(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１および２のジアステレオマー混合物からなる新規化合物。
【化１】
0003845796.tif 000015
【化２】
0003845796.tif 000016
式中ＲはＨまたはメチル基。
【請求項２】
式３からなる、キャリヤータンパク質と結合した化合物で免疫してシガトキシンＣＴＸ３Ｃと特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得るためのタンパクコンジュゲートを形成する残基を有する新規化合物。
【化３】
0003845796.tif 000017
式中−Ｏ−Ｌは合成ハプテン部とキャリヤータンパク質とが結合する際除去される基である。
【請求項３】
請求項２に記載の式３の新規化合物における−Ｏ−Ｌがオキシカルボジイミド又はオキシ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである請求項２に記載の新規化合物。
【請求項４】
式３で表される−Ｏ−Ｌ基を取り除いた残基をキャリヤータンパク質と結合させた一般式１で表されるタンパク質コンジュゲート化合物。
【化４】
0003845796.tif 000018
【請求項５】
キャリヤータンパク質が牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリムペットヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanine,ＫＬＭ）またはオボアルブミン（egg albumin、ＯＶＡ）であることを特徴とする請求項４にタンパク質コンジュゲート化合物。
【請求項６】
請求項４または５に記載のタンパク質コンジュゲートで免疫して得られるシガトキシンＣＴＸ３Ｃと特異的に反応するモノクローナル抗体。
【請求項７】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９２として受託されたシガトキシンＣＴＸ３Ｃと特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ１０Ｃ９。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シガトキシン類、特にシガトキシンＣＴＸ３Ｃを検出することが可能な抗原決定基（エピトープ）を有するＣＴＸ３ＣのＡ−Ｅ５環を有する新規なハプテン部構成化合物、該ハプテン部構成化合物をキャリヤータンパク質に結合したハプテンコンジュゲート化合物、該ハプテンプコンジュゲート化合物で免疫して得られる前記シガトキシン類に対し抗体として機能するモノクローナル抗体、および該ハプテンコンジュゲート化合物を用いて得られた受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９２として受託された（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに平成１４年３月５日に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８７４９として原寄託され、平成１５年２月１３日に前記原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託への移管申請により受託番号ＦＥＲＭ  ＰＢ−８２９２として受託された。）ハイブリドーマ１０Ｃ９に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫的手法を用いて、海毒、特にシガトキシン類（ＣＴＸ）を調査する研究は、ラジオイムノアッセイの発展に伴って１９７７年頃から始まった。
