(57)【要約】本開示は、免疫寛容の新たな技術を提供する。本開示は詳細には、ＣＤ８０／ＣＤ８６とＣＤ２８との相互作用を阻害する阻害因子によりアナジーが誘導された細胞を含む細胞製剤を臓器移植患者（レシピエント）に投与して、免疫寛容を誘導する技術において、細胞製剤に由来する細胞がレシピエントから無くなってしまっても免疫寛容が続くこと（感染性免疫寛容）を初めて見出した。さらに、このような細胞製剤は、アレルギーやｉＰＳ細胞等またはそれらに由来する細胞、組織または臓器によって生じる免疫拒絶反応に対する免疫寛容を惹起することができることが実証された。
2019245039.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において、ドナーに対する恒久的な免疫寛容（感染性免疫寛容）を惹起するための組成物であって、該組成物は、
ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、該ドナーに由来する抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞
を含む、組成物。
【請求項２】
前記免疫寛容は、前記被験体におけるCD8陽性T細胞において免疫寛容が惹起されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、請求項３〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
被験体において、疾患、障害または状態を予防または治療する方法であって、該方法は、
１）  ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合することによってアナジーが誘導された細胞を含む製剤を該被験体に投与する工程と、
２）  該被験体のＴ細胞のアナジー状態を確認し、アナジー状態が確認できる場合はさらなる処置をせず、アナジー状態が確認できない場合、該細胞を含む製剤を再度投与する工程と
を含む、方法。
【請求項１０】
前記製剤は、ＣＤ４陽性アナジー細胞、ＣＤ８陽性アナジー細胞、またはそれらの組合せを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記製剤は、ＣＤ８陽性アナジー細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アナジー状態の確認は、前記細胞を含む製剤が消失することを確認する工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、およびｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記疾患、障害または状態はアレルギーを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記疾患、障害または状態は、ｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
被験体のアレルギーを治療または予防するための組成物であって、該組成物は、
ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、アレルギーの原因となっている抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞
を含む、組成物。
【請求項２３】
前記アレルギーの原因となっている抗原は、食品、花粉、薬品、および金属から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
被験体において、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器によって生じる免疫拒絶反応を抑制するまたは予防するための組成物であって、該組成物は、
ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、該ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞に由来する抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞
を含む、組成物。
【請求項２５】
制御性Ｔ細胞ではない、アナジーが誘導されたＴ細胞。
【請求項２６】
制御性Ｔ細胞ではない、被験体に対してアナジーが誘導されたＴ細胞を製造する方法であって、
Ａ）ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合する工程と、
Ｂ）該混合物を培養してＴ細胞を得る工程と、
Ｃ）必要に応じて、該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物で該Ｔ細胞を刺激し、該Ｔ細胞が反応しないことを確認する工程と
を包含する、方法。
【請求項２７】
前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性細胞および／またはＣＤ８陽性細胞を含む、請求項２５に記載のＴ細胞または請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
特定の抗原に対する、被験体内のＣＤ８陽性Ｔ細胞の無反応または低反応を誘導するための組成物。
【請求項３５】
ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該験検体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞を含む、該被験体に由来しない抗原によって生じる疾患、障害または状態を処置または予防するための医薬。
【請求項３６】
前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３５に記載の医薬。
【請求項３７】
前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、請求項３６に記載の医薬。
【請求項３８】
前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、請求項３７に記載の医薬。
【請求項３９】
前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、請求項３７に記載の医薬。
【請求項４０】
前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項４１】
前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、請求項４０に記載の医薬。
【請求項４２】
前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、およびｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、請求項３６に記載の医薬。
【請求項４３】
前記疾患、障害または状態はアレルギーを含む、請求項３６に記載の医薬。
【請求項４４】
前記疾患、障害または状態は、ｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応を含む、請求項３６に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、免疫寛容に関する新規技術に関する。より特定すると、本開示は、アナジーＴ細胞を含む医薬組成物、当該医薬組成物の製造、および当該医薬組成物の品質管理に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓移植は、末期の肝不全の患者に対する最終的な処置として広く使用されてきた。毎年、日本国外では２０、０００以上の症例があり、日本では５００を超える症例がある。【０００３】
移植は、末期の腎臓、心臓、肝臓、膵臓等の臓器不全に対して選択される主な処置の１つであり、近年における移植拒絶反応の処置の著しい進歩にもかかわらず、免疫抑制レジメン無しには移植の大部分は最終的には拒絶される。連続的な薬物療法に依存する現在の免疫抑制レジメンは、薬物では移植に対して明確に向けられた反応のみならず、全ての免疫反応を抑制するため、臓器移植患者に、感染症や癌に対する感受性の増加を生じやすくしてしまう。【０００４】
この免疫寛容を誘導する技術として、Ｔ細胞の抗原特異的な免疫不応答（アナジー）の誘導がある。具体的には、抗原提示細胞上のＣＤ８０／ＣＤ８６と未活性化（ナイーブ）Ｔ細胞上のＣＤ２８との相互作用を阻害する抗体を臓器移植患者に直接投与して生体内でドナー抗原特異的アナジーを誘導する技術（特許文献１）や、同じ抗体の存在下でレシピエント細胞と放射線照射したドナー細胞を共培養により体外でドナー抗原特異的アナジー細胞を誘導し、レシピエントに戻す技術が報告されている（特許文献２、特許文献３および非特許文献1〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００２−５０４１２０号公報
【特許文献２】特表２００７−１３１５９８号公報
【特許文献３】特表２０１６−５２００８１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓａｔｏｒｕ  Ｔｏｄｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｒｏｇｙ、  ６４（ｖｏｌ．２）、６３２−６４３  （２０１６）
【非特許文献２】Ｔｅｒａｏｋａ  Ｓ，  Ｋｏｙａｍａ  Ｉ，  Ｂａｓｈｕｄａ  Ｈ，  Ｕｃｈｉｄａ  Ｋ，  Ｔｏｎｓｈｏ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｒｅｓ  ２（１）  ｐ１−８
【非特許文献３】Ｂａｓｈｕｄａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１５：１８９６−１９０２  （２００５）．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究した結果、ＣＤ８０／ＣＤ８６とＣＤ２８との相互作用を阻害する抗体等の阻害因子によりアナジーが誘導された細胞を含む細胞製剤を臓器移植患者（レシピエント）に投与して、免疫寛容を誘導する技術において、細胞製剤に由来する細胞がレシピエントから無くなってしまっても（検出されなくなっても）免疫寛容が続くこと（感染性免疫寛容）を初めて見出した。さらに、本発明者らは、このような細胞製剤が、アレルギーやｉＰＳ細胞等またはそれらに由来する細胞、組織または臓器によって生じる免疫拒絶反応に対する免疫寛容を惹起することができることを実証した。【０００８】
したがって、本開示は以下を提供する。
（１）被験体において、ドナーに対する恒久的な免疫寛容（感染性免疫寛容）を惹起するための組成物であって、該組成物は、
ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、該ドナーに由来する抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞
を含む、組成物。
（２）前記免疫寛容は、前記被験体におけるCD8陽性T細胞において免疫寛容が惹起されている、上記項目に記載の組成物。
（３）前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（４）前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（５）前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（６）前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（７）前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（８）前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（９）被験体において、疾患、障害または状態を予防または治療する方法であって、該方法は、
１）  ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合することによってアナジーが誘導された細胞を含む製剤を該被験体に投与する工程と、
２）  該被験体のＴ細胞のアナジー状態を確認し、アナジー状態が確認できる場合はさらなる処置をせず、アナジー状態が確認できない場合、該細胞を含む製剤を再度投与する工程と
を含む、方法。
（１０）前記製剤は、ＣＤ４陽性アナジー細胞、ＣＤ８陽性アナジー細胞、またはそれらの組合せを含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（１１）前記製剤は、ＣＤ８陽性アナジー細胞を含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（１２）前記アナジー状態の確認は、前記細胞を含む製剤が消失することを確認する工程を含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（１３）前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、およびｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（１４）前記疾患、障害または状態はアレルギーを含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（１５）前記疾患、障害または状態は、ｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応を含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（１６）前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（１７）前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（１８）前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（１９）前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（２０）前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（２１）前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の方法。
（２２）被験体のアレルギーを治療または予防するための組成物であって、該組成物は、
ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、アレルギーの原因となっている抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞
を含む、組成物。
（２３）前記アレルギーの原因となっている抗原は、食品、花粉、薬品、および金属から選択される、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（２４）被験体において、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器によって生じる免疫拒絶反応を抑制するまたは予防するための組成物であって、該組成物は、
ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、該ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞に由来する抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞
を含む、組成物。
（２５）制御性Ｔ細胞ではない、アナジーが誘導されたＴ細胞。
（２６）制御性Ｔ細胞ではない、被験体に対してアナジーが誘導されたＴ細胞を製造する方法であって、
Ａ）ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合する工程と、
Ｂ）該混合物を培養してＴ細胞を得る工程と、
Ｃ）必要に応じて、該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物で該Ｔ細胞を刺激し、該Ｔ細胞が反応しないことを確認する工程と
を包含する、方法。
（２７）前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（２８）前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（２９）前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（３０）前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（３１）前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（３２）前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の方法。
（３３）前記Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性細胞および／またはＣＤ８陽性細胞を含む、上記項目のいずれかに記載のＴ細胞または方法。
（３４）特定の抗原に対する、被験体内のＣＤ８陽性Ｔ細胞の無反応または低反応を誘導するための組成物。
（３５）ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該験検体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞を含む、該被験体に由来しない抗原によって生じる疾患、障害または状態を処置または予防するための医薬。
（３６）前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の医薬。
（３７）前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の医薬。
（３８）前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の医薬。
（３９）前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の医薬。
（４０）前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の医薬。
（４１）前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の医薬。
（４２）前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、およびｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の医薬。
（４３）前記疾患、障害または状態はアレルギーを含む、上記項目のいずれかに記載の医薬。
（４４）前記疾患、障害または状態は、ｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応を含む、上記項目のいずれかに記載の医薬。
（Ａ１）被験体において、ドナーに対する恒久的な免疫寛容（感染性免疫寛容）を惹起する方法であって、該方法は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、該ドナーに由来する抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞を有効量で該被験体に投与する工程を含む、方法。
（Ａ２）前記免疫寛容は、前記被験体におけるCD8陽性T細胞において免疫寛容が惹起されている、上記項目に記載の方法。
（Ａ３）前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ａ４）前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ａ５）前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ａ６）前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ａ７）前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ａ８）前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ａ９）被験体のアレルギーを治療または予防する方法であって、該方法は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、アレルギーの原因となっている抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞を有効量で該被験体に投与する工程を含む、方法。
（Ａ１０）前記アレルギーの原因となっている抗原は、食品、花粉、薬品、および金属から選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ａ１１）被験体において、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器によって生じる免疫拒絶反応を抑制するまたは予防する方法であって、該方法は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、該ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞に由来する抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞を有効量で該被験体に投与する工程を含む、方法。
（Ａ１２）特定の抗原に対する、被験体内のＣＤ８陽性Ｔ細胞の無反応または低反応を誘導する方法。
（Ａ１３）被験体に由来しない抗原によって生じる疾患、障害または状態を処置または予防する方法であって、該方法は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該験検体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞を有効量で該被験体に投与する工程を含む、方法。
（Ａ１４）前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ａ１５）前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ａ１６）前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ａ１７）前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ａ１８）前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ａ１９）前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ａ２０）前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、およびｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ａ２１）前記疾患、障害または状態はアレルギーを含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ａ２２）前記疾患、障害または状態は、ｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応を含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｂ１）被験体において、ドナーに対する恒久的な免疫寛容（感染性免疫寛容）を惹起するための医薬を製造するための、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、該ドナーに由来する抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞の使用。
