(57)【要約】所望のタンパク質又はペプチドを、ウイルス粒子エンベロープ上に提示し得るウイルスを有効成分として含有する、抗がん剤。
2020075672.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望のタンパク質又はペプチドを、ウイルス粒子エンベロープ上に提示し得るウイルスを有効成分として含有する、抗がん剤。
【請求項２】
前記ウイルスは、少なくとも１種類のＴＮＦレセプタースーパーファミリーのリガンドを、ウイルス粒子エンベロープ上に提示する、請求項１に記載の抗がん剤。
【請求項３】
前記少なくとも１種類のＴＮＦレセプタースーパーファミリーのリガンドはＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ、又はＣＤ３０Ｌ、或いは、同一機能を有するこれらの変異体である、請求項２に記載の抗がん剤。
【請求項４】
前記ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ、又はＣＤ３０Ｌ、或いは同一機能を有するこれらの変異体は、そのｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ（ＣＴ）配列が、前記ウイルスのＨＮ由来のＣＴ配列に置換されている、請求項３に記載の抗がん剤。
【請求項５】
前記ウイルスは、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗がん剤。
【請求項６】
前記ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、ゲノムよりＦ遺伝子を欠失した非増殖型である、請求項５に記載の抗がん剤。
【請求項７】
前記ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、ゲノムが不活化している、請求項５又は６に記載の抗がん剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗がん剤を含有する、がん治療用医薬組成物。
【請求項９】
更に、第二の抗がん剤を含有する、請求項８に記載のがん治療用医薬組成物。
【請求項１０】
前記第二の抗がん剤は、免疫活性化剤及び／又は免疫チェックポイント阻害剤を含む、請求項９に記載のがん治療用医薬組成物。
【請求項１１】
前記第二の抗がん剤は、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体、抗４−１ＢＢアゴニスト抗体、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、抗ＣＤ２７アゴニスト抗体、又は抗ＣＤ３０アゴニスト抗体を含む、請求項９又は１０に記載のがん治療用医薬組成物。
【請求項１２】
更に、パントエア菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）を含有する、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のがん治療用医薬組成物。
【請求項１３】
腫瘍内投与に用いられる、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のがん治療用医薬組成物。
【請求項１４】
がんの治療に用いるためのキットであって、前記治療において、同時使用又は逐次使用するための、
所望のタンパク質又はペプチドを、ウイルス粒子エンベロープ上に提示し得るウイルスと、第二の抗がん剤と、を含むキット。
【請求項１５】
前記ウイルスは、少なくとも１種類のＴＮＦレセプタースーパーファミリーのリガンドを、ウイルス粒子エンベロープ上に提示する、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記少なくとも１種類のＴＮＦレセプタースーパーファミリーのリガンドはＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ、又はＣＤ３０Ｌ、或いは、同一機能を有するこれらの変異体である、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ、又はＣＤ３０Ｌ、或いは同一機能を有するこれらの変異体は、そのｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ（ＣＴ）配列が、前記ウイルスのＨＮ由来のＣＴ配列に置換されている、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記ウイルスは、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスである、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１９】
前記ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、ゲノムよりＦ遺伝子を欠失した非増殖型である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、ゲノムが不活化している、請求項１８又は１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記第二の抗がん剤は、免疫活性化剤及び／又は免疫チェックポイント阻害剤を含む、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２２】
前記第二の抗がん剤は、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体、抗４−１ＢＢアゴニスト抗体、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、抗ＣＤ２７アゴニスト抗体、又は抗ＣＤ３０アゴニスト抗体を含む、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２３】
更に、パントエア菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）を含有する、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２４】
腫瘍内投与に用いられる、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗がん剤、がん治療用医薬組成物、及びキットに関する。
本願は、２０１８年１０月９日に、日本に出願された特願２０１８−１９１２６２号、及び、２０１９年２月２２日に、日本に出願された特願２０１９−０３０８９７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
がん細胞は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のような免疫抑制機構の亢進が一因となって増殖することがある。抗ＰＤ−１抗体のような免疫チェックポイント阻害剤は亢進した負の免疫逃避機構を阻害し、がん細胞の増殖を抑制する（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許５１５９７３０号公報
【特許文献２】国際公開第２０１６／１９９９３６号
【特許文献３】特開２０１６−１０２１１３号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ,（２０１８）１８：４２５
【非特許文献２】Ｃｌｉｎ.Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．,（２０１７）:２３（３）、７０７
【非特許文献３】Ｅｕｒ.Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ．,（２００２）３２：３６１７
【非特許文献４】Ｓｃi. Ｒｅｐ．,（２０１８）８：２２７８
【非特許文献５】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ,      （２０１６）４８：１２７０
【非特許文献６】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．,（２０１８）２４(８)：１８１６
【非特許文献７】ＪＥＡＤＶ,（２０１７）３１：１３２４
【非特許文献８】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ.,（２０１３）７３：７１８９
【非特許文献９】Ｓｃｉ.Ｔｒａｎｓｌ.Ｍｅｄ.,（２０１８）１０(４２６), ｅａａｎ４４８８.
【非特許文献１０】Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．,（２０１４）２１（８）：７７５
【非特許文献１１】Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．,（２０１３）２４（７）：６８３
【非特許文献１２】Ｆｒｏｎｔ. Ｉｍｍｕｎｏｌ．,（２０１３）４：１１
【非特許文献１３】Ｂｌｏｏｄ.（２０１４）１２３（１４）：２１７２
【非特許文献１４】Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．,（２０１８）９：４６７９
【非特許文献１５】Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．,（２０１７）２３：１９２９
【非特許文献１６】Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．,（２０１９）１０：２１４１
【非特許文献１７】ＦＥＢＳ  Ｊ．,（２００８）２７５：２２９６
【非特許文献１８】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．, （２００９）１８３（３）：１８５１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、負の免疫を阻害する免疫チェックポイント阻害剤だけでは抑制することが難しいがん種も多い。そこで、樹状細胞の活性化、および積極的にがん細胞を攻撃する正の免疫機構を賦活化、すなわちナチュルラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞、及び細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化し、がん細胞の増殖を抑制する抗腫瘍免疫活性化剤の開発が進められている。【０００６】
Ｔ細胞、ＮＫ細胞等に発現するＴＮＦレセプタースーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ、以降、特に受容体を示す場合にはＴＮＦＳＦ受容体と、リガンドを示す場合にはＴＮＦＳＦリガンドと表記）のＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＣＤ３０等の分子は正の免疫を活性化することにより、ＣＴＬ等の抗腫瘍免疫効果を示す。進行性固形がんは遠隔転移も多く、従来法での対応困難な患者に対して腫瘍溶解性ウイルス等の腫瘍内投与による処置が試みられており、全身性に誘導された抗腫瘍免疫作用が遠隔がんにも作用している可能性が報告されている。
すなわち、固形がんへの薬剤投与により、ＣＴＬ等の全身性の抗腫瘍免疫作用を亢進させることにより、投与部位から離れた遠隔がんの抑制が可能となると考えられる。そのためには樹状細胞の活性化及びＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＣＤ３０等、ＴＮＦＲＳＦのシグナル活性化を通して、ＮＫ細胞、Ｔ細胞機能を強化することにより、遠隔がんへの抗腫瘍効果が可能となる。【０００７】
Ｔ細胞等に発現したこれら受容体を刺激するのは、生体内では免疫細胞に発現したＴＮＦＳＦリガンドタンパク質である。当該リガンドタンパク質は３量体を形成し、受容体（レセプター又はＲとも表記）タンパク質と結合することによりシグナルを効率よく伝達する。しかし、リガンドタンパク質単独では効率よくシグナルを伝達することができないため、タンパク質製剤として利用することは容易ではない。そのために、受容体と結合しシグナルを効率よく伝達するアゴニスト抗体がもっぱら作出・利用されてきた。【０００８】
抗体医薬品として、例えばＣＤ２０を高発現する悪性リンパ腫において抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブは）は、ＣＤ２０陽性がん細胞に直接結合し、抗体のＦｃ部位が、ＦｃＲを発現するマクロファージ・ＮＫ細胞等と結合し、その結果、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）・補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）等によりがん細胞を障害する抗体医薬品である。直接がん細胞に結合し腫瘍を抑制するタイプの抗体は、多数市販され、大きな収益を上げている。
また、免疫チェックポイント阻害抗体(ニボルマブ等)は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１/Ｌ２の結合を阻害することにより負の免疫シグナルを遮断し、ＣＴＬ等の抗腫瘍免疫を賦活化させる。免疫チェックポイント阻害抗体も既に市販され大きな収益を上げている。【０００９】
一方、ＴＮＦＲＳＦシグナルを活性化するアゴニスト抗体は、全身投与による非臨床試験で高い抗腫瘍効果が示されたが、抗４−１ＢＢアゴニスト抗体の臨床試験において有効性が示される一方で高い肝毒性が報告され（非特許文献１５参照）、一旦試験が中断される等の問題が生じた。そのために、抗体医薬品として市販化に至っていない。
また、ＧＩＴＲアゴニスト抗体（ＤＴＡ−１）を用いた動物試験においても過剰投与によりアナフィラキシーショックが報告されている（非特許文献１３参照）。【００１０】
アゴニスト抗体は、単独でＴＮＦＳＦ受容体に結合し、シグナルを伝えることが可能である。受容体にはシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）が４ヶ所ある。アゴニスト抗体により結合するＣＲＤドメインが異なり、シグナル伝達強度に差異が生じる。その強度により毒性も異なるとされる（非特許文献１４参照）。【００１１】
また、ヒト抗体は６種類のＩｇＧサブクラスがある。それらのＦｃ領域は、免疫細胞等表面に存在する活性化ＦｃγＲに結合しＩＴＡＭモチーフを通してシグナルを活性化する特性、反対に細胞表面の抑制性ＦｃγＲＩＩＢに結合しＩＴＩＭモチーフを通してシグナルを抑制する特性、又はＦｃＲに結合しない特性を有する。ヒトＩｇＧ１抗体は活性化ＦｃγＲに結合し、ＡＤＣＣ/ＣＤＣ活性を増強し、ヒトＩｇＧ４はＦｃＲには結合しないとされる。
一方、抑制性ＦｃγＲＩＩＢのＫＯマウスでは、ＴＮＦＲＳＦシグナルを利用した抗腫瘍免疫が全く機能しないことも報告されている。ヒトでの肝毒性が報告された抗４−１ＢＢアゴニスト抗体のＵｒｅｌｕｍａｂは、ＣＲＤ１に結合するＩｇＧ４抗体である。肝毒性は肝臓に浸潤したＣＤ８陽性Ｔ細胞によって引き起こされる。
現在アゴニスト抗体のこれらの問題を克服するための研究が精力的に続けられている一方で、アゴニスト抗体に代わるＴＮＦＲＳＦシグナルを活性化する手段が必要とされている。【００１２】
ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ及びＣＤ３０は、通常状態の細胞では発現しておらず、刺激を受けて数時間から数日に渡って発現が維持され、その後減衰する。
従って、抗体に代えてウイルスベクター等に自然界に存在するＴＮＦＳＦリガンドの遺伝子を発現させＴＮＦＲＳＦシグナルを活性化する場合、リガンドは受容体の発現に合わせて供給される必要がある。通常の遺伝子供給用のベクターは、目的細胞に感染し、遺伝子が転写・翻訳後に目的のタンパク質が供給されるため、リガンドの発現にタイムラグが生じ、受容体の発現のタイミングとリガンドの供給のタイミングと量の調整が容易ではない。【００１３】
本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、抗腫瘍効果に優れた抗がん剤、がん治療用医薬組成物、及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は以下の態様を含む。
［１］所望のタンパク質又はペプチドを、ウイルス粒子エンベロープ上に提示し得るウイルスを有効成分として含有する、抗がん剤。
［２］前記ウイルスは、少なくとも１種類のＴＮＦＳＦのリガンドを、ウイルス粒子エンベロープ上に提示する、［１］に記載の抗がん剤。
［３］前記少なくとも１種類のＴＮＦＳＦのリガンドは、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ、又はＣＤ３０Ｌ、或いは、同一機能を有するこれらの変異体である、［２］に記載の抗がん剤。
［４］前記ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ、又はＣＤ３０Ｌ、或いは同一機能を有するこれらの変異体は、そのｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ（ＣＴ）配列が、前記ウイルスのＨＮ由来のＣＴ配列に置換されている、［３］に記載の抗がん剤。
［５］前記ウイルスは、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルス（ｈＰＩＶ２）である、［１］〜［４］のいずれかに記載の抗がん剤。【００１５】
［６］前記ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、ゲノムよりＦ遺伝子を欠失した非増殖型である、［５］に記載の抗がん剤。
［７］前記ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、ゲノムが不活化している、［５］又は［６］に記載の抗がん剤。
［８］［１］〜［７］のいずれかに記載の抗がん剤を含有する、がん治療用医薬組成物。
［９］更に、第二の抗がん剤を含有する、［８］に記載のがん治療用医薬組成物。
［１０］前記第二の抗がん剤は、免疫活性化剤及び／又は免疫チェックポイント阻害剤を含む、［９］に記載のがん治療用医薬組成物。【００１６】
［１１］前記第二の抗がん剤は、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体、抗４−１ＢＢアゴニスト抗体、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、抗ＣＤ２７アゴニスト抗体、又は抗ＣＤ３０アゴニスト抗体を含む、［９］又は［１０］に記載のがん治療用医薬組成物。
［１２］更に、パントエア菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）を含有する、［８］〜［１１］のいずれかに記載のがん治療用医薬組成物。
