(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程（a）、（b）、及び（c）を含むプレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質とセマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質の結合を低下させる物質のスクリーニング方法、
（a）被験物質存在下で、プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質とセマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質とを接触させる工程、
（b）被験物質存在下におけるプレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質とセマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質との結合を測定し、被験物質非存在下でのプレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質とセマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質との結合（対照）と比較する工程、
（c）上記（b）の比較結果に基づいて、対照に比して結合を低下させる被験物質を選択する工程。
【請求項２】
セマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質が、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグを結合させた組換えタンパク質であることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
マーカータンパク質がアルカリフォスファターゼ又は免疫グロブリンＦｃドメインであることを特徴とする請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質を発現している細胞膜又は細胞を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質を発現している細胞膜又は細胞が、プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質をコードするＤＮＡが安定に保持されている形質転換細胞であることを特徴とする請求項４記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
下記の工程（a）、（b）、および（c）を含むセマフォリン６Ｃのアンタゴニストのスクリーニング方法、
（a）被験物質の存在下で、プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質とセマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質とを接触させる工程、
（b）被験物質存在下におけるプレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質とセマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質との相互作用から生じるシグナルを測定し、被験物質非存在下でのプレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質とセマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質との相互作用から生じるシグナル（対照）と比較する工程、
（c）上記（b）の比較結果に基づいて、対照に比してシグナルを低下させる被験物質を選択する工程。
【請求項７】
下記の工程（a）、（b）、および（c）を含むセマフォリン６Ｃのアゴニストのスクリーニング方法、
（a）プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質に、被験物質またはセマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質を接触させる工程、
（b）プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質と被験物質との相互作用から生じるシグナルを測定し、プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質とセマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質との相互作用から生じるシグナル（対照）と比較する工程、
（c）上記（b）の比較結果に基づいて、対照のシグナルと類似のシグナルを示す被験物質を選択する工程。
【請求項８】
プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質とセマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質との相互作用から生じるシグナルが、プレキシンＡ１発現細胞の成長円錐退縮活性、またはプレキシンＡ１発現細胞の収縮活性であることを特徴とする請求項６または７記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
セマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質が、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグを結合させた組換えタンパク質であることを特徴とする請求項６又は７記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
マーカータンパク質がアルカリフォスファターゼ又は免疫グロブリンＦｃドメインであることを特徴とする請求項９記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質を発現している細胞を用いることを特徴とする請求項６〜１０のいずれか記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質を発現している細胞が、プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質をコードするＤＮＡが安定に保持されている形質転換細胞であることを特徴とする請求項１１記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質が、プレキシンＡ１であることを特徴とする請求項１〜１２いずれか記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、セマフォリン６Ｃ（以下、Ｓｅｍａ６Ｃと略する）の受容体がプレキシンＡ１であることを見い出したことに基づくものであり、具体的には、本発明は、プレキシンＡ１を用いたセマフォリン６Ｃのアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法、及び当該スクリーニングのためのスクリーニングツールなどに関する。
【０００２】
【従来の技術】
セマフォリンは２０種以上の分泌型及び膜貫通型タンパク質の大きなファミリーを構成し、そして８つのクラスに分類される（Cell 97,551-552(1999)）。多くのセマフォリンは神経に対して反発物質（chemorepellents)又は誘引物質として機能しており、軸索の方向付け、束形成若しくは分枝化、シナプス形成を制御している（総説については、Annu.Rev.Neurosci.19,341-377(1996)；Science 274,1123-1133(1996)参照）。特に、クラス３型の分泌セマフォリンは、後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン若しくは交感神経節ニューロンに対し強力な成長円錐退縮活性、軸索反発活性を有していることが示されている（Cell 75,217-227(1993); Cell 75,1389-1399(1993); Neuron 14,263-274(1995); Neuron 14,949-959(1995); Neuron 14,941-948(1995)、Eur.J.Neurosci.8,1317-1321(1996); Neuron 18,193-207(1997)）。
【０００３】
ニューロピリン（ニューロピリン−１及びニューロピリン−２）は、クラス３型セマフォリンと結合することが示されている（Neuron 19,547-559(1997); Cell 90,739-751(1997); Cell 90,753-762(1997)）。マウスにおいてＳｅｍａ３Ａ（以前には、セマフォリンＤ、クラス３型セマフォリンの１メンバー）遺伝子（Neuron 19,519-530(1997)）又はニューロピリン−１遺伝子（Neuron 19,995-1005(1997)）をターゲッティングにより不活性化すると、末梢神経線維の走行異常や突起形成の誘導が認められ、ニューロピリン−１はＳｅｍａ３Ａで誘発される化学的反発シグナルの伝播に必須であることが知られている。
【０００４】
他方、プレキシンは、元々ツメガエルのオタマジャクシで同定された神経の膜糖タンパク質である（Dev.Biol.122,90-100(1987)、Neuron 9,151-161(1992)、Neuron 14,1189-1199(1995)）。現在では数種のプレキシンが種々の動物種で同定されており、４つのサブファミリー、プレキシンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤに分類されている（Cell 99,71-80(1999)）。マウスやヒトでは、プレキシンＡサブファミリーに属する少なくとも３つのプレキシン、即ちプレキシンＡ１、Ａ２及び Ａ３［以前には、マウスではそれぞれ、プレキシン１、２及び３（Biochem.Biophys.Res.Commun.226,396-402(1996), Biochem.Biophys.Res.Commun.226,524-529(1996)); ヒトではそれぞれ、ＮＯＶ、ＯＣＴ及びＳＥＸ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,674-678(1996）］が同定されている。プレキシンＡサブファミリーのエクトドメイン（細胞外ドメイン）は、ｃ−Ｍｅｔ及びＭｅｔ関連レセプタープロテインチロシンキナーゼ中に存在するシステイン−リッチドメインに類似するシステインクラスター［Ｃ１、Ｃ２及びＣ３（Neuron 14,1189-1199(1995)）又はＭｅｔ関連配列（ＭＲＳ；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,674-678(1996)）と称される］の３個の繰り返しを有している（総説については、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,674-678(1996)；Dev.Neurosci.19,101-105(1997)参照）。更に、プレキシンのＮ末端と最初のシステインクラスター間の約５００アミノ酸（ａａ）残基は、セマフォリンファミリーに共有されるセマフォリンドメインと顕著な相同性を示す（Cell 75,217-227(1993); Cell 75,1389-1399(1993); Trends Cell Biol.6,15-22(1996); Eur.J.Neurosci.8,1317-1321(1996)）。
【０００５】
ツメガエルで行った我々の以前の研究で、プレキシンは神経系の特定の部分、例えば視蓋（Dev.Biol.122,90-100(1987)）及び網膜（Neuron 9,151-161(1992)）の内網状層並びに光受容細胞及び嗅覚神経回路、側線神経回路、聴覚平衡感覚神経回路を構成するニューロン（Neuron 14,1189-1199(1995)；J.Neurosci.15,942-955(1995)）中で発現されることが示されており、そしてプレキシンはニューロン細胞接触（Neuron 14,1189-1199(1995)）、神経線維走行及び束形成（J.Neurosci.15,942-955(1995)）又は内網状層の組織化（Neuron 9,151-161(1992)）に関与していることが示唆されている。しかしながら、プレキシンの分子的な性質や神経系の発生における本来の役割は不明である。
【０００６】
