(57)【要約】  組み換え融合ポリペプチドを用いて、細胞分化に関与する遺伝子の発現を亢進させることにより、体細胞から肝細胞様細胞を製造する方法を提供することにある。  本発明者らは、細胞膜透過性ペプチド、細胞分化に関与する遺伝子に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む融合ポリペプチドを提供し、当該融合ポリペプチドを含む培地で体細胞を培養することによって体細胞から肝細胞様細胞を製造する方法を提供した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞膜透過性ペプチド、細胞分化に関与する遺伝子の塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む融合ポリペプチドであって、前記塩基配列が、配列番号１、２、３、４、４４、４５、４６又は４７に示される塩基配列である、融合ポリペプチド。
【請求項２】
転写活性化因子が、VP64、VPR、p300又はGCN5である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
細胞膜透過性ペプチドが配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１又は２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
DNA結合ポリペプチドが転写活性化因子様エフェクター（TALE）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
DNA結合ポリペプチドが、配列番号７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２又は９４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
細胞膜透過性ペプチドが配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含むペプチドであり、DNA結合ポリペプチドが配列番号７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２又は９４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、かつ転写活性化因子がGCN5又はVP64である、請求項５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号６、８、１０、１２、４９、５１、５３又は５５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも３つの融合ポリペプチドを含む培地で体細胞を培養する工程を含む、体細胞を肝細胞様細胞へダイレクトリプログラミングする方法。
（ａ）細胞膜透過性ペプチド、配列番号１に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド；
（ｂ）細胞膜透過性ペプチド、配列番号２に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド；
（ｃ）細胞膜透過性ペプチド、配列番号３に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド；並びに
（ｄ）細胞膜透過性ペプチド、配列番号４に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド
【請求項９】
配列番号１に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが、配列番号７６若しくは７８に示されるアミノ酸配列を含むDNA結合ポリペプチドであり、
配列番号２に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが、配列番号８０に示されるアミノ酸配列を含むDNA結合ポリペプチドであり、
配列番号３に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが、配列番号８２に示されるアミノ酸配列を含むDNA結合ポリペプチドであり、かつ／又は
配列番号４に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが、配列番号８４若しくは８６に示されるアミノ酸配列を含むDNA結合ポリペプチドである、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞膜透過性ペプチドが配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、転写活性化因子がGCN5又はVP64である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記（ａ）〜（ｄ）の融合ポリペプチドが、それぞれ、配列番号６、８、１０及び１２に示されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも３つの融合ポリペプチドを含む培地で体細胞を培養する工程を含む、体細胞から肝細胞様細胞を製造する方法。
（ａ）細胞膜透過性ペプチド、配列番号１に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド；
（ｂ）細胞膜透過性ペプチド、配列番号２に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド；
（ｃ）細胞膜透過性ペプチド、配列番号３に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド；並びに
（ｄ）細胞膜透過性ペプチド、配列番号４に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド
【請求項１３】
配列番号１に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが、配列番号７６若しくは７８に示されるアミノ酸配列を含むDNA結合ポリペプチドであり、
配列番号２に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが、配列番号８０に示されるアミノ酸配列を含むDNA結合ポリペプチドであり、
配列番号３に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが、配列番号８２に示されるアミノ酸配列を含むDNA結合ポリペプチドであり、かつ／又は
配列番号４に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが、配列番号８４若しくは８６に示されるアミノ酸配列を含むDNA結合ポリペプチドである、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞膜透過性ペプチドが配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、転写活性化因子がGCN5又はVP64である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記（ａ）〜（ｄ）の融合ポリペプチドが、それぞれ、配列番号６、８、１０及び１２に示されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
体細胞が間葉系幹細胞又は線維芽細胞である、請求項８〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞膜透過性ペプチド、配列番号９５又は９６に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む融合ポリペプチドを、前記培地に添加する工程をさらに含む、請求項８〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法により製造された、肝細胞様細胞。
【請求項１９】
請求項１８に記載の肝細胞様細胞を含む、肝臓疾患を治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写調節融合ポリペプチドを用いた、体細胞を肝細胞様細胞にダイレクトリプログラミングする方法及び体細胞から肝細胞様細胞を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の細胞工学技術の進歩により、様々な種類の体細胞に、複数の特定の転写因子を同時に発現させることで別の体細胞へ直接分化させることが可能であることが明らかになってきた。この体細胞から別の体細胞への直接分化はダイレクトリプログラミングと呼ばれている（非特許文献１：J. Am. Med. Assoc., 2015, Vol.314, p.19-20）。現在では線維芽細胞又は間葉系幹細胞（MSC）等から、複数の特定の転写因子を強制発現させることで神経細胞、肝細胞、心筋細胞、膵島細胞など、様々な細胞種が作製できることが報告されている（非特許文献１、非特許文献２：Nature, 2011, Vol.476, p.220-223、非特許文献３：Nature, 2011, Vol.475, p.386-389）。【０００３】
複数の転写因子の遺伝子を細胞導入試薬や電気穿孔法、ウイルス感染で細胞に導入することにより、体細胞から多能性幹細胞を経ずに肝細胞を作製するダイレクトリプログラミング技術が近年報告されている。マウスでは、肝細胞核因子（HNF）-1α、HNF-3γ及びGATA binding protein 4（GATA-4）の組合せ、HNF-4α及びForkhead box protein（Fox）A-1の組み合わせ、HNF-4α及びFoxA-2の組み合わせ、HNF-3γ（FoxA-3とも称する）及びHNF-4αの組み合わせ、並びに、HNF-1α、HNF-3γ、HNF-4α及びGATA-4の組み合わせで体細胞を肝細胞にそれぞれダイレクトリプログラミングする方法が報告された（非特許文献３、非特許文献４：Nature, 2011, Vol.475, p.390-393、非特許文献５：Cell Stem Cell, 2016, Vol.18, p.797-808）。ヒトの細胞でも、HNF-1α、HNF-3γ、及びHNF-4αの3つの転写因子の組み合わせにより線維芽細胞を肝細胞にダイレクトリプログラミングする方法が報告された（非特許文献６：Cell Stem Cell, 2014, Vol.14, p.370-384）。さらに、これら３因子にGATA-4を加えた４つの転写因子を組み合わせることで、肝臓筋線維芽細胞（Myofibroblast）から肝臓細胞へ分化誘導できることが報告されている（非特許文献７：Cell Stem Cell. 14: 394-403，2014）。
また、microRNA（miR）は、20塩基前後の小さなRNAで遺伝子発現の転写後調節に関与し、増殖、分化、炎症、感染及びがん化など、様々な細胞機能に関与する。近年、miR302/367クラスター遺伝子の強制発現によって、iPS様細胞が作製できることが報告された（非特許文献８：Cell Stem Cell. 8 (4) (2011) 376-88、非特許文献８：Cell Stem Cell 8: 633-8, 2011、非特許文献１０： Stem Cells Dev. 22: 2268-77, 2013）。【０００４】
近年、Zinc finger蛋白質にヌクレアーゼを融合させたZinc finger nuclease（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）及びClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated Protein 9（CRISPR/CAS9）が報告された（非特許文献１１：Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, Vol.93, p.1156-1160、非特許文献１２：Genetics, 2010, Vol.186, p.757-761、非特許文献１３：Science, 2013, Vol.339, p.819-823、非特許文献１４：Science, 2013, Vol.339, p.823-826）。ZFN、TALEN及びCRISPR/CAS9は任意の遺伝子に結合することができるため、任意の標的遺伝子の切断が可能となった。【０００５】
近年、TALENのヌクレアーゼ部分を、転写誘導活性を有する蛋白質に置き換えた融合蛋白質（TALE-転写誘導因子とも称する）、及び、CAS9のニッカーゼ活性が欠失した変異体（nuclease-deficient Cas9（dCAS9））に転写誘導活性を有する蛋白質を結合させた融合蛋白質（dCAS9-転写誘導因子とも称する）が、標的遺伝子の塩基配列に結合することによって、遺伝子の発現を亢進させることが報告された（非特許文献１５：Nucl. Acids Res., 2014, Vol.42, p.4375-4390）。【０００６】
細胞膜透過性ペプチドは細胞膜を透過して細胞内部に移動する機能を持つポリペプチドである。ヒト免疫不全ウイルス（HIV）由来のTransactivator of transcription（TAT）をはじめ、Penetratin、Oligoarginine、Transportan、Membrane Transduction Sequenceなど、多数の配列が知られている（非特許文献１６：Pharmacol. Ther., 2015, Vol.154, p.78-86）。また、HIV-1のViral Protein R蛋白質に含まれるペプチド配列から見出された細胞膜透過性ペプチドが低濃度で細胞に融合蛋白質を導入できることが報告された（特許文献１：国際公報第2008/108505号）。不可逆的な細胞内の遺伝子変異を伴う改変においては、細胞膜透過性ペプチド及びTALENを結合させた融合ポリペプチドを用いることで、細胞導入試薬又は電気穿孔法を用いずに標的遺伝子を切断できることが報告されている（非特許文献１７：Cell Regen., (Lond), 2013, Vol.2, p.5-12）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公報第2008/108505号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J. Am. Med. Assoc., 2015, Vol.314, p.19-20
【非特許文献２】Nature, 2011, Vol.476, p.220-223
【非特許文献３】Nature, 2011, Vol.475, p.386-389
【非特許文献４】Nature, 2011, Vol.475, p.390-393
【非特許文献５】Cell Stem Cell, 2016, Vol.18, p.797-808
【非特許文献６】Cell Stem Cell, 2014, Vol.14, p.370-384
【非特許文献７】Cell Stem Cell. 14: 394-403，2014
【非特許文献８】Cell Stem Cell. 8 (4) (2011) 376-88
【非特許文献９】Cell Stem Cell 8: 633-8, 2011
【非特許文献１０】Stem Cells Dev. 22: 2268-77, 2013
【非特許文献１１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, Vol.93, p.1156-1160
【非特許文献１２】Genetics, 2010, Vol.186, p.757-761
【非特許文献１３】Science, 2013, Vol.339, p.819-823
【非特許文献１４】Science, 2013, Vol.339, p.823-826
【非特許文献１５】Nucl. Acids Res., 2014, Vol.42, p.4375-4390
【非特許文献１６】Pharmacol. Ther., 2015, Vol.154, p.78-86
【非特許文献１７】Cell Regen., (Lond), 2013, Vol.2, p.5-12
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、組み換え融合ポリペプチドを用いて体細胞から肝細胞様細胞を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく相当の創意検討を重ねた結果、細胞膜透過性ペプチド、細胞分化に関与する遺伝子の転写調節領域の塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む融合ポリペプチドを作製した。そして、当該融合ポリペプチドを含む培地で体細胞を培養することにより体細胞から多能性細胞及び肝細胞様細胞を製造することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］細胞膜透過性ペプチド、細胞分化に関与する遺伝子の塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む融合ポリペプチドであって、前記塩基配列が、配列番号１、２、３、４、４４、４５、４６又は４７に示される塩基配列である、融合ポリペプチド。
［２］転写活性化因子が、VP64、VPR、p300又はGCN5である、上記［１］に記載の融合ポリペプチド。
［３］細胞膜透過性ペプチドが配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含むペプチドである、上記［１］又は［２］に記載の融合ポリペプチド。
［４］DNA結合ポリペプチドが転写活性化因子様エフェクター（TALE）である、上記［１〜３のいずれか１項］に記載の融合ポリペプチド。
［５］DNA結合ポリペプチドが、配列番号７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２又は９４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、上記［４］に記載の融合ポリペプチド。
［６］細胞膜透過性ペプチドが配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含むペプチドであり、DNA結合ポリペプチドが配列番号７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２又は９４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、かつ転写活性化因子がGCN5又はVP64である、上記［５］に記載の融合ポリペプチド。
［７］配列番号６、８、１０、１２、４９、５１、５３又は５５に示されるアミノ酸配列を含む、上記［６］に記載の融合ポリペプチド。
［８］下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも３つの融合ポリペプチドを含む培地で体細胞を培養する工程を含む、体細胞を肝細胞様細胞へダイレクトリプログラミングする方法。
（ａ）細胞膜透過性ペプチド、配列番号１に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド；
（ｂ）細胞膜透過性ペプチド、配列番号２に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド；
（ｃ）細胞膜透過性ペプチド、配列番号３に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド；並びに
（ｄ）細胞膜透過性ペプチド、配列番号４に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド
［９］配列番号１に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが、配列番号７６若しくは７８に示されるアミノ酸配列を含むDNA結合ポリペプチドであり、
配列番号２に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが、配列番号８０に示されるアミノ酸配列を含むDNA結合ポリペプチドであり、
配列番号３に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが、配列番号８２に示されるアミノ酸配列を含むDNA結合ポリペプチドであり、かつ／又は
配列番号４に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが、配列番号８４若しくは８６に示されるアミノ酸配列を含むDNA結合ポリペプチドである、
上記［８］に記載の方法。
［１０］細胞膜透過性ペプチドが配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、転写活性化因子がGCN5又はVP64である、上記［８］又は［９］に記載の方法。
［１１］前記（ａ）〜（ｄ）の融合ポリペプチドが、それぞれ、配列番号６、８、１０及び１２に示されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである、上記［８］に記載の方法。
［１２］下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも３つの融合ポリペプチドを含む培地で体細胞を培養する工程を含む、体細胞から肝細胞様細胞を製造する方法。
（ａ）細胞膜透過性ペプチド、配列番号１に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド；
（ｂ）細胞膜透過性ペプチド、配列番号２に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド；
（ｃ）細胞膜透過性ペプチド、配列番号３に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド；並びに
（ｄ）細胞膜透過性ペプチド、配列番号４に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド
［１３］配列番号１に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが、配列番号７６若しくは７８に示されるアミノ酸配列を含むDNA結合ポリペプチドであり、
配列番号２に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが、配列番号８０に示されるアミノ酸配列を含むDNA結合ポリペプチドであり、
配列番号３に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが、配列番号８２に示されるアミノ酸配列を含むDNA結合ポリペプチドであり、かつ／又は
配列番号４に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが、配列番号８４若しくは８６に示されるアミノ酸配列を含むDNA結合ポリペプチドである、
上記［１２］に記載の方法。
［１４］細胞膜透過性ペプチドが配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、転写活性化因子がGCN5又はVP64である、上記［１２］又は［１３］に記載の方法。
［１５］前記（ａ）〜（ｄ）の融合ポリペプチドが、それぞれ、配列番号６、８、１０及び１２に示されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである、上記［１２］に記載の方法。
