(57)【要約】  本発明の目的は、異なる複数の種類の細胞集団が混在する場合に、個々の細胞集団の変化の作用機序を効率的に解析するための細胞情報処理方法を提供することである。本発明の細胞情報処理方法は、異なる複数種類の細胞を含む対象細胞群を播種した所定の容器を少なくとも２以上用意し、前記対象細胞群に対し、所定の細胞刺激を与えて培養し、２以上の時点で、１つの容器内にある全細胞を回収する細胞回収ステップと、各時点で回収した全細胞をシングルセル化するシングルセル化ステップと、各時点のシングルセル化された各細胞からシングルセルデータを取得するシングルセルデータ取得ステップと、各時点の前記シングルセルデータに基づいて、各時点で回収された全細胞を共通の第１の細胞特徴を有する複数の細胞集団にグループ分けして二次元平面又は三次元空間上にプロットし、且つ、第２の細胞特徴に基づいて、グループ分けした各細胞集団の細胞種を同定する処理を行い、各時点におけるクラスタリング結果を取得するグルーピングステップと、前記各時点におけるクラスタリング結果を比較することにより、同じ細胞腫の前記細胞集団の経時的な変化を検出する細胞変化検出ステップと、前記検出結果に基づいて、前記同じ細胞腫の細胞集団の経時的な変化の作用機序を解析する作用機序解析ステップと、を含む、細胞情報処理方法である。
2020071501.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる複数種類の細胞を含む対象細胞群を播種した所定の容器を少なくとも２以上用意し、前記対象細胞群に対し、所定の細胞刺激を与えて培養し、２以上の時点で、１つの容器内にある全細胞を回収する細胞回収ステップと、
各時点で回収した全細胞をシングルセル化するシングルセル化ステップと、
各時点のシングルセル化された各細胞からシングルセルデータを取得するシングルセルデータ取得ステップと、
各時点の前記シングルセルデータに基づいて、各時点で回収された全細胞を共通の第１の細胞特徴を有する複数の細胞集団にグループ分けして二次元平面又は三次元空間上にプロットし、且つ、第２の細胞特徴に基づいて、グループ分けした各細胞集団の細胞種を同定する処理を行い、各時点におけるクラスタリング結果を取得するグルーピングステップと、
前記各時点におけるクラスタリング結果を比較することにより、同じ細胞腫の前記細胞集団の経時的な変化を検出する細胞変化検出ステップと、
前記検出結果に基づいて、前記同じ細胞腫の前記細胞集団の経時的な変化の作用機序を解析する作用機序解析ステップと
を含む、細胞情報処理方法。
【請求項２】
前記細胞変化検出ステップは、前記各時点におけるクラスタリング結果を比較することにより、前記同じ細胞種の前記細胞集団を構成する細胞数の経時的な変化、及び経時的な前記第１の細胞特徴の変化を検出する請求項１に記載の細胞情報処理方法。
【請求項３】
前記細胞変化検出ステップは、さらに、前記各時点におけるクラスタリング結果において、前記同じ細胞種の前記細胞集団を構成する細胞数の経時的変化、及び経時的な前記第１の細胞特徴の変化を検出する請求項２に記載の細胞情報処理方法。
【請求項４】
前記細胞回収ステップは、さらに、上記所定の細胞刺激を与えずに培養する前記複数種類の細胞を含む対象細胞群を用意し、１以上の時点で、１つの前記所定の容器内にある全細胞を回収し、
前記細胞変化検出ステップは、前記各時点におけるクラスタリング結果を比較することにより、前記細胞集団の前記所定の細胞刺激の有無による、前記同じ細胞腫の細胞集団の経時的な変化を評価する請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞情報処理方法。
【請求項５】
前記作用機序解析ステップにおいて、前記細胞刺激の分子ターゲットを解析する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞情報処理方法。
【請求項６】
前記作用機序解析ステップにおいて、前記細胞刺激の分子ターゲットを解析し、治療を想定した適応例を特定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞情報処理方法。
【請求項７】
前記治療を想定した適応例は、細胞刺激により改善が見込める疾患もしくは症状、または分子ターゲットに関連する疾患もしくは症状である、請求項６に記載の細胞情報処理方法。
【請求項８】
前記分子ターゲットは、細胞刺激が直接的に、または間接的に働きかける細胞内外の分子である、請求項６または７に記載の細胞情報処理方法。
【請求項９】
前記細胞刺激は、化学的刺激および物理的刺激からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞情報処理方法。
【請求項１０】
前記化学的刺激は、細胞に対して生物学的な反応を誘起する薬剤の添加によるものである、請求項９に記載の細胞情報処理方法。
【請求項１１】
前記作用機序は、前記細胞刺激により細胞内外で誘起された生物学的な現象を発揮するための特異的な生化学的反応または相互作用である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞情報処理方法。
【請求項１２】
前記シングルセルデータは、単一細胞の機能や性質、状態を示す生体物質の情報であり、遺伝子のDNA配列情報（ゲノム）、遺伝子の発現を制御するエピジェネティックな情報（DNAメチル化、ヒストンメチル化、アセチル化、リン酸化）、遺伝子１次転写物（ｍRNA、非翻訳RNA、マイクロRNAなど）情報（トランスクリプトーム）、タンパク質の翻訳量やリン酸化、酸化、糖化等の修飾情報、アミノ酸配列情報（プロテオーム）、代謝産物情報（メタボローム）、細胞内水素イオン濃度指数（pH）、細胞内ATP濃度、イオン濃度（カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムなど）、細胞内温度からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞情報処理方法。
【請求項１３】
前記シングルセルデータは、遺伝子発現量及び遺伝子のＤＮＡ配列である請求項１２に記載の細胞情報処理方法。
【請求項１４】
前記グルーピングステップにおいて、前記第１の細胞特徴とは、前記シングルセルデータに含まれるｎ次元の細胞特徴を２次元または３次元に次元削減したものである請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞情報処理方法。
【請求項１５】
前記次元削減の方法は、主成分分析（PCA）、カーネルあり主成分分析（Kernel-PCA）、多次元尺度構成法（MDS）、t-SNE、及び畳込みニューラルネットワーク（CNN）からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１４に記載の細胞情報処理方法。
【請求項１６】
前記グルーピングステップにおいて、前記第１の細胞特徴とは、前記遺伝子発現量について主成分分析を行い、２次元又は３次元に次元削減して獲得されるものである請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の細胞情報処理方法。
【請求項１７】
前記グルーピングステップにおいて、前記第２の細胞特徴とは、細胞の機能または細胞の状態から各細胞種を同定することが可能な少なくとも１つの細胞情報である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の細胞情報処理方法。
【請求項１８】
前記細胞情報とは、遺伝子のDNA配列情報（ゲノム）、遺伝子の発現を制御するエピジェネティックな情報（DNAメチル化、ヒストンメチル化、アセチル化、リン酸化）、遺伝子１次転写物（ｍRNA、非翻訳RNA、マイクロRNAなど）情報（トランスクリプトーム）、タンパク質の翻訳量やリン酸化、酸化、糖化等の修飾情報、アミノ酸配列情報（プロテオーム）、代謝産物情報（メタボローム）、細胞内水素イオン濃度指数（pH）、細胞内ATP濃度、イオン濃度（カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムなど）、細胞内温度からなる群から選択される少なくとも１つである請求項１７に記載の細胞情報処理方法。
【請求項１９】
前記細胞の機能とは、細胞の増殖、修復、代謝、および細胞間の情報交換から選択される少なくとも１つである、請求項１７または１８に記載の細胞情報処理方法。
【請求項２０】
前記細胞の状態とは、遺伝子の発現状況、タンパク質の発現状況、および酵素活性から選択される少なくとも１つである、請求項１７または１８に記載の細胞情報処理方法。
【請求項２１】
