(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明支持体シート上に、ピルビン酸オキシダーゼ、フラビンアデニンヌクレオチド、チアミンピロホスフェート、リン酸源化合物、二価または三価金属イオン、ペルオキシダーゼおよびアスコルビン酸オキシダーゼと色素前駆体とからなる呈色性指示薬組成物を含む反応層を備えてなるピルビン酸定量用乾式分析素子。
【請求項２】
反応層が、支持体側に設けられた一もしくは二以上の試薬層およびその上に積層された試料展開層とを含む請求項１に記載のピルビン酸定量用乾式分析素子。
【請求項３】
試料展開層に、アスコルビン酸オキシダーゼ、リン酸源化合物、および二価または三価金属イオンを含む請求項２に記載のピルビン酸定量用乾式分析素子。
【請求項４】
試料展開層に、アスコルビン酸オキシダーゼ、リン酸源化合物、マグネシウムイオン、そして更に水溶性ポリマーを含む請求項２に記載のピルビン酸定量用乾式分析素子。
【請求項５】
色素前駆体がロイコ色素である請求項１乃至４の内のいずれかの項に記載のピルビン酸定量用乾式分析素子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ピルビン酸を定量するための乾式分析素子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液などの生物体液中の活性成分（例、グルコース、各種酵素、蛋白質、免疫成分、および中性脂肪）の定量分析は、医療診断の際に有用な情報を提供するものであり、その分析方法は古くから開発されている。
そして、最近では、その分析方法は大別して、湿式法、すなわち試験管などの容器中で血清などの生物体液試料を適当な試薬と液相にて反応させ、その反応により発生する主として発色などの化学変化を比色法などの方法を利用して読み取り、目的の成分の定量分析を行う方法、そして乾式法、すなわちシート状透明支持体上に、生物体液試料中の分析対象の成分の特性を考慮して予め決められた反応試薬を含浸させた層状物（反応層）を積層させた多層分析要素を用意し、これに血清などの生物体液試料を点着させ、次いで加温（インキュベーション）することにより発色などの化学変化を発生させ、その化学変化を比色法などの方法を利用して読み取り、目的の成分の定量分析を行う方法の二つの方法に分けられている。これらの湿式法と乾式法とは、それぞれ異なる利点を持つため、分析の目的に応じて適宜使い分けられて利用されている。
【０００３】
なかでも、多層分析要素（通常は、乾式分析要素と同じ意味で用いられる）を用いる乾式法は、その分析操作に熟練を必要とせず、また分析結果を得るまでの操作が簡単で、かつ短時間で終了するため、特に迅速を要する医療診断や、比較的小規模の分析箇所で多用されている。
【０００４】
上記の様にこれまでに多数の生物体液中の活性成分の定量分析方法が湿式、乾式を問わず開発され、確立されてきた。しかしながら、血液に存在し、同じく、有用な医療情報を提供する活性成分であるピルビン酸については、これまでに湿式法のみが開発されたのみである。すなわち、血液中のピルビン酸の含有量は、生体の代謝および組織内の酸化状態を知る指標になるものであり、たとえば、心疾患、出血、ショックなどの循環不全の指標になり、また肝疾患、糖尿病、尿毒症、解糖系酸素の欠損などの指標になるため、その含有量を検知することは、医療診断と治療のために非常に有用である。しかし、これまでに知られている血液などの生物体液中のピルビン酸の定量方法は、精度は高いが、定量結果の入手までに時間のかかる湿式法のみであった。
【０００５】
たとえば、特公平５−３８５９５号公報には  試料中のピルビン酸を、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−アラニントランスフェラーゼ、そして２−オキソブルタール酸と接触させて、Ｄ−アラニンに変換し、ついでこのＤ−アラニンにＤ−アミノ酸オキシダーゼを接触させることによりピルビン酸に戻すサイクリング反応を行ない、このサイクリング反応中に発生する過酸化水素あるいはアンモニアを定量することにより、ピルビン酸を定量する方法が記載されている。このピルビン酸の定量方法は、微量のピルビン酸を高い精度で定量する方法として優れた方法であるが、その検出に利用する反応が、サイクリング反応という特殊の反応であるため、湿式法による利用が前提となる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、血液などの生物体液に含まれているピルビン酸を乾式法を利用して高精度に分析するために有利に使用することのできるピルビン酸定量用乾式分析素子を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、透明支持体シート上に、ピルビン酸オキシダーゼ、フラビンアデニンヌクレオチド、チアミンピロホスフェート、リン酸源化合物、二価または三価金属イオン、ペルオキシダーゼおよびアスコルビン酸オキシダーゼと色素前駆体とからなる呈色性指示薬組成物を含む反応層を備えてなるピルビン酸定量用乾式分析素子にある。
