(57)【要約】  本開示は、コリネ型細菌において目的遺伝子の発現を制御し得る遺伝子制御配列を含む核酸、該核酸が導入された細菌、該細菌を用いた目的遺伝子の発現方法、並びに該細菌を用いた物質の生産方法に関する。上記核酸は、任意のプロモーター配列と、所定のヌクレオチド配列によって特定されるＡｒａＲ結合配列とを少なくとも一部に有する。加えて、上記核酸は、コリネ型細菌に導入されると、アラビノース未添加の場合には上記プロモーター配列のプロモーター活性が抑制され、アラビノース添加の場合にはプロモーター活性が誘導される性質を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターとして機能し得るヌクレオチド配列（Ｘ）と以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のヌクレオチド配列（Ｙ）とを少なくとも一部に有する遺伝子発現制御配列（Ｒ）を含み、
遺伝子発現制御配列（Ｒ）が以下の条件（Ｉ）を充足する、核酸：
（ａ）配列番号５から１２並びに配列番号１７及び１８の何れか１つに記載のヌクレオチド配列；
（ｂ）上記（ａ）に記載のヌクレオチド配列において１又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列、
但し、核酸がＲＮＡの場合は、ヌクレオチド配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替えるものとする、
条件（Ｉ）：コリネ型細菌において、アラビノース未添加の場合にヌクレオチド配列（Ｘ）のプロモーター活性が抑制されること。
【請求項２】
ヌクレオチド配列（Ｙ）がヌクレオチド配列（Ｘ）の３’末端に直接又は間接に連結されている、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
ヌクレオチド配列（Ｘ）が構成的プロモーターである、請求項１又は２に記載の核酸。
【請求項４】
ヌクレオチド配列（Ｘ）が、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃＩプロモーター、ｔａｃＩＩプロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ＥＦＴｕプロモーター、ｇｒｏＥＳプロモーター、ＳＯＤプロモーター、Ｐ１５プロモーター、ｌｄｈＡプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ｄａｐＡプロモーター、ｍｅｔＥプロモーター、及びｔｕｆプロモーターから選択される、請求項１から３の何れか１項に記載の核酸。
【請求項５】
ヌクレオチド配列（Ｘ）が、コリネ型細菌のゲノムＤＮＡに存在する遺伝子の５’上流に由来するプロモーター配列、コリネ型細菌に内在するプラスミドに由来するプロモーター配列、又はコリネ型細菌に感染し得るファージのゲノムに由来するプロモーター配列からなる、請求項１から４の何れか１項に記載の核酸。
【請求項６】
遺伝子発現制御配列（Ｒ）は、コリネ型細菌において、アラビノースを添加した場合に、アラビノース未添加の場合と比較して少なくとも１０倍高いプロモーター活性を示すものである、請求項１から５の何れか１項に記載の核酸。
【請求項７】
遺伝子発現制御配列（Ｒ）は、コリネ型細菌において、アラビノースを添加した場合に、アラビノース未添加の場合と比較して少なくとも１５倍高いプロモーター活性を示すものである、請求項１から６の何れか１項に記載の核酸。
【請求項８】
遺伝子発現制御配列（Ｒ）は、コリネ型細菌において、アラビノースを添加した場合に、アラビノース未添加の場合と比較して少なくとも２０倍高いプロモーター活性を示すものである、請求項１から７の何れか１項に記載の核酸。
【請求項９】
遺伝子発現制御配列（Ｒ）は、コリネ型細菌において、アラビノースを添加した場合に、アラビノース未添加の場合と比較して少なくとも３５倍高いプロモーター活性を示すものである、請求項１から８の何れか１項に記載の核酸。
【請求項１０】
遺伝子発現制御配列（Ｒ）は、コリネ型細菌において、アラビノースを添加した場合に、アラビノース未添加の場合と比較して少なくとも５０倍高いプロモーター活性を示すものである、請求項１から９の何れか１項に記載の核酸。
【請求項１１】
遺伝子発現制御配列（Ｒ）は、コリネ型細菌において、アラビノースを添加した場合に、アラビノース未添加の場合と比較して少なくとも７０倍高いプロモーター活性を示すものである、請求項１から１０の何れか１項に記載の核酸。
【請求項１２】
ヌクレオチド配列（Ｙ）が、以下の一般式（Ｉ）で表される、請求項１から１１の何れか１項に記載の核酸：
５’−Ｎ１ＴＧＴＮ２ＡＧＣＧＮ３ＴＮ４ＡＮ５Ｎ６Ｎ７−３’・・・一般式（Ｉ）
式中、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６及びＮ７は、それぞれ、独立にＡ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）若しくはＴ（チミン）を示し又は欠失し、核酸がＲＮＡの場合は、Ｔ（チミン）はＵ（ウラシル）と読み替えるものとする。
【請求項１３】
遺伝子発現制御配列（Ｒ）が以下の（ｌ）から（ｏ）の何れかのヌクレオチド配列を含む、請求項１から１２の何れか１項に記載の核酸：
（ｌ）配列番号２２から６１並びに配列番号９６から１０２の何れか１つに記載のヌクレオチド配列；
（ｍ）（ｌ）に記載のヌクレオチド配列において１又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列；
（ｎ）（ｌ）に記載のヌクレオチド配列に対して相補であるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
（ｏ）（ｌ）に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
但し、核酸がＲＮＡの場合は、塩基配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替えるものとする。
【請求項１４】
遺伝子発現制御配列（Ｒ）が更にＳＤ配列を含む、請求項１から１３の何れか１項に記載の核酸。
【請求項１５】
ＳＤ配列がヌクレオチド配列（Ｙ）の３’末端に直接又は間接に連結されている、請求項１から１４の何れか１項に記載の核酸。
【請求項１６】
ａｒａＥタンパク質及びａｒａＲタンパク質のうち少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を更に含む、請求項１から１５の何れか１項に記載の核酸。
【請求項１７】
コリネ型細菌に由来のａｒａＥタンパク質及びａｒａＲタンパク質のうち少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１から１６の何れか１項に記載の核酸。
【請求項１８】
複製起点、選択マーカー遺伝子、クローニング部位、制限酵素認識部位、及びターミネーターからなる群から選択される１種以上のヌクレオチド配列を更に含む、請求項１から１７の何れか１項に記載の核酸。
【請求項１９】
細菌において自律複製可能なプラスミドとして提供される、請求項１から１８の何れか１項に記載の核酸。
【請求項２０】
発現ベクターとして提供される、請求項１から１９の何れか１項に記載の核酸。
【請求項２１】
目的遺伝子をコードするヌクレオチド配列（Ｚ）を更に含み、ヌクレオチド配列（Ｚ）は、コリネ型細菌において上記目的遺伝子の発現が遺伝子発現制御配列（Ｒ）によって制御されるように遺伝子発現制御配列（Ｒ）と直接又は間接に連結されている、請求項１から１８の何れか１項に記載の核酸。
【請求項２２】
ＤＮＡである、請求項１から２１の何れか１項に記載の核酸。
【請求項２３】
請求項１から２２の何れか１項に記載の核酸が導入された細菌。
【請求項２４】
エシェリキア属菌である、請求項２３に記載の細菌。
【請求項２５】
コリネ型細菌である、請求項２３に記載の細菌。
【請求項２６】
コリネ型細菌に由来するａｒａＥタンパク質及びａｒａＲタンパク質をそれぞれコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を有するＤＮＡがゲノムＤＮＡに組み込まれており、かつ該ゲノムＤＮＡは上記ａｒａＥタンパク質及びａｒａＲタンパク質を発現可能に構成されている、請求項２３から２５の何れか１項に記載の細菌。
【請求項２７】
請求項２３から２６の何れか１項に記載の細菌をアラビノース又はそのアナログに暴露することにより目的遺伝子を発現させることを含む、目的遺伝子の発現方法。
【請求項２８】
上記細菌がコリネ型細菌である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２３から２６の何れか１項に記載の細菌をアラビノース又はそのアナログに暴露することにより目的遺伝子を発現させることを含む、目的物質の生産方法。
【請求項３０】
上記細菌がコリネ型細菌である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
コリネ型細菌において目的遺伝子の発現制御に用いるための核酸断片であって、
以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のヌクレオチド配列（Ｙ）を含む、核酸断片：
（ａ）配列番号５から９、１１及び１２並びに配列番号１７及び１８の何れか１つに記載のヌクレオチド配列；
（ｂ）上記（ａ）に記載のヌクレオチド配列において１又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列、
但し、
核酸がＲＮＡの場合は、ヌクレオチド配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替えるものとし、
ヌクレオチド配列（Ｙ）として配列番号１０、２０及び２１それぞれに示されるヌクレオチド配列は除外され、かつヌクレオチド配列（Ｙ）は以下の条件（ＩＩ）を満たすものとする、
条件（ＩＩ）：配列番号８０に示すプラスミドベクターｐＧＥ７２８−１のヌクレオチド配列における第２９１３番目から第２９２８番目までのヌクレオチド配列を上記ヌクレオチド配列（Ｙ）と入れ替えたプラスミドベクターで形質転換されたコリネ型細菌において、アラビノースを添加した場合に対してアラビノース未添加の場合にＰｔａｃＩのプロモーター活性が抑制される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コリネ型細菌においてアラビノース又はそのアナログに依存した遺伝子発現制御を可能にする核酸配列に関する。より詳細には、本発明は、コリネ型細菌においてプロモーターとして機能し得るヌクレオチド配列と所定のヌクレオチド配列からなるＡｒａＲ結合配列とを有する遺伝子発現制御配列を含む核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国において１９５０年代にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）がグルタミン酸産生菌として単離されて以来、同種を代表とするコリネ型細菌は、各種アミノ酸、有機酸、エタノールを含むアルコール類等を含む化学品の生産に幅広く利用されている。加えて、コリネ型細菌は、ゲノム解析や遺伝子発現解析等の基礎研究も精力的に行われており、コリネ型細菌の遺伝子組換え技術もほぼ確立されている。このように基礎研究が進展し、遺伝子組み換え技術も確立していることから、コリネ型細菌により生産され得る化学品の種類も増加しており、しかもそれら化学品の大量生産も可能になりつつある。
その結果、化学品や有用物質の生産におけるコリネ型細菌の利用は産業界において益々注目を集めている。【０００３】
ところで、各種遺伝子を導入したコリネ型細菌を利用して物質を生産する場合、コリネ型細菌において導入される各種遺伝子の発現を人為的に制御できれば、効率的なバイオプロセス並びに物質生産が可能になることから、コリネ型細菌において機能し得るプロモーター等を利用した遺伝子発現制御技術の開発が重要になってくる。【０００４】
コリネ型細菌において機能するプロモーターの一例として、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３株から単離されたアスパルターゼコード遺伝子のプロモーター配列を利用した技術が挙げられる（特許文献１）。特許文献１には、上記所定のプロモーター配列とクロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）遺伝子とを含むレポータープラスミドが導入された上記菌株では、上記プロモーター配列の存在しないネガティブ・コントロールのプラスミドのみ導入した菌株と比較すると２５倍のＣＡＴ活性が確認されたことが記載されている。【０００５】
更に別の例としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株のゲノムＤＮＡから単離された幾つかのＤＮＡ断片であって、コリネ型細菌においてｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を発揮するものが知られている（特許文献２）。特許文献２には、これらのＤＮＡ断片によるプロモーター活性は、ホストとなるコリネ型細菌を培養する培地の炭素源（各種糖類、エタノール、蛋白質分解物等）組成に依存することから、該培地中の炭素源組成を変更することにより目的遺伝子の発現を制御できると記載されている。【０００６】
更に別の例としては、コリネバクテリウム・グルタミカムに由来する、伸長因子遺伝子の１つであるＥＦ−ＴＵのプロモーター（ＰＥＦ−ＴＵ）、スーパーオキシドジムターゼ遺伝子のプロモーター（Ｐｓｏｄ）、シャペロニンタンパク質ＧｒｏＥＳ遺伝子のプロモーター（Ｐｇｒｏ）、伸長因子遺伝子の１つであるＥＦ−ＴＳのプロモーター（ＰＥＦ−ＴＳ）を利用した発現ユニット等が知られている（それぞれ特許文献３から６）。加えて、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株に由来するＣｇｌ１５６５遺伝子（遺伝子座ＮＣｇｌ１５０４）及びＣｇｌ１３６０遺伝子（遺伝子座ＮＣｇｌ１３０５）それぞれのプロモーター配列を利用した遺伝子発現技術も知られている（特許文献７）。
特許文献３から７には、上記各プロモーター配列と所定のレポーター遺伝子や酵素遺伝子とを導入してなるプラスミド構築物を構築すると共に、該プラスミド構築物が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカム形質転換体を取得し、該形質転換体を用いたレポーターアッセイ又は酵素活性の測定により、上記の各プロモーター配列についてプロモーター活性が認められたことが記載されている。【０００７】
更に、特許文献８には、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＣＪＨＢ１００株に由来するプロモーター配列を利用した発現カセットないしベクターが記載されている。これらプロモーター配列は、同菌株を培養し、各培養フェースにおいて過剰発現されるタンパク質を同定し、それらタンパク質をコードする遺伝子の５’非翻訳領域をクローニングすることにより同定されたプロモーター配列である。特許文献７では、ｐｃｊ１ないしｐｃｊ７と命名された合計７つのプロモーター配列を取得し、それらのプロモーター配列のプロモーター活性について、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスにおいてＧＦＰ遺伝子を利用したレポーターアッセイにより評価しており、その結果、ｐｃｊ３及び４を除く５つのプロモーター配列は、典型的なプロモーターであるｔａｃプロモーターに対して、より強力なプロモーター活性を示し、特にｐｃｊ１及びｐｃｊ４は１０倍を超えるプロモーター活性を示すことが示唆されている。加えて、特許文献７では、これらプロモーター配列が大腸菌（エシェリキア・コリ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においても機能し得ることが確かめられており、とりわけｐｃｊ１はコリネ型細菌及び大腸菌の双方で高い活性を示すことも示唆されている。【０００８】
更に、特許文献１から８に開示されるプロモーター配列はコリネ型細菌の野生型プロモーター配列であるが、野生型プロモーター配列に対して変異導入を施すことによりプロモーター活性を向上させた変異型プロモーター配列も知られている。このような変異型プロモーター配列としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムに由来する、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）遺伝子、ＬｙｓＣ−ａｓｄオペロン遺伝子、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＢ）遺伝子の各プロモーター配列に対して所定の変異を導入することにより取得された変異型プロモーターが挙げられる（特許文献９から１１）。特許文献９から１１に記載されるプロモーターに関する一連の技術は、リシン生合成経路に関与する酵素遺伝子の発現量を増加させることによりリシンの産生量を向上させることを狙いとするものである。【０００９】
更に、特許文献１２には、特許文献３から６に記載されるコリネバクテリウム・グルタミカムに由来のＰＥＦ−ＴＵ、Ｐｓｏｄ、Ｐｇｒｏ、及びＰＥＦ−ＴＳのうち２つ以上のプロモーター配列をタンデムに連結してなる多重プロモーターが開示されており、これらプロモーターそれぞれを単独で利用した場合よりも多重プロモーターの方が目的遺伝子の発現が向上した結果も示されている。【００１０】
更に、誘導型プロモーターを利用した技術としては、例えば特許文献１３に開示される遺伝子発現制御技術が挙げられる。特許文献１３に開示の技術は、嫌気条件下において誘導促進又は誘導抑制されるコリネバクテリウム・グルタミカムの遺伝子プロモーターを網羅的に解析することにより取得したプロモーター配列を利用したものである。特許文献１３には、このように嫌気条件により遺伝子発現を促進又は抑制できるプロモーター配列を利用すれば、コリネ型細菌を用いて嫌気条件下で目的物質を生産するに際し、目的物質産生に必要な各種遺伝子の発現を向上させることができ、かつ目的物質産生には不要な各種遺伝子の発現を抑制させることが可能となるから、より効率的な目的物質の生産が可能となることが示唆されている。【００１１】
更に、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて機能可能な異種性のプロモーターを利用した発現システムは古くから知られており、このような発現システムしては、例えばｔａｃ、ｔｒｃ、ＬａｃＵＶ５、ＰＲ、ＰＬ等を利用したエシェリキア・コリ発現システムが挙げられる（例えば、非特許文献１〜３を参照）。これらのプロモーターは、ラクトース又はそのアナログのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）等の誘導物質の添加によりプロモーター活性の発現が誘導される。【００１２】
加えて、λＰＬプロモーターとコリネバクテリウム・アンモニアゲネスから単離された潜在性プロモーターＣＪ１及びＣＪ４とを組み合せた熱誘導型発現ベクターが知られており、この熱誘導型発現ベクターはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスのみならずコリネバクテリウム・グルタミカムにおいても機能することが確かめられている（非特許文献４）。【００１３】
