(57)【要約】  本発明は優れたｐＨ応答性、温度応答性を兼ね備えた刺激応答性ポリマーを提供することを目的とする。本発明の刺激応答性ポリマーは、側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格を有し、前記側鎖に下記一般式（１）で表される構造を有する。式（１）において、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に、アルキル基であり、Ｒ3はアルキレン基であり、波線は他の原子との結合部位を示す。2019172362.tif 000013
2019172362.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格を有し、
前記側鎖に下記一般式（１）で表される構造を有する刺激応答性ポリマー。
【化１】
2019172362.tif 000012
式（１）において、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に、アルキル基であり、Ｒ3はアルキレン基であり、波線は他の原子との結合部位を示す。
【請求項２】
前記Ｒ1およびＲ2がそれぞれ独立に、炭素数１〜８のアルキル基である、請求項１に記載の刺激応答性ポリマー。
【請求項３】
前記Ｒ1およびＲ2のアルキル基の炭素数の合計が、５〜１２である、請求項１または２に記載の刺激応答性ポリマー。
【請求項４】
側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格が有する、側鎖変性アスパラギン酸の繰返し単位数が１０〜５００である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の刺激応答性ポリマー。
【請求項５】
側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格が有する、側鎖変性アスパラギン酸の繰返し単位数が２０〜３００である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の刺激応答性ポリマー。
【請求項６】
マクロ開始剤由来の骨格を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の刺激応答性ポリマー。
【請求項７】
ポリエチレングリコール骨格を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の刺激応答性ポリマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は刺激応答性ポリマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
刺激応答性ポリマーは、「環境応答性ポリマー」、「スマートポリマー」とも呼ばれる。刺激応答性ポリマーは、外部刺激（例えば、温度、ｐＨ、イオン強度、磁場、光等）によって引き起こされる環境の変化により、そのミクロ構造が変化し、結果的に巨視的変化が起こるポリマーであり、一般に前記変化は可逆的な変化である。【０００３】
刺激応答性ポリマーのｐＨや温度によって、性質が変わる特性を利用し、薬物送達、バイオセンサ等の、化学的、生物学的応用が期待されている。
例えば、温度に応答し、膨潤収縮を繰り返すアクリルアミド誘導体類のポリマーが提案されている（例えば特許文献１参照）。【０００４】
別の例としては、非特許文献１、２には、下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）を示す、温度応答性のポリアミノ酸が提案されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平８−１０３６５３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Y Tachibana, M Kurisawa et al,  Chemical Communications, 2003,0, 106-107
【非特許文献２】Y Tachibana, M Kurisawa et al,  Biomacromolecules, 2003, 4 (5), pp 1132-1134
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来から刺激応答性ポリマーは、多数提案されているが、刺激応答性ポリマーの特性を生かしつつ、体内で使用するためには、刺激応答性が発現する温度やｐＨが、体内環境と一致することが求められる。また、非特許文献１、２に開示されたポリアミノ酸は、ｐＨ応答性については開示されず、検討されていなかった。【０００８】
例えば、薬剤は室温では安定を保つ機能が求められるが、体温付近では薬理活性を発揮する機能が求められる。また、がんの治療に用いられる薬剤は、約ｐＨ６．５のがん細胞では効果を発揮し、中性付近の正常細胞では副作用を抑えるために作用を発揮しないことが求められている。しかしながら、このような特性を有する刺激応答性ポリマーは知られていなかった。【０００９】
従来知られている温度応答性ポリマーは、少ないｐＨ変化では温度応答性の変化が小さく、従来知られているｐＨ応答性ポリマーでは、少ないｐＨ変化によって、応答性のｏｎ−ｏｆｆを明確に行うことが難しかった。【００１０】
本発明では、僅かなｐＨの変化で応答性が変わり、各ｐＨにおいて優れた温度応答性を示す、すなわち優れたｐＨ応答性、温度応答性を兼ね備えた刺激応答性ポリマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、側鎖に特定の構造を導入した側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格を有するポリマーは、好適な刺激応答性を示すことを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明の刺激応答性ポリマーは、以下の［１］〜［７］に関する。【００１２】
［１］  側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格を有し、
前記側鎖に下記一般式（１）で表される構造を有する刺激応答性ポリマー。【００１３】
【化１】
2019172362.tif 000003
式（１）において、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に、アルキル基であり、Ｒ3はアルキレン基であり、波線は他の原子との結合部位を示す。
