(57)【要約】本発明は、分化誘導したインスリン分泌細胞と共存する高い増殖性を有するＫｉ６７陽性細胞を除去する手法を提供することを目的とする。  アルギン酸を含むゲル中に内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を包埋し分化させることを含む、Ｋｉ６７陽性細胞を３％未満含むインスリン産生細胞集団又は膵ベータ細胞集団の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｋｉ６７陽性細胞を３％未満含むインスリン産生細胞集団又は膵ベータ細胞集団の製造方法であって、
（１）アルギン酸を含むゲル中にインスリン産生細胞集団を包埋する工程、ならびに（２）包埋した細胞集団を分化させる工程、
を含む方法。
【請求項２】
（１）において該ゲルがさらに、ナノファイバーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（２）において分化させる工程が、動物に移植することにより行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団中に存在するＫｉ６７陽性細胞の数を減少させる方法又は該陽性細胞の増殖を抑制する方法であって、
アルギン酸を含むゲル中に該細胞集団を包埋することを含む、方法。
【請求項５】
該細胞集団中に存在する内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞の数を減少させない、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該ゲルがさらに、ナノファイバーを含む、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
Ｋｉ６７陽性細胞を３％未満含むインスリン産生細胞集団又は膵ベータ細胞集団が包埋された、アルギン酸を含むゲル。
【請求項８】
該細胞集団のＫｉ６７陽性細胞が１％未満である、請求項７に記載のゲル。
【請求項９】
該細胞集団が多能性幹細胞由来の細胞集団である、請求項７に記載のゲル。
【請求項１０】
糖尿病の治療方法において使用するための、請求項７に記載のゲル。
【請求項１１】
Ｋｉ６７陽性細胞を３％未満含むインスリン産生細胞集団又は膵ベータ細胞集団が包埋された、アルギン酸を含むゲルを生体内に固定することによる、糖尿病の治療方法。
【請求項１２】
内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団中に存在するＫｉ６７陽性細胞の増殖を抑制するための、アルギン酸を含むゲル。
【請求項１３】
Ｋｉ６７陽性細胞を３％未満含むインスリン産生細胞集団又は膵ベータ細胞集団を含む医薬の製造におけるアルギン酸を含むゲルの使用。
【請求項１４】
Ｋｉ６７陽性細胞を１％未満含むインスリン産生細胞集団又は膵ベータ細胞集団の製造方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
Ｋｉ６７陽性細胞を３％未満含むインスリン産生細胞集団又は膵ベータ細胞集団の製造方法であって、
（１）細胞を純化する工程、
（２）アルギン酸を含むゲル中にインスリン産生細胞集団を包埋する工程、及び
（３）包埋した細胞集団を分化させる工程、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞から分化誘導して得られるインスリン産生細胞集団又は膵ベータ細胞集団中に存在する高い増殖性を有するＫｉ６７陽性細胞を除去する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞から、インスリン産生細胞や膵ベータ細胞といったインスリン分泌細胞を分化誘導し、糖尿病の治療に応用する研究が進められている。【０００３】
これまでに、多能性幹細胞からインスリン分泌細胞へと分化誘導するために様々な手法が、開発・報告されている。非特許文献１には、ヒトＥＳ細胞に由来する膵前駆細胞をアルギン酸ベースの足場を用いて培養できることが示されており、テストしたすべての培養条件において、インスリン・ＰＤＸ１の発現が安定又は減少し、グルカゴン・ソマトスタチンの発現が増加し、β細胞関連遺伝子の発現が減少したことが確認されている。【０００４】
また、インスリン分泌細胞を生体内に移植する方法についても研究が進められており、膵島をアルギン酸ハイドロゲルで封入したシステムを用いて生体内に移植することにより、レシピエントの免疫系の干渉を回避できることが報告されている（特許文献１，２）。【０００５】
一方、これまでに多能性幹細胞由来の内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団をさらに分化誘導して得られたインスリン産生細胞集団又は膵ベータ細胞集団中に高い増殖性を有する細胞が混在していることは知られておらず、また、そのような細胞を除去することについて検討されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／０３２２４２
【特許文献２】ＷＯ２０１１／１５４９４１
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ．２０１５  Ｄｅｃ；１０３（１２）：３７１７−２６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本願発明者らは、多能性幹細胞からインスリン産生細胞又は膵ベータ細胞へと分化誘導した細胞集団中に、これらインスリン分泌細胞（インスリン産生細胞及び膵ベータ細胞）と共に、Ｋｉ６７マーカー陽性によって特徴付けられる増殖性の高い細胞（以下、「Ｋｉ６７陽性細胞」と記載する）が存在することを見出した。【０００９】
分化誘導したインスリン分泌細胞を糖尿病の治療等に応用しようとした場合、インスリン分泌細胞以外の細胞を厳密に制御することは、安全性の観点から極めて重要である。また、高い増殖性を有する細胞の混入・残存は、レシピエントへの悪影響や移植されたインスリン分泌細胞の長期の生着に影響を及ぼす虞があり、好ましくない。【００１０】
そこで本発明は、分化誘導したインスリン分泌細胞と共存する高い増殖性を有するＫｉ６７陽性細胞を除去する手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、多能性幹細胞から分化誘導して得られた内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団をアルギン酸を含むゲル中に包埋してさらに分化させることによって、Ｋｉ６７陽性細胞の数の減少又は該細胞の増殖が抑制され、Ｋｉ６７陽性細胞の含有量が低減されたインスリン産生細胞集団又は膵ベータ細胞集団が得られることを見出した。【００１２】
本発明は、これらの新規知見に基づくものであり、以下の発明を包含する。
［１］  Ｋｉ６７陽性細胞を３％未満含むインスリン産生細胞集団又は膵ベータ細胞集団の製造方法であって、
（１）アルギン酸を含むゲル中にインスリン産生細胞集団を包埋する工程、ならびに（２）包埋した細胞集団を分化させる工程、
を含む方法。
［１−１］  Ｋｉ６７陽性細胞を３％未満含むインスリン産生細胞集団又は膵ベータ細胞集団の製造方法であって、
（１）アルギン酸を含むゲル中に内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を包埋する工程、ならびに（２）包埋した細胞集団を分化させる工程、
を含む方法。
［１−２］  Ｋｉ６７陽性細胞を１％未満含むインスリン産生細胞集団又は膵ベータ細胞集団の製造方法である、［１］又は［１−１］の方法。
［２］  （１）において前記ゲルがさらに、ナノファイバーを含む、［１］又は［１−１］の方法。
［３］  （２）において分化させる工程が、動物に移植することにより行われる、［１］〜［２］のいずれかの方法。
［４］  内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団中に存在するＫｉ６７陽性細胞の数を減少させる方法又は該陽性細胞の増殖を抑制する方法であって、
アルギン酸を含むゲル中に該細胞集団を包埋することを含む、方法。
［４−１］  内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団中に存在するＫｉ６７陽性細胞の増殖を抑制する方法であって、
アルギン酸を含むゲル中に該細胞集団を包埋することを含む、方法。
［４−２］  前記細胞集団中に存在するＫｉ６７陽性細胞の絶対数を減少させる、［４］の方法。【００１３】
［５］  前記細胞集団中に存在する内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞の数を減少させない、［４］〜［４−２］のいずれかの方法。
［５−１］  前記細胞集団中に存在する内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞で、且つＫｉ６７陽性細胞でない細胞の数を減少させない、［４］〜［４−２］のいずれかの方法。
［６］  前記ゲルがさらに、ナノファイバーを含む、［４］〜［５−１］のいずれかの方法。
［７］  Ｋｉ６７陽性細胞を３％未満含むインスリン産生細胞集団又は膵ベータ細胞集団が包埋された、アルギン酸を含むゲル。
［７−１］  前記細胞集団のＫｉ６７陽性細胞が１％未満である、［７］のアルギン酸を含むゲル。
［７−２］  前記胞集団が多能性幹細胞由来の細胞集団である、［７］のアルギン酸を含むゲル。
［７−３］  糖尿病の治療方法において使用するための、［７］のアルギン酸を含むゲル。
［８］  前記ゲルがさらに、ナノファイバーを含む、［７］のアルギン酸を含むゲル。【００１４】
［９］  Ｋｉ６７陽性細胞を３％未満含むインスリン産生細胞集団又は膵ベータ細胞集団の製造方法であって、
（０）本明細書中に記載されているいずれかの方法（例えば、段落［００５５］から［００８６］のいずれかの方法）を含む工程、
（１）アルギン酸を含むゲル中にインスリン産生細胞集団を包埋する工程、及び
（２）包埋した細胞集団を分化させる工程、
を含む方法。
［１０］  Ｋｉ６７陽性細胞を３％未満含むインスリン産生細胞集団又は膵ベータ細胞集団が包埋された、アルギン酸を含むゲルを生体内に固定することによる、糖尿病の治療方法。
［１１］  内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団中に存在するＫｉ６７陽性細胞の増殖を抑制するための、アルギン酸を含むゲル。
［１２］  Ｋｉ６７陽性細胞を３％未満含むインスリン産生細胞集団又は膵ベータ細胞集団を含む医薬の製造におけるアルギン酸を含むゲルの使用。
［１３］  Ｋｉ６７陽性細胞を３％未満含むインスリン産生細胞集団又は膵ベータ細胞集団の製造方法であって、
（１）細胞を純化する工程、
（２）アルギン酸を含むゲル中にインスリン産生細胞集団を包埋する工程、及び
