(57)【要約】  本発明は、原料中の澱粉に放線菌由来のアミロマルターゼを作用させることを含む、澱粉含有食品の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
原料中の澱粉に放線菌由来のアミロマルターゼを作用させることを含む、澱粉含有食品の製造方法。
【請求項２】
放線菌がコリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
放線菌が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）、ストレプトマイセス・グリゼウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、及び、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）からなる群から選択される、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
澱粉含有食品が、米加工食品、小麦加工食品、ジャガイモ加工食品、トウモロコシ加工食品、タピオカ加工食品、および米、小麦、ジャガイモ、トウモロコシ、またはタピオカから抽出した澱粉の１種以上を含む加工食品からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の製造方法。
【請求項５】
澱粉含有食品が、ショ糖を含有していることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項記載の製造方法。
【請求項６】
原料中の澱粉に放線菌由来のアミロマルターゼを作用させることを含む、澱粉含有食品の製造方法であって、アミロマルターゼが、配列番号１、３、４、５、または６に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有するアミノマルターゼである、製造方法。
【請求項７】
原料中の澱粉に放線菌由来のアミロマルターゼを作用させることを含む、澱粉含有食品の物性改質方法。
【請求項８】
放線菌がコリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
放線菌が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）、ストレプトマイセス・グリゼウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、及び、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）からなる群から選択される、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
澱粉含有食品が、米加工食品、小麦加工食品、ジャガイモ加工食品、トウモロコシ加工食品、タピオカ加工食品、および米、小麦、ジャガイモ、トウモロコシ、またはタピオカから抽出した澱粉の１種以上を含む加工食品からなる群から選択される、請求項７〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
澱粉含有食品が、ショ糖を含有していることを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
原料中の澱粉に放線菌由来のアミロマルターゼを作用させることを含む、澱粉含有食品の物性改質方法であって、アミロマルターゼが、配列番号１、３、４、５、または６に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有するアミノマルターゼである、方法。
【請求項１３】
放線菌由来のアミロマルターゼを含む、澱粉含有食品の物性改質剤。
【請求項１４】
放線菌がコリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属である、請求項１３記載の剤。
【請求項１５】
放線菌が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）、ストレプトマイセス・グリゼウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、及び、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）からなる群から選択される、請求項１３又は１４記載の剤。
【請求項１６】
澱粉含有食品が、米加工食品、小麦加工食品、ジャガイモ加工食品、トウモロコシ加工食品、タピオカ加工食品、および米、小麦、ジャガイモ、トウモロコシ、またはタピオカから抽出した澱粉の１種以上を含む加工食品からなる群から選択される、請求項１３〜１５のいずれか一項記載の剤。
【請求項１７】
澱粉含有食品が、ショ糖を含有していることを特徴とする、請求項１３〜１６のいずれか一項記載の剤。
【請求項１８】
配列番号１、３、４、５、または６に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有するアミノマルターゼを含む、澱粉含有食品の物性改質剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、澱粉含有食品の製造方法等に関し、詳細には、コリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼを作用させることを含む、澱粉含有食品の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品産業分野には様々な課題が存在する。例えば、消費者の嗜好はますます多様化・高度化しており、これに伴って従前には存在しない新しい食感や風味を有した食品の開発が求められている。また、多くの食品は経時的にその品質が劣化してしまうため、かかる品質の経時劣化を低減させる手段の構築も大きな課題の一つとして挙げられる。さらには、食品原料は有限であるから、製造工程において少しでもロスの少ない製造手法の確立もまた重要な課題として認識されている。【０００３】
上述のような食品産業分野における課題の解決のための一つの選択肢として、食品の物性を酵素により改質することを特徴とする手段が報告されている。例えば、特許文献１には、β−アミラーゼを利用した食品の改質方法が開示されている。また、特許文献２には、トランスグルコシダーゼを利用した米飯食品または小麦加工食品の製造方法が開示されている。さらに特許文献３には、４−α−グルカノトランスフェラーゼを利用した、老化しにくい酵素処理澱粉粒の製造方法が開示されている。【０００４】
食品の製造に用い得る酵素の一つにアミロマルターゼが知られている。アミロマルターゼ（以下、本明細書において「ＡＭ」と称することがある）は、澱粉中のアミロースの分解およびアミロペクチン糖鎖の伸長を触媒する酵素であり、自然界に広く存在していることが知られている。アミロマルターゼを生産する生物には大腸菌などの微生物が挙げられるが、特に食品加工に利用されるものとしては、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）またはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（以下、本明細書において「Ｔｔ」と称することがある））などのサーマス属細菌由来の耐熱性アミロマルターゼが一般的である（特許文献３、特許文献４、非特許文献１）。【０００５】
