(57)【要約】  本発明の課題は、異なる波長の光照射によってイオンチャネルの開閉が可能な、及び／又は、イオン透過性（光反応性）が高い、改変チャネルロドプシンを提供することである。その解決手段は、ボルボックス由来のチャネルロドプシンのＮ末端領域を、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１のＮ末端領域に置換したチャネルロドプシンのＣ末端領域を、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−２のＣ末端領域又はテトラセルミス・ストリアータ由来のチャネルロドプシンのＣ末端領域に置換する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボルボックス由来のチャネルロドプシンのＮ末端領域をクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１のＮ末端領域に置換したチャネルロドプシンのＣ末端領域を、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−２のＣ末端領域に置換したポリペプチドであって、配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜３０７番目のアミノ酸を少なくとも含むポリペプチドのＣ末端に、配列番号２に示すアミノ酸配列の２７０〜３１５番目のアミノ酸を少なくとも含むクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−２のＣ末端領域が付加されてなる改変チャネルロドプシン。
【請求項２】
ボルボックス由来のチャネルロドプシンのＮ末端領域をクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１のＮ末端領域に置換したチャネルロドプシンのＣ末端領域を、テトラセルミス・ストリアータ由来のチャネルロドプシンのＣ末端領域に置換したポリペプチドであって、配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜３０７番目のアミノ酸を少なくとも含むポリペプチドのＣ末端に、配列番号３に示すアミノ酸配列の２５２〜２９２番目のアミノ酸を少なくとも含むテトラセルミス・ストリアータ由来のチャネルロドプシンのＣ末端領域が付加されてなる改変チャネルロドプシン。
【請求項３】
配列番号１に示すアミノ酸配列の１６６番目のアミノ酸（システイン）がアラニンに置換されてなる請求項１又は２記載の改変チャネルロドプシン。
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである請求項３記載の改変チャネルロドプシン。
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含むアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである請求項３記載の改変チャネルロドプシン。
（ａ）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含むアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号５に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
【請求項６】
配列番号１に示すアミノ酸配列の１４２〜１６９番目のアミノ酸が、配列番号６に示すクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１のアミノ酸配列の１４３〜１７０番目のアミノ酸に置換されてなる請求項１又は２記載の改変チャネルロドプシン。
【請求項７】
配列番号６に示すアミノ酸配列の１６７番目のアミノ酸（システイン）がアラニンに置換されてなる請求項６記載の改変チャネルロドプシン。
【請求項８】
配列番号６に示すアミノ酸配列の１６２番目のアミノ酸（グルタミン酸）がトレオニンに置換されてなる請求項６又は７記載の改変チャネルロドプシン。
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである請求項７記載の改変チャネルロドプシン。
（ａ）配列番号７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号７に示すアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含むアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号７に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである請求項７記載の改変チャネルロドプシン。
（ａ）配列番号８に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号８に示すアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含むアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである請求項８記載の改変チャネルロドプシン。
（ａ）配列番号９に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号９に示すアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含むアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号９に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
【請求項１２】
ボルボックス由来のチャネルロドプシンのＮ末端領域をクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１のＮ末端領域に置換したチャネルロドプシンが有する７つの膜貫通ドメインの３番目の膜貫通ドメインを、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１が有する７つの膜貫通ドメインの３番目の膜貫通ドメインに置換したポリペプチドであって、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである改変チャネルロドプシン。
（ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含むアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１０に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
プロモーターと機能的に連結された請求項１３記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれかに記載のポリペプチドを発現する細胞。
【請求項１６】
細胞が視細胞である請求項１５記載の細胞。
【請求項１７】
網膜外層の障害を患う被検体を治療するための医薬の製造における、請求項１〜１２のいずれかに記載のポリペプチド、請求項１３記載のポリヌクレオチド、請求項１４記載の発現ベクターのいずれかの使用。
【請求項１８】
