(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
入射光を金属薄膜の裏面で反射させ、当該反射光の偏光を測定する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置において、当該入射光の光源が２種以上の波長の異なる光源からなるものであり、当該金属薄膜がプリズムに密着しており、かつ金属薄膜上における化学反応又は物質間の相互作用が生起する前に、それぞれの波長における反射光の偏光のｐ成分とｓ成分との位相差を補償器により打ち消すように調整して反射光の光量をゼロとし、金属薄膜上における化学反応又は物質間の相互作用により新たに生じた偏光の位相差による反射光の光量を検出、定量できる装置を有し、かつ２種以上の波長の異なる光源からの入射光が、金属薄膜の表面から異なる位置にある物質の反応や作用を観測することを特徴とする表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置。
【請求項２】
金属薄膜上での化学反応又は物質間の相互作用が、抗原−抗体反応、錯体形成反応又は受容体との反応である請求項１に記載の装置。
【請求項３】
金属薄膜上での化学反応が抗原−抗体反応である請求項２に記載の装置。
【請求項４】
測定した値を記録、処理することができる装置をさらに有する請求項１〜３のいずれかに記載の装置。
【請求項５】
金属薄膜が、金属薄膜の表面に抗原若しくは抗体又は受容体が固定化されたものである請求項１〜４のいずれかに記載の装置。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載する装置を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を測定する方法。
【請求項７】
金属薄膜の表面に抗原又は抗体を固定化した金属薄膜を用いて、請求項６に記載の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を測定する方法により検体中の抗体又は抗原を検出又は定量する方法。
【請求項８】
金属薄膜の表面に受容体を固定化した金属薄膜を用いて、請求項６又は７に記載の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を測定する方法により検体中の前記受容体に結合する物質を測定又はスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の装置及び測定方法に関する。より詳細には、本発明は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置において、共鳴シグナルを金属薄膜で反射された反射光の偏光、好ましくは偏光のｐ成分とｓ成分との偏光成分により測定することを特徴とする表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置及びそれを用いた測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在の生化学・分子生物化学・細胞生物学は、主としてタンパク質間の相互作用、あるいは、タンパク質と他の分子との相互作用が研究の対象とされてきている。また、病気などの診断、測定の分野においては、抗原、抗体反応などの蛋白質間の相互作用又は蛋白質と他の分子との相互作用が多数利用されてきている。これらの蛋白質の作用については、種々の化学的、生化学的又は分子生物学的方法で検出、同定されているが、いずれの方法も蛋白質の相互作用をリアルタイムで測定するものではなく、相互作用、例えば反応の結果を測定することしかできないものであった。また、これらの測定法の多くは蛋白質などを標識化しなければ測定することができないものであった。さらに、実際のタンパク質同士の相互作用を解析するためには、速度論的な解析がきわめて重要になってくるが、従来の測定装置では速度論的な解析は大変な作業となることが多かった。
【０００３】