前記シングルセルデータから複数の生体物質の量又は状態を表す値を、生体物質ごとにそれぞれ複数の時点において取得した時系列データを予め作成し、前記生体物質ごとの時系列データの時間変化と、各生体物質の生物学的機能の類似性に基づいて、シングルセルデータを取得した細胞を、共通の第１の細胞特徴を有する細胞集団にグループ分けし、
前記生物学的機能の類似性は、共通の遺伝子オントロジーを有すること、共通のカノニカルパスウェイに属すること、共通の上流因子を有すること、共通の表現系に関わること、および、共通の疾患に関わることからなる群から選択される少なくとも１つに基づいて評価されるものである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の細胞情報処理方法。
【請求項２２】
前記細胞回収ステップ及び前記シングルセル化ステップにおいて、全細胞を回収し、シングルセル化する方法が、手動、フローサイトメトリー、磁気分離、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション、マイクロ流路、マイクロドロップレット、ナノウェル、マイクロピペット微細針吸引、レーザーピンセット、標識アレイ、表面プラズモンレスポンス、およびナノバイオデバイスからなる群から選択される少なくとも１つを用いる方法である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の細胞情報処理方法。
【請求項２３】
前記全細胞を回収し、シングルセル化する方法において、細胞の標識として蛍光標識、ラジオアイソトープ標識、抗体標識、および磁気標識からなる群から選択される少なくとも１つを用いる、請求項２２に記載の細胞情報処理方法。
【請求項２４】
前記複数種類の細胞を含む対象細胞群は、生体組織サンプル、血液サンプル、培養サンプル、および環境サンプルからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の細胞情報処理方法。
【請求項２５】
前記複数種類の細胞は、動物細胞、植物細胞、真菌細胞および細菌細胞からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２４に記載の細胞情報処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞情報処理方法に関する。特に、異なる複数の細胞種を含む対象細胞群において実施する各細胞種の同定方法、若しくは各細胞種の薬効及び薬理スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤の最適な適応症または用法・容量を探索する場合、複数の細胞に対する薬剤等による細胞刺激の効果を判定し、さらに作用機序を解析した結果から、薬剤等と最適な適応症を選択する。
従来、このような薬効及び薬理のスクリーニング方法としては、図７に示すように、各ウェル５２に配置された個々の細胞種５４、５６、及び５８のみからなる細胞集団に薬剤をそれぞれ与えて培養し、その薬効を各細胞集団の平均化データから解析する方法、又は、臓器から抽出された複数の細胞種を含む細胞集団に薬剤を与えて培養し、薬効を細胞集団の平均化データを用いて解析する方法が用いられてきた。【０００３】
しかし、同種の細胞のみからなる細胞集団でも、個々の細胞の経時的な動的挙動（例えば、細胞の活性化、細胞の阻害、細胞の相互作用、タンパク質発現、タンパク質分泌、細胞増殖、細胞形態の変化、細胞死等）に不均一性があるため、従来の方法では、十分に精度の高い解析を行なえていなかった。そこで、近年では、さらに解析精度を高めるために、同種の細胞のみからなる細胞集団を構成する細胞をシングルセル化し、個々の細胞（単一細胞）レベルでの分子生物学的な解析（シングルセル解析）が行われている。このようなシングルセル解析により、細胞集団の平均化データの解析ではなく、個々の細胞を解析することができるようになったため、平均化データによる解析では検出できなかった細胞や、小さな動的挙動の変化を検出することができるようになった。また、このようなシングルセル解析は、例えば、癌細胞のシングルセルトランスクリプトーム解析により、癌組織中に存在する細胞亜種を分類することに用いられている。また、シングルセル解析を用いて細胞活性を評価する方法として、特許文献１に記載される方法が提案されている。【０００４】
特許文献１には、細胞活性を評価する方法であって、（ａ）領域上に異なる複数種類の細胞を含む細胞集団を設置する工程、即ち、ナノウェルアレイプレート上の各ナノウェルに、異なる複数種類の細胞を含む細胞集団を設置する工程；（ｂ）該細胞集団の動的な挙動を、時間の関数としてアッセイする工程、即ち、単一細胞レベルの動的な挙動を顕微鏡、蛍光顕微鏡等で可視化して（つまり、画像解析により）経時的に測定する工程；（ｃ）該細胞集団から、該動的な挙動に基づいて、少なくとも１つの解析対象の細胞を同定する工程；（ｄ）同定された少なくとも１つの解析対象の細胞の分子プロファイルを特徴付ける工程、即ち、同定された少なくとも１つの解析対象細胞について単一細胞レベルで、質量分析、遺伝子分析、タンパク質分析等を行い、転写活性、トランスクリプトームのプロファイル、遺伝子発現活性、ゲノムプロファイル、タンパク質発現活性、プロテオームのプロファイル、タンパク質の相互作用活性、細胞受容体の発現活性、脂質プロファイル、脂質活性、炭水化物プロファイル、微小胞活性、グルコース活性、代謝プロファイル、細胞受容体の発現活性等を取得する工程；および（ｅ）工程（ｂ）および（ｄ）から得られた情報を相関させる工程を含む、上記方法が提案されている。
即ち、特許文献１に記載の方法は、異なる複数種類の細胞を含む細胞集団において、個々の細胞種の細胞活性を評価するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１８−５１４１９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載された方法は、人間が、画像解析によって少なくとも１００〜２００個の細胞からなる細胞集団の動的な挙動を観察し、複数種類の細胞及び動的な挙動が異なる細胞の中から解析対象の単一細胞の同定及び選択を行い、人間によって選び出された単一細胞の動的な挙動の作用機序および細胞間相互作用を解析するものであるため、つまり、各細胞種の形態や、経時的な各細胞の動的な変化を人間が恣意的に判断して解析を行う細胞を同定及び選択するため、精度の高い解析結果を得ることができないという問題がある。
また、特許文献１の一実施態様として記載されているように、解析対象の細胞集団に免疫細胞が含まれる場合、具体的には、血液サンプル中に免疫細胞が含まれる場合、血液サンプルに薬剤を与えてから約２４時間で細胞が死滅してしまうという事情がある。また、特許文献１に記載の解析方法は、薬剤を与えた細胞集団を経時的に観察し、解析を行うものであるため（つまり、１つのサンプルの観察を解析が終わるまで続けるものであり、また、さらに、解析対象の細胞の選択及び培養を繰り返しながら解析する方法であるため）、特許文献１に記載の方法を採用する場合、薬剤を細胞集団に与えてから少なくとも２４時間以内に全ての解析を終わらせなければならないという非常に厳しい時間的制約がある。【０００７】
また、特許文献１に記載の方法は、細胞同定や対象細胞の選択操作に手間やコストがかかり、また、その解析による評価の算出方法及びその結果も複雑であるため、効率的で、高精度、且つ迅速な評価及び解析を必要とする産業的に用いる方法としては実用的ではないという問題がある。
さらに、異なる複数の種類の細胞を含む細胞集団に薬剤をそれぞれ与えて培養し、シングルセル解析技術を用いて、異なる複数の細胞種を含む細胞集団において実施する各細胞種の同定方法、各細胞種の薬効及び薬理を効率的に解析する方法は現時点で報告されていない。【０００８】
また、図７に示すような薬効及び薬理スクリーニング方法を用いた薬剤の探索の初期段階では、薬剤（細胞刺激）による細胞死の無しの判断のみに基づいて、異なる細胞との相互作用解析や、薬効及び薬理のメカニズムの解析が進められるため、膨大な数の候補物質から薬剤となり得る物質を抽出してくる解析初期段階においては、例えば、細胞死が検出されたとしても、それがどのような要因により、細胞死が引き起こされたのか不明なまま、薬剤候補となり得なかったりする可能性があった。【０００９】
そこで、本発明は、従来技術の有する上記問題点を鑑みて、異なる複数の種類の細胞集団が混在する場合に、個々の細胞集団の変化の作用機序を効率的に解析するための細胞情報処理方法を提供することを目的とする。
