(57)【要約】  本発明は、新規な出血性血管障害の予防または抑制のための組成物を提供する。より詳細には、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドを含んでなる、出血性血管障害の予防または抑制のための組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドを含んでなる、出血性血管障害の予防または抑制のための組成物。
【請求項２】
前記カロテノイドが、パラコッカス・カロティニファシエンス(Paracoccus carotinifaciens)由来である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記出血性血管障害が、出血性脳血管障害、出血性膀胱炎、出血性胃潰瘍、および出血性腸炎からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記出血性脳血管障害が、脳出血、くも膜下出血、および出血性脳梗塞からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記出血性血管障害の重症度の上昇抑制または低減のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
下記(i)〜(v)の少なくともいずれか一つにおいて使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物：
(i) ＥＲＫのリン酸化の低減またはリン酸化ＥＲＫの発現量の低減、
(ii) ＥＲＫシグナル由来の細胞死の抑制、
(iii) ＨＯ−１の増加、
(iv) ＶＥ−カドヘリンの増加、
(v) コラゲナーゼにより誘導される細胞死の抑制。
【請求項７】
神経障害の予防または抑制のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記神経障害が脳神経障害である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記脳神経障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小型認知症、およびハンチントン病からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記神経障害の重症度の上昇抑制または低減のための、請求項７〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が飲食品または食品添加物である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が機能性食品である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が医薬品である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの有効量を、それを必要とする対象に投与することまたは摂取させることを含んでなる、対象の出血性血管障害を予防するかまたは抑制する方法。
【請求項１５】
出血性血管障害の予防または抑制のための、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本特許出願は、２０１８年３月８日に出願された日本国特許出願２０１８−０４２２６９号に基づく優先権の主張を伴うものであり、かかる先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、出血性血管障害の予防または抑制のための組成物に関し、より詳しくは、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドを含んでなる、出血性血管障害の予防または抑制のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
血管異常による出血性障害が知られており、その予防剤の開発の必要性が存在している。上記出血性血管障害の一つとして出血性脳血管障害が知られている。出血性脳血管障害は、脳の血管が破れることにより生じるものであり、脳組織への障害が生じることもある。上記出血性血管障害は脳高次機能に影響し、予後不良であり、患者のＱＯＬ（Ｏｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ）の低下を招くものである。この点からも、出血性脳血管障害をはじめとする出血性血管障害の予防剤が求められている。【０００４】
一方、アドニルビンおよびアドニキサンチンはカロテノイドの一種であり、動物、植物、微生物に広く分布している。アドニルビンまたはアドニキサンチンには抗不安の効果があることが知られている(特許文献１）。【０００５】
また、カロテノイドの一種であるアスタキサンチンには種々の効果があることが報告されている。例えば、特許文献２には、アスタキサンチンを主成分とするカロテノイド混合物が網膜障害予防に有用であり得ると記載されている。特許文献３には、アスタキサンチンが、ＬＤＬ酸化を抑制または防止し、動脈硬化、虚血性心疾患または虚血性脳障害を予防または抑制することが記載されている。特許文献４には、アスタキサンチンが、シクロオキシゲナーゼ−２活性を阻害することが記載されている。特許文献５には、アスタキサンチンが、脳障害を含む様々な医薬適用及び健康食品において有用であり得ることが記載されている。非特許文献１には、アスタキサンチンが虚血に関連した脳損傷を保護できることが記載されている。【０００６】
また、特許文献６には、リコペン等のカロテノイドが、乳清タンパク質等のカーゴ分子を血流へ送達するのに有用となり得ることが記載されている。ここで、カーゴ分子の性質に依存して疾患が回復または軽減され、カーゴ分子としてレスベラトロールやイソフラボンを用いた場合には、心血管および脳血管疾患に有用となり得ることが記載されている。【０００７】
しかしながら、アドニルビンおよび／またはアドニキサンチンと、出血性血管障害との関係については何ら報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１２−０２５７１２号公報
【特許文献２】特開２０１５−１４０３４６号公報
【特許文献３】特開平１０−１５５４５９号公報
【特許文献４】特開２００６−００８７１８号公報
【特許文献５】特開２０１５−２２６５５０号公報
【特許文献６】特表２０１４−５０５０６８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Pan L et al., Brain research bulletin, 2017 Apr, 130, p.211-220
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、効果的に出血性血管障害を予防または抑制するための新たな技術的手段を提供することを目的としている。本発明は、効果的に神経障害を予防するかまたは抑制するための新たな技術的手段を提供することを別の目的としている。
【００１１】
本発明者らは、今般、アドニルビンまたはアドニキサンチンが、出血性血管障害を効果的に予防または抑制しうることを見出した。
【００１２】
本発明には、以下の発明が包含される。
［１］  アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドを含んでなる、出血性血管障害の予防または抑制のための組成物。
［２］  前記カロテノイドが、パラコッカス・カロティニファシエンス(Paracoccus carotinifaciens)由来である、請求項１に記載の組成物。
［３］  前記出血性血管障害が、出血性脳血管障害、出血性膀胱炎、出血性胃潰瘍、および出血性腸炎からなる群から選択される少なくとも一種である、［１］または［２］に記載の組成物。
［４］  前記出血性脳血管障害が、脳出血、くも膜下出血、および出血性脳梗塞からなる群から選択される少なくとも一種である、［１］〜［３］のいずれか一つに記載の組成物。
［５］  前記出血性血管障害の重症度の上昇抑制または低減のための、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の組成物。
［６］  下記(i)〜(v)の少なくともいずれか一つにおいて使用するための、［１］〜［５］のいずれか一つ記載の組成物：
(i) ＥＲＫのリン酸化の低減またはリン酸化ＥＲＫの発現量の低減、
(ii) ＥＲＫシグナル由来の細胞死の抑制、
(iii) ＨＯ−１の増加、
(iv) ＶＥ−カドヘリンの増加、
(v) コラゲナーゼにより誘導される細胞死の抑制。
［７］  神経障害の予防または抑制のための、［１］〜［６］のいずれか一つに記載の組成物。
［８］  前記神経障害が脳神経障害である、［７］に記載の組成物。
［９］  前記脳神経障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小型認知症、およびハンチントン病からなる群から選択される少なくとも一種である、［８］に記載の組成物。