シガテラ毒は、天然からごく微量しか採集されず（８５０匹、４ｔの毒ウツボから毒本体のシガトキシンは僅か０．３５ｍｇ）、培養による生産も困難なことが抗体調製の障害となっている。ハワイ大学ホカマらは、貴重な毒本体シガトキシン（１μｇ）をヒト血清アルブミンにカルボジイミド法で連結したコンジュゲートを作製、これを抗原としてマウスに免疫、モノクローナル抗体を調製した（Ｔｏｘｉｃｏｎ 第１５巻、(1977 年)、第317頁）。この抗体は、シガトキシンに結合するが、オカダ酸とも強い交差活性を示し、その親和性の差は５倍程度しかない（Journal of Clinical Laboratory Analysis第6巻、(1992 年)、第54頁）。また、ブレベトキシン、マイトトキシン、パリトキシン等にも交差活性を示すことが分かっているが（Journal of AOAC International第81巻、(1998 年)、第727頁）、詳しいデータは発表されていない。このホカマらの抗体を用いて、シガトキシン類に汚染された魚類を免疫的手法によりモニターのため試薬、キット(Cigua Check TM)などが開発されている。
【０００３】
本発明者らは、以前シガトキシンの左側ＡＢＣ環部を化学合成し、これを合成ハプテンとしたタンパク質コンジュゲートを用いて、三種のモノクローナル抗体を調製しているが、これらはいずれもシガトキシンに非常に弱いアフィニティーしか示さなかった（Synthesis (1999年)、第1431頁） 。また、他のグループも、合成ハプテン（ＪＫＬＭ環部）のコンジュゲートの免疫を試みているが、モノクローナル抗体の調製には至っていない〔Toxicon第38巻(2000年) 第６６９頁〕。
【０００４】
このような状況の中で、本発明者らは、シガトキシン類の右末端の部分構造であるＩＪＫＬＭ環部をハプテンとして設計、合成し、この合成ハプテンのタンパク質コンジュゲートをマウスに免疫して、シガトキシン類に特異性の高いモノクローナル抗体の調製に成功している（特願２００１−２４７１２０）。得られたモノクローナル抗体３Ｄ１１のＣＴＸ３Ｃに対しての結合解離定数(Ｋｄ)は、１２２ｎＭであった。また、シガトキシンに構造の類似した海産ポリエーテル系毒素とこの抗体の交差活性を測定したところ、赤潮毒ブレベトキシン類と交差活性が確認されたが、この交差活性は、シガトキシン類との結合と比べると３５０分の１以下の非常に弱いものであった。
【０００５】
また、シガトキシン類のモノクローナル抗体を得ることを目的とする合成ハプテンとして、シガトキシンのＡＢＣ環部のＣ16位にカルボン酸リンカーを導入した誘導体とキャリヤープロテインであるＢＳＡまたはＫＬＨとからコンジュゲートを合成し、これをＲＩＢＩアジュパント中に乳化し、５匹のＢａｌｂ／ｃマウスに３週間間隔で４回注射して免疫し、該マウスから脾臓を取り出し、該脾臓細胞をミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）と融合し、前記抗体を得、前記抗体の前記合成ハプテンに対する反応特異性を評価している〔Synthesis 1999,No.SI.1431-1436 ISSN 0039-7881,〕。すなわち、シガトキシン類、特にシガトキシンＣＴＸ３Ｃの部分構造を用いて、免疫化学的な手法でシガトキシン類（ＣＴＸ）を調査するのに有用なモノクローナル抗体を製造するのに有用な合成シガトキシン類の検討がなされている。
【０００６】
本発明者らは、前記検討に対し更に検出限界を改善したモノクローナル抗体を得ることができる合成ハプテンを設計してきた。また、シガトキシンは分子長約３ナノメートルの巨大分子なので、すでにモノクローナル抗体３Ｄ１１が調製されているＩＪＫＬＭ環以外の部分構造も抗原決定基となる可能性がある。そこで、シガトキシンの左末端の部分構造であるＡＢＣＤＥ環部をハプテンとして設計、合成するアプローチを検討した。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、基本的にはシガトキシン類、特にシガトキシンＣＴＸ３Ｃの検出限界を改善したモノクローナル抗体を得ることができる合成ハプテンを提供することであり、更に、当該合成ハプテンを用いて、前記モノクローナル抗体を得ることができる人工抗原を得、これを用いてモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得、該ハイブリドーマを用いてモノクローナル抗体を産生させ、得られたモノクローナル抗体の性能を検証することである。
