(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ又はＲＮＡからなる単離核酸：
（ａ）  配列番号１のｃＤＮＡ配列の１位〜３６２７位のヌクレオチド配列からなり、ヒトリンパ球活性化抗原ＣＤ３０タンパク質をコードする単離核酸
（ｂ）  （ａ）の配列からなる単離核酸において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＣＤ３０抗原の表面抗原性を有するタンパク質をコードする単離核酸。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ又はＲＮＡからなる単離核酸：
（ａ）  配列番号１のｃＤＮＡ配列の２２３位〜２００７位のヌクレオチド配列からなり、ヒトリンパ球活性化抗原ＣＤ３０タンパク質をコードする単離核酸
（ｂ）  （ａ）の配列からなる単離核酸において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＣＤ３０抗原の表面抗原性を有するタンパク質をコードする単離核酸。
【請求項３】
以下の群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドからなる単離核酸：
配列番号２のアミノ酸配列の１９位〜３７９位のアミノ酸残基からなるフラグメントをコードする配列；
配列番号２のアミノ酸配列の１９位〜９３位のアミノ酸残基からなるフラグメントをコードする配列；
配列番号２のアミノ酸配列の１１２位〜４１６位のアミノ酸残基からなるフラグメントをコードする配列；
配列番号１の２１８位〜１７３２位のヌクレオチドの配列；及び
配列番号１の２７７位〜１３５９位のヌクレオチドの配列。
【請求項４】
インビトロ製造されたポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドである請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５】
放射性原子、染色基又は光又もしくは酵素染色反応に基づく核酸検出用システムに導入されるエピトープから選択される実験室分析により検出可能な１種以上の修飾を有する請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項６】
巨視的担体に結合された請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか一項に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするクローニングベクター。
【請求項８】
１種以上の選択マーカーを含む請求項７に記載のクローニングベクター。
【請求項９】
ＤＮＡが構成的及び／又は誘導的転写プロモーターの制御下にあることを特徴とする請求項７又は８に記載のクローニングベクター。
【請求項１０】
請求項７から９のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
組換えＣＤ３０抗原、ＣＤ３０抗原と他のタンパク質との融合タンパク質又はＣＤ３０抗原フラグメントであって、ＣＤ３０タンパク質のアミノ酸残基第１９〜９３またはアミノ酸残基第１１２〜４１６のアミノ酸配列を含む該フラグメントを発現することを特徴とする、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
融合タンパク質がβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
真核生物起源である請求項１１または１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
配列番号１のｃＤＮＡ配列の２７７〜１３５９位に対応する核酸によりコードされる細胞外ＣＤ３０抗原ドメインと他のポリペプチドとの組換え融合タンパク質。
【請求項１５】
組換え融合タンパク質が、β−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質である請求項１４に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１６】
以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパク質：
（ａ）配列番号１のｃＤＮＡ配列の２７７〜１３５９位のヌクレオチド配列によりコードされる請求項１４に記載の細胞外ＣＤ３０抗原ドメインの組換えタンパク質
（ｂ）（ａ）の組換えタンパク質に１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＤ３０抗原の表面抗原性を有する組換えタンパク質。
【請求項１７】
請求項１０から１３のいずれか一項に記載の宿主細胞を栄養培地中で培養し、濃縮後に栄養培地、細胞膜又は宿主細胞中のＣＤ３０分子を単離することを特徴とする、組換えＣＤ３０抗原、ＣＤ３０抗原と他のポリペプチドとの融合タンパク質またはＣＤ３０タンパク質のアミノ酸残基第１９〜９３またはアミノ酸残基第１１２〜４１６のアミノ酸配列を含むＣＤ３０抗原フラグメントの製造方法。
【請求項１８】
融合タンパク質が、β−ガラクトシダーゼとの融合体である請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
