(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖の非還元末端にあるβ−グリコシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを遊離させるが、非還元末端にあるβ−グリコシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは遊離させないエキソグリコシダーゼである、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼであって、以下の特性；
至適ｐＨ：６．０；
安定ｐＨ範囲：２５℃で１時間保持する場合において、ｐＨ５．５〜９．５；
作用適温の範囲：至適温度は４５℃である；
熱安定性：ｐＨ６．０で１５分間保持した場合に、４０℃まで安定である；
ＳＤＳゲル電気泳動における分子量：約４８，０００；および
等電点電気泳動における等電点：４．３；
を有する、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ。
【請求項２】
バシラス属に属する細菌が生産する、請求項１に記載のβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ。
【請求項３】
以下の工程：
（ａ）該β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを生産するバシラス属細菌を培養する工程；および
（ｂ）該培養工程（ａ）により得られた培養物より、該β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを採取する工程；を包含する、請求項１に記載のβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを生産する方法。
【請求項４】
前記バシラス属細菌が、Bacillus sp. AT173-1株（生命研菌寄第15390号；FERM P-15390）である、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖鎖の非還元末端にあるβ−グリコシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを遊離させるが、非還元末端にあるβ−グリコシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは遊離させないエキソグリコシダーゼである、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド結合を含む糖鎖は、生体内の糖脂質および糖タンパク質に多く存在している。これらの糖鎖は、近年の研究によって、生体内で重要な役割を果たしていることが明らかになりつつあり、それに伴ってより簡便で正確な糖鎖の構造解析技術が要望されてきている。このような糖鎖の構造解析技術のひとつに、エキソグリコシダーゼを利用する技術が有望視されている（Pauline Rudd（小林憲治訳）、化学と生物、３２巻、６６１頁、（１９９４））；佐野睦、宮村毅、「BIO VIEW」、Ｎｏ.１３、１３頁、宝酒造刊（１９９４））。これらは、エキソグリコシダーゼの基質特異性を利用したものであり、例えば、構造不明の糖鎖にβ−ガラクトシダーゼを加えて加水分解させた後、糖鎖からの単糖の遊離および／または基質糖鎖の構造変化に着目し、これらを確認することによって、糖鎖（オリゴ糖）の非還元末端におけるβ−ガラクトシド結合の存在を判定するものである。
【０００３】
ところで、これまで知られているＮ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド結合に作用する酵素はほとんどがＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド結合にも作用することが知られており（従ってβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（ＥＣ３．２．１．５２）と名付けられている）、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド結合のみに作用する酵素はHooghwinkelらが報告しているものだけである（G. J. M. Hooghwinkelら、Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.、３５３巻、８３９頁、（１９７２）；J. A. Cabezas、Biochem. J.、２６１巻、１０５９−１０６０頁（１９８９））。このHooghwinkelらの報告では、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド結合のみに作用する酵素が存在するということを示唆する実験結果は示されているが、実際に酵素は分離されてない。したがってこれまでにβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＥＣ３．２．１．５３）が実際に分離精製された例は知られていない。
【０００４】
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド結合は、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド結合同様糖脂質および糖タンパク質中に存在している。