（Ｂ２）前記免疫寛容は、前記被験体におけるCD8陽性T細胞において免疫寛容が惹起されている、上記項目に記載の使用。
（Ｂ３）前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ４）前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ５）前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ６）前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ７）前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ８）前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ９）被験体において、疾患、障害または状態を予防または治療するための医薬を製造するための、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合することによってアナジーが誘導された細胞の使用であって、該細胞は、該被験体のＴ細胞のアナジー状態を確認し、アナジー状態が確認できる場合はさらなる処置をせず、アナジー状態が確認できない場合、該細胞を含む医薬を再度投与されることを特徴とする、使用。
（Ｂ１０）前記医薬は、ＣＤ４陽性アナジー細胞、ＣＤ８陽性アナジー細胞、またはそれらの組合せを含む、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ１１）前記医薬は、ＣＤ８陽性アナジー細胞を含む、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ１２）前記アナジー状態の確認は、前記細胞を含む製剤が消失することを確認する工程を含む、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ１３）前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、およびｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ１４）前記疾患、障害または状態はアレルギーを含む、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ１５）前記疾患、障害または状態は、ｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応を含む、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ１６）前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ１７）前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ１８）前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ１９）前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ２０）前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ２１）前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ２２）被験体のアレルギーを治療または予防するための医薬を製造するための、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、アレルギーの原因となっている抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞の使用。
（Ｂ２３）前記アレルギーの原因となっている抗原は、食品、花粉、薬品、および金属から選択される、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ２４）被験体において、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器によって生じる免疫拒絶反応を抑制するまたは予防するための医薬を製造するための、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、該ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞に由来する抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞の使用。
（Ｂ２５）被験体に由来しない抗原によって生じる疾患、障害または状態を処置または予防するための医薬の製造のための、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該験検体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞の使用。
（Ｂ２６）前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ２７）前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ２８）前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の医薬。
（Ｂ２９）前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ３０）前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ３１）前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ３２）前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、およびｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ３３）前記疾患、障害または状態はアレルギーを含む、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｂ３４）前記疾患、障害または状態は、ｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応を含む、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｃ１）被験体において、ドナーに対する恒久的な免疫寛容（感染性免疫寛容）を惹起するための、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、該ドナーに由来する抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞。
（Ｃ２）前記免疫寛容は、前記被験体におけるCD8陽性T細胞において免疫寛容が惹起されている、上記項目に記載の細胞。
（Ｃ３）前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ４）前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ５）前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ６）前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ７）前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ８）前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ９）被験体において、疾患、障害または状態を予防または治療するための、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合することによってアナジーが誘導された細胞であって、該被験体のＴ細胞のアナジー状態を確認し、アナジー状態が確認できる場合はさらなる処置をせず、アナジー状態が確認できない場合、該細胞が再度投与されることを特徴とする、細胞。
（Ｃ１０）前記細胞は、ＣＤ４陽性アナジー細胞、ＣＤ８陽性アナジー細胞、またはそれらの組合せを含む細胞混合物である、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ１１）前記細胞は、ＣＤ８陽性アナジー細胞を含む、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ１２）前記アナジー状態の確認は、前記細胞が消失することを確認する工程を含む、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ１３）前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、およびｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ１４）前記疾患、障害または状態はアレルギーを含む、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ１５）前記疾患、障害または状態は、ｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応を含む、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ１６）前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ１７）前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ１８）前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ１９）前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ２０）前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ２１）前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ２２）被験体のアレルギーを治療または予防するための、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、アレルギーの原因となっている抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞の使用。
（Ｃ２３）前記アレルギーの原因となっている抗原は、食品、花粉、薬品、および金属から選択される、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ２４）被験体において、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器によって生じる免疫拒絶反応を抑制するまたは予防するための、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、該ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞に由来する抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞の使用。
（Ｃ２５）被験体に由来しない抗原によって生じる疾患、障害または状態を処置または予防するための、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該験検体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞。
（Ｃ２６）前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ２７）前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ２８）前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ２９）前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ３０）前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ３１）前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ３２）前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、およびｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ３３）前記疾患、障害または状態はアレルギーを含む、上記項目のいずれかに記載の細胞。
（Ｃ３４）前記疾患、障害または状態は、ｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応を含む、上記項目のいずれかに記載の細胞。
本開示は以下をも提供する。
（Ｄ１）被験体において、ドナーに対する恒久的な免疫寛容（感染性免疫寛容）を惹起するための組成物であって、該組成物は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体と、該被験体由来の細胞と、該ドナーに由来する抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞を含む、組成物。
（Ｄ２）前記免疫寛容は、前記被験体におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞において免疫寛容が惹起されている、上記項目に記載の組成物。
（Ｄ３）被験体において、疾患、障害または状態を予防または治療する方法であって、該方法は、１）  ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体と、該被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合することによってアナジーが誘導された細胞を含む製剤を該被験体に投与する工程と、２）  該被験体のＴ細胞のアナジー状態を確認し、アナジー状態が確認できる場合はさらなる処置をせず、アナジー状態が確認できない場合、該細胞を含む製剤を再度投与する工程とを含む、方法。
（Ｄ３Ａ）被験体において、疾患、障害または状態を予防または治療するための医薬であって、該医薬は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体と、該被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合することによってアナジーが誘導された細胞（例えば、Ｔ細胞）を含み、ここで、該医薬は、該医薬を投与した後に、該被験体のＴ細胞のアナジー状態を確認し、アナジー状態が確認できる場合はさらなる処置をせず、アナジー状態が確認できない場合、該細胞を含む医薬を再度投与されることを特徴とする、医薬。
（Ｄ４）前記製剤は、ＣＤ４陽性アナジー細胞、ＣＤ８陽性アナジー細胞、またはそれらの組合せを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法、医薬または組成物。
（Ｄ５）前記製剤は、ＣＤ８陽性アナジー細胞を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法、医薬または組成物。
（Ｄ６）前記アナジー状態の確認は、前記細胞を含む製剤が消失することを確認する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法、医薬または組成物。
（Ｄ７）前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、およびｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、上記項目のいずれか一項に記載の方法、医薬または組成物。
（Ｄ８）前記疾患、障害または状態はアレルギーを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法、医薬または組成物。
（Ｄ９）前記疾患、障害または状態は、ｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法、医薬または組成物。
（Ｄ１０）被験体のアレルギーを治療または予防するための組成物であって、該組成物は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体と、該被験体由来の細胞と、アレルギーの原因となっている抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞を含む、組成物。
（Ｄ１１）前記アレルギーの原因となっている抗原は、食品、花粉、薬品、および金属から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（Ｄ１１Ａ）項目Ｄ１〜Ｄ９のいずれか１つまたは複数に記載の特徴をさらに含む、項目Ｄ１０またはＤ１１に記載の組成物。
（Ｄ１２）被験体において、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器によって生じる免疫拒絶反応を抑制するまたは予防するための組成物であって、該組成物は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体と、該被験体由来の細胞と、該ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞に由来する抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞
を含む、組成物。
（Ｄ１２Ａ）項目Ｄ１〜Ｄ１１のいずれか１つまたは複数に記載の特徴をさらに含む、項目Ｄ１２に記載の組成物。
（Ｄ１３）制御性Ｔ細胞ではない、アナジーが誘導されたＴ細胞。
（Ｄ１３Ａ）項目Ｄ１〜Ｄ１１、Ｄ１１Ａ、Ｄ１２またはＤ１２Ａのいずれか１つまたは複数に記載の特徴をさらに含む、項目Ｄ１３に記載の組成物。
（Ｄ１４）制御性Ｔ細胞ではない、被験体に対してアナジーが誘導されたＴ細胞を製造する方法であって、Ａ）ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体と、該被験体由来の細胞と、該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合する工程と、Ｂ）該混合物を培養してＴ細胞を得る工程と、Ｃ）必要に応じて、該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物で該Ｔ細胞を刺激し、該Ｔ細胞が反応しないことを確認する工程とを包含する、方法。
（Ｄ１５）前記Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性細胞および／またはＣＤ８陽性細胞を含む、上記項目のいずれか一項に記載のＴ細胞または上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（Ｄ１５Ａ）項目Ｄ１〜Ｄ１１、Ｄ１１Ａ、Ｄ１２、Ｄ１２ＡまたはＤ１３のいずれか１つまたは複数に記載の特徴をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（Ｄ１６）特定の抗原に対する、被験体内のＣＤ８陽性Ｔ細胞の無反応または低反応を誘導するための組成物。
（Ｄ１６Ａ）項目Ｄ１〜Ｄ１、Ｄ１１Ａ、Ｄ１２、Ｄ１２Ａ、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１５またはＤ１５Ａのいずれか１つまたは複数に記載の特徴をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（Ｄ１７）ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該験検体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞を含む、該被験体に由来しない抗原によって生じる疾患、障害または状態を処置または予防するための医薬。
（Ｄ１８）前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、およびｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬。
（Ｄ１９）前記疾患、障害または状態はアレルギーを含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬。
（Ｄ２０）前記疾患、障害または状態は、ｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬。
（Ｄ２０Ａ）項目Ｄ１〜Ｄ１１、Ｄ１１Ａ、Ｄ１２、Ｄ１２Ａ、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１５、Ｄ１５Ａ、Ｄ１６、Ｄ１６Ａ、Ｄ１７〜Ｄ１９のいずれか１つまたは複数に記載の特徴をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬。【０００９】
本開示において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本開示のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【００１０】
本開示の組成物は、ドナーに対する恒久的な免疫寛容（感染性免疫寛容）を惹起することができる。また、免疫寛容を誘導するための医薬の製造において、ＣＤ８陽性細胞を指標として医薬の品質を管理することができる。本開示の組成物は、アレルギーの治療や、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の免疫拒絶反応の抑制をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例１で実施した実験のスキーム（左パネル、右パネル下）およびその結果(右パネル上）を示す。右パネル上の結果は、チミジン取り込みを示し、左からスティミュレイター細胞刺激によるレスポンダー細胞の増殖反応を示し、左から２番目は、上段に新鮮なレスポンダー細胞とスティミュレイター細胞を入れた場合を示し、右から２番目は上段にアナジー細胞とスティミュレイター細胞を入れた場合を示し、右端はアナジー細胞をスティミュレイター細胞/レスポンダー細胞と同じ段に入れた場合を示す。
【図２】図２は、細胞製剤に由来する細胞がレシピエントから無くなってしまっても免疫寛容が続くことを示す実験結果である。図２aは、左パネルに示す手法で実験を行った。その結果（心臓の生着率）を、右下グラフに示す。アナジー細胞の移入により、細胞数依存的に、移植した心臓の生着率が向上している。6×106個のアナジー細胞の移入により全てのマウスで100日以上の移植した心臓の生着の改善（生着率の改善）が観察され、移植した心臓に対する免疫寛容の誘導が証明された。図２bは、移入したアナジー細胞を、末梢血（ＰＢＭＣ）、リンパ節（ＭＬＮ）、脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、移植した心臓（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｈｅａｒｔ）内において検出されるかどうかを調べた結果である。免疫寛容BALB/c心臓移植は、アナジー細胞を移入したアロのBALB/cマウスの心臓を移植したB6マウスを示し、免疫寛容B6心臓移植はアナジー細胞を移入した同系のB6マウスの心臓を移植したB6マウスを示す。移入したアナジー細胞は、末梢血、リンパ節、脾臓のみならず、移植した心臓内においても、蛍光発現によっては検出されなかった。
