(57)【要約】  光免疫療法に利用可能なコンジュゲートを提供する。血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）（１７）に特異的な抗体（１１）に対して、赤色光線から近赤外光線にかけた波長域に吸収波長域が重なる光増感剤（１２）が結合をしているコンジュゲート（１０）。患部に位置する新生血管に対してコンジュゲート（１０）を抗原抗体反応で結合させ、患部に対して６６０〜７４０ｎｍの波長の励起光（２０）を照射することで光増感剤（１２）を励起し、新生血管に対して光増感作用（２１）によりダメージを与える。
2019172110.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）に特異的な抗体に対して、
赤色光線から近赤外光線にかけた波長域に吸収波長域が重なる光増感剤が結合をしている、
コンジュゲート。
【請求項２】
前記ＶＥＧＦＲはＶＥＧＦＲ−２である、
請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記抗体はラムシルマブ（Ramucirumab、IMC-1121B）である、
請求項２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記光増感剤はケイ素フタロシアニン錯体部分を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記光増感剤は下記式で表されるＩＲ７００である、請求項４に記載のコンジュゲート。
【化１】
2019172110.tif 000007
【請求項６】
新生血管を伴う患部の治療剤であって、
請求項１〜５のいずれかに記載のコンジュゲートを含有する治療剤。
【請求項７】
前記患部に位置する新生血管に対して前記コンジュゲートを抗原抗体反応で結合させ、
前記患部に対して６６０〜７４０ｎｍの波長の励起光を照射することで前記光増感剤を励起し、
前記新生血管に対して光増感作用によりダメージを与える、
請求項６に記載の治療剤。
【請求項８】
前記患部が前記新生血管を伴う腫瘍からなる、
請求項７に記載の治療剤。
【請求項９】
さらに追加的コンジュゲートを含有し、
前記追加的コンジュゲートでは、腫瘍細胞の表面抗原に特異的な抗体に対して、赤色光線から近赤外光線にかけた波長域に吸収波長域が重なる光増感剤が結合をしている、
請求項８に記載の治療剤。
【請求項１０】
前記追加的コンジュゲートにおいて、
前記抗体はトラスツズマブであり、
前記光増感剤は下記式で表されるＩＲ７００である、
請求項９に記載の治療剤。
【化２】
2019172110.tif 000008
【請求項１１】
前記治療剤とその他の抗がん剤とを組み合わせた処方であって、
光増感作用によりダメージを与えられた前記腫瘍にさらに前記抗がん剤を接触させる処方のための、
請求項８に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血管を標的とする抗体と光増感剤とのコンジュゲートに関し、特に光免疫療法（Photo-immunotherapy, PIT）に適したコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には光免疫療法（Photo-immunotherapy PIT）、特に近赤外光線免疫療法（Near Infrared-PIT, NIR-PIT）用の抗体−ＩＲ７００コンジュゲートが記載されている。抗体は腫瘍細胞上の抗原に特異的である。ＩＲ７００はＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステルに由来する蛍光団（フルオロフォア）である。コンジュゲートが腫瘍を有する患者に投与された後、腫瘍細胞に結合したコンジュゲートに対して近赤外光が照射される。コンジュゲートが結合した細胞に対してＩＲ７００の光増感作用の影響が及ぶ。光増感作用はコンジュゲートが結合した細胞のみを選択的に光によって破壊することで腫瘍細胞の死滅をもたらす。さらに特許文献２は上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合するセツキシマブとＩＲ７００とのコンジュゲートを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０１４−５２３９０７号公報
【特許文献２】国際公開第２０１７／０３１３６３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は光免疫療法（Photo-immunotherapy、PIT）に適した他のコンジュゲートを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
［１］  血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）に特異的な抗体に対して、赤色光線から近赤外光線にかけた波長域に吸収波長域が重なる光増感剤が結合をしている、コンジュゲート。
［２］  前記ＶＥＧＦＲはＶＥＧＦＲ−２である、［１］に記載のコンジュゲート。
［３］  前記抗体はラムシルマブ（Ramucirumab、IMC-1121B）である、［２］に記載のコンジュゲート。
