(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
開放端と細径化された底部を有し、前記細径された底部に折切を容易にするための脆弱部を設けてなるガラス製チューブであって、チューブは開放端の内径が５〜２０ｍｍであり、全長が４０〜１７０ｍｍであり、かつ、底部は長さが１５〜４０ｍｍであり、内径が２〜７ｍｍであるガラス製チューブと、該チューブの開放端に装着されるゴム袋を含んでなる精子洗浄濃縮用チューブ。
【請求項２】
次の各工程を含んでなる精子洗浄濃縮方法。
(1)  密度勾配担体を、請求項１に記載の精子洗浄濃縮用チューブのガラス製チューブに入れ、
(2)  同量のハンクス（ＨＡＮＫＳ）液または生食を加えて希釈した精液をシリンジに吸引し、
(3)  工程(2)の精液を除去フィルター上に静かに排出して、該除去フィルターで精液中の繊維やゼラチン様塊、尿酸結石を除去し、濾過された精液を前記ガラス製チューブ中の密度勾配担体に層積し、
(4)  精液の全量が密度勾配担体に層積された後、精液と密度勾配担体との界面の両側部分を攪拌して界面を無くし、
(5)  工程(4)のガラス製チューブを遠心分離し、
(6)  遠心分離後、該ガラス製チューブの開放端にゴム袋を潰した状態にして装着した後、ガラス製チューブの細径された底部を折切して洗浄濃縮された精子を含む沈殿および密度勾配担体を回収し、次いで
(7)  密度勾配担体層を可及的に除去して沈殿のみとする。
【請求項３】
前記密度勾配担体が修飾コロイドシリカ、パーコール、ショ糖重合体、またはフィコールである請求項２記載の精子洗浄濃縮方法。
【請求項４】
前記密度勾配担体がパーコールである請求項２記載の精子洗浄濃縮方法。
【請求項５】
前記パーコールはエンドトキシンを除去したのち、培養液を添加して等張化した９０〜９８％濃度のパーコールである請求項３または４記載の精子洗浄濃縮方法。
【請求項６】
前記パーコールはポリビニルピロリドン被膜をもつコロイドシリカである請求項３、４または５記載の精子洗浄濃縮方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はヒトから採取された精子を洗浄し濃縮して、医学的生殖介助（assisted reproduction technology ：ＡＲＴ）に資するための精子洗浄濃縮用チューブ、およびそれを用いた精子洗浄濃縮方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
男性不妊の原因は多岐にわたるが、約９０％は特発性造精機能障害による精液所見不良症例である。男性不妊に対する治療法は、外科的療法、造精機能賦活を目的とした薬物療法、ＡＲＴに大別される。精索静脈瘤における高位結紮術、精路通過障害における精管−精管吻合術などの外科的療法は、泌尿器科領域において成績が得られている。しかし、これらの症例の大半を占める精液所見不良症例では、薬物療法の有効率は高いとは言えず、治療に苦慮している。そのため、男性不妊に対する治療にはＡＲＴが応用されている。ＡＲＴは広義には配偶子の形成、受精、着床、妊娠維持を医学的に補助して不妊治療を行うことである。実際には子宮腔内人工授精（intrauterin insemination :ＩＵＩ）から体外受精または胚移植（in vitro fertlization embryo transfer : ＩＶＦ−ＥＴ）、さらには顕微受精（micro-insemination）に至る人工的な授精による不妊治療を指す場合が多い。
【０００３】
膣に射精された精液は子宮頚管、子宮腔内、卵管と雌性生殖路を遡上する過程においてその数を減じ、最終的に受精の場である卵管膨大部に到達するのは、１０匹程度と考えられている。精液所見の悪化は受精の場に到達する精子数の減少である。このためＡＲＴの研究と治療は２つの方向を目指している。１つはできるだけ少ない精子数で受精を可能とするため、雌性生殖路における精子遡上過程をバイパスして精子を卵子のより近くに送り届けようとする授精法の改良である。ＩＵＩは子宮頚管をバイパスし、ＩＶＦ−ＥＴでは卵を体外に取り出してインビトロで受精させ、さらに卵細胞質精子注入（intra-cytoplasma sperm injection：ＩＣＳＩ）では、卵子の細胞質に一匹の精子を穿刺することにより受精をもバイパスしてしまう。他法では、射精精液を洗浄、濃縮してより多くの精子を授精に供しようとする試みがある。
【０００４】
