(57)【要約】  同じ向きに配置された２つのリコンビナーゼ認識部位に挟まれた被切除領域を含み、これらリコンビナーゼ認識部位を特異的に認識する部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子が、前記被切除領域の外側に配置されており、前記被切除領域は、５’領域と３’領域とに分割されているマーカー遺伝子と、前記３’領域及び５’領域間に配置されている、ゲノム編集系をコードする遺伝子とを含む、植物細胞においてゲノム編集系を発現させるためのＤＮＡ構築物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞においてゲノム編集系を発現させるためのＤＮＡ構築物であって、
５’側に位置する第１のリコンビナーゼ認識部位と３’側に位置する第２のリコンビナーゼ認識部位とに挟まれた被切除領域を含み、
第１のリコンビナーゼ認識部位と第２のリコンビナーゼ認識部位は同じ向きであり、
第１及び第２のリコンビナーゼ認識部位を特異的に認識する部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子が、前記被切除領域の少なくとも１方の外側に配置されており、
前記被切除領域は、前記ゲノム編集系をコードする遺伝子と、５’領域と３’領域とに分割されているマーカー遺伝子とを含み、前記マーカー遺伝子の３’領域は第１のリコンビナーゼ認識部位の３’末端に隣接し、前記マーカー遺伝子の５’領域は第２のリコンビナーゼ認識部位の５’末端に隣接し、ゲノム編集系をコードする遺伝子は、前記マーカー遺伝子の３’領域と５’領域との間に配置されており、かつ
植物細胞に導入された場合に、前記部位特異的リコンビナーゼが発現し、前記被切除領域が切り出されて環状化することによって、前記５’領域と３’領域とがリコンビナーゼ認識部位を介して結合し、これにより前記マーカー遺伝子の発現が可能となる、ＤＮＡ構築物。
【請求項２】
アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡ配列由来の右境界配列（ＲＢ）及び左境界配列（ＬＢ）を更に含み、前記ＲＢとＬＢとに挟まれた伝達領域に、前記被切除領域及び前記部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子が配置されている、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３】
前記マーカー遺伝子が、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子又は薬剤耐性遺伝子である、請求項１又は２に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４】
前記マーカー遺伝子が、イントロンにて５’領域と３’領域とに分割されている、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項５】
前記被切除領域において、前記マーカー遺伝子の３’領域と５’領域との間に、更に外来遺伝子を含む、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項６】
前記外来遺伝子が植物ホルモン生合成遺伝子である、請求項５に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項７】
ゲノム編集された植物細胞の生産方法であって、下記（１）〜（２）の工程を含む方法
（１）請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を、植物細胞に導入する工程、
（２）前記工程にて得られた細胞から、前記マーカー遺伝子の発現を指標として、前記ＤＮＡ構築物が導入され、前記被切除領域の環状化が生じている細胞を選抜する工程。
【請求項８】
ゲノム編集された植物の生産方法であって、下記（１）〜（３）の工程を含む方法
（１）請求項６に記載のＤＮＡ構築物を、植物細胞に導入する工程、
（２）前記工程にて得られた細胞から、前記マーカー遺伝子の発現を指標として、前記ＤＮＡ構築物が導入され、前記被切除領域の環状化が生じている細胞を選抜する工程、
（３）前記工程にて得られた細胞を培養して植物組織を生成させ、前記ＤＮＡ構築物上の植物ホルモン生合成遺伝子の発現に起因する植物組織における形態変化を指標として、当該形態変化が生じた植物組織を選抜する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物細胞においてゲノム編集系を発現させるためのＤＮＡ構築物、及び当該ＤＮＡ構築物を用いた、ゲノム編集された植物細胞の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
農作物の遺伝子改変のツールとして、ゲノム編集技術への関心が世界的に高まっている。ゲノム編集技術は、ゲノム上の特定の塩基配列に特異的に結合する領域とＤＮＡを切断等する酵素領域とで構成されるゲノム編集系（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮシステム、ＺＦＮシステム、ＰＰＲシステム等）を用い、狙った遺伝子（標的遺伝子）をピンポイントで書き換える（編集する）技術である。標的遺伝子の改変が簡便かつ高確率で行えるため、農作物育種，有用物資生産、品種改良、目的遺伝子の機能解析等、植物に関する様々な分野において、ゲノム編集技術の利用が進みつつある（非特許文献１）。【０００３】
しかしながら、ゲノム編集技術においても、得られたゲノム編集植物のゲノムにおいて、ゲノム編集系や選抜マーカー等をコードする外来遺伝子が残存してしまうという問題がある。そのため、植物ゲノムに必要な変異のみを導入したい場合は、これら遺伝子のゲノムへの挿入を抑制するか、挿入後にゲノムから除去する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｏｓａｋａｂｅ  Ｙ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１５年３月、５６巻、３号、３８９〜４００ページ
【非特許文献２】Ｎａｎｔｏ，Ｋ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．２００５年、３巻、２０３〜２１４ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、ゲノム編集系等をコードする外来遺伝子が植物ゲノムに組み込まれることなく、標的遺伝子に改変を施すことができる植物のゲノム編集方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記目的を達成すべく、従前開発したＭＡＴ（Ｍｕｌｔｉ−Ａｕｔｏ−Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ベクターに着目した。ＭＡＴベクターは、部位特異的組換えシステムであるＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムの利用により、選別に用いたマーカー遺伝子（選抜用遺伝子）を、ゲノム編集植物のゲノム中に残存させないという利点を有する。具体的には、図１に示すとおり、ＭＡＴベクターにおいては、ゲノムに組み込まれた選抜用遺伝子が２つのリコンビナーゼ認識部位（ｌｏｘＰ配列）で挟まれており、部位特異的リコンビナーゼ（Ｃｒｅリコンビナーゼ）の作用により、当該選抜用遺伝子が環状に切り出されることが明らかになっている（非特許文献２）。【０００７】
そこで、選抜用遺伝子の代わりに、ゲノム編集に用いる人工制限酵素遺伝子等（ゲノム編集系をコードする遺伝子）を、リコンビナーゼ認識部位間に組み込み、部位特異的リコンビナーゼを一過的に発現させることによって、前記遺伝子等を含む領域が切除され、ゲノムへの組み込み前に環状ＤＮＡが生成しうる系を構想した。さらに、分割したマーカー遺伝子を前記被切除領域の両端部に配置することによって、該領域が環状化した場合、該マーカー遺伝子が再構成され、発現可能となることにより、前記環状ＤＮＡの挙動をモニタリングすることも構想した。【０００８】
そして実際に、図３に示すＤＮＡ構築物を作製し、植物に導入した結果、ゲノム編集系（ＳｇＲＮＡ及びＣａｓ９）をコードする遺伝子を含む環状ＤＮＡが生成されることにより、当該遺伝子が植物ゲノム中に組み込まれることなく、ゲノム編集系が一過的に発現することによって、標的遺伝子の配列を改変できることを明らかにした。さらに、本発明者は、前記環状ＤＮＡが、植物細胞内において安定して一定期間（約３５日間）保持されうることも見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は以下を提供するものである。
［１］  植物細胞においてゲノム編集系を発現させるためのＤＮＡ構築物であって、
５’側に位置する第１のリコンビナーゼ認識部位と３’側に位置する第２のリコンビナーゼ認識部位とに挟まれた被切除領域を含み、
第１のリコンビナーゼ認識部位と第２のリコンビナーゼ認識部位は同じ向きであり、
第１及び第２のリコンビナーゼ認識部位を特異的に認識する部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子が、前記被切除領域の少なくとも１方の外側に配置されており、
前記被切除領域は、前記ゲノム編集系をコードする遺伝子と、５’領域と３’領域とに分割されているマーカー遺伝子とを含み、前記マーカー遺伝子の３’領域は第１のリコンビナーゼ認識部位の３’末端に隣接し、前記マーカー遺伝子の５’領域は第２のリコンビナーゼ認識部位の５’末端に隣接し、ゲノム編集系をコードする遺伝子は、前記マーカー遺伝子の３’領域と５’領域との間に配置されており、かつ
植物細胞に導入された場合に、前記部位特異的リコンビナーゼが発現し、前記被切除領域が切り出されて環状化することによって、前記５’領域と３’領域とがリコンビナーゼ認識部位を介して結合し、これにより前記マーカー遺伝子の発現が可能となる、ＤＮＡ構築物。
［２］  アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡ配列由来の右境界配列（ＲＢ）及び左境界配列（ＬＢ）を更に含み、前記ＲＢとＬＢとに挟まれた伝達領域に、前記被切除領域及び前記部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子が配置されている、［１］に記載のＤＮＡ構築物。
［３］  前記マーカー遺伝子が、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子又は薬剤耐性遺伝子である、［１］又は［２］に記載のＤＮＡ構築物。
［４］  前記マーカー遺伝子が、イントロンにて５’領域と３’領域とに分割されている、［１］〜［３］のうちのいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［５］  前記被切除領域において、前記マーカー遺伝子の３’領域と５’領域との間に、更に外来遺伝子を含む、［１］〜［４］のうちのいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［６］  前記外来遺伝子が植物ホルモン生合成遺伝子である、［５］に記載のＤＮＡ構築物。
［７］  ゲノム編集された植物細胞の生産方法であって、下記（１）〜（２）の工程を含む方法
（１）［１］〜［６］のうちのいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を、植物細胞に導入する工程、
（２）前記工程にて得られた細胞から、前記マーカー遺伝子の発現を指標として、前記ＤＮＡ構築物が導入され、前記被切除領域の環状化が生じている細胞を選抜する工程。
［８］  ゲノム編集された植物の生産方法であって、下記（１）〜（３）の工程を含む方法
（１）［６］に記載のＤＮＡ構築物を、植物細胞に導入する工程、
（２）前記工程にて得られた細胞から、前記マーカー遺伝子の発現を指標として、前記ＤＮＡ構築物が導入され、前記被切除領域の環状化が生じている細胞を選抜する工程、
