(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（ａ）〜（ｃ）のプレートからなる被験物質の分析キット。
（ａ）該被験物質と特異的に結合可能な物質を結合せしめるか、若しくは被験物質またはその類似物質を結合せしめた担体を収容してなる多数のウエルを有するプレートであって、該ウエルは、プレート下部に連通する連通孔を設けられ、該連通孔には、個体担体を透過せず、かつ通常の状態において液体を透過しないフィルター部材が装着されている、プレート。
（ｂ）定量可能な試薬を封入したリポソームを固定化した担体を収容してなる多数のウエルを有するプレートであって、該ウエルは、プレート下部に連通する連通孔を設けられ、かつ該連通孔には通常の状態において液体を透過しないフィルター部材が装着されているとともに、各ウエルの位置が上記（ａ）のプレートの各ウエルの位置と一致するよう設けられた、プレート。
（ｃ）多数のウエルを有するプレートであって、各ウエルの位置が上記（ａ）及び（ｂ）のプレートの各ウエルの位置と一致するように設けられたプレート。
【請求項２】
多数のウエルを有するプレートであって、該ウエルは、プレート下部に連通する連通孔を設けられ、該連通孔には、担体を透過せず、かつ通常の状態において液体を透過しないフィルター部材が装着されていることを特徴とする、上記請求項１に記載の分析キットに使用する部材。
【請求項３】
上記請求項１に記載された（ａ）〜（ｃ）のプレートからなる分析キットを使用して被験物質の分析を行う方法であって、
（１）（ａ）のプレートの各ウエルに、被験物質が溶解していると想定される各検体溶液と、該被験物質またはその類似物質あるいは該被験物質またはその類似物質と特異的に結合し得る物質とリポソームを破壊可能な物質とから形成される複合体とを混合した溶液を加え、被験物質、被験物質またはその類似物質あるいはこれら物質と特異的に結合し得る物質を結合せしめた担体とを含む反応系において、競合的結合反応を行う工程。
（２）  該反応において結合しなかった複合体を各ウエル底部の連通孔から強制的に溶出させ、この各溶出液を（ａ）のプレートの各ウエルと対応する位置にある（ｂ）のプレートの各ウエルに供給し、リポソームを破壊し、リポソームに封入された定量可能な試薬を放出させる工程。
（３）リポソームから放出された定量可能な試薬を各ウエル底部の連通孔から強制的に溶出させ、該溶出液を（ｂ）の各ウエルと対応する位置にある（ｃ）のプレートの各ウエルに供給し、各ウエル中の定量可能な試薬の量を測定する工程、を有することを特徴とする前記方法。」
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被験物質の分析キット及びこれを用いた被験物質の分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本発明者等は、先に色素増感クロマトグラム法による物質検出法として、抗体固定化カラムと蛍光物質封入リポソームカラムを用いた、測定対象物質の濃度測定方法について特許出願している（特許第３２４３５０８号）。
この方法を具体的に述べると、抗体固定化カラムにサンプルとホスホリパーゼＡ２（以下ＰＬＡ２と略称する。）と標的物質のコンジュケートの混合液を注入し、抗原抗体反応を行い、この競合反応により抗体に結合しなかったＰＬＡ2コンジュケートをカラムから溶出させる。続いてこの溶出液をリポソームカラムに供給し、リン脂質を加水分解させてリポソームを破壊することによりリポソームに封入していたカルセインが漏出する。この漏出蛍光量の測定を行うことで物質濃度の測定を行うものである。
【０００３】
【発明の課題】
この先行技術では1検体を測定するのに、１mlの抗体固定化カラムとリポソーム固定化カラム各１本を必要としたため、このカラムを複数並行して用いても、同時送液は困難であり、そのために多検体同時測定が困難であった。また、従来技術では自然落下を利用した溶液回収で回収に１時間程度を要した。本発明の課題は、このような従来技術の問題点を解消しようとするものであり、多検体を同時に測定可能とするものである。また、測定時間短縮を達成しようとするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、多数のウエルを有するプレートであって、該ウエル、プレート下部に連通する連通孔を設けられ、該連通孔には、個体担体を透過せず、かつ通常の状態において液体を透過しないフィルター部材が装着されているプレートを用い、該プレートの各ウエル毎に、上記先行技術における、抗体固定化カラムあるいはリポソーム固定化カラムに対応する機能を保有せしめたことにより、多検体を同時にかつ短時間で分析可能であることを見いだし、本発明を完成するに至ったものである。