コリネバクテリウム属に分類されるコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、以下、本明細書において「Ｃｇ」または「コリネ菌」と称することがある）もまたアミロマルターゼを産生する微生物であることが知られている。コリネバクテリウム・グルタミカムは、Ｌ−グルタミン酸を培地中に排出する微生物として１９５７年に日本で分離された微生物であり、ミコール酸含有放線菌群に属し、胞子形成能を持たない、非運動性、好気性のグラム陽性細菌である。現在、全世界で２００万トン以上のＬ−グルタミン酸ナトリウム（うま味成分）が当該細菌を用いた発酵法によって製造されている。また、コリネバクテリウム・グルタミカムは、グルタミン酸以外にも、リジンなどのアミノ酸や核酸、有機酸といった多数の有用物質の生産に利用されている。しかし、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のアミロマルターゼを食用澱粉または食品中の澱粉に作用させた場合の効果については知見がない。また、ストレプトマイセス属細菌（例えば、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）、ストレプトマイセス・グリゼウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）またはストレプトマイセス・バイオラセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）など）由来のアミロマルターゼが食品添加物として使用できることは知られている。ストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼとコリネバクテリウム・グルタミカム由来のアミロマルターゼとは、アミノ酸の同一性が比較的高いことが知られており（約４０％）、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のアミロマルターゼと同様の酵素特性を有すると考えられる。しかしながら、ストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼを、食用澱粉または食品中の澱粉に作用させた場合の効果についても知見はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５７１５３４６号公報
【特許文献２】特許第４４７５２７６号公報
【特許文献３】特許第５９４４８３９号公報
【特許文献４】特許第４１８７３０５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎｇｕｙｅｎ  ＤＨ．  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｃｅ  ｇｒａｉｎ  ｓｔａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｌｕｍｐ−ｆｒｅｅ  ｃｏｏｋｅｄ  ｒｉｃｅ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ｄｉｓｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ．  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ６３：  ５５−６１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
食品の改質を目的として製造工程で耐熱性酵素を使用するとき、耐熱性酵素の温度特性が課題となることがある。例えば、耐熱性酵素は、食品中の澱粉が糊化した後においてもその活性を残しているため、糊化した澱粉をも改質してしまい、焦げ付き等の問題を生ずることがある（酵素を未糊化澱粉だけに作用させることが難しい）。また、多くの耐熱性酵素は、食品製造プロセス上の保存、混合、成型過程で多く用いられる温度帯（冷蔵〜室温）において活性が低く、これらのプロセス上で作用させる場合、効果が低くなり、その結果多量の酵素添加が必要となる。さらには、酵素の耐熱性が高いと食品製造プロセス上で失活させるために高温、長時間の工程が必要となり、食品成分への影響が大きいことが予想される。また、食品の種類によっては、加熱強度が足りず酵素を失活させきれないこともある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、ＣｇＡＭが、（１）食品中の澱粉が加熱糊化する前に失活するため未糊化澱粉だけに作用すること、（２）食品製造プロセス上で多く用いられる温度帯（冷蔵〜室温）における活性がＴｔＡＭより高いこと、および、（３）加熱失活が容易であることなどを見出した。また、これらに加えて、驚くべきことに、（４）ＣｇＡＭは澱粉本来の物性を維持したまま老化による硬化を抑制できること、（５）ＣｇＡＭを添加した米飯は粘りが向上し、且つ、その粘りを維持したまま食感の経時劣化を抑制することができること、（６）ＣｇＡＭを添加した米飯は炊飯時のコゲつきの発生を顕著に低減させること、（７）ＣｇＡＭで改質したショ糖や澱粉を喫食したラットの喫食後２時間における△血糖値ＡＵＣの値は、ＴｔＡＭで改質したショ糖や澱粉を喫食したラットの喫食後２時間における△血糖値ＡＵＣよりも低いこと等、ＴｔＡＭとは全く異なる作用を呈することを見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。【００１０】
［１］原料中の澱粉に放線菌由来のアミロマルターゼを作用させることを含む、澱粉含有食品の製造方法。
［２］放線菌がコリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属である、［１］記載の製造方法。
［３］放線菌が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）、ストレプトマイセス・グリゼウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、及び、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）からなる群から選択される、［１］又は［２］記載の製造方法。
［４］澱粉含有食品が、米加工食品、小麦加工食品、ジャガイモ加工食品、トウモロコシ加工食品、タピオカ加工食品、および米、小麦、ジャガイモ、トウモロコシ、またはタピオカから抽出した澱粉の1種以上を含む加工食品からなる群から選択される、［１］〜［３］のいずれか記載の製造方法。
［５］澱粉含有食品が、ショ糖を含有していることを特徴とする、［１］〜［４］のいずれか記載の製造方法。
［６］原料中の澱粉に放線菌由来のアミロマルターゼを作用させることを含む、澱粉含有食品の製造方法であって、アミロマルターゼが、配列番号１、３、４、５、または６に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有するアミノマルターゼである、製造方法。
［７］原料中の澱粉に放線菌由来のアミロマルターゼを作用させることを含む、澱粉含有食品の物性改質方法。
［８］放線菌がコリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属である、［７］記載の方法。
［９］放線菌が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）、ストレプトマイセス・グリゼウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、及び、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）からなる群から選択される、［７］又は［８］記載の方法。
［１０］澱粉含有食品が、米加工食品、小麦加工食品、ジャガイモ加工食品、トウモロコシ加工食品、タピオカ加工食品、および米、小麦、ジャガイモ、トウモロコシ、またはタピオカから抽出した澱粉の１種以上を含む加工食品からなる群から選択される、［７］〜［９］のいずれか記載の方法。
［１１］澱粉含有食品が、ショ糖を含有していることを特徴とする、［７］〜［１０］のいずれか記載の方法。
［１２］原料中の澱粉に放線菌由来のアミロマルターゼを作用させることを含む、澱粉含有食品の物性改質方法であって、アミロマルターゼが、配列番号１、３、４、５、または６に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有するアミノマルターゼである、方法。
［１３］放線菌由来のアミロマルターゼを含む、澱粉含有食品の物性改質剤。
［１４］放線菌がコリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属である、［１３］記載の剤。