（３）包埋した細胞集団を分化させる工程、
を含む方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１８−０５１２９７号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、分化誘導したインスリン分泌細胞と共存する高い増殖性を有するＫｉ６７陽性細胞を除去する手法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、アルギン酸を含むゲル中に内分泌前駆細胞を包埋して移植した場合の移植後６９日におけるＫｉ６７陽性細胞の増殖抑制効果を示す写真図である。
【図２】図２は、移植後６ヶ月の時点で摘出した移植片より回収された細胞のフローサイトメトリーの結果を示すグラフ図である。移植前後の目的細胞であるインスリン陽性／ＮＫＸ６．１陽性細胞の割合（Ａ）、ならびに、移植前後の目的外細胞であるＫｉ６７陽性／インスリン陰性細胞の割合（Ｂ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
１．用語
以下、本明細書において記載される用語について説明する。
【００１８】
本明細書において、「約」とは、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ２５％、２０％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％まで変動する値を示す。好ましくは、「約」又は「およそ」という用語は、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ１５％、１０％、５％、又は１％の範囲を示す。
【００１９】
本明細書において、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）又はｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、その語句に続く要素の包含を示すがこれに限定されないことを意味する。したがって、その語句に続く要素の包含は示唆するが、他の任意の要素の除外は示唆しない。
【００２０】
本明細書において、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ）  ｏｆ又はｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」とは、その語句に続くあらゆる要素を包含し、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「〜からなる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であり、他の要素は実質的に存在しないことを示す。
【００２１】
本明細書において、「フィーダー細胞を使用」しないとは、基本的にフィーダー細胞を含まないこと、フィーダー細胞を培養することによってプレコンディショニングした培地などを使用しないことを意味する。したがって、培地中にはフィーダー細胞から分泌される成長因子及びサイトカインなどの物質は含まれない。
【００２２】
なお、「フィーダー細胞」又は「フィーダー」とは、別な種類の細胞と共培養され、その細胞を支持し、成長することができる環境をもたらす細胞を意味する。フィーダー細胞は、それらが支持する細胞とは同じ種由来であっても、異なる種由来であってもよい。例えば、ヒト細胞のフィーダーとして、ヒト皮膚線維芽細胞又はヒト胚性幹細胞を使用してもよいし、マウス胚線維芽細胞の初代培養物、及び不死化マウス胚線維芽細胞を使用してもよい。フィーダー細胞は、放射線照射又はマイトマイシンＣ処理などによって不活性化することができる。
【００２３】
本明細書において、「接着」とは、細胞が容器に付着していること、例えば、細胞が適切な培地の存在下で滅菌プラスチック（又はコーティングされたプラスチック）の細胞培養ディッシュ又はフラスコに付着していることを指す。細胞のなかには、細胞培養容器に接着させなければ培養物中で維持できない、あるいは成長しないものもある。これに対し、非接着性細胞は、容器に接着させることなく培養物中で維持され、増殖できる。
【００２４】
本明細書において、「培養」とは、細胞をインビトロ環境において維持し、成長させ、かつ／又は分化させることを指す。「培養する」とは、組織又は体外で、例えば、細胞培養ディッシュ又はフラスコ中で細胞を持続させ、増殖させ（成長させ）、かつ／又は分化させることを意味する。
【００２５】
本明細書において、「富化する（ｅｎｒｉｃｈ）」及び「富化すること（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」とは、細胞の組成物などの組成物中の特定の構成成分の量を増加させることを指し、「富化された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量が、富化される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して増加している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して富化することができ、したがって、標的細胞型の割合は、富化される前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して増加する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について富化することもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって富化することもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を富化する方法により、細胞集団が標的細胞集団に関して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％富化される。
【００２６】
本明細書において、「枯渇する（ｄｅｐｌｅｔｅ）」及び「枯渇すること（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）」とは、細胞もしくは細胞の組成物などの組成物中の特定の構成成分の量を減少させることを指し、「枯渇された（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）」とは、細胞もしくは細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量が、枯渇される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して減少している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して枯渇させることができ、したがって、標的細胞型の割合は、枯渇される前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して減少する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について枯渇させることもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって枯渇させることもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を枯渇させる方法により、細胞集団は標的細胞集団に関して少なくとも５０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％減少（枯渇）している。
【００２７】
本明細書において、「細胞の数を減少させない」とは、本発明方法の実施に起因して細胞数が顕著に減少しないことを意味し、当該方法の実施前の細胞数と当該方法の実施後の細胞数との間に顕著な差がないことを意味する。ただし、本発明方法の実施を原因とするものではない細胞数の減少（例えば、従来公知の細胞培養及び分化の工程において通常生じ得る細胞の自然死等）は生じ得る。したがって、「細胞の数を減少させない」とは、本発明方法の実施前と比べた実施後の細胞の減少率が、３０％以下、２０％以下、１０％以下、又は５％以下である場合も含まれる。
【００２８】
本明細書において、「マーカー」とは、「マーカータンパク質」、「マーカー遺伝子」など、所定の細胞型により特異的に発現される細胞抗原又はその遺伝子を意味する。好ましくは、マーカーは細胞表面マーカーであり、その場合、生存細胞の濃縮、単離、及び／又は検出が実施可能となる。マーカーは、陽性選択マーカー或いは陰性選択マーカーでありうる。
【００２９】
マーカータンパク質の検出は、当該マーカータンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、フローサイトメトリーを利用して行うことができる。マーカー遺伝子の検出は、当該分野で公知の核酸増幅方法及び／又は核酸検出方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、バイオチップ等を利用して行うことができる。本明細書中において、マーカータンパク質が「陽性」であるとは、フローサイトメトリーで陽性と検出されることを意味し、「陰性」とは、フローサイトメトリーで検出限界以下であることを意味する。また、マーカー遺伝子が「陽性」であるとは、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されることを意味し、「陰性」とはＲＴ−ＰＣＲで検出限界以下であることを意味する。
【００３０】
本明細書において、「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、細胞内のプロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳として定義される。
【００３１】
本明細書において、「ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子」とは、ＣＤＫ８／１９の阻害活性を有するあらゆる物質を意味する。同じＣＤＫファミリーの他のタンパク質とは対照的に、ＣＤＫ８は、細胞増殖には必要とされず、ＣＤＫ８の阻害は、通常の条件下では大きな効果はない。ＣＤＫ１９とＣＤＫ８は上記で述べたように類似しており、ＣＤＫ８阻害は通常ＣＤＫ１９の阻害も伴う。
【００３２】