免疫原として請求項１７に記載の方法により得られたＣＤ３０抗原と他のポリペプチドとの融合タンパク質またはＣＤ３０タンパク質のアミノ酸残基第１９〜９３もしくはアミノ酸残基第１１２〜４１６のアミノ酸配列を含むＣＤ３０抗原フラグメントを使用することによる、ＣＤ３０に対する特異的抗体及び抗血清の製造方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法により得られたＣＤ３０抗原と他のポリペプチドとの融合タンパク質またはＣＤ３０タンパク質のアミノ酸残基第１９〜９３もしくはアミノ酸残基第１１２〜４１６のアミノ酸配列を含むＣＤ３０抗原フラグメントを用いた免疫吸着方法。
【請求項２１】
請求項１７に記載のインビトロ合成により得られたＣＤ３０抗原と他のポリペプチドとの融合タンパク質またはＣＤ３０タンパク質のアミノ酸残基第１９〜９３もしくはアミノ酸残基第１１２〜４１６のアミノ酸配列を含むＣＤ３０抗原フラグメントを含む、血清又は他の体液中の可溶性ＣＤ３０抗原を診断目的で検出するためのＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ又は類似の抗体に基づく方法で使用する標準化試薬。
【請求項２２】
ＣＤ３０のインビボ細胞外ドメインを含むことを特徴とする請求項１４から１６のいずれか一項に記載のインビトロ合成タンパク質又はペプチド。
【請求項２３】
ＤＮＡ又はＲＮＡであって、配列番号１に示すヒトリンパ球活性化抗原ＣＤ３０のヌクレオチド配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、ＣＤ３０抗原の表面抗原性を有するタンパク質をコードする単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
本発明はホジキン病に見いだされるリンパ表面抗原ＣＤ３０、そのタンパク質配列及び関連するヌクレオチド配列、遺伝子工学によるその製造、ホジキン病の診断及び試験手段、並びに特にトランスジェニック動物の作出のための前記ヌクレオチド配列の使用に係る。
ホジキン病（ＨＤ）の病因は未だに十分に解明されていないが、中央ヨーロッパでは頻発するヒトリンパ腫の１種に数えられている。表面抗原ＣＤ３０が報告されて以来、ホジキン病の腫瘍細胞即ちホジキン（Ｈ）細胞及びリード−ステルンベルグ（ＲＳ）細胞の同定は著しく容易になるか又は初めて可能になった（Ｓｃｈｗａｂら（１９８２），Ｎａｔｕｒｅ  ２９９，６５−６７；Ｓｔｅｉｎら（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３０，４４５−４４９；ＭｃＭｉｃｈａｅｌ刊（１９８７）：Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩＩ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を与えるか又はウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ，ＨＴＬＶ−ＩＩ，ＥＢＶ）により形質転換したＴ細胞及びＢ細胞に関する研究（Ｓｔｅｉｎら，（１９８５）Ｂｌｏｏｄ，６６，８４８−８５８；Ａｎｄｒｅｅｓｅｎら（１９８４）Ｂｌｏｏｄ，６３，１２９９−１３０２）により示されているように、ＣＤ３０表面抗原の外観はリンパ球の活性化に結び付けられる。ホジキン細胞及びリード−ステルンベルグ細胞は悪性形質転換Ｔ又はＢ細胞であり、ホジキン病における組織学的変異体は種々のサイトカインの分泌に起因すると予想される（Ｓｔｅｉｎら（１９８９）Ｒｅｃｅｎｔ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１７，１５−２６）。従って、ＣＤ３０抗原は細胞内シグナルシステム及び腫瘍形成に関して重要であると思われる。
ＣＤ３０抗原が大細胞未分化新生物（即ちＣＤ３０又はＫｉ−１陽性未分化大細胞リンパ腫（英語表記ＡＬＣＬ；Ｋｉ−ｉ+  ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｌａｒｇｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）と同義）の同定に適切であることも腫瘍組織の組織学的研究から判明した。これらの腫瘍は特に幼児及び若年者に見いだされ、別種のリンパ腫を構成し、真性組織球リンパ腫又は悪性組織球症と呼称される。ほとんどのＣＤ３０陽性ＡＬＣＬ中に転位Ｉｇ及びＴ細胞レセプター遺伝子が同時に存在することから明らかなように、これらの腫瘍細胞はリンパ様である。従って、ＣＤ３０陽性ＡＬＣＬは表現型のみならず、遺伝子型単位でもある。ＣＤ３０陽性ＡＬＣＬは一次と二次に分類され、主にＴ細胞及び中性細胞に由来するか、より低い程度であるがＢ細胞に由来する。形態学的にはＡＬＣＬはａ）不定、ｂ）ホジキン関連、ｃ）巨細胞高含有及びｄ）リンパ組織球性に分類される。
従来の定義によると、ＣＤ３０抗原はモノクローナル抗体、より特定的にはモノクローナル抗体Ｋｉ−１及びＢｅｒ−Ｈ２によってのみ検出可能であった（Ｓｃｈｗａｂら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９９，６５−６７；Ｓｃｈｗａｒｔｉｎｇら（１９８９）Ｂｌｏｏｄ  ７４，１６７８−１６８９）。しかしながら、モノクローナル抗体は抗原上の夫々のエピトープを確認するに過ぎず、関連する核酸の検出及び試験に不適切であるという欠点がある。更に、個体エピトープのみに基づく診断はアーチファクト（人為構造）に対して感受性であり、広範囲に使用できない。最後に、同位体の認識可能性は、サンプルの固定及び調製方法に依存し、更にエピトープは細胞の状態によって変化し得る。例えば、エピトープは隣接するＮ又はＯ−グリコシル化部位のグリコシル化により阻害され得、また、リン酸化、より特定的にはチロシンリン酸化等により構造変化が生じ、特にエピトープが多数のペプチド鎖部分から構成される場合にエピトープは消失する。細胞状態のこのような変化は特に腫瘍の進行中に生じることが多い。
