(57)【要約】  本発明は、ＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞に特異的な抗体または抗体結合フラグメントを提供する。より具体的には、配列番号：１または１８に記載のアミノ酸配列からなる配列を有するペプチドに結合し、かつ（１）Ｂ細胞表面上のＩｇＥ抗体に結合する、および／または（２）５６℃で加熱処理したＩｇＥ抗体に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１または１８に記載のアミノ酸配列からなる配列に対応するＩｇＥ抗体の重鎖のアミノ酸配列を有するペプチドに結合し、かつ
（１）Ｂ細胞表面上のＩｇＥ抗体に結合する、および／または
（２）５６℃で加熱処理した遊離形態のＩｇＥ抗体に結合する、
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
配列番号：１または１８に記載のアミノ酸配列からなる配列に対応するＩｇＥ抗体の重鎖のアミノ酸配列を有するペプチドに結合し、かつ
（１）Ｂ細胞表面上のＩｇＥ抗体に結合する、
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
配列番号：１または１８に記載のアミノ酸配列からなる配列に対応するＩｇＥ抗体の重鎖のアミノ酸配列を有するペプチドに結合し、かつ
（２）５６℃で加熱処理した遊離形態のＩｇＥ抗体に結合する、
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
請求項１に記載の抗体であって、
（１）Ｂ細胞表面上のＩｇＥ抗体に結合し、かつ
（２）５６℃で加熱処理した遊離形態のＩｇＥ抗体に結合する、
抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
肥満細胞表面上のＩｇＥ抗体に対するよりも、Ｂ細胞表面上のＩｇＥ抗体に対して強い親和性を有する、請求項２または４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
加熱処理前の遊離形態のＩｇＥ抗体に対するよりも、５６℃で加熱処理した遊離形態のＩｇＥ抗体に対して強い親和性を有する、請求項３または４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号：７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と
を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号：９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有する、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体のネコ化抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
請求項２、４、５、７及び８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、医薬組成物。
【請求項１２】
請求項３、４、６、７及び８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、加熱した遊離形態のＩｇＥ抗体の検出に用いるための組成物。
【請求項１３】
哺乳動物においてアレルギー症状またはその発症リスクを検査する方法であって、
哺乳動物から得られた生体試料を加熱して、請求項３、４、６、７及び８のいずれか一項に記載の抗体と反応する遊離形態のＩｇＥ抗体を含む生体試料を得ることと、
加熱した生体試料と請求項３、４、６、７及び８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントとを接触させることと、
を含む、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
加熱前の哺乳動物の生体試料と請求項３、４、５、７及び８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントとを接触させることをさらに含む、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、
哺乳動物から得られた生体試料に対する請求項３、４、５、７及び８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの反応性を生体試料の加熱前後で比較することをさらに含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞の膜結合型ＩｇＥ抗体に特異的に結合する抗ＩｇＥ抗体とこれを用いたアレルギー症状の診断および治療方法に関する。より具体的には、本発明は、ＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞の膜結合型ＩｇＥ抗体に結合し、肥満細胞に結合したＩｇＥ抗体に対しては実質的に結合しない抗ＩｇＥ抗体を提供する。本発明は、非加熱ＩｇＥ抗体に対しては実質的に結合せず、加熱ＩｇＥ抗体に対して結合する抗ＩｇＥ抗体を提供する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー症状には、肥満細胞が関与していることが知られている。例えば、花粉症や気管支喘息のアレルギーは、花粉やダニ由来のタンパク質などのアレルゲンと反応した肥満細胞がヒスタミンなどの生理活性物質を放出することにより炎症を引き起こす。肥満細胞の細胞表面にはＩｇＥ抗体に高親和性を有するＩｇＥ抗体受容体（ＦｃεＲＩ）が発現している。ＩｇＥ抗体は、ＦｃεＲＩに結合すると構造変化を引き起こし、アレルゲンとの接触に備える。そして、ＩｇＥ抗体がアレルゲンに結合し、少なくとも２分子のＩｇＥ抗体が架橋されるとＦｃεＲＩが集合し、ＦｃεＲＩシグナルが細胞に伝達されて、肥満細胞から脱顆粒によりヒスタミンなどが放出される。【０００３】
ＩｇＥ抗体の機能を押さえることによるアレルギー症状の治療戦略が試みられてきた。例えば、非特許文献１では、抗ＩｇＥ抗体であるオマリズマブは、血中ＩｇＥ抗体と結合する抗体をであり、血中ＩｇＥ抗体濃度を低下させることでアレルギー症状を抑制しようとする抗体医薬である（非特許文献１）。しかしながら、オマリズマブは、ＩｇＥ抗体産生細胞には反応せず、ＩｇＥ抗体の産生を抑制することはできないと考えられる（非特許文献１）。また、クイリズマブは、ＩｇＥ抗体産生細胞の膜結合型ＩｇＥ抗体に結合する抗体であり、これによってＩｇＥ抗体産生細胞を排除することが可能であることから、アレルギー症状を抑制しようとする抗体医薬である（非特許文献２および３）。しかし、クイリズマブは、血中のＩｇＥ抗体とも反応するため、血中ＩｇＥ抗体濃度の高い患者では、血中で抗体が消費されてしまうために、アレルギー症状の抑制効果が低いことが問題となっている（非特許文献２および３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２０１５／１９０５５５号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｚｈｅｎｇ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ３７５：  ６１９−６２２
【非特許文献２】Ｈａｒｒｉｓ，  Ｊ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６，  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３８：  １７３０−１７３２
【非特許文献３】Ｈａｒｒｉｓ，  Ｊ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６，  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｒｅｓ．，  １７：  ２９
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞の膜結合型ＩｇＥ抗体に特異的に結合する抗ＩｇＥ抗体とこれを用いたアレルギー症状の診断および治療方法を提供する。
【０００７】
本発明者らは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる配列を有する１３アミノ酸長のペプチドを免疫原として得られたモノクローナル抗体が、ＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞、及び加熱により構造変化させたＩｇＥ抗体（以下、「加熱したＩｇＥ抗体」と呼ぶことがある）に結合することを見出した。本発明者らはまた、臨床検体中の非加熱の（加熱による構造変化のない）ＩｇＥ抗体（以下、「非加熱ＩｇＥ抗体」と呼ぶことがある）や、肥満細胞表面上のＩｇＥ抗体には実質的に結合しないことを見出した。本発明は、このような知見に基づく発明である。
【０００８】
本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］配列番号：１または１８に記載のアミノ酸配列からなる配列を有するペプチドに結合し、かつ
（１）Ｂ細胞表面上のＩｇＥ抗体に結合する、および／または
（２）５６℃で加熱処理したＩｇＥ抗体に結合する、
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
［２］配列番号：１または１８に記載のアミノ酸配列からなる配列を有するペプチドに結合し、かつ
（１）Ｂ細胞表面上のＩｇＥ抗体に結合する、
上記［１］に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
［３］配列番号：１または１８に記載のアミノ酸配列からなる配列を有するペプチドに結合し、かつ
（２）５６℃で加熱処理した遊離形態のＩｇＥ抗体に結合する、上記［１］に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
［４］上記［１］に記載の抗体であって、
（１）Ｂ細胞表面上のＩｇＥ抗体に結合し、かつ
（２）５６℃で加熱処理した遊離形態のＩｇＥ抗体に結合する、
抗体またはその抗原結合フラグメント。
［５］肥満細胞表面上のＩｇＥ抗体に対するよりも、Ｂ細胞表面上のＩｇＥ抗体に対して強い親和性を有する、上記［２］または［４］に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
［６］加熱処理前の遊離形態のＩｇＥ抗体に対するよりも、５６℃で加熱処理した遊離形態のＩｇＥ抗体に対して強い親和性を有する、上記［３］または［４］に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
［７］配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号：７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と
を有する、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
［８］配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号：９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有する、上記［７］に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
［９］上記［１］〜［８］のいずれかに記載の抗体のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメント。
［１０］上記［１］〜［８］のいずれかに記載の抗体のネコ化抗体またはその抗原結合フラグメント。
［１１］上記［２］、［４］、［５］、［７］及び［８］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、医薬組成物。
［１２］上記［３］、［４］、［６］、［７］及び［８］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、加熱した遊離形態のＩｇＥ抗体の検出に用いるための組成物。
［１３］哺乳動物においてアレルギー症状またはその発症リスクを検査する方法であって、
哺乳動物から得られた生体試料を加熱して、上記［３］、［４］、［６］、［７］及び［８］のいずれかに記載の抗体と反応する遊離解体のＩｇＥ抗体を含む生体試料を得ることと、
加熱した生体試料と上記［３］、［４］、［６］、［７］及び［８］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントとを接触させることと、
を含む、方法。
［１４］上記［１３］に記載の方法であって、
加熱前の哺乳動物の生体試料と上記［３］、［４］、［６］、［７］及び［８］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントとを接触させることをさらに含む、方法。
［１５］上記［１４］に記載の方法であって、
哺乳動物から得られた生体試料に対する上記［３］、［４］、［６］、［７］及び［８］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの反応性を生体試料の加熱前後で比較することをさらに含む、方法。
