(57)【要約】  本発明は、心筋細胞成熟促進剤を提供する。  本発明は、2-メトキシ-5-((Z)-2-(3,4,5-トリメトキシフェニル)ビニル)フェノール、(1-エチル-1H-ベンゾトリアゾール-5-イル)メチル (2-(2-メトキシ-4-メチルフェニル)-4-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)カルバマート、(2'beta)-22-オキソビンカロイコブラスチン、2-(2-(4-クロロフェニル)エチル)-6-(2-フリル)-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン、4,5-アンヒドロ-1,2-ジデオキシ-4-メチル-2-((N-(モルホリン-4-イルアセチル)-L-アラニル-O-メチル-L-チロシル)アミノ)-1-フェニル-L-threo-ペント-3-ウロース、3-(3-メトキシフェニル)-N7,N7-ジメチルイソキノリン-1,7-ジアミン、メチル 4-(2-ベンジルベンゾイル)-2,5-ジメチル-1H-ピロール-3-カルボキシラート、2'-(4-アミノフェニル)-1H,1'H-2,5'-ビベンゾイミダゾール-5-アミン、およびそれらの塩から選ばれる1以上の化合物を含有してなる、心筋細胞成熟促進剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
2-メトキシ-5-((Z)-2-(3,4,5-トリメトキシフェニル)ビニル)フェノール、
(1-エチル-1H-ベンゾトリアゾール-5-イル)メチル (2-(2-メトキシ-4-メチルフェニル)-4-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)カルバマート、
(2'beta)-22-オキソビンカロイコブラスチン、
2-(2-(4-クロロフェニル)エチル)-6-(2-フリル)-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン、
4,5-アンヒドロ-1,2-ジデオキシ-4-メチル-2-((N-(モルホリン-4-イルアセチル)-L-アラニル-O-メチル-L-チロシル)アミノ)-1-フェニル-L-threo-ペント-3-ウロース、
3-(3-メトキシフェニル)-N7,N7-ジメチルイソキノリン-1,7-ジアミン、
メチル 4-(2-ベンジルベンゾイル)-2,5-ジメチル-1H-ピロール-3-カルボキシラート、
2'-(4-アミノフェニル)-1H,1'H-2,5'-ビベンゾイミダゾール-5-アミン、
およびそれらの塩から選ばれる1以上の化合物を含有してなる、心筋細胞成熟促進剤。
【請求項２】
未成熟心筋細胞を請求項１に記載の心筋細胞成熟促進剤の存在下で培養する工程を含む、成熟心筋細胞の製造方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法で得られた成熟心筋細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋細胞成熟促進剤、及び成熟心筋細胞の製造方法に関する。【０００２】
（発明の背景）
心臓疾患は世界の死因１位であり、重症心不全患者においては心移植が現在唯一の治療法であるが、心移植はドナー不足という問題を抱えている。心移植に代わる治療法として、多能性幹細胞（例、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）等）由来の心筋細胞移植が有望視されており、早急な実現化が望まれている。 また、薬剤の毒性試験や心疾患モデル研究細胞としても多能性幹細胞（例、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等）由来の心筋細胞が必要とされている。
ｉＰＳ細胞由来の成熟心筋細胞を再生医療に応用するためには、効率性と安全性向上が必須である。効率性については、成熟を誘導できる心筋細胞の数が少ないことや、培養液中の増殖因子などのタンパク質が非常に高価でコスト効率が悪いという問題がある。安全性については、心筋細胞の純度が低く、心筋以外の増殖性細胞が混入するため癌化リスクがあることが問題となる。
また心筋細胞を用いた薬剤の毒性試験や心疾患モデル研究を行うためには、生体内の心筋細胞を十分に模倣した成熟心筋細胞を大量に集める必要がある。心筋細胞は、出生と同時にその分裂能を喪失し、その再生が極めて困難であるという性質を有するため、大量の心筋細胞を得るために、多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する研究が多数行われてきた（特許文献１、特許文献２、非特許文献１、非特許文献２および非特許文献３）。
しかし、ヒト多能性幹細胞由来心筋細胞は一般的に胎児性心筋細胞に類似した未成熟な段階に留まり、成人心筋細胞と比べてイオンチャネル機能が不十分であると言われており、イオンチャンネルに関する薬物毒性や治療薬をスクリーニングするためには、成熟した心筋細胞を用いて行う必要がある。
従って、心筋細胞移植および薬物毒性や治療薬のスクリーニングに用いる細胞として成熟した心筋細胞およびその製造方法が求められている。【０００３】
一方、特許文献３〜９および非特許文献４には以下の化合物が知られている。
(1) 特許文献３【０００４】
【化１】
2019189554.tif 000002
【０００５】
(2) 特許文献４【０００６】
【化２】
2019189554.tif 000003
【０００７】
(3) 非特許文献４【０００８】
【化３】
2019189554.tif 000004
【０００９】
(4) 特許文献５【００１０】
【化４】
2019189554.tif 000005
【００１１】
(5) 特許文献６【００１２】
【化５】
2019189554.tif 000006
【００１３】
(6) 特許文献７【００１４】
【化６】
2019189554.tif 000007
【００１５】
(7) 特許文献８【００１６】
【化７】
2019189554.tif 000008
【００１７】
(8) 特許文献１０（後述する実施例化合物５のジアステレオマー）【００１８】
【化８】
2019189554.tif 000009
【００１９】
しかし、上記化合物が心筋細胞成熟促進化作用を有することは、いずれの文献にも何ら開示されていない。【００２０】