また、従来は入手可能な量が少なく、抗原が機能的に異なるサイトソル部分、トランスメンブラン部分及び細胞外タンパク質部分（以下、ドメインに同義）を有する膜である等の理由から、他の成長及びホルモン因子に関するレセプター又は結合タンパク質としてＣＤ３０抗原の特性を詳細に試験することは不可能であった。
従って、本発明の目的はモノクローナル抗体に基づかずにホジキン病及び未分化大細胞リンパ腫を試験、診断及び治療するための手段を提供することである。より特定的には、本発明の目的はタンパク質機能及び腫瘍の成長の試験手段並びにこれらの疾患の治療手段を提供することである。
この課題は、図２に示すヒトリンパ球活性化抗原ＣＤ３０のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能な単離核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）により解決される。より特定的には、この課題は図２に示すヌクレオチド配列の配列を含むＤＮＡ又はＲＮＡにより解決される。
本発明の核酸は実験室分析、例えば放射性原子、蛍光染色基（Ｈａｗｋｉｎｓ  ＆  Ｓｕｌｓｔｏｎ（１９９０）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｄｅｃ．３０７）及び／又は光に基づく核酸検出システムに導入されるエピトープにより検出可能な修飾を有し得る。好適態様によると、本発明の核酸は特にハイブリダイゼーションによりＣＤ３０−ＲＮＡをより容易に単離又は濃縮するために、巨視的担体、例えばビーズ、より特定的にはガラス担体もしくはＳｅｐｈａｒｏｓｅ担体、膜フィルター、ニトロセルロースフィルター又はナイロンフィルターに結合され得る。
本発明は更に上記ＤＮＡ配列を含むクローニングベクターに係る。特に適切なクローニングベクターとしては、本発明の核酸を増幅することが可能なベクター（例えばｐＢＲ３２２，ｐＵＲ１０１，Ｍ１３ｍｐ１０，Ｍ１３ｍｐ１１，Ｍ１３ｍｐ１８，Ｍ１３ｍｐ１９，ｐＧＥＭ１等）、クローニングしたＤＮＡ配列のタンパク質発現を宿主細胞中で可能にするベクター（例えばλｇｔ１１，ｐＡＴＨ等）、原核又は真核宿主細胞を一次的に形質転換するベクター（例えばｐＣＤＭ８又は誘導体又はｐＲＣ／ＣＭＶ等）、真核宿主細胞を安定的に形質転換し、宿主ゲノムに組み込むベクター（例えばｐＸＴ１等）、又は生殖細胞をゲノムに組み込み、こうしてトランスジェニック動物を作出するために適切なベクター（例えばｐＳＶ２Ｎｅｏ，ｐＲＳＶＮｅｏ，ｐＭＣ１Ｎｅｏ等）を挙げることができる。
更に本発明の教示は、ＣＤ３０抗原、ＣＤ３０抗原のフラグメント、ＣＤ３０抗原とのハイブリッドタンパク質又はその変異体を発現する宿主細胞に及び、より特定的にはＣＤ３０抗原を細胞外膜に取り込み、翻訳後修飾を付加する（例えばＣＤ３０抗原を天然にグリコシル化するか又は複合糖分子を付加する）真核宿主細胞（例えば実施例３に記載するＣＯＳ細胞、Ｌ９２９細胞、ＲＫ１３細胞、ＷＯＰ細胞又はＲ９ａｂ細胞）に及ぶ。
本発明の１態様によると、組換ＤＮＡ法により製造された上記ＣＤ分子は好ましくはリンパＣＤ３０表面抗原に対するポリクローナル及びモノクローナル抗体を製造するための免疫原である。例えば下記λ−ｇｔ１１クローンからβ−ガラクトシダーゼ及びＣＤ３０抗原フラグメントとのハイブリッドタンパク質を単離することができ、このハイブリッドタンパク質を免疫原として使用することができる。上記方法を使用して真核細胞中でＣＤ３０抗原を発現させ、これを精製後又は過剰発現細胞と共に膜内タンパク質として免疫感作に使用することもできる。更に、任意にグルタルアルデヒド又は別の結合試薬により適切な担体（例えばチレオグロブリン又はアルブミン）に結合した化学的手段により図２に示すタンパク質配列に対応するＣＤ３０ペプチドを合成し、免疫原としてフロイントアジュバントと共に適切な動物（例えばマウス、ウサギ、ヤギ又はヒツジ）に注入することができる。生物学的又は化学的合成により製造されたＣＤ３０（ハイブリッド）分子は所謂「サンドイッチ免疫吸着」試験で使用するためにも適切である。
本発明の別の態様によると、ヌクレオチド及びタンパク質配列の知見によりＣＤ３０の薬理学的に関連する部分も明示される。治療目的で投与されるＣＤ３０に対するリガンド分子は天然では膜タンパク質の細胞外部分にまず最初に結合するので、ＣＤ３０分子の細胞外領域が薬理学的に特に重要である。比較研究、ヒドロパシー曲線並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳試験により示されるように、ＣＤ３０の細胞外領域は２７７位と１３５９位との間ののｃＤＮＡ配列、即ち277−ＴＴＣＣＣＡＣＡＧＧＡＴＣＧＡＣＣＣ．．．及び．．．ＣＴＣＣＣＡＣＧＧＧＧＡＡＧ1359の間の配列である。従って、特に治療剤の開発のためにＣＤ３０分子のこれらの領域又はそのサブセクションを使用することは自明である。特に、最初の細胞外ＣＤ３０部分との融合タンパク質はホジキン細胞及びリード−ステルンベルグ細胞に対する天然又は合成抗毒素を単離又は濃縮するために特に適切である。更に、ＣＤ３０の細胞外アミノ酸配列に基づいて製造されたオリゴペプチド又は組換ペプチドを免疫原として使用し、細胞外ＣＤ３０に対するポリクローナル抗体を製造することもできる。更に、これらのタンパク質配列に対する合成リガンドを製造又は開発することができる。これらのリガンド又は抗体をサポニン又はリシンＡのような毒素に結合し、これらのリンパ腫を治療するために治療的に有用な抗毒素を得ることもできる。