(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＨ２-Ｇ-Ｅ-ＨＰ-Ｇ-Ａ-ＨＰ-Ｇ-Ｐ-Ａ-Ｇ-Ｐ-ＨＰ-Ｇ-Ｅ-ＨＰ-Ｇ-Ａ-ＨＰ-Ｇ-Ｐ-Ａ-Ｇ-Ｐ-ＨＰ-Ｇ-ＣＯＯＨ；および
ＮＨ２-Ｇ-Ｅ-Ｅ-Ｇ-Ｌ-Ｒ-Ｇ-Ａ-Ｒ-Ｇ-Ｅ-ＨＰ-Ｇ-Ｅ-Ｒ-Ｇ-Ｐ-ＨＰ-Ｇ-Ｐ-Ｑ-Ｇ-Ａ-Ｒ-ＣＯＯＨ；
（ここで“ＨＰ”はヒドロキシプロリンを示す）
からなる群から選択される少なくとも一つのペプチドフラグメントを含む、リウマチ性関節炎を抑制するための吸入用薬学的組成物。
【請求項２】
薬学的に許容できるキャリアまたは希釈剤をさらに含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
０．０１から５ｍｇ／日の範囲内の単位投与量当たりの量で前記ペプチドフラグメントを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
０．０１から０．５ｍｇ／日の範囲内の単位投与量当たりの量で前記ペプチドフラグメントを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が乾燥粉末形態である、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物がエアゾールスプレー形態である、請求項１記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
本特許出願は、以下のものの一部継続出願である：
Weinerら、米国特許出願第９５１，５６５号、１９９２年９月２５日出願、これもまたWeinerら、米国特許出願第４６０，８５２号、１９９０年２月２１日出願および第５９６，９３６号、１９９０年１０月１５日出願（前者はＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８８／０２１３９号、１９８８年６月２４日出願の各国段階にあり、後者もＰＣＴ／ＵＳ９１／０７５４２号の同じ段階）の一部継続出願であり、これらもまた米国特許出願第０６５，７３４号、１９８７年６月２４日出願、現在放棄、の一部継続出願である；
Weinerら、米国特許出願第４５４，８０６号、１９８９年１２月２０日出願；
Weinerら、米国特許出願第４８７，７３２号、１９９０年３月２日出願；
Weinerら、米国特許出願第８０９，２０６号、１９９１年１２月１３日出願、これはWeinerら、米国特許出願第５５１，６３２号、１９９０年７月１０日出願の一部継続出願であり、これは、米国特許出願第３７９，７７８号、１９８９年７月１４日出願、（現在放棄）の一部継続出願である；
Weinerら、米国特許出願第５９５，４６８号、１９９０年１０月１０日出願；および
Weinerら、米国特許出願第８４３，７５２号、１９９２年２月２８日出願。
前述の出願はここでそのまま文献として記載されている。
発明の分野
本発明は、ヒトにおける自己免疫関節炎の治療に関係している。特に本発明は、リウマチ性およびより一般的には自己免疫関節炎に関与する自己免疫応答特異的抑制を誘導するための、ヒトへのコラーゲンまたはフラグメントまたはアナログの経口、経腸、吸入投与に関している。本発明はまた、全コラーゲン、その関節炎抑制性ペプチドフラグメント、および前述のものの２種以上の組み合わせを含む、ヒトにおける関節炎の治療に有用な治療薬に関する。
発明の背景
コラーゲンはヒトまたは哺乳類の体の構造支持（structural supprot）において最も一般的なタンパク質である。コラーゲンの基本的な構成単位は、トロポコラーゲンである。トロポコラーゲンは、同じサイズの３本のポリペプチド鎖で構成されている。これらの鎖は、互いに巻き付いてスーパーヘリックスのケーブル（superhelical cable）、または３重鎖らせんのロッド（rod）を形成している。トロポコラーゲンの３本の鎖の各々が、約千のアミノ酸残基から構成されている。
５つの異なるタイプのコラーゲンタンパク質が、現在、別々の異なるアミノ酸構成と長さを有するものとして知られている。タイプＩコラーゲンは、２つのアルファ-１（Ｉ）と１つのアルファ-２ポリペプチド鎖から構成されている。タイプＩコラーゲンは、主として、皮膚組織、腱、骨の支持構造中、および眼の角膜中に見いだされる。タイプIIコラーゲンは、アルファ-１（II）タイプの３本のポリペプチド鎖を含み、主に関節の軟骨中、椎間円板内部、眼内部のガラス体中で見いだされる。タイプIIIコラーゲンは、３本のアルファ-１（III）ポリペプチド鎖から構成され、胎児の皮膚、心血管系（cardiovascular system）、および眼中の細網線維（reticular fibers）等の組織中に見いだされる。タイプIVコラーゲンは２つのアルファ-１（IV）と１つのアルファ-２（IV）ポリペプチド鎖の混合物であり、主に基礎膜（basement membranes）中に見いだされる。最後にタイプＶコラーゲンは２つのアルファ-１（Ｖ）と１つのアルファ-２（Ｖ）ポリペプチド鎖を有しており、例えば胎盤や皮膚中に見いだされる。ヒトアルファ-１（II）、ウシアルファ-１（II）、およびウシアルファ-１（Ｉ）アミノ酸配列の比較は、付録Ａに記載されている。ウシ配列は一部のものである。
リウマチ性関節炎は、細胞媒介自己免疫疾患、すなわち免疫システムが誤って自分自身の体の組織を外来のものと認識し、それに対して異常な免疫応答をおこす状態である。リウマチ性関節炎は、軟骨の破壊と骨の侵食を起こし、末梢関節の構造変形を引きおこす、しつこい炎症性の滑膜炎によって特徴づけられる。タイプIIコラーゲンが主要成分である関節軟骨を含む関節は、特に影響されやすい。
リウマチ性関節炎は、関節の腫張、炎症、および特に屈曲の際の（upon flexing）硬直と痛みを伴う。関節炎が進んだ状態では、関節をほんの少し動かしただけで衰弱させる痛みがおこることもある。かなりの割合の患者が、コラーゲンに特異的に反応するＣＤ４＋タイプのＴ細胞を有しており、および／またはコラーゲンに対する異常な体液性反応を有している。
関節炎の現在の治療としては、非特異的細胞毒性の免疫抑制剤の使用がある。これらの薬剤は、全免疫システムを抑制し、異常な自己免疫応答を選択的に抑制することができない。この免疫システムを長期間全体的に抑制することは、感染の危険性を増加させる。そのような免疫抑制剤の非制限的な例としては、メトトレキセート、シクロフォスファミド、イムラン（アザチオプリン）、サイクロスポリンＡ（cyclosporin A）などがある。
また、これらの非特異的細胞毒性の免疫抑制剤による長期治療は有害な副作用を伴い、これには、ある種の悪性腫瘍、腎臓疾患、糖尿病、肝臓機能異常の進展に向かう傾向の増加が含まれる。さらに細胞毒性免疫抑制剤治療は、疾病の進展を単に遅らせるだけであり、治療が中断された後に、加速されたペースで再発する。例えば、そのような薬剤が中断された後約６週間後に、患者は治療が始められる前と同じ状態まで悪化する。さらにこれらの薬剤の効果は、それ自体制限されている。これらは徐々に、約２−５年後に効果を失う。
