(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、４及び５のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体であって配列番号２４、２６、２７、３０、３２、３３、３９、４０、４２〜４６、４８、５１〜５３及び５５のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるペプチド、から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を認識する細胞傷害性Ｔリンパ球。
【請求項２】
請求項１記載の細胞傷害性Ｔリンパ球を有効成分として含有してなる制がん剤。
【請求項３】
配列番号２、４及び５のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体であって配列番号２４、２６、２７、３０、３２、３３、３９、４０、４２〜４６、４８、５１〜５３及び５５のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるペプチド、から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを使用することを特徴とする請求項１記載の細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導方法。
【請求項４】
配列番号２、４及び５のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体であって配列番号２４、２６、２７、３０、３２、３３、３９、４０、４２〜４６、４８、５１〜５３及び５５のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるペプチド、から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを有効成分として含有してなる、請求項１記載の細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導剤。
【請求項５】
配列番号２、４及び５のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体であって配列番号２４、２６、２７、３０、３２、３３、３９、４０、４２〜４６、４８、５１〜５３及び５５のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるペプチド、から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを有効成分として含有してなる制がん剤。
【請求項６】
配列番号２、４及び５のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体であって配列番号２４、２６、２７、３０、３２、３３、３９、４０、４２〜４６、４８、５１〜５３及び５５のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるペプチド、から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示してなる抗原提示細胞。
【請求項７】
請求項６記載の抗原提示細胞を有効成分として含有してなる細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導剤。
【請求項８】
請求項６記載の抗原提示細胞を有効成分として含有してなる制がん剤。
【請求項９】
請求項１記載の細胞傷害性Ｔリンパ球を被検細胞と接触させた際に生じる変化を指標とすることを特徴とする請求項１記載の細胞傷害性Ｔリンパ球に感受性の細胞の検出方法。
【請求項１０】
請求項１記載の細胞傷害性Ｔリンパ球を有効成分として含有してなる、請求項１記載の細胞傷害性Ｔリンパ球に感受性の細胞の検出剤。
【請求項１１】
配列番号２、４及び５のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体であって配列番号２４、２６、２７、３０、３２、３３、３９、４０、４２〜４６、４８、５１〜５３及び５５のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるペプチド、から選択された抗原ペプチド。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、がんの治療及び診断に有用な細胞傷害性Ｔリンパ球（細胞傷害性Ｔリンパ球と記載される場合もある）（cytotoxic T lymphocytes；以下、ＣＴＬと略す）及び該ＣＴＬを誘導する際等に有用なＣＴＬ誘導剤に関する。
