(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列における１個又は２個以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加したアミノ酸配列を含むβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列か、又は、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列における１個又は２個以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加したアミノ酸配列を含むβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列表における配列番号４に示す塩基配列か、遺伝子の縮重に基づきコードするアミノ酸配列を変えることなく配列表における配列番号４に示す塩基配列における１個又は２個以上の塩基を他の塩基で置換した塩基配列又はそれらの塩基配列に相補的な塩基配列を含んでなる請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項４】
配列表における配列番号５に示す塩基配列若しくはその塩基配列に相補的な塩基配列を含んでなる請求項２又は３記載のＤＮＡ。
【請求項５】
自律複製可能なベクターをさらに含んでなる請求項２乃至４のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項６】
請求項２乃至５のいずれかに記載のＤＮＡを適宜の宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項７】
請求項６記載の形質転換体を培養する工程と、産生したβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドを培養物から採取する工程を含んでなるβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は酵素活性を有するポリペプチド、詳細には、微生物由来の遺伝子を発現させて得ることのできるβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
キシロシルフラクトシドやラクトスクロースを始めとするフラクトフラノシル転移糖は、顕著な抗う蝕作用とビフィズス菌増殖促進作用を有し、蔗糖に代わる新しい甘味剤として、現在、食品分野や医薬品分野で大いに注目されている。フラクトフラノシル転移糖は、通常、蔗糖と澱粉糖や乳糖などを原料として用い、これらにβ−フラクトフラノシダーゼを作用させて製造される。斯界においては、これまでバチルス属やアルスロバクター属の微生物由来のβ−フラクトフラノシダーゼが頻用されてきたが、従来公知の微生物はいずれもβ−フラクトフラノシダーゼ産生能が低く、フラクトフラノシル転移糖を大規模に生産しようとすると、微生物を大量に培養しなければならないという問題がある。
【０００３】
ところで、昨今の組換えＤＮＡ技術の進歩には目覚ましいものがある。今日では、全アミノ酸配列が解明されていない酵素であっても、これをコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を解明できれば、その酵素をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作製し、これを微生物や動植物の細胞に導入して得られる形質転換体を培養すれば、比較的容易に所望量の酵素が取得できるようになった。斯かる状況に鑑み、β−フラクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を突き止め、その塩基配列を解明するのが斯界の急務となっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
斯かる状況に鑑み、この発明の第一の課題は、組換えＤＮＡ技術を適用することにより、容易に大量生産可能なβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドを提供することにある。
【０００５】
また、この発明の第二の課題は、斯かるポリペプチドをコードするＤＮＡを提供することにある。
【０００６】
加えて、この発明の第三の課題は、斯かるＤＮＡを導入した形質転換体を提供することにある。
【０００７】
さらに加えて、この発明の第四の課題は、斯かる形質転換体を用いるβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法を提供することにある。
【０００８】
さらに加えて、この発明の第五の課題は、斯かるポリペプチドを用いるフラクトフラノシル転移方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
これらの課題を解決すべく、本発明者が鋭意研究したところ、部分アミノ酸配列として配列表における配列番号１及び２に示すアミノ酸配列の一部又は全部を有するβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドは、微生物由来の遺伝子を発現させることにより、所望量を容易に得られることが判明した。
【００１０】
すなわち、この発明は、前記第一の課題を、微生物由来の遺伝子を発現させて得ることができ、部分アミノ酸配列として配列表における配列番号１及び２に示すアミノ酸配列の一部又は全部を有するβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドにより解決するものである。
【００１１】
また、この発明は、前記第二の課題を、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡにより解決するものである。
【００１２】
加えて、この発明は、前記第三の課題を、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを導入してなる形質転換体により解決するものである。
【００１３】
さらに加えて、この発明は、前記第四の課題を、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを導入してなる形質転換体を培養する工程と、産生した該ポリペプチドを培養物から採取する工程を含んでなるβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法により解決するものである。
【００１４】