【０００９】
従って、血中の遊離形態のＩｇＥ抗体に結合せず、肥満細胞に結合したＩｇＥ抗体にも結合せず、ＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞（形質細胞）の膜結合型ＩｇＥ抗体に結合する抗体は、アレルギー疾患または状態の治療に有益でありうる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の抗ＩｇＥ抗体が様々な哺乳動物のＩｇＥ抗体と結合することを示す。
【図２】図２は、本発明の抗ＩｇＥ抗体が様々な哺乳動物のＩｇＧ抗体とは実質的に結合しないことを示す。
【図３】図３は、本発明の抗ＩｇＥ抗体が臨床的なアレルギー症例においては、血清を加熱することで構造変化したＩｇＥ抗体と結合することを示す。図３はまた、実験的に感作した例においては、血清加熱前後のいずれのＩｇＥ抗体にも結合することを示す。
【図４】図４は、非加熱ＩｇＥ抗体は肥満細胞表面のＦｃεＲＩに結合するのに対して、加熱して構造変化したＩｇＥ抗体はＦｃεＲＩには結合しないことを示す。また、本発明の抗ＩｇＥ抗体が加熱して構造変化したＩｇＥ抗体に特異的に結合することを説明する。
【図５】図５は、肥満細胞の表面のＦｃεＲＩに結合できるＩｇＥ抗体の血清濃度（病原性ＩｇＥ抗体の量）が、本発明の抗ＩｇＥ抗体による加熱後のＩｇＥ抗体値から加熱前のＩｇＥ抗体値を控除することにより得られることを示す。
【図６】図６は、本発明の抗ＩｇＥ抗体がＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞に対して結合することを示す。
【図７】図７は、本発明の抗ＩｇＥ抗体が、インビトロで肥満細胞のＦｃεＲＩに結合したＩｇＥ抗体に対して結合しないことを示す。
【図８】図８は、本発明の抗ＩｇＥ抗体が、インビボで肥満細胞上のＩｇＥを架橋して肥満細胞を脱顆粒させず、それによるアレルギー炎症反応（膨疹形成）を誘発させないことを示す。
【図９】図９は、６Ｃ１２抗体の組換えマウス抗体のイヌ及びネコのＩｇＥ抗体及びＩｇＧ抗体に対する反応性を示す。
【図１０】図１０は、６Ｃ１２抗体のイヌキメラ抗体のイヌ及びネコのＩｇＥ抗体及びＩｇＧ抗体に対する反応性を示す。
【図１１】図１１は、６Ｃ１２抗体のイヌキメラ抗体のヒト及びラットのＩｇＥ抗体に対する反応性を示す。
【図１２】図１２は、インビボで病原性ＩｇＥがアレルギー反応を起し、非病原性ＩｇＥがアレルギー反応を起さないことを示す。図５に使用した血清の中から、病原性ＩｇＥのみを含む症例犬血清と非病原性ＩｇＥのみを含む実験感作犬血清をそれぞれ１検体ずつ選別し、各種濃度に希釈して健常犬皮膚に注射した後、２４時間後に同部位にアレルゲン（Ｄｅｒ  ｆ  ２）を皮内注射し、膨疹形成によってそれぞれのＩｇＥが肥満細胞に結合したか否かを示す。病原性ＩｇＥは肥満細胞に結合してＤｅｒ  ｆ  ２に対して膨疹を形成したが、非病原性ＩｇＥは肥満細胞に結合しないため膨疹を形成しないことを示す。
【図１３】図１３は、６Ｃ１２抗体の成熟したＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞に対する結合性を示す。
【図１４】図１４は、６Ｃ１２抗体による成熟したＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞に対する細胞傷害性を示す。
【図１５】図１５は、病原性ＩｇＥ抗体に対する６Ｃ１２抗体の結合性が加熱依存的であること、およびＰＮＧａｓｅＦによる病原性ＩｇＥ抗体の糖鎖修飾の分解の結果を示す。
【図１６】図１６は、病原性ＩｇＥ抗体に対してＰＮＧａｓｅＦによる糖鎖修飾分解後には６Ｃ１２抗体が結合することができることを示す。
【図１７】図１７は、病原性ＩｇＥ抗体に対する６Ｃ１２抗体の結合性が加熱依存的であること、およびＥｎｄｏＨによる病原性ＩｇＥ抗体の糖鎖修飾の分解の結果を示す。
【図１８】図１８は、病原性ＩｇＥ抗体に対してＥｎｄｏＨによる糖鎖修飾分解後に６Ｃ１２抗体が結合することができることを示す。
【図１９】図１９は、病原性ＩｇＥ抗体に対する６Ｃ１２抗体の結合性が加熱依存的であること、およびα−２，３ノイラミニダーゼによる病原性ＩｇＥ抗体の糖鎖修飾の分解の結果を示す。
【図２０】図２０は、病原性ＩｇＥ抗体に対してα−２，３ノイラミニダーゼによる糖鎖修飾分解後に６Ｃ１２抗体が結合することができないことを示す。
【図２１】図２１は、各種ペプチドと６Ｃ１２抗体との結合性を示す。
【図２２】図２２は、６Ｃ１２抗体とＩｇＥ抗体との結合状態のシミュレーションを示す。
【図２３】図２３は、上からヒト、イヌ、ネコ、ラット、およびマウスのＩｇＥ抗体の重鎖のアミノ酸配列のアラインメントデータを示す。
【図２４】図２４は、ＩｇＥ抗体の指定した領域の配列のヒトおよびイヌ間での比較を示す。
【発明の具体的な説明】
【００１１】
本明細書において、「対象」とは、哺乳動物、例えば、イヌ及びネコなどの愛玩動物、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、及びブタなどの家畜、ラット及びハムスターなどの齧歯類、サル、オランウータン、ゴリラ、チンパンジ、ボノボ及びヒトなどの霊長類を意味する。
【００１２】
本明細書において、「抗体」は、免疫グロブリンを意味し、一対のジスルフィド結合で安定化された２本の重鎖（Ｈ鎖）と２本の軽鎖（Ｌ鎖）が会合した構造をとるタンパク質をいう。重鎖は、重鎖可変領域ＶＨ、重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ１とＣＨ２の間に位置するヒンジ領域からなり、軽鎖は、軽鎖可変領域ＶＬと軽鎖定常領域ＣＬとからなる。この中で、ＶＨとＶＬからなる可変領域断片（Ｆｖ）が、抗原結合に直接関与し、抗体に多様性を与える領域である。また、ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、ＣＨ１からなる抗原結合領域をＦａｂ領域と呼び、ヒンジ領域、ＣＨ２、ＣＨ３からなる領域をＦｃ領域と呼ぶ。重鎖および軽鎖は、細胞内ではシグナル配列を有する前駆体として産生されるが、切断されて除去され、抗体産生細胞から抗体として産生され得る。
可変領域のうち、直接抗原と接触する領域は特に変化が大きく、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：  ＣＤＲ）と呼ばれる。ＣＤＲ以外の比較的変異の少ない部分をフレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ：  ＦＲ）と呼ぶ。軽鎖と重鎖の可変領域には、それぞれ３つのＣＤＲが存在し、それぞれＮ末端側から順に、重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３と呼ばれる。
【００１３】
本明細書において「処置」とは、治療または予防を意味する。従って、本明細書において「がんを処置することに用いる医薬組成物」とは、がんを治療または予防することに用いる医薬組成物を意味し、抗がん剤を一例として含む意味で用いられる。
【００１４】
本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。また、本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのいずれのアイソタイプであってもよい。モノクローナル抗体は、１つの細胞株から産生される非組換え抗体および組換え抗体などの、実質的に単一の種類の抗体からなる抗体であり得る。マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリなどの非ヒト動物を免疫して作製したものであってもよいし、組換え抗体であってもよく、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体、イヌ化抗体、完全イヌ抗体、ネコ化抗体、完全ネコ抗体等であってもよい。キメラ型抗体とは、異なる種に由来する抗体の断片が連結された抗体をいう。本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体は、好ましくは、ＩｇＥ抗体以外の抗体のアイソタイプに対しては実質的に結合しない。本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）および／または補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）を有する抗体とし得る。これにより、ＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞を攻撃し、生体から除去する効果が期待できる。ＩｇＧ１、及びＩｇＧ２ａのアイソタイプは、強いＡＤＣＣ活性を有し得る。本明細書では、「ＩｇＥ抗体に結合する抗体」を「抗ＩｇＥ抗体」と呼ぶことがある。本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体またはそのＩｇＥ抗体結合性断片は、細胞傷害剤との薬物抗体コンジュゲート（ＡＤＣ）の形態であってもよい。これにより、ＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞を攻撃し、生体から除去する効果が期待できる。また、本発明では、「ＩｇＥ抗体」と述べた場合には、断りの無い限り、遊離形態のＩｇＥ抗体を意味する。「遊離形態のＩｇＥ抗体」とは、膜結合型ＩｇＥ抗体との対比において、膜に結合していない形態のＩｇＥ抗体であることを意味する。本明細書では、「病原性ＩｇＥ抗体」とは、肥満細胞に結合することができるＩｇＥ抗体を言う。
【００１５】
「ヒト化抗体」とは、非ヒト由来の抗体に特徴的なアミノ酸配列で、ヒト抗体の対応する位置を置換した抗体を意味し、例えば、マウス又はラットを免疫して作製した抗体の重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３を有し、重鎖及び軽鎖のそれぞれ４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含むその他のすべての領域がヒト抗体に由来するものが挙げられる。かかる抗体は、ＣＤＲ移植抗体と呼ばれる場合もある。用語「ヒト化抗体」は、ヒトキメラ抗体を含む場合もある。
「ヒトキメラ抗体」は、非ヒト由来の抗体において、非ヒト由来の抗体の定常領域がヒトの抗体の定常領域に置換されている抗体である。ヒトキメラ抗体では、ＡＤＣＣ活性を高める観点では、例えば、定常領域に用いるヒトの抗体のサブタイプはＩｇＧ１とすることができる。
【００１６】
「イヌ化抗体」とは、非イヌ由来の抗体に特徴的なアミノ酸配列で、イヌ抗体の対応する位置を置換した抗体を意味し、例えば、マウス又はラットを免疫して作製した抗体の重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３を有し、重鎖及び軽鎖のそれぞれ４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含むその他のすべての領域がイヌ抗体に由来するものが挙げられる。かかる抗体は、ＣＤＲ移植抗体と呼ばれる場合もある。用語「イヌ化抗体」は、イヌキメラ抗体を含む場合もある。
「イヌキメラ抗体」は、非イヌ由来の抗体において、非イヌ由来の抗体の定常領域がイヌの抗体の定常領域に置換されている抗体である。イヌキメラ抗体では、ＡＤＣＣ活性を高める観点では、例えば、定常領域に用いるイヌの抗体のサブタイプは、特に限定されないが例えばＩｇＧｂとすることができる。
【００１７】
「ネコ化抗体」とは、非ネコ由来の抗体に特徴的なアミノ酸配列で、ネコ抗体の対応する位置を置換した抗体を意味し、例えば、マウス又はラットを免疫して作製した抗体の重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３を有し、重鎖及び軽鎖のそれぞれ４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含むその他のすべての領域がネコ抗体に由来するものが挙げられる。かかる抗体は、ＣＤＲ移植抗体と呼ばれる場合もある。用語「ネコ化抗体」は、ネコキメラ抗体を含む場合もある。
「ネコキメラ抗体」は、非ネコ由来の抗体において、非ネコ由来の抗体の定常領域がネコの抗体の定常領域に置換されている抗体である。
【００１８】
哺乳動物化抗体とは、哺乳動物のある種について、当該種以外の抗体に特徴的なアミノ酸配列で当該種の抗体に対応する位置を置換した抗体を意味し、例えば、マウス又はラットを免疫して作製した抗体の重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３を有し、重鎖及び軽鎖のそれぞれ４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含むその他のすべての領域が当該種の抗体に由来するものが挙げられる。かかる抗体は、ＣＤＲ移植抗体と呼ばれる場合もある。用語「哺乳動物化抗体」は、哺乳動物キメラ抗体を含む場合もある。
「哺乳動物キメラ抗体」は、哺乳動物のある種について、当該種以外の抗体において、当該種以外の抗体の定常領域が当該種の抗体の定常領域に置換されている抗体である。哺乳動物キメラ抗体では、ＡＤＣＣ活性を高める観点では、例えば、定常領域に用いる哺乳動物の抗体のサブタイプはＩｇＧ１あるいはイヌにおいてはＩｇＧｂとすることができる。
霊長類化抗体、霊長類キメラ抗体も同様の意味で用いられる。
