(57)【要約】  この出願は、ＭＭＣＴ法を用いて目的ＤＮＡを有する外来染色体を含むヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を製造するための方法、並びに、その方法によって作製されたヒトｉＰＳ細胞、或いはヒトｉＰＳ細胞から分化誘導されたヒトｉＰＳ細胞由来未分化もしくは分化細胞において、前記外来遺伝子を発現する方法を提供する。
2020075822.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来染色体を含むヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を製造するための方法であって、ウイルスエンベロープタンパク質を細胞表面に発現する及び目的ＤＮＡを有する外来染色体を含む供与細胞を準備する工程、前記供与細胞から微小核細胞を作製する工程、並びにＭＭＣＴ（Ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）法を用いて、前記微小核細胞と、受容細胞としてのヒトｉＰＳ細胞とをフィーダー細胞非存在下で共培養して融合し、前記目的ＤＮＡを有する外来染色体を前記ヒトｉＰＳ細胞に導入する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記外来染色体が、人工染色体又は哺乳類人工染色体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルスエンベロープタンパク質が、麻疹ウイルス由来エンベロープタンパク質又はその改変体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記改変体が、麻疹ウイルス由来Ｈタンパク質と、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ１３抗体もしくは抗ＣＤ７１抗体、又は前記抗体のＳｃＦｖとの融合タンパク質である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記供与細胞が、哺乳類細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳類細胞が、齧歯類細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記目的ＤＮＡが、外来遺伝子、遺伝子座又は染色体断片である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法によって、外来遺伝子を有する外来染色体を含むヒトｉＰＳ細胞を作製する工程、並びに、前記ヒトｉＰＳ細胞において、或いは前記ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導されたヒトｉＰＳ細胞由来未分化もしくは分化細胞において、前記外来遺伝子を発現する工程を含む、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞由来未分化もしくは分化細胞において外来遺伝子を発現する方法。
【請求項９】
前記ヒトｉＰＳ細胞由来未分化もしくは分化細胞が、幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、筋衛星細胞、前駆細胞、成熟細胞、又はその細胞集団である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒトｉＰＳ細胞由来未分化もしくは分化細胞が、神経細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、巨核球細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、膵細胞、腎細胞、及び小腸細胞からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記外来遺伝子を含むＤＮＡの上流及び／又は下流にインスレーター様ＤＮＡ配列を含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来染色体を含むヒト人工多能性幹細胞の製造方法に関する。【０００２】
具体的には、本発明は、ウイルスエンベロープタンパク質を用いるＭＭＣＴ（Ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）法を使用することを特徴とする外来染色体を含むヒト人工多能性幹細胞の製造方法に関する。【０００３】
外来染色体には、例えば人工染色体、例えば哺乳類人工染色体（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）、ヒト人工染色体（Ｈｕｍａｎ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）、マウス人工染色体（Ｍｏｕｓｅ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）などが含まれる。【０００４】
本発明はまた、上記ヒト人工多能性幹細胞、又はヒト人工多能性幹細胞由来未分化もしくは分化細胞、において外来染色体中の少なくとも１つの外来遺伝子を発現する方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
ＭＶ−ＭＭＣＴ（Ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｕｓｉｎｇ  Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｆｕｓｏｇｅｎ）法は、本発明者らによって開発された技術であり、この技術を用いることによって染色体を微小核細胞融合法（ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ）により供与細胞（ｄｏｎｏｒ  ｃｅｌｌｓ）から受容細胞（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ）内に移動させることができる。具体的には、外来染色体を保有する供与細胞を、弱毒化した麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  Ｖｉｒｕｓ；ＭＶ）由来のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質及びフュージョン（Ｆ）タンパク質をコードする遺伝子をトランスフェクションすることによって、供与細胞の表面にはＭＶ融合エンベロープタンパク質が発現される。この細胞をさらにコルセミドで処理することによって微小核細胞を形成し、受容細胞と共培養することによって微小核細胞融合を起こし、薬剤選択などの選択法によって目的の外来染色体導入受容細胞が得られる（非特許文献１〜３）。【０００６】
また、上記のＭＶに代えて例えば白血病ウイルス由来エンベロープタンパク質を供与細胞の表面に発現させたＭＭＣＴ法（レトロ−ＭＭＣＴ）も開発されている（非特許文献４）。具体的には、この文献には、マウス白血病ウイルス由来エンベロープタンパク質（「ＳＵ成分」と「ＴＭ成分」からなる。）を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いる種々の標的細胞への染色体（例えばヒト人工染色体及びマウス人工染色体）の高効率導入法（「ｒｅｔｒｏ−ＭＭＣＴ法」（レトロ−ＭＭＣＴ））が記載されている。【０００７】
遺伝子導入ベクターは、それに搭載可能な遺伝子サイズにより使い分けられている。例えばプラスミドでは約２０ｋｂ以下のサイズのポリヌクレオチド、ウイルスベクターでは１５０ｋｂ以下のサイズのポリヌクレオチド、ＢＡＣ／ＰＡＣでは３００ｋｂ以下のサイズのポリヌクレオチド、及びＹＡＣでは約１Ｍｂ未満のサイズのポリヌクレオチドであり、一方、ヒト人工染色体及びマウス人工染色体などの人工染色体では導入される染色体サイズに特に制限はない（非特許文献５）。このため、このような人工染色体には、目的の遺伝子座を含む染色体断片を搭載することができる。【０００８】
上記ヒト人工染色体及びマウス人工染色体は、本発明者らによって最初に開発されたものであり、染色体の由来により呼称が異なり、例えばヒト染色体由来の場合ヒト人工染色体と称し、一方マウス染色体由来の場合マウス人工染色体と称する（特許文献１、２及び３）。【０００９】
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、山中伸弥博士（京都大学）によって体細胞から人工的に作製された胚性幹（ＥＳ）細胞に類似した特徴を有する幹細胞であり、無限増殖性と分化多能性を有している（非特許文献６及び７）。ｉＰＳ細胞は、種々の組織の体細胞（幹細胞、前駆細胞又は成熟細胞）に分化することができるため、再生医療への応用が進められているし、また、遺伝性疾患の患者の体細胞から誘導されたｉＰＳ細胞は疾患モデル細胞を形成することから、医薬品開発のために利用されている（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】日本国特許第４９９７５４４号公報
【特許文献２】日本国特許第５５５７２１７号公報
【特許文献３】日本国特許第４８９５１００号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｍ．  Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１０，  １０：３７
【非特許文献２】Ｎ．  Ｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１３，  ６５：８０３−８０９
【非特許文献３】Ｍ  Ｈｉｒａｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１５，  １５：５８