「増殖因子」は特定の細胞の分化及び／又は増殖を促す内因性タンパク質である。「増殖因子」としては、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフェリン、種々のインターロイキン（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１８）、種々のコロニー−刺激因子（例えば、顆粒球／マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、種々のインターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γなど）及び幹細胞に対する効果を有する他のサイトカイン、例えば、幹細胞因子（ＳＣＦ）及びエリスロポエチン（Ｅｐｏ）が挙げられる。
【００３３】
本明細書において、「ＲＯＣＫ阻害剤」とは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ：Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ）を阻害する物質を意味し、ＲＯＣＫ  ＩとＲＯＣＫ  ＩＩのいずれを阻害する物質であってもよい。ＲＯＣＫ阻害剤は、上記の機能を有する限り特に限定されず、例えば、Ｎ−（４−ピリジニル）−４β−［（Ｒ）−１−アミノエチル］シクロヘキサン−１α−カルボアミド（本明細書中、Ｙ−２７６３２と称することもある）、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、（２Ｓ）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル］スルホニル］ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−ジアゼピン（Ｈ−１１５２）、４β−［（１Ｒ）−１−アミノエチル］−Ｎ−（４−ピリジル）ベンゼン−１ゼンカルボアミド（Ｗｆ−５３６）、Ｎ−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４ＰＥＲ（Ｒ）−１−アミノエチル］シクロヘキサン−１α−カルボアミド（Ｙ−３０１４１）、Ｎ−（３−｛［２−（４−アミノ−１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）−１−エチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル］オキシ｝フェニル）−４−｛［２−（４−モルホリニル）エチル］−オキシ｝ベンズアミド（ＧＳＫ２６９９６２Ａ）、Ｎ−（６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−６−メチル−２−オキソ−４−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−ピリジン−５−カルボキサミド（ＧＳＫ４２９２８６Ａ）を挙げることができる。ＲＯＣＫ阻害剤はこれらに限定されるものではなく、ＲＯＣＫのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＲＯＣＫに結合する抗体、ドミナントネガティブＲＯＣＫ変異体等もＲＯＣＫ阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
【００３４】
本明細書において、「ＧＳＫ３β阻害剤」とは、ＧＳＫ３β（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β）に対する阻害活性を有する物質である。ＧＳＫ３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３）は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼの一種であり、グリコーゲンの産生やアポトーシス、幹細胞の維持などにかかわる多くのシグナル経路に関与する。ＧＳＫ３にはαとβの２つのアイソフォームが存在する。本発明で用いられる「ＧＳＫ３β阻害剤」は、ＧＳＫ３β阻害活性を有すれば特に限定されず、ＧＳＫ３β阻害活性と合わせてＧＳＫ３α阻害活性を併せ持つ物質であってもよい。
【００３５】
ＧＳＫ３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９８０１４（２−［［２−［（５−ニトロ−６−アミノピリジン−２−イル）アミノ］エチル］アミノ］−４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）ピリミジン）、ＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル）、ＴＤＺＤ−８（４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン）、ＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、ＴＷＳ−１１９（３−［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ］フェノール）、ケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、１−アザケンパウロン（Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、ＳＢ４１５２８６（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）及びＡＲ−ＡＯ１４４−１８、ＣＴ９９０２１、ＣＴ２００２６、ＢＩＯ、ＢＩＯ−アセトキシム、ピリドカルバゾール−シクロペンタジエニルルテニウム複合体、ＯＴＤＺＴ、アルファ−４−ジブロモアセトフェノン、リチウム等が例示される。ＧＳＫ３βはこれらに限定されるものではなく、ＧＳＫ３βのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＧＳＫ３βに結合する抗体、ドミナントネガティブＧＳＫ３β変異体等もＧＳＫ３β阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
【００３６】
本明細書において「血清代替物」とは、例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｗａｋｏ）、Ｂ−２７サプリメント、Ｎ２−サプリメント、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、インスリン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン（例えば、亜セレン酸ナトリウム））、２−メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール又はこれらの混合物（例えば、ＩＴＳ−Ｇ）が挙げられる。血清代替物としては、Ｂ−２７サプリメント、ＫＳＲ、ＳｔｅｍＳｕｒｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、ＩＴＳ−Ｇが好ましい。培地に血清代替物を添加する場合の培地中の濃度は０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜２重量％である。本発明においては、血清に代えて「血清代替物」を使用することが好ましい。
【００３７】
２．Ｋｉ６７陽性細胞の増殖が抑制されたインスリン産生細胞集団又は膵ベータ細胞集団
本発明は、Ｋｉ６７陽性細胞の増殖が抑制されたインスリン産生細胞集団又は膵ベータ細胞集団に関するものであり、これらの細胞集団はアルギン酸を含むゲル中に内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を包埋し、それらを目的の細胞集団へと分化させることにより得ることができる。
【００３８】
本明細書において「Ｋｉ６７陽性細胞」とは、多能性幹細胞から膵β細胞へと分化する過程において、マーカーとしてＫｉ６７の発現によって特徴付けられる細胞を意味し、少なくとも内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団中に共存する細胞である。「Ｋｉ６７」は細胞周期関連核タンパク質として公知であり、増殖中の細胞のＧ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期において発現が認められ、増殖を休止しているＧ０期においては発現が認められないため、細胞増殖と細胞周期のマーカーとして知られている。
【００３９】
多能性幹細胞から膵β細胞へと分化する過程においては、分化段階に応じて異なる特徴を有する細胞が出現することが知られている（ＷＯ２００９／０１２４２８、ＷＯ２０１６／０２１７３４）。例えば、この分化段階は比較的未分化な順に、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、後前腸細胞、膵前駆細胞、内分泌前駆細胞、インスリン産生細胞、膵ベータ細胞に大きく分類することができる。
【００４０】
本明細書において、「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは、種々の異なった形態や機能を持つ組織や細胞に分化でき、３胚葉のどの系統の細胞にも分化し得る能力を意味する。「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）」は、胚盤には分化できず、したがって個体を形成する能力はないという点で、胚盤を含めて、生体のあらゆる組織に分化しうる「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは区別される。
【００４１】
本明細書において「多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは、複数の限定的な数の系統の細胞へと分化できる能力を意味する。例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞はｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔだが、ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔではない。
【００４２】
本明細書において、「多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）」とは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及びこれと同様の分化多能性、すなわち生体の様々な組織（内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て）に分化する能力を潜在的に有する細胞を指す。ＥＳ細胞と同様の分化多能性を有する細胞としては、「人工多能性幹細胞」（本明細書中、「ｉＰＳ細胞」と称することもある）が挙げられる。好ましくは、本発明において、多能性幹細胞とはヒト多能性幹細胞である。
【００４３】
