(57)【要約】  本発明は、がん幹細胞を特異的に認識する抗体、および当該抗体を含む医薬組成物、とくにがんを処置するための医薬組成物およびそれらの利用、がん幹細胞を標的としたがんの処置方法などに関する。がん幹細胞抗原ペプチドとＭＨＣとの複合体を認識する抗体および当該抗体を有効成分として含む医薬組成物を提供することにより、上記課題が解決された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡＪＢ８タンパク質、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ６およびＦＡＭ８３Ｂタンパク質からなる群から選択されるタンパク質に由来する抗原ペプチドと、ＭＨＣ分子との複合体を認識する抗原結合部位を有する、多重特異性抗体。
【請求項２】
さらにＣＤ３を認識する抗原結合部位を有する、請求項１に記載の多重特異性抗体。
【請求項３】
抗原ペプチドが、配列番号５、２３または６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１または２に記載の多重特異性抗体。
【請求項４】
ＤＮＡＪＢ８タンパク質、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ６タンパク質およびＦＡＭ８３Ｂタンパク質からなる群から選択されるタンパク質に由来する抗原ペプチドと、ＭＨＣ分子との複合体を認識する抗原結合部位が、配列番号７〜１４および２４〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列、または、アミノ酸配列番号７〜１４および配列番号２４〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１個または２個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項５】
さらに、ＣＤ８０領域を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項６】
ＤＮＡＪＢ８タンパク質、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ６タンパク質およびＦＡＭ８３Ｂタンパク質からなる群から選択されるタンパク質に由来する抗原ペプチドと、ＭＨＣ分子との複合体を認識する抗体を含む、医薬組成物。
【請求項７】
がんを予防および／または処置するための医薬組成物である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＭＨＣ分子が、ＨＬＡ分子である、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
抗原ペプチドが、配列番号５、２３または６に記載のアミノ酸配列からなる、請求項６〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
抗体の抗原結合部位が、配列番号７〜１４および２４〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
抗体が、請求項１〜５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体である、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん幹細胞に特異的に抗原提示される抗原を認識する抗体、および当該抗体を含む医薬組成物、とくにがんを処置するための医薬組成物およびそれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに開発された抗がん剤の治療効果は十分ではなく、がんを完治できる確率は極めて低い。その原因として、がん組織の根幹をなす細胞を、従来の治療剤が選択的にターゲッティングできていないことが挙げられる。近年になって、かかる「がん組織の根幹をなす細胞」として、がん幹細胞の存在が報告されている。がん幹細胞は、がんの発生、再発および転移に関わる原因細胞と考えられており、したがってがん幹細胞をターゲッティングすることができれば、がんの増殖、再発および転移を効果的に抑制できる可能性が高いと期待される。すなわち、がん幹細胞の検出技術とがん幹細胞を標的とする新規治療剤の開発は、がん医療にとって重要な課題となっている。【０００３】
がん幹細胞に特異的に発現する遺伝子（がん幹細胞抗原）として、いくつかの遺伝子が報告されている（例えば特許文献１〜３など）。これらの遺伝子の発現タンパク質の部分ペプチドは、細胞表面に抗原提示される。したがってかかるペプチドを利用して、がん幹細胞を標的としたがんワクチン免疫療法の開発が試みられている。がん幹細胞抗原由来ペプチドを用いたがんワクチン療法が効果を示すためには、患者体内で多くのワクチンペプチド特異的Ｔ細胞を誘導する必要がある。しかし末期症例では免疫が低下しており、多くのＴ細胞は誘導が難しいことが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０５０１９０号
【特許文献２】国際公開第２０１５／０５０２５９号
【特許文献３】国際公開第２０１６／０４７７１５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、がん幹細胞に特異的に抗原提示される抗原を認識する抗体、および当該抗体を含む医薬組成物、とくにがんを処置するための医薬組成物およびそれらの利用、がん幹細胞を標的としたがんの処置方法などに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、がんの造腫瘍能と薬剤抵抗性を担うがん幹細胞を標的としたがんワクチン免疫療法の開発を行う中で、ワクチンペプチド特異的Ｔ細胞はＴ細胞受容体を介して、がん細胞表面でＨＬＡ−クラスＩ分子に提示されたペプチドを認識してがん細胞を殺傷する点に注目し、このＴ細胞受容体の特異性を模倣する抗体があれば、免疫が低下した症例でも、がん幹細胞抗原を標的とした免疫療法が可能となると考えた。そこでかかる抗体の開発を続ける中で、ヒト末梢血よりファージディスプレイ抗体ライブラリを用いて、がん幹細胞抗原ペプチドとＨＬＡクラスＩの複合体を認識する抗体断片（ｓｃＦｖ）を分離することに成功した。そしてこれらの抗体をヒトＩｇＧ１型に変換すると、がん細胞株に対して補体および抗体依存性細胞傷害活性を示すという新たな知見を見出し、さらに研究を続けた結果本発明を完成させるに至った。【０００７】
すなわち、本発明に下記に掲げるものに関する：
［１］ＤＮＡＪＢ８タンパク質、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ６タンパク質およびＦＡＭ８３Ｂタンパク質からなる群から選択されるタンパク質に由来する抗原ペプチドと、ＭＨＣ分子との複合体を認識する抗原結合部位を有する、多重特異性抗体。
［２］さらにＣＤ３を認識する抗原結合部位を有する、［１］の多重特異性抗体。
［３］抗原ペプチドが、配列番号５、２３または６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、［１］または［２］の多重特異性抗体。
［４］ＤＮＡＪＢ８タンパク質、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ６タンパク質およびＦＡＭ８３Ｂタンパク質からなる群から選択されるタンパク質に由来する抗原ペプチドと、ＭＨＣ分子との複合体を認識する抗原結合部位が、配列番号７〜１４および２４〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列、または、アミノ酸配列番号７〜１４および配列番号２４〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１個または２個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含む、［１］〜［３］の多重特異性抗体。 
［５］さらに、ＣＤ８０領域を含む、［１］〜［４］の多重特異性抗体。
［６］ＤＮＡＪＢ８タンパク質、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ６タンパク質およびＦＡＭ８３Ｂタンパク質からなる群から選択されるタンパク質に由来する抗原ペプチドと、ＭＨＣ分子との複合体を認識する抗体を含む、医薬組成物。
［７］がんを予防および／または処置するための医薬組成物である、［６］の医薬組成物。
［８］ＭＨＣ分子が、ＨＬＡ分子である、［６］または［７］の医薬組成物。
［９］抗原ペプチドが、配列番号５、２３または６に記載のアミノ酸配列からなる、［６］〜［８］の医薬組成物。
［１０］抗体の抗原結合部位が、配列番号７〜１４および２４〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、［６］〜［９］の医薬組成物。
