(57)【要約】  本発明は、式(Ｉ)で表される基が直接的に又はリンカーを介して連結しているポリマーを含む、ｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体及びそれを含む組成物、並びにそれらを製造するためのキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式(Ｉ)：
【化１】
2019163790.tif 000094
［式中、
矢印は隣接する原子との結合を表し、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆである］
で表される基が、直接的に又はリンカーを介して連結しているポリマーを含む、
ｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体。
【請求項２】
２個以上の前記式(Ｉ)の基が、直接的に又はリンカーを介して前記ポリマーに連結されており、
ここで前記式(Ｉ)の基のそれぞれは、同一であっても異なってもよい、請求項１に記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体。
【請求項３】
数平均分子量が１，０００Ｄａ以上である、請求項１又は２に記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体。
【請求項４】
前記ポリマーが、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリペプチド、ポリサッカリド、及びそれらの共重合体から成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体。
【請求項５】
前記ポリマーがポリビニルアルコールである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体。
【請求項６】
以下の式(ＩＩ)で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、請求項５に記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体。
【化２】
2019163790.tif 000095
［式中、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆであり、
Ｌ1及びＬ2は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、−ＣＨ（ＯＡ1）2又は検出可能な標識であり、
Ａ1はＣ1-6アルキル基であり、
ｍ＝０〜３，９９８であり、
ｎ＝１〜２，０００であり、
ｍ＋２ｎ＝１０〜４，０００であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。］
【請求項７】
前記ポリマーがポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体。
【請求項８】
以下の式(ＩＩＩ)で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、請求項７に記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体：
【化３】
2019163790.tif 000096
［式中、
Ｌ3及びＬ4は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、−ＣＨ（ＯＡ1）2又は検出可能な標識であり、
Ａ1はＣ1-6アルキル基であり、
Ｒ5aは、それぞれ独立して、以下の（ＩＶ−ａ）又は（ＩＶ−ｂ）の基：
【化４】
2019163790.tif 000097
（式中、矢印はＮＨへの結合を示す）
であり、
Ｒ5bは、それぞれ独立して、以下の式（ＩＶ−ｃ）〜（ＩＶ−ｇ）からなる群から選択される基：
【化５】
2019163790.tif 000098
（式中、
矢印はＮＨへの結合を示し、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆであり、
Ｙ+は、Ｈ+、アルカリ金属イオン又はテトラ−Ｃ1-6アルキル−アンモニウムイオンである）
であり、
ｐ＝０〜２９９であり、
ｑ＝１〜３００であり、
ｒ＝０〜２９９であり、
ｐ+ｑ＋ｒ＝１０〜３００であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。］
【請求項９】
以下の式(Ｖ)で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、請求項７に記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体：
【化６】
2019163790.tif 000099
［式中、
Ｌ5及びＬ6は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
Ｒ6及びＲ7は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、−ＣＨ（ＯＡ1）2又は検出可能な標識であり、
Ａ1はＣ1-6アルキル基であり、
Ｒ8aは、以下の式（ＶＩ−ａ）の基：
【化７】
2019163790.tif 000100
（式中、矢印はカルボニル炭素への結合を示す）
であり、
Ｒ8bは、それぞれ独立して、以下の式（ＶＩ−ｂ）〜（ＶＩ−ｈ）からなる群から選択される基：
【化８】
2019163790.tif 000101
（式中、
矢印はカルボニル炭素への結合を示し、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆである）
であり、
ｓ＝０〜２９９であり、
ｔ＝１〜３００であり、
ｕ＝０〜２９９であり、
ｓ＋ｔ＋ｕ＝２〜３００であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。］
【請求項１０】
以下の式（ＸＸ）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、請求項７に記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体：
【化９】
2019163790.tif 000102
［式中、
Ｌ11及びＬ12は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
Ｒ15及びＲ16は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、−ＣＨ（ＯＡ1）2又は検出可能な標識であり、
Ａ1はＣ1-6アルキル基であり、
Ｒ17aは、以下の式（ＸＸＩ−ａ）の基：
【化１０】
2019163790.tif 000103
（式中、矢印はＮＨへの結合を示す）
であり、
Ｒ17bは、それぞれ独立して、以下の式（ＸＸＩ−ｂ）〜（ＸＸＩ−ｈ）からなる群から選択される基：
【化１１】
2019163790.tif 000104
（式中、
矢印はＮＨへの結合を示し、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆである）
であり、
ｘ＝０〜２９９であり、
ｙ＝１〜３００であり、
ｚ＝０〜２９９であり、
ｘ＋ｙ＋ｚ＝１０〜３００であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。］
【請求項１１】
以下の式（ＸＸＩＩ）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、請求項５に記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体：
【化１２】
2019163790.tif 000105
［式中、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆであり、
Ｌ13及びＬ14は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
Ｒ18及びＲ19は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、−ＣＨ（ＯＡ1）2又は検出可能な標識であり、
Ａ1はＣ1-6アルキル基であり、
Ｒ20は、それぞれ独立して、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、−ＮＲ21Ｒ22基、又は以下の基：
【化１３】
2019163790.tif 000106
（式中、矢印はカルボニル炭素への結合を示す）
であり、
Ｒ21及びＲ22はそれぞれ独立して、水素であるか、又はハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基であり、
ａ＝１〜３，９９８であり、
ｂ＝０〜３，９９７であり、
ｃ＝１〜２，０００であり、
ａ＋ｂ＋２ｃ＝１０〜４，０００であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。］
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体を含む、組成物。
【請求項１３】
腫瘍を治療するための、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
腫瘍を診断又は検出するための、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
式（ＶＩＩ）：
【化１４】
2019163790.tif 000107
［式中、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆである］
で表される化合物と、
前記式（ＶＩＩ）の化合物と反応して請求項１〜１１のいずか１項に記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体を形成することができるポリマーと
を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体、又は請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の組成物を製造するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体（以下で、「ＢＰＡ誘導体」とも呼ぶ）及びそれを含む組成物、並びにそれらを製造するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）とは、疾患部にホウ素（10Ｂ）を集積させ、そこに中性子線照射を行うことにより核反応を起こし、限局的にα線を発生させて標的細胞を殺傷する方法である。疾患部へのホウ素の集積は、ホウ素薬剤を投与することにより行われる。現在までにヒトに応用されてきた薬剤として、第１世代ホウ素薬剤であるホウ素クラスターのメルカプトウンデカハイドロドデカボレート（ＢＳＨ）と、第２世代ホウ素薬剤のｐ−ボロノフェニルアラニン（ＢＰＡ）がある。また、ホウ素クラスターをリポソーム、高分子、高分子ミセルなどのキャリアに搭載した第３世代のホウ素薬剤も報告されている（非特許文献１）。【０００３】
ＢＳＨは水溶性に優れた薬剤であるが、腫瘍への選択性に乏しい。ＢＳＨを含む第３世代ホウ素薬剤では、リポソーム、高分子、高分子ミセルなどのキャリアを使用することで、Enhanced Permeability and Retention効果（ＥＰＲ効果）により、腫瘍に選択的にホウ素を送達し得る。しかし、ＥＰＲ効果は一般的に長期血中滞留性を示すキャリアにより実現されるものであるため、第３世代ホウ素薬剤を用いた場合において腫瘍／血液ホウ素濃度比を高くすることは困難である。【０００４】
ＢＰＡは、腫瘍細胞に過剰発現しているアミノ酸トランスポーター（ＬＡＴ１）等によってフェニルアラニン構造を認識され、腫瘍細胞に選択的に取り込まれることが知られている（非特許文献２）。しかし、ＢＰＡは水溶性が乏しい。【０００５】
ＢＰＡの水溶性の問題に関しては、可溶化剤としてフルクトースやソルビトール等の糖と複合体を形成することによって改善できることが報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−５１７６６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Luderer M. J. et al., Pharm. Res., 32, 2824-2836 (2015)
【非特許文献２】Wongthai P. et al., Cancer Sci. 106, 279-286 (2015)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
第１世代及び第３世代のホウ素薬剤では、腫瘍への集積性を高めながら、腫瘍／正常組織ホウ素濃度比、及び腫瘍／血液ホウ素濃度比を高く維持することが困難である。一方で、第２世代のＢＰＡはこれらをある一定の時点において達成することは可能である。【０００９】
しかし、ＢＰＡは、主にアミノ酸トランスポーターのＬＡＴ１を介してがん細胞に取り込まれるが、ＬＡＴ１は交換輸送体であるため、細胞外のＢＰＡ濃度が低下すると、細胞内のＢＰＡを細胞外に流出してしまう。そのため、腫瘍組織に集積した後に早い段階で腫瘍内ホウ素濃度が低下するという問題があった。【００１０】
特許文献１の方法では、ＢＰＡの水溶性を改善できるが、腫瘍細胞からのＢＰＡの早期消失性の問題を解決できない。この問題に対する対処法としては、治療に必要な腫瘍内ホウ素濃度を維持するためにＢＰＡを点滴により投与しながら中性子線を疾患部に照射する方法がなされることもある。しかし、正常血管内にも大量のホウ素が存在してしまうため、正常組織への放射線被曝が懸念される。【００１１】
したがって本発明は、腫瘍細胞におけるＢＰＡの早期消失性を解決することにより、腫瘍へのホウ素の選択的集積と長期滞留を実現しながら、優れた腫瘍／正常組織ホウ素濃度比、及び腫瘍／血液ホウ素濃度比を達成することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、ポリマーにＢＰＡを担持させたホウ素送達システムが、アミノ酸トランスポーター介在のエンドサイトーシスにより腫瘍細胞に取り込まれ、従来のＢＰＡと比較して長期的に高い細胞内ホウ素濃度を維持することができることを見出し、本発明に至った。【００１３】
本発明は、以下の＜１＞〜＜２１＞を包含する。
＜１＞
以下の式(Ｉ)：
【化１】
2019163790.tif 000002
［式中、
矢印は隣接する原子との結合をかし、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆである］
で表される基が、直接的に又はリンカーを介して連結しているポリマーを含む、
ｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体。
＜２＞
２個以上の前記式(Ｉ)の基が、直接的に又はリンカーを介して前記ポリマーに連結されており、
ここで前記式(Ｉ)の基のそれぞれは、同一であっても異なってもよい、＜１＞に記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体。
＜３＞
数平均分子量が１，０００Ｄａ以上である、＜１＞又は＜２＞に記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体。
＜４＞
前記ポリマーが、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリペプチド、ポリサッカリド、及びそれらの共重合体から成る群から選択される、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体。
＜５＞
前記ポリマーがポリビニルアルコールである、＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体。
＜６＞
以下の式(ＩＩ)で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、＜５＞に記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体。
【化２】
2019163790.tif 000003
［式中、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆであり、
Ｌ1及びＬ2は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、−ＣＨ（ＯＡ1）2又は検出可能な標識であり、
Ａ1はＣ1-6アルキル基であり、
ｍ＝０〜３，９９８であり、
ｎ＝１〜２，０００であり、
ｍ＋２ｎ＝１０〜４，０００であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。］
＜７＞
前記ポリマーがポリペプチドである、＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体。
＜８＞
以下の式(ＩＩＩ)で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、＜７＞に記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体：
【化３】
2019163790.tif 000004
［式中、
Ｌ3及びＬ4は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、−ＣＨ（ＯＡ1）2又は検出可能な標識であり、
Ａ1はＣ1-6アルキル基であり、
Ｒ5aは、それぞれ独立して、以下の（ＩＶ−ａ）又は（ＩＶ−ｂ）の基：
【化４】
2019163790.tif 000005
（式中、矢印はＮＨへの結合を示す）
であり、
Ｒ5bは、それぞれ独立して、以下の式（ＩＶ−ｃ）〜（ＩＶ−ｇ）からなる群から選択される基：
【化５】
2019163790.tif 000006
（式中、
矢印はＮＨへの結合を示し、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆであり、
Ｙ+は、Ｈ+、アルカリ金属イオン又はテトラ−Ｃ1-6アルキル−アンモニウムイオンである）
であり、
ｐ＝０〜２９９であり、
ｑ＝１〜３００であり、
ｒ＝０〜２９９であり、
ｐ+ｑ＋ｒ＝１０〜３００であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。］
＜９＞
以下の式(Ｖ)で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、＜７＞に記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体：
【化６】
2019163790.tif 000007
［式中、
Ｌ5及びＬ6は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
Ｒ6及びＲ7は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、−ＣＨ（ＯＡ1）2又は検出可能な標識であり、
Ａ1はＣ1-6アルキル基であり、
Ｒ8aは、以下の式（ＶＩ−ａ）の基：
【化７】
2019163790.tif 000008
（式中、矢印はカルボニル炭素への結合を示す）
であり、
Ｒ8bは、それぞれ独立して、以下の式（ＶＩ−ｂ）〜（ＶＩ−ｈ）からなる群から選択される基：
【化８】
2019163790.tif 000009
（式中、
矢印はカルボニル炭素への結合を示し、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆである）
であり、
ｓ＝０〜２９９であり、
ｔ＝１〜３００であり、
ｕ＝０〜２９９であり、
ｓ＋ｔ＋ｕ＝２〜３００であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。］
＜１０＞
以下の式（ＸＸ）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、＜７＞に記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体：
【化９】
2019163790.tif 000010
［式中、
Ｌ11及びＬ12は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
Ｒ15及びＲ16は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、−ＣＨ（ＯＡ1）2又は検出可能な標識であり、
Ａ1はＣ1-6アルキル基であり、
Ｒ17aは、以下の式（ＸＸＩ−ａ）の基：
【化１０】
2019163790.tif 000011
（式中、矢印はＮＨへの結合を示す）
であり、
Ｒ17bは、それぞれ独立して、以下の式（ＸＸＩ−ｂ）〜（ＸＸＩ−ｈ）からなる群から選択される基：
【化１１】
2019163790.tif 000012
（式中、
矢印はＮＨへの結合を示し、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆである）
であり、
ｘ＝０〜２９９であり、
ｙ＝１〜３００であり、
ｚ＝０〜２９９であり、
ｘ＋ｙ＋ｚ＝１０〜３００であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。］
＜１１＞
以下の式（ＸＸＩＩ）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、＜５＞に記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体：
【化１２】
2019163790.tif 000013
［式中、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆであり、
Ｌ13及びＬ14は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
