(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：２に示すアミノ酸残基−３６〜＋１７２をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
（ｂ）配列番号：２に示すアミノ酸残基＋１〜＋１７２をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号第７５９７７号に含まれるｃＤＮＡによりコードされる完全長ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号第７５９７７号に含まれるｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）上皮細胞の増殖を刺激するポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、該第一のヌクレオチド配列が下記よりなる群から選ばれた第二のヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド：
（i）配列番号：２のアミノ酸残基−３６〜＋１７２をコードするヌクレオチド配列；
（ii）配列番号：２のアミノ酸残基＋１〜＋１７２をコードするヌクレオチド配列；
（iii）ＡＴＣＣ受託番号第７５９７７号に含まれるｃＤＮＡによりコードされる完全長ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
（iv）ＡＴＣＣ受託番号第７５９７７号に含まれるｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
（ｆ）上記（ｅ）のポリヌクレオチドであって、上記（i）〜（iv）のいずれかによって定義される該ヌクレオチド配列が、下記よりなる群から選ばれたものであるポリヌクレオチド：
（i）配列番号：１のヌクレオチド１０９〜６２７を含むヌクレオチド配列；
（ii）配列番号：１のヌクレオチド１〜６２７を含むヌクレオチド配列；
（iii）ＡＴＣＣ受託番号第７５９７７号に含まれるｃＤＮＡによりコードされる完全長ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含むヌクレオチド配列；
（iv）ＡＴＣＣ受託番号第７５９７７号に含まれるｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含むヌクレオチド配列；
（v）該ポリヌクレオチドに少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列_よりなる群から選ばれたポリヌクレオチド。
【請求項２】
上皮細胞がケラチノサイトである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
最初のメチオニンアミノ酸残基をコードしていない、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
Ｎ−末端メチオニンをコードしている、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
該ポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１ないし４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡである、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
該ポリヌクレオチドが二本鎖または一本鎖である、請求項１ないし６のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
外来性のポリヌクレオチドに融合している、請求項１ないし７のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
該外来性のポリヌクレオチドが外来性のポリペプチドをコードしている、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
該外来性のポリペプチドが該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに融合している、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１２】
該ポリヌクレオチドが調節配列に作動可能に連結されている、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載のベクターで細胞を遺伝子操作することを含む、宿主細胞の製造方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法によって製造された宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１１または１２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１ないし１０のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子操作した宿主細胞。
【請求項１７】
該ポリヌクレオチドが外来性の調節配列に作動可能に連結されている、請求項１４ないし１６のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項１８】
原核細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞または大腸菌細胞である、請求項１４ないし１７のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１４ないし１８のいずれかに記載の宿主細胞から該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現させ、ついで該ポリペプチドを回収することを含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項２０】
請求項１ないし１０のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現させ、ついで該ポリペプチドを回収することを含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項２１】
請求項１ないし１０のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２２】
化学的に合成されたものであるか、または請求項１４ないし１８のいずれかに記載の宿主細胞によって得ることができるか、または請求項１９または２０に記載の方法によって得ることができる、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
標識されていか、修飾されていか、またはポリエチレングリコールに融合されている、請求項２１または２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
外来性のポリペプチドに融合している、請求項２１ないし２３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２５】
Ｎ−末端メチオニンを欠く、請求項２１ないし２４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２６】
Ｎ−末端メチオニンを有する、請求項２１ないし２４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２７】
請求項２１ないし２６のいずれかに記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項２８】
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはＦａｂフラグメントである、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
固定化されている、請求項２７または２８に記載の抗体。
【請求項３０】
（ａ）配列番号：１の少なくとも３０の連続ヌクレオチドからなるプローブ；
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号第７５９７７号に含まれるｃＤＮＡの少なくとも３０の連続ヌクレオチドからなるプローブ；
（ｃ）配列番号：１の少なくとも５０の連続ヌクレオチドからなるプローブ；
（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号第７５９７７号に含まれるｃＤＮＡの少なくとも５０の連続ヌクレオチドからなるプローブ；
（ｅ）配列番号：１の５０よりも多い連続ヌクレオチドからなるプローブ；および
（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号第７５９７７号に含まれるｃＤＮＡの５０よりも多い連続ヌクレオチドからなるプローブ
よりなる群から選ばれたポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関する。とりわけ、本発明のポリペプチドは、時として以下で「ＫＧＦ−２」と呼ぶ、ケラチノサイト増殖因子−２である。本発明はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害することにも関する。
線維芽細胞増殖因子ファミリーは軟組織（soft-tissue）の増殖および再生に関連する増殖因子の大きなファミリーとして現れた。現在該ファミリーには、タンパク質レベルでの多様な程度のホモロジーを共有し、１つの例外はあるが、同様の広範なマイトジェンスペクトルを有する、すなわち、それらは中胚葉および神経外胚葉由来の多様な細胞の増殖を促進するおよび／または脈管形成を促進するようであるいくつかのメンバーが含まれる。
該ファミリーの多様なメンバーの発現パターンは発生のある段階の非常に限られた発現から多様な組織および器官において遍在する発現にまでわたり、非常に多彩である。全てのメンバーはヘパリンおよびヘパリン硫酸プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンに結合し、細胞外マトリクスに強く集中するようである。ＫＧＦはもともとは配列のホモロジーまたは因子の精製およびクローニングによってＦＧＦファミリーの一員として同定された。
ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）は培養マウスケラチノサイト株のマイトジェンとして単離された（ルービン（Ｒubin，Ｊ．Ｓ．）ら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８６：８０２−８０６（１９８９））。ＦＧＦファミリーの他のメンバーと異なり、間充織由来の細胞に殆ど活性を有さないが、上皮細胞の増殖を刺激する。ケラチノサイト増殖因子遺伝子は１９４のアミノ酸ポリペプチドをコードする（フィンチ（Ｆinch，Ｐ．Ｗ．）ら、Ｓcience、２４５：７５２−７５５（１９８９））。Ｎ末端の６４のアミノ酸は独特であるが、該タンパク質の残りはｂＦＧＦに約３０％のホモロジーを有する。ＫＧＦはＦＧＦファミリーの中で最も逸脱したメンバーである。その分子は疎水性シグナル配列を有し、効果的に分泌される。翻訳後の修飾にはシグナル配列の開裂および１つの部位でのＮ結合したグリコシル化を含み、その結果２８kＤaのタンパク質となる。ケラチノサイト増殖因子は皮膚および胎児の肺由来の線維芽細胞により産生される（ルービンら（１９８９））。ケラチノサイト増殖因子ｍＲＮＡは成人腎臓、結腸および腸骨に発現するが脳または肺には発現しないことが見いだされている（フィンチら、Ｓcience、２４５：７５２−７５５（１９８９））。ＫＧＦはＦＧＦタンパク質ファミリー内の保存領域を示す。ＫＧＦはＦＧＦ−２受容体に高アフィニティーで結合する。
本発明のポリペプチドはＦＧＦのファミリーのメンバーであると推定的に同定され、特に、該ポリペプチドはＦＧＦファミリの他のメンバーとのアミノ酸配列ホモロジーの結果としてＫＧＦ−２であると推定的に同定されている。
本発明の１つの態様により、ＫＧＦ−２である新規な成熟ポリペプチドならびに生物学的に活性であり、診断上または治療上有用なそのフラグメント、アナログおよび誘導体を提供する。本発明のポリペプチドはヒト起源のものである。
