(57)【要約】  基板上に配置するスポット位置で、パターン状に隣接するスポット同士の位置の誤認識や、装置駆動、温調等による基板の膨張や変形による位置ずれが発生した場合、画像の位置合わせが困難になる。  基板表面上に、生体高分子が付着するスポットを形成するパターン状のスポット部と、ランダム状のスポット部を備えた核酸分析用基板と解析方法を提供する。
2020145124.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、前記基板表面上に生体高分子が付着するパターン状のスポット部とランダム状のスポット部を備えることを特徴とする核酸分析用基板。
【請求項２】
請求項１の核酸分析用基板において、
前記ランダム状のスポット部は図形形状の領域で構成され、複数のサンプルがランダムに配置されることを特徴とする核酸分析用基板。
【請求項３】
請求項１の核酸分析用基板において、
前記パターン状のスポット部はサンプルが付着するスポットが規則的に配置されることを特徴とする核酸分析用基板。
【請求項４】
請求項２の核酸分析用基板において、
前記ランダム状のスポット部の図形形状領域は、サンプルが付着可能なコーティング膜で形成されていることを特徴とする核酸分析用基板。
【請求項５】
請求項２の核酸分析用基板において、
前記ランダム状のスポット部の図形形状領域に、サンプルが付着するスポットが不規則的に配置されることを特徴とする核酸分析用基板。
【請求項６】
請求項３の核酸分析用基板において、
前記パターン状のスポット部は、サンプルが付着するスポットの配列が六方格子状のパターン配列を持つことを特徴とする核酸分析用基板。
【請求項７】
請求項２の核酸分析用基板において、
前記ランダム状のスポット部の図形形状の領域がパターン状のスポットに、重ならないで配置されることを特徴とする核酸分析用基板。
【請求項８】
基板表面上に生体高分子が付着するパターン状のスポット部とランダム状のスポット部を備える基板と、基板上面をカバーするガラス部材と流路を形成する中間材のシートを備える、
ことを特徴とする核酸分析用フローセル。
【請求項９】
基板表面上に生体高分子が付着するパターン状のスポット部とランダム状のスポット部を備える基板の解析方法であって、
前記基板表面のパターン状のスポット部の発光する輝点とランダム状のスポット部の発光する輝点を用いて、前記基板上の輝点位置を同定することを特徴とする解析方法。
【請求項１０】
請求項９の解析方法において、
基準画像を作成し、前記基準画像とパターン状のスポット部の輝点の画像を用いて、画像の位置合わせを行い、
ランダム状のスポット部の輝点を用いて画像位置合わせの補正を行なう工程を含むことを特徴とする解析方法。
【請求項１１】
請求項９の解析方法において、
前記基準画像が、核酸塩基種類に基づく４枚の輝点画像を用いて作製される工程を含み、複数の画像を用いて基準画像を補正する工程を含むことを特徴とする解析方法。
【請求項１２】
請求項９の解析方法において、
前記基準画像が、前記基板の作製時のサンプル付着用の各スポットの位置情報を用いて作製される工程を含むことを特徴とした解析方法。
【請求項１３】
請求項９の解析方法において、
また、基準画像と解析対象画像の位置合わせの工程において、解析対象画像と基準画像の対応するスポット上の輝点が、各画像上の輝点同士の距離の二乗が最小となるような数値を用いて位置合わせを行う工程を含むことを特徴とする解析方法。
【請求項１４】
請求項９の解析方法において、
少なくとも一つのパターン状のスポット部とランダム状のスポット部が存在するように、一つの画像を複数のブロックに分割する工程を含むことを特徴とする解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分析用基板、核酸分析用フローセル、および画像位置合わせ方法に係り、生体関連物質を計測するための分析用のパターン状のスポット部およびランダム状のスポット部の配置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、核酸分析装置では、大量の塩基配列情報を同時並列でシーケンス可能としている。分析対象となる核酸は基板上に固定され、シーケンス反応を繰り返す。核酸の塩基配列に対して塩基を特定する蛍光ヌクレオチドを取り込ませ、そこから発する蛍光輝点から塩基を特定する技術が用いられている。核酸の複数の塩基に対応した画像がそれぞれ装置から提供されている。１サイクルと呼ばれるシーケンス単位では、固定された核酸のうち、それぞれ１塩基分をシーケンスする。このサイクルを繰り返すことにより各核酸の塩基を順番にシーケンスすることが出来る。大量の塩基配列情報を取得するためには、基板上に固定される核酸の密度を高める必要がある。核酸を固定する基板の種類は、基板上にランダムに核酸を固定するランダムスポットによる基板と、パターン状に核酸を整列固定するパターンスポットによる基板がある。ランダムスポットは固定された核酸同士が近すぎる場合、別々に検出できない可能性があり、高密度に核酸を配置する場合はパターンスポットが効果的である。例えば特許文献１に開示されている分析用基板では、核酸が結合する付着スポットが基板上に格子状に配置されたパターンスポットを形成し、高密度化を図っている。【０００３】
この様な基板上の核酸を分析する手法では、輝点である蛍光画像内の個々のスポットの位置を正確に同定する必要がある。一般的に、同一の検出視野を撮像した蛍光撮像同士であっても、視野を変えるためにステージ駆動等の移動を行った場合、駆動制御の精度によって、撮像した位置はずれて異なる位置を示す場合がある。このため、あるスポットの座標位置は、個々の画像内で異なる座標位置として撮像される場合がある。個々のスポットの位置を正確に同定するためには、個々のスポットの基板上の座標位置を正確に求める必要がある。【０００４】
