(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(c)〜(i)のいずれかのポリヌクレオチドを含む細胞増殖抑制剤。
(c)  配列表の配列番号２に記載のDNA配列からなるポリヌクレオチド
(d)  配列表の配列番号２に記載のDNA配列において１もしくは複数の塩基を置換、欠失もしくは付加してなるDNA配列からなり、かつ細胞増殖抑制活性を有するポリヌクレオチド
(e)  配列表の配列番号３に記載のDNA配列からなるポリヌクレオチド
(f)  配列表の配列番号３に記載のDNA配列において１もしくは複数の塩基を置換、欠失もしくは付加してなるDNA配列からなり、かつ細胞増殖抑制活性を有するポリヌクレオチド
(g)  配列表の配列番号４に記載のDNA配列からなるポリヌクレオチド
(h)  配列表の配列番号４に記載のDNA配列において１もしくは複数の塩基を置換、欠失もしくは付加してなるDNA配列からなり、かつ細胞増殖抑制活性を有するポリヌクレオチド、および
(i)  配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするDNA配列からなり、かつ細胞増殖抑制活性を有するポリヌクレオチド
【請求項２】
以下の(c)〜(i)のいずれかのポリヌクレオチドを含む癌治療剤。
(c)  配列表の配列番号２に記載のDNA配列からなるポリヌクレオチド
(d)  配列表の配列番号２に記載のDNA配列において１もしくは複数の塩基を置換、欠失もしくは付加してなるDNA配列からなり、かつ細胞増殖抑制活性を有するポリヌクレオチド
(e)  配列表の配列番号３に記載のDNA配列からなるポリヌクレオチド
(f)  配列表の配列番号３に記載のDNA配列において１もしくは複数の塩基を置換、欠失もしくは付加してなるDNA配列からなり、かつ細胞増殖抑制活性を有するポリヌクレオチド
(g)  配列表の配列番号４に記載のDNA配列からなるポリヌクレオチド
(h)  配列表の配列番号４に記載のDNA配列において１もしくは複数の塩基を置換、欠失もしくは付加してなるDNA配列からなり、かつ細胞増殖抑制活性を有するポリヌクレオチド、および
(i)  配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするDNA配列からなり、かつ細胞増殖抑制活性を有するポリヌクレオチド
【請求項３】
以下の(c)〜(i)のいずれかのポリヌクレオチドを治療遺伝子として含む癌の治療に用いられる遺伝子治療用組成物。
(c)  配列表の配列番号２に記載のDNA配列からなるポリヌクレオチド
(d)  配列表の配列番号２に記載のDNA配列において１もしくは複数の塩基を置換、欠失もしくは付加してなるDNA配列からなり、かつ細胞増殖抑制活性を有するポリヌクレオチド
(e)  配列表の配列番号３に記載のDNA配列からなるポリヌクレオチド
(f)  配列表の配列番号３に記載のDNA配列において１もしくは複数の塩基を置換、欠失もしくは付加してなるDNA配列からなり、かつ細胞増殖抑制活性を有するポリヌクレオチド
(g)  配列表の配列番号４に記載のDNA配列からなるポリヌクレオチド
(h)  配列表の配列番号４に記載のDNA配列において１もしくは複数の塩基を置換、欠失もしくは付加してなるDNA配列からなり、かつ細胞増殖抑制活性を有するポリヌクレオチド、および
(i)  配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするDNA配列からなり、かつ細胞増殖抑制活性を有するポリヌクレオチド
【請求項４】
治療遺伝子がウイルスベクターに含まれることを特徴とする、請求項３記載の遺伝子治療用組成物。
【請求項５】
ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項４記載の遺伝子治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、癌等の細胞の不死化が原因である疾病の治療および診断に有効となり得る遺伝子情報およびその使用に関する。より詳しくは、本発明は、癌細胞を含む不死化細胞に発現され、該細胞の増殖を抑制することにより、癌等の疾病の治療に有用なタンパク質を発現しうる遺伝子情報およびその使用に関する。特に、本発明は、癌細胞を含む不死化細胞でその発現が低下、または消失している細胞増殖抑制タンパク質をコードする遺伝子並びにそれらの診断薬または治療薬としての使用に関する。
背景技術
ヒト正常細胞はきわめて不死化し難く老化する。ヒト正常細胞は、細胞分裂回数カウント機構（老化機構）に従って、老化を運命づけられている。通常、生体組織から採取した初代細胞は、２０〜８０回の継代培養（分裂）を繰り返すことによって次第に増殖能を喪失し、老化形態を示す。細胞は老化すると、巨大化、扁平化、細胞外マトリックス成分の変化、有糸分裂促進物質刺激に対する不応答、および成長調節遺伝子発現の機能減退のようないくつかの形態学的および生化学的変化を示し、分裂を停止するため容易に判別される。
しかしながら、継代培養中に発癌剤処理、放射線照射処理等を行うことにより、ごく一部の細胞がこの細胞老化を免れて増殖を続けコロニーを形成する。このようにして無限増殖能を獲得した（または老化機構の破綻した）細胞は、連続培養が可能であり、一定の細胞世代数を経ても死滅することがなく、「不死化細胞」と呼ばれている。
正常細胞と不死化細胞を融合すると生じた雑種細胞は有限分裂能を示す。また、不死化細胞同士を融合しても有限分裂能を示す雑種細胞が得られる。このことから、ヒト細胞において不死化は、老化に対して遺伝的に劣性であり、細胞分裂回数カウント機構（老化機構）に関連する、ある特定の遺伝子（不死化抑制遺伝子）の欠損、もしくは機能の喪失が細胞の不死化に必要であることが示唆されている。
また、ヒト正常細胞から直接癌細胞を作製することは容易でないが、細胞の不死化と細胞の癌化には密接な関係がある。培養条件下で細胞を癌化させる実験系から、ヒト正常細胞は増殖に対して強力に負に働く老化機構を免れて、無限に増殖できる不死化段階に変化し、その後、比較的容易に癌化段階へと多段階に変異することが明らかになってきた。例えば、変異ｐ５３および変異Ｒｂ遺伝子等のいわゆる癌遺伝子を、ヒト正常細胞に発現させても癌化のみならず不死化もしないが、一旦不死化した細胞は前述の癌遺伝子によって容易に癌化する（Ｎａｍｂａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇｅｎ．，７：１９−３１，１９９６）。このことは、細胞の癌化において、細胞の不死化が重要な段階であることを強く示唆しており、従って、不死化段階の解析はヒト細胞の発癌機構を知る上できわめて重要である。
癌細胞における増殖抑制遺伝子として、網膜芽細胞腫のＲｂ遺伝子、大腸癌のｐ５３遺伝子、Ｗｉｌｍｓ腫瘍のＷＴ遺伝子等１０種類以上の候補が挙げられている。特に、好適な増殖抑制遺伝子はｐ５３であり、ｐ５３を用いた遺伝子治療が既に開始されているが（Ｌｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５，６３７−６４２，１９９９）、癌化に細胞の不死化が関与している以上、癌抑制遺伝子のみでなく、不死化抑制遺伝子による細胞増殖抑制も癌の有効な治療法となり得る。
現在、細胞老化および不死化に関連した遺伝子としては、Ｓｄｉ１（Ｎｏｄａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２１１：９０−９８，１９９４）、ＳＥＮ６（Ｂａｎｇａ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１４：３１３−３２１，１９９７）、ＳＥＮ６Ａ（Ｓａｎｄｈｕ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１２：２４７−２５２，１９９６）、ＩＮＧ１（Ｇａｒｋａｖｔｓｅｖ，Ｉ．ａｎｄ  Ｒｉａｂｏｗｏｌ，Ｋ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１７：２０１４−２０１９，１９９７）、Ｈｉｃ−５（Ｓｈｉｂａｎｕｍａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１７：１２２４−１２３５，１９９７）等が報告されているが、これらの遺伝子とヒト細胞の老化、不死化および癌化との関連はいまだ解明されていない。
発明の開示
本発明は、上記事情に鑑み、不死化抑制遺伝子の完全長ｃＤＮＡを同定し、該不死化抑制遺伝子に関する情報および、それがコードするタンパク質の機能に関する情報を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記遺伝子および前記タンパク質の診断薬および／または治療薬としての用途を開発することを目的とする。
本発明者らは、上記課題解決のため鋭意研究した結果、癌細胞を含む不死化細胞でその発現が低下、または消失しているタンパク質をコードする不死化抑制遺伝子を単離し、３５０個のアミノ酸配列を有するタンパク質（配列番号１）をコードする１０５０ｂｐの翻訳領域（配列番号２）に対応するＤＮＡ配列を含む複数のポリヌクレオチドを同定した。また、配列表の配列番号１に記載の前記タンパク質が細胞増殖抑制活性を有することを見出した。
さらに、本発明者らは、不死化抑制遺伝子は、癌等の不死化細胞が原因である疾病の診断に有用なマーカーとなり、さらに癌等の疾病の治療に有効なタンパク質を発現しうる遺伝子情報であることを見いだし、本発明を完成した。
すなわち、本発明に従えば、以下１〜２に記載のタンパク質およびポリヌクレオチドが提供される。
１．配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列における一若しくは複数のアミノ酸を置換、欠失、または付加してなるアミノ酸配列からなり、且つ細胞増殖抑制活性を有するタンパク質。
２．配列表の配列番号２に記載のＤＮＡ配列、配列表の配列番号３に記載のＤＮＡ配列、および配列表の配列番号４に記載のＤＮＡ配列からなる群より選ばれるＤＮＡ配列において一若しくは複数のＤＮＡを置換、欠失、または付加してなるＤＮＡ配列からなり、且つ細胞増殖抑制活性を有するポリヌクレオチド。