（３）前記工程にて得られた細胞を培養して植物組織を生成させ、前記ＤＮＡ構築物上の植物ホルモン生合成遺伝子の発現に起因する植物組織における形態変化を指標として、当該形態変化が生じた植物組織を選抜する工程。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、植物細胞において、ゲノム編集系等をコードする外来遺伝子がゲノムに組み込まれることなく、標的遺伝子の配列を改変することが可能となる。また、本発明によれば、ゲノム編集系を環状ＤＮＡから安定して発現させることができる。したがって、安全性の高いゲノム編集植物を高効率で生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明のＤＮＡ構築物の基となる、ＭＡＴ（Ｍｕｌｔｉ−Ａｕｔｏ−Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ベクターシステムの概要を示す図である。ＭＡＴベクターにおいて、ｌｏｘＰ配列が順方向に位置しており、その間に選抜用遺伝子と部位特異的酵素  Ｃｒｅリコンビナーゼが位置している。そのため、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムによって当該選抜用遺伝子が環状に切り出され、マーカーフリーの植物体を得ることができる。
【図２】本発明のＤＮＡ構築物を用いたゲノム編集の一例を示す図である。本発明のＤＮＡ構築物において、Ｔ−ＤＮＡ内に部位特異的酵素Ｃｒｅ遺伝子を配置し、またその認識部位ｌｏｘＰ２つを順方向に配置させることによって、該ＤＮＡ構築物が植物細胞に導入された際に、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムによる環状ＤＮＡの切り出しが生じることになる。さらに、環状に切り出される領域に人工制限酵素であるＣａｓ９と標的配列のＳｇＲＮＡ（図中、ハサミにて表す）をあらかじめ組み込むことで、ゲノムに組み込まれない環状ＤＮＡ（図中「環状化ＤＮＡ」）によるゲノム編集が可能となる。そして最終的には、細胞分裂の際、環状ＤＮＡが消失し、外来遺伝子がゲノムに組み込まれていない変異個体を得ることができる。
【図３】本発明のＤＮＡ構築物（図中Ａ）、及びそれから切り出され環状ＤＮＡ（図中Ｂ）の一態様を示す、概略図である。アグロバクテリウム法により導入されたＴ−ＤＮＡ領域（図中、「ＯＤ／ＲＢ」（オーバードライブ配列及び右境界配列）と、ＬＢ／ＬＢ（左境界配列２つ）にて挟まれた領域）から、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムにより環状ＤＮＡの切り出しが生じる。環状ＤＮＡの中には、ゲノム編集系をコードする遺伝子（図中「Ｃａｓ９」及び「ＳｇＲＮＡ」）、並びに植物ホルモン生合成遺伝子（図中「ｉａａＭ」、「ｉａａＨ」及び「ｉｐｔ」）が配置されている。環状ＤＮＡ中の遺伝子が、植物細胞内で一過的に発現することによって、非組込み型変異導入を行うことができる。また、本発明のＤＮＡ構築物ではｇｆｐ遺伝子が分割されて組込まれている（図中の「Ｐ３５Ｓ」、「Ｇ」及び「ｉｎ」と、「ｔｒｏｎ」、「ＦＰ」及び「Ｔ」）が、環状化した際には、ｇｆｐ遺伝子間のイントロン（図中の「ｉｎ」と「ｔｒｏｎ」）が再結合することにより、さらに植物細胞内でスプライシングが生じることによって、当該イントロンが抜け、コードするＧＦＰタンパク質が発現する仕組みとなっている。なお、図中の「ＳｇＲＮＡ」は、ゲノム編集における標的配列のガイドＲＮＡをコードする遺伝子を示す。「Ｐ３５Ｓ」は、３５Ｓカリフラワーモザイクウィルスプロモーターを示す。「Ｔ」は、熱ショックタンパク質ターミネーターを示す。「ｉｎｔＣｒｅ」は、５’にイントロンを付加したＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を示す。「ｌｏｘ」はＣｒｅリコンビナーゼが認識するｌｏｘＰ配列を示す。「Ｒｉ−Ｏｒｉ」及び「ＮＰＴＩＩＩ」は、カナマイシン耐性遺伝子を示す。「Ｇ」及び「ＦＰ」も併記された矢印は、ｇｆｐ遺伝子検出用プライマーセットを示す。なお、本図における表記は、以下の図面でも同様である。
【図４】本発明のＤＮＡ構築物の作動を検証するために、作製したベクターの概略図である。
【図５】本発明のＤＮＡ構築物を作製するためのベクター骨格を示す概略図である。当該骨格に位置するＭＣＳ内の各制限酵素サイトに、ＰＣＲにより増幅した遺伝子カセットをインフュージョン反応により挿入し、本発明のＤＮＡ構築物を作製した。
【図６】図５に示した骨格に挿入した遺伝子カセット、及びそれらを増幅するために用いたプライマー（図中の各矢印）を示す概略図である。
【図７】ベンサミアナタバコへのアグロインフィルトレーションに用いた、本発明のＤＮＡ構築物を示す概略図である。当該アグロインフィルトレーションには、イントロン内のｌｏｘＰ配列（図中「ｌｏｘ」の位置が異なる２種類のｌｏｘ  ｉｎｔ  ＧＦＰベクターと、イントロンなしのＧＦＰベクターをコントロールとして用いた。Ｔ−ＤＮＡ領域には３５Ｓカリフラワーモザイクウィルスプロモーター（図中、「３５ＳＰ」）、ヒートショックプロテインターミネーター（図中、「Ｔ」）、ｇｆｐ（図中、「Ｇ」及び「ＦＰ」、又は「ＧＦＰ」）が位置している。
【図８】ｌｏｘ  ｉｎｔｒｏｎ  ＧＦＰベクターを導入したベンサミアナタバコ葉片を、蛍光顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。より具体的には、ベンサミアナタバコへのアグロインフィルトレーションから６日目の葉片各２箇所にてＧＦＰの蛍光観察した結果を示す。上段において、ｌｏｘ  ｉｎｔ  ＧＦＰ０１ベクター由来のＧＦＰ蛍光を示し、中段において、ｌｏｘ  ｉｎｔ  ＧＦＰ０２ベクター由来のＧＦＰ蛍光を示す、下段において、ポジティブコントロールとして用いたＧＦＰベクター由来のＧＦＰ蛍光を示す。
【図９】ｌｏｘ  ｉｎｔｒｏｎ  ＧＦＰベクターを導入したベンサミアナタバコ葉片における蛍光強度を検出した結果を示すグラフである。より具体的には、図８に示した６日目の葉片についてアグロインフィルトレーションの菌液接種点を中心に直径１．５ｃｍ円内を画像解析により、ＧＦＰ蛍光強度の定量化した結果を示す。
【図１０】本発明のＤＮＡ構築物の作動を検証するために作製したベクターの概略図である。
【図１１】図１０に示したベクターをアグロインフィルトレーションにより導入したベンサミアナタバコ葉片を、蛍光顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。より具体的には、ベンサミアナタバコへのアグロインフィルトレーションから７日目の葉片のＧＦＰ蛍光を観察した結果を示す。上段において、図中Ａは、コントロールとして用いたＧＦＰベクター由来のＧＦＰ蛍光を示し、図中Ｂは、Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰ  ０１ベクター由来のＧＦＰ蛍光を示し、図中Ｃは、Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰ  ０２ベクター由来のＧＦＰ蛍光を示す。
【図１２】図１０に示したベクターをアグロインフィルトレーションにより導入したベンサミアナタバコ葉片における蛍光強度を検出した結果を示すグラフである。より具体的には、図８に示した６日目の葉片についてアグロインフィルトレーションの菌液接種点を中心に直径１．５ｃｍ円内を画像解析により、ＧＦＰ蛍光強度の定量化した結果を示す。
【図１３】本発明のＤＮＡ構築物の作動を検証するために、作製した改良型ベクターの概略図である。図中「Ｉｐｔ」はサイトカイニン合成遺伝子を示し、「ｉａａＨ」はオーキシン前躯体合成遺伝子を示す。
【図１４】図１３に示したベクターをアグロインフィルトレーションにより導入したベンサミアナタバコ葉片を、蛍光顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。より具体的には、ベンサミアナタバコへのアグロインフィルトレーションから７日目の葉片のＧＦＰ蛍光を観察した結果を示す。上段において、図中「ＧＦＰ−ｎｐｔ（ｃｏｎｔｒｏｌ）」は、コントロールとして用いたＧＦＰベクター由来のＧＦＰ蛍光を示し、図中「Ｓ０１  ｉＧＦＰ（１）  ｉｎｔＣｒｅ  ｉｐｔ  ｉａａＨ」及び「Ｓ０１  ｉＧＦＰ（２）  ｉｎｔＣｒｅ  ｉｐｔ  ｉａａＨ」は各々、改良型ベクター由来のＧＦＰ蛍光を示す。
【図１５】図１３に示したベクターをアグロインフィルトレーションにより導入したベンサミアナタバコ葉片における蛍光強度を、検出した結果を示す、グラフである。より具体的には、図８に示した６日目の葉片についてアグロインフィルトレーションの菌液接種点を中心に直径１．５ｃｍ円内を画像解析により、ＧＦＰ蛍光強度の定量化した結果を示す。
【図１６】図１３に示したベクターをアグロインフィルトレーションにより導入したベンサミアナタバコ葉片を、蛍光顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。図中Ａ及びＢは、ｉｐｔ、ｉａａＨ組込み改良型ベクター（Ｓ０１  ｉＧＦＰ（１）  ｉｎｔＣｒｅ  ｉｐｔ  ｉａａＨ）に由来する、感染後７日目及び３５日のＧＦＰ蛍光を各々示す。図中Ｃ及びＤは、ｉｐｔ、ｉａａＨ組込み改良型ベクター（Ｓ０１  ｉＧＦＰ（２）  ｉｎｔＣｒｅ  ｉｐｔ  ｉａａＨ）に由来する、感染後７日目及び３５日のＧＦＰ蛍光を各々示す。
【図１７】図１３に示したベクターをアグロインフィルトレーションにより導入したベンサミアナタバコ葉片を、ゲノムＰＣＲにて解析した結果を示す泳動写真である。上段は、ｉｐｔ、ｉａａＨ組込み改良型ベクター感染後７日目に解析した結果を示し、下段は、ｉｐｔ、ｉａａＨ組込み改良型ベクター感染後３５日目に解析した結果を示す。
【図１８】実施例にてゲノム編集の標的とした遺伝子  ＮｔＰＤＳ遺伝子の構成を示す概略図である。ゲノム編集の標的配列として、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈｅｌｉａｎａとＳＲ１タバコの共通配列であるＰＤＳの第三エキソン配列（ＰＤＳ３）を選択した。具体的に、ＰＤＳの第三エキソンの部分にあたる。ＰＤＳ３のＳｇＲＮＡターゲット配列は、ＧＡＧＧＣＡＡＧＡＧＡＴＧＴＣＣＴＡＧＧＴＧＧ（配列番号：２１）である。なお、当該配列中３’末のＴＧＧは、ＰＡＭ配列である。また、ｐＵＣ１１８への平滑末端クローニングに用いるインサートは、プライマーセット（１）及び（２）を用いて増幅した。コロニーＰＣＲを行う際にはプライマーセット（３）及び（４）を用いた。
【図１９】ＳＲ１  ＷＴのＰＤＳ３遺伝子をコロニーＰＣＲにて解析した結果を示す、泳動写真である。実施例に記載のｐＵＣ１１８への平滑末端クローニングで得られたコロニーに対し、Ｅｍｅｒａｌｄ  Ａｍｐを用いてコロニーＰＣＲを行った結果を示す。図中「Ｍ」は、５００ｂｐ  ＤＮＡラダーを泳動したマーカーレーンを示す。
【図２０】ゲノム編集系（Ｃａｓ９タンパク質及びＳｇＲＮＡ）の作動検証に用いた、本発明のＤＮＡ構築物の構成を示す概略図である。図中、「ａ−ｉｐｔ」は、アグロバクテリウムｐＯ２２系統由来のプロモーターを有するｉｐｔ遺伝子を示す。
【図２１】図２０に示したＤＮＡ構築物を、アグロバクテリウム法によりタバコ（ＳＲ１）の葉片に導入して培養した結果を示す写真である。感染後、２日間アグロバクテリウムを殺す選抜培地に置いた後、１週間ごとにホルモンフリー培地で継代培養を行った。図中Ａは、アグロバクテリウム感染後９日目のＳＲ１の葉片を観察した結果を示し、Ｂは感染後１６日目のＳＲ１の葉片を観察した結果を示し、Ｃは感染後４０日目のＳＲ１を観察した結果を示し、葉片からのカルスの形成が見られる。Ｄは葉片から分離されたカルスを示す。