前述特許文献１のようなパターンスポットを形成し、高密度化を図っても、周期的に整列した付着スポットであることから、誤認識による位置ずれが発生する場合、核酸の付着スポットの位置を同定することは困難となる。そのため、特許文献２では基板上に施したパターン状の付着スポットのうち、任意に付着スポットを欠損させ、その欠損個所を検出し、位置ずれを補正する分析手法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０２７０２７３号明細書
【特許文献２】米国特許第８７７４４９４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
大量の塩基配列情報を取得するために、サンプルの高密度化を目的として、基板上にパターン状のサンプルの付着スポットを配置した場合、サンプルの高密度化は図れるが、周期的に整列した付着スポットのため、隣接する付着スポット同士の位置の判別が困難になる課題がある。また、基板に固定された核酸は、シーケンス反応を繰り返しても基板上での固定位置は変わらないが、基板を載せたステージの駆動精度や、温調システムによる基板の膨張や変形などによって、サイクルごとに全く同じ位置の画像が取得されない場合がある。さらに、１画像においても、画像中央付近と四隅付近では収差が異なるため画像の位置合わせを困難にしている。【０００７】
これらの課題を解決する手段として、例えばマーカーなどの基準点を基板上に配置する方法がある。この場合、輝点と基準点の複数点の組み合わせで、一つの位置を決定することが必要となる。様々な要因による位置ずれに対応するために、通常は多くのマーカーとなる基準点を必要とし、これらの基準点を検出し位置を決定するためには画像処理の負荷が大きくなる傾向がある。【０００８】
また、特許文献２では、この課題を解決するために、任意にスポット部を欠損させて、それを位置情報として位置ずれの補正を行なっている。しかし、全ての付着スポットに必ずしもサンプルが付着するわけではないため、任意なスポットの欠損部と、サンプルが付着しなかった付着スポットとの区別が難しくなっている。さらに、欠損部が存在することでサンプル密度の低下に繋がっている。【０００９】
核酸分析では、一つの画像内に１００万個以上の核酸が付着可能であり、一回の分析で５０万枚近くの画像数を取得する場合がある。そのため、配列解析を行うためのサンプル位置の誤検出は、多数のミスリードが発生することになるため、高精度で迅速な画像位置合わせを可能とする核酸分析用基板と画像位置合わせの技術が必要となっている。【００１０】
本発明では、高密度にサンプルを配置させ、取得した画像の高精度な画像位置合わせを可能とする核酸分析用基板、核酸分析用フローセルおよび画像位置合わせ方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の目的を達成するために、基板と、前記基板表面上に生体高分子が付着するパターン状のスポット部とランダム状のスポット部を備えることを特徴とする核酸分析用基板、並びに核酸分析用フローセルを提供する。【００１２】
また、上記の目的を達成するために、
基板表面上に生体高分子が付着するパターン状のスポット部とランダム状のスポット部を備える基板の解析方法であって、
前記基板表面のパターン状のスポット部の発光する輝点とランダム状のスポット部の発光する輝点を用いて、前記基板上の輝点位置を同定することを特徴とする解析方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、パターン状のスポット部とランダム状のスポット部が存在することにより、ランダム状のスポット部だけで構成される基板よりも、高密度にサンプルを配置することが可能である。【００１４】
また、パターン状のスポット部だけでは困難な、位置合わせの精度と速度を向上させる。これは、パターン状のスポット部だけで構成されている基板は、付着スポットが周期的に整列しているために、隣接するスポット列が誤認識され、大きな位置ずれが起こる可能性がある。しかし、パターン状のスポット部とランダム状のスポット部が存在する基板では、検出されるランダム状の輝点がマーカー等の役割をすることよって、特別な位置検出用のマーカーを設置することなく、パターン状のスポット部とランダム状スポット部の位置関係、パターン状のスポット部とランダム状の輝点の位置関係、パターン状のスポット部の輝点とランダム状のスポット部の輝点の位置関係、あるいは個々のランダム状の輝点の位置関係などの様々な位置関係を使用することが可能である。使用状況により、これらの位置関係を単独あるいは組み合わせて使用することによって、サンプルの位置情報を精度良く特定することが可能となる。その結果、位置合わせの精度と処理速度の向上などの効果がある。【００１５】
また、特別な位置検出用のマーカーを設置する工程が無いことから基板製造の効率化も期待される。【００１６】
さらに、特許文献２のような画像位置合わせを目的とした基準点の役割を果たす付着スポット欠損部が存在しないため、スポット欠損部がある場合よりも付着スポット密度は高く配置可能である。【００１７】
このように、本発明により、画像の位置合わせ精度が向上し、近傍の異なる核酸同士の配列解析のミスリードを防ぎ、シーケンス精度と分析のスループットを向上させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】核酸分析装置の概略構成例を示す図
【図２】核酸分析装置の概略構成例を示す図
【図３】基板作製方法例の基板断面図
【図４】核酸分析用フローセルの構成例を示す図。
【図５】核酸分析装置を用いた核酸分析方法の例を示す図。
【図６】塩基配列決定方法の概念を示す図。
【図７】パターン状のスポット部とランダム状のスポット部の配置例を示す図。
【図８】ランダム状のスポット部の図形形状の例を示す図。
【図９】４種類の蛍光画像の例を示す図
【図１０】サイクル間の位置ずれの概念を示す図。
