(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト造血細胞の混合物から、ＨＣＣ−１抗体を使用して、ＨＣＣ−１エピトープ(ＨＣＣ−１+)に特異的な抗体によって認識される細胞を含む富化フラクションを分離することを特徴とする、造血幹細胞に富む組成物を得る方法；ただし、上記抗体はハイブリドーマＨＢ１１７２９によって産生されたものであるかまたはハイブリドーマＨＢ１１７２９によって産生された抗体のＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）2フラグメント、Ｆｖフラグメント、および、定常領域の大部分がヒト抗体定常領域により置換されている非ヒト抗体から選択される抗体であって、ハイブリドーマＨＢ１１７２９によって産生された抗体と同じ結合特異性を有する抗体である。
【請求項２】
幹細胞に関連する少なくとも一つの付加マーカーを発現する細胞を選択する工程を更に含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
幹細胞に関連する少なくとも一つの系統特異的マーカーを欠損する細胞を選択する工程を更に含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
付加マーカーがＣＤ３４、Ｔｈｙ−１、ｒｈｏlo、およびＣ−ｋｉｔからなる群から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項５】
系統特異的マーカーがＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ３８、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７１，ＣＤ３３、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ１９およびグリコフォリンＡからなる群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項６】
細胞が幹細胞に関連する少なくとも一つの付加マーカーを発現することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項７】
細胞が幹細胞に関連する少なくとも一つの系統特異的マーカーを欠損することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項８】
付加マーカーがＣＤ３４、Ｔｈｙ−１、ｒｈｏlo、およびＣ−Ｋitからなる群から選択される、請求項６記載の方法。
【請求項９】
系統特異的マーカーがＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ３８、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７１およびＣＤ３３からなる群から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
系統特異的マーカーがＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ１９およびグリコフォリンＡからなる群から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
細胞がＨＣＣ−１を発現し、少なくとも１つの系統特異的マーカーを発現しないことを特徴とする、請求項１記載の方法；ただし、上記系統特異的マーカーはＣＤ１４およびＣＤ１５からなる群から選択されるものである。
【請求項１２】
富化された細胞が細胞表面マーカーＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ１９およびグリコフォリンＡを発現しないことを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
細胞が幹細胞に関連する少なくとも一つの付加マーカーを発現することを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
付加マーカーがＣＤ３４、Ｔｈｙ−１、Ｃ−Ｋitおよびｒｈｏloからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ハイブリドーマＨＢ１１７２９によって産生されたものであるか
またはハイブリドーマＨＢ１１７２９によって産生される抗体のＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）2フラグメント、Ｆｖフラグメント、および、定常領域の大部分がヒト抗体定常領域により置換されている非ヒト抗体から選択される抗体であって、ハイブリドーマＨＢ１１７２９によって産生された抗体と同じ結合特異性を有する、ＨＣＣ−１抗体。
【請求項１６】
造血幹細胞に富む細胞の組成物の調製に使用する、請求項１５記載のＨＣＣ−１抗体。
【発明の詳細な説明】
導入
技術分野
本発明の分野は、ヒト造血幹細胞に富む細胞集団の単離方法である。
背景
哺乳類造血細胞は種々の範囲の生理学的活性を提供する。これらの細胞は、リンパ球、骨髄細胞および赤血球系統に分けられる。Ｂ細胞およびＴ細胞を含むリンパ球系統は、抗体の製造、細胞性免疫系の制御、血中異種抗原の検出、宿主の異種細胞の検出等を提供する。単核細胞、顆粒球、巨核球および他の細胞を含む骨髄細胞は、異種体の存在の監視、腫瘍細胞に対する防御の提供、異種物質の清掃、血小板の産生等を行う。赤血球系統は赤血球細胞を提供し、酸素運搬体として働く。
本明細書に記載のすべての刊行物は、参考としてその全体を本明細書に包含する。
造血細胞の性質、形態、特性および機能の多能性にかかわらず、これらの細胞は、“幹細胞”と呼ばれる単一の前駆体細胞集団から由来すると現在考えられている。幹細胞は、自己再生でき、特異的系統へ分化および発展する、系統免疫委任先祖となり得る。本明細書で使用する限り、“幹細胞”は造血細胞を意味し、他の細胞型の幹細胞ではない。
多能性幹細胞は、下記のように定義し得る：
(１)全ての定義された血液リンパ系統の子孫の基である；および(２)細胞の数の限定は、自己−再生による重度免疫無防備状態宿主の、多能性造血幹細胞を含む、全ての血液細胞型およびそれらの先祖の充分な再構築ができる。
幹細胞の高度に精製した集団は、インビトロ実験およびインビボ指示が必要である。例えば、幹細胞の精製集団は、その自己再生に関連する成長因子の指標となる。加えて、(１)具体的な系統への幹細胞の分化の初期段階；(２)このような分化の防止および(３)幹細胞増殖の陰性制御に関係のあるまだ未発見の成長因子であり得る。
発見された幹細胞は：(１)任意のクラスの造血細胞が欠損している宿主の造血細胞の再生；(２)疾病に罹患しており、骨髄除去、幹細胞の単離および幹細胞の再植付前の医薬または放射による処置により処置できる宿主；(３)種々の造血細胞の製造；(４)幹細胞自己−再生に関係ある成長因子の検出および評価；および(５)造血細胞系統の発達および造血細胞発達に関係の因子の評価に使用されている。
このような細胞は、幹細胞を移植する個体の健康を挿入遺伝子が促進する場所で、遺伝子療法に重要な標的である。加えて、幹細胞を単離する能力は、リンパ腫および白血病ならびに他の腫瘍状態の処置に、幹細胞が骨髄または末梢血のガン細胞から精製され、患者に骨髄制御または骨髄切除を行った後に再注入する場所で使用し得る。従って、実質的に純粋または純粋な形で幹細胞を単離することに世界的な努力がされている。
幹細胞は造血細胞の全数の少しの割合で含まれるだけである。造血細胞は、種々の細胞表面“マーカー”の存在により同定できる。このようなマーカーは具体的系統または先祖に特異的であるか、１種以上の細胞型に存在する。現在、分化細胞に関連する幾つのマーカーがまた幹細胞に存在するか、知られていない。幹細胞にのみ存在すると以前に示された一つのマーカー、ＣＤ３４がまたかなりの数の系統免疫委任先祖でも発見された。米国特許第４，７１４，６８０号はＣＤ３４マーカーを発現する細胞集団を記載している。
ＣＤ３４マーカーは、多くの系統免疫委任造血細胞で発見されている。特に、ＣＤ３４+集団の８０−９０％は他の系統特異的および非特異的マーカーによりマークされる。幹細胞である骨髄または末梢血細胞の全数が小さな集団であること、より分化した細胞とは別の幹細胞に関係するマーカーの不確実さ、および幹細胞の生物学的評価の一般的困難さからして、幹細胞の同定および精製が明確なものでなかった。幹細胞の特徴付および単離は、Ｂaum et al.(1992)Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 89：2804-2808；およびＴsukamoto et al., 米国特許第５，０６１，６２０号に記載されている。
造血細胞の減少したローダミン１２３(ｒｈｏ123)染色は、幹細胞効果に関連するように思える。このいわゆる“ｒｈｏlo”マーカーは、最初の色素蓄積ではなく、Ｐ−糖タンパク(Ｐ−gp)阻害剤に感受性な流出過程により測定される。ヒト骨髄細胞におけるｒｈｏ１２３を含む幾つかのＰ−gp−輸送蛍光色素の保持は、Ｐ−gpの発現と逆相関している。多能性幹細胞の物理的および抗原的特性を発現する骨髄細胞は、高レベルのＰ−gp発現および蛍光色素流出を示す。ヒト骨髄細胞のフラクションは、長期培養開始細胞(ＬＴＣ−ＩＣ)を含む、ヒト骨髄の実質的に全ての未分化先祖細胞に含まれるｒｈｏ123またはＰ−gpの増加のいずれかを基本にして単離される。ＣhaudharyおよびＲoninson(1991)Ｃell 66：85-94。