さらに加えて、この発明は前記第五の課題を、当該ポリペプチドの存在下でフラクトフラノシル供与体とフラクトフラノシル受容体を反応させる工程を含んでなるフラクトフラノシル転移方法により解決するものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、この発明の実施の形態について説明すると、この発明でいうポリペプチドとは、微生物由来の遺伝子を発現させて得ることができ、部分アミノ酸配列として配列表における配列番号１及び２に示すアミノ酸配列の一部又は全部を含んでなるβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド全般を包含するものとする。この発明のβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドは、通常、一部又は全部が解明されたアミノ酸配列を有しており、その一例として、例えば、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を含んでなるものが挙げられる。斯かるポリペプチドは、β−フラクトフラノシダーゼ活性に加えて、適宜のフラクトフラノシル供与体とフラクトフラノシル受容体間のフラクトフラノシル転移を触媒する作用を兼備し、次のような理化学的性質を有している。
（１）  分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定すると、分子量約４４，０００乃至５４，０００ダルトンを示す。
（２）  至適ｐＨ
４０℃で１０分間反応させると、約５．５乃至６．０に至適ｐＨを示す。
（３）  至適温度
ｐＨ６．０で１０分間反応させると、カルシウムイオン非存在下で４５℃付近に、また、カルシウムイオン存在下で５０℃付近に至適温度を示す。
（４）  ｐＨ安定性
４℃で２４時間インキュベートすると、ｐＨ約５．０乃至８．０で安定である。
（５）  温度安定性
ｐＨ６．０で１時間インキュベートすると、４５℃付近まで安定である。
【００１６】
ところで、斯界においては、ポリペプチドそのものの理化学的性質や宿主における発現効率を改善する目的で、人為的に、ポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換したり、あるいは、Ｎ末端付近、Ｃ末端付近及び／又は中間部のアミノ酸の１個又は２個以上を欠落させたり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に新たにアミノ酸を１個又は２個以上を付加することがある。この発明のβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドにおいても、斯かるアミノ酸配列の変更は当然あり得ることである。また、同じ遺伝子を用いる場合であっても、それを導入する宿主の種類や形質転換体の培養条件によっては、宿主内酵素によるＤＮＡ発現後の修飾により、配列番号１乃至３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端付近及び／又はＣ末端付近のアミノ酸の１個又は２個以上が欠落することがある。斯かる状況に鑑み、全体として配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列とは相違するアミノ酸配列を有するポリペプチドであっても、それがβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有し、かつ、部分アミノ酸配列として配列表における配列番号１及び２に示すアミノ酸配列の一部又は全部を含んでなるかぎり、当然、この発明に包含されるものとする。
【００１７】
この発明のβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドは、微生物由来の遺伝子を発現させることにより得ることができ、通常、宿主として、例えば、大腸菌、放線菌、枯草菌、酵母などの微生物を用い、斯かる宿主内でバチルス属の微生物由来の遺伝子、例えば、バチルス・スピーシーズＶ２３０株由来の遺伝子を発現させる。個々の遺伝子としては、例えば、配列表における配列番号４に示す塩基配列、より具体的には、配列番号５に示す塩基配列及びそれらの塩基配列に相補的な塩基配列のＤＮＡを含んでなるもの、さらには、遺伝子の縮重を利用して、コードするアミノ酸配列を変えることなく、それらの塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換したＤＮＡを含んでなるものが挙げられる。さらには、遺伝子が宿主内で当該ポリペプチドの産生を発現し易くするために、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡにおける塩基の１個又は２個以上を他の塩基で適宜置換したり、適宜のエンハンサーやプロモーターを連結し得ることは言うまでもない。
【００１８】
この発明で用いる遺伝子は、それが上述のような塩基配列のＤＮＡを含んでなるかぎり、それが天然に由来するものであるか、あるいは、人為的に合成されたものであるかは問わない。天然の給源としては、例えば、バチルス・スピーシーズＶ２３０株を始めとするバチルス属の微生物が挙げられ、斯かる微生物の菌体からはこの発明のＤＮＡを含む遺伝子が得られる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に植菌し、好気的条件下で約１日乃至３日間培養した後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該ＤＮＡを含む遺伝子を菌体外に溶出させる。このとき、細胞壁溶解酵素にプロテアーゼなどの蛋白質加水分解酵素を併用したり、菌体を超音波処理する際、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり、凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈澱、遠心分離、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理などの斯界における通常一般の方法を適用すれば目的とするＤＮＡが得られる。一方、ＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号４及び５に示す塩基配列に基づいて化学合成するか、配列番号３に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを自律増殖可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質転換体を培養し、培養物から菌体を採取し、その菌体から当該ＤＮＡを含むプラスミドを採取すればよい。なお、バチルス・スピーシーズＶ２３０株は岡山県の土壌から分離され、平成７年３月２４日以降、茨城県つくば市にある国際寄託当局としての通商産業省、工業技術院、生命工学工業技術研究所に寄託番号『ＦＥＲＭ  ＢＰ−５０５４』で寄託されている
【００１９】
斯かるＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形態で宿主に導入される。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律増殖可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられる。このうち、この発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるにはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、また、枯草菌で発現させるにはｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを２種以上の宿主内で増殖させる場合に有用である。