また、本発明に従えば、以下３〜５に記載のいずれか一つのＤＮＡ配列からなるＤＮＡに対するアンチセンスＤＮＡ、または３〜５に記載のいずれか一つのＤＮＡ配列がコードするＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡ或いはその誘導体を含むアンチセンスポリヌクレオチドが提供される。
３．配列表の配列番号２に記載のＤＮＡ配列。
４．配列表の配列番号３に記載のＤＮＡ配列。
５．配列表の配列番号４に記載のＤＮＡ配列。
また、本発明に従えば、以下６〜９に記載のタンパク質またはポリヌクレオチドからなる細胞増殖抑制剤、或いは癌治療剤が提供される。
６．配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
７．配列表の配列番号２に記載のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド。
８．配列表の配列番号３に記載のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド。
９．配列表の配列番号４に記載のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド。
また、本発明は、上記１または６に記載のタンパク質をマーカーとして用いることを特徴とする癌診断薬を提供する。
また、本発明は、上記７〜９のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドをマーカーとして用いることを特徴とする癌診断薬を提供する。
さらに、本発明は、上記７〜９のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを治療遺伝子として含むことを特徴とする遺伝子治療用組成物を提供する。
前記遺伝子治療用組成物において、好ましくは治療遺伝子がウイルスベクターに含まれ、さらに好ましくは該ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである。
最後に、本発明に従えば、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に対する蛍光標識された抗体を提供すること、癌細胞と疑われる細胞を前記蛍光標識された抗体で染色すること、そして蛍光発色の有無を測定することを特徴とする癌細胞の識別方法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の構成および好ましい実施の形態について詳細に説明する。
本明細書では、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）および当該分野における慣用記号に従い、アミノ酸、タンパク質、ＤＮＡ配列、核酸等を各種略号によって表示する。
また、本明細書中で使用される「ポリヌクレオチド」は、１本鎖および２本鎖のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｃＲＮＡ等様々な形で具体化できる。
なお、本明細書では、特に断りがない限り、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）は、センス鎖とアンチセンス鎖の二本鎖からなるものを指し、ＲＮＡは一本鎖からなるものを指し、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡは一本鎖からなるものを指す。
さらに、本明細書において「不死化抑制」という用語は、「細胞増殖抑制」と同義に使用される場合がある。また、本明細書において「不死化細胞」という用語は、癌細胞を含んで用いられる。
また、「アンチセンスポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドに含まれるが、本明細書では、該ポリヌクレオチドがアンチセンス鎖であることを特に明示するときには、アンチセンスポリヌクレオチドと表記する。
（不死化抑制遺伝子およびタンパク質）
本発明で用いられる不死化抑制遺伝子（以下、本発明に係る遺伝子という）の一つは、細胞増殖抑制活性を有する、配列表の配列番号１に記載の３５０個のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ配列からなり、単離され且つ精製されたポリヌクレオチド（配列番号２）である。また、本発明に係わる遺伝子は、配列番号３または４に記載のＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチドを包含する。さらに、本発明に係わる遺伝子は、配列番号２に記載のＤＮＡ配列、配列表の配列番号３に記載のＤＮＡ配列、または配列表の配列番号４に記載のＤＮＡ配列のいずれか一つのＤＮＡ配列において一若しくは複数のＤＮＡを置換、欠失、または付加してなるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチドを包含する。
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生させ、本発明に利用するとき、配列番号２、３、若しくは４に記載のＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチドによる発現には限定されず、前記アミノ酸配列を構成する各アミノ酸に対して対応する任意のコドンを組み合わせ、コドン使用頻度の違う様々な宿主で本発明に係る遺伝子として、発現を効率よく行わせることができる。従って、上記に定義されたポリヌクレオチド以外に、このような縮重コドンを随意に含む遺伝子も本発明に係る遺伝子の範囲に包含される。
本発明で用いられる細胞増殖抑制タンパク質（以下、本発明に係るタンパク質、またはＲＥＩＣタンパク質という）は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を含んでなるが、それのみならず該タンパク質の細胞増殖抑制活性と実質的に同様な活性を保持し、且つ配列番号１に記載のアミノ酸配列中の任意の一若しくは複数のアミノ酸を置換、欠失、付加等により改変してなるアミノ酸配列を有する該タンパク質の変異体も包含する。これらの変異体は、典型的には天然のアレル（ａｌｌｅｌｅ）変異および異種動物間の変異を含み、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して高いホモロジーを有する。本発明において、前記変異体をコードすべくポリヌクレオチドのＤＮＡ配列もそれらに対応して改変され得る。望ましいＤＮＡ配列の改変は、部位特異的突然変異等、当業者に公知の方法で実施可能である。
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）のＤｋｋ１タンパク質（ｘＤｋｋ１）のヒトホモログであるｈＤｋｋ３タンパク質として報告されている（Ｋｒｕｐｎｉｋ，Ｖ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２３８，３０１−３１３，１９９９）。ｘＤｋｋ１は、アフリカツメガエルにおける胚の中で強力な頭部誘導能を持つ、シュペーマン形成体における分泌型のタンパク質で、胚の分化、頭部形成に関与し、分泌型のシグナル分子Ｗｎｔファミリー（Ｃａｄｉｇａｎ，Ｋ．Ｍ．ａｎｄ  Ｎｕｓｓｅ，Ｒ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１１，３２８６−３３０５，１９９７）のシグナル伝達阻害因子として報告されている。さらにＫｒｕｐｎｉｋらは、ヒトＤｋｋファミリー（ｈＤｋｋ１〜４）の内で、ｈＤｋｋ１とｈＤｋｋ４がＷｎｔファミリーのシグナル伝達系のＷｎｔ活性の阻害活性を有するが、ｈＤｋｋ３はＷｎｔ活性の阻害活性を持たないと報告している。Ｗｎｔファミリータンパク質は癌関連遺伝子であることが、示唆されている（Ｃａｄｉｇａｎ前掲）。しかしながら、Ｋｒｕｐｎｉｋらの報告は、ｈＤｋｋ３とＷｎｔファミリータンパク質との関連について触れていない。従って、本発明以前に、このｈＤｋｋ３タンパク質が細胞の不死化或いは癌化に関連があることを示唆する情報は一切なかった。
また、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質および配列番号２に記載のＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチドにホモロジーのある分子として、ヒトグリオーマ細胞で発現が低下しているＲＩＧタンパク質が報告されている（Ｌｉｇｏｎ，Ａ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＮｅｕｒｏＶｉｒｏｌｏｇｙ  ４，２１７−２２６，１９９８）。しかしながら、ＲＩＧタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質との間のホモロジーが低く、本発明に係る後者のタンパク質とは機能および構造ともに異なるものである。
（各種細胞株における不死化抑制遺伝子の発現）
本発明に係る遺伝子は、不死化抑制遺伝子であるのでヒト各種細胞で発現していることが予想される。そこで各種ヒト癌細胞および不死化細胞における発現を調べたところ、肺癌、肝臓癌、リンパ腫、骨肉腫等の種々の組織から得られた１０系のヒト癌細胞株中、９系のヒト癌細胞および、１系のヒト不死化細胞株で発現が消失し、３系のヒト不死化細胞株で発現が減少していることが分かった。さらに、ヒト不死化細胞で本発明に係る遺伝子を強制発現させたところ、この細胞の増殖が有意に抑制されることが見出された。従って、本発明に係る遺伝子は、これらの細胞の増殖抑制活性を有することが明らかとなった。
（染色体上へのマッピング）
