(57)【要約】  培養細胞の細胞塊が形状崩壊を起こしにくく、均一に分散されたパラフィンブロックを作製するための、パラフィンブロック作製用マイクロチューブを提供する。  本発明は、底部にパラフィンが充填されている、パラフィンブロック作製用マイクロチューブを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
底部にパラフィンが充填されている、パラフィンブロック作製用マイクロチューブ。
【請求項２】
前記パラフィンの厚さが前記底部の底端部から１〜１０ｍｍである、請求項１に記載のパラフィンブロック作製用マイクロチューブ。
【請求項３】
前記底部が開口面を有し、前記パラフィンが前記開口面から露出している、請求項１または２に記載のパラフィンブロック作製用マイクロチューブ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のパラフィンブロック作製用マイクロチューブを用いた、パラフィンブロック作製方法であって、
前記パラフィンブロック作製用マイクロチューブに観察対象の細胞を充填する細胞充填工程と、
前記細胞充填工程で充填した細胞を固定液で固定する細胞固定化工程と、
前記細胞固定化工程で得られた固定した細胞を増粘多糖類で被覆して被覆化細胞を調製する被覆化工程と、
前記被覆化工程で得られた被覆化細胞にゲル化剤を反応させて、被覆化細胞の周囲にゲルの膜を形成させる膜形成工程を含む、パラフィンブロック作製方法。
【請求項５】
前記増粘多糖類が、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、カラギーナンからなる群から選択される少なくとも一つである、請求項４に記載のパラフィンブロック作製方法。
【請求項６】
前記ゲル化剤が、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも一つである、請求項４または５に記載のパラフィンブロック作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パラフィンブロック作製用マイクロチューブに関する。
【背景技術】
【０００２】
形態観察において、観察対象となる微生物、植物または動物などの組織や細胞等の構造を保持させながら標本スライドを作製する際に、パラフィンを用いて組織や細胞等を包埋してパラフィンブロックを作製する方法が広く用いられている。【０００３】
例えば、特許文献１は、識別可能な断面形状を有する柱状体を有するパラフィンブロックを開示している。該パラフィンブロックをスライスすると、薄片の中に該柱状体の色や断片形状の識別形状が形成され、その結果、標本を取り違えるといったトラブルを解消することを発明の効果としている。【０００４】
また、特許文献２は、顕微鏡標本作成用カセット本体の底面部に検体を包埋したパラフィンが付着しているパラフィンブロックが開示されている。該パラフィンに継ぎ目がないため、スライスする際に割れたり剥離したりするトラブルを解消することを発明の効果としている。【０００５】
一方、パラフィンブロックからミクロトームを用いてパラフィン切片を切り出し、該パラフィン切片をスライドガラスに付着させ、その後、脱パラフィン処理、抗原賦活化処理、ブロッキング処理、染色処理、封入処理等を行い、標本スライドを作製する方法が広く用いられており、標本スライドの作製方法についても様々な工夫がされている。【０００６】
例えば、特許文献３は、パラフィンブロックを用いた生体試料標本の作製方法を開示している。該作製方法では、パラフィンブロックに１以上の通孔をあけ、該通孔に組織を充填して包埋し、包埋された固形試料から薄切片を切り出してスライドガラスに付着させ、薄切片のパラフィンを除去して組織観察用薄切片を作製している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−１３６１２８号公報
【特許文献２】特開２０１５−１２９７３９号公報
【特許文献３】特開２０１８−０１３０５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