Ｒ18及びＲ19は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、−ＣＨ（ＯＡ1）2又は検出可能な標識であり、
Ａ1はＣ1-6アルキル基であり、
Ｒ20は、それぞれ独立して、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、−ＮＲ21Ｒ22基、又は以下の基：
【化１３】
2019163790.tif 000014
（式中、矢印はカルボニル炭素への結合を示す）
であり、
Ｒ21及びＲ22はそれぞれ独立して、水素であるか、又はハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基であり、
ａ＝１〜３，９９８であり、
ｂ＝０〜３，９９７であり、
ｃ＝１〜２，０００であり、
ａ＋ｂ＋２ｃ＝１０〜４，０００であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。］
＜１２＞
＜１＞〜＜１１＞のいずれか１つに記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体を含む、組成物。
＜１３＞
腫瘍を治療するための、＜１２＞に記載の組成物。
＜１４＞
腫瘍を診断又は検出するための、＜１２＞に記載の組成物。
＜１５＞
式（ＶＩＩ）：
【化１４】
2019163790.tif 000015
［式中、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆである］
で表される化合物と、
前記式（ＶＩＩ）の化合物と反応して＜１＞〜＜１１＞のいずか１つに記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体を形成することができるポリマーと
を含む、＜１＞〜＜９＞のいずれか１つに記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体、又は＜１０＞〜＜１２＞のいずれか１つに記載の組成物を製造するためのキット。
＜１６＞
それを必要とする対象に、有効量の＜１＞〜＜１１＞のいずれか１つに記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体を投与することを含む、腫瘍の治療方法。
＜１７＞
それを必要とする対象に、有効量の＜１＞〜＜１１＞のいずれか１つに記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体を投与することを含む、腫瘍の診断又は検出方法。
＜１８＞
腫瘍の治療のための、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１つに記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体。
＜１９＞
腫瘍の診断又は検出のための、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１つに記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体。
＜２０＞
腫瘍を治療するための医薬の製造における、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１つに記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体の使用。
＜２１＞
腫瘍の診断又は検出のための医薬の製造における、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１つに記載のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体の使用。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のｐ−ボロノフェニルアラニン誘導体によって、腫瘍へのホウ素の選択的集積と長期滞留を実現しながら、優れた腫瘍／正常組織ホウ素濃度比、及び腫瘍／血液ホウ素濃度比を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、11B-BPA、Fru-11B-BPA及びPVA-11B-BPAの11B-NMR(500MHz, D2O)の測定結果を示す。
【図２】図２は、Cy5-PVA-BPA及びFru-BPAで処理したBxPC3細胞の共焦点顕微鏡画像を示す。図中、コントロールはいずれのサンプルでも処理されていないBxPC3細胞である（なお、染色のためにLysotracker及びBPA検出試薬（DAHMI）は添加されている）。
【図３−１】図３−１は、細胞内におけるホウ素濃度を示すグラフである。結果を平均±S.D. (n=3)で示す。ｔ−検定によって統計的有意性を計算した。* p<0.05, ** p<0.01。
【図３−２】図３−２は、細胞内におけるホウ素濃度を示すグラフである。結果を平均±S.D. (n=3)で示す。ｔ−検定によって統計的有意性を計算した。* p<0.05, ** p<0.01。図中、「+30 min chase」は３０分の追加インキュベーションを意味する。
【図４−１】図４−１は、BCHを添加しない場合における、Cy5-PVA及びCy5-PVA-BPAの細胞内取り込みの結果を示す。データは、平均±SD (n=3)で示す。ｔ−検定によってｐ値を計算した。* p<0.05, ** p<0.01。
【図４−２】図４−２は、BCHを添加した場合における、Cy5-PVA及びCy5-PVA-BPAの細胞内取り込みの結果を示す。データは、平均±SD (n=3)で示す。ｔ−検定によってｐ値を計算した。* p<0.05, ** p<0.01。
【図５−１】図５−１は、CT-26移植マウスにおけるPVA-BPA及びFru-BPAの腫瘍蓄積の結果を示す。データは、平均±SD (n=4)で示す。ｔ−検定によってｐ値を計算した。* p<0.05, ** p<0.01。
【図５−２】図５−２は、CT-26移植マウスにおけるPVA-BPA及びFru-BPAの腫瘍／血液集積比を示す。データは、平均±SD (n=4)で示す。ｔ−検定によってｐ値を計算した。* p<0.05, ** p<0.01。
【図６−１】図６−１は、BxPC3移植マウスにおけるPVA-BPA及びFru-BPAの腫瘍蓄積の結果を示す。データは、平均±SD (n=4)で示す。ｔ−検定によってｐ値を計算した。* p<0.05, ** p<0.01。
【図６−２】図６−２は、BxPC3移植マウスにおけるPVA-BPA及びFru-BPAの腫瘍／血液集積比を示す。データは、平均±SD (n=4)で示す。ｔ−検定によってｐ値を計算した。* p<0.05, ** p<0.01。
【図７】図７は、Cy5-PVA-BPAを静脈注射して６時間経過した後のCT26腫瘍のCLSM画像を示す。赤：Cy5；青：Hoechst33342（核）；緑：DyLight488（血管）。
【図８−１】図８−１は、検体投与後における相対的腫瘍サイズの経時変化を示す。データは、平均±SD (n=4又は8)で示す。ボンフェローニの多重比較検定によってｐ値を計算した。* p<0.05, ** p<0.01。
【図８−２】図８−２は、検体投与後における相対的腫瘍サイズのカプラン・マイヤー曲線を示す。
【図９−１】図９−１は、Control(COLD)で処置後の腫瘍のＨＥ染色画像を示す。
【図９−２】図９−２は、Control(HOT)で処置後の腫瘍のＨＥ染色画像を示す。
【図９−３】図９−３は、Fru-BPA(HOT)3hで処置後の腫瘍のＨＥ染色画像を示す。
【図９−４】図９−４は、PVA-BPA(HOT)3hで処置後の腫瘍のＨＥ染色画像を示す。
【図１０−１】図１０−１は、19F-BPAの19F-NMRスペクトルを示す。
【図１０−２】図１０−２は、Fru-19F-BPAの19F-NMRスペクトルを示す。
【図１０−３】図１０−３は、PVA-19F-BPAの19F-NMRスペクトルを示す。
【図１１】図１１は、PVA-19F-BPA及びFru-19F-BPAの腫瘍蓄積の結果を示す。図中、Fru-BPAは、Fru-19F-BPAの結果を示す。PVA-BPAは、PVA-19F-BPAの結果を示す。
【図１２−１】図１２−１は、PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPAの腫瘍蓄積の結果を示す。
【図１２−２】図１２−２は、PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPAの腫瘍／血液集積比を示す。
【図１３−１】図１３−１は、検体投与後における相対的腫瘍サイズの経時変化を示す。１８日目における統計有意差はFisher LSDにより計算した。
【図１３−２】図１３−２は、図１３−１から中性子線照射群を抜粋した図である。１８日目における統計有意差はFisher LSDにより計算した。図中の「Polymer-BPA」は、PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPAのことである。
【図１４−１】図１４−１は、P[Asp(Glucamine)/Asp]-BPAの腫瘍集積性を示す。
【図１４−２】図１４−２は、P[Asp(Glucamine)/Asp]-BPAの腫瘍／血液集積比を示す。
【図１５】図１５は、検体投与後における相対的腫瘍サイズの経時変化を示す。データは、平均±SD (Control: n=8, fructose-BPA: n=6, PVA-BPA: n=6)で示す。
【図１６】図１６は、検体投与後における相対的腫瘍サイズの経時変化を示す。データは、平均±SD (n=8)で示す。
【図１７】図１７は、実施例１９における結合定数の評価結果を示す。図中、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）はそれぞれ、N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(A)、N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(B)及びN3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(C)を意味する。
【図１８】図１８は、Cy5-P[Lys(Gluconate)/Lys](C)-BPA及びSorbitol-BPAで処理したBxPC-3細胞の共焦点顕微鏡画像を示す。図中、「Polymer」は「Cy5-P[Lys(Gluconate)/Lys](C)」の意味である。
【図１９】図１９は、N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(A)-BPA (図中の(A)-BPA）、N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(B)-BPA (図中の(B)-BPA)、N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(C)-BPA (図中の(C)-BPA)、mPEG10k-P[Lys(Gluconate)/Lys]_-BPA (図中の(D)-BPA)及びSorbitol-BPAの腫瘍蓄積の結果を示す。データは、mean ± SD (n = 3)として表される。
【図２０】図２０は、実施例２２の検体投与後における相対的腫瘍サイズの経時変化を示す。データは、平均±SD (n=6)で示す。
【図２１】図２１は、実施例２２の検体投与後における相対的腫瘍サイズのカプラン・マイヤー曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
＜＜定義＞＞
本明細書において、「Ｃ1-10アルキル基」とは、炭素数１〜１０の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基である。Ｃ1-10アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシルなど挙げられる。Ｃ1-10アルキル基は、Ｃ1-8アルキル基、Ｃ1-7アルキル基、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-5アルキル基、Ｃ1-4アルキル基などを含む。
【００１７】
本明細書において、「Ｃ1-10アルコキシ基」とは、前記Ｃ1-10アルキルに酸素原子が結合した基である。Ｃ1-10アルコキシ基の例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチオキシ、１−エチルプロポキシ、ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ、１，１−ジメチルブトキシ、２，２−ジメチルブトキシ、３，３−ジメチルブトキシ、２−エチルブトキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシなど挙げられる。Ｃ1-10アルコキシ基は、Ｃ1-8アルコキシ基、Ｃ1-7アルコキシ基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ1-5アルコキシ基、Ｃ1-4アルコキシ基などを含む。
【００１８】
本明細書において、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を意味する。
【００１９】
本明細書において、「ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基」は、上記「Ｃ1-10アルキル基」中の置換可能な水素原子が、１個以上の、例えば１〜５個のハロゲン原子で置換された「Ｃ1-10アルキル基」を含む。具体的には、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、３，３，３−トリフルオロプロピル、４−フルオロブチル、４，４，４−トリフルオロブチルなどが挙げられる。
【００２０】
本明細書において、「ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルコキシ基」は、上記「Ｃ1-10アルコキシ基」中の置換可能な水素原子が、１個以上の、例えば１〜５個のハロゲン原子で置換された「Ｃ1-10アルコキシ基」を含む。具体的には、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、３，３，３−トリフルオロプロポキシ、４−フルオロブトキシ、４，４，４−トリフルオロブトキシなどが挙げられる。
【００２１】
本明細書において、「Ｃ1-40アルキレン基」とは、炭素数１〜４０の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキレン基のことである。具体的には例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、へキシレン基、ヘプチレン基、オクチレン基、ノニレン基、デシレン基、ウンデシレン基、ドデシレン基、トリデシレン基、テトラデシレン基、ペンタデシレン基、ヘキサデシレン基、ヘプタデシレン基、オクタデシレン基、ノナデシレン基、イコサニレン基、ヘンイコサニレン基、ドコサニレン基、トリコサニレン基、テトラコサニレン基、ペンタコサニレン基、ヘキサコサニレン基、ヘプタコサニレン基、オクタコサニレン基、ノナコサニレン基、トリアコンタニレン基、ヘントリアコンタニレン、ドトリアコンタニレン基、トリトリアコンタニレン基、テトラトリアコンタニレン基、ペンタトリアコンタニレン基、ヘキサトリアコンタニレン基、ヘプタトリアコンタニレン基、オクタトリアコンタニレン基、ノナトリアコンタニレン基、テトラコンタニレン基などが挙げられる。Ｃ1-40アルキレン基は、Ｃ1-20アルキレン基、Ｃ1-10アルキレン基、Ｃ1-5アルキレン基などを含む。
【００２２】
本明細書において、「Ｃ6-14アリーレン基」とは、炭素数が６〜１４の芳香族炭素環からなる２価の基であって、例えばフェニレン基、ナフチレン基、アントラセニレン基などが挙げられる。
【００２３】
本明細書において、「５〜１０員のヘテロアリーレン基」とは、５〜１０員の芳香族ヘテロ環からなる２価の基であって、当該芳香族ヘテロ環としては、例えばピロール環、インドール環、チオフェン環、ベンゾチオフェン環、フラン環、ベンゾフラン環、ピリジン環、キノリン環、イソキノリン環、チアゾール環、ベンゾチアゾール環、イソチアゾール環、ベンゾイソチアゾール環、ピラゾール環、インダゾール環、オキサゾール環、ベンゾオキサゾール環、イソキサゾール環、ベンゾイソキサゾール環、イミダゾール環、ベンゾイミダゾール環、トリアゾール環、ベンゾトリアゾール環、ピリミジン環、ウリジン環、ピラジン環、ピリダジン環などが挙げられる。
【００２４】
本明細書において、「オキソ基」とは、それが結合する炭素原子と一緒になってカルボニル基を形成する基のことである。
【００２５】
本明細書において「ポリマー」とは、少なくとも２個の繰り返し単位、好ましくは少なくとも３個の繰り返し単位、より好ましくは少なくとも５個の繰り返し単位、さらに好ましくは少なくとも１０個の繰り返し単位を有する化合物を意味する。
【００２６】
本明細書において「薬学的に許容される塩」とは、薬学的に許容され、かつ所望の薬理学的活性を有する、遊離体化合物の塩である。「薬学的に許容される塩」としては、特に限定されないが、例えば、
硫酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸などの無機酸との塩、
酢酸、シュウ酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、エタンスルホン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、ガラクタル酸、ナフタレン−２−スルホン酸などの有機酸との塩、
リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、アルミニウムイオンなどの１種または複数の金属イオンとの塩、
アンモニア、アルギニン、リシン、ピペラジン、コリン、ジエチルアミン、４−フェニルシクロヘキシルアミン、２−アミノエタノール、ベンザチンなどのアミンとの塩
が挙げられる。
【００２７】
本明細書において「腫瘍」とは、遺伝子変異によって制御されない増殖を行うようになった細胞集団をいい、良性腫瘍及び悪性腫瘍を含む。本明細書において、用語「悪性腫瘍」は用語「癌」と交換可能に用いられる。用語「癌」は、上皮由来の癌腫である癌、肉腫、および白血病等の血液悪性腫瘍も含む広い意味で用いられる。上皮由来の癌腫である癌の例としては、胃癌、大腸癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌、十二指腸癌、腎臓癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、肝細胞癌、舌癌、食道癌、咽頭癌等が挙げられるが、これらに限定されない。肉腫の例としては、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、皮膚線維肉腫、脂肪肉腫、筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、骨肉腫等が挙げられるが、これらに限定されない。血液悪性腫瘍の例としては、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において「腫瘍細胞」とは、腫瘍を形成する細胞であって、典型的には周辺の正常組織とは無関係に異常に増殖を行うに至った細胞（いわゆる癌化した細胞）をいう。
【００２８】
本明細書において「対象」とは、任意の哺乳動物のことである。「対象」としては、特に限定されないが、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダを挙げることができる。好ましくは、対象はヒトである。
【００２９】
＜＜ｐ−ボロノフェニルアラニン（ＢＰＡ）誘導体＞＞
本発明のＢＰＡ誘導体は、以下の式（Ｉ）で表されるＢＰＡ由来の基が、直接的に又はリンカーを介して連結しているポリマーを含む：
【化１５】
2019163790.tif 000016
［式中、
矢印は隣接する原子との結合を表し、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆである。］
【００３０】
本発明のＢＰＡ誘導体は、当該誘導体に存在する式（Ｉ）の基を介して、腫瘍細胞上のアミノ酸トランスポーター（特にＬＡＴ１）と結合する。アミノ酸トランスポーターへと結合した後、本発明のＢＰＡ誘導体は腫瘍細胞内にエンドサイトーシスにより取り込まれる。したがって、本発明のＢＰＡ誘導体によって、腫瘍細胞へのホウ素の選択的集積が可能となる。また、本発明のＢＰＡ誘導体はエンドソームへと運搬される。この結果、ＢＰＡ単体を使用した場合と比較して、腫瘍細胞からのホウ素の細胞外排出速度が低下する。したがって、腫瘍細胞中に長期間ホウ素を滞留させることができる。さらに、本発明のＢＰＡ誘導体は、優れた腫瘍／正常組織ホウ素濃度比、及び腫瘍／血液ホウ素濃度比を達成することができる。
【００３１】
式（Ｉ）の基の立体構造は、本発明のＢＰＡ誘導体が腫瘍細胞に選択的に取り込まれるのを阻害しない限り特に限定されず、以下の式（Ｉ−ａ）又は（Ｉ−ｂ）のいずれの立体構造を有していても良い。また、以下の式（Ｉ−ａ）の基と（Ｉ−ｂ）の基の両方が本発明のＢＰＡ誘導体に含まれていてもよい。式（Ｉ）の基は、好ましくは、Ｌ−フェニルアラニン部位を有する式（Ｉ−ａ）の基である。
【化１６】
2019163790.tif 000017
【００３２】
式（Ｉ）においてＸ1〜Ｘ4の少なくとも１つが18Ｆである場合、本発明のＢＰＡ誘導体は、例えばＰＥＴ（positron emission tomography）による腫瘍の診断及び検出に使用することができる。また、式（Ｉ）においてＸ1〜Ｘ4の少なくとも１つがＦ19である場合、本発明のＢＰＡ誘導体は、例えば19Ｆ−ＭＲＩによる腫瘍の診断及び検出に使用することができる。
【００３３】
式（Ｉ）の基と、ポリマー又はリンカーとの連結形態は特に限定されない。例えば、ボロン酸部位がポリマー又はリンカーに存在するジオール部位と反応して、以下の式（ＶＩＩＩ−ａ）〜（ＶＩＩＩ−ｃ）のようなボロン酸エステル構造を形成してもよい。