精子の最も基本的な機能は染色体の運搬である。機能的には精子は先体、頭部、中片−尾部の３つに分類され、頭部は染色体を収納し、中片−尾部はエネルギー代謝と精子運動を行い、先体は卵への接着、融合に関する。従来、人工的な授精に供する精子の調製は、成熟した正常形態を有する前進運動精子の選別を目的としており、主に中片−尾部の機能に着目したものである。
射精直後の精子は潜在的な授精能を有しているにすぎず、雌性生殖路またはインビトロで数時間培養することにより、キャパシテーション（capacitation）、先体反応（acrosome reaction ）等の生理的、形態的変化を経て授精が可能となる。ＩＶＦ−ＥＴでは、媒精に要する精子濃度が低いことから、乏精子症、精子無力症の切札と考えられたが、精液所見不良症例では、あらかじめ運動精子が低くては授精が成立しないことが臨床的にも明らかとなり、従来から妊孕性（女性を妊娠させる能力）の指標とされてきた精子濃度、運動率（中片−尾部機能）とともに、先体反応誘起能を含む先体機能を把握することも重要であることが示唆された。さらに重度の精液所見不良症例に対してＩＣＳＩが導入されたことにより、今後は、染色体の評価を含めさらに詳細に精子機能を把握することが重要となってくる。また、授精法の高度化は媒精に供する精子数を減じたが、卵、胚の体外操作を要するとともに、精子調製に際しても雌性生殖路で行われる精子の選別、生理的変化をインビトロで代行する必要を生じ、授精法の高度化に対応したより高度な精子精製法の確立が不可欠となっている。
【０００５】
また、人工的な授精に供する精子は、授精法により調製条件が異なる。すなわちＩＵＩでは、先ず精子濃縮が求められ、ＩＶＦ−ＥＴでは、必要とする精子濃度は減少するが、運動精子の選別、精漿、細菌の除去など、さらに高度な処理が要求される（精子洗浄濃縮法）。精子の調製は遠心分離による方法と精子自身の運動により分離する方法の２つに大別される。遠心分離による方法は、初期にはショ糖重合体フィコールを、現在では修飾コロイドシリカゲル、またはパーコール（Percoll）を用いた密度勾配遠心法を用いている。授精の方法に応じて、精子濃縮を目的とした単層パーコール法、クッション法、運動精子の選別が可能な多層パーコール法、攪拌密度勾配法等が採用されている。また、精子自身の運動に基づいた分離法としては、スイムアップ法（Swim up ）が汎用されており、精液所見が不良な症例に対しては、スイムアップ法の変法であるスイムダウン法（Swim down ）がある。
【０００６】
パーコール密度勾配遠心分離法は、攪拌密度勾配法の操作の煩雑性を避けるため、等張化８０％パーコールに直接、精液を層積し、精液とパーコール層を攪拌することにより、連続密度勾配を作製して遠心分離する方法である。運動精子は沈澱中に濃縮される。
精子はその形成、成熟の過程で細胞質を失い、運動性を有する成熟精子は細胞質を有する細菌、未成熟精子等に比して密度が高い。パーコール密度勾配遠心分離法はこの原理に基づき、成熟運動精子を精漿または細菌から分離するものである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のパーコール密度勾配遠心分離法では、遠心分離後に上清をピペット等で除去しているため、遠心管内壁に付着した精漿、細菌が沈澱中に濃縮された精子に流下して再汚染するという欠点を有している。また、沈澱が０．１〜０．２ｍｌと多いためパーコールの残留量も多くなるという欠点も有している。また、子宮腔内に洗浄した精子を注入する配偶者間人工授精（ＡＩＨ）では、パーコールを除去するため、培養液等で沈澱を再度希釈して低速で遠心分離する必要があった。そして、この際、精子回収率が低く（精子濃度の低下）、運動率の低下が起こり、精子精製の障害となっている。また、射精精液には下着の繊維などが混入しており、これには細菌が付着しているため、遠心分離後沈澱に混入した繊維により精子が細菌汚染されるという問題があった。
また、市販のパーコールは研究用グレードであり、エンドトキシンレベルが高いため、これを精子洗浄に用い、パーコールに懸濁した精子をＩＶＦ−ＥＴにおける胚培養系に直接添加することはできなかった。
【０００８】
本発明は、上記のような事情に鑑みてなされたもので、細菌による汚染やパーコールの残留の無い精子洗浄濃縮方法および精子洗浄濃縮用チューブを提供することを目的とする。
また、本発明は精子回収率が高く、運動率の低下を生ずることの無い精子洗浄濃縮方法および精子洗浄濃縮用チューブを提供することを目的とする。