前記課題を解決すべく、ＣＴＸ３ＣのＡ−Ｅ５環のＥ環の部分にリンカーを導入し、キャリヤータンパク質と連結可能な前記式３の化合物を合成した。そして、前記式３の化合物を用いて、人工抗原を得、これを用いてモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得、モノクローナル抗体を作製し、得られたモノクローナル抗体が、前記ハプテン部およびシガトキシンＣＴＸ３Ｃ類を特異的および効率的に検出できることを見出し、前記課題を解決することができた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１は、式１および２のジアステレオマー混合物からなる新規化合物である。
【０００９】
【化５】
0003845796.tif 000002
【００１０】
式中ＲはＨまたはメチル基である。
本発明の第２は、式３からなる、キャリヤータンパク質と結合した一般式１の化合物で免疫してシガトキシンＣＴＸ３Ｃと特異的に反応するモノクローナル抗体を生成させるキャリヤーコンジュゲートを形成する残基を生成する新規化合物である。
【００１１】
【化６】
0003845796.tif 000003
【００１２】
式３中−Ｏ−Ｌは合成ハプテン部とキャリヤータンパク質とが結合する際除去される基でありＣ２３は光学活性中心であり、好ましくは、前記−Ｏ−Ｌはオキシカルボジイミド又はオキシ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである前記キャリヤーコンジュゲートを形成する残基を生成する新規化合物である。
【００１３】
本発明の第３は、前記式３で表される−Ｏ−Ｌ基を取り除いた残基をキャリヤータンパク質と結合させた一般式１で表されるタンパク質コンジュゲート化合物である。
【００１４】
【化７】
0003845796.tif 000004
【００１５】
式中ｎは正の整数であり、好ましくは、前記キャリヤータンパク質が牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリムペットヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanine,ＫＬＭ）またはオボアルブミン（egg albumin、ＯＶＡ）であることを特徴とする前記タンパク質コンジュゲート化合物である。
本発明の第４は、前記タンパク質コンジュゲート類で免疫して得られるシガトキシンＣＴＸ３Ｃと特異的に反応するモノクローナル抗体である。
本発明の第５は、前記ハプテンコンジュゲート化合物を用いて得られた受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９２として受託されたシガトキシンＣＴＸ３Ｃと特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ１０Ｃ９である。
【００１６】
【本発明の実施の態様】
本発明をより詳細に説明する。
Ａ．本発明の前記ジアステレオマー混合物の合成。
下記の工程１により得られる。
【００１７】
【化８】
0003845796.tif 000005
【００１８】
化合物１のＯＨをベンジル基（Ｂｎ）保護基で保護した化合物の合成方法は、M. Maruyama et al, Heterocycles, 2001, 54, 93-99. に記載されている。化合物１は前記文献２に記載の化合物のＢｎをＤＤＱ（2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノン）を用いて脱保護することにより得られる。化合物１のアルコール(4.0 mg,6.0 μmol)をＴＨＦ（テトラヒドロフラン）(2 ｍＬ)に溶かし、室温でテトラブチルアンモニウムフルオリド (ＴＢＡＦ,１Ｍ ＴＨＦ溶液：１８μL,１８μmol)を加えた。３０分後、反応溶液を濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィーで精製し、化合物２(2.5 mg, 5.9 μmol,９８％)を得た。
【００１９】
２０ｍＬナス型フラスコに化合物２(2.8 mg, 6.6 μmol),ＣＨ2Ｃｌ2(300 μL), （ＭｅＯ）2ＣＨＣＨ2ＣＯＯＭｅ(１０μl,７０ μmol), ＴｓＯＨ・Ｈ2Ｏ(0.5 mg, 3 μmol) を加えた。室温で１．５時間攪拌した後、トルエン(1 ｍＬ) を加えて、ロータリーエバポレーターで減圧（120 mbar/hPa）し、１時間後に大気圧に戻した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、アセタール位に関してのジアステレオマー混合物 (式１：式２＝２：１) を(1.9 mg, 3.8 μmol, 57%) 得た。式１の化合物の物性を表１に示す。