［１３］腫瘍内投与に用いられる、［８］〜［１２］のいずれかに記載のがん治療用医薬組成物。
［１４］がんの治療に用いるためのキットであって、前記治療において、同時使用又は逐次使用するための、
所望のタンパク質又はペプチドを、ウイルス粒子エンベロープ上に提示し得るウイルスと、第二の抗がん剤と、を含むキット。
［１５］前記ウイルスは、少なくとも１種類のＴＮＦＳＦリガンドを、ウイルス粒子エンベロープ上に提示する、［１４］に記載のキット。【００１７】
［１６］前記少なくとも１種類のＴＮＦＳＦリガンドはＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ、又はＣＤ３０Ｌ、或いは、同一機能を有するこれらの変異体である、［１５］に記載のキット。
［１７］前記ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ、又はＣＤ３０Ｌ、或いは同一機能を有するこれらの変異体は、そのｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ（ＣＴ）配列が、前記ウイルスのＨＮ由来のＣＴ配列に置換されている、［１６］に記載のキット。
［１８］前記ウイルスは、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスである、［１４］〜［１７］のいずれかに記載のキット。
［１９］前記ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、ゲノムよりＦ遺伝子を欠失した非増殖型である、［１８］に記載のキット。
［２０］前記ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、ゲノムが不活化している、［１８］又は［１９］に記載のキット。【００１８】
［２１］前記第二の抗がん剤は、免疫活性化剤、及び／又は免疫チェックポイント阻害剤を含む、［１４］〜［２０］のいずれかに記載のキット。
［２２］前記第二の抗がん剤は、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体、抗４−１ＢＢアゴニスト抗体、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、抗ＣＤ２７アゴニスト抗体、又は抗ＣＤ３０アゴニスト抗体を含む、［１４］〜［２１］のいずれかに記載のキット。
［２３］更に、パントエア菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）を含有する、［１４］〜［２２］のいずれかに記載のキット。
［２４］腫瘍内投与に用いられる、［１４］〜［２３］のいずれかに記載のキット。【００１９】
［２５］パントエア菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）を有効成分として含有する、抗がん剤。
［２６］［２５］に記載の抗がん剤を含有する、がん治療用医薬組成物。
［２７］更に、所望のタンパク質又はペプチドをエンベロープ上に提示し得るウイルスを含有する、［２６］に記載のがん治療用医薬組成物。
［２８］前記ウイルスは、少なくとも１種類のＴＮＦＳＦリガンドを、ウイルス粒子エンベロープ上に提示する、［２７］に記載のがん治療用医薬組成物。
［２９］前記少なくとも１種類のＴＮＦＳＦリガンドは、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ、又はＣＤ３０Ｌ、或いは、同一機能を有するこれらの変異体である、［２８］に記載のがん治療用医薬組成物。
［３０］前記ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ、又はＣＤ３０Ｌ、或いは、同一機能を有するこれらの変異体は、そのｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ（ＣＴ）配列が、前記ウイルスのＨＮ由来のＣＴ配列に置換されている、［２９］に記載のがん治療用医薬組成物。【００２０】
［３１］前記ウイルスは、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスである、［２７］〜［３０］のいずれかに記載のがん治療用医薬組成物。
［３２］前記ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、ゲノムよりＦ遺伝子を欠失した非増殖型である、［３１］に記載のがん治療用医薬組成物。
［３３］前記ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、ゲノムが不活化している、［３１］又は［３２］に記載のがん治療用医薬組成物。
［３４］更に、第二の抗がん剤を含有する、［２６］〜［３３］に記載のがん治療用医薬組成物。
［３５］前記第二の抗がん剤は、免疫活性化剤、及び／又は免疫チェックポイント阻害剤を含む、［３４］に記載のがん治療用医薬組成物。【００２１】
［３６］前記第二の抗がん剤は、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体、抗４−１ＢＢアゴニスト抗体、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、抗ＣＤ２７アゴニスト抗体、又は抗ＣＤ３０アゴニスト抗体を含む、［３４］又は［３５］に記載のがん治療用医薬組成物。
［３７］腫瘍内投与に用いられる、［２６］〜［３６］に記載のがん治療用医薬組成物。
［３８］がんの治療に用いるためのキットであって、前記治療において、同時使用又は逐次使用するための、
パントエア菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）と、
所望のタンパク質又はペプチドを、ウイルス粒子エンベロープ上に提示し得るウイルスと、を含むキット。
［３９］前記ウイルスは、少なくとも１種類のＴＮＦＳＦリガンドをエンベロープ上に提示する、［３８］に記載のキット。
［４０］前記少なくとも１種類のＴＮＦＳＦリガンドはＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ、又はＣＤ３０Ｌ、或いは、同一機能を有するこれらの変異体である、［３９］に記載のキット。【００２２】
［４１］前記ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ、又はＣＤ３０Ｌ、或いは、同一機能を有するこれらの変異体は、そのｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ（ＣＴ）配列が、前記ウイルスのＨＮ由来のＣＴ配列に置換されている、［４０］に記載のキット。
［４２］前記ウイルスは、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスである、［３８］〜［４１］に記載のキット。
［４３］前記ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、ゲノムよりＦ遺伝子を欠失した非増殖型である、［４２］に記載のキット。
［４４］前記ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、ゲノムが不活化している、［４２］又は［４３］に記載のキット。
［４５］更に、第二の抗がん剤を含有する、［３８］〜［４４］に記載のキット。
［４６］前記第二の抗がん剤は、免疫活性化剤、及び／又は免疫チェックポイント阻害剤を含む、［４５］に記載のキット。
［４７］前記第二の抗がん剤は、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体、抗４−１ＢＢアゴニスト抗体、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、抗ＣＤ２７アゴニスト抗体、又は抗ＣＤ３０アゴニスト抗体を含む、［４５］又は［４６］に記載のキット。
［４８］腫瘍内投与に用いられる、［３８］〜［４７］に記載のキット。【００２３】
［４９］ＯＸ４０Ｌ若しくは抗ＯＸ４０アゴニスト抗体、４−１ＢＢＬ若しくは抗４−１ＢＢアゴニスト抗体、ＧＩＴＲＬ若しくは抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、ＣＤ２７Ｌ若しくは抗ＣＤ２７アゴニスト抗体、及びＣＤ３０Ｌ若しくは抗ＣＤ３０アゴニスト抗体からなる群から選ばれる少なくとも２つを含む、がん治療用医薬組成物。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、抗腫瘍効果に優れた抗がん剤、がん治療用医薬組成物、及びキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ及びＣＤ３０Ｌ作製用プラスミドの説明図である。具体的には、Ｆ遺伝子を欠失したｈＰＩＶ２構築用プラスミドのＮｏｔＩ又はＭｌｕＩ制限酵素切断部位に所望遺伝子を導入するための構築図である。
【図２】図２は、マウスＯＸ４０Ｌを導入したＢＣ−ＰＩＶの感染細胞及びＢＣ−ＰＩＶ粒子におけるＯＸ４０Ｌ発現と取込みをウエスタンブロットにより確認した図である。
【図３】図３は、マウス４−１ＢＢＬを導入したＢＣ−ＰＩＶの感染細胞及びＢＣ−ＰＩＶ粒子における４−１ＢＢＬの発現と取込みをウエスタンブロットにより確認した図である
【図４】図４は、ヒトＯＸ４０Ｌを導入したＢＣ−ＰＩＶ粒子におけるヒトＯＸ４０Ｌ取込みをウエスタンブロットにより確認した図である。
【図５】図５は、ヒト４−１ＢＢＬを導入したＢＣ−ＰＩＶの感染細胞及びＢＣ−ＰＩＶ粒子におけるヒト４−１ＢＢＬの発現と取込みをウエスタンブロットにより確認した図である。
【図６】図６は、マウス及びヒトＧＩＴＲＬを導入したＢＣ−ＰＩＶ粒子におけるマウス及びヒトＧＩＴＲＬの取込みをウエスタンブロットにより確認した図である。
【図７Ａ】図７Ａは、マウス及びヒトＣＤ２７Ｌを導入したＢＣ−ＰＩＶ粒子におけるマウス及びヒトＣＤ２７Ｌの取込みをウエスタンブロットにより確認した図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、マウス及びヒトＣＤ３０Ｌを導入したＢＣ−ＰＩＶ粒子におけるマウス及びヒトＣＤ３０Ｌの取込みをウエスタンブロットにより確認した図である。
【図８】図８は、ＢＣ−ＰＩＶへのマウス及びヒトのＴＮＦＳＦリガンドの２個導入する組合せを示す図である。
【図９】図９は、ＢＣ−ＰＩＶへのマウスＯＸ４０Ｌ及び４−１ＢＢＬの２つを導入したＢＣ−ＰＩＶ粒子における両者の取込みをウエスタンブロットにより確認した図である。
【図１０】図１０は、ＢＣ−ＰＩＶへのマウスＧＩＴＲＬ＋ＯＸ４０Ｌ又はマウスＧＩＴＲＬ＋４−１ＢＢＬの２つをそれぞれ導入したＢＣ−ＰＩＶ粒子における両者の取込みをウエスタンブロットにより確認した図である。
【図１１】図１１は、ＢＣ−ＰＩＶへのヒトＯＸ４０Ｌ及び４−１ＢＢＬの２つを導入したＢＣ−ＰＩＶ粒子における両者の取込みをウエスタンブロットにより確認した図である。
【図１２】図１２は、マウスＯＸ４０Ｌ又は４−１ＢＢＬ保持ＢＣ−ＰＩＶに対する、マウスＯＸ４０受容体又は４−１ＢＢ受容体タンパク質の結合を確認した図である。
【図１３】図１３は、ヒトＯＸ４０Ｌ保持ＢＣ−ＰＩＶに対する、ヒトＯＸ４０受容体タンパク質の結合を確認した図である。
【図１４】図１４は、ＢＣ−ＰＩＶに取込まれた、マウス４−１ＢＢＬ、４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ及びヒトＣＤ２７Ｌを非還元／還元状態で多量体構造の状態を確認した図である。
【図１５】図１５は、マコモ共生パントエア菌より熱（１２１℃、２０分）＋冷ＥｔＯＨによる抽出法により調製したＬＰＳの銀染色図である。
【図１６】図１６は、熱（１２１℃、２０分）＋冷ＥｔＯＨによる抽出法により調製したＬＰＳによるＮＫ細胞の活性化を確認した図である。
【図１７】図１７は、ＢＣ−ＰＩＶ、ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体投与によるＣＴ２６大腸がんに対する経時的な抗腫瘍効果を示す図である。
【図１８】図１８は、ＢＣ−ＰＩＶ、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体、ＬＰＳのＣＴ２６大腸がんに対する抗腫瘍効果を示す図である。
【図１９】図１９は、ＢＣ−ＰＩＶ、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体、ＬＰＳのＣＴ２６大腸がんに対する抗腫瘍効果を示す図である。
【図２０】図２０は、ＬＰＳのＣＴ２６大腸がんに対する影響を経時的に腫瘍容量変化で示した図である。
【図２１】図２１は、ＮＫ細胞阻害剤及びＣＤ４／８陽性Ｔ細胞阻害剤の有無条件でＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ等投与４日後のＣＴ２６腫瘍の増殖の様子を示す図である。
【図２２】図２２は、ＮＫ細胞阻害剤及びＣＤ４／８陽性Ｔ細胞阻害剤の有無条件でＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ等投与１０日後のＣＴ２６腫瘍の増殖の様子を示す図である。
【図２３】図２３は、ＮＫ細胞阻害剤及びＣＤ４／８陽性Ｔ細胞阻害剤の有無条件でＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ等投与４日後のＣＴ２６腫瘍の増殖の様子を示す図である。
【図２４】図２４は、ＮＫ細胞阻害剤及びＣＤ４／８陽性Ｔ細胞阻害剤の有無条件でＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ等投与１０日後のＣＴ２６腫瘍の増殖の様子を示す図である。
【図２５】図２５は、ＮＫ細胞阻害剤及びＣＤ４／８陽性Ｔ細胞阻害剤の有無条件でＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ等投与によるＣＴ２６大腸がんに対する経時的な抗腫瘍効果を示す図である。
【図２６】図２６は、ＮＫ細胞阻害剤及びＣＤ４／８陽性Ｔ細胞阻害剤の有無条件でＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ等投与によるＣＴ２６大腸がんに対する経時的な抗腫瘍効果を示す図である。
【図２７】図２７はＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ等投与によるＢ６マウスのＢ１６マウスメラノーマ腫瘍に対する経時的な抗腫瘍効果を示す図である。
【図２８】図２８は、ＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ等投与３日後のＢ６マウスのＢ１６マウスメラノーマ腫瘍の様子を示す図である。
【図２９】図２９は、ウイルス作製用プラスミドのＮｏｔＩ部位にＯＸ４０Ｌ又は４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ  ＣＴ遺伝子を導入して作製したＢＣ−ＰＩＶの抗腫瘍効果を示す図である。
【図３０】図３０は、ＯＸ４０Ｌ及び４−１ＢＢＬの２個の遺伝子導入したＢＣ−ＰＩＶによる抗腫瘍効果を示す図である。
【図３１】図３１は、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ又はＣＤ３０Ｌ単独保持ＢＣ−ＰＩＶ及びＧＩＴＲＬ／ＯＸ４０Ｌ又はＧＩＴＲＬ／４−１ＢＢＬの２つリガンドタンパク質保持ＢＣ−ＰＩＶよる抗腫瘍効果を示す図である。
【図３２】図３２は、不活化ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ又は不活化ＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬによる抗腫瘍効果を示す図である。
【図３３】図３３は、ＣＤ３０Ｌを導入したＢＣ−ＰＩＶによる抗腫瘍効果を示す図である。
【図３４】図３４は、不活化ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ又は不活化ＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬによる抗腫瘍効果を示す図である。
【図３５】図３５は、ｈＰＩＶ２以外のエンベロープウイルス（ＲＳウイルス）へのヒトＯＸ４０Ｌの取込みを示す図である。
【図３６】図３６は、ｈＰＩＶ２の以外のエンベロープウイルス（ＰＩＶ５）へのヒトＯＸ４０Ｌの取込みを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
［ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）、及びＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３）］
これらリガンドの受容体であるＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ（ＣＤ３５７）、ＣＤ２７及びＣＤ３０は 、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーである。ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０は、活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞、活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＮＫ細胞等で誘導的に発現する。
治療予後良好患者の腫瘍内にＯＸ４０及び４−１ＢＢ陽性リンパ球の増加が報告されている(非特許文献１、非特許文献２参照。)。活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞でＴＮＦＳＦ受容体とリガンドの結合を介したシグナル伝達、制御性Ｔ細胞の抑制サイトカインの産生等が誘発され、腫瘍抗原に対するＴＣＲシグナル、ＣＤ２８シグナルと共に、腫瘍特異的ＣＴＬが誘導される。
【００２７】
［ＯＸ４０（ＣＤ１３４）及びＯＸ４０Ｌ］
活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞等の膜上に存在する３量体ＯＸ４０は、同じく３量体で抗原提示細胞(ＡＰＣ)表面に存在するＯＸ４０Ｌと結合することにより、各種機能が活性化される。効率的な活性化には、ＯＸ４０及びＯＸ４０Ｌのホモトリマー形成と立体構造の維持が重要であるとされ、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌの相互作用、Ｔｏｌｌ様受容体等の刺激を受けて誘導的に発現する。
ＯＸ４０Ｌは、樹状細胞等により、抗原刺激２４−１２０時間後に誘導される分子である（非特許文献３参照。）。ＯＸ４０Ｌの発現は、活性化Ｂ細胞、樹状細胞等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）が主であるとされてきたが、ＮＫ細胞やマスト細胞での発現も確認されている。