従って、上記糖鎖構造解析方法に、従来から知られているβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを用いる場合は、該酵素反応後、基質糖鎖からの単糖の遊離および／または基質糖鎖の構造変化を確認する工程の他に、基質糖鎖の非還元末端がＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンかＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンか決定するための煩雑な分析工程をさらに付加させなければならないのが現状である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記従来の課題を解決するものであり、その目的とするところは、糖鎖の非還元末端にあるβ−グリコシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを遊離させるが、非還元末端にあるβ−グリコシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは遊離させないエキソグリコシダーゼである、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびその生産方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、グラム陽性菌であるバシラス（Bacillus）属に属する、新たに単離した菌株から、糖鎖の非還元末端のＮ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解して、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを遊離させるが、糖鎖の非還元末端のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド結合にはまったく作用せず、従ってＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンを遊離させないエキソグリコシダーゼである、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明のβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（以下、本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼまたは本酵素という）は、糖鎖の非還元末端のＮ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド結合を加水分解して、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを遊離させるが、糖鎖の非還元末端のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド結合にはまったく作用せず、従ってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを遊離させないことを特徴とするエキソグリコシダーゼである。このことによって、上記目的が達成される。
【０００８】
本発明の好ましいβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、次の特性をさらに有する。
▲１▼至適ｐＨ：６．０である。
▲２▼安定ｐＨ範囲：２５℃で１時間保持する場合において、ｐＨ５．５〜９．５である。
▲３▼作用適温の範囲：至適温度は４５℃である。
▲４▼熱安定性：ｐＨ６．０で１５分間保持した場合に、４０℃まで安定である。
▲５▼ＳＤＳゲル電気泳動による分子量：約４８，０００である。
▲６▼等電点電気泳動による等電点：４．３である。
【０００９】
本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、バシラス属の細菌により生産される。特に好ましいバシラス属細菌は、平成８年１月１２日に工業技術院生命工学工業技術研究所（生命研と略称する）に寄託したBacillus sp. AT173-1株（生命研菌寄第15390号；FERM P-15390）である。
【００１０】
本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの生産方法は、本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを生産するバシラス属細菌を培養する工程、および、該培養工程により得られた培養物より、本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを採取する工程を包含する。このことによって、上記目的が達成される。
【００１１】
本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの好ましい生産方法は、上記Bacillus sp. AT173-1株を用いる方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、バシラス属の細菌、特にBacillus sp. AT173-1株（生命研菌寄第15390号；FERM P-15390）（以下、本菌という）により生産される。本菌は、発明者らが滋賀県甲賀郡甲西町内の土壌から分離した菌である。本菌の菌学的性質をつぎに示す。
【００１３】
（ａ）形態および生理学的性質
本菌を培養した結果を表１〜表３に示す。特に記載のない限り培養温度は３０℃である。本菌の形態は、トリプチック・ソイ培地（DIFCO社製）での培養により調べた。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
【表２】
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【００１６】
【表３】
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【００１７】
表１〜表３の菌学的性質をもとに、Bergey' s Manual of Systematic Bacteriology 第２巻（Williams and Wilkins, Baltimore, 1986）を参照して、本菌はバシラス属に属する菌株であることがわかった。バシラス属の中ではバシラス・スファエリカス（Bacillus sphaericus)に最も類似しているが、胞子の形などが異なっているため、本菌をバシラス・スファエリカスと同定することはできなかった。そこで、発明者は本菌をBacillus sp. AT173-1株と命名した。
【００１８】
以下、本菌から本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを生産および採取するための条件について説明する。