【図３】図３は、ゲノム遺伝子中のGFP遺伝子をPCRにより増幅するより感度の高い検出手法を用いて、細胞製剤に由来する細胞がレシピエントから無くなってしまっても免疫寛容が続くことを示したものである。図３aは、左から、分子量マーカー、１：テンプレートなし、２：ＰＣ  ＧＦＰマウスゲノムＤＮＡ、３：１／１００希釈ＧＦＰマウスゲノムＤＮＡ、４：１／１０００希釈ＧＦＰマウスゲノムＤＮＡ、５：１／１００００希釈ＧＦＰマウスゲノムＤＮＡ、６：１／１０００００希釈ＧＦＰマウスゲノムＤＮＡ、および７：野生型マウスゲノムＤＮＡを示す。示すように、0.1％(１／１０００希釈ＧＦＰマウスゲノムＤＮＡの存在：レーン4)でも検出可能な、ゲノム遺伝子中のGFP遺伝子をPCRの条件を用いて、実施例２を行った。結果を図３ｂに示す。図３ｂは上段左からＰＢＭＣおよび脾臓を示し、下段左からリンパ球（ＭＬＮ）および心臓（Ｈｅａｒｔ）を示す。各レーンは左から分子量マーカー（Ｍ）、１：ＮＣテンプレートなし、２：ＰＣ(ポジティブコントロール:ＧＦＰマウスリンパ球ゲノムＤＮＡ)３：移植３日後、４：移植１週間後、５：移植４週間後、６：移植７週間後、７：移植１５週間後(免疫寛容)を示す。
【図４】図４は、アナジー細胞による免疫抑制は、抗原に特異的であることを示す図である。図４は、抗ＣＤ８０／８６抗体存在下でBalb/Cマウス脾臓細胞で刺激されたB6マウス由来のアナジー細胞のB6マウスへの移入後の心臓の生着率を示す。移植されたBALB/cマウスの心臓の拒絶を100％阻害し100日後でも心臓が生着しているが、これに対して他家（3rd  party）であるCBAマウスの心臓は移植後に速やかに拒絶反応を引き起こし、約50日で100％拒絶されることが示された。
【図５】図５は、実施例４で行った感染性免疫寛容を示す実験を示す。
【図６】図６は、図５に示す感染性免疫寛容の結果を示す。左パネルは、アナジー細胞の移入により移植した心臓への免疫寛容が誘導されたマウスから得たCD4陽性T細胞の移入による、生着率（免疫寛容）を示す。右パネルは、アナジー細胞の移入により移植した心臓への免疫寛容が誘導されたマウスから得たＣＤ８陽性Ｔ細胞の移入による、生着率（免疫寛容）を示す。
【図７】図７は、実施例５で行ったヒトインビトロモデルでのアロ特異的抑制性アナジー細胞の継代移入の手法を示す。
【図８ａ】図８は、実施例５で行った免疫抑制能の評価を示す。図8aには、その模式図を示す。図８ｂは、３Ｈ−チミジン取込み量のCPM値を示す。グラフ中左から、ナイーブなレスポンダー細胞のみ、アロ細胞による刺激下、ナイーブなレスポンダー細胞に、レスポンダー細胞：アナジー細胞の比率を１：１、１：０．５、１：０．２５、１：０．１２５でアナジー細胞を添加した時のCPM値を示す。図８cでは、ＩＬ−２（左）およびＩＬ−１０（右）の産生を示す。各グラフ中左からナイーブなレスポンダー細胞のみ、CD4陽性ナイーブ細胞のアロ細胞による刺激、1stアナジー細胞添加時のCD4陽性ナイーブ細胞のアロ細胞による刺激、2ndアナジー細胞添加時のCD4陽性ナイーブ細胞のアロ細胞による刺激、3rdアナジー細胞添加時のCD4陽性ナイーブ細胞のアロ細胞による刺激を示す。1stアナジー細胞、2ndアナジー細胞、3rdアナジー細胞のいずれも、レスポンダーCD4陽性細胞からの細胞増殖を誘導するサイトカインIL-2の産生を抑制し、一方で、免疫反応を抑制する代表的なサイトカインIL-10の産生を誘導することを示した。どちらも、レスポンダー細胞のみ（無刺激）の条件での各サイトカイン産生量を１としたときの比率を示す。
【図８ｂ】図８は、実施例５で行った免疫抑制能の評価を示す。図8aには、その模式図を示す。図８ｂは、３Ｈ−チミジン取込み量のCPM値を示す。グラフ中左から、ナイーブなレスポンダー細胞のみ、アロ細胞による刺激下、ナイーブなレスポンダー細胞に、レスポンダー細胞：アナジー細胞の比率を１：１、１：０．５、１：０．２５、１：０．１２５でアナジー細胞を添加した時のCPM値を示す。図８cでは、ＩＬ−２（左）およびＩＬ−１０（右）の産生を示す。各グラフ中左からナイーブなレスポンダー細胞のみ、CD4陽性ナイーブ細胞のアロ細胞による刺激、1stアナジー細胞添加時のCD4陽性ナイーブ細胞のアロ細胞による刺激、2ndアナジー細胞添加時のCD4陽性ナイーブ細胞のアロ細胞による刺激、3rdアナジー細胞添加時のCD4陽性ナイーブ細胞のアロ細胞による刺激を示す。1stアナジー細胞、2ndアナジー細胞、3rdアナジー細胞のいずれも、レスポンダーCD4陽性細胞からの細胞増殖を誘導するサイトカインIL-2の産生を抑制し、一方で、免疫反応を抑制する代表的なサイトカインIL-10の産生を誘導することを示した。どちらも、レスポンダー細胞のみ（無刺激）の条件での各サイトカイン産生量を１としたときの比率を示す。
【図８ｃ】図８は、実施例５で行った免疫抑制能の評価を示す。図8aには、その模式図を示す。図８ｂは、３Ｈ−チミジン取込み量のCPM値を示す。グラフ中左から、ナイーブなレスポンダー細胞のみ、アロ細胞による刺激下、ナイーブなレスポンダー細胞に、レスポンダー細胞：アナジー細胞の比率を１：１、１：０．５、１：０．２５、１：０．１２５でアナジー細胞を添加した時のCPM値を示す。図８cでは、ＩＬ−２（左）およびＩＬ−１０（右）の産生を示す。各グラフ中左からナイーブなレスポンダー細胞のみ、CD4陽性ナイーブ細胞のアロ細胞による刺激、1stアナジー細胞添加時のCD4陽性ナイーブ細胞のアロ細胞による刺激、2ndアナジー細胞添加時のCD4陽性ナイーブ細胞のアロ細胞による刺激、3rdアナジー細胞添加時のCD4陽性ナイーブ細胞のアロ細胞による刺激を示す。1stアナジー細胞、2ndアナジー細胞、3rdアナジー細胞のいずれも、レスポンダーCD4陽性細胞からの細胞増殖を誘導するサイトカインIL-2の産生を抑制し、一方で、免疫反応を抑制する代表的なサイトカインIL-10の産生を誘導することを示した。どちらも、レスポンダー細胞のみ（無刺激）の条件での各サイトカイン産生量を１としたときの比率を示す。
【図９】図９は、ＣＤ８陽性細胞の反応性およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の必要性の確認した結果を示す。左から、それぞれ、早期（３-２４日）、中期（２５−４２日）、後期（８０−１００日）に、抗CD4抗体による制御性Ｔ細胞（本明細書では、regT細胞とも表示する）を含むCD4陽性細胞の除去を行った場合の、移植した場合の心臓の生着率（心臓の拒絶が起きなかった割合）を示したものである。
【図１０ａ】図１０は、ドナーに対するＣＤ８陽性Ｔ細胞の反応を示す結果である。図１０ａは、ドナーに対するＣＤ８陽性Ｔ細胞の反応を示す実験の手順を示す。図１０ｂは、CSFEでラベルしたこの細胞を、BALB/c由来の放射線照射脾臓細胞と12ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．3513）もしくは24ウェルプレート(corningＣａｔ．Ｎｏ3526)にて2×106細胞/mＬで１：１で混合し、培養を行い、培養5日目のCD8陽性T細胞のCSFEの発現をフローサイトメーター(BD  verse)により調べた結果である。左から、ドナー細胞、免疫寛容マウス、ナイーブマウスを示す。上段にドットプロットによる結果、下段にヒストグラムによる結果を示す。図１０ｃは、抗ＣＤ３・ＣＤ２８抗体刺激と比較したＣＤ８ＭＬＲ増殖比率の比較を示す。グラフ中左群は抗ＣＤ３・ＣＤ２８抗体刺激なし、中央群は放射線照射した自己細胞による刺激、右群は放射線照射したドナー細胞による刺激の結果であり、各群において、左からナイーブＢ６細胞のCD8陽性T細胞、移植心を拒絶したマウス由来のCD8陽性T細胞、免疫寛容になったマウスのCD8陽性T細胞の反応を示す。
【図１０ｂ】図１０は、ドナーに対するＣＤ８陽性Ｔ細胞の反応を示す結果である。図１０ａは、ドナーに対するＣＤ８陽性Ｔ細胞の反応を示す実験の手順を示す。図１０ｂは、CSFEでラベルしたこの細胞を、BALB/c由来の放射線照射脾臓細胞と12ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．3513）もしくは24ウェルプレート(corningＣａｔ．Ｎｏ3526)にて2×106細胞/mＬで１：１で混合し、培養を行い、培養5日目のCD8陽性T細胞のCSFEの発現をフローサイトメーター(BD  verse)により調べた結果である。左から、ドナー細胞、免疫寛容マウス、ナイーブマウスを示す。上段にドットプロットによる結果、下段にヒストグラムによる結果を示す。図１０ｃは、抗ＣＤ３・ＣＤ２８抗体刺激と比較したＣＤ８ＭＬＲ増殖比率の比較を示す。グラフ中左群は抗ＣＤ３・ＣＤ２８抗体刺激なし、中央群は放射線照射した自己細胞による刺激、右群は放射線照射したドナー細胞による刺激の結果であり、各群において、左からナイーブＢ６細胞のCD8陽性T細胞、移植心を拒絶したマウス由来のCD8陽性T細胞、免疫寛容になったマウスのCD8陽性T細胞の反応を示す。
【図１０ｃ】図１０は、ドナーに対するＣＤ８陽性Ｔ細胞の反応を示す結果である。図１０ａは、ドナーに対するＣＤ８陽性Ｔ細胞の反応を示す実験の手順を示す。図１０ｂは、CSFEでラベルしたこの細胞を、BALB/c由来の放射線照射脾臓細胞と12ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．3513）もしくは24ウェルプレート(corningＣａｔ．Ｎｏ3526)にて2×106細胞/mＬで１：１で混合し、培養を行い、培養5日目のCD8陽性T細胞のCSFEの発現をフローサイトメーター(BD  verse)により調べた結果である。左から、ドナー細胞、免疫寛容マウス、ナイーブマウスを示す。上段にドットプロットによる結果、下段にヒストグラムによる結果を示す。図１０ｃは、抗ＣＤ３・ＣＤ２８抗体刺激と比較したＣＤ８ＭＬＲ増殖比率の比較を示す。グラフ中左群は抗ＣＤ３・ＣＤ２８抗体刺激なし、中央群は放射線照射した自己細胞による刺激、右群は放射線照射したドナー細胞による刺激の結果であり、各群において、左からナイーブＢ６細胞のCD8陽性T細胞、移植心を拒絶したマウス由来のCD8陽性T細胞、免疫寛容になったマウスのCD8陽性T細胞の反応を示す。
【図１１】図１１は、実施例８において示される、アレルギー性肺炎(喘息)モデルにおける免疫寛容の手順を示す。
【図１２】図１２は、図１１に示したアレルギー性肺炎(喘息)モデルにおける免疫寛容の実験結果を示す。図12aは気管支浸出液（ＢＡＬ）中に含まれる白血球の数を示しており、図１２ｂはＢＡＬ中に含まれる好酸球の数を示している。図１２ｃは、ＢＡＬ中に含まれるＩＬ−４の量を示す。各グラフにおいて、左から、リン酸緩衝生理食塩水のみを与えたマウス（ＰＢＳコントロール）、オバルブミン刺激したマウス（ＯＶＡチャレンジ）、オバルブミン刺激と本開示のアナジー細胞を与えたマウス（細胞治療）を示す。
【図１３】図１３は、実施例９において示される、食品アレルギーモデルにおける免疫寛容惹起の手順を示す。
【図１４】図１４は、図１３に示した食品アレルギーモデルにおける免疫寛容惹起の結果として、典型的な腸管のＦｏｘＰ３／ＣＤ４による免疫蛍光染色の結果を示す。左パネル（２列）は食物アレルギーを誘発させたマウス（食物アレルギーマウス）の２匹（１１，１２）の結果、中パネル（２列）は、食物アレルギーを誘発させかつアナジー細胞を移入したマウス（アナジー細胞移入食物アレルギーマウス）２匹（２１，２２）の結果、右端は正常マウス（無処置正常マウス）２匹（３１，３２）の結果を示す。食物アレルギーマウスおよびアナジー細胞移入食物アレルギー細胞を移入したマウスにおいては、独立した３箇所の組織染色像を示した（縦に３個）。
【図１５ａ】図１５は、図１３に示した食品アレルギーモデルにおける免疫寛容惹起の結果を示す。図１５ａには各マウス（図１４におけるマウス１１および１２（食物アレルギーマウス）、２１および２２（アナジー細胞移入食物アレルギーマウス）、３１および３２（無処置正常マウス））における典型的な腸のＨＥ染色の写真を示す。図１５ｂは、図１４で示された画像の解析結果から得られた１ｍｍ２当たりの制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋）の平均細胞数を示し、グラフ中左から食物アレルギーマウス（アレルギー）、アナジー細胞移入食物アレルギーマウス（アナジー細胞移入）、および無処置正常マウス（無処置正常）を示す。図１５ａで示された画像の解析結果から得られた１ｍｍ２当たりの平均好酸球数を示すグラフが図１５ｃであり、図１５ｂと同様にグラフ中左からアレルギー、アナジー細胞移入および無処置正常を示す。
【図１５ｂ】図１５は、図１３に示した食品アレルギーモデルにおける免疫寛容惹起の結果を示す。図１５ａには各マウス（図１４におけるマウス１１および１２（食物アレルギーマウス）、２１および２２（アナジー細胞移入食物アレルギーマウス）、３１および３２（無処置正常マウス））における典型的な腸のＨＥ染色の写真を示す。図１５ｂは、図１４で示された画像の解析結果から得られた１ｍｍ２当たりの制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋）の平均細胞数を示し、グラフ中左から食物アレルギーマウス（アレルギー）、アナジー細胞移入食物アレルギーマウス（アナジー細胞移入）、および無処置正常マウス（無処置正常）を示す。図１５ａで示された画像の解析結果から得られた１ｍｍ２当たりの平均好酸球数を示すグラフが図１５ｃであり、図１５ｂと同様にグラフ中左からアレルギー、アナジー細胞移入および無処置正常を示す。
【図１５ｃ】図１５は、図１３に示した食品アレルギーモデルにおける免疫寛容惹起の結果を示す。図１５ａには各マウス（図１４におけるマウス１１および１２（食物アレルギーマウス）、２１および２２（アナジー細胞移入食物アレルギーマウス）、３１および３２（無処置正常マウス））における典型的な腸のＨＥ染色の写真を示す。図１５ｂは、図１４で示された画像の解析結果から得られた１ｍｍ２当たりの制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋）の平均細胞数を示し、グラフ中左から食物アレルギーマウス（アレルギー）、アナジー細胞移入食物アレルギーマウス（アナジー細胞移入）、および無処置正常マウス（無処置正常）を示す。図１５ａで示された画像の解析結果から得られた１ｍｍ２当たりの平均好酸球数を示すグラフが図１５ｃであり、図１５ｂと同様にグラフ中左からアレルギー、アナジー細胞移入および無処置正常を示す。
【図１６】図１６は、ｉＰＳ細胞での免疫寛容惹起の結果を示す。グラフは、リンパ球の増加を３Ｈ−チミジン取込み量のＣＰＭ値として表したものである。左から、ナイーブリンパ球のみ、同種異系ｉＰＳ細胞由来神経細胞による刺激、同種異系ｉＰＳ細胞由来神経細胞による刺激の系にｉＰＳ由来神経細胞と抗体刺激で誘導したアナジー細胞をナイーブリンパ球とアナジー細胞の比率が１：１／２、１：１／４、１：１／８、１：１／１６となる様添加した際の反応、抗ＣＤ８０／ＣＤ８６抗体（１０μｇ／ｍｌ）を同種異系ｉＰＳ細胞由来神経細胞による刺激の系に添加した際の反応を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１３】
（用語の定義）
本明細書において「約」とは、本明細書で使用される場合、後に続く数値の±１０％を意味する。
【００１４】
本明細書において、「免疫寛容」とは、特定の抗原に対する特異的免疫反応を示さないか、特異的免疫反応が抑制された状態のことである。免疫寛容は、免疫細胞（特にＴ細胞）が特定の抗原に対する特異的免疫反応を示さないか、特異的免疫反応が抑制された状態と、ヒトが特定の抗原に対する特異的免疫反応を示さないか、特異的免疫反応が抑制された状態の両方またはいずれか一方を意味していてもよい。免疫寛容が惹起されることにより、免疫拒絶反応に対する処置が可能になったり、アレルギーに対する治療が可能なったりすることから注目されている。本明細書において、「アナジー」とは、抗原提示細胞から抗原を提示される際に共刺激が入力されないことにより、当該次回に共刺激のある条件で刺激されても反応できなくなった状態を意味する。したがって、本明細書では「アナジー細胞」とは、免疫寛容が生じた（免疫不応答の）細胞をいい、「アナジーＴ細胞」は、免疫寛容が生じた（免疫不応答の）Ｔ細胞であり、活性化されないことのほか、再び同じ抗原にであったときに無反応であるＴ細胞も包含される。なお、本明細書において、「免疫寛容を誘導されたＰＢＭＣ（またはＴ細胞）」と「アナジーなＰＢＭＣ（またはＴ細胞）」とは同意義である。ＣＤ４４陽性を確認することによって確認することができるが、これに限定されない。
【００１５】
本明細書において、「被験体」とは、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）を含む。特定の実施形態では、被験体は、ヒトである。
【００１６】
本明細書において、「恒久的な免疫寛容（感染性免疫寛容）」とは、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体等の阻害因子により、特定の抗原に対するアナジーが誘導された細胞が投与された被験体（レシピエント）において、アナジーが誘導された当該細胞が被験体から消失した後も、少なくとも一定期間（例えば、数カ月、あるいは、１年、あるいは、３年以上）、特定の抗原に対する免疫寛容の状態が維持されていることをいう。これは、アナジーが誘導された細胞が投与された被験体（レシピエント）の生体内で、アナジーが誘導され得る他の細胞において、新たにアナジーが誘導されること、すなわち感染性免疫寛容が誘導されていることを意味する。
【００１７】
本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではａｇｅｎｔに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、その他の有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。
【００１８】
本明細書において「阻害因子」は、所定の作用（例えば、相互作用、シグナル伝達など）を阻害することができる、あらゆる種類の低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖などをいう。特定の理論に束縛されることは望まないが、本開示において、細胞表面のＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用をブロックし、ＣＤ２８共刺激シグナルを阻害することにより、Ｔ細胞にアナジーを誘導する。本開示では、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用をブロックするのに使用される阻害因子は、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。一局面では、上記タンパク質は、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である。別の局面では、上記抗体の改変体は、抗原結合断片である。別の局面では、上記細胞表面分子の改変体は、融合タンパク質である。別の局面では、上記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される。別の局面では、上記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである。また、上記相互作用を間接的に阻害する因子（例えば、シグナル伝達の上流または下流のシグナルの阻害因子）も組み合わせて使用することも想定される。
【００１９】
本明細書において広義の「抗体」は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することができる分子またはその集団をいう。本明細書における広義の「抗体」は、全長抗体（すなわち、Ｆｃ部分を有する抗体）であっても、Ｆｃ部分を欠いている抗体であってもよい。Ｆｃ部分を欠いている抗体は、目的の抗原に結合することができればよく、そのような抗体としては、例えば、Ｆａｂ抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆｖ抗体、ｓｃＦｖ抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、どのようなタイプの抗体であってもよく、すなわち、当該分野において公知の免疫グロブリンであってもよい。例示的な実施形態において、抗体は、アイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭのクラスの抗体である。例示的な実施形態において、本明細書に記載される抗体は、１つまたは複数のアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、および／またはミュー重鎖を含む。例示的な実施形態において、本明細書に記載される抗体は、１つまたは複数のカッパまたは軽鎖を含む。例示的な態様において、抗体は、ＩｇＧ抗体であり、４つのヒトサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のうちの１つである。また、本開示における使用が想定される抗体としては、ラクダ科動物由来の抗体（例えば、ＶＨＨ抗体）、サメ由来の抗体（例えば、一本鎖抗体）、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ、単一ドメイン抗体）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、タンデムジ−ｓｃＦＶ、タンデムトリ−ｓｃＦｖ）などが挙げられ、これらは、当該分野において公知である。例えば、Ｋｏｒｔｔら、Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ．  ２００１  １８巻：９５〜１０８頁、（２００１年）およびＴｏｄｏｒｏｖｓｋａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２４８巻：４７〜６６頁、（２００１年）などを参照されたい。また抗体は、抗体修飾物または抗体非修飾物を含む。抗体修飾物は、抗体と、例えばポリエチレングリコール等の各種分子が結合していてもよい。抗体修飾物は、抗体に公知の手法を用いて化学的な修飾を施すことによって得ることができる。人工的に作出された抗体および抗体の種々の修飾／改変方法については、生化学（２０１６）第８８巻第３号３８０〜３８５頁も参照のこと。
【００２０】
本明細書において狭義の「抗体」は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することができるイムノグロブリンまたはその集団をいい、その改変体を「抗体の改変体」という。本明細書における狭義の「抗体」は、全長抗体（すなわち、Ｆｃ部分を有する抗体）であり得、本明細書における「抗体の改変体」は、上記抗体のＦｃ部分を欠いている改変体であり得る。したがって、本明細書において狭義の抗体は全長抗体とも称され得、抗体の改変体は全長抗体の改変体とも称され得る。Ｆｃ部分を欠いている改変体は、目的の抗原に結合することができればよく、そのような改変体としては、例えば、Ｆａｂ抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆｖ抗体、ｓｃＦｖ抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。また抗体の改変体は、抗体修飾物または抗体非修飾物を含む。抗体修飾物は、抗体と、例えばポリエチレングリコール等の各種分子が結合していてもよい。抗体修飾物は、抗体に公知の手法を用いて化学的な修飾を施すことによって得ることができる。
