(57)【要約】  耐熱性が向上した新たなイソアミラーゼ、及びその製造法の提供。  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるイソアミラーゼにおいて、Ｄ２６８Ｓ、Ａ２４１Ｔ及びＭ５７４Ｖから選ばれる１又は２以上のアミノ酸変異を有するイソアミラーゼ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるイソアミラーゼにおいて、Ｄ２６８Ｓ、Ａ２４１Ｔ及びＭ５７４Ｖから選ばれる１又は２以上のアミノ酸変異を有するイソアミラーゼ。
【請求項２】
前記配列同一性が９０％以上である請求項１記載のイソアミラーゼ。
【請求項３】
さらに、Ａ５５４Ｐ、Ｍ２７７Ｉ、Ａ５４９Ｐ及びＡ５８０Ｔから選ばれる１又は２以上のアミノ酸変異を有する請求項１又は２記載のイソアミラーゼ。
【請求項４】
さらに、Ａ５５４Ｐ、Ｍ２７７Ｉ、Ａ５４９Ｐ及びＡ５８０Ｔのアミノ酸変異を有する請求項１又は２記載のイソアミラーゼ。
【請求項５】
アミノ酸変異が、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ／Ａ２４１Ｔ、及びＡ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ／Ａ２４１Ｔ／Ｍ５７４Ｖから選ばれる変異を含む変異である請求項１〜４のいずれか１項記載のイソアミラーゼ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のイソアミラーゼをコードする遺伝子。
【請求項７】
請求項６記載の遺伝子を有する組み換えベクター。
【請求項８】
請求項７記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体。
【請求項９】
請求項８記載の形質転換体を培養して、該培養物からイソアミラーゼを採取することを特徴とするイソアミラーゼの製造法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項記載のイソアミラーゼを含有するデンプン糖化用酵素組成物。
【請求項１１】
さらに、β−アミラーゼ、α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼから選ばれる酵素を含有する請求項１０記載のデンプン糖化用酵素組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性が向上した変異イソアミラーゼ、及びその変異イソアミラーゼの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化工業において、デンプンやアミロペクチン中のα−１，６−グルコピラノシド結合を加水分解する酵素として、Klebsiella pneumoniaeなどが生産するプルラナーゼ及びイソアミラーゼが知られている。このうち、イソアミラーゼは、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン中のα−１，６−グルコピラノシド結合を加水分解する酵素であり、可逆的な反応が見られないため、他のアミラーゼやグルコアミラーゼなどを使用することで高純度のグルコースやマルトースが生産できることが知られている。イソアミラーゼ生産菌としては、Pseudomonas amyloderamosa（非特許文献１）などが報告されている。【０００３】
しかし、Pseudomonas amyloderamosaなどが生産するイソアミラーゼの至適温度は他のアミラーゼの至適温度よりも低く、産業的に使用するレベルの反応温度帯では併用が困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１７／２０４３１７号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｔａｒｃｈ(１９９６),４８：２９５−３００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような背景の下、本出願人は、イソアミラーゼのアミノ酸配列の一部を改変することによって耐熱性を向上できることを見出し、先に特許出願している（特許文献１）。耐熱性を向上するべく、新たな変異点を見い出すことが求められた。
従って、本発明の課題は、耐熱性の向上に寄与する別の変異点を見出し、新たなイソアミラーゼ、及びその製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、Pseudomonas amyloderamosaなどが生産するイソアミラーゼのアミノ酸配列のうち、後述する特定の位置のアミノ酸を他のアミノ酸に変異させることによって、耐熱性が一層向上した変異イソアミラーゼが得られることを見出し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１１］を提供するものである。【０００９】