より具体的に言えば、複数の細胞種が存在する細胞集団において実施する各細胞種の同定、若しくは薬効及び薬理スクリーニングをより簡単な操作で、高精度に且つ迅速に評価及び解析することができ、産業的な規模でも利用できる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の細胞情報処理方法は、異なる複数種類の細胞を含む対象細胞群を播種した所定の容器を少なくとも２以上用意し、上記対象細胞群に対し、所定の細胞刺激を与えて培養し、２以上の時点で、１つの容器内にある全細胞を回収する細胞回収ステップと、各時点で回収した全細胞をシングルセル化するシングルセル化ステップと、各時点のシングルセル化された各細胞からシングルセルデータを取得するシングルセルデータ取得ステップと、各時点の上記シングルセルデータに基づいて、各時点で回収された全細胞を共通の第１の細胞特徴を有する複数の細胞集団にグループ分けして二次元平面又は三次元空間上にプロットし、且つ、第２の細胞特徴に基づいて、グループ分けした各細胞集団の細胞種を同定する処理を行い、各時点におけるクラスタリング結果を取得するグルーピングステップと、上記各時点におけるクラスタリング結果を比較することにより、同じ細胞腫の上記細胞集団の経時的な変化を検出する細胞変化検出ステップと、上記検出結果に基づいて、上記同じ細胞腫の細胞集団の経時的な変化の作用機序を解析する作用機序解析ステップと、を含むものである。【００１１】
上記細胞変化検出ステップは、上記各時点におけるクラスタリング結果を比較することにより、同じ細胞種の上記細胞集団を構成する細胞数の経時的な変化、及び経時的な上記第１の細胞特徴の変化を検出するのが好ましい。
上記細胞変化検出ステップは、さらに、上記各時点におけるクラスタリング結果において、同じ細胞種の上記細胞集団を構成する細胞数の経時的変化、及び経時的な上記第１の細胞特徴の変化を検出してもよい。
上記細胞回収ステップは、さらに、上記所定の細胞刺激を与えずに培養する上記複数種類の細胞を含む対象細胞群を用意し、１以上の時点で、１つの上記所定の容器内にある全細胞を回収し、上記細胞変化検出ステップは、上記各時点におけるクラスタリング結果を比較することにより、上記細胞集団の上記所定の細胞刺激の有無による、上記同じ細胞腫の細胞集団の経時的な変化を検出するのが好ましい。【００１２】
上記作用機序解析ステップにおいて、上記細胞刺激の分子ターゲットを解析してもよい。
上記作用機序解析ステップにおいて、上記細胞刺激の分子ターゲットを解析し、治療を想定した適応例を特定してもよい。
上記治療を想定した適応例は、細胞刺激により改善が見込める疾患もしくは症状、または分子ターゲットに関連する疾患もしくは症状であることが好ましい。
上記分子ターゲットは、細胞刺激が直接的に、または間接的に働きかける細胞内外の分子であることが好ましい。【００１３】
上記細胞刺激は、化学的刺激および物理的刺激からなる群から選択される少なくとも１種であるのが好ましい。
上記化学的刺激は、細胞に対して生物学的な反応を誘起する薬剤の添加によるものであるのが好ましい。
上記作用機序は、上記細胞刺激により細胞内外で誘起された生物学的な現象を発揮するための特異的な生化学的反応または相互作用であることが好ましい。【００１４】
上記シングルセルデータは、遺伝子のDNA配列情報（ゲノム）、遺伝子の発現を制御するエピジェネティックな情報（DNAメチル化、ヒストンメチル化、アセチル化、リン酸化）、遺伝子１次転写物（ｍRNA、非翻訳RNA、マイクロRNAなど）情報（トランスクリプトーム）、タンパク質の翻訳量やリン酸化、酸化、糖化等の修飾情報、アミノ酸配列情報（プロテオーム）、代謝産物情報（メタボローム）、細胞内水素イオン濃度指数（pH）、細胞内ATP濃度、イオン濃度（カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムなど）、細胞内温度からなる群から選択される少なくとも１つであることが好ましい。
上記シングルセルデータは、遺伝子発現量及び遺伝子のＤＮＡ配列であることが好ましい。【００１５】
上記グルーピングステップにおいて、上記第１の細胞特徴とは、上記シングルセルデータに含まれるｎ次元の細胞特徴を２次元または３次元に次元削減して取得するものであることが好ましい。
上記次元削減の方法は、主成分分析（PCA）、カーネルあり主成分分析（Kernel-PCA）、多次元尺度構成法（MDS）、t-SNE、及び畳込みニューラルネットワーク（CNN）からなる群から選択される少なくとも１つであることが好ましい。
上記グルーピングステップにおいて、上記第１の細胞特徴とは、上記遺伝子発現量について主成分分析を行い、２次元又は３次元に次元削減して獲得されるものであることが好ましい。【００１６】
上記グルーピングステップにおいて、上記第２の細胞特徴とは、細胞の機能または細胞の状態から各細胞種を同定することが可能な少なくとも１つの細胞情報であることが好ましい。
上記細胞情報とは、遺伝子のDNA配列情報（ゲノム）、遺伝子の発現を制御するエピジェネティックな情報（DNAメチル化、ヒストンメチル化、アセチル化、リン酸化）、遺伝子１次転写物（ｍRNA、非翻訳RNA、マイクロRNAなど）情報（トランスクリプトーム）、タンパク質の翻訳量やリン酸化、酸化、糖化等の修飾情報、アミノ酸配列情報（プロテオーム）、代謝産物情報（メタボローム）、細胞内水素イオン濃度指数（pH）、細胞内ATP濃度、イオン濃度（カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムなど）、細胞内温度からなる群から選択される少なくとも１つであることが好ましい。
上記細胞の機能とは、細胞の増殖、修復、代謝、および細胞間の情報交換であることが好ましい。
上記細胞の状態とは、遺伝子の発現状況、タンパク質の発現状況、および酵素活性であることが好ましい。【００１７】
上記シングルセルデータから複数の生体物質の量又は状態を表す値を、生体物質ごとにそれぞれ複数の時点において取得した時系列データを予め作成し、生体物質ごとの時系列データの時間変化と、各生体物質の生物学的機能の類似性に基づいて、シングルセルデータを取得した細胞を、共通の第１の細胞特徴を有する細胞集団にグループ分けし、上記生物学的機能の類似性は、共通の遺伝子オントロジーを有すること、共通のカノニカルパスウェイに属すること、共通の上流因子を有すること、共通の表現系に関わること、および、共通の疾患に関わることからなる群から選択される少なくとも１つに基づいて評価されるものであることが好ましい。【００１８】
上記細胞回収ステップ及び上記シングルセル化ステップにおいて、全細胞を回収し、シングルセル化する方法として、手動、フローサイトメトリー、磁気分離、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション、マイクロ流路、マイクロドロップレット、ナノウェル、マイクロピペット微細針吸引、レーザーピンセット、標識アレイ、表面プラズモンレスポンス、およびナノバイオデバイスからなる群から選択される少なくとも１つを用いることができる。
上記全細胞を回収し、シングルセル化する方法において、細胞の標識として蛍光標識、ラジオアイソトープ標識、抗体標識、および磁気標識からなる群から選択される少なくとも１つを用いることができる。
複数種類の細胞を含む対象細胞群は、生体組織サンプル、血液サンプル、培養サンプル、および環境サンプルからなる群から選択される少なくとも１つを用いることができる。
上記複数種類の細胞は、動物細胞、植物細胞、真菌細胞および細菌細胞からなる群から選択される少なくとも１つを選択することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、異なる複数の種類の細胞集団が混在する場合に、個々の細胞種の細胞集団の変化の作用機序を効率的に解析するための細胞情報処理方法を提供できる。
より具体的に言えば、異なる複数の細胞種が存在する細胞集団において実施する各細胞種の同定、若しくは薬効及び薬理スクリーニングをより簡単な操作で、高精度に且つ迅速に評価及び解析することができ、産業的な規模でも利用できる効率的な方法を提供することができる。【００２０】
本発明によれば、経時的な細胞の動的な挙動等を人間が恣意的に判断することがないため、各細胞種の同定、各種細胞に対する薬剤または細胞刺激の作用機序を、精度高く、解析することができる。
また、画像解析等の手間をかけることなく、対象細胞を同定することができる。
また、免疫細胞に対する薬効スクリーニングを行う場合であっても、特に解析時間に制約を設けることなく解析を行うことができる。
また、同じ細胞種ごとに培養したサンプルそれぞれに薬剤または細胞刺激を与えて解析する必要なく、複数種類の細胞を共培養したサンプルに薬剤または細胞刺激を与えて解析することができるため、解析のために、多量のサンプルを用意したり、解析したりする手間や費用の負担を減らすことができる。
