(57)【要約】  式１Ａで示される部分構造を分子内に有するβ修飾リン酸化合物前駆体である。また、このβ修飾リン酸化合物前駆体を含有する反応阻害剤及び医薬である。【化１】2019172394.tif 000053（ここで、Ａ１は−ＳＲ１、−Ｓ−Ｓ−Ｒ１、−ＳｅＲ１、又は−Ｘ（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基などである。Ｌ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基などを示し、Ｌ２は炭素数１〜２０のアルキル基などを示す。Ｌ１とＬ２は互いに連結して４〜６員の環構造を形成してもよい。Ｌ１及びＬ２は、それぞれ置換基を有していてもよい。＊はリン酸化を受けてリン酸基が結合する結合手である。）
2019172394.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸化反応によりリン酸化されるβ修飾リン酸化合物前駆体であって、下記式１Ａで示される部分構造を分子内に有することを特徴とするβ修飾リン酸化合物前駆体。
【化１】
2019172394.tif 000042
（ここで、Ａ１は−ＳＲ１、−Ｓ−Ｓ−Ｒ１、−ＳｅＲ１、又は−Ｘ（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。Ｌ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基を示し、Ｌ２は炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基を示す。Ｌ１とＬ２は互いに連結して４〜６員の環構造を形成してもよく、環構造は炭素、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１種類以上の元素で構成される。Ｌ１及びＬ２は、それぞれヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アルキル基、アリール基、炭素数１５〜３０の飽和脂肪酸及び／又は不飽和脂肪酸を１以上含むリン脂質、モノリン酸基、ジリン酸基、又はトリリン酸基、及び塩基（ここで、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、Ｎ−メチルアデニン、Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−アミノアデニン、７−メチルグアニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−メチルシトシン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、又は５，６−ジヒドロウラシルを意味する）から選択される１又は２以上の置換基を有していてもよい。＊はリン酸化を受けてリン酸基が結合する結合手であり、リン酸化前においては水素又はリン酸基以外の置換基が結合していることを意味する。）
【請求項２】
下記式２Ａで示されるヌクレオシド誘導体又は該ヌクレオシド誘導体を３’末端に有する核酸であることを特徴とする請求項１に記載のβ修飾リン酸化合物前駆体。
【化２】
2019172394.tif 000043
（ここで、Ａ１は−ＳＲ１、−Ｓ−Ｓ−Ｒ１、−ＳｅＲ１、又は−Ｘ（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。Ｌ３は水素、又は下記式２Ｄで示されるモノリン酸基、ジリン酸基、又はトリリン酸基である。
【化３】
2019172394.tif 000044
（ここで、ｎは１〜３の整数を示す。Ｚ１は、ヒドロキシル基、又はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン若しくはプロリンのメチルエステル、エチルエステル、イソプロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ベンジルエステル若しくはフェニルエステルである。Ｚ２は、水素、炭素数１〜４のアルキル基、ハロゲン、又はフェニル基である。ｎが２以上の場合においてそれぞれのＺ１は同一又は異なっていてもよい。）
Ｂはアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、Ｎ−メチルアデニン、Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−アミノアデニン、７−メチルグアニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−メチルシトシン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、又は５，６−ジヒドロウラシルから選択される塩基である。＊はリン酸化を受けてリン酸基が結合する結合手であり、リン酸化前においては水素又はリン酸基以外の置換基が結合していることを意味する。）
【請求項３】
下記式３Ａで示されるメバロン酸誘導体であることを特徴とする請求項１に記載のβ修飾リン酸化合物前駆体。
【化４】
2019172394.tif 000045
（ここで、Ａ１は−ＳＲ１、−Ｓ−Ｓ−Ｒ１、−ＳｅＲ１、又は−Ｘ（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。）
【請求項４】
下記式４Ａで示されるホスファチジルイノシトール誘導体であることを特徴とする請求項１に記載のβ修飾リン酸化合物前駆体。
【化５】
2019172394.tif 000046
（ここで、Ａ１は−ＳＲ１、−Ｓ−Ｓ−Ｒ１、−ＳｅＲ１、又は−Ｘ（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。Ｒ３はアラキドン酸、リノール酸、及びリノレン酸から選択される不飽和脂肪酸であり、Ｒ４はステアリン酸、パルミチン酸から選択される飽和脂肪酸である。）
【請求項５】
下記式１Ｂで示される部分構造を分子内に有することを特徴とするβ修飾リン酸化合物。
【化６】
2019172394.tif 000047
（ここで、Ａ１は−ＳＲ１、−Ｓ−Ｓ−Ｒ１、−ＳｅＲ１、又は−Ｘ（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、炭素数１〜２０のアルケニル基から選択される。Ｌ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基を示し、Ｌ２は炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基を示す。Ｌ１とＬ２は互いに連結して４〜６員の環構造を形成してもよく、環構造は炭素、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１種類以上の元素で構成される。Ｌ１及びＬ２は、それぞれヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アルキル基、アリール基、炭素数１５〜３０の飽和脂肪酸及び／又は不飽和脂肪酸を１以上含むリン脂質、モノリン酸基、ジリン酸基、又はトリリン酸基、及び塩基（ここで、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、Ｎ−メチルアデニン、Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−アミノアデニン、７−メチルグアニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−メチルシトシン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、又は５，６−ジヒドロウラシルを意味する）から選択される１又は２以上の置換基を有していてもよい。）
【請求項６】
下記式２Ｂで示されるヌクレオシド誘導体又は該ヌクレオシド誘導体を３’末端に有する核酸であることを特徴とする請求項５に記載のβ修飾リン酸化合物。
【化７】
2019172394.tif 000048
（ここで、Ａ１は−ＳＲ１、−Ｓ−Ｓ−Ｒ１、−ＳｅＲ１、又は−Ｘ（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。Ｌ３は水素、又は下記式２Ｄで示されるモノリン酸基、ジリン酸基、又はトリリン酸基である。
【化８】
2019172394.tif 000049
（ここで、ｎは１〜３の整数を示す。Ｚ１は、ヒドロキシル基、又はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン若しくはプロリンのメチルエステル、エチルエステル、イソプロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ベンジルエステル若しくはフェニルエステルである。Ｚ２は、水素、炭素数１〜４のアルキル基、ハロゲン、又はフェニル基である。ｎが２以上の場合においてそれぞれのＺ１は同一又は異なっていてもよい。）
Ｂはアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、Ｎ−メチルアデニン、Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−アミノアデニン、７−メチルグアニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−メチルシトシン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、又は５，６−ジヒドロウラシルから選択される塩基である。）
【請求項７】
リン酸化を伴う反応におけるリン酸化後の反応の進行を阻害する反応阻害剤であって、請求項１〜４のいずれか１項に記載のβ修飾リン酸化合物前駆体を含有することを特徴とする反応阻害剤。
【請求項８】
前記β修飾リン酸化合物前駆体が前記式２Ａで示されるヌクレオシド誘導体又は該ヌクレオシド誘導体を３’末端に有する核酸であり、ＤＮＡポリメラーゼの反応を阻害することを特徴とする請求項７に記載の反応阻害剤。
【請求項９】
請求項７に記載の反応阻害剤を含有することを特徴とする医薬。
【請求項１０】
請求項７に記載の反応阻害剤によってリン酸化を伴う反応におけるリン酸化後の反応の進行を阻害する反応阻害方法であって、
前記式１Ａで示されるβ修飾リン酸化合物前駆体を用意する工程と、
前記β修飾リン酸化合物前駆体をリン酸化して前記式１Ｂで示されるβ修飾リン酸化合物を生成させるとともに、前記β修飾リン酸化合物を部分開裂させて下記式１Ｃで示される活性種を生成させる工程と、
【化９】
2019172394.tif 000050
（ここで、Ａ２は−Ｓ−、−Ｓ＋（Ｒ１）−、−Ｓ＋（Ｓ−Ｒ１）−、−Ｓｅ＋（Ｒ１）−、又は−Ｘ＋−（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。Ｌ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基を示し、Ｌ２は炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基を示す。Ｌ１とＬ２は互いに連結して４〜６員の環構造を形成してもよく、環構造は炭素、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１種類以上の元素で構成される。Ｌ１及びＬ２は、それぞれヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アルキル基、アリール基、炭素数１５〜３０の飽和脂肪酸及び／又は不飽和脂肪酸を１以上含むリン脂質、モノリン酸基、ジリン酸基、又はトリリン酸基、及び塩基（ここで、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、Ｎ−メチルアデニン、Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−アミノアデニン、７−メチルグアニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−メチルシトシン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、又は５，６−ジヒドロウラシルを意味する）から選択される１又は２以上の置換基を有していてもよい。）
を備えることを特徴とする反応阻害方法。
【請求項１１】
前記β修飾リン酸化合物前駆体は前記式２Ａで示される化合物であり、
前記β修飾リン酸化合物は前記式２Ｂで示される化合物であり、
前記活性種は下記式２Ｃで示される化合物であることを特徴とする請求項９に記載の反応阻害方法。
【化１０】
2019172394.tif 000051
（ここで、Ａ２は−Ｓ−、−Ｓ＋（Ｒ１）−、−Ｓ＋（Ｓ−Ｒ１）−、−Ｓｅ＋（Ｒ１）−、又は−Ｘ＋−（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。Ｌ３は水素、又は下記式２Ｄで示されるモノリン酸基、ジリン酸基、又はトリリン酸基である。
【化１１】
2019172394.tif 000052
（ここで、ｎは１〜３の整数を示す。Ｚ１は、ヒドロキシル基、又はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン若しくはプロリンのメチルエステル、エチルエステル、イソプロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ベンジルエステル若しくはフェニルエステルである。Ｚ２は、水素、炭素数１〜４のアルキル基、ハロゲン、又はフェニル基である。ｎが２以上の場合においてそれぞれのＺ１は同一又は異なっていてもよい。）
Ｂはアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、Ｎ−メチルアデニン、Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−アミノアデニン、７−メチルグアニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−メチルシトシン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、又は５，６−ジヒドロウラシルから選択される塩基である。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β修飾リン酸化合物前駆体、β修飾リン酸化合物、反応阻害剤及びこれを含む医薬並びに反応阻害方法に関し、特に、リン酸化を伴う反応におけるリン酸化後の反応の進行を阻害するβ修飾リン酸化合物前駆体、β修飾リン酸化合物、反応阻害剤及びこれを含む医薬並びに反応阻害方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リン酸化は、生体反応の重要なプロセスであり、生体内ではリン酸化を伴う様々な反応が行われている。例えば、ＤＮＡの複製では、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡのリン酸化を伴う反応を行っている。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマー配列を起点とし、一本鎖ＤＮＡを鋳型としてこれに相補的なデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を３’末端側に順次結合することで、３’→５’方向に相補鎖ＤＮＡを伸長する。この反応では、ＤＮＡポリメラーゼによって、ｄＮＴＰの三リン酸の２つのリン酸基が脱リン酸化されて残る１つのリン酸基が３’末端側の糖（デオキリシボース）の３位の水酸基（ヒドロキシル基）に結合する。その結果、３’末端側の糖はリン酸化され、相補鎖ＤＮＡが伸長する。ポリメラーゼは、ＤＮＡの複製や転写に関与し、癌やウイルスなどに起因する疾患の治療薬における重要な標的タンパク質でもある。【０００３】