【００１９】
本明細書において、「抗原結合フラグメント」とは、抗体のフラグメントであって、ＩｇＥ抗体に結合する能力を維持したフラグメントをいう。具体的には、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１領域からなるＦａｂ；２つのＦａｂがヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結されているＦ（ａｂ’）２；ＶＬ及びＶＨからなるＦｖ；ＶＬ及びＶＨを人工のポリペプチドリンカーで連結した一本鎖抗体であるｓｃＦｖのほか、ｄｉａｂｏｄｙ型、ｓｃＤｂ型、ｔａｎｄｅｍ  ｓｃＦｖ型、ロイシンジッパー型などの二重特異性抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
本明細書では、「ＩｇＥ抗体」は、免疫グロブリンのうち、２つの重鎖（ε鎖）と２つの軽鎖（κ鎖またはλ鎖）から形成される分子である。本明細書では、「ＩｇＥ抗体」を「ＩｇＥ」と呼ぶことがある。ＩｇＥ抗体の重鎖の定常領域は、４つのドメインから構成され、それぞれ可変領域からＣε１〜４と呼ばれる。ＩｇＥ抗体のＣε３は、ＩｇＥ受容体（Ｆｃε受容体）との結合に関与している。Ｆｃε受容体は、肥満細胞やＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞の膜表面に発現している。Ｆｃε受容体には、ＩｇＥ抗体に対して高親和性を示すＦｃεＲＩと低親和性を示すＦｃεＲＩＩとが存在する。ＦｃεＲＩは、肥満細胞表面に発現し、ＦｃεＲＩＩは、Ｂ細胞表面で発現する。ＩｇＥ抗体が肥満細胞のＦｃεＲＩと結合し、アレルゲンや病原体と反応すると、肥満細胞からヒスタミンなどのメディエーターが放出され、アレルギー反応を引き起こす。本明細書では、肥満細胞に結合するＩｇＥ抗体を「病原性ＩｇＥ抗体」または「病原性ＩｇＥ」ということがある。本明細書では、加熱したＩｇＥ抗体や肥満細胞に結合しないＩｇＥ抗体を「非病原性ＩｇＥ抗体」または「非病原性ＩｇＥ」ということがある。ヒトＩｇＥ抗体のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＨ００５２７８において登録されたアミノ酸配列であり得る。イヌＩｇＥ抗体のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｌ３６８７２において登録されたアミノ酸配列であり得る。ネコＩｇＥ抗体のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ１６２１３４において登録されたアミノ酸配列であり得る。ラットＩｇＥ抗体のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｋ０２９０１において登録されたアミノ酸配列であり得る。マウスＩｇＥ抗体のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＬＣ３８７２５３において登録されたアミノ酸配列であり得る。
本明細書では、「Ｂ細胞膜表面上のＩｇＥ抗体」とは、Ｂ細胞に結合したＩｇＥ抗体を意味する。ＩｇＥ抗体は、Ｂ細胞表面にＦｃε受容体を介して結合し得る。ＩｇＥ抗体はまた、ＩｇＥ抗体を産生するＢ細胞の膜表面に膜結合タンパク（たとえば、マウスではＭ１タンパク、ヒトではＭ１’タンパク）によって発現しうる。Ｂ細胞膜表面上のＩｇＥ抗体は、Ｂ細胞受容体であり得る。Ｂ細胞は、刺激（例えば、ＣＤ４０への刺激とＩＬ−４またはＩＬ−１３による刺激）により活性化していることができる。ＣＤ４０は、抗ＣＤ４０抗体などの公知の様々な方法によって刺激することができる。また、抗ＣＤ４０抗体の代わりにＣ４ｂ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ４ＢＰ）を使うこともでＢ細胞上のＣＤ４０を刺激することもできる。さらに、ＣＤ４０によるＢ細胞刺激はＢ細胞内のＴＲＡＦ（ＴＮＦ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ）分子を活性化させるが、その活性化刺激はＬＭＰ１、ＣＤ４０以外のＴＮＦ受容体（ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂなど）、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ２６７、ＣＤ２６９、Ｂ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  （ＢＡＦＦ／Ｂｌｙｓ／ＣＤ２５７）−ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＤ２６８）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）によってもＣＤ４０に対する刺激と同等の効果を得ることができる。あるいは、ＴＮＦファミリーのサイトカイン（ＴＮＦやＡＰＲＩＬ／ＣＤ２５６など）をＢ細胞に接触させても誘導できる。さらにヒトＢ細胞においては、Ｂ細胞の腫瘍化増殖を誘導するエプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ）をＢ細胞に感染させてもよい。また、ＣＤ４０刺激を使用せずにＢ細胞のＩｇＥ産生を誘導する方法として、ＩＬ−４、ＢＡＦＦ、および抗ＩｇＭ抗体を同時にＢ細胞に接触さえる方法を用いることもできる。ＩＬ−４の代わりとして、その構造が類似したサイトカインのＩＬ−１３を用いることもできる。このように、様々な公知の方法を適宜用いることによって、当業者は、刺激されたＢ細胞を得ることができる。本発明の抗体は、このようにして刺激したＢ細胞表面上のＩｇＥに結合し得る。
本明細書では、「肥満細胞表面上のＩｇＥ抗体」とは、肥満細胞に結合したＩｇＥ抗体を意味する。ＩｇＥ抗体は、肥満細胞にＦｃε受容体を介して結合し得る。
本発明によれば、６Ｃ１２は、加熱変性したＩｇＥ抗体とＢ細胞膜表面上のＩｇＥ抗体に結合性を示したが、加熱変性前のＩｇＥ抗体と肥満細胞表面上のＩｇＥ抗体に対しては反応性を示さなかった。このことから、Ｂ細胞膜表面上のＩｇＥ抗体は、少なくとも６Ｃ１２のエピトープ部分において加熱変性したＩｇＥ抗体と同様の構造を取るが、加熱変性前のＩｇＥ抗体や肥満細胞表面上のＩｇＥ抗体とは異なる構造を取ると考えられる。
本明細書では、「肥満細胞表面上のＩｇＥ抗体」とは、肥満細胞に結合したＩｇＥ抗体を意味する。ＩｇＥ抗体は、肥満細胞にＦｃε受容体を介して結合し得る。
【００２１】
本明細書では、「ＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞」とは、ＩｇＥ抗体を産生するＢ細胞（形質細胞）を意味する。Ｂ細胞は、免疫グロブリンのＶ（Ｄ）Ｊ組換えを終了すると細胞表面にＩｇＭを発現し、そしてＩｇＤを共発現する成熟Ｂ細胞になる。成熟Ｂ細胞が抗原を認識すると、形質細胞に変化する。成熟Ｂ細胞の形質細胞への最終分化の過程においては、重鎖定常領域のクラススイッチ組換えが起こり、ＩｇＭのＩｇＥへのアイソタイプの変更が生じて、ＩｇＥ抗体を産生するＢ細胞（形質細胞）が生成される。ＩｇＥ抗体を産生するＢ細胞（形質細胞）により産生される成熟したＣεのｍＲＮＡは、ＶＤＪ領域にＣε領域が連結したタンパク質をコードするものであり得る。
【００２２】
本明細書では、「ＡＤＣＣ活性」とは、抗体依存性細胞傷害活性を意味する。ＡＤＣＣ活性は、標的細胞の細胞表面抗原に本発明の抗体が結合した際、そのＦｃ部分にＦｃγ受容体保有細胞（エフェクター細胞）がＦｃγ受容体を介して結合し、標的細胞に障害を与える活性を意味する。
【００２３】
本明細書では、「ＣＤＣ活性」とは、補体依存性細胞傷害活性を意味する。ＣＤＣ活性は、抗体に結合した補体による細胞傷害活性を意味する。
【００２４】
本明細書では、「単離」とは、抗体が産生された環境下から取り出されたことを意味する。単離は、例えば、生じた環境に存在する細胞やその破片、培養液中の他の成分を除去する処理であり得、例えば、抗体の特異的吸着材（プロテインＡまたはプロテインＧによるアフィニティーカラム等）により精製されることを含む意味で用いられる。単離は、例えば、溶媒の交換を含み得る。
【００２５】
本発明によれば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列（ＮＴＮＤＷＩＥＧＥＴＹＹＣ）を有するペプチドに結合する抗体であって、Ｂ細胞膜表面上のＩｇＥ抗体に結合する抗体が提供される。本発明によれば、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列（ＨＨＨＨＨＨＧＧＳＧＧＳＤＷＩＥＧＥＴＹＹＣ）を有するペプチドに結合する抗体が提供される。本発明によれば、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列（ＨＨＨＨＨＨＧＧＳＧＧＳＤＷＩＥＧＥＴＹＹＣ）を有するペプチドに結合する抗体であって、Ｂ細胞膜表面上のＩｇＥ抗体に結合する抗体が提供される。いくつかの態様では、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列（ＨＨＨＨＨＨＧＧＳＧＧＳＤＷＩＥＧＥＴＹＹＣ）を有するペプチドに結合する抗体は、配列番号：１２〜１７のいずれか１以上のペプチドには、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列を有するペプチドよりも弱い親和性で結合する。
本発明によれば、配列番号：１８に記載のアミノ酸配列（ＤＷＩＥＧＥＴＹＹＣ）を有するペプチドに結合する抗体が提供される。本発明によれば、配列番号：１８に記載のアミノ酸配列（ＤＷＩＥＧＥＴＹＹＣ）を有するペプチドに結合する抗体であって、Ｂ細胞膜表面上のＩｇＥ抗体に結合する抗体が提供される。いくつかの態様では、配列番号：１８に記載のアミノ酸配列（ＤＷＩＥＧＥＴＹＹＣ）を有するペプチドに結合する抗体は、配列番号：１２〜１７のいずれか１以上のペプチドには、配列番号：１８に記載のアミノ酸配列（ＤＷＩＥＧＥＴＹＹＣ）を有するペプチドよりも弱い親和性で結合する。
【００２６】
本発明の抗体は、肥満細胞膜表面上のＩｇＥ抗体に対しては、実質的に反応を示さない。実質的に反応を示さないとは、例えば、陰性対照となる抗体（ＩｇＥ抗体に対して特異性を有しない抗体等、例えば、特定の抗原と反応しないアイソタイプコントロール抗体等）と比較して５倍以下、４倍以下、３倍以下、２倍以下、または１．５倍以下の反応性を有することを意味する。反応性は、ＥＬＩＳＡやフローサイトメトリーなどの周知技術によって確認することができる。
【００２７】
本発明によれば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列（ＮＴＮＤＷＩＥＧＥＴＹＹＣ）を有するペプチドに結合する抗体であって、加熱したＩｇＥ抗体に結合する抗体が提供される。本発明によれば、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列（ＨＨＨＨＨＨＧＧＳＧＧＳＤＷＩＥＧＥＴＹＹＣ）を有するペプチドに結合する抗体であって、加熱したＩｇＥ抗体に結合する抗体が提供される。本発明によれば、配列番号：１８に記載のアミノ酸配列（ＤＷＩＥＧＥＴＹＹＣ）を有するペプチドに結合する抗体であって、加熱したＩｇＥ抗体に結合する抗体が提供される。
【００２８】
本発明の抗体は、ある態様では、加熱したＩｇＥ抗体（例えば、病原性ＩｇＥ、ヒトＩｇＥにおいてＮ３９４に糖鎖修飾を有する抗体であり得る）に結合し得る。ＩｇＥ抗体の加熱は、例えば、５６℃で、例えば、１時間〜数時間、例えば、１０〜２０分、例えば１５分行うことができる。本発明の抗体は、ある態様では、加熱していないＩｇＥ抗体（例えば、４℃〜３７℃で静置された抗体）に対しては、実質的に反応を示さない。実質的に反応を示さないとは、例えば、陰性対照となる抗体（ＩｇＥ抗体に対して特異性を有しない抗体等、例えば、特定の抗原と反応しないアイソタイプコントロール抗体等）と比較して５倍以下、４倍以下、３倍以下、２倍以下、または１．５倍以下の反応性を有することを意味する。反応性は、ＥＬＩＳＡやフローサイトメトリーなどの周知技術によって確認することができる。本発明の抗体は、ある態様では、加熱していないＩｇＥ抗体に対しては、結合乖離定数ＫＤ値が、１０−５以下、１０−４以下、１０−３以下、または１０−２以下であり得る。
【００２９】
本発明の抗体は、ある態様では、加熱したＩｇＥ抗体に対して、非加熱ＩｇＥ抗体に対するよりも５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、または１００倍以上高い結合親和性を有し得る。本発明の抗体は、ある態様では、加熱したＩｇＥ抗体に対して、非加熱ＩｇＥ抗体に対するよりも、１０−３、１０−４、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、または１０−９低い結合乖離定数ＫＤ値を有し得る（すなわち、加熱したＩｇＥ抗体に対してより強く結合する）。
【００３０】