また、解析対象の細胞が、細胞の生育および機能維持のために１種類の細胞だけで培養することができないものであっても、本発明によれば、複数種類の細胞を共培養したサンプルから解析対象の細胞を同定することができる。また、解析対象以外の細胞との共培養による作用機序、例えば、解析対象細胞と免疫細胞との共培養が必要なサンプル薬剤又は細胞刺激の作用機序も適切に解析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明の細胞情報処理方法を説明するフローチャートである。
【図２Ａ】図２Ａは、細胞刺激直後の細胞を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、細胞刺激後、所定時間経過後の細胞を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、図２Ａに係るクラスタリングの結果を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図２Ｂに係るクラスタリングの結果を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、細胞刺激直後の細胞集団を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、細胞刺激後、所定時間経過後の細胞を示図である。
【図５Ａ】図５Ａは、図４Ａに係るクラスタリングの結果を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図４Ｂに係るクラスタリングの結果を示す図である。
【図６】図６は、図５Ｂに基づいて、細胞集団の経時的な変化を示す図である。
【図７】図７は、従来の薬剤スクリーニング方法を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
［細胞情報処理方法］
以下では、本発明の細胞情報処理方法について詳細に説明する。
実施形態１
実施形態１は、抗癌剤のスクリーニング解析を事例として説明する。
図１は、本発明の実施形態１に係る細胞情報処理方法を示すフローチャートである。
【００２３】
＜細胞回収ステップ（Ｓ１）＞
まず、本ステップにおいて、図２Ａに示すように、異なる複数種類の癌細胞２、４及び６を播種した所定の容器１を少なくとも２以上用意する。次に、準備した容器１に播種された対象細胞群に抗癌剤を添加して（つまり、細胞刺激を与えて）培養し、２以上の時点で（例えば、薬剤添加直後、薬剤添加後、１時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間・・・）、少なくとも２以上の容器１の中の１つの容器１内にある全細胞を回収した。なお、各時点で使用される容器１の数は、各時点で細胞回収のために用いる容器数が同じであれば、１つに限定されず、複数でもあってもよい。
図２Ａは、細胞刺激を与えた直後（薬剤添加後）の細胞を示し、図２Ｂは、細胞刺激を与えた後、所定時間（１時間）経過した細胞を示す。
【００２４】
《対象細胞群》
ここで、対象細胞群は、所定の容器１に播種された細胞群であり、且つ、異なる複数種類の細胞を含む細胞の群を意味する。「異なる複数種類の細胞を含む細胞の群」をより具体的に言えば、例えば、ヒトｉＰＳ細胞及びマウス胎児由来線維芽細胞から構成される細胞群のように、細胞種が異なる複数の細胞から構成される細胞群を意味し、同種由来の細胞で構成される細胞群であっても、異種由来の細胞で構成される細胞群であってもよい。
本実施形態においては癌細胞を用いて解析を行っているが、対象細胞群に含まれる細胞の種類は、特に限定されない。
【００２５】
「複数種類の細胞を含む対象細胞群」として、生体組織サンプル、血液サンプル、培養サンプル、および環境サンプルが例示される。
上記生体組織サンプルとしては、マウスの脳組織およびヒトの切除腫瘍組織が例示される。
上記血液サンプルとしては、ヒトの採血試料が例示される。
上記培養サンプルとしては、ヒトｉＰＳ細胞とマウス胎児由来線維芽細胞との共培養サンプルが例示される。
上記環境サンプルとしては、土壌サンプルおよび海底熱水噴出孔から採取した水サンプルが例示される。
【００２６】
また、「複数種類の細胞を含む対象細胞群」に含まれる「細胞」として、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、および細菌細胞が挙げられる。
【００２７】
上記動物細胞としては、脊椎動物、脊索動物（脊椎動物を除く）または昆虫の細胞が例示される。
上記脊椎動物としては、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ブタ、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、およびモルモットのような哺乳類、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、メダカ、およびトラフグが例示される。
上記哺乳類の細胞（哺乳類細胞）には、腫瘍細胞、肝細胞、繊維芽細胞、幹細胞、及び免疫細胞が含まれるが、これらに限定されない。
上記脊索動物（脊椎動物を除く）としては、ホヤが例示される。
上記昆虫としては、ショウジョウバエ、カイコ、タバコスズメガ、およびミツバチが例示される。
【００２８】
上記植物細胞としては、被子植物の細胞が例示される。
上記被子植物としては、シロイヌナズナ、イネ、コムギ、ミナトカモジグサ、ミヤコグサ、およびタバコが例示される。
【００２９】
上記真菌細胞としては、カビまたは酵母の細胞が例示される。
上記カビとしては、アカパンカビ（Neurospora crassa）、コウジカビ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・フミガータス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）、およびムコール・シルシネロイデス（Mucor circinelloides）が例示される。
上記酵母としては、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、およびトリコスポロン・オボイデス（Trichosporon ovoides）が例示される。
【００３０】
上記細菌細胞としては、例えば、エシェリヒア・コリ、サルモネラ・エンテリカ、クロストリジウム・デフィシル、またはバチルス・アンスラシスの細胞が挙げられる。
【００３１】
細胞刺激とは、化学的刺激（化学物質等）および物理的刺激（光、熱、または圧力等）からなる群から選択される少なくとも１種であれば、特に限定されない。
【００３２】
上記化学的刺激の例としては、細胞に対して生物学的な反応を誘起する薬剤の添加によるものが挙げられる。なお、薬剤は生物試料へ添加することにより細胞に対して生物学的な反応を誘起するものであってもよい。
上記生物学的な反応の具体例として、増殖、細胞死、分化、抗原抗体反応、増殖因子の分泌が挙げられる。
上述の薬剤とは、身体の構造及び機能に測定可能な効果を有するよう意図される薬剤であれば、特に限定されない。このような薬剤として、抗がん剤等の医薬品、成長因子、サイトカインおよび低分子薬などが挙げられ、成長因子の具体例としては、上皮成長因子（EGF: Epidermal Growth Factor）が挙げられ、サイトカインの具体例としては、腫瘍壊死因子（TNF-α）、インターロイキン１β（IL-1β）、インスリン、グルカゴン様ペプチド−１（GLP-1）、イマチニブ（imatinib）、アセトアミノフェン、アダリムマブ（Adalimumab）、およびニボルマブ（Nivolumab）が挙げられる。
【００３３】
なお、対象細胞群を収容する容器１は、対象細胞群を収容し培養できる細胞培養容器であればよく、特に限定されない。また、使用する培養液も、細胞や解析手法に応じて、適宜好ましいものを用いることができる。
各容器には、複数の細胞種を所定の比率で構成した対象細胞群（例えば、Ａ細胞、Ｂ細胞及びＣ細胞からなり、各細胞の数が、Ａ細胞：Ｂ細胞：Ｃ細胞＝２：１：１で構成される対象細胞群）が播種される。複数の細胞種を含む対象細胞群は、所定の時間培養された後、薬剤及び細胞刺激が与えられる。
【００３４】
＜シングルセル化ステップ（Ｓ２）＞
次いで、本ステップにおいては、細胞回収ステップ（Ｓ１）で回収された対象細胞群を、単一細胞化（シングルセル化）する。
【００３５】
対象細胞群をシングルセル化し、単一細胞を回収する方法及び器具は、特に限定されず、公知の方法や器具を使用することができる。例えば、公知の方法としては、手動、フローサイトメトリー、磁気分離、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション、マイクロドロップレット法、マイクロピペット微細針吸引法、及び表面プラズモン共鳴法が挙げられ、公知の器具としては、例えば、マイクロ流路、ナノウェル、レーザーピンセット、標識アレイ、およびナノバイオデバイスが挙げられる。