【０００８】
次に、本発明の好ましい態様を記載する。
（１）反応層が、支持体側に設けられた一もしくは二以上の試薬層およびその上に積層された試料展開層とを含む上記のピルビン酸定量用乾式分析素子。
【０００９】
（２）試料展開層に、アスコルビン酸オキシダーゼ、リン酸源化合物、および二価または三価金属イオンを含む上記のピルビン酸定量用乾式分析素子。
（３）試料展開層に、アスコルビン酸オキシダーゼ、リン酸源化合物、マグネシウムイオン、そして更に水溶性ポリマーを含む上記のピルビン酸定量用乾式分析素子。
（４）色素前駆体がロイコ色素である上記ピルビン酸定量用乾式分析素子。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のピルビン酸定量用乾式分析素子の構造は、これまでに多数の形態で知られている乾式分析素子（乾式分析要素或は乾式分析材料とも呼ばれている）と同様である。すなわち、乾式分析素子の構造は、透明なシート状支持体と、この支持体上に設けられている反応層とからなるものである。
【００１１】
透明なシート状支持体としては、たとえばポリエチレンテレフタレートシートなどのような無色で透明性の高いポリマー製シートが用いられる。
支持体の上に、次に反応層が設けられる。この反応層は、所望により、支持体上に、ゼラチンあるいは水溶性ポリマーからなる下塗り層を設けたのち、その上に設けてもよい。
【００１２】
反応層は、ピルビン酸と接触して反応を起こし、ついで呈色反応を示すまでに必要な反応試薬が含まれる層であり、試薬層（反応試薬含有層）と、所望によって設けられる別の機能層とからなる。試薬層は、ポリマーマトリックスに反応に関与する試薬の少なくとも一部が溶解もしくは分散されているそうである。
試薬層に付設することのできる別の機能層の代表例としては、試料展開層（展開層：表面に点着された液体試料を単位面積当り均一な量に分配して、下層の試薬層に供給する機能を有する多孔性の層）及び光反射層を挙げることができる。試料展開層および光反射層のいずれも、試薬層の上側（支持体側とは反対の側）に設けられる。試薬層の上に光反射層と試料展開層とをこの順に重ねて設けてもよい。また、光反射層と試薬層、試料展開層と試薬層、光反射層と試料展開層の間に、所望により、ゼラチンや水溶性ポリマーなどからなる接着層を設けてもよい。なお、反応に関与する試薬を任意の割合で試薬層と試料展開層とに分けて含有させることもできる。
【００１３】
本発明の分析素子においてピルビリンの検出に用いる検出試薬系は、ピルビン酸オキシダーゼ、フラビンアデニンヌクレオチド、チアミンピロホスフェート、リン酸源化合物、二価または三価金属イオン、およびペルオキシダーゼと色素前駆体とからなる呈色性指示薬組成物を含む。これらの試薬成分のそれぞれは、すでに各種の乾式分析素子の反応系において知られているものである。従って、これらの試薬成分について、次に簡単に記載する。
【００１４】
（１）ピルビン酸オキシダーゼ
ピルビン酸オキシダーゼは、グルタル−ピルベートトランスアミナーゼ（ＧＰＴ）やグルタル−オキサロアセテートトランスアミナーゼ（ＧＯＴ）などによって代表されるトランスアミダーゼの分析のために使用される酵素で、ピルビン酸を酸化して、過酸化水素を発生させる機能を有する酵素成分である。このようなピルビン酸オキシダーゼ（通常、ＰＯＰと呼ばれている）についての詳しい記載は、特公昭５９−１５６３７号公報、特公平１−４６１１９号公報に示されている。
【００１５】
（２）フラビンアデニンヌクレオチド
フラビンアデニンヌクレオチドは、通常ＦＡＤと呼ばれる化合物で、ピルビン酸オキシダーゼのコファクターとして機能する化合物である。このフラビンアデニンヌクレオチドについても、上記の各公報に詳しい記載がある。このフラビンアデニンヌクレオチド（ＦＡＤ）は、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＰ）１単位（Ｕ）（３７℃で１分間に１マイクロモルの過酸化水素を発生する活性を１単位とする）当り、通常０．１〜５０ナノモル、好ましくは０．３〜３０ナノモルに相当する量で用いられる。
【００１６】
（３）チアミンピロホスフェート
チアミンピロホスフェートは、通常ＴＰＰと呼ばれる化合物であって、上記のＦＡＤと同様に、ピルビン酸オキシダーゼのコファクターとして機能する化合物であり、このチアミンピロホスフェートについても、上記の各公報に詳しい記載がある。チアミンピロホスフェート（ＴＰＰ）は、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＰ）１単位（Ｕ）当り、通常５〜５００ナノモル、好ましくは１０〜３００ナノモルに相当する量で用いられる。