本発明によれば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列（ＮＴＮＤＷＩＥＧＥＴＹＹＣ）を有するペプチドに結合する抗体であって、Ｂ細胞膜表面上のＩｇＥ抗体に結合し、かつ、加熱したＩｇＥ抗体に結合する抗体が提供される。本発明によれば、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列（ＨＨＨＨＨＨＧＧＳＧＧＳＤＷＩＥＧＥＴＹＹＣ）を有するペプチドに結合する抗体であって、Ｂ細胞膜表面上のＩｇＥ抗体に結合し、かつ、加熱したＩｇＥ抗体に結合する抗体が提供される。いくつかの態様では、抗体は、単離されたモノクローナル抗体である。本発明によれば、配列番号：１８に記載のアミノ酸配列（ＤＷＩＥＧＥＴＹＹＣ）を有するペプチドに結合する抗体であって、Ｂ細胞膜表面上のＩｇＥ抗体に結合し、かつ、加熱したＩｇＥ抗体に結合する抗体が提供される。いくつかの態様では、抗体は、単離されたモノクローナル抗体である。
本発明によれば、加熱した病原性ＩｇＥ若しくはＢ細胞表面上のＩｇＥまたは配列番号：１１に記載のアミノ酸配列（ＨＨＨＨＨＨＧＧＳＧＧＳＤＷＩＥＧＥＴＹＹＣ）を有するペプチドとの結合に関して、配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号：９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有する抗体と競合する、単離されたモノクローナル抗体が提供される。本発明によれば、加熱した病原性ＩｇＥ若しくはＢ細胞表面上のＩｇＥまたは配列番号：１８に記載のアミノ酸配列（ＤＷＩＥＧＥＴＹＹＣ）を有するペプチドとの結合に関して、配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号：９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有する抗体と競合する、単離されたモノクローナル抗体が提供される。
【００３１】
本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体は、例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有する１３アミノ酸長のペプチドを、キャリアタンパク質と連結させて動物に免疫することにより取得することができる。キャリアタンパク質としては、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を用いることができる。ペプチドとキャリアタンパク質との連結は、例えば、１−エチル１−３−［ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドハイドリクロライド（ＥＤＣ）を用いて行うことができる。ペプチドとキャリアタンパク質との連結はまた、ペプチドとキャリアタンパク質の融合タンパク質として発現させてもよい。
【００３２】
抗体が、配列番号：１に記載のアミノ酸配列（ＮＴＮＤＷＩＥＧＥＴＹＹＣ）を有するペプチドまたは配列番号：１１に記載のアミノ酸配列（ＨＨＨＨＨＨＧＧＳＧＧＳＤＷＩＥＧＥＴＹＹＣ）を有するペプチド若しくは配列番号：１８に記載のアミノ酸配列（ＤＷＩＥＧＥＴＹＹＣ）を有するペプチドに結合するか否かは、適宜スペーサーを介して固相化した当該ペプチドに対して抗体が結合し得るか否かによって確認することができる。抗体が固相化したペプチドに結合したか否かは、調べたい抗体を標識して接触させることによって、あるいは、調べたい抗体を接触させた後に標識した二次抗体を用いて検出することができる。標識は、特に限定されないが、ビオチン標識、蛍光標識、酵素標識、及びラジオアイソトープ標識などが挙げられる。陰性対照としては、特定の抗原と反応しないアイソタイプコントロール抗体を用いることができる。抗体は、投与対象に応じて、当該投与対象のＩｇＥ抗体の重鎖アミノ酸配列における、配列番号１、１１または１８に対応するアミノ酸配列を有するペプチドに結合する抗体とすることができる。
【００３３】
抗体が、Ｂ細胞表面上のＩｇＥ抗体に結合するか否かは、ＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞を用いたフローサイトメトリーにより確認することができる。例えば、調べたい抗体を蛍光標識し、ＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞と接触させ、フローサイトメトリーで蛍光に基づいて調べたい抗体が細胞に結合したかを検出することができる。調べたい抗体を蛍光標識した場合には、細胞に調べたい抗体が結合すれば、細胞は抗体の蛍光標識に由来する蛍光を発するはずである。陰性対照としては、特定の抗原と反応しないアイソタイプコントロール抗体を用いることができる。いくつかの態様では、刺激したＢ細胞の表面上のＩｇＥ抗体に結合するか否かを確認することができる。
【００３４】
抗体が、肥満細胞表面上のＩｇＥ抗体に結合するか否かは、以下のように確認することができる。まず、肥満細胞とＩｇＥ抗体とを接触させ、肥満細胞表面のＦｃεＲＩにＩｇＥ抗体を結合させることができる。また、例えば、調べたい抗体を蛍光標識し、ＩｇＥ抗体を結合させた肥満細胞と接触させ、フローサイトメトリーで蛍光に基づいて調べたい抗体が細胞に結合したかを検出することができる。調べたい抗体を蛍光標識した場合には、細胞に調べたい抗体が結合すれば、細胞は抗体の蛍光標識に由来する蛍光を発するはずである。陰性対照としては、特定の抗原と反応しないアイソタイプコントロール抗体を用いることができる。
【００３５】
抗体が、５６℃で加熱したＩｇＥ抗体と結合するか否かは、ＩｇＥ抗体を５６℃で、例えば、１時間〜数時間、例えば、１０〜２０分間、例えば、１５分間加熱し、得られるＩｇＥ抗体と調べたい抗体とを接触させることにより確認することができる。より具体的には、加熱したＩｇＥ抗体を固相化し、これに対して調べたい抗体を標識して接触させることによって、あるいは、調べたい抗体を接触させた後に標識した二次抗体を用いて検出することができる。標識は、特に限定されないが、ビオチン標識、蛍光標識、酵素標識、及びラジオアイソトープ標識などが挙げられる。陰性対照としては、特定の抗原と反応しないアイソタイプコントロール抗体を用いることができる。
【００３６】
抗体が、加熱前のＩｇＥ抗体（非加熱のＩｇＥ抗体）と結合するか否かは、例えば、ＩｇＥ抗体を３７℃以下の環境に維持し、得られるＩｇＥ抗体と調べたい抗体とを接触させることにより確認することができる。より具体的には、非加熱のＩｇＥ抗体を固相化し、これに対して調べたい抗体を標識して接触させることによって、あるいは、調べたい抗体を接触させた後に標識した二次抗体を用いて検出することができる。標識は、特に限定されないが、ビオチン標識、蛍光標識、酵素標識、及びラジオアイソトープ標識などが挙げられる。陰性対照としては、特定の抗原と反応しないアイソタイプコントロール抗体を用いることができる。
【００３７】
本発明によれば、ＩｇＥ抗体に結合する抗体は、
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号：７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と
を有する。
【００３８】
本発明によれば、ＩｇＥ抗体に結合する抗体は、
(i)配列番号：８に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号：９に記載の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有し得る。本発明によれば、また、(ii)ＩｇＥ抗体に結合する抗体は、配列番号８に記載の重鎖のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号９に記載の軽鎖のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有し得る。
本発明によればまた、ＩｇＥ抗体に結合する抗体は、上記(i)または(ii)に記載されたＩｇＥ抗体に結合する抗体と、ＩｇＥ抗体との結合に関して競合する抗体であり得る。本発明によればまた、ＩｇＥ抗体に結合する抗体は、上記(i)または(ii)に記載されたＩｇＥ抗体に結合する抗体と、配列番号１、１１、または１８のアミノ酸配列を有するペプチドとの結合に関して競合する抗体であり得る。
【００３９】
本発明によれば、ＩｇＥ抗体に結合する抗体は、イヌキメラ抗体、イヌ化抗体、ネコキメラ抗体またはネコ化抗体などの哺乳動物キメラ抗体または哺乳動物化抗体であり得、例えば、イヌやネコに投与する用途で用いられる。
【００４０】
本発明によれば、ＩｇＥ抗体に結合する抗体は、ヒトキメラ抗体、またはヒト化抗体であり得、例えば、ヒトに投与する用途で用いられる。
【００４１】
本発明によれば、ＩｇＥ抗体に結合する抗体は、哺乳動物に投与する用途で用いられる場合には、ＩｇＧ１抗体とすることができる。
【００４２】
抗体がＡＤＣＣ活性を有するか否かは、ＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞とエフェクター細胞と本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体とを用いて確認することができる。エフェクター細胞としては、例えば、マウス脾細胞、ヒト末梢血や骨髄から分離した単球核を利用することができる。標的細胞としては、例えばＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞を用いることができる。標的細胞をあらかじめ５１Ｃｒ等で標識し、これに本発明の抗体を加えてインキュベーションし、その後標的細胞に対して適切な比のエフェクター細胞を加えてインキュベーションを行う。インキュベーション後、上清を採取し、上清中の上記標識をカウントすることにより、測定することが可能である。
【００４３】
抗体がＣＤＣ活性を有するか否かは、ＡＤＣＣ活性の試験において、エフェクター細胞の代わりに補体を用いることにより確認することができる。
【００４４】
本発明では、ＩｇＥ抗体に結合する抗体またはそのＩｇＥ抗体結合断片は、細胞傷害剤との薬物抗体コンジュゲート（ＡＤＣ）の形態であってもよい。細胞傷害剤としては、抗がん剤として用いられる細胞傷害剤を用いることができる。細胞傷害剤としては、例えば、化学療法剤（例えば、市販の抗がん剤などの抗がん剤、例えば、アウリスタチン（アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦフェニレンジアミン（ＡＦＰ）、モノメチルアウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＦとそれらの誘導体）、メイタンシノイドＤＭ１およびＤＭ４とそれらの誘導体）、カンプトテシン（ＳＮ−３８、トポテカンおよびエキソテカンとそれらの誘導体）、ＤＮＡ副溝結合剤（エネジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシンとそれらの誘導体）、タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセルとそれらの誘導体）、ポリケチド（ディスコデルモライドとその誘導体）、アントラキノン系（ミトキサントロンとその誘導体）、ベンゾジアゼピン（ピロロベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピン、およびオキサゾリジノベンゾジアゼピンとそれらの誘導体）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビンとそれらの誘導体）、ドキソルビシン類（ドキソルビシン、モルホリノ−ドキソルビシン、およびシアノモルホリノ−ドキソルビシンとそれらの誘導体）、強心配糖体（ジギトキシンやその誘導体）、カレキアマイシン、エポチロン、クリプトフィシン、セマドチン、セマドチン、リゾキシン、ネトロプシン、コンブレタスタチン、エリュテロビン、エトポシド、Ｔ６７（チュラリク）、およびノコダゾール）、放射性同位体（例えば、３２Ｐ、６０Ｃ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１５３Ｓｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、および２１２Ｂｉ）、および毒素（例えば、ジフテリアトキシンＡ、シュードモナスエンドトキシン、リシン、サポリン等）が挙げられ、本発明のＡＤＣにおける細胞傷害剤として用いることができる。細胞傷害剤はいずれも、がんの処置に用いられるものを用いることができる。細胞傷害剤と抗体とは、リンカーを介して連結することができる。当業者であれば、適宜、細胞傷害剤およびリンカーを選択することができる。
【００４５】
本発明によれば、ＩｇＥ抗体に結合する抗体は、検査試薬として用いることができる。この場合、ＩｇＥ抗体に結合する抗体は、いずれのアイソタイプの抗体であってもよい。
【００４６】
本発明によれば、
ＩｇＥ抗体に結合する抗体を製造する方法であって、
配列番号：１に記載のアミノ酸配列（ＮＴＮＤＷＩＥＧＥＴＹＹＣ）を有するイヌのペプチドを動物（例えば、非ヒト動物、非ヒト哺乳動物、鳥類）に免疫することを含む、方法が提供される。
【００４７】
本発明によれば、その必要のある対象において、アレルギーを伴う疾患または状態を処置する方法であって、対象に治療上有効量の本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体を投与することを含む、方法が提供される。
【００４８】
本発明によれば、本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体を含む、医薬組成物が提供される。
【００４９】
