(57)【要約】  長期間安定な液状試薬として耐えうるようアスコルビン酸オキシダーゼを安定化する方法を提供することを目的とする。本発明は、アスコルビン酸オキシダーゼを、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスコルビン酸オキシダーゼを、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
【請求項２】
前記界面活性剤が、エマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６、エマルゲン１０８、エマルゲン１２０、エマルゲン７０７、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４、およびノニオンＮＳ−２１０からなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アスコルビン酸オキシダーゼを、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤及びアミンを含む緩衝液と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
【請求項４】
前記界面活性剤が、エマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６、エマルゲン１０８、エマルゲン１２０、エマルゲン７０７、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４、およびノニオンＮＳ−２１０からなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アミンを含む緩衝液が、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、２−モルホリノエタンスルホン酸，一水和物（ＭＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸），二水和物（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項３または請求項４に記載のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
【請求項６】
前記アミンを含む緩衝液が、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、およびＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項３から請求項５のいずれかに記載のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
【請求項７】
アスコルビン酸オキシダーゼ、および、以下の（１）を含む、アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物。
（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤。
【請求項８】
アスコルビン酸オキシダーゼ、以下の（１）および以下の（２）を含む、アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物。
（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤、
（２）アミンを含む緩衝液。
【請求項９】
請求項７または請求項８に記載の組成物を含む、生体成分分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体成分を酵素的に測定する方法はこれまで種々開発されてきている。この中で、コレステロールオキシダーゼなどのオキシダーゼを用いる方法は、オキシダーゼの作用により生成した過酸化物をペルオキシダーゼの存在下、水素供与体の発色系に導き比色定量に供する。本測定系は生体成分中のアスコルビン酸の影響を受けやすいことから、過酸化水素測定前または測定時に生体成分中に存在するアスコルビン酸にアスコルビン酸オキシダーゼ（以下、ＡＳＯと省略する場合がある）を作用させ、デヒドロアスコルビン酸に変換せしめ影響を回避することが一般に行われている。しかし、溶液中のＡＳＯは非常に不安定であり、試薬保存中に失活し試薬の保存安定性を左右する要因となっている。【０００３】
これに対し、安定化剤としてカタラーゼ、ゼラチン、グロブリン、ペルオキシダーゼ、メトヘモグロビンまたはヘマチン等を用いることで効果があることが示されている。また、金属と陰性の酸基とからなる化合物およびカタラーゼ及び／またはペルオキシダーゼの添加でＡＳＯの保存安定性が向上することが開示されている（例えば、特許文献１参照。）。また、アスコルビン酸オキシダーゼを含む溶液に糖アルコールを添加する方法（例えば、特許文献２参照）、亜硝酸若しくはその塩又は亜硝酸エステルを水性媒体中で共存させる方法（例えば、特許文献３参照）、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質を用いる方法（例えば、特許文献４参照）、ビリルビン酸（塩）を配合させる方法（例えば、特許文献５参照）が開示されている。しかしながら、これらの方法では液状試薬として耐えうる安定性には尚問題が残る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特公平８−１５４３０号公報
【特許文献２】特開２００３−１１６５３９号公報
【特許文献３】ＷＯ２０１３／１７６２２５号公報
【特許文献４】特許４２８８５５９号公報
【特許文献５】特許４６２０８８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は長期間安定な液状試薬として耐えうるようＡＳＯを安定化する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、ＡＳＯをある種の界面活性剤と共存させることにより、ＡＳＯを液状状態で安定に保つことを見出し、更には、ＡＳＯを該界面活性剤及びある種の緩衝剤の組合せと共存させることによって、より一層効果的にＡＳＯを液状状態で安定に保つことを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の構成からなる。【０００７】
［項１］アスコルビン酸オキシダーゼを、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