また、メバロン酸は、テルペノイドやステロイドの合成に関与する化合物である。メバロン酸は、ＡＴＰを基質としてメバロン酸キナーゼによりリン酸化されて５−ホスホメバロン酸となり、その後のプロセスによってコレステロールなどに転化される。メバロン酸は、高脂血症などの治療薬における重要な標的物質としても知られている。【０００４】
このように、生体反応においてリン酸化は重要なプロセスであり、その後の反応を特異的かつ効率的に阻害できれば、種々の疾患の治療方法を提供できる可能性を秘めている。しかしながら、従来の技術では、リン酸化反応に起因する生体反応を選択的かつ効率的に阻害するには不十分であった。【０００５】
例えば、特許文献１には、ＤＮＡポリメラーゼの阻害剤としてアシクロビルが開示されている。アシクロビルは、ウイルスにおける一リン酸化と宿主（ヒト）における三リン酸化を受け、ＤＮＡポリメラーゼ反応において、伸長鎖の３’末端側に結合することで、ウイルスＤＮＡポリメラーゼを拮抗阻害する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平０９−１３６８４２号公報（請求項１など）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、アシクロビルのような化合物は、ＤＮＡの伸長を阻害するにすぎず、より効率的かつ強力に反応を阻害する阻害剤が求められていた。【０００８】
本発明は、リン酸化を伴う反応におけるリン酸化後の反応の進行を特異的に阻害することが可能なβ修飾リン酸化合物前駆体、β修飾リン酸化合物、反応阻害剤及びこれを含む医薬並びに反応阻害方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記問題を解決すべく鋭意研究を重ねた。その結果、炭素―炭素結合の一方の炭素（α位）にヒドロキシル基が結合し、他方の炭素（β位）に特定の修飾基が結合した部分構造を有する化合物について、ヒドロキシル基がリン酸化されることに起因して高い反応性を有する活性種が生成することを見出した。さらには、この活性種によって、リン酸化後の生体分子による反応が特異的に阻害されることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち、本発明は、リン酸化反応によりリン酸化されるβ修飾リン酸化合物前駆体であって、下記式１Ａで示される部分構造を分子内に有することを特徴とするβ修飾リン酸化合物前駆体である。
【化１】
2019172394.tif 000003
（ここで、Ａ１は−ＳＲ１、−Ｓ−Ｓ−Ｒ１、−ＳｅＲ１、又は−Ｘ（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。Ｌ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基を示し、Ｌ２は炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基を示す。Ｌ１とＬ２は互いに連結して４〜６員の環構造を形成してもよく、環構造は炭素、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１種類以上の元素で構成される。Ｌ１及びＬ２は、それぞれヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アルキル基、アリール基、炭素数１５〜３０の飽和脂肪酸及び／又は不飽和脂肪酸を１以上含むリン脂質、モノリン酸基、ジリン酸基、又はトリリン酸基、及び塩基（ここで、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、Ｎ−メチルアデニン、Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−アミノアデニン、７−メチルグアニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−メチルシトシン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、又は５，６−ジヒドロウラシルを意味する）から選択される１又は２以上の置換基を有していてもよい。＊はリン酸化を受けてリン酸基が結合する結合手であり、リン酸化前においては水素又はリン酸基以外の置換基が結合していることを意味する。）【００１１】
この場合において、下記式２Ａで示されるヌクレオシド誘導体又は該ヌクレオシド誘導体を３’末端に有する核酸であることが好ましい。
【化２】
2019172394.tif 000004
（ここで、Ａ１は−ＳＲ１、−Ｓ−Ｓ−Ｒ１、−ＳｅＲ１、又は−Ｘ（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。Ｌ３は水素、又は下記式２Ｄで示されるモノリン酸基、ジリン酸基、又はトリリン酸基である。
【化３】
2019172394.tif 000005
（ここで、ｎは１〜３の整数を示す。Ｚ１は、ヒドロキシル基、又はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン若しくはプロリンのメチルエステル、エチルエステル、イソプロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ベンジルエステル若しくはフェニルエステルである。Ｚ２は、水素、炭素数１〜４のアルキル基、ハロゲン、又はフェニル基である。ｎが２以上の場合においてそれぞれのＺ１は同一又は異なっていてもよい。）
Ｂはアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、Ｎ−メチルアデニン、Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−アミノアデニン、７−メチルグアニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−メチルシトシン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、又は５，６−ジヒドロウラシルから選択される塩基である。＊はリン酸化を受けてリン酸基が結合する結合手であり、リン酸化前においては水素又はリン酸基以外の置換基が結合していることを意味する。）【００１２】
あるいは、上記の場合において、下記式３Ａで示されるメバロン酸誘導体であることが好ましい。
【化４】
2019172394.tif 000006
（ここで、Ａ１は−ＳＲ１、−Ｓ−Ｓ−Ｒ１、−ＳｅＲ１、又は−Ｘ（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。）【００１３】
あるいはまた、上記の場合において、下記式４Ａで示されるホスファチジルイノシトール誘導体であることを特徴とする請求項１に記載のβ修飾リン酸化合物前駆体。
【化５】
2019172394.tif 000007
（ここで、Ａ１は−ＳＲ１、−Ｓ−Ｓ−Ｒ１、−ＳｅＲ１、又は−Ｘ（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。Ｒ３はアラキドン酸、リノール酸、及びリノレン酸から選択される不飽和脂肪酸であり、Ｒ４はステアリン酸、パルミチン酸から選択される飽和脂肪酸である。）【００１４】
本発明は、下記式１Ｂで示される部分構造を分子内に有することを特徴とするβ修飾リン酸化合物である。
【化６】
2019172394.tif 000008
（ここで、Ａ１は−ＳＲ１、−Ｓ−Ｓ−Ｒ１、−ＳｅＲ１、又は−Ｘ（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、炭素数１〜２０のアルケニル基から選択される。Ｌ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基を示し、Ｌ２は炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基を示す。Ｌ１とＬ２は互いに連結して４〜６員の環構造を形成してもよく、環構造は炭素、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１種類以上の元素で構成される。Ｌ１及びＬ２は、それぞれヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アルキル基、アリール基、炭素数１５〜３０の飽和脂肪酸及び／又は不飽和脂肪酸を１以上含むリン脂質、モノリン酸基、ジリン酸基、又はトリリン酸基、及び塩基（ここで、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、Ｎ−メチルアデニン、Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−アミノアデニン、７−メチルグアニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−メチルシトシン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、又は５，６−ジヒドロウラシルを意味する）から選択される１又は２以上の置換基を有していてもよい。）【００１５】
この場合において、下記式２Ｂで示されるヌクレオシド誘導体又は該ヌクレオシド誘導体を３’末端に有する核酸であることが好ましい。
【化７】
2019172394.tif 000009
（ここで、Ａ１は−ＳＲ１、−Ｓ−Ｓ−Ｒ１、−ＳｅＲ１、又は−Ｘ（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。Ｌ３は水素、又は下記式２Ｄで示されるモノリン酸基、ジリン酸基、又はトリリン酸基である。
【化８】
2019172394.tif 000010
（ここで、ｎは１〜３の整数を示す。Ｚ１は、ヒドロキシル基、又はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン若しくはプロリンのメチルエステル、エチルエステル、イソプロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ベンジルエステル若しくはフェニルエステルである。Ｚ２は、水素、炭素数１〜４のアルキル基、ハロゲン、又はフェニル基である。ｎが２以上の場合においてそれぞれのＺ１は同一又は異なっていてもよい。）
Ｂはアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、Ｎ−メチルアデニン、Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−アミノアデニン、７−メチルグアニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−メチルシトシン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、又は５，６−ジヒドロウラシルから選択される塩基である。）【００１６】
本発明は、リン酸化を伴う反応におけるリン酸化後の反応の進行を阻害する反応阻害剤であって、上記のいずれかに記載のβ修飾リン酸化合物前駆体を含有することを特徴とする反応阻害剤である。【００１７】
この場合において、β修飾リン酸化合物前駆体が前記式２Ａで示されるヌクレオシド誘導体又は該ヌクレオシド誘導体を３’末端に有する核酸であり、ＤＮＡポリメラーゼの反応を阻害することが好ましい。【００１８】
また、本発明は、上記の反応阻害剤を含有することを特徴とする医薬である。【００１９】
本発明は、上記のいずれかに記載の反応阻害剤によってリン酸化を伴う反応におけるリン酸化後の反応の進行を阻害する反応阻害方法であって、前記式１Ａに記載のβ修飾リン酸化合物前駆体を用意する工程と、前記β修飾リン酸化合物前駆体をリン酸化して前記式１Ｂに記載のβ修飾リン酸化合物を生成させるとともに、前記β修飾リン酸化合物を部分開裂させて下記式１Ｃで示される活性種を生成させる工程と、を備えることを特徴とする反応阻害方法である。
【化９】
2019172394.tif 000011
（ここで、Ａ２は−Ｓ−、−Ｓ＋（Ｒ１）−、−Ｓ＋（Ｓ−Ｒ１）−、−Ｓｅ＋（Ｒ１）−、又は−Ｘ＋−（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。Ｌ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基を示し、Ｌ２は炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基を示す。Ｌ１とＬ２は互いに連結して４〜６員の環構造を形成してもよく、環構造は炭素、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１種類以上の元素で構成される。Ｌ１及びＬ２は、それぞれヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アルキル基、アリール基、炭素数１５〜３０の飽和脂肪酸及び／又は不飽和脂肪酸を１以上含むリン脂質、モノリン酸基、ジリン酸基、又はトリリン酸基、及び塩基（ここで、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、Ｎ−メチルアデニン、Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−アミノアデニン、７−メチルグアニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−メチルシトシン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、又は５，６−ジヒドロウラシルを意味する）から選択される１又は２以上の置換基を有していてもよい。）【００２０】