例えば、プレドニゾンおよびメチルプレドニゾロン（これらもまた非特異的免疫抑制性の抗炎症剤である）、などのステロイド化合物もまた症状の軽減に用いられる。ステロイドもまた、その長期間使用に伴って、非常に有害な副作用を有する。
したがって、現在の関節炎の治療は効果が制限されており、非常に有害な副作用を含み、無制限に使用することができない。リウマチ性関節炎は、米国内で毎年ニ百万人が患っている。したがって、上記欠点の１つ以上を受けることのないヒト自己免疫関節炎の新規治療と新規治療用組成物に対する要望が高い。
これに代わる関節炎の治療は、本発明者により提案された経口抗原寛容治療である。これは、特定の自己免疫疾患特異的に関与する自己免疫応答を抑制することができ、したがって他の免疫機能を本質的にそのままに残す、１つ以上の組織特異的抗原（すなわち自己免疫攻撃を受けている組織にのみおこる抗原）の経口、経腸、吸入投与を含む。
このアプローチに一般的に有用な抗原は自己抗原、すなわちそれ自体自己免疫攻撃の原因（subject）である組織特異的抗原を含む。バイスタンダー抗原、これらもまた組織特異的（しかし自己免疫攻撃の標的ではない）であるが、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ-β）の放出によって免疫抑制活性を作用させている患部細胞を標的としているサプレッサーＴ細胞を誘引する能力も有する。ＴＧＦ-βは順に患部細胞の周囲に集中しているすべての免疫細胞をダウンレギュレートし、かくしてその箇所の免疫応答を抑制する。バイスタンダー抗原は自己抗原の制限部分なしに、（ｉ）それ自体自己免疫攻撃の標的ではなく、（ii）サプレッサーＴ細胞の誘引を介する必要な抑制活性を有することを含む。
本発明の研究の前には、関節炎の為の経口抗原寛容治療は、動物における人工的に誘導された関節炎様疾患（アジュバンド関節炎およびコラーゲン誘導関節炎）においてのみ試みられていた。
ヒト自己免疫関節炎とその動物（齧歯動物）モデルとの間に相関性が存在するかも知れないのにもかかわらず、経口、経腸、吸入抗原寛容は、関節炎を患うヒトにおいて試みられていなかった。さらに齧歯動物のモデルでは、コラーゲンは疾患の誘導を防止することだけが示されており、前に誘導された疾患（pre-induced disease）については全くまたは最小限の効果しか示されなかった。
関節炎とそのモデルにおけるコラーゲンの役割は、多くの出版物の対象となっており、いくつかは、齧歯動物モデルにおける疾患誘導を防止するためのコラーゲンの経口用途が記載されている。年代順にまとめた技術の概要は以下の通りである。
人工的に誘導された細胞媒介自己免疫関節炎モデルにおいて、コラーゲンは自己免疫攻撃を受ける組織であることが、Trentham D.E.ら、J.Clin.Invest.,66:1109-1117,Nov.1980によって示された。著者らは、タイプＩとタイプIIコラーゲンに対する体液性と細胞性の両方の自己免疫が、ラットにおけるアジュバント-およびコラーゲン-誘導関節炎の両方の特徴であることを示した。
Schoen,R.T.らJ.Immunol.,128:717-719,１９８２年２月、では、タイプIIコラーゲンと異なり、タイプＩコラーゲンを人工的にネイティブの脾臓細胞に結合し、正常動物に接種したものは、関節炎様疾患の誘導を防止するためには効果がないことを見いだした。
Thompson,H.S.G.らClin.Exp.Immunol.,64:581-586,1986は、可溶性タイプIIコラーゲンタンパク質（２．５または２５μｇ／ｇ体重／５日間）の予防的胃内投与の後の、ラットにおける多発性関節炎モデルの誘導に対する耐性を報告した。最小量、２．５μｇ／ｇ、はやや効果が高かった。
Nagler-Anderson,C.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:１９８６年１０月、pp.260-262は、未変性の（undenatured）可溶性タイプIIコラーゲンの予防的胃内投与（５００μｇ／マウス／６週間に１２回）は、アジュバントとコラーゲンの混合物とを用いた挑戦により、DBA/1 Lac Jマウスにおいて関節炎の誘導を抑制することを見いだした。
Myers,L.K.らJ.Immunol.,143:3976-3980，１９８９年１２月、は、タイプＩでなくタイプIIコラーゲンタンパク質の静脈内投与は、動物モデルにおいて実質的に誘導された関節炎様疾患に対する耐性を与えるかも知れないことを報告した。これに続く発表で、同じグルーブは、J.Exp.Med.,170:1999-2010，１９８９年１２月、は同じ主張の他の３つの文献：Schoenら，上記；Cremer,J.Immunol.,87:2995,1983;およびEnglert,Cell.Immunol.,87:357,1984を引用している。
この同じJ.Exp.Med.発表では、著者らは、挑戦の前にマウスへの静脈内投与において、コラーゲン誘導関節炎に対する防御を与えた、ニワトリタイプIIコラーゲンのフラグメント（アミノ酸残基１２２−１４７に対応するＣＢ１１）を同定したと述べている。
要約すると、最も関連する分野の教示は以下のものにすぎない：
−  実験は誘導動物モデルにおいてのみ行われた；
−  試験された動物は、疾患誘導を受けやすい種に制限されていた；
−  治療はすでに誘導された疾患には効果がなかった；
−  タイプＩコラーゲンの静脈内投与は治療誘導を防止する効果がなかった；
−  マウスへ静脈内投与されたひよこ（chick）タイプIIコラーゲンの１つの免疫抑制エピトープが同定された。
本発明の目的
本発明の目的は、リウマチ性関節炎と多発性軟骨炎を限定されることなく包含するヒトの自己免疫性関節炎のための治療の提供である。
本発明の別な目的は、異常免疫応答での軟骨への攻撃と、その結果として起こる生存するヒト中の部分軟骨（subchondral）の骨の変質を特に抑制することである。
本発明の付加の目的は、通常的な治療と共同される１またはそれ以上と同様、生存するヒトにおける望ましくない副作用なく、自己免疫性関節炎の臨床的な治療を提供することである。
本発明の更なる目的は、哺乳動物、特にヒト中の関節の腫脹、炎症、硬直および疼痛の１またはそれ以上のような関節炎に共同される症状を有意に減じることである。
本発明のまたさらに別な目的は、ヒトのリウマリ性関節炎の治療において有効な製薬の組成物の提供である。
本発明は、ここに添付された図面について更に述べられる：
図１は、腫脹した関節の平均値±登録での標準誤差と、コラーゲン（・）とプラシーボ（placebo）（ｏ）で治療した患者のための各月毎の追跡である。コラーゲンとプラシーボ間の有意な差（ｐ＝0.026）は変動の反復量によって示される。図２は全コラーゲンの抑制能力を示す。
図３はＣＤＰ１が１，１０及び１００μｇで試験されかつ１００μｇで著しい抑制を示す実験の結果を表す。
図４は１μｇと１０μｇでのＣＤＰ２が何らかの、特にＡＡの早期段階での抑制を誘導したことの別な実験を示す。
図５は１および１０μｇでのＣＤＰ３が抑制を誘導したことの第４の実験を示す。
要するに、１００μｇでのＣＤＰ１、１０と１μｇでのＣＤＰ２及び１と１０μｇでのＣＤＰ３は何らかの抑制を明らかに誘導した。
発明の概要