【００２０】
【表１】
0003845796.tif 000006
【００２１】
式１および２のＲをＨにした化合物３は、式１および２の化合物をＬｉＯＨで処理して得られる。式３においてＬがスクシンイミドの化合物４は工程２で得られる。
【００２２】
【化９】
0003845796.tif 000007
【００２３】
２０mLナシ型フラスコに式１および２の混合物(2.5 mg, 4.9 μmol)、ｔ−ＢｕＯＨ(0.5 mL)、水 (125 μL)、ＬｉＯＨ・Ｈ2Ｏ(2.8 mg, 68 μmol) を加えて、室温で１時間撹拌した。ＫＨＳＯ4(18.6 mg, 136 μmol) を加え、溶液のｐＨ（3-４程度）を確認した後、酢酸エチル (40 mL) で希釈した。無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、濃縮し、粗化合物３を得た。これにＤＭＦ(ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、２００μL)、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド (5.6 mg, 49 μmol)、ＥＤＣ−ＨＣｌ (ＥＤＣ＝1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド、4.8 mg, 25 μmol) を加えて、室温で１２時間攪拌した。反応溶液を酢酸エチル(40 mL)で希釈し、有機層を水で３回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮し、活性化エステルである化合物４を得た。これにＤＭＦ(100 μL) を加えた溶液を作製し、コンジュゲートの調製に使用した。
【００２４】
Ｂ．タンパクコンジュゲートの製造。
ＫＬＨコンジュゲートの調製；
ＫＬＨ(5.0  mg)のＰＢＳバッファー溶液 (1.0 mL)に活性化エステルである化合物４(約2.4 μmol) の ＤＭＦ溶液(50 μL) を加えて１０分間撹拌した。一日静置した後、４℃で透析した。この後、５．９時間後にＰＢＳバッファー(700 mL)を交換し、１２時間後に透析膜からエッペンドルフチューブに移し換えて、−７８℃で保存した。
【００２５】
ＢＳＡコンジュゲートの調製；
ＢＳＡ(7.0  ｍｇ) のＰＢＳバッファー溶液 (2.0 ｍＬ) に活性化エステルである化合物４(約2.4 μmol) のＤＭＦ溶液 (50 μL) を加えて１０分間撹拌した。一日静置した後、４℃で透析した。この後、５．９時間後にＰＢＳバッファー (700 ｍＬ) を交換し、１２時間後に透析膜からエッペンドルフチューブに移し換えて、−７８℃で保存した。
【００２６】
ハプテン価の解析
透析して得た ＢＳＡコンジュゲートを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。ＢＳＡコンジュゲートの平均分子量は約７０２００であった（ＢＳＡの分子量約66400）。ハプテン部分の分子量が（４７６）であるので、ＢＳＡコンジュゲートには平均８個のハプテンが連結されていることが分かった。
【００２７】
モノクローナル抗体の作製；
前項で得たＡＢＣＤＥ−ＫＬＨ(100μg）にＲＩＢＩアジュバンド（RIBI Immunol. Res. Inst.社製）を加え、良く攪拌してエマルジョンとしたのち、これをＢａｌｂ／ｃマウス（５匹）に二週間毎に３回、腹腔内投与した。初回免疫から３９日目にマウスの血清を採取し、ＡＢＣＤＥ−ＢＳＡを用い、ＥＬＩＳＡ法で血清の抗体価を滴定した。
【００２８】
ＥＬＩＳＡ法；