一方、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐ１ａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ））は、１９７１年、クレッチェマン（Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ）により光励起による表面ブラズモン励起法が確立され、それから１１年後、ＳＰＲが初めてナイランダー（Ｎｙｌａｎｄｅｒ）らによってセンサーとしてガスセンシングに応用された例が報告された。１９８０年代後半には、チオール、スルフィド類等の金表面に対する自己吸着の研究が行われ、カルボン酸やアミノ基など様々な官能基をもったアルキルチオール類で金表面を修飾した自己吸着性単層膜（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）の研究例が報告された。１９９３年、金表面の自己吸着性単層膜（Ｓｅｌｆ−ＡｓｓｅｍｂｌｅｄＭｏｎｏｌａｙｅｒ）上にポリマーを膜として固定化し、ポリマー中の活性部位に抗原−抗体などの特異的な反応を示すリガンドを固定したバイオセンサーが開発され、定性、定量分析や反応プロセスの解明などに用いられるようになった。
また、この頃から小型化を目的とした光ファイバー型ＳＰＲセンサーの研究例が報告され始め、従来の光源の波長を一定にし、試料への共鳴の起こる入射角を測定する方法から、光の入射角を一定にし波長を変化させるセンサー装置が開発された。
【０００４】
また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のよる測定は、エバネッセント波を用いて間接的に試料の状態変化を測定するデバイスである。例えば、金属薄膜の表面で生起している化学反応を当該金属薄膜の裏面から測定することができる測定装置である。このため、測定に使われるレーザー光の通る部位と試料の存在する部位が異なることから、金属薄膜センサー表面で起こる各種の反応や相互作用をリアルタイムでかつ連続的に測定することができる、測定に使用する光が試料に直接照射されないので試料の着色、濁りや気泡などの影響を受けにくい、及び、金属薄膜センサーの狭い領域での光学特性を測定するので必要とする試料溶液の量が極めて少なくてすむ、という極めて特殊な特性を有している。
したがって、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いることにより、金属薄膜センサー上で生起する相互作用や化学反応を、測定系による影響を受けることなく、リアルタイムで連続的に測定することができることになる。さらに、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）では標識物質を介さずに測定できるという点で、従来から感染症の検査や診断の分野において利用されてきたＲＩＡやＥＩＡなどの免疫測定法をＳＰＲ法に置き換えるためのセンサーデバイスとして注目されている測定法である。
【０００５】
ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐ１ａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）センサーは、金や銀などの金属薄膜表面に発生する表面プラズモン共鳴現象を利用して、金属薄膜表面付近の屈折率変化を検出するデバイスである。表面プラズモンとは、金属−誘電体界面に生じる電子の疎密波の一種であり、その波数は金属薄膜表面に接する数１００ｎｍまでの試料の厚さや光学特性（誘電率、屈折率）によって変化する。この変化を直接測定することは不可能なため、ＳＰＲセンサーではしーザー光を試料の反対面から当てエバネッセント波を発生させ、これが表面ブラズモンと共鳴する時のレーザーの反射角度変化又は反射強度の変化を測定することで表面の状態の変化を間接的に測定するのが一般的な方法となっている。
【０００６】
ＳＰＲ測定法の例を図１に示す。図１の装置では光源に発光ダイオードを用い、波長７６０ｎｍの偏光をプリズムでくさび型の光に集光し、プリズムの底部にオプトインターフェイスを介して装着させたセンサーチップに全反射の条件下で照射している。すると金薄膜側にエバネッセント波が生じ、金薄膜の自由電子によるブラズモンの共鳴に使われるため、固定したダイオードアレイでこの反射光の強度を測定すると、図２に示されるような「光の谷」が認められる。そして、例えば金薄膜を形成したセンサーチップ上に抗体を固定化し、この抗体が特異的に認識する抗原を含む試料を注入すると、特異的抗原−抗体反応によりセンサーチップ表面の質量が増加し、その結果としてセンサーチップ表面の屈折率が増加する。この屈折率の実部又は虚部の変化に応じて前記の「光の谷」は図２に示されるように角度変化又は反射強度変化がＡ点からＢ点へと移動するため（図２では角度変化を示す。）、この移動度の経時変化をセンサーグラムと呼ぶグラフとして表示することにより、センサーチップ表面での分子の相互作用をリアルタイムにモニターすることができる。