従って、本願は結合相手、即ちｉｎ  ｖｉｖｏで既に存在している天然の結合相手又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造されるかもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで導入される人工的結合相手、特に抗毒素の製造用リガンドを製造、試験又は単離するための細胞外ＣＤ３０配列の使用にも係る。細胞外ＣＤ３０配列に対するポリクローナル抗体が特に重要であり、ホジキン病及び未分化大細胞リンパ腫に対するポリクローナル抗毒素が初めて入手可能になった。細胞外ＣＤ３０ペプチドは化学的合成、より特定的には固相ペプチド合成により又は原核及び真核細胞における組換融合タンパク質として製造することができる。酵母及び真核細胞、特に昆虫細胞又は線維芽細胞（好ましくはヒト線維芽細胞）を含む組織培養物中で発現させると、細胞外タンパク質細胞は天然にグリコシル化及び部分的に修飾されるのでこのような発現が好適である。
本発明は更に、細胞内情報伝達に寄与するＣＤ３０の細胞内（サイトソル）タンパク質配列の使用に係る。当然のことながら、これらの配列は付加的なシグナル形質導入に関与する他のタンパク質との相互作用に使用される部分をコードする。比較研究、ヒドロパシー曲線並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳試験により示されるように細胞内情報伝達に関与するＣＤ３０のサイトソル部分は、１４４４位と２００７位の間のヌクレオチド配列（図２）、即ち1444−ＣＡＣＣＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＣＡ．．．と．．．ＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＡＡＡＧ−2007の間の配列により主にコードされる。本発明のこの態様の別の重要な特徴は、サイトソル活性を有する組換ＣＤ３０タンパク質（部分）の合成と、ＣＤ３０のサイトソル活性に影響するリガンド及び結合相手の開発である。
本発明の教示は更に、ＣＤ３０抗原発現に変異を伴うトランスジェニック動物、より特定的には齧歯目を作出するための上記ヌクレオチド配列の使用にも及び、このようなトランスジェニック動物はＣＤ３０に突然変異が生じており、より特定的にはＣＤ３０が截頭形であるか、ＣＤ３０の発現が過剰又は過少であるか、ＣＤ３０をリンパ球以外の細胞及び組織中で発現するか、ＣＤ３０をコードする無傷の構造遺伝子を完全に欠失するか、ＣＤ３０を構成的もしくは誘導的に発現するか、又は細胞の分化中に所定の部位でＣＤ３０を発現する。このようなトランスジェニック動物はリンパ腫の科学的研究、臨床試験の開発又はＣＤ３０抗原の細胞外レセプター部分の阻害及び誘導分子の研究のための優れたモデルである。
本発明の他の好適な態様は請求の範囲に記載する。
本発明の教示により提案される手段及び方法は、遺伝子のハイブリダイゼーション又は染色体上の位置決定によりＣＤ３０抗原をコードするＤＮＡ及びＲＮＡの検出のために使用することができる。即ち、ＣＤ３０遺伝子の転写がサンプル中の細胞内で行われたか否かを試験することができ、更にＣＤ３０抗原の発現のための調節機序を試験することができる。
これらのより科学的な用途に加え、新規ハイブリダイゼーション法（ＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖）反応、組織部分及び染色体上のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）は、付加的な非常に高感度の診断法を提供する。特に、この診断法は翻訳後修飾及び処理に対して非感受性である。
染色体上のＣＤ３０構造遺伝子の位置に関する研究の結果、遺伝子は染色体バンドｌｐ３６、即ちウイルス挿入（ＥＢＶ，ＨＴＬＶＩ及びＩＩ，ＨＶ６等）を含む染色体異常がホジキン病、ホジキン病以外のリンパ腫及び他の新形成（例えば神経芽腫及び悪性メラノーマ）に既に検出されている染色体中の脆弱な場所（ＬｅＢｅａｕ（１９８６）Ｂｌｏｏｄ  ６７，８４９−８５８参照）に存在することが少なくとも判明した。
より特定的には、非ホジキンリンパ腫ではこの染色体領域に変異（重複、転位、欠失等）が存在し、ＣＤ３０抗原の発現と共に腫瘍の特に急速な増殖に関連する。従って、本発明により提供されるヌクレオチド配列は、これらの染色体変異が患者に存在するか否かを診断し、ホジキン病又は関連する大細胞未分化リンパ腫が発生する可能性があるか否かを診断するための優れた手段である。
本発明により提供されるヌクレオチド配列は更に、このような疾患が家族に既に発生している場合の出生前診断にも適切である。
本発明の他の利点、態様及び特徴は図面に関する以下の記載に明示される。
尚、図１Ａ）はλｇｔ１１におけるＣＤ３０抗原ｍＲＮＡのクローン化ｃＤＮＡ部分を示し、
Ｂ）はポリアデニル化部位（＊）を有するｍＲＮＡ及び非コーディング領域（１本線）上のＣＤ３０抗原をコードする領域（影を付けた矩形）を示し、
Ｃ）は種々の制限酵素によるｃＤＮＡの制限地図であり、
Ｄ）はモノクローナル抗体Ｋｉ−１及びＢｅｒ−Ｈ２のエピトープに基づくＣＤ３０抗原の地図であり、
図２はＤＮＡの非転写鎖の配列、ＤＮＡのコーディング鎖の配列及び該配列から誘導可能なＣＤ３０タンパク質配列を示し、
図３は種々のヒト細胞系におけるＣＤ３０−ｍＲＮＡの試験結果を示し、
図４はＫｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７，１０５−１３２によるＣＤ３０アミノ酸配列の疎水性及び親水性のグラフであり、
図５はＣＤ３０配列とＮＧＦレセプタータンパク質群からの配列との比較であり、
