(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エキソフィアラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）属，フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属，アウレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属，トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属のいずれかに属する微生物を培養し、産生された下記式
【化１】
0003779751.tif 000007
（ただし、ｎ≧０の整数，Ｒ１−Ｒ５は任意の官能基）で示される化合物に、酸処理、アルカリ処理後の酸処理、又は化学的脱水処理を施すことにより下記式
【化２】
0003779751.tif 000008
で示される化合物（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトン（Ｍａｓｓｏｉａｌａｃｔｏｎｅ）を製造することを特徴とする（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンの製造方法。
【請求項２】
エキソフィアラ属に属する微生物がエキソフィアラ・ピシフィラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ  ｐｉｓｃｉｐｈｉｌａ）である請求項１記載の（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンの製造法。
【請求項３】
エキソフィアラ・ピシフィラがエキソフィアラ・ピシフィラＮＩ
１０１０２（微工研菌寄第１４２３２号）である請求項２記載の（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は下記式
【０００２】
【化３】
0003779751.tif 000002
で示される（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトン（Ｍａｓｓｏｉａｌａｃｔｏｎｅ）の製造法に関するものである。本発明者らは、微生物の培養物に対し、簡単な化学的処理を施すことにより本化合物を一段階の化学反応で製造する方法を開発した。詳細には、本発明は（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンの簡便な製造法、（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンおよび（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンを有効成分として含む香料組成物に関する。
【０００３】
【従来の技術】
ココナッツミルク様の香気を有する公知の香料物質である（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンは各種の香料組成物の持続性香気香味付与乃至変調剤として飲食品、香粧品類、保健・医薬品などの広い分野で有用であることが知られており、各種分野で用いられている。これまで（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンは植物からの抽出または化学合成により製造されている。植物からの抽出例としてはクリプトカリア  マッソイア（Ｃｒｙｐｔｏｃａｒｉａ  ｍａｓｓｏｉａ）の樹皮油の主成分として得られることが報告されている（日本化学会誌５８，２４６−２５１（１９３７））。また、サトウキビの糖みつ成分から単離されるほか、ココナッツミルクからも得られている。一方、化学合成による製造法としてはこれまではほとんどがラセミ体の合成の報告であった（特開昭６３−５７５８３、特開昭６３−２１５６７６、特開昭６３−２２２１６４）。近年、光学活性な（＋）−１，２−エポキシヘプタンから４工程で合成される光学活性な（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンの合成が報告されている（特開平２−５９５６４）。
【０００４】
【発明が解決しようとする問題点】
マッソイアラクトンはその（Ｒ）−（−）型の光学活性体とラセミ体間でにおいが異なることが知られている。すなわち（Ｒ）−（−）型の光学活性体はココナッツミルクの香りであるのに対し、ラセミ体はバター臭を呈する。そのため、品質の一定した香料組成物の製造にあたっては、その目的に応じて、高い光学純度を有する（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンが不可欠であり、その簡便な製造法の開発が望まれてきた。上述した植物由来の製造法は、多量の植物を伐採せねばならず、大量供給に適さない。また、必要に応じて（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンを生産する植物を入手するためには季節的環境的な制約を免れることはできない。一方、化学合成による（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンの製造法では、高い光学純度を有する目的物を得るために、出発原料として高い光学純度を有する比較的高価な光学活性体を出発原科を用いる必要がある。また、出発原料から目的物への変換には多工程を要せねばならない。さらに、各工程の反応後に反応試剤や副生物と目的物を分離し、中間体乃至目的物を逐一精製する必要がある。このため、工業的に大量合成を行い、かつ迅速かつ安価に光学的に純粋な（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンを供給するためにはかかる化学合成特有の諸制約を受けねばならない。