［１５］放線菌が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）、ストレプトマイセス・グリゼウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、及び、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）からなる群から選択される、［１３］又は［１４］記載の剤。
［１６］澱粉含有食品が、米加工食品、小麦加工食品、ジャガイモ加工食品、トウモロコシ加工食品、タピオカ加工食品、および米、小麦、ジャガイモ、トウモロコシ、またはタピオカから抽出した澱粉の1種以上を含む加工食品からなる群から選択される、［１３］〜［１５］のいずれか記載の剤。
［１７］澱粉含有食品が、ショ糖を含有していることを特徴とする、［１３］〜［１６］のいずれか記載の剤。
［１８］配列番号１、３、４、５、または６に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有するアミノマルターゼを含む、澱粉含有食品の物性改質剤。【００１１】
また、本発明の一態様において、本発明は以下の通りである。
[１Ａ］原料中の澱粉にコリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼを作用させることを含む、澱粉含有食品の製造方法。
[２Ａ］澱粉含有食品が、米加工食品、小麦加工食品、ジャガイモ加工食品、トウモロコシ加工食品、タピオカ加工食品、および米、小麦、ジャガイモ、トウモロコシ、またはタピオカから抽出した精製澱粉の1種以上を含む加工食品からなる群から選択される、[１Ａ]記載の製造方法。
[３Ａ］アミロマルターゼが、配列番号１、３、４、５、または６に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有するアミノマルターゼである、[１Ａ]または[２Ａ]記載の製造方法。
[４Ａ］原料中の澱粉にコリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼを作用させることを含む、澱粉含有食品の物性改質方法。
[５Ａ］澱粉含有食品が、米加工食品、小麦加工食品、ジャガイモ加工食品、トウモロコシ加工食品、タピオカ加工食品、および米、小麦、ジャガイモ、トウモロコシ、またはタピオカから抽出した精製澱粉の1種以上を含む加工食品からなる群から選択される、[４Ａ]記載の方法。
[６Ａ］アミロマルターゼが、配列番号１、３、４、５、または６に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有するアミノマルターゼである、[４Ａ]または[５Ａ]記載の方法。
[７Ａ］コリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼを含む、澱粉含有食品の物性改質剤。
[８Ａ］澱粉含有食品が、米加工食品、小麦加工食品、ジャガイモ加工食品、トウモロコシ加工食品、タピオカ加工食品、および米、小麦、ジャガイモ、トウモロコシ、またはタピオカから抽出した精製澱粉の1種以上を含む加工食品からなる群から選択される、[７Ａ]記載の剤。
[９Ａ］アミロマルターゼが、配列番号１、３、４、５、または６に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有するアミノマルターゼである、[７Ａ]または[８Ａ]記載の剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、既存の糖改質酵素とは質の異なる好ましい食感および経時的な劣化が起きにくく、さらに喫食後の血糖値を上昇させ難い澱粉含有食品を製造することができ、一部調理形態においては既存の耐熱性アミロマルターゼ特有の課題（例：調理器具への焦げ付き）を生ずることなく上記特性を備えた澱粉含有食品を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、各微生物由来のアミロマルターゼを添加した場合の、１０％澱粉ゲルのゲル強度の経時的な変化を示す図である。
【図２】図２は、各微生物由来のアミロマルターゼを添加した場合の、炊飯米のコゲの発生量を示す図である。
【図３】図３は、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のアミロマルターゼとストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼが、澱粉ゲルの物性改質において同様の効果を有することを示すグラフである。
【図４】図４は、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のアミロマルターゼとストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼは、アミロース分解において同様の作用を有することを示すグラフである。
【図５】図５は、サーマス・サーモフィルス由来のアミロマルターゼと、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のアミロマルターゼの糖鎖転移作用の違いを示す図である。
【図６】図６は、ラットを用いた、血糖値測定試験の日程を示す図である。
【図７】図７は、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のアミロマルターゼを用いてデキストリン及びショ糖を改質することにより、該成分の喫食後のラットの血糖値上昇が抑制されることを示す図（上図：△血糖値上昇曲線、下図：△血糖値ＡＵＣ）である。
【図８】図８は、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のアミロマルターゼを用いてαうるち米澱粉を改質することにより、該成分の喫食後のラットの血糖値上昇が抑制されることを示す図（上図：△血糖値上昇曲線、下図：△血糖値ＡＵＣ）である。
【図９】図９は、サーマス・サーモフィルス由来のアミロマルターゼを用いてαうるち米澱粉を改質しても、該成分の喫食後のラットの血糖値上昇は抑制されないことを示す図（上図：△血糖値上昇曲線、下図：△血糖値ＡＵＣ）である。
【図１０】図１０は、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のアミロマルターゼを添加して米飯を調理することにより、該米飯の喫食後のラットの血糖値上昇が抑制されることを示す図（上図：△血糖値上昇曲線、下図：△血糖値ＡＵＣ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
１．澱粉含有食品の製造方法
本発明は、原料中の澱粉に放線菌由来のアミロマルターゼを作用させることを含む、澱粉含有食品の製造方法（以下、「本発明の製造方法」と称することがある）を提供する。
【００１６】
アミロマルターゼ（ＥＣ番号：２．４．１．２５）は、１，４-α−グルカン鎖の一部分を、グルコースまたは別のα−グルカンの４-ＯＨ基に転移させる化学反応を触媒する酵素である。基質が十分に大きい場合、アミロマルターゼは分子内転移を生じさせ、生成物は環状構造となる。
【００１７】
本明細書において、「α−グルカン」とは、α−１，４−グルカン（マルトースを構成二糖単位とする鎖状構造の多糖類）、またはα−１，６−分岐構造を有するα−１，４−グルカンである。「α−グルカン」には、アミロース、アミロペクチン、澱粉およびグリコーゲンの他、ワキシースターチ、ハイアミロース澱粉、可溶性澱粉、デキストリン、澱粉加水分解産物、ホスホリラーゼによる酵素合成アミロペクチンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００１８】
本明細書において、「環状グルカン」とは、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状α−１，４−グルカン、ならびにα−１，４−グルコシド結合およびα−１，６−グルコシド結合の両方を有する分岐型環状グルカンを含む。「分岐型」とは、少なくとも１つのα−１，４−結合以外のグルコシド結合を有することをいう。分岐型環状グルカンの例としては、α−１，６−結合を有する分岐構造を環状構造内部に含む内分岐型環状グルカン、および環状構造に加えてさらに非環状構造部分を有する外分岐型環状グルカンなどが挙げられる。