加えて、エシェリキア・コリに由来するアラビノース調節因子のＡｒａＣ遺伝子、ａｒａＢＡＤオペロンのＰＢＡＤプロモーター及びＬ−アラビノーストランスポーターのＡｒａＥ遺伝子を組み合せることによりコリネバクテリウム・グルタミカムにおいてアラビノースに依存した目的遺伝子の発現制御を可能とした発現システムも知られている（非特許文献５）。非特許文献５には、基底下の非特異的発現も示すことなく目的遺伝子の発現を厳密に制御できたと記載されており、更にこの発現システムを用いてコリネ型細菌においてα−ケトグルタル酸脱水素酵素の阻害因子をコードするｏｄｈＩ遺伝子の発現を調節したところ、高いレベルのグルタミン酸産生を実現できたと記載されている。【００１４】
更に加えて、非特許文献６には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１株において、ＬａｃＩ型の転写調節因子であるＡｒａＲタンパク質が、Ｌ−アラビノース異化作用を担うａｒａＢＤＡ遺伝子、アラビノース吸収を担うａｒａＥ遺伝子、及び当該転写調節因子ＡｒａＲ遺伝子の発現を抑制することが示唆されている。より詳細には、ＡｒａＲタンパク質がａｒａＢＤＡの各遺伝子領域とＧａｌＭ／ａｒａＲの遺伝子領域との間にある特定配列（ＢＳＢ）、並びにａｒａＥ遺伝子の上流に存在する２箇所の特定配列（ＢＳＥ１及びＢＳＥ２）の合計３つの配列に結合し得ることが示されており、Ｌ−アラビノースによる上記遺伝子発現抑制の解除におけるＡｒａＲタンパク質及び上記ＡｒａＲ結合配列の役割について示唆がされている。なお、非特許文献６には、ｇａｌＭ及びａｒａＲのプロモーター領域についてＬａｃＺレポーターアッセイにより評価した結果も示されており、ＡｒａＲのプロモーター領域についてはＤグルコースを添加して培養した細胞とＬ−アラビノースを添加して培養した細胞との間でプロモーター活性の違いは見られなかったこと、並びにｇａｌＭプロモーターについてはＬ−アラビノースの添加に反応してＬａｃＺの発現レベルが増加したことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開平７−３１４７８
【特許文献２】特開平７−９５８９１
【特許文献３】特表２００７−５１４４２５
【特許文献４】特表２００７−５１４４２６
【特許文献５】特表２００７−５３６９０８
【特許文献６】特表２００８−５０６４００
【特許文献７】特表２０１０−５１５４５３
【特許文献８】特表２００８−５２３８０２
【特許文献９】特表２０１１−５１０６５１
【特許文献１０】特表２０１１−５１０６２５
【特許文献１１】特表２０１１−１８２７７９
【特許文献１２】特表２００８−５２３８３４
【特許文献１３】ＷＯ２００６／０２８０６３
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｇｅｎｅ．１９９１  Ｊｕｎ  １５；１０２（１）：９３−８．
【非特許文献２】Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９７  Ｎｏｖ；６３（１１）：４３９２−４００．
【非特許文献３】Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：４２８−４３０
【非特許文献４】Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００８），１８（４），１８（４），６３９−６４７．
【非特許文献５】Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１２  Ａｕｇ；７８（１６）：５８３１−５８３８．
【非特許文献６】Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２０１５  Ｄｅｃ；１９７（２４）：３７８８−３７９６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
上述の通り従来からコリネ型細菌において利用可能な各種遺伝子発現システムが知られている。しかしながら、従来技術のうち単にコリネ型細菌において機能し得る構成的プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）を単独で利用したものについては、遺伝子発現スイッチとしてオン／オフの切換え制御は事実上不可能であり、例えば厳密な遺伝子制御が必要不可欠となるバイオプロセスにはそもそも不向きである。【００１８】
加えて、ＩＰＴＧ等の発現誘導物質や温度等の所定のストレス環境下に組換えコリネ型細菌を暴露することにより目的遺伝子の発現を制御する発現システム（例えば非特許文献１から４）については、誘導物質の毒性やコストの問題及び目的遺伝子の発現制御プロセスが煩雑になる問題がある上、発現を誘導していない基底下においても一定レベルの非特異的発現が見られることもあり厳密な遺伝子発現の制御がしばしば困難となる状況も生じる。加えて、目的遺伝子の性質によっては、このような基底下での非特異的発現によりコリネ型細菌の生育が阻害されると言う問題もある。【００１９】
更に加えて、非特許文献５に記載される、エシェリキア・コリに由来するＡｒａＣ遺伝子、ＰＢＡＤプロモーター及びＡｒａＥ遺伝子を組合せた遺伝子発現システムについては、本発明者によりコリネ型細菌を用いて効果確認試験を行ったところ、アラビノース未添加に対してアラビノース添加の場合に１０倍程度のプロモーター活性は認められたものの、非特許文献５に記載されるような顕著なプロモーター活性は認められなかった。つまり、非特許文献５に記載の遺伝子発現システムは、再現性に乏しく実用に耐え得るものとは言えない。なお、そもそも非特許文献５に記載される遺伝子発現システムは、上記のとおりエシェリキア・コリ由来のプロモーター配列や遺伝子を利用するものである点で、本発明に係る遺伝子発現システムとはヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のレベルで全く構成が異なるものである。【００２０】
なお付け加えると、非特許文献６には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１においてＡｒａＲタンパク質が、ａｒａＢＡＤ遺伝子、ａｒａＥ遺伝子及び当該転写調節因子ＡｒａＲ遺伝子の発現を抑制すること、並びにＡｒａＲタンパク質がアラビノース遺伝子群の遺伝子間領域における所定の配列に結合し得ることは示唆されてはいるものの、これら遺伝子群及びＡｒａＲタンパク質結合配列を利用した遺伝子発現制御システムの具体的な構成を実現可能なレベルで記載するものではない。実際に、以下実施例の比較試験例１に示されるとおり、本発明者がＡｒａＲタンパク質結合配列を含むａｒａＥ遺伝子のプロモーター領域を確認したところ、該ａｒａＥ遺伝子のプロモーター領域をそのまま利用しても、遺伝子発現制御は不可能であり、そもそも遺伝子発現システムとしてプロモーター活性さえ示さなかった。つまり、非特許文献６は、コリネバクテリウム・グルタミカムのアラビノース遺伝子発現調節機構におけるＡｒａＲタンパク質の役割に関する分析結果を単に示した学術論文であり、人工遺伝子発現システムにおけるアラビノース遺伝子群及びＡｒａＲタンパク質結合配列の利用可能性を示唆するものでは無い。【００２１】
そこで、本発明の目的は、コリネ型細菌において目的遺伝子の発現を厳密に制御でき、かつ目的遺伝子の発現誘導時には良好な発現量を確保できる遺伝子発現システムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
上記目的を達成するために、本発明の第１の態様によれば、以下の核酸が提供される。
［１］プロモーターとして機能し得るヌクレオチド配列（Ｘ）と以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のヌクレオチド配列（Ｙ）とを少なくとも一部に有する遺伝子発現制御配列（Ｒ）を含み、
遺伝子発現制御配列（Ｒ）が以下の条件（Ｉ）を充足する、核酸：
（ａ）配列番号５から１２並びに配列番号１７及び１８の何れか１つに記載のヌクレオチド配列；
（ｂ）上記（ａ）に記載のヌクレオチド配列において１又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列、
但し、核酸がＲＮＡの場合は、ヌクレオチド配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替えるものとする、
条件（Ｉ）：コリネ型細菌において、アラビノース未添加の場合にヌクレオチド配列（Ｘ）のプロモーター活性が抑制されること。【００２３】
［２］ヌクレオチド配列（Ｙ）がヌクレオチド配列（Ｘ）の３’末端に直接又は間接に連結されている、［１］に記載の核酸。
［３］ヌクレオチド配列（Ｘ）が構成的プロモーターである、［１］又は［２］に記載の核酸。【００２４】
［４］ヌクレオチド配列（Ｘ）が、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃＩプロモーター、ｔａｃＩＩプロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ＥＦＴｕプロモーター、ｇｒｏＥＳプロモーター、ＳＯＤプロモーター、Ｐ１５プロモーター、ｌｄｈＡプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ｄａｐＡプロモーター、ｍｅｔＥプロモーター、及びｔｕｆプロモーターから選択される、［１］から［３］の何れか１つに記載の核酸。【００２５】
［５］ヌクレオチド配列（Ｘ）が、コリネ型細菌のゲノムＤＮＡに存在する遺伝子の５’上流に由来するプロモーター配列、コリネ型細菌に内在するプラスミドに由来するプロモーター配列、又はコリネ型細菌に感染し得るファージのゲノムに由来するプロモーター配列からなる、［１］から［４］の何れか１つに記載の核酸。
［６］遺伝子発現制御配列（Ｒ）は、コリネ型細菌において、アラビノースを添加した場合に、アラビノース未添加の場合と比較して少なくとも１０倍高いプロモーター活性を示すものである、［１］から［５］の何れか１つに記載の核酸。【００２６】
［７］遺伝子発現制御配列（Ｒ）は、コリネ型細菌において、アラビノースを添加した場合に、アラビノース未添加の場合と比較して少なくとも１５倍高いプロモーター活性を示すものである、［１］から［６］の何れか１つに記載の核酸。
［８］遺伝子発現制御配列（Ｒ）は、コリネ型細菌において、アラビノースを添加した場合に、アラビノース未添加の場合と比較して少なくとも２０倍高いプロモーター活性を示すものである、［１］から［７］の何れか１つに記載の核酸。【００２７】
［９］遺伝子発現制御配列（Ｒ）は、コリネ型細菌において、アラビノースを添加した場合に、アラビノース未添加の場合と比較して少なくとも３５倍高いプロモーター活性を示すものである、［１］ら［８］の何れか１つに記載の核酸。
［１０］遺伝子発現制御配列（Ｒ）は、コリネ型細菌において、アラビノースを添加した場合に、アラビノース未添加の場合と比較して少なくとも５０倍高いプロモーター活性を示すものである、［１］から［９］の何れか１つに記載の核酸。
［１１］遺伝子発現制御配列（Ｒ）は、コリネ型細菌において、アラビノースを添加した場合に、アラビノース未添加の場合と比較して少なくとも７０倍高いプロモーター活性を示すものである、［１］から［１０］の何れか１つに記載の核酸。【００２８】
［１２］ヌクレオチド配列（Ｙ）が、以下の一般式（Ｉ）で表される、［１］から［１１］の何れか１つに記載の核酸：
５’−Ｎ１ＴＧＴＮ２ＡＧＣＧＮ３ＴＮ４ＡＮ５Ｎ６Ｎ７−３’・・・一般式（Ｉ）
式中、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６及びＮ７は、それぞれ、独立にＡ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）若しくはＴ（チミン）を示し又は欠失し、核酸がＲＮＡの場合は、Ｔ（チミン）はＵ（ウラシル）と読み替えるものとする。【００２９】
［１３］遺伝子発現制御配列（Ｒ）が以下の（ｌ）から（ｏ）の何れかのヌクレオチド配列を含む、［１］から［１２］の何れか１つに記載の核酸：
（ｌ）配列番号２２から６１並びに配列番号９６から１０２の何れか１つに記載のヌクレオチド配列；
（ｍ）（ｌ）に記載のヌクレオチド配列において１又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列；
（ｎ）（ｌ）に記載のヌクレオチド配列に対して相補であるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
（ｏ）（ｌ）に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
但し、核酸がＲＮＡの場合は、塩基配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替えるものとする。【００３０】
［１４］遺伝子発現制御配列（Ｒ）が更にＳＤ配列を含む、［１］から［１３］の何れか１つに記載の核酸。
［１５］ＳＤ配列がヌクレオチド配列（Ｙ）の３’末端に直接又は間接に連結されている、［１］から［１４］の何れか１つに記載の核酸。
［１６］ａｒａＥタンパク質及びａｒａＲタンパク質のうち少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を更に含む、［１］から［１５］の何れか１つに記載の核酸。【００３１】
［１７］コリネ型細菌に由来のａｒａＥタンパク質及びａｒａＲタンパク質のうち少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含む、［１］から［１６］の何れか１つに記載の核酸。
［１８］複製起点、選択マーカー遺伝子、クローニング部位、制限酵素認識部位、及びターミネーターからなる群から選択される１種以上のヌクレオチド配列を更に含む、［１］から［１７］の何れか１つに記載の核酸。
［１９］細菌において自律複製可能なプラスミドとして提供される、［１］から［１８］の何れか１つに記載の核酸。【００３２】
［２０］発現ベクターとして提供される、［１］から［１９］の何れか１つに記載の核酸。
［２１］目的遺伝子をコードするヌクレオチド配列（Ｚ）を更に含み、ヌクレオチド配列（Ｚ）は、コリネ型細菌において上記目的遺伝子の発現が遺伝子発現制御配列（Ｒ）によって制御されるように遺伝子発現制御配列（Ｒ）と直接又は間接に連結されている、［１］から［１８］の何れか１つに記載の核酸。
［２２］ＤＮＡである、［１］から［２１］の何れか１つに記載の核酸。【００３３】
更に、本発明の第２の態様によれば、以下の細菌が提供される。
［２３］［１］から［２２］の何れか１つに記載の核酸が導入された細菌。
［２４］エシェリキア属菌である、［２３］に記載の細菌。
［２５］コリネ型細菌である、［２３］に記載の細菌。【００３４】
［２６］コリネ型細菌に由来するａｒａＥタンパク質及びａｒａＲタンパク質をそれぞれコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を有するＤＮＡがゲノムＤＮＡに組み込まれており、かつ該ゲノムＤＮＡは上記ａｒａＥタンパク質及びａｒａＲタンパク質を発現可能に構成されている、［２３］から［２５］の何れか１つに記載の細菌。【００３５】
更に、本発明の第３の態様によれば、以下の目的遺伝子の発現方法が提供される。
［２７］［２３］から［２６］の何れか１つに記載の細菌をアラビノース又はそのアナログに暴露することにより目的遺伝子を発現させることを含む、目的遺伝子の発現方法。
［２８］上記細菌がコリネ型細菌である、［２７］に記載の方法。【００３６】
更に、本発明の第４の態様によれば、以下の目的物質の生産方法が提供される。
［２９］［２３］から［２６］の何れか１つに記載の細菌をアラビノース又はそのアナログに暴露することにより目的遺伝子を発現させることを含む、目的物質の生産方法。
［３０］上記細菌がコリネ型細菌である、［２９］に記載の方法。【００３７】
更に、本発明の第５の態様によれば、以下の核酸断片が提供される。
［３１］コリネ型細菌において目的遺伝子の発現制御に用いるための核酸断片であって、
以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のヌクレオチド配列（Ｙ）を含む、核酸断片：
（ａ）配列番号５から９、１１及び１２並びに配列番号１７及び１８の何れか１つに記載のヌクレオチド配列；
（ｂ）上記（ａ）に記載のヌクレオチド配列において１又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列、
但し、
核酸がＲＮＡの場合は、ヌクレオチド配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替えるものとし、
ヌクレオチド配列（Ｙ）として配列番号１０、２０及び２１それぞれに示されるヌクレオチド配列は除外され、かつヌクレオチド配列（Ｙ）は以下の条件（ＩＩ）を満たすものとする、
条件（ＩＩ）：配列番号８０に示すプラスミドベクターｐＧＥ７２８−１のヌクレオチド配列における第２９１３番目から第２９２８番目までのヌクレオチド配列を上記ヌクレオチド配列（Ｙ）と入れ替えたプラスミドベクターで形質転換されたコリネ型細菌において、アラビノースを添加した場合に対してアラビノース未添加の場合にＰｔａｃＩのプロモーター活性が抑制される。
【発明の効果】
【００３８】
本発明によれば、効率的かつ厳密な遺伝子発現制御が可能となり、効率的なバイオプロセスを提供できる。加えて、本発明によれば、形質転換体をアラビノースに暴露すれば目的遺伝子の発現抑制状態が解除され、目的遺伝子の発現を促進することができることから、バイオプロセスにおける操作及び作業が容易となる。
以下、本発明の態様において更に採用し得る実施形態ないし変形例を以下に例示すると共に本発明の利点及び効果についても詳述する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】実施例において構築したプラスミドベクターの構造を模式的に示す図である。（ａ）は試験例１において構築したプラスミドベクターｐＧＥ７２８−１の構造を示し、（ｂ）は試験例３において構築したプラスミドベクターｐＧＥ７１６の構造を示す。
【図２】試験例３において構築したプラスミドベクターの構造を模式的に示す図である。（ａ）はプラスミドベクターｐＧＥ８３７の構造を示し、（ｂ）はプラスミドベクターｐＡｒａ１の構造を示す。
【図３】試験例３において実施したレポーターアッセイの結果を示す図である。図３において「未添加」はアラビノース未添加のサンプルを指し、「添加」はアラビノース添加のサンプルを指し、「誘導率」はアラビノース添加のサンプルが示したプロモーター活性値／アラビノース未添加のサンプルが示したプロモーター活性値の比率（フォールド）を示す。
【図４】試験例３において実施したレポーターアッセイの結果を示す図である。図４において「未添加」はアラビノース未添加のサンプルを指す。
【図５】コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１株ゲノムＤＮＡにおけるａｒａＥ遺伝子のプロモーター領域を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
〔核酸〕
本発明の第１の態様によれば、以下の核酸が提供される。
プロモーターとして機能し得るヌクレオチド配列（Ｘ）と以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のヌクレオチド配列（Ｙ）とを少なくとも一部に有する遺伝子発現制御配列（Ｒ）を含み、