【０００７】
この「光の谷」の移動度を表わす単位として、ＳＰＲ角度の０．１０の変化が１０００レゾナンスユニット（ＲＵ）と定義されており、１０００ＲＵはセンサーチップ表面でのタンパク質の約１ｎｇ／ｍｍ２の質量変化に相当することが確認されている。従来の測定においては１０ＲＵ程度からの変化を観察することができ約０．０１ｎｇ／ｍｍ２の質量変化を検出することが限界とされている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
このようにＳＰＲは他の光学測定装置とは異なる特異的な特徴を有しているために、今後ＳＰＲセンサーは、医療分野での遺伝子診断装置や、医薬品分野での新規薬剤設計などに有効に利用され得る新しい測定装置としての期待されているのであるが、より精度を上げるためには０．００１度以下の反射角を厳密測定しなければならないことや、乱反射によるノイズが大きく精密な測定が困難であることや、さらに、試料の屈折率、分子の反応速度、溶媒の性状などは温度により微妙に変化するものであるので、光学測定部分の温度を４〜４０℃の範囲で一定温度に厳密に制御することが難しいという課題があり、広く普及するにはまだ多くの問題が残されている。
【０００９】
本発明は、簡便で、高精度で、高信頼性で、かつ安定したＳＰＲの測定が可能な新規なＳＰＲ装置及びその測定方法を提供するものである。
また、本発明はリアルタイムの化学反応、特に抗原−抗体反応を高精度、高信頼性で測定できる新規な装置及び測定方法を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはＳＰＲの特徴を生かしながら、ＳＰＲの直面している問題点を解決するために鋭意研究したところ、ＳＰＲの測定を偏光を用いるてその偏光成分を測定することにより、簡便で高精度なＳＰＲ測定ができることを見出した。
【００１１】
本発明は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置において、金属薄膜で反射された反射光の偏光を測定し得る装置を有していることを特徴とする表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置に関し、より詳細にはＳＰＲ装置における反射光を偏光に分ける装置が、偏光のｐ成分とｓ成分を測定可能に分け、それらの各成分を測定することからなるＳＰＲ装置に関する。
また、本発明はＳＰＲの測定において、反射光の偏光を測定することからなるＳＰＲ測定方法に関し、より詳細には、ＳＰＲの測定における反射光を偏光成分に分け、分けられた偏光のｐ成分とｓ成分を測定し、それらのデータをデータ処理することからなるＳＰＲの測定方法に関する。
【００１２】
本発明のＳＰＲ装置は、例えば図１における従来のＳＰＲ装置の反射光の検出部の前に、偏光子などの光を偏光成分に分ける装置を設置し、この偏光装置により取り出された偏光を検出部で検出することを特徴とするものである。
図３は、本発明の偏光を用いたＳＰＲの検出結果を例示するものである。図３は金薄膜センサーのＳＰＲスペクトルである。図中の、細い点線は本発明の偏光にした後の偏光のｐ成分のＳＰＲスペクトルを示し、破線は偏光のｓ成分のＳＰＲスペクトルを示し、太い実線は両者の商、即ち（ｐ成分の強度）／（ｓ成分の強度）の値を示している。
【００１３】
この結果からも明らかなように、ＳＰＲの反射光を偏光にして、それを偏光のｐ成分及びｓ成分に分けて測定することにより、偏光のｐ成分がＳＰＲの吸収スペクトルを示すのに対して、偏光のｓ成分はＳＰＲの影響あまり受けないものであることが判明した。即ち、ＳＰＲの結果は偏光のｐ成分に主として表現されるものであり（図３の細い点線）、偏光のｓ成分はＳＰＲの結果を反映しないものであり、寧ろＳＰＲの測定時のバックグラウンドを示すものであることが分かった（図３の破線）。
