(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．２〜０．４Ｍ、ｐＨ７〜９のリン酸塩緩衝液中にＣａ／Ｐ比が１．０〜２．０のリン酸カルシウム系化合物粒子を懸濁させ、この懸濁液中に、溶菌操作の後に得られるＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液を添加することにより該リン酸カルシウム系化合物粒子にプラスミドＤＮＡを吸着させ、このプラスミドＤＮＡを吸着したリン酸カルシウム系化合物粒子を分離し、０．２〜０．４Ｍ、ｐＨ６以下のリン酸塩緩衝液と接触させてプラスミドＤＮＡを脱着させることを特徴とするプラスミドＤＮＡの単離方法。
【請求項２】
リン酸カルシウム系化合物粒子が１μｍ〜１ｍｍの平均粒径及び１〜３００ｍ2 ／ｇのＢＥＴ法による比表面積を有する粒子である請求項１記載のプラスミドＤＮＡの単離方法。
【請求項３】
Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０のリン酸カルシウム系化合物粒子をクロマトグラフィー用カラムに充填し、０．２〜０．４Ｍ、ｐＨ７〜９のリン酸塩緩衝液で平衡化した後、溶菌操作の後に得られるＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液及び０．２〜０．４Ｍ、ｐＨ７〜９のリン酸塩緩衝液を順次通水し、該リン酸カルシウム系化合物粒子にプラスミドＤＮＡを吸着させた後、０．２〜０．４Ｍ、ｐＨ６以下のリン酸塩緩衝液を通水してプラスミドＤＮＡを溶離することを特徴とするプラスミドＤＮＡの単離方法。
【請求項４】
リン酸カルシウム系化合物粒子が１μｍ〜１ｍｍの平均粒径及び１〜３００ｍ2 ／ｇのＢＥＴ法による比表面積を有する粒子である請求項３記載のプラスミドＤＮＡの単離方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子工学の分野において最も基本的な操作の一つである核酸からプラスミドＤＮＡを単離する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、大腸菌プラスミドベクターに目的のＤＮＡを組み込んで培養し、目的のＤＮＡを大量に調製する方法は、遺伝子工学分野において最も頻繁に行われている操作の一つである。現在、大腸菌からのプラスミドベクターの回収は、溶菌操作の後ゲノムＤＮＡと蛋白質等を取り除いてＲＮＡとプラスミドＤＮＡの混合物を得ることによって行われ、その方法としては、アルカリ−ＳＤＳ法をはじめとしていくつかの方法が知られている。ＲＮＡとプラスミドＤＮＡの混合物からさらに精製プラスミドＤＮＡを得るためには、イオン交換樹脂を用いたカラム分離法、塩化セシウム密度勾配超遠心法などが一般的に用いられている。しかしながら、塩化セシウム密度勾配超遠心法では、大がかりな装置で高い回転数で長時間遠心処理を行うため、細心の注意を要し、煩雑であり、また、経済的でなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液から特別な装置を必要とせずに簡単な操作で精製プラスミドＤＮＡを得る方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、特定濃度で特定ｐＨ範囲のリン酸塩緩衝溶液を作用させると、プラスミドＤＮＡはリン酸カルシウム系化合物粒子に吸着されるのに対し、ＲＮＡは吸着されないことを見出し、この知見に基づいて完成したものである。
すなわち、本発明によるプラスミドＤＮＡの単離方法は、０．２〜０．４Ｍ、ｐＨ７〜９のリン酸塩緩衝液中にＣａ／Ｐ比が１．０〜２．０のリン酸カルシウム系化合物粒子を懸濁させ、この懸濁液中に、溶菌操作の後に得られるＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液を添加することにより該リン酸カルシウム系化合物粒子にプラスミドＤＮＡを吸着させ、このプラスミドＤＮＡを吸着したリン酸カルシウム系化合物粒子を分離し、０．２〜０．４Ｍ、ｐＨ６以下のリン酸塩緩衝液と接触させてプラスミドＤＮＡを脱着させることを特徴とする。
【０００５】