［１６］体細胞が間葉系幹細胞又は線維芽細胞である、上記［８］〜［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］細胞膜透過性ペプチド、配列番号９５又は９６に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む融合ポリペプチドを、前記培地に添加する工程をさらに含む、上記［８］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］上記［１２］〜［１７］のいずれかに記載の方法により製造された、肝細胞様細胞。
［１９］上記［１８］に記載の肝細胞様細胞を含む、肝臓疾患を治療するための医薬組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の融合ポリペプチドを含む培地で体細胞を培養することによって、細胞導入試薬や電気穿孔法を使用せずに、体細胞から肝細胞様細胞を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒト臍帯由来間葉系幹細胞(Umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells、以下UC-MSC)を、NTP-TALE-HNF-1α-GCN5CD、NTP-TALE-HNF-3γ-GCN5CD、NTP-TALE-HNF-4α-GCN5CD及びNTP-TALE-GATA-4-VP64の4種類の融合ポリペプチドを含む培地で培養したときの細胞を過ヨウ素酸シッフ（PAS)染色した染色像を示す図である。
【図２】図１におけるNTP-TALE-Activator非添加群のPAS染色陽性細胞数と添加群のPAS染色陽性細胞数を計測し、各群の総細胞数に対する割合を示す図である。
【図３Ａ】マウスmicroRNA-302/367（以下、「miR-302/367」ともいう）クラスター遺伝子プロモーター領域における、本発明において作製した4種類のTALE（TALE1〜4）の結合領域（標的配列）の位置を示す図である。
【図３Ｂ】4種類のNTP-TALE-miR-302/367-VP64蛋白質（それぞれTALE1、2、3又は4を含む）がいずれも、マウス胎児由来線維芽細胞（Mouse embryonic fibrolast: MEF）において標的遺伝子（内在性miR-302/367クラスター遺伝子）の発現を誘導することを示す図である。
【図３Ｃ】TALE2を含むNTP-TALE-miR-302/367-VP64をMEFに作用させた結果得られたiPS様細胞の形態を示す図である。
【図３Ｄ】得られたiPS様細胞を用いて作製したキメラマウスを示す図である。
【図３Ｅ】キメラマウスのゲノムDNA中のGFP遺伝子に関するPCR解析結果を示す図である。
【図４】２つのキメラマウスクローンの染色体分析結果を示す図である。
【図５】NTP-TALE-HNF1αにVP64、VPR、p300のコアドメイン（p300CD）、GCN5CDを融合させたNTP-ATFがいずれも、UC-MSCにおいて内在性HNF1αの発現を誘導することを示す図である。
【図６】ヒトHNF1α/3γ/4αを標的とするNTP-ATFが、ヒトUC-MSCにおいて肝細胞分化に必要な内在性HNF遺伝子（HNF3γ及びHNF3β）の発現を誘導することを示す図である。
【図７】NTP-ATFを添加した培地でヒトUC-MSCを培養して得られた細胞において、肝細胞に特徴的なα-フェトプロテイン（a）及びアルブミン（b）のmRNAの発現が上昇したこと並びにアンモニア代謝能が上昇したこと（c）を示す図である。
【図８】ヒトHNF1α/3γ/4α標的NTP-ATF（3F）にGATA4標的NTP-ATFを加えた4種類のNTP-ATF(4F)を投与すると、より効率的に肝細胞への分化を誘導できることを示す図である。
【図９】4種類のNTP-ATF（4F）の作用によりヒト線維芽細胞が肝細胞様細胞にダイレクトリプログラミングされることを示す図である。
【図１０】4種類のNTP-ATF（4F）を作用させたヒト線維芽細胞の肝障害マウスの生体内における分化能を解析した結果を示す図である。
【図１１】4種類のNTP-ATF（4F）を作用させたヒトUC-MSCが肝障害マウスの生体内において肝障害を抑制した結果を示す図である。
【図１２】NTP-ATF（4F及びMPP1標的NTP-ATF）を作用させたヒトUC-MSCの、マーモセット肝線維症モデルの生体内における分化能を解析した結果を示す図である。
【図１３】NTP-ATF（4F単独又は4F及びMPP1標的NTP-ATF）を作用させたヒト線維芽細胞の、マーモセット肝線維症モデルの生体内における分化能を解析した結果を示す図である。
【図１４Ａ】NTP-ATFを作用させたヒトUC-MSCを移植したマーモセット肝線維症モデルにおいて肝線維症が軽減したことを示す、マッソン・トリクローム染色図である。
【図１４Ｂ】NTP-ATFを作用させたヒト臍帯由来間葉系幹細胞を移植したマーモセット肝線維症モデルにおいて肝線維症が軽減したことを示す、蛍光免疫組織化学染色図及びヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる2018年3月30日に出願された日本国特許出願（特願2018-069936号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
【００１４】
以下に、本発明について詳述する。
１．本発明の融合ポリペプチド
（１）細胞膜透過性ペプチド
本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、細胞分化に関与する遺伝子に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
【００１５】
本発明の融合ポリペプチドに含まれる細胞膜透過性ペプチドとしては、細胞膜を通過できる限り、アミノ酸配列は特に限定されない。本発明の細胞膜透過性ペプチドは、核内移行ペプチド（NTP（nuclear trafficking peptide））又はCPP（cell-penetrating peptide）とも称する。ペプチドが細胞膜を通過できるか否かは、公知の細胞膜通過評価系を用いて確認することができる（国際公報第2008/108505号）。
【００１６】
本発明の融合ポリペプチドに含まれる細胞膜透過性ペプチドは、公知の細胞膜透過性ペプチドを使用することができる（国際公報第2008/108505号、Pharmacol. Ther., 2015, Vol.154, p.78-86、Database (Oxford), 2012, bas015）。
本発明の融合ポリペプチドに含まれる細胞膜透過性ペプチドとしては、例えば、アミノ酸配列RI、FI及びRIGCを含み、アミノ酸残基数が25以下であるポリペプチドを使用することができる。１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドに含まれる細胞膜透過性ペプチドとしては、配列番号３９に示されるアミノ酸配列（RILQQLLFIHFRIGCRHSRI）を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４０に示されるアミノ酸配列（RILQQLLFIHFRIGCRH）を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４１に示されるアミノ酸配列（RILQQLLFIHFRIGC）を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４２に示されるアミノ酸配列（RIFIHFRIGC）を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるペプチド、又は、配列番号４３に示されるアミノ酸配列（RIFIRIGC）を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。好ましくは、配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるペプチドである。配列番号４２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列は、配列番号１３に示される。
【００１７】
（２）DNA結合ポリペプチド
本発明において、「細胞分化に関与する遺伝子に結合するDNA結合ポリペプチド」とは、細胞分化に関与する遺伝子の転写調節領域に結合するDNA結合ポリペプチドである。
転写調節領域としては、細胞分化に関与する遺伝子の発現調節に関与する領域である限り特に限定されるものではなく、例えば、プロモーター領域及びエンハンサー領域が挙げられる。
【００１８】
本発明において、細胞分化に関与する遺伝子とは、肝細胞分化に関与する遺伝子又は体細胞のリプログラミングに関与する遺伝子を意味する。「肝細胞分化に関与する遺伝子」とは、肝細胞又は肝細胞様細胞の分化を誘導する遺伝子を意味し、例えば、HNF-1α、HNF-3γ、HNF-4α、GATA-4（好ましくは、ヒトHNF-1α、ヒトHNF-3γ、ヒトHNF-4α、ヒトGATA-4）などの遺伝子が挙げられ、これらに限定されない。また、「リプログラミング」とは、分化した細胞を多能性細胞に変化させることを意味する。体細胞のリプログラミングに関与する遺伝子としては、例えば、miR-302/367クラスター遺伝子が挙げられ、これに限定されない。
本発明において、「細胞分化に関与する遺伝子に結合するDNA結合ポリペプチド」としては、細胞分化に関与する遺伝子がヒトHNF-1αである場合は、例えば、配列番号１に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが挙げられ、当該遺伝子がヒトHNF-3γである場合は、例えば、配列番号２に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが挙げられ、当該遺伝子がヒトHNF-4αである場合は、例えば、配列番号３に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが挙げられ、当該遺伝子がヒトGATA-4である場合は、例えば、配列番号４に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが挙げられる。
本発明において、「体細胞のリプログラミングに関与する遺伝子に結合するDNA結合ポリペプチド」としては、細胞のリプログラミングに関与する遺伝子がヒトmiR302/367クラスター遺伝子である場合は、例えば、配列番号４４、４５、４６又は４７に示される塩基配列に結合する、DNA結合ポリペプチドが挙げられる。
【００１９】
本明細書において、DNA結合ポリペプチドについて使用される「結合する」とは、標的の塩基配列のDNAに対して親和性を有することを意味する。また、「結合する」とは、標的の塩基配列に直接結合することだけでなく、標的の塩基配列に結合するポリヌクレオチドに結合することで間接的に標的の塩基配列に結合することも意味する。したがって、本発明の融合ポリペプチドに含まれるDNA結合ポリペプチドには、標的の塩基配列に直接結合するポリペプチドだけでなく、標的の塩基配列に結合するポリヌクレオチドに結合することで間接的に標的の塩基配列に結合するポリペプチドも含まれる。
【００２０】
さらに、本明細書において、DNA結合ポリペプチドについて使用される「結合する」とは、実際に標的の塩基配列に結合することだけでなく、標的の塩基配列に結合するように設計されたことも意味する。したがって、本発明の融合ポリペプチドに含まれるDNA結合ポリペプチドには、実際に標的の塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドだけでなく、標的の塩基配列に結合するように設計されたDNA結合ポリペプチドも含まれる。
【００２１】
被験ペプチドが標的の塩基配列又は標的の塩基配列に結合するポリヌクレオチドに結合することができるか否かは、ゲルシフトアッセイやChIP（Chromatin immunoprecipitation）-seqアッセイなどの公知の結合活性測定方法を用いて確認することができる。
【００２２】
被験ペプチドが標的の塩基配列に結合するように設計されたか否かは、例えば、標的の塩基配列に結合することが報告されているアミノ酸配列を被験ペプチドが含むかどうかで確認することができる。標的の塩基配列に結合することが報告されているアミノ酸配列として、例えば、Science, 2009, Vol.326, p.1509-1512、Nat.Biotechnol., 2011,Vol.29,p.143-148、日本公開公報2015/33365号、及びProc.Natl.Acad.Sci.USA., 1997, Vol.94, p.5525-5530に記載のアミノ酸配列が挙げられる。又は、被験ペプチドが標的の塩基配列に結合するように設計されたか否かは、ゲルシフトアッセイやChIP-seqアッセイなどの公知の結合活性測定方法を用いて被験ペプチドが標的の塩基配列に実際に結合するかどうかを確認してもよい。
【００２３】
標的の塩基配列に結合するように設計されたDNA結合ポリペプチドとしては、例えば、転写活性化因子様エフェクター（TALE）（Science, 2009, Vol.326, p.1509-1512）又はZinc-finger蛋白質（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1996, Vol.93, p.1156-1160）を使用することができる。TALE及びZinc-finger蛋白質を作製する技術は公知であり（Nat. Biotechnol., 2011,Vol.29, p.143-148、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ,1997, Vol.94, p.5525-5530）、TALEを作製する際には、塩基配列に対する高い結合活性を有するTALEを作製する方法を使用することもできる（日本公開公報2015/33365号、Platinum Gate TALEN construction protocol（Yamamoto lab）Ver.1.0 ［平成29年1月26日検索］、インターネット＜URL:https://www.addgene.org/static/cms/files/Platinum_Gate_protocol.pdf＞）。
TALEの結合領域（標的塩基配列）は、例えば、結合対象となる遺伝子の周辺配列を公知のデータベース（例えばEnsembl genome browserなど）で検索し、そのプロモーターやエンハンサーとして作用することが予想される当該遺伝子の転写開始点から上流（例えば、約1〜500ベースペア（bp）上流、約1〜50000bp上流）の遺伝子領域から、選択することができる。
【００２４】
標的の塩基配列に結合するポリヌクレオチドに結合することで間接的に標的の塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドとしては、例えば、CRISPR/CAS9（Science, 2013, Vol.339、p.819-823）を使用することができる。CRISPR/CAS9を作製する技術は公知であるため、当業者であれば、当該技術に基づいて、標的の塩基配列に結合するように設計されたポリヌクレオチド、及び、当該ポリヌクレオチドに結合するペプチドを作製することができる（Science, 2013, Vol.339, p.819-823、Science, 2013, Vol.339, p.823-826）。
【００２５】
本発明の融合ポリペプチドに含まれるDNA結合ポリペプチドとしては、TALEが好ましい。
本明細書で使用される「TALE」とは、３４アミノ酸からなる構造単位を１０〜３０個の繰り返し数で連結させて、目的とするゲノム上の標的塩基配列に結合するように設計されたDNA結合リピート部分及びチミンに結合するように設計されたアミノ酸配列を含むアミノ末端領域を含むポリペプチドを意味する（RCSB Protein Data Bank, Molecule of the Month, 2014, No.180、Nat. Biotechnol., 2011, Vol.29, p.143-148）。標的塩基配列に結合するように設計されたDNA結合リピート部分及びチミンに結合するように設計されたアミノ酸配列を含むアミノ末端領域は、例えば、公知のアミノ酸配列を使用することもできる（Science, 2009, Vol.326, p.1509-1512、Nat. Biotechnol., 2011, Vol.29, p.143-148,日本公開公報2015/33365号）。
【００２６】
本発明の融合ポリペプチドに含まれるDNA結合ポリペプチドとしては、細胞分化に関与する遺伝子がヒトHNF-1αである場合は、例えば、配列番号７６若しくは７８に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるTALE（それぞれTALE-HNF1α-1、TALE-HNF1α-2とも称する）、又は配列番号７５若しくは７７に示される塩基配列がコードするTALEが挙げられる。
また別の態様において、本発明の融合ポリペプチドに含まれるDNA結合ポリペプチドとしては、細胞分化に関与する遺伝子がヒトHNF-3γである場合は、例えば、配列番号８０に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるTALE、又は配列番号７９に示される塩基配列がコードするTALEが挙げられる。
また別の態様において、本発明の融合ポリペプチドに含まれるDNA結合ポリペプチドとしては、細胞分化に関与する遺伝子がヒトHNF-4αである場合は、例えば、配列番号８２に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるTALE、又は配列番号８１に示される塩基配列がコードするTALEが挙げられる。
また別の態様において、本発明の融合ポリペプチドに含まれるDNA結合ポリペプチドとしては、細胞分化に関与する遺伝子がヒトGATA-4である場合は、例えば、配列番号８４若しくは８６に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるTALE（それぞれTALE-GATA4-1、TALE-GATA4-2とも称する）、又は配列番号８３若しくは８５に示される塩基配列がコードするTALEが挙げられる。
また別の態様において、本発明の融合ポリペプチドに含まれるDNA結合ポリペプチドとしては、細胞のリプログラミングに関与する遺伝子がヒトmiR302/367クラスター遺伝子である場合は、例えば、配列番号８８、９０、９２若しくは９４に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるTALE（それぞれTALE-miR302/367-1、TALE-miR302/367-2、TALE-miR302/367-3、TALE-miR302/367-4とも称する）、又は配列番号８７、８９、９１若しくは９３に示される塩基配列がコードするTALEが挙げられる。
【００２７】
また別の態様において、本発明においては、本発明の融合ポリペプチドと他の融合ポリペプチドとを併用することができる。そのような他の融合ポリペプチドとしては、例えば、MMP-1遺伝子を標的とする融合ポリペプチドが挙げられる。そのようなMMP-1標的融合ポリペプチドに含まれるDNA結合ポリペプチドとしては、例えば、配列番号９５若しくは９６に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド、配列番号９８若しくは１００に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるTALE（それぞれTALE-MMP1-1、TALE-MMP1-2とも称する）、又は配列番号９７若しくは９９に示される塩基配列がコードするTALEが挙げられる。
【００２８】
（３）転写活性化因子
本発明において、転写活性化因子としては、本発明の融合ポリペプチドが標的遺伝子の転写を活性化できる限り特に限定されず、例えば、VP64、VPR、p300、GCN5、ヒストンメチル化酵素及びTFIID結合蛋白質などの公知の転写活性化因子を使用することができる（Nucl. Acids Res., 2014, Vol.42, p.4375-4390、Nat. Methods, 2015, Vol.12, p.326-328、EMBO J. , 1997, Vol.16, p.555-565、Nature, 2000, Vol.406, p.593-599、Nature, 2000, Vol.405, p.701-704）。１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドに含まれる転写活性化因子は、VP64、VPR、p300又はGCN5であり、好ましくは、GCN5である。VP64のアミノ酸配列を配列番号２１に示し、このアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号２０に示す。また、VPRのアミノ酸配列を配列番号１１４に示し、このアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１１３に示す。
本発明においては、VP64としては、配列番号１７に示されるアミノ酸配列のC末端にバリンが付加されたアミノ酸配列を有するもの（VP64V）（配列番号１９）を用いてもよい。
【００２９】
本発明において、転写活性化因子には、転写活性化能を有している限り、野生型だけでなく、改変体も含まれる。
【００３０】
本発明の融合ポリペプチドに含まれる転写活性化因子としては、例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性（HAT活性）を有する転写活性化因子を使用することができ、p300及びGCN5のようにHAT活性を有する転写活性化因子を使用する際には、当該転写活性化因子のHAT活性を示すコア領域を含むポリペプチドを使用することもできる。
本発明において、「p300」には、p300のコア領域（「p300CD」）を含むポリペプチドも含まれる。１つの実施形態において、p300のコア領域はAccession No.NP_001420.2のアミノ酸番号1048から1664までのアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
また、本発明において、「GCN5」には、GCN5のコア領域（「GCN5CD」）を含むポリペプチドも含まれる。１つの実施形態において、GCN5のコア領域はAccession No.NP_066564.2のアミノ酸番号497から837までのアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
p300及びp300のコア領域（p300CD）のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１０２及び１０４に示し、これらのアミノ酸配列をコードする塩基配列をそれぞれ配列番号１０１及び１０３に示す。また、GCN5及びGCN5CDのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１０６及び１０８に示し、これらのアミノ酸配列をコードする塩基配列をそれぞれ配列番号１０５及び１０７に示す。
【００３１】
（４）融合ポリペプチド
本発明の融合ポリペプチドが標的遺伝子の転写を活性化できる限り、細胞膜透過性ペプチド、DNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子の位置は限定されない。好ましくは、細胞膜透過性ペプチドは本発明の融合ポリペプチドのＮ末端側又はＣ末端側に位置する。より好ましくは、細胞膜透過性ペプチドは本発明の融合ポリペプチドのＮ末端側に位置する。１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、Ｎ末端側から、細胞膜透過性ペプチド、DNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子の順に構成される。
