(57)【要約】  本明細書において、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤、ＰＵＲＡの発現の抑制剤、およびＹＢ１の発現の抑制剤の少なくとも１つを含むがん治療剤が提供される。
2019189772.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤、ＰＵＲＡの発現の抑制剤、およびＹＢ１の発現の抑制剤の少なくとも１つを含むがん治療剤。
【請求項２】
ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤を含む、請求項１に記載のがん治療剤。
【請求項３】
ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤が、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである、請求項２に記載のがん治療剤。
【請求項４】
ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤がｓｉＲＮＡである、請求項３に記載のがん治療剤。
【請求項５】
ＰＵＲＡの発現の抑制剤およびＹＢ１の発現の抑制剤をさらに含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載のがん治療剤。
【請求項６】
がんが、胃がん、乳がん、肝がん、大腸がん、または膵がんである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のがん治療剤。
【請求項７】
ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを発現するベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを導入した細胞。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のがん治療剤、請求項７に記載のベクター、または、請求項８に記載の細胞を含む、がんを治療するための医薬組成物。
【請求項１０】
ヒト対象ががんを発症するか否かを予測するための指標として、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量を測定する方法であって、
（ａ）ヒト対象由来の試験サンプル中のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量を決定すること、
（ｂ）ヒト健常者由来の対照サンプル中のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量を決定すること、および
（ｃ）ヒト対象由来の試験サンプル中のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量が、ヒト健常者由来の対照サンプル中のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量よりも２倍を超える場合に、ヒト対象ががんを発症すると予測すること、
を含む、方法。
【請求項１１】
（ｃ）において、ヒト対象由来の試験サンプル中のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量が、ヒト健常者由来の対照サンプル中のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量よりも３倍を超える場合に、ヒト対象ががんを発症すると予測する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
がんが、胃がん、乳がん、肝がん、大腸がん、または膵がんである、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
ヒト対象が前がん状態である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、長鎖ノンコーディングＲＮＡを標的とするがん治療剤およびがん診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｏｎｇ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ：ｌｎｃＲＮＡ）は、タンパク質をコードしない２００塩基以上の長さを有するＲＮＡである。ｌｎｃＲＮＡは、細胞増殖、アポトーシス、細胞分化や疾患（がん、心疾患、神経変性疾患など）などの様々な生命現象に関与している。ｌｎｃＲＮＡの発現様式には組織特異性や疾患特異性が見られることが知られている。
ｌｎｃＲＮＡは臓器あるいは疾患特異的な発現パターンを示し、がんとの関わりも近年注目されている。１万種類以上存在するｌｎｃＲＮＡの大部分は機能が未だ不明であるが、発がんにおけるｌｎｃＲＮＡの機能を明らかにすることにより、新たな診断・治療法の開発につながることが期待されている。しかしながら、ｌｎｃＲＮＡを標的にした臨床への応用例は、現在のところ存在しない。【０００３】
特許文献１には、ＴＭ４ＳＦ１を白血病幹細胞マーカー遺伝子として使用する、急性骨髄性白血病の初発または再発を予測するための方法が記載されているが、ＴＭ４ＳＦ１はmRNAであり、長鎖noncoding RNAであるＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１は記載されておらず、これらの配列も異なるものである。
非特許文献１には、慢性胃炎および胃癌に関連する長鎖noncoding RNAの同定について記載されているが、その具体的な遺伝子およびその機能については何ら記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１５−２３１３７５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】北嶋洋志、P-1225慢性胃炎および胃癌に関連する長鎖noncoding RNAの同定、第75回日本癌学会学術総会、2016年10月6日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、発がんにおけるｌｎｃＲＮＡの機能を明らかにすることにより、がんの新たな診断・治療法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を重ねる中で、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡが、胃がんの前がん病変の段階から発現していること、そして、この発現を抑制することにより、細胞増殖抑制効果を発揮することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、以下に関するものである。
（１）ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤、ＰＵＲＡの発現の抑制剤、およびＹＢ１の発現の抑制剤の少なくとも１つを含むがん治療剤。
（２）ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤を含む、（１）に記載のがん治療剤。
（３）ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤が、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである、（２）に記載のがん治療剤。
（４）ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤がｓｉＲＮＡである、（３）に記載のがん治療剤。
（５）ＰＵＲＡの発現の抑制剤およびＹＢ１の発現の抑制剤をさらに含む、（２）〜（４）のいずれかに記載のがん治療剤。
（６）がんが、胃がん、乳がん、肝がん、大腸がん、または膵がんである、（１）〜（５）のいずれかに記載のがん治療剤。
（７）ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを発現するベクター。
（８）（７）に記載のベクターを導入した細胞。
（９）（１）〜（６）のいずれかに記載のがん治療剤、（７）に記載のベクター、または、（８）に記載の細胞を含む、がんを治療するための医薬組成物。
（１０）ヒト対象ががんを発症するか否かを予測するための指標として、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量を測定する方法であって、
（ａ）ヒト対象由来の試験サンプル中のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量を決定すること、
（ｂ）ヒト健常者由来の対照サンプル中のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量を決定すること、および
（ｃ）ヒト対象由来の試験サンプル中のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量が、ヒト健常者由来の対照サンプル中のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量よりも２倍を超える場合に、ヒト対象ががんを発症すると予測すること、
を含む、方法。