【００１９】
本発明において用いられるアミロマルターゼは、コリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼまたはその変異体であり得る。本明細書において「コリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼ」とは、コリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属に分類される細菌（野生型または変異株のいずれであってもよい）が生産するアミロマルターゼ、或いはコリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属に分類される細菌（野生型または変異株のいずれであってもよい）のアミロマルターゼ遺伝子を利用して遺伝子工学的手法により取得したアミロマルターゼであることを意味する。従って、コリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属に分類される細菌より取得したアミロマルターゼ遺伝子（野生型または変異体のいずれであってもよい）で形質転換または形質導入した宿主により発現させた組換えアミロマルターゼタンパク質もまた、「コリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼ」に該当する。
【００２０】
本発明の製造方法において好適に用いられるアミロマルターゼの由来としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・シンナモネウス、ストレプトマイセス・グリゼウス、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス、およびストレプトマイセス・バイオラセオルバーが例示されるが、これらに限定されない。コリネバクテリウム・グルタミカム由来のアミロマルターゼとしては、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアミロマルターゼが挙げられる。ストレプトマイセス・アベルミティリス由来のアミロマルターゼとしては、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するアミロマルターゼが挙げられる。ストレプトマイセス・シンナモネウス由来のアミロマルターゼとしては、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するアミロマルターゼが挙げられる。ストレプトマイセス・グリゼウス由来のアミロマルターゼとしては、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するアミロマルターゼが挙げられる。ストレプトマイセス・バイオラセオルバー由来のアミロマルターゼとしては、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するアミロマルターゼが挙げられる。またそれらの変異体としては、配列番号１、３、４、５、または６で示されるアミノ酸配列に対して、１または複数のアミノ酸が、付加、欠失、挿入または置換されたアミノ酸配列を有するアミロマルターゼが挙げられる。１以上の変異を有するアミロマルターゼは、コリネバクテリウム・グルタミカム、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・シンナモネウス、ストレプトマイセス・グリゼウス、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス、またはストレプトマイセス・バイオラセオルバー由来の野生型のアミロマルターゼと同等（またはそれ以上）の酵素学的特性を有している限り、いかなる変異または修飾が含まれていてもよい。配列番号１、３、４、５、または６で示されるアミノ酸配列に対して１以上の変異を有するアミロマルターゼは、配列番号１、３、４、５、または６のアミノ酸配列に対して通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、なおさらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、各々対応する野生型アミロマルターゼと同等（またはそれ以上）のアミロマルターゼ活性を有する。なお、本明細書において、アミノ酸配列や塩基配列の「同一性」とは、２つの配列間で同一のアミノ酸（塩基配列を比較する場合は塩基）の出現する程度を言う。配列の「同一性」は、当業者であれば自体公知の方法により容易に決定することができる。
【００２１】
上記した配列番号１、３、４、５、または６で示されるアミノ酸配列を有するアミロマルターゼまたは配列番号１、３、４、５、または６で示されるアミノ酸配列に対して１以上の変異を有する変異型アミロマルターゼは、自体公知の方法により製造することができる。一例としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアミロマルターゼをコードする塩基配列（配列番号２）を適切な遺伝子発現ベクターに挿入し、大腸菌などの自体公知のタンパク質大量発現系において発現させ、これを適切な手段を用いて精製することにより、アミロマルターゼを調製することができる。また、変異型のアミロマルターゼであれば、まず、部位特異的変異導入などの遺伝子工学的手法を用いて配列番号２で示される塩基配列の一部を改変し、これを遺伝子発現ベクターに挿入して、大腸菌などの自体公知のタンパク質大量発現系において発現させ、精製することにより調製することができる。
【００２２】
本明細書において、アミロマルターゼの活性は次の通り測定され、且つ定義される。すなわち、０．０５％馬鈴薯澱粉および０．０５％マルトースを含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にアミロマルターゼ溶液を加え、３０℃〜７０℃（アミロマルターゼの種類によって異なり得る）の水浴中で一定時間反応させた後、９６℃で５分間加熱し反応を停止させる。この反応液０．１ｍｌとヨウ素溶液（０．０２％ヨウ素、０．２％ヨウ化カリウム）１ｍｌを混合し６００ｎｍの吸光度を測定する。酵素液の代わりにミリＱ水を混合したブランクの吸光度から酵素添加時の吸光度を減じた値を活性値とし、６００ｎｍにおける吸光度を１分間に１減ずる酵素量を１ユニット（Ｕ）とした。
【００２３】
本発明の製造方法に用いられるコリネバクテリウム・グルタミカム由来のアミロマルターゼの至適温度は３０℃〜３８℃である。また、本発明の製造方法に用いられるストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼの至適温度は４５℃〜５５℃（例、５０℃）である。なお、本明細書において「至適温度」とは、３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で、０．０５％の馬鈴薯澱粉および０．０５％のマルトースが存在する条件下、各温度において１０分間アミロマルターゼを作用させた際に最も活性が高い温度を意味する。尚、サーマス・サーモフィルス属由来のアミロマルターゼの至適温度は約７０℃である。
【００２４】
また、本発明の製造方法に用いられるコリネバクテリウム・グルタミカム由来のアミロマルターゼの至適ｐＨは、６〜７である。また、本発明の製造方法に用いられるストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼの至適ｐＨは４〜９（例えば、７）である。なお、本明細書において「至適ｐＨ」とは、３０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３〜５．５）もしくは３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６〜７）もしくは３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜１０）中で、０．１％の馬鈴薯澱粉および０．０５％のマルトースが存在する条件下、各ｐＨにおいて３７℃で１０分間アミロマルターゼを作用させた際に最も活性が高いｐＨを意味する。
