(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
0003763577.tif 000012
［式中、ｗは核酸であり、
ｘはペプチドもしくはアミノ酸であり、
ｙは１〜２０の炭素原子に相当する鎖長のリンカーもしくは空欄であり、
Ｒ4はＨもしくはＣＨ2Ｏ-Ｒ3であり、かつ
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は同一であっても異なってもよく、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3の少なくとも一つが脂肪酸から誘導されたアシル基であるという条件で、それぞれ、水素、メチル基、エチル基、ヒドロキシル基、もしくは飽和または不飽和の３〜２４炭素原子の炭素鎖を備えた脂肪酸から誘導されたアシル基である］
の化合物に細胞を曝すことを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞内に核酸を導入する方法。
【請求項２】
ｙが存在する請求項１記載の方法。
【請求項３】
核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、もしくはこれらの組み合わせである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が同一である、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ1、Ｒ2および／またはＲ3が、パルミタート、ミリスタート、ラウラート、カプロアート、オレアートおよびコレステロールからなる群から選択された脂肪酸のアシル誘導体である、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ1、Ｒ2および／またはＲ3が、ミリスタートまたはラウラートのアシル誘導体である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
細胞が動物細胞である、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
化合物がリポソーム中に存在するか、他の脂質と混合された、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
化合物が、３〜７炭素原子に相当する鎖長を備えたリンカー基“ｙ”を含む、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ｙがアミノ酪酸、アミノカプロン酸、もしくはアミノカプリル酸である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ｘが全体的に陽性チャージを備えている、請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ｘがモノリシン、ジリシン、トリリシン、テトラリシン、もしくはペンタリシンである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ｗがｘに共有結合している、請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
以下の式：
0003763577.tif 000013
［式中、
ｗは核酸であり、
ｘはペプチドもしくはアミノ酸であり、
ｙは１〜２０の炭素原子に相当する鎖長のリンカーもしくは空欄であり、
Ｒ5は飽和もしくは不飽和の３〜２４炭素原子の炭素鎖を備えた脂肪酸から誘導されたアシル基である］
の化合物に細胞を曝すことを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞内に核酸を導入する方法。
【請求項１５】
ｙが存在する請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、もしくはこれらの組み合わせである、請求項１４または１５記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ5が、パルミタート、ミリスタート、ラウラート、カプロアート、オレアートおよびコレステロールからなる群から選択された脂肪酸のアシル誘導体である、請求項１４ないし１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
Ｒ5が、ミリスタートまたはラウラートのアシル誘導体である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
細胞が動物細胞である、請求項１４ないし１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
化合物がリポソーム中に存在するか、他の脂質と混合された、請求項１４ないし１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
リンカー基“ｙ”が、３〜７炭素原子に相当する鎖長を備えた、請求項１４ないし２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ｙがアミノ酪酸、アミノカプロン酸、もしくはアミノカプリル酸である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ｘが全体的に陽性チャージを備えている、請求項１４ないし２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ｘがモノリシン、ジリシン、トリリシン、テトラリシン、もしくはペンタリシンである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ｗがｘに共有結合している、請求項１４ないし２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
以下の式：
0003763577.tif 000014
［式中、
ｗは核酸であり、
ｘはペプチドもしくはアミノ酸であり、
ｙは１〜２０の炭素原子に相当する鎖長のリンカーもしくは空欄であり、
Ｒ4はＨもしくはＣＨ2Ｏ-Ｒ3であり、かつ
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は同一であっても異なってもよく、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3の少なくとも一つが脂肪酸から誘導されたアシル基であるという条件で、それぞれ、水素、メチル基、エチル基、ヒドロキシル基、もしくは飽和または不飽和の３〜２４炭素原子の炭素鎖を備えた脂肪酸から誘導されたアシル基である］
の化合物であって、細胞に核酸を導入するための化合物。
【請求項２７】
ｙが存在する請求項２６記載の化合物。
【請求項２８】
ｗが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、もしくはこれらの組み合わせである、請求項２６または２７記載の化合物。
【請求項２９】
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が同一である、請求項２６ないし２８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３０】
Ｒ1、Ｒ2および／またはＲ3が、パルミタート、ミリスタート、ラウラート、カプロアート、オレアートおよびコレステロールからなる群から選択された脂肪酸のアシル誘導体である、請求項２６ないし２９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３１】
Ｒ1、Ｒ2および／またはＲ3が、ミリスタートまたはラウラートのアシル誘導体である、請求項３０記載の化合物。
【請求項３２】
化合物がリポソーム中に存在するか、他の脂質と混合された、請求項２６ないし３１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３３】
化合物が、３〜７炭素原子に相当する鎖長を備えたリンカー基“ｙ”を含む、請求項２６ないし３２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３４】
ｙがアミノ酪酸、アミノカプロン酸、もしくはアミノカプリル酸である、請求項３３記載の化合物。
【請求項３５】
ｘが全体的に陽性チャージを備えている、請求項２６ないし３４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３６】
ｘがモノリシン、ジリシン、トリリシン、テトラリシン、もしくはペンタリシンである、請求項３５記載の化合物。
【請求項３７】
ｗがｘに共有結合している、請求項３０ないし３４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３８】
以下の式：
0003763577.tif 000015
［式中、
ｗは核酸であり、
ｘはペプチドもしくはアミノ酸であり、
ｙは１〜２０の炭素原子に相当する鎖長のリンカーもしくは空欄であり、
Ｒ5は飽和もしくは不飽和の３〜２４炭素原子の炭素鎖を備えた脂肪酸から誘導されたアシル基である］
の化合物であって、細胞に核酸を導入するための化合物。
【請求項３９】
ｙが存在する請求項３８記載の化合物。
【請求項４０】
ｗが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、もしくはこれらの組み合わせである、請求項３８または３９記載の化合物。
【請求項４１】
Ｒ5が、パルミタート、ミリスタート、ラウラート、カプロアート、オレアートおよびコレステロールからなる群から選択された脂肪酸のアシル誘導体である、請求項３８ないし４０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４２】
Ｒ5が、ミリスタートまたはラウラートのアシル誘導体である、請求項４１記載の化合物。
【請求項４３】
化合物がリポソーム中に存在するか、他の脂質と混合された、請求項３８ないし４２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４４】
化合物が、３〜７炭素原子に相当する鎖長を備えたリンカー基“ｙ”を含む、請求項３８ないし４３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４５】
ｙがアミノ酪酸、アミノカプロン酸、もしくはアミノカプリル酸である、請求項４４記載の化合物。
【請求項４６】
ｘが全体的に陽性チャージを備えている、請求項３８ないし４５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４７】
ｘがジリシン、トリリシン、テトラリシン、もしくはペンタリシンである、請求項４６記載の化合物。
【請求項４８】
ｗがｘに共有結合している、請求項３８ないし４５のいずれか一項に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、細胞内に化合物、特に核酸を導入する方法に関する。さらに、本発明は、この方法で使用する組成物に関する。
特定の化合物を細胞内に輸送することが望まれる状況は多い。このような適用の一つが、ＤＮＡを用いた真核細胞のトランスフェクションである。これは、現在、“トランスフェクタム(Transfectam)”(Promega)、“DOTAP”(Boehringer Mannheim)、“リポフェクチン(Lipofectin)”もしくは“リポフェクタミン(Lipofectamine)”(BRL)等の種々の商業的試薬を用いて、あるいはリン酸カルシウムを介したトランスフェクションを用いて行われている。
細胞に核酸をベースとする化合物を輸送する力を、薬物輸送および遺伝子治療にも適用できる。細胞内への化合物の輸送は、以下の式の化合物と関連して変わるであろう。このような変化は、作用時間（例えば、ゆっくりとした放出、すなわち持続作用）、必要な試薬の量、もしくは輸送形式に対する変化として現れるかもしれない。以下に記載されたパラメーターの範囲内で種々の化合物を用いて細胞内に輸送することは、試薬の細胞または組織特異的ターゲッティングを可能にするかもしれない。
本願発明者等は、以下の一般式の、脂肪酸アシル誘導体で修飾された化合物と分子とを結合させることにより、容易に細胞内にそれらの化合物を輸送することができることを見出した。
従って、本発明の第一の態様は、以下の式：
0003763577.tif 000002
［式中、
ｗは核酸であり、
ｘはペプチドもしくはアミノ酸であり、
ｙは１〜２０の炭素原子に相当する鎖長のリンカーもしくは空欄であり、
Ｒ4はＨもしくはＣＨ2Ｏ-Ｒ3であり、かつ