【００２０】
ベクターへの挿入には、斯界において、通常一般の方法が採用され、具体的には、先ず、ＤＮＡを含む遺伝子と自律増殖可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ  ３ＡＩ、Ｅｃｏ  ＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｂａｍ  ＨＩ、Ｓａｌ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉなどを用いれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
【００２１】
このようにして得られる組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母を始めとする適宜の宿主微生物に導入することができる。宿主が大腸菌の場合には、宿主を組換えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で培養すればよく、また、宿主が枯草菌の場合には、コンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。形質転換体をクローニングするには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、適宜のフラクトフラノシル供与体とフラクトフラノシル受容体を含む栄養培地で培養し、フラクトフラノシル転移物を生成するコロニーを選別すればよい。
【００２２】
斯くして得られる形質転換体は、栄養培地で培養すると、菌体内外に当該ポリペプチドを産生する。栄養培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を補足した通常一般の液体培地が使用され、個々の炭素源としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、果糖、蔗糖、トレハロースなどの糖質が、また、窒素源としては、例えば、アンモニア若しくはアンモニア塩、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げられる。形質転換体を斯かる栄養培地に植菌し、栄養培地を温度２０乃至６５℃、ｐＨ２乃至９に保ちつつ、通気撹拌などによる好気的条件下で約１乃至６日間培養すれば、当該ポリペプチドを含む培養物が得られる。この培養物は、酵素剤としてそのまま使用可能ではあるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、瀘過、遠心分離などにより当該ポリペプチドを菌体から分離し、超音波や細胞溶解酵素により菌体を破砕した後、瀘過、遠心分離などにより当該ポリペプチドを菌体又は菌体破砕物から分離し、精製する。精製には、酵素を精製するための通常の方法が採用でき、例えば、菌体又は菌体破砕物を除去した培養物に遠心分離、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル瀘過クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの１種又は２種以上を、適宜組合わせて適用すればよい。
【００２３】
前述のとおり、この発明のβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドは、フラクトフラノシル供与体とフラクトフラノシル受容体間のフラクトフラノシル転移を触媒するので、この発明のβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの存在下で、適宜のフラクトフラノシル供与体とフラクトフラノシル受容体を反応させれば、種々の有用なフラクトフラノシル転移物を得ることができる。フラクトフラノシル供与体として、通常、蔗糖、ラフィノース及びエルロースなどの分子内にβ−フラクトフラノシド結合を有する糖質が用いられ、また、フラクトフラノシル受容体として分子内にβ−フラクトフラノシド結合を有しない、例えば、キシロース、キシロオリゴ糖、ガラクトース、ガラクトオリゴ糖、乳糖、マルトース、マルトオリゴ糖、イソマルトース、イソマルトオリゴ糖などの還元性糖質、トレハロース、ネオトレハロースなどの非還元性糖質、ソルビトール、マルチトールなどの糖アルコール、さらには、グリセロール、エチレングリコールなどのアルコールが用いられる。これらを適宜組合せて用いることにより、有用なフラクトフラノシル転移物であるキシロシルフラクトシド、エルロース、イソマルトフラクトシド、ラクトスクロース、フラクトシルトレハロースなどが得られる。
【００２４】
反応条件としては、通常、フラクトフラノシル受容体１重量部に対してフラクトフラノシル供与体を約０．１乃至１０重量部、望ましくは、約０．５乃至５重量部用い、これらを水性媒体に濃度１０％（ｗ／ｗ）以上、望ましくは、２０乃至６０％（ｗ／ｗ）になるように溶解し、温度を約６０℃以下、望ましくは、約５乃至５５℃に、また、ｐＨを約３．５乃至８．０、望ましくは、約４．５乃至６．５の範囲に設定して反応させる。ポリペプチドの量は反応の進行具合により適宜選択すればよく、通常、フラクトフラノシル供与体固形分の１ｇ当り約０．１乃至５０単位用いると、約０．１乃至１００時間で反応が完結する。斯くして得られる反応物は、固形分当り、フラクトフラノシル転移物を約５％以上、通常、１０％以上含む。
【００２５】
反応物は、常法にしたがって濾過、遠心分離により不溶物を除去した後、活性炭やイオン交換樹脂による精製工程を経た後、濃縮してシラップにするか、必要とあらば、このシラップをさらに乾燥して粉末とする。フラクトフラノシル転移物の含量を高めるためには、例えば、斯かるシラップをインベルターゼ欠損酵母とともに培養して単糖類を除去するか、アルカリ溶液中で加熱処理して還元性糖質を分解するか、あるいは、膜濾過又はクロマトグラフィーにより夾雑物を分離すればよい。クロマトグラフィーを用いる方法としては、特開昭５８−２３７９９号公報及び特開昭５８−７２５９８号公報に開示された塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーが有用であり、この方法を適用するときには、所望量の高純度フラクトフラノシル転移物が最少のコストと労力で得られる。カラムクロマトグラフィーの方式としては、公知の固定床方式、移動床方式及び疑似移動床方式のいずれを適用してもよい。
【００２６】
斯くして得られるフラクトフラノシル転移物は、良好な呈味と甘味に加えて、適度の粘度と保湿作用、さらには、顕著な抗う蝕作用、ビフィズス菌増殖促進作用及びミネラル吸収促進作用を有する。したがって、この発明によるフラクトフラノシル転移方法により得られるフラクトフラノシル転移物は、斯かる性質・作用を必要とする種々の飲食物、化粧品及び医薬品の甘味付け並びに呈味及び物性の改善に有用である。
【００２７】