本発明の融合ポリペプチドに含まれる、細胞膜透過性ペプチド、細胞分化に関与する遺伝子に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子が由来する生物種は、限定されるものではなく、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、サル、イヌ、ウシ、トリなどが挙げられ、好ましくは、マウス、ラット、ヒト、サルであり、より好ましくはヒトである。
【００３２】
本発明の融合ポリペプチドとしては、例えば、下記のポリペプチドが挙げられる。
(i) 細胞膜透過性ペプチド、肝細胞分化に関与する遺伝子の転写調節領域に結合するDNA結合ポリペプチド、及び、転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(ii) 細胞膜透過性ペプチド、HNF-1α、HNF-3γ、HNF-4α又はGATA-4の転写調節領域に結合するDNA結合ポリペプチド、及び、転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(iii) 細胞膜透過性ペプチド、HNF-1α、HNF-3γ、HNF-4α又はGATA-4のプロモーター領域又はエンハンサー領域に結合するDNA結合ポリペプチド、及び、転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(iv) 細胞膜透過性ペプチド、細胞のリプログラミングに関与する遺伝子のプロモーター領域又はエンハンサー領域に結合するDNA結合ポリペプチド、及び、転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(v) 細胞膜透過性ペプチド、miR302/367クラスター遺伝子のプロモーター領域又はエンハンサー領域に結合するDNA結合ポリペプチド、及び、転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
【００３３】
(vi) 細胞膜透過性ペプチド、配列番号１、２、３、４、４４、４５、４６又は４７に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド、及び、転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(vii) 細胞膜透過性ペプチド、配列番号１に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(viii) 細胞膜透過性ペプチド、配列番号２に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(ix) 細胞膜透過性ペプチド、配列番号３に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(x) 細胞膜透過性ペプチド、配列番号４に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
【００３４】
(xi) 配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号１、２、３、４、４４、４５、４６又は４７に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド、及び、転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xii) 配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号１に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xiii) 配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号２に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xiv) 配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号３に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xv) 配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号４に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
【００３５】
(xvi) 細胞膜透過性ペプチド、配列番号１、２、３、４、４４、４５、４６又は４７に示される塩基配列に結合するTALE、及び、転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xvii) 細胞膜透過性ペプチド、配列番号７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２又は９４に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこれらのアミノ酸配列からなるTALE、及び、転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xviii) 細胞膜透過性ペプチド、配列番号１に示される塩基配列に結合するTALE、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xix)細胞膜透過性ペプチド、配列番号２に示される塩基配列に結合するTALE、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xx) 細胞膜透過性ペプチド、配列番号３に示される塩基配列に結合するTALE、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
(xxi) 細胞膜透過性ペプチド、配列番号４に示される塩基配列に結合するTALE、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xxii) 細胞膜透過性ペプチド、配列番号４４、４５、４６又は４７に示される塩基配列に結合するTALE、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
【００３６】
(xxiii) 細胞膜透過性ペプチド、配列番号７６又は７８のアミノ酸配列を含む若しくはこれらのアミノ酸配列からなるDNA結合ポリペプチド、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xxiv) 細胞膜透過性ペプチド、配列番号８０のアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるDNA結合ポリペプチド、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xxv) 細胞膜透過性ペプチド、配列番号８２のアミノ配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるDNA結合ポリペプチド、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xxvi) 細胞膜透過性ペプチド、配列番号８４又は８６のアミノ酸配列を含む若しくはこれらのアミノ酸配列からなるDNA結合ポリペプチド、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xxvii) 細胞膜透過性ペプチド、配列番号８８、９０、９２又は９４のアミノ酸配列を含む若しくはこれらのアミノ酸配列からなるDNA結合ポリペプチド、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
【００３７】
(xxviii) 配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号１に示される塩基配列に結合するTALE、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xxix) 配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号２に示される塩基配列に結合するTALE、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xxx) 配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号３に示される塩基配列に結合するTALE、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xxxi) 配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号４に示される塩基配列に結合するTALE、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xxxii) 配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号４４、４５、４６又は４７に示される塩基配列に結合するTALE、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
【００３８】
(xxxiii) 配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号７６又は７８に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこれらのアミノ酸配列からなるDNA結合ポリペプチド、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xxxiv) 配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号８０に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるDNA結合ポリペプチド、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xxxv) 配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号８２に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなるDNA結合ポリペプチド、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xxxvi) 配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号８４又は８６に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこれらのアミノ酸配列からなるDNA結合ポリペプチド、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xxxvii) 配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号８８、９０、９２又は９４に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこれらのアミノ酸配列からなるDNA結合ポリペプチド、並びに、VP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
(xxxviii) 配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこのアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２又は９４に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこれらのアミノ酸配列からなるDNA結合ポリペプチド及びGCN5を含む、融合ポリペプチド。
【００３９】
本発明の融合ポリペプチドが標的遺伝子の転写を活性化できる限り、細胞膜透過性ペプチド、DNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子のそれぞれの間にペプチドリンカー等のペプチドを含んでもよい。
【００４０】
また、本発明の融合ポリペプチドが標的遺伝子の転写を活性化できる限り、本発明の融合ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端にGlutathione S-transferase（GST）やヒスチジンタグ（Hisタグ）などのペプチドタグを含んでもよい。
【００４１】
本発明の融合ポリペプチドは、タグを切断するためにTEVプロテアーゼ認識配列、プレシジョンプロテアーゼ認識配列などのプロテアーゼ認識配列を含むものであってもよい。本発明の融合ポリペプチドにおけるプロテアーゼ認識配列の位置は限定されない。
本発明において、TEVプロテアーゼ認識配列としては、例えば、配列番号７４に示されるアミノ酸配列を含むものが挙げられ、また、プレシジョンプロテアーゼ認識配列としては、例えば配列番号１１８に示されるアミノ酸配列を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号６、１３２又は１６０に示されるアミノ酸配列を含む又はこのアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００４３】
また、本発明の融合ペプチドには、配列番号６、１３２又は１６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号６、１３２又は１６０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつHNF-1α遺伝子の転写を活性化する作用を有するポリペプチドが含まれる。
上記配列番号６、１３２又は１６０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列としては、例えば、
（ｉ）配列番号６、１３２又は１６０に示されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号６、１３２又は１６０に示されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号６、１３２又は１６０に示されるアミノ酸配列中に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号６、１３２又は１６０に示されるアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
【００４４】
本発明において、「HNF-1α遺伝子の転写を活性化する作用」とは、細胞においてHNF-1α遺伝子の発現量を増加させる作用を意味する。「HNF-1α遺伝子の転写を活性化する作用を有する」とは、被験融合ポリペプチドを添加していない培地で培養された細胞のHNF-1α遺伝子の発現量と比較して、被験融合ポリペプチドが10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、好ましくは、50%以上HNF-1α遺伝子の発現量を増加させる作用を有することを意味する。HNF-1α遺伝子の転写を活性化する作用は、例えば本発明の融合ペプチドを添加した培地で培養した細胞におけるHNF-1α遺伝子のmRNA量を、公知の方法、例えばReal-time PCRを用いて測定することにより、確認することができる。
【００４５】
また、本発明の融合ペプチドには、配列番号６、１３２又は１６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号６、１３２又は１６０に示されるアミノ酸配列と約80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、又は99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつHNF-1α遺伝子の転写を活性化する作用を有するポリペプチドが含まれる。
【００４６】
本明細書における「同一性」とは、EMBOSS NEEDLE program（J.Mol.Biol., 1970, Vol.48, p.443-453）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Identityを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Gap penalty=10
Extend penalty=0.5
Matrix=EBLOSUM62
【００４７】
上記の変異を有するポリペプチドを調製するために、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに変異を導入するには、Kunkel法やGapped duplex法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。また、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual(4th edition)」(Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)）等に記載された部位特異的変異誘発法等の方法を用いることができる。
【００４８】
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号８又は１６２に示されるアミノ酸配列を含む又はこのアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００４９】
また、本発明の融合ペプチドには、配列番号８又は１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号８又は１６２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつHNF-3γ遺伝子の転写を活性化する作用を有するポリペプチドが含まれる。
上記配列番号８又は１６２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列としては、例えば、
（ｉ）配列番号８又は１６２に示されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号８又は１６２に示されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号８又は１６２に示されるアミノ酸配列中に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号８又は１６２に示されるアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
【００５０】
本発明において、「HNF-3γ遺伝子の転写を活性化する作用」とは、細胞においてHNF-3γ遺伝子の発現量を増加させる作用を意味する。「HNF-3γ遺伝子の転写を活性化する作用を有する」とは、被験融合ポリペプチドを添加していない培地で培養された細胞のHNF-3γ遺伝子の発現量と比較して、被験融合ポリペプチドが１０%以上、２０%以上、３０%以上、４０%以上、好ましくは、５０%以上HNF-3γ遺伝子の発現量を増加させる作用を有することを意味する。HNF-3γ遺伝子の転写を活性化する作用は、例えば本発明の融合ペプチドを添加した培地で培養した細胞におけるHNF-3γ遺伝子のmRNA量を、公知の方法、例えばＲｅａｌ-ｔｉｍｅ  PCRを用いて測定することにより、確認することができる。
【００５１】
また、本発明の融合ペプチドには、配列番号８又は１６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号８又は１６２に示されるアミノ酸配列と約８０%以上、８５%以上、９０%以上、９５%以上、９６%以上、９７%以上、９８%以上、又は９９%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつHNF-3γ遺伝子の転写を活性化する作用を有するポリペプチドが含まれる。
【００５２】
同一性の検索方法及び変異の導入法は上記配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの場合と同様である。
【００５３】
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号１０又は１６４に示されるアミノ酸配列を含む又はこのアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００５４】
また、本発明の融合ペプチドには、配列番号１０又は１６４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号１０又は１６４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつHNF-4α遺伝子の転写を活性化する作用を有するポリペプチドが含まれる。
上記配列番号１０又は１６４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列としては、例えば、
（ｉ）配列番号１０又は１６４に示されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号１０又は１６４に示されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列中に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号１０又は１６４に示されるアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
【００５５】
本発明において、「HNF-4α遺伝子の転写を活性化する作用」とは、細胞においてHNF-4α遺伝子の発現量を増加させる作用を意味する。「HNF-4α遺伝子の転写を活性化する作用を有する」とは、被験融合ポリペプチドを添加していない培地で培養された細胞のHNF-4α遺伝子の発現量と比較して、被験融合ポリペプチドが10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、好ましくは、50%以上HNF-4α遺伝子の発現量を増加させる作用を有することを意味する。HNF-4α遺伝子の転写を活性化する作用は、例えば本発明の融合ペプチドを添加した培地で培養した細胞におけるHNF-4α遺伝子のmRNA量を、公知の方法、例えばReal-time PCRを用いて測定することにより、確認することができる。
【００５６】
また、本発明の融合ペプチドには、配列番号１０又は１６４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号１０又は１６４に示されるアミノ酸配列と約80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、又は99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつHNF-4α遺伝子の転写を活性化する作用を有するポリペプチドが含まれる。
【００５７】
同一性の検索方法及び変異の導入法は上記配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの場合と同様である。
【００５８】
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号１２、１４８又は１６６に示されるアミノ酸配列を含む又はこのアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００５９】