［１１］抗体が、［１］〜［５］の多重特異性抗体である、［６］〜［１０］の医薬組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、既存治療に抵抗性を示す難治性の癌、肉腫患者に対して、がん幹細胞を標的とした免疫療法を行うことが可能となる。また、従来のがんワクチン免疫療法と異なり、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する必要がないため、がんワクチン療法で必須とされる高い免疫力を必要としない。さらに、Ｔ細胞受容体発現Ｔ細胞の養子免疫療法に必要な細胞の遺伝子改変が不要となるため、養子免疫療法に必要な細胞の大量調整（１０１０個以上）が不要である。また、本発明の抗体はＴ細胞受容体より高い親和性を持つため、抗がん剤として高い薬効が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１はファージディスプレイ法によるｓｃＦｖ抗体のスクリーニングの概要を示す模式図である。ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリを、まずＨＬＡとＨＩＶとの複合体に反応するか否かでスクリーニングし、反応するものを非特異的抗体ファージとして除去する。その後ＨＬＡ−Ａ２４／ナチュラル抗原ペプチド複合体と反応するものを特異的抗体ファージ、反応しないものを非特異的抗体ファージとして選抜し、これを３回繰り返す。特異的抗体ファージから可溶性ｓｃＦｖを得る。
【図２】図２は、ペプチドタイトレーションアッセイの結果を示す図である。いずれの抗体も５ｎｇ／ｍＬ（矢印）より薄い濃度では結合が検出されなくなっていることがわかる。したがって反応検出限界は５ｎｇ／ｍＬであると考えられる。
【図３】図３は、ペプチドパルスＴ２−Ａ２４細胞に本開示の抗体を反応させた様子を示す写真図である。Ａは抗体としてクローンＡ１０およびクローンＢ１０を、ナチュラル抗原ペプチドとしてＤＮＡＪＢ８−１４３を、Ｂは抗体としてクローン１１を、ナチュラル抗原ペプチドとしてＳＦ９をそれぞれ用いた場合の写真図である。がん幹細胞抗原ペプチドをパルスした場合に、細胞周辺に本開示の抗体が結合し、赤く染色されていることが観察される。
【図４】図４は、ナチュラル抗原ペプチドを内在的に提示するがん細胞に本開示の抗体を反応させた様子を示す写真図である。Ａは抗体としてクローンＡ１０およびクローンＢ１０を、Ｂは抗体としてクローン１１をそれぞれ用いた場合の写真図である。ＨＬＡ−Ａ２４とＤＮＡＪＢ８またはＦＡＭ８３Ｂとを発現する細胞膜の一部に抗体が結合していることが観察される。
【図５】図５は、ペプチドパルスＴ２−Ａ２４細胞に本開示の抗体を反応させた際の細胞傷害活性を観察した写真図である。Ａは抗体としてクローンＡ１０およびクローンＢ１０を、ナチュラル抗原ペプチドとしてＤＮＡＪＢ８−１４３を、Ｂは抗体としてクローン１１を、ナチュラル抗原ペプチドとしてＳＦ９をそれぞれ用いた場合の写真図である。がん幹細胞抗原ペプチドをパルスした細胞の周辺に補体が結合して赤く染色され、細胞膜が破壊されて細胞内に流入したＤＡＰＩにより、核が青く染色されていることがわかる。
【図６】図６は、ナチュラル抗原ペプチドを内在的に提示するがん細胞に本開示の抗体を反応させた際の細胞傷害活性を観察した写真図である。Ａは抗体としてクローンＡ１０およびクローンＢ１０を、Ｂは抗体としてクローン１１をそれぞれ用いた場合の写真図である。ＨＬＡ−Ａ２４とＤＮＡＪＢ８またはＦＡＭ８３Ｂを発現する細胞の周辺に補体が結合して赤く染色され、細胞膜が破壊されて細胞内に流入したＤＡＰＩにより、核が青く染色されていることがわかる。
【図７】図７は、ｓｃＦｖからｈＩｇＧ１型に変換された本開示の抗体の、ＨＬＡ−Ａ０２／ＬＶ９ペプチド複合体に対する反応性をＦＡＣＳで解析した結果を示す図である。クローン１１、クローン１３およびクローン１９のいずれの抗体も２００μｇ／ｍＬの濃度で反応性が高かったが、クローン１９の反応性が最も高かった。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
【００１１】
本開示において、「エピトープペプチド」または「抗原ペプチド」とは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ（ヒトにおいてはヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）））分子と結合して、細胞表面に抗原提示され、かつ抗原性を有する（Ｔ細胞に認識され得る）ペプチドを意味する。エピトープペプチドには、ＭＨＣクラスＩと結合して抗原提示され、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に認識されるエピトープペプチドであるＣＴＬエピトープペプチド、およびＭＨＣクラスＩＩと結合して抗原提示され、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に認識されるエピトープペプチドであるヘルパーエピトープペプチドが含まれる。
【００１２】
エピトープペプチドのうち、腫瘍細胞において特異的にあるいは過剰に発現しているタンパク質由来のペプチドを、特に腫瘍抗原ペプチドという。同様に、がん幹細胞において特異的にあるいは過剰に発現しているタンパク質由来のペプチドを、がん幹細胞抗原ペプチドという。抗原提示とは、細胞内に存在するペプチドがＭＨＣと結合し、このＭＨＣ／抗原ペプチド複合体が細胞表面に局在化する現象をいう。細胞表面に提示された抗原はＴ細胞などにより認識された後、細胞性免疫や液性免疫を活性化することが知られており、ＭＨＣクラスＩに提示された抗原は、細胞性免疫を活性化するとともに、ナイーブＴ細胞のＴ細胞受容体に認識され、ナイーブＴ細胞を、細胞傷害活性を有するＣＴＬへと誘導するため、免疫療法には腫瘍抗原ペプチドとしては、一般にＭＨＣクラスＩと結合し、抗原提示されるペプチドが用いられる。
【００１３】
ＭＨＣと結合するペプチドの多くは、一定の特徴を有していることが知られている。本開示においては、この特徴を「結合モチーフ」という。いかなるＭＨＣがいかなる結合モチーフを有するペプチドと結合するかは、当該技術分野において知られている。例えば、ヒトＭＨＣの一種であるＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンであり、かつＣ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンである。また、ＨＬＡ−Ａ０２の結合モチーフは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンであり、および／またはＣ末端のアミノ酸がバリン、ロイシンもしくはイソロイシンである。
【００１４】
本開示において、「ナチュラルペプチド」とは、実際に細胞表面に抗原提示されているペプチドのことをいう。また「ナチュラル抗原ペプチド」とは、ナチュラルペプチドのうち抗原性が確認できたものをいう。ナチュラル抗原ペプチドとＭＨＣ分子との複合体をがん細胞から単離し、ナチュラル抗原ペプチドの配列およびその由来を決定することにより、本開示の抗体が認識する細胞表面抗原の候補を選抜することができる。
本開示において、「腫瘍（tumor）」は、良性腫瘍および悪性腫瘍（がん、悪性新生物）を含む。がん（cancer）は、造血器の腫瘍、上皮性の悪性腫瘍（癌、carcinoma）と非上皮性の悪性腫瘍（肉腫、sarcoma）とを含む。 
【００１５】
ＤＮＡＪＢ８は、ＤＮＡＪ／ＨＳＰ４０ファミリーの一員で２６ＫＤのタンパク質をコードする遺伝子であるが、精巣に高発現を認める以外、その局在、機能については詳細な報告はなされていない。ＤＮＡＪ／ＨＳＰ４０ファミリーは、その多くがＮ末端にＪドメインを有し、そのＪドメインがＨＳＰ７０と結合することによりＡＴＰの加水分解を促し、ＨＳＰ７０の基質結合領域の構造的変化をもたらすことで、ＨＳＰ７０の活性を制御していると考えられている。ＨＳＰ４０自身もペプチド結合領域を有し、ＨＳＰ７０へのペプチドの受け渡しの機能を有するものも存在する。
ＦＡＭ８３Ｂ（family with sequence similarity 83, member B）は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル経路において機能すると推定されるタンパク質をコードする遺伝子であるが、その機能の詳細は不明である。乳癌、子宮頚部癌、肺癌、甲状腺癌、大腸癌、精巣腫瘍、卵巣癌等の癌部において、各非癌部と比較して、発現が著しく上昇していることが知られており、がんの発生、形成および増殖に深く関与している癌遺伝子である可能性が指摘されている。 
【００１６】
