(57)【要約】  ＡｃｒＩＩＡ４とＣｄｔ１との融合タンパク質を、Ｃａｓタンパク質とともに細胞内で発現させることにより、Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性を細胞周期依存的に調節することができることを見出した。
2020059708.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内でＣａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性を細胞周期依存的に調節する方法であって、
（ｉ）ＡｃｒＩＩＡ４タンパク質とＣｄｔ１タンパク質の融合タンパク質、および
（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質
を含む細胞を提供することを含み、
該細胞内で、細胞周期依存的に該融合タンパク質が該Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性を抑制する方法。
【請求項２】
前記融合タンパク質におけるＣｄｔ１タンパク質が、Ｅ３ユビキチンリガーゼ介在タンパク質分解を受けるアミノ酸配列を含む部分ペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が、前記融合タンパク質とＣａｓタンパク質が自己切断ペプチドを介して融合されたタンパク質を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法であって、
（ｉ）ＡｃｒＩＩＡ４タンパク質とＣｄｔ１タンパク質の融合タンパク質、および
（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム
を含む細胞を提供することを含み、
該細胞内で、細胞周期依存的に該融合タンパク質が該ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムにおけるＣａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性を抑制し、これにより細胞周期依存的に細胞内のＤＮＡが編集される方法。
【請求項６】
前記融合タンパク質におけるＣｄｔ１タンパク質が、Ｅ３ユビキチンリガーゼ介在タンパク質分解を受けるアミノ酸配列を含む部分ペプチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞が、前記融合タンパク質とＣａｓタンパク質が自己切断ペプチドを介して融合されたタンパク質を含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
細胞が、さらに、ドナーＤＮＡを含む、請求項５から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ドナーＤＮＡが一本鎖ドナーＤＮＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを構成するガイドＲＮＡにおいて、標的ＤＮＡ領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列が２０塩基長未満である、請求項５から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項５から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から１１に記載の方法に用いるためのキットであって、ＡｃｒＩＩＡ４タンパク質とＣｄｔ１タンパク質の融合タンパク質、該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または該発現ベクターが導入された細胞を含むキット。
【請求項１３】
さらに、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）の少なくとも１つを含む、請求項１２に記載のキット。
（ｉ）Ｃａｓタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
（ｉｉ）ガイドＲＮＡ、該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
（ｉｉｉ）ドナーＤＮＡ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性を細胞周期依存的に調節する方法、および当該方法に用いるためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
部位特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）は、約２０ｂｐのＤＮＡ配列を認識し、標的配列を選択的に切断する。しかしながら、部位特異的ヌクレアーゼは、非標的ＤＮＡ配列を切断して、突然変異（オフターゲット変異）を導入し得る。オフターゲット変異は、標的配列に類似した非標的配列でしばしば起こり、予期しない副作用または表現型変化をもたらしかねない。したがって、特に臨床応用のためにゲノム編集ツールを使用する際には、オフターゲット効果に慎重に対処する必要がある。【０００３】
オフターゲット変異は、細胞内に部位特異的ヌクレアーゼがより高い濃度と長い持続時間で存在すること、および、部位特異的ヌクレアーゼの親和性がより高いことが原因で起こり得る。どちらの事象も部位特異的ヌクレアーゼがオフターゲット部位に結合する可能性を高め得るものである。同様に、オフターゲット部位での予期しない二重鎖切断（ＤＳＢ）後の修復の精度にも影響がある。【０００４】
これまで、多くの研究により、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９および他のゲノムの編集プラットフォームのオフターゲット効果を減少させるための方法の開発がなされてきている。例えば、部位特異的ヌクレアーゼを直接送達することにより、オンターゲット編集効率を阻害することなく、オフターゲット効果を減らすことができることが報告されている（非特許文献１）。また、他のアプローチにおいては、活性誘導可能ドメインによりヌクレアーゼ活性が制御されることが報告されている（非特許文献２）。これらの手法は、Ｃａｓ９の発現のためにプラスミドＤＮＡを使用する方法と比較して、活性Ｃａｓ９の存続時間を短縮し、細胞内のＣａｓ９の量を制御することが可能である。【０００５】
近年、高分子を細胞内に直接送達するためのナノ材料を使用する新規な方法が開発されている。これらの方法は、オフターゲット効果の減少にも役立ち得るものである（非特許文献３）。標的ＤＮＡに対する親和性を低下させるために、高忠実度のＣａｓ９突然変異体が開発されている（非特許文献４）。短縮型ｓｇＲＮＡの使用もまた、この目的のための効果的なアプローチである（非特許文献５）。これらの方法は、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ−標的ＤＮＡの三次複合体の安定性を低下させることにより、オフターゲット切断を抑制するものである。ニッカーゼ（非特許文献６）を使用することにより、修復過程における不確実なエラーが減少する可能性がある。他の効果的なアプローチとして、生じ得るオフターゲット部位および非常に特異的なｓｇＲＮＡ配列をバイオインフォマティクス・ツールにより予測することが挙げられる（非特許文献７）。これらの手法の組み合わせは、オフターゲット効果を減らすための強力な手段となる可能性があるが、オフターゲット突然変異を完全に抑制することは困難である。【０００６】
ところで、相同組換え修復（ＨＤＲ）は、相同組換えＤＮＡ修復経路を含むゲノム編集機構である。相同組換え修復には、切断部位周辺の配列と相同な配列を有する鋳型ＤＮＡが必要である。相同組換え修復により標的ゲノム配列を精密に編集することができる。さらに、オフターゲット切断は、相同組換えを介して精密に修復可能である。従って、精密なゲノム編集にとって、相同組換え修復を介するＤＮＡ修復の割合の増加が重要である。【０００７】
相同組換えは、Ｓ期とＧ２期において生じる。別の経路である非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は細胞周期のすべての期間において作動する（非特許文献８）。非相同末端結合に対する相同組換えの割合は、Ｓ期中期においてピークに達する（非特許文献９）。相同組換え修復を用いたゲノム編集の効率は、非相同末端結合経路の化学的または遺伝的な破壊による影響を受ける（非特許文献１０）。相同組換え修復の効率は、化学的に同期化した細胞へのＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体の送達のタイミングを制御することによっても高めることができる（非特許文献１１）。非相同末端結合経路の遮断や細胞の同期化をするために化学物質を使用する場合は、これらの化学物質の細胞に対する細胞毒性を考慮しなければならない。ジェミニン（１／１１０）タンパク質のＮ末端と融合され、Ｓ期およびＧ２期に特異的に活性化されうるＣａｓ９が報告されている（非特許文献１２）。ジェミニン融合Ｃａｓ９は、化学物質なしでＣａｓ９活性を制御できるため、細胞とってより好ましい。しかしながら、相同組換え修復活性は、わずかしか増加しない。これは、おそらく、Ｇ１期で劣化したＣａｓ９の量を回復するのに時間がかかり、Ｓ期でのＣａｓ９の活性が減少するためであると思われる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Gaj,  T.  et al.  Nat  Methods  9,  805-807  (2012)
【非特許文献２】Liu,  K.I.  et  al.  Nat  Chem  Biol  12,  980-987  (2016)
【非特許文献３】Matsumoto,  D.  et  al.  Sci  Rep-Uk  5  (2015)
【非特許文献４】Kleinstiver,  B.P.  et  al.  Nature  529,  490-495  (2016)
【非特許文献５】Fu,  Y.  et al.  Nat  Biotechnol  32,  279-284  (2014)
【非特許文献６】Shen,  B.  et  al.  Nat  Methods  11,  399-402  (2014)
【非特許文献７】Cradick,  T.J.  et al.  BMC  Bioinformatics  12,  152  (2011)
【非特許文献８】Mao,  Z.  et al.  Cell  Cycle  7,  2902-2906  (2008)
【非特許文献９】Karanam,  K.  et al.  Molecular  Cell  47,  320-329  (2012)
【非特許文献１０】Vasquez,  K.M.  et al.  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A  98,  8403-8410  (2001)