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は同一であっても異なってもよく、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3の少なくとも一つが脂肪酸から誘導されたアシル基であるという条件で、それぞれ、水素、メチル基、エチル基、ヒドロキシル基、もしくは飽和または不飽和の３〜２４炭素原子の炭素鎖を備えた脂肪酸から誘導されたアシル基である］
の化合物に細胞を曝すことを含む、細胞内に核酸を導入する方法からなる。
本願発明の第二の態様は、以下の式：
0003763577.tif 000003
［式中、
ｗは核酸であり、
ｘはペプチドもしくはアミノ酸であり、
ｙは１〜２０の炭素原子に相当する鎖長のリンカーもしくは空欄であり、
Ｒ5は飽和もしくは不飽和の３〜２４炭素原子の炭素鎖を備えた脂肪酸から誘導されたアシル基である］
の化合物に細胞を曝すことを含む、細胞内に核酸を導入する方法からなる。
本願発明の第三の態様は、以下の式：
0003763577.tif 000004
［式中、
ｗは核酸であり、
ｘはペプチドもしくはアミノ酸であり、
ｙは１〜２０の炭素原子に相当する鎖長のリンカーもしくは空欄であり、
Ｒ4はＨもしくはＣＨ2Ｏ-Ｒ3であり、かつ
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は同一であっても異なってもよく、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3の少なくとも一つが脂肪酸から誘導されたアシル基であるという条件で、それぞれ、水素、メチル基、エチル基、ヒドロキシル基、もしくは飽和または不飽和の３〜２４炭素原子の炭素鎖を備えた脂肪酸から誘導されたアシル基である］
の化合物であって、細胞に核酸を導入するための化合物からなる。
本願発明の第四の態様は、以下の式：
0003763577.tif 000005
［式中、
ｗは核酸であり、
ｘはペプチドもしくはアミノ酸であり、
ｙは１〜２０の炭素原子に相当する鎖長のリンカーもしくは空欄であり、
Ｒ5は飽和もしくは不飽和の３〜２４炭素原子の炭素鎖を備えた脂肪酸から誘導されたアシル基である］
の化合物であって、細胞に核酸を導入するための化合物からなる。
本願発明の各態様における好ましい形態は、ｙが存在するものである。
本願発明の好ましい実施態様では、核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、もしくはこれらの組み合わせである。核酸は、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、コレステロール、ビオチンもしくは放射線ラベル等の化学的付加物を具備することができる。
本願発明の方法は、動物もしくは植物に由来する樹立細胞系、動物もしくは植物に由来する一次細胞系(primary cell lines)、あるいは全身的、局所的もしくはエアゾールのいずれによって投与されるかに関わらず、完全な動物および植物に対して、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、もしくはこれらの組み合わせを含む核酸を輸送するのに使用することができる。これについては、欧州特許公開第４２４６８８号公報を参照することができ、その開示するところを参照としてここに取り込む。核酸は、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、コレステロール、ビオチンもしくは放射線ラベル等の化学的付加物を具備してもよい。
本発明の方法は、一般的に、必須的に水性混合物中で、関心の向けられた細胞の表面に化合物を適用することを含むと考えられる。しかしながら、完全な生物体の場合には、必須に非水性形態で、局部的もしくは全身的注入、局所的もしくは吸入によって化合物を適用する必要が生じるかもしれない。
本発明の記載は、細胞および生物体中における視覚化および追跡のためにペプチドにフルオレセイン（ＦＩＴＣ）またはビオチン等のラベル化合物を付加することを含む。ラベル化合物は、上述したあらゆる経路もしくは方法によって細胞に投与される。
ペプチドは、あらゆる長さとすることができ、核局在化シグナルおよび／または核酸結合ドメイン等の機能的ドメインを含むことができる。このような機能的ドメインは、縦列、もしくはリシンを用いて構成されるような分岐構造で含まれてもよい。典型的に、ペプチドは、例えば一つ以上のリシン残基のペプチドと結合することによって、核酸を引きつけ保持する全体的な陽性チャージを有する。しかしながら、in vivoにおける全身的輸送等の異なる形態の輸送に有利であれば、このペプチドは、全体的に中性のチャージを有するように構成されてもよい。
リンカーは、当該技術分野でよく知られた多くの分子とすることができる。しかしながら、現在のところ、リンカーは、アラニン、ロイシン、グリシン、フェニルアラニン、リシンもしくはこれらの同一または混合ポリマー等のアミノ酸またはペプチドであることが好ましい。リンカーは、非定型アミノ酸を含んでもよく、このようにすれば標準的なアミノ酸以上にリンカーの長さを伸長させることができる。これについては、リンカーが、アミノ酪酸、アミノカプロン酸、もしくはアミノカプリル酸であることが特に好ましい。
本発明のさらに好ましい実施態様では、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が同一であって、パルミタート、ミリスタート、ラウラート、カプロアート、オレアートおよびコレステロールからなる群を含む脂肪酸、特にラウラートまたはミリスタートのアシル誘導体であることが好ましい。
本願の出願人によるオーストラリア特許出願第６４９２４２号には、トロメタミン(tromethamine)もしくはエタノールアミン誘導体を介して脂肪酸の１〜３アシル誘導体にアミノ酸もしくはペプチドを結合させる方法が開示されている。この方法を用いることにより、脂肪酸残基の１〜３アシル誘導体を備えたペプチド／脂肪酸のアシル誘導体を広範囲に形成することができる。この出願に開示された方法を用いて、重要な化合物であるトリリシン・アラニン・トリス・トリパルミタート（Ｋ３ＡＴＰ３）を形成することができる。この出願の開示を、参照としてここに取り込む。
核酸（化合物の“ｗ”）は、リシン、アルギニン、オルニチン等の陽性にチャージしたアミノ酸を用いて、化合物の“ｘ”の位置で、化合物のリマインダー(reminder)と結合することができる。特に好ましい基は、モノリシン基、ジリシン基、トリリシン基、テトラリシン基もしくはペンタリシン基である。あるいは、核酸は、ペプチドもしくはアミノ酸“ｘ”に共有結合してもよい。さらに、リンカー基アラニンを、例えばロイシン、グリシン、フェニルアラニンもしくはα-ＢＯＣ（ε-フリー）リシン基で置換してもよく、脂肪酸のアシル誘導体の総数は１〜３の範囲で変えることができる。一つの脂肪酸のアシル誘導体を用いることが望まれる場合には、トリスをエタノールアミンで置換できることに注意するべきである。
また、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ＤＯＰＣ（ＤＯＰコリン）もしくはコレステロール等の脂質を用いた標準的な方法でリポソーム中に製剤することにより、細胞内への化合物の輸送を容易にして本発明の能力を増すと信じられる。これは、特に二つの脂肪アシル誘導体がある場合に考えられる。リポソームの形成方法は、例えばFelgner, P.Lら, 1987 PNAS 84 pp7413-7417およびYago, Kら1993 Biochem and Biophys. Res. Comm. 196(3) pp1042-1048に記載されている。化合物の溶液に単にＤＯＰＥを添加するだけでも、化合物の活性を顕著に増強することもわかっている（以下の実験例４、ベラフェクチンＧ２  ＋／−  ＤＯＰＥ）。同様に、塩類等の添加物を用いたトランスフェクション条件の別の変更によって、トランスフェクションを増強することができる。イオン強度の変化およびアルカリ土類カチオンの存在が、トランスフェクション効率を変えるものとして記載されている（LoefflerとBehr, Methods in Enzymology 1993, H, 599-654）。
本発明の主な適用は、遺伝子治療輸送試薬である。低毒性（特に商業的に利用できる試薬と比較した場合）と合わせて、これまで観察された細胞内への遺伝子の比較的効率的な輸送は、本発明を治療用化合物の理想とする。遺伝子治療に係るさらなる情報は、Nabelら, 1993 PNAS 90 pp11307-11311に見出され、その開示するところを参照としてここに取り込む。
本発明の特徴をより明瞭に理解するために、好ましい形態を、以下の実施例および図面を参照して記述する。
図１ａは、ベラフェクチンとＤＭＳＯの毒性を示し、１ｂはＤＭＳＯと比較したベラフェクチンにおける生存率％を示す。
細胞毒性は、標準的なＭＴＴ（３-［４，５−ジメチルチアゾール-２-イル］２，５-ジフェニルテトラゾリウムブロミド；チアゾリルブルー）アッセイを用いてアッセイされた。ベラフェクチンはＫ３ＡＴＰ３であり、その濃度はμＭで示され、ＤＭＳＯはベラフェクチンの希釈の濃度と同じ濃度で用いられた。
ａ．細胞死がＯＤを減少させる。
ｂ．希釈されたＤＭＳＯのみの存在下における細胞の生存を１００％とし、ベラフェクチンの存在下における生存をそれに応じて調節した。
図２ａは、ベラフェクチンおよびエタノールの細胞毒性を示し、２ｂはエタノールと比較したベラフェクチンにおける生存率を示す。
細胞毒性は、標準的なＭＴＴ（３-［４，５−ジメチルチアゾール-２-イル］２，５-ジフェニルテトラゾリウムブロミド；チアゾリルブルー）アッセイを用いてアッセイされた。
ベラフェクチン（Ｋ３ＡＴＰ３）を、１００％の温かいエタノールに１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、μＭで示される濃度まで水で希釈した。
ａ．平行してエタノールを希釈し、ベラフェクチンの希釈と同じ濃度で細胞毒性を試験した。
ｂ．希釈されたエタノールのみの存在下における細胞の生存を１００％とし、ベラフェクチンの存在下における生存率をそれに応じて調節した。
図３は、ベラフェクチンに仲介されたｐＳＶＬＣＡＴのトランスフェクションから４８時間後のＣＡＴ発現を示す。
μＭで示された一定量のベラフェクチンは、トランスフェクション用の細胞上に添加する前に１μｇのｐＳＶＬＣＡＴと混合した。示された結果は、トランスフェクションから４８時間後における５０μｌの細胞培養培地から測定されたＣＡＴ発現レベルである。
図４は、テスト試薬によって仲介されたＣＨＯ細胞のトランスフェクションから４８時間後にアッセイされたＣＡＴ発現を示す。
示された結果は、この実験における最も高いレベルのトランスフェクションを与えるトランスフェクション試薬の濃度のものである。これは、どの場合にも５μｌであった。ＣＡＴアッセイは、Neuman J.R., Morency, C.A.およびRussian, K.O. (1987) Biotechniques 5, p444-447によってなされた。
無し；トランスフェクション試薬を含まない、ＴＦ；トランスフェクタム(Promega)、
Ｌｆｅ；リポフェクタミン(BRL)、ＶＦ Ａ３：Ｋ３ＡＴＰ３、ＶＦ Ｇ２；Ｋ３ＧＴＰ２。
図５は、テスト試薬によって仲介されたＣｏｓ１細胞のトランスフェクションから４８時間後にアッセイされたＣＡＴ発現を示す。
示された結果は、トランスフェクションの最も高いレベルを与えるトランスフェクション試薬の濃度のものである。無し；試薬を含まない、ＶＦ Ａ３：Ｋ３ＡＴＰ３、ＶＦ Ｇ２；Ｋ３ＧＴＰ２、ＶＦ Ｇ２＋ＤＯＰＥ；Ｋ３ＧＴＰ２＋ＤＯＰＥ。
図６はトランスフェクション試薬の相対的な細胞毒性を示す。
用語の説明
ａ．（ＣＨＯ細胞）
ＣＡＴアッセイにおける細胞収穫時に種々の試薬でトランスフェクションした後の細胞の生存能力。
無し；トランスフェクション試薬を含まない、ＴＦ；トランスフェクタム、Ｌｆｅ；リポフェクタミン、ＶＦ Ｇ２：ベラフェクチンＧ２。全て５μｌ。高いＯＤは高い細胞生存率を示す。
ｂ．（Ｃｏｓ１細胞）
図ａと同様の細胞生存能力。ＶＦ Ａ３；ベラフェクチンＡ３  ９μｌ、Ｌｆｅ  ５μｌ。この実験例におけるアッセイは、３５ｍｍの皿で行われた。
図７ａ〜７ｂは、“ｘ”ペプチド実験例“ａ”の結果を示す。
図８は、“ｘ”ペプチド実験例“ｂ”の結果を示す。
図９は、“ｘ”ペプチド実験例“ｃ”の結果を示す。
（用語の説明  −  図７、８および９；無し；プラスミドＤＮＡと共に用いられる試薬を含まない、ｒｂ／ブランク；試薬空欄、化合物の記載の後の数字は、２ｍＭのストックのμｌ数を示す（水で希釈）。７ｂ：ＤＮＡすなわちトランスフェクション試薬を用いずに“モック・トランスフェクションされた(mock transfected)”皿から１００％の細胞生存率が得られた。細胞の非存在下では０％の生存率がアッセイされた。生存能力は、アラマーブルー(alamar blue)染料を用いて評価された。）
図１０ａおよび１０ｂは、“ｙ”リンカー実験例“ａ”の結果を示す。
図１１は、“ｙ”リンカー実験例“ｂ”の結果を示す。