［４］  前記光増感剤はケイ素フタロシアニン錯体部分を有する、［１］〜［３］のいずれかに記載のコンジュゲート。
［５］  前記光増感剤は下記式で表されるＩＲ７００である、［４］に記載のコンジュゲート。
【化１】
2019172110.tif 000003
［６］  新生血管を伴う患部の治療剤であって、［１］〜［５］のいずれかに記載のコンジュゲートを含有する治療剤。
［７］  前記患部に位置する新生血管に対して前記コンジュゲートを抗原抗体反応で結合させ、前記患部に対して６６０〜７４０ｎｍの波長の励起光を照射することで前記光増感剤を励起し、前記新生血管に対して光増感作用によりダメージを与える、［６］に記載の治療剤。
［８］  前記患部が前記新生血管を伴う腫瘍からなる、［７］に記載の治療剤。
［９］  さらに追加的コンジュゲートを含有し、前記追加的コンジュゲートでは、腫瘍細胞の表面抗原に特異的な抗体に対して、赤色光線から近赤外光線にかけた波長域に吸収波長域が重なる光増感剤が結合をしている、［８］に記載の治療剤。
［１０］  前記追加的コンジュゲートにおいて、前記抗体はトラスツズマブであり、前記光増感剤は下記式で表されるＩＲ７００である、［９］に記載の治療剤。
【化２】
2019172110.tif 000004
［１１］  前記治療剤とその他の抗がん剤とを組み合わせた処方であって、光増感作用によりダメージを与えられた前記腫瘍にさらに前記抗がん剤を接触させる処方のための、[８]に記載の治療剤。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は光免疫療法に適したコンジュゲートを提供することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】コンジュゲートの模式図である。
【図２】モデルマウスの観察像である。
【図３】放射効率（radiant efficiency）のグラフである。
【図４】モデルマウスの観察像である。
【図５Ａ】組織の蛍光観察像である。
【図５Ｂ】図５Ａの像の明暗を反転し見やすくしたものである。
【図６】腫瘍の大きさの時間変化を表すグラフである。
【図７】生存曲線のグラフである。
【図８Ａ】組織の明視野観察像である。
【図８Ｂ】図８Ａの像のコントラストを調整し見やすくしたものである。
【図９】微小血管密度のグラフである。
【図１０Ａ】モデルマウスの観察像である。
【図１０Ｂ】図１０Ａの像の明暗を反転し見やすくしたものである。
【図１１】放射効率（radiant efficiency）のグラフである。
【図１２】腫瘍の大きさの時間変化を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
［１．抗体］
【０００９】
図１に本実施形態のコンジュゲート１０が模式的に示されている。コンジュゲート１０は抗体１１と光増感剤１２とからなる抗体−薬物複合体（ADC, Antibody-Drug Conjugate）である。図に示す例において抗体１１は腫瘍１５内の間質細胞１６に対して特異的なモノクローナル抗体である。抗体１１は間質細胞１６に特有の標的分子１７の有する抗原決定基に対して特異的である。
【００１０】
本実施形態において間質細胞１６は血管内皮細胞である。また標的分子１７は血管内皮細胞増殖因子受容体（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor。以下、ＶＥＧＦＲという。）である。抗体１１はＶＥＧＦＲを標的とする。抗体１１は血管、特に新生血管を標的とする抗体である。
【００１１】
図１に示す抗体１１において、抗体のクラスはＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥのいずれでもよい。図中の抗体１１はＩｇＧである。ＩｇＧのサブクラスは１〜４のいずれでもよい。抗体１１はキメラ抗体でも、ヒト化抗体でも、完全ヒト抗体でもよい。抗体はハイブリドーマ抗体でもよく、リコンビナント抗体でもよい。
【００１２】
図１に示す抗体１１は、免疫グロブリン及びバリアントの全長でもよく部分断片でもよい。部分断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖Ｆｖタンパク質いわゆるｓｃＦｖ、及びジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質いわゆるｄｓＦｖでもよい。図中の抗体１１はＩｇＧの全長である。
【００１３】
図１に示す標的分子１７としてＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２が挙げられる。ＶＥＧＦＲは１から３まであることが報告されている。このうちＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２は血管内皮細胞に発現する。抗体１１はこれらを認識する抗体であればよい。ＶＥＧＦＲはＶＥＧＦＲ−２であることが好ましい。言い換えると抗体１１は抗ＶＥＧＦＲ−２抗体であることが好ましい。なお抗体は血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）とＶＥＧＦＲとの結合に対する拮抗作用を有していてもよく、拮抗作用を有していなくてもよい。一例において抗体１１はラムシルマブ（Ramucirumab、IMC-1121B）である。ラムシルマブはＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合に対する競合的結合阻害作用を有する。