さらに、得られた偏光のｐ成分及びｓ成分の強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を加工、処理して両者の相対値で示すことにより、従来のＳＰＲスペクトルに比べて極めて鮮明なＳＰＲスペクトルが得られることがわかった。例えば、図３に示すように、ｓ成分の強度をバックグラウンドと仮定して両者の商（（ｐ成分の強度）／（ｓ成分の強度））を当該相対値としてすると、図３に示されるように極めて鮮明なスペクトルとなることがわかる（図３の太い実線）。
【００１４】
従来ＳＰＲは、金属表面で起きている作用を金属の裏面から測定するものであり、かつ金属表面で起きている作用も化学反応や物質と物質の微弱な相互作用であり、従来ＳＰＲは測定法が簡易なため、感度が低くかつノイズも多く、さらに光源の強度分布などのノイズに強く依存していおり、ノイズを除去し感度を上げることは非常に困難とされていたが、本発明の方法は偏光を用いるという簡単な操作により、ノイズの多くの部分を含むバックグラウンド分を偏光のｓ成分の測定により簡単に計測することができ、同時に偏光のｐ成分によりＳＰＲスペクトルを確実に補足することができるので、ノイズの除去と感度の向上とを同時に達成することができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下に本発明のＳＰＲ装置及びＳＰＲの測定方法についての実施の形態を具体的に説明するが、本発明はこれらの具体的な装置及び方法に限定されるものではなく、本発明の技術的思想に基づくＳＰＲ装置及びその方法並びにそれに付帯する技術の一切は本発明の技術的範囲に属するものである。
【００１６】
本発明のＳＰＲ装置の例を図４に示す。図４中の１は金属薄膜であり、２は金属薄膜１の表面に取り付けられた試料セルである。試料セル２に検体を流し金属薄膜１の表面で化学反応や物質間の相互作用などを生起させる。３はプリズムであり、金属薄膜１はプリズム３に密着している。４は光源である。光源４から発射された光は光学系レンズ５及び６により集光されて、プリズム３に密着している金属薄膜２の裏面で反射される。反射光は光学レンズ７で平行光とさる。偏光板８により偏光を調整し、平行光は偏光ビームスプリッター９により偏光のｐ成分とｓ成分に分離される。各々の偏光成分はそれぞれＣＣＤカメラ１０及び１１で測定され、得られた画像情報は情報処理装置１２に転送され、データ処理が行われる。測定されたデータやデータ処理装置１２などで処理されたデータを、測定した値を記録、処理することができる装置に記録することもできる。また、必要に応じてそれらのデータを印刷したり表示することもできる。
本発明は、ＳＰＲ装置において偏光ビームスプリッター９を設けて偏光のｐ成分とｓ成分を分離して測定することを特徴とするものである。
【００１７】
本発明のＳＰＲ装置における反射光を偏光にする装置としては、偏光板や偏光子などの公知の装置を使用することができる。また、偏光を検出、定量する装置もＣＣＤカメラなどや他の公知のものを使用することができる。必要に応じてこれらの装置をＳＰＲ装置に設計変更することもできる。
これらの装置で得られた偏光のｐ成分の値とｓ成分の値は、その片方のみを測定データとすることもできるが、両成分の値を同時に測定するのが好ましい。また、両成分のＳＰＲスペクトルデータをそのまま使用することもできるが、これらの成分の値をデータ処理装置１２などの装置によりデータ処理するのが好ましい。これらの成分の値をデータ処理する方法としては、前記した商をとる方法に限定されるものではなく、両者の差（例えば、（ｓ成分の強度）−（ｐ成分の強度））をとってもよいし、他の処理方法を採用することができる。
【００１８】
また、偏光のｐ成分とｓ成分との間には位相差が生じる場合もあり、両者の位相差を測定することもできる。
ＳＰＲは、化学反応や物質間の相互作用をリアルタイムで連続的に測定できるものでるから、前記の偏光成分の位相差を利用して金属薄膜表面での化学反応や物質間の相互作用が起こったか否かを極めて高感度で検出、定量することが可能となる。例えば、図２に示されるように、金属薄膜の表面で化学反応や物質間の相互作用が生起すると、金属表面の状態が変化し、その結果ＳＰＲスペクトルの吸収を示す角度に変化が生じる（図２のＡからＢへの変化）。従来はこれを吸収スペクトルとして相対的な値により測定していたのであるが、本発明の位相差を用いる偏光成分の測定方法によれば、まず図２のＡの状態（反応や相互作用の生起する前の状態）において偏光のｐ成分とｓ成分の位相差をキャンセルするようにしておき、即ちいずれの偏光も観測することができない状態にしておき、次いで金属薄膜表面において化学反応や物質間の相互作用が生起するとこれにより新たな偏光の位相差が生じるために偏光のｐ成分とｓ成分の位相差を観測することができるようになる。
