(57)【要約】  免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症リスクを予測するための方法を提供し、安全で効果の高いがん免疫療法を実現すること。（ａ）被験者から単離された末梢血単核球におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合、（ｂ）被験者から単離された末梢血単核球におけるＶδ２＋γδＴ細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合、（ｃ）被験者から単離された末梢血Ｔ細胞におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合、及び（ｄ）被験者から単離された末梢血Ｔ細胞におけるＶδ２＋γδＴ細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合、から選ばれるいずれか１又は２以上を測定し、前記細胞数又は割合を指標として重症間質性肺炎の発症リスクを予測する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症リスクを予測する方法であって、
（ａ）被験者から単離された末梢血単核球におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合、
（ｂ）被験者から単離された末梢血単核球におけるＶδ２＋γδＴ細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合、
（ｃ）被験者から単離された末梢血Ｔ細胞におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合、及び
（ｄ）被験者から単離された末梢血Ｔ細胞におけるＶδ２＋γδＴ細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合、から選ばれるいずれか１又は２以上を測定すること、及び
前記細胞数又は割合に基づいて重症間質性肺炎の発症リスクを判断すること、を含む方法。
【請求項２】
前記細胞数又は割合がカットオフ値以上である場合に、当該被験者は重症間質性肺炎の発症リスクが高いと予測することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗原刺激後の細胞が凝集を生じる場合に、当該被験者は重症間質性肺炎の発症リスクが高いと予測することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
免疫チェックポイント阻害剤による治療の適否を判定する方法であって、請求項１〜３に記載の方法にしたがい重症間質性肺炎の発症リスクを予測し、前記予測に基づき免疫チェックポイント阻害剤による治療の適否を判定する方法。
【請求項５】
前記γδＴ細胞の抗原刺激が、ＩＬ−２、リン酸モノエステル化合物、ピロリン酸モノエステル化合物、トリリン酸モノエステル化合物、テトラリン酸モノエステル化合物、トリリン酸ジエステル化合物、テトラリン酸ジエステル化合物、窒素含有型ビスホスホン酸化合物、アルキルアミン、アルキルアルコール、アルケニルアルコール、イソプレニルアルコール、及びヒト由来腫瘍細胞から選ばれるいずれか１又は２以上の抗原を用いて行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原刺激に加えて、ＩＬ−１８、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、インターフェロンγ、及び末梢血コンディション培地から選ばれるいずれか１又は２以上を用いてγδＴ細胞を刺激する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞数又は割合が、フローサイトメトリー又はイメージサイトメトリーを用いて測定される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
（i）抗ＣＤ３抗体、及び（ii）抗Ｖδ２抗体を含む、免疫チェックポイント阻害剤による治療の適否を判定するためのキット。
【請求項９】
さらに、
（iii）ピロリン酸モノエステル誘導体、又は窒素含有ビスホスホン酸誘導体、及び
（iv）ＩＬ−１８、
から選ばれる１又は２以上を含む、請求項８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願：
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１８−１８７８５６号（２０１８年１０月３日出願）の明細書に記載された内容を包含する。
技術分野：
本発明は、免疫チェックポイント阻害剤によるがん免疫療法の適否を判定する方法、及び前記方法のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
次世代のがん標準治療法として、免疫チェックポイント阻害剤を利用した“がん免疫療法”が期待されている。免疫チェックポイントとは、がん細胞を認識し排除する自然の免疫防御機構を制御する分子である。ＰＤ−１は、免疫エフェクター細胞上に発現し、抗原提示細胞に発現するＰＤ−Ｌ１やＰＤ−Ｌ２と結合して、免疫防御機構を負に制御する、免疫チェックポイントとして機能する。【０００３】
多くのがん細胞は、Ｔ細胞のシグナルを制御することで免疫防御機構を回避するシステムを有し、ＰＤ−１リガンドであるＰＤ−Ｌ１の発現と予後不良の間には相関があることが知られている（非特許文献１）。抗ＰＤ−１抗体等を利用したＰＤ−１免疫チェックポイント阻害による抗がん剤の開発も進められているが、その作用機序には不明な点が多く、また単独での奏効率は５〜３０％程度にすぎない。一方で、間質性肺炎など有害事象を発症する例もあり、投薬後の管理も重要である。【０００４】
免疫チェックポイント阻害剤の効果を予測するバイオマーカーの探索も行われており、免疫グロブリン、ＣＤ５Ｌおよびゲルソリンの血中濃度が抗ＰＤ−１抗体の効果判定マーカーとして使用できること（特許文献１）や、特定のｍｉＲＮＡがＰＤ−１阻害剤の感受性予測に利用できること（特許文献２）が報告されている。しかし、免疫チェックポイント阻害剤による治療の適否を判定する方法は未だ確立していない。【０００５】
免疫チェックポイント阻害剤による治療の適否を予測・評価することは、その奏効率を高め、適切な患者に適切な医療を届ける精密医療を実現させるという点で、患者の安全はもちろん、医療行政の面からも望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／００１６１７
【特許文献２】特開２０１６−６４９８９号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Hamanishi J. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Feb 27; 104(9):3360-5. Epub 2007 Feb 21.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、免疫チェックポイント阻害剤による重症性間質性肺炎を発症するリスクを予測し、免疫チェックポイント阻害剤による治療の適否を診断することで、その奏効率を高め、より安全で効果の高いがん免疫療法を実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
免疫チェックポイントは、免疫システムの中で２段階で作用している。一つは、Ｔｈ０細胞が抗原提示細胞の抗原を最初に認識し、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞などに分化する際にそれを負に制御するプライミングフェーズでの作用である。このプライミングフェーズでの、免疫チェックポイントとしてはＣＴＬＡ−４/ＣＤ８０/ＣＤ８６が知られており、Ｔ細胞がある抗原を認識するかしないかを決定する。もう一つは、腫瘍細胞や感染細胞を免疫エフェクター細胞が障害するエフェクターフェーズでの作用である。このフェーズでの免疫チェックポイントとしては、ＰＤ−１/ＰＤ−Ｌ１/ＰＤ−Ｌ２が知られており、Ｔ細胞が腫瘍細胞や感染細胞を傷害するかしないかを決定する。細胞障害活性を有する免疫エフェクター細胞としては、ＣＤ８陽性Ｔ細胞（キラー細胞）、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、などが知られている。ＮＫ細胞はγδＴ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖させ、γδＴ細胞とＮＫ細胞は、標的細胞を傷害後、抗原提示分子（ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ）と抗原ペプチド複合体を細胞表面に提示し、それに反応してαβＴ細胞が感作され、抗原特異性を獲得し、腫瘍細胞や感染細胞を傷害する。【００１０】
発明者らは、ＰＤ−１免疫チェックポイント阻害剤の効果は、患者のエフェクター細胞の数とその機能に関連すると考え、抗ＰＤ−１抗体（ニボルマブ）の治療を受けたがん患者の末梢血中のエフェクター細胞の数、増殖能、及び腫瘍細胞障害活性と有害事象及び奏効率との関係を調べた。そして、エフェクター細胞であるγδＴ細胞（Ｖδ２＋γδＴ細胞）の末梢血単核球中の細胞数又は割合を測定することで、ＰＤ−１免疫チェックポイント阻害剤による重症性間質性肺炎などの有害事象の発症リスクを予測できることを見出した。エフェクター細胞であるγδT細胞は、刺激を受けた後、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６などの抗原提示細胞関連分子を発現し、αβT細胞に対して抗原提示を行うことが知られており、２次的なプライミングフェーズで作用することが示唆されている。このことから、本発明知見は、ＰＤ−１免疫チェックポイント阻害剤だけでなく、２次的なプライミングフェーズで作用するＣＴＬＡ−４阻害剤による重症間質性肺炎などにも適用可能であることを見出し、本発明を完成させた。【００１１】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［１３］を提供する。
［１］免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症リスクを予測する方法であって、
（ａ）被験者から単離された末梢血単核球におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合、
（ｂ）被験者から単離された末梢血単核球におけるＶδ２＋γδＴ細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合、
（ｃ）被験者から単離された末梢血Ｔ細胞におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合、及び
（ｄ）被験者から単離された末梢血Ｔ細胞におけるＶδ２＋γδＴ細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合、から選ばれるいずれか１又は２以上を測定すること、及び
前記細胞数又は割合に基づいて重症間質性肺炎の発症リスクを判断すること、を含む方法。
前記方法では、比較的急性でびまん性肺胞傷害（diffuse alveolar damage：ＤＡＤ）を伴う間質性肺炎（重症間質性肺炎）をそれ以外の（例えば器質化肺炎（organizing pneumonia：ＯＰ）を伴う）間質性肺炎と鑑別して、その発症を予測することができる。
［２］前記細胞数又は割合がカットオフ値以上である場合に、当該被験者は重症間質性肺炎の発症リスクが高いと予測することを特徴とする、［１］に記載の方法。
［３］抗原刺激後の細胞数又は割合が高く、抗原刺激後の細胞が凝集を生じる場合に、当該被験者は重症間質性肺炎の発症リスクが高いと予測することを特徴とする、［１］に記載の方法。
［４］免疫チェックポイント阻害剤による治療の適否を判定する方法であって、請求項１〜３に記載の方法にしたがい重症間質性肺炎の発症リスクを予測し、前記予測に基づき免疫チェックポイント阻害剤による治療の適否を判定する方法。
［５］前記γδＴ細胞の抗原刺激が、ＩＬ−２、リン酸モノエステル化合物、ピロリン酸モノエステル化合物、トリリン酸モノエステル化合物、テトラリン酸モノエステル化合物、トリリン酸ジエステル化合物、テトラリン酸ジエステル化合物、窒素含有型ビスホスホン酸化合物、アルキルアミン、アルキルアルコール、アルケニルアルコール、イソプレニルアルコール、及びヒト由来腫瘍細胞から選ばれるいずれか１又は２以上の抗原を用いて行われる、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記抗原刺激に加えて、ＩＬ−１８、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、インターフェロンγ、及び末梢血コンディション培地から選ばれるいずれか１又は２以上を用いてγδＴ細胞を刺激する、［５］に記載の方法。
［７］細胞数又は割合が、フローサイトメトリー又はイメージサイトメトリーを用いて測定される、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］（i）抗ＣＤ３抗体、及び（ii）抗Ｖδ２抗体を含む、免疫チェックポイント阻害剤による治療の適否を判定するためのキット。
［９］さらに、
（iii）ピロリン酸モノエステル誘導体、又は窒素含有ビスホスホン酸誘導体、及び
（iv）ＩＬ−１８、
から選ばれる１又は２以上を含む、［８］に記載のキット。
［１０］免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症リスクの診断を補助するための方法であって、
（ａ）被験者から単離された末梢血単核球におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合、
（ｂ）被験者から単離された末梢血単核球におけるＶδ２＋γδＴ細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合、
