(57)【要約】  このナノ微粒子（１）は、ＭＦｅ２Ｏ４からなるコア（１０）（Ｍは遷移金属を表す）と、コア（１０）を覆うシェル（２０）と、を有し、シェル（２０）がグルコース又はグルコース誘導体Ｇｌｃ’で化学修飾されている。Ｘは２価の連結基である。このナノ微粒子（１）は、ＭＦｅ２Ｏ４からなるコア（１０）と、コア（１０）を覆う官能基を含むシェルと、を有するコアシェル型ナノ微粒子を形成する工程と、前記官能基にグルコース又はグルコース誘導体を反応させる工程とにより製造することができる。［化１］2019172213.tif 000013
2019172213.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＦｅ２Ｏ４からなるコア（前記ＭＦｅ２Ｏ４において、Ｍは遷移金属を表す）と、
前記コアを覆うシェルと、を有し、
前記シェルがグルコース又はグルコース誘導体で化学修飾されているナノ微粒子。
【請求項２】
前記シェルがグルコース又はグルコース誘導体で化学修飾されたポリアルキレングリコールからなる、請求項１に記載のナノ微粒子。
【請求項３】
前記シェルがグルコース又はグルコース誘導体で化学修飾されたアモルファスＳｉＯ２からなる、請求項１に記載のナノ微粒子。
【請求項４】
前記グルコース誘導体がアミノ基を有する、請求項１〜３のうちいずれか一項に記載のナノ微粒子。
【請求項５】
ＭＦｅ２Ｏ４からなるコア（前記ＭＦｅ２Ｏ４において、Ｍは遷移金属を表す）と、前記コアを覆う官能基を含むシェルと、を有するコアシェル型ナノ微粒子を形成する工程と、
前記官能基にグルコース又はグルコース誘導体を反応させる工程と、を有する、請求項１〜４のうちいずれか一項に記載のナノ微粒子の製造方法。
【請求項６】
ＭＦｅ２Ｏ４からなるコア（前記ＭＦｅ２Ｏ４において、Ｍは遷移金属を表す）と、前記コアを覆うポリアルキレングリコールからなるシェルと、を有するコアシェル型ナノ微粒子を形成する工程と、
前記ポリアルキレングリコールの末端のヒドロキシメチル基を酸化させて、カルボキシル基にする工程と、
前記カルボキシル基にグルコース又はグルコース誘導体を反応させる工程と、を有する、請求項５に記載のナノ微粒子の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜４のうちいずれか一項に記載のナノ微粒子を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
【請求項８】
ポリアルキレングリコール、鉄を含む遷移金属の塩化物、及びアルカリを加熱し混合して、水酸化物を得る工程と、
前記水酸化物を含む反応物を加熱し焼成する工程と、を有するコアシェル型ナノ微粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノ微粒子、及びナノ微粒子の製造方法、このナノ微粒子を有効成分として含有する抗腫瘍剤、並びにこのナノ微粒子を製造するためのコアシェル型ナノ微粒子の製造方法に関する。
本願は、２０１８年３月５日に、日本に出願された特願２０１８−０３８９８９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
ナノメートルスケールの超微粒子であるナノ微粒子は、従来にない新たな特異な物性をもたらし、機能材料としての高性能化が期待できることから、種々の物質について検討がされている。特に、磁性材料を微粒子化すると、磁壁を持たない単磁区粒子が生じ、保磁力が大きくなることが期待されている。【０００３】
本発明者らは、表面をＳｉＯ２により被覆されたマグネタイト等の磁気ナノ微粒子の調製に成功しており、このＳｉＯ２を介して官能基を導入した技術を報告している（特許文献１、２参照）。この官能基により、磁気微粒子への薬剤等の修飾や、細胞、組織内へ磁気微粒子を容易に取り込むことが可能である。【０００４】
一方、がん細胞は正常細胞に比べて単位時間当たり３〜８倍のグルコースを取り込むことが知られている。また、ＥＰＲ効果、すなわち、がん細胞の周りの血管壁は高分子薬剤を透過しやすく、透過した高分子薬剤は腫瘍組織中あるいはその周辺に集積しやすいことも知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−２６１３３４号公報
【特許文献２】特開２００７−２６９７７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ナノ微粒子の表面に、グルコースに近似した構造を導入することができれば、腫瘍組織中あるいはその周辺に集積しやすい性質が得られると期待できる。【０００７】
本発明は、グルコース又はグルコース誘導体で化学修飾されたナノ微粒子、及びその製造方法、このナノ微粒子を有効成分として含有する抗腫瘍剤、並びにこのナノ微粒子を製造するためのコアシェル型ナノ微粒子の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の態様を有する。
［１］  ＭＦｅ２Ｏ４からなるコア（前記ＭＦｅ２Ｏ４において、Ｍは遷移金属を表す）と、
前記コアを覆うシェルと、を有し、