パラフィンを用いて培養細胞のパラフィンブロックを作製する場合、パラフィンに培養細胞を均一に分散させることが、高い再現性を得るうえで必要になる。しかし、培養細胞の細胞塊を公知の方法でパラフィンに浸漬させると細胞塊が形状崩壊を起こし、培養細胞が均一に分散しなくなるため、再現性の高い結果を得られなかった。そのため、パラフィンブロック作製時に、培養細胞が均一に分散したパラフィンブロックを作製することが求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記課題を鑑みて完成されたものであり、例えば、以下［１］〜［６］を含む。
［１］底部にパラフィンが充填されている、パラフィンブロック作製用マイクロチューブ。
［２］前記パラフィンの厚さが前記底部の底端部から１〜１０ｍｍである、［１］に記載のパラフィンブロック作製用マイクロチューブ。
［３］前記底部が開口面を有し、前記パラフィンが前記開口面から露出している、［１］または［２］に記載のパラフィンブロック作製用マイクロチューブ。
［４］［１］〜［３］のいずれかに記載のパラフィンブロック作製用マイクロチューブを用いた、パラフィンブロック作製方法であって、
前記パラフィンブロック作製用マイクロチューブに観察対象の細胞塊を充填する細胞充填工程と、
前記細胞充填工程で充填した細胞塊を固定液で固定する細胞固定化工程と、
前記細胞固定化工程で得られた固定した細胞塊を増粘多糖類で被覆して被覆化細胞を調製する被覆化工程と、
前記被覆化工程で得られた被覆化細胞にゲル化剤を反応させて、被覆化細胞の周囲にゲルの膜を形成させる膜形成工程を含む、パラフィンブロック作製方法。
［５］前記増粘多糖類が、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、カラギーナンからなる群から選択される少なくとも一つである、［４］に記載のパラフィンブロック作製方法。
［６］前記ゲル化剤が、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも一つである、［４］または［５］に記載のパラフィンブロック作製方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のパラフィンブロック作製用マイクロチューブによれば、培養細胞のパラフィンブロック作製時に、培養細胞の細胞塊の形状崩壊が起こりにくく、均一な分散性を維持しながら培養細胞をパラフィンブロック中に包埋することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明のパラフィンブロック作製用マイクロチューブの一実施形態を模式的に示した断面図である。
【図２】図２は、本発明のパラフィンブロック作製用マイクロチューブの他の実施形態を模式的に示した断面図である。
【図３】図３は、本発明のパラフィンブロック作製方法によって作製した、培養細胞ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２発現細胞）のパラフィンブロックから得られた薄切片をヘマトキシリン染色した標本スライドの顕微鏡写真である。
【図４】図４は、比較例としてパラフィンが充填されていない従来のマイクロチューブによって作製した、培養細胞ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２発現細胞）のパラフィンブロックから得られた薄切片をヘマトキシリン染色した比較スライドの顕微鏡写真である。
【図５】図５は、本発明のパラフィンブロック作製方法によって作製した、培養細胞ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２発現細胞）のパラフィンブロックの薄切片を、抗ＨＥＲ２抗体結合蛍光粒子を用いて免疫染色処理した標本スライドの、蛍光画像解析から求めた１細胞あたりの蛍光粒子数を示した棒グラフである。