ＢＯＲＩＳ（Brother of the Regulator of Imprinted Sites）遺伝子は、１１−ジンクフィンガープロテインとも呼ばれるＣＴＣＦ遺伝子のパラログであり、Ｎ末端ペプチド領域とＣ末端ペプチド領域の２つのペプチドをコードする領域の間に１１個のジンクフィンガー領域を有している。ＢＯＲＩＳは、様々な遺伝子発現のリプレッサーおよびアクチベーターのような一般的な転写因子として機能することが知られているほか、種々の腫瘍細胞、特にがん幹細胞において発現していることも知られている。ＢＯＲＩＳは、Ｃ末端ペプチド領域の配列により６つのサブファミリー（ｓｆ１〜６）に分類される。したがって各サブファミリーのＣ末端ペプチド領域の配列は、それぞれのサブファミリーに固有の配列（例えば、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ６の固有配列は、配列番号２２のアミノ酸配列で示される）となっており、同一サブファミリーに属するアイソフォーム間では高度に保存されている。また、ＢＯＲＩＳは、精巣以外の正常組織で発現しないことが報告されている。
【００１７】
本開示において、例えば「ＤＮＡＪＢ８」など、単に遺伝子名で表記している場合、別段の記載のない限り当該遺伝子名で表される公知の核酸配列を有する遺伝子を意味し、典型的にはｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列を表すが、当業者が当該遺伝子の配列として認識し得る限りこれに限定されない。たとえば、本開示における好ましい遺伝子およびその核酸配列の例としては、下記の配列で表される下記の遺伝子が挙げられるが、これらの遺伝子多型など（例えばＳＮＰｓなど）、これらの遺伝子と同じく当該遺伝子の配列と認識され得る配列についても本開示の遺伝子に含まれる。
ＤＮＡＪＢ８：Gene accession No. NM_153330（配列番号１）
ＦＡＭ８３Ｂ：Gene accession No. NM_001010872（配列番号３）
したがって本開示の遺伝子発現産物としてのｍＲＮＡを、単に遺伝子名の記載により表す場合がある。
【００１８】
本開示において、「ＤＮＡＪＢ８タンパク質」など、遺伝子名に「タンパク質」と付記して表す場合、当該遺伝子によりコードされるタンパク質、そのアイソフォーム、およびそのホモログのことを意味する。当該アイソフォームとしては、例えばスプライシングバリアント、個体差に基づくＳＮＰ等のバリアント等が挙げられる。具体的には、（１）当該遺伝子によりコードされるタンパク質において、９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、（２）当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列において、１または複数、好ましくは１〜数個、さらに好ましくは、１〜１０個、１〜５個、１〜３個、１もしくは２個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【００１９】
本開示において、例えば「ＤＮＡＪＢ８タンパク質に由来する抗原ペプチド」など、特定のタンパク質に由来する抗原ペプチドという場合、当該特定のタンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、連続した一部分の配列からなる部分ペプチドであって、上記抗原ペプチドとしての性質を有するものをいう。
【００２０】
＜１＞本開示の抗体
本開示の一側面は、がん幹細胞に特異的に発現する遺伝子、例えばＤＮＡＪＢ８、ＦＡＭ８３Ｂ、ＢＯＲＩＳ、ＰＶＴ１、ＡＳＢ４、ＬＩＮ２８Ｂなど、の発現産物であるタンパク質に由来する抗原ペプチドと、ＭＨＣ分子との複合体を特異的に認識する抗体に関する。かかる抗体は、原則として、前記抗原ペプチドとＭＨＣ分子との複合体を認識する抗原結合部位を有している。
【００２１】
本開示において「抗体」とは、抗原結合部位を有し、かかる抗原結合部位が認識する分子に結合する性質を有しているタンパク質を意味し、典型的には免疫グロブリンであるがこれに限定されない。したがって、免疫グロブリン分子だけでなく、例えば免疫グロブリンの抗原結合部位から生成させることができる抗体の機能的断片（抗原結合性断片）などもまた本開示の抗体に含まれる。かかる抗原結合性断片としては、典型的にはＦ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ｒＩｇＧ断片などが挙げられるほか、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディおよびｓｃ（Ｆｖ）２なども含まれる。例えば、これらの断片は、定常領域やヒンジ領域におけるジスルフィド結合により連結されていてもよいが、各領域をリンカーで結合して一本鎖化されたもの（ｓｃＦｖ）であってもよい。好ましい一態様において、本開示の抗体は、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。別の好ましい一態様において、本開示の抗体は、ＩｇＧ１型である。また、本開示の抗体には、免疫グロブリンやその機能的断片の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本開示の抗体に含まれる。
【００２２】
本開示の抗体は、細胞表面に存在するがん幹細胞抗原ペプチドとＭＨＣ分子との複合体を認識することができるものである限り特に限定されず、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。また、がん幹細胞抗原ペプチドとＭＨＣ分子との複合体を認識する抗原結合部位を有していれば特に限定されず、例えば他の抗原結合部位や別のタンパク質と結合するための結合領域などを有していてもよい。したがってある一態様において、本開示の抗体は、多重特異性抗体であり得る。好ましい一態様において、本開示の抗体は二重特異性抗体である。
【００２３】
本開示の抗体は、がん幹細胞の表面に存在するがん幹細胞抗原ペプチドとＭＨＣ分子との複合体を認識し、結合することができるため、様々な用途に用いることができる。一態様において、本開示の抗体は、がん幹細胞の検出に用いることができる。別の一態様において、本開示の抗体はがん幹細胞の処置（すなわちがんの処置）に用いることができる。本開示の抗体をがん幹細胞の処置に用いる場合、細胞性免疫を利用する方法であっても、液性免疫を利用する方法であってもよい。細胞性免疫を利用する態様としては、例えば本開示の抗体の有する抗原結合部位を組み込んだキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を導入されたＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）を用いた養子免疫細胞療法などが挙げられる。液性免疫を利用する態様としては、例えば抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性や、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣＣ）活性を利用する方法などが挙げられる。したがって好ましい一態様において、本開示の抗体は、ＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣＣ活性を有する。また、別の一態様において、本開示の抗体は、がん幹細胞抗原ペプチドとＭＨＣ分子との複合体を認識する抗原結合部位を組み込んだキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を包含する。
【００２４】
本開示の抗体は、上述のとおり、がん幹細胞に特異的に発現する遺伝子の発現産物であるタンパク質に由来する抗原ペプチドと、ＭＨＣ分子との複合体を特異的に認識する抗原結合部位を有している。特定の抗原を認識する抗原結合部位またはかかる抗原結合部位を有する抗体を選抜する方法は、当該技術分野において公知のいかなる方法を用いてもよい。このような方法としては、例えばファージディスプレイ法などが挙げられる。
【００２５】
がん幹細胞に特異的に発現する遺伝子としては、がん幹細胞特異的に発現していることが当該技術分野において既知の任意の遺伝子を用いてよいが、例えばＤＮＡＪＢ８、ＦＡＭ８３Ｂ、ＢＯＲＩＳ、ＰＶＴ１、ＡＳＢ４、ＬＩＮ２８Ｂなどが挙げられる。好ましい一態様において、がん幹細胞に特異的に発現する遺伝子は、ＤＮＡＪＢ８、ＦＡＭ８３ＢまたはＢＯＲＩＳ  ｓｆ６である。
【００２６】
抗原ペプチドは、ＭＨＣと結合する限り特に限定されない。ＭＨＣに結合するペプチドは、そのＭＨＣの型によりそれぞれ異なる特徴を有している。例えばヒトＭＨＣであるＨＬＡの場合、ＨＬＡクラスＩに結合するペプチドは、約８〜１４アミノ酸長程度、好ましくは８〜１０アミノ酸長程度であるのに対し、ＨＬＡクラスＩＩは、１０アミノ酸長以上、例えば約１０〜３０アミノ酸長のペプチドと結合する。また、ＨＬＡクラスＩの中でも、例えばＨＬＡ−Ａ０２と結合するペプチドは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンであり、および／またはＣ末端のアミノ酸がバリン、ロイシンもしくはイソロイシンであるという結合モチーフを有し、ＨＬＡ−Ａ２４と結合するペプチドは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンであり、および／またはＣ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンであるという結合モチーフを有する。