これら公知の方法の中でも、マイクロドロップレット法、マイクロ流路、ナノウェル、フローサイトメトリーを使用することが好ましい。シングルセル化の熟練を必要とせず、大量の細胞を高速に分離・回収できるため、解析精度を高めることができるからである。
【００３６】
単一細胞を回収する際には、蛍光標識、ラジオアイソトープ（ＲＩ）標識、抗体標識、および磁気標識を用いて、各細胞を標識することが好ましい。後述するグルーピングステップ（Ｓ４）において、各細胞集団の細胞種の同定に利用することができるからである。図２Ａ及び図２Ｂでは、蛍光標識１２、１４及び１８が、それぞれ、癌細胞２、４及び６に付されている。
特に、細胞の表面に発現しているタンパク質に結合する抗体と、蛍光、ＲＩ標識、または磁気標識との組み合わせは、抗体の特異性が増すため好ましい。
【００３７】
なお、Ｃ１ＴＭ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ａｕｔｏ  Ｐｒｅｐシステム（フリューダイム社製）等のシングルセル・ゲノム研究用自動化ソリューションを用いることもできる。当該ソリューションは、シングルセルの単離、細胞の標識、細胞の溶解、および、後述するシングルセルデータ取得ステップ（Ｓ３）において行うゲノムＤＮＡまたはトータルＲＮＡの抽出までを自動的に行うことができるため、例えば、ゲノムＤＮＡまたはトータルＲＮＡを用いてシングルセルデータを取得しようとする場合に利用すれば、作業効率をより高めることができる。
【００３８】
＜シングルセルデータ取得ステップ（Ｓ３）＞
次に、シングルセルデータ取得ステップ（Ｓ３）において、各時点で回収され、且つシングルセル化された各細胞から、遺伝子のＤＮＡ配列情報、蛍光標識及び遺伝子発現量をシングルセルデータとして取得する。シングルセルデータは、シングルセル化され回収された全ての単一細胞について取得する。
本発明における「遺伝子発現量」とは、遺伝子の転写産物であるｍRNA量であり、遺伝子発現解析により遺伝子の発現状態を調べることにより測定することができる。又は、遺伝子の発現産物であるタンパク質の量の解析を行うようにしてもよい。
【００３９】
《シングルセルデータ》
なお、シングルセルデータとは、単一細胞の機能や性質、状態を示す生体物質の情報を意味し、上述した遺伝子発現量及びＤＮＡ配列情報に限定されない。例えば、遺伝子のDNA配列情報（ゲノム）、遺伝子の発現を制御するエピジェネティックな情報（DNAメチル化、ヒストンメチル化、アセチル化、リン酸化）、遺伝子１次転写物（ｍRNA、非翻訳RNA、マイクロRNAなど）情報（トランスクリプトーム）、タンパク質の翻訳量やリン酸化、酸化、糖化等の修飾情報、アミノ酸配列情報（プロテオーム）、代謝産物情報（メタボローム）、細胞内水素イオン濃度指数（pH）、細胞内ATP濃度、イオン濃度（カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムなど）、細胞内温度などをシングルセルデータとして取得してもよい。
また、単一細胞を回収する際に、各細胞を蛍光物質や、抗体等で標識した場合は、それらの情報もシングルデータとして取得することもできる。
【００４０】
＜グルーピングステップ（Ｓ４）＞
次に、グルーピングステップ（Ｓ４）において、上記シングルセルデータ取得ステップにおいて取得したシングルセルデータ（遺伝子発現量データ、ＤＮＡ配列及び蛍光標識）に基づいて、シングルセルデータを取得した細胞を、共通の第１の細胞特徴を有する細胞集団にグループ分けし、さらに、シングルセルデータに含まれる各細胞種を判別することが可能な第２の細胞特徴に基づいて、グループ分けした各細胞集団の細胞種を同定する。
具体的には、主成分分析を用いて、遺伝子発現量データに含まれるｎ個（ｎ次元）の細胞特徴を可視化可能な２次元または３次元にまで圧縮処理し、回収された全細胞を複数の細胞集団にグループ分けして２次元平面または３次元空間上にプロットする（つまり、各主成分が「第１の細胞特徴」に該当する）。また、さらに、各細胞集団を構成する塩基配列及び蛍光標識（第２の細胞特徴）に基づき、グループ分けした各細胞集団の細胞種の同定処理（クラスタリング解析）を行う。
ここで、主成分分析の際の主成分軸は、データ（確率変数）の分散が最大になるような軸を探索することが好ましい。
【００４１】
本ステップにより、各細胞集団の細胞特徴と、細胞数が対応付けられて可視化されるため、細胞死と細胞特徴との関係性を同時に確認又は検出することが容易に、精度高くできる。
【００４２】
なお、回収された全細胞を複数の細胞集団にグループ分けするために使用する第１の細胞特徴の数は、特に限定されない。ｎ個の細胞特徴のうち、１個以上の細胞特徴を、細胞をグループ化するために用いてもよい。
また、本実施形態においては、主成分分析を用いて、２次元または３次元への次元削減により可視化し、シングルセルデータを取得した細胞を共通の第１の細胞特徴を有する細胞集団にグループ分けしているが、これに限定されず、次元削減の方法は、例えば、主成分分析（PCA）、カーネルあり主成分分析（Kernel-PCA）、多次元尺度構成法（MDS）、t-SNE、または、畳込みニューラルネットワーク（CNN）を用いることもできる。
また、各細胞のシングルセルデータ（複数の生体物質に係る情報）から、複数の生体物質の量または状態を表す値を、生体物質ごとにそれぞれ複数の時点において取得した時系列データを予め用意し、生体物質ごとの時系列データの時間変化と、各生体物質の生物学的機能の類似性に基づいて、シングルセルデータを取得した細胞を、共通の第１の細胞特徴を有する細胞集団にグループ分けしてもよい。ここで、生物学的機能の類似性は、共通の遺伝子オントロジーを有すること、共通のカノニカルパスウェイに属すること、共通の上流因子を有すること、共通の表現系に関わること、および、共通の疾患に関わることからなる群から選択される少なくとも１つに基づいて評価されるものであることが好ましい。
【００４３】
図３Ａは、図２Ａの細胞刺激直後の対象細胞群から取得したシングルセルデータに基づくクラスタリング結果を示し、図３Ｂは、図２Ｂの細胞刺激後、所定時間経過後（１時間後）の対象細胞群から取得したシングルセルデータに基づくクラスタリング結果を示す。
図２Ａの細胞刺激直後の対象細胞群から取得したシングルセルデータ（遺伝子発現量データ）に主成分分析を行い、２次元に圧縮することで、全細胞が、複数の細胞集団２０、２２及び２４にグループ分けされ、且つ、シングルセルデータ（ＤＮＡ配列及び蛍光標識１２、１４及び１８）に基づき、細胞集団２０を構成する細胞種が癌細胞２であり、細胞集団２２を構成する細胞種が癌細胞４であり、細胞集団２４を構成する細胞種が癌細胞６であることを同定する。
同様に、図２Ｂの細胞刺激後、所定時間経過後（１時間後）の対象細胞群から取得したシングルセルデータ（遺伝子発現量データ）に主成分分析を行い、２次元に圧縮することで、全細胞が、複数の細胞集団２６、２８及び３０にグループ分けされ、且つ、シングルセルデータ（ＤＮＡ配列及び蛍光標識１２、１４及び１８）に基づき、細胞集団２６を構成する細胞種が癌細胞２であり、細胞集団２８を構成する細胞種が癌細胞４であり、細胞集団３０を構成する細胞種が癌細胞６であることを同定する。
【００４４】
なお、本実施形態においては、第２の細胞特徴として、ＤＮＡ配列及び蛍光標識を用いて、各細胞集団の細胞種を同定したが、特にこれらに限定されない。細胞の機能（例えば、細胞の増殖、修復、代謝、および細胞間の情報交換）、又は細胞の状態（例えば、遺伝子の発現状況、タンパク質の発現状況、および酵素活性）から各細胞種を判別することが可能な（シングルデータに含まれる）細胞の生体物質の情報、例えば、遺伝子のDNA配列情報（ゲノム）、遺伝子の発現を制御するエピジェネティックな情報（DNAメチル化、ヒストンメチル化、アセチル化、リン酸化）、遺伝子１次転写物（ｍRNA、非翻訳RNA、マイクロRNAなど）情報（トランスクリプトーム）、タンパク質の翻訳量やリン酸化、酸化、糖化等の修飾情報、アミノ酸配列情報（プロテオーム）、代謝産物情報（メタボローム）、細胞内水素イオン濃度指数（pH）、細胞内ATP濃度、イオン濃度（カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムなど）、細胞内温度などを利用することができる。
【００４５】