（ｃ）被験者から単離された末梢血Ｔ細胞におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合、及び
（ｄ）被験者から単離された末梢血Ｔ細胞におけるＶδ２＋γδＴ細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合、から選ばれるいずれか１又は２以上を測定することを含み、
ここで、重症間質性肺炎の発症リスクは前記細胞数又は割合に基づいて決定される、方法。
［１１］免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症リスクを予測し、免疫チェックポイント阻害剤により治療するための方法であって、
（ａ）被験者から単離された末梢血単核球におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合、
（ｂ）被験者から単離された末梢血単核球におけるＶδ２＋γδＴ細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合、
（ｃ）被験者から単離された末梢血Ｔ細胞におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合、及び
（ｄ）被験者から単離された末梢血Ｔ細胞におけるＶδ２＋γδＴ細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合、から選ばれるいずれか１又は２以上を測定すること、
前記細胞数又は割合に基づいて重症間質性肺炎の発症リスクを予測すること、及び
前記予測にしたがい免疫チェックポイント阻害剤による治療を行う（例えば、発症リスクが高い被験者を除外して免疫チェックポイント阻害剤の投与を行う、あるいは発症リスクが高い患者には所定の措置を講じて免疫チェックポイント阻害剤の投与を行う）ことを含む、方法。
［１２］被験者が、肺がん患者である、［１］〜［７］、［１０］、及び［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］免疫チェックポイント阻害剤を含有する医薬組成物であって、重症間質性肺炎の発症を抑制し、腫瘍を治療または予防するために使用され、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法により重症間質性肺炎の発症リスクが少ないと判断される被験者に用いることを特徴とする医薬組成物。
上記［１］〜［１３］において、免疫チェックポイント阻害剤は、好ましくはＰＤ−１免疫チェックポイント阻害剤である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症リスクを投与前に予測し、治療の適否を判定することで、適切な患者に適切な医薬を提供する精密医療が実現される。本発明の方法は、患者から採取したわずかな末梢血を用いて実施できるため患者の負担が少なく、しかもフローサイトメトリー等を用いることで迅速かつ簡便に診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、健常人末梢血単核球におけるγδＴ細胞の割合をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。
【図２】図２は、ＰＴＡ及びＩＬ−２で増殖誘導したときの健常人末梢血単核球におけるγδＴ細胞の割合をフローサイトメトリーで解析した結果を示す（左：Ｄａｙ０、右Ｄａｙ１１）。（Ａ）Ｖδ２型γδＴ細胞のＤａｙ０における割合が５．５７％であった健常人、（Ｂ）Ｖδ２型γδＴ細胞のＤａｙ０における割合が１０．３５％であった健常人。
【図３】図３は、肺がん患者におけるγδＴ細胞の割合をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。
【図４】図４は、ＰＴＡ及びＩＬ−２で増殖誘導したときの肺がん患者の末梢血単核球におけるγδＴ細胞の割合をフローサイトメトリーで解析した結果を示す（左：Ｄａｙ０、右Ｄａｙ１１）。（Ａ）Ｖδ２型γδＴ細胞のＤａｙ０における割合が４．１４％であった肺がん患者、（Ｂ）Ｖδ２型γδＴ細胞のＤａｙ０における割合が２．９１％であった肺がん患者、（Ｃ）Ｖδ２型γδＴ細胞のＤａｙ０における割合が０．８９％であった肺がん患者、（Ｄ）Ｖδ２型γδＴ細胞のＤａｙ０における割合が０．７８％であった肺がん患者。
【図５】図５は、健常人末梢血単核球をＺｏｌ／ＩＬ−２あるいはＺｏｌ／ＩＬ−２／ＩＬ−１８で刺激したときのγδＴ細胞の増殖を示す（図中、左：コントロール（培地）、中央：Ｚｏｌ／ＩＬ−２、右：Ｚｏｌ／ＩＬ−２／ＩＬ−１８）。
【図６】図６は、健常人末梢血単核球のＣＤ３陰性画分をＩＬ−２あるいはＩＬ−２／ＩＬ−１８で刺激したときのＮＫ細胞の増殖を示す（図中、上：ＩＬ−２、下：ＩＬ−２／ＩＬ−１８）。
【図７】図７は、ＩＬ−２／ＩＬ−１８によるＮＫ細胞増殖誘導能とγδＴ細胞の増殖誘導との関係を混合培養により確認した結果を示す（図中、左：γδＴ細胞単独培養、中央：ＮＫ細胞単独培養、左：ＮＫ細胞とγδＴ細胞の混合培養。ＮＫ細胞（赤色）、γδＴ細胞（緑色）。
【図８】図８は、抗原刺激後のγδＴ細胞の増殖誘導メカニズムを示す。
【図９】図９は、ＰＤ１免疫チェックポイント阻害剤によるがん免疫療法と効果予測の概念を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．定義
「免疫チェックポイント阻害剤」
免疫チェックポイント阻害剤とは、ＣＴＬＡ−４/ＣＤ８０/ＣＤ８６シグナル伝達系や、ＰＤ−１/ＰＤ−Ｌ１/ＰＤ−Ｌ２シグナル伝達系などの免疫チェックポイントを阻害し、これにより抗腫瘍効果やウイルスなどの免疫逃避を抑制して抗感染症効果を示す物質を言う。
【００１５】
「ＰＤ−１（Programmed Death-1）」は、エフェクターＴ細胞表面に発現し、腫瘍細胞表面に発現するＰＤ−Ｌ１と相互作用することで免疫防御機構を負に制御する、いわゆる免疫チェックポイントである。ＰＤ−１は、細胞内領域に２つのＩＴＩＭ（Immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif）構造を有し、そのＣ末端側にＳＨＩＰ−２が結合することにより免疫抑制シグナルが伝達されると考えられている。
「ＰＤ−１免疫チェックポイント阻害剤」とは、ＰＤ−１が介在する免疫チェックポイント系を阻害する物質を意味する。これにより、「ＰＤ−１免疫チェックポイント阻害剤」は、腫瘍細胞による免疫逃避機構を抑制することで抗腫瘍効果を示し、またウイルスや病原微生物の免疫逃避を抑制することで抗感染症効果を示す。
【００１６】
一般に、Ｔ細胞は、抗原提示細胞上に提示された抗原ペプチド／ＭＨＣクラスＩあるいはＭＨＣクラスＩＩ複合体をＴ細胞受容体（ＴＣＲ）依存的に認識する。しかし、このＴＣＲ／抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体からのシグナルだけでは、完全な免疫応答は惹起されず、Ｔ細胞のプライミングには、ＴＣＲ／抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体のシグナルに加えて、ＣＤ２８／ＣＤ８０／ＣＤ８６シグナル系が必要である（正の副刺激シグナル）。これに対し、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ８０／ＣＤ８６シグナル系が作動すると、Ｔ細胞の活性化が負に制御される（負の副刺激シグナル）。すなわち、ＣＤ２８やＣＴＬＡ−４の副刺激シグナルは、Ｔ細胞がある抗原に対して反応するかどうかの最初の段階を規定する。一方、エフェクターフェーズでは、ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳＬシグナル系が正の副刺激シグナルとなり、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２シグナル系が負の副刺激シグナルとなる。すなわち、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１システムは、Ｔ細胞が標的細胞を殺すか殺さないかを決定するフェーズにおいて負のシグナル系として機能する。
【００１７】
ＰＤ−１免疫チェックポイント阻害剤としては、３つの候補、すなわち、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体が考えられる。まず、抗ＰＤ−１抗体はＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用、そして、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との相互作用の両者を遮断する。一方、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用のみを、抗ＰＤ−Ｌ２抗体はＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との相互作用のみを遮断する。
【００１８】
ＰＤ−１は活性化した免疫エフェクターＴ細胞に発現することが知られている。ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２は、予後の悪い腫瘍細胞に発現することが知られているが、ＰＤ−Ｌ２は樹状細胞にも発現している。そのため、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、活性化Ｔ細胞上に発現するＰＤ−１と腫瘍細胞上に発現するＰＤ−Ｌ１との相互作用を阻害して、Ｔ細胞の免疫抑制を遮断することで、Ｔ細胞の抗腫瘍効果を特異的に亢進させることが期待できる。一方、抗ＰＤ−Ｌ２抗体は、活性化Ｔ細胞上に発現するＰＤ−１と腫瘍細胞上に発現するＰＤ−Ｌ２との相互作用を阻害するため、Ｔ細胞の免疫抑制を遮断するほかに、Ｔ細胞上に発現するＰＤ−１と樹状細胞上に発現するＰＤ−Ｌ２との相互作用を阻害し、Ｔ細胞のプライミングにも影響を与える可能性がある。すなわち、抗ＰＤ−Ｌ２抗体や抗ＰＤ−１抗体はがん特異的な作用に加えて、別の異なる作用を示す可能性がある。このように、理論的には、ＰＤ−１免疫チェックポイント阻害剤としては、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が最もがん特異的であり、副作用も小さいと予想されるが、現実の作用については、臨床を踏まえたより詳細な解析が必要である。
【００１９】
現在販売あるいは開発中の免役チェックポイント阻害剤のうち、エフェクターフェーズで作用するＰＤ−１免疫チェックポイント阻害剤としては、抗ＰＤ−１抗体であるニボルマブ（オプジーボ）、ペムブロリズマブ（キイトルーダ）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１）；抗ＰＤ−Ｌ１抗体であるアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ／ＲＧ−７４４６）、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ（ＭＥＤＩ４７３６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＭＥＤ１０６８０／ＡＭＰ−５１４が挙げられる。他のフェーズで作用する、現在販売あるいは開発中の免疫チェックポイント阻害剤としては、抗ＣＴＬＡ−４抗体であるイピリムマブ（ＭＤＸ−０１０）、トレメリムマブ（ＣＰ６７５、２０６）；抗キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＲＩ）抗体であるリリルマブ（ＩＰＨ２１０２／ＢＭＳ−９８６０１５）、抗ＣＤ１３７抗体であるウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）、ＰＦ−０５０８２５６６、抗ＬＡＧ３抗体であるＢＭＳ−９８６０１６；抗ＯＸ４０抗体であるＭＥＤＩ６４６９等が挙げられる。
【００２０】
「間質性肺炎」
間質性肺炎とは肺の間質を炎症や線維化病変の場とする疾患の総称であり、進行して肺が線維化を起こしたものは肺線維症と呼ばれる。間質性肺炎の原因は多岐にわたり、職業・環境性や薬剤などによるもの、膠原病・サルコイドーシスなどの全身性疾患に付随して発症するもの、原因が特定できないものがある。一般的傾向として、急性発症はびまん性肺胞傷害（diffuse alveolar damage：ＤＡＤ）などの臨床像を取るのに対し、慢性発症では器質化肺炎（organizing pneumonia：ＯＰ）の臨床像を示す。ＯＰなどは一般に良好で薬剤中止あるいは副腎皮質ステロイド（ステロイド）の使用で改善することが多いが、ＤＡＤは治療反応性に乏しく予後不良で、回復しても線維化を残す。
【００２１】
「重症間質性肺炎」
本明細書において、重症間質性肺炎とは、比較的急性のＤＡＤを伴う間質性肺炎を意味し、急性憎悪を起こし、死に至る危険がある間質性肺炎の症状を意味する。本発明の方法によれば、ＤＡＤを伴う間質性肺炎と、それ以外の（例えばＯＰを伴う）間質性肺炎を鑑別して、その発症を予測することができる。
【００２２】
「末梢血単核球（ＰＢＭＣ）」
単核球（Mononuclear Cells）とは全身の結合組織、血中、リンパ組織に広く分布する単核の間葉系細胞群の総称で、組織中のマクロファージ、その前駆細胞である単球、リンパ球が含まれる。本発明にかかる「末梢血単核球（Peripheral Blood Mononuclear Cells: ＰＢＭＣ）」とは、末梢血に存在する単核球であり、主として単球とリンパ球からなる。末梢血単核球は公知の方法により、あるいは市販のキット等を用いて、単離することができる。
【００２３】
「腫瘍細胞障害活性」
「腫瘍細胞障害活性」とは、腫瘍細胞に対して、死、機能障害、増殖阻害を与える機能を意味する。ＮＫ細胞は、腫瘍細胞表面のリガンドとγδＴ細胞は、細胞内ＩＰＰ濃度の高い腫瘍細胞に対して、高い細胞障害性を示し、ＩＦＮ−γやＴＮＦ−αなどのサイトカインを産生し、抗腫瘍細胞活性を示す。腫瘍細胞傷害性を有する「エフェクターＴ細胞」としては、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞が知られている。
