(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２倍に稀釈したぶどう果汁に該稀釈果汁１リットル当たり酵母エキス５ｇを添加しｐＨを４．５に調整して寒天を加えた培地２５ｍｌを試験管に注入し滅菌した寒天斜面培地に菌株を接種し、２０℃の温度で３週間培養後、得られた胞子を無菌生理食塩水１５ｍｌに懸濁させた懸濁液１ｍｌ中に胞子数を１０×１０6／ｍｌ以上、２９．７×１０6／ｍｌ以下含有するとともに、酒石酸およびリンゴ酸を含有する糖濃度１５％のＹＭ改変培地で２０℃の温度で１週間培養後の酒石酸の分解率が２２％以上、４１％以下、リンゴ酸の分解率が２９％以上、４４％以下で、かつグリセロール生産量が１．８ｇ／ｌ以上、４．４３ｇ／ｌ以下であるボトリチス・シネレアに属する菌。
【請求項２】
前記ボトリチス・シネレアに属する菌が、ボトリチス・シネレア ＳＢＴ ７２５１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４７５５）である請求項１に記載のボトリチス・シネレアに属する菌。
【請求項３】
ぶどうに、請求項１または２に記載のボトリチス・シネレアに属する菌の胞子を接種して菌糸を生育させた後、乾燥させて貴腐化することを特徴とするぶどうの貴腐化方法。
【請求項４】
ぶどうに、請求項１または２に記載のボトリチス・シネレアに属する菌の胞子を接種して菌糸を生育させた後、乾燥させて貴腐化する過程と、貴腐化されたぶどうから果汁を調製して発酵させる過程とを有することを特徴とする貴腐ワインの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ぶどうの貴腐化に用いるのに適したボトリチス・シネレア菌の新菌株およびそれを用いた貴腐ワインの製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
貴腐ワインは最高の甘口白ワインであり、フランスのソーテルヌ、ドイツのトロッケンベーレンアウスレーゼおよびハンガリーのトカイが世界の三大貴腐ワインとして知られている。このことは、貴腐ワインの原料となる貴腐ぶどうは、どこでもできないことを意味している。貴腐ぶどうのできる条件あるいは過程は以下のとおりである。完熟したセミヨン種、リースリング種あるいはフルミント種などのぶどうにボトリチス・シネレア菌（以下菌と略記する）が自然繁殖し、ぶどうの成分が菌により代謝されてぶどうに存在しない成分が生成され、また分解される。例えばグリセロールが生成され、酒石酸、リンゴ酸などの有機酸が分解される。これらの反応と同時に水分が蒸発してぶどうの成分が濃縮され、非常に糖度の高い干しぶどう状のいわゆる貴腐ぶどうとなる。このようなプロセスが順調に進行するためには朝は霧が発生して菌の生育に都合のよい温度、湿度状態となり、日中は水分が蒸発して乾燥を進行させるために晴天になることが必要である。このような条件が備わる地域は限定され、そのうえ貴腐ぶどうになるまでには１か月以上の日数が必要である。この間に貴腐化に不都合な気候の変化が起こると、貴腐化の過程が良好に進行しなくなる場合も多い。貴腐化に好適な気象条件が揃うのは、ときには１０年に一度くらいの場合もある。すなわち、貴腐ぶどうづくりは自然に依存する部分が多く、工業的な観点からは非常にリスクも大きく、それだけに稀少価値がある。
【０００３】
このように偶然性が高く、リスクの大きい貴腐ぶどうづくりから脱却し、地理的条件や気象条件などの自然条件に影響されることなく、人工的に貴腐ぶどうをつくる研究が米国のAmerineらによって行われており、その成果について報告されている（例えば、”ＷＩＮＥＳ  ＆  ＶＩＮＥＳ”、Ｍａｙ、１９８８、ｐ６３〜６４）。そこでは、収穫したぶどうにボトリチスの胞子を接種し、室内で温度や湿度を制御してボトリチスによる処理がなされている。しかし、我が国においてはその事例がなく、自然にまかせて貴腐ぶどうがつくられているのが実態である。
【０００４】
【発明が解決しょうとする課題】
