(57)【要約】  本発明は、自家和合性を有するブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）、またはその後代に関する。本発明によれば、自家和合性を有するブラシカ・オレラセア植物が提供される。これによって、ブラシカ・オレラセア植物について、安定的、且つ効率的な原種種子生産が実施可能とする技術的手段を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自家和合性を有するブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）、またはその後代。
【請求項２】
自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）の自家不和合性遺伝子座（Ｓ遺伝子座）に座乗する遺伝子が、自家和合性のブラシカ・オレラセア植物のＳ遺伝子座に座乗する遺伝子により置き換えられてなる、請求項１に記載の自家和合性を有するブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）、またはその後代。
【請求項３】
自家和合性のブラシカ・オレラセア植物と、自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）とを交配し、交雑後代から自家和合性を有した個体を選抜することにより得られる、請求項１または２に記載の自家和合性を有するブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）、またはその後代。
【請求項４】
Ｓ遺伝子座に、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群のいずれか一以上のＤＮＡを有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の自家和合性ブラシカ・オレラセア植物：
（ａ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、植物における自家和合性の発現に関与する、ＤＮＡ、または
（ｃ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列からなり、植物における自家和合性の発現に関与する、ＤＮＡ。
【請求項５】
自家不和合性遺伝子座に、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡを含むＳアレルを導入することにより自家和合性とされた、請求項４に記載のブラシカ・オレラセア植物、またはその後代。
【請求項６】
ブロッコリーまたはキャベツである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の自家和合性ブラシカ・オレラセア植物、またはその後代。
【請求項７】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４７で特定されるカイラン品種に見出される、自家和合性の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ１」をＳ遺伝子座に有する、ブラシカ・オレラセア植物（カイランを除く）、またはその後代。
【請求項８】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４９で特定されるブロッコリー品種に見出される、自家和合性の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ１」をＳ遺伝子座に有する、ブラシカ・オレラセア植物（カイランを除く）、またはその後代。
【請求項９】
遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ１」が、下記（ｉ）〜(iii)の塩基配列を有する、請求項７または８に記載のブラシカ・オレラセア植物（カイランを除く）、またはその後代：
（i）  配列番号１に示される塩基配列、
(ii)  配列番号１に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する塩基配列、または
(iii)  配列番号１に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列。
【請求項１０】
ブロッコリーまたはキャベツである、請求項７〜９のいずれか一項に記載のブラシカ・オレラセア植物、またはその後代。
【請求項１１】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３５０で特定されるカリフラワー品種に見出される、自家和合性の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ２」をＳ遺伝子座に有する、ブラシカ・オレラセア植物（カリフラワー、ブラシカ・オレラセア野生種を除く）、またはその後代。
【請求項１２】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４８で特定されるブロッコリー品種に見出される、自家和合性の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ２」をＳ遺伝子座に有する、ブラシカ・オレラセア植物（カリフラワー、ブラシカ・オレラセア野生種を除く）、またはその後代。
【請求項１３】
遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ２」が、下記(Ｉ)〜(III)の塩基配列を有する、請求項１１または１２に記載のブラシカ・オレラセア植物（カリフラワー、ブラシカ・オレラセア野生種を除く）、またはその後代：
(Ｉ)  配列番号２に示される塩基配列、
(II)  配列番号２に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する塩基配列、または
(III)  配列番号２に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列。
【請求項１４】
ブロッコリーまたはキャベツである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のブラシカ・オレラセア植物、またはその後代。
【請求項１５】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４９で特定される、ブロッコリー、またはその後代。
【請求項１６】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４８で特定される、ブロッコリー、またはその後代。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の植物またはその後代の植物体の一部。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の植物またはその後代の種子。
【請求項１９】
自家和合性のブラシカ・オレラセア植物と、自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）とを交配し、交雑後代から自家和合性を有した個体を選抜することを含む、自家和合性を有するブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）の育成方法。
【請求項２０】
前記自家和合性のブラシカ・オレラセア植物の自家和合性が、自家不和合性遺伝子座（Ｓ遺伝子座）に座乗する遺伝子に関連づけられるものである、請求項１９に記載の自家和合性ブラシカ・オレラセア植物の育成方法。
【請求項２１】
前記自家和合性のブラシカ・オレラセア植物が、Ｓ遺伝子座に、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群のいずれか一以上のＤＮＡを有する、請求項１９または２０に記載の自家和合性ブラシカ・オレラセア植物の育成方法：
（ａ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、植物における自家和合性の発現に関与する、ＤＮＡ、または
（ｃ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列からなり、植物における自家和合性の発現に関与する、ＤＮＡ。
【請求項２２】
交雑後代からの自家和合性の個体の選抜を、個体が請求項２１に記載の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡを持つことを指標として、自家和合性植物を選抜することを含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の自家和合性ブラシカ・オレラセア植物の育成方法。
【請求項２３】
自家和合性と関連づけられる遺伝子を含むＳ遺伝子座の極近傍の領域（Ｓ遺伝子座から０〜４ｃＭ）に位置するＤＮＡマーカーを用いて、遺伝子型を判別し、自家和合性を有した個体を選抜することをさらに含む、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の自家和合性ブラシカ・オレラセア植物の育成方法。
【請求項２４】
前記の自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）を戻し交配親系統として、連続戻し交配することを含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の自家和合性ブラシカ・オレラセア植物の育成方法。
【請求項２５】
前記の自家和合性のブラシカ・オレラセア植物が、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４７で特定されるカイラン品種、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４９で特定されるブロッコリー品種、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４８で特定されるブロッコリー品種、または受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３５０で特定されるカリフラワー品種である、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の自家和合性ブラシカ・オレラセア植物の育成方法 。
【請求項２６】
前記自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物が、ブロッコリーまたはキャベツである、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の自家和合性ブラシカ・オレラセア植物の育成方法。
【請求項２７】
下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの塩基配列を有する、ブラシカ・オレラセア植物における自家和合性の検出用マーカー：
（Ａ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列、
（Ｂ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する塩基配列、または
（Ｃ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列。
【請求項２８】
請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の育成方法により得られた自家和合性ブラシカ・オレラセア植物、またはその後代を自殖して、採種することを含む、ブラシカ・オレラセア植物の採種方法。
【請求項２９】
請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の育成方法を用いて、有用な雑種第一代系統の親系統を維持または増殖する方法。
【請求項３０】
配列番号１０〜１５に示される塩基配列のいずれか１以上を有する、ブラシカ・オレラセア植物のＳ遺伝子座近傍領域をジェノタイプ分析するためのマーカー。