背景技術
ＣＴＬには、抗原ペプチドと主要組織適合性抗原遺伝子複合体（major histocompatibility gene complex；以下、ＭＨＣと略す）にコードされる主要組織適合性抗原ＭＨＣクラスＩ（ヒトの場合human leukocyte antigenクラスＩと呼ばれ、以下、ＨＬＡクラスＩと略す）分子との結合物である複合体を特異的なＴ細胞レセプター（T cell receptor；以下、ＴＣＲと略す）によって認識し、その複合体を細胞表面に提示している細胞を傷害することのできるものがある。このようなＣＴＬは自身と同じＭＨＣクラスＩ分子を有する標的細胞のみを認識し傷害することから、ＭＨＣクラスＩ分子拘束性ＣＴＬと呼ばれる。したがって該細胞傷害反応が成立するためには、１）特異的ＴＣＲを持ったＣＴＬが存在すること、２）ＨＬＡクラスＩ分子に提示されＣＴＬに認識される抗原ペプチドとなるために、ＭＨＣクラスＩ抗原分子との結合だけでなく、ＴＣＲによる認識を受ける複合体を形成できる抗原ペプチドが存在すること、が必要である。
すなわち本明細書における「抗原ペプチド」とは、ＭＨＣクラスＩ分子に結合しＭＨＣクラスＩ分子との複合体形成能を有すると共に該複合体が特異的なＣＴＬのＴＣＲによって認識される抗原性を有するペプチドを意味する。また本明細書における「ＨＬＡ拘束性抗原ペプチド」とはＭＨＣクラスＩ分子がＨＬＡ分子である抗原ペプチドであることを意味する。なお本明細書における「ペプチド」とは、アミノ酸のみからなるホモメリックペプチドに特に限定されず、非アミノ酸成分を含むヘテロメリックペプチドをも包含する。アミノ酸も天然型に特に限定されず、化学修飾されたアミノ酸であってもよい。また本明細書におけるペプチドは単量体に限定されず、多量体であってもよい。
このような抗原ペプチドは、例えば哺乳類細胞の細胞内で合成された抗原等が小胞体でプロセスされ、小さいエピトープペプチドに分解されることにより生じ、更にＭＨＣクラスＩ分子と会合し、細胞表面に提示される。すなわち、多くのサブユニットよりなるプロテオソーム複合体の中で、タンパク質は８〜１５アミノ酸よりなるペプチドに分解され、そのうちのいくつかがＴＡＰトランスポーターにより細胞質から小胞体に運ばれる。これらのペプチドは小胞体でクラスＩ／β2ミクログロブリン（microglobulin）のヘテロダイマーに結合できれば、３分子複合体として安定化され、ゴルジ装置を通って、細胞表面に輸送される。腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原タンパク質を発現している腫瘍細胞は、腫瘍細胞表面にＴリンパ球に認識される、ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドを提示できるはずである。
Ｔリンパ球に認識される最初の腫瘍特異抗原として、Ｔ．ブーン（Ｔ．Ｂｏｏｎ）らによりメラノーマ（ｍｅｌａｎｏｍａ）抗原Ｅ（以下、ＭＡＧＥと略す）と呼ばれる遺伝子がクローニング、同定された〔Ｐ．ファン  デル  ブルガン（P. van der Bruggen）ら、サイエンス（Science）、第２５４巻、第１６４３〜１６４７頁（１９９１）〕。彼らは、メラノーマ患者由来のＣＴＬクローン、及びそのＣＴＬに認識される同じ患者由来の一連のメラノーマ細胞株、そしてそれらのうちいくつかはそのＣＴＬに耐性であるように免疫選択された株を用いて、発現クローニング法によりＭＡＧＥを単離した。すなわちＣＴＬに認識されたメラノーマ細胞株より調製したある５ｋｂのＤＮＡ断片を元々認識されなかった細胞株に形質導入すると、上記ＣＴＬクローンによって認識されるようになることが示された。このＤＮＡ断片は推定分子量26,000タンパクをコードしていた。このタンパクをコードした遺伝子はＭＡＧＥ−１と呼ばれているがｍＲＮＡ分析によって、転移性だけでなく初期段階のメラノーマ由来の４０％の細胞株がＭＡＧＥ−１を発現していることが示された。該タンパク由来の抗原はＨＬＡ−Ａ１拘束性であり、ＭＡＧＥ−１特異的ＣＴＬクローンは、ＨＬＡクラスＩ分子の一種であるＨＬＡ−Ａ１分子に結合した、配列番号７に記載した９アミノ酸配列からなるペプチド配列（EADPTGHSY）を認識した〔Ｃ．トラヴァーサリ（C. Traversari）ら、ジャーナル  オブ  イクスペリメンタル  オブ  メディシン（Journal of Experimental of Medicine）、第１７６巻、第１４５３〜１４５７頁（１９９２）〕。