【図６】図６は、パラフィンが充填されていない従来のマイクロチューブを用いて作製した培養細胞ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２発現細胞）のパラフィンブロックの薄切片を、抗ＨＥＲ２抗体結合蛍光粒子を用いて免疫染色処理した比較スライドの、蛍光画像解析から求めた１細胞あたりの蛍光粒子数を示した棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明を、以下に詳細に説明する。本発明のパラフィンブロック作製用マイクロチューブは、マイクロチューブの底部にパラフィンが充填されていることを特徴とする。本発明のパラフィンブロック作製用マイクロチューブは、底部にパラフィンが充填されていればよい。本発明のパラフィンブロック作製用マイクロチューブを構成するパラフィン以外の部材としては、通常のマイクロチューブと同様の部材を用いることができ、特に限定されず、例えば公知のマイクロチューブそのものを使用することができる。以下パラフィンブロック作製用マイクロチューブを構成する、パラフィン以外の部材を単にマイクロチューブ部材と記す。
【００１３】
＜マイクロチューブ部材＞
本発明のパラフィンブロック作製用マイクロチューブに使用するマイクロチューブ部材は、特に限定されず、公知のマイクロチューブ等を使用することができる。例えば、マイクロチューブ部材の内部形状が、開口部から底部上端まで円柱形状であり底部上端から底部下端が略円錐形状のものや（図１参照）、開口部から底部上端まで円柱形状であり底部上端から底部下端が略半球形状のもの、開口部から底部まで円柱形状のものが挙げられる。また、本発明のパラフィンブロック作製用マイクロチューブは、底部にパラフィンが充填されているため、マイクロチューブ部材自体は底部に開口面を有していてもよい。
【００１４】
マイクロチューブ部材の内部容量については、特に限定されないが、例えば０．１ｍＬ〜５ｍＬのものを使用することができる。操作性の観点から０．２ｍＬ〜２ｍＬのものが好ましく０．５ｍＬ〜１．５ｍＬのものがより好ましい。
【００１５】
マイクロチューブ部材の材質は、特に限定されず、公知のマイクロチューブに使用されている材質を使用することができる。材質としては、例えば、ポリプロピレン、ＰＦＡ（パーフルオロアルコキシアルカン）のようなフッ素樹脂、ガラスが挙げられる。
【００１６】
マイクロチューブ部材のシリコンコーティングの有無、適用可能温度、オートクレーブの可否、遮光処理の有無、蓋の有無、蓋の形状は、自立式または非自立式については、後述する本発明のパラフィンブロックの製造方法に使用できる限り特に限定されない。
【００１７】
＜パラフィン＞
本発明のパラフィンブロック作製用マイクロチューブに使用するパラフィンは、常温で固体の状態で、加熱により融解するパラフィンワックスであれば、特に制限されず、公知のもの使用することができる。例えば、精製パラフィン、組織透過性を高める目的でポリマーが添加されたパラフィン、半透明や着色されたパラフィンを使用することができる。パラフィンの融点は、特に制限されないが、操作性の観点から融点が４０℃〜７０℃であるものが好ましく、６０℃〜６５℃であるものがより好ましい。
【００１８】
＜パラフィンブロック作製用マイクロチューブおよびその作製方法＞
本発明のパラフィンブロック作製用マイクロチューブは、上記パラフィンが上記マイクロチューブ部材に充填されているものであり、好ましくは該マイクロチューブ部材の底部の低端部から開口部への鉛直方向に１ｍｍ〜１０ｍｍの厚さ、より好ましくは４ｍｍ〜６ｍｍの厚さで充填されているものである。
【００１９】
上記パラフィンブロック作製用マイクロチューブは、上記マイクロチューブ部材に固形のパラフィンを入れ、該パラフィンの融点以上に加熱してパラフィンを溶かしてマイクロチューブ部材の底部にパラフィンを集約させ、その後、融点以下に静置してパラフィンを固化させることで作製することができる。
【００２０】
また、本発明のパラフィンブロック作製用マイクロチューブは、マイクロチューブ部材の底部が開口面を有し、パラフィンブロックが該開口面から露出していてもよい（図２参照）。該開口面は円形または楕円形が好ましく、円形がより好ましい。開口面の直径（短径）は、特に限定されないが、２ｍｍ〜１０ｍｍが好ましく、操作性の観点から３ｍｍ〜９ｍｍがより好ましく、４ｍｍ〜８ｍｍがさらに好ましい。パラフィンは、開口面に接して露出するのが好ましい。
【００２１】