【００２４】
「αβＴ細胞」
「αβＴ細胞」は、α鎖とβ鎖の２つの糖タンパク質から構成されるＴ細胞受容体を有するＴ細胞で、末梢血リンパ球の大部分を占める。αβＴ細胞はＴＣＲ／ＣＤ３複合体により、抗原性ペプチド／ＭＨＣ複合体を認識する。したがって、αβＴ細胞を解析するためには抗原性ペプチドに関する情報が必要になる。現在までにＴ細胞の認識する抗原性ペプチドが同定されているが、一つの腫瘍でもその種類は複数であることが推測され、その全体を把握し、解析するのは困難である。
【００２５】
「γδＴ細胞」
「γδＴ細胞」は、細胞表面にγ鎖とδ鎖の２つの糖タンパク質から構成されるＴ細胞受容体を有するＴ細胞である。γδＴ細胞は、通常αβＴ細胞と比べると、はるかに少ない。末梢血単核球のＣＤ３陽性Ｔ細胞中には約４％のγδＴ細胞が存在し、その５０〜７５％が、ＴＣＲ可変領域において、「Ｖγ２」（Ｖγ９と称されることもある）及び「Ｖδ２」を発現するＶγ２Ｖδ２Ｔ細胞（Ｖδ２＋γδＴ細胞）である。
【００２６】
γδＴ細胞を活性化する抗原分子はほとんど知られていないが、発明者らはモノエチルリン酸などの合成アルキルリン酸がγδＴ細胞の抗原になること（Tanaka Y et al., PNAS USA 91 :8175-8179，1994）、イソプレノイド生合成経路の起点となるイソメンテニル二リン酸（ＩＰＰ）などのピロリン酸モノエステル系代謝物を抗原として認識し、ＩＰＰで活性化されたγδＴ細胞は強い抗腫瘍活性を有することを報告している（Tanaka et al., Nature, 375: 155-158, 1995）。また、窒素含有型ビスホスホン酸で抗原提示細胞（Miyagawa F et al., J. Immunol 166: 5508-5514，2001）や腫瘍細胞（Kato Y. et al., J. Immunol 167: 5092-5098, 2001）を処理するとγδＴ細胞が活性化されることも報告している。γδＴ細胞は、その抗原認識機構の詳細に関しては、未解明の部分が多いが、解析は可能である。
【００２７】
「ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞」
本発明にかかる「ＮＫ細胞」は、Ｔ細胞にも、Ｂ細胞にも属さないリンパ球で、腫瘍細胞、ある種のウイルス感染細胞、移植骨髄細胞などに対して、主要組織適合性（ＭＨＣ）抗原に拘束されずに障害活性を示す。ＮＫ細胞の表面には、標的細胞表面のリガンドと結合して細胞障害活性を誘導する活性化受容体と、自己ＭＨＣクラスＩ分子を認識して活性化受容体からのシグナルを抑制する抑制受容体が存在する。このように、ＮＫ細胞は、通常はＭＨＣによる負のシグナルを受け、腫瘍細胞上のＭＨＣが欠落した際、腫瘍細胞障害性を発揮する。しかし、ヒトのＮＫ細胞でＰＤ−１の発現を検討すると、その発現の確認が困難であり、解析することは難しい。
【００２８】
発明者らは、ＩＬ−２とＩＬ−１８を組み合わせることでＮＫ細胞を効率的に増殖できることを見出している（ＷＯ２０１６／０２１７２０）。ＮＫ細胞はＣＤ５６の発現により同定できる。ＩＬ−２及びＩＬ−１８刺激後のＮＫ細胞は、抗原提示細胞に関連したＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０を発現しており、がん細胞の破壊に加えて、Ｔ細胞にがん抗原を提示することで、免疫防御を活性化させることが示唆される。
【００２９】
「キラーＴ細胞（ＣＴＬ）」
「キラーＴ細胞（ＣＴＬ）」は、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ：Cytotoxic T Lymphocyte）と称され、宿主にとって異物である、アロ抗原やウイルス抗原を有する細胞を認識して障害する。ＣＴＬは、細胞表面にＣＤ８抗原とα鎖、β鎖からなるＴ細胞受容体を有する。「ＣＤ８陽性Ｔ細胞」は、抗原提示細胞からＭＨＣ−クラスＩ抗原と抗原ペプチドの提示を受け、活性化されることで、細胞障害活性を有するようになる。活性化されたＣＴＬは、パーフォリン、グランザイム、ＴＮＦを放出したり、標的細胞のＦａｓ抗原を刺激してアポトーシスを誘導することで、細胞を障害する。
【００３０】
２．免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症リスク
免疫チェックポイント阻害剤は、腫瘍細胞によるエフェクターＴ細胞の機能抑制を解除することにより、その本来の機能を回復させる。しかし、エフェクターＴ細胞の数が極端に少ないがん患者に関しては、エフェクター細胞の機能を回復させても、その絶対数が足りないために効率的な抗腫瘍効果は期待できない。本発明は、エフェクター細胞であるγδＴ細胞の数（割合）と機能を測定することで、免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症リスクを予測することを特徴とする。
【００３１】
２．１  検体（試料）
本発明で使用される検体（試料）は、被験者、すなわち免疫チェックポイント阻害剤の使用を検討している、あるいは既に使用している被験者から単離された末梢血単核球である。１回の測定に必要な末梢血は、少なくとも１０ｍｌ、好ましくは１０ｍｌ〜２０ｍｌである。
【００３２】
末梢血単核球は、被験者から採取した末梢血を、必要であれば適当量の抗凝固剤を加え、常法にしたがい、ＰＢＳなどの生理学的緩衝液で希釈後、密度勾配遠心、比重遠心等にかけることにより単離することができる。単離した単核球は、Ｙｓｓｅｌ培地、Ｉｓｃｏｖ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等のヒトＴ細胞用の培地で希釈して、一定の濃度、例えば１×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜１×１０７ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、好ましくは５×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜３×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整する。
【００３３】
２．２  測定対象
（ａ）末梢血単核球におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合
「末梢血単核球におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合」は、特異的な表面マーカーを利用することで、測定することができる。
【００３４】
例えば、Ｔ細胞はその表面にＣＤ３抗原を有し、γδＴ細胞は、さらにγ鎖及びδ鎖の２つの糖タンパク質からなる受容体を表面に有している。よって、被験者から単離された末梢血単核球に対して、ＣＤ３に特異的に結合する抗体と、γ鎖及びδ鎖の一方又は両方に特異的に結合する抗体（例えば、抗Ｖγ２抗体、抗Ｖδ１抗体、抗Ｖδ２抗体）を使用することにより、末梢血単核球におけるγδＴ細胞の量を測定することができる。前述のとおり、γδＴ細胞の大部分はＶγ２Ｖδ２Ｔ細胞（Ｖδ２＋γδＴ細胞）であるため、Ｖδ２を指標とすることで、実質的にＶγ２Ｖδ２を検出することができる。すなわち、抗Ｖδ２抗体とＴ細胞抗原であるＣＤ３抗原を用いて検出したＣＤ３＋Ｖδ２＋細胞（Ｖδ２＋γδＴ細胞）を、γδＴ細胞の数や割合を示すものとして判定に用いることができる。測定は、後述するフローサイトメトリーあるいはイメージアナライザーを使用することで、簡便かつ迅速に、「末梢血単核球におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合」を求めることができる。
【００３５】
具体的には、末梢血採取後（Ｄａｙ０における）、一定数の末梢血単核球（以下のカットオフ値では、末梢血単核球１ｘ１０７個）に関して、細胞数又は割合を測定する。被験者の免疫状態は変化しうるため、末梢血採取は治療直前に実施することが好ましい。
【００３６】
（ｂ）末梢血単核球におけるＶδ２＋γδＴ細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合
「末梢血単核球におけるＶδ２＋γδＴ細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合」は、Ｖδ２＋γδＴ細胞の増殖能を示す。
【００３７】
使用される抗原は、γδＴ細胞によって認識され、これを活性化できるものであれば特に限定されない。例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、インターフェロンγなどのペプチド性抗原；マイコバクテリアやマラリア原虫などが産生する（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテニル二リン酸（ＨＭＢ−ＰＰ）、２−メチル−３−ブテニル二リン酸（２Ｍ３ＢＰＰ）、モノエチルリン酸などの合成アルキルリン酸を含むリン酸モノエステル化合物、トリリン酸モノエステル化合物、テトラリン酸モノエステル化合物、トリリン酸ジエステル化合物、テトラリン酸ジエステル化合物；例えば、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、モノエチルピロリン酸二ナトリウム、モノメチルピロリン酸二ナトリウム、モノプロピルピロリン酸二ナトリウムなどのＣ１−５のアルキル基を有するピロリン酸モノエステル化合物又はその塩に代表されるピロリン酸誘導体（例えば、特開２００３−１２８５５５号に記載の化合物など）；窒素含有ビスホスフォネートのジェミナル炭素原子にアルキルアミンまたはアルケニルアミンを導入したビスホスホン酸化合物もしくはそのエステル又はそれらの塩に代表される窒素含有ビスホスホン酸化合物（例えば、ＷＯ２０１６／０９８９０４、ＷＯ２０１６／１２５７５７に記載された化合物（後掲ＰＴＡなど））、アルキルアミン、アルキルアルコール、アルケニルアルコール、イソプレニルアルコールなどの非ペプチド性抗原、ならびにヒト由来腫瘍細胞や末梢血コンディション培地等を使用することができる。前記抗原は、機能し得る限り、そのフラグメント（断片）であってもよい。
【００３８】
抗原刺激後の細胞数や割合は、単離した末梢血単核球を含む培養液に上記した抗原を添加し、一定期間経過後に前項（ａ）と同様の方法で測定する。添加する抗原の量は、使用する抗原のγδＴ細胞活性化能に応じて適宜決定する。抗原添加後の測定までの時間も使用する抗原に応じて適宜決定されるが、通常は０．５時間以上、好ましくは１２時間〜１４日程度である。
【００３９】
例えば、ＩＬ−２の場合、例えば１０〜１０００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは２０〜２００ＩＵ／ｍｌとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートし、３日〜１４日後、好ましくは７日〜１１日後にγδＴ細胞の細胞数又は割合を測定する。
【００４０】
ピロリン酸モノエステル誘導体の場合であれば、例えば１０ｐＭ〜５００μＭ、好ましくは１００ｐＭ〜１００μＭとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートし、３日〜１４日後、好ましくは７日〜１１日後にγδＴ細胞の細胞数又は割合を測定する。
【００４１】
ＰＴＡのような窒素含有型ビスホスホン酸誘導体であれば、例えば１ｎＭ〜５００μＭ、好ましくは１０ｎＭ〜５μＭ（例えば、１μＭのＰＴＡ）となるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートし、３日〜１４日後、好ましくは７日〜１１日後にγδＴ細胞の細胞数又は割合を測定する。
【００４２】
（ｃ）末梢血Ｔ細胞におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合
「末梢血Ｔ細胞におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合」は、Ｔ細胞に特異的な抗ＣＤ３抗体と抗Ｖδ２抗体を用いることにより求めることができる。測定は、後述するフローサイトメトリーあるいはイメージアナライザーを使用することで求めることができる。
【００４３】
（ｄ）抗原刺激後の末梢血Ｔ細胞におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合
「末梢血Ｔ細胞における抗原刺激後のＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合」は、Ｖδ２＋γδＴ細胞の増殖能を示す。抗原刺激及び抗原刺激後のＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合の測定方法は、（ｂ）に記載した方法に準じて実施することができる。
本発明においては、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれを指標とすることも可能であるが、後述するように、ＣＤ３−Ｖδ２−細胞が多い被験者においては末梢血Ｔ細胞を試料とするほうが好ましい。
また、通常健常人ではγδＴ細胞の大部分はＶδ２＋細胞であるが、がん患者では、Ｖδ１が多い場合がある。そのような患者由来の試料でも、抗原刺激をするとＶδ２＋細胞が増殖し、Ｖδ１は検出感度以下になるため、Ｖδ２＋γδＴ細胞を、γδＴ細胞の数や割合を示すものとして評価することができる。したがって、Ｖδ１＋γδＴ細胞が多い被験者においては抗原刺激後の試料中のＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数や割合を指標とすることが好ましい。
【００４４】
２．３  細胞数又は割合の測定
・フローサイトメトリー
末梢血単核球あるいは末梢血Ｔ細胞中におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合の測定方法は、各細胞の表面抗原に特異的な抗体を使用して、フローサイトメトリーにより測定することができる。フローサイトメトリーは、流体に懸濁させた細胞を１個ずつセンシングゾーンに導き、その単一の流れにおいて、蛍光や散乱光を測定することで、多量の細胞を短時間に１個ずつ定量解析できる細胞測定法である。