図６は125Ｊで標識した細胞の免疫沈降によりＣＯＳ細胞におけるＣＤ３０の発現を示し、レーン１はマーカータンパク質、レーン２はＣＤ３０−５でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞のＢＥＲ−Ｈ２沈降、レーン３はＨＵＴ−１０２細胞のＢＥＲ−Ｈ２沈降、レーン４はモック（ＰＣＤＭ８）でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞のＢＥＲ−Ｈ２沈降に相当する。
ＣＤ３０−ｃＤＮＡのクローニング及び検討
約２０００００個のクローンを含むＨＵＴ−１０２細胞のλ−ｇｔ１１−ｃＤＮＡ遺伝子ライブラリー（Ｐｏｉｅｓｚら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，７４１５−７４１９）をモノクローナル抗体によりＣＤ３０抗原とのハイブリッドタンパク質について試験した。
Ｇｕｅｂｌｅｒ  ＆  Ｈｏｆｆｍａｎｎ（１９８３），Ｇｅｎｅ  ２５，２６３−２６９に従ってＨＵＴ−１０２細胞からのポリ（Ａ）+−ＲＮＡに基づくｃＤＮＡ合成を行った。変異により、ｃＤＮＡをＳｅｐｈａｒｏｓｅ−ＣＬ４Ｂカラムでサイズ選択した（Ｅｓｃｈｅｎｆｅｌｄｔ  ＆  Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２，３３５−３３７）。“ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌ．１，４９−７６（Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ刊，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ）におけるＨｕｙｎｈら（１９８５）の記載に従ってモノクローナル抗体Ｋｉ−１及びＢｅｒ−Ｈ２の混合物を使用して免疫スクリーニングを実施した。
９０９ｂｐ  ｃＤＮＡを有するクローンはモノクローナル抗体Ｂｅｒ−Ｈ２により認識されたハイブリッドペプチドを産生した。
ＣＤ３０の完全配列を含むクローンを得るために、ＨＵＴ−１０２細胞からのｐＣＤＭ８遺伝子ライブラリーを作成した（Ｓｅｅｄ  ＆  Ａｒｕｔｔｏ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，３３６５−３３６９；Ａｒｕｆｆｏ  ＆  Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，８５７３−８５７７）。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ｃＤＮＡ合成キットを使用してｃＤＮＡを合成した後、ＢｓｔＸＩリンカーを付加し、最後にＦＭＣ社製１．５％（ｗ／ｖ）Ｎｕ−シーブゲル上でサイズ分画した。＞１ｋｂｐのｃＤＮＡをゲルから単離し、ベクターｐＣＤＭ８に連結した。Ｄｏｖｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１６，６１２７−６１４５に従ってエレクトロポレーションにより大腸菌−ＭＣ１０６１／ｐ３中で形質転換を行った。
λ−ｇｔ１１ライブラリーを免疫スクリーニングすることにより得られたＣＤ３０−１−ｃＤＮＡサンプルを使用することによりコロニーをハイブリダイズした（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。このアプローチにより、ｃＤＮＡ配列中でオーバーラップする５個のクローン（図１）、即ち１４９２ｂｐ（ＣＤ３０−２）、１９０５ｂｐ（ＣＤ３０−３及びＣＤ３０−４）、２３４２ｂｐ（ＣＤ３０−５）及び２２４２ｂｐ（ＣＤ３０−６）を得た。ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ及び合成オリゴヌクレオチドプライマー（Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３−５４６７）を使用することによりＤＮＡを配列決定した。
同様に３’−ポリ（Ａ）末端をクローニングするために、ＨＵＴ−１０２細胞からの逆転写ポリ（Ａ）ＲＮＡでＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ：ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）プロトコルに従ってＰＣＲ反応を行った（Frohmanら（１９８８）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,8998-9002）。１分間変性させた後、４５秒間５４℃でプライマーを添加し、内部プライマー及びＳａｌ１部位を含むオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて１．５分間７２℃で伸長させることからなる３５サイクルで増幅を行った。このプロセスにより３３３ｂｐ  ｃＤＮＡを有するクローンＣＤ３０−７を得た。
ベクターｐＧＥＭ１中のクローンＣＤ３０−５のＤＮＡをブダペスト条約に従ってＤＭＳ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託番号ＤＳＭ６８３３で寄託した。
ＣＤ３０−ｃＤＮＡの配列及び該配列から誘導可能なタンパク質配列を図２に示す。シグナルペプチド及びトランスメンブランドメインは二重下線を付した。ポリアデニル化シグナルには一重下線を付した。ポリアデニル化部位は矢印で示した。細胞外ドメイン内の相同サブユニットを枠で囲み、潜在的Ｎ−グリコシル化部位には＊を付し、潜在的リン酸化部位には略号：ＴＹＲ（チロシンキナーゼ）、ＰＫＣ（タンパク質キナーゼＣ）、ＣＫ２（カゼインキナーゼＩＩ）及びＡＭＰ（ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ依存性キナーゼ）を付した。