前述した目的の１つまたはそれ以上は、コラーゲンタンパク質またはそれのペプチドフラグメントまたは有効量の共力剤（synergist）を持つまたは持たない前述のもののアナログの少なくとも１種を備えた経口、経腸または吸入での投与のための製薬の組成物の提供によって、かつ有効量の前記組成物の罹患したヒトへの経口、経腸または吸入による投与を備える同様の関節炎を治療する方法の提供によって、ヒトにおける自己免疫性関節炎の治療的処置において達成される。
本発明の詳細な説明
全ての特許出願、特許およびこの明細書中に引用された参考文献はそれらの全体の中で参考によってここに合同される。不一致の場合において、現開示に包含されるその定義と解釈はこの中に説明されるであろうことが含まれる。
定義
この開示中に使用された以下のそれぞれの用語は、以下に定義する意味を持つべきである：
”治療（Treatment）”は、関節炎に包含される生体の自身の軟骨に対して異常な免疫応答の発病と発現の予防と同じく関節炎の発病と発現を予防する予防的測定の両方を含む。その用語はまた、自己免疫性関節炎の発病（例えば臨床的な証明）後の臨床的症状の軽減または消去と同様に生体の自身のコラーゲンまたは通常の軟骨への異常な（細胞及び／又は体液）免疫応答の抑制または鎮静を包含する。
”哺乳動物”は、免疫システムを有しかつ自己免疫疾患に罹り易い何らかの生体である。この用語はヒトを包含する。
”自己免疫疾患”は、哺乳動物の免疫システムの機能不全として表され、ここでその免疫システムは、その哺乳類内部の外来物質および／または自己組織または物質との間の区別する事ができず、その結果自己組織および物質を、それらが外来であるように扱い、それらに対する免疫応答をおこす。
コラーゲン蛋白質のタイプＩ、タイプII又はタイプIIIの”活性フラグメント”はコラーゲン蛋白質の部分的なアミノ酸配列の１またはそれ以上を必須的に備え、かつ経口、経腸または吸入により投与についてのコラーゲンへのＴ細胞を介した又はＴ細胞依存の免疫応答の抑制又は消去する能力を所有する何れかの合成ペプチドまたはポリペプチド構造体と特徴付けられる。この定義は、インビトロでの、例えばリンパ球増殖アッセイにおける、またはインビボ、例えば齧歯動物モデルまたはヒトにおける自己免疫応答の抑制をもたらすことがないコラーゲン蛋白質のフラグメントは除外する。
コラーゲン蛋白質のタイプＩ、タイプII又はタイプIIIの”活性アナログ（Active analogs）フラグメント”は、コラーゲン蛋白質のタイプＩ、タイプII又はタイプIIIまたはそれらのフラグメントに構造的に関連した化合物を包含する。同様に、その用語は、経口、経腸または吸入により投与についてのコラーゲンへのＴ細胞を介した又はＴ細胞依存の免疫応答の抑制又は消去する能力を所有するアルファ１（ＩまたはII）とアルファ２（Ｉ）トロポコラーゲンポリペプチド鎖またはそれのフラグメントの何れかに限定されることのない組み合わせを包含する。その用語”アナログ”はまた、関節炎の免疫応答を抑制するための実質的に等価の能力を保持しているまでの時間、１またはそれ以上のアミノ酸によってアルファ１（Ｉ、IIまたはIII）および／またはアルファ２（Ｉ）トロポコラーゲンポリペプチド鎖のアミノ酸配列とは異なる何らかのポリペプチドをも包含する。
”共力剤”は、コラーゲン蛋白質または少なくとも１種の活性フラグメントまたはそれらのアナログの投与と連係して経口、経腸または吸入により投与される時に、関節炎の臨床的及び／又は組織学的な明示の抑制の発揚または増大する物質として表される。先の文章中で使用され、かつこの明細書中のそれ以外に”と共同して”（また、合同して、もこの中に係わる）はコラーゲン蛋白質または少なくとも１種の活性フラグメントまたはそれらのアナログの投与と実質的に同時に又はその後までを意味する。当然、共同された物質の投与は、最初に使いきった投与された物質の適切な効果の時間の間隔となることによってコラーゲンの投与が先立つことなくあるいは後続することなくすべきである。それ故、共力剤はコラーゲン蛋白質またはそれの生物学的な活性ペプチドフラグメントの約２４時間以前または以後、好適には約１週間以内に通例は投与されるべきである。
”経口”投与は、経口、経腸または胃内投与を包含する。胃を迂回することのない経口投与は好ましい。
本発明は、タイプＩ、タイプIIまたはタイプIIIコラーゲンまたはそれの生物学的に活性なペプチドフラグメントの少量の経口、経腸または吸入による投与がＴ細胞を介しまたはＴ細胞依存の自己免疫の抑制、殊にヒトにおけるリウマチ性関節炎に特に有効であることの発見と確証に基づく。かくて、以下に例示した如く、本発明に教示されたように、タイプＩ、タイプIIまたはタイプIIIコラーゲンまたは活性フラグメントまたはそれらの少なくとも１種のアナログのうちの少なくとも１種の経口、経腸または吸入による投与の簡単な方法は、関節炎の進展を抑制する治療に有効である。さらに、本発明の組成物と方法は、上述した欠点を有することなく、かつ従来技術の治療または一時的鎮静化の薬剤と技法と共同される。
経口、経腸または経吸入で誘導された寛容は、経口、経腸と吸入投薬量の広い範囲にわたって投薬量に依存する。しかしながら有効な投薬量の最小値と最大値がある。当業者によって理解されるように、このことは、全蛋白質あるいは分断ペプチドフラグメントまたはアナログであるかという、投与されるコラーゲン蛋白質のタイプの機能によって、そのペプチドまたはポリペプチドの溶解性と純度と同様に、変化する特有な投薬範囲内で、関節炎の臨床的及び病理的な症状の両方の抑制が起こることを意味する。さらに、患者の年齢、性別と身体的条件、同じく別な兼用する治療では、治療のためのコラーゲン蛋白質の有効な投薬量に挙動を有するように投与される。その結果、投薬の使用と投与予定の調整および改良はこれらのファクターに基づいて決定される必要があり、かつ実験的に決定する必要があるであろう。そのような決定は、しかしながら通常的な実験以下のものが要求される。タイプIIコラーゲンとそのフラグメントは最も好ましい。
一般に、関節炎におけるヒト体内コラーゲンに対する免疫応答の抑制を達成する好適な手段は、精製された又は高度に精製された水溶性の全部のタイプＩ、タイプIIまたはタイプIIIコラーゲン蛋白質またはその生物学的に活性なペプチドフラグメントを約０．０５から約１０ｍｇ／１日の量、経口、経腸または吸入による投与である。コラーゲンまたはそれの生物学的に活性なペプチドフラグメントの投与は、単一投薬形態または複数投薬形態で達成して良い。好適には、その全体のコラーゲン蛋白質は１日あたり０．１から１ミリグラムの投薬量で投与され、かつこの投薬は殊に好適にはタイプIIコラーゲンである。上述の投薬は、他のタイプのコラーゲン、同じくそのフラグメントとアナログでも容易に行われ、現記載に照らして、かつ３マイクログラム／１日のような少量のタイプIIコラーゲン量でのラットにおける免疫抑制の事実に照らして、その好適な量は３０マイクログラム／１日であり、１日あたり３００マイクログラムの量は有効性を欠くとして高過ぎる。Z.J.Zhangら、J.Immunol. 145:2489-2493,1990。
