(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示すアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするDNA。
【請求項２】
ストリンジェントな条件下で配列番号１に示すDNA配列にハイブリダイズする、請求項１に記載のDNA。
【請求項３】
請求項１又２に記載のDNAによりコードされるgp 130。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のDNAを含むDNA構築物。
【請求項５】
医薬に使用される、請求項３に記載のgp 130。
【請求項６】
１以上の成長因子の作用を拮抗させるために使用される、請求項５に記載のgp 130。
【請求項７】
前記成長因子が、IL−６、LIF、CNTF、オンコスタチンＭ又はIL−IIの内の１以上である、請求項６に記載のgp 130。
【請求項８】
移植前胚の正しい発達を確保するために使用される、請求項５〜７のいずれか１に記載のgp 130。
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規のヒトgp 130タンパク質、このタンパク質をコーディングするDNA配列、治療における、特にインビトロ受精におけるその使用、並びにこのようなタンパク質を含んで成る医薬組成物に関する。
首尾よい胚移植は、移植前胚の正しい発達を必要とし、受容性子宮内膜内へ移植されることができる孵化した芽細胞をもたらす。
かなりのデータであって、子宮上皮により分泌されるとき、可溶性成長因子がこの過程を制御するためにその胚上に直接的に作用するという着想を支持するものが集められた（Anderson, E. D., J. Cellular Biochem., 53: 280-287（1993）及びSchultz, G. A. and Hevner, S., Mutat. Res., 296: 17-31（1992））。
さらに、発達した胚は、その受容性に影響を与えるためにその内膜上にオートクラインに作用することができるさまざまなサイトカインを生産することが示されている。ヒト胚により生産されることが示された成長因子の例は、IL−１，IL−６，CSF-１及びTNF-αを含む（Zolt: et al, Fertil. Steril., 56（1991）265-272及びWitkin et al, J. Reprod. Immunol., 19（1991）85-93）。TNF-αは、桑実期までヒト胚の培養基中の存在するが、その胚盤胞からの培養基中には存在しないことが示されている（Lachappelle et al, Human Reproduction, 8: 1032-1038（1993））。この胚によるサイトカインの生産は、それ故、段階特異的なやり方で調節されることができる。
胚に対するサイトカインの可能性のある直接的な効果に対するデータは、多くのサイトカインがインビトロにおける移植前胚の発達に影響を及ぼすことが示されているマウスにおける実験から得られたものである。RFN-γとCSF-１は、生理学的濃度において、胚盤胞段階へ発達する胚の数を抑制する（Hill et al, J. Immunol., 139（1987）2250-2254）。TNF-αも、より微小な効果をもつことが示されている。TNF-αは、胚盤胞形成の速度に対して明らかな効果をもたないけれども、内部細胞塊（inner cell mass（ICM））に貢献する細胞の増殖を特異的に阻止するようであり、これは、減少されたICMをもつ胚盤胞をもたらす（Pampfer et al, Endocrinoligy, 134: 206-212（1994））。
他の成長因子もICM細胞に対し特定の効果をもつ。例えば、インスリン様成長因子１と２は、ICM増殖を刺激し、一方、白血病阻害性因子（LIF）は、それらの分化を抑制する（Harvey et al, Mol. Reprod. Dev., 31（1992）195-199）。
上述のように、IL−６は、ヒト胚により生産されることが示されている成長因子の中の１である。IL−６は、哺乳類における多くの細胞タイプの増殖及び分化を制御し、そしてさらに、その免疫系の制御において役割をもつタンパク質である。IL−６ＲへのIL−６の結合は、その細胞膜を通して実際にそのシグナルを伝達するgp 130として知られる第３成分とのIL−６Ｒの会合を開始させる（Taga et al, PNAS, 89: 10998-11001）。gp 130は、トランスメンブラン・タンパク質であり、すなわち、それは、その膜を貫通して延び、そしてその細胞質内に突き出し、これ故、それは、明細に区別できるドメインをもつ。この方法で、IL−６の“シグナル”伝達は、このタンパク質により仲介される。