網膜外層の障害が、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、網膜はく離のいずれかである請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれかに記載のポリペプチド又は請求項１４記載の発現ベクターのいずれかを有効成分として含む網膜外層の障害を治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変チャネルロドプシンに関する。より詳細には、異なる波長の光照射によってイオンチャネルの開閉が可能な、及び／又は、イオン透過性（光反応性）が高い、改変チャネルロドプシンに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子導入によって光応答性タンパク（チャネルロドプシン）を発現させた神経細胞に、光を当てることで細胞応答を制御するオプトジェネティックス（Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：光遺伝学）により、視機能の再建を図る研究が世界的に行われていることは周知の通りであり、本発明者らも、ボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ）由来のチャネルロドプシンのＮ末端領域を、クラミドモナス・レインハルトチイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）由来のチャネルロドプシン−１のＮ末端領域に置換することで、細胞膜上での発現効率が改善された改変チャネルロドプシンを特許文献１において報告している。この改変チャネルロドプシンは、光を当てることでイオンチャネルを開いて興奮を誘起することができるものであり、失明に至ったラットの網膜にその遺伝子を導入することによって視力を回復させることに本発明者らは成功している。【０００３】
しかしながら、元来の網膜に存在する神経細胞は、イオンチャネルの開閉によって興奮とその抑制を行う機能を有することから、こうした生来の視覚システムにより近い改変チャネルロドプシンが求められている。また、これまでに報告されている改変チャネルロドプシンよりも、イオン透過性が高い改変チャネルロドプシンが求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第５３２２０６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明は、異なる波長の光照射によってイオンチャネルの開閉が可能な、及び／又は、イオン透過性が高い、改変チャネルロドプシンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意検討を行った結果、本発明者らが特許文献１において報告した改変チャネルロドプシンのＣ末端領域を、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−２のＣ末端領域又はテトラセルミス・ストリアータ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｔｒｉａｔａ）由来のチャネルロドプシンのＣ末端領域に置換することで、可視光の広い波長領域の光照射によってイオンチャネルを開き、イオンチャネルを開く波長よりも短い波長の光照射によってイオンチャネルを閉じるチャネルロドプシンが得られることを見出した。【０００７】
また、本発明者らが特許文献１において報告した改変チャネルロドプシンが有する７つの膜貫通ドメインの３番目の膜貫通ドメインを、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１が有する７つの膜貫通ドメインの３番目の膜貫通ドメインに置換することで、イオン透過性が高いチャネルロドプシンが得られることを見出した。【０００８】
上記の知見に基づいてなされた本発明の改変チャネルロドプシンは、請求項１記載の通り、ボルボックス由来のチャネルロドプシンのＮ末端領域をクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１のＮ末端領域に置換したチャネルロドプシンのＣ末端領域を、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−２のＣ末端領域に置換したポリペプチドであって、配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜３０７番目のアミノ酸を少なくとも含むポリペプチドのＣ末端に、配列番号２に示すアミノ酸配列の２７０〜３１５番目のアミノ酸を少なくとも含むクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−２のＣ末端領域が付加されてなる。
また、本発明の改変チャネルロドプシンは、請求項２記載の通り、ボルボックス由来のチャネルロドプシンのＮ末端領域をクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１のＮ末端領域に置換したチャネルロドプシンのＣ末端領域を、テトラセルミス・ストリアータ由来のチャネルロドプシンのＣ末端領域に置換したポリペプチドであって、配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜３０７番目のアミノ酸を少なくとも含むポリペプチドのＣ末端に、配列番号３に示すアミノ酸配列の２５２〜２９２番目のアミノ酸を少なくとも含むテトラセルミス・ストリアータ由来のチャネルロドプシンのＣ末端領域が付加されてなる。
また、請求項３記載の改変チャネルロドプシンは、請求項１又は２記載の改変チャネルロドプシンにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列の１６６番目のアミノ酸（システイン）がアラニンに置換されてなる。
また、請求項４記載の改変チャネルロドプシンは、請求項３記載の改変チャネルロドプシンにおいて、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである。
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含むアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
また、請求項５記載の改変チャネルロドプシンは、請求項３記載の改変チャネルロドプシンにおいて、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである。
（ａ）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含むアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号５に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
また、請求項６記載の改変チャネルロドプシンは、請求項１又は２記載の改変チャネルロドプシンにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列の１４２〜１６９番目のアミノ酸が、配列番号６に示すクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１のアミノ酸配列の１４３〜１７０番目のアミノ酸に置換されてなる。