加えて、共力剤は、上述の有効性を増強するために治療において共同させることができる。本発明において使用される共力剤の限定されない実例は、大腸菌（E.Coli）とサルモネラ菌（Salmonella）の各種サブタイプのようなグラム陰性菌の広い種類からの細菌性リポポリサッカリド（LPS,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO;Difco,Detroit,MI;BIOMOL Res.Labs.,Plymouth,PA）、リピドＡ（Lipid A,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO;ICN Biochemicals,Cleveland,OH;Polysciences,Inc.,Warrington,PA）と、ブラウンの文献（Braun,V.,Biochim.Biophys.Acta 435:335-337,1976）の開示から得ることのできるトリパルミトイル-Ｓ-グリカリルシステイニル-セリル-セリン（Ｐ3Ｃ５５）に共有結合されるペプチドのような免疫調整性（immunoregulatory）リポプロテイン、を包含する。ＬＰＳが好適であり、リピドＡが殊に好適である。リピドＡは、全体のＬＰＳ分子よりも毒性が小さいことから本発明に用いるために特に好適である。本発明で用いるＬＰＳは、グラム陰性菌から抽出し、Galanesら（Eur.J.Biochem.9:245,1969）とSkelly,R.R.,ら（Infect.Immun.23:287,1979）の方法を用いて精製することができる。
処方（formulations）
別な態様において、本発明はまた、関節炎の動物モデルの自己免疫性関節炎を抑制する有効な量のコラーゲンプロテイン全部または生物学的に活性なペプチドフラグメント（以下に開示されるような）またはアナログを備えた、関節炎に罹った哺乳動物を治療するための経口製薬処方を提供する。その処方は、1990年3月2日提出の同時継続米国特許出願第487,732号に開示されているような共力剤（本発明の寛容抗原に共同される）を、関節炎の臨床的症状を治療するのに有効な量で、任意に更に備えている。タイプＩまたはタイプIIまたはタイプIIIコラーゲン蛋白質全体またはそれの活性ペプチドフラグメントまたはアナログと共同して投与される時、共力剤は、免疫攻撃下でコラーゲン組織の付近においてサイトキンＰＧＥ（プロスタグランジン-Ｅ）とＩＬ-４（インターロイキン-４）の増加の原因となる。可溶性コラーゲン、好適にはタイプIIまたはタイプIII、最も好ましくは酸性ｐＨ（例えば０．０１Ｍ酢酸）と一緒のタイプIIを含む液体水性処方が好適である。そのｐＨ調整薬はなんらかの製薬上許容される酸性物質とすることができ、また緩衝剤を含んでいて良い。好適なｐＨの範囲は４から５である。固体組成物はまた、０．０１Ｍ酢酸のような酸性の水性媒質で溶解した後に投与するのが好ましい。
この検討を通して、本発明の治療に従う関節炎の一様な１つの症状のなんらかの臨床的または統計学的に有意な希薄化（attenuation）は本発明の範囲内であるということが理解されるであろう。そのような症状は、関節圧痛、関節腫脹、ＡＭ硬直、握力低下、歩行力低下を含む。通常の個人において、上述した最初の３つの症状はなく、５０フィート歩行は９秒以下であり、成人の握力は２００ｍｍＨｇ以上である（年齢、性別および身体的条件の各種でのそれぞれの強度）。臨床的に有意な希薄化とは、患者により認識されるもの（圧痛または一般的な健康状態（well-being）のケースなど）及び／又は医師により認識されるもの（関節腫張のケースなど）を意味する。例えば、関節炎の関節に一様な腫脹または圧痛の認識の相違は有意差がある。それらのパラメータのために、５０フィート歩行のケースでの１秒、または握力のケースでの５ｍｍＨｇ、ＡＭ硬直の１５分の差は有意であるとして測定され得る。
加えて、細胞毒性薬または他の抗炎症薬の投与からの抑制能力もまた有意である。即ち、たとえ患者が改善されなくとも、彼／彼女がもし細胞毒性薬及び／又は抗炎症薬投与を再開する必要が無いならば有意な恩恵を亨受されているとさらに思うし、またその患者はこれらの通常薬剤とともに同一な状態または進展する疾患段階が保たれる。
本発明による経口、経腸または吸入の各組成物は、当該分野で周知であるような製薬上許容される媒質、希釈剤、充填剤、可溶化または乳化剤および塩類を包含する不活性な成分を任意に含んで良い。例えば錠剤は当該分野で周知の固体媒質を用いて通常の作製法に従って組成物として良い。本発明において用いられるカプセルは、ゼラチン、またはセルロース誘導体のようななんらかの製薬上許容される材料から作製して良い。徐放性経口デリバリーシステム（sustained release oral delivery systems）及び／又は経口投与投薬形態のための腸溶性コーティング（enteric coatings）は、例えば1985年12月3日付で発行された米国特許第4,556,552号；1982年1月5日付で発行された米国特許第4,309,404号；及び1982年1月5日付で発行された米国特許第4,309,406号のそれらに記載された事項が考慮される。
固体媒質の実例は、デンプン、糖、ベントナイト、シリカ及び他の慣用される媒質が包含される。本発明の組成物において使用して良い媒質と希釈剤の更なる非限定的な実例は、塩類溶液、シロップ、デキストロースおよび水を含む。
必要とされる有効量が投薬ユニット（カプセルまたは錠剤またはそれらの組み合わせのような）の複数の投与によって到達可能であることから、活性な成分、それ自身の有効量中で必要でない各投薬形態の個別投薬量が含まれる、コラーゲンの全体またはそれの活性フラグメントまたはアナログのユニット含有量は判断されるであろう。有効な投薬量の投与は単一投薬形態または複数投薬形態として良く、またそれは退化マトリックス（degradable matrix）またはレザバー（reservoir）のような腸溶性コーティング及び／又は徐放性メカニズムとともに提供して良い。
コラーゲン蛋白質の全体またはそれの生物学的に活性なペプチドフラグメントが経口または経腸で導入される場合、それらを別な摂取可能な形態とともに混合しかつ固体、半固体溶液、懸濁液、または乳化形態中に存在させても良い。それにはまた、製薬上許容される媒質、フレーバー増強剤、水、懸濁化剤、および乳化剤を共同し又は代替的に混合して良い。
共力剤、例えば、タイプＩ、タイプIIまたはタイプIIIコラーゲンの全体またはそれの活性フラグメントまたはアナログと共同して投与して良い、ＬＰＳまたはリピドＡ、の共力剤の量は、１日あたり約０．０１から１００ｍｇの範囲内とされ、かつ１日あたり０．１ｍｇから１０ｍｇの間が好ましい。
本発明の代替される好適な実施態様において、本発明での製薬組成物または投薬形態は、吸入、好ましくはエアゾール形態によって関節炎に罹患したヒトに対して投与することも可能である。投与の吸入モードは、好ましくは鼻粘膜を透過せずに気管支及び肺粘膜を通る。本発明のコラーゲン全体またはそれの活性フラグメントまたはアナログのより低い量は、1989年12月20日付提出の同時継続の米国特許出願第454,486号に記載されたようなコラーゲンとともにアジュバント関節炎（aduvant arthritis）で処置する時に見出されているような関節炎治療のためのエアゾール投与を用いることが望ましいだろうことが予期される。エアゾール投薬形態において投与しても良い本発明のコラーゲン全体またはそれの活性フラグメントまたはアナログの量は、１日あたり約０．０１ｍｇから約５ｍｇの間（好ましくは１日あたり０．０１から０．５ｍｇ）とされ、かつ１日あたり約０．０１から約１００ｍｇの間の範囲の量の共力剤を任意に含めて良く、かつ単一投薬形態または複数投薬形態で投与して良い。投与されるべき正確な量は患者の病気の状態と重さ及び患者の身体的条件とによって変更して良い。