【図２２】図２０に示したＤＮＡ構築物を、アグロバクテリウム法によりタバコ（ＳＲ１）の葉片に導入して培養して得られたカルスについて、ＣＡＰＳ解析した結果を示す泳動写真である。カルスから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、図１８に示すプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行い、得られた増幅産物を制限酵素ＢｌｎＩにて３７℃で４時間処理した。左側の電気泳動写真は、感染後３９日目のカルスをＣＡＰＳ解析した結果を示す。当該解析においては、図１８に示すプライマー（１）及び（２）を用いた。図中の「ＷＴ」は、ＳＲ１のＰＤＳ３を増幅した断片であり、未切断の目安となる。右側の電気泳動写真は、感染後４５日目のカルスをＣＡＰＳ解析した結果を示す。当該解析においては、図１８に示すプライマー（３）及び（４）を用いた。図中の「Ｍ」は、１００ｂｐＤＮＡラダーを泳動した結果を示すマーカーレーンである。黒矢印は、Ｂｌｎ１での未切断断片の位置を示す。なお、図中の丸１及び丸３は、ＣＡＰＳ解析により変異導入が検出されたサンプルである。図中の丸２は、ＣＡＰＳ解析で変異を検出できなかったサンプルである。
【図２３】図２０に示したＤＮＡ構築物を、アグロバクテリウム法によりタバコ（ＳＲ１）の葉片に導入して培養して得られたカルス（感染後３９日目）について、ＣＡＰＳ解析した結果を示す泳動写真である。当該カルスについて、平滑末端クローニングを行い、得られたコロニーに対してコロニーＰＣＲを行い、ＰＤＳ３を増幅した。その後、ＢｌｎＩで４時間３７℃処理したサンプルを、電気泳動した結果を示す。図中「Ｍ」は、１００ｂｐマーカーを泳動レーンであり、黒矢印は、未切断断片の位置を示す。
【図２４】図２０に示したＤＮＡ構築物を、アグロバクテリウム法によりタバコ（ＳＲ１）の葉片に導入して培養して得られたカルス（感染後４５日目）について、ＣＡＰＳ解析した結果を示す泳動写真である。当該カルスについて、平滑末端クローニングを行い、得られたコロニーに対してコロニーＰＣＲを行い、ＰＤＳ３を増幅した。その後、ＢｌｎＩで４時間３７℃処理したサンプルを、電気泳動した結果を示す。図中「Ｍ」は、１００ｂｐマーカーを泳動レーンであり、黒矢印は、未切断断片の位置を示す。
【図２５】形態選抜及び変異導入に用いた、本発明のＤＮＡ構築物の構成を示す概略図である。図中、「３５Ｓ−ｉｐｔ」は、プロモーターをアグロバクテリウムｐＯ２２系統由来のプロモーターから３５Ｓプロモーターに変更したｉｐｔ遺伝子を示す。
【図２６】図２５に示したＤＮＡ構築物を導入することにより得られた、カルスを観察した結果を示す写真である。当該ＤＮＡ構築物をアグロバクテリウム法によるＳＲ１に導入した。感染から３０日後に周辺部のカルス化が認められた（図中、Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ及びＩ  参照）。カルス化した葉片のＧＦＰ蛍光を観察した結果、１８葉片中５葉片でＧＦＰ蛍光カルスが観察された（図中、Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ及びＪ  参照）。図２５に示した構築物Ａを導入し、ＭＳ培地で生育して得られたカルスを、図のＡ〜Ｄに示す。図２５に示した構築物Ｂを導入し、ＮＡＭ含有ＭＳ培地で生育して得られたカルスは、図のＥ〜Ｈに示す。図２５に示した構築物Ｃを導入し、ＭＳ培地で生育して得られたカルスを、図のＩ及びＪに示す。
【図２７】本発明のＤＮＡ構築物、及びそれから生成される環状ＤＮＡと、該環状ＤＮＡの挙動を検証するために用いたプライマーとの位置関係を示す概略図である。プライマー（１）及び（２）は、ｇｆｐのコーディング領域断片を増幅するためのプライマーセットである。環状ＤＮＡへの切り出しが起こることでＰＣＲ反応が進むように設計されており、環状ＤＮＡの検出のため用いた。プライマー（３）及び（４）は、Ｃａｓ９のコーディング領域断片を増幅するためのプライマーセットである。Ｃａｓ９の存在を確認するために用いた。増幅されるバンドの長さにより、環状ＤＮＡへの切り出しを確認するために用いた。
【図２８】図２５に示したＤＮＡ構築物を導入して得られたカルスについて、ゲノムＰＣＲ分析及びＣＡＰＳ解析した結果を示す泳動写真である。感染後３０日目のカルスからゲノムＤＮＡを抽出し、図２７に示すプライマーセットを用い、ゲノムＰＣＲを行い、ｇｆｐ遺伝子（環状ＤＮＡ）及びＣａｓ９遺伝子を検出した。また図２２において説明した方法にてＣＡＰＳ解析を行い、標的遺伝子における変異導入を検出した。図２５に示した構築物Ａを導入し、ＭＳ培地で生育して得られたカルスは、レーン１〜６に示す。図２５に示した構築物Ｂを導入し、ＭＳ培地で生育して得られたカルスは、レーン７及び８に示す。図２５に示した構築物Ｂを導入し、ＮＡＭ含有ＭＳ培地で生育して得られたカルスは、レーン９〜１３に示す。図２５に示した構築物Ｃを導入し、ＭＳ培地で生育して得られたカルスは、レーン１４〜１８に示す。また図中の「Ｍ」はＤＮＡラダー５００ｂｐを泳動したマーカーレーンを示す。黒矢印は、ＣＡＰＳ解析における未切断断片の位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（ＤＮＡ構築物）
本発明の、植物細胞においてゲノム編集系を発現させるためのＤＮＡ構築物は、
５’側に位置する第１のリコンビナーゼ認識部位と３’側に位置する第２のリコンビナーゼ認識部位とに挟まれた被切除領域を含み、
第１のリコンビナーゼ認識部位と第２のリコンビナーゼ認識部位は同じ向きであり、
第１及び第２のリコンビナーゼ認識部位を特異的に認識する部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子が、前記被切除領域の少なくとも１方の外側に配置されており、
前記被切除領域は、前記ゲノム編集系をコードする遺伝子と、５’領域と３’領域とに分割されているマーカー遺伝子とを含み、前記マーカー遺伝子の３’領域は第１のリコンビナーゼ認識部位の３’末端に隣接し、前記マーカー遺伝子の５’領域は第２のリコンビナーゼ認識部位の５’末端に隣接し、ゲノム編集系をコードする遺伝子は、前記マーカー遺伝子の３’領域と５’領域との間に配置されていることを、特徴とする。
【００１２】
そして、この構成をとることによって、本発明のＤＮＡ構築物は、植物細胞に導入された場合に、前記部位特異的リコンビナーゼが発現し、前記被切除領域が切り出されて環状化することによって、前記５’領域と３’領域とがリコンビナーゼ認識部位を介して結合し、これにより前記マーカー遺伝子の発現が可能となる。また、当該環状化された領域は、該植物細胞のゲノムに組み込まれることなく該細胞内に、一定期間安定して存在し、コードするゲノム編集系を発現させることができる。そのため、効率的にゲノム編集された植物細胞を得ることができる。
【００１３】
本発明に係る「被切除領域」は、部位特異的リコンビナーゼによって切除され環状化するために、その末端に該部位特異的リコンビナーゼが特異的に認識する２つのリコンビナーゼ認識部位（５’側に位置する第１のリコンビナーゼ認識部位と、３’側に位置する第２のリコンビナーゼ認識部位）が、同じ向きにて配置される。
【００１４】
本発明において「部位特異的リコンビナーゼ」とは特定の配列（リコンビナーゼ認識部位）を認識し、該配列間で組換えを生じさせる酵素であればよく、特に制限はないが、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、醤油酵母（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）由来のリコンビナーゼＲ、ＦＬＰリコンビナーゼ、γδリゾルバーゼ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ФＣ３１インテグラーゼ、Ｂｘｂ１−インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、λインテグラーゼが挙げられる。また「リコンビナーゼ認識部位」としては、前記各酵素が特異的に認識し得る配列であればよく、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼであれば、ｌｏｘＰ配列が挙げられ、リコンビナーゼＲであればＲｓ配列が挙げられ、ＦＬＰリコンビナーゼであれば、ＦＲＴ配列が挙げられる。
【００１５】
被切除領域に含まれる「マーカー遺伝子」としては、該遺伝子がコードするマーカータンパク質が植物細胞において発現し、検出可能であればよく、例えば、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子、薬剤耐性遺伝子が挙げられる。
【００１６】
蛍光タンパク質遺伝子としては、具体的には、例えば、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子、ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）遺伝子、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）遺伝子、エクオリン遺伝子が挙げられる。発光酵素遺伝子としては、具体的には、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。発色酵素遺伝子としては、具体的には、例えば、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子、ＳＥＡＰ遺伝子が挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、具体的には、例えば、カナマイシン耐性（ＮＰＴII）遺伝子、ハイグロマイシン耐性（ＨＰＴ）遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子（ビアラホス耐性遺伝子、グリフォセート耐性遺伝子（ＥＰＳＰＳ）、スルホニル尿素系耐性遺伝子（ＡＬＳ））が挙げられる。
【００１７】
「マーカー遺伝子」は、後述の実施例において示すとおり、被切除領域の環状化及びその環状化ＤＮＡをモニタリングするために、被切除領域において、５’領域と３’領域とに分割されて含まれる。さらに、当該３’領域は第１のリコンビナーゼ認識部位の３’末端に隣接し、前記５’領域は第２のリコンビナーゼ認識部位の５’末端に隣接するよう、被切除領域において配置される。そして、この構成をとることによって、前述の部位特異的リコンビナーゼの作用により、第１のリコンビナーゼ認識部位及び第２のリコンビナーゼ認識部位間で組換えが生じた際に、マーカー遺伝子の５’領域と３’領域とが結合され、再構成されることになる。
【００１８】
マーカー遺伝子の分割は、当該再構成により、機能的なタンパク質を発現しうるものであれば特に制限はなく、例えば、マーカー遺伝子のエキソン中であってもよく、マーカー遺伝子のイントロン中であってもよいが、再構成において配列に改変が生じても影響が少なく、また分割の設計がし易いという観点から、前記マーカー遺伝子は、イントロンにて５’領域と３’領域とに分割されていることが好ましい。
【００１９】
また、マーカー遺伝子の３’領域と５’領域との間には、少なくともゲノム編集系をコードする遺伝子が配置されていればよいが、マーカー遺伝子の３’領域に含まれるターミネーター領域と、５’領域に含まれるプロモーター領域とが接近し過ぎると、マーカータンパク質の発現に負の影響を与える傾向があることから、前記３’領域及び５’領域間は、２０００塩基以上であることが好ましく、４０００塩基以上であることがより好ましい。
【００２０】
本発明に係る被切除領域において、前記マーカー遺伝子の３’領域と５’領域との間に、ゲノム編集系をコードする遺伝子が配置される。本発明において「ゲノム編集系」とは、ゲノムＤＮＡ上の任意の部位に改変を生じさせ得る人工制限酵素システムである限り特に制限されない。人工制限酵素システムとしては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮシステム、ＺＦＮシステム、ＰＰＲシステムが挙げられる。
【００２１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ヌクレアーゼ（ＲＧＮ；ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）であるＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、Ｓｉｎｇｌｅ−ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ（ＳｇＲＮＡ））を使用する。該システムを細胞内に導入することにより、ガイドＲＮＡが標的部位に結合し、該結合部位に誘導されたＣａｓタンパク質によってＤＮＡを切断することができる（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（米国特許８６９７３５９号、国際公開２０１３／１７６７７２号）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１（Ｚｅｔｓｃｈｅ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３（３）：７５９−７１，（２０１５））。