また、請求項７記載の改変チャネルロドプシンは、請求項６記載の改変チャネルロドプシンにおいて、配列番号６に示すアミノ酸配列の１６７番目のアミノ酸（システイン）がアラニンに置換されてなる。
また、請求項８記載の改変チャネルロドプシンは、請求項６又は７記載の改変チャネルロドプシンにおいて、配列番号６に示すアミノ酸配列の１６２番目のアミノ酸（グルタミン酸）がトレオニンに置換されてなる。
また、請求項９記載の改変チャネルロドプシンは、請求項７記載の改変チャネルロドプシンにおいて、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである。
（ａ）配列番号７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号７に示すアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含むアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号７に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
また、請求項１０記載の改変チャネルロドプシンは、請求項７記載の改変チャネルロドプシンにおいて、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである。
（ａ）配列番号８に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号８に示すアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含むアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
また、請求項１１記載の改変チャネルロドプシンは、請求項８記載の改変チャネルロドプシンにおいて、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである。
（ａ）配列番号９に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号９に示すアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含むアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号９に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
また、本発明の改変チャネルロドプシンは、請求項１２記載の通り、ボルボックス由来のチャネルロドプシンのＮ末端領域をクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１のＮ末端領域に置換したチャネルロドプシンが有する７つの膜貫通ドメインの３番目の膜貫通ドメインを、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１が有する７つの膜貫通ドメインの３番目の膜貫通ドメインに置換したポリペプチドであって、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである。
（ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含むアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１０に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチド
また、本発明のポリヌクレオチドは、請求項１３記載の通り、請求項１〜１２のいずれかに記載のポリペプチドをコードする。
また、本発明の発現ベクターは、請求項１４記載の通り、プロモーターと機能的に連結された請求項１３記載のポリヌクレオチドを含む。
また、本発明の細胞は、請求項１５記載の通り、請求項１〜１２のいずれかに記載のポリペプチドを発現する。
また、請求項１６記載の細胞は、請求項１５記載の細胞において、細胞が視細胞である。
また、本発明は、請求項１７記載の通り、網膜外層の障害を患う被検体を治療するための医薬の製造における、請求項１〜１２のいずれかに記載のポリペプチド、請求項１３記載のポリヌクレオチド、請求項１４記載の発現ベクターのいずれかの使用である。
また、請求項１８記載の使用は、請求項１７記載の使用において、網膜外層の障害が、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、網膜はく離のいずれかである。
また、本発明の網膜外層の障害を治療するための医薬組成物は、請求項１９記載の通り、請求項１〜１２のいずれかに記載のポリペプチド又は請求項１４記載の発現ベクターのいずれかを有効成分として含む。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、異なる波長の光照射によってイオンチャネルの開閉が可能な、及び／又は、イオン透過性が高い、改変チャネルロドプシンを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１における、ｎｅｏｍＶＣｈＲ１発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドの構成である。
【図２】同、ｎｅｏｍＶＣｈＲ１を発現する細胞についてのパッチクランプ法による光誘発電流の測定結果である。
【図３】実施例２において、ｓｗｉｔＣｈがｎｅｏｍＶＣｈＲ１よりもイオン透過性が高いことを示すグラフである。
【図４】実施例３における、ｍＶＣｈＲ１−ＣｌＣｈＲ１−３ＴＭ発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドの構成である。
【図５】同、ｍＶＣｈＲ１−ＣｌＣｈＲ１−３ＴＭがｍＶＣｈＲ１よりもイオン透過性が高いことを示すグラフである。
【図６】実施例４において、ｓｗｉｔＣｈ２がｓｗｉｔＣｈよりも細胞膜における局在性が高いことを示す蛍光顕微鏡写真である。
【図７】実施例５において、ｓｗｉｔＣｈ２の１６１位のグルタミン酸をトレオニンに置換したｓｗｉｔＣｈ２−ｍｕｔ１がｓｗｉｔＣｈ２よりもイオン透過性が高いことを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の改変チャネルロドプシンは、本発明者らが特許文献１において報告した改変チャネルロドプシンを基礎とする。この改変チャネルロドプシンは、ボルボックス由来のチャネルロドプシンのＮ末端領域を、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１のＮ末端領域（細胞膜局在発現に関与する領域であって膜貫通ドメインを含まない）に置換することで、細胞膜上での発現効率が改善されたものであり、その具体例としては、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（特許文献１において配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド）が挙げられる。特許文献１に記載された事項は、本明細書に記載された事項として取り扱う。
【００１２】
本発明の改変チャネルロドプシンは、本発明者らが特許文献１において報告した改変チャネルロドプシンのＣ末端領域を、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−２のＣ末端領域又はテトラセルミス・ストリアータ由来のチャネルロドプシンのＣ末端領域に置換したものである。