【００１４】
［２．光増感性の付与］
【００１５】
図１に示すようにコンジュゲート１０において光増感剤１２が抗体１１に結合している。抗体１１と光増感剤１２とは共有結合性の結合をしている。図の例示では光増感剤１２がリンカー１３を介して抗体１１の重鎖の定常領域（ＣＨ領域）のＣＨ２に結合している。他の観点においてコンジュゲート１０は光増感剤で修飾された抗体である。共有結合性の結合は非共有結合性の結合に置き換えてもよい。例えば部位特異的な抗体結合ペプチドに対して光増感剤１２を結合させた上で、この抗体結合ペプチドを抗体１１の特定部位に結合させてもよい。
【００１６】
図１において単一の分子であるコンジュゲート１０の全体から見れば、光増感剤１２の部分は原子団と解釈される。またコンジュゲート１０自体を光増感剤と解釈することもできる。しかしながら本明細書では説明を簡便にするため、この原子団の部分に範囲を限定して、これを単に光増感剤と呼ぶものとする。
【００１７】
図１に示す光増感剤１２は所定の吸収波長域を有する。この吸収波長域は赤色光線から近赤外光線にかけた波長域に重なる。赤色光線から近赤外光線にかけた波長域は、波長６５０〜８５０ｎｍの波長域であることが好ましい。
【００１８】
係る波長域が選ばれる理由は生体内の物質に依拠する。生体内にはコラーゲン、ヘモグロビン、水といった光の吸収物質がある。上記波長域の光線は、他の波長域の光線に比べてこれらに吸収される割合が小さい。このことを指して“NIR window”と呼ばれることがある。さらに近赤外光線は生体に対して及ぼす害が小さいながらも、生体の深部に届きやすい。なおこれらの説明は光増感剤１２の物性の説明であって、後述する照射用の光線の波長を狭く解釈するものではない。
【００１９】
技術分野によっては波長６５０〜８５０ｎｍの波長域には近赤外光線のみならず、可視光線が含まれるものと解釈される場合がある。これは係る波長域が近赤外光線と可視光線との間の接続領域であるためである。しかしながらこのような波長域の光が赤外線であるか可視光線であるかの厳密な区別は発明の本質と強く関連しない。本実施形態ではコンジュゲートが励起光を照射されることで光増感作用を発揮する際、励起光の中に近赤外光線の他に赤い可視光線が成分として含まれていてもよいものとする。
【００２０】
図１に示す光増感剤１２は蛍光団又は発色団でもよい。本実施形態において光増感剤１２が波長６５０〜８５０ｎｍの波長域に蛍光を発したとしてもかかる蛍光は積極的に用いられない。光増感剤１２が光増感作用２１を有していることで、励起光２０の有する光エネルギーを間質細胞１６に対するダメージに変換できればよい。光増感剤１２が光エネルギーを間質細胞１６に対するダメージに変換できる割合が高いほどよい。またその分、蛍光として患部から出ていくエネルギーが減ってもよい。これらの観点から光増感剤を選別してもよい。
【００２１】
図１に示す光増感剤１２はケイ素フタロシアニン錯体部分（原子団）を有する。光増感剤１２は下記式で表されるＩＲＤｙｅ７００ＤＸ、略称ＩＲ７００が好ましい。なお「ＩＲＤｙｅ」は商標である。
【００２２】
【化３】
2019172110.tif 000005
【００２３】
ＩＲ７００は例えばＬＩ−ＣＯＲ社から下記式に示すＮＨＳエステルとして提供されている。ＮＨＳエステルは例えば抗体の定常領域に位置するアミノ基を容易に標識することが出来る。
【００２４】
【化４】
2019172110.tif 000006
【００２５】
光増感剤１２に応用され得る他の光増感剤又は光増感剤の有する構造としては、ポルフィリンやポルフィリン骨格を有する誘導体や、フタロシアニンやフタロシアニン骨格を有する誘導体が挙げられる。ＩＲ７００と類似する構造を有するナフタロシアニンが挙げられる。光増感剤は光線力学的療法（ＰＤＴ）に用いられるポルフィリン系の誘導体でもよい。ポルフィリン系の誘導体の例としてクロリンｅ６、プロトポルフィリン及びヘマトポルフィリン誘導体（ＨｐＤ）が挙げられる。
【００２６】
［３．治療剤の製造］
【００２７】
治療剤にはコンジュゲートが含まれている。一態様において治療剤は光感受性新生血管阻害薬である。治療剤には薬学的に許容されるキャリアが含まれる。薬学的に許容される流体及び生理学的に許容される流体を、ビヒクルとして非経口製剤の調製に用いてもよい。ビヒクルの例は、水、生理食塩液、平衡塩類溶液、水性デキストロース、又はグリセロールである。湿潤剤、乳化剤、防腐剤、及びｐＨ緩衝剤などをさらに添加してもよい。添加例としては酢酸ナトリウムやソルビタンモノラウレートである。
【００２８】
［４．治療剤の使用法］
【００２９】
＜投与＞
【００３０】
上述のコンジュゲートは光免疫療法（Photo-immunotherapy、PIT）、特に近赤外光線免疫療法（Near Infrared-PIT, NIR-PIT）における使用に適している。本実施形態の治療剤はコンジュゲートを含有する。治療剤は新生血管を伴う患部の治療に用いる。治療は光免疫療法によって行われる。まず治療にあたり患者に治療剤を投与する。