【請求項３１】
細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）を利用したブラシカ・オレラセアの雑種第一代種子の採種方法であって、
自家和合性を有するブラシカ・オレラセア植物を利用して、雑種第一代系統の親系統を増殖させる工程を含む、方法。
【請求項３２】
前記の自家和合性を有するブラシカ・オレラセア植物が、Ｓ遺伝子座に、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群のいずれか一以上のＤＮＡを有するものである、請求項３１に記載の採種方法：
（ａ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、植物における自家和合性の発現に関与する、ＤＮＡ、または
（ｃ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列からなり、植物における自家和合性の発現に関与する、ＤＮＡ。
【請求項３３】
前記の自家和合性を有するブラシカ・オレラセア植物が、下記1)〜6)のいずれかのものである、請求項３１または３２に記載の採種方法：
1) 受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４７で特定されるカイラン品種に見出される、自家和合性の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ１」をＳ遺伝子座に有する、ブラシカ・オレラセア植物（カイランを除く）、またはその後代；
2) 受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４９で特定されるブロッコリー品種に見出される、自家和合性の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ１」をＳ遺伝子座に有する、ブラシカ・オレラセア植物（カイランを除く）、またはその後代；
3) 受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３５０で特定されるカリフラワー品種に見出される、自家和合性の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ２」をＳ遺伝子座に有する、ブラシカ・オレラセア植物（カリフラワー、ブラシカ・オレラセア野生種を除く）、またはその後代；
4) 受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４８で特定されるブロッコリー品種に見出される、自家和合性の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ２」をＳ遺伝子座に有する、ブラシカ・オレラセア植物（カリフラワー、ブラシカ・オレラセア野生種を除く）、またはその後代；
5) 受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４９で特定される、ブロッコリー、またはその後代；および
6) 受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４８で特定される、ブロッコリー、またはその後代。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本願は、先行する日本国特許出願である特願２０１８−０３０８７２号（出願日：２０１８年２月２３日）に基づくものであって、その優先権の利益を主張するものであり、その開示内容全体は参照することによりここに組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、自家和合性（self compatibility，ＳＣ）を付与したブラシカ・オレラセア（Brassica oleracea）植物に関する。更に詳しくは、本発明は、ブラシカ・オレラセア作物が本来有する自家不和合性（self incompatibility, ＳＩ）遺伝子について、機能欠失型の遺伝子座を導入することで、採種上の問題点を克服する技術に関する。
【背景技術】
【０００３】
アブラナ科植物は、中近東や地中海沿岸を起源とする植物種であり、ブラシカ（Brassica）属植物には農業上極めて重要な作物が含まれる。なかでもブラシカ・オレラセア種（Brassica oleracea）は、B. oleracea var. capitata (キャベツ)、B. oleracea var. italica (ブロッコリー)、B. oleracea var. botrytis (カリフラワー)、B. oleracea var. gemmifera (メキャベツ)、B. oleracea var. gongyloides (コールラビー)、B. oleracea var. acephara (ハボタン、ケール)、B. oleracea var. albograbra (カイラン)等を含む極めて重要な植物種である。【０００４】
ブラシカ・オレラセアをはじめとする多くのアブラナ科植物は、自己と同じＳハプロタイプを有する植物の花粉を交配しても、柱頭上での花粉発芽や花粉管伸長が阻害され、受精することができない「自家不和合性」の性質を有する。この性質を利用し、アブラナ科作物では、１９６０年代より雑種第一代（Ｆ１）品種を市場に提供するための大規模採種体系が確立され、各種苗会社によりＦ１品種の開発が積極的に進められてきた。両親の優れた性質を受け継ぐＦ１品種は、在来品種や固定種に比べて品種内の均一性が高く、様々な環境に適応した高い能力を示すため商業的利用価値が高く、多くの国で利用されてきた。【０００５】
Ｆ１を採種する具体的な方法は、あるＳハプロタイプを有する親系統と、別のＳハプロタイプを有する親系統とを同一の圃場で栽培し、ミツバチ等を利用した虫媒による集団交配を行う。この過程では当然のことながら自己花粉や同系統からの花粉も受粉することになるが、ＳＩの性質によりこれら花粉からの発芽や花粉管伸長は阻害されるため、自殖種子（セルフ種子）は形成されない。一方で、異なるＳハプロタイプを有する系統から受粉した場合には、正常な受精が起き、Ｆ１種子の形成へと進む。
このように、植物が本来持つＳＩは、Ｆ１採種体系において利用価値が高いが、一方で問題点も抱えていた。【０００６】
生物学的現象であるＳＩは、その機能の発現が完璧ではなく、遺伝的背景やＳハプロタイプの種類、環境要因によってその強度が変動し、自己花粉の花粉管伸長を止められずに自家受精による自殖種子が一定の割合で混入してしまうという問題があった。【０００７】
この問題を解決するため、これまで育種家たちは、ブラシカ・オレラセア内に存在する多くのＳハプロタイプの中からＳＩの機能が強く発現する系統を選抜してきた。それにも関わらず、大規模な商業レベルでの採種を行った場合には、自殖種子の混入を完全に避けることはできなかった。【０００８】
Ｆ１種子として提供する商品に、そのような自殖種子が含まれてしまった場合、品種の価値を低下させるだけでなく、種苗会社にとって重要な親系統が他者に流出してしまうという問題も孕んでいた。【０００９】
前述の問題を解決する手段として、１９９０年代に入ると細胞質雄性不稔性（cytoplasmic male sterility, ＣＭＳ）を利用したＦ１採種が行われるようになった。ＣＭＳとは、雄性不稔を引き起こす原因遺伝子を細胞質ゲノム内に有する母性遺伝形質である。作物によっては不稔形質の発現が不安定な種もあるが、ブラシカ・オレラセアのＣＭＳは非常に安定的で環境による影響を受けにくいため、高純度のＦ１種子生産が可能となった。【００１０】
一方で、アブラナ科作物が本来持つＳＩは維持されたままであり、Ｆ１採種を行うために親系統を増殖（原種増殖）する上においては、厄介な性質として残った。【００１１】
即ち、ＣＭＳを利用したＦ１採種体系において、ＳＩの性質は完全に不要となった訳であるが、どの親系統もＳＩを有しているため、通常の交配を行っても殆ど自家受精が起きず、自殖種子の増殖が効率的に行えないという問題があった。また、Ｆ１採種時のその親系統同士が同Ｓハプロタイプを有する場合も、これらを組み合わせたＦ１を採種することができないという問題があった。【００１２】
これまでにも、自家不和合性（ＳＩ）を打破するための手法については、種々の研究が行われてきていた。例えば、(i)手交配による蕾受粉を行う手法、(ii)開花した花をＣＯ２に暴露させる手法、または、(iii)ＮａＣｌ水溶液を花に散布する等の操作を行う手法によって、原種増殖が試みられてきた（文献T. Guohua et al., Cruciferae Newsletter (1986) p75（非特許文献１））。
しかしながら、手交配による蕾受粉は時間と労力がかかり、大規模な生産を行うことが難しく、ＣＯ２処理やＮａＣｌ処理は各系統の遺伝的背景やＳハプロタイプに依存してＳＩ打破効果が安定的でないという問題点があり、どの種苗会社も原種増殖には苦慮している状況が続いていた（文献Niikura et al., Theor Appl Genet (2000) vol.101 p1189（非特許文献２））。【００１３】
なお関連する先行技術として、例えば、特許４３４６９３３号（特許文献１）には、アブラナ科植物のＳ遺伝子型同定方法について記載されている。また、国際公開公報ＷＯ２０１４／１１５６８０Ａ（特許文献２）には、自家和合性を有するアブラナ科植物の作出方法が記載されている。しかしながら、ここで対象とされているのは同じブラシカ属植物であるもののブラシカ・ラパ種（Brassica rapa）であり、ブラシカ・オレラセア種とは全く異なるものである。植物の「属」が同じであっても、「種」が異なれば、ある「種」についての知見が、他の「種」にそのまま適用できないことは当業者に良く知られていることである。【００１４】
以上のように、ＣＭＳを利用したブラシカ・オレラセアにおけるＦ１種子の採種体系において、効率的且つ安定的に原種系統を増殖する方法は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特許４３４６９３３号
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ２０１４／１１５６８０Ａ
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Cruciferae Newsletter (1986) p75 T. Guohua et al., “Use of CO2 and salt solution to overcome self-incompatibility of Chinese cabbage (B. campestris spp. Pekinensis).”
【非特許文献２】Theor Appl Genet (2000) vol.101 p1189 S. Niikura et al., “Genetic analysis of the reaction level of self-incompatibility to a 4% CO2 gas treatment in the radish (Raphanus sativus L.).”
【非特許文献３】Breeding Science (2003) vol.53 p199 M. Watanabe et al., “Recent progress on self-incompatibility research in Brassica species.”
【非特許文献４】Theor Appl Genet (1996) vol.92 p388, T. Nishio et al., “Registration of S alleles in Brassica campestris L by the restriction fragment sizes of SLGs.”
【非特許文献５】Breeding Science (2004) vol.54 p291 A. Horisaki et al., “Effectiveness of insect-pollination to evaluate the level of self-incompatibility and genetic variation in Brassica rapa L.”