図１２は、“ｙ”リンカー実験例“ｃ”の結果を示す。
（用語の説明  −  図１０ａ、１０ｂ、１１、１２：試薬；２ｍＭストックからのテスト化合物、そうでない場合には記載する。（．４）；０．４ｍＭでの試薬ストック。０：試薬を含まない。標準的なトランスフェクション条件下でＤＮＡのみ。培地ブランク：ＣＡＴアッセイで培地のみ。相対生存力（アラマーブルー）：３７℃でのインキュベーション中に添加されたアラマーブルーを用いて、培地のＯＤ570-595を測定。）
図１３ａおよび１３ｂは、Ｒ１−Ｒ４誘導体実験例“ａ”から得られた結果を示す。
（用語の説明：図１０ａ、１０ｂ、１１、１２の用語の説明と同じ）
図１４ａおよび１４ｂは、Ｒ１−Ｒ４誘導体実験例“ｂ”から得られた結果を示す。
（用語の説明：図１０ａ、１０ｂ、１１、１２の用語の説明と同じ）
図１５ａおよび１５ｂは、Ｒ１−Ｒ４実験例“ｃ”から得られた結果を示す。
（用語の説明：図１０ａ、１０ｂ、１１、１２の用語の説明と同じ。標準偏差が示されている）
図１６ａおよび１６ｂは、Ｒ１−Ｒ４誘導体実験例“ｄ”から得られた結果を示す。
図１７ａおよび１７ｂは、Ｒ１−Ｒ４誘導体実験例“ｅ”から得られた結果を示す。
図１８ａおよび１８ｂは、Ｒ１−Ｒ４誘導体実験例“ｇ”から得られた結果を示す。
Ｃｏｓ１細胞は、６０ｍｍ皿で標準的なアッセイに従ってトランスフェクトされた。５０μｌ、４８時間培養した上清を、ＣＡＴアッセイのために５時間３７℃でインキュベートした。
図１９ａおよび１９ｂは、Ｒ１−Ｒ４、Ｃ１０−Ｃ１６実験例“ｂ”の結果を示す。Ｈｅｌａ細胞。
（用語の説明  −  図１９ａおよび１９ｂ；Ｌｆｅ；リポフェクタミン、最適なトランスフェクションが起こる［脂質］／［ＤＮＡ］の比率（１．３９）、無し；試薬を含まないがトランスフェクションに係るＤＮＡは含む。細胞毒性は、アラマーブルーで調べられた。）
図２０ａおよび２０ｂは、“ｙ”リンカー非標準アミノ酸実験例“１”の結果を示す。
（用語の説明；ＬＦＥ；リポフェクタミン。遺伝子発現のレベルは、β-ガラクトシダーゼのユニットとして“ａ”に示されている。相対生存能力は、染料“アラマーブルー”を用いて“ｂ”でアッセイされ、染料の存在下でインキュベーションした後に測定された光学密度として示されている。高いＯＤは、高い細胞生存率を示す。）
図２１ａおよび２１ｂは、“ｙ”リンカー非標準アミノ酸“実験例２”の結果を示す。
（用語の説明；ｌｆｅ；リポフェクタミン、ｖｆ；ベラフェクチンＡ３、Ｃ３；Ｋ３Ｃ３ＴＬ３、Ｃ５；Ｋ３Ｃ５ＴＬ３、Ｃ７；Ｋ３Ｃ７ＴＬ３、トランスフェクタントの％は、染色されていない細胞数と比較して、多くのフィールドにおいて、青く染色された細胞数から計算した。ａ；ＣＨＯ細胞、ｂ；Ｃｏｓ１細胞）
図２２ａおよび２２ｂは、ＰＣ３およびジャーカット（Jurkat）細胞系において“ｙ”リンカー非標準アミノ酸の結果を示す。
図２３ａは、“製剤”実験例“Ａ”の結果を示す。
種々のリポソーム製剤、成分およびリポフェクタミン(Lfe)を用いてトランスフェクションされたＣＨＯ細胞から発現されたＣＡＴ。代表的な実験結果が示されている。
図２３ｂは、“製剤”実験例“ｂ”の結果を示す。
リポソーム製剤、成分試薬および商業的調製物を用いてトランスフェクションされた細胞のパーセント。ＶＦ Ａ２；Ｋ３ＡＴＰ２。リポソームは、ＶＦ Ａ２とＤＯＰＥを用いて、所望の比率のＶＦ Ａ２：ＤＯＰＥに製剤された。示された結果は、一回の実験のものである。
図２４は、“未製剤の混合物”実験例“２”の結果を示す。
（用語の説明；トランスフェクション効率は、４８時間後に発現されたβ-ｇａｌユニットのレベルとして評価された。Ｌ３：Ｋ３ＡＴＬ３、Ｍ３；Ｋ３ＡＴＭ３。ピークは、最も高い読み取り値を与えるリポペプチドとＤＮＡの組み合わせを示す。［脂質］は、用いられた全体のリポペプチドの濃度を示す。）
実施例
化学的用語
使用される略号：
α-ＢＯＣ（ε-Ｚ-Ｌｙｓ）＝  α-ブチルオキシカルボニル-ε-カルボベンゾキシ-リシン
ＡＥＰ＝  アラニン-エタノールアミン-パルミタート
ＡＴＰ１＝  アラニン-トリス-モノパルミタート
ＡＴＰ２＝  アラニン-トリス-ジパルミタート
ＡＴＰ３＝  アラニン-トリス-トリパルミタート
ＣＤＣｌ3＝  クロロホルム-ｄ
ＤＣＣＤ＝  ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ＝  ジクロロメタン
ＤＩＥＡ＝  ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ＝  ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ＝  ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ-Ｄ６＝  ジメチルスルホキシド-ｄ６
ＤＳＣ＝  ジスクシンイミジルカルボナート
ＦＡＴＰ１＝  フルオレセイン=アラニン-トリス-モノパルミタート
ＦＡＴＰ２＝  フルオレセイン=アラニン-トリス-ジパルミタート
ＦＡＴＰ３＝  フルオレセイン=アラニン-トリス-トリパルミタート
ＦＩＴＣ＝  フルオレセインイソチオシアナート（異性体Ｉ）
ＨＯＳＵ＝  ヒドロキシスクシンイミド
ＴＥＡ＝  トリエチルアミン
ＴＦＡ＝  トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ＝  テトラヒドロフラン
Ｔｒｉｓ＝  ２-アミノ-２-ヒドロキシ-メチル-１，３-プロパンジオール
Ｚ＝  Ｎ-カルボベンゾキシ
材料および方法
α-ＢＯＣ（ε-Ｚ-Ｌｙｓ）は、Peptide Institute, Inc.（大阪、日本）、ＤＳＣは、Tokyo Kasei Kogyo Co.（東京、日本）から購入した。全てのアミノ酸はＬ型であり、言及しない限りSigma Chemical Company(St. Louis, MO)から購入した。全ての溶剤は、分析用試薬であり、購入したままの状態で用いられた。
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
以下の溶媒系、すなわちＲｆ1  クロロホルム／メタノール／酢酸：９５／５／３；Ｒｆ2  クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン：９５／７／３で、Alufolein Silica gel 60 F254プレート（Merck）上で行った。
高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
自動勾配調節器とモデル７４６データモジュールとを備えた６０００Ａシリーズの溶媒輸送システムを具備するMillipore Waters HPLC装置（Waters Chromatography Division of Millipore, Milford, MA）で分析ＨＰＬＣを行った。クロマトグラフィーは、ＮＯＶＡＰＡＫTMＣ18逆相カラム（１００ｘ８ｍｍ）を用いて行われた。ペプチドおよびペプチド-トリス複合体は、２ｍｌ／分の流速で５分以内で０．１％ＴＦＡの２４〜８０％アセトニトリルから線形勾配溶出で分析した（系Ａ）。Waters Lambda Max 480を用いて２６０ｎｍで検出を行った；（ＲtA）。リポペプチド複合体を、２ｍｌ／分の流速で５分以内で、０．１％ＴＦＡの５０％水、５０％アセトニトリルから、０．１％ＴＦＡの５０％アセトニトリル、５０％ＴＨＦまでの線形勾配を用いて、Ｃ18カラム上で分析した（系Ｂ）；（ＲtB）。蛍光ラベル化合物の分離は、PrepPakR C4セミプレパラティブ逆相カラム(Semipreparative Reverse Phase column)（２５ｘ１０）上で、流速６ｍｌ／分で行った。
分離ＨＰＬＣ
分離は、PrePak C4逆相カラム（１００ｘ４０ｍｍ）を用いてMillipore Waters DeltaPrep 4000 HPLC上で、２０ｍｌ／分の流速で、上述した分析ＨＰＬＣと同じ溶出バッファー系の線形勾配を用いて溶出して行われた。
核磁気共鳴（ＮＭＲ）
ＮＭＲスペクトルを２００ＭＨｚのBruckerスペクトロメーターを用いて記録した。
化学合成
ＡＴＰ１、ＡＴＰ２およびＡＴＰ３の調製
これらの化合物は、エタノール中の炭素（１０％）にパラジウムの存在下で、パーヒドロゲネーター(Parr hydrogenator)で４０psi.圧でＺ-Ａｌａ-Ｔｒｉｓ-モノ、ジ、およびトリパルミタートを水素化することによって得られた。ベンジルオキシカルボニル基の除去は、ＨＰＬＣ（系Ｂ）で観察した。ろ過して触媒を除去し、溶媒を蒸発させた後、ＡＴＰ１、ＡＴＰ２、およびＡＴＰ３を量的収率で得た。ＺＡＴＰ１、ＺＡＴＰ２、ＺＡＴＰ３および対応するグリシル化合物の合成および精製は、Whittaker, R.G., Hayes, P.J.およびBender, V.J., 1993 Peptide Research 6, 125-128、並びにWhittaker R.W.特許第６４９２４２号、脂肪と結合したアミノ酸、ペプチドもしくはこれらの誘導体（Amino acids, peptides or derivatives thereof coupled to fats）に記載されている。
ＦＡＴＰ１、ＦＡＴＰ２およびＦＡＴＰ３の調製
ＤＣＭ（５００μｌ）中のＡＴＰ１（１０ｍｇ、２５μモル）の溶液に、ＤＭＦ（５００μｌ）中のＦＩＴＣ（１０ｍｇ２５μモル）の溶液を攪拌しながら添加した。反応の見かけのｐＨを、ＴＥＡを添加することによって９．０に維持し、反応をＨＰＬＣ（系Ｂ）で観察した。フルオレセイン-Ａｌａ-Ｔｒｉｓ-パルミタートの形成は１０分で完了し、クロマトグラフィーで精製された状態、Ｒ１：７．０８でＦＡＴＰ１産物を与えるように、生成物を分離ＨＰＬＣで精製した。溶媒を減圧下で除去し、ＦＡＴＰ１生成物をtert-ブタノールから凍結乾燥した。
ＦＡＴＰ２およびＦＡＴＰ３は、それぞれ、クロマトグラフィーで精製された生成物  Ｒ１：８．６１および９．９２を与えるように、ＦＩＴＣ（１０ｍｇ、２６μモル）を含むＤＣＭ（５００μｌ）中でＡＴＰ２（１６．３ｍｇ、２５μモル）とＡＴＰ３（２２ｍｇ、２５μモル）を反応させることによって同一の方法で合成した。
フルオレセインラベルされたアラニン−エタノールアミン-パルミタートの調製
アラニン−エタノールアミン-パルミタート（ＡＥＰ）を、エタノール中の炭(charcoal)（１０％）にパラジウムの存在下でパーヒドロゲネーター(Parr hydrogenator)でＺ-Ａｌａ-エタノールアミン-パルミタートの水素化によって調製した。ベンジルオキシカルボニル基の除去はＨＰＬＣ（系Ｂ）で観察した。ろ過して触媒を除去し、溶媒を蒸発させた後、化合物を得た。
（Ｌｙｓ）ｎ化合物の調製
Ｚ-Ａｌａ-エタノールアミンと対応するパルミタートの合成および精製は、Whittaker, R.G., Hayes, P.J.およびBender, V.J.,(1993), Peptide Research 6, 125-128.,およびWhittaker R.G.特許第６４９２４２号、脂肪と結合したアミノ酸、ペプチドもしくはこれらの誘導体（Amino acids, peptides or derivatives thereof coupled to fats）に記載されている。
ＤＭＦ（５００μｌ）中のＡＥＰ（２０ｍｇ、５４μモル）の溶液に、ＦＩＴＣ（２２ｍｇ、５６μモル）を攪拌しながら添加し、見かけのｐＨをＴＥＡを添加することによって９．０に維持した。反応は２０分未満で完了し、生成物を分離ＨＰＬＣで精製して、クロマトグラフィーでＲｔ：７．０１の純度の上記化合物を得た。
オリゴ−Ｌｙｓ化合物［（ＢＯＣ（ε-Ｚ-Ｌｙｓ）ｎ］の合成を古典的な溶液法（１）で行った。リポペプチドＢＯＣ（ε-Ｚ-Ｌｙｓ）ｎ-Ｘ-Ｔｒｉｓ-パルミタートを、リンカーアミノ酸（Ｘ）-Ｔｒｉｓ化合物を介してオリゴ−Ｌｙｓとパルミチン酸とをカップリングすることによって合成した。この合成は、活性化されたエステル法(an activated ester method)でＢＯＣ（ε-Ｚ-Ｌｙｓ）ｎ−ＯＨをアミノ酸-Ｔｒｉｓ（２）とカップリングし、さらに対称無水法(the symmetrical anhydride method)（１）でパルミチン酸と前記複合体をカップリングすることによって行われる。中間体および最終的な生成物の純度を、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、およびＮＭＲで確認した。
１）Bodanszky, M.とBodanszky, A. 1984. Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin.
２）Whittaker, R.G., Hayes, P.J.,とBender, V.J., 1993, Ｔｒｉｓをアミノ酸およびペプチドに結合させる穏やかな方法（A Gentle Method for Linking Tris to Amino Acids and Peptides）, Peptide Reserch, 6,3(p.125-128).