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるイソアミラーゼにおいて、Ｄ２６８Ｓ、Ａ２４１Ｔ及びＭ５７４Ｖから選ばれる１又は２以上のアミノ酸変異を有するイソアミラーゼ。
［２］前記配列同一性が９０％以上である［１］記載のイソアミラーゼ。
［３］さらに、Ａ５５４Ｐ、Ｍ２７７Ｉ、Ａ５４９Ｐ及びＡ５８０Ｔから選ばれる１又は２以上のアミノ酸変異を有する［１］又は［２］記載のイソアミラーゼ。
［４］さらに、Ａ５５４Ｐ、Ｍ２７７Ｉ、Ａ５４９Ｐ及びＡ５８０Ｔのアミノ酸変異を有する［１］又は［２］記載のイソアミラーゼ。
［５］アミノ酸変異が、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ／Ａ２４１Ｔ、及びＡ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ／Ａ２４１Ｔ／Ｍ５７４Ｖから選ばれる変異を含む変異である［１］〜［４］のいずれか１記載のイソアミラーゼ。
［６］［１］〜［５］のいずれか１記載のイソアミラーゼをコードする遺伝子。
［７］［６］記載の遺伝子を有する組み換えベクター。
［８］［７］記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体。
［９］［８］記載の形質転換体を培養して、該培養物からイソアミラーゼを採取することを特徴とするイソアミラーゼの製造法。
［１０］［１］〜［５］のいずれか１記載のイソアミラーゼを含有するデンプン糖化用酵素組成物。
［１１］さらに、β−アミラーゼ、α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼから選ばれる酵素を含有する［１０］記載のデンプン糖化用酵素組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のイソアミラーゼは、ネイティブのイソアミラーゼと比べて耐熱性が２℃以上向上している（一重変異体）。本発明のイソアミラーゼは、この耐熱性を６℃以上向上させることもできる（五重変異体〜七重変異体）。そして、本発明のイソアミラーゼの至適温度は他の各種アミラーゼの至適温度と重複する。従って、本発明のイソアミラーゼは、各種アミラーゼと併用してデンプン等に作用させることにより、高純度のグルコースやマルトース等を工業的に有利に生産することができる。本発明において「併用」とは、本発明のイソアミラーゼと、それ以外の１種以上の酵素を混合した状態において、少なくとも２種以上の酵素が活性を示す状態にあることをいう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ネイティブ及び各変異体酵素の熱安定性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のイソアミラーゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるイソアミラーゼにおいて、Ｄ２６８Ｓ、Ａ２４１Ｔ及びＭ５７４Ｖから選ばれる１又は２以上のアミノ酸変異を有するイソアミラーゼである。
【００１３】
ここで、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼは、非特許文献１に記載された、Pseudomonas amyloderamosaが産生するイソアミラーゼである。このイソアミラーゼには、同一のアミノ酸配列を有する限り、Pseudomonas amyloderamosa由来でないイソアミラーゼが含まれる。また、同一アミノ酸配列を有する限り、ポリペプチドだけでなく、糖ペプチドも含まれる。なお、配列番号１は、成熟タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００１４】
配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されたイソアミラーゼにおける、アミノ酸残基の欠失、置換又は挿入の数は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼと同等の酵素活性を示すものであれば限定されないが、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がさらに好ましく、１〜８個がさらに好ましい。
また、当該欠失、置換又は挿入されたイソアミラーゼと配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性は、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９９％以上がさらに好ましい。このような配列の同一性パーセンテージは、基準配列を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開又は市販されているソフトウエアを用いて計算することができる。例として、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発社製）などを用いることができる。