前記シェルがグルコース又はグルコース誘導体で化学修飾されているナノ微粒子。【０００９】
［２］  前記シェルがグルコース又はグルコース誘導体で化学修飾されたポリアルキレングリコールからなる、前記［１］に記載のナノ微粒子。【００１０】
［３］  前記シェルがグルコース又はグルコース誘導体で化学修飾されたアモルファスＳｉＯ２からなる、前記［１］に記載のナノ微粒子。【００１１】
［４］  前記グルコース誘導体がアミノ基を有する、前記［１］〜［３］のうちいずれか一項に記載のナノ微粒子。【００１２】
［５］  ＭＦｅ２Ｏ４からなるコア（前記ＭＦｅ２Ｏ４において、Ｍは遷移金属を表す）と、前記コアを覆う官能基を含むシェルと、を有するコアシェル型ナノ微粒子を形成する工程と、
前記官能基にグルコース又はグルコース誘導体を反応させる工程と、を有する、前記［１］〜［４］のうちいずれか一項に記載のナノ微粒子の製造方法。【００１３】
［６］  ＭＦｅ２Ｏ４からなるコア（前記ＭＦｅ２Ｏ４において、Ｍは遷移金属を表す）と、前記コアを覆うポリアルキレングリコールからなるシェルと、を有するコアシェル型ナノ微粒子を形成する工程と、
前記ポリアルキレングリコールの末端のヒドロキシメチル基を酸化させて、カルボキシル基にする工程と、
前記カルボキシル基にグルコース又はグルコース誘導体を反応させる工程と、を有する、前記［５］に記載のナノ微粒子の製造方法。【００１４】
［７］  前記［１］〜［４］のうちいずれか一項に記載のナノ微粒子を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
［８］  ポリアルキレングリコール、鉄を含む遷移金属の塩化物、及びアルカリを加熱し混合して、水酸化物を得る工程と、
前記水酸化物を含む反応物を加熱し焼成する工程と、を有するコアシェル型ナノ微粒子の製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、ナノ微粒子、及びナノ微粒子の製造方法、このナノ微粒子を有効成分として含有する抗腫瘍剤、並びにこのナノ微粒子を製造するためのコアシェル型ナノ微粒子の製造方法を提供する。本発明のナノ微粒子は、シェルがグルコース又はグルコース誘導体で化学修飾されているので、腫瘍組織中に集積しやすい性質が得られると期待できる。また、本発明のナノ微粒子は、ＭＦｅ２Ｏ４からなるコアを有しているので、磁気ハイパーサーミア（癌温熱療法）への利用も期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１（上）は、比較例１で取得されたコバルトフェライト（ＣｏＦｅ２Ｏ４）磁気ナノ微粒子のＸ線回折（ＸＲＤ）の測定結果である。図１（下）は、実施例１で取得されたコアシェル型ナノ微粒子のＸ線回折（ＸＲＤ）の測定結果である。
【図２】図２（上）は、実施例１で取得されたコアシェル型ナノ微粒子のＦＴ−ＩＲの測定結果である。図２（下）は、コバルトフェライト（ＣｏＦｅ２Ｏ４）標準試料のＦＴ−ＩＲの測定結果である。
【図３】図３は、実施例１で取得されたコアシェル型ナノ微粒子のＭＳ測定の結果である。
【図４】図４（上）は、実施例２で取得されたコアシェル型ナノ微粒子のＦＴ−ＩＲの測定結果である。図４（下）は、実施例１で取得されたコアシェル型ナノ微粒子のＦＴ−ＩＲの測定結果である。
【図５】図５（上）は、実施例３で取得されたナノ微粒子のＦＴ−ＩＲの測定結果である。図５（下）は、実施例２で取得されたコアシェル型ナノ微粒子のＦＴ−ＩＲの測定結果である。
【図６】実施例３のナノ微粒子が、ＨｅＬａ細胞内に取り込まれたことを示すＴＥＭ像である。
【図７】コアシェル型ナノ微粒子のＦＴ−ＩＲの測定結果である。
【図８】コアシェル型ナノ微粒子のＸ線回折（ＸＲＤ）の測定結果である。
【図９】コアシェル型ナノ微粒子のＦＴ−ＩＲの測定結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
≪ナノ微粒子≫
以下、本発明の実施形態について説明する。
本実施形態のナノ微粒子は、ＭＦｅ２Ｏ４からなるコア（前記ＭＦｅ２Ｏ４において、Ｍは遷移金属を表す）と、前記コアを覆うシェルと、を有し、前記シェルがグルコース又はグルコース誘導体で化学修飾されている。
【００１８】
下記式（１）のナノ微粒子１は、本実施形態のナノ微粒子の構造の一例である。ナノ微粒子１は、ＭＦｅ２Ｏ４からなるコア１０（Ｍは遷移金属を表す）と、コア１０を覆うシェル２０と、を有し、シェル２０が２価の連結基Ｘを介してグルコース誘導体Ｇｌｃ’で化学修飾されている。Ｘは２価の連結基である。
【００１９】
【化１】
2019172213.tif 000003
【００２０】
ここで、グルコース誘導体Ｇｌｃ’とは、グルコース骨格を有する化合物をいう。グルコース誘導体Ｇｌｃ’としてアミノ基を有するグルコース誘導体が好ましい。グルコース誘導体Ｇｌｃ’の具体例として、グルコサミンが挙げられる。
【００２１】
式（１）のナノ微粒子１のうち、シェルがグルコサミンで化学修飾されたものとして、下記式（１−１）で表されるナノ微粒子が挙げられる。
【００２２】
【化２】
2019172213.tif 000004
（ｋは１以上の整数を表す。）