【化１７】
2019163790.tif 000018
［式中、
矢印は隣接する原子との結合を表し、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆである。］
【００３４】
また、上記式（ＶＩＩＩ−ａ）及び（ＶＩＩＩ−ｂ）のようなエステル構造を形成している場合、ポリマー又はリンカーに存在する追加のヒドロキシ基と反応して、トリオールボレート構造を形成していてもよい。トリオールボレート構造は、例えば以下の式（ＩＶ-ａ）に見られる構造である。
【化１８】
2019163790.tif 000019
［式中、
矢印は隣接する原子との結合を表し、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆであり、
Ｙ+は、例えばＨ+、アルカリ金属イオン又はテトラ−Ｃ1-6アルキル−アンモニウムイオンである。］
【００３５】
また、上記式（ＶＩＩＩ−ａ）及び（ＶＩＩＩ−ｂ）のようなエステル構造を形成している場合、水溶液中でヒドロキシ基がホウ素と結合したボロン酸エステル構造を形成していてもよい。そのようなボロン酸エステル構造は、例えば以下の式（ＩＶ−ｂ）及び（ＩＶ-ｃ）で見られる構造である。
【化１９】
2019163790.tif 000020
［式中、
矢印は隣接する原子との結合を表し、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆであり、
Ｙ+は、例えばＨ+、アルカリ金属イオン又はテトラ−Ｃ1-6アルキル−アンモニウムイオンである。］
【００３６】
また例えば、ボロン酸部位がポリマー又はリンカーに存在するジカルボン酸部位と反応して、以下の式（ＶＩＩＩ−ｄ）のような構造を形成してもよい。
【化２０】
2019163790.tif 000021
［式中、
矢印は隣接する原子との結合を表し、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆである。］
【００３７】
本発明のＢＰＡ誘導体中の式（Ｉ）の基の数は、本発明のＢＰＡ誘導体の効果を阻害しない限り特に限定されない。当該基の数の下限は、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、又は１００個であり、当該基の数の上限は、例えば、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、２０００個、３０００個又は５０００個である。当該基の数は、好ましくは、２個以上である。本発明のＢＰＡ誘導体中に２個以上の式（Ｉ）の基である場合、当該式（Ｉ）の基のそれぞれは、同一であっても異なってもよい。複数の式（Ｉ）の基を介して腫瘍細胞上の複数のアミノ酸トランスポーター（特にＬＡＴ１）と多価結合することによって、本発明のＢＰＡ誘導体のアミノ酸トランスポーターへの結合能は、ＢＰＡ単体のアミノ酸トランスポーターへの結合能と比較して大幅に増大する。より好ましくは、式（Ｉ）の基の数は、２〜５０００個、２〜２０００個、２〜１０００個、２〜５００個、２〜３００個、２〜２００個、１０〜５０００個、１０〜２０００個、１０〜１０００個、１０〜５００個、１０〜３００個又は１０〜２００個である。なお、ボロン酸とヒドロキシ基との反応は平衡反応である。したがって、本発明のＢＰＡ誘導体がボロン酸エステル構造を有する場合、本発明のＢＰＡ誘導体に含まれる式（Ｉ）の基の数は、本発明のＢＰＡ誘導体が形成される溶液中のボロン酸とポリマーの濃度に依存して変動し得る。
【００３８】
本発明のＢＰＡ誘導体に含まれるポリマーは、本発明のＢＰＡ誘導体の効果を阻害しない限り特に限定されない。ポリマーは、直鎖であっても分枝鎖であってよく、ホモポリマー又はコポリマー（共重合体）の形態を取り得る。コポリマーである場合、コポリマーは、ランダムコポリマー又はブロックコポリマーであってよい。本発明のＢＰＡ誘導体に含まれるポリマーは、好ましくは水溶性ポリマーである。本発明のＢＰＡ誘導体において使用され得るポリマーとして、例えば、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリエーテル、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリシロキサン、ポリビニル、ポリペプチド、ポリサッカリド、ポリヌクレオチド及びそれらの共重合体などが挙げられる。好ましくは、当該ポリマーは、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリペプチド、ポリサッカリド、及びそれらの共重合体である。より好ましくは、当該ポリマーは、ポリビニルアルコール又はポリペプチドである。
【００３９】
本発明のＢＰＡ誘導体の数平均分子量の下限は、例えば１，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ又は７，０００Ｄａであり（好ましくは５，０００Ｄａであり）、その上限は、特に限定されないが、例えば１，５００，０００Ｄａ、１，０００，０００Ｄａ、５００，０００Ｄａ、３００，０００Ｄａ、１００，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ又は５０，０００Ｄａである。本発明のＢＰＡ誘導体の数平均分子量は、好ましくは１，０００Ｄａ以上であり、より好ましくは３，０００Ｄａ〜１５０，０００Ｄａであり、さらに好ましくは６，０００Ｄａ〜７０，０００Ｄａである。本明細書において、特に断らない限り、数平均分子量は1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分値に基づく算出によって求められる値である。
【００４０】
式（Ｉ）の基がポリマーにリンカーを介して連結する場合、当該リンカーは、ＢＰＡと結合可能な基を含む。好ましくは、当該基はヒドロキシ基又はカルボキシル基である。好ましくは、当該リンカーは少なくとも２つのヒドロキシ基、又は少なくとも２つのカルボキシル基を含む。リンカーは、本発明のＢＰＡ誘導体の機能を阻害しない限り特に限定されないが、例えば、２つのヒドロキシ基で置換されたＣ1-40アルキレン基である。ここで前記Ｃ1-40アルキレン基中のメチレン基は１〜１０個のオキソ基で置換されていてもよく、前記Ｃ1-40アルキレン基中のメチレン基は１〜１０個のハロゲンで置換されていてもよく、前記Ｃ1-40アルキレン基中のメチレン基は１〜１０個のヒドロキシ基で置換されていてもよく、隣接するメチレン基同士が１〜１０個の不飽和結合で結ばれていてもよく、そして前記アルキレン基中のメチレン基のうち、１〜２０個のメチレン基がＮＨ、Ｎ（Ｃ1-10アルキル）、Ｏ、Ｓ、Ｃ6-14アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレンで交換されていてもよい。またリンカーは、例えば、ポリオール（例えばカテコール及びポリフェノール）、糖（例えばフルクトース）、糖アルコール（例えばソルビトール）及びグルカミンを含む。またリンカーは、例えば以下の式（Ｘ−ａ）及び（ＸＩＩ−ａ）を含む。
【化２１】
2019163790.tif 000022
［式中、矢印は隣接する原子との結合を表す。］
【００４１】
本発明のＢＰＡ誘導体は、少なくとも一種の検出可能な標識を含んでもよい。本明細書において「検出可能な標識」とは、既存の任意の検出手段により検出し得る任意の原子又は化合物のことである。検出手段としては、特に限定されないが、例えば、肉眼、光学検査装置（例えば、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、位相差顕微鏡、in vivoイメージング装置）、Ｘ線装置（例えば、単純Ｘ線装置、ＣＴ（コンピュータ断層撮影）装置）、ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）装置、核医学検査装置（例えば、シンチグラフ装置、ＰＥＴ（positron emission tomography）装置、ＳＰＥＣＴ（single photon emission computed tomography）装置）、超音波検査装置及びサーモグラフィー装置などが挙げられる。各検出手段に適した標識は当業者に知られており、例えば、Lecchi et al., Q J Nucl Med Mol Imaging. 2007; 51（2）: pp. 111-26などに記載されている。検出可能な標識としては、特に限定されないが、例えば、蛍光標識、発光標識、造影剤、金属原子、１種又は２種以上の金属原子を含む化合物、放射性同位体、１種又は２種以上の放射性同位体を含む化合物、ナノ粒子、及びリポソームが挙げられる。本発明のＢＰＡ誘導体における検出可能な標識の導入位置は特に限定されない。例えば、ポリマーの末端基に導入されていてもよいし、ポリマー中に存在する置換基（例えばヒドロキシ基）に直接又はリンカーを介して導入されてもよい。
【００４２】
肉眼および光学検査装置での検出に適した標識としては、例えば、種々の蛍光標識および発光標識が挙げられる。具体的な蛍光標識としては、特に限定されないが、例えば、Cy（商標）シリーズ（例えば、Cy（商標）2、 3、 5、 5.5、 7 など）、DyLight（商標）シリーズ（例えば、DyLight（商標）405、 488、 549、 594、 633、 649、 680、 750、 800 など）、Alexa Fluor（登録商標）シリーズ（例えば、Alexa Fluor（登録商標）405、 488、 549、 594、 633、 647、 680、 750など）、HiLyte Fluor（商標）シリーズ（例えば、HiLyte Fluor（商標）488、 555、 647、 680、 750など）、ATTOシリーズ（例えば、ATTO488、 550、 633、 647N、 655、 740など）、FAM、 FITC、 テキサスレッド、GFP、RFP、Qdot、IRDye（登録商標）（例えばIRDye（登録商標）700DX）などを用いることができる。
【００４３】
また、具体的な発光標識としては、特に限定されないが、例えば、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン、イクオリンなどを用いることができる。
【００４４】
Ｘ線装置での検出に適した標識としては、例えば、種々の造影剤が挙げられる。具体的な造影剤としては、特に限定されないが、例えば、ヨウ素原子、ヨウ素イオン、ヨウ素含有化合物などを用いることができる。
【００４５】
ＭＲＩ装置での検出に適した標識としては、例えば、種々の金属原子や１種又は２種以上の該金属原子を含む化合物、例えば１種又は２種以上の該金属原子の錯体などが挙げられる。具体的には、特に限定されないが、例えば、ガドリニウム（ＩＩＩ）（Ｇｄ（ＩＩＩ））、イットリウム−８８（88Ｙ）、インジウム−１１１（111Ｉｎ）、およびこれらと、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、（１，２−エタンジイルジニトリロ）四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン、２，２’−ビピリジン（ｂｉｐｙ）、１，１０−フェナントロリン（ｐｈｅｎ）、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ＤＰＰＥ）、２，４−ペンタンジオン（ａｃａｃ）、シュウ酸塩（ｏｘ）などの配位子との錯体、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、酸化マンガン（ＭｎＯ）などを用いることができる。
【００４６】
核医学検査装置での検出に適した標識としては、例えば、種々の放射性同位体や１種又は２種以上の該放射性同位体を含む化合物、例えば１種又は２種以上の該放射性同位体の錯体などが挙げられる。放射性同位体としては、特に限定されないが、例えば、テクネチウム−９９ｍ（99mＴｃ）、インジウム−１１１（111Ｉｎ）、ヨウ素−１２３（123Ｉ）、ヨウ素−１２４（124Ｉ）、ヨウ素−１２５（125Ｉ）、ヨウ素−１３１（131Ｉ）、タリウム−２０１（201Ｔｌ）、炭素−１１（11Ｃ）、窒素−１３（13Ｃ）、酸素−１５（15Ｏ）、フッ素−１８（18Ｆ）、銅−６４（64Ｃｕ）、ガリウム−６７（67Ｇａ）、クリプトン−８１ｍ（81mＫｒ）、キセノン−１３３（133Ｘｅ）、ストロンチウム−８９（89Ｓｒ）、イットリウム−９０（90Ｙ)などを用いることができる。また、放射性同位体を含む化合物としては、特に限定されないが、例えば、123Ｉ−ＩＭＰ、99mＴｃ−ＨＭＰＡＯ、99mＴｃ−ＥＣＤ、99mＴｃ−ＭＤＰ、99mＴｃ−テトロフォスミン、99mＴｃ−ＭＩＢＩ、99mＴｃＯ4−、99mＴｃ−ＭＡＡ、99mＴｃ−ＭＡＧ３、99mＴｃ−ＤＴＰＡ、99mＴｃ−ＤＭＳＡ、18Ｆ−ＦＤＧなどが挙げられる。
【００４７】
超音波検査装置での検出に適した標識としては、特に限定されないが、例えば、ナノ粒子、リポソームなどを用いることができる。
【００４８】
本発明の一実施形態において、本発明のＢＰＡ誘導体は、以下の式（ＩＩ）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である。
【化２２】
2019163790.tif 000023
［式中、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆであり、
Ｌ1及びＬ2は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、−ＣＨ（ＯＡ1）2又は検出可能な標識であり、
Ａ1はＣ1-6アルキル基であり、
ｍ＝０〜３，９９８であり、
ｎ＝１〜２，０００であり、
ｍ＋２ｎ＝１０〜４，０００であり、
各繰り返し単位の順序は任意である（すなわち、ランダムコポリマーでもブロックコポリマーでもよい）。］
【００４９】
ｍ及びｎは重合度である。ｍの下限は０であるが、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８又は９である。ｍの上限は３，９９８であるが、好ましくは３，９９８、３，５００、３，０００、２，５００、２，０００、１５００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０である。ｎの下限は１であるが、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。ｎの上限は２,０００であるが、好ましくは２０００、１９９０、１９８０、１９７０、１９６０、１９５０、１９００、１８００、１７００、１６００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００又は５００である。（ｍ＋２ｎ）の下限は１０であるが、好ましくは１０、２０、３０、４０又は５０である。（ｍ＋２ｎ）の上限は４,０００であるが、好ましくは４,０００、３，５００、３，０００、２，５００、２,０００、１,５００、１,０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００又は２００である。ｍ及びｎは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分値に基づく定量により算出することができる。
【００５０】
Ｌ1及び／又はＬ2がリンカーである場合、特に限定されないが、例えば、Ｃ1-40アルキレン基である。ここで前記Ｃ1-40アルキレン基中のメチレン基は１〜１０個のオキソ基で置換されていてもよく、前記Ｃ1-40アルキレン基中のメチレン基は１〜１０個のハロゲンで置換されていてもよく、隣接するメチレン基同士が１〜１０個の不飽和結合で結ばれていてもよく、そして前記アルキレン基中のメチレン基のうち、１〜２０個のメチレン基がＮＨ、Ｎ（Ｃ1-10アルキル）、Ｏ、Ｓ、Ｃ6-14アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、又は重合度が２〜２,０００、２〜１,０００、２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、２〜５０もしくは２〜１０のポリオキシアルキレンで置き換えられていてもよい。リンカーは例えば、以下の構造であってもよい。
【化２３】
2019163790.tif 000024
［式中、ｗは１〜２，０００であり、ＺはＣ1-5アルキレン基である］
またリンカーは例えば、以下の構造であってもよい。
【化２４】
2019163790.tif 000025
［式中、ｗは１〜２，０００であり、ＺはＣ1-5アルキレン基である］
【００５１】
本発明の一実施形態において、本発明のＢＰＡ誘導体は、以下の式(ＩＩＩ)で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である。
【化２５】
2019163790.tif 000026
［式中、
Ｌ3及びＬ4は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、−ＣＨ（ＯＡ1）2又は検出可能な標識であり、
Ａ1はＣ1-6アルキル基であり、
Ｒ5aは、それぞれ独立して、以下の（ＩＶ−ａ）又は（ＩＶ−ｂ）の基：
【化２６】
2019163790.tif 000027
（式中、矢印はＮＨへの結合を示す）
であり、
Ｒ5bは、それぞれ独立して、以下の式（ＩＶ−ｃ）〜（ＩＶ−ｇ）からなる群から選択される基：
【化２７】
2019163790.tif 000028
（式中、
矢印はＮＨへの結合を示し、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆであり、
Ｙ+は、Ｈ+、アルカリ金属イオン又はテトラ−Ｃ1-6アルキル−アンモニウムイオン（例えば、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラ−ｎ−プロピルアンモニウム、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム、テトラ−ｎ−ペンチルアンモニウム、テトラ−ｎ−ヘキシルアンモニウム）である）
であり、
ｐ＝０〜２９９であり、
ｑ＝１〜３００であり、
ｒ＝０〜２９９であり、
ｐ+ｑ＋ｒ＝１０〜３００であり、
各繰り返し単位の順序は任意である（すなわち、ランダムコポリマーでもブロックコポリマーでもよい）。］
【００５２】
本明細書において「Ｒ5aは、それぞれ独立して」とは、繰り返し単位が複数存在する場合に、当該繰り返し単位中のＲ5aも複数存在するが、当該Ｒ5a同士が互いに同一であっても異なっても良いことを意味する。「Ｒ5bは、それぞれ独立して」についても同様である。
【００５３】
ｐ、ｑ及びｒは重合度である。ｐの下限は０であるが、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８又は９である。ｐの上限は２９９であるが、好ましくは２９９、２９０、２８０、２７０、２６０又は２５０である。ｑの下限は１であるが、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８又は９である。ｑの上限は３００であるが、好ましくは３００、２９０、２８０、２７０、２６０又は２５０である。ｒの下限は０であるが、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８又は９である。ｒの上限は２９９であるが、好ましくは２９９、２９０、２８０、２７０、２６０又は２５０である。（ｐ+ｑ＋ｒ）の下限は１０であるが、好ましくは１０、２０又は３０である。（ｐ+ｑ＋ｒ）の下限は３００であるが、好ましくは３００、２９０、２８０、２７０、２６０又は２５０である。ｐ、ｑ及びｒは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分値に基づく定量により算出することができる。
【００５４】
Ｌ3及び／又はＬ4がリンカーである場合、特に限定されないが、例えば、Ｃ1-40アルキレン基である。ここで前記Ｃ1-40アルキレン基中のメチレン基は１〜１０個のオキソ基で置換されていてもよく、前記Ｃ1-40アルキレン基中のメチレン基は１〜１０個のハロゲンで置換されていてもよく、隣接するメチレン基同士が１〜１０個の不飽和結合で結ばれていてもよく、そして前記アルキレン基中のメチレン基のうち、１〜２０個のメチレン基がＮＨ、Ｎ（Ｃ1-10アルキル）、Ｏ、Ｓ、Ｃ6-14アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、又は重合度が２〜２，０００、２〜１,０００、２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、２〜５０もしくは２〜１０のポリオキシアルキレンで置き換えられていてもよい。リンカーは例えば、以下の構造であってもよい。
【化２８】
2019163790.tif 000029
［式中、ｗは１〜２，０００であり、ＺはＣ1-5アルキレン基である］
またリンカーは例えば、以下の構造であってもよい。
【化２９】
2019163790.tif 000030
［式中、ｗは１〜２，０００であり、ＺはＣ1-5アルキレン基である］
【００５５】
本発明の一実施形態において、本発明のＢＰＡ誘導体は、以下の式(Ｖ)で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である。
【化３０】
2019163790.tif 000031
［式中、
Ｌ5及びＬ6は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
Ｒ6及びＲ7は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、−ＣＨ（ＯＡ1）2又は検出可能な標識であり、
Ａ1はＣ1-6アルキル基であり、
Ｒ8aは、以下の式（ＶＩ−ａ）の基：
【化３１】
2019163790.tif 000032
（式中、矢印はカルボニル炭素への結合を示す）
であり、
Ｒ8bは、それぞれ独立して、以下の式（ＶＩ−ｂ）〜（ＶＩ−ｈ）からなる群から選択される基：
【化３２】
2019163790.tif 000033