【００１９】
このような測定方法は、従来の吸収スペクトルのような相対的なものではなく、新たな偏光による観測可能な光量が有るか無いかという絶対的なものであるから、極めて高感度で測定を行うことが可能となる。
したがって、本発明は、ＳＰＲ装置において反射光における偏光のｐ成分とｓ成分との位相差を打ち消すように調整し得る装置をさらに有するものを包含するものである。
【００２０】
本発明のこのようなＳＰＲ装置の例を図５に示す。図５は光源２４としてレーザーを用いた例を示している。また、入射光として偏光子２６をとおした偏光を用いた例を示している。偏光された入射光はプリズム２３を通り、金属表面に試料セル２２を有する金属薄膜２１の裏面で反射され、反射光としてプリズム２３から出る。プリズム２３から出た反射光は、偏光のｐ成分とｓ成分との位相差を打ち消すように調整し得る装置の１種である補償板３３に入り、例えば、試料セル２２における反応等の前の状態では補償板３３からの光量が無いように、即ち光量がゼロになるように調整される。補償板３３の後には検光子２９が設けられ、その後に検出、定量できる検出器３１がある。試料セル２２で化学反応等が生起してＳＰＲスペクトルが変動すると、偏光の位相差が変動し、予め調整された補償板３３から試料セル２２における化学反応等に応じた光量が検出器３１によって検出されることになる。
【００２１】
偏光子２６としては、偏光が得られるものであればよく、通常の偏光子を使用することができるが、適宜ＳＰＲ装置に適した方式等に設計変更することもできる。また、前記偏光のｐ成分とｓ成分との位相差を打ち消すように調整し得る装置３３としては、バビネ−ソレイユの補償器やブレイス−ケーラーの補償器などの補償器（コンペンセーター）などを使用することができるがこれらに限定されるものではない。
検出器３１によって得られたデータはデータ処理装置３２により適宜データ処理される。
【００２２】
図６にこの装置によるＳＰＲ応答のセンサーグラムを例示する。横軸は時間であり、縦軸は光子数を示す。金属薄膜の表面での化学反応や物質間の相互作用が生じる前の定常状態になったときに、偏光のｐ成分とｓ成分との位相差を打ち消すように調整し得る装置３３により光量がゼロとなるように調整する。次いで、金属薄膜の表面に検体などを流して金属薄膜の表面で化学反応や物質間の相互作用が生じるようにする。図６に示すｔ時間後に金属薄膜の表面で目的の化学反応や物質間の相互作用が生じると、ＳＰＲ応答が変化し、光量をゼロに調整したところから光量が観察できるようになる（図６のｔ時間後の部分参照）。この場合の光量は、光子単位で測定することも可能である。
このように本発明のこの装置によれば、光子単位での測定も可能であり、極めて高感度でＳＰＲ応答を測定することができるようになる。本発明においては、この方法をゼロメソッドＳＰＲと称する。
【００２３】
このような本発明の装置を使用することにより、金属薄膜上における化学反応や物質間の相互作用等により新たに生じたＳＰＲの微弱な変動を偏光の位相差の有無により検出、定量することができるようになり、金属薄膜表面で起きた化学反応や物質間の相互作用等を極めて高感度で検出、定量することが可能となる。例えば、金属薄膜表面にある抗体を固定化しておき、その状態でのＳＰＲ装置の反射光の偏光の位相差を打ち消すように調整しておき、即ち光量を全く観測することができない状態にしておき、次いで、抗体が固定化されている金属薄膜表面にその抗原を含む検体を流す。当該検体中にその抗体に対する抗原が含有されていると、金属薄膜表面において抗原−抗体反応が生起し、ＳＰＲの吸収反射角が変動することになるが（図２参照）、本発明のＳＰＲ装置によれば前記の光量が全く観測されない状態から新たな位相差により光量が観測される状態に変化することになる。この新たな位相差に基づく光量を測定することにより、検体中に抗原が含有されているか否かを検出し、定量することが可能となる。
【００２４】
本発明のＳＰＲ装置における入射光としては、従来のＳＰＲ装置の入射光をそのまま使用することもできるが、入射光を偏光とすることもできる。このような装置としては、例えば前記した図５に示すような装置を挙げることができる。
また、本発明のＳＰＲ装置の光源としては、従来から使用されているＬＥＤに限らず、レーザー光などの種々の光源を使用することができる。光源の波長も種々の波長のもを使用することができる。光源の波長としては、可視領域、赤外領域、紫外領域などの広い範囲の波長を選択することができる。