腫瘍抗原として知られているものは多くのものがあるが、現在ＣＤ−８陽性のＣＴＬに認識されるものとしては、上記のＭＡＧＥ−１を始めとして１０種以上存在することが知られているＭＡＧＥファミリー、gp 100、チロシナーゼ（tyrosinase）、またがん胎児性抗原（carcinoembryonic antigen；以下、ＣＥＡと略す）、HER2/neu等がよく知られている。ＣＴＬに認識されるものは、腫瘍抗原タンパク質由来のペプチドであり、HLAクラスＩ分子との複合体として提示される。
HLAクラスＩ分子は主としてHLA-A、-B、-Cがあり、これらに結合して提示される抗原ペプチドは、９〜１０個のアミノ酸よりなり、更に各々のＨＬＡ分子によって異なる一定の構造上の特徴があることが知られている。例えば、世界的に最も頻度の高いHLA-A2.1分子に結合するペプチドとしてはＮ末端より２番目にLeu、且つＣ末端にLeu又はValを有する９〜１０個のアミノ酸よりなるペプチドが最も良く知られているものである。また、日本人を始めとするアジアの人種に多いHLA-A24分子に結合するペプチドはＮ末端より２番目にTyr、Phe、Met、Trpのいずれか、且つＣ末端にLeu、Ile、Trp、Pheのいずれかを有する９〜１０個のアミノ酸よりなるものであるペプチドが最もよく知られている〔Ａ．コンドー（Ａ．Kondo）ら、ジャーナル  オブ  イムノロジー（Journal of Immunology）、第１５５巻、第４３０７〜４３１２頁（１９９５）〕。
現在までに抗原ペプチドが同定されている腫瘍抗原としては、HLA-A1に対するMAGE-1，MAGE-3、HLA-A2.1に対するMAGE-3、MART1、チロシナーゼ、gp100、HER2/neu、CEA等、HLA-Cw1に対するMAGE-3、HLA-B44に対するMAGE-3等、HLA-A24に対してはチロシナーゼ、β−カテニン（ｃａｔｅｎｉｎ）等がある。ＣＥＡ由来の抗原ペプチドに関しては、配列番号３４に示した９個のアミノ酸配列からなるペプチドがＨＬＡ−Ａ２．１拘束性抗原ペプチドとして同定されている［ジャーナル  オブ  ナショナル  キャンサー  インスティテュート（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、第８７巻、第９８２〜９９０頁（１９９５）］。同様に、ＨＥＲ２／ｎｅｕ由来の抗原ペプチドに関しては、配列番号３５又は３６に示した９個のアミノ酸配列からなるペプチドがＨＬＡ−Ａ２．１拘束性抗原ペプチドとして同定されている［ジャーナル  オブ  エクスペリメンタル  メディシン、第１８１巻、第２１０９〜２１１７頁（１９９５）、キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第５４巻、第１０７１〜１０７６頁（１９９４）］。これらの中の多くは、まず腫瘍細胞を認識するクラスＩ拘束性のＣＴＬを株化し、このＣＴＬの認識する腫瘍抗原を同定し、続いて遺伝子工学的方法により腫瘍抗原タンパク質中最小単位を見出し、更にＨＬＡクラスＩ分子への結合モチーフに関する情報を基に最小単位中のペプチドが見出されている〔Ｙ．カワカミ（Y. Kawakami）ら、プロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  ザ  サイエンシーズ  オブ  ザ  ＵＳＡ（Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America）第９１巻、第３５１５〜３５１９頁（１９９４）〕。また、まず前記のＨＬＡクラスＩ分子結合ペプチドに共通したモチーフ構造を基に、腫瘍抗原タンパク質中のＨＬＡクラスＩ分子結合ペプチドを見出し、続いて抗原提示細胞を利用してＣＴＬを誘導可能なものを選択した後、最終的に腫瘍細胞に対して傷害性を有するＣＴＬが誘導できているかどうかにより抗原ペプチドが決定されている〔Ｅ．セリス（E. Celis）ら、プロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ザ  ＵＳＡ、第９１巻、第２１０５〜２１０９頁（１９９４）、Ｂ．ゴーグラー（B. Gaugler）ら、ジャーナル  オブ  イクスペリメンタル  オブ  メディシン、第１７９巻、第９２１〜９３０頁（１９９４）〕。
