(57)【要約】  ロイシンリッチα２グリコプロテインを含有する、保存安定性の高いロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物を提供することを課題とする。  ロイシンリッチα２グリコプロテインを含む、ｐＨが７．０〜９．３であるロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物により、前記課題を解決することができる。
2020075692.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイシンリッチα２グリコプロテインを含む、ｐＨが７．０〜９．３であるロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物。
【請求項２】
ロイシンリッチα２グリコプロテインを測定するための校正用試料溶液である、請求項１記載のロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物。
【請求項３】
保存容器に充填されている、請求項１又は２記載のロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物。
【請求項４】
ｐＨが７．８〜９．０である、請求項１〜３のいずれかに記載のロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物。
【請求項５】
塩濃度が、２００ｍＭ〜８００ｍＭである、請求項１〜４のいずれかに記載のロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物。
【請求項６】
前記塩が、金属塩である、請求項５に記載のロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物を使用する、ロイシンリッチα２グリコプロテイン測定方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載のロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物を含む、ロイシンリッチα２グリコプロテイン測定キット。
【請求項９】
ｐＨが７．０〜９．３である溶媒にロイシンリッチα２グリコプロテインを接触させる工程を含む、ロイシンリッチα２グリコプロテインの保存安定化方法。
【請求項１０】
前記溶媒のｐＨが７．８〜９．０である、請求項９に記載のロイシンリッチα２グリコプロテインの保存安定化方法。
【請求項１１】
前記溶媒の塩濃度が、２００ｍＭ〜８００ｍＭである、請求項９又は１０に記載のロイシンリッチα２グリコプロテインの保存安定化方法。
【請求項１２】
前記塩が、金属塩である、請求項９〜１１のいずれかに記載のロイシンリッチα２グリコプロテインの保存安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物に関する。より詳細には、本発明は、ロイシンリッチα２グリコプロテインを長期間、安定に保存することが可能な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロイシンリッチα２グリコプロテイン（以下、ＬＲＧと称することがある）は、血清タンパク質のひとつである。ＬＲＧは、約５０ｋＤａの糖タンパク質であり、好中球から分泌されることが報告されている（非特許文献１）。
近年では、特定の疾患と生体試料中のＬＲＧとの関連性についての研究が行われている。例えば、特許文献１は、生体試料中のＬＲＧを検出することが、ベーチェット病などの自己免疫疾患の検査に有用であることを報告している。【０００３】
生体試料中の測定対象成分定量を行うには、校正用試料を用いる必要がある。校正用試料は、内部標準又は濃度較正用基準（キャリブレータ）等の用途で用いられる、測定対象成分を含む試料である。正確な定量値を得るためには、時間経過や温度に対して安定した校正用試料が求められる。すなわち、校正用試料中の測定対象成分が保存中に分解及び／又は変性してしまえば、測定値もその影響を受けることが考えられる。ＬＲＧの定量においては、これまでに、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）などを用いた方法が知られているが、校正用試料についての検討はなされていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−２８６２７９
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．２００２ ７２（３）：４７８−８５．２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、ＬＲＧを含む校正用試料溶液を作製しようと試みた。すると、ｐＨ７未満の溶液にＬＲＧを添加した場合、ＬＲＧの安定性が悪く、時間と共にＬＲＧが徐々に分解され失われていくことが分かった。