【０００５】
【問題点を解決するための手段】
そこで本発明者らは、上記問題点を解決するため種々検討を重ねた結果、微生物を培養し、その培養物に簡単な化学的処理を施すことにより（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンが得られることを見出し、本発明を完成した。以下に本発明について詳細を記述する。
【０００６】
本発明は微生物の培養物に簡単な化学的処理を施し、反応液中に（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンを生成せしめ、しかる後に通常の分離法を用いて（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンを分離するというものである。
【０００７】
微生物としては本発明に記載の処理により（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンを生成するものであれば何でもよく、例えば下記式
【０００８】
【化４】
0003779751.tif 000003
（ただし、ｎ≧０の整数，Ｒ１−Ｒ５は任意の官能基）で示される化合物を産生する微生物を用いることができる。例えば、下記式
【０００９】
【化５】
0003779751.tif 000004
で示されるエキソフィリンＡ（Ｅｘｏｐｈｉｌｉｎ  Ａ）（ただし、Ｒ１＝Ｈ）またはハリメシンＣ（Ｈａｌｙｍｅｃｉｎ  Ｃ）ただしＲ１＝ＣＨ３ＣＯ）または下記式
【００１０】
【化６】
0003779751.tif 000005
で示されるハリメシンＡ（Ｈａｌｙｍｅｃｉｎ  Ａ）（ただしＲ１＝ＣＨ３ＣＯ，Ｒ２＝Ｈ）またはハリメシンＢ（Ｈａｌｙｍｅｃｉｎ  Ｂ）（ただしＲ１＝ＣＨ３ＣＯ，Ｒ２＝Ｄ−ｍａｎｎｏｓｙｌ）を産生する微生物を用いることができる。
【００１１】
本発明において用いられる微生物としては本発明に記載の処理により（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンを生成するものであれば何でもよく、例えばエキソフィアラ属，フサリウム属，アウレオバシディウム属，トリコデルマ属のいずれかに属する微生物を用いることができる。
【００１２】
エキソフィアラ属の微生物の例としてはエキソフィアラ・ピシフィラをあげることができる。
【００１３】
エキソフィアラ・ピシフィラの例としてはエキソフィアラ・ピシフィラ  ＮＩ１０１０２株をあげることができる。なお本菌株は平成６年３月２４日に工業技術院生命工学研究所に寄託されており、その受託番号は微工研菌寄第１４２３２号である。
【００１４】
当該微生物の培養は原則として一般微生物の培養法に準ずるが、通常は液体培地による深部培養が適している。
【００１５】
培養に用いられる培地は当該微生物が利用する培養源を含有する培地、合成培地、半合成培地、あるいは天然培地が用いられる。培地組成は炭素源として例えばグルコース等、窒素源として例えばＬ−アスパラギン等が用いられる。その他無機塩類として塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム等が必要に応じて用いられる。
【００１６】
培養条件はｐＨ：４〜９、温度：１０〜３５℃で２〜１４日間、望ましくはｐＨ：６〜７、温度：２２〜２７℃で５〜１０日間培養する。
【００１７】
本発明における培養物は、菌体と培地とを分離することなく利用可能であることを特徴とする。菌体と培地の混合物たる培養物は混合状態のまま以下の化学的処理に用いられる。勿論、当該培養物に対して分離操作を行うことによって得られる菌体あるいは培地単独であっても、また、さらに培養物の抽出物、菌体抽出物、培地抽出物の如き有機溶媒等による抽出操作を加えることによって得られる抽出物いずれであっても用いることができることは言うまでもない。
【００１８】
本発明で用いられる簡単な化学的処理とは、培養物に対する化学的処理が（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンを生成するものであればよく、公知の反応を単独で用いても、またこれらを適宜組み合わせてもよい。
【００１９】