【００４５】
Ｖδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合は、Ｔ細胞マーカーであるＣＤ３と、γδＴ細胞マーカーであるＶδ２等を用いた２色蛍光ヒストグラムにより簡便に測定することができる。具体的に言えば、末梢血単核球をＣＤ３抗体と抗体Ｖδ２抗体を用いた２色蛍光ヒストグラムで解析すると、ＣＤ３＋Ｖδ２−がαγＴ細胞（Ｇ１）に該当し、ＣＤ３＋Ｖδ２＋がγδＴ細胞（Ｇ２）に該当し、それ以外に、ＣＤ３−Ｖδ２−の細胞（Ｇ３）が検出できる。Ｇ２／Ｇ１＋Ｇ２＋Ｇ３が末梢血単核球におけるＶδ２＋γδＴ細胞の割合に該当し、Ｇ２／Ｇ１＋Ｇ２が末梢血Ｔ細胞におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数と割合に該当する。
【００４６】
・イメージサイトメトリー（イメージアナライザー）
末梢血単核球におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合の測定方法は、各細胞の表面抗原に特異的な抗体を使用して、イメージサイトメトリーにより測定することもできる。イメージサイトメトリーは、マルチウェルプレートやスライドグラス上の細胞を、レーザー走査して、その蛍光イメージや散乱光・透過光イメージを取得し、画像処理することにより、多量の細胞を短時間に１個ずつ定量解析できる細胞測定法である。
【００４７】
フローサイトメトリーと同様に、末梢血単核球あるいは末梢血Ｔ細胞におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数と割合は、Ｔ細胞マーカーであるＣＤ３と、Ｖδ２を用いた散乱光像や２色蛍光像により簡便に測定することができる。
【００４８】
２．４  予測・判定方法
（１）末梢血単核球におけるＶδ２＋γδＴ細胞の数・割合に基づく予測
（ａ）末梢血単核球におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合、及び／又は（ｂ）末梢血単核球におけるＶδ２＋γδＴ細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合が、所定のカットオフ値以上の場合、免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症リスクは高いと予測できる。そして、その発症リスクに基づき免疫チェックポイント阻害剤による治療の適否を判定することができる。
【００４９】
カットオフ値は、使用する免疫チェックポイント阻害剤、ならびに末梢血単核球数及び細胞の培養期間に応じて、適宜決定される。
【００５０】
（ａ）細胞数のカットオフ値は、末梢血単核球が１ｘ１０７個とした場合、通常０．５x１０５〜１５x１０５の範囲、好ましくは０．５x１０５〜１４x１０５、０．５x１０５〜１３x１０５、０．５x１０５〜１２x１０５、０．５x１０５〜１１x１０５、０．５x１０５〜１０x１０５、０．５x１０５〜９x１０５、０．５x１０５〜８x１０５、０．５x１０５〜７x１０５、０．５x１０５〜６x１０５、０．５x１０５〜５x１０５の範囲、より好ましくは１x１０５〜１５x１０５、１x１０５〜１４x１０５、１x１０５〜１３x１０５、１x１０５〜１２x１０５、１x１０５〜１１x１０５、１x１０５〜１０x１０５、１x１０５〜９x１０５、１x１０５〜８x１０５、１x１０５〜７x１０５、１x１０５〜６x１０５、１x１０５〜５x１０５、１x１０５〜４x１０５の範囲、とくに好ましくは１x１０５〜３x１０５の範囲である。
細胞割合のカットオフ値は、通常０．５〜１５％の範囲、好ましくは０．５〜１４％、０．５〜１３％、０．５〜１２％、０．５〜１１％、０．５〜１０％、０．５〜９％、０．５〜８％、０．５〜７％、０．５〜６％、０．５〜５％、０．６〜５％、０．７〜５％、０．８〜５％、０．９〜５％、１．０〜５％、０．６〜４％、０．７〜４％、０．８〜４％、０．９〜４％、１．０〜４％の範囲、より好ましくは０．６〜３％、０．７〜３％、０．８〜３％の範囲、０．９〜３％、とくに好ましくは１〜３％の範囲である。
（ｂ）抗原刺激を与える場合の細胞数のカットオフ値は、与える抗原刺激によって異なるが、上記した値の数十倍超、好ましくは１００倍〜２０００倍になる。例えば、ＰＴＡとＩＬ−２を用いた抗原刺激では、細胞数は２００倍〜３０００倍に増加し、細胞割合は９８％超となる。重症間質性肺炎の発症リスクが高い被験者では、Ｖδ２＋γδＴ細胞の反応性が高く、ピロリン酸誘導体やビスホスホン酸化合物による抗原刺激を与えると細胞が凝集を生じるため、目視判定することも可能である。例えば、末梢血単核球に１μＭのＰＴＡを作用させて、１日目の細胞凝集を目視判定する。
【００５１】
（２）末梢血Ｔ細胞におけるＶδ２＋Ｔ細胞の数・割合に基づく予測
（ｃ）末梢血Ｔ細胞におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合、及び／又は（ｄ）末梢血Ｔ細胞におけるＶδ２＋γδＴ細胞の抗原刺激後の細胞数又は割合が、所定のカットオフ値以上の場合、免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症リスクは高いと予測できる。そして、その発症リスクに基づき免疫チェックポイント阻害剤による治療の適否を判定することができる。
一般的には、前述した末梢血単核球におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合によって被験者の応答を予測できるが、ＣＤ３−Ｖδ２−の細胞（Ｇ３）が多い被験者の場合には、これを除いた末梢血Ｔ細胞におけるＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数や割合を対象に診断するほうが好ましい。
【００５２】
カットオフ値は、使用する免疫チェックポイント阻害剤、ならびに末梢血Ｔ細胞数及び培養期間に応じて、適宜決定される。
【００５３】
（ｃ）細胞数のカットオフ値は、Ｔ細胞が１ｘ１０７個とした場合、通常１x１０５〜２０x１０５の範囲、好ましくは１x１０５〜１９x１０５、１x１０５〜１８x１０５、１x１０５〜１７x１０５、１x１０５〜１６x１０５、１x１０５〜１５x１０５、１x１０５〜１４x１０５、１x１０５〜１３x１０５、１x１０５〜１２x１０５、１x１０５〜１１x１０５、１x１０５〜１０x１０５、１x１０５〜９x１０５、１x１０５〜８x１０５、１x１０５〜７x１０５、１x１０５〜６x１０５、１x１０５〜５x１０５の範囲、より好ましくは２x１０５〜５x１０５、２x１０５〜４x１０５の範囲、とくに好ましくは２x１０５〜３x１０５の範囲である。
細胞割合のカットオフ値は、通常１〜２０％の範囲、好ましくは１〜１９％、１〜１８％、１〜１７％、１〜１６％、１〜１５％、１〜１４％、１〜１３％、１〜１２％、１〜１１％、１〜１０％、１〜９％、１〜８％、１〜７％、１〜６％、１〜５％、１〜４％、１〜３％の範囲、より好ましくは２〜５％、２〜４％の範囲、とくに好ましくは２〜３％の範囲である。
（ｂ）抗原刺激を与える場合の細胞数のカットオフ値は、与える抗原刺激によって異なるが、上記した値の数十倍超、好ましくは１００倍〜２０００倍になる。例えば、ＰＴＡとＩＬ−２を用いた抗原刺激では、細胞数は２００倍〜３０００倍に増加し、細胞割合は９８％超となる。
重症間質性肺炎の発症リスクが高い被験者では、Ｖδ２＋γδＴ細胞の反応性が高く、ピロリン酸誘導体やビスホスホン酸化合物による抗原刺激を与えると細胞が凝集を生じるため、目視判定することも可能である。例えば、末梢血単核球に１μＭのＰＴＡを作用させて、１日目の細胞凝集を目視判定する。
【００５４】
２．５  その他の方法
上記した方法に加えて、使用する免疫チェックポイント阻害剤や治療目的に応じて、下記（ｅ）〜（ｉ）の指標を適宜組み合わせて、治療の適否を判定してもよい。
（ｅ）抗原刺激後のγδＴ細胞のＰＤ−１発現量、
（ｆ）抗原刺激後のγδＴ細胞の腫瘍細胞障害活性、
（ｇ）被験者から単離された末梢血単核球におけるＮＫ細胞の細胞数又は割合、
（ｈ）被験者から単離された末梢血単核球におけるＮＫ細胞の増殖刺激後の細胞数又は割合、
（ｉ）前記増殖刺激後のＮＫ細胞の腫瘍細胞障害活性。
なお、前述のとおり、γδＴ細胞はＶδ２＋γδＴ細胞として上記指標を求めても良い。
【００５５】
（ｅ）抗原刺激後のγδＴ細胞のＰＤ−１発現量
「抗原刺激後のγδＴ細胞のＰＤ−１発現量」は、免疫チェックポイント阻害剤に対する応答性の指標である。したがって、重症間質性肺炎の発症リスクと併せて、免疫チェックポイント阻害剤に対する応答性を評価することで、より精密な治療が可能になる。
【００５６】
使用する抗原は、γδＴ細胞によって認識され、これを活性化できるものであれば特に限定されず、前記（ｂ）に記載した抗原と同様のものを使用することができる。また、抗原の添加量や抗原添加後測定までの時間も前記（ｂ）に記載したとおりである。ＰＤ−１の発現量は、上述したフローサイトメトリーやイメージサイトメトリーを使用することで、簡便に定量解析することができる。
【００５７】
（ｆ）抗原刺激後のγδＴ細胞の腫瘍細胞障害活性
「抗原刺激後のγδＴ細胞の腫瘍細胞障害活性」は、免疫チェックポイント阻害剤に応答して、現実にγδＴ細胞が腫瘍細胞障害活性を発揮するかどうかの指標である。したがって、重症間質性肺炎の発症リスクと併せて、免疫チェックポイント阻害剤に応答したγδＴ細胞の腫瘍細胞障害活性を評価することで、より精密な治療が可能になる。
【００５８】
使用する抗原は、γδＴ細胞によって認識され、これを活性化できるものであれば特に限定されず、前記（ｂ）に記載した抗原と同様のものを使用することができる。また、抗原の添加量や抗原添加後測定までの時間も前記（ｂ）に記載したとおりである。
【００５９】
通常の腫瘍細胞の場合、細胞傷害活性を測定するためには、γδＴ細胞の腫瘍細胞障害性をあげるために窒素含有ビスホスホン酸（Ｎ−ＢＰ）等による刺激を行うことが好ましい。例えば、まず、腫瘍細胞をＮ−ＢＰ処理し、処理終了１５分前にテルピリジン誘導体をパルスする。がん細胞を洗浄後、γδＴ細胞を作用させ、細胞障害性を惹起する。４０分後に、後述する方法により腫瘍細胞傷害活性を測定する。
【００６０】
γδＴ細胞の細胞障害性を受けやすい腫瘍細胞を用いる方法もある。例えば、Ｄａｕｄｉバーキットリンパ腫細胞はＮ−ＢＰによる刺激を与えなくてもγδＴ細胞の細胞障害性を受ける。Ｄａｕｄｉ細胞にＰＤ−Ｌ１を強制発現させると、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の効果をより簡便に測定することができる。すなわち、Ｄａｕｄｉ／ＰＤ−Ｌ１細胞にγδＴ細胞を作用させると、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用により免疫抑制を受ける。しかし、ここに抗ＰＤ−Ｌ１抗体を添加すると、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用が遮断されるため、細胞障害性が上昇する。この系を用いることにより、免疫チェックポイント阻害剤の腫瘍細胞障害性活性をin vitroで容易に評価できる。
【００６１】
腫瘍細胞障害活性は、β放射線放射活性測定法、γ放射線放射活性測定法、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性測定法、及び時間分解蛍光法、非ＲＩ系細胞障害測定法（ＷＯ２０１５／１５２１１１）など、培養がん細胞株を利用して公知の方法により実施することができる。
【００６２】
・β放射線放射活性測定法
標的細胞（腫瘍細胞）を３Ｈ−Ｐｒｏｌｉｎｅで標識し、エフェクター細胞（γδＴ細胞又はＮＫ細胞）と混合培養し、エフェクター細胞による細胞障害によって標的細胞から放出される３Ｈ−Ｐｒｏｌｉｎｅ量（β放射線）を測定する。標的細胞とエフェクター細胞の混合比（Ｅ／Ｔ比）や培養時間は使用する細胞に応じて適宜設定され、例えばＥ／Ｔ比＝０．５〜２程度で調整する。
次式で示される細胞障害活性（％）を計算し、細胞障害活性を評価する。
細胞障害活性（％）＝（Ｅ／Ｔ比）−標的細胞のみの放出量 ／ 標的細胞を全て障害したときの放出量−標的細胞のみの放出量
【００６３】
・γ放射線放射活性測定法
標的細胞（腫瘍細胞）を５１Ｃｒで標識し、エフェクター細胞（γδＴ細胞又はＮＫ細胞）と混合培養し、エフェクター細胞による細胞障害によって標的細胞から放出される３Ｈ−Ｐｒｏｌｉｎｅ量（β放射線）を測定する。β放射線放射活性測定法と同様に、標的細胞とエフェクター細胞の混合比（Ｅ／Ｔ比）や培養時間は使用する細胞に応じて適宜設定され、細胞障害活性（％）を計算することで細胞障害活性を評価する。
【００６４】
・時間分解蛍光法
標的細胞（腫瘍細胞）をユーロピウム（Ｅｕ）で標識し、エフェクター細胞（γδＴ細胞又はＮＫ細胞）と混合培養し、エフェクター細胞による細胞障害によって標的細胞から放出される３Ｅｕ量（蛍光）を測定する。β放射線放射活性測定法やγ放射線放射活性測定法と同様に、標的細胞とエフェクター細胞の混合比（Ｅ／Ｔ比）や培養時間は使用する細胞に応じて適宜設定され、細胞障害活性（％）を計算することで細胞障害活性を評価する。
【００６５】
・乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性測定法
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は細胞質に存在する酵素で、細胞が障害を受けると培地中に放出される。この放出されたＬＤＨを、ＬＤＨによって触媒される乳酸脱水素反応で生じるＮＡＤＨをＩＴＮ（テトラゾリウム塩）と反応させて生じるホルマザン色素（４９０ｎｍの吸光度量）を通して定量する。ＲＩを使用しないため、安全性が高い。他の方法と同様に、標的細胞とエフェクター細胞の混合比（Ｅ／Ｔ比）や培養時間は使用する細胞に応じて適宜設定され、細胞障害活性（％）を計算することで細胞障害活性を評価する。
【００６６】
・キレート前駆体を利用した非ＲＩ測定法