また、本発明の融合ペプチドには、配列番号１２、１４８又は１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号１２、１４８又は１６６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつGATA-4遺伝子の転写を活性化する作用を有するポリペプチドが含まれる。
上記配列番号１２、１４８又は１６６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列としては、例えば、
（ｉ）配列番号１２、１４８又は１６６に示されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号１２、１４８又は１６６に示されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号１２、１４８又は１６６に示されるアミノ酸配列中に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
【００６０】
本発明において、「GATA-4遺伝子の転写を活性化する作用」とは、細胞においてGATA-4遺伝子の発現量を増加させる作用を意味する。「GATA-4遺伝子の転写を活性化する作用を有する」とは、被験融合ポリペプチドを添加していない培地で培養された細胞のGATA-4遺伝子の発現量と比較して、被験融合ポリペプチドが10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、好ましくは、50%以上GATA-4遺伝子の発現量を増加させる作用を有することを意味する。GATA-4遺伝子の転写を活性化する作用は、例えば本発明の融合ペプチドを添加した培地で培養した細胞におけるGATA-4遺伝子のmRNA量を、公知の方法、例えばReal-time PCRを用いて測定することにより、確認することができる。
【００６１】
また、本発明の融合ペプチドには、配列番号１２、１４８又は１６６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号１２、１４８又は１６６に示されるアミノ酸配列と約80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、又は99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつGATA-4遺伝子の転写を活性化する作用を有するポリペプチドが含まれる。
【００６２】
同一性の検索方法及び変異の導入法は上記配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの場合と同様である。
【００６３】
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号４９、５１、５３又は５５に示されるアミノ酸配列を含む又はこのアミノ酸配列からなるポリペプチドである。配列番号４９、５１、５３及び５５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列は、それぞれ配列番号４８、５０、５２及び５４に示される
【００６４】
また、本発明の融合ペプチドには、配列番号４９、５１、５３又は５５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号４９、５１、５３又は５５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつmiR302/367クラスター遺伝子の転写を活性化する作用を有するポリペプチドが含まれる。
上記配列番号４９、５１、５３又は５５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列としては、例えば、
（ｉ）配列番号４９、５１、５３又は５５に示されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号４９、５１、５３又は５５に示されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号４９、５１、５３又は５５に示されるアミノ酸配列中に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号４９、５１、５３又は５５に示されるアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
【００６５】
本発明において、「miR302/367クラスター遺伝子の転写を活性化する作用」とは、細胞においてmiR302/367クラスター遺伝子の発現量を増加させる作用を意味する。「miR302/367クラスター遺伝子の転写を活性化する作用を有する」とは、被験融合ポリペプチドを添加していない培地で培養された細胞のmiR302/367クラスター遺伝子の発現量と比較して、被験融合ポリペプチドが10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、好ましくは、50%以上miR302/367クラスター遺伝子の発現量を増加させる作用を有することを意味する。miR302/367クラスター遺伝子の転写を活性化する作用は、例えば本発明の融合ペプチドを添加した培地で培養した細胞におけるmiR302/367クラスター遺伝子のmRNA量を、公知の方法、例えばReal-time PCRを用いて測定することにより、確認することができる。
【００６６】
また、本発明の融合ペプチドには、配列番号４９、５１、５３又は５５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号４９、５１、５３又は５５に示されるアミノ酸配列と約80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、又は99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつmiR302/367クラスター遺伝子の転写を活性化する作用を有するポリペプチドが含まれる。
【００６７】
同一性の検索方法及び変異の導入法は上記配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの場合と同様である。
【００６８】
本発明の融合ポリペプチドは、本明細書に開示される、細胞膜透過性ペプチド、肝細胞分化に関与する遺伝子に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写調節因子の配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。本発明の融合ポリペプチドは、特に限定されるものではないが、例えば、後述の「５．本発明の融合ポリペプチドを生産する方法」に記載の方法に従い製造することができる。
【００６９】
２．本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドには、本発明の融合ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
本発明の融合ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号５、７、９、１１、４８、５０、５２及び５４を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明のポリヌクレオチドは、その塩基配列に基づき、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明の融合ポリペプチドを発現する宿主の種類に応じて、そのコドンを最適化することができる。この最適化により、宿主における発現量を向上させることができる。
【００７１】
３．本発明の発現ベクター
本発明の発現ベクターには、本発明の融合ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
【００７２】
本発明のポリヌクレオチドを発現させるために用いる発現ベクターとしては、RNAポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸を含む反応液中で本発明の融合ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを発現し、コムギ胚芽抽出液中でこれらによりコードされるポリペプチドを産生できるものである限り、又は、真核細胞（例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母）及び／又は原核細胞（例えば、大腸菌）の各種の宿主細胞中で本発明の融合ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを発現し、これらによりコードされるポリペプチドを産生できるものである限り、特に制限されるものではない。このような発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、センダイウイルス）等が挙げられ、好ましくは、pEU-E01-MCS（セルフリーサイエンス社）を使用することができる。
【００７３】
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。RNAポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸を含む反応液中で発現させるためのプロモーターとしては、T3プロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーターなどが挙げられる。動物細胞で本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、Cytomegalovirus（CMV）、Rous sarcoma virus（RSV）、Simian virus 40（SV40）などのウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、EF（elongation factor）１αプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。細菌（例えば、エシェリキア属菌）で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、λPLプロモーター、tacプロモーター、T3プロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーターなどが挙げられる。また、酵母で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、GAL1プロモーター、GAL10プロモーター、PH05プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが挙げられる。
【００７４】
RNAポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸を含む反応液並びにコムギ胚芽抽出液を用いる場合、若しくは、宿主細胞として動物細胞、昆虫細胞、又は酵母を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン及び終止コドンを含み得る。この場合、本発明の発現ベクターは、エンハンサー配列、本発明の融合ポリペプチドをコードする遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、あるいは複製可能単位などを含んでいてもよい。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域、及び複製可能単位を含み得る。この場合、本発明の発現ベクターは、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。
【００７５】
４．本発明の形質転換された宿主細胞
本発明の形質転換された宿主細胞には、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。
【００７６】
形質転換させる宿主細胞としては、使用する発現ベクターに適合し、当該発現ベクターで形質転換されて、蛋白質を発現することができるものである限り、特に限定されるものではない。形質転換する宿主細胞としては、例えば、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞又は人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（例えば、Sf9）、細菌（エシェリキア属菌など）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）など）が挙げられ、好ましくは、CHO細胞、293細胞、NS0細胞等の培養細胞を使用することができる。
【００７７】
宿主細胞を形質転換する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸カルシウム法、電気穿孔法等を用いることができる。
【００７８】
５．本発明の融合ポリペプチドを生産する方法
本発明の融合ポリペプチドを生産する方法には、本発明の発現ベクターを用いて、RNAポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸を含む反応液中で合成したmRNAをコムギ胚芽抽出液と反応させて、融合ポリペプチドを発現させる工程、又は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、融合ポリペプチドを発現させる工程を含む、融合ポリペプチドを生産する方法が含まれる。
【００７９】
本発明の融合ポリペプチドを生産する方法は、本発明の発現ベクターを用いて、RNAポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸を含む反応液中でmRNAを合成し、合成したmRNAをコムギ胚芽抽出液と反応させて、融合ポリペプチドを発現させる工程、又は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、融合ポリペプチドを発現させる工程を含む限り、特に限定されるものではない。当該方法で使用されるRNAポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸を含む反応液並びにコムギ胚芽抽出液としては、例えば、WEPRO7240G Expression Kit（セルフリーサイエンス社）に含まれる試薬が挙げられる。また、当該方法で使用される好ましい宿主細胞としては、前述の好ましい本発明の形質転換された宿主細胞が挙げられる。
【００８０】
形質転換された宿主細胞の培養は公知の方法により行うことができる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ及び培養時間は、適宜選択される。宿主細胞を培養することにより、本発明の融合ポリペプチドを生産することができる。
【００８１】
本発明の融合ポリペプチドを生産する方法は、本発明の発現ベクターを用いて、RNAポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸を含む反応液中でmRNAを合成する工程、並びに合成したmRNAをコムギ胚芽抽出液と反応させて、融合ポリペプチドを発現させる工程に加えて、さらには、融合ポリペプチドを回収、好ましくは単離又は精製する工程を含むことができる。単離又は精製方法としては、例えば、GSTタグと融合した本発明の融合ポリペプチドをグルタチオンセファロースビーズに結合させた後、過剰な還元型グルタチオンで溶出することによるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【００８２】
また、本発明の融合ポリペプチドを生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、融合ポリペプチドを発現させる工程に加えて、さらには、当該形質転換された宿主細胞から融合ポリペプチドを回収、好ましくは単離又は精製する工程を含むことができる。単離又は精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。好ましくは、培養上清中に蓄積された融合ポリペプチドは、各種クロマトグラフィーにより精製することができる。
【００８３】
本発明の融合ポリペプチドには、本発明の融合ポリペプチドを生産する方法で生産された融合ポリペプチドも含まれる。
【００８４】
６．本発明の融合ポリペプチドを用いた肝細胞分化に関与する遺伝子の転写を調節する方法
本発明の融合ポリペプチドを用いた肝細胞分化に関与する遺伝子の転写を調節する方法には、本発明の融合ポリペプチドを含む培地で細胞を培養することによって、当該細胞における肝細胞分化に関与する遺伝子の転写を調節させる方法が含まれる。
【００８５】
本発明の方法によって転写が調節される肝細胞分化に関与する遺伝子としては、特に限定されないが、例えばHNF-1α、HNF-3γ、HNF-4α及びGATA-4（好ましくはヒトHNF-1α、ヒトHNF-3γ、ヒトHNF-4α及びヒトGATA-4）が挙げられる。
【００８６】
本発明の方法で使用される融合ポリペプチドは、「１．本発明の融合ポリペプチド」に記載された融合ポリペプチドが挙げられる。
【００８７】
本発明の方法に使用される細胞としては、特に限定されないが、例えば、体細胞が挙げられる。本明細書において、「体細胞」とは、生殖細胞以外の生体内に存在する細胞を意味する。本発明の方法に使用される体細胞としては、特に限定されないが、例えば、間葉系幹細胞（MSC）、線維芽細胞が挙げられる。また、本発明で使用される体細胞が由来する生物種は特に限定されるものではないが、哺乳動物が好ましく、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、サル、イヌ、ウシなどが挙げられるが、好ましくは、マウス、ラット、ヒト、サルであり、より好ましくはヒトである。より具体的には、本発明で使用される体細胞としては、例えば、ヒトMSC、ヒト線維芽細胞が挙げられる。
【００８８】
本発明の方法で使用される培地は、細胞培養の分野において通常使用される培地であれば特に限定されない。また、細胞の種類に応じて、血清を培地に添加することができる。
【００８９】
本発明の方法で使用される培養条件は、細胞の種類に応じて当業者が適宜選択することができる。
【００９０】
培地に添加される本発明の融合ポリペプチドの濃度は、細胞の種類や細胞数、融合ポリペプチドの転写調節活性等により異なるが、例えば、0.01nM〜10μM程度、好ましくは0.1nM〜5μM程度を用いることができる。
【００９１】
本発明の融合ポリペプチドを添加するタイミング及び回数は特に限定されない。本発明の融合ポリペプチドを培地に添加するタイミングは、例えば、培養開始時に添加してもよく、又は、培養開始後に添加してもよい。培養開始後に本発明の融合ポリペプチドを培地に添加する場合、培養開始から例えば1時間後、5時間後、10時間後、15時間後、24時間後（1日後）、36時間後、48時間後（2日後）、3日後、4日後、5日後に添加してもよい。
【００９２】
本発明の融合ポリペプチドが肝細胞分化に関与する遺伝子の転写を調節することができるか否かは、公知の遺伝子発現量測定方法を用いて確認することができる。遺伝子発現量を測定する方法としては、例えば、Real-Time PCR等の方法が挙げられる。Real-Time PCRを用いる場合、例示的な方法において、TaqMan Fast Advanced Master Mix （サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用することによって、被験融合ポリペプチドが肝細胞分化に関与する遺伝子の転写を調節することができるか否かを確認することができる。遺伝子発現量の具体的な評価方法としては、例えば、後記実施例２に記載されるような方法を用いることができる。
【００９３】
７．本発明の融合ポリペプチドを用いた体細胞を肝細胞様細胞にダイレクトリプログラミングする方法
本発明の融合ポリペプチドを用いた体細胞を肝細胞様細胞にダイレクトリプログラミングする方法には、肝細胞分化に関与する遺伝子の転写を促進できる本発明の融合ポリペプチドを含む培地で体細胞を培養することによって、体細胞を肝細胞様細胞にダイレクトリプログラミングする方法が含まれる。
【００９４】
本明細書において「ダイレクトリプログラミング」とは、細胞の分化状態を異なる分化状態へ変更するプロセスを意味する。また、「ダイレクトリプログラミングする」とは、細胞の分化状態を異なる分化状態へ変更することを意味する。
【００９５】
本明細書において、「肝細胞様細胞」とは、肝細胞の特徴的な機能である、グリコーゲン産生能及び尿素産生能を有する細胞を意味する。
【００９６】
肝細胞分化に関与する遺伝子としては、例えば、HNF-1α、HNF-3γ、HNF-4α及びGATA-4（好ましくは、ヒトHNF-1α、ヒトHNF-3γ、ヒトHNF-4α及びヒトGATA-4）などの遺伝子が挙げられる。
【００９７】
本発明のダイレクトリプログラミングする方法で使用される融合ポリペプチドとしては、「１．本発明の融合ポリペプチド」に記載された融合ポリペプチドが挙げられる。
【００９８】
本発明のダイレクトリプログラミングする方法に関して、それぞれ異なる肝細胞分化に関与する遺伝子に結合する本発明の融合ポリペプチドを複数（例えば１〜４種類）含む培地を使用することができる。好ましくはそれぞれ異なる肝細胞分化に関与する遺伝子に結合する本発明の融合ポリペプチドを４種類含む培地を使用することができる。
【００９９】
本発明の方法の１つの実施形態において、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも１種類、好ましくは２種類、より好ましくは３種類、さらにより好ましくは４種類の融合ポリペプチドを含む培地を使用することができる：
（ａ）細胞膜透過性ペプチド、HNF-1αの転写調節領域に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む融合ポリペプチド；
（ｂ）細胞膜透過性ペプチド、HNF-3γの転写調節領域に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む融合ポリペプチド；
（ｃ）細胞膜透過性ペプチド、HNF-4αの転写調節領域に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む融合ポリペプチド；並びに、
（ｄ）細胞膜透過性ペプチド、GATA-4の転写調節領域に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む融合ポリペプチド。
【０１００】
上記（ａ）〜（ｄ）の融合ポリペプチドにおいて、細胞膜透過性ペプチドは配列番号４２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
上記（ａ）〜（ｄ）の融合ポリペプチドにおいて、「転写調節領域」としては、例えばプロモーター領域又はエンハンサー領域が挙げられる。