最近の幾つかの研究はプレキシンがセマフォリンのレセプターとして機能することを示している。プレキシンファミリーの１つのサブファミリーのメンバー、即ちエクトドメイン中に３個ではなくて２個のシステインクラスターを有しているプレキシンＣ１（ＶＥＳＰＲ）は、リンパ系由来の細胞中で発現され、そしてポックスウイルスでコードされ分泌されるクラスＶ型セマフォリンであるＳｅｍａＶＡに対する受容体として使用される（Ａ３９Ｒ; Immunity 8,473-482(1998)）。ショウジョウバエでの研究（Cell 95,903-916(1998)）により、プレキシンＡがクラス１型セマフォリンであるＳｅｍａ−１ａで誘発される化学的反発シグナルを伝播するレセプターとして使用され、そしてＣＮＳや運動軸索の束形成を調節することが示されている。プレキシンとセマフォリンの相互作用に関する最近の研究（Cell 99,71-80(1999)）によって、クラス４型セマフォリンであるＳｅｍａ４ＤがプレキシンＢ１に 、クラス７型セマフォリン（ＧＰＩアンカー型）であるＳｅｍａ７ＡがプレキシンＣ１に結合することが示されている。更に、プレキシンＡサブファミリーの或るメンバー（プレキシンＡ１及びプレキシンＡ３）はニューロピリン（ニューロピリン−１及びニューロピリン−２）とコンプレックスを形成し、クラス３型セマフォリンであるＳｅｍａ３Ａのシグナルを細胞内に伝播することが示されている（Cell 99,59-69(1999); Cell 99,71-80(1999）。総合すると、これら上記の所見は、プレキシンがニューロピリンに依存又は依存することなく無関係にある種のセマフォリンシグナルを伝播するのに重要なレセプター分子である可能性を示唆している。しかしながら、セマフォリンは多種多様な構造及び機能を有していることから、当該セマフォリンの受容体やシグナル伝達機構は個々のセマフォリンクラスにより相違していると考えられる。そして現在、クラス６型等のセマフォリンのクラスに関しては未だその受容体が同定されておらず、またプレキシンとの関係についても一切明らかにされていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はクラス６型セマフォリンに属するＳｅｍａ６Ｃの受容体がプレキシンＡ１であるとの知見に基づくものであり、本発明の課題は、プレキシンＡ１を用いたＳｅｍａ６Ｃのアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法、及び当該スクリーニングのためのスクリーニングツールなどを提供することにある。Ｓｅｍａ６Ｃは神経細胞に対する成長円錐退縮活性、細胞に対する収縮活性を有しているため、本発明のスクリーニング方法は、これらの活性を促進又は阻害することにより治療され得る疾患の治療剤又は予防剤の選択に有用である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、プレキシンＡを発現するトランスフェクタントを作製し、これを用いてプレキシンＡサブファミリーメンバーのリガンドを鋭意スクリーニングした。その結果、クラス６型膜貫通型セマフォリンがプレキシンＡと、特にクラス６型の膜貫通型セマフォリンであるＳｅｍａ６Ｃ（ＳｅｍａＹ; Moll.Cell.Neurosci.13,9-23(1999)）がプレキシンＡ１と特異的に結合すること、そしてＳｅｍａ６Ｃのエクトドメイン（細胞外ドメイン）の組換えタンパク質がプレキシンＡ１を発現する繊維芽系細胞の収縮や神経細胞の成長円錐の退縮を誘導することなどを見い出し、クラス６型膜貫通型セマフォリンの受容体がプレキシンＡ、特にＳｅｍａ６Ｃの受容体がプレキシンＡ１であることを明らかにした。そして、このようにＳｅｍａ６Ｃの受容体がプレキシンＡ１であることを明らかにしたことに伴い、プレキシンＡ１を利用してセマフォリン６Ｃのアゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングすることが可能となった。
【０００９】
ここで、Ｓｅｍａ６Ｃが神経細胞に対する成長円錐退縮活性を有していることは従来より知られており（国際公開第98/11216号パンフレット、Moll.Cell.Neurosci.13,9-23(1999)）、また当該Ｓｅｍａ６Ｃのアンタゴニスト等のスクリーニングが神経再生促進剤の開発等において有用であることも示されている（国際公開第98/11216号パンフレット）。本発明において、Ｓｅｍａ６Ｃの受容体が同定されたことにより、当該受容体であるプレキシンＡ１を利用することにより、より効率的かつ特異性の高いスクリーニングを行うことができるようになった。
【００１０】
特に、Ｓｅｍａ６Ｃ結合部位及びプレキシンＡ１が聴覚系の神経組織に一致して局在していたこと、及びＳｅｍａ６Ｃが聴覚神経に対する成長円錐退縮活性を有していたことから、当該Ｓｅｍａ６Ｃは聴覚神経の伸長抑制や成長円錐の退縮に関与していると考えられる。また当該Ｓｅｍａ６Ｃは嗅覚神経の伸長抑制や成長円錐の退縮にも関与していることが考えられる。従って本発明のスクリーニング方法は、種々の神経疾患、特に聴覚及び／又は嗅覚神経疾患の治療剤又は予防剤の選別に有用である。またＳｅｍａ６Ｃは細胞に対する収縮活性も有しているため、本発明のスクリーニング方法は、プレキシン発現細胞の収縮を指標とする細胞の遊走抑制又は促進剤のスクリーニングにも使用することができ、これらは、血管新生の促進や、癌の転移等の治療剤又は予防剤の選別に使用することができる。
【００１１】
さらに本発明においては、プレキシンＡ１の発現の組織学的分析により、プレキシンＡ１が聴覚系のニューロン（聴覚経路を構成する全ての神経節及び核）特異的に発現していること、また嗅覚系のニューロン特異的に発現していることを初めて明らかにした。従って、プレキシンＡ１をコードするＤＮＡ・ＲＮＡのアンチセンス鎖やプレキシンＡ１に対する抗体は、聴覚や嗅覚神経の疾患の診断に使用することができる。
本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
【００１２】
すなわち本発明は、（a）被験物質存在下で、プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質とセマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質とを接触させる工程、（b）被験物質存在下におけるプレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質とセマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質との結合を測定し、被験物質非存在下でのプレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質とセマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質との結合（対照）と比較する工程、（c）上記（b）の比較結果に基づいて、対照に比して結合を低下させる被験物質を選択する工程を含むプレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質とセマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質の結合を低下させる物質のスクリーニング方法（請求項１）や、セマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質が、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグを結合させた組換えタンパク質であることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法（請求項２）や、マーカータンパク質がアルカリフォスファターゼ又は免疫グロブリンＦｃドメインであることを特徴とする請求項２記載のスクリーニング方法（請求項３）や、プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質を発現している細胞膜又は細胞を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のスクリーニング方法（請求項４）や、プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質を発現している細胞膜又は細胞が、プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質をコードするＤＮＡが安定に保持されている形質転換細胞であることを特徴とする請求項４記載のスクリーニング方法（請求項５）や、（a）被験物質の存在下で、プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質とセマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質とを接触させる工程、（b）被験物質存在下におけるプレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質とセマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質との相互作用から生じるシグナルを測定し、被験物質非存在下でのプレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質とセマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質との相互作用から生じるシグナル（対照）と比較する工程、（c）上記（b）の比較結果に基づいて、対照に比してシグナルを低下させる被験物質を選択する工程を含むセマフォリン６Ｃのアンタゴニストのスクリーニング方法（請求項６）や、（a）プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質に、被験物質またはセマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質を接触させる工程、（b）プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質と被験物質との相互作用から生じるシグナルを測定し、プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質とセマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質との相互作用から生じるシグナル（対照）と比較する工程、（c）上記（b）の比較結果に基づいて、対照のシグナルと類似のシグナルを示す被験物質を選択する工程を含むセマフォリン６Ｃのアゴニストのスクリーニング方法（請求項７）や、プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質とセマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質との相互作用から生じるシグナルが、プレキシンＡ１発現細胞の成長円錐退縮活性、またはプレキシンＡ１発現細胞の収縮活性であることを特徴とする請求項６または７記載のスクリーニング方法（請求項８）や、セマフォリン６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質が、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグを結合させた組換えタンパク質であることを特徴とする請求項６又は７記載のスクリーニング方法（請求項９）や、マーカータンパク質がアルカリフォスファターゼ又は免疫グロブリンＦｃドメインであることを特徴とする請求項９記載のスクリーニング方法（請求項１０）や、プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質を発現している細胞を用いることを特徴とする請求項６〜１０のいずれか記載のスクリーニング方法（請求項１１）や、  プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質を発現している細胞が、プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質をコードするＤＮＡが安定に保持されている形質転換細胞であることを特徴とする請求項１１記載のスクリーニング方法（請求項１２）や、プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質が、プレキシンＡ１であることを特徴とする請求項１〜１２いずれか記載のスクリーニング方法（請求項１３）に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のＳｅｍａ６Ｃのアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニングに用いられる「プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質」は、天然物であっても組換え体であってもよい。またプレキシンＡ１はヒト型であることが好ましいが、マウス型など他の種由来のプレキシンＡ１も同様の目的に使用できる。プレキシンＡ１のマウス型のアミノ酸配列及び塩基配列は、文献（Biochem. Biophys. Res. Comm. 226, 524-529,（1996））や Genbank accession番号 D86948 において公開されている。また、ヒトプレキシンＡ１の配列は文献（Cell 99, 71-80, 1999）又は Genbank accession番号X87832 において公開されており、これらの配列情報をもとに容易にクローニングすることができる。