本発明のエアゾール製薬組成物は、任意な成分として、製薬上許容される媒質、希釈剤、可溶化剤と乳化剤、及び当該分野で周知であるタイプの塩類を包含して良い。そのような物質の限定されない実例は、生理的に緩衝化した塩類溶液、及び水のような通常の塩溶液を包含する。
本発明のこの代替される実施態様によるコラーゲン全体またはそれの活性フラグメントまたはアナログの投与のルートは、エアゾールまたは吸入形態である。共力剤を持つ又は持たないコラーゲン全体またはそれの活性フラグメントは、乾燥粉末粒子または好適にはキャリアガス（例えば空気またはＮ2）中に懸濁した霧化された水溶液として投与することができる。好適なエアゾール製薬組成物は、例えば、本発明によるコラーゲン全体またはそれの活性フラグメントまたはアナログを約０．０１ミリグラムから約５（好適には約０．５まで）ミリグラムの間で含んでいる生理的に許容される緩衝化された塩溶液を備えて良い。
液体中に溶解または懸濁されていないコラーゲン全体またはその生物学的に活性なペプチドフラグメントの固体粒子を細かく分散した形態のドライエアゾール（dry aerosol）は、本発明の実践においてまた有用である。コラーゲン全体またはそれの活性フラグメントまたはアナログは、散布される粉末の形態において１から５ミクロン、好ましくは２から３ミクロンの平均粒径を有する細かく分散された粒子を含んでいて良い。細かく分散された粒子は、当該分野で周知の技法を用いた粉末化とスクリーンろ過によって調製して良い。その粒子は、粉末の形態とすることができる、細かく分散された材料の予定された量を吸入することによって投与して良い。
本発明のエアゾール製薬組成物において有用である媒質及び／又は希釈剤の特有な限定されない実例は、水と、ｐＨ７．０−８．０のリン酸塩緩衝溶液のような生理学的に許容される緩衝塩溶液とを包含する。本発明のエアゾール製薬組成物または投薬形態において使用される適当な媒質または希釈剤の任意な限定されない実例は、1987年4月21日付で発行された米国特許第4,659,696号；1989年9月5日付で発行された同第4,863,720号；及び1987年10月6日付で発行された同第4,698,332号中に開示されている。
本発明の製薬組成物は、例えば、1986年11月25日付で発行された米国特許第4,624,251号；1972年11月21日付発行の同第3,703,173号；1971年2月9日付発行の同第3,561,444号及び1971年1月13日発行の同第4,635,627号中に開示されたようなネブライザーを用いたエアゾールスプレーの形態において投与して良い。そのエアゾール材料は治療されるべき患者によって吸入される。Newman,S.P.in Aerosols and the Lung、Clarke,S.W.とDavia,D.,eds.,pp.197-224,Butterworths,London,England,1984、中に開示されたような加圧計量投薬吸入器（pressurized metered dose inhaler;MDI）と乾燥粉末吸入器（dry powder inhaler）のような他のエアゾールデリバリーシステムが、本発明を実践する際に用いることができる。
ここに開示されたタイプのエアゾールデリバリーシステムは、Fisons Corporation(Bedford,MA)、Schering Corp.(Kenilworth,NJ）及びAmerican Pharmoseal Co.（Valencia,CA）を含む各種市販品が用いられる。
本発明ではまた、経口投与した時に動物モデルにおける関節炎の抑制を誘発する、タイプIIコラーゲン蛋白質の生物学的に活性なペプチドフラグメントを発見している。これらのペプチドフラグメントの大部分は本発明以前には記載され又は示唆されておらず、かつ以前の経口寛容剤として使用されたものはない。経口寛容活性をもつペプチドの経口、経腸又は吸入による投与は、コラーゲン蛋白質の自己免疫応答を誘導する部分に対する哺乳動物の感作の危険の無い完全なコラーゲン蛋白質の投与よりも、より好都合であり及び／又は自己免疫抑制を引出すことにおいて特異的であることが予見される。任意な免疫抑制ペプチドは、本明細書、特許請求の範囲および図面に照して通例の実験によって検証することができる。
リウマチ性関節炎に罹患したヒトからのＴ細胞は、例えば末梢の血液と分離されかつクローン化が可能なＣＤ8+タイプのＴ細胞、から収集することができる。コラーゲン全体に応答するＴＧＦ-βを分泌するそれらのＣＤ8+Ｔ細胞は、分離され、クローン化され、かつコラーゲンペプチドフラグメントによって（その存在中）刺激された時、ＴＧＦ-βを分泌するそれらの能力のための試験をするインビトロアッセイに用いる。これら細胞のＴＧＦ-β分泌の能力は、例えばコラーゲン全体の存在中、例えばトランスウェルシステム（transwell system）中、のＣＤ4+コラーゲン-反応Ｔ細胞の増殖の抑制のモニタリングによって評価することができる。ＴＧＦ-βを分泌するＣＤ8+Ｔ細胞を刺激するコラーゲン ペプチドフラグメントは経口的に免疫寛容を生じるであろう。そのような実験が、1992年2月28日付で提出された米国特許出願第843,752号中に開示されている。ヒトのＴ細胞の分離とクローン化のための方法は、1990年3月30日付で提出された米国特許出願第502,559号とAllegretta,M.ら,Science ２４７:718-721,1990中に開示されている。
以下は、その範囲を限定することなく本発明を説明することを意図した実施例である。
実施例
下記に示す３つの研究のために、患者の関節炎の状態を、主観的な痛み、全体の解剖学的な観察、身体的動作の時間測定、および患者によって記述された主観的な健康状態といった、異なる数種の基準を用いて測定した。全体の解剖学的な観察は、ＡＭ硬直（ＡＭ stiffness）、握力、および腫張した関節の数を含み、医師による月々の試験において行った。この試験はタイプＩコラーゲン治療前および治療中の、関節炎を生じている関節について行い、同じ関節の治療前の状態と比較した。
主観的な痛みを測定した月々のデータは、医師が、関節炎を生じている関節のそれぞれに対して、順次静かに圧力を加え、患者に痛みを感じたかどうかを知らせてもらうことによって得た。
朝方の硬直（morning stiffness)のデータは、患者の経験と、関節が身体的に柔軟になるのにどれくらいの時間がかかったかの報告に基づいて得た。また、それぞれの手の握力は、２０ｍｍＨｇに膨らませたカフ（cuff）を備えた標準水銀血圧計を用いて、毎月測定した。最後に、各患者に対して、５０フィート歩くのに何秒必要であったかを時間計測した。
総合的な評価（Ｐ＝劣る、Ｆ＝まあまあ、Ｇ＝良い、ＶＧ＝たいへん良い、およびＶＰ＝たいへん劣る）は、看護をしている医師によって、主観的になされたものである。経過も同様に主観的に評価した（Ｂ＝良い、Ｗ＝悪い、ＭＢ＝やや良い、ＭＷ＝やや悪い、Ｓ＝同じ）。