【００２１】
本開示の一実施形態において「ポリクローナル抗体」は、例えば、抗原に特異的なポリクローナル抗体の産生を誘導するために、哺乳類（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、サル等）、鳥類等に、目的の抗原を含む免疫原を投与することによって生成することが可能である。免疫原の投与は、1つ以上の免疫剤、および所望の場合にはアジュバントの注入をしてもよい。アジュバントは、免疫応答を増加させるために使用されることもあり、フロイントアジュバント（完全または不完全）、ミネラルゲル（水酸化アルミニウム等）、または界面活性物質（リゾレシチン等）等を含んでいてもよい。免疫プロトコールは、当該技術分野で公知であり、選択する宿主生物に合わせて、免疫応答を誘発する任意の方法によって実施される場合がある（タンパク質実験ハンドブック,羊土社(2003):86-91.）。
【００２２】
本開示の一実施形態において「モノクローナル抗体」は、集団を構成する個々の抗体が、少量自然に生じることが可能な突然変異を有する抗体を除いて、実質的に単一のエピトープに対応する同一な抗体である場合を含む。または、集団を構成する個々の抗体が、少量自然に生じることが可能な突然変異を有する抗体を除いて、実質的に同一である抗体であってもよい。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、異なるエピトープに対応する異なる抗体を典型的に含むような、および／または同一なエピトープに対応する異なる抗体を典型的に含むような、通常のポリクローナル抗体とは異なる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養から合成できる点で有用である。「モノクローナル」という形容は、実質的に均一な抗体集団から得られるという特徴を示していてもよいが、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、モノクローナル抗体は、"KohlerG,  Milstein  C.,Nature.  1975  Aug  7;256(5517):495-497."に掲載されているようなハイブリドーマ法と同様の方法によって作製してもよい。あるいは、モノクローナル抗体は、米国特許第4816567号に記載されているような組換え法と同様の方法によって作製してもよい。または、モノクローナル抗体は、"Clackson  et  al.,  Nature.  1991  Aug  15;352(6336):624-628."、または"Marks  et  al.,  J  Mol  Biol.  1991  Dec  5;222(3):581-597."に記載されているような技術と同様の方法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。または、"タンパク質実験ハンドブック,羊土社(2003):92-96."に掲載されている方法によって作製してもよい。
【００２３】
本開示の一実施形態において「キメラ抗体」は、例えば、異種生物間における抗体の可変領域と、抗体の定常領域とを連結したもので、遺伝子組換え技術によって構築できる。マウス-ヒトキメラ抗体は、例えば、"Roguska  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  1994Feb  1;91(3):969-973."に記載の方法で作製できる。マウス-ヒトキメラ抗体を作製するための基本的な方法は、例えば、クローン化されたcDNAに存在するマウスリーダー配列および可変領域配列を、哺乳類細胞の発現ベクター中にすでに存在するヒト抗体定常領域をコードする配列に連結する。または、クローン化されたcDNAに存在するマウスリーダー配列および可変領域配列をヒト抗体定常領域をコードする配列に連結した後、哺乳類細胞発現ベクターに連結してもよい。ヒト抗体定常領域の断片は、任意のヒト抗体のH鎖定常領域およびヒト抗体のL鎖定常領域のものとすることができ、例えばヒトH鎖のものについてはCγ1、Cγ2、Cγ3またはCγ4を、L鎖のものについてはCλまたはCκを各々挙げることができる。
【００２４】
本開示の一実施形態において「ヒト化抗体」は、例えば、非ヒト種由来の1つ以上のCDR、およびヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域（FR）、さらにヒト免疫グロブリン由来の定常領域を有し、所望の抗原に結合する抗体である。抗体のヒト化は、当該技術分野で既知の種々の手法を使用して実施可能である(Almagro  et  al.,  Front  Biosci.  2008  Jan  1;13:1619-1633.)。例えば、CDRグラフティング（Ozaki  et  al.,Blood.1999  Jun1;93(11):3922-3930.）、Re-surfacing  (Roguska  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  US  A.1994  Feb  1;91(3):969-973.)、またはFRシャッフル（Damschroder  et  al.,  Mol  Immunol.  2007Apr;44(11):3049-3060.  Epub  2007  Jan  22.）などが挙げられる。抗原結合を改変するために（好ましくは改善するために）、ヒトFR領域のアミノ酸残基は、CDRドナー抗体からの対応する残基と置換してもよい。このFR置換は、当該技術分野で周知の方法によって実施可能である（Riechmann  et  al.,  Nature.  1988  Mar  24;332(6162):323-327.）。例えば、CDRとFR残基の相互作用のモデリングによって抗原結合に重要なFR残基を同定してもよい。または、配列比較によって、特定の位置で異常なFR残基を同定してもよい。
【００２５】
本開示の一実施形態において「ヒト抗体」は、例えば、抗体を構成する重鎖の可変領域および定常領域、軽鎖の可変領域および定常領域を含む領域が、ヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来する抗体である。主な作製方法としてはヒト抗体作製用トランスジェニックマウス法、ファージディスプレイ法などがある。ヒト抗体作製用トランスジェニックマウス法では、内因性Igをノックアウトしたマウスに機能的なヒトのIg遺伝子を導入すれば、マウス抗体の代わりに多様な抗原結合能を持つヒト抗体が産生される。さらにこのマウスを免疫すればヒトモノクローナル抗体を従来のハイブリドーマ法で得ることが可能である。例えば、"Lonberg  et  al.,  Int  Rev  Immunol.1995;13(1):65-93."に記載の方法で作製できる。ファージディスプレイ法は、典型的には大腸菌ウイルスの一つであるM13やT7などの繊維状ファージのコート蛋白質（g3p、g10p等）のN末端側にファージの感染性を失わないよう外来遺伝子を融合蛋白質として発現させるシステムである。例えば、"Vaughan  et  al.,  Nat  Biotechnol.  1996  Mar;14(3):309-314."に記載の方法で作製できる。
【００２６】
本明細書において、「被験体由来の細胞」とは、本開示の組成物が投与される被験体から得た細胞または該被験体から得た細胞に由来する細胞をいう。本明細書において、「被験体由来の抗原」とは、免疫応答を生じさせる被験体自身が生成する抗原、例えば、自己免疫疾患を有する被験体における自己免疫疾患の原因となる被験体自身が生成する抗原をいう。本明細書において、「被験体に由来しない抗原」とは、免疫応答を生じさせ得る外来の抗原をいう。本明細書において、「被験体に由来しない抗原の含有物（ａｎｔｉｇｅｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌ）」は、被験体に由来しない抗原を含有する任意の物質または物質の集合物をいい、例えば、被験体に由来しない抗原を発現している細胞、細胞集団、組織等が挙げられる。
【００２７】
本明細書において、「移植免疫拒絶反応」とは、臓器、組織または細胞の移植を受けた被験体において、被験体の免疫系が、移植された臓器、組織または細胞に対して攻撃し、損傷または破壊することをいう。
【００２８】
本明細書において、「アレルギー」とは、被験体に由来しない抗原に対して、免疫応答が過剰に起こる状態をいう。アレルギーを引き起こす被験体に由来しない抗原は、アレルゲンとも呼ばれ、例えば、ダニ抗原、卵白抗原、ミルク抗原、小麦抗原、ピーナッツ抗原、大豆抗原、ソバ抗原、ゴマ抗原、コメ抗原、甲殻類抗原、キウイ抗原、リンゴ抗原、バナナ抗原、モモ抗原、トマト抗原、マグロ抗原、サケ抗原、サバ抗原、牛肉抗原、鶏肉抗原、豚肉抗原、ネコ皮屑抗原、昆虫抗原、花粉抗原、イヌ皮屑抗原、真菌抗原、細菌抗原、ラテックス、ハプテンおよび金属等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２９】
本明細書において、「自己免疫疾患」とは、免疫系が自身の細胞、組織または臓器に対して望ましくない免疫応答を行う任意の疾患をいう。自己免疫疾患としては、例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、１型糖尿病、炎症性腸疾患（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）、全身性エリテマトーデス、乾癬、強皮症、自己免疫性甲状腺疾患、円形脱毛症、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ熱、胃炎、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、膵島炎、卵巣炎、精巣炎、ブドウ膜炎、水晶体起因性ブドウ膜炎、重症筋無力症、原発性粘液水腫、悪性貧血、自己免疫性溶血性貧血、アジソン病、強皮症、グッドパスチャー症候群、腎炎（例えば、糸球体腎炎）、乾癬、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、特発性血小板減少性紫斑病、特発性白血球減少症、ウェゲナー肉芽腫および多発性／皮膚筋炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書において、「移植片対宿主病」とは、移植された臓器、組織または細胞が、免疫応答によって、移植を受けた被験体の細胞、組織または臓器を攻撃し、損傷または破壊することをいう。
【００３１】
本明細書において、「ｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらの細胞に由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応」とは、ｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞が有する抗原、またはｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞に由来する（から分化した）細胞、組織もしくは臓器が有する抗原によって生じる免疫拒絶反応をいう。
【００３２】
（好ましい実施形態）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本開示の例示であり、本開示の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本開示の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、本明細書中の記載を参酌して、任意の実施形態を組み合わせ得る。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
【００３３】
（感染性免疫寛容を惹起するための組成物）
本発明者らは、ＣＤ８０／ＣＤ８６とＣＤ２８との相互作用を阻害する阻害因子によりアナジーが誘導された細胞を含む細胞製剤を臓器移植患者（レシピエント）に投与して、免疫寛容を誘導する技術において、予想外にも、細胞製剤に由来する細胞がレシピエントから無くなった（検出されなくなった）後も免疫寛容が続くこと（感染性免疫寛容）を見出した。
【００３４】
したがって、一つの局面において、本開示は、被験体において、ドナー（ドナー由来の抗原、またはドナー由来の抗原の含有物、例えば、ドナーの細胞、組織または臓器）に対する恒久的な免疫寛容（感染性免疫寛容）を惹起するための組成物であって、該組成物は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、該ドナーに由来する抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容（アナジー）が誘導された細胞を含む、組成物を提供する。抗原の含有物は細胞であり得、該細胞の増殖および活性化を防止するために、放射線照射され得る。
【００３５】
本開示の組成物は、一旦免疫寛容が誘導され、移植免疫拒絶反応が抑制された場合、継続的な細胞製剤の投与をすることなく、恒久的に移植免疫拒絶反応が抑制または予防される。
【００３６】
いくつかの実施形態において、移植免疫拒絶反応は、腎臓、肝臓、心臓、皮膚、肺、すい臓、食道、胃、小腸、大腸、神経、血液、免疫系細胞を含む血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球または骨髄が移植されることにより生じることを特徴とする。
【００３７】
特定の実施形態において、免疫寛容（アナジー）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞および／またはＣＤ８陽性Ｔ細胞において惹起されており、好ましくは、免疫寛容（アナジー）は、少なくともＣＤ８陽性Ｔ細胞において惹起されている。したがって、本開示の組成物は、ＣＤ４陽性アナジーＴ細胞および／またはＣＤ８陽性アナジーＴ細胞を含み得る。また、本開示の組成物は、制御性Ｔ細胞、例えばＦＯＸＰ３陽性ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞をさらに含んでもよい。
【００３８】
この免疫寛容（アナジー）が惹起された細胞は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体等の阻害因子によって誘導され得る。このような阻害因子は、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。一局面では、上記タンパク質は、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である。別の局面では、上記抗体の改変体は、抗原結合断片である。別の局面では、上記細胞表面分子の改変体は、融合タンパク質である。別の局面では、上記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される。別の局面では、上記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである。いくつかの実施形態において、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６は、抗原提示細胞により発現され、ＣＤ２８は、Ｔ細胞により発現される。特定の実施形態において、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体および／または抗ＣＤ８６抗体あるいはＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質であり得る。本開示における使用が想定される阻害因子としては、上述されるようにＣＴＬＡ−４  Ｉｇ融合タンパク質が挙げられる。ＣＴＬＡ−４  Ｉｇ融合タンパク質は、抗原提示細胞上におけるＣＤ８０／ＣＤ８６への結合について、Ｔ細胞上の共刺激受容体であるＣＤ２８と競合し、その結果、Ｔ細胞の活性化を阻害するように機能する。本開示では、上記ＣＴＬＡ−４  Ｉｇ融合タンパク質として、アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標））、ベラタセプトまたはＭａｘｙ−４が想定される。ベラタセプトは、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する結合アビディティを顕著に増大させる２つのアミノ酸置換（Ｌ１０４ＥおよびＡ２９Ｙ）を含有する（Ｄａｖｉｅｓ  ＪＫら、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．（２０１２）；２１（９）：２０４７〜６１、Ａｄａｍｓ  ＡＢら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１６）１９７（６）：２０４５〜５０を参照のこと）。また、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質と同様の効果が期待される阻害因子として、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質（Ｐｅａｃｈ  ＲＪら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．（１９９４）１８０（６）：２０４９〜２０５８）も挙げられる。本開示の阻害因子は、核酸の形態でも使用され得る。一例を挙げると、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質をコードする核酸を、アデノウイルスベクターなどを介して細胞に導入し、発現させることも想定される。例えば、Ｊｉｎ  ＹＺら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．（２００３）；３５（８）：３１５６〜９を参照のこと。
【００３９】
（治療）
別の局面において、本開示は、被験体において、疾患、障害または状態を予防または治療する方法であって、該方法は、（１）ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体等の阻害因子と、該被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合することによってアナジーが誘導された細胞を含む製剤を該被験体に投与する工程と、（２）該被験体のＴ細胞のアナジー状態を確認し、アナジー状態が確認できる場合はさらなる処置をせず、アナジー状態が確認できない場合、該細胞を含む製剤を再度投与する工程とを含む、方法を提供する。
【００４０】
この局面ではまた、本開示は、被験体において、疾患、障害または状態を予防または治療するための医薬であって、該医薬は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体等の阻害因子と、該被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合することによってアナジーが誘導された細胞（例えば、Ｔ細胞）を含み、ここで、該医薬は、被験体のＴ細胞のアナジー状態を確認し、アナジー状態が確認できる場合はさらなる処置をせず、アナジー状態が確認できない場合、該細胞を含む製剤を再度投与されることを特徴とする。
【００４１】
いくつかの実施形態において、前記製剤または医薬は、ＣＤ４陽性アナジー細胞、ＣＤ８陽性アナジー細胞、またはそれらの組合せを含む。特定の実施形態において、前記製剤または医薬は、ＣＤ８陽性アナジー細胞を含む。
【００４２】
アナジー状態の確認は、アナジーが誘導された細胞を含む製剤が消失することを確認することによって行われ得る。アナジーが誘導された細胞を含む製剤の消失の確認は、典型的には、被験体（例えば、レシピエント）から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得てＤＮＡを採取し、ＰＣＲ等の方法により発現しているＭＨＣを解析し、被験体に由来しない細胞（例えば、ドナー由来の細胞）に発現し被験体（例えば、レシピエント由来の細胞）に発現しないＭＨＣの有無を検出すること等により行われ得る。あるいは、アナジーが誘導された細胞を標識し、被験体から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）における標識の有無を検出することによっても、アナジーが誘導された細胞を含む製剤の消失の確認を行うことができる。
【００４３】
いくつかの実施形態において、疾患、障害または状態は、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、およびｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される。
【００４４】
本開示が対象とする疾患等が移植免疫拒絶反応である実施形態において、アナジー細胞は、上記阻害因子と、レシピエント由来の細胞（ＰＢＭＣまたは脾臓細胞）と、ドナー由来の抗原またはドナー由来の抗原の含有物とを混合することによって誘導され得る。ナー由来の抗原の含有物は、ＰＢＭＣ、脾臓細胞または移植される臓器由来の細胞であり得る。
【００４５】
本開示が対象とする疾患等がアレルギーである実施形態において、アナジー細胞は、上記阻害因子と、被験体由来の細胞（ＰＢＭＣまたは脾臓細胞）と、アレルギーを引き起こす被験体に由来しない抗原とを混合することによって誘導され得る。
【００４６】
本開示が対象とする疾患等が自己免疫疾患である実施形態において、アナジー細胞は、上記阻害因子と、被験体由来の細胞（ＰＢＭＣまたは脾臓細胞）と、自己免疫疾患の原因となる被験体由来の抗原とを混合することによって誘導され得る。
【００４７】
本開示が対象とする疾患等が移植片対宿主病である実施形態において、アナジー細胞は、上記阻害因子と、移植片を提供するドナーのＰＢＭＣまたは脾臓細胞と、レシピエント由来の抗原または該抗原の含有物とを混合することによって誘導され得る。レシピエント由来の抗原の含有物は、ＰＢＭＣ、脾臓細胞または臓器が移植される部位の周辺の細胞もしくはそれに由来する細胞であり得る。
【００４８】
本開示が対象とする疾患等がｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞およびそれらの細胞に由来する細胞、組織または臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応である実施形態において、アナジー細胞は、上記阻害因子と、被験体由来の細胞（ＰＢＭＣまたは脾臓細胞）と、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞から分化させた移植に用いる細胞とを混合することによって誘導され得る。
【００４９】
以下に本開示による疾患等の治療例を示すが、以下に限定されるものではない。
【００５０】
（アレルギーおよび自己免疫疾患）
１つの局面において、本開示は、本開示の医薬を用いてアレルギーおよび／または自己免疫疾患を治療または予防する方法およびそれに用いる医薬、組成物、細胞混合物を提供する。アレルギーおよび自己免疫疾患に関しては、患者の末梢血から得たマクロファージを慣例的な方法により抗原提示能の高い樹状細胞（マクロファージ由来樹状細胞）へと分化させ、放射線（γ線）照射後のこの細胞にアレルギーや自己免疫疾患における過剰反応の原因となっている抗原を提示させ、同じ患者末梢血から得たＴ細胞群と、抗ＣＤ８０抗体および／または抗ＣＤ８６抗体あるいはＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質などの阻害因子の存在下で１〜２週間共培養し、アレルギーや自己免疫疾患の原因となっている抗原に特異的なアナジー細胞を得る。このアナジー細胞を患者に投与することで、アレルギーや自己免疫疾患の原因となっている抗原に特異的な免疫寛容を誘導し、アレルギーおよび自己免疫疾患の予防および治療に用いる。予防的療法であるか治療であるか、さらに症状の強弱等の諸条件により、投与回数は複数回となることもある。