（１１）（ｃ）において、ヒト対象由来の試験サンプル中のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量が、ヒト健常者由来の対照サンプル中のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量よりも３倍を超える場合に、ヒト対象ががんを発症すると予測する、（１０）に記載の方法。
（１２）がんが、胃がん、乳がん、肝がん、大腸がん、または膵がんである、（１０）または（１１）に記載の方法。
（１３）ヒト対象が前がん状態である、（１０）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のがん治療剤および医薬組成物は、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現を抑制することにより、胃がん、乳がん、肝がん、大腸がん、および膵がんなどのがんにおいて、細胞増殖抑制効果を発揮することができる。
本発明の方法により、前がん段階において、がん発症の可能性を予測することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１の左図は、健常者および胃がん患者由来の背景粘膜のヒストン修飾（H3K4me3）プロファイル（ChIP-Seq法）を示す。図１の中央図は、遺伝子アノテーションを示す。H3K4me3プロファイルで検出された３５，３８７個のピークのうち、１５１２個が上方制御され、３１４０個が下方制御され、１１３９８個は不変であった。図１の右図は、H3K4me3による転写開始点の活性領域の一例を示す。ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１は、がん患者において活性化され、健常者で活性化されていなかった。
【図２Ａ】図２の左図は、各胃がん細胞株から得たtotal RNAについて行った定量ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１に対応するTCONS_00006264が、正常胃粘膜細胞と比較して、胃がん細胞（MKN45、HSC45、JRST）において多く発現されていた。図２の右上図は、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１と、そのｍＲＮＡであるＴＭ４ＳＦ１とのゲノム上での位置関係を示す。図２の右下図は、各胃がん細胞株におけるＴＭ４ＳＦ１とＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現解析の結果を示す。ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１（右側）が、ごく少数の胃がん細胞株を除き、ＴＭ４ＳＦ１（左側）よりも多く発現していた。縦軸は、正常な胃と比較した胃がん細胞の相対的な発現を示し、横軸は、胃がん細胞の名称を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、各胃がんステージのがん組織（臨床検体）から得たtotal RNAについて行った定量ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。図２Ｂの左図は、各胃がんステージのがん組織（臨床検体）と健常者の正常胃粘膜におけるＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現を示し、右図は、各胃がんステージの胃がん患者のがん部と非がん部におけるＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現を示す。
【図３】図３は、ＭＴＴアッセイを用いた、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１（ｌｎｃＲＮＡ）のノックダウン（ＫＤ）による細胞増殖能への影響を示す。左図が、胃がん細胞株HSC45、中央図がMKN45、右図がSNU1を示す。各図において、縦軸は、細胞生存率（OD450）を示し、横軸は、ノックダウン後の日数を示す。
【００１１】
【図４】図４は、トランスフェクションによりＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１をノックダウンした細胞についての細胞遊走アッセイ（左図）およびマトリゲル浸潤アッセイ（右図）の結果を示す。左図の縦軸は、遊走細胞（％）を示し、横軸は、ノックダウンに使用したＲＮＡの種類を示す。右図の縦軸は、浸潤細胞（％）を示し、横軸は、ノックダウンに使用したＲＮＡの種類を示す。
【図５】図５は、マウス異種移植におけるＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１過剰発現による腫瘍形成能の評価を示す。左上図は、SNU638安定細胞株（４×１０６細胞）を移植後３１日目に取り出した腫瘍を示す（写真）。右上図の縦軸は、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１過剰発現株およびコントロール株（ＧＦＰ）の腫瘍体積(mm3)を示し、横軸は、細胞株移植後の日数を示す。左下図は、SNU638安定細胞株（１×１０７細胞）を移植後３０日目に取り出した腫瘍を示す（写真）。右下図の縦軸は、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１過剰発現株およびコントロール株（ＧＦＰ）の腫瘍体積(mm3)を示し、横軸は、細胞株移植後の日数を示す。
【図６】図６は、マウス異種移植におけるＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１ノックダウン（ＫＤ）による腫瘍抑制効果を示す。左図は、HSC45細胞株（２．７×１０６細胞）を移植後３０日目に取り出した腫瘍を示す（写真）。右図の縦軸は、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１ノックダウン細胞株および非ノックダウン株の腫瘍体積(mm3)を示し、横軸は、細胞株移植後の日数を示す。
【図７】図７は、ＰＵＲＡまたはＹＢ１に対するウエスタンブロッティングを示す。ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１とＰＵＲＡおよびＹＢ１は、複合体の形成により、バンド強度が増大し（左図）、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の非存在下では、バンドが消滅した（右図）。
【図８】図８は、ＰＵＲＡまたはＹＢ１のノックダウンによる細胞増殖能への影響を示す。左図の縦軸は、正常細胞と比較した細胞生存率を示し、横軸は、ノックダウン後の日数を示す。
【００１２】
【図９】図９は、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１をノックダウンした胃がん細胞株HSC45から抽出したＲＮＡのｃＲＮＡを合成後のマイクロアレイ実験の結果を示す。
【図１０】図１０は、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１のノックダウンにより、免疫応答遺伝子の発現が抑制されることを示す。縦軸は、胃がん細胞（対照ｓｉＲＮＡ投与）と比較した胃がん細胞（ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１  ｓｉＲＮＡ投与）の相対的な発現を示し、横軸は、免疫応答遺伝子の名称を示す。
【図１１】図１１は、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の過剰発現により、免疫応答遺伝子の発現が誘導されることを示す。縦軸は、胃がん細胞（ＧＦＰ発現）と比較した胃がん細胞（ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１過剰発現）の相対的な発現を示し、横軸は、免疫応答遺伝子の名称を示す。
【図１２】図１２は、ＰＵＲＡのノックダウンにより、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１過剰発現細胞株において、免疫応答遺伝子の発現が抑制されることを示す。縦軸は、胃がん細胞（対照ｓｉＲＮＡ投与）と比較した胃がん細胞（ＰＵＲＡ  ｓｉＲＮＡ投与）の相対的な発現を示し、横軸は、免疫応答遺伝子の名称を示す。
【００１３】
【図１３】図１３は、各がん細胞株におけるＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現解析の結果を示す。ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１が、各種乳がん細胞（左図）、各種肝がん細胞（中央図）、各種大腸がん細胞（右図）において、多く発現していた。縦軸は、アクチンと比較したＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の相対的な発現を示し、横軸は、各種がん細胞の名称を示す。