上記各細胞種を判別することが可能な細胞情報には、細胞が本来持っている遺伝子、タンパク質、及び代謝産物等の情報だけでなく、細胞外から導入された遺伝子（例えば、不死化遺伝子）、タンパク質及び代謝物や、有機物等の情報も含む。不死化遺伝子の例としては、ｈＴＥＲＴ遺伝子（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子）、及びＳＶ４０Ｔ抗原（サルウィルス４０Ｔ抗原遺伝子）が挙げられる。また、シングルセルを回収する際に、各細胞を蛍光物質や、抗体等で標識した場合は、それらの情報も含む。
【００４６】
＜細胞変化検出ステップ（Ｓ５）＞
次に、細胞変化検出ステップ（Ｓ５）は、グルーピングステップ（Ｓ４）で取得された細胞刺激直後の細胞に係るクラスタリング結果と、細胞刺激後、所定時間経過した細胞に係るクラスタリング結果との比較することにより、同じ細胞種の細胞集団の経時的な変化（実時間に対する変化、もしくは変化から推定された疑似時間に対する変化）を検出する。なお、細胞集団の経時的変化は、経時的に変化した細胞特徴を抽出し、且つ、その経時的な変化量を算出することが好ましい。
ここで、「細胞集団の経時的変化」とは、細胞数、細胞特徴（第１の細胞特徴）、または、その他細胞特徴（即ち、遺伝子のDNA配列情報（ゲノム）、遺伝子の発現を制御するエピジェネティックな情報（DNAメチル化、ヒストンメチル化、アセチル化、リン酸化）、遺伝子１次転写物（ｍRNA、非翻訳RNA、マイクロRNAなど）情報（トランスクリプトーム）、タンパク質の翻訳量やリン酸化、酸化、糖化等の修飾情報、アミノ酸配列情報（プロテオーム）、代謝産物情報（メタボローム）、細胞内水素イオン濃度指数（pH）、細胞内ATP濃度、イオン濃度（カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムなど）、細胞内温度等）、及び細胞の生体物質の経時的な変化を意味する。
【００４７】
グルーピングステップ（Ｓ４）で取得されたクラスタリング結果である図３Ａ及び図３Ｂを比較し、同じ細胞種の細胞で構成される細胞集団の細胞特徴（第１の細胞特徴である主成分１及び２）の変化を検出する。具体的には、図３Ａの細胞集団２０と図３Ｂの細胞集団２６との比較、図２Ａの細胞集団２２と図３Ｂの細胞集団２８との比較、図３Ａの細胞集団２４と図３Ｂの細胞集団３０との比較により、各細胞集団の細胞特徴に経時的変化があることを検出する。
また、図３Ａ及び３Ｂから同じ細胞種の細胞集団２０及び２６を構成する細胞数を比較し、図３Ａの細胞刺激直後の細胞数に対する図３Ｂの細胞刺激後１時間後の細胞数の減少（即ち、癌細胞２の細胞死数）、抗癌剤の経時的な変化として検出する。同様に、図３Ａ及び３Ｂから同じ細胞種の細胞集団２４及び３０を構成する細胞数を比較し、図３Ａの細胞刺激直後の細胞数に対する図３Ｂの細胞刺激後１時間後の細胞数の減少（即ち、癌細胞６の細胞死数）を、抗癌剤の経時的な変化として検出する。一方、図３Ａ及び３Ｂから同じ細胞種の細胞集団２２及び２８を構成する細胞数を比較し、図３Ａの細胞刺激前後の細胞数に変化がないためこと（即ち、癌細胞４の細胞死がなく、癌細胞４の細胞死には抗癌剤の影響がないこと）を検出する。
【００４８】
このように、本発明においては、各細胞集団の細胞特徴と、細胞数が対応付けられて表示されるため、細胞死の有無だけでなく、経時的な細胞死や細胞特徴の変化、及び細胞死と細胞特徴との関係性を容易に、精度高く確認又は検出することができる。
【００４９】
＜作用機序解析ステップ（Ｓ６）＞
次に、作用機序解析ステップ（Ｓ６）において、細胞変化検出ステップ（Ｓ５）において取得された細胞変化検出結果に基づいて、同じ細胞種の細胞集団内または細胞集団間の変化の作用機序を解析する。ここで、作用機序とは、薬剤による細胞刺激がその薬理学的効果を発揮するための特異的な作用であり、且つ、同じ細胞種の細胞集団内または細胞集団間でみられる特異的な生化学的反応または相互作用を意味する。
【００５０】
本実施形態において、細胞集団内または細胞集団間の変化の作用機序とは、細胞刺激により細胞内外で誘起された生物学的な現象（例えば、増殖、細胞死、抗原抗体反応、増殖因子の分泌等）であり、より詳細には、細胞刺激により細胞内外で誘起された生物学的な現象を発揮するための特異的な生化学的反応または相互作用（例えば、生体物質の代謝、遺伝子発現、エネルギー代謝、シグナル伝達等）である。
本実施形態においては、細胞変化検出ステップ（Ｓ５）において取得された細胞変化検出結果から、上述したような作用機序を解析することにより、細胞変化検出ステップ（Ｓ５）において取得された各細胞集団の細胞数の変化、及び細胞特徴の変化に関与する因子（例えば、生体物質、遺伝子等）を抽出する。
【００５１】
上記作用機序解析として、例えば、遺伝子発現プロファイルの解析や、分子ターゲットの解析が挙げられる。
遺伝子発現プロファイルの解析には、例えば、テンソル分解を用いることができる。
【００５２】
分子ターゲットの解析の例を説明する。
まず、薬剤（細胞刺激）によって発現が変化し、かつ、その変化が疾患によるものと一致していると期待できる遺伝子を特定する。ここで、実際に化合物（薬剤）が結合しているのはタンパクであるが、計測されているのはｍＲＮＡの発現量である。タンパクに化合物（薬剤）が結合することでそのタンパクをコードしている遺伝子のｍＲＮＡの量が変化しているとは思えないので、発現量が変化している遺伝子の中に分子ターゲット（標的タンパク）は無いと推定する。
化合物が実際に結合しているタンパクの他の遺伝子発現プロファイルに対する影響は、そのタンパクがコードされている遺伝子をノックアウトした場合に近いと期待される。そこで遺伝子を網羅的にノックアウトした場合の遺伝子発現プロファイルを参照することで標的遺伝子を推定する。
【００５３】
複数の疾患または症例タイプ候補から細胞刺激の最適な適応例を見出すには、複数の種類の細胞に対して一斉に効果判定および作用機序解析を行うことで、効果の序列を得ることができる。その効果の比較もしくは序列に基づいて、最適な適応症または用途を見出すことができる。ここで、細胞刺激の効果判定は、例えば、細胞刺激（薬剤）処理無のデータと細胞刺激（薬剤）処理有の時間依存データを比較して、同一細胞集団に由来する細胞が生物学的データまたは細胞特徴、細胞数を比較し、変化があった場合は、効果があったと判定できる。
【００５４】
上記グルーピングステップ（Ｓ４）において、各細胞のシングルセルデータ（複数の生体物質に係る情報）から、複数の生体物質の量または状態を表す値を、生体物質ごとにそれぞれ複数の時点において取得した時系列データを予め用意し、生体物質ごとの時系列データの時間変化と、各生体物質の生物学的機能の類似性に基づいて、シングルセルデータを取得した細胞を、共通の第１の細胞特徴を有する細胞集団にグループ分けした場合は、は、複数の時点の各々について、複数の細胞集団の各々に含まれる１つ以上の第１の細胞特徴から、細胞集団の状態を表す値を生成し、生成された、複数時点の、複数の細胞集団の状態を表す値を、生体物質ごとにそれぞれ複数の時点において取得した時系列データからなるデータセットから、同じ細胞種の細胞集団間の状態の依存関係も推定することができる。
【００５５】
細胞集団間の状態の依存関係の推定は、例えば、以下のようにして行うことができる。
細胞の種類ごとに、時間経過による細胞数変動および遺伝子発現量変動を見出し、遺伝子の時間変動パターンに基づいて作用機序を推定する。遺伝子発現量の時間的な変化パターンが似ている遺伝子を、例えば、３つある隣接２時点における状態値の遷移が、ある閾値に照らして増加した、不変だった、減少した、の３つのうちのどれであるかを判定し、９３＝２７のグループ（細胞集団）に分類する。
生物学的機能が似ている遺伝子を公共のＷｅｂツールＤＡＶＩＤ（https://david.ncifcrf.gov/）のFunctional Annotation Clusteringを用い、類似した遺伝子オントロジーを有する遺伝子をグループ化する。時間的変化の類似性と、生物学的機能の類似性とに基づいてグループ化し、各グループ（細胞集団）の状態値間の時間的な依存関係を、例えば、ベイジアンネットワークモデルに照らして、または、時系列もしくは生物学的な関係性によってグループ間（細胞集団間）の紐付けをして、推定することができる。
【００５６】
実施形態１の方法は、異なる複数の細胞種が存在する対象細胞群を構成する全ての細胞について、シングルセル解析を行い、各細胞の細胞種を同定するものであるため、異なる複数の細胞種が存在する対象細胞群から人為的に各細胞の細胞種を同定する従来の方法よりも、各細胞種の同定、各種細胞に対する薬剤または細胞刺激の作用機序を、精度高く、解析することができる。
また、細胞種の同定及び選択に画像解析等の手間をかけることがなく、また、免疫細胞に対する薬効スクリーニングを行う場合であっても、１つのサンプルの観察を解析が終わるまで続けるものでもないため、特に解析時間に制約を設けることなく解析を行うことができる。