【００２３】
下記式（２）のナノ微粒子２は、本実施形態のナノ微粒子の構造の一例である。ナノ微粒子２は、ＭＦｅ２Ｏ４からなるコア１０（Ｍは遷移金属を表す）と、コア１０を覆うシェル２０と、を有し、シェル２０が２価の連結基Ｘを介してグルコースで化学修飾されている。Ｘは２価の連結基である。
【００２４】
【化３】
2019172213.tif 000005
【００２５】
式（２）のナノ微粒子２の具体例としては、下記式（２−１）、式（２−２）、式（２−３）で表されるナノ微粒子が挙げられる。
【００２６】
【化４】
2019172213.tif 000006
【００２７】
【化５】
2019172213.tif 000007
【００２８】
【化６】
2019172213.tif 000008
（ｋは１以上の整数を表す。）
【００２９】
（シェル）
コアを覆うシェルはグルコース又はグルコース誘導体で化学修飾されている。シェルはコアの全部を覆うものであってもよく、部分的に覆うものであっていてもよい。シェルの内部に２個以上のコアを包摂した包摂構造を形成していてもよい。
【００３０】
本実施形態のナノ微粒子において、ＭＦｅ２Ｏ４からなるコアが、シェルで覆われていることは、微粒子に対してグルコース又はグルコース誘導体を化学修飾する反応工程を経た後、グルコース又はグルコース誘導体が反応性のシェルに化学修飾されたことで確認することができる。
【００３１】
シェルとなる材料は、グルコース又はグルコース誘導体で化学修飾され得るものであればよく、ポリアルキレングリコールからなるものであってもよい。ポリアルキレングリコールをシェルとするナノ微粒子は、例えば、後述する「コアシェル型ナノ微粒子の製造方法」により製造することができる。
【００３２】
シェルとなる材料は、アモルファスＳｉＯ２からなるものであってもよく、シェルは、コアを覆うアモルファスＳｉＯ２ネットワーク（網状膜）を形成していてもよい。例えば、アモルファスＳｉＯ２の網状膜によって、コアが分離された状態であってもよい。ここで「網状膜」とは、アモルファスＳｉＯ２が個々のコアの周囲を取り囲み、且つアモルファスＳｉＯ２が連なっているものが例示されるが、これに限定されない。
【００３３】
なお、ナノ微粒子のコアが、アモルファスＳｉＯ２からなるシェルで覆われていることの確認は、Ｘ線回折によりアモルファスＳｉＯ２とマグネタイトの回折線が観測されること、及びナノ微粒子の一次粒子径が上記Ｘ線回折の半値幅から予想される程度の値であること、からも行うことができる。
【００３４】
（コア）
本実施形態に係るコアは、ＭＦｅ２Ｏ４からなる。本実施形態に係るナノ微粒子のコアとしてフェライトを採用することで、磁性材料としての利用が可能となる。
前記ＭＦｅ２Ｏ４において、Ｍは遷移金属を表す。遷移金属としては、イオン化したときに２価になるものが好ましく、例えば、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎが挙げられる。また、これらの遷移金属を２種以上併せて用いても良い。前記ＭがＦｅである場合、ＭＦｅ２Ｏ４は、例えばＦｅ３Ｏ４である。これらのなかでも、ＭはＣｏであることが好ましい。また、２種以上併せて用いる場合には、ＭｎＺｎが好ましい。
【００３５】
（アモルファスＳｉＯ２をシェルとするナノ微粒子）
本実施形態に係るナノ微粒子は、前記コアとそれを覆うシェルとを有し、前記シェルがグルコース又はグルコース誘導体で化学修飾されたアモルファスＳｉＯ２からなるからなるものであってもよい。アモルファスＳｉＯ２に対しては、例えば、３−イソシアネートプロピルトリエトキシシランシラン、３−グリシドキシプロピルトリエトキシシラン等のカップリング剤を用いて、式（２−１）、式（２−２）で表されるナノ微粒子のように、グルコース又はグルコース誘導体を化学修飾することができる。
【００３６】
シェルは、コアを覆うアモルファスＳｉＯ２ネットワーク（網状膜）を形成していてもよい。本実施形態に係るナノ微粒子は、シェルの内部に２個以上のコアを包摂した包摂構造を形成していてもよい。
【００３７】
アモルファスＳｉＯ２をシェルとするナノ微粒子において、前記ＭＦｅ２Ｏ４に対する前記ＳｉＯ２のモル比（ＳｉＯ２／ＭＦｅ２Ｏ４）は、０．１以上５以下であることが好ましく、０．３以上４以下であることがより好ましく、０．４以上２以下であることがさらに好ましい。ＳｉＯ２／ＭＦｅ２Ｏ４が０．１以上５以下であることが好ましい。また、ＳｉＯ２／ＭＦｅ２Ｏ４が上記範囲内の値であると、ナノ微粒子の分散性に優れるため好ましい。
【００３８】
≪ナノ微粒子の製造方法の製造方法≫
本実施形態のナノ微粒子は、例えば、ＭＦｅ２Ｏ４からなるコア（前記ＭＦｅ２Ｏ４において、Ｍは遷移金属を表す）と、前記コアを覆う官能基を含むシェルと、を有するコアシェル型ナノ微粒子を形成する工程と、前記官能基にグルコース又はグルコース誘導体を反応させる工程と、を有する方法に沿って製造できる。
【００３９】