９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（ファルコン社製、3910）の各ウエルに５０ μＬの ABCDE−ＢＳＡ溶液を入れ、室温で２時間放置後、４℃で一晩放置して、プレートにコンジュゲートを吸着させた。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ〔ＰＢＳバッファーに５％Ｔｗｅｅｎ ２０〔和光純薬製 ポリオキシエチレン（polyoxyethylene） (２０) ソルビタン モノラウレート（Sorbitan Monolaurate）ＩＣＩ社  商標Ｔｗｅｅｎ− ２０ 相当品 No. 167-11515〕〕を含むもの〕で３回洗浄後、ＭＩＬＬＩ-Ｑ水（Millipore 社製の複数段階の樹脂やフィルターを用いて、精製水を脱イオン化もの）で一度洗浄し、吸着しなかったコンジュゲートを除去した。ハイブリドーマ培養上清（もしくは抗血清、精製抗体溶液）を加え、室温で１時間放置後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎと、ＭＩＬＬＩ-Ｑ水で順次洗浄した。５０μＬの 酵素標識二次抗体（ヤギ抗マウスIgG-西洋わさびペルオキシダーゼ）（ＺＹＭＥＤ社製、62-6520  1000倍希釈）を各ウエルに入れ、室温で１時間放置後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎと、ＭＩＬＬＩ-Ｑ水で順次洗浄した。１００μＬの基質溶液 〔基質溶液の組成: 1,2-phenylenediamine 4.0 mg、過酸化水素水 10 μＬ、０．１Ｍ クエン酸 バッファー(pH 5.0) 10 ml〕を加え、５分間呈色反応を進行させた後、２規定 硫酸（50 μl）で反応を停止した。マイクロプレート吸光度測定装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ,Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ 170-6850）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定し、陽性のクローンを判別した。
【００２９】
血清中の抗体価の測定
ハプテン（ABCDEあるいはIJKLM）−ＢＳＡ溶液を吸着した９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレートの最上段に、５０μＬのＰＢＳバッファーを入れた。２００倍に希釈したマウスの抗血清(50 μl) を最上段のウエル(Ａ１)に加え、この溶液を順次２倍希釈した（縦列Ａ１−Ａ８に４００倍から５１，０００倍の希釈系列を作製）。プレートを室温で１時間放置後、上述の方法で４５０ｎｍの吸光度を測定した（図１参照）。血清希釈率の対数と吸光度をプロットすると、血清濃度依存的に、血清中の抗体が ＡＢＣＤＥ−ＢＳＡコンジュゲートと結合することが分かった（図１参照）。
【００３０】
抗体価の高いマウスからの脾臓の摘出、培養
５匹の中で、最も高い抗体価を示したマウスに、腹腔内にＡＢＣＤＥ−ＫＬＨ（100 μg）を追加免疫し、３日後に脾臓を摘出した。脾臓に付着している組織や臓器の断片をピンセットで取り除いた後、基本培地〔ＲＰＭＩ Ｍｅｄｉｕｍ 1640 (GIBCO 社製、一袋、炭酸水素ナトリウム２g, ペニシリン-ストレプトマイシン（GIBCO 社製）20 mg, 200 mM-グルタミン20 mLを蒸留水に溶かして1000 mlとしてpHを7.2に調製したもの〕入りのシャーレに移し、ピンセットで脾臓内の細胞を浮遊させた。脾細胞浮遊液を濾過後、50 ml遠心管に移した。さらに、基本培地15 mlを加え、良くピペッティングして濾過し、全量を30 mlとした。800 rpmで5分間、室温で遠心分離し、上清を除去、タッピングした。ＨＴ・ＢＣ培地〔牛胎児血清（FCS）200 ml,ＨＴコスモバイオ社製ＨＴ液（５０倍濃縮）20 ml, BC（Bioresearch island社製 BriClone）５０ｍＬ, 基本培地 ７３０ｍＬを混合したもの〕を３０mＬ加え、細胞を浮遊させた。
【００３１】
冷凍庫から（-130 ーC）からミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（大日本製薬社製）を凍結したチューブを取り出し、３７℃恒温槽中で速やかに解凍した。チューブをアルコール綿でよく消毒したのち、チューブ内の細胞浮遊液を基本培地３０ｍＬに移した。８００ｒｐｍ（回転／分）で５分間、室温で遠心分離し、上清を除去した。タッピング後、１０％ＦＣＳ(基本培地に10％のFCSを添加)を１０ｍＬ加え、細胞を浮遊させ、５０ｍＬ培養フラスコに移した。フラスコの栓をゆるめ、炭酸ガス培養装置にいれた。１−２日毎に継代し、２５０ｍＬフラスコ２本分（90-100 ml）にした。