遺伝子発現制御配列（Ｒ）が以下の条件（Ｉ）を充足する、核酸：
（ａ）配列番号５から１２並びに配列番号１７及び１８の何れか１つに記載のヌクレオチド配列；
（ｂ）上記（ａ）に記載のヌクレオチド配列において１又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列、
但し、核酸がＲＮＡの場合は、ヌクレオチド配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替えるものとする、
条件（Ｉ）：コリネ型細菌において、アラビノース未添加の場合にヌクレオチド配列（Ｘ）のプロモーター活性が抑制されること。
【００４１】
本発明に係る「核酸」は、より詳細にはコリネ型細菌を含む細菌類において目的遺伝子の発現制御に用いるための核酸である。本発明に係る核酸は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）及びＲＮＡ（リボ核酸）の何れの形態で提供されてもよい。更に、本発明に係る核酸は、一本鎖又は二本鎖の形態であってもよい。なお、核酸は、具体的には単離された核酸、ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡである。
細菌類の細胞内において目的遺伝子の発現制御因子として機能し得る形態としては通常ＤＮＡであること、ＲＮＡよりもＤＮＡの方が化学的に安定であること等を考慮すると、本発明の核酸はＤＮＡの形態で提供されることが好ましい。しかしながら、ＲＮＡの形態で提供される場合であっても、イン・ビトロ又はイン・ビボにおいてＲＮＡからＤＮＡに変換されれば本発明所定の遺伝子発現制御機能は発揮されることから、ＤＮＡの形態に限定されずＲＮＡの形態でも提供されてもよい。逆転写酵素等を用いてＲＮＡからＤＮＡに変換する技術等は当業者に知られている。加えて、本発明において核酸は、メチル化等の化学修飾を受けたものであってもよい。
【００４２】
加えて、本発明に係る核酸は、遺伝子発現制御配列（Ｒ）が、後述のとおりレポーターアッセイ等によりプロモーター活性を測定した場合に、上記（Ｉ）を満たすものであればよく、本発明に係る核酸においては目的遺伝子をコードするヌクレオチド配列の有無は問わない。目的遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含まない実施形態に係る核酸は、具体的には、コリネ型細菌を含む細菌類において目的遺伝子の発現に供試される発現プラスミド構築物（目的遺伝子をコードするヌクレオチド配列が導入されたもの）の構築に用いるための発現カセット又は発現ベクター（即ち、目的遺伝子を所定のクローニング部位に挿入する前のもの）である。
【００４３】
本発明において「コリネ型細菌」とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂａｒｇｅｙｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，第８巻，ｐ．５９９、１９７４年）に定義されている一群の微生物を指す。
より詳細には、コリネ型細菌として、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属菌、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属菌、マイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌等が挙げられる。
【００４４】
コリネバクテリウム属菌としては、例えば以下のような種及び菌株が挙げられる。
コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（例えば、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９７６株、ＡＴＣＣ１３０３２株、ＡＴＣＣ３１８３１株、ＡＴＣＣ１３０５８株、ＡＴＣＣ１３０５９株、ＡＴＣＣ１３０６０株、ＡＴＣＣ１３２３２株、ＡＴＣＣ１３２８６株、ＡＴＣＣ１３２８７株、ＡＴＣＣ１３６５５株、ＡＴＣＣ１３７４５株、ＡＴＣＣ１３７４６株、ＡＴＣＣ１３７６１株、ＡＴＣＣ１４０２０株）；
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（例えばＡＴＣＣ１５８０６株）；
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）（例えばＡＴＣＣ１３８７０株）；
コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）（例えばＡＴＣＣ１７９６５株）；
コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）；
コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｋａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）（例えばＡＴＣＣ２１５１１株）；
コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）（例えばＡＴＣＣ１５９９１株）；
コリネバクテリウム・リリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ）（例えばＡＴＣＣ１５９９０株）；
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ  （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ））（例えばＡＪ１２３４０株、ＦＥＲＭ  ＢＰ１５３９株）；
コリネバクテリウム・ハーキュリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ）（例えばＡＴＣＣ１３８６８株）。
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）（例えばＡＴＣＣ６８７１株、ＡＴＣＣ６８７２株）。
【００４５】
ブレビバクテリウム属菌の具体例としては、例えば以下の種及び菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）（例えばＡＴＣＣ１４０２０株）；
ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）［例えば、ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）株、ＭＪ−２３３ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）株、ＡＴＣＣ１３８２６株、ＡＴＣＣ１４０６７株、ＡＴＣＣ１３８２６株］；
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）（例えばＡＴＣＣ１４０６８株）；
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））（例えばＡＴＣＣ１３８６９株）；
ブレビバクテリウム・ロゼウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）（例えばＡＴＣＣ１３８２５株）；
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）（例えばＡＴＣＣ１４０６６株）；
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ）（例えばＡＴＣＣ１９２４０株）；
ブレビバクテリウム・アルバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｂｕｍ）（例えばＡＴＣＣ１５１１１株）；
ブレビバクテリウム・セリナム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｅｒｉｎｕｍ）（例えばＡＴＣＣ１５１１２株）。
【００４６】
アースロバクター属菌の具体例としては、例えば以下のような種及び菌株が挙げられる。
アースロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、ＡＴＣＣ８０１０株、ＡＴＣＣ４３３６株、ＡＴＣＣ２１０５６株、ＡＴＣＣ３１２５０株、ＡＴＣＣ３１７３８株、ＡＴＣＣ３５６９８株）等が挙げられる。
【００４７】
マイクロコッカス属菌の具体例としては、マイクロコッカス・フロイデンライヒ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）［例えば、Ｎｏ．２３９（ＦＥＲＭ    Ｐ−１３２２１）株］；マイクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ    ｌｕｔｅｕｓ）［例えば、Ｎｏ．２４０（ＦＥＲＭ    Ｐ−１３２２２）株］；マイクロコッカス・ウレアエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｕｒｅａｅ）（例えば、ＩＡＭ１０１０株）；マイクロコッカス・ロゼウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）（例えば、ＩＦＯ３７６４株）等が挙げられる。
マイクロバクテリウム属菌の具体例としては、マイクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）（例えばＡＴＣＣ１５３５４株）。
【００４８】
なお、ＡＴＣＣとは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９  Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１０８  ＵＳＡ）の略であり、上記ＡＴＣＣ株は同機関より分譲を受けることができる。
【００４９】
更に、本発明においてコリネ型細菌は、自然界に元々存在する野生型菌株であってもよいし、又はゲノムＤＮＡやプラスミドＤＮＡが操作され若しくはこれらＤＮＡに所定の遺伝子や人工配列等が導入された組換え体であってもよい。更に、コリネ型細菌は、所定の化学物質や環境条件に暴露されることにより作出された変異株であってもよい。
【００５０】
本発明において「コリネ型細菌においてプロモーターとして機能し得るヌクレオチド配列（Ｘ）」とは、上述のようなコリネ型細菌に属する菌種／菌株のうち何れか１つ以上においてプロモーター活性を示すヌクレオチド配列を指す。ヌクレオチド配列（Ｘ）は、人工的に合成された配列であってよく、又は細菌を含む生物体に存在する天然配列であってもよい。
【００５１】
本発明において「プロモーター」と言う用語は、当業者において一般に理解される意味で使用される。より詳細には、「コリネ型細菌においてプロモーターとして機能し得るヌクレオチド配列（Ｘ）」とは、コリネ型細菌においてＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合し、該ＲＮＡポリメラーゼの転写活性によりｍＲＮＡへの転写を開始させ得るヌクレオチド配列を意味する。
なお、当該技術分野においては、ＲＮＡポリメラーゼの転写活性により純粋にｍＲＮＡへの転写を開始させ得るヌクレオチド配列に加えて、オペレーター配列（例えばｌａｃＯ）やリボソーム結合配列（シャイン・ダルガノ配列 ；ＳＤ配列)等の遺伝子制御配列をも含めてプロモーターと言う場合もあるが、本発明において「プロモーター」と言う場合、原則、ＲＮＡポリメラーゼの転写活性により純粋にｍＲＮＡへの転写を開始させ得るヌクレオチド配列のみを指す。但し、本発明に係る核酸においては、上述のような追加の遺伝子制御配列の存在が排除される趣旨ではない。
【００５２】
このようにヌクレオチド配列（Ｘ）としては、コリネ型細菌に属する菌種／菌株のうち何れか１つ以上においてプロモーターとして機能し得るものであれば、特に限定されるものでもないが、利便性を考慮すると、コリネ型細菌に属する菌種全てに共通してプロモーター活性を示すヌクレオチド配列を採用する実施形態が好ましい。更に加えて、幾つのかの実施形態においては、ヌクレオチド配列（Ｘ）として、コリネ型細菌に加え、エシェリキア属（例えばエシェリキア・コリ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）においてもプロモーターとして機能し得るヌクレオチド配列が採用され得る。
【００５３】
更に、幾つかの実施形態においては、ヌクレオチド配列（Ｘ）は、上述のようなコリネ型細菌を含む細菌のゲノムＤＮＡに内在する遺伝子の５’上流域に由来するプロモーター配列、これら細菌において自律複製し得るプラスミドに由来するプロモーター配列、又はこれら細菌に感染するファージのゲノムに由来するプロモーター配列等を含む。更に加えて、特定の実施形態においては、これら細菌やファージに由来するプロモーター配列は、野生型配列であってもよく、又は野生型配列に所定の変異を導入したものでもよい。
なお、一般的には、プロモーター配列は、転写開始点の５’上流にあり、−３５ボックスと−１０ボックスによって特徴付けられることが知られていることから 、プライマー伸長法や定量ＲＴ−ＰＣＲ等の公知の方法によって転写開始点を決定し、決定される転写開始点の情報等を勘案して取得することもできる。
即ち、本発明においては、ヌクレオチド配列（Ｘ）として既知のプロモーター配列を利用してもよいが、特にこれに限定されず、上記のように新たに取得したプロモーター配列を利用してもよく又は人工的に新たに作出したプロモーターを利用してもよい。
【００５４】
更に、本発明においてヌクレオチド配列（Ｘ）として利用され得るプロモーター配列のタイプとしては、特定の培養条件や化学物質の添加等により目的遺伝子の発現を誘導できる誘導型プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＲＮＡポリメラーゼの利用可能性に依存するもので常時発現を可能にする構成型プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）等が例示される。
【００５５】
本発明においては、ヌクレオチド配列（Ｘ）として利用されるプロモーターのタイプは特に限定されるものでもないが、構成型プロモーターであることが好ましい。何故ならば、ヌクレオチド配列（Ｘ）が特に構成的プロモーターとして機能し得るものである場合、本発明所定のヌクレオチド配列（Ｙ）の存在により、アラビノース未添加時の基底下においては該ヌクレオチド配列（Ｘ）のプロモーター活性を厳密に抑制できると共に、アラビノースの添加という簡易な操作により該プロモーター活性の抑制状態を解除し、目的遺伝子の有意な発現を速やかに誘導できるからである。
【００５６】
より具体的には、ヌクレオチド配列（Ｘ）は、コリネ型細菌を含む細菌における各種アミノ酸生合成系に関与する酵素遺伝子のプロモーター又はその誘導体（変異導入配列）であってもよい。より具体的には、グルタミン酸生合成系酵素遺伝子（例えばグルタミン酸脱水素酵素遺伝子）、グルタミン合成系酵素遺伝子（例えばグルタミン合成酵素遺伝子）、リジン生合成系酵素遺伝子（例えばアスパルトキナーゼ遺伝子）、スレオニン生合成系遺伝子（例えばホモセリン脱水素酵素遺伝子）、イソロイシン及びバリン生合成系酵素遺伝子（例えばアセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子）、ロイシン生合成系酵素遺伝子（例えば２−イソプロピルリンゴ酸合成酵素遺伝子）、プロリン及びアルギニン生合成系酵素遺伝子（例えばグルタミン酸キナーゼ遺伝子）、ヒスチジン生合成系酵素遺伝子（例えばホスホリボシル−ＡＴＰピロホスホリラーゼ遺伝子）、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン等の芳香族アミノ酸生合成系酵素遺伝子（例えばデオキシアラビノヘプツロン酸リン酸（ＤＡＨＰ）合成酵素遺伝子）、イノシン酸およびグアニル酸のような核酸生合成系酵素遺伝子（例えばホスホリボシルピロフォスフェート（ＰＲＰＰ）アミドトランスフェラーゼ遺伝子、イノシン酸脱水素酵素遺伝子及びグアニル酸合成酵素遺伝子）等の各プロモーター又はこれらの誘導体（変異導入配列）が挙げられる。
【００５７】
更に、ヌクレオチド配列（Ｘ）は、細胞分裂に関与する因子をコードする遺伝子のプロモーターであってもよく、例えばｄｉｖＩＶＡ遺伝子のプロモーターが挙げられる。
更に、ヌクレオチド配列（Ｘ）として対数増殖期に作動するプロモーターも好ましく使用され、例えば、ｄｉｖＩＶＡ、ｇａｐ、ｌｄｈＡ、ｆｄａ、ｇｌｙＡ、ｃｙｓＫ、ａｒｏＦ、ｇｐｍＡ、ｅｎｏ、ｆｕｍＣ、ｐｆｋ、ｓｄｈＡ、ｍｄｈ、ａｒｇＦ、ｐｒｏＡ、ｐｒｏＣ、ａｃｅＥ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＥ、ｎｉｆＳ１、ｔｐｉ、ａｃｅＤ、ｃｙｓＤ、ｓｄｈＢ、ｐｃｋ等の各種遺伝子のプロモーターが挙げられる。
【００５８】
更に、ヌクレオチド配列（Ｘ）としては、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｅｔプロモーター等の大腸菌発現システムにおいて利用される強力なプロモーター（ｓｔｒｏｎｇ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）も好ましく使用される。
その他、ヌクレオチド配列（Ｘ）としては、ＥＦ−Ｔｓプロモーター、ＥＦ−Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＳプロモーター、ＳＯＤプロモーター、Ｐ１５プロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ｄａｐＡプロモーター、ｔｕｆプロモーター、ｍｅｔＥプロモーター、更に特許文献１〜１３に開示される各種プロモーターも使用できる。
【００５９】
次に、ヌクレオチド配列（Ｙ）について説明する。本発明に係る核酸における遺伝子発現制御配列（Ｒ）は、ヌクレオチド配列（Ｘ）に加えて、上記（ａ）又は（ｂ）に記載のヌクレオチド配列（Ｙ）を含む。
【００６０】
（ａ）に記載のヌクレオチド配列は、配列番号５から１２の何れか１つに記載のヌクレオチド配列である。これらのヌクレオチド配列は、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノムＤＮＡ上に存在するＡｒａＲタンパク質結合配列に由来するものである。それらのヌクレオチド配列を以下に示す。
（１）  ５’−ＡＴＧＴＴＡＧＣＧＣＴＡＡＣＡＴ−３’（配列番号５）
（２）  ５’−ＡＴＧＴＧＡＧＣＧＡＴＡＡＣＡＣ−３’（配列番号６）
（３）  ５’−ＡＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＡＡＣＡＣ−３’（配列番号７）
（４）  ５’−ＡＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＡＡＣＴＣ−３’（配列番号８）
（５）  ５’−ＡＴＧＴＧＡＧＣＧＴＴＡＡＡＡＴ−３’（配列番号９）
（６）  ５’−ＡＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＡＡＡＣＴ−３’（配列番号１０）（ＢＳＥ１）
（７）  ５’−ＡＴＧＴＴＡＧＣＧＣＴＧＡＣＡＴ−３’（配列番号１１）