【００５１】
（移植片対宿主病）
１つの局面において、本開示は、本開示の医薬を用いて移植片対宿主病を治療または予防する方法およびそれに用いる医薬、組成物、細胞混合物を提供する。移植片対宿主病においては、移植免疫拒絶反応に対する治療とは対照的に、移植片を提供するドナーのＰＢＭＣまたはＴ細胞等の移植片対宿主病の原因となりうる細胞を、放射線（γ線）照射した宿主由来のＰＢＭＣまたはそれ以外の細胞と抗ＣＤ８０抗体および／または抗ＣＤ８６抗体あるいはＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質などの阻害因子の存在下で１〜２週間共培養し、宿主に特異的なアナジー細胞を得る。このアナジー細胞を宿主に投与することで、移植片対宿主病の原因となっている移植片による宿主への反応を抑制し（免疫寛容を誘導し）移植片対宿主病を予防および治療する。予防的療法であるか治療であるか、さらに移植する組織やその大きさ、症状の強弱等の諸条件により、投与回数は複数回となることもある。
【００５２】
（ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞を用いた治療への応用）
１つの局面の局面において、本開示は、本開示の医薬を用いてｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞を用いた予防または治療において、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞およびそれらの細胞に由来する細胞、組織または臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応またはその他の副作用を治療または予防する方法およびそれに用いる医薬、組成物、細胞混合物を提供する。ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞を用いた治療への応用では、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞およびそれらの細胞に由来する細胞、組織または臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応が代表的に治療対象として例示される。
【００５３】
代表的な例を詳細に述べると、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞を用いた治療への応用においては、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞から分化させた移植に用いる細胞または樹状細胞に放射線（γ線）を照射し、この細胞と移植を受ける患者のＰＢＭＣまたはＴ細胞群を抗ＣＤ８０抗体および／または抗ＣＤ８６抗体あるいはＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質などの阻害因子の存在下で１〜２週間共培養し、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞から分化させた細胞に特異的なアナジー細胞を得る。このアナジー細胞を宿主に投与することで、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞に由来する移植した細胞、組織、および臓器に特異的な免疫寛容を誘導し、それらへの拒絶反応を予防および治療する。予防的療法であるか治療であるか、さらに移植する組織やその大きさ、症状の強弱の諸条件により、投与回数は複数回となることもある。
【００５４】
（アレルギー）
１つの局面において、本開示は、本開示の医薬を用いてアレルギーを治療または予防する方法およびそれに用いる医薬、組成物、細胞混合物を提供する。本発明者らは、ＣＤ８０／ＣＤ８６とＣＤ２８との相互作用を阻害する抗体等の阻害因子によりアナジーが誘導された細胞を含む製剤が、アレルギーに対する免疫寛容を惹起することができることを実証した。したがって、別の局面の局面において、本開示は、被験体のアレルギーを治療または予防するための組成物であって、該組成物は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体等の阻害因子と、該被験体由来の細胞と、アレルギーの原因となっている抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞を含む、組成物を提供する。
【００５５】
いくつかの実施形態において、アレルギーに対する免疫寛容は、恒久的な免疫寛容（感染性免疫寛容）であり得る。
【００５６】
アレルギーの原因となる抗原としては、食品、花粉、薬品、および金属などが挙げられ、より具体的には、ダニ抗原、卵白抗原、ミルク抗原、小麦抗原、ピーナッツ抗原、大豆抗原、ソバ抗原、ゴマ抗原、コメ抗原、甲殻類抗原、キウイ抗原、リンゴ抗原、バナナ抗原、モモ抗原、トマト抗原、マグロ抗原、サケ抗原、サバ抗原、牛肉抗原、鶏肉抗原、豚肉抗原、ネコ皮屑抗原、昆虫抗原、花粉抗原、イヌ皮屑抗原、真菌抗原、細菌抗原、ラテックス、ハプテンおよび金属等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５７】
（ｉＰＳ細胞等によって生じる免疫拒絶反応の抑制または予防）
１つの局面の局面において、本開示は、ｉＰＳ細胞等によって生じる免疫拒絶反応の抑制または予防のための方法を提供し、その抑制または予防のための、医薬、組成物、細胞混合物を提供する。本発明者らは、ＣＤ８０／ＣＤ８６とＣＤ２８との相互作用を阻害する抗体等の阻害因子によりアナジーが誘導された細胞を含む製剤が、ｉＰＳ細胞等またはそれらに由来する細胞、組織または臓器によって生じる免疫拒絶反応に対する免疫寛容を惹起することができることを実証した。したがって、別の局面の局面において、本開示は、被験体において、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器によって生じる免疫拒絶反応を抑制するまたは予防するための組成物であって、該組成物は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体等の阻害因子と、該被験体由来の細胞と、該ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞に由来する抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞を含む、組成物を提供する。
【００５８】
いくつかの実施形態において、ｉＰＳ細胞等またはそれらに由来する細胞、組織または臓器によって生じる免疫拒絶反応に対する免疫寛容は、恒久的な免疫寛容（感染性免疫寛容）であり得る。
【００５９】
ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞に由来する（から分化した）細胞、組織もしくは臓器としては、例えば、神経細胞または組織、角膜細胞または組織、心筋細胞または組織、肝臓または組織、軟骨細胞または組織、皮膚細胞または組織、腎臓または組織、などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞に由来する（から分化した）細胞、組織もしくは臓器としては、神経細胞または組織、心筋細胞または組織、軟骨細胞または組織および皮膚細胞または組織が挙げられる。
【００６０】
（制御性Ｔ細胞ではない、アナジーを誘導する活性を有するＴ細胞および製造方法）
本発明者らは、移植後後期（例えば、移植後８０日以降）には、ＣＤ８陽性細胞の反応性が失われ、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を除去しても免疫寛容が誘導されることを実証した。したがって、本開示の一つの局面において、制御性Ｔ細胞ではない、アナジーを誘導する活性を有するＴ細胞が提供される。さらなる態様において、本開示は、制御性Ｔ細胞ではない、被験体に対してアナジーを誘導する活性を有するＴ細胞を製造する方法であって、（Ａ）ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、該被験体由来の細胞と、該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合する工程と、（Ｂ）該混合物を培養してＴ細胞を得る工程と、（Ｃ）必要に応じて、該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物で該Ｔ細胞を刺激し、該Ｔ細胞が反応しないことを確認する工程とを包含する、方法を提供する。
【００６１】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞が反応しないことを確認する工程は、刺激に応じて増殖しないことを確認することを含み得る。
【００６２】
いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性細胞および／またはＣＤ８陽性細胞を含む。特定の実施形態において、前記Ｔ細胞は、ＣＤ８陽性細胞を含む。
【００６３】
別の局面の局面において、本開示は、特定の抗原に対する、被験体内のＣＤ８陽性Ｔ細胞の無反応または低反応を誘導するための組成物を提供する。
【００６４】
（医薬）
別の局面において、本開示は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体等の阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該験検体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合することによって免疫寛容が誘導された細胞を含む、該被験体に由来しない抗原によって生じる疾患、障害または状態を処置または予防するための医薬を提供する。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本開示の医薬によって処置される疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、およびｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらに由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される。
【００６６】
以下に、典型的な本開示の細胞製剤の製造および品質管理の方法の一例を示す。
【００６７】
（アナジーＴ細胞を含む細胞製剤の製造および品質管理）
１．生物由来原料およびその対応状況
一つの実施形態では、アナジーＴ細胞の製造工程において、表１に記載の生物由来原料基準に適合した生物由来原料を使用する。
【００６８】
アナジーＴ細胞の投与は、レシピエントに対しドナーからの臓器移植（例えば、肝臓移植）が実施された後に行われる。ドナー臓器（例えば、肝臓）の中には、自己由来アナジーＴ細胞の材料であるドナー由来単核球もウイルス除去されない状態で含まれており、ドナー由来単核球を含んだままドナー臓器（例えば、肝臓）はレシピエントに移植される。そのため、自己由来アナジーＴ細胞の材料として使用するドナー由来単核球は、生物由来原料に該当しないと考える。
【００６９】
【表１】
2019245039.tif 000003
ベラタセプト（例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹから入手可能）
２．細胞製剤の製法
一つの実施形態では、細胞製剤は以下のように製造することができる。以下に例示する各種数値等は、代表例であり、当業者は適宜変更して細胞製剤の製造を行うことができる。
１）  投与１９日前頃に、医療機関においてドナーにアフェレーシスを実施し、ドナーアフェレーシス産物を３０Ｇｙの放射線を照射し、細胞増殖能を無くした後に、細胞加工を実施する細胞培養加工施設へ発送する。
２）  ドナーアフェレーシス産物受領後、細胞培養加工施設において、ドナー単核球を密度勾配遠心法により分離、回収後、２つに分けて凍結し、−８０±１０℃で保管する。
３）  投与１４日前頃に、医療機関においてレシピエントにアフェレーシスを実施し、レシピエントアフェレーシス産物を、細胞加工を実施する細胞培養加工施設へ発送する。
４）  レシピエントアフェレーシス産物受領後、細胞培養加工施設において、レシピエント単核球を密度勾配遠心法により分離、回収し、解凍したドナー単核球ならびに抗ＣＤ８０抗体および抗ＣＤ８６抗体またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質などの阻害因子と共培養する。
５）  投与７日前頃に培地交換を行う。７日間培養した中間製品を回収し、解凍したドナー単核球ならびに抗ＣＤ８０抗体および抗ＣＤ８６抗体またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質などの阻害因子と共培養する。
６）  投与当日に細胞加工物を密度勾配遠心法により回収後に、洗浄し、生理食塩液に充填する。
７）  医療機関に発送し、医療機関でレシピエントに投与する。
【００７０】
（製造および品質試験フローの代表例）
【００７１】
【化１】
2019245039.tif 000004
３．工程内管理試験
一つの実施形態では、製造工程内において、表２に記載した工程内管理試験を実施することができる。以下に例示する各種数値等や手順は、代表例であり、当業者は適宜変更して工程内管理試験を実施することができる。
【００７２】
【表２】
2019245039.tif 000005
４．規格試験、特性解析試験
一つの実施形態では、最終製品を用いて表３に記載した規格試験を行うことができる。表３に例示する手順は、代表例であり、当業者は適宜変更して規格試験、特性解析試験を実施することができる。例えば、その改変例としては、実施例１１に例示した規格を挙げることができる。誘導性抑制性Ｔ細胞投与時には結果が判明しない場合、工程内管理試験の結果を参考に、治験製品の出荷を判断することができる。
【００７３】
また、製造工程内の細胞、最終製品を用いて表３に記載した特性解析試験を行うことができる。
【００７４】
【表３】
2019245039.tif 000006
【００７５】
上記治験製品規格試験、特性解析試験は、本明細書に記載されるとおりであり、治験製品規格試験は、外観、細胞数、生細胞率、細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ/ＣＤ４５ＲＯ）、製造工程由来不純物（ドナー由来細胞、培地成分、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、細胞凍害保護液成分、比重分離液成分）、ウイルス否定試験、無菌試験、マイコプラズマ否定試験、およびエンドトキシンを含み得る。効能試験として、培養細胞を用いたリンパ球混合試験（ＭＬＲ）によるサイトカイン産生もしくはトリチウム取り込み試験を含み得る。細胞表現型の基準値については、例えば、ＣＤ３陽性細胞比率は、代表的には表中の５０％以上を基準値とすることができ、あるいは例えば、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上あるいは、これらの間の数値（１％、０．５％刻み等で設定し得る）であってもよい。ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ８陽性ＣＤ４４陽性細胞比率は、代表的には表中の１０％以上を基準値とすることができ、あるいは例えば、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１１％以上、１２％以上、１３％以上、１４％以上、１５％以上などであってもよい。ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ４４陽性細胞比率は、設定しなくてもよく、あるいは例えば、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１１％以上、１２％以上、１３％以上、１４％以上、１５％以上などを基準値として設定してもよい。ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性細胞比率は、設定しなくてもよく、あるいは例えば、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１１％以上、１２％以上、１３％以上、１４％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上などを基準値として設定してもよい。ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性細胞比率は、設定しなくてもよく、あるいは例えば、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１１％以上、１２％以上、１３％以上、１４％以上、１５％以上などを基準値として設定してもよい。ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性細胞比率は、設定しなくてもよく、あるいは例えば、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１１％以上、１２％以上、１３％以上、１４％以上、１５％以上などを基準値として設定してもよい。ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ２５細胞比率は、代表的には表中の５％以上を基準値とすることができ、あるいは例えば、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１１％以上、１２％以上、１３％以上、１４％以上、１５％以上などであってもよい。細胞数は、１×１０９個以上を代表的に基準として採用し得るが、あるいは、例えば、１×１０８個以上、５×１０８個以上、１×１０９個以上、２×１０９個以上、３×１０９個以上などであってもよい。生細胞率は、７０％以上を代表的に基準として採用し得るが、あるいは、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上などを基準として採用することもできる。
【００７６】
最終製品の組成
最終製品は、一例をあげると、下記表に記載の構成物で構成される。これらの規格もまた、当業者は適宜変更して組成を変更して再生医療等製品を構成することができる。
【００７７】
【表３−１】
2019245039.tif 000007
【００７８】
当業者は、規格試験、特性解析試験について、本明細書に記載される技術的事項を適宜参酌して必要に応じて変更を行って具体的に実施することができる。
【００７９】
５．再生医療等製品の投与方法
一つの実施形態において、臓器移植後１４日後に一回投与する。当業者は、投与方法やその期間等について、本明細書に記載される技術的事項を適宜参酌して必要に応じて変更を行って具体的に実施することができる。
【００８０】
（自己由来制御性Ｔ細胞製造手順）
以下に、自己由来制御性Ｔ細胞の典型的な製造方法を説明する。
【００８１】
事前の確認
一つの実施形態では、事前の確認は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬、手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更して事前の確認の製造を行うことができる。
【００８２】
ドナー及び患者の感染症スクリーニング検査を実施し、ドナーについてはＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗体、ＨＩＶ−１／２、ＨＴＬＶ−１抗体が全て陰性であることを確認する。
【００８３】
１．ドナーリンパ球の分離（無菌下で行う）
一つの実施形態では、ドナーリンパ球の分離は以下のように製造することができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更してドナーリンパ球の分離を行うことができる。
・アフェレーシスでドナーリンパ球を回収バッグに採取し、その回収バッグを放射線照射する。
・前述の放射線照射済み末梢血単核球を、適量のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  PREMIUM(GE  Healthcare  #17-5442-02)またはLymphocyte  separation  Solution(ナカライテスク#20828)等（例えば、２０ｍＬ）が入った遠心管に入れ、８６０Ｇで２０分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをslow、ブレーキをslowに設定する）する。
・上清を捨て、リンパ球層を含む細胞浮遊液を、別の遠心管（例えば、５０ｍＬ遠心管２本）に移す。
・細胞浮遊液の入った遠心管に、生理食塩液を追加し（例えば、全液量が５０ｍＬになるまで適量）、シリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた５０ｍＬシリンジ）またはピペットで吸引排出を繰り返して、よく混和させる。
・５００Ｇで１０分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをfastに設定してもよい）する。
・上清を捨て、再度生理食塩液を追加し（例えば、全液量が５０ｍＬになるまで適量）、細胞ペレットを、ピペットで吸引排出を繰り返して、よく混和させる。
・５００Ｇで５分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをfastに設定してもよい）する。
・上清を捨てる。
・予めドナーより採取した血漿を含むＡＬｙＳ５０５Ｎ-0培養液(細胞科学研究所  （CSTI）1020Ｐ10))を、細胞ペレットに加え（例えば、全液量が３１ｍＬになるまで適量）、
ピペットで吸引排出を繰り返して、よく混和させる。
・シリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた１ｍＬシリンジ）またはピペットで、適量（例えば、０．３ｍＬ）抜き取り、細胞数および生細胞数を確認する。
【００８４】
２．ドナーリンパ球の凍結保存（無菌下で行う）
一つの実施形態では、ドナーリンパ球の凍結保存は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更してドナーリンパ球の凍結保存を行うことができる。
・凍結バッグ（例えば、フローズバッグF-050  ２５ｍＬ凍結バッグ(株)ニプロ89-101）
を無菌下で開封し、ラベルに必要事項（日付、製造番号、ドナー名）を記入する。
・シリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた３０ｍＬシリンジ）で、細胞浮遊液を取り、凍結バッグに入れる。
・ＡＣＤ液（(株)テルモTP-A05ACD、例えば、細胞浮遊液１５ｍＬに対して２ｍＬ）を、
細胞浮遊液が入った凍結バッグに加え、４℃で冷却した保冷剤に挟んで、１０分間程度冷やす。
・シリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた２０ｍＬシリンジ）を用いて、４℃で冷却したＣＰ−１（極東製薬工業(株)  551-27202-4細胞凍害保護液CP-1）例えば、８．５ｍＬ）を、凍結バッグに１分半程度の時間をかけて加える。この際、凍結バッグをゆっくり攪拌する。
・シリンジを用いて、凍結バッグおよびそのポート内の空気を全て抜き取る。
・チューブシーラーを使用して凍結バッグをシールし、まず４℃で約５〜１０分冷却し、その後−８０℃の冷凍庫で保管する。
【００８５】
３．ドナーリンパ球の解凍（無菌下で行う）
一つの実施形態では、ドナーリンパ球の解凍は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更してドナーリンパ球の解凍を行うことができる。