発明者らが開発した非ＲＩ系による細胞障害能迅速測定法では、キレート剤前駆体で腫瘍細胞を処理する。具体的には、まず、ブタノイルオキシメチル基で保護したテルピリジン誘導体で腫瘍細胞を処理する。すると、その脂溶性のために細胞に取り込まれ、エステラーゼで加水分解を受け、細胞内にネガティブチャージを有するキレート剤が蓄積する。ここで、免疫エフェクター細胞を作用させると、腫瘍細胞が障害され、膜構造が少し破壊される。すると、キレート剤は速やかに培養上清に漏出する。ここで、培養上清を少し回収し、ランタノイド系金属であるユーロピウムを添加するとキレートが形成され、励起光を当てると時間分解蛍光が発せられる。この時間分解蛍光を測定すれば、細胞障害性が非ＲＩで定量できる。
【００６７】
時間分解蛍光の利点は、励起光を当てた後、通常の蛍光性化合物は２μ秒ほどの蛍光しか発しないのと比較し、１００μ秒程度の長い時間蛍光を発するため、バックグラウンドとの差が大きくなり、測定の信頼性が上がる。本アッセイ法で用いるテルピリジンジカルボン酸のアルコキシメチル誘導体のうち下記化合物は、ほとんどの腫瘍細胞株で、高い最大標識量と２０％以下の自然漏出量を得ることができる。
【００６８】
【化１】
2020071354.tif 000002
【００６９】
腫瘍細胞障害活性の測定で使用する腫瘍細胞株は特に限定されない。腫瘍細胞としては、例えば、ヒト骨髄性腫瘍あるいは白血病細胞株であるＫ５６２、ＨＬ６０、ＥＢ１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＨＥＬ−９２．１．７、ＨＳＢ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨｕＴ−７８、ＫＧ−１Ａ、ＨＮＴ−３４、ＭＯＬＴ−４、ＭＶ４−１１、ＮＢ−４、ＲＥＨ、ＲＰＭＩ−１７８８、ＴＦ−１、ＴＨＰ−１、ＴＫ６、Ｕ９３７；ヒト肺がん細胞株であるＡ−４２７、Ａ−５４９、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−６、ＣＬＳ−５４、ＤＭＳ−７９、ＧＣＴ、ＨＥＬ−２９９、Ｈ−Ｍｅｓｓｏ−１、Ｈ−Ｍｅｓｓｏ−１Ａ、ＬＣＬＣ−９７ＴＭ１、ＬＸ−１、ＬＸ−２８９、ＭＲＣ−５、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、ＮＣＩ−Ｈ１４６、ＮＣＩ−Ｈ２０９、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ８２、ＮＣＩ−Ｈ１２８、ＳＣＬＣ−２１Ｈ、ＳＣＬＣ−２２Ｈ、ＳＫ−ＬＵ−１、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＳＶ−８０；ヒト肝がん細胞株であるＣｈａｎｇ−Ｌｉｖｅｒ、Ｈｅｐ−Ｇ２、ＨｕＨ−７、ＰＬＣ−ＰＲＦ−５、ＳＫ−ＨＥＰ−１；ヒト乳がん細胞株であるＢＴ−２０、ＢＴ−４７４、ＢＴ−５４９、ＣＯＬＯ−８２４、ＨＢＬ−１００、ＭＡ−ＣＬＳ−２、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＸ−１、ＳＫ−ＢＲ−３、Ｔ−４７Ｄ、ＺＲ−７５−１；ヒト卵巣がん細胞株であるＨＥＹ；ヒト胃がん細胞株であるＡＧＳ、ＣＬＳ−１４５、ＨＧＣ−２７、ＭＫＮ１、ＭＫＮ２８、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ；ヒト膵臓がん細胞株であるＡｓＰＣ−１、Ｃａｐａｎ−１、Ｃａｐａｎ−２、ＤＡＮ−Ｇ、ＦＡＭＰＡＣ、ＦＡＭＰＡＣ−Ａ、ＰＡ−ＣＬＳ５２、Ｐａｎｃ−１；ヒト腎臓がん細胞株である２９３（ＨＥＫ−２９３）、７６９−Ｐ、７８６−０、Ａ−４９８、Ａ−７０４、ＡＣＨＮ、ＣａＫｉ−２、ＲＣ−１２４、ＲＣ−１３１、ＲＣ−１３４、ＲＣ−１３８、ＲＣ−１４２、ＲＣＣ−ＡＢ（ＫＴＣＴＬ−２１）、ＲＣＣ−ＥＲ（ＫＴＣＴＬ−１３）、ＲＣＣ−ＥＫ（ＫＴＣＴＬ−１３５）、ＲＣＣ−ＥＷ（ＫＴＣＴＬ−２）、ＲＣＣ−ＡＬ４、ＲＣＣ−ＦＧ１（ＫＴＣＴＬ−２６）、ＲＣＣ−ＦＧ２（ＫＴＣＴＬ−２６Ａ）、ＲＣＣ−ＧＨ、ＲＣＣ−ＧＳ（ＫＴＣＴＬ−１８５）、ＲＣＣ−ＨＢ（ＫＴＣＴＬ−４８）、ＲＣＣ−ＪＷ（ＫＴＣＴＬ−１９５）、ＲＣＣ−ＫＬ、ＲＣＣ−ＫＰ（ＫＴＣＴＬ−５３）、ＲＣＣ−ＬＲ（ＫＴＣＴＬ−１２０）、ＲＣＣ−ＭＦ（ＫＴＣＴＬ−１Ｍ）、ＲＣＣ−ＭＨ（ＫＴＣＴＬ−１２９）、ＲＣＣ−ＯＦ１（ＫＴＣＴＬ−５４）、ＲＣＣ−ＧＷ、ＲＣＣ−ＰＲ、ＲＣＣ−ＷＫ（ＫＴＣＴＬ−８７）、ＳＫ−ＮＥＰ−１、ＷＴ−ＣＬＳ１；ヒト骨肉腫細胞株であるＣＡＤＯ−ＥＳ１、ＨＯＳ（ＴＥ−８５）、ＫＨＯＳ−２４０Ｓ、ＫＨＯＳ−３１２Ｈ、ＫＨＯＳ−ＮＰ、ＭＧ−６３、ＭＨＨ−ＥＳ１、ＭＮＮＧ−ＨＯＳ、ＲＤ−ＥＳ、ＳａＯＳ−２、ＳＫ−ＥＳ−１、ＳＷ−１３５３、ＴＭ−７９１、Ｕ−２ＯＳ；ヒト大腸がん細胞株であるＣＷ２、ＤＬＤ−１、Ｃｏｌｏ３２０；ヒト悪性黒色腫細胞株であるＣ３２ＴＧ、Ｇ３６１；ヒト前立腺細胞株であるＰＣ−３、ＤＵ−１４５、ＬＮＣａＰを挙げることができるが、これらに限定されない。とくに、ＮＫ細胞の場合は、その腫瘍細胞障害活性試験の標準的細胞株として使用されるＫ５６２細胞、γδＴ細胞の場合はＵ９３７組織球由来白血病細胞が好ましい。
【００７０】
免疫チェックポイント阻害剤の奏効率を高めるために、他の免疫療法との併用療法の開発も進められている。例えば、ニボルマブ（ヒト型抗ＰＤ−１モノクローナル抗体）とイピリムマブ（ヒト型抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体）の併用による奏効率は６割であると報告されている。また、発明者らはＩＬ−１８を、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＤＬＡ−４抗体と併用することにより、抗腫瘍効果の相乗的向上が認められることを報告している（ＷＯ２０１０／００１６１７）。そのような併用療法における免疫チェックポイント阻害剤の奏効率を予測する場合には、併用される抗体やサイトカインの存在下で腫瘍細胞傷害活性をみてもよい。
【００７１】
（ｇ）末梢血単核球におけるＮＫ細胞の細胞数又は割合
「末梢血単核球におけるＮＫ細胞の細胞数又は割合」は、末梢血単核球とＮＫ細胞にそれぞれ特異的な表面マーカーを利用することで、測定することができる。前述のとおり、ＮＫ細胞は、腫瘍細胞障害活性を有する。したがって、重症間質性肺炎の発症リスクと併せて、ＮＫ細胞の数や割合を評価することで、より精密な治療が可能になる。
【００７２】
ＮＫ細胞はその表面にＣＤ５６抗原を有している。よって、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ５６抗体を使用することにより、末梢血単核球中のＮＫ細胞の量を測定することができる。測定は、後述するフローサイトメトリーあるいはイメージアナライザーを使用することで、簡便かつ迅速に、「末梢血単核球におけるＮＫ細胞の細胞数又は割合」を求めることができる。
【００７３】
（ｈ）末梢血単核球におけるＮＫ細胞の増殖刺激後の細胞数又は割合
「末梢血単核球におけるＮＫ細胞の増殖刺激後の細胞数又は割合」は、ＮＫ細胞の増殖能を示す。したがって、重症間質性肺炎の発症リスクと併せて、腫瘍細胞障害活性を有するＮＫ細胞の増殖能を評価することで、より精密な治療が可能になる。
【００７４】
使用される増殖刺激因子は、ＮＫ細胞の増殖を刺激できるものであれば特に限定されない。例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、インターフェロンγ、及び末梢血コンディション培地などを挙げることができる。前記増殖刺激因子は、機能し得る限り、そのフラグメント（断片）であってもよい。
【００７５】
増殖刺激後の細胞数や割合は、単離した末梢血単核球を含む培養液に上記した増殖刺激因子を添加し、一定期間経過後に前項（ｂ）と同様の方法で測定する。添加する増殖刺激因子の量は、使用する増殖刺激因子のＮＫ細胞増殖刺激能に応じて適宜決定される。増殖刺激因子添加後の測定までの時間も使用する増殖刺激因子に応じて適宜決定されるが、通常は０．５時間以上、好ましくは１２時間〜１４日程度である。
【００７６】
ＩＬ−２の場合であれば、例えば１０〜１０００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは２０〜２００ＩＵ／ｍｌとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートし、３日〜１４日後、好ましくは７日〜１１日後にＮＫ細胞の細胞数又は割合を測定する。
【００７７】
インターフェロンγの場合であれば、例えば１〜１００００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは１０〜１０００ＩＵ／ｍｌとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートし、１日〜１４日後、好ましくは３日〜１０日後にＮＫ細胞の細胞数又は割合を測定する。
【００７８】
ＩＬ−１８の場合であれば、例えば１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは２０〜３００ＩＵ／ｍｌとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートし、１日〜１４日後、好ましくは３日〜１０日後にＮＫ細胞の細胞数又は割合を測定する。
【００７９】
（ｉ）増殖刺激後のＮＫ細胞の腫瘍細胞障害活性
「増殖刺激後のＮＫ細胞の腫瘍細胞障害活性」は、免疫チェックポイント阻害剤に応答して、現実にＮＫ細胞が腫瘍細胞障害活性を発揮するかどうかの指標である。したがって、重症間質性肺炎の発症リスクと併せて、ＮＫ細胞の腫瘍細胞障害活性を評価することで、より精密な治療が可能になる。
【００８０】
使用する抗原は、ＮＫ細胞の増殖を刺激できるものであれば特に限定されず、前記（ｈ）に記載した増殖刺激因子と同様のものを使用することができる。また、増殖刺激因子の添加量や増殖刺激因子添加後測定までの時間も前記（ｈ）に記載したとおりである。
【００８１】
腫瘍細胞障害活性は、β放射線放射活性測定法、γ放射線放射活性測定法、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性測定法、及び時間分解蛍光法、非ＲＩ系細胞障害測定法（ＷＯ２０１５／１５２１１１）など、培養がん細胞株を利用して公知の方法により実施することができる。腫瘍細胞障害活性の測定方法については、次項で詳述する。
【００８２】
３．診断用試薬・キット
本発明は、上記した免疫チェックポイント阻害剤の効果予測用試薬及びキットも提供する。
【００８３】
本発明のキットは、（i）抗ＣＤ３抗体、及び（ii）抗Ｖδ２抗体を必須の構成要素とし、判定（診断）のための指示書を含んでいてもよい。
【００８４】
本発明のキットは、さらに（iii）ピロリン酸モノエステル誘導体、又は窒素含有ビスホスホン酸誘導体、及び／又は（iv）ＩＬ−１８、を含んでいてもよい。
【００８５】
本発明のキットにおいて、抗体は適宜標識あるいは固定化されていてもよい。また、目的とする抗原分子の検出に使用できる限り、抗体フラグメント（断片）であってもよい。抗体フラグメントとしては、たとえばＦ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｒＩｇＧ、Ｆｃを挙げることができる。
【００８６】
上記した構成要素のほか、本発明のキットは、前述したフローサイトメトリー又はイメージサイトメトリー、腫瘍細胞障害活性測定に必要な各種試薬（例えば抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体）、二次抗体、基質溶液、腫瘍細胞株（例えば、Ｋ５６２細胞株など）、培地（例えば、Ｙｅｓｓｅｌ培地など）を含む。また上記（i）〜（iv）や、その他の構成要素は、それぞれ個別に判定（診断）用試薬として提供されていてもよい。
【００８７】
４．コンパニオン診断と治療戦略
本発明の免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症のリスクを予測する方法、前記方法にしたがい免疫チェックポイント阻害剤による治療の適否を判定する方法（診断方法）、試薬（診断薬）、及びキット（診断用キット）は、免疫チェックポイント阻害剤の効果や副作用を投薬前に予測する臨床検査、いわゆるコンパニオン診断に利用することができる。
【００８８】
対象となる免疫チェックポイント阻害剤は、例えば、前述したような、抗ＰＤ−１抗体であるニボルマブ（オプジーボ）、ペムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５）；抗ＰＤ−Ｌ１抗体であるジピリズマブ（ＣＴ−０１１）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ／ＲＧ−７４４６、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＭＥＤ１０６８０／ＡＭＰ−５１４；抗ＰＤ−Ｌ２抗体；抗ＣＴＬＡ−４抗体であるイピリムマブ（ＭＤＸ−０１０）、トレメリムマブ（ＣＰ６７５、２０６）；抗キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＲＩ）抗体であるリリルマブ（ＩＰＨ２１０２／ＢＭＳ−９８６０１５）；抗ＣＤ１３７抗体であるウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）、ＰＦ−０５０８２５６６；抗ＬＡＧ３抗体であるＢＭＳ−９８６０１６；抗ＯＸ４０抗体であるＭＥＤＩ６４６９等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
本発明の予測方法（診断方法）、試薬（診断薬）、及びキット（診断用キット）を用いて免疫チェックポイント阻害剤による重症性間質性肺炎の発症リスクを予測することで、被験者（患者）に対する投薬の適否を決定する。そして、その結果に基づき、免疫チェックポイント阻害剤を投与するという、免疫チェックポイント阻害剤による一連の治療戦略が提供される。そのような、免疫チェックポイント阻害剤の治療方法も、本発明の対象である。
【００９０】