【００２２】
また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムから、ヌクレアーゼ活性を除去したものに、脱アミノ化酵素であるデアミナーゼを付加した人工酵素複合体も、本発明に係るゲノム編集系として用いることができる（Ｔａｒｇｅｔ−ＡＩＤ（Ｋ．Ｎｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ８７２９，（２０１６）））。
【００２３】
ＴＡＬＥＮシステムは、ＤＮＡ切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩドメイン）に加えて転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターのＤＮＡ結合ドメインを含む人工ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を使用する（例えば、米国特許８４７０９７３号、米国特許８５８６３６３号）。該システムを細胞内に導入することにより、ＴＡＬＥＮがＤＮＡ結合ドメインを介して標的部位に結合し、そこでＤＮＡを切断する。標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインは、公知のスキーム（例えば、Ｚｈａｎｇ，  Ｆｅｎｇ  ｅｔ．  ａｌ．  （２０１１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９  （２）に従って設計することができる。
【００２４】
ＺＦＮシステムは、ジンクフィンガーアレイを含むＤＮＡ結合ドメインにコンジュゲートした核酸切断ドメインを含む人工ヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用する（例えば、米国特許６２６５１９６号、８５２４５００号、７８８８１２１号、欧州特許１７２０９９５号）。該システムを細胞内に導入することにより、ＺＦＮがＤＮＡ結合ドメインを介して標的部位に結合し、そこでＤＮＡを切断する。標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインは、公知のスキームに従って設計することができる。
【００２５】
ＰＰＲシステムとしては、例えば、ヌクレアーゼドメインが融合されたＰＰＲ（ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅｒｅｐｅａｔ）を使用することができる（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５３：１１７１−１１７９（２０１２））。
【００２６】
これらゲノム編集系の中でも、標的部位の認識に核酸（ガイドＲＮＡ）を用いるため、標的部位をより自由に選択でき、その調製も簡便であるという観点から、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが好ましい。なお、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて用いられるガイドＲＮＡの長さは、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０塩基である。好ましい塩基長の上限としては、３０以下、より好ましくは２５以下、さらに好ましくは２２以下、最も好ましくは２０以下である。Ｃａｓタンパク質は、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含んでいてもよい。また、Ｃａｓタンパク質は、II型ＣＲＩＳＰＲ系酵素が好ましく、例えば、Ｃａｓ９タンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得、また、Ｃａｓ９ホモログ又はオルソログであり得る。
【００２７】
本発明に係る被切除領域において、前記マーカー遺伝子の３’領域と５’領域との間に、ゲノム編集系をコードする遺伝子の他、更に他の外来遺伝子が含まれていてもよい。「外来遺伝子」としては特に制限はなく、例えば、植物ホルモン生合成遺伝子、複製促進因子遺伝子、細胞死抑制因子遺伝子が挙げられる。
【００２８】
植物ホルモン生合成遺伝子としては、具体的に、ｉｐｔ遺伝子、ｉａａＭ遺伝子、ｉａａＨ遺伝子、ｒｏｌ（ｒｏ１Ａ、ｒｏｌＢ、ｒｏｌＣ）遺伝子等が挙げられる。不定胚の形成を促進する遺伝子として、ＷＳＵ遺伝子、ＢＢＭ遺伝子、ＡＧＬ１５遺伝子、Ｌｅｃ１遺伝子等が、挙げられる。複製促進因子遺伝子としては、具体的に、ＡＰＳ遺伝子、ｃｔ−ａｒｓ１遺伝子等が挙げられる。細胞死抑制遺伝子としては、具体的に、ＡＣＣｄ遺伝子、Ｂａｘ−Ｉ遺伝子、ＮａＧＨ遺伝子等が挙げられる。
【００２９】
本発明の「ＤＮＡ構築物」においては、前述の被切除領域の他、当該領域の少なくとも一方の外側に、前記部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子が配置されていればよいが、さらに他の遺伝子を含んでいてもよい。「他の遺伝子」としては特に制限はなく、例えば、本発明のＤＮＡ構築物を、植物細胞以外の宿主（例えば、大腸菌）にて、複製できるようにするための複製起点（Ｒｉプラスミド由来の変異型複製起点（Ｒｉ−ｏｒｉ）等）や、前記宿主において機能するマーカー遺伝子（ＮＰＴIII遺伝子等）が挙げられる。
【００３０】
なお、本発明においてＤＮＡ構築物に含まれる各遺伝子には、タンパク質又はＲＮＡのコード領域のみならず、その発現を制御する領域（プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル等）が適宜付加されていてもよい。「プロモーター」としては、植物細胞内において機能し、構成的に発現するか、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるＤＮＡであればよい。例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、Ｅｌ２―３５Ｓオメガプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来ＰＲタンパク質プロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＲｕＢｉｓｃｏプロモーターが挙げられる。「ターミネーター」としては、前記プロモーターによる転写転写を終結でき、ポリＡ付加シグナルを有する配列であればよく、例えば、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）遺伝子のターミネーター、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ  ３５Ｓターミネーターが挙げられる。
【００３１】
また、本発明の「ＤＮＡ構築物」において、前記部位特異的リコンビナーゼによる組換えが生じた際に、その範囲はリコンビナーゼ認識部位間のみならず、その周辺領域にも及び得るから、第１のリコンビナーゼ認識部位の５’末端には、更に前記マーカー遺伝子の５’領域の３’末部位が配置され、第２のリコンビナーゼ認識部位の３’末端には、更に前記マーカー遺伝子の３’領域の５’末部位が配置されていることが好ましい。この場合における、前記５’領域の３’末部位と、前記３’領域の５’末部位の長さには、特に制限はないが、１０塩基以上であることが好ましく、５０塩基以上であることがより好ましく、８０塩基以上であることがさらに好ましく、１００塩基以上であることがより好ましい。
【００３２】
本発明の「ＤＮＡ構築物」の形態としては、配置された遺伝子を導入された植物細胞内で発現できるものであれば特に制限はなく、例えば、ｐＵＣ系（ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９等）、ｐＡＬ系（ｐＡＬ５１、ｐＡＬ１５６等）、ｐＢI系（ｐＢI１２１、ｐＢI１０１、ｐＢI２２１、ｐＢI２１１３、ｐＢI１０１．２等）、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系、中間ベクター系（ｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ等）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）が挙げられる。
【００３３】
本発明のＤＮＡ構築物を、後述の実施例に示すように、アグロバクテリウム法により植物細胞に導入する場合には、当該構築物は、アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡ配列由来の右境界配列（ＲＢ）及び左境界配列（ＬＢ）を更に含んでいることが望ましい。なお、この場合、前記被切除領域及び前記部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子は、前記ＲＢとＬＢとに挟まれた伝達領域に配置されることとなる。
【００３４】
さらに、アグロバクテリウムにおける前記伝達領域の形成を高め、植物細胞への当該領域の移行を促進するという観点から、ＲＢの５’末端にはオーバードライブ（ＯＤ）配列が隣接していることが好ましい。また、ＬＢは複数（例えば、２個）配置されていてもよい。さらに、ＲＢの３’末端及びＬＢの５’末端には各々、テロメア配列が隣接していてもよい（Ｃｈｉｕｒａｚｚｉ  Ｍ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９４年、２６巻、９２３〜９３４ページ、Ｔｅｏ  ＣＨ．ら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１１年、６８巻、２８〜３９ページ  参照）。
【００３５】
また、本発明のＤＮＡ構築物は、当業者であれば適宜公知の手法を用いて作製することができる。例えば、後述の実施例に示すように、精製された遺伝子カセットを適当な制限酵素で切断し、骨格となる適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイト等に連結することにより作製することができる。また、Iｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング、ＴＡクローニング、二重交叉組換え（ｄｏｕｂｌｅ  ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ）等の手法を用いても、本発明のＤＮＡ構築物は作製できる。さらに、本発明のＤＮＡ構築物においてコードされる遺伝子の塩基配列は、導入される植物細胞においてそれらの翻訳産物を効率良く発現させるため、当該細胞に合わせたコドンに最適化されていてもよい。
【００３６】
（ゲノム編集された植物細胞の生産方法）
本発明のゲノム編集された植物細胞の生産方法は、
（１）上述の本発明のＤＮＡ構築物を、植物細胞に導入する工程、
（２）前記工程にて得られた細胞から、前記マーカー遺伝子の発現を指標として、前記ＤＮＡ構築物が導入され、前記被切除領域の環状化が生じている細胞を選抜する工程。
を含む、方法である。
【００３７】
後述の実施例において示すとおり、この方法によれば、前記被切除領域の環状化が生じている細胞、すなわち当該領域に含まれるゲノム編集系をコードする遺伝子等が、植物ゲノムに組み込まれていない細胞を選抜することができ、ひいては標的遺伝子のみが改変された植物細胞を得ることができる。
【００３８】