この場合において、前記β修飾リン酸化合物前駆体は前記式２Ａで示される化合物であり、前記β修飾リン酸化合物は前記式２Ｂで示される化合物であり、前記活性種は下記式２Ｃで示される化合物であることが好ましい。
【化１０】
2019172394.tif 000012
（ここで、Ａ２は−Ｓ−、−Ｓ＋（Ｒ１）−、−Ｓ＋（Ｓ−Ｒ１）−、−Ｓｅ＋（Ｒ１）−、又は−Ｘ＋−（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。Ｌ３は水素、又は下記式２Ｄで示されるモノリン酸基、ジリン酸基、又はトリリン酸基である。
【化１１】
2019172394.tif 000013
（ここで、ｎは１〜３の整数を示す。Ｚ１は、ヒドロキシル基、又はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン若しくはプロリンのメチルエステル、エチルエステル、イソプロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ベンジルエステル若しくはフェニルエステルである。Ｚ２は、水素、炭素数１〜４のアルキル基、ハロゲン、又はフェニル基である。ｎが２以上の場合においてそれぞれのＺ１は同一又は異なっていてもよい。）
Ｂはアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、Ｎ−メチルアデニン、Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−アミノアデニン、７−メチルグアニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−メチルシトシン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、又は５，６−ジヒドロウラシルから選択される塩基である。）
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、リン酸化を伴う反応におけるリン酸化後の反応の進行を反応性の高い活性種によって特異的に阻害することが可能なβ修飾リン酸化合物前駆体、β修飾リン酸化合物、反応阻害剤及びこれを含む医薬並びに反応阻害方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】β修飾リン酸化合物前駆体による反応阻害機構を示す説明図である。
【図２】実施例におけるリン酸部分の切断実験の結果を示すＮＭＲスペクトル図である。
【図３】実施例におけるＢ型肝炎ウイルスの増殖抑制効果を示すグラフである。
【図４】実施例における不可逆阻害実験の結果を示すグラフである。
【図５】実施例における抗ＨBＶ活性評価の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
１．部分構造
（１）β修飾リン酸化合物前駆体
以下、本発明のβ修飾リン酸化合物前駆体について説明する。本発明のβ修飾リン酸化合物前駆体は、リン酸化反応によりリン酸化されるβ修飾リン酸化合物前駆体であって、下記式１Ａの部分構造を分子内に有する。
【化１２】
2019172394.tif 000014
（ここで、Ａ１は−ＳＲ１、−Ｓ−Ｓ−Ｒ１、−ＳｅＲ１、又は−Ｘ（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。Ｌ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基を示し、Ｌ２は炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基を示す。Ｌ１とＬ２は互いに連結して４〜６員の環構造を形成してもよく、環構造は炭素、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１種類以上の元素で構成される。Ｌ１及びＬ２は、それぞれヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アルキル基、アリール基、炭素数１５〜３０の飽和脂肪酸及び／又は不飽和脂肪酸を１以上含むリン脂質、モノリン酸基、ジリン酸基、又はトリリン酸基、及び塩基（ここで、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、Ｎ−メチルアデニン、Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−アミノアデニン、７−メチルグアニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−メチルシトシン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、又は５，６−ジヒドロウラシルを意味する）から選択される１又は２以上の置換基を有していてもよい。＊はリン酸化を受けてリン酸基が結合する結合手であり、リン酸化前においては水素又はリン酸基以外の置換基が結合していることを意味する。）
【００２４】
ここで、Ｒ１は、水素、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアリール基、炭素数１〜１０のアルケニル基から選択されることが好ましく、水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアリール基、炭素数１〜６のアルケニル基から選択されることが特に好ましい。
【００２５】
炭素数１〜１０のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、２−プロペニル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、２−エチルヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基などを挙げることができる。炭素数１〜１０のアリール基としては、フェニル基、ｏ−トリル基、ｐ−トリル基、２，３−ジメチルフェニル基、２，４−ジメチルフェニル基、２，５−ジメチルフェニル基、２，６−ジメチルフェニル基、メシチル基、ｏ−クメニル基などを挙げることができる。炭素数１〜６のアルケニル基としては、ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ヘキセニル基などを挙げることができる。以下の説明においても同様である。
【００２６】
また、Ｌ１，Ｌ２は、互いに同じであっても異なっていてもよく、それぞれ、水素、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアリール基、又は炭素数１〜１０のアルケニル基から選択されることが好ましく、水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアリール基、炭素数１〜６のアルケニル基から選択されることが特に好ましい。
【００２７】
Ｌ１とＬ２が互いに連結して環構造を形成する場合、シクロヘキサン、ベンゼン、五単糖、六単糖などを挙げることができる。Ｌ１及びＬ２は、それぞれ置換基を有していてもよく、置換基としては、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アルキル基、アリール基、炭素数１５〜３０の飽和脂肪酸及び／又は不飽和脂肪酸を１以上含むリン脂質、及び塩基から選択される。例えば、Ｌ１及びＬ２がリボース又はデオキシリボースの場合、置換基として１’位に塩基が結合するとヌクレオシド誘導体となる。
【００２８】
塩基としては、天然の核酸塩基でもよく、非天然の（合成した）核酸塩基でもよい。天然の核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルを挙げることができる。非天然の核酸塩基としては、Ｎ−メチルアデニン、Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−アミノアデニン、７−メチルグアニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−メチルシトシン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５，６−ジヒドロウラシルなどを挙げることができる。
【００２９】
＊は結合手であり、リン酸化前においては水素又はリン酸基以外の置換基が結合していることを意味している。リン酸化前において、特に、水素と結合していること（すなわち、＊−Ｏがヒドロキシル基であること）が好ましい。
【００３０】
上記式１Ａで示されるβ修飾リン酸化合物前駆体は、リン酸化される化合物において、リン酸化を受ける酸素に結合したα位の炭素に対して、隣接するβ位の炭素を上記Ａ１で修飾した化合物ということができる。リン酸化は、生体内及び生体外のいずれの反応でもよいが、医薬用途としてのβ修飾リン酸化合物前駆体としては、生体内でリン酸化される生体化合物の類似体が好ましい。生体内でリン酸化される生体化合物としては、後述するヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸などの遺伝子関連物質、後述するメバロン酸やイノシトールリン酸などの代謝関連物質などを挙げることができる。
【００３１】
（２）β修飾リン酸化合物
次に、β修飾リン酸化合物について説明する。本発明のβ修飾リン酸化合物は、式１Ａのβ修飾リン酸化合物前駆体において、α位の炭素に結合する酸素がリン酸化された化合物である。具体的には、下記式１Ｂで示される部分構造を有するβ修飾リン酸化合物である。
【化１３】
2019172394.tif 000015
（ここで、Ａ１は−ＳＲ１、−Ｓ−Ｓ−Ｒ１、−ＳｅＲ１、又は−Ｘ（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、炭素数１〜２０のアルケニル基から選択される。Ｌ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基を示し、Ｌ２は炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基を示す。Ｌ１とＬ２は互いに連結して４〜６員の環構造を形成してもよく、環構造は炭素、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１種類以上の元素で構成される。Ｌ１及びＬ２は、それぞれヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アルキル基、アリール基、炭素数１５〜３０の飽和脂肪酸及び／又は不飽和脂肪酸を１以上含むリン脂質、モノリン酸基、ジリン酸基、又はトリリン酸基、及び塩基（ここで、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、Ｎ−メチルアデニン、Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−アミノアデニン、７−メチルグアニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−メチルシトシン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、又は５，６−ジヒドロウラシルを意味する）から選択される１又は２以上の置換基を有していてもよい。）
【００３２】
（３）反応阻害剤及び反応阻害方法
次に、反応阻害剤及び反応阻害方法について説明する。本発明の反応阻害剤は、リン酸化を伴う反応におけるリン酸化後の反応の進行を阻害する反応阻害剤であって、上記式１Ａで示される部分構造を分子内に有するβ修飾リン酸化合物前駆体を含有する。そして、上記式１Ａのβ修飾リン酸化化合物前駆体がリン酸化されて上記式１Ｂのβ修飾リン酸化化合物が生成する。このβ修飾リン酸化化合物は、以下の反応メカニズムにより、リン酸化後の反応を阻害する。
【００３３】
以下、本発明の反応阻害方法（反応メカニズム）について説明する。上記の反応阻害剤を用いた反応阻害方法では、まず、上記式１Ａで示される部分構造を分子内に有するβ修飾リン酸化合物前駆体を用意する（工程１）。
【００３４】
次に、このβ修飾リン酸化合物前駆体をリン酸化して、式１Ｂで示される部分構造を分子内に有するβ修飾リン酸化合物を生成させる（工程２）。このとき生成する式１Ｂの化合物は、構造が不安定であり、部分開裂して下記式１Ｃで示される活性種が生成する。
【化１４】
2019172394.tif 000016
（ここで、Ａ２は−Ｓ−、−Ｓ＋Ｒ１−、−Ｓ＋−Ｓ−Ｒ１−、−Ｓｅ＋Ｒ１−、又は−Ｘ＋−（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。Ｌ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基を示し、Ｌ２は炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基を示す。Ｌ１とＬ２は互いに連結して４〜６員の環構造を形成してもよく、環構造は炭素、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１種類以上の元素で構成される。Ｌ１及びＬ２は、それぞれヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アルキル基、アリール基、炭素数１５〜３０の飽和脂肪酸及び／又は不飽和脂肪酸を１以上含むリン脂質、モノリン酸基、ジリン酸基、又はトリリン酸基、及び塩基（ここで、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、Ｎ−メチルアデニン、Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−アミノアデニン、７−メチルグアニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−メチルシトシン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、又は５，６−ジヒドロウラシルを意味する）から選択される１又は２以上の置換基を有していてもよい。）
【００３５】
この活性種は、反応性が高く、他の化合物を求核攻撃して共有結合を形成しやすい性質を有している。例えばＡ２が−Ｓ−の場合、α、β炭素と硫黄原子とがチイラン環を分子内に形成する。このチイラン環は、アミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、イミダゾイル基などの官能基と反応して共有結合を形成しやすく、このため、タンパク質中の分子内にリシン、システイン、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンなどのアミノ酸の側鎖の部分と共有結合しやすい。活性種がタンパク質と不可逆的に共有結合することで、その後の反応の進行が停止し、反応阻害作用を発揮すると推測される。
【００３６】