【非特許文献４】Ｔ．  Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬＯＳ  ＯＮＥ，  ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１５７１８７  Ｊｕｎｅ  ７，  ２０１６
【非特許文献５】Ｐ．  Ｏｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈａｎｄｂ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００７，  １７８：１７７−２０２
【非特許文献６】Ｋ．  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｙａｍａｎａｋａ，  Ｃｅｌｌ  ２００６，  １２６（４）：６６３−６７６
【非特許文献７】Ｋ．  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ２００７，  １３１（５）：８６１−８７２
【非特許文献８】Ｖ．Ｋ．  Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１５，  ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｃｅｌｌ．２０１５．００００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
例えばヒト人工多能性幹細胞（以下、「ｉＰＳ細胞」とも称する。）に、目的ＤＮＡ（例えば、遺伝子、遺伝子座、染色体断片など）を含む外来染色体を導入するための技術の開発は、再生医療又は医薬品開発のために重要であるが、従来のトランスジェニック技術による遺伝子導入では導入できる遺伝子サイズに制限があり、また導入された遺伝子は宿主の染色体に組み込まれることから、安全性の問題、遺伝子発現制御の問題があった。【００１３】
従来の遺伝子導入法（例えばプラスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣなど）を用いて、一度にメガベース（Ｍｂ）サイズの巨大ＤＮＡ（例えば染色体、その断片、人工染色体など）をヒトｉＰＳ細胞に導入することはできなかった。また、ヒトｉＰＳ細胞に染色体を導入する際に、フィーダー細胞上での培養法が使用されたが、ヒトｉＰＳ細胞に染色体を導入することはできなかった。さらに、ヒトｉＰＳ細胞に染色体を導入する際に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法を用いたＭＭＣＴ法が使用されてきたが、ヒトｉＰＳ細胞に染色体を導入することはできなかった。【００１４】
本発明の目的は、メガベース（Ｍｂ）サイズの外来染色体を含むヒトｉＰＳ細胞を製造する方法を提供することである。この方法では、外来染色体が人工染色体（例えば哺乳類人工染色体、ヒト人工染色体、マウス人工染色体など）である場合、人工染色体はヒトｉＰＳのゲノムに組み込まれない。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、以下の特徴を包含する。
（１）外来染色体を含むヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を製造するための方法であって、ウイルスエンベロープタンパク質を細胞表面に発現する及び目的ＤＮＡを有する外来染色体を含む供与細胞を準備する工程、上記供与細胞から微小核細胞を作製する工程、並びにＭＭＣＴ（Ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）法を用いて、上記微小核細胞と、受容細胞としてのヒトｉＰＳ細胞とをフィーダー細胞非存在下で共培養して融合し、上記目的ＤＮＡを有する外来染色体を上記ヒトｉＰＳ細胞に導入する工程を含む、上記方法。
（２）上記外来染色体が、人工染色体又は哺乳類人工染色体である、上記（１）に記載の方法。
（３）上記ウイルスエンベロープタンパク質が、麻疹ウイルス由来エンベロープタンパク質又はその改変体である、上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）上記改変体が、麻疹ウイルス由来Ｈタンパク質と、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ１３抗体もしくは抗ＣＤ７１抗体、又は前記抗体のＳｃＦｖとの融合タンパク質である、上記（３）に記載の方法。
（５）上記供与細胞が、哺乳類細胞である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）上記哺乳類細胞が、齧歯類細胞である、上記（５）に記載の方法。
（７）上記目的ＤＮＡが、外来遺伝子、遺伝子座又は染色体断片である、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法によって、外来遺伝子を有する外来染色体を含むヒトｉＰＳ細胞を作製する工程、並びに、上記ヒトｉＰＳ細胞において、或いは上記ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導されたヒトｉＰＳ細胞由来未分化もしくは分化細胞において、上記外来遺伝子を発現する工程を含む、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞由来未分化もしくは分化細胞において外来遺伝子を発現する方法。
（９）上記ヒトｉＰＳ細胞由来未分化もしくは分化細胞が、幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、筋衛星細胞、前駆細胞、成熟細胞、又はその細胞集団である、上記（８）に記載の方法。
（１０）上記ヒトｉＰＳ細胞由来未分化もしくは分化細胞が、神経細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、巨核球細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、膵細胞、腎細胞、及び小腸細胞からなる群から選択される、上記（９）に記載の方法。
（１１）上記外来遺伝子を含むＤＮＡの上流及び／又は下流にインスレーター様ＤＮＡ配列を含む、上記（８）〜（１０）のいずれかに記載の方法。【００１６】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１８−１９１８９４号の開示内容を包含する。【００１７】
本発明により、ヒトｉＰＳ細胞に外来染色体を効率よく導入することができるため、外来染色体が目的ＤＮＡを含むときにはヒトｉＰＳ細胞を再生医療や医薬品開発に使用できるという有用性が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】この図は、Ｔａｋｉｇｕｃｈｉら（ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ．  Ｂｉｏｌ．２０１４；３：９０３−９１４）の方法によるＭＡＣ５およびＭＡＣ６の作製手順と構造を示す。図中、黒丸はセントロメアを表し、白三角はテロメアを表す。また、ＨＳ４はインスレーター、ＣＡＧ及びＰＧＫはそれぞれプロモーター、ＥＧＦＰは蛍光タンパク質をコードする遺伝子、ｎｅｏ及びｐｕｒｏはそれぞれ薬剤耐性遺伝子、ＨＰＲＴはヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を表す。
【図２】この図は、ヒトｉＰＳ細胞株に対してＭＡＣベクターを導入した際の蛍光顕微鏡像を示す。左パネルは明視野像、右パネルは対応するＧＦＰ蛍光視野像を示す。
【図３】この図は、ＭＡＣベクター（ＭＡＣ５、ＭＡＣ６）を導入したヒトｉＰＳ細胞クローンのＰＣＲ解析の結果を示す。２０１Ｂ７はベクター非導入ヒトｉＰＳ細胞であり、バンドが出現しない陰性対照である。ＣＨＯ  ＭＡＣ５およびＣＨＯ  ＭＡＣ６は導入したＭＡＣベクターを保持する陽性対照である。２０１Ｂ７ＭＡＣ５＃１、２０１Ｂ７ＭＡＣ５＃２、２０１Ｂ７ＭＡＣ５＃４、及び２０１Ｂ７ＭＡＣ６＃１は導入したＭＡＣベクターを保持するクローンである。
【図４】この図は、ヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７にＭＡＣ５（左パネル）もしくはＭＡＣ６（右パネル）を導入したクローンのキナクリン・ヘキスト染色における核型解析結果を示す。染色体は、左上から右下に向かって順番に１番〜２２番、Ｘ、Ｙ、ＭＡＣを示す。
【図５】この図は、ヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７にＭＡＣ５（左パネル）もしくはＭＡＣ６（右パネル）を導入したクローンのキナクリン・ヘキスト染色におけるモダル解析結果を示す。
【図６】この図は、ヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７ＭＡＣ５＃２（上段）もしくは２０１Ｂ７ＭＡＣ６＃１（下段）由来奇形種のヘマトキシリン・エオジン染色像を示す。観察された、内胚葉組織（左パネル）、中胚葉組織（中パネル）、外胚葉組織（右パネル）を示す。
【図７】この図は、ヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７ＭＡＣ６＃１の蛍光顕微鏡によるＧＦＰ蛍光観察像を示す。長期培養前０ＰＤＬ時点でのＧＦＰ蛍光観察像（上段）と長期培養後２０ＰＤＬ時点でのＧＦＰ蛍光観察像（下段）を示す。
