乱測定装置ＮＡＮＯ−Ｖｉｅｗｅｒ  （リガク社製）、Ｘ線発生装置ＭｉｃｒｏＭＡＸ００７（リガク社製）、検出器ＰＩＬＡＴＵＳ  ２００Ｋ（ＤＥＣＴＲＩＳ社製）    測定条件：Ｘ線波長１．５４１８Å（ＣｕＫα）、室温（２０℃）、露光時間３０分  【０３２０】
上記条件での測定後、円周平均を行い、１次元プロファイルを得た。１次元プロファイルを、ＩｇｏｒＰｒｏソフトウェア（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ社製）を用いて解析することで、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔを得た。得られたＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔを、図４のＡ２（実線）で示す。図４のＡ２は、Ｑが０．１５以下の領域にピークを有している。また、Ｑが０．１５以上０．３以下の領域における変化幅が±１０％以下となっている。この結果から、構造タンパク質微小体が、電子密度が高いコア部と、当該コア部を囲むように配置されたランダムコイルと、を備えていることが確認された。  【０３２１】
＜Ｇｕｉｎｉｅｒ解析＞  （ｉｉｉ）構造タンパク質分子の会合の項に記載のとおり、Ｇｕｉｎｉｅｒ解析を行った。その結果、第一の測定試料群から求められた原点散乱強度は２０．６１７、第二の測定試料群から求められた原点散乱強度は７．３８であり、構造タンパク質微小体が、３つの構造タンパク質分子の会合体であることが確認された。  【０３２２】
＜動的光散乱法による平均粒子径の測定＞  測定試料群として、構造タンパク質微小体を第一の分散液（６Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ及び５ｍＭ  ＤＴＴの水溶液、ｐＨ７．０）中に、２ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で分散させたものを準備した。  次いで、各測定試料について、以下の条件で動的光散乱法による粒度分布の測定を行い、体積平均径を求めた。    測定装置：ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ  ｎａｎｏ−ＺＳ（マルバーン社製）    測定温度：２０℃  各測定試料について５回ずつ上記測定を行い、得られた測定値の平均値を求めた。  各測定試料の濃度及び測定値（平均値）から、濃度に対する平均粒子径のプロットを取り、分子間相互作用を排除した０濃度外挿を行った。０濃度外挿により得られた値を、構造タンパク質微小体の平均粒子径とした。  【０３２３】
上記の測定の結果、構造タンパク質微小体の平均粒子径は１３．２２５ｎｍであった。  【０３２４】
次に、得られた構造タンパク質微小体を用いて、ナノファイバーの製造を行った。  【０３２５】
具体的には、まず、グアニジンチオシアン酸水溶液（５Ｍ  グアニジンチオシアン酸、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．０）１ｍｌに対し、タンパク質粉末（配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含むフィブロインの粉末）８．３３ｍｇを加え、１分間、ボルテックスミキサーで撹拌した。この操作を６回繰り返し、投入した粉末量を５０ｍｇにした。その後、室温で一日静置させた。静置後、遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ  ３７４０）を用いて遠心分離（２００００ｇ、２０分、２０℃）を行い、上清を回収した。その後、試料溶液を透析チューブ（ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ社製、＃Ｄ１００）に入れ、６Ｍ  Ｕｒｅａ溶液で二日透析（外液交換三回）した。これにより、構造タンパク質微小体を含まないタンパク質溶液（Ｓ０）（タンパク質の濃度：７．５ｍｇ／ｍＬ）を得た。次いで、構造タンパク質微小体を、分散液（６Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ及び５ｍＭ  ＤＴＴの水溶液、ｐＨ７．０）中に、７．５ｍｇ／ｍＬの濃度で分散させて、構造タンパク質微小体を含むタンパク質溶液（Ｓ１）を得た。  【０３２６】
溶液（Ｓ０）と溶液（Ｓ１）とをＳ０：Ｓ１＝１：２（体積比）で混合し、希釈液（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．０）で２倍希釈することで、ナノファイバーが得られた。  【０３２７】