【非特許文献６】Proc Natl Acad Sci (1997) vol.94 p7673 M. Kusaba et al., “Striking sequence similarity in inter- and intra-specific comparisons of class I SLG alleles from Brassica oleracea and Brassica campestris: Implications for the evolution and recognition mechanism.”
【非特許文献７】Plant Cell (2007) vol.19 p3961 M. Kitaura et al., “Two distinct forms of M-locus protein kinase localize to the plasma membrane and interact directly with S-locus receptor kinase to transduce self-incompatibility signaling in Brassica rapa.”
【非特許文献８】Plant Cell (2012) vol.24 p4607 E.Indriolo et al., “The ARC1 E3 ligase gene is frequently deleted in self-compatible Brassicaceae species and has a conserved role in Arabidopsis lyrata self-pollen rejection.”
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、ブラシカ・オレラセア植物について、安定的、且つ効率的な原種種子生産、が実施可能とする技術的手段を提供することをその目的とする。また本発明は、ブラシカ・オレラセア植物について、どのような親系統同士でも、親のＳハプロタイプを気にすることなく、Ｆ１採種を可能とする技術を確立することもその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者等は従来より、ブラシカ・オレラセア植物について、安定的、且つ効率的な原種種子生産が実施可能とする技術を開発すべく鋭意研究を重ねてきた。多くの検討のなかから、本発明者等は、ブラシカ・オレラセア植物が本来的に有する自家不和合性に着目した。【００１９】
本発明者らは、もし自家不和合性の機能を欠失した自家和合性遺伝子を利用することができれば、自家交配もしくは同Ｓハプロタイプとの交配が可能となり、特別な処理をしなくても効率的に原種増殖が可能となるだけでなく、同じＳハプロタイプを有する親系統同士のＦ１も採種可能となると考えた。【００２０】
自家和合性系統の具体的な利用方法としては、例えば、花が咲いた花序に交配用の紙袋をかけ、袋を手で叩く等の物理的衝撃を与えるだけで自己の花粉が柱頭に付着し、受精が起きる。大規模な採種を行う場合も、ミツバチ等の虫媒受粉により、効率的に且つ大量に自家受精種子を得ることができる。
このような商業的メリットが大きいにも関わらず、ブロッコリーやキャベツ等の主要なブラシカ・オレラセア作物でこのような方法が利用されてこなかったのは、これらの作物の中に自家和合性の遺伝資源が存在しなかったからである。【００２１】
本発明者らは、ブラシカ・オレラセア種とその近縁種の遺伝資源を広く調査し、ＳハプロタイプのＤＮＡ分析や交配試験を繰り返して鋭意検討を行った。多大な労力を伴う種々の調査や検討の結果、株式会社サカタのタネが保有していた遺伝資源の中から、カイラン「Ｋ−３」系統、ブラシカ・オレラセア野生種「Ｔ−１６」系統、およびカリフラワー「ＣＦ−３３」系統が、ＳＣの性質を有することを見出すことができた。【００２２】
カイランやブラシカ・オレラセア野生種、カリフラワーは、ブロッコリーやキャベツの近縁種ではあるが、育種素材として利用するためには、対象作物に対する不良形質を多数有しているため、従来、利用しにくい等の問題があった。特にこれらの種においては、Ｓ遺伝子座近傍には、表現形質に影響を与える因子が多数存在しているため、単に戻し交配を進めるだけでは効率的に親系統を育成することはできない場合が多い。
そこで本発明者らは、Ｓアレル近傍の解析を詳細に行い、大規模集団での戻し交配を経ることによって、ＳＣを導入した品質の高いブロッコリーやキャベツを育成することに成功した。【００２３】
このように、本発明者らは、自家和合性を有するブラシカ・オレラセア系統を見出し、産業的利用価値の高い育種系統が育成できることを証明した。そして、本発明による自家和合性のブラシカ・オレラセア植物、または自家和合性系統の育成方法を利用することによって、新規自家和合性系統の育成が可能となり、これを利用することにより、安定した原種種子生産が実施可能となる。更に、このように育成された系統を利用することによって、Ｆ１品種を作出するための相手親のＳハプロタイプを気にすることなく、新規組合せのＦ１品種を開発することが可能となる。【００２４】
本発明はこれらの知見に基づくものである。【００２５】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。【００２６】
＜１＞  自家和合性を有するブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）、またはその後代。【００２７】
＜２＞  自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）の自家不和合性遺伝子座（Ｓ遺伝子座）に座乗する遺伝子が、自家和合性のブラシカ・オレラセア植物のＳ遺伝子座に座乗する遺伝子により置き換えられてなる、前記＜１＞の自家和合性を有するブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）、またはその後代。【００２８】
＜３＞  自家和合性のブラシカ・オレラセア植物と、自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）とを交配し、交雑後代から自家和合性を有した個体を選抜することにより得られる、前記＜１＞または＜２＞の自家和合性を有するブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）、またはその後代。【００２９】
＜４＞  Ｓ遺伝子座に、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群のいずれか一以上のＤＮＡを有する、前記＜１＞〜＜３＞のいずれかの自家和合性ブラシカ・オレラセア植物：
（ａ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、植物における自家和合性の発現に関与する、ＤＮＡ、または
（ｃ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列からなり、植物における自家和合性の発現に関与する、ＤＮＡ。【００３０】
＜５＞  自家不和合性遺伝子座に、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡを含むＳアレルを導入することにより自家和合性とされた、前記＜４＞のブラシカ・オレラセア植物、またはその後代。【００３１】
＜６＞  ブロッコリーまたはキャベツである、前記＜１＞〜＜５＞のいずれかの自家和合性ブラシカ・オレラセア植物、またはその後代。【００３２】
＜７＞  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４７で特定されるカイラン品種に見出される、自家和合性の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ１」をＳ遺伝子座に有する、ブラシカ・オレラセア植物（カイランを除く）、またはその後代。【００３３】
＜８＞  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４９で特定されるブロッコリー品種に見出される、自家和合性の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ１」をＳ遺伝子座に有する、ブラシカ・オレラセア植物（カイランを除く）、またはその後代。【００３４】
＜９＞  遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ１」が、下記（ｉ）〜(iii)の塩基配列を有する、前記＜７＞または＜８＞のブラシカ・オレラセア植物（カイランを除く）、またはその後代：
（i）  配列番号１に示される塩基配列、
(ii)  配列番号１に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する塩基配列、または
(iii)  配列番号１に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列。【００３５】
＜１０＞  ブロッコリーまたはキャベツである、前記＜７＞〜＜９＞のいずれかのブラシカ・オレラセア植物、またはその後代。【００３６】
＜１１＞  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３５０で特定されるカリフラワー品種に見出される、自家和合性の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ２」をＳ遺伝子座に有する、ブラシカ・オレラセア植物（カリフラワー、ブラシカ・オレラセア野生種を除く）、またはその後代。【００３７】
＜１２＞  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４８で特定されるブロッコリー品種に見出される、自家和合性の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ２」をＳ遺伝子座に有する、ブラシカ・オレラセア植物（カリフラワー、ブラシカ・オレラセア野生種を除く）、またはその後代。【００３８】
＜１３＞  遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ２」が、下記(Ｉ)〜(III)の塩基配列を有する、前記＜１１＞または＜１２＞のブラシカ・オレラセア植物（カリフラワー、ブラシカ・オレラセア野生種を除く）、またはその後代：
(Ｉ)  配列番号２に示される塩基配列、
(II)  配列番号２に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する塩基配列、または
(III)  配列番号２に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列。【００３９】
＜１４＞  ブロッコリーまたはキャベツである、前記＜１１＞〜＜１３＞のいずれかのブラシカ・オレラセア植物、またはその後代。【００４０】
＜１５＞  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４９で特定される、ブロッコリー、またはその後代。
＜１６＞  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４８で特定される、ブロッコリー、またはその後代。【００４１】
＜１７＞  前記＜１＞〜＜１６＞のいずれかの植物またはその後代の植物体の一部。
＜１８＞  前記＜１＞〜＜１６＞のいずれかの植物またはその後代の種子。【００４２】
＜１９＞  自家和合性のブラシカ・オレラセア植物と、自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）とを交配し、交雑後代から自家和合性を有した個体を選抜することを含む、自家和合性を有するブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）の育成方法。【００４３】
＜２０＞  前記自家和合性のブラシカ・オレラセア植物の自家和合性が、自家不和合性遺伝子座（Ｓ遺伝子座）に座乗する遺伝子に関連づけられるものである、前記＜１９＞の自家和合性ブラシカ・オレラセア植物の育成方法。【００４４】