【図８】この図は、ヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７ＭＡＣ６＃１の長期培養におけるキナクリン・ヘキスト染色による核型解析結果を示す。染色体は、左上から右下に向かって順番に１番〜２２番、Ｘ、Ｙ、ＭＡＣを示す。長期培養前０ＰＤＬ時点での解析結果（左）とＧ４１８選抜培養下での長期培養後２０ＰＤＬ時点での解析結果（中）、Ｇ４１８非選抜培養下での長期培養後２０ＰＤＬ時点での解析結果（右）を示す。
【図９】この図は、表示のプライマーを用いたときの、ヒトｉＰＳ細胞株（ＤＭＤ−ｉＰＳ＃１）にＤＹＳ−ＨＡＣ２を導入したクローンのＰＣＲ解析結果を示す。ＤＭＤ−ｉＰＳ＃１は非導入ＤＭＤ患者由来ｉＰＳ細胞であり、バンドが出現しない陰性対照である。ＣＨＯ  ＤＹＳ−ＨＡＣ２は導入したＤＹＳ−ＨＡＣ２ベクターを保持する陽性対照である。ＤＭＤ−ｉＰＳ  ＤＹＳ−ＨＡＣ２＃２，５，８，９は導入したＤＹＳ−ＨＡＣ２ベクターを保持するクローンである。
【図１０】この図は、ヒトアルファサテライト及び、ＲＰ１１−９５４Ｂ１６をプローブとして用いたときの、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者由来ヒトｉＰＳ細胞株（ＤＭＤ−ｉＰＳ＃１）にＤＹＳ−ＨＡＣ２を導入したクローンのＦＩＳＨ染色結果を示す。赤色（矢印）でヒト１３番、２１番、もしくはＤＹＳ−ＨＡＣ２を染色している。また、緑色（矢頭）でジストロフィン遺伝子を染色している。小窓にＤＹＳ−ＨＡＣ２ベクターを拡大して示している。
【図１１】この図は、ＤＭＤ患者由来ヒトｉＰＳ細胞株にＤＹＳ−ＨＡＣ２を導入したクローンＤＭＤ−ｉＰＳ  ＤＹＳ−ＨＡＣ２＃８由来奇形種のヘマトキシリン・エオジン染色像を示す。観察された、内胚葉組織（左パネル）、中胚葉組織（中パネル）、外胚葉組織（右パネル）を示す。
【図１２】この図は、正常ヒトｉＰＳ細胞株に２１番染色体を導入した外来ヒト２１番断片含有ヒトｉＰＳ細胞株のキナクリン・ヘキスト染色における核型解析結果を示す。染色体は、左上から右下に向かって順番に１番〜２２番、Ｘ、Ｙを示す。３本の２１番染色体を含有することを示している。
【図１３】この図は、正常ヒトｉＰＳ細胞株に２１番染色体を導入した外来ヒト２１番断片含有ヒトｉＰＳ細胞株由来奇形種のヘマトキシリン・エオジン染色像を示す。観察された、内胚葉組織（左パネル）、中胚葉組織（中パネル）、外胚葉組織（右パネル）を示す。
【図１４】この図は、表示のプライマーを用いたときの、ＭＡＣベクター上に外来ＤＮＡを搭載したヒトｉＰＳ細胞クローンのＰＣＲ解析の結果を示す。２０１Ｂ７および、２０１Ｂ７／ＭＡＣ６は非搭載細胞であり、バンドが出現しない陰性対照である。ＳＩＭ＃１は外来ＤＮＡが搭載されたＭＡＣベクターを保持するヒトｉＰＳ細胞クローンである。
【図１５】この図は、ヒトｉＰＳ細胞株（２０１Ｂ７／ＭＡＣ６）内のＭＡＣベクター（ＭＡＣ６）上に３種のプラスミドベクターを導入したクローンに対して、マウスＣｏｔ−１ＤＮＡ及び、ｐＢＧ２−Ｖ０ｂｉｎｓＥｌｕｃｉｎｓをプローブとして用いたときの、ＦＩＳＨ染色結果を示す。赤色（矢印）でマウス人工染色体（ＭＡＣ６）を染色している。また、緑色（矢頭）でｐＢＧ２−Ｖ０ｂｉｎｓＥｌｕｃｉｎｓを染色している。小窓にプラスミドベクターを導入したＭＡＣ６ベクターを拡大して示している。
【図１６】この図は、外来ＤＮＡを搭載したヒトｉＰＳ細胞クローンＳＩＭ＃１由来奇形種のヘマトキシリン・エオジン染色像を示す。観察された、内胚葉組織（左パネル）、中胚葉組織（中パネル）、外胚葉組織（右パネル）を示す。
【図１７】この図は、外来ＤＮＡを搭載したヒトｉＰＳ細胞クローンＳＩＭ＃１の蛍光顕微鏡によるＧＦＰ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＢＦＰ２蛍光観察像を示す。長期培養前０ＰＤＬ時点での各種蛍光観察像を示す。
【図１８】この図は、外来ＤＮＡを搭載したヒトｉＰＳ細胞クローンＳＩＭ＃１の長期培養におけるキナクリン・ヘキスト染色による核型解析結果を示す。染色体は、左上から右下に向かって順番に１番〜２２番、Ｘ、Ｙ、ＭＡＣを示す。長期培養前０ＰＤＬ時点での解析結果（左パネル）とＧ４１８選抜培養下での長期培養後２０ＰＤＬ時点での解析結果（中パネル）、Ｇ４１８非選抜培養下での長期培養後２０ＰＤＬ時点での解析結果（右パネル）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明をさらに詳細に説明する。
【００２０】
１．外来染色体を含むヒトｉＰＳ細胞の製造方法
本発明は、外来染色体を含むヒトｉＰＳ細胞を製造するための方法を提供する。
上記方法は、以下に説明する第１工程〜第３工程を含む。
【００２１】
［第１工程］
この工程は、ウイルスエンベロープタンパク質を細胞表面に発現する及び目的ＤＮＡを有する外来染色体を含む供与細胞を準備する工程である。
【００２２】
本明細書中「外来染色体」という用語は、供与細胞に本来存在しない染色体であり、例えば、供与細胞と異なる起源の哺乳動物細胞の染色体もしくはその染色体断片、或いは、人工的に作製された染色体（「人工染色体」という）を含む。
【００２３】
本明細書中「人工染色体」という用語は、ヒト及び齧歯類（例えばマウス、ラットなど）を含む哺乳動物（「哺乳類」ともいう。）由来の染色体のセントロメア、長腕及び、もしあれば、短腕のセントロメア近傍の断片（可能なかぎり遺伝子類が除去されている。）、及び天然もしくは人工テロメアを含む、人工的に作製された染色体由来ベクターを指す。従って、本発明の人工染色体は、従来のベクター系であるウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、コスミド、プラスミドなどと異なる。
【００２４】
外来染色体には、目的ＤＮＡ（例えば遺伝子、遺伝子座、染色体断片など）を挿入する部位が含まれており、この部位に目的ＤＮＡが挿入される。外来染色体の例には、例えば人工染色体、例えば哺乳類人工染色体、マウス人工染色体、ヒト人工染色体などが含まれる。
【００２５】
マウス人工染色体については、例えば日本国特許第５５５７２１７号公報、日本国特許第４９９７５４４号公報などに、またヒト人工染色体については、例えば日本国特許第４８９５１００号公報にそれぞれ記載されている。
【００２６】
マウス人工染色体の作製に使用するためのマウス染色体は、マウス染色体１〜１９、Ｘ及びＹのいずれでもよいが、好ましくは１番〜１９番染色体のいずれかである。例えばマウス１１番染色体断片由来の人工染色体ベクターの場合には、上記長腕断片は、非限定的に例えば、該１１番染色体の長腕のＡＬ６７１９６８、或いはＢＸ５７２６４０（ＡＬ６７１９６８よりセントロメア側に位置する。）、ＣＲ９５４１７０（ＡＬ６７１９６８及びＢＸ５７２６４０よりセントロメア側に位置する。）又はＡＬ７１３８７５（ＡＬ６７１９６８よりセントロメア側に位置する。）、よりも遠位の領域が削除された長腕断片からなる。或いは、マウス１５番染色体断片由来のマウス人工染色体の場合、上記長腕断片は、例えば、ＡＣ１２１３０７、ＡＣ１６１７９９などの位置よりも遠位の領域が削除された長腕断片からなる。或いは、マウス１６番染色体断片由来のマウス人工染色体の場合、上記長腕断片は、例えば、ＡＣ１２７６８７、ＡＣ１４０９８２などの位置よりも遠位の領域が削除された長腕断片からなる。
【００２７】
ヒト人工染色体の作製に使用するためのヒト染色体は、ヒト染色体１〜２２、Ｘ及びＹのいずれでもよいが、好ましくは１番〜２２番染色体のいずれかである。ヒト人工染色体の作製は、例えば特開２０１０−００４８８７号公報、ＷＯ２００８／０１３０６７などに記載されている方法を参照することができる。
【００２８】
外来染色体には、目的ＤＮＡ（例えば遺伝子、遺伝子座、染色体断片など）を挿入するための、ｌｏｘＰ（Ｃｒｅリコンビナーゼ認識部位）、ＦＲＴ（Ｆｌｐリコンビナーゼ認識部位）、φＣ３１ａｔｔＢ及びφＣ３１ａｔｔＰ（φＣ３１リコンビナーゼ認識部位）、Ｒ４ａｔｔＢ及びＲ４ａｔｔＰ（Ｒ４リコンビナーゼ認識部位）、ＴＰ９０１−１ａｔｔＢ及びＴＰ９０１−１ａｔｔＰ（ＴＰ９０１−１リコンビナーゼ認識部位）、或いはＢｘｂ１ａｔｔＢ及びＢｘｂ１ａｔｔＰ（Ｂｘｂ１リコンビナーゼ認識部位）などのＤＮＡ配列挿入部位をさらに含むことができる。また、外来染色体は、目的ＤＮＡ配列を挿入するための部位を含むことができるため、この部位に、目的ＤＮＡを組み込むことによって、該外来染色体が任意の細胞に導入されたときに該目的ＤＮＡを発現することが可能となる。
【００２９】
目的ＤＮＡは、非限定的に、例えば有用遺伝子、疾患原因遺伝子、治療用遺伝子、それらの遺伝子を含む染色体断片、細胞分化に必要な遺伝子、レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子（ポジティブ選択マーカー遺伝子、ネガティブ選択マーカー遺伝子など）などを包含する。
【００３０】
本発明の外来染色体における目的ＤＮＡの挿入部位の近傍又は挿入部位の両側には、少なくとも１つのインスレーター配列を存在させることができる。インスレーター配列は、エンハンサーブロッキング効果（すなわち、隣り合う遺伝子が互いに影響を受けない）又は染色体バウンダリー効果（遺伝子発現を保証する領域と遺伝子発現が抑制される領域を隔て区別する）を有する。このような配列には、例えばヒトβグロビンＨＳ１〜ＨＳ５、ニワトリβグロビンＨＳ４などが包含されてもよい。
【００３１】
上記供与細胞には、上記の目的ＤＮＡが、例えば以下の手順によって外来染色体に導入される。遺伝子導入は、例えばリポフェクション法などの遺伝子導入法を用いて行うことができる。このとき、外来染色体を含む供与細胞は、例えば薬剤選択、ＨＡＴ選択などの選別法によって選択しうる。
【００３２】