【０００５】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（３）に係るものである。
１．  以下（ａ）〜（ｃ）のプレートからなる被験物質の分析キット
（ａ）該被験物質と特異的に結合可能な物質を結合せしめるか、若しくは被験物質またはその類似物質を結合せしめた担体を収容してなる多数のウエルを有するプレートであって、該ウエルは、プレート下部に連通する連通孔を設けられ、該連通孔には、個体担体を透過せず、かつ通常の状態において液体を透過しないフィルター部材が装着されている、プレート。
（ｂ）定量可能な試薬を封入したリポソームを固定化した担体を収容してなる多数のウエルを有するプレートであって、該ウエルは、プレート下部に連通する連通孔を設けられ、かつ該連通孔には通常の状態において液体を透過しないフィルター部材が装着されているとともに、各ウエルの位置が上記（ａ）のプレートの各ウエルの位置と一致するよう設けられた、プレート。
（ｃ）多数のウエルを有するプレートであって、各ウエルの位置が上記（ａ）及び（ｂ）のプレートの各ウエルの位置と一致するように設けられたプレート。
２．多数のウエルを有するプレートであって、該ウエルは、プレート下部に連通する連通孔を設けられ、該連通孔には、担体を透過せず、かつ通常の状態において液体を透過しないフィルター部材が装着されていることを特徴とする、上記１に記載の分析キットに使用する部材。
３．上記請求項１に記載された（ａ）〜（ｃ）のプレートからなる分析キットを使用して被験物質の分析を行う方法であって、
（１）（ａ）のプレートの各ウエルに、被験物質が溶解していると想定される各試験液と、該被験物質またはその類似物質あるいは該被験物質またはその類似物質と特異的に結合し得る物質とリポソームを破壊可能な物質とから形成される複合体とを混合した溶液を加え、被験物質、被験物質またはその類似物質あるいはこれら物質と特異的に結合し得る物質を結合せしめた担体とを含む反応系において、競合的結合反応を行う工程。
（２）  該反応において結合しなかった複合体を各ウエル底部の連通孔から強制的に溶出させ、この各溶出液を（ａ）のプレートの各ウエルと対応する位置にある（ｂ）のプレートの各ウエルに供給し、リポソームを破壊し、リポソームに封入された定量可能な試薬を放出させる工程。
（３）リポソームから放出された定量可能な試薬を各ウエル底部の連通孔から強制的に溶出させ、該溶出液を（ｂ）の各ウエルと対応する位置にある（ｃ）のプレートの各ウエルに供給し、各ウエル中の定量可能な試薬の量を測定する工程、を有することを特徴とする前記方法。」
【０００６】
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明は、いわゆる競合法を応用したものである。
ここで、競合法として一般的な方法を示すと、例えば、被験物質を溶解してある検体溶液に、酵素と前記被験物質とから形成される酵素複合体を加え、前記被験物質と前記酵素複合体とが混合された複合体混合液を調製する混合液調製工程を行い、前記被験物質との結合によりその被験物質を捕捉可能な結合基を形成してある担体を設けてなる分離手段に、前記複合体混合液を供給し、前記被験物質と前記酵素複合体とを競合的に前記結合基に結合させ、前記被験物質のすべてが前記結合基に結合するとともに、前記分離手段中に含まれる結合基の残部のすべてに酵素複合体が結合したものとみなせる状態を得る競合反応工程を行い、その結合基に結合した被験物質に、さらに、発光要素等を結合させて、前記測定対象物質の量を測定する方法である。
【０００７】
このような方法により、測定対象物質と結合基との選択的な反応を利用して、前記測定対象物質量を、定量容易な量に変換できることになって、たとえば、環境中の農薬等の微量の測定対象物質であっても、精度高く検出できる。しかし、この方法では、競合反応工程後において、被験物質に抗体等を介して発光要素を結合する手段を要し、分析操作が煩雑となり、迅速な分析が行えない。
