(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
藍藻類または紅藻類から選択される光合成藻類を、５〜４００Gの磁場中で光照射して培養し、フィコビリ蛋白質および／または脂肪酸を生産させることを特徴とする光合成藻類によるフィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の生産方法。
【請求項２】
前記光合成藻類が藍藻類のスピルリナ(Spirulina)であることを特徴とする請求項１の光合成藻類によるフィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の生産方法。
【請求項３】
前記光照射と前記磁場の印加を同期させることを特徴とする請求項１または２の光合成藻類によるフィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の生産方法。
【請求項４】
前記光の照度が８００〜８０００luxであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかの光合成藻類によるフィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の生産方法。
【請求項５】
前記フィコビリ蛋白質がフィコシアニンであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかの光合成藻類によるフィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の生産方法。
【請求項６】
前記脂肪酸がγ−リノレン酸であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかの光合成藻類によるフィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の生産方法。
【請求項７】
磁場印加により、前記光合成藻類の藻体そのものの生育量を増大させるとともに、前記藻体からの前記フィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の収量を増大させることを特徴とする請求項１〜６のいずれかの光合成藻類によるフィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は光合成藻類によるフィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
食品あるいは化粧品などの着色等に使用される青色蛋白質であるフィコシアニンのようなフィコビリ蛋白質、あるいはコレステロール上昇抑制やアトピー性皮膚炎の治療に有効であるプログラスタンジン前駆体であるγ−リノレン酸に代表される脂肪酸などの有用物質生産の方法として藻類を培養して抽出することが行われている。また、クロレラやスピルリナなど一部の藻類では菌体そのものを健康食品として食しており、市販もされている。これらは、通常液体培養液中で自然光下で培養されているが、光合成経路に着目して直接または間接的に光合成に関与する有用物質生産の加速を試みた例はない。
【０００３】
一方、生物に対する磁場の影響については、多数の研究例が報告されているが、明確な作用はわかっていない。例えばTrichomonas vaginalsに対する殺菌作用、マウスの癌の抑制作用があり、特に骨折の治療促進では実際に臨床において重要な役割を果たしている。
【０００４】
また、磁場の強さによって、また対象生物の種類によって成長を促進したり、抑制したりすることが知られている。例えば、特開平６−１２１６６８号公報には、磁場中で微細生物を培養する方法が開示されており、磁場の印加により枯草菌によるサーファクチンの生産効率が向上すること、および大腸菌の増殖が加速されることが示されている。また、菌類であるS. cerevisiae に対する５００G 〜１０００G の磁場では生育促進効果が得られ、それ以上の強い磁場では抑制効果があることも報告されている［高橋不二雄「磁気と生物  分子レベルからのアプローチ」（学会出版センター）］。
【０００５】
緑藻類であるChlorella sp. では４００G 以下の磁場において生育がやや促進され、５８０G では抑制されている［高橋不二雄、亀崎紀行、発酵工学、vol. 63, No. 1,71-74(1985)］。Dunaliella salina の生育はＦｅ−ＥＤＴＡを添加した培地において１００G の磁場印加によって増加し、β−カロチン蓄積量も増加する傾向があることが報告されている［Y. Yamaoka, O. Takimura, et al., "Research in photosynthesis" Vol. III. 87-90(1992) ］。これは蛋白質の磁気異方性、チラコイド膜などの生体膜内中における蛋白質の磁場配向性あるいはクロロフィルの磁気異方性によるものと言われているが、正確なメカニズムは未だに不明である。