【００３１】
投与経路として、局所経路、注射（皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、腫瘍内注射、及び静脈内注射など）、経口経路、眼経路、舌下経路、直腸経路、経皮経路、鼻腔内経路、膣経路、及び吸入経路が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３２】
静脈内投与であれば、コンジュゲートは血中を巡り患部に到達する。投与により患部に位置する新生血管に対してコンジュゲートを特異的に結合させる。結合は間質細胞１６の表面の標的分子１７と抗体１１との間の抗原抗体反応によって行われる。結合の結果コンジュゲートは拡散せずに患部に局在するようになる。
【００３３】
＜照射＞
【００３４】
本実施形態のコンジュゲートを含む治療剤は一種の分子標的治療薬であるが、このコンジュゲートは腫瘍細胞に対して特異的ではない。コンジュゲートは腫瘍外の他の組織の細胞上の標的分子に結合している場合がある。さらに特異性を高めるために照射部位を限定する。
【００３５】
図１に示すようにコンジュゲート１０の結合した腫瘍１５を狙い撃ちにして励起光２０を照射する。間質細胞１６は腫瘍１５内の間質として存在する。間質細胞１６の周りには腫瘍細胞１８がある。なお図は模式的なものであり腫瘍や新生血管の組織学的な特徴は表していない。
【００３６】
図１において、励起光２０を受けた光増感剤１２は励起される。励起された光増感剤１２が光増感作用２１を発揮することで、間質細胞１６にダメージを与える。光増感作用２１は腫瘍細胞１８に対して与えられてもよい。光増感作用２１は必ずしも電磁波とは限らない。励起光２０として波長６５０〜９００ｎｍの、好ましくは６６０〜７４０ｎｍ、さらに好ましくは６６０〜７１０ｎｍの光線を照射する。波長は６８０ｎｍでもよい。
【００３７】
図１に示す励起光２０の照射線量は好ましくは１（Ｊ／ｃｍ２）以上であり、さらに好ましくは１０〜５００（Ｊ／ｃｍ２）である。照射線量は２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００及び４００（Ｊ／ｃｍ２）のいずれかでもよい。励起光２０の光源はＬＥＤでもよい。
【００３８】
１回のコンジュゲートの投与後に、１回又は２回以上の照射をしてもよい。照射は２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回でもよい。コンジュゲートの投与は２回以上行ってもよい。２回目以降のコンジュゲートの投与後の照射回数も１回又は２回以上でよい。
【００３９】
＜ダメージの範囲＞
【００４０】
本実施形態において標的となる患部は新生血管を伴う腫瘍である。腫瘍の治療に際しては、腫瘍に付随する新生血管の血管内皮細胞を標的としてコンジュゲートを結合させる。次にコンジュゲートが結合した細胞に対して励起光を照射する。このような細胞はしばしば腫瘍の間質として存在している。したがって励起光は腫瘍細胞に対しても照射され得る。ダメージは新生血管に対して特異的に光増感作用により与えられる。新生血管に対するダメージは新生血管に支えられている腫瘍細胞の生存にも影響を与えると考えられる。
【００４１】
＜追加的コンジュゲート＞
【００４２】
治療剤にはさらに追加的コンジュゲートが含有されてなる混合治療剤でもよい。追加的コンジュゲートは腫瘍細胞の表面抗原に特異的な抗体から構成される。係る抗体に対して光増感剤が共有結合性の結合をしている。光増感剤は赤色光線から近赤外光線にかけた波長域（波長６５０〜８５０ｎｍ）に吸収波長域が重なる。抗体はトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）でもよい。光増感剤はＩＲ７００でもよい。コンジュゲートは実施例で説明するＴｒａ−ＩＲ７００でもよい。共有結合性の結合は非共有結合性の結合に置き換えてもよい。例えば部位特異的な抗体結合ペプチドに対して光増感剤を結合させた上で、この抗体結合ペプチドをトラスツズマブ等の抗体の特定部位に結合させてもよい。
【００４３】
例えば混合治療剤によってＴｒａ−ＩＲ７００などの他の光増感性のコンジュゲートをＲａｍ−ＩＲ７００と同時投与することができる。この場合、これらのコンジュゲートへの照射は一まとめに行うことが出来る。ただしこれらのコンジュゲートは必ずしも同時に投与しなくてもよい。また励起光の照射は各コンジュゲートを含む各治療剤の投与ごとに時期をずらして行ってもよい。
【００４４】
＜他の療法の併用＞
【００４５】
光免疫療法の後にはさらに、腫瘍に対して化学療法を適用してもよく、しなくてもよい。化学療法のための治療剤には、腫瘍細胞を標的とした化学療法剤、及び抗脈管形成剤などの抗新生物剤が挙げられる。化学療法免疫抑制剤（リツキシマブ、ステロイドなど）、またはサイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦなど）も挙げられる。化学療法剤に関して以下を参照されたい。
【００４６】