【００２８】
ヒトとマウスのＯＸ４０Ｌのアミノ酸配列の相同性はそれほど高いとはいえないが、立体構造は類似している。ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ結合により、ＰＩ３Ｋ/ＰＫＢ、ＮＦ−ｋＢ、ＮＦＡＴシグナルの活性化によりＴ細胞の増殖、生存、サイトカイン産生等がおこる。
特に、ＣＤ４陽性Ｔ細胞と抗原提示細胞間のＯＸ４０とＯＸ４０Ｌ結合による機能はよく研究されており、活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞は種々のサイトカインを分泌する。ＩＬ−４分泌によるオートクライン作用によりＴｈ２型Ｔ細胞が分化し、ＩＬ−１２及びＴｈ１型サイトカインの分泌によるＴｈ１型のＴ細胞に分化することが知られている。
特に、Ｔｈ１型Ｔ細胞は、がん細胞を直接攻撃するＣＴＬの活性化に寄与する。また、免疫を負に制御する制御性Ｔ細胞には、ＯＸ４０は恒常的に発現し、ＡＰＣのＯＸ４０Ｌの発現により、制御性Ｔ細胞の作用が抑制されることが知られ、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌシグナルは負の免疫機構を抑制し、抗腫瘍効果に寄与する。
【００２９】
ＮＫ細胞は、骨髄中の前駆細胞から作られ、がん細胞、ウイルス感染細胞、紫外線や酸化ストレスを受けた炎症細胞などを標的にする。抗原による前感作なしに細胞傷害活性を発揮できるのが特徴である。ＮＫ細胞にＯＸ４０が発現することは報告されていたが、その機能についてはほとんど報告がなかった。
しかし、最近マウスのＢ細胞悪性リンパ腫細胞株（ＢＣＬ１）を用いた治療モデルで抗ＣＤ２０抗体に加え、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体を追加することにより、マウスの生存期間が４０％延長されることが報告された（非特許文献４参照。）。ＮＫ細胞をアシアロＧＭ１抗体で抑制すると生存期間の延長が認められなかったことから、ＮＫ細胞でのＯＸ４０の発現とそのシグナルは抗腫瘍効果に寄与していると考えられる。
ヒトＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において、ＮＫ細胞上でＯＸ４０に加えて４−１ＢＢの発現も上昇、例えば抗ＣＤ２０抗体刺激後、ＯＸ４０は２４時間後、４−１ＢＢは４時間後に顕著に上昇したと報告されている（非特許文献４参照。）。これは、ＯＸ４０受容体及び４−１ＢＢ受容体に結合するＯＸ４０Ｌ及び４−１ＢＢＬの発現も刺激後早期に起こる必要があることを示す。また、ＮＫ細胞上のＯＸ４０の発現には、Ｔ細胞や単球細胞との接触が必要であることも示されており抗原による前感作なしに細胞傷害活性を発揮するＮＫ細胞ではあるが、抗腫瘍効果を発揮するためにはＴ細胞との連携が重要であり、単にＮＫ細胞単独では効率的な抗腫瘍免疫が誘導されないと考えられる。
【００３０】
［４−１ＢＢ及び４−１ＢＢＬ］
４−１ＢＢ及び４−１ＢＢＬも、ＯＸ４０及びＯＸ４０Ｌと同様に、それぞれ３量体でその機能が高まり（非特許文献１７、１８参照）、その機能はＣＤ４陽性Ｔ細胞やＮＫ細胞におけるＯＸ４０及びＯＸ４０Ｌと類似している。一方で、サリドマイド処理Ｔｒｅｇ細胞で、ＯＸ４０の発現は強く抑制されたが、４−１ＢＢは変化がなかったとされ（非特許文献５参照。）、ＯＸ４０と４−１ＢＢは全く同じ機能を担っているのではないと考えられる。
【００３１】
［抗ＯＸ４０アゴニスト抗体及び抗４−１ＢＢアゴニスト抗体］
組換え体ＯＸ４０Ｌ及び４−１ＢＢＬ単量体タンパク質の投与では抗腫瘍効果がほとんどなく、ＴＮＦＲＳＦシグナルを活性化させるために、通常抗ＯＸ４０アゴニスト抗体又は抗４−１ＢＢアゴニスト抗体が使用される。これらアゴニスト抗体の使用により、非臨床腫瘍治療試験で腫瘍退縮や腫瘍増殖効果が多数報告されている。
また、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体及び抗４−１ＢＢアゴニスト抗体を用いた臨床試験が多数実施されている（非特許文献６、７、８参照。）。
一方、抗４−１ＢＢアゴニスト抗体Ｕｒｅｌｕｍａｂは臨床試験において、抗腫瘍効果が示された一方で、肝毒性が報告された（非特許文献１５参照）。最近、Ｕｒｅｌｕｍａｂ及び他の抗４−１ＢＢアゴニスト抗体であるＵｔｏｍｉｌｕｍａｂの特性が調べられた（非特許文献１６参照）。４−１ＢＢ受容体は４つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ１−４）をもち、これらにリガンド又はアゴニスト抗体が結合することにより、シグナルが活性化される。Ｕｒｅｌｕｍａｂは、ＣＲＤ１に結合するヒトＩｇＧ４抗体で、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂは、ＣＲＤの３及び４に結合するヒトＩｇＧ２抗体であり、抗体の特性が異なる。これら抗体とマウスの脾臓細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞との共培養試験において、Ｕｒｅｌｕｍａｂは脾臓細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞のいずれの細胞との共培養でもＩＦＮγを誘導できたが、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂは脾臓細胞との共培養ではＩＦＮγを誘導できたが、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のみでの共培養ではＩＦＮγを誘導できなかった。これ等の結果から、Ｕｒｅｌｕｍａｂにより活性化されたＣＤ８陽性Ｔ細胞は単独で活性化し、当該ＣＤ８陽性Ｔ細胞が肝臓に浸潤し肝毒性が誘発されたものと考えられている。
アゴニスト抗体については、ＣＲＤとの結合部位及びＦｃ−ＦｃγＲとの結合等、安全性の面でまだ解決すべき課題があると考えられる。
【００３２】
［ＧＩＴＲ及びＧＩＴＲＬ］
ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘発性腫瘍壊死因子受容体）は、ＯＸ４０及び４−１ＢＢ同様活性化ＣＤ４／８陽性Ｔ細胞及び制御性Ｔ細胞に最も多く発現している。ＧＩＴＲとＧＩＴＲＬの結合によりＴＮＦＲＳＦシグナルが活性化するほかに、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の活性化、制御性Ｔ細胞の活性抑制にも寄与している。刺激後２４−７２時間後に発現が上昇し、数日間発現が続く。ＧＩＴＲアゴニスト抗体を用いたマウスの抗腫瘍試験で、ＧＩＴＲアゴニスト抗体により腫瘍内の制御性Ｔ細胞が減少し、ＣＴＬ活性が上昇する。多数の抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体の開発が進められている。
【００３３】
［ＣＤ２７及びＣＤ２７Ｌ］
ＣＤ２７はＴＮＦＲＳＦに属する受容体分子で、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）はそのカウンタパートとなるリガンドである。ＣＤ２７Ｌはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫等の悪性腫瘍細胞に発現している。受容体のＣＤ２７はナイーブＴ細胞及び制御性Ｔ細胞に恒常的に発現するとされ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ及びＣＤ３０と発現状態が異なる。ＣＤ２７とＣＤ２７Ｌの結合により、Ｔ細胞の活性化補助、Ｔ細胞の分化等のエフェクター機能およびメモリー機能がある。Ｃｅｌｌｄｅｘ社により、ＣＤ２７に対するアゴニスト抗体が、卵巣がん、頭頚部がん、グリオブラストーマ及び腎細胞がんに対して、フェーズ２試験が実施されている。ＣＤ２７Ｌは関節リウマチ患者や乾癬性関節炎患者の滑膜由来のＴ細胞等で増加が認められている。
【００３４】
［ＣＤ３０及びＣＤ３０Ｌ］
ＣＤ３０はＴＮＦＲＳＦに属する受容体分子で、ＣＤ３０Ｌはそのカウンタパートとなるリガンドで、活性化ＣＤ４／８陽性Ｔ細胞に発現する。ＣＤ３０は未分化大細胞を含む様々なリンパ腫と関連している。
【００３５】
最近の論文で、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）９を活性化する非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡがＣＤ４陽性Ｔ細胞のＯＸ４０の発現を上昇させることができ、複数移植固形がんの一カ所にＣｐＧと共に抗ＯＸ４０アゴニスト抗体を投与すると、投与部位だけでなく、遠隔部位のがんも退縮させる効果があることが報告された（非特許文献９参照。）。つまり、固形がんへの投与、さらに遠隔がんの退縮又はがん増殖抑制には、抗ＯＸ４０、抗４−１ＢＢ、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ２７及び抗ＣＤ３０のアゴニスト抗体投与のみでは不十分で、ＣＤ４陽性Ｔ細胞やＮＫ細胞でこれらの受容体の発現が重要である。
【００３６】
［ＢＣ−ＰＩＶベクター及びＶＬＰ. ＢＣ−ＰＩＶベクター］
本発明者らは、マイナス一本鎖ＲＮＡウイルスであるパラミクソウイルス科パラミクソウイルス亜科ルブラウイルス属に属するヒトパラインフルエンザ２型ウイルス(以後ｈＰＩＶ２という。) の膜融合（Ｆｕｓｉｏｎ）タンパク質（Ｆ膜タンパク質又はＦタンパク質）をコードするＦ遺伝子を機能しないように欠失させ、当該Ｆ遺伝子が恒常的に発現するように組込まれたＶｅｒｏ細胞を樹立し、当該細胞で２次感染性粒子が産生しないよう作製されたＢＣ−ＰＩＶベクターを構築した（非特許文献１０参照。）。
【００３７】
当該ベクターでは、感染宿主で２次感染性粒子が産生されないため高い安全性が担保される。当該ベクターは外来遺伝子を導入することができ、ＲＮＡベクターの特性を活かし、感染細胞で高い外来遺伝子発現が認められる。
更に、ＢＣ−ＰＩＶは、抗原導入に特徴をもつ。その特徴は、抗原遺伝子だけでなく、外来のウイルス外膜等の大型抗原タンパク質の立体構造を維持した状態で、ＢＣ−ＰＩＶエンベロープ上に、ｈＰＩＶ２のＨＮ膜タンパク質及びＦ膜タンパク質と共存させることができ、効率的なワクチン用ベクターとして利用できる（非特許文献１０参照。）。
中和抗体誘導に立体構造が必須とされる、当該ウイルス以外のウイルスの高分子量膜タンパク質を当該ベクターに導入し、中和抗体の誘導に成功している。また、抗原をエンベロープ上に導入したＢＣ−ＰＩＶはゲノムを不活化してもベクターとしての利用が可能である（ＶＬＰ. ＢＣ−ＰＩＶ）。不活化の際、非増殖型ベクターであるために、通常のウイルス不活化処理より遥かに低濃度の薬剤で処理することが可能で、導入抗原の免疫原性を維持することができる（非特許文献１１、特許文献２参照。）。
【００３８】
好ましい実施形態では、ＢＣ−ＰＩＶは、固形がんを治療する治療薬を提供し、当該治療薬は、ＯＸ４０Ｌ遺伝子又はＯＸ４０Ｌの細胞内領域のｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ（ＣＴ）配列を、ｈＰＩＶ２ ＨＮのＣＴ配列に置換したＯＸ４０Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ遺伝子を保持する。
これには、当該ベクターを直接固形がんに注入する方法も含む。ＯＸ４０Ｌ又はＯＸ４０Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴは、遺伝子形式だけでなく、タンパク質形式でもＢＣ−ＰＩＶ又はＶＬＰ. ＢＣ−ＰＩＶ上に取込まれる。当該タンパク質は、ＮＫ細胞のＢＣ−ＰＩＶ認識による細胞傷害活性やＩＦＮγ等のサイトカインの産生作用と相まって、ＢＣ−ＰＩＶ等によるプライミングにより短時間のうちに活性化されたＴ細胞、ＮＫ細胞等のＯＸ４０受容体と相互作用し、腫瘍に対する免疫作用を生じる。
【００３９】
一つの好ましい形態では膜外領域を含むＯＸ４０Ｌをウイルスエンベロープ上に搭載するエンベロープ型ウイルスである。より好ましい形態では、ＯＸ４０Ｌ又はＯＸ４０Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴを、遺伝子形式かつタンパク質形式で保持するＢＣ−ＰＩＶ又はＯＸ４０ＬあるいはＯＸ４０Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴをタンパク質形式で保持するＶＬＰ. ＢＣ−ＰＩＶである。
【００４０】
また、別の好ましい実施形態では、ＢＣ−ＰＩＶは、固形がんを治療する治療薬を提供し、当該治療薬は、４−１ＢＢＬ遺伝子又は４−１ＢＢＬの細胞内領域のｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ（ＣＴ）配列をｈＰＩＶ２ ＨＮのＣＴ配列に置換した４−１ＢＢＬ −ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ遺伝子を保持する。
これには、当該ベクターを直接固形がんに注入する方法も含む。４−１ＢＢＬ又は４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴは、遺伝子形式だけでなく、タンパク質形式でもＢＣ−ＰＩＶ又はＶＬＰ. ＢＣ−ＰＩＶ上に取込まれる。当該タンパク質は、ＮＫ細胞のＢＣ−ＰＩＶ認識による細胞傷害活性やＩＦＮγなどのサイトカインの産生作用と相まって、ＢＣ−ＰＩＶ等によるプライミングにより短時間のうちに活性化されたＴ細胞、ＮＫ細胞等の４−１ＢＢ受容体と相互作用し、腫瘍に対する免疫作用を生じる。
【００４１】
一つの好ましい形態では膜外領域を含む４−１ＢＢＬをウイルスエンベロープ上に搭載するエンベロープ型ウイルスである。より好ましい形態では、４−１ＢＢＬ又は４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴを遺伝子形式かつタンパク質形式で保持するＢＣ−ＰＩＶ又は４−１ＢＢＬ若しくは４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴをタンパク質形式で保持するＶＬＰ. ＢＣ−ＰＩＶである。
【００４２】
また、別の好ましい実施形態では、ＢＣ−ＰＩＶは、固形がんを治療する治療薬を提供し、当該治療薬は、ＧＩＴＲＬ遺伝子又はＧＩＴＲＬの細胞内領域のｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ（ＣＴ）配列をｈＰＩＶ２ ＨＮのＣＴ配列に置換したＧＩＴＲＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ遺伝子を保持する。
これには、当該ベクターを直接固形がんに注入する方法も含む。ＧＩＴＲＬ又はＧＩＴＲＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴは、遺伝子形式だけでなく、タンパク質形式でもＢＣ−ＰＩＶ又はＶＬＰ. ＢＣ−ＰＩＶ上に取込まれる。当該タンパク質は、ＮＫ細胞のＢＣ−ＰＩＶ認識による細胞傷害活性やＩＦＮγなどのサイトカインの産生作用と相まって、ＢＣ−ＰＩＶ等によるプライミングにより短時間のうちに活性化されたＴ細胞、ＮＫ細胞等のＧＩＴＲ受容体と相互作用し、腫瘍に対する免疫作用を生じる。
【００４３】
一つの好ましい形態では膜外領域を含むＧＩＴＲＬをウイルスエンベロープ上に搭載するエンベロープ型ウイルスである。より好ましい形態では、ＧＩＴＲＬ又はＧＩＴＲＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴを遺伝子形式かつタンパク質形式で保持するＢＣ−ＰＩＶ又はＧＩＴＲＬ若しくはＧＩＴＲＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴをタンパク質形式で保持するＶＬＰ. ＢＣ−ＰＩＶである。
【００４４】
また、別の好ましい実施形態では、ＢＣ−ＰＩＶは、固形がんを治療する治療薬を提供し、当該治療薬は、ＣＤ２７Ｌ遺伝子又はＣＤ２７Ｌの細胞内領域のｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ（ＣＴ）配列をｈＰＩＶ２ ＨＮのＣＴ配列に置換したＣＤ２７Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ遺伝子を保持する。
これには、当該ベクターを直接固形がんに注入する方法も含む。ＣＤ２７Ｌ又はＣＤ２７Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴは、遺伝子形式だけでなく、タンパク質形式でもＢＣ−ＰＩＶ又はＶＬＰ. ＢＣ−ＰＩＶ上に取込まれる。当該タンパク質は、ＮＫ細胞のＢＣ−ＰＩＶ認識による細胞傷害活性やＩＦＮγなどのサイトカインの産生作用と相まって、ＢＣ−ＰＩＶ等によるプライミングにより短時間のうちに活性化されたＴ細胞、ＮＫ細胞等のＣＤ２７受容体と相互作用し、腫瘍に対する免疫作用を生じる。
【００４５】
一つの好ましい形態では膜外領域を含むＣＤ２７Ｌをウイルスエンベロープ上に搭載するエンベロープ型ウイルスである。より好ましい形態では、ＣＤ２７Ｌ又はＣＤ２７Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴを遺伝子形式かつタンパク質形式で保持するＢＣ−ＰＩＶ又はＣＤ２７Ｌ若しくはＣＤ２７Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴをタンパク質形式で保持するＶＬＰ. ＢＣ−ＰＩＶである。
【００４６】
また、別の好ましい実施形態では、ＢＣ−ＰＩＶは、固形がんを治療する治療薬を提供し、当該治療薬は、ＣＤ３０Ｌ遺伝子又はＣＤ３０Ｌの膜内領域のｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ（ＣＴ）配列をｈＰＩＶ２ ＨＮのＣＴ配列に置換したＧＩＴＲ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ遺伝子を保持する。
これには、当該ベクターを直接固形がんに注入する方法も含む。ＣＤ３０Ｌ又はＣＤ３０Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴは、遺伝子形式だけでなく、タンパク質形式でもＢＣ−ＰＩＶ又はＶＬＰ. ＢＣ−ＰＩＶ上に取込まれる。当該タンパク質は、ＮＫ細胞のＢＣ−ＰＩＶ認識による細胞傷害活性やＩＦＮγなどのサイトカインの産生作用と相まって、ＢＣ−ＰＩＶ等によるプライミングにより短時間のうちに活性化されたＴ細胞、ＮＫ細胞等のＣＤ３０受容体と相互作用し、腫瘍に対する免疫作用を生じる。
【００４７】
一つの好ましい形態では膜外領域を含むＣＤ３０Ｌをウイルスエンベロープ上に搭載するエンベロープ型ウイルスである。より好ましい形態では、ＣＤ３０Ｌ又はＣＤ３０Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴを遺伝子形式かつタンパク質形式で保持するＢＣ−ＰＩＶ又はＣＤ３０Ｌ若しくはＣＤ３０Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴをタンパク質形式で保持するＶＬＰ. ＢＣ−ＰＩＶである。