本発明に係る遺伝子の染色体上へのマッピングを行ったところ、ヒト１１番染色体の短腕１５（１１ｐ１５）にマッピングされることが分かった。１１ｐ１５領域には、Ｂｅｃｋｗｉｔｈ−Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ症候群、ドーパミン受容体Ｄ４、ヘモグロビン・βグロビン鎖、鎌状赤血球症、ｃｄｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐ５７ｋｉｐ２、Ｈ−ｒａｓ、ＩＧＦ−ＩＩ、インシュリン、ＱＴ延長症候群、副腎皮質癌、Ｗｉｌｍｓ腫瘍２、横紋筋肉腫、乳酸脱水素酵素、ニーマン・ピック病、副腎甲状腺ホルモン、アシャー症候群などの疾患原因遺伝子が存在することが報告されている。また、非小細胞肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌等の各種固形癌において、１１ｐ１５における染色体の不安定性が報告されている（Ｌａｌａｎｄｅ，Ｍ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，３０，１７３，１９９７；Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９，１７４３−１７４６，１９９９）。さらに、肺腺癌、横紋筋腫由来の細胞株にヒト染色体ＤＮＡを導入する実験で、癌抑制遺伝子が１１ｐ１５にマップされることが報告されている（Ｏ’Ｂｒｉａｎｔ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１７，３２４３−３２５１，１９９７；Ｒｅｉｄ，Ｌ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，５，２３９−２４７，１９９６）。これらの報告から、ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ（ＬＯＨ）、ゲノムインプリンティングなどの染色体の不安定化が本発明に係る遺伝子の発現低下をもたらし、それが原因で細胞癌化が誘導される可能性が考えられる。さらに該遺伝子は細胞の不死化抑制遺伝子であるだけでなく、癌抑制遺伝子でもあることも強く示唆される。
（不死化抑制遺伝子の入手）
本発明に係る遺伝子は、本明細書に開示されるＤＮＡ配列情報に基づいて、遺伝子工学的手法（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）に従い、得ることができる。
実際には本発明に係る遺伝子は、実施例に示すように、正常細胞で高発現し、不死化細胞で低発現している遺伝子のｃＤＮＡを、Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＤＡ）法により濃縮、選択することにより、得ることができる。さらに、サイズ分画や、オリゴキャッピング法またはＲａｃｅ法等により調製された、長鎖ｃＤＮＡライブラリーから、遺伝子の全長ｃＤＮＡを選択的に得ることもできる。具体的には、老化した正常細胞であるＫＭＳ−６細胞と不死化細胞であるＫＭＳＴ−６細胞のｃＤＮＡからＲＤＡ法に従い、不死化細胞で発現が低下している、少なくとも２６６ｂｐの新規ｃＤＮＡを得ることができた。本発明に係る遺伝子に包含されるホモログは、種々の不死化細胞とその親株である正常細胞を材料として、同様の処理により得ることが可能である。当業者が材料として必要な細胞株を選択することは容易である。
上記のようにして得られた遺伝子の断片のＤＮＡ配列をもとに任意の配列、長さに調製した、特異的プローブを用いて、ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーをコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション等によりスクリーニングし、不死化抑制遺伝子を含有するｃＤＮＡを単離することができる。また、オリゴキャッピング法により調製したヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーを同様にスクリーニングし、不死化抑制遺伝子を含有するｃＤＮＡを単離することもできる。
さらに、例えば、市販されている各種ヒトｃＤＮＡライブラリーや、各種培養細胞、組織等から常法に従い、調製されたｃＤＮＡライブラリー等からも所望のｃＤＮＡクローンを単離することができる。また、前記遺伝子断片のＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列をもとにそれに特異的な抗体を用いて、免疫学的なスクリーニング法により、所望のｃＤＮＡクローンを選択することもできる。さらに、前記遺伝子断片のＤＮＡ配列をもとに、適宜特異的なＰＣＲ用のプライマーを設計し、常法に従いＰＣＲ反応を行いｃＤＮＡライブラリーから、増幅されたＤＮＡ断片を保持する所望のｃＤＮＡクローンを選択することもできる。
（遺伝子発現系）
本発明に係る遺伝子を利用するのに際し、少なくとも配列表の配列番号２に記載のＤＮＡ配列またはそれにコンセンサスなＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを適当な発現カセットおよび／または発現ベクターに組み込み、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質またはその変異体を、標的とするヒト細胞内で発現させることが好ましい。
発現カセットは、標的細胞内で本発明に係る遺伝子を発現させることができるものであれば、特に制限されることなくいかなるカセットでも用いることができる。当業者はそのような発現カセットを容易に選択することができる。好ましくは、動物由来の細胞内で前記遺伝子発現が可能な発現カセットであり、より好ましくは、哺乳類由来の細胞内で前記遺伝子発現が可能な発現カセットであり、特に好ましくは、ヒト由来の細胞内で前記遺伝子発現が可能な発現カセットである。
前記発現カセットには、本発明に係る遺伝子のほか、遺伝子を転写するためのプロモーターやエンハンサー、ポリＡシグナル、遺伝子が導入された細胞の標識および／または選別のためのマーカー遺伝子、細胞のゲノムＤＮＡ配列内に効率良く該遺伝子を挿入するためのウイルス由来の遺伝子配列、遺伝子発現により産生される薬物として作用する物質を細胞外に分泌および／または細胞内の局所に滞留させるためのシグナル配列等、いかなる配列でも用いることが可能である。
発現カセットに用いられるプロモーターは、例えばアデノウイルス（Ａｄ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、シンビスウイルス（Ｓｉｎｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、センダイウイルス（ＳｅＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、インフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＪＣウイルス（ＪＣｖｉｒｕｓ）、パルボウイルスＢ１９（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｂ１９）、ポリオウイルス（Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）等のウイルス由来のプロモーター、ａｌｐｈａ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＳＲ−α）、ｍｙｅｌｉｎ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＢＰ）、ｇｌｉａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）、β−ａｃｔｉｎ、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ１−ａｌｐｈａ（ＥＦ１−α）、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）、ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ（Ｍｄｒｌ）、ａｌｂｕｍｉｎ  ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）、熱ショック蛋白（ＨＳＰ）、低酸素誘導蛋白（ＨＩＰ）等の哺乳類由来のプロモーター、およびＣＭＶ初期エンハンサー／ｃｈｉｃｋｅｎ  βアクチンプロモーター／βグロビンポリＡからなるキメラプロモーター（ＣＡＧ）、ＣＭＶ初期エンハンサー／ａｌｐｈａ−ｓｋｅｋｅｔａｌ  ａｃｔｉｎプロモーターからなるキメラプロモーター等のキメラ型プロモーター等を含む。
また、遺伝子とそれを発現させるレトロウイルス由来のプロモーターであるＬＴＲは、ＬＴＲのＵ３領域を例えば、ＣＡＧ、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＴＫ、ＳＶ４０、ＳＲ−α、ＭＢＰ、β−ａｃｔｉｎ、ＥＦ１−α等のプロモーターに置換した、キメラ型ＬＴＲとして用いることができる。
また、本発明に係る遺伝子を含む発現カセットをコスミド、プラスミド、またはウイルス由来の任意の宿主細胞適合性組換えベクターに組み込むことができる。このような組換えウイルスベクターの種類、分子量、形状等には、特に制限はない。具体的には、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡウイルスが挙げられ、（＋）鎖および／または（−）鎖ウイルスが挙げられるが、特に制限を設けるものではない。
前記組換えウイルスベクターは、ＭｏＭＬＶベクター、ＨＳＶベクター、Ａｄベクター、ＡＡＶベクター、ＨＩＶベクター、ＳｅＶベクター等のいかなるウイルスベクターであっても良い。また、ウイルスベクターの構成タンパク質群のうち１つ以上を、異種ウイルスの構成タンパク質に置換する、もしくは、遺伝子情報を構成する核酸配列のうち１部を異種ウイルスの核酸配列に置換する、シュードタイプ型のウイルスベクターも本発明に使用できる。さらに、治療効果を持つウイルスであれば、ヒト以外の宿主域を持つウイルスも組換えウイルスベクターとして使用可能である。
以上、詳細に説明したように、本発明に係る遺伝子は、例えば宿主細胞である微生物または真核生物の発現ベクターに組み込んで形質転換された微生物、または真核生物を培養することによって、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質等を容易に、かつ安定して製造することができる。上記に列挙したものの中から選択された発現ベクターは、それ単独で、またはカチオニックリポソーム、ポリリジン、ポリリジンセリン等の医学的に許容できる様々な担体と複合体を形成させた上で、宿主細胞に導入することができる。
（アンチセンスポリヌクレオチド）