EP-A-0411946は、組換えgp 130タンパク質、並びにそのようなタンパク質をコーディングするDNA配列及びそのクローリングのための方法を開示している。
Yasukawa et al, Immunology Letters, 31（1992）123-130は、そのタンパク質のトランスメンブラン結合形態からそのトランスメンブラン及び細胞質領域を除去することにより作り出されたgp 130の可溶性の組換え形態を開示している。
Narazaki et al, Blood., 82, No.4（1993）1120-1126は、gp 130の可溶性形態が存在し、そしてトランスメンブランgp 130により通常仲介されるシグナルを抑制する能力をもつことができる。
今般、そのトランスメンブランgp 130をコーディングする配列の別のスプライシングによりその形態が生じるところの、そのトランスメンブラン・タンパク質を欠くgp 130の新規の形態が発見された。gp 130のこの形態は、例えば、IL−６レセプターの複合体へ結合することができ、トランスメンブランgp 130とその複合体との会合の遮断をもたらす。
新規のスプライシングパターンであって同時にそのトランスメンブラン・ドメインの欠失をもたらすものは、フレーム内終結コドンの前の45アミノ酸を導く、フレームシフトをもたらす。
従って、本発明は、以下のＣ−末端配列：
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又はそれに実質的に相同なＣ−末端配列を含むgp 130を提供する。
好ましくは、本発明の新規のgp 130は、アミノ酸位置614からの上記の配列をもつ。この態様においては、本発明の新規のgp 130は、図２中に示すものに実質的に相同な位置１−613おける配列をもつ。
そのアミノ酸のレベルにおいては、その構成アミノ酸の有意な数が相同性を示す場合、他のタンパクに実質的に相同であると認められることができる。そのアミノ酸の少なくとも40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％又は99％が、増加するに従って好ましくなって、相同であることができる。
従って、上記の他のスプライシング・メカニズムの活性化は、ヒト胚盤胞における新規のgp 130の生産をもたらすことができ、例えば、LIFの効果の失活をもたらしこれは次に、その内部細胞塊の分化を許容することができ、ICM分化が進行することを許容する。それ故、明らかに、本発明の新規gp 130は、被験体における移植前の正しい分化及び発達を保証するための移植前胚の治療において使用されることができる。
さらに、本発明は
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に実質的に相同な配列を含む、本発明のタンパク質をコーディングするDNA配列をも提供する。
“実質的に同一のアミノ酸配列”は、その遺伝子コードの縮重により、所定のアミノ酸配列をもコードし又はそのような配列に実質的に相同である他の核酸配列の全てを含む。
実質的な相同性をもつ配列は、ストリンジェントな条件下（例えば、約0.9Ｍの塩溶液中35〜65℃において)図２中に示す核酸配列にハイブリダイズするであろうものとし認められることができる。
本発明のDNA配列を含んで成るDNA構築物は、本発明の他の態様を形成する。
本明細書中に討議するように、本発明のタンパク質は、特定の成長因子の作用の拮抗において、有用であり、これ故、特定の発達過程が移植前胚中で“スイッチング・オン”されることを可能にする。従って、さらなる態様においては、本発明は、IL−６、白血病阻害性因子（LIF）、オンコスタチンＭ（Oncostatin M）、Ciliary Neurotrophic Factor(CNTF)及びIL−IIを含む１以上の成長因子の作用の拮抗における本発明のタンパク質の使用を提供する。
さらに、本発明は、移植前胚における正しい発達の保証における使用のための薬剤の製造における本発明のタンパク質の使用をも提供する。好ましくは、本薬物は、ICMの分化が正しい時に生じることを保証するために使用される。
薬物は、好ましくは、１以上の医薬として許容される担体及び／又は賦形剤と共に本発明のタンパク質を含んで成る医薬配合品の形態で提示される。このような医薬配合物は、本発明のさらなる側面を形作る。