未成熟な心筋細胞であっても長期間（例えば、１年以上）培養することで、成熟した心筋細胞を得ることは可能であるが、成熟心筋細胞の商用製法としては、時間がかかり過ぎ、高価な培地や培地添加物の費用も嵩む。
したがって、現在、安価で短期間に効率よく高純度の成熟した心筋細胞を得ることができる心筋細胞成熟促進剤の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】WO 2007/002136
【特許文献２】WO 2009/118928
【特許文献３】WO 2006/094235
【特許文献４】WO 92/16486
【特許文献５】WO 2012/002527
【特許文献６】WO 02/076402
【特許文献７】WO 03/045929
【特許文献８】WO 2008/063548
【特許文献９】US 2007/0293465
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Yan P, et al, Biochem Biophys Res Commun. 379:115-20 (2009)
【非特許文献２】Laflamme MA, et al, Nat Biotechnol, 25:1015-1024 (2007)
【非特許文献３】Yang L et al, Nature, 453:524-528 (2008)
【非特許文献４】Journal of Medicinal Chemistry, 1993, vol.36, pp 2739-2744
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明は、安価で短期間に効率よく高純度の成熟した心筋細胞を得ることができる、心筋細胞成熟促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明者らは、下記化合物またはその塩が、心筋細胞成熟促進化作用を有することを見出し、更なる研究の結果、本発明を完成するに至った。【００２５】
即ち、本発明は、以下の通りである。
［１］  2-メトキシ-5-((Z)-2-(3,4,5-トリメトキシフェニル)ビニル)フェノール、
(1-エチル-1H-ベンゾトリアゾール-5-イル)メチル (2-(2-メトキシ-4-メチルフェニル)-4-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)カルバマート、
(2'beta)-22-オキソビンカロイコブラスチン、
2-(2-(4-クロロフェニル)エチル)-6-(2-フリル)-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン、
4,5-アンヒドロ-1,2-ジデオキシ-4-メチル-2-((N-(モルホリン-4-イルアセチル)-L-アラニル-O-メチル-L-チロシル)アミノ)-1-フェニル-L-threo-ペント-3-ウロース、
3-(3-メトキシフェニル)-N7,N7-ジメチルイソキノリン-1,7-ジアミン、
メチル 4-(2-ベンジルベンゾイル)-2,5-ジメチル-1H-ピロール-3-カルボキシラート、
2'-(4-アミノフェニル)-1H,1'H-2,5'-ビベンゾイミダゾール-5-アミン、
およびそれらの塩から選ばれる1以上の化合物を含有してなる、心筋細胞成熟促進剤。
［２］  未成熟心筋細胞を上記［１］に記載の心筋細胞成熟促進剤の存在下で培養する工程を含む、成熟心筋細胞の製造方法。
［３］  上記［２］に記載の方法で得られた成熟心筋細胞。
【発明の効果】
【００２６】
上記化合物またはその塩は、心筋細胞を成熟させる作用を有するので、心筋細胞成熟促進剤として有用である。上記化合物を用いる心筋細胞成熟促進化方法は、未成熟心筋細胞を長期間培養する方法と比較して、安価に短期間で未成熟心筋細胞を成熟させる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、試験例２における、フローサイトメーターによるmCherryの発現解析の結果を示す図である。上から順に、コントロール（添加なし）、コントロール（DMSO添加）、実施例番号２の化合物の添加の場合の結果を示す。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
本発明の心筋細胞成熟促進剤は、以下の化合物：
2-メトキシ-5-((Z)-2-(3,4,5-トリメトキシフェニル)ビニル)フェノール（実施例番号１）
(1-エチル-1H-ベンゾトリアゾール-5-イル)メチル (2-(2-メトキシ-4-メチルフェニル)-4-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)カルバマート（実施例番号２）
(2'beta)-22-オキソビンカロイコブラスチン（実施例番号３）
2-(2-(4-クロロフェニル)エチル)-6-(2-フリル)-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン（実施例番号４）
4,5-アンヒドロ-1,2-ジデオキシ-4-メチル-2-((N-(モルホリン-4-イルアセチル)-L-アラニル-O-メチル-L-チロシル)アミノ)-1-フェニル-L-threo-ペント-3-ウロース（実施例番号５）
3-(3-メトキシフェニル)-N7,N7-ジメチルイソキノリン-1,7-ジアミン（実施例番号６）
メチル 4-(2-ベンジルベンゾイル)-2,5-ジメチル-1H-ピロール-3-カルボキシラート（実施例番号７）
2'-(4-アミノフェニル)-1H,1'H-2,5'-ビベンゾイミダゾール-5-アミン（実施例番号８）
およびそれらの塩から選ばれる1以上の化合物を含有してなる。【００２９】
上記化合物が塩である場合、薬理学的に許容される塩が好ましく、このような塩としては、例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩等が挙げられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アンモニウム塩等が挙げられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン］、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等との塩が挙げられる。