本発明に係わる遺伝子を構成するＤＮＡのセンス鎖または該ＤＮＡがコードするＲＮＡについては、その塩基配列と相補的な塩基配列からなるアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡがそれぞれ存在する。すなわち、このようなアンチセンスＤＮＡは、配列番号２、配列番号３、または配列番号４に記載のＤＮＡ配列のすくなくとも一部に相補的なＤＮＡ配列を有する。また、このようなアンチセンスＲＮＡは、配列番号２、配列番号３、または配列番号４に記載のＤＮＡ配列からなるＤＮＡがコードするＲＮＡのすくなくとも一部に相補的なＲＮＡ配列を有する。好ましくは、前記アンチセンスＤＮＡおよびアンチセンスＲＮＡは、配列番号２に記載のＤＮＡ配列またはそれに対応するＲＮＡ配列の一部に相補的である。従って、前記アンチセンスＤＮＡまたは前記アンチセンスＲＮＡを含む本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明に係る遺伝子から本発明に係わるタンパク質が製造される過程（転写、翻訳等）で、遺伝情報を担うＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズして、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えて、該タンパク質の生合成を阻害する。また、本発明は、アンチセンスポリヌクレオチド誘導体を包含する。該誘導体は、例えば、アンチセンスポリヌクレオチドの３’末端、若しくは５’末端に他の物質が結合したものや塩基、糖、リン酸の少なくともいずれか一部において、置換、欠失、または付加等の修飾をくわえたものである。特に、生体に投与するとき、ヌクレアーゼによる分解を防ぐために、ホスホロチオエート型（リン酸基がイオウ原子で共有結合）のポリヌクレオチド誘導体であることが好ましい。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはその誘導体は、その塩基数が１０〜２０００であることが好ましい。この範囲で塩基数が比較的少ないオリゴヌクレオチドであれば、ＤＮＡ合成機を用いて化学合成することができる。さらに、本発明に係わる遺伝子のｃＤＮＡの一部を鋳型としてＰＣＲ法で合成できる場合もある。
（治療薬としての用途）
本発明に係るタンパク質は、癌細胞を含む不死化細胞の増殖を抑制するので、癌等の細胞の不死化が原因である疾病の治療に治療薬として用いることが可能である。従って、これらのタンパク質をコードする本発明に係る遺伝子も、治療薬として使用可能である。さらに、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはその誘導体は、本発明に係る遺伝子に拮抗的に作用し、細胞増殖を刺激するので様々な疾患の治療に適用できる。
本発明に係るタンパク質を細胞増殖抑制剤、または癌治療剤として癌等の疾病の治療に使用する場合、該タンパク質を薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、安定化剤等とともに錠剤、カプセル剤、注射用懸濁液、その他の製剤として患者に投与することが好ましい。この目的で用いる製剤用の助剤は、当業者に周知である。また、本発明の細胞増殖抑制剤および癌治療剤は、靜脈内投与、経口投与等、好ましい投与経路を設定して、望ましい治療効果を達成することが期待できる。
（遺伝子治療への応用）
本発明に係る遺伝子を細胞増殖抑制剤として、または癌治療剤として癌等の疾病の治療に使用する場合、好ましくは、該遺伝子を治療遺伝子として、前述の治療用にデザインされた担体と併せて遺伝子治療用組成物を調製し、患者に投与する。
本発明の遺伝子治療用組成物は、まず患者から標的細胞を体外に取り出し、本発明に係る遺伝子を導入した後に、再びその細胞を患者の体内に戻すという自家移植による遺伝子治療（ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療）に使用可能である。また、本発明に係る遺伝子を直接患者に投与する遺伝子治療（ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療）にも使用可能である。
本発明に係る遺伝子を遺伝子治療に使用するとき、アデノウイルスベクターが好ましく用いられる。アデノウイルスベクターの特徴として、（１）多くの種類の細胞に遺伝子導入ができる、（２）増殖停止期の細胞に対しても効率よく遺伝子導入ができる、（３）遠心により濃縮が可能であり、高タイター（１０〜１１ＰＦＵ／ｍｌ以上）のウイルスが得られる、（４）ｉｎ  ｖｉｖｏの組織細胞への直接の遺伝子導入に適している、といった点が挙げられる。
遺伝子治療用のアデノウイルスとしては、Ｅ１／Ｅ３領域を欠失させた第１世代のアデノウイルスベクター（Ｍｉｙａｋｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９３，１３２０，１９９６）から、Ｅ１／Ｅ３領域に加え、Ｅ２もしくはＥ４領域を欠失させた第２世代のアデノウイルスベクター（Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，８９４４，１９９６；Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ，Ｈ．＆Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１０，２０１３，１９９９）、アデノウイルスゲノムをほぼ完全に欠失させた（ＧＵＴＬＥＳＳ）第３世代のアデノウイルスベクター（Ｓｔｅｉｎｗａｅｒｄｅｒ，Ｄ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３，９３０３，１９９９）が開発されているが、本発明に係る遺伝子を導入するには、特に限定されずいずれのアデノウイルスベクターでも使用可能である。
さらに、ＡＡＶの染色体に組み込み能を付与したアデノ−ＡＡＶハイブリッドベクター（Ｒｅｃｃｈｉａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９６，２６１５，１９９９）や、トランスポゾンの遺伝子を用いることにより染色体に組み込む能力を有したアデノウイルスベクターなどを利用すれば、長期的な遺伝子発現にも応用が可能である。
また、アデノウイルスファイバーのＨ１ループに組織特異的な移行性を示すペプチド配列を挿入することにより、アデノウイルスベクターに組織特異性を付与することも可能である（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ，Ｈ．＆Ｈａｙａｋａｗａ，Ｔ．，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ，７，１５４４，２０００）。
本発明の遺伝子治療用組成物の生体への投与の方法については特に制限はない。例えば非経口的投与、例えば靜脈内投与することにより好ましく実施できる。
（対象疾患）
本発明に係る遺伝子によってコードされる本発明に係るタンパク質は、受容細胞の老化または静止状態を誘発するため、癌細胞の非癌性細胞への分化を媒介することができる。例えば、癌、或いは癌原細胞の急性増殖を抑制するための治療に使用できる。
一般的に腫瘍（ｔｕｍｏｒ）には、良性腫瘍（ｂｅｎｉｇｎ  ｔｕｍｏｒ）と悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｕｍｏｒ）があり、後者を総称して癌（ｃａｎｃｅｒ）という。
本発明に係るタンパク質を用いることにより、治療可能な腫瘍は特に限定されず、良性腫瘍、悪性腫瘍のいずれも治療が可能であるが、特に悪性腫瘍に対して有効である。
悪性腫瘍を発生臓器別に分類すると、脳・神経腫瘍、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、リンパ腫・白血病、結腸癌、膵癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫、その他の癌に分類される。上記のとおり、治療可能な腫瘍は特に限定されず、前記の腫瘍、癌、いずれも治療が可能であるが、特に肺癌、肝癌、食道癌、骨・骨肉腫、に対して有効である。
さらに各臓器癌を組織学的に分類すると、上皮細胞由来の癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、非上皮細胞由来の肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）、およびそれらの混合腫瘍に大別される。本発明に係るタンパク質を用いることにより、治療可能な腫瘍は特に限定されず、上皮細胞由来の癌腫、非上皮細胞由来の肉腫、混合腫瘍のいずれも治療が可能であるが、特に上皮細胞由来の癌腫に対して有効である。
さらに多くの癌ではない疾病も本発明に係る遺伝子またはタンパク質により治療が可能であり、その代表例として緑内障、乾癬等の細胞の過剰成長による疾患が挙げられる。
また、例えば、レトロウイルスは組胞増殖期の細胞でのみ増殖するため、ＨＩＶ等のレトロウイルス感染症、いぼ（性交性いぼを含む）、口頭乳頭腫症、進行性マルチフォーカルロイコセファロパシー等のような疾病に対して、本発明に係る遺伝子は、治療的に有効であることが期待される。これは、該遺伝子が感染細胞増殖を阻害することによってウイルスの増殖を抑制するからである。従って、インフルエンザ、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎）、ＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、パピローマウイルス等のウイルスの増殖を抑制する抗ウイルス剤としても有用である。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはその誘導体は、細胞増殖を刺激する活性を有するので、細胞の増殖を必要とする疾患の治療に用いることができる。例えば、創傷、火傷等の治療を目的とした皮膚組織細胞の増殖、心筋梗塞、脳梗塞等の治療を目的とした血管内皮細胞の増殖、肝硬変、腎不全等の治療を目的とした萎縮組織細胞の増殖等、放射線被爆、エイズ等によるリンパ球の減少の治療を目的とした骨髄細胞の増殖が挙げられる。
（診断薬としての用途）