【００１３】
本発明者らが特許文献１において報告した改変チャネルロドプシンのＣ末端領域を、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−２のＣ末端領域に置換した本発明の改変チャネルロドプシンは、具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜３０７番目のアミノ酸を少なくとも含むポリペプチドのＣ末端に、配列番号２に示すアミノ酸配列の２７０〜３１５番目のアミノ酸を少なくとも含むクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−２のＣ末端領域が付加されてなるものである。
【００１４】
本発明者らが特許文献１において報告した改変チャネルロドプシンのＣ末端領域を、テトラセルミス・ストリアータ由来のチャネルロドプシンのＣ末端領域に置換した本発明の改変チャネルロドプシンは、具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜３０７番目のアミノ酸を少なくとも含むポリペプチドのＣ末端に、配列番号３に示すアミノ酸配列の２５２〜２９２番目のアミノ酸を少なくとも含むテトラセルミス・ストリアータ由来のチャネルロドプシンのＣ末端領域が付加されてなるものである。
【００１５】
ここで、本発明の改変チャネルロドプシンが、例えば、４５０〜６００ｍｍといった可視光の広い波長領域の光照射によってイオンチャネルを開き、４００ｎｍといったイオンチャネルを開く波長よりも短い波長の光照射によってイオンチャネルを閉じる特性を有するためには、配列番号１に示すアミノ酸配列の１６６番目のアミノ酸（システイン）がアラニンに置換されることが好ましい。また、配列番号１に示すアミノ酸配列の１９４番目のアミノ酸（アスパラギン酸）がシステインに置換されたり、２２９番目のアミノ酸（ヒスチジン）がアスパラギンに置換されたりしてもよい。さらに、その他の部位特異的な変異を有していてもよい。
【００１６】
配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜３０７番目のアミノ酸を少なくとも含み、かつ、１６６番目がアラニンに、１９４番目がシステインに、２２９番目がアスパラギンに置換されたポリペプチドのＣ末端に、配列番号２に示すアミノ酸配列の２７０〜３１５番目のアミノ酸を少なくとも含むクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−２のＣ末端領域が付加されてなる本発明の改変チャネルロドプシンの具体例としては、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００１７】
配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜３０７番目のアミノ酸を少なくとも含み、かつ、１６６番目がアラニンに、１９４番目がシステインに、２２９番目がアスパラギンに置換されたポリペプチドのＣ末端に、配列番号３に示すアミノ酸配列の２５２〜２９２番目のアミノ酸を少なくとも含むテトラセルミス・ストリアータ由来のチャネルロドプシンのＣ末端領域が付加されてなる本発明の改変チャネルロドプシンの具体例としては、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００１８】
また、配列番号１に示すアミノ酸配列の１４２〜１６９番目のアミノ酸が、配列番号６に示すクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１のアミノ酸配列の１４３〜１７０番目のアミノ酸に置換されてもよい。この置換は、本発明者らが特許文献１において報告した改変チャネルロドプシンが有する７つの膜貫通ドメイン（即ちボルボックス由来のチャネルロドプシンが有する７つの膜貫通ドメイン）の３番目の膜貫通ドメインを、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１が有する７つの膜貫通ドメインの３番目の膜貫通ドメインに置換することを意味し、この置換により、イオン透過性を高めることができる。
【００１９】
この場合においても、例えば、４５０〜６００ｍｍといった可視光の広い波長領域の光照射によってイオンチャネルを開き、４００ｎｍといったイオンチャネルを開く波長よりも短い波長の光照射によってイオンチャネルを閉じる特性を有するためには、配列番号６に示すアミノ酸配列の１６７番目（配列番号１に示すアミノ酸配列の１４２〜１６９番目のアミノ酸と置換した後は１６６番目）のアミノ酸（システイン）がアラニンに置換されることが好ましい。また、配列番号１に示すアミノ酸配列の１９４番目のアミノ酸（アスパラギン酸）がシステインに置換されたり、２２９番目のアミノ酸（ヒスチジン）がアスパラギンに置換されたりしてもよい。さらに、その他の部位特異的な変異を有していてもよい。
【００２０】
また、配列番号６に示すアミノ酸配列の１６２番目（配列番号１に示すアミノ酸配列の１４２〜１６９番目のアミノ酸と置換した後は１６１番目）のアミノ酸（グルタミン酸）をトレオニンに置換することで、イオン透過性を高めることができる。また、配列番号１に示すアミノ酸配列の１７０番目のアミノ酸（ロイシン）をシステインに置換したり、１９７番目のアミノ酸（システイン）をセリンに置換したりしてもよい。
【００２１】
配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜３０７番目のアミノ酸を少なくとも含み、かつ、１４２〜１６９番目のアミノ酸が、配列番号６に示すクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１のアミノ酸配列の１４３〜１７０番目のアミノ酸に置換され、さらに、１６６番目がアラニンに、１９４番目がシステインに、２２９番目がアスパラギンに置換されたポリペプチドのＣ末端に、配列番号２に示すアミノ酸配列の２７０〜３１５番目のアミノ酸を少なくとも含むクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−２のＣ末端領域が付加されてなる本発明の改変チャネルロドプシンの具体例としては、配列番号７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００２２】
配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜３０７番目のアミノ酸を少なくとも含み、かつ、１４２〜１６９番目のアミノ酸が、配列番号６に示すクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１のアミノ酸配列の１４３〜１７０番目のアミノ酸に置換され、さらに、１６６番目がアラニンに、１９４番目がシステインに、２２９番目がアスパラギンに置換されたポリペプチドのＣ末端に、配列番号３に示すアミノ酸配列の２５２〜２９２番目のアミノ酸を少なくとも含むテトラセルミス・ストリアータ由来のチャネルロドプシンのＣ末端領域が付加されてなる本発明の改変チャネルロドプシンの具体例としては、配列番号８に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００２３】