なお、溶液（Ｓ０）及び溶液（Ｓ１）を用いて、Ｓ０：Ｓ１＝１：０の測定試料（１）、Ｓ０：Ｓ１＝０：２の測定試料（２）、及び、Ｓ０：Ｓ１＝１：２の測定試料（３）を調製し、各測定試料について、ＴｈＴ染色による蛍光強度の経時変化を測定した。結果を図１０に示す。図１０に示すとおり、測定試料（３）（図１０の実線）では、測定試料（１）（図１０の二点鎖線）の測定値及び測定試料（２）（図１０の長破線）の測定値の和（図１０中の（１＋２）（図１０の短破線））と比較して、大幅に蛍光強度が増加した。このことから、溶液（Ｓ０）中のタンパク質が、単独ではナノファイバーを形成していないにも関わらず、構造タンパク質微小体の存在下では、ナノファイバーの形成に寄与していることが確認された。  【０３２８】
（実施例２）  実施例１と同様にして、構造タンパク質溶液を得た。次いで、構造タンパク質溶液に、チオシアン酸グアニジンの濃度が１Ｍとなるまで水を添加し、その後、終濃度が７５体積％となるように（すなわち、４倍希釈となるように）エタノールを加えた。これにより、溶液中に構造タンパク質微小体が形成された。遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ３７４０、株式会社久保田製作所製）を用いて、１５０００ｇ、１０分、２０℃の条件で遠心分離を行い、構造タンパク質微小体を沈殿画分として回収した。その後、超純水で洗浄し、凍結乾燥を行って、構造タンパク質微小体を収率８０％で得た。  【０３２９】
得られた構造タンパク質微小体について、実施例１と同様にＴｈＴ染色による蛍光強度測定、小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）の解析、Ｇｕｉｎｉｅｒ解析を行った。その結果、実施例１と同様の構造タンパク質微小体が得られていることが確認された。【０３３０】
（実施例３）  配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含むフィブロインの粉末試料を準備した。粉末試料１０ｍｇに、尿素バッファー（３Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．０）を１ｍＬ加え、５分間振とう（１８００ｒｐｍ）させ、構造タンパク質溶液を得た。次いで、構造タンパク質溶液を１．５ｍLチューブに分注した。その後、これをボルテックスミキサーを用いて３４００ｒｐｍ、３０分間振とうし、構造タンパク質溶液を高速回転させることで、構造タンパク質溶液にせん断応力を作用させた。これにより、溶液中に構造タンパク質微小体を形成し、構造タンパク質微小体が分散した分散液を得た。【０３３１】
次いで、上記のようにして得られた構造タンパク質微小体分散液に、ＴｈＴを４μＭとなるように添加し、実施例１と同様の分析条件で蛍光強度測定を行った。ＴｈＴ染色による蛍光強度測定の結果を、図１１に実線で示す。図１１に実線で示されたグラフは、４８０〜５００ｎｍの範囲内にピークを有していることから、構造タンパク質微小体の特徴を有していることが確認された。  【０３３２】
（比較例１）  剪断応力を作用させていないことを除いて実施例３と同様に調整したタンパク質溶液について、ＴｈＴ染色による蛍光強度測定の結果を、図１１に破線で示す。蛍光極大波長は５１２ｎｍであり、スペクトルはブロードな形状を示した。比較の結果より、単量体に剪断応力を作用させることで、構造タンパク質微小体が得られることが確認された。  【０３３３】
（実施例４）  配列番号１３示されるアミノ酸配列を含むフィブロインの粉末試料を準備した。フィブロインの粉末試料５．１ｍｇに、尿素バッファー（６Ｍ尿素、１０ｍＭｔｒｉｓＨＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．０）を２２２μＬ加え、５分間振とう（１８００ｒｐｍ）後、超音波処理（２０％、１０秒、４回、インターバル１０分）を行い、フィブロインを完全に溶解させた。次いで、フィブロインが溶解した溶液を、フィルタ（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ−ＧＶ、ＤｕｒａｐｏｒｅＰＶＤＦ０．２２μｍ）を用いて濾過して不純物を取り除き、構造タンパク質溶液（フィブロイン溶液）を得た。得られた構造タンパク質溶液の紫外・可視吸収を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）で測定した。測定の結果、紫外・可視吸収スペクトルは２８０ｎｍを極大とする吸収スペクトルを示し、顕著な散乱は見られなかった。この結果から、フィブロインが完全に溶解していることが確認された。  【０３３４】
次いで、構造タンパク質溶液を、半透膜からなる透析チューブ（ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ社製、商品名＃Ｄ１００）に入れ、外溶液を３Ｍ尿素バッファー（３Ｍ尿素、１０ｍＭｔｒｉｓＨＣｌ、２．５ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７．０）として透析を２４時間行った。その後、外溶液をｍｉｌｉＱ（メルクミリポア社製）に変更して、更なる透析を行うことで、構造タンパク質ゲル（ハイドロゲル）を得た。なお、ここでは、かかる透析操作により、得られた構造タンパク質ゲル中に構造タンパク質微小体が形成されると共に、形