（式中、
矢印はカルボニル炭素への結合を示し、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆである）
であり、
ｓ＝０〜２９９であり、
ｔ＝１〜３００であり、
ｕ＝０〜２９９であり、
ｓ＋ｔ＋ｕ＝２〜３００であり、
各繰り返し単位の順序は任意である（すなわち、ランダムコポリマーでもブロックコポリマーでもよい）。］
【００５６】
本明細書において「Ｒ8bは、それぞれ独立して」とは、繰り返し単位が複数存在する場合に、当該繰り返し単位中のＲ8bも複数存在するが、当該Ｒ8b同士が互いに同一であっても異なっても良いことを意味する。
【００５７】
ｓ、ｔ及びｕは重合度である。ｓの下限は０であるが、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８又は９である。ｓの上限は２９９であるが、好ましくは２９９、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０である。ｔの下限は１であるが、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８又は９である。ｔの上限は３００であるが、好ましくは３００、２９０、２８０、２７０、２６０又は２５０である。ｕの下限は０であるが、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８又は９である。ｕの上限は２９９であるが、好ましくは２９９、２９０、２８０、２７０、２６０又は２５０である。（ｓ＋ｔ＋ｕ）の下限は２であるが、好ましくは２、３、４、５である。（ｓ＋ｔ＋ｕ）の上限は３００であるが、好ましくは３００、２９０、２８０、２７０、２６０又は２５０である。ｓ、ｔ及びｕは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分値に基づく定量により算出することができる。
【００５８】
Ｌ5及び／又はＬ6がリンカーである場合、特に限定されないが、例えば、Ｃ1-40アルキレン基である。ここで前記Ｃ1-40アルキレン基中のメチレン基は１〜１０個のオキソ基で置換されていてもよく、前記Ｃ1-40アルキレン基中のメチレン基は１〜１０個のハロゲンで置換されていてもよく、隣接するメチレン基同士が１〜１０個の不飽和結合で結ばれていてもよく、そして前記アルキレン基中のメチレン基のうち、１〜２０個のメチレン基がＮＨ、Ｎ（Ｃ1-10アルキル）、Ｏ、Ｓ、Ｃ6-14アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、又は重合度が５０〜５００のポリオキシアルキレンで置き換えられていてもよい。リンカーは例えば、以下の構造であってもよい。
【化３３】
2019163790.tif 000034
［式中、ｗは１〜２，０００であり、ＺはＣ1-5アルキレン基である］
またリンカーは例えば、以下の構造であってもよい。
【化３４】
2019163790.tif 000035
［式中、ｗは１〜２，０００であり、ＺはＣ1-5アルキレン基である］
【００５９】
本発明の一実施形態において、本発明のＢＰＡ誘導体は、以下の式（ＩＸ）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である。
【化３５】
2019163790.tif 000036
［式中、
Ｌ7及びＬ8は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
Ｒ9及びＲ10は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、−ＣＨ（ＯＡ1）2又は検出可能な標識であり、
Ａ1はＣ1-6アルキル基であり、
Ｒ11aは、以下の式（Ｘ-ａ）：
【化３６】
2019163790.tif 000037
（式中、矢印はＮＨへの結合を示す）
であり、
Ｒ11bは、それぞれ独立して以下の式（Ｘ−ｂ）：
【化３７】
2019163790.tif 000038
（式中、
矢印はＮＨへの結合を示し、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆであり、
Ｙ+は、Ｈ+、アルカリ金属イオン又はテトラ−Ｃ1-6アルキル−アンモニウムイオン（例えば、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラ−ｎ−プロピルアンモニウム、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム、テトラ−ｎ−ペンチルアンモニウム、テトラ−ｎ−ヘキシルアンモニウム）である）
であり、
ｅ＝０〜２９９であり、
ｆ＝１〜３００であり、
ｇ＝０〜２９９であり、
ｅ＋ｆ＋ｇ＝１０〜３００であり、
各繰り返し単位の順序は任意である（すなわち、ランダムコポリマーでもブロックコポリマーでもよい）。］
【００６０】
本明細書において「Ｒ11bは、それぞれ独立して」とは、繰り返し単位が複数存在する場合に、当該繰り返し単位中のＲ11bも複数存在するが、当該Ｒ11b同士が互いに同一であっても異なっても良いことを意味する。
【００６１】
ｅ、ｆ及びｇは重合度である。ｅの下限は０であるが、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８又は９である。ｅの上限は２９９であるが、好ましくは２９９、２９０、２８０、２７０、２６０又は２５０である。ｆの下限は１であるが、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８又は９である。ｆの上限は３００であるが、好ましくは３００、２９０、２８０、２７０、２６０又は２５０である。ｇの下限は０であるが、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８又は９である。ｇの上限は２９９であるが、好ましくは２９９、２９０、２８０、２７０、２６０又は２５０である。（ｅ＋ｆ＋ｇ）の下限は１０であるが、好ましくは１０、２０又は３０である。（ｅ＋ｆ＋ｇ）の下限は３００であるが、好ましくは３００、２９０、２８０、２７０、２６０又は２５０である。ｅ、ｆ及びｇは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分値に基づく定量により算出することができる。
【００６２】
Ｌ7及び／又はＬ8がリンカーである場合、特に限定されないが、例えば、Ｃ1-40アルキレン基である。ここで前記Ｃ1-40アルキレン基中のメチレン基は１〜１０個のオキソ基で置換されていてもよく、前記Ｃ1-40アルキレン基中のメチレン基は１〜１０個のハロゲンで置換されていてもよく、隣接するメチレン基同士が１〜１０個の不飽和結合で結ばれていてもよく、そして前記アルキレン基中のメチレン基のうち、１〜２０個のメチレン基がＮＨ、Ｎ（Ｃ1-10アルキル）、Ｏ、Ｓ、Ｃ6-14アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、又は重合度が２〜２，０００、２〜１,０００、２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、２〜５０もしくは２〜１０のポリオキシアルキレンで置き換えられていてもよい。リンカーは例えば、以下の構造であってもよい。
【化３８】
2019163790.tif 000039
［式中、ｗは１〜２，０００であり、ＺはＣ1-5アルキレン基である］
またリンカーは例えば、以下の構造であってもよい。
【化３９】
2019163790.tif 000040
［式中、ｗは１〜２，０００であり、ＺはＣ1-5アルキレン基である］
【００６３】
本発明の一実施形態において、本発明のＢＰＡ誘導体は、以下の式（ＸＩ）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である。
【化４０】
2019163790.tif 000041
［式中、
Ｌ9及びＬ10は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
Ｒ12及びＲ13は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、−ＣＨ（ＯＡ1）2又は検出可能な標識であり、
Ａ1はＣ1-6アルキル基であり、
Ｒ14aは、以下の式（ＸＩＩ−ａ）：
【化４１】
2019163790.tif 000042
（式中、矢印はＮＨへの結合を示す）
であり、
Ｒ14bは、それぞれ独立して以下の式（ＸＩＩ−ｂ）：
【化４２】
2019163790.tif 000043
（式中、
矢印はＮＨへの結合を示し、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆであり、
Ｙ+は、Ｈ+、アルカリ金属イオン又はテトラ−Ｃ1-6アルキル−アンモニウムイオン（例えば、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラ−ｎ−プロピルアンモニウム、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム、テトラ−ｎ−ペンチルアンモニウム、テトラ−ｎ−ヘキシルアンモニウム）である）
であり、
ｈ＝０〜２９９であり、
ｉ＝１〜３００であり、
ｋ＝０〜２９９であり、
ｈ＋ｉ＋ｋ＝１０〜３００であり、
各繰り返し単位の順序は任意である（すなわち、ランダムコポリマーでもブロックコポリマーでもよい）。］
【００６４】
本明細書において「Ｒ14bは、それぞれ独立して」とは、繰り返し単位が複数存在する場合に、当該繰り返し単位中のＲ14bも複数存在するが、当該Ｒ14b同士が互いに同一であっても異なっても良いことを意味する。
【００６５】
ｈ、ｉ及びｋは重合度である。ｈの下限は０であるが、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８又は９である。ｈの上限は２９９であるが、好ましくは２９９、２９０、２８０、２７０、２６０又は２５０である。ｉの下限は１であるが、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８又は９である。ｉの上限は３００であるが、好ましくは３００、２９０、２８０、２７０、２６０又は２５０である。ｋの下限は０であるが、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８又は９である。ｋの上限は２９９であるが、好ましくは２９９、２９０、２８０、２７０、２６０又は２５０である。（ｈ＋ｉ＋ｋ）の下限は１０であるが、好ましくは１０、２０又は３０である。（ｈ＋ｉ＋ｋ）の下限は３００であるが、好ましくは３００、２９０、２８０、２７０、２６０又は２５０である。ｈ、ｉ及びｋは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分値に基づく定量により算出することができる。
【００６６】
Ｌ9及び／又はＬ10がリンカーである場合、特に限定されないが、例えば、Ｃ1-40アルキレン基である。ここで前記Ｃ1-40アルキレン基中のメチレン基は１〜１０個のオキソ基で置換されていてもよく、前記Ｃ1-40アルキレン基中のメチレン基は１〜１０個のハロゲンで置換されていてもよく、隣接するメチレン基同士が１〜１０個の不飽和結合で結ばれていてもよく、そして前記アルキレン基中のメチレン基のうち、１〜２０個のメチレン基がＮＨ、Ｎ（Ｃ1-10アルキル）、Ｏ、Ｓ、Ｃ6-14アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、又は重合度が２〜２，０００、２〜１,０００、２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、２〜５０もしくは２〜１０のポリオキシアルキレンで置き換えられていてもよい。リンカーは例えば、以下の構造であってもよい。
【化４３】
2019163790.tif 000044
［式中、ｗは１〜２，０００であり、ＺはＣ1-5アルキレン基である］
またリンカーは例えば、以下の構造であってもよい。
【化４４】
2019163790.tif 000045
［式中、ｗは１〜２，０００であり、ＺはＣ1-5アルキレン基である］
【００６７】
本発明の一実施形態において、本発明のＢＰＡ誘導体は、以下の式（XX）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である。
【化４５】
2019163790.tif 000046
［式中、
Ｌ11及びＬ12は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
Ｒ15及びＲ16は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、−ＣＨ（ＯＡ1）2又は検出可能な標識であり、
Ａ1はＣ1-6アルキル基であり、
Ｒ17aは、以下の式（ＸＸＩ−ａ）の基：
【化４６】
2019163790.tif 000047
（式中、矢印はＮＨへの結合を示す）
であり、
Ｒ17bは、それぞれ独立して、以下の式（ＸＸＩ−ｂ）〜（ＸＸＩ−ｈ）からなる群から選択される基：
【化４７】
2019163790.tif 000048
（式中、
矢印はＮＨへの結合を示し、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆである）
であり、
ｘ＝０〜２９９であり、
ｙ＝１〜３００であり、
ｚ＝０〜２９９であり、
ｘ＋ｙ＋ｚ＝１０〜３００であり、
各繰り返し単位の順序は任意である（すなわち、ランダムコポリマーでもブロックコポリマーでもよい）。］
【００６８】
本明細書において「Ｒ17bは、それぞれ独立して」とは、繰り返し単位が複数存在する場合に、当該繰り返し単位中のＲ17bも複数存在するが、当該Ｒ17b同士が互いに同一であっても異なっても良いことを意味する。
【００６９】
x、y及びzは重合度である。ｘの下限は０であるが、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８又は９である。ｘの上限は２９９であるが、好ましくは２９９、２９０、２８０、２７０、２６０又は２５０である。ｙの下限は１であるが、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８又は９である。ｙの上限は３００であるが、好ましくは３００、２９０、２８０、２７０、２６０又は２５０である。ｚの下限は０であるが、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８又は９である。ｚの上限は２９９であるが、好ましくは２９９、２９０、２８０、２７０、２６０又は２５０である。（ｘ＋ｙ＋ｚ）の下限は１０であるが、好ましくは１０、２０又は３０である。（ｘ＋ｙ＋ｚ）の下限は３００であるが、好ましくは３００、２９０、２８０、２７０、２６０又は２５０である。ｘ、ｙ及びｚは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分値に基づく定量により算出することができる。
【００７０】
Ｌ11及び／又はＬ12がリンカーである場合、特に限定されないが、例えば、Ｃ1-40アルキレン基である。ここで前記Ｃ1-40アルキレン基中のメチレン基は１〜１０個のオキソ基で置換されていてもよく、前記Ｃ1-40アルキレン基中のメチレン基は１〜１０個のハロゲンで置換されていてもよく、隣接するメチレン基同士が１〜１０個の不飽和結合で結ばれていてもよく、そして前記アルキレン基中のメチレン基のうち、１〜２０個のメチレン基がＮＨ、Ｎ（Ｃ1-10アルキル）、Ｏ、Ｓ、Ｃ6-14アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、又は重合度が、２〜１,０００、２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、２〜５０もしくは２〜１０のポリオキシアルキレンで置き換えられていてもよい。リンカーは例えば、以下の構造であってもよい。
【化４８】
2019163790.tif 000049
［式中、ｗは１〜２，０００であり、ＺはＣ1-5アルキレン基である］
【００７１】
本発明の一実施形態において、本発明のＢＰＡ誘導体は、以下の式（ＸＸＩＩ）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である。
【化４９】
2019163790.tif 000050
［式中、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆであり、
Ｌ13及びＬ14は、それぞれ独立して、リンカーであるか又は存在せず、
Ｒ18及びＲ19は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、−ＣＨ（ＯＡ1）2又は検出可能な標識であり、
Ａ1はＣ1-6アルキル基であり、
Ｒ20は、それぞれ独立して、ハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基、−ＮＲ21Ｒ22基、又は以下の基：
【化５０】
2019163790.tif 000051
（式中、矢印はカルボニル炭素への結合を示す）
であり、
Ｒ21及びＲ22はそれぞれ独立して、水素であるか、又はハロゲンで置換されていてもよいＣ1-10アルキル基であり、
ａ＝１〜３，９９８であり、
ｂ＝０〜３，９９７であり、
ｃ＝１〜２，０００であり、
ａ＋ｂ＋２ｃ＝１０〜４，０００であり、
各繰り返し単位の順序は任意である。］
【００７２】
ａ、ｂ及びｃは重合度である。ａの下限は１であるが、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８又は９である。ａの上限は３，９９８であるが、好ましくは３，９９８、３，５００、３，０００、２，５００、２，０００、１５００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０である。ｂの下限は０であるが、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８又は９である。ｂの上限は３，９９７であるが、好ましくは３，９９７、３，５００、３，０００、２，５００、２，０００、１５００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０である。ｃの下限は１であるが、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。ｃの上限は２，０００であるが、好ましくは２０００、１９９０、１９８０、１９７０、１９６０、１９５０、１９００、１８００、１７００、１６００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００又は５００である。（ａ＋ｂ＋２ｃ）の下限は１０であるが、好ましくは１０、２０、３０、４０又は５０である。（ａ＋ｂ＋２ｃ）の上限は４，０００であるが、好ましくは４，０００、３，５００、３，０００、２，５００、２，０００、１，５００、１，０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００又は２００である。ａ、ｂ及びｃは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分値に基づく定量により算出することができる。
【００７３】
Ｌ13及び／又はＬ14がリンカーである場合、特に限定されないが、例えば、Ｃ1-40アルキレン基である。ここで前記Ｃ1-40アルキレン基中のメチレン基は１〜１０個のオキソ基で置換されていてもよく、前記Ｃ1-40アルキレン基中のメチレン基は１〜１０個のハロゲンで置換されていてもよく、隣接するメチレン基同士が１〜１０個の不飽和結合で結ばれていてもよく、そして前記アルキレン基中のメチレン基のうち、１〜２０個のメチレン基がＮＨ、Ｎ（Ｃ1-10アルキル）、Ｏ、Ｓ、Ｃ6-14アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、又は重合度が２〜２,０００、２〜１,０００、２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、２〜５０もしくは２〜１０のポリオキシアルキレンで置き換えられていてもよい。リンカーは例えば、以下の構造であってもよい。
【化５１】
2019163790.tif 000052
［式中、ｗは１〜２，０００であり、ＺはＣ1-5アルキレン基である］
【００７４】
本発明のＢＰＡ誘導体は、種々の公知の方法を適用して、式（Ｉ）の基をポリマーに導入することで製造することができる。例えば、以下の式（ＶＩＩ）：
【化５２】
2019163790.tif 000053
［式中、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆである］
で表される化合物と、
前記式（ＶＩＩ）の化合物と反応して式(Ｉ)：
【化５３】
2019163790.tif 000054
［式中、
矢印は隣接する原子との結合を表し、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆである］
で表される基を形成することができるポリマーとを、水又は水含有溶媒（例えば、リン酸緩衝生理食塩水など）中で混合し、例えば４〜１００℃で、１０分〜１時間反応させることによって製造することができる。
【００７５】
＜＜組成物＞＞
本発明の組成物は、本発明のＢＰＡ誘導体を含む。本発明の組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、緩衝剤、賦形剤又はこれらの組み合わせをさらに含んでも良い。本発明の組成物は、腫瘍の治療、診断、又は検出のために使用することができる。本発明の組成物を対象の生体内に投与する場合は、その投与経路は特に限定されないが、例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、関節内投与、腹腔内投与、眼内投与などが挙げられる。また、投与量は疾患の種類、対象の年齢、体重、性別などにより適宜選択される。
【００７６】
＜＜キット＞＞
本発明のキットは、式（ＶＩＩ）：