無機酸との塩の好適な例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等との塩が挙げられる。
有機酸との塩の好適な例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等との塩が挙げられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、アルギニン、リジン、オルニチン等との塩が挙げられる。
酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等との塩が挙げられる。【００３０】
本発明の心筋細胞成熟促進剤は、上記化合物またはその塩を１種含有しても、２種以上を含有してもよい。
上記化合物またはその塩は、自体公知の方法、例えば、特許文献３〜９および非特許文献４に記載の方法または類似の方法に従って、それぞれ製造することができる。【００３１】
上記化合物は、水和物、非水和物、溶媒和物、無溶媒和物のいずれであってもよい。
また、上記化合物は、同位元素（例、２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３５Ｓ、１２５Ｉなど）などで標識または置換された化合物であってもよい。
１Ｈを２Ｈ（Ｄ）に変換した重水素変換体も、上記化合物に包含される。
互変異性体も、上記化合物に包含される。
上記化合物は、薬学的に許容され得る共結晶または共結晶塩であってもよい。ここで、共結晶または共結晶塩とは、各々が異なる物理的特性（例えば、構造、融点、融解熱、吸湿性、溶解性および安定性等）を持つ、室温で二種またはそれ以上の独特な固体から構成される結晶性物質を意味する。共結晶または共結晶塩は、自体公知の共結晶化法に従い製造することができる。【００３２】
本発明の心筋細胞成熟促進剤は、そのまま、あるいは、薬理学的に許容される担体を配合し、自体公知の方法で製剤化して用いられる。【００３３】
上記化合物またはその塩は、優れた心筋細胞成熟促進化作用を有するので、心筋細胞成熟促進剤として有用である。従って、未成熟心筋細胞を上記化合物またはその塩の存在下で培養することにより、培地成分のみで培養するよりも短期間に、成熟心筋細胞を製造することができる。【００３４】
本明細書中、「多能性（pluripotency）」とは、種々の異なった形態や機能を持つ組織や細胞に分化でき、３胚葉のどの系統の細胞にも分化し得る能力を意味する。「多能性（pluripotency）」は、胚盤には分化できず、したがって個体を形成する能力はないという点で、胚盤を含めて、生体のあらゆる組織に分化しうる「全能性（totipotency）」とは区別される。【００３５】
本明細書中、「多能性（multipotency）」とは、複数の限定的な数の系統の細胞へと分化できる能力を意味する。例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞はmultipotentだが、pluripotentではない。【００３６】
本明細書中、「幹細胞（stem cell）」としては、例えば、多能性幹細胞（pluripotent stem cell）が挙げられる。【００３７】
本発明の心筋細胞成熟促進剤を適用する「心筋細胞」は、特に限定はないが、好ましくは、哺乳動物（例、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ブタ、サル、ヒト）由来であり、より好ましくはヒト由来である。【００３８】
本発明の心筋細胞成熟促進剤により成熟促進可能な心筋細胞としては、後述するマーカー発現レベル、形態や構造（例、サルコメア、ミトコンドリア）、性質（例、拍動状態、電位生理学的な成熟度）などから未成熟な状態と判断できれば特に限定はない。
本発明の心筋細胞成熟促進剤により成熟促進可能な心筋細胞はまた、多能性幹細胞から分化誘導された細胞であってもよい。あるいは、生体から分離された未熟な心筋細胞（例えば、マウスやラットの胎仔もしくは新生仔由来の心筋細胞）であってもよい。【００３９】
多能性幹細胞は、以下のものに限定されないが、例えば、胚性幹(ES)細胞、精子幹細胞（「GS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、人工多能性幹(iPS)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞、iPS細胞およびntES細胞である。【００４０】
(A) 胚性幹細胞
ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
ES細胞は、受精卵の8細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ES細胞は、マウスで1981年に発見され(M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156)、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立された (J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)。
ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor (LIF))、塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor (bFGF))などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばUSP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848； Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147； H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932； M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559； H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585；Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。