【図１１】画像の位置合わせ方法の例を示す図。
【図１２】１画像を６４ブロックに分割した場合のランダム状のスポット部の配置例を示す図。
【図１３】１画像を６４ブロックに分割した図１２の４ブロックを拡大した図。
【図１４】１画像を６４ブロックに分割し、さらに各ブロックを１６ブロックに小分割し、６４ブロックに分割した１画像の４ブロックを拡大した図。
【図１５】画像の位置合わせ方法の例を示す図。
【図１６】パターン状のスポット部とランダム状のスポット部とランダム状スポット部の付着スポットの配置例を示す図。
【図１７】画像の位置合わせ方法の例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、添付図面を参照して本発明の実施例について説明する。なお、本発明の理解のために具体的な実施例を示すが、本発明を限定的に解釈するためものではない。また、実施例の説明上、核酸分析とは核酸つまりＤＮＡ断片のシーケンス（塩基配列解析）を示しているが、本来この分析対象はＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質などの生体高分子でもよく、生体関連物質の全般に適用可能である。
【００２０】
まず、実施例に共通する核酸分析装置の概略構成、核酸分析用基板の作製方法とフローセル構成、ＤＮＡの塩基配列のシーケンス処理について、例を示し説明する。
【００２１】
（１）核酸分析装置
本発明で使用する核酸分析装置の概要を、図１に一例を示し説明する。
核酸分析装置１００は、フローセル１０９と、光学系ユニット、温調系ユニット、送液ユニット、コンピュータ１１９を装備している。
【００２２】
光学系ユニットは、フローセル１０９へ励起光を照射し、核酸の伸長反応によって取り込まれた塩基配列から発せられる蛍光を検出する。光学系ユニットは、光源１０７、コンデンサレンズ１１０、励起フィルタ１０４、ダイクロイックミラー１０５、バンドパスフィルタ１０３、対物レンズ１０８、結像レンズ１０２、２次元センサ１０１の構成を持っている。励起フィルタ１０４、ダイクロイックミラー１０５、バンドパスフィルタ１０３が、フィルタキューブ１０６内に含まれている。温調系ユニットは、ステージ１１７に設置され、例えば、ペルチェ素子などを備える加熱冷却可能な温調基板１１８を備え、フローセル１０９の温度を調整することが可能である。送液ユニットは、複数の試薬容器１１３を収容する試薬保管ユニット１１４、試薬容器１１３へアクセスするノズル１１１、複数の試薬容器１１３に入っている各試薬をフローセル１０９へ導入する配管１１２、フローセル１０９で反応後、反応した試薬等の廃液を廃棄する廃液容器１１６、廃液を廃液容器１１６へ導入する配管１１５の構成を持っている。
【００２３】
核酸分析装置では、あらかじめ核酸サンプルを固定したフローセル１０９をＸＹ方向に駆動するステージ１１７上に搭載する。フローセルには流路穴があり、真空チャックによってステージに固定される。これにより、ステージに接続された送液ユニットの流路と結合し、反応試薬などの送液が可能になる。試薬ラック１１４は、冷温保管されており、ラックへのノズル１１１の突き刺しにより試薬へアクセスが可能である。ノズルは流路とつながっており、シリンジポンプの動作によって、試薬はフローセルを経由し、最終的に廃液タンク１１６まで送液される。使用される試薬は複数の試薬が用いられているが、流路切り替えバルブによって選択されている。ＸＹステージは温調基板１１８が搭載され、シーケンス反応が行われる。光学系ユニットにおいては、光源１０７は、例えばＬＥＤ光源が使用されており、光源１０７から発せられた励起光は、コンデンサレンズ１１０で集光され、フィルタキューブ１０６に入射する。フィルタキューブの内部には、励起フィルタ１０４、バンドパスフィルタ１０３、ダイクロイックミラー１０５があり、励起フィルタ１０４とバンドパスフィルタ１０３によって特定の蛍光波長が選択される。励起フィルタから透過した光は、ダイクロイックミラー１０５で反射し対物レンズ１０８によってフローセル１０９に照射される。励起光によって、フローセル１０９上に固定された試料に取り込まれた蛍光体のうち、照射された励起光の波長帯域に励起する蛍光体が励起される。励起された蛍光体から発せられる蛍光は、ダイクロイックミラー１０５を透過し、バンドパスフィルタ１０３にて特定の波長帯域のみが透過され、結像レンズ１０２によって、２次元センサ１０１上に蛍光スポットとして結像する。励起光によって励起する蛍光体は、１種類または複数種類でも検出が可能である。例えば、励起光によって励起する蛍光体が１種類のみ場合、塩基配列に対応する４種類の蛍光を識別するために、検出する波長帯域に応じてフィルタキューブ１０６を４種類用意し、切り替え可能とすることで検出が可能となる。また、複数種類の蛍光体を同時に励起させる場合、例えば２種類の蛍光体を同時に励起させる場合の核酸分析装置概要例を図２に示す。核酸分析装置２００は、対象とする２種類の蛍光の波長帯域を透過するバンドパスフィルタ１０３を透過後、２種類の蛍光を分けるダイクロイックミラー１２０を備え、２つの二次元センサでデュアルビューによるイメージングを行うことが可能である。そして、検出する波長帯域に応じてフィルタキューブ１０６を２種類用意し、切り替え可能とすることで４種類の蛍光検出が可能となる。この場合、１種類ごとの検出よりも短時間の検出が可能であり、対象とする試料の塩基配列解析にかかる時間の短縮につながる。コンピュータ１１９では、装置制御およびリアルタイムの画像処理を行っている。
【００２４】
（２）核酸分析用基板の作製方法、構成およびフローセルの構成
次に、本発明で使用する核酸分析用基板の作製方法の一例を図３に示し説明する。
【００２５】