［項２］前記界面活性剤が、エマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６、エマルゲン１０８、エマルゲン１２０、エマルゲン７０７、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４、およびノニオンＮＳ−２１０からなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤である、項１に記載の方法。
［項３］アスコルビン酸オキシダーゼを、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤及びアミンを含む緩衝液と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
［項４］前記界面活性剤が、エマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６、エマルゲン１０８、エマルゲン１２０、エマルゲン７０７、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４、およびノニオンＮＳ−２１０からなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤である、項３に記載の方法。
［項５］前記アミンを含む緩衝液が、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、２−モルホリノエタンスルホン酸，一水和物（ＭＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸），二水和物（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、項３または項４に記載のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
［項６］前記アミンを含む緩衝液が、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸 (ＡＤＡ)およびＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、項３から項５のいずれかに記載のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
［項７］アスコルビン酸オキシダーゼ、および、以下の（１）を含む、アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物。
（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤。
［項８］アスコルビン酸オキシダーゼ、以下の（１）および以下の（２）を含む、アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物。
（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤、
（２）アミンを含む緩衝液。
［項９］項７または項８に記載の組成物を含む、生体成分分析用キット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、安定なＡＳＯ含有液状製剤を提供でき、長期間または過酷な条件下での保管後の液状製剤においてもアスコルビン酸の影響を受けることなく、正確な測定値を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の実施の形態について詳細に説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また本明細書中の「〜」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ｘ〜Ｙ」と記載されていれば「Ｘ以上、Ｙ以下」を示す。また本明細書中の「及び／又は」は、いずれか一方または両方を意味する。また、本明細書において、単数形の表現は、他に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。
【００１０】
（界面活性剤によるアスコルビン酸オキシダーゼの安定化）
本発明の実施態様の一つは、アスコルビン酸オキシダーゼを、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法である。ここで、本発明に用いる前記界面活性剤は全てポリオキシアルキレン系の非イオン性界面活性剤である点で共通する性質を有する。
【００１１】
前記界面活性剤の種類は特に限定されない。
例えば、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルとして、花王製エマルゲンＡ６０（「エマルゲン」は登録商標。以下同様。）、エマルゲンＡ９０またはエマルゲンＡ５００が挙げられる。
例えば、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテルとして、エマルゲンＢ６６が挙げられる。
例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテルとして、エマルゲン１０３、エマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１３０Ｋ、エマルゲン１４７またはエマルゲン１５０が挙げられる。
例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとして、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、またはエマルゲン７０９が挙げられる。
例えば、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルとして、エマルゲンＬＳ１０６、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４、またはエマルゲンＭＳ１１０が挙げられる。
例えば、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルとして、ノニオンＮＳ−２１０（「ノニオン」は登録商標。以下同様。）が挙げられる。
【００１２】
中でも、前記界面活性剤が、エマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６、エマルゲン１０８、エマルゲン１２０、エマルゲン７０７、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４、およびノニオンＮＳ−２１０からなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤であることが好ましい。
【００１３】
本発明に用いる界面活性剤のＨＬＢは、本発明の効果を奏する限り限定されないが、例えば、ＨＬＢ１０〜２０程度の界面活性剤を用いることができ、より高い安定化効果が期待できるという観点から、ＨＬＢ１１〜１８程度の界面活性剤が好ましく、ＨＬＢ１２〜１６程度の界面活性剤がより好ましい。