「ＥＳ細胞」としては、マウスＥＳ細胞であれば、ｉｎＧｅｎｉｏｕｓ社、理研等が樹立した各種マウスＥＳ細胞株が利用可能であり、ヒトＥＳ細胞であれば、ＮＩＨ、理研、京都大学、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ社が樹立した各種ヒトＥＳ細胞株が利用可能である。たとえばＥＳ細胞株としては、ＮＩＨのＣＨＢ−１〜ＣＨＢ−１２株、ＲＵＥＳ１株、ＲＵＥＳ２株、ＨＵＥＳ１〜ＨＵＥＳ２８株等、ＷｉｓＣｅｌｌ  ＲｅｓｅａｒｃｈのＨ１株、Ｈ９株、理研のＫｈＥＳ−１株、ＫｈＥＳ−２株、ＫｈＥＳ−３株、ＫｈＥＳ−４株、ＫｈＥＳ−５株、ＳＳＥＳ１株、ＳＳＥＳ２株、ＳＳＥＳ３株等を利用することができる。
【００４４】
「人工多能性幹細胞」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にＯｃｔ３／４・Ｓｏｘ２・Ｋｌｆ４・ｃ−Ｍｙｃの４因子を導入することにより、樹立されたｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，Ｃｅｌｌ，（２００６）１２６：６６３−６７６）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１−８７２．）、上記４因子導入後、Ｎａｎｏｇの発現を指標として選別し、樹立したＮａｎｏｇ−ｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ，Ｋ．，Ｉｃｈｉｓａｋａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ  ４４８，３１３−３１７．）、ｃ−Ｍｙｃを含まない方法で作製されたｉＰＳ細胞（Ｎａｋａｇａｗａ  Ｍ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，１０１−１０６）、ウイルスフリーで６因子を導入して樹立されたｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１１  Ｍａｙ；８（５）：４０９−１２，Ｏｋｉｔａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．３１（３）：４５８−６６．）も用いることができる。また、Ｔｈｏｍｓｏｎらにより作製されたＯＣＴ３／４・ＳＯＸ２・ＮＡＮＯＧ・ＬＩＮ２８の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Ｙｕ  Ｊ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８：１９１７−１９２０．）、Ｄａｌｅｙらにより作製された人工多能性幹細胞（Ｐａｒｋ  ＩＨ，Ｄａｌｅｙ  ＧＱ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４５１：１４１−１４６）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開２００８−３０７００７号）等も用いることができる。
【００４５】
このほか、公開されているすべての論文（例えば、Ｓｈｉ  Ｙ．，Ｄｉｎｇ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，（２００８）Ｖｏｌ３，Ｉｓｓｕｅ  ５，５６８−５７４；、Ｋｉｍ  ＪＢ．，Ｓｃｈｏｌｅｒ  ＨＲ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２００８）４５４，６４６−６５０；Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄ．，Ｍｅｌｔｏｎ，ＤＡ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）  ２６，Ｎｏ  ７，７９５−７９７）、あるいは特許（例えば、特開２００８−３０７００７号、特開２００８−２８３９７２号、ＵＳ２００８／２３３６６１０、ＵＳ２００９／０４７２６３、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８２２０、ＷＯ２００８／１２４１３３、ＷＯ２００８／１５１０５８、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
【００４６】
人工多能性細胞株としては、ＮＩＨ、理化学研究所（理研）、京都大学等が樹立した各種ｉＰＳ細胞株が利用可能である。例えば、ヒトｉＰＳ細胞株であれば、理研のＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１Ａ株、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−２Ａ株、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１２Ａ株、Ｎｉｐｓ−Ｂ２株、京都大学のＦｆ−ＷＪ−１８株、Ｆｆ−Ｉ０１ｓ０１株、Ｆｆ−Ｉ０１ｓ０２株、Ｆｆ−Ｉ０１ｓ０４株、Ｆｆ−Ｉ０１ｓ０６株、Ｆｆ−Ｉ１４ｓ０３株、Ｆｆ−Ｉ１４ｓ０４株、ＱＨＪＩ０１ｓ０１株、ＱＨＪＩ０１ｓ０４株、ＱＨＪＩ１４ｓ０３株、ＱＨＪＩ１４ｓ０４株、２５３Ｇ１株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株、ＣＤＩ社のＭｙＣｅｌｌ  ｉＰＳ  Ｃｅｌｌｓ（２１５２５．１０２．１０Ａ）株、ＭｙＣｅｌｌ  ｉＰＳ  Ｃｅｌｌｓ（２１５２６．１０１．１０Ａ）株、等が挙げられる。
【００４７】
本明細書において「内分泌前駆細胞集団」とは、内分泌前駆細胞により特徴付けられる細胞集団を意味する。
【００４８】
内分泌前駆細胞は、Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ  Ａ、ＮｅｕｒｏＤ及びＮＧＮ−３の少なくとも一つのマーカーの発現、及び膵関連のホルモン系（例えば、インスリン等）のマーカーが発現していないことによって特徴付けられる細胞を意味する。内分泌前駆細胞は、ＰＡＸ−４、ＮＫＸ２−２、Ｉｓｌｅｔ−１、ＰＤＸ−１、ＰＴＦ−１αなどのマーカーが発現していてもよい。
【００４９】
内分泌前駆細胞集団は、内分泌前駆細胞を３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上の割合で含む細胞集団である。内分泌前駆細胞集団には、内分泌前駆細胞に加えて、その他の細胞（例えば、膵前駆細胞、インスリン産生細胞、Ｋｉ６７陽性細胞等）が含まれていてもよい。
細胞集団中の特定の細胞の割合は、フローサイトメトリーのような細胞数を算出可能な公知の手法に基づいて求めることができる。
【００５０】
「それ以降の分化段階にある細胞集団」とは、内分泌前駆細胞よりも膵β細胞へと分化段階が進んだ細胞により特徴付けられる細胞集団を意味する。内分泌前駆細胞よりも膵β細胞へと分化段階が進んだ細胞としては、例えば、インスリン産生細胞が挙げられる。
【００５１】
「インスリン産生細胞」は、インスリンのマーカーの発現によって特徴付けられる細胞を意味する。「インスリン産生細胞」は、ＮＫＸ６．１のマーカーを発現していてもよく、好ましくは、インスリン及びＮＫＸ６．１の両方のマーカーが発現している細胞である。
【００５２】
「それ以降の分化段階にある細胞集団」又は「インスリン産生細胞集団」は、インスリン産生細胞を５％以上、好ましくは１５％以上、より好ましくは３０％以上の割合で含む細胞集団である。当該細胞集団には、インスリン産生細胞に加えて、その他の細胞（例えば、内分泌前駆細胞；グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの少なくとも一つのマーカーを発現する他の膵ホルモン産生細胞；Ｋｉ６７陽性細胞等）が含まれていてもよい。
【００５３】
本明細書において「膵β細胞」は、「インスリン産生細胞」より成熟した細胞を意味しており、具体的には、膵β細胞の成熟マーカーであるＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＩＡＰＰの少なくとも一つのマーカーを発現する、あるいはグルコース刺激によるインスリン分泌上昇反応によって特徴付けられる細胞を意味する。
【００５４】
「膵β細胞集団」は、内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団が生体内で分化・成熟することによって得ることができる、膵β細胞を含む細胞集団である。当該細胞集団には、膵β細胞に加えて、その他の細胞（例えば、インスリン産生細胞、Ｋｉ６７陽性細胞等）が含まれていてもよい。
【００５５】
本発明において、アルギン酸を含むゲル中に包埋される細胞（スターティングマテリアルの細胞）におけるＫｉ６７陽性細胞の割合は特に限定されないが、８０％〜０．１％、７０％〜１％、６０％〜２％、５０％〜３％、４０％〜４％、３０％〜５％であってもよい。
【００５６】
本発明において、アルギン酸を含むゲル中に包埋される細胞（スターティングマテリアルの細胞）におけるＭＡＦＡ遺伝子又はそのタンパク質の発現量は特に限定されないが、膵島におけるＭＡＦＡ遺伝子又はそのタンパク質の発現量の約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下であってもよい。
【００５７】
本発明において、アルギン酸を含むゲル中に包埋される細胞（スターティングマテリアルの細胞）におけるグルカゴン陽性かつインスリン陰性細胞の割合は特に限定されないが、約２．５％以下、約２％以下、約１％以下、約０．５％以下であってもよい。
【００５８】
本発明において、アルギン酸を含むゲル中に包埋される細胞（スターティングマテリアルの細胞）におけるＣｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ  Ａ陽性細胞の割合は特に限定されないが、約５０％以上（例えば、約５５％以上）、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上であってもよい。
【００５９】
本発明において、アルギン酸を含むゲル中に包埋される細胞（スターティングマテリアルの細胞）におけるアルカリフォスファターゼ陽性細胞の割合は特に限定されないが、１％以下、０．５％以下、０．０１％以下、０．００８％以下、０．００５％以下、０．００１％以下であってもよい。
【００６０】
本発明において、アルギン酸を含むゲル中に包埋される細胞（スターティングマテリアルの細胞）におけるＫｉ６７陽性細胞の割合は約５０％以下、もしくは約３０％以下であり、ＭＡＦＡ遺伝子又はそのタンパク質の発現量は膵島におけるＭＡＦＡ遺伝子又はそのタンパク質の発現量の約２０％以下、もしくは約１０％以下であり、グルカゴン陽性かつインスリン陰性細胞の割合が約２．５％以下、もしくは約１％以下であり、Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ  Ａ陽性細胞の割合が約５０％以上であり、かつアルカリフォスファターゼ陽性細胞の割合が１％以下であってもよい。