（８）  ５’−ＡＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＡＣＡＴ−３’（配列番号１２）
（９）  ５’−ＧＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＡＡＣＡＣ−３’（配列番号１７）
（１０）５’−ＧＴＧＴＧＡＧＣＧＡＴＣＡＣＡＣ−３’（配列番号１８）
【００６１】
以下の実施例で示すとおり、配列番号５から１２並びに配列番号１７及び１８の何れか１つに記載のヌクレオチド配列をヌクレオチド配列（Ｙ）として採用した核酸（発現ベクター）をコリネ型細菌に導入した場合、アラビノース未添加の基底下においてはプロモーター活性を厳密に抑制することが可能であると共に、アラビノース添加により抑制状態を解除することによりプロモーター活性を有意に誘導させることができる。アラビノース未添加の状況においてプロモーター活性を信頼性良く抑制し、かつアラビノース添加により高いレベルでプロモーター活性を誘導し得る遺伝子発現制御効果を確保するためには、（ａ）及び（ｂ）のヌクレオチド配列において以下の（i）から（vi）に規定のヌクレオチド配列を基準とすることが好ましい。
（i）配列番号５から８並びに配列番号１０、１１及び１７の何れか１つに記載のヌクレオチド配列；
（ii）より好ましくは配列番号５から８、１０及び１７の何れか１つに記載のヌクレオチド配列；
（iii）更により好ましくは配列番号６から８、１０及び１７の何れか１つに記載のヌクレオチド配列；
（iv）更により好ましくは配列番号６、７、１０及び１７の何れか１つに記載のヌクレオチド配列；
（v）更により好ましくは配列番号６、７及び１７の何れか１つに記載のヌクレオチド配列；
（vi）最も好ましくは配列番号１７に記載のヌクレオチド配列。
更に加えて、上記遺伝子発現制御効果をより顕著なレベルで実現するためには、ヌクレオチド配列（Ｙ）として上記（ａ）に規定のヌクレオチド配列を採用することが更により好ましく、それらヌクレオチド配列のうち上記（i）から（vi）の何れかに示すヌクレオチド配列を採用することがなお更に好ましく、（i）から（vi）に行くほどより高い効果が期待できる。
【００６２】
本発明においては、ヌクレオチド配列（Ｙ）として、上記（ａ）に規定されるヌクレオチド配列の他、遺伝子発現制御配列（Ｒ）が条件（Ｉ）を満たすことを前提として、上記（ｂ）に規定されるヌクレオチド配列も採用され得る。
即ち、（ｂ）に規定されるヌクレオチド配列とは、配列番号５から１２並びに配列番号１７及び１８の何れか１つに記載のヌクレオチド配列において１又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列である。
【００６３】
ここで、「１又は複数」の範囲は、遺伝子発現制御配列（Ｒ）が条件（Ｉ）を満たす限り、特に限定されるものでもない。その範囲としては、例えば１から１０個、１から９個、１から８個、好ましくは１から７個、より好ましくは１から６個、更により好ましくは１から５個、特に好ましくは１から４個、１から３個、１から２個、又は１個とすることができる。
【００６４】
更に、特定の実施形態においては、ヌクレオチド配列（Ｙ）は、以下に示す一般式（Ｉ）で表されるヌクレオチド配列である。
５’−Ｎ１ＴＧＴＮ２ＡＧＣＧＮ３ＴＮ４ＡＮ５Ｎ６Ｎ７−３’・・・一般式（Ｉ）
【００６５】
式中、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６及びＮ７は、それぞれ、独立にＡ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）又はＴ（チミン）を示す。更に、Ｎ１は、Ａ（アデニン）又はＧ（グアニン）であることが好ましく、Ｎ２は、Ｇ（グアニン）又はＴ（チミン）であることが好ましく、Ｎ３は、Ａ（アデニン）、Ｃ（シトシン）又はＴ（チミン）であることが好ましく、Ｎ４は、Ａ（アデニン）、Ｃ（シトシン）又はＧ（グアニン）であることが好ましく、Ｎ５は、Ａ（アデニン）又はＣ（シトシン）であることが好ましく、Ｎ６は、Ａ（アデニン）、Ｃ（シトシン）又はＴ（チミン）であることが好ましく、Ｎ７は、Ｃ（シトシン）又はＴ（チミン）であることが好ましい。但し、核酸がＲＮＡの場合は、Ｔ（チミン）は、Ｕ（ウラシル）と読み替えるものとする。
【００６６】
加えて、特定の実施形態においては、一般式（Ｉ）で表されるヌクレオチド配列においてＮ１からＮ７のヌクレオチドのうち任意の箇所（例えば１から３箇所又は１から２箇所）が欠失したヌクレオチド配列がヌクレオチド配列（Ｙ）として採用され得る。更に、より具体的な実施形態においては、一般式（Ｉ）で表されるヌクレオチド配列においてＮ２及びＮ３のうち何れか１つ又はこれらの両方が欠失したヌクレオチド配列がヌクレオチド配列（Ｙ）として採用してもよい。
【００６７】
本発明の核酸において、ヌクレオチド配列（Ｘ）とヌクレオチド配列（Ｙ）との位置関係は、遺伝子発現制御配列（Ｒ）が条件（Ｉ）を満たすものである限り特に限定されるものでもない。
例えば、ヌクレオチド配列（Ｙ）がヌクレオチド配列（Ｘ）の５’末端に直接若しくは間接に連結されてもよく、又はヌクレオチド配列（Ｙ）がヌクレオチド配列（Ｘ）の３’末端に直接若しくは間接に連結されてもよい。この場合、ヌクレオチド配列（Ｙ）は、非翻訳領域や遺伝子間領域に存在してもよく、又は所定の遺伝子をコードする領域（オープンリーディングフレーム）内に存在してもよい。
更に加えて、ヌクレオチド配列（Ｘ）の少なくとも一部とヌクレオチド配列（Ｙ）の少なくとも一部とが重複する実施形態も本発明に包含され得る。ヌクレオチド配列（Ｘ）の少なくとも一部とヌクレオチド配列（Ｙ）の少なくとも一部とが重複する実施形態としては、具体的には以下が挙げられる。
ｉ）ヌクレオチド配列（Ｙ）全域がヌクレオチド配列（Ｘ）領域内に包含される形態；
ii）ヌクレオチド配列（Ｙ）の３’側一部がヌクレオチド配列（Ｘ）の５’側一部と重複する形態；並びに
iii）ヌクレオチド配列（Ｙ）の５’側一部がヌクレオチド配列（Ｘ）の３’側一部と重複する形態。
【００６８】
上述の通りヌクレオチド配列（Ｘ）及び（Ｙ）の位置関係は、特に限定されるものでもないが、上記所定の効果を信頼性良く生じせしめるためには、ヌクレオチド配列（Ｙ）がヌクレオチド配列（Ｘ）の３’末端に直接又は間接に連結されていることが好ましい。
ここで、「ヌクレオチド配列（Ｙ）がヌクレオチド配列（Ｘ）に間接に連結されている」、「ヌクレオチド配列（Ｙ）の３’末端又は５’末端がヌクレオチド（Ｙ）の５’末端又は３’末端に間接に連結されている」等の語句は、ヌクレオチド配列（Ｘ）とヌクレオチド配列（Ｙ）とが１個のヌクレオチド又は複数のヌクレオチドからなる配列を介して連結されていることを意味する。「複数のヌクレオチドからなる配列」におけるヌクレオチドの個数は、遺伝子発現制御配列（Ｒ）が条件（Ｉ）を満たす限り特に限定されるものでもないが、例えば２から５０個、好ましくは２から４０個、より好ましくは２から３５個、２から３０個、２から２５個、２から２０個、２から１５個、２から１０個、更により好ましくは２から９個、２から８個、２から７個、２から６個、２から５個、２から４個、２から３個である。加えて、上記ヌクレオチド配列（Ｘ）とヌクレオチド配列（Ｙ）とを連結する「複数のヌクレオチドからなる配列」は、特定の機能を有しない単なるリンカー配列であってもよいし、又は更なるプロモーター配列、リボソーム結合配列（シャイン・ダルガノ配列 ；ＳＤ配列)、他の転写調節配列や翻訳調節配列等の遺伝子発現調節機能を有する配列であってもよい。
【００６９】
一方、「ヌクレオチド配列（Ｙ）がヌクレオチド配列（Ｘ）に直接に連結されている」、「ヌクレオチド配列（Ｙ）の３’末端又は５’末端がヌクレオチド（Ｙ）の５’末端又は３’末端に直接に連結されている」等の語句は、字義どおりに理解されればよく、ヌクレオチド配列（Ｘ）とヌクレオチド配列（Ｙ）とが、上記のような１又は複数の別のヌクレオチドを介さずに直接連結されていることを意味する。
【００７０】
更に、ヌクレオチド配列（Ｘ）及びヌクレオチド配列（Ｙ）はそれぞれ、本発明の核酸において１つずつ存在してもよく又はそれぞれ複数存在してもよい。更に加えて、ヌクレオチド配列（Ｘ）若しくはヌクレオチド配列（Ｙ）が複数存在する場合にあっては、複数のヌクレオチド配列（Ｘ）若しくはヌクレオチド配列（Ｙ）は互いに全く同一の配列を有するものであってもよいし、又は異なる配列を有するものであってもよい。
【００７１】
次に、条件（Ｉ）について説明する。
本発明において遺伝子発現制御配列（Ｒ）が条件（Ｉ）を充足することの意義は、以下のとおりである。
【００７２】
上述のとおり、本発明に係る核酸において、遺伝子発現制御配列（Ｒ）は、目的遺伝子の発現を制御するプロモーターとして機能するヌクレオチド配列（Ｘ）と、コリネ型細菌のゲノムＤＮＡに存在するＡｒａＲ結合配列に由来するヌクレオチド配列をヌクレオチド配列（Ｙ）として含むものである。
【００７３】
このようなヌクレオチド配列（Ｘ）及び（Ｙ）の構成により、アラビノース濃度が基底レベル以下の環境下では、本発明所定の核酸が導入されたコリネ型細菌においてＡｒａＲタンパク質がヌクレオチド配列（Ｙ）に結合した形態となり、その結果、ヌクレオチド配列（Ｘ）のプロモーター活性が抑制された状態になるものと推測される。ところが、一方、アラビノース濃度が基底レベルを超えた環境に該コリネ型細菌が暴露された場合、上記ＡｒａＲタンパク質がアラビノースによるアロステリックな調節を受け、ヌクレオチド配列（Ｙ）から解離することで、ヌクレオチド配列（Ｘ）のプロモーター活性が誘導され、目的遺伝子の発現が促進されるものと推測される。即ち、本発明に係る核酸を利用して目的遺伝子の発現を制御した場合に実際に観測される現象としては、アラビノース濃度が基底レベル以下の環境下では、ヌクレオチド配列（Ｘ）によるプロモーター活性が抑制された状態にあり、ヌクレオチド配列（Ｘ）のプロモーター活性の制御下にある所定の遺伝子の発現は、ｍＲＮＡへの転写ないしタンパク質発現のレベルで抑制される。一方、アラビノース濃度が基底レベルを超えた環境においては該所定の遺伝子の発現は、ｍＲＮＡ転写ないしタンパク質発現のレベルで促進される。
従って、遺伝子発現制御配列（Ｒ）は、コリネ型細菌において、アラビノースを添加した場合に対してアラビノース未添加の場合にヌクレオチド配列（Ｘ）のプロモーター活性が抑制されること、と云う条件（Ｉ）を充足することが必要となる。
ここで、条件（Ｉ）の充足性は、以下に示すレポーターアッセイにより確認することができる。
【００７４】
即ち、上述の如く構成した遺伝子発現制御配列（Ｒ）の３’末端にレポーター遺伝子をコードするヌクレオチド配列を連結してなるＤＮＡ断片が、コリネ型細菌において機能可能な発現ベクターの所定部位に導入されたＤＮＡ構築物を用意する。ここで、レポーター遺伝子としては、例えば、βガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、各種蛍光タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質）等が挙げられる。より具体的には、配列番号８０又は８１に示すヌクレオチド配列を有する発現ベクタープラスミド等のように、遺伝子発現制御配列（Ｒ）の３’末端に直接又は間接にレポーター遺伝子をコードするヌクレオチド配列を連結してなるＤＮＡ断片が挿入されてなるＤＮＡ構築物、即ちレポータープラスミドを用意すればよい。このようなレポータープラスミドは、独自に構築してもよいし、又はレポーターアッセイ用に市販されている各種レポータープラスミドシステムを利用してもよい。
そして、このようなＤＮＡ構築物をコリネ型細菌に導入した形質転換体を得る。
上記形質転換体を、所定の濃度以上でアラビノースを含有する培地と、アラビノースが所定の濃度未満である培地とをそれぞれ用いて一定の時間培養し、培養液をそれぞれサンプリングする。サンプリングした培養液に由来する菌体それぞれについて、レポーター遺伝子のｍＲＮＡを定量ＰＣＲ等の手法で定量し、又はレポーター遺伝子から発現したレポータータンパク質の活性を適宜測定する。前者の培養液サンプルについて測定したｍＲＮＡの発現量又はレポータータンパク質の活性値が後者の培養液サンプルについて測定されたものの何倍であるかを求めることにより、条件（Ｉ）の充足性を求めることができる。
【００７５】
より具体的には、本発明において、条件（Ｉ）の充足性は、例えば以下の実施例に示すレポーターアッセイ法により確認することができる。
即ち、以下実施例の試験例１において使用したプラスミドベクターｐＧＥ７２８−１（配列番号８０）において、レポーター遺伝子であるβガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）の上流に存在する、プロモーター配列（ＰｔａｃＩ）とＡｒａＲ結合配列とを連結させてなる領域（配列番号３２）を、条件（Ｉ）の充足性について評価する対象の遺伝子制御配列（Ｒ）と交換し、得られたプラスミドベクターを用いてレポーターアッセイを行うことにより、当該遺伝子制御配列（Ｒ）の条件（Ｉ）の充足性について確認するのが好都合である。βガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）を利用したプロモーター活性の評価方法は、当業者において既に周知慣用のアッセイ系として確立されていることから、実験操作も容易でデータの信頼性及び再現性良いからである。
レポーターアッセイにおいて、アラビノース添加による誘導条件、培地組成、培養温度や培養時間等の培養条件等を含むアッセイ条件は、信頼性のあるプロモーター活性の比が得られるものであれば特に限定されるものでもなく、選択する遺伝子発現制御配列（Ｒ）の性質、用いるレポーター遺伝子の種類や性質、用いるコリネ型細菌の性質等を考慮し、アッセイ条件を適宜調整すればよい。
【００７６】
より詳細には、βガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）アッセイは、例えばＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，２７０：１１１８１−１１１８９又はＧｅｎｅｔｉｃｓ，２０１０，１８５：８２３−８３０に記載の手順に従い実施することができる。以下により具体的な手順を一例として示す。
【００７７】
（１）コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株に上記ＤＮＡ構築物を導入することにより得た形質転換体を、所定量の液体培地（４％グルコース，２５μｇ／ｍＬカナマイシン）に植菌し、所定の温度でＯＤ６１０＝０．５〜１．５（場合によりＯＤ６１０＝０．５〜１）になるまで培養する。ＯＤ６１０＝０．５〜１．５（場合によりＯＤ６１０＝０．５〜１）になったところで所定量の培養液を別の培養容器に移し、アラビノースを所定の終濃度となるように添加したものと、アラビノースを未添加のものを準備する。
（２）上記培養液をそれぞれ所定時間培養し、アラビノース誘導あり、なしの培養液をそれぞれサンプリングし、ＯＤ（６１０ｎｍ）を測定し、２０μＬを８０μＬの透過バッファー（１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，２０ｍＭ  ＫＣｌ，２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，０．８ｍｇ／ｍＬ  ＣＴＡＢ，０．４ｍｇ／ｍＬ  デオキシコール酸ナトリウム，５．４μＬ／ｍＬβメルカプトエタノール）と混ぜる。
（３）基質溶液（６０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，４０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，１ｍｇ／ｍＬ  ＯＮＰＧ，２．７μＬ／ｍＬβメルカプトエタノール）６００μＬと混合し、２５℃でインキュベートする。
（４）１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３７００μＬを加えて反応を停止させ、１５，０００ｇ、５分間の遠心分離を行う。
（５）上清の吸光度（Ａ４２０）を測定する。
（６）以下の式２に基づき、プロモーター活性としてミラー・ユニット（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｕｎｉｔ）を計算する。
１ミラー・ユニット＝１０００×（Ａ４２０／ｔ×Ｖ×ＯＤ６１０）・・・式（ＩＩ）
式中、ｔは時間（分）を示し、Ｖは培養液（ｍＬ）を示す。
【００７８】
なお、上記液体培地としては、例えば以下に示す組成を有する培地を使用できる。
酵母エキス２ｇ、カザミノ酸１ｇ、尿素２ｇ、硫安７ｇ、リン酸水素二カリウム０．５ｇ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．５ｇ、硫酸鉄・7水和物６ｍｇ、硫酸マンガン・１水和物４．２ｍｇ、ビオチン０．２ｍｇ、チアミン０．２ｍｇ（１Ｌあたり）。
【００７９】
上述の通りアラビノースを添加した培養液について測定されたプロモーター活性値と、アラビノース未添加の培養液について測定されたプロモーター活性値とを比較することにより、アラビノース添加時に観測されるプロモーター活性に対してアラビノース未添加時に観測されるプロモーター活性が有意に抑制されたものと言える遺伝子発現制御配列（Ｒ）が、条件（Ｉ）を充足するものであり、本発明に係る核酸の構成要素たるヌクレオチド配列（Ｙ）として採用され得る。
【００８０】
ここで、遺伝子発現制御配列（Ｒ）は、アラビノースの添加等によりヌクレオチド配列（Ｘ）のプロモーター活性を誘導させた試料について測定されるプロモーター活性値が、対照となるアラビノース未添加の試料について測定されるプロモーター活性に対して少なくとも５倍高いものであることが好ましく、より好ましくは少なくとも１０倍高く、更により好ましくは少なくとも１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍又は４５倍高く、特に好ましくは少なくとも５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍又は１５０倍高いものである。
なお、ここで「アラビノース等を添加することによりプロモーター活性を誘導させる」と言う意味は、ヌクレオチド配列（Ｙ）のみによってヌクレオチド配列（Ｘ）のプロモーター活性を制御している実施形態においては、アラビノースのみの添加により抑制の制御ができるが、ヌクレオチド配列（Ｙ）に加えて別の遺伝子発現制御因子（例えばｌａｃＯ）を利用している場合にはアラビノース添加に加えて該別の遺伝子発現制御因子による制御に必要な操作が必要となると言う意味である。
加えて、遺伝子発現制御配列（Ｒ）は、逆説的には、アラビノース未添加の対照試料について測定されるプロモーター活性値が、ヌクレオチド配列（Ｘ）のプロモーター活性を誘導させた試料について測定されるプロモーター活性値の１／５以下であることが好ましく、この場合、より好ましくは１／１０以下、更により好ましくは１／１５以下、１／２０以下、１／２５以下、１／３０以下、１／３５以下、１／４０以下又は１／４５以下、特に好ましくは１／５０以下、１／５５以下、１／６０以下、１／６５以下、１／７０以下、１／８０以下、１／９０以下、１／１００以下、又は１／１５０以下である。
【００８１】