コアシェル型ナノ微粒子を形成する工程は、特許文献１（特開２００１−２６１３３４号公報）や特許文献２（特開２００７−２６９７７０号公報）に沿った方法を採用することができ、後述する≪コアシェル型ナノ微粒子の製造方法≫において説明された方法を採用することができる。特許文献１（特開２００１−２６１３３４号公報）や特許文献２（特開２００７−２６９７７０号公報）に沿った方法で形成した、表面をＳｉＯ２により被覆されたナノ微粒子では、さらに、グルコース又はグルコース誘導体で化学修飾し易いように、シランカップリング剤で官能基を導入してもよい。
【００４０】
後述する≪コアシェル型ナノ微粒子の製造方法≫に沿った方法で形成した、表面に−ＣＨ２ＯＨ基を有するコアシェル型ナノ微粒子では、さらに、下記式（３）に示されるように、−ＣＨ２ＯＨ基を酸化して、表面に−ＣＯＯＨ基を有するコアシェル型ナノ微粒子としてもよい。
【００４１】
【化７】
2019172213.tif 000009
（ｋは１以上の整数を表す。）
【００４２】
このコアシェル型ナノ微粒子を用いるナノ微粒子の製造方法は、一例として、ＭＦｅ２Ｏ４からなるコア（前記ＭＦｅ２Ｏ４において、Ｍは遷移金属を表す）と、前記コアを覆うポリアルキレングリコールからなるシェルと、を有するコアシェル型ナノ微粒子を形成する工程と、前記ポリアルキレングリコールの末端のヒドロキシメチル基を酸化させて、カルボキシル基にする工程と、前記カルボキシル基にグルコース又はグルコース誘導体を反応させる工程と、を有する。
【００４３】
前記官能基にグルコース又はグルコース誘導体を反応させる工程は、官能基とグルコース又はグルコース誘導体との組み合わせに応じて、公知の方法で行うことができる。例えば、前記官能基がカルボキシル基であって、前記グルコース誘導体がグルコサミンであるとき、前記カルボキシル基にグルコース誘導体を反応させる工程は、下記式（４）で示すことができる。
【００４４】
【化８】
2019172213.tif 000010
（ｋは１以上の整数を表す。）
【００４５】
≪コアシェル型ナノ微粒子の製造方法≫
本実施形態のコアシェル型ナノ微粒子の製造方法は、ポリアルキレングリコール、鉄を含む遷移金属の塩化物、及びアルカリを加熱し混合して、水酸化物を得る工程と、
前記水酸化物を含む反応物を加熱し焼成する工程と、を有する。
【００４６】
ポリアルキレングリコールとしては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等を挙げることができる。これらのポリアルキレングリコールの質量平均分子量は２００〜８０００であるものが好ましく、３００〜２０００であるものがより好ましい。例えば、質量平均分子量が約３８０〜４２０の市販のＰＥＧ４００、質量平均分子量が約５６０〜６４０の市販のＰＥＧ６００、質量平均分子量が約９００〜１１００の市販のＰＥＧ１０００、質量平均分子量が１８５０〜２１５０の市販のＰＥＧ２０００、質量平均分子量が約４００の市販のＰＰＧ４００、等を用いることができる。ＰＥＧ２０００を用いると立体障害が大きいため、コアシェル型ナノ微粒子の分散性が良くなると考えられる。
【００４７】
鉄を含む遷移金属の塩化物としては、ＭＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（Ｍは遷移金属を表す）、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏの試薬を用いることができる。ＭＣｌ２・６Ｈ２Ｏ及びＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏを、Ｍ：Ｆｅ＝１モル：２モルの比で混合して用いてもよく、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏを単独で用いてもよい。
【００４８】
ポリアルキレングリコール、鉄を含む遷移金属の塩化物、及びアルカリを加熱し混合すると、中和反応し、水酸化物を得ることができる。中和反応の温度としては、４０〜１００℃が好ましく、６０〜８０℃が好ましい。中和反応の時間は、３０分〜２時間が好ましい。さらに、水酸化物を含む反応物を加熱し焼成することで、コアシェル型ナノ微粒子を液体のポリアルキレングリコール中に沈殿させることができる。焼成温度は、１２０〜２８０℃が好ましく、１６０〜２２０℃がより好ましい。焼成時間は３時間以上とすることが好ましい。
【００４９】
本実施形態のコアシェル型ナノ微粒子の磁性体部分の体積平均粒子径は、１ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることが好ましく、２ｎｍ以上２０ｎｍ以下であることがより好ましい。
ここで、体積平均粒子径は、コアシェル型ナノ微粒子の１個のコアの磁性体部分に対して求められた一次粒子径である。体積平均粒子径は算術平均径である。
コアシェル型ナノ微粒子のコアの磁性体部分の体積平均粒子径は、Ｘ線回折（ＸＲＤ）により求めることができる。
【００５０】
上記コアシェル型ナノ微粒子を、上記水溶液を混合し焼成して製造する場合、焼成温度が高くなるほど、又焼成時間が長いほど、コアシェル型ナノ微粒子が成長して粒径が大きくなるので、焼成温度又は焼成時間を調整することで、コアシェル型ナノ微粒子の粒径を制御できる。
【実施例】
【００５１】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。【００５２】