β修飾リン酸化合物前駆体が阻害する反応としては、リン酸化を伴う種々の反応を挙げることができる。特に、生体内での反応に対して効率的に阻害することができる。活性種が結合する分子は、タンパク質に限定されず、種々の分子に結合して反応を阻害する。
【００３７】
このように、本発明では、β修飾リン酸化合物前駆体を用いることで、リン酸化により活性種を生成させて共有結合により不可逆的に反応を阻害することが可能となる。また、リン酸化を受ける反応に特化して反応を阻害することができるため、副作用などが生じにくい。さらに、式１Ａの部分構造に基づいて、特定の反応をターゲットにした反応阻害剤の化合物を設計できるという利点もある。
【００３８】
（４）医薬
本発明の反応阻害剤は、上記のようにリン酸化後の反応を阻害することから、医薬、農薬などの薬剤における有効成分として有用であり、特に、医薬用途が好ましい。医薬の種類としては、錠剤、カプセル、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、ゼリー剤、液剤などを挙げることができる。
【００３９】
上記の薬剤は、本発明の反応阻害剤のほかに、本発明の反応阻害効果を損なわない範囲内で、溶剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、懸濁化剤などの添加物を含んでいてもよい。製剤用溶剤としては、例えば、水、エタノール、グリセリンなどを挙げることができる。賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット、トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、アラビアゴム、デキストラン、プルラン、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩類；リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウムなどを挙げることができる。結合剤としては、例えば、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、マクロゴールなどを挙げることができる。崩壊剤としては、例えば、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンなどを挙げることができる。滑沢剤としては、例えば、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、コロイドシリカ、ビーガム、ビーズワックス、ゲイロウ、硼酸、グリコール、フマル酸、アジピン酸、安息香酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、無水珪酸、珪酸水和物などを挙げることができる。安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレゾール、チメロサール、無水酢酸、ソルビン酸などを挙げることができる。懸濁化剤としては、例えば、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを挙げることができる。
【００４０】
（５）β修飾リン酸化合物前駆体の製造方法
次に、β修飾リン酸化合物前駆体の製造方法について説明する。式１Ａのβ修飾リン酸化合物前駆体は、下記式のスキームで合成することができる。具体的には、β位の炭素にヒドロキシル基などが結合した化合物を出発物質とし、このヒドロキシル基以外のヒドロキシル基に保護基を結合して保護する。次に、β炭素に結合したヒドロキシル基をＡ１で置換し、最後に保護基を脱離させることで式１Ａの化合物を合成することができる。出発物質や保護基の種類、反応条件（濃度、温度等）などは、合成するβ修飾リン酸化合物前駆体によって異なる。
【化１５】
2019172394.tif 000017
【００４１】
β修飾リン酸化合物前駆体としては、種々の具体的な化合物を挙げることができる。以下、ヌクレオシド誘導体、メバロン酸誘導体、ホスファチジルイノシトール誘導体についてそれぞれ詳細に説明する。
【００４２】
２．ヌクレオシド誘導体
（１）β修飾リン酸化合物前駆体
β修飾リン酸化合物前駆体としては、下記式２Ａで示されるヌクレオシド誘導体を挙げることができる。
【化１６】
2019172394.tif 000018
（ここで、Ａ１は−ＳＲ１、−Ｓ−Ｓ−Ｒ１、−ＳｅＲ１、又は−Ｘ（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。Ｌ３は水素、又は下記式２Ｄで示されるモノリン酸基、ジリン酸基、又はトリリン酸基である。
【化１７】
2019172394.tif 000019
（ここで、ｎは１〜３の整数を示す。Ｚ１は、ヒドロキシル基、又はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン若しくはプロリンのメチルエステル、エチルエステル、イソプロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ベンジルエステル若しくはフェニルエステルである。Ｚ２は、水素、炭素数１〜４のアルキル基、ハロゲン、又はフェニル基である。ｎが２以上の場合においてそれぞれのＺ１は同一又は異なっていてもよい。）
Ｂはアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、Ｎ−メチルアデニン、Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−アミノアデニン、７−メチルグアニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−メチルシトシン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、又は５，６−ジヒドロウラシルから選択される塩基である。＊はリン酸化を受けてリン酸基が結合する結合手であり、リン酸化前においては水素又はリン酸基以外の置換基が結合していることを意味する。）
【００４３】
ここで、ヌクレオシド誘導体としては、具体的には、以下に示される化合物を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
塩基がアデニンであるアデノシン誘導体としては、下記式（２Ａ−１Ａ）〜（２Ａ−１２Ａ）の化合物を例示することができる。
【化１８】
2019172394.tif 000020
【００４５】
塩基がグアニンであるグアノシン誘導体としては、下記式（２Ａ−１Ｇ）〜（２Ａ−１２Ｇ）の化合物を例示することができる。
【化１９】
2019172394.tif 000021
【００４６】
塩基がシトシンであるシチジン誘導体としては、下記式（２Ａ−１Ｃ）〜（２Ａ−１２Ｃ）の化合物を例示することができる。
【化２０】
2019172394.tif 000022
【００４７】
塩基がチミンであるチミジン誘導体としては、下記式（２Ａ−１Ｔ）〜（２Ａ−１２Ｔ）の化合物を例示することができる。
【化２１】
2019172394.tif 000023
【００４８】
塩基がウラシルであるウリジン誘導体としては、下記式（２Ａ−１Ｕ）〜（２Ａ−１２Ｕ）の化合物を例示することができる。
【化２２】
2019172394.tif 000024
【００４９】
本発明におけるヌクレオシド誘導体には、ヌクレオチド又はその誘導体（Ｌ３がモノリン酸基、ジリン酸基、又はトリリン酸基、若しくはこれらの誘導体の場合）も含まれる。ヌクレオチド又はその誘導体としては、Ｌ３が上記の式２Ｄの化合物を挙げることができる。ここで、ヌクレオシド誘導体がヌクレオチドである場合、式２Ｄにおいて、Ｚ１がヒドロキシル基、Ｚ２が水素の場合に該当する。また、ヌクレオシド誘導体がヌクレオチド誘導体である場合、式２Ｄにおいて、Ｚ１がグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン若しくはプロリンのメチルエステル、エチルエステル、イソプロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ベンジルエステル若しくはフェニルエステル、Ｚ２が炭素数１〜４のアルキル基、ハロゲン、又はフェニル基の場合に該当する。この場合において、Ｚ１としては、アラニンイソプロピルエステル、アラニンシクロヘキシルエステル、アラニンネオペンチルエステル、バリンイソプロピルエステル、又はロイシンイソプロピルエステルであることが好ましい。これらのエステル類は、グリシン等のアミノ酸由来の窒素を介してリンに結合する。また、Ｚ２としては、フェニル基であることが好ましい。
【００５０】
さらに、β修飾リン酸化合物前駆体としては、上記式２Ａのヌクレオシド誘導体を３’末端に有する核酸を挙げることができる。ここで、核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）のいずれでもよく、また、ＤＮＡの場合は二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡのいずれでもよい。核酸の構成単位数としては、特に制限はないが、通常は１〜１００塩基（二本鎖ＤＮＡの場合は塩基対）の範囲内であり、１〜５０塩基（塩基対）の範囲内が好ましく、１〜１０塩基（塩基対）の範囲内がより好ましい。
【００５１】
（２）β修飾リン酸化合物
上記式２Ａで示されるヌクレオシド誘導体がリン酸化を受けたあとのβ修飾リン酸化合物としては、下記式２Ｂで示される部分構造を有するβ修飾リン酸化合物を挙げることができる。
【化２３】
2019172394.tif 000025
（ここで、Ａ１は−ＳＲ１、−Ｓ−Ｓ−Ｒ１、−ＳｅＲ１、又は−Ｘ（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。Ｌ３は水素、又は上記式２Ｄで示されるモノリン酸基、ジリン酸基、又はトリリン酸基である。Ｂはアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、Ｎ−メチルアデニン、Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−アミノアデニン、７−メチルグアニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−メチルシトシン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、又は５，６−ジヒドロウラシルから選択される塩基である。）
【００５２】
さらに、β修飾リン酸化合物としては、上記式２Ｂのヌクレオシド誘導体を３’末端に有する核酸を挙げることができる。ここで、核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）のいずれでもよく、また、ＤＮＡの場合は二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡのいずれでもよい。核酸の構成単位数としては、特に制限はないが、通常は１〜１００塩基（二本鎖ＤＮＡの場合は塩基対）の範囲内であり、１〜５０塩基（塩基対）の範囲内が好ましく、１〜１０塩基（塩基対）の範囲内がより好ましい。
【００５３】
（３）反応阻害剤及び反応阻害方法
β修飾リン酸化合物前駆体が式２Ａで示されるヌクレオシド誘導体であり、β修飾リン酸化合物が上記式２Ｂで示されるヌクレオシド誘導体である場合、中間体である活性種として下記式２Ｃで示される化合物が生成する。
【化２４】
2019172394.tif 000026
（ここで、Ａ２は−Ｓ−、−Ｓ＋（Ｒ１）−、−Ｓ＋（Ｓ−Ｒ１）−、−Ｓｅ＋（Ｒ１）−、又は−Ｘ＋−（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。Ｌ３は水素、モノリン酸基、ジリン酸基、又はトリリン酸基である。Ｂはアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、Ｎ−メチルアデニン、Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−アミノアデニン、７−メチルグアニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−メチルシトシン、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、又は５，６−ジヒドロウラシルから選択される塩基である。）
【００５４】
β修飾リン酸化合物が式２Ａで示されるヌクレオシド誘導体の場合、特にポリメラーゼ反応を効率的に阻害する。ポリメラーゼ反応は、ＤＮＡポリメラーゼとＲＮＡポリメラーゼの両方が含まれるが、式２Ａのヌクレオシド誘導体は、特にＤＮＡポリメラーゼを好適に阻害することができる。以下、図面を参照して、ＤＮＡポリメラーゼ阻害作用について説明する。
【００５５】
図１は、式２Ａのヌクレオシド誘導体の一例として、Ａ１が−ＳＲ１（チオアルキル基）の場合におけるＤＮＡポリメラーゼ阻害作用を示す模式図である。生体内（細胞内）にヌクレオシド誘導体を投与すると、キナーゼによってヌクレオシド誘導体の５’ヒドロキシル基がリン酸化され、ヌクレオシド三リン酸誘導体となる。これは、ＤＮＡポリメラーゼ反応の基質となり、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する一本鎖ＤＮＡの３’末端側に結合する。次に、このヌクレオシド誘導体の３’ヒドロキシル基に次のヌクレオシドの５’リン酸基が結合する（図の下段左側）。この状態の反応中間体では、２’のチオアルキル基の求核攻撃によって３’のリン酸基が解離するとともに、２’位の炭素、３’位の炭素、チオアルキル基の硫黄の３つでチイラン環が形成される（図の下段中央）。このチイラン環は反応性が高く、ＤＮＡポリメラーゼを構成する特定のアミノ酸の側鎖と反応して共有結合する（図の下段右側）と推測される。この反応は不可逆的であり、これ以降にポリメラーゼ反応が進行することがない。このように、ヌクレオシド誘導体を用いることで、従来のアシクロビルなどを用いた伸長阻害反応とは異なり、ポリメラーゼに共有結合して反応を阻害するという新規なメカニズムで効率的に反応を阻害することができる。
【００５６】
ポリメラーゼ反応の阻害を行うには、まず、式２Ａのヌクレオシド誘導体を標的とする生体試料（細胞、ウイルスなど）に添加する。ヌクレオシド誘導体は、緩衝液など適当な溶媒に溶解して添加する。添加時のヌクレオシド誘導体の濃度は、標的とする反応の特性等に応じて適宜設定することができる。例えば、後述するＢ型肝炎ウイルスの場合、ヌクレオシド誘導体の濃度は、通常は１μＭ〜１ｍＭの範囲内であり、１０μＭ〜５００μＭの範囲内が好ましく、５０〜２００μＭの範囲内が特に好ましい。反応時間も適宜設定することができるが、例えばＢ型肝炎ウイルスの場合、通常は１〜３０日の範囲内であり、５〜１０日の範囲内がより好ましい。
【００５７】