【０００８】
これに対して、上記特許第３２４３５０８号発明においては、被験物質またはそ類似物質あるいは被験物質またはその類似物質と特異的に結合しうる物質と、リポソーム破壊能を有する物質とから形成した複合体を使用するとともに、蛍光物質等の定量可能物質を封入したリポソーム固定化カラムを用いる点に特徴を有するものある。すなわち、競合反応工程においては、被験物質またはその類似物質あるいは被験物質またはその類似物質と特異的に結合しうる物質を結合した担体カラムを使用し、被験物質、該担体に結合した物質及び上記複合体を有する反応系で、競合結合反応を行い、次いで競合反応において結合しなかった該複合体をリポソーム固定化カラムに供給し、該複合体は、その量に見合う量のリポソームを破壊し、リポソーム内に封入した蛍光物質等の量を定量して、該定量値から被験物質の量を求めるものである。この方法においては、分析操作において、被験物質に抗体等を介して発光要素を結合する手段を要しないの、分析操作が簡便であるという利点を有する。
【０００９】
本発明は、原理的には特許第３２４３５０８号発明に従うものではあるが、この発明の方法にも前記した問題点があり、これをさらに発展改良したものである。
本発明においては、被験物質分析用キットの部材として、多数のウエルを有するプレートであって、該ウエルは、プレート下部に連通する連通孔を設けられ、該連通孔には、担体を透過せず、かつ通常の状態において液体を透過しないフィルター部材が装着されているプレートを使用する。
【００１０】
このプレートとしてはマイクロタイタープレートが好ましく、上記フィルターとしては、担体を透過せず、かつ通常の状態において液体を透過しないフィルター部材であればよいが、特に、使用する被験物質またはその類似物質あるいは被験物質またはその類似物質と特異的に結合しうる物質と、リポソーム破壊能を有する物質とから形成した複合体が吸着しないものが好ましい。これには、例えば親水性ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）膜からなるフィルターを挙げることができる。
【００１１】
本発明においては、上記プレートの各ウエルに、該被験物質と特異的に結合可能な物質を結合せしめた担体、若しくは被験物質またはその類似物質を結合した担体を収容して、各ウエルに競合的反応を行うための固定化カラムを設ける。例えば９６穴マイクロタイタープレートを使用した場合、９６個のウエルにおいて、各々反応系が異なる競合反応を一度に同時に行うことが可能となる。使用する担体としては、セファロース、アガロースゲル等が挙げられ、例えば、ゲルマトリックス「Protein G Sepharose 4 Fast Flow」 (アマシャムバイオサイエンス株式会社)が好ましい。
【００１２】
また、該担体に結合させる該被験物質と特異的に結合可能な物質とては、例えば、該被験物質に対するモノクローナルあるいはポリクローナル抗体が好ましく、このほか各種の受容体蛋白、ＤＮＡ，ＲＮＡ等が挙げられる。また、被験物質の類似物質とは、例えば被験物質がＰＣＢの場合、オルトジクロロベンゼンが挙げられるが、上記被験物質と特異的に結合可能な物質と結合しうるものであれば、特に限定されるものではない。例えばジクロロベンゼンに対する抗体は、ＰＣＢのほかダイオキシン等のオルトジクロロベンゼンと類似する構造の化合物と選択的に結合するので、これら被験物質としてこれら芳香族化合物の定量にも使用することができる。
【００１３】
本発明においては、このようにプレートの各ウエルに固定化カラムを設けることにより、例えば、各ウエルに収容する担体おいて結合する物質を各々変えることにより、多種の被験物質を同時に分析したり、あるいは各ウエルに収容する担体おいて結合する物質が同じであっても、各ウエル毎に検体溶液を変えることにより、各検体溶液に含まれる被験物質の量を同時に分析することも可能となる。以下、この競合反応を行うプレートを競合反応プレートという。
【００１４】