近年、マウス幹細胞が、純粋形でないにしても、非常に富化され、そこから骨髄から得た約３０より少ない細胞が、致死的に放射したマウスの造血系のすべての系統を再構築できた。各評価細胞は、すべての造血系統について多能性であるが、自己再生はこれらの細胞で変化する。Ｓpangrude et al., (1988)Ｓcience 241：58-62；Ｓmith et al.(1991)Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 88：2788-2792；Ｕchida(1992)スタンフォード大学博士論文；およびまたＥＰＡ８９  ３０４６５１．６およびマウス幹細胞の単離が記載されているその引用文献も参照。
本発明の要約
幹細胞に富む組成物を造血細胞の集団から単離してもたらす方法を提供する。この方法は、幹細胞(ＣＤ３４+ＨＣＣ−１+)に高い割合で到達し得るが、一方、より成熟した細胞(ＣＤ３４+ＨＣＣ−１lo/-)かに到達しにくい、欠失しているＣＤ５９細胞表面タンパク質の独特なエピトープに対して特異的な抗体を利用する分離法である。
このエピトープを認識する抗体による幹細胞の陽性選択を、ＣＤ３４マーカーを発現する細胞の選択と組み合わせて使用し、幹細胞に富む細胞集団を得る。陰性選択を、幹細胞濃厚化スキームにおいて独立してまたは上記方法の１個または両方と組み合わせる。これらの方法由来の細胞の濃厚集団も提供され、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１+と名付ける。
【図面の簡単な説明】
図１は、骨髄単核細胞(ＢＭＭＮＣ)上のＣＤ３４とＨＣＣ−１の共発現を示す蛍光プロットを記載する。(Ａ)はＢＭＭＮＣ上のＣＤ３４とＨＣＣ−１発現の２色蛍光プロットである。(Ｂ)はＣＤ３４+、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１+およびＣＤ３４+ＨＣＣ−１-細胞集団の光分散特性の輪郭プロットを示す。
図２は、ＣＤ３４+細胞の種々のサブセットによるＨＣＣ−１の発現を示す３色免疫蛍光分析である。それぞれ１０4 ＣＤ３４+事象を表す輪郭プロットを産生した。各ブロットは、異なる系統抗原またはローダミン１２３によるＨＣＣ−１の染色パターンを示し、ＨＣＣ−１染色をｙ軸に、同定された系統マーカーをｘ軸に示す。
図３。ＣＤ３４+ｒｈｏloＨＣＣ−１+細胞による長期骨髄培養(ＬＴＢＭＣ)における造血の開始。白四角はＣＤ３４+ｒｈｏloＨＣＣ−１+細胞、白丸はＣＤ３４+ＨＣＣ−１+細胞、白三角はＣＤ３４+細胞、黒四角はＣＤ３４+ｒｈｏloＨＣＣ−１-細胞および黒丸はＣＤ３４+ＨＣＣ−１-細胞を示す。(Ａ)は間質細胞培養で成育した各集団による、ＣＦＵ−ＧＭの蓄積生産を示す。(Ｂ)は分類された細胞の集団を、サイトカインを添加した培地中で成育させた、前−ＰＦＵ検定の結果を示す。
図４は骨髄単核細胞(ＢＭＭＮＣ)上のＣＤ３４およびＨＣＣ−１発現の２色免疫蛍光分析を示す。細胞分類窓(箱)を示す。
図５。ＣＤ３４およびＨＣＣ−１発現を基本に単離した貯蔵細胞集団由来のＣＦＵ−ＧＭおよび有核細胞の産生。黒三角はＣＤ３４hiＨＣＣ−１+細胞、黒丸はＣＤ３４+ＨＣＣ−１hi細胞、黒四角はＣＤ３４+ＨＣＣ−１+細胞、ＸはＣＤ３４+細胞、白三角はＣＤ３４loＨＣＣ−１+細胞、白丸はＣＤ３４+ＨＣＣ−１lo細胞および白四角はＣＤ３４+ＨＣＣ−１-細胞を示す。
(Ａ)分類した集団由来の前−ＣＦＵ検定におけるＣＦＵ−ＧＭを図４の窓に示す。
(Ｂ)は種々の分類集団から製造される有核細胞の全数を示す。データは３重培養の平均＋ＳＥＭで示す。
図６。種々の造血細胞および細胞系によるＨＣＣ−１発現。データは、骨髄細胞の４サンプルおよび末梢血細胞の３サンプルの平均±ＳＤで示す。細胞系のＨＣＣ−１発現は、少なくとも細胞系当たり２回行う。
図７は、異なる患者由来の白血病骨髄細胞上のＣＤ３４とＨＣＣ−１の発現を示す。２色蛍光分析を、フィコエリスリン標識ＨＣＣ−１およびＦＩＴＣ標識ＣＤ３４抗体を使用して示す。パネル１は正常ＢＭ。パネル２は患者３。パネル３は患者１３。パネル４は患者１９。パネル５は患者３１。パネル６は患者３２。パネル７は患者３３。
図８は、死体骨髄由来のＣＤ３４+ＨＣＣ−１+細胞の表現型のＦＡＣＳ分析の結果を記載する。(Ａ)はＣＤ３４+細胞のＨＣＣ−１lo/-とＨＣＣ−１hi集団への分離を記載する。(Ｂ)はリンパ芽球ゲートでＨＣＣ−１lo/-とＨＣＣ−１hiに分類された細胞を記載する。(Ｃ)はＨＣＣ−１lo/-で分離された細胞の全面および側面分散プロフィールを記載する。(Ｄ)はＴhy−１発現で分離されたＨＣＣ−１lo/-細胞を記載する。(Ｅ)はＨＣＣ−１hiゲートで分類された細胞の全面および側面分散プロフィールを記載する。(Ｆ)はＴhy−１発現で分離されたＨＣＣ−１hi細胞を記載する。
図９はＣＤ３４+ＨＣＣ−１hiおよびＣＤ３４+ＨＣＣ−１lo/-集団に分類されたＣＤ３４+骨髄細胞を使用したＡＣ６．２１共培養の結果を記載する。各集団について敷石領域形成細胞(ＣＡＦＣ)の頻度を比較する。結果は、ＨＣＣ−１がＣＤ３４+を同じサイズのサブセットに分け、ＣＡＦＣ活性を２−３倍増加させることを示す。
図１０は、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１hiおよびＣＤ３４+ＨＣＣ−１lo/-に分類したＣＤ３４+細胞集団のＳＣＩＤ−ｈｕ胸腺検定の結果を記載する。各点は、示した細胞集団に個々の移植片を注入した６週間後に見られた提供者細胞の割合を示す。
図１１は、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１hi細胞集団を植え付けたＳＣＩＤ−ｈｕ骨検定の結果を記載する。２色免疫蛍光分析は、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１hi細胞が多能性であり、リンパ球、骨髄細胞、赤血球およびＣＤ３４+子孫を発生させることを証明する。
図１２は、ＣＤ３４+Ｌin-死体骨髄細胞上のＨＣＣ−１およびＴhy１の共発現を記載する。(ＬＩＮ-はＣＤ２-、ＣＤ１４-、ＣＤ１５-、ＣＤ１９-およびグリコフォリンＡ-である。)
図１３は、未分化造血細胞を末梢に移動させるため、化学療法およびサイトカインで処置した患者由来の末梢血成分分離サンプルから得、ＨＣＣ−１、ＣＤ３４およびＴhy−１マーカーの共発現の免疫蛍光技術を使用して分析した結果を示す。
寄託情報
抗体ＨＣＣ−１産生ハイブリドーマは、アメリカ合衆国、メリーランド州２０８５１、ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１番のＡＴＣＣに、１９９４年１０月１８日にブダペスト条約に基づいて寄託し、受託番号ＨＢ１１７２９で受領された。
具体的態様の記載
本発明は、幹細胞に非常に富む造血細胞の集団を単離する方法を提供する。
ＣＤ３４+造血細胞先祖サブセット上に発現される細胞表面分子に対する抗体は、機能的容量にしたがって造血細胞先祖のサブフラクション化を可能にする。ＣＤ３４+成人骨髄細胞は、モノクローナル抗体ＨＣＣ−１により同定されるＣＤ５９のエピトープの反応性により分類された。このＣＤ３４+細胞のサブフラクションは、ＣＤ３４単独での選択と比較して、幹細胞がより豊富である。本発明により、ＨＣＣ−１により認識されるＣＤ５９エピトープが、幹細胞に高い密度で発現される。
ＨＣＣ−１はＣＤ３４+細胞集団を、ＨＣＣ−１+亜集団に完全に見られる幹細胞活性により、ほぼ等しい亜集団に細分する。幹細胞活性は、高濃度のＨＣＣ−１(ＨＣＣ−１hi)を発現するＣＤ３４+細胞により豊富である。造血細胞先祖の分析は、ＷhitlockおよびＷitte(1982)Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 79：3608-3612；およびＷhitlock et al.(1987) Ｃell 48：1009-1021により報告されている。ＣＤ５９はほとんどの骨髄細胞で発現される。
一つの理論に縛られることなく、本明細書に示される結果は、分子量＝８０ＫＤ、ｇｐ８０の細胞表面タンパク質に関係するＣＤ５９は、ＨＣＣ−１エピトープの近付きやすさの決定をし得ることを示す。この仮説の支持として、ＨＣＣ−１に結合する(すなわち、線維芽細胞)およびしない(ＨＬ６０細胞)細胞型由来のＣＤ５９免疫沈降は、ｇｐ８０がＨＣＣ−１と結合しない細胞由来のＣＤ５９とのみ免疫沈降することを証明する。それにもかかわらず、幾つかの別の仮説が結果を説明するが、同様に請求されている本発明と結び付くかまたは限定しない。例えば、ＨＣＣ−１はアスパラギン１８で予測されるように、ＣＤ５９上のカルボアルデヒドエピトープに結合し得る。未分化細胞分化に応じて、グリコシレーションパターンは変化し得、ＨＣＣ−１による結合の損失をもたらす。あるいは、ＨＣＣ−１特異的エピトープは、分化の間、ＣＤ５９とＣＤ５５のような他のＧＰＩ−結合タンパク質との間の変化相互作用によりマスクされまたは現れる。ＳtefanovaおよびＨorejsi(1991)Ｊ. Ｉmmunol. 147：1587。記載されている多数のＧＰＩ−結合タンパク質があり(例えば、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤＷ１７、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ６６、ＣＤ６７、ＣＤ７３およびＴhy−１)、その多くが系統または成熟段階特異的方法で発現される。ＣＤ５９と他のこのようなタンパク質の関係の変化は、ＨＣＣ−１結合の変化をもたらし得る。