本発明は上述のような貴腐ぶどうづくりの現状、すなわち自然の偶然性にまかせて貴腐ぶどうをつくることから脱却し、種々の条件を制御して自然条件に左右されず人工的に貴腐化ぶどうを生産するために必要な接種用菌として優れた性質、すなわち胞子生産性、グリセロール生産性、酒石酸、リンゴ酸などの有機酸資化性の高いボトリチス・シネレア菌の菌株を提供することを課題とする。なお、ボトリチス・シネレア菌の場合、胞子というのは正確な用語ではなく、正確には分生子と言うべきであるが、便宜上、胞子と表現する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明のボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）の新菌株であるＳＢＴ  ７２５１株は、雪印ベルフォーレ株式会社のぶどう園のシャルドネ種のぶどうから分離したものであって、そのサンプルが平成７年２月１０日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５、茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４７５５で寄託されている。
【０００６】
この新菌株の菌学的性質等については実施例において後述するとおりであるが、特に胞子形成性、有機酸資化性及びグリセロール生産性において他の対象菌に対して非常に優れたものであり、優れた風味の貴腐ワイン用原料としての貴腐化ぶどうの生産に特に好適なものである。しかも、この新菌種は、ぶどう上での増殖性にも優れ、木になった状態のぶどうへの接種によっても十分な貴腐化効果を発揮できるもので、通常の気象条件（例えば温度１０〜３０℃程度、湿度６０〜９０％ＲＨ程度）であれば野外での貴腐化を簡易に達成可能である。
【０００７】
この新菌株を用いたぶどうの貴腐化は、その胞子をぶどうに接種し、菌糸を十分に生育させたところでこれを乾燥させることにより行うことができる。ぶどうへの胞子の接種は、胞子を水等の適当な液媒体に分散させて、これをスプレーする方法、胞子分散液にぶどうを浸漬する方法など種々の方法が利用できる。接種される胞子の量としては、ぶどうの種類や接種後にぶどうが置かれる環境などに応じて選択すればよいが、例えば、リースリング種１房（２００〜３００ｇ）に対して胞子濃度１０4／ｍｌの懸濁液１０ｍｌ程度とされる。
【０００８】
接種後は、ぶどうの湿度環境を適度に維持して菌糸を十分に生育させる。例えば、野外において木になった状態のぶどうを処理する場合は、接種後にぶどうの房にビニール袋等で密封して房を乾燥させないようにする方法が操作も簡単で便利である。また、ぶどうを収穫後、これに胞子を接種し、温度及び湿度を制御して菌糸を生育させる方法も利用できる。菌の増殖にともなって、有機酸の資化やグリセロールの生産が行われ、十分な増殖が得られた段階で、ぶどうを乾燥させて貴腐化ぶどうを得ることができる。乾燥に移す時期は、例えば、接種後、平均気温が１５〜２０℃で推移した場合、２週間程度で菌糸がぶどうの房全体に繁殖するが、この頃に乾燥に移す。気象条件によって増殖の速度が変わるので、乾燥に移す時期は菌の増殖状態を観察することによって決定することができる。また、乾燥過程は、例えば、ぶどうの糖度を測定して、所望の糖度、例えば３５〜４０％が得られた段階で終了させればよい。菌の増殖過程とぶどうの乾燥過程は、それぞれ１回づつでも良いが、必要に応じて、これらの過程を交互に繰返し行ってもよい。
【０００９】
貴腐化されたぶどうから果汁を調製し、これを発酵させて貴腐ワインを得ることができる。果汁の調製及び発酵のための方法は特に限定されず、公知の通常の方法が利用できる。
【００１０】
【実施例】
以下実施例により本発明をより詳細に説明する。
実施例１
１．菌株の分離
雪印ベルフォーレのぶどう園のシャルドネ種のぶどうの果粒から常法に従って採取した菌糸を無菌的にポテトデキストロース寒天培地の平板上で２５℃、１４日間培養した。培養後、コロニーから菌体を顕微鏡用スライドガラス上に取り、形成された胞子の懸濁液をそこで作成し、これを滅菌済毛管ピペットで吸い取り、ポテトデキストロース寒天培地上に接種して、２５℃、７日間培養した。培養により得られたコロニーから菌糸を１白金耳取り、ポテトデキストロース寒天培地で、２０℃、７日間培養した。更に、この培養操作を５回繰返して純粋分離を行った。
２．菌株の検定
純粋分離操作で得られた各コロニーについて菌学的な特徴を調べたところ、これはいずれもボトリチス・シネレア菌の特徴を有するものであった。これらはいずれもボトリチス・シネレア菌であることが判明した。これらの単離株を、ＢＣ−Ｓ、ＢＦ、Ｂ７、ＣＤ−１、ＣＤ−２、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＳ−１、ＣＳ−Ｌ、ＫＳ、ＫＨ、ＮＺ、Ｒとした。ＣＤ−１株における菌学的特徴を代表として以下に示す。