［１０］  前記神経障害の重症度の上昇抑制または低減のための、［７］〜［９］のいずれか一つに記載の組成物。
［１１］  前記組成物が飲食品または食品添加物である、［１］〜［１０］のいずれか一つに記載の組成物。
［１２］  前記組成物が機能性食品である、［１］〜［１１］のいずれか一つに記載の組成物。
［１３］  前記組成物が医薬品である、［１］〜［１２］のいずれか一つに記載の組成物。
［１４］  アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの有効量を、それを必要とする対象に投与することまたは摂取させることを含んでなる、対象の出血性血管障害を予防するかまたは抑制する方法。
［１５］  出血性血管障害の予防または抑制のための、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの使用。
【００１３】
本発明によれば、効果的に対象の出血性血管障害を予防または抑制することができる。また、本発明の組成物は、出血性脳血管障害、出血性膀胱炎、出血性胃潰瘍、および出血性腸炎からなる群から選択される少なくとも一種の出血性血管障害を予防または抑制することができる上で有利である。さらに、本発明の組成物は、神経障害、好ましくは脳神経障害の予防または抑制において有利に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（ａ）コラゲナーゼ添加または非添加の、アドニキサンチン含有培地群および対照培地群における、ヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）の総細胞数に対するＰＩ陽性細胞の割合を示すグラフである。図中、Ｃｏｎは対照（対照培地・コラゲナーゼ非添加群）、Ｖｅｈは陰性対照としてのビヒクル（対照培地・コラゲナーゼ添加群）を示す。（ｂ）コラゲナーゼ添加または非添加の、アドニルビン含有培地群および対照培地群における、ヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）の総細胞数に対するＰＩ陽性細胞の割合を示すグラフである。図中、Ｃｏｎは対照（対照培地・コラゲナーゼ非添加群）、Ｖｅｈは陰性対照としてのビヒクル（対照培地・コラゲナーゼ添加群）を示す。
【図２】上段はコラゲナーゼ添加または非添加の、アドニキサンチン含有培地群またはアドニルビン含有培地群および対照培地群におけるヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）における各種タンパク質の発現をウエスタンブロット法により確認した結果を示す。下段は各種タンパク質の発現量の比を示すグラフである。ここで、対照培地・コラゲナーゼ非添加群（以下、対照ともいう）における発現量の比の平均値を１とする。（ａ）上段はｐＥＲＫ、ｔＥＲＫおよびβ−アクチンの発現を、ウエスタンブロット法により確認した結果を示す。下段はｔＥＲＫに対するｐＥＲＫの比（ｐＥＲＫ／ｔＥＲＫ）を示すグラフである。図中、Ｃｏｎは対照（対照培地・コラゲナーゼ非添加群）、Ｖｅｈは陰性対照としてのビヒクル（対照培地・コラゲナーゼ添加群）を示す。（ｂ）上段はＶＥ−カドヘリンおよびβ−アクチンの発現を、ウエスタンブロット法により確認した結果を示す。下段はβ−アクチンに対するＶＥ−カドヘリンの比（ＶＥ−カドヘリン／β−アクチン）を示すグラフである。図中、Ｃｏｎは対照（対照培地・コラゲナーゼ非添加群）、Ｖｅｈは陰性対照としてのビヒクル（対照培地・コラゲナーゼ添加群）を示す。（ｃ）上段はｐＥＲＫ、ｔＥＲＫおよびβ−アクチンの発現を、ウエスタンブロット法により確認した結果を示す。下段はｔＥＲＫに対するｐＥＲＫの比（ｐＥＲＫ／ｔＥＲＫ）を示すグラフである。図中、Ｃｏｎは対照（対照培地・コラゲナーゼ非添加群）、Ｖｅｈは陰性対照としてのビヒクル（対照培地・コラゲナーゼ添加群）を示す。
【図３】ヘモグロビン添加または非添加の、アドニキサンチン含有培地群、アドニルビン含有培地群および対照培地群における、ヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）の総細胞数に対するＰＩ陽性細胞の割合を示すグラフである。図中、Ｃｏｎは対照（対照培地・ヘモグロビン非添加群）、Ｖｅｈは陰性対照としてのビヒクル（対照培地・ヘモグロビン添加群）を示す。
【図４】上段はヘモグロビン添加または非添加の、アドニキサンチン含有培地群および対照培地群におけるヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）における各種タンパク質の発現をウエスタンブロット法により確認した結果を示す図である。下段は各種タンパク質の発現量の比を示すグラフである。ここで、対照培地・ヘモグロビン非添加群における発現量の比の平均値を１とする。（ａ）上段はＶＥ−カドヘリンおよびβ−アクチンの発現を、ウエスタンブロット法により確認した結果を示す。下段はβ−アクチンに対するＶＥ−カドヘリンの比（ＶＥ−カドヘリン／β−アクチン）を示すグラフである。図中、Ｃｏｎは対照（対照培地・ヘモグロビン非添加群）、Ｖｅｈは陰性対照としてのビヒクル（対照培地・ヘモグロビン添加群）を示す。（ｂ）上段はＨＯ−１およびβ−アクチンの発現を、ウエスタンブロット法により確認した結果を示す図である。下段はβ−アクチンに対するＨＯ−１の比（ＨＯ−１／β−アクチン）を示すグラフである。図中、Ｃｏｎは対照（対照培地・ヘモグロビン非添加群）、Ｖｅｈは陰性対照としてのビヒクル（対照培地・ヘモグロビン添加群）を示す。
【図５】ＬＰＳ添加または非添加の、アドニキサンチン含有培地群、アドニルビン含有培地群および対照培地群における、ヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）の総細胞数に対するＰＩ陽性細胞の割合を示すグラフである。図中、Ｃｏｎは対照（対照培地・ＬＰＳ非添加群）、Ｖｅｈは陰性対照としてのビヒクル（対照培地・ＬＰＳ添加群）を示す。
【図６】ＬＰＳ添加または非添加の、アドニキサンチン含有培地群および対照培地群における、ヒト脳神経芽細胞腫（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞）の総細胞数に対するＰＩ陽性細胞の割合を示すグラフである。図中、Ｃｏｎは対照（対照培地・ＬＰＳ非添加群）、Ｖｅｈは陰性対照としてのビヒクル（対照培地・ＬＰＳ添加群）を示す。
【発明の具体的説明】
【００１５】
本発明の、出血性血管障害の予防または抑制のため組成物は、アドニルビンおよびアドニキサンチンから選択される一種以上のカロテノイドを含んでなることを特徴としている。
【００１６】
カロテノイド
本発明におけるカロテノイドとしては、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のものであり、例えば、アドニルビン、アドニキサンチンおよびこれら２種のカロテノイドの組み合わせが挙げられる。また、カロテノイドとしては、遊離体、脂肪酸エステル体が挙げられる。吸収性の観点から、遊離体を使用することが好ましい。カロテノイドは、光学異性体、シス-トランス異性体等の立体異性体であってもよい。さらに、これらカロテノイドは有効成分として用いることが好ましい。
【００１７】
アドニルビンの化学式は3-hydroxy-β,β-carotene-4,4’-dione （C40H5203、分子量580.853）であり、構造式は下記式で表される。
【化１】
2019172369.tif 000002
アドニルビンのシス-トランス異性体としては、シス体、トランス体またはそれらの組み合わせであってもよく、シス体としては１３−シス体を挙げることができる。
【００１８】
アドニキサンチンの化学式は3,3’-dihydroxy-β,β-carotene-4-one （C40H5403、分子量582.869）であり、構造式は下記式で表される。
【化２】
2019172369.tif 000003
アドニキサンチンの光学異性体としては、３Ｓ，３’Ｒ−アドニキサンチン、３Ｓ，３’Ｓ−アドニキサンチン、３Ｒ，３’Ｓ−アドニキサンチンおよび３Ｒ，３’Ｒ−アドニキサンチンならびにこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群から選ばれる少なくとも１つを挙げることができ、好ましくは、３Ｓ，３’Ｒ−アドニキサンチンである。また、アドニキサンチンのシス-トランス異性体としては、シス体、トランス体またはそれらの組み合わせであってもよい。アドニキサンチンのシス-トランス異性体として、好ましくは、シス体およびトランス体の組み合わせである。
【００１９】