本発明はまた、プラスミドＤＮＡを液体クロマトグラフィーによって単離する方法に関し、この方法は、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０のリン酸カルシウム系化合物粒子をクロマトグラフィー用カラムに充填し、０．２〜０．４Ｍ、ｐＨ７〜９のリン酸塩緩衝液で平衡化した後、溶菌操作の後に得られるＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液及び０．２〜０．４Ｍ、ｐＨ７〜９のリン酸塩緩衝液を順次通水し、該リン酸カルシウム系化合物粒子にプラスミドＤＮＡを吸着させた後、０．２〜０．４Ｍ、ｐＨ６以下のリン酸塩緩衝液を通水してプラスミドＤＮＡを溶離することを特徴とする。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明に用いるリン酸カルシウム系化合物は、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０のものであれば、特に制限はなく、例えば、Ｃａ10（ＰＯ4)6 （ＯＨ)2、Ｃａ10（ＰＯ4)6 Ｆ2 、Ｃａ10（ＰＯ4)6 Ｃl2、Ｃａ3(ＰＯ4)2 、Ｃａ2 Ｐ2 Ｏ7 及びＣａ4 Ｏ（ＰＯ4)2 のうちから選ばれた１種又は２種以上を使用することができる。これらのうち安定性や吸着性能の点からＣａ／Ｐ比が１．５〜１．８のものが好ましく、Ｃａ／Ｐ比が１．６７のハイドロキシアパタイトを主成分とするものが最も好ましい。フッ素アパタイトを用いる場合、全リン酸カルシウム系化合物中のフッ素含有率が５重量％以下であるのが好ましい。フッ素含有率が５重量％を超えると、フッ素の溶出が起こり好ましくない。これらのリン酸カルシウム系化合物は、公知の方法で合成することができる。
【０００７】
本発明においては、リン酸カルシウム系化合物粒子は、その平均粒径が１μｍ〜１ｍｍの範囲にあり、かつＢＥＴ法による比表面積が１〜３００ｍ2 ／ｇ、好ましくは５〜３００ｍ2 ／ｇの範囲内にあるものが好ましい。平均粒径が１μｍより小さいと、取扱いが困難であり、比表面積が１ｍ2 ／ｇより小さいと、低比表面積のため充分な吸着性能が得られない。一方、平均粒径が１ｍｍより大きく、比表面積が３００ｍ2 ／ｇより大きいと、それぞれ充填密度の低下、不均一な凝集体の発生などの理由から性能が劣化する。
上記のようなリン酸カルシウム系化合物は、種々のカルシウム化合物及びリン酸化合物を出発原料として合成し、造粒乾燥した後分級することにより製造することができる。上記の条件に適合した粒子を得るには、多孔質顆粒とすることが必要となることもあるが、多孔質顆粒は、常法で製造することができる。
【０００８】
本発明の方法においては、上記のようなリン酸カルシウム系化合物粒子に核酸成分中のプラスミドＤＮＡだけを吸着させるために、０．２〜０．４Ｍ、ｐＨ７〜９のリン酸塩緩衝液中にＣａ／Ｐ比が１．０〜２．０のリン酸カルシウム系化合物粒子を懸濁させ、この懸濁液中に、溶菌操作の後に得られるＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液を添加する。溶菌操作は、アルカリ−ＳＤＳ法など、任意の公知の方法で行うことができる。溶菌操作により大腸菌中のゲノムＤＮＡや菌体の構成成分としての蛋白質や脂質を除去し、残りのプラスミドＤＮＡとＲＮＡを主として含む溶液を用いる。
リン酸塩緩衝液の濃度が０．２Ｍ未満であると、試料中のＲＮＡがプラスミドと共にリン酸カルシウム系化合物粒子に吸着される。また、０．４Ｍを超えると、リン酸塩が析出する恐れがある。。リン酸塩緩衝液が０．３〜０．４ＭでｐＨ７〜８である場合に、リン酸カルシウム系化合物粒子はプラスミドＤＮＡだけを吸着する能力が高く、好結果が得られる。
【０００９】
また、リン酸塩緩衝液のｐＨが７〜９の範囲にあるとき、プラスミドＤＮＡだけがリン酸カルシウム系化合物粒子に吸着され、ｐＨ７未満、特にｐＨ６以下のリン酸塩緩衝液を作用させると、リン酸カルシウム系化合物粒子に吸着されていたプラスミドＤＮＡが脱着される。これにより、プラスミドＤＮＡを核酸成分から容易に単離することができる。
したがって、上記のようなリン酸カルシウム系化合物粒子をクロマトグラフィー用カラムに充填しておき、液体クロマトグラフィーによってプラスミドＤＮＡを核酸成分から容易に単離することもできる。
【００１０】
【実施例】
次に、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれによって制限されるものではない。
【００１１】
実施例１〜３
（１）試料溶液の調製
アンピシリン耐性遺伝子を持った pBulescriptSK（＋）ベクターをＪＭ１０９コンピテントセルに形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ−寒天培地上で３７℃で一昼夜培養して単一コロニー株を得た。これを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培養液中で３７℃で一昼夜振盪培養して菌体を得た。この菌体を遠心分離したのち、アルカリ−ＳＤＳ法により核酸濃度２００μｇ／ｍｌのプラスミド−ＲＮＡ混合溶液（以下、試料溶液と称する。）を得た。