【００１４】
プレキシンＡ１の「細胞外ドメイン」とは、例えばマウスの場合、前記文献に記載されたプレキシンＡ１のアミノ酸配列の第１位〜第１２３７位の部分、又はこの部分を含み前後１０アミノ酸残基以内のアミノ酸配列よりなる部分を指すが、Ｓｅｍａ６Ｃとの結合能が維持されている限り、置換・欠失・付加等の改変を含むアミノ酸配列も本発明でいうところの「プレキシンＡ１の細胞外ドメイン」に含まれる。
【００１５】
本発明において「プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質」とは、前記の細胞外ドメイン部分を少なくとも有しているプレキシンＡ１の部分タンパク質又は全長タンパク質を指す。Ｓｅｍａ６Ｃは受容体であるプレキシンＡ１の細胞外ドメイン部分と結合するため、当該細胞外ドメインさえ有していれば本発明のスクリーニングにおけるプレキシンＡ１の役割を果たすことができる。好ましくは、プレキシンＡ１の全長タンパク質が用いられる。また、天然型のみならずそのアミノ酸配列の一部が改変されたものも、Ｓｅｍａ６Ｃとの結合能が維持されている限り、当該「プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質」の範疇に含まれる。
【００１６】
プレキシンＡ１の部分又は全長を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、単にプレキシンＡ１のＤＮＡと略する場合があり、また当該ＤＮＡの発現産物をプレキシンＡ１のタンパク質と略する場合がある）は、文献（Cell 99, 71-80, 1999又は Genbank accerion番号X87832）に記載の配列情報に基づき、適当なＤＮＡ部分をハイブリダイゼーションのプローブ又はＰＣＲのプライマーとし、例えばヒトあるいは動物脳由来のｃＤＮＡライブラリー等を用いることによりクローニングすることができる。これらのクローニングは、例えばMolecular Cloning 2nd Edt.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)などの基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。またその改変も、例えばMolecular Cloning 2nd Edt.,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、PCR A Practical Approach IRL Press p200(1991)等の基本書に基づき当業者ならば容易に行うことができる。当該改変はプレキシンＡ１の細胞外ドメイン以外の部分で行われるのが好ましく、また、保存的なアミノ酸への置換が好ましい。
【００１７】
以上のようにして得られたＤＮＡからタンパクを発現させる手法としては、以下のような方法が挙げられる。すなわちまず、先に調製したプレキシンＡ１のＤＮＡを、ｐＣＡＧＧＳ（Gene 108,193-199(1991)）やｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ３．１誘導体（インビトロジェン社）などの公知の発現ベクターに挿入する。その際、プレキシンＡ１の最初のＡＴＧの前にコザック配列を有することが好ましい。その後適当な宿主に導入し培養することにより、導入したプレキシンＡ１のＤＮＡに対応するプレキシンＡ１のタンパク質を細胞表面に発現させた形質転換体を作製することができる。また用いたプレキシンＡ１のＤＮＡの種類によっては（例えば細胞外ドメインのみをコードするＤＮＡを用いた場合）、培養上清中に当該プレキシンＡ１タンパク質を分泌させることができる。宿主としては、一般的に広く普及している哺乳動物細胞株であるＬ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）や、ＣＯＳ細胞などが好ましいが、これに限定されることなく、昆虫細胞、酵母、細菌などを用いることも可能である。
【００１８】
前記プレキシンＡ１発現ベクターの宿主細胞への導入方法としては、公知の発現ベクターの宿主細胞への導入方法であればどのような導入方法でもよく、例えばリン酸カルシウム法（J.Virol.,52, 456-467 (1973)）、LT-1（Panvera社製）を用いる方法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、Lipofectin; Gibco-BRL社製）を用いる方法などが挙げられる。
【００１９】
ところで、動物細胞の染色体中に導入遺伝子が安定に保持されている形質転換体（いわゆるステーブルな形質転換体）は、導入遺伝子の種類によって取得困難な場合が多々あり、当該プレキシンＡ１に関してもこのステーブルな形質転換体を取得した例は知られていない状況にあった。しかるに、本発明において組換え細胞選択方法の工夫等種々の試行錯誤の結果により、プレキシンＡ１のＤＮＡを安定に保持する形質転換体の取得に初めて成功した。
【００２０】
以上のようにして得られた細胞表面にプレキシンＡ１を発現させた形質転換体は、後述のようにそのまま本発明のスクリーニング系に用いることができるが、当該形質転換体の細胞膜をスクリーニングに用いる場合は、例えば以下のようにして細胞膜を調製することができる。すなわちまず、低張ホモジネートバッファー（１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ若しくは１ｍＭのＡＥＢＳＦ、５μｇ／ｍｌのアプロチニン、５μｇ／ｍｌのロイペプチン；ｐＨ７．４）を添加し、４℃で３０分間程度静置して細胞を低張破壊した後、ピペッティングでホモジナイズし、４℃で５０，０００×ｇ、３０分間遠心分離することにより、細胞膜画分の沈殿物を得る。そして、この沈殿物をトリス−塩酸緩衝生理食塩水（トリス−塩酸緩衝液、１５４ｍＭの塩化ナトリウム；ｐＨ７．４）に懸濁することにより、本発明の細胞膜画分を得ることができる。
その他、例えば F. Pietri-Rouxel（Eur. J. Biochem., 247, 1174-1179(1997)）らの方法などにより、本発明の細胞膜画分を得ることができる。
【００２１】
さらに、後述するように単離したプレキシンＡ１そのものをスクリーニングに使用する場合もあり、その場合は、上記で得られた形質転換体又はその細胞膜画分から単離されたプレキシンＡ１を使用することができる。具体的には、例えば R. G. Shorrら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 2778-2782 (1982)、J. Biol. Chem. 257, 12341-12350(1982))などに記載の方法により、プレキシンＡ１を含む粗抽出液を得ることができ、また、該粗抽出液からプレキシンＡ１を精製する方法としては、例えばJ. L. Benovicら (Biochem., 23, 4510-4518 (1984))の方法などが挙げられる。
【００２２】
さらに、前記したようにプレキシンＡ１（例えばプレキシンＡ１の細胞外ドメイン）を形質転換体から分泌させた場合は、培養上清から、例えば抗プレキシンＡ１抗体を結合させたカラムを用いて、あるいはプレキシンＡ１の細胞外ドメインに通常のペプチドタグを付加した場合はこのタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いて、常法によりプレキシンＡ１を精製することができる。
【００２３】
本発明においてＳｅｍａ６Ｃとは、以前はＳｅｍａＹ（セマフォリンＹ）と呼ばれていたものであり、そのラット及びヒト型の塩基配列及びアミノ酸配列は、国際公開第98/11216号パンフレット及び Moll.Cell.Neurosci.13,9-23(1999)に記載されている。Ｓｅｍａ６Ｃは、細胞外ドメイン中の９６個の塩基が欠失していないスプライシングアイソフォームを有しており、そして、このアイソフォーム（Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｌ）、及び９６個の塩基の欠失したアイソフォーム（Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ)の両方に活性（成長円錐退縮活性）のあることが明らかにされている。（国際公開第98/11216号パンフレット及びMoll.Cell.Neurosci.13,9-23(1999)）。従って、スクリーニングには二つのアイソフォームの片方あるいは両方を用いることが可能である。更に、本質的にＳｅｍａ６Ｃと同様の性質を有する限り、アミノ酸配列の置換・欠失等の改変を施した改変タンパクも用いることができる。
【００２４】
後述するように本発明のスクリーニングにおいては、当該Ｓｅｍａ６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質は被験物質の活性測定に対するコントロールとして用いられるものである。そして、Ｓｅｍａ６Ｃの細胞外ドメインがプレキシンＡ１の細胞外ドメインと結合するため、前記プレキシンＡ１の場合と同様に、Ｓｅｍａ６Ｃの細胞外ドメインを少なくとも有していれば、本発明のスクリーニングにおけるＳｅｍａ６Ｃの役割を果たすことができる。
【００２５】
ここでＳｅｍａ６Ｃの「細胞外ドメイン」とは、前記文献に記載されたＳｅｍａ６Ｃのアミノ酸配列の第１位〜第５９９位の部分、又はこの部分を含み前後２０アミノ酸残基以内のアミノ酸配列よりなる部分を指すが、プレキシンＡ１への結合活性、成長円錐退縮活性、及び／又は細胞収縮活性を有している限り、置換・欠失・付加等の改変を含んだものであっても、Ｓｅｍａ６Ｃの「細胞外ドメイン」の範疇に含まれる。
【００２６】
本発明において「Ｓｅｍａ６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質」とは、前記の細胞外ドメイン部分を少なくとも有しているＳｅｍａ６Ｃの部分タンパク質又は全長タンパク質を指す。また、天然型のみならずそのアミノ酸配列の一部が置換・欠失・付加等改変されたものも、プレキシンＡ１との結合が可能である限り、当該「Ｓｅｍａ６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質」の範疇に含まれる。
【００２７】
Ｓｅｍａ６Ｃの部分又は全長を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、国際公開第98/11216号パンフレット及び Moll.Cell.Neurosci.13,9-23(1999)に記載の配列情報に基づき、適当なＤＮＡ部分をハイブリダイゼーションのプローブ又はＰＣＲのプライマーとし、例えば脳あるいは筋肉由来のｃＤＮＡライブラリー等を用いることによりクローニングすることができる。これらのクローニングは、例えばMolecular Cloning 2nd Edt.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)などの基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。またその改変も、例えば Molecular Cloning 2nd Edt.,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、PCR A Practical Approach IRL Press p200(1991)等の基本書に基づき当業者ならば容易に行うことができる。当該改変はＳｅｍａ６Ｃの細胞外ドメイン以外の部分で行われるのが好ましく、さらに、保存的なアミノ酸への置換が好ましい。