＜ＸＲＤ分析＞
粉末Ｘ線回折測定機器（リガク：ＭｉｎｉＦｌｅｘ ＩＩ）を用いてＸＲＤ分析を行った。【００５３】
＜平均粒径（一次粒子径）の測定＞
粉末Ｘ線回折測定機器（リガク：ＭｉｎｉＦｌｅｘ ＩＩ）を用いて、コアシェル型ナノ微粒子の磁性体部分の平均粒径（一次粒子径）を測定した。数値は、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｉｚｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＳＤＡ）を用いて体積平均粒子径として算出した。【００５４】
＜ＭＳ測定＞
ＤＨＢをマトリクスとして、Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ｓｐｅｅｄ−ＴＯＦ−ＭＳ装置（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）により、ナノ微粒子の質量分析測定を行った。装置の仕様を以下に示す。
レーザー周波数；          １ｋ  Ｈｚ
質量分解能（ＦＷＨＭ）；  Ｍａｘ：  ２５００
質量精度  ；              ｍｉｎ：  ２  ｐｐｍ
レーザー焦点径；ｍａｘ：  １０  μｍ
レーザー；            Ｎｄ：Ｙａｇ  ｌａｓｅｒ  （３５５  ｎｍ）
最大パワー              ＜１７０ｋＷ
パルスエネルギー        ＜５００μＪ
パルス幅                ＞３ｎｓ
平均パワー              ＜１．５Ｗ【００５５】
＜二次粒径（モード径及びメジアン径）の測定＞
得られたナノ微粒子について、レーザー回折・散乱型粒度分布計（堀場製作所製：ＬＡ−９５０Ｖ２）を用いて水溶液中におけるナノ微粒子の粒度分布から、二次粒径（モード径及びメジアン径）を測定した。サンプルは全て水溶液中に分散させ、超音波処理にて分散処理を行った後、循環系にて測定を行った。装置の概要を以下に示す。【００５６】
堀場製作所製  ＬＡ−９５０Ｖ２
・測定原理：      Ｍｉｅ散乱理論
・測定レンジ：   ０．０１〜３０００ μｍ
・レーザー光源： 半導体レーザー（６５０ ｎｍ）
発光ダイオード（４０５ ｎｍ）
・検出器：       リング上６４分割シリコンフォトダイオード×１個
４ｃｈアレイデテクタ×５個
シリコンフォトデテクタ×３個【００５７】
［比較例１］
＜ナノ微粒子の作製＞
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ水溶液と、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ水溶液と、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ水溶液をそれぞれモル比（ＣｏＣｌ２：ＦｅＣｌ２：Ｎａ２ＳｉＯ３＝１：２：３）で添加し、１５分間撹拌し、その後混合させ希釈したＮａＯＨを用いてｐＨを８．０に調整した。ｐＨ調整後の液をさらに１５分間撹拌し、遠心分離機により３５００ｒｐｍで１５分間遠心した後、上澄み液を除去し、沈殿物を純水にて洗浄する動作を３回繰り返した。約５０℃の恒温槽で約４０時間乾燥させた沈殿物を乳鉢にて粉砕した。その後、約８００℃で約１６時間焼成を行い、比較例のナノ微粒子試料を得た。ＸＲＤ分析の結果を図１（上）に示す。指数づけしたピークから、単相のスピネル構造を持ったＣｏＦｅ２Ｏ４ [No. 000-022-1086、Name: Cobalt Iron Oxide、Quality Mark: S、Cell (8.392, 8.392, 8.392)] が同定でき、２θ＝２０〜３０°の位置にアモルファスＳｉＯ２のブロードなピークが観察された。得られたナノ微粒子の組成は、ＣｏＦｅ２Ｏ４・３ＳｉＯ２であった。平均粒径（一次粒子径）は１０ｎｍであった。二次粒径は、モード径が３．６３μｍ、メジアン径は２．２７μｍであった。【００５８】
［実施例１］
＜ＰＥＧ４００を用いたＣｏＦｅ２Ｏ４ナノ微粒子の作製＞
５０ｍｌのＰＥＧ４００の中で、５ｍｍｏｌのＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２．５ｍｍｏｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、及び１５ｍｍｏｌの水酸化ナトリウムを７０℃で１時間混合して、中和反応させた。反応液を、反応容器のまま箱型オーブンの中に入れ、２００℃で１６時間加熱し、炉冷後の反応液に対して、遠心分離機（３５００ｒｐｍ, １０ｍｉｎ）で沈殿させ、エタノールで三回洗浄する工程を３回繰り返した。乾燥して、ＣｏＦｅ２Ｏ４をコアとするコアシェル型ナノ微粒子の粉末を得た。得られたコアシェル型ナノ微粒子の磁性体部分の平均粒径（一次粒子径）は１２ｎｍであった。【００５９】
（ＸＲＤ分析結果）
