(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス起原の同種または異種の少なくとも１つの遺伝子の発現が誘導性プロモーターのコントロール下に置かれており、前記同種または異種の遺伝子が当該ウイルスの複製または増殖に必須であるゲノム領域の全体または一部であることを特徴とする、組換えアデノウイルス。
【請求項２】
誘導性プロモーターが、重金属、ヒートショック、ホルモンまたはテトラサイクリンに応答するプロモーターから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３】
プロモーターが、テトラサイクリンまたはその類似体の１つによって誘導可能なプロモーターであることを特徴とする、請求項１または２に記載のアデノウイルス。
【請求項４】
テトラサイクリンによって誘導可能なプロモーターが、少なくとも１つのテトラサイクリンオペレーターを含む調節配列に作動可能に結合した最小プロモーターから成ることを特徴とする、請求項３に記載のアデノウイルス。
【請求項５】
調節配列が少なくとも２つのテトラサイクリンオペレーターを含むことを特徴とする、請求項４に記載のアデノウイルス。
【請求項６】
調節配列の全部または一部が、配列番号３もしくは配列番号４の配列またはそれらの誘導体の１つによって表されることを特徴とする、請求項４または５に記載のアデノウイルス。
【請求項７】
最小プロモーターがヒトＣＭＶに由来することを特徴とする、請求項４から６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８】
最小プロモーターが、ヒトＣＭＶプロモーターのヌクレオチド＋７５〜−５３または＋７５〜−３１の領域に相当することを特徴とする、請求項４から７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９】
プロモーターが、それがコントロールするウイルス起原の遺伝子の転写を単独では確実にコントロールできないように突然変異したウイルス遺伝子の同種または異種のプロモーターであることを特徴とする、請求項４から６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１０】
最小プロモーターが、前記ウイルス遺伝子の同種プロモーターに由来することを特徴とする、請求項９に記載のアデノウイルス。
【請求項１１】
最小プロモーターが単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼのプロモーターに由来することを特徴とする、請求項９に記載のアデノウイルス。
【請求項１２】
最小プロモーターの全部または一部が、配列番号１もしくは配列番号２の配列またはそれらの誘導体の１つによって表されることを特徴とする請求項１１に記載のアデノウイルス。
【請求項１３】
最小プロモーターが、転写すべきウイルス遺伝子の上流に、該遺伝子の固有のプロモーターに置換するかまたは置換しないで配置されていることを特徴とする、請求項４から１２のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項１４】
前記最小プロモーターに加えて、前記ウイルス遺伝子の固有のプロモーターを不活性化形態または非機能性形態で含むことを特徴とする、請求項４から１３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項１５】
調節配列が最小プロモーターの上流に配置されていることを特徴とする、請求項４から１４のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項１６】
調節配列が、前記ウイルス遺伝子の下流に配置されていることを特徴とする、請求項４から１４のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項１７】
調節配列が、前記ウイルス遺伝子に直結しているかまたは直結していないことを特徴とする、請求項１６に記載のアデノウイルス。
【請求項１８】
誘導性プロモーターがＯｐ2／Ｔｋによって表されることを特徴とする、請求項１から１７のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項１９】
誘導性プロモーターの全部または一部が配列番号５の配列またはその誘導体の１つによって表されることを特徴とする請求項１から６または９から１８のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項２０】
その発現が誘導性プロモーターのコントロール下に置かれている同種遺伝子を少なくとも１つ含むことを特徴とする、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２１】
その発現がテトラサイクリンまたはその類似体の１つによって誘導可能なプロモーターのコントロール下に置かれている同種遺伝子を少なくとも１つ含むことを特徴とする、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２２】
当該１または複数の遺伝子が、前記アデノウイルスの複製及び／または増殖に必須である前記アデノウイルスのゲノム領域の全部または一部であることを特徴とする、請求項２０または２１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２３】
その複製及び／または増殖に必須の領域が、領域Ｅ４、Ｅ２、領域ＩＶａ２及び／または領域Ｌ５の全部または一部から選択されることを特徴とする、請求項２２に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２４】
領域Ｅ２が、７２ＫのｃＤＮＡ、１４０ＫのポリメラーゼのｃＤＮＡ及び８７Ｋのプレターミナルタンパク質のｃＤＮＡに対応するフラグメントから選択されたフラグメントによって表されることを特徴とする、請求項２３に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２５】
領域Ｅ４が、ヌクレオチド３５５７６−３２４９０に対応するＴａｑ１−Ｂｇｌ２フラグメントによって表されることを特徴とする請求項２３に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２６】
領域Ｅ４が、少なくとも読取り枠ＯＲＦ６によって表されることを特徴とする請求項２３に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２７】
領域Ｅ４が、ＯＲＦ６及びＯＲＦ７の配列を含む３４１１５位と３２４９０位との間に存在するＢｇｌ２フラグメントによって表されることを特徴とする、請求項２３または２５に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２８】
ＩＶａ２をコードする領域が、アデノウイルスＡｄ５の配列上のヌクレオチド３３２８−６３１６を含むＢｇｌＩＩ−ＮｒｕＩフラグメント、ヌクレオチド４０２９−５７１９に対応するＤｒａＩ−ＮｌａＩＩＩフラグメント、及び、ヌクレオチド４０２９−５７８８に対応するＤｒａＩ−ＸｈｏＩフラグメントから選択されたフラグメントから成ることを特徴とする、請求項２３に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２９】
遺伝子Ｅ１の全部または一部が欠失しており、領域Ｅ４の全部または一部を誘導性プロモーターＯｐ2／Ｔｋのコントロール下に含むことを特徴とする、請求項１から２３及び２５から２７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３０】
遺伝子Ｅ１の全部または一部が欠失しており、領域Ｅ２の全部または一部を誘導性プロモーターＯｐ2／Ｔｋのコントロール下に含むことを特徴とする、請求項１から２４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３１】
遺伝子Ｅ１及びＥ２の全部または一部が欠失しており、領域Ｅ４の全部または一部を誘導性プロモーターＯｐ2／Ｔｋのコントロール下に含むことを特徴とする、請求項１から２７及び２９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３２】
遺伝子Ｅ１及びＥ４の全部または一部が欠失しており、領域Ｅ２の全部または一部を誘導性プロモーターＯｐ2／Ｔｋのコントロール下に含むことを特徴とする、請求項１から２７及び３０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３３】
プロモーターＯｐ2／Ｔｋのコントロール下に置かれた領域からその固有のプロモーターが除去されていることを特徴とする、請求項２０から３２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３４】
更に、１つまたは複数の治療用遺伝子をコードする核酸配列を含むことを特徴とする、請求項２０から３３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３５】
前記核酸配列が、欠失配列に追加または置換して領域Ｅ１、Ｅ３またはＥ４の処に存在することを特徴とする、請求項３４に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３６】
その発現が誘導性プロモーターのコントロール下に置かれた、ウイルス起原の異種遺伝子を少なくとも１つ含むことを特徴とする、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３７】
その発現がテトラサイクリンまたはその類似体の１つによって誘導可能なプロモーターのコントロール下に置かれたウイルス起原の異種遺伝子を少なくとも１つ含むことを特徴とする、請求項１から１９及び３６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３８】
遺伝子が、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）のゲノムの遺伝子またはその機能性相同体の１つであるかまたはそれから誘導されることを特徴とする、請求項３６または３７に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３９】
遺伝子がアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）のキャプシド形成機能を表す遺伝子であることを特徴とする請求項３８に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４０】
ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子及び／またはｃａｐ遺伝子またはそれらの相同体の１つの発現を誘導性プロモーターのコントロール下に含むことを特徴とする請求項３６から３９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４１】
発現カセットＯｐ２／Ｔｋ−ｒｅｐ−ｃａｐを含むことを特徴とする、請求項３６から４０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４２】
固有のプロモーターｐ５がプロモーターＯｐ2／Ｔｋによって置換されていることを特徴とする、請求項４１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４３】
ウイルス起原の異種遺伝子と誘導性プロモーターとが、欠失配列に追加または置換して前記アデノウイルスのゲノムの領域Ｅ１の処に存在することを特徴とする、請求項３６から４２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４４】
自身のＩＴＲとキャプシド形成配列とを含むことを特徴とする請求項１から４３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４５】
少なくとも領域Ｅ１が非機能性であることを特徴とする、請求項１から４４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４６】
アデノウイルスのゲノムがヒトもしくは動物に由来するかまたは混成型であることを特徴とする、請求項１から４５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４７】
ヒト起原のアデノウイルスが、グループＣに分類されるアデノウイルスから選択されることを特徴とする、請求項４６に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４８】
動物起原のアデノウイルスが、イヌ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、トリ及びサルのアデノウイルスから選択されることを特徴とする、請求項４６に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４９】