一方、ＨＬＡクラスＩ分子はいくつかのサブタイプに分類されるが、その保有サブタイプの種類は人種間で大きく異なり、世界的にはHLA-A2が最も多く、白色人種の４５％を占めている。そして、このHLA-A2拘束性の抗原ペプチドの同定が最も進んでいる。日本人ではHLA-A2は４０％を占めるが、そのサブタイプを見ると白色人種と同じHLA-A*0201は２０％で、残りの多くはA*0206である。これらのサブタイプへの結合ペプチドは異なり、主として研究されているHLA-A2はHLA-A*0201である。一方、日本人ではHLA-A24が６０％以上を占めており、このHLA-A24はアジア人種では他の人種に比べて比率が高い。しかし、現在までにこのＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原ペプチドが発見されている腫瘍抗原として上記のチロシナーゼ、β−カテニンがあるが、その解析は非常に遅れている。したがってアジア人種、特に日本人において腫瘍細胞特異的に作用するＣＴＬの解析も遅れており、腫瘍治療に有用なＣＴＬの提供が不可能であった。本発明の目的は該ＣＴＬを提供することにある。
発明の開示
本発明の第１の態様は、配列番号１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも１つの抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を認識するＣＴＬに関する。本発明の第２の態様は、第１の態様のＣＴＬを有効成分とする制がん剤に関する。本発明の第３の態様は、第１の態様のＣＴＬの誘導方法に関する。本発明の第４の態様は、配列番号１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを有効成分とするＣＴＬの誘導剤に関する。本発明の第５の態様は、配列番号１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを有効成分とする制がん剤に関する。本発明の第６の態様は、配列番号１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞に関する。なお本明細書ではＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する細胞として、「標的細胞」なる語と「抗原提示細胞」なる語を使用する。本明細書において「標的細胞」とは該細胞を特異的に認識するＣＴＬにより傷害を受ける細胞とする。一方、本明細書において「抗原提示細胞」とはＭＨＣ分子と共に抗原を提示しＴリンパ球の活性化を惹起する機能を有する細胞を意味し、特に断りのない限りＭＨＣ分子がＨＬＡ−Ａ２４分子である細胞とする。また本明細書における「抗原提示能を有する細胞」とは該細胞に存在するＭＨＣ分子と抗原ペプチドが複合体を形成することにより抗原提示細胞となることができる細胞を意味し、特に断りのない限りＭＨＣ分子がＨＬＡ−Ａ２４分子である細胞とする。本発明の第７の態様は、第６の態様の抗原提示細胞を有効成分とするＣＴＬの誘導剤に関する。本発明の第８の態様は、第６の態様の抗原提示細胞を有効成分とする制がん剤に関する。本発明の第９の態様は、第１の態様のＣＴＬを被検細胞と接触させた際に生じる変化を指標として該ＣＴＬに感受性の細胞の検出方法に関する。なお本明細書における「被検細胞」とは、末梢血リンパ球、組織等の体外摘出試料由来のヒト細胞又は株化細胞である。また本明細書における「感受性細胞」とは、ＣＴＬにより認識され細胞溶解あるいはサイトカイン遊離を引き起こされる腫瘍細胞をはじめとする、異常細胞を意味する。本発明の第１０の態様は、第１の態様のＣＴＬを有効成分として含有することを特徴とする該ＣＴＬに感受性の細胞の検出剤に関する。更に、本発明の第１１の態様は、ＨＬＡ拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチド存在下、該抗原ペプチドとＨＬＡ分子との複合体を認識可能なＣＴＬを被検細胞と接触させることを特徴とするＨＬＡ分子の検出方法に関する。
本発明者らは、腫瘍抗原であるＭＡＧＥ−３タンパク質中のＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフを有するペプチドを中心として多くの候補ペプチドの中から抗原ペプチドを探索した結果、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを用いると、ＨＬＡ−Ａ２４を発現している健常人の末梢血単核球より該腫瘍抗原発現細胞を選択的に傷害するＣＴＬを誘導できることを明らかにした。