【００２８】
以上のようにして得られたＤＮＡからタンパクを発現させる手法としては、前記のプレキシンＡ１と同様の手法が用いられる。
【００２９】
ここで、本発明のスクリーニングを簡便に行うために、本発明者らは、多くの試行錯誤の結果、Ｓｅｍａ６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質にマーカータンパク質及び／又はペプチドタグを結合させた融合タンパク質を作製したところ、当該融合タンパク質がプレキシンＡ１と明確な結合を示すと同時に生物学的活性を保持しており、本発明のスクリーニングツールとして好適に使用できることを明らかにした。以上のような融合タンパク質は、特に立体構造の不明な蛋白の場合は、融合蛋白であることに起因する形質転換細胞における発現量不足、生物学的活性の消失、安定性の低下、等の問題をきたすため取得は困難であり、Ｓｅｍａ６Ｃに関しても、またＳｅｍａ６Ｃの属するクラス６型セマフォリン全体に関しても、従来は上記融合タンパク質の作製には成功していなかった。
【００３０】
以上のように本発明においてＳｅｍａ６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質の融合タンパク質が取得され、そしてこの融合タンパク質が受容体であるプレキシンＡ１に結合し、また生物学的活性を保持することが明らかとなったことにより、Ｓｅｍａ６Ｃ以外の他のクラス６型セマフォリン（Ｓｅｍａ６Ａ、Ｓｅｍａ６Ｂ）に関しても、同様の融合タンパク質を明細書の記載に従い作製することができ、また当該融合タンパク質がその受容体に結合できることは明らかである。従って本発明は、クラス６型セマフォリンの細胞外ドメインと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質を提供するものである。
【００３１】
ここで「マーカータンパク質」とは、例えばアルカリフォスファターゼ（Cell 63,185-194 (1990)）、抗体のＦｃ領域（Genbank accession number M87789）、ＨＲＰなどの従来よく知られたマーカータンパク質が挙げられる。このうちアルカリフォスファターゼが好ましい。
また「ペプチドタグ」とは、例えばＭｙｃタグ（Glu-Gln-Lys-Lue-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Ile）、Ｈｉｓタグ（His-His-His-His-His-His)、ＦＬＡＧタグ（Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp）などの従来よく知られたペプチドタグが挙げられる。
【００３２】
なお、上記のようなクラス６型セマフォリンの細胞外ドメインにマーカータンパク質やペプチドタグの結合したものは、スクリーニング用途のみならず、神経異常の診断用マーカー（特に、後述するように聴覚神経異常の診断用マーカー）として、また当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００３３】
本発明において「Ｓｅｍａ６Ｃのアゴニスト」とは、受容体であるプレキシンＡ１に結合して、あるいは下流のシグナル伝達分子に作用して、単独でＳｅｍａ６Ｃ様の作用を引き起こす物質、あるいは、Ｓｅｍａ６Ｃ及び／又は受容体であるプレキシンＡ１に結合して、あるいは下流のシグナル伝達分子に作用して、Ｓｅｍａ６Ｃの作用を増強する物質を指す。また本発明において「Ｓｅｍａ６Ｃのアンタゴニスト」とは、Ｓｅｍａ６Ｃ及び／又は受容体であるプレキシンＡ１に結合して、あるいは下流のシグナル伝達分子に作用して、Ｓｅｍａ６Ｃの作用を阻害する物質を指す。
【００３４】
以上のようなスクリーニングツールを用いて実際にＳｅｍａ６Ｃのアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニングを行う方法は、プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質と被験物質とをインビトロで接触させる方法と、当該被験物質をインビボで非ヒト動物に投与する方法とに大別でき、各々につき以下に説明する。
まず、プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質と被験物質とをインビトロで接触させることを特徴とする本発明のＳｅｍａ６Ｃのアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法として、以下の３つの方法を具体的に例示することができる。
【００３５】
１）プレキシンＡ１タンパク質を発現させた細胞を用いる方法
前記の記載に従い作製されたプレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質を発現する細胞を用いて本発明のスクリーニングを行う手法としては、具体的には以下に例示される方法を挙げることができる。
すなわち、Ｓｅｍａ６Ｃのアンタゴニストをスクリーニングする際には、まず前記の記載に従い、Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓとアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）との融合タンパク質Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰを作製する。他方、前記の記載に従いプレキシンＡ１タンパク質を細胞表面に発現した形質転換体を作製する。次にこの細胞に対して、（ｉ）Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰを添加した場合、及び（ii）Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰ及び被験物質を添加した場合の当該Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰの細胞への結合性を、アルカリフォスファターゼ活性により検出する。（ｉ）の場合と比して（ii）の場合の方がＡＰ活性が低い、若しくは無い場合は、その被験物質がＳｅｍａ６Ｃのアンタゴニストであることが示される。詳しくは実施例を参照されたい。 さらに、Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰのプレキシンＡ１タンパク質発現細胞への結合性の代わりに、上記と同様の実験を行なった場合に、プレキシンＡ１タンパク質を発現する細胞にＳｅｍａ６Ｃを加えたときに見られる細胞の変化を被験物質が阻害することを指標にすることも可能である。ここで「細胞の変化」とは、成長円錐退縮や、細胞の収縮等を指す。
【００３６】
またＳｅｍａ６Ｃのアゴニストをスクリーニングする際には、例えば、前記プレキシンＡ１タンパク質を細胞表面に発現した形質転換体に対して、（ｉ）Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰを添加した場合、及び（ii）被験物質を添加した場合や、Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰと被験物質とを添加した場合のプレキシンＡ１タンパク質発現細胞の応答性、例えば成長円錐の退縮、細胞の収縮を比較する。（ｉ）の場合と被験物質のみを添加した（ii）の場合で同じあるいは類似の応答性が認められた場合、その被験物質がＳｅｍａ６Ｃのアゴニストであることが示される。また、被験物質の添加によってＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰを添加した場合に見られるＳｅｍａ６Ｃの作用が増強された場合も、アゴニストであると考えられる。詳しくは実施例を参照されたい。
【００３７】
ここでプレキシンＡ１タンパク質発現細胞は、上記のように組換えプレキシンＡ１タンパク質を細胞表面に発現させた細胞を用いることが簡便であるが、培養下丘ニューロン、後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンのような神経細胞がその細胞表面にプレキシンＡ１タンパク質を発現していることが本発明により明らかとなったため、これらの神経細胞も本発明のスクリーニングにおいて使用することができる。これらの細胞の培養に関しては、国際公開第98/11216号パンフレットや後述の実施例を参照されたい。
【００３８】
なお具体的な検出方法としては、Ｓｅｍａ６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質とプレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質との相互作用から生じるシグナルの有無を検出できる方法であれば特に制限されないが、前記のようにプレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質に対するＳｅｍａ６Ｃの細胞外ドメインを有するタンパク質の結合性を指標とした場合の他、細胞の形態学的変化の測定（Cell 99,59-69(1999)、後述の実施例も参照）や、成長円錐退縮活性の測定（国際公開第98/11216号パンフレット及びMoll.Cell.Neurosci.13,9-23(1999)、後述の実施例も参照）を行うことによっても、本発明のスクリーニングを行うことができる。
【００３９】
２）プレキシンＡ１タンパク質を発現させた細胞膜を用いる方法
前記のプレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質を細胞表面に発現する細胞の代わりにその細胞より調製された細胞膜を用いても、前記１）と同様の手法により、本発明のスクリーニングを行うことができる。この場合は、プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質に対する結合性が測定される。
【００４０】
３）単離精製されたプレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質を用いる方法
先述の記載に基づき単離精製されたプレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質を用いても、本発明のスクリーニングを行うことができる。この場合も、プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質に対する結合性が測定される。
【００４１】
次に、被験物質を非ヒト動物に投与しプレキシンＡ１活性を評価することを特徴とする本発明のＳｅｍａ６Ｃのアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法として例えば以下の方法を具体的に挙げることができる。
ラット、マウス等の野生型非ヒト動物及び／又はプレキシンＡ１をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現した非ヒト動物に被験物質を投与し、成長円錐退縮活性や細胞に対する収縮活性等のプレキシンＡ１活性を評価又は比較・評価することによってセマフォリン６Ｃのアゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングする方法等を具体的に挙げることができる。
【００４２】
本発明において、プレキシンＡ１をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、染色体上のプレキシンＡ１をコードする遺伝子の一部若しくは全部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、かかるプレキシンＡ１を発現する機能を失なった非ヒト動物をいい、また、プレキシンＡ１をコードする遺伝子機能が染色体上で過剰発現する非ヒト動物とは、野生型非ヒト動物に比べてかかるプレキシンＡ１を大量に産生する非ヒト動物をいう。そして、本発明における非ヒト動物としては、マウス、ラット等の齧歯目動物などの非ヒト動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