【００１５】
本発明のイソアミラーゼは、Ｄ２６８Ｓ、Ａ２４１Ｔ及びＭ５７４Ｖから選ばれる１又は２以上のアミノ酸変異を有するが、耐熱性向上の観点から、さらにＡ５５４Ｐ、Ｍ２７７Ｉ、Ａ５４９Ｐ及びＡ５８０Ｔから選ばれる１又は２以上のアミノ酸変異を有するのが好ましい。本発明における好ましいアミノ酸変異は、Ｄ２６８Ｓ、Ａ２４１Ｔ及びＭ５７４Ｖからから選ばれる１又は２以上の変異と、Ａ５５４Ｐ、Ｍ２７７Ｉ、Ａ５４９Ｐ及びＡ５８０Ｔの４変異を含む５〜７重変異である。
【００１６】
具体的なアミノ酸変異としては、Ｄ２６８Ｓ、Ａ２４１Ｔ、Ｍ５７４Ｖ、Ｄ２６８Ｓ／Ａ２４１Ｔ、Ｄ２６８Ｓ／Ｍ５７４Ｖ、Ａ２４１Ｔ／Ｍ５７４Ｖ、Ｄ２６８Ｓ／Ａ２４１Ｔ／Ｍ５７４Ｖ、Ｄ２６８Ｓ／Ａ５５４Ｐ、Ｄ２６８Ｓ／Ｍ２７７Ｉ、Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ、Ｄ２６８Ｓ／Ａ５８０Ｔ、Ａ２４１Ｔ／Ａ５５４Ｐ、Ａ２４１Ｔ／Ｍ２７７Ｉ、Ａ２４１Ｔ／Ａ５４９Ｐ、Ａ２４１Ｔ／Ａ５８０Ｔ、Ｍ５７４Ｖ／Ａ５５４Ｐ、Ｍ５７４Ｖ／Ｍ２７７Ｉ、Ｍ５７４Ｖ／Ａ５４９Ｐ、Ｍ５７４Ｖ／Ａ５８０Ｔ、Ｄ２６８Ｓ／Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ、Ｄ２６８Ｓ／Ａ５５４Ｐ／Ａ５４９Ｐ、Ｄ２６８Ｓ／Ａ５５４Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ｄ２６８Ｓ／Ｍ２７７Ｉ／Ａ５４９Ｐ、Ｄ２６８Ｓ／Ｍ２７７Ｉ／Ａ５８０Ｔ、Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ａ２４１Ｔ／Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ、Ａ２４１Ｔ／Ａ５５４Ｐ／Ａ５４９Ｐ、Ａ２４１Ｔ／Ａ５５４Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ａ２４１Ｔ／Ｍ２７７Ｉ／Ａ５４９Ｐ、Ａ２４１Ｔ／Ｍ２７７Ｉ／Ａ５８０Ｔ、Ａ２４１Ｔ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ｍ５７４Ｖ／Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ、Ｍ５７４Ｖ／Ａ５５４Ｐ／Ａ５４９Ｐ、Ｍ５７４Ｖ／Ａ５５４Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ｍ５７４Ｖ／Ｍ２７７Ｉ／Ａ５４９Ｐ、Ｍ５７４Ｖ／Ｍ２７７Ｉ／Ａ５８０Ｔ、Ｍ５７４Ｖ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ｄ２６８Ｓ／Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ａ５４９Ｐ、Ｄ２６８Ｓ／Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ａ５８０Ｔ、Ｄ２６８Ｓ／Ａ５５４Ｐ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ｄ２６８Ｓ／Ｍ２７７Ｉ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ａ２４１Ｔ／Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ａ５４９Ｐ、Ａ２４１Ｔ／Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ａ５８０Ｔ、Ａ２４１Ｔ／Ａ５５４Ｐ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ａ２４１Ｔ／Ｍ２７７Ｉ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ｍ５７４Ｖ／Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ａ５４９Ｐ、Ｍ５７４Ｖ／Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ａ５８０Ｔ、Ｍ５７４Ｖ／Ａ５５４Ｐ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ｍ５７４Ｖ／Ｍ２７７Ｉ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ／Ａ２４１Ｔ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ／Ｍ５７４Ｖ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ／Ａ２４１Ｔ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ／Ｍ５７４Ｖ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ／Ａ２４１Ｔ／Ｍ５７４Ｖ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ／Ａ２４１Ｔ／Ｍ５７４Ｖ等が挙げられる。