【００３２】
マウスから取り出した脾細胞（２ｘ１０8個）とミエローマ細胞（5ｘ１０7個）を混合し、遠心（800 rpm、 5分間、室温）し、上清を除去、タッピングした。この後、ＥＣＦバッファー〔マンニトール 45.5 g, 10 mM 塩化カルシウム（10 ml）, 10 mM 塩化マグネシウム（10 ml）, 20 mM Tris buffer pH 7.2  を蒸留水で溶かして、1000 mlにしたもの〕 を３０ｍＬを加え、遠心（800 rpm、 5分間、室温）、上清除去、タッピングする操作を２回繰り返した後、ＥＣＦバッファー(4.8 ml) を加えた。これを６ウエルプレート（ＳＵＭＩＲＯＮ製）に、１．２ｍＬずつ分注し、島津社製ＳＳＨ−１０細胞融合装置を用い、以下の条件で細胞融合した〔［電極間距離:１．０ｍｍ; 交流周波数: 1 ＭＨｚ; 交流初期印加電圧: ８０Ｖ; 交流初期印加時間:１０秒（s）; パルス幅:４０（マイクロ秒（μｓ）; パルス電圧:９２０Ｖ; パルス電界強度:２．３０ｋＶ／ｃｍ; 交流２次印加電圧:８０Ｖ; パルス印加間隔:１．０秒; 印加パルス数: １; パルス電圧変化:＋０Ｖ; 交流最終印加時間:１０秒; 交流電圧減衰率:０％; 接触強化:ｏｆｆ〕。
【００３３】
調製したハイブリドーマ細胞（Mouse-Mouse hybridoma）を、各ウエルにＨＡＴ培地 〔HAT-RPMI 1640, 20% FCS, 5% Briclone (BioResearch Ireland社製)含有〕 １００μＬを加えた９６ウエルプレート１０枚に移した。２週間後、ハプテンとしたＡＢＣＤＥ環部に結合する抗体を産生するハイブリドーマ（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに平成１４年３月５日に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８７４９として原寄託され、平成１５年２月１３日に前記原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託への移管申請により受託番号ＦＥＲＭ  ＰＢ−８２９２として受託された。本明細書では前記寄託ハイブリドーマを抗体と同じ名称１０Ｃ９と表示する。）をＡＢＣＤＥ−ＢＳＡを用い、ＥＬＩＳＡ法でスクリーニングした。陽性のウエルを選択し、２ 回クローニング後に、再度ＥＬＩＳＡ陽性となった抗体を産生するモノクローンを順次培養し、それぞれ約２００ｍＬまで増殖させた。この結果、６種のモノクローナル抗体を調製することができた（表２）。得られたモノクローナル抗体の結合試験をＥＬＩＳＡ法で検討した。抗原として、シガトキシン類の部分構造を連結したＢＳＡコンジュゲートを用いた。その結果、ＡＢＣＤＥ−ＫＬＨ環部を免疫して得られたIgG抗体は、ＡＢＣＤＥ−ＢＳＡ（化学式）へ強く結合し、IＪＫＬＭ−ＢＳＡ（化合物５）とは結合しないことがわかった。
【００３４】
【化１０】
0003845796.tif 000008
【００３５】
モノクローナル抗体の調製の評価
抗体の精製及びサブクラスの決定
上清を抗マウスIgG＋IgMアフィニティーカラム（NGK Industries, Ltd.社製）で精製した（結合用リン酸バッファー（pH 7.0）、溶出用バッファー（0.2 M Glycine-HCl, pH 2.5）。精製した抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、>９５%の純度であることを確認した。ＰＩＥＲＣＥ社製タイピングキット（37501）を用いて、それそれの抗体のサブクラスを決定した。
【００３６】
抗体の親和性解析（競争阻害実験）
次に、選別した６種のモノクローナル抗体を精製し、ハプテンとの解離定数(Kd)を求めた。ＥＬＩＳＡ用プレートに順次２倍希釈した競合阻害剤（PBS溶液 各30 ml）の溶液を調製した。これに抗体溶液(30 ml)を加え、室温で二時間放置した。抗体と阻害剤の混合溶液５０μＬを、ハプテン−ＢＳＡ溶液（0.625 μ/mL）を吸着した９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（ファルコン社製、3910）に加え、室温で１５分間放置した。プレートを洗浄後、吸光度を測定し、滴定曲線を得た。Friguet らの方法〔Journal of Immunological Method, 第77巻（1985年）, 第305 頁〕を参考に、Ｋｌｏｔｚプロットして得られた直線の傾きから阻害剤のＫｄ値を求めた（図２ｂ）。