【００２５】
また、本発明の製造方法に用いられるコリネバクテリウム・グルタミカム由来のアミロマルターゼの耐熱性に関し、該酵素は４０℃以下で安定である。また、本発明の製造方法に用いられるストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼの耐熱性は、５０℃以下で安定である。なお、本明細書において「耐熱性」とは、アミロマルターゼが、３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中において、１０分間の間、活性を失わないことを意味する。
【００２６】
また、本発明の製造方法に用いられるコリネバクテリウム・グルタミカム由来のアミロマルターゼのｐＨ安定性は、６〜８である。また、本発明の製造方法に用いられるストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼのｐＨ安定性は４〜９である。なお、本明細書において「ｐＨ安定性」とは、アミロマルターゼが、緩衝液（２５℃）中において、約１８時間の間、活性を失わないことを意味する。
【００２７】
本発明の製造方法において用いられるコリネバクテリウム・グルタミカム由来のアミロマルターゼまたはストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼの添加量は、所望の効果を得られる限り特に限定されないが、原料中の澱粉１ｇ当たり、通常０．００００１〜１００００Ｕ、好ましくは０．０００１〜１０００Ｕ、より好ましくは０．００１〜１００Ｕ、更に好ましくは０．０１〜１０Ｕ、特に好ましくは０．１〜１Ｕであり得る。一例として、本発明の製造方法により製造される澱粉含有食品が炊飯米である場合は、炊飯前の乾燥米１ｇに対して、通常０．００００１〜１００００Ｕ、好ましくは０．０００１〜１０００Ｕ、より好ましくは０．００１〜１００Ｕ、更に好ましくは０．０１〜１０Ｕ、特に好ましくは０．１〜１Ｕのアミロマルターゼが添加され得る。
【００２８】
また、コリネバクテリウムまたはストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼの添加時期は、所望の効果を得られる限り特に限定されない。酵素の添加時期は、製造する食品の種類およびその調理手順、使用する澱粉原料の種類、消費者の嗜好などを考慮して適宜設定すればよく、特に制限されるものではない。従って、酵素は澱粉含有食品の調理前、調理中、調理後、または喫食時前のいずれの時期においても添加し得るが、一態様として、原材料にアミロマルターゼを添加・混合して食品の製造や加工を行うか、製造や加工中の食品にアミロマルターゼを添加・混合することによって酵素を原材料中の澱粉に作用させる態様が好ましい。具体例として、炊飯米を製造する場合であれば、乾燥米を水で洗米し、洗米した米に水とコリネバクテリウムまたはストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼを混合して室温（１０℃〜３０℃）で一定時間（例えば、０．５〜２時間）静置し、その後、通常の方法で炊飯を行うことにより、本発明の所望の効果を有する炊飯米を調製することができる。
【００２９】
本発明の製造方法において、コリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼを原料中の澱粉に作用させる温度または時間は、所望の効果を得られる限り特に限定されない。酵素の作用温度は、使用する酵素の量、製造する食品の種類およびその調理手順、使用する澱粉原料の種類、消費者の嗜好などを考慮して適宜設定すればよく、特に制限されるものではない。ただし、コリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼは耐熱性細菌由来のアミロマルターゼと比較して至適温度が低い点は考慮されるべきである。従って、一態様においては、酵素添加時の食品の温度は、通常１〜１００℃、好ましくは、５〜５０℃、より好ましくは１０〜４５℃、更に好ましくは２０〜４０℃、特に好ましくは３０〜３７℃であり得る。また、酵素の作用時間も、特に制限されないが、通常０．１〜４８時間、好ましくは、０．２〜３６時間、より好ましくは０．５〜２４時間、更に好ましくは０．８〜２０時間、特に好ましくは１〜１８時間であり得る。なお、乾燥米１ｇに対して０．１〜１Ｕのアミロマルターゼを添加して炊飯米を製造する場合を例示すると、洗米した米に水とコリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼを加え、４〜４０℃で０．１〜１８時間、好ましくは、１０〜３８℃で０．２５〜６時間、より好ましくは２０〜３７℃で０．５〜１時間、酵素で米を改質した後に、通常の方法で炊飯を行うことにより、本発明の所望の効果を有する炊飯米を調製することができる。
【００３０】
本発明の製造方法において、原材料の澱粉にコリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼを作用させる際のｐＨ環境は、上述した通り当該酵素の至適ｐＨやｐＨ安定性を考慮して、必要に応じて、食品に添加可能なｐＨ調整剤を用いて、例えば、ｐＨ６〜ｐＨ７に予め調製される。
【００３１】
本発明の製造方法により製造される澱粉含有食品には、澱粉を含有するあらゆる食品が含まれる。澱粉含有食品に含まれる澱粉の由来は特に限定されず、米澱粉、麦澱粉（小麦、大麦、ライ麦等を含む）、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、トウモロコシ澱粉、大豆澱粉、およびタピオカ澱粉からなる群から選択される１以上であってよい。また、澱粉含有食品の具体例としては、例えば、米加工食品、小麦加工食品、ジャガイモ加工食品、トウモロコシ加工食品、タピオカ加工食品、および米、小麦、ジャガイモ、トウモロコシ、またはタピオカから抽出した精製澱粉の1種以上を含む加工食品が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書において、米加工食品としては、炊飯米類またはその加工品（赤飯、ピラフ、炊き込みご飯、粥、リゾット、おにぎり、寿司、餅、または餅菓子等）、米麺またはその加工品等が含まれるが、これらに限定されない。また、小麦加工食品としては、パスタ、ラーメン、うどん等の麺類、パン類、ピザ、ナン等のパン類生地、およびクッキー、ケーキ等の菓子類等が含まれるがこれらに限定されない。また、ジャガイモ加工食品としては、ポテトサラダ、フライドポテト、ボイルドポテト、マッシュポテト、およびポテトチップス等のポテトスナック類等が含まれるがこれらに限定されない。また、トウロモコシ加工食品としては、タコス、トルティーヤ、アレパ、またはその生地等が含まれるがこれらに限定されない。また、タピオカ加工食品としては、タピオカ入り蒸し団子、およびタピオカ入りプリン等が含まれるが、これらに限定されない。また、米、小麦、ジャガイモ、トウモロコシ、またはタピオカから抽出した精製澱粉の１種以上を含む加工食品としては、カマボコ、カニカマ、ソーセージ、およびハンバーグ等が含まれるがこれらに限定されない。
【００３２】
２．澱粉含有食品の物性改質方法
本発明はまた、原料中の澱粉に放線菌由来のアミロマルターゼを作用させることを含む、澱粉含有食品の物性改質方法（以下、「本発明の方法」と称することがある）を提供する。
【００３３】
本発明の方法に用いられる放線菌のアミロマルターゼ、その添加量、添加時期、反応温度、反応ｐＨ、調製方法等、あるいは、澱粉含有食品の種類等は、いずれも「１．澱粉含有食品の製造方法」において説明したものと同様である。
【００３４】
３．澱粉含有食品の物性改質剤
本発明はまた、放線菌由来のアミロマルターゼを含む、澱粉含有食品の物性改質剤（以下、「本発明の剤」と称することがある）を提供する。
【００３５】