ＡＡＶを作製するための、ＡＡＶ起原の少なくとも１つの遺伝子をテトラサイクリン誘導性プロモーターのコントロール下に含む組換えアデノウイルスの使用。
【請求項５０】
テトラサイクリンまたはその類似体の１つの存在下で、転写アクチベーターの発現カセットをそのゲノムに含む細胞系を、テトラサイクリン誘導性プロモーターのコントロール下のＡＡＶ起原の少なくとも１つの遺伝子を含むアデノウイルスと、ＡＡＶ由来の組換えウイルスまたはＡＡＶのＩＴＲ間にトランスジーンを含むキャプシド形成プラスミドと共にコトランスフェクションする段階から成ることを特徴とするＡＡＶの産生方法。
【請求項５１】
アデノウイルスがｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をテトラサイクリン誘導性プロモーターのコントロール下に含むことを特徴とする、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＡＡＶの産生が、十分な量のテトラサイクリンまたはその類似体の１つの存在によって誘発されることを特徴とする、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
形質転換細胞系が２９３細胞系に由来することを特徴とする、請求項５０から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
細胞系が、テトラサイクリンまたはその類似体の１つの存在下でアデノウイルス中に存在する誘導性プロモーターの調節配列に結合し得る第一ポリペプチドと転写を活性化する第二ポリペプチドとの組合せから成る転写アクチベーターの発現カセットをそのゲノムに含む２９３細胞系であることを特徴とする、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
第一ポリペプチドが、テトラサイクリンまたはその類似体の１つが存在するときに限って前記誘導性プロモーターの調節配列に結合する能力をもつように突然変異させたテトラサイクリンの野生型リプレッサーであることを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
突然変異が、野生型テトラサイクリンリプレッサーをコードする配列の少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換及び／または付加であることを特徴とする請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
突然変異したテトラサイクリンリプレッサーが、７１、９５、１０１または１０２位に局在するアミノ酸の少なくとも１つが突然変異した野生型リプレッサーＴｎ１０であることを特徴とする、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
テトラサイクリンリプレッサーの全部または一部が配列番号８の配列によって表されることを特徴とする、請求項５４から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
第二ポリペプチドがタンパク質の転写活性化ドメインを含むことを特徴とする、請求項５４から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
タンパク質がＨＳＶのビリオンタンパク質１６（ＶＰ１６）であることを特徴とする、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記転写アクチベーターの発現カセットが、テトラサイクリンまたはその類似体の１つによって誘導可能なプロモーターを含むことを特徴とする、請求項５０から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
発現カセットＯｐ2／Ｔｋ−ＴｅｔＲ−ＶＰ１６をそのゲノムに組み込んだ２９３細胞系を使用することを特徴とする、請求項５０から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
請求項５４から６０に定義された転写アクチベーターの発現カセットをそのゲノムに組み込んだ２９３細胞系であることを特徴とする細胞系。
【請求項６４】
発現カセットＯｐ2／Ｔｋ−ＴｅｔＲ−ＶＰ１６をそのゲノムに組み込んでいることを特徴とする、請求項６３に記載の細胞系。
【請求項６５】
アデノウイルスまたはＡＡＶを産生するための請求項６３または６４に記載の細胞系の使用。
【請求項６６】
アデノウイルスの相補性に必要な機能と請求項５４から６０に定義された転写アクチベーターとをトランス配置で含む細胞系を、
領域Ｅ１に欠失を有する前記アデノウイルスのゲノムの左側部分を含む第一ＤＮＡと、
前記アデノウイルスのゲノムの少なくとも右側部分を含み、その複製に必須の少なくとも１つの領域をテトラサイクリンによって誘導可能なプロモーターのコントロール下に有し、更に第一ＤＮＡに共通の部分を有している第二ＤＮＡと共に、テトラサイクリンまたはその類似体の１つの存在下でコトランスフェクションする段階と、
組換えによって産生されたアデノウイルスを回収する段階とから成ることを特徴とする請求項１から３５のいずれか一項に記載のアデノウイルスの産生方法。
【請求項６７】
更に、第一または第二のＤＮＡが異種ＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
請求項１から３５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスを少なくとも１つ含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項６９】
注射可能な製剤に許容される医薬用担体を含む請求項６８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規なウイルスベクター、それらの作製及びそれらの使用に関する。本発明はまた、これらのウイルスベクターを含む医薬組成物に関する。
遺伝子療法は、病気に冒された細胞または器官に遺伝情報を導入することによって欠損または異常（突然変異、異常発現、など）を矯正する治療方法である。遺伝情報を、器官から抽出した細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ導入し、修飾された細胞を生物体内に再導入してもよく、または、遺伝情報を適正な組織に直接ｉｎ  ｖｉｖｏ導入してもよい。後者の場合には種々の技術が存在しており、特に、ＤＮＡとＤＥＡＥ−デキストランとの複合体（Ｐａｇａｎｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１（１９６７）８９１）、ＤＮＡと核タンパク質との複合体（Ｋａｎｅｄａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３（１９８９）３７５）、ＤＮＡと脂質との複合体（Ｆｅｌｇｎｅｒら，ＰＮＡＳ  ８４（１９８７）７４１３）を用いる種々のトランスフェクション技術、及び、リポソームの使用（Ｆｒａｌｅｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（１９８０）１０４３１）などがある。
より最近には、遺伝子導入ベクターとしてウイルスを使用する方法が開発され、物理的トランスフェクション技術に代替し得る有望な方法であると考えられている。この観点から、いくつかの細胞集団に感染するウイルスの能力が種々のウイルスについて試験された。これらのウイルスとしては特に、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＨＭＳ、ＭＭＳなど）、ＨＳＶウイルス、アデノ関連ウイルス及びアデノウイルスがある。
アデノウイルスに関してより詳細に考察すると、アデノウイルスは約３６ｋｂの大きさの直鎖状二重鎖ＤＮＡをもつウイルスである。アデノウイルスのゲノムは特に、各末端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ、Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ）とキャプシド形成配列と初期遺伝子と後期遺伝子とを含む（図１参照）。主要な初期遺伝子は領域Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４に含まれている。これらの初期遺伝子のうちで、領域Ｅ１（特にＥ１ａ及びＥ１ｂ）に含まれている遺伝子はウイルス複製に必要である。領域Ｅ４及びＬ５は例えばウイルス増殖に関与し、主要な後期遺伝子は領域Ｌ１〜Ｌ５に含まれている。アデノウイルスＡｄ５のゲノムは全配列が決定されており、データベースでアクセスできる（特にＧｅｎｅｂａｎｋ  Ｍ７３２６０参照）。また、種々の血清型のアデノウイルス（Ａｄ２、Ａｄ７、Ａｄ１２、など）のゲノムの一部は配列決定されており、全部が配列決定されているものもある。これらのウイルスベクターの利点は、十分に広い宿主スペクトルを有していること、静止細胞に感染し得ること、感染細胞のゲノムに取り込まれないこと、及び、今日までヒトの重大な疾病に関与したことがないこと、などである。これらの特性を考慮して、アデノウイルスは既に遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ導入に使用されている。従って、種々の遺伝子（β−ｇａｌ、ＯＴＣ、α−１ＡＴ、サイトカインなど）を組み込んだアデノウイルスに由来の種々のベクターが作製されている。
勿論、これらのウイルスベクターの集合は、その発現が遺伝子治療に望ましくないという反面性をもつ多数のウイルス遺伝子を含んでいる。従って、野生型ウイルス遺伝子及び／または該遺伝子に由来するタンパク質であって治療対象生物に望ましくないかまたは全面的に有害な免疫応答及び／または炎症応答を誘発し得るような遺伝子がｉｎ  ｖｉｖｏで発現しないようにコントロールすることが是非とも必要である。
このため、現在提案されているウイルスベクター構築物は、これらのベクターが標的細胞内で自律的に複製できないように修飾されている。これらを欠損ベクターと呼ぶ。従って一般には、少なくともウイルス感染細胞中で該ウイルスが複製されるために必要な配列は欠損ウイルスのゲノムから欠失している。これらの領域は（その全部または一部が）除去されるか、非機能性になっているか、または、別の配列、特に治療的に有効な分子をコードする配列によって置換されている。しかしながら、ウイルス粒子のキャプシド形成に必要な配列は欠損ウイルスのゲノム中に保存されているのが好ましい。
特に組換えアデノウイルスの場合、従来技術に記載されている構築物は一般に、領域Ｅ１（Ｅ１ａ及び／またはＥ１ｂ）及び任意にＥ３が欠失し、欠失場所にヘテロロガスＤＮＡ配列が挿入されたアデノウイルスである（Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎｅ１０１（１９９１）１９５；Ｇｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら，Ｇｅｎｅ５０（１９８６）１６１）。他の構築物は、領域Ｅ１の処及び領域Ｅ４の必須でない部分に欠失を含む（ＷＯ９４／１２６４９）。これらの欠損組換えアデノウイルスは、組換えアデノウイルスの複製に必要なすべての欠損機能を相補し得るコンピテント細胞系を使用または非使用の種々の方法で作製できる。実際、アデノウイルスに由来のベクターは一般に、アデノウイルスゲノムの一部が組み込まれた相補性細胞系（２９３細胞系）において産生される。より詳細には、２９３細胞系はアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）のゲノムの左端（約１１〜１２％）を含み、この左端には、左側ＩＴＲ、キャプシド形成領域、Ｅ１ａとＥ１ｂとを含む領域Ｅ１、及び、タンパク質ｐＩＸをコードする領域の一部が含まれている。この細胞系は、領域Ｅ１に関する欠損組換えアデノウイルス、即ち、領域Ｅ１の全部または一部が欠失した組換えアデノウイルスをトランスに相補することが可能である。
しかしながら、これらの欠損ウイルスベクターを作製する際に、Ｅ１型の細胞機能によって複製され得るウイルス粒子またはトランス相補性をｉｎ  ｖｉｖｏで生じるような組換えの可能性を完全に排除することはできない。かかるベクターを後で遺伝子治療に使用するためにはこの種のイベントが全く不適合なことは明らかである。複製可能なウイルス粒子がｉｎ  ｖｉｖｏに存在するとき、ウイルス増殖を誘発する、または、炎症反応、組換えのような危険を伴うコントロール不能な伝播が生じる、などの極めて有害な結果が予測され得る。