前述のように、本発明に係る遺伝子は、癌細胞を含む不死化細胞でその発現が減少しているので、該不死化細胞の増殖が原因である疾病の広範囲な診断用マーカーとなり得る。特に、本発明に係る遺伝子は、癌診断薬として使用可能である。さらに、本発明に係る遺伝子によって発現される本発明に係るタンパク質も、癌細胞を含む不死化細胞でその発現が減少するので、該タンパク質も同様にして、癌診断薬を含む前記診断用マーカーとして用いることが可能である。
本発明に係るタンパク質を癌等の診断に使用する場合、該タンパク質に対する特異的抗体を作製し、これをアッセイに用いる。ここで抗原として、前述の遺伝子工学的手法に従って大量に産生できるタンパク質またはその一部を用いることができ、得られる抗体はポリクロナール抗体およびモノクロナール抗体のいずれでもよい。これら抗体は前記タンパク質の精製、測定、識別等に利用できるが、特に、モノクロナール抗体は、細胞、組織または体液中の該タンパク質の存在を評価するための免疫アッセイに好適に使用できる。このように抗体によって提供される該タンパク質の検出および／または測定の能力は、腫瘍の存在または重症度の評価手段として非常に望ましいものである。
（遺伝子診断）
本発明に係る遺伝子を、癌等の遺伝子診断に使用する場合、該遺伝子を構成するＤＮＡ配列に基づき、それとハイブリダイズし得るＤＮＡまたは該ＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列にハイブリダイズし得るＲＮＡを含むポリヌクレオチドを作製し、これをアッセイに用いる。この目的のために、上記のアンチセンスポリヌクレオチドの全長または一部を用いることができる。このようなポリヌクレオチドの長さは、１０〜２０００塩基が好ましく、より好ましくは１５〜１０００塩基である。これらのポリヌクレオチドは、３２Ｐ等の放射性同位元素、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオレセイン等の蛍光化合物、またはアクリジニウムエステル等の化学発光化合物で任意に標識され得る。得られた標識ポリヌクレオチドは、サザンおよびノーザンブロッティングのような従来の分析において、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡプローブとしてアッセイに用いることができる。好ましくは、これらのプローブはストリンジェントな条件下で前記遺伝子とハイブリダイズし得るものである。また、短い１０〜５０塩基のポリヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲ法による診断でプライマーとして用いることができる。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
（実施例１）  不死化関連遺伝子のクローニング
１．初代線維芽細胞株の培養
９週齢の雌性胚からヒト線維芽細胞を調製し、初代線維芽細胞株（ＫＭＳ−６）を得た（Ｎａｍｂａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３５：２７５−２８０，１９８５）。細胞は１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、三光純薬社製）を含むイーグル最少培地（ＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ社製）、またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ社製）を用いて５％ＣＯ２濃度、３７℃条件下で培養した。細胞はプレート中でほぼ密集するまで５〜７日間培養した後、１／４倍希釈で継代培養した。
２．６０Ｃｏ放射線処理による不死化細胞株の樹立
セミコンフルエントに培養したＫＭＳ−６細胞に２００−４００ｒａｄｓの線量の６０Ｃｏγ線を１３回照射し、計２，８００ｒａｄｓで放射線処理を行った。その後、１／２倍ずつ継代を重ね、最終的に約５０回の継代培養を行い、老化形態を示さず、増殖能を有する不死化細胞株（ＫＭＳＴ−６）を得た（Ｎａｍｂａら、前掲）。
３．ＲＤＡ法による遺伝子のクローニング
４５継代し、老化させたＫＭＳ−６細胞から、Ａｃｉｄ−Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ（ＡＧＰＣ）法により全ＲＮＡを抽出し、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｌ社製）を用いてｍＲＮＡを精製した。同様に、不死化しているＫＭＳＴ−６細胞から、ｍＲＮＡを抽出、精製した。各々２μｇの精製したｍＲＮＡを鋳型としａｖｉａｎ  ｍｙｅｌｏｂａｓｔｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）を用いて、それぞれｃＤＮＡを調製した。ＫＭＳ−６から調製したｃＤＮＡ  ０．０１μｇと、ＫＭＳＴ−６から調製したｃＤＮＡ１μｇを６８℃で８時間、サブトラクションした。サブトラクションで除かれなかったｃＤＮＡを鋳型とし、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて２本鎖ＤＮＡを調製した。これをプラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込んだ後、大腸菌（ＤＨ５α）に導入し、約４００クローンからなる大腸菌ライブラリーを得た。
（実施例２）  クローンＲＥＩＣ
１．大腸菌ライブラリーのスクリーニング
上記大腸菌ライブラリーから擬陽性クローンを除外するため、別の不死化細胞株であるＯＵＭＳ−２４Ｆ（Ｂａｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５３：４５１−４５６，１９９３）のｍＲＮＡをもとに作製した３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの結果、陽性となったクローンを除外し、約３０の不死化抑制遺伝子候補クローンを得た。
２．ＤＮＡシークエンシング
スクリーニングにより得られたクローシのＤＮＡ配列を、Ｓａｎｇｅｒ法（Ｓａｎｇｅｒ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３−５４６７，１９７７）を用いて決定した。その結果、フィブロネクチン、α２タイプＩプロコラーゲン等の細胞外マトリックスタンパク質、コラゲナーゼ、ＷＳ９−１４等の酵素タンパク質、ｐ２１等の細胞周期調節タンパク質等、老化に関連する遺伝子配列を持つクローンが同定された。そのうち、既知の遺伝子とホモロジーを示さず、新規遺伝子と考えられるクローンＲＥＩＣ（Ｄ９３）が得られていることが判明した。そのＤＮＡ配列を配列表の配列番号５に示す。
（実施例３）  クローンＲＥＩＣ（１０−１）
クローンＲＥＩＣ（Ｄ−９３）のＤＮＡ配列から該クローンは完全長ｃＤＮＡではないことが予想された。そこで、ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリー（ＢＲＬ社製）から、配列番号５に記載のＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして、より長いＤＮＡ配列を有するｃＤＮＡ断片を持つクローンのスクリーニングを行った。その結果、ＲＥＩＣ（Ｄ９３）の５’領域を含む、全長ｃＤＮＡ断片を保持すると予想されるクローン、ＲＥＩＣ（１０−１）を得た。このｃＤＮＡクローンについてＤＮＡシーケンシングを行い、その全ＤＮＡ配列を決定した。このクローンのＤＮＡ配列を配列表の配列番号３に示す。
（実施例４）  クローンＲＥＩＣ（１０−２）
オリゴキャッピング法（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｓｕｇａｎｏ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ，１３８：１７１−１７４，１９９４）で調製したヒト心臓ｃＤＮＡライブラリー（日本ジーン社製）を用いて、実施例２と同様に、配列番号５に記載のＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして、より長いＤＮＡ配列を有するｃＤＮＡ断片を持つクローンのスクリーニングを行った。その結果、ＲＥＩＣ（Ｄ９３）の５’領域を含む、全長ｃＤＮＡ断片を保持すると予想されるクローン、ＲＥＩＣ（１０−２）を得た。このｃＤＮＡクローンについてＤＮＡシーケンシングを行い、その全ＤＮＡ配列を決定した。このクローンのＤＮＡ配列を配列表の配列番号４に示す。
（実施例５）  クローニングされたｃＤＮＡの解析
実施例３および４の結果から、本発明に係る遺伝子は、配列番号５に記載のＤＮＡ配列を完全に含み（配列番号３の塩基番号１８４８−２１１３、配列番号４の塩基番号１８２０−２０９５にそれぞれ相当）、さらに該配列の５’側には３５０個のアミノ酸を有するタンパク質（配列番号１）をコードする、配列番号２に記載の１０５０ｂｐの翻訳領域（配列番号３の塩基番号２２６−１２７５、配列番号４の塩基番号１９８−１２４７にそれぞれ相当）を含むことを確認した。この遺伝子は、不死化細胞で発現が低下していることから前述のように、Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌ（ＲＥＩＣ）と表現し、以下「ＲＥＩＣ遺伝子」または単に「ＲＥＩＣ」と呼ぶ。
本発明に係るＲＥＩＣ遺伝子のホモログの探索は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でＷｅｂサイト上に公開されているデータベースから、相同解析プログラム（ＢＬＡＳＴ）を用いて行った。
ＢＬＡＳＴの結果から、配列番号１のアミノ酸配列と同一若しくはホモロジーを示す配列を有するタンパク質として、ｈＤｋｋ３とＲＩＧ７−１が得られた。ｈＤｋｋ３は、１００％の同一性を示し、ＲＩＧ７−１は、部分的には同一であるが、全体で４３％のホモロジーしか示さなかった。ｈＤｋｋ３およびＲＩＧ７−１のアミノ酸配列と、ＲＥＩＣ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１）とのホモロジー比較を図１に示す。
（実施例６）  各種細胞株におけるＲＥＩＣの発現量の解析