本発明の１つの態様により、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含め、ヒトＫＧＦ−２をコードする単離された核酸分子、さらにはまた、そのアンチセンスアナログ、ならびに生物学的に活性であって、診断上または治療上有用なそのフラグメントを提供する。
本発明の他の態様により、ＫＧＦ−２タンパク質の組換え産生において試薬として有用なクローニングプラスミドおよび発現プラスミドなどの組換えベクターを用いた組換え技術によるそのようなポリペプチドの製造方法、ならびにヒトＫＧＦ−２の核酸配列を含む組換え原核および／または真核宿主細胞を提供する。
本発明のさらに別の態様により、例えば上皮細胞増殖を創傷の治癒のために刺激することおよび毛小胞の産生を刺激することおよび皮膚創傷の治癒を刺激することなどのための治療上の目的のためそのようなポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用する方法を提供する。
本発明のさらに別の態様により、そのようなポリペプチドに対する抗体を提供する。
本発明のさらに別の態様により、ヒトＫＧＦ−２配列に特異的にハイブリダイズする十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブを提供する。
本発明のさらに別の態様により、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニストを提供する。該アンタゴニストは、例えば創傷治癒プロセスにおいて瘢痕（scarring）を減少させること、腫瘍の増殖、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチおよび腫瘍の増殖を妨害および／または治療することなどのそのようなポリペプチドの作用を抑制するのに使用するものである。
本発明のさらに別の態様により、ＫＧＦ−２核酸配列中の変異またはそのような配列によりコードされるポリペプチドの過剰発現に関連した疾患またはその疾患の罹患し易さを検出する診断アッセイを提供する。
本発明の別の態様により、化学的研究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関連したイン・ビトロでの目的のためにそのようなポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用する方法を提供する。
本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当業者に明らかであろう。
以下の図面は、本発明の態様を説明するものであって、請求の範囲により包含される本発明の範囲を限定しようとするものではない。
図１は、本発明のポリペプチドのｃＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を説明する。最初の３６アミノ酸残基は推定リーダー配列（下線を記す）を表わす。アミノ酸に関する標準的な１文字略号を使用する。配列決定の不正確さはポリヌクレオチド配列を決定しようとする際の共通の問題である。配列決定は、３７３自動化ＤＮＡシークエンサー（アプライド・バイオシステムズ、インク（Ａpplied Ｂiosystems,Ｉnc.））を使用して行った。配列決定の正確さは、９７％以上であると予想される。
図２は、本発明のポリペプチドと他の線維芽細胞増殖因子との間のアミノ酸配列比較を説明する。
本発明の一つの態様により、図１（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、または１９９４年１２月１６日にＡＴＣＣ受託番号第７５９７７号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする、単離された核酸（ポリヌクレオチド）を提供する。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト前立腺および胎児の肺から得られる。該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの断片は最初にヒト正常前立腺由来のライブラリーから単離された。全長タンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームはランダムにプライミングされたヒト胎児肺ｃＤＮＡライブラリーから引き続き単離した。それは、構造上、ＦＧＦファミリーに関係がある。それは２０８個のアミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、そのうち最初の３６アミノ酸残基が推定リーダー配列であり、それゆえ成熟タンパク質は１７２アミノ酸を含む。そのタンパク質は、ヒトケラチノサイト増殖因子に対し、２０６アミノ酸長にわたり、４５％の同一性および８２％の類似性をもって、最も高い程度のホモロジーを示す。
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖であるなら、コーディング鎖または非コーディング（アンチ−センス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコーディング配列は、図１（配列番号：２）に示すコーディング配列または寄託されたクローンのコーディング配列と同じであってよく、あるいは遺伝コードの重複または縮重の結果として、図１（配列番号：１）のＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なったコード配列であってもよい。
図１（配列番号：２）の成熟ポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、以下のものが含まれ得る：成熟ポリペプチドのコーディング配列のみ；成熟ポリペプチドのコーディング配列、およびリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパク質配列といったような付加的コーディング配列；成熟ポリペプチドのコーディング配列（また場合により、付加的コーディング配列）、および成熟ポリペプチドのコーディング配列のイントロンまたは非コーディング配列５'および／または３'といったような非コーディング配列。
従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコーディング配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付加的コーディングおよび／または非コーディング配列が含まれるポリヌクレオチドを包含する。
本発明はさらに、図１（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異体またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体であり得る。
従って、本発明には、図１（配列番号：２）に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変異体は、図１（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。そのようなヌクレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体並びに付加および挿入変異体が含まれる。
先に示したように、該ポリヌクレオチドは、図１（配列番号：１）に示すコーディング配列の天然に存在するアレル変異体または寄託されたクローンのコーディング配列の天然に存在するアレル変異体であるコーディング配列を有し得る。当業界で知られているように、アレル変異体は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であり、これは、コードされるポリペプチドの機能を実質的には変えない。
本発明にはまた、成熟ポリペプチドのコーディング配列が、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列に、同じ読み枠内で融合し得るポリヌクレオチドも含まれる。リーダー配列を有するポリペプチドがプレタンパク質であり、また宿主細胞により切断されて、成熟型のポリペプチドを形成したリーダー配列を有することがある。該ポリヌクレオチドはまた、付加的５'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であるプロタンパク質もコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質がプロタンパク質であり、また不活性型のタンパク質である。プロ配列が一度切断されると、活性成熟タンパク質が残る。
従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパク質、または配列およびプレ配列（リーダー配列）の両方を有するタンパク質をコードし得る。
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合には、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するための、pＱＥ−９ベクターにより与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ（tag）であってよく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯＳ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、赤血球凝集素（ＨＡ）タグであってよい。ＨＡタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する（ウイルソン（Ｗilson，Ｉ．）ら、Ｃell、３７：７６７（１９８４））。
本発明はさらに、配列間に少なくとも５０％、また好ましくは７０％の同一性がある場合に、上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、また好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１（配列番号：１）のcＤＮＡもしくは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能もしくは活性を保持するポリペプチドをコードする。
本明細書中でいう寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者への便宜として与えられるものであって、寄託が３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２下に要求されることを承認するものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成して、本明細書の配列のいずれかの記載と矛盾する際はいつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用し、または販売するには、実施許諾が要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは付与されない。
本発明はさらに、図１（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有する、または寄託されたcＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。
図１（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドを示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」という用語は、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能もしくは活性を保持するポリペプチドを意味する。従って、アナログには、プロプロテイン部分を切断することにより活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造することができるプロプロテインが含まれる。
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ましくは組換ポリペプチドであってよい。