化学療法剤には、カルボプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、トポテカン、イリノテカン、ゲムシタビン、チアゾフリン（iazofurine）、ゲムシタビン、エトポシド、ビノレルビン、タモキシフェン、バルスポダール、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、ミトキサントロン、ドキシル（リポソームに封入されたドキソルビシン（doxiorubicine））、及びビノレルビンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４７】
本実施形態では、コンジュゲートを含む治療剤とその他の化学療法のための治療剤とを組み合わせた処方として提供される。係る処方を用いる際は光免疫療法によりダメージを与えられた腫瘍に、さらに上述の化学療法のための治療剤を接触させる。処方はコンジュゲートを含む治療剤とその他の化学療法のための治療剤との組み合わせ剤として提供されてもよい。
【００４８】
なお化学療法は、光免疫療法の前に行ってもよく、同時期に平行して行ってもよい。さらに手術、放射線療法、及び粒子線療法をこれらと組み合わせてもよい。
【００４９】
＜腫瘍の種類＞
【００５０】
本実施形態の光免疫療法で処置される腫瘍には、乳癌（例えば、小葉癌及び腺管癌）、肉腫、肺癌（例えば、非小細胞癌、大細胞癌、扁平上皮癌、及び腺癌）、肺中皮腫、結腸直腸腺癌、胃癌、前立腺癌、卵巣癌（漿液性嚢胞腺癌及びムチン性嚢胞腺癌など）、卵巣胚細胞腫瘍、精巣癌、及び精巣胚細胞腫瘍、膵臓腺癌、胆管腺癌、肝細胞癌、膀胱癌（例えば、移行上皮癌、腺癌、及び扁平上皮癌を含めた）、腎細胞腺癌、子宮内膜癌（例えば、腺癌及び混合型ミュラー腫瘍（癌肉腫）を含めた）、子宮内頸部の癌、子宮外頸部の癌、及び膣癌（これらの各々の腺癌及び扁平上皮癌など）、皮膚の腫瘍（例えば、扁平上皮癌、基底細胞癌、悪性黒色腫、皮膚付属器腫瘍（skin appendage tumor）、カポジ肉腫、皮膚リンパ腫、皮膚付属器腫瘍（skin adnexal tumor）、ならびに様々な種類の肉腫及びメルケル細胞癌）、食道癌、鼻咽頭癌及び口腔咽頭癌（これらの扁平上皮癌及び腺癌を含めた）、唾液腺癌、脳腫瘍及び中枢神経系腫瘍（例えば、神経膠、神経細胞、及び髄膜を起源とする腫瘍を含めた）、末梢神経腫瘍、軟組織肉腫及び骨肉腫及び軟骨肉腫などの固形腫瘍、ならびにリンパ腫瘍（Ｂ細胞悪性リンパ腫及びＴ細胞悪性リンパ腫を含めた）が含まれていてもよい。一例では、腫瘍が、腺癌である。リンパ腫を含めて、これらの腫瘍には新生血管が関与する。また所定の腫瘍に対して、新生血管を標的としないコンベンショナルなＰＩＴの効果が確認されている場合には、本実施形態の光免疫療法で処置される腫瘍に当該腫瘍が含まれてもよい。
【００５１】
＜治療有効量＞
【００５２】
治療にあたってコンジュゲートの治療有効量を推定する必要がある。治療有効量は治療剤単独で、又は（１若しくは複数の）さらに他の治療剤と共に、処置される患者体又は患部において所望の効果を達成するのに十分な治療剤の量である。治療有効量は、処置される患者又は患部、コンジュゲートの種類、及び投与方法といった複数の因子に依存してもよい。
【００５３】
治療有効量は、疾患の進行を遅延させるか、もしくは疾患の退縮を引き起こすのに十分な量である。疾患ががんであれば、がんの転移を防止するのに十分な量としてもよい。また疾患により引き起こされる症状を軽減するできる量である。あるいは疾患ががんであれば、腫瘍を有する患者の生存期間を延長するのに十分な量をいう。
【００５４】
疾患の退縮について次の通り考えてもよい；光免疫療法後の腫瘍のサイズが、コンジュゲートの非存在下における光免疫療法後の腫瘍のサイズと比較して、例えば、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は１００％低減したこと。
【００５５】
疾患の退縮について次の通り考えてもよい。光免疫療法後の腫瘍の細胞数が、コンジュゲートの非存在下における光免疫療法後の腫瘍の細胞数と比較して、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は１００％死滅したこと。
【００５６】
生存期間の延長について次の通り考えてもよい。光免疫療法後の生存期間が、コンジュゲートの非存在下における光免疫療法後の生存期間（１００％）と比較して、さらに少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも１００％長いことである。
【００５７】
事前に決定した一般的な治療有効量に関わらず、個々の患者における治療有効量は患者のコンディションに応じて変化する。個々の治療における有効量は患者に対する投与量を変化させることで、腫瘍の退縮具合などを観察することにより決定してもよい。個々の治療における有効量を、イムノアッセイその他の測定試験を介して決定してもよい。
【００５８】
治療剤は治療有効量を投与するために、単回投与で投与してもよく、複数回投与で投与してもよい。
【００５９】