本発明において、カロテノイドは、薬学的に許容可能な塩の形態であってもよく、これらの塩も本発明におけるカロテノイドに含まれる。本発明において、カロテノイドは、酸または塩基と塩を形成する場合もある。本発明において、薬学的に許容可能な塩は、アドニルビンおよび／またはアドニキサンチンと薬学的に許容可能な塩を形成するものであれば特に限定されない。具体的には、例えば、ハロゲン化水素酸塩（例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩等）、無機酸塩（例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩等）、有機カルボン酸塩（例えば酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩等）、有機スルホン酸塩（例えばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩等）、アミノ酸塩（例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩、カルシウム塩等）等が挙げられるが、これに限定されない。
【００２０】
本発明のカロテノイドは、市販品であってもよく、あるいは従来の化学合成法により製造された化学合成品、微生物による発酵法、または動物もしくは植物等からの抽出および精製方法等により製造されたもの（天然由来）（微生物、動物または植物由来物ともいう）を使用することができる。ここで、微生物、動物または植物由来物とは、微生物、動物または植物から得られる産生物であり、好ましくは、パラコッカス属微生物由来物、より好ましくはパラコッカス・カロティニファシエンス由来物であってよい。
【００２１】
例えば、微生物からのアドニルビンおよびアドニキサンチンの抽出および精製方法として下記の方法が挙げられる。パラコッカス・カロティニファシエンス（Paracoccus carotinifaciens）の乾燥菌体を、アセトンを使用する室温抽出に供し、抽出液をエバポレーターで濃縮し、濃縮液が二層に分離したところで濃縮物にヘキサン−クロロホルム（１：１）混合液を加えて良く混和した後、分液操作により有機溶媒層を得る。前記有機溶媒層をエバポレーターで濃縮乾固する。濃縮乾固物をクロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムにて各カロテノイドを分離する。例えばアセトン：ヘキサン（３：７）３００ｍＬで溶出する画分をさらにＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＰＲＣ−ＳＩＬ（株式会社島津製作所）、アセトン：ヘキサン（３：７））で精製することでアドニルビン遊離体を得ることができる。また、アセトンで溶出する画分をさらにＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＰＲＣ−ＳＩＬ、アセトン：ヘキサン（４：６））で精製することで、アドニキサンチン遊離体を得ることができる。
【００２２】
さらに、本発明の組成物においては、本発明のカロテノイドとしてのアドニルビンおよびアドニキサンチンに加えてアスタキサンチンを含むカロテノイド混合物を使用してもよい。上記カロテノイド混合物は、カンタキサンチン、アステロイデノン、β−カロテン、エキネノンおよび３−ヒドロキシエキエノンをさらに含むことが好ましい。例えば、特開２００７−２６１９７２号公報、特開２００９−５０２３７号公報に記載の方法に準じてパラコッカス・カロティニファシエンスの乾燥菌体から抽出したカロテノイド混合物は、アスタキサンチン、アドニルビンおよびアドニキサンチンを含み、好ましくはカンタキサンチン、アステロイデノン、β−カロテン、エキネノンおよび３−ヒドロキシエキエノンをさらに含む。
【００２３】
本発明の組成物におけるカロテノイドの含有量は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、組成物全体に対し、例えば、０．０１〜５０質量％が挙げられ、好ましくは０．０５〜４０質量％、より好ましくは０．０７〜３０質量％、さらに好ましくは０．１〜２０質量％である。本発明の組成物におけるアドニルビンおよび／またはアドニキサンチンの含有量の測定は、ＨＰＬＣ法により、Toxicol Rep. 2014 Aug 25;1:582-588.の記載に準じて実施される。
【００２４】
本発明の組成物は、上記カロテノイドと共に、所望により経口上許容可能または薬学的に許容可能な添加剤を配合した組成物として提供することができる。上記添加剤として、溶剤、溶解補助剤、溶解剤、滑沢剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、保存剤、防腐剤、界面活性剤、調整剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、賦形剤、増粘剤、着色剤、芳香剤または香料等が挙げられる。
【００２５】
本発明の組成物は、上記カロテノイドおよび所望により経口上許容可能または薬学的に許容可能な添加剤を混合、溶解、分散、懸濁するなどの公知の手法により、調製することができる。また、本発明の組成物の調製においては、本発明の効果を妨げない限り、上記手法により調製された混合物、溶解物、分散物、懸濁物などに、均質化処理や殺菌処理を施してもよい。
【００２６】
また、本発明の組成物の形態は、本発明の効果を妨げない限り、特に制限されず、固形状、半固形状（ペースト、ゲルを含む）または液状（油状、スラリー状を含む）であってもよいが、固形状または液状であることが好ましい。
【００２７】
また、本発明の組成物の剤形は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、注射剤、錠剤（例えば、裸錠、糖衣錠、フィルムコーティング錠、腸溶錠、徐放錠、口腔内崩壊錠、舌下錠、チュアブル錠等）、カプセル剤（例えば、硬カプセル、軟カプセル）、エリキシル剤、丸剤、粉剤、散剤、顆粒剤、水剤、トローチ剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、乳剤、懸濁剤、液剤、吸入剤、エアロゾル剤、粉末吸入剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、バップ剤、ローション剤、点滴剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。本発明の組成物の剤形は、経口摂取または投与用の剤形であることが好ましく、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、乳剤、液剤、懸濁剤、水剤、トローチ剤等が挙げられる。
【００２８】
本発明の組成物の投与または摂取方法としては、特に限定されないが、点滴、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射等の注射、経口、経粘膜、経皮、鼻腔内、口腔内等による投与または摂取が挙げられ、好ましくは、経口摂取または投与である。
【００２９】
本発明の組成物としては、食品もしくは飲料等の飲食品、飲食品添加物、飼料、医薬品、医薬部外品、または化粧料が挙げられ、摂取の簡便性の観点から飲食品が好ましい。
【００３０】
本発明の飲食品は、本発明の組成物をそのまま飲食品として調製したもの、各種タンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、他の有効成分（例えば、乳酸菌、バチルス属菌（Bacillus）等の細菌、酵母等の真菌、食物繊維、ＤＨＡまたはＥＰＡ）等を更に配合したもの、本発明の組成物を溶液状等の液状、半液体状または固体状にしたものでよく、また、本発明の組成物を一般の飲食品へ添加したものであってもよい。
【００３１】
上記飲食品としては、具体的には、例えば、即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品等の即席食品類；清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、アルコール飲料等の飲料類；栄養ドリンク；パン、パスタ、麺、ケーキミックス、パン粉等の小麦粉製品；飴、グミ、ゼリー、キャラメル、チューイングガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、デザート菓子等の菓子類；栄養バー；ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、たれ類、ドレッシング類、つゆ類、カレー・シチューの素類等の調味料；加工油脂、バター、マーガリン、マヨネーズ等の油脂類；乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、アイスクリーム類、クリーム類等の乳製品；農産缶詰、ジャム・マーマレード類、シリアル等の農産加工品；ハム、ベーコン、ソーセージ、焼き豚等の畜肉加工食品：冷凍食品等を例示することができるが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明の飲食品には、健康食品、サプリメント、機能性食品（例えば、特定保健用食品、栄養機能食品または機能性表示食品を含む）、栄養補助食品、特別用途食品（例えば、病者用食品、乳児用調製粉乳、妊産婦、授乳婦用粉乳またはえん下困難者・咀嚼困難者用食品を含む）または乳児用液体調製乳（乳児用液体ミルクともいう）も包含される。後述のように、本発明の組成物は出血性血管障害の予防または抑制作用、神経障害の予防または抑制作用を有することから、出血性血管障害の予防または抑制のための飲食品、神経障害の予防または抑制のための飲食品が提供される。すなわち、本発明の飲食品は、血圧または動脈硬化が気になるヒトのための飲食品として提供できる。さらに、機能性食品等の飲食品において、「血圧が高めの方に」、「動脈硬化がある方に」、「血管年齢を若返らせるための」、「血管を強くするための」、「脳血管を強くするための」等の表示を付して提供してもよい。