ES細胞作製のための培養液として、例えば0.1mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM 非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン酸、20% KSR及び4ng/ml bFGFを補充したDMEM/F-12培養液を使用し、37℃、2% CO2/98% 空気の湿潤雰囲気下でヒトES細胞を維持することができる(O. Fumitaka et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:215-224)。また、ES細胞は、3〜4日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば1mM CaCl2及び20% KSRを含有するPBS中の0.25% トリプシン及び0.1mg/mlコラゲナーゼIVを用いて行うことができる。
ES細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Oct-3/4、Nanogなどの遺伝子マーカーの発現を指標にしてReal-Time PCR法で行うことができる。特に、ヒトES細胞の選択では、OCT-3/4、NANOG、ECADなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる(E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:443-452)。
ES細胞としては、マウスES細胞であれば、inGenious targeting laboratory社、理研（理化学研究所）等が樹立した各種マウスES細胞株が利用可能であり、ヒトES細胞であれば、NIH、理研、京都大学、Cellartis社が樹立した各種ヒトES細胞株が利用可能である。たとえば、ヒトES細胞株としては、NIHのCHB-1〜CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1〜HUES28株等、WisCell ResearchのH1株、H9株、理研のKhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等を利用することができる。あるいは、臨床グレードの細胞株並びにそれらの細胞株を用いて作製された研究用および臨床用の細胞株等を用いてもよい。【００４１】
(B) 精子幹細胞
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41〜46頁,羊土社(東京、日本))。【００４２】
(C) 胚性生殖細胞
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。【００４３】
(D) 人工多能性幹細胞
「人工多能性幹細胞（iPSC）」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にOct3/4・Sox2・Klf4・c-Mycの４因子を導入することにより、樹立されたiPSC（Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のiPSC（Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872.）、上記４因子導入後、Nanogの発現を指標として選別し、樹立したNanog-iPS細胞（Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.）、c-Mycを含まない方法で作製されたiPS細胞（Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101 - 106）、ウイルスフリー法で6因子を導入して樹立されたiPS細胞（Okita K et al. Nat. Methods 2011 May;8(5):409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3):458-66.）も用いることができる。また、Thomsonらにより作製されたOCT3/4・SOX2・NANOG・LIN28の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.）、Daleyらにより作製された人工多能性幹細胞（Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開2008-307007号）等も用いることができる。
このほか、公開されているすべての論文（例えば、Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5,568-574；、Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650；Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797）、あるいは特許（例えば、特開2008-307007号、特開2008-283972号、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
人工多能性細胞株としては、NIH、理研、京都大学等が樹立した各種iPSC株が利用可能である。例えば、ヒトiPSC株であれば、理研のHiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大学の253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株等が挙げられる。あるいは、京都大学やCellular Dynamics International等から提供される臨床グレードの細胞株並びにそれらの細胞株を用いて作製された研究用および臨床用の細胞株等を用いてもよい。【００４４】
本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、及び成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、及び株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