・保存されたドナー細胞の凍結バッグを、例えば、３７℃恒温槽で解凍する。以降の操作は、好ましくは無菌下で行う。
・シリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた５０ｍＬシリンジ）を用いて、解凍された凍結バッグから細胞浮遊液を抜き取り、遠心管（例えば、５０ｍＬ遠心管２本に１２．５ｍＬずつ）に移す。
・細胞浮遊液の入った遠心管に、例えば５％アルブミン液(日本製薬(株)  123146364  献血アルブミン5％静注12.5g/250mL)（例えば、細胞浮遊液１２．５ｍＬに対して３７．５ｍＬ）を追加し、よく混和させる。その後、約５分間静置する。
・例えば、６００Ｇで１０分間、２２℃で遠心分離（例えば、好ましくは、遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをslowに設定する）する。
・上清を静かに捨て、細胞ペレットに、洗浄用のアルブミン加生理食塩液（例えば、５％アルブミン液２５ｍＬと生理食塩液１９ｍＬから作製する）等の適宜の液を加えて懸濁する。
・例えば、６００Ｇで１０分間、２２℃で遠心分離（例えば、好ましくは、遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをslowに設定する）する。
・上清を静かに捨て、細胞ペレットに、ＡＬｙＳ５０５Ｎ培養液（例えば、５０ｍＬ遠心管に対して１０ｍＬ）を加えて懸濁する。
・ＡＬｙＳ５０５Ｎ-0培養液またはそれと同等の液が入った培養バッグ（例えば、(株)ニプロ87598  ニプロメディウムALyS505NB10）に、抗ヒトＣＤ８０抗体（例えば、ｍ２Ｄ１０．４；Ｃａｔ．Ｎｏ．１６−０８０９−８５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）と抗ヒトＣＤ８６抗体（例えば、ＩＴ２．２；Ｃａｔ．Ｎｏ．１６−０８６９−８５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）をそれぞれ例えば最終濃度１０μｇ／ｍＬで加え（またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（例えば、ベラタセプト）などの阻害因子を加え）、この培養バッグに、上記の細胞浮遊液をシリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた２０ｍＬシリンジ）で注入して加える。一例では、培養バッグ中の総液量は、約８４０ｍＬである。
【００８６】
４．患者リンパ球の分離〜一次培養開始（無菌下で行う）
一つの実施形態では、患者リンパ球の分離は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更して患者リンパ球の分離を行うことができる。
・患者より採取した血漿は、恒温槽中、例えば、５６℃で３０分間加温し、非働化しておく。直ちに使用しないものは、凍結保存する。
・患者より採取した末梢血を、適量の適切な媒体、例えばＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（例えば、２０ｍＬ）が入った遠心管に入れ、例えば、８６０Ｇで２０分間、２２℃で遠心分離（例えば、好ましくは、遠心分離機のアクセルをslow、ブレーキをslowに設定する）する。
・上清を捨て、リンパ球層を含む細胞浮遊液を、別の遠心管（例えば、５０ｍＬ遠心管２本）に移す。
・細胞浮遊液の入った遠心管に、生理食塩液を追加し（例えば、全液量が５０ｍＬになるまで適量）、ピペットで吸引排出を繰り返して、よく混和させる。
・例えば、５００Ｇで１０分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをfastに設定してもよい）する。
・上清を捨て、再度生理食塩液を追加し（例えば、全液量が５０ｍＬになるまで適量）、細胞ペレットを、ピペットで吸引排出を繰り返して、よく混和させる。
・例えば、５００Ｇで５分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをfastに設定してもよい）する。
・上清を捨て、細胞ペレットに、例えば、ＡＬｙＳ５０５Ｎ-0培養液（例えば、１０ｍＬ）を加えて懸濁し、細胞浮遊液を作製する（例えば、合計２０ｍＬになるまでＡＬｙＳ５０５Ｎ-0培養液を追加する）。ここで、０．５ｍＬ程度の細胞浮遊液を抜き取り、細胞数、生細胞数および表面抗原の発現を確認する。
・「３．ドナーリンパ球の解凍」で作製したＡＬｙＳ５０５Ｎ-0培養液中ドナー細胞および抗体等の阻害因子が入った培養バッグに患者由来の非働化血漿を追加する。
・この培養バッグに、上記患者由来細胞浮遊液をシリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた２０ｍＬシリンジ）で注入して加え、チューブシーラーを使用して培養バッグをシールする。一例では、培養バッグ中の総液量は、約1000mＬである。
・３７℃インキュベーター内で、例えば、１週間培養する。
【００８７】
５−１．培地交換（例えば、１週間目、好ましくは無菌下で行う）
一つの実施形態では、培地交換は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更して培地交換を行うことができる。
・インキュベーターから培養バッグを取り出し、内容物を、遠心管（例えば、２２５ｍＬ遠心管４本）に分注する。
・例えば、６００Ｇで１０分間、２２℃で遠心分離（例えば、好ましくは、遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをfastに設定してもよい）する。
・上清を静かに捨て、細胞ペレットに、例えば、ＡＬｙＳ５０５Ｎ-0培養液を加えて懸濁し、細胞浮遊液を作製する（例えば、合計２０ｍＬになるまでＡＬｙＳ５０５Ｎ-0培養液を追加する）。ここで、０．３ｍＬ程度の細胞浮遊液を抜き取り、細胞数および生細胞数を確認する。
・例えば、ＡＬｙＳ５０５Ｎ-0培養液が入った培養バッグに、細胞浮遊液をシリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた２０ｍＬシリンジ）で注入して加える。
・抗ヒトＣＤ８０抗体（例えば、２Ｄ１０．４）希釈液と抗ヒトＣＤ８６抗体（例えば、ＩＴ２．２）希釈液を、それぞれ例えば、最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように（またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（例えば、ベラタセプト）等の阻害因子を）、培養バッグにシリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた２０ｍＬシリンジ）で注入して加える。
【００８８】
５−２．ドナーリンパ球の解凍・抗原再刺激〜二次培養開始（例えば、１週間目、無菌下で行う）
一つの実施形態では、ドナーリンパ球の解凍・抗原再刺激〜二次培養開始は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更してドナーリンパ球の解凍・抗原再刺激〜二次培養開始を行うことができる。
・保存されたドナー細胞の凍結バッグと患者由来の非働化血漿を、例えば、３７℃恒温槽で解凍する。以降の操作は、好ましくは、無菌下で行う。
・シリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた５０ｍＬシリンジ）を用いて、解凍された凍結バッグからドナー細胞浮遊液を抜き取り、遠心管（例えば、５０ｍＬ遠心管２本）に移す。
・ドナー細胞浮遊液の入った遠心管に、５％アルブミン液（例えば、５０ｍＬ遠心管２本につき、合計で約５０ｍＬ）を追加し、よく混和させる。その後、約５分間静置する。
・例えば、６００Ｇで１０分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをslowに設定する）する。
・上清を静かに捨て、細胞ペレットに、洗浄用のアルブミン加生理食塩液（例えば、５％アルブミン液２５ｍＬと生理食塩液１９ｍＬから作製する）を加えて懸濁する。
・例えば、６００Ｇで１０分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをslowに設定する）する。
・上清を静かに捨て、細胞ペレットに、例えば、ＡＬｙＳ５０５Ｎ-0培養液（例えば、５０ｍＬ遠心管に対して１０ｍＬ）を加えて懸濁する。
・「３．ドナーリンパ球の解凍」で作製したＡＬｙＳ５０５Ｎ培養液中患者細胞および抗体等の阻害因子が入った培養バッグに、解凍した患者由来の非働化血漿（例えば、１０ｍＬ）をシリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた２０ｍＬシリンジ）で注入して加え、さらに、この培養バッグに、上記の細胞浮遊液をシリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた２０ｍＬシリンジ）で注入して加える。一例では、培養バッグ中の総液量は、約1000ｍＬである。
・チューブシーラーを使用して培養バッグをシールする。
・３７℃インキュベーター内で、例えば、１週間培養する。
【００８９】
６．二次培養中の検査（培養細胞抜き取り試験）
一つの実施形態では、二次培養中の検査は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更して二次培養中の検査を行うことができる。
・代表的に、二次培養開始から３日目（培養通算１０日目）に少量の培養液を、培養バッグから抜き取り、マイコプラズマ汚染などについて検査する。
【００９０】
７．培養リンパ球の回収・充填（無菌下で行う）
一つの実施形態では、培養リンパ球の回収・充填は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更して培養リンパ球の回収・充填を行うことができる。
・例えば、二次培養開始から７日目（培養通算１４日目）インキュベーターから培養バッグを取り出し、内容物を、遠心管（例えば、２２５ｍＬ遠心管４本）に分注する。
・例えば、６００Ｇで１０分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをｆａｓｔ、ブレーキをｆａｓｔに設定してもよい）する。
・上清を静かに捨て、細胞ペレットに、生理食塩液を加えて懸濁する。
・例えば、６００Ｇで１０分間、２２℃で遠心分離（例えば、好ましくは、遠心分離機のアクセルをｆａｓｔ、ブレーキをｆａｓｔに設定してもよい）する。
・上清を静かに捨て、細胞ペレットに、生理食塩液（例えば、１０ｍＬ）を加えて懸濁し、細胞浮遊液を作製する。
・細胞浮遊液を、適量のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（例えば、２０ｍＬ）が入った遠心管（例えば、５０ｍＬ遠心管）に静かに入れて重層させる。
・例えば、８６０Ｇで２０分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをｓｌｏｗ、ブレーキをｓｌｏｗに設定する）する。
・上清を捨て、リンパ球層を含む細胞浮遊液を、別の遠心管（例えば、５０ｍＬ遠心管）に移す。
・細胞浮遊液の入った遠心管に、生理食塩液を追加し（例えば、全液量が５０ｍＬになるまで適量）、シリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた５０ｍＬシリンジ）で吸引排出を繰り返して、よく混和させる。
・例えば、５００Ｇで１０分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをｆａｓｔ、ブレーキをｆａｓｔに設定してもよい）する。
・上清を５ｍＬ程度残して他は捨て、ピペットで吸引排出を繰り返して、よく混和させる。
・生理食塩液を追加し（例えば、全液量が５０ｍＬになるまで適量）、シリンジ（例えば、例えば、１８Ｇ注射針をつけた５０ｍＬシリンジ）で吸引排出を繰り返して、よく混和させる（ａ）。
・例えば、５００Ｇで５分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをｆａｓｔ、ブレーキをｆａｓｔに設定してもよい）する（ｂ）。
・上清を５ｍＬ程度残して他は捨て、ピペットで吸引排出を繰り返して、よく混和させる（ｃ）。
・上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）をさらに２回繰り返す。
・最後の遠心分離後の上清を、適量（例えば、４ｍＬ）を抜き取り、無菌検査およびマイコプラズマ検査に供する。
・再度生理食塩液を加えて懸濁し、細胞浮遊液を、最終的な容器（例えば、１００ｍＬ生理食塩液のボトル）に移す。適量（例えば、４ｍＬ）を抜き取り、最終的な生成物の、細胞数、生細胞数、表面抗原の発現およびエンドトキシンの含有量を確認する。
【００９１】
８．二次包装
一つの実施形態では、二次包装は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更して二次包装を行うことができる。
・代表的には、適切な基準（代表的には、ＮＵＨＣＰＣ−Ｍ−１２−ＡＴＲＥＧ）に基づいてラベルに被験者ＩＤ、製造番号、使用期限を入力して印刷し、容器にラベルを貼付する。
・適切な基準（代表的には、ＮＵＨＣＰＣ−ＰＭＦ−ＡＴＲＥＧ１４）に基づいて「用法・用量・効能または効果ならびに使用上の注意または取扱い上の注意」を発行する。
・チャック付ビニール袋に試験物および「用法・用量・効能または効果ならびに使用上の注意または取扱い上の注意」を収納する。
・出荷するまで移送容器に入れてモニタリングユニット内に保管する。
【００９２】
（注記）
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上
」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つ
の値の範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。
【００９３】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００９４】
以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００９５】
以下、実施例に基づいて本開示をより具体的に説明する。ただし、本開示はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本明細書全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。【００９６】
（実施例１：免疫寛容誘導実験）
本実施例では、免疫寛容を惹起するために投与される細胞製剤が反応すべきレスポンダー細胞と直接接触することが、抑制作用の発揮に必要であるかどうかを試験した。以下に手法を説明する。【００９７】
（非接触式混合培養）
（材料および方法）
（アナジー細胞の調製）
既に文献に記載された方法に従い図1に示す実験を行った(1-4)。概説すると、Ｐｒｏｍｏ  ｃｅｌｌ社製Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ―４４０１０）またはＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＃１７−５４４２−０２）またはＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク＃２０８２８）等を用いて、4人のボランティア（2人をスティミュレイター、2人をレスポンダーとする）のヒト末梢血から単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離し、４×１０６細胞／ｍｌとなるよう２％ヒトＡＢ型血清（プール）添加Ｂｉｏｗｅｓｔ社製ＡＬｙＳ５０５Ｎ−０培地（細胞科学研究所（CSTI）1020Ｐ10）で調整した。スティミュレイターＰＢＭＣには放射線(γ線)３０Ｇｙを照射し、レスポンダーＰＢＭＣと１：１で混合した。上記にて混合したＰＢＭＣに、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製マウス抗ヒトＣＤ８０抗体（2D10.4）（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６−０８０９−８５）とマウス抗ヒトＣＤ８６抗体（IT2.2）（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６−０８６９−８５）をそれぞれ最終濃度が１０μｇ／ｍＬになる様に添加し、12ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、#3513）（1〜2.5ml）、6ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ．Ｎｏ．3516)(3〜6ml)、6ｃｍシャーレ(Greiner  CELLSTAR（登録商標）dish，Ｃａｔ．Ｎｏ．628160)(3〜6ml)、または１０ｃmシャーレ(Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ．Ｎｏ．430167)(10〜15ml)にて３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養を開始した(day0)。培養開始後5日目(day5)に遠心により培養液を除いた後に、放射線照射スティミュレイターPBMCと抗CD80抗体/抗CD86抗体を含む培養液を培養開始時と同じ条件で添加した。2日後(day7)に細胞を回収し遠心により培養液をウォッシュアウトし、アナジー細胞を得た。【００９８】
（細胞非通過膜(Millicell（登録商標））を有するセルカルチャーインサートプレート（Cat.N：  PSHT004R1）を用いた培養（ダブルチャンバー培養））
得られたアナジー細胞またはレスポンダーPBMCを、放射線照射したスティミュレーターPMBCと1:1の比率に調整し、通称トランスウェルメンブレンと呼ばれる液性因子は透過するが、細胞は透過できない膜を有する上段のウェル中にて培養した。この下段には、新たに採取したレスポンダーPBMCおよび放射線照射スティミュレーターPBMCを各２×106細胞/mＬで１：１に混合した(最終２００μＬ／ウェルで４ウェルずつ)。これらの上段、下段のウェルを、９６ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．3381)上に組み、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。【００９９】
培養開始４日目に３Ｈ−チミジン（１０μＬ）を添加し、培養開始５日目（３Ｈ−チミジン添加の１６〜２０時間後）にＣｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により培養細胞を回収し、シンチレーションカウンターにより３Ｈ−チミジン取込み量を測定した。【０１００】
（結果）
結果を図１右パネル上に示す。【０１０１】
トランスウェルメンブレンを介して上段と下段が分離されているため、これを使った培養では細胞間の接触はそれぞれの段のウェル内に制限されるが、産生された液性因子はウェル間を行き来できる。アナジー細胞をスティミュレイター細胞/レスポンダー細胞と同じ段に入れた場合（右端）、左端に見られるスティミュレイター細胞刺激によるレスポンダー細胞の増殖反応を抑制している。それに対して、上段にアナジー細胞とスティミュレイター細胞を入れた場合には、その抑制効果が大きく減弱しており(右から2つ目)、免疫抑制的なサイトカイン(IL-10等)の関与は少ないと示唆された。また上段に新鮮なレスポンダー細胞とスティミュレイター細胞を入れた場合には(左から2番目)、若干の増殖の増強が見られ、これは上段の反応により産生された細胞増殖を誘導するIL-2等の様な液性因子の効果と推察される。この結果から、アナジー細胞が免疫抑制能を発揮するには、スティミュレイター細胞との接触に加え、ナイーブなレスポンダー細胞との直接の接触が必要であることが示され、また抑制能の発揮にはアナジーを誘導するための抗CD80/86抗体存在下での抗原刺激培養が必要であることが示された。【０１０２】
（実施例２：マウス心臓移植におけるエキソビボ誘導性アナジー細胞の養子移入の効果と細胞が消失した後も免疫寛容が持続することを示すマウス実験）
本実施例では、マウスモデルを用いて、細胞製剤に由来する細胞がレシピエントから無くなってしまっても免疫寛容が続くことを実証した。以下にその手順を示す。【０１０３】
（材料および方法）
以下に本実施例で用いた方法および使用した材料を示す。【０１０４】
既に文献に記載された方法に従い実験を行った（5-7）。要約すると、GFPを発現する様に遺伝子改変されたC57BL6(以下B6)由来マウスおよびBALB/cマウスから脾臓を摘出し、赤血球を溶血し脾臓細胞（リンパ球）を得た後、4×106細胞/mlとなるように10%非働化ウシ胎児血清(FCS)(SIGMA  #172012-500ML  Lot  11D257またはbiosera  #FB-1380/500  Lot.015BS482)を含むRPMI1640培地(Sigma;R8758-500MK)にて調整した。スティミュレイターとなるBALB/c脾臓細胞に放射線(γ線)３０Ｇｙを照射したのち、B6脾臓細胞と１：１で混合し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製ハムスター抗マウスＣＤ８０抗体（16-10Ａ１）（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６−０８０１−８２）とラット抗マウスＣＤ８６抗体（GL1）（Ｃａｔ．Ｎｏ．１４−０８６2−８２）を各最終濃度が１０μｇ／ｍＬになる様に添加し、12ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、#3513）（1-2.5  ml）、6ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ．Ｎｏ．3516)(3〜6ml)、6ｃｍシャーレ(Greiner  CELLSTAR（登録商標）dish，Ｃａｔ．Ｎｏ．628160)(3〜6ml)または１０ｃｍシャーレ(Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ．Ｎｏ．430167)(10〜15ml)にて３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で14日間培養した。培養開始後7日目に遠心により培養液を除いた後に、新たにBALB/c放射線照射脾臓細胞と抗CD80抗体/抗CD86抗体とを含む培養液を培養開始時と同じ条件で添加した。14日後に細胞を回収しアナジー細胞を得た。【０１０５】
このGFP発現B6マウス由来アナジー細胞を、２Ｇｙの放射線照射3日後にBALB/cマウスの心臓を移植した野生型B6マウスに、6×106個、4×106個、または2×106個ずつ尾静脈から投与し、心臓の拒絶を観察した。移植後3カ月以上経過(免疫寛容を達成)した6×106個のアナジー細胞を移入したレシピエントマウスを屠殺し、末梢血単核球(PBMC)とともに、摘出した脾臓、リンパ節、移植した心臓からリンパ球を得て、移入したアナジー細胞の存在をGFPの蛍光によりフローサイトメーターを用いて調べた。コントロールとして、同系のB6マウスの心臓を移植し6×106個のアナジー細胞を移入したB6レシピエントマウスを用いて同様の解析を行った。また、BALB/cマウス心臓を移植した3日後、7日後、28日後、50日後、100日後に、6×106個のアナジー細胞を移入した心移植レシピエントマウスを屠殺し、末梢血単核球(PBMC)とともに、摘出した脾臓、リンパ節、移植した心臓からリンパ球を得て、これらからゲノム遺伝子を抽出した後、GFP遺伝子をPCRで増幅するより感度の高い方法で移入したアナジー細胞の存在を調べた。【０１０６】