ＣＤ３０−ｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列は３６３０ｂｐを含み、Ｇ／Ｃ含有率は６２％である。オープンリーディングフレームはヌクレオチド223から終結コドンであるヌクレオチド2007に及ぶ。翻訳開始ＡＴＧコドンは典型的な開始配列により囲まれている（Ｋｏｚａｋ（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４４，２８３−２９２）。オープンリーディングフレームは相同度７７％の２つの約３６０ｂｐドメイン（367〜747及び895〜1272）から構成される。オープンリーディングフレームに先行する配列は非翻訳リーダー配列の222bpであり、後続する配列はヌクレオチド２８６７〜２８８８の短いパリンドローム配列を有する1615bpの非翻訳配列である。過度に長い５’リーダー配列は発現に不要であり、例えばＣＤ３０−５（実施例３）からこの配列をもたないｃＤＮＡをＣＯＳ細胞中で発現させることができる。
非翻訳３’領域は２つのポリアデニル化部位（図２中、矢印により示す）と、これに先行する独特のポリ（Ａ）シグナル配列ＴＧＴＡＡＡ及びＡＡＴＡＡＴを含む（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１，３４９−３５９；Ｂａｒｄｗｅｌｌら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ６５，１２５−１３３；Ｓｈｅｅｔｓら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１８，５７９９−５８０５）。
細胞、組織及び染色体の試験のためのＣＤ３０ヌクレオチド配列の使用
実施例１
ノーザンブロット分析。Ｃｈｉｒｇｗｉｎら（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４−５２９９のイソシアン酸グアニジウム−塩化セシウム法により細胞及び組織からＲＮＡを単離した。Ｓｗａｎら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９，１４０８−１４１２に従ってオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムによりＲＮＡを精製した。得られたポリ（Ａ）+ＲＮＡを次に２．２ｍｏｌ／ｌホルムアルデヒド（レーン当たり２μｇポリ（Ａ）+ＲＮＡ）を用いて１．２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上でゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜に移した後、32Ｐ−ｄＣＴＰ標識ＣＤ３０  ＤＮＡインサートにハイブリダイズした。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ／Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製“ＤＮＡ標識キット”を使用してＤＮＡを放射性標識した。Thomas（1977）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,5201-5205の方法によりハイブリダイゼーションを行った。
図３Ａ及びＢはヒト細胞系ＨＵＴ−１０２、ＳＵ−ＤＨＬ−１（Ｍｏｒｇａｎら（１９８９）Ｂｌｏｏｄ  ７３，２１５５−２１６４）、Ｌ−４２８（Ｓｃｈａａｄｔら（１９８０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２６，７２３−７３１）、Ｌ−５９１（Ｄｉｅｈｌら（１９８２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｐ．６６，６１５−６３２）、Ｌ−５４０（Ｄｉｅｈｌら（１９８１）Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０１，１１１−１２４）、Ｃｏ（Ｊｏｎｅｓら（１９８５）Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．３，１３３−１４５）、Ｈｏ（Ｋａｍｅｓａｋｅら（１９８６）Ｂｌｏｏｄ  ６８，２８５−２９２）、Ｕ−９３７
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Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １７，５６５−５７７）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｃａｉｌｌｅａｕら（１９７４）Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．５３，６６１−６７４）及びＨＰＢ−ＡＬＬ（Ｂｏｙｌｓｔｏｎ  ＆  Ｃｏｓｔｏｒｄ（１９８５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，７３８  ７４２）からのＲＮＡと比較のためにＰＢＬ細胞（末梢血液リンパ球）のＲＮＡのこの種のノーザンブロット分析を示す。この自動ラジオグラフィーは４日続けられた。ハイブリダイズされたサンプルはコード領域を有するＣＤ３０−５挿入体（図３Ａ）と、翻訳されていない３’末端のＣＤ３０−６／Ｂｇｌｌ−Ｘｂａｌフラグメント（３Ｂ）である。