このように、予め底部からパラフィンが露出している状態にあることで、後述するパラフィンブロック作製時に、細胞をマイクロチューブから取り出す際の操作が容易になる。
【００２２】
上記開口面を有するパラフィンブロック作製用マイクロチューブは、以下のようにして作製することができる。上記のようにしてパラフィンを充填することにより作製したパラフィンブロック作製用マイクロチューブの底部を、例えば、ハサミやカッターナイフなどの刃物を用いて切断して開口面を有するパラフィンブロック作製用マイクロチューブを作製する。また、予め底部に開口面を有するマイクロチューブ部材を作製しておき、開口面を剥離可能な膜や金属板などで蓋をしておいた後、パラフィンを入れて溶解および固化させ、最後に蓋を除くことで開口面を有するパラフィンブロック作製用マイクロチューブを作製することができる。
【００２３】
パラフィンブロック作製用マイクロチューブが有するパラフィンの上面に観察対象の培養細胞の細胞塊を載せ、パラフィンと細胞塊を後述する増粘多糖類で被覆し更にゲル化剤で膜形成させた後に、パラフィンを底部から、マイクロチューブの開口部に向けて押し出すことで、パラフィン、細胞等が一体となった状態で取り出すことができるようになる。
【００２４】
＜パラフィンブロック作製方法＞
本発明のパラフィンブロック作製用マイクロチューブを用いて、以下のようにしてパラフィンブロックを作製することができる。
【００２５】
（１）細胞充填工程
パラフィンブロック作製用マイクロチューブに、ピペットなどを用いてパラフィンブロック作製用マイクロチューブ、通常はマイクロチューブ内のパラフィン上に観察対象の細胞塊を充填する。その後、任意のバッファーで洗浄したあと、遠心分離を行って上清を除く操作を行ってもよい。
【００２６】
（２）細胞固定化工程
上記細胞充填工程の後、充填した細胞塊を固定液で固定する。固定液は、特に制限されないが、例えば、ホルマリン、亜鉛ホルマリン、エタノール、エタノールとアセトンの混合液、ブアンが挙げられる。固定は常法に従って行うことができる。例えば、１０％中性緩衝ホルマリンや４％パラホルムアルデヒドを用いる場合は、固定を８時間以上行い、亜鉛ホルマリンを用いる場合は、４〜４８時間固定を行う。
【００２７】
（３）被覆化工程
上記細胞固定化工程後、固定した細胞塊を増粘多糖類で被覆して被覆化細胞を調製する。すなわち、細胞固定化工程で使用された固定液を除いたあと、固定した細胞塊とパラフィンを増粘多糖類で周囲を被覆する。増粘多糖類は、後述するゲル化剤と反応させて膜を形成するものであれば特に限定されない。増粘多糖類としては、例えば、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、カラギーナンが挙げられ、アルギン酸ナトリウムが好ましい。
【００２８】
被覆化に先立ち、パラフィンブロック作製用マイクロチューブの底部に開口面が無い場合は、上記のようにハサミやカッターナイフのような刃物で底部を切断して、パラフィンを開口面に露出させておくことが好ましい。パラフィンブロック作製用マイクロチューブの開口部から、パラフィン上面の固定した細胞塊に任意の濃度に希釈した増粘多糖類溶液を注ぎ入れる。その後、開口面の大きさより小さい棒状の部材、例えば、綿棒のようなもので開口面に露出したパラフィンを軽く上下させ、増粘多糖類溶液を細胞およびパラフィンの周囲に満遍なく行き渡らせて、細胞およびパラフィンを増粘多糖類で被覆することが好ましい。
【００２９】
（４）膜形成工程
上記被覆化工程後、被覆化細胞にゲル化剤を反応させて、被覆化細胞の周囲にゲルの膜を形成させる。すなわち、パラフィンブロック作製用マイクロチューブにゲル化剤を加え、被覆した増粘多糖類と反応させて細胞塊およびパラフィンの周囲にゲル状の膜を形成させる。ゲル化剤は、増粘多糖類と反応してゲルを形成するものであれば、特に限定されない。ゲル化剤としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムが挙げられる。上記被覆化工程と膜形成工程を交互に行い、重畳的なゲル膜で細胞とパラフィンの周囲に形成させることが好ましい。こうすることで、細胞塊が形状崩壊せずパラフィンと一体となったパラフィンブロックを、パラフィンブロック作製用マイクロチューブから取り出すことができる。