同時に、対応するウイルスタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を防止することが是非とも必要である。これらのタンパク質は、細胞に対して必ずしも毒性でないとしても、治療対象器官に対して有害な炎症及び／または発熱のタイプの免疫系の応答を誘発し得るので極めて望ましくない（Ｄ．Ｙ．Ｓｃｈｗａｒｚ，（１９９５），Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９２，１４０１−１４０５；Ｊ．Ｆ．Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，（１９９４），Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，５，１２１７−１２２９及び（１９９４）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９１，６１９６−６２００；Ｙ．Ｙａｎｇ，（１９９４），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１，４３３−４４２，（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６９，２００４−２０１５及びＮａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）７，３６２−３６９）。
より詳細には本発明の目的は、これらの欠点を解消することである。特に、複製可能なウイルス粒子が除去されたことによって安全性が強化されたアデノウイルス型ウイルスのロットを作製するために有用な解決方法を提案することである。
出願人は意外にも、独自のプロモーター系を用いることによってウイルス遺伝子の発現を有効にコントロールすることができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでウイルスを産生するときには発現が生じるが、最終的に組換えウイルスを治療目的でｉｎ  ｖｉｖｏに使用するときには発現が生じないような反面性が得られることを知見した。
より詳細には本発明は、同種または異種のウイルス起原の少なくとも１つの遺伝子の発現が誘導プロモーターによってコントロールされる組換えアデノウイルスに関する。
本発明で使用される誘導プロモーターなる用語は、その活性が外部の化学物質及び／または生物物質の存在によって開始される任意のプロモーターを意味しており、本発明の範囲においてこれらの物質は更に毒性が軽減されているかあるいは全く無いものを意味する。“外部”なる用語は、化学物質及び／または生物物質が請求の範囲に記載のアデノウイルスによって治療される細胞中に天然には存在しないことを意味する。
本発明で使用され得る誘導プロモーターの例としては特に、重金属に応答するプロモーター（ＣＲＣ  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９９１）１６７−２２０；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８２），２９６，３９−４２）、熱衝撃に応答するプロモーター、ホルモンに応答するプロモーター（Ｌｅｅら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ（１９８８），８５，１２０４−１２０８；（１９８１），２９４，２２８−２３２；Ｋｌｏｃｋら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７），３２９，７３４−７３６；Ｉｓｒａｅｌ  ＆  Ｋａｕｆｍａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ−Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９），１７，２５８９−２６０４）、または、グルコース、ラクトース、ガラクトースもしくは抗生物質のタイプの化学物質に応答するプロモーター、のような従来のプロモーターが挙げられる。
極めて最近には、テトラサイクリンによって誘導可能なプロモーターが記載されたが、このプロモーターは本発明の範囲において特に有利である。
テトラサイクリン誘導プロモーターと呼ばれるこのプロモーターは、テトラサイクリンの１つまたは複数のオペレーターに操作（機能）的に結合した最小プロモーターを含む。最小プロモーターの活性化、従って１つまたは複数の関連ウイルス遺伝子の転写を可能にするのは、“転写アクチベーター”と呼ばれるタンパク質がテトラサイクリンのオペレーター配列に結合するからであり、この結合はテトラサイクリンまたはその類似体の１つが存在するときにのみ成立する。
転写アクチベーターと呼ばれるタンパク質に関してより詳細に説明すると、このタンパク質の特徴は、テトラサイクリンの存在下でテトラサイクリンによって誘導可能なプロモーターのオペレーター配列に容易に結合し、最小プロモーターを活性化する能力を有することである。より好ましくは、転写アクチベーターは２つのポリペプチドから成るタンパク質であり、その第一ポリペプチドはテトラサイクリンまたはその１つの類似体の存在下でｔｅｔオペレーター配列に結合し、第二ポリペプチドは特に転写を活性化する機能を有している。転写アクチベーターと呼ばれるタンパク質の第一ポリペプチドは、野生型リプレッサーの挙動とは逆の挙動を示すように突然変異したテトラサイクリンのリプレッサーである。即ち、テトラサイクリンの存在下ではｔｅｔオペレーターに結合するがテトラサイクリンの非存在下ではｔｅｔオペレーターに結合しない。第二ポリペプチドに関しては、このポリペプチドの好適例は単純ヘルペスウイルスのタンパク質１６の活性化ドメインである。
使用される誘導プロモーターが例えばグルコースまたはガラクトースによって誘導可能なプロモーターである場合、このモデルに基づいて構築された転写アクチベーター、例えばＧｌｕ−ＶＰ１６またはＧａｌ４−ＶＰ１６を使用し得る。
本発明の好ましい実施態様において使用される誘導プロモーターは上記のようなテトラサイクリンまたはその類似体の１つによって誘導可能なプロモーターである。
本発明で使用されたテトラサイクリン誘導プロモーターなる用語は、テトラサイクリンの少なくとも１つのオペレーター“ｔｅｔオペレーター”またはその類似体の１つを含む所謂調節配列に操作的に結合された最小プロモーターを意味する。
テトラサイクリンの類似体なる用語は、テトラサイクリンに構造的に相同であり、上記に定義した転写アクチベーターと呼ばれるタンパク質のトランス活性化ドメインに結合したそのレセプターに少なくとも約１０6Ｍ-1のＫａで結合し得る任意の化合物を意味する。本発明で使用し得る類似体の例としては特に、ドキシサイクリン、クロロテトラサイクリン及びアンヒドロテトラサイクリンがある。
最小プロモーターなる用語は、結合しているＤＮＡ配列の転写を単独では有効に確保できないすべてのプロモーター配列を意味する。このようなプロモーターの活性は、テトラサイクリンの存在下の転写アクチベータータンパク質と調節配列との結合に完全に依存していることが判明した。実際、この最小プロモーターの機能は特に、転写の方向を決めることである。この観点から、最小プロモーターは好ましくは、ウイルス配列の上流に存在して該ウイルス配列と共に連続ヌクレオチド配列を形成するように配置されている。
この最小プロモーターはヒトサイトメガロウイルスの初期プロモーターに由来し、より好ましくはヌクレオチド＋７５〜−５３または＋７５〜−３１の間に含まれている。しかしながら例えばチミジンキナーゼをコードする遺伝子の転写を活性化するプロモーターのような従来のプロモーターに由来の最小プロモーターを本発明に使用することも可能である。
更に、結合している遺伝子の転写を単独では有効に確保できないように１つまたは複数の遺伝的突然変異を与えることによって従来のプロモーターを最小プロモーターにしてもよい。本発明ではまた、考察中のウイルス遺伝子の発現を支配する天然のプロモーターに直接由来する最小プロモーターを使用してもよい。また、非誘導状態で可能な限り基底に近いバックグラウンドノイズを得るように、Ｅ．ＭＡＲＴＩＮＥＺら（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，（１９９４），１３，Ｎｏ．１３，３１１５−３１２６）に記載された所謂“ＴＡＴＡ−ｌｅｓｓ”プロモーターを使用してもよい。
一般にこの最小プロモーターは、その発現をコントロールすべきヌクレオチド配列の上流に天然プロモーターに置換してまたは置換しないで配置される。実際、核酸配列の固有プロモーターは、当業者に公知の種々の技術、特に１つもしくは複数の塩基の削除、欠失及び／または付加によって失活形態または非機能性形態で存続し得る。
本発明の特定実施態様によれば、最小プロモーターは、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼの最小プロモーターに由来する（Ｍｃ  Ｋｎｉｇｈｔら（１９８４）Ｃｅｌｌ  ３７：２５３−２６２）。従ってこのプロモーターはＴｋと命名されている。
より好ましくは、このプロモーターの全部または一部は、配列番号１もしくは２またはその誘導体の１つによって示される配列のいずれかで表される。
本発明で使用された“由来の”なる用語は、所与の配列の遺伝的及び／または化学的な修飾によって作製され所望の活性を維持している任意の配列を意味する。遺伝的及び／または化学的な修飾という表現は、１つまたは複数の核酸の突然変異、置換、欠失、付加及び／または修飾を意味する。
所謂調節配列に関しては、調節配列はテトラサイクリンまたはそのいずれか１つの類似体の少なくとも１つのオペレーターを含む。１つまたは複数のオペレーターはテトラサイクリンの存在下で転写アクチベーターによって認識され、その結果として最小プロモーターを活性化し得る。
使用され得るｔｅｔオペレーター配列は特に、Ｈｉｌｌｅｎ  ＆  Ｗｉｓｓｅｍａｎｎ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，Ｓａｅｇｅｒ  ＆  Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，（１９８９），１０，１４３−１６２），Ｗａｔｅｒｓら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８３），１１，５２５−５３９），Ｓｔｕｂｅｒら（Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，（１９８１），７８，１６７−１７１），Ｕｎｇｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８４），１２，７６９３−７７０３）及びＴｏｖａｒら（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８８），２１５，７６−８０）によって記載された配列から選択できる。
調節配列は、転写の調節を強化することが望まれるか否かに従ってｔｅｔオペレーターの非反復配列を含んでもよくまたは逆にｔｅｔオペレーターの複数の配列例えば１０個までの配列を含んでもよい。本発明の特定実施態様によれば、調節配列は２つのｔｅｔオペレーター配列を使用する。従ってこの配列をＯｐ２と呼ぶ。
より好ましくは、調節配列の全部または一部が配列番号３もしくは４またはそれらの誘導体の１つによって示された配列で表される。
従来は、転写アクチベーターとそのリガンドであるテトラサイクリンとによって形成された複合体の存在下でウイルス起原の遺伝子の転写が行われるように、この調節配列は最小プロモーターの上流、即ち５′末端に操作的に結合されていた。従って５′から３′の方向で、最小プロモーターに直結または非直結の調節配列と最小プロモーターとウイルス起原の遺伝子とがこの順序で存在していた。しかしながらまた、この調節配列を、最小プロモーターの内部で、転写すべきウイルスのヌクレオチド配列の下流、即ち該配列の３′末端に配置することも可能である。この場合には、５′から３′の方向で、最小プロモーター、ウイルス遺伝子、調節配列という順序で存在する。
本発明の好ましい実施態様によれば、テトラサイクリン誘導プロモーターは、Ｔｋと呼ばれるチミジンキナーゼの最小プロモーターに、Ｏｐ２で表される調節配列を結合させたものである。この特定の場合を以後の記載ではＯｐ２／Ｔｋで表す。より好ましくは、本発明で使用される誘導プロモーターの全部または一部が配列番号５またはその誘導体の１つによって表される。
このテトラサイクリン誘導プロモーターＯｐ２／Ｔｋ、特にその全部または一部が配列番号５またはその誘導体の１つによって表されるプロモーターも本発明の目的の１つを構成する。
従って、請求の範囲に記載のアデノウイルスにおいて、誘導プロモーターに操作的に結合した１つまたは複数のウイルス遺伝子の発現は、転写アクチベーターとテトラサイクリンとによって形成された複合体と上記プロモーターの調節配列との結合に全面的に依存する。
この結合はテトラサイクリンの存在下でしか生じない。テトラサイクリンまたはその任意の類似体が存在しないとき、調節配列と転写アクチベーターとの間に結合は成立しない。その結果として、最小プロモーターに結合したウイルス配列の転写は全く生じない。更に、転写誘導物質を常時存在させる必要がないという利点も得られる。
本発明の第一の目的は、特に誘導プロモーター、特に好ましくはテトラサイクリン誘導プロモーターによってその発現がコントロールされる少なくとも１つの同種遺伝子即ちアデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルスを提供することである。