【００３３】
本発明の組成物の摂取量または投与量は、特に限定されず、組成物の処方、カロテノイドの種類、純度、対象の種類、対象の年齢または体重、症状、摂取または投与時間、組成物の形態、摂取または投与方法、他のカロテノイドまたは薬剤の組み合わせ等に依存して決定できる。また、本発明の組成物は、出血性血管障害または神経障害の予防または抑制のための有効量となるように、１日の摂取量単位の形態から構成されることが好ましい。例えば、本発明の組成物を経口摂取する場合、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドが体重６０ｋｇの成人１人１日当たり０．０１〜１００００ｍｇ、好ましくは０．１〜１０００ｍｇ、より好ましくは１〜１００ｍｇの範囲の摂取量または投与量となるように該カロテノイドを組成物に配合することができる。本発明のカロテノイドと組み合わせて用いる他のカロテノイドまたは薬剤も、それぞれ臨床上用いられる摂取量または投与量を基準として適宜決定できる。
【００３４】
また、本発明の組成物の１日の摂取量または投与量は、上述の組成物の摂取量または投与量と同様、組成物の処方等に応じて適宜選択されるものである。本発明の組成物の１日の摂取量または投与量は、例えば１回または複数回で対象に摂取させるかまたは投与してもよいが、１回で対象に摂取させるかまたは投与することが好ましい。したがって、本発明の組成物の１日の摂取または投与回数は、１日に１〜５回であり、好ましくは、１日に１〜３回であり、より好ましくは、１日に１回である。
【００３５】
一つの態様によれば、本発明の組成物を適用する対象は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されないが、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒト、犬、猫である。当該対象は健常者（健常動物）であっても患者（患者動物）であってもよい。
【００３６】
本発明の組成物によれば、血管内皮細胞、好ましくは脳血管内皮細胞の細胞死を抑えることができ、出血、好ましくは脳出血の発症頻度を減らすことができる。したがって、本発明の組成物によれば、出血性血管障害を予防するかまたは抑制することが可能である。したがって、本発明の一つの態様によれば、本発明の組成物は、出血性血管障害の予防または抑制のための組成物として提供される。ここで、本明細書における「障害の予防」とは、想定される悪化に対して事前に備え、障害の発生を未然に防ぐことを意味する。本明細書における「障害の抑制」とは、障害の症状の進展または悪化を抑制して病態の進行を止める、緩和するまたは遅延させることを意味する。
【００３７】
上記出血性血管障害とは、血管異常に基づく出血性障害であり、例えば、出血性脳血管障害、出血性膀胱炎、出血性胃潰瘍、出血性腸炎が挙げられ、好ましくは、出血性脳血管障害である。さらに、出血性脳血管障害としては、好適には脳出血、くも膜下出血、出血性脳梗塞が挙げられる。また、上記出血性血管障害は、細胞死に起因する障害であることが好ましい。
【００３８】
また、本発明の組成物は、好ましくは、出血性血管障害の重症度の上昇抑制または低減のために用いられる。重症度とは、各障害の評価尺度に基づく症状の程度をいう。出血性血管障害が出血性脳血管障害である場合の重症度としては、例えば、以下の重症度分類が挙げられる：Japan Coma Scale（JCS）（太田富雄，和賀志郎，半田肇，他．急性期意識障害の新しいgradingとその表現法．（いわゆる3-3-9度方式）  第3 回脳卒中の外科研究会講演集1975；pp61-69）、Glasgow Coma Scale（GCS）（Teasdale G, Jennett B. Assessment of coma and impaired consciousness. A practical scale. Lancet 1974；2：81-84）、modified NIH Stroke Scale（NIHSS）（2001）（Lyden PD, Lu M, Levine SR, Brott TG, Broderick J：NINDS rtPA Stroke Study Group. A modified National Institutes of Health Stroke Scale for use in stroke clinical trials:preliminary reliability and validity. Stroke 2001；32：1310-1317）、Japan Stroke Scale（JSS）（第5版）（日本脳卒中学会・脳卒中重症度スケール（急性期）の発表にあたって. 脳卒中1997；19：1-5）、脳卒中運動機能障害重症度スケール（JSS-M）（日本脳卒中学会・脳卒中運動障害重症度スケール（JSS-M）の発表にあたって. 脳卒中1999；21：352-356）、脳卒中情動障害スケール（JSS-E）（日本脳卒中学会・脳卒中感情障害（うつ・情動障害）スケール. 脳卒中2003；25：205-214）、脳卒中うつスケール（JSS-D）（日本脳卒中学会・脳卒中感情障害（うつ・情動障害）スケール. 脳卒中2003；25：205-214）、脳卒中感情障害（うつ・情動障害）スケール同時評価表（JSS-DE）（日本脳卒中学会・脳卒中感情障害（うつ・情動障害）スケール. 脳卒中2003；25：205-214）、日本版modified Rankin Scale（mRS）判定基準書（van Swieten JC, Koudstaal PJ, Visser MC, Schouten HJ, van Gijn J. Interobserver agreement for the assessment of handicap in stroke patients.Stroke 1988；19：604-607、篠原幸人，峰松一夫，天野隆弘，大橋靖雄：mRS信頼性研究グループ．modified Rankin Scaleの信頼性に関する研究−日本語版判定基準書および問診表の紹介．脳卒中2007；29：6-13、Shinohara Y, Minematsu K, Amano T, Ohashi Y. Modified Rankin Scale with expanded guidance scheme and interview questionnaire: Interrater agreement and reproducibility of assessment. Cerevrovasc Dis 2006；21：271-278）、Stroke Impairment Assessment Set（SIAS）（里宇明元, 園田茂, 道免和久；千野直一編著. 脳卒中患者の機能評価−SIASとFIMの実際. Springer；1997）、Brunnstromの運動検査による回復段階（Brunnstrom S. Moter testing procedures in hemiplegia：based on sequential recovery stages. Phys Ther 1966；46：357-375、石田暉. 脳卒中後遺症の評価スケール. 脳と循環1999；4：151-159）、Barthel Indexおよびその判定基準（Mahoney FI, Barthel DW. Functional evaluation: the Barthel Index. Md St Med J 1965；14：61-65、石田暉. 脳卒中後遺症の評価スケール. 脳と循環1999；4：151-159）。ここで、本発明における出血性脳血管障害の重症度分類としては、modified NIH Stroke Scale（NIHSS）（2001）とされる。
【００３９】
さらに、上記出血性血管障害としては、下記 (a)〜(e)の少なくとも一種に起因するものが挙げられる：
(a) 細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）、好ましくはＥＲＫ１／２、のリン酸化の増大またはリン酸化ＥＲＫの発現量の増加（好ましくは、総ＥＲＫの発現量に対するリン酸化ＥＲＫの発現量の増加）、
(b) ＥＲＫシグナル由来の細胞死、
(c) ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）の低減（好ましくは、ＨＯ−１タンパク質の発現量の低減）、
(d) 血管内皮カドヘリン（ＶＥ−カドヘリン）の低減（好ましくは、ＶＥ−カドヘリンタンパク質の発現量の低減）、
(e) コラゲナーゼにより誘導される細胞死。
【００４０】