［２］  前記Ｒ1およびＲ2がそれぞれ独立に、炭素数１〜８のアルキル基である、［１］に記載の刺激応答性ポリマー。
［３］  前記Ｒ1およびＲ2のアルキル基の炭素数の合計が、５〜１２である、［１］または［２］に記載の刺激応答性ポリマー。
［４］  側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格が有する、側鎖変性アスパラギン酸の繰返し単位数が１０〜５００である、［１］〜［３］のいずれかに記載の刺激応答性ポリマー。
［５］  側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格が有する、側鎖変性アスパラギン酸の繰返し単位数が２０〜３００である、［１］〜［３］のいずれかに記載の刺激応答性ポリマー。
［６］  マクロ開始剤由来の骨格を有する、［１］〜［５］のいずれかに記載の刺激応答性ポリマー。
［７］  ポリエチレングリコール骨格を有する、［１］〜［６］のいずれかに記載の刺激応答性ポリマー。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の刺激応答性ポリマーは、ｐＨ応答性、温度応答性を兼ね備えている。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例１で得られたＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）の温度およびｐＨと、散乱光強度（ＳＬＩ）との関係を示す図である。
【図２】図２は、実施例２で得られたＰＡｓｐ（ＤｎＢｐｒｏ）の温度およびｐＨと、散乱光強度との関係を示す図である。
【図３】図３は、実施例３で得られたＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）の温度およびｐＨと、散乱光強度との関係を示す図である。
【図４】図４は、実施例４で得られたＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）の温度およびｐＨと、散乱光強度との関係を示す図である。
【図５】図５は、実施例５で得られたＰＡｓｐ（ＤｉＰｅｎ）の温度およびｐＨと、散乱光強度（ＳＬＩ）との関係を示す図である。
【図６】図６は、実施例８で得られた平均重合度８０のＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）および、実施例９で得られた平均重合度２５０のＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）の温度およびｐＨと、散乱光強度（ＳＬＩ）との関係を示す図である。
【図７】図７は、実施例６で合成したＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）および、実施例７で合成したＰＡｓｐ（ＤｎＢｐｒｏ）について、示差走査熱量計による熱反応分析−１を行った結果を示す図である。
【図８】図８は、実施例６で合成したＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）について、示差走査熱量計による熱反応分析−２を行った際の１回目の昇温の結果を示す図（左図）および示差走査熱量計による熱反応分析−１を行った際の１回目の昇温の結果を示す図（右図）である。
【図９】図９は、実施例６で合成したＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）および、実施例７で合成したＰＡｓｐ（ＤｎＢｐｒｏ）について、中和滴定による濁度測定を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
次に本発明について具体的に説明する。
本発明の刺激応答性ポリマーは、側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格を有し、前記側鎖に下記一般式（１）で表される構造を有する。本発明の刺激応答性ポリマーは、特定の構造を有する側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格を有しているため、ｐＨ応答性、温度応答性を兼ね備えている。なお、刺激応答性としてｐＨ応答性のみを有するポリマー、温度応答性のみを有するポリマーは、従来から知られていたが、重合体の側鎖に特定の構造を有するｐＨ応答性および温度応答性を兼ね備えたポリマーは報告されておらず、ｐＨ応答性および温度応答性を兼ね備える本発明の刺激応答性ポリマーは様々な用途への使用が可能である。また、本発明の刺激応答性ポリマーは、特定の構造を有する側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格によって刺激応答性を発現し、該骨格は、ポリアミノ酸骨格であるため、生分解性にも優れる。
【００１７】
【化２】
2019172362.tif 000004
式（１）において、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に、アルキル基であり、Ｒ3はアルキレン基であり、波線は他の原子との結合部位を示す。
【００１８】
本発明の刺激応答性ポリマーは、特定の側鎖を有する側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格を有する。このため、本発明の刺激応答性ポリマーは、ｐＨに応じて異なった下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）を示す。本発明の刺激応答性ポリマーは、体内の温度、ｐＨに近い範囲で刺激応答性を示すため、がんの治療薬用のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）等の各種生体用途への使用が可能である。また、本発明の刺激応答性ポリマーは、生分解性を有しているため、生体材料や製剤材料に好適に使用することができる。また、ｐＨ応答性、温度応答性を兼ね備えているため、農林水産業用資材、土木・建築資材、フィルム・シート、衛生用品等、各種用途への使用が可能である。
【００１９】
（側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格）
本発明の刺激応答性ポリマーが有する側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格は、側鎖変性アスパラギン酸を構成単位とする骨格であり、以下の式（Ａ）および（Ｂ）で表される構成単位の少なくとも一方を有しており、通常は両方を有している。