上記治療方法の対象となる疾患としては、免疫チェックポイント阻害剤の対象となりうる疾患（癌、感染症等）である。癌としては、例えば、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭頚部癌、メラノーマ、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管カルシノーマ、子宮内膜カルシノーマ、子宮頚部カルシノーマ、膣カルシノーマ、外陰部カルシノーマ、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、柔組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性白血病、急性白血病、小児固形癌、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、尿管癌、腎盂カルシノーマ、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍新脈管形成、脊椎腫瘍、脳幹グリオーム、下垂体アデノーマ、カポシ肉腫、扁平上皮癌、扁平細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発腫瘍等が挙げられる。とくに、ＰＤ−Ｌ１を発現する転移性癌や肺癌に好適に適用することができる。
【００９１】
感染症としては、例えば、ＨＩＶ感染（ＡＩＤＳ）、肝炎、ヘルペス、マラリア、デング熱、リューシュマニア症、インフルエンザ、赤痢、肺炎、結核、敗血症、リステリア症等を挙げることができる。とくに、重篤な免疫不全を生じるＨＩＶ感染に好適に適用することができる。
【００９２】
上記のほか、アルツハイマー型認知症（Kuti Baruch1, et al. Nature Medicine. 2016; 22(2): 135-7）、脳アミロイド血管症、ダウン症候群、加齢黄斑変性、レビー小体型認知症、パーキンソン病、多系統萎縮症、タウオパチー、前頭側頭葉変性症、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等における投薬の適否の診断にも利用することが可能である。
【００９３】
５．重症間質性肺炎の発症リスクが少ない被験者を対象とした免疫チェックポイント阻害剤を含有する医薬組成物
本発明によれば、免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症リスクを予測し、当該リスクが少ないと判断される被験者を対象とした、免疫チェックポイント阻害剤の新たな用途を提供する。本発明は、そのような免疫チェックポイント阻害剤を含有する医薬組成物であって、重症間質性肺炎の発症を抑制し、腫瘍を治療または予防するために使用され、前述した方法により重症間質性肺炎の発症リスクが少ないと判断される被験者に用いることを特徴とする医薬組成物も提供する。
【００９４】
６．その他
本発明の方法及び試薬・キットは、免疫チェックポイント阻害剤の使用前段階での投薬の適否の診断に加えて、治療開始後のリスク予測、さらには、ＨＩＶ感染症などのウイルス感染症や、原虫感染症、細菌感染症などにおける免疫チェックポイント阻害剤治療における投薬の適否の診断にも利用することができる。
【実施例】
【００９５】
本発明を実施例により、具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００９６】
実施例１：健常人及び肺がん患者における末梢血中のγδＴ細胞及びＮＫ細胞の比較
免疫チェックポイント阻害剤を用いたがん免疫療法において、重要なことはエフェクター細胞であるＴ細胞の数とＰＤ−１発現を含む免疫状態である。極論を言えば、がん患者で免疫系が疲弊し、腫瘍細胞障害性Ｔ細胞のほとんどない、あるいは、極端に少ない症例に対して免疫チェックポイント阻害剤を投与しても、腫瘍細胞障害性は期待できない。【００９７】
「腫瘍細胞が腫瘍特異的な免疫エフェクター細胞に免疫寛容を誘導する際、ＰＤ−１免疫チェックポイントを介在させているとすると、αβＴ細胞でもγδＴ細胞でも、その作用機構は同じである」と仮定すると、αβＴ細胞に対する免疫寛容誘導と、γδＴ細胞に対する免疫寛容誘導が同時に起こっていると考えられる。すなわち、γδＴ細胞の免疫寛容状態を判断できれば、αβＴ細胞の免疫寛容状態も推測することができる。そこで、本実施例では、上記仮説の検証として、健常人とがん患者における、Ｖγ２Ｖδ２のγδＴ細胞の数と抗原反応性を検討した（なお、健常成人では、γδＴ細胞の半数以上がＶγ２Ｖδ２であり、Ｖδ２を指標とすれば、実質的にはＶγ２Ｖδ２を検出することになる）。【００９８】
１．材料及び方法
（１）Ｖγ２Ｖδ２Ｔ細胞及びＮＫ細胞の数又は割合
末梢血単核球（ＰＢＭＣ：Peripheral Blood Mononuclear Cell）中のγδＴ細胞の数又は割合は、以下の手順にしたがい、２色フローサイトメトリーで解析する。
肺がん患者より、末梢血（１０ｍｌ）を採取し、常法にしたがいＰＢＭＣ画分を調製し、５０μｌのＰＢＳ／２％ ＦＣＳに懸濁させる。各３μｌの抗体をウェルに加え、氷上で３０分放置後、２％ ＦＣＳ／ＰＢＳで３回洗浄し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭ、ＢＤバイオサイエンス）で解析する。
ＰＭＢＣ中のγδＴ細胞（Ｖδ２陽性細胞）の数及び割合は、抗ＣＤ３抗体と抗Ｖδ２抗体を用いた２色フローサイトメトリーにより求めることができる。
ＰＭＢＣ中のＮＫ細胞（ＣＤ５６陽性細胞）の数及び割合は、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ５６抗体を用いた２色フローサイトメトリーにより求めることができる。
ＣＤ３はＴ細胞の表面マーカーであり、ＣＤ５６はＮＫ細胞の表面マーカーである。Ｖδ２は、ここではγδＴ細胞を検出するために使用される。健常人のγδＴ細胞の大部分はＶδ２陽性細胞であり、Ｖδ１陽性細胞が多い試料でも、後述する抗原刺激後にはＶδ２陽性細胞が増殖し、Ｖδ１陽性細胞は検出感度以下になるため、Ｖδ２陽性細胞をγδＴ細胞として評価することができるからである。【００９９】
（２）Ｖγ２Ｖδ２Ｔ細胞の抗原刺激（増殖誘導）
１ｍＭのＰＴＡストック溶液（ＤＭＳＯ中）３μｌをＰＭＢＣ（３ｍｌ）に加え、終濃度１μＭにする。Ｖδ２陽性細胞懸濁液を２４ウェルプレートの２ウェル（１．５ ｍｌ／ウェル, ２ウェル）に移す。ＩＬ−２、ＩＬ−１８を２ウェルに加え、それぞれ終濃度１００Ｕ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。Ｄａｙ １からＰＢＭＣに、毎日ＩＬ−２又はＩＬ−２／ＩＬ−１８を培地に加える。
＊ＰＴＡは、下記構造を有する窒素含有型ビスホスホン酸（ＷＯ２０１６／１２５７５７、及びMedicinal Chemistry, 2007, 85-99）で、ＦＰＰＳ合成を阻害することでγδＴ細胞を活性化する。
【化２】
2020071354.tif 000003
Ｚｏｌ（ゾメタ）／ＩＬ−２／ＩＬ−１８による刺激は、ＰＴＡ（１μＭ）をＺｏｌ（１μＭ）に代えて同様に行う。【０１００】
（３）抗原刺激後のＶγ２Ｖδ２Ｔ細胞の数又は割合
Ｄａｙ１１に細胞を回収し、（１）にしたがい、２色フローサイトメトリーでγδＴ細胞の数又は割合を解析する。【０１０１】
（４）ＮＫ細胞のＩＬ−２／ＩＬ−１８による刺激
ＰＭＢＣから、常法にしたがい、ＭＡＣＳ（ｒ）Ｂｅａｄｓ標識抗ＣＤ３抗体を用いて、ＮＫ細胞を精製する。具体的には、ＰＭＢＣ（３ｍｌ）を１５ｍｌのコニカルチューブに移し、１７００ｒｐｍ、４℃で５分遠心する。次いで、上清を吸引除去し、細胞ペレットを分散させ、８０μｌのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ に再懸濁させる。２０μｌのＭＡＣＳ（ｒ）Ｂｅａｄｓ標識抗ＣＤ３抗体（Ｍｙｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ）を細胞懸濁液に加え、４℃で１５分間インキュベートする。１５分後、２ｍｌのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡを加えて細胞を再懸濁させる。次いで、３００ｘｇ、４℃で１０分遠心して上清を吸引除去する。細胞ペレットを分散させ、１ｍｌのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ に再懸濁させる。細胞懸濁液を、ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化したＬＤカラム（磁性球体で構成される）にかける。ＣＤ３陰性細胞を１ｍｌのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡで２回溶出する。１７００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、上清を捨て、アスピレーターで吸引除去する。次いで、細胞ペレットを分散させ、ＣＤ３陰性細胞を１．５ｍｌのＹＭ−ＡＢ培地に再懸濁させる。
ＮＫ細胞懸濁液を２４ウェルプレート（１．５ ｍｌ／ウェル, １ウェル）に移し、ＩＬ−２及びＩＬ−１８をウェルに加え、それぞれ終濃度１００ＩＵ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌにし、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。Ｄａｙ ０から１０日間、毎日ＩＬ−２／ＩＬ−１８を培地に加える。【０１０２】
（５）増殖刺激後のＮＫ細胞の数又は割合
Ｄａｙ１１に細胞を回収し、（１）にしたがい、２色フローサイトメトリーでＮＫ細胞の数又は割合を解析する。【０１０３】
２．結果
（１）健常人のγδＴ細胞の割合
１２人の健常人のγδＴ細胞の割合をフローサイトメトリーで解析すると、これまで報告されてきたとおり、平均すると末梢血単核球中の３％から４％程度であり、１０％を超えているドナーも存在した。一方、２％を切るようなドナーは２例と少なく、１％を切るようなドナーはいなかった（図１）。【０１０４】
（２）健常人のγδＴ細胞の反応性
次に、健常人のγδＴ細胞の反応性に関して検討を行った。Ｖδ２γδＴ細胞の割合が５．５７％だった健常人の末梢血単核球にＰＴＡを作用させ、ＩＬ−２とともに１１日間培養すると、γδＴ細胞の割合は９８．３９％まで上昇した。また、この際、細胞数は１０００倍以上になった（図２（Ａ））。【０１０５】
同じく、Ｖδ２γδＴ細胞の割合が１０．３５％だった健常人の末梢血単核球にＰＴＡを作用させ、ＩＬ−２とともに１１日間培養すると、γδＴ細胞の割合は９８．９９％まで上昇し、細胞数は１０００倍以上になった。このように、健常人のγδＴ細胞はＰＴＡ／ＩＬ−２刺激により培養１１日目に９９％近くの純度と１０００倍以上の増殖性を示す（図２（Ｂ））。【０１０６】
（３）肺がん患者のγδＴ細胞の割合
肺がん患者のγδ型Ｔ細胞の割合を表１に示す。γδＴ細胞の少ない症例（LC02，LC05，LC09，LC10）と多い症例（LC03，LC04，LC07，LC08）にはっきりと分かれているのが分かる。【０１０７】
【表１】
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【０１０８】
肺がん患者の末梢血単核球中のγδＴ細胞の割合を検討すると、１２症例中９症例でγδＴ細胞の割合が２％以下と著しく減少していた。また、減少した症例の内訳をみてみると、６症例で１％未満であった。これは、肺がんにより、γδＴ細胞が抑制され、免疫寛容になっている可能性を示している。また、このγδＴ細胞と同様に、肺がん特異的αβＴ細胞も免疫抑制がかかっているとすると、免疫エフェクター細胞自体の数が極端に少ないことになり、免疫チェックポイントで免疫抑制シグナルを遮断したとしても、十分な免疫エフェクター作用が回復しないのではないかと推測される（図３）。【０１０９】
（４）肺がん患者のγδＴ細胞の反応性
次に、肺がん患者のうち、γδＴ細胞の割合が、健常人と同程度の症例を選択し、γδＴ細胞の増殖誘導能を検討した。Ｖδ２γδＴ細胞の割合が４．１４％だった肺がん患者の末梢血単核球にＰＴＡを作用させ、ＩＬ−２とともに１１日間培養すると、γδＴ細胞の割合は９８．５９％まで上昇した。また、この際、細胞数は１０００倍以上になった。すなわち、健常人に近い数値の肺がん患者は、健常人と同程度のγδＴ細胞増殖誘導能があることが明らかとなった（図４（Ａ））。【０１１０】
同様に、γδＴ細胞の割合が、２％以上の肺がん患者の末梢血γδＴ細胞の増殖誘導能を検討した。その結果、Ｖδ２γδＴ細胞の割合が２．９１％だった肺がん患者の末梢血単核球にＰＴＡを作用させ、ＩＬ−２とともに１１日間培養すると、γδＴ細胞の割合は９９．７４％まで上昇し、細胞数は１０００倍以上になった。この症例でも、健常人と同程度のγδＴ細胞増殖誘導能があることが明らかとなった（図４（Ｂ））。【０１１１】
次に、γδＴ細胞の割合が、１％を下回る肺がん患者の末梢血γδＴ細胞の増殖誘導能を検討した。Ｖδ２γδＴ細胞の割合が０．８９％だった肺がん患者の末梢血単核球にＰＴＡを作用させ、ＩＬ−２とともに１１日間培養すると、γδＴ細胞の割合は８４．２１％までしか上昇しなかった。すなわち、健常人と比較して明らかにγδＴ細胞の割合が低い肺がん患者は、健常人と比較して、γδＴ細胞増殖誘導能が低いことが明らかになった（図４（Ｃ））。【０１１２】
同様に、γδＴ細胞の割合が、１％を下回る別の肺がん患者の末梢血γδＴ細胞の増殖誘導能を検討した。その結果、Ｖδ２γδＴ細胞の割合が０．７８％だった肺がん患者の末梢血単核球にＰＴＡを作用させ、ＩＬ−２とともに１１日間培養すると、γδＴ細胞の割合は９０．５７％までしか上昇しなかった（図４（Ｄ））。【０１１３】
このように、γδＴ細胞の割合が末梢血において低い（１％を下回る）患者は、γδＴ細胞の免疫寛容が起こっている可能性が高い。これが、腫瘍細胞によるなんらかの免疫エフェクターＴ細胞免疫寛容誘導システムによるものであれば、腫瘍抗原ペプチド特異的なαβＴ細胞の免疫寛容も同時に起こっている可能性が高い。すなわち、γδＴ細胞の末梢血中の割合を測定すれば、腫瘍抗原ペプチド特異的αβＴ細胞の免疫寛容状態を判断できる可能性がある。したがって、免疫チェックポイント阻害剤の感受性を判断する基準の一つとして、末梢血単核球中でのγδＴ細胞の割合を検討することが考えられ、γδＴ細胞の割合が、免疫チェックポイント阻害剤のサロゲートマーカーになる可能性がある。【０１１４】
（５）γδＴ細胞とＮＫ細胞との関係