本発明によれば、アレルギーを伴う疾患または状態を処置することに用いるための医薬組成物であって、治療上有効量の本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体を含む、医薬組成物が提供される。本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体は、ＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞表面のＩｇＥ抗体に特異的に結合することによって、当該Ｂ細胞を標的化することができる。当該Ｂ細胞を抑制または死滅させることによってアレルギー症状の原因となるＩｇＥ抗体の産生を抑制することができる。また、本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体は、非加熱の血中ＩｇＥ抗体との親和性が低い場合には、これによって、血中ＩｇＥ抗体でトラップされずに、ＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞にまで到達し、当該Ｂ細胞を抑制または死滅させることができる。
【００５０】
本発明によれば、アレルギーを伴う疾患または状態を処置することに用いるための医薬組成物の製造における、本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体の使用が提供される。
【００５１】
本発明の医薬組成物は、本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体に加えて、賦形剤をさらに含んでいてもよい。賦形剤としては、水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５２】
本発明の医薬組成物は、様々な形態、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤などとすることができる。好ましい態様は、注射剤であり、非経口（例えば、静脈内、経皮、腹腔内、筋肉内、経粘膜）で投与することが好ましい。
【００５３】
本発明の医薬組成物は、凍結乾燥製剤の形態で提供されてもよい。凍結乾燥製剤は、注射用水を伴っていてもよく、用事調製され得る。
【００５４】
本発明の医薬組成物は、他の抗アレルギー薬と併用されうる。本発明の医薬組成物は、他のアレルギー薬をさらに含んでいてもよい。本発明の医薬組成物は、他のアレルギー薬を含まず、他のアレルギー薬と併用されるものであってもよい。本発明では、本発明に医薬組成物と、他のアレルギー薬との組合せ医薬が提供され得る。本発明の組合せ医薬においては、本発明の医薬組成物と他のアレルギー薬とは同一の製剤に含まれていても、別々の製剤に含まれていてもよい。本発明の組合せ医薬において、本発明の医薬組成物と他のアレルギー薬とが別々の製剤に含まれている場合には、これらを同時に投与してもよく、連続的または逐次的に投与してもよい。他の抗アレルギー薬としては、例えば、ステロイド薬（ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、デキサメサゾンなど）、抗ヒスタミン薬（ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、オロパタジン、レボセチリジン、セチリジン、フマル酸クレマスチン、ヘキソフェナジン、ロタラジンなど）、免疫抑制薬（シクロスポリン、タクロリムスなど）、免疫療法薬（標準化スギ花粉エキス原液、ヤケヒョウヒダニエキス・コナヒョウヒダニエキス配合、組換え型Ｄｅｒ  ｆ  ２‐プルラン結合体など）、トロンボキサンＡ２合成阻害薬（オザグレル塩酸水和物など）、トロンボキサンＡ２受容体拮抗薬（セラトロダスト、ラマトロバンなど）、ロイコトリエン受容体拮抗薬（モンテルカストナトリウム、プランルカスト水和物など）、Ｔｈ２サイトカイン阻害薬（スプラタストトシル酸塩など）が挙げられる。
本発明のある態様では、本発明の医薬組成物は、オマリズマブと併用されうる。
【００５５】
本発明によれば、哺乳動物においてアレルギー症状またはその発症リスク（または病原性ＩｇＥ抗体の有無）を検査（または診断）する方法であって、
哺乳動物から得られた生体試料を加熱して、本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体と反応するＩｇＥ抗体を得ることと（または、本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体と反応する構造変化を生じる条件下で哺乳動物から得られた生体試料を加熱することと）、
加熱した生体試料と本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントとを接触させることと、
を含む、方法が提供される。本発明の方法では、本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体は、加熱したＩｇＥ抗体に結合するが、臨床上のアレルギー症状を呈する検体の非加熱ＩｇＥ抗体に対しての親和性が低く、これによって、血中に存在し得る非病原性ＩｇＥ抗体による診断のノイズを抑制することができる。
【００５６】
本発明によれば、哺乳動物が病原性ＩｇＥ抗体を有するか否かを検査することによって、アレルギー症状を発症している個体においてはアレルギー症状の重篤度を評価することができる。また、本発明によれば、哺乳動物が病原性ＩｇＥ抗体を有するか否かを検査することによって、アレルギー症状の発症リスクを評価することができる。従って、本発明の方法は、アレルギー症状を有する哺乳動物において、アレルギー症状の重篤度を検査する方法であり得る。また、本発明の方法は、哺乳動物において、アレルギー症状の発症リスクを検査する方法であり得る。
【００５７】
本発明の方法では、生体試料の加熱は、ＩｇＥ抗体を変性させる目的で実施される。従って、生体試料の加熱条件は、ＩｇＥ抗体が変性して本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体と反応するようになる条件であれば特に限定されないが、例えば、５６℃で、例えば、１時間〜数時間、例えば、１０分間〜２０分間、例えば、１５分間加熱することにより行われ得る。
【００５８】
本発明の方法で用いられ得る生体試料としては、ＩｇＥ抗体を含む生体試料であれば特に限定されないが、例えば、ＩｇＥ抗体を含む組織検体、またはＩｇＥ抗体を含む体液試料、例えば、血液、血漿または血清、あるいは涙であり得る。
【００５９】
本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体が、加熱した生体試料中のＩｇＥ抗体と反応した場合には（すなわち、生体試料中に本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体と反応する物質が存在した場合には）、その生体試料が由来する対象は、アレルギー症状を有すると決定（または診断）することができる。
【００６０】
本発明の方法は、加熱前の哺乳動物の生体試料と本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体を接触させる工程をさらに含んでいてもよい。これによって、本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体が、加熱前の生体試料中のＩｇＥ抗体と反応した場合には（すなわち、生体試料中に本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体と反応する物質が存在した場合には）、その生体試料が由来する対象は、肥満細胞に対してヒスタミン放出を促進させないＩｇＥ抗体を含むと決定することができる。これによって、生体試料中にＩｇＥ抗体が存在するにも関わらず、本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体が、加熱前の生体試料中のＩｇＥ抗体と反応が認められない場合には（すなわち、生体試料中に本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体と反応する物質が存在しない場合には）、その生体試料が由来する対象が、アレルギー症状を有すると決定（または診断）することができる。
【００６１】
本発明の方法は、哺乳動物から得られた生体試料に対する本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの反応性を加熱前後で比較することをさらに含んでいてもよい。加熱前後で、生体試料に含まれるＩｇＥ抗体に対する反応が変わらない場合には（例えば、加熱前後での反応性に統計的な有意差が認められない場合には）、生体試料中のＩｇＥ抗体は、肥満細胞に対して非反応性のＩｇＥ抗体であると決定することができ、または、生体試料の由来する対象が臨床上健康に影響するアレルギー症状を有しないと決定（または診断）することができる。また、加熱により、生体試料に含まれるＩｇＥ抗体に対する反応が高まった場合には、生体試料中のＩｇＥ抗体は、肥満細胞に対して反応性のＩｇＥ抗体であると決定することができ、または、生体試料の由来する対象が臨床上健康に影響するアレルギー症状を有すると決定（または診断）することができる。この態様において、加熱に代えて、ＰＮＧａｓｅＦまたはＥｎｄｏＨなどの糖鎖分解酵素を用いてもよい。用い得る糖鎖分解酵素は、当該酵素で処理した病原性ＩｇＥ抗体を非加熱の条件下で６Ｃ１２と接触させたときに、６Ｃ１２抗体との結合性を高める酵素が挙げられる。特に、Ｎ型糖鎖をＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびマンノースからなる群から選択される２つの糖単位の間で分解する酵素であり得る。
【００６２】
本発明の方法では、例えば、陰性対照として、臨床上のアレルギー症状を有しない健常者（動物を含む）を用いることができる。また、本発明の方法では、例えば、陽性対象として、臨床上のアレルギー症状を有する患者（動物を含む）を用いることができる。本発明の方法では、陽性対象及び／または陰性対照と比較して、検査される対象がアレルギー症状を有するのか否かを決定してもよい。
【００６３】
本発明によれば、本発明のＩｇＥ抗体に結合する抗体を含む、アレルギー症状を診断することに用いるための診断薬および診断キットが提供される。本発明の診断薬および診断キットには、抗体を標識するための蛍光、ＲＩ、または酵素が含まれていてもよい。本発明の診断薬および診断キットには、標識された二次抗体が含まれていてもよい。本発明の診断キットには、必要な緩衝液、ブロッキング液、酵素反応停止液、およびマイクロプレートリーダーからなる群から選択される１つまたは全てが含まれていてもよい。
【００６４】
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【実施例】
【００６５】
実施例１：抗ＩｇＥ抗体の作製
本実施例では、抗ＩｇＥ抗体の作製を試みた。以下、断りの無い限り、ヒトＩｇＥ抗体のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＨ００５２７８において登録されたアミノ酸配列であり；イヌＩｇＥ抗体のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｌ３６８７２において登録されたアミノ酸配列であり；ネコＩｇＥ抗体のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ１６２１３４において登録されたアミノ酸配列であり；ラットＩｇＥ抗体のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｋ０２９０１において登録されたアミノ酸配列であり；マウスＩｇＥ抗体のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＬＣ３８７２５３において登録されたアミノ酸配列である。【００６６】
ヒトと動物種のＩｇＥ抗体に広く交差反応する抗ＩｇＥ抗体を作製することを目的として、ヒト、イヌ、マウス、及びラットのＩｇＥ抗体重鎖ＣＨ３領域の中でアミノ酸配列が保存されている部位（１３個のアミノ酸からなるイヌＩｇＥ抗体重鎖定常領域アミノ酸配列情報ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＡ５６７９７．１のアミノ酸番号２８２〜２９４、２８２ＮＴＮＤＷＩＥＧＥＴＹＹＣ２９４；配列番号１に記載されるアミノ酸配列である）を選択し、免疫用の合成ペプチドを作製した（表１参照）。表１に示されるように免疫に使用したペプチド配列は、その周辺領域を含めて種間で相同性を有する。なお、表１に示されるペプチド配列の領域は、ＩｇＥ抗体のＣＨ３領域に位置し、特にＩｇＥ抗体受容体と相互作用する４つの離れた領域（ヒトのＩｇＥ定常領域アミノ酸情報、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  −  Ｐ０１８５４におけるアミノ酸番号２１３〜２１７、アミノ酸番号２４３〜２４６、アミノ酸番号２７４〜２７６、アミノ酸番号３０５〜３０８の領域）間に位置する領域である。ＩｇＥ抗体の重鎖の片方が定常領域が上記アミノ酸領域においてＩｇＥ抗体受容体と結合すると、他方の定常領域はその構造を変化させる。そして、当該他方の定常領域は、ＣＨ３領域の１番目と４番目のアミノ酸領域とで当該一方の定常領域が結合したＩｇＥ抗体受容体に結合し得る。このようにして、肥満細胞表面上のＩｇＥ抗体受容体に結合したＩｇＥ抗体は、重鎖定常領域の構造変化を生じる。そして、この構造変化は、ＩｇＥ抗体が加熱されて引き起こす構造変化と類似している。【００６７】