本発明において、体細胞を採取する由来となる哺乳動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。得られるiPS細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患者本人またはHuman leukocyte antigen （HLA）の型が同一もしくは実質的に同一である他人から体細胞を採取することが特に好ましい。ここでHLAの型が「実質的に同一」とは、免疫抑制剤などの使用により、該体細胞由来のiPS細胞から分化誘導することにより得られた細胞を患者に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にHLAの型が一致していることをいう。例えば主たるHLA(例えばHLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座）が同一である場合などが挙げられる（以下同じ）。一方、ヒトに投与（移植）しない場合、例えば、候補薬剤の心筋細胞への毒性を試験する方法においては、iPS細胞のソースとなる体細胞の由来は特に制限されない。患者の薬剤感受性や副作用の有無を評価するためのスクリーニング用の細胞のソースとしてiPS細胞を使用する場合には、患者本人または薬剤感受性や副作用と相関する遺伝子多型が同一である他人から体細胞を採取することが望ましい。【００４５】
(E) 核移植により得られたクローン胚由来のES細胞
nt ES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している（T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES(nuclear transfer ES)細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術（J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646）とES細胞作製技術(上記)との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47〜52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。【００４６】
本発明において「心筋細胞」とは、少なくとも心筋トロポニン(cTNT)、αMHC（α myosin heavy chain、MYH6）およびβMHC（MYH7）から成る群から選択される少なくとも一つのマーカー遺伝子を発現している細胞を意味する。cTNTは、ヒトの場合NCBIのaccession番号NM_000364が例示され、マウスの場合、NM_001130176が例示される。αMHCは、ヒトの場合NCBIのaccession番号NM_002471が例示され、マウスの場合、NM_001164171が例示される。βMHCは、ヒトの場合NCBIのaccession番号NM_000257が例示され、マウスの場合、NM_080728 が例示される。
心筋細胞は成熟化するにつれてトロポニンI1(TNNI1)の発現が減少し、トロポニンI３(TNNI3)の発現が上昇するアイソフォームスイッチが起こることが知られている（Fikru B. Bedada,(2014) 3(4): 594-605.）。本明細書において、心筋が成熟化した（している）とは、少なくともTNNI3の発現が上昇していることを意味する。【００４７】
多能性幹細胞から未成熟の心筋細胞への分化誘導方法として、例えばLaf Lamme MAらにより報告された方法により、多能性幹細胞から心筋細胞を製造することができる（Laflamme ΜΑ &Murry CE, Nature 2011, Review)。
この他にも特に特定されないが、例えば、人工多能性幹細胞を浮遊培養により細胞塊（胚様体)を形成させて心筋細胞を製造する方法、Bone Morphogenic Protein （BMP）シグナル伝達を抑制する物質の存在下で心筋細胞を製造する方法（WO2005/033298)、Activin AとBMPを順に添加させて心筋細胞を製造する方法（WO2007/002136)、カノニカルWntシグナル経路の活性化を促す物質の存在下で心筋細胞を製造する方法（WO2007/126077)および人工多能性幹細胞からFLk/KDR陽性細胞を単離し、シクロスポリンAの存在下で心筋細胞を製造する方法（WO2009/118928)などが例示される。
また、胚様体形成法でサイトカインを用いて心筋細胞を分化誘導する方法(Yang L, et al.、 Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population.、 Nature.、 2008 May 22;453(7194):524-8)、接着培養でサイトカインを使わずに心筋細胞を分化誘導する方法(Lian X, et al.、 Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.、 Proc Natl Acad Sci U S A.、 2012 July 3;109(27):E1848-57)、接着培養と、浮遊培養とを併用し、サイトカインを使わずに心筋細胞を分化誘導する方法(Minami I, et al.、 A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xeno-free conditions.、 Cell Rep.、 2012 Nov 29;2(5):1448-60)なども提案されている。【００４８】
未成熟の心筋細胞を多能性幹細胞から得るための培地としては、自体公知の培地を特に限定されずに用いることができる。例えばIMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）、StemPro34（invitrogen）、StemFit AK02からＣ液を除いた培地（AJINOMOTO AK02のA液４００ｍLおよびB液１００ｍLの計５００ｍL）、Essential 6 medium (Thermo Fischer Scientific)およびこれらの混合培地などが用いられる。