コンジュゲートの治療有効量は例えば体重６０キログラム当たり少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも２０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも３０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも５０ｍｇ／６０ｋｇである。静脈内投与では、例えば０．５〜５０ｍｇ／６０ｋｇである。用いる量は１ｍｇ／６０ｋｇ、２ｍｇ／６０ｋｇ、５ｍｇ／６０ｋｇ、２０ｍｇ／６０ｋｇ、又は５０ｍｇ／６０ｋｇでもよい。
【００６０】
コンジュゲートの治療有効量は、体重を基準として、少なくとも１０μｇ／ｋｇ、少なくとも１００μｇ／ｋｇ、少なくとも５００μｇ／ｋｇ又は少なくとも５００μｇ／ｋｇである。腹腔内投与では、例えば１０μｇ／ｋｇ〜１０００μｇ／ｋｇである。用いる量は例えば１００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、又は１０００μｇ／ｋｇでもよい。
【００６１】
＜変形例＞
【００６２】
なお、本発明は上記実施の形態に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが可能である。上記実施形態ではヒトの患者の患部を例にして説明した。患者は哺乳動物に置き換えてもよい。患部はin vitro又はin vivoの人工的な培養組織に置き換えてもよい。
【００６３】
また上記実施形態では患部として腫瘍を中心に説明した。新生血管を伴う患部の他の一例は脈絡膜新生血管を伴う加齢黄斑変性を起こした黄斑部である。黄斑部に生じた変性部位に対して上述の腫瘍と同様に、上述の光免疫療法によってダメージをあたえてもよい。加齢黄斑変性の治療に際しては、変性部位中の新生血管の血管内皮細胞にコンジュゲートを結合させる。次に変性部位に対して励起光を照射する。
【００６４】
他の疾患の一例は未熟児網膜症や増殖性糖尿病網膜症である。これらの疾患では網膜において新生血管が増殖する病態が見られる。このため、これらの疾患は失明を引き起こすことがある。この病態の見られる網膜に対して上述の腫瘍と同様に、上述の光免疫療法によってダメージをあたえてもよい。これらの疾患の治療に際しては、病態の見られる部位の新生血管の血管内皮細胞にコンジュゲートを結合させる。次にその部位に対して励起光を照射する。
【実施例】
【００６５】
＜１．合成＞【００６６】
ラムシルマブに対してＩＲＤｙｅ７００ＤＸのＮＨＳエステル（ＬＩ−ＣＯＲ社）を反応させることでコンジュゲートを作成した。本実施例ではかかるコンジュゲートをＲａｍ−ＩＲ７００と称する。同様にＨＥＲ２特異的な抗体であるトラスツズマブのコンジュゲートを得た。これをＴｒａ−ＩＲ７００と称する。【００６７】
＜２．動物試験＞【００６８】
図２には腫瘍を生じたモデルマウスが示されている。モデルマウスは以下の通り作製した。６週齢メスのヌードマウスに対してＨＥＲ２陽性細胞株であるＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃癌細胞株を５×１０６個皮下移植した。１−２週の経過観察によってマウス皮下腫瘍モデルが得られた。【００６９】
図２ではＴｒａ−ＩＲ７００及びＲａｍ−ＩＲ７００をモデルマウスに対して以下の通り静脈内投与（i.v.）した。１００ｕｇのＴｒａ−ＩＲ７００コンジュゲート、１００ｕｇのＲａｍ−ＩＲ７００コンジュゲート、又は両者（計２００μｇ）をマウス尾静脈より投与した。【００７０】
図２ではモデルマウス体内におけるＴｒａ−ＩＲ７００及びＲａｍ−ＩＲ７００の局在は以下の通り観察した。コンジュゲートの標的腫瘍に対する選択的な局在は、小動物イメージングシステムを用いてＩＲ７００のシグナルを経時的に計測することで確認した。【００７１】
図２における観察の結果は以下の通りであった。ＮＣＩ−Ｎ８７細胞株の皮下腫瘍では時間の経過につれてＴｒａ−ＩＲ７００が分子標的に対して選択的に局在するようになることが認められた。さらにＮＣＩ−Ｎ８７細胞株の皮下腫瘍では時間の経過につれてＲａｍ−ＩＲ７００が分子標的に対して選択的に局在するようになることが認められた。先にも述べたとおりＲａｍ−ＩＲ７００を構成する抗体（ラムシルマブ）は腫瘍新生血管に発現したＶＥＧＦＲ−２を分子標的として選択的に結合する。【００７２】
図３にはＴｒａ−ＩＲ７００及びＲａｍ−ＩＲ７００の放射効率（radiant efficiency）のグラフが示されている。各曲線の表すところは以下の通りである。ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍におけるＴｒａ−ＩＲ７００およびＲａｍ−ＩＲ７００の選択的な局在のシグナルは、試薬の静脈投与後１−２日でピークとなった。局在のシグナルはその後経時的に減少した。また、Ｔｒａ−ＩＲ７００およびＲａｍ−ＩＲ７００を併用して静脈投与するとＩＲ７００の局在のシグナルは相加的に増加した。【００７３】
図４にはモデルマウスが示されている。図２と異なる点は以下の通りである。ヌードマウスの右後肢に対してＨＥＲ２を発現したＮＣＩ−Ｎ８７細胞株を、同じヌードマウスの左後肢に対してＨＥＲ２を発現しないＡ４３１細胞株を移植した。Ｔｒａ−ＩＲ７００およびＲａｍ−ＩＲ７００の分子標的に対する選択性をＩＲ７００のシグナル計測にて評価した。Ｔｒａ−ＩＲ７００はＨＥＲ２分子に対して選択的に局在した。これに対して、Ｒａｍ−ＩＲ７００はどちらの腫瘍に対しても局在した。これらの細胞から形成される腫瘍には通常、新生血管が生じる。実験結果はＲａｍ−ＩＲ７００が新生血管に対して選択的であるとともに、腫瘍に対しても選択的であることを示している。【００７４】