さらに本発明者らの知見によれば、一般に、光源の波長が長くなるほど金属薄膜の表面から遠くにある物の反応や作用を観測することができるとされているので、金属薄膜の表面から近い位置の反応や作用を観測したい場合には波長の短い光源を、また金属薄膜の表面から遠くの位置にある反応や作用を観測したい場合には波長の長い光源を使用するのが好ましい。
【００２５】
また、波長の異なる２以上の光源を同時に使用することにより、金属薄膜の表面から異なる位置にある物質の反応や作用等を同時に観測することができる。２種以上の光源の波長の相違の程度は、反射光においてこれらの波長を各々分離することができる程度に相違するものであればよく、また、観測したい金属表面からの距離に応じて適宜設定することができる。
波長の異なる２種の光源を用いた本発明のＳＰＲ装置の例を図７に示す。光源５１と光源５２は、波長の異なるＬＥＤ光源であり、光源５１及び光源５２から発射された光は、ダイクロイックミラー４５により平行入射光とされ、次いで光学系レンズ４６により集光されてプリズム４３に入射される。入射された光は、表面に試料セル４２を有する金属薄膜４１の裏面で反射され、プリズム４３を出て光学系レンズ４７で元の平行光とされた後、ダイクロイックミラー４８によりそれぞれの波長に分離される。分離された反射光をそのまま従来の方法、例えばＣＣＤカメラなどで観測することもできる。
【００２６】
ダイクロイックミラー４８により分離された各波長の反射光を観測すれば、金属薄膜の表面に取り付けられた試料セル４２で生起している化学反応や相互作用などの金属薄膜４１の表面から異なる位置にある物質の反応や作用等を同時に観測することができることになる。したがって、本発明は波長の異なる２種以上の光源を用いるＳＰＲ装置及びそれを用いたＳＰＲ測定方法にも関する。
また、図７に示すようにダイクロイックミラー４８により分離された各波長の反射光を、本発明の方法に従って偏光ビームスプリッター４９を用いて偏光成分に分け、偏光のｐ成分とｓ成分とをそれぞれ観測することもできる。これにより、さらに高感度で試料セル中の金属薄膜の表面からの距離の異なる位置にある物質の挙動を把握することができる。
さらに、２つの波長で測定した各波長のＳＰＲ成分の差を計測することにより、金属薄膜からの特定の距離の部分の挙動を高精度で測定することができるようになる。このとき、波長を接近させると、金属薄膜の膜厚方向の限られた部分の挙動を高精度で測定することができるようになり、このデータを処理してゆくことにより膜厚方向の解像度を上げることができることになる。
【００２７】
本発明のＳＰＲ装置について詳細に説明してきたが、本発明のＳＰＲは、第一に測定系の光を偏光成分に分離して測定することを特徴とするものであり、第二に分離された各々の偏光成分からのデータをデータ処理することを特徴とするものであり、第三に入射光として偏光を用いることを特徴とするものであり、第四に偏光成分の位相差を利用して観測される光量の有無による高感度の測定ができることを特徴とするものであり、第五に入射光として波長の異なる２種以上の光源を使用することを特徴とするものであり、第六にこれらの本発明の特徴を組み合わせて使用することができることを特徴とするものである。
【００２８】
本発明のＳＰＲの装置及びその測定方法における測定対象としては、金属薄膜上で生起し得る化学反応や物質間の相互作用などであれば特に制限はなく、本発明においてはこれらをまとめて「化学反応や物質間の相互作用」というが、これは通常の化学反応や相互作用に限定されるものではなく、分子や分子の集合体の挙動、膜や物質の構造変化、結晶構造の変化などのＳＰＲで測定可能なあらゆる変化を包含をするものである。例えば、金属薄膜上での化学反応や物質間の相互作用が抗原−抗体反応や受容体との反応などの基質特異的な反応、錯体形成反応などの非共有結合相互作用などが挙げられる。また、ＤＮＡ断片などのプローブを固定し、ハイブリダイゼーションの有無を測定対象とすることも考えられる。現在多くの診断や検査において抗原−抗体反応が利用されているが、その多くは放射性同位元素を用いたＲＩＡ法や、酵素を用いたＥＩＡ法や、蛍光標識体を用いたＦＩＡ法などであるが、本発明のＳＰＲの装置や測定方法を用いることにより、これらの抗原−抗体反応を標識化を行うことなく、より簡便で、かつ迅速な測定が可能となり、本発明は診断や検査における新たな手法を提供するものである。標識化の必要のない点はプローブを用いたハイブリダイゼーションにおいても同様である。