これらの培地には、細胞や培養条件毎に、自体公知の添加物を添加することができる。例えば、培地は、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。さらに必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、1-チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質を含んでいてもよい。これらの中でも好ましい培地は、トランスフェリン、1-チオールグリセロール、L-グルタミン、アスコルビン酸をそれぞれ含有するStemPro34またはStemFit AK02からＣ液を除いた培地、もしくはB27サプリメントを含有するRPMI1640である。【００４９】
上記培地を用いて心筋細胞へ分化誘導する最初の添加物としては、アクチビンA、BMP4およびbFGFの組み合わせか、あるいはCHIR99021が挙げられる。
アクチビンA、BMP4およびbFGFの組み合わせの場合、これらの添加物の使用濃度は、好ましくは、アクチビンAが１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、BMP4が１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、bFGFが１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌであり、より好ましくは、アクチビンAが６ｎｇ／ｍｌ、BMP4が１０ｎｇ／ｍｌ、bFGFが５ｎｇ／ｍｌである。
CHIR99021の場合、その使用濃度は、好ましくは100ｎＭ〜100μＭであり、より好ましくは4〜6μＭである。【００５０】
上記添加物を加えた後、血管内皮増殖因子（VEGF）及びWnt阻害剤を培地へ添加することで心筋細胞へ誘導することができる。
使用するVEGFの濃度は、好ましくは1〜100ng/mlであり、より好ましくは10ng/mlである。
Wnt阻害剤としては、DKK1タンパク質（例えば、ヒトの場合、NCBIのアクセッション番号：NM_012242）、スクレロスチン（例えば、ヒトの場合、NCBIのアクセッション番号：NM_025237）、IWR-1（Merck Millipore）、IWP-2（Sigma-Aldrich）、IWP-3（Sigma-Aldrich）、IWP-4（Sigma-Aldrich）、PNU-74654（Sigma-Aldrich）、XAV939（Sigma-Aldrich）およびこれらの誘導体などが例示され、中でも、IWP-3、IWP-4、IWR-1が好ましく用いられる。
使用するWnt阻害剤の濃度、Wntを阻害する濃度であれば特に限定されないが1ｎＭ〜50μＭが好ましく、特に好ましくは1〜2μＭである。【００５１】
未成熟の心筋細胞を多能性幹細胞から得るための培養期間としては、例えば、５〜３６５日、好ましくは５〜１００日、より好ましくは５〜６０日、さらに好ましくは５〜４０日、さらに一層好ましくは５〜３０日である。【００５２】
本発明の心筋細胞成熟促進剤における化合物の使用量は、特に限定するものではないが、未成熟の心筋細胞１×１０４〜１×１０７細胞あたり、例えば、０．０１〜１００μＭ、好ましくは０．１〜３０μＭ、さらに好ましくは１〜１０μＭである。【００５３】
心筋細胞の成熟度の指標としては、心筋成熟化マーカーの発現レベル、形態や構造（例、サルコメア、ミトコンドリア）、性質（例、拍動状態、電位生理学的な成熟度）などが挙げられる。これらの指標は自体公知の方法で確認できる。
例えば、心筋成熟化マーカーの発現レベルは、マーカー遺伝子の発現量をＰＣＲを用いて測定する；マーカータンパク質の発現量をウエスタンブロット等により解析する；または蛍光標識により顕微鏡もしくはフローサイトメーターにより解析することができる。電位生理学的な成熟度の指標は、パッチクランプにより静止膜電位の深さ等を用いることができる。サルコメアの微細構造やミトコンドリアの指標は、電子顕微鏡により観察するか；蛍光標識により顕微鏡もしくはフローサイトメーターにより解析するか；またはextracellular flux analyzerなどにより機能解析することができる。【００５４】
一つの実施形態では、本発明の心筋細胞成熟促進剤を用いて得られた成熟した心筋細胞は心臓の再生医療に用いることができる。例えば、心臓疾患に罹患している患者の心臓に、本発明の方法で製造した心筋細胞の細胞塊を含む組成物を投与することができる。具体的には、本発明の方法で得られた心筋細胞は、そのまま細胞懸濁液として、あるいは、心筋シート（単層または多層）の形で、心疾患患者の心臓に移植してもよい。心筋シートの製造法については、例えば、WO2012/133945、WO2013/137491、WO2014/192909、WO2016/076368を参照のこと。
別の実施形態では、本発明の心筋細胞成熟促進剤を用いて得られた心筋細胞は均一に成熟しており、心疾患の治療のための薬剤スクーニングや薬剤の心毒性評価に利用することもできる。例えば、本発明の方法で得られた心筋細胞に試験薬剤を投与し、心筋細胞の応答を調べることにより、試験薬剤の効果や毒性の評価を行うことができる。
別の実施形態では、本発明の心筋細胞成熟促進剤を用いて得られた自動能が低下した心筋細胞は心臓の再生医療に用いることができる。
【実施例】
【００５５】
試験例１
心筋細胞の成熟化を検出するため、TNNI1の遺伝子座にEmGFP（配列番号１）、TNNI3の遺伝子座にmCherry（配列番号２）のレポータータンパク質の配列を挿入したダブルノックインのヒトiPS細胞株を作製した(ヒトiPS細胞はCTL社より購入したPBMC (LP_167, Sample ID:20130318)を用いてエピソーマルベクター(搭載遺伝子；OCT3/4, KLF4, SOX2, L-MYC, LIN28, mouse p53DD)により作製された(参考文献；Okita K, et al. Stem Cells. 2012 Nov 29. doi: 10.1002/stem.1293)。
上記レポーターiPS細胞株の維持培養は従来法で行った(Okita K, et al. Stem Cells. 2012 Nov 29. doi: 10.1002/stem.1293)。【００５６】