同時の５色流動血球計算分析は、ＨＣＣ−１hi集団が、前に未分化多能性造血先祖であると特徴付けられたＣＤ３４+Ｔhy−１+ＬＩＮ-細胞を実質上全て含むことを示す。(図１２、図１３)従って、ＨＣＣ−１エピトープは、実質的に全ての未分化造血幹細胞を含むＣＤ３４+細胞のサブセットの高レベルに発現され、ＨＣＣ−１モノクローナル抗体(および同じエピトープを認識する他の抗体)は、造血細胞のこのサブセットの精製を可能にする。
ＨＣＣ−１抗体に認識されるのに加えて、本明細書に記載の幹細胞は以下の表現型により特徴付し得る：ウシ細胞の場合、ＣＤ３４+、ＣＤ３-、ＣＤ７-、ＣＤ８-、ＣＤ１０-、ＣＤ１４-、ＣＤ１５-、ＣＤ１９-、ＣＤ２０-およびＴhy−１+を含むがこれらに限定されない；および成人細胞の場合、ＣＤ３４+、ＣＤ３-、ＣＤ７-、ＣＤ８-、ＣＤ１０-、ＣＤ１４-、ＣＤ１５-、ＣＤ１９-、ＣＤ２０-およびＴhy−１+または表１に示す通りを含むがこれらに限定されない。またヒトＣＤ３４+細胞集団について、ｒｈｏ１２３が細胞を高いおよび低いサブセットに分割できる(“ｒｈｏlo”および“ｒｈｏhi”)。マウス幹細胞でのｒｈｏの使用の記載についてはＳpangrude(1989)Ｉmmunology Ｔoday 10：344-350参照。好ましくはＣＤ３４+ＨＣＣ−１+細胞はヒトであるが、任意の適当な動物由来であり得る。
好ましくは、細胞はＬＩＮ-である。ＬＩＮ-細胞は、一般に、Ｔ細胞(ＣＤ２、３、４および８のような)、Ｂ細胞(ＣＤ１０、１９および２０のような)、骨髄細胞(ＣＤ１４、１５、１６および３３のような)、ナチュラルキラー(“ＮＫ”)細胞(ＣＤ２、１６および５６のような)、ＲＢＣ(グリコフォリンＡのような)、巨核球、肥満細胞、好酸球または好塩基球に関連するマーカーを欠く。このような系統特異的マーカーの欠失または低い発現は、抗体の細胞特異的マーカーへの結合の欠如により同定され、いわゆる“陰性選択”に有用である。
表１はウシ、成人および可動性末梢血の幹細胞の可能な表現型を要約する。表１において、骨髄細胞は骨髄単核マーカー、ＮＫはナチュラルキラー細胞およびＡＭＰＢは成人可動性末梢血を意味する。本明細書で使用する限り、下記、上記両方および表１で、陰性の印または上付きの陰性の印(-)は、具体的マーカーのレベルがＦＡＣＳ分析で制御されたＩｇイソタイプ上で検出不可能であり、具体的マーカーを非常に少なく発現する細胞を含む。
0003779323.tif 000002
本発明の他の態様において、幹細胞に非常に富む組成物を提供する。本明細書に示す結果は、ＨＣＣ−１抗体がヒト造血細胞に見られ、幹細胞に高い割合で現れるＣＤ５９細胞表面のエピトープと非常に特異的に結合することを示す。この特異性は幹細胞の単離および精製に使用できる。このような組成物は、ヒト造血系の再構築および造血細胞の種々のパラメーターの研究に利用性を有する。
この組成物は、表２のような他の幹細胞特異的マーカーの陽性選択および／または系統特異的マーカーの陰性選択により更に幹細胞を豊富にし得る。適当な因子による好適な選択ならびに幹細胞の自己再構築および幹細胞のマーカーについでのスクリーニングの生検定の発達により、種々の幹細胞に富む組成物が種々の目的のために製造し得る。
幹細胞に富む組成物は、細胞が腫瘍細胞を含み得ない場合、造血植え付けに使用し得る。更に、自己幹細胞の使用は移植片対宿主病を避ける。加えて、細胞を、同種または非同種な適当な遺伝子移入組換えにより修飾し得、個々にまたは造血細胞一般に、遺伝子欠損を修正するかもしくは幹細胞またはその子孫に本質的に欠損している遺伝的能力を提供する。加えて、幹細胞組成物は、その再生および分化に関連する因子の単離および定義に使用し得る。
上記のように得た細胞は、直ぐに、または液体窒素温度で凍結して長期間貯蔵して、融解し、再使用できるようにし得る。通常、細胞は１０％ＤＭＳＯ、５０％ＦＣＳ、４０％ＲＰＭＩ１６４０培地中に保存する。一度融解したら、細胞を、幹細胞増殖および分化に関連する成長因子および／または間質細胞の使用により拡大し得る。
他の態様において、本発明はＨＣＣ−１により認識されるエピトープに特異的な抗体を含む。ＣＤ５９をコードする遺伝子は、最近単離され、そのヌクレオチド配列が決定された。Ｓawada et al.(1989)Ｎucl. Ａcids Ｒes. 17：6728；Ｐhibrick et al.(1990)Ｅur. Ｊ. Ｉmmunol. 20：87；Ｄavies et al.(1989)Ｊ. Ｅxp. Ｍed. 170：637；およびＯkada et al.(1989)Ｂiochem. Ｂiophys. Ｒes. Ｃommun. 162：1553。ＨＣＣ−１により認識されるエピトープに対応する合成ペプチドは、ＣＤ５９の細胞外部分をカバーする合成ペプチドのオーバーラップセットに対するＨＣＣ−１の特異性を検出することにより測定できる。ＨＣＣ−１により特異的に認識されるペプチドは、本明細書に記載のおよび当業者に既知の方法により、更なる抗体を発生させるのに使用する。あるいは、ＣＤ５９またはＣＤ５９を発現する細胞を、抗体の産生に使用し得る。次いで、抗体をＨＣＣ−１と競合するかまたは本明細書に記載の細胞集団と特異的に結合する能力でスクリーニングする。
本明細書で使用する限り、“ＨＣＣ−１抗体”は、天然または組換え、合成または天然由来であれ、ＨＣＣ−１により認識されるエピトープに特異的に結合する充分な特異性を残している、任意の抗体またはそのフラグメントを含む。
本明細書で使用する限り、ＨＣＣ−１は、優先的には造血先祖細胞を認識するという方法で、ＨＣＣ−１により認識されるエピトープに結合するモノクローナル抗体ＨＣＣ−１またはモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を意味する。これはまたこれらの抗体と同じ抗原特異性を有する抗体も含む。
ＨＣＣ−１抗体は、モノクローナル抗体製造の分野で既知の方法により得る。使用する実際の方法は、本明細書の実施例に記載されているが、抗体製造の分野で既知の方法も使用し得る。このような方法は、Ｂ細胞と所望の特異性の細胞表面抗体の分離、軽および重鎖の可変領域を発現するＤＮＡのクローニングおよび好適な宿主細胞における組換え遺伝子の発現を含むが、これらに限定されない。標準モノクローナル抗体産生技術が、抗体がハイブリドーマ細胞を産生する非動化公開から得られる場合、使用できる。これらのハイブリドーマは幹細胞での動物の免疫化、ＣＤ５９タンパク質またはその抗原部分の精製および、免疫動物からの、好ましくは免疫化宿主脾臓から単離したＢリンパ球と、適合性非動化細胞、好ましくはＢ細胞ミエローマの融合により製造できる。
本発明は、更に、本明細書に記載の方法で得たＨＣＣ−１抗体を含む組成物を含む。本明細書で使用する限り、“抗体”または“抗体(複数)”は、その機能的部分を含む抗体および抗体フラグメントを含む。“抗体”なる用語は、全抗体が結合特性を有するエピトープへの結合を行うのに、充分な軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域の充分な部分からなる単一特性または二重特異性化合物を含む。フラグメントは、少なくとも一つの重または軽鎖免疫グロブリンポリペプチドの可変領域を含み得、Ｆａｂフラグメント、Ｆ(ａｂ)2フラグメントおよびＦｖフラグメントを含むが、これらに限定されない。
加えて、単一特異性ドメインは、当分野で既知の方法で、他の分子に結合し得る。結合は、例えば、化学的または遺伝子工学的であり得る。ＨＣＣ−１抗体は、当分野で既知の組換え手段により製造し得る。このような組換え抗体は、細菌で製造されたフラグメント、および定常領域の大部分がヒト抗体定常領域により置換されている非ヒト抗体を含むが、これらに限定されない。加えて、このような“ヒト化”抗体は、組換え抗体を発現するように遺伝子操作した宿主脊椎動物により得られ得る。
抗体は、酵素、磁気ビーズ、コロイド状磁気ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射活性化合物または医薬を含むが、これらに限定されない他の化合物と接合できる。抗体と接合できる酵素は、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼおよびβ−ガラクトシダーゼを含むが、これらに限定されない。抗体と接合できる蛍光色素は、フルオレッセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、フィコエリスリン、アロフィコシアニンおよびテキサスレッドを含むが、これらに限定されない。抗体と接合できる更なる蛍光色素については、Ｈaugland, Ｒ. Ｐ. Ｍolecular Ｐrobes：Ｈandbook of Ｆluorescent Ｐrobes and Ｒesearch Ｃhemicals(1992-1994)参照。抗体と接合できる金属化合物は、フェリチン、コロイド状金、および特にコロイド状スーパーパラマグネティックビーズを含むが、これらに限定されない。抗体と接合できるハプテンは、ビオチン、ジゴキシゲニン、オキサゾロンおよびニトロフェノールを含むが、これらに限定されない。抗体と接合でき、または取り込まれる放射活性化合物は当分野で既知であり、テクネチウム９９ｍ(99ＴＣ)、125Ｉおよび14Ｃ、3Ｈおよび35Ｓを含むがこれらに限定されない放射活性を含むアミノ酸を含むが、これらに限定されない。
他の態様において、本発明は、少なくとも一つの系統特異性または非特異性マーカー(ＬＩＮ-)を欠き、高レベルのＨＣＣ−１を発現するヒト造血細胞を単離することを含む、幹細胞に富む組成物を得る方法を提供する。本明細書で使用する限り、ＨＣＣ−１+またはＨＣＣ−１hi細胞は、ＨＣＣ−１抗体により認識されるマーカーがＨＣＣ−１抗体またはＨＣＣ−１抗体により認識されるエピトープに結合する他の抗体による結合が可能なように高い割合で出現している細胞を意味する。系統特異的マーカーの例は、造血細胞発達の後にＨＣＣ−１エピトープをマスクするように思える８０ｋＤ糖タンパクである。非常に富化された組成物は、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１hiおよびＬＩＮ-である細胞の選択的単離により得られ得る。