【化５４】
2019163790.tif 000055
［式中、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆである］
で表される化合物と、
前記式（ＶＩＩ）の化合物と反応して式(Ｉ)：
【化５５】
2019163790.tif 000056
［式中、
矢印は隣接する原子との結合を表し、
Ｘ1〜Ｘ4はそれぞれ独立して、Ｈ、18Ｆ又は19Ｆである］
で表される基を形成することができるポリマーと
を含む。
【００７７】
前記式（ＶＩＩ）の化合物と反応して式（Ｉ）で表される基を形成することができるポリマーは、直鎖であっても分枝鎖であってよく、ホモポリマー又はコポリマー（共重合体）の形態を取り得る。コポリマーである場合、コポリマーは、ランダムコポリマー又はブロックコポリマーであってよい。当該ポリマーは、好ましくは水溶性ポリマーである。当該ポリマーは、例えば、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリエーテル、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリシロキサン、ポリビニル、ポリペプチド、ポリサッカリド、ポリヌクレオチド又はそれらの共重合体を含む。好ましくは、当該ポリマーは、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリペプチド、ポリサッカリド、又はそれらの共重合体を含み、より好ましくは、当該ポリマーは、ポリビニルアルコール又はポリペプチドを含む。前記式（ＶＩＩ）の化合物と反応して式（Ｉ）で表される基を形成することができるポリマーは、その側鎖に前記式（ＶＩＩ）の化合物と反応して式（Ｉ）で表される基を形成することができる部分が連結されていてもよい。当該部分は、ポリマーと式（Ｉ）で表される基との間のリンカーを構成し得る。
【００７８】
前記式（ＶＩＩ）の化合物と反応して式（Ｉ）で表される基を形成することができるポリマーは、例えば以下の式（ＸＶ−ａ）〜（ＸＶ−ｇ）であってもよい。式中の記号の定義及びその範囲は上記の通りである。
【化５６】
2019163790.tif 000057
【化５７】
2019163790.tif 000058
【化５８】
2019163790.tif 000059
【化５９】
2019163790.tif 000060
【化６０】
2019163790.tif 000061
【化６１】
2019163790.tif 000062
【化６２】
2019163790.tif 000063
【００７９】
本発明のキットには、本発明のＢＰＡ誘導体の製造方法についての説明書が含まれてもよい。また、本発明のＢＰＡ誘導体を使用して腫瘍を治療、診断又は検出するための方法についての説明書が含まれてもよい。
【００８０】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【００８１】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例】
【００８２】
実施例１
ポリビニルアルコール（PVA）の合成
＜使用した試薬＞
特に記述のない試薬及び溶媒は、市販品をそのまま使用した。
酢酸ビニル：市販品 (和光、和光特級) をアルゴン雰囲気下で蒸留したものを使用。
シアノメチル  メチル（フェニル）カルバモジチオエート（Cyanomethyl methyl (phenyl) carbamodithioate）： Sigma Aldrich
α, α’−アゾビスイソブチロニトリル (AIBN) ： Sigma Aldrich 
メタノール（MeOH） (試薬特級) ： ナカライテスク
5 mol/l 塩酸 (質量分析用) ： 和光純薬工業株式会社
5 mol/l 水酸化ナトリウム (質量分析用) ： 和光純薬工業株式会社
ベンゼン (試薬特級) ： 和光純薬工業株式会社
テトラヒドロフラン(THF) ： 和光純薬工業株式会社
りん酸二水素ナトリウム(NaH2PO3) ： 和光純薬工業株式会社
りん酸水素二ナトリウム : ナカライテスク
＜使用した機器＞
NMR (Nuclear Magnetic Resonance) ： BRUKER AVANCEIII 400 (400 MHz, BRUKER BioSpin)
GPC (Gel Permeation Chromatography) ： 日本分光株式会社
PVAcを測定したカラム：TSK-gel superAW3000, superAW4000, 及びsuperAWL-guard column (Tosoh Corporation)
PVAを測定したカラム：Superdex 200 Increase 10/300 GL (GEヘルスケア)
検出器：RI-2031 【００８３】
（１）ポリ（ビニルアセテート） (PVAc) の合成
【化６３】
2019163790.tif 000064
開始剤 AIBN 2.86 mg (0.0174 mmol) およびRAFT剤である シアノメチル メチル（フェニル）カルバモジチオエート 38.68 mg (0.174 mmol) を秤量し、100 mL 二口ナス型フラスコに氷浴中アルゴン雰囲気下で加えた。その後、酢酸ビニル 3.22 mL (34.8 mmol) を系内にアルゴン雰囲気下で加え、凍結脱気を4回行った。系内をアルゴンで満たし、60 ℃で24時間攪拌した。その後、反応溶液を透析膜 (MWCO = 3.5kD) に入れ、300 mLのTHF溶液中で12時間透析を3度行った後、Benzene 溶液から凍結乾燥を行い、目的物であるPVAcを燈黄色固体として収量2.97 gで得た。得られたPVAcを1H-NMRおよびGPCにより解析した。【００８４】
1H-NMRから、PVAcの重合度は172であり、Mn = 14,800と計算された。具体的には、RAFT剤由来の芳香環シグナル (7.56 - 7.28 ppm, (br, Ar-H)) を基準 (5H) とし、主鎖骨格由来のシグナル (1.84 - 1.66 ppm (br, -CH2)) およびエステル基由来 (2.04 - 1.85 ppm (br, O-CO-CH3)) のシグナルに基づいて数平均分子量を計算した。また、GPCカーブは単峰性で、分子量分布はMw / Mn = 1.31と狭く、分子量はMn = 12,800と計算された。なお、GPCより求めた分子量は、標準ポリエチレングリコールを基準とする相対分子量であるため、以下では1H-NMRで得られた分子量をMnとした。
【化６４】
2019163790.tif 000065
【００８５】
（２）ポリビニルアルコール（PVA）の合成
【化６５】
2019163790.tif 000066
300 mL ナス型フラスコに、上記（１）で得たPVAc 1.00 g (0.062 mmol) を量り取り、MeOH 30 mLに溶解させた。PVAc のエステルに対して5当量の水酸化ナトリウム 2.32 g (57.94 mmol) を加え、さらに純水を加えて60℃で24 時間攪拌した。反応溶液を透析膜 (MWCO = 3.5kD) に入れ、2 Lの純水中で透析を3回行った。得られたポリマー溶液を0.45 μm フィルターで濾過後、凍結乾燥を行い、目的物であるPVAを燈黄色固体として収量240 mgで得た。得られたPVAを、1H-NMRおよびGPCにより解析した。1H-NMRより、けん化率は99 mol %と求められた。また、得られたPVAのGPCカーブは単峰性であることが確認された。なお、上記化学式中の「＊」及び「＊＊」は、構造未決定である。
【化６６】
2019163790.tif 000067
【００８６】
実施例２
PVAにBPAが結合したBPA誘導体（PVA-BPA）の結合評価
＜使用した試薬＞
特に記述のない試薬・溶媒は市販品をそのまま使用した。
5 mol/l 塩酸 (質量分析用) ： 和光純薬工業株式会社
5 mol/l 水酸化ナトリウム (質量分析用) ： 和光純薬工業株式会社
りん酸二水素ナトリウム (NaH2PO3) ： 和光純薬工業株式会社
4-ボロノ-L-フェニルアラニン (BPA)（本試薬のホウ素は10B）： Katchem
4-ボロノ-L-フェニルアラニン (11B-BPA)（本試薬のホウ素は、11B-BPAと10B-BPAが混在している）：Sigma-Aldrich
アリザリンレッドS （ARS）： 和光純薬工業株式会社
りん酸水素二ナトリウム : ナカライテスク
D-フルクトース (以下で「Fru」とも呼ぶ): 和光純薬工業株式会社
なお、FruとBPAとを反応させて得られるBPA誘導体を以下で「Fru-BPA」とも呼ぶ。
＜使用した機器＞
NMR (Nuclear Magnetic Resonance) ： BRUKER AVANCEIII  HD500 (500 MHz, BRUKER BioSpin)
蛍光分光光度計 (FP8300) : 日本分光株式会社【００８７】
11B-BPA溶液、Fru-11B-BPA溶液及びPVA-11B-BPA溶液を、10 mM PBS (140 mM NaCl, pH 9.5) を用いて以下の濃度に調製した。
11B-BPA溶液：11B-BPA濃度191.3 mM = 40 mg / mL
Fru-11B-BPA溶液：11B-BPA濃度191.3 mM = 40 mg / mL，フルクトース濃度103.2 mg / mL
PVA-11B-BPA溶液：11B-BPA濃度191.3 mM = 40 mg / mL，PVA中ジオール濃度573.9 mM = 50.4 mg / mL【００８８】
各サンプル450 μLとD2O 50 μLを混合し、11B-NMRを測定した。11B-NMRスペクトルの結果を図１に示す。シグナル強度が一番高いピークは、BPA溶液であった (br, 2.1 ppm - 10.0 ppm)。PVA - BPA溶液及びFru-BPA溶液のピークは、BPA溶液のシグナルとは明らかに異なっていることに加え、BPA自体のシグナル強度が低下していることから定性的にPVAとBPAが結合していることが確認された。【００８９】
平衡定数（pH7.4）に基づいて、上記のPVA-11B-BPA溶液において、(遊離のBPA)：(PVAに結合したBPA) ＝ 10:90〜0:100（モル比率）と計算された。なお、当該PVA-11B-BPA溶液のpHは9.5であり、pHが高いほど平衡定数も高くなることから、当該溶液中でほぼ100%のBPAがPVAに結合していると推測される。【００９０】
Springsteen G., Wang B. H. Tetrahedron 58, 5291-5300 (2002) に記載の方法にしたがって、ARS法を用いてPVAとBPAの平衡定数を算出した。初めに、以下に示す Solution A、B、C、D をそれぞれ調製した。
・Solution A : ARS (9.0×10-6 M) 
・Solution B : ARS (9.0×10-6 M) + BPA (2.0×10-3 M) 
・Solution C : ARS (9.0×10-6 M) + BPA (2.0×10-3 M) + PVA (ジオール濃度 = 5.0×10-1 M) 
・Solution D : ARS (9.0×10-6 M) + BPA (2.0×10-3 M) + フルクトース(0.8×10-1 M)
・Solution E : ARS (9.0×10-6 M) + BPA (2.0×10-3 M) + グルコース(0.8×10-1 M)【００９１】
Solution A と Solution B を様々な比率で混合し、ディスポセル（PS製、TGK社）を用いて蛍光測定を行った (Ex = 468 nm, Em = 572 nm)。得られた蛍光強度からARS-BPAの平衡定数K0を算出した。次に、Solution Bと各ジオール化合物を含むSolution C、D、Eのいずれかを様々な比率で混合し、ディスポセルを用いて蛍光測定を行った (Ex = 468 nm, Em = 572 nm)。これらの結果と、先のK0の値を使い、各化合物（ジオール[2OH]濃度換算）-BPAの見かけ上の相対平衡定数K1を算出した。結果を以下の表１に示す。
【表１】
2019163790.tif 000068
【００９２】
平衡定数（pH7.4）に基づいて、上記のSolution Cにおいて、(遊離のBPA)：(PVAに結合したBPA) ＝ 約50:50 (モル比率)と計算された。【００９３】
実施例３
PVA-BPAの細胞内取り込み
＜使用した試薬＞
ロズウェルパーク記念研究所培地 (RPMI) : Sigma Aldrich
D-PBS (-) : 和光純薬工業株式会社
ウシ胎児血清 (FBS) : Biosera
Trypsin-EDTA solution : Sigma life science
ペニシリン/ ストレプトマイシン : Sigma life science
Cy5-NHS : Thermo Fisher Scientific 
LysoTracker （登録商標） red DND - 99 : Thermo Fisher Scientific
4-ジエチルアミノサリチルアルデヒド: 東京化成工業株式会社
メチルアミン : 東京化成工業株式会社
DMSO : ナカライテスク
2-アミノノルボルナン-2-カルボン酸 (BCH) : Sigma-Aldrich
Hoechst（登録商標） 33342 ： Thermo Fischer Scientific.
4-ブロモ-L-フェニルアラニン (BPA) ： Katchem
実施例１と同様の方法で製造されたPVA (Mn = 6,500 〜 9,500)
りん酸水素二ナトリウム : ナカライテスク
DAHMI: Springsteen G., et al., Acs Sensors 1, 1394-1397 (2016) に記載の方法に従って製造。
セルストレイナー：Falcon セルストレイナー 5 mL チューブ用 35 μm
BxPC3細胞 (ヒトすい臓癌細胞株) : American Type Culture Collection (Manassas, VA)
＜使用した機器＞
フローサイトメーター (FCM) ：Guava easy Cyte 6 - 2L（Merck Millipore）
共焦点レーザー走査型顕微鏡 (CLSM)：LSM710（Carl Zeiss）
Agilent 7900 ICP - MS（アジレント・テクノロジー株式会社）
NMR (Nuclear Magnetic Resonance) ： BRUKER AVANCEIII 400 (400 MHz, BRUKER BioSpin) 【００９４】
（１）PVA-BPAにCy5が結合したBPA誘導体（Cy5-PVA-BPA）の合成
PVA 125 mg (1.67 × 10-2 mmol) を6 mLバイアルに量り取り、2.5 mLのDMSOに溶解させた。次に、PVA溶液に対して1.2当量のCy5-NHSを1.23 mL (2.00 × 10-2 mmol) を加え、室温で3時間攪拌した。反応溶液を透析膜 (MWCO = 3.5kD) に入れ、2 Lの純水中で透析を3回行った。透析溶液中のフリーのCy5を完全に除くため、PD - 10 columnを用いて精製した後、凍結乾燥を行い、PVAとCy5-NHSとの反応物（Cy5-PVA）を青色個体として得た（収量 122 mg）。PVA中ジオール濃度0.34 mM及びBPA濃度0.11 mMとなるようにCy5-PVA 及びBPAを10 mM PBS (140 mM NaCl, pH 9.5)中で混合し、Cy5-PVA-BPAを調製した。平衡定数（pH7.4）に基づいて、調製された溶液において、 (遊離のBPA)：(PVAに結合したBPA) ＝約60:40 (モル比率)と計算された。【００９５】
（２）共焦点顕微鏡を用いたCy5-PVA-BPAの細胞への取り込みの評価
Glass base dish(AGCテクノグラス社)にBxPC3細胞を5 × 104 cell / dishとなるよう播種し、24時間、前培養した。上記（１）で調製したCy5-PVA-BPA溶液またはFru-BPA溶液 (フルクトース濃度 = 0.28 mM, BPA濃度 = 0.11 mM)を、D-PBS/RPMI培地(10% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin含有)混合液 (PBS : RPMI = 1 : 4)で調製し、これらのサンプルを1mLずつ各ウェルに加え、30分インキュベートした。培地を取り除いた後、2 mM DAHMI （BPA蛍光検出用化合物）/ DMSO 溶液10 μL と50 nM LysoTracker （登録商標） red DND - 99 / PBS 溶液990 μLを各ウェルに加え、30分インキュベートした。PBS 1 mLで3回洗浄後、PBS 1 mLを加え、CLSMで観察した。得られた結果を図２に示す。Fru-BPAは、細胞内に取り込まれると細胞質全体にBPAが分布することが確認された。一方、図２よりCy5-PVA及びBPAがリソソームと共局在していることから、Cy5-PVA-BPAはエンドサイトーシスで取り込まれることが示唆された。【００９６】
実施例４
PVA-BPAの細胞内取込量とLAT1介在性の評価
シャーレにBxPC3細胞を5 × 106 cells / well となるよう播種し、24時間、前培養した。次に、D-PBS / RPMI (10% FBS, 1% ペニシリン−ストレプトマイシン) 培地溶液 (D-PBS : RPMI = 1 : 4)を用いて、下記のサンプルを準備した。
PVA-BPA溶液 (ジオール濃度 = 3.03 mM，BPA濃度= 3.03 mM)
Fru-BPA溶液 (フルクトース濃度 = 7.82 mM, BPA濃度= 3.03 mM)
上記PVA-BPA溶液 ＋ BCH（LAT1阻害剤）(20 mM）
上記Fru-BPA溶液 ＋ BCH（20 mM）【００９７】
平衡定数（pH7.4）に基づいて、上記のPVA-BPA溶液において、(遊離のBPA)：(PVAに結合したBPA) ＝約30:70 (モル比率)と計算された。【００９８】
これらのサンプルを10 mLずつ各シャーレに加え、3時間インキュベートした。各ウェルを10 mL D-PBSで洗浄後、1.0 mL トリプシン-EDTA溶液を加え、10分インキュベートした。なお、PVA-BPAとFru-BPAについては、D-PBSで洗浄後、新しい培養液を加えて30分追加のインキュベーションを行い、その後、D-PBSで洗浄してから1.0 mL トリプシン-EDTA溶液を加えて10分インキュベートしたサンプルも用意した。細胞が剥がれたのを光学顕微鏡で確認後、10 % FBSを含むRPMI培地を9.0 mL加え、細胞懸濁液を調製した。1500 rpm、24 ℃、5 分で遠心分離し、上澄み液を除去した。細胞数を計測した後、試料液を15 mLファルコンチューブに入れ、70 % 硝酸 を1 mL 加えた。その後、50 ℃で 15 分、70 ℃で 15 分、90 ℃で 1 時間 それぞれインキュベートした。純水を用いて10 mLまでメスアップした後、疎水性フィルターで濾過後、ICP-MS を用いて評価した。得られた結果を図３−１及び３−２に示す。【００９９】
図３−１から見て取れるように、PVA-BPAはFru-BPAと比較して約3倍の細胞内ホウ素濃度を示した。一方、LAT1阻害剤であるBCH（2-アミノビシクロ[2.2.1]ヘプタン-2-カルボン酸）を用いた場合、Fru-BPAとPVA-BPAの両方が細胞内取り込み量を大きく減少させた。この結果からPVA-BPAは、LAT1介在型エンドサイトーシスで細胞内に取り込まれることが示唆された。また、図３−２では、30 分の追加インキュベーションを行うと、Fru-BPAは大きく細胞内ホウ素濃度を減少させた。一方で、PVA-BPAは追加インキュベーションを行った後も極めて高いホウ素濃度を示した。【０１００】
実施例５
BPAの有無によるPVAの細胞内取込量への影響
12-ウェルプレートにBxPC3を1 × 105 cell / well となるよう播種し、24時間、前培養した (n = 3) 。次に、D-PBS / RPMI (10% FBS, 1% ペニシリン−ストレプトマイシン) 培地溶液 (D-PBS : RPMI = 1 : 4)を用いて下記のサンプルを準備した
Cy5-PVA-BPA溶液 (PVAのジオール濃度 = 0.34 mM, BPA濃度= 0.11 mM)
上記Cy5-PVA-BPA溶液 + BCH (20.0 mM)【０１０１】
平衡定数（pH7.4）に基づいて、上記のCy5-PVA-BPA溶液において、(遊離のBPA)：(PVAに結合したBPA) ＝約60:40 (モル比率)と計算された。【０１０２】
これらのサンプルを1 mLずつ各ウェルに加え、30 分、3 時間、6 時間インキュベートした。各ウェルを1 mL PBSで洗浄後、0.5 mL トリプシン-EDTA溶液を加え、10 分インキュベートした。細胞が剥がれたのを光学顕微鏡で確認後、10 % FBSを含むRPMI培地を0.5 mL加え、細胞懸濁液を調製した。調製した細胞懸濁液をセルストレイナーによって濾過後、フローサイトメーターを用いて細胞のCy5の蛍光強度を定量した。得られた結果を図４−１及び４−２に示す。【０１０３】
Cy5-PVA-BPAは、Cy5-PVAよりも有意に高い細胞内取り込み量を示した（図４−１）。一方、BCHによりLAT1を阻害した場合では、その取り込み量に差がなくなった（図４−２）。実施例４と同様に、PVA-BPAはLAT1介在エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれていることが示唆された。【０１０４】
実施例６
皮下腫瘍モデルに対する効果
＜使用した試薬、細胞及び動物＞
実施例１と同様の方法で製造されたPVA (Mn = 6,500〜9,500)
5mol / l 塩酸 (質量分析用) ： 和光純薬工業株式会社
5mol / l 水酸化ナトリウム (質量分析用) ： 和光純薬工業株式会社
4-ボロノ-L-フェニルアラニン (BPA) ： Katchem
りん酸水素二ナトリウム : ナカライテスク
レモゾール : 和光純薬工業株式会社
ドライゾール : 関東化学
クライオスタット： Leica CM 3050S, Leica Microsystems, Nussloch GmbH, Germany
O.C.T コンパウンド： Sakura Finetek Japan, INC.