【００２９】
本発明の方法により抗原−抗体反応を測定する場合には、例えば、検査の対象となる抗原又は抗体を金属薄膜上に固定し、本発明の方法により。例えば、金属薄膜の表面にメルカプト化合物などを用いて抗原を固定化し、これに検体を導入すると、検体中に固定化された抗原と反応する抗体が存在すると抗原−抗体反応が起こり、ＳＰＲスペクトルが反応前のものから反応後の状態に変動し、これを偏光成分に分離したシグナルとして観測することにより、検体中の抗体の存在を知ることができる。
【００３０】
また、金属薄膜の表面に設けられた試料セルに２以上の方向から検体と検出試薬とを導入し、検出試薬又は検体が導入された時のＳＰＲスペクトルの変動を前記と同様に検出して、検体の検査を行うこともできる。
本発明の方法によれば、目的の検査対象に適した抗原若しくは抗体が金属薄膜の表面に固定化された金属薄膜又は抗原若しくは抗体などの検出試薬を導入できる試料セルを用いることにより、標識化などの煩雑な操作を必要としない簡便で迅速かつ高感度の抗原−抗体反応を測定することができる。
【００３１】
本発明の方法により受容体との反応を測定する場合には、例えば、前記した方法などに準じて金属薄膜の表面に受容体を固定しておき、これに受容体に結合し得る又はその可能性のある物質を含有する検体を試料セルに導入する。検体中の物質が受容体と結合するとＳＰＲ応答を観察することができる。本発明のＳＰＲ装置は極めて高感度であるために、固定化された受容体数が少なくてもＳＰＲを応答を測定することが可能となる。また、受容体との結合が比較的弱い場合においても本発明のＳＰＲ装置によれば、ＳＰＲ応答を測定することが可能となる。例えば、金属薄膜の表面に女性ホルモン受容体を固定化しておき、これに環境ホルモンとなる疑いのある物質を含有する検体を導入すると、極めて高感度で女性ホルモン受容体との結合性の有無およびその程度を知ることができる。
したがって、本発明は、本発明のＳＰＲ装置を用いた特定の受容体に結合する物質をスクリーニングする方法を提供するものである。本発明のこのスクリーニング方法によれば、環境ホルモンなどの有害物質の探索や特定の受容体の拮抗剤などの開発に有用となる。
【００３２】
【発明の効果】
本発明は、測定系に偏光を検出、定量する手段を採用することにより、簡便、高精度、高信頼性で、迅速かつ安定した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の測定装置及び測定方法を提供するものである。また、本発明はＳＰＲ装置を用いた標識化などの煩雑な操作を必要としない簡便で迅速かつ高感度の抗原−抗体反応や受容体との反応を測定する方法及びその装置を提供するものである。
本発明のＳＰＲ装置は極めて高感度であるために、受容体との反応やハイブリダイゼーションなどの微弱な反応を検出することができ、生化学分野にも広く応用されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、従来のＳＰＲ装置の概要を例示するものである。
【図２】図２は、従来のＳＰＲスペクトルを例示するものである。
【図３】図３は、金薄膜を用いたＳＰＲにおいて、本発明の偏光成分に分けたＳＰＲスペクトルを示す。
【図４】図４は、本発明の偏光成分に分けたＳＰＲ装置を例示するものである。
【図５】図５は、本発明の偏光成分の位相差を利用したＳＰＲ装置を例示するものである。
【図６】図６は、本発明の偏光成分の位相差を利用したＳＰＲ装置によるＳＰＲ応答のセンサーグラムを例示するものである。
【図７】図７は、本発明の２以上の光源を用いたＳＰＲ装置を例示するものである。
【符号の説明】
１    金属薄膜
２    試料セル
３    プリズム
４    光源
８    偏光子
９    偏光ビームスプリッター
１０    検出器
１２  データ処理装置
２６  偏光子
２９  検光子
３３  補償器
４５  ダイクロイックミラー
４８  ダイクロイックミラー
４９  偏光ビームスプリッター
【図１】
0003778248.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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