上記（ａ）〜（ｄ）の融合ポリペプチドにおいて、HNF-1αの転写調節領域に結合するDNA結合ポリペプチド、HNF-3γの転写調節領域に結合するDNA結合ポリペプチド、HNF-4αの転写調節領域に結合するDNA結合ポリペプチド、及びGATA-4の転写調節領域に結合するDNA結合ポリペプチドはそれぞれ、配列番号１に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド、配列番号２に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド、配列番号３に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチド及び配列番号４に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドであってもよい。また、配列番号１に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドは、配列番号７６若しくは７８に示されるアミノ酸配列を含むDNA結合ポリペプチドであってもよく、配列番号２に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドは配列番号８０に示されるアミノ酸配列を含むDNA結合ポリペプチドであってもよく、配列番号３に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが配列番号８２に示されるアミノ酸配列を含むDNA結合ポリペプチドであってもよく、かつ／又は配列番号４に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドが配列番号８４若しくは８６に示されるアミノ酸配列を含むDNA結合ポリペプチドであってもよい。
また、上記（ａ）〜（ｄ）の融合ポリペプチドにおいて、HNF-1αの転写調節領域に結合するDNA結合ポリペプチド、HNF-3γの転写調節領域に結合するDNA結合ポリペプチド、HNF-4αの転写調節領域に結合するDNA結合ポリペプチド、及びGATA-4の転写調節領域に結合するDNA結合ポリペプチドは、それぞれ、配列番号７６又は７８に示されるアミノ酸配列からなるDNA結合ポリペプチド、配列番号８０に示されるアミノ酸配列からなるDNA結合ポリペプチド、配列番号８２に示されるアミノ酸配列からなるDNA結合ポリペプチド及び配列番号８４又は８６に示されるアミノ酸配列からなるDNA結合ポリペプチドであってもよい。また、これらのDNA結合ポリペプチドとしては、好ましくはTALEである。
上記（ａ）〜（ｄ）の融合ポリペプチドにおいて、転写活性化因子としては、例えばVP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択されるものであり、好ましくはGCN5、VP64又はVPRである。
上記（ａ）〜（ｄ）の融合ポリペプチドは、それぞれ、配列番号６、１３２若しくは１６０に示されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、配列番号８若しくは１６２に示されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、配列番号１０若しくは１６４に示されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド及び／又は配列番号１２、１４８若しくは１６６に示されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドであってもよい。
【０１０１】
本発明の方法においては、リプログラミングに関与する遺伝子に結合する本発明の融合ポリペプチドを１若しくは複数含む培地を使用することができる。
【０１０２】
本発明の融合ポリペプチドを用いることにより、体細胞をリプログラミングすることができる。そして、体細胞をリプログラミングすることにより、多能性細胞を作製することができる。本発明において、多能性細胞とは、個体は形成しないが、三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に属する細胞系列の全てに分化し得る能力を有する細胞を意味する。本発明において、多能性細胞としては、例えば多能性幹細胞が挙げられる。多能性幹細胞としては、例えば、人工多能性幹細胞（iPS）細胞が挙げられる。iPS細胞は、多能性分化能と自己複製能を有する。また、本明細書では、iPS細胞と同様の多能性分化能を有する細胞をiPS様細胞と称することがある。
【０１０３】
１つの実施形態において、リプログラミングに関与する遺伝子に結合する本発明の融合ポリペプチドを１若しくは複数含む培地としては、下記の融合ポリペプチドを含む培地を使用することができる：
細胞膜透過性ペプチド、miR302/367クラスター遺伝子の転写調節領域に結合するDNA結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む融合ポリペプチド。
ここで、この融合ポリペプチドにおいて、「転写調節領域」としては、「プロモーター領域又はエンハンサー領域」が挙げられる。
上記融合ポリペプチドにおいて、「miR302/367クラスター遺伝子の転写調節領域に結合するDNA結合ポリペプチド」としては、配列番号４４、４５、４６又は４７に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドであってもよい。また、配列番号４４、４５、４６又は４７に示される塩基配列に結合するDNA結合ポリペプチドは、それぞれ、配列番号８８、９０、９２又は９４に示されるアミノ酸配列を含む若しくはこれらのアミノ酸配列からなるDNA結合ポリペプチドであってもよい。DNA結合ポリペプチドとしては、好ましくはTALEである。
上記（ａ）〜（ｄ）の融合ポリペプチドにおいて、転写活性化因子としては、例えばVP64、VPR、p300及びGCN5からなる群から選択されるものであり、好ましくはGCN5、VP64又はVPRである。
【０１０４】
１つの実施形態において、下記の融合ポリペプチドを含む培地を使用することができる：
配列番号４９、５１、５３又は５５に示されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
【０１０５】
本発明のダイレクトリプログラミングする方法で使用される体細胞、培地、培養条件、本発明の融合ポリペプチドの濃度、並びに、添加タイミング及び回数は、上記の「６．本発明の融合ポリペプチドを用いた肝細胞分化に関与する遺伝子の転写を調節する方法」で説明したとおりである。
【０１０６】
複数種の本発明の融合ポリペプチドを添加するタイミングは、体細胞から肝細胞様細胞をダイレクトリプログラミングできる限り、同時でも同時でなくてもよい。
【０１０７】
本発明の融合ポリペプチドが体細胞を肝細胞様細胞にダイレクトリプログラミングすることができるか否かは、被験融合ポリペプチドを含む培地で培養された被験細胞が、肝細胞様細胞として特徴的な機能である、（ａ）グリコーゲン産生能及び（ｂ）アンモニア代謝経路による尿素産生能を有するかどうかで確認することができる。グリコーゲン産生能を測定する方法としては、例えば、PAS染色アッセイが挙げられる。PASで染色することによって、被験細胞がグリコーゲン産生能を有しているか否かを確認することができる。PAS染色の具体的な評価方法としては、例えば、後記実施例４に記載されるような方法を用いることができる。アンモニア代謝経路による尿素産生能を測定する方法としては、例えば、培養上清中の尿素濃度を測定することによって、被験細胞が尿素産生能を有しているか否かを確認することができる。尿素産生能の具体的な評価方法としては、例えば、後記実施例５に記載されるような方法を用いることができる。
【０１０８】
８．本発明の融合ポリペプチドを用いた体細胞から肝細胞様細胞を製造する方法
本発明の融合ポリペプチドを用いた体細胞から肝細胞様細胞を製造する方法には、肝細胞分化に関与する遺伝子又は細胞のリプログラミングに関与する遺伝子の転写を促進できる本発明の融合ポリペプチドを含む培地で体細胞を培養することによって、体細胞から肝細胞様細胞を製造する方法が含まれる。
【０１０９】
肝細胞分化に関与する遺伝子としては、例えば、HNF-1α、HNF-3γ、HNF-4α及びGATA-4（好ましくは、ヒトHNF-1α、ヒトHNF-3γ、ヒトHNF-4α及びヒトGATA-4）などの遺伝子が挙げられる。
また、細胞のリプログラミングに関与する遺伝子としては、例えば、miR302/367クラスター遺伝子（好ましくはヒトmiR302/367クラスター遺伝子）などが挙げられる。
【０１１０】
本発明の肝細胞様細胞を製造する方法で使用される融合ポリペプチドは、「１．本発明の融合ポリペプチド」に記載された、１又は複数の融合ポリペプチドが挙げられる。
【０１１１】
また、本発明の肝細胞様細胞を製造する方法で使用される培地並びにこれに含まれる１又は複数の融合ポリペプチドは、上記「７.本発明の融合ポリペプチドを用いた体細胞を肝細胞様細胞にダイレクトリプログラミングする方法」において使用される「融合ポリペプチドを含む培地」並びにこれに含まれる融合ポリペプチドと同じである。より具体的には、本発明の肝細胞様細胞を製造する方法で使用される１又は複数の融合ポリペプチドとしては、「７．本発明の融合ポリペプチドを用いた体細胞を肝細胞様細胞にダイレクトリプログラミングする方法」に記載された（ａ）〜（ｄ）の融合ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種類、好ましくは２種類、より好ましくは３種類、さらにより好ましくは４種類の融合ポリペプチド又は配列番号４９、５１、５３又は５５に示されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを使用することができる。
【０１１２】
本発明の肝細胞様細胞を製造する方法に使用される体細胞としては、特に限定されないが、例えば、MSC（好ましくはヒトMSC）、線維芽細胞（好ましくはヒト線維芽細胞）が挙げられる。
【０１１３】
本発明の肝細胞様細胞を製造する方法で使用される体細胞、培地、培養条件、本発明の融合ポリペプチドの濃度、並びに、添加タイミング及び回数は、上記の「６．本発明の融合ポリペプチドを用いた肝細胞分化に関与する遺伝子の転写を調節する方法」で説明したとおりである。
【０１１４】
複数種の本発明の融合ポリペプチドを添加するタイミングは、体細胞から肝細胞様細胞を製造できる限り、同時でも同時でなくてもよい。
【０１１５】
本発明の融合ポリペプチドを含む培地で培養することによって、体細胞から肝細胞様細胞が製造されたかどうかは、「７．本発明の融合ポリペプチドを用いた体細胞を肝細胞様細胞にダイレクトリプログラミングする方法」に記載された方法で確認することができる。
【０１１６】
本発明の方法において、用いられる培地は、上記（ａ）〜（ｄ）の融合ポリペプチドに加えて、さらに他の標的遺伝子に結合する融合ポリペプチドを含むものであってもよい。そのような他の融合ポリペプチドとしては、例えば、MMP-1遺伝子を標的とする融合ポリペプチドが挙げられる。
【０１１７】
９．本発明の肝細胞様細胞
本発明の肝細胞様細胞には、本発明の融合ポリペプチドを用いた体細胞から肝細胞様細胞を製造する方法によって製造された肝細胞様細胞が含まれる。
【０１１８】
本発明の融合ポリペプチドを用いた体細胞から肝細胞様細胞を製造する方法としては、「８．本発明の融合ポリペプチドを用いた体細胞から肝細胞様細胞を製造する方法」に記載された製造方法が挙げられる。
【０１１９】
１０．本発明の組成物
本発明の組成物は、少なくとも１種類の細胞分化に関与する遺伝子に結合する本発明の融合ポリペプチドを含む。本発明の組成物に含まれる融合ポリペプチドは、上記「７.本発明の融合ポリペプチドを用いた体細胞を肝細胞様細胞にダイレクトリプログラミングする方法」において使用される「融合ポリペプチドを含む培地」に含まれる（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも１種類、好ましくは２種類、より好ましくは３種類、さらにより好ましくは４種類の融合ポリペプチド又は配列番号４９、５１、５３又は５５に示されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドと同様である。
【０１２０】
本発明の組成物には、少なくとも１種類の肝細胞分化に関与する遺伝子又は細胞のリプログラミングに関与する遺伝子の塩基配列に結合する本発明の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、組成物も含まれる。
【０１２１】
本発明の組成物が少なくとも１種類の肝細胞分化に関与する遺伝子に結合する本発明の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む場合、当該ポリヌクレオチドは、単離ポリヌクレオチドとして存在するだけでなく、当該ポリヌクレオチドがプラスミドに組み込まれている状態やウイルスベクター（レンチウイルスベクターやアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどの公知のウイルスベクター）に組み込まれている状態として存在してもよい。又は、該ポリヌクレオチドがコードする遺伝子のmRNAとして存在してもよい。
【０１２２】
本発明の組成物は、体細胞を肝細胞様細胞にダイレクトリプログラミングするために使用することができる。また、本発明の組成物は、体細胞から肝細胞様細胞を製造するために使用することができる。すなわち、本発明は、体細胞を肝細胞様細胞にダイレクトリプログラミングするための組成物、及び体細胞から肝細胞様細胞を製造するための組成物を提供する。
【０１２３】
本発明の組成物は、細胞培養の培地に添加して使用することができる。また、本発明の組成物は、培地そのものとして使用することもできる。本発明の組成物を培地として使用する場合は、本発明の組成物は、本発明の融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのほか、炭素源、ビタミン、無機塩類などの栄養源、及び増殖因子など、通常の細胞培養に必要な成分を含むことができる。
【０１２４】
また、本発明の組成物は、医薬組成物として使用することができる。本発明の組成物を医薬組成物として使用する場合は、本発明の融合ポリペプチド若しくは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は本発明の肝細胞様細胞のほか、本発明の組成物に適する任意の担体（リポソーム、脂質小胞体、ミセル等）、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、緩衝剤、懸濁剤、潤滑剤、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存料、界面活性剤、着色料などを含んでもよい。
【０１２５】
複数の融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを培地に添加する場合、又は生体に投与する場合、組成物は、各融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードする各ポリヌクレオチドを、単一の容器に一緒に含むものであってもよいし、それぞれ別個の容器に含むものであってもよい。複数の融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同時に添加又は投与しない場合、組成物は、各融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードする各ポリヌクレオチドをそれぞれ別個の容器に含む。例えば、組成物は、各融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードする各ポリヌクレオチドを、単一の包装中の別個の容器に、又は別個の包装中の別個の容器に含む。
本発明の組成物は、肝細胞分化に関与する遺伝子又は細胞のリプログラミングに関与する遺伝子に結合する融合ポリペプチドに加えて、さらに他の標的遺伝子に結合する融合ポリペプチドを含むものであってもよい。そのような他の融合ポリペプチドとしては、例えば、MMP-1遺伝子を標的とする融合ポリペプチドが挙げられる。
【０１２６】
１１．本発明の組み合わせキット
本発明の組み合わせキットには、少なくとも２種類のそれぞれ異なる細胞分化に関与する遺伝子の塩基配列に結合する本発明の融合ポリペプチドを含む、組み合わせキットが含まれる。
【０１２７】
１つの実施形態において、本発明の組み合わせキットは、１又は複数の融合ポリペプチドを含む、組み合わせキットである。本発明の組合せキットに含まれる１又は複数の融合ポリペプチドは、上記「７.本発明の融合ポリペプチドを用いた体細胞を肝細胞様細胞にダイレクトリプログラミングする方法」において使用される「融合ポリペプチドを含む培地」に含まれる（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも１種類、好ましくは２種類、より好ましくは３種類、さらにより好ましくは４種類の融合ポリペプチド又は配列番号４９、５１、５３又は５５に示されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドと同様である。
【０１２８】
本発明の組み合わせキットには、少なくとも２種類のそれぞれ異なる細胞分化に関与する遺伝子に結合する本発明の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、組み合わせキットも含まれる。
【０１２９】
本発明の組み合わせキットが少なくとも２種類のそれぞれ異なる細胞分化に関与する遺伝子に結合する本発明の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む場合、当該ポリヌクレオチドは、単離ポリヌクレオチドとして存在するだけでなく、当該ポリヌクレオチドがプラスミドに組み込まれている状態やウイルスベクター（レンチウイルスベクターやアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどの公知のウイルスベクター）に組み込まれている状態として存在してもよい。又は、当該ポリヌクレオチドがコードする遺伝子のmRNAとして存在してもよい。
【０１３０】
複数の融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを培地に添加する場合、又は生体に投与する場合、組み合わせキットは、各融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードする各ポリヌクレオチドを、粉末剤又は液剤のような単一の組成物中に一緒に又は複数の組成物中に別々に含むことができる。融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同時に添加又は投与しない場合、組み合わせキットは、各融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードする各ポリヌクレオチドをそれぞれ別個の組成物中に含むことができる。例えば、組み合わせキットは、各融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードする各ポリヌクレオチドを、単一の包装中の別個の組成物中に、又は別個の包装中の別個の組成物中に含む。
【０１３１】
本発明の組み合わせキットには、本発明の融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのほか、緩衝液、希釈用溶液、細胞培養用培地、培養用プレート、その他の細胞培養に必要な製品、使用説明書などを含めることもできる。
【０１３２】
また、本発明の組み合わせキットは、体細胞を肝細胞様細胞へダイレクトリプログラミングするために使用することができる。すなわち、本発明は、本発明の融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、体細胞をダイレクトリプログラミングするための組み合わせキットを提供する。また、本発明の組み合わせキットは、体細胞をリプログラミングするために使用することができる。すなわち、本発明は、本発明の融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、体細胞をリプログラミングするための組み合わせキットを提供する。
【０１３３】
また、本発明の組み合わせキットは、体細胞から肝細胞様細胞を製造するために使用することができる。すなわち、本発明は、本発明の融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、体細胞から肝細胞様細胞を製造するための組み合わせキットを提供する。
本発明の組み合わせキットは、肝細胞分化に関与する遺伝子又は細胞のリプログラミングに関与する遺伝子に結合する融合ポリペプチドに加えて、さらに他の標的遺伝子に結合する融合ポリペプチドを含むものであってもよい。そのような他の融合ポリペプチドとしては、例えば、MMP-1遺伝子を標的とする融合ポリペプチドが挙げられる。
【０１３４】
１２．本発明の医薬組成物
本発明の医薬組成物には、本発明の肝細胞様細胞又は本発明の融合ポリペプチド及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。例えば、本発明の医薬組成物は、本発明の肝細胞様細胞又は上記「７.本発明の融合ポリペプチドを用いた体細胞を肝細胞様細胞にダイレクトリプログラミングする方法」に記載の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも２種類、好ましくは３種類、より好ましくは４種類の融合ポリペプチド又は配列番号４９、５１、５３又は５５に示されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを含む。また、本発明においては、上記「１０．本発明の組成物」に記載の組成物を医薬組成物として使用することができる。本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、門脈内投与又は皮下投与等により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。薬学的に許容される賦形剤としては、例えば、生理食塩水や緩衝液が挙げられる。また、必要に応じて、肝細胞様細胞の栄養源となる成分を含めることができる。
【０１３５】
本発明の医薬組成物は、肝臓疾患の予防又は治療のために用いることができる。本発明において、肝臓疾患としては、例えば、肝線維症、肝炎、肝硬変、肝臓癌などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１３６】
本発明には、本発明の肝細胞様細胞又は本発明の融合ポリペプチドを含む、肝臓疾患の予防又は治療のための医薬組成物が含まれる。また、本発明には、本発明の肝細胞様細胞又は本発明の融合ポリペプチドの治療有効量を投与する工程を含む、肝臓疾患を予防又は治療する方法が含まれる。また、本発明には、肝臓疾患の予防又は治療に使用するための、本発明の肝細胞様細胞又は本発明の融合ポリペプチドが含まれる。さらに、本発明には、肝臓疾患の予防又は治療用医薬組成物の製造における、本発明の肝細胞様細胞又は本発明の融合ポリペプチドの使用が含まれる。例えば、これらの使用及び方法の発明において使用される融合ポリペプチドは、上記「７.本発明の融合ポリペプチドを用いた体細胞を肝細胞様細胞にダイレクトリプログラミングする方法」に記載の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも２種類、好ましくは３種類、より好ましくは４種類の融合ポリペプチドを含む。
【０１３７】
本発明の肝細胞様細胞を肝臓疾患の予防又は治療に用いる場合において、患者に投与する細胞の個数は、当業者であれば患者の症状、性別、年齢等によって適宜設定することができるが、1回投与分の量として、例えば、約1×104〜1×1011個、好ましくは約1×106〜1×1010個である。
【０１３８】