（２）吸着工程
平均粒径２０μｍ、比表面積５０ｍ2 ／ｇのハイドロキシアパタイト粒子２０ｍｇを表１に示すｐＨ及び濃度のリン酸ナトリウム緩衝液７０μｌ中に懸濁させ、試料溶液を１５μｌ添加し、室温で５分間振盪した。その後、懸濁液の上清を回収し、０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、臭化エチジウム染色により核酸成分の分析（未吸着物質の確認）を行い、結果を表１に示す。
（３）脱着工程
上記懸濁液から分離したハイドロキシアパタイト粒子に、濃度が４００ｍＭでｐＨが６のリン酸ナトリウム緩衝液を加え、室温で５分間振盪し、上清を回収し、０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、臭化エチジウム染色により核酸成分の分析（ハイドロキシアパタイト粒子から脱着された物質の確認）を行い、結果を表１に示す。
【００１２】
比較例１
平均粒径２０μｍ、比表面積５０ｍ2 ／ｇのハイドロキシアパタイト粒子２０ｍｇをｐＨ６の４００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液７０μｌ中に懸濁させ、実施例１（１）で調製した試料溶液を１５μｌ添加し、室温で５分間振盪した。その後、懸濁液の上清を回収し、０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、臭化エチジウム染色により核酸成分の分析を行ったところ、プラスミドＤＮＡ及びＲＮＡの両方が上清に含まれており、ハイドロキシアパタイト粒子に吸着されなかったことが分かった。結果を表１に示す。
【００１３】
実施例４〜６
吸着工程において、表１に示す濃度及びｐＨのリン酸ナトリウム緩衝液を用い、脱着工程ではｐＨ６の３００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を用いた以外は、実施例１と同様に操作し、結果を表１に示す。
【００１４】
比較例２
ｐＨ６の３００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を用いた以外は、比較例１と同様に操作したところ、表１に示したように、プラスミドＤＮＡ及びＲＮＡもハイドロキシアパタイト粒子に吸着されなかった。
【００１５】
実施例７〜９
吸着工程において、表１に示す濃度及びｐＨのリン酸ナトリウム緩衝液を用い、脱着工程ではｐＨ６の２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を用いた以外は、実施例１と同様に操作し、結果を表１に示す。
【００１６】
比較例３
ｐＨ６の２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を用いた以外は、比較例１と同様に操作したところ、表１に示したように、プラスミドＤＮＡ及びＲＮＡもハイドロキシアパタイト粒子に吸着されなかった。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
表１に示した結果から明らかなとおり、０．２〜０．４Ｍ、ｐＨ７〜９のリン酸ナトリウム緩衝液を用いて高純度で精製プラスミドＤＮＡを得ることができたが、０．３〜０．４Ｍ、ｐＨ７〜８のリン酸ナトリウム緩衝液を用いた場合に、特に純度の高い精製プラスミドＤＮＡが得られた。
【００１９】
実施例１０
平均粒径２０μｍ、比表面積５０ｍ2 ／ｇのハイドロキシアパタイト粒子をクロマトグラフィー用カラムに充填し、３００ｍＭ、ｐＨ８のリン酸ナトリウム緩衝液でカラム内を洗い、実施例１（１）で調製した試料溶液を入れ、３００ｍＭ、ｐＨ８のリン酸ナトリウム緩衝液をカラム容積の３倍量通水した後、２００ｍＭ、ｐＨ６のリン酸ナトリウム緩衝液をカラム容積の２倍量通水し、これを溶離液とした。溶離液を回収し、０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、臭化エチジウム染色により核酸成分の分析を行ったところ、プラスミドＤＮＡの存在を確認することができた。
【００２０】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、溶菌操作によって得られる、ＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液から特別な装置を必要とせずに簡単な操作で精製プラスミドＤＮＡを効率よく得ることができる。