本発明の剤に含まれる放線菌由来のアミロマルターゼ（例、コリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼ）の配合量としては、特に限定されないが、原料中の澱粉１ｇ当たり、通常０．００００１〜１００００Ｕ、好ましくは０．０００１〜１０００Ｕ、より好ましくは０．００１〜１００Ｕ、更に好ましくは０．０１〜１０Ｕ、特に好ましくは０．１〜１Ｕの割合で添加できるような配合量であれば、いかなる配合量であってもよい。
【００３６】
本発明の剤には、コリネバクテリウム属またはストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼ以外の成分が含まれていてもよい。かかる成分としては、例えば、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤および調味料等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
本発明の剤の剤型は、特に限定されず、粉末状または顆粒状等の固形状、液体状、ペースト状で有りうる。
【００３８】
その他、本発明の剤の使用条件等は、「１．澱粉含有食品の製造方法」において説明した条件を参照すれば、当業者であれば適宜設定可能である。
【００３９】
以下の実施例において本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
［実施例１］澱粉ゲルの物性への影響
米澱粉の１０％懸濁液にコリネバクテリウム・グルタミカム由来のアミロマルターゼまたはサーマス・サーモフィルス由来のアミロマルターゼ（以下、「ＣｇＡＭ」または「ＴｔＡＭ」など称することがある）を、５０Ｕ／ｇ澱粉で添加し、撹拌しながら３７℃で１時間反応させた。次いで、９８℃で１０分間加熱し、その後５０℃まで冷却した後に、冷却後の澱粉ゲルをプラスチック製円筒形チューブを用いて直径５ｍｍ、高さ２０ｍｍの円柱状に成型し、５℃で１〜７日間保存することでゲル化させた。得られた澱粉ゲルをチューブから取り出し、カミソリの刃を用いて直径５ｍｍ、高さ５ｍｍの円柱状に成型した後、テクスチャーアナライザー（ＴＡ−ＸＴ  Ｐｌｕｓ）を用いて圧縮試験に供し、１日目、３日目および７日目のゲル強度を測定した。結果を図１に示す。【００４１】
図１に示されるように、アミロマルターゼを添加しなかった場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、澱粉ゲルは、澱粉の老化に伴い冷蔵保存中に徐々に硬化した。また、ＴｔＡＭを添加した場合、澱粉の粘度が著しく下がり、ゲル形成に時間がかかった。また、ゲル化後は急速に硬化した。ＣｇＡＭを添加した場合、酵素無添加の澱粉ゲルと近い物性を有するゲルが形成された。さらに、当該ゲルは、その後日数を経ても、ほとんど硬化しなかった。【００４２】
[実施例２]炊飯米の食感改質
乾燥米１５０ｇを洗米し、水と各微生物由来のアミロマルターゼ（１．０Ｕ／ｇ乾燥米）を添加して３２５ｇに調整し、室温（２０℃）で１時間静置した。次いでこれを、炊飯器ＳＲ−１３ＧＰ（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ）を用いて炊飯した。得られた炊飯米を炊飯器から取り出し、プラスチック製蓋つき容器に移し室温で１時間静置した後に専門パネル４名により官能評価を行った。【００４３】
官能評価は「やわらかさ」、「粒立ち」、「粘り」の３項目について行った。なお、本明細書においては「やわらかさ」とは、炊飯米を咀嚼するとき感じる抵抗力が小さいことを、「粒立ち」は、咀嚼時に粒が壊れず強く残っていることを、また、「粘り」は、米粒どうしが付着していることをそれぞれ意味する。評価基準は次の通りである。酵素無添加の条件で調製した炊飯米の「やわらかさ」、「粒立ち」、「粘り」を基準（０点）とし、各項目における程度の強さを−２点〜＋２点（０．５点刻み）で評価した。基準品（酵素無添加）以外の試料はブラインドで提示した。スコアは、４人の専門パネルの評点の平均値とした。結果を表１に示す。【００４４】
【表１】
2019189065.tif 000002
【００４５】
表１に示される通り、ＴｔＡＭを添加して調製した炊飯米とは異なり、ＣｇＡＭを添加して調製した炊飯米は、柔らかく粘りの高い食感に変化した。【００４６】
［実施例３］炊飯米の経時劣化抑制【００４７】
実施例２と同様の条件で炊飯米を調製した。これを２０℃に設定した恒温槽内に１８時間静置した後に、官能評価に供した。官能評価の条件および方法は、実施例２で用いたものと同じである。結果を表２に示す。【００４８】
【表２】
2019189065.tif 000003
【００４９】
表２に示される通り、酵素無添加の炊飯米は２０℃、１８時間の保存によってやわらかさが減少し、粘りは低下した。ＴｔＡＭを添加した場合は、炊飯直後の時点でやわらかさおよび粘りは低下しており、２０℃、１８時間の保存後の物性変化は小さかった。一方で、ＣｇＡＭを添加した場合は、炊飯直後の時点でやわらかさおよび粘りは増加しており、２０℃、１８時間の保存後では、若干のやわらかさの減少および粘りの低下は見られるものの、ＴｔＡＭと比較すると、全体的に酵素無添加で調製した炊飯米の炊飯当日の物性に近い物性を維持していた。【００５０】
［実施例４］焦げつきの抑制
実施例２と同様の条件において炊飯米を調製し、その焦げつきの発生量を検討した。尚、焦げ発生量とは、炊飯完了直後に米飯の入った内釜を炊飯器から取り出し、逆さにして米飯を落下させた際に内釜に張り付いて残った部分の重量を示す。結果を表３および図２に示す。なお、表３に示される値は、３回の試験で得られた値より算出した平均値である。【００５１】
【表３】
2019189065.tif 000004
【００５２】
表３および図２に示される通り、ＴｔＡＭを添加すると釜底に飴状の焦げが発生するが、ＣｇＡＭではほとんど焦げは発生しなかった。【００５３】
［実施例５］小麦澱粉含有食品の経時劣化抑制
ＣｇＡＭの小麦澱粉含有食品の経時劣化抑制効果を確認する目的で、ＣｇＡＭを配合した食パンを調製し、調製後一定期間保存後の食パンの食感の劣化の度合いを検証した。具体的には、まずホームベーカリー（エムケー精工、ＨＢＫ−１００）付属の金属容器内に水を計量し、所定量のＣｇＡＭ（試験区１：無添加、試験区２：０．０１Ｕ／ｇ小麦粉、試験区３：０．１Ｕ／ｇ小麦粉、試験区４：１．０Ｕ／ｇ小麦粉）を添加した。次いでこの上に強力粉、砂糖、スキムミルク、及び食塩を予備混合した混合物を加えた。水さらにその上にドライイーストとショートニングを加え、既定のプログラム（食パン、焼き色：普通）にて混捏、焼成することで食パン調製した。各成分の実際の配合量は以下の表４に示す。焼成完了後、室温で１．５時間静置することにより放冷し、次いで２ｃｍ厚さにスライスし、チャック付きビニール袋に封入して、温度１０℃、湿度５０％で２日間保存した。【００５４】
【表４】
2019189065.tif 000005
【００５５】
上述の条件下で保存した食パンの食感（「パサつき」）を、専門パネル３名による官能試験により評価した。官能試験において用いた評価基準は次の通りである。【００５６】
×：強くパサついている
△：パサついている
○：少しパサついている
◎：しっとりしている【００５７】
結果を以下の表５に示す。【００５８】
【表５】
2019189065.tif 000006
【００５９】
表５に示される通り、ＣｇＡＭを配合した食パンにおいては、焼成後２日間を経過しても、食パンのパサつきが抑えられていた。【００６０】
［実施例６］馬鈴薯澱粉の物性への影響
ポテトフレーク（「じゃがいもフレーク」、株式会社大望）を計量し（１試験区４０ｇ）、１２０ｇの市水と混合した。これにＣｇＡＭを添加して、均一になるまでスパチュラで撹拌した。得られた混合物を室温で３０分間静置した。３０分間の静置後、混合物を５０ｇずつ３パックに小分けし、真空シーラーにより密封した。密封されたパックを沸騰水で３０分間湯煎し、次いで流水で約２５℃まで冷却した。パックを開け、中身を２４穴マイクロプレートに分注した。これを冷蔵（５℃）保存し、分注日当日、１日後、１週間後、２週間後の時点でテクスチャーアナライザーを用いて圧縮試験に供し、ペーストの硬さを測定した。【００６１】