▲１▼コロニー、分生子柄及び分生子の観察
ポテトデキストロース寒天培地上で２０℃、１４日間の培養で、直径約７ｃｍ程度、最初無色、のち灰褐色のコロニーが形成された。菌核は黒色で形及び大きさは様々であった。分生子柄は、円筒形、長さ３〜５ｍｍ、幅は２０μｍ、下部は褐色、滑面、頂部は交互に分岐していた。分生子は、８〜１４×６〜９μｍ、倒卵形、基部に突起があり、淡褐色、平滑であった。なお、これらの特性は、宇田川らの菌類図鑑（下）、講談社サイエンティフィック、１９７８年発行におけるボトリチス・シネレア菌の特性と一致していた。
▲２▼有機酸の資化性及びグリセロールの生成
後述するとおり、酒石酸及びリンゴ酸の資化性、更にはグリセロールの生成能が認められた。
３．胞子生産性
上記の各単離株及び標準株としてのＳＢＴ  ７２５５（ＩＦＯ−３１８３１、以下菌株Ａと称する）について胞子生産性を調べた。
（方法）
２倍希釈したぶどう果汁に、稀釈果汁１リットル当たり酵母エキス５ｇを添加し、ｐＨを４．５に調整してＭ培地とした。これに寒天を１リットル当たり２０ｇ加えて大型試験管に２５ｍｌづつ分注して滅菌後寒天斜面培地とし、各菌株の菌糸を無菌的に接種して２０℃、３週間培養後無菌生理食塩水１５ｍｌを試験管内に注入して胞子を懸濁させ、血球計算板を用い、検鏡により１ｍｌ当たりの胞子数を計測した。なお、ぶどう果汁培地を採用したのは、これがポテトデキストロース培地あるいは野菜ジュース培地等より当該菌の生育および胞子形成が良好であったためである。
（結果）
表１に示した。
【００１１】
【表１】
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胞子濃度１０×１０6／ｍｌ以上を胞子生産能が優れているものとし、ＣＤ−１、ＣＤ−２、ＣＤ−４、ＣＳ−１、ＣＳ−Ｌの５菌株を選抜し、第２次スクリーニングのため、これらの５菌株について他の菌学的性状、すなわち有機酸資化性及びグリセロール生成能について更に調べた。
４．有機酸資化性
（方法）
ぶどうに多く含まれる酒石酸およびリンゴ酸の資化性についてしらべた。表２に示した組成のＹＭ改変培地を１００ｍｌ容三角フラスコに４０ｍｌ入れ、滅菌後、これに各菌株について菌糸を無菌的に１白金耳接種し、２０℃、１週間振盪培養後、遠心分離（５０００ｇ、１５分）して、上澄液を０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過し、濾液を分析に供した。なお、糖濃度の影響をしらべるため、ブドウ糖により１５％および３０％の二通りに調整した。
【００１２】
【表２】
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（結果）
資化性は培地中の有機酸濃度を測定し、培養前のイニシャル濃度との差（減少分）をイニシャル濃度で除し、それに１００を乗じて得られた値を分解率とした。この分解率が高いほど資化能力が大であり、好ましいと判断される。その理由は、貴腐化の過程で酸が代謝されず乾燥濃縮されれば、非常に酸味が強くなりワインとしては好ましくないからである。酒石酸の資化性については表３に、リンゴ酸の資化性については表４に示した。
【００１３】
【表３】
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表３に見るとおり、糖度が高い方が分解率が高い傾向にあったが、菌株の資化能力の順序は、殆ど糖濃度の影響を受けなかった。すなわち、酒石酸資化能力は、ＣＤ−１》ＣＳ−１＞ＣＤ−４＞ＣＤ−２＞ＣＳ−Ｌの順に高かった。
【００１４】
【表４】
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表４に見るとおり、酒石酸と同様糖度が高い方が分解率が高い傾向にあったが、菌株の資化能力の順序は、殆ど糖濃度の影響を受けなかった。すなわち、リンゴ酸資化能力は、ＣＤ−１》ＣＤ−２＞ＣＤ−４＞ＣＳ−１＞ＣＳ−Ｌの順に高かった。
【００１５】
以上の結果から、酒石酸及びＬ−リンゴ酸ともに資化能力が大きいのはＣＤ−１であった。
５．グリセロール生産能
（方法）