Hoechst（登録商標） 33342 ： Thermo Fischer Scientific.
トマトレクチン, DyLight 488 コンジュゲート： Funakoshi
BxPC3細胞 (ヒトすい臓がん細胞株) : American Type Culture Collection (Manassas, VA)
CT26 細胞 (マウス大腸がん細胞株) : American Type Culture Collection (Manassas, VA)
BALB/cマウス：Charles River Japan
BALB/c nudeマウス：Charles River Japan
＜使用した機器＞
Agilent 7900 ICP - MS  : アジレント・テクノロジー株式会社
共焦点レーザー走査型顕微鏡 (CLSM) ： LSM710：Carl Zeiss
富士ドライケムNX500 ： 富士フイルム株式会社
重水中性子照射設備 ： KUR
オールインワン蛍光顕微鏡 (BZ - X710): KEYENCE【０１０５】
CT26細胞をBALB/cマウスに2.0 x 105 cells/mouseで皮下注射し、BxPC3細胞はBALB/c nudeマウスに5.0 x 106 cells/mouseで皮下注射することにより皮下腫瘍モデルを作成した。腫瘍サイズがおよそ200 mm3の達したところでマウスに対して200 μLの下記のサンプルを尾静脈からゆっくりと投与した (BPA 8 mg / マウス)。
PVA-BPA (BPA濃度=191mM, PVAジオール濃度=574 mM) in PBS (pH 9.5)
Fru-BPA (BPA濃度=191 mM, フルクトース濃度=574 mM) in PBS (pH 9.5)【０１０６】
試料投与から所定時間後に解剖して採血及び腫瘍の摘出を行った。血液及び各種臓器を10 mL ファルコンチューブに入れ、70% 硝酸を1 mL加えた。その後、50℃で15分、70℃で15分、90℃で1時間それぞれインキュベートした。純水を用いて10 mLまでメスアップを行い、疎水性フィルターで濾過後、ICP-MSを用いて評価した。CT-26移植マウスを用いた体内動態の結果を図５−１及び５−２に、BxPC3移植マウスを用いた体内動態の結果を図６−１及び６−２に示す。PVA-BPAはいずれの腫瘍においても優れた腫瘍集積性を示し、長期的に高い腫瘍内ホウ素濃度を維持することができた。また、腫瘍／血液比についても、従来のFru-BPAと遜色ない値を示した。【０１０７】
実施例７
Cy5-PVA-BPAの腫瘍浸透性試験
実施例６と同様に、Cy5-PVA-BPA溶液とCT26皮下腫瘍モデルを準備し、腫瘍サイズがおよそ200 mm3のマウスに対して200 μL のサンプルを尾静脈から投与した (BPA 8 mg / マウス)。投与から5.5時間後にトマトレクチン-DyLight488溶液(50 μg)とHoechst33342 (50 μg)を静脈投与した。試料投与から6 時間後に腫瘍を摘出して腫瘍を中心で切り、その断面を下にした状態でガラスベースディッシュに載せてCLSMで観察した。得られた結果を図７に示す。Cy5-PVAが全体に分布していることから、BPAを腫瘍全体にデリバリーできていることが示唆された。【０１０８】
実施例８
抗腫瘍効果
CT-26細胞をBalb/c マウスの右大腿付近に皮下移植し(2.0 x 105 cells/mouse)、腫瘍サイズが約50 〜 100 mm3のマウスに対して250 μLの下記のサンプルをゆっくりと尾静脈投与した (BPA 10 mg / マウス)。
PVA-BPA (BPA濃度=191mM, PVAジオール濃度=574 mM) in PBS (pH 9.5)
Fru-BPA (BPA濃度=191 mM, フルクトース濃度=574 mM) in PBS (pH 9.5)【０１０９】
平衡定数（pH7.4）に基づいて、上記のPVA-11B-BPA溶液において、(遊離のBPA)：(PVAに結合したBPA) ＝ 10:90〜0:100（モル比率）と計算された。なお、当該PVA-BPA溶液のpHは9.5であり、pHが高いほど平衡定数も高くなることから、当該溶液中でほぼ100%のBPAがPVAに結合していると推測される。【０１１０】
中性子線照射群に関しては、試料投与から3時間後及び6時間後にマウスの右大腿付近のみに中性子線を50分照射した。照射日を1日目とし、2〜3日おきに腫瘍径を電子ノギスにて、体重を電子天秤にて全25日間測定した。測定した腫瘍径は、楕円体積近似式 (ab2 × 1/2、a : 長辺、b : 短辺)に代入し腫瘍体積とした。評価した検体をまとめると下記のようになる。【０１１１】
Control (COLD) (n=8)：無治療群。
Fru-BPA (COLD) (n=8)：Fru-BPAを注射しただけの検体。
PVA-BPA (COLD) (n=8)：PVA-BPAを注射しただけの検体。
Control (HOT) (n=8)：中性子線を照射しただけの検体。
Fru-BPA (HOT) 3h (n=8)：Fru-BPAを注射してから3時間後に中性子線を照射した検体。
PVA-BPA (HOT) 3h (n=4)：PVA-BPAを注射してから3時間後に中性子線を照射した検体。
PVA-BPA (HOT) 6h (n=8)：PVA-BPAを注射してから6時間後に中性子線を照射した検体。【０１１２】
これらの腫瘍サイズの経時変化及びカプラン・マイヤー曲線を図８−１及び８−２に示す。PVA-BPAはFru-BPAと比較して、中性子捕捉療法において有意な腫瘍増大の抑制効果を示した。【０１１３】
熱中性子線を照射して25日後に腫瘍を摘出し、ホルマリン溶液に4日間浸透させた。ホルマリン溶液から腫瘍を取り出し、腫瘍組織の中央で輪切りした。切り出した臓器を凍結切片作製用の包埋剤 (O.C.T. コンパウンド) で処理後、クライオスタットを用いて4 μmの組織切片を作成し、HE染色を行った。結果を図９−１〜図９−４に示す。PVA-BPA (HOT) 3h（図９−４）においては、抗腫瘍効果の実験の結果と一致して、腫瘍全体において細胞死が誘導されていることが示唆された。【０１１４】
実施例９
PVA-19F-BPAの19F核磁気共鳴シグナルと腫瘍集積性
＜使用した試薬、細胞及び動物＞
実施例１と同様の方法で製造されたPVA（Mn= 6,500〜9,500）
5 mol / l 塩酸 (質量分析用) ： 和光純薬工業株式会社
5 mol / l 水酸化ナトリウム (質量分析用) ： 和光純薬工業株式会社
70% 硝酸（1.42）：和光純薬工業株式会社
りん酸水素二ナトリウム : ナカライテスク
2-アミノ-3-(4-ボロノ-2-フルオロフェニル)プロパン酸 (19F-BPA)（ラセミ体）：Fluorotech LLC
CT26 細胞 (マウス大腸がん細胞株) : American Type Culture Collection (Manassas, VA)
BALB/cマウス：Charles River Japan
＜使用した機器＞
NMR (Nuclear Magnetic Resonance) ： BRUKER AVANCEIII 400 (400 MHz, BRUKER BioSpin)
Agilent 7900 ICP - MS  : アジレント・テクノロジー株式会社【０１１５】
下記のサンプルを10 mM PBS (140 mM NaCl, pH 9.5) を用いて以下の濃度で調製した。
19F-BPA (19F-BPA濃度=176mM)
Fru-19F-BPA (19F-BPA濃度=176mM, フルクトース濃度=573.9 mM)
PVA-19F-BPA (19F-BPA濃度=176mM, PVA中ジオール濃度 573.9 mM)【０１１６】
これらのサンプル450 μLとD2O 50 μLを混合し、19F-NMRを測定した。結果を図１０−１〜図１０−３に示す。PVA-19F-BPAのNMRシグナルを明確に検出することができた（図１０−３）。PVA-19F-BPA は、将来的な診断技術として、19F-MRIに応用できるものと考えられる。【０１１７】
実施例１０
PVA-19F-BPAとFru-19F-BPAの体内動態
CT26細胞をBALB/cマウスに2.0 x 105 cells/mouseで皮下注射し、皮下腫瘍モデルを作成した。腫瘍サイズが約200 mm3に達したところでマウスに対して200 μLの下記のサンプルを尾静脈からゆっくりと投与した (19F-BPA 8 mg / マウス)。
PVA-19F-BPA (BPA濃度=176mM, PVAジオール濃度=574 mM) in PBS (pH 9.5)
Fru-19F-BPA (BPA濃度=176 mM, フルクトース濃度=574 mM) in PBS (pH 9.5)【０１１８】
試料投与から所定時間後に解剖して腫瘍の摘出を行った。腫瘍を10 mL ファルコンチューブに入れ、70% 硝酸を1 mL加えた。その後、50℃で15分、70℃で15分、90℃で1時間、それぞれインキュベートした。純水を用いて10 mLまでメスアップを行い、疎水性フィルターで濾過後、ICP-MSを用いてホウ素量を定量した。結果を図１１に示す。PVA-19F-BPAは長期的に腫瘍内に高濃度で滞留するため、19F-MRIでsignal/noise比を向上することが期待される。【０１１９】
実施例１１
PEG-P[Lys(Fru)/Lys]の合成
＜使用した試薬＞
ジメチルスルホキシド (DMSO) (水素化カルシウムで脱水してから蒸留精製して使用)：和光純薬工業株式会社
Lys(TFA)-NCA：中央化成品株式会社
MeO-PEG-NH2 (PEGの分子量:10KDa)：日油株式会社
メタノール：和光純薬工業株式会社
NaOH：和光純薬工業株式会社
HCl：和光純薬工業株式会社
ベンゼン: 和光純薬工業株式会社
ジエチルエーテル：関東化学株式会社
2,3,4,5-ジ-O-イソプロピリデン-ベータ-D-フルクトピラノース (DiOFru)：東京化成工業株式会社
1,1'-カルボニルジイミダゾール (CDI)：Sigma-Aldrich
トリフルオロ酢酸 (TFA)：和光純薬工業株式会社
4-ボロノ-L-フェニルアラニン (BPA)：KatChem
＜使用した機器＞
NMR (Nuclear Magnetic Resonance) ： BRUKER AVANCEIII 400 (400 MHz, BRUKER BioSpin)
GPC (Gel Permeation Chromatography) ： 日本分光株式会社
PEG-PLys(TFA)を測定したカラム：TSK-gel superAW3000, superAW4000, and superAWL-guard column (Tosoh Corporation)
PEG-PLysを測定したカラム：Superdex 200 Increase 10/300 GL (GEヘルスケア)
検出器：RI-2031 【０１２０】
（１）MeO-PEG-PLys(TFA) の合成
【化６７】
2019163790.tif 000069
MeO-PEG-NH2 1.00gをベンゼンに溶解し一晩凍結乾燥した後、10 mLの蒸留したDMSOをアルゴン雰囲気下で加え溶解した。一方、Lys(TFA)-NCA 1.60 gを15 mLの蒸留したDMSOでアルゴン雰囲気下にて溶解した。これらの溶液をアルゴン雰囲気下で混合し、24時間室温で撹拌した。その後、過剰量のジエチルエーテルに反応液を加えて沈殿を生成し、その沈殿を減圧ろ過で回収して、一晩減圧乾燥を行い、PEG-PLys(TFA)を得た。得られたPEG-PLys(TFA)の分子量分布をGPCにより確認し、Mw/Mnは1.12であった。また、1H-NMRの結果からPLys(TFA)の重合度は57だった。
【化６８】
2019163790.tif 000070
【０１２１】
（２）PEG-PLysの合成
【化６９】
2019163790.tif 000071
1.2 gのPEG-PLys(TFA)をNaOH水溶液（5M）/水/メタノール（10mL/5mL/35mL）の混合溶液に溶解し、35°Cで20時間撹拌した。その後、0.01 N HClにて2回透析し、純水で3回透析した（使用透析膜のMWCO：6〜8k Da）。その後凍結乾燥し、600 mgのPEG-PLysを得た。
【化７０】
2019163790.tif 000072
【０１２２】
（3）PEG-P[Lys(Fru-ISP)/Lys]の合成
【化７１】
2019163790.tif 000073
1.21 gのCDIと3.88 gのDiOFruをアルゴン雰囲気下で蒸留したDMSO 15 mL中に溶解し、45°Cで20時間撹拌した。次に、MeO-PEG-PLys 300 mgを蒸留したDMSO 5mLに溶解し、そこにCDI、DiOFruを反応させた溶液を加え、室温で20時間反応させた。反応後、メタノール中で２回透析し、純水で2回透析した（透析膜のMWCO: 6k〜8k Da）。最後に凍結乾燥して360 mgのPEG-P[Lys(Fru ISP)/Lys]を得た。分子量分布をGPCにより測定し、Mw/Mn = 1.17だった。1H-NMRより、DiOFruの高分子への導入率は58%と計算された。1H-NMRの結果から、上記化学構造式における(p+q)は33であり、rは24であった。
【化７２】
2019163790.tif 000074
【０１２３】
（4）PEG-P[Lys(Fru)/Lys]の合成
【化７３】
2019163790.tif 000075
PEG-P[Lys(Fru-ISP)/Lys]をTFA/H2O (95/5 v/v)に20 mg/mLで溶解し、室温で一晩撹拌した。その後、反応液を純水中で1回透析し、0.01 N HClで2回透析して、さらに純水中で2回透析した（透析膜のMWCO：6k〜8k Da）。透析後、凍結乾燥し、PEG-P[Lys(Fru)/Lys]を得た。Mn = 24,100であった。
【化７４】
2019163790.tif 000076
【０１２４】
実施例１２
PEG-P[Lys(Fru)/Lys]にBPAが結合したBPA誘導体（PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPA）の腫瘍集積性と抗腫瘍効果の評価
＜使用した試薬、細胞及び動物＞
実施例１１と同様の方法で製造されたPEG-P[Lys(Fru)/Lys]（Mn = 24,100）
・5mol / l 塩酸 (質量分析用) ： 和光純薬工業株式会社
・5mol / l 水酸化ナトリウム (質量分析用) ： 和光純薬工業株式会社
・4-ボロノ-L-フェニルアラニン (BPA) ： Katchem
・りん酸水素二ナトリウム : ナカライテスク
・BxPC3細胞 (ヒトすい臓がん細胞株) : American Type Culture Collection (Manassas, VA)
・CT26 細胞 (マウス大腸がん細胞株) : American Type Culture Collection (Manassas, VA)
・BALB/cマウス：Charles River Japan
・BALB/c nudeマウス：Charles River Japan
＜使用した機器＞
Agilent 7900 ICP - MS : アジレント・テクノロジー株式会社
重水中性子照射設備 ： KUR【０１２５】
Balb/c nudeマウスに1 x 107 cells/mouseでBxPC3細胞を皮下注射した。腫瘍サイズが約200 mm3に達したところで、下記のサンプルを静脈注射した。
PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPA in PBS (33 mg PEG-P[Lys(Fru)/Lys]/mouse, 8 mg BPA/mouse)【０１２６】
試料投与から所定時間後に解剖して採血し腫瘍の摘出を行った。腫瘍を10 mL ファルコンチューブに入れ、70%硝酸を1 mL加えた。その後、50℃で15 分、70℃で15分、90℃で1 時間、それぞれインキュベートした。純水を用いて10 mLまでメスアップを行い、疎水性フィルターで濾過後、ICP-MSを用いてホウ素量を定量した。結果を図１２−１及び１２−２に示す。【０１２７】
実施例１３
CT26皮下腫瘍モデルにおけるPEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPAの抗腫瘍効果
CT-26細胞をBalb/c マウスの右大腿付近に皮下移植し(2.0 x 105 cells/mouse)、腫瘍サイズが約15 〜 150 mm3のマウスに対して、250 μLの下記のサンプルをゆっくりと尾静脈投与した (BPA 10 mg / マウス)。
Fru-BPA (BPA濃度 = 192 mM, フルクトース濃度:BPA濃度 = 3:1) in PBS (pH 8.5)
PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPA (BPA濃度=192mM , ポリマー側鎖のフルクトース濃度： BPA濃度=1.2：1) in PBS (pH 8.5)【０１２８】
中性子線照射群に関しては、試料投与から3時間後及び6時間後にマウスの右大腿付近のみに中性子線を50分照射した。照射日を1日目とし、2〜3日おきに腫瘍径を電子ノギスにて、体重を電子天秤にて全25日間測定した。測定した腫瘍径は、楕円体積近似式 (ab2 × 1/2、a : 長辺、b : 短辺)に代入し、腫瘍体積とした。評価した検体をまとめると下記のようになる。【０１２９】
Control (COLD) (n=7)：無治療群。
Fru-BPA (COLD) (n=7)：Fru-BPAを注射しただけの検体。
PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPA (COLD) (n=4)：PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPAを注射しただけの検体。
Control (HOT) (n=6)：中性子線を照射しただけの検体。
Fru-BPA (HOT) 3h (n=7)：Fru-BPAを注射してから3時間後に中性子線を照射した検体。