【非特許文献１１】Lin,  S.,  Staahl,  B.T.,  Elife  3,  e04766  (2014)
【非特許文献１２】Howden,  S.E.  et  al.  Stem  Cell  Rep  7,  508-517  (2016)
【非特許文献１３】Yang,  H.  &  Patel,  D.J.  Mol  Cell  67,  117-127  e115  (2017)
【非特許文献１４】Kim,  I.  et  al.  Sci  Rep  8,  3883  (2018)
【非特許文献１５】Shin,  J.  et  al.  Sci  Adv  3,  e1701620  (2017)
【非特許文献１６】Sakaue-Sawano,  A.  et  al.  Cell  132,  487-498  (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、細胞内で相同組換え修復の効率を高めるための新たな方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
近年、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの抗ＣＲＩＳＰＲ（Ａｃｒ）阻害剤が報告されている（非特許文献１３）。Ａｃｒ阻害剤の中でも、ＡｃｒＩＩＡ４は、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体に強く結合するが、Ｃａｓ９に対する結合親和性はより低い（非特許文献１４）。また、ＡｃｒＩＩＡ４は、哺乳動物細胞におけるＣａｓ９活性を効率的に阻害する（非特許文献１５）。さらに、ＡｃｒＩＩＡ４によるＣａｓ９活性の阻害はオフターゲット編集を減少させる（非特許文献１５）。これらＡｃｒＩＩＡ４の特性に着目し、本発明者は、まず、ＡｃｒＩＩＡ４をＣａｓ９活性を制御するスイッチとして採用することを考えた。【００１１】
ここで、非相同末端結合が細胞周期を通じて作動する一方、相同組換えが細胞周期のＧ１期においては作動しないという知見に基づき、Ｇ１期に特異的にＡｃｒＩＩＡ４を機能させてＣａｓ９による非相同末端結合を抑制することができれば、相同組換え修復の効率を相対的に高めることができると考えられる。本発明者は、Ｃｄｔ１と呼ばれるライセンス因子と融合した蛍光タンパク質が、細胞周期のＳ期、Ｇ２期、およびＭ期においてＳＣＦＳｋｐ２Ｅ３ユビキチンリガーゼが介在するタンパク質分解により分解されることが報告されていること（非特許文献１６）に鑑み、細胞周期依存的にＡｃｒＩＩＡ４を分解させる手段として、Ｃｄｔ１を採用することとした。【００１２】
本発明者は、この構想に基づき、ＡｃｒＩＩＡ４をＣｄｔ１と融合し、この融合タンパク質をＣａｓ９とともに細胞内で発現させ、細胞周期におけるＣａｓ９活性の評価を行った。その結果、相同組換えが作動しない細胞周期上の時期においてはＣａｓ９活性が抑制される一方、相同組換えが作動する細胞周期上の時期においては、Ｃａｓ９活性が発揮されることを見出した（図１）。この事実は、Ｃｄｔ１と融合したＡｃｒＩＩＡ４にＣａｓ９に対する阻害活性を発揮させることに成功するとともに、ユビキチンリガーゼによる細胞周期依存的なＣｄｔ１の分解に伴ってＡｃｒＩＩＡ４の機能をも喪失させることに成功したことを意味する。【００１３】
また、本発明者は、自己切断ペプチドを介して、前記融合タンパク質とＣａｓ９とを融合したタンパク質を発現させることにより、相同組換え効率を向上させるとともに、非相同末端結合とオフターゲットを減少させることができることを見出した。さらに、本発明者は、一本鎖ドナーＤＮＡや短縮型ガイドＲＮＡを利用したシステムでは、相同組換えによる標的の精密編集の割合をより高めるとともに、オフターゲットをより減少させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１４】
本発明は、ＡｃｒＩＩＡ４とＣｄｔ１との融合タンパク質を利用して細胞周期依存的にＣａｓ活性を調節する方法、当該方法を利用して細胞周期依存的に細胞内のＤＮＡを編集する方法、およびこれら方法に用いるためのキットに関し、より詳しくは、以下を提供するものである。【００１５】
［１］細胞内でＣａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性を細胞周期依存的に調節する方法であって、
（ｉ）ＡｃｒＩＩＡ４タンパク質とＣｄｔ１タンパク質の融合タンパク質、および
（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質
を含む細胞を提供することを含み、
該細胞内で、細胞周期依存的に該融合タンパク質が該Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性を抑制する方法。【００１６】
［２］前記融合タンパク質におけるＣｄｔ１タンパク質が、Ｅ３ユビキチンリガーゼ介在タンパク質分解を受けるアミノ酸配列を含む部分ペプチドである、［１］に記載の方法。【００１７】
［３］細胞が、前記融合タンパク質とＣａｓタンパク質が自己切断ペプチドを介して融合されたタンパク質を含む、［１］または［２］に記載の方法。【００１８】
［４］Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、［１］から［３］のいずれかに記載の方法。【００１９】
［５］ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法であって、
（ｉ）ＡｃｒＩＩＡ４タンパク質とＣｄｔ１タンパク質の融合タンパク質、および
（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム
を含む細胞を提供することを含み、
該細胞内で、細胞周期依存的に該融合タンパク質が該ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムにおけるＣａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性を抑制し、これにより細胞周期依存的に細胞内のＤＮＡが編集される方法。【００２０】
［６］前記融合タンパク質におけるＣｄｔ１タンパク質が、Ｅ３ユビキチンリガーゼ介在タンパク質分解を受けるアミノ酸配列を含む部分ペプチドである、［５］に記載の方法。【００２１】
［７］細胞が、前記融合タンパク質とＣａｓタンパク質が自己切断ペプチドを介して融合されたタンパク質を含む、［５］または［６］に記載の方法。【００２２】
［８］細胞が、さらに、ドナーＤＮＡを含む、［５］から［７］のいずれかに記載の方法。【００２３】
［９］ドナーＤＮＡが一本鎖ドナーＤＮＡである、［８］に記載の方法。【００２４】
［１０］ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを構成するガイドＲＮＡにおいて、標的ＤＮＡ領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列が２０塩基長未満である、［５］から［９］のいずれかに記載の方法。【００２５】
［１１］Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、［５］から［１０］のいずれかに記載の方法。【００２６】
［１２］［１］から［１１］に記載の方法に用いるためのキットであって、ＡｃｒＩＩＡ４タンパク質とＣｄｔ１タンパク質の融合タンパク質、該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または該発現ベクターが導入された細胞を含むキット。【００２７】
［１３］さらに、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）の少なくとも１つを含む、[１２］に記載のキット。【００２８】
（ｉ）Ｃａｓタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
（ｉｉ）ガイドＲＮＡ、該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
（ｉｉｉ）ドナーＤＮＡ
【発明の効果】
【００２９】
本発明により、細胞周期依存的にＣａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性を調節することが可能となった。特に、本発明によれば、相同組換え修復が作動する細胞周期上の時期において、Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性を発揮させ、それ以外の時期においては、当該エンドヌクレアーゼ活性を抑制することができる。このため、本発明において、ドナーＤＮＡとともにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを利用すれば、相同組換え修復による正確なゲノム編集の効率を高めるとともに、非相同末端結合によるオフターゲット効果を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】細胞周期依存的に活性化されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの概念図である。
【図２】ｍＫＯ２−Ｃｄｔ１の発現レベルの変化を示す写真である。
【図３】２９３Ａ細胞におけるＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１の発現と局在を確認した結果を示す写真である。
【図４】ＡｃｒＩＩＡ４またはＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１による量依存的な突然変異誘発の阻害を示す写真である。
【図５】ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムとＡｃｒＩＩＡ４またはＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１とのモル比が１：５の場合における、ＡｃｒＩＩＡ４またはＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１による突然変異誘発の阻害を示す写真である。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムについては、ガイドＲＮＡの有無で検証した。
【図６】自己切断２Ａペプチドを利用してＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１とＣａｓ９を同時発現させるためのベクターを示す図、および当該ベクターを利用した場合のＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１とＣａｓ９の細胞周期における発現レベルを示すグラフである。
【図７】図６に記載のベクターを用いた場合における、ＡｃｒＩＩＡ４またはＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１の細胞周期における発現量の変化を示すグラフである。