培養物に対する化学的処理としては具体的には酸処理を最も好ましい例として示すことができる。また、初めに水酸化ナトリウムの如きアルカリで処理し、引き続き酸で処理してもよい。また、酸処理後、有機溶媒中ピリジン存在下オキシ塩化リン処理などの脱水処理を行ってもよい。一方、培養抽出物に対する化学的処理としては、上記例のみならず有機溶媒中脱水縮合剤を作用させることによっても達成される。具体的には有機溶媒中触媒量のジメチルアミノピリジン存在下ジシクロヘキシルカルボジイミドを作用させることを例示できる。これらの化学的処理は、これらを繰り返しあるいは適宜組み合わせて用いることも可能である。
【００２０】
上記酸処理に用いることのできる酸としては必要に応じて適宜選択することができる。具体的には硫酸あるいはリン酸を好ましく例示することができる。
【００２１】
化学的処理を行う際の溶媒は、液体培地を用いた培養物を直接用いる場合には特に必要とせず、上記の酸を直接培地に添加するのみであることを特徴とする。菌体あるいは各種抽出物を用いる際あるいは液体培地以外の培地で培養する際には適宜溶媒と組み合わせて用いる。いずれの場合にも酸の添加量は制限されるものではないが、例えば反応液中の濃度が０．０１規定から６規定の範囲を好ましく例示できる。より好ましくは０．１規定から１規定の範囲を例示できる。
【００２２】
溶媒の種類は適宜選択することができる。具体的には水、メタノール、エタノール、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ベンゼン、トルエン等を例示することができる。
【００２３】
反応温度は必要に応じて適宜選択でき、例えば室温から還流温度の範囲を好ましく例示できる。より好ましくは還流温度を例示できる。反応時間としては約１時間〜６時間の範囲を例示することができる。
【００２４】
その後、（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンの物理化学的性質を利用した通常の分離手段を用いて目的の物質を得る。例えば、蒸留、水蒸気蒸留、溶剤抽出、イオン交換、吸着または分配カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過、透析法、沈殿法等を単独あるいは適宜組み合わせて抽出、精製する。
【００２５】
必要に応じて前々項の反応混合物を溶媒抽出後、減圧濃縮し、残渣を得る。この残渣を再び溶媒に溶解あるいは懸濁させ、酸添加後再度加熱処理を施し、前述の如き後処理を行うことにより（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンの収率を向上させることができる。溶媒と酸の組み合わせは適宜選択すればよく、水中硫酸あるいはリン酸を好ましく例示することができる。さらに好ましくはベンゼンあるいはトルエン中ｐ−トルエンスルホン酸を例示することができる。また、酸処理以外の方法として、他の公知の脱水法、例えばピリジン中オキシ塩化リンを作用させることにより同様に（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンを得ることができる。
【００２６】
本発明者らは上記の微生物培養物の菌体に下記式
【００２７】
【化７】
0003779751.tif 000006
で示されるエキソフィリンＡ（Ｅｘｏｐｈｉｌｉｎ  Ａ）が含まれることを確認した。確認方法は以下の通りである。培養物より菌体を分離し、クロロホルム−メタノール抽出画分を得た。次いで、本画分をゲルろ過、引き続き逆相ＨＰＬＣに供し、エキソフィリンＡを得た。本確認試験によって得られたエキソフィリンＡの１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（溶媒ＣＤ３ＯＤ：ＣＤＣｌ３＝３：１）を図１に示す。
【００２８】
したがって、本発明に記した微生物の培養物を酸処理することにより（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンが生じる反応は、エキソフィリンＡの如き３，５−ジヒドロキシデカン酸のエステル結合による多量体および３，５−ジヒドロキシデカン酸自体を中間体として考えることができる。
【００２９】
本発明により得られたマッソイアラクトンは比旋光度（［α］Ｄ）が−１１４°（ｃ  ０．１４）であった。文献値（［α］Ｄ−１１４．５°  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｓｙｍｍｅｔｒｙ  ４，１０１７−１０２６（１９９３））との比較から本発明により得られたマッソイアラクトンはＲの絶対配置を有し、９９％以上の光学純度であることが確認された。加えて本発明により製造される（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンは既知の方法により製造された（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンと同等の持続性のあるマイルドな甘いココナッツミルク様の香気を有している。
【００３０】