Ｈｅｐ３Ｂ（肝細胞癌）、ＨｕＨ６（肝芽腫）、ＨｕＨ７（肝細胞癌）、ＨｕＣＣＴ１（胆管癌）、Ａ５４９（肺癌）、ＨａＣａｔ（不死化ケラチノサイト）、ＨｅＬａ（子宮頚部癌）、Ｓａｏｓ２（骨肉腫）、Ｔ２４（膀胱癌）、そしてＵ９３７（組織球性リンパ腫）の１１種類の癌細胞株と、３種類の正常線維芽細胞（ＯＵＭＳ２４、ＫＭＳ−６、ＨＳＦ４１２）およびそれぞれ対応する不死化細胞（ＯＵＭＳ２４Ｆ、ＫＭＳＴ−６、ＳＵＳＭ１）とから調製した全ＲＮＡ（１０μｇ）を１％ホルムアルデヒド／アガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロースフィルター（ＨｙｂｒｉｂｏｎｄＮ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に固定化した。次に、（α−３２Ｐ）−ｄＣＴＰでラベルしたプローブを用いて、ＲＥＩＣｃＤＮＡ断片のノーザンハイブリダイゼーション（４２℃、１２時間）を行った。メンブレンを５ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１ｘデンハールト水溶液、０．２％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、そして熱変性させた２００μｇ／ｍｌのサケ精巣ＤＮＡを含むバッファー中に入れ、ラジオアイソトープで標識したプローブＤＮＡを加え、６５℃でハイブリダイズした。その後、フィルターを５５℃の２ｘＳＳＣ／０．５％ＳＤＳバッファー中で洗浄し、さらに５５℃の０．１ｘＳＳＣ／０．５％ＳＤＳバッファー中でもう一度洗浄した。Ｘ線フィルム上でオートラジオグラフィーにかけた結果を図２に示す。正常細胞でサイズが約２．６ｋｂのｍＲＮＡが検出され、この転写産物の大きさは配列番号３または配列番号４に記載のＲＥＩＣｃＤＮＡのＤＮＡ配列の大きさに矛盾しないことが明らかとなった。各不死化細胞株でもＲＥＩＣ遺伝子の発現は認められたが、正常細胞株と比較して発現量が減少していた。さらに、Ｔ２４株を除く各癌細胞株でＲＥＩＣ遺伝子の発現が消失していることが確認された。
（実施例７）  細胞増殖阻害試験
１．発現プラスミドの作製
遺伝子発現プロモーターとして、ＥＦ−１αを保持するプラスミドベクターｐＴｒａｃｅｒ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。ＥＦ１−αプロモーターの下流のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ部位に、配列番号３に記載のＤＮＡ配列を含む、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩで切り出した、２．６ｋｂのＲＥＩＣｃＤＮＡ断片をサブクローニングし、発現プラスミドＲＥＩＣ／ｐＴｒａｃｅｒ（図３）を得た。
２．３Ｈチミジンの取り込み（不死化ＫＭＳＴ−６細胞）
不死化ＫＭＳＴ−６細胞を２４ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェルとなるように播種した。トランスフェクション試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ社製）を用いて、５μｇの発現プラスミドＲＥＩＣ／ｐＴｒａｃｅｒをリポフェクションした。１μＣｉ／ウェルとなるように、メチル−３Ｈチミジン（１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を調製し、細胞への取り込みを行った。１２時間後、得られた細胞を冷却したＰＢＳ（−）で洗浄した。さらに５％トリクロロ酢酸中に固定し、９５％エタノールで洗浄した。こうして得られた細胞を０．３Ｍ  ＮａＯＨで溶解した後、ＨＣｌで中和し、取り込まれた３Ｈチミジンの放射活性を、液体シンチレーションカウンターで測定した。その結果、ＲＥＩＣ遺伝子が細胞増殖抑制効果を有することが確認された（図４）。対照として、ベクターＰＴｒａｃｅｒＡのみをＫＭＳＴ−６細胞にリポフェクションした。
３．３Ｈチミジンの取り込み（Ｓａｏｓ２骨肉腫細胞）
Ｓａｏｓ２骨肉腫細胞を２４ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェルとなるように播種した。リン酸カルシウム法を用いて、２μｇの発現プラスミドＲＥＩＣ／ｐＴｒａｃｅｒをトランスフェクションした。１μＣｉ／ウェルとなるように、メチル−３Ｈチミジン（１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を調製し、細胞への取り込みを行った。１２時間後、細胞を冷却したＰＢＳ（−）で洗浄した。さらに５％トリクロロ酢酸中に固定し、９５％エタノールで洗浄した。こうして得られた細胞を０．３Ｍ  ＮａＯＨで溶解した後、ＨＣｌで中和し、取り込まれた３Ｈチミジンの放射活性を、液体シンチレーションカウンターで測定した。その結果、ＲＥＩＣ遺伝子が細胞増殖抑制効果を有することが確認された（図５）。対照として、ベクターＰＴｒａｃｅｒＡのみをＳａｏｓ２細胞にリポフェクションした。
（実施例８）  ＲＥＩＣタンパク質を認識する抗体の作製
１．ＲＥＩＣタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳
ＲＥＩＣタンパク質をＧＳＴ融合タンパク質として発現させるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系で翻訳させた。
配列番号３に記載のＤＮＡ配列をもとに、プライマー：５’−ＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＧＣＧＧＣＴＴＧＧＧＧＣＣＡＣ−３’および５’−ＴＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧ−３’を用いてＲＥＩＣのＯＲＦ領域をＰＣＲで選択的に増幅した。増幅したＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩで消化して、ＧＳＴ融合タンパク発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）のＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ部位にＲＥＩＣが融合タンパク質として発現するようにサブクローニングし、発現プラスミドＲＥＩＣ／ｐＧＥＸ−２Ｔ（図６）を得た。
常法に従い、プラスミドＲＥＩＣ／ｐＧＥＸ−２Ｔで形質転換した大腸菌にＩＰＴＧ誘導処理を施し、融合タンパク質を産生させた。集菌した大腸菌をＰＢＳに懸濁し、超音波処理後、遠心して得られた上清をグルタチオンセファロース４Ｂカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）にかけて、融合タンパク質を精製した。カラムに吸着した前記融合タンパク質をトロンビンで消化し、溶出した。その後、再度グルタチオンカラムで未消化の融合タンパク質を取り除き、数個の余分なアミノ酸を有するＲＥＩＣタンパク質を得た。
２．抗体
上記１で得られ、精製されたタンパク質を生理食塩水で希釈し、その１ｍｇをウサギ耳静脈に２週間おきに投与することによりウサギを免疫した。２回の免疫後、抗体価をＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて測定した。その結果、１／２０００希釈した抗体が前記タンパク質０．０１μｇに対して反応することを確認したので、さらに２回の追加免疫を行った。全採血により得られた血液を、３７℃で３０分間インキュベートし、凝固した血餅を取り除いた後、ポアサイズが０．４５μｍのフィルターを用いて無菌濾過し、所望の抗血清を得た。
（実施例９）  抗体による細胞核染色
ＲＥＩＣ遺伝子の細胞内局在を検討するために、実施例８で作製した抗ＲＥＩＣ抗血清と、コントロールとして、染色体を特異的に蛍光染色する色素であるＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）とを用いて、細胞の２重染色を行った。まず、ＫＭＳ−６細胞を６ウェルシャーレで培養した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８を培地中に１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加した後、１時間培養した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色した細胞を１％パラフォルムアルデヒドで固定し、前記抗血清で処理した後、ＦＩＴＣ標識したヤギ抗ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）で染色した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８を励起波長３６０ｎｍで励起し、ＦＩＴＣ標識した抗体は励起波長４８８ｎｍで励起した。この免疫蛍光法による測定結果を図７に示す。これより前記抗血清が核を特異的に染色し、ＲＥＩＣタンパク質が細胞内で核に局在することを確認した。
（実施例１０）  ＲＥＩＣ遺伝子の染色体マッピング
ＲＥＩＣ遺伝子の染色体マップは、ヒト−ハムスター雑種細胞由来のパネル（Ｓｔａｎｄｆｏｒｄ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ／Ｈａｍｓｔｅｒ  ＲＨ  Ｐａｎｅｌ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）を用いて、ラジエーション・ハイブリッド地図（ＲＨマップ）を解析することにより決定した。ＰＣＲ用のプライマーは、５’−ＧＡＴＴＴＡＧＡＴＣＴＧＧＡＣＣＡＧＧＣ−３’（配列番号４の塩基番号１２４４−１２６３）および５’−ＣＴＧＡＧＣＡＡＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧ−３’（配列番号４の塩基番号１７７７−１７９６に相当する配列のアンチセンス鎖）を用いた。ＰＣＲは、９４℃３分のプレヒート後、９４℃３０秒、６３℃３０秒、７２℃１分で３０サイクル反応を行った。反応溶液を２％アガロースゲルで電気泳動後、ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ（ＥｔＢｒ）染色した結果、５５３ｂｐの増幅産物が確認された（図８）。ＰＣＲの結果をもとに、スタンフォード大学のＲＨデータベースから、ＲＥＩＣ遺伝子がヒト１１番染色体の短腕１５（１１ｐ１５）に位置することを確認した。