有機酸資化性試験と同一培地、同一条件にてしらべた。グリセロールは貴腐ワインに多量に含まれ、ワインに滑らかさと甘味を付与し、貴腐ワインの風味を特徴付ける重要な成分であり、多いほど良いとされる。貴腐ワイン中のグリセロールは酵母によるアルコール発酵の副産物として生成されるが、それは僅かな量で、大部分はボトリチス・シネレア菌によって生産される。したがって、グリセロール生産性が高いほど良い菌株といえる。
（結果）
表５に示した。
【００１６】
【表５】
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糖濃度が高いほうがグリセロールの生産が多い傾向にあった。また、グリセロール生産能の順序は糖濃度の影響を若干受けた。グリセロール生産能を菌株別にみると、糖濃度の高低に関係なく、ＣＤ−１が最も大きく、次いでＣＳ−Ｌが大きかったが他の菌株は糖濃度によって変動した。
【００１７】
以上、検討した５菌株のうち、胞子生産能、有機酸（酒石酸、リンゴ酸）資化性およびグリセロール生産能のすべての特性においてＣＤ−１が格段に優れていた。
【００１８】
このＣＤ−１を、ボトリチス・シネレア  ＳＢＴ  ７２５１株と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１４７５５）。
実施例２
１．ブドウの貴腐化
選抜菌株ＣＤ−１を２０℃、２週間Ｍ培地にて通気培養し、形成した胞子を１０6／ｍｌの濃度になるよう水に懸濁して、これを接種液とした。自社ブドウ園のＢＸ１８度以上の完熟したリースリング種ブドウに、この接種液を噴霧して胞子を接種した。接種後、菌糸が生育するまでブドウの房をビニール袋で覆い、その後は開封して乾燥させた。その期間、雨避けのためブドウに傘（紙製）をかけた。
【００１９】
胞子接種して約１か月後、ＢＸが約３５度以上に達したところで貴腐化したブドウを収穫し、これを圧搾して貴腐化果汁を得た。得られた貴腐化果汁の成分組成を表６に示した。
【００２０】
【表６】
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表６に見るとおり、還元糖分は３６０ｇ／ｌと通常のブドウの果汁糖分の２倍、貴腐化果汁の特性成分であるグリセロールは１７ｇ／ｌと充分に生成されていた。また、濃縮された状態にもかかわらず、総酸は約６ｇ／ｌと通常のブドウの果汁と同程度であった。これは酒石酸、リンゴ酸などの有機酸が菌によって資化されていることを示す。また、グルコン酸は貴腐化ブドウの成分の特徴であると報告されている。以上、果汁成分組成からみて、選抜菌株ＣＤ−１によりブドウの貴腐化が充分可能であることがわかった。
２．貴腐ワインの醸造
貴腐化果汁にりん酸水素二アンモニウム［(NH4)2HPO4］を５００ｐｐｍ添加し、ワイン酵母Ｗ−３により調整した酒母を１０％添加し、２０℃で発酵を行った。約４０日を経て発酵が停止したので、遠心分離により酵母を除去し、亜硫酸を１００ｐｐｍ添加して分析に供した。
３．生成ワインの成分分析結果
表７に示した。なお、比較のため、ドイツの貴腐ワイン、トロッケンベーレンアウスレーゼ1979（Trockenbeerenauslese, ＴＢＡ、セント・ウルスラ社製) の成分分析結果を併記した。
【００２１】
試醸品とＴＢＡのブドウ糖、果糖、エチルアルコール含量はきわめて類似し、さらに貴腐ワインの特性であるグリセロールは試醸品の方が高い値を示した。また、有機酸の酒石酸、リンゴ酸などは若干パターンが違うが、これはブドウの産地の気候条件の違いに因るものと推測される。そのほかの有機酸の違いは発酵の条件の違いにも因るものと推測される。また、貴腐ワインの特性成分であるムチン酸、グルコン酸などは互いに近い値を示した。このように、本発明にかかる貴腐菌ＣＤ−１株により、天然の貴腐ブドウから作った貴腐ワインと同じような貴腐ワインが人工的に作ることが出来ることが成分組成からみても証明された。また、官能評価においてもフルーティで、豊かな芳香を有し、滑らかな口当たりの良いごく甘口のワインであるとの高い評価を得た。
【００２２】
【表７】
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【００２３】
【発明の効果】
貴腐ワインは自然条件の制約を受けてきわめて稀にしかできないが、本発明による菌を用いることにより、自然条件に左右されずに人工的にブドウに菌を生育させて貴腐化し、恒常的に貴腐ワインをつくることができる。