ＮＳＡＩＤは「非ステロイド性抗炎症剤」を表し、ＲＦは「リウマチ性因子」を表し、ＥＳＲは「血沈速度」を表し、ＨＣＴは「ヘマトクリット値」を表し、ｂｉｄは「１日に２回」を表し、ｑｉｄおよびｑｄは「１日につき」を表し、ＩＡは「関節内」を表す。
全タイプIIひよこ（chick）コラーゲンタンパク質の１日の服用量は、治療の第１月めが０．１ミリグラムで、その後の各月は０．５ミリグラムとした。
実施例１：
水溶性の精製された全ひよこタイプIIコラーゲンタンパク質を、発売元から得た（Genzyme,Boston,MA）；あるいはトレンサム，ディー．等による手法（Trentham,D.et al.,J.Exp.Med.146:857,1977）に従って精製した。関節炎に苦しむ患者ＬＳ、ＭＦ、ＮＳおよびＣＯに、０．０１Ｍの酢酸に０．１または０．５ｍｇ／ｍｌのコラーゲンを溶解した全タイプIIコラーゲンタンパク質溶液を投与した。患者は、毎日空腹時に、治療の第１月めが０．１ミリグラムで、その後の月はすべて０．５ミリグラムに相当する、前もって決められた量を服用するように指示された。患者のほとんどは、前もって決められた量のタイプIIコラーゲンタンパク質をオレンジジュースに加えて溶解性を保ち、すぐに（shortly）その混合物を飲んだ。
患者が大幅な改善を報告したならば（そして医師が同意したならば）、コラーゲン治療は３カ月後に中止した。しかしながら、患者が関節炎の再発を報告した場合は、その後タイプIIコラーゲン治療を再び続けた。上記患者のそれぞれについて集められた月々のデータを、表１〜４に要約して示す。
表１は、患者１、ＬＳ、３０歳女性の、関節炎の病状を測定して集められたデータの要約である。この研究の間、従来のオーラノフィンの薬剤治療は中止した。コラーゲン治療の第２月めに関節炎の驚くべき回復がみられたため、さらなる治療は中止した、コラーゲン治療開始後８および９カ月め（during months 8 and 9）に、フェルデン（ピロキシカム）（Feldene(piroxicam)）が投与された。
全タイプIIコラーゲンタンパク質を用いた治療の第１月めの後、大幅な改善が観察された。完全な回復は、治療の第２月めに観察されたが、握力試験においては依然としていくらかの弱さがみられた。この筋肉の弱さは、関節炎による関節の痛みから、長い間筋肉を使わず、筋肉が萎縮したことによって起こり得るものである。治療の第３カ月めには、右手の関節の１つが依然として腫張しており、関節炎が残っているのが観察された。この関節炎は、わずかな圧力にも敏感で、朝方の硬直の根源であり、右手の握りの弱さの理由となっていた。しかしながら、左手の関節には、相変わらず関節炎はなく、５０フィート歩行は正常であった。
治療は３カ月半の間中止されたが、７カ月めに、患者ＬＳが両手の６つの関節に軽い関節炎の再発を体験したときから再開された。この再発による歩行動作への影響はなかった。患者は５０フィート歩行を正常時間内で行なうことができた。
治療は、１日の服用量が０．５ミリグラムの通常の状態に戻した。１カ月以内には、右手の１つの関節に依然として関節炎が残っているだけで、再び、関節炎を患った状態からの顕著な回復が観察された。握力は、再発中に観察された値から２倍にもなった。
治療はさらに１カ月続けられ、患者ＬＳは、左手に関節炎の関節を残すものの、研究中観察されたなかで、両手の握力の最高値を示した。再発に対して３カ月コラーゲン治療を行った後、さらに治療を行なうのは止めた。現在まで、患者ＬＳは、右手の１つの関節の限られた症状の他には、関節炎の臨床的な症状に倒れることも、あるいは症状を表すこともなく４カ月が過ぎた。両手の握力はわずかに減った。
表２は、患者ＬＳと同様の研究に参加している女性の患者、ＭＦ（２３）の経過の要約である。従来のメトトレキサートを用いた薬剤治療は中止した。患者ＭＳは、全タイプIIコラーゲンタンパク質を１日０．１ミリグラムの服用量で１カ月間投与し、その後１日０．５ミリグラムの服用量で２カ月間投与する治療の、第１カ月めの後に、症状からの驚くべき開放を経験するのが観察された。完全な回復は、治療の第２カ月めの後に観察された。その後１１カ月の間、関節炎の再発は観察されなかった。
表３は、この研究における３人目の患者、女性、ＮＳ（５０）についてのデータを要約したものである。この研究の間、メトトレキサートを用いた薬剤治療は中止した。コラーゲンタンパク質を用いた治療の第１カ月めの間に、症状の顕著な低減が観察された。腫張した関節の数は５から１へ減り、一方、すべての圧痛のある関節は完全な回復を示した。朝方の硬直は１２０分から１５分へ減少したが、握力は、左手の握力だけがわずかな改善を示した。右手の１つの関節に腫張が残っているのが観察されたが、他の前から患っていた関節すべてにおいては完全な回復が観察された。完全な回復はコラーゲン治療の第３カ月めの間に達成され、ときどき関節炎が突発するものの、さらに治療を行なうのは止めた。
表４は、この研究の最後の参加者である患者ＣＯ（女性、４２）からのデータをまとめたものである。他の患者に比べて、より漸次に関節炎から回復するのが観察された。患っていた関節の半分は、コラーゲン治療の第１カ月めの後に、関節炎による腫張、および圧痛から回復したが、朝方の硬直、両手の握力、および５０フィート歩行にかかる時間は、だいたいにおいて病気の状態と変わらないままであった。顕著な回復は治療の第２カ月めに記録され、１つの圧痛のある関節と５０フィート歩行試験においてある種のわずかな歩行の弱さがみられるのを除いて、ほとんど完全な回復は第３カ月めに観察された。翌２カ月は、治療を中止したが、第５カ月めの間に、患者ＣＯが部分的な再発を経験的に認知したときから再開した。さらなる治療をさらに３カ月行った後、患者ＣＯもまた、関節炎から完全に回復し、現在に至っている。
0003845447.tif 000002
0003845447.tif 000003
0003845447.tif 000004
0003845447.tif 000005
実施例２
実施例１と同様の調剤量およびプロトコールを用いた。リウマチ様の関節炎に苦しむ患者ＭＬ、ＭＴ、ＲＢ、ＬＭ、ＤＨおよびＳＨに、実施例１と同様にひよこタイプIIコラーゲンを投与し、実施例１と同様にして観察した。これらのすべての患者もまた、シングルブラインド法で治療された；彼らの症状は実施例１における患者よりも悪く、彼らの平均年齢は約９歳も上であった。一人の女性の患者（ＤＨ）は、向上がみられず、旅行に不便だという理由で中止した。
表５〜１０は、全タイプＩコラーゲンタンパク質を関節炎の抑制または治療に経口投与する効果についての、第２の実施中の研究に係わる、６人の追加の個々の患者（女性５人、男性１人）に関して集められたデータを要約したものである。患者ＲＢ（表７）だけが完全な回復を経験した。２番目の患者はこの研究を中止した。その他の患者は、表１〜４に示される第１の研究に係わる患者のような、顕著な回復はまだ経験していない。関節炎からの大幅な改善はあるが、回復の速度はより漸次である。この第２の研究の効果を有効に評価するにはさらに時間が必要である。しかし第２の研究の患者はすべて、第１の研究における患者よりもかなり重い病状を有していたものである。さらに、第２の患者のグループは、第１の患者よりも、概して歳上である（歳は２３，３６，５２，５５，５５，および６５である）。それにもかかわらず、患者５および７はかなり有益な効果が得られており、患者８および１０でさえも細胞毒性の薬剤の使用を中止することができた。