供与細胞は、微小核形成能を有する細胞、好ましくは哺乳類細胞であり、例えばヒト細胞、齧歯類細胞などを含む。具体的には、供与細胞は、哺乳類の臓器、器官の組織に由来する細胞など、例えばそれらの初代培養細胞、株化細胞、不死化細胞、ＡＴＣＣ寄託細胞などを含むことができる。そのような細胞の例は、上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞、肝細胞、筋細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、心筋細胞、毛乳頭細胞、神経細胞、卵巣細胞、ｉＰＳ細胞などである。齧歯類細胞の例は、非限定的に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスＡ９細胞などである。
【００３３】
供与細胞にはさらに、その細胞表面にウイルスエンベロープタンパク質を発現させるための処理が施される。
【００３４】
ウイルスエンベロープタンパク質は、例えば麻疹ウイルス、白血病ウイルス、エコトロピック（レトロ）ウイルス、アンホトロピック（レトロ）ウイルス水疱性口内炎ウイルスなどのウイルス由来のエンベロープタンパク質又はその改変体である。このエンベロープタンパク質には、麻疹ウイルス由来エンベロープタンパク質の場合、例えばヘマグルチニン（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；Ｈ）タンパク質及びフュージョン（Ｆｕｓｉｏｎ；Ｆ）タンパク質、それらの改変体、白血病ウイルス由来エンベロープタンパク質の場合、例えばＳＵタンパク質及びＴＭタンパク質、それらの改変体を含むことができる。好ましいウイルスエンベロープタンパク質は、麻疹ウイルス由来エンベロープタンパク質、例えばＨタンパク質及びＦタンパク質である。
【００３５】
さらに改変体の例として、Ｈタンパク質を遺伝子工学技術により、Ｈタンパク質が特定の受容細胞の表面抗原に結合可能にするように改変を加えることができる。例えば、抗体の抗原認識の最小単位ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ（ＳｃＦｖ）、好ましくは抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ１３抗体もしくは抗ＣＤ７１抗体、或いはこれらの抗体のＳｃＦｖをＨタンパク質に融合することで野生型Ｈタンパク質では融合できない細胞種に対しても融合可能となる。或いは、染色体受容細胞に対して、Ｈタンパク質に結合しうるＣＤ４６抗原、ＣＤ１２０（ＳＬＡＭ）抗原を発現するよう遺伝子改変を加えることで融合を引き起こすことができる。もしくは、Ｈタンパク質にＴａｇペプチド配列を付加することができ、受容細胞に抗Ｈｉｓ  ｔａｇ抗体もしくは、抗Ｈタンパク質抗体を発現するよう遺伝子改変を加えることで、融合を引き起こすことができる。或いは、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）が例示される。
【００３６】
上記各エンベロープタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミド、或いは複数のエンベロープタンパク質をコードするＤＮＡカセットを含むプラスミドを、遺伝子組換え技術によって構築し、これらのプラスミドで供与細胞を形質転換することができる。
【００３７】
供与細胞にはさらに、目的細胞の選択のために、薬剤耐性遺伝子（例えばブラストサイジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）耐性遺伝子、ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子など）及び／又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子（例えばＧＦＰ、ＤｓＲｅｄなど）を導入することができる。
【００３８】
上記の手法によってウイルスエンベロープタンパク質を細胞表面に発現する及び目的ＤＮＡを有する外来染色体を含む供与細胞を作製することができる。
【００３９】
［第２工程］
この工程は、上記第１工程の供与細胞から微小核細胞を作製する工程である。
【００４０】
供与細胞から、人工染色体を含む微小核細胞を作製するために、供与細胞を倍数体誘発剤（例えばコルセミド、コルヒチンなど）で処理することによって微小核多核細胞を形成し、さらにサイトカラシン処理により微小核体を形成する。
【００４１】
微小核細胞を作製するための処理条件は、上記供与細胞を、例えばコルセミド０．１μｇ／ｍＬ及び２０％ＦＣＳを含有するＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地中、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて７２時間培養することを含む。
【００４２】
［第３工程］
この工程は、ＭＭＣＴ（Ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ；微小核細胞融合）法を用いて、上記第２工程の微小核細胞と受容細胞としてのヒトｉＰＳ細胞とをフィーダー細胞非存在下で共培養して細胞融合し、目的ＤＮＡを有する外来染色体をヒトｉＰＳ細胞に導入する工程である。
【００４３】
本発明において使用する微小核細胞融合法は、人工染色体を含有する微小核形成能を有する細胞由来の微小核細胞（「供与細胞」）と、他の所望の細胞（「受容細胞」）との微小核細胞融合によって、供与細胞内の人工染色体を受容細胞内に移入する方法である。
【００４４】
本発明により、フィーダーフリー培養法及び、ウイルスエンベロープを用いるＭＭＣＴ法を使用することによって、外来染色体をヒトｉＰＳ細胞に導入することができる。
【００４５】
ｉＰＳ細胞は、体細胞（体性幹細胞を含む。）に、ある特定の再プログラム化因子（ＤＮＡ又はタンパク質）を導入し、適当な培地にて培養、継代培養することによって約３〜５週間でコロニーを生成する。再プログラム化因子は、例えばＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃからなる組み合わせ；Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４からなる組み合わせ；Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８からなる組み合わせ；あるいは、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８からなる組み合わせなどが知られている（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ；１２６：６６３−６７６（２００６）；ＷＯ２００７／０６９６６６；Ｍ．Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１−１０６（２００８）；Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ；１３１：８６１−８７２（２００７）；Ｊ．Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ；３１８：１９１７−１９２０（２００７）；Ｊ．Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ；Ｒｅｓ．１８，６００−６０３（２００８））。培養例は、マイトマイシンＣ処理したマウス胎仔線維芽細胞株（例えばＳＴＯ）をフィーダー細胞とし、このフィーダー細胞層上でＥＳ細胞用培地を用いて、再プログラム化因子発現ベクター導入体細胞（約１０４〜１０５細胞／ｃｍ２）を約３７℃の温度で培養することを含む。このときフィーダー細胞は必ずしも必要ではない（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ；１３１：８６１−８７２（２００７））。基本培地は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ハムＦ−１２培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、それらの混合培地などであり、ヒトｉＰＳ細胞用培地は、霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル社、日本）などを使用することができる。
【００４６】
フィーダー細胞の非存在下でのヒトｉＰＳ細胞の培養培地は、例えばＳｔｅｍＦｉｔＴＭ  ＡＫ０２Ｎ（リプロセル社、日本）、ＴｅＳＲＴＭ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ  ＸＦ／ＦＦ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭ  ＧＷＮＴ）などがあげられる。また培養用基質はＧｅｌｔｒｒｅｘＴＭ  ＬＤＥＶ−Ｆｒｅｅ  ｈＥＳＣ−ｑｕａｌｉｆｉｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１（ニッピ、日本）、ｈＥＳ  Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ  ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）などがあげられる。
【００４７】
フィーダー細胞の非存在下、上記例示の培地にて、第２工程で作製された微小核細胞とヒトｉＰＳ細胞を共培養して細胞融合を行う。その後、例えば薬剤（例えば抗生物質）を含む培地で培養することによって、薬剤耐性（及び蛍光陽性）を指標として外来染色体を含むヒトｉＰＳ細胞を選択し回収することができる。
【００４８】
細胞融合のための培養条件は、例えば、培地としてＳｔｅｍｆｉｔＴＭ（味の素、日本）、培養用基質としてｉＭａｔｒｉｘＴＭ−５１１（ニッピ、日本）０．５μｇ／ｍＬでの培養皿コーティング、温度として３７℃、期間として２４時間などである。
【００４９】