【図８】図６に記載のベクターとドナーＤＮＡを用いて、相同組換え修復（ＨＤＲ）を介したゲノム編集を試験した結果を示す写真である。
【図９】図６に記載のベクターを用いて、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による標的部位におけるゲノム編集を試験した結果を示す写真である。
【図１０】図６に記載のベクターを用いて、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によるオフターゲット部位におけるゲノム編集を試験した結果を示す写真である。
【図１１】図６に記載のベクターと一本鎖ドナーＤＮＡを用いて、相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介した、標的部位またはオフターゲット部位におけるゲノム編集を試験した結果を示す写真である。標的遺伝子として、ＡＡＶＳ１遺伝子を利用した。
【図１２】標的遺伝子として、ＥＭＸ１遺伝子を利用して、図１１と同様の実験を行った結果を示すグラフである。
【図１３】標的遺伝子として、ＶＥＧＦＡ遺伝子を利用して、図１１と同様の実験を行った結果を示すグラフである。
【図１４】短縮型一本鎖ガイドＲＮＡを用いて、図１２と同様の実験を行った結果を示すグラフである。
【図１５】短縮型一本鎖ガイドＲＮＡを用いて、図１３と同様の実験を行った結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
−Ｃａｓタンパク質の活性調節法−
本発明は、細胞内でＣａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性を細胞周期依存的に調節する方法を提供する。本発明の方法は、（ｉ）ＡｃｒＩＩＡ４タンパク質とＣｄｔ１タンパク質の融合タンパク質、および（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質、を含む細胞を提供することを含み、該細胞内で、細胞周期依存的に該融合タンパク質が該Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性を抑制する。
【００３２】
本発明における「ＡｃｒＩＩＡ４タンパク質」は、抗ＣＲＩＳＰＲ（Ａｃｒ）阻害剤として知られているタンパク質の一つである。典型的なＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のＡｃｒＩＩＡ４タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に、当該タンパク質がコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。本発明に用いられる「ＡｃｒＩＩＡ４タンパク質」は、Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性の阻害能を有している限り、上記Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のＡｃｒＩＩＡ４タンパク質のホモログ、変異体、あるいは部分ペプチドであってもよい。ホモログとしては、例えば、対象となるＡｃｒＩＩＡ４タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号１）と、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性の阻害能を有するタンパク質が含まれる。塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときの数値で評価することができる（以下、同様）。また、変異体としては、天然型のＡｃｒＩＩＡ４タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号１）に対して１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたアミノ酸配列からなり、Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性の阻害能を有するタンパク質が含まれる。ここで、「複数個」とは、例えば、２〜１５個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜８個（例えば、２〜７個、２〜６個、２〜５個、２〜４個、２〜３個、２個）である。また、ＡｃｒＩＩＡ４タンパク質による「Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性の阻害」には、完全な阻害および部分的な阻害（例えば、５０％以上の阻害、７０％以上の阻害、９０％以上の阻害）が含まれるが、完全な阻害であることが好ましい。Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性は、本実施例に記載の通り、ガイドＲＮＡと組み合わせて細胞内に導入した場合における、標的部位の切断活性を指標に評価することができる。
【００３３】
本発明における「Ｃｄｔ１タンパク質」は、高等真核生物における過剰複製を防ぐタンパク質として知られており、その機能は、ユビキチン介在タンパク質分解とジェミニン結合による分解により阻害されることが知られている（Ｎｉｓｈｉｔａｎｉ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６，  ４４９０５−４４９１１  （２００１）、Ｋｉｍ，  Ｙ．  ＆  Ｋｉｐｒｅｏｓ，  Ｅ．Ｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖ  ２  （２００７）、Ｗｏｈｌｓｃｈｌｅｇｅｌ，  Ｊ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０，  ２３０９−２３１２  （２０００）、Ｌｅｅ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４３０，  ９１３−９１７  （２００４））。典型的なヒト由来のＣｄｔ１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３に、当該タンパク質がコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号４に示す。本発明に用いられる「Ｃｄｔ１タンパク質」は、細胞周期依存的に分解される限り、上記のヒト由来のＣｄｔ１タンパク質のホモログ、変異体、あるいは部分ペプチドであってもよい。ホモログとしては、例えば、対象となるＣｄｔ１タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号３）と、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、細胞周期依存的に分解されるタンパク質が含まれる。また、変異体としては、天然型のＣａｓタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号３）に対して１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたアミノ酸配列からなり、細胞周期依存的に分解されるタンパク質が含まれる。ここで、「複数個」とは、例えば、２〜８０個、好ましくは２〜４０個、より好ましくは２〜２０個（例えば、２〜１０個、２〜５個、２〜３個、２個）である。
【００３４】
本発明において用いるＣｄｔ１の部分ペプチドは、Ｅ３ユビキチンリガーゼ介在タンパク質分解を受けるアミノ酸配列を含む部分ペプチドであることが好ましい。Ｃｄｔ１のＮ末端は、ＳＣＦＳｋｐ２Ｅ３リガーゼおよびＣＵＬ４Ｄｄｂ１（Ｃｕｌｌｉｎ４、損傷特異的ＤＮＡ結合タンパク質１）Ｅ３リガーゼという２種類のＥ３ユビキチンリガーゼにより標的とされるユビキチン化ドメインである（Ｎｉｓｈｉｔａｎｉ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  ＥＭＢＯ  Ｊ  ２５，  １１２６−１１３６  （２００６））。
【００３５】
ＳＣＦＳｋｐ２Ｅ３リガーゼは、Ｓ期およびＧ２期においてリン酸化アミノ酸（Ｓｅｒ３１および／またはＴｈｒ２９）を標的としている。そして、サイクリンＡ依存性キナーゼが、これらのリン酸化反応を触媒しており、この反応においては、Ｃｄｔ１のサイクリン結合モチーフ（Ｃｙモチーフ）であるＡｒｇ６８−Ａｒｇ６９−Ｌｅｕ７０が必要である。従って、本発明に用いられるＣｄｔ１の部分ペプチドの一つの態様は、Ｃｄｔ１タンパク質の全長アミノ酸配列におけるリン酸化アミノ酸（Ｓｅｒ３１および／またはＴｈｒ２９）とＣｙモチーフ（Ａｒｇ６８−Ａｒｇ６９−Ｌｅｕ７０）とを含む部分ペプチドである。本態様の部分ペプチドの例としては、本実施例において用いたＣｄｔ１タンパク質の全長アミノ酸配列における３０〜１２０位のアミノ酸配列からなる部分ペプチドが挙げられる。本態様の部分ペプチドをＡｃｒＩＩＡ４タンパク質と融合して細胞内に導入、または、細胞内で発現させることにより、細胞周期のＳ期およびＧ２期においてＣａｓタンパク質を活性化させることができる。
【００３６】
一方、ＣＵＬ４Ｄｄｂ１Ｅ３リガーゼは、Ｃｄｔ１のＮ末端（約１〜１０のアミノ酸残基）で増殖細胞核抗原相互作用タンパク質モチーフ（ＰＩＰボックス）において高度に保存されている６個のアミノ酸を認識する。ＣＵＬ４Ｄｄｂ１Ｅ３リガーゼが介在するＣｄｔ１のタンパク質分解は、Ｓ期またはＤＮＡ損傷後にのみ生じる（Ｈａｖｅｎｓ，  Ｃ．Ｇ．  ＆  Ｗａｌｔｅｒ，  Ｊ．Ｃ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ３５，  ９３−１０４  （２００９）、Ｉｓｈｉｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５，  ４１９９３−４２０００  （２０１０）、Ｒｏｕｋｏｓ，  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １２４，  ４２２−４３４  （２０１１））。従って、本発明に用いられるＣｄｔ１の部分ペプチドの他の一つの態様は、Ｃｄｔ１のＮ末端（約１〜１０のアミノ酸残基）を含む部分ペプチドである。ここで、ＣＵＬ４Ｄｄｂ１Ｅ３リガーゼ介在タンパク質分解を適用したＦｕｃｃｉ（ＣＡ）と呼ばれる新しいＦｕｃｃｉシステムが報告されている（Ｓａｋａｕｅ−Ｓａｗａｎｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６８，  ６２６−６４０  ｅ６２５  （２０１７））。Ｆｕｃｃｉ（ＣＡ）は、Ｃｄｔ１由来のＣｙモチーフの非存在下でのｍＫＯとアミノ酸残基１〜１００との融合タンパク質である。このため、本態様における部分ペプチドにおいては、Ｃｙモチーフは必須ではない。従って、本態様の部分ペプチドの例としては、Ｃｙモチーフを変異させた、Ｃｄｔ１タンパク質の全長アミノ酸配列における１〜１００位のアミノ酸配列からなる部分ペプチドが挙げられる。本態様の部分ペプチドをＡｃｒＩＩＡ４タンパク質と融合して細胞内に導入、または、細胞内で発現させることにより、細胞周期のＳ期においてＣａｓタンパク質を活性化させることができる。