【００２０】
前記刺激応答性ポリマーは、側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格を有しており、該骨格は、ポリアミノ酸骨格である。このため、前記刺激応答性ポリマーは生体適合性と、生分解性を有しており、医薬材料等の生体用途に安全に使用できることが期待できる。
【００２１】
【化３】
2019172362.tif 000005
式（Ａ）および（Ｂ）において、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ式（１）におけるＲ1、Ｒ2およびＲ3と同義である。
側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格が有する、（Ａ）で表される構成単位と、（Ｂ）で表される構成単位との割合としては特に限定は無いが（Ａ）：（Ｂ）が、通常は１：０．５〜１：１０である。
【００２２】
側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格が有する側鎖変性アスパラギン酸の繰返し単位数（平均重合度）は、通常は１０〜５００であり、好ましい一例としては、１０〜３００である。側鎖変性アスパラギン酸の繰返し単位数の下限としては、より好ましくは２０であり、さらに好ましくは４０であり、特に好ましくは５０であり、最も好ましくは６０である。側鎖変性アスパラギン酸の繰返し単位数の上限としては、より好ましくは４００であり、さらに好ましくは３００であり、特に好ましくは２５０である。側鎖変性アスパラギン酸の繰返し単位数の範囲としては、前記上限と下限とを、任意に組み合わせて設定することが可能である。側鎖変性アスパラギン酸の繰返し単位数の好適な範囲の例としては、２０〜３００、４０〜２５０が挙げられる。前記範囲内では刺激応答能が安定して得られるため好ましい。側鎖変性アスパラギン酸の繰返し単位数は、刺激応答性ポリマーの用途に応じて、適宜設定すればよい。
【００２３】
（一般式（１）で表される構造）
前記側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格は、側鎖に下記一般式（１）で表される構造を有する。
【００２４】
【化４】
2019172362.tif 000006
式（１）において、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に、アルキル基であり、Ｒ3はアルキレン基であり、波線は他の原子との結合部位を示す。
【００２５】
本発明の刺激応答性ポリマーは、上記構造を有することにより、ｐＨ応答性、温度応答性を兼ね備えている。
Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に、通常は炭素数１〜１２のアルキル基であり、好ましくは炭素数１〜８のアルキル基であり、より好ましくは２〜６のアルキル基であり、さらに好ましくは炭素数３または４のアルキル基であり、特に好ましくは炭素数４のアルキル基である。アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基などが挙げられる。Ｒ1およびＲ2は、直鎖アルキル基でも、分岐を有するアルキル基であってもよい。
また、Ｒ1およびＲ2のアルキル基の炭素数を合計すると、５〜１２であることが好ましく、６〜８であることよりが好ましい。
【００２６】
Ｒ3は、好ましくは炭素数２または３のアルキレン基である。Ｒ3は、直鎖アルキレン基でも、分岐を有するアルキレン基であってもよいが、直鎖アルキレン基であることが好ましい。
【００２７】
（刺激応答性ポリマーおよびその製造方法）
本発明の刺激応答性ポリマーは、前述の側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格を有し、側鎖に前述の一般式（１）で表される構造を有する。
【００２８】
刺激応答性ポリマーは、前記側鎖変性アスパラギン酸の単独重合体でもよく、側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格と、他の重合体からなる骨格とを有する共重合体、すなわちブロック共重合体であってもよい。本発明の刺激応答性ポリマーがブロック共重合体であると、側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格に由来する、ｐＨ応答性、温度応答性を有し、かつ、他の重合体からなる骨格に由来する性質を有する刺激応答性ポリマーを得ることが可能であり、産業上の利用範囲が広い。
【００２９】
前記他の重合体としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリアミノ酸、側鎖変性ポリアミノ酸（但し、前述の側鎖変性ポリアスパラギン酸を除く）、ポリグリセリン、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。他の重合体としては、生体適合性を有する重合体が好ましく、具体的にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリアミノ酸、側鎖変性ポリアミノ酸（但し、前述の側鎖変性ポリアスパラギン酸を除く）が好ましい。中でも各種用途への使用が可能なポリエチレングリコールがより好ましい。すなわち、刺激応答性ポリマーが有する他の重合体からなる骨格としては、ポリエチレングリコール骨格が好ましい。
【００３０】
他の重合体部分の分子量としては特に限定は無いが、他の重合体部分の、単量体の繰返し単位数としては、通常は２０〜５００００であり、好ましくは４０〜２０００である。
前記他の重合体の種類や他の重合体の繰返し単位数は、刺激応答性ポリマーの用途に応じて、適宜設定することができる。
【００３１】
刺激応答性ポリマーの製造方法としては、特に限定は無いが、例えば以下の方法が挙げられる。有機溶媒中で、βベンジル−Ｌ−アスパラギン酸−Ｎ−カルボキシ無水物（β-benzyl-L-asparatate N-carboxy anhydride）（ＢＬＡ−ＮＣＡ）を、重合開始剤を用いて重合し、所望の重合度（所望のベンジル保護アスパラギン酸の繰返し単位数）のベンジル保護ポリアスパラギン酸を得る。次いで、ベンジル保護ポリアスパラギン酸のベンジル基を、Ｎ，Ｎ−ジブチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジブチル−１，３−プロパンジアミン等のアミンを用いて、置換することにより、側鎖に一般式（１）で表される構造を有する、側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格を有する刺激応答性ポリマーを得ることができる。