典型的な合成例を以下に記す。
工程（I）  α-ＢＯＣ（ε-Ｚ-Ｌｙｓ）2ＯＨ
α-ＢＯＣ（ε-Ｚ-Ｌｙｓ）ＯＨ（９．９ｇ、３０ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのＤＣＭに溶解した。ＨＯＳＵ（５．２ｇ、４５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（９．０ｇ、１５ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加し、０℃まで冷却した。５０ｍｌのＤＣＭに溶解したＤＣＣＤ（６．２ｇ、３０ｍｍｏｌ）を反応混合物中に滴下した。０℃で１時間、次いで室温で夜通し攪拌し、活性化されたエステル（α-ＢＯＣ（ε-Ｚ-Ｌｙｓ）ＯＳＵ、ＨＰＬＣで８６％の収率）を得た。ＤＣＵ（ジシクロヘキシル尿素）沈降物をろ過し、α-アミノ（（ε-Ｚ-Ｌｙｓ）ＯＨ（７．５６ｇ、２７ｍｍｏｌ）をこの反応混合物に添加し、室温で夜通し攪拌した。化合物Ｉは、ＨＰＬＣで調べたところ９３％の収率で生成された。溶媒を減圧下で除去し、油性残渣を酢酸エチルに溶解し、酸、塩基、および水で洗浄した。酢酸エチル相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。残渣をジエチルエーテルで粉砕して、９３％の収率で１６．６ｇの化合物Ｉを得た。Ｒｆ1：０．５２、ＲｔA:７．３３分；1ＨＮＭＲ：δ（ＤＭＳＯ-ｄ6、ｐｐｍ）、１．３９（９Ｈ、ｓ、ＢＯＣ（ＣＨ3）3）、１．４−１．８（１２Ｈ、ｂｒｓ、β、γ、δ ＣＨ2）、２．９９（４Ｈ、ｂｒｓ、εＣＨ2）、３．９５（１Ｈ、ｍ、αＣＨ）、４．１４（１Ｈ、ｍ、αＣＨ）、５．０３（４Ｈ、ｓ、Ａｒ-ＣＨ2）、６．８９（１Ｈ、ｄ、α-ウレタン  ＮＨ、Ｊ＝７．５Ｈｚ）、７．２５（２Ｈ、ｔ、ε-ウレタン  ＮＨ）、７．４１（１０Ｈ、ｍ、Ａｒ（Ｈ））、７．９５（１Ｈ、ｄ、アミド  ＮＨ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）。
工程（II）  Ｈ（ε-Ｚ-Ｌｙｓ）2ＯＨ
化合物Ｉ（１５．６ｇ、２７ｍｍｏｌ）を５０ｍｌのＤＣＭに溶解し、０℃まで冷却した。ＴＦＡ（５０ｍｌ）を反応混合物中に添加し、０℃で１０分間、さらに室温で５０分間攪拌した。溶媒および過剰なＴＦＡを蒸発させて乾燥させ、油性残渣をジエチルエーテルで粉砕した。１５．３ｇの化合物IIを得た：Ｒf2：０．１９、ＲtA:６．０７分。
工程（III）  α-ＢＯＣ（ε-Ｚ-Ｌｙｓ）3ＯＨ
α-ＢＯＣ（ε-Ｚ-Ｌｙｓ）ＯＨ（８．９６ｇ、２７ｍｍｏｌ）をＨＯＳＵとＤＣＣＤによって実施例Ｉのようにして活性化した。ＤＣＵをろ過し、ろ過物を１５．１ｇの化合物IIに添加した。ＤＩＥＡ（６ｇ、４６ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、室温で夜通し攪拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチルに溶解し、酸、塩基および水で洗浄した。酢酸エチルを硫酸ナトリウム上で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。この残渣をジエチルエーテルで破砕し、２０ｇの化合物IIIの白色の沈殿物を８７％の収率で得た。Ｒｆ1：０．３６、ＲｔA:７．９２分；1ＨＮＭＲ：δ（ＤＭＳＯ-ｄ6、ｐｐｍ）、１．３９（９Ｈ、ｓ、ＢＯＣ（ＣＨ3）3）、１．４−１．８（１８Ｈ、ｂｒｓ、β、γ、δ ＣＨ2）、２．９９（６Ｈ、ｂｒｓ、εＣＨ2）、３．９５（１Ｈ、ｍ、αＣＨ）、４．１４（１Ｈ、ｍ、α  ＣＨ）、４．３４（１Ｈ、ｍ、α  ＣＨ）、５．０３（６Ｈ、ｓ、Ａｒ-ＣＨ2）、６．８（１Ｈ、ｄ、ε-ウレタン  ＮＨ、Ｊ＝７．５Ｈｚ）、７．２５（３Ｈ、ｔ、ε-ウレタン  ＮＨ）、７．４１（１５Ｈ、ｍ、Ａｒ（Ｈ）、７．０８（１Ｈ、ｄ、アミド  ＮＨ、Ｊ＝８Ｈｚ）、８．１５（１Ｈ、ｄ、アミド  ＮＨ、Ｊ＝８Ｈｚ）。
工程（IV）  α-ＢＯＣ（ε-Ｚ-Ｌｙｓ）3-Ａｌａ-Ｔｒｉｓ
α-ＢＯＣ（ε-Ｚ-Ｌｙｓ）3ＯＨ（１ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を４０ｍｌのＤＭＦに溶解し、ＤＳＣ（０．９２ｇ、３．６ｍｍｏｌ）を添加した。ＤＩＥＡ（０．２ｍｌ、１．２ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１時間攪拌した後、ＨＰＬＣで調べたところ７８％の収率のトリ-Ｌｙｓの活性化エステルを生成した。Ａｌａ-Ｔｒｉｓ（０．４６ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、０．６ｍｌのＤＩＥＡを添加してｐＨを８に調節した。表題の化合物の形成をＨＰＬＣで調べた。２時間後、活性化されたエステルはほぼ完全に利用され、Ａｌａ−Ｔｒｉｓにカップリングして化合物IVを形成するか、トリ-Ｌｙｓ化合物に加水分解された。化合物IVの全体的な収率はＨＰＬＣで５２％であった。分離ＨＰＬＣで２７０ｍｇの純粋な化合物を収穫した。ＲｔA:７．４分；1ＨＮＭＲ：δ（ＤＭＳＯ-ｄ6、ｐｐｍ）、１．３９（９Ｈ、ｓ、ＢＯＣ（ＣＨ3）3）、１．４−１．９（１８Ｈ、ｂｒｓ、β、γ、δ ＣＨ2）、２．９７（６Ｈ、ｂｒｓ、εＣＨ2）、３．５３（６Ｈ、ｄ、Ｔｒｉｓ（ＣＨ2）、Ｊ＝３Ｈｚ、３．７５−４．４３（４Ｈ、ｂｒｓ、α  ＣＨ）、３．８９（３Ｈ、ｔ、ＣＨ）、５．０８（６Ｈ、ｓ、Ａｒ-ＣＨ2）、６．８（１Ｈ、ｄ、α-ウレタン  ＮＨ、Ｊ＝７．４Ｈｚ）、７．１９（３Ｈ、ｔ、ε-ウレタン  ＮＨ）、７．４１（１５Ｈ、ｍ、Ａｒ（Ｈ）、７．８０（１Ｈ、ｄ、アミド  ＮＨ、Ｊ＝８Ｈｚ）、８．１５（１Ｈ、ｄ、アミド  ＮＨ、Ｊ＝８Ｈｚ）、８．３５（１Ｈ、ｄ、アミド  ＮＨ、Ｊ＝８Ｈｚ）。
工程（V）  α-ＢＯＣ（ε-Ｚ-Ｌｙｓ）3-Ａｌａ-Ｔｒｉｓ（パルミタート）ｎｎ＝１、２、３
α-ＢＯＣ（ε-Ｚ-Ｌｙｓ）3-Ａｌａ-Ｔｒｉｓ（１７３ｍｇ、０．１７３ｍｍｏｌ）を３ｍｌのＤＣＭと１ｍｌのＤＭＦに溶解した。パルミチン酸（８９ｍｇ、０．３４６ｍｍｏｌ）と触媒量のＤＭＡＰを反応混合物に添加した。０℃まで冷却し、２ｍｌのＤＣＭに溶解したＤＣＣＤ（７１ｍｇ、０．３４６ｍｍｏｌ）を反応混合物中に滴下した。０℃で３０分間、次いで室温で夜通し攪拌した。モノ、ジ、およびトリパルミタート化合物を備えた表題の化合物の比率は、ＨＰＬＣ（系Ｂ）で１７％、４０％、および４３％であった。
溶媒を乾燥するまで蒸発させ、残渣をＤＣＭに再懸濁した。ＤＣＵをろ過し、ろ過物を炭酸水素ナトリウム（５％）と水で洗浄した。この混合物の分離ＨＰＬＣにより、高い純度のモノパルミタート化合物（１７ｍｇ、ＲtB：７．６３分）、ジパルミタート化合物（７６ｍｇ、ＲtB：８．６５分）、およびトリパルミタート化合物（６３ｍｇ、ＲtB：９．２９分）が得られた。トリパルミタート化合物の１ＨＮＭＲ：δ（ＣＤＣｌ3、ｐｐｍ）：０．８−０．９５（９Ｈ、ｔ、ＣＨ3）、１．３−１．４７（８４Ｈ、ｍ、ＢＯＣ（ＣＨ3）3、パルミタート（ＣＨ2）、Ａｌａ（ＣＨ3））、１．４７−１．９（１８Ｈ、ｂｒｓ、β、γ、δ ＣＨ2）、１．８３（６Ｈ、ｔ  ＣＨ2）、２．２８（６Ｈ、ｔ、ＣＨ2）、３．０９（６Ｈ、ｂｒｓ、ε  ＣＨ2）、３．９７  ２Ｈ、ｍ、α  ＣＨ）、４．２９（１Ｈ、ｍ、α  ＣＨ）、４．３５（６Ｈ、ｓ、Ｔｒｉｓ（ＣＨ2））、４．４７（１Ｈ、ｔ、α  ＣＨ）、５．０４（６Ｈ、ｓ、Ａｒ-ＣＨ2）、５．５６（１Ｈ、ｄ、アミド  ＮＨ、Ｊ＝７Ｈｚ）、５．７（１Ｈ、ｄ、アミド  ＮＨ、Ｊ＝７．５Ｈｚ）、５．７８（１Ｈ、ｄ、アミド  ＮＨ、Ｊ＝７．５Ｈｚ）、６．９２（１Ｈ、ｄ、α-ウレタン  ＮＨ、Ｊ＝７．４Ｈｚ）、７．１９（３Ｈ、ｔ、ε-ウレタン  ＮＨ）、７．３５（１５Ｈ、ｍ、Ａｒ（Ｈ））。
工程（VI）  （Ｌｙｓ）3-Ａｌａ-Ｔｒｉｓ（パルミタート）3
化合物V（４５ｍｇ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶かし、０℃まで冷却した。Ｂｏｃ基を除去するために、０℃で１０分間、室温で３０分間でＴＦＡ（２ｍｌ）を加えた。溶媒および過剰のＴＦＡを、ジエチルエーテルとの共蒸発(co-evaporation)を繰り返すことによって完全に除去した。この化合物の1ＨＮＭＲは、ＢＯＣ（ＣＨ3）基が消えたことを示した。残渣をＤＣＭ／メタノール（５０／５０、４ｍｌ）の溶液に溶かし、Ｚ基を除去するために１０％のパラジウム／炭素を用いてパーヒドロゲネーターで２時間４０ｐｓｉで水素化した。Ｚ基の除去は、1ＨＮＭＲ分光法で確認した（５．０４および７．３５ｐｐｍにおける化学的シフトがないことに基づく）。
生物学的用語
使用される略号：
Ａ＝  アラニン
ＤＤＭＥ＝  ２倍の濃度に調製され、凍結され、３７℃で溶かされ、ろ過され、使用前に１倍に希釈される（枯渇した(depleted)）ダルベッコ修飾イーグル培地（Loeffler, J-PとBehr, J-P, Method in Enzymology (1993) H, p599-654.
ＤＭＥ＝  ダルベッコ修飾イーグル培地
ＤＯＰＥ＝  ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
ＥＭ＝  電子顕微鏡
Ｆ＝  フェニルアラニン
ＦＣＳ＝  ウシ胎児血清
ＦＬＡＥＰ＝  フルオレセイン・アラニン・エタノールアミン・パルミタート
ＦＬＡＴＰ３＝  フルオレセイン・アラニン・Ｔｒｉｓ・トリパルミタート
Ｇ＝  グリシン
Ｋ＝  リシン
Ｋ３ＡＴＰ１−３＝  トリリシン・アラニン・トリス・モノ−トリパルミタート
Ｌ＝  ロイシン
Ｌｆｅ＝  リポフェクタミン（Gibco BRL）
ＭＴＳ＝  ３-（４，５-ジメチルチアゾール-２-イル）-５-（３-カルボキシメトキシフェニル）-２-（４-スルホフェニル）-２Ｈ-テトラゾリウム、内部塩(inner salt)；（Owen試薬）
ＭＴＴ＝  ３-［４，５，ジメチルチアゾール-２-イル］２，５-ジフェニルテトラゾリウムブロミド；チアゾールブルー
ＰＢＳ＝  リン酸バッファー生理食塩水
ＴＥＭ＝  透過(transmission)電子顕微鏡
ＶＦ＝  ベラフェクチン＝  Ｋ３ＡＴＰ３
ＶＦＡ３＝  Ｋ３ＡＴＰ３
ＶＦＧ２＝  Ｋ３ＧＴＰ２
Ａ．細胞の取り込みおよび分布
細胞内に化合物を輸送する能力を評価するために、フルオレセイン・アラニン・エタノールアミン・パルミタート（ＦＬＡＥＰ）およびフルオレセイン・アラニン・トリス・トリパルミタート（ＦＬＡＴＰ３）を用いて予備実験を行った。
ＦＬＡＥＰとＦＬＡＴＰ３複合体を、ＤＭＳＯ溶液から水性媒体（ＰＢＳ）に１０μＭまで希釈し、煮沸したカバーガラス上で生育された半集密的(subconfluent)なＣｏｓ１細胞の洗浄された単層上に添加した。２４時間まで曝すこの実験に明示された時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、ホルムアルデヒドで２０分間固定した。Bio Rad MRC 500共焦点顕微鏡でレーザー励起して細胞を観察した。
ＦＬＡＥＰもしくはＦＬＡＴＰ３のいずれかで処理してから１５分間のみで固定された細胞は、強烈な細胞質染色を示した。等レベルのフルオレセインのみに曝された細胞は、細胞全体から非常に弱い蛍光を示したに過ぎなかった。ＦＬＡＴＰ３が細胞および核の膜と優先的に結合すること、複合体溶液が単層から洗い流され、２時間後に培地を含む血清で置換されたにも関わらず、細胞に残ったパターンが２４時間成長し続けたことは特に注目するべきである。これと同じ染色の持続性は、同じ条件下でＦＬＡＥＰ複合体では観察されなかった。
４％のパラホルムアルデヒドにおける固定は、ホルムアルデヒド定着剤より細胞の形態を保持した。結果的に、細胞中の蛍光のより高分解能の映像が得られた。これは、両方の複合体が、一般的な分布を示すよりもむしろ、細胞質の分離した領域に局在することを示した。ライトミクロスコープレベルでの観察により、局在の領域が、小胞体、ゴルジ装置およびミトコンドリア膜であることが示唆された。