以下、実施例に基づき、この発明の実施の形態について説明する。なお、実施例で用いる手法自体は公知であり、例えば、ジェー・サムブルックら『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、第２版、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス発行などにも詳述されている。
【００２８】
【実施例１】
〈ＤＮＡと形質転換体の調製〉
【００２９】
【実施例１−１】
〈精製β−フラクトフラノシダーゼの調製〉
蔗糖１．０％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸一ナトリウム・２水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）、炭酸カルシウム０．３％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地（ｐＨ７．０）を５００ｍｌ容フラスコに１００ｍｌずつとり、１２０℃で１５分間オートクレーブして滅菌し、冷却した後、バチルス・スピーシーズＶ２３０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５０５４）を接種し、３０℃で２０時間回転振盪培養して種培養物を得た。
【００３０】
１０ｌ容ジャーファーメンターに上記と同一組成の新鮮な培地を約７ｌとり、同様にして滅菌し、３０℃まで冷却した後、種培養物を１％（ｖ／ｖ）接種し、３０℃で２０時間通気攪拌培養した。培養物を遠心分離したところ、β−フラクトフラノシダーゼを３．６単位／ｍｌ含む上清が６．３ｌ得られた。この上清に硫酸アンモニウムを８０％飽和になるまで加え、４℃で一夜静置した後、遠心分離してβ−フラクトフラノシダーゼを含む沈澱を採取した。
【００３１】
この沈澱を５ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、新鮮な同一緩衝液に対して一昼夜透析した後、遠心分離して上清２１０ｍｌを採取した。この上清をあらかじめ５ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）により平衡化しておいた東ソー製イオン交換クロマトグラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ−トヨパール６５０』３８０ｍｌのカラムに負荷し、０Ｍから０．５Ｍまで上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下にて１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を通液し、塩化ナトリウム濃度０．１Ｍ付近で溶出した画分を採取した。
【００３２】
この画分を１Ｍ硫酸アンモニウムと５ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析した後、遠心分離して上清を回収し、この上清をあらかじめ５ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）により平衡化しておいた東ソー製疎水性カラムクロマトグラフィー用ゲル『ブチルトヨパール６５０』１００ｍｌのカラムに負荷し、１Ｍから０Ｍに下降する硫酸アンモニウムの濃度勾配下にて５ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を通液し、硫酸アンモニウム濃度０．１Ｍ付近で溶出した画分を採取した。
【００３３】
その後、この画分を５ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析し、遠心分離し、得られた上清をあらかじめ５ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）により平衡化しておいた『ＤＥＡＥ−トヨパール６５０』１０ｍｌのカラムに負荷し、上記と同様にして分画したところ、比活性２０５単位／ｍｇ蛋白質の精製β−フラクトフラノシダーゼが１４ｍｇ得られた。この精製β−フラクトフラノシダーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、β−フラクトフラノシダーゼ活性を伴う蛋白質の実質的な単一バンドが観察された。
【００３４】
なお、この発明において、β−フラクトフラノシダーゼ活性は、次のようにして測定した活性値（単位）で表示する。すなわち、基質としての蔗糖を５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に０．１％（ｗ／ｖ）になるように溶解し、この水溶液５ｍｌに被検試料を０．２ｍｌ加え、４０℃で１０分間反応させた後、ソモギー銅液０．２ｍｌを加えて反応を停止させ、反応物の還元力をソモギー・ネルソン法により測定する。対照として、あらかじめ１００℃で１０分間加熱しておいて被検試料を上記と同様に処置して対照とした。β−フラクトフラノシダーゼ活性の１単位とは、上記条件下で反応させたときに、１分間に２マイクロモルのグルコースに相当する還元力を生成する酵素又はポリペプチドの量と定義する。
【００３５】
【実施例１−２】
〈Ｎ末端アミノ酸配列〉
アプライド・バイオシステム製気相プロテイン・シーケンサ『４７３Ａ型』を用い、常法にしたがって分析したところ、実施例１−１の方法により得た精製β−フラクトフラノシダーゼは、Ｎ末端に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有していた。
【００３６】
【実施例１−３】
〈部分アミノ酸配列〉
実施例１−１の方法により得た精製β−フラクトフラノシダーゼを適量とり、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して４℃で１８時間透析した後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて蛋白質濃度を約１ｍｇ／ｍｌとした。この水溶液を約１ｍｌとり、リジルエンドペプチダーゼを２０μｇ加え、３０℃で６０時間インキュベートして酵素を部分加水分解した。加水分解物をあらかじめ０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸により平衡化させておいた日本ミリポア・リミテッド製高速液体クロマトグラフィー用カラム『マイクロボンダパックＣ１８』に負荷し、０％（ｖ／ｖ）から４０％（ｖ／ｖ）に上昇する水性アセトニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を０．９ｍｌ／分の流速で通液した。そして、通液開始から約７７分後に溶出した画分を採取し、真空乾燥した後、５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸に溶解した。その後、実施例１−２と同様に分析したところ、同画分に含まれるペプチド断片は配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列を有していた。
【００３７】