心筋細胞への分化誘導は、レポーターiPS細胞株を0.5×TrypLE select (ライフテクノロジーズ、0.5 mM EDTA/PBSで1/2希釈)で4〜5分処理後、セルスクレーパー(IWAKI)で細胞を剥離し、ピペッティングによりシングルセルへと解離した。遠心分離(1,000 rpm, 5 min)により培地を除去し、得られた細胞を、30mLバイオリアクター1本(ABLE)あたり1×107 cells播種して、StemFit AK02からＣ液を除いた培地（AJINOMOTO AK02のA液４００ｍLおよびB液１００ｍLの計５００ｍL）に1%Ｌ−グルタミン、トランスフェリン１５０μｇ/mL、アスコルビン酸５０μｇ/mL（sigma）、モノチオグリセロール4×10-4 M、10μM Rock inhibitor（Y-27632）、2ng/mL BMP4（R&D）および0.5% Matrigel（Growth Factor Reduced）を添加し、37℃、5%酸素条件下にて培養(５５ｒｐｍ、浮遊撹拌培養法)して、胚様体を形成させた（０日目）。
翌日(１日目)、10μg/mLのアクチビンAを9μL(最終濃度3 ng/mL)、10μg/mLのbFGFを15μL(最終濃度5 ng/mL)および10μg/mLのBMP4を24μL(最終濃度10 ng/mL)をバイオリアクター中へ添加し、37℃、5%酸素条件にてさらに2日間培養した。
続いて（３日目）、得られた胚様体を50 mL遠沈管に回収して遠心分離に供した(200 g、1 min)後、培地を除去し、StemFit AK02からＣ液を除いた培地（AJINOMOTO AK02のA液４００ｍLおよびB液１００ｍLの計５００ｍL）に1%Ｌ−グルタミン、トランスフェリン１５０μｇ/mL、アスコルビン酸５０μｇ/mL（sigma）、モノチオグリセロール4×10-4 M、10 ng/mL VEGF、1μM IWP-3、0.6 μM Dorsomorphinおよび5.4 μM SB431542を添加した培地中で、37℃、5%酸素条件下(５５ｒｐｍ、浮遊撹拌培養法)で、3日間培養した。
続いて(６日目)、バイオリアクターを静置して胚様体を沈降させ、培地の80〜90%除去した後、1%Ｌ−グルタミン、トランスフェリン１５０μｇ/mL、アスコルビン酸５０μｇ/mL（sigma）、モノチオグリセロール4×10-4 Mおよび5 ng/mL VEGFを添加したStemFit AK02からＣ液を除いた培地（AJINOMOTO AK02、A液４００ｍLおよびB液１００ｍLの計５００ｍL）をtotal 30mLになるよう添加し、8日間、37℃、5%酸素条件下で培養した(５５ｒｐｍ、浮遊撹拌培養法)。この間、2〜3日に1度同じ条件の培地に交換した。【００５７】
分化誘導開始から14日目の胚様体を、2 mg/mＬcollagenase type I （Ｓｉｇｍａ）で2時間処理し、0.25% trypsin/EDTA（Invitrogen）で10分間処理した。50% FBS/IMDM（Thermo Fisher Science）を添加して、ピペッティングにより単一の細胞(single cell)とした後、遠心分離に供した（1,000 rpm、5分）。遠心分離後、上清を除去し、StemFit AK02培地を基本とした心筋分化培地AK02培地（AJINOMOTO AK02のA液４００ｍLおよびB液１００ｍLの計５００ｍLにアスコルビン酸５０μｇ/mL、Ｌ−グルタミン２ｍM、トランスフェリン１５０mｇ/mL、モノチオグリセロール4×10-4 M、VEGF 5 ng/mlを混合したもの）１００mLに再懸濁した。再懸濁した細胞を、あらかじめiMatrix-511（ニッピより購入）でコートしたCellCarrier-384 Ultra Microplate（パーキンエルマー/6057300）上に1．０×１０4細胞/ウェルにて播種し、StemFit AK02培地を基本とした心筋分化培地AK02培地（AJINOMOTO AK02のA液４００ｍLおよびB液１００ｍLの計５００ｍLにアスコルビン酸５０μｇ/mL、Ｌ−グルタミン２ｍM、トランスフェリン１５０mｇ/mL、モノチオグリセロール4×10-4 Mを混合したものを１ウェルあたり７０μＬ）で培養した。
評価化合物（以下の表１に示す実施例番号１〜８の化合物）を、１ウェルあたり１化合物（１μＭ）を５０μＬ、培養3日目および6日目に添加した。培養８日目に、パラホルムアルデヒド（和光純薬、163-20145）で固定し、1次抗体としてラット抗mCherry（インビトロジェン、M11217）、２次抗体としてヤギ抗ラットIgGアレクサ647（インビトロジェン、A-21247)を用いた免疫染色をした。ＨＣＳ（high contents screening）システム（パーキンエルマー/OperaPhenix ハイコンテンツイメージングシステム）を用いて撮影モードNon-Confocal、対物レンズ１０×air  NA0.3でアレクサ647の発現量を測定した。
蛍光強度から化合物を添加していないコントロールウェルの平均蛍光強度（ｎ＝６０の平均値）は797だった。結果を表２に示す（ｎ＝３の平均値）。【００５８】
【表１】
2019189554.tif 000010
【００５９】
【表２】
2019189554.tif 000011
【００６０】
試験例２
心筋細胞の成熟化を検出するため、TNNI1の遺伝子座にEmGFP（配列番号１）、TNNI3の遺伝子座にmCherry（配列番号２）のレポータータンパク質の配列を挿入したダブルノックインのヒトiPS細胞株を作製した(ヒトiPS細胞はCTL社より購入したPBMC (LP_167, Sample ID:20130318)を用いてエピソーマルベクター(搭載遺伝子；OCT3/4, KLF4, SOX2, L-MYC, LIN28, mouse p53DD)により作製された(参考文献；Okita K, et al. Stem Cells. 2012 Nov 29. doi: 10.1002/stem.1293)。
上記レポーターiPS細胞株の維持培養は従来法で行った(Okita K, et al. Stem Cells. 2012 Nov 29. doi: 10.1002/stem.1293)。【００６１】