本発明においては、上記プレートの各ウエルに、定量可能な物質を封入したリポソームを固定化した担体を収容することにより、プレートの各ウエルをリポソーム固定化カラムとして使用することができる。定量可能な物質としては、カルセイン等の自己消光可能な蛍光色素等が望ましいが、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）等の発色色素の前駆体、過酸化酵素等の発色色素を発色させる触媒剤等でもよく、また、特にこれらに限られず、その量が定量可能な物質であればいずれも使用できる。また、このプレートの各ウエルの位置は上記競合反応プレートの位置と一致させるのが望ましい。以下、このプレートをリポソーム固定化プレートという。
【００１５】
さらに、本発明の被験物質の分析キットの部材として、各ウエルの位置が上記プレートの各ウエルの位置と一致するように設けられたプレートを使用する。以下このプレートを定量プレートという。
これらの部材からなる本発明の分析キットを使用した分析方法について以下説明する。
【００１６】
（競合反応）
（１）競合反応プレートの各ウエルに、検体溶液中の被験物質と特異的に結合可能な物質を結合せしめた担体を収容せしめる場合においては、各ウエルに、検体溶液、及び該被験物質またはその類似物質と特異的に結合する物質とリポソームを破壊可能な物質とから形成される複合体との混合溶液を加え、該担体結合物質に対して、被験物質と該複合体とによる競合反応を行う。上記リポソームを破壊可能な物質としては、リパーゼ好ましくはホスホリパーゼ等の酵素が挙げられる。
【００１７】
競合反応は、上記担体における被験物質に特異的に結合可能な物質に、検体中の被験物質が全て結合し、かつ被験物質に特異的に結合可能な物質の全ての残部に、上記複合体が結合するまで行われる。
また、使用する複合体の量は、この結合によっても未反応の複合体が残るように設定する。すなわち、上記複合体の、担体に結合させた上記物質との結合性は、検体中の被験物質の結合性よりも弱く、担体上の上記物質に結合した複合体の量は、検体中の全ての被験物質の量を反映する。したがって、予め既知濃度の被験物質の反応によりもたらされる未反応複合体を定量しておくことにより、濃度未知の被験物質を定量することができる。
【００１８】
（２）競合反応プレートの各ウエルに、被験物質またはその類似物質を結合させた担体を収容させる場合においては、被験物質またはその類似物質に対して特異的に結合する物質とリポソームを破壊可能な物質とから形成した複合体を使用し、各ウエルに、被験物質と該複合体との混合溶液を加え、競合反応を行う。  競合反応は、該複合体に検体液中の被験物質の全てが結合し、かつ、残部の複合体の全てが担体に結合した上記物質と結合する状態になるまで行う。これによれば、一定量使用した複合体のうちの、担体の上記物質との結合に消費された結合体を除く分は、担体の上記物質との結合には使われず、被験物質と結合したものであるから、被験物質と結合した状態で溶出される複合体の量は、検体中の被験物質の量に対応するから、この複合体量を把握できれば、検体中の被験物質の量を知ることができる。この場合には溶出される複合体量を測定すれば、検体中の被験物質の量、濃度を定量できるが、以下の工程を経るのがさらに簡便である。
【００１９】
（リポソーム破壊−定量可能物質の放出）
（３）上記（１）あるいは（２）における競合反応を行ったのち、競合反応プレートは、ウエルの位置関係が競合プレートと同一の位置関係にあるプレートの上部側に重ねられ、各ウエル上部が密閉された状態で遠心分離操作を行う。これにより、競合反応プレートの各ウエルの連通孔に設けられたフィルター部材により、各ウエル内の担体はウエル内に止まるが、上記（１）における競合反応に関与しなかった複合体、あるいは（２）の検体中の被験物質と結合した複合体は、溶出液として下部のプレートの対応する各ウエル内に強制的に溶出させる。この定量プレート内に溶出された複合体は多本架ピペットを用いて、リポソーム固定化プレートの対応する各ウエルに供給される。複合体にはリポソームを破壊可能な物質が結合しており、これによりリポソームは破壊され、リポソーム内に封入された定量可能物質がウエル内に放出される。
【００２０】
（定量）
（４）上記リポソームの破壊工程後、リポソーム固定化プレートに重ねられ、リポソーム破壊を免れた担体は、定量試薬を封入したまま各ウエル内に止まるが、リポソームが破壊され放出した定量試薬は定量プレートに溶出される。定量プレートの各ウエルにある溶出液中の定量試薬の量は、上記競合反応プレートから溶出された複合体の量に比例し、この複合体の量は、検体液中の被験物質の量が反映されたものであるから、定量試薬の量を定量すれば、検体液中の被験物質の存在あるいはその存在量乃至濃度を測定することができる。