【実施例１−４】
〈染色体ＤＮＡの調製〉
５００ｍｌ容フラスコに１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウムおよび水からなる液体培地（ｐＨ７．０）を１００ｍｌずつとり、１２０℃で２０分間オートクレーブして滅菌し、冷却した後、バチルス・スピーシーズＶ２３０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５０５４）を接種し、２７℃で２４時間回転振盪培養した。
【００３８】
培養物を遠心分離して菌体を分離し、適量のＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加え、３７℃で３０分間インキュベートし、−８０℃で１時間凍結した後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加え、６０℃に予温したＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、冷却し、遠心分離して上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、染色体ＤＮＡを含む沈澱部を採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、リボヌクレアーゼ７．５μｇとプロテアーゼ１２５μｇをそれぞれ加え、３７℃で１時間反応させた。反応物にクロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、抽出物に冷エタノールを加え、静置したところ、精製染色体ＤＮＡを含む沈澱が得られた。この沈澱を濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８０℃で凍結した。
【００３９】
【実施例１−５】
〈形質転換体ＢＢＦ４の調製〉
実施例１−４の方法により得た精製染色体ＤＮＡの溶液を１ｍｌとり、これに制限酵素Ｓａｕ  ３ＡＩを約３０単位加え、３７℃で２０分間反応させて染色体ＤＮＡを部分的に切断した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約２，０００乃至５，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。別途、プラスミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）を制限酵素Ｂａｍ  ＨＩにより切断し、そのベクター断片０．１μｇとＤＮＡ断片１μｇを宝酒造製『ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ』を用いて連結した。得られた組換えＤＮＡに東洋紡績製コンピテントセル『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ  ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ』を３０μｌ加え、氷冷下で３０分間静置した後、４２℃に加温し、ＳＯＣブロスを加え、３７℃で１時間インキュベートして組換えＤＮＡを大腸菌に導入した。
【００４０】
斯くして得られた形質転換体を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシドを５０μｇ／ｍｌ含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で１８時間培養した後、培地上に形成された約２，０００個のコロニーをアマシャム製ナイロン膜『Ｈｙｂｏｎｄ−Ｈ＋』上に固定した。別途、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列の第５乃至１３番目に相当するＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａで表される配列に基づき、５´−ＧＡＹＴＡＹＡＡＲＧＡＲＧＡＹＴＡＹＧＧＮＴＴＹＧＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学合成し、同位体３２Ｐで標識した後、これをプローブとしてナイロン膜上に固定した形質転換体のコロニーにハイブリダイズさせ、顕著な会合を示したコロニーを選別し、『ＢＢＦ４』と命名した。
【００４１】
この形質転換体ＢＢＦ４をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常一般のアルカリ法により組換えＤＮＡを菌体外に溶出させ、これを常法により精製し、分析したところ、形質転換体ＢＢＦ４に含まれる組換えＤＮＡ、すなわち、『ｐＢＢＦ４』は約６，３００塩基対からなり、図１に示す制限酵素切断部位を有していた。図１に見られるように、この組換えＤＮＡ  ｐＢＢＦ４においては、当該ポペプチドをコードする１，３６５塩基対からなるＤＮＡが制限酵素Ｅｃｏ  ＲＶによる切断部位の下流に連結していた。
【００４２】
【実施例１−６】
〈塩基配列の決定〉
実施例１−５の方法により得た組換えＤＮＡ  ｐＢＢＦ４を１μｇとり、これにシーケンシング・プライマー０．０２μｇとアプライド・バイオシステム製シーケンシング・キット『エー・ビー・アイ・プリズム・レディー・リアクション・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・キット』のプレミックス液９．５μｌをそれぞれ加えた後、さらに適量の水を加えて全量を２０μｌとした。この混液に適量のミネラルオイルを重層した後、パーキン・エルマー製ＤＮＡサーマルサイクラー『ＰＪ２０００型』により９６℃で３０秒間、５０℃で１５秒間、さらに、６０℃で４分間この順序で２５回繰り返し反応させ相補鎖ＤＮＡを含む反応物を得た。その後、５％（ｗ／ｖ）セチルトリメチルアンモニウムブロマイドを含む０．５Ｍ食塩水を２．５μｌ加えて反応物を沈澱させ、通常一般のエタノール法により精製し、真空乾燥した。得られた粉状物に５０ｍＭＥＤＴＡ  １μｌとホルムアミド５μｌを加えて溶解し、９０℃で２分間インキュベートした後、急冷した。
【００４３】
反応物をアプライド・バイオシステム製ＤＮＡシーケンシング・システム『３７３型』に装着した６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上に適量とり、電気泳動して反応物を分離し、解析したところ、相補鎖ＤＮＡは配列表における配列番号５に示す塩基配列を含んでいた。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は配列表における配列番号３に示したとおりであり、そのアミノ酸配列と配列表における配列番号１及び２に示す部分アミノ酸配列を比較したところ、配列番号１に示す部分アミノ酸配列は配列番号３のアミノ酸配列における第１乃至２１番目の配列に、また、配列番号２に示す部分アミノ酸配列は配列番号３のアミノ酸配列における第２０１乃至２１２番目の配列に一致した。このことは、本例のポリペプチドが配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有するものであり、バチルス・スピシーズＶ２３０株においては、そのアミノ酸配列が配列表における配列番号４、詳細には、配列番号５に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。なお、配列表における配列番号５に示す塩基配列において、第３６１乃至４５６番目の塩基配列は、分泌型酵素一般に認められるシグナルペプチド領域であると推定される。