配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜３０７番目のアミノ酸を少なくとも含み、かつ、１４２〜１６９番目のアミノ酸が、配列番号６に示すクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１のアミノ酸配列の１４３〜１７０番目のアミノ酸に置換され、さらに、１６１番目がトレオニンに、１６６番目がアラニンに、１９４番目がシステインに、２２９番目がアスパラギンに置換されたポリペプチドのＣ末端に、配列番号２に示すアミノ酸配列の２７０〜３１５番目のアミノ酸を少なくとも含むクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−２のＣ末端領域が付加されてなる本発明の改変チャネルロドプシンの具体例としては、配列番号９に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００２４】
本発明者らが特許文献１において報告した改変チャネルロドプシンが有する７つの膜貫通ドメインの３番目の膜貫通ドメインが、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１が有する７つの膜貫通ドメインの３番目の膜貫通ドメインに置換されてなる本発明の改変チャネルロドプシンの具体例としては、配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００２５】
本発明の改変チャネルロドプシンは、配列番号４，５，７〜１０のそれぞれに示すアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を有し、かつ配列番号４，５，７〜１０のそれぞれに示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチドを含む。また、配列番号４，５，７〜１０のそれぞれに示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号４，５，７〜１０のそれぞれに示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチドを含む。ここで、「複数個」とは、５０個以下の整数、好ましくは３０個以下の整数、より好ましくは１０個以下の整数、例えば２〜９個、２〜７個、２〜５個である。配列番号４，５，７〜１０のそれぞれに示すアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは少なくとも９５％であり、より好ましくは少なくとも９６％であり、さらに好ましくは少なくとも９７％であり、さらにより好ましくは少なくとも９８％であり、最も好ましくは少なくとも９９％である。なお、同一性の％は、複数（２つ）のアミノ酸配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＤＡＮＡＳＹＳ、ＢＬＡＳＴなど）をデフォルトの設定で使用して算出した値をいう。「同等の生物学的活性」とは、例えば光感受性、チャネル機能といった生物学的な活性の強さが実質的に同一であることをいう。また、この用語は、実質的に同質の生物学的活性を有する場合を含んでもよく、この場合の「同質」の生物学的活性とは、光感受波長やイオン透過性などの性質が同一であることをいう。
【００２６】
本発明の改変チャネルロドプシンは、遺伝子工学的手法により製造することができる。具体的には、まず、本発明の改変チャネルロドプシンをコードするポリヌクレオチド（以下、「本発明の改変チャネルロドプシン遺伝子」という）を調製する。本発明の改変チャネルロドプシン遺伝子は、当業者に公知の手法によって調製することができる。具体的には、例えば、本発明者らが特許文献１において報告した改変チャネルロドプシンをコードするポリヌクレオチド、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−２をコードするポリヌクレオチド、テトラセルミス・ストリアータ由来のチャネルロドプシンをコードするポリヌクレオチド、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１をコードするポリヌクレオチドのそれぞれの配列情報に基づいて化学合成することで調製することができる。また、それぞれのポリヌクレオチドの配列情報に基づき、それぞれのポリヌクレオチドの所望領域を増幅するＰＣＲプライマーを用いてそれぞれのポリヌクレオチドの所望領域を増幅し、連結することによって調製することもできる。次に、プロモーターと機能的に連結された本発明の改変チャネルロドプシン遺伝子を、宿主菌体内で複製維持が可能であり、コードされるポリペプチドを安定に発現させることができ、この遺伝子を安定に保持できる発現ベクターに組み込み、得られた組換え発現ベクターを用いて宿主を形質転換し、宿主において本発明の改変チャネルロドプシンを生産させることができる。組換え技術については、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９８４  ８１：５６６２や、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓなどを参照することができる。発現ベクターとしては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２８、ｐＧＥＸ４Ｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、及び他のプラスミドＤＮＡ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、及び他のプラスミドＤＮＡ）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、及び他のプラスミドＤＮＡ）、λファージ（λｇｔ１１やλＺＡＰ）、哺乳動物用プラスミド（ｐＣＭＶやｐＳＶ４０）、ウイルスベクター（例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどの動物ウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなどの昆虫ウイルスベクター）、植物用ベクター（例えばバイナリベクターｐＢＩ系）、コスミドベクターなどを用いることができる。ここで、「機能的に連結された」とは、プロモーター配列が目的のポリヌクレオチド配列の転写を開始することができるような、プロモーター配列と目的のポリヌクレオチド配列との間の機能的な結合をいう。プロモーターは特に制限されず、宿主に応じて適するプロモーターを選択すればよく、公知の構成的プロモーターや誘導性プロモーターを用い��ことができるが、構成的プロモーターを用いることが好ましい。その具体例としては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧプロモーター、シナプシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ＣａＭＶプロモーター、解糖系酵素プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ｔｈｙ１プロモーターなどが挙げられる。本発明の改変チャネルロドプシン遺伝子の発現ベクターへの挿入は、例えば、本発明の改変チャネルロドプシン遺伝子にフランキングする制限酵素部位を作製又は連結し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することにより行う。