ところで、メンデルの法則に従い出生してくるホモ接合体マウスには、プレキシンＡ１をコードする遺伝子機能の欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型とが含まれ、これらホモ接合体マウスにおける欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比較実験をすることができることから、野生型の非ヒト動物、すなわち上記プレキシンＡ１をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現した非ヒト動物と同種の動物、さらには同腹の動物を、例えばセマフォリン６Ｃ等のアゴニストやアンタゴニストのスクリーニングに際して併用することが好ましい。以下、かかるプレキシンＡ１をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現した非ヒト動物の作製方法を、プレキシンＡ１ノックアウトマウスやプレキシンＡ１トランスジェニックマウスを例にとって説明する。
【００４４】
プレキシンＡ１ノックアウトマウスは、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、プレキシンＡ１をコードする遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたプレキシンＡ１をコードする遺伝子をウイルスベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシークエンシングにより特定する。このクローンのプレキシンＡ１をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲットベクターを作製する。
【００４５】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、本発明のプレキシンＡ１ノックアウトマウスを作製することができる。また、該ノックアウトマウスが生起しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおける該蛋白質の発現をウエスタンブロット法等により調べる方法を挙げることができる。
【００４６】
プレキシンＡ１トランスジェニックマウスは、プレキシンＡ１遺伝子の発現産物をコードするｃＤＮＡにチキンβ−アクチン、マウスニューロフィラメント、ＳＶ４０等のプロモーター、及びラビットβ−グロビン、ＳＶ４０等のポリＡ又はイントロンを融合させて導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、仮親のマウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することによりトランスジェニックマウスを創製することができる。また、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等より粗ＤＮＡを抽出し、導入したプレキシンＡ１遺伝子をプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
【００４７】
以上のような本発明のスクリーニング方法を用いて選択されたＳｅｍａ６Ｃのアゴニスト又はアンタゴニストは、Ｓｅｍａ６Ｃが神経伸長抑制活性、神経細胞の成長円錐退縮活性を有しているため（国際公開第98/11216号パンフレット）、神経疾患の治療剤又は予防剤として使用され得る。すなわち、Ｓｅｍａ６Ｃのアンタゴニストは神経伸長の促進による神経疾患の治療又は予防剤として使用することができ、Ｓｅｍａ６Ｃのアゴニストは神経伸長の抑制による神経疾患の治療又は予防剤として使用することができる。このように本発明のスクリーニング方法は、神経疾患の治療剤又は予防剤を選別するために有用である。
【００４８】
特に、Ｓｅｍａ６Ｃ結合部位及びプレキシンＡ１が聴覚系の神経組織に一致して局在していたこと、及びＳｅｍａ６Ｃが聴覚神経に対する成長円錐退縮活性を有していたことから明らかなように、当該Ｓｅｍａ６Ｃは聴覚神経の伸長抑制や成長円錐の退縮に関与している。従って本発明のスクリーニング方法は、特に聴覚神経疾患の治療剤又は予防剤の選別に有効であり、特にＳｅｍａ６Ｃのアンタゴニストのスクリーニングにより、聴覚神経の伸長を促進することによる聴覚神経疾患の治療剤又は予防剤を選択することができる。
【００４９】
また、後述するようにプレキシンＡ１は聴覚のみならず嗅覚神経でも発現しているため、本発明のスクリーニング方法は、嗅覚神経疾患の治療剤又は予防剤の選別にも有効に使用される。
【００５０】
さらに、Ｓｅｍａ６ＣはプレキシンＡ１を介して細胞に対する収縮活性を有していることが明らかとなったため、本発明のスクリーニング方法は、プレキシンＡ１発現細胞の収縮を指標とする細胞の遊走抑制又は促進剤を選択することにも利用できる。当該スクリーニングにより得られたＳｅｍａ６Ｃのアゴニストは、細胞の遊走を抑制することにより、例えば癌の転移の治療剤又は予防剤として使用することができ、またＳｅｍａ６Ｃのアンタゴニストは、細胞の遊走を促進することにより、例えば血管新生の促進剤として使用することができる。
【００５１】
本発明はまた、以上のスクリーニング方法により得られた聴覚及び／又は嗅覚神経疾患の治療剤又は予防剤、あるいはプレキシンＡ１発現細胞の遊走阻害剤又は促進剤をも提供するものであり、具体的には、例えばＳｅｍａ６Ｃに対する中和抗体、Ｓｅｍａ６Ｃの改変タンパクの他、低分子化合物ライブラリーを当該スクリーニングに供することにより得られる低分子化合物なども挙げられる（国際公開第98/11216号パンフレット）。
【００５２】
本発明においてはまた、プレキシンＡ１をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部よりなる、中枢神経疾患の診断用プローブ、及び当該プローブを含有してなる中枢神経の疾患の診断薬をも提供するものである。
後述の実施例に記載のように、In situ ハイブリダイゼーション及び免疫染色の手法を用いることにより、本発明においてはじめてプレキシンＡ１の組織分布が明らかとなった。すなわち聴覚系の神経（具体的には蝸牛神経腹側核及び背側核、上オリーブ核群、台形体、腹側及び背側の外側毛様体核、下丘、内側膝状体、大脳皮質聴覚野）においてプレキシンＡ１が特異的に発現していること、及び、嗅覚系の神経（具体的には鋤鼻器と鼻腔の感覚上皮、嗅球の僧帽細胞及び顆粒細胞、外側嗅条、扁桃核）においてもプレキシンＡ１が発現していることが明らかとなった。従って、例えば病理切片に対してプレキシンＡ１の In situ ハイブリダイゼーションを行うことにより、上記に挙げたような神経組織、特に上記聴覚系神経疾患の有無や疾患進行具合を検出することができる。
【００５３】
ここで診断用プローブとしては、プレキシンＡ１をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ（ｃＲＮＡ）のアンチセンス鎖の全部又は一部であり、プローブとして成立する程度の長さ（少なくとも２０ベース以上）を有するものであれば特に制限されるものではない。具体的には、例えばプレキシンＡ１のＯＲＦの第５６４位〜第２７３２位の部分などが挙げられる。当該プローブを診断薬の有効成分とするためには、プローブが分解されないような適当なバッファー類や滅菌水に溶解することが好ましい。またIn situ ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばJ.Neurobiol.29,1-17 (1996)に記載の手法が挙げられる。またin situ PCRの方法をとることも可能である。後述の実施例も参照されたい。
【００５４】
前記診断においては、プローブのみならず、プレキシンＡ１に対する抗体をも使用することができ、この場合は免疫染色法により検出することができる（Dev.Biol.170,207-222(1995); J.Neurobiol.29,1-17(1996)、後述の実施例参照）。抗体は、例えばAntibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D.ら編, Cold Spring Harber Laboratory Press 出版 New York 1989などに記載の方法により容易に作製される。
【００５５】
本発明においてはまた、プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質を発現している細胞又はプレキシンＡ１をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損若しくは過剰発現した非ヒト動物から得られる細胞を、被験物質といっしょにインビトロで培養した後、あるいはマウス、ラット等の野生型非ヒト動物又はプレキシンＡ１をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損若しくは過剰発現した非ヒト動物等の非ヒト動物に被験物質を投与した後、プレキシンＡ１の発現量を測定・評価するプレキシンＡ１発現抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法をも提供するものである。そして、非ヒト動物に被験物質を投与する場合、マウス、ラット等の野生型非ヒト動物の場合とプレキシンＡ１をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現した非ヒト動物の場合とを比較・評価することもできる。
【００５６】
例えば、プレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質を発現する細胞と被験物質とを用いたスクリーニング方法を具体的に説明すると、当該発現細胞を被験物質の存在下で培養し、一定時間培養後細胞膜表面に発現されたプレキシンＡ１の細胞外ドメインを有するタンパク質が減少又は増加したことを免疫化学的に検出して、あるいはｍＲＮＡの発現が抑制又は促進したことを指標として評価することができる。このときのｍＲＮＡの検出法は、ＤＮＡチップ、ノーザンハイブリダイゼーション等の方法で行なうことができる他、プレキシンプロモーターの下流にルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子をつないだ遺伝子を導入した細胞を用いると、被験物質によるプレキシン遺伝子の発現抑制又は促進はそのレポーター遺伝子の活性を指標に検出することが可能である。このスクリーニングで選択されたプレキシンＡ１発現抑制剤又は促進剤は、プレキシンＡ１の発現増強を必要としている患者を治療するのに用いられる医薬組成物や、プレキシンＡ１の発現抑制を必要としている患者を治療するのに用いられる医薬組成物、例えば聴覚神経などのプレキシンＡ１発現細胞の障害が原因となる疾患の治療剤又は予防剤として使用できる。具体的には例えば聴覚障害、嗅覚障害などを挙げることができる。
【００５７】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００５８】
実施例１（プレキシンＡ１特異的モノクローナル抗体の産生）
マウスプレキシンＡ１タンパク質（Biochem.Biophys.Res.Commun.226,524-529(1996)）のアミノ酸（ａａ）８６〜４８０をコードしているｃＤＮＡフラグメントをｐＥＴ−３ｃベクター（Meth.Enzymol.185,60-89(1990)）内に常法によりクローン化し、そして大腸菌内にトランスフェクションした。組換えタンパク質の発現と精製は、報告されている方法（J.Neurobiol.29,1-17(1996)）に従って行った。組換えタンパク質溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を同量のタイターマックス（ＣｙｔＲｘ）と混合し、そしてエーテルで深く麻酔したラット（Wistar；中部化学資材）の足蹠内に２週間間隔で４回注入した。最後の追加免疫後３日目に、鼠径及び膝窩リンパ節から得られたリンパ球を、以前に記載されている方法（Dev.Biol.122,90-100(1987)）により骨髄細胞（Ｐ3Ｘ63Ａg8Ｕ1）と融合させた。ハイブリドーマ細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ; JRH Bioscience）及び１０％のハイブリドーマクローニング因子（Igen）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Nissui）を使用して培養した。ハイブリドーマクローンのスクリーニングは、先ずエリザアッセイ（ＥＬＩＺＡ）によって、続いて報告されている方法（Meth.Enzymol.92,168-174(1983)）に従って実施した。エリザアッセイ陽性ハイブリドーマ培養物の上清液を組織切片の免疫染色用に更に処理し、そしてプレキシンＡ１特異的ハイブリドーマクローンｐｌ１９２を単離した。
【００５９】