本発明の組成物は、下記実施例に示すように、出血性血管障害における下記(i)〜(v) の少なくとも一種において使用することができる：
(i) ＥＲＫのリン酸化の低減またはリン酸化ＥＲＫの発現量の低減（好ましくは、総ＥＲＫの発現量に対するリン酸化ＥＲＫの発現量の低減）、
(ii) ＥＲＫシグナル由来の細胞死の抑制、
(iii) ＨＯ−１の増加（好ましくは、ＨＯ−１タンパク質の発現量の増加）、
(iv) ＶＥ−カドヘリンの増加（好ましくは、ＶＥ−カドヘリンタンパク質の発現量の増加）、
(v) コラゲナーゼにより誘導される細胞死の抑制。
【００４１】
したがって、本発明の別の態様によれば、本発明の組成物は、上記（a）〜（e）の少なくとも一種に起因する疾患に関し、上記(i)〜(v)の少なくとも一種において使用することができる。さらに、本発明の組成物は、上記（a）〜（e）の少なくとも一種に起因する疾患を改善することができる。本明細書における「改善」とは、確立された病態の改善という「治療」の意味を含むだけでなく、「予防」の意味も含む。
【００４２】
アドニキサンチンおよび／またはアドニルビンのメカニズムの詳細は現時点では明らかでない。しかしながら、アドニキサンチンおよび／またはアドニルビンは、血管内皮細胞における細胞死誘発性の障害に対して、ＨＯ−１の発現量を増加させるかまたはリン酸化ＥＲＫの発現量を減少させることにより、ＶＥ−カドヘリンによる細胞間結合を強化させ、血管内皮細胞へのダメージを軽減しているものと推定される。
【００４３】
また、本発明の組成物によれば、神経障害を予防するかまたは抑制することが可能である。したがって、本発明の一つの態様によれば、本発明の組成物は、神経障害の予防または抑制のための組成物として提供される。
【００４４】
上記神経障害としては、好適には脳神経障害が挙げられる。さらに、脳神経障害としては、好適にはアルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小型認知症、ハンチントン病が挙げられる。また、上記神経障害は、細胞死に起因する障害であることが好ましい。
【００４５】
さらに、本発明の組成物によれば、対象が出血性血管障害（好ましくは出血性脳血管障害）に罹患した場合においても、神経細胞（好ましくは脳神経細胞）の保護効果により、神経障害（好ましくは脳神経障害）を予防または抑制することが可能である。
したがって、上記神経障害は、上記出血性血管障害に由来する障害、例えば、上記出血性血管障害の合併症であってよく、さらに、上記神経障害は血管障害により漏出した血液成分による障害であってよい。
【００４６】
また、本発明の組成物は、好ましくは、神経障害の重症度の上昇抑制または低減のために用いられる。神経障害が脳神経障害である場合の重症度としては、例えば、以下の重症度分類が挙げられる：Japan Coma Scale（JCS）（太田富雄，和賀志郎，半田肇，他．急性期意識障害の新しいgradingとその表現法．（いわゆる3-3-9度方式）  第3 回脳卒中の外科研究会講演集1975；pp61-69）、Glasgow Coma Scale（GCS）（Teasdale G, Jennett B. Assessment of coma and impaired consciousness. A practical scale. Lancet 1974；2：81-84）、modified NIH Stroke Scale（NIHSS）（2001）（Lyden PD, Lu M, Levine SR, Brott TG, Broderick J：NINDS rtPA Stroke Study Group. A modified National Institutes of Health Stroke Scale for use in stroke clinical trials:preliminary reliability and validity. Stroke 2001；32：1310-1317）、Japan Stroke Scale（JSS）（第5版）（日本脳卒中学会・脳卒中重症度スケール（急性期）の発表にあたって. 脳卒中1997；19：1-5）、脳卒中運動機能障害重症度スケール（JSS-M）（日本脳卒中学会・脳卒中運動障害重症度スケール（JSS-M）の発表にあたって. 脳卒中1999；21：352-356）、脳卒中情動障害スケール（JSS-E）（日本脳卒中学会・脳卒中感情障害（うつ・情動障害）スケール. 脳卒中2003；25：205-214）、脳卒中うつスケール（JSS-D）（日本脳卒中学会・脳卒中感情障害（うつ・情動障害）スケール. 脳卒中2003；25：205-214）、脳卒中感情障害（うつ・情動障害）スケール同時評価表（JSS-DE）（日本脳卒中学会・脳卒中感情障害（うつ・情動障害）スケール. 脳卒中2003；25：205-214）、日本版modified Rankin Scale（mRS）判定基準書（van Swieten JC, Koudstaal PJ, Visser MC, Schouten HJ, van Gijn J. Interobserver agreement for the assessment of handicap in stroke patients.Stroke 1988；19：604-607、篠原幸人，峰松一夫，天野隆弘，大橋靖雄：mRS信頼性研究グループ．modified Rankin Scaleの信頼性に関する研究−日本語版判定基準書および問診表の紹介．脳卒中2007；29：6-13、Shinohara Y, Minematsu K, Amano T, Ohashi Y. Modified Rankin Scale with expanded guidance scheme and interview questionnaire: Interrater agreement and reproducibility of assessment. Cerevrovasc Dis 2006；21：271-278）、Stroke Impairment Assessment Set（SIAS）（里宇明元, 園田茂, 道免和久；千野直一編著. 脳卒中患者の機能評価−SIASとFIMの実際. Springer；1997）、Brunnstromの運動検査による回復段階（Brunnstrom S. Moter testing procedures in hemiplegia：based on sequential recovery stages. Phys Ther 1966；46：357-375、石田暉. 脳卒中後遺症の評価スケール. 脳と循環1999；4：151-159）、Barthel Indexおよびその判定基準（Mahoney FI, Barthel DW. Functional evaluation: the Barthel Index. Md St Med J 1965；14：61-65、石田暉. 脳卒中後遺症の評価スケール. 脳と循環1999；4：151-159）。ここで、本発明における脳神経障害の重症度分類としては、modified NIH Stroke Scale（NIHSS）（2001）とされる。
【００４７】
本発明の別の態様によれば、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドを有効量含んでなる組成物を対象に投与することまたは摂取させることを含んでなる、対象の出血性血管障害を予防するかまたは抑制する方法が提供される。本発明のさらに別の態様によれば、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの有効量を、それを必要とする対象に投与することまたは摂取させることを含んでなる、対象の出血性血管障害を予防するかまたは抑制する方法が提供される。ここで、「有効量」とは、１日の摂取量単位における、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの含有量等と同様に設定することができる。上記出血性血管障害としては、出血性脳血管障害、出血性膀胱炎、出血性胃潰瘍、または出血性腸炎が挙げられ、出血性脳血管障害が好ましい。さらに、出血性脳血管障害としては、好適には脳出血、くも膜下出血、または出血性脳梗塞が挙げられる。また、上記出血性血管障害としては、下記(a)〜(e)の少なくとも一種に起因するものが挙げられる：(a) ＥＲＫのリン酸化の増大またはリン酸化ＥＲＫの発現量の増加、(b) ＥＲＫシグナル由来の細胞死、(c) ＨＯ−１の低減、(d) ＶＥ−カドヘリンの低減、(e) コラゲナーゼにより誘導される細胞死。本発明のさらに別の態様によれば、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドを有効量含んでなる組成物を対象に投与することまたは摂取させることを含んでなる、対象における、下記(i)〜(v)の少なくとも一種の方法が提供される： (i) ＥＲＫのリン酸化の低減またはリン酸化ＥＲＫの発現量の低減方法、(ii) ＥＲＫシグナル由来の細胞死の抑制方法、(iii) ＨＯ−１の増加方法、(iv) ＶＥ−カドヘリンの増加方法、および(v) コラゲナーゼにより誘導される細胞死の抑制方法。