【００３０】
（５）任意工程
上記パラフィンブロックから、キシレンやリモネンのような置換溶剤を用いてパラフィン除去し、一度上記ゲル膜で固定された細胞塊だけにしたあと、再度パラフィンで該細胞塊を包埋しパラフィンブロックとすることが好ましい。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
［実施例１］
（１）パラフィンブロック作製用マイクロチューブの作製
０．５ｍｌのマイクロチューブ（製品番号：ＴＢＩ−０５０１、Ｂｉｏ  Ｒａｄ製）に、パラフィンペレット（ティシュー  テック  パラフィンワックス；サクラファインテックジャパン製）を０．０７ｇ充填した。ドライヤーを用いて該マイクロチューブに温風を当て、マイクロチューブ内のパラフィンペレットを溶解させて底部に集めた。その後、マイクロチューブ用スタンドに立てた状態で、１時間以上常温で静置し、パラフィンブロック作製用マイクロチューブを作製した。パラフィンは底端部より５ｍｍの厚さを有していた。【００３２】
（２）細胞の充填および固定
上記で作製したマイクロチューブの開口部から、ＳＫＢＲ３培養細胞懸濁液を１．０×１０7〜３．０×１０7個／ｍＬになるようにパラフィンの上部に充填した。ここに、ウシ胎児血清ＦＢＳ（製品番号：ＳＨ３０９１０．０３、Ｈｙｃｌｏｎｅ製）を３００μＬ加え、軽くピペッティング後、室温で１０分間静置した。１０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去した。ここに、１０％中性緩衝ホルマリン溶液（製品番号：２０２１１
組織工程用；武藤化学株式会社製）を４００μＬ添加し、冷蔵庫内で一晩静置し、パラフィンの上部に存在する培養細胞を固定した。【００３３】
（３）アルギン酸ナトリウムによる被覆
上記固定化したマイクロチューブを、１０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去した。チューブの底部の一部をはさみで切断し、パラフィンの切断面を露出させた。１％アルギン酸ナトリウム溶液を２００μＬチューブの開口部から２００μＬ静かに添加した後、上記切断により露出したパラフィンの切断面を綿棒で押し上げて、アルギン酸ナトリウム溶液をマイクロチューブ底部まで行き渡らせて、パラフィンおよびその上部に存在する培養細胞（以下、「パラフィン細胞塊」と称す）を、アルギン酸ナトリウムで被覆した。【００３４】
（４）塩化カルシウム溶液による膜形成
上記被覆処理後、マイクロチューブ開口部から１Ｍ塩化カルシウム溶液を２００μＬ添加したあと、上記切断により露出したパラフィンの切断面を綿棒で押し上げて、塩化カルシウム溶液をマイクロチューブ底部まで行き渡らせ、パラフィン細胞塊を被覆しているアルギン酸ナトリウムと反応させ、パラフィン細胞塊の周囲にアルギン酸カルシウムの膜が形成されたペレット（以下、「細胞ペレット」と称す）を作製した。該細胞ペレットを、細胞ペレットのパラフィン側が上部、細胞側が下になるように、マイクロチューブから１Ｍ塩化カルシウム溶液が入った容器に移し１０分間静置した。該細胞ペレットを該容器から一度取り出して、１％アルギン酸ナトリウム溶液に潜らせ、再度細胞ペレットのパラフィン側が上部、細胞側が下になるように、１Ｍ塩化カルシウム溶液が入った容器に移し１０分間静置し、再度アルギン酸カルシウムの膜を細胞ペレットに形成させた。【００３５】
（５）パラフィンブロック化
上記で得られた細胞ペレットをミリＱ水で洗浄したあと、包埋用カセット（アジア器材製システムカセットＩＩ−Ｍ（６分画））に、細胞ペレットのパラフィン側が上に、細胞側を下にして置き、ミリＱ水で湿らせたスポンジで細胞ペレットの周囲を覆い、包埋カセッテ用ＳＵＳフレームで蓋をして５分間静置した。【００３６】
続いて、包埋用カセットをプロセッサー（製品番号：ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ  ＶＩＰ５ジュニア、サクラ精機株式会社製）の専用カゴにセットして、下記表１の条件で処理した。パラフィン工程は６５℃で行った。【００３７】
【表１】
2020110404.tif 000003
【００３８】