＜２１＞  前記自家和合性のブラシカ・オレラセア植物が、Ｓ遺伝子座に、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群のいずれか一以上のＤＮＡを有する、前記＜１９＞または＜２０＞の自家和合性ブラシカ・オレラセア植物の育成方法：
（ａ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、植物における自家和合性の発現に関与する、ＤＮＡ、または
（ｃ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列からなり、植物における自家和合性の発現に関与する、ＤＮＡ。【００４５】
＜２２＞  交雑後代からの自家和合性の個体の選抜を、個体が前記＜２１＞の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡを持つことを指標として、自家和合性植物を選抜することを含む、前記＜１９＞〜＜２１＞のいずれかの自家和合性ブラシカ・オレラセア植物の育成方法。【００４６】
＜２３＞  自家和合性と関連づけられる遺伝子を含むＳ遺伝子座の極近傍の領域（Ｓ遺伝子座から０〜４ｃＭ）に位置するＤＮＡマーカーを用いて、遺伝子型を判別し、自家和合性を有した個体を選抜することをさらに含む、前記＜１９＞〜＜２２＞のいずれかの自家和合性ブラシカ・オレラセア植物の育成方法。【００４７】
＜２４＞  前記の自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）を戻し交配親系統として、連続戻し交配することを含む、前記＜１９＞〜＜２３＞のいずれかの自家和合性ブラシカ・オレラセア植物の育成方法。【００４８】
＜２５＞  前記の自家和合性のブラシカ・オレラセア植物が、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４７で特定されるカイラン品種、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４９で特定されるブロッコリー品種、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４８で特定されるブロッコリー品種、または受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３５０で特定されるカリフラワー品種である、前記＜１９＞〜＜２４＞のいずれかの自家和合性ブラシカ・オレラセア植物の育成方法。【００４９】
＜２６＞  前記自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物が、ブロッコリーまたはキャベツである、前記＜１９＞〜＜２５＞のいずれかの自家和合性ブラシカ・オレラセア植物の育成方法。【００５０】
＜２７＞  下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの塩基配列を有する、ブラシカ・オレラセア植物における自家和合性の検出用マーカー：
（Ａ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列、
（Ｂ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する塩基配列、または
（Ｃ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列。【００５１】
＜２８＞  前記＜１９＞〜＜２６＞のいずれかの育成方法により得られた自家和合性ブラシカ・オレラセア植物、またはその後代を自殖して、採種することを含む、ブラシカ・オレラセア植物の採種方法。【００５２】
＜２９＞  前記＜１９＞〜＜２６＞のいずれかの育成方法を用いて、有用な雑種第一代系統の親系統を維持または増殖する方法。【００５３】
＜３０＞  配列番号１０〜１５に示される塩基配列のいずれか１以上を有する、ブラシカ・オレラセア植物のＳ遺伝子座近傍領域をジェノタイプ分析するためのマーカー。【００５４】
＜３１＞  細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）を利用したブラシカ・オレラセアの雑種第一代種子の採種方法であって、
自家和合性を有するブラシカ・オレラセア植物を利用して、雑種第一代系統の親系統を増殖させる工程を含む、方法。【００５５】
＜３２＞  前記の自家和合性を有するブラシカ・オレラセア植物が、Ｓ遺伝子座に、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群のいずれか一以上のＤＮＡを有するものである、前記＜３１＞の採種方法：
（ａ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、植物における自家和合性の発現に関与する、ＤＮＡ、または
（ｃ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列からなり、植物における自家和合性の発現に関与する、ＤＮＡ。【００５６】
＜３３＞  前記の自家和合性を有するブラシカ・オレラセア植物が、下記1)〜6)のいずれかのものである、前記＜３１＞または＜３２＞の採種方法：
1)  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４７で特定されるカイラン品種に見出される、自家和合性の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ１」をＳ遺伝子座に有する、ブラシカ・オレラセア植物（カイランを除く）、またはその後代；
2)  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４９で特定されるブロッコリー品種に見出される、自家和合性の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ１」をＳ遺伝子座に有する、ブラシカ・オレラセア植物（カイランを除く）、またはその後代；
3)  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３５０で特定されるカリフラワー品種に見出される、自家和合性の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ２」をＳ遺伝子座に有する、ブラシカ・オレラセア植物（カリフラワー、ブラシカ・オレラセア野生種を除く）、またはその後代；
4)  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４８で特定されるブロッコリー品種に見出される、自家和合性の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ２」をＳ遺伝子座に有する、ブラシカ・オレラセア植物（カリフラワー、ブラシカ・オレラセア野生種を除く）、またはその後代；
5)  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４９で特定される、ブロッコリー、またはその後代；および
6)  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４８で特定される、ブロッコリー、またはその後代。
【発明の効果】
【００５７】
本発明による自家和合性形質を有するブラシカ・オレラセア植物を利用することによって、採種性の優れた新たなブラシカ・オレラセア親系統の育成が可能となる。このように作出されたＳＣ系統を利用することにより、Ｆ１種子を採種するための親系統の原種増殖が効率的となる。このため、従来必要とされた交配労力を大幅に削減し、採種圃場の栽培面積を縮小することができる。更に、従来のＳＩ系統においてしばしば問題となっていた原種種子の安定供給の面でも、大きく貢献すると期待される。【００５８】
また、このように育成された系統を利用することによって、Ｆ１採種のための採種親のＳハプロタイプを気にすることなく、新規組合せのＦ１品種を開発することができる。このことは、Ｆ１品種の幅を広げ、育種の可能性そのものを広げることに繋がる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】実施例２における各世代のブロッコリー（鉢植え栽培）の草姿を示す。図中、（ａ）は、戻し交配に使用したＳＩ系のエリートライン「ＢＲ−９」の草姿、（ｂ）は、戻し交配の途中段階の草姿、および（ｃ）は、ＢＲ−９と同様な草姿にまでＢＣが進んだＳＣ系統「ＳＣ−ＢＲ−９」の草姿を示す。
【図２】実施例２において育成されたブロッコリー（圃場栽培）を示す。図中、（ａ）は、戻し交配に使用したＳＩ系のエリートライン「ＢＲ−９」、（ｂ）は、「ＢＲ−９」と同様な草姿にまでＢＣが進んだＳＣ系統「ＳＣ−ＢＲ−９」、および（ｃ）は「ＳＣ−ＢＲ−９」をＣＭＳ細胞質に置換した系統「ＣＭＳ−ＳＣ−ＢＲ−９」の草姿を示す。
【図３】実施例３の網室採種試験の結果（「ＳＣ−ＢＲ−９」、および「ＣＭＳ−ＳＣ−ＢＲ−９」）を示す。
【図４】実施例４の網室採種試験の結果（「ＳＣ−ＢＲ−６」、および「ＣＭＳ−ＳＣ−ＢＲ−６」）を示す。
【図５（Ａ）】実施例６におけるキャベツのＳＩ系エリートライン「ＣＢ−３」と、ＳＣ因子を導入した「ＳＣ−ＣＢ−３」の結実の様子を示す。図は花序の形態を示し、下位の蕾より順に開花が進んだ。
【図５（Ｂ）】図は、実施例６において、交配後１ヶ月以上経過した時点での莢の様子である。
【図５（Ｃ）】図は、実施例６において、各莢内に形成した種子数を数えた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００６１】
自家和合性ブラシカ・オレラセア植物およびその育成方法
本発明は前記したように、自家和合性を有するブラシカ・オレラセア（Brassica oleracea）植物（カリフラワーとカイランを除く）、またはその後代に関する。
【００６２】
ここで自家和合性を有するブラシカ・オレラセア植物は、自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）の自家不和合性遺伝子座（Ｓ遺伝子座）に座乗する遺伝子が、自家和合性のブラシカ・オレラセア植物のＳ遺伝子座に座乗する遺伝子により置き換えられてなるものである。すなわち、本発明による自家和合性ブラシカ・オレラセアとは、自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）のＳ遺伝子座に座乗する遺伝子を、自家和合性を有する他のブラシカ・オレラセア植物のＳ遺伝子座に座乗する遺伝子で置き換えることによって、自家不和合性が自家和合性となったブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）をいう。
ここで「置き換えられてなる」とは、自家不和合性の形質を発現する遺伝子が、自家和合性を発現し得るものに置き換えられることを意味し、置き換える手段は特に限定されない。
【００６３】
本発明による自家和合性を有するブラシカ・オレラセア植物（自家和合性ブラシカ・オレラセア植物）は、Ｓ遺伝子が本来有する自家不和合性機能を欠失しており、当該植物を材料として自家和合性を有する新規ブラシカ・オレラセア植物を育成することが可能となる。換言すると、本発明による自家和合性ブラシカ・オレラセア植物は、自家不和合性遺伝子座に、自家和合性ブラシカ・オレラセア植物から見出された自家和合性因子を含むＳアレルを導入することにより自家和合性としたものであり、その後代を含むものである。
【００６４】
ここで「自家和合性ブラシカ・オレラセア植物」が「自家和合性」を有するか否かを判断する手法には、特に限定はなく、公知の手法により判断してよいが、例えば、本明細書に記載の自家和合性植物の選抜手法、例えば、自家受粉による交配試験、後述するＳハプロタイプ導入に際しての交配試験、後述する開花交配と蕾交配の結実率の比較、公知のＳ遺伝子座に関するＤＮＡマーカーの利用などをすることにより判断することができる。具体的には、例えば、後述する実施例１に記載の手法に従うことによって、自家和合性を有するか否かを判断することができる。
【００６５】