同様に、腫瘍抗原である各種タンパク質中のＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフを有するペプチドを中心とした候補ペプチドの中からＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドを探索した結果、ＭＡＧＥ−１タンパク質アミノ酸配列中に存在する配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、ＣＥＡタンパク質アミノ酸配列中に存在する配列番号４又は５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、更にＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質アミノ酸配列中に存在する配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを用いると、ＨＬＡ−Ａ２４を発現している健常人の末梢血単核球より該腫瘍抗原発現細胞を選択的に傷害するＣＴＬを誘導できることを明らかにし、本発明を完成させた。
【図面の簡単な説明】
第１図は、抗原ペプチドＭＡ３−２の刺激により誘導したエフェクター細胞の、標的細胞に対する特異的細胞傷害活性を示す図である。
第２図は、抗原ペプチドＭＡ３−４の刺激により誘導したエフェクター細胞の、標的細胞に対する特異的細胞傷害活性を示す図である。
第３図は、抗原ペプチドＭＡ３−２の刺激により誘導したエフェクター細胞の、各種がん細胞に対する特異的細胞傷害活性を示す図である。
第４図は、抗原ペプチドＭＡ３−４の刺激により誘導したエフェクター細胞の、各種がん細胞に対する特異的細胞傷害活性を示す図である。
第５図は、抗原ペプチドＭＡ１−１の刺激により誘導したエフェクター細胞の、各種標的細胞に対する特異的細胞傷害活性を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明の第１の態様は、配列番号１〜６いずれかに記載のアミノ酸配列で表されるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を認識するＣＴＬであり、該ＣＴＬは標的細胞に対して特異的に細胞溶解又はサイトカイン遊離反応等を起こす。なお、本明細書におけるＣＴＬはＨＬＡ−Ａ２４分子上に提示された抗原ペプチドの抗原性を認識し傷害活性を有するものを指し、その他の抗原性認識などにより限定されるものではない。
本明細書において、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドの機能的誘導体とは、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体形成能を有すると共に、形成された複合体が配列番号１〜６いずれか記載のアミノ酸配列で表される抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を認識するＣＴＬに認識されるものを意味する。例えば、配列番号１〜６いずれかに記載のアミノ酸配列で表されるペプチドのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が、欠失、他のアミノ酸若しくはアミノ酸アナログに置換、及び／又は１又は数個のアミノ酸若しくはアミノ酸アナログの付加、又はそれらの組み合わせによってアミノ酸配列は異なるが、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体形成能を有すると共に、形成された複合体が本発明のＣＴＬに認識されるペプチドであり、ジスルフィド結合等によるペプチドの２量体も含まれる。機能的誘導体のアミノ酸配列長は、９〜１０が好ましいが、これに特に限定されない。なお、本明細書におけるアミノ酸アナログとは、種々のアミノ酸のＮ−アシル化物、Ｏ−アシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物等を意味する。
また、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体がＣＴＬに認識されれば、抗原ペプチドのＮ末端や遊離のアミノ基は、ホルミル基、アセチル基、ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）基等が結合していてもよい。また、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体がＣＴＬに認識されれば、抗原ペプチドのＣ末端や遊離のカルボキシル基は、メチル基、エチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基等が結合していてもよい。同様にＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体がＣＴＬに認識されれば、抗原ペプチドに含まれるシステインのチオール基はアセトアミドメチル基、メトキシベンジル基等が結合していてもよい。