【００１４】
ＡＳＯを含む溶液中の界面活性剤の濃度としては特に限定されるものではないが、範囲の上限は、好ましくは２０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは１０ｇ／Ｌ、範囲の下限は好ましくは０．１ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．５ｇ／Ｌで、使用されるのが望ましい。
【００１５】
（界面活性剤と緩衝液との組合せによるアスコルビン酸オキシダーゼの安定化）
本発明の別の実施態様は、アスコルビン酸オキシダーゼを、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤及びアミンを含む緩衝液と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法である。このように特定のポリオキシアルキレン系非イオン性界面活性剤と、アミンを含む緩衝液とを共存させることで、両成分の作用が相俟って相乗的に高い安定化効果を発揮できることが、後述の実施例の結果から明らかである。
【００１６】
前記方法において、界面活性剤と緩衝液とを組合せる場合、界面活性剤の種類は特に限定されない。
例えば、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルとして、花王製エマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０またはエマルゲンＡ５００が挙げられる。
例えば、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテルとして、エマルゲンＢ６６が挙げられる。
例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテルとして、エマルゲン１０３、エマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１３０Ｋ、エマルゲン１４７、またはエマルゲン１５０が挙げられる。
例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとして、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、またはエマルゲン７０９が挙げられる、
例えば、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルとして、エマルゲンＬＳ１０６、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４、またはエマルゲンＭＳ１１０が挙げられる。
例えば、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルとして、ノニオンＮＳ−２１０が挙げられる。
【００１７】
中でも、前記界面活性剤が、エマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６、エマルゲン１０８、エマルゲン１２０、エマルゲン７０７、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４、およびノニオンＮＳ−２１０からなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤であることが好ましい。
【００１８】
さらに、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとして上記で例示されたもの以外では、エマルゲン１１０８、エマルゲン１１１８Ｓ−７０、エマルゲン１１３５Ｓ−７０またはエマルゲン１１５０Ｓ−６０（以上花王製）などを用いることができる。
【００１９】
本発明の方法において、使用されるアミンを含む緩衝液は特に限定されないが、例えば、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸〔Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＣＥＳ）〕、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸〔Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＤＡ）〕、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸〔Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＢＥＳ）〕、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン〔Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ（Ｂｉｃｉｎｅ）〕、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン〔Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅ（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）〕、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸〔Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＣＡＰＳ）〕、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸〔３−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＥＰＰＳ）〕、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸〔２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）〕、２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸〔２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３−［４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＰＳＯ）〕、２−モルホリノエタンスルホン酸，一水和物〔２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ（ＭＥＳ）〕、３−モルホリノプロパンスルホン酸〔３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）〕、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸〔２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＭＯＰＳＯ）〕、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）〔Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ＰＩＰＥＳ）〕、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸），二水和物〔Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ），ｄｉｈｙｄｒａｔｅ（ＰＯＰＳＯ）〕、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸〔Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＡＰＳ）〕、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〔Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−���ｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＥＳ）〕、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン〔Ｎ−［Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎｅ（Ｔｒｉｃｉｎｅ）〕およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（Ｔｒｉｓ）〕からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミンが挙げられる。
【００２０】
本発明の方法において、前記アミンを含む緩衝液は、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸〔Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＤＡ）〕及びＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸〔Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＢＥＳ）〕からなる群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【００２１】
本発明のＡＳＯの安定化方法において使用する前記アミンを含む緩衝液と前記界面活性剤の組合せは特に限定されない。
【００２２】
例えば、前記方法においてアミンを含む緩衝液としてＡＤＡを選択する場合は、エマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６、エマルゲン１０８、エマルゲン１２０、エマルゲン７０７、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４およびノニオンＮＳ−２１０からなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤であることが好ましい。
【００２３】
また、例えば、前記方法においてアミンを含む緩衝液としてＢＥＳを選択する場合は、エマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６、エマルゲン１０８、エマルゲン１２０、エマルゲン７０７、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４およびノニオンＮＳ−２１０からなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤であることが好ましい。
【００２４】
ＡＳＯを含む溶液中のアミンを含む緩衝液の濃度としては特に限定されるものではないが、範囲の上限は、好ましくは２００ｍＭ、さらに好ましくは１００ｍＭ、範囲の下限は好ましくは５ｍＭ、さらに好ましくは２０ｍＭで、使用されるのが望ましい。
【００２５】
また、アミンを含む緩衝液のｐＨ調整範囲は特に限定されないが、一般に生体試料の測定に必要な酵素等がいずれも中性付近で安定な性質を示しており、本発明においても中性付近の緩衝液を用いることが好ましい。範囲の上限は、好ましくは９．５、さらに好ましくは７．５、範囲の下限は、好ましくは４．５、さらに好ましくは６．０で、調整されるのが望ましい。
【００２６】
本発明で用いられるＡＳＯとは、ＥＣ１．１０．３．３に分類される以下の反応を触媒する酵素である。
Ｌ−アスコルビン酸＋１／２Ｏ２→デヒドロアスコルビン酸＋Ｈ２Ｏ
上記酵素の由来は特に限定されないが、例えばキュウリ、カボチャ等の植物などから採取されるものなどに由来し得る。
また、本発明に用いられるＡＳＯには特開平６−２０９７７０に記載の以下の反応を触媒する酵素も含む。
Ｌ−アスコルビン酸＋１／２Ｏ２→デヒドロアスコルビン酸＋Ｈ２Ｏ２
上記酵素の由来は特に限定されないが、例えば微生物などから採取されるものなどを含有する。前記微生物としては特に限定されないが、例えばトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属またはユペニシリウム属（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）が挙げられる。また、上記酵素は、化学的に合成してもよいし、遺伝子工学的に発現させて取得されるものであってもよい。アスコルビン酸オキシダーゼ活性を有する限り、公知のアスコルビン酸オキシダーゼを変異させたり、一部のドメインを欠損させたりしたタンパク質等の変異体であってもよい。
ＡＳＯを含む溶液中のＡＳＯの濃度は、特に限定されないが、酵素の起源によっても異なり、通常０．１〜５０Ｕ／ｍＬの範囲で好適に用いられる。
【００２７】
本発明のＡＳＯの安定化方法においては、さらに防腐剤などを共存させてもよい。防腐剤は特に限定されないが、例えば、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。
【００２８】
また、本発明のＡＳＯの安定化方法は、種々の生化学診断方法に適用できる。該生化学診断方法としては、例えば尿酸、遊離脂肪酸、グルコース、中性脂肪、コレステロール、リン脂質等を測定する方法が挙げられる。