【００２７】
抗原ペプチドは、タンパク質の全長配列から結合モチーフに基づいてＭＨＣ拘束性ペプチドを予測することにより決定してもよいし、実際に抗原提示されているナチュラルペプチドを同定することにより決定してもよい。ナチュラルペプチドの同定方法としては、当該技術分野において公知の方法またはその組み合わせであってよく、例えば上記特許文献２に記載されている方法などが挙げられる。本開示の抗体は、細胞表面に抗原提示された抗原ペプチドを認識するものであるから、好ましくは、抗原ペプチドはナチュラルペプチドである。本発明者らにより、ヒトがん幹細胞におけるＤＮＡＪＢ８のナチュラルペプチドとしてＤＮＡＪＢ８−１４３（ＡＦＭＥＡＦＳＳＦ（配列番号５））が、ＦＡＭ８３ＢのナチュラルペプチドとしてＳＦ９（ＳＹＱＰＮＥＮＫＦ（配列番号６））が、ナチュラルペプチドとしてＢＯＲＩＳ  ｓｆ６の固有配列（配列番号２２）の部分ポリペプチドであるＬＶ９（ＬＬＦＩＧＴＩＫＶ（配列番号２３））が、それぞれ同定されている。したがって、より好ましい一態様において、抗原ペプチドは、ＤＮＡＪＢ８−１４３、ＳＦ９、またはＬＶ９である。 
【００２８】
本開示の好ましい一態様において、ＭＨＣはＨＬＡである。より好ましい一態様において、ＭＨＣはＨＬＡクラスＩである。さらに好ましい一態様においてＭＨＣは、ＨＬＡ−Ａ０２である。別のさらに好ましい一態様において、ＭＨＣは、ＨＬＡ−Ａ２４である。
【００２９】
本開示の抗体は、上述のとおり、抗原ペプチドとＭＨＣ分子との複合体を特異的に認識可能であれば特に限定されず、さらに別の分子を認識し、結合する抗体であってもよい。したがって本開示の抗体は、好ましい一態様において、がん幹細胞抗原ペプチドとＭＨＣ分子との複合体を認識する抗原結合部位以外に、別の分子に対する結合領域を有していてもよい。かかる結合領域は、典型的には抗原結合部位であるが、それに限定されず、例えば細胞表面受容体に対するリガンドなどであってもよい。好ましい一態様において、本開示の抗体は、２以上の分子に対して特異的に結合する抗体、すなわち多重特異性抗体である。ここで本開示において「多重特異性抗体」とは、少なくとも１つの抗原結合部位を有し、２以上の分子に対して特異的に結合する抗体を意味する。したがって例えば、本開示の二重特異性抗体といった場合、少なくとも１つの抗原結合部位を有し、２つの分子に対して特異的に結合する抗体であって、少なくとも１つの抗原結合部位が、がん幹細胞抗原ペプチドとＭＨＣ分子との複合体を認識する抗原結合部位であり、さらにもう１つの別の分子に対しても特異的に結合することができる抗体を意味する。別の分子に対する特異的結合は、別の抗原結合部位により達成されてもよいし、他の方法、例えば別の分子に対するリガンド領域などにより達成されてもよい。
【００３０】
本開示の抗体が多重特異性抗体である場合、本開示の抗体が認識する別の抗原は特に限定されないが、がん幹細胞の処置に資するものであることが好ましい。かかる抗原としては、例えばＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７などの免疫細胞の細胞表面に発現するタンパク質などが挙げられる。本開示の好ましい一態様において、別の抗原としては、ＣＤ３やＣＤ２８などのＴ細胞表面タンパク質が挙げられる。したがって本開示の多重特異性抗体は、好ましい一態様において、がん幹細胞抗原ペプチドとＭＨＣ分子との複合体を認識する抗原結合部位以外に、ＣＤ３および／またはＣＤ２８に対する結合領域を有する。かかる結合領域は、抗原結合部位であってもよいし、例えばＣＤ２８に対するリガンドとしてＣＤ８０などであってもよい。
【００３１】
本発明者らにより、上述のナチュラル抗原ペプチドＤＮＡＪＢ８−１４３、ＳＦ９、およびＬＶ９について、これらの抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２との複合体を認識する抗原結合部位を有する抗体がスクリーニングされた。したがって本開示の好ましい一態様において、がん幹細胞抗原ペプチドとＭＨＣ分子との複合体を認識する抗原結合部位は、配列番号７〜１４および配列番号２４〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列、または、ＧＮＴ、ＤＧＴもしくはＨＤＳで示されるアミノ酸配列を含むものである。本開示の好ましい別の一態様において、がん幹細胞抗原ペプチドとＭＨＣ分子との複合体を認識する抗原結合部位は、配列番号７〜１４および配列番号２４〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１個または２個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むものであってもよい。当該アミノ酸置換は、酸性アミノ酸同士の置換、塩基性アミノ酸同士の置換、または、中性アミノ酸同士の置換などの保存的置換が好ましい。
【００３２】
本開示の抗体の典型例としては、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるがん幹細胞抗原ペプチド（ＤＮＡＪＢ８−１４３）とＨＬＡ−Ａ２４の複合体を認識する抗原結合部位を有する特異抗体、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるがん幹細胞抗原ペプチド（ＳＦ９）とＨＬＡ−Ａ２４の複合体を認識する抗原結合部位を有する特異抗体、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるがん幹細胞抗原ペプチド（ＤＮＡＪＢ８−１４３）とＨＬＡ−Ａ２４の複合体を認識する抗原結合部位およびＣＤ３を認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるがん幹細胞抗原ペプチド（ＳＦ９）とＨＬＡ−Ａ２４の複合体を認識する抗原結合部位およびＣＤ３を認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるがん幹細胞抗原ペプチド（ＤＮＡＪＢ８−１４３）とＨＬＡ−Ａ２４の複合体を認識する抗原結合部位、ＣＤ３を認識する抗原結合部位およびＣＤ２８を認識する抗原結合部位を有する三重特異性抗体、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるがん幹細胞抗原ペプチド（ＳＦ９）とＨＬＡ−Ａ２４の複合体を認識する抗原結合部位、ＣＤ３を認識する抗原結合部位およびＣＤ２８を認識する抗原結合部位を有する三重特異性抗体、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるがん幹細胞抗原ペプチド（ＤＮＡＪＢ８−１４３）とＨＬＡ−Ａ２４の複合体を認識する抗原結合部位、ＣＤ３を認識する抗原結合部位およびＣＤ８０領域を有する三重特異性抗体、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるがん幹細胞抗原ペプチド（ＳＦ９）とＨＬＡ−Ａ２４の複合体を認識する抗原結合部位、ＣＤ３を認識する抗原結合部位およびＣＤ８０領域を有する三重特異性抗体などが挙げられる。
本開示の抗体の別の典型例としては、配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるがん幹細胞抗原ペプチド（ＬＶ９））とＨＬＡ−Ａ０２の複合体を認識する抗原結合部位を有する特異抗体、配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるがん幹細胞抗原ペプチド（ＬＶ９）とＨＬＡ−Ａ０２の複合体を認識する抗原結合部位およびＣＤ３を認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体、配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるがん幹細胞抗原ペプチド（ＬＶ９）とＨＬＡ−Ａ０２の複合体を認識する抗原結合部位、ＣＤ３を認識する抗原結合部位およびＣＤ２８を認識する抗原結合部位を有する三重特異性抗体、配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるがん幹細胞抗原ペプチド（ＬＶ９）とＨＬＡ−Ａ０２の複合体を認識する抗原結合部位、ＣＤ３を認識する抗原結合部位およびＣＤ８０領域を有する三重特異性抗体などが挙げられる。
【００３３】
本開示の抗体は、抗原結合部位に、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、相補性決定領域（ＣＤＲ）２、および相補性決定領域（ＣＤＲ）３の少なくとも１つを含み、重鎖および軽鎖の両方に、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、相補性決定領域（ＣＤＲ）２、および相補性決定領域（ＣＤＲ）３の少なくとも１つを含むことが好ましい。