複数の融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを生体に投与する場合、医薬組成物は、各融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードする各ポリヌクレオチドを、単一の容器に一緒に含むものであってもよいし、それぞれ別個の容器に含むものであってもよい。複数の融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同時に投与しない場合、医薬組成物は、各融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードする各ポリヌクレオチドをそれぞれ別個の容器に含む。例えば、医薬組成物は、各融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードする各ポリヌクレオチドを、単一の包装中の別個の容器に、又は別個の包装中の別個の容器に含む。
【０１３９】
本発明の肝細胞様細胞は、薬物開発のためのツール（例えば試薬）としても使用することができる。例えば、薬物候補が肝臓に影響を与えるかどうかを検討するためのツールとして使用することができる。
【０１４０】
本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
［実施例］
【０１４１】
市販のキット又は試薬等を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。また、便宜上、濃度mol/LをMとして表す。例えば、１M水酸化ナトリウム水溶液は1 mol/Lの水酸化ナトリウム水溶液であることを意味する。
【実施例１】
【０１４２】
NTP-TALE-Activatorの作製
ヒトHNF-1α、ヒトHNF-3γ、ヒトHNF-4α及びヒトGATA-4は、人工多能性幹細胞のような未分化な細胞を介さずに、分化した体細胞を肝細胞へダイレクトに分化誘導する作用が報告されている。
本実施例では、これらの遺伝子のプロモーターに特異的に結合するTALE、配列番号１３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドがコードする細胞膜透過性ペプチド（NTPとも称する）（国際公報第2008/108505号）及び各種転写活性化因子を含む融合ポリペプチド（以下、TALE、NTP及び各種転写活性化因子を含む融合ポリペプチドを「NTP-TALE-Activator」又は「NTP-ATF（Artificial transcription factor）」とも称する）を作製した。【０１４３】
（１）発現プラスミドpEU-E01-GST-NTP-TEVの作製
発現プラスミドpEU-E01-MCS(セルフリーサイエンス社)のマルチクローニングサイトにGlutathione S-transferase（GST）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１４）、細胞透過性ペプチド（NTP。アミノ酸配列RIFIHFRIGCからなる）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１３）、TEVプロテアーゼの標的ペプチド（以下、「TEV」と記す。）（配列番号７４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５）を５’側から順に挿入した。
具体的には、pGEX-6P-1（GE ヘルスケア）を鋳型としてPCR反応によりポリヌクレオチドの５’末端に制限酵素EcoRVサイトを、３’末端に制限酵素BamHIサイトをそれぞれ付加したポリヌクレオチドを合成した。
制限酵素EcoRV及びBamHIを用いて発現プラスミドpEU-E01-MCSに上記ポリヌクレオチドを挿入することにより、発現プラスミドpEU-E01-GSTを作製した。
次に、５’末端側から順に制限酵素BamHIサイト配列、NTPをコードするポリヌクレオチド、TEVプロテアーゼの認識配列をコードするポリヌクレオチド（以下、「TEV配列」と記す。）、制限酵素XhoIサイト配列、制限酵素SgfIサイト配列、制限酵素PmeIサイト配列、制限酵素NotIサイト配列、制限酵素SalIサイト配列を含むポリヌクレオチド（但し、制限酵素XhoIサイトと制限酵素SgfIサイトの間にはコードするアミノ酸配列のフレームを合わせるためにシトシンを挿入した）を作製した。
制限酵素BamHI及びSalIを用いて、前記ポリヌクレオチドを発現プラスミドpEU-E01-GSTに挿入した。
その後、配列番号１６及び配列番号１７に示されるプライマーを用いてインバースPCRを行い、制限酵素BsmBIの標的配列を含む領域を除去することによって、発現プラスミドpEU-E01-GST-NTP-TEVを作製した。【０１４４】
（２）プラスミドpEU-E01-GST-NTP-TEV-ΔTALE-VP64の作製
配列番号１８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド［TALEの一部をコードする塩基配列及びVP64をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（ΔTALE-VP64と称する。VP64のC末端にバリンが付加されている）］を、（１）で作製した発現プラスミドpEU-E01-GST-NTP-TEVのTEV配列の直後にIn-Fusion ライゲーション（タカラバイオ）により組み込むことで、プラスミドpEU-E01-GST-NTP-TEV-ΔTALE-VP64Vを得た。VP64のC末端にバリンが付加されているため末尾にVを付けた名称とした。【０１４５】
（３）マウスmiR-302/367クラスター遺伝子を標的とするTALEの作製
マウスmiR-302/367クラスター遺伝子（Accession Noは、miR302aがMI0000402、miR302b はMI0003716、miR302cはMI0003717、miR302dはMI0003718、miR367はMI0003531である）の周辺配列を公知のデータベースであるEnsemble genome browserで検索し、そのプロモーターとして作用することが予想される当該遺伝子の転写開始点から上流約500bpの遺伝子領域から、TALE［クローン１（TALE-1）、クローン２（TALE-2）、クローン３（TALE-3）、クローン４（TALE-4）］の標的塩基配列として、それぞれ、TACTTTCCCCAGAGCT（塩基番号-126〜-109）、TCAAACGGGCAGATAGG（塩基番号-265〜-249）、TAAAGAGGAGGATAT（-238〜-224）、及びTCAAACGGGCAGATAGGAG（-265〜-247）の４種類の塩基配列（それぞれ配列番号４４から配列番号４７に示される塩基配列）を選択した（図３Ａ）。
公知の方法（例えば、Platinum Gate TALEN construction protocol（Yamamoto lab）（https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/b0/52/b0527900-3204-471a-992d-189679e2ede0/platinum-gate-protocol.pdf）を参照。）により、これら４種類の塩基配列にそれぞれ特異的に結合するように設計されたDNA結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製した。
T4 DNA Ligase（Quick Ligation Kit:New England BioLabs）を用いて、（２）で作製したプラスミドDNAであるpEU-E01-GST-NTP-TEV-ΔTALE-VP64に含まれる塩基配列を、上述のDNA結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（TALE-1〜4）に置換した。これにより、上記標的塩基配列に結合するポリペプチド（それぞれTALE-miR302/367-1からTALE-miR302/367-4とも称する）をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドDNAを取得した。【０１４６】
（４）ヒトHNF1α遺伝子を標的とするTALEの作製
転写因子であるヒトHNF1α（hepatocyte nuclear factor 1 homeobox A、Accession No. NM_001306179.1）の周辺配列を公知のデータベースであるEnsemble genome browserで検索し、そのプロモーターとして作用することが予想される当該遺伝子の転写開始点から上流500bpの遺伝子領域から、Accession No.NC_12.12の塩基番号120978444から120978461まで、及び塩基番号120978580から120978597までの2箇所の塩基配列をTALEの標的塩基配列として選択し、上記（３）と同様の方法により、これらの塩基配列に特異的に結合するように設計されたDNA結合ポリペプチド（TALE-HNF1α-1及びTALE-HNF1α-2とも称する）をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドDNAを取得した。【０１４７】
（５）ヒトHNF3γ遺伝子を標的とするTALEの作製
転写因子であるヒトHNF3γ遺伝子（Accession No.NM_004497.2）の周辺配列をEmsanble genome browserで検索し、そのプロモーターとして作用することが予想される当該遺伝子の転写開始点から上流500bpの遺伝子領域から、Accession No.NC_19.10の塩基番号45864156から45864173までの塩基配列からなる遺伝子領域をTALEの標的塩基配列として選択した。上記（３）と同様の方法により、この塩基配列に特異的に結合するように設計されたDNA結合ポリペプチド（TALE-HNF3γ-1とも称する））をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドDNAを取得した。【０１４８】
（６）ヒトHNF4α遺伝子を標的とするTALEの作製
転写因子であるヒトHNF4α遺伝子(Accession No.NM_000457.4)の周辺配列をEmsanble genome browserで検索し、エンハンサーとして作用することが予想される当該遺伝子の転写開始点から上流50000bpの遺伝子領域から、Accession No.NC_20.11の塩基番号44355800から44355817までの塩基配列からなる領域をTALEの標的塩基配列として選択した。上記（３）と同様の方法により、この塩基配列に結合するように設計されたDNA結合ポリペプチド（TALE-HNF4α-1とも称する））をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドDNAを取得した。【０１４９】
（７）ヒトGATA4遺伝子を標的とするTALEの作製
転写因子であるヒトGATA4遺伝子(Accession No.NM_001308093.1)の周辺配列をEmsanble genome browserで検索し、プロモーターとして作用することが予想される当該遺伝子の転写開始点から上流500bpの遺伝子領域から、Accession No.NC_08.11の塩基番号11703958から11703975まで、及び塩基番号11703918から11703935までの２箇所の塩基配列からなる領域をTALEの標的塩基配列として選択した。上記（３）と同様の方法により、これらの塩基配列に結合するように設計されたDNA結合ポリペプチド（TALE-GATA4-1及びTALE-GATA4-2とも称する）をそれぞれコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドDNAを取得した。【０１５０】
（８）ヒトMMP1遺伝子を標的とするTALEの作製
ヒトMMP1遺伝子の周辺配列をEmsanble genome browserで検索し、プロモーターとして作用することが予想される当該遺伝子の転写開始点から上流500bpの遺伝子領域から、TALEの標的塩基配列を選択した。上記（３）と同様の方法により、これらの塩基配列に結合するように設計されたDNA結合ポリペプチド（TALE-MMP1-1及びTALE-MMP1-2とも称する）をそれぞれコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドDNAを取得した。TALE-MMP1-1及び転写因子VPRを含むNTP-ATF（NTP-TALE-MMP1-1-VPR）（配列番号５７）をコードする塩基配列を配列番号５６に示す。また、TALE-MMP1-2及び転写活性化因子VPRを含むNTP-ATF（NTP-TALE-MMP1-2-VPR）（配列番号１１０）をコードする塩基配列を配列番号１０９に示す。【０１５１】
（９）コントロール蛋白質
TALEを含む蛋白質に対するネガティブコントロールとして、pEU-E01-GST-NTP-TEV-ΔTALE-VP64発現プラスミドDNAのTEV配列の下流にEGFP(Accession No.AMQ45847.1由来)のコード領域をフレームが一致するように制限酵素処理とライゲーション反応により挿入した。これをpEU-E01-GST-NTP-TEV-EGFP発現プラスミドDNAと称する。【０１５２】
（３）から（８）で作製した各種TALEをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを発現プラスミドDNA「pEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-VP64V」と総称する。【０１５３】
（１０）NTP-TALE-Activatorをコードする発現プラスミドの作製
以下の方法で、（３）から（８）で作製した発現プラスミドpEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-VP64Vを用いて、発現プラスミドpEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-VP64を作製した。
また、発現プラスミドpEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-VP64のVP64をコードする塩基配列を、VPR、p300のCore Effector Domain（以下、「p300CD」と記す。）及びGCN5のCore Effector Domain（以下、「GCN5CD」と記す。）をそれぞれコードする塩基配列に置き換えた種々の発現プラスミドを作製した。
具体的には、PrimeSTAR（登録商標） Max DNA Polymerase(タカラバイオ)を用いて、PCR反応により、（３）から（８）で作製した発現プラスミドpEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-VP64Vを鋳型として、TALE及びVP64をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの、５’末端側に制限酵素SgfIサイト配列が、３’末端側に制限酵素NotIサイト配列がそれぞれ付加されたポリヌクレオチドを作製した。当該ポリヌクレオチドをTALE-VP64と称する。
TALE-VP64の作製に用いたプライマーの配列を以下に示す。
Forward: GCGATCGCaccatgATCCACGGAGTCCCA（配列番号１１１）
Reverse: GTTTAAACCAGCATGTCCAGGTCGAAATC（配列番号１１２）【０１５４】
このTALE-VP64を制限酵素SgfIおよびNotIで切断し、（１）で作製した発現プラスミドpEU-E01-GST-NTP-TEVの制限酵素サイトSgfIおよびNotIの間に挿入し、発現プラスミドpEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-VP64を作製した。【０１５５】
次に、上述した発現プラスミドDNAであるpEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-VP64を鋳型としてPCR反応を行った。PCRに用いたプライマーの塩基配列を以下に示す。
Forward: GTTTAAACTGCGGCCGCGTCG（配列番号２２）
Reverse: GCTGGCTGACGCGCGAGTTTG（配列番号２３）
これにより、VP64をコードする塩基配列を除去し、かつ、３’側にCGCGCGTCAGCCAGC（配列番号３７）を、５’側にGTTTAAACTGCGGCC（配列番号３８）をそれぞれ付加したポリヌクレオチドを作製した。以下、当該ポリヌクレオチドをpEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-PCRと称する。【０１５６】
また、VPRについて、配列番号５８及び配列番号５９に示されるプライマーを用いたPCR反応により、VPRをコードするポリヌクレオチドの５’末端側にCGCGCGTCAGCCAGCを、３’末端側にGTTTAAACTGCGGCCをそれぞれ付加した。当該ポリヌクレオチドをVPR-PCRと称する。【０１５７】
pEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-PCR及びVPR-PCRを1対10の量比でIn-Fusion（登録商標） HD Cloning Plus kit（タカラバイオ）を用いて連結させた。これにより、転写活性化因子としてVPRをコードする発現プラスミドを作製した。当該発現プラスミドをpEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-VPRと称する。当該発現プラスミドについては、公知のアガロース電気泳動法及びシークエンシングを行うことにより、所望のコンストラクトがクローニングされていることを確認した。【０１５８】
同様に、p300CDに関してはPCR反応により、1246pCMVbp300HA（Addgene）を鋳型として、p300CDをコードするポリヌクレオチドの５’末端側にCGCGCGTCAGCCAGCを、３’末端側にGTTTAAACTGCGGCCをそれぞれ付加した。当該ポリヌクレオチドをp300CD-PCRと称する。
PCRに用いたプライマーの塩基配列を以下に示す。
Forward: CGCGCGTCAGCCAGCATTTTCAAACCAGAAGAACTA（配列番号１１５）
Reverse: GGCCGCAGTTTAAACGTCCTGGCTCTGCGTGTGCAGC（配列番号１１６）【０１５９】
同様に、GCN5CDをコードするポリヌクレオチドはPCR反応により、Flexi ORF clone FXC03762（かずさDNA研究所）を鋳型として、GCN5CDをコードするポリヌクレオチドの５’末端側にCGCGCGTCAGCCAGCを、３’末端側にGTTTAAACTGCGGCCをそれぞれ付加した。当該ポリヌクレオチドをGCN5CD-PCRと称する。
PCRに用いたプライマーの塩基配列を以下に示す。
Forward: CGCGCGTCAGCCAGCGGCATCATCGAGTTCCATGTC（配列番号２４）
Reverse: GGCCGCAGTTTAAACCTTGTCAATGAGGCCTCCCTC（配列番号２５）【０１６０】
これらをVPRの場合と同様に、In-Fusion（登録商標） HD Cloning Plus kitを用いて、pEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-PCRにp300CD-PCR及びGCN5CD-PCRをそれぞれ連結させた。
これにより転写活性化因子としてp300CDをコードする発現プラスミド、及び転写活性化因子としてGCN5CDをコードする発現プラスミドをそれぞれ完成した。当該発現プラスミドをそれぞれpEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-p300CD及びpEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-GCN5CDと称する。
完成した２種類の転写活性化因子を含む発現プラスミド群は、アガロース電気泳動法及びシークエンシングにより、所望のコンストラクトがクローニングされていることを確認した。【０１６１】
（１１）NTP-TALE-Activator組み換え蛋白質の作製
（９）で作製した各種NTP-ATFをコードする発現プラスミドを鋳型として、コムギ無細胞タンパク質合成キット（WEPRO7240G Expression Kit、セルフリーサイエンス社)を用いて、組み換え蛋白質を発現し、精製した。【０１６２】
コムギ無細胞タンパク質合成キットを用いて、（９）で作製した各種NTP-ATF発現用プラスミドDNAと対照蛋白質をコードするpEU-E01-GST-NTP-TEV-EGFP発現プラスミドDNAをそれぞれ4μgを用いて反応液量1.2 mLになるスケールで各蛋白質を合成した。合成後、反応液量に対して0.1%のEmpigen（シグマ）を添加した。さらに、リン酸緩衝液で飽和したGlutathione Sepharose 4B（GEヘルスケア）を60μL加えて4℃で2時間振盪した。遠心分離によりGlutathione Sepharoseを回収し、氷冷したリン酸緩衝液1 mLに懸濁した。再度、遠心分離する作業を2回繰り返した。回収したGlutathione Sepharoseを150 mM塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液1 mLに懸濁した。再度、遠心分離によりGlutathione Sepharoseを分離した。【０１６３】
次に、Glutathione Sepharoseに結合したNTP-ATFを抽出するために、以下の操作を行った。
即ち、30 mMの還元型グルタチオン（和光）を含む50 mMトリス塩酸緩衝液（pH 8.0）60μLを上述のGlutathione Sepharoseに添加した。室温1分間浸透した後、遠心分離により上清を回収した。同じ作業を2回繰り返した。上清を回収することにより、NTP-ATFを回収した。
回収した上清にグリセリン（ナカライ）を終濃度20%、及びプロテアーゼ阻害剤（Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail、サーモフィッシャーサイエンス）を終濃度1%となるようにそれぞれ添加して氷上で保存した。
回収した蛋白質を無血清培地（miR-302/367標的NTP-ATFの場合にはOpti-MEM培地（サーモフィッシャー）、他のNTP-ATFの場合にはMSCGM-CDTM 間葉系幹細胞増殖培地（カタログ番号 00190632、ロンザジャパン株式会社））で透析した後、0.22μmの滅菌フィルター（マイレックス）で滅菌した。
蛋白質濃度は、SDSポリアクリルアミド電気泳動法とクーマジーブリリアント染色法を用いて、並行して泳動したBSA（シグマ fractionV）との比較から算定した。【０１６４】
NTP-TALE-HNF-1α-GCN5CD、NTP-TALE-HNF-3γ-GCN5CD、NTP-TALE-HNF-4α-GCN5CD及びNTP-TALE-GATA-4-VP64を、微量透析カラム（トミー）でOpti-MEM培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に対して3時間4℃で透析した。精製後の濃度は、NTP-TALE-HNF-1α-GCN5CDが85nM、NTP-TALE-HNF-3γ-GCN5CDが50nM、NTP-TALE-HNF-4α-GCN5CDが90nM、NTP-TALE-GATA-4-VP64が75nMであった。後述する実施例で使用するために、Opti-MEM培地でそれぞれ10nMに希釈した。【０１６５】
本実施例で得られた各種NTP-ATFを表１に示す。
【表１】
2019189814.tif 000002
【実施例２】
【０１６６】
NTP-TALE-Activatorによる標的遺伝子の発現誘導
（１）各NTP-TALE-Activator単独添加による発現誘導（各NTP-TALE-Activatorを培地に添加したときの細胞内ヒトmRNA発現量の測定