被験細胞系から２種のＲＮＡが検出され、大きいほうのＲＮＡは約３８００ヌクレオチドであり、小さいほうは約２６００ヌクレオチドであった。ＲＮＡは恐らくポリアデニル化中の異なるスプライシングに由来すると思われる。
ＣＤ３０をコードするＲＮＡの量はホジキンリンパ腫に由来する細胞系ＳＵ−ＤＨＬ−１及び細胞系Ｌ−５９１で最大であった。ホジキンリンパ腫に由来する細胞系Ｌ−５４０、Ｌ−４２８、Ｈｏ、Ｃｏがこれに続き、最後はＨＴＬＶ−１により形質転換された細胞系ＨＵＴ−１０２の順であった。ＣＤ３０抗原の外観から判断すると、末梢血液リンパ球又は細胞系ＨＰＢ−ＡＬＬ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１又はＵ−９３７にはＲＮＡ転写物は存在しなかった。これはハイブリダイゼーションサンプルの高特異性及び感受性を示す。
実施例２
染色体のマッピング。２人の健康な供与者から単離した末梢血液リンパ球をＰＨＡで刺激し、Ｓｔｏｌｌｍａｎｎら（１９８５），Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．６０，１８３−１９６に従って細胞分裂の中期に培地中でコルヒチンにより阻害し、染色体を生成した後、Ｆｏｎａｔｓｃｈら（１９８７），Cytogenet.Cell Genet.45,109-112に従って218位のＳｍａｌ部位と1732位のＳｍａｌ部位との間の配列を含むＣＤ３０−５／Ｓｍａｌ−ｃＤＮＡフラグメントとｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。ＤＮＡを3Ｈ−ｄＣＴＰ及び3Ｈ−ｄＴＴＰでニック−トランスレーションにより放射性標識した。サンプルの比活性は１．２×１０7ｄｐｍ／μｇ  ＤＮＡであった。９９の中期体が計数された。
この試験の結果、ＣＤ３０遺伝子は染色体バンドｌｐ３６に位置することが判明した。１６２個の銀粒子の２１．６％がこの領域に特異的に存在する。χ２乗値は非常に意義がある（Ｐ＜０．００１）。
実施例３
ＣＯＳ細胞におけるＣＤ３０抗原の発現。このために、ＣＯＳ細胞をＣＤ３０−５−ｃＤＮＡでトランスフェクトした後、ＣＤ３０抗原をこれらの細胞から免疫沈降させた。使用した発現ベクターは、ＣＤ３０−ｃＤＮＡ断片を予めクローニングしたｐＣＤＭ８ベクターとした。ＤＥＡＥデキストラン法（Ｓｅｅｄ  ＆  Ａｒｕｆｆｏ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４  ３３６５−３３６９）により細胞培養物中のＣＯＳ−１細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、細胞を単離し、ＩＯＤＯビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）で放射性標識し、可溶化し、タンパク質を免疫沈降させ、ゲル電気泳動により分離した。
対照としてＨＵＴ−１０２細胞からの表面タンパク質をＩＯＤＯビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）で放射性標識し、抗マウスＩｇ（Ｓｃｈｗａｒｔｉｎｇら（１９８９）Ｂｌｏｏｄ  ７４，１６７８−１６８９）で被覆したアガロースゲルにより単離した。
図６はモノクローナル抗体Ｂｅｒ−Ｈ２で免疫沈降したＣＤ３０の電気泳動ＳＤＳゲル分析を示す。レーン１：対照。レーン２：ＣＤ３０−５−ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞。レーン３：125Ｊで標識したＨＵＴ−１０２細胞。レーン４：対照−インサートを含まないベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞。いずれの場合も相対分子量１２００００を有する単一のタンパク質バンドが検出された。
更に免疫細胞学的ＡＰＡＡＰ（アルカリホスファターゼ抗アルカリホスファターゼ）染色（Ｃｏｒｄｅｌｌら（１９８４）Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３２  ２１９−２２９）を実施した。これは、どのモノクローナル抗体がどのハイブリッドタンパク質又は截頭発現タンパク質と反応したかを示すために比較によりモノクローナル抗体Ｋｉ−１及びＢｅｒ−Ｈ２のエピトープをマッピングする方法であり、更にはｃＤＮＡマップから誘導されるアミノ酸配列のマッピング法でもあった。λｇｔ１１免疫スクリーニング及びＡＰＡＡＰ免疫染色からのデータをまとめると、Ｋｉ−１エピトープはアミノ末端とアミノ酸９３の間の細胞外ドメイン（図１Ｄ）に位置付けられ、Ｂｅｒ−Ｈ２エピトープはアミノ酸１１２〜４１６の間に位置付けられた。
実施例４
ウサギを免疫感作して抗ＣＤ３０ポリクローナル血清を製造するための、ウサギ細胞系ＲＫ１３及びＲ９ａｂにおけるＣＤ３０抗原の発現。このために細胞系をベクターｐＣＤＭ８−ＣＤ３０−５又はｐＲＣ／ＣＭＶ−ＣＤ３０−５  ＤＥＡＥデキストランでトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を採取し、適切なプロトコルに従ってウサギを免疫感作するために使用した。
実施例５
付加的なラット及びマウス抗ＣＤ３０モノクローナル抗体を製造するための、マウス線維芽細胞細胞系Ｌ９２９及びＷＯＰにおけるＣＤ３０抗原の発現。このために、マウス線維芽細胞をＤＥＡＥデキストラン法又はスフェロブラスト融合（Ｓａｎｄｒｉ−Ｇｏｌｄｒｉｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１  ７４３−７５２）によりベクターｐＣＤＭ８−ＣＤ３０−５又はｐＲＣ／ＣＭＶ−ＣＤ３０−５でトランスフェクトした。トランスフェクション後、マウス及びラットを適切なプロトコルに従って細胞で免疫感作した。ハイブリドーマを作成するために、動物の脾臓を取り出し、得られたリンパ球を適切なマウスミエローマ細胞系と融合した