尚、本実施例において使用したＣｇＡＭの使用量は、乾燥ポテトフレーク１ｇあたり０．１Ｕ又は１．０Ｕとした。【００６２】
また、物性測定に用いたテクスチャーアナライザーの測定条件は次の通りである。
装置：テクスチャーアナライザー（「ＴＡ−ＸＴ  Ｐｌｕｓ」（英弘精機株式会社））  直径５ｍｍステンレス製球状プランジャー
測定条件：圧縮速度  １ｍｍ／秒、プレートに充填されたモデルポテトサラダの中心部を５０％圧縮（突き刺し）し、最大応力を記録（Ｎ＝３）。【００６３】
結果を以下の表６（圧縮応力）に示す。【００６４】
【表６】
2019189065.tif 000007
【００６５】
表６に示される通り、ＣｇＡＭはモデルポテトサラダの経時的な硬化を抑制することが示された。【００６６】
［実施例７］ストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼの澱粉改質特性１
ストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼとコリネバクテリウム・グルタミカム由来のアミロマルターゼとは、アミノ酸の同一性が比較的高いことが知られており、それらの機能は類似すると予想される。これを実証する目的で、以下の実験を行った。【００６７】
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に１０％懸濁液となるように米澱粉（ＳＩＧＭＡ）を加え、さらにＣｇＡＭ、ＴｔＡＭまたはストレプトマイセス・アベルミティリス由来のアミロマルターゼ（以下、「ＳａＡＭ」と称することがある）を、５０Ｕ／ｇ澱粉となるように添加し、これを撹拌しながら３７℃で１時間反応させた。次いで、９８℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、その後５０℃まで冷却した後に、冷却後の澱粉ゲルを、直径５ｍｍの円筒形チューブに分注し、５℃で１〜７日間保存することでゲル化させた。得られた澱粉ゲルを、澱粉糊液の調製日を０日として、１日後、３日後および７日後の時点で冷蔵庫から取り出し、カミソリの刃を用いて直径５ｍｍ、高さ５ｍｍの円柱状に成型した後、切断面が上下となるようにテクスチャーアナライザー（ＴＡ−ＸＴ  Ｐｌｕｓ）のステージに乗せ圧縮試験を行い、ゲル強度を測定した。【００６８】
尚、物性測定に用いたテクスチャーアナライザー及び測定条件は次の通りである。
装置：テクスチャーアナライザー（「ＴＡ−ＸＴ  Ｐｌｕｓ」（英弘精機株式会社））  直径１５ｍｍアクリル製円柱プランジャー、ステンレス製ステージ。
測定条件：圧縮速度  ０．５ｍｍ／秒、澱粉ゲル片を９０％圧縮した際に得られる最大応力（ｇ）を記録（Ｎ＝６〜９）。【００６９】
結果を図３に示す。図３に示されるように、ＳａＡＭで処理した澱粉ゲルの物性およびその経時変化はＣｇＡＭで処理した澱粉ゲルのそれらとほぼ同等であった。即ち、ストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼとＣｇＡＭは、澱粉改質において同様の効果を奏する可能性が高いことが示された。【００７０】
［実施例８］ストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼの澱粉改質特性２
ジメチルスルホキシドにアミロース（BAR-5K-1、GLICO NUTRITION CO., LTD.）を加え１０％溶液とし、次いでこれをミリＱ水で希釈し１％アミロース溶液を調製した。次に、調製した１％アミロース溶液５００μｌに１Ｕ／ｍＬに調整した各アミロマルターゼ溶液（ＳａＡＭ、ＣｇＡＭ、又はＴｔＡＭ）を５０μＬ添加した。ＳａＡＭ：５０℃、ＣｇＡＭ：３７℃、ＴｔＡＭ：７０℃にて６０分間反応させた。次いで、各反応液を１００℃、１０分間加熱して酵素を失活させ、室温まで冷却した。冷却後の各反応液を、アミロース濃度が０．１％となるようにミリＱ水で希釈し、イオンクロマトグラフィ（Ｄｉｏｎｅｘ）を用いて、希釈後の反応液中に含まれるアミロース分解物の糖鎖長の分布を分析した。ピーク面積の総和に対する各糖鎖のピーク面積の相対値を算出した。結果を図４に示す。【００７１】
図４に示される通り、ＣｇＡＭでアミロースを処理して得られる糖鎖長分布と、ＳａＡＭでアミロースを処理して得られる糖鎖長分布は極めて類似していた。本結果においても、ストレプトマイセス属由来のアミロマルターゼが有する澱粉改質特性は、ＣｇＡＭのそれに類似することが示された。【００７２】
［実施例９］ＣｇＡＭとＴｔＡＭの糖鎖転移性の検討
２８．５ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に米各澱粉（１．５ｇ）を添加し、５％の澱粉懸濁液を調製した。得られた澱粉懸濁液をスタンディングパウチに入れ、１００℃、１５分間加熱することで澱粉を糊化させた（糊化澱粉溶液１）。また、２８．５ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）にグルコース（「Ｇ１」と称することがある）又はショ糖（「ｓｕｃ」と称することがある）を１．５ｇ添加し、５％のＧ１溶液又はｓｕｃ溶液を調製し、これを１．５ｍＬチューブに分注した。次いで、糊化澱粉溶液１（５００μＬ）と、Ｇ１溶液又はＳｕｃ溶液又はミリＱ水（５００μＬ）を混合し、混合溶液（１ｍＬ）を得た。【００７３】
次に、２．５Ｕ／ｍＬのＣｇＡＭ溶液及び２．５Ｕ／ｍＬのＴｔＡＭ溶液を調製した。得られた酵素溶液１００μＬを上述のように調整した混合溶液（１ｍＬ）にそれぞれ添加した（澱粉１ｇ当たり酵素１００Ｕ）。酵素溶液の添加後、ＣｇＡＭを添加した反応液は３０℃で、ＴｔＡＭを添加した反応液は５０℃まで加温した。尚、酵素液の代わりにミリＱ水を添加したコントロールは３０℃に加温した。２４時間後に１００℃、１０分間加熱することで、反応液中の各酵素を失活させた。後日、各反応液はＴＬＣ分析に供した。【００７４】
ＴＬＣ分析は次のように行った。スタンダードとしては０．５％の３種類の糖液を２μＬスポットした。尚、スタンダードとして用いた３種類の糖液は、それぞれ次の通りである。
糖液１：グルコース（Ｇ１）、マルトース（Ｇ２）、マルトトリオース（Ｇ３）、マルトテトラオース（Ｇ４）、マルトペンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ６）及びマルトヘプタオース（Ｇ７）混合液
糖液２：ショ糖溶液（ｓｕｃ）
糖液３：αシクロデキストリン（αＣＤ）及びβシクロデキストリン（βＣＤ）混合液【００７５】
酵素失活後の反応液はミリＱ水で５倍希釈することで米澱粉、Ｇ１、又はＳｕｃが０．５％となるように調整した後、２μＬをスポットした。【００７６】
１回展開とし、展開用の溶媒の組成は、ｎブタノール：ピリジン：ミリＱ水（ＭＱ）＝６：４：１とした。検出は、２０％硫酸／ＥｔＯＨを担体に噴霧し、次いでこれを１１０℃で約１０分間加熱することで発色させた。結果を図５に示す。尚、図５中、「（−）」は、糊化澱粉溶液１（５００μＬ）と５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）（５００μＬ）を混合し、酵素液の代わりにミリＱ水を添加して３０℃２４時間加温したサンプルをスポットしたレーンを示す。【００７７】
図５に示される通り、ＴｔＡＭはグルコース（Ｇ１）に糖鎖を転移し、オリゴ糖を生成しているが、ショ糖（ｓｕｃ）には糖鎖を転移させなかった。一方で、ＣｇＡＭは、グルコース（Ｇ１）及びショ糖（ｓｕｃ）のいずれにも糖鎖を転移させており、両ＡＭでショ糖に対する反応特性が異なることが示された。【００７８】
［実施例１０］ＣｇＡＭによるショ糖含有デキストリンの物性改質
（被験物質の調製）
デキストリン（松谷化学工業株式会社  パインデックス＃１００）をミリＱ水で溶解し５％溶液とした。ショ糖（純正化学試薬特級）も同様にミリＱ水で溶解し５％溶液とした。これらを１：１の量比で混合し、ここにＣｇＡＭ溶液をデキストリン１ｇあたり１００Ｕとなるよう添加した。コントロールにはミリＱ水を同量添加した。この混合液を３０℃のウォーターバスで２４時間静置し、酵素反応させた。その後、１００℃の湯浴で１０分間加熱し、酵素を失活させた。酵素反応後のデキストリン−ショ糖溶液は−８０℃のフリーザーで保存した。【００７９】