実施例１で作製した各NTP-TALE-Activatorが標的遺伝子のmRNA発現を亢進するかどうか評価した。【０１６７】
間葉系幹細胞増殖培地（ロンザジャパン株式会社、MSCGM-CD）を用いてヒト臍帯マトリクス由来MSC（以下「UC-MSC」と称する。PromoCell社、C-12971）を37℃に設定されたCO2インキュベーター内で96ウェルプレート（ベクトンディッキンソン、Biocoat collagen l cell ware）にウェル当たり細胞7000個を播種して培養した。継代1日後に100μLの肝臓細胞分化誘導培地（20ng/ml HGF（PeproTech、100-39）、10ng/ml basic-FGF（PeproTech、100-18B）、0.61mg/ml Nicotinamide（シグマ、N0636-100G）及び10%ウシ胎児血清（サーモフィッシャーサイエンティフィック、12483-020）含有Iscove改変ダルベッコ培地（IMDM、サーモフィッシャーサイエンティフィック、12200-036）。濃度はすべて終濃度を示す。）に置換し、実施例１で取得したNTP-TALE-HNF-1α-GCN5CD、NTP-TALE-HNF-3γ-GCN5CD、NTP-TALE-HNF-4α-GCN5CD又はNTP-TALE-GATA-4-VP64をそれぞれ2.5μLずつ別々の肝臓細胞分化誘導培地に添加した。コントロール群として、NTP-TALE-Activatorを添加しないウェルを作製した。24時間後、細胞を回収した。各NTP-TALE-Activatorを含む肝臓細胞分化誘導培地でUC-MSCを培養した群をNTP-TALE-Activator単独添加群と称する。コントロール群を非添加群と称する。【０１６８】
回収した細胞は氷冷したリン酸緩衝液100μLで1回洗浄した後、TaqMan（登録商標）Gene Expression Cells-to-CTTM kit（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に付属の溶解液（Lysis solution 29.7μL及びDNaseI 0.3μLの混合溶液）30μLを各ウェルに添加して細胞と混合した。室温で5分静置した後、上記kitに付属のStop solutionを各ウェル3μL加えて室温で2分静置した。これにより細胞から抽出されたRNAを含む細胞溶解液が得られた。【０１６９】
細胞から抽出したRNAを含む細胞溶解液を鋳型として、逆転写酵素（Prime Script（登録商標）、タカラバイオ）を用い、そのプロトコールに従ってRNAからcDNAを作製した。次いで、下記のプライマー及びSYBR（登録商標） Green PCR Master Mix and SYBR（登録商標） Green RT-PCR Reagents Kit（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用し、CFX96リアルタイムPCR装置（バイオラッド）でReal-Time PCRを行い、各mRNA量を測定した。内在性コントロール遺伝子として、グリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）遺伝子mRNA量を測定した。同一試料について各3ウェル重複して実施した。【０１７０】
ヒトHNF-1αのmRNA量測定のために、配列番号２７及び配列番号２８に示されるプライマーをそれぞれ用いた。ヒトHNF-3γのmRNA量測定のために、配列番号２９及び３０に示されるプライマーをそれぞれ用いた。ヒトHNF-4αのmRNA量測定のために、配列番号３１及び３２に示されるプライマーをそれぞれ用いた。ヒトGATA-4のmRNA量測定のために、配列番号３３及び３４に示されるプライマーセットをそれぞれ用いた。ヒトGAPDHのmRNA量測定のために、配列番号３５及び配列番号３６に示されるプライマーセットを用いた。【０１７１】
ポジティブコントロールとして、ヒト肝臓（BioChain  1234149-50）全RNAを抽出し、これを鋳型としてcDNAを合成した。RNAの抽出とcDNAの逆転写の方法は、上記キットに付属の逆転写酵素を用い、そのプロトコールに従ってRNAを抽出し、cDNAを作製した。【０１７２】
測定結果は、各実験群におけるヒトHNF-1α、ヒトHNF-3γ、ヒトHNF-4α及びヒトGATA-4の、ヒトGAPDHのmRNA発現量に対する相対発現量を、各実験群におけるポジティブコントロールの発現量を1とした時の比で示している。検出限界値は各遺伝子ともポジティブコントロール比で0.00036であった。【０１７３】
【表２】
2019189814.tif 000003
【０１７４】
表２に示す通り、非添加群に比較して、ヒトHNF-1α、ヒトHNF-3γ、ヒトHNF-4α及びヒトGATA-4 mRNAの発現はいずれも上昇したことが認められた。
したがって、各NTP-TALE-Activatorが標的遺伝子の転写を誘導することが認められた。【０１７５】
（２）複数のNTP-TALE-Activator添加による発現誘導（複数のNTP-TALE-Activatorを同じ培地に添加したときの細胞内ヒトmRNA発現量の測定）【０１７６】
上記（１）に記載の方法と同様の方法で試験を行った。ただし、100μLの肝臓細胞分化誘導培地（成分組成は実施例２と同じ）に、NTP-TALE-HNF-1α-GCN5CD、NTP-TALE-HNF-3γ-GCN5CD、NTP-TALE-HNF-4α-GCN5CD及びNTP-TALE-GATA-4-VP64をそれぞれ2.5μLずつ同じ培地に添加した（肝臓細胞分化誘導培地にはNTP-TALE-HNF-1α-GCN5CD、NTP-TALE-HNF-3γ-GCN5CD、NTP-TALE-HNF-4α-GCN5CD及びNTP-TALE-GATA-4-VP64が含まれている。これらNTP-TALE-Activatorを含む肝臓細胞分化誘導培地でUC-MSCを培養した群を「NTP-TALE-Activator添加群」と称する。）。そして、１日2回、5日間連続してNTP-TALE-HNF-1α-GCN5CD、NTP-TALE-HNF-3γ-GCN5CD、NTP-TALE-HNF-4α-GCN5CD及びNTP-TALE-GATA-4-VP64をそれぞれ2.5μL添加した。その後、肝臓細胞分化誘導培地100μLで培地交換し、さらに2日間培養した。コントロール群として、各NTP-TALE-Activatorを添加しないウェルを作製した（非添加群と称する）。培養後の細胞をそれぞれ回収した。同一試料について各3ウェル重複して実施した。【０１７７】
実施例２と同様に、ヒトHNF-1α、ヒトHNF-3γ、ヒトHNF-4α、ヒトGATA-4及びヒトGAPDHのmRNA量を測定した。測定結果は、各実験群におけるヒトHNF-1α、ヒトHNF-3γ、ヒトHNF-4α及びヒトGATA-4の、ヒトGAPDHのmRNA発現量に対する相対発現量を、各実験群におけるポジティブコントロールの発現量を1とした時の比で示している。なお検出限界値は各遺伝子ともポジティブコントロール比で0.00036であった。【０１７８】
【表３】
2019189814.tif 000004
【０１７９】
表３に示す通り、非添加群に比較して、ヒトHNF-1α、ヒトHNF-3γ、ヒトHNF-4α及びヒトGATA-4 mRNAの発現は、NTP-TALE-Activator添加群でいずれも上昇した。
したがって、各NTP-TALE-Activatorを組み合わせて添加した場合にも標的遺伝子の転写を誘導することが認められた。【０１８０】
（３）NTP-TALE-Activatorによる内在性miR-302/367クラスター遺伝子の発現誘導
以下の通り、実施例１で作製した、TALE1〜4のそれぞれを含む4種類のNTP-TALE-miR-302/367-VP64蛋白質をマウス胎児由来線維芽細胞（MEF）の培養液にそれぞれ別々に添加し、内在性miR-302/367クラスター遺伝子発現を誘導するかを検証した。【０１８１】
使用したMEFは、Nanog遺伝子プロモーターの3’側下流にGFP遺伝子をノックインした遺伝子改変C57BL/6マウス由来で、受精後13.5日の胚から調製した。細胞の維持及び添加実験は、以後に記載する細胞も含めて全て、37℃、湿度100%に設定したCO2インキュベーターで行った。それぞれの蛋白質を0.25mMの濃度で培養液中に添加した。
MEFの培養液中にNTP-ATFとして、４種類のNTP-TALE-miR-302/367-VP64蛋白質をそれぞれ、0.25 nMから10 nMまで濃度を変えて添加した。
翌日、回収した細胞を氷冷したリン酸緩衝液(PBS:phosphate buffer saline)100μLで1回洗浄した後、TaqMan（登録商標）Gene Expression Cells-to-CTTM kit（サーモフィッシャーサイエンス）に付属の溶解液（Lysis solution 29.7μL及びDNaseI 0.3μLの混合溶液）30μLを各ウェルに添加してピペッティングで細胞と混合した。室温で5分静置した後、上記kitに付属のStop solutionを各ウェル3μL加えて室温で2分静置した。
これにより得られた細胞を用いて、miR-302/367クラスター遺伝子の発現量を定量的PCR解析で評価した（miScript II RT kit 及び、miScript SYBR Green PCR kit Qiagen）。以後の実験では0.25nMのNTP-ATFを使用した。【０１８２】
細胞から抽出したRNAを含む細胞溶解液を鋳型として、逆転写酵素（Prime Script（登録商標）、タカラバイオ）を用い、通常使用されるプロトコールに従って、RNAからcDNAを作製した。
次いで、下記のプライマー及びSYBR（登録商標） Green PCR Master Mix and SYBR（登録商標） Green. RT-PCR Reagents Kit（サーモフィッシャーサイエンス）を使用し、CFX96リアルタイムPCR装置（バイオラッド）で、定量的なPCR解析を行った。
使用したプライマーの配列を以下に示す（Fw：フォワードプライマー）。
【表４】
2019189814.tif 000005
リバースプライマーは、キット付属のユニバーサルプライマーを用いた。【０１８３】
測定結果を、内在性コントロールとして測定したU6 mRNAの発現量を使用し、相対比で示した。
U6 mRNAの発現量を確認するためのプライマーの配列を以下に示す。
Forward primer: GTGCTCGCTTCGGCAGCACATA（配列番号１５８）
リバースプライマーは、キット付属のユニバーサルプライマーを用いた。【０１８４】
その結果、4種類のNTP-TALE-miR-302/367-VP64蛋白質（TALE1、2、3又は4を含む）を添加した培地で培養したMEFのいずれにおいても、内在性miR-302/367クラスター遺伝子（miR-302a, miR-302b, miR-302c, miR-302d及びmiR-367からなるクラスター遺伝子）の発現を確認することができた（図１B）。
従って、4種類のNTP-TALE-miR-302/367-VP64蛋白質（TALE1、2、3又は4を含む）のいずれも、標的遺伝子である内在性miR-302/367クラスター遺伝子の発現を誘導することが示された。【０１８５】
（４）NTP-TALE-Activatorによる内在性HNF1αの発現誘導
実施例１で作製したNTP-TALE-HNF1α-1-VPR、NTP-TALE-HNF1α-1-p300CD、及びNTP-TALE-HNF1α-1-GCN5CD蛋白質を、ヒトUC-MSCの培地にそれぞれ別々に添加し、内在性HNF1αの発現を誘導するかどうかを検証した。
具体的には、間葉系幹細胞（PromoCell社 C-12971。以下、「UC-MSC」と記す。）は、間葉系幹細胞増殖培地（Lonza社 PT-3001）で継代した。
上記NTP-TALE-HNF1α-1-VPR、NTP-TALE-HNF1α-1-p300CD、及びNTP-TALE-HNF1α-1-GCN5CD蛋白質を、それぞれヒトUC-MSCに0.25nMで添加した後、24時間後に、RNAを回収し、上述した方法により、内在性HNF1α mRNAの発現量を測定した。
ネガティブコントロール（NC）として無処理のヒトUC-MSCを使用し、ポジティブコントロール（PC）は、成人肝臓組織由来RNA（Biochain）を使用した。
使用したプライマーの配列を以下に示す。
HNF1α Forward primer: ACTCCCATGAAGACGCAGAAGC（配列番号６０）
HNF1α Reverse primer: TCTTCTGCCTCTCATAGGCTG（配列番号６１）
GAPDH- Forward primer: AATCCCATCACCATCTTCCA（配列番号６２）
GAPDH- Reverse primer: TGGACTCCACGACGTACTCA（配列番号６３）
その結果、NTP-TALE-HNF1α-1-p300CD、及びNTP-TALE-HNF1α-1-GCN5CD蛋白質はいずれも、ヒトUC-MSCにおいて内在性HNF1αの発現を誘導することが示された（図５）。また、解析の結果、転写因子としてGCN5CDを使用したNTP-ATFが最も強く機能することが分かった。図５中、「NC」はネガティブコントロールとして溶媒のみを添加したもの、「PC」はポジティブコントロールとしてヒト成人肝臓におけるHNF1αのRNA発現量を示す。縦軸は、ポジティブコントロールのヒトHNF1αのmRNA発現量を１としたときの相対的な発現量を示す。
本実施例では、GCN5CDを含むNTP-ATFが最も強く内在性HNF1αの発現を誘導した。そこで、以後の解析におけるHNF1αの発現の誘導には、NTP-TALE-HNF1α-1-GCN5CDを使用することとした。【０１８６】
（５）NTP-TALE-Activatorによる内在性HNF3γ及びHNF3βの発現誘導
ヒトHNF1α、ヒトHNF3γ及びヒトHNF4α遺伝子を標的とするNTP-ATFをヒトUC-MSCに作用させた場合に、肝細胞分化に必要な内在性HNF遺伝子（HNF3γ及びHNF3β）の発現を誘導できるかどうかを検証した。
ヒトUC-MSCを無血清培地で2日間培養した後、精製したNTP-TALE-HNF1α-1-GCN5CD、NTP-TALE-HNF3γ-VP64、及びNTP-TALE-HNF4α-1-VP64を各蛋白質とも0.25nMの濃度になるように混和し、1日2回、3日間連続して添加した。
添加3日後とさらに3日間培養した後の細胞をそれぞれ回収し、上記（１）に記載した方法を用いてヒトHNF3γ及びヒトHNF3β（Accession No.NM_021784.4）の発現量を調べた。NC（溶媒のみを添加し、NTP-ATF無添加のUC-MSC群）におけるヒトHNF3γmRNA発現量及びヒトHNF3βmRNA発現量を1としたときのNTP-ATF作用群の相対的な発現量を算出した。ポジティブコントロール（PC）としては成人肝臓組織由来RNAを使用した。【０１８７】
使用したプライマーの配列を以下に示す。
HNF3γ Forward primer: taacatctgggtgggtct（配列番号６４）
HNF3γ Reverse primer: cagtggattagccaataaca（配列番号６５）
HNF3β Forward primer: cgactggagcagctactatgc （配列番号６６）
HNF3β Reverse primer: tacgtgttcatgccgttcatc （配列番号６７）【０１８８】
その結果、ヒトHNF1α、ヒトHNF3γ及びヒトHNF4α遺伝子を標的とするNTP-ATFで処理した細胞群では、非添加群であるネガティブコントロール群（NC、添加3日後）に比較して、ヒトHNF3γ及びヒトHNF3β mRNAの発現が、NTP-ATF添加後3日目、6日目のいずれも顕著に上昇した。
すなわち、ヒトHNF1α、ヒトHNF3γ及びヒトHNF4α遺伝子を標的とするNTP-ATFの組み合わせは、ヒト間葉系幹細胞に作用させることにより、肝細胞分化に必要な内在性HNF3γ及びHNF3βの発現を誘導することが示された（図６）。
なお、図６における数値は、ベータアクチン（グリセルアルデヒド-３-リン酸脱水素酵素）比で示されたものである。誤差線は重複する3被検試料の測定値の標準誤差を示す。また、図６においてポジティブコントロール群（PC）では、ヒトHNF3γ及びヒトHNF3βのmRNAについて、いずれも高い発現が見られており、実験系に問題がないことが確認された。
【実施例３】
【０１８９】
NTP-TALE-Activatorによる細胞の分化誘導
（１）NTP-TALE-HNF-1α-GCN5CD、NTP-TALE-HNF-3γ-GCN5CD、NTP-TALE-HNF-4α-GCN5CD及びNTP-TALE-GATA-4-VP64によるMSCから肝細胞様細胞への分化誘導
（１−１）過ヨウ素酸シッフ染色（PAS）染色によるグリコーゲン産生能の評価
実施例２において、ヒトHNF-1α、ヒトHNF-3γ、ヒトHNF-4α及びヒトGATA-4の各遺伝子を標的とするNTP-TALE-Activatorを作用させることにより、各遺伝子発現が上昇することが認められた。そこで上述の4種類のNTP-TALE-Activator（すなわち、NTP-TALE-HNF-1α-GCN5CD、NTP-TALE-HNF3γ-GCN5CD、NTP-TALE-HNF4α-GCN5CD及びNTP-TALE-GATA4-VP64）の作用により、ヒト臍帯マトリクス由来MSC（UC-MSC）を肝細胞様細胞へ分化させることが可能か評価した。【０１９０】
実施例２と同様の方法でUC-MSCを培養した。培養後の細胞に過ヨウ素酸シッフ染色（PAS）染色を行った。NTP-TALE-Activator含有培地でUC-MSCを培養した群を添加群と称する。コントロール群として、NTP-TALE-Activatorを添加しないウェルを作製した（非添加群と称する）。PAS染色により、肝細胞に特徴的なグリコーゲンが蓄積された細胞を検出することができる。【０１９１】
PAS染色は、PAS染色キット（武藤科学)を用いて、キットに添付のプロトコールに従って以下の方法で実施した。まず、培地を除去して細胞をリン酸緩衝液で洗浄した。付属の固定液(ホルムアルデヒド10.5%含有)で室温5分処理し、細胞を固定した。流水で10分水洗した後、過ヨウ素酸水溶液で室温10分処理して酸化させ、蒸留水により10分水洗した。37℃で30分間、Schiff溶液と反応させた後、5分ずつ3回、亜硫酸水で洗浄した。5分間流水で水洗の後、ヘマトキシリン液で室温で15分静置して核染色を行った。流水水洗した後、60℃の温水に5分浸して発色させた後、冷風で乾燥させた。【０１９２】
図１に示す通り、非添加群に比較して、添加群はPAS染色により大多数の細胞が発色した。【０１９３】
NTP-TALE-Activator非添加群のPAS染色により発色した陽性細胞数（無処理）と添加群のPAS染色により発色した陽性細胞数（処理）を計測し、各群の総細胞数に対する割合を算出した。(陽性細胞数/総細胞数)×100（%）で算出した値を図２に示す。NTP-TALE-Activatorを添加したUC-MSC細胞は非添加群に比較して、グリコーゲン含有量が高い細胞へ分化していることが示された。
すなわち、本発明の4種類のNTP-TALE-Activator（すなわち、NTP-TALE-HNF-1α-GCN5CD、NTP-TALE-HNF3γ-GCN5CD、NTP-TALE-HNF4α-GCN5CD及びNTP-TALE-GATA4-VP64）の作用により、MSCをグリコーゲン産生能の高い細胞へ分化させることができることが示された。【０１９４】
（１−２）アンモニア代謝能の評価
実施例２と同様の方法でUC-MSCを培養した。培養後の培養上清中に含まれる尿素の量をQuantichrom urea assay kit（Bio assay system）を用いて測定することにより、肝細胞に特徴的なアンモニア代謝能を調べた。実験の陽性対照として肝臓癌由来細胞株HepG2細胞の尿素産生量を同時に調べた。HepG2細胞は10%牛胎児血清(サーモフィッシャーサイエンティフィック、12483-020）を含むダルベッコ改変イーグル培地（日水製薬、05919）で培養した。
尿素産生量測定時点で各群に細胞数の顕著なばらつきがないことを顕微鏡下での観察にて確認した。また、上記培養後の尿素産生量を測定した時点の各細胞群から実施例２と同様に試料中のヒトGAPDHのmRNA発現量を測定して比較を行った。その結果、HepG2細胞における発現量を1.000とした場合に、添加群と非添加群におけるヒトGAPDHの発現比はそれぞれ0.9849と0.9973であり、３群の細胞数に顕著な差がないことが示された。【０１９５】
また、非添加群に比較して、添加群（NTP-TALE-HNF-1α-GCN5CD、NTP-TALE-HNF-3γ-GCN5CD、及びNTP-TALE-HNF-4α-GCN5CD及びNTP-TALE-GATA-4-VP64を添加した培地で培養した間葉系幹細胞群）では、7日後に細胞の尿素排出量が10倍以上に増加しており、アンモニア代謝能が顕著に増加していた（図は示さず）。【０１９６】
以上より、NTP-TALE-HNF-1α-GCN5CD、NTP-TALE-HNF-3γ-GCN5CD、NTP-TALE-HNF-4α-GCN5CD及びNTP-TALE-GATA-4-VP64を含む培地でMSCを培養することにより、MSCから肝細胞様細胞を製造できることが示された。【０１９７】
したがって、NTP-TALE-HNF-1α-GCN5CD、NTP-TALE-HNF-3γ-GCN5CD、NTP-TALE-HNF-4α-GCN5CD及びNTP-TALE-GATA4-VP64を使用することにより、細胞導入試薬や電気穿孔法、ウイルスを使用せず、かつ、細胞内に外来遺伝子を導入することなしに、MSCから肝細胞様細胞を製造できることが示された。【０１９８】
（２）NTP-TALE-HNF1α-1-GCN5CD、NTP-TALE-HNF3γ-VP64及びNTP-TALE-HNF4α-1-VP64によるMSCから肝細胞様細胞への分化誘導
（２−１）細胞内ヒトα-フェトプロテイン及びヒトアルブミン mRNA発現量の測定
実施例２（５）で上述した方法と同様にして、ヒトUC-MSCにNTP-TALE-HNF1α-1-GCN5、NTP-TALE-HNF3γ-VP64及びNTP-TALE-HNF4α-1-VP64を、各蛋白質とも0.25nMの濃度になるように混和し、1日2回、3日間連続して添加した。添加3日後と、さらに3日間培養した後の細胞をそれぞれ回収し、肝細胞で特異的に発現する遺伝子であるヒトα-フェトプロテイン（Accession No.NM_001134.2）及びヒトアルブミン（Accession No.NM_000477.5）の発現を実施例２と同様の方法でリアルタイムPCRにより解析した。【０１９９】
使用したプライマーの配列を以下に示す。
α-フェトプロテイン Forward primer: tgccaactcagtgaggacaa（配列番号６８）
α-フェトプロテイン Reverse primer: tccaacaggcctgagaaatc （配列番号６９）
アルブミンForward primer: gatgtcttcctgggcatgtt（配列番号７０）
アルブミンReverse primer: acatttgctgcccacttttc（配列番号７１）【０２００】
その結果、上記NTP-ATFを添加した3日後にヒトαフェトプロテインmRNAが、添加6日後に、ヒトアルブミンmRNAの発現がそれぞれ上昇した（図７）。
なお、ポジティブコントロール群（PC、成人肝臓組織由来cDNA）において、ヒトHNF3γ及びヒトHNF3βのmRNAの発現がいずれも見られており、実験系に問題がないことが確認できた。【０２０１】
（２−２）アンモニア代謝能の評価
上記（２−１）に記載した方法と同様にして、NTP-TALE-HNF1α-1-VP64、NTP-TALE-HNF3γ-VP64及びNTP-TALE-HNF4α-1-VP64を添加した培地においてヒトUC-MSCを培養し、添加3日後とさらに3日間培養した細胞をそれぞれ回収した。