β修飾リン酸化合物前駆体により、リン酸化を伴う反応において、リン酸化より後の反応が阻害される。β修飾リン酸化合物前駆体による反応阻害活性は、リン酸化により生成する化合物（ポリメラーゼ反応の場合はＤＮＡやＲＮＡ）や、さらには細胞、ウイルスなど生体試料そのものを定量することで評価することができる。
【００５８】
（４）医薬
ヌクレオシド誘導体は、ポリメラーゼ阻害剤であり、ＤＮＡの複製やＲＮＡの転写反応を阻害するため、細胞やウイルスの増殖などを抑制する。このため、式２Ａで示されるヌクレオシド誘導体は、増殖阻害剤であり、ウイルス性疾患や癌などの治療薬として有用である。
【００５９】
（５）ヌクレオシド誘導体前駆体の製造方法
以下、ヌクレオシド誘導体の製造方法について説明する。具体的な反応条件などは、後述する実施例において詳細に説明するため、ここでは、いくつかのヌクレオシド誘導体について、合成方法（製造方法）の概略を説明する。
【００６０】
（ａ）式（２Ａ−１Ａ）の化合物の合成（※Ａ１が−ＳＨの化合物）
下記の合成スキームに沿って説明する。以下で説明する合成スキームにおいて、数字は化合物の番号を表す。まず、ヌクレオシド（下記スキームではアデノシン）を出発物質とし、１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン（ＴＰＤＳＣｌ２）をピリジンなどの溶媒中で反応させる。これにより、リボースの３’ヒドロキシル基と５’ヒドロキシル基との間でシロキサン結合の環状構造を形成させ、３’位と５’位のヒドロキシル基を保護する（化合物１）。次に、Ｎ−フェニルトリフルオロメタンスルホンイミドを添加して、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）などの求核剤をジクロロメタン（ＤＣＭ）などの溶媒中で反応させて、リボースの２’位をトリフルオロスルホン酸基とする（化合物２）。次に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの存在下でチオ酢酸カリウムなどのチオール基を有する化合物を反応させて、リボースの２’位にチオエステルを形成させる（化合物３）。さらにアンモニア／メタノール溶液中で反応させることでチオエステル基をチオール基に変換する（化合物４）。続いて、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（３ＨＦ−Ｅｔ３Ｎ）とテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）とを添加してリボースの３’位と５’位の保護基を脱離させてヒドロキシル基にする。
【化２５】
2019172394.tif 000027
【００６１】
（ｂ）式（２Ａ−６Ａ）の化合物の合成（※Ａ１が−Ｓ−Ｓ−Ｃ３Ｈ５の化合物）
化合物４までの合成スキームは上記の式（２Ａ−１Ａ）の化合物の合成の場合と同じである。続いて、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）とアゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ）の混合溶媒などの溶媒中で１−プロパンチオールなどのチオアルキル化合物と反応させてリボースの２’位をジスルフィドアルキル基に変換する（化合物５）。次に、溶媒中で塩化ベンゾイル（ＢｚＣｌ）と反応させて、塩基のアミノ基をベンゾイル基で保護する。続いて、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（３ＨＦ−Ｅｔ３Ｎ）とＴＨＦとを添加してリボースの３’位と５’位の保護基を脱離させてヒドロキシル基にする（化合物１１）。
【化２６】
2019172394.tif 000028
【００６２】
（ｃ）式（２Ａ−８Ａ）の化合物の合成（※Ａ１が−Ｓｅ−ＣＨ３の化合物）
化合物２までの合成スキームは上記の式（２Ａ−１Ａ）の化合物の合成の場合と同じである。次に、ジメチルジセレニド、水素化ホウ素ナトリウム、さらにはＴＨＦ等の溶媒中で反応させる（化合物１２）。さらに、フッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）、ＴＨＦなどを添加してリボースの３’位と５’位の保護基を脱離させてヒドロキシル基にする（化合物１３）。
【化２７】
2019172394.tif 000029
【００６３】
（ｄ）式（２Ａ−１０Ａ）〜（２Ａ−１２Ａ）の化合物の合成（※Ａ１がハロゲンの化合物）
次に、ハロゲン化合物の合成スキームについて説明する。化合物２までの合成スキームは上記の式（２Ａ−１Ａ）の化合物の合成の場合と同じである。次に、ハロゲン化リチウムを添加して加熱してハロゲンを導入する。ハロゲン化リチウムとしては、フッ化リチウム、塩化リチウム、臭化リチウム、ヨウ化リチウムを挙げることができる。続いて、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（３ＨＦ−Ｅｔ３Ｎ）とＴＨＦとを添加してリボースの３’位と５’位の保護基を脱離させてヒドロキシル基にする。
【化２８】
2019172394.tif 000030
【００６４】
３．メバロン酸誘導体
（１）β修飾リン酸化合物前駆体
β修飾リン酸化合物前駆体としては、下記式３Ａで示されるメバロン酸誘導体を挙げることができる。
【化２９】
2019172394.tif 000031
（ここで、Ａ１は−ＳＲ１、−Ｓ−Ｓ−Ｒ１、−ＳｅＲ１、又は−Ｘ（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。）
【００６５】
特に、Ａ１が−ＳＨ、−ＳＣＨ３、−Ｓ−Ｃ２Ｈ５、−Ｓ−Ｃ３Ｈ７、−Ｓ−ＳＨ、−Ｓ−Ｓ−ＣＨ３、−Ｓ−Ｓ−Ｃ２Ｈ５、−Ｓ−Ｓ−Ｃ３Ｈ７などの化合物が好ましい。
【００６６】
（２）β修飾リン酸化合物
また、上記式３Ａで示されるメバロン酸誘導体がリン酸化を受けたあとのβ修飾リン酸化合物としては、下記式３Ｂで示される部分構造を有するβ修飾リン酸化合物を挙げることができる。
【化３０】
2019172394.tif 000032
（ここで、Ａ１は−ＳＲ１、−Ｓ−Ｓ−Ｒ１、−ＳｅＲ１、又は−Ｘ（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。）
【００６７】
（３）反応阻害剤及び反応阻害方法
特に、β修飾リン酸化合物前駆体が式３Ａで示されるメバロン酸誘導体であり、β修飾リン酸化合物が上記式３Ｂで示されるメバロン酸誘導体である場合、中間体である活性種として下記式３Ｃで示される化合物が生成する。
【化３１】
2019172394.tif 000033
（ここで、Ａ２は−Ｓ−、−Ｓ＋（Ｒ１）−、−Ｓ＋（Ｓ−Ｒ１）−、−Ｓｅ＋（Ｒ１）−、又は−Ｘ＋−（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。）
【００６８】
以下、３Ａで示されるメバロン酸誘導体の活性種生成反応について具体例（Ａ１が−ＳＨの化合物）を示して説明する。下記式に示されるメバロン酸誘導体は、リン酸化によりＡ１の硫黄が骨格の炭素―炭素結合とチイラン環を形成する。この環構造は非常に不安定であり、他の化合物と容易に共有結合する性質を有している
【化３２】
2019172394.tif 000034
【００６９】
β修飾リン酸化合物が式３Ａで示されるメバロン酸誘導体の場合、特にメバロン酸キナーゼや５−ホスホメバロン酸キナーゼを効率的に阻害する。メバロン酸は、テルペンを合成するメバロン酸経路に関与する物質であり、メバロン酸キナーゼによってメバロン酸とＡＴＰから５−ホスホメバロン酸が生成し、さらに５−ホスホメバロン酸キナーゼによって５−ホスホメバロン酸とＡＴＰから５−ジホスホメバロン酸が生成する。式３Ａで示されるメバロン酸誘導体は、このメバロン酸のアナログとしてメバロン酸経路の効率的は反応阻害剤となる。すなわち、式３Ａで示されるメバロン酸誘導体がリン酸化されて式３Ｂの化合物を経て式３Ｃの活性種が生成し、これがメバロン酸キナーゼや５−ホスホメバロン酸キナーゼなどに共有結合することで、リン酸化後の反応を阻害すると推測される。
【００７０】
（４）医薬
式３Ａで示されるメバロン酸誘導体は、メバロン酸経路を阻害するため、コレステロールの生成を抑制する。このため、式３Ａで示されるメバロン酸誘導体は、コレステロール生成阻害剤であり、高脂血症や高コレステロール血症などの治療薬として有用である。
【００７１】
４．ホスファチジルイノシトール誘導体
（１）β修飾リン酸化合物前駆体
β修飾リン酸化合物前駆体としては、下記式４Ａで示されるホスファチジルイノシトール誘導体を挙げることができる。
【化３３】
2019172394.tif 000035
（ここで、Ａ１は−ＳＲ１、−Ｓ−Ｓ−Ｒ１、−ＳｅＲ１、又は−Ｘ（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。Ｒ３はアラキドン酸、リノール酸、及びリノレン酸から選択される不飽和脂肪酸であり、Ｒ４はステアリン酸、パルミチン酸から選択される飽和脂肪酸である。）
【００７２】
特に、Ａ１が−ＳＨ、−ＳＣＨ３、−Ｓ−Ｃ２Ｈ５、−Ｓ−Ｃ３Ｈ７、−Ｓ−ＳＨ、−Ｓ−Ｓ−ＣＨ３、−Ｓ−Ｓ−Ｃ２Ｈ５、−Ｓ−Ｓ−Ｃ３Ｈ７などの化合物が好ましい。
【００７３】
（３）反応阻害剤及び反応阻害方法
特に、β修飾リン酸化合物前駆体が式４Ａで示されるホスファチジルイノシトール誘導体であり、β修飾リン酸化合物が上記式４Ｂで示されるホスファチジルイノシトール誘導体である場合、中間体である活性種として下記式４Ｃで示される化合物が生成する。
【化３４】
2019172394.tif 000036
（ここで、Ａ２は−Ｓ−、−Ｓ＋（Ｒ１）−、−Ｓ＋（Ｓ−Ｒ１）−、−Ｓｅ＋（Ｒ１）−、又は−Ｘ＋−（ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択されるハロゲンを意味する）を示し、Ｒ１は水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアリール基、又は炭素数１〜２０のアルケニル基である。Ｒ３はアラキドン酸、リノール酸、及びリノレン酸から選択される不飽和脂肪酸であり、Ｒ４はステアリン酸、パルミチン酸から選択される飽和脂肪酸である。）
【００７４】
以下、４Ａで示されるホスファチジルイノシトールの活性種生成反応について具体例（Ａ１が−ＳＣＨ３の化合物）を示して説明する。下記式に示されるホスファチジルイノシトールは、リン酸化によりＡ１の硫黄がイノシトール骨格の炭素―炭素結合と環構造を形成する。この環構造の硫黄はプラスの電荷を有している。この環構造も非常に不安定であり、他の化合物と容易に共有結合する性質を有している
【化３５】
2019172394.tif 000037
【００７５】
β修飾リン酸化合物が式４Ａで示されるホスファチジルイノシトールの場合、特にホスホイノシチド−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の反応を効率的に阻害する。ＰＩ３Ｋは、イノシトールリン脂質をリン酸化することにより、ホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸を生成する。これらの化合物は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路に関与する物質であり、Ａｋｔはがん遺伝子産物でもある。式４Ａで示されるホスファチジルイノシトールがリン酸化されて式４Ｂの化合物を経て式４Ｃの活性種が生成し、これがＰＩ３Ｋに共有結合することで反応を阻害すると推測される。
【００７６】
（４）医薬
式４Ａで示されるホスファチジルイノシトールは、ＰＩ３Ｋ活性阻害剤であり、癌、悪性リンパ腫、白血病、リウマチなどの治療薬として有用である。
【００７７】
（５）ホスファチジルイノシトールの製造方法
式４Ａで示されるホスファチジルイノシトールの製造方法は、式２Ａで示されるヌクレオシド誘導体と同様の方法で製造することができる。すなわち、式４Ａのホスファチジルイノシトールは、以下の手順で合成することができる。まず、シロキサン類を保護基としてイノシトールの２’以外のヒドロキシル基を保護する。次に、２’位にトリフルオロスルホン酸基を導入したのち、チオエステルからチオール基に変換する。最後に保護基をイノシトールから脱離させる。
【実施例】
【００７８】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、これらは本発明の目的を限定するものではない。また、以下の実施例において「％」表示は特に規定しない限り質量基準（質量パーセント）である。【００７９】
以下の実施例におけるヌクレオシド誘導体の合成スキームの全体を下記に示す。以下、この合成スキームに沿ってヌクレオシド誘導体の合成方法を説明する（なお、合成スキーム中の番号は化合物の番号と一致している）。また、「％」の数字は収率を意味する。
【化３６】
2019172394.tif 000038
【化３７】
2019172394.tif 000039
【００８０】
１．ヌクレオシド誘導体の合成
（１）化合物１の合成
アルゴン（Ａｒ）雰囲気下で、ｐｙｒｉｄｉｎｅ（６５ｍＬ）にａｄｅｎｏｓｉｎｅ（３．０１ｇ，１０．１ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）を溶かし、ＴＰＤＳＣｌ２（３．２ｍＬ，１０．１ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）を加え、室温で４６時間撹拌した。減圧下で溶媒を留去し、酢酸エチルと水（０．１Ｍ  ＨＣｌ  ａｑ．，Ｈ２Ｏ，ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３  ａｑ．，ｂｒｉｎｅ）で分液した。無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥した後、綿栓ろ過し、減圧下で溶媒を留去した。中性フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３（ＭｅＯＨ  ０−４％））にて精製し、化合物１（４．１４ｇ，８０％）を得た。得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲ情報は以下のとおりである。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．０６−１．１３（ｍ，２８Ｈ），３．３１（ｓ，１Ｈ），４．０１−４．１６（ｍ，３Ｈ），４．５６（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．０７−５．１１（ｍ，１Ｈ），５．７９（ｓ，２Ｈ），５．９７（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９７（ｓ，１Ｈ），８．２８（ｓ，１Ｈ）．【００８１】
（２）化合物２の合成