さらに好ましいアミノ酸変異としては、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ／Ａ２４１Ｔ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ／Ａ２４１Ｔ／Ｍ５７４Ｖが挙げられる。
【００１７】
本発明の変異イソアミラーゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるイソアミラーゼにおいて、Ｄ２６８Ｓ、Ａ２４１Ｔ及びＭ５７４Ｖから選ばれる１又は２以上をアミノ酸変異することにより構築した遺伝子を用いて製造することができる。
【００１８】
本発明の変異イソアミラーゼを製造するための遺伝子は、前記の変異イソアミラーゼをコードする塩基配列を有する遺伝子であり、例えば前記の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子において、置換すべきアミノ酸配列をコードする塩基配列を、所望のアミノ酸残基をコードする塩基に置換することにより構築することができる。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば適切に設計されたプライマーを用いるＰＣＲによって行うことができる。あるいは、改変型のアミノ酸配列をコードする遺伝子を全合成してもよい。
【００１９】
このようにして得た遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、これを適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分野において知られている。変異イソアミラーゼ遺伝子を組み込むための発現ベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられ、例えば大腸菌用としてはｐＥＴ−１４ｂ、ｐＢＲ３２２等が挙げられる。枯草菌用としては、ｐＵＢ１１０等が挙げられる。糸状菌用としては、ｐＰＴＲＩ等が挙げられる。また、酵母用としては、ｐＲＳ４０３等が挙げられる。
【００２０】
得られた組み換えプラスミドは、大腸菌、枯草菌、カビ、酵母、放線菌、酢酸菌、シュードモナス属菌等の微生物に形質転換し、当該形質転換体を培養すれば、本発明変異イソアミラーゼが得られる。当該形質転換体は、変異イソアミラーゼ遺伝子をプラスミドのまま保持しても良いし、ゲノム内に取り込んでも良い。
【００２１】
本発明のイソアミラーゼは、Pseudomonas amyloderamosaなどが生産するイソアミラーゼに比べて耐熱性が２℃以上向上しており、かつ至適ｐＨ、イソアミラーゼ活性等はPseudomonas amyloderamosaなどが生産するイソアミラーゼと同等である。特に、本発明のイソアミラーゼは、この耐熱性を６℃以上向上させることも可能である（五重変異体〜七重変異体）。従って、デンプンに、β−アミラーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどから選ばれる酵素と、本発明イソアミラーゼとを作用させれば、高純度のグルコースやマルトースが容易に得られる。ここで、β−アミラーゼとしては、ＧＯＤＯ−ＧＢＡ２（合同酒精株式会社）、オプチマルトＢＢＡ（ダニスコジャパン株式会社）、β−アミラーゼＬ／Ｒ（ナガセケムテックス株式会社）、ハイマルトシンＧＬ（エイチビィアイ株式会社）等を用いることができる。また、α−アミラーゼとしては、例えば、クライスターゼＴ１０（大和化成株式会社）を用いることができる。グルコアミラーゼとしては、例えば、グルクザイム（天野エンザイム株式会社）、ＧＯＤＯ−ＡＮＧＨ（合同酒精株式会社）を用いることができる。
【００２２】
本発明のイソアミラーゼは、糖化用のイソアミラーゼとして使用することが好ましく、デンプン糖化用のイソアミラーゼとして使用することがさらに好ましい。
本発明のイソアミラーゼは、必要により他の１種以上の酵素と混合したデンプン糖化用酵素組成物とすることも好ましい。他の１種以上の酵素は、上述したβ−アミラーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼから選択することができる。
【００２３】
反応は、例えば、アミラーゼ等のデンプン糖化酵素に本発明のイソアミラーゼを添加し、当該デンプン糖化酵素と当該イソアミラーゼが作用するｐＨ、温度条件にて混合撹拌することにより行なわれる。本発明方法によれば、高純度のグルコースやマルトースを工業的に有利に製造することができる。