【００３７】
本発明における「ＡｃｒＩＩＡ４タンパク質とＣｄｔ１タンパク質の融合タンパク質」は、ＡｃｒＩＩＡ４タンパク質をコードするＤＮＡとＣｄｔ１タンパク質をコードするＤＮＡとを連結し、適切なベクターに挿入して発現させることにより調製することができる。発現させた融合タンパク質が、上記目的の機能を発揮しうる限り、両タンパク質をコードするＤＮＡの連結の仕方に特に制限はない。また、上記融合タンパク質には、さらに、他の機能性タンパク質が融合されていてもよい。他の機能性タンパク質は、その機能を発揮しうる限り、上記融合タンパク質のＮ末側とＣ末側のいずれか一方もしくは両側、または上記両タンパク質の間に、直接的にまたは間接的に融合させることができる。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、融合タンパク質に付与したい機能に応じて適宜選択されるが、例えば、融合タンパク質に付与したい機能が細胞内局在性であれば、核移行シグナル（ＮＬＳ）などが挙げられ、融合タンパク質に付与したい機能が当該融合タンパク質の検出や精製であれば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）やＦＬＡＧ−タグタンパク質などが挙げられる。また、融合タンパク質を構成するタンパク質の間には、リンカーペプチドが介在していてもよい。
【００３８】
本発明に用いる「Ｃａｓタンパク質」は、ＡｃｒＩＩＡ４タンパク質によって、そのエンドヌクレアーゼ活性を阻害しうるものであれば、特に制限はない。このような「Ｃａｓタンパク質」としては、Ｃａｓ９タンパク質が好ましく、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質が特に好ましい。各種Ｃａｓタンパク質のアミノ酸配列および塩基配列は、文献やＮＣＢＩなどの公開されたデータベースに掲載されている（例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０９３７１２、ＷＯ２０１３／１４２５７８、ＷＯ２０１４／１３１８３３、アクセッション番号：Ｑ９９ＺＷ２．１、ＷＰ＿０２１７３６７２２等）。典型的なＳｐＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を配列番号５に、当該タンパク質がコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号６に示す。
【００３９】
本発明に用いられる「Ｃａｓタンパク質」は、既知のＣａｓタンパク質のホモログ、変異体、あるいは部分ペプチドであってもよい。ホモログとしては、例えば、対象となるＣａｓタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号５）と、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質が含まれる。また、変異体としては、天然型のＣａｓタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号３）に対して１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたアミノ酸配列からなり、エンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質が含まれる。ここで、「複数個」とは、例えば、２〜２００個、好ましくは２〜１００個、より好ましくは２〜５０個（例えば、２〜３０個、２〜１０個、２〜５個、２〜３個、２個）である。変異体の例としては、例えば、特定のアミノ酸残基に変異を導入することによりエンドヌクレアーゼ活性の一部を喪失させたニッカーゼ型Ｃａｓタンパク質（ｎＣａｓ）や、特定のアミノ酸残基に変異を導入することによりＰＡＭの認識特異性を改変したＣａｓタンパク質（Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ５２３，４８１−４８５（２０１５）、Ｈｉｒａｎｏ，Ｓ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ６１，  ８８６−８９４（２０１６））が挙げられる。
【００４０】
本発明においては、前記融合タンパク質およびＣａｓタンパク質を含む細胞を提供する。このような細胞の調製においては、前記融合タンパク質およびＣａｓタンパク質を、直接、細胞に導入してもよく、前記融合タンパク質およびＣａｓタンパク質を細胞内で発現させてもよい。また、いずれか一方のタンパク質を、直接、細胞に導入し、他の一方を細胞内で発現させてもよい。
【００４１】
細胞内でタンパク質を発現させる方法としては特に制限はなく、適宜公知の手法を選択して利用することができる。例えば、融合タンパク質の発現ベクターとＣａｓタンパク質の発現ベクターを細胞内に導入してもよく、また、融合タンパク質とＣａｓタンパク質の双方を発現するベクターを細胞内に導入してもよい。
【００４２】
発現ベクターの形態を採用する場合には、発現させるべきＤＮＡに作動的に結合している１つ以上の調節エレメントを含む。ここで、「作動可能に結合している」とは、調節エレメントに上記ＤＮＡが発現可能に結合していることを意味する。「調節エレメント」としては、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリＵ配列）が挙げられる。発現ベクターは、宿主ゲノムに組み込まれることなく、コードするタンパク質を安定して発現することができるものが好ましい。このような発現ベクターの形態としては、エピソーマルベクターが挙げられる。
【００４３】
また、本発明においては、発現ベクターの形態ではなく、ｍＲＮＡの形態で細胞に導入して、上記融合タンパク質およびＣａｓタンパク質を発現させてもよい。
【００４４】
本発明においては、融合タンパク質とＣａｓタンパク質の間に自己切断ペプチドを導入することが好ましい。これにより、融合タンパク質とＣａｓタンパク質の発現量を厳密に制御することができる（図６）。自己切断ペプチドとしては、例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａなどが挙げられるが、これらに制限されない。
【００４５】
本発明に用いられる「細胞」としては、上記融合タンパク質およびＣａｓタンパク質が機能する細胞であって、上記融合タンパク質におけるＣｄｔ１を細胞周期特異的に分解する機構を持つ細胞であれば、その由来に特に制限はない。細胞は、好ましくは、動物細胞、植物細胞、藻細胞、真菌細胞などの真核生物細胞であり、特に好ましくは動物細胞である。
【００４６】
「動物細胞」には、例えば、動物の個体を構成している細胞、動物から摘出された器官・組織を構成する細胞、動物の組織に由来する培養細胞などが含まれる。具体的には、例えば、各段階の胚の胚細胞（例えば、１細胞期胚、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、１６細胞期胚、桑実期胚など）；誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、造血幹細胞などの幹細胞；線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、脳細胞、腎細胞などの体細胞などが挙げられる。ゲノム編集動物の作成には、受精卵を用いることができる。
【００４７】
動物としては、例えば、哺乳動物の他、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、昆虫類が挙げられる。「哺乳動物」とは、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を包含する概念である。非ヒト哺乳動物の例としては、ウシ、イノシシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの偶蹄類、ウマなどの奇蹄類、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、リスなどの齧歯類、ウサギなどのウサギ目、イヌ、ネコ、フェレットなどの食肉類などが挙げられる。上記の非ヒト哺乳動物は、家畜またはコンパニオンアニマル（愛玩動物）であってもよく、野生動物であってもよい。
【００４８】
「植物細胞」としては、例えば、穀物類、油料作物、飼料作物、果物、野菜類の細胞が挙げられる。「植物細胞」には、例えば、植物の個体を構成している細胞、植物から分離した器官や組織を構成する細胞、植物の組織に由来する培養細胞などが含まれる。植物の器官や組織としては、例えば、葉、茎、茎頂（生長点）、根、塊茎、塊根、種子、カルスなどが挙げられる。植物の例としては、イネ、トウモロコシ、バナナ、ピーナツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、タバコ、コムギ、オオムギ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、カーネーションなどが挙げられる。
【００４９】
上記融合タンパク質およびＣａｓタンパク質、並びに、それらを発現させるためのｍＲＮＡやベクターの細胞への導入は、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法、ナノ粒子媒介性トランスフェクション法、ウイルス媒介性核酸送達法などの公知の方法を適宜選択して行うことができる。
【００５０】
こうして調製された上記融合タンパク質およびＣａｓタンパク質を含む細胞においては、Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性が細胞周期依存的に調節される。ここで「細胞周期依存的」とは、Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性が細胞周期の時期に依存して変化することを意味する。本発明の好ましい態様においては、Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性は、細胞周期のＳ／Ｇ２／Ｍ期において高く、Ｇ１期において低い。このような細胞周期依存性は、抗ＣＲＩＳＰＲ阻害剤であるＡｃｒＩＩＡ４を含む本発明の融合タンパク質を細胞周期のＳ／Ｇ２／Ｍ期に分解させることにより実現することができる。このような融合タンパク質の分解は、本発明の融合タンパク質に含まれる、もう一方のドメインであるＣｄｔ１の細胞周期依存的な分解によって誘導することができる。このＣｄｔ１の細胞周期依存的な分解は、例えば、内因性のＥ３ユビキチンリガーゼなどの作用により、引き起こされる。
【００５１】
−ゲノム編集法−