固定された細胞と同じ暴露時間でなされた未固定の生きた細胞を低分解能で観察することにより、異なるパターンの染色が示唆された。ＦＬＡＥＰ複合体は、容易に細胞に入るようであるが、特に核に濃縮される。これは、おそらく、この一般的な細胞質および核の分布が、これらを仕切る成分に付着していない分子によることを示唆している。固定において、これらの分子は、細胞の構成要素に結合する複合体のみを残して細胞から洗い流される。しかしながら、ＦＬＡＴＰ３複合体は、細胞が生きていようと固定されていようと類似したパターンを示した。
明白でない細胞毒性が、１０μＭの濃度で２時間まで各化合物で処理された細胞に見られた。５０μＭもしくはそれ以上のＦＬＡＥＰにＣｏｓ１細胞を７２時間連続して曝した後、標準的なＭＴＴ細胞毒性アッセイ（以下参照）でアッセイして顕著な細胞毒性が観察された。７２時間の同じ暴露時間後、ＦＬＡＴＰ３は１２．５μＭで約８０％の細胞毒性を示し（同じ濃度のＤＭＳＯ希釈物と比較）、６．２５μＭで７０％の細胞毒性を示した。
これらの結果は、脂肪アシル誘導体を備えた模範化合物が細胞内への自身の進入を容易にできることを示唆した。観察された細胞毒性は、化合物が細胞に進入するのに必要な時間では無視できるが、曝す時間が長くなると顕著に増大する。従って、結合によってＤＮＡ等の他の化合物を細胞に導入するのに、類似した化合物を用いることができるか否かを調べるために実験を行った。
Ｂ．トランスフェクション実験
ａ）細胞毒性
細胞毒性を、標準的なＭＴＴ（３-［４，５，ジメチルチアゾール-２-イル］２，５-ジフェニルテトラゾリウムブロミド；チアゾールブルー）アッセイを用いてアッセイした。簡単に、Ｃｏｓ１細胞を９６ウェルミクロタイタートレイの２ｘ１０4細胞／ウェルにまき、１００μｌの培養液で夜通し付着させた。テスト化合物を、プレートに２倍希釈で１００μｌの培養液に２ｘ濃度で添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ2で７２時間の通常の培養条件でインキュベートした。２０μｌのＭＴＴ（ＰＢＳ中に５ｍｇ／ｍｌ）を２．５時間３７℃で添加し、次いで全ての液体を除いた。ｒｅｆ ＯＤを６３０ｎｍとし、５７０ｎｍでＯＤを読む前に１００μｌの酸性プロパノールを添加し、プレートを１０分間振った。
ベラフェクチンＡ３と称される模範化合物Ｋ３ＡＴＰ３（トリ・リシン・アラニン・トリス・トリパルミタート）を、その全体的な陽性チャージでＤＮＡを引きつけるように設計した。これは水性溶液に不溶性であり、温かいエタノールに部分的に溶け、ＤＭＳＯに可溶性である。細胞毒性は、２．５ｍｇ／ｍｌの２５％ＤＭＳＯストックから希釈されたＫ３ＡＴＰ３に、７２時間連続的にＣｏｓ１細胞を曝すことによって試験した。１２．５−５０μＭ化合物の同じ濃度のＤＭＳＯ希釈物と比較して７０％の細胞が生存していた（図ａおよびｂ）。化合物が同じ濃度のエタノールに希釈された場合、細胞の生存はわずかに優れていた（図２ａおよびｂ）。
ｂ）ＤＮＡ輸送
実験例１：模範化合物Ｋ３ＡＴＰ３（ベラフェクチンＡ３）のトランスフェクション特性を調べるために、ＳＶ４０後期プロモーターの支配下にＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子を備えた完全な未切断のプラスミド、ｐＳＶＬＣＡＴ（Cameron, F.H.とJennings, P.A.(1989) PNAS 86, 9139-9143）を試験試薬と混合し、種々の条件下でＣｏｓ１細胞に添加した。４８時間培養した後、分泌されたＣＡＴレベルを培地からアッセイした。
方法：
溶液Ｉ：５００μｌのダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥ）中の１μｇのプラスミドＤＮＡ
溶液II：５００μｌのＤＭＥ中の０−２０μｌのベラフェクチンＡ３（２．５ｍｇ／ｍｌ  ２５％ＤＭＳＯ）、ボルテックス
溶液ＩとIIを組み合わせ、簡単にボルテックスし、室温で１０分間インキュベートする。
混合物を６０ｍｍ組織培養皿中の洗浄された細胞（前日に０．５ｘ１０6／皿でまかれた）に３７℃、５％ＣＯ2で６時間添加する。
残りの４８時間は２ｍｌのＤＭＥ＋１０％ＦＣＳを加える。
組織培養培地におけるＣＡＴレベルをアッセイする（Sleigh, M.J. (1986) Anal. Biochem. 156. 251-256）。
結果：
顕著なＣＡＴレベルを、５μｌ（１２．５μｇ）およびそれ以上のベラフェクチンＡ３（２．５ｍｇ／ｍｌ＝１．８ｍＭ）でトランスフェクションされたこれらのサンプルから調べた。ピークＣＡＴレベルは１０μｌ（２５μｇ）のベラフェクチンＡ３で観察された（図３）。
実験例２：
１００％のＤＭＳＯもしくはエタノールに溶解されたベラフェクチンＡ３ストック溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を用いたＣｏｓ１細胞中のトランスフェクションレベルの比較および細胞のベラフェクチンＡ３／ＤＮＡ複合体の暴露時間の最適化
方法：
ａ-  ＤＭＳＯまたはエタノールに溶かされたベラフェクチンＡ３を比較。
ｂ-  ６時間から夜通し、細胞上におけるベラフェクチンＡ３の比較。
１００％溶媒中の１０ｍｇ／ｍｌのベラフェクチンＡ３を水で２．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。
実験例１と同様にしてトランスフェクションを行った。ベラフェクチンＡ３を、種々の時間で細胞と接触させた。
結果：
ｉ）  顕著なレベルのＣＡＴが、１０μｌ（２５μｇ）以上のベラフェクチンＡ３で処理された全てのサンプルから検出された。
（ii）  エタノール性サンプルは、低いトランスフェクション性能を示した。
（iii）  ベラフェクチンＡ３を用いて夜通しインキュベーションしたものは、６時間インキュベーションしたものと比べて約５０％ＣＡＴレベルを低減した。
実験例３：
ＣＨＯ細胞におけるベラフェクチンＡ３とＧ２を用いてなされるトランスフェクションレベルと、商業的に利用できる試薬トランスフェクタム(Promega)とリポフェクタミン(BRL)を用いてなされるトランスフェクションレベルとの比較。
方法：
６０ｍｍ皿当たり０．５μｇのｐＳＶＬＣＡＴ ＤＮＡを用いたこと以外は、ベラフェクチンおよびトランスフェクタム（上記参照）と同じプロトコルを用いた。
リポフェクタミンプロトコルは、製造元の説明に従った。０．５μｇのｐＳＶＬＣＡＴ／６０ｍｍ皿。
ＣＨＯ細胞を１ｘ１０5／６０ｍｍ皿となるようにまき、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥ／Ｈａｍｓ培地に夜通し付着させた。
トランスフェクタム５もしくは１０μｌ  １ｍｇ／４００μｌストック溶液。
リポフェクタミン５もしくは１０μｌ  ２ｍｇ／ｍｌ（ＤＯＰＥと３：１の混合試薬）。
ベラフェクチンＡ３（Ｋ３ＡＴＰ３）とベラフェクチンＧ２（Ｋ３Ｇ［グリシン］ＴＰ２）、それぞれ５、１０および１５μｌの２ｍＭ（それぞれ２．８および２．３ｍｇ／ｍｌ））ストック溶液。
テスト試薬およびＤＮＡの存在下で、血清を含まずに６時間インキュベーションした後、１ｍｌのＤＭＥ／Ｈａｍｓ＋１０％ＦＣＳを加えた。４８時間で収穫するまで、２４時間で培地を２ｍｌの新鮮なＤＭＥ／Ｈａｍｓ＋１０％ＦＣＳに変えた。
結果：
ＣＨＯ細胞をトランスフェクション工程開始から４８時間後に溶解させ、ＣＡＴ活性をアッセイした。トランスフェクションのピークは、どの場合でも５μｌのトランスフェクション試薬を用いた場合に観察された。ベラフェクチンＡ３を用いて得られたＣＡＴレベルは、トランスフェクタムを用いて得られた値の約５４％、リポフェクタミンを用いて得られた値の１８％であった。
ベラフェクチンＧ２を用いて得られたＣＡＴレベルは、トランスフェクタムを用いて得られた値の約６４％、リポフェクタミンを用いて得られた値の２２％であった。
図４参照。
実験例４：
Ｃｏｓ１細胞におけるベラフェクチンＡ３（Ｋ３ＡＴＰ３）とベラフェクチンＧ２（Ｋ３ＧＴＰ２）を用いてなされるトランスフェクションレベルと、商業的に利用できる試薬リポフェクタミン(BRL)を用いてなされるトランスフェクションレベルとの比較。
プロトコルは、上記のベラフェクチンの場合と同じである。リポフェクタミンプロトコルは、製造元の説明に従った。
Ｃｏｓ１細胞を５ｘ１０5／６０ｍｍ皿となるようにまき、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥに夜通し付着させた。
溶液Ａ：０．５μｇのｐＳＶＬＣＡＴ／６０ｍｍ。
溶液Ｂ：リポフェクタミン１０および１５μｌ  ２ｍｇ／ｍｌ（ＤＯＰＥと３：１の混合試薬）。
ＯＲ；ベラフェクチンＡ３とベラフェクチンＧ２  ２０μｌ  ２ｍＭ（それぞれ２．８および２．３ｍｇ／ｍｌ）ストック溶液。
ＯＲ；ベラフェクチンＧ２を等モルのＤＯＰＥと共に試験した。
ベラフェクチンＧ２とＤＯＰＥをＤＤＭＥに混合し、使用前に３０秒間ボルテックスした。
溶液ＡとＢとを混合してから、洗浄した細胞上に添加した。
テスト試薬およびＤＮＡの存在下で、血清を含まずに６時間インキュベーションした後、１ｍｌのＤＭＥ＋１０％ＦＣＳを加えた。４８時間で収穫するまで、２４時間で培地を２ｍｌの新鮮なＤＭＥ＋１０％ＦＣＳに変えた。
結果：
Ｃｏｓ１細胞からの組織培養液サンプル（上清）について、トランスフェクション工程開始後４８時間のＣＡＴ活性をアッセイした。ベラフェクチンＡ３およびベラフェクチンＧ２は、それぞれ、リポフェクタミンを用いてなされるレベルの約６０％および３０％のレベルまでＣｏｓ１細胞をトランスフェクションした。等モルの未製剤のＤＯＰＥ（ＤＭＳＯ／Ｈ2Ｏ中に２ｍＭ）をベラフェクチンＧ２サンプルに添加することにより、ベラフェクチンＧ２のみと比較してほぼ二倍のトランスフェクション効率が示され、リポフェクタミンでなされるレベルの６０％、並びにベラフェクチンＡ３と同じレベルに相当した。得られたＣＡＴレベルは、図５に示されている。
Ｃ．  相対細胞毒性
種々の試薬によって引き起こされる細胞毒性の相対レベルを、染料“アラマーブルー(Alamar Blue)”（Alamar, Sacramento CA）を用いた実験で比較した。本発明のタイプの化合物は、他の試薬より一般的に顕著に低い細胞毒性を示した。
たとえば図６ａおよびｂ。
細胞毒性の相対レベルも、Cell titre 96 Aqueous(Promega)として市販されているＭＴＳ染料を用いた実験でアッセイした。
Ｄ．  模範の“トランスフェクション”化合物の変異体の相対効率
Ｃｏｓ１もしくはＣＨＯ細胞系を、ある範囲の濃度の各トランスフェクション化合物を用いて、０．５μｇのｐＳＶＬＣＡＴもしくは２μｇのｐＰＧＫｌａｃＺプラスミドでトランスフェクションした。化合物の最適濃度、すなわち、４８時間で最高レベルのＣＡＴを生じる濃度、もしくは２４時間でもっとも高いパーセントのｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）染色細胞を生じる濃度を、表１のデータに用いた。全ての化合物を一回の実験でテストしていないので、トランスフェクションを示す絶対的な量は用いられていない。むしろ、記号は、全ての実験で対照として含まれるリポフェクタミン(BRL)に対するトランスフェクション効率を示すために用いられる。表１は、少なくとも一つの細胞型のトランスフェクションを仲介する多数の化合物の相対効率を示す。
0003763577.tif 000006
実験例３に記載された変異体を用いて、上記実験例１のＢに記載の通りに実験を行った。示された結果は、最適化されたレベルのトランスフェクション試薬から得られたものである。示された全ての結果は、発明者らによって得られたものである。商業的試薬を伴う会社の文献は含まれていない。
合成され試験された他の種類の化合物は以下に記載されている。