【００２１】
この定量においては、定量試薬としてカルセイン等の自己消光可能な蛍光色素を使用した場合、高濃度の状態では、自己消光して蛍光を発せず、低濃度の状態では蛍光を発するため、担体にリポソームが破壊されると、漏出して蛍光を発するようになる。したがって、定量プレートの各ウエル中の蛍光強度を測定することにより、検体中の被験物質の量乃至その濃度を測定することができる。この場合には、予め作成しておいた蛍光強度と検体中の被験物質量乃至その濃度との関係を示す検量線等を用いることができる。
【００２２】
また、発色色素の前駆体あるいは該前駆体を発色色素に変換する過酸化酵素等を使用する場合にあっては、リポソーム内に前駆体あるいは酵素のうち一方を封入しておき、定量プレートに溶出された溶出液に対して他方の前駆体あるいは酵素を添加することにより、発色色素を生成させ、生成された発色色素の吸光度を測定して検体中の被験物質の量乃至その濃度を測定できる。しかし、本発明においてはこれら例示に止まらず、定量可能な物質であれば、その原理からみれば、いずれの物質でもよいことは容易に理解されるであろう。
【００２３】
以上の分析方法の説明においては、競合反応、リポソームの破壊を別工程として多本架ピペットを介する溶出液移動を伴う方法について説明したが、本発明においては多本架ピペットを介する溶出液移動をともなわず一挙にこれら工程を行うこともできる。これには競合反応プレート、リポソーム固定化プレート及び定量プレートを、競合プレートが最も上になるよう順次重ね、検体溶液及び上記複合体を競合反応プレートの各ウエルに加えた後、該各ウエル上部を密閉し、この積層物を適宜振とう、遠心分離にかける。この操作中に、競合反応後の溶出液は、リポソーム固定化カラムに供給され、破壊されたリポソーム中の定量試薬は、定量プレートの各ウエルに自動的に溶出される。操作終了後は、この定量プレートを取り出し各ウエル中の定量試薬の量を定量すればよい。
【００２４】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明は特にこの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
（１）〔抗PCB固定化ゲルの調製〕
抗PCB抗体を固定化するゲルマトリクスは、Protein G Sepharose 4 Fast Flow (アマシャムバイオサイエンス株式会社) を使用した。ゲル1 mlを含む溶液1.3 mlを ポリプレップカラム (Bio-Rad Laboratories, California, USA) へ添加し、5 mlのHEPES緩衝液 (10 mM HEPES pH7.4、150 mM NaCl、1 mM CaCl2) を用いて平衡化を行った。2 mg/mlマウスモノクローナルIgG (Reserch Diagnostics, Inc., Flanders, USA) 0.5 mlにHEPES緩衝液 0.5 mlを添加して全量を1 mlとし、平衡化後のカラムへ添加した。ゲルおよび抗体溶液の混合液を室温で20分間振とうしながらインキュベーションを行った後、HEPES緩衝液5 mlを用いて洗浄を行い、最終的にはHEPES緩衝液1 mlで懸濁した。
【００２５】
（２）〔リポソームゲルの調製〕
100 mmol卵黄ホスファチジルコリン、2 mmolビオチン化ホスファチジルエタノールアミン (Avanti Polar-Lipids, Inc. Alabaster, USA) を混合し、エバポレーションを行った後、凍結乾燥させ脂質フィルムを調製した。このフィルムに100 mM カルセイン溶液 (pH7.4) を加えて懸濁し、多層膜リポソームを調製した。さらに0.1 mmのポリカーボネートフィルターを装着したエクストルーダーを用いて高圧濾過し、カルセイン封入ビオチン化単層膜リポソームとした。ゲルマトリクスSephacryl S-1000 (アマシャムバイオサイエンス株式会社) にアビジンを固定化させ、これにカルセイン封入リポソームを添加してリポソーム固定化ゲルを調製した。
【００２６】