上記本発明の方法において、Ｃａｓタンパク質をガイドＲＮＡと組合せ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムとして機能させることにより、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが標的化する細胞内のＤＮＡを編集することができる。従って、本発明は、ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法であって、（ｉ）ＡｃｒＩＩＡ４タンパク質とＣｄｔ１タンパク質の融合タンパク質、および（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを含む細胞を提供することを含み、該細胞内で、当該融合タンパク質が細胞周期依存的に当該ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムにおけるＣａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性を抑制し、これにより細胞周期依存的に細胞内のＤＮＡが編集される方法を提供する。
【００５２】
ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と相互作用する塩基配列（以下、「Ｃａｓ相互作用塩基配列」と称する）と標的ＤＮＡ領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列（以下、「標的化塩基配列」と称する）とを含むＲＮＡである。このためガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成して、当該複合体を標的ＤＮＡ領域に誘導し、標的ＤＮＡ領域に誘導されたＣａｓタンパク質は、そのエンドヌクレアーゼ活性によって標的ＤＮＡ領域中の標的部位を切断する。この標的部位の切断が、非相同末端結合により修復された場合、主として、ヌクレオチドの挿入や欠失が生じ、フレームシフトなどにより遺伝子のノックアウトを行うことができる。一方、細胞外から、修復鋳型となるドナーＤＮＡを導入した場合には、標的ＤＮＡ領域とドナーＤＮＡとの間の相同組換えにより、当該領域に遺伝子のノックインを行うことができる。
【００５３】
ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む場合（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの場合）には、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む一分子ガイドＲＮＡでも、ｃｒＲＮＡ断片とｔｒａｃｒＲＮＡ断片とからなる二分子ガイドＲＮＡであってもよい。
【００５４】
ｃｒＲＮＡ中の標的化塩基配列は、通常、１２〜５０塩基、好ましくは、１７〜３０塩基、より好ましくは１７〜２５塩基からなる塩基配列であり、ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏ−ｓｐａｃｅｒ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ）配列と隣接する領域を標的化するように選択される。本発明においては、ガイドＲＮＡにおいて、短い標的化塩基配列を利用することにより、オフターゲット効果を減少させることができることが見出された（図１４、１５）。従って、標的化塩基配列の鎖長は、この目的においては、好ましくは、２０塩基長未満（例えば、１９塩基長、１８塩基長、１７塩基長）である。
【００５５】
多くのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系においては、ｃｒＲＮＡは、さらに、ｔｒａｃｒＲＮＡと相互作用（ハイブリダイズ）が可能な塩基配列を３’側に含む。一方、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの一部の塩基配列と相互作用（ハイブリダイズ）が可能な塩基配列を５’側に含む。これら塩基配列の相互作用により形成された二重鎖ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と相互作用する。
【００５６】
ＰＡＭは、Ｃａｓタンパク質の種類や由来により異なる。典型的なＰＡＭ配列は、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ型）では、「５′−ＮＧＧ」であり、Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ−Ａ１型）では、「５′−ＣＣＮ」であり、Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ−Ａ２型）では、「５′−ＴＣＮ」であり、Ｈ．ｗａｌｓｂｙｌ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ−Ｂ型）では、「５′−ＴＴＣ」であり、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ−Ｅ型）では、「５′−ＡＷＧ」であり、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ−Ｆ型）では、「５′−ＣＣ」であり、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ−Ｆ型）では、「５′−ＣＣ」であり、Ｓ．Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ−Ａ型）では、「５′−ＮＮＡＧＡＡ」であり、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ−Ａ型）では、「５′−ＮＧＧ」であり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質では、「５′−ＮＧＲＲＴ」または「５′−ＮＧＲＲＮ」であり、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質では、「５′−ＮＮＮＮＧＡＴＴ」であり、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来のＣａｓ９タンパク質では、「５′−ＮＡＡＡＡＣ」である。
【００５７】
なお、上記の通り、Ｃａｓタンパク質を改変すること（例えば、変異の導入）により、ＰＡＭ認識を改変することも可能である（Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ５２３，４８１−４８５（２０１５）、Ｈｉｒａｎｏ，Ｓ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ６１，  ８８６−８９４（２０１６））。これにより、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの標的化ＤＮＡ領域の選択肢を拡大することができる。
【００５８】
本発明においては、異なる標的ＤＮＡ領域を標的化する複数のガイドＲＮＡを利用することにより、異なる標的ＤＮＡ領域のＤＮＡを同時に編集することもできる。
【００５９】
細胞に導入される「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム」は、例えば、ガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質の組み合わせの形態であっても、ガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡとの組み合わせの形態であっても、それらを発現するベクターの形態であってもよい。細胞へのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの導入法は、上記の融合タンパク質およびＣａｓタンパク質の導入法と同様である。
【００６０】
本発明の方法において、ドナーＤＮＡを用いることにより、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの標的ＤＮＡ領域（Ｃａｓタンパク質による切断部位の周辺領域）で生じる相同組換え修復（ＨＤＲ）を利用して、標的ＤＮＡ領域に所望のＤＮＡを挿入することができる。相同組換え修復のプロセスにおいては、標的ＤＮＡ領域の塩基配列とドナーＤＮＡの塩基配列の相同性を必要とし、ドナーＤＮＡを、Ｃａｓタンパク質による切断部位を含む標的ＤＮＡ領域の鋳型修復に用い、ドナーＤＮＡから標的ＤＮＡ領域への遺伝情報の移動をもたらす。これにより、標的ＤＮＡ領域の塩基配列を変化（例えば、挿入、欠失、置換など）させることができる。従って、ドナーＤＮＡは、標的ＤＮＡ領域内の塩基配列と高い同一性を有する２つの塩基配列（相同性アーム）とそれらの間に配置された所望のＤＮＡ（標的ＤＮＡ領域に挿入するためのＤＮＡ）を含む。
【００６１】
相同性アームは相同組換えを行うのに十分な程度の大きさがあればよく、また、ドナーＤＮＡの形態や鎖長により変動し得るが、二本鎖ドナーＤＮＡの場合は、例えば、５００〜１０００塩基対であり、一本鎖ドナーＤＮＡの場合は、例えば、３０〜１００塩基である。また、相同性アームは相同組換えを行うのに十分な程度に標的ＤＮＡ領域内の塩基配列と同一性を有していれば、１００％の同一性がなくともよい。例えば、９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．９％以上の同一性をそれぞれ有する。
【００６２】
また、相同性アームの間に存在する所望のＤＮＡの長さは特に限定されることなく、様々なサイズのものを利用することができる。所望のＤＮＡ中に、事後的に除去したい塩基配列が存在する場合には、当該塩基配列の両端に、例えば、組換え酵素の認識配列（例えば、ｌｏｘＰ配列やＦＲＴ配列）を付加することもできる。当該認識配列に挟まれた塩基配列は、組換え酵素（例えば、Ｃｒｅ組換え酵素やＦＬＰ組換え酵素）を作用させることにより、除去することができる。また、ＤＮＡのノックインの成功を確認するため等の目的で、例えば、選択マーカー配列（例えば、蛍光タンパク質や薬剤耐性遺伝子など）を所望のＤＮＡ中に組み込むこともできる。また、所望のＤＮＡとして、１つ以上の調節エレメントに作動的に結合させた遺伝子を用いることもできる。
【００６３】
本発明で用いられるドナーＤＮＡは、直鎖状ＤＮＡであっても、環状ＤＮＡであってもよい。また、一本鎖ＤＮＡであっても、二本鎖ＤＮＡであってもよい。産生が容易でコストが低い、反応が迅速である、相同組換えの効率が増加する、予想外の組み込みが少ないなどの観点から、一本鎖ＤＮＡであることが好ましい。
【００６４】
−キット−
また、本発明は、上記本発明の方法に用いるためのキットであって、ＡｃｒＩＩＡ４タンパク質とＣｄｔ１タンパク質の融合タンパク質、該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または該発現ベクターが導入された細胞を含むキットを提供する。
【００６５】
当該キットにおけるＡｃｒＩＩＡ４タンパク質とＣｄｔ１タンパク質の融合タンパク質は、例えば、自己切断ペプチドを介してＣａｓタンパク質と融合された形態であってもよい。すなわち、前記融合タンパク質とＣａｓタンパク質は、同一分子として、細胞に導入し、または、発現させることができる。