本発明において、「ブラシカ・オレラセア植物」とは、アブラナ科の植物であって、ブラシカ属植物のブラシカ・オレラセア種の植物を意味し、ここには、B. oleracea var. capitata (キャベツ)、B. oleracea var. italica (ブロッコリー)、B. oleracea var. botrytis (カリフラワー)、B. oleracea var. gemmifera (メキャベツ)、B. oleracea var. gongyloides (コールラビー)、B. oleracea var. acephara (ハボタン、ケール)、およびB. oleracea var. albograbra (カイラン)等が包含される。
【００６６】
また「自家和合性」（self-compatibility, ＳＣ）とは、ブラシカ・オレラセア植物が本来有する自家不和合性（self-incompatibility, ＳＩ）の機能が欠失しているものであり、自己、若しくは自己と同型のＳハプロタイプを有する植物との受精を可能とする性質のことをいう。
【００６７】
本発明による自家和合性ブラシカ・オレラセア植物は、典型的には、次のような特徴を有する。
（１）  自家不和合性の機能が欠失しているため、自己若しくは自己と同じＳハプロタイプを有する植物との効率的な交配が可能であり、従来は困難であった原種種子の増殖を効率的に実施することができる。
（２）  具体的には、配列番号１若しくは配列番号２で示されるＤＮＡ配列をＳ遺伝子座に有する植物であり、そのアレルを有することによって自家和合性を示す植物である。
（３）  上記配列を有する系統を交配材料に利用することで、自家和合性を有した新規親系統の育成が可能となる。
【００６８】
・育成方法
本発明によれば、自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物に、自家和合性の見出されたブラシカ・オレラセア植物を交配させ、交雑後代から自家和合性を有した個体を選抜することにより、自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物に、自家和合性を持たせた植物を育成することができる。
【００６９】
すなわち、本発明による自家和合性を有するブラシカ・オレラセア植物の育成方法は、前記したように、自家和合性のブラシカ・オレラセア植物と、自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）とを交配し、交雑後代から自家和合性を有した個体を選抜することを含む。
【００７０】
ここで素材として使用される「自家和合性のブラシカ・オレラセア植物」は、自家和合性因子を有するブラシカ・オレラセア植物であり、自家受粉による交配試験は、後述するＳハプロタイプ導入に際しての交配試験、後述する開花交配と蕾交配の結実率の比較、公知のＳ遺伝子座に関するＤＮＡマーカーの利用などをすることにより、自家和合性因子を有するブラシカ・オレラセア植物を選抜することができる。具体的には、例えば、後述する実施例１に記載の手法に従うことによって、自家和合性因子を有するブラシカ・オレラセア植物を選抜することが可能である。
【００７１】
また前記した自家和合性のブラシカ・オレラセア植物の「自家和合性」は、自家不和合性遺伝子座（Ｓ遺伝子座）に座乗する遺伝子に関連づけられるものである。すなわち、本発明において、「自家和合性」は、Ｓ遺伝子座に座乗する遺伝子の機能またはその機能の欠損によるものであるか（もしくはそのように推測されるものであるか）、または、Ｓ遺伝子座に座乗する遺伝子の影響により発現される自家和合性をいい、例えば、Ｓ遺伝子座以外の影響により自家和合性となるようなものは除外される。なお、ブラシカ・オレラセア植物においては、実施例１で後述するように、従来の知見によれば、ＳＩの性質を有している植物であっても、Ｓ遺伝子座以外の影響によりＳＣに見えたりする場合が大多数を占めているとされている(Horisaki et al., 2004（非特許文献５）)。
【００７２】
本発明において、素材として使用する「自家和合性ブラシカ・オレラセア植物」は、Ｓ遺伝子座に、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡを有する：
（ａ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、植物における自家和合性の発現に関与する、ＤＮＡ、または
（ｃ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列からなり、植物における自家和合性の発現に関与する、ＤＮＡ。
【００７３】
ここで、「ＤＮＡを有する」とある場合の「有する」という語は、「含む」に言い換えてもよいが、好ましくは「から実質的になる」（consisting substantially of）、より好ましくは「からなる」（consisting of）と言い換えても良い。
【００７４】
また前記（ｂ）において、「配列番号１または配列番号２に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する」とは、配列番号１または配列番号２に示される塩基配列と、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの相同性検索のための公知のアルゴリズム（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを使用する）を用いて計算したときに、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＤＮＡを包含する。
【００７５】
ここで「配列同一性」とは、例えば２つの塩基（ヌクレオチド）配列をアラインメントしたとき（ただしギャップを導入してもよいしギャップを導入しなくてもよい）、ギャップを含む塩基の総数に対する同一塩基の数の割合（％）を指す。
【００７６】
またここで、（ｂ）のＤＮＡが「植物における自家和合性の発現に関与する」とは、（ｂ）のＤＮＡによって、それをＳ遺伝子座に有する植物が自家和合性を実質的に発現することを意味する。
【００７７】
また前記（ｃ）において、「配列番号１または配列番号２に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列」とあるところの「複数個」とは、例えば、１０個程度であり、望ましくは７個程度であり、好ましくは５個、より好ましくは３個である。
【００７８】
本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明の育成方法において、素材としての「自家和合性のブラシカ・オレラセア植物」は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４７で特定されるカイラン品種、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４９で特定されるブロッコリー品種、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４８で特定されるブロッコリー品種、または受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３５０で特定されるカリフラワー品種である。
【００７９】
またここで素材として使用される「自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物」は、前記した素材として使用される「自家和合性のブラシカ・オレラセア植物」と交配可能であって、アブラナ科植物が本来的に有する自家不和合性を有しているものであれば、特に制限はない。ただし、カリフラワーおよびカイランについては、自家和合性のものが既に知られていることから、素材として使用される「自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物」から、カリフラワーおよびカイランは除外される。「自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物」は、好ましくは、ブロッコリー、キャベツ、メキャベツ、コールラビー、ハボタン、ケールであり、より好ましくはブロッコリー、キャベツである。
【００８０】
本発明の育成方法においては、まず、自家和合性のブラシカ・オレラセア植物と、自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）とを交配する。そして交配して得られる交雑後代から自家和合性を有した個体を選抜する。
すなわち、このようにして、素材としての「自家和合性のブラシカ・オレラセア植物」のＳ遺伝子座のＳハプロタイプを自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）に導入し、交雑後代から、Ｓハプロタイプが導入されて自家和合性を有している個体を選別する。
【００８１】
ここで交配は、素材としての「自家和合性のブラシカ・オレラセア植物」と「自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物」とを交配して、交雑後代が得られるのであれば特に制限はなく、虫媒等の自然交配、手交配などいずれであってもよい。またここでいう交配には、戻し交配も含む意味である。
【００８２】
Ｓハプロタイプの導入に際しては、交配試験により、その植物が自家和合性であるか自家不和合性であるかを確認することが可能である。
具体的には、自家受粉による交配試験と、比較対象としてＳハプロタイプが異なる系統の花粉を用いた他家受粉による交配試験とを実施する。自家受粉と他家受粉との結果を比較し、同程度の種子が結実した場合を自家和合性、自家受粉の結実率が低い場合を自家不和合性と判断することができる。
【００８３】
また、一般的にＳＩは開花した花における反応であるから、開花交配（open flower pollination; OP）と蕾交配(bud pollination; BP)の結実率を比較することによっても、その植物がＳＩとＳＣのいずれの性質を示すかを判断することができる。蕾のステージではＳＩに関連する遺伝子の発現量が少ないため、萼や花弁を剥いて強制的に受粉させれば、卵細胞が受精能力を備えた段階であれば種子を形成させることが可能である。この原理を利用して、ＯＰ交配の結実率がＢＰ交配の結実率よりも低い場合、ＳＩ系統と判断することができる。
【００８４】
本発明においてまた、Ｓハプロタイプの分析には、Watanabeらの文献(2003)（非特許文献３）に記載されているようなＳ遺伝子座に座乗する遺伝子群（S-receptor kinase; ＳＲＫ、S-locus glycoprotein; ＳＬＧ、S locus protein 11; ＳＰ１１（＝S locus cysteine-rich protein; ＳＣＲ））の多型を指標に分類することができる。分類するための手段は何れの方法でもよく、例えば、Nishioらの文献（1996）（非特許文献４）に記載されたような一般的に知られているプライマー等を用いることが可能である。また、配列番号１または配列番号２に基づいたＤＮＡマーカーを作製した分析や、Ｓ遺伝子の塩基配列の解析をしてもよい。
【００８５】
したがって、本発明の好ましい態様によれば、交雑後代からの自家和合性の個体の選抜を、個体が、前記した（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡを持つことを指標として、自家和合性植物を選抜することができる。すなわち、前記した（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡを持つということは、自家和合性を示すこととなる。
【００８６】
このように本発明において、自家和合性の判断においては、ＤＮＡマーカーによるＳ遺伝子座の解析を実施することによって、Ｓ遺伝子座がヘテロの状態でも自家和合性遺伝子座の有無を判別することができ、交配試験よりも効率的な戻し交配を実施することができる。
【００８７】
したがって、本発明の好ましい態様によれば、本発明の育種方法は、前記の自家不和合性のブラシカ・オレラセア植物（カリフラワーとカイランを除く）を戻し交配親系統として、連続戻し交配することを含む。
【００８８】