【００３２】
なお、刺激応答性ポリマーがブロック共重合体である場合には、例えば、開始剤として、マクロ開始剤を用いることにより、側鎖変性ポリアスパラギン酸骨格と、他の重合体からなる骨格とを有するブロック共重合体を得ることができる。マクロ開始剤としては、アミン末端をもつポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等が挙げられる。
【実施例】
【００３３】
次に本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
〔実施例１〕
（ベンジル保護ポリアスパラギン酸の合成）
βベンジル−Ｌ−アスパラギン酸−Ｎ−カルボキシ無水物（β-benzyl-L-asparatate N-carboxy anhydride）（ＢＬＡ−ＮＣＡ）（１．５ｇ、６．０ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３．０ｍＬ）に溶解させ、塩化メチレン（２７．０ｍＬ）を加えた。【００３４】
そこに、ＤＭＦで２０倍に希釈したブチルアミン（９０μＬ、５０μｍｏｌ）を加え、３５℃で３日間撹拌を行い、重合反応を進行させ反応液を得た。
上記のプロセスは全てアルゴン雰囲気下で行った。【００３５】
ＤＭＦと塩化メチレンは、脱水したものを関東化学より購入し、ニッコーハンセン社のＵｌｔｉｍａｔｅ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍで精製したものを用いた。ブチルアミンはＷａｋｏ社より購入し、アルゴン雰囲気下で蒸留したものを用いた。【００３６】
重合反応後、反応液を体積比が３／２のヘキサン／酢酸エチル混合溶媒（５００ｍＬ）に滴下し、沈殿物をフィルター濾過で回収することにより、ベンジル保護ポリアスパラギン酸（ＰＢＬＡ）を得た。【００３７】
ヘキサンと酢酸エチルは、国産化学社より購入したものをそのまま用いた。
得られたＰＢＬＡは、1Ｈ−ＮＭＲ（ＥＳＣ４００、ＪＥＯＬ）による解析から、平均重合度は１０６とわかった。【００３８】
（ポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギン［ＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）］の合成）
ＰＢＬＡ（３０ｍｇ、ベンジル保護アスパラギン酸単位のモル数が０．１５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３．０ｍＬ）に溶解し、ベンゼン（６．０ｍＬ）を加え、凍結乾燥した。【００３９】
これをアルゴン雰囲気下でＤＭＦ（２．０ｍＬ）に懸濁し、３０分間撹拌したのち、Ｎ，Ｎ−ジブチルエチレンジアミン（２．９ｍｍｏｌ）を加え、４０℃にて４時間撹拌し、反応液を得た。室温まで放冷したのち、反応液を氷冷した１０％酢酸水溶液（３．０ｍＬ）にゆっくり滴下し、反応液の中和を行った。【００４０】
中和した反応液は、透析膜（分子区画３．５ｋＤａ）を用いて０．０１Ｍ塩酸に対して３回、純水に対して４回透析を行い、凍結乾燥により、ポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギン［ＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）］を得た。得られたポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギンは、1Ｈ−ＮＭＲ（ＥＳＣ４００、ＪＥＯＬ）により、アミノ酸側鎖の１００％にジブチルアミノ基が導入されていることがわかった。【００４１】
塩化メチレンは国産化学社より購入したものをそのまま用いた。ベンゼンは、Ｗａｋｏ社より購入したものをそのまま用いた。ＤＭＦは、脱水のものを関東化学より購入し、ニッコーハンセン社のＵｌｔｉｍａｔｅ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍで精製したものを用いた。Ｎ，Ｎ−ジブチルエチレンジアミンはＴＣＩ社より購入したものを、アルゴン雰囲気下で蒸留精製したものを用いた。１０％酢酸水溶液は、Ｗａｋｏ社より購入した酢酸を希釈して用いた。０．０１Ｍ塩酸は、犬印社より購入した塩酸を希釈して用いた。【００４２】
得られたＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）の構造式を、下記式（Ｉ）に示す。式（Ｉ）において、ｎは平均重合度である１０６を示す。【００４３】
【化５】
2019172362.tif 000007
〔実施例２〕
（ポリジブチルアミノプロピルアミドアスパラギン［ＰＡｓｐ（ＤｎＢｐｒｏ）］の合成）
Ｎ，Ｎ−ジブチルエチレンジアミンを、Ｎ，Ｎ−ジブチル−１，３−プロパンジアミンに変更した以外は、実施例１と同様に行い、ポリジブチルアミノプロピルアミドアスパラギン［ＰＡｓｐ（ＤｎＢｐｒｏ）］を得た。得られたポリジブチルアミノプロピルアミドアスパラギンは、1Ｈ−ＮＭＲ（ＥＳＣ４００、ＪＥＯＬ）により、アミノ酸側鎖の１００％にジブチルアミノ基が導入されていることがわかった。【００４４】
Ｎ，Ｎ−ジブチル−１，３−プロパンジアミンはＴＣＩ社より購入したものを、アルゴン雰囲気下で蒸留精製したものを用いた。
得られたＰＡｓｐ（ＤｎＢｐｒｏ）の構造式を、下記式（ＩＩ）に示す。式（ＩＩ）において、ｎは平均重合度である１０６を示す。【００４５】
【化６】
2019172362.tif 000008
【００４６】
〔実施例３〕
（ＰＥＧ−ベンジル保護ポリアスパラギン酸の合成）
アミン末端をもつポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（６００ｍｇ、５０μｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解し、３０分撹拌した。そこに、ＢＬＡ−ＮＣＡ（１．５ｇ、６．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３．０ｍＬ）に溶解させ、塩化メチレン（１７．０ｍＬ）を加えることにより得た、ＢＬＡ−ＮＣＡ溶液を加えた。【００４７】
ＢＬＡ−ＮＣＡ溶液を加えた後、３５℃で３日間撹拌を行い、重合反応を進行させ反応液を得た。
上記のプロセスは全てアルゴン雰囲気下で行った。【００４８】