【０００６】
このように藻類等の生物を用いて有用物質の生産を促進する試みが種々なされているが、前記したフィコビリ蛋白質や脂肪酸の生産を促進した例はない。また、磁場印加により藻類自体の生育を行った例はあるが、それから得られる有用物質の生産に磁場を利用した例はない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、着色剤等として使用されるフィコシアニン等のフィコビリ蛋白質やプログラスタンジン前駆体であるγ−リノレン酸に代表される脂肪酸の生産を促進することができる光合成藻類によるフィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の生産方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
このような目的は、下記（１）〜（７）の特定事項によって達成される。
（１）藍藻類または紅藻類から選択される光合成藻類を、５〜４００Gの磁場中で光照射して培養し、フィコビリ蛋白質および／または脂肪酸を生産させることを特徴とする光合成藻類によるフィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の生産方法。
（２）前記光合成藻類が藍藻類のスピルリナ(Spirulina)であることを特徴とする上記（１）の光合成藻類によるフィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の生産方法。
（３）前記光照射と前記磁場の印加を同期させることを特徴とする上記（１）または（２）の光合成藻類によるフィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の生産方法。
（４）前記光の照度が８００〜８０００luxであることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかの光合成藻類によるフィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の生産方法。
（５）前記フィコビリ蛋白質がフィコシアニンであることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかの光合成藻類によるフィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の生産方法。
（６）前記脂肪酸がγ−リノレン酸であることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかの光合成藻類によるフィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の生産方法。
（７）磁場印加により、前記光合成藻類の藻体そのものの生育量を増大させるとともに、前記藻体からの前記フィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の生産量を増大させることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかの光合成藻類によるフィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の生産方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１０】
本発明では、磁場中で光照射して光合成藻類である藍藻類、紅藻類、クリプト藻類を培養する。これにより、これらの光合成藻類によって生産されるフィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の生産量が向上する。
【００１１】
これについての理由は明確ではないが、フィコシアニン等のフィコビリ蛋白質はクロロプラスト内のチラコイド膜上にあり、光を受けてそのエネルギーをクロロフィルａに伝える働きがある。このチラコイド膜は脂肪酸、特に多不飽和脂肪酸を多く含み、きわめて流動性に富んでいる。したがって磁場により配向性が影響を受け、フィコシアニン等のフィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の含有量が増加すると考えられる。そして、この結果、光の利用効率が増加するために生育量が増し、光合成活性が増すと考えられる。
【００１２】
本発明に用いられる光合成藻類としては、藍藻類、紅藻類、クリプト藻類が挙げられ、これらの藻類はフィコシアニン、フィコエリトリンのようなフィコビリ蛋白質および／または脂肪酸を含む。
【００１３】