【００４８】
［複数の遺伝子を保持するＢＣ−ＰＩＶベクター及びＶＬＰ. ＢＣ−ＰＩＶベクター］
好ましい実施形態では、ＢＣ−ＰＩＶベクター又はＶＬＰ. ＢＣ−ＰＩＶベクターは、１ベクター中に複数の遺伝子を保持する。ウイルス作製用プラスミドの外来遺伝子導入可能部位を調節することにより、２つ以上の遺伝子を発現するウイルスベクターの構築が可能である。
導入対象の遺伝子としては、ＴＮＦＳＦのリガンドをコードする遺伝子が好ましく、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＴＮＦα、ＬＴα、ＴＬ１Ａ、ＣＤ３０Ｌ、及びＣＤ２７Ｌ、並びに、同一機能を有するこれらの変異体から選ばれる２種類以上がより好ましい。
中でも、ＴＮＦＳＦのリガンドの組み合わせとしては、ＯＸ４０Ｌと４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬとＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬと４−１ＢＢＬの組み合わせがより好ましい。
【００４９】
これらリガンドの組み合わせをエンベロープ上に提示するために、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ、又はＣＤ３０Ｌ、或いは同一機能を有するこれらの変異体は、そのｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ（ＣＴ）配列が、前記ウイルスのＨＮ由来のＣＴ配列に置換されていることが好ましい。
【００５０】
［パントエア菌由来のＬＰＳによる樹状細胞（ＤＣ）・ＮＫ細胞等の活性化］
効率的な抗腫瘍免疫の誘導には、ＮＫ細胞やＣＤ４陽性Ｔ細胞等のＯＸ４０及び４−１ＢＢ経路の活性化に加えて、活性化した樹状細胞等によるがん細胞のＣＴＬエピトープの提示が重要である。
樹状細胞等のプロフェッショナル抗原提示細胞に、エンドサイトーシス等の作用により取込まれたがん細胞由来タンパク質は、プロテアーゼにより種々の長さのペプチドへと切断される。樹状細胞は、取込まれたがん細胞由来の分解された８〜１０アミノ酸長ＣＴＬエピトープペプチドをクロスプレゼンテーション作用により、細胞表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上に提示し、ＣＤ８陽性Ｔ細胞にペプチド情報を伝達し、ＣＴＬ活性化に繋げる。
一方、樹状細胞は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０等の共刺激分子が誘導されない未熟な状態では、ナイーブＴ細胞刺激時にＭＨＣ分子による抗原シグナルによる刺激（第１シグナル）を与えるのみで、共刺激シグナル（第２シグナル）が入らず、最終的にＴ細胞はその抗原に対して応答できない状態（アナジー）に陥る。腫瘍抗原に対するアナジー状態に陥らないようにするために、樹状細胞がＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０等の共刺激分子発現による第２シグナルを伝え、成熟化させる必要がある。
【００５１】
本発明者らは以前、イネ科マコモ属の多年草であるマコモ（Ｚｉｚａｎｉａ ｌａｔｉｆｏｌｉａ、真菰。別名：ハナガツミ）の肥大果肉中より、滅菌した安全キャビネット内で、グラム陰性菌であるパントエア菌を分離した。当該菌より抽出したリポポリサッカライド（ＬＰＳ）が未熟な樹状細胞に、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０等の共刺激分子の発現を誘導し、樹状細胞を強く成熟化させることを示している（特許文献３参照。）。パントエア菌由来のＬＰＳは、大腸菌等のＬＰＳと異なり、動物試験では毒性が極めて小さいとされる。
【００５２】
また、ＬＰＳにより、間接的に又は直接的にＮＫ細胞の活性化が報告されている（非特許文献１２参照。）。間接的には、ＴＬＲ４を通して樹状細胞及びマクロファージを活性化し、その結果ＮＫ細胞が活性化される。直接的には、通常ＮＫ細胞にはＴＬＲ４の発現は低いと考えられているが、ＬＰＳ刺激によりＮＫ細胞からのＩＦＮγの産生上昇に伴ってＮＫ細胞の分解が低下することが報告されている。
好ましい実施形態では、固形がんを治療する方法を提供し、当該方法には、パントエア菌のＬＰＳを直接固形がんに注入することを含む。当該ＬＰＳの作用により、がん組織中のＮＫ細胞活性化による自然免疫作用によるがん細胞の殺傷、さらに樹状細胞活性化によるＣＤ４陽性Ｔ細胞への腫瘍抗原エピトープの提示、ＣＴＬの活性化による獲得免疫によるがん細胞の殺傷が図られる。
【００５３】
更に、別の好ましい実施形態では、ＯＸ４０Ｌ遺伝子、４−１ＢＢＬ遺伝子、ＧＩＴＲＬ遺伝子、ＣＤ２７Ｌ遺伝子又はＣＤ３０Ｌ遺伝子だけでなく、ＢＣ−ＰＩＶ又はＶＬＰ. ＢＣ−ＰＩＶに、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ又はＣＤ３０Ｌ、或いは、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ又はＣＤ３０Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴタンパク質をエンベロープに包含するベクターとパントエア菌のＬＰＳを混合して直接固形がんに注入する方法を含む。
【００５４】
＜抗がん剤＞
［第一実施形態］
１実施形態において、本発明は、所望のタンパク質又はペプチドを、ウイルス粒子エンベロープ上に提示し得るウイルスを有効成分として含有する、抗がん剤を提供する。
【００５５】
実施例にて後述するように、所望のタンパク質又はペプチドをコードする遺伝子が導入されていない、所謂空ウイルスベクターでも抗腫瘍効果が得られている。
【００５６】
本実施形態に用いられるウイルスとしては、所望のタンパク質又はペプチドをエンベロープ上に提示し得るものであれば限定されず、センダイウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルスが挙げられ、ヒトパラインフルエンザウイルスが好ましく、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスがより好ましい。
【００５７】
上述した通り、２次感染性粒子を産生させない観点から、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルス（ｈＰＩＶ２）は、膜融合機能を有するＦ遺伝子を欠損し、非増殖型であることが好ましい。
更に、安全性の観点から、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、ゲノムが不活化していることが好ましい。ゲノムの不活化は、アルキル化剤処理、過酸化水素処理、ＵＶ照射、放射線照射、又は熱処理によって行われることが好ましく、アルキル化剤であるβ−プロピオラクトンで処理されることが好ましい。
【００５８】
また、本実施形態に用いられるウイルスは、少なくとも１種類のＴＮＦＳＦのリガンドをエンベロープ上に提示することが好ましい。少なくとも１種類のＴＮＦＳＦのリガンドとしては、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＴＮＦα、ＬＴα、ＴＬ１Ａ、ＣＤ３０Ｌ、及びＣＤ２７Ｌから選ばれる少なくとも１種類が好ましく、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ、及びＣＤ３０Ｌ、並びに、同一機能を有するこれらの変異体からなる群から選ばれる少なくとも１種がより好ましい。
同一機能を有するこれらの変異体とは、リガンドを構成するアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴＮＦＲＳＦ経路のシグナル伝達能を有するものをいう。
欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸の数としては、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個が特に好ましい。
また、本実施形態に用いられるＴＮＦＳＦのリガンドとしては、そのホモログも含まれる。
【００５９】
所望のタンパク質又はペプチドをエンベロープ上に提示するために、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ及び／又は、ＣＤ３０Ｌ、或いは同一機能を有するこれらの変異体は、そのｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ（ＣＴ）配列が、前記ウイルスのＨＮ由来のＣＴ配列に置換されていることが好ましい。
【００６０】
［第二実施形態］
１実施形態において、本発明は、パントエア菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）を有効成分として含有する、抗がん剤を提供する。
【００６１】
実施例にて後述するように、パントエア菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）単独でも抗腫瘍効果が得られている。
【００６２】
＜がん治療用医薬組成物＞
［第三実施形態］
１実施形態において、本発明は、上述した第一実施形態の抗がん剤を含有する。本実施形態のがん治療用医薬組成物は、第二の抗がん剤を含んでもよい。
本実施形態のがん治療用医薬組成物を含む第二の抗がん剤としては、細胞毒性薬、細胞増殖静止薬、免疫活性化剤、免疫チェックポイント阻害剤等が挙げられ、免疫活性化剤、及び／又は免疫チェックポイント阻害剤を含むものが好ましい。
免疫活性化剤としては、ＴＮＦＳＦ受容体のアゴニスト抗体が挙げられ、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、抗ＣＤ３０アゴニスト抗体、抗４−１ＢＢアゴニスト抗体、抗ＣＤ２７アゴニスト抗体等が挙げられる。
免疫チェックポイント阻害剤としては、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体、抗ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト抗体、抗ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト抗体等が挙げられる。
中でも、本実施形態のがん治療用医薬組成物を含む抗がん剤としては、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体、抗４−１ＢＢアゴニスト抗体、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、抗ＣＤ３０アゴニスト抗体及び／又は、抗ＣＤ２７アゴニスト抗体を含むものが好ましい。
【００６３】
本実施形態のがん治療用医薬組成物は、更に、パントエア菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）を含有することが好ましい。実施例で後述するように、パントエア菌由来のＬＰＳを含有することで、抗腫瘍効果の増強が期待される。
【００６４】
本実施形態のがん治療用医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含有することが好ましい。薬学的に許容される担体としては、通常製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができ、例えば、滅菌水、生理食塩水等の溶媒；ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤等が挙げられる。
【００６５】
本実施形態のがん治療用医薬組成物は、添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤；界面活性剤；乳化剤等が挙げられる。
【００６６】
本実施形態のがん治療用医薬組成物は、上記の薬学的に許容される担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
【００６７】
本実施形態のがん治療用医薬組成物は、経口的に使用される剤型又は非経口的に使用される剤型に製剤化されていてもよく、非経口的に使用される剤型に製剤化されることが好ましい。経口的に使用される剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。非経口的に使用される剤型としては例えば注射剤、軟膏剤、貼付剤等が挙げられるが、注射剤が好ましい。
【００６８】
注射剤用の溶媒としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液が挙げられる。注射剤用の溶媒は、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ−５０等の非イオン性界面活性剤等を含有していてもよい。
【００６９】
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的方法が挙げられるが、腫瘍内投与が好ましい。
【００７０】
本実施形態のがん治療用医薬組成物の１回あたりの投与量は、非経口的に投与する場合には、投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．０１から３００ｍｇ、例えば約０．１から２００ｍｇ、例えば約０．１から１００ｍｇの有効成分を静脈注射又は局所投与により投与することが考えられる。また、上記の量を１日あたり１回又は数回に分けて投与してもよい。
【００７１】
本実施形態のがん治療用医薬組成物の適用対象としては、がんであれば限定されず、乳がん（例えば、浸潤性乳管がん、非浸潤性乳管がん、炎症性乳がん等）、前立腺がん（例えば、ホルモン依存性前立腺がん、ホルモン非依存性前立腺がん等）、膵臓がん（例えば、膵管がん等）、胃がん（例えば、乳頭腺がん、粘液性腺がん、腺扁平上皮がん等）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性中皮腫等）、結腸がん（例えば、消化管間質腫瘍等）、直腸がん（例えば、消化管間質腫瘍等）、大腸がん（例えば、家族性大腸がん、遺伝性非ポリポーシス大腸がん、消化管間質腫瘍等）、小腸がん（例えば、非ホジキンリンパ腫、消化管間質腫瘍等）、食道がん、十二指腸がん、舌がん、咽頭がん（例えば、上咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん等）、頭頚部がん、唾液腺がん、脳腫瘍（例えば、松果体星細胞腫瘍、毛様細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫、退形成性星細胞腫等）、神経鞘腫、肝臓がん（例えば、原発性肝がん、肝外胆管がん等）、腎臓がん（例えば、腎細胞がん、腎盂と尿管の移行上皮がん等）、胆嚢がん、胆管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、子宮肉腫、卵巣がん（例、上皮性卵巣がん、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣性胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍等）、膀胱がん、尿道がん、皮膚がん（例えば、メルケル細胞がん等）、血管腫、悪性リンパ腫（例えば、細網肉腫、リンパ肉腫、ホジキン病等）、メラノーマ（悪性黒色腫）、甲状腺がん（例えば、甲状腺髄様がん等）、副甲状腺がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、骨腫瘍（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟部組織肉腫等）、転移性髄芽腫、血管線維腫、隆起性皮膚線維肉腫、網膜肉腫、陰茎癌、精巣腫瘍、小児固形がん（例えば、ウィルムス腫瘍、小児腎腫瘍等）、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、慢性骨髄増殖性疾患、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病等）等が挙げられる。
【００７２】
［第四実施形態］
１実施形態において、本発明は、上述した第二実施形態の抗がん剤を含有するがん治療用医薬組成物を提供する。実施例で後述するように、パントエア菌由来のＬＰＳの単独投与でも抗腫瘍効果が確認されている。
【００７３】
本実施形態のがん治療用医薬組成物は、所望のタンパク質又はペプチドをエンベロープ上に提示し得るウイルスを含有することが好ましい。
また、係るウイルスは、少なくとも１種類のＴＮＦＳＦのリガンドをエンベロープ上に提示したウイルスを含有することが好ましい。
【００７４】
本実施形態のがん治療用医薬組成物は、更に、第二の抗がん剤を含むことが好ましく、係る第二の抗がん剤として、免疫活性化剤及び／又は免疫チェックポイント阻害剤を含むことがより好ましい。
その他、本実施形態のがん治療用医薬組成物の好ましい態様については、第三実施形態と同様である。
【００７５】
［第五実施形態］
１実施形態において、本発明は、ＯＸ４０Ｌ若しくは抗ＯＸ４０アゴニスト抗体、４−１ＢＢＬ若しくは抗４−１ＢＢアゴニスト抗体、ＧＩＴＲＬ若しくは抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、ＣＤ２７Ｌ若しくは抗ＣＤ２７アゴニスト抗体、及びＣＤ３０Ｌ若しくは抗ＣＤ３０アゴニスト抗体からなる群から選ばれる少なくとも２つを含むがん治療用医薬組成物を提供する。実施例で後述するように、複数のＴＮＦＳＦのリガンドをコードする遺伝子を保持するＢＣ−ＰＩＶベクターの投与で、相乗的な抗腫瘍効果が確認されている。
本実施形態のがん治療用医薬組成物における、リガンド又はアゴニスト抗体の組み合わせとしては、上述した分子から少なくとも２種類選択される。中でも、ＯＸ４０Ｌ若しくは抗ＯＸ４０アゴニスト抗体と４−１ＢＢＬ若しくは抗４−１ＢＢアゴニスト抗体の組み合わせ、ＧＩＴＲＬ若しくは抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体とＯＸ４０Ｌ若しくは抗ＯＸ４０アゴニスト抗体の組み合わせ、ＧＩＴＲＬ若しくは抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体と４−１ＢＢＬ若しくは抗４−１ＢＢアゴニスト抗体の組み合わせが好ましい。
【００７６】
＜キット＞
１実施形態において、本発明は、がんの治療に用いるためのキットであって、前記治療において、同時使用又は逐次使用するための、
所望のタンパク質又はペプチドをエンベロープ上に提示し得るウイルスと、第二の抗がん剤と、を含むキットを提供する。