ＤＭＦと塩化メチレンは、脱水のものを関東化学より購入し、ニッコーハンセン社のＵｌｔｉｍａｔｅ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍで精製したものを用いた。アミン末端をもつＰＥＧは、日油株式会社より購入し、イオン交換カラムにより精製したものを用いた。アミン末端をもつＰＥＧの平均重合度は２７３であった。【００４９】
重合反応後、反応液を体積比が３／２のヘキサン／酢酸エチル混合溶媒（５００ｍＬ）に滴下し、沈殿物をフィルター濾過で回収することにより、ＰＥＧ−ベンジル保護ポリアスパラギン酸を得た。【００５０】
なお、ＰＥＧ−ベンジル保護ポリアスパラギン酸とは、ポリエチレングリコールからなる部位と、ベンジル保護ポリアスパラギン酸からなる部位とを有するブロック共重合体である。
ヘキサンと酢酸エチルは、国産化学社より購入したものをそのまま用いた。【００５１】
（ＰＥＧ−ポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギン［ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）］の合成）
ＰＥＧ−ベンジル保護ポリアスパラギン酸（３０ｍｇ、ベンジル保護アスパラギン酸単位のモル数が９０μｍｏｌ）を塩化メチレン（３．０ｍＬ）に溶解し、ベンゼン（６．０ｍＬ）を加え、凍結乾燥した。これをアルゴン雰囲気下でＤＭＦ（２．０ｍＬ）に懸濁し、３０分間撹拌したのち、Ｎ，Ｎ−ジブチルエチレンジアミン（１．８ｍｍｏｌ）を加え、４０℃にて４時間撹拌した。室温まで放冷したのち、反応液を氷冷した１０％酢酸水溶液（３．０ｍＬ）にゆっくり滴下し、反応液の中和を行った。【００５２】
中和した反応液は、透析膜（分子区画６−８ｋＤａ）を用いて０．０１Ｍ塩酸に対して３回、純水に対して４回透析を行い、凍結乾燥により、ＰＥＧ−ポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギン［ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）］を得た。得られたＰＥＧ−ポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギンのポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギン部分は、1Ｈ−ＮＭＲ（ＥＳＣ４００、ＪＥＯＬ）により、アミノ酸側鎖の１００％にジブチルアミノ基が導入されており、ポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギン部分の平均重合度が６５であることがわかった。【００５３】
塩化メチレンは国産化学社より購入したものをそのまま用いた。ベンゼンは、Ｗａｋｏ社より購入したものをそのまま用いた。ＤＭＦは、脱水のものを関東化学より購入し、ニッコーハンセン社のＵｌｔｉｍａｔｅ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍで精製したものを用いた。Ｎ，Ｎ−ジブチルエチレンジアミンはＴＣＩ社より購入したものを、アルゴン雰囲気下で蒸留精製したものを用いた。１０％酢酸水溶液は、Ｗａｋｏ社より購入した酢酸を希釈して用いた。０．０１Ｍ塩酸は、犬印社より購入した塩酸を希釈して用いた。【００５４】
なお、ＰＥＧ−ポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギンとは、ポリエチレングリコールからなる部位と、ポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギンからなる部位とを有するブロック共重合体である。【００５５】
得られたＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）の構造式を、下記式（ＩＩＩ）に示す。式（ＩＩＩ）において、ｍはＰＥＧ部分の平均重合度である２７３を示し、ｎはポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギン部分の平均重合度である６５を示す。【００５６】
【化７】
2019172362.tif 000009
【００５７】
〔実施例４〕
（ＰＥＧ−ベンジル保護ポリアスパラギン酸の合成）
アミン末端をもつポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（２３０ｍｇ、２０μｍｏｌ）を塩化メチレン（７．０ｍＬ）に溶解し、３０分撹拌した。そこに、ＢＬＡ−ＮＣＡ（０．３０ｇ、１．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．０ｍＬ）に溶解させた、ＢＬＡ−ＮＣＡ溶液を加えた。【００５８】
ＢＬＡ−ＮＣＡ溶液を加えた後、３５℃で３日間撹拌を行い、重合反応を進行させ反応液を得た。
上記のプロセスは全てアルゴン雰囲気下で行った。【００５９】
ＤＭＦと塩化メチレンは、脱水のものを関東化学より購入し、ニッコーハンセン社のＵｌｔｉｍａｔｅ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍで精製したものを用いた。アミン末端をもつＰＥＧは、日油株式会社より購入し、イオン交換カラムにより精製したものを用いた。アミン末端をもつＰＥＧの平均重合度は２７３であった。【００６０】
重合反応後、反応液を体積比が３／２のヘキサン／酢酸エチル混合溶媒（５００ｍＬ）に滴下し、沈殿物をフィルター濾過で回収することにより、ＰＥＧ−ベンジル保護ポリアスパラギン酸を得た。【００６１】
なお、ＰＥＧ−ベンジル保護ポリアスパラギン酸とは、ポリエチレングリコールからなる部位と、ベンジル保護ポリアスパラギン酸からなる部位とを有するブロック共重合体である。
ヘキサンと酢酸エチルは、国産化学社より購入したものをそのまま用いた。【００６２】
（ＰＥＧ−ポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギン［ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）］の合成）
ＰＥＧ−ベンジル保護ポリアスパラギン酸（３０ｍｇ、ベンジル保護アスパラギン酸単位のモル数が５９μｍｏｌ）を塩化メチレン（３．０ｍＬ）に溶解し、ベンゼン（６．０ｍＬ）を加え、凍結乾燥した。これをアルゴン雰囲気下でＤＭＦ（２．０ｍＬ）に懸濁し、３０分間撹拌したのち、Ｎ，Ｎ−ジブチルエチレンジアミン（１．２ｍｍｏｌ）を加え、４０℃にて４時間撹拌した。室温まで放冷したのち、反応液を氷冷した１０％酢酸水溶液（３．０ｍＬ）にゆっくり滴下し、反応液の中和を行った。【００６３】