本開示の抗体は、好ましい一態様において、抗原結合部位に、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）３として、配列番号７および／または配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む。別の好ましい一態様において、抗原結合部位に、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）３として、配列番号９および／または配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む。さらに別の好ましい一態様において、抗原結合部位に、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）３として、配列番号１１および／または配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む。さらに別の好ましい一態様において、抗原結合部位に、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）３として、配列番号１３および／または配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む。
さらに本開示の抗体は、好ましい一態様において、その抗原結合部位が、アミノ酸配列番号７〜１４のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１個または２個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むものであってもよい。
また本開示の抗体は、好ましい一態様において、抗原結合部位に、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）１として、配列番号２４および／または配列番号２７に記載のアミノ酸配列、相補性決定領域（ＣＤＲ）２として、配列番号２５に記載のアミノ酸配列および／またはＧＮＴで示されるアミノ酸配列、並びに、相補性決定領域（ＣＤＲ）３として、配列番号２６および／または配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む。別の好ましい一態様において、抗原結合部位に、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）１として、配列番号２９および／または配列番号３２に記載のアミノ酸配列、相補性決定領域（ＣＤＲ）２として、配列番号３０に記載のアミノ酸配列および／またはＤＧＴで示されるアミノ酸配列、並びに、相補性決定領域（ＣＤＲ）３として、配列番号３１および／または配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含む。さらに別の好ましい一態様において、抗原結合部位に、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）１として、配列番号３４および／または配列番号３７に記載のアミノ酸配列、相補性決定領域（ＣＤＲ）２として、配列番号３５に記載のアミノ酸配列および／またはＨＤＳで示されるアミノ酸配列、並びに、相補性決定領域（ＣＤＲ）３として、配列番号３６および／または配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む。
さらに本開示の抗体は、好ましい一態様において、その抗原結合部位が、配列番号２４〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１個または２個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むものであってもよい。
なお、本開示の抗体において、３つのＣＤＲのなかでも特にＣＤＲ３が抗原結合に重要である。
【００３４】
＜２＞本開示の医薬組成物
本開示の一側面は、本開示の抗体を含む医薬組成物に関する。上述のとおり本開示の抗体は、がん幹細胞の表面に抗原提示されたがん幹細胞抗原ペプチドを特異的に認識することができるため、種々の用途の医薬組成物の有効成分として用いることができる。したがって本開示の医薬組成物に有効成分として含まれる本開示の抗体としては、上記＜１＞において詳述した任意の抗体を用いることができる。
【００３５】
本開示の医薬組成物は、本開示の抗体を有効成分として含む。本開示の医薬組成物は、がん幹細胞を処置するための処置剤（すなわちがん治療剤）として利用できるだけでなく、例えばがん幹細胞の検出剤、処置対象である患者のがんワクチン免疫療法に対する有効性を診断するためのコンパニオン診断剤などの用途にも用いることができる。
【００３６】
上述のとおり、好ましい一態様にて本開示の抗体は、ＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣＣ活性を有する。すなわち本開示の抗体は、本開示の抗体は、がん幹細胞の表面に提示されているがん幹細胞抗原ペプチドを認識し、がん幹細胞表面に結合することで、当該がん幹細胞に対する傷害活性を発揮することができる。したがって、好ましい一態様において、本開示の医薬組成物は、がんを予防および／または処置するための医薬組成物である。
【００３７】
ここでがんの「予防」には、患者のがんへの罹患の予防だけでなく、手術により原発巣の腫瘍を切除した患者における再発予防、手術、放射線療法もしくは薬物療法等のがん治療により完全に除去できなかった腫瘍の転移防止等が含まれる。また、がんの「処置」には、がんを縮小させるがんの治癒・症状改善のみでなく、がん細胞の増殖、腫瘍の拡大もしくは原発巣からのがん細胞の転移を抑制する進行防止等が含まれる。
【００３８】
本開示の医薬組成物は、腫瘍を有し得るあらゆる生物個体に対して投与することができるが、好ましくはヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの齧歯類、チンパンジーなどの霊長類、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの偶蹄目、ウマなどの奇蹄目、ウサギ、イヌ、ネコなど）の個体であり、より好ましくはヒトの個体を投与対象とするものである。
【００３９】
また本開示の医薬組成物を腫瘍検出剤として用いる場合、検出対象の細胞集団は、上記生物個体から得られた任意の生体試料由来の細胞集団に対して用いることが可能であるが、好ましくはヒトから得られた生体試料に由来する細胞集団であり、より好ましくは組織の細胞においてＤＮＡＪＢ８またはＦＡＭ８３ＢまたはＢＯＲＩＳ  ｓｆ６がほとんど発現していないことが確認されている精巣以外の組織、例えば心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸および血液からなる群から選択される１または２以上の生体試料に由来する細胞を含む細胞集団である。
【００４０】
上述のとおり本開示の抗体の好ましい一態様は、ＤＮＡＪＢ８タンパク質またはＦＡＭ８３Ｂタンパク質に由来するがん幹細胞抗原ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４との複合体を認識する抗原結合部位を有するものである。また、本開示の抗体の好ましい別の一態様は、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ６タンパク質に由来するがん幹細胞抗原ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ０２との複合体を認識する抗原結合部位を有するものである。したがって、本開示の医薬組成物は、特にＤＮＡＪＢ８を発現するがんまたはＦＡＭ８３Ｂを発現するがんまたはＢＯＲＩＳ  ｓｆ６を発現するがんを罹患する対象に対して好適に用いることができる。また、特にＨＬＡとしてＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２を有する対象に対して好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸癌、肺癌、乳癌、骨髄腫、口腔癌、膵癌、皮膚癌、前立腺癌等のがん（腫瘍）の予防または処置のために使用することができる。 
【００４１】
また近年、がん細胞が免疫細胞による攻撃を遮蔽することにより、免疫系による排除を回避していること、かかる遮蔽は、もともと自己に対する過剰な免疫反応や正常組織に対する障害を抑えるために備わっている「免疫チェックポイント」と呼ばれるメカニズムを利用していることなどがわかってきた。したがって、がん細胞において免疫チェックポイントの機能を抑制することにより、免疫細胞による攻撃を効果的なものとすることができる。本開示の医薬組成物は、一態様において、有効成分である抗体が結合したがん幹細胞を傷害することができる免疫細胞を利用することにより抗腫瘍効果を発揮するものであるため、免疫チェックポイントの機能を併せて抑制することにより、より高い治療効果を発揮することができると考えられる。したがって好ましい一態様において、本開示の医薬組成物は、免疫チェックポイント阻害剤とともに用いられる。