本発明の最終的な側面は、好ましくは、医薬配合物の形態で、本発明のタンパク質により、移植前胚を処理する段階を含んで成る１以上の成長因子の作用を拮抗するための方法を提供する。好ましくは、本発明は、移植前胚の正しい発達を保証する方法を提供する。
本発明を、これから、本発明をいずれの方法によるかを問わず限定するものと解釈されるべきではない以下の実施例により記載する。
図１：  可溶性gp 130の配列及びそれをコーディングするDNA配列；
図２：  生来のgp 130の配列；
配列表の説明
配列番号１：可溶性gp 130のDNA及びアミノ酸配列
配列番号２：可溶性gp 130のアミノ酸配列
配列番号３：生来のgp 130のDNA及びアミノ酸配列
配列番号４：生来のgp 130のアミノ酸配列
図３：  ヒト胚からのRNA上の入れ子状RT-PCR増幅の産物を示すアガロース・ゲル。各パネルは、異なるcDNA標的に特異的なプライマーを用いての増幅の産物を示す。異なる胚から増幅されたcDNAsを、各レーンにロードした。レーンを、表１（以下）中のcDNAラベルに従って標識する。追加のサンプルは：レーンｐ、第１  ３半期外細胞塊；レーンｑ,
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からのcDNA；レーンｒ，10ugヒト・ゲノムDNA；及びレーンｓ、ネガティブ・コントロールとしての入力無cDNA。DNA分子量マーカーは、レーンｉにロードされた123塩基対ラダーであった。予想PCR産物のサイズを、bpで示す。
表１
ヒト胚cDNAs及び対照
発達の段階
ａ      ２細胞
ｂ      ３細胞
ｃ      ４細胞
ｄ      ６細胞
ｅ      ８細胞
ｆ      モニラ（monila）
ｇ      胚盤胞
ｈ      ａ〜ｇについての培養上清
ｊ      ３つのプールされた胚盤胞
ｋ      ｊについての培養上清
ｌ      ２×６細胞及び１×８細胞
ｍ      ｌについての培養上清
ｎ      １×４細胞及び１×６細胞
ｏ      ｎについての培養上清
サンプルａ〜ｈは、同一ドナーからのものである。
図４：  RT-PCRのために使用されたプライマー
実施例１：胚培養及びRNA抽出
IVFプログラムの一部として受精された低温保存ヒト胚を、本試験に使用した。これらの胚は、それらの親により研究目的のために寄贈されていたものであり、そして本試験は、ヒトの胎生学及び受精の権威、並びに地域倫理委員会の要求を満たすものであった。冷凍胚を、解凍し、そして要求される発達段階まで、0.4％ヒト血清アルブミン（Armour Pharmaceuticals UK）を補ったEarlesバランス塩培地中で培養し、次に５μｌの培養液中に液体窒素中で急速冷凍し（そしてこれ故、氷結晶により溶解した）。同一容量の培養上清を対照として冷凍した。残った丘細胞の全てを、日常の取扱いの間に除去した。
第１の３半期栄養芽層からの全RNAを、Chomsczynski及びSacchi, Anal. Biochem., 162: 156-159（1987）の方法により単離し、この方法で、冷凍した組織を、４Ｍチオシアン酸グアニジニウム（Gibco BRL Liringston, Scotland）、25mMクエン酸ナトリウムpH7.0, 0.5％サルコシル及び0.1Ｍ  ２−メルオプトエタノールを含む５mlのバッファー中でホモジェナイズする。この溶解物を、0.5mlの２Ｍ酢酸ナトリウムpH４の添加により酸性にし、そして５mlのバッファー飽和フェノール及び１mlのクロロホルム−イソアミルアルコール（49: 1  Ｖ／Ｖ）を使用してフェノール−クロロホルム抽出を行った。この懸濁液を、15分間氷上に置き、そして４℃において20分間10,000ｇにおいて遠心分離した。RNAを含む水柤を沈殿させ、70％エタノール中で２回洗浄し、乾燥させ、そしてTE（10mM Tris-HCl pH7.4及び１mM EDTA）中に再懸濁させた。RNAの濃度を260nmにおいて分光光度計により測定した。
RNAを、上記手順に基づきスケール・ダウンしたプロトコールを使用して単一のヒト胚から調製した。そのRNAの沈殿を助けるために、100μｇの担体酵母RNA(Gibco BRL, Livingston, Scotland)を、ホモジェネーション段階で添加した。残りの詳細は先に記載した通りである。但し、容量の全てを50分の１であり、そしてその手順全体を、400μｌのエッペンドルフ管内で行った。