【００６６】
前記融合タンパク質とＣａｓタンパク質を別分子として利用する場合には、本発明のキットは、（ｉ）Ｃａｓタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含んでいてもよい。
【００６７】
本発明のキットは、目的に応じて、さらに、（ｉｉ）ガイドＲＮＡ、該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および（ｉｉｉ）ドナーＤＮＡ、の少なくとも１つを含んでもよい。
【００６８】
また、本発明のキットは、一つまたは複数の追加の試薬をさらに含む場合があり、追加の試薬としては、例えば、希釈緩衝液、再構成溶液、洗浄緩衝液、核酸導入試薬、タンパク質導入試薬、対照試薬（例えば、対照のガイドＲＮＡ）が挙げられるが、これらに制限されない。当該キットは、本発明の方法を実施するための使用説明書を含んでいてもよい。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００７０】
Ａ．材料および方法
（１）プラスミド構築
ＡｃｒＩＩＡ４とＦＬＡＧタグ遺伝子とをコードするプラスミドＤＮＡは、ユーロフィンジェノミクスにより合成されたものである。ｐＦｕｃｃｉ−Ｇ１オレンジ発現ベクターは医学生物学研究所から購入した。ｇＲＮＡクローニングベクターおよびｈＣａｓ９はジョージ・チャーチから譲り受けた（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド４１８２４番および４１８１５番）。ＡｃｒＩＩＡ４フラグメントは、増幅されたＤＮＡをＢａｍＨＩとＢｓｔＸＩとで消化することにより産生した。このフラグメントをｈＣｄｔ１（３０／１２０）のＮ末端のｐＦｕｃｃｉ−Ｇ１オレンジ発現ベクターに結合してＡｃｒＩＩＡ４−ｈＣｄｔ１（３０／１２０）プラスミドＤＮＡを構築した。ＡｃｒＩＩＡ４フラグメントをＣＭＶプライマーとＡｃｒ−ＲＥｓｉｔｅ＿ＸｂａＩ＿Ｒｖとにより増幅し、ＢａｍＨＩとＸｂａＩとにより消化した。このフラグメントをｐＦｕｃｃｉ−Ｇ１オレンジベクターに結合し、これをＢａｍＨＩとＸｂａＩとで消化してＡｃｒＩＩＡ４プラスミドＤＮＡを構築した。ＮＬＳを導入するために、プライマーＢａｍＨＩ＿ＮＬＳ−ＡｃｒＩＩＡ４＿ＦｗとプライマーＡｃｒ−ＲＥｓｉｔｅ＿ＸｂａＩ＿Ｒｖとを使用した。ＤＮＡフラグメントを増幅し、ＢａｍＨＩとＸｂａＩとにより消化し、そして元のベクターに挿入して、これをＢａｍＨＩとＸｂａＩとにより消化した。ＡｃｒＩＩＡ４−２Ａ−Ｃａｓ９またはＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１−２Ａ−Ｃａｓ９をコードする新しいプラスミドＤＮＡを、ギブソン・アセンブリを用いて構築した。ＡｃｒＩＩＡ４、ＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１、および、Ｃａｓ９フラグメントをＰＣＲにより増幅した。ギブソン・アッセンブリー・マスター・ミックス（ＮＥＢ）を用いて、ＮｏｔＩ処理したｐＥＢＭｕｌｔｉ−Ｈｙｇ（富士フィルム）と各フラグメントとをｐＥＢベクターに挿入した。【００７１】
構築したＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１ベクターが発現する融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７に、この融合タンパク質がコードするＤＮＡを配列番号８に示す。また、構築したＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１−２Ａ−Ｃａｓ９ベクターが発現する融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号９に、この融合タンパク質がコードするＤＮＡを配列番号１０に示す。【００７２】
（２）細胞培養とトランスフェクション
２９３Ａ細胞（インビトロジェン）を、１０％ＦＢＳとペニシリン／ストレプトマイシンとを添加したＤＭＥＭ中、５％ＣＯ２雰囲気において３７℃で維持した。Ｃａｓ９、ＡｃｒＩＩＡ４−２Ａ−Ｃａｓ９またはＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１−２Ａ−Ｃａｓ９をコードするエピソーマルベクターをリポフェクタミン３０００により導入後、３〜７日間、３５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシン溶液（富士フィルム）を用いて細胞を選択した。リポフェクタミン３０００（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）をウエスタンブロットおよびプラスミド量の評価に使用した。Ｎｅｏｎ（登録商標）トランスフェクションシステム１０μＬキット（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）を用いて内因性相同組換え修復活性を評価した。ウエスタンブロット分析およびタイムラプス観察において、５００ｎｇのプラスミドＤＮＡを、リポフェクションによって８０〜９０％の密集度まで増殖した２９３Ａ細胞にトランスフェクトした。標的部位での阻害を実証実験するために、修復鋳型プラスミドとｓｇＲＮＡプラスミド（各２５０ｎｇ）とを、リポフェクションによって８０〜９０％の密集度まで増殖した２９３Ａ細胞にトランスフェクトした。ｓｓＯＤＮを鋳型として使用する相同組換え修復評価では、５０ｐｍｏｌのｓｓＯＤＮと２５０ｎｇのｓｇＲＮＡプラスミドとを、１，２４５Ｖのパルス電圧、１０ｍｓのパルス幅、および３つのパルスを使用して５×１０４個の細胞にトランスフェクトした。【００７３】
（３）ｍＫＯ−Ｃｄｔ１（３０／１２０）のタイムラプス観察
２９３Ａ細胞を２４ウェルプレート（グライナーバイオワン）のウェルに細胞４×１０４個／ウェルの密度で播種し、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有する高グルコースＤＭＥＭ（和光）において、５％ＣＯ２の雰囲気中３７℃で２４時間培養した。リポフェクタミン３０００（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）を用いて、製造業者のプロトコルに従って、ｐＦｕｃｃｉ−Ｇ１オレンジ発現ベクター（５００ｎｇ）を２９３Ａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、トランスフェクトされた細胞を１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するフェノールレッドフリー高グルコースＤＭＥＭ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）を用いて３５ｍｍガラス底皿（グライナーバイオワン）に播種した。ｍＬＯの発現を、ＦＬＵＯＶＩＥＷ  ＦＶ１０ｉ顕微鏡（オリンパス）を用いて２５時間にわたって１時間毎に観察した。【００７４】
（４）免疫細胞化学
２９３Ａ細胞を２４ウェルプレート（グライナーバイオワン）のウェルに細胞４×１０４個／ウェルの密度で播種し、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有する高グルコースＤＭＥＭ（和光）中で、５％ＣＯ２の雰囲気中３７℃で２４時間培養した。リポフェクタミン３０００（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）を用いて、製造業者のプロトコルに従って、プラスミド（５００ｎｇ）を細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、増殖培地を新鮮な培地と交換し、細胞をさらに２４時間培養した。観察の２４時間前に、トランスフェクトされた細胞を３５ｍｍガラス底皿に播種した。細胞を、１６％ホルムアルデヒド溶液（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した４％ホルムアルデヒド溶液により室温で１０分間固定した。細胞を、０．１％トリトンＸ−１００（カルビオケム）により室温で１０分間透過処理し、そして、ブロッキングワン（ナカライテスク）を用いて室温で１時間ブロックした。その後、細胞を、抗ＦＲＡＧタグ抗体（シグマ・アルドリッチ）と室温で１時間反応させ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）で標識した抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｃｒｏｓｓ−Ａｄｓｏｒｂｅｄ二次抗体と室温で３０分間反応させた。細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（同仁化学研究所）により室温で１５分間染色した。染色細胞の観察は、前述のＦＬＵＯＶＩＥＷ  ＦＶ１０ｉ顕微鏡を用いて行った。【００７５】
（５）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析
２９３Ａ細胞を６×ウェルプレートのウェルに細胞１×１０５個／ウェルの密度で播種した。二重チミジンブロックおよびノコダゾール処理を行った。二重チミジンブロックのために、５μＭのチミジンを添加し、１８時間培養した。その後、培地を新鮮な培地と交換し、８時間培養し、続いて５μＭのチミジンを添加し、１６時間培養した。ノコダゾール処理のために、２００ｎｇ／ｍＬのノコダゾールを添加し、１８時間培養した。両方の処理の後、ＰＢＳで３回洗浄し、最後の洗浄後に新鮮な培地を添加することによって細胞を薬物から解放した。細胞を３時間毎（０時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１５時間）に収集し、７０％エタノールを用いて氷上で３０分間固定した。固定された細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＲＮａｓｅＡ（１０μｇ／ｍＬ）を含むヨウ化プロピジウム溶液（フナコシ）を用いて室温で３０分間染色した。染色された細胞を、ＮｏｖｏＣｙｔｅ（ＡＣＥＡバイオサイエンス）およびＮｏｖｏＥｘｐｒｅｓｓソフトウェアによって分析した。【００７６】
（６）ウエスタンブロット分析