本発明の方法においてゲノム編集の対象となる「植物」は、被子植物及び裸子植物を含む種子植物であり、被子植物には、単子葉植物及び双子葉植物が含まれる。単子葉植物としては、例えば、イネ科植物、ユリ科植物、バショウ科植物、パイナップル科植物、ラン科植物が挙げられる。双子葉植物としては、例えば、アブラナ科植物、マメ科植物、ナス科植物、ウリ科植物、ヒルガオ科植物、バラ科植物、クワ科植物、アオイ科植物、キク科植物、ヒユ科植物、タデ科植物が挙げられる。また、裸子植物としては、例えば、マツ、スギ、イチョウ、ソテツが挙げられる。
【００３９】
本発明のＤＮＡ構築物が導入される「植物細胞」には、前述の植物体中の細胞の他、当該植物由来の培養細胞も含まれる。さらに、種々の形態の植物細胞、例えば、葉の切片、種子、種子の胚の茎頂、塊茎の幼芽の茎頂、懸濁培養細胞、プロトプラスト、カルス、未熟胚、花粉等が含まれる。
【００４０】
本発明のＤＮＡ構築物の植物細胞への「導入」は、当業者であれば適宜公知の手法を用いて行なうことができ、例えば、アグロインフィルトレーション等のアグロバクテリウム法、ｉＰＢ（ｉｎ  ｐｌａｎｔａ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）法等のパーティクルボンバードメント法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、ウィスカー法、プラズマ法、レーザーインジェクション法が挙げられる。なお、ｉＰＢ法については、例えば、特開２０１７−２０５１０４号公報及び特開２０１７−２０５１０３号公報に開示されている。
【００４１】
本発明のＤＮＡ構築物が挿入された植物細胞は、前記マーカー遺伝子の発現を指標とすることにより、当該ＤＮＡ構築物が導入され、前記被切除領域の環状化が生じている細胞を選抜することができる。「選抜」は、当業者であれば、マーカー遺伝子の種類に合わせて適宜行なうことができる。例えば、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子である場合には、蛍光顕微鏡でその発現を検出して細胞を選抜することができる。また蛍光強度の違いを利用することにより、セルソーター等で選抜することも可能である。発光酵素遺伝子を用いた場合には、細胞に発光基質を加え、発光光度計で発光量を測定することにより、その発現を検出して細胞を選抜することができる。発色酵素遺伝子を用いた場合には、細胞に発色基質を加え、発色の有無を観察することにより、その発現を検出して細胞を選抜することができる。薬剤耐性遺伝子を用いた場合には、各薬剤を含有する培地（選択培地）で細胞を培養することにより、細胞を選抜することができる。
【００４２】
また、本発明において、前記外来遺伝子として植物ホルモン生合成遺伝子も含むＤＮＡ構築物を用いる場合には、以下のゲノム編集された植物の生産方法の態様もとり得る。
【００４３】
ゲノム編集された植物の生産方法であって、下記（１）〜（３）の工程を含む方法
（１）植物ホルモン生合成遺伝子も含む本発明のＤＮＡ構築物を、植物細胞に導入する工程、
（２）前記工程にて得られた細胞から、前記マーカー遺伝子の発現を指標として、前記ＤＮＡ構築物が導入され、前記被切除領域の環状化が生じている細胞を選抜する工程、
（３）前記工程にて得られた細胞を培養して植物組織を生成させ、前記ＤＮＡ構築物上の植物ホルモン生合成遺伝子の発現に起因する植物組織における形態変化を指標として、当該形態変化が生じた植物組織を選抜する工程。
【００４４】
当該方法における工程（１）及び（２）については上述のとおりである。工程（３）においては、植物ホルモン生合成遺伝子の発現に起因する植物組織における形態変化を指標とすることにより、本発明のＤＮＡ構築物が導入され、前記被切除領域の環状化が生じている植物組織を選抜することができる。なお、植物組織生成に至る植物細胞の培養法としては、特に制限はなく、当業者であれば、後述の実施例に示すような公知の培地等を用いて適宜行なうことができる。
【００４５】
また、工程（３）における「選抜」も、当業者であれば、植物ホルモン生合成遺伝子の種類に合わせて適宜行なうことができる。例えば、植物ホルモン生合成遺伝子がｉｐｔ遺伝子である場合には、不定芽形成又はカルス形成を指標として、植物組織を選抜することができる。ｉａａＭ遺伝子及びｉａａＨ遺伝子である場合には、不定根形成又はカルス形成を指標として、植物組織を選抜することができる。ｉｐｔ遺伝子、ｉａａＭ遺伝子及びｉａａＨ遺伝子である場合には、不定根形成又はカルス形成を指標として、植物組織を選抜することができる。ｒｏｌ遺伝子である場合には、毛状根形成又はカルス形成を指標として、植物組織を選抜することができる。ＡＧＬ１５遺伝子である場合には、不定胚形成を指標として、植物組織を選抜することができる。また、ＢＢＭ遺伝子、ＷＳＵ遺伝子又はＬｅｃ１遺伝子である場合には、カルス形成を指標として、植物組織を選抜することができる。
【００４６】
また、このようにして選抜して得られた植物細胞等において、標的遺伝子の配列が改変されたことの確認は、当業者であれば、公知の手法を適宜用いて行なうことができる。例えば、シークエンス（配列決定）法、ＰＣＲ法、ＣＡＰＳ法、ＲＦＬＰ法、サザンブロッティング法等を用いて確認することもできる。また、標的遺伝子におけるゲノム編集の有無等は、該遺伝子から発現されるＲＮＡの有無、量、分子量等を解析することにより確認することもできる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロッティング法を用いて確認することもできる。さらに、標的遺伝子から発現されるタンパク質の有無、量、分子量等を解析することにより確認することもできる。例えば、ウエスタンブロッティング法、免疫染色、ＥＬIＳＡ法、ＲIＡ、ドットイミュノバイディングアッセイを用いて行なうことができる。
【００４７】
また、植物においては、古くから、その体細胞が分化全能性を有していることが知られており、様々な植物において、植物細胞、植物組織（カルス等）から植物体を再生する方法が確立されている（例えば、田部井豊  編、「形質転換プロトコール［植物編］」、株式会社化学同人、２０１２年９月２０日出版）  参照のほど）。したがって、例えば、本発明の方法により得られた植物細胞又は植物組織から植物体を再生することにより、標的遺伝子の配列が改変された植物体を得ることができる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本実施例は、以下に示す実験材料及び方法を用いて行なった。なお、以下にて、メーカー名の記載のない試薬は、和光純薬社製のものである。【００４９】
（植物体の準備と栽培）
トランジェントアッセイには、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）を用いた。ベンサミアナタバコは、ウィルスに対する免疫システムがないため、アグロインフィルトレーション等の感染実験においてよく使用されている。【００５０】
浸漬法による感染実験の際には、タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）のＳＲ１を用いた。ＳＲ１のゲノムは異質複二倍体（２ｎ＝２４）でありＮ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ（２ｎ＝１２：ＳＳ）とＮ．ｔｏｍｅｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ（２ｎ＝１２：ＴＴ）を祖先としている。本実施例にて用いたＳＲ１種子はＪＴ（日本たばこ産業）より譲渡された。【００５１】
ＳＲ１の種子に７０％エタノール１ｍｌ加え、６０００ｒｐｍで遠心し、上清を捨てた。滅菌溶液（１０倍希釈ハイタ―）１ｍｌを加え１０分間攪拌し、その後上清を捨てた。クリーンベンチ内で、滅菌水１ｍｌを加え攪拌し、その後上清を捨てた。この操作を３回繰り返した。浮いている種は捨て、寒天培地に播種し、全明で２〜３週間高温室に置いた。芽が出てきた種から２００ｍｌコニカルビーカーに移し替え、大きくなったものを、さらにジャムビンに移し替えた。約２ヵ月後の植物体の葉を感染実験に使用した。【００５２】
（使用培地と抗生物質）
ＬＢ培地は、Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  １０ｇ、Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ５ｇ及びＮａＣｌ  １０ｇを、ＤＷで１０００ｍｌにメスアップし、ｐＨ７．２に調整した後、オートクレーブ（１２１℃、２０分）にて滅菌したものを用いた。寒天培地の場合は、全量を２００ｍｌで調製し、ｐＨ調整後に、Ｂａｃｔｏ  Ａｇｅｒ  ３ｇを加えてオートクレーブ（１２１℃、２０分）にて滅菌した。寒天培地に抗生物質を加える場合は、シャーレに広げる直前に加えた。【００５３】
ＭＳ培地は、ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（日本製薬社製）１袋、ＭＵＲＡＳＨＩＧＥ＆ＳＫＯＯＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＶＩＴＡＭＩＮ  ＳＯＬＵＴＩＯＮ（１０００×）、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  １ｍｌ及びスクロース  ３０ｇを、ＤＷで１０００ｍｌにメスアップし、１Ｍ  水酸化カリウムでｐＨ５．８に調整した後、２００ｍｌに小分けしてゲランガム０．６ｇを加え、オートクレーブ（１２１℃、２０分）にて滅菌した。【００５４】
抗生物質又はアセトシリンゴンを加える場合は、シャーレに広げる直前に加えた。抗生物質は各々、アンピシリン  １００ｍｇ／ｌ、カナマイシン  ５０ｍｇ／ｌ、ストレプトマイシン  ２０ｍｇ／ｌ、カルベニシリン  １００ｍｇ／ｌ、セフォタキシン  ２００ｍｇ／ｌになるよう調整して用いた。アセトシリンゴンの使用濃度は、５０ｍｇ／ｌになるように調整した。【００５５】
植物ホルモンを添加する場合は、以下の濃度になるようにｐＨ調製前に加えた。
再分化培地：ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）  ０．１ｍｇ、ｌ、６−ベンジルアデニン（ＢＡ）  １．０ｍｇ／ｌ
ＮＡＭ培地：１−ナフチルアセトアミド（ＮＡＭ）  １．０ｍｇ／ｌ。【００５６】
（アグロインフィルトレーション）
ＬＢ培地（リファンピシン  ２５ｍｇ／Ｌ、カナマイシン  ５０ｍｇ／Ｌ）でシングルコロニーを取り、２〜３ｍｌの液体ＬＢ培地で、２８℃、１５０〜２００ｒｐｍで１８時間培養した。培養したアグロ菌液に、２００μＭのアセトシリンゴンを添加したＬＢ培地を加え、２８℃、１５０〜２００ｒｐｍで２４時間培養した。培養液を３０００ｇで１０分間遠心し、集菌した後、培養液と等量のインフィルトレーションバッファーに再懸濁した。再び３０００ｇで１０分間遠心し、集菌した後培養液の半分量のインフィルトレーションバッファーに再懸濁した。ＯＤを０．３にあわせ、アセトシリンゴンを２００μＭになるように添加した。インフィルトレーション溶液をシリンジにいれ、ベンサミアナの葉の裏側から注入した。【００５７】
（形質転換）
大腸菌（ＪＭ１０１）、アグロバクテリウム（ＬＢＡ４５０４）への形質転換は、ヒートショック法を用いて行った。コンピテントセルに１ｎｇのＤＮＡを加え、２０分間氷上に置いた。ヒートブロックを用い、４２℃で３０秒ヒートショックし、直ちに氷にさした。その後、コンピテントセルの５倍量の液体ＬＢ培地を加えた後、大腸菌では３７℃、１時間、アグロバクテリウムでは２８℃、２時間でインキュベートした。インキュベート後、適当な抗生物質を含むＬＢ培地に菌液をまき、コンラージ棒で伸ばし大腸菌は３７℃で約１２時間、アグロバクテリウムは２８℃で４８時間インキュベートし、コロニーを得た。【００５８】
（ＳＲ１タバコへの浸漬法による感染実験）
ベクターを形質転換したアグロバクテリウムを、カナマイシンを加えたＬＢ培地で、２８℃で４８時間振蕩培養して感染菌液とした。無菌苗から十分に育った葉を切り取り、滅菌水を入れたシャーレで、太い葉脈を避け１ｃｍ角程度の葉片にした。２７ｍｌの滅菌水を入れた５０ｍｌファルコンチューブに葉片を入れ、感染菌液を３ｍｌ加えよく攪拌した。葉片全体が感染液に浸かるようにし、１０分間浸漬した。葉片を滅菌キムタオルに取り出し、余分な菌液を吸い取った。アセトシリンゴンを加えたＭＳ再分化培地に置床し、２８℃全暗で４８時間共存培養を行った。共存培養した葉片を、カルベニシリンとセファタキシンを加えたＭＳ培地上にシャーレ１枚当り１６〜２５枚程度置床し、１週間全暗条件にて培養を行った。１週間後以降は２５℃１６ｈ明／８ｈ暗条件で培養した。その後は、１週間ごとに培地を交換し継代を行った。【００５９】