【図１４】図１４の左図は、乳がん細胞株において、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１のノックダウンにより、２日後に、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現が抑制されることを示す。縦軸は、乳がん細胞（対照ｓｉＲＮＡ投与）と比較した乳がん細胞（ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１  ｓｉＲＮＡ投与）の相対的な発現を示し、横軸は、乳がん細胞株の名称を示す。図１４の右図は、ＭＴＴアッセイを用いた、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１（ｌｎｃＲＮＡ）のノックダウン（ＫＤ）による細胞増殖能への影響を示す。右上図が、乳がんSK-BR-3細胞株、右下図がMDA-MB-435S細胞株を示す。各図において、縦軸は、細胞生存率（OD450）を示し、横軸は、ノックダウン後の日数を示す。
【００１４】
【図１５】図１５の左図は、肝がん細胞において、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１のノックダウンにより、２日後に、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現が抑制されることを示す。縦軸は、肝がん細胞（対照ｓｉＲＮＡ投与）と比較した肝がん細胞（ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１  ｓｉＲＮＡ投与）の相対的な発現を示し、横軸は、肝がん細胞株の名称を示す。図１５の右図は、ＭＴＴアッセイを用いた、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１（ｌｎｃＲＮＡ）のノックダウン（ＫＤ）による細胞増殖能への影響を示す。右上図が、肝がんHuh7細胞株、右下図がHT17細胞株を示す。各図において、縦軸は、細胞生存率（OD450）を示し、横軸は、ノックダウン後の日数を示す。
【図１６】図１６の左図は、肝がん細胞において、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１のノックダウンにより、２日後に、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現が抑制されることを示す。縦軸は、肝がん細胞（対照ｓｉＲＮＡ投与）と比較した肝がん細胞（ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１  ｓｉＲＮＡ投与）の相対的な発現を示し、横軸は、肝がん細胞株の名称を示す。図１６の右上図は、ＭＴＴアッセイを用いた、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１（ｌｎｃＲＮＡ）のノックダウン（ＫＤ）による細胞増殖能への影響を示す。右上図は、肝がんHLF細胞株を使用した。縦軸は、細胞生存率（OD450）を示し、横軸は、ノックダウン後の日数を示す。図１６の右下図は、トランスフェクションによりＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１をノックダウンした細胞についての細胞遊走アッセイ（左図）およびマトリゲル浸潤アッセイ（右図）の結果を示す。左図の縦軸は、遊走細胞（％）を示し、横軸は、ノックダウンに使用したＲＮＡの種類を示す。右図の縦軸は、浸潤細胞（％）を示し、横軸は、ノックダウンに使用したＲＮＡの種類を示す。
【図１７】図１７の左図は、膵がん細胞において、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１のノックダウンにより、２日後に、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現が抑制されることを示す。縦軸は、膵がん細胞（対照ｓｉＲＮＡ投与）と比較した膵がん細胞（ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１  ｓｉＲＮＡ投与）の相対的な発現を示し、横軸は、膵がん細胞株の名称を示す。図１７の右図は、ＭＴＴアッセイを用いた、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１（ｌｎｃＲＮＡ）のノックダウン（ＫＤ）による細胞増殖能への影響を示す。縦軸は、細胞生存率（OD450）を示し、横軸は、ノックダウン後の日数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現、ＰＵＲＡの発現、およびＹＢ１の発現の少なくとも１つを抑制するための治療剤、例えば、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現を抑制するための治療剤、組成物、方法およびキット、ならびにＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量を測定することを含むがんの検出方法が提供される。
本治療剤、組成物、方法およびキットは、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡ、例えば配列番号１によって例示されるＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡを結合する核酸分子（例えば短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖（double-stranded）ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））を使用することを含んでいてもよい。
また、本明細書において、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の高発現に関連する疾患、状態または障害、例えば細胞増殖疾患、腫瘍、がんなどを治療および／または予防するための治療剤、組成物、方法およびキットも提供される。
さらに、本明細書において、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の高発現に関連する疾患、状態または障害、例えば細胞増殖疾患、腫瘍、がんなどを診断するための方法も提供される。
【００１６】
１．本発明のがん治療剤
本発明の一側面は、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤、ＰＵＲＡの発現の抑制剤、およびＹＢ１の発現の抑制剤の少なくとも１つを含むがん治療剤、例えば、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤を含むがん治療剤に関する。
本発明のがん治療剤は、例えば、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤を含む。長鎖ノンコーディングＲＮＡのＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１のアノテーションデータは、Human Body Map(Broad Institute)から取得することができる。本明細書において、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡは、配列番号１によって示される。
【００１７】
本発明において、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡは、例えば、ヒト由来であり、配列番号１で示される塩基配列またはこの各塩基配列において１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入を含む塩基配列、或いは、上記の各塩基配列と７０％以上、８０％以上又は９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上もしくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であってもよい。
本明細書において、「数個」とは、２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個の塩基数をいう。また、配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴなどの公知のアルゴリズムを使用して決定することができる。
【００１８】
本発明において、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤は、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）作用を有する、ｓｉＲＮＡ（例えば、5’- CCAUCAGUUGGGAGUUGAAGA -3’（配列番号２）または5’-GCCAAGUGUCCGAGAUGCAAC-3’（配列番号３））若しくはその前駆体ＲＮＡ、又はそれらの修飾ＲＮＡ、或いは、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１遺伝子の転写体ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを包含する。また、本発明において、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤は、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどであってもよい。ベクターは、アンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡ、該アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ若しくは該アンチセンスＤＮＡを含んでいてもよい。