【００１９】
（ｂ）培養条件
本菌の培養条件は特に限定されず、通常の液体培地または固体培地が用いられる。炭素源としては、各種の糖類が用いられ、アミノ糖、グルコース、糖蜜などが用いられる。窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、肉エキス、アミノ酸などが用いられるがこれらに限定されない。上記炭素源や窒素源の他、各種の無機塩類（例えば、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩）およびビタミン類などが必要に応じて添加され得る。本菌の生育好適ｐＨは６〜８であるがこれに限定されない。
【００２０】
本菌の培養温度は本菌が生育できる温度であれば特に制限はないが、培養温度２０℃〜４５℃が好ましく、特に３０℃が好ましい。液体培養の場合は、通常２４時間〜７２時間、好気的に撹拌または振盪しながら培養を行う。培養過程における菌体増殖経時変化は、例えば、培養懸濁液の濁度変化（通常は６６０ｎｍの吸光度の計測）をモニターして、知り得る。本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、主として菌体外に分泌される。
【００２１】
（ｃ）β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの採取方法
上記培養液から本発明の酵素を採取、精製するには、既知の精製法が単独もしくは併用して利用され得る。例えば、培養液を濾過または遠心分離にかけて菌体を除き、得られた上清を、硫安、芒硝などによる塩析、またはメタノール、エタノール、アセトンなどの有機溶媒による沈殿などに供することにより分画、濃縮し、本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを含有する粗酵素液が得られる。さらにこの粗酵素液は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および／またはその他の各種クロマトグラフィーを行うことにより精製される。好ましい精製法の概要を以下に示す。
【００２２】
（１）培養液を遠心分離して菌体を除去し、上清液を得る。
（２）次いで、得られた上清液を硫安（８０％飽和溶液）で塩析する。
（３）次いで、得られた塩析液をｐＨ８．０のトリス・塩酸バッファーで透析し、ＱＡＥ−トヨパールカラムクロマトグラフィーにかける。
（４）上記（３）で得られた活性画分に、最終２５％飽和濃度になるように硫安溶液を加え、フェニルセファロースカラムクロマトグラフィーにかける。
（５）上記（４）で得られた活性画分をｐＨ６．０の酢酸バッファーで透析し、Ｑ−セファロースカラムクロマトグラフィーにかける。
（６）上記（５）で得られた活性画分を限外濾過膜で濃縮し、セファクリルＳ−２００カラムクロマトグラフィーにかける。
（７）上記（６）で得られた活性画分に、最終２５％飽和濃度になるように硫安溶液を加え、リソースＰＨＥカラムクロマトグラフィーにかける。
【００２３】
（ｄ）本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの活性測定法
本明細書においては、本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性は、パラニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニドを基質として用い、１分間に１マイクロモルのパラニトロフェノールを遊離させる酵素量を１単位（Ｕ）として測定する。具体的には本明細書においては、ｐＨ６．０の５０ｍ  Ｍ酢酸バッファーに溶解させた２．５ｍＭのパラニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド溶液０．４ｍｌに、あらかじめジチオスレイトールを０．１％になるように加えて室温で１時間放置した試料溶液０．１ｍ１を加え、３７℃で１０分間反応させる。その後、２％炭酸ナトリウム溶液を２．５ｍｌ加えて反応を停止し、この反応液の波長４２０ｎｍにおける吸光度（パラニトロフェノールの遊離に伴って増加する）を測定する。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明のβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド結合を特異的に加水分解するエキソグリコシダーゼである。そのため、糖鎖の非還元末端がＮ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニドのとき、該グリコシド結合を加水分解して、非還元末端からＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを遊離させるが、その糖鎖の非還元末端がＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドのとき、本酵素は作用せず、遊離単糖も生じさせない。
【００２５】
以下の実施例にて、本発明をさらに詳細に説明するが、これはなんら本発明を限定するものではない。
【００２６】
【実施例】
実施例１
（培養上清の調製）
１００ｍｌの培地（０．０６２５％Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、１％脱脂大豆製ペプトン、１％酵母エキス、０．１％Ｋ2ＨＰＯ4および０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）を含有する５００ｍｌ容振盪フラスコ８０本に、本菌を植菌し、３０℃で２日間、往復振盪培養を行った。培養終了後、この培養液を回収し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を除き、培養上清を７３６０ｍｌ得た。
【００２７】
実施例２
（培養上清中のβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性およびβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性）