【００４２】
本開示において、ある剤Ａと別の剤Ｂとを「ともに用いる」または「併用する」という場合、剤Ａが効果を発揮している間に剤Ｂが効果を発揮する状態にすることをいう。したがって、剤Ａの投与と同時に剤Ｂを投与してもよいし、剤Ａの投与後一定の間隔を空けて剤Ｂを投与してもよい。また、剤Ａと剤Ｂとは同一の投与形態であってもよいし、異なる投与形態であってもよい。さらに、剤Ａまたは剤Ｂがその効果を喪失してしまわない限り、剤Ａと剤Ｂとを混合して一つの組成物としてもよい。
【００４３】
本態様における免疫チェックポイント阻害剤としては、本開示の医薬組成物の抗原認識能力を阻害しない限り、免疫チェックポイント阻害剤として公知である任意の剤を用いることができる。免疫チェックポイント阻害剤として知られたものとしては、これに限定するものではないが、例えば抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、抗Ｂ７−Ｈ４抗体、抗Ｂ７−Ｈ５抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体などが挙げられる。
【００４４】
また、本開示の医薬組成物の剤形としては、特に限定はないが、油乳濁液（エマルション製剤）、高分子ナノ粒子、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤、マイクロスフェア製剤、マイクロカプセル製剤などが挙げられる。
投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などの既知の任意の投与方法が挙げられる。製剤中の本開示の医薬組成物の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００４５】
また、上述のとおり、本開示の抗体の有する抗原結合部位を組み込んだキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を導入されたＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）を用いた養子免疫細胞療法によりがんを処置することも可能である。本開示において、「キメラ抗原受容体」は、がん細胞の細胞表面に存在する分子を認識する抗体の抗体可変領域の軽鎖と重鎖を直列に結合させた単鎖抗体（ｓｃＦｖ）をＮ末端側に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体を構成する分子のうちＣＤ３ζ鎖をＣ末端側に持つように設計されたキメラタンパク分子である。このキメラ抗原受容体は、ｓｃＦｖ領域で特定の抗原を認識すると、ＣＤ３ζ鎖を介してＴ細胞の活性化が生じる。Ｔ細胞の活性化を増強するために、ｓｃＦｖとζ鎖の間に１または２以上の共刺激分子（例えばＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳなど）を組み込んでもよい。したがって、ｓｃＦｖとして、本開示の抗体を用いてＣＡＲを作製することができる。がん幹細胞抗原ペプチドとＭＨＣとの複合体を認識するＣＡＲは、ＣＴＬが標的とし得るがん幹細胞抗原ペプチドを提示しているがん幹細胞、がん幹細胞を貪食してＭＨＣクラスＩ上に腫瘍抗原ペプチドを提示している樹状細胞などを認識することができるため、前記ＣＡＲを導入した遺伝子改変Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）を含む医薬組成物もまた、本開示の医薬組成物に包含される。
【００４６】
＜３＞腫瘍の検出方法（検査方法、診断方法）
本開示の一側面は、本開示の抗体を利用した腫瘍の検出方法（検査方法、診断方法）に関する。
本開示の抗体を用いる本開示の検出方法（診断方法）は、典型的には、被験者の血液を採取するか、もしくは腫瘍が疑われる被験組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこに含まれるがん幹細胞抗原ペプチドとＭＨＣ分子との複合体を有する細胞の量を、本開示の抗体によって検出・測定することにより、大腸癌、肺癌、乳癌、骨髄腫、口腔癌、膵癌、皮膚癌、前立腺癌等のがん（腫瘍）の罹患の有無またはその程度を検出、検査または診断するものである。
【００４７】
本開示の抗体を用いる本開示の検出（検査）方法の特定の態様は、次の（ａ）および（ｂ）、および任意に（ｃ）の工程を含むものである：
（ａ）被験者から得られた生体試料と本開示の腫瘍検出剤とを接触させる工程、
（ｂ）該生体試料中のがん幹細胞抗原ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を提示する細胞の量を、上記腫瘍検出剤が結合した細胞の量を指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の結果をもとに、がんの罹患を判断する工程。
本開示の抗体を用いる本開示の診断方法の特定の態様は、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の工程を含む。
ここで用いられる生体試料としては、被験者の生体組織（がん細胞の存在が疑われる組織およびその周辺組織、または血液など）から調製される試料を挙げることができる。具体的には、該組織から採取された組織細胞を含む試料などを挙げることができる。
【００４８】
腫瘍の有無の予測、判定、判断または診断は、例えば、被験者の血液や腫瘍が疑われる被験組織における本開示の抗体が結合した細胞の量を測定することにより行うことができる。その際、場合によっては正常な対応組織における本開示の抗体が結合した細胞レベル等を基準値として、該基準値と被験者から得られた試料における前記レベルとを比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる。
ここで被験者の被験組織と正常な対応組織との前記レベルの比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。並行して行わない場合は、複数（少なくとも２つ、好ましくは３以上、より好ましくは５以上）の正常な組織を用いて均一な測定条件で測定して得られた本開示の抗体が結合する細胞の量の平均値または統計的中間値を、正常者の値すなわち基準値として、比較に用いることができる。
【００４９】
被験者が、がんに罹患しているかどうかの判断は、例えば該被験者の組織における本開示の抗体が結合する細胞が、正常者のそれらのレベルと比較して例えば２倍以上、好ましくは３倍以上多いことを指標として行うことができる。
【００５０】
＜４＞がんの予防および／または処置方法
本開示の一側面はまた、対象におけるがんを予防および／または処置する方法であって、本開示の抗体またはＣＡＲ−Ｔ細胞の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法にも関する。
本開示における「対象」は、がんに罹患し得る生物個体であればいかなる生物個体であってもよいが、好ましくはヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの齧歯類、チンパンジーなどの霊長類、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの偶蹄目、ウマなどの奇蹄目、ウサギ、イヌ、ネコなど）の個体であり、より好ましくはヒトの個体である。本開示において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、がんの予防および／または処置が企図される場合には、典型的にはがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。本開示の一態様において、対象はＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２陽性である。本開示の好ましい一態様において、対象はＤＮＡＪＢ８またはＦＡＭ８３ＢまたはＢＯＲＩＳ  ｓｆ６陽性のがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する。本開示の一態様において、対象はＨＬＡ−Ａ２４陽性であり、かつ、ＤＮＡＪＢ８またはＦＡＭ８３Ｂ陽性のがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する。本開示の別の一態様において、対象はＨＬＡ−Ａ０２陽性であり、かつ、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ６陽性のがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する。 
【００５１】