【００１９】
ｓｉＲＮＡは、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１遺伝子の転写体ＲＮＡの一部に相補的な１８〜２５ヌクレオチド、好ましくは２０〜２４ヌクレオチド、さらに好ましくは２１〜２３ヌクレオチドからなる、かつＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）作用を有する、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡであってもよい。センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの各３'末端には、２〜５ヌクレオチド、好ましくは２ヌクレオチドの突出末端を有していてもよい。
本発明において、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１遺伝子の発現の抑制剤は、例えば、センス鎖と、アンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡの組み合わせであってもよく、例えば、センス鎖の5’-CCAUCAGUUGGGAGUUGAAGA-3’（配列番号２）とアンチセンス鎖の5’-UUCAACUCCCAACUGAUGGAA-3’（配列番号４）の組合せ、または、センス鎖の5’-GCCAAGUGUCCGAGAUGCAAC-3’（配列番号３）とアンチセンス鎖の5’-UGCAUCUCGGACACUUGGCAG-3’（配列番号５）の組合せが好ましい。
【００２０】
本発明の一態様において、本発明のがん治療剤は、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤を含まずに、ＰＵＲＡ（purine-rich element binding protein A）の発現の抑制剤およびＹＢ１（Y box binding protein）の発現の抑制剤の両方を含んでいてもよいし、これらのいずれかを単独で含んでいてもよい。
本発明の別の態様において、本発明のがん治療剤は、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤に加えて、ＰＵＲＡの発現の抑制剤およびＹＢ１の発現の抑制剤を含んでいてもよい。
ＰＵＲＡ、ＰＵＲＢ、ＹＢ１の複合体は転写調節に関与することが報告されている(J Biol Chem, 2008; Mol Cell Biol, 2007)。ＰＵＲＡの発現の抑制剤およびＹＢ１の発現の抑制剤は、それぞれ、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）作用を有する、ｓｉＲＮＡ（例えば、PURAに対するsiRNAの5’-CCACCUAUCGCAACUCCAUTT-3’（配列番号６）または5’-GCUACUGCAGGGUGAGGAATT-3’（配列番号７）、YB１に対するsiRNAの5’-CCUAUGGGCGUCGACCACATT-3’（配列番号１０）または 5’-GUUCCAGUUCAAGGCAGUATT-3’（配列番号１１））若しくはその前駆体ＲＮＡ、又はそれらの修飾ＲＮＡ、或いは、ＰＵＲＡおよびＹＢ１遺伝子の転写体ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを包含する。また、本発明において、ＰＵＲＡまたはＹＢ１の発現の抑制剤は、例えば、ｓｈＲＮＡであってもよい。ベクターは、アンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡ、該アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ若しくは該アンチセンスＤＮＡを含んでいてもよい。 
【００２１】
ＰＵＲＡおよびＹＢ１に対するｓｉＲＮＡは、ＰＵＲＡおよびＹＢ１遺伝子の転写体ＲＮＡの一部に相補的な１８〜２５ヌクレオチド、好ましくは２０〜２４ヌクレオチド、さらに好ましくは２１〜２３ヌクレオチドからなる、かつＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）作用を有する、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡであってもよい。センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの各３'末端には、２〜５ヌクレオチド、好ましくは２ヌクレオチドの突出末端を有していてもよい。
本発明において、ＰＵＲＡおよびＹＢ１遺伝子の発現の抑制剤は、例えば、センス鎖と、アンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡの組合せであってもよく、例えば、ＰＵＲＡに対するsiRNAのセンス鎖の5’-CCACCUAUCGCAACUCCAUTT-3’（配列番号６）とアンチセンス鎖の5’-AUGGAGUUGCGAUAGGUGGTT-3’（配列番号８）の組合せ、または、センス鎖の5’-GCUACUGCAGGGUGAGGAATT-3’（配列番号７）とアンチセンス鎖の5’-UUCCUCACCCUGCAGUAGCTT-3’（配列番号９）の組合せ、あるいは、YB１に対するsiRNAのセンス鎖の5’-CCUAUGGGCGUCGACCACATT-3’（配列番号１０）とアンチセンス鎖の5’-UGUGGUCGACGCCCAUAGGTT-3’（配列番号１２）との組合せ、または、センス鎖の5’-GUUCCAGUUCAAGGCAGUATT-3’（配列番号１１）とアンチセンス鎖の5’-UACUGCCUUGAACUGGAACTT-3’（配列番号１３）の組合せであってもよい。
【００２２】
本発明の治療剤の細胞への導入は、任意の既知の導入手法、例えば、限定されずに、リポフェクタミン法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、超音波導入法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターなど）を利用する方法、またはマイクロインジェクション法などを用いることができる。
ウイルスベクターを使用する場合、ウイルスの力価としては１×１０３〜１×１０１５ｐ．ｆ．ｕ．（プラーク形成単位）であってもよく、好ましくは１×１０５〜１×１０１３、より好ましくは１×１０７〜１×１０１１、さらに好ましくは１×１０８〜１×１０１０で用いることができる。
【００２３】
上記核酸分子は、裸の核酸として使用しても、種々の核酸構築物またはベクターに組み込んで使用してもよい。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター等の公知の任意のものを利用することができる。核酸構築物またはベクターは、例えば哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子から誘導される適当な転写または翻訳制御配列を少なくとも含んでいることが好ましい。かかる制御配列は、遺伝子発現において調節的役割を有する配列、例えば転写プロモーターまたはエンハンサー、転写を調節するためのオペレーター配列、メッセンジャーＲＮＡ内部のリボゾーム結合部位をコードしている配列、ならびに、転写、翻訳開始または転写終了を調節する適切な配列を包含する。
【００２４】
２．本発明の医薬組成物
本発明はまた、上記の治療剤を含む医薬組成物に関する。上記の治療剤は、がん細胞の増殖を抑制することができるため、医薬組成物の有効成分として有用である。本発明の医薬組成物は、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤に加えて、ＰＵＲＡの発現の抑制剤およびＹＢ１の発現の抑制剤を含んでいてもよいし、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤を含まずに、ＰＵＲＡの発現の抑制剤およびＹＢ１の発現の抑制剤の両方を含んでいてもよいし、これらのいずれかを単独で含んでいてもよい。本発明の医薬組成物は、上記の治療剤と、１または２以上の薬学的に許容し得る界面活性剤、担体、希釈剤および／または賦形剤を含んでもよい。薬学的に許容し得る担体、希釈剤等は医薬分野でよく知られており、例えば、その全体を本明細書に援用するRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)などに記載されている。 
【００２５】
上記医薬組成物は、限定されずに、上記のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１、ＰＵＲＡ、およびＹＢ１の高発現に関連する疾患や、細胞増殖性疾患などの処置に用いることができる。したがって、本発明はまた、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１、ＰＵＲＡ、およびＹＢ１の高発現が関与する疾患の処置のための有効量の上記のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１、ＰＵＲＡ、およびＹＢ１の転写体ＲＮＡの抑制剤を含む医薬組成物に関する。