図１（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基（好ましくは、同型アミノ酸残基）で置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるものであってもよく、またはコードされたものでなくてもよいもの、（ii）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような、他の化合物と融合しているもの、または（iv）リーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用される配列、またはプロプロテイン配列といったような、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであり得る。そのようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ましくは、均一となるまで精製される。
「単離された」という用語は、物質がその元の環境（例えば、それが天然に存在するなら、天然の環境）から除去されていることを意味する。例えば、生きている動物にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分となり得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の部分ではないという点で、なお単離されている。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術による製造にも関する。
宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺伝的に操作される（トランスデュースされ、またはトランスフォームされ、またはトランスフェクトされる）。該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、またはＫＧＦ−２遺伝子を増幅するのに適するよう修飾された従来の栄養培地で培養することができる。温度、pＨ等といったような培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で先に使用した培養条件であって、当業者に明らかであろう。
本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを組換え技術により製造するのに使用することができる。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含ませることができる。そのようなベクターには、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったようなウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベクターも、それが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。
適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内であると思われる。
発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現制御配列（プロモーター）に作動可能に結合し、mＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例として、以下のものが挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ.coli.lacまたはtrp、ファージラムダＰLプロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結区も含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。
さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の場合にはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性といったような、またはＥ.coliではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、トランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型特性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含むのが好ましい。
上記のような適当なＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを、適当な宿主をトランスフォームするために使用して、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。
適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げられる：Ｅ.coli、Ｓtreptomyces、Ｓalmonella typhimuriumといったような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；Ｄrosophila Ｓ２およびＳpodoptera Ｓｆ９といったような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowesメラノーマといったような動物細胞；アデノウイルス；植物細胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。
とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含む組換え構築物も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったようなベクターを含む。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、該配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配列を含んでなる。適当なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知られていて、市販されている。以下のベクターを例として挙げる。細菌用：pＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ−９（キアゲン（Ｑiagen））、pbs、pＤ１０、ファージスクリプト（phagescript）、psiＸ１７４、pbluescript ＳＫ、pbsks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８Ａ、pＮＨ４６Ａ（ストラタジーン（Ｓtratagene））；ptrc９９a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５（ファルマシア（Ｐharmacia））。真核生物用：pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ（Ｓtratagene）、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ（ファルマシア）。しかし、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。
プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰR、ＰLおよびtrpが含まれる。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期（immediate early）、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲内である。
さらなる態様では、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核細胞であり得て、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより行うことができる。（デイビス（Ｄavis,L.）、ディブナー（Ｄibner,Ｍ.）、バッティー（Ｂattey,Ｌ.）、ベーシック・メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｂasic Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology）（１９８６））。
宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。
成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現させることができる。そのようなタンパク質を、本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造するために、無細胞翻訳系もまた使用することができる。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、サンブルック（Ｓambrook）ら、モレキュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃloning）：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ  Ｌaboratory Ｍanual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor）、ニューヨーク、（１９８９）により記載されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。例には、bp１００〜２７０の、複製開始点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
通例、組換え発現ベクターには、複製開始点、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ.cerevisiaeＴＲＰ１遺伝子、並びに下流の構造配列の転写を行わせるために高度に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）のような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および終結配列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリーダー配列と共に、適当な相（phase）で構築される。場合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパク質をコードすることができる。
細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終結信号と共に、機能的なプロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入することにより構築される。そのベクターは、ベクターの維持を確実なものとするために、また所望により、宿主内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含んでなるであろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主には、大腸菌（Ｅ.coli）、バシラス・サチリス（Ｂacillus subtillis）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓalmonella typhimurium）、ならびにシュードモナス（Ｐseudomonas）属、ストレプトマイセス（Ｓtreptomyces）属、およびスタフィロコッカス（Ｓtaphylococcus）属の範囲内の様々な種が含まれるが、他のものもまた、選択物質として使用することができる。
代表的であるが、非限定的な例として、細菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニングベクターpＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでなり得る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２２３−３（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals）、ウプサラ（Ｕppsala）、スウェーデン）およびＧＥＭ１（プロメガ・バイオテク（Ｐromega Ｂiotec）、マディソン、ウィスコンシン、米国）が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。