（アガロース電気泳動）
ＤＮＡのアガロース電気泳動においては、トリス−酢酸−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）泳動バッファー（５０×）（コスモ・バイオ社製）をＤＷで５０倍希釈し、泳動バッファーとした。アガロースゲルとして、このバッファーにＡｇａｒｏｓｅ  Ｌ０３（タカラ社製）を１％添加して加熱溶解させ、ゲルトレイで固めて調製した、１％アガロースゲルを使用した。【００６０】
（ゲル抽出）
アガロース電気泳動をした後に、ＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｇｅｌ／ＰＣＲ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社製）を用いて、付属の説明書に従って行い、ゲルからＤＮＡを抽出した。【００６１】
（制限酵素処理）
制限酵素処理は全てタカラ社製の酵素を用いて、付属の説明書に従って行った。【００６２】
（インフュージョン反応）
インフュージョン（Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ）反応は、２つのＤＮＡ末端が１５ｂｐの相同配列を持つ場合に、それらＤＮＡを結合することができる反応である。インフュージョン反応によるクローニングは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ（タカラ社製）を用いて付属の説明書に従ってＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物と、制限酵素処理で線上化したベクターを、Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラ社製）を用い、付属の説明書に従って反応を行った。インフュージョン反応により環状化したベクターを大腸菌に形質転換し、コロニーＰＣＲでベクターを確認した。
Ｐｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  ＭＡＸを用いたＰＣＲの基本的なプログラムは、以下のとおりである。【００６３】
【表１】
2020071528.tif 000002
【００６４】
（コロニーＰＣＲ）
Ｅｍｅｒａｌｄ  Ａｍｐ（タカラ社製）を用い、付属の説明書に従って、形質転換した大腸菌コロニーを２μｌチップの先で取り、ＰＣＲを行った。
Ｅｍｅｒａｌｄ  Ａｍｐを用いたＰＣＲの基本的なプログラムを以下に示す。【００６５】
【表２】
2020071528.tif 000003
【００６６】
（ゲノム抽出）
Ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラ社製）を用い、付属の説明書に従って反応を行った。【００６７】
（ゲノムＰＣＲ）
全てのゲノムは、５０ｎｇ／μｌになるよう調整してテンプレートとした。Ｅｘ−Ｔａｑ（タカラ社製）を用い、付属の説明書に従ってＰＣＲを行った。
基本的なプログラムを以下に示す。【００６８】
【表３】
2020071528.tif 000004
【００６９】
（平滑末端クローニング）
Ｍｉｇｈｔｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｅｔ（タカラ社製）を用い、付属の説明書に従ってクローニングを行った。クローニングベクターは、付属のＢＡＰ処理されたｐＵＣ１１８を用いた。【００７０】
（ＣＡＰＳ解析）
ＣＡＰＳ（Ｃｌｅａｖｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）解析は、標的配列であるＰＤＳ３をＰｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  ＭＡＸを用いて増幅して行った。ＰＤＳ３には、制限酵素ＢｌｎＩで切断される配列がＰＡＭ配列の直前に位置している。したがって、制限酵素の認識配列に変異が入ると、ＢｌｎＩによるＰＤＳ３の切断ができなくなるため、制限酵素の未切断の有無により変異体を検出することができる。【００７１】
（シークエンス解析）
Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステム社製）を用い、付属の説明書に従って、ＤＮＡシークエンス反応を行った。その後、エタノール沈殿を行い、ホルムアミドで溶解した後、ＡＢＩ３１３０シークエンサーの説明書に従い、シークエンスを行った。解析はＦｉｎｃｈ  ＴＶを用いて行った。【００７２】
（実施例１）  Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクター
本発明者らは、ゲノム編集植物を作製する上で、変異を引き起こす人工制限酵素遺伝子等の外来遺伝子を、植物ゲノムに組み込むことなく、一過的に発現させるために、図２及び３に示すような、植物細胞における人工制限酵素等（ゲノム編集系）の発現方法、及び該方法に用いられるＤＮＡ構築物を構想した。【００７３】
そして、このＤＮＡ構築物が、植物ゲノムに組込まれる前に環状ＤＮＡを切り出し、環状ＤＮＡの遺伝子を一過的に発現できることを検証すべく、先ず、図４にて示す、Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターを設計した。【００７４】
Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターの大きな特徴は、レポーター遺伝子として用いるｇｆｐが分割されて組み込まれている点である。すなわち、このベクターを用いたアグロバクテリウム法によって、当該ベクター中のＬＢとＲＢの間のＴ−ＤＮＡが植物に導入され、Ｔ−ＤＮＡ中のｉｎｔｃｒｅが一過的に発現をする。次いで、該酵素によるｌｏｘＰ間の組換えによって切り出され、環状化が生じた結果、分割されていたｇｆｐ遺伝子が再構成され、該遺伝子がコードするＧＦＰが発現することになる。そのため、このＧＦＰの発現を検出することにより、環状ＤＮＡの生成及びその安定性を確認することが可能となる。なお、「ｉｎｔｃｒｅ」及び「ｉｎｔｒｏｎ  ｃｒｅ」とは、ゴーディング部分の前半部にイントロンが挿入されているＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を意味する。【００７５】
そして、このように設計したＳｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターを以下のようにして作製した。先ず、ＭＣＳ（マルチクローニングサイト）、ＲＢ、ＯＤ及びＬＢ×２を有するＴ−ＤＮＡ領域を合成し、ｐＵＣ５７へクローニングした。その後、ｐＲＩ２０１ベクターのｎｐｔIII及びＲｉ−Ｏｒｉを、下記プライマー（１）及び（２）を用い、ＰＣＲにより増幅し、ＥｃｏＲＶサイトへ挿入した。【００７６】
ｇｆｐのコーディング領域の内側に３４ｂｐのｌｏｘＰ配列を含むシロイヌナズナ由来のＫＯＲ１イントロンを組み込んだｌｏｘ  ｉｎｔｒｏｎ  ＧＦＰを合成した。ＫＯＲ１イントロンの組込み位置は、植物イントロンのコンセンサス領域（ａｇ／／ｇｔａａｇｔ――――ｔｇｃａａｇ／／ｇ）に配慮して決定した。３４ｂｐのｌｏｘＰ配列を含むシロイヌナズナ由来のＫＯＲ１イントロンは、下記のとおり２種類用いた。【００７７】
ｌｏｘ−ｉｎｔｒｏｎ（ＫＯＲ１）０１  （配列番号：１）
ＧＴＡＡＧＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＡＣＴＣＴＴＴＡＣＡＧＡＡＡＴＧＧＴＡＡＴＣＴＣＡＧＡＴＡＴＡＧＴＡＡａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａｔｇｔａｔｇｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔＴＧＧＡＴＡＡＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＴＧＡＣＡＣＴＴＴＴＡＡＣＣＡＡＧＡＴＴＧＴＡＣＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＴＴＡＡＡＣＴＣＣＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＣＡＴＣＴＡＡＡＴＴＧＧＡＴＴＴＡＡＣＴＣＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＴＡＴＴＴＴＧＧＣＡＧ
ｌｏｘ−ｉｎｔｒｏｎ（ＫＯＲ１）０２  （配列番号：２）
ＧＴＡＡＧＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＡＣＴＣＴＴＴＡＣＡＧＡＡＡＴＧＧＴＡＡＴＣＴＣＡＧＡＴＡＴＡＧＴＡＡＴＧＧＡＴＡＡＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＴＧＡＣＡＣＴＴＴＴＡＡＣＣＡＡａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａｔｇｔａｔｇｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔＧＡＴＴＧＴＡＣＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＴＴＡＡＡＣＴＣＣＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＣＡＴＣＴＡＡＡＴＴＧＧＡＴＴＴＡＡＣＴＣＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＴＡＴＴＴＴＧＧＣＡＧ
前記２種の配列において、大文字はシロイヌナズナ由来のＫＯＲ１イントロンの配列（１７１ｂｐ）を示し、小文字はｌｏｘＰ配列（３４ｂｐ）を示す。【００７８】
図４に示すＳｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ベクター骨格のＭＣＳにおける各制限酵素サイトへの導入は、制限酵素による切断とＰＣＲ増幅断片のインフュージョン反応により行った。概要としては以下のとおりである。【００７９】
ｌｏｘ  ｉｎｔｒｏｎ  ｇｆｐ
ｌｏｘ  ｉｎｔｒｏｎ  ｇｆｐは２箇所の制限酵素サイトへ分割して導入した。３５Ｓプロモーターからイントロンの終わりまでは、下記プライマー（３）及び（４）を用いたＰＣＲにより増幅し、ＳｍａＩサイトに導入した。またイントロンの始めからＨＳＴ（熱ショックタンパク質ターミネーター）までは、下記プライマー（７）及び（８）を用いたＰＣＲにより増幅し、Ｋｐｎサイトに導入した。【００８０】
ｉｎｔｒｏｎ  ｃｒｅ
遺伝子合成された３５ＳプロモーターとＨＳＴを有するｉｎｔｒｏｎ  ｃｒｅは、下記プライマー（５）及び（６）を用いて増幅し、ＳｍａＩサイトへｌｏｘ  ｉｎｔｒｏｎ  ｇｆｐの上流部と共に導入した。【００８１】
また、後述のとおりＳｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターに下記遺伝子を挿入する場合には、以下のようにして行なった。【００８２】
ａ−ｉｐｔ、３５Ｓ−ｉｐｔ
秋田県立大学の我彦廣悦氏より譲受したアグロバクテリウムｐＯ２２系統由来のプロモーターを有するａ−ｉｐｔは、下記プライマー（１３）及び（１４）を用いて増幅し、ＥｃｏＲＩサイトへ導入した。また３５Ｓプロモーターを有する３５Ｓ−ｉｐｔは下記プライマー（９）及び（１０）を用いて同サイトへ導入した。【００８３】
ｉａａＨ、ｉａａＭ
３５ＳプロモーターとＨＳＰを有するｉａａＨは、ａ−ｉｐｔと導入する際は下記プライマー（１５）及び（１６）を用いて増幅し、また３５Ｓ−ｉｐｔと導入する際は下記プライマー（１１）及び（１２）を用いて増幅し、各々ＥｃｏＲＩサイトに導入した。同プロモーターとターミネーターを有するｉａａＭは下記プライマー（１７）及び（１８）を用いて増幅し、ＨｉｎｄIIIサイトに導入した。【００８４】