結果
上表に示された結果は、Ｋ１−４、ＡもしくはＧリンカーおよびパルミタート１−３を備えた全ての試験化合物が、試験された細胞型においてあるレベルのトランスフェクションをすることを示している。リシンもしくはパルミタートのいずれかを欠く化合物は、トランスフェクションを支持できなかった。このことは、ＤＮＡを引きつける分子（Ｋ）および推定上の細胞浸透分子（パルミタート）の両方の必要性を示唆している。別のリンカーは、トランスフェクションレベルに影響を与えるが、両方ともトランスフェクションを支持することができた。
模範化合物の変異体はトランスフェクション効率を変える
２頁に記載された一般式の化合物は、記載された基本構造ブロック“ｘ、ｙ、Ｒ１−Ｒ４”からなる。これらの構成要素は、標準アッセイ系で標準細胞系をトランスフェクションするのに最適な構造ブロックを評価するために組織的に変えられる。結果は、実験例を使用することによって示され、標準的な条件下でどちらかの全体的なレベル（ＣＡＴもしくはβ-ガラクトシダーゼ発現）によって表されるレポーター遺伝子の発現レベルとして、あるいはトランスフェクションした細胞（β-ガラクトシダーゼ  −  青色細胞）の％として示される。細胞毒性の代表的なレベルも記載される。
“ｘ”ペプチド
上述の模範化合物“ベラフェクチンＡ３”は、分子に４+のチャージを付与する３つのリシン残基を備えている。０+〜６+を有するＫ０〜Ｋ５を具備する変異体を試験した。
目的：効率的なトランスフェクションのための最適な数のＫ残基を調べる。
方法：各実験では、以下の間で比較を行った。
ａ．  Ｋ０ＡＴＰ３、Ｋ３ＡＴＰ３、Ｋ５ＡＴＰ３およびＫ２ＡＴＰ２、Ｋ５ＡＴＰ２（ＣＨＯ細胞）
ｂ．  Ｋ１ＡＴＰ２、Ｋ２ＡＴＰ２（Ｃｏｓ１細胞）。
ｃ．  Ｋ３ＡＴＰ３、Ｋ４ＡＴＰ３、Ｋ５ＡＴＰ３（ＣＨＯ細胞）
全ての試験リポペプチド試薬は、最初は７５％のＤＭＳＯ中に１０ｍＭで溶かされており、次いで水で希釈して、４℃で貯蔵される２ｍＭストックを調製した。２μｌ〜１５μｌの範囲の２ｍＭストックリポペプチドの体積を５００μｌのＤＤＭＥに希釈した。１μｇのプラスミドｐＳＶＬＣＡＴを、５００μｌのＤＤＭＥに分けて希釈した。ＣＨＯ細胞（２ｘ１０5／日）もしくはＣｏｓ１細胞（５ｘ１０5／日）の６０ｍｍ皿中の５００μｌのＤＤＭＥに加える前に室温で１０−２０分間溶液を合わせた。
細胞を、３７℃かつ５％ＣＯ２の標準的な条件下で６時間インキュベートした。夜通しインキュベートするために、１．５ｍｌのＤＭＥ／Ｈａｍｓ＋１０％ＦＣＳ（ＣＨＯ）もしくはＤＭＥ＋１０％ＦＣＳ（Ｃｏｓ１）を細胞に添加した。収穫前の２４時間に、新鮮なＤＭＥ／Ｈａｍｓ＋１０％ＦＣＳもしくはＤＭＥ＋１０％ＦＣＳを用いて培地を置換した。細胞溶解物を調製し、上述したようにＣＡＴ活性をアッセイした。Ｃｏｓ１細胞では、培養上清をＣＡＴ活性についてアッセイした。
結果：
ａ：トリパルミタート化合物では、Ｋ３ＡＴＰ３が良好なトランスフェクションを示した（３７℃、１μｌのＣ14アセチルＣｏＡで２０分間のアッセイ時間後２５μｌ溶解物から平均６２３７ｃｐｍ（全利用可能カウントは４０−５００００ｃｐｍ））。Ｋ５化合物は、その最適レベルにおいて顕著に低減したカウントを示した（平均１７８５ｃｐｍ）。Ｋ０化合物は、このアッセイ系では測定可能なトランスフェクションを示さなかったが、低レベルのトランスフェクションが、ＣＨＯ細胞でβ−ｇａｌアッセイ系（後述）を用いて観察された。
ジパルミタート化合物では、Ｋ２の存在がトランスフェクションにおいて顕著に優れており、Ｋ５化合物の１３２ｃｐｍと比較して、平均５４１８ｃｐｍを与えた。トランスフェクションした皿の細胞の生存力はグラフ７ｂに示されている。毒性は、最も高いレベルのトランスフェクションを示す皿で最も高い（ＯＤは最も低い）。
図７ａおよびｂ参照。
ｂ：単一のＫの含有は、平均１２６７０ｃｐｍの顕著なトランスフェクションを可能にした（２５μｌの溶解物、３７℃で１３５分のインキュベーション、２μｌのＣ14アセチルＣｏＡ（全利用可能カウントは９０−１０００００ｃｐｍ）。第二のリシン残基の存在は、同じレベルの化合物で生じる最適な結果である約５倍のトランスフェクションレベル（平均６２２１５ｃｐｍ）を示した。
図８
ｃ：Ｋ４ＡＴＰ３とＫ５ＡＴＰ３化合物の両方は、Ｋ３等価物に比べて顕著に低いトランスフェクションを生じ、２０μｌの溶解物を２時間インキュベーションした後の各ＣＡＴ活性の平均レベルは、それぞれ１０７１、６３６３および１３４６７ｃｐｍであった。
図９
結論
示されたデータから、Ｋn=1〜5ＡＴＰ２／３の０〜５のリシン含有の間の最適活性の序列は以下のように示される：
Ｋ３≧Ｋ２＞Ｋ５＞Ｋ４＞＞Ｋ１。
細胞生存能力の代表的なグラフは実験ｂに示されている（図７ｂ参照）。これは、細胞生存能力とトランスフェクションとの関係の逆を示す。これは、共通に見いだされることである。
“ｙ”リンカー
上述の模範化合物は、３つのリシン残基（Ｋ３）と、“ｙ”の位置にアラニン（Ａ）リンカーとを備えている。アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、リシン（Ｋ）もしくはグリシン（Ｇ）を備えた変異体を試験した。
目的：効率的なトランスフェクションのための最適なリンカー残基を調べる。
方法：それぞれの実験で、比較を以下の間で行った：
ａ．  Ｋ２  Ｋ／Ｆ／Ｌ  ＴＰ２  （Ｃｏｓ１）
ｂ．  Ｋ２  Ａ／Ｌ      ＴＰ２  （Ｃｏｓ１）
ｃ．  Ｋ３  Ａ／Ｌ／Ｇ  ＴＬ３  （Ｃｏｓ１）
ｐＳＶＬＣＡＴのトランスフェクションおよびＣＡＴ酵素のアッセイに関して、実験例“ａ”および“ｂ”を上述の通りに行った。
実験例“ｃ”に関しては、マウスＰＧＫプロモーターの支配下にβ−ガラクトシダーゼをコードするプラスミドｐＰＧＫｌａｃｚＮＬＳ（G. Hannan提供）もしくはＳＶ４０初期プロモーター（Sleigh, M.J.とLockett, T.J. (1985). EMBO J. 4:3831-3837）を利用したｐＳＶＧＡＬをトランスフェクションした。この実験とアッセイは、FelgnerらJ. Biol Chem. 269(4) 2550-2561 1994から修飾されている。このプロトコルによれば、ミクロタイタートレイで７２の異なる組み合わせおよび濃度のＤＮＡおよびテスト試薬を同時に評価することができる。最大レベルの遺伝子産物を示すウェルは、各試薬の最適な結果として選択された。細胞毒性は、アラマーブルーを用いて評価され、サンプルグラフは実験例ａについて示されている。
結果
ａ：ジリシン、ジパルミタート化合物中のリンカーＫ、ＦおよびＬの比較において、ＬはＦとほとんど変わらない結果を示したが、実質的にＫ化合物より効果的であった。図１０ａ参照。ＬおよびＦ化合物の毒性は、Ｋ化合物よりもわずかに高く、このことは単に細胞生存レベルがより高いというだけでは、より高いＣＡＴレベルが観察されないことを示唆している。
図１０ｂ参照。
ｂ：ペプチド比較実験で用いられたＡリンカーと、実験例“ａ”でより高いレベルの遺伝子発現を与えることが示されたＬリンカーとの比較において、二つの化合物が、非常に類似した活性を備えていることが示された。
図１１。
ｃ：二つの模範的なリンカーＡおよびＬを、Ｇリンカーに対してトリリシン、トリラウラート（Ｌ３）のバックグラウンドで試験した。この場合では、Ａリンカー化合物は、トランスフェクションにおいて優れており、他の化合物は、Ｌ５７％、Ｇ  １２％、リポフェクタミン  ３９％の相対トランスフェクションレベルを示した。
図１２。
結論
示されたデータの比較から、種々のリンカーの効率の序列は、以下のように推定される。
Ａ≧Ｌ＞Ｆ＞Ｋ＞＞Ｇ。
“Ｒ１−Ｒ４”脂肪アシル誘導体
Ｉ．  トリスリンカーのアシル誘導体数、１〜３
トリスリンカーは、ペプチドおよびリンカーに一つ、二つもしくは三つの脂肪アシル誘導体を付加しやすくする。一般的にこれらの全ての誘導体は、互いに同一である。一つ、二つもしくは三つの脂肪アシル誘導体を具備する点で異なるが、全て同一の構成ブロックを有する化合物を、上記の標準的なトランスフェクションおよびアッセイ方法を用いて比較した。
目的：一つ、二つもしくは三つの脂肪アシル誘導体を具備するペプチド脂肪アシル誘導体化合物が哺乳動物細胞をトランスフェクションする能力を比較。
方法：プラスミド上にＣＡＴもしくはβ−ｇａｌ遺伝子のいずれかをトランスフェクトする能力について化合物を試験し、上記のようにアッセイした。
実験例：
0003763577.tif 000007
結果
ａ：実験例“ａ”で試験された化合物の比較により、ジおよびトリパルミタートの両方は高レベルのトランスフェクションを与えるが、モノパルミタート分子は非常に非効率的であることが示された。
図１３ａ。
他の実験では、Ｋ３モノパルミタート化合物は、トリパルミタートＫ３分子の３０％の活性を示した（データ示さず）。
図１３ｂ。
ｂ：フェニルアラニンリンカーを備えたモノ、ジおよびトリパルミタート化合物の相対トランスフェクション能力は、アラニンリンカー（ａ）を備えたものと類似していた。
図１４ａおよびｂ。
ｃ：ロイシンリンカーを備えたモノ、ジおよびトリパルミタート化合物の相対トランスフェクション能力は、アラニンリンカー（ａ）を備えたものと類似していた。
図１５ａおよびｂ。
ｄ：リシンリンカーの場合は、ジパルミタートはトリパルミタート分子より顕著に低い活性であることが示された。トリパルミタートの増大したトランスフェクション活性は、先の場合にみられたように、細胞毒性の増大と付随している。
図１６ａおよびｂ。
ｅ：この比較では、トリパルミタート分子（平均８３２５ｃｐｍ）は、ジパルミタート（平均９８４ｃｐｍ）より劇的に効率的であった。細胞毒性レベルは、増大したトランスフェクションと共にわずかに大きかった。
図１７ａおよびｂ。
ｆ：異なる数の脂肪アシル基（ｎ＝１〜３）を備えた化合物を、３つの異なる長さの脂肪アシル誘導体（パルミタート、ミリスタートおよびラウラート）のバックグラウンドにおけるトランスフェクション効率に関して比較したところ、３つの脂肪アシル基を備えた化合物は、一貫して、２つもしくは１つの基を備えた化合物よりも、トランスフェクションにおいてより効果的であることが示された。３つの脂肪アシル基が存在する場合の毒性は、一般的にわずかに高いが、常にリポフェクタミンより低かった。表２参照。
0003763577.tif 000008
示されたそれぞれの結果は、７２の異なる条件のミクロタイタープレートからの最も高い読みである。最大値が得られた［脂質］/［ＤＮＡ］の比率が示されている。示された実験は、上記のようにしてＣｏｓ１細胞中で行われた。ＭＴＳ ＯＤは、異なる試薬に曝された細胞の相対生存能力の測定値であり、高い値は、優れた細胞生存能力を示す。*これらのポイントは、別の実験から得られたもので、実験の間に絶対値のわずかな変化があることが予想される。この実験では、生存能力は染料アラマーブルーを用いて測定され、直接比較し得るものではない。
ｇ：Ｋ４化合物
テトラリシンアラニンのバックグラウンドに１〜３のパルミタート（Ｋ４ＡＴＰ１／２／３）の間で比較を行った。先の実験にみられるように、トリパルミタートは、ジもしくはモノパルミタートより効果的であった。化合物のいずれか一つを用いて活性を測定した。最適なトランスフェクションには高レベルのこれらの試薬を必要としたにもかかわらず、細胞毒性は低かった。
図１８ａおよびｂ参照。
結論
“Ｋ３”化合物を用いた実験の結果は、“Ｋ４”化合物を用いた場合と類似して見える。すなわち、三つの脂肪アシル基は、細胞をトランスフェクトする能力において、二つもしくは一つの基よりも優れている。
Ｒ１−Ｒ４のセクションの結論
上記実験に示されたように、３つの脂肪アシル誘導体を備えた化合物は、一般に、一つまたは二つの脂肪アシル誘導体を備えた化合物よりも、細胞をトランスフェクトすることにおいて優れた能力を示す。トランスフェクションの最適ポイントでは、一般的に、商業的試薬“リポフェクタミン”より細胞に対する毒性が顕著に低い。この節に示されたほとんどのデータは、Ｃｏｓ１細胞で行われた実験によるものであるが、これらの結果はＣＨＯ細胞で得られた結果に反映していた。遺伝子産物の絶対的なレベルがそうであるように、種々の化合物に関する最適濃度は細胞系間で変わるが、［脂質］/［ＤＮＡ］間の最適な比率は、一般的に細胞に依存し、トランスフェクション能力における化合物の相対的位置付けは類似している。