本発明の方法で作製されたヒトｉＰＳ細胞は、継代培養を重ねて行っても（例えば０ＰＤＬ〜２０ＰＤＬ）、蛍光陽性率に変化がなく、人工染色体はヒトｉＰＳ細胞内に安定に保持されることが証明された（後述の実施例参照）。
【００５０】
２．外来染色体中の外来遺伝子の発現方法
本発明はさらに、上記１．で作製されたヒト人工多能性幹細胞、又はヒト人工多能性幹細胞由来未分化もしくは分化細胞、において外来染色体中の少なくとも１つの外来遺伝子を発現する方法を提供する。
【００５１】
本発明の別の態様によれば、上記方法は、上記１．に記載の方法によって、外来遺伝子を有する外来染色体を含むヒトｉＰＳ細胞を作製する工程（以下、「第１工程」という）、並びに、上記ヒトｉＰＳ細胞において、或いは上記ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導されたヒトｉＰＳ細胞由来未分化もしくは分化細胞において、上記外来遺伝子を発現する工程（以下、「第２工程」という）を含む、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞由来未分化もしくは分化細胞において外来遺伝子を発現する方法を含む。
【００５２】
以下において第１工程及び第２工程について説明する。
［第１工程］
この工程では、上記１．に記載の方法によってヒトｉＰＳ細胞を作製する。したがって、上記１．に記載の方法をそのままここに引用する。
【００５３】
［第２工程］
この工程では、上記１．に記載の方法によって作製されたヒトｉＰＳ細胞において、或いは上記ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導されたヒトｉＰＳ細胞由来未分化もしくは分化細胞において、上記外来遺伝子を発現することを含む。
【００５４】
上記ヒトｉＰＳ細胞由来未分化もしくは分化細胞は、非限定的に、例えば幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、筋衛星細胞（骨格筋の幹細胞）、前駆細胞、成熟細胞、又はその細胞集団である。そのような細胞の例は、非限定的に、神経細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、巨核球細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、膵細胞、腎細胞、及び小腸細胞からなる群から選択される細胞又はその細胞集団である。
【００５５】
上記ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導によってヒトｉＰＳ細胞由来未分化もしくは分化細胞を作製するために、公知の方法、例えば中間中胚葉細胞（特表２０１３−５３０６８０号公報）、肝細胞（特開２０１４−１２８２１０号公報、再表２０１６／１４８２１６号公報）、血球細胞（再表２０１４／２０００３０号公報）、造血系細胞（再表２０１７／０３８９５８号公報）、造血幹細胞（Ｎ．  Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１３；２１（７）：１４２４−１４３１）、Ｔ細胞（再表２０１６／０１０１４８号公報、再表２０１７／１７９７２０号公報）、角膜内皮細胞（再表２０１３／０５１７２２号公報）、網膜色素上皮細胞（再表２０１５／０５３３７５号公報）、心筋細胞（再表２０１５／１８２７６５号公報）、骨格筋前駆細胞（再表２０１６／１０８２８８号公報）、腎前駆細胞（再表２０１７／０４３６６６号公報）、膵前駆細胞（再表２０１７／１８８３７８号公報）、神経幹細胞（再表２０１４／０６９４３１号公報）、神経系細胞（特開２０１６／１３１５４３号公報）、運動ニューロン（再表２０１７／２０９２９０号公報）、末梢神経細胞（再表２０１８／０７４５６７号公報）、ケラチノサイト（Ｉ．  Ｋｏｇｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１４；１１９５：１−１２）、血管平滑筋細胞（Ｓ．  Ａｙｏｕｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１７；１１３（１１）：１２８２−１２９３）などに記載の分化誘導法を参照することができる。
【００５６】
上記外来遺伝子（これは、上記１．に記載の目的ＤＮＡであってもよく、外来遺伝子を含む遺伝子座もしくは染色体断片を含むものとする。）は、上記のとおり、有用遺伝子、例えば疾患原因遺伝子、治療用遺伝子、それらの遺伝子を含む染色体断片、細胞分化に必要な遺伝子などを包含する。有用遺伝子は、非限定的に、例えば、サイトカイン類、例えばインターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、顆粒球コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、成長因子（例えば血小板由来生長因子、血管内皮成長因子、肝細胞成長因子、ケラチノサイト増殖因子、神経成長因子、等）、栄養因子（例えば神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、等）など、エリスロポエチン、血液凝固系タンパク質、血小板産生促進因子、ホルモン類、抗体類（例えばモノクローナル抗体、ｓｃＦＶなどの組換え抗体、等）、酵素類などのタンパク質をコードする遺伝子もしくはＤＮＡを含む。有用遺伝子はさらに、筋ジストロフィー、血友病、神経変性疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、遺伝性疾患、腫瘍などの疾患に関連する治療用遺伝子もしくはＤＮＡ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）などの免疫系遺伝子又はＤＮＡを含む
【００５７】
上記外来遺伝子を含むＤＮＡの上流及び／又は下流にインスレーター様ＤＮＡ配列を含んでもよい。インスレーター及びその例は、上記１．に記載の通りである。インスレーターは、好ましくはエンハンサーとプロモーターの間に挿入するとよい。本明細書の「インスレーター様」なる用語は、隣接する染色体環境の影響を遮断する作用を有する、かつインスレーター配列又はそれに類似する配列を含む広義の意味で使用される。
【００５８】
さらに、上記外来遺伝子を含むＤＮＡの発現のために必要な要素として、必要であれば外来のプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写開始部位、停止配列などの制御配列を含むことができる。
【００５９】
さらに、上記方法において、発現された外来遺伝子を含む細胞もしくは細胞集団を回収する工程を含んでもよい。
【００６０】
回収された細胞もしくは細胞集団は、ヒトｉＰＳ細胞については分化細胞の作製のために使用することができるし、またヒトｉＰＳ細胞由来未分化もしくは分化細胞については再生医療のために又は新薬の開発や毒性評価のために使用することができる。ここで新薬の開発に使用するヒトｉＰＳ細胞由来未分化もしくは分化細胞は、例えば遺伝性疾患などの難治性疾患をもつ患者の体細胞から誘導されたｉＰＳ細胞に由来してもよい。
【実施例】
【００６１】
以下の実施例を参照しながら、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、それらの実施例によって制限されないものとする。【００６２】
［実施例１］ヒトｉＰＳ細胞への人工染色体ベクターの導入
［Ａ］薬剤耐性遺伝子で標識されたＭＡＣベクターをヒトｉＰＳ細胞に導入することで、人工染色体保持ヒト細胞株を樹立する。【００６３】
［Ａ．１．１］微小核細胞融合及び薬剤耐性クローンの単離
ＭＡＣベクター（ＭＡＣ５もしくはＭＡＣ６（図１））含有ＣＨＯ細胞を１０ｃｍ直径培養皿１枚に播種し、９０％コンフルエントにまで培養した。これに抗ＣＤ９−ＳｃＦｖ融合ＭＶ−Ｈ発現プラスミドベクター１２μｇ及びＭＶ−Ｆ発現プラスミド１２μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて添付のプロトコールに従い導入した。２４時間後に２５ｃｍ２フラスコ３個にパッセージした翌日から、コルセミド処理（Ｆ１２／２０％ＦＢＳ／０．１μｇ／ｍＬコルセミド）を４８時間行い、再度培地交換を行い、コルセミド処理（Ｆ１２／２０％ＦＢＳ／０．１μｇ／ｍＬコルセミド）を２４時間行い、微小核を形成させた。コルセミド処理後、フラスコ内の培地を取り除き、フラスコの９分目までをサイトカラシンＢで満たした。フラスコを遠沈管にセットし、温湯（３４℃）をフラスコが隠れない程度に加え、ＪＬＡ−１０，５００  Ｒｏｔｏｒ（ＢＥＣＫＭＡＮ）で８，０００ｒｐｍ、１時間、３４℃で遠心分離した。遠心分離終了後、サイトカラシンＢを回収除去し、各フラスコ内のペレットを２ｍＬ無血清ＤＭＥＭ培地にて５０ｍＬチューブに回収した。孔径８μｍ、５μｍ、３μｍフィルターの順にフィルトレーションした後、２，０００ｒｐｍ、１０分、室温（ＲＴ）で遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し各チューブのペレットを受容（「レシピエント」ともいう）細胞培養用培地で懸濁して、レシピエント細胞を培養しているディッシュに添加し、インキュベートした。レシピエント細胞はヒトｉＰＳ細胞に対して予めラミニン−５１１  ０．５μｇ／ｍＬでコーティングした１０ｃｍ直径培養皿１枚に播種し、９０％コンフルエントに培養したものを使用した。２４時間後、１０ｃｍ直径培養皿３枚に再播種した。更に２４時間後に、９０μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８により選択培養を行った。３〜４週間選択培養した。結果として薬剤耐性コロニーがＭＡＣ５導入群から３個、ＭＡＣ６導入群から１個獲得された（図２）。これらを単離し増殖させ、以下の解析を行った。【００６４】
［Ａ．１．２］ＰＣＲ