本発明の目的は、ロイシンリッチα２グリコプロテインを含有する、保存安定性の高いロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らが更に検討を加えた結果、ＬＲＧを含む溶液のｐＨを特定の範囲に調整すると、ＬＲＧの安定性が向上することを見出した。また、溶液を特定の塩濃度の範囲内にすると、ＬＲＧの安定性がさらに向上することが分かった。本発明は、このような知見に基づくものである。
具体的に、本発明は以下のとおりである。
＜１＞ロイシンリッチα２グリコプロテインを含む、ｐＨが７．０〜９．３であるロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物、
＜２＞ロイシンリッチα２グリコプロテインを測定するための校正用試料溶液である、＜１＞記載のロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物、
＜３＞保存容器に充填されている、＜１＞又は＜２＞記載のロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物、
＜４＞ｐＨが７．８〜９．０である、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物、
＜５＞塩濃度が、２００ｍＭ〜８００ｍＭである、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載のロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物、
＜６＞前記塩が、金属塩である、＜５＞に記載のロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物、
＜７＞＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載のロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物を使用する、ロイシンリッチα２グリコプロテイン測定方法、
＜８＞＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載のロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物を含む、ロイシンリッチα２グリコプロテイン測定キット、
＜９＞ｐＨが７．０〜９．３である溶媒にロイシンリッチα２グリコプロテインを接触させる工程を含む、ロイシンリッチα２グリコプロテインの保存安定化方法、
＜１０＞前記溶媒のｐＨが７．８〜９．０である、＜９＞に記載のロイシンリッチα２グリコプロテインの保存安定化方法、
＜１１＞前記溶媒の塩濃度が、２００ｍＭ〜８００ｍＭである、＜９＞又は＜１０＞に記載のロイシンリッチα２グリコプロテインの保存安定化方法、並びに
＜１２＞前記塩が、金属塩である、＜１１＞に記載のロイシンリッチα２グリコプロテインの保存安定化方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ロイシンリッチα２グリコプロテインを含有する、保存安定性の高いＬＲＧ含有組成物、特に、ＬＲＧ含有校正用試料を提供することができる。したがって、本発明によれば、生体試料中のＬＲＧを正確に定量することができ、疾患の診断を正確に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】初期値を１００％とした場合の、種々のｐＨの溶液中におけるＬＲＧ量の経時変化を表すグラフである。
【図２】初期値を１００％とした場合の、種々の塩濃度の溶液中におけるＬＲＧ量の経時変化を表すグラフである。
【図３】初期値を１００％とした場合の、種々のｐＨの溶液中におけるＬＲＧ量の経時変化を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（ロイシンリッチα２グリコプロテイン）
ロイシンリッチα２グリコプロテイン又はＬＲＧは、約５０ｋＤａの糖タンパク質である。ＬＲＧは、血清タンパク質の一種であり、健常人の血清には約３．０μｇ／ｍＬ含まれると言われている。ＬＲＧは、好中球から分泌されることが報告されている。体内におけるＬＲＧの量的変化と様々な疾患、例えば、結核又は腫瘍との関連性が近年研究されており、これらの疾患を正確に診断するために、生体内のＬＲＧ量を正確に測定する必要がある。
【００１１】
ＬＲＧの測定は、公知の手法、例えば、免疫学的手法を使用して行うことができる。免疫学的手法としては、ＥＬＩＳＡ、酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集免疫測定法（ＬＴＩＡ）、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、イムノクロマトグラフ法、及び高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）等が挙げられる。