【実施例】
【００２４】
次に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。【００２５】
実施例１（イソアミラーゼの部位特異的変異導入）
Pseudomonas amyloderamosaゲノムを鋳型としてプライマーＰＳＴＰＩＡ−Ｆ（AAACTGCAGATGAAGTGCCCAAAGATTCTC（配列番号２））及びＨＩＮＤＰＩＡ−Ｒ（CCCAAGCTTCTACTTGGAGATCAACAGCAG（配列番号３））を用いて耐酸性イソアミラーゼ遺伝子配列を含む約２．３ｋｂの断片を取得した。この断片を制限酵素Ｐｓｔ  Ｉ及びＨｉｎｄ  IIIで消化し、ｐＨＳＧ３９８（タカラバイオ株式会社）を制限酵素Ｐｓｔ  Ｉ及びＨｉｎｄ  IIIで消化した約２．２ｋｂの断片と連結することにより、ｐ−ＰＩを取得した。ネイティブの耐酸性イソアミラーゼの発現プラスミドであるプラスミドｐ−ＰＩに部位特異的変異導入を行い、一重変異体（Ｄ２６８Ｓ）発現プラスミドｐ−ＰＩＤ２６８Ｓを取得した。同様に一重変異体（Ａ２４１Ｔ）発現プラスミドｐ−ＰＩＡ２４１Ｔ、一重変異体（Ｍ５７４Ｖ）発現プラスミドｐ−ＰＩＭ５７４Ｖ、五重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ）発現プラスミドｐ−ＰＩ５Ｍを取得した。また、ｐ−ＰＩ５Ｍに部位特異的変異導入を行い、最適化  五重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ）発現プラスミドｐ−ＰＩ５Ｍｓ、六重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ／Ａ２４１Ｔ）発現プラスミドｐ−ＰＩ６Ｍ、七重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ／Ａ２４１Ｔ／Ｍ５７４Ｖ）発現プラスミドｐ−ＰＩ７Ｍを取得した。【００２６】
実施例２（酵素の生成）
ネイティブ耐酸性イソアミラーゼ発現プラスミドｐ−ＰＩ、一重変異体（Ｄ２６８Ｓ）発現プラスミドｐ−ＰＩＤ２６８Ｓ、一重変異体（Ａ２４１Ｔ）発現プラスミドｐ−ＰＩＡ２４１Ｔ、一重変異体（Ｍ５７４Ｖ）発現プラスミドｐ−ＰＩＭ５７４Ｖ、五重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ）発現プラスミドｐ−ＰＩ５Ｍ、最適化  五重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ）発現プラスミドｐ−ＰＩ５Ｍｓ、六重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ／Ａ２４１Ｔ）発現プラスミドｐ−ＰＩ６Ｍ、七重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ／Ａ２４１Ｔ／Ｍ５７４Ｖ）発現プラスミドｐ−ＰＩ７Ｍにより大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、それぞれのイソアミラーゼを生産する大腸菌株を取得した。これらの大腸菌を３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地（酵母エキス  ０．５％、トリプトン１．０％、塩化ナトリウム  ０．５％、ＩＰＴＧ  ０．１ｍＭ  ｐＨ７．２）で、３０℃３日培養し、培養液１Ｌを得た。超音波により菌体を破砕後、遠心分離（１０，０００ｇ、１０分間）を行い、上清をＵＦ濃縮（旭化成社製  ＡＩＰモジュール）により、１，０００Ｕ／ｍＬとなるように濃縮した。これらを０．２μｍのポアサイズの膜で除菌することにより、ネイティブ耐酸性イソアミラーゼ、一重変異体（Ｄ２６８Ｓ）イソアミラーゼ、一重変異体（Ａ２４１Ｔ）イソアミラーゼ、一重変異体（Ｍ５７４Ｖ）イソアミラーゼ、五重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ）イソアミラーゼ、最適化  五重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ）イソアミラーゼ、六重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ／Ａ２４１Ｔ）イソアミラーゼ、七重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ／Ａ２４１Ｔ／Ｍ５７４Ｖ）イソアミラーゼの酵素溶液とした。【００２７】
実施例３（各変異体の熱安定性向上）
実施例２で調製した各酵素溶液を４０℃、５０℃、５５℃、５７．５℃、６０℃、６２．５℃、６５℃に１０分間保ったのちに氷冷し、残存活性を測定した。各温度における残存活性のプロットより作成された近似式を用いて残存活性が５０％になる温度を算出し、この温度をネイティブ耐酸性イソアミラーゼと比較した場合に、増加する度合いを耐熱化度とした。七重変異体のアミノ酸配列を配列番号４に示す。【００２８】