成された構造タンパク質微小体がナノファイバーに成長している。すなわち、ここで得られた構造タンパク質ゲル中には、繊維状物質として、構造タンパク質微小体やナノファイバーが含まれている。  【０３３５】
図１２（ａ）に示すように、得られたタンパク質ゲルの一方向における両端を固定し、異方性応力が加わる形で乾燥させて、タンパク質構造体を得た。  【０３３６】
得られたタンパク質構造体の配向性を、Ｘ線回折（ＸＲＤ）により確認した。具体的には、Ｘ線発生装置ＭｉｃｒｏＭＡＸ００７（リガク社製）、検出器Ｒ−ＡＸＩＳ−ＩＶ（リガク社製）を用い、Ｘ線波長１．５４１８Å（ＣｕＫα）、室温（２０℃前後）、カメラ長８０ｍｍ、露光時間１５分の条件で、Ｘ線回折パターンを得た。得られた２次元Ｘ線回折プロファイルを図１３に示す。図１３中、（１）〜（４）は特定の回折角に対して円環積した強度の方位角度分布を示しており、（５）は子午線方向の回折強度プロファイルを示している。図１３に示すとおり、回折パターンが弧を描いており、且つスポット状に観察される部分があることから、タンパク質構造体中でタンパク質ナノファイバーが高度に配向していることが確認された。  【０３３７】
また、タンパク質構造体の配向性を、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により確認した。具体的には、ＳＰＭ−９７００（島津製作所製）、カンチレバー（オリンパス社製、ＯＭＣＬ−ＡＣ２４０ＴＳ−Ｒ３）を用い、ダイナミックモードで測定することにより、ＡＦＭ像を得た。得られたＡＦＭ像を図１５（ａ）に示す。図１５（ａ）に示すとおり、ＡＦＭ像において一方向に配向した繊維状物質が観察され、タンパク質構造体における高度な配向性が確認された。  【０３３８】
（比較例２）  実施例４と同様にしてタンパク質ゲルを調製した。ついで、図１２（ｂ）に示すように、タンパク質ゲルを規則性無く固定して、乾燥させ、タンパク質構造体を得た。  【０３３９】
得られたタンパク質構造体について、実施例１と同様にＸ線回折（ＸＲＤ）の解析及び原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）による観察を行った。得られた２次元Ｘ線回折プロファイルを図１４に示し、得られたＡＦＭ像を図１５（ｂ）に示す。図１４に示すとおり、回折パターンはぼんやりとしたハローであり、タンパク質構造体に配向性が無いことが確認された。また、図１５（ｂ）に示すとおり、ＡＦＭ像において繊維状物質の配向は観察されなかった。  【０３４０】
（参考試験）  タンパク質ゲルの製造過程で形成されるタンパク質微小体について、以下の方法で、ＴｈＴ染色による蛍光強度測定、小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）の解析、Ｇｕｉｎｉｅｒ解析、動的光散乱法による平均粒子径の測定を行った。  【０３４１】
＜ＴｈＴ染色による蛍光強度測定＞  測定試料として、タンパク質微小体を分散液（６Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴの水溶液、ｐＨ７．０）中に、５ｍｇ／ｍＬの濃度で分散させ、更にＴｈＴを４μＭとなるように添加したものを用いた。測定条件は、以下のとおりとした。    測定機器：ＪＡＳＣＯ  ＦＰ−８２００（日本分光株式会社製）    測定範囲：４４０〜６００ｎｍ    励起波長：４５０ｎｍ    スキャンスピード：Ｍｅｄｉｕｍ    測定回数：３回  【０３４２】
ＴｈＴ染色による蛍光強度測定の結果を、図３にＡ１として示す。図３のＡ１は、４８０〜５００ｎｍの範囲内にピークを有しており、これにより、タンパク質微小体がβシート構造を有していることが確認された。  【０３４３】
＜ＳＡＸＳの測定＞  測定試料として、タンパク質微小体を分散液（６Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴの水溶液、ｐＨ７．０）中に、５ｍｇ／ｍＬの濃度で分散させ、更にＴｈＴを４μＭとなるように添加したものを用いた。測定条件は、以下のとおりとした。    測定装置：Ｘ線小角散乱測定装置ＮＡＮＯ−Ｖｉｅｗｅｒ  （リガク社製）、Ｘ線発生装置ＭｉｃｒｏＭＡＸ００７（リガク社製）、検出器ＰＩＬＡＴＵＳ  ２００Ｋ（ＤＥＣＴＲＩＳ社製）    測定条件：Ｘ線波長１．５４１８Å（ＣｕＫα）、室温（２０℃）、露光時間３０分  【０３４４】