適当な宿主株をトランスフォーメーションして、その宿主を適当な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法（例えば、温度シフトまたは化学誘導）により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。
細胞を、一般的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保持する。
タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても破壊でき、そのような方法は、当業者に周知である。
組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。哺乳動物発現系の例には、ガルツマン（Ｇluzman）、Ｃell、２３：１７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５'に隣接する非転写配列もまた含んでなるであろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることができる。
ＫＧＦ−２ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から回収して、精製することができる。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成するのに使用することができる。最後に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程に使用することができる。
本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、または原核もしくは真核宿主から（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によって）組換え技術により製造することができる。組換え製造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチドは、糖付加され得るか、または糖付加され得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれ得る。
本発明のポリペプチドは新規血管の成長または脈管形成を刺激するために使用される。特に、本発明のポリペプチドはケラチノサイト細胞の成長および増殖を刺激する。従って、本発明のポリペプチドは創傷の治癒を刺激することおよび毛髪喪失を防ぐことに関連するケラチノサイトを刺激することに使用する。
本発明のポリペプチドはまた、上皮細胞増殖を刺激することによって皮膚の創傷を治癒することに使用してよい。
本発明のポリペプチドはまた、例えば筋肉細胞および神経組織、前立腺細胞および肺細胞などの細胞の分化を刺激するのに使用してよい。
１〜３６までのアミノ酸をコードするＫＧＦ−２のシグナル配列は、一般的にハイブリダイゼーションおよび／またはコンピューターサーチ演算方式によって分泌されたタンパク質を同定するのに使用してよい。
ＫＧＦ−２のヌクレオチド配列はハイブリダイゼーションによって５'配列を単離するために使用することができる。ついで、本来のプロモーター／エンハンサー配列の制御下でＫＧＦ−２遺伝子を含むプラスミドは内在性の細胞およびウイルスのＫＧＦ−２遺伝子発現のトランスアクチベーターの同定を目的としたイン・ビトロの研究において使用することができる。
ＫＧＦ−２タンパク質はまた、ＫＧＦ−２受容体に作用を及ぼすペプチドミメティックス（peptido-mimetics）を同定するよう設計された実験において正のコントロールとして使用してよい。
本発明のさらに別の態様により、そのようなポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを科学的研究、ＤＮＡの合成、ＤＮＡベクターの製造に関連したイン・ビトロでの目的のためおよびヒトの疾患の診断薬および治療薬を提供する目的のために利用する方法を提供する。
全長のＫＧＦ−２遺伝子のフラグメントをｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用して全長ＫＧＦ−２遺伝子を単離し、これらの遺伝子と高い配列類似性または同様の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離する。一般的にこのタイプのプローブは少なくとも２０塩基を有する。しかしながら、好ましくは、該プローブは少なくとも３０塩基を有し、一般的には５０塩基を越えず、しかし一層多数の塩基を有していてよい。該プローブはまた、全長の転写物に対応するクローン、および制御領域およびプロモーター領域、エキソンおよびイントロンを含む完全なＫＧＦ−２遺伝子を含む単一または複数のゲノムクローンを同定するのに使用してよい。スクリーニングの例にはオリゴヌクレオチドプローブを合成するため公知のＤＮＡ配列を使用することによるＫＧＦ−２遺伝子のコーディング領域の単離を含む。本発明の遺伝子の配列と相補的な配列を有している標識したオリゴヌクレオチドは、ライブラリーのどのメンバーに該プローブがハイブリダイズするかを決定するため、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするのに使用する。
本発明はＫＧＦ−２ポリペプチドの受容体の同定方法を提供する。該受容体をコードする遺伝子は当業者に公知の多数の方法、例えば、リガンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティング（コリガン（Ｃoligan）ら、カレント・プロトコールズ・イン・イムン（Ｃurrent Ｐrotocols in Ｉmmun．）、１（２）、第５章、（１９９１））などにより同定することができる。好ましくは、発現クローニングを用い、その際、ポリアデニル化したＲＮＡを該ポリペプチドに応答性の細胞から調製し、ついでこのＲＮＡから作成されたｃＤＮＡライブラリーをプールに分け、ＣＯＳ細胞または該ポリペプチドに応答性でない他の細胞にトランスフェクションするために使用する。ガラススライド上で増殖させたトランスフェクションした細胞を標識したポリペプチドにさらす。該ポリペプチドはヨウ素化または部位特異的なプロテインキナーゼの認識部位を含めることを含む多様な手段によって標識することができる。固定およびインキュベーションの後でスライドをオートラジオグラフィー分析にかける。正のプールを同定し、ついでサブプールを調製し、ついで相互作用性のサブ−プールおよび再スクリーニング方法を用いて再度トランスフェクションし、最終的に推定受容体をコードする単一クローンを産生する。
受容体の同定のための別法として、標識したポリペプチドを細胞膜または受容体分子を発現する抽出調製物と光親和性結合させることができる。架橋した物質をＰＡＧＥ分析によって分離し、ついでＸ−線フィルムにさらす。ポリペプチドの受容体を含む標識した複合体を切り出し、ペプチドフラグメントに分離し、タンパク質マイクロシークエンシングにかける。マイクロシークエンシングから得たアミノ酸配列を推定受容体をコードする遺伝子を同定するためｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための縮重したオリゴヌクレオチドプローブのセットを設計するのに使用する。
本発明はＫＧＦ−２の作用をアゴナイズするかまたはＫＧＦ−２の機能をブロックするものを同定するための化合物のスクリーニング方法を提供する。そのようなアッセイの例には、哺乳動物のケラチノサイト細胞、スクリーニングすべき化合物、および3［Ｈ］チミジンを、ケラチノサイト細胞が通常増殖する細胞培養条件下で混合することを含む。コントロールアッセイはスクリーニングすべき化合物の不在下で行い、該化合物の存在下でのケラチノサイトの増殖量と比較して該化合物がケラチノサイトの増殖刺激するかどうかを決定する。
アンタゴニストをスクリーニングするため、同じアッセイをＫＧＦ−２の存在下で準備し、ついでケラチノサイト増殖を妨害する化合物の能力を測定し、アンタゴニストの能力を決定する。ケラチノサイト細胞増殖の量は3［Ｈ］チミジンの取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーにより測定する。
他の方法において、ＫＧＦ−２受容体を発現する哺乳動物細胞または膜調製物を該化合物の存在下で標識したＫＧＦ−２とともにインキュベーションする。ついで、この相互作用を増強またはブロックする化合物の能力を測定することができる。別のやり方として、ＫＧＦ−２と受容体との相互作用の後の公知の第二メッセンジャー系の応答を測定し、該化合物の存在下または不在下において比較する。そのような第二メッセンジャー系には以下に限られるものではないが、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネルまたはホスホイノシチド加水分解が含まれる。
可能性のあるＫＧＦ−２アンタゴニストの例には、該ポリペプチドに結合する、抗体、また幾つかの場合にはオリゴヌクレオチドが含まれる。かわりに、可能性のあるＫＧＦ−２アンタゴニストはＫＧＦ−２受容体に結合するＫＧＦ−２の変異体の形態であってよく、しかしながら、第２メッセンジャー応答を引き出さないことから、ＫＧＦ−２アンタゴニストの作用を有効にブロックする。
別の可能性のあるアンタゴニストにはまた、アンチセンス技術の利用によって調製されたアンチセンス構築物も含まれる。アンチセンス技術を利用して、三重らせん形状またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御することができ、この方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列の５'コーディング部分を使用して、長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子領域に対して相補的であるよう設計し（三重らせん−リー（Ｌee)ら、Ｎucl.Ａcids Ｒes.、６：３０７３（１９７９）クーニー（Ｃooney）ら、Ｓcience、２４１：４５６（１９８８）；およびダーバン（Ｄervan）ら、Ｓcience、２５１：１３６０（１９９１）を参照）、そのことによって、転写およびＫＧＦ−２の産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、イン・ビボにおいてmＲＮＡにハイブリダイズして、mＲＮＡ分子のＫＧＦ−２ポリペプチドへの翻訳をブロックする（アンチセンス−オカノ（Ｏkano）、Ｊ.Ｎeurochem.、５６：５６０（１９９１）；オリゴデオキシヌクレオチドズ・アズ・アンチセンス・オブ・ジーン・エクスプレッション（Ｏigodeoxynucleotides as Ａntisense Ｉnhibitors of Ｇene Ｅxpression）、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Ｐress）、ボカ・レイトン（Ｂoca Ｒaton）、フロリダ（１９８８））。上記のオリゴヌクレオチドをまた、細胞に送り込むことから、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボにおいて発現させて、ＫＧＦ−２の産生を阻害することができる。
可能性のあるＫＧＦ−２アンタゴニストには、ＫＧＦ−２受容体に結合する、および該受容体の結合部位を占め、それによってＫＧＦ−２に近づき難くして正常な生物学的活性を妨げる小分子が含まれる。。小分子の例には、これらに限定されるものではないが、小ペプチドまたはペプチド様分子が含まれる。
ＫＧＦ−２アンタゴニストを腫瘍中の新規血管成長または脈管形成の誘導を妨害するのに使用する。ＫＧＦ−２によって刺激された脈管形成はまた、糖尿病性網膜症を含む本発明のアンタゴニストによって治療される、および慢性関節リウマチなどの病理学組織の成長の抑制によって治療されるいくつかの病理に貢献する。
ＫＧＦ−２のアンタゴニストはまた、ボーマン嚢を満たす細胞塊を形成する糸球体上皮細胞の顕著な増殖によって特徴づけられる糸球体腎炎を治療するために使用してよい。
アンタゴニストはまた手術後のケロイドの形成、心筋梗塞後の線維症、肺線維症に関連する線維傷害および再狭搾において見られる瘢痕組織の過剰増殖を抑制するために使用してもよい。ＫＧＦ−２アンタゴニストはまた、癌およびカポジ肉腫を含むＫＧＦ−２によって刺激される他の増殖性の疾患を治療するのに使用してよい。
ＫＧＦ−２アンタゴニストはまた、上皮細胞増殖によって特徴づけられる角膜およびブドウ膜の炎症の深層の慢性浸潤である角膜炎を治療するのに使用してよい。