（結果）
結果を図２および図３に示す。図２aに示すように、アナジー細胞の移入により、細胞数依存的に、移植した心臓の生着率が改善し、6×106個のアナジー細胞の移入により全てのマウスで100日以上の移植した心臓の生着が観察された、すなわち、移植した心臓に対する免疫寛容の誘導が見られた。しかし、図２bに示す様に、移入したアナジー細胞は、末梢血、リンパ節、脾臓のみならず、移植した心臓内においても、蛍光発現によっては検出されなかった。さらに図３aに示す様に、0.1％(１／１０００希釈ＧＦＰマウスゲノムＤＮＡの存在：レーン4)でも検出可能な、ゲノム遺伝子中のGFP遺伝子をPCRにより増幅するより感度の高い検出手法でも、図３bに示す様に、GFP遺伝子の発現は、移植後3日目までは末梢血、脾臓、腸間膜リンパ節、移植した心臓内のすべてにおいて確認できたものの、移植後7日目以降においては、いずれの組織においてもその遺伝子の発現は検出されなかった。このことは、アナジー細胞の移入により100日以上のドナー特異的な免疫抑制に由来する移植した心臓の生着（免疫寛容）が誘導されるものの、移入した細胞は1週間以内にレシピエント生体内で消失することを示唆している。【０１０７】
（実施例３：アナジー細胞による免疫抑制は、抗原に特異的である）
本実施例では、アナジー細胞が特異性を持ち、3rd  party由来の抗原に対する拒絶を抑制しないことを実証した。【０１０８】
（材料および方法）
実施例2と同様の手法で、野生型B6マウス(H-2b)から得た脾臓細胞を、抗ＣＤ８０／８６抗体存在下でBALB/cマウス(H-2b)由来の脾臓細胞で刺激しアナジー細胞を得た。このアナジー細胞を、２Ｇｙの放射線照射3日後にBALB/cマウスまたはCBAマウス(H-2k)の心臓を移植した野生型B6マウスに5×106個尾静脈から投与し、心臓の拒絶を観察した。【０１０９】
（結果）
図４に示す様に、抗ＣＤ８０／８６抗体存在下でBalb/Cマウス脾臓細胞で刺激されたB6マウス由来のアナジー細胞のB6マウスへの移入は、移植されたBALB/cマウスの心臓の拒絶を100％阻害し100日後でも心臓が生着している。これに対して3rd  partyであるCBAマウスの心臓は移植後に速やかに拒絶反応を引き起こし、約50日で100％拒絶される。以上から、抗ＣＤ８０／８６抗体存在下で抗原に反応させられたレシピエント由来のリンパ球は、刺激された抗原特異的に免疫反応の抑制能を有することが示された。【０１１０】
(実施例４：感染性免疫寛容を示す実験)
本実施例では、感染性免疫寛容が生じることを実証した。【０１１１】
（材料および方法）
実施例2と同様の手法でアナジー細胞を得て、図5に示す実験を行った。概説すると、蛍光色素GFPを全ての細胞が発現するよう遺伝子改変されたB6マウスから得た脾臓細胞を、抗ＣＤ８０／８６抗体存在下でBALB/cマウス由来の放射線照射した脾臓細胞で刺激しアナジー細胞を得た。このアナジー細胞を、２Ｇｙの放射線照射4日後にBALB/cマウスの心臓を移植した野生型B6マウスに5×106個尾静脈から投与した。免疫寛容が誘導されたとみなされる心臓移植から100日以上経過した後に、レシピエントマウスを屠殺し、脾臓を摘出した後、赤血球を溶血し脾臓細胞を得た。このアナジー細胞から、CD8-T細胞アイソレーションキット(BioLegend  480035)、もしくはCD4-T細胞アイソレーションキット(BioLegend  480033)を用いて、レシピエントマウス由来のGFP陰性CD8陽性またはGFP陰性CD4陽性細胞を分離した。同様に、B6マウスから新たに取得した新鮮な（ナイーブ）脾臓細胞からも、CD8陽性またはCD4陽性細胞を同様に採取した。これら単離された細胞を、２Ｇｙの放射線照射4日後にBALB/cマウスの心臓を移植した野生型B6マウスに4×106個尾静脈から投与し、心臓の拒絶を観察した。【０１１２】
（結果）
結果を図６に示す。【０１１３】
アナジー細胞の移入により移植した心臓への免疫寛容が誘導されたマウスから得たCD4陽性T細胞またはCD8陽性T細胞の移入は、60%程度のレシピエントマウスにおいて、移植した心臓への免疫寛容を誘導した。それに対して、同数のナイーブなCD8陽性T細胞、CD4陽性T細胞の移入は免疫寛容を誘導できず、移植した心臓は全例で拒絶された。以上の結果は、in  vitroの培養で得られたアナジー細胞の移入により、レシピエントマウスの生体内でアナジーを誘導可能な細胞が新たに誘導されること、すなわち感染性免疫寛容が誘導されている事を示している。また図１に示される様に、移入細胞数を増加させることで免疫寛容の誘導率を上げることは可能であると推察される。【０１１４】
（実施例５：ヒトインビトロモデルでのアロ特異的抑制性アナジー細胞の継代移入）
本実施例では、ヒトインビトロモデルでのアロ特異的抑制性アナジー細胞の継代移入でも効果があることを実証した。【０１１５】
（材料および方法）
実施例１と同様の手法で、ヒト由来のアナジー細胞を得た(1-4)。概説すると、Ｐｒｏｍｏ  ｃｅｌｌ社製Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ―４４０１０）を用いて、4人のボランティア（2人をスティミュレイター、2人をレスポンダーとする）のヒト末梢血から単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離し、４×１０６細胞／ｍＬとなるよう２％ヒトＡＢ型血清（プール）添加Ｂｉｏｗｅｓｔ社製ＡＬｙＳ５０５Ｎ−０培地で調整した。スティミュレイターＰＢＭＣには放射線３０Ｇｙを照射し、レスポンダーＰＢＭＣと１：１で混合した。上記にて混合したＰＢＭＣに、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製マウス抗ヒトＣＤ８０抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６−０８０９−８５）とマウス抗ヒトＣＤ８６抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６−０８６９−８５）をそれぞれ最終濃度が１０μｇ／ｍＬになる様に添加し、12ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、#3513）、6ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ．Ｎｏ．3516)、6ｃｍディッシュ(Greiner  CELLSTAR（登録商標）dish、Ｃａｔ．Ｎｏ．628160)または10ｃｍディッシュ(Greiner  CELLSTAR（登録商標）dish、Ｃａｔ．Ｎｏ．664  160-013)にて３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養を開始した(day0)。培養開始後5日目(day5)に遠心により培養液を除いた後に、放射線照射スティミュレイターPBMCと抗CD80抗体/抗CD86抗体を含む培養液を培養開始時と同じ条件で添加した。その2日後(day7)に細胞を回収し遠心により培養液をウォッシュアウトし、アナジー細胞(1st)を得て、この細胞を蛍光色素CFSEでラベルした。【０１１６】
CFSE  cell  proliferation  kit(Invitrogen  C34554)を用いてCFSEでラベルした細胞を、新たに採取した同一レスポンダーPBMCとの比率が1:1になるように混合した後に、放射線照射した同一スティミュレイターPBMCとレスポンダー細胞の１：１の混合培養系に加えた(day7)。この培養4日目(day11)に再度放射線照射スティミュレイターPBMCを補充した。この培養7日目(day14)にCFSE陰性のレスポンダー由来の細胞のみをJSAN(ベイバイオサイエンス社)を使いソーティングにより回収した(2ndアナジー細胞)。これをCFSEラベルした後に、新たに採取した同一レスポンダーPBMCとの比率が1:1になるように混合し、放射線照射した同一スティミュレイターPBMCとレスポンダー細胞の１：１の混合培養系に加えた(day14)。この培養4日目(day  18)に再度放射線照射スティミュレイターPBMCを補充した。この培養7日目(day  21)にCFSE陰性のレスポンダー由来の細胞をJSANを使いソーティングにより回収した(3rdアナジー細胞)。【０１１７】
（免疫抑制能の評価）
各混合培養系において培養後2日目に、CFSE陰性のレスポンダーCD4陽性細胞をソーティングにより単離し、IL-2、IL-10の発現mRNAレベルを定量的なリアルタイムPCR(qPCR)(TaqManTM)法にて解析した。【０１１８】
また1stアナジー細胞と2ndアナジー細胞をそれぞれの誘導最終日に回収し、レスポンダーPBMCとの比率が1：1から1：0.125になるように希釈し、レスポンダーPBMCと新たに採取した同一のスティミュレイター由来の放射線(γ線)３０Ｇｙを照射したＰＢＭＣとを約１：１の細胞数で含む９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．３７９９）での混合培養系（各2×１０5／２００μＬ／ウェルで４ウェルずつ）に添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。培養開始４日目に３Ｈ−チミジン（１０μＬ）を添加し、培養開始５日目（３Ｈ−チミジン添加の１６〜２０時間後）にＣｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により培養細胞を回収し、シンチレーションカウンターにより３Ｈ−チミジン取込み量を測定した。【０１１９】
（結果）
図7に示されるこの実験では、図8aの模式図に示す様な反応がin  vitroで起きていると推定され、この機構により、アナジー細胞存在下で反応したナイーブ細胞に免疫抑制能が付与されると考えられる。【０１２０】
図8bは、３Ｈ−チミジン取込み量のCPM値を示しており、1stアナジー細胞と2ndアナジー細胞は免疫抑制能を発揮することを示している。図８cでは、1stアナジー細胞、2ndアナジー細胞、3rdアナジー細胞ともに、レスポンダーCD4陽性細胞からの細胞増殖を誘導するサイトカインIL-2の産生を抑制し、一方で、免疫反応を抑制する代表的なサイトカインIL-10の産生を誘導することを示しており、1stアナジー細胞、2ndアナジー細胞、3rdアナジー細胞ともに、免疫抑制作用を有することが示された。以上の結果から、アナジー細胞による免疫抑制能は、そのアナジー細胞の存在下で同じ抗原刺激に対しての反応を抑制されたナイーブ細胞へ引き継がれる、すなわち感染性の免疫抑制能がヒト免疫細胞でも受け継がれることを示している。【０１２１】
（実施例６：ＣＤ８陽性細胞の反応性およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の必要性の確認）
本実施例では、マウスにおいて、移植後後期（８０日以降）には、ＣＤ８陽性細胞の反応性が失われ、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を除去しても免疫寛容が誘導されることを確認した。【０１２２】
（材料および方法）
以下に、本実施例での手順および使用した材料を説明する。【０１２３】
実施例2と同様の手法で、野生型B6マウスから得た脾臓細胞を、抗ＣＤ８０／８６抗体存在下、BALB/c細胞で刺激しアナジー細胞を得た。このアナジー細胞を、２Ｇｙの放射線照射3日後にBALB/cマウスの心臓を移植した野生型B6マウスに5×106個尾静脈から投与した。心移植後3日〜24日、25日〜42日、80日〜100日の間、regT細胞を含むCD4陽性T細胞を除去するために研究室で作製した抗マウスCD4抗体(GK1.5)を200μgずつ3日おきに腹腔内に投与し、移植した心臓の拒絶を観察した。【０１２４】
（結果）
結果を図9に示す。抗CD4抗体によるregT細胞を含むCD4陽性細胞の除去を、心移植後早期（３〜24日）または中期（25〜42日）に行った場合、移植した心臓の拒絶が起きるマウスが認められた。それに対して、後期（80〜100日）においてregT細胞を含むCD4陽性細胞を除去した場合は、全てのマウスで移植した心臓の拒絶は見られなかった。すなわち、約42日後まではregT細胞を含むCD4陽性T細胞が免疫寛容に必要であり、これを枯渇させるとCD8陽性T細胞による移植した心臓の拒絶が誘導される。しかし、80日以降にはregT細胞を含むCD4陽性T細胞の必要性が無くなり、CD8陽性細胞の反応性自体が失われることが示唆された。すなわち、細胞治療を受けたレシピエントには、最終的には(80日以降には)免疫抑制性の細胞の存在なしでも免疫寛容が誘導されていることを示すものである。【０１２５】
（実施例７：ドナーに対するＣＤ８陽性Ｔ細胞の反応）
本実施例では、ドナーに対するＣＤ８陽性Ｔ細胞の反応を確認した。【０１２６】
（材料および方法）
実施例2と同様の手法で、野生型B6マウスから得た脾臓細胞を、抗ＣＤ８０／８６抗体存在下、BALB/c細胞で刺激しアナジー細胞を得た。このアナジー細胞を、２Ｇｙの放射線照射3日後にBALB/cマウスの心臓を移植した野生型B6マウスに5×106個尾静脈から投与した。拒絶反応が見られずに移植した心臓が生着して100日以上経過した免疫寛容誘導マウスとナイーブマウスから脾臓細胞を得て、CFSE  cell  proliferation  kit(Invitrogen  C34554)を用いてCSFEでラベルした(図10a)。CSFEでラベルしたこの細胞を、BALB/c由来の放射線照射脾臓細胞と12ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．3513）もしくは24ウェルプレート(corningＣａｔ．Ｎｏ3526)にて2×106細胞/mＬで１：１で混合し、培養を行い、培養5日目のCD8陽性T細胞のCSFEの発現をフローサイトメーター(BD  verse)により調べた(図10ｂ)。【０１２７】
さらに、免疫寛容誘導マウス(アナジー細胞4×106個の投与で免疫寛容が誘導されたマウス)、拒絶マウス(アナジー細胞の2×106個の不十分な投与で拒絶反応が見られたマウス)、移植なしの野生型マウスの脾臓細胞をPE蛍光標識抗マウスCD8抗体(53-6.7;eBioscience、#12-0081-85)と反応させた後に、抗PE磁気ビーズ(ミルテニーバイオテク#1300-10-639)を用いてauto-MACS(ミルテニーバイオテク)により、CD8陽性細胞を分離した。この細胞と、B6およびBALB/cマウス由来の放射線照射脾臓細胞を96ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．3799）上でそれぞれ1×106細胞/mＬ、１：１で混合し、培養（培養体積は、200μＬ）を行い、培養開始４日目に３Ｈ−チミジン（１０μＬ）を添加し、培養開始５日目（３Ｈ−チミジン添加の１６〜２０時間後）にＣｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により培養細胞を回収し、シンチレーションカウンターにて３Ｈ−チミジン取込み量を測定した。ポジティブコントロールとして抗CD3抗体(eBioscience  #MA5-17622)と抗CD28抗体(eBioscience#16-0281-82)による刺激(各10μgの培養系への直接添加または培養プレートへのプレコート)による全CD8陽性T細胞の増殖を誘導する実験も行い、これとの比較(%)により増殖能の低下を調べた(図10ｃ)。【０１２８】
（結果）
結果を図１０に示す。【０１２９】
図１０ｂに示すように、ナイーブなCD8陽性T細胞は、ドナー細胞の刺激により分裂（増殖）することで、多くの細胞でCSFEの発現レベルが低下するが(右)、ナイーブ細胞のみでは増殖しないのでCSFEの蛍光レベルが低くなる細胞は無い(左)。それに対して、免疫寛容が惹起されたマウスのCD8陽性T細胞はドナー細胞の刺激を受けても分裂（増殖）反応がほとんど起きないので、CSFEの発現が低下した細胞が少ない(中)。つまり、CD8陽性細胞は本来単独でドナー細胞に反応するが、免疫寛容を誘導されたマウスのCD8陽性細胞は単独での反応性を失っている。すなわち、抑制性細胞の存在に依存しないCD8陽性T細胞自体の免疫寛容（不反応性）が誘導されている。【０１３０】
また、図10cに示すように、免疫寛容を誘導されたマウスのCD8陽性T細胞は、抗CD3/抗CD28抗体刺激に比べてのドナー刺激に対する増殖反応が、ナイーブマウスのCD8陽性T細胞や移植した心臓に対する拒絶反応が見られたマウスのCD8陽性T細胞に比べて低下していた。これは、全CD8陽性T細胞中にドナー抗原特異的に反応し増殖する細胞が減少していることを示しており、アナジーが誘導されたマウスにおいては、ドナー抗原特異的なT細胞に特異的にクローンアナジーまたはクローン除去が誘導されている可能性を示している。【０１３１】
以上のように、細胞治療として移入した細胞が1週間で無くなるという結果と、感染性免疫寛容を示す免疫寛容を誘導されたマウスの細胞によっても免疫寛容が誘導される実験結果とから、感染性免疫寛容が本開示によって惹起されることが実証されているといえる。【０１３２】
以上の結果から、以下が結論付けられる。
１．本開示のアナジー細胞は、レシピエントのナイーブ細胞に接触することにより免疫抑制能を発揮する。
２．移入した抑制性アナジーT細胞は検出不能になる。
３．移入した抑制性アナジー細胞によりレシピエント生体内で新たな免疫抑制能を持った細胞が誘導される。
４．最終的にドナー抗原特異的CD8陽性クローンの反応性は顕著に低下する。これは、クローンアナジーまたはクローン除去が誘導されている可能性を示している。【０１３３】
従って、移入したドナー特異的アナジー細胞はレシピエント体内から早期に消失するものの、消失後も継続してレシピエント生体内で新たなドナー特異的な免疫抑制細胞を誘導し、最終的には移植拒絶の中心的役割を担うとされるドナー特異的なCD8陽性T細胞自身にその反応性を喪失させることが示唆された。【０１３４】
したがって、本実施例の結果から、本開示を用いた治療の管理に、移入した抑制性アナジーT細胞が検出不能となること、および／またはレシピエント生体内で新たな免疫抑制能を持った細胞が誘導されることを検出することが、有用であることが理解される。さらに、ドナー抗原特異的CD8陽性クローンを検出することで、治療が良好であるかの管理に利用することができることが理解される。【０１３５】
（実施例８：アレルギー性肺炎(喘息)モデルにおける免疫寛容）
本実施例では、アレルギー性肺炎モデル(喘息)において免疫寛容が生じるか実証した。【０１３６】
（材料および方法）
図１１に示す様に、既に文献に記載されたアレルギー性肺炎(喘息)モデルを用いて実験を行った(8)。【０１３７】
（OVA特異的アナジー細胞の取得）
OVA(Sigma-Aldrich  #O1641またはMBLライフサイエンス  TS-5001-P等)100μgと抗マウスCD80/86抗体それぞれ250μgを同時に腹腔内投与して、OVAに感作させたB6マウスを５日後に屠殺し、脾臓を摘出し、溶血により脾臓細胞を得た。この脾臓細胞を、4×106細胞/mＬとなるように10%FCSを含むRPMI1640培地にて調整し、ここにOVAを100μg/mＬ、CD80/86抗体をそれぞれ最終濃度10μg/mＬとなる様に添加した。この脾臓細胞懸濁物を、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で７日間培養して、OVA特異的アナジー細胞を得た。【０１３８】
（アレルギー（鼻炎）モデルでの抑制能評価）
アレルギー性肺炎(喘息)モデルとして、OVA100μgとアラムアジュバントを含むエマルジョンを０日と７日に腹腔内投与してOVAに感作させたマウスに、１４日、１７日、２０日にOVA140μgを含む70μＬのPBSを点鼻投与するモデルを使用した。誘導したアナジー細胞を１４日目に1×107個尾静脈から投与し、24日目に気管支洗浄液(BAL：Bronchoalveolar  Lavage)を1mlの生食水を用いた気管洗浄により回収し、そこに浸出した白血球数(CD45陽性細胞)と好酸球数(CD45陽性CD11b陽性SiglecF陽性細胞のCD45陽性細胞中の比率として算出)を測定した。加えて、BAL中のIL-4をELISAにより測定した(eBioscience  #88-704-88)。【０１３９】
（結果）
結果を図12に示す。図12aは気管支浸出液(BAL)中に含まれる白血球の数を示しており、図12bはBAL中に含まれる好酸球の数を示している。アナジー細胞の移入により、浸出する白血球数および好酸球が減っている。さらに図12cに示される様に、BAL中に含まれるアレルギー反応に関係するとされているIL-4も減少している。このことから、OVAによるアレルギー性肺炎(喘息)モデルにおいて、抗CD80/86抗体とOVAとの共培養で誘導されたアナジー細胞の移入が免疫寛容を誘導し、アレルギー反応を減弱することが示された。【０１４０】
(実施例９：食品アレルギーモデルにおける免疫寛容惹起)
本実施例では、食品アレルギーモデルにおける免疫寛容惹起を調べた。【０１４１】
以下に詳細を述べる。【０１４２】
（材料および方法）
図13に示すように、既に文献に記載された食品アレルギーモデルを用いて実験を行った(9)。概説すると、OVA100μgとアラムアジュバント(Thermo  Fisher#77161)を含むエマルジョンを0日目と14日目に腹腔内投与してOVAに感作したマウスに、28日目から２〜３日毎に7回、OVA50ｍｇを経口投与して誘導する食物アレルギーモデルに、実施例８と同様の方法で得たアナジー細胞を１４日目に５×10６個尾静脈から投与した。３６日後にマウスを屠殺した後、腸管を採取し、ビオチン標識抗FoxP3抗体(eBioscience  #13-5773-829)とAlexa594標識ストレプトアビジン(Molecular  Probes  #S11227)とFITC標識抗CD4抗体(RM4-5,  Molecular  Probes  #553047)を用いた免疫染色により腸管に存在するregT細胞を、HE染色により腸管に存在する好酸球(エオジン強染色細胞)を染色した。CD4陽性Foxp3陽性細胞密度は、蛍光顕微鏡Axioplan  2  imaging(Zeiss)で、CCDカメラAxioCam  HRc(Zeiss)にて蛍光免疫染色画像を取得後、画像解析ソフトKS400(Zeiss)を用いて、測定対象領域面積の測定と同領域に存在する陽性細胞を計数し陽性細胞数／mm2を算出した。好酸球密度は、光学顕微鏡Axioskop  2  plus(Zeiss)で、CCDカメラAxioCam  MRc(Zeiss)にてHE（ヘマトキシリンエオジン）染色画像を取得後、画像解析ソフトKS400(Zeiss)を用いて、測定対象領域面積の測定と同領域に存在するエオジン強陽性好酸球を計数し陽性細胞数／mm2を算出した
（結果）
結果を図14および15に示す。図14には典型的なFoxP3/CD4の免疫染色の結果を示す。アレルギー発症マウスが、マウス#11、#12(各腸管の異なる部位の画像３枚)、アナジー細胞移入マウスがマウス#21、#22(各腸管の異なる部位の画像３枚)、無処置の正常マウスがマウス#31、#32(各１枚)である。図15aには各マウスの典型的なHE染色の写真１枚ずつ示す。図14で示された画像の解析結果を数値化し、1mm2当たりのregT細胞の個数をグラフにしたものが図15bであり、図15aで示された画像の解析結果を数値化し、1mm2当たりの好酸球の個数をグラフにしたものが図15ｃである。【０１４３】
図15bに示される様に、regT細胞の浸潤はアナジー細胞投与群ではアレルギー発症群に比べて増えており、正常マウスよりも多く腸管壁内に存在している。これと一致して、図15cに示される様に、アレルギー時に多いとされる好酸球の数は、アナジー細胞の移入によって正常マウスと同レベルまで減少している。以上の結果から、食品アレルギーにおいてもアナジー細胞の移入により免疫寛容が誘導され、その結果、好酸球の浸潤の減少とregTの浸潤が誘導され、症状が緩和されていることが実証された。【０１４４】
（実施例１０：ｉＰＳ細胞での免疫寛容惹起）