図５Ａ及びＢにはモデルマウスから採取した腫瘍の組織切片の蛍光観察像が示されている。細胞がいずれの場所にあるかはDAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）のシグナルで確認した。図に示すようにラムシルマブ（Ram-Alexa488）と、トラスツズマブ（Tra-Cy5）の染色像はあまり重なっていない。このためラムシルマブはトラスツズマブと異なり、腫瘍細胞の間に位置する間質に対して特異的に結合することが分かる。【００７５】
図６は腫瘍の大きさの時間変化を表すグラフである。キャリアのみの投与、Ｔｒａ−ＩＲ７００単独投与、Ｒａｍ−ＩＲ７００単独投与、並びにＴｒａ−ＩＲ７００及びＲａｍ−ＩＲ７００の混合投与の各ケースが示されている。また励起光として近赤外光線（ＮＩＲ）を照射した場合としなかった場合とで分けられている。【００７６】
図６に示すデータの検定は以下の通り行った。担癌マウスは治療介入時にランダマイズされるとともに各群１０匹ずつ用意された。腫瘍体積の計測は週３回行った。治療群のデータはMann-WhitneyのＵ検定によって非治療群（control）のデータと比較した。Ｒａｍ−ＩＲ７００を単独投与した群であって近赤外光照射処置をした群において腫瘍増大に対する抑制効果のあることが分かった。Ｒａｍ−ＩＲ７００を投与したが、近赤外光照射処置をしなかった群では有意な治療効果は得られなかった。また近赤外光照射処置を行った場合には、混合投与によりＴｒａ−ＩＲ７００単独投与の時よりも高い抑制効果が得られた。【００７７】
図７は図６に示した各ケースのマウスの生存曲線を示している。データの検定はｌｏｇ  ｒａｎｋ検定により行った。Ｒａｍ−ＩＲ７００の投与に光照射を加えた群では無治療の群（control）よりも有意な生存期間の延長が見られた。光照射を加えた各群ではＲａｍ−ＩＲ７００単独投与でも生存性が高まった。また光照射を加えた各群では混合投与によりＴｒａ−ＩＲ７００単独投与のケースよりも生存性が高まった。【００７８】
図８Ａ及びＢは光免疫療法後の腫瘍組織の明視野観察像である。ＰＩＴ直後の腫瘍組織内における血管構造の変化をＣＤ−３１免疫染色によって評価した。具体的な方法は以下の通りであった。ＰＩＴ処置後２４時間後に腫瘍を摘出し、パラフィン包埋された切片に対して抗マウスＣＤ３１抗体（Ｄｉａｎｏｖａ，  ＤＩＡ−３１０）を４度で１２時間反応させた。その後ImmPRESS HRP 抗ラット IgG抗体（Vector Lab.）を室温で３０分反応させた。その後、ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit (Vector)でＣＤ３１陽性細胞を可視化させた。“control”は非治療コントロール、“Tra-IR700+NIR 100J/cm2”はＴｒａＩＲ７００投与と近赤外光照射との組み合わせ、RamはＲａｍＩＲ７００投与のみ、“Ram-IR700+NIR 100J/cm2”はＲａｍＩＲ７００投与と近赤外光照射との組み合わせをそれぞれ表す。【００７９】
図９は図８Ａ及びＢに示した微小血管の密度を表すグラフである。評価方法は以下の通りである。腫瘍切片スライド内の最も血管密度が高い領域５領域を目視によって選抜した。これらの領域にてＣＤ３１染色陽性の血管数を２００倍の視野で測定した。Studentのｔ検定によって非治療コントロール（control）と比較した時の血管密度の変化を評価した。【００８０】
図９に示すようにＲａｍＩＲ７００投与と近赤外光照射との組み合わせでは腫瘍内新生血管の減少を認めた。これに対して、ＲａｍＩＲ７００投与のみやＴｒａＩＲ７００と近赤外光照射との組み合わせでは統計学的に有意な新生血管の減少は認めなかった。【００８１】
以上よりＲａｍ−ＩＲ７００は新生血管を伴う腫瘍に対する光免疫療法に適したコンジュゲートであることが示された。【００８２】
＜３．抗体の交差性の考慮＞【００８３】
上記の例ではラムシルマブ（Ram-Alexa488）は抗ヒト型ＶＥＧＦＲ−２抗体である。抗体の交差性及び特異性を考慮するために、コンジュゲートの抗体を抗マウス型ＶＥＧＦＲ−２抗体（ＤＣ１０１）に代えて同様の試験を行った。【００８４】
図１０Ａ及びＢは腫瘍を生じたモデルマウスを示している。Ｔｒａ−ＩＲ７００及びＤＣ１０１−ＩＲ７００をモデルマウスに対してそれぞれ１００ｕｇずつ静脈内投与（i.v.）した。モデルマウス体内におけるＴｒａ−ＩＲ７００及びＤＣ１０１−ＩＲ７００の局在は図２と同様に検出した。【００８５】
図１０Ａ及びＢが示すように、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞株により生じた皮下腫瘍に対して、Ｔｒａ−ＩＲ７００が分子標的を目印に選択的に局在することが認められた。またＮＣＩ−Ｎ８７細胞株により生じた皮下腫瘍に対して、ＤＣ１０１−ＩＲ７００が分子標的を目印に選択的に局在することが認められた。先にも述べたとおりＤＣ１０１−ＩＲ７００を構成する抗体はマウスのＶＥＧＦＲ−２を分子標的として選択的に結合する。【００８６】