該アンタゴニストを例えば以下に記載するような製薬学的に許容し得る担体とともに組成物において使用してよい。
本発明のポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストは、適当な製薬学的担体と組み合わせて医薬組成物を含むよう使用することができる。そのような組成物は、治療上有効な量の該ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストおよび薬学上許容され得る担体または賦形剤を含んでなる。そのような担体には、これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。その製剤は、投与方法に適合すべきである。
本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供する。そのような容器に関連して、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。さらに、本発明のポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストは、他の治療化合物と共に使用することができる。
該医薬組成物は、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったような、便利な方法で投与することができる。該医薬組成物は、具体的な徴候を治療および／または予防するのに有効な量で投与される。一般に、それらは、少なくとも約１０μg／kg（体重）の量で投与され、最も多くの場合、それらは、１日当り約８mg／kg（体重）を超えない量で投与されるであろう。最も多くの場合、投与経路および症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０μg／kg〜約１mg／kg（体重）である。局所投与の具体的な場合においての用量は１cm2あたり０．１μgから９mgである。
該ＫＧＦ−２ポリペプチド、ポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストまたはアゴニストはまた、「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのようなポリペプチドのインビボにおける発現により、本発明に従って使用することができる。
従って、例えば、患者由来の細胞を、エクス・ビボにおいてポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で操作した後、操作した細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方法は、当業界で周知である。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用によって、当業界で既知の方法により、細胞を操作することができる。
同様に、例えば、当業界で既知の方法により、ポリペプチドのイン・ビボにおける発現のために、細胞をイン・ビボにおいて操作することができる。当業界で知られているように、細胞をイン・ビボにおいて操作して、ポリペプチドをイン・ビボにおいて発現させるために、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投与することができる。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞をイン・ビボにおいて操作するために使用することができるアデノウイルスであってもよい。他の運搬ビヒクルの例にはＨＳＶ−に基づいたベクター系、アデノ関連ウイルスベクターおよび不活性ビヒクル（例えばデキストランコートしたフェライト粒子）が含まれる。
本発明はまた、ＫＧＦ−２核酸配列中の変異の存在に関係がある疾患、または疾患に対する感受率を検出するための診断アッセイの一部としての、ＫＧＦ−２遺伝子の使用にも関する。
ＫＧＦ−２遺伝子において変異が起こっている個体は、様々な技術により、ＤＮＡレベルで検出することができる。診断用の核酸は、患者の細胞から、例えば、血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料から得ることができる。ゲノムＤＮＡは、検出のために直接使用することができ、または分析前にＰＣＲ（サイキ（Ｓaiki）ら、Ｎature、３２４：１６３−１６６（１９８６））を利用することにより、酵素的に増幅することができる。ＲＮＡまたはcＤＮＡもまた、同じ目的に使用することができる。例としては、ＫＧＦ−２をコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを使用して、ＫＧＦ−２変異を同定して分析することができる。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較しての増幅産物のサイズにおける変化により検出することができる。点変異は、増幅されたＤＮＡが、放射能標識化ＫＧＦ−２のＲＮＡ、あるいはまた、放射能標識化ＫＧＦ−２のアンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズすることにより同定することができる。完全に対合している配列は、ＲＮアーゼＡ消化により、または融解温度の相違により、対合していない二本鎖と区別することができる。
ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝試験は、変性剤を含む、または含まないゲルでのＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により成し遂げることができる。小さな配列の欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動により視覚化することができる。ＤＮＡフラグメントの様々な配列は、変性ホルムアミド勾配ゲル上で区別することができ、ここでは、様々なＤＮＡフラグメントの移動度が、それらの特異的な融解または部分的な融解温度により、ゲルにおける様々な位置で遅延される（例えば、ミエーズ（Ｍyers）ら、Ｓcience、２３０：１２４２（１９８５）を参照）。
特定の位置での配列変化はまた、ＲＮアーゼおよびＳ１保護といったようなヌクレアーゼ保護アッセイ、または化学切断法により示すことができる（例えば、コットン（Ｃotton）ら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８５））。
従って、特異的なＤＮＡ配列の検出は、ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定、または制限酵素の使用（例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ））、およびサザンブロッティングといったような方法により成し遂げることができる。
さらに従来的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異はまた、in situ分析により検出することもできる。
本発明はまた、さまざまな組織中のＫＧＦ−２タンパク質のレベルの変化を検出するための診断アッセイにも関する。なぜなら正常なコントロール組織サンプルに比較した該タンパク質の過剰発現は、例えば腫瘍などの疾患または疾患の罹患し易さの存在を検出するからである。宿主由来のサンプル中のＫＧＦ−２タンパク質のレベルを検出するために使用するアッセイは当業者によく知られており、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイおよび「サンドイッチ」アッセイが含まれる。ＥＬＩＳＡアッセイ（コリガンら、カレント・プロトコールズ・イン・イムノロジー、１（２）、第６章、（１９９１））にはまずＫＧＦ−２抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製することを含む。さらにリポーター抗体を該モノクローナル抗体に対して調製する。リポーター抗体に放射能、蛍光または本例においては西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素などの検出可能な試薬を結合させる。サンプルを宿主から採り、ついで固相支持体（例えばポリスチレン皿、該サンプル中のタンパク質を結合させる）上でインキュベーションする。ついで皿上の遊離タンパク質結合部位をウシ血清アルブミンのような非特異的なタンパク質とインキュベーションすることによりカバーする。ついで、モノクローナル抗体をインキュベーションすると、その間にモノクローナル抗体がポリスチレン皿に付着したＫＧＦ−２タンパク質に結合する。未結合のモノクローナル抗体をすべてバッファーで洗い流す。ついで西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したリポーター抗体を皿に入れると、ＫＧＦ−２に結合したモノクローナル抗体に対してリポーター抗体が結合する。ついで未結合のリポーター抗体を洗い流す。ペルオキシダーゼ基質をついで該皿に加え、所定の時間において発色する量が、標準曲線に比較した際の患者のサンプルの所定量に存在するＫＧＦ−２タンパク質の量の測定値である。
競合アッセイを使用してよく、その際、ＫＧＦ−２に特異的な抗体を固相支持体に結合させ、標識したＫＧＦ−２および宿主由来のサンプルを該固相支持体を通過させ、例えば液体シンチレーションクロマトグラフィーなどによって検出されたレベルの量を該サンプル中のＫＧＦ−２の量に相関させることができる。
「サンドイッチ」アッセイはＥＬＩＳＡアッセイと同様である。「サンドイッチ」アッセイではＫＧＦ−２を固相支持体を通過させ、固相支持体に結合した抗体に結合する。第二抗体をついでＫＧＦ−２に結合させる。標識されており、第二抗体に特異的である第三抗体をついで固相支持体を通過させて第二抗体に結合させ、ついでその量を定量することができる。
本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせることができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要性がある。実際の配列データ（反復多型性）に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を病気と関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階である。
簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー（好ましくは、１５−２５bp）を調製することにより、配列を染色体にマップすることができる。３'の翻訳されていない領域のコンピューター分析を利用して、ゲノムＤＮＡ中の１つ以上のエキソンをスパン（span）しないプライマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なものとする。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む、それらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与えるであろう。
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いての本発明を利用して、サブローカリゼーションは、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプール由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達成することができる。その染色体へマップするのに同様に利用することができる他のマッピング方法には、in situハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティッド（flow−sorted）染色体を用いてのプレスクリーニング、および染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセレクションが含まれる。
cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッドへの蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えることができる。この技術は、５００または６００塩基という短いcＤＮＡで利用することができる；しかし、２，０００bpより大きいクローンは、簡単な検出に十分な信号強度を有する独自の染色体位置へ結合する可能性が高い。ＦＩＳＨは、ＥＳＴが得られたクローンの使用を必要とし、また長ければ長いほどよい。例えば、２，０００bpが良好であり、４，０００はより良好であって、４，０００以上は、おそらく、良好な結果を妥当な時間割合で得るのに必要ない。この技術の概説には、ベルマ（Ｖerma）ら、ヒューマン・クロモソームズ（Ｈuman Ｃhromosomes）：ア・マニュアル・オブ・ベーシック・テクニックス（a Ｍanual of Ｂasic Ｔechniques）、パーガモン・プレス（Ｐergamon Ｐress）、ニューヨーク（１９８８）を参照。
ある配列が正確な染色体位置に一度マップされると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデータと関連付けることができる。そのようなデータは、例えば、マクジック（Ｖ.ＭcＫusick）、メンデリアン・インヘリタンス・イン・マン（Ｍendelian Ｉnheritance in Ｍan）ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシティー・ウェルチ・メディカル・ライブラリー（Ｊohns Ｈopkins Ｕniversity Ｗelch Ｍedical Ｌibrary）を介してオンラインで利用できる）に見い出される。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係を結合分析（物理的に隣接した遺伝子の共遺伝（coinheritance））によって確認する。
次に、病気に冒された個体と冒されていない個体との間のcＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまたは全てにおいて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、その変異は疾患の原因となるものであるらしい。
現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッピングの分析から、疾患と関連する染色体領域に正確に局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因となる遺伝子の１つとなり得るであろう。（これは、１メガベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子を仮定する）。
ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫原として使用して、それらに対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発現ライブラリーの生成物も含まれる。当業界で既知の様々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造に使用することができる。
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒトでない動物に投与することにより得ることができる。次いで、そのようにして得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するのに使用することができる。次いで、そのような抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離することができる。
モノクローナル抗体を調製するには、連続的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術（コーラー（Ｋohler）およびミルスタイン（Ｍilstein）、１９７５、Ｎature、２５６：４９５−４９７）、トリオーマ（trioma）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（コズボール（Ｋozbor）ら、１９８３、Ｉmmunology Ｔoday４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（コール（Ｃole）ら、１９８５、モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・キャンサー・セラピー（Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer Ｔherapy）、アラン・アール・リス・インク（Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.）、７７−９６頁において）が含まれる。
単鎖抗体の産生に関して記載されている技術（米国特許第４,９４６,７７８号）は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するのに適合し得る。また、トランスジェニックマウスを使用して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現させることもできる。
本発明をさらに、以下の実施例に関して記載する；しかし、本発明は、そのような実施例に限定されないことを理解すべきである。部または量は全て、特にことわらない限り、重量単位である。
以下の実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法および／または用語を記載する。
「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字および／または数字により示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されていて、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法により入手可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラスミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろう。
ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列にのみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒切断することを示す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に知られているように使用した。分析目的には、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、一般的に、より多量の体積中、ＤＮＡ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通常利用されるが、供給者の指示に従って変えることができる。消化後、その反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して、所望のフラグメントを単離する。
切断したフラグメントのサイズ分離は、ゲッデル（Ｇoeddel,Ｄ）ら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、８：４０５７（１９８０）により記載されている８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。
「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、または２つの相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を示す。そのような合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有さないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰでホスフェートを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドにライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントにライゲートするであろう。
「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過程をいう（マニアチスら、同上、１４６頁）。特にことわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせるべきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０．５μg当たり１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）と共に、既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができる。
外在性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合に細胞が外在性ＤＮＡによって「形質転換」されたという。外在性ＤＮＡは組み込まれて（共有結合して）細胞のゲノムを構成する染色体間（inter-chromosomal）ＤＮＡであってもなくてもよい。例えば、原核生物および酵母では、外在性ＤＮＡはプラスミドなどのエピソーム要素の上に維持される。真核生物細胞に関しては、安定して形質転換されたまたはトランスフェクションされた細胞は、染色体複製により娘細胞によって外在性ＤＮＡが遺伝されるように外在性のＤＮＡが染色体に組み込まれたものである。この能力は外在性のＤＮＡを含む娘細胞の集団からなる細胞株またはクローンを確立する真核生物細胞の能力によって証明される。形質転換の例はグラハム（Ｇraham, Ｆ.）およびバン・デア・エブ（Ｖan der Ｅb, Ａ.）、Ｖirology５２：４５６−４５７（１９７３））中に示されている。
「トランスダクション」または「トランスデュースされた」という語は、外来ＤＮＡを細胞が取り込み、その外来ＤＮＡを自らの染色体に組み込むプロセスをいう。トランスダクションは例えば、トランスフェクション（細胞がＤＮＡを取り込む様々な技術）、または感染（ウイルスがＤＮＡを細胞に移すのに使用される）によって行うことができる。
実施例１
ＫＧＦ−２の細菌発現および精製
最初に、ＫＧＦ−２をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ第７５９７７号）を、プロセシングしたＫＧＦ−２cＤＮＡ（シグナルペプチド配列を含む）配列の５'および３'末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを利用して増幅する。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列：
0003774230.tif 000002
を有し、続くＡfl III制限酵素部位を、続いて、推定開始コドンの後に続くコドンから始まるＫＧＦ−２コーディング配列の３０ヌクレオチドを含む。３'配列：
0003774230.tif 000003