【表１】
2020059832.tif 000002
【００６８】
合成ペプチドはＫＬＨとコンジュゲートさせ、Ｃ５７Ｂｌ６マウスに免疫した後、腸骨リンパ節細胞を採取し、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２と融合してハイブリドーマを作製した。ラットＩｇＥ（インビトロジェン社））とイヌＩｇＥ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）に反応するものを二段階スクリーニングで選択した結果、ハイブリドーマクローン（６Ｃ１２、マウスＩｇＧ１κ）を得た。【００６９】
６Ｃ１２産生ハイブリドーマを定法どおりにプリスタン処理したＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に１×１０６個／マウスで摂取した後、２〜３週間後の腹水を採取し、モノクローナル抗体をＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにて精製した。本明細書では、当該クローンから得られた６Ｃ１２クローンから産生されるモノクローナル抗体を単に６Ｃ１２と呼ぶ。【００７０】
実施例２：得られた抗ＩｇＥモノクローナル抗体の特性解析
精製した６Ｃ１２をビオチン標識し、ＥＬＩＳＡシステムを確立して各動物種のＩｇＥ抗体に対する反応性を検討した。ＥＬＩＳＡ法は、９６穴ＥＬＩＳＡ用ブラックマイクロプレート（グライナー社）に任意の濃度でＩｇＥ抗体およびＩｇＧ抗体をリン酸緩衝液に希釈して固相化した。固相化に使用したＩｇＥ抗体およびＩｇＧ抗体は次のとおりである。イヌＩｇＥ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ヒトＩｇＥ（ミリポア社）、ラットＩｇＥ（インビトロジェン社）、マウスＩｇＥ（ＢＤ  Ｐｈａｍｉｎｇｅｎ社）、また別途作製された、カイコ体液より精製した組換型ネコＩｇＥタンパク（Ｇｒｉｏｔ−Ｗｅｎｋｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｖｅｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，  ７５：  ５９−６９参照）、イヌＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ社）、ヒトＩｇＧ（ミリポア社）、及びネコＩｇＧ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いた。固相化は４℃で一晩行った。【００７１】
固相化したプレートは、ブロッキングバッファー（魚ゼラチン１％含有リン酸緩衝液）で４℃、一晩ブロッキング後、同バッファーで０．５μｇ／ｍｌに希釈したビオチン標識精製６Ｃ１２を、室温で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．０５％含有リン酸緩衝液）で洗浄後にストレプトアビジン−βガラクトシダーゼを室温２時間反応させた。洗浄した後、βガラクトシダーゼの基質である４ＭＵ（４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）溶液を加えて１時間反応させた後、酵素反応停止液の０．２５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３を加えて反応を停止した後、酵素より分解、生成された蛍光物質の蛍光強度を蛍光プレートリーダーで測定した（励起波長  ３５５  ｎｍ、蛍光波長  ４６０ｎｍ、カットオフ波長４５５ｎｍ）。【００７２】
結果は、図１および図２に示される通りであった。図１に示されるように、精製した６Ｃ１２は、イヌＩｇＥ、ヒトＩｇＥ、ラットＩｇＥ、組換型ネコＩｇＥタンパクに反応した。一方で図２に示されるように、ヒトおよびイヌ、ネコＩｇＧには反応が認められなかった。このことから、６Ｃ１２は、ＩｇＥ抗体に特異的に結合する抗体であることが明らかとなった。但し、この実施例で用いられたＩｇＥ抗体は、培養細胞やがん細胞等により産生されたＩｇＥ抗体であり、臨床的アレルギー症状を有する生体から得られる非加熱のＩｇＥ抗体とは異なる立体構造を有すると考えられる抗体である。【００７３】
これらのことから、６Ｃ１２の認識部位は免疫に用いたペプチドの中でも、イヌ、ヒト、ラット、ネコに共通した部位であると推測された（表１参照）。【００７４】
実施例３：得られた抗ＩｇＥモノクローナル抗体とＩｇＥ抗体の構造変化との関係
本実施例では、得られた抗ＩｇＥモノクローナル抗体とＩｇＥ抗体の構造変化との関係を調べた。【００７５】
上記のＩｇＥ抗体測定ＥＬＩＳＡ法を応用した抗原特異的ＩｇＥ抗体定量測定ＥＬＩＳＡによってイヌの血清中のＤｅｒ  ｆ  ２−ＩｇＥ抗体（すなわち、Ｄｅｒ  ｆ  ２に結合するＩｇＥ抗体）について検討を行った。抗原にはコナヒョウヒダニの主要アレルゲンの一つのＤｅｒ  ｆ  ２（日本全薬工業株式会社提供、カイコを用いて作製した組換型タンパク）を用いた。血清は、臨床的にアレルギーを発症していると考えられるイヌの血清（臨床例血清）４１検体と実験用ビーグルにＤｅｒ  ｆ  ２とアラムアジュバントを２回以上皮下注射することで免疫して得られた血清（実験犬血清）９検体を用いた。【００７６】
血清中Ｄｅｒ  ｆ  ２−ＩｇＥ抗体測定は次のように行った。上記と同様のＥＬＩＳＡプレートにＤｅｒ  ｆ  ２を１  μｇ／ｍｌで固相化し、室温で２時間ブロッキングを行った。ブロッキングバッファーで２００倍希釈した血清を添加して４℃で一晩反応させた後、ビオチン化した６Ｃ１２を反応させ、上記と同様にストレプトアビジン−βガラクトシダーゼと４ＭＵの反応で生成された蛍光物質の蛍光強度を測定した。また、組換型ネコＩｇＥ抗体を２００倍に希釈した正常犬血清にて各種濃度に希釈したものを測定することで、上記ネコＩｇＥ組換タンパクを標準品とした標準曲線を作成し、臨床例血清および実験犬血清中のＤｅｒ  ｆ  ２−ＩｇＥ濃度を定量測定した。その結果、図３に示されるように、臨床例血清ではほとんどＩｇＥ抗体が検出されなかったが、実験犬血清では高いＩｇＥ値が検出された。従来の研究から、血清ＩｇＥは古くから５６℃で加熱するとその立体構造が変化しＩｇＥ抗体受容体に結合しなくなることがわかっていたため（図４参照）、立体構造を変化させることを目的として、測定前の血清を５６℃で１５分加熱し、再度６Ｃ１２によるＩｇＥ抗体の測定を行ったところ、図３に示されるように、臨床例血清においても高いレベルのＩｇＥ抗体が検出された。なお、加熱したＩｇＥ抗体は、肥満細胞表面のＦｃεＲＩには結合できず、肥満細胞による脱顆粒には寄与しないことが知られている。【００７７】
加熱前後におけるＩｇＥ抗体測定値を比較すると、図５に示されるように、臨床例血清すべての検体でＩｇＥ抗体値の大きな差異（４９−１２７１ｎｇ／ｍｌ、平均値４４７  ｎｇ／ｍｌ、中央値３９２ｎｇ／ｍｌ）が認められたが、実験犬血清では小さな差異（０−１０３ｎｇ／ｍｌ、平均値２６ｎｇ／ｍｌ、中央値１８ｎｇ／ｍｌ）しか認められなかった。このことから、６Ｃ１２は立体構造の変化依存的にＩｇＥ抗体を認識することが明らかとなった。また、アレルギー犬臨床例血清では加熱による構造変化前のＩｇＥ抗体が大量に存在し、実験犬血清にはあらかじめ構造変化したＩｇＥ抗体が大量に存在することが分かった。【００７８】
以上のことから次のことが考えられた。古くからアレルギー症状の発症や患者皮膚におけるアレルギー反応検査（プリックテスト、皮内反応）と血清中のＩｇＥ抗体測定値は相関が弱いことが問題となっていた（例えば、Ｂｒｙａｎｔ，  Ｄ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９７５，  Ｃｌｉｎ．  Ａｌｌｅｒｇｙ，  ５：  １４５−１５７参照）。また、発明者らの経験的にも、実験犬では血清中ＩｇＥ抗体が非常に高くても容易にアレルギー症状を発症しない、あるいは皮内反応（アレルゲンを皮内に注射して膨疹形成を見る）で陽性反応が出ないことがあるが、それは発症に関与するＩｇＥ抗体（以下、病原性ＩｇＥ抗体）が産生されないためではないかと考えられた。上記の血清加熱によっては以前から、ＩｇＥ抗体の立体構造が変化するためＩｇＥ抗体は肥満細胞表面のＩｇＥ抗体受容体（Ｆｃε  ＲＩ）に結合できなくなり、アレルギー反応を起さないことが実験的にマウスＩｇＥにおいても（Ｗｙｃｚｏｌｋｏｗｓｋａ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｐｒｏｕｖｏｓｔ−Ｄａｎｏｎ，  Ａ．，  １９７６，  Ｉｎｔ．  Ａｒｃｈ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ５０：  ４３−５４）、ヒトのアレルギー患者血清ＩｇＥ抗体においても（Ｓｏｌｌｅｙ，  Ｇ．Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９７６，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ５８：  ４０８−４２０）分かっていた。６Ｃ１２は熱変性したＩｇＥ抗体を検出できることから、６Ｃ１２が検出するＩｇＥ抗体は、変性したＩｇＥ抗体であると推測され、それは肥満細胞に結合できない、非病原性ＩｇＥ抗体であると考えられた。我々の実験結果から、アレルギーの犬の臨床例血清に多く含まれる病原性ＩｇＥ抗体は立体構造変化が可能な病原性ＩｇＥ抗体であり、実験的感作によって誘導されたＩｇＥ抗体は非病原性であると考えられ、６Ｃ１２によってＩｇＥ抗体とアレルギー発症の矛盾を解決できる現象を捉えることができた。【００７９】
また、このことはネコにおいても同様であった。上記のＩｇＥ抗体測定系をネコの血清に置き換え、固相化アレルゲンをＤｅｒ  ｆ  ２からコナヒョウヒダニに置き換えてネコＩｇＥ抗体を測定したところ、加熱後にＩｇＥ抗体が検出され、イヌと同様に病原性ＩｇＥ抗体を検出することができた（表２）。このことから、上記のとおりイヌでみられた現象はネコでも確認され、ヒトを含め動物種全体に通用する概念であると考えられた。【００８０】
【表２】
2020059832.tif 000003
【００８１】
実施例４：得られた抗ＩｇＥ抗体の細胞特異性
ＩｇＥは、血中の遊離形態に加えて、Ｂ細胞表面および肥満細胞表面に発現している。本実施例では、得られた抗ＩｇＥ抗体の細胞特異性を評価した。【００８２】
臨床的にアレルギーを疑う犬の末梢血単核球をコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）  １μｇ／ｍｌを添加した１０％ウシ胎児血清加ＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃で３日間培養した後、イヌＢ細胞マーカーの抗ＣＤ２１抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）と同時に、市販の抗イヌＩｇＥマウスモノクローナル抗体（クローンＥ６−７１Ａ１）あるいは６Ｃ１２で染色し、フローサイトメトリー法でＩｇＥ抗体を細胞表面に持つＢ細胞を解析した。結果は、図６に示される通りであった。【００８３】
図６に示されるように、６Ｃ１２はＥ６−７１Ａ１と同様にＩｇＥ抗体を発現するＢ細胞を検出することが明らかとなった。このことから、６Ｃ１２はＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞を検出することができることがわかった。よって、６Ｃ１２はＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞を排除できる抗体医薬へと応用できることがわかった。６Ｃ１２は血中の病原性ＩｇＥ抗体には結合しないことから、抗体医薬として投与した際に血中のＩｇＥ抗体に吸収されることがなく、投与した抗体医薬がそのままＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞に到達すると考えられる。これまでに開発されてきたＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞をターゲットとした抗体医薬（クイリズマブ；Ｑｕｉｌｉｚｕｍａｂ）は血中のＩｇＥ抗体にも反応すること（Ｈａｒｒｉｓ，  Ｊ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６，  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｒｅｓ．，  １７：  ２９）と比較すると、得られた抗体は既存抗体に対する大きな有用性を有することが示唆された。【００８４】