中和した反応液は、透析膜（分子区画６−８ｋＤａ）を用いて０．０１Ｍ塩酸に対して３回、純水に対して４回透析を行い、凍結乾燥により、ＰＥＧ−ポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギン［ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）］を得た。得られたＰＥＧ−ポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギンのポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギン部分は、1Ｈ−ＮＭＲ（ＥＳＣ４００、ＪＥＯＬ）により、アミノ酸側鎖の１００％にジブチルアミノ基が導入されており、ポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギン部分の平均重合度が２１であることがわかった。【００６４】
塩化メチレンは国産化学社より購入したものをそのまま用いた。ベンゼンは、Ｗａｋｏ社より購入したものをそのまま用いた。ＤＭＦは、脱水のものを関東化学より購入し、ニッコーハンセン社のＵｌｔｉｍａｔｅ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍで精製したものを用いた。Ｎ，Ｎ−ジブチルエチレンジアミンはＴＣＩ社より購入したものを、アルゴン雰囲気下で蒸留精製したものを用いた。１０％酢酸水溶液は、Ｗａｋｏ社より購入した酢酸を希釈して用いた。０．０１Ｍ塩酸は、犬印社より購入した塩酸を希釈して用いた。【００６５】
なお、ＰＥＧ−ポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギンとは、ポリエチレングリコールからなる部位と、ポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギンからなる部位とを有するブロック共重合体である。【００６６】
得られたＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）の構造式を、下記式（ＩＶ）に示す。式（ＩＶ）において、ｍはＰＥＧ部分の平均重合度である２７３を示し、ｎはポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギン部分の平均重合度である２１を示す。【００６７】
【化８】
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【００６８】
〔散乱光強度の定量〕
実施例１〜４で合成した重合体をそれぞれ、Ｄ−ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）に２ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、４℃で一晩静置し、溶液を得た。【００６９】
溶液をＤ−ＰＢＳで２倍に希釈する際に、０．５Ｍ塩酸または０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いて、最終的に濃度が１ｍｇ／ｍＬでかつ、ｐＨが６．５、７．４、８．１、８．６となるように調整した。調整した溶液は４℃にて２時間以上静置した。【００７０】
Ｄ−ＰＢＳはＷａｋｏ社より購入したものをそのまま用いた。０．５Ｍ塩酸と０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液は、Ｗａｋｏ社より購入した５Ｍ塩酸または５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液をそれぞれ１０倍希釈したものを用いた。【００７１】
調整した溶液（３０μＬ）をクオーツキュベットに入れ、１０℃から６０℃の間の５℃刻みで散乱光強度をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ  （Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて測定した。
結果を図１〜４に示す。【００７２】
〔実施例５〕
（ベンジル保護ポリアスパラギン酸の合成）
βベンジル−Ｌ−アスパラギン酸−Ｎ−カルボキシ無水物（β-benzyl-L-asparatate N-carboxy anhydride）（ＢＬＡ−ＮＣＡ）（１．５ｇ、６．０ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３．０ｍＬ）に溶解させ、塩化メチレン（２７．０ｍＬ）を加えた。【００７３】
そこに、ＤＭＦで２０倍に希釈したブチルアミン（９０μＬ、５０μｍｏｌ）を加え、３５℃で３日間撹拌を行い、重合反応を進行させ反応液を得た。
上記のプロセスは全てアルゴン雰囲気下で行った。【００７４】
ＤＭＦと塩化メチレンは、脱水したものを関東化学より購入し、ニッコーハンセン社のＵｌｔｉｍａｔｅ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍで精製したものを用いた。ブチルアミンはＷａｋｏ社より購入し、アルゴン雰囲気下で蒸留したものを用いた。【００７５】
重合反応後、反応液を体積比が３／２のヘキサン／酢酸エチル混合溶媒（５００ｍＬ）に滴下し、沈殿物をフィルター濾過で回収することにより、ベンジル保護ポリアスパラギン酸（ＰＢＬＡ）を得た。【００７６】
ヘキサンと酢酸エチルは、国産化学社より購入したものをそのまま用いた。
得られたＰＢＬＡは、1Ｈ−ＮＭＲ（ＥＳＣ４００、ＪＥＯＬ）による解析から、平均重合度は１５６とわかった。【００７７】
（ポリジイソプロピルアミノエチルアミドアスパラギン［ＰＡｓｐ（ＤｉＰｅｎ）］の合成）
ＰＢＬＡ（３０ｍｇ、ベンジル保護アスパラギン酸単位のモル数が０．１５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３．０ｍＬ）に溶解し、ベンゼン（６．０ｍＬ）を加え、凍結乾燥した。【００７８】
これをアルゴン雰囲気下でＤＭＦ（２．０ｍＬ）に懸濁し、３０分間撹拌したのち、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンジアミン（２．９ｍｍｏｌ）を加え、４０℃にて４時間撹拌し、反応液を得た。室温まで放冷したのち、反応液を氷冷した１０％酢酸水溶液（３．０ｍＬ）にゆっくり滴下し、反応液の中和を行った。【００７９】