本発明により製造されたマッソイアラクトンは既知の方法により製造された（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンと同等の香調を有することから、従来の方法で製造された（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンを含有する香料組成物を製造するのと同様の方法で、本発明により製造された（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンを香気香味の有効成分として含有することを特徴とする香料組成物を製造することができる。また、この香料組成物を添加して、従来同様の風味を持つ果汁飲料、炭酸飲料、アイスクリーム、洋菓子の如き飲食品類、タバコ類、シャンプー、ポマード、口紅の如き香粧品類、室内芳香消臭剤、歯磨き、消毒用洗剤、シロップ剤の如き保健・医薬品を提供できる。
【００３１】
以下に本発明実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３２】
【実施例】
〈培養および集菌〉
培地としてグルコース  １％、Ｌ−アスパラギン  ０．０５％、リン酸二水素カリウム  ０．０５％を海水に溶解しｐＨ７．０に調整したものを用いた。上記の液体培地５０ｍＬにエキソフィリンＡを生産するエキソフィアラ・ピシフィラＮＩ  １０１０２株（微工研菌寄第１４２３２号）を一白金耳接種し、２５℃で４日間振とう培養した（１）。さらに同じ組成の液体培地５００ｍＬに（１）を加え、２５℃で４日間振とう培養した（２）。最後に同じ組成の培地１５Ｌに（２）を加え２５℃で１０日間培養した。
【００３３】
〈化学的処理と精製〉
上記の培養物（１００ｍＬ）に濃硫酸（０．２９ｍＬ）を加え、４時間加熱還流した。反応液を室温に戻し、５規定水酸化ナトリウム水溶液で中性とした後、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）で３回抽出した。抽出液を濃縮後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ  Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０，Ａｒｔ．７７３４  １０ｇ；溶出溶媒  ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）で精製し、１．４ｍｇの（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンを無色油状物質として得た。本法により得られた（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンの物理化学的データを以下に示す。
【００３４】
１Ｈ  ＮＭＲ（９０ＭＨｚ：ＣＤＣｌ３）スペクトルデータ
δ０．９０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ）
１．１−１．９（ｍ，８Ｈ）
２．３６（２Ｈ，ｍ）
４．４５（１Ｈ，ｍ）
６．１０（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１０，２Ｈｚ）
７．００（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１０，５Ｈｚ）
比旋光度［α］Ｄ−１１４°（ｃ  ０．１４，ＣＨＣｌ３
【００３５】
〈エキソフィリンＡの確認試験〉
上記培養物（１５Ｌ）より菌体を分離し、５倍量のクロロホルム−メタノール（２：１）を加え、ディスパーサーで５分間（３回）、超音波で５分間抽出した。抽出液をろ過した後、ろ液の４分の１量の水を加え二層分配した。有機層を脱水後濃縮乾固した。次いで、本画分をゲルろ過（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＨＷ−４０：移動相  アセトン）で精製した。エキソフィリンＡ含有画分を引き続き逆相ＨＰＬＣ（ＯＤＳ  Ｈｉｂａｒ  ＲＴ２５０−１０  Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ  ＲＰ−１８：移動相  アセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸＝３：１：０．００２  流量  ２ｍＬ／分）に供し、保持時間１５分にピークを示すエキソフィリンＡを得た。
【００３６】
【発明の効果】
本発明の効果を列挙すれば以下の如くなる。
（１）微生物の培養物に対して分離操作なしに直接化学的処理を行い、最低一段階の化学反応で（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンを得ることができるため簡便である。
（２）微生物の培養物を用いるため、（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンの用時大量調製が可能となる。
（３）得られた（Ｒ）−（−）−マッソイアラクトンは高い光学純度を有し、従来の製造法と同等の品質を提供することができる。
（４）特殊な試薬を用いることがないため廃液等の処理が平易で安全である。
【００３７】
【図面の簡単な説明】
【図１】エキソフィリンＡの１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（溶媒  ＣＤ３ＯＤ：ＣＤＣｌ３＝３：１）を示す。
【図１】
0003779751.tif 000009