ＸＲＤ分析の結果を図１（下）に示す。指数づけしたピークから、単相のスピネル構造を持ったＣｏＦｅ２Ｏ４ [No. 000-022-1086、Name: Cobalt Iron Oxide、Quality Mark: S、Cell (8.392, 8.392, 8.392)] が同定でき、不純物のピークを持たないことから、目的のＣｏＦｅ２Ｏ４が作成できた。湿式混合法で作ったＣｏＦｅ２Ｏ４をコアとするコアシェル型ナノ微粒子のＸＲＤ分析の結果の図１（上）に比べて、図１（下）のＰＥＧ４００を用いたコアシェル型ナノ微粒子のＸＲＤ分析の結果は、２０〜３０°の位置にアモルファスのブロードなピークがないことが確認された。【００６０】
（ＦＴ−ＩＲ測定結果）
続いて、得られたコアシェル型ナノ微粒子のＦＴ−ＩＲ測定をした。実施例１のコアシェル型ナノ微粒子のＦＴ−ＩＲ測定結果を図２（上）に示す。ＣｏＦｅ２Ｏ４標準試料のＦＴ−ＩＲ測定結果を図２（下）に示す。本製法にて作製したコアシェル型ナノ微粒子は、エタノールにて洗浄したものであり、仮にＰＥＧ４００単体で存在しているものがあるとすれば洗浄過程で取り除かれる。図２（上）の測定結果は、ＣＯＣ、ＣＯや、ＣＣ等の飽和炭化水素に特有の結合のピークを有していることから、ＰＥＧ４００を用いて作製したＣｏＦｅ２Ｏ４をコアとするコアシェル型ナノ微粒子は、ＰＥＧ４００に由来するＰＥＧの主鎖がＣｏＦｅ２Ｏ４のコアと化学結合しているものと考えられる。【００６１】
（ＭＳ測定結果）
さらに、ＰＥＧ４００を用いて作製した実施例１のコアシェル型ナノ微粒子について、ＤＨＢをマトリクスとする質量分析測定を行った。測定結果を図３に示す。ピーク間隔が４４であるＰＥＧ４００由来のピークが観測されたことからも、本コアシェル型ナノ微粒子は、ＰＥＧ４００に由来するＰＥＧの主鎖が化学結合していることが確認された。ナノ微粒子とＰＥＧとの結合はレーザーによって切れたと考えられる。ピーク間隔が４４であるということは、ＰＥＧ４００の分子内の結合は反応によって不飽和結合などに形を変えていないことがわかる。【００６２】
（二次粒径測定結果）
ＰＥＧ４００を用いて作製したＣｏＦｅ２Ｏ４ナノ微粒子の二次粒径はモード径が４７５ｎｍ、メジアン径は４３０ｎｍであった。比較例のナノ微粒子の二次粒径（モード径３．６３μｍ、メジアン径２．２７μｍ）に比べて液中でのコロイド径は１桁ほど小さくなっており、分散性に優れることを確認できた。【００６３】
［実施例２］
＜ＰＥＧ４００末端の水酸基のカルボキシル化＞
純水１５０ｍｌに実施例１で得られたＣｏＦｅ２Ｏ４ナノ微粒子の粉末０．２ｇを入れ、４ｍｌの過酸化水素水溶液試薬（３０Ｗ／Ｖ％）を入れ、室温で１０ｈ撹拌した。純水で３回洗浄してから乾燥し、粉末とした。【００６４】
【化９】
2019172213.tif 000011
（ｋは１以上の整数を表す。）【００６５】
（ＦＴ−ＩＲ測定結果）
得られた実施例２のコアシェル型ナノ微粒子のＦＴ−ＩＲ測定をした。実施例２のコアシェル型ナノ微粒子のＦＴ−ＩＲ測定結果を図４（上）に示す。比較のため、実施例１のコアシェル型ナノ微粒子のＦＴ−ＩＲ測定結果を図４（下）に示す。図４（上）の測定結果から、１６６０ｎｍのケトン由来のピーク、２５００〜３３００ｎｍの短波長方向に広がったＯＨ由来のピークが観測されたことによって、過酸化水素が酸化剤として働いて、ＰＥＧ４００末端の水酸基のカルボキシル化が、式（５）に沿って正しく行われたことが確認できた。【００６６】
［実施例３］
＜ＰＥＧ４００へのグルコサミンの化学修飾＞
純水１５０ｍｌに実施例２で得られたコアシェル型ナノ微粒子の粉末０．０５ｇと、グルコサミン塩酸塩０．５ｇを入れ、リービッヒ冷却をしながら１３０℃で２５．５ｈ攪拌加熱した。その後、純水で洗浄してから乾燥し、粉末にした。【００６７】
【化１０】
2019172213.tif 000012
（ｋは１以上の整数を表す。）【００６８】
（ＦＴ−ＩＲ測定結果）
得られたナノ微粒子についてＦＴ−ＩＲ測定をした。実施例３のナノ微粒子のＦＴ−ＩＲ測定結果を図５（上）に示す。比較のため、実施例２のナノ微粒子のＦＴ−ＩＲ測定結果を図５（下）に示す。【００６９】
１６００ｎｍ付近のピークに関して反応後にピークがブロードに、さらに頂点が左に移動していることがわかる。これは、コアシェル型ナノ微粒子の側のＣＯＯＨ基とグルコサミンのアミノ基が脱水縮合してアミド結合が形成されたことで、１５５０ｎｍ付近のピークが重ね合わせられたことによるものと考えられる。また、２８８０ｎｍ付近のＣＨのピーク強度が上がっていること、様々な状態でＯＨを持つ糖の影響によってＯＨのピークが広がっていることから、糖が修飾されたと考えることができる。以上の図５（上）の測定結果から、式（６）に沿って、ＰＥＧ４００へのグルコサミンの化学修飾が正しく行われたことを確認できた。【００７０】
実施例３のナノ微粒子は、シェルがグルコース骨格を有するグルコサミンで化学修飾されているので、腫瘍組織中に集積しやすい性質が得られると期待できる。また、実施例３のナノ微粒子は、ＭＦｅ２Ｏ４からなるコアを有しているので、磁気ハイパーサーミア（癌温熱療法）への利用も期待できる。【００７１】
［実施例４］
（材料）
・培地：ＤＭＥＭ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０％ （ｖｏｌ/ｖｏｌ） ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍを用いた。以下、培地（ＤＭＥＭ／１０％ＣＳ）という。