実施例２：逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）
cDNAを、AMV逆転写酵素（Super RT, HT Biotech, Cambridge, UK）を使用して各胚からの全RNAの半分から合成した。３〜５マイクログラムのRNAを、42℃において60分間その製造者の指示に従って、オリゴdT(Pharmacia)でプライムした。このcDNA調製物のPCR増幅を、製造者推奨のバッファー中１ＵのTaq DNAポリメラーゼ（Cetus, Emeryville, CA)及び10μＭの各外部プライマー対（図４参照）を使用して30μｌの最終容量中Hybaid Omnigene DNA熱サイクラーを用いて先に記載したように（Sharkey, A. et al, Molecular Endocrinol., 6: 1235-1241（1992））行った。以下のサイクル特性を、使用した：95℃において30秒、Ｘ℃において30秒、72℃において30秒の30サイクル、ここで、Ｘは、サイトカイン・プライマーの各対についてのアニーリング温度である。
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オリゴヌクレオチド・プライマー
gp 130とヒスチジルRNAシンテターゼのためのオリゴヌクレオチド・プライマーを、Cruachem PS250 DNA合成装置上で合成した。プライマー配列を、いずれの汚染ゲノムDNAの増幅もcDNA種からの異なるサイズの産物をもたらすように、公表されたヌクレオチド配列（図４参照）からデザインした。
少量の材料のために、入れ子PCRプロトコールにおいて２対のプライマーを各標的cDNAのために使用した。このcDNA産物の30分の１を、Amplitaq(Cetus)を使用して増幅した。外部プライマー対を使用した30サイクルのPCRの後に、第１ラウンドの反応の50分の１を、内部プライマー対を含む新たな管に移し、そしてさらに30ラウンドの増幅に供した。ネガティブ・コントロールとして、その中で胚が成長した培養液の等量を抽出し、そして同一方法でRT-PCRに供した。また、BeWoセルライン（ECACC No.86082803）の200細胞を、ポジティブ・コントロールとして抽出した。
本試験において使用したプライマーを、その予想生成物のサイズと共に、図４中に示す。各生成物の同一性を、先に記載したように（Sharkey et al, Mol. Endocrinol. (1992)）フローニング及び配列決定により確認した。検出された生成物が、汚染ゲノムDNAプライマーよりむしろcDNAの増幅から得られたことを確認するために、イントロン／エクソン境界を横切るように選んだ。また、10ナノグラムのゲノムDNAを、上記cDNAと同時にPCRに供して、ゲノムDNAから得られた予想サイズの生成物が無いことを確認した。
結果
RT-PCRの技術を、インビトロ受精により生産されたヒト胚から抽出した全RNAに適用した。胚を、適切な段階まで培養し、次に液体窒素中で急速冷凍した。保存された胚を解凍し、そして全RNAを抽出した。単一胚から抽出された全RNAから検出可能なRT-PCR産物を作り出すために、そのcDNAが、外部プライマー対、その後内部プライマー対を用いた２セットのPCR増幅に供されるところの入れ子状PCRプロトコールを使用した。プライマーは、公表されたcDNA配列に基づき、そして汚染性ゲノムDNAの増幅がcDNA産物から直ちに区別されることができるように、イントロン−エクソン境界を横切るようにデザインされた。
最初に、各胚からのcDNAを、首尾よいRNA単離及び逆転写を確認するためにヒスチジルtRNAシンテターゼ（Hist RS）のためのプライマーを用いてテストした。使用されたプライマーは、ゲノムDNAから400bpより大きな、そしてHist RS mRNAから得られて、cDNAから110bpより大きな弱い生成物を生じた。Hist RSについての転写物は、発達の全段階において胚からのmRNA内に、並びにポジティブ・コントロール（図３、それぞれ、レーンｐとｑ）として使用された、脱落膜及び絨毛癌セルラインBeWoにおいて、検出された。同一方法で、抽出され、そしてRT-PCRに供された胚培養上清の等容量中には、生成物は全く検出されず、これは、外来cDNA又はRNAによりその培養物が全く汚染されていないことを示している。