Ａｒ雰囲気下、氷冷下で化合物１（１．００ｇ，１．８３ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）とＤＭＡＰ（６５０ｍｇ，５．５ｍｍｏｌ，３ｅｑ．）を脱水ＤＣＭ（１７ｍＬ）に溶かし、Ｎ−Ｐｈｅｎｙｌｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｍｉｄｅ（８０３ｍｇ，２．２ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．）を加えて２時間撹拌した。氷冷したジクロロメタンと水（０．１Ｍ  ＡｃＯＨ  ａｑ．，ｓａｔ．  ＮａＨＣＯ３  ａｑ．，ｂｒｉｎｅ）で分液した。無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥した後、綿栓ろ過し、減圧下で溶媒を留去した。中性フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で精製し、化合物２（９４６ｍｇ，８１％）を得た。得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲ情報は以下のとおりである。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．０６−１．１１（ｍ，２８Ｈ，），４．０２−４．２０（ｍ，３Ｈ），５．２６−５．２９（ｍ，１Ｈ），５．７２（ｓ，２Ｈ），５．７８（ｄ，Ｊ＝４．８  Ｈｚ，１Ｈ），６．１０（ｓ，１Ｈ），７．９６（ｓ，１Ｈ），８．２６（ｓ，１Ｈ）．  【００８２】
（３）化合物３の合成
Ａｒ雰囲気下で化合物２（２．８０ｇ，４．３６ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）及び、脱水アセトニトリルで共沸したチオ酢酸カリウム（１．０６ｇ，９．２８ｍｍｏｌ，２．１ｅｑ．）を脱水ＤＭＦ（９ｍＬ）に溶かし、１４．５時間撹拌した。減圧下で溶媒を留去し、ヘキサン／酢酸エチル＝１／５混合溶媒と水（ｓａｔ．  ＮａＨＣＯ３  ａｑ．，ｂｒｉｎｅ）で分液した。無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥した後、綿栓ろ過し、減圧下で溶媒を留去した。中性フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝２／３）で精製し、化合物３（１．７２ｇ，６７％）を得た。得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲ情報は以下のとおりである。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．０１−１．１８（ｍ，２８Ｈ），２．１５（ｓ，３Ｈ），３．９７−４．０３（ｍ，２Ｈ），４．２３−４．２７（ｍ，１Ｈ），４．５４−４．５８（ｍ，１Ｈ），５．０１−５．０６（ｍ，１Ｈ），６．１２（ｓ，１Ｈ），６．４０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｓ，１Ｈ），８．２３（ｓ，１Ｈ）．【００８３】
（４）化合物４の合成
Ａｒ雰囲気下、氷冷下で化合物３（１．４２ｇ，２．５０ｍｍｏｌ）を７Ｍ  ＮＨ３−ＭｅＯＨ（２５ｍＬ）に溶かし１時間撹拌した。減圧下で溶媒を留去し、酢酸エチルと水（ｓａｔ．  ＮａＨＣＯ３  ａｑ．，ｂｒｉｎｅ）で分液した。無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥した後、綿栓ろ過し、減圧下で溶媒を留去し、化合物４（１．７５ｇ，ｑｕａｎｔ．）を得た。得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲ情報は以下のとおりである。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．００−１．１８（ｍ，２８Ｈ），１．４４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），３．８１−３．９１（ｍ，２Ｈ），４．０３−４．０７（ｍ，１Ｈ），４．２０−４．２４（ｍ，１Ｈ），４．５８−４．６３（ｍ，１Ｈ），５．７６（ｓ，１Ｈ），６．４０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），８．１１（ｓ，１Ｈ），８．３３（ｓ，１Ｈ）．【００８４】
（５）化合物５の合成
化合物４（３０４ｍｇ，０．５７１ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）をＴＨＦ（１．９ｍＬ，０．３Ｍ  ｔｏ  化合物４）に溶かし、ＤＩＡＤ（１２４μＬ，０．６２８ｍｍｏｌ，１．１ｅｑ．）を加えて１８時間撹拌した。１−ｐｒｏｐａｎｅｔｈｉｏｌ（３．１ｍＬ，３３．７ｍｍｏｌ，５９ｅｑ．）を加え、８０℃に加熱して２９時間撹拌し、室温まで放冷した。減圧下で溶媒を留去し、中性フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で精製し、化合物５（２３０ｍｇ，６７％）を得た。得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲ情報は以下のとおりである。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ０．８８−０．９２（ｍ，３Ｈ），１．０６−１．１７（ｍ，２８Ｈ），１．５３−１．５８（ｍ，２Ｈ），２．５３（ｔ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，２Ｈ），３．８８−３．９４（ｍ，２Ｈ），４．０１−４．０５（ｍ，１Ｈ），４．１５−４．２０（ｍ，１Ｈ），４．７４（ｔ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），５．６８（ｓ，１Ｈ），６．４９（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９７（ｓ，１Ｈ），８．３２（ｓ，１Ｈ）．【００８５】
（６）化合物６の合成
Ａｒ雰囲気下、氷冷下で化合物５（３１４ｍｇ，０．５２３ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）をｐｙｒｉｄｉｎｅ（２．１ｍＬ，０．２５Ｍ  ｔｏ  化合物５）に溶かし、そこにＢｚＣｌ（９１μＬ，０．７８５ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ．）を加えて３時間３０分撹拌した。ＢｚＣｌ（６０μＬ，０．５２３ｍｍｏｌ  １．０ｅｑ．）を加え、さらに１時間撹拌した。ＢｚＣｌ（３０μＬ，０．２６２ｍｍｏｌ  ０．５ｅｑ．）を加え、さらに４０分撹拌した。ＢｚＣｌ（６０μＬ，０．５２３ｍｍｏｌ  １．０ｅｑ．）を加え、さらに４０分撹拌した。４ｍＬの水を加え、５分撹拌した後、２８％アンモニア水溶液を８ｍＬ加えて１５分撹拌した。酢酸エチルと水（ｓａｔ．  ＮａＨＣＯ３  ａｑ．，ｂｒｉｎｅ）で分液した。無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥した後、綿栓ろ過し、減圧下で溶媒を留去した。中性フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で精製し、化合物６（１８３ｍｇ，５０％）  を得た。得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲ情報は以下のとおりである。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ０．８８−０．９２（ｍ，３Ｈ），１．０１−１．１８（ｍ，２８Ｈ），１．５５−１．６１（ｍ，２Ｈ），２．５７（ｔ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，２Ｈ），３．９１−３．９７（ｍ，２Ｈ），４．０３−４．０７（ｍ，１Ｈ），４．１８−４．２２（ｍ，１Ｈ），４．７４（ｔ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），６．５７（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．６１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），８．０２（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｓ，１Ｈ），８．８０（ｓ，１Ｈ），９．０８（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１２．５，１２．９，１３．０，１３．１，１３．６，１７．１，１７．４，１７．５，２２．１，４１．３，６１．７，６３．３，７３．９，８３．９，８４．８，１２３．０，１２７．９，１２８．９，１３２．８，１３３．９，１４２．０，１４９．６，１５１．６，１５２．６，１６４．７；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）ｃａｌｃ．ｍ／ｚ７０４．２８（Ｍ+Ｈ+），７２６．２６（Ｍ+Ｎａ+），ｆｏｕｎｄ  ｍ／ｚ  ７０４．２８２１（Ｍ+Ｈ+），７２６．２６２３（Ｍ+Ｎａ+）．【００８６】
（７）化合物７の合成
Ａｒ雰囲気下で、化合物６（２４１ｍｇ，０．３４２ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）をＴＨＦ（３．４ｍＬ）に溶かし、３ＨＦ−Ｅｔ３Ｎ（１３９μＬ，０．８５５ｍｍｏｌ，２．５ｅｑ．）を加えて２時間２０分撹拌した。減圧下で溶媒を留去し、中性フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３（ＭｅＯＨ  ０−５％））で分離し、化合物７（１５４ｍｇ，９８％）を得た。得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲ情報は以下のとおりである。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＳＯＣＤ３）：δ０．７８−０．８１（ｍ，３Ｈ），１．４０−１．４５（ｍ，２Ｈ），２．４９−２．５５（ｍ，２Ｈ），３．６６−３．７７（ｍ，２Ｈ），３．８２−３．８４（ｍ，１Ｈ），３．９６−３．９９（ｍ，１Ｈ），４．４１−４．４５（ｍ，１Ｈ），５．１４（ｔ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），５．９２（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６４（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．６４（ｓ，１Ｈ），８．７４（ｓ，１Ｈ），１１．２１（ｂｒ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ１３．１，２２．９，４１．９，６１．２，６３．２，７２．８，８６．０，８６．４，１２４．６，１２９．４，１２９．７，１３３．８，１３４．９，１４４．８，１５１．０，１５３．１，１５３．３，１６８．０；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）ｃａｌｃ．ｍ／ｚ４６２．１３（Ｍ+Ｈ+），４８４．１１（Ｍ+Ｎａ+），ｆｏｕｎｄ  ｍ／ｚ  ４６２．１２８８（Ｍ+Ｈ+），４８４．１１２１（Ｍ+Ｎａ+）．【００８７】
（８）化合物８の合成
アルゴン雰囲気下、０℃にてＳＭ（１５４ｍｇ，０．３４４ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）をｐｙｒｉｄｉｎｅ（３．４ｍｌ，０．１Ｍ  ｔｏ  化合物７）に溶かし、撹拌しながら、ＢｚＣｌ（４６μｌ，０．４０１  ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．）を加えた。ＴＬＣにて反応を追跡しながら、撹拌開始から２ｈ，４ｈ，７ｈ，１０ｈ後にそれぞれＢｚＣｌを０．６ｅｑ．，０．６ｅｑ．，１．２ｅｑ．，１．２ｅｑ．ずつ加えて、反応開始から１１ｈ後にＭｅＯＨ（５ｍｌ）を加えて１０ｍｉｎ撹拌した。溶媒を減圧留去した後、ＥｔＯＡｃ−水（ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３  ａｑ．，ｂｒｉｎｅ）にて分液を行った。芒硝乾燥したのち溶媒留去を行い、中性フラッシュカラム（Ｈ／Ａ＝１／１）にて精製して化合物８（１３３ｍｇ，６８％）を得た。得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲ情報は以下のとおりである。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ０．７３８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．３８（ｍ，２Ｈ），２．４２（ｍ，２Ｈ），３．９６（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），４．３０（ｍ，１Ｈ），４．７０−４．７２（ｍ，２Ｈ），４．８２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），５．４４（ｂｒｓ，１Ｈ），６．５９（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３７−７．５０（ｍ，６Ｈ），７．９７−８．００（ｍ，４Ｈ），８．１５（ｓ，１Ｈ），８．７１（ｓ，１Ｈ），９．５１（ｂｒｓ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１２．８，１４．２，２１．１，２１．９，４１．１，６０．５，６１．３，６３．８，７４．４，８２．３，８５．５，１２２．７，１２８．０，１２８．５，１２８．８，１２９．４，１２９．７，１２９．８，１３２．８，１３３．４，１３３．６，１４２．２，１４９．５，１５１．３，１５２．６，１６５．０，１６６．５，１７１．３；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）ｃａｌｃ．ｍ／ｚ５６６．１５（Ｍ+Ｈ+），５８８．１４（Ｍ+Ｎａ+），６０４．１１（Ｍ+Ｋ+），ｆｏｕｎｄ  ｍ／ｚ  ５４４．１４６１（Ｍ+Ｈ+），５８８．１３２７（Ｍ+Ｎａ+），６０４．１０１７（Ｍ+Ｋ+）．【００８８】
（９）化合物９（β修飾リン酸化合物）の合成