その他、本実施形態のキットの好ましい態様については、＜がん治療用医薬組成物＞の［第三実施形態］と同様である。逐次投与の場合の順番は特に問わない。
【００７７】
また、１実施形態において、本発明は、がんの治療に用いるためのキットであって、前記治療において、同時使用又は逐次使用するための、
パントエア菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）と、
所望のタンパク質又はペプチドをエンベロープ上に提示し得るウイルスと、を含むキットを提供する。
その他、本実施形態のキットの好ましい態様については、＜がん治療用医薬組成物＞の［第四実施形態］と同様である。逐次投与の場合の順番は特に問わない。
【００７８】
＜治療方法＞
１実施形態において、本発明は、上述した抗がん剤又はがん治療用医薬組成物を、治療を必要とする患者に投与することを含む、がんの治療方法を提供する。
【００７９】
また、１実施形態において、本発明は、有効量の所望のタンパク質又はペプチドをエンベロープ上に提示し得るウイルスと、有効量の第二の抗がん剤とを、治療を必要とする患者に、同時に、または、逐次投与することを含む、がんの治療方法を提供する。その他、本実施形態の治療方法の好ましい態様については、＜がん治療用医薬組成物＞の［第三実施形態］と同様である。逐次投与の場合の順番は特に問わない。
【００８０】
また、１実施形態において、本発明は、有効量のパントエア菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）と、有効量の所望のタンパク質又はペプチドをエンベロープ上に提示し得るウイルスとを、治療を必要とする患者に、同時に、または、逐次投与することを含む、がんの治療方法を提供する。その他、本実施形態の治療方法の好ましい態様については、＜がん治療用医薬組成物＞の［第四実施形態］と同様である。逐次投与の場合の順番は特に問わない。
【００８１】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、がんの治療のための抗がん剤、がん治療用医薬組成物、又はキットを提供する。抗がん剤、がん治療用医薬組成物、又はキットとしては、上述したものと同様のものを使用することができる。
【実施例】
【００８２】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００８３】
以下の実施例のＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ及びＣＤ３０Ｌ及びそれらのＣＴ置換体の表記において、動物種由来の言及及び記載が特にない場合はマウス由来とする。
［実験例１］
（マウス又はヒトの、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ、及びＣＤ３０Ｌをそれぞれ保持するＢＣ−ＰＩＶの構築）
ＢＣ−ＰＩＶは、エンベロープ上に異種ウイルスの多量体の抗原の立体構造を維持した状態で搭載できることが可能である。抗原が外来ウイルス等の膜タンパク質以外の場合は、当該抗原にｈＰＩＶ２膜タンパク質のＨＮ又はＦの膜領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ (ＴＭ)配列）及び／又は細胞内領域（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ（ＣＴ）配列）を付加することにより、当該抗原はＢＣ−ＰＩＶエンベロープに取込まれる。
一方、ＢＣ−ＰＩＶへの導入抗原が、ウイルス膜タンパク質又は膜タンパク質の場合、導入抗原の膜アンカーリングシグナルはそのままでもＢＣ−ＰＩＶエンベロープに取込まれる場合と、膜アンカーリングシグナルをｈＰＩＶ２のそれと置換しないとＢＣ−ＰＩＶエンベロープに取込まれない場合がある。【００８４】
マウス及びヒトのＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ及びＣＤ３０Ｌは、膜アンカーリングの膜領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ (ＴＭ)配列）及び細胞内領域（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ（ＣＴ）配列）を保持するタンパク質であり、ＢＣ−ＰＩＶへの取込みを、膜アンカーリングシグナルとして、マウス及びヒトのＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ及びＣＤ３０Ｌのインタクトな配列をもつ、マウス及びヒトのＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ、及びＣＤ３０Ｌ遺伝子と、ｈＰＩＶ２のＨＮタンパク質のＣＴ配列で置換した配列をもつ、マウス及びヒトＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ、及びＣＤ３０Ｌ遺伝子を保持するＢＣ−ＰＩＶをそれぞれ構築し、エンベロープへの取込みを検討した。【００８５】
前者は、マウス及びヒトＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ及びＣＤ３０Ｌ遺伝子の配列をそのまま（インタクト）、ＢＣ−ＰＩＶの構築プラスミドのＮｏｔＩ又はＭｌｕＩの制限酵素切断部位に当該制限酵素切断配列とＢＣ−ＰＩＶ導入用ｔａｇ配列を付加したプラスミドを構築した (図１参照)。
この際、導入遺伝子を含めたＢＣ−ＰＩＶの遺伝子全長の塩基数を６の倍数（ルール・オブ・６）になるように調整した。
一方、マウス又はヒトの、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ及びＣＤ３０Ｌのインタクトの配列ではＢＣ−ＰＩＶベクターに取込まれない後者の場合には、マウス又はヒトの、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ及びＣＤ３０ＬのＣＴ配列を、ｈＰＩＶ２の膜タンパク質の配列と置換する必要がある。ＴＮＦＳＦリガンドタンパク質は、ＩＩ型膜タンパク質であるため、通常利用するＩ型膜タンパク質のｈＰＩＶ２のＦタンパク質のＴＭ配列及びＣＴ配列の導入は難しいと考えられる。
そこで、ＩＩ型膜タンパク質であるｈＰＩＶ２のＨＮ膜タンパク質のＮ末端側にあるＣＴ及びＴＭ配列の利用を考えた。ここで、ｈＰＩＶ２のＨＮ膜タンパク質は４量体タンパク質であり、当該ＴＭ配列をＴＮＦＳＦリガンドタンパク質のＴＭ配列と置換するとＴＮＦＳＦリガンドタンパク質は、３量体であるところ、４量体を形成する可能性があるので、ｈＰＩＶ２のＨＮ膜タンパク質のＣＴ配列のみ（Ｎ末端−ＭＥＤＹＳＮＬＳＬＫ  ＳＩＰＫＲＴＣＲＩＩ  ＦＲＴＡＴ）でマウス又はヒトの、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ及びＣＤ３０ＬのＣＴ配列を置換したマウス又はヒトの、ＯＸ４０Ｌ遺伝子（ＯＸ４０Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ遺伝子）、４−１ＢＢＬ遺伝子（４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ遺伝子）、ＧＩＴＲＬ遺伝子（ＧＩＴＲＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ遺伝子）、ＣＤ２７Ｌ遺伝子（ＣＤ２７Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ遺伝子）及びＣＤ３０Ｌ遺伝子（ＣＤ３０Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ遺伝子）を導入することとし、ＢＣ−ＰＩＶ導入用ｔａｇ配列を付加したプラスミドを構築した(図１参照)。
これら遺伝子を保持するＢＣ−ＰＩＶ構築用プラスミドを用いて、マイナス一本鎖ウイルス作製に常用されるリバースジェネティクス法により、ＢＣ−ＰＩＶウイルスの回収を行った。すべてのウイルスを回収することができた。【００８６】
この際使用したマウスＯＸ４０Ｌ遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ１２７６３．１であり（配列番号１）、ヒトＯＸ４０Ｌ遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００３３２６．３（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ.）である（配列番号２）。
この際使用したマウス４−１ＢＢＬ遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ１５４３５．１であり（配列番号３）、ヒト４−１ＢＢＬ遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００３８１１．３（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ.）である（配列番号４）。
この際使用したマウスＧＩＴＲＬ遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿１８３３９１．３であり（配列番号５）、ヒトＧＩＴＲＬ遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００５０９２．３（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ.）である（配列番号６）。
この際使用したマウスＣＤ２７Ｌ遺伝子はマウス脾臓よりＰＣＲにより回収した。遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ７８０９１．１であり（配列番号７）、ヒトＣＤ２７Ｌ遺伝子はＭＴ２細胞よりＰＣＲにより回収した。配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ０００７２５．２である（配列番号８）。
この際使用したマウスＣＤ３０Ｌ遺伝子はマウス脾臓よりＰＣＲにより回収した。遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ１１７０９７．１であり（配列番号９）、ヒトＣＤ３０Ｌ遺伝子はＭＴ２細胞よりＰＣＲにより回収した。配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ１１１９３９．１である（配列番号１０）。【００８７】
［実験例２］
（マウス又はヒトの、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ及びＣＤ３０ＬそれぞれのＢＣ−ＰＩＶへの取込みの確認）
実験例１で回収できたＢＣ−ＰＩＶが、目的のタンパク質を発現しているか及び当該タンパク質がＢＣ−ＰＩＶに取込まれているかを調べた。実験例１で作製したウイルス作製用プラスミドのＮｏｔＩ部位及び／又はＭｌｕＩ部位に導入した、各々すべての遺伝子を保持するＢＣ−ＰＩＶを回収することができたので、回収したＢＣ−ＰＩＶを、ｈＰＩＶ２のＦ膜タンパク質発現Ｖｅｒｏ細胞に感染させ７日間培養し、回収した細胞を、市販で入手可能な抗マウスＯＸ４０Ｌ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、ｃａｔ♯：ＢＡＦ１２３６）、抗マウス４−１ＢＢＬ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、ｃａｔ♯：ＡＦ１２４６）、抗ヒトＯＸ４０Ｌ抗体（ＰｒoＳｃｉ社、ｃａｔ♯：７２４３）、抗ヒト４−１ＢＢＬ抗体（Ｂｉｏｒｂｙｔ  Ｌｔｄ、 ｃａｔ♯：оｒｂ２２４０４７）、抗マウスＧＩＴＲＬ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、  ｃａｔ＃：ＭＡＢ２１７７２）、抗ヒトＧＩＴＲＬ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、  ｃａｔ＃：ＡＦ６９４）、抗マウスＣＤ２７Ｌ抗体（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ、ｃａｔ＃１０１９５６−Ｔ３２）、抗ヒトＣＤ２７Ｌ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ、  ｃａｔ＃：ｓｃ−３６５５３９）及び抗ヒト／マウスＣＤ３０Ｌ抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、ｃａｔ＃ＭＡＢ７３２）を用いたウエスタンブロットに供した。感染細胞での発現は、マウスＯＸ４０Ｌ、マウス及びヒトの４−１ＢＢＬの結果を図２、３及び５に記載した。【００８８】
次に、所望遺伝子をウイルス作製用プラスミドのＮｏｔＩ部位に導入したＢＣ−ＰＩＶ粒子のエンベロープにＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ、及びＣＤ３０Ｌがそれぞれ取込まれているかを確認するために、回収したＢＣ−ＰＩＶを、ｈＰＩＶ２のＦ膜タンパク質発現Ｖｅｒｏ細胞に感染させ７日間培養し、上清を回収した。
上清は、３，０００ｒｐｍ（１，７００ｘｇ）の遠心分離で細胞残渣を除去し、０．８μｍのフィルターを通して更に不純物を除去した。得られた上清を超遠心分離（１４０，０００ｘｇ、４０分）した。上清を除去後、沈殿物をＰＢＳに懸濁し、ＢＣ−ＰＩＶウイルス画分として、導入タンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロットに供した。ウエスタンに供したウイルス数はいずれも１０６粒子とした。
以降のウエスタンブロットで、試料の処理を通常のウエスタンブロット用の還元剤を含むサンプルバッファーで調製した際、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ及びＣＤ３０Ｌ等の多量体構造が強固であるため単量体だけでなく、多量体構造と考えられる分子量に抗体陽性シグナルが見出される場合があった。【００８９】
（マウス又はヒトの、ＯＸ４０Ｌ及び４−１ＢＢＬそれぞれのウイルスベクター粒子への取込み）
以下、記載がない場合には「ウイルスベクター粒子のエンベロープへの取込み」を「ウイルスベクター粒子への取込み」と「ＢＣ−ＰＩＶ粒子のエンベロープへの取込み」を「ＢＣ−ＰＩＶ粒子への取込み」と記載する。
マウス又はヒトの、ＯＸ４０Ｌ及び４−１ＢＢＬそれぞれのウイルスベクター粒子への取込みのウエスタンブロットの結果を図２乃至５に示す。
これらの結果から、マウス／ヒトＯＸ４０Ｌ、マウスＯＸ４０Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ、マウス４−１ＢＢＬ、マウス／ヒト４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴはＢＣ−ＰＩＶ粒子に取込まれていた。一方、ヒトＯＸ４０Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ及びヒト４−１ＢＢＬのＢＣ−ＰＩＶ粒子への取込みは難しいことが分った。【００９０】
（マウス又はヒトの、ＧＩＴＲＬのウイルスベクター粒子への取込み）
マウス又はヒトの、ＧＩＴＲＬ及びＧＩＴＲＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴのウイルスベクター粒子への取込みのウエスタンブロットの結果を図６に示す。
ＧＩＴＲＬ及びＧＩＴＲＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴはマウス及びヒトともＢＣ−ＰＩＶ粒子に取込まれていた。しかし、ヒトＧＩＴＲＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴはＢＣ−ＰＩＶ粒子のエンベロープ膜に取込まれる量がそれほど多くはなかった。当該ウエスタンブロットにおいて、ＧＩＴＲＬ試料を通常ウエスタン用サンプルバッファー用いて処理をした際、マウスでは二量体、ヒトでは二量体及び三量体と考えられる陽性バンドも確認され、多量体の結合が強いことが示された。【００９１】
（マウス又はヒトの、ＣＤ２７Ｌのウイルスベクター粒子への取込み）
マウス又はヒトの、ＣＤ２７Ｌ及びＣＤ２７Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴのウイルスベクター粒子への取込みのウエスタンブロットの結果を図７Ａに示す。
ＣＤ２７Ｌは、マウス及びヒトともにＢＣ−ＰＩＶ粒子に取込まれていた。一方、ＣＤ２７Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴはヒトのみがＢＣ−ＰＩＶ粒子のエンベロープ膜に取込まれていた。いずれも多量体と考えられる分子量の位置に陽性バンドが確認された。特に、ヒトのＣＤ２７Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴでは単量体はほとんどバンドが確認できず、二量体及び三量体と考えられる分子量のところに陽性バンドが認められた。【００９２】
（マウス又はヒトのＣＤ３０Ｌのウイルスベクター粒子への取込み）
さらに、マウスＣＤ３０Ｌ及びＣＤ３０Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ、及びヒトＣＤ３０Ｌ及びＣＤ３０Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴの場合においても、抗体の感度があまりよくないので明瞭なバンドではないが、ＢＣ−ＰＩＶベクター粒子上で陽性反応を示し、ウイルスベクター粒子への取込みが認められた(図７Ｂ参照)。【００９３】
これらの結果、ＢＣ−ＰＩＶ粒子のエンベロープ膜にＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ、及びＣＤ３０Ｌ又はそれらのＣＴの置換体が取込まれており、当該ベクターの固形腫瘍への投与により、Ｔ細胞、ＮＫ細胞等への刺激直後に誘導的に発現するＯＸ４０受容体、４−１ＢＢ受容体、ＧＩＴＲ受容体、ＣＤ２７受容体、及びＣＤ３０受容体に迅速に結合するＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ及びＣＤ３０Ｌの提供が可能となる。
これはエンベロープ型ウイルスベクターの特性と考えることができる。つまり、感染、転写、翻訳過程が必要なアデノウイルスベクター等と異なり、転写、翻訳過程を経ずに投与後即座にＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ又はＣＤ３０Ｌを提供できるという優れた特徴を有するといえる。【００９４】
［実験例３］  
（ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ及びＧＩＴＲＬ遺伝子から２個の遺伝子を保持するＢＣ−ＰＩＶの構築）