発現ベクターは、プロモーター及び本発明の改変チャネルロドプシン遺伝子の他、必要に応じてエンハンサー及び他のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（アンピシリン耐性マーカー、テトラサイクリン耐性マーカーなどの薬剤耐性遺伝子マーカー、ＬＥＵ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３などの栄養要求性相補遺伝子マーカー、ＡＰＨ、ＤＨＦＲ、ＴＫなどの優性選択マーカーなど）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）などを含んでもよい。宿主の形質転換は、プロトプラスト法、スフェロプラスト法、コンピテントセル法、ウイルス法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ジーンボンバートメント法、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーションなどを用いて行うことができる。こうして得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミンなどを含む培地を用いて適当な条件で培養する。形質転換体の培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、２５〜３７℃で３〜６時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液などを用いて行う。培養中は、必要に応じて、組換え発現ベクターに挿入した選択マーカーに応じて、アンピシリンやテトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。また、形質転換に使用する宿主は、本発明の改変チャネルロドプシンを発現できるものであれば特に制限されるものではなく、細菌（大腸菌や枯草菌）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）、動物細胞（ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞など）、昆虫細胞などが挙げられる。本発明の改変チャネルロドプシンは、形質転換体の培養により得られた培養物（培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞や菌体のホモジェネートなど）から一般的な方法によって分取や精製を行い、限外濾過濃縮、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化などによって、その活性を保持する形態で得ることができる。或いは、本発明の改変チャネルロドプシンは、単離や精製を行うことなく、本発明の改変チャネルロドプシンを発現する細胞の形態で提供してもよい。この場合、形質転換に使用する宿主細胞は、その後の用途に適した宿主細胞、例えば視細胞、好ましくヒト視細胞である。また、本発明の改変チャネルロドプシンを医療用途に使用する場合には、本発明の改変チャネルロドプシンの発現ベクターの形態で提供してもよい。この場合には、細胞への導入効率、細胞内での複製維持、安定性、発現効率などに優れた発現ベクターを用いることが好ましい。このようなベクターとしては、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクター、（自立複製可能な）プラスミド、トランスポゾンなどを挙げることができる。本発明の改変チャネルロドプシンの発現ベクター作製用プラスミドは、例えばＴｏｍｉｔａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２００７  Ａｕｇ；４８（８）：３８２１−６や、Ｓｕｇａｎｏ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２００５  Ｓｅｐ；４６（９）：３３４１−８に記載される方法に従って調製することができる。
【００２７】
ここで、本発明の改変チャネルロドプシン遺伝子としては、例えば、配列番号１１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード）、配列番号１２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード）、配列番号１３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード）、配列番号１４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号８に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード）、配列番号１５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号９に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード）、配列番号１６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード）が挙げられる。しかしながら、本発明の改変チャネルロドプシン遺伝子は、これらのポリヌクレオチドに限定されず、これらのポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、配列番号４，５，７〜１０のそれぞれに示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。また、配列番号１１〜１６のそれぞれに示す塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、さらに好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、配列番号４，５，７〜１０のそれぞれに示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ここで、「ストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーション」とは、例えば、３０〜５０℃、３〜４×ＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）、０．１〜０．５％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、好ましくは４０〜４５℃、３．４×ＳＳＣ、０．３％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び１×ＳＳＣ溶液、０．２×ＳＳＣ溶液による室温での連続した洗浄などの条件が挙げられる。ただし、上記条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記の要素や他の要素（例えば、ハイブリダーゼーションプローブの濃度、長さ及びＧＣ含量、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２８】