次に、肥満細胞表面のＩｇＥ抗体に対する抗体の反応性を評価した。肥満細胞の表面のＩｇＥ抗体に対する反応性については、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでまず検証した。ラット肥満細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３にラットＩｇＥ（インビトロジェン社）を添加し、ＲＢ−２Ｈ３表面のＦｃεＲＩに結合させた後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で蛍光標識した６Ｃ１２を添加してフローサイトメトリーで反応性を確かめた。その結果、図７に示されるように、ＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇＥ抗体によってＲＢＬ−２Ｈ３表面にラットＩｇＥ抗体が結合していることは確かめられたが、６Ｃ１２は添加濃度を増加させても蛍光強度が陰性コントロールと同じであり、ＲＢＬ−２Ｈ３表面のＩｇＥ抗体には結合しなかった。肥満細胞のＦｃεＲＩに結合するとＩｇＥ抗体は構造変化することが知られており、６Ｃ１２抗体は、この構造変化によりＩｇＥ抗体に結合できなくなったと考えられる。【００８５】
次に、正常肥満細胞を利用するｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の反応性を評価した。健常犬の皮膚肥満細胞にアレルギー犬の血清を皮内注射してＩｇＥ抗体を感作させるＰｒａｕｓｎｉｔｚ−Ｋｕｓｔｎｅｒテストを用いて、正常肥満細胞表面上のＩｇＥ抗体に対する６Ｃ１２の反応性を検証した。アレルギー犬血清をＩｇＥ抗体濃度３００ｎｇ／ｍｌに調整した後、健常ビーグル犬の胸部の皮内に０．０５  ｍｌ  注射し、２４時間後に同箇所に６Ｃ１２と抗イヌＩｇＥ抗体（クローンＥ６−７１Ａ１）をそれぞれ、１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌで０．０５ｍｌ皮内注射した。Ｅ６−７１Ａ１を注射した箇所はいずれもＥ６−７１Ａ１が肥満細胞上に結合した証拠となる膨疹形成がみられたが（肥満細胞上ＩｇＥ  ２分子がＥ６−７１Ａ１によって「架橋」されると肥満細胞が脱顆粒して炎症が起こる）、６Ｃ１２は膨疹を形成しなかった（図８）。以上のことから、６Ｃ１２は肥満細胞上のＩｇＥ抗体には結合しないことが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで証明された。このことから、得られた抗ＩｇＥ抗体は肥満細胞に対して脱顆粒を誘発させることがないことが明らかとなった。また、６Ｃ１２は抗体医薬としてアレルギー患者に投与しても、肥満細胞上のＩｇＥ抗体に結合せず、アナフィラキシーショックを起さないことがわかった。【００８６】
このように、６Ｃ１２はＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞を認識し、血中ＩｇＥ抗体（生、非加熱状態、病原性）と肥満細胞の表面のＩｇＥ抗体は認識しないことがわかった。すなわち、６Ｃ１２は以下の結合特異性を有する。【００８７】
【表３】
2020059832.tif 000004
【００８８】
上記実施例から、６Ｃ１２を加熱・非加熱血清中のＩｇＥ抗体検査に用いると、構造変化する病原性ＩｇＥ抗体を検出できることが示され、本発明の抗体がＩｇＥ抗体を指標とした炎症の検査に用い得ることが明らかとなった。また、本発明の抗体を抗体医薬へ展開すると、ＩｇＥ抗体産生Ｂ細胞を体内から排除できるアレルギーの根本的治療として活用できることも示唆された。既存の抗ヒトＩｇＥ抗体医薬には、オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）（Ｚｈｅｎｇ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ３７５：  ６１９−６２２）とクイリズマブ（Ｑｕｉｌｉｚｕｍａｂ）（Ｈａｒｒｉｓ，  Ｊ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６，  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３８：  １７３０−１７３２；及びＨａｒｒｉｓ，  Ｊ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６，  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｒｅｓ．，  １７：  ２９）が知られているが、前者は血中ＩｇＥ抗体を下げる効果はあるもののＩｇＥ抗体産生細胞を排除できず、後者はＩｇＥ抗体産生細胞を排除できるものの血中ＩｇＥ抗体にも反応するため、血中ＩｇＥ抗体が高い値を示すアレルギー患者ほど、すなわちアレルギー症状が強い患者ほどその効果が半減することが問題であった。しかし、６Ｃ１２を抗ＩｇＥ抗体医薬として用いると、血中ＩｇＥ抗体に邪魔されることなく、ＩｇＥ抗体産生細胞を消滅させることが可能である（表３参照）。ちなみに、オマリズマブの認識部位はＩｇＥ重鎖定常領域４２４ＨＬＰ４２６（非特許文献１におけるアミノ酸番号、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  −  Ｐ０１８５４におけるアミノ酸番号は３０５ＨＬＰ３０７）であり、６Ｃ１２とは重ならない。オマリズマブは、血中ＩｇＥ抗体を下げる効果はあるもののＩｇＥ抗体産生細胞を排除できず、本発明の抗体は、血中ＩｇＥ抗体を下げる効果は期待できないもののＩｇＥ抗体産生細胞を排除しうる。従って、本発明の抗体とオマリズマブとの併用により、血中ＩｇＥ抗体の低下作用と、ＩｇＥ抗体産生細胞の除去効果との相乗効果が期待される。【００８９】
実施例５：キメラ抗体の作製
本実施例では、組換えマウス抗体（マウスＩｇＧ１κ）および組換えイヌキメラ抗体を作製した。【００９０】
６Ｃ１２産生ハイブリドーマのＩｇＧ１抗体可変領域遺伝子を解析し、その重鎖（配列番号８参照）と軽鎖（κ鎖）（配列番号９参照）の遺伝子配列を得た。但し、配列番号８において、アミノ酸番号１〜２２はシグナル配列であり、アミノ酸番号２３〜１７９が重鎖可変領域であり、アミノ酸番号１８０〜２１２が重鎖定常領域である。また、配列番号９において、アミノ酸番号１〜２２はシグナル配列であり、アミノ酸番号２３〜１２８が軽鎖可変領域であり、アミノ酸番号１２９〜１７４が軽鎖定常領域である。【００９１】
この遺伝子配列を元に、マウスＩｇＧ１重鎖遺伝子およびκ鎖遺伝子を用いて６Ｃ１２の組換型マウス抗体（マウスＩｇＧ１κ）を２９３細胞で発現させ、作製した。培養細胞上清中の抗体濃度を測定して実験に供した。その結果、図９に示されるように、イヌおよびネコのＩｇＥ抗体あるいはＩｇＧ抗体に対する反応を検討したところ、イヌおよびネコのＩｇＧ抗体にはこの組換型マウス抗体は反応がなく、イヌおよびネコのＩｇＥ抗体には６Ｃ１２よりも高い反応を示した。【００９２】
また、イヌＩｇＧｂ遺伝子（Ｔａｎｇ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｖｅｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，  ８０：  ２５９−２７０）と組換型のイヌ化キメラ抗体をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させ、作製した。培養上清からプロテインＡカラムを用いたアフィニティー精製を行って組換型抗体を回収し、実験に供した。その結果、図１０に示されるように、この組換型イヌ化キメラ抗体はイヌおよびネコのＩｇＥ抗体に６Ｃ１２と同等の反応性を示し、イヌおよびネコのＩｇＧ抗体には反応しなかった。また、図１１に示されるように、イヌ化キメラ抗体はヒトＩｇＥ抗体とラットＩｇＥ抗体にも６Ｃ１２と同等の反応があることがわかった。よって、６Ｃ１２は組換型抗体にしてもその反応性は維持され、抗体医薬として用い得ることがわかった。【００９３】
本実施例によれば、６Ｃ１２抗体のエピトープは、加熱したＩｇＥ抗体、およびＢ細胞表面上の膜結合型ＩｇＥ抗体においては、６Ｃ１２に結合可能な状態であるが、肥満細胞表面上の膜結合型ＩｇＥにおいては、６Ｃ１２に結合不能な状態で存在すると考えられる。６Ｃ１２抗体は、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として得られたことから、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原とすることによって、加熱したＩｇＥ抗体、および／またはＢ細胞表面上の膜結合型ＩｇＥ抗体と結合し、かつ、肥満細胞表面上の膜結合型ＩｇＥ抗体には結合しない抗体を得ることができることが示される。【００９４】
実施例６：本発明の抗ＩｇＥ抗体による動物の検査
本発明の抗ＩｇＥ抗体６Ｃ１２は、臨床的なアレルギー症状を呈する検体のＩｇＥ抗体に対しては、非加熱では反応せず、加熱すると反応を示した。これに対して、実験的にアレルゲンを皮下注射して感作した検体のＩｇＥ抗体に対しては加熱前後で結合性を示した。これにより、上記実施例では、６Ｃ１２は、肥満細胞に結合可能なＩｇＥ抗体（病原性ＩｇＥ抗体）には加熱前には結合できず、肥満細胞に結合不能なＩｇＥ抗体（加熱したＩｇＥ抗体および実験的に感作した検体のＩｇＥ抗体）には結合できると考えられた。【００９５】
まず、６Ｃ１２を用いてイヌ血清サンプルを２検体選択した。具体的には、病原性ＩｇＥ抗体を含む検体として、加熱前の血清に対して６Ｃ１２が反応せず（Ｄｅｒ  ｆ  ２−ＩｇＥ濃度が０ｎｇ／ｍｌ）、加熱後の血清に対して６Ｃ１２が反応した（Ｄｅｒ  ｆ  ２−ＩｇＥ濃度が  ８４８ｎｇ／ｍｌ）検体を選んだ。また、非病原性ＩｇＥ抗体を含む検体として、加熱前後の血清それぞれに対して６Ｃ１２の反応性が同等（Ｄｅｒ  ｆ  ２−ＩｇＥ濃度が加熱前１０５４ｎｇ／ｍｌ、加熱後１０５２ｎｇ／ｍｌ）であった検体を選んだ。【００９６】
ビーグル犬の皮内に、
Ｎｏ．１：病原性ＩｇＥ抗体を含む検体から得られたＩｇＥ抗体  ５０  ｎｇ／ｍＬ
Ｎｏ．２：病原性ＩｇＥ抗体を含む検体から得られたＩｇＥ抗体  １００  ｎｇ／ｍＬ
Ｎｏ．３：病原性ＩｇＥ抗体を含む検体から得られたＩｇＥ抗体  ３００  ｎｇ／ｍＬ
Ｎｏ．４：非病原性ＩｇＥ抗体を含む検体から得られたＩｇＥ抗体  ５０  ｎｇ／ｍＬ
Ｎｏ．５：非病原性ＩｇＥ抗体を含む検体から得られたＩｇＥ抗体  １００  ｎｇ／ｍＬ
Ｎｏ．６：非病原性ＩｇＥ抗体を含む検体から得られたＩｇＥ抗体  ３００  ｎｇ／ｍＬ
をそれぞれ図１２の上段に示される箇所にそれぞれ投与した（１日目）。【００９７】
２４時間後にＩｇＥ抗体が反応するアレルゲンを皮内投与した（２日目）。具体的には、Ｄｅｒ  ｆ  ２（１０  μｇ／ｍＬに用事希釈したサンプル）を皮内投与した。１５分後、膨疹の直径（ｍｍ）、硬さ（１：膨疹なし、２：柔らかい、３：固い）、および赤み（１：赤みなし、２：マイルド、３：強い）でアレルギー症状を評価した。【００９８】
結果は、図１２に示される通りであった。図１２に示されるように、膨疹および赤みは、上記１〜３の検体から得られたＩｇＥ抗体を投与した場合にのみ認められた。また、アレルギー症状の評価結果は表４に示される通りであった。【００９９】
【表４】
2020059832.tif 000005
【０１００】
以上から、６Ｃ１２は、病原性ＩｇＥ抗体の存在を決定することに有用であると考えられた。【０１０１】
実施例７Ａ：ＩｇＥ産生Ｂ細胞腫瘍細胞株に対する細胞傷害性
リンパ腫を疑うイヌ（１３歳、ヨークシャテリア種、去勢オス）の血液から末梢血単核球をフィコール比重遠心法で定法にしたがって分離した後、ウシ胎児血清を１０％含有するＲＰＭＩ−１６４０を用いて６か月間以上継代培養を行ったところ、継続的に増殖する腫瘍細胞を得た。この腫瘍細胞の細胞表面抗体の種類についてイヌ用の各種抗体を用いてフローサイトメトリー法で検討した。検討に使用した抗体は、抗イヌＩｇＭヤギポリクローナル抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）、抗イヌＩｇＧヒツジポリクローナル抗体（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ社）、抗イヌＩｇＡヤギポリクローナル抗体（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ社）、抗イヌＩｇＥヤギポリクローナル抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）および６Ｃ１２で、それらいずれもビオチン標識されたものを用いた。これら抗体を１×１０６個／ｍｌの細胞濃度に調整した腫瘍細胞浮遊液５０μｌに５００μｇ／ｍｌの濃度で添加して４℃で３０分間反応させた後、洗浄して次にＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン（ＢｉｏＬｅｎｄ社）を５００μｇ／ｍｌの濃度で添加し、さらに４℃で３０分間反応させた。染色した細胞の検出はＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社）を用いて行い、解析直前に各細胞浮遊液に０．２μＬで加えたＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ（Ｐｒｏｐｉｄｉｍｕ  Ｉｏｄｉｄｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社）に染色された細胞を死細胞として除去した後、使用した抗体に染色された細胞集団を検出した。細胞集団の解析はＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社）を用いた。その結果、この腫瘍細胞はその細胞表面にＩｇＥのみを発現し、その他の抗体であるＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡは発現していない細胞であることがわかった。よって、本腫瘍細胞をイヌＩｇＥ産生Ｂ細胞腫瘍細胞株とした。図１３に示されるように、ＩｇＥ抗体は、ＩｇＥ産生Ｂ細胞の細胞表面に有効に結合した。【０１０２】