上記条件での測定後、円周平均を行い、１次元プロファイルを得た。１次元プロファイルを、ＩｇｏｒＰｒｏソフトウェア（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ社製）を用いて解析することで、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔを得た。得られたＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔを、図４にＡ２（実線）として示す。図４のＡ２は、Ｑが０．１５以下の領域にピークを有している。また、Ｑが０．１５以上０．３以下の領域における変化幅が±１０％以下となっている。この結果から、タンパク質微小体が、電子密度が高いコア部と、当該コア部を囲むように配置されたランダムコイルと、を備えていることが確認された。  【０３４５】
＜Ｇｕｉｎｉｅｒ解析＞  （ｉｉｉ）タンパク質分子の会合の項に記載のとおり、Ｇｕｉｎｉｅｒ解析を行った。その結果、第一の測定試料群から求められた原点散乱強度は２０．６１７、第二の測定試料群から求められた原点散乱強度は７．３８であり、タンパク質微小体が、３つのタンパク質分子の会合体であることが確認された。  【０３４６】
＜動的光散乱法による平均粒子径の測定＞  測定試料群として、タンパク質微小体を第一の分散液（６Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ及び５ｍＭ  ＤＴＴの水溶液、ｐＨ７．０）中に、２ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で分散させたものを準備した。  次いで、各測定試料について、以下の条件で動的光散乱法による粒度分布の測定を行い、体積平均径を求めた。    測定装置：ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ  ｎａｎｏ−ＺＳ（マルバーン社製）    測定温度：２０℃  各測定試料について５回ずつ上記測定を行い、得られた測定値の平均値を求めた。  各測定試料の濃度及び測定値（平均値）から、濃度に対する平均粒子径のプロットを取り、分子間相互作用を排除した０濃度外挿を行った。０濃度外挿により得られた値を、タンパク質微小体の平均粒子径とした。  【０３４７】
上記の測定の結果、タンパク質微小体の平均粒子径は１３．２２５ｎｍであった。
【産業上の利用可能性】
【０３４８】
天然の綿、絹、羊毛等は高精度に制御されたナノ構造の集合体である。一方、本発明により、高度に制御された構造をとるタンパク質ナノファイバーを人工的に工業規模で製造することが期待できる。また、本発明により製造されるタンパク質ナノファイバーは、細胞シート、生体分子デバイス、フィルタ、紡糸、化粧品等への応用も期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年11月8日(2021.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造タンパク質から構成され、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の全てを満たし、
前記構造タンパク質がフィブロイン様タンパク質である、構造タンパク質微小体。
（ｉ）チオフラビンＴ染色による蛍光強度測定で、４８０〜５００ｎｍの範囲内にピークを有する。（ｉｉ）小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）のＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔにおいて、Ｑが０．１５以下の領域にピークを有し、且つ、Ｑが０．１５以上０．３以下の領域における変化幅が±１０％以下である。（ｉｉｉ）２〜１０の構造タンパク質分子の会合体である。
【請求項２】
動的光散乱法によって測定される平均粒子径が、１〜５０ｎｍである、請求項１に記載の構造タンパク質微小体。
【請求項３】
小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）のＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｋｒａｔｋｙ  Ｐｌｏｔにおいて、前記ピークの大きさが、Ｑが０．１５以上０．３以下の領域における平均値の１．１倍以上である、請求項１又は２に記載の構造タンパク質微小体。
【請求項４】
Ｇｕｉｎｉｅｒ解析により求められる重量濃度で規格化した原点散乱強度が、未会合の前記構造タンパク質分子の原点散乱強度の１．５倍以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の構造タンパク質微小体。
【請求項５】
前記構造タンパク質が、改変フィブロインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の構造タンパク質微小体。
【請求項６】
前記構造タンパク質が、改変クモ糸フィブロインを含む、請求項５に記載の構造タンパク質微小体。