藍藻類としてはスピルリナ (Spirulina)、特にスピルリナ  プラテンシス(Spirulina platensis) 、アナベナ(Anabena) 、ノストック(Nostoc)、フィルミディウム(Phormidium)、トリポセリックス(Tolypotherix)、ユレモ(Oscillatoria)、ジュズモ(Chaetomorpha)等がある。
【００１４】
紅藻類としてはコラリナ(Corallina) 、ポリフィリジウム(Porphyridium)、ツノマタ(Chondrus)、アサクサノリ(Porphyra tenera) 、テングサ(Celidium)等がある。
【００１５】
これらのなかでも、藍藻類のスピルリナが好ましい。このものは、もともとフィコビリ蛋白質であるフィコシアニンの含有量が多く、通常の光合成条件下で、乾燥重量で１g 中１００mg程度含有する。このほか、藍藻類のアナベナで５０mg程度、ノストックで６０mg程度であり、紅藻類のコラリナで１mg程度である。紅藻類は紅色の色素蛋白質であるフィコエリトリンを主として含む。
【００１６】
これら光合成藻類は一般的にフィコビリ蛋白質を０〜２２０mg/gを含み、フィコシアニンの含有量は０〜２００mg/g、フィコエリトリンの含有量は０〜１００mg/gである。
【００１７】
また、脂肪酸はＣ16〜Ｃ18の飽和ないし不飽和脂肪酸であり、具体的にはパルミチン酸、パルミトレン酸、ステアリン酸、オレイン酸（シスおよびトランス）、リノール酸、γ−リノレイン酸等が挙げられる。
【００１８】
脂肪酸の含有量は通常３０〜８０mg/g程度であり、このなかでγ−リノレインの含有量は０〜１５mg/g程度である。
【００１９】
本発明では、光合成藻類の培養に際し、光照射を磁場中で行う。この場合光照射と同時に磁場を印加することが好ましく、光照射と磁場の印加は同期させることが特に好ましい。ただし、必ずしも光照射の時期と磁場の印加の時期とは一致させる必要がなく、光照射の一時期に磁場を印加してもよいが、少なくとも光照射の時期の６０％以上は磁場を印加することが好ましい。磁場の印加を光照射の一時期にて行う場合は、連続的であっても間欠的であってもよい。一時期にて磁場を印加する場合は光照射の初期である方が好ましい。
【００２０】
印加する磁場の強度は２〜７００G 、さらには５〜７００G 、よりさらには５〜６００G 、特には５〜４００G であることが好ましい。このような磁場を印加することによって、フィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の生産量が増加する。これに対し、磁場の強度が小さくなると、本発明の実効が得られず、磁場の強度が大きくなっても効果が飽和してしまう傾向にあり、フィコビリ蛋白質、脂肪酸ともに生産量の増加が望めなくなってしまい、特にフィコシアニン等のフィコビリ蛋白質の生産量は逆に低下しやすくなる。
【００２１】
特に、本発明では、有用物質として期待されるフィコシアニンやγ−リノレン酸の生産量を増すことを目的とする場合は、５〜４００G であることが好ましい。
【００２２】
磁場の印加中における磁場の強度は一定であっても変化させてもよいが、通常は一定である。
【００２３】
磁場はフェライト磁石、サマリウム−コバルトあるいはネオジ−鉄−ボロンなどの希土類磁石などの永久磁石、あるいは電磁石による静磁場でもよく、電磁石による交番磁場でもよい。
【００２４】
なお、光合成藻類は固定状態でない培養が一般的であるので、静磁場を用いたとしても個々の細胞には交番磁場が印加されているものと考えられる。
【００２５】
光照射は、本発明の光合成藻類が光合成を行えるような条件であれば特に制限されないが、光合成を促進するためには６００〜７００nmの波長領域の光を用いることが好ましい。具体的には蛍光灯、タングステンランプなど通常の光源でよく、６６０nm前後の発振波長を有する発光ダイオード（ＬＥＤ）を光源としても効果的である。
【００２６】
光の照度は印加する磁場の強度等の他の条件にもよるが、８００〜８０００lux であることが好ましく、さらには８００〜５０００lux であることが好ましい。
【００２７】
このような照度とすることで、フィコビリ蛋白質および脂肪酸の生産量が増加しやすい。これに対し照度が低くなると光合成の進行が阻害されやすく、照度が高くなると光合成の進行が促進されすぎて磁場の有効利用が図れなくなってしまう。
【００２８】
本発明では、所定波長域で一定照度の光を照射することが好ましいので、上述のような光源を用いて光照射することが好ましいが、場合によっては太陽光、特に昼光を用いてもよい。ただし、太陽光は光合成を抑制するような波長の光を含むこと、一定照度等の光照射条件の制御が困難であることなどを考えると、その使用はあまり望ましくない。
【００２９】
本発明における培養は通気下で公知の方法によって行えばよく、少なくとも一部分に磁場の印加を可能にした公知の培養装置を用いて行えばよい。このような培養装置は、例えば、西澤一俊、千原光雄「藻類研究法」共立出版（１９９２）、山口勝己「微細藻類の利用」日本水産学会（１９９２）等に記載されている。
【００３０】