まず、シリコンウエハ３０２を熱処理し、表面に酸化膜３０１を生成する（図３−Ａ）。酸化膜上に疎水性でＤＮＡなどの吸着を防ぐＨＭＤＳ（Ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｄｉｓｉｌｉｚａｎｅ）層３０３をコーティングする（図３−Ｂ）。次に保護膜をコーティングし、さらにパターン状やランダム状のスポット部が切り抜かれたフォトマスク３０４を載せる（図３−Ｃ）。そして、フォトリソグラフィ処理で保護膜３０５を溶解しやすくし、現像処理を行う（図３−Ｄ）。さらに、酸素プラズマでスポット部のＨＭＤＳ層を除去し、除去部に、サンプルを固定する材料としてアミノシラン３０６などを蒸着する（図３−Ｅ）。最後に保護膜を洗浄除去し、基板を作製する（図３−Ｆ）。
【００２６】
基板に用いられる材料としては、特に制限は無いが、ＤＮＡを蛍光で分析する場合や、分析中に温度の上げ下げが行われる場合などは、自家蛍光が低く、熱膨張係数が小さく、且つ分析溶液の耐性が高いシリコン、ガラス、石英、ＳＵＳ、チタンなどが特に望ましい。
【００２７】
付着スポットなどのサンプル付着部に用いられる材料としては、基板上に共有結合を介して形成できるようなものがよい。この様な材料としては、基板表面に酸化膜を持つシリコン、ガラス、石英、サファイア、セラミック、フェライト、アルミナなどの無機材料やアルミニウム、ＳＵＳ、チタン、鉄などの金属材料を用いる場合は、特にシランカップリング材が望ましい。また、シランカップリング材のなかでも、共有結合を介してアミノ基を含むコーティング膜を形成できるような反応性が高い官能基を持つものがよく、この様な官能基としては、ビニル基、エポキシ基、スチリル基、メタクリル基、アクリル基、アミノ基、ウレイド基、イソシアネート基、イソシアヌレート基、メルカプト基を分子内に持つエトキシシランやメトキシシランが挙げられる。
【００２８】
次に、フローセルの構成を図４で説明する。
【００２９】
フローセルは下面に核酸分析用の基板４０３と上面のガラス部４０１と流路を形成する中間材４０２を挟み込み接合する。下面の基板の穴が送液試薬の注入口、および排出口となる。
【００３０】
（３）ＤＮＡの塩基配列のシーケンス処理
次に、核酸分析装置を用いたＤＮＡシーケンス方法の一例を図５に示し説明する。まず、分析対象のＤＮＡを固定したフローセルを核酸分析装置に搭載する５０１。次に、４種類の塩基の種類毎に異なる種類の蛍光体が標識された蛍光標識ヌクレオチドやＤＮＡポリメラーゼを含む反応試薬をフローセルに送液し、フローセルの温度を調整し、試薬を反応させる５０２。その結果、あらかじめ試料に結合したプライマと呼ばれる塩基配列の存在によって、試料ＤＮＡの配列に相補的な蛍光体が付いたヌクレオチドが取り込まれ、伸長反応が行われる。本核酸分析装置では、取り込まれた塩基の種類を４種類の蛍光によって検出することが可能である。分析対象となる試料ＤＮＡの配列に対応するＡ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）の４塩基の判別が可能である。塩基配列に対応する蛍光検出は、１塩基伸長する毎に、洗浄後、撮像により４種類の蛍光画像を取得する５０３。次に、撮像された１塩基の蛍光体は、酵素等を含む試薬によって蛍光体を除去する５０４。洗浄後、次の１塩基を検出するために、蛍光体が標識された蛍光標識ヌクレオチドを含む先の反応試薬をフローセルに送液し、フローセルの温度を調整し、蛍光体が付いた塩基試薬を反応させ５０５、洗浄後、撮像する５０６。この蛍光色素除去、１塩基伸長、撮像５０６を１サイクルとして、（Ｎ−１）回繰り返すことにより、Ｎ塩基分のシーケンスが可能となる。図６に、このシーケンス方法の例を示す。蛍光体が標識された蛍光標識ヌクレオチドをＣｙ３−ｄＡＴＰ、Ｃｙ５−ｄＴＴＰ、ＴｘＲ−ｄＧＴＰ、ＦＡＭ−ｄＣＴＰを用いた場合、個々の付着スポット（例えば塩基配列-ＴＡＴＡＣＧ-を持つＤＮＡ断片（６０１））において、あるサイクル（＃Ｍ）のケミストリ処理によって一塩基分伸長させると、例えば蛍光体のＣｙ３−ｄＡＴＰが取り込まれる。この蛍光標識ヌクレオチドは、輝点として観察され、撮像処理において、Ｃｙ３の蛍光画像上のスポットとして検出される。このＣｙ３−ｄＡＴＰが取り込まれる場合、対応するＤＮＡ断片の塩基はＴ（チミン）であると判断される。同様に、サイクル（＃Ｍ＋１）では、輝点として観察され、蛍光体Ｃｙ５の蛍光画像上のスポットとして検出される。このＣｙ５−ｄＴＴＰが取り込まれたる場合、対応するＤＮＡ断片の塩基はＡ（アデニン）であると判断される。同様に、サイクル（＃Ｍ＋２）では、輝点として観察され、蛍光体ＴｘＲの蛍光画像上のスポットとして検出される。このＴｘＲ−ｄＧＴＰが取り込まれる場合、対応するＤＮＡ断片の塩基はＣ（シトシン）であると判断される。同様に、サイクル（＃Ｍ＋３）では、輝点として観察され、蛍光体ＦＡＭの蛍光画像上のスポットとして検出される。このＦＡＭ−ｄＣＴＰが取り込まれる場合、対応するＤＮＡ断片の塩基はＧ（グアニン）であると判断される。以上のサイクル＃Ｍから、サイクル＃Ｍ＋３までのサイクル処理によって、このスポットにおける塩基配列はＴＡＣＧと決定される。この様にして、サンプルとなるＤＮＡ断片の塩基配列はシーケンスされる。
【実施例１】
【００３１】
基板表面上に核酸が付着するパターン状のスポット部と、ランダム状のスポット部を備える核酸分析用基板について、図７を用いて一例を説明する。【００３２】
図７は基板上の一部を拡大した図である。基板上に一定の規則性を持って核酸の付着スポットが整列する領域であるパターン状のスポット部７０１と非規則的に核酸が付着する領域であるランダム状のスポット部７０２が存在する。図６−Ａでは、円形箇所が整列している部分がパターン状スポット部７０１を示し、円形箇所はサンプルが付着する付着スポットを示している。そして、三角形の箇所がランダム状のスポット部７０２である。各スポット部は、アミノ基を含むコーティング膜で形成される核酸が付着するエリアをもち、核酸が付着しない領域は、表面が疎水性のＨＭＤＳでコーティングされている。パターン状のスポット部では、整列した円形箇所に核酸が付着し、円形箇所の周辺は核酸が付着せず、表面が疎水性のＨＭＤＳでコーティングされている。三角形のランダム状のスポット部は、核酸が付着するアミノ基を含むコーティング膜で形成されている。【００３３】