【００４４】
【実施例２】
〈形質転換体を用いるポリペプチドの製造と理化学的性質〉
【００４５】
【実施例２−１】
〈形質転換体によるポリペプチドの製造〉
蔗糖１．０％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸一ナトリウム・２水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）、炭酸カルシウム０．３％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地を１００ｍｌずつ５００ｍｌ容フラスコにとり、１２０℃で１５分間オートクレーブして滅菌し、冷却し、ｐＨ７．０に調整した後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加えた。この液体培地に実施例１−５の方法により得た形質転換体ＢＢＦ４を接種し、３７℃で２０時間回転振盪培養して種培養物を得た。
【００４６】
１０ｌ容ジャーファーメンターに上記と同一組成の新鮮な液体培地を約７ｌとり、同様にして滅菌し、３７℃まで冷却し、ｐＨ調整し、アンピシリンを加えた後、種培養物を１％（ｖ／ｖ）接種し、２０時間通気撹拌培養した。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去し、上清に硫酸アンモニウムを７０％飽和になるように加え、４℃で２４時間静置した後、遠心分離により沈澱を採取した。この沈澱を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０ｍＭ燐酸緩衝液に対して４℃で２４時間透析した後、透析内液中のβ−フラクトフラノシダーゼ活性を測定したところ、培養物１ｌ当たり、約８単位のポリペプチドが産生していた。その後、この粗ポリペプチドを実施例１−１の方法により精製したところ、比活性２０５単位／ｍｇ蛋白質のポリペプチドが培養物１ｌ当り約８ｍｇの収量で得られた。
【００４７】
対照として、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株又はバチルス・スピーシーズＶ２３０株をアンピシリン無含有の上記と同一組成の液体培地を用いて、バチルス・スピーシーズＶ２３０株の場合、培養温度を３０℃に設定した以外は上記と同様に培養し、処理した。培養上清の活性を測定したところ、バチルス・スピーシーズＶ２３０株のβ−フラクトフラノシダーゼ産生は培養物１ｌ当り３．６単位程度であり、これは形質転換体ＢＢＦ４に比較して有意に低いものであった。なお、宿主に用いた大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株は、β−フラクトフラノシダーゼを全く産生しなかった。
【００４８】
【実施例２−２】
〈ポリペプチドの理化学的性質〉
【００４９】
【実施例２−２（ａ）】
〈作用〉
基質として蔗糖、ラフィノース、エルロース、スタキオース、ラクトスクロース、キシロシルフラクトシド、マルトース、セロビオース、乳糖、イヌリン又はレバンのいずれかを２％（ｗ／ｖ）含む水溶液に、実施例２−１の方法により得たポリペプチドを基質固形分１ｇ当り２単位ずつ加え、４０℃、ｐＨ５．５で２４時間反応させた。
【００５０】
それぞれの反応物を適量とり、メルク製シリカゲル薄層クロマトグラフィー用ゲル『キーゼルゲル６０』にスポットし、室温下、１−ブタノール／ピリジン／水混液（容量比７：３：１）により展開した後、乾燥させた。そして、反応物がフラクトースを含む場合には、０．２％（ｗ／ｖ）ナフトレゾルシノールを含む０．５Ｎ燐酸溶液を噴霧した後、１１０℃で５分間加熱し、また、反応物がフラクトース以外の糖質を含む場合には、２０％（ｗ／ｖ）硫酸／メタノール混液を噴霧し、１１０℃で１０分間加熱して発色させた。その結果、本例のポリペプチドは蔗糖、ラフィノース、エルロース、スタキオース、ラクトスクロース及びキシロシルフラクトシドにβ−フラクトフラノシダーゼ活性を発揮してフラクトースを遊離するものの、マルトース、セロビオース、乳糖、イヌリン及びレバンには実質的に作用しないことが判明した。
【００５１】
さらに、フラクトフラノシル受容体として表１に示す単糖、オリゴ糖及びアルコールを用い、本例のポリペプチドによるフラクトフラノシル転移の特異性を調べた。すなわち、表１に示すいずれかのフラクトフラノシル受容体とフラクトフラノシル供与体としての蔗糖を重量比で等量混合し、これを１０％（ｗ／ｖ）になるように溶解した水溶液に実施例２−１の方法により得たポリペプチドを蔗糖固形分１ｇ当り２単位ずつ加え、４０℃、ｐＨ５．５で２４時間反応させた。そして、反応物を上記と同様の薄層クロマトグラフィーにより分離した後、０．２％（ｗ／ｖ）ナフトレゾルシノールを含む０．５Ｎ燐酸溶液を噴霧し、１１０℃で５分間加熱して発色させてフラクトフラノシル転移物を検出した。結果を表１に示す。
【００５２】
【表１】
0003779034.tif 000002
【００５３】
表１に示す結果から明らかなように、本例のポリペプチドは、フラクトフラノシル供与体としての蔗糖からＤ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、マルトース、イソマルトース、セロビオース、マルトトリオース、パノース、乳糖、メリビオース、トレハロースへのフラクトフラノシル転移を触媒し、それぞれのフラクトフラノシル受容体に対応するフラクトフラノシル転移物を生成する。また、本例のポリペプチドは上記のような糖質に対してのみならず、Ｄ−キシリトール、Ｄ−ソルビトール、マルチトールを始めとする糖アルコールや、グリセロール、エチレングリコールなどのアルコールにも作用し、それぞれに対応するフラクトフラノシル転移物を生成する。
【００５４】
【実施例２−２（ｂ）】
〈分子量〉
実施例２−１の方法により得たポリペプチドをゲル濃度１０％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、同時に泳動した分子量マーカーの移動度と比較して分子量を測定したところ、分子量は４４，０００乃至５４，０００ダルトンであった。なお、分子量マーカーには、ウサギ筋肉フォスフォリラーゼＢ（９７，４００ダルトン）、ウシ血清アルブミン（６６，２００ダルトン）、オボアルブミン（４５，０００ダルトン）、ウシカルボニックアンヒドラーゼ（３１，０００ダルトン）、大豆トリプシンインヒビター（２１，５００ダルトン）及び卵白リゾチーム（１４，４００ダルトン）を用いた。
【００５５】
【実施例２−２（ｃ）】
〈至適ｐＨ〉
常法により、ｐＨの相違する２０ｍＭ緩衝液中、４０℃で１０分間インキュベートしたところ、図２に示すように、本例のポリペプチドはｐＨ５．５乃至６．０付近に至適ｐＨを示した。