【００２６】
細胞増殖性疾患としては、限定されずに、例えば、良性腫瘍または悪性腫瘍などを含む。本発明の一態様において、細胞増殖性疾患はがんである。本発明の一態様において、本発明の医薬組成物は、がん細胞の細胞増殖能力を、例えば、ＭＴＴアッセイにおいて、正常細胞の２分の１以下、３分の１以下に抑制することができる。
【００２７】
本発明が対象とするがんとしては、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１、ＰＵＲＡ、およびＹＢ１の転写体ＲＮＡが発現している限り限定されないが、例えば、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫などの肉腫、脳腫瘍、頭頚部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、虫垂癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、肛門癌、腎癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、皮膚癌などの癌腫、さらには白血病や悪性リンパ腫などが挙げられる。
【００２８】
がん細胞がＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１、ＰＵＲＡ、およびＹＢ１を発現しているか否かは、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１、ＰＵＲＡ、およびＹＢ１の転写体ＲＮＡの発現を、遺伝子レベルで検出することにより判断できる。具体的には、遺伝子レベルでは、例えば、ノーザンブロッティング法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等のＰＣＲ法、in situハイブリダイゼーション法、in vitro転写法等の任意の公知の遺伝子発現解析法により検出することができる。本発明の一態様において、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１、ＰＵＲＡ、およびＹＢ１の転写体ＲＮＡの発現量は、正常細胞に比べ、２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましく１０倍以上、特に好ましくは２０倍以上増加している。
【００２９】
本発明の医薬組成物は、対象とする疾患を処置するのに有用な他の作用物質、例えば抗腫瘍剤、抗炎症剤などをさらに含んでもよい。
抗腫瘍剤としては、限定されずに、例えば、イホスファミド、ニムスチン（例えば、塩酸ニムスチン）、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、ラニムスチン等のアルキル化剤、ゲムシタビン（例えば、塩酸ゲムシタビン）、エノシタビン、シタラビン・オクホスファート、シタラビン製剤、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤（例えば、ＴＳ−１）、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン等の代謝拮抗剤、イダルビシン（例えば、塩酸イダルビシン）、エピルビシン（例えば、塩酸エピルビシン）、ダウノルビシン（例えば、塩酸ダウノルビシン、クエン酸ダウノルビシン）、ドキソルビシン（例えば、塩酸ドキソルビシン）、ピラルビシン（例えば、塩酸ピラルビシン）、ブレオマイシン（例えば、塩酸ブレオマイシン）、ペプロマイシン（例えば、硫酸ペプロマイシン）、ミトキサントロン（例えば、塩酸ミトキサントロン）、マイトマイシンＣ等の抗腫瘍性抗生物質、エトポシド、イリノテカン（例えば、塩酸イリノテカン）、ビノレルビン（例えば、酒石酸ビノレルビン）、ドセタキセル（例えば、ドセタキセル水和物）、パクリタキセル、ビンクリスチン（例えば、硫酸ビンクリスチン）、ビンデシン（例えば、硫酸ビンデシン）、ビンブラスチン（例えば、硫酸ビンブラスチン）等のアルカロイド、アナストロゾール、タモキシフェン（例えば、クエン酸タモキシフェン）、トレミフェン（例えば、クエン酸トレミフェン）、ビカルタミド、フルタミド、エストラムスチン（例えば、リン酸エストラムスチン）等のホルモン療法剤、カルボプラチン、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、ネダプラチン等の白金錯体、サリドマイド、ネオバスタット、ベバシズマブ等の血管新生阻害剤、Ｌ−アスパラギナーゼなどが挙げられる。
【００３０】
抗炎症剤としては、限定されずに、ステロイド系抗炎症剤（プレドニゾロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルチカゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン等）や非ステロイド系抗炎症剤（アセチルサリチル酸、ロキソプロフェン、アセトアミノフェン、ケトプロフェン、チアプロフェン酸、スプロフェン、トルメチン、カルプロフェン、ベノキサプロフェン、ピロキシカム、ベンジダミン、ナプロキセン、ジクロフェナク、イブプロフェン、ジフルニサール、アザプロパゾン等）、炎症性サイトカインの発現を抑制するＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｄＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｒａｓｉＲＮＡなど）、アンチセンス核酸などの物質、および／または炎症性サイトカインの作用を抑制する薬物、例えば、炎症性サイトカインに対する抗体や、炎症性サイトカインの受容体拮抗剤などが挙げられる。
【００３１】
本発明のがん治療剤、医薬組成物などにおいて、２種以上のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１、ＰＵＲＡ、およびＹＢ１の発現の抑制剤を組み合わせて用いる場合、２種以上の分子を単一の組成物に含めても、複数の組成物に別々に含ませ、それらを組み合わせて用いてもよい。例えば、核酸分子であれば、２種以上の核酸分子を単一の核酸構築物またはベクターに組み込んでも、それぞれ１種類ずつの核酸分子を含む複数種の核酸構築物またはベクターの組み合わせとして調製してもよい。
【００３２】
本発明の種々の態様において、上記のがん治療剤は、種々の薬物送達担体に担持させて使用することもできる。かかる担体としては、限定されずに、例えば、ポリマーナノ粒子、ポリマーミセル、デンドリマー、リポソーム、ウイルスナノ粒子、カーボンナノチューブ等が挙げられる（Cho K. et al., Clin Cancer Res. 2008 Mar 1;14(5):1310-6など参照）。
【００３３】
本発明の治療剤や医薬組成物は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、たとえば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、腫瘍内、動脈内、門脈内、骨髄内、歯髄内、舌下、口腔内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる（たとえば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、２００３年、上記Remington’s Pharmaceutical Sciencesなどを参照）。 
【００３４】
例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。
【００３５】
３．本発明のキット
本発明は、本発明の各種剤または組成物に含まれ得る活性成分を、単独でもしくは組み合わせて含む１個または２個以上の容器を含む組成物の調製キット、ならびに、そのようなキットの形で提供される各種剤または組成物の必要構成要素にも関する。本発明のキットは、上記のほか、本発明の治療剤または医薬組成物の調製方法や投与方法などが記載された指示、例えば説明書や、ＣＤ、ＤＶＤ等の電子記録媒体等を含んでいてもよい。
【００３６】
４．本発明のがん診断方法
本発明の一態様は、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡを標的とするがんの診断方法に関する。
【００３７】
本発明の一態様は、ヒト対象ががんを発症するか否かを予測するための指標として、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量を測定する方法であって、
（ａ）ヒト対象由来の試験サンプル中のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量を決定すること、
（ｂ）ヒト健常者由来の対照サンプル中のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量を決定すること、および
（ｃ）ヒト対象由来の試験サンプル中のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量が、ヒト健常者由来の対照サンプル中のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量よりも２倍を超える場合に、ヒト対象ががんを発症すると予測すること、