ＨＣＣ−１+幹細胞は、成人および胎児両方の骨髄、可動性末梢血(ＭＰＢ)および臍帯血を含むが、これらに限定されない、幹細胞の既知の源から単離し得る。最初に骨髄細胞が、腸骨(例えば、腸骨稜を経由して坐骨から)、脛骨、大腿骨、脊椎または他の骨腔を含むが、これらに限定されない骨髄の源から得られ得る。幹細胞の他の源は、胚芽性卵黄嚢、胎児肝臓および胎児脾臓を含むが、これらに限定されない。
骨髄の単離のために、簡便にはウシ胎児血清(ＦＣＳ)または他の自然に存在する因子を、低濃度、一般に５−２５mＭの許容可能な緩衝液と共にを添加した食塩水を含むが、これらに限定されない好適な溶液が骨を興奮させるために使用し得る。簡便な緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液および乳酸緩衝液を含むが、これらに限定されない。そうでなければ、骨髄を骨から、既知の方法により吸引する。
最初に免疫委任系統の細胞を除去することにより、細胞を分離するために、種々の使用し得る。モノクローナル抗体は、特定の細胞系統および／または分化の期に関連するマーカーの同定に特に有用である。抗体は固体支持体に結合し得、粗分離を可能にする。用いる分離技術は、回収すべきフラクションの生存能力の保持を最大にしなければならない。異なる効果の種々の技術が、“相対的に粗い”分離に使用し得る。このような分離は、マーカーを有しない全存在細胞の１０％まで、通常約５％より多くない、好ましくは１％より多くない細胞が、残すべき細胞集団に残り得る。具体的な用いる技術は、分離の能率、関連する細胞毒性、実施の容易さおよびスピードおよび複雑な装置および／または技術の必要性に依存する。
分離の方法は、抗体被覆磁気ビーズを使用した磁気分離、親和性クロマトグラフィー、モノクローナル抗体に結合させた細胞毒性の使用または、補体およびサイトトキシンを含むがこれらに限定されないモノクローナル抗体との結合を、固体支持体、例えばプレートに結合した抗体の“選別”、溶出法または他の勘弁な方法を含むが、これらに限定されない。
分離技術の使用は、物理的(密度勾配遠心および対向遠心分離法)、細胞表面(レクチンおよび抗体親和性)および生体染色特性(ミドコンドリア結合色素ｒｈｏ１２３およびＤＮＡ結合色素Ｈoechst33342)に基づくものを含むが、これらに限定されない。
正確な分離を提供する技術は、種々の複雑さの程度、例えば、色の多様性、低い角度および鋭角光走査検出チャンネル、インピーダンスチャンネルを有するＦＡＣＳを含むが、これに限定されない。
最初の分離において、典型的には１×１０8-9、好ましくは約５×１０8-9細胞で開始し、ＨＣＣ−１抗体を一つの蛍光色素で標識し得るが、種々の免疫委任系統に対する抗体または抗ｇｐ８０抗体は、少なくとも一つの異なる色素と接合し得る。系統の各々を別の段階で分離し得るが、望ましくは系統を、一つがＨＣＣ−１および／または他の幹細胞マーカーに対して陽性選択されるように、同時に分離する。細胞を死亡細胞に対して、死亡細胞(プロピジウムヨウジド(ＰＩ)を含むが、これに限定されない)に関する色素を使用して選択し得る。好ましくは、細胞を２％ＦＣＳ含有培地中に回収する。
精製幹細胞は、ＦＡＣＳ分析で、低い側面分散および低い培地全面分散プロフィールを有する。サイトスピン調製物は、富化幹細胞が成熟リンパ細胞と成熟顆粒細胞の間の大きさを有することを示す。細胞は、光分散特性ならびにその種々の細胞表面抗原の発現を基本として選択し得る。
具体的な分離の程度が本発明では重要ではないが、示される程度が好ましい。好ましくは、細胞を最初に粗く分離し、続いて、ＣＤ３４およびＨＣＣ−１hiの陽性選択により細かく分離する。
９０％以上、通常約９５％以上のＣＤ３４+ＨＣＣ−１hi細胞を含む組成物が、この方法で達成し得る。望ましい幹細胞を、ＬＩＮ-および／またはＴhy−１+および／またはｒｈｏlo、または表２に記載のようなこれらのマーカーの組み合わせに対する選択により更に富化し得、種々の造血細胞系統の全てのメンバーの細胞再生および発育が可能になる。表２のブランクは、細胞が具体的マーカーに対して陰性であることではない；単にそのマーカーを使用しなかったという意味である。
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ＣＤ３４+ＨＣＣ−１hi細胞をヒト造血細胞源から分離することにより、長期培養活性がＨＣＣ−１lo/-と比較して、ＨＣＣ−１hiフラクションで富化される。更に、ＨＣＣ−１hi細胞は、長期培養で、Ｂおよび骨髄細胞を産生する。Ｔｈｙ−１に対する抗体および／または表２に具体化した任意の組み合わせおよび／またはｃ−kitの使用による更なるＨＣＣ−１hi細胞の富化において、幹細胞頻度が更に増加できる。
ＣＤ３４+ＨＣＣ−１hi細胞から産生され、およびこれらの培養から得られる細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、赤血球細胞、骨髄性単球細胞を、下記のインビボ検定において発生できる。
種々の細胞集団の持続性造血細胞能力の証明は、ＳＣＩＤ−ｈｕ骨モデルにおける連続骨髄、赤血球およびＢリンパ球細胞製造の検出により達成される。Ｋyoizumi et al. (1992) Ｂlood 79：1704；Ｃhen et al. (1994) Ｂlood 84：2497。この可能性を分析するために、ヒト胎児骨を単離し、この骨の長手側方向にスライスした部分を、scid/scid動物の乳房脂肪パッドに移植し得る：骨腔は、試験供給体集団の注射前のマウス宿主の全体放射により、内因性前駆細胞を枯渇する。注射する集団のＨＬＡは、受容体骨細胞のＨＬＡと適合しない。有効なＳＣＩＤ−ｈｕ骨移植活性は、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１hi成熟骨髄細胞集団で見られるが、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１lo/-集団では検出されない。強い移植を示す一つの実験において、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１hi集団由来の、骨髄、Ｂリンパ球および赤血球系統の子孫の検出が可能である(図１１)。
Ｔ細胞への分化を証明するために、胎児胸腺を単離し、４−７日、約２５℃で培養し、実質的にリンパ球集団を枯渇させる。次いで、Ｔ細胞活性を試験すべき細胞を、胸腺組織にマイクロインジェクションし、そこでは注射する集団のＨＬＡは、胸腺細胞のＨＬＡと適合しない。次いで、胸腺組織をscid/scidマウスに、米国特許第５，１４７，７８４号に記載のように、特に、腎臓カプセル下の移植で、移植し得る。
特に、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１hi細胞の貯蔵集団は、ＨＬＡ不適合胸腺フラグメントにマイクロインジェクションできる。６−１０週間後、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１hi細胞を注射した胸腺フラグメントの検定は、供給体由来Ｔ細胞について行い、評価できる。ＳＣＩＤ−ｈｕ胸細胞移植活性の全てではないが、大多数がＣＤ３４+ＨＣＣ−１hi成熟骨髄集団に残る。胸腺移植活性の相対的に少量が、ＣＡＦＣおよびＳＣＩＤ−ｈｕ骨移植活性の枯渇が示された、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１lo/-集団で観察される(表９および図１０)。これは、ＨＣＣ−１エピトープが、ＳＣＩＤ−ｈｕ胸腺検定では検出可能であるが、ＳＣＩＤ−ｈｕ骨検定またはＣＡＦＣ検定では活性はない、Ｔ細胞先祖で低レベルで発現される。Ｔｈｙ+および／またはｃ−kitおよび／またはｒｈｏ１２３に基づくＣＤ３４+ＨＣＣ−１hiフラクションのサブフラクションは、活性の更なる富化を証明する。
対象細胞組成物は、種々の方法での使用を見付け得る。それらは、放射宿主および／または化学療法に付されている宿主のような免疫無防備状態宿主における完全な再構築に；またはエリスロポイエチン、コロニー刺激因子、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ−ＣＳＦまたはＭ−ＣＳＦ、インターロイキン、例えば、ＩＬ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８等、または特定の系統またはそれらの増殖、成熟および分化に免疫委任する幹細胞に関連する間質細胞、種々の因子を用いることによる、１個またはそれ以上の選択した系統のそれらの成熟、増殖および分化を提供することにより、具体的系統における細胞の源として、使用できる。ＣＤ３４+ＨＣＣ−１hi細胞は、また、造血細胞の分化および成熟に関連する因子の単離および評価に使用し得る。従って、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１hi細胞は、培地、例えば、条件培地の決定、細胞成育活性のための液体の評価、具体的な系統の免疫委任の関与の検定に使用し得る。ＣＤ３４+ＨＣＣ−１hi細胞は、遺伝子疾患の処置に使用し得る。造血細胞に関与する遺伝子疾患は、自己または同種異系幹細胞の、遺伝子欠損を修正するための遺伝子修飾により処置し得る。例えば、β−地中海貧血症、鎌状赤血球貧血症、アデノシンデアミナーゼ不全、リコンビナーゼ不全、リコンビナーゼ調整遺伝子不全等を含むが、これらに限定されない疾病が、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１hi細胞への、均質または無作為組換えによる野生型遺伝子の挿入により、修正し得る。遺伝子治療の他の処方は、利点を有し、化学療法間の選択的負荷に付される正常幹細胞の医薬耐性遺伝子の挿入である。好適な医薬耐性遺伝子は、多剤耐性(ＭＤＲ)タンパク質コード遺伝子を含むが、これらに限定されない。