Ｇ４１８耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として組換え体を選別するため以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＭＡＣベクターの存在を確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
ＴＲＡＮＳ  Ｌ１：５'−ＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＣ−３'（配列番号１）
Ｎｅｏ  Ｒ：５'−ＣＣＣＣＴＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡ−３'（配列番号２）【００６５】
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＥＸＴａｑ（ＴａＫａＲａ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃２分を３５サイクル行った。ＰＣＲの結果、薬剤耐性クローン全てがＭＡＣベクター陽性であった（図３）。【００６６】
［Ａ．１．３］キナクリン・ヘキスト二重染色よる核型解析
上記ＰＣＲ解析によって陽性であったクローンについて、上述の方法と同じようにキナクリン・ヘキスト二重染色を行った。キナクリン・ヘキスト二重染色したクローンの染色体像を蛍光顕微鏡により観察した（図４）。調べた２クローンにおいてＭＡＣベクターが６５％以上の割合で保持されていることがわかった（図５）。【００６７】
［Ａ．１．４］奇形種形成による多能性解析
上記で得られた２０１Ｂ７／ＭＡＣ５＃２、２０１Ｂ７／ＭＡＣ６＃１について、１×１０６個の細胞をＳＣＩＤマウスの精巣に移植した。その後４〜８週間後に形成された奇形種を採取し、１０％中性ホルマリンを用いて固定した。その後、ティシュー・テックＶＩＰ６ＡＩ（サクラファインテックジャパン）を用いてパラフィン包埋ブロックを作製した。パラフィンブ包埋ロックを薄切し、薄切切片とし、ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、組織学的な解析を実施した。結果として、内胚葉組織（図６左パネル）、中胚葉組織（図６中パネル）、外胚葉組織（図６右パネル）が観察された。これらの結果より、ＭＡＣベクター導入ヒトｉＰＳ細胞株において、多能性を持つことが示された。【００６８】
［Ｂ］人工染色体含有ｉＰＳ細胞内における人工染色体ベクターの安定性評価
得られたＭＡＣベクター含有ｉＰＳ細胞について、ヒトｉＰＳ細胞内における人工染色体ベクターの安定性を、蛍光顕微鏡を用いたＧＦＰ陽性率解析、キナクリン・ヘキスト二重染色による核型解析を用いた人工染色体ベクター含有率により、評価した。【００６９】
［Ｂ．１．１］ＭＡＣベクター含有ヒトｉＰＳ細胞における蛍光顕微鏡によるＭＡＣベクター安定性評価
ＭＡＣ６含有２０１Ｂ７についてのネオマイシン選択培養下での０ＰＤＬの培養開始時点，もしくは２０ＰＤＬの長期培養後においてＭＡＣ６保持細胞を示すＧＦＰ陽性細胞の割合を、蛍光顕微鏡を用いて計測した結果、０ＰＤＬ、２０ＰＤＬにおいても９０％以上の細胞がＧＦＰ陽性を示したことから、９０％以上のＭＡＣベクター保持率であったことからヒトｉＰＳ細胞内でＭＡＣベクターは安定に保持され、遺伝子発現も安定していると示された（図７）。【００７０】
［Ｂ．１．２］ＭＡＣベクター含有ヒトｉＰＳ細胞におけるキナクリン・ヘキスト二重染色による核型解析を用いた人工染色体ベクター含有率の評価
上述の方法を用いて、ＭＡＣ６含有２０１Ｂ７についてのネオマイシン誘導体Ｇ４１８非選択培養下での０ＰＤＬの培養開始時点，もしくは２０ＰＤＬの長期培養後においてＭＡＣ６保持細胞を検証するために、キナクリン・ヘキスト二重染色による核型解析を実施し、ＭＡＣベクター含有率を算出した。０ＰＤＬ時点では、４７,ＸＸ,＋ＭＡＣ６の核型を示す細胞がメジャーであり、９０％の細胞がＭＡＣ６を含有していた（図８左パネル）。Ｇ４１８存在下における２０ＰＤＬ培養時点では、同様に４７,ＸＸ,＋ＭＡＣ６である核型を示す細胞がメジャーであり、９０％の細胞がＭＡＣ６を含有していた（図８中パネル）。Ｇ４１８非存在下における２０ＰＤＬ培養時点では、４７,ＸＸ,＋ＭＡＣ６である核型を示す細胞がメジャーであり、７５％の細胞がＭＡＣ６を含有していた（図８右パネル）。人工染色体ベクター含有ヒトｉＰＳ細胞は長期培養後も核型が安定であることが示された。また、人工染色体ベクターはヒトｉＰＳ細胞内において、長期間維持されることが示された。【００７１】
[実施例２]デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）疾患患者由来ヒトｉＰＳ細胞への人工染色体ベクターの導入
［Ａ］薬剤耐性遺伝子で標識されたＤＹＳ−ＨＡＣ２ベクターをヒトＤＭＤ患者由来ｉＰＳ細胞株へ導入する。【００７２】
［Ａ．１．１］微小核細胞融合及び薬剤耐性クローンの単離
ＤＹＳ−ＨＡＣ２ベクター含有ＣＨＯ細胞を１０ｃｍ直径培養皿１枚に播種し、９０％コンフルエントにまで培養した。これに野生型ＭＶ−Ｈ発現プラスミドベクターもしくは、抗ＣＤ７１−ＳｃＦｖもしくはＣＤ９−ＳｃＦｖ融合ＭＶ−Ｈ発現プラスミドベクター１２μｇ及びＭＶ−Ｆ発現プラスミド１２μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて添付のプロトコールに従い導入した。２４時間後に２５ｃｍ２フラスコ３個にパッセージした翌日から、コルセミド処理（Ｆ１２／２０％ＦＢＳ／０．１μｇ／ｍＬコルセミド）を４８時間行い、再度培地交換を行い、コルセミド処理（Ｆ１２／２０％ＦＢＳ／０．１μｇ／ｍＬコルセミド）を２４時間行い、微小核を形成させた。コルセミド処理後、フラスコ内の培地を取り除き、フラスコの９分目までをサイトカラシンＢで満たした。フラスコを遠沈管にセットし、温湯（３４℃）をフラスコが隠れない程度に加え、ＪＬＡ−１０，５００  Ｒｏｔｏｒ（ＢＥＣＫＭＡＮ）で８，０００ｒｐｍ、１時間、３４℃で遠心分離した。遠心分離終了後、サイトカラシンＢを回収除去し、各フラスコ内のペレットを２ｍＬ無血清ＤＭＥＭ培地にて５０ｍＬチューブに回収した。孔径８μｍ、５μｍ、３μｍフィルターの順にフィルトレーションした後、２，０００ｒｐｍ、１０分、室温（ＲＴ）で遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し各チューブのペレットをレシピエント細胞培養用培地で懸濁して、レシピエント細胞を培養しているディッシュに添加し、インキュベートした。レシピエント細胞はヒトｉＰＳ細胞（ＤＭＤ−ｉＰＳ#1）に対して予めＧｅｌｔｒｅｘＴＭ  ＬＤＥＶ−Ｆｒｅｅ  ｈＥＳＣ−ｑｕａｌｉｆｉｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（５％濃度）でコーティングした１０ｃｍ直径培養皿１枚に播種し、９０％コンフルエントに培養したものを使用した。２４時間後、１０ｃｍ直径培養皿３枚に再播種した。更に２４時間後に、９０μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８により選択培養を行った。３〜４週間選択培養した。結果として薬剤耐性コロニーが野生型ＭＶ−Ｈを用いたＤＹＳ−ＨＡＣ２導入群から１０個、抗ＣＤ７１−ＳｃＦｖ融合ＭＶ−Ｈ発現プラスミドベクターを用いたＤＹＳ−ＨＡＣ２導入群から１２個、もしくはＣＤ９−ＳｃＦｖ融合ＭＶ−Ｈ発現プラスミドベクターを用いたＤＹＳ−ＨＡＣ２導入群から１０個、合計３２個のクローンを得た。これらを単離し増殖させ、以下の解析を行った。【００７３】
［Ａ．１．２］ＰＣＲ
上記で得たＧ４１８耐性である３２個のクローンのゲノムＤＮＡを鋳型として組換え体を選別するため以下のプライマーを用いてＰＣＲを行った。そのプライマー配列を以下に示す。
ＮｅｏＦ：５'−ＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧＣＴＧＣＴＣＴ−３'（配列番号３）
ＤｌｏｘＰ３Ｌ：５'−ＧＣＡＴＧＧＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＧＴＡ−３'（配列番号４）
ｈＣＭＶ５８６：５'−ＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＴ−３'（配列番号５）【００７４】
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐＴＭ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＥＸＴａｑ（ＴａＫａＲａ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ＤＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃２分を３５サイクル行った。ＰＣＲの結果、解析を実施した３２個のクローンのうち１１クローンについて陽性の結果を得た（図９）。【００７５】
［Ａ．１．３］ＦＩＳＨ解析による薬剤耐性クローンの選別
上記で得られたクローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でＦＩＳＨ解析を行った。ヒトアルファサテライト及び、ＲＰ１１−９５４Ｂ１６をプローブとして用いたときの、ヒトｉＰＳ細胞株（ＤＭＤ−ｉＰＳ＃１）にＤＹＳ−ＨＡＣ２を導入したクローンのＦＩＳＨ染色結果を図１０に示す。ヒト１３番、２１番、もしくはＤＹＳ−ＨＡＣ２を赤色（矢印）で染色している。また、緑色（矢頭）でジストロフィン遺伝子を染色している。図１０中、小窓にＤＹＳ−ＨＡＣ２ベクターを拡大して示している。【００７６】
［Ａ．１．４］奇形種形成による多能性解析