γδＴ細胞とＮＫ細胞との関係について検討を行った。まず、健常人の末梢血単核球を精製し、既報（Sigie T. et al., Cancer Immunol Immunother. 2013 Apr; 62(4):677-87. Epub 2012 Nov 15.）にしたがい、窒素含有ビスホスホン酸（Ｎ−ＢＰ）の１種であるＺｏｌ（Zoledronic acid：ゾメタ）／ＩＬ−２あるいはＺｏｌ／ＩＬ−２／ＩＬ−１８で刺激し、γδＴ細胞の増殖誘導を検討した。【０１１５】
その結果、γδＴ細胞の刺激因子であるＺｏｌと増殖因子であるＩＬ−２との混合刺激よりも、細胞保護作用のあるＩＬ−１８を添加した刺激において明らかな増殖優位性が認められた（図５）。これがどのようにして起こるのか検討した結果、この実験系からＮＫ細胞を除去するとγδＴ細胞の増殖誘導が抑制されることが明らかとなった。つまり、ヒトγδＴ細胞の増殖誘導の際、ＮＫ細胞が重要な役割をしていることが明らかとなった（図には示していない）。【０１１６】
Ｚｏｌ／ＩＬ−２／ＩＬ−１８での増殖誘導後の結果を表２に示す。増殖誘導前と同様に、γδＴ細胞の少ない症例（LC02，LC05，LC09，LC10）と多い症例（LC03，LC04，LC07，LC08）にはっきりと分かれているのが分かる。【０１１７】
【表２】
2020071354.tif 000005
【０１１８】
（６）ＮＫ細胞とＩＬ−１８との関係
次に、ＮＫ細胞とＩＬ−１８との関係について検討を行った。ＮＫ細胞はＩＬ−２刺激により増殖誘導を受けるが、ここにＩＬ−１８を添加するとどうなるのか検討した。まず、ヒト末梢血単核球からＣＤ３陽性細胞を除去し、ＣＤ３−細胞画分をＩＬ−２あるいはＩＬ−２／ＩＬ−１８で刺激した。【０１１９】
その結果、ＩＬ−２／ＩＬ−１８刺激群で明らかなＮＫ細胞の増殖誘導優位性がみとめられた（図６）。つまり、ＩＬ−２／ＩＬ−１８刺激により、ＮＫ細胞が強力な増殖誘導を受けることが明らかとなった。ＩＬ−２／ＩＬ−１８刺激前の結果を表３に、刺激後の結果を表４に示す。【０１２０】
【表３】
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【０１２１】
【表４】
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【０１２２】
次にこのＩＬ−２／ＩＬ−１８によるＮＫ細胞増殖誘導能がどのようにγδＴ細胞の増殖誘導と結びついているのか検討を行った。まず、既報（Li et al., PLoS One. 2013 Dec 20;8(12), Fig.2参照）にしたがい、γδＴ細胞を緑色色素で標識し、ＩＬ−２／ＩＬ−１８刺激で増殖誘導されたＮＫ細胞を赤色色素で標識して、混合培養した。その結果、γδＴ細胞とＮＫ細胞は相互作用し、細胞塊を形成していることが明らかとなった（図７）。【０１２３】
３．考察
上記の結果から、ゾメタやＰＴＡのようなＮ−ＢＰによるγδＴ細胞の増殖誘導メカニズムはは、γδＴ細胞とＮＫ細胞の相互作用に基づくものと予想された（図８）。すなわち、Ｎ−ＢＰがＣＤ１４陽性であるマクロファージに取り込まれると、ブチロフィリン３Ａ１（ＢＴＮ３Ａ１）の細胞外領域に変化が起こり、それをγδＴ細胞がγδＴ細胞受容体依存的に認識する。すると、γδＴ細胞受容体からγδＴ細胞内にシグナルが誘導され、ＩＬ−２のプロモーター領域に転写因子が動員されることにより、若干量のＩＬ−２の産生がみられる。一方、Ｎ−ＢＰストレスを受けたマクロファージではインフラマソーム依存的にカスパーゼＩが活性化され、ＩＬ−１８前駆体を加水分解し、成熟型ＩＬ−１８を産生し、細胞外へ放出する。ここで、ＩＬ−２／ＩＬ−１８によりＮＫ細胞が増殖誘導を受ける。他方、γδＴ細胞にもＩＬ−１８が作用するとＬＦＡ−１やＩＣＡＭ−１が発現誘導される。これらの接着分子を介してＮＫ細胞とγδＴ細胞との強い相互作用がおこり、γδＴ細胞の爆発的な増殖誘導がおこる。以上のことから、一次的にはγδＴ細胞の数（割合）と増殖誘導性を、二次的にはＮＫ細胞の数（割合）と増殖誘導性を検討すれば、免疫チェックポイント阻害剤の感受性予測が可能であることが予想される。【０１２４】
図９に示すとおり、がん細胞がＰＤ−Ｌ１分子を発現すると、活性化されたγδＴ細胞はＰＤ−１分子を発現しているため、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用によりγδＴ細胞に負の副刺激シグナルが誘導され、腫瘍細胞傷害性が抑制される。ここで、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を作用させるとＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用が遮断され、負の副刺激シグナルが解除されるため、γδＴ細胞はがん細胞を効率よく障害できるようになる。ところが、γδＴ細胞が疲弊現象（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）を起こしている場合には、γδＴ細胞の機能そのものが不可逆的に抑制されてしまっているため、ＰＤ−１免疫チェックポイント阻害剤によりＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断しても、γδＴ細胞の腫瘍細胞傷害性は回復しない。本実施例の結果は、γδＴ細胞の末梢血中の数（割合）と機能を評価することにより、免疫寛容状態を判断し、免疫チェックポイント阻害剤の効果を予測しうることを示す。【０１２５】
実施例２：ニボルマブ（抗ＰＤ−１抗体）の奏功性
実施例１の結果、ＰＤ−１免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果を予測する際、免疫エフェクターＴ細胞の機能と増殖性、そして、ＮＫ細胞の増殖性が鍵となる可能性が高いことが確認された。つまり、免疫エフェクターＴ細胞として、αβＴ細胞とγδＴ細胞があるが、これらの免疫寛容誘導システムが同一であるとすると、γδＴ細胞の状態を明らかにすれば、αβＴ細胞の免疫寛容状態も予想できることになる。【０１２６】
そこで、本実施例では、ニボルマブ（抗ＰＤ−１抗体製剤）治療後の患者について、末梢血単核球中のγδＴ細胞の割合、γδＴ細胞の抗原刺激による増殖誘導性、増殖誘導後のＰＤ−１を発現量と奏功性及び有害事象との相関関係について検討を行った。【０１２７】
１．試験デザイン
［施設数］多施設共同試験（長崎大学病院、長崎原爆病院）
［対象］肺がん患者  
［選択基準］
コンピュータ断層撮影で組織学的に肺がんと確認された患者（any T, any N, and M1, stage IV)、
パーフォーマンスステータス（ＰＳ）０、年齢２０〜７５歳、主要組織は機能を維持しており、当機関の試験基準に合致し、試験の性質について説明を受けた後、本試験への参加に対する同意書面を自発的に提出したものを採用する。【０１２８】
［排除基準］
以下のうち一つでも該当する患者は、対象として除外する。
１）本剤の成分に対し過敏症の既往歴のある患者
２）妊婦および妊娠している可能性のある患者、または授乳中の患者
３）その他、研究責任者が研究対象者として不適当と判断した患者【０１２９】
［プライマリーエンドポイント］
第１のプライマリーエンドポイントは、ニボルマブを投与された肺がん患者における、奏効率（ＯＲＲ）と末梢血リンパ球ゲート中及びＣＤ３陽性細胞中のＶδ２Ｔ細胞の割合との相関関係である。
第２のプライマリーエンドポイントは、肺がん患者における奏効率（ＯＲＲ）と抗原刺激後のＰＤ−１発現Ｖδ２Ｔ細胞の割合との相関関係である。【０１３０】
［セカンダリーエンドポイント］
第１のセカンダリーエンドポイントは、ニボルマブを投与された肺がん患者における、奏効率（ＯＲＲ）と末梢血単核球中のＮＫ細胞の割合との相関関係である。
第２のプライマリーエンドポイントは、肺がん患者における奏効率（ＯＲＲ）とＩＬ−２／ＩＬ−１８刺激後のＮＫ細胞の増殖との割合の相関関係である。【０１３１】
［検体収集］
同意の得られた抗ＰＤ−１抗体ニボルマブを投与予定の症例より、投与前および投与３ヶ月後に、末梢血１０ｍｌのヘパリン採血を行う。この際、入院中の通常採血に付随して採血を行い、この採血のための新たな穿刺は行わない。【０１３２】
［研究評価項目］
（Ａ）腫瘍容積の測定及び奏効率（RECIST）
腫瘍容積はＭＲＩを用いて測定する。測定はガイドラインにしたがって実施し、奏効率（ＯＲＲ：Objective Response Rate）は超音波検査と臨床評価を使用してＲＥＣＩＳＴガイドラインにしたがい個別に評価する。【０１３３】
（Ｂ）抗ＰＤ−１抗体ニボルマブ投与前および投与後末梢血単核球中のＶγ２Ｖδ２Ｔ細胞およびＣＤ５６陽性ＮＫ細胞の数と割合の検討
フィコール濃度勾配遠心法により、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を精製し（実施例１参照）、７ mlのＹＭ−ＡＢ培地に懸濁する。ＹＭ−ＡＢ培地に懸濁したＰＢＭＣのうち１ｍｌに関してフローサイトメトリー解析を行う。具体的には、細胞懸濁液０．１ｍｌずつを９６ウェル丸底プレート９ウェルに播種し、１７００ｒｐｍ、４℃、2分間遠心する。上清を除去し、細胞ペレットをボルテックス攪拌する。そこに４６μｌの２％ ＦＣＳ／ＰＢＳと、それぞれ以下を添加する。
(i)２％ ＦＣＳ／ＰＢＳ（4μｌ）
(ii)ＰＥ標識抗ＣＤ３抗体（2μｌ）＋２％ ＦＣＳ／ＰＢＳ（2μｌ）
(iii)２％ ＦＣＳ／ＰＢＳ（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗Ｖδ２抗体（2μｌ）
(iv)ＰＥ標識抗ＣＤ３抗体（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体（2μｌ）
(v)ＰＥ標識抗ＣＤ３抗体（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体（2μｌ）
(vi)ＰＥ標識抗ＣＤ３抗体（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗Ｖδ１抗体（2μｌ）
(vii)ＰＥ標識抗ＣＤ３抗体（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗Ｖδ２抗体（2μｌ）
(viii)ＰＥ標識抗ＣＤ２５抗体（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体（2μｌ）
(ix)ＰＥ標識抗ＣＤ５６抗体（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体（2μｌ）
抗体添加後、プレートを氷上で１５分インキュベートし、１００μｌの２％ ＦＣＳ／ＰＢＳを添加する。その後、プレートを１７００ ｒｐｍ、４℃、２分間遠心し、上清を除去する。この操作を計３回行い、最後に、２００μｌの２％ ＦＣＳ／ＰＢＳを添加し、７０μｍのフィルター膜に通し、フローサイトメトリーで解析を行う。この解析結果を基に、Ｖγ２Ｖδ２Ｔ細胞の割合と数、および、細胞表面マーカーの検討を行う。【０１３４】
（Ｃ）ＰＴＡ刺激による抗ＰＤ−１抗体ニボルマブ投与前および投与後末梢血Ｖδ２Ｔ細胞の増殖誘導性の検討
ＹＭ−ＡＢ培地に懸濁したＰＢＭＣのうち３ｍｌに関してγδＴ細胞の増殖試験を行う。３ｍｌのＰＢＭＣ懸濁液に１ｍＭのＰＴＡを加え、２４ウェルプレートの２ウェル（１．５ ｍｌ／ウェル, ２ウェル）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする（Ｄａｙ ０）。
一方のウェルにＩＬ−２（１００ Ｕ／ｍｌ）、他方のウェルにＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）＋ＩＬ−１８（１００ｎｇ／ｍｌ）の最終濃度で添加する（Ｄａｙ １）。ＩＬ−２あるいはＩＬ−２＋ＩＬ−１８をさらに添加する(Ｄａｙ ２−Ｄａｙ ９)。Ｄａｙ １０において細胞数を測定し、Ｖγ２Ｖδ２Ｔ細胞の増殖誘導性を検討する。【０１３５】
（Ｄ）抗ＰＤ−１抗体ニボルマブ投与前および投与後末梢血ＩＬ−２/ＩＬ−１８誘導性ＮＫ細胞の増殖誘導性の検討
ＹＭ−ＡＢ培地に懸濁したＰＢＭＣのうち残り３ｍｌに関してＮＫ細胞の増殖試験を行う。細胞懸濁の入った１５ｍｌのコニカルチューブを１７００ｒｐｍ、４℃で５分遠心する。次いで、上清を吸引除去し、細胞ペレットを分散させ、８０μｌのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ に再懸濁させる。そこに２０μｌのＭＡＣＳ（登録商標）Ｂｅａｄｓ（Ｍｙｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ）標識抗ＣＤ３抗体を２０μｌ加え、４℃で１５分間インキュベートする。ここに２ｍｌのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡを加えて細胞を軽く懸濁させる。次いで、この細胞懸濁液を３００ｘｇ、４℃で１０分遠心して上清を除去する。細胞ペレットを分散させ、１ｍｌのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡを添加し、細胞をよく懸濁させる。細胞懸濁液を、ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化したＬＤカラム（磁性球体で構成される）にかける。ＣＤ３陰性細胞を１ｍｌのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡで２回溶出する。１７００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、上清を捨て、アスピレーターで吸引除去する。次いで、細胞ペレットを分散させ、ＣＤ３−細胞を１．５ｍｌのＹＭ−ＡＢ培地に懸濁させる。 これを２４ウェルプレートに播種し、ＩＬ−２及びＩＬ−１８をそれぞれ終濃度１００Ｕ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする（Ｄａｙ ０）。ＩＬ−２及びＩＬ−１８を毎日培地に加える（Ｄａｙ ２−Ｄａｙ ９）。Ｄａｙ １０において細胞数を測定し、ＮＫ細胞の増殖誘導性を検討する。【０１３６】
（Ｅ）増殖誘導後のＶδ２Ｔ細胞のＰＤ−１を含む表面マーカー解析（方法：前記（Ｆ）参照）