造血細胞が関与しない疾病もまた遺伝子修飾で処置し得、そこで、疾病は、ホルモン、酵素、インターフェロン、成長因子等を含むが、これらに限定されない具体的な選択的生産物の欠損に関与する。好適な調節開始領域を使用することにより、欠損タンパク質の誘発可能製造が達成され得、タンパク質の製造が製造が通常このようなタンパク質を製造する細胞と異なる細胞においてでさえ、本来の製造と平衡となる。具体的な遺伝子製造または疾病、特に造血細胞疾病への感受性を阻害するために、リボザイム、アンチセンスまたは他のメッセージを挿入することも可能である。
以下の実施例は、説明のために提供し、限定するものではない。
実施例１
材料および方法
細胞製造
骨髄(ＢＭ)吸引は、インフォームド・コンセントに続いて、正常提供者から得た。細胞は、軽密度単核細胞(＜１．０７７ｇ／ｄＬ)を得るために、lymphoprep(Ｎycomed Ｐharma Ａs, Ｏslo, Ｎorway)で分離した。単核細胞は、表面細胞の選択により得たが、顆粒球細胞および赤血球細胞は、ペレットから得た。血小板は、末梢血(ＰＢ)を１０００rpm、１０分遠心することにより得、血小板に富むフラクションを回収し、更に３０００rpm、１０分遠心した。蛍光活性細胞分別器を使用して得たＣＤ３４+ＢＭ細胞を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化に使用した。
死体骨髄および可動性末梢血
多臓器供給者脊椎体由来の死体骨髄細胞懸濁液を、Ｎorthwest Ｔissue Ｃenter(Ｓeattle, ＷＡ)から得た。患者末梢血サンプルをインフォームド・コンセント後に得、化学療法レジメを未分化造血細胞を末梢に可動性にさせるために設計した。多くの骨髄腫患者を、標準技術に従って、高用量のシクロホスファミドおよびＧＭ−ＣＳＦで可動性にした。典型的に、肺癌患者は、高用量のシクロホスファミド＋ＩＬ３およびＧ−ＣＳＦで可動性にした。
細胞をＩsoＰrepに広げ、低密度単核細胞(死体骨髄に関してはｄ＜１．０６８ｇ／ｄＬ、末梢血に関してはｄ＜１．０７７ｇ／ｄＬ)を回収し、更に蛍光活性化細胞分類および分析の処理をした。
モノクローナル抗体(ＭＡｂ)の製造
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、上記のようにして得たＣＤ３４+ＢＭ細胞で、２０μgムラミルジペプチド／マウス存在下に脾臓内的に免疫化し、３週間間隔で３回追加免疫をした。脾臓細胞をポリエチレングリコールを使用して、ＮＳ１−Ａｇ４−１マウス骨髄腫細胞と、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン(ＨＡＴ)培地でハイブリドーマの選択を行いながら融合した。ＫohlerおよびＭilstein(1975)Ｎature, 256:495。予備スクリーニングを、ＴおよびＢ細胞系および成熟細胞に結合する抗体を除去するために行った。これをペルオキシダーゼELISAおよび間接的免疫蛍光の手段で評価した。この規定に合う上清を更に骨髄中の未分化細胞に対する反応性についてスクリーニングした。始生細胞は、ＣＤ１８抗原を発現せず(ＣＤ１８-)、大豆アグルチニンと凝集しなかった(ＳＢＡ-)。得られたこの集団と結合するハイブリドーマ上清をペルオキシダーゼELISAの手段によりイソタイプ分類し、更に、ＣＤ３４+細胞との反応性を、２色免疫蛍光によりスクリーニングし、ＣＤ３４抗原を発現する細胞を選択する抗体を同定した。
成熟細胞と非反応性であり、ＢＭ単核細胞の小亜集団(ＢＭＭＮＣ)と結合しない抗体を産生するハイブリドーマを、限界希釈により３回クローン化し、ＭＡｂのイソタイプを商業的に入手可能なイソタイプ分類キット(Ｓilenus, Ａustralia)を使用して測定した。ＨＣＣ−１ＭＡｂはＩｇＭであることが判明した。続く実験は、非希釈組織培養上清を使用して行った。
免疫蛍光染色
ＨＣＣ−１と、ＢＭおよび末梢血(ＰＢ)中の種々の造血細胞系統の反応性のフローサイトメトリー分析を、以下の各抗体と組み合わせたＨＣＣ−１を使用して行った：ＣＤ２(Ｔ１１、Ｃoulter, Ｈialeah, ＦＬ)、ＣＤ３(Ｔ３、Ｃoulter)、ＣＤ７(３Ａ１、Ｃoulter)、ＣＤ８(Ｔ８、Ｃoulter)、ＣＤ１０(ＣＡＬＬＡ、Ｂecton Ｄickinson(BD), Ｍountain Ｖiew, ＣＡ)、ＣＤ１３(Ｍｙ７、Ｃoulter)、ＣＤ１４(ＴＵＫ４、Ｄakopattws, Ａ／Ｓ, Ｄenmark)、ＣＤ１９(ＨＤ３７、Ｄako)、ＣＤ２０(Ｂ１、Ｃoulter)、ＣＤ３３(ＬeuＭ９、ＢＤ)、ＣＤ３４(８Ｇ１２、ＢＤ)、ＣＤ３７(Ｌeu１７、ＢＤ)、ＣＤ４１ａ(Ｐlt１、Ｃoulter)、ＣＤ４５(ＫＣ５６、Ｃoulter)、ＣＤ７４１(Ｔ９、Ｄako)、ＨＬＡ−クラス１(Ｗ６／３２、Ｄako)、ＨＬＡ−ＤＲ(Ｌ２４３、ＢＤ)、ＧＬＹ−Ａ(ＪＣ１５９、Ｄako)、ｃ−kit(ＹＢ５.Ｂ８、Ｌ. Ａahman博士、Ｈanson Ｃentre for Ｃancer Ｒesearch, Ａdelaide, Ａustralia)およびＷＥＭＧ１１(Ａ. Ｌopez博士、Ｉ.Ｍ.Ｖ.Ｓ.、Ａdelaide, Ａustralia)。
蛍光活性化細胞分類および分析のための抗体染色
抗体染色に使用した緩衝液は、２％ウシ胎児血清、１０mＭ  ＨＥＰＥＳ、１０Ｕ／mＬヘパリンおよび１mg／mＬヒトガンマグロブリン(Ｇamimune, Ｍiles)を添加したダルベッコ修飾リン酸緩衝化食塩水(ＣＡ++およびＭｇ++非存在)であった。緩衝液で１／２に希釈したＨＣＣ−１ハイブリドーマ上清中で細胞１０7／mＬ、および抗−Ｔｈｙ１抗体(ＧＭ２０１)５μg／mＬを、３０分、氷上でインキュベートした。細胞を洗浄し、ＨＣＣ−１結合をＦＩＴＣ−結合ヤギ抗−マウスＩｇＭでおよび抗−Ｔｈｙ１結合をＰＥ−結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ1(両方とも１／１００希釈、Ｓouthern Ｂiotechnology Ａssociates)を使用して、３０分氷上でインキュベートして検出した。再び細胞を洗浄し、スルホローダミン結合抗−ＣＤ３４抗体
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を３μg／mＬで添加し、氷上で３０分インキュベートした。細胞を洗浄し、スルホローダミン蛍光を検出するために６００nmに同調させた色素レーザー(ＣＲ−５９９、Ｃoherent, Ｐalo Ａlto, ＣＡ)が付いたＦＡＣＳtarPLUS(Ｂecton Ｄickinson, Ｓan Ｊose, ＣＡ)で細胞分類または分析するために再懸濁した。
２重色蛍光を同時に非希釈ＨＣＣ−１上清と、モノクローナル抗体またはそれらの上清の１：１の混合物の直接フィコエリスリン(ＰＥ)結合体をインキュベートすることにより行った。細胞を４℃で４５分間インキュベートし、洗浄し、更に４５分間、１：５０希釈の蛍光イソチオシアネート(ＦＩＴＣ：Ｓouthern Ｂiotechnology Ａssociates, Ｂirmingham, ＡＬ)に結合したヤギ抗マウスＩｇＭ(μ重鎖特異的)とインキュベートした。ＩｇＧ上清を、ＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ(γ重鎖特異的；ＳＢＡ、Ｂirmingham, ＡＬ)の１：５０希釈を使用して検出した。ＣＤ４１、ＣＤ７１およびグリコフォリンＡモノクローナル抗体は、ＦＩＴＣ結合であり、従ってＨＣＣ−１をヤギ抗マウスＩｇＭ−ーＣを使用して検出した。分析ゲートは、＜１％細胞がその領域内で陽性であるように、イソタイプ調和対照抗体に従ってセットした。非結合対照は、両方とも抗サルモネラ抗体である３Ｄ３(ＩｇＧ１)および１Ａ６(ＩｇＭ)を含んだ(Ｌ. Ａshman博士, Ａustralia)。ＰＥおよびＦＩＴＣと結合したイソタイプ調和対照をＤakopattsから得た。フローサイトメトリー分析を、PROFILE II(Ｃoulter Ｅlectronics, Ｈialeah, Ｆlorida)を使用して、少なくとも５０，０００事象をリストモードで回収して行った。更にデータをEPICS-ELITEソフトウェアを使用して分析した。細胞分類をＦＡＣＳtarPLUS(Ｂecton Ｄickinson, Ｍountain Ｖiew, ＣＡ)で行った。分類細胞を、１０％ＦＣＳを添加したイスコフ修飾ダルベッコ培地(ＩＭＤＭ)に回収した。
３色免疫蛍光標識を、３番目の蛍光色素としてエネルギー結合色素(ＥＣＤ)を使用して行った。骨髄細胞を同時にハイブリドーマ上清およびＦＩＴＣおよびＰＥと結合した２つのＩｇＧイソタイプＭＡｂとインキュベートした。洗浄後、細胞をビチオンに結合したヤギ抗マウスＩｇＭ(１／５０希釈、Ｓouthern Ｂiotechnology)と４５分間、氷上でインキュベートし、３回洗浄し、更にストレプトアビジン−ＥＣＤ(Ｃoulter)の１／５０希釈とインキュベートした。一度免疫標識が完了すると、細胞を１％パラホルムアルデヒドに固定し、Ｃoulter Ｐrofileを使用して分析した。