ここで、パターン状に並んだスポット部のパターン状とは、斜方格子状、長方格子状、面心長方格子状、六方格子状、正方格子状などの配列パターンであり、特に、付着スポットの高密度化を図ることが可能である六方格子状で付着スポットを配列することが望ましい。また、ランダム状のスポット部の図形が辺を持つ図形の場合、ランダム状のスポット部の図形の各辺は、図形の外側のパターン状のスポット列に平行であることが望ましい。例えば、図７のようにランダム状のスポット部の図形が三角形の場合、図７−Ｂのように、三角形のランダム状のスポット部の辺の一部が、周辺に位置するパターン状の付着スポットと重なる場合に比べ、図７−Ａのように、ランダム状のスポット部の三角形の各辺は、その周辺に位置するパターン状の付着スポット列と重ならないことが望ましい。あるいは、ランダム状のスポット部の三角形の各辺は、その周辺に位置するパターン状の付着スポット列と平行であることが望ましい。これは、パターン状の付着スポットが、ランダム状のスポット部と重なることによる検出可能な蛍光画像上のスポット数の減少を回避することが可能である。また、画像の位置合わせにおいて、図形の外側に整列した平行したスポット列、あるいは図形の外周のスポットを指標として、位置合わせを行なうことも可能である。例えば、パターン状のスポット部とランダム状のスポット部の領域位置関係から、位置合わせを行う領域が選択可能となり、少数のスポット位置の確認によって、位置合わせが可能となる。その結果、位置合わせの精度と処理速度の向上などの効果がある。【００３４】
また、ランダム状のスポット部の図形が円系状の部分を持つ図形の場合、パターン状の付着スポット列と重ならないことが、同様に望ましい。重ならないことで、ランダム状のスポット部の図形部分の判別を行いやすくする。【００３５】
また、図８−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆで例を示すように、ランダム状のスポット部の形状は、三角形や四角形などの多角形、円形、楕円形、またこれらの組み合わせた図形であることが考えられる。その中でも、複数の三角形を組み合わせて出来る図形は、パターン状のエリアとランダム状のエリアを区別しやすく、図形の位置合わせに使用しやすい利点がある。【００３６】
また、ランダム状のスポット部に付着するサンプルのランダムな位置関係から、マーカーとしての活用することが可能になるため、複数のサンプルが重ならずに付着することが望ましい。そのため、ランダム状のスポット部のサイズは、サンプルのサイズによって異なるため規定はできないが、少なくとも各ランダム状のスポット部の領域の形状やスポット位置によって位置の判別が可能である複数のサンプル数が付着可能な大きさであれば良い。【００３７】
パターン状のスポット部は、一つの付着スポットに複数種類の核酸サンプルが付着すると、その複数種類の核酸サンプルから蛍光色素が検出され誤検出となる。そのため、付着スポットのサイズが大きすぎると誤検出の原因となりえる。一方、付着スポットのサイズが小さすぎると核酸サンプルとの接触確率が低下し、核酸サンプルが付着しない付着スポットが増え、分析のスループットが低下する。そのため、パターン状の付着スポットの直径や付着スポットの配置は、核酸サンプルが１つの付着スポットに１個だけが付着する様なサイズや位置が望ましく、付着スポットの大きさがサンプルの大きさの１／２以上、２倍未満程度の大きさが好ましく、良好な結果が得られている。例えば、核酸サンプルが、５０ｎｍのサイズの場合、付着スポットのサイズは２５ｎｍ以上１００ｎｍ未満が望ましい。
【実施例２】
【００３８】
パターン状のスポット部と、ランダム状のスポット部を備える核酸分析用基板を用いた画像取得と位置合わせ方法の例を説明する。【００３９】
分析対象である核酸サンプルは、フローセル上の基板に配置されたパターン状スポット部とランダム状スポット部に固定される。そして、伸長反応により、蛍光体が付いたヌクレオチドが取り込まれ、４種のＤＮＡ塩基に対応する４種類の蛍光画像を撮像し取得する。１塩基伸長の各サイクルで、１視野あたり４種類の蛍光画像を輝点として観測される。図９では、４種類の蛍光画像の例を示す。白丸が輝点を示す。輝点は蛍光画像上のスポットとして検出できる。この４種類のＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃに対応する画像（９０１、９０２、９０３、９０４）を合わせた画像９０５の輝点位置が、画像当たりの核酸試料が固定された位置を示している。【００４０】
また、基板の蛍光画像を検出する検出視野数は、基板の大きさや装置の解像度によって異なり、数百以上の視野におよぶ場合もある。例えば、検出視野が８００ある場合、各サイクルで、ステージを８００視野分移動させ撮像することになる。図１０に示すように、サイクルＮ（１００１）とサイクルＮ＋１（１００２）ではステージの移動に伴う位置ずれが生じる場合がある。この位置ずれはステージ駆動の制御精度や熱による基板の歪み等、様々な要因に起因する。【００４１】
核酸サンプルを分析するには、核酸試料を固定した基板を用いて、伸長反応により、蛍光体が付いたヌクレオチドを取り込ませ、輝点画像を撮像し輝点の位置情報を取得する工程を繰り返す必要がある。そして、複数画像を用いて核酸を解析するために、複数画像の正確な位置合わせが必要となる。【００４２】
画像の位置合わせ方法の一例を、図１１を用いて説明する。まず輝点である蛍光画像上の全スポットを検出する１１０１。次に、位置合わせの基準となる基準画像を作成する１１０２。ここで基準画像とは、輝点である蛍光画像上のスポットの位置座標を合わせるために用いる基準とするスポットの位置の画像のことを示す。そして、基準画像の輝点であるスポットの位置に対して、解析対象画像と基準画像の輝点のスポット同士の位置を合わせる１１０３。【００４３】