例えば、特定の実施態様において、本発明は、ウイルスの複製及び／または増殖に必須である少なくとも１つのゲノム領域の全部または一部がテトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下に置かれた組換えアデノウイルスを目的とする。本発明によれば、ウイルスの複製及び／または増殖に必須の領域は、領域Ｅ４、Ｅ２、領域ＩＶａ２及び／または領域Ｌ５などの全部または一部から有利に選択される。
特に有利な実施態様によれば、本発明の組換えアデノウイルスは、複製及び／または増殖に必須の配列として、領域Ｅ２またはＥ４の機能性部分の全部または一部を含む。より詳細には、領域Ｅ４の場合、重要な遺伝子はＯＲＦ３、ＯＲＦ６及びＯＲＦ６／７遺伝子である。
領域Ｅ２はウイルスＤＮＡの調節に関与する。この領域Ｅ２は２つの転写サブユニットＥ２Ａ及びＥ２Ｂから構成されている。
領域Ｅ４は、後期遺伝子の発現の調節、後期核ＲＮＡの安定性、宿主細胞のタンパク質の発現の抑制、ウイルスＤＮＡの複製の効率に関与する。Ｅ４が除去された突然変異体は増殖できない。従ってＥ４はウイルス増殖に必須の領域を構成する。この領域Ｅ４は、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ３／４、ＯＲＦ６及びＯＲＦ６／７と呼ばれる７つの読取り枠から構成されている（図２）。これらのうちで、ＯＲＦ３及びＯＲＦ６はウイルス増殖に必須の２つの遺伝子である。これらの遺伝子の各々がウイルス増殖を誘発できるが、ＯＲＦ６はＯＲＦ３よりも重要な役割を果たしている（Ｈｕａｎｇｅｔ  Ｈｅａｒｉｎｇ（１９８８），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３，２６０５）。
特定の実施態様においては、本発明のベクター中で、上記に考察した領域の全部がテトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下に置かれている。領域Ｅ２の場合、この領域は特に、７２ＫのｃＤＮＡ、１４０ＫのポリメラーゼのｃＤＮＡまたは８７Ｋのプレターミナルタンパク質のｃＤＮＡに対応するフラグメントである。領域Ｅ４の場合、この領域は特に、ヌクレオチド３５５７６−３２４９０に対応するＴａｑ１−Ｂｇｌ２フラグメントである。
別の特定実施態様において、これらの領域の機能性部分、即ちウイルス増殖を生じさせるに十分な部分の発現だけがコントロールされる。特にＥ４の場合、この部分は少なくとも１つの機能性遺伝子ＯＲＦ３またはＯＲＦ６を含む。好ましくは、Ｅ４の機能性部分は実質的にＯＲＦ６から構成される。例えば、３４１１５位と３２４９０位との間に存在しＡｄ５のＯＲＦ６及びＯＲＦ７の配列を含むフラグメントＢｇｌ２が上記に定義した本発明の誘導プロモーターの下流に配置され得る。
本発明の別の特定実施態様において、必須領域はタンパク質ＩＶａ２をコードする領域、例えばそのｃＤＮＡから構成される。別の実施態様では、タンパクＩＶａ２をコードする領域が、野生型アデノウイルスＡｄ５の配列のヌクレオチド３３２８−６３１６に対応するＢｇｌＩＩ−ＮｒｕＩフラグメント、ヌクレオチド４０２９−５７１９に対応するＤｒａＩ−ＮｌａＩＩＩフラグメント、または、ヌクレオチド４０２９−５７８８に対応するＤｒａＩ−ＸｈｏＩフラグメントに含まれている。
本発明の好ましい実施態様によれば、ウイルス増殖に必須の領域のプロモーターがウイルスゲノムの内部で誘導プロモーター、特に好ましくはテトラサイクリン誘導プロモーターによって置換されている。
第一の特定実施態様によれば、本発明の組換えアデノウイルスは、遺伝子Ｅ１の全部または一部を欠失し、領域Ｅ４の全部または一部を、好ましくはＯｐ２／Ｔｋ型のテトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下に有している。
別の特定実施態様によれば、本発明の組換えアデノウイルスは、遺伝子Ｅ１の全部または一部を欠失し、領域Ｅ２の全部または一部を、好ましくはＯｐ２／Ｔｋ型のテトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下に有している。
同じく本発明の好ましい実施態様によれば、本発明の組換えアデノウイルスは、遺伝子Ｅ１及びＥ２の全部または一部を欠失し、領域Ｅ４の全部または一部を、好ましくはＯｐ２／Ｔｋ型のテトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下に有している。
特に有利な変形実施態様によれば、本発明の組換えアデノウイルスは、遺伝子Ｅ１及びＥ４の全部または一部を欠失し、領域Ｅ２の全部または一部を、好ましくはＯｐ２／Ｔｋ型のテトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下に有している。
本発明の組換えアデノウイルスが更に、細胞、器官または生物体内において導入及び／または発現されるのが望ましい１つまたは複数の治療用遺伝子を含む異種核酸配列を含んでいるのが有利である。
このように導入され得る治療用遺伝子は、標的細胞内で転写及び任意に翻訳されることによって治療効果を発揮する産生物を産生する任意の遺伝子である。
治療用遺伝子としては特に、治療効果を有するタンパク質性産生物をコードする遺伝子がある。このようにコードされるタンパク質性産生物は、タンパク質、ペプチドなどである。このタンパク質性産生物は標的細胞に対して同種の産生物でもよい（即ち、標的細胞がいかなる病的異常も有していないときに標的細胞中で正常に発現される産生物）。この場合、タンパク質の発現によって、例えば細胞内の不十分な発現または修飾によって失活したはもしくは活性低下したタンパク質の発現という問題が解決されたり、あるいは、タンパク質の超発現が得られたりする。治療用遺伝子はまた、安定性が強化されたり活性が修飾されたりした細胞性タンパク質の突然変異体をコードし得る。細胞性タンパク質はまた、標的細胞に対して異種のタンパク質でもよい。この場合、発現されたタンパク質は例えば、細胞の欠損活性を補完または付与して、病的異常に対する抵抗力を細胞に与える。
本発明の治療用産生物としては、特に、酵素；血液誘導体；ホルモン；リンホカイン：インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦなど（ＦＲ９２０３１２０）；成長因子；神経伝達物質またはそれらの前駆物質もしくは合成酵素；栄養因子：ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５など；アポリポタンパク質：ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、など（ＦＲ９３０５１２５）；ジストロフィンもしくはミニジストロフィン（ＦＲ９１１１９４７）；腫瘍抑制遺伝子：ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖ、など（ＦＲ９３０４７４５）；ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子などの凝固に関与する因子をコードする遺伝子；自殺遺伝子：チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼなど；あるいは天然または人工の免疫グロブリンの全部または一部（Ｆａｂ、ＳｃＦｖなど）がある。
治療用遺伝子はまた、標的細胞内で発現したときに遺伝子の発現またはリボザイムのような細胞性ｍＲＮＡの発現をコントロールし得る遺伝子またはアンチセンス配列でもよい。このような配列は例えば、欧州特許１４０３０８に記載の技術によって、標的細胞内で細胞性ｍＲＮＡの相補的ＲＮＡに転写され、細胞性ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されることをブロックする。
治療用遺伝子はまた、ヒト体内で免疫応答を誘発し得る抗原性ペプチドをコードする遺伝子でもよい。従ってこの特定実施態様においては特に、本発明は微生物またはウイルスに対してヒトを免疫感作し得るワクチンを製造し得る。これらのワクチンは特に、エプスタイン・バールウイルス、ＨＩＶウイルス、肝炎Ｂ型ウイルス（ＥＰ１８５５７３）、偽狂犬病ウイルスに特異的な抗原性ペプチドまたは腫瘍に特異的な抗原性ペプチド（ＥＰ２５９２１２）である。
一般に、異種核酸配列はまた、感染細胞内の機能性転写のプロモーター領域と、問題の遺伝子の３′に存在し転写終了シグナルとポリアデニル化部位とを特定する領域とを含む。これらの要素の集合が発現カセットを構成する。プロモーター領域に関しては、この領域は、感染細胞内で機能し得るときに該当する遺伝子の発現を支配する天然のプロモーター領域である。この領域はまた、異なる起原の領域（別のタンパク質の発現を支配する領域、あるいは合成領域）でもよい。この領域として特に、真核細胞遺伝子またはウイルス遺伝子のプロモーター配列を挙げることができる。例えば、感染の対象となる細胞のゲノムに由来のプロモーター配列でもよい。また、使用されるアデノウイルスも含めたウイルスのゲノムに由来のプロモーター配列でもよい。これに関しては例えば、遺伝子Ｅ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＲＳＶなどのプロモーターを例示し得る。更に、これらのプロモーター領域は、活性化配列、調節配列、または組織特異的発現もしくは主働的発現を可能にする配列の付加によって修飾されてもよい。更に、異種核酸がプロモーター配列を含まない場合には、該核酸をプロモーター配列の下流で欠損ウイルスのゲノムに挿入してもよい。
更に、異種核酸配列はまた、合成された治療用産生物を標的細胞の分泌経路に導くシグナル配列を、特に治療用遺伝子の上流に含んでいてもよい。このシグナル配列は治療用産生物の天然のシグナル配列でもよいが、全く別の機能性シグナル配列でもよくまたは人工のシグナル配列でもよい。
この核酸配列は好ましくは、領域Ｅ１、Ｅ３またはＥ４の処に欠失配列に付加または置換して存在する。
本発明の第二の主要な目的は、その発現が誘導プロモーター、より好ましくはテトラサイクリン誘導プロモーターによってコントロールされる異種ウイルス起原の少なくとも１つの遺伝子を含むアデノウイルスを提供することである。
本発明の好ましい実施態様によれば、異種ウイルス起原の遺伝子はＡＡＶのゲノム遺伝子またはその機能性類似体であるかまたはそれらに由来する。
ＡＡＶは比較的小さい大きさのＤＮＡウイルスであり、感染する細胞のゲノムに部位特異的に安定に組み込まれる。ＡＡＶはまた、増殖、形態または細胞分化に対する影響を誘発することなく広いスペクトルの細胞に感染し得る。更に、ヒトの病的異常には関与しないと考えられる。ＡＡＶのゲノムは、クローニングされ、配列決定され、特性決定されている。このゲノムは、４６８０塩基を含み、各末端に、ウイルスの複製起点として作用する約１４５塩基の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）領域を含んでいる。ゲノムの残りの部分は、キャプシド形成機能を有する２つの本質的な領域に分割される、即ち、ウイルスの複製及びウイルス遺伝子の発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含むゲノムの左側部分と、ウイルスのキャプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含むゲノムの右側部分とに分割される。ここから３つのプロモーターが検出され、マッピング装置で測定した概略位置に従って夫々ｐ５、Ｐ１９及びｐ４０と命名されている。ｒｅｐ領域からは少なくとも４つのタンパク質が合成され、夫々の見掛け分子量に従ってＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０と命名されている。プロモーターｐ５に由来の２つのｍＲＮＡ転写物はＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８の合成に使用される。Ｒｅｐ５３及びＲｅｐ４０はプロモーターｐ１９に由来のメッセンジャーから合成される。ｃａｐ遺伝子に関してより詳細に考察すると、この遺伝子はウイルスのキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）をコードしている。ＶＰ３は主要キャプシドタンパク質であり、そのアミノ酸配列はより大きいがより少ない２つのタンパク質ＶＰ１及びＶＰ２の配列に内包されている（図解）。これらのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、特性決定され、夫々の配列は文献に記載されている（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５（１９８３）５５５）。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子導入のためにＡＡＶ由来のベクターを使用することは文献に記載されている（特に、ＷＯ９１／１８０８８；ＷＯ９３／０９２３９；米国特許第４，７９７，３６８号、第５，１３９，９４１号、欧州特許第４８８５２８号参照）。一般に、遺伝子治療に使用される構築物はｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子の欠失を含み、これらが有益な遺伝子によって置換されている。