【００６１】
内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団は、多能性幹細胞を膵β細胞へと分化誘導する公知の手法を用いて得ることができる。すなわち、以下の分化誘導工程を利用して各目的の細胞集団を得ることができる：
工程１）多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞へと分化誘導する；
工程２）胚体内胚葉細胞から原腸管細胞へと分化誘導する；
工程３）原腸管細胞から後前腸細胞へと分化誘導する；
工程４）後前腸細胞から膵前駆細胞へと分化誘導する；
工程５）膵前駆細胞から内分泌前駆細胞へと分化誘導する；
工程６）内分泌前駆細胞からインスリン産生細胞へと分化誘導する。
以下、各工程を説明するが、各細胞への分化誘導はこれらの手法に限定されない。
【００６２】
工程１）胚体内胚葉細胞への分化
多能性幹細胞は、まず胚体内胚葉細胞に分化させる。多能性幹細胞から胚体内胚葉を誘導する方法は既に公知であり、そのいずれの方法を用いてもよい。好ましくは、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地、より好ましくはアクチビンＡ、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養して、胚体内胚葉細胞に分化させる。培養開始時の細胞数としては、特に限定されず、２２０００〜１５００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、好ましくは２２０００〜１０００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、より好ましくは２２０００〜８００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２である。培養期間は１日〜４日、好ましくは１日〜３日、特に好ましくは３日である。
【００６３】
培養温度は、特に限定されないが、３０〜４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
【００６４】
本工程で用いる培地としては、ＲＰＭＩ  １６４０培地、ＭＥＭ培地、ｉＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地など、哺乳類細胞の培養に使用される基本培地を使用することができる。
【００６５】
アクチビンＡの培地中の濃度は、通常３０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜１５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０〜１２０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
別の態様として、アクチビンＡの培地中の濃度は、約０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１〜５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約３〜１０ｎｇ／ｍｌである。
【００６６】
ＧＳＫ３β阻害剤の培地中の濃度は、用いるＧＳＫ３β阻害剤の種類によって適宜設定され、例えばＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合の濃度は、通常１〜１０μＭ、好ましくは２〜５μＭ、より好ましくは２〜４μＭ、特に好ましくは約３μＭである。
【００６７】
ＲＯＣＫ阻害剤の培地中の濃度は、用いるＲＯＣＫ阻害剤の種類によって適宜設定されるが、例えばＲＯＣＫ阻害剤としてＹ２７６３２を使用する場合の濃度は、通常５〜２０μＭ、好ましくは５〜１５μＭ、特に好ましくは約１０μＭである。
【００６８】
具体的には、アクチビンＡ、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で１日培養した後、アクチビンＡのみを含む培地で１日毎に培地を交換しながらさらに２日培養する。
【００６９】
工程２）原腸管細胞への分化
工程１）で得られた胚体内胚葉細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養して原腸管細胞に分化誘導する。培養期間は２日〜８日、好ましくは約４日である。
【００７０】
培養温度は、特に限定されないが、３０〜４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
【００７１】
培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
【００７２】
増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ１０が好ましく、ＥＧＦ及び／又はＫＧＦがより好ましく、ＫＧＦがさらに好ましい。
【００７３】
増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ〜１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ〜１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５〜２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜３２０ｎＭ）、好ましくは約５〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約１．６〜１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５〜２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．３〜１１６ｎＭ）、好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）、より好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦを使用する場合の濃度は、通常５〜１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０〜１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
【００７４】
工程３）後前腸細胞への分化
工程２）で得られた原腸管細胞を、さらに増殖因子、シクロパミン、ノギン等を含む培地で培養し、後前腸細胞に分化誘導する。培養期間は１日〜５日、好ましくは約２日程度である。
【００７５】
培養温度は、特に限定されないが、３０〜４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
【００７６】
培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
【００７７】
増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ１０が好ましく、ＥＧＦ及び／又はＫＧＦがより好ましく、ＫＧＦがさらに好ましい。
【００７８】
増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ〜１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ〜１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５〜２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜３２０ｎＭ）、好ましくは約５〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約１．６〜１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５〜２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．３〜１１６ｎＭ）、好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）、より好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦを使用する場合の濃度は、通常５〜１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０〜１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
【００７９】
シクロパミンの培地中の濃度は、特に限定するものではないが、通常０．５〜１．５μＭ、好ましくは０．３〜１．０μＭ、特に好ましくは約０．５μＭである。
【００８０】
ノギンの培地中の濃度は、特に限定するものではないが、通常１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜１５０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【００８１】
工程４）膵前駆細胞への分化
工程３）で得られた後前腸細胞を、さらにＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子を含む培地、好ましくはＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子と増殖因子を含む培地で培養し、膵前駆細胞に分化誘導する。培養期間は２日〜１０日、好ましくは約５日程度である。
【００８２】
工程３）で得られた後前腸細胞を、既報（Ｔｏｙｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）１４，１８５−１９７）に従い、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで処理後にピペッティングすることにより分散し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを遠心分離して懸濁した後、工程４の新しい培地に再播種する。
【００８３】
培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
【００８４】
ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子としては、前述した各種化合物又はその塩を用いることができ、用いる化合物又はその塩に応じて、培地への添加量は適宜決定されるが、通常約０．００００１μＭ−５μＭ、好ましくは０．００００１μＭ−１μＭである。ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子の培地中の濃度としては、ＣＤＫ８／１９に対して５０％以上の阻害活性に達する濃度が好ましい。
【００８５】
増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ１０が好ましく、ＫＧＦ及び／又はＥＧＦがより好ましく、ＫＧＦ及びＥＧＦがさらに好ましい。
【００８６】
増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ〜１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ〜１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５〜２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜３２０ｎＭ）、好ましくは約５〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約１．６〜１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５〜２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．３〜１１６ｎＭ）、好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）、より好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦ及びＥＧＦを使用する場合の濃度は、ＫＧＦは通常通常５〜１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０〜１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬ、ＥＧＦは通常１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜１５０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【００８７】
工程４）における培養の最初の１日はＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行い、以後はＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地で培養してもよい。
【００８８】
いずれの工程においても、培地には、上記した成分のほか、血清代替物（例えば、Ｂ−２７サプリメント、ＩＴＳ−Ｇ）を添加してもよい。また、必要に応じて、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（製品名）、非必須アミノ酸、ビタミン、抗生物質（例えば、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（本明細書中、ＡＡと称することがある）、ペニシリン、ストレプトマイシン、又はこれらの混合物）、抗菌剤（例えば、アンホテリシンＢ）、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を添加してもよい。培地に抗生物質を添加する場合には、その培地中の濃度は通常０．０１〜２０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％である。
【００８９】
また細胞培養は、フィーダー細胞を使用せず、接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、ＯｐｔｉＣｅｌｌ（製品名）（Ｎｕｎｃ社）等の細胞培養シートなどの培養容器が使用される。培養容器は、細胞との接着性（親水性）を向上させるための表面処理や、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル（例：ＢＤマトリゲル（日本ベクトン・デッキンソン社））、ビトロネクチンなどの細胞接着用基質でコーティングされていることが好ましい。培養容器としては、Ｔｙｐｅ  Ｉ−ｃｏｌｌａｇｅｎ、マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチン又はポリ−Ｄ−リジンなどでコートされた培養容器が好ましく、マトリゲル又はポリ−Ｄ−リジンでコートされた培養容器がより好ましい。
【００９０】
培養温度は、特に限定されないが、３０〜４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
【００９１】
工程４）で得られた膵前駆細胞は公知の表面マーカーである糖タンパク質２（ＧＰ２）などを利用して、さらに純化することができる。上記純化は自体公知の方法、例えば、抗ＧＰ２抗体を固定化したビーズを用いて行うことができる。
【００９２】
工程５）内分泌前駆細胞への分化
工程４）で得られた膵前駆細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養して内分泌前駆細胞に分化誘導する。培養期間は２日〜３日、好ましくは約２日である。
培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、既報（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１４；３２：１１２１−１１３３）に従い、ＳＡＮＴ１、レチノイン酸、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮを添加し、さらに、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
また細胞培養は、フィーダー細胞を使用せず、非接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、多孔プレート（Ｎｕｎｃ社）等あるいはバイオリアクターが使用される。培養容器は、細胞との接着性を低下させるための表面処理されていることが好ましい。
培養温度は、特に限定されないが、３０〜４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
【００９３】
工程６）インスリン産生細胞への分化
工程５）で得られた内分泌前駆細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養してインスリン産生細胞に分化誘導する。培養期間は７日〜１５日、好ましくは約７〜１０日である。
増殖因子としては、論文  （Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１４；３２：１１２１−１１３３）  に記載の因子を用いており、加えて、γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害薬、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ２を添加することもある。
培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、既報（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１４；３２：１１２１−１１３３）に従い、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＸＸを添加し、さらに、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
また細胞培養は、フィーダー細胞を使用せず、非接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、多孔プレート（Ｎｕｎｃ社）等あるいはバイオリアクターが使用される。培養容器は、細胞との接着性を低下させるための表面処理されていることが好ましい。
培養温度は、特に限定されないが、３０〜４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
【００９４】
本発明において「アルギン酸を含むゲル」は、公知の手法（ＷＯ２０１０／０３２２４２、ＷＯ２０１１／１５４９４１）に準じて作製することができ、アルギン酸塩、アルギン酸エステル又はアルギン酸修飾物の溶液に架橋剤を添加してゲル化させることにより得ることができる。
【００９５】
アルギン酸塩は水溶性の塩であればよく、金属塩、アンモニウム塩等を利用することができる。例えば、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸アンモニウム等を好適に用いることができる。
【００９６】
アルギン酸エステル（アルギン酸プロピレングリコールとも称される）はアルギン酸のカルボキシル基にプロピレングルコールがエステル結合した誘導体である。アルギン酸修飾物は、例えば、細胞接着活性配列（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）で修飾されたＲＧＤ修飾アルギン酸である。
【００９７】
アルギン酸塩に含まれるマンヌロン酸とグルロン酸の割合（Ｍ／Ｇ比）（本明細書中、当該割合のことを「グレード」と呼ぶ場合がある）は任意であり、一般的に、Ｍ＞Ｇである場合には柔軟性に富んだゲルを形成することができ、Ｍ＜Ｇである場合には強固なゲルを形成することができる。本発明においては、グルロン酸を１０〜９０％、２０〜８０％、３０〜７０％、又は、４０〜６０％の割合で含むものを利用することができる。
【００９８】
アルギン酸塩、アルギン酸エステル又はアルギン酸修飾物は溶媒中に、０．０５〜１０重量％、好ましくは、０．１〜５重量％、より好ましくは０．５〜３重量％の量で含めることができる。溶媒はアルギン酸塩、アルギン酸エステル又はアルギン酸修飾物を溶解可能なものであればよく、水、生理食塩水等を利用することができる。
【００９９】
架橋剤はアルギン酸塩、アルギン酸エステル又はアルギン酸修飾物の溶液をゲル化できるものであればよく、特に限定されないが、多価の金属カチオンを利用することができる。多価の金属カチオンとしては、２価の金属カチオンが好ましく、より好ましくは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンである。架橋剤は塩の形態で利用することができ、本発明においては、塩化カルシウム、塩化ストロンチウム、塩化バリウムから選択される少なくとも一つを架橋剤として利用することができる。Ｈｙｓｔｅｍの架橋にはポリエチレングリコ−ルジアクリレ−トを使用してもよい。
【０１００】