戻し交配を行う過程では、特段の選抜を行わない場合、各世代の個体群におけるゲノム置換率の平均は、第一世代（ＢＣ１Ｆ１）では７５％、第二世代（ＢＣ２Ｆ１）では８７．５％、第三世代（ＢＣ３Ｆ１）では９３．７５％、第４世代（ＢＣ４Ｆ１）では９６．８７５％となり、世代が進むほど戻し交配親系統に近い遺伝子型を有することになる。従って、戻し交配親系統からＳ遺伝子座だけを置換した実用的な準同質遺伝子系統を作出するためには、一般的には、６〜７回の戻し交配が必要になる。
【００８９】
このように長期間を必要とする戻し交配をより効率的に進めるために、ゲノムワイドなＤＮＡマーカーを用いて、Ｓ遺伝子座以外の領域を早期に戻し交配親系統に近づけることも可能である。
【００９０】
例えば、前記したように、戻し交配第一世代（ＢＣ１Ｆ１）では平均で７５％のゲノムが戻し交配親系統と同じ遺伝子型を有するが、ＢＣ１Ｆ１世代は分離世代であるために個々体が有するゲノム置換率は異なり、集団の規模を拡大すれば、個体によっては９０％以上のゲノム領域が戻し交配親系統と同じ遺伝子型を示す個体を獲得することも可能である。このような個体を選抜することで、Ｓ遺伝子座以外の領域を早期に、少ない世代数で戻し交配親系統と同じ遺伝子型に揃えることが可能となる。
【００９１】
ゲノムワイドなＤＮＡマーカーとして利用可能な具体的手段として、戻し交配親系統のゲノム配列情報を有している場合には、その情報に基づくＤＮＡマーカーを作製して各遺伝子座のジェノタイピングを行ってもよい。
【００９２】
また、戻し交配親系統のゲノム配列情報が無い場合であっても、ＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic DNA）法、ＳＲＡＰ（sequence-related amplified polymorphism）法、ＡＦＬＰ（Amplified fragment length polymorphism）法などのランダムＰＣＲ法を利用することによって、分離世代の中から、戻し交配親系統に近い遺伝子型を有した個体を選抜することが可能である。その他にも、ゲノム中に散在する多数のＳＮＰｓを網羅的に解析できるよう設計されたＳＮＰｓジェノタイピングチップ（affymetrix社製品やIllumina社製品等）があれば、そのような手段を用いて解析してもよい。
【００９３】
戻し交配の際に別の留意すべき点として、Ｓ遺伝子座に連鎖する非目的形質の連鎖引きずり（Ｌｉｎｋａｇｅ  Ｄｒａｇ）が挙げられる。
【００９４】
通常の戻し交配では、Ｓ遺伝子が座乗している第６染色体以外の領域を戻し交配親系統の遺伝子型に置き換えることは、前述のように時間はかかるものの、世代を重ねれば比較的容易に実施可能である。一方で、Ｓ遺伝子座近傍の領域については、意図的にこれを排除する育種計画が必要となる。
具体例としては、Ｓ遺伝子座近傍に座乗するマーカーを設計し、分離世代においてＳ遺伝子座を判別するマーカーと共に個々体の遺伝子型を解析することができる。ほとんどの場合、両マーカーは共分離するが極めてまれに連鎖が切れ、Ｓ遺伝子は自家和合性系統の遺伝子座を有していながら、近傍のゲノム領域は戻し交配親系統の遺伝子型を示す個体が出現する。このような個体を選抜することにより、Ｓ遺伝子座に連鎖する非目的形質を切り離した個体を選抜することが可能となる。
【００９５】
Ｓ遺伝子座近傍のＤＮＡ配列情報は、ＮＣＢＩに登録されているブラシカ・オレラセアのアッセンブル情報（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000695525.1/）を利用することで入手可能である。交配する系統間で、配列番号１０〜１５で示したようなＳ遺伝子座近傍に座乗するマーカーを用いた場合に多型を得ることが出来れば、これらを利用することも可能である。このような手段により連鎖引きずりを極力小さい領域に抑えることで、戻し交配親系統により近い形質を付与することが可能となる。
【００９６】
よって本発明の好ましい態様によれば、自家和合性と関連づけられる遺伝子を含むＳ遺伝子座の極近傍の領域（Ｓ遺伝子座から０〜１０ｃＭ、好ましくは０〜４ｃＭ）に位置するＤＮＡマーカーを用いて、遺伝子型を判別し、自家和合性を有していながら、Ｓ遺伝子座近傍のゲノム領域が戻し交配親系統の遺伝子型を有した個体、すなわち、表現型が戻し交配親系統に極めて近い草姿を示す個体を選抜することができる。
【００９７】
このようなＤＮＡマーカーとしては、配列番号１０〜１５に示される塩基配列のいずれか１以上を有するものが好ましいものとして挙げられる。
ここで、ＤＮＡマーカーが塩基配列を「有する」とは、該マーカーがその塩基配列を有していることをいう。本発明においては、ＤＮＡマーカーは、対応する塩基配列内の塩基のいずれかの１又は数個（例えば、１、２もしくは３個、好ましくは１又は２個、より好ましくは１個）が置換、欠失、付加もしくは削除されていてもよいことを意味し、あるいは、対応する塩基配列を一部として含みかつ所定の性質を保持する配列であってもよい。このような場合、「有する」という語は、「含む」に言い換えてもよい。また、１個の塩基の置換、欠失、付加もしくは削除が許容される場合については、「有する」を「から実質的になる」と言い換えても良い。
【００９８】
すなわち、このようなＤＮＡマーカーは、ブラシカ・オレラセア植物のＳ遺伝子座近傍領域をジェノタイプ分析するために使用できる。
【００９９】
葯培養、花粉培養における倍加半数体の作出は、Palmer Cら、(1996)「In Vitro Haploid Production in Higherplants」第３巻（KluwerAcademic Publishers編者：SJain,S SoporyおよびRVeilleux）の１４３〜１７２頁に従って行うことができる。
【０１００】
このようにして育成された新規自家和合性の系統は、Ｆ１採種体系における雄親として利用することができる。一方で、自家受粉による自殖種子が大量に結実するために、そのままでは雌親として使用することができない。雌親として使用するためには、自家受粉が起きないようＣＭＳ細胞質を持たせたＡラインを作製する必要がある。
【０１０１】
もし、戻し交配親系統のＣＭＳ系統を既に有している場合は、新たに作製した自家和合性系統をＢラインとして２回の戻し交配を実施すれば、Ｓ遺伝子座とその近傍のみが置き換えられたＡラインを育成することが可能となる。
【０１０２】
従来の自家不和合性系統は、種子を増殖するために多大なる労力を払う必要があったが、自家和合性を導入した親系統の場合は、虫媒受粉を行うだけで容易に結実し、種子の増殖を行うことができる。このようにして増殖した親系統の種子を原種として、大規模なＦ１採種を実施することが可能となる。
【０１０３】
ここで、Ａライン、およびＢラインとは、細胞質雄性不稔を利用した採種体系における細胞質雄性不稔系統、および維持系統のことである。両系統の核ゲノム構成はほぼ同一であるため植物体の表現型は類似しているが、細胞質の影響によりＡラインは花粉を生産しないものである。Ｂラインの花粉をＡラインに交配することで得られた原種種子を、Ｆ１採種の種子親として使用する。
【０１０４】
本発明において「親系統」とは、Ｆ１品種を作製するために育成された系統をいい、通常は農業形質が異なる２種類の親系統を材料として、これらを掛け合わせたＦ１品種を作製する。
【０１０５】
本発明において「原種増殖」とは、Ｆ１品種を採種するために必要となる親系統種子の増殖のことである。
【０１０６】
自家和合性ブラシカ・オレラセア植物
本発明による自家和合性ブラシカ・オレラセア植物は、前記したように、後述する本発明の育成方法により育成された植物およびその後代である。
【０１０７】
また、本発明による自家和合性ブラシカ・オレラセア植物は、Ｓ遺伝子座に、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡを有する、自家和合性を有するブラシカ・オレラセア植物（カイラン、カリフラワーを除く）、またはその後代である：
（ａ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、植物における自家和合性の発現に関与する、ＤＮＡ、または
（ｃ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列からなり、植物における自家和合性の発現に関与する、ＤＮＡ。
【０１０８】
本発明の好ましい態様によれば、本発明によるブラシカ・オレラセア植物は、自家不和合性遺伝子座に、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡを含むＳアレルを導入することにより自家和合性とされたもの、またはその後代である。
【０１０９】
また本発明による自家和合性ブラシカ・オレラセア植物の「後代」とは、自家受粉による自殖後代を含む他、葯・花粉培養由来の後代や、本発明による自家和合性ブラシカ・オレラセア植物と、該植物と交配可能なブラシカ・オレラセア植物とを交配させて得られる交雑種も包含される。したがって、「後代」には、例えば、本発明による自家和合性ブラシカ・オレラセア植物を花粉親（雄親）とし、該植物と交配可能なブラシカ・オレラセア植物を種子親（雌親）として交配することによって得られるものも含まれる。また、戻し交配親系統のＣＭＳ系統が既に存在している場合には、新たに作製した自家和合性系統をＢラインとして２回の戻し交配を実施すれば、Ｓ遺伝子座とその近傍のみが置き換えられたＡラインを育成することが可能となる。このようにして得られる細胞質雄性不稔の自家和合性ブラシカ・オレラセア植物も後代に包含されうる。さらに「後代」には、例えば本発明による自家和合性ブラシカ・オレラセア植物と、該ブラシカ・オレラセア植物と融合可能な植物との細胞融合による植物や、種属間交雑植物も含まれる。
【０１１０】
本発明の別の態様によれば、本発明は、本発明による自家和合性ブラシカ・オレラセア植物もしくはその後代の植物体の一部、または、それらの種子にも関する。
ここで、「植物体の一部」とは、花、葉、茎、根等の器官もしくはその部分または組織、或いは、これら器官または組織からの細胞、細胞の集合体等を包含する。
【０１１１】
本発明の好ましい態様によれば、本発明による自家和合性ブラシカ・オレラセア植物は、典型的にはカリフラワーとカイランを除くものであり、好ましくは、ブロッコリー、キャベツ、メキャベツ、コールラビー、ハボタン、ケールであり、より好ましくはブロッコリー、キャベツである。
【０１１２】
本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明による自家和合性ブラシカ・オレラセア植物、またはその後代は、下記のいずれかのものであることができる：
1) 受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４７で特定されるカイラン品種に見出される、自家和合性の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ１」をＳ遺伝子座に有する、ブラシカ・オレラセア植物（カイランを除く）、またはその後代；
2) 受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４９で特定されるブロッコリー品種に見出される、自家和合性の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ１」をＳ遺伝子座に有する、ブラシカ・オレラセア植物（カイランを除く）、またはその後代；
3) 受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３５０で特定されるカリフラワー品種に見出される、自家和合性の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ２」をＳ遺伝子座に有する、ブラシカ・オレラセア植物（カリフラワー、ブラシカ・オレラセア野生種を除く）、またはその後代；
4) 受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４８で特定されるブロッコリー品種に見出される、自家和合性の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ２」をＳ遺伝子座に有する、ブラシカ・オレラセア植物（カリフラワー、ブラシカ・オレラセア野生種を除く）、またはその後代；