本発明の改変チャネルロドプシンは、本発明者らが特許文献１において報告した改変チャネルロドプシンが有する細胞膜上での発現効率が高いという特性を保持し、さらに、可視光の広い波長領域の光照射によってイオンチャネルを開き、イオンチャネルを開く波長よりも短い波長の光照射によってイオンチャネルを閉じるという特性や、イオン透過性が高いという特性を有するものである。従って、本発明の改変チャネルロドプシンや、これをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、網膜外層の障害を患う被検体の治療に有用である。ここで、「網膜外層の障害」とは、網膜外層に存在する視細胞が変性、消失するなどして視機能不全や視機能障害を生じているが、視細胞以外の細胞は依然として正常なままであったり、機能の一部が保持されていたりする任意の疾患をいう。このような疾患としては、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、網膜はく離などを挙げることができる。「被検体」とは、網膜外層の障害に起因して、失明している被検体や、失明のリスクを有する被検体を意味する。被検体はヒトに限らず、その他の哺乳動物であってもよい。その他の哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどが挙げられる。「網膜外層の障害を患う被検体の治療」とは、網膜外層の障害に起因して失明していたり、失明のリスクを有したりする被検体において、本発明の医薬の投与前と比較して、視機能を回復することを意味する。
【００２９】
本発明の医薬組成物は、本発明の改変チャネルロドプシンや、これをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効成分とし、網膜外層の障害を患う被検体を治療するための医薬として製剤化される。その有効量は、所与の症状や用法について治療効果を与え得る量であり、動物を用いた試験、臨床試験の実施により当業者によって適宜決定されるが、投与対象とする被検体の年齢、体重、性別、疾患の状態や重篤度、投与方法などが考慮される。ウイルスの場合、ウイルス量は、例えば１０１２〜１０１３ｃａｐｓｉｄｓ／ｍｌ（例えば、約１０１３ｃａｐｓｉｄｓ／ｍｌ）である。医薬としての製剤化に際し、有効成分は１以上の薬学的に許容される担体と共に製剤化されてよい。薬学的に許容される担体としては、各種緩衝液、例えば生理食塩水、リン酸塩、酢酸塩などの緩衝液が挙げられる。医薬は、その他の治療成分を含んでよい。その他の治療成分としては、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、網膜はく離などの治療剤として公知の薬剤が挙げられる。医薬は、例えば局所投与用の注射剤、点眼剤、洗眼剤などに製剤化することができる。注射用製剤は、保存剤を添加して、例えばアンプルや複数回投与容器中の単位投与剤形として提供することができる。また、医薬は、好適なビヒクル、例えば発熱物質不含の滅菌水などで使用前に再構成するための凍結乾燥剤としてもよい。医薬の投与は、被検体の患部、すなわち網膜への直接的な注射や、硝子体への直接的な接触によって行うことが好ましい。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。【００３１】
実施例１：配列番号４に示すアミノ酸配列からなる本発明の改変チャネルロドプシン（略称：ｎｅｏｍＶＣｈＲ１）
（ｎｅｏｍＶＣｈＲ１を発現する細胞の取得）
特許文献１に記載の方法に準じて次のようにして取得した。特許文献１に記載の配列番号１に示すアミノ酸配列からなる改変チャネルロドプシンの１〜３０７番目のアミノ酸（但し１６６番目をアラニンに、１９４番目をシステインに、２２９番目をアスパラギンに置換）をコードするポリヌクレオチドの領域と、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−２の配列番号２に示すアミノ酸配列の２７０〜３１５番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域が連結され、その５’末端と３’末端に制限酵素配列を付加したポリヌクレオチドを化学合成し、アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入した。こうして調製したｎｅｏｍＶＣｈＲ１発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドの構成を図１に示す。このプラスミドは、マルチクローニングサイトの３’領域に蛍光タンパク質遺伝子（ｖｅｎｕｓ）が配置されており、目的遺伝子はＣ末領域にｖｅｎｕｓを付加した融合タンパク質として発現されるので、ｖｅｎｕｓを指標にしてセルソータ（ＳＨ−８００、Ｓｏｎｙ）を用いてｎｅｏｍＶＣｈＲ１を発現する細胞を分取した。なお、細胞は、Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ（ＨＥＫ）２９３細胞を用い、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。ｎｅｏｍＶＣｈＲ１発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドは、２種類のプラスミド（ｐＡＡＶ−ＲＣ、ｐＨｅｌｐｅｒ）とともに、制限酵素で切断して直鎖状にした後、エレクトロポレーション法（ＣＵＹ２１Ｐｒｏ−ｖｉｔｒｏ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｅｐａ  Ｇｅｎｅ）により細胞に導入した。【００３２】
（パッチクランプ法による光誘発電流の測定）
ｎｅｏｍＶＣｈＲ１を発現する細胞について、顕微鏡下でｖｅｎｕｓの発現を確認した後、パッチクランプシステム（ＥＰＣ−１０、ＨＥＫＡ）を用いて測定した。細胞外液は、１３８ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ  ＮａＯＨ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２からなり、１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ７．４に調整したものを用いた。電極内液は、１３０ｍＭ  ＣｓＣｌ、１．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  Ｎａ２ＡＴＰからなり、１Ｎ  ＣｓＯＨでｐＨ７．２に調整したものを用いた。光照射は１秒間で行い、強度は１μＷ／ｍｍ２に設定した。波長は４００、４５０、５００、５５０、６００ｎｍのそれぞれとした。結果を図２に示す。図２から明らかなように、ｎｅｏｍＶＣｈＲ１は、４５０〜６００ｍｍの可視光の広い波長領域の光照射によってイオンチャネルを開き、イオンチャネルを開く波長よりも短い４００ｎｍの光照射によってイオンチャネルを閉じる特性を有することがわかった。【００３３】
実施例２：配列番号８に示すアミノ酸配列からなる本発明の改変チャネルロドプシン（略称：ｓｗｉｔＣｈ）
特許文献１に記載の配列番号１に示すアミノ酸配列からなる改変チャネルロドプシンの１〜１４１番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域と、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１の配列番号６に示すアミノ酸配列の１４３〜１７０番目のアミノ酸（但し１６７番目をアラニンに置換）をコードするポリヌクレオチドの領域と、配列番号１に示すアミノ酸配列の１７０〜３０７番目のアミノ酸（但し１９４番目をシステインに、２２９番目をアスパラギンに置換）をコードするポリヌクレオチドの領域と、テトラセルミス・ストリアータ由来のチャネルロドプシンの配列番号３に示すアミノ酸配列の２５２〜２９２番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域が連結され、その５’末端と３’末端に制限酵素配列を付加したポリヌクレオチドを化学合成し、アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入すること以外は実施例１と同様にして、ｓｗｉｔＣｈを発現する細胞を分取した。こうして取得したｓｗｉｔＣｈを発現する細胞について、パッチクランプ法による光誘発電流の測定を実施例１と同様にして行った。結果を図３に示す。図３から明らかなように、ｓｗｉｔＣｈは、ｎｅｏｍＶＣｈＲ１よりもイオン透過性が高いことがわかった。【００３４】