本開示の予防／処置方法に用いる本開示の抗体およびＣＡＲ−Ｔ細胞としては、本明細書に記載の任意のものが挙げられる。本開示における有効量とは、例えば、がんの症状を低減し、またはその進行を遅延もしくは停止する量であり、好ましくは、がんを抑制し、または治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラットなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。有効成分の具体的な用量は、それを必要とする対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、処置への反応性、剤形、および処置に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
【００５２】
具体的な用量としては、例えば、本開示の抗体の場合、通常、０．０００１ｍｇ〜２０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜２０００ｍｇであり、これを１週間〜４週間に１回投与するのが好ましい。本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞の場合、通常、１×１０４〜１×１０８個、好ましくは１×１０５〜１×１０７個であり、これを１日〜４週間に１回投与するのが好ましい。また、投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などの既知の任意の適切な投与方法を用いることができる。
【００５３】
本開示の予防／処置方法の一態様は、投与する工程の前に、ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２陽性の対象を予防／処置の対象として選択する工程をさらに含む。本開示のこの態様は、上記選択する工程の前に、対象のＨＬＡ型を決定する工程をさらに含んでもよい。対象のＨＬＡ型の決定は、既知の任意の手法により行うことができる。また、本開示の予防／処置方法の一態様は、投与する工程の前に、ＤＮＡＪＢ８またはＦＡＭ８３ＢまたはＢＯＲＩＳ  ｓｆ６陽性のがんを有する対象を予防／処置の対象として選択する工程をさらに含む。本開示のこの態様は、上記選択する工程の前に、対象におけるＤＮＡＪＢ８またはＦＡＭ８３ＢまたはＢＯＲＩＳ  ｓｆ６陽性のがんを検出する工程をさらに含んでもよい。対象におけるＤＮＡＪＢ８またはＦＡＭ８３ＢまたはＢＯＲＩＳ  ｓｆ６陽性のがんの検出は、上記＜３＞に記載の腫瘍の検出方法を用いることができる。本開示の予防／処置方法の一態様は、投与する工程の前に、ＨＬＡ−Ａ２４陽性であり、かつ、ＤＮＡＪＢ８またはＦＡＭ８３Ｂ陽性のがんを有する対象、または、ＨＬＡ−Ａ０２陽性であり、かつ、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ６陽性のがんを有する対象を予防／処置の対象として選択する工程をさらに含む。本開示のこの態様は、上記選択する工程の前に、対象のＨＬＡ型を決定する工程および対象におけるＤＮＡＪＢ８またはＦＡＭ８３ＢまたはＢＯＲＩＳ  ｓｆ６陽性のがんを検出する工程をさらに含んでもよい。 
【００５４】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００５５】
例１．ＨＬＡ−Ａ２４／ナチュラル抗原ペプチド複合体に特異的な抗体のスクリーニング
（１）抗体ファージの作成
がん幹細胞抗原ペプチドとして、ＤＮＡＪＢ８タンパク質由来のナチュラル抗原ペプチドＤＮＡＪＢ８−１４３（配列番号５）およびＦＡＭ８３Ｂタンパク質由来のナチュラル抗原ペプチドＳＦ９（配列番号６）を用いて、ＨＬＡ−Ａ２４／ＤＮＡＪＢ８−１４３複合体およびＨＬＡ−Ａ２４／ＳＦ９複合体を認識するｓｃＦｖを、Tsukahara et al., J Biol Chem., 2014, Aug 8;289(32):22035-47に記載のファージディスプレイ法と同様の方法を用いて同定した。なお、以下の実施例１〜５において「がん幹細胞抗原ペプチド」は、ＤＮＡＪＢ８−１４３およびＳＦ９を意味する。 
具体的にはまず、ｓｃＦｖライブラリから、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ領域）および軽鎖可変領域（ＶＬ領域）をリンカーで結合したペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだファージミドベクターを作製し、大腸菌に感染させた。これにヘルパーファージをさらに感染させて、ＶＨ領域およびＶＬ領域がリンカーで結合されたｓｃＦｖを提示するＭ１３ファージ（抗体ファージ）を作製した。【００５６】
（２）バイオパニング
バイオパニングの前に、ファージライブラリから、ＨＬＡ−Ａ２４とＨＩＶペプチド（ＲＹＬＲＤＱＱＬＬＧＩ（配列番号１５））との複合体をビオチン修飾したものとストレプトアビジン結合磁気ビーズとを用いて、非特異的結合ファージを除去した。残った抗体ファージから、ビオチン修飾ＨＬＡ−Ａ２４／ＤＮＡＪＢ８−１４３複合体またはビオチン修飾ＨＬＡ−Ａ２４／ＳＦ９複合体とストレプトアビジン結合磁気ビーズとを用いて、それぞれの複合体に結合する抗体ファージを選抜する（ポジティブパニング）工程を３回繰り返し、ＨＬＡ−Ａ２４／ナチュラル抗原ペプチド複合体に特異的に結合する候補抗体ファージを得た。【００５７】
（３）ｓｃＦｖ抗体のＩｇＧ１型への変換とＦＡＣＳ解析
得られた候補抗体ファージからｓｃＦｖ部分を切り離し、ＶＬ領域の後ろにＦＬＡＧタグを標識し、ＨＬＡ−Ａ２４／ＤＮＡＪＢ８−１４３複合体またはＨＬＡ−Ａ２４／ＳＦ９複合体に対する反応性を、ＦＡＣＳを用いて解析した。解析の結果、反応性の高かったクローンを選抜し、ＦＬＡＧタグに代えてヒトＩｇＧ１の重鎖Ｆｃ領域（ＣＨ２およびＣＨ３領域、配列番号１９）を連結し、ｓｃＦｖ抗体をＩｇＧ１型に変換した。ＩｇＧ１型に変換した抗体（ｓｃＦｖ−ｈＩｇＧ１）を用いて、さらにＦＡＣＳ解析を行い、特に反応性の高かったクローン（ＤＮＡＪＢ８−１４３：クローンＡ１０およびクローンＢ１０、ＳＦ９：クローン４およびクローン１１）を選抜した。【００５８】
これらのクローンのＣＤＲ３領域の配列は以下のとおりであった。
クローンＡ１０  ＶＨ領域：ＣＡＲＶＧＷＤＬＬＧＲＡＦＤＩＷ（配列番号７）
クローンＡ１０  ＶＬ領域：ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＧＶＶＦ（配列番号８）
クローンＢ１０  ＶＨ領域：ＣＡＲＤＧＥＭＡＴＶＶＡＧＰＦＤＮＷ（配列番号９）
クローンＢ１０  ＶＬ領域：ＣＱＶＷＤＳＳＶＶＦ（配列番号１０）
クローン４  ＶＨ領域：ＣＡＫＤＩＧＳＧＷＦＳＭＤＶＷ（配列番号１１）
クローン４  ＶＬ領域：ＣＡＫＤＩＧＳＧＷＦＳＭＤＶＷ（配列番号１２）
クローン１１  ＶＨ領域：ＣＡＫＧＫＹＳＧＳＹＹＡＬＤＹＷ（配列番号１３）
クローン１１  ＶＬ領域：ＣＱＳＹＤＳＳＬＳＧＳＶＦ（配列番号１４）【００５９】
例２．ペプチドタイトレーションアッセイ
ＨＬＡ−Ａ２４を発現するＴ２細胞（Ｔ２−Ａ２４細胞）に様々な濃度（それぞれ５０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、５００ｐｇ／ｍＬ、５０ｐｇ／ｍＬ、５ｐｇ／ｍＬ）でナチュラル抗原ペプチドをパルスしたものと、例１で得られた抗体クローンとを反応させ、抗体の反応限界濃度を算出した。ネガティブコントロールとして、ＨＩＶ（配列番号１５）、ＥＢＶ（ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ（配列番号１６））、ＣＭＶ（ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ（配列番号１７））ペプチドをそれぞれ５０μｇ／ｍＬでパルスしたものを用いた。
結果を図２に示す。いずれのクローンも、５ｎｇ／ｍＬ程度の反応検出限界であった。【００６０】
例３．抗原提示細胞との反応性
（１）ペプチドパルスＴ２−Ａ２４細胞との反応性
例２で得られたｓｃＦｖ−ｈＩｇＧ１抗体が、実際に細胞表面に抗原を提示する細胞と反応するか否かを試験した。Ｔ２−Ａ２４細胞に終濃度５０μｇ／ｍＬに調製したＤＮＡＪＢ８−１４３、ＨＩＶ、ＣＭＶおよびＥＢＶをパルスしたものに、例２で得られたＡ１０抗体およびＢ１０抗体を終濃度１０μｇ／ｍＬで反応させ、抗ｈＩｇＧ−ＰＥで免疫染色して観察した。クローン１１抗体についても、終濃度１００μｇ／ｍＬに調製したＳＦ９およびＨＩＶでＴ２−Ａ２４細胞をパルスした以外は同様に観察した。
結果を図３に示す。各がん幹細胞抗原ペプチドでパルスしたＴ２−Ａ２４細胞表面にｓｃＦｖ−ＩｇＧ１抗体が結合していることが観察された。【００６１】
（２）各タンパク質を発現するがん細胞との反応性
次に実際のがん細胞に対する反応性を試験した。Ａ１０抗体およびＢ１０抗体の試験ではヒト結腸腺癌細胞株ＨＴ２９（ＨＬＡ−Ａ２４（＋）およびＤＮＡＪＢ８（＋））、ＤＮＡＪＢ８を過剰発現させたＨＴ２９およびヒト腎腺癌細胞株ＡＣＨＮ（ＨＬＡ−Ａ２４（−）およびＤＮＡＪＢ８（＋））を、クローン１１抗体の試験ではヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０のＳＰ画分細胞（ＨＬＡ−Ａ２４（＋）およびＦＡＭ８３Ｂ（＋））をそれぞれ用いた以外は（１）と同様に試験した。