中和した反応液は、透析膜（分子区画３．５ｋＤａ）を用いて０．０１Ｍ塩酸に対して３回、純水に対して４回透析を行い、凍結乾燥により、ポリジイソプロピルアミノエチルアミドアスパラギン［ＰＡｓｐ（ＤｉＰｅｎ）］を得た。得られたポリジイソプロピルアミノエチルアミドアスパラギンは、1Ｈ−ＮＭＲ（ＥＳＣ４００、ＪＥＯＬ）により、アミノ酸側鎖の１００％にジイソプロピルアミノ基が導入されていることがわかった。【００８０】
塩化メチレンは国産化学社より購入したものをそのまま用いた。ベンゼンは、Ｗａｋｏ社より購入したものをそのまま用いた。ＤＭＦは、脱水のものを関東化学より購入し、ニッコーハンセン社のＵｌｔｉｍａｔｅ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍで精製したものを用いた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンジアミンはＴＣＩ社より購入したものを、アルゴン雰囲気下で蒸留精製したものを用いた。１０％酢酸水溶液は、Ｗａｋｏ社より購入した酢酸を希釈して用いた。０．０１Ｍ塩酸は、犬印社より購入した塩酸を希釈して用いた。【００８１】
得られたＰＡｓｐ（ＤｉＰｅｎ）の構造式を、下記式（Ｉ）に示す。式（Ｉ）におい
て、ｎは平均重合度である１５６を示す。【００８２】
【化９】
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【００８３】
〔実施例６〕
（ポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギン［ＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）］の合成）
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンジアミンを、Ｎ，Ｎ−ジブチルエチレンジアミンに変更した以外は、実施例５と同様に行い、ポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギン［ＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）］を得た。得られたポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギンは、1Ｈ−ＮＭＲ（ＥＳＣ４００、ＪＥＯＬ）により、アミノ酸側鎖の１００％にジブチルアミノ基が導入されていることがわかった。【００８４】
Ｎ，Ｎ−ジブチルエチレンジアミンはＴＣＩ社より購入したものを、アルゴン雰囲気下で蒸留精製したものを用いた。
得られたＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）の平均重合度は１５６であった。
〔実施例７〕
（ポリジブチルアミノプロピルアミドアスパラギン［ＰＡｓｐ（ＤｎＢｐｒｏ）］の合成）
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンジアミンを、Ｎ，Ｎ−ジブチル−１，３−プロパンジアミンに変更した以外は、実施例５と同様に行い、ポリジブチルアミノプロピルアミドアスパラギン［ＰＡｓｐ（ＤｎＢｐｒｏ）］を得た。得られたポリジブチルアミノプロピルアミドアスパラギンは、1Ｈ−ＮＭＲ（ＥＳＣ４００、ＪＥＯＬ）により、アミノ酸側鎖の１００％にジブチルアミノ基が導入されていることがわかった。【００８５】
Ｎ，Ｎ−ジブチル−１，３−プロパンジアミンはＴＣＩ社より購入したものを、アルゴン雰囲気下で蒸留精製したものを用いた。
得られたＰＡｓｐ（ＤｎＢｐｒｏ）の平均重合度は１５６であった。
〔実施例８〕
（ベンジル保護ポリアスパラギン酸の合成）
ブチルアミンの量を、９０μＬ、５０μｍｏｌから、１８０μＬ、１００μｍｏｌに変更した以外は実施例５と同様に行い、ベンジル保護ポリアスパラギン酸（ＰＢＬＡ）を得た。
得られたＰＢＬＡは、1Ｈ−ＮＭＲ（ＥＳＣ４００、ＪＥＯＬ）による解析から、平均重合度は８０とわかった。【００８６】
（ポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギン［ＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）］の合成）
平均重合度が１５６のＰＢＬＡを、平均重合度が８０のＰＢＬＡに変更した以外は実施例６と同様に行い、ポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギン［ＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）］を得た。得られたポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギンは、1Ｈ−ＮＭＲ（ＥＳＣ４００、ＪＥＯＬ）により、アミノ酸側鎖の１００％にジブチルアミノ基が導入されていることがわかった。
得られたＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）の平均重合度は８０であった。
〔実施例９〕
（ベンジル保護ポリアスパラギン酸の合成）
ブチルアミンの量を、９０μＬ、５０μｍｏｌから、４５μＬ、２５μｍｏｌに変更した以外は実施例５と同様に行い、ベンジル保護ポリアスパラギン酸（ＰＢＬＡ）を得た。
得られたＰＢＬＡは、1Ｈ−ＮＭＲ（ＥＳＣ４００、ＪＥＯＬ）による解析から、平均重合度は２５０とわかった。【００８７】
（ポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギン［ＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）］の合成）
平均重合度が１５６のＰＢＬＡを、平均重合度が２５０のＰＢＬＡに変更した以外は実施例６と同様に行い、ポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギン［ＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）］を得た。得られたポリジブチルアミノエチルアミドアスパラギンは、1Ｈ−ＮＭＲ（ＥＳＣ４００、ＪＥＯＬ）により、アミノ酸側鎖の１００％にジブチルアミノ基が導入されていることがわかった。
得られたＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）の平均重合度は２５０であった。【００８８】
〔散乱光強度の定量〕