は、Ｈind III部位に対する相補的配列、および続くＫＧＦ−２の２６ヌクレオチドを含む。その制限酵素部位は、細菌発現ベクターpＱＥ−６０（キアゲン、インク）（Ｑiagen Ｉnc.）、チャタワース（Ｃhatsworth）、カリフォルニア、９１３１１）の制限酵素部位に一致する。pＱＥ−６０は、抗生物質耐性（Ａmpr）、細菌の複製開始点（ori）、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモーター／オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈisタグおよび制限酵素部位部位をコードする。ついでpＱＥ−６０ベクターをＮco ＩおよびＨind IIIで消化する。増幅した配列をpＱＥ−６０にライゲーションし、ついでインフレームで挿入した。次いで、そのライゲーション混合物を使用して、Ｍ１５／rep４（キアゲン、インク）であるＥ.coli株をサンブルック（Ｓambrook, Ｊ.）ら、モレキュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃloning）：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌaboratory Ｍanual）、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス（Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress）、（１９８９）に記載された方法によってトランスフォームした。Ｍ１５／rep４はプラスミドpＲＥＰ４の多重コピーを含み、これは、lacＩリプレッサーを発現して、またカナマイシン耐性（Ｋanr）も与える。トランスフォーマントを、それらが、ＬＢプレートで増殖する能力により同定しついでアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。所望の構築物を含むクローンを、Ａmp（１００μg／ml）およびＫan（２５μg／ml）の両方を補った、ＬＢ培地中での液体培養で一晩増殖させた（Ｏ／Ｎ）。そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養物に１：１００〜１：２５０の割合で播種する。細胞が、０．４〜０．６の間の光学密度６００（Ｏ.Ｄ.600）まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を、最終濃度が１mＭとなるまで加えた。ＩＰＴＧは、lacＩリプレッサーを不活性化し、Ｐ／Ｏをクリアリングし、遺伝子発現を増加させることにより誘導する。細胞をさらに３−４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により収集した。細胞ペレットをカオトロピック剤である６モルのグアニジンＨＣl中で可溶化した。清澄後、この溶液から、該タンパク質による強固な結合を可能にする条件下、ヘパリンアフィニティーカラムでのクロマトグラフィーにより、可溶化したＫＧＦ−２を精製する（ホチュリ（Ｈochuli,Ｅ.）ら、Ｊ. Ｃhromatography４１１：１７７−１８４（１９８４））。高い塩濃度バッファーによりカラムからＫＧＦ−２（純度７５％）を溶出する。
実施例２
切断された形態のＫＧＦ−２の細菌発現および精製
最初に、ＫＧＦ−２をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ第７５９７７号）を、切断された形態のＫＧＦ−２ポリペプチドの配列の５'および３'末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを利用して増幅する。該切断形態には該ポリペプチドから３６アミノ酸シグナルペプチド配列を差し引いたものを含み、全長のタンパク質のアミノ酸３７を構成するシステイン残基の直前にメチオニンおよびアラニン残基が付加されている。該５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列：
0003774230.tif 000004
を有し、続くＮco Ｉ制限酵素部位を、続いて、ＫＧＦ−２コーディング配列の２４ヌクレオチドを含む。３'配列：
0003774230.tif 000005
は、Ｈind III部位に対する相補的配列、および続くＫＧＦ−２の２６ヌクレオチドを含む。その制限酵素部位は、細菌発現ベクターpＱＥ−６０（キアゲン、インク、チャタワース、カリフォルニア、）の制限酵素部位に一致する。pＱＥ−６０は、抗生物質耐性（Ａmpr）、細菌の複製開始点（ori）、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモーター／オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈisタグおよび制限酵素部位部位をコードする。ついでpＱＥ−６０をＮco ＩおよびＨind IIIで消化する。増幅した配列をpＱＥ−６０にライゲーションし、ついでインフレームで挿入する。次いで、そのライゲーション混合物を使用して、Ｍ１５／rep４（キアゲン、インク）であるＥ.coli株をサンブルックら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス、（１９８９）に記載された方法によってトランスフォームした。Ｍ１５／rep４はプラスミドpＲＥＰ４の多重コピーを含み、これは、lacＩリプレッサーを発現して、またカナマイシン耐性（Ｋanr）も与える。トランスフォーマントを、それらが、ＬＢプレートで増殖する能力により同定しついでアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、制限分析によって確認する。所望の構築物を含むクローンを、Ａmp（１００μg／ml）およびＫan（２５μg／ml）の両方を補った、ＬＢ培地中での液体培養で一晩増殖させた（Ｏ／Ｎ）。そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養物に１：１００〜１：２５０の割合で播種する。細胞が、０．４〜０．６の間の光学密度６００（Ｏ.Ｄ.600）まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を、最終濃度が１mＭとなるまで加えた。ＩＰＴＧは、lacＩリプレッサーを不活性化し、Ｐ／Ｏをクリアリングし、遺伝子発現を増加させることにより誘導する。細胞をさらに３−４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により収集した。細胞ペレットをカオトロピック剤である６モルのグアニジンＨＣl中で可溶化する。清澄後、この溶液から、該タンパク質による強固な結合を可能にする条件下、ヘパリンアフィニティーカラムでのクロマトグラフィーにより、可溶化したＫＧＦ−２を精製する（ホチュリら、Ｊ. Ｃhromatography４１１：１７７−１８４（１９８４））。高い塩濃度バッファーによりカラムからＫＧＦ−２を溶出する。
実施例３
バキュロウイルス発現システムを用いてのＫＧＦ−２のクローニングおよび発現
完全な長さのＫＧＦ−２タンパク質をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第７５９７７号を、遺伝子の５'および３'に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを利用して増幅する。
その５'プライマーは、配列：
0003774230.tif 000006
を有し、またＢam ＨＩ制限酵素部位（肉太の活字）、続いて、真核細胞における翻訳の開始に有効な信号に似ている６ヌクレオチド（コザック（Ｋozak,Ｍ.）、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.１９６：９４７−９５０（１９８７））を含み、またこの直ぐ後は、ＫＧＦ−２遺伝子の最初の１７ヌクレオチド（翻訳開始コドン「ＡＴＧ」に下線を引いてある）である。
その３'プライマーは、配列：
0003774230.tif 000007
を有し、また制限エンドヌクレアーゼＡsp７１８の切断部位、およびＫＧＦ−２遺伝子の３'の非翻訳配列に対して相補的な１９ヌクレオチドを含む。増幅された配列を、市販のキット（キアゲン、インク、チャタワース、カリフォルニア）を使用して、１％アガロースゲルから単離した。次いで、そのフラグメントをエンドヌクレアーゼＢam ＨＩおよびＡsp７１８で消化し、再度１％アガロースゲル上で精製した。このフラグメントをＦ２と名付ける。
ベクターpＡ２（pＶＬ９４１ベクターの修飾、以下に論ずる）を、バキュロウイルス発現系を用いてのＫＧＦ−２タンパク質の発現に使用する（概説には、サマーズ（Ｓummers,Ｍ.Ｄ.）およびスミス（Ｓmith,Ｇ.Ｅ.）１９８７、ア・マニュアル・オブ・メソッズ・フォー・バキュロウイルス・ベクターズ・アンド・インセクト・セル・カルチャー・プロシーデュアーズ（Ａ manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures）、Ｔexas Ａgricultural Ｅxperimental Ｓtation Ｂulletin Ｎo.１５５５を参照）。この発現ベクターは、オートグラファ（Ａutographa）カリフォルニアポリヘドロシスウイルス（ＡcＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いて、制限エンドヌクレアーゼＢam ＨＩおよびＡsp７１８の認識部位を含む。シミアンウイルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化部位を、有効なポリアデニル化に使用する。組換えウイルスを容易に選択するため、Ｅ.coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化信号が続くポリヘドリンプロモーターと同じ向きに挿入する。同時トランスフェクトした（cotransfected）野生型ウイルスＤＮＡの、細胞により媒介される相同組換えのためのウイルス配列をポリヘドリン配列の両側に隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターを、例えば、pＡc３７３、pＶＬ９４１、およびpＡcＩＭ１を、pＲＧ１の代わりに使用することができるであろう（ラッコゥ（Ｌuckow,Ｖ.Ａ.）およびサマーズ、Ｖirology、１７０：３１−３９）。
プラスミドを制限酵素Ｂam ＨＩおよびＡsp７１８で消化する。次いで、ＤＮＡを１％アガロースゲルから市販のキット（キアゲン、インク、チャタワース、カリフォルニア）を使用して、単離する。このベクターＤＮＡをＶ２と名付ける。
フラグメントＦ２およびプラスミドＶ２をＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲションする。次いで、Ｅ.coli ＨＢ１０１細胞をトランスフォームして、ＫＧＦ−２遺伝子を有するプラスミド（pＢacＫＧＦ−２）を含む細菌を、クローニングオリゴヌクレオチドの両方でＰＣＲを使用して同定する。クローニングされたフラグメントの配列を、ＤＮＡシークエンシングにより確認する。
リポフェクション法（フェルグナー（Ｆelgner）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７（１９８７）を利用して、プラスミドpＢacＫＧＦ−２ ５μgを市販の線形化バキュロウイルス（「ＢaculoＧoldTMバキュロウイルスＤＮＡ」、ファーミンゲン（Ｐharmingen）、サン・ディエゴ（Ｓan Ｄiego）、カリフォルニア）１．０μgと共に同時トランスフェクションする。
ＢaculoＧoldTMウイルスＤＮＡ１μgおよびプラスミドpＢacＫＧＦ−２ ５μgを、無血清グレイス（Ｇrace's）培地（ライフ・テクノロジーズ・インク（Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.）、ゲイザーズバーグ（Ｇaithersburg）、メリーランド）５０μlを含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、リポフェクチン（Ｌipofectin）１０μlとグレイス培地９０μlを加え、混合して、室温で１５分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合物を、無血清グレイス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレートに播種したＳf９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴加する。そのプレートを前後に揺り動かして、新たに加えた溶液を混合する。次いで、そのプレートを２７℃で５時間インキュベートする。５時間後、そのトランスフェクション溶液をプレートから除去して、１０％ウシ胎児血清を補ったグレイス昆虫培地１mlを加える。そのプレートをインキュベートに戻して、２７℃で４日間培養し続ける。
４日後、上清を集めて、サマーズおよびスミス（上記）により記載されたようにして、プラークアッセイを行う。変法として「Ｂlue Ｇal」（ライフ・テクオロジーズ・インク、ゲイザーズバーグ）を含むアガロースゲルを使用したが、このことにより、青色に染色されたプラークを容易に単離することが可能となる。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関する利用者のガイド、およびライフ／テクノロジーズ・インク、ゲイザーズバーグにより配布されたバキュロウイルス学、９−１０頁にも見出すことができる）。
４日後、ウイルスの連続希釈物を細胞に加えて、青色に染色されたプラークをエッペンドルフピペットの先端で採取する。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、グレイス培地２００μlを含むエッペンドルフ管内で再び懸濁させる。その寒天を短時間の遠心分離により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清を、３５mmの皿に播種したＳf９細胞を感染させるのに使用する。４日後、これらの培養皿の上清を収集した後、４℃で保存する。