基準画像の作成は、撮像された実画像をもとに基準画像（Ｋ１）を作成する。例えば核酸分析の場合、１サイクルで１視野あたり、４種類の核酸塩基ＡＴＣＧのそれぞれの塩基種類に基づく４枚の輝点画像を取得する。最初に１サイクル目の４枚の画像を合わせ、基準画像（Ｋ１）を作成する。この１サイクル目の１視野で撮像する４枚の画像は、ステージ移動が無い場合、ステージ移動で発生する可能性がある位置ずれは無い。そのため、画像を重ね合わせはステージ移動がある場合に比べ容易である。
そして、１つの蛍光画像上のスポットに複数サンプルが付着していなければ、輝点である各蛍光画像上のスポットは４枚の画像で重複しない。そのため、各蛍光画像上のスポットが重ならないようにして、画像の重ね合わせを行うことになる。例えば、図９の画像が、１サイクル目で撮像した４種類のＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃに対応する蛍光画像（９０１、９０２、９０３、９０４）の場合、合わせた画像９０５が基準画像（Ｋ１）となる。【００４４】
また、撮像で全ての輝点が検出されるような特殊なプライマを用いた場合、１枚で全ての輝点が検出された蛍光画像を基準画像とすることも可能である。【００４５】
また、基準画像（Ｋ１）は、複数サイクルで撮像した蛍光画像を合わせて作成してもよい。この場合、サンプルが付着している箇所が、各サンプルの塩基配列に応じて輝点となり、輝点は蛍光画像上のスポットとして検出される。そのため、輝点位置を合わせるために、画像を回転、拡大縮小、平行移動することを繰り返しながら、各蛍光画像上のスポットについて、各蛍光画像上のスポット同士の距離の二乗が最小となるような方法を適用し、位置合わせを行ってよい。同一スポットの同定には、複数のサイクルで取得する複数の画像を合わせることで、精度が向上し誤検出を防ぐことができる。一つのスポットに複数のサンプルが付いた場合の判別も可能である。しかし、使用する画像が多すぎる場合、位置合わせの計算に時間を要することになりスループットが低下することがある。【００４６】
また、最初のサイクルの４枚の画像を基に作製した基準画像は、次のサイクルの４枚の取得画像による基準画像の補正を行って良く、また、複数のサイクルの取得画像を用いて補正しても良い。例えば、２サイクル目から１０サイクル目までの画像と最初の基準画像（Ｋ１）の位置合わせを行い、基準画像（Ｋ１）を補正し、基準画像（Ｋ２）を作成する。この基準画像（Ｋ２）を用いて、１１サイクル目の画像の位置合わせを行って良い。【００４７】
また、基準画像の補正は、画像位置合わせの誤差増加に応じた補正や、一定時間間隔ごとに補正しても良い。このような基準画像の補正は、複数のサイクルや複数視野の撮像によるステージ駆動のずれや、熱などによる基板ゆがみ等の経時変化に対応することが可能となる。【００４８】
さらに、基準画像作成や基準画像と解析対象画像の位置合わせにおいて、パターン状のスポット部の輝点は、規則的に付着スポットが整列しているために、輝点の位置合わせが容易となる反面、隣の列と誤認識される場合は位置ずれが起こる可能性がある。一方、ランダム状のスポット部の輝点は、輝点の位置座標がランダムであるため、複数の輝点との位置関係から位置マーカーとして使用可能であり、輝点の位置合わせに有用である。そのため、パターン状スポット部の輝点による位置合わせを行った後にランダム状のスポット部の輝点で補正をすることで、位置ずれを回避することが可能である。また、ランダム状のスポット部の輝点による位置合わせから、輝点の位置合わせを行う場合、ランダムなスポットだけの基板に比べ、本発明のランダム状のスポット部の領域は少ないため、短時間での位置合わせが可能となる。このように、パターン状のスポット部とランダム状スポット部の両方を備える基板は、位置合わせの検出において、パターン状のスポット部の優位な特徴とランダム状のスポット部の優位な特徴を組み合わせて検出することで、位置合わせを容易にし、分析のスループットを向上させることが可能である。また、パターン状のスポット部とランダム状のスポット部の両方の領域を備えることで、各領域の配置から、領域位置の推定が可能な場合もある。また、ランダム状のスポット部の輝点位置合わせだけで、輝点位置の特定をすることも可能である。【００４９】
また、画像間の位置合わせを行う場合に、位置合わせ精度や速度を向上させるために、一枚の画像を複数のブロックに分割し、ブロック単位で位置合わせすることが可能である。位置合わせのエリアを小さく区切り、ブロック単位で位置合わせを行うことで、位置合わせを行うための輝点数が減少し、位置合わせの速度は上昇する。この場合、輝点数が減少することで、位置合わせのマーカーとなる輝点数が減少することを意味し、ブロック単位の特定が困難になる可能性が考えられるが、周辺ブロックの輝点位置情報によって、ブロック単位の位置を特定することが可能である。この場合、各ブロックには、少なくとも一つのパターン状のスポット部とランダム状のスポット部が存在することが望ましいが、周辺ブロックの位置関係によって各ブロック位置が判別できる場合、ランダムスポット部が無いブロックがあっても良い。【００５０】
１つの画像を分割するブロック数に制限は無いが、例えば、基板上でランダム状スポット部が周期的に同一の位置関係をとる場合、単位ブロックのサイズが、観察時に発生する画像ずれのサイズより大きいことが望ましい。
これは、画像ずれサイズより単位ブロックのサイズが大きい場合、位置合わせを行う対象ブロック周辺で一致するブロックを探索することで、対象ブロックの位置を特定することが可能である。一方、画像ずれサイズより単位ブロックのサイズが小さい場合、位置ずれサイズに応じて探索するブロック数を増加させる必要がある。【００５１】