本実施例では、ｉＰＳ細胞およびそれから分化した細胞・組織を用いた移植実験において生じた深刻な免疫拒絶反応を、本開示のアナジー細胞を用いて治癒し得るかどうかを実証する実験を行った。以下のように免疫寛容を惹起させた。以下説明する。【０１４５】
（材料および方法）
（ｉＰＳ細胞からのニューロン分化〜免疫寛容惹起実験）
既に文献（10）に記載された方法に従い、ｉＰＳ細胞を神経細胞に分化させた。この神経細胞に放射線(γ線)３０Ｇｙを照射してスティミュレイター細胞として用いた。レスポンダー細胞には、MHCの異なるボランティアのヒト末梢血から得た単核細胞（ＰＢＭＣ）を用い、スティミュレイター細胞とレスポンダー細胞とが各々２×１０６細胞／ｍＬとなるように２％ヒトＡＢ型血清（プール）添加Ｂｉｏｗｅｓｔ社製ＡＬｙＳ５０５Ｎ−０培地にて調整し、実施例1と同様に抗ヒトＣＤ８０抗体と抗ヒトＣＤ８６抗体各１０μｇ／ｍＬ存在下で、12ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．3513）にて３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で7日間培養した。７日後に細胞を回収し遠心により培養液をウォッシュアウトし、アナジー細胞を得た。【０１４６】
（免疫抑制能の評価）
iPS細胞由来神経細胞（スティミュレイター細胞）との共培養で得られたアナジー細胞を、新たに採取した同一ボランティアのPBMCとの比率が1/2から1/16になるように希釈した後に、同一iPS細胞由来の放射線(γ線)３０Ｇｙを照射した神経細胞と、新たに採取した同一ボランティアのPBMCとを約１：１の細胞数で含む９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．３７９９）での混合培養系(各2×１０5細胞／２００μＬ／ウェルで４ウェルずつ)に添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。培養開始４日目に３Ｈ−チミジン（１０μＬ）を添加し、培養開始５日目（３Ｈ−チミジン添加の１６〜２０時間後）にＣｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により培養細胞を回収し、３Ｈ−チミジン取込み量をシンチレーションカウンターで測定した。【０１４７】
（結果）
図16に示す様に、ｉＰＳ細胞から分化した神経細胞は、MHCの一致しないボランティアのPBMCを刺激し増殖を誘導する。このｉＰＳ細胞から分化した神経細胞に反応して起きるリンパ球の増殖反応を、抗CD80/86抗体とｉＰＳ細胞から分化した神経細胞との共培養で誘導されたアナジー細胞はin  vitroにおいて抑制することが示された。これはiPS細胞由来の細胞や組織を用いた移植において生じる免疫拒絶反応を本開示が減弱させ得ることが実証したものである。【０１４８】
（実施例１１：様々な阻害因子を用いた免疫寛容の惹起）
本実施例では、様々な阻害因子を用いても免疫寛容を惹起することができることを示す。【０１４９】
（アナジー細胞の生成）
基本的には、実施例１に記載の方法および既に文献に記載された方法に従い実験を行う（１〜３）。レシピエントＰＢＭＣおよびドナーＰＢＭＣには、それぞれヒト末梢血から新鮮に分離したものを使用するか、または−８０℃で凍結保存したものを急速解凍して使用し、これらの細胞はともに、自己血漿または１０％非働化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（ＳＩＧＭＡ  ＃  １７２０１２−５００ＭＬ  Ｌｏｔ  １１Ｄ２５７またはｂｉｏｓｅｒａ  ＃ＦＢ−１３８０／５００  Ｌｏｔ．０１５ＢＳ４８２）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ；Ｒ８７５８−５００ＭＫ）にて４×１０６細胞／ｍＬに調整する。ドナーＰＢＭＣには、２０Ｇｙ放射線を照射しておく。これらのレシピエントＰＢＭＣとドナーＰＢＭＣとを、１：１で混合し、この混合物に、阻害因子（例えば、抗ＣＤ８０抗体／抗ＣＤ８６抗体では、それぞれ最終濃度１０μｇ／ｍｌ、ベラタセプト（またはアバタセプト）では、最終濃度１０μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌ）を添加する。培養は、６ｃｍシャーレ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＣＥＬＬＳＴＡＲ（登録商標）ｄｉｓｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６２８１６０）（培養体積３〜６ｍＬ）または１０ｃｍシャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４３０１６７）（培養体積１０〜１５ｍＬ）にて３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で７日間行う（培養開始時の細胞密度は、４×１０６細胞／ｍＬ）。【０１５０】
培養開始から7日目に遠心により、培養したレシピエントＰＢＭＣを回収し、上記の培地で４×１０６細胞／ｍＬに調整する。この培養したレシピエントＰＢＭＣに、新たに調製した照射済みドナーＰＢＭＣを細胞数比２：１になるように添加し、さらに阻害因子（例えば、抗ＣＤ８０抗体／抗ＣＤ８６抗体では、それぞれ最終濃度５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、ベラタセプト（またはアバタセプト）では、最終濃度１０μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌ）も添加する。培養は、上記と同じ条件で７日間行う（細胞密度：４×１０６細胞／ｍＬ）。【０１５１】
（免疫反応抑制能の評価）
培養開始から通算して１４日目に遠心により誘導細胞を回収し、基本的には既に文献に記載された方法に従いリンパ球混合試験を行った（３）。細胞懸濁物を、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで共培養する。共培養開始４日目に３Ｈ−チミジン（１０μｌ）を添加し、共培養開始５日目（３Ｈ−チミジン添加の１６〜２０時間後）に培養液中の３Ｈ−チミジンを除去し、３Ｈ−チミジン取込み量を測定し、免疫反応抑制能を確認することができる。
【０１５２】
(実施例１２：細胞製剤の品質管理)
細胞製剤の製法については、上述の実施例１〜１０における記載を参照のこと。実施例に準じて製造された細胞製剤について、以下のように品質管理を行う。【０１５３】
満たすべき品質規格の代表例は以下のとおりである。【０１５４】
【表４】
2019245039.tif 000008
細胞製剤の品質管理試験
本明細書に記載の方法によって、例えば、実施例１〜１０の記載に準じて生成されたアナジー細胞が、最終製品の品質規格に合致するか否か調べるために、以下の試験を実施する。【０１５５】
・外観
生理食塩液中に懸濁させたアナジー細胞を、外観について目視で調べる。品質規格に合致する懸濁液は、微黄白色〜淡黄色の細胞からなるはずである。【０１５６】
・細胞表現型およびアナジー細胞の純度
アナジー細胞を、各表現型についてフローサイトメトリーで調べるために、例えば以下の抗体を使用し、多重染色により解析する：
ＣＤ３：ＦＩＴＣ蛍光標識抗ヒトＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃１１−００３８−４２）またはＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ蛍光標識抗ヒトＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃ＣＤ０３２８）
ＣＤ４：ＰＥ蛍光標識抗ヒトＣＤ４抗体（ＲＰＡ−Ｔ４；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃２５−００４９−４２）
ＣＤ８：ＡＰＣ蛍光標識抗ヒトＣＤ８抗体（ＲＰＡ−Ｔ８；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃１７−００８８−４２）
ＣＤ２５：ＰｅｒＣＰ蛍光標識抗ヒトＣＤ２５抗体  （ＭＥＭ−１８１；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃Ａ１５８０２）
ＣＤ４４：ＰＥ−Ｃｙ７蛍光標識抗ヒトＣＤ４４抗体（ＩＭ７；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃２５−０４４１−８２）
ＣＤ４５：Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ蛍光標識抗ヒトＣＤ４５抗体（ＨＩ３０；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃３０４０３２）
ＣＤ４５ＲＡ：ＦＩＴＣ蛍光標識抗ＣＤ４５ＲＡ抗体（ＡＬＢ１１；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａ０７７８６）またはＰＥ蛍光標識抗ＣＤ４５ＲＡ抗体（ＡＬＢ１１；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＩＭ１８３４Ｕ）
ＣＤ４５ＲＯ：ＥＣＤ蛍光標識抗ＣＤ４５ＲＯ抗体（ＵＣＨＬ１；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＩＭ２７１２Ｕ）またはＰＥ蛍光標識抗ＣＤ４５ＲＯ抗体（ＵＣＨＬ１；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａ０７７８７）またはＡＰＣ蛍光標識抗ＣＤ４５ＲＯ抗体（ＵＣＨＬ１；Ｂａｙ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２０−０４５７）
（手順）
ＣＤ３陽性細胞比率、生細胞中のＣＤ４５陽性細胞比率、ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ８陽性ＣＤ４４陽性細胞比率、ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ４４陽性細胞比率、ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性細胞比率、ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性細胞比率、ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性細胞比率およびＣＤ３陽性細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性細胞比率
生理食塩液中に懸濁させたアナジー細胞を、上記抗体に反応させた後に、Ｚｏｍｂｉｅ  ＮＩＲ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＬｇｅｎｅｄ  ＃４２３１０６）を用いて死細胞を染色する。この多重蛍光染色された細胞をＦＡＣＳ  Ｖｅｒｓｅ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）において、全生細胞中のＣＤ３陽性細胞の比率を決定する。【０１５７】
品質規格に合致するアナジー細胞は、５０％以上の細胞がＣＤ３陽性となるはずである。同時に、蛍光に基づき、生細胞中のＣＤ４５陽性細胞の比率、生きた全ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ８陽性ＣＤ４４陽性細胞の比率、ＣＤ４陽性ＣＤ４４陽性細胞の比率、ＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性細胞の比率、ＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性細胞の比率、ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性細胞の比率、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性細胞の比率を決定する。【０１５８】
品質規格に合致するアナジー細胞は、生細胞の９５％以上の細胞がＣＤ４５陽性となるはずであり、赤血球や血小板などの不純物を顕著な量では含まない。さらに、品質規格に合致するアナジー細胞は、ＣＤ３陽性細胞集団中、5％以上がＣＤ８陽性ＣＤ４４陽性、5％以上がＣＤ４陽性ＣＤ４４陽性、5％以上がＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性、5％以上がＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性、5％以上がＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性、そして５％以上がＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性の細胞である。【０１５９】
・安全性
基本的には、日本薬局方または該当する各国の薬局方の記載に準拠して試験を行う。以下に、例示的な実施形態を述べる。【０１６０】
無菌試験法
アナジー細胞浮遊液を軽く遠心分離し、その上清を、無菌試験に供する。日本薬局方における代表的な無菌試験の一つである直接法では、上清を、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地または液状チオグリコール酸培地に接種し、それぞれ３０〜３５℃または２０〜２５℃で１４日間以上培養する。その後、培養物を培養期間中に数回観察する。別の代表的な無菌試験であるメンブランフィルター法では、上清を無菌希釈液（例えば、１ｇ／Ｌの肉製又はカゼイン製ペプトン溶液（ｐＨ７．１±０．２））で希釈し、希釈した上清をメンブランフィルター上に移し、濾過する。その後そのメンブランフィルターを、上述の２種類の培地にそれぞれ入れ、１４日間以上培養する。品質規格に合致する製品では、培養期間中及び最終日に、培地に肉眼的な微生物の増殖は存在しない。【０１６１】
エンドトキシン試験法
アナジー細胞浮遊液を、適宜生理食塩液で希釈し、ｐＨ６．０〜８．０に調製する。その後、ライセート試薬と混合し、ライセート試液のゲル形成を指標として（ゲル化法）、またはライセート試液のゲル化過程における濁度変化を指標として（比濁法）もしくは合成基質の加水分解による発色を指標として（比色法）、試料中のエンドトキシン濃度を定量的に求める。必要に応じて、ライセート試薬の表示感度を確認する予備試験を行う。品質規格に合致する製品では、エンドトキシン濃度は、０．２５ＥＵ／ｍＬ未満にならなければならない。【０１６２】
マイコプラズマ否定試験
培養液、またはアナジー細胞浮遊液を軽く遠心分離し、その上清を、マイコプラズマ否定試験に供する。日本薬局方における代表的なマイコプラズマ否定試験の一つである培養法では、試料を、寒天平板培地に接種し、５〜１０％の炭酸ガスを含む窒素ガス中で、適切な湿度のもと３５〜３７℃で１４日間以上培養する、あるいは、試料を、液体培地を入れた容器に接種し、３５〜３７℃で培養し、液体培地の色調変化を観察したときか、または培養開始から一定期間ごとに液体培養物からアリコートを取り、新たな寒天平板培地に播いて、培養を続ける。その後、全ての寒天平板培地を対象に７日目と１４日目に倍率１００倍以上の顕微鏡でマイコプラズマの集落の有無を調べる。別の代表的なマイコプラズマ否定試験である指標細胞を用いたＤＮＡ染色法では、典型的には、指標細胞であるＶｅｒｏ細胞と指定のマイコプラズマ菌株を用いる。この方法では、カバーグラスを沈めた培養ディッシュなどに指標細胞を接種し、５％炭酸ガスを含む空気中、３５〜３８℃で一日増殖させる。その後試料（培養液または上清）を添加して、同様の条件で３〜６日間培養を続ける。カバーグラス上の培養細胞を固定後、ビスベンズイミド等の染色剤によりＤＮＡ蛍光染色し、蛍光顕微鏡（倍率４００〜６００倍またはそれ以上の倍率）で検鏡し、陰性（非接種）対照及びマイコプラズマ陽性対照と比較しながら、細胞核を囲むように微小な核外蛍光斑点を持つ細胞が０．５％以上存在した場合には、マイコプラズマ陽性と判断する。品質規格に合致する製品では、マイコプラズマ陰性であるべきである。【０１６３】
・細胞数
生理食塩液中に懸濁させたアナジー細胞を、血球計算盤を用いて顕微鏡下で、または自動セルカウンターにより細胞数を測定する。品質規格に合致する、投与に適切なアナジー細胞の数は、１×１０８〜３０×１０８個（例えば、１００ｍＬ生理食塩液中）であり、この範囲を下回る場合には、適宜細胞を追加すべきである。【０１６４】
・生細胞率
生理食塩液中に懸濁させたアナジー細胞を、０．３〜０．５％トリパンブルー染色液（例えば、カタログ＃３５５２５−０２、ナカライテスク）と混合し、血球計算盤を用いて顕微鏡下で、または自動セルカウンターにより生細胞数を測定する。品質規格に合致する製品では、７０％以上の細胞が生細胞であるべきである。【０１６５】
これらの知見は、免疫拒絶抑制のための細胞製剤の品質管理において重要なチェックポイントとなり得る。【０１６６】
参考文献
以下の参考文献は、実施例等において基本技術として参照したものであり、これらの文献が本開示に対して先行技術を構成することを認めるものではない。これらの内容は参考として援用される。
1.  Davies  JK,  Barbon  CM,  Voskertchian  A,  Nadler  LM,  Guinan  EC.  Ex  vivo  alloanergization  with  belatacept:  a  strategy  to  selectively  modulate  alloresponses  after  transplantation.  Cell  transplantation.  2012;21(9):2047-61.
2.  Davies  JK,  Gribben  JG,  Brennan  LL,  Yuk  D,  Nadler  LM,  Guinan  EC.  Outcome  of  alloanergized  haploidentical  bone  marrow  transplantation  after  ex  vivo  costimulatory  blockade:  results  of  2  phase  1  studies.  Blood.  2008;112(6):2232-41.
3.  Davies  JK,  Nadler  LM,  Guinan  EC.  Expansion  of  allospecific  regulatory  T  cells  after  anergized,  mismatched  bone  marrow  transplantation.  Science  translational  medicine.  2009;1(1):1ra3.
4.  Guinan  EC,  Boussiotis  VA,  Neuberg  D,  Brennan  LL,  Hirano  N,  Nadler  LM,  et  al.  Transplantation  of  anergic  histoincompatible  bone  marrow  allografts.  The  New  England  journal  of  medicine.  1999;340(22):1704-14.
5.  Bashuda  H,  Kimikawa  M,  Seino  K,  Kato  Y,  Ono  F,  Shimizu  A,  et  al.  Renal  allograft  rejection  is  prevented  by  adoptive  transfer  of  anergic  T  cells  in  nonhuman  primates.  The  Journal  of  clinical  investigation.  2005;115(7):1896-902.
6.  Bashuda  H,  Shimizu  A,  Uchiyama  M,  Okumura  K.  Prolongation  of  renal  allograft  survival  by  anergic  cells:  advantages  and  limitations.  Clin  Transplant.  2010;24  Suppl  22:6-10.
7.  Luo  Z,  Gotoh  M,  Grochowiecki  T,  Tanaka  T,  Kimura  F,  Kawashima  H,  et  al.  Anergic  T  cells  generated  in  vitro  suppress  rejection  response  to  islet  allografts.  Transplantation.  2000;69(10):2144-8.
8.  Kamijo  S,  Takeda  H,  Tokura  T,  Suzuki  M,  Inui  K,  Hara  M,  et  al.  IL-33-mediated  innate  response  and  adaptive  immune  cells  contribute  to  maximum  responses  of  protease  allergen-induced  allergic  airway  inflammation.Jouranl  of  Immunology.  2013;190(9):4489-99
9.  Brandt  EB,  Strait  RT,  Hershko  D,  Wang  Q,  Muntel  EE,  Scribner  TA,  et  al.  Mast  cells  are  required  for  experimental  oral  allergen-induced  diarrhea.  The  Journal  of  clinical  investigation.  2003;  112  (12):1666-77.    
10.  Matsumoto  T,  Fujimori  K,  Andoh-Noda  T,  Ando  T,  Kuzumaki  N,  Toyoshima  M,  et  al.  Functional  Neurons  Generated  from  T  Cell-Derived  Induced  Pluripotent  Stem  Cells  for  Neurological  Disease  Modeling.  Stem  cell  reports.  2016;6(3):422-35.
（注記）
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本出願は、日本国特許出願特願２０１８−１１９００３（２０１８年６月２２日出願）に対して優先権主張の利益を主張するものであり、当該出願の内容は本願において、その内容が（全部であり得る）参考として援用されることが理解される。また、日本国特許出願特願２０１８−１１８９９６および特願２０１８−１１９００１（いずれも２０１８年６月２２日出願）ならびにそれらに対して優先権主張する国際出願の内容は、その一部または全文が、本明細書において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１６７】
本開示は、特定の抗原に特異的な免疫寛容が誘導された細胞を含む医薬組成物を提供する。また、感染性免疫寛容が確認されたことから、本開示は治療管理を必要とする分野において利用可能性がある。このような技術に基づく製剤等に関連する産業（製薬）において利用可能な技術が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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