更に加えて、選択したレポーターアッセイの種類や測定条件等にもよるが、上記（１）から（６）の手順又は実施例に示されるレポーターアッセイの条件を採用した場合、アラビノース未添加の試料について測定されるプロモーター活性が１０ミラー・ユニット以下であることが好ましい。更に、アラビノース未添加の試料について測定されるプロモーター活性の上限値としては、好ましくは９、より好ましくは８、７、６、５、４、特に好ましくは３．５、３．４、３．３、３．２、３．１、３．０、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．２、１．１、１．０である（単位はミラー・ユニット）。
【００８２】
好ましい一の実施形態として、以下の（ｐ）から（ｓ）の何れかのヌクレオチド配列を含む遺伝子発現制御配列（Ｒ）を採用することができる。
（ｐ）配列番号２２から４１の何れか１つに記載のヌクレオチド配列；
（ｑ）（ｐ）に記載のヌクレオチド配列において１又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列；
（ｒ）（ｐ）に記載のヌクレオチド配列に対して相補であるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
（ｓ）（ｐ）に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
但し、核酸がＲＮＡの場合は、ヌクレオチド配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）と読み替えるものとする。
【００８３】
配列番号２２から４１に示される各ヌクレオチド配列を以下に示す。
（１−１）：５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＴＡＧＣＧＣＴＡＡＣＡＴ−３’ （配列番号２２）
（１−２）：５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＡＴＡＡＣＡＣ−３’（配列番号２３）
（１−３）：５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＡＡＣＡＣ−３’（配列番号２４）
（１−４）：５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＡＡＣＴＣ−３’（配列番号２５）
（１−５）：５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＴＴＡＡＡＡＴ−３’（配列番号２６）
（１−６）：５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＡＡＡＣＴ−３’ （配列番号２７） 
（１−７）：５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＴＡＧＣＧＣＴＧＡＣＡＴ−３’（配列番号２８）
（１−８）：５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＡＣＡＴ−３’（配列番号２９）
（１−９）：５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＡＡＣＡＣ−３’（配列番号３０）
（１−１０）：５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＴＧＴＧＡＧＣＧＡＴＣＡＣＡＣ−３’（配列番号３１）
【００８４】
（１−１１）：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＴＡＧＣＧＣＴＡＡＣＡＴ−３’ （配列番号３２）
（１−１２）：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＡＴＡＡＣＡＣ−３’（配列番号３３）
（１−１３）：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＡＡＣＡＣ−３’（配列番号３４）
（１−１４）：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＡＡＣＴＣ−３’（配列番号３５）
（１−１５）：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＴＴＡＡＡＡＴ−３’（配列番号３６）
（１−１６）：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＡＡＡＣＴ−３’ （配列番号３７） 
（１−１７）：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＴＡＧＣＧＣＴＧＡＣＡＴ−３’（配列番号３８）
（１−１８）：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＡＣＡＴ−３’（配列番号３９）
（１−１９）：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＡＡＣＡＣ−３’（配列番号４０）
（１−２０）：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＴＧＴＧＡＧＣＧＡＴＣＡＣＡＣ−３’（配列番号４１）
【００８５】
更に、別の好ましい実施形態として、以下の（ｔ）から（ｓ）の何れかのヌクレオチド配列を含む遺伝子発現制御配列（Ｒ）を採用することもできる。
（ｔ）配列番号４２から６１の何れか１つに記載のヌクレオチド配列；
（ｕ）（ｔ）に記載のヌクレオチド配列において１又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列；
（ｖ）（ｔ）に記載のヌクレオチド配列に対して相補であるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
（ｗ）（ｔ）に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
但し、核酸がＲＮＡの場合は、ヌクレオチド配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）と読み替えるものとする。
【００８６】
配列番号４２から６１に示されるヌクレオチド配列を以下に示す。
（２−１）：５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＴＡＧＣＧＣＴＡＡＣＡＴ−３’ （配列番号４２）
（２−２）：５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＡＴＡＡＣＡＣ−３’（配列番号４３）
（２−３）：５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＡＡＣＡＣ−３’（配列番号４４）
（２−４）：５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＡＡＣＴＣ−３’（配列番号４５）
（２−５）：５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＴＴＡＡＡＡＴ−３’（配列番号４６）
（２−６）：５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＡＡＡＣＴ−３’ （配列番号４７） 
（２−７）：５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＴＡＧＣＧＣＴＧＡＣＡＴ−３’（配列番号４８）
（２−８）：５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＡＣＡＴ−３’（配列番号４９）
（２−９）：５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＡＡＣＡＣ−３’（配列番号５０）
（２−１０）：５’−ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＴＧＴＧＡＧＣＧＡＴＣＡＣＡＣ−３’（配列番号５１）
【００８７】
（２−１１）：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＴＡＧＣＧＣＴＡＡＣＡＴ−３’ （配列番号５２）
（２−１２）：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＡＴＡＡＣＡＣ−３’（配列番号５３）
（２−１３）：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＡＡＣＡＣ−３’（配列番号５４）
（２−１４）：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＡＡＣＴＣ−３’（配列番号５５）
（２−１５）：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＴＴＡＡＡＡＴ−３’（配列番号５６）
（２−１６）：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＡＡＡＣＴ−３’ （配列番号５７） 
（２−１７）：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＴＡＧＣＧＣＴＧＡＣＡＴ−３’（配列番号５８）
（２−１８）：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＡＣＡＴ−３’（配列番号５９）
（２−１９）：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＡＡＣＡＣ−３’（配列番号６０）
（２−２０）：５’−ＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＴＧＴＧＡＧＣＧＡＴＣＡＣＡＣ−３’（配列番号６１）
【００８８】
上記配列（１−１）から（１−２０）及び（２−１）から（２−２０）において下線部の配列がヌクレオチド配列（Ｙ）に相当し、それ以外の５’上流領域はヌクレオチド配列（Ｘ）に相当する。
（１−１）から（１−２０）に示す遺伝子発現制御配列（Ｒ）におけるヌクレオチド配列（Ｙ）はそれぞれ順に、配列番号５から１２並びに配列番号１７及び１８に示すヌクレオチド配列に相当する。（２−１）から（２−２０）に示す遺伝子発現制御配列（Ｒ）におけるヌクレオチド配列（Ｙ）もそれぞれ順に、配列番号５から１２並びに配列番号１７及び１８に示すヌクレオチド配列に相当する。
【００８９】
一方、（１−１）から（１−１０）に示す配列におけるヌクレオチド配列（Ｘ）は、エシェリキア・コリ（大腸菌）における発現システムで頻繁に使用されるＰｔａｃＩの−３５ボックス、−１０ボックス及び転写開始部位（＋１）を包含するコア配列であり、プロモーター活性の発現に必要十分と考えられる配列である（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  ２０１２，１１：１９）。これに対して、（１−１１）から（１−２０）に示す遺伝子制御配列（Ｒ）におけるヌクレオチド配列（Ｘ）は、当業者において一般的に認識されているＰｔａｃＩ配列において転写開始部位（＋１）から上流の全域を含む配列に相当し、上記コア配列の５’末端に６個のヌクレオチドが更に付加されたものである（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８０，ｐｐ．２１−２５，Ｊａｎｕａｒｙ  １９８３）。
【００９０】
ヌクレオチド配列（Ｘ）としてＰｔａｃＩ（配列番号１又は２）を用いた場合、実施例に示されるとおり特に効率的な目的遺伝子の発現制御が可能となることから、上記（ｐ）から（ｓ）に示すヌクレオチド配列を遺伝子発現制御配列（Ｒ）として利用することは好ましい。
【００９１】
しかしながら、ＰｔａｃＩのみならず、ＰｔａｃＩＩ（配列番号３又は４）をヌクレオチド配列（Ｘ）として使用することも好ましく、この場合、より具体的には上記（ｔ）から（ｗ）に示すヌクレオチド配列を含む遺伝子発現制御配列（Ｒ）を採用することが好ましい。上記（ｔ）に規定される上記（２−１）から（２−１０）に示す配列におけるヌクレオチド配列（Ｘ）は、エシェリキア・コリ（大腸菌）における発現システムでしばしば使用されるＰｔａｃＩＩの−３５ボックス、−１０ボックス及び転写開始部位（＋１）を包含するコア配列であり、プロモーター活性の発現に必要十分と考えられる配列だからである（上記文献参照。）。更に、（２−１１）から（２−２０）に示す配列におけるヌクレオチド配列（Ｘ）は、当業者において一般的に認識されているＰｔａｃＩＩ配列において転写開始部位（＋１）から上流の全域を含む配列（上記コア配列の５’末端に６個のヌクレオチドが更に付加されたもの）であり、ＰｔａｃＩと同様に高いプロモーター活性を発現し得えるからである（上記文献参照。）。
【００９２】
更に、別の好ましい実施形態として、以下の（ｈ）から（ｋ）の何れかのヌクレオチド配列を含む遺伝子発現制御配列（Ｒ）を採用することもできる。
（ｈ）配列番号９６から１０２の何れか１つに記載のヌクレオチド配列；
（ｉ）（ｈ）に記載のヌクレオチド配列において１又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列；
（ｊ）（ｈ）に記載のヌクレオチド配列に対して相補であるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
（ｋ）（ｈ）に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
但し、核酸がＲＮＡの場合は、ヌクレオチド配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）と読み替えるものとする。
【００９３】
配列番号９６から１０２に示す各ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列（Ｘ）として、それぞれ順に、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３１株ゲノム上に存在するｔｕｆプロモーター、ｄaｐＡプロモーター、ｍｅｔＥプロモーター、ｌｄｈＡプロモーター、ｇaｐＡプロモーター、ｓｏｄプロモーター、及びｔｕｆプロモーターのヌクレオチド配列を含み、かつヌクレオチド配列（Ｙ）として配列番号５に示すヌクレオチド配列を含む。なお、配列番号１０２に係るヌクレオチド配列は、同じくｔｕｆプロモーターを採用した配列番号９６に係るヌクレオチド配列に対して、ｔｕｆプロモーターへのＡｒａＲ結合配列の連結部位を変えたものであり、より詳細には、推定転写領域５’末端側部位をＡｒａＲ結合配列の５’末端側領域にオーバーラップさせたものである。
【００９４】
更に、更なる別の実施形態として、上記（ｈ）から（ｋ）によって特定される実施形態について、（ｈ）に係る配列番号９６から１０２の何れか１つに記載のヌクレオチド配列におけるヌクレオチド配列（Ｘ）の領域（即ち、配列番号５に係るヌクレオチド配列部分）が、配列番号６から１２並びに配列番号１７及び１８の何れか１つに記載のヌクレオチド配列で置換された各種変形例を包含する実施形態（Ｖ）が挙げられる。
【００９５】
上述の各実施形態における（ｑ）、（ｕ）及び（ｉ）にそれぞれ示すヌクレオチド配列並びにそれらに相応のその他ヌクレオチド配列において、「１又は複数」の範囲は、遺伝子発現制御配列（Ｒ）が条件（Ｉ）を満たす限り、特に限定されるものでもない。その範囲としては、例えば１から４０個、１から３５個、１から３０個、１から３０個、１から２５個、１から２０個、１から１８個、１から１５個、１から１２個、１から１０個、好ましくは１から９個、１から８個、１から７個、より好ましくは１から６個、更により好ましくは１から５個、特に好ましくは１から４個、１から３個、１から２個、又は１個とすることができる。
【００９６】
更に、上述の各実施形態における（ｒ）、（ｖ）及び（ｊ）にそれぞれ示すヌクレオチド配列並びに本発明におけるその他ヌクレオチド配列について、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列」とは、具体的には、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等の核酸ハイブリダイゼーション法において（ｐ）、（ｔ）又は（ｈ）に記載のヌクレオチド配列等の基準とするヌクレオチド配列に対して相補であるヌクレオチド配列と相補的な複合体を形成するヌクレオチド配列を意味する。ここで、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、６Ｍ  尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件、または０．１％ＳＤＳ（６０℃、０．３ｍｏｌ  ＮａＣｌ、０．０３Ｍ  クエン酸ソーダ）のハイブリダイゼーション条件、あるいはこれらと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ  尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件下では、より相同性の高いヌクレオチド配列を特定することができる。
【００９７】
更に、（ｓ）、（ｗ）及び（ｋ）に示すヌクレオチド配列はそれぞれ、（ｐ）、（ｔ）及び（ｈ）に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列である。更に、（ｓ）、（ｗ）及び（ｋ）に示すヌクレオチド配列としては、（ｐ）、（ｔ）及び（ｈ）にそれぞれ記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であることが好ましく、より好ましくは約９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、更に好ましくは約９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列である。
なお、これらの事項は、上述の変形例に係る実施形態（Ｖ）にも同様に適用され得るものであり、これらの事項が実施形態（Ｖ）に適用された特定の変形例も、本明細書に明確に開示されるものである。
【００９８】
加えて、本発明に係る核酸における遺伝子発現制御配列（Ｒ）は、ヌクレオチド配列（Ｘ）及び（Ｙ）に加えて、他の遺伝子発現調節配列を更に含むものであってもよい。このような他の遺伝子発現調節配列としては例えば、ｌａｃオペレーター等の更なる転写調節配列、リボソーム結合配列（シャイン・ダルガノ配列 ；ＳＤ配列)等の翻訳調節配列等が挙げられる。
本発明に係る核酸が特に発現カセット、発現ベクター等の形態で提供される実施形態においては、例えば以下（３−１）から（３−６）に示すＳＤ配列を含んでもよい。
（３−１）５’−ＡＧＧＡ−３’ 
（３−２）５’−ＧＧＴ−３’ 
（３−３）５’−ＧＡＡＧＧＡＴＴ−３’ 
（３−４）５’−ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ−３’ 
（３−５）５’−ＧＡＡＧＧＣＧＡ−３’ 
（３−６）５’−ＧＡＡＧＧＡＧＡ−３’
【００９９】
ＳＤ配列の位置は、本発明所望の効果が得られる限り特に限定されるものでもない。ヌクレオチド配列（Ｘ）及び（Ｙ）による目的遺伝子の発現制御効果をより確実に生じせしめる観点からすれば、ＳＤ配列は、ヌクレオチド配列（Ｙ）の３’末端と開始コドンとの間に存在することが好ましく、この場合、ＳＤ配列は、ヌクレオチド配列（Ｙ）の３’末端に直接又は間接に連結される。
【０１００】
加えて、本発明に係る遺伝子制御配列（Ｒ）において、特に（３−１）に示すＳＤ配列を採用することが好ましい。（３−１）に示すＳＤ配列は、ＰｔａｃＩ及びＰｔａｃＩＩに組合されるＳＤ配列であり、以下の実施例にも示される通り、アラビノースを利用した目的遺伝子の厳密な遺伝子発現制御を確実なものとし、かつタンパク質発現レベルで高い遺伝子発現量も約束できるからである。