また、本発明は、エンドトキシンを効率的に除去することのできる精子洗浄濃縮方法および精子洗浄濃縮用チューブを提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意検討の結果、遠心管の底部を細径化して、遠心分離により精子が細径底部に濃縮されるようにし、遠心分離後、遠心管内部を陰圧状態に保った状態で、細径底部を折切すれば、上清が流下するのを防ぐことができることに想到し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、開放端と細径化された底部を有してなるチューブと、該チューブの開放端に装着されたゴム袋を含んでなる精子洗浄濃縮用チューブである。ここで、細径底部には折切を容易にするための脆弱部を設けてもよい。
また、本発明は、▲１▼密度勾配担体を前記の精子洗浄濃縮用チューブのガラス製チューブに入れ、▲２▼同量のハンクス（ＨＡＮＫＳ）液または生食を加えて希釈した精液をシリンジに吸引し、▲３▼工程▲２▼の精液を除去フィルター上に静かに排出して、該除去フィルターで精液中の繊維やゼラチン様塊、尿酸結石を除去し、濾過された精液を前記ガラス製チューブ中の密度勾配担体に層積し、▲４▼精液の全量が密度勾配担体に層積された後、精液と密度勾配担体との界面の両側部分を攪拌して界面を無くし、▲５▼工程▲４▼のチューブを遠心分離し、▲６▼遠心分離後、該ガラス製チューブの開放端にゴム袋を潰した状態にして装着した後、ガラス製チューブの細径された底部を折切して洗浄濃縮された精子を含む沈殿および密度勾配担体を回収し、次いで▲７▼密度勾配担体層を可及的に除去して沈澱のみとするとの各工程を含んでなる精子洗浄濃縮方法である。
ここで密度勾配担体としては、修飾コロイドシリカ、パーコールまたはショ糖重合体、フィコールなどが例示される。パーコールはエンドトキシンを除去したのち培養液を添加して等張化した９０〜９８％濃度のパーコールが好ましい。なお、本発明において、「パーコール」とは、ポリビニルピロリドン被膜をもつコロイド状シリカゾルを意味する。
遠心分離条件は目的に応じて、種々選択されるが、一般的には、１．０００ｘｇで２０〜３０分間である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
先ず、本発明の精子洗浄濃縮用チューブについて、図面に基づいて説明する。
図１は本発明の精子洗浄濃縮用チューブの一実施例を示す平面図であり、図２は図１のチューブのII−II線断面図である。
図１および図２に示すように、本発明の精子洗浄濃縮用チューブは、開放端１１と細径化された底部１２を有するガラス製チューブ１と、このチューブ１の開放端１１に装着されたゴム袋２を含んでなる。ここで、細径底部１２には折切を容易にするための脆弱部（カット部）１３を設けてもよい。
【００１１】
チューブ１は開放端１１と細く絞られた底部１２を有しており、全体をガラスで形成することにより、エンドトキシンなどの有機性汚染物質を不活化するために約３００℃で１時間の加熱滅菌を可能にしている。また、ガラス製であるため、遠心分離後にアンプルカットの要領で底部１２を折切することができる。チューブ１のサイズは、開放端１１の内径が５〜２０mmであり、全長が４０〜１７０mmである。底部１２のサイズは、通常、長さが１５〜４０ｍｍ、内径が２〜７ｍｍであり、精子の回収量（通常５〜１０μｌ）に合わせて、好ましくはチューブ１の底部から１０〜３０ｍｍ前後の位置にカット部（脆弱部）１３が設けられており、容易に折切できるようにしている。
【００１２】
図１および図２ではガラス製チューブの開放端１１にはゴム袋２が装着されているが、ゴム袋２は取り外し可能である。精子の回収に際して、ゴム袋２を潰れた状態でチューブ１の開放端１１に装着すれば、圧潰を解消した時に、ゴム袋２は弾性により元の状態に回復してチューブ１の内部に陰圧が生じる。そして陰圧により、細径底部１２を折切して開放した時に、チューブ１に収容された折切部分より上にある液（上清）が流下するのを防ぐことができる。また、精子は遠心による沈澱により、管底に５〜１０μｌ程度に濃縮されて存在するので、パーコール層を可及的に除去して沈澱のみとすることができる。目的に応じて培養液で再懸濁することもあるが、この場合でも、管径が細いためパーコール混入を最小限とすることができる。
【００１３】
次に、本発明の精子洗浄濃縮方法について、図３を用いて説明する。