【００１２】
本発明の組成物に含まれるＬＲＧとしては、市販のものを使用してもよく、自ら作製又は精製したものを使用してもよい。本発明の組成物に含まれるＬＲＧとしては、インビトロで作製したものを使用してもよく、生体から抽出したものを使用してもよい。
【００１３】
（ｐＨ）
本発明のロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物のｐＨは、ＬＲＧの安定性を考慮すると、７．０〜９．３であり、好ましくは７．０〜９．０であり、より好ましくは７．５〜９．０であり、さらに好ましくは７．８〜９．０であり、最も好ましくは８．０〜９．０である。
ｐＨの調整は、当業者に周知のｐＨ調整用試薬、例えば水酸化ナトリウムを用いて行うことができる。
【００１４】
（塩濃度）
本発明のＬＲＧ組成物における塩濃度は、好ましくは２００ｍＭ〜８００ｍＭであり、より好ましくは３００ｍＭ〜７００ｍＭであり、最も好ましくは３００ｍＭ〜６００ｍＭである。塩濃度を上記の範囲内とすることで、ＬＲＧの安定性をさらに向上させることができる。
【００１５】
本発明のＬＲＧ組成物に含まれる塩の種類は、公知の任意の塩を用いることができ、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩等の金属塩、並びにアンモニウム塩、アミン塩等の非金属塩を使用することができる。金属塩を使用することが好ましく、ナトリウム塩を使用することがより好ましい。ナトリウム塩を供給するために、塩化ナトリウムを使用することが最も好ましい。また、複数の種類の塩を組み合わせて使用することもできる。
【００１６】
（ロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物）
本明細書において、ロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物（以下、ＬＲＧ組成物と称することがある）とは、ＬＲＧの測定において使用される、ＬＲＧを含む溶液を意味する。本発明のＬＲＧ組成物は、ＬＲＧ測定において、校正用試料溶液として好適に用いられることができる。本明細書において、校正用試料溶液とは、測定対象物質の測定を正確に行うために使用する、測定対象物質を一定の濃度で含有する試料溶液を意味し、標準物質、キャリブレーター、コントロール、及び内部標準物質などが該当する。本発明のＬＲＧ組成物の供給の形態としては、ＬＲＧとｐＨが７．０〜９．３の溶媒とを混合した、あらかじめ溶液状態にした形態が挙げられる。また、本発明のＬＲＧ組成物の別の供給の形態としては、それぞれを別個に用意し、使用時に両者を混合して溶液状態にする形態が挙げられる。
本発明のＬＲＧ組成物におけるＬＲＧの濃度は、以下に限定されるものではないが、０．１〜１０００μｇ／ｍＬ、０．１〜１００μｇ／ｍＬ、１〜１００μｇ／ｍＬ、１〜５０μｇ／ｍＬ、又は１〜３０μｇ／ｍＬであることができる。
なお、ロイシンリッチα２グリコプロテイン測定方法において「ロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物を使用する」とは、ロイシンリッチα２グリコプロテイン測定を正確に行うためにロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物を使用することを意味し、例えば、ロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物を校正用試料溶液（標準物質、キャリブレーター、コントロール、及び内部標準物質など）として使用することを意味する。
【００１７】
本発明のＬＲＧ組成物の組成は、ＬＲＧを含有し且つｐＨが７．０〜９．３であること以外、本発明の効果を損なわないこと、及びＬＲＧの用途に対して妨害的に作用しないことを限度として特に制限はない。ＬＲＧを免疫学的測定方法により測定するのであれば、本発明の効果を損なわず、かつ、抗原抗体反応、ビオチン・アビジンによる検出のための標識反応、酵素反応など、測定系を構成する反応の全部又は一部を妨害しなければよい。免疫学的測定方法において通常使用される各種成分、例えば、酢酸、クエン酸、リン酸、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、グリシン、ホウ酸、炭酸やグッドなどの各種緩衝液、非特異的な反応を抑制するための成分（Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの非イオン性界面活性剤など）、抗原抗体反応を促進する成分（ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、リン脂質ポリマーなどの高分子など）、ＬＲＧ以外の糖タンパク質やペプチド（アルブミンやカゼインなど）、アミノ酸、糖類（ショ糖、シクロデキストリンなど）、防腐剤（アジ化ナトリウム、ＰｒｏＣｌｉｎ９５０など）などを目的に応じ、適宜選択して使用することができる。