を含む。
【００３８】
本発明の別の一態様において、（ｃ）において、ヒト対象由来の試験サンプル中のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量が、ヒト健常者由来の対照サンプル中のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡの発現量よりも、例えば、３倍、５倍、１０倍、または２０倍を超える場合に、ヒト対象ががんを発症すると予測される。
【００３９】
本発明の診断方法において、がんは、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の転写体ＲＮＡを発現している限り限定されないが、例えば、胃がん、乳がん、肝がん、大腸がん、または膵がんであることが好ましく、例えば、ヒト対象は、前がん状態のヒト対象である。
【００４０】
５．本発明のがん処置方法
本発明のさらなる態様は、本発明のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤、ＰＵＲＡの発現の抑制剤、およびＹＢ１の発現の抑制剤の少なくとも１つを含むがん治療剤、例えば、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤を含むがん治療剤または医薬組成物を用いる疾患の処置方法に関する。本発明の処置方法は、本発明のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤、ＰＵＲＡの発現の抑制剤、およびＹＢ１の発現の抑制剤の少なくとも１つを含むがん治療剤または医薬組成物を対象に投与する工程を含む。投与される対象は、典型的には本発明のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤、ＰＵＲＡの発現の抑制剤、およびＹＢ１の発現の抑制剤等による処置を必要としている。かかる対象としては、限定されずに、例えば、上記のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１、ＰＵＲＡ、およびＹＢ１の高発現に関連する疾患や、細胞増殖性疾患などを患っているか、これらの疾患を有すると診断されたか、これらの疾患を発症するリスクが高い対象である。したがって、本発明の処置方法は、本発明のＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現の抑制剤、ＰＵＲＡの発現の抑制剤、およびＹＢ１の発現の抑制剤の少なくとも１つを含む治療剤または医薬組成物による処置を必要としている対象を同定する工程をさらに含んでもよい。細胞増殖性疾患の具体例は、医薬組成物に関して上記したとおりである。
【００４１】
本発明の処置方法においては、本発明の治療剤または医薬組成物を、対象とする疾患を処置するのに有用な他の作用物質または処置方法と併用することができる。本発明の治療剤または医薬組成物により、化学療法や放射線治療に対するがんの感受性が改善することが期待される。疾患の処置において、本発明の治療剤または医薬組成物と併用し得る作用物質、例えば、例えば抗腫瘍剤、抗炎症剤などは、医薬組成物に関して上記したとおりである。また、本発明の処置方法は、放射線治療などの物理療法や外科手術などの外科的治療などと併用することができる。
【００４２】
本発明の処置方法における有効量とは、例えば、疾患の症状を低減し、または疾患の進行を遅延もしくは停止する量であり、好ましくは、疾患を抑制し、または治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、本発明の処置方法に用いる薬物の用量は当業者に公知であるか、または、上記の試験等により適宜決定することができる。
【００４３】
本明細書に記載される本発明の処置方法において投与する活性成分の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。本発明の処置方法に用いる薬物の用量は、好ましくは、ヒトの場合、１回あたり、かつ成人１ｋｇ体重あたりｓｉＲＮＡ分子に換算して例えば約０．０１ｍｇ〜約１，０００ｍｇである。本発明の処置方法に用いる薬物の濃度は、好ましくは、ｓｉＲＮＡの場合、１ｎＭ〜２００μＭが好ましく、５ｎＭ〜１８０μＭがより好ましく、１０ｎＭ〜１６０μＭが特に好ましい。
投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、骨髄内、歯髄内、舌下、口腔内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路が含まれる。
投与頻度は、用いる剤や組成物の性状や、上記のものを含む対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってもよい。
【００４４】
本明細書で用いる場合、用語「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、特定の疾患の処置が企図される場合には、典型的にはかかる疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
また、用語「処置」は、本明細書で用いる場合、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【００４５】
今回本発明者により、本発明の抑制剤が、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１（配列番号１）の発現を抑制することにより、胃がん、乳がん、肝がん、大腸がん、膵がん細胞株において細胞増殖を抑制できること、そして、ＤＮＡあるいはＲＮＡ結合タンパク質であることが報告されているＰＵＲＡとＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１（配列番号１）との結合が阻害されて、結果として、免疫応答に関与する遺伝子群の発現の低下を生じることが明らかになった。
したがって、本発明の抑制剤は、細胞増殖阻害以外に、免疫応答の惹起または維持の作用をもたらすことができる。したがって、本発明はまた、上記抑制剤を含む、上記作用を提供するための組成物、上記抑制剤の上記作用を提供するための組成物の製造における使用、上記作用を提供するための上記抑制剤、上記作用を提供するための有効量の上記抑制剤を含む組成物、ならびに、上記抑制剤の上記作用を提供するための使用にも関する。
【実施例】
【００４６】
本発明を下記の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施例に限定されないものとする。【００４７】
例１：胃がん細胞株及び臨床検体からのｌｎｃＲＮＡの取得
胃がん細胞株（AGS, AZ521, HSC43, HSC45, JRST, KATOIII, MKN1, MKN7, MKN28, MKN45, MKN74, NCI-N87, NUGC3, NUGC4, SH101, SNU1, SNU638）、肝がん細胞株（Hep3B, HepG2, Huh1, Huh7, HT17, Li-7, HLE, HLF, PLC/PRF/5, JHH4）、大腸癌細胞株（CaCO2, Colo320, DLD1, HCT116, HT29, Lovo, RKO, SW48, SW480, SW620, T84, WiDr）、乳がん細胞株（MCF7, MDA-MB-157, MDA-MB-231, MDA-MB361, MDA-MB-435S, MDA-MB-468, SK-BR-3, T47D）、膵がん細胞株（Panc-1）を培養し解析に用いた。臨床検体については、上部消化管内視鏡による生検で得られた組織の一部から、腺管分離法により腺管を分離した（Nakamura S, Goto J, Kitayama M, Kino I (1994) Application of the crypt-isolation technique to flow-cytometric analysis of DNA content in colorectal neoplasms. Gastroenterology 106 (1):100-107）。臨床検体に関する解析は札幌医科大学の承認を得た。 【００４８】
例２：ChIP-seq実験とデータ解析
健常者の正常胃粘膜および胃がん患者の非がん部背景粘膜から腺管分離法で得た腺管成分を用いてChIP（クロマチン沈降）実験を行った（Maruyama R, Choudhury S, Kowalczyk A, Bessarabova M, Beresford-Smith B, Conway T, Kaspi A, Wu Z, Nikolskaya T, Merino VF, Lo PK, Liu XS, Nikolsky Y, Sukumar S, Haviv I, Polyak K (2011) Epigenetic regulation of cell type-specific expression patterns in the human mammary epithelium. PLoS genetics 7 (4):e1001369. doi:10.1371/journal.pgen.1001369）。転写開始点の活性化マーカーであるヒストン修飾H3K4me3に対する抗体を使用した。ChIP実験で得られたＤＮＡにアダプター配列を付加し、ＰＣＲで増幅後に次世代シーケンサーSOLiD4(Life Technologies)を用いて解析した。解析ソフトウェアMACS1.4を使用し、lncRNAのアノテーションデータはHuman Body Map(Broad Institute)から取得した。結果を図１に示す。