これまで、ＢＣ−ＰＩＶに導入されたＴＮＦスーパーファミリーのリガンド遺伝子は１個であった。ＢＣ−ＰＩＶウイルス作製用プラスミドには外来遺伝子を導入可能部位がＮｏｔＩ及びＭｌｕＩ制限酵素部位の２か所ある。ｈＰＩＶ２は上流のＮｏｔＩに挿入した遺伝子のほうが、発現極性効果により発現量は高いことが知られている。そこで、ＯＸ４０Ｌ遺伝子、４−１ＢＢＬ遺伝子、及びＧＩＴＲＬ遺伝子をウイルス作製用プラスミドのＮｏｔＩ及びＭｌｕＩに導入し、２つの遺伝子を発現するＢＣ−ＰＩＶの回収を検討した（図８）。
２個の遺伝子と挿入部位の組合せは、図８に示したように、マウスの場合（１：Ｍ１）ＮｏｔＩ：ＯＸ４０Ｌ＋ＭｌｕＩ：４−１ＢＢＬ、（２：Ｍ２）ＮｏｔＩ：４−１ＢＢＬ＋ＭｌｕＩ：ＯＸ４０Ｌ、（３：Ｍ３）ＮｏｔＩ：ＯＸ４０Ｌ＋ＭｌｕＩ：４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ、（４：Ｍ４）ＮｏｔＩ：４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ＋ＭｌｕＩ：ＯＸ４０Ｌ、（５：Ｍ５）ＮｏｔＩ：ＧＩＴＲＬ＋ＭｌｕＩ：ＯＸ４０Ｌ及び（６：Ｍ６）ＮｏｔＩ：ＧＩＴＲＬ＋ＭｌｕＩ：４−１ＢＢＬとした。
ヒトの場合は、（７：Ｈ７）ＮｏｔＩ：ＯＸ４０Ｌ＋ＭｌｕＩ：４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ、及び（８：Ｈ８）ＮｏｔＩ：４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ＋ＭｌｕＩ：ＯＸ４０Ｌとした。
ウイルスの回収は実施例１に記載したリバースジェネティクス法により行った。その結果（１）乃至（８）のすべてのＢＣ−ＰＩＶウイルスを回収することができた。【００９５】
［実験例４］  
（ＯＸ４０Ｌ及び４−１ＢＢＬ遺伝子の２個遺伝子を保持するＢＣ−ＰＩＶへの２種類のリガンドの取込み）
図８に示したＭ１−Ｍ４の組合せ（（１）ＮｏｔＩ：ＯＸ４０Ｌ＋ＭｌｕＩ：４−１ＢＢＬ、（２）ＮｏｔＩ：４−１ＢＢＬ＋ＭｌｕＩ：ＯＸ４０Ｌ、（３）ＮｏｔＩ：ＯＸ４０Ｌ＋ＭｌｕＩ：４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ、（４）ＮｏｔＩ：４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ＋ＭｌｕＩ：ＯＸ４０Ｌ）の、ＢＣ−ＰＩＶへの取込みについて検討した。培地上清から回収した１０６粒子をウエスタンブロットに供した。用いた抗体及び希釈倍率もこれまでのウエスタンブロット試験と同様に行った。
図９の結果から分かるように、Ｍ１−Ｍ４の組合せにおいて、２つのタンパクが共にＢＣ−ＰＩＶ粒子に取込まれていた。ＮｏｔＩとＭｌｕＩのそれぞれに導入した遺伝子から翻訳されたタンパクの取込み量を比較すると、極性効果により発現量が高いＮｏｔＩに導入した遺伝子産物のほうの取込み量が高かった。【００９６】
（ＧＩＴＲＬ遺伝子（ＮｏｔＩ）及び４−１ＢＢＬ遺伝子又はＯＸ４０Ｌ遺伝子（ＭｌｕＩ）を保持するＢＣ−ＰＩＶのへのリガンドの取込み）
図８に示したＭ５−Ｍ６の組合せ（（５）ＮｏｔＩ：ＧＩＴＲＬ＋ＭｌｕＩ：ＯＸ４０Ｌ及び（６）ＮｏｔＩ：ＧＩＴＲＬ＋ＭｌｕＩ：４−１ＢＢＬ）の、ＢＣ−ＰＩＶへの取込みについて検討した。
試験方法はこれまでと同様の方法で実施した。結果を図１０に示した。図１０のレーン２、３に示すように（５）及び（６）のＮｏｔＩに導入したＧＩＴＲＬのＢＣ−ＰＩＶ粒子への取込みが確認された。また、（５）のＭｌｕＩに導入したＯＸ４０Ｌ（レーン５）及び（６）のＭｌｕＩに導入した４−１ＢＢＬのＢＣ−ＰＩＶ粒子への取込みも確認された（レーン７）
これらの結果から、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬは狙い通りにＢＣ−ＰＩＶ粒子に取込まれていた。【００９７】
（ヒトＯＸ４０Ｌ遺伝子及びヒト４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ遺伝子の２個遺伝子を保持するＢＣ−ＰＩＶへの２種類のリガンドの取込み）
図８に示したＨ７−Ｈ８の組合せ（（７）ＮｏｔＩ：ＯＸ４０Ｌ＋ＭｌｕＩ：４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ、及び（８）ＮｏｔＩ：４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ＋ＭｌｕＩ：ＯＸ４０Ｌ））の、ＢＣ−ＰＩＶへの取込みについて検討した。
試験方法はこれまでと同様の方法で実施した。
図１１のレーン２、３に示すように（７）のＮｏｔＩに導入したヒトＯＸ４０Ｌ及びＭｌｕＩに導入したヒトＯＸ４０ＬはＢＣ−ＰＩＶ粒子に取込まれていた。量的には、ＮｏｔＩに導入したヒトＯＸ４０Ｌの取込み量のほうが遥かに多かった。一方、図１１のレーン５、６に示すようにヒト４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴは（７）のＭｌｕＩに導入した試料では、取込みが確認できなかった。（８）のＮｏｔＩに導入した４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ試料ではＢＣ−ＰＩＶ粒子への取込みが確認できた。
これらの結果から、マウスではＢＣ−ＰＩＶ粒子にＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、及びＧＩＴＲＬからなる群から選ばれる２種類のタンパク質を取込むことができた。ヒトでは取込まれない場合もあり、各々の組み合わせについて検討する必要があるが、ＢＣ−ＰＩＶに２つのＴＮＦＳＦリガンドタンパクを導入することができた。つまり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏにおいて、１細胞で２種類のＴＮＦＲＳＦシグナルの同時活性化による効果を得ることが可能となる。【００９８】
［実験例５］
（マウス及びヒトＯＸ４０／４−１ＢＢ受容体とＢＣ−ＰＩＶ上のＯＸ４０Ｌ／４−１ＢＢＬの結合の確認）
ＴＮＦＲＳＦシグナルが活性化されるためには、ＯＸ４０受容体とリガンド又は４−１ＢＢ受容体とリガンドの結合がトリガーとなるために、結合の確認は重要である。
ＯＸ４０Ｌ（マウス又はヒト）、ＯＸ４０Ｌ-ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ（マウス又はヒト）、４−１ＢＢＬ（マウスのみ）又は４−１ＢＢＬ-ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ（マウスのみ）を保持すると考えられる１ｘ１０６粒子のＢＣ−ＰＩＶを９６穴のＥＬＩＳＡプレートの１ウエルに一晩貼り付け、ブロックエース（雪印メグミルク）で処理後３量体のマウスＯＸ４０受容体（Ｃ末端ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  Ｔａｇを付加（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ、  Ｃａｔ＃７８９０４））、ヒトＯＸ４０受容体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ、  Ｃａｔ＃７８０８０４）、又はマウス４−１ＢＢ受容体（Ｃ末端ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  Ｔａｇを付加（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ，  Ｃａｔ＃７５６７０４））を、１、１０、５０、１００ｎｇ添加し、ヒトのＦｃ領域に吸着するＨＲＰをコンジュゲートしたＰｒｏｔｅｉｎＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ、  Ｃａｔ＃６８９２０２）を加えＰＯＤ基質ＴＭＢキット（ナカライテスク）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。試験は各４連で実施した。
マウスの結果を図１２に、ヒトの結果を図１３に示す。【００９９】
まず、マウスの結果を示す。ＢＣ−ＰＩＶに取込まれた、ＯＸ４０Ｌ及びＯＸ４０Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴはＯＸ４０受容体の添加濃度依存的に吸光度が上昇し、ＯＸ４０に吸着した。結合能はＯＸ４０Ｌ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴに比べてＯＸ４０Ｌのほうが高い(図１２左図)。
４−１ＢＢＬ及び４−１ＢＢＬ-ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴも４−１ＢＢ受容体の添加濃度依存的に吸光度が上昇するが、添加量が１０ｎｇを超えると、平衡に達する。結合は４−１ＢＢＬ-ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴに比べて４−１ＢＢＬのほうが高い(図１２右図)。
１ｘ１０６粒子のＢＣ−ＰＩＶに取込まれる、ＯＸ４０Ｌ及び４−１ＢＢＬタンパク数が同程度であると想定するとＢＣ−ＰＩＶに取込まれる４−１ＢＢＬタンパクのほうがＯＸ４０Ｌに比べて、結合能が高いと想定される。
これらの結果から、ＢＣ−ＰＩＶに取込まれたＴＮＦＳＦのリガンドはＴＮＦＳＦ受容体と結合してシグナルを活性化する可能性が高いことが示唆された。【０１００】
次にヒトの結果について図１３に示す。ＢＣ−ＰＩＶに取込まれた、ＯＸ４０ＬはＯＸ４０受容体の添加濃度依存的に吸光度が上昇し、ＯＸ４０に吸着した。しかしＯＸ４０Ｌ-ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴは全くほとんど反応しなかった。これは、図４で示したように、ＯＸ４０Ｌ-ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴはウイルス粒子に取込まれないとの結果と符合する。
これらの結果から、ＢＣ−ＰＩＶ粒子に取込まれたヒトＴＮＦＳＦリガンドもＴＮＦＳＦ受容体に結合することが確認でき、マウス結果のヒトへの外挿性の可能性が示された。【０１０１】
（ＢＣ−ＰＩＶに取込まれたタンパク質が多量体であることの確認）
ＢＣ−ＰＩＶに取込まれたマウス４−１ＢＢＬ、４−１ＢＢＬ―ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ、及びヒトＣＤ２７Ｌを還元剤（ＤＴＴ）有無のサンプルバッファー処理下で４−１ＢＢＬ、４−１ＢＢＬ―ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ及びＣＤ２７Ｌの状態を調べた(図１４)。試料回収時の還元剤無添加状態の４−１ＢＢＬ、４−１ＢＢＬ―ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ及びＣＤ２７Ｌは、ＤＴＴの添加により、多量体構造が会合した高分子量（偶数レーン〇）の状態から多量体構造の崩れた低分子量(奇数レーン)の状態にシフトした。これらの結果から、マウス４−１ＢＢＬ、４−１ＢＢＬ―ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ及びヒトＣＤ２７ＬはＢＣ−ＰＩＶ粒子上で高分子量の多量体（基本は三量体を形成し、更に三量体が会合）を形成しているものと予想された。【０１０２】
［実験例６］
（マコモより単離したパントエア菌ＬＰＳの精製（熱（１２１℃、２０分）＋冷ＥｔＯＨによる抽出））
マコモより単離したパントエア菌を培養して得られた菌体３．５ｇを、５０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、オートクレーブ（１２１℃、２０分間）し、室温まで冷した。遠心（１０，０００ｒｐｍ（９，１００ｘｇ）、３０分間）処理し、上清を回収した。上清２０ｍＬに、５Ｍ塩化ナトリウム３ｍＬと１００％エタノール２７ｍＬを加えて−８０℃で一晩静置した。室温で解凍後、４℃で１００００ｒｐｍ（９，１００ｘｇ）、３０分間遠心分離し、上清を除去後、７０％エタノール５ｍＬに懸濁、４℃で１００００ｒｐｍ（９，１００ｘｇ）、２０分間遠心分離し、上清を除去後、十分に乾燥させた。１０ｍＬの蒸留水に溶かし、以下の試験に用いた。大腸菌のＬＰＳ、１μｇ、３μｇと共に試料溶液、０．５μＬ、１μＬ 、２μＬ 、３μＬ及び５μＬを電気泳動し、銀染色を行った（図１５参照。）。熱（１２１℃、２０分）＋冷ＥｔＯＨによる抽出ＬＰＳの特性は、大腸菌のＬＰＳに比べて低分子が中心であった。大腸菌のＬＰＳの分子量とは異なっていた。大腸菌のＬＰＳを参照に、凡そ０．５μｇ/μＬの濃度であると見積もった。【０１０３】
（ＬＰＳの特性）
今回回収した試料には低分子量のＬＰＳと考えられる産物がほとんどである（図１５参照。）。高分子量のＬＰＳにおいてより毒性が高いとされる。
ＬＰＳにより活性化されたマクロファージより産生されたＴＮＦαが好中球を活性化しエステラーゼが血管内皮細胞を障害する。がんに対して出血性の壊死を誘発する。また、血液凝固の促進や微小循環障害を引き起こし、ＤＩＣ（播種性血管内凝固症候群）の原因となる。しかし、低用量のＴＮＦαは抗腫瘍免疫にとって有用なサイトカインであると考えられている。
ＬＰＳはＴＮＦα等のサイトカインを誘導する一方で、樹状細胞及びＮＫ細胞の活性化能がある。我々は、抗腫瘍免疫には、がん細胞特異的なＣＴＬ等による獲得免疫の他にＮＫ細胞等による自然免疫も重要であり、ＴＮＦＲＳＦシグナルによるＣＴＬ等による獲得免疫に加えて、低分子ＬＰＳによるＮＫ細胞の活性化による相乗効果についても検討するために、当該ＬＰＳによるＮＫ細胞の活性化について検討した。【０１０４】
（熱（１２１℃、２０分）＋冷ＥｔＯＨ法により抽出したＬＰＳによるＮＫ細胞の活性化）
パントエア菌より取得した熱（１２１℃、２０分）＋冷ＥｔＯＨ法により抽出したＬＰＳの抽出物を単独又はＮＫ細胞の阻害剤である抗アシアロＧＭ１抗体と共にマウスに移植したＣＴ２６マウス大腸がん腫瘍に投与し抗腫瘍効果を調べた。マウスの腹側を除毛後、５ｘ１０５個のＣＴ２６マウス大腸がん細胞を腹側皮下（ＳＣ）部位に麻酔下で接種した。抗アシアロＧＭ１抗体は、ＬＰＳの投与３日前に腹腔内に１００μＬ（和光純薬工業；コード＃０１４−０９８０１）を投与した。腫瘍の長径が５−７ｍｍに達した際に、５μｇ（１０μＬ）を腫瘍内に接種した。投与２及び７日後の様子を図１６に示した。投与後マウスは立毛等症状を呈した。投与２日後には、腫瘍領域は黒色に変化した。投与７日後では、腫瘍部位の黒色領域は縮小したが、ＬＰＳ＋抗アシアロＧＭ１抗体投与マウスでは、壊死腫瘍近傍より新たな腫瘍の生育が認められた（図１６右下〇部分参照。）。一方、ＬＰＳのみ投与マウスでは新しい腫瘍の生育は認められなかった。当該ＬＰＳにはＮＫ細胞を誘導する可能性のあることが示された。【０１０５】
［実験例７］
（ＯＸ４０Ｌ遺伝子をＢＣ−ＰＩＶウイルス作製用プラスミドのＭｌｕＩ部位に導入したＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ、抗マウスＯＸ４０アゴニスト抗体投与によるＣＴマウス２６大腸がんに対する抗腫瘍効果）
本実験例のポイントは、ＣＴ２６細胞を２か所に接種し、ＢＣ−ＰＩＶ、ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ及びＢＣ−ＰＩＶ＋抗マウスＯＸ４０アゴニスト抗体を、２か所の内の１か所の固形がんに投与し、投与部位と遠隔部位における腫瘍退縮効果を調べることにある。
抗マウスＯＸ４０アゴニスト抗体は単独使用では効果がないことが報告されており（非特許文献９参照。）、今回単独投与は実施しなかった。
マウスの腹側を除毛後、１×１０６個のＣＴマウス２６大腸がん細胞を腹側皮下（ＳＣ）部位２か所に麻酔下で接種した。６日後、腫瘍の長径が５−７ｍｍに達した動物を以下の各群（各３匹）に振分け、２か所のがんの１か所に試料を投与した。投与は１日おきに３回行った。【０１０６】
第１群：ＰＢＳ投与群
第２群：ＢＣ−ＰＩＶ投与群
第３群：ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ投与群
第４群：ＢＣ−ＰＩＶ＋抗マウスＯＸ４０アゴニスト抗体投与群
各試料を６０μＬに調製し投与した。【０１０７】
腫瘍容量の経時的変化の結果を図１７に示す。ＰＢＳは、２匹の平均値を、他は３匹の平均値をとった。３回目の投与後より、３日毎又は４日毎に腫瘍径を測定し、短径ｘ短径ｘ長径ｘ０．５の計算により腫瘍容量とした。長径が凡そ１５ｍｍに達した動物は、倫理上死亡したものとして処理した。【０１０８】
投与したＢＣ−ＰＩＶのウイルス量は、５．３×１０７粒子である。ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０ＬはＯＸ４０Ｌ遺伝子を、ＢＣ−ＰＩＶ作製用プラスミドのＭｌｕＩ制限酵素部位に導入して回収したウイルスを使用した。ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌのウイルス量は６．５×１０７粒子である。抗マウスＯＸ４０アゴニスト抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ、ｃａｔ♯：１１９４０８）は５μｇを用いた。
結果を図１７に示した。投与部位の腫瘍容量は、ＢＣ−ＰＩＶ＋抗マウスＯＸ４０アゴニスト抗体投与群の３匹の内２匹で、腫瘍容量が０となり消失した。ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ投与群３匹の内２匹で、腫瘍がほとんど退縮した。腫瘍への直接投与部位では、ＰＢＳ投与群とＢＣ−ＰＩＶ投与群間で腫瘍容量に大きな差が認められ、ＢＣ−ＰＩＶ投与群のみでも抗腫瘍活性が認められた。    
また、ＢＣ−ＰＩＶ投与群とＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ投与群間では腫瘍容量に明らかな差があり、ＢＣ−ＰＩＶ上に取込まれたＯＸ４０Ｌの効果が大きいものと考えられた。ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ投与群とＢＣ−ＰＩＶ＋抗マウスＯＸ４０アゴニスト抗体投与群では、腫瘍の容量に両者間にあまり大きな差が認められず、ＢＣ−ＰＩＶ＋抗マウスＯＸ４０アゴニスト抗体投与群で２匹の腫瘍が消失、ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌの２匹の腫瘍もかなり退縮した。【０１０９】
遠隔腫瘍は、ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ及びＢＣ−ＰＩＶ＋抗マウスＯＸ４０アゴニスト抗体投与群で、他の群に比べて明らかに増殖抑制効果が認められた（図１７参照。）。
Ｉｄｉｔ Ｓａｇｉｖ−Ｂａｒｆｉ等は、Ｓｃｉ. Ｔｒａｎｓｌ. Ｍｅｄ.（非特許文献９参照。）で抗マウスＯＸ４０アゴニスト抗体単独投与では、投与部位及び遠隔部位での抗腫瘍抑制効果はほとんど認められず、ＣｐＧ ＤＮＡとの組合せ投与により、ＣＤ４陽性Ｔ細胞にＯＸ４０が誘導され、両者を組合せることにより、投与部位及び遠隔部位で高い抗腫瘍効果が得られると指摘している。今回ＢＣ−ＰＩＶと抗マウスＯＸ４０アゴニスト抗体の組合せで腫瘍抑制効果が認められたことから、ＢＣ−ＰＩＶ単独でＣＤ４陽性Ｔ細胞にＯＸ４０の発現を誘導する効果があると考えられた。【０１１０】