Ａｒ雰囲気下、０℃にてｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ（９μｌ，０．０６ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ．  ｉｎ  １５０μｌ  ＴＨＦ）、脱水ＴＥＡ（２８μｌ，０．２ｍｍｏｌ，５．０ｅｑ．  ｉｎ  １５０μｌ  ＴＨＦ）、化合物８（２３ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．  ｉｎ  ２００μｌ  ＴＨＦ  ａｎｄ  ２８μｌ  ＴＥＡ）を加え、１．５ｈ撹拌した後、反応系を室温に戻し、２．５ｈ撹拌した。その後ＭＱを１５０μｌ加え、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ撹拌した後、ＨＰＬＣにて精製した。反応収率はＨＰＬＣで計算し６２％であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ‐）  ｃａｌｃ．  ｍ／ｚ  ７２０．１４（Ｍ‐），  ｆｏｕｎｄ  ｍ／ｚ  ７１９．７８０７（Ｍ‐），  ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）  ｃａｌｃ．  ｍ／ｚ  ７２２．１５（Ｍ+Ｈ+），ｆｏｕｎｄ  ｍ／ｚ  ７２２．１４４３（Ｍ  +  Ｈ+）．【００８９】
（１０）化合物１０（β修飾リン酸化合物前駆体Ａ−１）の合成
Ａｒ雰囲気下で、化合物４（５４９ｍｇ，１．０４ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）をＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶かし、３ＨＦ−Ｅｔ３Ｎ（４２４μＬ，２．６ｍｍｏｌ，２．５ｅｑ．）を加えて２時間４０分撹拌した。減圧下で溶媒を留去し、ＤＣＭで吸引ろ過、洗浄し、化合物１０（２６６ｍｇ，８９％）を得た。得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲ情報は以下のとおりである。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＳＯＣＤ３）：δ３．３１−３．３９（ｍ，２Ｈ），３．７３−３．７６（ｍ，４Ｈ），４．２４−４．２９（ｍ，１Ｈ），５．７８（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．２９（ｓ，２Ｈ），８．１２（ｓ，１Ｈ），８．３０（ｓ，１Ｈ）．【００９０】
（１１）化合物１１（β修飾リン酸化合物前駆体Ａ−２）の合成
Ａｒ雰囲気下で、化合物５（５５３ｍｇ，０．９２０ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）をＴＨＦ（９．２ｍＬ）に溶かし、３ＨＦ−Ｅｔ３Ｎ（３７５μＬ，２．３０ｍｍｏｌ，２．５ｅｑ．）を加えて２時間撹拌した。減圧下で溶媒を留去し、中性フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３  （ＭｅＯＨ  ０−５％））で分離し、化合物１１（３３７ｍｇ，ｑｕａｎｔ．）を得た。得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲ情報は以下のとおりである。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ０．７４−０．７８（ｍ，３Ｈ），１．３６−１．４３（ｍ，２Ｈ），２．４４−２．４７（ｍ，２Ｈ），３．８４−３．９１（ｍ，４Ｈ），４．５１（ｔ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．５４（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｓ，１Ｈ），８．３２（ｓ，１Ｈ）．【００９１】
（１２）Ｐｒｏ  Ａの合成
?７８℃で、無水ＤＣＭ（４．２ｍｌ）中の塩化ホスホリル（１３０μｌ、１．４ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）の溶液に、フェノール（１３２ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）及びトリエチルアミン（１３２ｍｇ）の溶液を加えた。無水ＤＣＭ（１．４ｍｌ）中の１９５μｌ、１．４ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を滴下した。同じ温度で３時間撹拌した後、反応混合物をＬ−アラニンイソプロピルエステル塩酸塩（２３５ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）で一度に処理し、続いてトリエチルアミン（３９０μｌ、２．８ｍｍｏｌ，  ２．０ｅｑ．）を滴下した。それを?７８℃でさらに１時間撹拌し、次いで１時間かけて室温まで温めた。０℃に冷却した後、上記混合物を、無水ＤＣＭ（１．４ｍｌ）中の化合物１１（９４．２ｍｇ、０．２８０ｍｍｏｌ、０．２当量）及びＮＭＩ（１１１μｌ、１．４ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液でさらに処理し、０℃で１６時間撹拌した。反応混合物をＨ２Ｏ（７．０ｍｌ）で処理し、ＤＣＭで抽出した。有機層を０．５Ｍの希ＨＣｌ及び食塩水で順次洗浄した。無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、それを濃縮し、次いでシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝−１０／１）及びＨＰＬＣで精製して所望の生成物Ｐｒｏ  Ａを得た（４８ｍｇ，３８％）。得られた化合物のＮＭＲ情報は以下のとおりである。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ−０．０６  （ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ），０．１８（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），０．２３−０．２７（ｍ，４Ｈ），０．３０（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．４９−０．５９（ｍ，２Ｈ），１．６４−１．６６（ｍ，２Ｈ），２．７８−２．９１（ｍ，１Ｈ），３．０６−３．１３（ｍ，２Ｈ），３．３６−３．５０（ｍ，２Ｈ），３．６４−３．７０（ｍ，１Ｈ），３．８３−３．８９（ｍ，１Ｈ），５．０８−５．２１（ｍ，２Ｈ），５．６８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．２９−６．３３（ｍ，３Ｈ），６．４５−６．４９（ｍ，４Ｈ），７．２８（ｓ，１Ｈ），７．３５（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ１２．５，１９．６，２１．２，２１．３，４９．７，６２．４，６７．８，７２．６，８３．６，１１８．８，１２０．０，１２０．１，１２４．４，１２９．５，１４０．０，１４９．０，１５０．７，１５２．５，１５６．０，１７２．５；３１Ｐ−ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ４．２７（Ｐ（Ｒ）），４．６７（Ｐ（Ｓ））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ+）ｃａｌｃ．ｍ／ｚ  ６２７．１８（Ｍ+Ｈ＋），６４９．１６（Ｍ+Ｎａ+），６６５．１４（Ｍ+Ｋ+），ｆｏｕｎｄ  ｍ／ｚ  ６２７．１７８６（Ｍ+Ｈ+），６４９．１６１１（Ｍ+Ｎａ+），６６５．１３２８（Ｍ+Ｋ+）．【００９２】
（１３）化合物１２（β修飾リン酸化合物前駆体（セレン））の合成
氷冷下でジメチルジセレニド（３００μＬ，３．１７ｍｍｏｌ）を溶解したエタノール（５ｍＬ）に水素化ホウ素ナトリウム（２８９ｍｇ，７．６４ｍｍｏｌ）を加えた。化合物２（３．３６ｇ，５．３０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解し、反応溶液に加え、７０℃で３．５時間撹拌した。ジメチルジセレニド（１００μＬ，１．０６ｍｍｏｌ）と水素化ホウ素ナトリウム（６２．３ｍｇ，１．６４ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で２．５時間撹拌した。１Ｍ塩酸で中和した後、溶媒を留去した。残渣を酢酸エチル（５０ｍＬ）に溶解し水で３回、飽和食塩水１回で洗浄し、有機層を芒硝乾燥した。溶媒を留去した後、中性フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１→９／１→酢酸エチル／メタノール＝９／１）により精製し、化合物１２（１．９０ｇ，６１％）を得た。本反応には耐圧容器を用いた。得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲ情報は以下のとおりである。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ０．８９−１．２２（ｍ，２８Ｈ），１．９５（ｓ，３Ｈ），３．７２−３．９０（ｍ，２Ｈ），４．０４−４．２３（ｍ，２Ｈ），４．７３（ｄｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１０．４Ｈｚ，１Ｈ），５．６４（ｂｒ，ｓ，２Ｈ），６．４９（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），８．２６（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ５．８０１，１２．７０，１３．１５，１３．１６，１３．８６，１７．１３，１７．２１，１７．２５，１７．２７，１７．４８，１７．５１，１７．５７，１７．６４，４９．８７，６１．２３，７４．９４，８４．２３，８４．５８，１１９．５６，１３９．３２，１４９．９３，１５２．７５４；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｃａｌｃ．ｍ／ｚ５８８．１９（Ｍ＋Ｈ＋），６１０．１８（Ｍ＋Ｎａ＋），ｆｏｕｎｄ  ｍ／ｚ  ５８８．１９４５（Ｍ＋Ｈ＋），６１０．１７６８（Ｍ＋Ｎａ＋）．【００９３】
（１４）化合物１３（ＳｅｌｅｎｏＡ：β修飾リン酸化合物前駆体（セレン））の合成
氷冷下で化合物１２（１．８３ｇ，３．１２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１８ｍＬ）に溶解し、ＴＢＡＦ（１Ｍ  ｉｎ  ＴＨＦ，７．８ｍＬ，７．８０ｍｍｏｌ）を加え、１７．５時間撹拌した。溶媒を留去し、中性フラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝９５／５→８５／１５）で精製し、化合物１３（１．０４ｇ，９７％）を得た。得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲ情報は以下のとおりである。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１．８５（ｓ，３Ｈ），３．６４−３．８３（ｍ，４Ｈ），４．４３（ｍ，１Ｈ），５．７３（ｄｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．４５（ｄｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．２８（ｓ，２Ｈ），８．２８（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ４．１７，４９．１，５９．８，７３．３，８４．１，８５．０，１１８．３，１３９．３，１４９．２，１５２．５，１５６．０；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｃａｌｃ．ｍ／ｚ３４６．０４（Ｍ＋Ｈ＋），３６８．０２（Ｍ＋Ｎａ＋），ｆｏｕｎｄ  ｍ／ｚ  ３４６．０４０２（Ｍ＋Ｈ＋），３６８．０２１４（Ｍ＋Ｎａ＋）．【００９４】
（１５）Ｐｒｏ  ＳｅｌｅｎｏＡの合成
ＰＯＣｌ３（１３４μＬ，１．５０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４．５ｍＬ）に溶解し、−７８℃で撹拌した。フェノール（１３２．６ｍｇ，１．４６ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２０１ｕＬ，１．５０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１．５ｍＬ）に溶解し、滴下し、３時間撹拌した。Ｌ−イソプロピルアラニン塩酸塩（２４８．４ｍｇ，１．５４ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２０１ｕＬ，３．００ｍｍｏｌ）を加え、更に１時間撹拌し、室温まで上昇させた。化合物１３（９４．２ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）とＮＭＩ（１１４ｕＬ，１．５０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１．５ｍＬ）に溶解し滴下した。０℃で２０．５時間撹拌した後、水でクエンチした。ＲＰ−ＨＰＬＣ（ＭｉｌｉＱ／ＡＣＮ＝２０／８０→５０／５０）により精製を行い、Ｐｒｏ  ＳｅｌｅｎｏＡ（３３．５ｍｇ，１９％）を得た。得られた化合物のＮＭＲ情報は以下のとおりである。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ２Ｃｌ２）：δ１．０１−１．２５（ｍ，９Ｈ），１．８８（ｓ，３Ｈ），３．６４−３．８９（ｍ，３Ｈ），４．２０−４．８３（４ｍ，Ｈ），５．８２−６．０４（ｍ，２Ｈ），６．４５（ｄ，１Ｈ），７．０５−７．４３（ｍ，７Ｈ），８．１３（ｄ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ２Ｃｌ２）：δ４．９５，２０．２４，２１．８４，４８．９３，５０．２６，６６．５０，７９．７１，８３．３９，８４．８１，１１９．２，１２０．７，１２５．０，１３０．１，１４０．１，１４９．５，１５１．２，１５３．０，１５６．６，１７３．１；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｃａｌｃ．ｍ／ｚ６１５．１１（Ｍ＋Ｈ＋），ｆｏｕｎｄ  ｍ／ｚ  ６１５．１２４４（Ｍ＋Ｈ＋）；【００９５】
（１６）ｄＡＳｅＴＰの合成