また、その情報をもとにＧｅｎｅＢａｎｋのＳＴＳゲノムマーカーと、ＲＥＩＣ遺伝子の塩基配列を比較したところ、ＲＥＩＣ遺伝子の３’非翻訳領域がマーカーのＤ１１Ｓ２３８８（１１ｐ１５のゲノムマーカー）と一致することを確認した。（図９，図１０）。これらの結果から、ＲＥＩＣ遺伝子が１１ｐ１５に位置することが明らかとなった。なお、図９中に示した各種癌組織におけるＬＯＨ頻度は、以下の文献から引用した。乳癌（Ｂ）：Ｗｉｎｑｖｉｓｔ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３，４４８６，１９９３；食道癌（Ｅ）：Ｄｏｌａｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７８，９５０，１９９８；胃癌（Ｇ）：Ｂａｆｆａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，２６８，１９９６；肝細胞癌（Ｈ）：Ｓｈｅｕ，Ｊ−Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８０，４６８，１９９９；頭頚部癌（ＨＮ）：Ｅｌ−Ｎａｇｇａｒ，Ａ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２，９０３，１９９６；および前立腺癌（Ｐ）：Ｄａｈｉｙａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７２，２８３，１９９７．
（実施例１１）  臨床サンプル中のＲＥＩＣ遺伝子の発現
１．臨床サンプルの入手
各種癌および非癌組織は、岡山大学医学部で手術を受けた、３４人の患者からインフォームドコンセントを得て入手した。
２．ＲＥＩＣ遺伝子の発現
上記１で入手した癌、および非癌組織から、グアニジン−チオシアネート法により全ＲＮＡを回収した。回収した全ＲＮＡ（１０μｇ）を１％ホルムアルデヒド／アガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロースフィルター（ＨｙｂｒｉｂｏｎｄＮ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に固定化した。次に、（α−３２ｐ）−ｄＣＴＰでラベルしたプローブを用いて、ＲＥＩＣｃＤＮＡ断片のノーザンハイブリダイゼーション（４２℃、１２時間）を行った。メンブレンを５ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１Ｘデンハールト水溶液、０．２％ＳＤＳ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、そして熱変性させた１００μｇ／ｍｌのサケ精巣ＤＮＡを含むバッファー中に入れ、ラジオアイソトープで標識したプローブＤＮＡを加え、６５℃でハイブリダイズした。その後、フィルターを５５℃の２ｘＳＳＣ／０．５％ＳＤＳバッファー中で洗浄し、さらに５５℃の０．１ｘＳＳＣ／０．５％ＳＤＳバッファー中でもう一度洗浄した。Ｘ線フィルム上でオートラジオグラフィーにかけた。その結果、非小細胞肺癌患者１１例中１０例（図１１Ａ：ケース１〜６，８〜１１）、肝細胞癌患者１３例中４例（図１１Ｂ：ケース８，９，１１，１３）、食道癌患者２例中１例（図１１Ｃ：ケース２）、胃癌患者４例中１例（図１１Ｄ：ケース４）、でＲＥＩＣ遺伝子の発現量が減少していた。一方、大腸癌患者３例では、ＲＥＩＣ遺伝子の発現量の低下は見られなかった（図１１Ｅ）。
（実施例１２）  ＲＥＩＣ遺伝子のＲＦＬＰ解析
ＲＥＩＣ遺伝子の変異解析を行うために、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＲＦＬＰ）解析を行った。まず、肝細胞癌由来のＪＨＨ−１、ＨｕＨ−６、ＨｅｐＧ２、ＨＬＥ、ＨｕＨ−７、ＰＬＣ／ＰＲＣ／５、Ｈｅｐ３Ｂ、ＪＨＨ−７、ＪＨＨ−２、ＪＨＨ−６、ＪＨＨ−４、ＪＨＨ−５細胞株から染色体ＤＮＡを下記の方法に従い、回収した。また、ポジティブコントロールとして、正常線維芽細胞株ＫＭＳ−６から染色体ＤＮＡを回収した。
１．染色体ＤＮＡの回収
培養皿２枚からコンフルエントに培養した各細胞をトリプシン処理により回収した。回収した細胞を１×ＴＥＮ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴＥＮ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｎａｃｌ）中に懸濁しホモジナイズした。ホモジナイズした懸濁液に７５０μｌのＳＤＳ（１０％）と５００μｇ／μｌとなるようにｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（ＭＥＲＣＫ社製、２０ｍｇ／ｍｌ）とを加え、緩やかに転倒混和し、５５℃で１時間インキュベート後、３７℃で一晩インキュベートした。フェノール・クロロフォルム抽出を２回行い、回収した上清からさらにクロロホルム抽出を２回行い上清を回収した。回収した上清にあらかじめ−２０℃で保冷した１０．２ｍｌのエタノールを加えて混和し、得られる糸状のＤＮＡをパスツールピペットでとり、余分のエタノールを取り除いて乾燥させた。乾燥させたＤＮＡに適量のＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、室温で１〜２日混和してＤＮＡを溶解した。
２．ＲＦＬＰ解析
上記１で回収したＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで消化後、１％アガロースゲルに電気泳動し、ニトロセルロースフィルター（ＨｙｂｒｉｂｏｎｄＮ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に固定化した。次に、（α−３２ｐ）−ｄＣＴＰで配列番号３のＲＥＩＣｃＤＮＡ断片の全長をラベルしたプローブを用いて、サザンハイブリダイゼーション（４２℃、１２時間）を行った。メンブレンを５ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１Ｘデンハールト水溶液、０．２％ＳＤＳ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、そして熱変性させた１００μｇ／ｍｌのサケ精巣ＤＮＡを含むバッファー中に入れ、ラジオアイソトープで標識したプローブＤＮＡを加え、６５℃でハイブリダイズした。その後、フィルターを５５℃の２ｘＳＳＣ／０．５％ＳＤＳバッファー中で洗浄し、さらに５５℃の０．１ｘＳＳＣ／０．５％ＳＤＳバッファー中でもう一度洗浄した。Ｘ線フィルム上でオートラジオグラフィーにかけた。その結果、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＪＨＨ−４の３個の癌細胞株でアレルが消失していることが確認された。癌細胞では、ＲＥＩＣ遺伝子の発現が低下しているだけでなく、ＲＥＩＣ遺伝子自体にＬＯＨが起きている可能性が示唆される（図１２）。
（実施例１３）  細胞周期へのＲＥＩＣ遺伝子の関与
細胞周期におけるＲＥＩＣ遺伝子の発現量の変化を確認するために、以下の実験を行った。ＫＭＳ−６細胞を１０ｃｍシャーレに２×１０６細胞／シャーレとなるように播種した。播種する際の培地中の血清濃度を０．５％となるように調製し、７２時間培養して、細胞周期をＧ０期（休止期）に同調させた。次に血清濃度を１０％となるように血清を添加し、細胞を刺激することにより細胞周期を開始させた。添加後０、０．５、１、３、６、１２、２４、４８時間の全ＲＮＡと、通常の培養条件の全ＲＮＡを回収し、ノーザンハイブリダイゼーションでＲＥＩＣ遺伝子の発現量の変化を解析した。その結果、血清添加後１２時間でＲＥＩＣ遺伝子の発現が最も低下し、その後再びＲＥＩＣ遺伝子の発現が上昇することが確認された。コントロールとして、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量の変化を解析した結果、細胞周期には関係なく一定の発現量であることが確認された（図１３Ａ）。同時に、実施例７−２に従って３Ｈチミジンの取り込みを確認したところ、血清添加後２４時間で３Ｈチミジンの取り込みが増加し、その後再び３Ｈチミジンの取り込みが減少することが確認された。（図１３Ｂ）。
以上の結果から、ＲＥＩＣ遺伝子は、細胞周期のＧ０期に強く発現し、細胞増殖を停止する方向に働き、一方その発現が減少することにより、細胞周期をＧ１期に向かわせる方向に働くと考えられる。
（実施例１４）  細胞増殖抑制剤による、ＲＥＩＣ遺伝子の発現誘導
ＪＨＨ−１細胞を１０ｃｍシャーレに２×１０６細胞／シャーレとなるように播種した。上皮細胞増殖抑制剤である、ＴＧＦ−βを２．５ｎｇ／ｍｌとなるようにＪＨＨ−１細胞の培養液に添加した。ＴＧＦ−β添加前、添加後３、６、１２、２４、４８時間の全ＲＮＡと、通常の培養条件の全ＲＮＡを回収した。回収したＲＮＡをノーザンハイブリダイゼーションで解析したところ、ＴＧＦ−β添加後、２４時間後にＲＥＩＣ遺伝子の発現が上昇することが確認され（図１４）、細胞増殖抑制にＲＥＩＣ遺伝子の発現が関与することが示唆された。
以上の結果から、ＲＥＩＣ遺伝子の発現を誘導する化合物は、細胞増殖抑制効果が期待できるため、癌治療用候補低分子化合物のスクリーニングにＲＥＩＣ遺伝子の発現を用いることが有用であると考えられる。
（実施例１５）  コスミドベクターｐＡｘＣＡＲＥＩＣの作製