Ｓf９細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳを補ったグレイス培地で増殖させる。その細胞に、感染多重度（ＭＯＩ）２で組換えバキュロウイルスＶ−ＧＰＲを感染させる。６時間後、その培地を除去して、メチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００II培地（ライフ・テクノロジーズ・インク、ゲイザーズバーグ）に替える。４２時間後、５μＣiの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣiの35Ｓシステイン５μＣi（アマシャム（Ａmersham））を加える。その細胞をさらに１６時間インキュベートした後、それらを遠心分離により収集して、標識化タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより視覚化する。
実施例４
ＣＯＳ細胞における組換えＫＧＦ−２の発現
プラスミド、ＫＧＦ−２ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０複製開始点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）Ｅ.coli複製開始点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモーターを含む、ベクターpcＤＮＡＩ／Ａmp（インビトロゲン（Ｉnvitrogen））から得られる。完全なＧ−タンパク質結合性受容体の前駆体およびその３'末端にイン・フレームで融合したＨＡタグをコードするＤＮＡフラグメントを、そのベクターのポリリンカー領域にクローン化することから、組換えタンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターの下に指示される。ＨＡタグは、前記のようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する（ウィルソン、ニマン（Ｈ.Ｎiman）、ハイテン（Ｒ.Ｈeighten）、チェレンソン（Ａ.Ｃherenson）、コノリー（Ｍ.Ｃonnolly）、およびラーナー（Ｒ.Ｌerner）、１９８４、Ｃell３７、７６７）。ＨＡタグを我々の標的タンパク質へ融合させることにより、組換えタンパク質を、ＨＡエピトープを認識する抗体で容易に検出することが可能となる。
プラスミド構築方法を以下に記載する：
ＫＧＦ−２をコードするＡＴＣＣ第７５９７７号のＤＮＡ配列を、２つのプライマーを用いてのＰＣＲにより構築する：
５'プライマー配列：
0003774230.tif 000008
は開始コドンから出発するＫＧＦ−２のコーディング配列の３０ヌクレオチドが続くＨind III部位を含む；
３'配列は：
0003774230.tif 000009
は、Ｘba Ｉ制限酵素部位に対する相補的配列、翻訳終始コドン、ＨＡタグ、およびＫＧＦ−２コーディング配列の最後の３２ヌクレオチド（終始コドンは含まれていない）を含む。従って、ＰＣＲ産物は、Ｈind III部位、ＫＧＦ−２コーディング配列、続いて、イン・フレームで融合したＨＡタグ、そのＨＡタグの隣の翻訳終結コドン、およびＸbaＩ部位を含む。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡフラグメントおよびベクター、pcＤＮＡＩ／Ａmpを、Ｈind IIIおよびＸba Ｉ制限酵素で消化して、ライゲーションする。そのライゲーション混合物をＥ.coli株ＸＬ１Ｂlue（ストラタジーン・クローニング・システムズ（Ｓtratagene Ｃloning Ｓystems）、ラ・ホラ（Ｌa Ｊolla）、カリフォルニア）にトランスフォームし、そのトランスフォームされた培養物をアンピシリン培地プレート上に置いて、耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡをトランスフォーマントから単離して、正しいフラグメントの存在に関してＰＣＲおよび制限分析により試験する。組換えＫＧＦ−２の発現のために、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法により、ＣＯＳ細胞を発現ベクターでトランスフェクションする。（サンブルック、フリッチ（Ｅ.Ｆritsch）、マニアチス（Ｔ.Ｍaniatis）、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス、（１９８９））。ＫＧＦ−２ＨＡタンパク質の発現を、放射能標識および免疫沈降法により検出する（ハーロゥ（Ｅ.Ｈarlow）、レーン（Ｄ.Ｌane）、アンチボディーズ（Ａntibodies）：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌaboratory Ｍanual）、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス、（１９８８））。トランスフェクションから２日後、タンパク質を35Ｓ−システインで８時間標識化する。次いで、細胞培地を集めて、細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０mＭ ＮaＣl、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％ＤＯＳ、５０mＭトリス、pＨ７．５））で溶菌する（ウィルソンら、同上３７：７６７（１９８４））。ＣＯＳ細胞ライゼートおよび上清から得られた35Ｓ−システイン標識化タンパク質を、ＨＡポリクローナル抗体で免疫沈降させて、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離する。
実施例５
イン・ビトロでの組換えＫＧＦ−２の転写および翻訳
ＰＣＲ産物はpＡ２ベクター中のクローニングされたcＤＮＡ由来であり、ＫＧＦ−２の昆虫細胞発現に使用する。このＰＣＲに使用したプライマーは：
0003774230.tif 000010
である。
最初のプライマーはＡＴＧ開始コドンに対するＴ３プロモーターの５'の配列を含む。第２のプライマーはＫＧＦ−２のオープン・リーディング・フレームの３'端に相補的であり、終始コドンの逆相補的な配列をコードする。
得られたＰＣＲ産物はキアゲンから市販され入手可能であるキットを用いて精製する。このＤＮＡの０．５μgをイン・ビトロの転写反応の鋳型として使用する。その反応をＴＮＴという名でプロメガから市販されており入手可能であるキットにて行う。そのアッセイを放射性標識したメチオニンを基質として、試薬の指示された量の１／２だけを使用したことを除いては３３℃で１．５時間反応を進行させてキットの指示に従って行う。
その反応物の５μlを１０−１５％の変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離する。そのゲルを３０分間、水：メタノール：酢酸をそれぞれ６：３：１の容量の混合物中で固定する。ついでそのゲル減圧下加熱乾燥させ、引き続いてＸ−線フィルムに１６時間さらす。そのフィルムを現像して概念的には翻訳されたＫＧＦ−２にサイズで一致する放射性タンパク質のバンドの存在が示され、それによってＫＧＦ−２のクローニングされたcＤＮＡが期待される大きさのタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを含むことが示唆された。
先の教示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であることから、後記する請求の範囲内で、特に記載した以外の方法で、本発明を行うことができる。
配列表
配列番号１
（i）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：６２７塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：cＤＮＡ
（xi）配列の記述：配列番号１：
0003774230.tif 000011
配列番号２
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２０８アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）配列の記述：配列番号：２
0003774230.tif 000012
配列番号３
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３６塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：オリゴヌクレオチド
（ix）配列の記述：配列番号：３
0003774230.tif 000013
配列番号４
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：オリゴヌクレオチド
（ix）配列の記述：配列番号：４
0003774230.tif 000014
配列番号５
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３６塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：オリゴヌクレオチド
（ix）配列の記述：配列番号：５
0003774230.tif 000015
配列番号６
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：オリゴヌクレオチド
（ix）配列の記述：配列番号：６
0003774230.tif 000016
配列番号７
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：オリゴヌクレオチド
（ix）配列の記述：配列番号：７
0003774230.tif 000017
配列番号８
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２７塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：オリゴヌクレオチド
（ix）配列の記述：配列番号：８
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配列番号９
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：オリゴヌクレオチド
（ix）配列の記述：配列番号：９
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配列番号１０
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：６９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：オリゴヌクレオチド
（ix）配列の記述：配列番号：１０
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配列番号１１
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：５４塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：オリゴヌクレオチド
（ix）配列の記述：配列番号：１１
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配列番号１２
（i）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：オリゴヌクレオチド
（ix）配列の記述：配列番号：１２
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【図１Ａ】
0003774230.tif 000023
【図１Ｂ】
0003774230.tif 000024
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
0003774230.tif 000026
【図２Ｂ】
0003774230.tif 000027
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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