・ＨｅＬａ細胞：理研セルバンクから入手したＨｅＬａ細胞を、培地（ＤＭＥＭ／１０％ＣＳ）で継代培養していたものを、３５ｍｍ ｇｌａｓｓ ｂｏｔｔｏｍ ｄｉｓｈに播種した後、２４ｈ後のものを実験に使用した。播種時の細胞数は、２×１０５ ｃｅｌｌｓ/ ｄｉｓｈであった。【００７２】
（ナノ微粒子懸濁液の調製）
実施例３のナノ微粒子の粉末にＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、超音波処理することによって均一な懸濁液とした後、適宜ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈することによって、最終的に１０ｍｇ/ｍｌの濃度の懸濁液を調製した。更に、培地（ＤＭＥＭ／１０％ＣＳ）で１００倍希釈したナノ微粒子懸濁液を調製した。【００７３】
（実験）
ｄｉｓｈ上のＨｅＬａ細胞に対して、培地（ＤＭＥＭ／１０％ＣＳ）で１００倍希釈したナノ微粒子懸濁液を添加し、３７℃のＣＯ２インキュベータで２４ｈ静置した。その後、２．５％（ｗ/ｖ）グルタルアルデヒド／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で室温１ｈ固定した後、ＴＥＭ観察用のサンプル調製を行った。ＴＥＭ観察には、ＪＥＭ−１４００（日本電子株式会社）を使用した。【００７４】
図６は、実施例３のナノ微粒子が、ＨｅＬａ細胞内に取り込まれたことを示すＴＥＭ像である。図６に示すように、エンドソーム／リソソーム内に、実施例３のナノ微粒子の凝集体を確認でき、滴下から２４時間後には実施例３のナノ微粒子が、ＨｅＬａ細胞内に取り込まれたことが確認できた。
実施例３のナノ微粒子ががん細胞内に取り込まれていることから、シェルがグルコース又はグルコース誘導体で化学修飾されているナノ微粒子を有効成分として含有する抗腫瘍剤は、磁気ハイパーサーミアへの利用が期待される。【００７５】
［実施例５］
＜ＰＥＧ４００を用いたＭｎ０．８Ｚｎ０．２Ｆｅ２Ｏ４ナノ微粒子の作製＞
５０ｍｌのＰＥＧ４００の中で、５ｍｍｏｌのＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２．０ｍｍｏｌのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．５ｍｍｏｌのＺｎＣｌ２（無水物）、及び１５ｍｍｏｌの水酸化ナトリウムを７０℃で１時間混合して、中和反応させた。反応液を、反応容器のまま箱型オーブンの中に入れ、２００℃で１６時間加熱し、炉冷後の反応液に対して、遠心分離機（３５００ｒｐｍ, １０ｍｉｎ）で沈殿させ、エタノールで３回洗浄する工程を３回繰り返した。乾燥して、Ｍｎ０．８Ｚｎ０．２Ｆｅ２Ｏ４をコアとするコアシェル型ナノ微粒子の粉末を得た。得られたコアシェル型ナノ微粒子の磁性体部分の平均粒径（一次粒子径）は１２ｎｍであった。ＦＴ-ＩＲ, ＴＧ-ＤＴＡ（示差熱分析）などから洗浄後も十分な量のＰＥＧが存在することが確認できたことから、ＰＥＧが粒子周囲をコーティングしていると考えられる。【００７６】
さらにグルコース修飾によりがん細胞への取り込みも変化することからも、粒子を包含したＰＥＧにグルコースが修飾され、粒子の取り込み量に差が出ていると考えられる。１つのコア粒子に約６０００個のＰＥＧが付いていると考えられ、一周、２ｎｍ程度の薄さで覆っていると考えられる。【００７７】
［実施例５−２］
５０ｍｌのＰＥＧ４００の中で、５ｍｍｏｌのＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２．０ｍｍｏｌのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．５ｍｍｏｌのＺｎＣｌ２（無水物）、及び１５ｍｍｏｌの水酸化ナトリウムを７０℃で１時間混合して、中和反応させた。反応液を、反応容器のまま箱型オーブンの中に入れ、１６０℃で１６時間加熱し、炉冷後の反応液に対して、遠心分離機（３５００ｒｐｍ, １０ｍｉｎ）で沈殿させ、エタノールで２回、純水で２回洗浄した。その後乾燥させ、Ｍｎ０．８Ｚｎ０．２Ｆｅ２Ｏ４をコアとするコアシェル型ナノ微粒子の粉末を得た。得られたコアシェル型ナノ微粒子の磁性体部分の平均粒径（一次粒子径）は６ｎｍであった。
作製時に加える水量が少ないほど粒径分布が狭くなるという傾向があり、ほぼ単分散の平均粒径６ｎｍのナノ微粒子を得ることができた。【００７８】
［実施例５−３］
５０ｍｌのＰＥＧ４００及び４ｍｌの純水の混合液の中で、５ｍｍｏｌのＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２．０ｍｍｏｌのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．５ｍｍｏｌのＺｎＣｌ２（無水物）、及び１５ｍｍｏｌの水酸化ナトリウムを７０℃で１時間混合して、中和反応させた。反応液を、反応容器のまま箱型オーブンの中に入れ、１６０℃で１６時間加熱し、炉冷後の反応液に対して、遠心分離機（３５００ｒｐｍ, １０ｍｉｎ）で沈殿させ、エタノールで２回、純水で２回洗浄した。その後乾燥させ、Ｍｎ０．８Ｚｎ０．２Ｆｅ２Ｏ４をコアとするコアシェル型ナノ微粒子の粉末を得た。得られたコアシェル型ナノ微粒子の磁性体部分の平均粒径（一次粒子径）は１０ｎｍであった。コア部分の酸化物の１次粒径は、６〜３０ｎｍで、作製条件（水の量、焼成温度）で制御することができる。【００７９】