アルギン酸を含むゲルにはナノファイバーを含めることができる。ナノファイバーは、ナノメートル領域の直径を有する天然又は合成ファイバーである。天然ナノファイバーとしては、コラーゲン、セルロース、シルクフィブロイン、ケラチン、ゼラチン、キトサンなどの多糖類の一又は複数を含むものが挙げられる。合成ナノファイバーとしては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ヒドロキシバリレート）（ＰＨＢＶ）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセテート）（ＰＥＶＡ）などが挙げられる。ナノファイバーはアルギン酸を含むゲル中に１重量％未満、例えば、０．９重量％、０．８重量％、０．７重量％、０．６重量％、０．５重量％、又はそれ未満の量にて含めることができる。アルギン酸を含むゲル中に含めるナノファイバーの量の下限は特に限定されないが、０．０５重量％以上、好ましくは０．１重量％以上とすることができる。
【０１０１】
本発明において「包埋」とは、アルギン酸を含むゲル中に内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を、散在させ収容することを意味する。
【０１０２】
アルギン酸を含むゲルへの細胞集団の包埋は、アルギン酸塩、アルギン酸エステル又はアルギン酸修飾物の溶液中に細胞集団を混合し、ゲル化させることにより行うことができる。
【０１０３】
細胞集団はアルギン酸塩、アルギン酸エステル又はアルギン酸修飾物の溶液中に１×１０４細胞〜１×１０９細胞／ｍＬ、好ましくは１×１０７細胞〜１×１０８細胞／ｍＬから選択される量にて含めることができる。
【０１０４】
細胞集団を含むアルギン酸塩、アルギン酸エステル又はアルギン酸修飾物の溶液のゲル化は、当該溶液に架橋剤を添加して行うことができる。添加する架橋剤の量は、当該溶液に対し０．１〜５重量％、例えば、０．１〜１重量％、から選択される量とすることができる。ゲル化は、細胞培養や細胞移植に用いられる所定の構成及び／又は形状を有する容器内にて、あるいは当該容器に適合するゲルが得られるように設計された鋳型内で行うことができる。
【０１０５】
あるいは、公知の手法（ＷＯ２０１０／０１０９０２）に準じてアルギン酸を含むゲルカプセルを形成することにより行われてもよい。すなわち、架橋剤の溶液に対し、細胞集団を含むアルギン酸塩、アルギン酸エステル又はアルギン酸修飾物の溶液を滴下して行ってもよい。滴下する際のノズルの形状や滴下方法に応じて、液滴のサイズを調整することができ、ひいてはアルギン酸を含むゲルカプセルの大きさを規定することができる。滴下方法は特に限定されないが、エアスプレー法、エアレススプレー方式、静電スプレー法等の手法により行うことができる。アルギン酸を含むゲルカプセルの大きさは特に限定されないが、直径が５ｍｍ以下、１ｍｍ以下、５００μｍ以下とすることができる。架橋剤溶液には、０．１〜１０重量％、例えば、０．１〜５重量％、から選択される量の架橋剤を含めることができる。アルギン酸を含むゲルカプセルは、０．１μｍ〜５０μｍのポアを有するメンブレンで周囲を覆われていてもよい。
【０１０６】
アルギン酸を含むゲル中に包埋された細胞集団は、目的の細胞集団へと分化させる工程に付すことができる。分化させる工程は、当該細胞集団を上述の培養方法に供することによって行ってもよいし、あるいは、動物生体内に移植することによって行ってもよい。特に、膵β細胞集団へと分化させる工程は、アルギン酸を含むゲル中に包埋された内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を動物生体内に移植することによって行うことができる。
【０１０７】
「動物」は哺乳動物が好ましく、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、モルモット等が挙げられるが、好ましくはヒトである。
【０１０８】
移植は、アルギン酸を含むゲル中に包埋された細胞集団を一定の位置で固定できる生体内領域に行うことが好ましく、例えば、動物の皮下、腹腔内、腹膜上皮、大網、脂肪組織、筋肉組織や膵臓、腎臓等の各臓器の被膜下などに行うことできる。アルギン酸を含むゲル中に包埋された細胞集団をカプセル、バッグ、チャンバーなどのデバイスに封入して生体内に移植することもできる。移植される細胞数は、移植される細胞の分化段階や、移植対象における疾患の重篤度、年齢、体重、移植部位の大きさ等の要因により変化し得、特に限定されないが、例えば、１０×１０４細胞〜１０×１０１１個程度とすることができる。移植された細胞集団は、生体内環境において分化誘導され、目的の細胞集団、好ましくは膵β細胞集団へと分化することができ、その後、回収されてもよいし、そのまま生体内に留置してもよい。
【０１０９】
内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を、アルギン酸を含むゲル中に包埋して分化させることにより、当該細胞集団においてＫｉ６７陽性細胞の増殖を抑制することができる。
本手法は、テラトーマの増殖を抑制するのでなく、膵系譜に含まれる増殖性細胞の残存数を減少又は抑制することができる。
本手法は、ｉＰＳ細胞の増殖を抑制するのでなく、膵系譜に含まれる増殖性細胞の残存数を減少又は抑制することができる。
【０１１０】
本手法によれば、アルギン酸を含むゲル中に包埋せずに分化させた場合と比べて、分化誘導後に得られた細胞集団中におけるＫｉ６７陽性細胞の絶対数を低減することが可能である。これにより、分化誘導後に得られた細胞集団中におけるＫｉ６７陽性細胞を枯渇させることができる。すなわち、分化誘導後に得られた細胞集団中におけるＫｉ６７陽性細胞の割合を、アルギン酸を含むゲル中に包埋せずに分化させた場合と比べて低減することが可能であり、その割合は１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満とすることができ、好ましくは３％未満、２％未満、又は１％未満とすることができる。
【０１１１】
一方、本手法においては、内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞の増殖及び／又は分化への影響はないか、又は小さく、分化誘導後に得られた細胞集団中における、目的のインスリン産生細胞又は膵ベータ細胞の絶対数は、アルギン酸を含むゲル中に包埋せずに分化させた場合と比べて、有意な差は生じない。これにより、分化誘導後に得られた細胞集団中における、目的のインスリン産生細胞又は膵ベータ細胞を富化することができる。すなわち、分化誘導後に得られた細胞集団中の目的のインスリン産生細胞又は膵ベータ細胞の割合を、アルギン酸を含むゲル中に包埋せずに分化させた場合と比べて増大させることが可能であり、その割合は４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上とすることができる。
【０１１２】
本手法により得られたインスリン産生細胞又は膵ベータ細胞は動物生体内に移植して、動物生体内で分化させた場合にはそのまま留置して、インスリン分泌細胞として利用することが可能である。
【０１１３】
本手法により得られたインスリン産生細胞、膵ベータ細胞、又は本発明のアルギン酸を含むゲル中に包埋された細胞集団は動物生体内に移植して、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、低血糖抑制剤などの医薬として利用することが可能である。
【０１１４】
また、アルギン酸を含むゲル中に包埋され移植された細胞集団は、宿主における免疫系の干渉を回避又は低減することができ、宿主生体内における当該細胞集団の分化、増殖、及び／又は維持を達成することができる。
【０１１５】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１１６】
実施例Ｉ：内分泌前駆細胞のアルギン酸を含むゲルに包埋した移植による、移植片中の目的外細胞（Ｋｉ６７陽性細胞）の減少／増殖抑制（Ｉ）
１．方法
（１）内分泌前駆細胞のアルギン酸を含むゲルへの包埋
ヒトｉＰＳ細胞から内分泌前駆細胞を分化誘導して作製した内分泌前駆細胞を、３重量％のアルギン酸（ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＧ１００）溶液と混合し、その細胞分散液を内径１ｃｍ２、厚さ約５００μｍの円形のモールドに充填し、ストロンチウムを用いて架橋し、細胞が分散して包埋されるアルギン酸を含むゲルシートを作製した。【０１１７】
（２）内分泌前駆細胞の生体内移植
免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを用いて、既知の方法で移植部位にｂＦＧＦを処置し血管新生を誘導した後、上記（１）で得られた内分泌前駆細胞包埋ゲルシートを背部皮下に移植した。比較例として、アルギン酸を含むゲルに包埋していない膵内分泌前細胞を腎被膜下に移植した。移植後６９日の時点、及び移植後６ヶ月の時点で移植片をそれぞれ摘出した。【０１１８】
（３）移植片中の目的外細胞の評価
移植後６９日の時点で摘出した移植片を固定、脱水後に凍結切片を作製し、目的外細胞について評価するために免疫組織染色を実施した。インスリン分泌細胞への成熟が期待できる目的細胞はＣｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ  Ａ（ＣＨＧＡ）陽性／ＮＫＸ６．１陽性を、目的細胞の長期生着に悪影響を及ぼす可能性がある目的外細胞はＰＤＸ１弱陽性又は陰性／Ｋｉ６７陽性を指標として評価した。
また、移植後６ヶ月の時点で摘出した移植片は、１００ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液によりアルギン酸を脱架橋することで細胞を回収した。回収した細胞は、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ処理により分散させた後に固定し、フローサイトメトリーに付した。目的外細胞はＫｉ６７陽性／インスリン陰性を指標として、目的細胞はインスリン陽性／ＮＫＸ６．１陽性およびグルカゴン陽性／インスリン陰性を指標として、それぞれ評価した。なお、本明細書中、「Ｋｉ６７陽性／インスリン陰性」、「インスリン陽性／ＮＫＸ６．１陽性」、「グルカゴン陽性／インスリン陰性」などの表記において用いられる「／」とは「及び」を意味する。【０１１９】
２．結果
移植後６９日の時点で摘出した移植片の免疫組織染色の結果を図１に示す。内分泌前駆細胞をアルギン酸を含むゲルに包埋して皮下に移植した場合、ゲルに包埋しないで腎被膜下に移植した場合に比較して、移植片に含まれるＫｉ６７陽性細胞数は１／１０程度であることが確認された。この結果より、アルギン酸を含むゲルに包埋して移植することにより、Ｋｉ６７陽性細胞が減少する、もしくはその増殖が抑制されることが示された。