Ｃａｓ９、ＰＤＳ３のＳｇＲＮＡ（Ｓｉｎｇｌｅ−ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）
国立研究開発法人農業生物資源研究所（現：国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構）の土岐精一氏より譲渡された、パセリ由来ＰＣｕｂｉユビキチンプロモーターと大豆由来Ｐｅａ３Ａターミネーターとを有するＣａｓ９、及びシロイヌナズナ由来のＡｔＵ−６プロモーターを有するＰＤＳ３のＳｇＲＮＡは、下記プライマー（１９）及び（２０）を用いて増幅し、ＮｏｔＩサイトに導入した。【００８５】
なお、このように挿入した遺伝子は全て、合成時にタバコにおけるコドン使用頻度に最適化した。また、前記プライマーの配列を以下に示し、これら配列の位置関係は図６に示す。
Ｒｉ−Ｏｒｉ  ｎｐｔIIIのＥｃｏＲＶサイトへの挿入
プライマー（１）  Ｒｉ−ＮＰＴ−Ｆ
５’  ＡＧＣＴＣＧＧＣＡＣＡＡＧＡＴＧＡＴＣＣＴＡＣＡＡＧＧＴＡＧ  ３’
（配列番号：３、Ｔｍ：５９．２℃）。
プライマー（２）  Ｒｉ−ＮＰＴ−Ｒ
５’  ＡＡＡＧＡＧＣＧＴＴＴＡＧＡＴＧＴＴＧＣＣＡＴＧＴＴＴＴＡＣ  ３’
（配列番号：４、Ｔｍ：５３．７℃）。
ｌｏｘ  ｉｎｔｒｏｎ  ｇｆｐのＳｍａＩサイトへの挿入
プライマー（３）  ｌｏｘ−ＧＵＳ−Ｆ
５’  ＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＣＣＣＧＴＣＣＣＣＡＧＡＴＴＡＧＣＣ  ３’
（配列番号：５、Ｔｍ：６３．３℃）。
プライマー（４）  Ｏｕｔ−ＳｍａＩ（ＧＦ−Ｉ）−Ｒ
５’  ＡＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＡＡＡＴＡＣＡＧＣ  ３’
（配列番号：６、Ｔｍ：６１．９℃）。
Ｉｎｔｒｏｎ  ｃｒｅのＳｍａＩサイトへの挿入
プライマー（１１）  ｌｏｘ−ｉａａＨ−Ｆ
５’  ＧＴＣＣＣＣＡＧＡＴＴＡＧＣＣＴＴＴＴＣＡ  ３’
（配列番号：７、Ｔｍ：４８．６℃）。
プライマー（６）Ｏｕｔ−ＳｍａＩ（ＨＳＰ−Ｔ）−Ｒ
５’  ＡＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＴＡＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＴ  ３’
（配列番号：８、Ｔｍ：５６．５℃）。
ｌｏｘ  ｉｎｔｒｏｎ  ｇｆｐのＫｐｎＩサイトへの挿入
プライマー（７）  Ｏｕｔ−ＫｐｎＩ（Ｉ−Ｐ）−Ｆ（ｅｎｄ）
５’  ＧＡＴＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＧＧＧＴＡＡＧＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣ  ３’
（配列番号：９、Ｔｍ：５２．４℃）。
プライマー（８）Ｏｕｔ−ＫｐｎＩ（ＨＳＰ−Ｔ）−Ｒ
５’  ＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＴＴＡＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＴ  ３’
（配列番号：１０、Ｔｍ：５７．８℃）。
ａ−Ｉｐｔ及びｉａａＨのＥｃｏＲＩサイトへの挿入
プライマー（９）  ｌｏｘ−ｉｐｔ−Ｆ
５’  ＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＧＴＣＣＣＣＡＧＡＴＴＡＧＣＣ  ３’
（配列番号：１１、Ｔｍ：６０．６℃）。
プライマー（１０）  ｌｏｘ−ｉｐｔ−Ｒ
５’  ＧＧＣＴＡＡＴＣＴＧＧＧＧＡＣＣＴＴＡＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＴ  ３’
（配列番号：１２、Ｔｍ：５５．１℃）。
プライマー（１１）  ｌｏｘ−ｉａａＨ−Ｆ
５’  ＧＴＣＣＣＣＡＧＡＴＴＡＧＣＣＴＴＴＴＣＡ  ３’
（配列番号：７、Ｔｍ：４８．６℃）。
プライマー（１２）  ｌｏｘ−ｉａａＨ−Ｒ
５’  ＴＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＴ  ３’
（配列番号：１３、Ｔｍ：５５．０℃）。
３５Ｓ−ｉｐｔ及びｉａａＨのＥｃｏＲＩサイトへの挿入
プライマー（１３）  ｌｏｘ−ｉｐｔ−Ｆ
５’  ＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＧＴＣＣＣＣＡＧＡＴＴＡＧＣＣ  ３’
（配列番号：１１、Ｔｍ：６０．６℃）。
プライマー（１４）  ｌｏｘ−ＳｍａＩ（ＨＳＰ−Ｔ）−Ｒ
５’  ＣＴＴＡＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＴＡＴＴＣＣＡ  ３’
（配列番号：１４、Ｔｍ：３８．８℃）。
プライマー（１５）  ｌｏｘ−ＳｍａＩ（ＨＳＰ‐Ｔ／ｉｐｔ）−Ｆ
５’  ＡＴＧＡＴＴＡＡＡＧＡＴＡＡＧＣＡＡＣＧＡＡＧＧＴＡＡＴＧＧ  ３’
（配列番号：１５、Ｔｍ：５２．４℃）。
プライマー（１６）  ｌｏｘ−ＥｃｏＲＩ（ａ−ｉｐｔ−Ｔ）−Ｒ
５’  ＴＴＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＡＡＴＡＴＣＣＧＴＧＡＣ  ３’
（配列番号：１６、Ｔｍ：６０．６℃）。
ｉａａＭのＨｉｎｄIIIサイトへの挿入
プライマー（１７）  Ｏｕｔ−ＨｉｎｄIII（３５Ｓ−Ｐ）−Ｆ
５’  ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＧＴＣＣＣＣＡＧＡＴＴＡＧＣＣ  ３’
（配列番号：１７、Ｔｍ：６７．４℃）。
プライマー（１８）  ｌｏｘ−ＨｉｎｄIII（ＨＳＰ−Ｔ）−Ｒ
５’  ＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＣＴＴＡＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＴ  ３’
（配列番号：１８、Ｔｍ：５２．４℃）。
Ｃａｓ９及びＰＤＳ３のＳｇＲＮＡのＮｏｔＩサイトへの挿入
プライマー（１９）  ｌｏｘ−ＮｏｔＩ（ｃａｓ９−Ｐ）−Ｆ
５’  ＧＡＴＧＧＴＡＣＣＧＣＧＧＣＣＣＴＡＧＣＡＡＣＧＡＴＴＧＴＡ  ３’
（配列番号：１９、Ｔｍ：６１．９℃）。
プライマー（２０）  ｌｏｘ−ＮｏｔＩ（ＳｇＲＮＡ−Ｔ）−Ｒ
５’  ＧＧＡＣＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＣＡＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡ  ３’
（配列番号：２０、Ｔｍ：６０．６℃）。【００８６】
（実施例２）  トランジェントアッセイによるＳｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターの作動についての検証
Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターを用いたアグロバクテリウム法により、環状ＤＮＡが生成されるかどうかを検証するに際して、先ず、植物細胞において、ｌｏｘＰを組み込んだイントロンを有するｇｆｐ遺伝子におけるスプライシングが正常に起き、ＧＦＰが発現するかを、確認した。具体的には、図７に示すｌｏｘＰ配列の位置が異なる２種類のｌｏｘ  ｉｎｔｒｏｎ  ＧＦＰベクターと、それらのコントロールとしてＧＦＰベクターを用い、ベンサミアナタバコへのアグロインフィルトレーションを行った。【００８７】
その結果、図８及び図９に示すとおり、ＧＦＰ蛍光を観察することができ、挿入したイントロンのスプライシングは正常に生じ、ｌｏｘ  ｉｎｔｒｏｎ  ＧＦＰ遺伝子は作動することが確認された。【００８８】
次に、Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターを用いたアグロバクテリウム法により、環状ＤＮＡが生成されるかどうかを検証すべく、図１０に示す２種類のＳｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターとコントロールＧＦＰベクターを用いて、再度ベンサミアナタバコへのアグロインフィルトレーションを行い、ＧＦＰ蛍光の観察を行った。【００８９】
その結果、図１１及び１２に示すとおり、ＧＦＰ蛍光を検出することができ、Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターを用いたアグロバクテリウム法により、環状ＤＮＡが生成されていることは確認された。しかしながら、Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターを導入した場合の蛍光強度は、コントロールのそれの十分の一程度であった。【００９０】
次に、図１３に示すとおり、ｉｐｔとｉａａＨを組み込んだＳｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターを用い、アグロインフィルトレーションを行い、ＧＦＰ蛍光の観察を行った。その結果、図１４及び１５に示すとおり、ｉｐｔ及びｉａａＨを挿入することによって、Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターの蛍光強度はコントロールの４５％まで向上することが明らかになった。【００９１】
さらに、Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターを用い、アグロインフィルトレーションを行い、感染後７日目と３５日目に、ＧＦＰ蛍光の観察及びゲノムＰＣＲによる環状ＤＮＡの検出を行った。その結果、図１６に示すとおり、感染後３５日目でも、ＧＦＰ蛍光を観察することができ、また図１７に示すとおり、ゲノムＰＣＲの結果から、環状ＤＮＡが維持されていることも明らかになった。【００９２】
以上の結果から、Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターを用いたアグロインフィルトレーションにより環状ＤＮＡの切り出しが生じることが確認された。さらに切り出された環状ＤＮＡは３５日目になっても維持され得ることが明らかになった。【００９３】
また、Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターに、ｉｐｔ及びｉａａＨを挿入することにより、ＧＦＰの発現が向上することも明らかになった、このように向上する理由については定かではないが、本発明者らは以下のように推察する。すなわち、ターミネーター（Ｔｅｒ）とプロモーター（３５ＳＰ）とが隣接した状態になっていたため、ＧＦＰの発現の発現不良が生じたものの、ｉｐｔ及びｉａａＨの挿入によって、その状態が解消され、ＧＦＰの発現が向上したことが考えられる。また、挿入したｉｐｔ遺伝子が発現することにより、生合成が促進されたホルモンの効果によって、ＧＦＰの発現が向上した可能性もある。【００９４】
（実施例３）  Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターを用いたゲノム編集
Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターを用いることにより、上記構想どおり、植物ゲノムに組み込まれることなく、標的遺伝子を改変（ゲノム編集）できるかどうかを検証した。【００９５】
今回、ゲノム編集の対象として、ＰＤＳ（ｐｈｙｔｏｅｎｅ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）遺伝子を選択した。また、ゲノム編集における標的配列は、この遺伝子の第３エキソン部分（ＰＤＳ３）とした（図１８  参照）。【００９６】
そして、この遺伝子のゲノム編集を試みるに際して先ず、ＳＲ１タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）のＰＤＳ３遺伝子配列を決定するためにシークエンス解析を行った。具体的には、図１８に示すプライマーセット（１）及び（２）を用いてＰＤＳ３を増幅した。その後、ｐＵＣ１１８へ平滑末端クローニングし、コロニーＰＣＲを行った。その結果、図１９に示すとおり、１本又は２本のバンドが得られた。【００９７】