【００１８】
また、本発明のＬＲＧ組成物は、公知の容器に保存することができる。本発明のＬＲＧ組成物に使用できる保存容器の材質としては、これらに限定されないが、ポリプロピレン、ポリスチレン、ガラスを挙げることができる。保存容器の形態としては、ハードタイプまたはソフトタイプのいずれでもよく、アンプル、バイアル、ソフトバッグ、注射型容器などが例示される。
【００１９】
ＬＲＧは、ＬＲＧ発現細胞により製造することができる。ＬＲＧ発現細胞は、ＬＲＧをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主を形質転換することにより得ることができる。宿主細胞としては、原核生物もしくは真核生物である微生物細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞等を挙げることができる。哺乳動物細胞としては、例えば、ＨｅｐＧ２細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒトＦＬ細胞、サルＣＯＳ−７細胞、サルＶｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０細胞、マウスミエローマ細胞，ラットＨ４ＩＩＥ−Ｃ３細胞、ラットＧＨ３細胞などが用いられ得る。 
前記のようにして得られたプラスミドは、通常の遺伝子工学的方法により前記宿主細胞に導入することができる。形質転換体の培養は、微生物培養、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞の培養に使用される通常の方法によって行うことができる。ＬＲＧタンパク質の取得は、一般のタンパク質の単離・精製に通常使用される方法を組み合わせて実施すればよい。
【００２０】
本明細書において「保存安定化」又は「安定性が向上する」とは、ＬＲＧを含む溶液中に含有されるＬＲＧの大部分が長期間分解されずに又は構造を変化させずに維持されることにより、当該溶液中のＬＲＧの初期値と保存後の測定値とにおいて、大きな差異がなくなることを意味する。より具体的には、例えば、ＬＲＧを含む溶液中に含有されるＬＲＧの７５％以上が２９日間の間分解されずに又は構造を変化させずに維持されることにより、３７℃で２９日間保存後の当該溶液中のＬＲＧの測定値が、初期値の７５％以上となることを意味する。本発明のＬＲＧ組成物としては、３７℃で２９日保存後に、当初の量を基準としてＬＲＧ測定値が８０％以上となるものが好ましく、９０％以上となるものがより好ましく、９５％以上となるものがさらに好ましく、９６％以上となるものが最も好ましい。本発明のＬＲＧ組成物は、３７℃の高温においても長期間安定性を有するが、低温や常温で保存するＬＲＧ組成物を本発明の範囲から除外するものではない。
【００２１】
（ＬＲＧの測定を行うための生体試料）
ＬＲＧの測定を行うための生体試料としては、ＬＲＧの測定が可能であれば特に限定されることはないが、血液、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、便等が挙げられ、血清又は血漿を用いることが好ましく、血清を用いることがさらに好ましい。生体又は対象は、哺乳動物であれば特に限定されることはなく、ヒト又は動物（例えば、サル、イヌ、ネコ、マウス、モルモット、ラット、ハムスター、ウマ、ウシ、及びブタ）を含み、好ましくはヒトである。生体試料には、必要に応じて適宜前処理を実施してもよい。
【００２２】
（ロイシンリッチα２グリコプロテイン測定キット）
本発明のロイシンリッチα２グリコプロテイン測定キット（以下、ＬＲＧ測定キットと称することがある）では、ＬＲＧ組成物を使用することにより、ＬＲＧの測定を正確に行うことが可能である。ＬＲＧ測定キットとしては、例えば免疫学的手法を用いたキットを挙げることができる。本発明のＬＲＧ測定キットは、免疫学的手法によりヒト体内のＬＲＧ濃度を測定するための試薬を含むことができる。免疫学的手法としては、ＥＬＩＳＡ、酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集免疫測定法（ＬＴＩＡ）、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、イムノクロマトグラフ法、及び高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）等が挙げられる。免疫学的手法は、好ましくはラテックス凝集免疫測定法（ＬＴＩＡ）である。
本発明のＬＲＧ測定キットは、自己免疫疾患、結核、腫瘍、炎症性疾患、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎及びクローン病）の診断のために使用することができる。
【００２３】
本発明のＬＲＧ測定キットには、他に使用説明書などを含むこともできる。キットは、任意の構成要素、例えば緩衝剤、安定化剤、検体希釈液、ｐＨ調整剤、反応容器等を含んでいてもよい。
【００２４】