5) 受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４９で特定される、ブロッコリー、またはその後代；および
6) 受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４８で特定される、ブロッコリー、またはその後代。
【０１１３】
好ましくは、前記の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ１」は、下記（ｉ）〜(iii)の塩基配列を有する：
（i）  配列番号１に示される塩基配列、
(ii)  配列番号１に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する塩基配列、および
(iii)  配列番号１に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列。
【０１１４】
また好ましくは、前記の遺伝子座「ＢｏＳ−ＳＣ２」が、下記(Ｉ)〜(III)の塩基配列を有する：
(Ｉ)  配列番号２に示される塩基配列、
(II)  配列番号２に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する塩基配列、または
(III)  配列番号２に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列。
【０１１５】
前記(ii)の「配列番号１に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する」および前記(II)の「配列番号２に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する」とは、前記した（ｂ）の場合と同様に、配列番号１または配列番号２に示される塩基配列と、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの相同性検索のための公知のアルゴリズム（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを使用する）を用いて計算したときに、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＤＮＡを包含する。
【０１１６】
また前記(iii)の「配列番号１に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列」および前記(III)の「配列番号２に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列」とあるところの「複数個」とは、前記した（ｃ）の場合と同様に、例えば、１０個程度であり、望ましくは７個程度であり、好ましくは５個、より好ましくは３個である。
【０１１７】
本発明の別の態様によれば、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの塩基配列を有する、ブラシカ・オレラセア植物における自家和合性の検出用マーカーも提供される：
（Ａ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列、
（Ｂ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する塩基配列、または
（Ｃ）  配列番号１または配列番号２に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列。
なおここでいう（Ｂ）および（Ｃ）については、前記した（ｂ）と（ｃ）における塩基配列と同義で定義される。
【０１１８】
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の育成方法により得られた自家和合性ブラシカ・オレラセア植物、またはその後代を自殖して、採種することを含む、ブラシカ・オレラセア植物の採種方法が提供される。
【０１１９】
ここで、本発明により育成された自家和合性系統を自殖する場合、交配方法として、自己若しくは同系統の花粉を柱頭に交配すればよい。具体的な方法としては、開花した花の葯をピンセットでつまみ取り、それを柱頭に接触させることで花粉を受粉させる。他にも、花が咲いた花序に交配用の紙袋をかけ、袋を手で叩く等の物理的衝撃を与えるだけで自己の花粉が柱頭に付着し、受精を起こすことができる。
【０１２０】
また、大規模な採種を行う場合は、外界からの虫の侵入を遮断した網室内において、同系統の植物を多数植えておき、ミツバチ等を利用した虫媒受粉を実施することにより、効率的且つ大量に自家受精種子を得ることができる。
【０１２１】
更に大規模な採種を行う場合には、屋外において、予期せぬ交雑が起きぬよう十分な隔離管理をした圃場において、同系統の植物を多数植えておき、ミツバチ等を利用した虫媒受粉を実施することにより、効率的且つ大量に自家受精種子を得ることができる。
【０１２２】
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の育成方法を用いて、有用な雑種第一代品種の親系統を維持または増殖する方法が提供される。
【０１２３】
また本発明のさらに別の態様によれば、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）を利用したブラシカ・オレラセアの雑種第一代種子の採種方法であって、自家和合性を有するブラシカ・オレラセア植物を利用して、雑種第一代系統の親系統を増殖させることを特徴とする方法も提供される。
【０１２４】
このような本発明の方法によって、従来は必要とされていた（１）ＳＩを打破するために必要だったステップ（蕾受粉、ＣＯ２処理、ＮａＣｌ処理等）、（２）ＳＩの強弱を考えて増殖の戦略（採種規模等の計画）を考えるステップ、を省略することが可能となる。
【０１２５】
また、本発明によれば、エリートライン同士のＳハプロタイプを気にすることなく、Ｆ１を作製する親の組合せを考えられる育種法が提供できる。
【実施例】
【０１２６】
下記の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。【０１２７】
実施例１：  自家和合性因子の探索
自家和合性因子を探索するため、ブロッコリー、キャベツ、カリフラワー、カイラン、ハボタン、およびその他ブラシカ・オレラセア野生種を材料として、交配試験、およびＳハプロタイプ判別マーカーによるＳ遺伝子座の分析を実施した。【０１２８】
自家受粉による交配試験の結果から、ＳＩが極めて弱いか、または完全な自家和合性の系統を選定した。
Ｓハプロタイプ判別マーカーとして、配列番号３〜９で示される公知のプライマーを用いて、各系統のＳハプロタイプ分析を行った。
その結果、同じＳハプロタイプの系統であっても、従来の知見の通り、Ｓ遺伝子座以外の影響によりＳＩとなったりＳＣに見えたりする場合が大多数を占めていた(Horisaki et al.,  2004（非特許文献５）)。【０１２９】
一方で、カイランの「Ｋ−３」系統、ブラシカ・オレラセア野生種の「Ｔ−１６」系統、およびカリフラワーの「ＣＦ−３３」系統については、それらの系統を交配した集団の分離後代を調査した結果、これらの素材と同じＳハプロタイプを有する個体であれば、安定的にＳＣの表現型を示した。
このことから、これら素材の自家和合性は、Ｓ遺伝子座に座乗する遺伝子の機能が欠失したことによると推測された。【０１３０】
Ｓ遺伝子座に座乗する遺伝子の一つであるＳＬＧ（S-locus glycoprotein）を増幅するプライマーとして、ＰＳ５（配列番号３）、およびＰＳ１５（配列番号４）を使用して、増幅したＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。
その結果、Ｋ−３は配列番号１（この遺伝子型を「ＢｏＳ−ＳＣ１」とする）の塩基配列を、Ｔ−１６およびＣＦ−３３は配列番号２（この遺伝子型を「ＢｏＳ−ＳＣ２」とする）の塩基配列をそれぞれ有していた。【０１３１】
ＮＣＢＩのＢｌａｓｔで検索した結果、配列番号１の塩基配列は、ＸＭ＿０１３７３４３３９（ＢｏＳ−１３  ｌｉｋｅのＳＬＧ）として登録されており、配列番号２の塩基配列はＤ８５２０２（ＢｏＳ−１６のＳＬＧ）として登録されていた。【０１３２】
配列番号２の塩基配列については、Kusaba et al., (1997）（非特許文献６）の文献において、ブラシカ・オレラセア種内に存在する多数の自家不和合性遺伝子の複対立遺伝子の一つとして扱われていたものであるが、当該アレルが自家和合性であるとは言及されていない。【０１３３】
配列番号１の塩基配列については、同文献において、系統名ＴＯ１０００のゲノムアッセンブルによりＳＬＧと推定された遺伝子に関するものとされる一方、ＴＯ１０００系統は自家和合性であると述べられているが、それがＳ遺伝子座を原因とする自家和合性であるとは言及されていない。実際、前述のように自家和合性のように見えても、極めて弱い自家不和合性である場合や、Ｓ遺伝子座以外のシグナル伝達因子の欠損により自家和合性となる場合も多数報告されている（M. Kitaura et al., 2007（非特許文献７） および E.Indriolo, 2012（非特許文献８））。
このため、前記したKusabaらの文献等からは、配列番号１を含む遺伝子座が自家和合性に関連するか否か判断することは困難であった。【０１３４】
かかる状況において、本発明者らは、次の実施例２〜６に記載したように、大規模な戻し交配の集団と、多くの世代を重ねた実験を行うことにより、配列番号１および配列番号２を含む遺伝子座そのものが自家和合性を示す遺伝子座であることを今回初めて同定した。【０１３５】
実施例２：  ブロッコリー「ＢＲ−９」育種系統へのＳＣの導入
カイランの系統である「Ｋ−３」（ＳハプロタイプはＢｏＳ−ＳＣ１、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４７）をＳＩ機能欠失系統の素材とし、株式会社サカタのタネが保有するブロッコリーの親系統である「ＢＲ−９」（ＳハプロタイプはＢｏＳ−１８）を戻し交配親系統として交配試験を行った。
戻し交配（Back cross；ＢＣ）を効率的に進めるにあたって、基本的にＳハプロタイプマーカーによるＤＮＡ検定を行い、Ｓ遺伝子座がＢｏＳ−ＳＣ１／ＢｏＳ−１８のヘテロとなった個体を選抜し、表現型を確認しながら「ＢＲ−９」を連続戻し交配した。【０１３６】
なお、前記したカイラン系統「Ｋ−３」の種子は、２０１７年９月２９日付けで独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）に国際寄託（原寄託）されている（寄託者が付した識別のための表示：Ｋ−３、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４７）。【０１３７】
まず、ＢｏＳ−ＳＣ１を有するカイラン「Ｋ−３」と、ブロッコリー「ＢＲ−９」を交配してＦ１を採種し、その後、数年にわたって「ＢＲ−９」の戻し交配を進めた。戻し交配を効率的に進めるため、２０種のＲＡＰＤプライマーによる選抜を行い、戻し交配親系統である「ＢＲ−９」に近い遺伝子型を示す個体を選抜した。
その結果、ＢＣ２Ｆ１世代でこれらのＲＡＰＤマーカーが「ＢＲ−９」と完全に一致する個体を選抜した。【０１３８】
しかしながら、ＢＣ３Ｆ１世代を播種し、幼苗でＳ遺伝子座のＤＮＡ選抜を行った後、圃場に定植して表現型調査を行ったところ、これらの選抜個体の多くは「ＢＲ−９」よりも早生で、ヘッドのしまりが緩く、ブロッコリーとしての商品価値が低いものであった（図１ｂ）。【０１３９】
この結果から、第６染色体に座乗しているＢｏＳ−ＳＣ１遺伝子の極近傍に、早生性やヘッドのしまりに関与している因子が存在する可能性が示唆された。【０１４０】
翌年、ＢＣ４Ｆ１を播種し、発芽した１５８１個体についてＳハプロタイプマーカーによるＤＮＡ検定を行い、選抜後、圃場に定植した。
ヘッドが上がってきたタイミングで熟期やヘッドのしまり、スムースさ等の表現型を確認し、「ＢＲ−９」に比較的近い草姿の３０個体を選抜した。