上記で得られたＤＭＤ−ｉＰＳ  ＤＹＳ−ＨＡＣ２  ＃８  について、１×１０６個の細胞をＳＣＩＤマウスの精巣に移植した。その後４〜８週間後に形成された奇形種を採取し、１０％中性ホルマリンを用いて固定した。その後、ティシュー・テックＶＩＰ６ＡＩ（サクラファインテックジャパン）を用いてパラフィン包埋ブロックを作製した。パラフィンブ包埋ロックを薄切し、薄切切片とし、ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、組織学的な解析を実施した。結果として、内胚葉組織（図１１左パネル）、中胚葉組織（図１１中パネル）、外胚葉組織（図１１右パネル）が観察された。これらの結果より、ＤＹＳ−ＨＡＣ２ベクター含有ヒトＤＭＤ患者由来ｉＰＳ細胞株において、多能性を持つことが示された。【００７７】
[実施例３]ヒトｉＰＳ細胞へのヒト２１番染色体断片の導入
［Ａ］薬剤耐性遺伝子で標識されたヒト２１番断片をヒトｉＰＳ細胞に導入することで、ヒト２１番染色体断片保持ヒト細胞株（ダウン症モデルｉＰＳ細胞株）を樹立する。【００７８】
［Ａ．１．１］微小核細胞融合及び薬剤耐性クローンの単離
ヒト２１番染色体断片含有ＣＨＯ細胞を１０ｃｍ直径培養皿１枚に播種し、９０％コンフルエントにまで培養した。これに抗ＣＤ９−ＳｃＦｖ融合ＭＶ−Ｈ発現プラスミドベクター１２μｇ及びＭＶ−Ｆ発現プラスミド１２μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて添付のプロトコールに従い導入した。２４時間後に２５ｃｍ２フラスコ３個にパッセージした翌日から、コルセミド処理（Ｆ１２／２０％ＦＢＳ／０．１μｇ／ｍＬコルセミド）を４８時間行い、再度培地交換を行い、コルセミド処理（Ｆ１２／２０％ＦＢＳ／０．１μｇ／ｍＬコルセミド）を２４時間行い、微小核を形成させた。コルセミド処理後、フラスコ内の培地を取り除き、フラスコの９分目までをサイトカラシンＢで満たした。フラスコを遠沈管にセットし、温湯（３４℃）をフラスコが隠れない程度に加え、ＪＬＡ−１０，５００  Ｒｏｔｏｒ（ＢＥＣＫＭＡＮ）で８，０００ｒｐｍ、１時間、３４℃で遠心分離した。遠心分離終了後、サイトカラシンＢを回収除去し、各フラスコ内のペレットを２ｍＬ無血清ＤＭＥＭ培地にて５０ｍＬチューブに回収した。孔径８μｍ、５μｍ、３μｍフィルターの順にフィルトレーションした後、２，０００ｒｐｍ、１０分、室温（ＲＴ）で遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し各チューブのペレットをレシピエント細胞培養用培地で懸濁して、レシピエント細胞を培養しているディッシュに添加し、インキュベートした。レシピエント細胞はヒトｉＰＳ細胞に対して予めＧｅｌｔｒｒｅｘＴＭ  ＬＤＥＶ−Ｆｒｅｅ  ｈＥＳＣ−ｑｕａｌｉｆｉｅｄ（５％濃度）でコーティングした１０ｃｍ直径培養皿１枚に播種し、９０％コンフルエントに培養したものを使用した。２４時間後、１０ｃｍ直径培養皿３枚に再播種した。更に２４時間後に、５０μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８により選択培養を行った。３〜４週間選択培養した。結果として薬剤耐性コロニー１個を得た。これらを単離し増殖させた。【００７９】
［Ａ．１．２］キナクリン・ヘキスト二重染色よる核型解析
上記薬剤耐性であったクローンについて、上述の方法と同じようにキナクリン・ヘキスト二重染色を行い、21番染色体を導入したことにより、２１番染色体を３本、独立に含有していることを確認することができた（図１２）。【００８０】
［Ａ．１．３］奇形種形成による多能性解析
上記で得られた外来ヒト２１番断片含有ヒトｉＰＳ細胞について、１×１０６個の細胞をＳＣＩＤマウスの精巣に移植した。その後４〜８週間後に形成された奇形種を採取し、１０％中性ホルマリンを用いて固定した。その後、ティシュー・テックＶＩＰ６ＡＩ（サクラファインテックジャパン）を用いてパラフィン包埋ブロックを作製した。パラフィンブ包埋ロックを薄切し、薄切切片とし、ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、組織学的な解析を実施した。結果として、内胚葉組織（図１３左パネル）、中胚葉組織（図１３中パネル）、外胚葉組織（図１３右パネル）が観察された。これらの結果より、外来ヒト２１番断片含有ヒトｉＰＳ細胞において、多能性を持つことが示された。【００８１】
[実施例４] ＭＡＣベクター含有ヒトｉＰＳ細胞内でのＭＡＣベクターへの遺伝子搭載
［Ａ］ヒトｉＰＳ細胞内における人工染色体上への遺伝子導入を実証するために、３遺伝子同時導入法により３種のプラスミドベクターを同時にヒトｉＰＳ細胞内のＭＡＣベクターに搭載した。【００８２】
［Ａ．１．１］ヒトｉＰＳ細胞内のＭＡＣベクターへの遺伝子挿入用プラスミドベクターの作製
カセットベクターを以下のように作製した。
（１）ｐＢＧ２−Ｖ０ｂｉｎｓＥｌｕｃｉｎｓ
ｐＢＧ２−Ｖ０のＡｓｃＩ／ＮｈｅＩ切断サイトにｐＢＧ２−Ｖ０ｂ（１Ｃ）のＡｓｃＩ／ＡｖｒＩＩサイトにＣＡＧ−ＥｌｕｃベクターのＡｓｃＩ／ＡｖｒＩＩ断片を挿入した。【００８３】
（２）ＧＬＶ２−ＥＦ１ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ
ｔＤＮＡ  ｐＥＦ  ＢＧＨｐＡのＥｃｏＲＩ切断サイトにＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩを挿入した。ｔＤＮＡ  ｐＥＦ  ＢＧＨｐＡ−ＸｂａＩのＸｂａＩサイトにｐＣＭＶ  ｔｄＴｏｍａｔｏのＮｈｅＩ／ＡｖｒＩＩ切断断片を挿入した（ｔＤＮＡ  ＥＦ１ａ  ｔｄＴｏｍａｔｏ）。ｔＤＮＡ  Ｅｆｉａ  ｔｄＴｏｍａｔｏのＡｓｃＩ／ＮｈｅＩにｐＢＧ２−Ｖｌａ（２Ａ）のＢｘｂＩ−ＰｈｉＣ３１＿ＣＬ＿Ｆ／ＢｘｂＩ−ＰｈｉＣ３１＿ＣＬ＿ＲでのＰＣＲ産物のＡｓｃＩ／ＡｖｒＩＩ切断断片を挿入した（ＧＬＶ２−ＥＦ１ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ）。【００８４】
（３）ＧＬＶ３−Ｎｅｏ−ＢＦＰ
ｔＤＮＡ−ＥＦ１ａＢＧＨｐＡのＥｃｏＲＩ切断サイトにｐＴａｇＢＦＰ２のＢＦＰ＿ｃｌ＿ＥｃｏＲＩ＿Ｆ／ＢＦＰ＿ｃｌ＿ＥｃｏＲＩ＿ＲでのＰＣＲ産物のＥｃｏＲＩ切断断片を挿入した（ｔＤＮＡ−ＥＦ１ａ−ＢＦＰ）。ｔＤＮＡ−ＥＦ１ａ−ＢＦＰのＡｓｃＩ／ＮｈｅＩ切断サイトにｐＢＧ２−Ｖ２ａ（３Ａ）のＰｈｉＣ３１ａｔｔ＿３'ＨＰＲＴ＿Ａｓｃ１＿Ｆ／ＰｈｉＣ３１ａｔｔ＿３'ＨＰＲＴ＿ｃｌ＿ＲでのＰＣＲ産物のＡｓｃＩ／ＡｖｒＩＩ切断断片を挿入した（ＧＬＶ３−ＥＦ１ａ−ＢＦＰ）。ＧＬＶ３−ＥＦ１ａ−ＢＦＰのＡｓｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片にｐＢＧ２−ｖ１ｂ１よりのＳＡ−Ｎｅｏ  ＡｖｒＩＩ  Ｆｗ／ＳＡ−Ｎｅｏ  ＡｇｅＩ  ＲｖでのＰＣＲ産物のＡｖｒＩＩ／ＡｇｅＩ断片、ＧＬＶ３−ＥＦ１ａ−ＢＦＰよりのＰｈｉＣ３１  ＡｓｃＩ  Ｆ／ＰｈｉＣ３１  ＡｖｒＩＩ  ＲでのＰＣＲ産物のＡｓｃＩ／ＡｖｒＩＩ断片、および、ＡｇｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｏｌｉｇｏの断片を挿入した（ＧＬＶ３−Ｎｅｏ−ＢＦＰ）。【００８５】
［Ａ．１．２］トランスフェクションおよびＧ４１８耐性クローンの単離
遺伝子導入はエレクトロポーレーターＮＥＰＡ２１（ＮＥＰＡＧＥＮＥ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を用いて行った。３×１０６個のｉＰＳ細胞をＰＢＳ、５ｍＬを用いて洗浄し、１２００ｒｐｍにて室温で５分間、遠心分離し、細胞を回収した。さらにＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．），５ｍＬを用いて、１２００ｒｐｍにて室温で５分間、遠心分離し、細胞を回収した。これを９０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁した。これにｐＢＧ２−Ｖ０ｂｉｎｓＥｌｕｃｉｎｓ３．５μｇ、ＧＬＶ２−ＥＦ１ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ７μｇ、ＧＬＶ３−ＥＦ１ａ−ＢＦＰ１０．５μｇ、Ｃｒｅ発現ベクター３μｇ、Ｂｘｂ１インテグレース発現ベクター３μｇ、ＰｈｉＣ３１インテグレース発現ベクター３μｇを混合し、ＮＥＰＡ２１エレクトロポーレーターを用いて、添付のプロトコールに従い、Ｐｏｒｉｎｇ  Ｐｕｌｓｅ（Ｖｏｌｔａｇｅ  １３５Ｖ、Ｐｕｌｓｅ  Ｌｅｎｇｔｈ  ５．０ｍｓｅｃ、Ｐｕｌｓｅ  Ｉｎｔｅｒｖａｌ  ５０ｍｓｅｃ、Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｐｕｌｓｅ  ２、Ｄｅｃａｙ  Ｒａｔｅ  １０％、Ｐｏｌａｒｉｔｙ  ＋）、  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｕｌｓｅ（Ｖｏｌｔａｇｅ  ２０Ｖ、Ｐｕｌｓｅ  Ｌｅｎｇｔｈ  ５０．０ｍｓｅｃ、Ｐｕｌｓｅ  ｉｎｔｅｒｖａｌ  ５０．０ｍｓｅｃ、Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｐｕｌｓｅ  ５、Ｄｅｃａｙ  Ｒａｔｅ  ４０％、Ｐｏｌａｒｉｔｙ  ＋／−）の条件にて導入した。導入後４８時間からＧ４１８（９０μｇ／ｍＬ）選択培養下で３〜４週間培養すると、蛍光陽性薬剤耐性コロニーが出現した。ＭＡＣベクター含有ヒトｉＰＳ細胞より１回の導入で得た１個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った。【００８６】
［Ｂ］薬剤耐性クローンの選別
［Ｂ．１．１］ＰＣＲ