ＰＴＡにより増殖誘導したＶγ２Ｖδ２Ｔ細胞をＤａｙ １０において回収し、細胞表面マーカーのフローサイトメトリーによる検討を行う。具体的には、細胞懸濁液０．１ｍｌずつを９６ウェル丸底プレート７ウェルに播種し、１７００ｒｐｍ、４℃、２分間遠心する。上清を除去し、細胞ペレットをボルテックス攪拌する。そこに４６μｌの２％ ＦＣＳ／ＰＢＳと、それぞれ以下を添加する。
(i)２％ ＦＣＳ／ＰＢＳ（4μｌ）
(ii)ＰＥ標識抗ＣＤ３抗体（2μｌ）＋２％ ＦＣＳ／ＰＢＳ（2μｌ）
(iii) ２％ ＦＣＳ／ＰＢＳ（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗Ｖδ２抗体（2μｌ）
(iv)ＰＥ標識抗ＣＤ３抗体（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗Ｖδ２抗体（2μｌ）
(v)ＰＥ標識抗ＣＤ３抗体（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体（2μｌ）
(vi)ＰＥ標識抗ＣＤ３抗体（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体（2μｌ）
(vii)ＰＥ標識抗ＣＤ５６抗体（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗Ｖδ２抗体（2μｌ）
(viii)2% ＰＥ標識抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗Ｖδ２抗体（2μｌ）
(ix)ＰＥ標識抗ＤＮＡＭ−１抗体（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗Ｖδ２抗体（2μｌ）
(x)ＰＥ標識抗ＦａｓＬ（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗Ｖδ２抗体（2μｌ）
(xi)ＰＥ標識抗ＴＲＡＩＬ抗体（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗Ｖδ２抗体（2μｌ）
(xii)ＰＥ標識抗ＣＤ１６抗体（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗Ｖδ２抗体（2μｌ）
(xiii)無標識抗ＰＤ−１抗体（2μｌ）＋ＲＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗Ｖδ２抗体（2μｌ）
抗体添加後、プレートを氷上で１５分インキュベートし、１００μｌの２％ ＦＣＳ／ＰＢＳを添加する。その後、プレートを１７００ ｒｐｍ、４℃、２分間遠心し、上清を除去する。この操作を計３回行い、最後に、２００μｌの２％ ＦＣＳ／ＰＢＳを添加し、７０μｍのフィルター膜に通し、フローサイトメトリーで解析を行う。この解析結果を基に、Ｖγ２Ｖδ２Ｔ細胞の割合と個数、および、細胞表面マーカーの検討を行う。【０１３７】
（Ｆ）増殖誘導後のＮＫ細胞の表面マーカー解析
Ｄａｙ １０において細胞を回収し、細胞表面マーカーのフローサイトメトリーによる検討を行う。具体的には、細胞懸濁液０．１ｍｌずつを９６ウェル丸底プレート７ウェルに播種し、１７００ ｒｐｍ、４℃、２分間遠心する。上清を除去し、細胞ペレットをボルテックス攪拌する。そこに４６μｌの２％ ＦＣＳ／ＰＢＳと、それぞれ以下を添加する。
(i)２％ ＦＣＳ／ＰＢＳ（4μｌ）
(ii)ＰＥ標識抗ＣＤ５６抗体（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体（2μｌ）
(iii)ＰＥ標識抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ５６抗体（2μｌ）
(iv)ＰＥ標識抗ＤＮＡＭ−１抗体（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ５６抗体（2μｌ）
(v)ＰＥ標識抗ＦａｓＬ（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ５６抗体（2μｌ）
(vi)ＰＥ標識抗ＴＲＡＩＬ抗体（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ５６抗体（2μｌ）
(vii)ＰＥ標識抗ＣＤ１６抗体（2μｌ）＋ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ５６抗体（2μｌ）
抗体添加後、プレートを氷上で１５分インキュベートし、１００μｌの２％ ＦＣＳ／ＰＢＳを添加する。その後、プレートを１７００ ｒｐｍ、４℃、２分間遠心し、上清を除去する。この操作を計3回行い、最後に、２００μｌの２％ ＦＣＳ／ＰＢＳを添加し、７０μｍのフィルター膜に通し、Ｖγ２Ｖδ２Ｔ細胞の細胞表面マーカーに関するフローサイトメトリーで解析する。この解析結果を基に、ＮＫ細胞の割合と個数、および、細胞表面マーカーの検討を行う。【０１３８】
（Ｇ）増殖誘導後のＶδ２Ｔ細胞に対するＰＤ−１免疫チェックポイント阻害剤の有用性の検討
増殖誘導したＶγ２Ｖδ２Ｔ細胞の細胞障害性アッセイを行う。標的細胞としてはヒトＰＤ−Ｌ１を強制発現させたヒトＤａｕｄｉバーキットリンパ腫由来細胞株Ｄａｕｄｉ／ｈＰＤ−Ｌ１を用い、ＰＤ−１免疫チェックポイント阻害剤としてはマウス抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体２７Ａ２を用いる。
まずＤａｕｄｉ／ｈＰＤ−Ｌ１を３０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、７５ｃｍ２フラスコで３７℃、５％ＣＯ２で培養する。細胞数を測定し、１ｘ１０６個の細胞を４本の１５ｍｌコニカルチューブに移す。細胞懸濁液を１７００ｒｐｍ、４℃で５分遠心し、上清を吸引除去し、細胞ペレットを分散させる。チューブ１及び２には、細胞を１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１ｘ１０６個の/ｍｌの細胞懸濁液を調製する。チューブ３及び４には、１００ｎＭのＰＴＡ溶液を１ｍｌ添加し、よく懸濁する。３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気下で１時間４５分インキュベートする。チューブ４に、１ｍｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体２７Ａ２を２μｌ添加し、最終濃度が０．５μｇ／ｍｌになるようにする。さらに、これらのチューブを３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気下で１５分間インキュベートする。次に、チューブ１に、２．５μｌのＤＭＳＯ、チューブ２〜４にテルピリジン誘導体Ｃｈ４６（ビス（ブチリロキシメチル）４’−（ヒドロキシメチル）−２，２’：６’，２’’−テルピリジン−６，６’−ジカルボキシラート：ＷＯ２０１５／１５２１１１  実施例８参照）を２．５μｌ添加し、３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気下で１５分インキュベートする。次にこれらのチューブを１７００ ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、上清を除去する。細胞ペレットをタッピングし、２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を添加し、細胞をよく懸濁後、この操作を３回繰り返し、細胞を洗浄する。５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を懸濁し、この細胞懸濁液２ｍｌを新しい１５ｍｌコニカルチューブに移し、６ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を添加し、細胞の最終濃度を５ｘ１０４個/ｍ ＝ ５ｘ１０３個/１００μｌとする。ＲＰＭＩ１６４０培地中１ x １０７のＶγ２Ｖδ２Ｔ細胞を１５ｍｌのコニカルチューブに移す。１７００ｒｐｍ、４℃で５分遠心し、上清を吸引除去し、５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に添加し、細胞をよく懸濁後、以下のように系列希釈を行い、細胞懸濁液を調製する。
5 ml (Ｖγ２Ｖδ２Ｔ細胞)          : 2 x 106/ml:        40 : 1 (E/T ratio)
2 ml (2 x 106/ml)    + 2 ml (RPMI) : 1 x 106/ml:        20 : 1 (E/T ratio)
2 ml (1 x 106/ml)    + 2 ml (RPMI) : 5 x 105/ml :       10 : 1 (E/T ratio)
2 ml (5 x 105/ml)    + 2 ml (RPMI) : 2.5 x 105/ml :      5 : 1 (E/T ratio)
2 ml (2.5 x 105/ml)  + 2 ml (RPMI) : 1.25 x 105/ml:    2.5 : 1 (E/T ratio)
2 ml (1.25 x 105/ml) + 2 ml (RPMI) : 6.25 x 104/ml:   1.25 : 1 (E/T ratio)
2 ml (6.25 x 105/ml) +2 ml  (RPMI) : 3.125 x 104/ml: 0.625 : 1 (E/T ratio)
2 ml (RPMI)                        : 0/ml:               0 : 1 (E/T ratio)【０１３９】
次に丸底９６ウェルプレートに、３ウェルずつに、１００μｌのＶγ２Ｖδ２Ｔ細胞懸濁液（試験用）、１００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地（自然漏出測定用）、あるいは９０μｌのＲＰＭＩ１６４０培地（最大漏出測定用）を添加する。ここに、１００μｌのＤａｕｄｉ／ｈＰＤ−Ｌ１細胞を添加し、５００ｒｐｍで、室温２分間遠心し、３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気下で１５分インキュベート後、最大漏出測定用ウェルに１０μｌの０．１２５％ジギトニン（１９％ＤＭＳＯ中（ＭｉｌｉＱ溶液））を添加し、よくピペッティングする。プレートをさらに、３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気下で２０分以上インキュベートし、１７００ｒｐｍ、４℃で２分間遠心する。次に、25μlの上清を新しい丸底９６ウェルプレートに移し、２５０μｌのＥｕ溶液とよく混和する。これを２００μｌ新しい蛍光測定用プレートに移し、時間分解蛍光を測定する。これらの結果を基に、増殖培養したＶγ２Ｖδ２Ｔ細胞の示すＰＤ−Ｌ１発現性腫瘍細胞株への抗腫瘍効果におけるＰＤ−１免疫チェックポイント阻害剤の影響を検討する。【０１４０】
（Ｈ）増殖誘導後のＮＫ細胞とＰＤ−１免疫チェックポイント阻害剤の有用性の検討
増殖誘導したＮＫ細胞の細胞障害性アッセイを行う。標的細胞としてヒト骨髄腫由来細胞株Ｋ５６２細胞株を、Ｖγ２Ｖδ２Ｔ細胞の代わりにＮＫ細胞用いる以外は、上記（Ｇ）と同じ手順で時間分解蛍光を測定し、その結果を基に増殖培養したＮＫ細胞の示すＫ５６２細胞株への抗腫瘍効果を検討する。【０１４１】
［統計解析］
ニボルマブ投与前および投与後について、上記評価項目記載のバイオマーカーについて要約統計量（例数、平均、標準偏差、最小値、四分位範囲、中央値、最大値等）を求める。ニボルマブ奏功の有無で２群に分け、各バイオマーカーの要約統計量を求める。これらの結果から、末梢血単核球中のγδＴ細胞の割合、γδＴ細胞の抗原刺激による増殖誘導性、増殖誘導後のＰＤ−１を発現量と奏功性との相関関係について検討を行う。さらに、γＮＫ細胞の割合及び増殖誘導能と奏功性との相関関係について検討を行う。次にニボルマブ奏功に対するカットオフ値を推定するために、各バイオマーカーによるＲＯＣ曲線を作成する。また、ニボルマブ奏功に対して多因子による関与が考えられた場合には、各バイオマーカーによるＬｏｇｉｓｔｉｃモデルより多因子ＲＯＣ曲線を求め、多因子でのカットオフ値を推定する。【０１４２】
[結果]
下表に結果を示す。
【０１４３】
【表５】
2020071354.tif 000008
【０１４４】
１３名の被験者のうち、ＴＲ０１、ＴＲ０２、ＴＲ０３、及びＴＲ０７において間質性肺炎の発症が確認された。そのうち、ＴＲ０１とＴＲ０２はＤＡＤ（びまん性肺胞傷害）であり、他の２例（ＯＰ（器質性肺炎））とは異なり、急性憎悪を来たし、投薬を中止するも１例は死亡するに至った。ＴＲ０１及びＴＲ０２は、ＴＲ０３及びＴＲ０７とは異なり末梢血単核球に対するγδＴ細胞の割合（ＣＤ３＋Ｖδ２＋／Ａｌｌ）及びＴ細胞に対するＶδ２＋細胞の割合（Ｖδ２＋／ＣＤ３＋）が高く、統計解析の結果、データの完全分離が確認された。【０１４５】
以上より、末梢血単核球に対するＶδ２＋γδＴ細胞の細胞数又は割合を指標にすることで、ＤＡＤを伴う間質性肺炎をそれ以外の間質性肺炎と鑑別して、その発症リスクを予測することが可能であると考えられた。これにより、投薬前に重大な有害事象を発生するリスクのある患者を見分け、投薬前に治療対象から除外したり、事前の手当てを行うなど、免疫チェックポイント阻害剤による安全な治療が可能になる。なお、ここでは末梢血単核球をベースとして評価したが、ＣＤ３−Ｖδ−の細胞が多い試料の場合には、末梢血Ｔ細胞に対するＶδ２＋細胞の細胞数又は割合を指標とすることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明は、免疫チェックポイント阻害剤による重症間質性肺炎の発症リスクを投与前に予測し、治療の適否を判定することで、精密医療の実現に有用である。【０１４７】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
2020071354.tif 000011
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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