［実験例８］
（ＢＣ−ＰＩＶ、抗マウスＯＸ４０アゴニスト抗体、ＬＰＳのＣＴ２６大腸がんに対する抗腫瘍効果）
また、Ｉｄｉｔ Ｓａｇｉｖ−Ｂａｒｆｉ等は、Ｓｃｉ. Ｔｒａｎｓｌ. Ｍｅｄ.（非特許文献９参照。）では、ＣｐＧ ＤＮＡ＋抗マウスＯＸ４０アゴニスト抗体の固形がんへの投与後、腫瘍（がん）組織でＮＫ細胞数の速やかかつ顕著な増加が認められると指摘しており、ＮＫ細胞数の顕著な増加が、がん細胞増殖抑制をもたらすと考えられる。
また、ＣＴＬ活性化のため、腫瘍細胞特異的ＣＴＬエピトープを提示する樹状細胞の活性化も重要である。発明者らは、以前に植物マコモ共生パントエア菌由来のＬＰＳが樹状細胞を強く成熟化させることを報告した(特許文献３参照)。また、ＬＰＳ単独でＮＫ細胞を活性化できることについては図１６に記載した。【０１１１】
そこで、今回当該ＬＰＳ、ＢＣ−ＰＩＶ、抗マウスＯＸ４０アゴニスト抗体を組合せ、抗腫瘍効果について調べた。マウス腹側を除毛後、腹側皮下（ＳＣ）部位３か所（５×１０５個(１か所)、３×１０５個（２か所)）にＣＴマウス２６大腸がん細胞を麻酔下で接種した。５日後、腫瘍の長径が５−７ｍｍに達した３か所のがんの１つに試料を投与した。投与は、１日置きに３回行った。パントエア菌より熱（１２１℃、２０分）＋冷ＥｔＯＨ法により抽出したＬＰＳ、ＢＣ−ＰＩＶ、抗マウスＯＸ４０アゴニスト抗体を組合せて投与した。図１８に投与３０日後の最も効果の高いＬＰＳ（２．５μｇ）＋ＢＣ−ＰＩＶ（５×１０７粒子）＋抗マウスＯＸ４０アゴニスト抗体(５μｇ)の組合せ投与結果を示す。【０１１２】
ＰＢＳ投与に比べて、ＢＣ−ＰＩＶ＋抗マウスＯＸ４０アゴニスト抗体の組合せ投与、及びＬＰＳ＋ＢＣ−ＰＩＶ＋抗マウスＯＸ４０アゴニスト抗体の組合せ投与(３匹の内１匹)（図１８の真ん中のマウス参照。）で高い腫瘍抑制効果を示した。特に後者の組合せは投与時に大きな腫瘍を選抜し投与を行った。【０１１３】
（ＬＰＳの効果）
図１６においてＬＰＳの効果が示唆されたので、ＯＸ４０Ｌ遺伝子をウイルス作製用プラスミドのＭｌｕＩ部位に導入したＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０ＬとＬＰＳの組合せでＬＰＳの効果を調べた。ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌの投与粒子数を１．６×１０７粒子とし、投与回数は、通常投与より１回少ない２回とした。投与は、ＰＢＳ投与群(コントロール群)、ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ＋ＬＰＳ(０μg)投与群、 ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ＋ＬＰＳ (２．５μｇ) 投与群、ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ＋ＬＰＳ（５μｇ）投与群、ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ＋ＬＰＳ (１２．５μｇ) 投与群、ＬＰＳ (１２．５μｇ) 投与群に分けて行った。動物数はすべてｎ＝３とし、腫瘍容量はその平均値で示した。３匹の内２匹を死亡とみなした場合には、その群は除外した。【０１１４】
図１９に２回目の投与時の腫瘍の様子を示し、図２０に腫瘍容量の結果を示す。ＬＰＳを投与した腫瘍部位は黒く変色し、ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌと組合せた場合、投与部位では、ＬＰＳの量に依存して腫瘍の増殖が抑制されることが確認された（図２０左図参照。）。ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ＋ＬＰＳ (１０μｇ)群、及びＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ＋ＬＰＳ (１２．５μｇ)群で２匹、ＬＰＳ (１２．５μｇ)群で１匹、投与側の腫瘍が消失した。ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ＋ＬＰＳ （１２．５μｇ）群のみｄａｙ１９まで死亡は認められなかった。ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ＋ＬＰＳ（１０μｇ）群とＬＰＳ (１２．５μｇ)群の各１匹は、投与時の腫瘍径が比較的小さい遠隔がん（各３．２×５．２ｍｍ及び３．２×３．５ｍｍ）は、投与部位及び遠隔腫瘍ともに退縮した。コントロール群は、投与部位での腫瘍の増大が大きく早期に死亡した。コントロール群に比べて他の群の腫瘍の増殖は大きくなかった。【０１１５】
一方、遠隔の腫瘍容量については、死亡除外による差異は、多少はあるが、ＬＰＳ濃度に依存した遠隔部位腫瘍の縮小に及ぼす影響は小さいと考えられた（図２０参照。）。ＰＢＳ投与群は腫瘍の急激な増大により早期に除外した。【０１１６】
今回の試験では、ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌの投与回数を抑え、ＬＰＳの投与容量の詳細について調べた。ＬＰＳ投与では、初回投与から３日目の結果を示した図１９からわかるように１回目の投与翌日から投与腫瘍部位が黒くなり、投与２日後には腫瘍が極めて小さくなった。ＬＰＳの投与量が多いと、２回目の投与の際に、腫瘍が縮小し、ほとんど試料を腫瘍内に効果的に投与できない場合があった。
ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ＋ＬＰＳ（５μｇ）投与１日後の腫瘍組織のＨＥ染色像では、出血痕と腫瘍細胞とは形態が全く異なった大量の単核の円形細胞が充実性に浸潤増殖しているのが観察された。腫瘤のより中心部には散在性の微細出血を伴った変性壊死巣が認められ、ヘモジデリンを貪食するマクロファージも多く観察されことから、ＬＰＳにより誘導された多量のＴＮＦαによる、急激ながん細胞出血性の壊死を誘発したことが予想された。しかし、ＬＰＳ（１２．５μｇ）投与群とＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ＋ＬＰＳ（１２．５μｇ）投与群間に投与部位での腫瘍増殖に差が認められたことから、ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌの効果もあることが分った。
一方、遠隔部位のがんでは、ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌの投与回数が２回と少ないため通常の３回投与に比べて効果が高くなく、ＬＰＳの容量も遠隔部位の抗腫瘍効果への影響があまり認められなかった。試験結果から、今回用いた容量のＬＰＳ投与では腫瘍の出血壊死が認められたので、ＬＰＳを添加する場合ＬＰＳ投与量を減らす必要があると考えられた。【０１１７】
［実験例９］
（ＯＸ４０ＬのＮＫ細胞、並びに、ＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性Ｔ細胞への影響と４−１ＢＢＬの効果）
Ｉｄｉｔ Ｓａｇｉｖ−Ｂａｒｆｉ等のＣｐＧ ＤＮＡと抗マウスＯＸ４０アゴニスト抗体の固形腫瘍への同時投与による投与部位及び遠隔部位への抗腫瘍効果の報告で、腫瘍内に集積したＮＫ細胞に４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）の速やかな上昇を指摘した。そこで、今回はＯＸ４０Ｌ及び４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴを導入したＢＣ−ＰＩＶの効果についても確認すると共に、抗腫瘍免疫にＮＫ細胞及びＣＤ４／８陽性Ｔ細胞の関与を調べるために、阻害剤（ＮＫ細胞は抗アシアロＧＭ１抗体、ＣＤ４／８陽性Ｔ細胞は、抗マウスＣＤ４／８抗体）を使用し、腫瘍の増殖への影響を調べた。
ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ又はＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ  ＣＴは、ＢＣ−ＰＩＶ作製プラスミドのＭｌｕ部位（図１参照。）に所定の遺伝子を導入して作製したものである。投与に用いたＢＣ−ＰＩＶの粒子数は、総数８．１×１０６粒子とした。投与は、１日置きに３回行った。パントエア菌より熱（１２１℃、２０分）+冷ＥｔＯＨにより抽出したＬＰＳを用い投与量を、７．５μｇに固定した。試料の投与容量は、６０μＬとした。【０１１８】
マウスの腹側を除毛後、５×１０５個のＣＴ２６マウス大腸がん細胞を、腹側皮下（ＳＣ）部位２か所に麻酔下で接種した。１週間後、腫瘍の長径が５−７ｍｍに達した動物を以下の各群（各３匹）に振分け、２か所のがんの１つにそれぞれ試料を投与した。
投与は以下の１２群に分けて実施した。初回投与日をｄａｙ０として腫瘍径を測定した。ＮＫ細胞抑制には抗アシアロＧＭ１抗体（和光純薬、１００μＬ/匹）を、試料投与の３日前に腹腔に投与し、抗ＣＤ４／８抗体（抗ＣＤ４抗体：Ｔｏｎｂｏ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ＃：７０−００４１、１００μｇ／匹、 抗ＣＤ８抗体：Ｂｉｏ Ｘ ｃｅｌｌ、Ｃａｔ＃：ＢＰ００６１、１００μｇ／匹）を最初の試料投与前日と翌日に腹腔内に投与した。【０１１９】
第１群：ＰＢＳ投与群
第２群：ＬＰＳ（７．５μｇ）投与群
第３群：ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ (半量)＋ＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ (半量)＋ＬＰＳ（７．５μｇ）投与群
第４群：ＯＸ４０アゴニスト抗体＋ＬＰＳ（７．５μｇ）投与群
第５群：ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ投与群
第６群：ＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ  ＣＴ投与群
第７群：ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ＋ＬＰＳ（７．５μｇ）投与群
第８群：ＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ＋ＬＰＳ（７．５μｇ） 投与群
第９群：ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ＋ＬＰＳ（７．５μｇ）＋抗ＮＫ抗体投与群
第１０群：ＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ ＋ＬＰＳ（７．５μｇ）＋抗ＮＫ抗体投与群
第１１群：ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ＋ＬＰＳ（７．５μｇ） ＋抗ＣＤ４／８抗体投与群
第１２群：ＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ＋ＬＰＳ（７．５μｇ） ＋抗ＣＤ４／８抗体投与群【０１２０】
結果は、投与した初日をｄａｙ０とした。図２１及び図２２に、ＯＸ４０Ｌ関連について、投与後５日目と１０日目の腫瘍の様子を示した。図２３及び図２４に、４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ関連について、投与後５日目と１０日目の腫瘍の様子を示した。図２５に、ＯＸ４０Ｌ関連投与について、投与部位と遠隔部位についての腫瘍容量の平均値を示した。図２６に、４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ関連投与について、投与部位と遠隔部位についての腫瘍容量の平均値を経時的に示した。
腫瘍容量は、短径×短径×長径×０．５で計算し、３匹の平均とした。最大腫瘍径が１５ｍｍに達した動物は死亡とみなした。測定可能な動物が１匹となった時には、その際の数値は除外した。【０１２１】
今回の試験で、ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ＋ＬＰＳ、又はＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ ＋ＬＰＳの抗腫瘍効果は、抗アシアロＧＭ−１抗体又は抗ＣＤ４／８抗体投与により、投与部位及び遠隔部位の両部位で腫瘍増殖抑制が強く阻害されることが確認された（図２１及び図２２の第９群参照（抗アシアロＧＭ１抗体投与、４日後又は１０日後）、図２３及び図２４の第１０群参照（抗アシアロＧＭ１抗体投与、４日後又は１０日後）、図２１及び図２２の第１１群参照（抗ＣＤ４／８抗体投与、４日後又は１０日後）、図２３及び図２４の第１２群参照（抗ＣＤ４／８抗体投与、４日後又は１０日後）。【０１２２】
図２２の投与１０日目及びの第７群、第９群及び第１１群の腫瘍の様子から分かるように、第７群のＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ＋ＬＰＳでは、投与部位及び遠隔部位で腫瘍が縮小傾向であるのに対して、第９群（第７投与群にＮＫ細胞阻害抗体を追加）及び第１１群では、腫瘍が明らかに増大している。第１１群（第７投与群にＣＤ４／８陽性Ｔ細胞阻害抗体を追加）では、３匹中２匹で腫瘍細胞が腹腔内に転移し、急速に腹部全体が肥大している。第９群は、投与部位での腫瘍の増大が著しい。第７群の３匹のマウスの２つある腫瘍の投与部位（左の動物から向かって右、左、左の腫瘍に投与）だけでなく、遠隔腫瘍においても退縮又は腫瘍の増大抑制が、第９群及び第１１群に比べて著しい。
図２４のＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ＋ＬＰＳ投与の第８群、第１０群（第８投与群にＮＫ細胞阻害抗体を追加）、第１２群（第８投与群にＣＤ４／８陽性Ｔ細胞阻害抗体を追加）についても同様の結果であった。【０１２３】
また、図２５及び図２６の腫瘍容量の結果からも、ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ＋ＬＰＳ又はＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ＋ＬＰＳの抗腫瘍効果は、抗アシアロＧＭ１抗体又は抗ＣＤ４／８抗体投与により、投与部位及び遠隔部位の両部位で腫瘍増殖抑制が強く阻害されていることが理解できる。
これらの結果から、今回のＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ＋ＬＰＳ、又はＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ＋ＬＰＳの高い抗腫瘍効果は、ＮＫ細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞／ＣＤ８陽性Ｔ細胞が強く関与していることが示唆された。以前に、当該ＬＰＳは、樹状細胞の成熟化を強く誘導する（特許文献３参照。）ことを報告しており、樹状細胞の活性化も腫瘍増殖抑制に関与していると考えられる。【０１２４】
次に、図２１及び図２２のＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ＋ＬＰＳ（第７群）とＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ（第５群）についてみると、最終的に両者とも３匹のうち１匹は遠隔も含めて腫瘍が消失した。ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ投与群の投与部位は、３回の投与後一旦腫瘍が大きくなったがその後腫瘍が縮小に転じた。つまり、抗腫瘍効果が投与してから時間がたって起こっている。ＣＴＬは免疫惹起操作の１週間程度で起こったこと、ＣＤ４／８陽性Ｔ細胞の阻害により当該効果が認められないことから、当該腫瘍の縮小の主因はＣＴＬであると考えられた。一方、ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ＋ＬＰＳ投与群の投与部位は図２１の第７群の写真からわかるように投与後直ぐに、投与部位の多くの腫瘍が黒変壊死し、腫瘍の多くが縮小していることから、ＬＰＳにより誘導されたＴＮＦα及びＮＫ細胞による腫瘍細胞死が投与初期段階から起こっていると考えられた。遠隔部位は、ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ投与群では１０日後の写真は腫瘍が大きく見えるが、時間を経るごとに腫瘍は増大せず退縮傾向にあった。これは、ＣＴＬを主とする全身性の抗腫瘍免疫が遠隔部位の腫瘍細胞に作用したものと考えられた。一方、ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ＋ＬＰＳ群の遠隔部位は、時間が経過するとＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌより増大傾向が認められた。【０１２５】
今回、第４群に、ＯＸ４０アゴニスト抗体とＬＰＳの組合せを設定した。第４群と第７群を比較して、ＬＰＳと組合せた抗ＯＸ４０アゴニスト抗体又はＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌの効果は、ほぼ同等か、ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌのほうが優れた効果を示した。ここで、ＬＰＳにもＴ細胞にＯＸ４０受容体の誘導能があることが示唆された。ＢＣ−ＰＩＶのエンベロープ上にＯＸ４０Ｌを取込むことにより、ＯＸ４０受容体を誘導し、ＴＮＦＲＳＦシグナルを効率よく活性化させることが、図１７の結果と共に再確認できた。平行して行った４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴを導入したＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴにおいても同様の効果が認められた。【０１２６】
以上の結果、ＢＣ−ＰＩＶのエンベロープ上に、ＯＸ４０Ｌ及び／又は４−１ＢＢＬを取込むことにより、ＯＸ４０Ｌ及び４−１ＢＢＬタンパク質単独での投与では示すことが難しいとされる高い抗腫瘍効果を、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体と同程度に示すことができ、ＯＸ４０アゴニスト抗体及び４−１ＢＢアゴニスト抗体以外の形態で高い抗腫瘍効果を示すことが確認された。【０１２７】
［実験例１０］
（ウイルス作製用プラスミドのＭｌｕＩ部位に４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ  ＣＴ遺伝子を導入して作製したＢＣ−ＰＩＶのメラノーマ（Ｂ１６マウスメラノーマ細胞）に対する抗腫瘍効果）
ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ又はＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ及び／又はＬＰＳは、マウス大腸がん細胞（ＣＴ２６）に対する抗腫瘍効果が認められた。そこで他の腫瘍(メラノーマ)に対する抗腫瘍効果の有無についても検討した。
Ｂ６マウスの背部を除毛し、５×１０５個のＢ１６マウスメラノーマ細胞を、麻酔下で背部ＳＣ領域２か所に移植した。今回、腫瘍の生育が１か所のマウスが多く（２回目の投与時に別部位に腫瘍が出現したマウスが複数存在した。）、腫瘍径が４−７ｍｍになったマウスの腫瘍に、ＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴとＬＰＳを組合せて投与した。
投与ウイルス量は、１匹あたり５．９×１０７粒子とし、投与ＬＰＳ量は、７．５μｇとし、３回投与した。１群は３匹とした。投与量は６０μＬとした。【０１２８】
第１群：ＢＣ−ＰＩＶ投与群
第２群：ＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ  ＣＴ投与群
第３群：ＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ＋ＬＰＳ（７．５μｇ）投与群【０１２９】
３匹（死亡例は除去した。）の腫瘍容量の平均を図２７に示した。Ｂ１６メラノーマは、ＣＴ２６大腸がん腫瘍と異なり腫瘍内が液体状で、試料投与の際、内容物が流出することが多く見受けられた。Ｂ１６メラノーマの場合、第３群：ＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴ ＋ＬＰＳ（７．５μｇ）群では、腫瘍退縮時間が、ＣＴ２６大腸がんに比べて早く、投与２日後には、がんは変色し退縮していた（ＣＴ２６大腸がんの場合より退縮速度は速かった。）。図２８に投与３日後の様子を示した。第３群では、投与部位のがんは完全に退縮した。この群のマウスで投与後に反対側に腫瘍の増殖が認められたが、内２匹で径が３ｍｍ程度に増殖後退縮し、両側とも腫瘍が完全に消失した。
メラノーマ細胞の抗腫瘍効果には、ＣＴＬの他にＮＫ細胞による自然免疫も重要と指摘されていることから、ＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ ＣＴのＣＴＬ誘導の他にＬＰＳによるＮＫ細胞の活性化も重要であると考えられた。【０１３０】
［実験例１１］
（ウイルス作製用プラスミドのＮｏｔＩ部位にＯＸ４０Ｌ又は４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ  ＣＴ遺伝子を導入して作製したＢＣ−ＰＩＶの抗腫瘍効果）
図２１、２２、２５で示されたようにＯＸ４０Ｌ遺伝子をウイルス作製用プラスミドのＭｌｕＩ部位に導入したＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌの単独投与で、投与部位の腫瘍容量は最終投与後一旦腫瘍が増大しその後縮小に転じた。遠隔部位の腫瘍は投与後腫瘍増殖が抑制された。
ＢＣ−ＰＩＶの遺伝子発現は極性効果を示し、ＢＣ−ＰＩＶウイルス作製用プラスミドの上流のＮＰ遺伝子産物量が最大で下流のL遺伝子に向かって遺伝子産物量は減少する。そのため、ウイルス作製用プラスミドのＭｌｕＩ部位よりプラス鎖の５´上流側のＮｏｔＩ部位に外来遺伝子を導入したＢＣ−ＰＩＶのほうが導入遺伝子の発現量は多くなる。そこで、ＮｏｔＩ部位にＯＸ４０Ｌ又は４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ  ＣＴ遺伝子を導入したＢＣ−ＰＩＶを用い抗腫瘍効果を調べた。
動物モデルと投与回数・間隔はこれまでの試験と同様とした。ＰＢＳ、ＢＣ−ＰＩＶ(２．１ｘ１０７粒子)，ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ（ＮｏｔＩ）(２．１ｘ１０７粒子)及びＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ  ＣＴ（ＮｏｔＩ）(２．１ｘ１０７粒子）を３回投与した。
初回投与２３日後の腫瘍増殖の結果を図２９に示す。ＰＢＳ、ＢＣ−ＰＩＶ投与では、投与部位及び遠隔部位の腫瘍は増殖し、抗腫瘍効果は認められなかった。一方、ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ及びＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ  ＣＴを投与したマウスは、投与開始から２３日後には図に示すように投与部位及び遠隔部位ともに完全に退縮した。ＴＮＦＳＦのリガンドタンパクをＢＣ−ＰＩＶ上により多く搭載することにより、より高い抗腫瘍効果を示すことが分かった。また、パントエア菌のＬＰＳを用いることなく投与部位及び遠隔部位の腫瘍に対して退縮効果が示された。【０１３１】
（２個のＴＮＦＳＦリガンド遺伝子を保持するＢＣ−ＰＩＶの抗腫瘍効果の検討（ＯＸ４０Ｌ及び４−１ＢＢＬの２個の遺伝子を保持するＢＣ−ＰＩＶの抗腫瘍効果））
今回５種類のＴＮＦＳＦリガンド遺伝子をそれぞれＢＣ−ＰＩＶに導入した。５種類のＴＮＦＲＳＦシグナルがすべて同じ特性をもっているとは限らず、抗腫瘍作用も異なっていると考えられる。そこで、２種類のＴＮＦＳＦリガンドを１つのＢＣ−ＰＩＶに導入しその効果について検討した。
２個の遺伝子を導入したＢＣ−ＰＩＶにおける各リガンドタンパク質の搭載量は、図９のウエスタンブロットに示した。【０１３２】
担癌マウスの作製、投与容量、投与回数等はこれまでの方法に従った。投与群を以下に示した。
第１群：ＢＣ−ＰＩＶ投与群
第２群：ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ（ＮｏｔＩ）・４−１ＢＢＬ（ＭｌｕＩ）投与群
第３群：ＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ（ＮｏｔＩ）・ＯＸ４０Ｌ（ＭｌｕＩ）投与群
第４群：ＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ−ＰＩＶ２−ＨＮ  ＣＴ（ＮｏｔＩ）・ＯＸ４０Ｌ
（ＭｌｕＩ）投与群【０１３３】
各試料を５０μＬに調製し投与した。今回は、投与ウイルス量が１．６×１０６粒子と通常より低い量で、単独投与ではあまり抗腫瘍効果が得られないウイルス量である。投与方法はこれまでと同様とした。
結果を図３０に示した。リガンドを２個導入したＢＣ−ＰＩＶへの各リガンドタンパク質の取込み量は図９に示したように異なっている。今回の結果は、４−ＢＢＬの発現量が多い組合せに腫瘍抑制効果があり、第３群のＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ（ＮｏｔＩ）・ＯＸ４０Ｌ（ＭｌｕＩ）投与群に最も高い効果が認められた。
一方、ＯＸ４０Ｌと４−１ＢＢＬの組合せ以外は、それほどの高い相乗効果が認められなかったので、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ及びＣＤ３０Ｌの発現確認と共にＧＩＴＲＬとＯＸ４０Ｌ又は４−１ＢＢＬとの組合せについて抗腫瘍効果の検討を行った。【０１３４】
（ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ及びＣＤ３０Ｌの抗腫瘍効果と２個のリガンドタンパク（ＧＩＴＲＬ／ＯＸ４０Ｌ及びＧＩＴＲＬ／４−ＢＢＬ）による抗腫瘍効果の検討）
ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ及びＣＤ３０Ｌを保持するＢＣ−ＰＩＶ／ＧＩＴＲＬ、ＢＣ−ＰＩＶ／ＣＤ２７Ｌ又はＢＣ−ＰＩＶ／ＣＤ３０Ｌの抗腫瘍効果、及びＧＩＴＲＬとＯＸ４０Ｌ又はＧＩＴＲＬ及び４−１ＢＢＬの２つのタンパク質を保持するＢＣ−ＰＩＶの抗腫瘍効果について検討した。
実験はマウスへのＣＴ２６大腸がん細胞移植、腫瘍への投与はこれまでと同じように、マウスの腹側を除毛後、５×１０５個のマウスＣＴ２６大腸がん細胞を腹側皮下（ＳＣ）部位２か所に麻酔下で接種した。６日後、腫瘍の長径が５−７ｍｍに達した動物を以下の各群（各３匹）に振分け、２か所のがんの１か所に試料を投与した。投与は１日おきに３回行った。
投与ウイルス量は、１匹当たりＢＣ−ＰＩＶ：９．０×１０６粒子、ＢＣ−ＰＩＶ／ＧＩＴＲＬ：９．０×１０６粒子、ＢＣ−ＰＩＶ／ＣＤ２７Ｌ：９．０×１０６粒子又はＢＣ−ＰＩＶ／ＣＤ３０Ｌ：９．０×１０６粒子、ＢＣ−ＰＩＶ／ＧＩＴＲＬ（ＮｏｔＩ）・ＯＸ４０Ｌ（ＭｌｕＩ）：２．４×１０６粒子、ＢＣ−ＰＩＶ／ＧＩＴＲＬ（ＮｏｔＩ）・４−１ＢＢＬ（ＭｌｕＩ）：２．４×１０６粒子とした。２個のタンパク質を導入したＢＣ−ＰＩＶの投与粒子数は、他に比べて約１／４のウイルス数であった。【０１３５】
担癌マウスの作製、投与容量、投与間隔はこれまでと同様の方法に従った、投与群を以下とした。
第１群：ＰＢＳ投与群
第２群：ＢＣ−ＰＩＶ投与群
第３群：ＢＣ−ＰＩＶ／ＧＩＴＲＬ投与群
第４群：ＢＣ−ＰＩＶ／ＣＤ３０Ｌ投与群
第５群：ＢＣ−ＰＩＶ／ＣＤ２７Ｌ投与群
第６群：ＢＣ−ＰＩＶ／ＧＩＴＲＬ（ＮｏｔＩ）・ＯＸ４０Ｌ（ＭｌｕＩ）
第７群：ＢＣ−ＰＩＶ／ＧＩＴＲＬ（ＮｏｔＩ）・４−１ＢＢＬ（ＭｌｕＩ）
試料は第１群から第５群には６０μＬ、第６群７群には５０μＬを調製し投与した。【０１３６】
腫瘍容量の経時的変化の結果を図３１に示す。２又は３匹の平均値をとった。初回投与日より図に示した日にちに腫瘍径を測定した。３回目の投与後より、３日毎又は４日毎に腫瘍径を測定し、短径×短径×長径×０．５により腫瘍容量とした。長径が凡そ１５ｍｍに達した動物は、倫理上死亡したものとして処理した。
図から分かるように、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ及びＣＤ３０Ｌ保持ＢＣ−ＰＩＶの各単独投与群では、ＧＩＴＲＬは少し劣るが、それぞれ投与部位及び遠隔部位において未処理群及びＢＣ−ＰＩＶ投与群に比べて、抗腫瘍効果が認められた。
一方、ＧＩＴＲＬとＯＸ４０Ｌ又はＧＩＴＲＬと４−１ＢＢＬの組合せ投与群では、投与ウイルス量が単独導入に比べて約１／４と少なく、またＯＸ４０Ｌ又は４−１ＢＢＬ単独では効果があまり期待できないウイルス量であるにも拘わらず、投与部位及び遠隔部位において高い抗腫瘍効果が認められた(初回投与２４日後：図３２参照)。２４日後には無処置コントロールでは、３匹中２匹が死亡したが、驚くことにＧＩＴＲＬ／ＯＸ４０Ｌの投与群マウスでは３匹中３匹が投与部位及び遠隔部位の腫瘍が退縮した。ＧＩＴＲＬ／４−１ＢＢＬの投与群マウスでは３匹中２匹が投与部位及び遠隔部位の腫瘍が退縮した。
これらの結果、ＢＣ−ＰＩＶは単独でＴＮＦＳＦリガンド保持する場合より、２個のリガンドを保持するＢＣ−ＰＩＶが高い抗腫瘍効果を示す可能性が示された。
当該試験で、図３３で示すようにＣＤ３０Ｌ投与マウスでは３匹中３匹とも投与部位の腫瘍のみ退縮し、遠隔部位の腫瘍は増大した。【０１３７】
（不活化したＢＣ−ＰＩＶを用いた抗腫瘍免疫効果の検討）
ＴＮＦＲＳＦを活性化するアゴニスト抗体（抗ヒト４−ＢＢＬ）を用いた臨床試験で肝毒性の有害事象が報告されている。ＴＮＦＳＦリガンドを導入したＢＣ−ＰＩＶの利用はそのようなリスクを低減するために考案されたものである。さらに、安全性を高める観点から、不活化したＢＣ−ＰＩＶを用いて抗腫瘍効果を検討した。ＢＣ−ＰＩＶの不活化は、特許６３５８７０６号公報に従って実施した。【０１３８】
不活化ＢＣ−ＰＩＶの有効性評価は、ＯＸ４０Ｌ又は４−１ＢＢＬを導入したＢＣ−ＰＩＶを用いて実施した。
組合せは、以下に示した。
第１群：ＰＢＳ投与群
第２群：ＢＣ−ＰＩＶ投与群
第３群：不活化ＢＣ−ＰＩＶ投与群
第４群：ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ投与群
第５群：不活化ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ投与群
第６群：ＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ投与群
第７群：不活化ＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ投与群とした。【０１３９】
試験は今までと同様の方法で実施し、移植細胞数は５×１０５個とした。
投与ウイルス量は、（不活化）ＢＣ−ＰＩＶ：３．０×１０７粒子、(不活化)ＢＣ−ＰＩＶ／ＯＸ４０Ｌ：３．０×１０７粒子、(不活化)ＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ：３．０×１０６粒子とした。(不活化)ＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬの粒子数は他の１／１０量とした。投与方法は従来法と同様とした。今回使用したＣＴ２６細胞は従来と異なるＣＴ２６細胞を用いており、抗腫瘍免疫剤に関する感受性は従来のＣＴ２６細より高かった。【０１４０】
結果を図３４に示す。ＯＸ４０Ｌに関しては、図に示すように無処置群により不活化の有無とは関係なく抗腫瘍効果が認められた。４−１ＢＢＬについては、投与量がＯＸ４０Ｌに比べて１／１０量であったが、当該ＣＴ２６腫瘍には効果を示し、不活化ＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ投与群のほうが、ＢＣ−ＰＩＶ／４−１ＢＢＬ投与群より高い抗腫瘍効果を示した。
これらの結果、ＴＮＦＳＦリガンドを搭載したＢＣ−ＰＩＶは、非増殖型及び不活化型のＢＣ−ＰＩＶの両者とも、ＴＮＦＳＦリガンドを有効にＴＮＦＳＦ受容体と結合し効率的にシグナルを伝達し、抗腫瘍効果を保持することが分った。【０１４１】
［実験例１２］
（ｈＰＩＶ２以外のエンベロープウイルスへのヒトＯＸ４０Ｌの取込み）
（ＲＳＶウイルスへヒトＯＸ４０Ｌの取込み）
ＢＣ−ＰＩＶはヒトパラインフルエンザ２型ウイルス（ｈＰＩＶ２）由来でエンベロープ構造をもつ。ｈＰＩＶ２以外のエンベロープ構造をもつウイルスにおけるヒトＯＸ４０Ｌの取込みについて検討した。今までの試験においてマウス及びヒトのＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ２７Ｌ及びＣＤ３０ＬのいずれもＢＣ−ＰＩＶのエンベロープ膜に取込まれることが確認されているので、他のエンベロープウイルスへＴＮＦＳＦリガンドタンパクの取込みも、ＴＮＦＳＦリガンドタンパクの一つが取込まれれば他も取込まれるものと考えて、その代表してヒトＯＸ４０Ｌの他ウイルスエンベロープへの取込みについて検討した。
方法はヒトＯＸ４０Ｌ遺伝子を保持するプラスミドを細胞にトランスフェクションしヒトＯＸ４０Ｌを発現させた細胞に、エンベロープ構造をもつウイルスを感染させ、培養上清より当該ウイルスを回収し、当該ウイルス粒子へのヒトＯＸ４０Ｌタンパクの取込みをウエスタンブロットによって評価した（図３５参照。）。【０１４２】
エンベロープ構造をもつウイルスとしてＲＳウイルスのＬoｎｇ株、感染細胞はＨＥｐ２細胞を用いた。ヒトＯＸ４０Ｌ遺伝子をｐｃＤＮＡ（商標）３．１プラスミド（サーモフィシャー）に導入した。当該プラスミド（３μｇ）を用いて、ＨＥｐ２細胞（９×１０５個）にトランスフェクションした。陰性コントロールとしてヒトＯＸ４０Ｌ遺伝子が挿入されていないｐｃＤＮＡ３．１プラスミドを用いてＨＥｐ２細胞にトランスフェクションした。２日後にそれぞれの細胞に同量のＲＳウイルスを感染させた。ＲＳウイルス感染２日後にＨＥｐ２細胞にウイルスによる細胞変性効果（ＣＰＥ）が認められたので、培養上清を回収した。培養上清からのウイルス粒子の調製は実施例２に準じて行った。ウエスタンブロットには抗ヒトＯＸ４０Ｌ抗体（ＰｒoＳｃｉ社、ｃａｔ♯：７２４３）を用いた。陽性コントールにはヒトＯＸ４０Ｌを搭載したＢＣ−ＰＩＶを用いた。【０１４３】
図３５に示すように、レーン１及び４はヒトＯＸ４０Ｌ保持ＢＣ−ＰＩＶ粒子、レーン２及び５はｐｃＤＮＡ３．１プラスミドをトランスフェクションしＲＳウイルス感染細胞から回収したＲＳウイルス粒子、レーン３及び６はヒトＯＸ４０Ｌ遺伝子保持ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドをトランスフェクションし、ＲＳウイルス感染細胞から回収したＲＳウイルス粒子である。レーン１乃至３は抗ヒトＯＸ４０Ｌ抗体、レーン４乃至６は抗ＲＳウイルスＦタンパク質抗体を用いたウエスタンブロットを示す図である。レーン５及び６は抗ＲＳウイルスＦ抗体（アブカム社ｃａｔ♯：ａｂ４３８１２）で陽性バンドが認められ、ＲＳウイルスが確認された。ヒトＯＸ４０Ｌ保持ＢＣ−ＰＩＶ２の陽性コントロールの入ったレーン１及びヒトＯＸ４０Ｌ遺伝子保持ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドをトランスフェクションし、ＲＳウイルス感染細胞から回収したＲＳウイルスの入ったレーン３で、抗ヒトＯＸ４０Ｌ抗体に陽性のバンドが確認された。
これらの結果から、ヒトＯＸ４０Ｌタンパク質がＲＳウイルスのエンベロープ上に取込まれることが示された。【０１４４】
（ＰＩＶ５へヒトＯＸ４０Ｌの取込み）
更に、別のエンベロープ構造をもつウイルスとしてＰＩＶ５（旧名ＳＶ５）ウイルス、感染細胞はＢＨＫ細胞を用いて同様の試験を行った。結果を図３６に示した。図のレーン１は陽性コントロールのヒトＯＸ４０Ｌ保持ＢＣ−ＰＩＶ、レーン２はｐｃＤＮＡ３．１プラスミドをトランスフェクションした細胞から回収したＰＩＶ５、レーン３はヒトＯＸ４０Ｌ遺伝子保持ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドをトランスフェクションし、トランスフェクション２４時間後にＰＩＶ５ウイルスを感染させ、感染２日後の培養上清から回収したＰＩＶ５ウイルス粒子である。ヒトＯＸ４０Ｌ保持ＢＣ−ＰＩＶ２の陽性コントロールの入ったレーン１及びヒトＯＸ４０Ｌ遺伝子保持ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドをトランスフェクションし、ＰＩＶ５ウイルス感染細胞から回収したＰＩＶ５の入ったレーン３で、抗ヒトＯＸ４０Ｌ抗体に陽性のバンドが確認された。【０１４５】
これらの結果から、ヒトＯＸ４０Ｌタンパク質がＰＩＶ５ウイルスのエンベロープ上に取込まれることが示された。
以上の結果から、プラスミド等よる一過性発現細胞、組換えによる恒常的発現細胞、組換えウイルス等に由来するＴＮＦスーパーファミリーのリガンドタンパク（膜アンカー部分は他タンパク質で置換可）を取込んだあらゆる種類のエンベロープ型ウイルスを取得できる可能性が示された。今後、これらウイルスを利用した抗腫瘍免疫剤の可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明によれば、抗腫瘍効果に優れた、抗がん剤、がん治療用医薬組成物、及びキットを提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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