２９３Ａ細胞を２４ウェルプレートのウェルに細胞４×１０４個／ウェルの密度で播種した。２４時間後、細胞を５００ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いてトランスフェクトした。２４時間後、トランスフェクトされた細胞を、３５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含有するＤＭＥＭを入れた１０ｃｍ２の皿に播種し、細胞を１週間の培養中に選択した。細胞を６ウェルプレートのウェルに細胞１×１０５個／ウェルの密度で播種し、二重チミジンブロックおよびノコダゾール処理を上記のように行った。これらの処理の後、ＰＢＳで３回洗浄した後に培地を新鮮な無薬物培地と交換することにより細胞を薬物から解放した。回復後３時間毎（０時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１５時間）に細胞を収集した。収集した細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液（ナカライテスク）を使用し、氷上で３０分間培養することによって溶解した。タンパク質濃度は、市販のタンパク質アッセイ（バイオ・ラッド）とｉＭａｒｋマイクロプレートリーダー（バイオ・ラッド）とを用いて算出した。標準曲線は、予備希釈タンパク質アッセイ標準（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）を用いて作成した。同量のタンパク質をＢｏｌｔ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｌｕｓゲル（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）のウェルに充填し、電気泳動を１００Ｖで１時間行った。ｉＢｌｏｔゲル転写デバイス（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）を用いて、製造業者のプロトコルに従い、分解したタンパク質をＰＶＤＦ膜（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）に転写した。転写膜を、ブロッキングワン溶液（ナカライテスク）により室温で１時間処理した。次に、β−アクチン（和光）に対する一次抗体と、ＦＲＡＧ−ｔａｇ（和光）と、Ｃａｓ９（クロンテック）（すべて１：１０，０００希釈）とを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ−Ｔ、タカラバイオ）を含むトリス緩衝食塩水を用いて３回すすいだ後、室温で１時間反応させた。その後、抗マウスＩｇＧ（和光）に対する西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体と抗ウサギＩｇＧ（和光）とを、ＴＢＳ−Ｔを使用して３回すすいだ後、室温で１時間反応させた。西洋ワサビペルオキシダーゼを、３回すすいだ後、Ｃｌａｒｉｔｙ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＥＣＬ基質（バイオ・ラッド）と室温で１時間反応させた。発光は、ＣｈｅｍｉＤｏｃＸＲＳ＋システム（バイオ・ラッド）を用いて検出した。【００７７】
（７）Ｔ７Ｅ１アッセイおよび制限酵素アッセイ
２９３Ａ細胞を細胞４×１０４個／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞を５００ｎｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、トランスフェクトされた細胞を、３５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含有するＤＭＥＭと共に６ウェルプレートのウェルに播種し、細胞を１週間の培養中に選択した。トランスフェクトされた細胞を２４ウェルプレートのウェルに細胞４×１０４個／ウェルの密度で播種した。細胞を２４時間培養し、ｓｇＲＮＡをコードするプラスミドＤＮＡおよび鋳型ＤＮＡの２種類でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキット（キアゲン）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。各標的のＴ７Ｅ１プライマーと共にヘラクレスＩＩ融合ＤＮＡポリメラーゼ（アジレント）を用いて、ゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ）を増幅した。数種の遺伝子、即ち、ＡＡＶＳ１標的、ＥＭＸ１標的と標的外、および血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）標的と標的外に対するＰＣＲ条件は、最初の変性では９５℃で３分間、事前増幅では９８℃で１０秒間、７２℃〜６２℃（１サイクル当たり１度ずつ低下）で２０秒間、および７２℃の３０秒間を１０サイクル、増幅では９８℃で１０秒間、６２℃で２０秒間、および７２℃で３０秒間を２５サイクル、そして最終的伸長では７２℃で３分間とした。生成物は、使用するまで３％ジメチルスルホキシド中に４℃で保存した。他の遺伝子に対するＰＣＲ条件は、製造元のマニュアルに従った。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（キアゲン）を使用してＰＣＲフラグメントＤＮＡを精製した。フラグメントＤＮＡ（２００ｎｇ）を、２μＬの１０×ＮＥ緩衝液２（ＮＥＢ）を含有する１９μＬの溶液中で、９５℃で１０分間、９５℃から２５℃までは０．１℃／秒のランプレートで、そして、４℃にアニールした。アニール後のＤＮＡに１μＬのＴ７エンドヌクレアーゼ１を加え、３７℃で１時間培養した。反応後のサンプルをＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  精製キット（キアゲン）により精製した。ＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所）を用いてＤＮＡ断片を分析した。インデル効率を以下のように計算した。【００７８】
１００＊（１−（１−（ａ＋ｂ）／（ａ＋ｂ＋ｃ））＾（１／２））
ここで、ａおよびｂは、切断フラグメントの面積を示し、ｃは、非切断フラグメントの面積を示す。【００７９】
制限酵素アッセイにおいて、２００ｎｇの増幅されたＤＮＡを、カットスマート緩衝液（ＮＥＢ）と１×ウシ血清アルブミン（ＮＥＢ）との中において、０．５μＬのＸｈｏＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ）と３７℃で１時間（ＸｈｏＩ）または３時間（ＨｉｎｄＩＩＩ）反応させた。反応後のサンプルをエタノール沈殿により精製した。ＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所）を用いてＤＮＡ断片を分析した。インデルのインデル効率を以下のように計算した。【００８０】
１００＊（（ａ＋ｂ）／（ａ＋ｂ＋ｃ））
ここで、ａおよびｂは切断フラグメントの面積を示し、ｃは非切断フラグメントの面積を示す。【００８１】
（８）プライマー・リスト
本実施例で使用したプライマーのリストを以下の表１および２に示す。【００８２】
【表１】
2020059708.tif 000003
【００８３】
【表２】
2020059708.tif 000004
【００８４】
Ｂ．結果
（１）ＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１の細胞周期依存性発現
ｍＫＯ蛍光タンパク質と融合したＣｄｔ１ドメインの細胞周期依存性発現を、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）を用いて観察した。発現プラスミドであるＦｕｃｃｉベクター（Ｓａｋａｕｅ−Ｓａｗａｎｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  １３２，  ４８７−４９８  （２００８））を、２９３Ａ細胞に一過性トランスフェクトした。ｍＫＯの発現をＣＬＳＭを用いて観察した。ｍＫＯ発現のタイムラプス観察により、発現レベルが時間依存的に変化することが示唆された（図２）。【００８５】
ＮＬＳを有するＡｃｒＩＩＡ４またはＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１（３０／１２０）をコードするプラスミドＤＮＡを構築し、２９３Ａ細胞を一過性トランスフェクトするために使用した。トランスフェクションの４８時間後に、細胞核におけるＡｃｒＩＩＡ４およびＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１の局在化がＣＬＳＭによって確認された（図３）。【００８６】
（２）インデルの導入に対するＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１の効果
Ｃｄｔ１（３０／１２０）ドメインがＡｃｒＩＩＡ４の阻害活性に影響を及ぼすかどうかを実証実験するために、Ｃａｓ９と、Ｈ２Ｂ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡと、ＡｃｒＩＩＡ４／ＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１との共発現を行った。阻害活性を、Ｔ７Ｅ１アッセイにおける突然変異分析によって評価した。ＡｃｒＩＩＡ４／ＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１のＣａｓ９に対するモル比が増加したときに、変異誘発率の低下が観察された（図４）。ＡｃｒＩＩＡ４またはＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１のＣａｓ９に対するモル比が５：１の場合、ＡｃｒＡＩＩおよびＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１によって阻害された突然変異誘発率は、Ｃａｓ９を単独で発現した場合の８．０％から、それぞれ０．９％および３．７％に減少した（図５）。観察された非相同末端結合による突然変異誘発率の減少により、ＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１の発現がＣｄｔ１の細胞周期依存的分解により制限され得ることが示唆された。【００８７】
（３）精密編集用ドナープラスミドを用いたゲノム編集に対するＡｃｒＩＩＡ４‐Ｃｄｔ１の効果
非相同末端結合による突然変異誘発率はＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１によって低下し、ＡｃｒＩＩＡ４単独ではほぼ完全に突然変異誘発を抑制できたことが示された。Ｃａｓ９とＡｃｒＩＩＡ４のＤＮＡの量を制御するために、自己切断ペプチド配列（Ｔ２Ａ）によって分離されたＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１とＣａｓ９とをコードするプラスミドＤＮＡを構築した（図６左）。この発現システムを用いて、ＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１およびＣａｓ９の量を厳密に調整することができた（図６右）。Ｔ２Ａの切断後、プロリン残基がＣａｓ９のＮ末端に付加されたが、Ｃａｓ９の一部はアポ型またはｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡとの複合体で表面に露出していたため、これがＣａｓ９の活性に影響を及ぼすことはなかった。プラスミドはエピソーマルベクターに基づくものであるため、コードされたタンパク質を宿主ゲノムに組み込まれることなく安定して発現することができる。【００８８】