移植後６ヶ月の時点で摘出した移植片より回収された細胞のフローサイトメトリー分析の結果を図２に示す。内分泌前駆細胞をアルギン酸を含むゲルに包埋して皮下に移植することにより、目的細胞であるインスリン陽性／ＮＫＸ６．１陽性細胞へと分化が生じると共に（図２（Ａ）、移植前１．０％（ｎ＝１）、移植後１０．８±３．６％（ｎ＝４））、目的外細胞であるＫｉ６７陽性／インスリン陰性細胞が劇的に減少することが確認された（図２（Ｂ）、移植前３３．０％（ｎ＝１）、移植後１．２±０．３％（ｎ＝４））。【０１２０】
実施例ＩＩ：増殖性細胞を含むインスリン産生細胞をアルギン酸を含むゲルに包埋して移植した後の目的外増殖性細胞の減少
１．方法
（１）インスリン産生細胞のアルギン酸を含むゲルへの包埋
ヒトｉＰＳ細胞からインスリン産生細胞を分化誘導して作製したインスリン産生細胞を、３重量％のアルギン酸（ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＧ１００）溶液と混合し、その細胞分散液を内径１ｃｍ２、厚さ約５００μｍの円形のモールドに充填し、ストロンチウムを用いて架橋し、細胞が分散して包埋されるアルギン酸を含むゲルシートを作製した。【０１２１】
（２）インスリン産生細胞の生体内移植
免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを用いて、上記（１）で得られたインスリン産生細胞包埋ゲルシートを背部皮下に移植した。移植後６ヶ月の時点で移植片をそれぞれ摘出した。【０１２２】
（３）移植片中の目的外細胞の評価
移植後６ヶ月の時点で摘出した移植片は、１００ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液によりアルギン酸を脱架橋することで細胞を回収した。回収した細胞は、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ処理により分散させた後に固定し、フローサイトメトリーに付した。目的外の増殖性細胞はＫｉ６７陽性／インスリン陰性を指標として、目的細胞はインスリン陽性／ＮＫＸ６．１陽性およびグルカゴン陽性／インスリン陰性を指標として、それぞれ評価した。【０１２３】
２．結果
移植後６ヶ月の時点で摘出した移植片は、移植前と変わらぬ外観を維持していた。摘出した移植片より回収された細胞のフローサイトメトリー分析の結果を表１に示す。増殖性細胞を含むインスリン産生細胞をアルギン酸を含むゲルに包埋して皮下に移植することにより、移植前に含まれていた目的外の増殖性細胞が顕著に減少することが確認された。同時にグルカゴン陽性／インスリン陰性細胞率の上昇が確認され、膵島様細胞へと分化したことが確認された。【０１２４】
【表１】
2019182157.tif 000002
【０１２５】
実施例ＩＩＩ：インスリン産生細胞のアルギン酸を含むゲルへの包埋による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養における目的外細胞（Ｋｉ６７陽性細胞）の減少（Ｉ）
１．方法
（１）インスリン産生細胞のアルギン酸を含むゲルへの包埋
ヒトｉＰＳ細胞からインスリン産生細胞を分化誘導して作製したインスリン産生細胞を、表２で示された処方の通り、濃度（０．５−３重量％）及びグレード（ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＧ１００（Ｇ／Ｍ比：≧１．５），ＮＯＶＡＴＡＣＨ  ＭＶＧ  ＧＲＧＤＳＰ（Ｇ／Ｍ比：≧１．５），ＰＲＯＮＯＶＡ  ＵＰ  ＶＬＶＭ（Ｇ／Ｍ比：≦１））の異なるアルギン酸溶液と混合し、その細胞分散液を内径１ｃｍ２、厚さ約５００μｍの円形のモールドに充填し、ストロンチウム水溶液あるいはカルシウム水溶液を用いて架橋し、細胞が分散して包埋されるアルギン酸を含むゲルシートを作製した。弾性（Ｐａ）はレオメーター（粘弾性測定装置）で測定した。【０１２６】
【表２】
2019182157.tif 000003
【０１２７】
（２）インスリン産生細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養
ハイドロゲルに包埋したインスリン産生細胞、及び非包埋のインスリン産生細胞（比較例）を、インスリン産生細胞を分化するための増殖因子を含む培地中で培養し、培養７日後に回収した。【０１２８】
（３）目的外細胞の評価
アルギン酸を含むゲルに包埋した内分泌前駆細胞は、１００ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液によりアルギン酸を脱架橋することでゲル中より回収した。回収した内分泌前駆細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ処理による分散後に固定し、フローサイトメトリーを用いて、Ｋｉ６７陽性細胞数を評価し、培養前後におけるその変化率を比較した。【０１２９】
２．結果
表３に、培養前後におけるＫｉ６７陽性細胞数の変化率を示す。
比較例の変化率は約２０％増加したのに対し、実施例ではほとんど変化が見られなかった。【０１３０】
【表３】
2019182157.tif 000004
【０１３１】
実施例ＩＶ：インスリン産生細胞のアルギン酸を含むゲルへの包埋による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養における目的外細胞（Ｋｉ６７陽性細胞）の減少（ＩＩ）
１．方法
（１）インスリン産生細胞のアルギン酸を含むゲルへの包埋
ヒトｉＰＳ細胞からインスリン産生細胞を分化誘導して作製したインスリン産生細胞を、ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＧ１００（Ｇ／Ｍ比：≧１．５）のアルギン酸溶液と、表４に指定された細胞密度で混合し、その細胞分散液を内径１ｃｍ２、厚さ約５００μｍの円形のモールドに充填し、ストロンチウム水溶液を用いて架橋し、細胞が分散して包埋されるアルギン酸を含むゲルシートを作製した。
（２）インスリン産生細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養
ハイドロゲルに包埋したインスリン産生細胞、及び非包埋のインスリン産生細胞（比較例）を、インスリン産生細胞を分化するための増殖因子を含む培地中で表４に指定された酸素条件で培養し、培養６日後に回収した。【０１３２】
【表４】
2019182157.tif 000005
【０１３３】
（３）目的外細胞の評価
アルギン酸を含むゲルに包埋した内分泌前駆細胞は、１００ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液によりアルギン酸を脱架橋することでゲル中より回収した。回収した内分泌前駆細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ処理による分散後に固定し、フローサイトメトリーを用いて、Ｋｉ６７陽性細胞数を評価し、培養前後におけるその変化率を比較した。【０１３４】
２．結果
表５に、培養前後におけるＫｉ６７陽性細胞数の変化率を示す。
比較例の変化率は約５％増加したのに対し、実施例では全て減少した。【０１３５】
【表５】
2019182157.tif 000006
【０１３６】
実施例Ｖ：インスリン産生細胞のアルギン酸および細胞外マトリックスを含むゲルへの包埋による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養における目的外細胞（Ｋｉ６７陽性細胞）の減少
１．方法
（１）インスリン産生細胞のアルギン酸および細胞外マトリックスを含むゲルへの包埋
ヒトｉＰＳ細胞からインスリン産生細胞を分化誘導して作製したインスリン産生細胞を、表６に指定された処方のとおり、グレード（ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＧ１００（Ｇ／Ｍ比：≧１．５）、ＮＯＶＡＴＡＣＨ  ＭＶＧ  ＧＲＧＤＳＰ（Ｇ／Ｍ比：≧１．５）、ＮＯＶＡＴＡＣＨ  Ｍ  ＲＥＤＶ（Ｇ／Ｍ比：≦１）、ＮＯＶＡＴＡＣＨ  Ｇ  ＶＡＰＧ（Ｇ／Ｍ比：≧１．５））の異なるアルギン酸溶液、ならびにＨｙｓｔｅｍ、Ｈｙｓｔｅｍ−Ｃ、Ｈｙｓｔｅｍ−ＨＰまたはＧｅｌａｔｉｎと混合し、その細胞分散液を内径１ｃｍ２、厚さ約５００μｍの円形のモールドに充填し、ストロンチウム水溶液、または加えてさらにポリエチレングリコールジアクリレート水溶液を用いて架橋し、細胞が分散して包埋されるアルギン酸および細胞外マトリックス含むゲルシートを作製した。【０１３７】
【表６】
2019182157.tif 000007
【０１３８】
（２）インスリン産生細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養
ハイドロゲルに包埋したインスリン産生細胞、及び非包埋のインスリン産生細胞（比較例）を、インスリン産生細胞を分化するための増殖因子を含む培地中で培養し、培養７日後に回収した。【０１３９】
（３）目的外細胞の評価
アルギン酸および細胞外マトリックス含むゲルに包埋したインスリン産生細胞は、１００ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液によりアルギン酸を脱架橋することでゲル中より回収した。回収したインスリン産生細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ処理による分散後に固定し、フローサイトメトリーを用いて、Ｋｉ６７陽性細胞数を評価し、培養前後におけるその変化率を比較した。【０１４０】
２．結果
表７に、培養前後におけるＫｉ６７陽性細胞数の変化率を示す。
比較例の変化率は約５．２％増加したのに対し、実施例ではほとんど変化が見られない、あるいは減少した。細胞の足場となり得る細胞外マトリックスをゲルに添加した場合においても、Ｋｉ６７陽性細胞の増殖を抑制できることが確認された。【０１４１】
【表７】
2019182157.tif 000008
【０１４２】
実施例ＶＩ：ナノファイバーを含むアルギン酸カプセルにおけるｉＰＳ細胞増殖性の評価
ヒトｉＰＳ細胞を、１重量％のナノファイバー（「ＢｉＮＦｉ−ｓ（ビンフィス）」（ｓｕｇｉｎｏ）；グレードＡＦｏ−１００，平均繊維径１０−５０ｎｍ）及び３重量％のアルギン酸（ＰＲＯＮＯＶＡ  ＳＬＧ１００）を添加した溶液と混合し、得られた混合液を塩化バリウム溶液に滴下して、ｉＰＳ細胞を包埋したナノファイバーを含むアルギン酸ゲルカプセルを作製した。
得られたゲルカプセルを培地に加え、包埋されたｉＰＳ細胞の増殖性を確認したところ、ナノファイバーを含まないアルギン酸カプセルと比べて、増殖による細胞漏出を抑制し安定した細胞塊を形成することが確認された。
【図１】
2019182157.tif 000009
【図２】
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【国際調査報告】
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