また、撮像によって取得される画像は、画面中央部と四隅で収差が異なるため、画像の位置合わせを行なう際のずれ量も異なる。そのため、ランダム状のスポット部の数は多いほど、位置合わせの精度が高くなる。ランダム状のスポット部は、基板上にランダムに配置することによって、ランダム状のスポットの輝点位置だけではなく、ランダム状のスポット部の配置パターンにも一意性を持たせ、既知の配置として位置合わせに寄与させてもよい。【００５２】
単位ブロックのサイズが、観察時に発生する画像ずれのサイズより大きい場合のランダム状のスポット部の配置パターンと分割するブロックの例を次に示す。例えば一画像が１ｍｍ２程度の大きさであり、画像ずれが０．１ｍｍ程度以内のずれを想定した場合、分割するブロックは、一画像あたり６４ブロックに分割した場合の例を図１２に示す。図１２を１画像とし、１画像を６４ブロックに分割している。各単位ブロックには便宜上、１〜６４の番号を記載しているが、この番号は無くて良い。そして、各ブロックは少なくとも隣接するブロック同士で、ランダム状のスポット部の配置が異なるように配置する。また、基板の設計や製造を簡易化するために、例えば、６４ブロック全てのランダム状のスポット部の配置を異なるものにはせず、４つの単位ブロック毎に同じ配置を使用しても良い。４つの単位ブロックの例として、図１２上のブロック１、２、９、１０について拡大した図１３を示す。４つの単位ブロックはそれぞれ異なるランダム状のスポット部の配置を持つ。この４ブロック単位を１６個配置し、６４ブロックとして良い。このような配置方法は、基板製造の容易さやコストを軽減する効果がある。【００５３】
また、上記の単位ブロックよりさらに細かく分割する例として、図１４を用いて説明する。図１４では、ランダム状のスポット部の種類と数を増やすことにより、ブロック単位での一意性を高めている。図１４は、１画像を６４ブロックに分割し、さらに各ブロックを１６ブロックに小分割した例である。１画像の４／６４ブロックについて示している。周辺のランダム状スポット部の配置から、ブロックの位置を特定するために、この小分割した各ブロックに少なくとも一つのランダム状のスポット部を配置するのが良い。また、ランダム状のスポット部の配置は、近傍周辺のランダム状スポット部の配置からブロック位置を特定可能な配置となる場合、小分割したブロック内にランダム状のスポット部が無いブロックがあっても良い。【００５４】
尚、図１２、図１３、図１４では、パターン状のスポット部を省略し、ランダム状のスポット部のみを表示している。
【実施例３】
【００５５】
画像の位置合わせ方法の例を図１５に示す。【００５６】
基板の設計情報から、基準画像を作成する１５０１。例えば、シミュレーションなどによって、基準画像を作成してよい。ここで基準画像とは、輝点である蛍光画像上のスポットの位置座標を合わせるために用いる基準とするスポットの位置の画像のことを示す。スポットの位置情報だけで合わせる場合は、画像を作成しなくて良い。この基準画像は使用する基板に応じて、あらかじめ基準画像を作成しておいて良い。あらかじめ作成しておいた基準画像を、使用する基板に応じて記憶媒体から基準画像を呼び出しても良い。基板の設計情報から作成する最初の基準画像は、パターン状のスポット部の付着スポットの位置である。使用する条件によってはパターン状のスポット部の領域、ランダム状のスポット部の領域情報があっても良い。次に基板上の輝点を検出する１５０２。基板上の輝点は、蛍光画像上ではスポットとして検出される。次に基準画像のパターン状のスポット部のスポットの位置に対して、解析対象画像のパターン状のスポットの位置を合わせる１５０３。このパターン状のスポット部の位置合わせは、あらかじめ位置情報が分かっている基準画像があるという利点のため、高スループットな位置合わせを実現できる。しかし、パターン状のスポット部のみの位置合わせは、スポットが周期的に整列しているために、隣接するスポット列を誤認識する可能性がある。そのため、ランダム状のスポット部の輝点である蛍光画像上のスポット、つまり、ランダ状のスポットを用いて画像の位置合わせの補正を行なう１５０４。ランダム状のスポットは隣接するスポット同士の距離が不規則であるため、ランダム状のスポット全体における位置の判別が、パターン状のスポット部よりも特定しやすい。ただし、ランダム状のスポット部の輝点位置情報は、基板の設計情報から作成したパターン状のスポット部の位置情報の基準画像には無いため、各サイクルで取得した輝点情報によって、基準画像の補正を行う。
【実施例４】
【００５７】
基板表面上に核酸が付着するパターン状のスポット部と、ランダム状のスポット部を備える核酸分析用基板について、実施例１と異なる実施例について図１６を用いて一例を説明する。【００５８】
図１６は基板上の一部を拡大した図である。基板上に一定の規則性を持って核酸の付着スポットが整列する領域であるパターン状のスポット部１６０１と、核酸が付着する付着スポットを非規則的に持つランダム状のスポット部１６０２を備えた基板である。ランダム状のスポット部１６０２には、ランダム状のスポット部に非規則的に配置した付着スポット１６０３を持つ。各付着スポットは、アミノ基を含むコーティング膜で形成され核酸が付着することができる。核酸が付着しない領域は、表面が疎水性のＨＭＤＳでコーティングされている。パターン状のスポット部では、整列した円形箇所に核酸が付着し、ランダム状のスポット部も円形箇所に核酸が付着する。円形箇所の周辺は核酸が付着せず、表面が疎水性のＨＭＤＳでコーティングされている。ランダム状のスポット部の付着スポットは、前述した核酸分析用基板の作製方法の例で説明したフォトマスク３０４の作成時に、配置される。このランダム状のスポット部の付着スポットの配置は、スポット同士が接触しない配置であり、周辺のパターン状のスポット部のとは異なる付着スポット配置を持つ。