具体的には、本発明のＡＳＯの安定化方法には、前記診断方法に必要な他の構成成分を共存させてもよい。例えば中性脂肪測定試薬を構成する成分には、一般にＡＳＯのほか、リパーゼ、グリセロールキナーゼ、ＡＴＰ、マグネシウム、ペルオキシダーゼ、色原体などが挙げられ、これらのすべてを共存させてもよいし、これらの中から適宜必要なものを選んで共存させてもよい。
【００２９】
（アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物）
本発明の別の実施態様は、アスコルビン酸オキシダーゼ、および、以下の（１）を含む、アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物である。
（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤。
【００３０】
本発明のアスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物は、アスコルビン酸オキシダーゼ、以下の（１）および以下の（２）を含む組成物であってもよい。
（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤、
（２）アミンを含む緩衝液。
【００３１】
前記界面活性剤およびアミンを含む緩衝液の詳細については、前記の本発明のＡＳＯの安定化方法の項で説明したとおりである。
【００３２】
本発明は、前記のいずれかに記載の組成物を含む、生体成分分析用キットであってもよい。
種々の生体成分測定方法が既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のＡＳＯ安定化方法やＡＳＯ含有組成物を生体成分分析用キットに適用して、各種試料中の生体成分の量又は濃度を測定することができる。その組成は特に限定されない。
本発明の組成物またはキットは、汎用自動分析機への適用などを考慮して２つ以上に分包される態様をとる場合もあるが、その場合ＡＳＯは少なくともいずれかに含まれていればよく、その場合、ＡＳＯを含む方の組成物に、前記界面活性剤と必要に応じて添加され得る前記アミンを含む緩衝液とを共存させることが好ましい。また、本発明の組成物（キットに含まれる形態を含む）は、水溶液であっても凍結乾燥したものであってもよい。本発明によれば、ＡＳＯが経時的に失活し易い液状製剤においても長期的な保存安定性を示すことができる。かかる観点を考慮すれば、本発明は液状製剤（例えば、水溶液等の液状の組成物）において、より有効に用いられ得る。また、凍結乾燥等で粉末状（固形状）の製剤として調製する場合であっても、例えば、液体溶媒に用事調製した後におけるＡＳＯの失活を抑制でき安定性を高めることができるというメリットがある。
【００３３】
本発明は、前記のいずれかに記載の組成物、又は前記のいずれかに記載の組成物を含む生体成分分析用キットの製造方法をも提供する。
前記のようなアスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物を製造する方法では、アスコルビン酸オキシダーゼと、（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤とを共存させるように、当該分野で公知の製剤技術に従って組成物を調製すればよい。更に、前記のようなアスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物を製造する方法では、アスコルビン酸オキシダーゼと、（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤と、（２）アミンを含む緩衝液とを共存させるように、当該分野で公知の任意の製剤化技術に従って組成物を調製すればよい。これらの製造方法において、アスコルビン酸オキシダーゼと、前記（１）に記載のポリオキシアルキレン系の非イオン性である界面活性剤と、必要に応じて添加される前記（２）に記載のアミンを含む緩衝液との添加順序は、本発明の効果を奏する限り、特に限定されない。
ここで、前記（１）に記載のポリオキシアルキレン系の非イオン性である界面活性剤、前記（２）に記載のアミンを含む緩衝液の詳細については、前記の本発明のＡＳＯの安定化方法の項で説明したとおりである。
【００３４】
更なる実施形態として、本発明は、安定化されたアスコルビン酸オキシダーゼを含有する組成物を製造するための、（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤の使用、を提供する。更に、本発明は、安定化されたアスコルビン酸オキシダーゼを含有する組成物を製造するための、（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤、及び、（２）アミンを含む緩衝液の使用、を提供する。これらの製造における使用において、各成分の添加順序は、本発明の効果を奏する限り、特に限定されない。
ここで、前記（１）に記載のポリオキシアルキレン系の非イオン性である界面活性剤、前記（２）に記載のアミンを含む緩衝液の詳細については、前記の本発明のＡＳＯの安定化方法の項で説明したとおりである。
【００３５】
更なる一つの実施形態として、本発明は、アスコルビン酸オキシダーゼを安定化するための、（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤を含む組成物、をも提供する。更に、本発明は、アスコルビン酸オキシダーゼを安定化するための、（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤、及び、（２）アミンを含む緩衝液を含む組成物を提供する。これらの組成物は、前記（１）に記載のポリオキシアルキレン系の非イオン性である界面活性剤、及び必要に応じて前記（２）に記載のアミンを含む緩衝液の他に、本発明の効果を損なわない限り、添加物等の他の任意の成分を含んでいてもよく、またこれらの組成物を製造する際の各成分の添加順序は問わない。
ここで、前記（１）に記載のポリオキシアルキレン系の非イオン性界面活性剤、前記（２）に記載のアミンを含む緩衝液の詳細については、前記の本発明のＡＳＯの安定化方法の項で説明したとおりである。
【００３６】
（アスコルビン酸オキシダーゼの活性測定法）
ＡＳＯの活性測定は、以下の測定条件で行う。
＜反応液＞
１００ｍＭ  リン酸緩衝液  ｐＨ５．６
０．５ｍＭ  Ｌ−アスコルビン酸
＜測定条件＞
（１）上記反応液を１ｍＭキュベットにとり、３０℃で約５分間予備加温する。
（２）酵素溶液０．１ｍＬを添加し反応を開始する。正確に５分間反応させた後に、０．２Ｎ塩酸溶液３．０ｍＬを加えて反応を停止させる。この液を分光光度計で２４５ｎｍの吸光度を測定する。
（３）盲検は反応液を３０℃で５分放置後、０．２Ｎ塩酸溶液３．０ｍＬを加えて混和し、次いで酵素溶液０．１ｍＬを加えて調製する。この液について同様に急高度を測定する。