プレキシンＡ１組換えタンパク質に対するモノクローナル抗体ｐｌ１９２は、神経系におけるプレキシンタンパク質の分布を調べるために用いられた。この抗体はプレキシンＡ１発現細胞と結合したが（図４Ａ参照）、プレキシンＡ２発現細胞及びプレキシンＡ３発現細胞とは結合しなかった。マウス胚脳のイムノブロットにおいては、モノクローナル抗体ｐｌ１９２はプレキシンＡ１タンパク質であると考えられる１８０ｋＤaのバンドとの結合が認められた（図５Ａ参照）。更に、組織切片に対するモノクローナル抗体ｐｌ１９２の結合パターンは、In situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）で検出されたプレキシンＡ１のｍＲＮＡの局在性とよく一致していたが、プレキシンＡ２又はプレキシンＡ３のｍＲＮＡの局在性とは明確に異なっていた。以上の結果よりモノクローナル抗体ｐｌ１９２がプレキシンＡ１タンパク質を特異的に認識することが示された。
【００６０】
実施例２（免疫染色）
種々の発生時期又は出生後のＩＣＲ系マウス（中部化学資材）の胚又は脳を、４％のパラホルムアルデヒドを含む１０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）中で一夜固定した。報告されている方法（Dev.Biol.170,207-222(1995); J.Neurobiol.29,1-17(1996)）に従って胚又は出生後マウス脳から凍結切片（厚さ１４μｍ）を作製し、免疫組織化学に用いた。まず、作製した凍結切片を抗プレキシンＡ１抗体（ｐｌ１９２）で処理した後、この切片に結合した抗プレキシンＡ１抗体に蛍光（ｃｙ−２又はｃｙ−３）標識された抗ラットＩgＧ抗体（Amersham）を結合させて蛍光顕微鏡下で観察した。また、以下、膣栓が検出された日を胎生０．５日（Ｅ０．５）と呼ぶこととする。
【００６１】
実施例３（イムノブロット）
培養した下丘細胞（後述）をＳＤＳを含む緩衝液で可溶化し、これに含まれるタンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥ（１２．５％のゲル）による電気泳動法で分離し、そしてニトロセルロース膜（Ｓ＆Ｓ）に転移した。ニトロセルロース膜をブロッキング溶液と一緒に４℃で１２時間インキュベートし、続いて抗プレキシンＡ１抗体ｐｌ１９２と一緒に２時間インキュベートした。結合した抗プレキシンＡ１抗体をビオチン化抗ラットＩgＧ（Amersham）及びエリートキット（Vector laboratories）を使用して視覚化した。
【００６２】
実施例４（In situ ハイブリダイゼーション）
In situ ハイブリダイゼーションは、報告されている方法（J.Neurobiol.29,1-17(1996)）に従って実施した。35Ｓ−標識アンチセンス及びセンスｃＲＮＡプローブはそれぞれ、プレキシンＡ１・ＯＲＦの５６４〜２７３２ｂｐ、プレキシンＡ２・ＯＲＦの２２３３〜２９８８ｂｐ、及びプレキシンＡ３・ＯＲＦの１２９６〜２３８９ｂｐに相当するサブクローン化したｃＤＮＡフラグメント（Biochem.Biophys.Res.Commun.226,396-402(1996)；Biochem.Biophys.Res.Commun.226,524-529(1996)）から転写させて作製した。
【００６３】
実施例５（下丘組織片及び下丘単離細胞の培養）
１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥ培地を使用してコラーゲン（Cellmatrix；新田ゼラチン）塗布した３０ｍｍの培養皿（Nunc）中で、Ｅ１６．５マウス胚の脳から摘出した下丘組織片を培養した。下丘単離細胞は、下丘組織片をトリプシンで処理することによって取得した。下丘単離細胞をＰＬＬ（１００μｇ／ｍｌ）とマウスラミニン（２０μｇ／ｍｌ；Gibco BRL）を塗布した２４ウェルプレートの各ウェルあたり５×１０5個の細胞密度で培養した。ニューロンを含まない培養物を得るために、２日目の初代細胞培養物をＥＤＴＡで単一細胞に分離し、そしてその後再度培養した。
【００６４】
実施例６（プレキシンｃＤＮＡのトランスフェクション）
全長のマウスプレキシンＡ１タンパク質（ａａ １〜１８９４；Biochem.Biophys.Res.Commun.226,524-529(1996)）をコードしているｃＤＮＡを常法によりクローニングし、最初のＡＴＧの前にコザック配列（Nucleic Acid Res.15,8125-8148(1987)）を挿入し、そしてその後発現ベクターｐＣＡＧＧＳ（Gene 108,193-199(1991); Dr. Miyazakiから寄贈）のクローニング部位に挿入した。マウスプレキシンＡ２タンパク質（ａａ １８〜１８８４；Biochem.Biophys.Res.Commun.226,396-402(1996)）及びプレキシンＡ３タンパク質（aa 20〜1872; Biochem.Biophys.Res.Commun.226,396-402(1996)）をコードしているｃＤＮＡを常法によりクローニングし、これらのＮ末端にマウスＳｅｍａ３Ａのシグナル配列（Neuron 14, 941-948 (1995)）とｍｙｃ−ｔａｇ（ＧＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）を付加し、その後発現ベクターｐＣＡＧＧＳに挿入した。プレキシンＡ１又はプレキシンＡ２を発現する安定形質転換細胞を取得するために、プレキシンＡ１又はプレキシンＡ２発現ベクターとｐＳＴ−ｎｅｏＢ（Cell Struct.Funct.12,575-580(1987)）を同時にリン酸カルシウム法（Mol.Cell.Biol.7,2745-2752(1987)）によりＬ細胞に導入し、Ｇ４１８（GIBCO）により選択した。プレキシンＡ２又はプレキシンＡ３をＣＯＳ７細胞中で一過的に発現させるために、LipofectoAMINE 試薬（GIBCO-BRL）を用いてプレキシンＡ２及びプレキシンＡ３発現ベクターをトランスフェクションした。これらのＬ細胞とＣＯＳ７細胞は１０％のＦＢＳを有するＤＭＥ培地を用いて培養した。
【００６５】
実施例７（Ｓｅｍａ６Ｃ−アルカリホスファターゼ融合タンパク質の産生）
ラットＳｅｍａ６Ｃの短いスプライスバリアント（Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ；Moll.Cell.Neurosci.13,9-23(1999)）の細胞外ドメインをコードしているｃＤＮＡ（前記文献記載のアミノ酸配列の第１位〜第５９９位に相当する部分）のＣ末端側にヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＡＰ; Cell 63,185-194 (1990)）の配列を融合し、そしてＨｉｓ６−ｔａｇ配列（Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2 (1996)）をＣ末端に配置し、その後哺乳類発現ベクターｐＣＥＰ４（FEBS Lett.333,61-66 (1993)、Invitrogen）に挿入した。このＳｅｍａ６Ｃ−アルカリホスファターゼ融合タンパク質（Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰ）発現ベクターをＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（ロッシュ）でＣＯＳ７細胞に導入し、融合タンパク質Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰをその培養上清中に一過的に発現させた。その後培養上清を採集し、以前に報告されている（J.Neurosci.17,9163-9193(1997)）ようにしてＮｉ-ＮＴＡカラム（Qiagen）を使用してＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰをアフィニティー精製した。
【００６６】
実施例８（Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰの細胞表面結合）
プレキシンＡ１発現Ｌ細胞と非発現Ｌ細胞（親株）を、ＰＬＬでコートした２４ウエルの培養皿（住友ベークライト）に播いた。これらの細胞は、１％のＦＣＳ及び種々の濃度のＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰを含有するＨＢＨＡ溶液（Cell 63,185-194 (1990)）２５０μｌと一緒に氷上で１時間インキュベートした。ＨＢＨＡ溶液を除去した後、細胞表面に結合したＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰを可溶化するために、細胞を２５０μｌの 溶解液（最終濃度で１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１％のトリトンＸ−１００；ｐＨ８．０）に溶解した。細胞溶解物は、以前に記載されているようにして（Cell 63,185-194 (1990)）、比色分析に付してＡＰ活性を測定した。
【００６７】
実施例９（培養ニューロン及び脳に対するＳｅｍａ６Ｃの結合）
Ｅ１６．５マウス胚から得た下丘組織片培養又は摘出脳をメタノールにより０℃で５秒間固定した後、Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰと一緒に３７℃で１時間インキュベートした。これらの標本をＨＢＨＡ緩衝液で５回洗浄し、下丘組織片培養は４％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で、また摘出脳は５０％のアセトンと２％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で再固定した。標本をＰＢＳで洗浄し、６５℃で１時間保温して内在性ＡＰを不活性化し、ＴＢＳＴで洗浄し、そしてその後ＮＢＴ／ＢＣＩＰを添加することで標本に結合したＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰを視覚化した。
【００６８】
実施例１０（成長円錐退縮の検出）
Ｅ８ニワトリ胚及びＥ１２．５マウス胚から得られる後根神経節（ＤＲＧ）を、１０％のＦＢＳ及び２０ｎｇ／ｍｌの２．５ＳＮＧＦ（WAKO）を含有するＤＭＥ培地を用いて、ＰＬＬ（１００μｇ／ｍｌ）とマウスラミニン（２０μｇ／ｍｌ；Gibco BRL）を塗布した培養皿中で培養した。ニワトリＤＲＧは培養開始後２０時間目に、またマウスＤＲＧは１２時間目に、アフィニティー精製Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰをこれら培養物にそれぞれ添加し、さらに１時間培養後、グルタルアルデヒドなどで固定し、顕微鏡下で成長円錐の退縮した神経突起数の割合を算出した。
【００６９】
実施例１１（Ｓｅｍａ６Ｃによって誘導される細胞形態学的変化の検出）
プレキシンＡ１を発現するＬ細胞、プレキシンＡ２を発現するＬ細胞及びプレキシン非発現細胞（親株）は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭとＨａｍ−Ｆ１２（ニッスイ）の１:１混合物で ２４ウエルの培養皿（２×１０4個の細胞／ウエル）中、２日間培養した。これら培養物に１６５ｎＭのＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰを３７℃で添加し、さらに１時間培養した後、培養物を固定して細胞のサイズを測定した。
【００７０】
実施例１２（前庭蝸牛系におけるプレキシンの発現）
実施例１２−１  内耳におけるプレキシンの発現
In situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）及び免疫蛍光染色により、内耳におけるプレキシンＡ１及びプレキシンＡ３の発現を調べた。その結果（顕微鏡写真）を図１に示す。図１Ａ〜図１ＤはＩＳＨ分析で検出されたプレキシンＡ１及びプレキシンＡ３のｍＲＮＡの分布を示し、Ｅ１６．５胚から得られる内耳切片をプレキシンＡ１のｃＲＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせた場合が図１Ａ及び図１Ｂに、プレキシンＡ３のｃＲＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせた場合が図１Ｃ及び図１Ｄにそれぞれ示されている。プレキシンＡ１及びプレキシンＡ３のｃＲＮＡプローブとのＩＳＨシグナルは、らせん神経節（ＳＧ）及び前庭神経節（ＶＧ）では強いが、蝸牛レセプター（ＣＲ）、卵形嚢斑（ＵＭ）、球形嚢斑（ＳＭ）、膨大部稜（ＡＣ）及び膜迷路の非感覚上皮（矢印）では弱かった。