示されたデータの比較により、未製剤の混合されていない化合物の種々の数の脂肪アシル基（ｎ＝１〜３）の効率の序列を以下のように推定することができる。
３＞２＞１。
“Ｒ１−Ｒ４”脂肪アシル誘導体
II．  炭素鎖の長さ
目的：Ｃ１６（パルミタート）と異なる長さの脂肪アシル誘導体が、哺乳動物細胞をトランスフェクトするのにより優れた能力を有するか否かを調べる。
方法：以下のような長さの異なる１〜３つの同一の脂肪アシル誘導体を備えたトリリシンアラニントリス（Ｋ３ＡＴ）の変異化合物を調製した。
Ｃ１６  パルミタート  （Ｐ）
Ｃ１４  ミリスタート  （Ｍ）
Ｃ１２  ラウラート    （Ｌ）
Ｃ１０  カプロアート  （Ｃ）
これらの各化合物を、上記の標準的な条件を用いて標準的な細胞系でトランスフェクション能力および細胞毒性を調べた。
結果
ａ．  Ｃｏｓ１およびＣＨＯ細胞におけるＰ、Ｍ、ＬおよびＣ誘導体間の比較。
この表は、ラウラートおよびミリスタートを備えた化合物が、始めに用いられていたパルミタート誘導体より効率的に細胞をトランスフェクトできることを示している。カプロアートは、これらの化合物中で最も低い活性誘導体であった。
0003763577.tif 000009
用語の説明：
示されたそれぞれの結果は、７２の異なる条件のミクロタイタープレートからの最も高い読みである。最大値を与える［脂質］/［ＤＮＡ］比は、（Ｃｏｓ１）（ＣＨＯ）の順で二つの異なる細胞型について括弧内に示されている。示された実験は、上述のようにしてＣｏｓ１細胞中で行われた。生存能力は、染料アラマーブルーで測定した。＃は、別の実験で試験された化合物を示す。*この実験における生存能力を、ＭＴＳを用いて調べた。ＯＤは、種々の試薬に曝された細胞の相対生存能力の測定値であり、アラマーブルーを用いた場足のように、高い値は優れた細胞生存能力を示す。
ｂ．  Ｈｅｌａ細胞で調べられたＣ１０〜Ｃ１６のＲ１−Ｒ４
目的：Ｃｏｓ１およびＣＨＯ細胞において最も効率的な脂肪アシル基がＨｅｌａ細胞でも最も効率的であるか否か調べる。
方法：Ｈｅｌａ細胞を、Ｃｏｓ１もしくはＣＨＯ細胞の代わりにＤＭＥ＋１０％ＦＣＳに２ｘ１０4／ウェルの密度となるようにまき、上記のようにｐＰＧＫｌａｃｚＮＬＳでトランスフェクトした。
４８時間で、アラマーブルーを用いて毒性を調べ、細胞にβ-galアッセイを行った。
結果：
β-galアッセイの結果は、Ｃｏｓ１およびＣＨＯ細胞におけるのと同様に、炭素鎖の長さがＣ１６からＣ１２に減少すると、トランスフェクション能力が増大した。Ｃ１０分子を用いた場合には、トランスフェクション能力は非常に低くなり、ここではＣ１２がピークのトランスフェクション効率であることを示している。予期せぬことに、細胞生存能力のピークレベルもＣ１２化合物（Ｋ３ＡＴＬ３）でみられた。
図１９ａおよびｂ。
結論
脂肪アシル誘導体の長さの変化は、いくつかの細胞型をトランスフェクトする化合物の能力に劇的な影響を与える。トランスフェクションの序列は、試験された全ての細胞型で維持されている。この位置におけるミリスタートおよびラウラートの両方が、原型のパルミタートより優れたトランスフェクションレベルを与え、ラウラートは試験された全てのものより優れていた。
“ｙ”リンカー  標準的ではないアミノ酸
一連のアミノ酸をリンカー基として用いた。これらは、上述したロイシン、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、α-ＢＯＣ（ε-フリー）リシンを含んでいる。さらに、アミノ酪酸、アミノカプロン酸およびアミノカプリル酸等（それぞれ、３、５および７炭素−炭素単結合のリンカーを有する）の非標準アミノ酸についても調べた。
実験１
目的：位置“ｙ”に種々の長さの非標準アミノ酸リンカーを用いることによって、Ｔｒｉｓとチャージしたペプチド“ｘ”との間に、より長いスペースを備えた化合物のトランスフェクション特性を調べる。
方法：ペプチド／脂肪アシル複合体を、リンカー基として非標準アミノ酸であるアミノ酪酸（Ｃ３）、アミノカプロン酸（Ｃ５）およびアミノカプリル酸（Ｃ７）、トリリシン核酸結合ドメイン、および三つの脂肪アシル基にラウラートを用いて合成した。これらの新しい複合体では、ＤＮＡ結合およびトリス／脂肪アシル分子は、原型分子と比較した際に、それぞれ余分な３、５および７炭素結合の長さによって分類された。これらの化合物を、細胞をトランスフェクトする相対的な能力を調べるために、上記の標準的な方法で試験した。
結果：Ｋ３“ｙ”ＴＬ３化合物、ｙ＝Ｃ３、Ｃ５、Ｃ７、Ａ、Ｌ、Ｇを、上記の標準的なβ-galレポーター遺伝子系を用いてトランスフェクション効率について、互いにおよび商業的試薬リポフェクタミンと比較した。Ｋ３ＧＴＬ３を除く全ての化合物は、リポフェクタミンよりトランスフェクションにおいてより効率的であることがわかった。Ｃ３、Ｃ５、特にＣ７化合物は、標準的な単一のアミノ酸リンカーを用いた化合物より劇的に効率的であることが示された。
図２０ａ。
試薬の細胞毒性は、付随したグラフに示されている。図２０ｂ。トランスフェクションレベルの増大が、細胞毒性の増大と連動しないことに注目すべきである。
実験２
トランスフェクトされた細胞の割合
目的：Ｃ３−Ｃ７化合物によって示されたトランスフェクションの増大が、トランスフェクトされた細胞の割合の増大に反映されているか調べる。
方法：トランスフェクトされた細胞の割合を評価するために、ｐＰＧＫｌａｃＺＮＬＳでＣＨＯおよびＣｏｓ１細胞をトランスフェクトするためにこれらの複合体を用いた。用いられたトランスフェクション条件は、トランスフェクション用の３５ｍｍ皿で生育された細胞を用いたＣＡＴ実験で上述されているものである。トランスフェクションの前日に、３．４ｘ１０5／皿（Ｃｏｓ１）もしくは６．８ｘ１０4／皿（ＣＨＯ）の密度に細胞をまいた。トランスフェクション後２４時間における生存能力の分析をした後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．１Ｍリン酸バッファー中に０．２％グルタルアルデヒド、ｐＨ７．３に４℃で５分間固定した。細胞を冷却したＰＢＳで２度洗浄した。新鮮な染色溶液（１０ｍｌの０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．３；２．５ｍｌのＨ2Ｏ中に１０５ｍｇのフェロシアン化カリウム(potassium ferrocyanido)と２．５ｍｌのＨ2Ｏ中に８２ｍｇのフェリシアン化カリウム(potassium ferricyanide)の１．０ｍｌの１：１混合物；ジメチルホルムアミド中に２％のX-galを０．２ｍｌ、１１．２μｌの１ＭのＭｇＳＯ4）（２ｍｌ）を各皿に添加して、発色するまで皿を３７℃でインキュベートした。光学顕微鏡で不規則なフィールドの細胞を調べ、青色（β-ＧＡＬの発現）細胞の比率を調べた。
結果：試験試薬を用いて観察されたトランスフェクションの増大は、青く染まった細胞数で示されているように、トランスフェクションした細胞比の増大に反映された。
図２１ａは、ＣＨＯ細胞で得られた結果を示し、図２１ｂは、Ｃｏｓ１細胞で得られた結果を示している。このグラフのＸ軸において、Ｌｆｅはリポフェクタミン、ｖｆは原型のペプチド／脂肪アシル複合体Ｋ３ＡＴＰ３、ＡはＫ３ＡＴＰ３を示し、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ７は、それぞれアミノ酪酸、アミノカプロン酸およびアミノカプリル酸が連結している複合体を示す。
図２１ａおよびｂ。
結論
ペプチド／脂肪アシル複合体のリンカー部の長さを増すことにより、レポーター遺伝子の全体的な発現レベルとトランスフェクトされた細胞比の両方において、トランスフェクション特性が改善される。これらの試薬を用いることにより、トランスフェクションのピークレベルが、比較的低レベルの毒性でなされることに特に注意するべきである。これらの試薬は、トランスフェクションレベルの増大が直接細胞毒性レベルの増大につながるという最初の観察に合うものではない。
トランスフェクションを行う長いリンカーを備えた複合体の改善された能力は、細胞型から独立であると思われる。
図２２ａおよびｂに示されたデータは、アミノカプリル酸連結複合体Ｋ３Ｃ７ＴＬ３が、ヒト前立腺ガン上皮細胞系ＰＣ３（図２２ａ）およびＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞系（図２２ｂ）を用いた場合にも、リポフェクタミンより効果的なトランスフェクション試薬であることを示している。
図２２ａおよびｂ。
試験した細胞型
上述の通り、記載された一般式の複合体は、いくつかの細胞型のトランスフェクを成功させるために用いられた。より完全なリストを以下に示す。
0003763577.tif 000010
オリゴヌクレオチドトランスフェクション
目的：細胞にプラスミド全体のレポーター遺伝子をトランスフェクトする能力を示した化合物がオリゴヌクレオチドのトランスフェクションにも効率的であるか否かを調べる。
方法：１８マーの５’−フルオレセイン化ホスホロチオアート（fluoresceinated phosphorothioate）オリゴヌクレオチドをＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。Ｋ３Ｃ７ＡＴＬ３、Ｋ３ＡＴＬ３および無試薬の、細胞内にオリゴヌクレオチドをトランスフェクトする能力を比較した。オリゴヌクレオチドを、１２１．２μＭヌクレオチド、６０．６、および３０．３μＭヌクレオチドまで連続的に希釈した。テストリポペプチドを、８４μＭ、４２、および２１μＭまで連続して希釈した。これらの希釈物を、３ｘ３マトリックス中で組み合わせ、上記の半分の濃度とされた。すなわち、オリゴヌクレオチドの最初の希釈は、６０．６μＭヌクレオチド（３．３７μＭの１８マーオリゴヌクレオチド）およびリポペプチド４２μＭとなった。混合物を室温で１０分間インキュベートし、ＣＨＯ細胞（前日に１ｘ１０4／ウェルとなるようにまかれた）に添加し、全体で１００μｌの血清を含まないＤＤＭＥで洗浄した。テスト試薬を含まない混合物を含むウェルは、同じ条件下で添加された３つの異なる濃度のオリゴヌクレオチドを含有している。
３７℃かつ５％ＣＯ2の標準条件で３時間インキュベーションした後、混合物を除去し、５０μｌのＤＤＭＥで置換した。共焦点顕微鏡(the confocal microscope)で細胞の生存を観察した。蛍光レベルが高いので、BioRad MRC 500共焦点顕微鏡のレーザーのピンホール装置を最小まで絞った。全ての画像を定量的比較のために同じ設定で回収した。
共焦点分析後、１００μｌのＥＭＥＭ＋１０％のＦＣＳをウェルに添加し、細胞を夜通し標準的な条件下でインキュベートした。細胞を蛍光で再度調べた。
結果
トランスフェクションの時点から３時間後のトランスフェクションの結果を表４に示す：
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結論
各トランスフェクション試薬の使用により、高レベルのオリゴヌクレオチドを取り込んだ１００％の生存細胞を生じた。実験に記載された３時間の時点では、細胞核は蛍光化オリゴヌクレオチドで強烈に染色された。
アスタリスク“＊”でマークされた結果は、無試薬の実験を除いて、マークされていないものより低い傾向を発した。無試薬では、蛍光レベルは、実験に用いられた検出レベルで、蛍光を発する各細胞における強度を変える単一スポットに限定された。
表４に特定されたものより高い割合の細胞が、トランスフェクション試薬の無い条件下でオリゴヌクレオチドを取り込んだが、取り込みの量は、用いられた検出レベルで記すには不十分であった。