上記のような条件で培養することによって、スピルリナの場合には、一般的にフィコビリ蛋白質の生産量は１０〜８０％増加し、その含有量は乾燥重量１g 当たり１１０〜１８０mgとなる。また、脂肪酸はその組成に変化はないが、その生産量は全体で５〜５０％増加し、その含有量は４８〜７０mg/gとなる。
【００３１】
特に５〜４００G の磁場の印加によって、スピルリナの場合、フィコシアニンの生産量は４０〜８０％増加し、その含有量は１４０〜１８０mg/gとなる。またγ−リノレイン酸の生産量は１０〜５０％増加し、その含有量は５０〜７０mg/gとなる。
【００３２】
これらの有用物質を取り出すには、光合成藻類を破砕後、通常の方法によって抽出すればよい。したがって既存の設備等をそのまま利用できるので、新たな設備等を必要としない。このような抽出方法等については、西澤一俊、千原光雄「藻類研究法」共立出版（１９９２）等に記載されている。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。
【００３４】
実施例１
藻類の一種、Spirulina platensis IAMM-135（東京大学分子細胞生物学研究所から供与）５mg（湿重量）を使用し、３０mm径２００mm長さの試験管中、温度２４±２度、蛍光灯により照度１２００±１００lux の光照射下で、４８０時間通気培養を行った。培養液は表１に示す組成のＳＯＴ培地を用いた。永久磁石は縦１５cm、横３cm、厚さ１cmの大きさで、試験管の両側からＮ極とＳ極を向かい合わせて装着した。試験管側面にて１００G 、３５０G 、４００G および７００G になるように設置した。
【００３５】
また永久磁石を装着しない条件で通気培養を行った。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
藻体の生育は、７５０nmにおける培養液の濁度（ＯＤ750 ）を分光光度計（島津製作所製  SHIMADZU UV-2100）で測定し、次式に従って培地１リットル当たりの藻体の乾燥重量を求めた。
【００３８】
S. platensis (ｇ培地／リットル）＝ＯＤ750 ×０．６５
【００３９】
磁場の強さと藻体の生育量の関係を図１に示す。
【００４０】
図１から、特に４００G 程度以下、とりわけ５〜４００G の磁場を印加することによって藻体の生育量が磁場を印加しない場合に比べて促進されることがわかる。
【００４１】
上記の培養条件で各々得られた藻体を用いてフィコシアニン、クロロフィルａ、β−カロチンを、以下のようにして定量し、さらに光合成活性を評価した。
【００４２】
１）フィコシアニンの定量
培養後の藻体をステンレス製ふるい１６６−メッシュ（９０μm ）を用いて集菌し、水洗後、凍結乾燥した。この乾燥試料を約５mg精秤し、０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH７．０）を５ml加え、冷暗所にて２時間放置後超音波処理（２８kHz ）を施した。さらに、硫安を２０％の飽和溶液になるように加え、冷暗所にて２時間放置した。得られた抽出液を遠心分離（４０００rpm 、１０分間）し、上澄み液を分光光度計を用いて６５０nm、６２０nm、５６５nmの吸光度Ａ650 、Ａ620 、Ａ565 から、次式（西澤一俊、千原光雄「藻類研究法」共立出版（１９９２））を用いて乾燥試料１g 中のフィコシアニン含有量を求めた。
フィコシアニン(mg/g)＝0.198A620 −0.133A650 −0.0019A565
【００４３】
２）クロロフィルａの定量
上記と同様にして得た乾燥試料を約５mg精秤し、メタノール５mlを加えて、超音波処理（２８kHz ）をした後、暗所に３０〜４０分間放置して十分に抽出させた。抽出液を遠心分離して上澄み液を分光光度計により６６５nmの吸光度Ａ665 を測定した。次式を用いて乾燥試料１g 中のクロロフィルａの含有量を求めた。
【００４４】
クロロフィルａ（μg/g ）＝１３．４Ａ665
【００４５】
３）β−カロチンの定量
β−カロチンは以下のようにして定量した。
【００４６】
市販のβ−カロチン（和光純薬製特級品）を標準物質として検量線を作成した。すなわち、上記β−カロチン１００mgを精秤し、クロロホルムに溶解して０．０１％溶液を調製した。この溶液を０．５ml、１ml、２ml、４ml採取し、それぞれ蒸発乾固させた後、アセトンを加えて精確に５mlとした。念の為シリンジフィルタ（０．４５μm 径）を通した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて定量した。作成した検量線を図２に示す。高速液体クロマトグラフィーの条件を以下に示す。
【００４７】
カラム :CrestPak C18T-5 ，溶離液：メタノール，カラム温度：６０℃，
流速：1.5ml/min ，検知器：JASCO UV-970（測定波長４５０nm）
【００４８】