より具体的には、上記（ｐ）から（ｓ）に係る実施形態、上記（ｔ）から（ｗ）に係る実施形態、上記（ｈ）から（ｋ）に係る実施形態、並びに上記変形例に係る実施形態（Ｖ）において、（ｐ）、（ｔ）及び（ｈ）それぞれに規定されるヌクレオチド配列を、当該ヌクレオチド配列の３’末端に以下の（４−１）に示す配列が直接連結されてなるヌクレオチド配列とそれぞれ読み替えることによる実施形態が挙げられる。
（４−１）５’−ＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ−３’（配列番号６２）
【０１０１】
更に、本発明に係る核酸が、特に発現カセット又はベクターの形態で提供される実施形態においては、当該核酸は、細菌（特にエシェリキア・コリ及び／又はコリネ型細菌）において機能し得るターミネーター（転写終結シグナル）（例えばＴｒｒｎＢ、ＴＧｒｏＥＬ、Ｔｔｒｐ、ＴＴ７）を更に含んでもよい。ターミネーターの位置は、本発明所望の効果が得られる限り特に限定されるものでもないが、一般的にはヌクレオチド配列（Ｙ）又はＳＤ配列の３’末端にターミネーターが直接又は間接に連結され得る。更に具体的には、ヌクレオチド配列（Ｙ）又はＳＤ配列の３’末端にクローニング部位が設けられている場合には、該クローニング部位の３’末端にターミネーターが直接又は間接に連結され得る。更に加えて、ヌクレオチド配列（Ｙ）又はＳＤ配列の３’末端に目的遺伝子コード領域が連結されている実施形態においては、目的遺伝子コード領域の３’末端にターミネーターが直接又は間接に連結され得る。
【０１０２】
更に、本発明に係る核酸は、任意に、ａｒａＥタンパク質及びａｒａＲタンパク質のうち少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を更に含んでいても良い。菌体内においてａｒａＥタンパク質及びａｒａＲタンパク質が強制的に発現されると、アラビノース添加による遺伝子発現制御の確実性及び厳密性を担保できるからである。
上述のとおりヌクレオチド配列（Ｙ）がコリネバクテリウム・グルタミカムのゲノムＤＮＡに存在するＡｒａＲ結合配列に由来するものであることを考慮すると、コリネ型細菌、好ましくはコリネバクテリウム属菌、より好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムのゲノムＤＮＡに存在するａｒａＥ遺伝子コード配列及びａｒａＲ遺伝子コード配列の少なくとも１つが挿入された核酸（ＤＮＡ）であることが好ましい。
【０１０３】
更に、本発明に係る核酸は、少なくとも１つの複製起点、選択マーカー遺伝子、クローニング部位及び制限酵素認識部位からなる群から選択される１種以上のヌクレオチド配列を更に含むものであってもよい。複製起点及び選択マーカー遺伝子は、細菌全般又は複数種の細菌において機能可能なものであってもよく、又は特定の菌種において機能可能なものであってもよい。例えば、以下の何れか１つ以上を含むものが挙げられる。
（１）コリネ型細菌においてのみ機能可能な複製起点及び／又は選択マーカー遺伝子コード配列；
（２）エシェリキア属菌（例えばエシェリキア・コリ）においてのみ機能可能な複製起点及び／又は選択マーカー遺伝子コード配列；並びに
（３）コリネ型細菌及びエシェリキア属菌の両方において機能可能な複製起点及び／又は選択マーカー遺伝子コード配列。
【０１０４】
更に、本発明に係る核酸は、コリネ型細菌やエシェリキア属菌を含む細菌において自律複製可能なプラスミドとして提供され得る。更に加えて、本発明に係る核酸は、発現ベクターとして提供され得る。
本発明に係る核酸は、例えば、コリネ型細菌とエシェリキア属菌との両方で自律複製可能であり、更にコリネ型細菌において目的遺伝子を発現させることができるシャトル発現ベクターの形態で提供されるものであってもよい。
【０１０５】
更に、本発明に係る核酸は、ヌクレオチド配列（Ｙ）の３’末端に直接又は間接に連結され、かつ目的遺伝子をコードするヌクレオチド配列（Ｚ）を更に含むものであっても良い。ただし、上述のとおり本発明に係る核酸においてヌクレオチド配列（Ｚ）は必須の構成要素ではない。
【０１０６】
更に、本発明の第５の態様によれば、以下の核酸も提供される。
コリネ型細菌において目的遺伝子の発現制御に用いるための核酸断片であって、
以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のヌクレオチド配列（Ｙ）を含む、核酸断片：
（ａ）配列番号５から９、１１及び１２並びに配列番号１７及び１８の何れか１つに記載のヌクレオチド配列；
（ｂ）上記（ａ）に記載のヌクレオチド配列において１又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列、
但し、
核酸がＲＮＡの場合は、ヌクレオチド配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替えるものとし、
ヌクレオチド配列（Ｙ）として配列番号１０、２０及び２１それぞれに示されるヌクレオチド配列は除外され、かつヌクレオチド配列（Ｙ）は以下の条件（ＩＩ）を満たすものとする、
条件（ＩＩ）：配列番号８０に示すプラスミドベクターｐＧＥ７２８−１のヌクレオチド配列における第２９１３番目から第２９２８番目までのヌクレオチド配列を上記ヌクレオチド配列（Ｙ）と入れ替えたプラスミドベクターで形質転換されたコリネ型細菌において、アラビノースを添加した場合に対してアラビノース未添加の場合にＰｔａｃＩのプロモーター活性が抑制される。
ここで、ＰｔａｃＩのプロモーター活性が１／８以下に抑制されることが好ましく、より好ましくは１／９以下、１／１０以下、１／１５以下、１／２０以下、１／２５以下、更により好ましくは１／３０以下、１／３５以下、１／４０以下、１／４５以下、特に好ましくは１／５０以下、１／５５以下、１／６０以下、１／６５以下、１／７０以下、１／８０以下、１／９０以下、１／１００以下、又は１／１５０以下である。
ところで、配列番号１０、２０及び２１に示されるヌクレオチド配列は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１株のゲノムＤＮＡ上に存在するアラビノース遺伝子群の遺伝子間領域に存在する天然のＡｒａＲ結合配列（それぞれＢＳＥ１、ＢＳＥ２、ＢＳＢ）に相当する（非特許文献６）。
【０１０７】
上記第５の態様に係る核酸を規定する各用語については、第１の態様に係る核酸について説明した通りであり、第１の態様に係る核酸について示した上記実施形態ないし特徴は、特に齟齬を生じない限り第５の態様に係る核酸においても採用され得るものであり、それら実施形態ないし特徴の各種組合せは第５の態様に係る核酸において採用し得る実施形態として本明細書に開示されるものである。
更に、第５の態様に係る核酸も、以下に示す更なる態様においても利用され得る。
【０１０８】
〔核酸が導入された細菌〕
更に本発明の第２の態様によれば、本発明に係る核酸が導入された細菌が提供される。
本発明に係る核酸が導入された細菌の種類は、特に限定されるものでもないが、エシェリキア属菌や上述のコリネ型細菌（好ましくはコリネバクテリウム属菌）が挙げられる。
本発明に係る核酸が導入された細菌はコリネ型細菌に由来するａｒａＥタンパク質及びａｒａＲタンパク質をそれぞれコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む核酸がこれらタンパク質を発現可能にゲノムＤＮＡに組み込まれたものであってもよい。この場合、当該細菌に導入される本発明に係る核酸は、具体的には遺伝子発現制御配列（Ｒ）（ヌクレオチド配列（Ｙ））の３’下流に目的遺伝子をコードするヌクレオチド配列（Ｚ）が連結されたものであり得る。菌体内においてａｒａＥタンパク質及びａｒａＲタンパク質が強制的に発現されると、上述のアラビノース添加による目的遺伝子の発現制御がより確実かつ効率よく実現されるからである。なお、上述のとおりホストのゲノムＤＮＡにａｒａＥタンパク質及びａｒａＲタンパク質をそれぞれコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列が組み込まれた実施形態においては、本発明に係る核酸は、同様にａｒａＥタンパク質及びａｒａＲタンパク質をそれぞれコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含まずともよいし、又は該少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むものであってもよい。
【０１０９】
〔目的遺伝子の発現方法及び目的物質の生産方法〕
本発明の第３の態様によれば、上記本発明の核酸が導入された細菌をアラビノース又はそのアナログに暴露することにより目的遺伝子を発現させることを含む、目的遺伝子の発現方法が提供される。
更に、本発明の第４の態様によれば、上記本発明の核酸が導入された細菌をアラビノース又はそのアナログに暴露することにより目的遺伝子を発現させることを含む、目的物質の生産方法が提供される。
なお、以下、本発明の第３及び第４の態様に係る方法を、まとめて本発明の方法と呼ぶことがある。
【０１１０】
本発明の方法における「細菌をアラビノース又はそのアナログに暴露する」の具体的な態様としては、プロモーター活性が誘導される限り特に限定されるものでもないが、例えば、本発明の細菌を培養する工程において培地にアラビノースを添加することにより該細菌をアラビノースに暴露するものであってもよい。
この場合、培地におけるアラビノース又はそのアナログの濃度は、プロモーター活性が誘導される限り特に限定されるものでもないが、例えば、０．００１％以上、好ましくは０．００５％以上、より好ましくは０．００７％、更により好ましくは０．００８％以上、０．００９％以上、特に好ましくは０．０１％以上、０．０１５％以上、０．０１８％以上である。加えて、アラビノース又はそのアナログの濃度の上限値も、プロモーター活性が誘導される限り特に限定されるものでもないが、コストを考慮すると５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは２．５％以下である。これらの上限値と下限値を任意に組み合せた数値範囲は、プロモーター活性の誘導時のアラビノース又はそのアナログの濃度の範囲として本明細書に開示されるものであり、本発明の特定の実施形態において採用され得る。
なお、本発明においてアラビノースは、より具体的にはＬ−アラビノースである。
更に加えて、本発明において、アラビノースのアナログ（「そのアナログ」）とは、本発明に係る核酸における遺伝子制御配列（Ｒ）（ヌクレオチド配列（Ｙ））の存在下においてアラビノースと同様の遺伝子発現制御の挙動を示し、かつアラビノースの基本骨格を有しつつもアラビノースの化学構造における一部の原子又は原子団がアラビノースのそれとは異なる原子又は原子団と置換されてなる化合物を言う。
【０１１１】
更に、アラビノース添加によるプロモーター活性の誘導時間（例えば、アラビノース存在下における培養時間）は、所望のプロモーター活性の発現が得られるよう適宜調整すれば足り、特に限定されるものでもないが、例えば０．５〜４８時間、好ましくは１〜２４時間、より好ましくは１〜１２時間、１〜６時間とすることができる。特定の実施形態においては、以下の実施例にも示されるとおり極めて短い時間で十分なプロモーター活性の上昇と目的遺伝子の発現量とを確保できることから、効率性／生産性並びに経済性に優れたバイオプロセスを実現できる。
【０１１２】
ところで、コリネ型細菌やエシェリキア属菌等の細菌の形質転換体を利用した各種遺伝子の発現方法や各種物質の生産方法は知られており、例えば上述の特許文献１から１３及び非特許文献１から７にも様々なプロセスが記載されている。
本発明をそれら公知のプロセスに適用すれば、より効率的な物質の生産が可能であり、それら公知のプロセスにおいて本発明を適用することにより得られる核酸、形質転換体、及びそのプロセスも本発明に包含される。ただし、本発明は公知のプロセスに本発明を適用した場合に限定されるものでもなく、本発明を適用したプロセス全般が本発明に係る方法に包含されることは言うまでもない。
なお、本明細書実施例に示すプロセスの例からも、本発明に係る核酸が各種遺伝子の発現方法や目的物質の生産方法に適用可能であることは明らかである。
特に第４の態様に係る目的物質の生産方法においては、目的遺伝子の翻訳産物であるタンパク質そのものを目的物質として生産するものであってもよいし、又は目的遺伝子の翻訳産物であるタンパク質が菌体内で産生される結果、副次的に生成される物質（例えば代謝産物）を目的物質として生産するものであってもよい。後者の場合、目的遺伝子の翻訳産物であるタンパク質としては、例えば酵素が挙げられ、菌体内において発現した組換え酵素により代謝が進み目的物質が産生され得る。
【０１１３】
上述の如き構成を有する本発明の核酸は、例えばコリネ型細菌やエシェリキア属菌を含む各種細菌が有するゲノムＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡ並びにこれら細菌に感染し得る各種バクテリオファージが有するゲノム核酸、人工的に設計したヌクレオチド配列を有する核酸断片等の資源を材料として用い、各種クローニング技術や変異導入技術を含む遺伝子工学技術／分子生物学的手法に基づいて製造することができる。各種クローニング技術や変異導入技術を含む遺伝子工学技術／分子生物学的手法については、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （３−Ｖｏｌｕｍｅ  Ｓｅｔ）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒ等を参照することができ、当業者においては本明細書の開示を参照した上でこのような公知技術を用いて本発明に係る核酸を製造することができる。加えて、本発明に係る核酸は、その一部又は全てが化学合成により製造されてもよい。本発明に係る細菌についても、本明細書の開示内容並びに各種遺伝子工学技術／分子生物学的手法を参照することにより作製することができる。なお、本発明に係る核酸／細菌及びこれらの製造方法、並びに本発明に係る方法の一例が、以下の実施例に示される。
【０１１４】
以上、本発明の具体的な実施形態について詳述したが、言うまでもなく本発明は上述の実施形態に限定されるものではない。本発明の要旨から逸脱しない範囲において各構成、要素及び特徴について種々の改変、修正、組合せが採用され得る。
なお、本発明において「含む」及び「有する」の語はそれぞれ、特に断わりのない限り、これらの語が目的語として言及する要素以外の要素の存在を排除するものではなく、これらの用語は混用される。
【実施例】
【０１１５】
［試験例１］
試験例１は、ａｒａＥ遺伝子及びａｒａＲ遺伝子、並びに本発明に係る遺伝子制御配列（Ｒ）と目的遺伝子（レポーター遺伝子）が導入された発現ベクターをコリネ型細菌に導入し、該目的遺伝子（レポーター遺伝子）の発現を制御した例を示す。
以下、試験手順の詳細を示す。【０１１６】
１．各種発現ベクターの作製
以下の手順で、各種コリネ型細菌／大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターを作製した。【０１１７】
（１）ｐＧＥＫ００３（ＫａｎＲ／ｐＵＣｏｒｉ／ｐＣＧ１ｏｒｉ）の構築
ｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ）をテンプレートとし、カナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）並びに大腸菌用複製起点ｐＵＣｏｒｉ（高コピー数）をそれぞれ含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した。
更に、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０５８（ＮＢＲＣ１２１６９）株が保持するプラスミドｐＣＧ１をテンプレートとしてコリネバクテリウム用複製起点ｐＣＧ１ｏｒｉを含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した。
ＫａｎＲ、ｐＵＣｏｒｉ並びにｐＣＧ１ｏｒｉについてＰＣＲ法により増幅させた領域のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号６３、６４及び６５に示す。
加えて、ｐＣＧ１は、上記菌株から常法に従い抽出したものである。【０１１８】
次いで、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用い、上記ＤＮＡ断片をＫａｎＲ／ｐＵＣ  ｏｒｉ／ｐＣＧ１  ｏｒｉの順序で環状に連結することにより、プラスミドベクターｐＧＥＫ００３を作製した。【０１１９】
（２）ｐＧＥＫ００８（ＰｌｄｈＡ−ｒｒｎＢｔｅｒ／ＫａｎＲ／ｐＵＣｏｒｉ／ｐＣＧ１ｏｒｉ）の構築
ｐＧＥＫ００３をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＶで切断し、直鎖状ＤＮＡ断片を得た。なお、この直鎖状ＤＮＡ断片は、ｐＣＧ１ｏｒｉとＫａｎＲとの間の領域にある上記制限酵素の認識部位で切断されたものである。
次いで、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用い、別途ＰＣＲ法により増幅させたＰｌｄｈＡ断片及びｒｒｎＢｔｅｒ断片と、上記ｐＧＥＫ００３切断断片とを環状となるように連結させ、プラスミドベクターｐＧＥＫ００８を取得した。
なお、ｐＧＥＫ００８においては、ＰｌｄｈＡ−ｒｒｎＢｔｅｒ／ＫａｎＲ／ｐＵＣｏｒｉ／ｐＣＧ１ｏｒｉがこの順に並んでいる。
加えて、上記ＰｌｄｈＡ断片の増幅ではコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用い、上記ｒｒｎＢｔｅｒ断片の増幅ではプラスミドベクターｐＦＬＡＧ−ＣＴＣ（シグマ）をテンプレートとして用いた。これら増幅断片のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号６６及び６７に示す。【０１２０】
（３）ｐＧＥＫ０２０（ＰｌｄｈＡ−ｌａｃＺ−ｒｒｎＢｔｅｒ／ＫａｎＲ／ｐＵＣｏｒｉ／ｐＣＧ１ｏｒｉ）の構築
ｐＧＥＫ００８をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、直鎖状ＤＮＡ断片を得た。なお、この直鎖状ＤＮＡ断片は、ＰｌｄｈＡとｒｒｎＢｔｅｒとの間の領域にある上記制限酵素の認識部位で切断されたものである。
更に、後述のテンプレートを用い、別途ＰＣＲ法によりＬａｃＺ遺伝子断片（ＬａｃＺ断片）を増幅させた。この際、プライマーペアーにはそれぞれアダブター配列としてＮｄｅＩサイト及びＢａｍＨＩサイトを挿入し、増幅させたＬａｃＺ断片を同様にＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断した。次いで、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用い、上記ｐＧＥＫ００８切断断片と上記ＬａｃＺ断片を環状となるように連結させ、プラスミドベクターｐＧＥＫ０２０を取得した。
このｐＧＥＫ０２０においては、ＰｌｄｈＡ−ｌａｃＺ−ｒｒｎＢｔｅｒ／ＫａｎＲ／ｐＵＣｏｒｉ／ｐＣＧ１ｏｒｉがこの順に並んでいる。
