(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物触媒としてオフィオストマ  ノボ−ウルミ（Ophiostoma novo-ulmi）ＩＭＩ３５６０５０株またはそれに由来する酵素活性を有する材料を用いることを特徴とする２−（３−ベンゾイルフェニル）プロピオン酸のアルキルエステルの鏡像異性体混合物から優勢的に（Ｓ）−２−（３−ベンゾイルフェニル）プロピオン酸を調製する方法。
【請求項２】
１５〜２５％の変換率で少なくとも９３％の鏡像異性体過剰率の（Ｓ）−２−（３−ベンゾイルフェニル）プロピオン酸をもたらす請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アルキルエステルが１〜３個の炭素原子を有する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アルキルエステルがエチルエステルである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
反応をｐＨ８〜１１で行う請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
反応をｐＨ９．５〜１０．５で行う請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はアリールアルカノン酸分割に関し、とくに２−（３−ベンゾイルフェニル）プロピオン酸（ケトプロフェン）分割に関する。
発明の背景
多くの２−アリールプロピオン酸が抗炎症剤としてよく知られている。これには例えば、イブプロフェン、ナプロキセンおよびケトプロフェンがある。これら化合物は、対掌性であって、これらの主要な治療的活性がその（Ｓ）−鏡像異性体に存在することが今日確立されている。
（Ｒ）−鏡像異性体が混在しない（Ｓ）−鏡像異性体を得るためのいくつかの方法が公知である。これには非対称化学合成および種々のキラルアミンとともに形成されたジアステレオマー塩の化学量論的結晶などの化学分割が含まれる。
別のアプローチとしては、２−アリールプロピオン酸のエステルを選択的に加水分解する生物触媒を用いる生物触媒的方法がある。正しい立体特異性を有する生物触媒が確認できれば、一つの鏡像異性体の未反応エステルともう一方の鏡像異性体の酸産生物を含む反応混合物を得ることができる。次いでの産生物の分離および回収は比較的容易である。未反応のエステルは、ラセミ化されて、さらなる反応に再使用することができ、これによってラセミ基質の所望の単一鏡像異性体産生物へのほぼ完全な変換が確実となる。
EP-A-０２２７０７８には、そのような生物触媒分割における市販のいくつかの細胞外微生物リパーゼの使用が記述されている。しかし、一般に、大量の酵素が要求され、反応には２〜６日を要した。したがってそのような反応の実施は高価につく。確認された最良の酵素粉末はCandida cylindracea（Candida rugosaとしても知られている）からのものであるが、EP-A-０４０７０３３において、この調製物は活性が低く、エステラーゼ活性の一つ以上の酵素を含むことが示された。さらに、高い鏡像異性体過剰率を有するケトプロフェンを得るためには、調製物を精製することが必要であった。
EP-A-０２３３６５６には、Bacillus thaiからのエステラーゼ遺伝子の分離およびクローニングが記述されている。この酵素は、ナプロキセンおよびイブプロフェンの双方のエチルおよびメチルエステルを選択的に加水分解してそれぞれの化合物の（Ｓ）−酸を生じることが示されている。また、他の酵素の副次活性を最小にした結果、酵素のクローニングによって高い鏡像異性体過剰率の産生物をもたらす調製物が得られたことが示されている。
WO-A-９３２３５４７には、ナプロキセンエステルを選択的に加水分解するエステラーゼを産生する他の多くの菌株が記述されている。見出された最良の菌株はZopfiella latipesで、これから得られたエステラーゼがクローニングされていた。
WO-A-９３０４１８９には、エチルケトプロフェンの（Ｓ）−鏡像異性体を選択的に加水分解して＞９０％の鏡像異性体過剰率を有する（Ｓ）−酸産生物を生じさせることができる生物のTrichosporon spが記述されている。このバイオ変換を行う酵素は、細胞内酵素である。安定した無細胞調製物を得るのは難しいことが証明されたので、遺伝子クローニングまたは古典的突然変異によって生物触媒活性を高めることは困難である。
本発明の背後にある目的は、異なるケトプロフェンエステルに対して良好な活性を有し、これが良好な鏡像異性体過剰率を有するケトプロフェン酸産生物をもたらし、例えば大腸菌中で生物触媒コストを最小に維持できるようなクローニングおよび高い発現に適する生物触媒を得ることであった。
発明の概要