実施例５、８、９で合成した重合体をそれぞれ、Ｄ−ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）に２ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、４℃で一晩静置し、溶液を得た。【００８９】
実施例５で合成した重合体を用いた場合には、溶液をＤ−ＰＢＳで２倍に希釈する際に、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いて、最終的に濃度が１ｍｇ／ｍＬでかつ、ｐＨが７．４、８．４、９．４となるように調整した。
実施例８または９で合成した重合体を用いた場合には、溶液をＤ−ＰＢＳで２倍に希釈する際に、０．５Ｍ塩酸を用いて、最終的に濃度が１ｍｇ／ｍＬでかつ、ｐＨが６．５、７．４となるように調整した。
調整した溶液は４℃にて２時間以上静置した。【００９０】
Ｄ−ＰＢＳはＷａｋｏ社より購入したものをそのまま用いた。０．５Ｍ塩酸と０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液は、Ｗａｋｏ社より購入した５Ｍ塩酸または５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液をそれぞれ１０倍希釈したものを用いた。【００９１】
調整した溶液（３０μＬ）をクオーツキュベットに入れ、実施例５で合成した重合体を用いた場合には１０℃から６５℃、実施例８または９で合成した重合体を用いた場合には１０℃から６０℃、の間の５℃刻みで散乱光強度をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ  （Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて測定した。
実施例５で合成した重合体についての測定結果を図５に示す。実施例８および９で合成した重合体についての測定結果を図６に示す。図６中のＤＰ８０は、実施例８で合成した重合体を意味し、ＤＰ２５０は、実施例９で合成した重合体を意味する。
〔示差走査熱量計による熱反応分析−１〕
実施例６で合成したＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）または、実施例７で合成したＰＡｓｐ（ＤｎＢｐｒｏ）を、Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に２ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、４℃で一晩静置した。溶液をＤ−ＰＢＳで２倍に希釈し、最終的に１ｍｇ／ｍＬに調整し、サンプル溶液を得た。
Ｄ−ＰＢＳはＷａｋｏ社より購入したものをそのまま用いた。
Ｍｉｃｒｏｃａｌ  ＤＳＣ−ＶＰ  （Ｍａｌｖｅｒｎ社）のサンプルセルに減圧脱気したサンプル溶液をセル容量分入れ、１０℃から８０℃の間における熱反応を毎分１℃の速度で昇温することにより調査した。調査は３回行った。
得られたＤＳＣ曲線から、Ｄ−ＰＢＳ同士で測定したものをベースラインとして差し引き、図７に示した。（１）で示した左図が１回目の昇温、（２）で示した中図が２回目の昇温、（３）で示した右図が３回目の昇温の結果を示す。
〔示差走査熱量計による熱反応分析−２〕
実施例６で合成したＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）を、Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に２ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、４℃で一晩静置した。溶液をＤ−ＰＢＳで希釈し、最終的に０．２５ｍｇ／ｍＬに調整し、サンプル溶液を得た。
Ｄ−ＰＢＳはＷａｋｏ社より購入したものをそのまま用いた。
Ｍｉｃｒｏｃａｌ  ＤＳＣ−ＶＰ  （Ｍａｌｖｅｒｎ社）のサンプルセルに減圧脱気したサンプル溶液をセル容量分入れ、１０℃から８０℃の間における熱反応を毎分１℃の速度で昇温することにより調査した。
得られたＤＳＣ曲線から、Ｄ−ＰＢＳ同士で測定したものをベースラインとして差し引き、１回目の昇温結果を、上記〔示差走査熱量計による熱反応分析−１〕で行った、ＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）を１ｍｇ／ｍＬに調整した際の１回目の昇温および降温の結果と共に、図８に示す。
〔中和滴定による濁度測定〕
実施例６で合成したＰＡｓｐ（ＤｎＢｅｎ）または、実施例７で合成したＰＡｓｐ（ＤｎＢｐｒｏ）を、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍの塩酸溶液に１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、４℃で一晩静置し、サンプル溶液を得た。
１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍの塩酸溶液は、Ｗａｋｏ社より購入した５Ｍ塩酸に、塩化ナトリウムを加えつつ、５０倍に希釈したものを用いた。
調製したサンプル溶液（７ｍＬ）を３７℃に設定した恒温槽に入れ、１時間撹拌した。そこに、平沼産業社の自動滴定装置ＴＳ−２０００を用いて、５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を８μＬずつ加えることにより滴定し、Ｄ２２７４１１−Ａ光学プローブ（平沼産業社）を用いて５３０ｎｍの透過度を検査した。
ｐＨは、ＨＯＲＩＢＡ社マイクロ電極９６１８Ｓ−１０Ｄを用いて検出した。
５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液は、Ｗａｋｏ社より購入した０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液に、塩化ナトリウムを加えることにより調製した。
ｐＨと、透過度の変化を、図９に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2019172362.tif 000021
【図９】
2019172362.tif 000022
【国際調査報告】
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2019172362.tif 000024
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