次に、１本又は２本のバンドを得られたコロニー各４個から、プラスミド抽出を行い、シークエンス解析を行なった。その結果、相同性の異なる２種類の配列を得ることができた。これはＳＲ１のゲノムが異質複二倍体（２ｎ＝２４）であり、Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ（２ｎ＝１２：ＳＳ）とＮ．ｔｏｍｅｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ（２ｎ＝１２：ＴＴ）を持つためであると予想する。実際、１本のバンドをシークエンスした結果、得られた配列は、Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓのそれとの相同性が高かった。また、２本のバンドをシークエンスした結果、Ｎ．ｔｏｍｅｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓのそれとの相同性を高く示した。【００９８】
以上の結果より、ｐＵＣ１１８にクローニングし、ＰＤＳ３遺伝子についてコロニーＰＣＲにより解析した結果、１本のバンドが検出された場合には、Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓのゲノムに由来し、２本のバンドが検出された場合には、Ｎ．ｔｏｍｅｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓに由来することが示唆された。【００９９】
次に、Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターを用いた変異導入を試みた。なお、Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターには、変異導入のため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを導入した。すなわち、Ｃａｓ９及びＰＤＳ３のＳｇＲＮＡをコードするＤＮＡを前記ベクターに組込んだ。さらに、ホルモンフリー培地でのカルス形成能を高めるため、ｉａａＭも組み込み、図２０に示す変異導入用Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターを構築した。そして、浸漬法を用いたタバコ（ＳＲ１）への感染実験を行い、Ｃａｓ９による変異導入を試みた。【０１００】
その結果、図２１に示すとおり、Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターを導入したＳＲ１の葉片から、カルスを誘導することができた。また、感染後３９日目と４５日目、２つの実験区から各々無作為にカルス２つをサンプリングし、図１８に示すプライマー（１）及び（２）を用い、ＰＣＲによりＰＤＳ３を増幅した。次いで、増幅した断片に対しＣＡＰＳ解析を行い、変異導入の検出を行った。その結果、図２２に示すとおり、各実験区１つのカルスにおいて、標的配列  ＰＤＳ３に変異が導入されたことが認められた。【０１０１】
さらに、図１８に示すプライマー（１）及び（２）を用いて増幅した断片を、Ｍｉｇｈｔｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｒｅｇｅｎｔ  Ｓｅｔを用い、ｐＵＣ１１８へ平滑末端クローニングした。当該クローニングによって得られたコロニーは、青白選抜及び図１８に示すプライマー（３）及び（４）を用いたコロニーＰＣＲにて、前記増幅断片の挿入を確認した。そして、コロニーＰＣＲの反応液を、ＢｌｎＩ処理に供することで、標的配列に変異が導入されたことを確認した（図２３及び２４  参照）。また、未切断のあるクローンに対してシークエンス解析を行ったところ、下記表４に示すとおり、ＤＮＡ配列の置換又は短い欠失が認められた。【０１０２】
【表４】
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【０１０３】
なお、表４中の配列にて「―」は、野生型（ＷＴ）と比して欠失している部位を示し、小文字にて表記した塩基は、野生型（ＷＴ）より置換された部位を示す。【０１０４】
以上のとおり、ＣＡＰＳ解析及びシークエンス解析の結果、Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターによって、ゲノム編集系を植物細胞において発現させ、標的遺伝子に変異を導入できることが明らかとなった。【０１０５】
なお、図１８に示すプライマー（１）〜（４）、及び未切断のあるクローンに対する前記シークエンス解析に用いたプライマーの配列は、以下のとおりである。
ＰＤＳ３の平滑末端クローニング
プライマー（１）  ＮｔＰＤＳ（１８６６−１８９２ＳＧ）Ｆ
５’  ＡＣＡＴＡＴＡＧＧＧＧＴＴＧＣＡＣＴＣＴＴＣＴＡＡＧＧ  ３’
（配列番号：２７、Ｔｍ：５４．４℃）。
プライマー（２）  ＮｔＰＤＳ（２９９３−３０１７ｃ）Ｒ
５’  ＣＣＣＡＧＴＣＴＣＡＴＡＣＣＡＡＴＣＴＣＣＡＴＣＡ  ３’
（配列番号：２８、Ｔｍ：５３．９℃）。
ＰＤＳ３のコロニーＰＣＲ
プライマー（３）  ＰＤＳ３−Ｆ２（Ａｆｆｒｃ）
５’  ＧＴＡＴＴＧＴＣＡＴＣＡＡＣＴＧＧＴＴＧＡＴＴＡＴＣＴＧＡＧＴＡＣＣ  ３’
（配列番号：２９、Ｔｍ：５７．０℃）。
プライマー（４）  ＰＤＳ３−Ｒ２（Ａｆｆｒｃ）
５’  ＣＴＴＴＣＣＡＴＡＴＣＴＴＴＴＡＣＣＴＡＡＴＡＴＧＣＴＧ  ３’
（配列番号：３０、Ｔｍ：５０．３℃）。
ＰＤＳ３のシークエンス解析
ＰＵＣ  Ｍ４
５’  ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ  ３’
（配列番号：３１、Ｔｍ：４３．２℃）。
ＰＵＣ  ＲＶ
５’  ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ  ３’
（配列番号：３２、Ｔｍ：４０．８℃）。【０１０６】
（実施例４）  Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクター導入によるゲノム編集個体の作製
Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターを用い、浸漬によるアグロバクテリウム法でＳＲ１タバコへの感染実験を行い、環状ＤＮＡを有する組換え個体の選抜を行った。また選抜効果を向上させるため、感染時に細胞増殖の促進を目指し、Ｔ−ＤＮＡに組み込む植物ホルモン遺伝子と培養条件を検討した。【０１０７】
具体的には、図２５に示すように、植物ホルモン遺伝子の組み合わせを変えた３種類のＣａｓ９を有する変異導入Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターを作製して用いた。なお、ｉａａＨを有するベクターに、オーキシン前駆体合成遺伝子ｉａａＭを組み込むことで、ホルモンフリー培地におけるオーキシン合成を促した。またｉａａＭを組込まず、オーキシン前駆体の類縁物質  ＮＡＭ（ナフタレンアセトアミド）を添加したＭＳ培地を用いて、オーキシン合成を促す条件も検討した。より具体的には、図２５に示すコンストラクトＡを導入したタバコ葉片は、ＭＳ培地において培養し、コンストラクトＢを導入したタバコ葉片は、ＭＳ培地又はＭＳ  ＮＡＭ培地において培養し、コンストラクトＣを導入したタバコ葉片は、ＭＳ培地又はＭＳ  ＮＡＭ培地において培養した。【０１０８】
前記５つの培養条件で各２０枚の葉片に感染実験を行った結果、１８葉片分のカルスを得ることができた（コンストラクトＡのＭＳ培地で６葉片、コンストラクトＢのＭＳ培地で２葉片、コンストラクトＢのＭＳ  ＮＡＭ培地で５葉片、コンストラクトＣのＭＳ培地で５葉片）。なお、ベクターにおける植物ホルモン遺伝子の組み合わせや、ＭＳ培地のＮＡＭの有無によるカルス形成能の差を確認することはできなかった。【０１０９】
また、図２６に示すとおり、カルス化した１８葉片のうち５葉片（コンストラクトＡのＭＳ培地で２葉片、コンストラクトＢのＭＳ  ＮＡＭ培地で２葉片、コンストラクトＣのＭＳ培地で１葉片）で、ＧＦＰ蛍光を観察することができた。【０１１０】
さらに、これら葉片においてカルス化した部位をまとめてサンプリングし、ゲノム抽出を行い、図２７に示すプライマーセットを用い、ＰＣＲ分析を行なった。その結果、図２８に示すとおり、ｇｆｐ（環状ＤＮＡ）及びＣａｓ９が検出された。さらに、実施例３に示した結果同様に、ＣＡＰＳ解析によって変異導入も検出された。【０１１１】
なお、図２８に示すプライマー（１）〜（４）の配列は、以下のとおりである。
ｇｆｐ（環状ＤＮＡ）の検出
プライマー（１）  ｐＲＩ−ＧＦＰ  Ｆ
５’  ＣＡＣＴＧＴＴＧＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧ  ３’
（配列番号：３３、Ｔｍ：５９．２℃）。
プライマー（２）  ｐＲＩ−ＧＦＰ  Ｒ
５’  ＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＡＴＡＡＧＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣ  ３’
（配列番号：３４、Ｔｍ：５３．７℃）。
Ｃａｓ９の検出
プライマー（３）  ＦＦＣａｓ９−１１３Ｆ
５’  ＣＣＧＡＴＡＧＧＣＡＣＴＣＴＡＴＣＡＡＧ  ３’
（配列番号：３５、Ｔｍ：４８．０℃）。
プライマー（４）  ＦＦＣａｓ９−６４０Ｒ
５’  ＣＡＧＡＧＡＧＧＡＴＡＧＣＣＴＴＡＧＣＡ  ３’
（配列番号：３６、Ｔｍ：４８．０℃）。【０１１２】
（実施例５）  Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクター導入による、ゲノム編集個体の作製２
実施例４同様に、図２５のＢに示したコンストラクトを有する変異導入Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターを用い、感染を実施した。各１６枚の葉片に感染実験を行った結果、ＭＳ培地で２９カルスを得ることができた。また、２９カルスのうち１２カルスでＧＦＰ蛍光を検出でき、ＧＦＰ蛍光が検出されたカルスを選抜した。さらに、ＧＦＰ蛍光により選抜した１２カルスのうち、３カルスにおいてＣＡＰＳ解析によって変異導入が検出された。ゲノムへのランダム挿入が起こっていないと考えられる変異導入カルスが得られた。【０１１３】
（比較例１）  Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクター（Ｃｒｅカセット無し）導入による、ゲノム編集個体の作製
図２５のＢに示したコンストラクトを有するが、その外側にＣｒｅリコンビナーゼ発現用カセット（ｉｎｔｃｒｅ）を備えていない変異導入Ｓｗｉｔｃｈ  ｏｎ  ＧＦＰベクターを用い、実施例４と同様の方法で感染を実施した。各２０枚の葉片に感染実験を行った結果、ＭＳ培地で４０カルスを得ることができた。しかしながら、４０カルスのうちＧＦＰ蛍光を有するカルスは１つも得られなかった。さらに、４０カルスのうちＣＡＰＳ解析によって変異導入が検出されたカルスは１つも得られなかった。【０１１４】
以上の実施例及び比較例に示した結果より、本発明においては、Ｃｒｅリコンビナーゼによって切り出されたＤＮＡが環状化することによって、ＧＦＰ蛍光の発現が可能となる。そして、当該蛍光を指標としてカルスを選抜することが、変異導入カルスを得るために有効であることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
以上説明したように、本発明によれば、植物細胞において、ゲノム編集系等をコードする外来遺伝子がゲノムに組み込まれることなく、標的遺伝子の配列を改変することが可能となり、安全性の上で有利である。また、本発明によれば、ゲノム編集系を一定期間安定して発現させることができるため、高効率でゲノム編集を行うことができる。したがって、本発明は、農作物育種，有用物資生産、品種改良、目的遺伝子の機能解析等において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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