健常個体と胃がん(GC)患者を比較した結果、上方制御されるアノテーションが１５１２個存在し、H3K4me3による転写開始点の活性領域の一例として、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１（配列番号１）を見出した。【００４９】
例３：ＲＮＡ抽出及び発現解析
各胃がん細胞株からTrizolを用いてtotal RNAを抽出し、逆転写反応した。遺伝子毎に設計したプライマーを用いてSYBR法による定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。正常胃粘膜のＲＮＡは市販のものを用いた。結果を図２Ａに示す。
ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１に対応するTCONS_00006264が、正常胃粘膜細胞と比較して、胃がん細胞において多く発現されていることが分かった（図２Ａの左図）。また、長鎖ノンコーディングＲＮＡであるＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１は、そのｍＲＮＡであるＴＭ４ＳＦ１と、ゲノム上で近位に位置し、共発現することが予想された（図２Ａの右上図）。
また、各胃がん細胞株におけるＴＭ４ＳＦ１とＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現解析を行った結果、ごく少数の胃がん細胞株を除き、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１とＴＭ４ＳＦ１が多くの細胞株で共に多く発現していた（図２Ａの右下図）。
さらに、各胃がんステージのがん組織（臨床検体）からTrizolを用いてtotal RNAを抽出し、逆転写反応した。遺伝子毎に設計したプライマーを用いてSYBR法による定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。正常胃粘膜のＲＮＡは市販のものを用いた。結果を図２Ｂに示す。健常者の正常胃粘膜または胃がん患者の非がん部との比較により、がん部ではＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現が亢進することが示唆された。胃がんでは、各ステージ（Ｉ〜ＩＶ）において、正常組織と比較して、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現が亢進されるので、胃がんの初期段階での検出、胃がんの予防、早期治療に有効であることが示唆された。【００５０】
例４：ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１を標的に設計したｓｉＲＮＡの設計
ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１を標的とするｓｉＲＮＡの設計にはRossetta InpharmaticsやsiDirectのデザインアルゴリズムを用いた。これによりセンス鎖（例えば、5’-CCAUCAGUUGGGAGUUGAAGA-3’（配列番号２）、5’-GCCAAGUGUCCGAGAUGCAAC-3’（配列番号３））と、アンチセンス鎖（例えば、5’-UUCAACUCCCAACUGAUGGAA-3’（配列番号４）、5’-UGCAUCUCGGACACUUGGCAG-3’（配列番号５））を用いた。 
コントロールｓｉＲＮＡはシグマ社製Mission Negative control SIC-001を用いた（配列非公開）。 【００５１】
例５：ノックダウン実験および機能解析
リポフェクタミン法により、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１を標的に設計したｓｉＲＮＡを胃がん細胞株にトランスフェクションした。トランスフェクションによりＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１をノックダウンした細胞について、定量ＲＴ−ＰＣＲ、ＭＴＴアッセイ、細胞遊走アッセイ、マトリゲル浸潤アッセイを行った。結果を図３，４に示す。
胃がん細胞（HSC45、MKN45、SNU1）において、ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１＃２（配列番号２，４）およびｓｉ−ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１＃３（配列番号３，５））（２０ｎＭ）を用いて、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１をノックダウンすることにより、細胞増殖能が有意に低下した（図３）。また、HSC45胃がん細胞株において、細胞遊走能力および浸潤能力が顕著に低下したため（図４）、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１ががん遺伝子として機能していることが示唆された。【００５２】
例６：ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１安定発現株の樹立
ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１−ＧＦＰ発現ベクターまたはコントロールＧＦＰベクターを作成した。TM4SF1AS1についてはSGI-DNA社のDNA合成サービスより合成DNAを、プラスミドベクターについてはpBI-CMV2 (Clontech)を購入した。PCRで増幅したネオマイシン耐性遺伝子(NeoR)カセットをIn-fusion反応(Takara)によりpBI-CMV2に組み込んだpBI-CMV2 NeoRを、コントロールGFPベクターとした。さらに合成DNAをもとにPCRで増幅したTM4SF1AS1をIn-fusion反応によりpBI-CMV2 NeoRのMCS部位に組み込み、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１−ＧＦＰ発現ベクターを作成した。
胃がん細胞株SNU638にＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１−ＧＦＰ発現ベクターまたはコントロールＧＦＰベクターをトランスフェクションした。抗生物質ネオマイシンを添加し３週間選抜後、BD FACS Aria (BD Bioscience)を用いてＧＦＰ陽性細胞を分取した。 【００５３】
例７：マウスゼノグラフト実験
ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１−ＧＦＰ発現ベクターまたはコントロールＧＦＰベクターをトランスフェクションした胃がん細胞株SNU638を、ヌードマウス（BALB/cAJcl-nu）の左右背側部に皮下移植した。移植後に定期的に腫瘍サイズの測定を行った。結果を図５に示す。
また、胃がん細胞株HSC45を、ヌードマウス（BALB/cAJcl-nu）の左右背側部に皮下移植した。移植後に定期的に腫瘍サイズの測定を行い、同時にAteloGene in vivo Transfection kit (KOKEN)を用いてＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１（配列番号２，４）、またはコントロールのｓｉＲＮＡ（５０μＭ）を腫瘍部分に注入し、マウス皮下腫瘍のノックダウンを行った。ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１安定発現株とコントロールＧＦＰ株については、同様にヌードマウスに皮下移植し、腫瘍サイズの測定を行った。結果を図６に示す。
ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１安定発現株であるSNU638株において、腫瘍サイズが有意に増加したことから（図５）、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の過剰発現が腫瘍形成を促進することが理解された。また、胃がん細胞株のHSC45株におけるＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１のノックダウンによって、腫瘍形成が抑制されることが理解された（図６）。【００５４】
例８：マイクロアレイ解析
ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１をノックダウンした胃がん細胞株HSC45からＲＮＡを抽出し、ｃＲＮＡを合成後にSurePrint G3 Human GE 8x60K V2 microarray (Agilent Technologies)へのマイクロアレイ実験を行った。データ解析については、GeneSpring GX version 13 (Agilent Technologies)を使用した。【００５５】
例９：ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１結合タンパク質の同定