加えて、上記ＬａｃＺ遺伝子断片の増幅では出願人所有するプラスミドベクターをテンプレートとして用いた。この出願人所有のプラスミドベクターにおいて増幅させたＬａｃＺ遺伝子領域は、ｐＳＶ−β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ）に由来するものであり、同ベクターのＬａｃＺ遺伝子コード領域と同一のヌクレオチド配列を含むものである。
レポーター遺伝子又は目的遺伝子としてＬａｃＺ遺伝子として利用する場合、大腸菌ゲノムＤＮＡ又はｌａｃＺ遺伝子コード領域を含む市販のプラスミド（例えば上記プラスミドベクター）を入手し、ＬａｃＺ遺伝子コード領域をクローニングしてもよい。
上記増幅させたＬａｃＺ遺伝子断片のヌクレオチド配列を配列番号６８に示す。【０１２１】
（４）ｐＧＥＫ０３０（ＭＣＳ−ｌａｃＺ−ｒｒｎＢｔｅｒ／ＫａｎＲ／ｐＵＣｏｒｉ／ｐＣＧ１ｏｒｉ）の構築
ｐＧＥＫ０２０をＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで切断し、ｐＣＧ１ｏｒｉからＰｌｄｈＡまでの領域を除去した直鎖状ＤＮＡ断片を取得した。
部分的に相補の合成オリゴヌクレオチド（配列番号６９及び７０）をアニーリングさせることにより構成したマルチクローニングサイト（ＭＣＳ；ＡｇｅＩ−ＳｐｅＩ−ＫｐｎＩ−ＮｈｅＩ−ＸｈｏＩ−ＮｄｅＩ）と、ｐＧＥＫ０２０をテンプレートとしてＰＣＲ法により増幅させたｐＣＧ１ｏｒｉ断片と、上記直鎖状ＤＮＡ断片とをＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ）を用いて環状となるように連結させ、プラスミドベクターｐＧＥＫ０３０を取得した。
このｐＧＥＫ０３０においては、ＭＣＳ−ｌａｃＺ−ｒｒｎＢｔｅｒ／ＫａｎＲ／ｐＵＣｏｒｉ／ｐＣＧ１ｏｒｉがこの順に並んでいる。
なお、上記増幅させたｐＣＧ１ｏｒｉ断片のヌクレオチド配列を配列番号７１に示す。【０１２２】
（５）ｐＧＥＫ０９４（Ｐｔａｃ−ｌａｃＺ−ｒｒｎＢｔｅｒ／ＫａｎＲ／ｐＵＣｏｒｉ／ｐＣＧ１ｏｒｉ）の構築
ｐＧＥＫ０９４の構築には、ｐＧＥＫ０２０のＭＣＳに別要素を導入してなる別のプラスミド（以下、派生プラスミド）を材料として用いたが、派生プラスミドとＧＥＫ０２０との違いは単にＭＣＳに別要素が挿入されているか否かにあり、該別要素はｐＧＥＫ０９４を作製するに際し派生プラスミドを以下のとおりＫｐｎＩ及びＮｄｅＩで処理することにより削除されるものである。結果的に、本手順（５）において構築したｐＧＥＫ０９４は、ｐＧＥＫ０２０のＭＣＳにおけるＫｐｎＩサイトとＮｄｅＩサイトとの間に以下に説明のＰｔａｃ断片が挿入されたものに同等である。従って、ｐＧＥＫ０９４の構築に実際に使用した派生プラスミドの作製工程の詳細は省略する。
更に、Ｐｔａｃ断片は、出願人所有のプラスミドベクターをテンプレートとしてＰＣＲ法により増幅させることにより取得したものであるが、同プラスミドベクターにおけるＰｔａｃ領域は、市販のプラスミドベクターｐＦＬＡＧ−ＣＴＣ（シグマ）に由来するものである。従って、ｐＦＬＡＧ−ＣＴＣ（シグマ）をテンプレートとしてＰｔａｃ断片を増幅させることができる。実際に増幅させたＰｔａｃ断片のヌクレオチド配列を配列番号７２に示す。
そして、上記派生プラスミドをＫｐｎＩとＮｄｅＩとで切断することにより取得した直鎖状ＤＮＡ断片と増幅させたＰｔａｃ断片とをＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて環状となるように連結させ、ｐＧＥＫ０９４を取得した。【０１２３】
（６）ｐＧＥＫ１２２（ｒｒｎＢＴ１ｔｅｒ−Ｔ７ｔｅｒ−Ｔ７Ｕｔｅｒ−ｌａｃＩ／Ｐｔａｃ−ｌａｃＺ−ＰｌｄｈＡ／ＫａｎＲ／ｐＵＣｏｒｉ／ｐＣＧ１ｏｒｉ）の構築
大腸菌（ＤＨ５α）ゲノムＤＮＡをテンプレートとしＰＣＲ法によりｌａｃＩ遺伝子断片を増幅させた。加えて、Ｔ７ターミネーター配列を保持するプラスミドベクター（出願人所有のもの）をテンプレートとし、ＰＣＲ法によりＴ７ターミネーター断片（Ｔ７Ｕｔｅｒ−Ｔ７ｔｅｒ−ｒｒｎＢＴ１ｔｅｒ）（ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ. ２０１５ Ｍａｒ ２０；４（３）：ｐｐ２６５−２７３を参照）を増幅させた。増幅させたＴ７ターミネーター断片のヌクレオチド配列を配列番号７３に示す。本試験例で用いたＴ７ターミネーターのヌクレオチド配列は、Ｔ７Ｕｔｅｒ−Ｔ７ｔｅｒ−ｒｒｎＢＴ１ｔｅｒの要素がこの順序に連結されており、上記文献に開示のものと該要素の順序が異なる。加えて、各要素の間に存在するリンカー配列も上記文献に開示されるものと異なる。
ｌａｃＩ遺伝子については、発明者において種々のベクターを作製する経緯において挿入されたものであるが、以下に記載されるとおり本発明に係るベクターにおいては最終的に除去されている。故に、増幅させたｌａｃＩ遺伝子コード領域のヌクレオチド配列の情報は省略する。【０１２４】
次いで、上記ｐＧＥＫ０９４をＫｐｎＩ及びＡｇｅＩで切断し、得られた消化産物と、上記増幅させたｌａｃＩ遺伝子断片及びＴ７ターミネーター断片とをＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔにより連結し、プラスミドベクターｐＧＥＫ１２２を取得した。【０１２５】
（７）ｐＧＥ６５１（ＰｄａｐＡ−ａｒａＥ−ｒｒｎＢＴ１ｔｅｒ−Ｔ７ｔｅｒ−Ｔ７Ｕｔｅｒ−ｌａｃＩ/Ｐｔａｃ−ｌａｃＺ−ｒｒｎＢｔｅｒ/ ＫａｎＲ/ｐＵＣｏｒｉ/ｐＣＧ１ｏｒｉ）の構築
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ法によりＰｄａｐＡ断片を増幅させた。加えて、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１株ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ法によりａｒａＥ断片を増幅させた。上記増幅させたＰｄａｐＡ領域及びａｒａＥ遺伝子コート領域のヌクレオチド配列それぞれを配列番号７４及び７５に示す。【０１２６】
更に、ｐＧＥＫ１２２を制限酵素ＸｂａＩで切断し、得られた消化産物、並びに上記ＰｄａｐＡ断片及びａｒａＥ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔにより環状となるように連結した。このようにして作製したベクターをｐＧＥ６５１と命名した。
（８）ｐＧＥ６７７（ＰｄａｐＡ−ａｒａＥ−ｒｒｎＢＴ１ｔｅｒ−Ｔ７ｔｅｒ−Ｔ７Ｕｔｅｒ−ｌａｃＩ／Ｐｔａｃ−ｌａｃＺ−ｒｒｎＢｔｅｒ/ ＫａｎＲ/ｐＳＣ１０１/ｐＣＧ１ｏｒｉ）の構築
また、制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩの処理により、ｐＧＥ６５１のｐＵＣ  ｏｒｉを出願人所有のプラスミドベクターに含まれる大腸菌複製起点ｐＳＣ１０１  ｏｒｉ（低コピー数）と交換したベクターを作製し、これをｐＧＥ６７７と命名した。
上記出願人所有のプラスミドベクターにおけるｐＳＣ１０１ｏｒｉ領域は、プラスミドベクターｐＭＷ１１９（タカラバイオから購入、現在はニッポンジーンから入手可能）に由来するものであり、同ベクターのｐＳＣ１０１ｏｒｉ領域と同一のヌクレオチド配列を含むものである。
制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩを両端に含むｐＳＣ１０１ｏｒｉ領域部分のヌクレオチド配列を配列番号７６に示す。【０１２７】
（９）ｐＧＥ６８９（ＰｄａｐＡ−ａｒａＥ−ｒｒｎＢＴ１ｔｅｒ−Ｔ７ｔｅｒ／ＰｄａｐＡｍ−ａｒａＲ／Ｐｔａｃ−ＡｒａＲＢＳ−ｌａｃＺ−ｒｒｎＢｔｅｒ/ ＫａｎＲ/ｐＳＣ１０１/ｐＣＧ１ｏｒｉ）の構築
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ法によりＰｄａｐＡｍ領域を含むＤＮＡ断片を増幅させた。増幅させたＰｄａｐＡｍ断片のヌクレオチド配列を配列番号７７に示す。なお、このＰｄａｐＡｍにはプロモーター活性が２倍程度高くなる変異が導入されている。
更に、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１株ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ法によりａｒａＲ遺伝子断片を増幅させた。増幅させたａｒａＲ遺伝子コード領域のヌクレオチド配列を配列番号７８に示す。
更に、ｐＧＥＫ０９４をテンプレートとしてＰＣＲ法によりＰｔａｃにＡｒａＲ結合配列が連結した断片を増幅させた。この断片のヌクレオチド配列を配列番号７９に示す。
上記（８）で取得したｐＧＥ６７７を制限酵素ＡｇｅＩ及びＮｄｅＩで切断することにより、Ｔ７Ｕｔｅｒ及びＬａｃＩ領域を除去した直鎖状ＤＮＡ断片を取得し、このＤＮＡ断片、並びに上記ＰｄａｐＡ断片、ａｒａＲ遺伝子断片及びＰｔａｃにａｒａＲ結合配列が連結した断片をＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔにより環状となるように連結し、ｐＧＥ７２８−１を作製した。
ｐＧＥ７２８−１の構造を図１（ａ）に示し、そのヌクレオチド配列を配列番号８０に示す。【０１２８】
（１０）ｐＧＥ７２８−１におけるＡｒａＲ結合配列への変異導入（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）
ＡｒａＲ結合配列部位をカバーする縮重プライマー又は変異導入プライマーのプライマーペアーを幾つか設計し、ｐＧＥ７２８−１をテンプレートとしてＰＣＲと同様の手法でプラスミド全体を増幅した後、制限酵素ＤｐｎＩによりテンプレートＤＮＡを切断し、大腸菌へ形質転換することでＡｒａＲ結合配列にセミランダムに変異を導入したプラスミドベクターを得た。具体的には、大腸菌形質転換体コロニーをランダムに選び、これら形質転換体が保持するプラスミドベクターについてＡｒａＲ結合領域のヌクレオチド配列をシーケンシングすることにより変異の導入を確認した。
このようにして、ｐＧＥ７２８−１に対してＡｒａＲ結合配列（ＡｒａＲＢＳ）に所定の変異を有するプラスミドベクターｐＧＥ７２８−２〜ｐＧＥ７２８−１２を取得した。ｐＧＥ７２８−１〜ｐＧＥ７２８−１２におけるＡｒａＲ結合配列はそれぞれ、以下の表１のＮｏ．１〜１２に示すとおりである。【０１２９】
（１１）ＬａｃＺアッセイ（β-ガラクトシダーゼの発現）
上述のとおり作製したｐＧＥ７２８−１〜ｐＧＥ７２８−１２について、上記実施の形態に記載したβガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）レポーターアッセイの手順に従って遺伝子発現の制御可能性について評価した。なお、該ＬａｃＺレポーターアッセイの手順（１）の発現誘導の際には培地中アラビノース最終濃度を２％とし、ＯＤ６１０＝０．５〜１の範囲でアラビノースを培養液に添加した。加えて、手順（２）においては５時間培養した後にサンプリングし、取得した試料についてＬａｃＺの活性を測定した。
［結果］
以下の表１に試験例１の結果を示す。
【表１】
2019156152.tif 000002
【０１３０】
表１に示すとおり、試料Ｎｏ．９〜１２に対して、Ｐｔａｃに所定のヌクレオチド配列を有するＡｒａＲ結合配列（配列番号５から１２）がそれぞれ組合された試料Ｎｏ．１〜８については、アラビノース未添加の場合に対して、アラビノースを添加した場合にはプロモーター活性が１０倍以上高く誘導されることが示された。中でも、試料Ｎｏ．２、３、４、６が、プロモーター活性の誘導効率が比較的高く、とりわけＰｔａｃに配列番号２、３を組み合せた試料Ｎｏ．２及び３は、アラビノース未添加に対してアラビノース添加の場合プロモーター活性が８０倍超上昇することが示された。
加えて、試料Ｎｏ．１〜６については、アラビノース未添加の場合、プロモーター活性を示す絶対値が１０以下となっており、プロモーター活性（ＬａｃＺ発現）が厳密に抑制されることが確かめられた。更に、このうち、Ｐｔａｃに配列番号２、３を組み合せた試料Ｎｏ．２及び３については、アラビノース未添加の場合、プロモーター活性を示す絶対値は１未満であり、プロモーター活性（ＬａｃＺ発現）が特に顕著に抑制されることが確かめられた。つまり、Ｐｔａｃに配列番号２又は３を組み合せた試料Ｎｏ．２及び３については、アラビノース未添加の場合、プロモーター活性（ＬａｃＺ発現）を特に顕著に抑制できると同時に、アラビノース添加によりプロモーター活性が特に顕著に高く上昇し、活性な形態の目的遺伝子産物を多量に発現させることができることが示された。従って、Ｐｔａｃに配列番号２又は３のヌクレオチド配列を組合せる形態は、特に厳密な遺伝子発現の制御（スイッチのオン、オフ）を可能とすると共に遺伝子発現のスイッチが入った場合には特に高い遺伝子発現量を確保することができる点、本発明において特に好ましい実施形態と言える。
このように、本発明に係る核酸が有し得る所定の配列構成によれば、アラビノース未添加／添加による効率的かつ精密な遺伝子発現制御が可能になることが示された。【０１３１】
[試験例２]
試験例１で構築したｐＧＥ７２８−１に対して、試験例１と同様の点変異導入法によりＡｒａＲ結合配列に所定の変異を導入することにより、さらに２つのプラスミドベクターｐＧＥ７２８−１３及びｐＧＥ７２８−１４を取得した。ｐＧＥ７２８−１３及びｐＧＥ７２８−１４におけるＡｒａＲ結合配列はそれぞれ、以下の表２に示すとおりである。
試験例１において作製した幾つかのプラスミドベクター（表１及び表２を参照。）並びに本試験例において新たに作製したｐＧＥ７２８−１３及びｐＧＥ７２８−１４について、下記の変更点（ｉ）及び（ｉｉ）を除き、試験例１と同様にしてβガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）レポーターアッセイにより遺伝子発現の制御可能性について評価した。【０１３２】
(i)培養液のＯＤ（濁度）値が０．５〜１．５の範囲にある時に、遺伝子発現誘導のために培養液にアラビノースを添加した。
(ii）プロモーター活性は、試験例１と同様に、アラビノースによる誘導なしの試料に対するアラビノースによる誘導ありの試料のβガラクトシダーゼの活性比により評価したが、各プラスミドベクターについて表２に示すサンプル数（ｎ数）により試験を行い、ｎ数が２以上のプラスミドベクターについては、各サンプルのβガラクトシダーゼの活性比について平均値を算出し、その平均値の値をプロモーター活性比とした。【０１３３】
表２に試験例２の結果を示す。
【表２】
2019156152.tif 000003
【０１３４】
表２に示すとおり、試験例１において優れた遺伝子発現制御能を示すことが確認されたｐＧＥ７２８−２及びｐＧＥＥ７２８−３（それぞれＡｒａＲＢＳとして配列番号２及び３を採用）は、本試験例においても、プロモーター活性比がそれぞれ９４．１及び９８．９を示し、優れた遺伝子発現制御能を保持していることが再確認できた。
本試験例の結果において特に注目すべき点として、新たに構築したｐＧＥ７２８−１３及びｐＧＥ７２８−１４のうち、ｐＧＥ７２８−１３はプロモーター活性比が１６２の値を示し、上記ｐＧＥ７２８−２及びｐＧＥＥ７２８−３のプロモーター活性比の値を遥かに超え、極めて優れた遺伝子発現制御能を保持していることが確認された。加えて、本試験例で新たに構築したｐＧＥ７２８−１４については、プロモーター活性比が１４．８と言う比較的低い値ではあるものの、十分な遺伝子制御発現能を保持していることが確認された。【０１３５】
なお、ｐＧＥ７２８−１、ｐＧＥ７２８−６、ｐＧＥ７２８−７、ｐＧＥ７２８−８については、試験例１で得られたプロモーター活性比に対して、比較的大きな変動が見られた。その原因は定かではないが、遺伝子発現誘導のタイミング等の各種条件により変動することは生物学ないしバイオテクノロジー分野において予測される事項であり、試験例１及び本試験例の結果により、ｐＧＥ７２８−１、ｐＧＥ７２８−６、ｐＧＥ７２８−７、ｐＧＥ７２８−８についても、優れた遺伝子制御能力を有することが再現されたことに変わりがないことは十分に把握できる。【０１３６】
以上のとおり、本試験例により、格別優れた遺伝子発現制御能を発揮できる遺伝子発現制御配列が取得されたと共に、本発明所定の遺伝子発現制御配列によれば、再現良くかつ厳密に遺伝子発現を制御できることが示された。【０１３７】
[試験例３]
試験例３は、ａｒａＥ遺伝子及びａｒａＲ遺伝子をプラスミドベクターではなくゲノムに組み込んだコリネ型細菌を用い、本発明に係る遺伝子制御配列を含む発現ベクターを用いて目的遺伝子（レポーター遺伝子）の発現を制御した例を示す。
以下、試験手順の詳細を示す。
（１）発現プラスミドベクターの作製
ｐＧＥ７２８を制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで切断することにより、ａｒａＥコード領域及びａｒａＲコード領域が除去されたＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）を用いて平滑化し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ）で末端リン酸化を行った後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）でライゲーションすることで環状化した。得られたプラスミドをｐＧＥ７１６と命名した。
ｐＧＥ７１６の構造を図１（ｂ）に示し、そのヌクレオチド配列を配列番号８１に示す。【０１３８】
（２）染色体にａｒａＥ遺伝子及びａｒａＲ遺伝子を組み込んだコリネ型細菌の作製
コリネバクテリウム・グルタミカムの染色体遺伝子組み換えは、概略、枯草菌由来のｓａｃＢ遺伝子を用いたマーカーレス遺伝子組換え法で行った（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００４，  ８：２４３−２５４）。
以下にその手順の詳細を示す。【０１３９】
（２−１）ｐＧＥ０１５（ＫａｎＲ／ｓａｃＢ／ｐＵＣｏｒｉ）の構築
ｐＨＳＧ２９９（タカラバイオ）をＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで切断し、ＰＣＲ法により増幅したｓａｃＢ断片を同じ制限酵素で切断してライゲーションにより環状に連結することにより、プラスミドベクターｐＧＥ０１５を構築した。
なお、ＰＣＲ法によるｓａｃＢ断片の増幅には、ｐＮＩＣ２８−Ｂｓａ４（英国のＳｏｕｒｃｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社；日本代理店であるダナフォーム社から入手）をテンプレートとして用いた。増幅させたｓａｃＢ断片のヌクレオチド配列を配列番号８２に示す【０１４０】
（２−２）ｐＧＥ２０９（ＫａｎＲ／ｓａｃＢｍ／ｐＵＣｏｒｉ）の構築
以下のプライマー１及び２を用い、ＰＣＲ法によりｐＧＥ０１５のＳａｃＢ領域内に存在するＫｐｎＩサイトに変異を導入することによりＫｐｎＩサイトを消失させた。その結果、該ＫｐｎＩサイトが消失したＳａｃＢ遺伝子（ｓａｃＢｍ）コード配列を有するプラスミドベクターｐＧＥ２０９を取得した。
プライマー１：５’−ＴＧＡＡＣＡＧＡＴＡＣＣＡＴＴＴＧＣＣＧＴＴＣＡＴＴ−３’（配列番号８３）
プライマー２：５’−ＡＡＴＧＧＴＡＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＣＣＧＣ−３’（配列番号８４）【０１４１】
（２−３）ｐＧＥ２８５（ＫａｎＲ／ｓａｃＢｍ／ｐＳＣ１０１ｏｒｉ）の構築
試験例１示す手順と同様にしてＰＣＲ法により大腸菌複製起点ｐＳＣ１０１ｏｒｉ断片を増幅させた。
更に、ｐＧＥ２０９をテンプレートとして用い、ＫａｎＲ及びｓａｃＢｍ領域を含むＤＮＡ断片を増幅させた。増幅させたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を配列番号８５に示す。