Fru-BPA (HOT) 6h (n=7)：Fru-BPAを注射してから6時間後に中性子線を照射した検体。
PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPA (HOT) 3h (n=6)：PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPAを注射してから3時間後に中性子線を照射した検体。
PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPA (HOT) 6h (n=5)：PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPAを注射してから6時間後に中性子線を照射した検体。【０１３０】
これらの腫瘍サイズの経時変化を図１３−１及び１３−２に示す。PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPAはFru-BPAと比較して、中性子捕捉療法において有意な腫瘍増大の抑制効果を示した。【０１３１】
実施例１４
P[Asp(glucamine)/Asp]の合成
＜使用した試薬＞
ジメチルスルホキシド (DMSO) (水素化カルシウムで脱水してから蒸留精製して使用)：和光純薬工業株式会社
BLA-NCA：ナノキャリア株式会社
4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド (DMTMM)：和光純薬工業株式会社
トリエチルアミン (TEA): 和光純薬工業株式会社
ジエチルエーテル：関東化学株式会社
メタノール：和光純薬工業株式会社
NaOH：和光純薬工業株式会社
HCl：和光純薬工業株式会社
N,N-ジメチルホルムアミド (DMF): 和光純薬工業株式会社（脱水蒸留してから使用）
ジクロロメタン (DCM): 和光純薬工業株式会社（脱水蒸留してから使用）
4-ボロノ-L-フェニルアラニン (BPA)：KatChem
D-グルカミン: 東京化成工業株式会社
＜使用した機器＞
NMR (Nuclear Magnetic Resonance) ： BRUKER AVANCEIII 400 (400 MHz, BRUKER BioSpin)
GPC (Gel Permeation Chromatography) ： 日本分光株式会社
PBLAを測定したカラム：TSK-gel superAW3000, superAW4000, 及びsuperAWL-guard column (Tosoh Corporation)
PAspを測定したカラム：Superdex 200 Increase 10/300 GL (GEヘルスケア)
検出器：UV-2070 (Ch.1), RI-2031 (Ch.2) 【０１３２】
（１）ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（PBLA）の製造
【化７５】
2019163790.tif 000077
アルゴン雰囲気下においてBLA-NCA 1.44 gを3 mLのDMFと27 mLのDCMの混合溶媒に溶解し、3.9 μLのプロピルアミンを加えて48 時間撹拌した。撹拌後、反応液をジエチルエーテルに滴下して沈殿を得て、吸引濾過、減圧乾燥によりPBLAを得た。分子量分布はGPCにより、Mw / Mn = 1.11と求められ、重合度は1H-NMRの結果から73であった。
【化７６】
2019163790.tif 000078
【０１３３】
（２）ポリアスパラギン酸（PAsp）の製造
【化７７】
2019163790.tif 000079
1 gのPBLAを0.5 MのNaOH水溶液に入れ、35℃で20時間撹拌した。反応液を純水に対して4回透析を行い（透析膜MWCO：3.5 kDa）、凍結乾燥して0.2 gのPAspを得た。
【化７８】
2019163790.tif 000080
【０１３４】
（３）P[Asp(glucamine)/Asp] の製造
【化７９】
2019163790.tif 000081
0.2 gのPAspと3 gのDMTMM、2.6 gのD-グルカミンを純水に溶解し、数滴のTEAを加えて24時間室温で撹拌した。撹拌後、反応液を純水に対して4回透析し（透析膜MWCO: 3.5kDa）、凍結乾燥してP[Asp(glucamine)/Asp]を得た。物性をGPCと1H-NMRにより評価し、1H-NMRの結果からグルカミン導入率は30%であった。1H-NMRの結果から、上記化学構造式における(s+t)は17であり、uは56であった。
【化８０】
2019163790.tif 000082
【０１３５】
実施例１５
P[Asp(glucamine)/Asp]にBPAを結合させたBPA誘導体（P[Asp(glucamine)/Asp]-BPA）の腫瘍集積性
CT26細胞をBALB/cマウスに2.0 x 105 cells/mouseで皮下注射し皮下腫瘍モデルを作成した。腫瘍サイズが約200 mm3に達したところでマウスに対して200 μLの下記のサンプルを尾静脈からゆっくりと投与した (BPA 8 mg / マウス)。
P[Asp(glucamine)/Asp]-BPA (BPA濃度=192 mM, BPA濃度：グルカミン濃度＝1:1.2) in PBS (pH 9)【０１３６】
試料投与から所定時間後に採血し解剖して腫瘍の摘出を行った。腫瘍を10 mL ファルコンチューブに入れ、70%硝酸を1 mL加えた。その後、50℃で15分、70℃で15分、90℃で1時間インキュベートした。純水を用いて10 mLまでメスアップを行い、疎水性フィルターで濾過後、ICP-MSを用いてホウ素量を定量した。結果を図１４−１及び１４−２に示す。P[Asp(glucamine)/Asp]-BPAを使用することにより、腫瘍集積性、腫瘍/血液集積比を向上させることができる可能性が示唆された。【０１３７】
実施例１６
BxPC3皮下腫瘍モデルにおけるPVA-BPAの抗腫瘍効果
BxPC3細胞をBalb/c マウスの右大腿付近に皮下注射し(5 x 106 cells/mouse)、腫瘍サイズが約500 mm3となったマウスに対して、250 μLの下記のサンプルをゆっくりと尾静脈投与した (BPA 10 mg / マウス)。
PVA-BPA (BPA濃度=191mM, PVAジオール濃度=574 mM) in water (pH 9.2)
Fru-BPA (BPA濃度=191 mM, フルクトース濃度=574 mM) in water (pH 9.2)
(pHはHCl水溶液及びNaOH水溶液にて調整した。)【０１３８】
試料投与から3時間後に、マウスの右大腿付近のみに中性子線を50分照射した。照射日を1日目とし、経時的に腫瘍径を電子ノギスにて、体重を電子天秤にて全５５日間測定した。測定した腫瘍径は、楕円体積近似式 (ab2 × 1/2、a : 長辺、b : 短辺)に代入し腫瘍体積とした。評価した検体をまとめると下記のようになる。【０１３９】
Control (COLD) (n=8)：無治療群。
Fru-BPA (HOT) (n=6)：Fru-BPAを注射してから3時間後に中性子線を照射した検体。
PVA-BPA (HOT) (n=6)：PVA-BPAを注射してから3時間後に中性子線を照射した検体。【０１４０】
結果を図１５に示す。５５日目において、Fru-BPA とPVA-BPAとの間で統計的有意差が得られた（p<0.05 [t-test]）。【０１４１】
実施例１７
BxPC3皮下腫瘍モデルにおけるPEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPAの抗腫瘍効果
BxPC3細胞をBalb/c マウスの右大腿付近に皮下注射し(5 x 106 cells/mouse)、腫瘍サイズが約15 〜 150 mm3のマウスに対して、250 μLの下記のサンプルをゆっくりと尾静脈投与した (BPA 10 mg / マウス)。
Fru-BPA (BPA濃度 = 192 mM, フルクトース濃度:BPA濃度 = 3:1) in PBS (pH 8.5)
PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPA (BPA濃度=192mM , ポリマー側鎖のフルクトース濃度： BPA濃度=1.2：1) in PBS (pH 8.5)【０１４２】
中性子線照射群に関しては、試料投与から3時間後及び6時間後にマウスの右大腿付近のみに中性子線を50分照射した。照射日を1日目とし、2〜3日おきに腫瘍径を電子ノギスにて、体重を電子天秤にて全25日間測定した。測定した腫瘍径は、楕円体積近似式 (ab2 × 1/2、a : 長辺、b : 短辺)に代入し、腫瘍体積とした。評価した検体をまとめると下記のようになる。【０１４３】
Control (HOT) (n=8)：中性子線を照射しただけの検体。
Fru-BPA (HOT) (n=8)：Fru-BPAを注射してから3時間後に中性子線を照射した検体。
PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPA (HOT) (n=8)：PEG-P[Lys(Fru)/Lys]-BPAを注射してから3時間後に中性子線を照射した検体。【０１４４】
これらの腫瘍サイズの経時変化を図１６に示す。【０１４５】
実施例１８
N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]及びmPEG10k- P[Lys(Gluconate)/Lys]の合成
【化８１】
2019163790.tif 000083
【０１４６】
＜使用した試薬＞
11-azide-3,6,9-trioxaundecane-1-amine : Sigma Aldrich
Methoxy-PEG10k-NH2 : NOF Co.
NCA-L-Lys(Tfa) : Chuo Kasei Co.
D-glucono-1,5-lactone : 東京化成工業
トリエチルアミン(TEA) : ナカライテスク
ジメチルスルホキシド(DMSO) : 和光純薬工業から購入したものをアルゴン雰囲気下で蒸留精製したものを使用
メタノール : 和光純薬工業
ベンゼン : ナカライテスク
ジエチルエーテル : 関東化学
5 mol/L水酸化ナトリウム水溶液 : 和光純薬工業
5 mol/L 塩酸 : ナカライテスク
重水(0.05 wt.% 3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 acid, sodium salt : Sigma Aldrich
＜使用した機器＞
NMR (Nuclear Magnetic Resonance) ： BRUKER AVANCEIII 400 (400 MHz, BRUKER BioSpin)
GPC (Gel Permeation Chromatography) ： 日本分光株式会社
Superdex 200 Increase 10/300 GL (GEヘルスケア)
検出器：RI-2031【０１４７】
（１−１）
N3-PLys_(A)の合成
NCA-Lys(Tfa) 3.2 g (11.9 mmol)を秤量し、100 mL二口ナスフラスコにアルゴン雰囲気下で加えた。そこに、蒸留精製したDMSO 33 mLを加え、NCAを溶解させた。その後、開始剤 11-azide-3,6,9-trioxaundecane-1-amine 30 μL (0.151 mmol)を加え、40 ℃の水浴中で3日間撹拌した。その後、反応溶液を透析膜(MWCO =3.5 kD)に入れ、500 mLのメタノールに対して4 hの透析を3回行った。透析したサンプル溶液をロータリーエバポレーターにより、溶媒を留去したのち、一晩減圧乾燥した。得られた固形物にメタノール100 mLと5 Mの水酸化ナトリウム水溶液2 mL、超純水8 mLを加え、溶解させた。40 ℃の水浴中で一晩撹拌した。その後反応溶液を透析膜(MWCO=3.5 kDa)に入れ、1 Lの0.01 M水酸化ナトリウム水溶液に対して4 h透析を2回、その後、3 Lの超純水に対して4 hの透析を4回行った。透析したサンプルを500 mLのナスフラスコに入れ、凍結乾燥により溶媒を除去し、N3-PLys_(A)の白色固体を得た。1H-NMRより、得られた化合物の重合度は64.4であった。
【化８２】
2019163790.tif 000084
【０１４８】
（１−２）
N3-PLys_(B)の合成
開始剤 11-azide-3,6,9-trioxaundecane-1-amineを20 μL (0.101 mmol)使用した以外は、上記（１−１）と同様の方法で反応を行うことで、N3-PLys_(B)の白色固体を得た。1H-NMRより、得られた化合物の重合度は98.4であった。
【化８３】
2019163790.tif 000085
【０１４９】
（１−３）
N3-PLys_(C)の合成
開始剤 11-azide-3,6,9-trioxaundecane-1-amineを15 μL (0.0755 mmol)使用した以外は、上記（１−１）と同様の方法で反応を行うことで、N3-PLys_(C)の白色固体を得た。1H-NMRより、得られた化合物の重合度は130.4であった。
【化８４】
2019163790.tif 000086
【０１５０】
（１−４）
mPEG10k- PLysの合成
一端が-OMe基、もう一端が-NH2基で数平均分子量が10,000のポリエチレングリコール(以下 mPEG10k-NH2)を開始剤として、上記（１−１）と同様の重合反応を行った。mPEG10k-NH2 1.00 g (0.100 mmol)を秤量し、二口ナスフラスコに加え、ベンゼン2 mLに溶解させた。次に凍結乾燥により、溶媒を留去した。アルゴン雰囲気下で、蒸留精製したDMSO 10 mLを加え、溶解させた。次にアルゴン雰囲気下でNCA-Lys(Tfa) 1.61 gを秤量し、別の二口ナスフラスコに加えた。そこに精製蒸留したDMSO 16 mLを加え、溶解させた。シリンジを用いてNCA/DMSO溶液をPEG/DMSO溶液に加え、40 ℃の水浴で2日間撹拌した。反応溶液をジエチルエーテル 500 mLに滴下し、再沈殿法により精製した。沈殿物を吸引ろ過により回収し、一晩減圧乾燥させることで、白色固体を得た。得られたポリマーを100 mLナスフラスコに加え、そこにメタノール 100 mLと5 M 水酸化ナトリウム水溶液 2 mL、超純水 8 mLを加え、40 ℃の水浴で一晩撹拌した。サンプル溶液を透析膜(MWCO 3.5 kDa)に入れ、1 Lの0.01 M 水酸化ナトリウム水溶液に対して、4 h透析を2回、その後、3Lの超純水に対して4 h透析を4回行った。透析したサンプル溶液を500 mLナスフラスコに入れ、凍結乾燥により、溶媒を留去し、白色固体のmPEG10k- PLys 1.3 gを得た。1H-NMRより、得られた化合物の重合度は52.1であった。
であった。
【化８５】
2019163790.tif 000087
【０１５１】
（２−１）
N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(A)の合成
200 mLナスフラスコに、上記（１−１）得られたN3-PLys_(A)1.3g（0.066mmol）、D-glucono-1,5-lactone 2.73g (15.3 mmol)、及びTEA 2.1mL(15 mmol)を加え、メタノール100 mLに溶解し、還流下で24 h撹拌した。その後ロータリーエバポレーターにより溶媒を留去し、得られた沈殿物を0.01 M塩酸30 mLに溶解した。サンプル溶液を透析膜(MWCO=3.5 kDa)に入れ、1 Lの0.01 M塩酸に対して4 h透析を1回、その後、3 Lの超純水に対して4 hの透析を4回行った。透析した溶液を0.45 μmのフィルターでろ過した後、凍結乾燥により溶媒を留去し、N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(A)2.5 gを白色固体で得た。1H-NMRより、グルコン酸の高分子への導入率は98.0％であった。また、重合度及び導入率から、Mn = 19763であった。また、GPCより、多分散指数(PDI)は1.22であった。
【化８６】
2019163790.tif 000088
【０１５２】
（２−２）
N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(B)の合成
N3-PLys_(A)の代わりにN3-PLys_(B)を1.6g（0.054mmol）使用したこと、D-glucono-1,5-lactoneを 3.36g (18.9 mmol)使用したこと、そしてTEAを 2.6mL(19 mmol)使用したこと以外は、上記（２−１）と同様の方法で反応を行うことで、N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(B) 3.0 gを白色固体で得た。1H-NMRより、グルコン酸の高分子への導入率は98.4％であった。また、重合度及び導入率から、Mn = 29712であった。また、GPCより、多分散指数(PDI)は1.24であった。
【化８７】
2019163790.tif 000089
【０１５３】
（２−３）
N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(C)の合成
N3-PLys_(A)の代わりにN3-PLys_(C)を1.5g（0.038mmol）使用したこと、D-glucono-1,5-lactoneを 3.15g (17.7 mmol)使用したこと、そしてTEAを 2.4mL(17 mmol)使用したこと以外は、上記（２−１）と同様の方法で反応を行うことで、N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(C) 2.9 gを白色固体で得た。1H-NMRより、グルコン酸の高分子への導入率は97.8％であった。また、重合度及び導入率から、Mn = 39636であった。また、GPCより、多分散指数(PDI)は1.35であった。
【化８８】
2019163790.tif 000090
【０１５４】
（２−４）
mPEG10k-P[Lys(Gluconate)/Lys]_の合成