先ず、精液の受付を行い、氏名、カルテ番号等の確認および、目視による観察（血精液症等のチェック）を行う。次に、患者氏名の確認を行い、精液を５ｍｌディスポシリンジに吸引して精液量の測定を行った後、シリンジで精液を数回吸入、排出して液化ならびに均一化を図る。精液が均一に液化されたら、これをスライドグラスに滴下して精子数および運動率を観察する。次に、精液の液化状態およびゲルの混在を観察する。一方、本発明の精子洗浄濃縮用チューブ１に９０〜９８％等張化パーコールを入れる（工程▲１▼）。次に、精液に同量のハンクス液または生食を加えてシリンジＳで吸入、排出を繰り返して希釈し、この希釈した精液をシリンジＳに吸引して（工程▲２▼）、チューブ１の開放端１１に挿入した除去フィルターＦ上に静かに排出して、除去フィルターＦで精液中の繊維やゼラチン様塊、尿酸結石などを除去し（図３−▲１▼）、濾過された精液をパーコールに層積する（工程▲３▼、図３−▲２▼）。精液の全量がパーコールに層積されたら、チューブ１の精液とパーコールの界面の両側部分、通常両側２ｃｍの範囲を、例えばＬ型攪拌棒で攪拌して界面を無くする（工程▲４▼、図３−▲３▼））。
【００１４】
次にチューブ１を例えば、３０００ｒｐｍ（１．０００ｘｇ）で２０〜３０分間遠心分離すると、遠心分離により、精子はチューブ１下端の細径底部１２に濃縮される（工程▲５▼、図３−▲４▼）。遠心分離後、チューブ１の開放端１１にゴム袋２を潰した状態にして装着した後、細径底部１２をカット部１３で折切して精子を回収する（工程▲６▼、図３−▲５▼）。ガラス折切時には、折切時の怪我を防ぐため、専用のチップ（図示していない）をチューブ１の下部に装着して注意深く折切するのが好ましい。回収された精子は管底に１０μｌ程度に濃縮されているので、パーコール層を可及的に除去して沈澱のみとする（工程▲７▼、図３−▲６▼）。目的に応じて培養液で再懸濁することもある（図３−▲７▼）。尚、チューブ１の上部および上清は廃棄されるが、ゴム袋２は繰り返し使用できるので、洗浄して保管する。
【００１５】
〔実施例１〕
用手法により採取されたヒト精液を室温に約３０分間放置して液化させ、一般的な精液所見を観察した後、本発明の方法により精液を洗浄濃縮して（３０００回転／分、２０分）、精子濃度、精子運動および酸性フォスファターゼ活性（Acid P）の測定を行ったところ、表１の様な結果が得られた。
尚、観察温度は顕微鏡ステージ用透明加温盤を用いて３７℃に維持し、精子濃度はマクラー氏精子算定盤を用いて測定した。また、精子運動（運動率、運動速度）は精液１０μｌを、ヒト血清アルブミン処理を行った精子運動観察用チャンバーに載せて観察し、コンピュータ画像解析装置（ＣＡＳＡ３０００、ＣｅｌｌＳｏｆｔ社製）を用いて測定した。また、酸性フォスファターゼ活性測定試薬（Acid P）は酸性フォスファＫＩＩテストワコー（和光純薬工業（株）製）を用い、４．６ｍｍｏｌｅフェニルリン酸２ナトリウムを基質として３７℃で酸性フォスファターゼ活性を測定した。
【００１６】
【表１】
0003744298.tif 000002
(注)原精液の量は2.4±1.1mlであり、本法により洗浄濃縮後、精子懸濁液は10mlとなるようにハンクス液に再懸濁した。
【００１７】
本法では、未成熟な精子は細胞質を有するために運動性が悪く受精能力も低いことから、成熟して細胞質を失った運動性および受精能力の向上した精子のみを選択的に回収しており、表１からも分かるように精子濃度は数十倍になっている。また、洗浄により精子運動率も向上している。精漿除去率の指標として酸性フォスファターゼ活性を比較した結果は、原精液と比較して著しく減少しており、洗浄によりほぼ完全に精漿を除去し得たと考えられる。
【００１８】
【発明の効果】
以上、説明してきたことから明らかなように、本発明を採用すれば、精子回収率が高く、運動率の高い精子を選択的に回収することができるので、授精率を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の精子洗浄濃縮用チューブの一実施例を示す平面図である。
【図２】  図１のチューブのII−II線断面図である。
【図３】  図１に示す精子洗浄濃縮用チューブの使用状況を説明する図である。
【符号の説明】
１  チューブ
１１  開放端
１２  底部
１３  脆弱部
２  ゴム袋
Ｆ  除去フィルター
Ｌ  Ｌ型攪拌棒
Ｓ  シリンジ
【図１】
0003744298.tif 000003
【図２】
0003744298.tif 000004
【図３】
0003744298.tif 000005