ＡＡＶが複製されるためには、それらを複製するために必要な機能にトランス相補性を与え得る補助（“ヘルパー”）ウイルスの存在が必要である。このような補助ウイルスとしては特に、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、または、ワクチンのウイルスがある（このような補助ウイルスが存在しないとき、ＡＡＶは感染細胞のゲノム中に潜伏形態で維持されるが、複製されないのでウイルス粒子を産生しない）。従って従来の方法では、組換えＡＡＶは、ヒト補助ウイルスに感染した細胞（例えばアデノウイルス）中で、ＡＡＶの２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）領域で囲まれた問題の遺伝子を含むプラスミドと、ＡＡＶのキヤプシド形成遺伝子（ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）を含むプラスミドとをコトランスフェクションすることによって産生される。アデノウイルスとのコトランスフェクションによって、カスケード的連鎖反応が開始され、高力価のＡＡＶが産生され、アデノウイルスの産生が顕著に減少する。この連鎖反応は、プロモーターｐ５及びｐ１９からの転写を誘発するＥ１ａ遺伝子産物の合成によって開始され、最終的に少量のＲｅｐタンパク質を合成する。ｐ５から合成された１種または複数のＲｅｐタンパク質が３つのプロモーターからｍＲＮＡの大量合成を極めて高いレベルで協調的に誘導する。アデノウイルスが存在しないとき、ＡＡＶゲノムは消滅するかまたは宿主の染色体に取り込まれる。ＡＡＶの遺伝子を有効に発現させるためにはアデノウイルスのＥ１Ａ以外の遺伝子も必要である。
出願人は、ＡＡＶのウイルス遺伝子の１つの発現をアデノウイルスの誘導プロモーターのコントロール下に少なくとも維持できること、より好ましくはＡＡＶのキャプシド形成機能の発現をコントロールできること、特にｒｅｐ遺伝子及び／またはｃａｐ遺伝子または他の任意の機能性相同遺伝子の発現をコントロールできることを証明したが、これらは極めて有利な知見であった。
機能性相同体は、ｒｅｐ遺伝子またはｃａｐ遺伝子の修飾（突然変異、削除、付加、など）によって得られた同種類の活性を有している任意の遺伝子を意味する。このような機能性相同遺伝子はまた、ｒｅｐ遺伝子またはｃａｐ遺伝子に対応するプローブを用いて核酸バンクからハイブリダイゼーションによって得られる遺伝子であってもよい。本発明によってコントロールされ得る突然変異したｒｅｐ遺伝子の例として特に、Ｙ．Ｙａｎｇら（（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６０５８−６０６９）の論文に記載されたコドン２８６と２８７の間にセリンを挿入することによって誘導された突然変異体ｉｎ１１７７がある。
本発明の好ましい実施態様によれば、使用される誘導プロモーターは前記に定義したようなテトラサイクリン誘導プロモーターである。
このようなアデノウイルスはいくつかの理由で有利である。即ち、操作面でＡＡＶ株の作製方法が極めて簡単になる。実際、この特定の場合には、誘導プロモーターのコントロール下のｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含むアデノウイルスと、組換えＡＡＶと、適当な細胞系とが本質的に使用される。最後に、このようなアデノウイルスから得られるＡＡＶの予測される力価は従来の方法で得られる力価を上回ることが判明した。
誘導プロモーターは特に、考察される１つまたは複数の遺伝子の発現を正常に導くプロモーターの１つの置換、特にプロモーターｐ５、ｐ１９またはｐ４０の置換によって導入され得る。プロモーターＰ５はウイルスの産生に導くカスケード式連鎖反応の開始に最も関与すると考えられるので、プロモーターｐ５を好ましくはＯｐ２／Ｔｋ型のテトラサイクリンによって誘導可能なプロモーターで置換するのが特に好ましい。このような構築物はテトラサイクリンの非存在下ではｒｅｐ遺伝子及びｃａｐの発現をブロックできるという利点を有している。
誘導プロモーターのコントロール下のＡＡＶのキャプシド形成機能は、請求の範囲に記載のアデノウイルスのゲノムの種々の領域に導入され得る。キャプシド形成機能はＡＡＶにトランス相補性を与えるウイルスの能力を変調させない領域に挿入されるのが有利である。また、キャプシド形成機能を該アデノウイルスのゲノムの機能性領域に挿入することも可能であり、このとき、この領域はプラスミドまたは使用された細胞系によってトランス配置で与えられる。例えば、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子またはｒｅｐ及びｃａｐの双方の遺伝子を領域Ｅ１またはＥ３の処に欠失配列に置換または補充して挿入することが可能である。
ＩＴＲ−ｐｓｉ領域が近接していることに起因する転写漏出を完全に防止するために、負の調節配列と呼ばれる配列を更に導入してもよい。一方でこのような配列が特に請求の範囲に記載のアデノウイルスの左側ＩＴＲとｐｓｉ配列との間に挿入されているとき、テトラサイクリン誘導プロモーターをコードする配列は、アデノウイルスの左側ＩＴＲとｐｓｉ配列との間にときには存在するエンハンサーによって誘発されるｒｅｐ及びｃａｐの寄生的転写活性化を完全に阻止し得る。本発明で使用され得る負の配列の例としては、特に、ビメンチンプロモーター（Ｓａｌｖｅｔｔｉら，（１９９３），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６７６−１６８５）、インターフェロンプロモーター（Ｗｈｉｔｅｍｏｒｅら，（１９９０），Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，８７，７７９９−７８０３）、心筋ミオシンのＬ鎖２の遺伝子（Ｒｕｏｑｕｉａｎ−Ｓｈｅｎら，（１９９１），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ１．，１６７６−１６８５）、マウスアルブミンプロモーター（Ｈｅｒｂｓｔら，（１９９０），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３８９６−３９０５）に同定されている配列が挙げられる。
好ましい実施態様によれば、本発明は、発現カセットＯｐ２／Ｔｋ−ｒｅｐ−ｃａｐを含む組換えアデノウイルスに関する。
本発明の目的はまた、ＡＡＶ起原のウイルス配列がテトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下に組み込まれているこれらのアデノウイルスをＡＡＶの作製に使用することである。
好ましい実施態様において、本発明の目的となるアデノウイルスは、ＩＴＲ配列とキャプシド形成可能配列とを含む。好ましくは、これらのアデノウイルスは更に、非機能性の領域Ｅ１を有している。
逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）はアデノウイルスの複製起点を構成する。これらの配列はウイルスゲノムの３′末端及び５′末端に局在している（図１参照）。当業者に公知の分子生物学の慣用技術によってこれらの配列を容易に単離し得る。ヒトアデノウイルス（特に血清型Ａｄ２及びＡｄ５）及びネコアデノウイルス（特にＣＡＶ１及びＣＡＶ２）のＩＴＲ配列のヌクレオチド配列は文献に記載されている。例えば、アデノウイルスＡｄ５の場合、左側ＩＴＲ配列はゲノムのヌクレオチド１−１０３を含む領域に対応する。
キャプシド形成配列（Ｐｓｉとも呼ばれる）はウイルスＤＮＡのキャプシド形成に必要である。従って本発明の欠損組換えアデノウイルスを作製できるためにはこの領域が存在しなければならない。キャプシド形成配列はアデノウイルスのゲノム内の左側ＩＴＲ（５′）とＥ１遺伝子との間に局在している（図１）。この配列は分子生物学の慣用技術によって単離または人工的に合成できる。ヒトアデノウイルス（特に血清型Ａｄ２及びＡｄ５）及びネコアデノウイルス（特にＣＡＶ１及びＣＡＶ２）のキャプシド形成配列のヌクレオチド配列は文献に記載されている。例えばアデノウイルスＡｄ５の場合、キャプシド形成配列はゲノムのヌクレオチド１９４−３５８を含む領域に対応する。
本発明の組換えアデノウイルスの特に有利な実施態様によれば、領域Ｅ１はアデノウイルスＡｄ５の配列のヌクレオチド４５４からヌクレオチド３３２８までのＰｖｕＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントの欠失によって不活性化されている。この配列は文献にも記載されており、また、データベースからも入手できる（特に、Ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ｎｏ．Ｍ７３２６０参照）。別の好ましい実施態様では、領域Ｅ１はヌクレオチド３８２からヌクレオチド３４４６までのＨｉｎｆＩＩ−Ｓａｕ３Ａフラグメントの欠失によって不活性化されている。
本発明のアデノウイルスは、種々の起原のアデノウイルスから作製できる。実際、アデノウイルスの種々の血清型が存在しており、その構造及び特性は多少違っているが、遺伝的編成は類似している。従って、当業者は任意の型のアデノウイルスに対して本出願に記載の教示を容易に再現し得る。
より特定的には本発明のアデノウイルスはヒト起原、動物起原または混成型（ヒト及び動物）である。
ヒト起原のアデノウイルスの場合、好ましくはグループＣに分類されるアデノウイルスを使用する。より好ましくは、ヒトアデノウイルスの種々の血清型のうちで、２型または５型のアデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）を本発明に使用する。
上記に指摘したように、本発明のアデノウイルスは動物起原でもよく、または動物起原のアデノウイルスに由来の配列を含んでもよい。出願人は実際、動物起原のアデノウイルスが高い効率でヒト細胞に感染でき、試験に用いたヒト細胞中で増殖できないことを証明した（国際特許出願ＷＯ９４／２６９１４参照）。出願人はまた、動物起原のアデノウイルスがヒト起原のアデノウイルスによってトランス相補性を与えられないこと、従ってヒトアデノウイルスの存在下では感染性粒子の形成に導くｉｎ  ｖｉｖｏの組換え及び増殖の危険が完全に除去されていることを証明した。従って、動物起原のアデノウイルスまたはアデノウイルスの領域の使用は、遺伝子治療のベクターとしてウイルスを使用する際に伴う危険性がいっそう軽減されるので特に有利である。
本発明で使用できる動物起原のアデノウイルスは、ネコ、ウシ、ネズミ（例えばＭａｖ１、Ｂｅａｒｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５（１９９０）８１）、ヒツジ、ブタ、トリまたはサル（例えばＳＡＶ）に由来し得る。トリアデノウイルスのうちでは特に、ＡＴＣＣで入手し得る血清型１〜１０、例えばＰｈｅｌｐｓ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−４３２）、Ｆｏｎｔｅｓ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−２８０）、Ｐ７−Ａ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８２７）、ＩＢＨ−２Ａ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８２８），Ｊ２−Ａ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８２９），Ｔ８−Ａ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８３０），Ｋ−１１（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２１）またはＡＴＣＣ  ＶＲ−８３１〜８３５で照合できる菌株がある。ウシアデノウイルスとしては特に、公知の種々の血清型、特に、ＡＴＣＣから参照番号ＡＴＣＣＶＲ−３１３、３１４、６３９−６４２、７６８及び７６９で入手し得る血清型（１〜８型）を使用し得る。また、ネズミアデノウイルスＦＬ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５５０）及びＥ２０３０８（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５２８）、ヒツジアデノウイルス５型（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１３４３）または６型（ＡＴＣＣ  ＶＲ１３４０）、ブタアデノウイルス５３５９、またはサルアデノウイルス、特に参照番号ＶＲ−５９１〜５９４、９４１〜９４３、１９５〜２０３でＡＴＣＣから入手し得るものなどがある。