（動物試験）
以下の方法で、ラットを用いて、澱粉投与後の血糖値を測定し、血糖値上昇抑制効果を評価した。被験物質は血糖値測定試験当日に流水解凍して試験に供した。下記の血糖値の測定方法及び図６の試験日程に従って、空腹時、投与１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後の血糖値を測定した。被験物質投与は、被験物質の全糖量が１ｇ／２０ｍＬ／ｋｇの量で、経口投与で行った。尚、被験物質の全糖質量分析は一般財団法人日本食品分析センターに委託し、フェノール硫酸法を用いて測定した。【００８０】
（血糖値の測定方法）
ラットへの糖負荷試験は種々行われているが、本試験では特開２００５−３２８７７６号公報において開示されている糖負荷試験を改変し実施した。【００８１】
[動物]
動物種及び系統：ラット、Slc:Wistar（SPF）
生産者：日本エスエルシー（株）
性別：雄性
入荷時週齢：6週齢
検疫・馴化：動物は入荷から群分けまで馴化する。ただし、入荷日を0日として7日までの期間は検疫を行う。一般状態観察は毎日行う。【００８２】
［飼育環境］
温度：22±3℃
湿度：50±20%
照明時間：12時間/日【００８３】
［飼料］
種類：ラボMRストック固形飼料（日本農産工業（株））もしくはＣＲＦ−１（オリエンタル酵母工業（株））
給餌法：絶食期間を除き自由に与える。【００８４】
［飲料水］
種類：水道水
給水法：試験期間を通じ自由に与える。【００８５】
［動物の選択及び群分け］
検疫・馴化期間中において、一般状態観察に異常のみられなかった動物より試験に使用する動物を選択する。動物は７週齢で使用する。検疫・馴化終了日に体重を測定し，得られた体重を指標として、層別連続無作為化法を用いて６〜１０匹／群に割り付ける。【００８６】
［絶食処置］
糖負荷試験実施日の前日夕方より一晩絶食を開始する。【００８７】
［血糖値の測定］
尾の先端の静脈を無麻酔下でメス刃を用いて切開する。切開面より漏出する血液を用いて検査（血糖値）を実施する。自己検査用グルコース測定器「アキュチェック」（ロシュ・ダイアグノスティクス）または「グルテストＮｅｏ」（三和化学研究所）を用いて測定し、測定器に表示された血糖値を記録する。これを空腹時血糖値とする。なお、同一日の試験には同じグルコース測定器を用いた。【００８８】
評価項目の算出は以下のように行った。
空腹時血糖値を０分の血糖値とした。
各測定時間の血糖値から、０分の血糖値を除した値を、「△血糖値（ｍｇ／ｄＬ）」とした。
各測時間の△血糖値の中でもっとも高い値を各個体の「△Ｃｍａｘ（ｍｇ／ｄＬ）」とした。
△血糖値上昇曲線の下面積を算出した値を「△血糖値ＡＵＣ（ｍｇ／ｄＬ・ｍｉｎ）」とした。算出方法は日本Ｇｌｙｃｅｍｉｃ  ｉｎｄｅｘ研究会の方法に準じた。
対照群の△血糖値ＡＵＣを１００とした時の被験物質投与群の△血糖値ＡＵＣの値から、血糖値上昇抑制効果を評価した。【００８９】
試験結果を図７に示す。試験結果より、ＣｇＡＭをショ糖とデキストリンの混合物に作用させることで投与後２時間における△血糖値ＡＵＣの値が低く抑えられ、血糖値の上昇が抑制されていることが示された。これは実施例９で認められた、ショ糖に糖鎖を付加するＣｇＡＭの効果によってショ糖が高分子化し、消化されにくくなったためであると考えられる。【００９０】
［実施例１１］ＣｇＡＭ処理による澱粉の物性改質
（被験物質の調製）
αうるち米澱粉（マイアルファーＫ：上越スターチ株式会社）を１０ｇ秤量し、８０ｇのミリＱ水を添加した。スタンディングパウチ（ラミジップスタンドタイプ：株式会社生産日本社）に移し替え、ヒートシーラーで密閉した後、恒温槽にて１００℃で１５分加温し、澱粉を完全に糊化させた。途中、澱粉がダマにならないように撹拌した。澱粉糊液を、コントロール及びＣｇＡＭ用のものは３７℃、ＴｔＡＭ用のものは５０℃に戻した後、各ＡＭ添加量が澱粉１ｇに対し１Ｕとなるよう調製したＣｇＡＭ溶液またはＴｔＡＭ溶液を１０ｍＬ添加した。コントロールにはミリＱ水１０ｍＬを添加した。その後、直ちにシーラーで密閉し、恒温槽に入れ、コントロール及びＣｇＡＭ添加区は３７℃、ＴｔＡＭ添加区は５０℃で６０分間静置し酵素反応させた。酵素反応後、恒温槽にて１００℃で１５分加温し、酵素を失活させた。酵素処理澱粉は室温に戻した後−８０℃で凍結した。【００９１】
（動物試験）
実施例１０の方法に準じた。【００９２】
（血糖値の測定方法）
実施例１０の方法に準じた。【００９３】
試験結果を図８及び９に示す。試験結果より、ＣｇＡＭ処理澱粉を投与した群は、対照群及びＴｔＡＭ処理澱粉投与群に比べ、投与後２時間における△血糖値ＡＵＣの値が低く抑えられ、血糖値の上昇が抑制されていることが示された。【００９４】
[実施例１２]ＣｇＡＭ処理による米飯の物性改質
（被験物質の調製）
原料として宮城県産ひとめぼれを使用した。玄米は一つの生産元で同一日に収穫されたものを確保し、同一日に精米したものを、脱酸素剤を入れた遮光真空パックに入れ、試験まで５℃にて冷蔵保存した。【００９５】
精白米は、炊飯当日の秤量３０分前までに室温に戻した。電子天秤（ＵＳ６００２Ｓ、メトラー・トレド株式会社）を使用し、精白米を秤量した。ザルに入れた精白米を、ボウルに溜めた水道水中にてやさしく時計回りに１０回かき混ぜた。水道水を取り換え、同じ作業を５回繰り返した。洗米後、米をザルに取り上げ、炊飯釜に移した後、電子天秤上で１５０％の加水率になるように水道水を添加し、さらにＣｇＡＭを生米１ｇあたり１Ｕの量で添加した。室温で１時間浸漬した後、炊飯器（ＳＲ−０３ＧＰ：パナソニック株式会社）に釜をセットして炊飯した。炊飯直後、バット上に炊飯釜を転倒させ、米飯を取り出した。釜壁に近い米飯は取り除き、スパチュラでバットの端によけた。スパチュラで米飯を平らに均し、軽く隙間を開けてラップをした後、室温で１５分粗熱をとった。米飯はユニパック（生産日本株式会社）に入れて厚さ２ｃｍ程度にならし、−８０℃のフリーザーで凍結した。翌日、凍結乾燥機（ＦＤＵ−２１００：東京理化機器株式会社）を使用して凍結乾燥した。凍結乾燥が確認できた後、ミキサーミル（ＭＭ３０１：Verder Scientific Co. Ltd.）を用いて粉砕した。粉砕サンプルは、スタンディングパウチに分注してシールで密閉し、室温で保管した。【００９６】
（動物試験）
実施例１０の方法に準じた。ただし、被験物質はミリＱ水で懸濁し試験に供した。【００９７】
（血糖値の測定方法）
実施例１０の方法に準じた。なお、被験物質投与は、被験物質の全糖量が２ｇ／２０ｍＬ／ｋｇの量で、経口投与で行った。【００９８】
試験結果を図１０に示す。ＣｇＡＭ処理米飯を投与した群は対照群に比べ、投与後２時間における△血糖値ＡＵＣの値が低く抑えられ、血糖値の上昇が抑制されていることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明によれば、好ましい食感および経時的な劣化が起きにくく、さらに血糖値を上昇させ難い澱粉含有食品を、既存の耐熱性アミロマルターゼが持つ課題を生ずることなく製造することができるため、食品製造業において非常に有益である。【０１００】
本出願は、日本で出願された特願２０１８−０５８９３１（出願日：２０１８年３月２６日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
2019189065.tif 000008
【図２】
2019189065.tif 000009
【図３】
2019189065.tif 000010
【図４】
2019189065.tif 000011
【図５】
2019189065.tif 000012
【図６】
2019189065.tif 000013
【図７】
2019189065.tif 000014
【図８】
2019189065.tif 000015
【図９】
2019189065.tif 000016
【図１０】
2019189065.tif 000017
【配列表】
2019189065000001.app
【国際調査報告】
2019189065.tif 000018
2019189065.tif 000019
2019189065.tif 000020
2019189065.tif 000021