驚いたことに、一連の異なる起源の微生物のスクリーニングによって、子嚢菌Ophiostoma novo-ulmi（Ceratocystis ulmiとしても知られている）が所望の反応を行うことができる細胞内加水分解酵素を産生することが示された。さらなる試験によって、WO-A-９３０４１８９に開示された菌株とは異なって、安定した無細胞活性が得られること、したがってクローニングおよび無細胞バイオ変換における有効使用に適していることが示された。Ophiostoma novo-ulmiは、Dutch Elm病の強力な原因菌として知られている植物病原性菌である。これは、より弱力株であるOphiostoma ulmiおよびまたO.piceaeと密接に関連していることが知られている。
本発明の基になる最初の発見に続いて、立体特異性エステラーゼ活性がOphiostoma novo-ulmi以外の菌株、Ophiostoma ulmi（時にCeratocystis ulmiとしても知らられている）およびOphiostoma piceae（時にCeratocystis piceaeとしても知られている）および米国、ヨーロッパ、中東およびウズベキスタンの種々の場所から収集された分離株に存在することが見出された。加えて、ＩＭＩ（英国、サレイ州、エグハム）から得られた別のCeratocystis sp.を得て、活性についてスクリーニングした。活性はまた、C.coronata（例えば、ＩＭＩ１７６５３３）、C.ips（例えば、ＩＭＩ２１２１１４）、C.tetropii（例えば、ＩＭＩ２１２１１７）、C.cainii（例えば、ＩＭＩ１７６５２３）、C.arborea（例えばＩＭＩ１７６５２９）およびC.stenoceras（例えばＩＭＩ１２６８４９４）に存在することが発見された。したがって、この活性は世界中の種々の場所から収集された一連の種々のCeratocystis菌株に広範に存在するようである。
ここでＡＪ３と記するスクリーニングされたオリジナル分離株は、ブダペスト条約に基づいて１９９３年２月１５日に受け入れ番号ＩＭＩ３５６０５０の下でＩＭＩに寄託された。この菌株は活性の良好な例を提供するが、多様な関連株における活性の広範な性質から、本発明の範囲はこの特定の生物に限定することを意図しない。本発明はまた、そのような生物から分離された酵素活性のどのような適当な技術による使用にまで及ぶ。
発明の詳細な説明
本発明によると、Ophiostoma属の微生物およびそれらの酵素活性は、ケトプロフェンのラセミアルキルエステルを立体選択的に加水分解して、例えば９３〜９６％またはそれ以上の鏡像異性体過剰の実質的に（Ｓ）−鏡像異性体に富む酸を１５〜２５％の変換率で生じさせ、そして残りを（Ｒ）−鏡像異性体に富む残留エステルにするために使用することができる。
反応はエステルの鏡像異性体のいかなる混合物でも行われ得るが、通常混合物はラセミ酸塩である。エステルのアルキル基は、好ましくは１〜３個の炭素原子を有する。反応は好ましくはｐＨ８〜１１、より好ましくは９．５〜１０．５、さらに好ましくは約１０で行う。シクロヘキサンなどの有機溶媒が通常用いられる。
次いで、標準的化学的手段をエステルからの酸産生物の分離に使用することができる。必要であれば、酸の光学純度を（Ｒ）−α−メチルベンジルアミンなどのキラルアミンの使用によって向上させることができる。未変換の残余エステルは、さらなる使用のためにラセミ化することができる。
本発明を以下の実施例によって説明する。
［実施例１］ラセミエチルケトプロフェンのＡＪ３によるバイオ変換
以下の培地を微生物の増殖に用いた。
（ＮＨ4）2ＳＯ4（ｇ／ｌ）               ０．５
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（ｇ／ｌ）            ０．２５
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（ｇ／ｌ）            ０．１
ＫＨ2ＰＯ4（ｇ／ｌ）                    ８．０
酵母抽出物（ｇ／ｌ）                  １０．０
グルコース（ｇ／ｌ）                    ５．０
微量元素溶液（μｌ／ｌ）            １００
ｐＨ（ＮａＯＨを用いて）                ６．５
使用した微量元素溶液は以下の組成を有する。
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ                      ３．５７
ＺｎＯ（ｇ／ｌ）                        ２．０
ＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（ｇ／ｌ）            ０．８５
Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ（ｇ／ｌ）         ４．８
ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ（ｇ／ｌ）            ２．０
ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ（ｇ／ｌ）            ５．４
Ｈ3ＢＯ4（ｇ／ｌ）                  ０．３
ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ（ｇ／ｌ）            ２．４
ＨＣｌ（ｍｌ／ｌ）                  ２５０
ＡＪ３の細胞をモルト抽出物寒天プレートから２５０ｍｌ遮光フラスコ(baffled flask)の３０ｍｌの増殖培地に接種した。これを２３℃で３０時間振盪して、次いで２．５ｍｌを３０ｍｌの培地を含む二番目の２５０ｍｌ遮光フラスコに移した。２３℃で振盪しながら４０時間増殖させた後、ラセミエチルケトプロフェンを２０ｇ／ｌの濃度になるように培養液に加えた。次いで１２０時間バイオ変換をさせて、その後にＨＰＬＣ分析によって加えたエステルの１８．２％が加水分解されたことが示された。形成されたケトプロフェン酸の鏡像異性体過剰率は、９６％で（Ｓ）−鏡像異性体が優勢であることが見出された。
［実施例２］有機溶媒の影響
グルコースを含まずにｐＨが６．０である以外は実施例１と同じ増殖培地を用いて粗酵素溶液を調製した。ＡＪ３の細胞を１リットル振盪フラスコ中の１００ｍｌの培地に接種した。この培養物を３０℃で４８時間振盪しながら増殖させた。次いで、１０ｍｌを１リットル振盪フラスコ中の９０ｍｌの新鮮培地に移して、３０℃でさらに８時間振盪しながら増殖させた。このフラスコを用いて、１．５リットル培地に更に５ｇ／ｌグルコースおよび０．５ｍｌ／ｌのシリコーン／ＰＰＧを基礎にした消泡剤（ＸＦＯ３７１、Ivanhoe Chemicals、イリノイ、米国）を含む２．８リットルの実験室用培養器に接種した。この培養器で、撹拌および通気しながら、ＤＯＴ＞５０％空気飽和および温度３０℃およびｐＨ６．０を維持するように調整して４８時間培養した。
培養完了後、遠心分離によって細胞を集めて、ペレットを溶菌緩衝液、すなわち０．１Ｍ炭酸ナトリウムの５％トリトンＸ−１００水溶液に１０％（ｗ／ｖ、細胞湿重量に基づく）の濃度に再懸濁させた。溶菌を８℃で一晩振盪しながら行って、その後に酵素活性を含む溶菌液を遠心分離によって細胞破砕物から分離した。
ラセミエチルケトプロフェンを、トルエン、シクロヘキサン、メタノールおよびＭＴＢＥ（メチルｔ−ブチルエーテル）の四つの有機溶媒にそれぞれ２０ｇ／ｌの濃度に溶解した。これら溶液のそれぞれ２ｍｌをガラスバイアルの５ｍｌの粗酵素溶液に加えた。５ｍｌ粗酵素溶液、４００μｌの５０％ラセミエチルケトプロフェン、０．５％（ｗ／ｖ）のツイーン８０ストック溶液および２．５％（ｗ／ｖ）のトリトンＸ−１００を含む対照バイオ変換水溶液もまたガラスバイアルに用意した。全試料を撹拌しながら２５℃で４８時間反応させた。それぞれの反応混合物の水相の分析によって表１のような結果が得られた。
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バイオ変換は、溶媒としてのシクロヘキサンおよびＭＴＢＥの存在下ではある程度起きるが、これら条件下でトルエンによって著しく阻害されることが観察される。
［実施例３］アルキル基の影響
ラセミケトプロフェンの種々のエステルをシクロヘキサンに２０ｇ／ｌの濃度で溶解した。エステルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルを用いた。メチルエステルの場合は、シクロヘキサン中のエステル溶解度が低いために懸濁液が調製された。
ガラスバイアルの５ｍｌの粗酵素溶液に、それぞれ２ｍｌの上記の六つのラセミケトプロフェンエステル溶液を加えた。５ｍｌ粗酵素溶液、２００μｌの５０％ラセミエチルケトプロフェン、０．５％ツイーン８０ストック溶液および２．５％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００を含む対照のバイオ変換水溶液もまたガラスバイアルに調製した。反応を振盪しながら２５℃で２４時間行った。それぞれのバイオ変換の水相のＨＰＬＣ分析によって、表２にような結果が得られた。
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［実施例４］ＡＪ３溶菌液の調製
ＡＪ３分離株を次のような方法で５００リットルの量に増殖させた。