【００５６】
【実験例２−２（ｄ）】
〈至適温度〉
常法により、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１０分間インキュベートしたところ、図３に示すように、本例のポリペプチドは５ｍＭカルシウムイオン存在下では５０℃付近に、また、カルシウムイオンの非存在下では４５℃付近に至適温度を示した。
【００５７】
【実験例２−２（ｅ）】
〈ｐＨ安定性〉
常法により、ｐＨの相違する１００ｍＭ緩衝液中、４℃で２４時間インキュベートしたところ、図４に示すように、本例のポリペプチドはｐＨ５．０乃至８．０付近まで安定であった。
【００５８】
【実施例２−２（ｆ）】
〈熱安定性〉
常法により、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で６０分間インキュベートしたところ、図５に示すように、本例のポリペプチドは４５℃付近まで安定であった。
【００５９】
【実施例３】
〈形質転換体によるポリペプチドの製造〉
【００６０】
【実施例３−１】
〈形質転換体ＢＢ５の作製〉
実施例１−５の方法により得た組換えＤＮＡ  ｐＢＢＦ４を制限酵素Ｐｓｔ  Ｉで切断し、宝酒造製『ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ』を用いて切断部を平滑化した後、常法にしたがってアガロース電気泳動して当該ポリペプチドをコードする塩基配列を含む約２，８００塩基対のＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片とあらかじめ制限酵素Ｓｍａ  Ｉで切断しておいた東洋紡績製プラスミドベクター『ｐＨＹ３００ＰＬＫ』と宝酒造製『ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ』を用いて連結した。得られた組換えＤＮＡをシェーファーらが『プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ』、第７３巻、２，１５１乃至２，１５５頁（１９７６年）に報告している方法に準じてプロトプラスト化したバチルス・ズブチリスＩＳＷ１２１４株に加え、さらに、関口らが『アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー』、第４６巻、１，６１７乃至１，６２１頁（１９８２年）に報告している方法に準じて形質転換した。斯くして得られた枯草菌を宿主とする形質転換体を『ＢＢＦ５』と命名した。
【００６１】
この形質転換体ＢＢＦ５をテトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３０℃で２４時間回転振盪培養した後、組換えＤＮＡを実施例１−４と同様にして抽出し、精製し、分析したところ、形質転換体ＢＢＦ５に含まれる組換えＤＮＡ、すなわち、ｐＢＢＦ５は約７，７００塩基対からなり、図６に示すような制限酵素切断部位を有していた。
【００６２】
【実施例３−２】
〈形質転換体によるポリペプチドの製造〉
蔗糖５．０％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン１．０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸一ナトリウム・２水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）、炭酸カルシウム０．３％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地を５００ｍｌ容フラスコに１００ｍｌずつとり、１２０℃で１５分間オートクレーブして滅菌し、冷却し、ｐＨ７．０に調整した後、テトラサイクリンを１０μｇ／ｍｌ加えた。この液体培地に実施例３−１の方法により得た形質転換体ＢＢＦ５を接種し、３０℃で２４時間回転振盪培養して種培養物を得た。
【００６３】
３０ｌ容ファーメンターに上記と同一組成の新鮮な液体培地を約１９ｌとり、同様に滅菌し、３０℃まで冷却し、ｐＨ調整し、テトラサイクリンを加えた後、種培養物１％（ｖ／ｖ）を接種し、２４時間通気攪拌培養した。形質転換体ＢＢＦ５が産生したポリペプチドの大部分は培養上清中に認められ、そのβ−フラクトフラノシダーゼ活性は４５単位／ｍｌであった。培養液をＭＦ膜により濾過し、その濾液をＵＦ膜により濃縮したところ、約８００単位／ｍｌのポリペプチド水溶液が８２０ｍｌ得られた。
【００６４】
その後、実施例１−１と同様にしてポリペプチドを精製した後、実施例２−２の方法により理化学的性質を調べたところ、本例のポリペプチドは実施例２−１のものと同様の理化学的性質を有していた。
【００６５】
【実施例４】
〈乳糖へのフラクトフラノシル転移〉
フラクトフラノシル供与体としての蔗糖とフラクトフラノシル受容体としての乳糖をそれぞれ２０％（ｗ／ｗ）含む水溶液をｐＨ５．５に調整し、これに実施例２−１の方法により得た粗ペプチドを蔗糖固形分１ｇ当り１単位加え、５５℃で１６時間反応させた。反応物を９０℃で３０分間加熱してポリペプチドを失活させた後、冷却し、常法にしたがって活性炭で脱色し、濾過し、イオン交換樹脂により脱塩して精製し、濃縮して、濃度７５％（ｗ／ｗ）のシラップ状物を原料固形分当り９５％の収率で得た。
【００６６】
固形分当りラクトスクロースを３７％含む本品は、良好な呈味と甘味に加えて、適度の保湿性を有しており、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして飲食物、化粧品、医薬品に有利に配合使用できる。
【００６７】
【実施例５】
〈乳糖へのフラクトフラノシル転移〉
フラクトフラノシル供与体としての蔗糖を２２％（ｗ／ｗ）とフラクトフラノシル受容体としての乳糖を１８％（ｗ／ｗ）含む水溶液をｐＨ６．０に調整し、これに実施例３−１の方法により得た粗ポリペプチドを蔗糖固形分１ｇ当り１単位と、インベルターゼ欠損酵母を固形分当り湿重量で５％（ｗ／ｗ）になるようにそれぞれ加え、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液によりｐＨを６乃至７に保ちながら３５℃で２０時間反応させた。反応物を９０℃で３０分間加熱してポリペプチドを失活させ、冷却し、常法にしたがって活性炭で脱色し、濾過し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮した後、真空乾燥し、粉砕して粉状物を原料固形分当り７０％の収率で得た。
【００６８】
固形分当りラクトスクロースを６５％含む本品は、良好な呈味と甘味に加えて、適度の保湿性を有しており、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして飲食物、化粧品、医薬品に有利に配合使用できる。
【００６９】
【実施例６】
〈マルトースへのフラクトフラノシル転移〉