上記処理後、包埋装置（製品番号：ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ  ＶＩＰ５ジュニア、サクラ精機株式会社製）の待機用パラフィン槽へ、細胞ペレットのパラフィン側が上部、細胞側が下になるように包埋用カセットを移し、包埋装置の操作方法に従ってパラフィンブロックを作製した。作製したパラフィンブロックは冷却プレート上で１時間以上置いてパラフィンを固化させた。【００３９】
［比較例］
本発明のパラフィンを充填したマイクロチューブの代わりに、パラフィンを充填していないマイクロチューブを使用したこと以外、上記実施例１と同様にして比較例のパラフィンブロックを作製した。その際、マイクロチューブ底部の細胞塊およびその周囲を覆っているゲル膜の部分がハサミで切断されることになったため、細胞塊およびゲルの形状が崩れてしまった。【００４０】
［作製例］
上記実施例および比較例で作製したパラフィンブロックから、以下のようにして蛍光粒子で染色した標本スライドを作製した。
（１）蛍光粒子の作製
蛍光色素としてＳｕｌｆｏ  Ｒｈｏｄａｍｉｎ１０１（シグマアルドリッチ社製）１４．４ｍｇを２２ｍＬの水に溶解させた。ここに、乳化重合用乳化剤であるエマルゲン（登録商標）４３０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王株式会社製）の５％水溶液を２ｍＬ添加した。これを撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業株式会社製）を０．６５ｇ加えた。【００４１】
この溶液に、ドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学株式会社製）の１０％水溶液を１０００μＬ添加し、７０℃で５０分間撹拌した。その後、９０℃まで昇温させ２０分間撹拌し、蛍光粒子の分散液を得た。【００４２】
（２）蛍光粒子へ抗体の導入
下記の方法により、上記蛍光粒子に抗ＨＥＲ２抗体を結合させた。
まず、上記分散液から遠心分離によって回収した蛍光粒子１ｍｇを５ｍＬの純水に分散させ、これに１００μＬのアミノプロピルトリエトキシシラン水分散液（製品番号：ＬＳ−３１５０、信越化学工業株式会社製）を添加して、室温で１２時間撹拌した。【００４３】
１００００ｇで６０分間遠心分離して上澄みを除去した後、エタノールを加えて沈殿物を分散させ再度遠心分離を行った。エタノールおよび純水を用いた同様の手順をそれぞれ１回行った。得られた粒子のＦＴ−ＩＲ測定により、蛍光粒子にアミノ基が導入されたのを確認した。【００４４】
アミノ基が導入された蛍光粒子を、２ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含有したＰＢＳを用いて３ｎＭに調製した。ここに、最終濃度が１０ｍＭになるようにＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を加えて撹拌し、蛍光粒子とＳＭ（ＰＥＧ）１２を反応させ、蛍光粒子にマレイミド基を導入した。【００４５】
上記反応液を１００００×ｇで６０分間遠心分離して上澄み液を除去した。２ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含有したＰＢＳを加え、沈殿物を分散させ、再度遠心分離して上澄みを除去した。同様の手順を３回行った。その後、５００μＬのＰＢＳを用いて沈殿物を再分散させ、マレイミド基が導入された蛍光粒子の分散液を得た。【００４６】
１００μｇの抗ＨＥＲ２抗体を１００μＬのＰＢＳに溶解させた。該溶解液に、１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加して、３０分間反応させて還元化抗ＨＥＲ２抗体溶液を得た。【００４７】
上記マレイミド基が導入された蛍光粒子分散液と還元化抗ＨＥＲ２抗体溶液とを、ＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。４μＬの１０ｍＭメルカプトエタノールを加えて反応を中止させた。反応液を１００００×ｇで６０分間遠心分離し上澄みを除去した。２ｍＭのＥＤＴＡを含有したＰＢＳを加えて沈殿物を再分散させ、再度遠心分離を行った。この操作を３回行った後、５００μＬのＰＢＳを加えて抗ＨＥＲ２抗体が結合した蛍光粒子の分散液を得た。【００４８】