上記（１−４）で得られたmPEG10k- PLys 1.3 g (0.050 mmol)、D-glucono-1,5-lactone 1.5 g (8.43 mmol)、及びTEA 0.83 mL (8.4 mmol)を50 mLナスフラスコに加え、そこにメタノール10 mLを加え溶解させた。還流下で24 h撹拌した。その後ロータリーエバポレーターで溶媒を留去し、得られた沈殿物を0.01 M塩酸10 mLに溶解させた。サンプル溶液を透析膜(MWCO=3.5 kDa)に入れ、1 Lの0.01 M塩酸に対して4 hの透析を一回、その後、3 Lの超純水に対して4 hの透析を4回行った。透析した溶液を0.45 μmのフィルターでろ過した後、凍結乾燥により溶媒を留去し、mPEG10k-P[Lys(Gluconate)/Lys]_ 1.8 gを白色固体で得た。1H-NMRより、グルコン酸の高分子への導入率は98.9％であった。また、GPCより、多分散指数(PDI)は1.16であった。
【化８９】
2019163790.tif 000091
【０１５５】
実施例１９
N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_-BPAの結合評価
＜使用した試薬＞
5 mol / L 塩酸： ナカライテスク
5 mol / L 水酸化ナトリウム水溶液 ： 和光純薬工業
リン酸二水素ナトリウム (NaH2PO3) ： ナカライテスク
[10B-rich] 4-borono-L-phenylalanine (BPA)： Katchem
Alizarin Red S（ARS）： 和光純薬工業株式会社
D-fructose : 和光純薬工業株式会社
D-glucose : ナカライテスク
D-sorbitol : 東京化成工業
＜使用した機器＞
蛍光分光光度計 (FP8300) : 日本分光株式会社【０１５６】
Springsteen G., Wang B. H. Tetrahedron 58, 5291-5300 (2002) に記載の方法にしたがって、ARS法を用いてN3-P[Lys(Gluconate)/Lys]とBPAの平衡定数を算出した。初めに、以下に示す Solution A、B、C、D をそれぞれ調製した。
・Solution A : ARS (9.0×10-6 M) 
・Solution B : ARS (9.0×10-6 M), BPA (2.0×10-3 M) 
・Solution C1 : ARS (9.0×10-6 M), BPA (2.0×10-3 M), Sorbitol (0.05 M)
・Solution C2 : ARS (9.0×10-6 M), BPA (2.0×10-3 M), Glucose (1.5 M)
・Solution C3 : ARS (9.0×10-6 M), BPA (2.0×10-3 M), Fructose (0.1 M)
・Solution C4 : ARS (9.0×10-6 M), BPA (2.0×10-3 M), N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(A) (0.01 M :側鎖グルコン酸基準)
・Solution C5 : ARS (9.0×10-6 M), BPA (2.0×10-3 M), N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(B) (0.01 M :側鎖グルコン酸基準)
・Solution C6 : ARS (9.0×10-6 M), BPA (2.0×10-3 M), N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(C) (0.01 M :側鎖グルコン酸基準)【０１５７】
Solution A と Solution B を様々な比率で混合し、ディスポセル（PS製、TGK社）を用いて蛍光測定を行った (Ex = 468 nm, Em = 572 nm)。得られた蛍光強度からARS-BPAの平衡定数K0を算出した。次に、Solution BとSolution Cのいずれかを様々な比率で混合し、ディスポセルを用いて蛍光測定を行った (Ex = 468 nm, Em = 572 nm)。これらの結果と、先のK0の値を使い、各化合物とBPAの見かけ結合定数を算出した。結果を図１７に示す。【０１５８】
実施例１８で合成したN3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_は、BPAに対して高い結合力を有することがわかった。その結合力は糖化合物の中で高い結合力を有するSorbitolと比較して、約4倍であり、血中に多く存在するGlucoseと比較して、約500倍であった。これらの結果から、N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_-BPAは血中において高い安定性を示すことが期待される。【０１５９】
実施例２０
Cy5-P[Lys(Gluconate)/Lys]_-BPAの細胞への取り込み
（１）Cy5-P[Lys(Gluconate)/Lys](C)の合成
実施例１８（２−３）で合成したN3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(C)100 mg ( 2.5 μmol) を6 mLバイアルに量り取り、 1.8 mL のDMSOに溶解させた。次に、12.5 mg/mL Cy5 - DBCO / DMSO溶液 224 μL ( 2.8 μmol) を加え、室温で一晩攪拌した。反応溶液を限外濾過膜 (MWCO = 10 kD) に入れ、そこに超純水10 mLを加え、限外ろ過を行った。さらに、超純水15 mLを加え限外ろ過を2回行った。限外ろ過精製したサンプルを更に精製するために、PD-10 カラム (GEヘルスケア)を用いて精製し、分取したサンプル溶液を凍結乾燥により溶媒を留去し、Cy5-P[Lys(Gluconate)/Lys](C) 97 mgを青色固体として得た。【０１６０】
（２）Cy5-P[Lys(Gluconate)/Lys](C)_-BPAの細胞への取り込みの評価
顕微鏡観察用の8 wellプレート(Lab-Tek Chambered #1.0 borosilicate Coverglass system)にBxPC-3細胞を5 x 104 cell / wellとなるように播種し、37 ℃ 5 % CO2雰囲気下で一晩インキュベーションした(培地 : 10 % FBS, 1 % Penicilin-Streptmycin含有RPMI-1640)。インキュベーション後、アスピレータを用いて培地を取り除き、以下のサンプル溶液500 μLを加えた。
・Sorbitol-BPA : BPA (3.03 mM), Sorbitol (3.64 mM)/10 % PBS - 90 % RPMI培地
・Cy5-P[Lys(Gluconate)/Lys](C)-BPA : BPA (3.03 mM), Cy5-P[Lys(Gluconate)/Lys](C) (3.64 mM : 側鎖グルコン酸基準)/10 % PBS - 90 % RPMI培地
上記サンプル溶液は、リン酸緩衝液(10 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4)に10倍濃度で調整し、その後RPMI培地で希釈して使用した。サンプル溶液を加えた後、1 hインキュベーションした。その後、アスピレータでサンプル溶液を取り除き、20 μM DAHMI, 50 nM LysoTracker Green/PBS溶液500 μLを加え、30 minインキュベーションした。その後、アスピレータで溶液を取り除き、PBS 500 μLで3回洗浄した。洗浄後PBS 500 μLを加え、共焦点顕微鏡で蛍光を観察した。その結果を図１８に示す。【０１６１】
顕微鏡観察の結果、Cy5-P[Lys(Gluconate)/Lys](C)は細胞質全体に分布しているのではなく、エンドソームに局在していることが確認された。またCy5-P[Lys(Gluconate)/Lys](C)がBPAと局在していることから、Cy5-P[Lys(Gluconate)/Lys](C)-BPAはエンドサイトーシスにより細胞に取り込まれることが示唆された。【０１６２】
実施例２１
N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_-BPA及びSorbitol-BPAの体内動態
＜使用した試薬、細胞及び動物＞
・実施例１８で合成したN3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(A)、N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(B)、N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(C)及びmPEG10k-P[Lys(Gluconate)/Lys]_
・D-Sorbtiol : 東京化成工業
・5 mol /L 塩酸 ： ナカライテスク
・5 mol / L 水酸化ナトリウム (質量分析用) ： 和光純薬工業
・L - 4 - boronophenyl - alanine (BPA) ： Katchem
・硝酸(1.42) : 和光純薬工業
・CT26 細胞 (マウス大腸がん細胞株) : American Type Culture Collection (Manassas, VA)
・BALB/cマウス：Charles River Japan
＜使用した機器＞
Agilent 7900 ICP - MS : アジレント・テクノロジー株式会社
重水中性子照射設備 ： KUR【０１６３】
CT-26細胞をBALB/cマウスに1.0 x 105 cells/mouseで皮下注射することにより、皮下腫瘍モデルを作成した。腫瘍サイズが約200 mm3となったマウスに対して、200μLの下記のサンプル溶液(pH 7.4)を尾静脈投与した (BPA 10 mg / マウス)。以下のサンプル溶液は、糖もしくはポリマーとBPAを適当量の超純水に溶解させ、水酸化ナトリウム水溶液を加え、溶液をアルカリ性にし、溶質を完全に溶解させた後、塩酸を加えpH 7.4に調整し、超純水を加え、終濃度が以下の濃度になるように希釈し、0.22 μmのフィルターを用いてろ過滅菌することにより調製した。
・N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(A)-BPA (BPA 240mM)
・N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(B)-BPA (BPA 240mM)
・N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_(C)-BPA (BPA 240mM)
・mPEG10k-P[Lys(Gluconate)/Lys]_-BPA (BPA 240mM)
・Sorbitol-BPA (BPA 240 mM, Sorbitol 288 mM)【０１６４】
試料投与から3時間後に解剖して腫瘍の摘出を行った。摘出した腫瘍を14 mLチューブ(PPラウンドチューブ, Falcon)に入れ、硝酸(1.42)を1 mL加えた。その後、50℃で15 min、70℃で15min、90℃で1 hそれぞれインキュベートした。その後、超純水を10 mLまで加え、疎水性フィルターで濾過後、ICP-MSを用いてホウ素量を定量した。CT26移植マウスを用いた体内動態の結果を図１９に示す。【０１６５】
実施例２２
N3-P[Lys(Gluconate)/Lys]_-BPAの抗腫瘍効果
CT-26細胞をBalb/c マウスの右大腿付近に皮下移植し(1.0 x 105 cells/mouse)、腫瘍サイズが約50 〜 100 mm3のマウスに対して200 μLの下記のサンプルをゆっくりと尾静脈投与した (BPA 10 mg / マウス)。
・N3-P[Lys(Gluconate)/Lys](B)-BPA (BPA 240mM)
・N3-P[Lys(Gluconate)/Lys](C)-BPA (BPA 240mM)
・Sorbitol-BPA (BPA 240 mM, Sorbitol 288 mM)【０１６６】
中性子線照射群に関しては、試料投与から2.5時間後にマウスの右大腿付近のみに中性子線を50 min 照射した。照射日を1日目とし、2〜3日おきに腫瘍径を電子ノギスにて、体重を電子天秤にて全30日間測定した。測定した腫瘍径は、楕円体積近似式 (ab2 × 1/2、a : 長辺、b : 短辺)に代入し腫瘍体積とした。評価した検体をまとめると下記のようになる(n=6)。【０１６７】
Control (COLD)：無治療群。
Control (HOT)：中性子線を照射しただけの検体。
Sorbitol-BPA (HOT)：Sorbitol-BPAを注射してから2.5時間後に中性子線を照射した検体。
N3-P[Lys(Gluconate)/Lys](B)-BPA (HOT)：N3-P[Lys(Gluconate)/Lys](B)-BPAを注射してから2.5時間後に中性子線を照射した検体。
N3-P[Lys(Gluconate)/Lys](C)-BPA (HOT)：N3-P[Lys(Gluconate)/Lys](C)-BPAを注射してから2.5時間後に中性子線を照射した検体。【０１６８】
これらの腫瘍サイズの経時変化及びカプラン・マイヤー曲線を図２０及び２１に示す(腫瘍体積1600 mm3をエンドポイントとして生存曲線を作成した)。Sorbitol-BPA、N3-P[Lys(Gluconate)/Lys](B)-BPA (HOT)及びN3-P[Lys(Gluconate)/Lys](C)-BPA (HOT)は、コントロール群(Control(COLD)及びControl(HOT))と比較して、高い抗腫瘍効果と生存率を示した。また、N3-P[Lys(Gluconate)/Lys](C)-BPA (HOT)は他の群と比較して、高い生存率を示した。【０１６９】
実施例２３
P[VA(RGD)/VA]の合成
腫瘍関連血管や腫瘍細胞に過剰発現していると報告されている、αvβ3インテグリンに対して強いアフィニティを有する環状RGDfKペプチドをPVA側鎖に導入した。
【化９０】
2019163790.tif 000092
【０１７０】
＜使用した試薬＞
特に記述のない試薬・溶媒は市販品をそのまま使用した。
・PVA(Mn=9200)：実施例１（２）の方法にしたがって合成。
・cyclic RGDfKペプチド：Synpeptide社より購入
・CDI：Sigma Aldrich社より購入
・DMSO：和光純薬工業株式会社より購入
・DMSO-d6: 和光純薬工業株式会社より購入【０１７１】
PVA 100 mgとCDI 17.7 mgをDMSO 10 mLに溶解させ、室温で２時間撹拌した。その後、cyclic RGDfKペプチド 19.7 mgを加えて、室温で24時間撹拌した。生成物を水に対して3回透析を行った。透析後のサンプルを凍結乾燥により回収した。1H-NMR解析の結果、ポリマー１つに対してcyclic RGDfKペプチドが１〜２個結合していた。
【化９１】
2019163790.tif 000093
【０１７２】
実施例２４
P[VA(RGD)/VA]-BPAの腫瘍集積性評価
＜使用した試薬、細胞及び動物＞
・P[VA(RGD)/VA]：実施例２３で製造したもの
・BPA：KatChem
・BxPC3細胞：American Type Culture Collection (Manassas, VA)
・BALB/c nudeマウス：Charles River Japan【０１７３】
BxPC3細胞をBALB/c nudeマウスに5 x 106 cells/mouseで皮下注射した。腫瘍サイズが約200 mm3に達したところで、下記のサンプルを静脈注射した (BPA 8mg / mouse)。
P[VA(RGD)/VA]−BPA（BPA濃度：191 mM, P[VA(RGD)/VA]のジオール濃度：91 mM） in PBS (pH 10)【０１７４】
静脈注射から６時間後にマウスを頚椎脱臼により安楽死させた後、解剖して腫瘍の摘出を行った。腫瘍を10 mL ファルコンチューブに入れ、70% 硝酸を1 mL加えた。その後、50℃で15分、70℃で15分、90℃で1時間それぞれインキュベートした。純水を用いて10 mLまでメスアップを行い、疎水性フィルターで濾過後、ICP-MSを用いてホウ素量を定量した。その結果、P[VA(RGD)/VA]−BPAは、投与から６時間後においても腫瘍に対して6.2±2.4% dose/g tumorという高い集積性を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１７５】
本発明によれば、ＢＮＣＴにおいて、腫瘍選択的に大量のホウ素を送達することが可能である。また、診断薬としてのフッ素修飾ＢＰＡにも応用することができ、ホウ素系診断薬としても利用可能である。
【図１】
2019163790.tif 000108
【図２】
2019163790.tif 000109
【図３−１】
2019163790.tif 000110
【図３−２】
2019163790.tif 000111
【図４−１】
2019163790.tif 000112
【図４−２】
2019163790.tif 000113
【図５−１】
2019163790.tif 000114
【図５−２】
2019163790.tif 000115
【図６−１】
2019163790.tif 000116
【図６−２】
2019163790.tif 000117
【図７】
2019163790.tif 000118
【図８−１】
2019163790.tif 000119
【図８−２】
2019163790.tif 000120
【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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