【００３７】
本発明において「アスコルビン酸オキシダーゼが安定である」とは、アスコルビン酸オキシダーゼの経時的な失活が抑制され、長期的な保存安定性が改善されていることをいう。具体的には、界面活性剤もアミンを含む緩衝液も含まない蒸留水（但し、塩化マグネシウムを１ｇ／Ｌを含んでいてもよい）で保存した場合に比べて、３５℃で７日間保存後のＡＳＯの残存酵素活性が高められていることをいう。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。【００３９】
実施例１：界面活性剤によるアスコルビン酸オキシダーゼの安定化
ＡＳＯ（東洋紡製ＡＳＯ−３１１）３Ｕ／ｍＬを塩化マグネシウム（１ｇ／Ｌ）を含む蒸留水に溶解し、この水溶液に各種添加剤を１ｇ／Ｌ加え、添加剤を加えない場合を対照として、３７℃で７日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値＝[スタート活性]に対する保存後の活性値の割合）を検討した。【００４０】
【表１】
2019181911.tif 000002
【００４１】
結果を表１に示す。
ＡＳＯ水溶液にエマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６、エマルゲン１０８、エマルゲン１２０、エマルゲン７０７、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４、またはノニオンＮＳ−２１０を加えることで、添加剤を加えない場合に対し良好な安定性が得られた。【００４２】
実施例２：界面活性剤と緩衝液との組合せによるアスコルビン酸オキシダーゼの安定化
ＡＳＯ（東洋紡製ＡＳＯ−３１１）３Ｕ／ｍＬを塩化マグネシウム（１ｇ／Ｌ）を含む蒸留水、ＡＤＡ（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）、またはＢＥＳ（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）に溶解し、この水溶液に各種添加剤を１ｇ／Ｌ加え、蒸留水に添加剤を加えない場合を対照として、３７℃で７日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値＝[スタート活性]に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
なお、参考として、緩衝液単独でのアスコルビン酸オキシダーゼの安定化についてもデータを取得したところ、ＡＳＯをＡＤＡまたはＢＥＳに溶解することで、蒸留水に対し良好な安定性が得られた。【００４３】
【表２】
2019181911.tif 000003
【００４４】
【表３】
2019181911.tif 000004
【００４５】
結果を表２〜表３に示す。
アミンを含む緩衝液（ＡＤＡまたはＢＥＳ）および各種添加剤の相乗効果を調べた。相乗効果は以下の通り判定した。
［安定化効果  総合（Ａ）］
各実施例の実験結果から比較例の結果を差し引き、安定化効果を相対化した。
（各実施例の活性残存率％）−（比較例（蒸留水×添加剤なし）での活性残存率（１２％））
［安定化効果  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂ）］
各Ｂｕｆｆｅｒ（ＡＤＡまたはＢＥＳ）単独の安定化効果を求めた。
（添加剤なしの場合の活性残存率％）−（比較例（蒸留水×添加剤なし）での活性残存率（１２％））
［安定化効果  添加剤（Ｃ）］
各添加物単独の安定化効果を求めた。
（Ｂｕｆｆｅｒなしの場合の活性残存率％）−（比較例（蒸留水×添加剤なし）での活性残存率（１２％））
［相乗効果］
総合（Ａ）−Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂ）−添加剤（Ｃ）
相乗効果がなければ０％となるはずである。従って、正の値であればプラスの相乗効果、負の値であればマイナスの相乗効果があると判断した。【００４６】
表２の結果によれば、ＡＤＡ緩衝液と、エマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６、エマルゲン１０８、エマルゲン１２０、エマルゲン７０７、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４、およびノニオンＮＳ２１０からなる群より選ばれる少なくとも１種の添加剤との組合せにおいて、安定化効果における相乗効果が見られた。【００４７】
表３の結果によれば、ＢＥＳ緩衝液と、エマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６、エマルゲン１０８、エマルゲン１２０、エマルゲン７０７、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４、およびノニオンＮＳ２１０からなる群より選ばれる少なくとも１種の添加剤との組合せにおいて、安定化効果における相乗効果が見られた。【００４８】
溶液中のアスコルビン酸オキシダーゼは非常に不安定であるため、前記の試験条件下での実施例の結果に示されるように、本発明により保存安定性を向上させることができたことは、非常に有益である。特に、酵素の機能を利用した分子生物学用途の分析用試薬、生化学用途の分析試薬、体外診断薬、液状体外診断薬、チップ状またはスリット状に加工したドライ系の体外診断薬、酵素センサーや酵素電極、医薬品、食品および飲料などの組成物では、酵素反応が最も重要なファクターとなり、律速要因にもなり得る。従って、前記実施例の結果に示すように、不安定化しやすい溶液中でアスコルビン酸オキシダーゼの保存安定性を高めることができ、しかも非常に簡便な手法で安定性を高めることができたことは極めて有益であることが明らかとなった。【００４９】
なお、上記開示した実施形態および実施例はすべて例示であり制限的なものではない。また、実施形態および実施例に開示された内容を組み合わせた実施形態及び実施例も本発明の範囲に含まれる。本発明の技術的範囲は、特許請求の範囲によって有効であり、特許請求の範囲の記載と均等の意味および範囲内のすべての変更・修正・置き換え等を含むものである。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明により、アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯ）を含有する、より長期間安定な液状試薬を供することができる。
【国際調査報告】
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2019181911.tif 000007
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