（３）抗ＨＥＲ２抗体結合蛍光粒子を用いた免疫染色
実施例および比較例で作製したパラフィンブロックから、ミクロトームを用いて４μＭの薄切片を切り出してスライドに付着させ、実施例のパラフィンブロック由来の標本スライド、および比較例のパラフィンブロック由来の比較スライドを作製した。以下の方法によって、両スライドを上記で作製した抗ＨＥＲ２抗体が結合した蛍光粒子で免疫染色を行った。【００４９】
該スライドをキシレンの入った容器に入れ、途中３回キシレンを交換しながら計３０分間スライドをキシレンに浸漬させ、スライド上のパラフィンを除去した。次いで、該スライドを、エタノールの入った容器に入れ、途中３回エタノールを交換しながら計３０分間スライドをエタノールに浸漬させ、キシレンをエタノールに置換した。続いて、該スライドを、純水の入った容器に入れ、途中３回純水を交換しながら計３０分間スライドを純水に浸漬させ、エタノールを水に置換した。【００５０】
続いて、該スライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に３０分間浸漬させたあと、１２１℃で１０分間熱処理をして抗原の賦活化処理を行った。その後、ＰＢＳの入った容器に該スライドを３０分浸漬させた後、スライド上の薄切片に１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを載せて、１時間放置してブロッキング処理を行った。【００５１】
次いで、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで抗ＨＥＲ２抗体結合蛍光粒子を０．０２ｎＭに調製した染色溶液を、スライド上の薄切片に載せて３時間反応させた。反応後、ＰＢＳの入った容器に該スライドを入れ３０分間浸漬させた。該スライドを４％パラホルムアルデヒド溶液で１０分間固定処理を行った後、ヘマトキシリン染色を行った。封入剤のＡｑｕａｔｅｘ（Ｍｅｒｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を滴下しカバーガラスを載せて薄切片を封入し、免疫染色後の標本スライドおよび比較スライドを作製した。なお、上記標本スライドは、免疫染色日を６回に分け各回３枚ずつ作製した。同様に、上記比較スライドは免疫染色日を６回に分けて各回４〜５枚ずつ作製した。【００５２】
［評価］
上記作製例で作製した標本スライドおよび比較スライドの明視野画像および蛍光画像を、Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｍ２（カールツァイス社製）を用いて取得した。標本スライド上の切片の代表的な明視野画像および比較スライド上の切片の代表的な明視野画像をそれぞれ図３および図４に示す。【００５３】
蛍光画像の取得には、５８０ｎｍの波長の励起光を照射し切片から発せられる６１０ｎｍの波長の蛍光を結像して取得した。蛍光画像から、ジ−オングストローム社製の輝点計測ソフト「Ｇ−ｃｏｕｎｔ」を用いて蛍光粒子数を計測した。その後、明視野画像と重ね合わせて細胞領域内の輝点数を算出して、標本スライドおよび比較スライドの各切片の細胞当たりの蛍光粒子数およびＣＶ値（変動係数）を算出した。結果をそれぞれ図５および図６に示す。これより、本発明のパラフィンブロック作製方法により得られた薄切片の方が、比較例に比べてＣＶ値が低く、分散性が改善されていることが示された。
【図１】
2020110404.tif 000004
【図２】
2020110404.tif 000005
【図３】
2020110404.tif 000006
【図４】
2020110404.tif 000007
【図５】
2020110404.tif 000008
【図６】
2020110404.tif 000009
【国際調査報告】
2020110404.tif 000010
2020110404.tif 000011
2020110404.tif 000012
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