上記実施例１で得られた上清中の本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの活性は上記（ｄ）に記載の方法に準じて測定した。β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性は、基質にパラニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを用い、その他の条件は上記（ｄ）に記載の方法に準じて測定した。結果を図１に示す。図中の横軸は反応時間を、縦軸はパラニトロフェノールの生成量に伴う４２０ｎｍの吸光度をそれぞれ表し、●はパラニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニドを、および○はパラニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドをそれぞれ基質としたときの数値を示す。パラニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニドを基質としたときには、遊離したパラニトロフェノールの増加に伴う４２０ｎｍの吸光度の増加がみられたが、パラニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを基質としたときには、遊離したパラニトロフェノールの増加に伴う４２０ｎｍの吸光度の増加はまったくみられなかった。上清中の本酵素の活性は、０.０８８Ｕ/ｍｌであった。
【００２８】
実施例３
（本酵素の調製）
すべてのカラムクロマトグラフィー操作は、４℃で行った。上記実施例１で得られた培養上清に硫安を８０％飽和になるまで加え、生じた沈澱を遠心分離して回収した。この沈澱を、ｐＨ６．０、５０ｍＭの酢酸バッファーに溶解し、次いでｐＨ８．０、５０ｍＭのトリス・塩酸バッファーで透析した。この酵素液を、ｐＨ８．０、５０ｍＭトリス・塩酸バッファーで平衡化したＱＡＥ−トヨパール５５０Ｃカラム（東ソー株式会社製）に吸着させ、０．１〜１Ｍの食塩濃度勾配をかけて溶出した。得られた本酵素画分に最終濃度で２５％飽和になるように硫安溶液を加えて、２５％飽和硫安を含むｐＨ８．０、５０ｍＭトリス・塩酸バッファーで平衡化したフェニルセファロースＨＰカラム（ファルマシアバイオテク社製）に吸着させ、２５〜０％飽和の硫安濃度勾配をかけて溶出した。得られた本酵素画分をｐＨ６．０、５０ｍＭの酢酸バッファーで透析し、この透析液をｐＨ６．０、５０ｍＭの酢酸バッファーで平衡化したＱ−セファロースＦＦカラムに吸着させ、０〜０．５Ｍの食塩濃度勾配をかけて溶出した。得られた本酵素画分を限外濾過膜で濃縮し、その濃縮液を、０．１５Ｍの食塩を含むｐＨ８．０、５０ｍＭトリス・塩酸バッファーで平衡化したセファクリルＳ−２００カラム（ファルマシアバイオテク社製）にかけた。得られた本酵素画分に最終濃度で、２５％飽和になるように硫安溶液を加えて、２５％飽和硫安を含むｐＨ８．０、５０ｍＭトリス・塩酸バッファーで平衡化したリソースＰＨＥカラム（ファルマシアバイオテク社製）に吸着させ、２５〜０％飽和の硫安濃度勾配をかけて溶出した。
【００２９】
以上の操作により、実施例１で得られた培養上清７３６０ｍｌ（計６４７Ｕ）から、収率１．５％で８７００倍に精製された本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを含む溶液を２．５ｍｌ（９．５６Ｕ）得た。本酵素の比活性は、タンパク質１ｍｇあたり１５４Ｕであった。本精製酵素液は、後述するＳＤＳゲル電気泳動および等電点電気泳動で単一のバンドを示した。上記（ｃ）に記載の（１）〜（７）に対応した本実施例１および３の各精製工程における酵素の精製度合いを、表４に示す。表中の活性値は、いずれも上記（ｄ）に記載の測定方法に準じて測定した値である。
【００３０】
【表４】
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【００３１】
以下の実施例では、上記実施例３で、得られた酵素液またはその濃縮液を用いた。
【００３２】
実施例４
（本酵素の基質特異性）
種々のピリシルアミノ化糖鎖を基質として、それらに対する本酵素の反応性を比較した。結果を表５に示す。
【００３３】
【表５】
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【００３４】
表５中の基質（１）、（２）および（５）は宝酒造（株）製のものを、（４）はアジノキ（株）製のものを使用した。基質（３）は、ピリシルアミノ化ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ：宝酒造（株）製）に、β−ガラクトシダーゼ（アスペルギルス・エスピー由来、東洋紡（株）製）を作用させて調製した。
【００３５】
基質（１）、（２）、（３）および（５）に対する反応は、以下に示す方法で行った。２０ｐｍｏｌの基質、２０μｇの牛血清アルブミン（シグマ社製）および１μｇのジチオスレイトールを含む、４μｌのｐＨ６．０、５０ｍＭの酢酸バッファーに６μｌの１４Ｕ／ｍｌ本酵素液を加え、３７℃で６時間反応させた。そしてこの反応液に４０μｌの１％トリフルオロ酢酸を加えて反応を停止した。基質（４）に対する反応は、基質の量を１０ｐｍｏｌとした以外は、上記反応条件にしたがった。得られた反応液は、高速液体クロマトグラフィーで分析し、分解率を計算した。
【００３６】
非還元末端にＮ−アセチル−β−ガラクトサミニド結合を有する基質（１）、（２）および（４）は、非還元末端に存在するすべてのＮ−アセチル−β−ガラクトサミニド結合が完全に加水分解されたのにたいして、非還元末端にＮ−アセチル−β−グルコサミニド結合を有する基質（３）および（５）はまったく加水分解されなかった。
【００３７】
実施例５
（本酵素の至適ｐＨおよび安定ｐＨ）
（１）至適ｐＨ