図１１はＴｒａ−ＩＲ７００及びＤＣ１０１−ＩＲ７００の放射効率（radiant efficiency）のグラフを示す。ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍におけるＴｒａ−ＩＲ７００およびＤＣ１０１−ＩＲ７００の選択的な局在のシグナルは、試薬の静脈投与後１−２日でピークとなった。局在のシグナルはその後経時的に減少した。【００８７】
図１２は腫瘍の大きさの時間変化を表すグラフである。キャリアのみの投与、Ｔｒａ−ＩＲ７００単独投与、ＤＣ１０１−ＩＲ７００単独投与の各ケースが示されている。また励起光として近赤外光線（ＮＩＲ）を照射した場合としなかった場合とで分けられている。【００８８】
図１２に示すデータの検定は図６と同様に行った。ＤＣ１０１−ＩＲ７００を投与した群であって近赤外光照射処置をした群において腫瘍増大に対する抑制効果のあることが分かった。ＤＣ１０１−ＩＲ７００を投与したが、近赤外光照射処置をしなかった群では有意な治療効果は得られなかった。【００８９】
以上よりＤＣ１０１−ＩＲ７００はＲａｍ−ＩＲ７００と同様に、新生血管を伴う腫瘍に対する光免疫療法に適したコンジュゲートであることが示された。またヒトとマウスとの間における抗ＶＥＧＦＲ−２抗体の交差性及び特異性を考慮した上でも、図２〜図９に表された各実験が抗体コンジュゲートの治療上の有効性をサポートしていることが示された。【００９０】
この出願は、２０１８年３月９日に出願された日本出願特願２０１８−０４２８０３を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【符号の説明】
【００９１】
１０  コンジュゲート、  １１  抗体、  １２  光増感剤、  １３  リンカー、  １５  腫瘍、  １６  間質細胞、  １７  標的分子、  １８  腫瘍細胞、  ２０  励起光、  ２１  光増感作用
【図１】
2019172110.tif 000009
【図２】
2019172110.tif 000010
【図３】
2019172110.tif 000011
【図４】
2019172110.tif 000012
【図５Ａ】
2019172110.tif 000013
【図５Ｂ】
2019172110.tif 000014
【図６】
2019172110.tif 000015
【図７】
2019172110.tif 000016
【図８Ａ】
2019172110.tif 000017
【図８Ｂ】
2019172110.tif 000018
【図９】
2019172110.tif 000019
【図１０Ａ】
2019172110.tif 000020
【図１０Ｂ】
2019172110.tif 000021
【図１１】
2019172110.tif 000022
【図１２】
2019172110.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月27日(2019.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
新生血管を伴う腫瘍の治療剤であって、
ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ、ＩＭＣ−１１２１Ｂ）に対して、赤色光線から近赤外光線にかけた波長域に吸収波長域が重なる光増感剤が結合をしているコンジュゲートを含有し、
前記腫瘍に位置する新生血管に対して前記コンジュゲートを抗原抗体反応で結合させ、前記腫瘍に対して６６０〜７４０ｎｍの波長の励起光を照射することで前記光増感剤を励起し、前記新生血管に対して光増感作用によりダメージを与える、
治療剤。
【請求項２】
トラスツズマブに対して、赤色光線から近赤外光線にかけた波長域に吸収波長域が重なる光増感剤が結合をしているコンジュゲートを含有する他の治療剤を投与されている患者に対して投与する、
請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
前記ラムシルマブの前記光増感剤はケイ素フタロシアニン錯体部分を有する、請求項１又は２に記載の治療剤。
【請求項５】
前記ラムシルマブの前記光増感剤は下記式で表されるＩＲ７００である、請求項４に記載の治療剤。
【化１】
2019172110.tif 000024
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
トラスツズマブに対して、赤色光線から近赤外光線にかけた波長域に吸収波長域が重なる光増感剤が結合をしている追加的コンジュゲートをさらに含有する、
請求項１に記載の治療剤。
【請求項１０】
前記トラスツズマブの前記光増感剤は下記式で表されるＩＲ７００である、請求項９に記載の治療剤。
【化２】
2019172110.tif 000025
【請求項１１】
前記治療剤とその他の抗がん剤とを組み合わせた処方であって、
光増感作用によりダメージを与えられた前記腫瘍にさらに前記抗がん剤を接触させる処方のための、
請求項１に記載の治療剤。
【国際調査報告】
2019172110.tif 000026
2019172110.tif 000027
2019172110.tif 000028
2019172110.tif 000029