＜活性測定方法＞
イソアミラーゼの活性測定法は、以下のとおりである。
０．５％ワキシーコーンスターチ溶液０．３５ｍＬに、０．５Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）０．１ｍＬを混合し、適時希釈した酵素液を０．１ｍＬ加え、４５℃で１５分間反応させる。その後、０．１Ｎ  ＨＣｌにて５倍希釈したヨード溶液（０．０５Ｍヨウ素を含む０．５Ｍヨウ化カリウム溶液）０．５ｍＬを加えて酵素反応を止め、１０ｍＬの水を加えて十分に撹拌した後、分光光度計を用いて６１０ｎｍで測定する。酵素活性の単位は、上記条件下で１分間に０．０１吸光度を増加する酵素量を１単位とした。
その結果、図１及び表１に示すように、一重変異体（Ｄ２６８Ｓ）で約２．９℃、一重変異体（Ａ２４１Ｔ）で約２．１℃、一重変異体（Ｍ５７４Ｖ）で約３．４℃、五重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ）で約６．０℃、最適化五重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ）で約６．８℃、六重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ／Ａ２４１Ｔ）で約７．１℃、七重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ｓ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ／Ａ２４１Ｔ／Ｍ５７４Ｖ）で約８．２℃の耐熱化度の向上が確認された。【００２９】
実施例４（デンプンの糖化）
デンプンの糖化として、還元糖遊離試験を行った。１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶性デンプンを３０％（重量/重量）となるように加温溶解し、（１）０．０５ｍｇ/ｍＬに溶解したグルコアミラーゼ（和光純薬株式会社製）を３０％溶性デンプン１ｇあたり２０ｍｇ及び五重変異体イソアミラーゼを３０％溶性デンプン１ｇあたり１２５Ｕ添加したもの、（２）グルコアミラーゼを３０％溶性デンプン１ｇあたり２０ｍｇ及び六重変異体イソアミラーゼを３０％溶性デンプン１ｇあたり１２５Ｕ添加したもの、（３）グルコアミラーゼを３０％溶性デンプン１ｇあたり２０ｍｇ及び七重変異体イソアミラーゼを３０％溶性デンプン１ｇあたり１２５Ｕ添加したものそれぞれを５５℃、６０℃、６２．５℃で１６時間反応させた。
１００℃、５分間加熱し反応を停止させ、生成した還元糖量について、以下に示すＤＮＳ法にて測定した。【００３０】
＜測定方法（ＤＮＳ法）＞
還元糖量の測定法は、以下のとおりである。
ＤＮＳ（３，５−ジニトロサリチル酸）溶液１．５ｍＬに、適時希釈したサンプル液を０．５ｍＬ加えた後に撹拌し、沸騰水中で５分間反応させる。水冷後、４ｍＬの水を加えて十分に撹拌した後、分光光度計を用いて５４０ｎｍで測定する。還元糖量はグルコース溶液を用いて作製した検量線より算出した。ＤＮＳ溶液は、１％ＤＮＳ溶液４４００ｍＬに４．５％水酸化ナトリウム溶液を１５００ｍＬとロッセル塩１２７５ｇ溶解した後、別に調製したフェノール溶液（１％フェノール、２．４４％水酸化ナトリウム）を３４５ｍＬと、炭酸水素ナトリウムを３４．５ｇ加えて撹拌溶解し、２日間暗所保存後、ろ紙にて濾過したものを使用した。
その結果を表２に示した。五重変異体イソアミラーゼを用いた５５℃反応において得られた還元糖量を１００％としたとき、六重変異体イソアミラーゼを用いた際は１０２％、七重変異体イソアミラーゼを用いた際は１０２％に向上した。また、６０℃反応においては、五重変異体イソアミラーゼでは１００％と変化がないのに対して、六重変異体イソアミラーゼを用いた際は１０２％、七重変異体イソアミラーゼでは１０５％に向上した。さらに、６２．５℃反応においては、五重変異体イソアミラーゼでは９８％に低下したのに対して、六重変異体イソアミラーゼを用いた際は９９％、七重変異体イソアミラーゼでは９９％であった。したがって、五重変異体イソアミラーゼに比べて、六重変異体又は七重変異体イソアミラーゼを使用した場合の方が明らかに還元糖生成量の向上が認められた。さらに、５５℃から６０℃の温度上昇に伴って五重変異体イソアミラーゼは枝切り効果に変化が無いのに対し、六重変異体又は七重変異体イソアミラーゼは枝切り効果が向上し、歩留りの向上が認められたことから、変異による熱安定性効果が確認された。【００３１】
【表１】
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【００３２】
【表２】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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