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実施例６
所定の疾患の間に血清中に存在する可溶性ＣＤ３０をＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ又は類似の免疫検出システムで測定するための、組換法により得られたＣＤ３０抗原の使用。この目的のためのＣＤ３０は、明記した核酸配列を必要に応じてやや修飾して使用することにより、真核又は原核生物中で発現させることにより得られる。ＣＤ３０内容のアフィニティークロマトグラフィー精製及び定量後、これらの調製物をＣＤ３０イムノアッセイの標準化に使用することができる。
ＣＤ３０ペプチド配列及びその結果として可能な本発明の適用
ＣＤ３０抗原の誘導アミノ酸配列に関する比較の結果、ＣＤ３０ポリペプチドは他のトランスメンブラン成長因子レセプターと等価であることが判明した。より特定的には、細胞外ドメインにおける第１のシステイン高含有サブユニットは他の公知のレセプターの細胞外ドメインと等価であり、より程度は低いが第２のシステイン高含有サブユニットも同様である（図５参照）。主な類似が見いだされるのは、例えばＮＧＦＲ，ＴＮＦＲ−１，ＴＮＦＲ−ＩＩ（Ｓｃｈａｌｌら（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６１，３６１−３７０；Ｈｅｌｌｅｒら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，６１５１−６１５５；Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒら（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６１，３５１−３５９；Ｋｏｈｎｏら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，８３３１−８３３５；Ｅｎｇｅｌｍａｎｎら（１９９０），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１５３１−１５３６；Ｓｍｉｔｈら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８，１０１９−１０２３）のようなヒト神経成長因子レセプタータンパク質群及び低親和性のヒト神経成長因子レセプター（ＮＧＦＲ）（Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４７，５４５−５５４）である。
ＣＤ３０の細胞外ドメインは４０アミノ酸の６個のシステイン高含有タンパク質部分（図４参照）に分割することができ、これらのアミノ酸は短い部分１Ｂ及び３Ｂ以外は各々６個のシステイン基を含む。ＮＧＦＲタンパク質群の他の構成員の場合と同様に、これらのサブドメインにおけるシステインの位置は高度に保存される。ヒトインシュリンレセプター関連レセプター（Ｓｈｉｅｒ  ＆  Ｗａｔｔ（１９８９），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１４６０５−１４６０８）；形質転換成長因子β１結合タンパク質（Ｋａｎｚａｋｉら（１９９０），Ｃｅｌｌ  ６１，１０５１−１０６１）；マウスインターロイキン−３レセプター（Ｇｏｒｍａｎら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，５４５９−５４６３）；ショウジョウバエのセブンレス（ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ）タンパク質（Ｍｉｃｈａｅｌら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，５３５１−５３５３）等のレセプターの対応する領域との間にも相同が存在する。
ＤＮＡレベルには他の成長因子レセプター、特にヒト線維芽細胞成長因子レセプター４との間に相同が存在する（Ｐａｒｔａｎｅｎら（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０，１３４７−１３５４）。
以上の配列間の比較の結果から明らかなように、ＣＤ３０抗原が成長因子のレセプターである可能性は非常に高い。従って、本発明により提供されるＣＤ３０のヌクレオチド及びタンパク質配列は明白にレセプター研究に使用でき、即ちどの因子がＣＤ３０と結合し得るか、結合がどのように影響を受けるか（競合的であるか又は構成的であるか）、更にはリガンドの結合が細胞にどのような効果を及ぼすか等を研究するために使用することができる。
より特定的には、本発明により入手可能になったヌクレオチドを使用してレセプター及び関連するシグナルシステムを試験するためのトランスジェニック動物を作出することができる。
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図２ｇ】
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【図２ｈ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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