実施例３：配列番号１０に示すアミノ酸配列からなる本発明の改変チャネルロドプシン（略称：ｍＶＣｈＲ１−ＣｌＣｈＲ１−３ＴＭ）
（ｍＶＣｈＲ１−ＣｌＣｈＲ１−３ＴＭを発現する細胞の取得）
特許文献１に記載の配列番号１に示すアミノ酸配列からなる改変チャネルロドプシンの１〜１４１番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域と、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１の配列番号６に示すアミノ酸配列の１４３〜１７０番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域と、配列番号１に示すアミノ酸配列の１７０〜３０７番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域が連結され、その５’末端と３’末端に制限酵素配列を付加したポリヌクレオチドを化学合成し、アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入すること以外は実施例１と同様にして、ｍＶＣｈＲ１−ＣｌＣｈＲ１−３ＴＭを発現する細胞を分取した。ｍＶＣｈＲ１−ＣｌＣｈＲ１−３ＴＭ発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドの構成を図４に示す。【００３５】
（パッチクランプ法による光誘発電流の測定）
ｍＶＣｈＲ１−ＣｌＣｈＲ１−３ＴＭを発現する細胞について、パッチクランプ法による光誘発電流の測定を実施例１と同様にして行った。結果を図５に示す。図５には、ｍＶＣｈＲ１−ＣｌＣｈＲ１−３ＴＭを発現する細胞と同様にして取得した特許文献１に記載の配列番号１に示すアミノ酸配列からなる改変チャネルロドプシン（略称：ｍＶＣｈＲ１）についての測定結果をあわせて示す。図５から明らかなように、ｍＶＣｈＲ１−ＣｌＣｈＲ１−３ＴＭは、ｍＶＣｈＲ１よりもイオン透過性が高いことから、ｍＶＣｈＲ１が有する７つの膜貫通ドメイン（即ちボルボックス由来のチャネルロドプシンが有する７つの膜貫通ドメイン）の３番目の膜貫通ドメインを、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１が有する７つの膜貫通ドメインの３番目の膜貫通ドメインに置換することで、イオン透過性を高めることができることがわかった。【００３６】
実施例４：配列番号７に示すアミノ酸配列からなる本発明の改変チャネルロドプシン（略称：ｓｗｉｔＣｈ２）
特許文献１に記載の配列番号１に示すアミノ酸配列からなる改変チャネルロドプシンの１〜１４１番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域と、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１の配列番号６に示すアミノ酸配列の１４３〜１７０番目のアミノ酸（但し１６７番目をアラニンに置換）をコードするポリヌクレオチドの領域と、配列番号１に示すアミノ酸配列の１７０〜３０７番目のアミノ酸（但し１９４番目をシステインに、２２９番目をアスパラギンに置換）をコードするポリヌクレオチドの領域と、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−２の配列番号２に示すアミノ酸配列の２７０〜３１５番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域が連結され、その５’末端と３’末端に制限酵素配列を付加したポリヌクレオチドを化学合成し、アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入すること以外は実施例１と同様にして、ｓｗｉｔＣｈ２を発現する細胞を分取した。こうして取得したｓｗｉｔＣｈ２を発現する細胞の蛍光顕微鏡写真を図６に示す。図６には、実施例２において取得したｓｗｉｔＣｈを発現する細胞の蛍光顕微鏡写真をあわせて示す。図６から明らかなように、ｓｗｉｔＣｈ２は、ｓｗｉｔＣｈよりも細胞膜における局在性が高いことがわかった。この結果から、本発明の改変シャネルロドプシンのＣ末端領域は、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−２のＣ末端領域であることの方が、テトラセルミス・ストリアータ由来のチャネルロドプシンのＣ末端領域であることよりも、細胞膜における局在性が高い点で有利であると考察された。【００３７】
実施例５：配列番号７に示すアミノ酸配列からなる本発明の改変チャネルロドプシン（略称：ｓｗｉｔＣｈ２）の変異体のイオン透過性の検討
（検討方法）
以下の７種類のｓｗｉｔＣｈ２の変異体を発現する細胞を、実施例４におけるｓｗｉｔＣｈ２を発現する細胞と同様にして取得し、パッチクランプ法による光誘発電流を実施例１と同様にして測定した。
・  ｓｗｉｔＣｈ２−ｍｕｔ１：ｓｗｉｔＣｈ２の１６１位のグルタミン酸をトレオニンに置換した変異体（Ｅ１６１Ｔ）
・  ｓｗｉｔＣｈ２−ｍｕｔ２：ｓｗｉｔＣｈ２の１７０位のロイシンをシステインに置換した変異体（Ｌ１７０Ｃ）
・  ｓｗｉｔＣｈ２−ｍｕｔ３：ｓｗｉｔＣｈ２の１９７位のシステインをセリンに置換した変異体（Ｃ１９７Ｓ）
・  ｓｗｉｔＣｈ２−ｍｕｔ４：ｓｗｉｔＣｈ２の１６１位のグルタミン酸をトレオニンに、１７０位のロイシンをシステインに置換した変異体（Ｅ１６１Ｔ＋Ｌ１７０Ｃ）
・  ｓｗｉｔＣｈ２−ｍｕｔ５：ｓｗｉｔＣｈ２の１６１位のグルタミン酸をトレオニンに、１９７位のシステインをセリンに置換した変異体（Ｅ１６１Ｔ＋Ｃ１９７Ｓ）
・  ｓｗｉｔＣｈ２−ｍｕｔ６：ｓｗｉｔＣｈ２の１７０位のロイシンをシステインに、１９７位のシステインをセリンに置換した変異体（Ｌ１７０Ｃ＋Ｃ１９７Ｓ）
・  ｓｗｉｔＣｈ２−ｍｕｔ７：ｓｗｉｔＣｈ２の１６１位のグルタミン酸をトレオニンに、１７０位のロイシンをシステインに、１９７位のシステインをセリンに置換した変異体（Ｅ１６１Ｔ＋Ｌ１７０Ｃ＋Ｃ１９７Ｓ）【００３８】
（検討結果）
ｓｗｉｔＣｈ２の１６１位のグルタミン酸をトレオニンに置換することで、イオン透過性が向上することがわかった。ｓｗｉｔＣｈ２とｓｗｉｔＣｈ２−ｍｕｔ１（配列番号９に示すアミノ酸配列からなる）の測定結果を図７に示す。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、異なる波長の光照射によってイオンチャネルの開閉が可能な、及び／又は、イオン透過性（光反応性）が高い、改変チャネルロドプシンを提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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