【００７１】
図１Ｅ〜図１ＨはＥ１６．５胚から得られる内耳切片の抗プレキシンＡ１抗体ｐｌ１９２による免疫蛍光染色の結果を示す。このモノクローナル抗体ｐｌ１９２はらせん神経節（ＳＧ）とその遠心性線維（ＳＧｅ）及び求心性線維（ＳＧａ）、前庭神経節（ＶＧ）とその遠心性線維（ＶＧｅ）、蝸牛レセプター（ＣＲ）、膨大部稜（ＡＣ）、球形嚢斑（ＳＭ）及び膜迷路の非感覚上皮（矢印）と結合した。なお、図１Ａ〜図１Ｄの目盛り線は２００μｍを、図１Ｅ〜図１Ｈの目盛り線は１００μｍをそれぞれ表している。
【００７２】
以上のように、Ｅ１６．５胚では、プレキシンＡ１のｍＲＮＡの強いＩＳＨシグナルはらせん神経節及び前庭神経節で検出され（図１Ａ、Ｂ）、モノクローナル抗体ｐｌ１９２を用いた免疫染色で、プレキシンＡ１タンパク質がらせん神経節とその遠心性及び求心性線維、前庭神経節とその遠心性線維に局在していることが示され（図１Ｅ〜Ｈ）、また蝸牛レセプター（コルチ器官; 図１Ｅ）、膨大部稜（図１Ｆ）、球形嚢斑（図１Ｈ）や卵形嚢斑のような前庭レセプター及び膜迷路の非感覚上皮（図１Ｆ）においても、これらの領域でのプレキシンＡ１のｍＲＮＡに対するＩＳＨシグナルは弱かったが、モノクローナル抗体ｐｌ１９２に対して免疫陽性であることがわかった（図１Ａ、Ｂ参照）。他方、プレキシンＡ３のｍＲＮＡのＩＳＨシグナルは、らせん神経節及び前庭神経節では強く、Ｅ１６．５胚の膜迷路では中程度であった（図１Ｃ、Ｄ）。なお、プレキシンＡ２のｍＲＮＡ転写物は、内耳並びにらせん神経節及び前庭神経節では全く検出されなかった。
【００７３】
実施例１２−２  中枢聴覚路におけるプレキシンの発現
In situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）及び免疫蛍光染色により、中枢聴覚路におけるプレキシンＡ１、プレキシンＡ２及びプレキシンＡ３の発現を調べた。その結果（顕微鏡写真）を図２に示す。図２Ａ、図２Ｃ、図２Ｄ及び図２ＦはＩＳＨ分析で検出されたＥ１６．５胚の脳幹冠状切片におけるプレキシンＡ１のｍＲＮＡの分布を、図２Ｅは同じくプレキシンＡ２のｍＲＮＡの分布を、図２Ｂは同じくプレキシンＡ３のｍＲＮＡの分布を示す。プレキシンＡ１のｃＲＮＡプローブとの強いＩＳＨシグナルが、蝸牛核（ＣＮ）、上オリーブ核複合体及び台形体に相当する領域（ＳＯ/ＴＢ）、外側毛帯の腹側核（ＶＬＬ）、下丘（ＩＣ）、並びに内側膝状体（ＭＧＢ）で検出され、プレキシンＡ２のｍＲＮＡは下丘の中心部分にのみ検出され、またプレキシンＡ３プローブに対するシグナルは脳幹の殆どの部分で検出された。また、図２ＧはＥ１６．５胚の下丘冠状切片のモノクローナル抗体ｐｌ１９２による免疫蛍光染色の結果を示し、この抗体は外側毛帯（II）、下丘のニューロピル（星印）、下丘腕（ｂｉｃ）及び下丘の交連線維（ｃｉｃ）と結合した。なお、図２中の目盛り線は２００μｍを表している。
【００７４】
以上のように、プレキシンＡ１は中枢聴覚路を構成する全ての核で発現が認められ、Ｅ１６．５胚では強いＩＳＨシグナルが蝸牛神経を受容する背側及び腹側蝸牛核（図２Ａ）、上オリーブ核コンプレックス及び台形体に相当する領域、並びに外側毛帯の腹側及び背側核（図２Ｃ）で検出されたが、前庭神経を受容する前庭核（ＶＮ）では非常に弱いか殆ど皆無であった（図２Ａ参照）。プレキシンＡ１の発現は、脳幹聴核（外側毛帯）から出る上行性線維が全て集中している下丘（図２Ｄ）及び下丘から線維を受け取る内側膝状体（下丘腕）（図２Ｆ）で最も顕著であり、聴覚皮質を含む新皮質の殆どの部分で発現されていた（データは示さず）。また、モノクローナル抗体ｐｌ１９２による免疫組織化学により、外側毛帯、下丘腕及び下丘の交連線維において強い免疫陽性反応が認められた（図２Ｇ）。なお、プレキシンＡ１は出生後０日（Ｐ０）及び３日（Ｐ３）目のマウスの聴覚路の全ての中心核で発現していたが、成熟マウスでは発現していなかった（データは示さず）。
【００７５】
一方、プレキシンＡ２は下丘の中心部分を除いて聴覚及び前庭経路では発現されず（図２Ｅ）、プレキシンＡ３のｍＲＮＡに対するＩＳＨシグナルは、Ｅ１６．５胚（図２Ｂ）並びにＰ０及びＰ３マウスの聴覚及び前庭経路の中心核を含むＣＮＳ（中枢神経系）の殆どの部分で検出されたが、成熟マウスでは検出されなかった。
【００７６】
実施例１３（嗅覚系におけるプレキシンの発現）
脊椎動物の嗅覚系は、解剖学的及び機能的に異なる２つのニューロン経路、即ち主嗅覚路及び副嗅覚路に分けられ、In situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）及び免疫蛍光染色により、嗅覚系におけるプレキシンＡ１、プレキシンＡ２及びプレキシンＡ３の発現を調べたところ、その結果（顕微鏡写真）を示す図３から、これら３種のマウスプレキシンは上記２つの嗅覚路で異なる発現パターンを示すことがわかった。なお、図３における目盛り線は２００μｍを表している。
【００７７】
実施例１３−１  嗅覚及び鋤鼻レセプターにおけるプレキシンの発現
図３Ａ及び図３Ｂは、それぞれＥ１６．５胚の鼻腔冠状切片におけるプレキシンＡ１のｍＲＮＡの分布及びプレキシンＡ３のｍＲＮＡの分布を示しており、プレキシンＡ１プローブとプレキシンＡ３プローブの両者に対する強いＩＳＨシグナルが嗅上皮（ＯＥ）で、そして中程度のシグナルが呼吸上皮（ＲＥ）で検出された。また図３Ｃには、Ｅ１６．５胚の鼻腔切片のモノクローナル抗体ｐｌ１９２による免疫蛍光染色の結果が示され、この抗体が嗅神経線維（矢印）と結合したことが観察された。そしてまた図３Ｄ及び図３Ｆには、それぞれＥ１６．５胚及びＰ０マウスの鋤鼻器官（ＶＮＯ）切片におけるプレキシンＡ１のｍＲＮＡの分布が示され、図３Ｇには同じくプレキシンＡ３のｍＲＮＡの分布が示されており、プレキシンＡ１プローブとプレキシンＡ３プローブに対するＩＳＨシグナルは、鋤鼻レセプター層（ｖｎｒ）や非感覚上皮（図３Ｆ及び図３Ｇ中の矢印）で検出されるが、支持細胞層（ｓｃ）では検出されなかった。さらに図３Ｅには、Ｅ１６．５胚の鋤鼻器官切片のモノクローナル抗体ｐｌ１９２による免疫蛍光染色の結果が示され、プレキシンＡ１タンパク質が鋤鼻神経に局在（矢印）していることを示している。
【００７８】
以上のように、プレキシンＡ１のｍＲＮＡに対するＩＳＨシグナルは、Ｅ１６．５胚の鼻腔（図３Ａ）と鋤鼻器官（図３Ｄ）の両方の感覚上皮で検出され、鋤鼻感覚上皮におけるプレキシンＡ１の発現はＰ０マウスではより強くなっており（図３Ｆ）、支持細胞層ではなくて感覚細胞層に限定されていた。また、モノクローナル抗体ｐｌ１９２による免疫組織化学によって、プレキシンＡ１タンパク質は嗅神経線維（図３Ｃ）と鋤鼻神経線維（図３Ｅ）に局在していることがわかった。一方、プレキシンＡ３のｍＲＮＡに対するＩＳＨシグナルは、Ｅ１６．５胚並びにＰ０及びＰ３マウスの嗅上皮及び鋤鼻上皮で検出され（図３Ｂ及び図３Ｇ）、鋤鼻上皮ではその感覚細胞層に限定されていた。そして、プレキシンＡ１及びプレキシンＡ３のｍＲＮＡの発現は、嗅覚上皮又は鋤鼻感覚上皮の範囲内では領域的相違を全く示さなかったのに対し、プレキシンＡ２のｍＲＮＡは試験したどの発生段階においても嗅上皮及び鋤鼻上皮では発現しなかった。
【００７９】
実施例１３−２  嗅球におけるプレキシンの発現
図３Ｈ及び図３ＩにはそれぞれＥ１６．５胚及びＰ３マウスの嗅球の冠状切片におけるプレキシンＡ１のｍＲＮＡの分布が示され、図３Ｊ及び図３ＫにはそれぞれプレキシンＡ２及びプレキシンＡ３のＰ３マウスの嗅球の冠状切片におけるｍＲＮＡの分布が示されている。プレキシンＡ１は、Ｅ１６．５胚では副嗅球（ＡＯＢ）の僧帽細胞層（ｍａ）と顆粒細胞層（ｇａ）で強く発現しており、そして主嗅球（ＭＯＢ）の僧帽細胞層（ｍｍ）と顆粒細胞層（ｇｍ）では中程度に発現していた（図３Ｈ）。主嗅球及び副嗅球から出る求心性線維で構成されている外側嗅条は、モノクローナル抗体ｐｌ１９２に対して免疫陽性であった（データは示さず）。Ｐ０及びＰ３マウスでは、プレキシンＡ１の発現は主嗅球では顕著に減少していたが、副嗅球では強かった（図３Ｉ）。また成熟嗅球では、プレキシンＡ１ ｍＲＮＡは全く検出されなかった。一方、プレキシンＡ２の嗅球における発現は、プレキシンＡ１の発現に対してほぼ相補的であり、プレキシンＡ２のｍＲＮＡに対するＩＳＨシグナルは、Ｅ１６．５胚並びにＰ０及びＰ３マウスの主嗅球（ＭＯＢ）の僧帽細胞層（ｍｍ）及び房状分岐細胞層（ｔｆ）で観察されたが、副嗅球（ＡＯＢ）では観察されなかった（図３Ｊ）。そして、成熟マウスにおけるプレキシンＡ２の主嗅球の僧帽細胞での発現は弱かった。他方、プレキシンＡ３は、Ｅ１６．５胚並びにＰ０及びＰ３マウスの主嗅球の僧帽及び房飾細胞並びに副嗅球の僧帽細胞及び顆粒細胞で発現していた（図３Ｋ）が、成熟マウスにおいては、主嗅球及び副嗅球の両方の僧帽細胞で弱く発現していた。
【００８０】
実施例１３−３  嗅覚路におけるプレキシンの発現
図３Ｌ〜図３Ｎは、Ｅ１６．５胚の終脳尾側から作られた冠状切片におけるそれぞれプレキシンＡ１のｍＲＮＡ、プレキシンＡ２のｍＲＮＡ及びプレキシンＡ３のｍＲＮＡの分布を示しており、これら３種のプレキシンが嗅覚路の中心核で異なる発現パターンを示すことがわかった。すなわち、Ｅ１６．５胚では、プレキシンＡ１のｍＲＮＡに対する強いＩＳＨシグナルが副嗅覚路の中心核、例えば後皮質扁桃核（ＰＣｏ）及び内側扁桃核で検出されたが、主嗅覚路の核では検出されなかった（図３Ｌ）が、反対にプレキシンＡ２に対するＩＳＨシグナルが主嗅覚路の中心核、例えば前嗅核、梨状皮質（Ｐｉｒ)、嗅内野皮質及び外側扁桃核（Ｌａ）で検出され、副嗅覚路の核では検出されなかった（図３Ｍ）。これに対し、プレキシンＡ３は主嗅覚路及び副嗅覚路の両方の全ての中心嗅核で発現していた（図３Ｎ）。また、Ｐ０及びＰ３マウスの中心嗅核における３種のプレキシンの発現パターンは、上記Ｅ１６．５胚における発現パターンと基本的に同一であった。そして、成熟嗅覚路では、プレキシンＡ２及びプレキシンＡ３のｍＲＮＡに対する弱いＩＳＨシグナルが主嗅覚路の中心核で検出されたが、プレキシンＡ１のｍＲＮＡに対するＩＳＨシグナルは検出されなかった。
【００８１】
実施例１４（プレキシンＡ１のリガンドとしてのＳｅｍａ６Ｃの同定）
神経系の発生におけるプレキシンの機能に対する更なる知見を得るためには、プレキシンと相互作用するリガンドの同定が必須であり、このようなリガンドをスクリーニングするために、前記実施例６記載の方法に従い全長のマウスプレキシンＡ１のｃＤＮＡでＬ細胞をトランスフェクションして、プレキシンＡ１タンパク質を発現するトランスフェクタント（安定形質転換細胞）を取得した。図４Ａ及び図４Ｂには、抗プレキシンＡ１抗体ｐｌ１９２を用いたプレキシンＡ１発現Ｌ細胞及び対照としてのプレキシンＡ１非発現Ｌ細胞の免疫染色の結果が示されており、この抗体がプレキシンＡ１発現Ｌ細胞表面にのみ結合していることから、プレキシンＡ１がトランスフェクタントの細胞表面に局在していることが確かめられた。
【００８２】
次に、プレキシンＡ１を発現するトランスフェクタントと結合する分泌型及び膜貫通型セマフォリンをスクリーニングし、Ｓｅｍａ６ＣがプレキシンＡ１と結合することを以下のようにして確認した。まず、プレキシンＡ１との結合実験を行うために、Ｓｅｍａ６Ｃの細胞外ドメイン中の３２アミノ酸の有無による２つのスプライシングアイソフォームのうち、３２アミノ酸領域を欠くアイソフォーム（Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ）の細胞外ドメインにＡＰタグを付した組換えタンパク質（Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰ）を調製した。このＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰと前記トランスフェクタント（プレキシンＡ１発現Ｌ細胞）とを用いて結合実験を行った。Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰが、プレキシンＡ１発現Ｌ細胞と強く結合したことが図４Ｃに、対照のプレキシンＡ１非発現Ｌ細胞（親株）とは結合しなかったことが図４Ｄにそれぞれ示されている。なお、図４Ａ〜Ｄにおける目盛り線は１００μｍを表している。
【００８３】