同時に、Ｓ遺伝子座の極近傍の両側に位置するＤＮＡマーカーＢｏＣ６ＭＫ１（配列番号１０および１１によるＰＣＲを実施した。Ｓ遺伝子座から１．１ｃＭの距離に座乗）と、ＢｏＣ６ＭＫ２（配列番号１２および１３によるＰＣＲを実施。Ｓ遺伝子座から０．３ｃＭの距離に座乗）とを用いてジェノタイピング分析を行ったところ、表現型選抜を行った３０個体の中から、両側のマーカーが「ＢＲ−９」型に置き換わった４個体を選抜することができた。次いで、これらの個体から自殖種子および葯・花粉培養後代を得た。【０１４１】
上記選抜株の後代を播種し、Ｓ遺伝子座がＢｏＳ−ＳＣ１ホモ型になった個体を選抜後、得られた自家和合性の「ＳＣ−ＢＲ−９」系統を圃場にて栽培した。前述と同様に、花蕾が上がってきた１月に表現型の調査をしたところ、これらの個体は、ＢＣ親である「ＢＲ−９」と見分けがつかないほど草姿や熟期が似ていた（図１ｃ、および図２）。【０１４２】
この系統を用いて、「ＢＲ−９」のＡライン（細胞質雄性不稔）系統への戻し交配を行い、自家和合性の「ＳＣ−ＢＲ−９」の細胞質雄性不稔系統「ＣＭＳ−ＳＣ−ＢＲ−９」（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４９）も完成させた（図２）。【０１４３】
なお、前記したブロッコリー系統「ＣＭＳ−ＳＣ−ＢＲ−９」の種子は、２０１７年９月２９日付けで独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）に国際寄託（原寄託）されている（寄託者が付した識別のための表示：ＣＭＳ−ＳＣ−ＢＲ−９、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４９。【０１４４】
以上の結果より、Ｓ遺伝子座がカイラン由来のＢｏＳ−ＳＣ１ホモ型であっても、極近傍のゲノム領域を戻し交配親系統「ＢＲ−９」の遺伝子型に組換えた個体を選抜することによって、ブロッコリーとして高い商品価値を有した自家和合性系統を初めて育成することに成功した。【０１４５】
実施例３：  自家和合性系統の虫媒による採種試験
「ＢＲ−９」が本来持つＳ遺伝子（ＢｏＳ−１８）をＢｏＳ−ＳＣ１に置き換えたＮｏｒｍａｌ細胞質系統「ＳＣ−ＢＲ−９」（Ｂライン）と、そのＣＭＳ系統「ＣＭＳ−ＳＣ−ＢＲ−９」（Ａライン）とを用いて、網室における採種試験を虫媒受粉にて実施した（図３）。【０１４６】
反復試験を目的として２つの網室を使用し、ＡラインとＢラインをそれぞれ２４株ずつ栽培してミツバチによる虫媒交配を行い、得られた種子重量を調査した。
１区目の平均収量は、Ａライン（Ａ line）が３０．４ｇ／株、Ｂライン（Ｂ line）が３６．２ｇ／株、２区目の平均収量は、Ａラインが３５．８ｇ／株、Ｂラインが２９．７ｇ／株となり、非常に高い収量となった（表１）。【０１４７】
もとのＳＩ系統である「ＣＭＳ−ＢＲ−９」と「ＢＲ−９」（ＢｏＳ−１８ホモ型）の採種試験では、７株の平均でＡラインが０．０２ｇ／株、Ｂラインが０．６１ｇ／株しか採種できていないことと比較すると、その差は歴然であった。
これらのことから、本発明にしたがって育成された系統が、如何に採種性の優れた系統であるかということが確認された。【０１４８】
【表１】
2019163954.tif 000002
【０１４９】
実施例４：  ブロッコリー「ＢＲ−６」育種系統へのＳＣの導入とそのＣＭＳ系統の育成
別のブロッコリー親系統である「ＢＲ−６」についても、自家和合性因子の素材としてブラシカ・オレラセア野生種の「Ｔ−１６」を材料とし、自家和合性化を試みた。【０１５０】
実施例２と同様にして、Ｓハプロタイプ判別マーカーを使用しながら「ＢＲ−６」の戻し交配を進め、表現型を選抜し、さらにＳ遺伝子座近傍のマーカーＢｏＣ６ＭＫ１（配列番号１０および１１によるＰＣＲを実施した。Ｓ遺伝子座から１．１ｃＭの距離に座乗）と、ＢｏＣ６ＭＫ３（配列番号１４および１５によるＰＣＲを実施。Ｓ遺伝子座から２．２ｃＭの距離に座乗）とを用いたジェノタイピング分析に基づく選抜を経て、得られたＢＣ４Ｆ１Ｓ１世代の表現型を調査した。
その結果、Ｓ遺伝子座が「Ｔ−１６」由来のＢｏＳ−ＳＣ２ホモ型であっても、極近傍のゲノム領域を戻し交配親系統「ＢＲ−６」の遺伝子型に組換えた個体を選抜することによって、熟期や外観がＢＣ親系統である「ＢＲ−６」に極めて近い草姿を示すことが明らかとなった。【０１５１】
このようにして育成された「ＳＣ−ＢＲ−６」（Ｎｏｒｍａｌ細胞質、Ｂライン）およびそのＣＭＳ系統「ＣＭＳ−ＳＣ−ＢＲ−６」（雄性不稔細胞質、Ａライン）（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４８）を用い、実施例３と同様にして網室での採種試験を実施した（図４）。【０１５２】
なお、前記したブロッコリー系統「ＣＭＳ−ＳＣ−ＢＲ−６」の種子は、２０１７年９月２９日付けで独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）に国際寄託（原寄託）されている（寄託者が付した識別のための表示：ＣＭＳ−ＳＣ−ＢＲ−６、受託番号：  ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４８）。同様に、寄託者が付した識別のための表示がMilkywayである系統種子は、２０１７年９月２９日付けで独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）に国際寄託（原寄託）されている（受託番号：  ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３５０）。【０１５３】
Ａライン、Ｂラインそれぞれ１４株ずつ栽培して虫媒交配を実施した結果、各ラインの平均種子収量は、Ａラインで３９．５ｇ／株、Ｂラインで３９．８ｇ／株となり、高い採種性を持つことが示された（表２）。【０１５４】
以上の結果より、Ｓ遺伝子座がＢｏＳ−ＳＣ２ホモ型であっても、ブロッコリーとして高い商品価値を有した自家和合性系統が育成されることが明らかとなった。【０１５５】
【表２】
2019163954.tif 000003
【０１５６】
実施例５：  自家和合性ＳＣキャベツの開発（４系統）
カイランの系統である「Ｋ−３」（ＳハプロタイプはＢｏＳ−ＳＣ１、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３４７）をＳＩ機能欠失系統の素材とし、株式会社サカタのタネが保有するキャベツの親系統である「ＣＢ−２０」（葉深系キャベツ、ＳハプロタイプはＢｏＳ−５）、「ＣＢ−３５」（寒玉系キャベツ、ＳハプロタイプはＢｏＳ−５１）、「ＣＢ−２３」（春系キャベツ、ＳハプロタイプはＢｏＳ−８）および「ＣＢ−９７」（ボール系キャベツ、ＳハプロタイプはＢｏＳ−１５）をそれぞれ戻し交配親系統として交配試験を行った。【０１５７】
戻し交配（ＢＣ）を効率的に進めるにあたって、基本的にＳハプロタイプマーカーによるＤＮＡ検定を行い、Ｓ遺伝子座がそれぞれＢｏＳ−ＳＣ１／ＢｏＳ−５、ＢｏＳ−ＳＣ１／ＢｏＳ−５１、ＢｏＳ−ＳＣ１／ＢｏＳ−８、およびＢｏＳ−ＳＣ１／ＢｏＳ−１５のヘテロとなった個体を選抜し、表現型を確認しながら「ＣＢ−２０」、「ＣＢ−３５」、「ＣＢ−２３」および「ＣＢ−９７」を連続戻し交配した。【０１５８】
まず、ＢｏＳ−ＳＣ１を有するカイラン「Ｋ−３」と、キャベツ「ＣＢ−２０」、「ＣＢ−３５」、「ＣＢ−２３」および「ＣＢ−９７」をそれぞれ交配してＦ１を採種し、その後、数年にわたって「ＣＢ−２０」、「ＣＢ−３５」、「ＣＢ−２３」および「ＣＢ−９７」の戻し交配をそれぞれ進めた。【０１５９】
戻し交配を効率的に進めるため、２０種類のＲＡＰＤプライマーによる選抜を行い、それぞれの戻し交配系統において、それぞれの戻し交配親系統である「ＣＢ−２０」、「ＣＢ−３５」、「ＣＢ−２３」および「ＣＢ−９７」に近い遺伝子型を示す個体を選抜した。【０１６０】
その結果、「ＣＢ−２０」、「ＣＢ−３５」、および「ＣＢ−２３」はＢＣ４Ｆ１世代において、これらのＲＡＰＤマーカーがそれぞれの戻し交配親系統と完全に一致する個体を選抜した。
また、「ＣＢ−９７」はＢＣ４Ｆ１世代において、これらのＲＡＰＤマーカーがその戻し親系統とほぼ一致する個体を選抜した。【０１６１】
さらに世代を進め、圃場で試作し、表現型が元の戻し交配親系統と同等であることを確認した。【０１６２】
それぞれの系統においてＢｏＳ−ＳＣ１のホモ接合体を自殖あるいは葯・花粉培養から得て、キャベツの自家和合性系統を初めて育成することに成功した。【０１６３】
さらに、「ＣＢ−２０」、「ＣＢ−３５」、「ＣＢ−２３」および「ＣＢ−９７」のＡライン（細胞質雄性不稔）系統への戻し交配をそれぞれ行い、自家和合性の「ＳＣ−ＣＢ−２０」、「ＳＣ−ＣＢ−３５」、「ＳＣ−ＣＢ−２３」および「ＳＣ−ＣＢ−９７」の各系統、並びに、細胞質雄性不稔系統「ＣＭＳ−ＳＣ−ＣＢ−２０」、「ＣＭＳ−ＳＣ−ＣＢ−３５」、「ＣＭＳ−ＳＣ−ＣＢ−２３」および「ＣＭＳ−ＳＣ−ＣＢ−９７」の各系統も完成させた。【０１６４】
実施例６：  ＳＣキャベツの別系統への導入と手交配試験
実施例５にて育成した自家和合性キャベツ系統を元に、さらに他のキャベツ育成系統を交配して、自家和合性を保有するキャベツの育成を展開した。【０１６５】
その一例として、「ＣＢ−３」（ボール系キャベツ、ＳハプロタイプはＢｏＳ−２ｂ）を種子親とし、前記した実施例５にて育成途中の自家和合性を有する「ＣＢ−９７」（ボール系キャベツ、ＳハプロタイプはＢｏＳ−ＳＣ１／ＢｏＳ−１５）のＢＣ５Ｆ１世代を花粉親として交配し、Ｆ１を作出した。【０１６６】
戻し交配（ＢＣ）を効率的に進めるにあたって、基本的にＳハプロタイプマーカーによるＤＮＡ検定を行い、Ｓ遺伝子座がそれぞれＢｏＳ−ＳＣ１／ＢｏＳ−２ｂのヘテロとなった個体を選抜し、表現型を確認しながら「ＣＢ−３」を連続戻し交配した。
自家和合性のアレルを有する「ＣＢ−３」系統のＢＣ４Ｆ１世代に、さらに「ＣＢ−３」を戻し交配および自殖して、自家和合性を有するキャベツ「ＳＣ−ＣＢ−３」系統を育成した。【０１６７】
ＳＩ系の戻し交配親系統である「ＣＢ−３」と共に、新たに育成した自家和合性の「ＳＣ−ＣＢ−３」を材料として、手交配による交配試験を実施した。
結果は以下の通りであった。【０１６８】
アブラナ科植物の花序は、図５（Ａ）のような形態をしており、下位の蕾より順に開花が進んだ。
このような花序に対し、開花交配（open flower pollination；ＯＰ）と蕾交配（bud pollination；ＢＰ）を同日に実施して自家不和合性／自家和合性の検定を実施した。蕾交配を行う際には、萼や花弁をピンセットで切除し、雌蕊を剥き出しにして受粉を行った。交配した蕾や花には、図５（Ａ）に示したようなルールでナンバーをつけ、交配後１ヶ月以上経過して種子が充実した時点で、各位の結実種子数をカウントした。【０１６９】
図５（Ｂ）は、交配後１ヶ月以上経過した時点での莢の様子である。
ＳＩ系の戻し交配親系統は、交配時点におけるＯＰ／ＢＰの境界を示した毛糸より下位には、ほとんど種子を形成していなかった。一方でＢＰ区は、交配した時点では柱頭にＳＩ遺伝子が発現していないため、種子が形成されたことを確認できた。これに対しＳＣを導入した系統では、ＢＰ区のみならずＯＰ区にも大量の種子を形成したことがわかった。【０１７０】
図５（Ｃ）は、これらの各莢内に形成した種子数を数えた結果を示す。
結果のように、ＳＩ系の戻し交配親系統である「ＣＢ−３」は、ＯＰ区の莢にはほとんど種子が形成していないのに対し、ＢＰ区では１莢当たり１０粒前後の種子が形成されていた。一方、ＳＣの形質を導入した系統は、ＯＰ区で１０−２０粒程度の多くの種子が形成されており、自家和合性形質を付与できたことが確認された。【０１７１】
以上の結果より、これまで自家和合性系統の存在が知られていなかったブロッコリーやキャベツにおいても、本発明に従うことによって、自家和合性を導入し、作物としての品質を兼ね備えた系統を育成できることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５（Ａ）】
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【図５（Ｂ）】
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【図５（Ｃ）】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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