リン酸トリメチル（８４．１ｍｇ）にセレノアデノシン（化合物１３：１０１ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）とトリブチルアミン（６４３μＬ，２．７０ｍｍｏｌ）を加え、−３０℃で撹拌しながら、塩化ホスホリル（８４μＬ，０．９０ｍｍｏｌ）を滴下し、１６時間撹拌した。アセトニトリル（１．６ｍＬ）にビス（トリブチルアンモニウム）ピロリン酸（９９３．５ｍｇ，１．５１ｍｍｏｌ）とトリブチルアミン（６００μＬ）を加え、２４時間撹拌した。１Ｍ  ＴＥＡＢ（５ｍＬ）を加え、凍結乾燥をした。ＨＰＬＣ（ＤＥＡＥ−２ＳＷ，１Ｍギ酸アンモニウム／ＭＱ＝０／１００→５０／５０）で反応の進行を分析し、ＨＰＬＣ（Ｃ１８  Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ，５０ｍＭ  ＴＥＡＢ／ＡＣＮ＝１００／０→７０／３０）で精製をし、三リン酸体のトリエチルアンモニウム塩を得た。０．１Ｍ過塩素酸ナトリウムのアセトン溶液を加え、吸引ろ過により三リン酸体のナトリウム塩（９３．９ｍｇ，４３％）を得た。得られた化合物のＮＭＲ情報は以下のとおりである。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ８．２８（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｓ，１Ｈ），６．４０（ｄ，Ｊ＝８ＭＨｚ，１Ｈ），４．４２（ｔ，Ｊ＝１０ＭＨｚ，１Ｈ），４．２３（ｄ，Ｊ＝１．６ＭＨｚ，２Ｈ），３．９８（ｍ，１Ｈ），３，７４（ｑ，Ｊ＝７．２ＭＨｚ，１Ｈ），１．６４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ４．２６，４８．１９，６３．４３，７１．７８，８２．６９，８５．８５，１１８．１，１４０．６，１４８．６，１５２．７，１５５．６；３１Ｐ−ＮＭＲ（１６０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ?５．３９（ｂｒ，１Ｐ），?１０．２８（ｄ，Ｊ＝１７ＭＨｚ，１Ｐ），?２０．８１（ｂｒ，１Ｐ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−）ｃａｌｃ．ｍ／ｚ５８３．９２（Ｍ?Ｈ）?，ｆｏｕｎｄ  ｍ／ｚ  ５８３．９２０２（Ｍ?Ｈ）?；【００９６】
２．鎖切断反応（Ｃｈａｉｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）
化合物９の溶液（ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ＝２：１，３５ｍＭ，１００ｕＬ）、ＨＥＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｕＬ，ｐＨ＝９．０，５００ｍＭ）、Ｈ２Ｏ（３３２．５ｕＬ）、ＤＴＴ水溶液（１Ｍ，１７．５ｕＬ）を加え、混合した後、２５℃で２０時間インキュベートした。ＨＰＬＣ（条件は下記に記載）で分析し、ピークの同定はＨＲＭＳ（ＥＳＩ）で行った。その結果のグラフを図２に示す。
＜ＨＰＬＣ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ＞
Ｃｏｌｕｍｎ：  Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８  ２５０×４．６ｍｍ  Ｓ−５μｍ  １２ｎｍ
Ｅｌｕｅｎｔ：  Ａ）  ５０ｍＭ  ＴＥＡＡ  ｂｕｆｆｅｒ，  ５％  ＡＣＮ
Ｂ）  ＡＣＮ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ：  Ｂ  ｃｏｎｃ．  ０−１０％（０−１０ｍｉｎ），１０−１００％（１０−２２．５ｍｉｎ），１００％（２２．５−３０ｍｉｎ）
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：  １ｍＬ／ｍｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：２６０ｎｍ【００９７】
図２のＨＰＬＣの結果から、ヌクレオシド誘導体のピーク（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ａ）と、リン酸フェニルのピーク（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｂ）が確認された。このことから、リボースの３’位がリン酸化された状態で、ＤＴＴにより２’位のジスルフィド基を脱保護すると、以下の反応によって３’位のリン酸部が切断され、チイラン構造を有する活性化されたヌクレオシド誘導体とリン酸フェニルとに分解されることが確認できた。
【化３８】
2019172394.tif 000040
【００９８】
３．Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の増殖抑制効果
ヒト肝がん細胞ＨｕＨ−７由来でＨＢＶゲノム（遺伝子型Ｃ）が恒常的に複製する細胞株ＥＢ−ＨＢＣｅを２４ウェルプレートに播種し、化合物Ａ−１（化合物１０）及びＡ−２（化合物１１）を終濃度１０又は１００μＭで添加し９日間培養した。その間、３日毎に培地を交換するとともに同濃度の化合物を添加した。培養した細胞からＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ社）によってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅＩ及びＲＮａｓｅ阻害剤の処理を行った。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりｃＤＮＡを合成し、ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔ（東洋紡社）を用いた定量ＰＣＲによってＨＢＶ複製中間体であるウイルスＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）を定量した。その結果を図３に示す。左側のグラフから順に、コントロール、化合物Ａ−１を１０μＭ、化合物Ａ−１を１００μＭ、化合物Ａ−２を１０μＭ、化合物Ａ−２を１００μＭ添加した結果である。また、最も右側のグラフは、肝炎の治療薬であるＥＴＶ（エンテカビル）を１０μＭ添加した結果である。【００９９】
この図から、化合物Ａ−１と化合物Ａ−２のいずれも１００μＭ添加した場合に、ウイルスＲＮＡの低下がみられた。このことから、いずれの化合物もＢ型肝炎ウイルスの増殖を抑制できることがわかった。特に濃度１００μＭにおける化合物Ａ−１と化合物Ａ−２の結果を比較すると、化合物Ａ−２のほうが化合物Ａ−１よりも若干、ウイルスＲＮＡの量が少なかった。このことから、同じ濃度であれば化合物Ａ−２のほうが化合物Ａ−１よりもウイルス増殖抑制効果が高いことがわかった。【０１００】
４．不可逆阻害実験
下記の鋳型ＲＮＡ（０．２μＭ，最終濃度，以下同様），下記のプライマーＤＮＡ（０．２μＭ），ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ（各１００μＭ），Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３，５ｍＭ），ＫＣｌ（５ｍＭ），ＤＴＴ（０．２ｍＭ），ＭｇＣｌ２（０．５ｍＭ）を含む溶液に、ＡＭＶ逆転写酵素（２０Ｕ／μＬ）を０．２５μＬと、ｄＡＴＰあるいはｄｄＡＴＰあるいはｄＡＳｅＴＰ（１００μＭ）を加え、４２℃で３時間インキュベートした。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  １００Ｋを用いて、限外ろ過を３回行った後、Ａｍｉｃｏｎ  ３Ｋを用いてタンパク溶液を濃縮した。タンパク溶液を用いて、再度鎖伸長反応を行った（鋳型ＲＮＡ  ０．２μＭ，プライマーＤＮＡ  ０．２μＭ，１００μＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ，Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）  ２．５ｍＭ，ＫＣｌ  ５ｍＭ，ＤＴＴ  ０．２ｍＭ，０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ＡＭＶ逆転写酵素  ０．１Ｕ／μＬ）。
反応時間５分、３０分、６０分において１０μＬのサンプルを取り、２×変性バッファーに加えて、反応を停止した。各サンプルを２０％  ｄＰＡＧＥ（７．５Ｍ  Ｕｒｅａ，  １×ＴＢＥ，７．５％  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ，２０ｍＡ  ｃｏｎｓｔ．）で電気泳動を行い、蛍光発光で伸長核酸を定量検出した。その結果を図４に示す。
プライマーＤＮＡ：５’−（ＦＡＭ）−ＧＧＴＧＧＡＣＴＴＴＣＧＣ−３’
鋳型ＲＮＡ：５’−ＡＣＧＡＣＧＵＧＣＧＡＡＡＧＵＣＣＡＣＣ−３’【０１０１】
この図から、ｄＡＳｅＴＰは、逆転写酵素による核酸伸長反応を阻害することがわかった。【０１０２】
５．抗ＨＢＶ活性
ヒト肝がん細胞ＨｕＨ−７由来でＨＢＶゲノム（遺伝子型Ｃ）が恒常的に複製する細胞株ＥＢ−ＨＢＣｅを２４ウェルプレートに播種し、各化合物を種々の終濃度で添加し９日間培養した。その間、３日毎に培地を交換するとともに同濃度の化合物を添加した。
培養上清を回収しＰＮＥ溶液（８．４５％  ＰＥＧ６０００，  ０．４４５Ｍ  ＮａＣｌ，１３ｍＭ  ＥＤＴＡ）添加によってウイルス粒子を沈殿させた後、ＤＮａｓｅ  Ｉ（タカラバイオ社）及びＲＮａｓｅ  Ａ（タカラバイオ社）で３７℃、１時間処理することによって粒子外の核酸を除いた。さらに、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋで一晩処理した後、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出しエタノール沈殿を行った。沈殿を可溶化した後、ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔ（東洋紡社）を用いてＨＢＶ  ＤＮＡの定量測定を行った。その結果を図５に示す。図中の「ＳｅｌｅｎｏＡ」は化合物１３を、「ｅｎｔｅｃａｖｉｒ」はエンテカビルを、それぞれ添加した結果を表す。【０１０３】
この図から、ＳｅｌｅｎｏＡ（化合物１３）、Ｐｒｏ  ＳｅｌｅｎｏＡ、Ｐｒｏ  Ａのいずれも抗ＨＢＶ活性を示し、添加濃度が増えるほど活性が高くなることがわかった。特に、Ｐｒｏ  ＳｅｌｅｎｏＡは、添加濃度が１０μMでは、これらの３種類の中で最も高い抗ＨＢＶ活性を示すことがわかった。【０１０４】
７．抗ＨＩＶ活性
（１）抗ＨＩＶ活性測定
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（ＳＩＧＭＡ／Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ５７９６）に、最終濃度１０％のｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（Ｊａｐａｎ  Ｂｉｏ  Ｓｅｒｕｍ社）を添加した培地で、３７℃、５％  ＣＯ２の条件でＴＺＭ−ｂｌ細胞を培養した。ＴＺＭ−ｂｌ細胞を９６ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅに播種した（１．３×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬ  ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）。翌日、薬剤溶液とＨＩＶ−１（ＮＬ４−３，  １０ｎｇ）をこの順に培養液に添加した。２日後、培養上清２００μＬを除去し、１×Ｓｔｅａｄｙ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ／Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ２５１０）を１００μＬ加え、かきとった８０μＬの細胞破砕液を専用のプレート（Ｃｏｓｔｅｒ／Ｃａｔ．Ｎｏ３９１２）  ＩＥＳEＬ，  ＶＥＲＩＴＡＳ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でＬｕｃｉｆｅｒａｓｅを定量し、薬剤の抗ＨＩＶ−１活性（ＥＣ５０）を算出した。異なるタイプのウイルスを用い、複数の化合物について実験を行った。その結果を下記表（Ａ）に示す。表中、「ＡＺＴ」はアジドチミジン、「Ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ」はラミブジン、「Ｄｉｄａｎｏｓｉｎｅ」はジダノシンを意味する。【０１０５】
（２）細胞毒性評価
ＭＴＴ  ａｓｓａｙは、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ  ９６  Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。  ＭＴ−４細胞にＨＩＶ−１  ＮＬ４−３をＭＯＩ＝０．００１で感染させた。（３７℃，  １−１．５時間）ＨＩＶ−１感染又は非感染ＭＴ−４細胞（２．５×１０５／ｍｌ，１００μＬ）を９６ウェルマイクロプレートに分注し（最終ＤＭＳＯ濃度；０．５％）、３７℃，５％ＣＯ２で培養を開始した。培養５日目に培養上清（１００μＬ）を除去し、ｄｙｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＭＴＴ試薬）１５μＬを各ウェルに添加し、ＣＯ２インキュベーター内で１時間培養した。続いてｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ／ｓｔｏｐ  ｍｉｘを１００μＬ  各ウェルに添加し、よく混和し４℃で一晩静置した。プレートを室温に戻してからＤＤ５７０／６９０を分光光度計（ＢＩＯ−ＴＥＫ  ＥＬｘ８０８）で測定した（ＣＣ５０）。その結果を下記表（Ｂ）に示す。【０１０６】
【表１】
2019172394.tif 000041
【０１０７】
表において、（Ａ）の結果から、Ｐｒｏ  ＳｅｌｅｎｏＡはＬａｍｉｖｕｄｉｎｅ、Ｄｉｄａｎｏｓｉｎｅと比べると高い抗ＨＩＶ活性を示した。また、ＨＩＶタイプＭ４１Ｌ／Ｔ６９ＳＳＧ／Ｔ２１５Ｙに対しては、ＡＺＴよりも優れた抗ＨＩＶ活性を示した。また、（Ｂ）の結果から、Ｐｒｏ  ＳｅｌｅｎｏＡはＡＺＴよりも毒性が低いことが分かった。
【図１】
2019172394.tif 000054
【図２】
2019172394.tif 000055
【図３】
2019172394.tif 000056
【図４】
2019172394.tif 000057
【図５】
2019172394.tif 000058
【国際調査報告】
2019172394.tif 000059
2019172394.tif 000060
2019172394.tif 000061
2019172394.tif 000062
2019172394.tif 000063
2019172394.tif 000064
2019172394.tif 000065
2019172394.tif 000066
2019172394.tif 000067
2019172394.tif 000068
2019172394.tif 000069
2019172394.tif 000070