また、実施例８記載の方法により、プレキシンＡ１に対するＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰの結合に関する定量分析を行った。結果を図４Ｅに示すが、図４Ｅにおいては、プレキシンＡ１に対するＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰの特異的結合を求めるために、プレキシンＡ１非発現Ｌ細胞との非特異的結合に起因するＡＰ活性が差し引かれて示されている。また、図４Ｅのデータに由来するスキャッチャードプロットが図４Ｆに示され、スキャッチャード分析によるプレキシンＡ１とＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰとの結合の推定解離定数（ＫD）は１６．５ｎＭであった。また、モノクローナル抗体ｐｌ１９２及びプレキシンＡ１組換えタンパク質に対する抗血清のいずれもＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰとプレキシンＡ１との結合を遮断することがなかった。そして、Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰはプレキシンＡ２又はプレキシンＡ３タンパク質を発現するＣＯＳ７細胞とは結合せず、またニューロピリン−１を発現するＬ細胞とも結合しなかった。ＡＰ融合Ｓｅｍａ３Ａ（Cell 90, 753-762 (1997)）、ＡＰ融合Ｓｅｍａ４Ｃ（Ｍ-Ｓｅｍａ Ｆ; FEBS Lett.370,269-272 (1995)）又はＡＰ融合Ｓｅｍａ４Ｄ（Ｍ-Ｓｅｍａ Ｇ; J.Biol.Chem.271,33376-33381(1996)）の細胞外ドメインや、イムノグロブリンＦｃ領域とＡＰとの融合タンパク質は、いずれもプレキシンＡ１発現細胞に結合しなかった。
【００８４】
実施例１５（ニューロンに対するＳｅｍａ６Ｃの結合）
Ｓｅｍａ６Ｃがニューロンで発現された天然プレキシンＡ１タンパク質と結合することを確認するために、前記実施例５記載の方法に従いＥ１６．５マウス胚下丘単離細胞を調製し、２日間培養を行った初代培養物は多数のニューロンを含有していた。また、この初代培養から二次培養を行い、ニューロンを含まずグリア細胞を多く含むものを作製した。これらの細胞にモノクローナル抗体ｐｌ１９２を用いて免疫ブロットを行ったところ、１８０ｋＤａの位置にプレキシンＡ１タンパク質であると考えられるｐｌ１９２陽性バンドが、多数のニューロンを含む下丘初代培養の溶解物中に検出された（図５Ａレーン１の星印）が、ニューロンを含まずグリア細胞で構成される二次培養では検出されなかった（図５Ａレーン２）。これらの結果から、プレキシンＡ１はニューロンでは発現されるがグリア細胞では発現されないことが示された。また、Ｅ１６．５胚の下丘外植片培養物に対するモノクローナル抗体ｐｌ１９２による免疫蛍光染色を行ったところ、下丘フラグメント（図５Ｂ中の星印）、神経突起（図５Ｂ中の矢印）並びに成長円錐（図５Ｃ中の鏃）はモノクローナル抗体ｐｌ１９２に対して免疫陽性であり、殆どの下丘ニューロンがプレキシンＡ１を発現していることが明らかとなった。
【００８５】
次に、前記下丘組織片へのＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰの結合を検討した結果を図５Ｄ（明視野画像）及び図５Ｅ（位相差画像）に示す。これらの結果から、Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰはニューロン含有移植片（星印）及び神経突起とは結合したが、非ニューロン細胞（矢印）とは結合しないことがわかる。なお、Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰはプレキシンＡ１を発現しない培養上丘ニューロンとは結合しなかった（図２Ｄ参照）。また、図５Ｆ及び図５Ｇに、Ｅ１６．５胚の摘出脳に対するＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰとＡＰ（１０ｎＭ）との結合結果を示す。Ｅ１６．５胚から得られた摘出脳における多量のプレキシンＡ１タンパク質が局在している箇所、すなわち外側毛帯（II）、下丘（ＩＣ）、下丘腕（ｂｉｃ）、内側膝状体（ＭＧＢ）から出る聴放線（ａｒ）などの聴放線を含む聴覚神経核及び神経束においてＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰの顕著な結合が検出された。なお目盛り線はそれぞれ、図５Ｂでは１００μｍ、図５Ｃでは５０μｍ、図５Ｄ及び図５Ｅでは２５０μｍ、そして図５Ｆ及び図５Ｇでは１ｍｍで表されている。
【００８６】
実施例１６（Ｓｅｍａ６Ｃによって誘導される成長円錐退縮）
アフィニティー精製したＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰを、Ｅ８ニワトリ胚及びＥ１２．５マウス胚から得られる後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン並びにＥ１６．５マウス胚から得られる下丘ニューロンの移植片培養物に加え３７℃で１時間処理し、実施例１０記載の方法に従いＳｅｍａ６Ｃの成長円錐退縮活性を測定した。その結果をそれぞれ図６Ａ〜図６Ｃに示す。図６Ａ（３つの独立した試験から得られた成長円錐退縮の平均パーセント）に示されるように、Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰはニワトリ胚ＤＲＧニューロンで用量依存的に成長円錐の退縮を惹起し、１６５ｎＭ添加でほぼ１００％の成長円錐退縮が観察された。これに対して、図６Ｂ及び図６Ｃ（共に３つの独立した試験から得られた平均パーセント）に示されるように、同量（１６５ｎＭ）のＳｅｍａ６Ｃ（中黒カラム）又は対照緩衝液（Ｃｏｎｔ；中抜きカラム；１％のＦＢＳを含有する１０ｍＭのＨＥＰＥＳ；Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰ組換えタンパクに対する透析緩衝液）を上記培養物に添加したとき、マウス胚ＤＲＧニューロンでは、Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰが５０％の成長円錐退縮を誘導し（図６Ｂ；ｐ＝０．００１）、また培養下丘ニューロンに対しては、Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰで２０％の成長円錐退縮が観察された（図６Ｃ；ｐ＝０．００１）。
【００８７】
実施例１７（Ｓｅｍａ６Ｃによって誘導される細胞収縮）
プレキシンＡ１がＳｅｍａ６Ｃで誘発されるシグナルを細胞内に伝播し得るかどうかを試験するために、プレキシンＡ１発現Ｌ細胞、プレキシンＡ２発現Ｌ細胞及びプレキシン非発現Ｌ細胞にＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰを加え、実施例１１記載の方法に従い細胞の形態を観察した。図７には、１６５ｎＭのＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰ又は対照緩衝溶液（Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰ用の透析緩衝液）を上記プレキシンＡ１発現細胞、プレキシンＡ２発現細胞及びプレキシン非発現細胞の各培養物に添加し、３７℃で１時間培養後の各細胞の形態学的変化が示されている。図７Ａ及び図７Ｂには、Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰ処理又は対照緩衝液処理したプレキシンＡ１発現細胞の結果（位相差顕微鏡）が図示され、また図７Ｃ〜図７Ｅには、Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰ処理又は対照緩衝液処理した、それぞれプレキシンＡ１発現Ｌ細胞、プレキシンＡ２発現Ｌ細胞及びプレキシン非発現Ｌ細胞の細胞サイズに関する定量分析結果が、２５×２５μｍ2（６２５μｍ2）、５０×５０μｍ2（２，５００μｍ2）及び１００×１００μｍ2（１０，０００μｍ2）の四角より小さな細胞のパーセントをプロットすることにより示されている。なお、図７Ｃ〜図７Ｅにおける各点は、３つのウエルから得られる９つの独立した領域の平均的なパーセントである。なお、図７Ａ及び図７Ｂにおける目盛り線は５０μｍで表されている。
【００８８】
ニワトリＤＲＧニューロンの成長円錐の完全な退縮を誘導するのに十分な１６５ｎＭのＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰ（図６Ａ参照）をプレキシンＡ１発現細胞に添加し３７℃で１時間培養後に固定し、細胞サイズを測定したところ顕著に縮小した（図７Ａ）。また、細胞サイズの半定量測定によって、プレキシンＡ１を発現する細胞のサイズがＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰによって顕著に縮小したことがわかった（図７Ｃ）。同じ量（１６５ｎＭ）のＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰでプレキシンＡ２発現Ｌ細胞（図７Ｄ）又はプレキシン非発現Ｌ細胞（図７Ｅ）を処理しても形態変化は認められなかった。Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰはプレキシンＡ１発現Ｌ細胞の細胞サイズの縮小を誘導したが、プレキシンＡ２発現Ｌ細胞及びプレキシン非発現Ｌ細胞では誘導しなかったとの結果により、Ｓｅｍａ６Ｃで誘発されるシグナルがプレキシンＡ１に対するＳｅｍａ６Ｃの特異的な相互作用によって細胞内に伝播されることが確認された。
【００８９】
実施例１８（プレキシンＡ１発現細胞を用いたＳｅｍａ６Ｃのアンタゴニストのスクリーニング）
実施例１４に記載されたＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰとプレキシンＡ１発現細胞との結合実験に、さらに被験物質を添加することにより、Ｓｅｍａ６Ｃのアンタゴニストをスクリーニングすることができる。すなわち、実施例７記載の方法により調製されたＳｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰと、実施例６記載の方法により調製されたプレキシンＡ１タンパクを細胞表面に発現する形質転換体とを用い、このプレキシンＡ１発現細胞に対して、（ｉ）Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰを添加した場合、及び（ii）Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰ及び被験物質を添加した場合の当該Ｓｅｍａ６Ｃ−Ｓ−ＡＰの前記発現細胞への結合性をアルカリフォスファターゼ活性により検出し、（ｉ）の場合と比して（ii）の場合の方がＡＰ活性が低い、あるいはＡＰ活性が無い被験物質を選択する。
【００９０】
【発明の効果】
本発明により、プレキシンＡ１を用いたＳｅｍａ６Ｃのアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法、及び当該スクリーニングのためのスクリーニングツールなどを提供することができる。また、Ｓｅｍａ６Ｃは神経細胞に対する成長円錐退縮活性、細胞に対する収縮活性を有しているため、本発明のスクリーニング方法により得られるＳｅｍａ６Ｃのアゴニスト又はアンタゴニストは、これらＳｅｍａ６Ｃ活性の欠失又は過剰発現に起因する疾患の治療剤又は予防剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  In situハイブリダイゼーション及び免疫蛍光染色による、内耳におけるプレキシンＡ１及びプレキシンＡ３の発現結果を示す図である。
【図２】  In situハイブリダイゼーション及び免疫蛍光染色による、中枢聴覚路におけるプレキシンＡ１、プレキシンＡ２及びプレキシンＡ３の発現結果を示す図である。
【図３】  In situハイブリダイゼーション及び免疫蛍光染色による、嗅覚系におけるプレキシンＡ１、プレキシンＡ２及びプレキシンＡ３の発現結果を示す図である。
【図４】プレキシンＡ１発現Ｌ細胞に対するＳｅｍａ６Ｃ−ＡＰの結合を示す図(Ａ〜Ｄ)とグラフ(Ｅ，Ｆ)である。
【図５】発現Ｌ細胞におけるプレキシンＡ１のイムノブロットの電気泳動(Ａ)及び培養下丘ニューロン及び摘出脳聴覚路に対するＳｅｍａ６Ｃとの結合(Ｂ〜Ｇ)を示す図である。
【図６】Ｓｅｍａ６Ｃの成長円錐退縮活性を示すグラフである。
【図７】Ｓｅｍａ６Ｃによって誘導される細胞の形態学的変化を示す図(Ａ，Ｂ)及びグラフ(Ｃ〜Ｅ)である。
【図１】
0003787473.tif 000002
【図２】
0003787473.tif 000003
【図３】
0003787473.tif 000004
【図４】
0003787473.tif 000005
【図５】
0003787473.tif 000006
【図６】
0003787473.tif 000007
【図７】
0003787473.tif 000008