本発明のさらに別の態様によれば、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの有効量を、それを必要とする対象に投与することまたは摂取させることを含んでなる、対象における、上記(i)〜(v)の少なくとも一種の方法が提供される。本発明のさらに別の態様によれば、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドを有効量含んでなる組成物を対象に投与することまたは摂取させることを含んでなる、対象の神経障害を予防または抑制する方法が提供される。本発明のさらに別の態様によれば、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの有効量を、それを必要とする対象に投与することまたは摂取させることを含んでなる、対象の神経障害を予防または抑制する方法が提供される。上記神経障害としては、好適には、脳神経障害が挙げられる。さらに、脳神経障害としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小型認知症、ハンチントン病が挙げられる。本発明のさらに別の態様によれば、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドを有効量含んでなる組成物を対象に投与することまたは摂取させることを含んでなる、上記（a）〜（e）の少なくとも一種に起因する疾患を改善する方法が提供される。本発明のさらに別の態様によれば、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの有効量を、それを必要とする対象に投与することまたは摂取させることを含んでなる、対象における、上記（a）〜（e）の少なくとも一種に起因する疾患を改善する方法が提供される。本発明のさらに別の態様によれば、上述の、出血性血管障害を予防または抑制する方法、(i)〜(v)の少なくとも一種の方法、神経障害を予防または抑制する方法、上記（a）〜（e）の少なくとも一種に起因する疾患を改善する方法は、対象が健常者である場合、ヒトに対する医療行為を除く非治療的方法とされる。ここで、ヒトに対する医療行為とは、医師等の処方を必要として、ヒトに対して医薬品を摂取させる（投与する）行為等を意味する。本発明の、出血性血管障害を予防または抑制する方法、(i)〜(v)の少なくとも一種の方法、神経障害を予防または抑制する方法、上記（a）〜（e）の少なくとも一種に起因する疾患を改善する方法は、本発明の組成物について、本明細書に記載された内容に従って実施することができる。
【００４８】
また、本発明の別の態様によれば、出血性血管障害の予防または抑制のための、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの使用が提供される。本発明のさらに別の態様によれば、下記(i)〜(v)の少なくとも一種のための、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの使用が提供される： (i) ＥＲＫのリン酸化の低減またはリン酸化ＥＲＫの発現量の低減、(ii) ＥＲＫシグナル由来の細胞死の抑制、(iii) ＨＯ−１の増加、(iv) ＶＥ−カドヘリンの増加、および(v) コラゲナーゼにより誘導される細胞死の抑制。本発明のさらに別の態様によれば、神経障害の予防または抑制のための、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの使用が提供される。本発明のさらに別の態様によれば、下記（a）〜（e）の少なくとも一種に起因する疾患を改善するための、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの使用が提供される： (a) ＥＲＫのリン酸化の増大またはリン酸化ＥＲＫの発現量の増加、(b) ＥＲＫシグナル由来の細胞死、(c) ＨＯ−１の低減、(d) ＶＥ−カドヘリンの低減、(e) コラゲナーゼにより誘導される細胞死。
【００４９】
また、本発明の別の態様によれば、出血性血管障害の予防または抑制のための組成物の製造における、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの使用が提供される。本発明の別の態様によれば、神経障害の予防または抑制のための組成物の製造における、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドの使用が提供される。
【００５０】
また、本発明の別の態様によれば、出血性血管障害の予防または抑制のための、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドが提供される。本発明の別の態様によれば、神経障害の予防または抑制のための、アドニルビン、アドニキサンチンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される一種以上のカロテノイドが提供される。
【００５１】
上記の使用、化合物（カロテノイド）の態様は何れも、本発明の組成物または方法に関する記載に準じて実施することができる。
【実施例】
【００５２】
以下、調製例、試験例により、本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術範囲は、これらの例示に限定されるものではない。なお、特に記載しない限り、本発明で用いられる全部のパーセンテージや比率は質量による。また、特に記載しない限り、本明細書に記載の単位や測定方法はJIS規格による。【００５３】
調製例１：アドニキサンチン、アドニルビンおよびアスタキサンチンの調製
特開２０１２−１５８５６９号公報に記載の方法に準じて、アドニルビン遊離体およびアドニキサンチン遊離体の調製を行った。以下に簡単に記載する。
パラコッカス・カロティニファシエンス(Paracoccus carotinifaciens)の乾燥菌体を、アセトンを使用する室温抽出に供した。得られた抽出液をエバポレーターで濃縮し、濃縮液が二層に分離したところで濃縮物にヘキサン-クロロホルム（１：１）混合液を加えて良く混和した後、分液操作により有機溶媒層を得た。
得られた有機溶媒層をエバポレーターで濃縮乾固した。濃縮乾固物をクロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムにて各カロテノイドを分離した。具体的には、アセトン：ヘキサン（３：７）３００ｍＬで溶出する画分をさらにＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＰＲＣ−ＳＩＬ（株式会社島津製作所）、アセトン：ヘキサン（３：７））で精製し、アドニルビン遊離体（以下、単にアドニルビンともいう）を得た。また、アセトン：ヘキサン（５：５）で溶出する画分を濃縮し、４℃で放置することで、アスタキサンチン遊離体を結晶として得た（以下、単にアスタキサンチンともいう）。アセトンで溶出する画分をさらにＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＰＲＣ−ＳＩＬ、アセトン：ヘキサン（４：６））で精製し、アドニキサンチン遊離体（以下、単にアドニキサンチンともいう）を得た。【００５４】
調製例２：アドニキサンチン含有培地、アドニルビン含有培地およびアスタキサンチン含有培地の調製
調製例１で得られたアドニキサンチン、アドニルビンまたはアスタキサンチンをＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、ナカライテスク社）に溶解させた。その後、上記アドニキサンチン、アドニルビンまたはアスタキサンチンをそれぞれ０．１μＭ、０．３μＭ、または１μＭとなるように、ＥＢＭ−２（ＬＯＮＺＡ社）培地中または１％もしくは１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＶＡＬＥＡＮＴ社）含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、ナカライテスク社）中に添加し、アドニキサンチン含有培地、アドニルビン含有培地またはアスタキサンチン含有培地を得た。対照培地としてはアドニキサンチン、アドニルビンおよびアスタキサンチンを含まないＥＢＭ−２培地または１％もしくは１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。なお、ヒト脳毛細血管内皮細胞の培養にはＥＢＭ−２培地を、ヒト脳神経芽細胞腫の培養には１％または１０％ウシ胎仔血清含有ダルベッコ変法イーグル培地を用いた。【００５５】
試験例１：ヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）におけるアドニキサンチン、アドニルビンのコラゲナーゼ誘発細胞死の抑制効果の検討
（ａ）アドニキサンチンの抑制効果の検討