そして、回収された細胞のアンモニア代謝能を、培地中に排出された尿素量を測定することにより解析した（Quantichrom urea assay kit（Bio assay system））。
その結果、図７（c）に示す通り、非添加群であるネガティブコントロール群（NC、添加3日後）に比較して、NTP-ATF群添加6日後に、細胞の尿素排出量が有意に増加した。【０２０２】
以上より、NTP-TALE-HNF1α-1-VP64、NTP-TALE-HNF3γ-VP64及びNTP-TALE-HNF4α-1-VP64を含む培地でMSCを培養することにより、MSCから肝細胞様細胞を製造できることが示された。【０２０３】
したがって、NTP-TALE-HNF1α-1-VP64、NTP-TALE-HNF3γ-VP64及びNTP-TALE-HNF4α-1-VP64を使用することにより、細胞導入試薬や電気穿孔法、ウイルスを使用せず、かつ、細胞内に外来遺伝子を導入することなしに、MSCから肝細胞様細胞を製造できることが示された。【０２０４】
（３）4種のNTP-ATFの添加によるMSCから肝細胞様細胞への分化誘導
HNF1α、HNF3γ及びHNF4αという3つの転写因子（以下、「3因子」又は「HNF1α/3γ/4α」とも称する）の遺伝子を標的とする3種類のNTP-ATF（NTP-TALE-HNF1α-1-GCN5、NTP-TALE-HNF3γ-1-GCN5及びNTP-TALE-HNF4α-1-GCN5）を含む混合物（以下、「3F」という）と、HNF1α、HNF3γ及びHNF4αにGATA-4を加えた4つの転写因子（以下、「4因子」又は「HNF1α/3γ/4α+GATA-4」とも称する）の遺伝子を標的とする4種類のNTP-ATF（NTP-TALE-HNF1α-1-GCN5、NTP-TALE-HNF3γ-1-GCN5及びNTP-TALE-HNF4α-1-GCN5及びNTP-TALE-GATA4-VP64）を含む混合物（以下、「4F」又は「4因子」という）の機能性（分化誘導能）を、以下の通り検証した。
即ち、各NTP-ATFを0.25nMの濃度になるように混和し、1日2回、5日間連続して培地に添加（投与）した。培養4日目と6日目に細胞からRNAを回収し、定量的PCR解析を行った。
その結果、3F作用群及び4F作用群のいずれにおいても、α-フェトプロテイン及びアルブミンmRNAの発現が認められたが、3F作用群と比較して4F作用群においてより効率よくα-フェトプロテイン（図８（a）、培養4日間）及びアルブミンmRNA（図８（b）、培養6日間）を発現誘導できることが分かった。
縦軸は、無処理UC-MSCを同じ条件で7日間培養したコントロール細胞（NC）、コントロール蛋白質としてNTP-EGFPを作用したUC-MSC（NE）、3F作用群及び4F作用群における、ネガティブコントロールである無処理の肝臓がん細胞株（HepG2）の発現量を1としたときの相対的な発現誘導をそれぞれ示す。誤差線は重複する3被検試料の測定値の標準誤差を示す。
この結果から、上記4因子を標的とするNTP-ATFが、3因子を標的とするNTP-ATFと比較して、MSCからの肝細胞様細胞への分化をより効率よく誘導することが示された。
【実施例４】
【０２０５】
細胞のリプログラミング
（１）マウス胎児由来線維芽細胞（MEF）からiPS様細胞へのリプログラミング
実施例２（３）において内在性miR-302/367クラスター遺伝子の発現を誘導することが示された4種類のNTP-TALE-miR-302/367-VP64蛋白質（TALE1、2、3又は4を含む）を用いて、iPS様細胞の作製を試みた。
I型コラゲンをコートした6ウェルプレート（NUNC）に5×104個のMEFを播種し、翌日から、0.25 nMのNTP-ATFを1日2回の頻度で添加した。この操作を5日間連続して行い、翌日、アキュターゼ（Millipore）を用いて細胞をプレートから剥離した。これを、予め、10μg/mlの濃度のマイトマイシン-C（ナカライ化学）で処理したフィーダー細胞を播いた10cmプレートに約106個で播いた。以後、ノックアウト血清（KSR, Gibco）10%と103units/mlのmLIF（leukemic inhibitory factor）を加えたGlasfow's MEM (和光) （以下、「GMEM培地」と記す。）で培養した。
使用したMEFは、未分化形質を獲得するとNanog遺伝子プロモーターが活性化し、GFPを発現するため、緑色蛍光蛋白質を発現する (Okita K  et al. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448: 313-7, 2007) (RIKEN Cell Bank)。
GMEM培地を2日に1回の頻度で交換しながら約3週間、培養を継続した。3回の独立した実験の結果、TALE2を含むNTP-ATFを用いることで、緑色蛍光蛋白質を発現するiPS様候補クローンが、複数得られた（図３Ｃ）。図３Ｃは、得られたクローンのうち２つのクローン（cl-6A7及びcl-6B5）のGFP発現及び形態を示す。【０２０６】
（２）得られたiPS様細胞の多能性分化能の検討
得られたiPS様細胞が多能性分化能を有すること示すため、報告されている胚盤補完法（Chen J et al. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proc Natl Acad Sci U S A. 90:4528-32, 1993）に従って、キメラマウスを作製した。
使用したMEFは、黒ネズミであるC57BL/6マウス由来の細胞であり、胚盤補完法に使用したICRマウスは白ネズミである。生まれたマウスが白毛と黒毛のキメラを示したことから、上記（１）で作製したiPS様細胞が多能性分化能を有し、次世代の臓器形成に関与することが示された（図３Ｄ）。【０２０７】
キメラマウスの尾、肝臓、心臓、眼球組織の一部を、0.4mg/ mlのプロテアーゼK（Kurabo）入りの500μl溶解バッファー(1M Tris-HCl pH8.9, 5MNaOH, 0.5MEDTA) に入れ、55℃で一晩処理した。抽出されたDNAはエタノール沈殿で回収した。トランスジーンであるGFP遺伝子の検出はPCRで行った。
使用したプライマーの配列を以下に示す。
GFP- Forward primer:tgggatccctatgctactccgtcgaagttc（配列番号７２）
GFP- Reverse primer:ctaggcaaactgtggggaccaggaagac（配列番号７３）
その結果、キメラマウスのゲノムDNA中に導入遺伝子であるGFP遺伝子が存在することが確認された（図３Ｅ）。図３Ｅにおいて、レーン１はICRマウスの尾、レーン２はC57BL/6マウスの尾、レーン３はNanog-GFP MEF、レーン４は非キメラマウスの尾、レーン５〜８はそれぞれキメラマウスの肝臓、心臓、眼球、尾である。【０２０８】
得られたiPS様細胞の核型分析は次のようにして行った。まず、100 ng/mlのコルセミド（karyoMAX COLCEMID solution, Gibco）存在下に細胞を4時間培養した後、氷冷PBSで洗浄した。さらに、75 mM KClで10分間処理した後、氷冷カルノイ液（酢酸：メタノール=1:3）で固定した。氷冷カルノイ液で4回リンスした後、スライドグラスに滴下し、風乾した。Giemsa染色した後、顕微鏡下で染色体数を算定した。
その結果、正常の染色体数である40本の染色体を有する細胞の頻度と40本とは異なる数の染色体数を示す細胞の頻度が確認できた（図４）。図４中、灰色部分は正常の染色体数である40本の染色体を有する細胞の頻度を示し、黒色部分は40本と異なる数の染色体数を示す細胞の頻度を示す。【０２０９】
以上の結果から、本発明のNTP-ATFにより、体細胞からiPS様細胞にリプログラミングできること、並びに作製されたiPS様細胞は、in vivoにおいても多能性分化能を有することが示された。
【実施例５】
【０２１０】
NTP-ATFによるヒト線維芽細胞から肝細胞様細胞へのダイレクトリプログラミング
本発明のNTP-ATFを用いて線維芽細胞をダイレクトリプログラミング誘導できるかどうかを以下のようにして検証した。
ヒト線維芽細胞として、2種類のヒト線維芽細胞株HUC-F2及びMRC-5を使用し、実施例３（３）で用いた4種類のNTP-ATF（NTP-TALE-HNF1α-1-VP64、NTP-TALE-HNF3γ-VP64、NTP-TALE-HNF4α-1-VP64及びNTP-TALE-GATA4-VP64）をそれぞれ0.25nMで一日2回、5日間作用させた。培養3日目及び7日目に細胞を回収し、ヒトα-フェトプロテインとヒトアルブミンのmRNA発現量並びに尿素産生能を上述した方法で評価した。
その結果、4種類のNTP-ATFを3日間作用した後、ヒトα-フェトプロテインとヒトアルブミンのmRNA発現量は、いずれの細胞でも増加していた。また、4種類のNTP-ATFを5日間作用させた後では、いずれの細胞も有意な尿素産生能を示した（図９）。図中、NCはネガティブコントロールとして溶媒のみを添加したサンプルを示す。
これらの結果から、本発明のNTP-ATFは、体細胞を肝細胞様細胞にダイレクトリプログラミングできることが示された。
【実施例６】
【０２１１】
1.  4種類のNTP-ATFを作用させたヒトUC-MSCの生体内での分化能の検討
上述した実施例３で記載した方法で、ヒトUC-MSCに4種類のNTP-ATFを5日間作用させ、6日後に細胞を回収した。この細胞を、肝障害モデルマウスに3×105個移植（静注）した後、5ヶ月間、生存したマウスの肝臓組織を採取し、組織中のヒト細胞の存在とそのアルブミン産生能を免疫組織化学的解析で評価した。還流固定後、組織サンプルを4%パラホルムアルデヒド溶液中で、一晩4℃で震盪しながら固定した。PBSで3回洗浄後、パラフィン包埋切片を作成した。パラフィン包埋切片を65度30分処理後、脱パラフィン処理を行った。その後、電子レンジで700 ワット1分、100ワット10分間処理することで、抗原を賦活化した。免疫組織化学的解析は、一次抗体として抗I型コラゲン抗体を使用した。観察の際、自家蛍光を抑制するため、TrueBlac（Biotium）で1分間、処理し、PBSで3回洗浄後、封入した。
一次抗体として、ヒトミトコンドリアに対する単クローン抗体(Ms mAb to Mitochondria abcam)を使用し、二次抗体はBiotinylate goat anti-mouse IgG(H+L)抗体（abcam HRP/DAB(ABC) detection kit付属）を使用した。ヒトアルブミンの検出は、抗ヒトアルブミンマウス単クローン抗体（Bethyl）を一次抗体として使用し、抗マウスIgG Alexa Fluor 488 (ThermoFisher)を二次抗体として、使用した。
その結果、4F作用群では、ヒトミトコンドリアに対する抗体で検出される細胞が多数検出されたのに対して、対照蛋白質作用群では、僅かであった。また、4F作用群では、アルブミン抗体で検出される陽性細胞が多く認められたのに対して、対照蛋白質作用群では検出されなかった（図は省略）。【０２１２】
2.  4種類のNTP-ATFを作用させたヒト線維芽細胞の生体内での分化能の検討
上記「1.」の方法において、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞の代わりにヒト繊維芽細胞を用いて、4種類のNTP-ATFをヒト繊維芽細胞に5日間作用させ、6日後に細胞を回収した。この細胞を肝障害モデルマウスに3×105個移植（静注）し、12週間後、生存したマウスの肝臓組織を採取し、組織中のヒト細胞の存在を免疫組織化学的解析で評価した。その他の条件は上記「1.」の方法と同様である。
その結果、4F作用群では、ヒトミトコンドリアに対する抗体で検出される細胞が多数検出されたのに対して、対照蛋白質作用群では、僅かであった（図１０）。
すなわち、本発明により体細胞からダイレクトリプログラミングされた肝細胞様細胞は、生体内においても生着して分化能を有することが明らかとなった。また、移植後12週間という短期間で生体内で肝細胞様細胞に分化したことは驚くべきことである。
【実施例７】
【０２１３】
4種類のNTP-ATFを作用させたヒトUC-MSCの生体内での機能性評価
上述した実施例３で記載した方法で、ヒトUC-MSCに4種類のNTP-ATFを5日間作用させ、6日後に回収した細胞を、肝障害モデルマウスであるTRECKマウス（Toxin receptor cell-knockout）に移植して、肝炎を誘導させた状態で延命効果を調べた。
TRECKマウスはジフテリア毒素に対するヒト受容体遺伝子がアルブミンプロモーターで発現制御されるトランスジェニックマウスであり（Nat. Biotech. 2001年 Vol 19:746-750）、このマウスにジフテリア毒素を筋注すると重度の肝障害が発症し、投与後2日目をピークに、血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）が上昇する。
血中のALT値を元に、平均して3つの実験群に分け、(i) 無処理ヒトUC-MSC群、(ii) 上述のヒトUC-MSCから分化した肝細胞様細胞を静脈内に投与した群、及び(iii) ネガティブコントロールとして、NTP-EGFPをぞれぞれ最終濃度0.25nMで作用させたヒトUC-MSCを移植した群について調べた。【０２１４】
細胞の移植後7日目から22日目にかけて3回、マウス肝臓に対する障害作用によって肝障害を誘発することが知られている抗マウスFas抗体7μg/kgをマウス腹腔内に投与した。移植した細胞が肝細胞としての機能を獲得していれば、肝臓機能が代償されマウスは生存できる。
その結果を図１１に示す。4種類のNTP-ATF（4F）の投与によりヒトUC-MSCを移植したマウス群は、移植後16日で約80%の個体が生存した（図中、実線グラフ）のに対して、NTP-EGFPで処理した細胞投与群の生存率は約60%だった（図中、点線グラフ）。
図１１はN=10のデータを示す。縦軸はマウスの生存した個体数を、横軸は細胞を移植後の日数を示す。
この結果から、4種類のNTP-ATF（4F）の投与によりヒトUC-MSCから分化した肝細胞様細胞は、生体内において肝細胞としての機能を果たし、肝障害を抑制することが明らかとなった。また、3種類のNTP-ATFを作用したヒトUC-MSCは、肝障害に対して保護作用があることが示された。
【実施例８】
【０２１５】
コモンマーモセット肝線維症モデルの作製とNTP-ATFを作用させたヒトMSCの移植
実施例６及び実施例７と同様の方法で、ヒトUC-MSCに、4種類のNTP-ATF（4F）を各0.25 nM、1日2回の頻度で5日間作用させ、その翌日と翌々日にヒトメタロプロテアーゼ-1（MMP1）標的NTP-ATF（MMP1標的NTP-ATF）を作用させた（即ち4F＋MMP1標的NTP-ATFを作用させた）。この細胞を、コモンマーモセット肝線維症モデルに移植し、生体内での機能を評価した。本明細書の各実施例においては、２つのMMP1（MMP1-1、MMP1-2）標的NTP-ATFのうち、MMP1-1標的NTP-ATFをMMP1標的NTP-ATFとして用いた。また、対照蛋白質（コントロール）として、標的遺伝子に結合するTALEの代わりに17個の塩基をランダムに並べたスクランブル配列を標的とするTALEを含む融合ポリペプチド（スクランブル（SCR）蛋白質）を用いた。
コモンマーモセット肝線維症モデルは、論文報告された方法に準じて作製した。
即ち、6歳10ヶ月（YI023F）と7歳2ヶ月（I4255F）の雌にチオアセタミドを週3回の頻度で、20mg/kg、30mg/kgをそれぞれ、3週間と4週間皮下注し、その後、血中ビリルビン値をモニターしながら、40mg/kgを週2回、投与を継続した。この間、定期的に肝生検を行い、ヘマトキシリン・エオジン染色とマッソン・トリクローム染色（武藤化学）で線維化を評価した。
肝生検で同程度の線維化を示すことを確認し、その1週間後、NTP-ATF（4F＋MMP1標的NTP-ATF）又はコントロールを作用させたMSCを106個／2mlで尾静脈から約15分かけてゆっくり注入した。免疫抑制剤として、タクロリムス（0.1 mg/kg、1日1回皮下注、アステラス製薬）、セルセプト（50mg/kg、1日1回経口投与、中外製薬株式会社）及びプレドニゾロン （10mg/kg、1日1回筋注投与。移植3日前より連日、術後1週間後から5mg/kgに減量、2週間後から2mg/kgに減量、術後3週間後より1mg/kg以後継続、塩野義製薬）の3剤を併用した。
細胞輸注を行った1ヶ月後に再度肝生検を行い、ヒト細胞の局在、アルブミン産生能及び線維化の程度を評価した。ヒトアルブミンの検出には、一次抗体として抗ヒトアルブミンマウス単クローン抗体（日本バイオテスト）を使用し、二次抗体として、Biotinylate goat anti-mouse IgG(H + L)抗体（abcam HRP/DAB(ABC) detection kit付属）を使用した。【０２１６】
その結果、4F＋MMP1標的NTP-ATFを作用させたヒトUC-MSCを移植した個体（I4225F）でヒトアルブミンが検出された（図１２右図）。一方、対照蛋白質を作用させた細胞を移植した個体（YI023F）では陽性細胞を検出しなかった（図１２左図）。
この結果から、本発明のNTP-ATFを作用させたヒトUC-MSCはコモンマーモセットの生体内において肝細胞様細胞に分化することが示された。
【実施例９】
【０２１７】
コモンマーモセット肝線維症モデルの作製とNTP-ATFを作用させた線維芽細胞の移植
実施例８と同様の方法で、ヒト線維芽細胞（MRC-5）に、4種類のNTP-ATF（4F）を各0.25 nM、1日2回の頻度で5日間作用させ、その翌日及び翌々日にヒトメタロプロテアーゼ-1（MMP1）標的NTP-ATF（MMP1標的NTP-ATF）を作用させた（即ち4F＋MMP1標的NTP-ATFを作用させた）。この4F＋MMP1標的NTP-ATFを作用させた線維芽細胞又は4Fのみを作用させたヒト線維芽細胞を、コモンマーモセット肝線維症モデルに移植し、生体内での機能を評価した。また、対照蛋白質として、スクランブル（SCR）蛋白質を用いた。
コモンマーモセット肝線維症モデルは、論文報告された方法に準じて作製した。
即ち、2歳1ヶ月（I6447M）、2歳2ヶ月（I6454M）及び1歳9ヶ月（I6517M）の３個体のコモンマーモセット肝線維症モデルに、チオアセタミド（TAA）を週3回または2回の頻度で、40mg/kg、30mg/kgをそれぞれ、合計１週間と1-1.5週間皮下注し、血中ビリルビン値をモニターしながら、30mg/kgを週2回、投与を継続した。この間、定期的に肝生検を行い、ヘマトキシリン・エオジン染色とマッソン・トリクローム染色（武藤化学）で線維化を評価した。
肝生検で同程度の線維化を示すことを確認し、その1週間後、各種NTP-ATF（4F、4F＋MMP1標的NTP-ATF）又は対照蛋白質を作用させたMRC-5を106個／2mlで尾静脈から約15分かけてゆっくり注入した。細胞移植を行ったのは、TAA投与開始後、59日目であった。細胞移植3日前から、免疫抑制剤として、タクロリムス（0.1 mg/kg、1日1回皮下注、アステラス製薬）、セルセプト（50mg/kg、1日1回経口投与、中外製薬株式会社）及びプレドニゾロン （10mg/kg、1日1回皮下注投与、塩野義製薬）を連日行った。プレドニゾロンは、術後1週間後から5mg/kgに減量、2週間後から2mg/kgに減量、術後3週間後より1mg/kgで継続投与した。
細胞輸注を行った1ヶ月後に再度肝生検を行い、ヒト細胞の局在、アルブミン産生能及び線維化の程度を評価した。ヒトアルブミンの検出には、一次抗体として抗ヒトアルブミンマウス単クローン抗体（日本バイオテスト）を使用し、二次抗体として、Biotinylate goat anti-mouse IgG(H + L)抗体（abcam HRP/DAB(ABC) detection kit付属）を使用した。免疫染色は、異なる５つの肝分葉に対して行った。【０２１８】
その結果、4Fを作用させた線維芽細胞を移植した個体（I6517M）でヒトアルブミンが検出された（図１３中段）。さらに、驚くべきことに、4F＋MMP1標的NTP-ATFを作用させた線維芽細胞を移植した個体（I6447M）では、4Fのみを作用させた線維芽細胞を移植した個体（I6517M）と比較して、顕著に高い量のヒトアルブミンが検出された（図１３下段）。一方、対照蛋白質を作用させた線維芽細胞を移植した個体（I6454M）では陽性細胞を検出しなかった（図１３上段）。
この結果から、本発明の4種類のNTP-ATF（4F）を作用させた線維芽細胞は、コモンマーモセットの生体内において肝細胞様細胞に分化（ダイレクトリプログラミング）することが示された。さらに、4Fに加えてMMP1標的NTP-ATFを作用させた線維芽細胞は、コモンマーモセットの生体内において、その肝細胞様細胞への分化及び／又は増殖が著しく促進されることが示された。この結果は、本発明者でさえ予測することができない驚くべき結果であった。
【実施例１０】
【０２１９】
コモンマーモセット肝線維症の軽減
肝臓組織の線維化は、マッソン・トリクローム（M・T）染色（武藤化学）とI型コラゲンに対する免疫組織化学的解析で評価した。
実施例８と同じコモンマーモセットの個体について、M・T染色とI型コラゲンに対する免疫組織化学的解析を行った。コモンマーモセットのI4225Fは4F＋MMP1標的NTP-ATFを作用させた細胞を移植した個体であり、YI023Fは、対照蛋白質を作用させた細胞を移植した個体である。
抗ヒトI型コラゲンウサギポリクローナル抗体（abcam）を一次抗体として使用し、二次抗体は抗ウサギIgG-Alexa Fluor 555 標識ウサギ抗体（ThermoFisher）を使用した。M・T染色については、TAAを14週間投与したYI023Fと6週間投与したI4225Fの組織像も示した。
その結果、TAAを14週間投与したYI023Fと6週間投与したI4225Fにおいては、青色シグナルとして検出される膠原線維量はごく僅かか、ほとんど検出されなかった（図１４Ａ上段）。一方、細胞移植前の組織では、YI023FとI4225Fのいずれの検体も、顕著な青色シグナルが検出された（図１４Ａ中段、「Pre」）。そして移植後一ヶ月後には、4FとMMP1標的NTP-ATFを作用させた細胞移植個体（I4225F）において、青色シグナルが減弱している傾向が認められた（図１４Ａ下右図）。
また、より客観的にNTP-ATFの効果を検証するため、I型コラゲンに対する抗体を用いて蛍光免疫組織化学的解析を行い、得られた画像データをもとにヒストグラムを作成した。より具体的には、蛍光シグナルを蛍光顕微鏡で解析し（キーエンス社）、撮影した画像データをImage J（NIH）に取り込み、組織切片の辺縁にそってデータをトリミングした後、赤色を指標にヒストグラムを作成した。
その結果、4F＋MMP1標的NTP-ATFを作用させた細胞を移植した個体（I4225F）で、I型コラゲン量が減少していることが示された（図１４Ｂ、蛍光免疫染色図及びヒストグラムの右下図）。図１４Ｂにおけるヒストグラムの横軸は二次抗体に由来する蛍光シグナル強度を反映し、縦軸は頻度を示す。
これらの結果から、本発明のNTP-ATFを作用させた細胞を生体に移植することにより、肝臓組織の線維化に起因する肝疾患を治療できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０２２０】
本発明の融合ポリペプチドは、ダイレクトリプログラミングに関わる遺伝子の発現を調節して体細胞を他の性質を有する体細胞に分化させるのに有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０２２１】
配列番号５〜１３、１５〜１８、２０〜２５、２７〜４３及び４８〜１６６は、合成DNA又は合成ペプチドである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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