0003845447.tif 000006
0003845447.tif 000007
0003845447.tif 000008
0003845447.tif 000009
0003845447.tif 000010
0003845447.tif 000011
実施例１および２の患者の追跡調査の要約
これらの公開投薬研究（open-dosing studies)において、１０人のうち６人の患者は、臨床的症状のほとんどが低減または除去されたことからわかるように、ひよこタイプIIコラーゲンの経口投与によりかなりの有益な効果を得ることができた。１０人のうち３人は、さらに治療を行なうことなく、改善された状態を保ち続けている。他の２人の患者は再発を経験したが、コラーゲン治療再開始の１カ月後には、改善された状態に回復した。第６番めの患者は、第１の３人と同様に改善しつつあるようにみえるが、追跡できなかった。７番めの患者は緩やかな改善のみを経験し、他の２人の患者は改善を経験しなかったが、依然として細胞毒性の薬剤の使用を中止することができていた。１０番めの患者は、初期症状が思わしくなく、改善がみられず、また研究センターから場所が遠いという理由でこの研究を中止した。これらの好ましい結果に基づいて、ダブルブラインド研究を試みた。
実施例３
米国リウマチ協会（American Rheumatism Association）の定義による重篤な活性関節炎（active arthritis）にかかった６０人の患者が、ダブル・ブラインド・スタディ（double blind study）に参加した。これらの患者は、免疫抑制薬は中止していたが、３カ月の試験期間中、ＮＳＡＩＤ及び／またはプレドニゾン投与（≦１０ｍｇ／日）を維持していた。患者は任意に、実施例１及び２に記載した患者と同じもしくはプラシーボのいずれかの処理を受けた。このプラシーボは、メンブラン・フィルターを通した０．１Ｍの整数倍の酢酸１．０ｍｌからなる。すべての試験は、処理の開始時と同じ試験者によって行われ、１、２及び３カ月の試験は、１日のうちの同じ時間に行った。Weinblatt,M.E.ら,N.Engl.J.Med.312:818(1985)及びSewell,K.L.ら,Arthritis Rheum.in pressに記載されたような従来からの手法を、関節炎活性を測定するために使用した。歩行時間測定のために補助的な装置が用いられた。試験の間、臨床的試験者が患者を注視し、安全なモニタリングの責任をもった。実験室安全試験は、ランダム化の直前、及びその２、４、６、８及び１２週間後に行った。
完全な血液カウント、ディフェレンシャル（differential）及び血小板カウント、肝臓及び腎臓機能試験、プロトロンビン及び部分的トロンボプラスチン時間、尿分析、及びＥＳＲを測定した。ＨＬＡ類別は、Kammer,G.M.及びTrentham,D.E.Artiritis Rheum.,27:489(1984)に記載されたように、対立因子Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ／Ｑｌｏｃｉに対して行った。血清ＩｇＭリウマチ性因子（rheumatoid factor）力価は比濁法によって、タイプIIコラーゲンに対するＩｇＧ抗体力価は（Helfgott,S.M.ら,Lancet 337:387(1991)に記載されたように）ＥＬＩＳＡによって、コラーゲンまたはプラシーボ投与の直前及び終了時に決定した。
試験の結論においては、６０人のうち５９人の患者を評価した。一人の患者は病気ではなく、４０日後に試験を中止した。この患者はコラーゲンを受けていた。他に、４人の患者には、３カ月の処理の終了に先立って、その薬物治療試験を中止した。これらの患者は、残りの試験に対して最も悪いスコアに帰しており、分析には含めた。この４人すべてはプラシーボを受けていた。表１１は、試験を開始するに当たって、統計学的臨床及び実験室的パラメーターが、両グループ間で類似していることを示す。コラーゲン処理患者及びプラシーボ処理患者の間の比較は、腫張した関節の数のような連続的な測定に対するウィルコクソン・ランク・サム（Wilcoxon rank-sum）試験、麻酔薬使用のような対生した測定に対するフィッシャー・エグザクト（Fisher exact）試験、及び、機能分類（Function Class）に対するカイ自乗トレンド（trend）試験を用いて行われた。報告したＰ-値は２-面である。２８人の患者がコラーゲンを受け、３１人の患者がプラシーボを受けた。
0003845447.tif 000012
図１及び表１２に見られるように、１、２、及び３カ月において、プラシーボ患者に比較してコラーゲングループにおける腫張した関節数は、かなり改善された（Ｐ＜０．０３）。さらに、圧痛または痛み関節、関節腫張及び圧痛係数、及び１５ｍ歩行時間は、かなり改善された（表２）。コラーゲン患者のうちの４人（１４％）は、疾患の完全な回復を得たのに対し、プラシーボグループでは皆無であった。完全な回復は、腫張または圧痛関節が無いこと、朝方の硬直または午後の疲労が無いこと、医師と患者の評価による関節炎が無いこと、機能分類Ｉの状態、及びプレドニゾン無しでも通常のＥＳＲ（＜２８分／時間）であることによって決定された。
0003845447.tif 000013
0003845447.tif 000014
表１３は、Weinblatt,M.E.ら、N.Eng.J.Med.312:818(1985);Sewell,K.L.ら,Arthritis Rheum.in press;及びSteinbrocker,O.ら,JAMA:659(1949)で定義されたさらなる測定による患者の状態を示す。コラーゲン受容グループでは、免疫抑制の改善の安定化が生じたのに対し、プラシーボ受容患者では時間とともに悪化する傾向があった。医師と患者により全体の検定が実施されたとき、この傾向が現れた（Ｐ＜０．０５）。ワインブラット（Weinblatt）ら及びセウェル（Sewell）らに定義された状態の悪化は、プラシーボグループでは１１人の患者（３５％）に生じたが、コラーゲン処理患者では２人（７％）であった（Ｐ＜０．０１）（表１３）。痛みの制御のための鎮痛薬は、臨床実験者によって処方された。プラシーボを受けた１２人の患者（３９％）は、麻酔薬を必要としたが、コラーゲンを受けている患者は４人（１４％）であった（Ｐ＜０．０４）（表１３）。
0003845447.tif 000015
0003845447.tif 000016
一方、試験を中止した４人のプラシーボ患者の影響を減じるための分析においても、コラーゲン処理からは同様なかなりの（Ｐ≦０．０５）改善が見られた。
他の関節炎試験で見られるものに似たプラシーボ効果が観察された。Williams,H.T.ら,Arthritis Rheum 31:702(1988)。プラシーボグループで機能分類Ｉのランクに達したのは４人の患者（１３％）であった。しかし、コラーゲン処理患者での相対的改善は有意なものであった。