ＥＢＭ−２培地  １００μＬを入れた９６ウェルプレート（ＦＡＬＣＯＮ社）に４９５０細胞／ウェルとなるようにヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）（Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ、ＤＳファーマバイオメディカル社）を播種し、コンフルエントになるまで、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。その後、上記培地を調製例２で得た０．１μＭ、０．３μＭ、もしくは１μＭのアドニキサンチン含有培地または対照培地  １００μＬに交換した。２４時間後に、培地を、３０Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ（シグマアルドリッチ社）を含む０．１μＭ、０．３μＭ、もしくは１μＭのアドニキサンチン含有培地または対照培地に交換した。前記培地の量は１ウェルあたり１００μＬであった。４時間コラゲナーゼに暴露した後、ヘキスト３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）染色による細胞死評価を行った（ｎ＝６）。具体的には、８μＭのヘキスト３３３４２と２μＭのＰＩとの存在下で３７℃にて１５分間培養した。その後、ヘキスト陽性細胞およびＰＩ陽性細胞をオリンパスＩＸ７０倒立落射蛍光顕微鏡（オリンパス社）を用いて撮影した。その後、解析ソフトＩｍａｇｅＪを用いて総細胞およびＰＩ陽性細胞数を計測した。視野中の総細胞数に対するＰＩ陽性細胞数の割合を死細胞の割合として表した。１ウェルあたり２枚の代表的視野を記録した。【００５６】
細胞死の評価結果を図１（ａ）に示す。測定値は平均値±標準誤差で表した。図１（ａ）に示される通り、アドニキサンチン含有培地群はいずれの濃度においても対照培地・コラゲナーゼ添加群と比較して有意に細胞死を抑制した（＊＊：p<0.01 vs 対照培地・コラゲナーゼ非添加群（Ｗｅｌｃｈのｔ検定）、＃：p<0.05 vs 対照培地・コラゲナーゼ添加群（ダネットの検定）、＃＃：p<0.01 vs 対照培地・コラゲナーゼ添加群（ダネットの検定））。【００５７】
（ｂ）アドニルビンの抑制効果の検討
アドニキサンチンをアドニルビンとする以外は試験例１（ａ）と同様に行った。
細胞死の評価結果を図１（ｂ）に示す。測定値は平均値±標準誤差で表した。図１（ｂ）に示される通り、アドニルビンはいずれの濃度においても対照培地・コラゲナーゼ添加群と比較して有意に細胞死を抑制した（＊＊：p<0.01 vs 対照培地・コラゲナーゼ非添加群（Ｗｅｌｃｈのｔ検定）、＃：p<0.05 vs 対照培地・コラゲナーゼ添加群（ダネットの検定）、＃＃：p<0.01 vs 対照培地・コラゲナーゼ添加群（ダネットの検定））。【００５８】
（ｃ）アスタキサンチンの抑制効果の検討
アドニキサンチンをアスタキサンチンとし、アスタキサンチンの濃度を０．１μＭ、０．３μＭとする以外は試験例１（ａ）と同様に行った。細胞死を評価した結果、アスタキサンチンはいずれの濃度においても対照培地・コラゲナーゼ添加群と比較して有意な差を示さないものであった。【００５９】
試験例２：コラゲナーゼ処理したヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）におけるアドニキサンチン、アドニルビン添加による各種タンパク質発現量の検討
（ａ）アドニキサンチン添加によるＥＲＫ、ＨＯ−１、ＶＥ−カドヘリンの発現量の検討
ＥＢＭ−２（ＬＯＮＺＡ社）培地５００μＬを入れた２４ウェルプレート（ＦＡＬＣＯＮ社）に５０，０００細胞／ウェルとなるようにヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）（Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ、ＤＳファーマバイオメディカル社）を播種し、コンフルエントになるまで、５％ＣＯ２雰囲気下３７℃で培養した。その後、培地を調製例２で得た１μＭのアドニキサンチン含有培地または対照培地５００μＬに交換した。２４時間後に、培地を、３０Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ（シグマアルドリッチ社）を含む１μＭのアドニキサンチン含有培地または対照培地に交換した。前記培地の量は１ウェルあたり５００μＬであった。４時間コラゲナーゼに暴露した後、サンプリングを行い、ウエスタンブロット法によりタンパク質発現量を確認した。【００６０】
具体的には、サンプリングにより得られた細胞を、１％プロテアーゼ阻害剤カクテルおよび１％のホスファターゼ阻害剤カクテル２および３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含む放射免疫沈降アッセイ緩衝液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で溶解し、回収した。その後、溶解したサンプルを１５，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミン標準を用いたＰｒｏｔｅｉｎアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて測定した。得られた細胞抽出液は、常法に従ってＳＤＳサンプルバッファー中で５分間煮沸し、２０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドグラジエントゲル電気泳動にかけ、次いでポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に転写した。タンパク質を転写したＰＶＤＦ膜は、ブロッキングバッファー（５％脱脂粉乳を含むトリスリン酸緩衝液）を用いて室温で１時間ブロッキングし、その後、一次抗体を用いて２４時間インキュベートした。その後、ＰＶＤＦ膜を、洗浄バッファー（０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むトリスリン酸緩衝液）で３回洗浄し、ペルオキシダーゼ−ラベルしたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＫＰＬ社）を用いて１時間インキュベートした。最後に、ＬＡＳ−４０００  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ  （Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ社）およびＭｕｌｔｉ  ｇａｕｇｅ  ｖｅｒ．  ３．０．（Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ社）を用いて化学発光法によりシグナルの検出および解析を行った。ここで、一次抗体には、抗総ＥＲＫ（ｔＥＲＫ）抗体（ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ  （Ｅｒｋ１／２）  Ａｎｉｔｂｏｄｙ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗リン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）抗体（Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ  （Ｅｒｋ１／２）  （Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＶＥ−カドヘリン抗体（Ｒａｂｂｉｔ  ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｂｃａｍ社）を使用した。また、対照の一次抗体として抗β−アクチン抗体（Mouseβ-actin antibody、シグマアルドリッチ社）を使用した。その後、検出したシグナルの濃度を、ｔＥＲＫ、βアクチンにより補正した（ｐＥＲＫ／ｔＥＲＫ、ＶＥ−カドヘリン／βアクチンの算出）。【００６１】
ウェスタンブロッティングの結果を図２（ａ）〜（ｃ）に示す。図２（ａ）に示される通り、アドニキサンチンはＥＲＫのリン酸化を有意に抑制した（＊：p<0.05 vs 対照培地・コラゲナーゼ非添加群（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）、＃：p<0.05 vs 対照培地・コラゲナーゼ添加群（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定））。図２（ｂ）に示される通り、アドニキサンチンはＶＥ−カドヘリンの発現量を有意に増加させた（＃：p<0.05 vs 対照培地・コラゲナーゼ添加群（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定））。【００６２】
（ｂ）アドニルビン添加によるＥＲＫの発現量の検討
アドニキサンチンをアドニルビンとする以外は試験例２（ａ）と同様に行った。
細胞死の評価結果を図２（ｃ）に示す。測定値は平均値±標準誤差で表した。図２（ｃ）に示される通り、アドニルビンはＥＲＫのリン酸化を有意に抑制した。（＊：p<0.05 vs 対照培地・コラゲナーゼ非添加群（Ｗｅｌｃｈのｔ検定）、＃：p<0.05 vs 対照培地・コラゲナーゼ添加群（Ｗｅｌｃｈのｔ検定））。【００６３】