ＡＪ３を１リットルのポイント遮光フラスコ(point baffled flask)中の１００ｍｌの培地（実施例１と同様）中に接種した。２５℃で４８時間軌道振盪（３００ｒｐｍ、２５ｍｍ動程）しながら増殖を行った後、各１ｍｌを１００ｍｌの培地をそれぞれ含む三つの１リットル遮光フラスコに移した。次いで同様の条件下で４８時間培養を続けて増殖させた後に、５００リットルの培地を含む７５０リットル容量の培養器の接種に合わせて使用した。
次のような培地を使用した。
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１５リットルの５０％（ｗ／ｖ）滅菌グルコース液の添加前に、この培地を１２１℃で５０分間滅菌した。
制御条件は、温度２５℃、ｐＨ６．０（燐酸または水酸化ナトリウム添加による）、撹拌および通気調整による
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の空気飽和であった。
６４時間の増殖の後、細胞をその場で死滅させ、溶解が容易になるように処理した。これは、温度を１５℃に下げて、水酸化ナトリウムを加えてｐＨを１０に上げることによって行われた。５０分間の処理の後、培養液のｐＨを燐酸を用いて７に再調整して、連続遠心分離で細胞を集めた。集めた細胞を異なる容器に分注して、−２０℃で使用時まで保存した。
凍結細胞を解凍して、２５％（ｗ／ｖ、細胞湿重量に基づく）の濃度で５０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ６．５）中に再懸濁させた。３０分間撹拌した後、細胞を遠心分離によって集めた。次いで、細胞を溶菌緩衝液、すなわち０．３Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ１０．５）に２５％（ｗ／ｖ、細胞湿重量に基づく）の濃度に再懸濁させた。溶菌を４℃で一晩撹拌しながら行って、その後に遠心分離によって溶菌液から細胞破砕物を分離して上清を清澄にした。酵素溶液（すなわち溶菌液上清）の活性を標準バイオ変換条件、すなわち、０．１Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ１０．０）に適当に希釈した１ｍｌ酵素溶液、４０μｌの５０％ラセミエチルケトプロフェン、０．５％（ｗ／ｖ）のツイーン８０ストック溶液および２．５％（ｗ／ｖ）のトリトンＸ−１００、を用いて測定した。バイオ変換を、密封した２０ｍｌ容量のガラスバイアル中で２５℃で１時間振盪しながら行った。活性をＵ／ｍｌで表した（１ユニット（Ｕ）＝２５℃で１時間当たりに１ｍｇケトプロフェン酸を産生する活性）。測定活性が１〜５Ｕ／ｍｌの範囲にある場合、酵素溶液は適当に希釈されたとみなした。
５０％ラセミエチルケトプロフェンストック溶液を次のように調製した。２５ｇラセミエチルケトプロフェンおよび０．２５ｇのツイーン８０を１０ｍｌの蒸留水に加えて、この混合物を５分間超音波処理した（１５振幅μｍ、１０秒オン／１０秒オフサイクル）。次いで容量を蒸留水で５０ｍｌにして、ストック溶液をオートクレーブで滅菌して、長期保存を可能にした。
典型的な溶菌液活性は１．５Ｕ／ｍｌであった。
［実施例５］加水分解活性の分離および精製
清澄にした溶菌液（実施例４）を、溶菌液の伝導度が２０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．２、緩衝液Ａ）と同じになるまで蒸留水に対して限外濾過を行った（３０、０００分子量遮断ホローファイバーカートリッジ使用のアミコンＤＣ２限外濾過ユニット）。次いで、溶液を４〜５倍に濃縮して、＞９０％の初期活性が一般に保持された。酵素活性を予め平衡にしておいたＱＡ５２陰イオン交換樹脂（ファルマシア）に湿ＱＡ５２ゲル１ｍｌ当たり７〜１０Ｕの割合で室温で１時間バッチ法で負荷した。負荷ゲルを流速２００ｍｍ／時間でカラムに充填した。続いてクロマトグラフィーを４℃で行った。
カラムを緩衝液Ａで基線まで洗浄した。溶出を１０カラム容量の０−０．５ＭのＮａＣｌの緩衝液Ａ溶液の勾配を用いて行って、１／３５勾配容量に相当するフラクションを集めた。得られる典型的な溶出プロフィールを表３に示す。
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活性は０．１２〜０．１８ＭのＮａＣｌ濃度範囲に溶出された。フラクション７〜１０のみを一緒に集めて回収活性＝６３．５％、回収蛋白質＝１５．８％を得た。
集めた活性フラクションをＹＭ３０膜を用いて撹拌セル限外濾過ユニット（アミコン）中で活性を失うことなく濃縮して、３．２〜３．６ｍＳの伝導度に達するまで緩衝液Ａに対して透析した。次いでこれをＱＡ５２樹脂上で再クロマトグラフして、表４の結果を得た。
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この第２回目クロマトグラフィーにおいて、活性は０．２〜０．２５ＭのＮａＣｌ濃度範囲に溶出された。フラクション１５〜１７のみを一緒に集めた。集めた試料を活性および蛋白質含量についてアッセイした。