また、シングルセル解析を利用するため、人為的に細胞の変化を確認し、対象細胞を選択する場合よりも、細胞を観察する（回収する）時点数を減らすことができる。
【００５７】
また、実施形態１の方法は、グルーピングステップ（Ｓ４）により、各時点の細胞の状態を可視化できるものであるため、細胞変化検出ステップ（Ｓ５）において、各細胞（細胞集団）の変化を容易に確認することができる。また、その結果、作用機序解析ステップ（Ｓ６）において、解析する必要のある細胞種や、遺伝子等も容易に把握することができる。
また、従来のスクリーニング方法では、細胞死の有無だけを確認できるだけで、細胞死の原因を同時に確認することはできなかったが、本実施形態１によれば、グルーピングステップ（Ｓ４）及び細胞変化検出ステップ（Ｓ５）により、細胞死の有無とともに、その他の細胞特徴の変化の有無も検出することができる。
【００５８】
実施形態１の変形例
実施形態１では、上記細胞回収ステップ（Ｓ１）において、細胞刺激直後に回収された細胞と、細胞刺激後、所定時間培養した後に回収された細胞を回収し、それら細胞のシングルセルデータの比較に基づく解析を行っているが、これに限定されず、上記細胞回収ステップ（Ｓ１）において、細胞刺激無しの細胞（対照サンプル）と、細胞刺激有りの細胞を用意し、それぞれ所定時間培養した後に、細胞を回収し、それら細胞のシングルセルデータの比較に基づくスクリーニング解析を行ってもよい。
【００５９】
具体的には、上記細胞回収ステップ（Ｓ１）において、準備した複数の容器１のうち、一部の容器１に播種された対象細胞群に対しては、細胞刺激を与えずに培養し、２以上の時点で、１つの容器内にある全細胞を回収する作業以外は、実施形態１と同様である。
【００６０】
このように、さらに、対照サンプルを用意し解析を行うことにより、薬剤（細胞刺激）による効果であるのか、それとも培養条件等のその他要因による効果であるのかを確認することができる。
より詳細には、作用機序解析ステップ（Ｓ６）において、薬剤（細胞刺激）による個々の細胞集団内または細胞集団間への作用機序を解析することができ、さらに、細胞刺激の分子ターゲットを解析したり、治療を想定した適応例を特定したりすることもできるようになる。
ここで、治療を想定した適応例としては、例えば、細胞刺激により改善が見込める疾患もしくは症状、または分子ターゲットに関連する疾患もしくは症状を挙げることができる。
【００６１】
実施形態２
上述の実施形態１、及び実施形態１の変形例の細胞変化検出ステップにおいては、細胞刺激直後に回収された細胞に係るクラスタリング結果（図３Ａ）と、細胞刺激後所定時間経過後のクラスタリング結果（図３Ｂ）とを比較し、細胞死のスクリーニング解析を行ったが、これに限定されず、例えば、細胞の形状等の経時的な変化についても検出及び解析を行うことができる。
【００６２】
実施形態２は、図４Ａ及び図４Ｂに示すような細胞の経時的な形状変化のモニタリングを事例として説明する。なお、本実施形態２では、細胞２、４及び６は、実施形態１で用いた癌細胞ではなく、細胞２は、樹状細胞、細胞４は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、及び細胞６は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞とする。
なお、実施形態２において、細胞回収ステップ（Ｓ１）、シングルセル化ステップ（Ｓ２）、シングルセルデータ取得ステップ（Ｓ３）、グルーピングステップ（Ｓ４）、及び作用機序解析ステップ（Ｓ６）における処理は、実施形態１と同じであるため、これらステップの記載は省略する。
【００６３】
図４Ａ及び図４Ｂは、細胞回収ステップ（Ｓ１）において、全細胞の回収時における細胞を示す図であり、図４Ａは、細胞刺激を与えた直後（薬剤添加後）の細胞を示し、図４Ｂは、細胞刺激を与えた後、所定時間（１時間）経過した細胞を示す。図中の細胞３２は、細胞２の形状が変化したものを示し、細胞３４は、細胞６の形状が変化したものである。
【００６４】
図５Ａ及び５Ｂは、グルーピングステップ（Ｓ４）で取得されたクラスタリング結果を示す。図５Ａは、図４Ａの細胞刺激直後の対象細胞群から取得したシングルセルデータに基づくクラスタリング結果を示し、図５Ｂは、図４Ｂの細胞刺激後１時間後の対象細胞群から取得したシングルセルデータに基づくクラスタリング結果を示す。
図４Ａの細胞刺激直後の対象細胞群から取得したシングルセルデータ（遺伝子発現量データ）に主成分分析を行い、２次元に圧縮することで、全細胞が、複数の細胞集団３６、３８及び４０にグループ分けし、且つ、シングルセルデータ（ＤＮＡ配列及び蛍光標識１２、１４及び１８）に基づき、細胞集団３６を構成する細胞種が細胞２であり、細胞集団３８を構成する細胞種が細胞４であり、細胞集団４０を構成する細胞種が細胞６であることを同定する。
同様に、図４Ｂの細胞刺激後、１時間経過後の対象細胞群から取得したシングルセルデータ（遺伝子発現量データ）に主成分分析を行い、２次元に圧縮することで、全細胞が、複数の細胞集団４２、４４、４６、４８及び５０（５つの細胞集団）にグループ分けし、且つ、シングルセルデータ（ＤＮＡ配列及び蛍光標識１２、１４及び１８）に基づき、細胞集団４２及び４４を構成する細胞種が細胞２であり、細胞集団４６を構成する細胞種が細胞４であり、細胞集団４８及び５０を構成する細胞種が細胞６であることを同定する。
【００６５】
＜細胞変化検出ステップ（Ｓ５）＞
実施形態１では、細胞刺激直後、及び所定時間経過後において、グループ分けされた細胞集団の数が同じであったため、細胞刺激直後の細胞に係るクラスタリング結果と、細胞刺激後、所定時間経過した細胞に係るクラスタリング結果との比較により、細胞集団の経時的な変化の検出だけを行ったが、実施形態２では、細胞刺激直後、及び所定時間経過後において、グループ分けされた細胞集団の数が異なるため、さらに、各クラスタリング結果からも同じ細胞種の細胞集団の経時的な変化を検出する。
【００６６】
図５Ａと図５Ｂを比較し、図５Ａの細胞２で構成される細胞集団３６と図５Ｂの細胞２で構成される細胞集団４２の細胞特徴（第１の細胞特徴）に変化がないことを検出し、その結果、図５Ｂの細胞集団４２が、変化前の細胞集団であることを検出する。即ち、図５Ｂの細胞集団４２が、図４Ａ及び４Ｂの細胞の形状が変化する前の細胞２で構成される細胞集団であることを推定（または確認）することができる。
同様に、図５Ａと図５Ｂを比較し、図５Ａの細胞４で構成される細胞集団３８と図５Ｂの細胞４で構成される細胞集団４６の細胞特徴（第１の細胞特徴）に変化がないことを検出する。即ち、図５Ｂの細胞集団４６が、図４Ａ及び４Ｂの細胞４で構成される細胞集団であることを推定（または確認）することができる。
同様に、図５Ａと図５Ｂを比較し、図５Ａの細胞６で構成される細胞集団４０と図５Ｂの細胞６で構成される細胞集団４８の細胞特徴（第１の細胞特徴）に変化がないことを検出し、その結果、図５Ｂの細胞集団４８が、変化前の細胞集団であることを検出する。即ち、図５Ｂの細胞集団４８が、図４Ａ及び４Ｂの細胞の形状が変化する前の細胞６で構成される細胞集団であることを推定（または確認）することができる。
【００６７】
続いて、図５Ｂに示すクラスタリング結果において、細胞集団４２と同じ細胞種を示す細胞集団を探索して、細胞集団４４を検出し、その結果、細胞集団４２から細胞集団４４への経時的変化（図６の実線参照）を検出する。即ち、細胞集団４４が、図４Ａ及び４Ｂの細胞２の形状が変化した後の細胞３２で構成される細胞集団であることを検出することを、異なる細胞種の細胞集団との混同を回避し、且つ、それら異なる細胞種の細胞集団からの経時的変化や、それら異なる細胞種の細胞集団への経時的変化（例えば、図６の破線参照）と紐づけられることなく、推定（または確認）することができる。
同様に、細胞集団４８から細胞集団５０への経時的変化（図６の実線参照）を検出する。即ち、細胞集団５０が図４Ａ及び４Ｂの細胞６の形状が変化した後の細胞３４で構成される細胞集団であることを、異なる細胞種の細胞集団との混同を回避し、且つ、それら異なる細胞種の細胞集団からの経時的変化や、それら異なる細胞種の細胞集団への経時的変化（例えば、図６の破線参照）と紐づけられることなく推定（または確認）することができる。
【００６８】
実施形態２の方法も、異なる複数の細胞種が存在する対象細胞群を構成する全ての細胞について、シングルセル解析を行い、各細胞の細胞種を同定するものであるため、従来のスクリーニング方法のように、図７に示すように、細胞種別に薬剤のスクリーニングを行わなくても、各細胞種の同定、及び各細胞種別にそれぞれ、薬剤又は細胞刺激による細胞の変化を容易に且つ、精度高く検出することができる。
【実施例】
【００６９】