［実施例６］
実施例５で得られたコアシェル型ナノ微粒子について、更に、実施例２と同様に、ＰＥＧ４００末端の水酸基のカルボキシル化と、実施例３と同様に、ＰＥＧ４００へのグルコサミンの化学修飾を行った。【００８０】
（ＦＴ−ＩＲ測定結果）
グルコサミンで化学修飾された実施例６のナノ微粒子のＦＴ−ＩＲ測定をした。ＭｎＦｅ２Ｏ４標準試料のＦＴ−ＩＲ測定結果を図７（上）に示す。実施例５のＰＥＧ４００を用いたＭｎ０．８Ｚｎ０．２Ｆｅ２Ｏ４ナノ微粒子のＦＴ−ＩＲ測定結果を図７（中）に示す。１１０５ ± ５５ｃｍ−１のＣ−Ｏ−Ｃ逆対称伸縮運動、１４８５ ± １５ｃｍ−１のＣＨ２対称変角振動、３４００ ± ２００ｃｍ−１のＯ−Ｈ間伸縮運動が観測された。実施例６のグルコサミンで化学修飾後のナノ微粒子のＦＴ−ＩＲ測定結果を図７（下）に示す。１０９５ ± ２５ｃｍ−１のＣ−Ｏ−Ｃ伸縮運動、１１７５ ± ２５ｃｍ−１のＣ−Ｏ伸縮運動、１２６５ ± ５５ｃｍ−１のＣ−Ｏ伸縮、Ｏ−Ｈ変角振動、１６７０ ± ４０ｃｍ−１のアミド結合によるＣ＝Ｏ伸縮、３４００ ± ２００ｃｍ−１のＯ−Ｈ間伸縮運動が観測された。【００８１】
［実施例７］
＜ＰＥＧ２０００を用いたＣｏＦｅ２Ｏ４ナノ微粒子の作製＞
１／３００ｍｏｌのＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、及び１／６００ｍｏｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏを、１ｍｌの水に溶解させ、５５℃で液状にした３０ｇのＰＥＧ２０００に加えた。１０時間撹拌させた後、０．５ｍｌの水に溶解させたＮａＯＨを加えた。１０時間撹拌させた後、１６０℃で１６時間加熱した。遠心分離してエタノール、水で洗浄し、５０℃で乾燥させて、ＣｏＦｅ２Ｏ４をコアとするコアシェル型ナノ微粒子の粉末を得た。得られたコアシェル型ナノ微粒子の磁性体部分の平均粒径（一次粒子径）は２７ｎｍであった。【００８２】
（ＸＲＤ分析結果）
ＸＲＤ分析の結果を図８に示す。指数づけしたピークから、単相のスピネル構造を持ったＣｏＦｅ２Ｏ４ [No. 000-022-1086、Name: Cobalt Iron Oxide、Quality Mark: S、Cell (8.392, 8.392, 8.392)] が同定できたことから、目的のＣｏＦｅ２Ｏ４が作成できたことを確認した。湿式混合法で作ったＣｏＦｅ２Ｏ４をコアとするコアシェル型ナノ微粒子のＸＲＤ分析の結果の図１（上）に比べて、図８のＰＥＧ２０００を用いたコアシェル型ナノ微粒子のＸＲＤ分析の結果は、２０〜３０°の位置にアモルファスのブロードなピークがないことが確認された。【００８３】
（ＦＴ−ＩＲ測定結果）
続いて、得られたコアシェル型ナノ微粒子のＦＴ−ＩＲ測定をした。実施例７のコアシェル型ナノ微粒子のＦＴ−ＩＲ測定結果を図９に、実線「２０００」に示す。図９の太線「Ｓｔｄ．（ＭｎＦｅ）」は、ＭｎＦｅ２Ｏ４標準試料のＦＴ−ＩＲ測定結果であり、図９の点線「４００」は、実施例１のＰＥＧ４００を用いたＣｏＦｅ２Ｏ４ナノ微粒子のＦＴ−ＩＲ測定結果である。
実施例７のコアシェル型ナノ微粒子からは、１１０５ ± ５５ｃｍ−１のＣ−Ｏ−Ｃ逆対称伸縮運動、１４８５ ± １５ｃｍ−１のＣＨ２対称変角振動、３４００ ± ２００ｃｍ−１のＯ−Ｈ間伸縮運動が観測された。
実施例７のコアシェル型ナノ微粒子のＦＴ−ＩＲ測定結果は、ＣＯＣ、ＣＨ２や、Ｏ−Ｈ等の飽和炭化水素に特有の結合のピークを有していることから、ＰＥＧ２０００を用いて作製したＣｏＦｅ２Ｏ４をコアとするコアシェル型ナノ微粒子は、ＰＥＧ２０００に由来するＰＥＧの主鎖がＣｏＦｅ２Ｏ４のコアと化学結合しているものと考えられる。
【符号の説明】
【００８４】
１・・・ナノ微粒子、１０・・・コア、２０・・・シェル、Ｇｌｃ・・・グルコース、Ｇｌｃ’・・・グルコース誘導体
【図１】
2019172213.tif 000014
【図２】
2019172213.tif 000015
【図３】
2019172213.tif 000016
【図４】
2019172213.tif 000017
【図５】
2019172213.tif 000018
【図６】
2019172213.tif 000019
【図７】
2019172213.tif 000020
【図８】
2019172213.tif 000021
【図９】
2019172213.tif 000022
【国際調査報告】
2019172213.tif 000023
2019172213.tif 000024
2019172213.tif 000025
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