【００１７】
（４）リン酸源化合物
リン酸源化合物もまた、ピルビン酸オキシダーゼのコファクターとして機能する化合物である。リン酸源化合物の例としては、リン酸、リン酸三ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸三カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素アルミニウム、リン酸水素カルシウム、リン酸マンガン、リン酸水素マンガン、リン酸水素マグネシウム、リン酸水素鉄、リン酸水素コバルトなどがある。リン酸源化合物についても、上記の各公報に詳しい記載がある。このリン酸源化合物は、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＰ）１単位（Ｕ）当り、リン酸イオンに換算して、通常０．１〜１０マイクロモル、好ましくは０．３〜５マイクロモルに相当する量で用いられる。
【００１８】
（５）二価または三価金属イオン
二価または三価の金属イオンもまた、ピルビン酸オキシダーゼのコファクターとして機能する化合物である。その例としては、二価のカルシウムイオン、コバルトイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、そして三価のアルミニウムイオンを挙げることができる。これらは、塩化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、硫酸水素塩、リン酸水素塩、炭酸塩、炭酸水素塩、酢酸塩などとして、反応層に導入される。具体的な化合物例としては、塩化マンガン、リン酸マンガン、リン酸水素マンガン、塩化マグネシウム、およびリン酸水素マグネシウムを挙げる事ができる。これらの金属イオンそして、それらの塩についても、上記の各公報に詳しい記載がある。この金属イオンは、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＰ）１単位（Ｕ）当り、通常５ナノモル〜１０マイクロモル、好ましくは１０ナノモル〜５マイクロモルに相当する量で用いられる。
【００１９】
（６）ペルオキシダーゼと色素前駆体（呈色性指示薬組成物）
ピルビン酸の酸化によって発生した過酸化水素は、ペルオキシダーゼの存在下で、色素前駆体に発色をもたらす。このような発色を示す色素前駆体（過酸化水素検出呈色指示薬成分）としては、４−アミノアンチピリンなどのＮ，Ｎ−ジ置換アニリン、及びロイコ色素が知られている。本発明における色素前駆体としてはロイコ色素が好ましい。
【００２０】
反応層は通常、ゼラチンなどの親水性ポリマーあるいはラテックスを構造形成マトリックスとして構成される。
【００２１】
本発明の反応層には、さらにアスコルビン酸オキシダーゼを含むことが望ましい。このアスコルビン酸オキシダーゼは、血液試料中に混在するアスコルビン酸が、反応層において、生成した過酸化水素を還元して本来の測定値に負誤差を与えるのを防ぐために、予めアスコルビン酸を分解して、不活性化する機能を果たすものであり、その使用は、ピルビン酸を乾式法により定量する際において、微量のピルビン酸を正確に測定する点から非常に有効である。なお、このアスコルビン酸オキシダーゼは、特に試料展開層に導入することが有利である。
【００２２】
また、試料展開層には、セルロース誘導体のような親水性ポリマーを導入することが好ましい。この親水性ポリマーは、試料展開層に点着された液体試料の展開を制御し、微量の反応を均等かる高感度にするために、有用である。特に好ましい親水性ポリマーは、カルボキシメチルセルロースである。
【００２３】
本発明の乾式分析素子は、支持体シートの上（あるいは、その表面に設けた下塗り層の上）に、試薬層形成材料の水溶液を均一に塗布し、乾燥させることにより形成する。試薬層は、一層のみでもよく、所望により二層以上とすりこともできる。試料展開層は、一旦乾燥した試薬層の表面を濡らした状態にして、その表面に織物あるいは編物を押しつけるなどして接合して形成する。必要により、接着層や光反射層などの補助層を介在させてもよい。この試料展開層に任意に、試薬の一部を溶解した水溶液を含浸させるて試薬含有展開層とすることもできる。また、試料展開層は、親水性樹脂中に微粒子が分散されて多孔性層であってもよい。
【００２４】
本発明の乾式分析素子は通常、長尺状の透明プラスチックシートの上に、試薬層と、試料展開層を順に形成させ、ついで、これを所定のサイズに切断する方法を利用して工業的に製造する。この所定のサイズに切断された乾式分析素子は通常、プラスチック材料製のマウントに収容されて、医療診断において、ピルビン酸の定量分析に使用される。
【００２５】