付着スポットを非規則的に配置するとは、周辺のパターン状のスポット部の規則的な配置に対して、異なった配置となっていることを意味し、付着スポット単独あるいは複数個で、周辺のパターン状の付着スポットと比較し、異なった配置をしていることを意味している。また、配置する付着スポットの数や密度によるが、ランダム状のスポット部における蛍光画像上のスポット位置とランダム状のスポット部のスポット位置、あるいはランダム状のスポット部におけるスポット位置とパターン状のスポット部のスポット位置によって、それぞれのスポット位置を特定できれば良い。図１６−（Ａ）はランダム状のスポット部に付着スポットの単体をランダムに配置した例である。図１６−（Ｂ）はパターン状のスポット部の付着スポットとは異なる位置関係をもつ付着スポットの集合体をランダムに配置した例である。図１６−（Ｂ）は４個の付着スポットの集合体を複数個配置した例ある。付着スポットの集合体は、どんな数や配置でも良いが、位置マーカー的に使用するため、少なくともパターン状のスポット部と区別可能であることが望ましい。
【実施例５】
【００５９】
実施例４の基板を用いた場合の画像に関連した位置合わせ方法の例を図１７に示す。【００６０】
基板の設計情報から、各スポット部の位置情報の基準画像を作成する１７０１。例えば、シミュレーションなどによって、基準画像を作成してよい。ここで基準画像とは、輝点である蛍光画像上のスポットの位置座標を合わせるために用いる基準とするスポットの位置の画像のことを示す。スポットの位置情報だけで合わせる場合は、画像を作成しなくて良い。この基準画像は使用する基板に応じて、あらかじめ基準画像を作成して良い。あらかじめ作成しておいた基準画像を、使用する基板に応じて記憶媒体から基準画像を呼び出しても良い。基板の設計情報から作成する最初の基準画像は、パターン状のスポット部の付着スポットの位置、ランダム状のスポット部の付着スポットの位置から作成する。取得した位置合わせを行うために、パターン状のスポット部の領域、ランダム状のスポット部の領域情報があっても良い。次に基板上の輝点を検出する１７０２。基板上の輝点は、蛍光画像上ではスポットとして検出される。次に基準画像のランダム状のスポット部のスポットの位置と、解析対象画像のランダム状のスポット部のスポットの位置を合わせる１７０３。このランダム状のスポット部の位置合わせは、あらかじめ位置情報が分かっている基準画像があるという利点のため、また、位置合わせをする領域が少ないため、高スループットな位置合わせを実現できる。また、ランダム状のスポットは隣接するスポット同士の距離が不規則であるため、ランダム状のスポット全体における位置の判別が、パターン状のスポット部よりも特定しやすい。次に、パターン状のスポット部のスポットと解析対象画像のパターン状のスポットの位置合わせを行なう１７０４。ランダム状のスポット部の位置合わせを行っているため、パターン状のスポット部のスポットは、位置合わせが容易となる効果がある。【００６１】
尚、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。上記した実施例は本発明を理解するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加、削除、置換をすることが可能である。
【符号の説明】
【００６２】
１００  核酸分析装置
１０１  ２次元センサ
１０２  結像レンズ
１０３  バンドパスフィルタ
１０４  励起フィルタ
１０５  ダイクロイックミラー
１０６  フィルタキューブ
１０７  光源
１０８  対物レンズ
１０９  フローセル
１１０  コンデンサレンズ
１１１  ノズル
１１２  配管
１１３  試薬容器
１１４  試薬ラック
１１５  配管
１１６  廃液容器
１１７  ステージ
１１８  温調基板
１１９  コンピュータ
１２０  ダイクロイックミラー
２００  核酸分析装置
３０１  酸化膜
３０２  シリコンウエハ
３０３  ＨＭＤＳ
３０４  フォトマスク
３０５  保護膜
３０６  アミノシラン
４０１  ガラス板
４０２  中間材
４０３  基板
５０１  フローセル搭載
５０２  試薬反応：１塩基伸長
５０３  撮像
５０４  試薬反応：蛍光除去
５０５  試薬反応：１塩基伸長
５０６  撮像
６０１  DNA断片の塩基配列
７０１  パターン状のスポット部
７０２  ランダム状のスポット部
９０１  Ａ（アデニン）に相当する蛍光ヌクレオチドが発光した画像
９０２  Ｔ（チミン）に相当する蛍光ヌクレオチドが発光した画像
９０３  Ｇ（グアニン）に相当する蛍光ヌクレオチドが発光した画像
９０４  Ｃ（シトシン）に相当する蛍光ヌクレオチドが発光した画像
９０５  ９０１〜９０４を重ね合わせた場合の画像
１００１  サイクルＮのステージ位置
１００２  サイクルＮ＋１のステージの移動に伴う位置ずれ
１１０１  スポットの輝点を検出する
１１０２  基準画像を作成する
１１０３  解析対象画像と基準画像の輝点同士の位置を合わせる
１５０１  基板の設計情報から基準画像を作成する
１５０２  基板上の輝点を検出する
１５０３  基準画像のパターン状のスポットと解析対象画像のパターン状のスポットの位置を合わせる
１５０４  ランダム状のスポットを用いて画像の位置合わせの補正を行なう
１６０１  パターン状のスポット部
１６０２  ランダム状のスポット部
１６０３  付着スポット
１７０１  基板の設計情報から基準画像を作成する
１７０２  基板上の輝点を検出する
１７０３  基準画像のランダム状のスポットと、解析対象画像のランダム状のスポットの位置を合わせる
１７０４  基準画像のパターン状のスポットと、解析対象画像のパターン状のスポットの位置を合わせる
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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