次に、ＩｇＥ抗体による細胞傷害性を検討した。イヌの末梢血単核球を取得し、フィコール比重遠心法を用いた常法に従ってイヌ末梢血からエフェクター細胞を分離した。イヌＩｇＥ産生Ｂ細胞腫瘍細胞株（２．５×１０４細胞／ウェル）を標的細胞として用い、上記実施例で作製したキメラ抗体またはコントロールイヌ抗体を１０ｎｇ／ｍＬの濃度で３０分反応させた。その後、イヌの末梢血単核球（１．２５×１０５細胞／ウェル）を各ウェルに加えて、さらに５時間培養した。培地を回収して培地中のラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の濃度を測定した。ＬＤＨは細胞内の酵素であり、細胞が傷害された場合には細胞外に漏出し、培地中で検出されることとなる。ＬＤＨの測定は、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ＬＤＨ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ−ＷＳＴ  （ＤＯＪＩＮＤＯ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）を用いて製造者マニュアルに従って行った。【０１０３】
本実施例では、全細胞が有するＬＤＨ量に対して、細胞が傷害されることによって培地中に放出されるＬＤＨ量を検討し、その割合を細胞毒性として算出する。【０１０４】
【数１】
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【０１０５】
上記式において、
実験的放出（ＥＲ）は、各濃度の抗体溶液、エフェクター細胞、および標的細胞を混合した後に放出されるＬＤＨの量を表し、
エフェクターによる自発的放出（ＥＳＲ）は、エフェクター細胞が自発的に放出するＬＤＨ量を表し、
標的自発的放出（ＴＳＲ）は、標的細胞が自発的に放出するＬＤＨ量を表し、
標的最大放出（ＴＭＲ）は、溶解緩衝液で細胞を完全に破壊して得られる、標的細胞に含まれる全ＬＤＨ量を表し、
培地バックグラウンド（ＣＭＢ）は、培地中にバックグラウンドとして含まれるＬＤＨ量を表し、
体積補正用コントロール（ＶＣＣ）は、培地中に溶解緩衝液を添加したときのＬＤＨ量を表す。【０１０６】
結果は、図１４に示される通りであった。図１４に示されるように、６Ｃ１２抗体は、イヌのＩｇＥ産生Ｂ細胞を効果的に死滅させることができた。【０１０７】
さらに、６Ｃ１２抗体によるＩｇＥ産生Ｂ細胞の細胞傷害性をインビトロで検証した。ヒトの末梢血単核球を抗ＣＤ４０抗体とリコンビナントＩＬ−４で刺激してＩｇＥ産生Ｂ細胞を誘導した。その際に６Ｃ１２あるいはマウスＩｇＧ含有マウス血清（陰性対照）を加え、３７℃５％ＣＯ２下で５日間、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６２０で培養した。ＩｇＥ産生Ｂ細胞の出現数をＥＬＩＳＰＯＴ法で数えた。
抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体を固相化したＰＶＤＦメンブランプレートのウェルに培養後の細胞を８．４×１０４細胞／ｗｅｌｌで添加し、２４時間反応させた後、洗浄し、その後ビオチン標識した抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体、ストレプトアビジン結合アルカリフォスファターゼを加えた後、基質を反応させてＩｇＥ産生Ｂ細胞のスポットを発色させた。肉眼的に認識可能な大きさの発色スポットを数えた。
１条件３ウェルアッセイとして平均値を出して評価した。結果は表５に示される通りであった。【０１０８】
【表５】
2020059832.tif 000007
【０１０９】
ウエル間では６Ｃ１２添加において５〜７個／ウエルのスポットを数えることができたが（平均６個／ウエル）、陰性対照のマウス血清添加ウエルでは、２６〜３８個／ウエルのスポットを数えることができた（平均３３個／ウエル）。よって、６Ｃ１２は、ヒトの末梢血単核球からＩｇＥ産生細胞が出現するのを抑える作用があることがわかった。このことは、ＩｇＥ産生細胞に直接的に６Ｃ１２が作用し、細胞傷害活性を起すと考えられた。【０１１０】
実施例８Ａ：糖鎖分解酵素によるＩｇＥ上の糖鎖の分解と６Ｃ１２抗体による当該ＩｇＥの親和性
本実施例では、ダニアレルゲンであるＤｅｒ  ｆ  ２に対するＩｇＥ抗体（Ｄｅｒ  ｆ  ２−ＩｇＥ）をＰＮＧａｓｅＦ、ＥｎｄｏＨ、またはノイラミニダーゼで処理して、その糖鎖を分解し、分解された糖鎖を有するＤｅｒ  ｆ  ２−ＩｇＥに対する６Ｃ１２抗体の親和性を確認した。【０１１１】
酵素処理工程以外は実施例３と同様に試験を行った。具体的には、９６穴ＥＬＩＳＡプレートに組換型Ｄｅｒ  ｆ  ２を  １μｇ／ｍＬの濃度で１００μＬ／ｗｅｌｌ加えた後、４℃で一晩固相化した。洗浄後、２％  Ｇｅｌａｔｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  （０．１μｇ／ｍＬ）含有ＰＢＳを２００μＬ／ｗｅｌｌで加えて室温で２時間ブロッキングし、洗浄した。イヌ血清としては、Ｄｅｒ  ｆ  ２−ＩｇＥ陽性アトピー症例犬とＤｅｒ  ｆ  ２実験感作犬から得たものをそれぞれ使用し、予めこれまでの加熱・非加熱血清を用いたＤｅｒ  ｆ  ２−ＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ法によってそれぞれ病原性ＩｇＥと非病原性ＩｇＥのみが検出されたものを選択して使用した。これら血清を２００倍希釈したものを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温で６時間放置した。洗浄後、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ  ＰＲＩＭＥＴＭ、Ｎ−Ｚｙｍｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ）を濃度は２５０  ｕｎｉｔｓ／ｍＬで、ノイラミニダーゼ（α２−３，６，８  Ｎｅｕｒａｍｉｄａｓｅ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｊａｐａｎ）  を濃度１００  ｕｎｉｔｓ／ｍＬで１００μＬ／ｗｅｌｌを添加した。添加後、３７℃で一晩インキュベートした。洗浄後、ビオチン標識した０．７５μｇ／ｍＬの６Ｃ１２抗体を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温で２時間インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジン標識β−ガラクトシダーゼ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−β−Ｇａｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．０５  Ｕ／ｍＬで１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、室温で２時間反応させた。洗浄後、０．１  ｍＭ  ４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ  β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを１００μＬ／ｗｅｌｌで加えて室温で１時間、反応させた。β−ガラクトシダーゼ反応を、０．２５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して停止させた。上記基質の分解産物の蛍光強度を、励起波長３５５ｍｎ、蛍光波長４６０  ｎｍ、カットオフ４５５ｎｍの条件で蛍光プレートリーダーで測定した。さらに、Ｄｅｒ  ｆ  ２−ＩｇＥ濃度が既知である標準イヌ血清と比較した。【０１１２】
結果は、図１５〜１６（ＰＮＧａｓｅＦ処理）、図１７〜１８（ＥｎｄｏＨ処理）、および図１９〜２０（ノイラミニダーゼ処理）に示される通りであった。
図１５、１７、および１９に示されるように、６Ｃ１２抗体は、病原性Ｄｅｒ  ｆ  ２−ＩｇＥに対して加熱処理依存的に結合した。病原性Ｄｅｒ  ｆ  ２−ＩｇＥを酵素処理すると、図１５、１７、および１９に示されるように、レクチン（糖鎖結合タンパク質）との結合性が喪失したことから、糖鎖が分解された。
ここで、６Ｃ１２抗体が、酵素処理した非病原性Ｄｅｒ  ｆ  ２−ＩｇＥおよび病原性Ｄｅｒ  ｆ  ２−ＩｇＥに結合するかを確認したところ、図１６および１８に示されるように、ＰＮＧａｓｅＦまたはＥｎｄｏＨで処理した病原性Ｄｅｒ  ｆ  ２−ＩｇＥに対しては、６Ｃ１２抗体が親和性を示した。これに対して、図２０に示されるように、ノイラミニダーゼで処理した病原性Ｄｅｒ  ｆ  ２−ＩｇＥに対しては、６Ｃ１２は親和性を示さなかった。【０１１３】
これらの結果から、６Ｃ１２抗体は、加熱された病原性Ｄｅｒ  ｆ  ２−ＩｇＥに対して、Ｎ型糖鎖依存的にＩｇＥ抗体に結合することが示された。【０１１４】
実施例９Ａ：６Ｃ１２抗体のエピトープの同定
６Ｃ１２抗体は、表１に示されるように、免疫原として用いたペプチド配列のうちヒトと他の動物とで保存された領域に結合することが考えられる。【０１１５】
図２１に示されるように、免疫原として用いたペプチド配列（Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｆｕｌｌ）から、Ｎ末端をそれぞれ３アミノ酸および４アミノ酸欠失させたＰｅｐｔｉｄｅ（−３）およびＰｅｐｔｉｄｅ（−４）、並びに、Ｃ末端をそれぞれ１アミノ酸〜５アミノ酸欠失させたＰｅｐｔｉｄｅ（−１Ｃ）〜Ｐｅｐｔｉｄｅ（−５Ｃ）を作製した。これらのペプチドはＮ末端に６×Ｈｉｓタグおよびそれに続くグリシン−セリンリンカー（ＧＳリンカー）を有し、抗Ｈｉｓタグ抗体で捕捉し、ビオチン化した６Ｃ１２抗体との結合をストレプトアビジン標識β−ガラクトシダーゼで常法により検出した。結果は、図２１に示される通りであった。図２１に示されるように、Ｐｅｐｔｉｄｅ（−３）のみが６Ｃ１２抗体との結合性を保持していた。従って、６Ｃ１２抗体は、Ｐｅｐｔｉｄｅ（−３）をエピトープとする抗体であると考えられる。【０１１６】
図２２に示されるように、６Ｃ１２抗体が結合するＩｇＥ抗体の部位をインシリコシミュレーションにより表示させた。Ｐｅｐｔｉｄｅ（−３）の領域は、αヘリックスとβシートから構成される部位であり、タンパク質表面に存在するが線型的なペプチドとしては、存在していない。病原性ＩｇＥを加熱することや糖鎖を分解することによって、抗体の構造が変化し、または当該エピトープ部分の構造が変化することによって６Ｃ１２抗体が当該ペプチド部分に結合できるようになると考えられる。従って、Ｐｅｐｔｉｄｅ（−３）ペプチドに結合する抗体は、６Ｃ１２抗体と同様に加熱した病原性ＩｇＥや活性化したＢ細胞表面上のＩｇＥに選択的に結合し、病原性ＩｇＥの検出や、活性化したＢ細胞を標的化することに用い得ると考えられる。【０１１７】
配列表
配列番号１：免疫原となるイヌのペプチドのアミノ酸配列
配列番号２：６Ｃ１２抗体の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号３：６Ｃ１２抗体の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号４：６Ｃ１２抗体の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号５：６Ｃ１２抗体の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号６：６Ｃ１２抗体の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号７：６Ｃ１２抗体の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号８：６Ｃ１２抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号９：６Ｃ１２抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１０：６×ＨｉｓタグとＧＳリンカー配列とが結合したＰｅｐｔｉｄｅ−ｆｕｌｌのアミノ酸配列
配列番号１１：６×ＨｉｓタグとＧＳリンカー配列とが結合したＰｅｐｔｉｄｅ（−３）のアミノ酸配列
配列番号１２：６×ＨｉｓタグとＧＳリンカー配列とが結合したＰｅｐｔｉｄｅ（−４）のアミノ酸配列
配列番号１３：６×ＨｉｓタグとＧＳリンカー配列とが結合したＰｅｐｔｉｄｅ（−３Ｃ）のアミノ酸配列
配列番号１４：６×ＨｉｓタグとＧＳリンカー配列とが結合したＰｅｐｔｉｄｅ（−４Ｃ）のアミノ酸配列
配列番号１５：６×ＨｉｓタグとＧＳリンカー配列とが結合したＰｅｐｔｉｄｅ（−５Ｃ）のアミノ酸配列
配列番号１６：６×ＨｉｓタグとＧＳリンカー配列とが結合したＰｅｐｔｉｄｅ（−２Ｃ）のアミノ酸配列
配列番号１７：６×ＨｉｓタグとＧＳリンカー配列とが結合したＰｅｐｔｉｄｅ（−１Ｃ）のアミノ酸配列
配列番号１８：Ｐｅｐｔｉｄｅ（−３）のアミノ酸配列
【図１】
2020059832.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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