ＡｃｒＩＩＡ４‐Ｃｄｔ１融合タンパク質の細胞周期依存性発現をウエスタンブロットにより分析した。ＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１−２Ａ−Ｃａｓ９をコードするプラスミドの一過性トランスフェクションの後、細胞をハイグロマイシンにより選択した。生き残った細胞を同期化のためにチミジンまたはノコダゾールで処理した。薬物処理からの解放後に得た細胞におけるＡｃｒＩＩＡ４およびＣａｓ９の発現をウエスタンブロットにより確認した（図７）。Ｃｄｔ１ドメインと融合したＡｃｒＩＩＡ４の発現の低下はＳ／Ｇ２／Ｍ期で観察されたが、発現はＧ１期で増加した。Ｃｄｔ１ドメインを含まないＡｃｒＩＩＡ４の発現レベルは細胞周期に亘って変化しなかった。なお、ＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１とは反対に、同じ遺伝子カセットから発現されたＣａｓ９は、発現レベルと細胞周期との相関を示さなかった。【００８９】
Ｃａｓ９およびＡｃｒＩＩＡ４／ＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１用のエピソームベクターの一過性トランスフェクションの後、細胞を３〜７日間ハイグロマイシンを用いて選択した。生き残った細胞を、リポフェクションによって、ＡＡＶＳ１部位コードプラスミドおよびドナー鋳型ＤＮＡを標的とするｓｇＲＮＡでトランスフェクトした。ドナー鋳型ＤＮＡはｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９に対する２つの認識部位をコードしていたので、プラスミドは細胞内で切断されて二本鎖修復フラグメントを形成したと思われた。修復ＤＮＡ配列の挿入は、トランスフェクションの７２時間後にＸｈｏＩ消化によって確認された（図８）。ｓｇＲＮＡの非存在下では、修復配列の挿入を示す特異的ＸｈｏＩ消化は観察されなかった。ＡｃｒＩＩＡ４とＣａｓ９を共発現した場合、ＸｈｏＩ消化バンドは観察されなかった。これは、ｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９切断が完全に抑制されたことを意味する。Ｃａｓ９単独の存在下では、ＸｈｏＩ消化バンドが観察され、精密編集の効率は１．６％であると概算された。ＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１およびＣａｓ９の共発現の場合、効率は２．０％に増加した。これらの結果は、Ｃａｓ９の細胞周期依存的な活性化により、相同組換え修復効率が増加したことを示した。【００９０】
相同組換え修復と非相同末端結合の効率の割合を評価するために、非相同末端結合を介した標的突然変異誘発をＴ７Ｅ１アッセイで評価した（図９）。標的突然変異誘発率は、Ｃａｓ９単独およびＣａｓ９とＡｃｒＩＩＡ４−ＣｄｔＩとの共発現について、それぞれ１．５％および０．８％であると概算された。ＡｃｒＩＩＡ４とＣａｓ９との共発現により、非相同末端結合による突然変異誘発は完全に抑制された。Ｃａｓ９単独を使用した場合と比較して、ＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１とＣａｓ９との組み合わせについての相同組換え修復効率の増加値および非相同末端結合による突然変異誘発の減少値から、Ｃａｓ９の細胞周期活性化による精密ゲノム編集が２９３細胞を使用して達成されたことがわかる。【００９１】
ゲノム編集の精密度に関して、オフターゲット効果の減少は、特に臨床的使用または動植物の飼育・栽培にとって別の重要な問題である。オフターゲット効果を減らすために、いくつかの方法が開発され報告されている。これらには、ｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体およびｓｇＲＮＡの短縮シード配列の直接送達が含まれる。このような結果は、細胞内におけるＣａｓ９活性の制限の重要性を示すものであった。さらに、標的に類似したオフターゲット部位での切断に加えて、非相同末端結合による不確実な修復プロセスは変異配列の修復つながることから、別の鍵となり得る。非相同末端結合が支配的な細胞周期におけるＣａｓ９活性の抑制は、オフターゲット効果を抑制できると我々は仮定した。ＡＡＶＳ１標的部位を使用して、Ｔ７Ｅ１アッセイにより、オフターゲット効果にも対処した（図１０）。オフターゲット候補として、ＡＡＶＳ１標的配列と比較して２塩基変異を有するＭＹＢＰＣ２遺伝子を選択した。この部位では、Ｃａｓ９単独での発現は８．３％のオフターゲット率を示した。驚くべきことに、Ｔ７Ｅ１消化によるオフターゲット突然変異を示すバンドは、ＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１とＣａｓ９との共発現では観察されなかった。さらに、ＡｃｒＩＩＡ４とＣａｓ９との共発現は、オンターゲットおよびオフターゲットの変異を示さなかった。【００９２】
（４）ｓｓＯＤＮを用いた相同組換え修復による精密ゲノム編集
細胞周期依存的Ｃａｓ９活性化における、相同組換え修復効率向上のためのｓｓＯＤＮの使用について検証した。細胞を、Ｃａｓ９、ＡｃｒＩＩＡ４−２Ａ−Ｃａｓ９、またはＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１−２Ａ−Ｃａｓ９をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトした。ハイグロマイシンによる選択の後、ｓｇＲＮＡコードプラスミドおよびｓｓＯＤＮ鋳型ＤＮＡのさらなるトランスフェクションをエレクトロポレーションによって行った。２回目のトランスフェクションの７２時間後に、非相同末端結合を介したオンターゲットおよびオフターゲット突然変異や相同組換え修復を介した精密編集をＨｉｎｄＩＩＩまたはＴ７Ｅ１消化によって分析した。ＡＡＶＳ１、ＥＭＸ１、およびＶＥＧＦＡという３種の遺伝子について３箇所のｓｇＲＮＡ標的部位を調べた。ＡＡＶＳ１については、Ｃａｓ９単独発現と比較してＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１をＣａｓ９と共に発現した場合、精密編集効率は約１．４倍増加した。これらの結果は、プラスミドＤＮＡ鋳型を使用した前述の実験の結果と同様であったが、その効率の値はそれぞれ１０．８％と７．８％に増加した（図１１）。同様に、非相同末端結合を介した標的配列での突然変異誘発の効率も、Ｃａｓ９単独、ならびにＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１およびＣａｓ９の共発現について、それぞれ３６．６％および２７．１％に増加した。ＡｃｒＩＩＡ４は標的突然変異誘発をほぼ完全に抑制し、０．６％までにした。ＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１およびＣａｓ９の共発現は標的突然変異を７４％抑制した。Ｃａｓ９を単独で発現した場合、ＭＹＢＰＣ２遺伝子でのオフターゲット突然変異誘発は３．４％であったが、ＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１を使用した場合は、０．６％に効率的に減少した。【００９３】
ＥＭＸ１遺伝子またはＶＥＧＦＡ遺伝子を標的とする別のｓｇＲＮＡを使用して、他の標的部位でも結果が同様となるかどうかを確かめた（図１２、１３）。その結果、ＡＡＶＳ１遺伝子の場合と同様に、標的の正確な編集は、ＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１をＣａｓ９と共に発現した場合、Ｃａｓ９のみを発現した場合と比較して顕著に増加する一方、オフターゲット部位における突然変異率は顕著に減少した。【００９４】
（５）短縮型ｓｇＲＮＡと組み合わせることによるオフターゲット効果の減少
オフターゲット突然変異を減少するために、短縮型ｓｇＲＮＡをＡｃｒＩＩＡ４−Ｃｄｔ１に適用した。ＥＭＸ１遺伝子およびＶＥＧＦＡ遺伝子を標的とする２つの新しい短縮型ｓｇＲＮＡを構築し、オフターゲット突然変異の減少の効果をＴ７Ｅ１アッセイを用いて評価した。ＥＭＸ１遺伝子およびＶＥＧＦＡ遺伝子のいずれを標的とした場合でも、短縮型ｓｇＲＮＡを使用すると、オフターゲット突然変異が顕著に減少する一方、標的の正確な編集の効率の低下もなかった（図１４、１５）。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
以上説明したように、本発明によれば、細胞周期依存的にＣａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性を調節することが可能となる。また、本発明において、ドナーＤＮＡとともにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを利用すれば、相同組換え修復による正確なゲノム編集の効率を高めるとともに、非相同末端結合によるオフターゲット効果を抑制することができる。本発明は、再生医療などの医療分野、有用形質を有する作物の作成などの農業分野、微生物を利用した有用物質の生産などの工業分野、実験動物の作成などの研究分野を含む、ゲノム編集技術が利用可能な幅広い分野に貢献しうる。
【配列表フリーテキスト】
【００９６】
配列番号７：融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号８：融合タンパク質をコードする塩基配列
配列番号９：融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０：融合タンパク質をコードする塩基配列
配列番号１１〜５３：プライマー
【図１】
2020059708.tif 000005
【図２】
2020059708.tif 000006
【図３】
2020059708.tif 000007
【図４】
2020059708.tif 000008
【図５】
2020059708.tif 000009
【図６】
2020059708.tif 000010
【図７】
2020059708.tif 000011
【図８】
2020059708.tif 000012
【図９】
2020059708.tif 000013
【図１０】
2020059708.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
2020059708.tif 000016
【図１３】
2020059708.tif 000017
【図１４】
2020059708.tif 000018
【図１５】
2020059708.tif 000019
【配列表】
2020059708000001.app
【国際調査報告】
2020059708.tif 000020
2020059708.tif 000021
2020059708.tif 000022
2020059708.tif 000023