好ましくは、動物起原の種々のアデノウイルスのうちでも、ネコ起原のアデノウイルスまたはアデノウイルスの領域、特にアデノウイルスＣＡＶ２の全部の菌株〔例えば、マンハッタン株またはＡ２６／６１（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８００）〕を本発明に使用する。ネコアデノウイルスは多くの構造的研究の対象となっている。従って、アデノウイルスＣＡＶ１及びＣＡＶ２の完全な制限地図が従来の技術文献に記載されており（Ｓｐｉｂｅｙら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０（１９８９）１６５）、また、遺伝子Ｅ１ａ、Ｅ３及び配列ＩＴＲがクローニングされ、配列決定されている（特に、Ｓｐｉｂｅｙら，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．１４（１９８９）２４１；Ｌｉｎｎｅ，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．２３（１９９２）１１９，ＷＯ９１／１１５２５参照）。
本発明は更に、ＡＡＶを作製するための有効な方法に関する。
より詳細には本発明の目的を成すＡＡＶの作製方法は、テトラサイクリンまたはその類似体の１つの存在下で、転写アクチベーターの発現カセットをゲノムに含む細胞系を、テトラサイクリン誘導プロモーターの存在下の少なくとも１つのＡＡＶ起原の遺伝子と、ＡＡＶ由来の組換えウイルスまたはＡＡＶのＩＴＲ間のトランスジーンを含むプラスミドと共にコトランスフェクションすることを特徴とする。より好ましくはこのＡＡＶはｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を異種ウイルス遺伝子として含むアデノウイルスである。
本発明方法は、十分な量のテトラサイクリンと転写アクチベーターとの存在下では、アデノウイルス内部でテトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下に配置されたｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子の発現が誘発され得るという特性を利用している。
前述のようにこの方法の利点は、従来の方法に比べて操作が容易なことである。本発明の場合には、請求の範囲に記載のようなアデノウイルス由来の細胞系とＡＡＶに由来の組換えウイルスとを同時感染させるだけでよい。
本発明の形質転換アデノウイルスだけでなく、テトラサイクリンまたはその類似体の１つの存在下でアデノウイルス中に存在する誘導プロモーターの調節配列に結合し得る第一のポリペプチドと転写を活性化する第二ポリペプチドとから構成された転写アクチベーターと呼ばれるタンパク質の発現カセットをそのゲノムに含む細胞系を用いて方法を行うことも可能である。
特に転写アクチベーターと呼ばれるタンパク質に関しては、このタンパク質は、テトラサイクリンの存在下で所謂調節配列に結合する傾向を有していること、及び、対応する最小プロモーターを活性化する能力を有していることを特徴としている。上記に説明したように、このタンパク質は２つのポリペプチドから成り、第一ポリペプチドはテトラサイクリンまたはその類似体の１つの存在下でｔｅｔオペレーター配列に結合でき、第二ポリペプチドは特に転写を活性化する機能を有している。
本発明の特に有利な実施態様によれば、転写アクチベーターと呼ばれるタンパク質の第一ポリペプチドは、野生型リプレッサーの挙動とは逆の挙動を示すように突然変異したテトラサイクリンのリプレッサーである。即ち、このポリペプチドはテトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレーター配列に結合するが、テトラサイクリンの非存在下では結合しない。この種の突然変異は慣用の突然変異誘発型生物学的技術によって惹起され得る。野生型リプレッサーと本発明の突然変異リプレッサーとのアミノ酸の違いは、１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失及びまたは付加から成る。その結果として、形質転換リプレッサーに２つの機能的特性が与えられる。形質転換リプレッサーは野生型リプレッサーとの類似によってテトラサイクリンオペレーターが表す調節配列に結合し得る。その反面で、形質転換リプレッサーはテトラサイクリンによって逆方向に調節される。
テトラサイクリンの野生型リプレッサーの多数のクラスが既に記載されており、そのうちでも特にクラスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥを挙げることができる。これらのリプレッサーの代表例としては特にクラスＢに属するリプレッサーＴｎ１０がある。本発明の好ましい実施態様に使用されるリプレッサーはこの野生型リプレッサーＴｎ１０に由来する。より詳細には、７１、９５、１０１または１０２位に局在するアミノ酸の少なくとも１つが突然変異したリプレッサーＴｎ１０が使用される。
より好ましくは、このリプレッサーは配列番号８で表されるアミノ酸配列の全部または一部を有している。このリプレッサーはＴｅｔＲと呼ばれる。
転写アクチベーターと呼ばれるタンパク質中に存在する第二ポリペプチドに関しては、このポリペプチドは既知のいかなる転写活性化ドメインでもよい。本発明の好ましい実施態様によれば、このポリペプチドは、単純ヘルペウウイルのタンパク質１６の活性化ドメインであり、より特定的にはＶＰ１６のＣ末端の１３０個のアミノ酸であり、より好ましくは、ＶＰ１６のこのＣ末端の１１個のアミノ酸またはＶＰ１６もしくはその誘導体のＣ末端部のペプチド部分である（Ｓｃｅｉｐｅｌ  Ｋ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９２；１３，４９６１−４９６８）。
請求の範囲に記載のＡＡＶの作製方法の場合には、この転写アクチベーターの発現カセットが好ましくは２９３細胞系のゲノムに組み込まれている。
本発明の好ましい実施態様によれば、細胞系内のこの転写アクチベーターの発現も前記に定義したようなテトラサイクリンまたはその類似体の１つによって誘導可能なプロモーターのコントロール下に置かれている。より好ましくは、２９３細胞系のゲノムにカセットＯｐ２／Ｔｋ−ＴｅｔＲ−ＶＰ１６が組み込まれている。
本発明の目的はまた、本発明で定義した誘導プロモーターを任意に含む前記に定義したような転写アクチベーターの発現カセットをそのゲノムに含む細胞系を提供することである。より好ましくは、細胞系のゲノムにカセットＯｐ２／Ｔｋ−ＴｅｔＲ．−ＶＰ１６が組み込まれている。
本発明はまた、本発明のアデノウイルスまたはＡＡＶを産生するためのこの種の細胞系の使用に関する。
その発現がテトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下に維持された少なくとも１つの遺伝子を含むアデノウイルスの作製方法も本発明の目的の１つである。
本発明の欠損組換えアデノウイルスは種々の方法で作製され得る。
第一の方法では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば結合によってまたはプラスミドの形態で）作製した欠損組換えウイルスのＤＮＡを、コンピテント細胞系、即ちウイルスの相補性に必要な全部の機能と転写アクチベーターとをトランス配置で含む細胞系に導入する。これらの機能は好ましくは細胞のゲノムに組み込まれており、このため組換えが生じる危険性が排除され、細胞系の安定性が強化される。
次いで、十分な量のテトラサイクリンまたはその類似体の１つの存在下で増殖するベクターを、分子生物学の慣用技術によって回収し、精製し、増幅する。
変形実施態様によれば、適正な欠失とテトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下の１つまたは複数のウイルス遺伝子と１つまたは複数の治療用遺伝子とを含む欠損組換えウイルスのＤＮＡを結合によるかまたはプラスミドの形態でｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製することが可能である。通常は、実施例で説明するような分子生物学で慣用の技術に従って欠損組換えウイルスのＤＮＡを適正な制限酵素によって消化し次いで結合させることによって欠失を生じさせる。次いで、酵素開裂及び結合を順次行ってウイルス遺伝子または治療用遺伝子と誘導プロモーターとを選択領域の処で選択方向でこのＤＮＡに挿入する。この結果、適正な欠失を有し、テトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下の１つまたは複数のウイルス遺伝子と１つまたは複数の治療用遺伝子とを含むＤＮＡが得られる。このＤＮＡは請求の範囲に記載の組換えアデノウイルスを直接産生し得る。
また、異種遺伝子及び誘導プロモーターを順次に導入し得る順次段階によって組換えウイルスを作製することも可能である。即ち、適正な欠失（または欠失の一部）と例えばＯｐ２／Ｔｋのような誘導プロモーターとを含む第一の組換えウイルスのＤＮＡを結合によるかまたはプラスミドの形態で構築する。次いでこのＤＮＡを使用して、上記欠失を誘導プロモーターと共に含む第一の組換えウイルスを産生させる。次に、この第一ウイルスのＤＮＡを単離し、第二のプラスミド、または、適正な欠失特に相同組換え可能領域である領域Ｅ１に欠失を有しかつ任意に治療用遺伝子を含む第二の欠損組換えウイルスのＤＮＡとコトランスフェクトする。この第二段階で本発明の組換えウイルスが得られる。
本発明はまた、上記のような１つまたは複数の組換えアデノウイルスを含む医薬組成物全般に関する。本発明の医薬組成物は、局所投与、経口投与、非経口投与、鼻孔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、眼内投与、経皮投与、などに適した形態に製剤化され得る。
好ましくは医薬組成物は、注射用製剤を得るための医薬として許容される担体を含む。このような医薬組成物は特に、無菌で等張性の生理的塩類溶液（一リン酸ナトリウム、二リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなど、またはこれらの塩の混合物）の形態であるか、または、場合に応じて滅菌水または生理的血清を添加して注射可能な溶質を復元し得る乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物である。
注射に使用されるウイルスの用量は種々のパラメーター、特に使用される投与形態、対応する病的異常、発現させる遺伝子、または所望の治療期間に従って調節される。一般的に、本発明の組換えアデノウイルスは、１０4〜１０14ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０6〜１０10ｐｆｕ／ｍｌの用量の剤形で製剤化され投与される。ｐｆｕ（“プラーク形成単位”）なる用語はウイルス溶液の感染力価に対応し、適当な細胞培養物を感染させ、通常は５日後の感染細胞のプラーク数を計測することによって測定される。ウイルス溶液のｐｆｕ力価の測定方法は文献に詳しく記載されている。
本発明のアデノウイルスは多くの病的異常の治療または予防に使用され得る。これらのアデノウイルスは該当部位の処に直接注入することによって過増殖性病的異常（癌、再発狭窄症、など）の治療に有利である。この点で、本発明はまた、上記に定義したようなアデノウイルスベクターを上記細胞またはその一部に感染させることから成る増殖性細胞の破壊方法を提供する。自殺遺伝子が治療薬に対する感受性を与える遺伝子である場合、本発明の破壊方法では、細胞を治療薬によって処理する。この方法を実施するために、本発明はまた、治療薬に対する感受性を与える遺伝子から成る自殺遺伝子を含む上記に定義したような組換えアデノウイルスを含む産生物を提供することを目的とする。上記治療薬は、過増殖性病的異常を治療するために時間的に同時に、異なる時期にまたは時差的に併用薬剤として使用される。より特定的には、自殺遺伝子はチミジンキナーゼ遺伝子であり、治療薬はガンシクロビルまたはアシクロビルまたはその類似体である。
本発明の組換えベクターは遺伝子治療における使用に特に好適な特性を有している。これらのベクターは実際、感染性、安全性及び極めて高い遺伝子導入能力を合わせて有している。
添付図面を参照しながら実施例に基づいて本発明をより詳細に以下に説明する。これらの実施例及び図面は本発明を例示するもので本発明を限定するものではない。
図１は、アデノウイルスＡｄ５の遺伝子編成を示す。Ａｄ５の完全配列はデータベースから入手でき、当業者は任意の制限部位を選択または作成し、従ってゲノムの任意の領域を単離し得る。
図２は領域Ｅ４の遺伝子編成を示す。
図３はＡＡＶの遺伝子編成を示す。
分子生物学の汎用技術
プラスミドＤＮＡの分離用抽出、プラスミドＤＮＡの塩化セシウム勾配遠心、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲルにおける電気泳動、ＤＮＡフラグメントの電気溶出による精製、フェノールまたはフェノール−クロロホルムによるタンパク質の抽出、塩媒体中のエタノールまたはイソプロパノールによるＤＮＡの沈殿、大腸菌の形質転換、などのような分子生物学で慣用の方法は当業者に公知であり、文献にも十分に記載されている〔Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８２；Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ら（ｅｄｓ），“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７〕。
ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ型のプラスミド及びＭ１３シリーズのファージは市販製品である（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
結合のためには、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲル中の電気泳動によってＤＮＡフラグメントを大きさに基づいて分離し、フェノールまたはフェノール／クロロホルム混合物によって抽出し、エタノールで沈殿させ、次いで製造業者の指示通りに用いたファージＴ４のＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下でインキュベートする。
５′の突出末端の埋め戻しは、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント（Ｂｉｏｌａｂｓ）を製造業者の指示通りに用いて行う。３′の突出末端の破壊は、製造業者の指示通りに用いたファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で行う。５′の突出末端の破壊はヌクレアーゼＳ１によって調節される処理によって行う。
合成オリゴヌクレオチドによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘発される突然変異はＴａｙｌｏｒらによって開発された方法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３（１９８５）８７４９−８７６４〕に従い、Ａｍｅｒｓｈａｍによって販売されているキットを使用して行う。
所謂ＰＣＲ技術〔Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｓａｉｋｉ  Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０（１９８５）１３５０−１３５４；Ｍｕｌｌｉｓ  Ｋ．Ｂ．，Ｆａｌｏｏｎａ  Ｆ．Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７）３３５−３５０〕によるＤＮＡフラグメントの酵素増幅は“ＤＮＡサーマルサイクラー”（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）を製造業者の指示通りに使用して行う。
ヌクレオチド配列の確認はＳａｎｇｅｒらによって開発された方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４（１９７７）５４６３−５４６７〕に従ってＡｍｅｒｓｈａｍによって販売されているキットを用いて行う。
使用細胞系
以下の実施例では以下の細胞系を使用したかまたは使用し得る。
−ヒト胎児腎臓２９３細胞系（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）。この細胞系のゲノムには、ヒトアデノウイルスＡｄ５のゲノムの左側部分（１２％）が組み込まれている。
−ヒト表皮癌に由来のヒトＫＢ細胞系。この細胞系はその培養可能条件と共にＡＴＣＣから入手できる（参照番号ＣＣＬ１７）。
−ヒト表皮癌に由来のヒトＨｅＬａ細胞系。この細胞系はその培養可能条件と共にＡＴＣＣから入手できる（参照番号ＣＣＬ２）。
−ネコＭＤＣＫ細胞系。ＭＤＣＫ細胞の培養条件は特にＭａｃａｔｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４４（１９８８）９によって記載されている。
−ｇｍ  ＤＢＰ６細胞系（Ｂｒｏｕｇｈら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９０（１９９２）６２４）。この細胞系はアデノウイルスのＥ２遺伝子をＭＭＴＶのＬＴＲのコントロール下に含むＨｅＬａ細胞から成る。
実施例１
プロモーターＯｐ２−Ｔｋのコントロール下のドメインＥ４を含むアデノウイルスの構築
１．プラスミドｐＩＣ２０Ｈ／Ｏｐ２−Ｔｋの構築
このプラスミドは、テトラサイクリンオペレーターの２つの配列の直後に最小プロモーターＴｋの配列を含む。これらの配列はテトラサイクリンに結合するとテトラサイクリンリプレッサーによって認識される。
このプラスミドを得るために、プラスミドｐＩＣ２０Ｈ（Ｍａｒｓｈら，Ｇｅｎｅ  ３２（１９８４）４８）をＣｌａＩ−ＢａｍＨＩによって消化し、チミジンキナーゼ最小プロモーターの上流に２つのテトラサイクリンオペレーターを含む配列番号５の配列をこれらの２つの部位の間に導入する。
２．プラスミドｐＩＣ２０Ｈ／ＩＴＲ−Ｏｐ２Ｔｋの構築
このプラスミドは、プラスミドｐＩＣ２０Ｈ／Ｏｐ２ＴｋをＣｌａＩによって消化し、Ａｄ５のＩＴＲを含むＨｐａ２フラグメントを挿入することによって得られる（配位：１／＋１２２）。このＨｐａ２フラグメントは、市販のベクターｐＳＬ１１８０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＨｉｎｄ３によって消化し、増幅フラグメントの両側にＨｉｎｄ３部位をもつようにＰＣＲ作製したＩＴＲをこの部位に導入することによって得られる。ＩＴＲ−Ｏｐ２−ＴＫｐｒｏｍの順序の配列が得られる。
３．プラスミドｐＩＣ２０Ｈ／ＩＴＲ−Ｏｐ２Ｔｋ−Ｅ４の構築
このプラスミドは、プラスミドｐＩＣ２０Ｈ／ＩＴＲ−Ｏｐ２ＴｋをＨｉｎｄ３によって消化し、Ａｄ５の領域Ｅ４を含むＰＹ６のＮｈｅ−Ｘｂａ１フラグメントをこの部位に挿入することによって得られる。プラスミドｐＰＹ６は以下のプロトコルに従って得られる。
プラスミドｐＩＣ２０ＨからプラスミドｐＰＹ２を作製する。このプラスミドｐＰＹ２は、コンテキストＥ．ｃｏｌｉ  ｄａｍ＋から作製されたプラスミドｐＩＣ２０ＨのＸｂａ１部位とＳａｌ１部位との間にプラスミドｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＡｖｒ２−Ｓａｌ１フラグメント（ＭＭＴＶのプロモーターを含む約１．３ｋｂ）のクローニングしたものである。プラスミドｐＰＹ４は、ＢａｍＨ１及びＢｇｌ２で切断し次いで再結合した３５ｂｐのフラグメントをプラスミドｐＰＹ２から欠失させることによって得られる。プラスミドｐＰＹ５は、３５５７６位（Ｔａｑ１）と３２４９０位（Ｂｇｌ２）との間に位置する５型アデノウイルスの領域Ｅ４を含むＴａｑ１−Ｂｇｌ２フラグメントをＣｌａ１部位とＢａｍＨ１部位との間にクローニングしたプラスミドｐＩＣ２０Ｈに対応する。従ってプラスミドｐＰＹ５の領域Ｅ４は、部分消化後にプラスミドｐＰＹ４のＳｍａ１部位とＳｐｈ１部位との間にクローニングされたＥｃｏＲＶ−Ｓｐｈ１フラグメントに含まれている。この結果としてプラスミドｐＰＹ６が得られる。
４．プラスミドｐＩＣ２０Ｈ／ＩＴＲ−Ｏｐ２Ｔｋ−Ｅ４−Ｌ５の構築
このプラスミドは、プラスミドｐＩＣ２０Ｈ／ＩＴＲ−Ｏｐ２Ｔｋ−Ｅ４をＫｐｎ１及びＸｂａ１によって消化し、領域Ｌ５の全部を含むＡｄ５の３．１ＫｂのＫｐｎ１−Ｘｂａ１フラグメント（配位：３３５９５−３０４７０）を挿入することによって得られる。
５．プラスミドｐＹＧ４−ＥＰの構築
ＩＴＲ、Ｏｐ２、Ｔｋプロモーター、Ｅ４及びＬ５を順次に含む対応フラグメントを回収するためにプラスミドｐＩＣ２０Ｈ／ＩＴＲ−Ｏｐ２Ｔｋ−Ｅ４−Ｌ５をＸｂａ１及びＮｒｕ１によって消化する。このフラグメントを、Ｘｂａ１部位からＳｐｈ１部位までのアデノウイルスの配列全部を含むプラスミドｐＹＧ４のＸｂａ１部位とＮｒｕ１部位とに挿入する。このプラスミドｐＹＧ４−ＥＰは、Ａｄ５のＳｐｈ１−Ｘｂａ１フラグメントがＳｐｈ１部位とＸｂａ１部位（配位：２５０９５−２８５９０）との間に挿入されたベクターｐＩＣ２０Ｈである。
アデノウイルスの領域Ｅ３が欠失したこのベクターｐＹＧ４−ＥＰは、アデノウイルスの相補的組換えに十分なアデノウイルス配列をＳｐｈ１部位とＸｂａ１部位との間に有しており、組換えアデノウイルスの作製に使用し得る。
６．組換えアデノウイルスの構築
この構築は、以下の実施例３の手順で作製した２９３／ＴｅｔＲ−ＶＰ１６細胞と、Ｓｐｈ１消化によって直鎖化したプラスミドｐＹＧ４及びアデノウイルスＲＳＶ−βｇａｌまたはテトラサイクリンの存在下もしくは非存在下でＳｒｆ１消化によって直鎖化したトランスジーンを含むアデノウイルスとのコトランスフェクションによって行う。次に、組換えアデノウイルスを選択及び増幅するために慣用のウイルス学の技術に従って処理する。
実施例２
ＡＡＶのｒｅｐ−ｃａｐ遺伝子をＯｐ２／Ｔｋプロモーターのコントロール下に含む組換えアデノウイルスの構築
１．中間プラスミドｐＸＬ２６３０の構築
この中間プラスミドは、Ｏｐ２−Ｔｋの下流にＥｃｏＲＩ部位を導入し得る。この位置の制限部位の存在は２つの利点を有している。この制限部位はプロモーターｐ５の削除後のｒｅｐ−ｃａｐの上流にこのプロモーターを導入する役割を果たし、また、実施例３に後述する手順で形質転換した２９３細胞系を作製するためにこのハイブリッドプロモーターをＴｅｔＲ−ＶＰ１６の上流に挿入し得る。
このために、実施例１に記載のプロトコルに従って得られたプラスミドｐＩＣ２０Ｈ／Ｏｐ２−ＴｋをＢａｍＨＩによって消化し、平滑末端にするためにＴ４のＤＮＡポリメラーゼによって処理し、次いでＥｃｏＲＶで再消化し、この消化後に得られたＯｐ２−Ｔｋプロモーターを含むフラグメントを市販のプラスミドｐＢＳＳＫ＋のＥｃｏＲＶ部位に導入する。このフラグメントの方向はＥｃｏＲＩ部位がプロモーターの下流に存在するように選択する。
３．ｐ５の転写レベル＋１のＥｃｏＲＩの導入
プロモーターｐ５を削除するために、プロモーターｐ５の転写レベル＋１のＥｃｏＲＩをＲｅｐ７８のコーディング配列の上流に、プラスミドｐＡＶ２に対するＰＣＲ技術によって導入する（Ｌａｕｇｈｌｉｎ  Ｃ．，Ｇｅｎｅ（１９８３），２３，６９−７３）。この反応は以下のオリゴヌクレオチドを用いて行う。
配列番号６（配列５２６９）：
5′GAATTCTTTTGAAGCGGGAGGTTTGAACGCG3′
EcoRI
配列番号７（配列５０３９）：
5′CTCCATGTACCTGGCTGA3′
このようにして作製したフラグメントをｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入してプラスミドｐＭＡ４とした。このフラグメントのヌクレオチド配列を確認した。
４．Ｏｐ２−Ｔｋ−ｒｅｐ−ｃａｐの結合体を含むプラスミドｐＭＡ６の構築
この中間プラスミドは誘導プロモーターとｒｅｐとを結合し得る。ｐＸＬ２６３０のＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとｐＭＡ４のＥｃｏＲＩ−ＮｒｕＩフラグメントとをｐＩＣ２０Ｒ（Ｍａｒｓｈら，Ｇｅｎｅ  ３２（１９８４）４８１）のＸｈｏＩ部位（ＳａｌＩと適合性）及びＮｒｕＩに導入して、プラスミドｐＭＡ６を作製する。
５．ＨｉｎｆＩ（３８２）部位までのアデノウイルスＡｄ５の左側部分、多重クローニング部位及びアデノウイルスＡｄ５のＳａｕ３Ａ（３４４６）−ＮｒｕＩ（６３１６）フラグメントを含むプラスミドｐＣ０１（図７  ＥＸ９４００８）の構築
５−ａ．プラスミドｐＣＥの構築
アデノウイルスＡｄ５のゲノムの左端に対応するＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを先ずベクターｐＩＣ１９Ｈ（Ｍａｒｓｈら，Ｇｅｎｅ  ３２（１９８４）４８１）のＥｃｏＲＩ部位とＸｂａＩ部位との間にクローニングした。これによってプラスミドｐＣＡが得られる。プラスミドｐＣＡを次にＨｉｎｆＩによって切断し、その５′突出末端を大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントによって埋め戻し、次いでＥｃｏＲＩによって切断した。このようにして作製したアデノウイルスＡｄ５のゲノムの左末端を含むプラスミドｐＣＡのフラグメントを次に、ベクターｐＩＣ２０Ｈ（Ｍａｒｓｈら，Ｇｅｎｅ  ３２（１９８４）４８１）のＥｃｏＲＩ部位とＳｍａＩ部位との間にクローニングした。これによってプラスミドｐＣＢが得られる。プラスミドｐＣＢを次にＥｃｏＲＩによって切断し、その５′突出末端を大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントによって埋め戻し、次いでＢａｍＨＩによって切断した。このようして作製したアデノウイルスＡｄ５のゲノムの左末端を含むプラスミドｐＣＢを次にベクターｐＩＣ２０ＨのＮｒｕＩ部位とＢｇｌＩＩ部位との間にクローニングした。これによってプラスミドｐＣＥが得られる。プラスミドｐＣＥの重要な特徴は、アデノウイルスＡｄ５の最初の３８２塩基対を含み、その直後に多重クローニング部位を含むことである。
５−ｂ．プラスミドｐＣＤ′の構築