gp 130のためのプライマーを用いた類似のRT-PCR分析の例を、図３中に示す。cDNAのストックを、２つの別個の場合において各RNAサンプルから逆転写し、そしてそのPCR検定を、各cDNA株について２回繰り返した。これらの結果を図３中に示す。これは、移植前発達の間のgp 130の発現のパターンを示している。正しいサイズのPCR断片の同定を、クローン化されたPCR生成物の配列決定により確認した。新規サイズの生成物が見られた場合に、さらにクローン化、そして配列決定を行った。
gp 130について、予想される断片は、712bpである。しかしながら、桑実胚〜胚盤胞の転移の間に約600bpの新規のより小さな転写物が、検出された。この結果は、矛盾しないものであった。なぜなら、サンプルｊであって３つのプールされた胚盤胞から作られたcDNAから得られたものにおいては、両生成物が同時に検出されたからである。クローニング及び配列決定の間、このより小さな生成物は、そのトランスメンブラン・ドメインをコーディングするエクソンを除去する他のスプライシング事件のために引き起こされるようであった。この新規の転写物の予想配列を、図１中に示す。この新規のスプライシング・パターンはフレーム内終結コドンの前に45の新たなアミノ酸をもたらすフレームシフトをも含む。
討議
多くの成長因子は、培養された移植前哺乳類胚の発達に影響を及ぼすことが示されている（レビューのためには、Anderson, E. D., J. Cellular Biochem., 53: 280-287（1993）及びSchultz, G. A. and Hevner, S., Mutat, Res., 296: 17-31（1992）を参照のこと）。
しかしながら、移植前発達における成長因子レセプターの発現における種間の相違についてのよい証拠が存在する。例えば、EGF mRNAは、ブタ胚内で発現されるが、マウス移植前胚においてはいずれかの段階においても発見されていない（Vaughan et al, Development, 116: 663-669（1992）; Rapolee et al, Science, 241: 1823-1825（1988）; 及びWatson, A. J. et al, Biol. Reprod., 50: 725-733（1994））。それ故、ヒト移植前発達を制御する因子に興味をもつ研究者らに対するこれらの研究の有用性は、限定されている。さらに、このような研究において調査された特定の成長因子及びレセプターは、特別の基準により選ばれている。倫理的及び実際的な理由のために、このような研究は、ヒト胚を用いての使用には好適でない。それ故、我々は、単一のヒト移植前胚における成長因子及びレセプターmRNAsの発現のついてスクリーニングすることを我々に許容する入れ子状RT-PCR法を使用した。この方法は、他の種において数年前から広く使用されてきている。なぜなら、それは、その胚材料の使用において、信頼でき、感度が良く、そして経済的なものであるからである。
ヒスチジル−tRNAシンテターゼのためのプライマーを用いたRT-PCRは、cDNAが、各胚RNAサンプルから首尾よく調製されていたことを確認するためにcDNAサンプル上で使用された。このハウスキーピング遺伝子に特異的なcDNAを、単一の２細胞胚からさえも作られたcDNAサンプル中で首尾よく検出した。これは、この方法が、本試験のために十分に感度が良いものであったことを示している。
我々は、桑実胚〜胚盤胞の転移の間に、gp 130 PCR産物のサイズが約100bp程減少したことを発見した。このより小さな産物のスクリーニングは、それが、gp 130 mRNAの新規のスプライス変異体から得られることを示した。この新規のスプライス変異体は、そのトランスメンブラン・ドメインを欠き、そしてgp 130の新規の形態を作り出すと予想されるであろう。可溶性gp 130タンパク質が、最近、ヒト血清中で検出されており、そしてIL−６とLIFRの作用を拮抗することが示されている。これらのサイトカインが、それらの対応レセプターと会合するとき、可溶性gp 130は、この複合体に結合することができ、膜結合gp 130との会合を遮断する。この可能性は、後期胚盤胞段階における胞胚腔（blastocoel cavity）の内の新規gp 130の選択的発現が、線状細胞塊の分化の防止におけるLIFの効果を不活性化するであろうし、ICMの分化が進行せしめるということである。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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