結合抗体ＹＢ５.Ｂ８およびＨＬＡクラス１を使用する場合、ＣＤ３４をＩＣＨ３(ＩｇＧ２ａ)抗体、続いてヤギ抗マウス−ＩｇＧ２ａ−ＰＥ(Ｃaltag)で検出した。ＹＢ５.Ｂ８およびＨＬＡクラス１は、ヤギ抗マウス−ＩｇＧ１−ＦＩＴＣ(Ｃaltag)を使用して検出した。
ローダミン１２３(Ｒｈ１２３)
Ｒｈ１２３(Ｍolecular Ｐrobes Ｉnc., Ｐortland, Ｏregon)をＰＢＳ中に１mg／mＬで、−８０℃で、５％ＦＣＳを添加したハンクス平衡塩溶液(ＨＢＳＳ.５)中で０．１μg／mＬで使用する作業溶液と主に貯蔵した。ＢＭ細胞を１０7／mＬで、３７℃、５％ＣＯ2で１５分毎に混合しながら４５分インキュベートした。それらを２回ＨＢＳＳ.５で洗浄し、ＨＢＳＳ.５に再懸濁し、更に１５分、３７℃でインキュベートして残った非結合Ｒｈ１２３を除去した。細胞を更に２回ＨＢＳＳ.５で洗浄し、次いで、ＰＥおよびＥＣＯで標識した抗体で染色した。Ｒｈ１２３を含む細胞サンプルは、ローダミンが生存色素であるため、ＦＡＣＳ固定せず、標識の日に分析または分類した。
造血細胞先祖のクローン原性検定
分類細胞集団を、その顆粒球マクロファージコロニー形成細胞(ＣＦＵ−ＧＭ)、未分化赤血球先祖(ＢＦＵ−Ｅ)および多能性コロニー形成細胞(ＣＦＵ−ＧＥＭＭ)の含量について分析した。細胞を、３mＭ  Ｌ−グルタミン、３０％ＦＣＳ、１％脱イオン化ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ：Ｃohn fraction Ｖ, Ｓigma)、ヒト膀胱癌細胞系５６３７由来の５％条件培地、１ng  ｒＨｕ  ＩＬ−３(Ａmgen, Ｔhousand Ｏaks, ＣＡ)および４ＵのｒＨｕ−エリスロポイエチン(Ｅprex：２０００単位／mＬ、Ｊanssen Ｃilag, Ｓwitzerland)を添加したＩＭＤＭ中の０．９％メチルセルロースから成る培地１mlに１０3から２×１０4細胞で３つずつ置いた。全ての検定は、３７％、空気中、５％ＣＯ2の高湿度雰囲気下でインキュベートした。ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーを、培養１４日目にＳimmons et al.(1990)Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 87:1386の記載にしたがって採点した。
長期骨髄培養
この方法は、ＳimmonsおよびＴorok-Ｓtorb(1991)；Ｂlood, 78:55；およびＳimmons et al.(1987)Ｎature, 328:429に記載の方法に基づく。ＢＭＭＮＣを、葉酸(０．０１mg／mＬ)、ミオイノシトール(０．４mg／mＬ、Ｓigma)、１μＭ  ヒドロコルチゾンコハク酸ナトリウム(Ｓigma)、５×１０-5Ｍ  ベータメルカプトエタノール、１２．５％ＦＣＳおよび１２．５％ウマ血清(ＣＳＬ, Ｍelbourne, Ａustralia)含有１０mＬ  長期液体培養(ＬＴＬＣ)培地(α−最少必須培地、Ｇibco)含有Ｔ−２５組織培養フラスコ(Ｃorning)中で、５％ＣＯ2中３７℃で３から４週間、細胞の付着層がコンフルエントになるまで維持して培養した。次いで、それらを１５  Ｇｙ(137Ｃｓ)で放射し、ＬＴＬＣ培地に、間質層の源として使用すべき、３５mm組織培養皿当たり１−２×１０5細胞で移した。１×１０4分類ＢＭＭＮＣを３mＬ  ＬＴＬＣに再懸濁し、各プレートで３個ずつ調整した各分類フラクションに入れた。クローン源性検定はまたフラクションのそれぞれの入力クローン原性細胞の数を提供するのにまた行った。一週間間隔で、１０週間までの期間にわたり、非付着性細胞１．５mＬを注意深く各培養物から移し、当量の予め暖めたＬＴＬＣ培地に移した。各週供給で回収した培地に存在する非付着性細胞の数を、血球計算盤を使用して計数し、クローン原性細胞(ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅ)の数を、Ｓimmons et al.(1987)Ｎature 328:439およびＳimonns et al. (1990)記載のように測定した。
前−ＣＦＵ検定
この検定は、最初にＩscove et al.(1989)Ｊ. Ｉmmunol. 142:2332により行われ、Ｈaylock et al.(1992)Ｂlood 80:1405により修飾された。免疫標識ＢＭＭＮＣを、ＦＡＣＳtarPLUSを使用して細胞フラクションに分類し、前−ＣＦＵ培地(３０％ＦＣＳ、１％脱イオンＢＳＡ、３mＭ  Ｌ−グルタミンおよび５×１０-5Ｍ  ベータメルカプトエタノール添加ＩＭＤＭ)に、１０3細胞／mＬの濃度で再懸濁した。３つの１mＬ懸濁液培養を、それぞれ以下のヒト成長因子を最終濃度１０ng／mＬで添加した前−ＣＦＵ培地中に、２４ウェルプレートで作った：全てＡmgen(Ｔhousand Ｏaks, ＣＡ)から提供されたヒトインターロイキン−１β(ＩＬ−１β)、ＩＬ−３、ＩＬ−６、顆粒球コロニー刺激因子(Ｃ−ＣＳＦ)、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)および幹細胞因子(ＳＣＦ)。クローン原性検定を３つずつ行い、前−ＣＦＵ培養を開始するのに使用した入力集団におけるＣＦＵ−ＧＭの数を測定した。培養物を５％ＣＯ2下、２８日間、３７℃でインキュベートした。７、１４、２１および２８日目に、各ウェルの内容物を除去し、ＩＭＤＭ中に洗浄し、細胞計数を行い、前週の細胞製造を測定した。回収細胞の１／１０について、そのＣＦＵ−ＧＭ(前記のように)を検定し、更に１／１０を、前記の６種のヒト成長因子を含む新鮮飼育培地での前−ＣＦＵ培養にセットした。細胞の残りは、細胞形態を評価するために、免疫表現型分析またはシトスピンの製造に使用した。
白血病細胞
患者から白血病細胞を得、Ｔo et al. (1989) Bone Ｍarrow Ｔransplant 4:41の方法に従い、−１９６℃で凍結保存した。簡単には、滅菌方法を使用して、細胞を１０7から１０8mＬでＲＰＭＩに懸濁し、等量の“凍結混合物”(２０％ＦＣＳおよび１０％ジメチルスルフオキシド)を振盪しながら滴下した。細胞懸濁液を２mＬ  プラスチック凍結容器(Ｎunc Ｉntermed, Ｄenmark)に入れ、制御冷凍庫(ＫＲＹＯ  １０シリーズ)で凍結させた。凍結保存細胞を、急速に予め暖めておいた(３７℃)培地で希釈し、細胞を融解した(１０mmol／Ｌクエン酸、２％ＢＳＡおよび５０kunitz単位／mＬ  ＤＮＡase添加Ｃａ2+、Ｍｇ2+非存在ＨＢＳＳ)。この方法は本質的にＨaylock et al. (1992)記載のように行った。単核細胞をＬymphoprepで分類後回収し、２回融解液(上記)で洗浄し、更に分析するために１０7／mＬで再懸濁した。
細胞系
細胞系を、空気中５％ＣＯ2含有、高湿度雰囲気下、３７℃で、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ中に滅菌プラスチックフラスコ(７５cm2表面領域、Ｃorning 25110-75)中に維持した。ＴＦ−１細胞系を、１０名のｇ／mＬ組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ(Ａmgen, Ｔhousand Ｏaks, ＣＡ)と添加した培地で成育させ、ＭＯ７ｅ細胞系にｒＨｕＩＬ−３(Ａmgen)１０ng／mＬ添加した。全ての細胞系を２、３日毎に継代培養し、５×１０4mＬから５×１０5／mＬの間の対数増殖を維持させた。ＴＦ−１、ＭＯ７ｅ、ＮＡＬＭ−６およびＲＣ２Ａ細胞系は、Ｌ. Ａshman博士から善意で提供された。他の全ての造血細胞系(Ｋ５６２、ＨＥＬ−ＤＲ、ＨＥＬ９００、ＨＩ−Ｍｅｇ、ＫＧ１、ＨＬ６０、ＤＡＵＤＩ、ＢＡＬＭ、ＪＵＲＫＡＴ、ＨＵＴ７８、ＭＯＬＴ４およびＵ９３７)はＭatthew Ｒoberts Ｌaboratory, Ｈanson Ｃentre for Ｃancer Ｒesearch, IMVS, Ａdelaide, Ａustraliaで慣用的に維持されている。
実施例２
ＨＣＣ−１で認識される細胞の特性
モノクローナル抗体ＨＣＣ−１を、最初にその骨髄細胞中のＣＤ３４+細胞の亜集団に対する特性を基本にして選択した。図１に示す結果は、骨髄中の平均６９±５．９％のＣＤ３４+細胞(５５−８２％の範囲、ｎ＝５)が、一方静止期末梢血の４６．４±９．５％のＣＤ３４+細胞(４２−６５％の範囲、ｎ＝３)がＨＣＣ−１を発現した。図１Ｂに示す結果は、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１+およびＣＤ３４+ＨＣＣ−１-亜集団は別の光分散特性を示し、前者は低い直角光分散および中程度の前部光分散(ＦＳＣ)の細胞を含むが、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１-集団は２頂点ＦＳＣ分散を示す細胞を含む。
これらの２つの集団を更に特徴付するために、３色フローサイトメトリー分析を、系統制限抗原または活性化マーカーが同定された、十分定義された特性のモノクローナル抗体のパネルと組み合わせて、ＨＣＣ−１およびＨＰＣＡ−２(ＣＤ３４)を使用して行った。図２に示すように、ＨＣＣ−１はＣＤ３４+細胞共発現骨髄細胞(ＣＤ３４、ＣＤ３３)、赤血球(グリコフォリンＡ)、Ｔリンパ球(ＣＤ２、ＣＤ７)およびＢリンパ球(ＣＤ１０、ＣＤ１９)制限抗原に結合する。図２において、外形プロットは、ゲーティングパラメーターに付されていない、ある２００，０００事象を含むリストモードファイルから産生した−即ち、分散特性または蛍光強度。このヒストグラムそれぞれは、各３色染色サンプルから回収したリストモードファイル由来の１０，０００のＣＤ３４+事象から産生した。表３に示すように、ＨＣＣ−１またはｃ−kit、ＣＤ４５、ＣＤ３７およびＨＬＡ−ＤＲを発現するＣＤ３４+細胞の集団を小分割する。