結果を図４に示す。各癌細胞表面においてもＴ２−Ａ２４細胞と同様に、ｓｃＦｖ−ｈＩｇＧ１抗体が細胞表面に結合していることが確認された。したがって、本開示の抗体は、内在的に提示されたナチュラル抗原ペプチドも認識することができることが示された。【００６２】
例４．補体依存性細胞傷害（ＣＤＣＣ）活性の確認
（１）ペプチドパルスＴ２−Ａ２４細胞に対する細胞傷害活性
例３（１）と同様にペプチドをパルスしたＴ２−Ａ２４細胞と終濃度１０μｇ／ｍＬに調製した各抗体とを反応させ、蛍光標識としてＰＥ抱合抗Ｃ３ｂ抗体およびＤＡＰＩを用いて観察した。ＣＤＣＣ活性が確認される場合、細胞周辺にＣ３ｂが結合して赤く染色され、ＣＤＣＣ活性により細胞膜が破壊されてＤＡＰＩが細胞内に流入し、核が青く染色される。
結果を図５に示す。いずれの抗体でも、がん幹細胞抗原ペプチドをパルスしたＴ２−Ａ２４に対するＣＤＣＣ活性が観察された。【００６３】
（２）がん幹細胞に対する細胞傷害活性
ヒト結腸腺癌細胞株ＨＴ２９（ＨＬＡ−Ａ２４（＋）およびＤＮＡＪＢ８（＋））に代えてヒト腎細胞がＣａｋｉ−１（ＨＬＡ−Ａ２４（＋）およびＤＮＡＪＢ８（＋））を用いた以外は例３（２）と同じ細胞を用いて、例４（１）と同様に試験した。
結果を図６に示す。実際の癌細胞もＴ２−Ａ２４細胞と同様に細胞膜の傷害によるＤＡＰＩの流入が観察された。したがって内在的にがん幹細胞抗原を提示するがん細胞に対してもＣＤＣＣ活性が確認された。したがって本開示の抗体は、ナチュラル抗原ペプチドを内在的に提示する細胞を傷害することができることが示された。【００６４】
また、Ｃａｋｉ−１細胞を、３７℃、５％ＣＯ２条件下、血清入り培地でクローンＡ１０またはクローンＢ１０と７時間共培養した後ＦＡＣＳで解析したところ、クローンＡ１０では４．２３％の細胞に、クローンＢ１０では２３．３６％の細胞にＰＥの蛍光である赤色およびＤＡＰＩの蛍光である青色が両方観察された。【００６５】
例５．二重特異性抗体ＢｉＴＥの解析
（１）ＢｉＴＥの作製および各細胞との結合性
Stadler et al., Nature Medicine volume 23, pages 815-817 (2017)に記載の方法と同様の方法を用いて、クローンＡ１０、クローンＢ１０、クローン４およびクローン１１の各抗体のｓｃＦｖに、抗ＣＤ３のｓｃＦｖ（配列番号２１）を連結して、それぞれの二重特異性抗体ＢｉＴＥを作製した。かかるＢｉＴＥを用いて、がん幹細胞抗原ペプチドをパルスしたＴ２−Ａ２４細胞、Ｔ細胞およびＮＫ細胞に対する結合性を試験した。各ＢｉＴＥは、がん幹細胞抗原ペプチドをパルスしたＴ２−Ａ２４細胞との結合性を示した。またＴ細胞とも高い結合性を示したが、ＮＫ細胞とは結合性を示さなかった。 【００６６】
（２）細胞傷害活性
（１）で作製したＢｉＴＥとＴ細胞を混合し、がん幹細胞抗原ペプチドをパルスしたＴ２−Ａ２４細胞と、ＦＩＴＣ標識したアネキシンＶおよびプロピジウムヨーダイド（ＰＩ）の存在下で共培養した。２．５時間および５時間後にそれぞれＦＡＣＳで蛍光を解析したところ、コントロール（無処理およびＴ細胞のみ）の場合は２．５時間後および５時間後においてＦＩＴＣおよびＰＩの蛍光が両方観察された細胞にほとんど変化がなかったのに対し、ＢｉＴＥの存在下で共培養した場合は、ＦＩＴＣおよびＰＩの蛍光が両方観察された細胞は、２．５時間後と比較して５時間後において顕著な増加が見られた。【００６７】
例６．ＨＬＡ−Ａ０２／ナチュラル抗原ペプチド複合体に特異的な抗体のスクリーニング
（１）抗体ファージの作成
がん幹細胞抗原ペプチドとして、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ６に固有の配列である配列番号２２で表されるポリペプチド由来のナチュラル抗原ペプチドＬＶ９（配列番号２３）を用いて、ＨＬＡ−Ａ０２／ＬＶ９複合体を認識するｓｃＦｖを、Tsukahara et al., J Biol Chem., 2014, Aug 8;289(32):22035-47に記載のファージディスプレイ法と同様の方法を用いて同定した。なお、実施例６において「がん幹細胞抗原ペプチド」は、ＬＶ９を意味する。 
具体的にはまず、ｓｃＦｖライブラリから、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ領域）および軽鎖可変領域（ＶＬ領域）をリンカーで結合したペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだファージミドベクターを作製し、大腸菌に感染させた。これにヘルパーファージをさらに感染させて、ＶＨ領域およびＶＬ領域がリンカーで結合されたｓｃＦｖを提示するＭ１３ファージ（抗体ファージ）を作製した。【００６８】
（２）バイオパニング
バイオパニングの前に、ファージライブラリから、ＨＬＡ−Ａ０２とＨＩＶペプチド（ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（配列番号３９））との複合体をビオチン修飾したものとストレプトアビジン結合磁気ビーズとを用いて、非特異的結合ファージを除去した。残った抗体ファージから、ビオチン修飾ＨＬＡ−Ａ０２／ＬＶ９複合体とストレプトアビジン結合磁気ビーズとを用いて、それぞれの複合体に結合する抗体ファージを選抜する（ポジティブパニング）工程を３回繰り返し、ＨＬＡ−Ａ０２／ナチュラル抗原ペプチド複合体に特異的に結合する候補抗体ファージを得た。【００６９】
（３）ｓｃＦｖ抗体のＩｇＧ１型への変換とＦＡＣＳ解析
得られた候補抗体ファージからｓｃＦｖ部分を切り離し、ＶＬ領域の後ろにＦＬＡＧタグを標識し、ＨＬＡ−Ａ０２／ＬＶ９複合体に対する反応性を、ＦＡＣＳを用いて解析した。解析の結果、候補ｓｃＦｖ  ２３個より反応性の高かったクローンを選抜し、ＦＬＡＧタグに代えてヒトＩｇＧ１の重鎖Ｆｃ領域（ＣＨ２およびＣＨ３領域、配列番号１９）を連結し、ｓｃＦｖ抗体をＩｇＧ１型に変換した。ＩｇＧ１型に変換した抗体（ｓｃＦｖ−ｈＩｇＧ１）を用いて、さらにＦＡＣＳ解析を行い、特に反応性の高かったクローン（ＬＶ９：クローン１１、クローン１３、およびクローン１９）を選抜した。
いずれの抗体も２００μｇ／ｍＬの濃度で反応性が高かったが、クローン１９の反応性が最も高かった。ネガティブコントロールとして、ＨＩＶ（ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（配列番号３９））、ＥＢＶ（ＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号４０））、ＣＭＶ（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号４１））ペプチドをそれぞれ２００μｇ／ｍＬでパルスしたものを用いた。結果を図７に示す。【００７０】
これらのクローンのＣＤＲ１〜３領域の配列は以下のとおりであった。
クローン１１  ＶＨ領域
ＣＤＲ１領域の配列：ＧＦＴＦＤＫＹＧ（配列番号２４）
ＣＤＲ２領域の配列：ＩＴＷＮＳＧＫＶ（配列番号２５）
ＣＤＲ３領域の配列：ＣＡＲＤＬＧＹＹＹＤＳＳＧＹＬＫＰＴＧＳＧＦＤＹＷ（配列番号２６）
クローン１１  ＶＬ領域
ＣＤＲ１領域の配列：ＳＳＮＩＧＡＧＹＤ（配列番号２７）
ＣＤＲ２領域の配列：ＧＮＴ
ＣＤＲ３領域の配列：ＣＧＴＷＤＳＳＬＳＶＶＬＦ（配列番号２８）
クローン１３  ＶＨ領域
ＣＤＲ１領域の配列：ＧＹＴＦＴＧＹＹ（配列番号２９）
ＣＤＲ２領域の配列：ＩＳＴＶＦＮＴＰ（配列番号３０）
ＣＤＲ３領域の配列：ＣＡＲＳＹＳＧＳＬＱＤＡＦＤＩＷ（配列番号３１）
クローン１３  ＶＬ領域
ＣＤＲ１領域の配列：ＮＬＫＲＫＮ（配列番号３２）
ＣＤＲ２領域の配列：ＤＧＴ
ＣＤＲ３領域の配列：ＣＱＶＷＤＩＤＳＥＤＹＶＦ（配列番号３３）
クローン１９  ＶＨ領域
ＣＤＲ１領域の配列：ＴＹＳＦＳＮＹＷ（配列番号３４）
ＣＤＲ２領域の配列：ＩＹＰＧＤＰＤＴ（配列番号３５）
ＣＤＲ３領域の配列：ＣＡＲＲＷＡＡＲＰＤＤＡＦＤＩＷ（配列番号３６）
クローン１９  ＶＬ領域
ＣＤＲ１領域の配列：ＮＩＥＳＫＩ（配列番号３７）
ＣＤＲ２領域の配列：ＨＤＳ
ＣＤＲ３領域の配列：ＣＱＶＷＤＳＳＳＤＨＶＶＦ（配列番号３８）
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本開示の抗体は、内在的に提示されたナチュラル抗原ペプチドに対して反応することができ、さらには液性免疫反応により細胞傷害活性を示す。そのため、既存治療に抵抗性を示す難治性の癌、肉腫患者に対して、がん幹細胞を標的とした免疫療法を行うことが可能となる。また、細胞傷害機序が液性免疫であるため、投与対象の免疫力に依存しないがんワクチン免疫療法を実施することができ、抗がん剤としてもがん免疫療法としても高い効果が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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