In vitro転写反応で合成した５−ブロモＵＴＰ標識ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１  ＲＮＡとRiboCluster Profiler RiboTrap Kit (MBL)を使用し、ＲＮＡプルダウン実験を行った。SDS-PAGEによりＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１  ＲＮＡで特異的なタンパク質バンドを切り出し、質量分析を行った。 【００５６】
例１０：ウェスタンブロット
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供試し、ゲルからタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写後、メンブレンをブロッキング剤で処理した。各タンパク質に対する抗体で一次抗体反応を行い、メンブレンの洗浄後２次抗体反応を行った。再度メンブレンの洗浄後、Clarity Western ECL substrate (BIORAD)を用いてタンパク質を発色させ、蛍光をImageQuant LAS4000 mini (GE Heathcare)で検出した。一次抗体は、anti YB1 antibody (RN015P, MBL)、anti Myc tag mAb (M192-3S, MBL)、anti PURA antibody (ab79936, abcam)を、二次抗体はmouse IgG antibody (CST, 7076) または Anti-rabbit IgG antibody conjugated with horseradish peroxidase (CST, 7074)を使用した。 
ＰＵＲＡ、ＰＵＲＢ、ＹＢ１の複合体は転写調節に関与することが報告されている(J Biol Chem, 2008; Mol Cell Biol, 2007)。
ウエスタンブロッティングの結果、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１とＰＵＲＡおよびＹＢ１は、複合体の形成により、バンド強度が増大し（図７の左図）、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の非存在下では、バンドが消滅した（図７の右図）。従って、ＰＵＲＡとＹＢ１はＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１  ＲＮＡを介して相互作用することが推定された。【００５７】
例１１：ＰＵＲＡおよびＹＢ１のｓｉＲＮＡを用いるノックダウンによる細胞増殖能への影響
ＰＵＲＡおよびＹＢ１を標的とするｓｉＲＮＡの設計にはRossetta InpharmaticsやsiDirectのデザインアルゴリズムを用いた。これによりセンス鎖（例えば、ＰＵＲＡに対するsiRNAの5’-CCACCUAUCGCAACUCCAUTT-3’（配列番号６）または5’-GCUACUGCAGGGUGAGGAATT-3’（配列番号７）、YB１に対するsiRNAの5’-CCUAUGGGCGUCGACCACATT-3’（配列番号１０）または5’-GUUCCAGUUCAAGGCAGUATT-3’（配列番号１１））と、アンチセンス鎖（例えば、ＰＵＲＡに対するsiRNAの5’-AUGGAGUUGCGAUAGGUGGTT-3’（配列番号８）または5’-UUCCUCACCCUGCAGUAGCTT-3’（配列番号９）、YB１に対するsiRNAの5’-UGUGGUCGACGCCCAUAGGTT-3’（配列番号１２）または5’-UACUGCCUUGAACUGGAACTT-3’（配列番号１３））を用いた。
コントロールｓｉＲＮＡはシグマ社製Mission Negative control SIC-001を用いた（配列非公開）。 
リポフェクタミン法により、ＰＵＲＡまたはＹＢ１を標的に設計したｓｉＲＮＡを胃がん細胞株HSC45にトランスフェクションした。トランスフェクションによりＰＵＲＡまたはＹＢ１をノックダウンした細胞について、ＭＴＴアッセイを行った。結果を図８に示す。
胃がん細胞（HSC45）において、ｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＵＲＡ＿０４１１（配列番号６，８）、ｓｉＰＵＲＡ＿０４１２（配列番号７，９）、ＹＢＸ＿７０６４（配列番号１０，１２）、およびＹＢＸ＿７０６５（配列番号１１，１３））（２０ｎＭ）を用いて、ＰＵＲＡ（左図）またはＹＢ１（右図）をノックダウンすることにより、細胞増殖能が有意に低下した。【００５８】
例１２：ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の下流遺伝子の探索
ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１をノックダウンした胃がん細胞株HSC45からＲＮＡを抽出し、ｃＲＮＡを合成後にSurePrint G3 Human GE 8x60K V2 microarray (Agilent Technologies)へのマイクロアレイ実験を行った（図９）。データ解析については、GeneSpring GX version 13 (Agilent Technologies)を使用した。発現が抑制された６４９個の遺伝子には、例えば、以下の表１に記載される免疫応答遺伝子が集積していた（Gene Ontology解析）。【００５９】
【表１】
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【００６０】
また、ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１＃２（配列番号２，４）およびｓｉ−ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１＃３（配列番号３，５））（２０ｎＭ）を用いて、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１をノックダウンで発現が抑制された免疫応答遺伝子の発現解析（ＲＴ−ＰＣＲ）を行ったところ、免疫応答遺伝子の発現が実際に抑制されていた（図１０）。これに対し、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１安定発現細胞株では、免疫応答遺伝子の発現が実際に誘導されていた（図１１）。また、ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＰＵＲＡ＿＃１（配列番号６，８）およびｓｉ−ＰＵＲＡ＿＃２（配列番号７，９））（２０ｎＭ）を用いて、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１およびＰＵＲＡの両方をノックダウンした場合には、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１のみをノックダウンした場合と比較して、免疫応答遺伝子の発現がさらに減少していた（図１２）。従って、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１とＰＵＲＡは、ｌｎｃＲＮＡ−タンパク質複合体として、免疫応答遺伝子の発現に関与する可能性が示唆された。【００６１】
例１３：他のがん細胞におけるＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現
例３と同様にして、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１  ＲＮＡの発現を解析したところ、乳がん細胞、肝がん細胞、大腸がん細胞においても、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１が高度に発現していた（図１３）。従って、他の組織のがん細胞株においても、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１の発現は亢進し、がん遺伝子として機能していることが示唆された。
例５と同様にして、上記細胞株のうち、乳がん細胞株（SK-BR-3、MDA-MB-231、MDA-MB-435S）、肝がん細胞株（Huh7、HLF、HT17、Li-7、PLC/PRF/5）、大腸がん細胞株（SW620、HT29、DLD1、T84、WiDr）および膵がん細胞株（Panc-2）をノックアウト実験に使用した。ｓｉＲＮＡ（ｓｉＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１  ０２（配列番号２，４））（２０ｎＭ）を用いたところ、乳がん細胞株では、SK-BR-3およびMDA-MB-435Sについて、肝がん細胞株では、Huh7、HLF、およびHT17について、細胞増殖の抑制が確認され（図１４〜１６）、肝がん細胞株のHLFについては、遊走浸潤能の抑制が確認され（図１６）、膵がん細胞株のPanc-1について、細胞増殖の抑制が確認された（図１７）。
従って、胃がん以外のがん細胞株においても、ＴＭ４ＳＦ１ＡＳ１のノックダウンにより、細胞増殖抑制の効果が認められた。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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