（ＬＲＧ組成物の保存安定化方法）
本発明のＬＲＧ組成物の保存安定化方法は、ｐＨが７．０〜ｐＨ９．３である溶媒にロイシンリッチα２グリコプロテインを接触させる工程を含む。溶媒は、ｐＨが７．０〜ｐＨ９．３であれば特に限定されることはない。溶媒は、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＣＨＥＳ及びＴｒｉｓ等の緩衝液を含むことができ、緩衝液の濃度は、１〜１０００ｍＭであることができる。「接触させる」には、溶媒にＬＲＧを投入すること以外に、ＬＲＧを含むｐＨが７．０〜９．３以外の溶液のｐＨを７．０〜９．３に調整することも含む。
【００２５】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、本明細書において特に説明のない限り、％は重量％を示す。
【実施例】
【００２６】
〔実施例１〕種々のｐＨの溶液中におけるＬＲＧ量の経時変化の検討１
種々のｐＨのＬＲＧ標準抗原溶液を作製した後保存試験を行い、各々のＬＲＧ標準抗原溶液におけるＬＲＧ量の経時変化を調査することにより、ＬＲＧ保存安定性に対するｐＨの影響を検討した。使用したＬＲＧは、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター細胞）を用いて作製した。具体的には、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にヒトＬＲＧ遺伝子を、プラスミドを用いて導入し、無血清培地でＬＲＧ遺伝子導入ＣＨＯ−Ｋ１細胞を培養し、培養上清からヒトＬＲＧリコンビナントタンパクを回収することにより調製した。
下記表１の組成のＬＲＧ標準抗原溶液を作製し、４Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．５又は８．０に調整した。各々のＬＲＧ標準抗原溶液を３７℃で２９日間保存し、ＬＲＧ量の経時変化を確認した。サンプル組成と実験結果を表１及び２並びに図１に示す。【００２７】
【表１】
2020075692.tif 000003
【００２８】
【表２】
2020075692.tif 000004
【００２９】
ｐＨを８．０に調整したＬＲＧ標準抗原溶液では、３７℃で２９日保存後の測定値は、当初のＬＲＧ量の９３％であった。ｐＨを７．５に調整したＬＲＧ標準抗原溶液の測定値は、当初のＬＲＧ量の８１％であった。したがって、ＬＲＧ標準抗原溶液のｐＨが７．５であるよりも８．０である方が、ＬＲＧの保存安定性が良好であることが示された。
〔実施例２〕種々の塩濃度の溶液中におけるＬＲＧ量の経時変化の検討【００３０】
実施例１で作製したサンプルNo．２において、塩化ナトリウムの濃度を１５０ｍＭから５００ｍＭに変更して保存試験を行い、ＬＲＧ保存安定性に対する塩濃度の影響を検討した。サンプル組成と実験結果を表３及び図２に示す。
【表３】
2020075692.tif 000005
【００３１】
塩濃度を５００ｍＭに上昇させたＬＲＧ標準抗原溶液では、塩濃度が１５０ｍＭであるＬＲＧ標準抗原溶液に対して、ＬＲＧの保存安定性が向上することが示された。塩濃度が１５０ｍＭであるＬＲＧ標準抗原溶液では、３７℃で２９日保存後の測定値は、当初のＬＲＧ量の９３％であったが、塩濃度が５００ｍＭであるＬＲＧ標準抗原溶液では、３７℃で２９日保存後の測定値は、当初のＬＲＧ量の９８％であった。【００３２】
〔実施例３〕種々のｐＨの溶液中におけるＬＲＧ量の経時変化の検討２
緩衝液として下記表４に記載のものを用いたこと及びｐＨを６．０、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、又は９．５に調整したこと以外は、実施例１で調製したサンプルと同じ組成のＬＲＧ標準抗原溶液を作製した。各々のＬＲＧ標準抗原溶液を３７℃で２９日間保存し、ＬＲＧ量の経時変化を確認した。サンプル組成と実験結果を表４及び図３に示す。【００３３】
【表４】
2020075692.tif 000006
【００３４】
上記結果により、ＬＲＧ標準抗原溶液のｐＨを７．０〜９．３に調整することにより、ＬＲＧの保存安定性が向上することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明のロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物は、高い保存安定性を有する。したがって、本発明のロイシンリッチα２グリコプロテイン組成物を校正用試料として使用することにより、生体試料中のＬＲＧを正確に定量することができ、疾患の診断を正確に行うことができる。
【図１】
2020075692.tif 000007
【図２】
2020075692.tif 000008
【図３】
2020075692.tif 000009
【国際調査報告】
2020075692.tif 000010
2020075692.tif 000011
2020075692.tif 000012
2020075692.tif 000013