（３）〔コンジュゲートの調製〕
PLA2と3,4-ジクロロアニリンをアミンカップリング法により結合させ、PLA2-3,4-ジクロロアニリンコンジュゲートを作製した。35.7 mM PLA2 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA) 、357 mM 3,4-ジクロロアニリン (和光純薬工業株式会社)、 357 mM N-ヒドロキシスクシンイミド (NHS) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA)、 3.57 mM N-エチルN’-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC) (株式会社同人化学研究所)、10 mM HEPES (pH7.4)、150 mM NaCl、1 mM CaCl2を混合し、4°Cで24時間振とうさせて反応を行った後、0.5 Mとなるようエタノールアミン (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA) を加え、更に4°Cで24時間振とうさせてブロッキングを行った。反応後の溶液はHEPES緩衝液にて透析を行った。
【００２７】
（４）〔マイクロプレートを用いたPCB検出〕
本研究では、ウェルの底部に親水性PVDF膜を装着した96穴マイクロタイタープレート、マルチスクリーンHV (MILLIPORE, Bedford, USA) を使用した。このマルチスクリーンを用いることにより96個のミニカラムを作製することができ、色素増感クロマトグラフィー法を、96検体の同時測定へ展開することが可能となる（図1）。
【００２８】
第1プレートとして、マイクロプレートの各ウェルに抗体固定化ゲル20 mlを添加した抗体固定化ゲルプレートを作製した。また第2プレートであるリポソームゲルマイクロプレートは、各ウェルにカルセイン封入リポソームゲル10 mlを添加して作製した。まず、抗体固定化ゲルプレートに様々な濃度のPCBサンプルと5 mg/ml PLA2コンジュゲートの混合液100 mlを添加し、37°Cで1時間振とうさせて競合反応を行った。反応後、マイクロプレートを多本架冷却遠心機 (LX-120, 株式会社トミー精工) を用いて180xg、1分間、4°Cで遠心させることで反応液を溶出させた (図2)。続いてリポソームゲルマイクロプレートに各溶出液を加え、室温で10分間、振とうさせて反応を行った後、180xg、1分間、4°Cで遠心させて反応液を溶出させた。溶出液の漏出蛍光量の測定は、Typhoon 8600 (アマシャムバイオサイエンス株式会社) を使用した。励起フィルターはFluorescein 526 SPを用いて測定を行った。その結果、PCBサンプルの濃度の増加とともに漏出蛍光量の増加がみられ (図3) 、マイクロプレートを使用した検出系においてもPCBを検出することが可能であることが証明された。
【００２９】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明においては、色素増感クロマトグラフィー法を多検体測定へと応用し、測定時間を大幅に短縮することに成功した。使用するマイクロプレートを96穴からさらに384穴タイプへ展開することでさらに多くの検体を同時測定可能となることが期待される。また使用する抗体を変更することによりPCB以外のあらゆる物質の検出を行うことも可能となり、環境汚染物質の検出のみならず、食中毒検査、あるいは医療分野等への応用も期待できるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は実施例で行った本発明の工程図の概略を示す図である。
（１）抗PCB抗体固定化ゲルプレート
（２）カルセイン封入リポソームゲルプレート
（３）PCBサンプル及びPLA2コンジュゲート混合液
（４）ピペットチップ
【図２】図２は実施例で使用したプレート及び多本架冷却遠心機の写真である。
【図３】図３は、実施例において測定された漏出蛍光画像を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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