十分な培地（ＥＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）で夜通しインキュベートしたした後、全てのサンプルにおいて蛍光レベルが減少し、最も重要な変化はほとんどの核における蛍光の損失であり、細胞質の染色は局所的であった。トランスフェクション試薬を用いたサンプルの蛍光レベルは、トランスフェクション試薬を用いなかったサンプルより実質的に高いままであった。
製剤
商業的に利用できるほとんどのトランスフェクション化合物は、中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を用いて製剤されたリポソームである。さらに、二つの脂肪アシル誘導体を備えた化合物は、一つもしくは三つの脂肪アシル誘導体を備えた化合物より安定なリポソーム構造を形成するらしいことが示唆されており、商業的試薬は決まって二つのアシル誘導体を備えている。短い鎖の脂肪アシル誘導体、特にラウラートが、細胞をトランスフェクトするのに大きな力を示すということを示唆した上記の結果から、より短い鎖のホスファチジルエタノールアミン化合物を使用することによって、より効率的なトランスフェクションが示されるかもしれない。しかして、ＤＯＰＥの使用は、トランスフェクションに効果的なリポソーム構造を形成する能力において例証的であって、限定的なものではないとみられるべきである。
目的：脂質ＤＯＰＥを用いたリポソーム製剤の効率を調べる。
方法：ベラフェクチンＡ２（Ｋ３ＡＴＰ２）を、標準的な方法（K.YagiらBiochem. Biophys. Res. Comm. 196 3., 1993 pp1042-1048）を用いてリポソーム中に製剤し、Ｈ2Ｏ中に２ｍＭとなるように取り込んだ。製剤は、ＤＯＰＥと１：２、１：１、および２：１モーラーで調製された。
以下の別々の実験に記載されたようにして、リポソーム製剤を商業的化合物と比較した。
ａ．  上記の標準的なトランスフェクション方法および１μｇのプラスミドｐＳＶＬＣＡＴを用いて、これらの製剤を、サンプル当たり１０μｌのベラフェクチンＡ２（２ｍＭ）に相当する単一の濃度でＣＨＯ細胞上で試験し、同じ細胞型で未製剤の化合物およびリポフェクタミンと比較した。ＣＡＴ産生をトランスフェクション後４８時間で調べた。
ｂ．  リポソーム製剤を、β-gal発現を含むプラスミド、ｐＰＧＫｌａｃＺを用いて同じ濃度で試験し、リポフェクタミンおよびＤＯＴＡＰ（Boehringer Mannheim）と比較した。トランスフェクションから２４時間後、細胞を固定し、β-gal発現物を染色した。
結果：
ａ．  リポソーム製剤の使用により、二つの別々の実験で３つの異なる比率を用いて、最適なリポフェクタミン誘発発現の６２％〜１５６％の範囲のＣＨＯ細胞からの発現を得た。非リポソーム製剤中のＶＦＡ２化合物を使用すると、リポフェクタミンのたったの５％程度のＣＡＴレベルが与えられた。未製剤もしくはリポソーム方法を介して“製剤された”いずれの場合でも、ＤＯＰＥのみでは、トランスフェクションしなかった。
注意：ＤＯＰＥのみでは、真のリポソームを形成しない。以下のＥＭセクションを参照。
図２３ａ。
ｂ．  染色細胞対未染色細胞の予備的な細胞数により、リポフェクタミンによるものと比較して、最高のリポソーム製剤（Ｋ３ＡＴＰ２：ＤＯＰＥ  １：２）が２倍のトランスフェクトされた細胞数を与え、ＤＯＴＡＰが約半分の細胞数を与えることが示唆された。これらの条件下でリポフェクタミンを用いてトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の比率は、１７．５％であると調べられた。
図２３ｂ。
試薬の濃度は、これらのベラフェクチンＡ２／ＤＯＰＥ製剤にとって最適ではなかった。しかしながら、リポフェクタミンとＤＯＴＡＰからのデータは、最適化された濃度から得られたものであった。
予備的データは、これらの製剤の細胞毒性が、リポフェクタミンおよびＤＯＴＡＰとほぼ同じであることを示唆した（データ示さず）。
電子顕微鏡
製剤されたもしくは未製剤の化合物の溶液を、潜在的な膜様構造について分析した。別々の実験で以下のサンプルを分析した。
ａ：製剤された化合物Ｋ３ＡＴＰ２：ＤＯＰＥ、ＤＯＰＥと、未製剤の化合物Ｋ３Ｃ７ＡＴＬ３とリポフェクタミンのネガティブ染色サンプル。
ｂ：二つの比率のヌクレオチド（プラスミド）と混合されたＫ３Ｃ７ＡＴＬ３とリポフェクタミンのロータリーシャドウサンプル（rotary shadowed sample）。
方法：
ネガティブ染色
２ｍＭのリポソームストックサンプルを、濾過した蒸留水で１０分の１に希釈し、濾過したネガティブ染料（アンモニウムモリブタート２％、ｐＨ６．５）を１：１で混合し、炭素−ホームバー(carbon-formvar)被覆銅／ロジウム２００メッシュ電子顕微鏡グリッド上にまき、３３ｋ〜１００ｋの間の倍率で６０ｋＶでJeol JEM 100CX電子顕微鏡で調べた。
ロータリー金属シャドウイング
０．６９および０．２５のリポソーム：１モルのＤＮＡヌクレオチド比を水に希釈し、１０分間室温で混合し、７°の角度で蒸発したプラチナ−パラジウム（６０：４０）を用いて炭素−ホームバー被覆グリッドおよびロータリー金属シャドウにまき、２６ｋ〜６６ｋの間の倍率で６０ｋＶで電子顕微鏡で調べた。
結果：
ａ：リポソームの形成の成功を調べるために、製剤されたＫ３ＡＴＰ２：ＤＯＰＥのネガティブに染色されたサンプルをＴＥＭで分析した。これらのサンプルは、ＤＯＰＥのみのものは同じ条件下ではなかったが、マルチラメラリポソーム構造を形成したことを示した。
製剤されたリポソームが効率的なトランスフェクションを与えうるので、効率的なトランスフェクションを示す純粋な未製剤の化合物が何らかの膜様構造を有するか否かを調べることは興味深い。これらの化合物のいくつかをネガティブに染色し、再度ＴＥＭで分析した。興味深いことに、効率的なトランスフェクションを与え、３つの脂肪アシル誘導体を備えた上記化合物は、１０ｎｍ〜０．２μｍのサイズの膜結合小胞の“束(rafts)”“塊(stacks)”を自発的に形成したことがわかった。
ｂ：化合物を準最適（０．２５）および最適（０．６９）な比率のリポペプチド：ヌクレオチドでプラスミドＤＮＡと混合し、ロータリーシャドウをした。これらのサンプルの分析により、トランスフェクションに最適な比率においてほとんどのＤＮＡがリポソームの内部に取り込まれたことが、劇的に示された。不十分な化合物が存在する比率（０．２５：１）では、大量のＤＮＡが溶液中でフリーであった。これは、テスト化合物Ｋ３Ｃ７ＴＬ３とリポフェクタミンのいずれにおいても正しく、ＤＮＡと混合した際にＥＭでは非常に類似して見えるが、ＤＮＡと結合していない外観は非常に異なる。
トランスフェクション化合物と他の脂質の未製剤の混合物
オリゴヌクレオチドによってトランスフェクトされた細胞の比率（１００％蛍光細胞）と遺伝子産物を発現した細胞の比率（＜１００％青色細胞）との間に食い違いがあった。“トランスフェクション”をするためにオリゴヌクレオチドは形質膜を通過することのみ必要とするが、遺伝子産物を産生するために、ＤＮＡが核に取り込まれ、転写および翻訳される必要があるので、このことは驚くべき結果ではない。しかしながら、トランスフェクションの成功および遺伝子産物の生成が、形質膜および核膜等の種々の膜を横切る異なる能力を備えた化合物の組み合わせから得られる多数の工程の方法であることを示唆している。
このことを考慮して、数と長さが異なる種々の脂肪アシル基を備えた多数の同一化合物を、以下に記載するβ−galプレートアッセイで組み合わせ、試験した。
いくつかの化合物によるトランスフェクションの改良も、ベラフェクチンＧ２（Ｋ３ＧＴＰ２）を用いた実験例４で見られたような中性脂質ＤＯＰＥの単なる添加によって観察された。
化合物の混合物；実験例１
方法：化合物Ｋ３ＡＴＬ３を用いてなされたトランスフェクションの最適レベルを、５μＭのＫ３ＡＴＬ３を必要とすると予め調べた。Ｋ３ＡＴＬ３を、１００μｌ中に５μＭの脂質の全濃度となるように、Ｋ３ＡＴＬ１、Ｋ３ＡＴＬ２、Ｋ３ＡＴＭ３、Ｋ３ＡＴＰ３およびＫ３ＡＴＣ３のいずれかと、０：５、１：４、２：３、３：２、４：１および５：０の比率で混合した。Ｋ３ＡＴＭ３を、同様にＫ３ＡＴＭ１、Ｋ３ＡＴＭ２、およびＫ３ＡＴＰ３と混合した。各脂質混合物を、一定量のｐＳＶＧＡＬ ＤＮＡ ０．５μｇ／ウェルと組み合わせ、トランスフェクションを通常に行った。
結果：全てのウェルからの発現物は、最適レベルのＤＮＡが用いられた２倍くらい低かったが、Ｋ３ＡＴＬ３とＫ３ＡＴＭ３の４：１の組み合わせを含むウェルにおける発現レベルは強く、Ｋ３ＡＴＬ３またはＫ３ＡＴＭ３を単独で含む場合より高いレベルのβ−gal発現を示した（データ示さず）。
実験例２：
これは、二つのリポペプチドＫ３ＡＴＬ３とＫ３ＡＴＭ３の４：１モルの混合物を作成し、リポペプチドとＤＮＡの濃度の両方の二重希釈を含む標準的なプレートアッセイでさらに試験を行った。同じ条件下で純粋な化合物Ｋ３ＡＴＬ３を用いて行われた発現を比較した。
結果：小さいが明らかな発現の増大が、リポペプチドの混合物を用いてなされた。試験された各濃度のリポペプチドにおいて、最適なレベルのトランスフェクション試薬が、同じ濃度におけるＬ３のみと比べて、Ｌ３／Ｍ３の４：１混合物を使用することにより、より高レベルのトランスフェクションを示した。
図２４。
結論
リポペプチドトランスフェクション試薬の組み合わせは、いずれかの試薬のみと比較して優れたレベルのトランスフェクションを可能にする。さらにこのような試験を行えば、それぞれの化合物のみと比べて優れたレベルのトランスフェクションを示す別の組み合わせを見いだすことができるであろう。この結果は、これらの分子の混合物が、個々のトランスフェクション特性に重要な効果を及ぼすことを示唆している。
Ｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクション
目的：記載された式の化合物が、完全な生物体に効果的にＤＮＡを輸送し、輸送された遺伝子を発現するために用いられるか否かを調べる。
方法：緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein）をコードするプラスミドｐＧＦＰ-Ｎ１（Clontech）を、水中に５％のデキストロース２０μｌ中に１０μｇ（１０μｌ）となるように希釈し、水中に５％のデキストロース２７．９μｌ中に１０ｍＭのＫ３ＡＴＬ３（１０％ＤＭＳＯ）２．１μｌと合わせた。室温で１０分間インキュベートした後、混合物を無毛マウスの足の筋肉に注射した。２４時間後にマウスをと殺し、筋肉のスナップをドライアイスで凍結させた。組織の凍結部位を調製し、共焦点顕微鏡で蛍光を調べた。
結果：蛍光が筋肉細胞の細胞質に観察され、非常に強い蛍光がモーター終板(the motor end-plate)に観察された。注射されていない方の足の組織には蛍光が観察されなかった。
結論
予備的な実験によって、効果的な遺伝子の完全な動物への移入が、これらの化合物を用いてなされることが示された。
本発明は、化合物、特にＤＮＡを真核細胞に輸送する有効な方法を提供する。この方法は、標準的なＣａＰＯ4型のトランスフェクションより効率的であり、本願発明のある実施態様は商業的に利用できるトランスフェクション試薬より実質的に優れている。本願発明の方法は、リボザイム、アンチセンス等の核酸をベースとする薬剤のような別の化合物の輸送においても同様に使用できると考えられる。
広く記載された本願の範囲の精神から外れることなく、特定の実施態様に示したように、本願発明に多数の変化および／または変更を加えてもよいことは、当業者に理解されるであろう。それゆえ、これらの実施態様は、例証的なものであって、限定でないと見なされるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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