ＲＥＩＣの開始コドン前にＢａｍＨＩサイトをデザインしたプライマー（ＲＥＩＣＳ；５’−ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＣＧＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＧＧ−３’（配列番号４の塩基番号１９０−２０６に相当する配列の５’側にＢａｍＨＩサイトであるＧＧＡＴＣＣを繋げた配列））と、終止コドンの後にＥｃｏＲＩサイトをデザインしたプライマー（ＲＥＩＣＡ；５’−ＧＡＡＴＴＣＴＡＡＡＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧ−３’（配列番号４の塩基番号１２３０−１２４９に相当する配列のアンチセンス鎖の５’側にＥｃｏＲＩサイトであるＧＡＡＴＴＣ配列を繋げた配列））を設計した。次に、ｐＴｒａｃｅｒ／ＲＥＩＣを鋳型にして、ＲＥＩＣのコーディング領域をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ条件は、９４℃３０秒、６３℃３０秒、７２℃１分を３０サイクルで行った。約１．１ｋｂの増幅産物をゲルから回収し、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ消化した後、ｐＵＣ１１９にサブクローニングした。これを大腸菌ＤＨ５αに導入し、アンピシリン耐性クローンから抽出したプラスミドの塩基配列の解析を行い、インサートの配列に変異が入っていないことを確認した（ｐＵＣ１１９／ＲＥＩＣ、図１５）。ｐＵＣ１１９／ＲＥＩＣをＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ消化し、約１．１ｋｂのＲＥＩＣ断片を回収した。回収したＲＥＩＣ断片をＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラ社製）を用いて末端を平滑化し、ＣＡＧプロモーターが含まれるコスミド（ｐＡｘＣＡｗｔ、図１６）のＳｗａＩ部位にサブクローニングした。得られたコスミド（ｐＡｘＣＡＲＥＩＣ、図１７）をＣｌａＩ消化してインサートの有無を確認した。さらに、ＳｔｕＩ、ＳｐｅＩ消化してインサートの向きが５’−プロモーター、インサート、ポリＡシグナルであることを確認した。
（実施例１６）  ＲＥＩＣ発現組換えアデノウイルスベクターの作製
ＲＥＩＣ発現組換えアデノウイルスベクターは、ＣＯＳ−ＴＰＣ法（Ｍｉｙａｋｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９３，１３２０，１９９６）に従って作製した。
実施例１５で作製したｐＡｘＣＡＲＥＩＣ（８μｇ）とＥｃｏＴ２２Ｉ処理したＣＯＳ−ＴＰＣ（図１８）（５μｇ）とをリン酸カルシウム法にて２９３細胞にトランスフェクションした。３７℃、５％ＣＯ２条件下で１２時間培養した後、細胞を９６穴プレートに播種し、さらに１０〜１５日間培養を続けた。細胞が死滅したウェルから死滅細胞ごと培養液を回収し、凍結融解６回後、５，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ遠心した上清を１次ウイルス液として−８０℃にて保存した。１次ウイルス液を２９３細胞、ＨｅＬａ細胞に感染させ、３日後にＨｅＬａ細胞では変性が認められず、２９３細胞が完全に死滅したクローンの２９３細胞から死滅細胞ごと培養液を回収し、凍結融解を６回行った後の上清を２次ウイルス液として−８０℃にて保存した。２次ウイルス液を調製した際の細胞から実施例１２−１に記載の方法に従って、染色体ＤＮＡを調製した。このＤＮＡをＸｈｏＩ、ＣｌａＩ消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、アデノウイルスゲノムおよび、ＲＥＩＣ遺伝子の有無を確認した。
この操作で選択したクローンの２次ウイルス液から、２９３細胞に感染させ、細胞が死滅したら、死滅細胞ごと培養液を回収し、凍結融解６回後、３，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ遠心した上清を３次ウイルス液として−８０℃にて保存した。同様の操作でスケールアップを行い、最終的に４次ウイルス液を調製し、−８０℃にて保存した（Ａｄｅｎｏ−ＲＥＩＣ）。
（実施例１７）  野生型アデノウイルス混入の有無の確認
実施例１６で得られた４次ウイルス液をＨｅＬａ細胞に感染させ、３日後に実施例１２−１に記載の方法に従って、染色体ＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡを鋳型にして、Ｅ１Ａ遺伝子の開始コドンから第１エクソン３’端までを増幅するように設計したプライマーセット（５’−ＡＴＧＡＧＡＣＡＴＡＴＴＡＴＣＴＧＣＣＡＣＧＧＡＧＧＴＧＴＴＡＴＴＡＣ−３’、５’−ＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＧＴＣＧＴＣＡＣＴＧＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＣＡ−３’）を用いて、２５サイクルＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ後、アガロースゲル電気泳動を行い、Ｅ１Ａ遺伝子増幅断片（２１４ｂｐ）の有無を確認した。
（実施例１８）  Ａｄｅｎｏ−ＲＥＩＣの遺伝子導入効率の確認
ＴＣＩＤ５０（５０％  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｏｓｅ）法によりＡｄｅｎｏ−ＲＥＩＣの力価を測定した。実施例１６で調製したＡｄｅｎｏ−ＲＥＩＣを１０倍ずつ段階希釈し、１０４倍希釈ウイルス液を用意した。９６ウェルプレートの１列目に１０４倍希釈ウイルス液を移した後、１１列目まで３ｎ希釈を行い、最終的に１０４から３１１希釈ウイルス液を調製した。１２列目は非感染細胞のコントロールとした。３×１０４細胞／ウェルとなるように２９３細胞を播種後、１１〜１３日間、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養し、細胞変性の有無を判定した。Ｋａｒｂｅｒの式を用いて統計学的にＴＣＩＤ５０を計算した結果、前記Ａｄｅｎｏ−ＲＥＩＣの力価は６．６×１０９ｐｆｕ／ｍｌであることを確認した。
産業上の利用可能性
以上説明したように、本発明に係る遺伝子およびそれがコードする本発明に係るタンパク質はいずれも、癌細胞を含む不死化細胞で発現が低下、または消失しているので、これらの細胞の増殖が原因である疾病の診断に有効なマーカーとなり、癌診断薬等の診断薬として用いることができる。
また、本発明に係るタンパク質は、細胞増殖抑制活性を有するので、癌等の細胞の異常増殖が原因となる疾病の治療に有用である。
さらに、本発明に係る遺伝子は、細胞増殖抑制活性を有する前記タンパク質を細胞内で発現するので、遺伝子療法に応用して、癌等の細胞の異常増殖が原因となる疾病の治療に用いることができる。
加えて、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、細胞増殖を刺激するので、細胞の増殖を必要とする疾病の治療に用いることができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明に用いるＲＥＩＣ（Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌ）タンパク質と、ｈＤｋｋ３およびＲＩＧ７−１タンパク質とのホモロジー比較を表す配列アラインメントを示す図である。
図２は、各種ヒト細胞株におけるＲＥＩＣ遺伝子の発現を比較するためのノーザンブロットの結果を示すオートラジオグラフィー写真に相当する図である。
図３は、本発明で用いる発現プラスミドＲＥＩＣ／ｐＴｒａｃｅｒの構築を模式的に表す図である。
図４は、本発明に従う不死化ＫＭＳＴ−６細胞への３Ｈチミジンの取り込み試験の結果を示す図である。
図５は、本発明に従うＳａｏｓ２骨肉腫細胞への３Ｈチミジンの取り込み試験の結果を示す図である。
図６は、本発明で用いる発現プラスミドＲＥＩＣ／ｐＧＥＸ−２Ｔの構築を模式的に表す図である
図７は、免疫蛍光法によるＫＭＳ−６細胞の二重染色の結果を示す写真に相当する図である。
図８は、実施例１０で得られた５５３ｂｐの増幅産物を示す電気泳動写真に相当する図である。
図９は、ヒト１１番染色体マップである。マップ中、１１ｐ１５に報告されている各種癌組織におけるＬＯＨ頻度（％）と、それぞれのＬＯＨに対応するＳＴＳゲノムマーカー名を示してある。ＬＯＨ頻度の値とともに示される、癌組織は、それぞれＢ（乳癌）、Ｅ（食道癌）、Ｇ（胃癌）、Ｈ（肝細胞癌）、ＨＮ（頭頚部癌）、およびＰ（前立腺癌）である。
図１０は、本発明に係るＲＥＩＣ遺伝子と、図９に示すマーカーＤ１１Ｓ２３８８とのホモロジー比較を表す配列アラインメント図である。
図１１Ａは、一群の非小細胞肺癌患者の組織中におけるＲＥＩＣ遺伝子の発現を調べたノーザンブロットの結果を示すオートラジオグラフィー写真に相当する図である。「Ｎ」は、非癌組織を示し、「Ｔ」は、癌組織を示す。
図１１Ｂは、一群の肝細胞癌患者の組織中におけるＲＥＩＣ遺伝子の発現を調べたノーザンブロットの結果を示すオートラジオグラフィー写真に相当する図である。「Ｎ」は、非癌組織を示し、「Ｔ」は、癌組織を示す。
図１１Ｃは、複数の食道癌患者の組織中におけるＲＥＩＣ遺伝子の発現を調べたノーザンブロットの結果を示すオートラジオグラフィー写真に相当する図である。「Ｎ」は、非癌組織を示し、「Ｔ」は、癌組織を示す。
図１１Ｄは、複数の胃癌患者の組織中におけるＲＥＩＣ遺伝子の発現を調べたノーザンブロットの結果を示すオートラジオグラフィー写真に相当する図である。「Ｎ」は、非癌組織を示し、「Ｔ」は、癌組織を示す。
図１１Ｅは、複数の大腸癌患者の組織中におけるＲＥＩＣ遺伝子の発現を調べたノーザンブロットの結果を示すオートラジオグラフィー写真に相当する図である。「Ｎ」は、非癌組織を示し、「Ｔ」は、癌組織を示す。
図１２は、肝臓癌由来の各種細胞株において、ＲＥＩＣ遺伝子のＲＦＬＰ解析を行なったサザンブロットの結果を示すオートラジオグラフィー写真に相当する図である。
図１３Ａは、ＫＭＳ−６の細胞周期におけるＲＥＩＣ遺伝子の発現量の変化を調べたノーザンブロットの結果を示すオートラジオグラフィー写真に相当する図である。
図１３Ｂは、図１３Ａと同様にＫＭＳ−６の細胞周期におけるＫＭＳ−６細胞への３Ｈチミジンの取り込み試験の結果を示す図である。
図１４は、ＴＧＦ−βの存在および非存在下、ＲＥＩＣ遺伝子の発現量の変化を比較したノーザンブロットの結果を示すオートラジオグラフィー写真に相当する図である。
図１５は、本発明で用いる発現プラスミドｐＵＣ１１９／ＲＥＩＣの構築を模式的に表す図である。
図１６は、本発明で用いるコスミドｐＡｘＣＡｗｔの構築を模式的に表す図である。
図１７は、本発明で用いるコスミドベクターｐＡｘＣＡＲＥＩＣの作製を模式的に表す図である。
図１８は、本発明で用いるアデノウイルスベクターを作製するためのアデノウイルスの処理を模式的に示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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