【請求項７】
構造タンパク質と可溶化剤とを含む構造タンパク質溶液を得る第一工程と、
前記構造タンパク質溶液に、前記構造タンパク質溶液中の溶媒と相溶性のある有機溶媒を添加して、前記構造タンパク質の前記構造タンパク質溶液に対する溶解度を下げることにより、請求項１〜６のいずれか一項に記載の構造タンパク質微小体を形成させる第二工程と、を含み、前記構造タンパク質がフィブロイン様タンパク質である、構造タンパク質微小体の製造方法。
【請求項８】
前記可溶化剤が、ジメチルスルホキシド、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム及び過塩素酸塩からなる群より選択される少なくとも一種を含んでいる、請求項７に記載の、構造タンパク質微小体の製造方法。
【請求項９】
遠心分離により前記構造タンパク質微小体を回収する第三工程を更に含む、請求項７又は８に記載の、構造タンパク質微小体の製造方法。
【請求項１０】
前記構造タンパク質が、改変フィブロインを含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の、構造タンパク質微小体の製造方法。
【請求項１１】
前記構造タンパク質が、改変クモ糸フィブロインを含む、請求項１０に記載の、構造タンパク質微小体の製造方法。
【請求項１２】
フィブロイン様タンパク質が溶解したタンパク質溶液を準備するＡ工程と、
前記タンパク質溶液と請求項１〜６のいずれか一項に記載の構造タンパク質微小体とを混合して、タンパク質ナノファイバーを得る第Ｂ工程と、を含む、ナノファイバーの製造方法。
【請求項１３】
前記タンパク質溶液が、第一の溶媒を含み、
前記第一の溶媒が、有機溶媒、塩溶液、酸性溶液、塩基性溶液及びカオトロピック溶液からなる群より選択される一つである、請求項１２に記載の、ナノファイバーの製造方法。
【請求項１４】
前記第一の溶媒が、有機溶媒、塩溶液、酸性溶液及び塩基性溶液からなる群より選択される一つである、請求項１３に記載の、ナノファイバーの製造方法。
【請求項１５】
前記第一の溶媒が、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール及びジメチルスルホキシドからなる群より選択される一つである、請求項１４に記載の、ナノファイバーの製造方法。
【請求項１６】
前記フィブロイン様タンパク質が、改変フィブロインを含む、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の、ナノファイバーの製造方法。
【請求項１７】
前記フィブロイン様タンパク質が、改変クモ糸フィブロインを含む、請求項１６に記載の、ナノファイバーの製造方法。
【請求項１８】
タンパク質構造体の製造方法であって、
フィブロイン様タンパク質から構成された繊維状物質を含有する構造前駆体を準備する（ア）工程と、
前記構造前駆体に異方性応力を作用させることにより前記繊維状物質を一方向に配向させて、前記タンパク質構造体を得る（イ）工程と、を含み、
前記繊維状物質が、請求項１〜６のいずれか一項に記載の構造タンパク質微小体と、前記構造タンパク質微小体を核としてフィブロイン様タンパク質が自己組織化してなるタンパク質ナノファイバーのうちの少なくともいずれか一方を含んでいる、タンパク質構造体の製造方法。
【請求項１９】
前記タンパク質ナノファイバーが、アミロイド様結晶を有する、請求項１８に記載の、タンパク質構造体の製造方法。
【請求項２０】
前記アミロイド様結晶が、前記繊維状物質の配向方向に対して垂直に配向している、請求項１９に記載の、タンパク質構造体の製造方法。
【請求項２１】
前記繊維状物質の太さが３ｎｍ以上である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の、タンパク質構造体の製造方法。
【請求項２２】
前記（イ）工程において、前記構造前駆体の一方向における両端を固定し、乾燥収縮させることで前記異方性応力を作用させる、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の、タンパク質構造体の製造方法。
【請求項２３】
前記構造前駆体が、ハイドロゲル、繊維、フィルムからなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の、タンパク質構造体の製造方法。
【請求項２４】
前記フィブロイン様タンパク質が、改変フィブロインを含む、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の、タンパク質構造体の製造方法。
【請求項２５】
前記フィブロイン様タンパク質が、改変クモ糸フィブロインを含む、請求項２４に記載の、タンパク質構造体の製造方法。
【国際調査報告】
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