有意な副作用や変化は観察されなかった。タイプIIコラーゲンに対する抗体の存在、ＨＬＡハプロタイプや性別を含むいかなる基本特性もコラーゲンに対する応答性に関連していない。コラーゲングループのすべての患者は、３カ月後にコラーゲンを中止した。
この制御された試験は、少量の可溶化した天然異種のタイプIIコラーゲンの経口投与が、活性ＲＡの臨床的顕現を改善し、それが安全であるという証拠を提供する。６４％のコラーゲン処理患者が免疫抑制薬（通常はメトトレキサートまたは６-メルカプトプリン）を受け、コラーゲン処理でさらなる改善が生ずる一方、
基本の値が獲得されているので、経口コラーゲンは、免疫抑制治療と比較して同等またはそれ以上に有効である。さらに重要なことには、経口コラーゲンは毒性を持たないために好ましい治療法である。疾患の激化または経口抗原に対するアレルギーが、理論的には進行するかもしれないが、これらの実験及び動物実験では観察されなかった。
パイロット（pilot）研究の４人の患者で、改善が見られたが治療の中止後約３カ月にぶり返したものは、コラーゲンの再開の恩恵を受けた。動物では、経口寛容の防御効果が、抗原供餌の中止後２または３カ月に結局現れた。経口トララーゲン（toleragen）の中止後の疾患の再発は、多発性硬化症及びブドウ膜炎患者に生じた。従って、経口寛容の臨床的効果を維持するには、さらなる投与が必要であることが明らかになった。
これらの実験は、経口コラーゲンの臨床的有効性を示している。疾患の長期間の制御のための最適投与量及びレジメント（regiments）は、熟練した実施者によりよく知られた技術に従って決定される。
実施例４：コラーゲン由来ペプチド
周知の技術を用いてイン・ハウス（in-house）で合成したコラーゲン由来ペプチドは、特に（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）からの）ペプチド合成装置を用い、供給者の装置に引き継いだ。このペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する。
１．ＮＨ2-Ｇ-Ｐ-Ｒ-Ｇ-Ｐ-ＨＰ-Ｇ-Ｐ-ＨＰ-Ｇ-Ｐ-Ａ-Ｇ-Ｌ-ＨＰ-Ｇ-Ｐ-Ｓ-Ｇ-Ｅ-ＨＰ-Ｇ-Ｐ-Ｋ-ＣＯＯＨ
２．ＮＨ2-Ｇ-Ｅ-ＨＰ-Ｇ-Ａ-ＨＰ-Ｇ-Ｐ-Ａ-Ｇ-Ｐ-ＨＰ-Ｇ-Ｅ-ＨＰ-Ｇ-Ａ-ＨＰ-Ｇ-Ｐ-Ａ-Ｇ-Ｐ-ＨＰ-Ｇ-ＣＯＯＨ
３．ＮＨ2-Ｇ-Ｅ-Ｅ-Ｇ-Ｌ-Ｒ-Ｇ-Ａ-Ｒ-Ｇ-Ｅ-ＨＰ-Ｇ-Ｅ-Ｒ-Ｇ-Ｐ-ＨＰ-Ｇ-Ｐ-Ｑ-Ｇ-Ａ-Ｒ-ＣＯＯＨ
上記には、標準的な一文字略語を用い、ＨＰはヒドロキシプロリンを表している。
前記のペプチド１−３は、以下のように設計された。
ヒトのタイプIIコラーゲンのアミノ酸配列を、繰り返す傾向にある（一致または保存的置換を有する）アミノ酸トリプレットに分けた。トリプレットを生ずる周期は、バイスタンダー抑制（Bystander Suppression）の概念（米国特許出願番号８４３，７５２）と一致する免疫抑制Ｔ細胞エピトープの形成に類似していると仮定した。ペプチドの長さは、ＭＨＣクレフト（creft）に制限されたクラスＩは９アミノ酸長さであり、ＭＨＣクレフトに制限されたクラスIIは１５アミノ酸長さであるという事実に基づいている。次いで、トリプレットが生ずる周期が選択され、それらを含むペプチドが合成され試験された。ヒドロキシプロリンは、合成の便宜のためプロリンに置換された。
他の第４番目のペプチドも合成した。このペプチドは、Myers,L.K.ら,J.Exp.Med.,1989,同上、に開示され、次の配列を有している。
４．Ｈ2Ｎ-Ｐ-Ｔ-Ｇ-Ｐ-Ｌ-Ｇ-Ｐ-Ｋ-Ｇ-Ｑ-Ｔ-Ｇ-Ｅ-Ｌ-Ｇ-Ｉ-Ａ-Ｇ-Ｆ-Ｋ-Ｇ-Ｅ-Ｑ-Ｇ-Ｐ-Ｋ-ＣＯＯＨ
上記のペプチドは、以下のようにして寛容活性が試験された（ペプチド１−３はＣＤＰ１−ＣＤＰ３と記し、ペプチド４はＣＢ１１Ｐと記す）。
ルイスラットに、１、１０、１００マイクログラムの特別なペプチドまたは可溶性ニワトリタイプIIコラーゲンを種々に供餌した。天然の対照動物には、同量のＪＧＢバッファー（１２７ｍＭ二塩基性硫酸カリウム、１８．４ｍＭ一塩基性硫酸カリウム、ｐＨは７．６に調整）を供餌した。
ペプチド、コラーゲン、またはバッファーの供餌は、１０ｍｇ／ｍｌのヒト結核菌を含む０．１ｍｌの完全フロイントアジュバントの対抗によるアジュバント関節炎（ＡＡ）の誘発に先立って、７、５、及び２日前に行った。関節炎の重篤度は、標準的な方法論（Trentham,D.E.ら,1977,同上）に従い、４つの膝の観察によって、以下の尺度で等級づけて評価した。０＝通常、１＝発赤のみ、２＝発赤と腫張、３＝重度の腫張、４＝関節奇形。全関節炎スコアは、各膝のスコアの合計とした。最大関節炎スコアは、疾患の進行に渡って、一匹の動物での最高スコアである。この等級づけ方法によると、可能な最大のスコアは１６（４つの膝×１つの膝当たり４スコア）である。
結果を図２−５に要約した。
図２は、全コラーゲンの抑制能力を示す。
図３は、ＣＤＰ１を１、１０、及び１００μｇで試験した実験結果を示し、１００μｇでの顕著な抑制を表している。
図４は、他の実験での１μｇ及び１０μｇのＣＤＰ２が、特にＡＡの初期において幾分かの抑制を誘発したことを示す。
図５は、第４の実験での１及び１０μｇのＣＤＰ３が、抑制を誘発したことを示す。
要約すれば、１００μｇのＣＤＰ１、１０及び１μｇのＣＤＰ２、１及び１０μｇのＣＤＰ３は、明らかに抑制を誘発した。
また一般に、ペプチド供餌ラットのＡＡ初期には抑制がみられ、あるペプチド及び投与量に対して、疾患の重篤度はより早く”ピーク”となり、即ち緩和される。
この実験の技術的課題は、バッファー供餌ラットが、多くの技術的要因により重い疾患にかからないことである。それにもかかわらず、ＣIIを必要としない抑制が見られた。
下記の表１４は、各ペプチドの最適な投与量、即ち、１００μｇのＣＤＰ１、１μｇのＣＤＰ２、及び１μｇのＣＤＰ３が用いられた同種の実験において、関節炎スコアで表した結果を示す。ミヤー（Myers）らのペプチドのＣＢ１１も１０μｇで試験した。
0003845447.tif 000017
この実験は、ＣＤＰ２及びＣＢ１１が、アジュバント関節炎の抑制からみて最良に実施されたことを示している。ＣＤＰ１は、この実験では顕著な抑制を示さなかったが、おそらく技術的要因であろう。ＣＤＰ２及びＣＤＰ３は、有意な抑制を示した。全てのタイプIIコラーゲンが、予想した程の抑制を再び示さなかったのは、おそらく技術的要因であろう。それにもかかわらず、有意な抑制が３種のペプチドで示された（関節炎スコアで２またはそれ以上の点を有意とした）。
付録Ａ
0003845447.tif 000018
0003845447.tif 000019
0003845447.tif 000020
0003845447.tif 000021
0003845447.tif 000022
0003845447.tif 000023
0003845447.tif 000024
【図１】
0003845447.tif 000025
【図２】
0003845447.tif 000026
【図３】
0003845447.tif 000027
【図４】
0003845447.tif 000028
【図５】
0003845447.tif 000029