本発明の乾式分析素子を利用してのピルビン酸の定量分析は、乾式分析素子を利用する、グルコース、中性脂肪、トランスアミナーゼ、蛋白質などの生体内活性成分の分析方法と同様にして行なわれる。具体的には、反応層（通常は、その最上層にある試料展開層）の表面に、血清などの試料溶液をピペットなどを用いて点着し、その後、３７℃附近の温度で一定時間保存し（インクベーション）、次いでそのインクベーションにより生成した発色を比色法により測定する方法が用いられる。そして、この測定値を、別に標準試料（ピルビン酸含有量が予め確認されている試料）を用いて作製した検量線と照合させることにより、測定試料中のピルビン酸含有量を高精度で知ることができる。
【００２６】
【発明の効果】
本発明のピルビン酸定量用乾式分析素子を用いることにより、湿式法では必須の分析操作の実施時における試薬液の調整などが不必要になり、特に熟練を必要とすることなく、短時間のうちに、湿式法と同様な高精度のピルビン酸の定量が可能となる。
【００２７】
【実施例】
［実施例１］ピルビン酸定量用乾式分析素子の製造
下記の方法により、支持体表面に試薬層と試料展開層（試薬の一部を含有するもの）とがこの順に積層された本発明に従うピルビン酸定量用乾式分析素子を製造した。
【００２８】
（１）支持体表面への試薬層の形成
下記組成の試薬を水溶液として、ゼラリン下塗りが施されている、表面が平滑で、厚さが１８０μｍの無色透明なポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムの表面に、乾燥膜厚が約１５μｍになるように塗布乾燥させた。
【００２９】
【表１】
0003779046.tif 000002
【００３０】
【化１】
0003779046.tif 000003
【００３１】
（２）試薬層上への試料展開層の形成
上記の試薬層に約３０ｍｇ／ｍ2 の割合で水を全面に供給して湿潤させた後、その上に、別に用意したポリエステル製のブロード織物（空隙体積：９．８μＬ／ｍ2 ）を載せ、軽く圧力をかけてラミネートし、乾燥させた。次いで、そのブロード織物層に、下記組成物の水溶液を塗布（１００ｃｃ／ｍ2 ）して、均一に浸透させた後、乾燥して試料展開層を形成した。
【００３２】
【表２】
0003779046.tif 000004
【００３３】
［実施例２］ピルビン酸定量用乾式分析素子を用いての測定例−Ｉ
ピルビン酸濃度がそれぞれ、０．２５〜５．０ｍｇ／ｄＬ（市販の湿式法によるピルビン酸測定キット「デタミナーＰＡ」（協和メデックス（株）製）で濃度検定したもの）の範囲にあるヒト血清を用意し、それぞれを１０μＬ採り、実施例１で製造したピルビン酸定量用乾式分析素子に点着し、３７℃にて２．５分間インキュベートした。その後、分析素子に発生した発色の光学濃度を、６５０ｎｍの波長にて支持体側から反射濃度測定法により測定した。それぞれの測定データにおけるピルビン酸濃度（検定値）と反射濃度（ＯＤｒ）との関係を調べた。その結果を下記の表に示す。また、それぞれの関係から作成した検量線を第１図に示す。
【００３４】
【表３】
0003779046.tif 000005
【００３５】
第１図の検量線から、ピルビン酸濃度（ｘ）と反射光学濃度（ｙ）との関係として、下記の関係式が得られ、本発明のピルビン酸定量用乾式分析素子は、ピルビン酸定量の高精度の分析素子として有用であることが確認された。
ｙ＝０．６５ｘ3 ＋０．１９３５ｘ2 ＋１．２４０５ｘ−０．４３０７
【００３６】
［実施例３］ピルビン酸定量用乾式分析素子を用いての測定例−Ｉ
ピルビン酸濃度が、０．５ｍｇ／ｄＬ、１．０ｍｇ／ｄＬ、そして３．０ｍｇ／ｄＬ（前記のピルビン酸測定キット「デタミナーＰＡ」で濃度検定したもの）の範囲にある三種類のヒト血清を用意し、それぞれを１０μＬ採り、実施例１で製造したピルビン酸定量用乾式分析素子に点着し、３７℃にて２．５分間インキュベートした。その後、分析素子に発生した発色の光学濃度を、６５０ｎｍの波長にて支持体側から反射濃度測定法により測定した。
なお、本発明の乾式分析素子を用いた場合の測定データの再現性を評価するために、同一の血清を用い、それぞれ５点の分析素子に点着し、発色を測定する実験を行なった。それぞれの測定データにおけるピルビン酸濃度（検定値）と反射濃度（ＯＤｒ）、そして実施例２で得られた検量線（第１図）から計算した乾式法によるピルビン酸濃度との関係を調べた。その結果を下記に示す。
【００３７】
【表４】
0003779046.tif 000006
【００３８】
上記の表の結果から明らかなように、本発明のピルビン酸定量用乾式分析素子を用いた試料中のピルビン酸濃度の定量は、高精度でかつ高い再現性にて実施できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で製造した本発明のピルビン酸定量用乾式分析素子を用いての血清試料中のピルビン酸濃度（Ｐｙｒ  ｍｇ／ｄＬ）］と反射光学濃度（ＯＤｒ）との関係を示す検量線である。
【図１】
0003779046.tif 000007