活性＝２７．８Ｕ／ｍｌ
全活性＝２５９９Ｕ
全活性回収率＝８３．５％
蛋白質（ビューレット法）＝１．３４ｍｇ／ｍｌ
全蛋白質＝１２５ｍｇ
全蛋白質回収率＝５．５％
集めたフラクションを、ファルマシアモノＰ ＨＲ５／５プレパック陰イオン交換ＦＰＬＣを用いてさらに精製した。以下のようなクロマトグラフ条件を用いた。
低塩緩衝液＝２０ｍＭエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）
高塩緩衝液＝２０ｍＭエタノールアミン−ＨＣｌ＋０．３ＭのＮａＣｌ（ｐＨ９．０）
流速＝１ｍｌ／分
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試料容量＝１ｍｌ
フラクション容量＝１ｍｌ
第２回目ＱＡ５２クロマトグラフィーから集めたフラクションを３０、０００分子量遮断限外濾過膜を用いて１０倍に濃縮して、得られる濃縮物をファルマシアＧ２５ＰＤ１０ゲル濾過カラムを用いてＨＰＬＣ用低塩緩衝液中に脱塩した。１回に約５ｍｇの全蛋白質がＨＰＬＣカラムに負荷された。次のような溶出プロフィールが得られた（表５）。
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フラクション９および１０を集めて、８８．５％の全活性回収率を得た。次いで、この集めた活性をさらにサイズふるいＨＰＬＣによって精製した。
アナルゲル−ＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ ３０ｃｍｘ７．８ｍｍサイズふるいＨＰＬＣカラムを次の分離に用いた。次のようなクロマトグラフ条件を用いた。
緩衝液  −  ０．１Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4＋２０ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）
流速＝０．４ｍｌ／分
試料容量＝２００μｌ
フラクション容量＝４００μｌ
モノＰイオン交換ＨＰＬＣから集めたフラクションを１０、０００分子量遮断限外濾過膜を用いて１．５倍に濃縮した。濃縮された試料をファルマシアＧ２５ｐｄ１０カラムを用いてサイズふるいＨＰＬＣ用緩衝液中に脱塩した。次のような溶出プロフィールが得られた（表６）。
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本発明のＡＪ３ラセミエチルケトプロフェンエステラーゼの分子量の推定を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって行った。既製の１２％均質ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲル（ＢＤＨ）を、分子量比較のための予め染色した分子量蛋白質標準    マーカー（ＢＩＳＣ）を用いて泳動させた。泳動緩衝液はエレクトログラド緩衝液ＴＴＳ（ＢＤＨ）を用いた。
電気泳動を定電圧（２００Ｖ）で限定電流（４０ｍＡ／ゲル）で先行する青色染料がゲルを完全に貫通するまで行った。蛋白質はクマシーブルー染色によって可視化した。
エステラーゼに相当する蛋白質バンドを、活性および非活性試料における蛋白質バンドを比較して同定した。活性蛋白質および蛋白質標準物の相対的泳動距離の比較によって、新規の精製変性蛋白質は３２、５００ダルトンマーカーよりも僅かに大きい分子量を有することが示された。
［実施例６］加水分解活性に及ぼすｐＨの影響
バイオ変換のｐＨプロフィールを上記の集めた材料を−２０℃で４カ月保存した後に用いて試験した。溶液を室温で解凍して、蒸留水で１０倍に希釈した（希釈酵素溶液）。１．１Ｍ緩衝液ストック溶液を以下に示す塩を用いて各ｐＨに調製した（ｐＨは必要に応じて水酸化ナトリウムまたは塩酸を用いて調整した）。
ｐＨ６．０  ：  ＮａＨ2ＰＯ4
ｐＨ７．０  ：  ＮａＨ2ＰＯ4
ｐＨ８．０  ：  ＮａＨ2ＰＯ4
ｐＨ９．０  ：  グリシン−ＨＣｌ
ｐＨ１０．０：  グリシン−ＨＣｌ
ｐＨ１１．０：  Ｎａ2ＨＰＯ4
バイオ変換反応は密封したガラスバイアル中で次のような構成で行われた。
１ｍｌ希釈酵素溶液
１００μｌの１．１Ｍの各ｐＨ緩衝液ストック溶液
４０μｌ  ５０％ラセミエチルストック溶液
２．５％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００
ｐＨ１２．０におけるバイオ変換のために、１ＭのＮａＯＨ溶液をｐＨ１１．０反応混合物に正しいｐＨに達するまで直接に加えた。全てのバイオ変換をそれぞれ２回繰り返し、反応は２５℃で１時間振盪しながら行った。反応の主な結果を表７に示す。最大活性はｐＨ１０で見出された。
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