表３において、データは平均±ＳＤおよび、ＨＬＡ−クラス１、ＣＤ７１およびＣＤ４５以外、全ての系統抗原について３−５実験の範囲である(例えば、ＣＤ３４+ＣＤ１９+細胞の５７．２±５．０％がＨＣＣ−１を発現する)。
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ＨＣＣ−１発現を表１２および１３ならびに表４に示す。
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実施例３
ＨＣＣ−１と系統制限クローン原性先祖およびその前駆体との反応性
表５に示すように、ＢＭＭＮＣの蛍光活性化細胞分類(ＦＡＣＳ)は、骨髄細胞(ＣＦＵ−ＧＭ)および赤血球(ＢＦＵ−Ｅ)先祖がＣＤ３４+ＨＣＣ−１+およびＣＤ３４+ＨＣＣ−１-亜集団から回収されることを完全に証明した。
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データは４つの実験の３つずつの培養の平均＋ＳＥＭで示す。
２つの亜集団のＣＦＵ−ＧＭの数は、ＨＣＣ−１+およびＨＣＣ−１-集団と比較した場合、または非分画ＣＤ３４+集団におけるＣＦＵ−ＧＭの発生率と比較した場合、有意な差はなかった(Ｆridmanの変位の両側検定ｐ＜０．０５)。しかしながら、ＢＦＵ−Ｅについて、ＨＣＣ−１-亜集団が数が多い傾向があるが、統計的有意には至らなかった。加えて、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１+フラクションのＢＦＵ−Ｅは、主に大多中心タイプであったが、ＨＣＣ−１-フラクションにおいては、単一赤血球コロニーまたは小さい集落と比較して、より小さかった。ＨＣＣ−１+およびＨＣＣ−１-亜集団における系統限定先祖の存在と比較して、多能性クローン原性細胞(ＣＦＵ−ＧＥＭＭ)は、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１+集団中でのみ回収された。ＣＤ３４+ＨＣＣ−１+およびＣＤ３４+ＨＣＣ−１-における階級的により未分化の先祖の存在をまた試験した。先の研究は、標準間質性細胞依存性長期骨髄培養条件(長期培養開始細胞；ＬＴＣ−ＩＣ、Ｓutherland et al. (1989) Ｂlood 74:1563)またはサイトカイン由来懸濁培養検定(前−ＣＦＵ検定、Ｓmith et al. (1991) Ｂlood 77:2122；およびＢrandt et al. (1990) Ｊ. Ｃlin. Ｉnvest. 86:932)における造血細胞を開始および維持する能力を有する未分化造血細胞は、高いレベルのＣＤ３４抗原を発現するが、低いか検出不能なレベルのＣＤ３３、ＣＤ３８またはＨＬＡ−ＤＲを発現し、生物蛍光色素ローダミン１２３の低い保持を示す小さい芽細胞である。Ａndrews et al. (1989)；Ｔerstappen et al. (1991)；Ｂrandt et al. (1990)；およびＵdomsakdi et al. (1991)。これらの抗原の発現を欠くＣＤ３４+細胞およびＣＤ３４+Ｒholo細胞(図２のように)における高レベルのＨＣＣ−１は、ＬＴＣ−ＩＣおよび前−ＣＦＵからＨＣＣ−１に結合するＣＤ３４+細胞の亜集団中に存在する可能性を示唆する。従って、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１+およびＣＤ３４+ＨＣＣ−１-フラクションを、正常成人ＢＭＭＮＣから単離し、ＬＴＢＭＣと放射同種異系骨髄間質細胞の共培養に続く造血の開始の能力を検定する。図３に示すように、ＣＦＵ−ＧＭおよび成熟骨髄細胞の製造を支持する能力を有する細胞は、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１+集団にのみ存在した。
Ｕdomsakdi et al. (1991)が提示のデータは、インビトロ効果と同様な、ＣＤ３４+細胞による低いＲho123保持を証明する。従って、３色ＦＡＣＳを、ＣＤ３４+Ｒholo集団をＨＣＣ−１+およびＨＣＣ−１-に細分割するのに使用した。図２は、ＣＤ３４+細胞の８．５％がＲholoＨＣＣ−１+であるが、ＣＤ３４+細胞の１．５％がＲholoＨＣＣ−１-であることを示す。図３に示す実験は、未分化造血細胞活性が、ＨＣＣ−１抗体に結合したＣＤ３４+Ｒholo細胞の亜集団(すなわち、ＣＤ３４+ＲholoＨＣＣ−１+)に制限されることを証明した。
同様な一連の実験を行い、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１+およびＣＤ３４+ＨＣＣ−１-亜集団の、サイトカイン由来間質細胞非存在懸濁培養(前−ＣＦＵ)検定(Ｓmith, et al. (1991)；Ｂrandt, et al. (1990)；Ｈaylock et al.)における初めからのＣＦＵ−ＧＭ産生の能力を評価した。図５は、間質細胞依存検定で得られた結果に従い、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１+細胞のみが、前−ＣＦＵ培養条件下でＣＦＵ−ＧＭの製造を支持することを示す。ＣＤ３４+ＨＣＣ−１+集団は、更にＣＤ３４+ＨＣＣ−１hiおよびＣＤ３４+ＨＣＣ−１loに、図４に示すように細分割された。これらの２つのサブセットの分化能力の分析は、図５に示すように、ＣＦＵ−ＧＭの最初からの産生の能力を有する細胞が、ほとんどすべてＣＤ３４+ＨＣＣ−１hiを制限することを証明した。
実施例４
ＣＤ３４+造血細胞上のＨＣＣ−１抗原の発現
ＨＣＣ−１モノクローナル抗体を、正常ヒト骨髄(ＢＭＭＮＣ)および末梢血単核細胞(ＰＢＭＮＣ)におけるその反応性を、図６に示すように、間接的免疫蛍光により試験した。８人の正常の個体ＨＣＣ−１はＢＭＭＮＣの４９．５±４．１％(平均±ＳＥＭ、ｎ＝８)で発現するが、一方末梢血でＨＣＣ−１は９．８±２．２％(平均±ＳＥＭ、ｎ＝６)発現した。
ＨＣＣ−１は、ＢＭ中のＴリンパ球細胞の僅かな割合(ＣＤ２+細胞の１２±２．０％がＨＣＣ−１を発現)で発現されるが、ＣＤ１９+Ｂリンパ球細胞の高い割合(２３．９±６．４％)がＨＣＣ−１を発現する。ＢＭ中のＣＤ３４+骨髄細胞３７．４±５．７％がＨＣＣ−１を発現するが、一方ＰＢ中に見られる成熟顆粒球はこの抗原を発現しなかった。ＨＣＣ−１は血小板の生成集団では検出不可能であるが、赤血球特異的抗原、グリコフォリンＡ(ＧＬＹ−Ａ)との共発現で測定して、赤血球の６１．９％±６．７％(ｎ＝４)で検出された。
実施例５
細胞系におけるＨＣＣ−１抗原の発現
種々の培養造血細胞系におけるＨＣＣ−１の発現を、間接的免疫蛍光で試験した。細胞系をＨＣＣで、４℃で４５分間免疫標識し、洗浄し、更に４５分間、フィコエリスリン(ＰＥ、Ｓouthern Ｂiotechnology Ａssociates, Ｂirmingham, Ａlabama)結合ヤギ抗マウスＩｇＭ  １：５０希釈(μ鎖特異的)とインキュベートした。ＨＢＳＳ５で２回洗浄後、細胞を１％パラホルムアルデヒドを使用して固定し、Ｐrofile II(Ｃoulter, Ｈialeah, Ｆlorida)を使用したフローサイトメトリー分析に付した。分析ゲートを非結合イソタイプ適合ＩｇＭ制御抗体１Ａ６(Ｌeonie Ａshman博士、Ｈanson Ｃentre for Ｃancer Ｒesearch, IMVS)に従ってセットした。得られた結果を図６に示し、ＨＣＣ−１がＢ細胞系および組織球細胞系Ｕ９３７には結合しないが、Ｔ細胞系およびＡ５６２は全て高レベルのＨＣＣ−１抗原を発現することを示す。
実施例６
ヒト白血病細胞におけるＨＣＣ−１の発現
ＨＣＣ−１がＣＤ３４およびＣＤ３３を発現するＢＭＭＮＣの大多数で発現するため、白血病細胞がまたＨＣＣ−１を発現するか否かの決定が興味深かった。各場合において、診断を標準臨床基準および広範な細胞表面マーカーの特徴付により確立した。骨髄サンプルを、診断時に得、ＣＤ３４およびＨＣＣ−１の発現について試験した。代表例を図７に示し、データを表６に要約する。
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ＨＣＣ−１は分析した全ての白血病サンプルで発現されるが、急性白血病の７７％が正常レベル以下のＨＣＣ−１を発現することが判明した。急性白血病ＢＭ細胞におけるＣＤ３４抗原の発現は、サンプルの８７％に増えた。しかしながら、ＣＤ３４+細胞のＨＣＣ−１発現は、急性白血病サンプルで８０％に減少した、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)サンプルもまたそのＨＣＣ−１発現を試験した。ＣＭＬサンプルの大部分が、試験した急性白血病サンプルで見られたより高い割合のＣＤ３４+細胞のＨＣＣ−１を発現した。
実施例７
クローニングＣＤ５９
ＨＣＣ−１抗原をコードする遺伝子を単離するために、レトロウイルス発現ライブラリーを、Ｒayner及びＧonda(Ｍol. Ｃell Ｂiol. 1994)の方法により、一次間質細胞培養からのｍＲＮＡを使用して構築した。ｃＤＮＡ転写物を、レトロウイルスプラスミドベクター、ｐＲＵＦ.neoに指向性にクローン化した。ライブラリーからのＤＮＡをアンホトロピックパッケージング細胞系に形質導入し、一時的に産生されるレトロウイルス粒子を回収し、自己指向性パッケージング細胞系の安定な感染に使用した。後者の細胞から産生されるウイルスを、続いて因子依存的マウス造血細胞系ＦＤＣ−Ｐ１の感染に使用した。