試験例３：ヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）におけるアドニキサンチン、アドニルビンのヘモグロビン誘発細胞死の抑制効果の検討
ＥＢＭ−２（ＬＯＮＺＡ社）培地１００μＬを入れた９６ウェルプレート（ＦＡＬＣＯＮ社）に４９５０細胞／ウェルとなるようにヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）（Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ、ＤＳファーマバイオメディカル社）を播種し、コンフルエントになるまで、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。その後、上記培地を調製例２で得た１μＭアドニキサンチン含有培地、１μＭアドニルビン含有培地または対照培地１００μＬに交換した。２４時間後に、培地を、１０μＭのヘモグロビン（シグマアルドリッチ社）を含む、１μＭアドニキサンチン含有培地、１μＭアドニルビン含有培地または対照培地に交換した。前記培地の量は１ウェルあたり１００μＬであった。４時間ヘモグロビンに暴露した後、試験例１と同様にヘキスト３３３４２／ＰＩ染色による細胞死評価を行った（ｎ＝６）。【００６４】
細胞死の評価結果を図３に示す。測定値は平均値±標準誤差で表した。図３に示される通り、アドニキサンチンおよびアドニルビンは対照培地・ヘモグロビン添加群と比較して有意に細胞死を抑制した（＊＊：p<0.01 vs 対照培地・ヘモグロビン非添加群（チューキーの検定）、＃：p<0.05 vs 対照培地・ヘモグロビン添加群（チューキーの検定）、＃＃：p<0.01 vs 対照培地・ヘモグロビン添加群（チューキーの検定））。【００６５】
試験例４：ヘモグロビン処理したヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）におけるアドニキサンチン添加によるＨＯ−１、ＶＥ−カドヘリンの発現量の検討
ヘモグロビンの添加を１μＭアドニキサンチン含有培地または対照培地に交換してから６時間後とする以外は試験例３と同様に行った。その後、試験例２と同様にサンプリングを行い、ウエスタンブロット法によりタンパク質発現量を確認した（ｎ＝４）。具体的には、サンプリングにより得られた細胞を１％プロテアーゼ阻害剤カクテルおよび１％のホスファターゼ阻害剤カクテル２および３を含む放射免疫沈降アッセイ緩衝液で溶解し、回収した。その後、溶解したサンプルを１５，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミン標準を用いたＰｒｏｔｅｉｎアッセイキットを用いて測定した。得られた細胞抽出液は、常法に従ってＳＤＳサンプルバッファー中で５分間煮沸し、２０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドグラジエントゲル電気泳動にかけ、次いでポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に転写した。タンパク質を転写したＰＶＤＦ膜は、ブロッキングバッファー（５％脱脂粉乳を含むトリスリン酸緩衝液）を用いて室温で１時間ブロッキングし、その後、一次抗体を用いて２４時間インキュベートした。その後、ＰＶＤＦ膜は、洗浄バッファー（０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むトリスリン酸緩衝液）で３回洗浄し、ペルオキシダーゼ−ラベルしたヤギ抗ラビットＩｇＧ抗体（ＫＰＬ社）を用いて１時間インキュベートした。最後に、ＬＡＳ−４０００  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ  （Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ社）およびＭｕｌｔｉ  ｇａｕｇｅ  ｖｅｒ．  ３．０．（Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ社）を用いて製造者マニュアルに従ってシグナルの検出および解析を行った。ここで、一次抗体には、抗ＨＯ−１抗体（Ｒａｂｂｉｔ  ＨＯ−１  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＶＥ−カドヘリン抗体（Ｒａｂｂｉｔ  ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｂｃａｍ社）を使用した。また、対照として抗β−アクチン抗体を用いた。その後、検出したシグナルの濃度をβアクチンにより補正した（ＨＯ−１／βアクチン、ＶＥ−カドヘリン／βアクチンの算出）。【００６６】
ウェスタンブロッティングの結果を図４（ａ）、（ｂ）に示す。測定値は平均値±標準誤差で表した。図４（ａ）に示される通り、アドニキサンチンはＶＥ−カドヘリンの発現量を有意に増加させた（＊：p<0.05 vs 対照培地・ヘモグロビン添加群（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）、＃：p<0.05 vs 対照培地・ヘモグロビン添加群（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定））。図４（ｂ）に示される通り、アドニキサンチンはＨＯ−１の発現量を有意に増加させた（＃＃：p<0.01 vs 対照培地・ヘモグロビン添加群（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定））。【００６７】
試験例５：ヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）におけるアドニキサンチン、アドニルビンのＬＰＳ誘発細胞死の抑制効果の検討
ＥＢＭ−２（ＬＯＮＺＡ社）培地１００μＬを入れた９６ウェルプレート（ＦＡＬＣＯＮ社）に４９５０細胞／ウェルとなるようにヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＭＶＥＣｓ）を播種し、コンフルエントになるまで、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。その後、上記培地を調製例２で得た１μＭアドニキサンチン含有培地、１μＭアドニルビン含有培地または対照培地１００μＬに交換した。２４時間後に、培地を、１μＭのリポポリサッカライド（ＬＰＳ、シグマアルドリッチ社）を含む、１μＭアドニキサンチン含有培地、１μＭアドニルビン含有培地または対照培地に交換した。前記培地の量は１ウェルあたり１００μＬであった。８時間ＬＰＳに暴露した後、試験例１と同様にヘキスト３３３４２／ＰＩ染色による細胞死評価を行った（ｎ＝６）。【００６８】
細胞死の評価結果を図５に示す。測定値は平均値±標準誤差で表した。図５に示される通り、アドニキサンチンおよびアドニルビンは対照培地・ＬＰＳ添加群と比較して有意に細胞死を抑制した（＊＊：p<0.01 vs 対照培地・ＬＰＳ非添加群（チューキーの検定）、＃＃：p<0.01 vs 対照培地・ＬＰＳ添加群（チューキーの検定））。【００６９】
試験例６：ヒト脳神経芽細胞腫におけるアドニキサンチンのＬＰＳ誘発細胞死の抑制効果の検討
１０％ウシ胎仔血清含有ダルベッコ変法イーグル培地１００μＬを入れた９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルとなるようにヒト脳神経芽細胞腫（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）を播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２４時間培養した。その後、培地を調製例２で得た０．１μＭ、０．３μＭ、または１μＭのアドニキサンチンを含有する１％ＦＢＳ  ＤＭＥＭに交換した。１時間後に、培地を、１μＭのＬＰＳ（シグマアルドリッチ社）を含む、０．１μＭ、０．３μＭ、または１μＭのアドニキサンチンを含有する１％ＦＢＳ  ＤＭＥＭまたは対照培地に交換した。前記培地の量は１ウェルあたり１００μＬであった。２４時間ＬＰＳに暴露した後、試験例１と同様にヘキスト３３３４２／ＰＩ染色による細胞死評価を行った（ｎ＝６）。【００７０】
細胞死の評価結果を図６に示す。測定値は平均値±標準誤差で表した。図６に示される通り、アドニキサンチンは対照培地・ＬＰＳ添加群と比較して有意に細胞死を抑制した（＊＊：p<0.01 vs 対照培地・ＬＰＳ非添加群（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）、＃＃：p<0.01 vs 対照培地・ＬＰＳ添加群（ダネットの検定））。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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