以下では実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００７０】
［実施例１］
ヒト乳がん細胞ＭＣＦ−７株、Ｔ−４７Ｄ株、ＳＫ−Ｂｒ−３株、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１株を、１：１：１：１（細胞数）で混合して６ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。
生着を確認後に、生理食塩水、ドキソルビシン溶液、パクリタキセル溶液、カルボプラチン溶液、フルオロウラシル溶液、およびエピルビシン溶液を各ウェルに添加した。
添加時（０時間後）、添加から６時間後、１２時間後、および２４時間後の時点で細胞をトリプシン処理して回収した。
細胞分散液を１０００細胞／μＬに希釈し、Ｃ１システム（フリューダイム社製）を用いてシングルセルを捕捉した。
ｃＤＮＡ調製キット（ＳＭＡＲＴｅｒ（Ｒ）  Ｕｌｔｒａ（Ｒ）  Ｌｏｗ  ＲＮＡキット，クロンテック社製）にＴＰ５３遺伝子の５００−６１０および７５０−８７０のターゲットプライマーを加えて、細胞の溶解、ｍＲＮＡの逆転写およびｃＤＮＡプレ増幅を行った。
得られたｃＤＮＡを回収し、０．０５ｎｇ／μＬより高い濃度を、ライブラリー調製のために選択した。ライブラリー調製は、Ｎｅｘｔｅｒａ（Ｒ）  ＸＴ  ＤＮＡサンプル調製キット（イルミナ社製）を用いて行った。【００７１】
調製したライブラリーについて、次世代シーケンサー（ＨｉＳｅｑ（Ｒ）２５００システム，イルミナ社製）により、２×１００ｂｐの末端読取りを用いて配列決定した。得られたデータから細胞毎の遺伝子発現量を算出し、薬剤毎に時点サンプルをまとめ、主成分分析を用いてクラスタリング解析を行った。
細胞は、ＴＰ５３のターゲットシークエンスの結果から５２４Ａ（５２４番目の塩基がＡ）が検出された細胞をＳＫ−Ｂｒ−３株クラスターに、５８０Ｔ（５８０番目の塩基がＴ）が検出された細胞をＴ−４７Ｄ株クラスターに、８３９Ａ（８３９番目の塩基がＡ）が検出された細胞をＭＤＡ−ＭＢ−２３１株クラスターに、いずれにも該当しないもの（５２４Ｇ（５２４番目の塩基がＧ）、５８０Ｃ（５８０番目の塩基がＣ）または８３９Ｇ（８３９番目の塩基がＧ）が検出された細胞）はＭＣＦ−７株クラスターに、それぞれグルーピングした。【００７２】
細胞の種類ごとに、時間経過による細胞数変動および遺伝子発現量変動を見出し、遺伝子の時間変動パターンに基づいて作用機序を推定した。遺伝子発現量の時間的な変化パターンが似ている遺伝子を、具体的には、３つある隣接２時点における状態値の遷移が、ある閾値に照らして増加した、不変だった、減少した、の３つのうちのどれであるかを判定し、２７（＝３の３乗）のグループに分類した。生物学的機能が似ている遺伝子を公共のＷｅｂツールＤＡＶＩＤ(https://david.ncifcrf.gov/)のFunctional Annotation Clusteringを用い、類似した遺伝子オントロジーを有する遺伝子をグループ化した。時間的変化の類似性と、生物学的機能の類似性とに基づいてグループ化した結果、８２個のグループが得られた。８２個のグループの状態値間の時間的な依存関係を、ベイジアンネットワークモデルに照らし推定したところ、抗癌作用の機序を捉える事ができた。ＭＣＦ−７株に対してフルオロウラシルの効果として、時系列的にＤＮＡ複製作用の低下からアポトーシス作用が惹起されている様を観察できた。また、薬剤の感受性および作用機序が細胞毎に異なることが観察された。【００７３】
［実施例２］
ヒト初代肝細胞、ヒトクッパー細胞、およびｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（human telomerase reverse transcriptase））を導入した不死化ヒト肝星細胞を、２：１：１（細胞数比）で混合して播種し、２４時間培養した。
生着を確認後に、生理食塩水、アセトアミノフェン、カルバマゼピン、アミオダロン、ロシグリタゾン、ベンズブロマロン、およびイソニアジドを曝露し、曝露時（０時間）、曝露から６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、および７２時間後の時点で細胞をトリプシン処理して回収した。
回収した細胞は、ＡＳＧＰＲ１抗体およびＥｐＣＡＭ抗体で免疫染色し、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ：蛍光活性化セルソーティング）を用いてシングルセル化した。【００７４】
回収したシングルセルについて、ｃＤＮＡ調製キット（ＳＭＡＲＴｅｒ（Ｒ）  Ｕｌｔｒａ（Ｒ）  Ｌｏｗ  ＲＮＡキット，クロンテック社製）を用いて細胞の溶解、ｍＲＮＡの逆転写およびｃＤＮＡプレ増幅を行った。
得られたｃＤＮＡを回収し、０．０５ｎｇ／μＬより高い濃度を、ライブラリー調製のために選択した。ライブラリー調製は、Ｎｅｘｔｅｒａ（Ｒ）  ＸＴ  ＤＮＡサンプル調製キット（イルミナ社製）を用いて行った。
調製したライブラリーについて、次世代シーケンサー（ＨｉＳｅｑ（Ｒ）２５００システム，イルミナ社製）により、２×１００ｂｐの末端読取りを用いて配列決定した。
また、細胞を溶解した後、ｍＲＮＡを回収した残液中のアルブミン量、ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）量、ＣＤ６８量、ＣＤ１１ｂ量、およびＣＤ１４量を測定した。
得られたデータから細胞毎の遺伝子発現量を算出し、薬剤毎に時点サンプルをまとめ、主成分分析を用いてクラスタリング解析を行った。【００７５】
細胞は、アルブミンおよびＬＤＨが検出された細胞をヒト初代肝細胞クラスターに、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１４が検出された細胞をヒトクッパー細胞クラスターに、ｈＴＥＲＴ遺伝子が検出された細胞を不死化ヒト肝星細胞クラスターに、それぞれグルーピングした。
細胞の種類ごとに、時間経過による細胞数変動および遺伝子発現量変動を見出し、遺伝子発現量の時間変動パターンに基づいて作用機序を推定した。【００７６】
［実施例３］
マウス胎児由来線維芽細胞を６ウェルプレートに播種し、２４時間後に、ヒトｉＰＳ細胞にＲＯＣＫ（Rho-associated coiled-coil forming kinase／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤Ｙ−２７６３２（１０μＬ；富士フイルム和光純薬社製）を加えた懸濁液を、さらに、１０００細胞／ウェル／２００μＬ、３０００細胞／ウェル／２００μＬ、および９０００細胞／ウェル／２００μＬで播種した。
播種時（０時間）、播種から６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、および１２０時間後の細胞を回収した。
細胞分散液を１０００細胞／μＬに希釈し、Ｃ１システム（フリューダイム社製）を用いてシングルセルを捕捉した。次いで、ＳＭＡＲＴｅｒ（Ｒ）  Ｕｌｔｒａ（Ｒ）  Ｌｏｗ  ＲＮＡキットを用いて、細胞の溶解、ｍＲＮＡの逆転写およびｃＤＮＡプレ増幅を行った。
得られたｃＤＮＡを回収し、０．０５ｎｇ／μＬより高い濃度を、ライブラリー調製のために選択した。ライブラリー調製は、Ｎｅｘｔｅｒａ（Ｒ）  ＸＴ  ＤＮＡサンプル調製キット（イルミナ社製）を用いて行った。【００７７】
調製したライブラリーについて、次世代シーケンサー（ＨｉＳｅｑ（Ｒ）２５００システム，イルミナ社製）により、２×１００ｂｐの末端読取りを用いて配列決定した。得られたデータから細胞毎の遺伝子発現量を算出し、薬剤毎に時点サンプルをまとめ、主成分分析を用いてクラスタリング解析を行った。
細胞は、配列データからヒトｉＰＳ細胞であるかマウス胎児由来線維芽細胞であるかを同定し、それぞれの時間経過による細胞数変動および遺伝子発現量変動を見出し、遺伝子の時間変動パターンを取得した。ヒトｉＰＳ細胞の各遺伝子時間変動パターンをまとめてグループ化およびパターン化し、さらに時間的な依存関係を算出することで、ｉＰＳ細胞から胚様体までの変化を観察した。【００７８】
以上、本発明の細胞情報処理方法についての種々の実施形態及び実施例を挙げて詳細に説明したが、本発明は、これらの実施形態及び実施例に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良又は変更をしてもよいのはもちろんである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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