感染ＦＤＣ−Ｐ１細胞をＧ４１８耐性について選択し、次いでＨＣＣ−１抗原を発現する細胞を単離し、富化した。形質転換体のクローン性集団をＦＡＣＳ分類およびメチルセルロース中のコロニー単離に従って確立した。
プロウイルス性組み込み体からｃＤＮＡを単離するために、ＰＣＲ増幅を使用した。これに続いて、ｃＤＮＡを配列決定し、Genbank/ＥＭＢＬ配列相同性解析により、ｍＡｂＨＣＣ−１はヒトリンパ球抗原（ＣＤ５９）遺伝子によりコードされる抗原を認識することが明らかにされた。この結果を確認するために、ＣＤ５９  ｃＤＮＡをｐＲＵＦ.neoにサブクローンし、前記のようにＦＤＣ−Ｐ１細胞の感染に最後に使用した。ＨＣＣ−１に加えて、非依存的抗−ＣＤ５９  ＭＡｂ(ＭＥＭ  ４３)はＣＤ５９−発現形質転換体に結合できた。
実施例８
骨髄細胞のＨＣＣ−１hiおよびＨＣＣ−１lo集団への分離
死体骨髄細胞を得、実施例１記載のように処理し、ＨＣＣ−１ならびにＣＤ３４およびＴｈｙ−１に対する抗体で染色した。ＨＣＣ−１染色で分類したＣＤ３４+細胞は、ＨＣＣ−１lo/-およびＨＣＣ−１hiと名付ける２つの別の集団を形成することが判明した。図８Ａ。ＨＣＣ−１hi細胞は典型的にイソタイプ対照抗体より１０倍大きい平均蛍光強度を有した。ＨＣＣ−１hi細胞は、得られた細胞の少数派であることが判明した。図８Ｂ。ＨＣＣ−１lo/-細胞(図８Ｃ)は、非常に(７４％)Ｔｈｙ−１-ＣＨ３４+および僅か２．５％Ｔｈｙ−１+ＣＨ３４+(図８Ｄ)であることが判明した；一方、ＨＣＣ−１hi細胞(図８Ｅ)は、３１％Ｔｈｙ−１+ＣＨ３４+および３０％Ｔｈｙ−１-ＣＨ３４-(図８Ｆ)であることが判明した。
実施例９
ＨＣＣ−１+細胞の特徴付
分類細胞集団を、間質細胞との３−６週間の共培養における敷石領域形成細胞の頻度の分析のために、Ｂaum et al. (1989)の方法に従って、成熟骨髄細胞の増殖を促進するために、ヒト組換えＩＬ−６  １０ng／mＬおよびＬＩＦ  ２０ng／mＬを添加して、制限希釈して分析した。
Ｗhitlock et al. (1987) Ｃell 48:1009-1021記載のマウス間質細胞、ＡＣ６は、支持的環境として働いた。ＡＣ６、ＡＣ６．２１の継代を本発明で使用し、別にＳｙｓ１と呼ぶ。コンフルエントな間質細胞層を７−８週間まで継代せずに、組織培養培地を５−７日毎に変えて維持した。継代のために、間質細胞層を３回無血清培地で洗浄し、次いで無血清培地中の０．５mg／mＬ  コラゲナーゼ−ディスパース(Ｂoehringer−Ｍannheim, Ｉndianapolis, ＩＮ)２．５mＬ(Ｔ−２５フラスコ)を重層した。培養物を３７℃で１５−３０分インキュベートした；次いで、酵素被覆培地中の細胞を回収し、血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地に回収した。間質細胞をパスツールピペットでピペッティングして懸濁し、次いで元の細胞濃度の１／５から１／５０で直接培養した。一般に、１：１０で副次培養したコンフルエントな間質層は、５−７日後に再びコンフルエントに到達する。
ＨＣＣ−１hiおよびＨＣＣ−１lo/-サブセットに分類したＣＤ３４+死体骨髄細胞を、造血細胞発展に好ましい条件下で、予め確立した間質細胞単層(ＡＣ６．２１)で制限希釈した。(５０％  ＩＭＤＭ、４５％  ＲＰＭＩ、５％ウシ胎児血清、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、１mＭ  ピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／mＬ  ペニシリン、１００μg／mＬ  ストレプトマイシン、４mＭ  Ｌ−グルタミン、１０ng／mＬ  ヒト組換えＩＬ−６および２０ng／mＬ  ヒト組換えＬＩＦ添加)。培養物を厳しい非屈折細胞の集落の形成の割合を視覚的採点した。集落を、毎週、＞５０細胞の敷石領域の存在を採点し、最初に置いた敷石領域形成細胞(ＣＡＦＣ)の頻度を制限希釈分析により計算した。
骨髄およびＢリンパ球子孫の両方の出現を、６週間後、培養皿から細胞を回収し、抗−ＣＤ１９−ＦＩＴＣ、抗−ＣＤ１５−ＦＩＴＣおよび抗−ＣＤ３３−ＰＥ(全てＢecton Ｄickinsonから)で染色し、ＦＡＣＳＣＡＮで分析した。得られた結果を図９および表７に示す。
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実施例１０
ＳＣＩＤ−ｈｕ胸腺検定
分類細胞集団を、胎児胸腺片にマイクロインジェクトし、ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウス腎臓カプセル下で、Ｇaly et al. (1994) Blood 84:104記載の方法に従ってインプラントした。インプラント６週間後、胸腺片を回収し、Ｔ細胞子孫の存在について分析した。簡単に、胎児胸腺のフラグメントを、ゼラチン筏(rafts)(Ｇelfoam, Ｕpjohn)の上のニトロセルロースフィルター(０．８μm、Ｃoster Ｃorp., Ｃambridge, ＭＡ)に、Ｇaly et al. (1993) Ｊ. Ｅxp. Ｍed. 178:391記載の方法に従って置いた。２５℃および５％ＣＯ2でインキュベーション７−１３日後、胸腺フラグメントを、137Ｃｓ源(Ｊ. Ｌ. Ｓhepherd ＆ Ａssociates)由来の２５０cＧyで放射、洗浄し、油充填マイクロインジェクター(Ｎarishige)および１mm  直径ガラスマイクロピペット(Ｗorld Ｐrecisiion Ｉnstruments)を使用して、１μl容量中のＨＬＡ−不適合分類細胞ＨＣＣ−１hiまたはＥＣＣ−１lo/-サブセットに分類したＣＤ３４+死体骨髄細胞とすぐにマイクロインジェクトした。フラグメントをフィルターに戻して置き、３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートし、次いで、Ｓystemix Ｉnc.(Ｐalo Ａlto, ＣＡ)で繁殖させた、麻酔した６−８週令のｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスの腎臓カプセル下に挿入した。マウスを移植６週間後に殺し、胸腺移植片を回収し、一細胞懸濁液に分解し、ＦＡＣＳcanの３色免疫蛍光分析に付した。以下のＭＡｂを使用した：フルオレッセイン結合抗−ＨＬＡ抗体、抗ＣＤ２またはマウスＩｇＧ無関係対照、フィコエリスリン結合Ｗ６／３２、抗−ＣＤ１ａ(Ｃoulter)、抗−ＣＤ４またはマウスＩｇＧ１対照(Ｂecton Ｄickinson)およびＴricolor(ＴＣ)結合抗ＣＤ４５、−ＣＤ８、−ＣＤ３またはマウスＩｇＧ１無関係対照(Ｃaltag)。結果を図１０に示し、そこで“陽性”は＞１％提供者−由来胸腺の移植片を意味する。
実施例１１
ＳＣＩＤ−ｈｕ骨髄検定
分類細胞集団を、Ｃhen et al. (1994) Ｂlood 84:2487記載の方法に従って、ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスに皮下的にインプラントされた胎児骨片に注入した。注入８週間後、骨片を、骨髄細胞、赤血球およびリンパ球子孫について分析した。簡単に、割った胎児の長い骨を、麻酔下、ＳＣＩＤマウスの乳房脂肪パッド中に皮下的にインプラントした。受容者の胎児骨および提供者ＡＢＭ細胞のＨＬＡ免疫表現型分類は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ＡＴＣＣ)から得たハイブリドーマ由来のＦＩＴＣ結合ＭＡ２．１、ＢＢ７．２、ＧＡＰ−Ａ３およびＷ６／３２  ＭＡｂで行った。ＳＣＩＤ−ｈｕ骨マウスを、８週間骨インプラント後のＨＬＡ−不適合分類細胞集団ＨＣＣ−１hiおよびＨＣＣ−１lo/-サブセット似分類したＣＤ３４+死体骨髄細胞の受容者として使用し、単一全体放射投与(137Ｃｓ源から４００ｃＧｙ、ガンマ細胞４０、Ｊ. Ｌ. Ｓhepherd＆Ａssociates)を受けた。次いで、分類細胞(１０μＬ中で３×１０4)を直接移植骨に、ハミルトンシリンジに結合した針を使用して直接注入した。８週間後、マウスを殺し、ヒト骨を回収した。興奮骨細胞を赤血球細胞溶解液に再懸濁し、次いで２回緩衝液で洗浄し、ＨＬＡ抗体のＦＩＴＣで染色する前に計数し、種々の造血系統をＰＥ−結合抗体：抗−ＣＤ１９および抗−ＣＤ２０(Ｂ細胞)；抗−ＣＤ３３、抗−ＣＤ１４および抗−ＣＤ１５(骨髄細胞)；抗−ＣＤ１６および抗−ＣＤ５６(ＮＫ細胞)；抗−グリコフォリンＡ(赤血球細胞)；および抗−ＣＤ３４(先祖細胞)。ＦＩＴＣおよびＰＥ−結合無関係マウス免疫グロブリンを陰性対照として使用した。細胞をＦＡＣＳcan蛍光細胞分析器(Ｂecton Ｄickinson)で分析した。結果を図１１および表８に示し、ここで“陽性”は＞１％提供者由来細胞の移植片を意味する。結果は、ＣＤ３４+ＨＣＣ−１hi集団が全てのＳＣＩＤ−ｈｕ骨移植可能性を含み、Ｂ−細胞、骨髄細胞、ＮＫ細胞、赤血球およびＣＤ３４先祖細胞を発生させることを示す。
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以上の発明が、理解を明確にするために、説明および実施例により詳細に記載しているが、当業者には、ある変化および修飾が実施し得ることが明白であろう。従って、記載および実施例は、本発明の範囲を制限するものではなく、添付の請求の範囲によって叙述されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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