２５ｍＭブリトン−ロビンソン広域バッファーにより、ｐＨを４．０、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、８．０および９．０に調製した以外は、上記（ｄ）に記載の方法に準じて、各ｐＨにおける本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性を測定した。結果を図２に示す。図中の横軸は反応ｐＨを示し、縦軸は、得られた最大活性値を１００とした場合の相対活性（％）を示す。本酵素の至適ｐＨは６．０であった。
【００３８】
（２）安定ｐＨ範囲
５３ｍＭブリトン−ロビンソン広域バッファーにより、本酵素液のｐＨを３．０から１１．０まで０．５間隔で調整し、２５℃で１時間保持した後の本酵素の残存活性を上記（ｄ）に記載の方法に準じて測定した。結果を図３に示す。図中の横軸は保持ｐＨを示し、縦軸は最初の活性を１００とした場合の残存活性（％）を示す。ｐＨ５．５〜９．５の範囲で本酵素は安定であった。
【００３９】
実施例６
（本酵素の作用適温の範囲および熱安定性）
（１）作用適温の範囲
種々の反応温度条件（３０、３７、４０、４５、５０、５５℃）下での本酵素活性を上記（ｄ）に記載の方法に準じて測定した。結果を図４に示す。図中の横軸は反応温度を示し、縦軸は、得られた最大活性値を１００とした場合の相対活性（％）を示す。本酵素の至適温度は４５℃であった。
【００４０】
（２）熱安定性
種々の温度条件（２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５℃）下、０．２％牛血清アルブミンを含むｐＨ６．０の５０ｍＭ酢酸バッファーに溶解した０．１４Ｕ／ｍｌの本酵素液を１５分間保持した後、本酵素の残存活性を上記（ｄ）に記載の方法に準じて測定した。結果を図５に示す。図中の横軸は保持温度を表し、縦軸は最初の活性を１００とした場合の残存活性（％）を表す。本酵素は４０℃まで安定であった。
【００４１】
実施例７
（本酵素の分子量）
一般的なＳＤＳゲル電気泳動法を用いて、本酵素の分子量を測定した。本酵素を含む試料を、分子量既知の種々のタンパク質を含む標準試料と同一電気泳動ゲル上で分析し、それらの移動度と分子量の関係に基づいて分子量を測定した。ゲルはファルマシアバイオテク社製ファーストゲル・グラジエント１０−１５を用いた。図６に各標準タンパク質の移動度（横軸）と分子量（縦軸；×１０4）の関係を示す。図中のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは、それぞれウサギ筋肉ホスホリラーゼｂ（分子量９４，０００）、ウシ血清アルブミン（分子量６７，０００）、ニワトリ卵白アルブミン（分子量４３，０００）、ウシ赤血球カルボニック・アンヒドラーゼ（分子量３０，０００）、大豆トリプシン・インヒビター（分子量２０，１００）および牛乳α−ラクトアルブミン（分子量１４，４００）を示す。ＳＤＳゲル電気泳動法により測定した本酵素の分子量は、約４８，０００である。
【００４２】
実施例８
（本酵素の等電点）
常法の等電点電気泳動法により本酵素の等電点を測定した。本酵素を、分子量既知の種々のタンパク質を含む標準試料と同一電気泳動ゲル上で分析し、それらの移動度と等電点の関係に基づく検量線から、本酵素の等電点を測定した。本酵素の等電点は約４．３であった。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によれば、糖鎖の非還元末端のＮ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド結合を特異的に加水分解するβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、およびその生産方法が提供される。
【００４４】
本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、糖鎖の非還元末端にあるβ−グリコシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを遊離させるが、非還元末端にあるβ−グリコシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンをまったく遊離させないので、構造解析が望まれる糖鎖の非還元末端にあるβ−グリコシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンの存在の有無を容易に判定し得、糖鎖の構造決定に非常に有用である。本酵素は微生物の培養によって生産されるため、簡便な工程で大量かつ安価に提供され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】培養上清中の本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性およびβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を示す。
【図２】ｐＨ４．０〜９．０の範囲で本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性を測定した場合の相対活性を示す。
【図３】本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性をｐＨ３．０〜１１．０の各条件下、２５℃で１時間保持した後に測定した残存活性を示す。
【図４】３０〜５５℃の温度範囲で本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性を測定した場合の相対活性を示す。
【図５】本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを０．２％牛血清アルブミンを含む５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ６．０）中、２５〜５５の各温度条件下で、１５分間保持した後に測定した残存活性を示す。
【図６】ＳＤＳ電気泳動により測定した本β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの分子量を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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