上記ｐＳＣ１０１ｏｒｉ断片、並びにＫａｎＲ及びｓａｃＢｍ領域を含むＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて環状に連結させることにより、プラスミドベクターｐＧＥ２８５を取得した。【０１４２】
（２−４）ｐＧＥ８２５（ＫａｎＲ／ｔｎｐ１上流域−ｔｎｐ１下流域／ｓａｃＢｍ／ｐＳＣ１０１ｏｒｉ）の構築
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株ゲノム内のｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅであるｔｎｐ１ａの上流領域及び下流領域を含むＤＮＡ断片を、出願人所有のプラスミドベクターをテンプレートとしてＰＣＲ法により増幅させた。増幅させたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を配列番号８６に示す。
更に、ｐＧＥ２８５をＥｃｏＲＩで切断することにより、ＫａｎＲとｓａｃＢｍとの間で切断された直鎖状ＤＮＡ断片を得た。
上記ｔｎｐ１ａの上流領域及び下流領域を含む増幅断片と上記ｐＧＥ２８５の直鎖状ＤＮＡ断片とをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて環状に連結させることにより、プラスミドベクターｐＧＥ８２５を取得した。【０１４３】
（２−５）ｐＧＥ８３７（ＫａｎＲ／ｔｎｐ１上流域−Ｐｔａｃ−ａｒａＥ−ｒｒｎＢｔｅｒ−ｔｎｐ１下流域／ｓａｃＢｍ／ｐＳＣ１０１ｏｒｉ）の構築
ｐＧＥ８２５をＸｈｏＩで切断することにより、ｔｎｐ１上流域とｔｎｐ１下流域との間で切断された直鎖状ＤＮＡを得た。
更に、Ｐｔａｃ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１株ゲノム内に存在するａｒａＥ遺伝子コード領域、及びｒｒｎＢｔｅｒターミネーターがこの順に連結されたＤＮＡ断片（Ｐｔａｃ−ａｒａＥ−ｒｒｎＢｔｅｒ増幅断片）を、出願人所有のプラスミドベクターをテンプレートとしてＰＣＲ法により増幅した。なお、Ｐｔａｃ−ａｒａＥ−ｒｒｎＢｔｅｒ増幅断片のヌクレオチド配列を配列番号８７に示す。
次いで、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、上記ｐＧＥ８２５の直鎖状ＤＮＡ断片、及びＰｔａｃ−ａｒａＥ−ｒｒｎＢｔｅｒ増幅断片を環状に連結させることにより、プラスミドベクターｐＧＥ８３７を取得した。
ｐＧＥ８３７の構造を図２（ａ）に示し、そのヌクレオチド配列を配列番号８８に示す。【０１４４】
（２−６）コリネバクテリウム・グルタミカムゲノムへのＰｔａｃ−ａｒａＥへの導入
ｐＧＥ８３７をコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株にエレクトロポレーションにより導入し、上記マーカーレス遺伝子組み換え法によりΔｔｎｐ１ａ：：Ｐｔａｃ−ａｒａＥ株を作製した。得られた菌株をＧＥＳ７５９と命名した。【０１４５】
（２−７）ｐＧＥ２３４（ＫａｎＲ／ｔｎｐ３ｂ上流域−ＰｌｄｈＡ−ｌａｃＺ−ｒｒｎＢｔｅｒ−ｔｎｐ３ｂ下流域／ｓａｃＢｍ／ｐＵＣｏｒｉ）の構築
ｐＧＥ２０９をＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで切断することにより、ＫａｎＲとＳａｃＢｍとの間で切断された直鎖状ＤＮＡ断片を得た。
更に、ＰＣＲ法により、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ゲノム内のｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅであるｔｎｐ３ｂの上流域（ｔｎｐ３ｂ上流域断片）及び下流域（ｔｎｐ３ｂ下流域断片）をそれぞれ増幅させた。これらの増幅させた領域のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号８９及び９０に示す。
更に、試験例１で構築したｐＧＥＫ０２０をテンプレートとしてＰｌｄｈＡ−ｌａｃＺ−ｒｒｎＢｔｅｒの領域を含む断片（ＰｌｄｈＡ−ｌａｃＺ−ｒｒｎＢｔｅｒ断片）をＰＣＲ法により増幅させた。この断片は、発明者において種々のベクターを作製する経緯において挿入されたものであるが、以下に記載されるとおり最終的にコリネ型細菌ゲノムへのａｒａＲ遺伝子の導入に使用したｐＡｒａ１においてはＰｌｄｈＡ及びｌａｃＺ領域は結果的に除去されている。故に、増幅させたＰｌｄｈＡ−ｌａｃＺ−ｒｒｎＢｔｅｒ断片のヌクレオチド配列の情報は省略する。【０１４６】
上記のｐＧＥ２０９の直鎖状ＤＮＡと、ｔｎｐ３ｂ上流域断片及びｔｎｐ３ｂ下流域断片と、ＰｌｄｈＡ−ｌａｃＺ−ｒｒｎＢｔｅｒ断片とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて環状となるように連結させ、プラスミドベクターｐＧＥ２３４を取得した。【０１４７】
（２−８）ｐＡｒａ１（ＫａｎＲ／ｔｎｐ３ｂ上流域−Ｐｔａｃ−ａｒａＲ−ｒｒｎＢｔｅｒ−ｔｎｐ３ｂ下流域／ｓａｃＢｍ／ｐＵＣｏｒｉ）の構築
ｐＧＥ２０９をＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで切断することにより、ＰｌｄｈＡ−ｌａｃＺ領域が除去された直鎖状ＤＮＡ断片を得た。
更に、ｐＧＥＫ０９４をテンプレートとしてＰＣＲ法によりＰｔａｃ断片（配列番号９１）を増幅させた。
更に、ｐＧＥ６８９をテンプレートとして用いＰＣＲ法によりａｒａＲ遺伝子断片（配列番号９２）を増幅させた。
次いで、上記ｐＧＥ２０９の直鎖状ＤＮＡとＰｔａｃ断片とａｒａＲ遺伝子断片とＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いることにより環状となるよう連結させ、プラスミドベクターｐＡｒａ１を得た。
ｐＡｒａ１の構造を図２（ｂ）に示し、そのヌクレオチド配列を配列番号９３に示す。【０１４８】
（２−９）ＧＥＳ７５９ゲノムへのＰｔａｃ−ａｒａＲへの導入
ｐＡｒａ１をＧＥＳ７５９へエレクトロポレーションにより導入し、上記マーカーレス遺伝子組み換え法によりΔｔｎｐ３ｂ：：Ｐｔａｃ−ａｒａＲ株を作製した。得られた菌株をＡＩＳ１と命名した。【０１４９】
（３）ｐＧＥ７１６によるＡＩＳ１の形質転換及びＬａｃＺアッセイ（β-ガラクトシダーゼの発現）
次いで、ＡＩＳ１にｐＧＥ７１６をエレクトロポレーションし、カナマイシンでセレクションした。
得られた形質転換体を液体培地（４％Ｇｌｃ，２５μｇ／ｍＬ  Ｋａｎ）１０ｍＬにＯＤ６１０＝０．２になるように植菌し、３３℃，２００ｒｐｍで培養した。４時間の培養後に培養液半量（４．５ｍＬ）を別の試験管にとり、２０％アラビノース０．５  ｍＬと混ぜてアラビノース終濃度２％とした。また、比較対照としてアラビノース未添加のものも用意した。これら試料を２時間更に培養した後に、アラビノース誘導あり、なしの培養液をそれぞれサンプリングし、ＬａｃＺアッセイによりプロモーター活性を測定した。
なお、その他ＬａｃＺアッセイの手順並びに上記液体培地の組成は実施の形態に記載した通りである。【０１５０】
［結果］
ＬａｃＺアッセイの結果を図３に示す。【０１５１】
まず、試験例３の概要を説明すると、試験例３は以下の点において試験例１と異なっている。
即ち、試験例１においてはＡＴＣＣ１３０３２株に導入するプラスミドベクターとして本発明所定の遺伝子発現制御配列（Ｒ）及びレポーター遺伝子（ＬａｃＺ遺伝子）に加えてａｒａＥ遺伝子及びａｒａＲ遺伝子をコードしているものを使用した。これに対して、試験例３においては、予めゲノムＤＮＡにａｒａＥ遺伝子及びａｒａＲ遺伝子が強制発現するように導入されたＡＩＳ１株（ＡＴＣＣ１３０３２株由来）を用い、該菌株に導入するプラスミドベクターとしてはａｒａＥ遺伝子及びａｒａＲ遺伝子が除去されたｐＧＥ７１６を使用した。【０１５２】
図３において、ＡＩＳ１／ｐＧＥ７１６−３及びＡＩＳ１／ｐＧＥ７１６−３はそれぞれ、異なる形質転換体コロニーに由来するサンプルである。
プロモーター活性のフォールド（誘導効率）に注目すると、ＡＩＳ／ｐ７１６−３については６７倍、ＡＩＳ／ｐ７１６−４については１６０倍を示し、本発明所定の遺伝子発現制御配列によればアラビノースによる効果的な目的遺伝子の発現制御が可能となることが示された。【０１５３】
［試験例４］（アラビノース濃度／誘導時間の影響）
試験例３と同様に菌株ＡＩＳ１にｐＧＥ７１６をエレクトロポレーションし、カナマイシンでセレクションし形質転換体を得た。
形質転換した細胞を液体培地１０ｍＬにＯＤ６１０＝１．０になるように植菌し、３３℃，２００ｒｐｍで培養した。４時間後に半量（５ｍＬ）を別の試験管にとり、培地中のアラビノース最終濃度がそれぞれ０．００２％、０．０２％、０．２％、２％となるように２０％アラビノースを添加した。なお、比較対照としてアラビノース未添加のサンプルも用意した。
上記サンプルを培養し、４時間後、２０時間後、２４時間後にアラビノース誘導あり、無しの培養液をそれぞれサンプリングし、ＬａｃＺアッセイによりプロモーター活性を測定した。
ＬａｃＺアッセイの手順並びに上記液体培地の組成は試験例３に記載した通りである。【０１５４】
［結果］
ＬａｃＺアッセイの結果を図４に示す。
図４に示されるとおり、アラビノースによる発現誘導後４時間の時点で既に発現量はほぼ飽和状態に達しており、それ以降はレポーター遺伝子の発現量に目立った上昇は認められなかった。つまり、少なくとも本試験例に係る核酸の配列構成によれば、発現誘導後４時間以内で十分な目的遺伝子の発現量が得られることが明らかとなった。
更に、アラビノース濃度については、０．０２％が最も高い発現量（プロモーター活性）を示したが、最も低い濃度である０．００２％でも十分なレベルのプロモーター活性を誘導できることが明らかとなった。【０１５５】
［試験例５］（各種プロモーターとの組合せ）
（１）ｐＧＥＫ０３５（ＭＣＳ−ＳＤ−ｌａｃＺ−ｒｒｎＢｔｅｒ／ＫａｎＲ／ｐＵＣｏｒｉ／ｐＣＧ１ｏｒｉ）の構築
試験例１（４）の項で構築したｐＧＥＫ０３０を、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｄｅＩで切断し、ｐＧＥＫ０３０切断断片を得た。この切断断片に、以下の配列を有するオリゴＤＮＡをアニーリングし、ライゲーションすることによりＳＤ配列を挿入したベクターｐＧＥＫ０３５を作製した。なお、このＳＤ配列は、プロモーター活性の確認を行った最終構築物であるｐＡｒａ２４ないしｐＡｒａ３０では除去されている。
ＳＤ配列：５’−ｔＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧｔｔ−３’（配列番号９５）【０１５６】
（２）ｐＧＥＫ１０７（ＭＣＳ−ＳＤ−ｌａｃＺ−ｒｒｎＢｔｅｒ／ＫａｎＲ／ｐＳＣ１０１ｏｒｉ／ｐＣＧ１ｏｒｉ）の構築
ｐＧＥＫ０３５を制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｍａＩで処理することにより、ｐＧＥＫ０３５に含まれる複製起点ｐＵＣｏｒｉを除去し、当該複製起点を、出願人所有のプラスミドベクターに含まれる大腸菌複製起点ｐＳＣ１０１ｏｒｉ（低コピー数）と入れ替えた。これにより得られたベクターをｐＧＥＫ１０７と命名した。【０１５７】
（３）各種プロモーターとＡｒａＲ結合配列を組み合わせたシャトルベクターの作製
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３１株ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ法により構成的プロモーターであるｔｕｆ、ｄaｐＡ、及びｓｏｄプロモーター、並びに誘導的プロモーターであるｌｄｈＡ、ｇaｐＡ、及びｍｅｔＥプロモーター断片をそれぞれ増幅させた。加えて、試験例３で構築したプラスミドベクターｐＧＥ７１６をテンプレートとし、ＰＣＲ法によりＡｒａＲ結合配列及びＳＤ配列を増幅させた。
次いで、上記のとおりＰＣＲ法により取得した各プロモーター断片と、ＡｒａＲ結合配列及びＳＤ配列の増幅断片とを、オーバーラップＰＣＲ法により連結させた。このオーバーラップＰＣＲ法により、配列番号９６から１０２に示すヌクレオチド配列をそれぞれ有するＤＮＡ断片を取得した。これらＤＮＡ断片は、上記実施の形態の項において、本発明係る核酸に係る好ましい実施形態として示した配列番号９６から１０２に係るヌクレオチド配列をそれぞれ含むものである。【０１５８】
上記（２）の項で取得したｐＧＥＫ１０７を制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｄｅＩで切断し、得られたベクター断片に、上記各プロモーター／ＡｒａＲ結合配列断片をそれぞれ、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔにより環状となるように連結した。これにより得られたプラスミドをそれぞれ、ｐＡｒａ２４、ｐＡｒａ２５、ｐＡｒａ２６、ｐＡｒａ２７、ｐＡｒａ２８、ｐＡｒａ２９、及びｐＡｒａ３０と命名した。【０１５９】
試験例３と同様に、菌株ＡＩＳ１に各プラスミドをエレクトロポレーションし、カナマイシンでセレクションして形質転換体を取得し、得られた各形質転換体を、液体培地１０ｍＬにＯＤ６１０＝０．２になるように植菌し、３３℃、２００ｒｐｍで培養した。４時間後に、培養液の半量（５ｍＬ）を別の試験管にとり、培地中のアラビノース最終濃度が０．２％となるように２０％アラビノースを添加した。加えて、比較対照としてアラビノース未添加のものも用意した。これら試料を４時間更に培養した後に、アラビノース誘導あり、なしの培養液をそれぞれサンプリングし、ＬａｃＺアッセイによりプロモーター活性を測定した。
ＬａｃＺアッセイの手順並びに上記液体培地の組成は試験例３に記載した通りである。【０１６０】
［結果］
ＬａｃＺアッセイの結果を以下の表３に示す。
【表３】
2019156152.tif 000004
【０１６１】
表３に示される通り、本試験例により、プロモーター部位として、ｔａｃプロモーターに限らず、その他各種プロモーターを採用しても、厳密に遺伝子発現を制御できることが確認された。なお付け加えると、所定の態様で推定転写開始部位をＡｒａＲ結合配列にオーバーラップさせたｐＡｒａ３０については、推定転写開始部位がＡｒａＲ結合配列にオーバーラップしていないｐＡｒａ２４よりも、優れた遺伝子発現制御能を示した。【０１６２】
以上のとおり、本試験例によれば、所定のヌクレオチド配列を有するＡｒａＲ結合配列を遺伝子制御配列の一要素として採用した本発明所定の構成によれば、プロモーター部位として、ｔａｃプロモーターに限らず、構成的プロモーター及び誘導的プロモーター含むその他多様なプロモーターを採用して場合にあっても、優れた遺伝子制御能力が発揮され得ることが証明された。【０１６３】
［比較試験例１］
比較試験例１は、本発明に係る制御配列の代わりにコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１株ゲノムに天然に存在するａｒａＥ遺伝子のプロモーター領域を用いて目的遺伝子の制御を試みた比較例である。
以下に試験手順の詳細を示す。【０１６４】
（１）ｐＧＥ７２８ＰａｒａＥ（ＰｄａｐＡ−ａｒａＥ−ｒｒｎＢＴ１ｔｅｒ−Ｔ７ｔｅｒ／ＰｄａｐＡ−ａｒａＲ／ＰａｒａＥ−ｌａｃＺ−ｒｒｎＢｔｅｒ／ＫａｎＲ／ｐＳＣ１０１ｏｒｉ／ｐＣＧ１ｏｒｉ）の構築
ｐＧＥ７２８をＫｐｎＩ及びＮｄｅＩで切断することにより、ｐＧＥ７２８においてＰｔａｃ−ａｒａＲＢＳの領域が除去された配列からなる直鎖状ＤＮＡを得た。
更に、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用い、ＰＣＲ法に従い、図５に示すａｒａＥ遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片（ＰａｒａＥ断片）を増幅させた。増幅させたＰａｒａＥ断片のヌクレオチド配列を配列番号９４に示す。
Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、上記直鎖状ＤＮＡとＰａｒａＥ断片とを環状となるように連結することにより、プラスミドベクターｐＧＥ７２８ＰａｒａＥを作製した。【０１６５】
試験例１に示した形質転換体の取得及びＬａｃＺアッセイの手順において、上記のようにして得られた発現ベクターｐＧＥ７２８ＰａｒａＥを用いた以外は、同様にしてコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の形質転換体を取得し、ＬａｃＺアッセイによりプロモーター活性を評価した。【０１６６】
［結果］
ＬａｃＺアッセイの結果を以下の表４に示す。
【表４】
2019156152.tif 000005
【０１６７】
表４に示されるとおり、アラビノースの誘導あり（つまり、アラビノース添加）の活性値が、アラビノース誘導なし（つまり、アラビノース未添加）の活性値よりも低くなってしまい、アラビノースによる遺伝子発現制御は不可能であることが示された。
本比較試験例１で遺伝子制御配列として用いたヌクレオチド配列は、図５に示されるとおりコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１株のゲノムＤＮＡ上に固有に存在するにものであり、天然のＡｒａＲ結合配列を含むものである。つまり、非特許文献６に示されるような、上記コリネ型細菌に固有のプロモーター領域を使用しても、表２の結果が示す通り、本発明所定のヌクレオチド配列により達成される遺伝子発現制御は不可能であり、そもそも遺伝子発現システムとしてプロモーター活性さえ示さなかった。【０１６８】
（補足事項）
上記試験例及び比較試験例においては、各種プラスミドベクター等の構築の過程においてＰＣＲ法により増幅させた各種遺伝子コード領域、プロモーター領域、ターミネーター領域、複製起点等のヌクレオチド配列の情報が配列表に開示されていることから、ＰＣＲ増幅に使用したプライマーの配列情報は省略した。当業者においては、配列表に開示される各ヌクレオチド配列の情報又はジーンバンク等に存在するヌクレオチド配列の情報等を参照することにより、上記試験例で使用したプラスミドベクター等の構築物ないし本発明に係る核酸等を適宜作製することができる。
なお、上記試験例及び比較試験例においては、各種遺伝子コード領域、プロモーター領域、ターミネーター領域、複製起点等のクローニングには上述のとおりＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ又はＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを利用した工程もあるが、ＰＣＲ増幅の際に使用したプライマーペアーについては、フォワード／リバースプライマーの５’末端にはそれぞれ、上記クローニングキットの指示に従い適切なアダプター配列が付加されたものであることを補足する。
【産業上の利用可能性】
【０１６９】
本発明は、バイオテクノロジー分野、化学物質や生物材料等の物質生産の分野等において高い産業上の利用可能性を有する。
【図１】
2019156152.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2019156152000001.app
【国際調査報告】
2019156152.tif 000011
2019156152.tif 000012
2019156152.tif 000013
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