フラクトフラノシル供与体としての蔗糖とフラクトフラノシル受容体としてのマルトースをそれぞれ２０％（ｗ／ｗ）含む水溶液をｐＨ５．５に調整し、これに実施例２−１の方法により得たポリペプチドを蔗糖固形分１ｇ当り１単位加え、５０℃で２４時間反応させた。反応物を９０℃で３０分間加熱してポリペプチドを失活させ、冷却し、常法にしたがって活性炭で脱色し、濾過し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮して濃度７５％（ｗ／ｗ）のシラップ状物を原料固形分当り９５％の収率で得た。このシラップ状物は、固形分当り、エルロースを約２８％含んでいた。
【００７０】
その後、このシラップ状物を４５％（ｗ／ｗ）まで濃縮した後、エルロース含量を高めるべく、ダウケミカル製アルカリ金属型強酸性カチオン交換樹脂『ダウエックス５０Ｗ×４（Ｃａ型）』を用いるカラムクロマトグラフィーに供した。すなわち、同カチオン交換樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付きステンレス製円筒管４本にカラム状に充填し、円筒管を直列に連結してカラム全長を２０ｍとした後、カラム温度を４０℃に保ちつつ、シラップ状物を樹脂に対して５％（ｖ／ｖ）負荷し、４０℃の温水をＳＶ０．２の流速で流して分画した。そして、エルロース高含有画分を採取し、常法にしたがって精製し、濃縮し、真空乾燥し、粉砕したところ、固形分当りエルロースを８４％含む粉状物を原料固形分当り２５％の収率で得た。
【００７１】
本例のシラップ状物は良好な呈味と甘味に加えて、適度の保湿性を有しており、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして飲食物、化粧品、医薬品に有利に配合使用できる。一方、本例の粉状物は還元性低く、呈味及び甘味良好なうえに、適度な保湿性と低う蝕性をも有しているので、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして飲食物、化粧品、医薬品に有利に配合使用できる。
【００７２】
【実施例７】
〈キシロースへのフラクトフラノシル転移〉
フラクトフラノシル供与体として蔗糖３０％（ｗ／ｗ）とフラクトフラノシル受容体としてのキシロースを１５％（ｗ／ｗ）含む水溶液をｐＨ５．５に調整し、これに実施例１−２の方法により得た粗ポリペプチドを蔗糖固形分１ｇ当り０．５単位加え、５０℃で４０時間反応させた。反応物を９０℃で３０分間加熱してポリペプチドを失活させた後、冷却し、常法にしたがって活性炭で脱色し、濾過し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮して濃度７５％（ｗ／ｗ）のシラップ状物を原料固形分当り９５％の収率で得た。
【００７３】
固形分当りキシロシルフラクトシドを３５％含む本品は、良好な呈味と甘味に加えて、適度な粘度と保湿性、さらには、低う蝕性をも有しているので、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして飲食物、化粧品、医薬品に有利に配合使用できる。
【００７４】
【実施例８】
〈キシロースへのフラクトフラノシル転移〉
フラクトフラノシル供与体としての蔗糖を３０％（ｗ／ｗ）とフラクトフラノシル受容体としてのキシロースを１５％（ｗ／ｗ）含む水溶液をｐＨ６．０に調整し、これに実施例３−１の方法により得た粗ポリペプチドを蔗糖固形分１ｇ当り０．５単位加え、５０℃で４０時間反応させた。反応物に水酸化ナトリウムを加えてｐＨ１０以上に保ちながら１００℃で加熱した後、冷却し、常法にしたがって活性炭で脱色し、濾過し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮して濃度７５％（ｗ／ｗ）のシラップ状物を原料固形分当り５５％の収率で得た。
【００７５】
固形分当りキシロシルフラクトシドを６０％含む本品は、良好な呈味と甘味に加えて、適度な粘度と保湿性を有しており、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして飲食物、化粧品、医薬品に有利に配合使用できる。
【００７６】
【実施例９】
〈トレハロースへのフラクトフラノシル転移〉
フラクトフラノシル供与体としてのラフィノースを１４％（ｗ／ｗ）とフラクトフラノシル受容体としてのトレハロースを１０％（ｗ／ｗ）含む水溶液をｐＨ５．５に調整し、これに実施例２−１の方法により得た粗ポリペプチドをラフィノース固形分１ｇ当り０．４単位加え、５０℃で４０時間反応させた。反応物を９０℃で３０分間加熱してポリペプチドを失活させ、冷却し、常法にしたがって活性炭で脱色し、濾過し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮した後、真空乾燥し、粉砕して粉状物を原料固形分当り９５％の収率で得た。
【００７７】
固形分当りフラクトフラノシルトレハロースを２０％含む本品は、良好な呈味と甘味に加えて、適度な粘度と保湿性を有しており、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収剤などとして飲食物、化粧品、医薬品に有利に配合使用できる。
【００７８】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明は、組換えＤＮＡ技術を適用することにより容易に大量生産可能なβ−フラクトフラノシダーゼ活性ポリペプチドを提供するものである。この発明のポリペプチドはアミノ酸配列の一部又は全部が明らかにされたポリペプチドであり、食品、化粧品、医薬品への配合使用を前提とするフラクトフラノシル転移物の製造に安心して使用し得るものである。斯くも有用なるポリペプチドは、形質転換体を用いるこの発明の方法により、所望量を容易に製造することができる。
【００７９】
この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な、意義のある発明であると言える。
【００８０】
【配列表】
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【００８１】
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【００８２】
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【００８３】
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【００８４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】この発明による組換えＤＮＡ  ｐＧＧＦ４の制限酵素切断地図である。
【図２】この発明による実施例のポリペプチドの至適ｐＨを示す図である。
【図３】この発明による実施例のポリペプチドの至適温度を示す図である。
【図４】この発明による実施例のポリペプチドのｐＨ安定性を示す図である。
【図５】この発明による実施例ポリペプチドの熱安定性を示す図である。
【図６】この発明による組換えＤＮＡ  ｐＢＢＦ５の制限酵素切断地図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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