アデノウイルスＡｄ５のゲノムのＳａｕ３Ａ（３３４６）−ＳｓｔＩ（３６４５）フラグメントとＳｓｔＩ（３６４５）−ＮａｒＩ（５５１９）フラグメントとを先ずベクターｐＩＣ２０ＨのＣｌａＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間に結合し、クローニングした。これによりプラスミドｐＰＹ５３が得られる。コンテキストｄａｍ−から調製したＳａｕ３Ａ（３３４６）部位とＴａｑＩ（５２０７）部位との間のアデノウイルスＡｄ５のゲノムの部分を含むプラスミドｐＰＹ５３のＳａｌＩ−ＴａｑＩフラグメントを次に、ベクターｐＩＣ２０ＨのＳａｌＩ部位とＣｌａＩ部位との間にクローニングして、プラスミドｐＣＡ′を作製する。コンテキストｄａｍ−から調製したアデノウイルスＡｄ５のゲノムのＴａｑＩ（５２０７）−ＮａｒＩ（５５１９）フラグメントとプラスミドｐＣＡ′のＳａｌＩ−ＴａｑＩフラグメントとを次に、ベクターｐＩＣ２０ＨのＳａｌＩ部位とＮａｒＩ部位との間に結合しクローニングした。これによってプラスミドｐＣＣ′が得られる。コンテキストｄａｍ−から調製したアデノウイルスＡｄ５のゲノムのＮａｒＩ（５５１９）−ＮｒｕＩ（６３１６）フラグメントとプラスミドｐＣＣ′のＳａｌＩ−ＮａｒＩフラグメントとを次に、ベクターｐＩＣ２０ＲのＳａｌＩ部位とＮｒｕＩ部位との間に結合しクローニングした。これによってｐＣＤ′が得られる。
５−ｃ．プラスミドｐＣ０１の構築
プラスミドｐＣＤ′のＸｈｏＩによる部分消化及びＳａｌＩによる完全消化を順次行うことによって、アデノウイルスＡｄ５のＳａｕ３Ａ（３４４６）部位からＮｒｕＩ（６３１６）部位までの配列を含む制限フラグメントを作製する。このフラグメントをプラスミドｐＣＥのＳａｌＩ部位にクローニングした。これによってプラスミドｐＣ０１が得られる。
６−プラスミドｐＭＡ７及びＭＡ８の構築
ＡＡＶのＯｐ２−Ｔｋ−ｒｅｐ−ｃａｐ−ポリＡ＋を含むｐＭＡ６のＥｃｏＲＶ−ＳｎａＢＩフラグメント（ＡＡＶの配列の４４９５位のＳｎａＢＩ部位まで）をアデノウイルスのＩＴＲに対して２つの方向でｐＣ０１のＥｃｏＲＶ部位に導入する。このようにして得られたプラスミドをｐＭＡ７（カセットの方向はアデノウイルスのＩＴＲに逆方向）及びｐＭＡ８（同方向）と命名する。
７．Ｏｐ２−Ｔｋ−ｒｅｐ−ｃａｐを含む組換えアデノウイルスの構築
この項では、ＡＡＶのカセットＯｐ２−Ｔｋ−ｒｅｐ−ｃａｐ−ポリＡ＋を含む欠損組換えアデノウイルスの構築を説明する。このアデノウイルスは、アデノウイルスの領域Ｅ１（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）によってコードされた機能をトランス配置で与えるヘルパー細胞（２９３細胞系）中でプラスミドｐＭＡ７またはｐＭＡ８と欠損アデノウイルスベクターとをコトランスフェクションすることによって得られる。
より詳細には、アデノウイルスＡｄＲＳＶβｇａｌとプラスミドｐＭＡ７及びｐＭＡ８との間のｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換えを以下のプロトコルに従って行うことによってアデノウイルスＡｄＭＡ７及びＡｄＭＡ８を作製する。ＮｄｅＩによって直鎖化したプラスミドｐＭＡ７またはｐＭＡ８とＣｌａＩによって直鎖化したアデノウイルスＡｄＲＳＶＢｇａｌとをリン酸カルシウムの存在下で２９３細胞中でコトランスフェクトして組換えを生じさせる。このようにして得られた組換えアデノウイルスをプラーク精製によって選択する。単離後、組換えアデノウイルスを２９３細胞系中で増幅させると、約１０１０ｐｆｕ／ｍｌの力価を有する未精製の組換え欠損アデノウイルスを含む培養上清が得られる。精製のために、ウイルス粒子を塩化セシウム勾配上で公知の技術（特にＧｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２（１９７３）４５６参照）によって遠心する。
アデノウイルスＡｄＭＡ７またはＡｄＭＡ８を２０％グリセロール中で−８０℃で保存する。
８．領域Ｅ３にＯｐ２／Ｔｋ  ｒｅｐ−ｃａｐ  ポリＡ＋ＡＡＶを含む組換えアデノウイルスの構築
この項では領域Ｅ３にＯｐ２：Ｔｋ  ｒｅｐｃａｐ  ポリＡ＋ＡＡＶを含むＥ１の欠失した組換えアデノウイルスの構築を記載する。
プラスミドｐＭＡ２８は領域Ｅ３にＯｐ２：Ｔｋ  ｒｅｐｃａｐポリ＋ＡＡＶを含むＡｄ（Ｅ１−，Ｅ３−）の全配列を含む。このプラスミドは大腸菌中で組換えによって構築され、例えば国際特許出願ＰＣＴ／ＦＲ９６／００２１５に記載の菌株Ｃ２１１０（ｐＸＬ２６３８）（Ｅ１−，Ｅ３−）にプラスミドｐＭＡ２４を導入することによって構築する。この国際特許出願は参照によって本発明に含まれるものとする。
８．１．中間プラスミドｐＭＡ２２の構築
Ｏｐ２：Ｔｋ  ｒｅｐｃａｐ  ポリＡ＋ＡＡＶを含むプラスミドｐＭＡ７のＸｂａＩ−ＸｂａＩフラグメントを領域Ｅ３に置換してｐＹＧ４−ＥＰのＸｂａＩ部位に導入し、Ｏｐ２：Ｔｋ  ｒｅｐｃａｐ  ポリＡ＋ＡＡＶが領域Ｅ３の方向に対して逆方向になるようにした。このようにして構築したプラスミドがｐＭＡ２２である。
８．２．大腸菌中で組換えを行うために使用されるプラスミドｐＭＡ２４の構築
アデノウイルスの２７０８２から２８５９３までの配列及び３４７１から３１５０９までの配列が両側に隣接したカセットＯｐ２：Ｔｋ  ｒｅｐｃａｐ  ポリＡ＋ＡＡＶを含むｐＭＡ２２のＮｈｅＩ−ＳｐｈｅＩフラグメントをプラスミドｐＸＬ２７５６の適合部位に導入することによって、カセットＯｐ  ２：Ｔｋ  ｒｅｐｃａｐ  ポリＡ＋ＡＡＶ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｓａｃＢ遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子を内包した組換えに必要な領域を含むプラスミドｐＭＡ２４を作製した。
８．３．領域Ｅ３にＯｐ２：Ｔｋ  ｒｅｐｃａｐ  ポリＡ＋ＡＡＶを含む組換えアデノウイルスの構築
この構築は大腸菌中での組換えによって行った。即ち、プラスミドｐＭＡ２４をＣ２１１０（ｐＸＬ２６８８）またはｃ２１１０（ｐＸＬ２７８９）菌株にエレクトロポレートし、ＬＢ培地、ショ糖、テトラサイクリン上で第二の組換えイベントを選択した。このようにしてプラスミドｐＭＡ２８を含む菌株Ｃ２１１０が得られる。
次いでこのプラスミドをＰａｃＩ消化後の２９３細胞にトランスフェクトした。
実施例３
２９３  Ｏｐ２−Ｔｋ−ＴｅｔＲ−ＶＰ１６産生細胞系の構築
この項では、そのゲノムに組み込まれたハイブリッドトランスアクチベーターのカセットＴｅｔＲ−ＶＰ１６をプロモーターＯｐ２−Ｔｋのコントロール下に含む２９３細胞系の構築を記載する。このために、プラスミドｐＭＡ２を構築し、このプラスミドｐＭＡ２とネオマイシン耐性遺伝子をプロモーターＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）のコントロール下に含むプラスミドｐＭＳＣＶ（Ｈａｗｌｅｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９３），ｖｏｌ１７６，１１４９−１１６３）とのコトランスフェクションによって細胞系を樹立した。ｐＭＡ２は、プラスミドｐＵＨＤ１７．１の適合性部位ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩの間にｐＸＬ２６３０のＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを挿入することによって構築する。プラスミドｐＵＨＤ１７．１は、配列ＶＰ１６に操作的に結合した突然変異テトラサイクリンのリプレッサーをコードする配列を含むプラスミドである。このベクターは、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６のＣ末端の１３０個のアミノ酸に結合した野生型テトラサイクリンリプレッサーの配列を含むベクターｐＵＨＤ１５．１（Ｈ．Ｂｕｊａｒｄ；Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９２，８９，５５４７６−５５５１）に由来する。突然変異したテトラサイクリンのリプレッサーのアミノ酸３〜１３５に対応する３９９塩基対のＸｂａＩ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩフラグメントをｐＵＨＤ１５．１の対応する制限フラグメントに置換することによってｐＵＨＤ１７．１が得られる。
本発明の２９３  Ｏｐ２−Ｔｋ−ＴｅｔＲ−ＶＰ１６細胞系は、リン酸カルシウムの存在下でプラスミドｐＭＡ２及びｐＭＳＣＶによって選択された細胞と、グルココルチコイドのレセプターをコードする構築物（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら，１９８５）とのコトランスフェクションによって構築した。より詳細には、直径５ｃｍの容器に入れた２９３系の細胞に１〜５μｇのプラスミドｐＭＡ２をトランスフェクトした。
ジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎｅ）耐性クローンの選択
細胞のトランスフェクション後、細胞を洗浄し、次いでウシ胎仔血清を（最終濃度７％）補充した培養培地（ＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）を加えて、細胞を２０時間インキュベートする。翌日、実効濃度４００ｍｇ／リットルのジェネティシンＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下で細胞を選択する。ジェネティシンを３日毎に交換すると、約３週後に選択可能なクローンが出現する。トランスフェクトされなかった細胞が残らず死亡したとき、耐性遺伝子が挿入された細胞だけが生き残り、分裂して細胞クローンを産生する。細胞クローンが肉眼で観察できる十分な大きさになったとき、これらのクローンを個々に、“２４ウェル”の培養プレートの培養ウェルに移す。次いで、各クローンをジェネティシンの存在下で、先ず“１２ウェル”の培養プレート、次いで“６ウェル”の培養プレートのウェルで漸次増幅させ、最後に細胞培養容器で増殖させる。各細胞クローンを液体窒素中で凍結保存する。
いくつかのクローンを単離し、増幅し、適当な濃度のテトラサイクリンを添加した後、プロモーターＯｐ２−Ｔｋのコントロール下にリポーター遺伝子、例えばｌａｃＺを発現させる能力に基づいて選択した。使用したプラスミドはｐＭＡ９であった。このプラスミドｐＭＡ９は、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼをコードする配列を含むｐＲＳＶｇａｌＩＸのＳｔｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメントと核局在シグナルとを、ＥｃｏＲＩによって予め直鎖化しバクテリオファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を形成し次いでＢａｍＨＩによって再度消化したプラスミドｐＭＡ２に導入することによって構築した。
これらのクローンのうちで、前記のアデノウイルスに含まれていたｒｅｐ−ｃａｐを条件付きで発現させＡＡＶを高力価で産生し得るクローンを産生細胞系として使用した。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：６１
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0003821846.tif 000002
配列番号：２
配列の長さ：６４
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0003821846.tif 000003
配列番号：３
配列の長さ：６７
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0003821846.tif 000004
配列番号：４
配列の長さ：７５
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0003821846.tif 000005
配列番号：５
配列の長さ：１４１
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：６
配列の長さ：３１
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
0003821846.tif 000007
配列番号：７
配列の長さ：１８
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
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配列番号：８
配列の長さ：２０６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
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【図１】
0003821846.tif 000010
【図２】
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【図３】
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