心筋細胞への分化誘導は、レポーターiPS細胞株を0.5×TrypLE select (ライフテクノロジーズ、0.5 mM EDTA/PBSで1/2希釈)で4〜5分処理後、セルスクレーパー(IWAKI)で細胞を剥離し、ピペッティングによりシングルセルへと解離した。遠心分離(1,000 rpm, 5 min)により培地を除去し、得られた細胞を6 well plate 1 wellあたり2x106cells/1.5mLになるように、StemPro-34 SFM (ThermoFisher)に1%Ｌ−グルタミン、トランスフェリン１５０μｇ/mL、アスコルビン酸５０μｇ/mL（sigma）、モノチオグリセロール4×10-4 M、10μM Rock inhibitor（Y-27632）、2ng/mL BMP4（R&D）および0.5% Matrigel（Growth Factor Reduced）を添加した培地で懸濁し、37℃、5%酸素条件下にて静置培養して、胚様体を形成させた（０日目）。
翌日(１日目)、胚様体の入った6 well plate 1 wellに、1.5 mLのStemPro-34 SFM (ThermoFisher)に1%Ｌ−グルタミン、トランスフェリン１５０μｇ/mL、アスコルビン酸５０μｇ/mL（sigma）、モノチオグリセロール4×10-4 M、10μg/mLのアクチビンAを1.8μL(濃度12 ng/mL)、10μg/mLのbFGFを15μL(濃度10 ng/mL)および10μg/mLのBMP4を2.7μL(濃度18 ng/mL)を添加し、0日目の培地と合わせて最終3 mL(アクチビンA: 6ng/ml, bFGF: 5ng/ml, BMP4: 10ng/ml)として、37℃、5%酸素条件にてさらに2日間培養した。
続いて（３日目）、胚様体の入った6 well plateを傾け、胚様体をwellの端に沈降するまで1〜2分静置し、胚様体を吸わないように上清をアスピレートした。その後IMDM (ThermoFisher)培地を添加し、上記と同様に傾けて1〜2分静置し、胚様体を吸わないように上清をアスピレートした後、6 well plate 1 wellに、3 mLのStemPro-34 SFM (ThermoFisher)に1%Ｌ−グルタミン、トランスフェリン１５０μｇ/mL、アスコルビン酸５０μｇ/mL（sigma）、モノチオグリセロール4×10-4 M、10 ng/mL VEGF、1μM IWP-3、0.6 μM Dorsomorphinおよび5.4 μM SB431542を添加した培地を加え、37℃、5%酸素条件下で、3日間培養した。
続いて(６日目)、胚様体の入った6 well plateを傾け、胚様体をwellの端に沈降するまで1〜2分静置し、胚様体を吸わないように上清をアスピレートした後、6 well plate 1 wellに、2 mLのStemPro-34 SFM (ThermoFisher)に1%Ｌ−グルタミン、トランスフェリン１５０μｇ/mL、アスコルビン酸５０μｇ/mL（sigma）、モノチオグリセロール4×10-4 M、5 ng/mL VEGFを添加した培地を加え、4日間、37℃、5%酸素条件下で培養した。8日目に同様の培地で培地交換を行った。
続いて(10日目)、胚様体の入った6 well plateを傾け、胚様体をwellの端に沈降するまで1〜2分静置し、胚様体を吸わないように上清をアスピレートした後、6 well plate 1 wellに、2 mLのStemPro-34 SFM (ThermoFisher)に、(1) 1%Ｌ−グルタミン、トランスフェリン１５０μｇ/mL、アスコルビン酸５０μｇ/mL（sigma）、モノチオグリセロール4×10-4 Mおよび5 ng/mL VEGF、並びに(2) 40 nMの実施例番号2の化合物またはDMSO (培地容積に対して0.1%添加)を、それぞれ添加した培地を加え、37℃、常酸素条件下で、6日間培養した。13日目に同じ条件の培地で培地交換を行った。【００６２】
16日目、各条件の胚様体を蛍光顕微鏡で撮影後、胚様体の入った6 well plateを傾け、胚様体をwellの端に沈降するまで1〜2分静置し、胚様体を吸わないように上清をアスピレートした。その後、2 mLのPBSを加えて上記と同様に傾けて1〜2分静置し、胚様体を吸わないようにPBSをアスピレートして、1 wellあたり3 mLのIMDMにDNase 10μｇ/mL、Liberase 100μｇ/mLを加えた溶液を添加し、37℃、通常酸素条件下で1時間静置した。1時間後、plateを傾けて胚様体をwellの端に沈降するまで1〜2分静置し、胚様体を吸わないように上清をアスピレートした。その後、2 mLのPBSを加えて上記と同様に傾けて1〜2分静置し、胚様体を吸わないようにPBSをアスピレートして、1 wellあたり2 mLのTrypLE selectにDNase 10μｇ/mLを添加した溶液を添加し、37℃、通常酸素条件下で10分静置した。その後、1 wellあたり2 mLのStemPro-34 SFM (ThermoFisher)に1%Ｌ−グルタミン、トランスフェリン１５０μｇ/mL、アスコルビン酸５０μｇ/mL（sigma）、モノチオグリセロール4×10-4 M、5 ng/mL VEGF、DNase 10μｇ/mLを添加した培地を加え、ピペッティングにより単一の細胞(single cell)とした後、遠心分離に供した（1,000 rpm、5分）。遠心分離後、上清を除去し、1〜2 mLの2%FBS/PBSで懸濁後、フローサイトメーター（BD FACSAria Fusionセルソーター）でTNNI1+細胞におけるmCherryの発現解析を行った。結果を表３および図１に示す。【００６３】
【表３】
2019189554.tif 000012
【産業上の利用可能性】
【００６４】
上記化合物またはその塩は心筋細胞の成熟を促す作用を有するので、心筋細胞成熟促進剤として有用である。【００６５】
本出願は、日本で２０１８年３月３０日に出願された特願２０１８−６９８７１号を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含される。
【図１】
2019189554.tif 000013
【配列表】
2019189554000001.app
【国際調査報告】
2019189554.tif 000014
2019189554.tif 000015
2019189554.tif 000016
2019189554.tif 000017