この結果、６種のモノクローナル抗体はいずれもＡＢＣＤＥ（ＡＥと略す場合がある。化合物６の上部）環部、及び ＣＴＸ３Ｃ（化合物６の下部）に強く結合することが分かった（Ｋｄ＜２７ｎＭ）。また、６種の抗体の中では１０Ｃ９が、ＡＢＣＤＥ環部（Ｋｄ＝０．８ｎＭ）,ＣＴＸ３Ｃ(Ｋｄ＝２．８ｎＭ）共に最も親和性が高いことが分かった。それぞれのモノクローナル抗体のＫｄ値を表２に示す。
【００３７】
【表２】
0003845796.tif 000009
【００３８】
【化１１】
0003845796.tif 000010
【００３９】
また、ＡＢＣＤ環部、ＡＢＣ環部と分子サイズが小さくなるにつれて（化合物７）、抗体の結合親和性は、著しく低下することが分かった。（結合解離定数Ｋｄの値は大きくなる。）結果を表３に示す。
【００４０】
【表３】
0003845796.tif 000011
【００４１】
【化１２】
0003845796.tif 000012
【００４２】
さらに、構造の類似した海産ポリエーテル毒素との結合試験を検討したところ、赤潮毒〔ブレベトキシンＡ（ＢＴＸ Ａ）、及びブレベトキシンＢ（ＢＴＸ Ｂ）〕、オカダ酸や、マイトトキシン（これらの化学構造については、化合物８参照〕とはほとんど結合しなかった。結果を表４に示す。
【００４３】
【表４】
0003845796.tif 000013
【００４４】
【化１３】
0003845796.tif 000014
【００４５】
以上のように、以前調製したモノクローナル抗体３Ｄ１１よりも、強くＣＴＸ３Ｃに結合し、かつ特異性も高いモノクローナル抗体６種の調製に成功した。
【００４６】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明において設計した合成ハプテン(ＡＢＣＤＥ環部)を用いることにより、前記合成ハプテンおよびシガトキシンＣＴＸ３Ｃを特異的に検出限界を改善して検出できるモノクローナル抗体を得ることができる。また、本発明は、危険な毒素の部分構造（無毒）を化学合成し、これを用いて、毒素本体に結合するモノクローナル抗体を調製する新しい抗体調製法を提供するものである。
【００４７】
本明細書で使用の略号表
BSA: bovine serum albumin
CTX: ciguatoxin
ELISA: enzyme linked immunosorbent assayHRP: Horseradish Peroxidase (西洋わさびペルオキシダーゼ)
O.D.: Optical Density
OPD: o-Phenylene Diamine
PBS: Phosphate Buffered Saline
Bn: benzyl
DDQ: 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinoneEDC；1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochlorideFCS: fetal calf serum
Ig: Immunoglobulin
KLH: keyhole limpet hemocyanine
TBAF: tetra-n-butylammonium fluoride Ts: p-tolenesulfonyl
THF: tetrahydrofuran
OVA: ovalbumin
【図面の簡単な説明】
【図１】  １−５はシガトキシンのＡ〜Ｅ環部を含むＢＳＡとのコンジュゲートＡＥ−ＢＳＡに対する抗体価、（１）−（５）はシガトキシンのＩ〜Ｍ環部を含むＢＳＡとのコンジュゲートＩＭ−ＢＳＡに対する抗体価
【図２】  ハイブリドーマ１０Ｃ９を用いて産生した抗体のＡ〜Ｅ環部との結合および結合解離定数Ｋｄの算出
（ａ）１０Ｃ９とＡＢＣＤＥ−ＢＳＡの結合をＣＴＸ３Ｃを添加して阻害する実験
（ｂ）Ｋｌｏｔｚプロット
【図１】
0003845796.tif 000019
【図２】
0003845796.tif 000020