乾燥試料約５mgを精秤し、アセトン３mlを加えて超音波処理（２８kHz ）した後、冷暗所にて十分抽出させた。これを遠心分離した後、上澄み液を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定を行い、保持時間からβ−カロチンを同定し、また上記で得た検量線を用いて定量した。乾燥試料１g 当たりのβ−カロチン含有量を次式により求めた。
【００４９】
β−カロチン（μg/g ）＝（ピーク面積−1.03×105 ）／（7.703 ×104 ）
【００５０】
これらの結果を図３に示す。
【００５１】
図３より、フィコシアニン量は藻体の生育量と同様に、特に４００G 以下、とりわけ５〜４００G の磁場を印加することにより、磁場を印加しない場合に比べ、増加することがわかる。これに対してクロロフィルａおよびβ−カロチンの量はほとんど変化しない。
【００５２】
４）光合成活性
光合成による酸素発生量を酸素電極(RANK BROTHER,UK) を用いて測定した。すなわち、生育定常期における細胞懸濁液をクロロフィルａ量が５μg/ml程度になるようにＳＯＴ培地で希釈し、約６mlを電解室内に入れた。印加電圧０．６Ｖ（参照電極 Ag・AgCl）、光照度１００００lux 、２５．０℃において攪拌しながら４分間測定を行った。なお、酸素発生量は印加磁場０を１００％とした相対％の酸素発生比で示した。
【００５３】
結果を図４に示す。
【００５４】
図４より、酸素発生量は、藻体の生育量（図１）およびフィコシアニン量（図３）と同様の傾向を示し、特に４００G 以下、とりわけ５〜４００G の磁場を印加することによって光合成活性が高まっていることがわかる。
【００５５】
次に、脂肪酸の定量を以下のようにして行った。
【００５６】
４）脂肪酸の定性および定量
乾燥試料約１０mgを精秤し、これに内標準物質としてペンタデカン酸５００μg を添加した。５％塩酸−メタノールによりメチルエステル化させ、ｎ−ヘキサンで抽出後、ガスクロマトグラフィー(SHIMADZU GC-14B島津製作所）を用いて脂肪酸分析を行った。カラムはＯＶ−１７（０．２５２mm径、３０m 高さ）を使用し、インジェクション温度２００℃、カラム温度は昇温速度５℃/minで１５０℃から２５０℃までとした。内標準物質との保持時間とピーク面積比から脂肪酸の定性および定量を行った。
【００５７】
この結果、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、cis −オレイン酸、trans −オレイン酸、リノール酸、γ−リノレイン酸が検出された。これらの脂肪酸の組成と印加磁場の強度との関係を図５に示す。また、脂肪酸の総量と印加磁場の強度との関係を図６に示す。なお、図５において、脂肪酸は総炭素数と二重結合数とで表示し、cis はciとtrans はtrとして表示する。
【００５８】
図５、図６の結果から、磁場の印加により、脂肪酸の組成に変化はみられなかったが、脂肪酸の総量は増加することがわかる。特に４００G 以下、とりわけ５〜４００G の磁場の印加で脂肪酸の総量が増加することがわかる。
【００５９】
また、γ−リノレン酸についてみると、１００G と３５０G で増加することから脂肪酸の総量と同様の傾向にあることがわかる。
【００６０】
実施例２
藻類を紅藻類のコラリナ(Corallina) に変え、培地組成をこれに合わせたほかは実施例１と同様にして培養および分析を行った。この結果、実施例１と同様の傾向を示すことがわかった。
【００６１】
実施例３
藻類を藍藻類のアナベナ(Anabena) にし、培地をこれに合わせたほかは実施例１と同様にして培養を行い、分析したところ、実施例１と同様の傾向を示すことがわかった。
【００６２】
【発明の効果】
本発明によれば、光合成藻類を、好ましくは光照射と同時に、特に５〜４００Gの比較的弱い磁場中で培養するだけで、光合成藻類の藻体そのものの生育量を増大させるとともに、光合成過程に直接または間接に関与するフィコビリ蛋白質および／または脂肪酸の生産量を増加させることができる。しかも分離精製において従来と同様の方法が適用できるために新たな設備等は必要としないことから、これら有用物質の生産コストを低下させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】藻体の生育量と磁場の強度の関係を示すグラフである。
【図２】β−カロチンの検量線を示すグラフである。
【図３】フィコシアニン量、クロロフィルａ量、β−カロチン量と磁場の関係を示すグラフである。
【図４】光合成活性（酸素発生量）と磁場の強度の関係を示すグラフである。
【図５】脂肪酸組成と磁場の強さの関係を示すグラフである。
【図６】脂肪酸総量と磁場の強さの関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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