ＨＡＴ耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として組換え体を選別するため以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、部位特異的に導入した遺伝子の挿入が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
ＴＲＡＮＳ  Ｌ１：５'−ＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＣ−３'（配列番号６）
ＳＩＭ  Ｎｅｏ  Ｒｖ：５'−ＣＧＣＣＴＴＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＡＡＣＡ−３'（配列番号７）
ｔｄＴｏｍａｔｏＦ：５'−ＡＣＡＡＣＡＡＣＡＴＧＧＣＣＧＴＣＡＴＣ−３'（配列番号８）
ｔｄＴｏｍａｔｏＲ：５'−ＣＡＴＧＣＣＧＴＡＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＴ−３'（配列番号９）
ＥｌｕｃＦ：５'−ＣＧＡＴＣＣＴＧＧＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＴ−３'（配列番号１０）
ＥｌｕｃＲ：５'−ＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＴＧＡＡＴＧＴＴＴＧ−３'（配列番号１１）
ＢＦＰ  Ｆｗ：５'−ＣＴＧＧＡＡＧＧＣＡＧＡＡＡＣＧＡＣＡＴ−３'（配列番号１２）
ＢＦＰ  Ｒｖ：５'−ＴＧＣＴＡＧＧＧＡＧＧＴＣＧＣＡＧＴＡＴ−３'（配列番号１３）【００８７】
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を用い、バッファーやｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９４℃１分の熱変性後、９８℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃２分を３５サイクル行った。ＰＣＲの結果、１クローンが陽性であった（図１４）。【００８８】
［Ｂ．１．２］セルアナライザーによる蛍光陽性頻度の解析
各クローンの各蛍光陽性頻度を定量するために、ＢＤ社製Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いて、ＥＧＦＰ、ＢＦＰ、ｔｄＴｏｍａｔｏの陽性頻度を測定した。各クローン１×１０５個を５００μＬのＰＢＳ（−）に懸濁し、測定を行った。結果としてＥＧＦＰ、ＢＦＰ、Ｔｄｔｏｍａｔｏ三重陽性細胞を含むクローンであった。【００８９】
［Ｂ．１．３］発光測定
各クローンのＥｍｅｒａｌｄ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現を検出するために、東洋ビーネット株式会社製のルシフェラーゼ・アッセイシステムを用いて発光測定を試薬の標準手順書に従い実施した。細胞は１×１０４個を用いて測定を実施し、Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現陽性であった。【００９０】
［Ｂ．１．４］ＦＩＳＨ解析による薬剤耐性クローンの選別
上記で得られたクローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でｍｏｕｓｅ  ｃｏｔ−１配列を赤色プローブとした（図１５の矢印）。ｐＢＧ２−Ｖ０ｂｉｎｓＥｌｕｃｉｎｓ、ＧＬＶ２−ＥＦ１ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏもしくはＧＬＶ３−ＥＦ１ａ−ＢＦＰを緑色プローブとしたＦＩＳＨ解析を行った（図１５の矢頭）。代表例としてＥｍｅｒａｌｄ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子（Ｅｌｕｃ）の搭載を示すｐＢＧ２−Ｖ０ｂｉｎｓＥｌｕｃｉｎｓおよび、ｍｏｕｓｅ  ｃｏｔ−１配列をプローブとした染色結果を示す。結果から、外来ＤＮＡを挿入されたＭＡＣベクターが宿主染色体から独立して保持されていた。【００９１】
［Ｂ．１．５］奇形種形成による多能性解析
上記で得られた外来ＤＮＡ搭載ＭＡＣベクター含有ヒトｉＰＳ細胞について、１×１０６個の細胞をＳＣＩＤマウスの精巣に移植した。その後４〜８週間後に形成された奇形種を採取し、１０％中性ホルマリンを用いて固定した。その後、ティシュー・テックＶＩＰ６ＡＩ（サクラファインテックジャパン、日本）を用いてパラフィン包埋ブロックを作製した。パラフィンブ包埋ロックを薄切し、薄切切片とし、ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、組織学的な解析を実施した。結果として、内胚葉組織（図１６左パネル）、中胚葉組織（図１６中パネル）、外胚葉組織（図１６右パネル）が観察された。これらの結果より、外来ＤＮＡ搭載ＭＡＣベクター含有ヒトｉＰＳ細胞において、多能性を持つことが示された。【００９２】
［Ｃ］外来ＤＮＡ搭載ＭＡＣベクター含有ヒトｉＰＳ細胞におけるＭＡＣベクター安定性と遺伝子発現持続性
得られた外来ＤＮＡ搭載ＭＡＣベクター含有ｉＰＳ細胞について、ヒトｉＰＳ細胞内における人工染色体ベクターの安定性を、蛍光顕微鏡を用いた蛍光タンパク質陽性率解析、キナクリン・ヘキスト二重染色による核型解析を用いた人工染色体ベクター含有率解析により、評価した。【００９３】
［Ｃ．１．１］外来ＤＮＡ搭載ＭＡＣベクター含有ヒトｉＰＳ細胞における蛍光顕微鏡によるＭＡＣベクター安定性と遺伝子発現持続性評価
上記で得られた外来ＤＮＡ搭載ＭＡＣベクター含有ヒトｉＰＳ細胞について、０ＰＤＬ培養開始時点、ネオマイシン非選択培養下での２０ＰＤＬ長期培養時点での、外来ＤＮＡ搭載ＭＡＣベクター含有ヒトｉＰＳ細胞のＧＦＰ陽性率、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性率、ＢＦＰ２陽性率を蛍光顕微鏡により評価した。計測の結果、０ＰＤＬにおいては、ＧＦＰ，ｔｄＴｏｍａｔｏ，ＢＦＰ２いずれも陽性である細胞が存在した（図１７）。２０ＰＤＬ長期培養後も遺伝子発現が認められた。このことから、外来ＤＮＡ搭載ＭＡＣベクターはヒトｉＰＳ細胞内において、長期間、搭載した外来ＤＮＡを発現可能であると示された。【００９４】
［Ｃ．１．２］
外来ＤＮＡ搭載ＭＡＣベクター含有ヒトｉＰＳ細胞におけるキナクリン・ヘキスト二重染色による核型解析を用いた人工染色体ベクター含有率の評価
上述の方法を用いて、外来ＤＮＡ搭載ＭＡＣベクター含有２０１Ｂ７についてのネオマイシン誘導体Ｇ４１８非選択培養下での０ＰＤＬの培養開始時点，もしくは２０ＰＤＬの長期培養後においてＭＡＣ６保持率を検証するために、キナクリン・ヘキスト二重染色による核型解析を実施し、ＭＡＣベクター含有率を算出した。０ＰＤＬ時点では、４７,ＸＸ,＋ＭＡＣ６の核型を示す細胞がメジャーであり、９５％の細胞がＭＡＣ６を含有していた（図１８左パネル）。Ｇ４１８存在下における２０ＰＤＬ培養時点では、同様に４７,ＸＸ,＋ＭＡＣ６である核型を示す細胞がメジャーであり、９０％の細胞がＭＡＣ６を含有していた（図１８中パネル）。Ｇ４１８非存在下における２０ＰＤＬ培養時点では、４７,ＸＸ,＋ＭＡＣ６である核型を示す細胞がメジャーであり、７５％の細胞がＭＡＣ６を含有していた（図１８右パネル）。人工染色体ベクター含有ヒトｉＰＳ細胞は長期培養後も核型が安定であることが示された。また、外来ＤＮＡ搭載人工染色体ベクターはヒトｉＰＳ細胞内において、長期間維持されることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の方法によって、目的ＤＮＡを有するメガベース（Ｍｂ）サイズの人工染色体を含むヒトｉＰＳ細胞を製造すること、並びに、ヒトｉＰＳ細胞、又はヒトｉＰＳ細胞から分化誘導されたヒトｉＰＳ細胞由来未分化もしくは分化細胞において、目的ＤＮＡ（例えば外来遺伝子）を発現することが可能である。この方法は、ヒトｉＰＳ細胞を利用した再生医療や医薬品開発に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００９６】
配列番号１〜１３：プライマー【００９７】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2020075822.tif 000003
【図２】
2020075822.tif 000004
【図３】
2020075822.tif 000005
【図４】
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【図５】
2020075822.tif 000007
【図６】
2020075822.tif 000008
【図７】
2020075822.tif 000009
【図８】
2020075822.tif 000010
【図９】
2020075822.tif 000011
【図１０】
2020075822.tif 000012
【図１１】
2020075822.tif 000013
【図１２】
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【図１３】
2020075822.tif 000015
【図１４】
2020075822.tif 000016
【図１５】
2020075822.tif 000017
【図１６】
2020075822.tif 000018
【図１７】
2020075822.tif 000019
【図１８】
2020075822.tif 000020
【配列表】
2020075822000001.app
【国際調査報告】
2020075822.tif 000021
2020075822.tif 000022
2020075822.tif 000023
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