機能的誘導体は、配列番号１〜６いずれか記載のアミノ酸配列で表される抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を認識するＣＴＬを用いることにより同定することが出来、例えば、下記方法が挙げられる。
第１の方法は、機能的誘導体としての候補物質とＨＬＡ−Ａ２４発現細胞を混合し、ＨＬＡ−Ａ２４分子に未結合の候補物質を洗浄後、ＣＴＬと反応させる。候補物質特異的な、細胞傷害性、サイトカイン遊離、又は増殖反応が認められれば機能的誘導体であると判断出来る。
第２の方法としては、候補物質を抗原提示能を有する細胞に添加し、適当な時間、例えば、抗原が細胞内に取り込まれプロセッシングを受け、抗原ペプチドとＨＬＡ分子複合体が細胞表面に提示されるために要する時間、反応させた後、ＣＴＬと反応させる。候補物質特異的なサイトカイン遊離又は増殖反応が認められれば、該物質は機能的誘導体であると判断出来る。
第３の方法としては、後述の抗原提示能を有する細胞上のＨＬＡ−Ａ２４分子上にペプチドを提示させることが可能な発現ベクターに候補物質のアミノ酸配列をコードする核酸を結合させ、該組換えベクターにより形質転換された抗原提示能を有する細胞とＣＴＬを反応させる。候補物質特異的なサイトカイン遊離又は増殖反応が認められれば、該物質は機能的誘導体であると判断出来る。
上記機能的誘導体としては、例えば、配列番号１〜６いずれかに記載のアミノ酸配列で表されるペプチドのアミノ酸配列において、ＨＬＡ−Ａ２４分子への結合を強めるために、Ｎ末端より２番目のアミノ酸がＨＬＡ−Ａ２４分子に結合するペプチドに特徴的なＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐより選択されるアミノ酸に置換、及び／又はＣ末端のアミノ酸がＨＬＡ−Ａ２４分子に結合するペプチドに特徴的なＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅより選択されるアミノ酸に置換されたペプチドのうち、ＨＬＡ−Ａ２４分子との結合能を有し、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体が配列番号１〜６いずれか記載のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体をＣＴＬに認識されるペプチドが挙げられる。
また、配列番号１〜６いずれかに記載のアミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列で表されるペプチドにおいて、置換されるそれぞれのアミノ酸と側鎖の類似したアミノ酸若しくはアミノ酸アナログに置換したペプチドのうち、ＨＬＡ−Ａ２４分子と結合能を有し、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体が本発明のＣＴＬに認識されるペプチドも挙げられる。側鎖の類似したアミノ酸としては、例えば、グリシン（Ｇｌｙ）とアラニン（Ａｌａ）；バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とメチオニン（Ｍｅｔ）；アスパラギン（Ａｓｎ）とグルタミン（Ｇｌｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）とグルタミン酸（Ｇｌｕ）；セリン（Ｓｅｒ）とスレオニン（Ｔｈｒ）；リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）とチロシン（Ｔｙｒ）が挙げられる。
例えば、配列番号４に示す抗原ペプチドの機能的誘導体として、Ｎ末端より６番目のアミノ酸（Ｖａｌ）をＩｌｅに置換した配列番号２４に記載のアミノ酸配列で表されるペプチド、Ｎ末端より８番目のアミノ酸（Ｇｌｙ）をＡｌａに置換した配列番号４６に記載のアミノ酸配列で表されるペプチドが挙げられる。一方、配列番号５に示す抗原ペプチドの機能的誘導体として、Ｎ末端より６番目のアミノ酸（Ｖａｌ）をＩｌｅ、Ｍｅｔにそれぞれ置換した配列番号５３、５５に記載のアミノ酸配列で表されるペプチド、又はＮ末端より４番目のアミノ酸（Ｃｙｓ）をＣｙｓのチオール基と４，５−ジハイドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン（４，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｃｙｃｌｏｐｅｎｔｅｎ−１−ｏｎｅ：以下ＤＨＣＰと略す）との反応により得られる生成物に置換した配列番号３３に記載したペプチドが挙げられる。なお、Ｎ末端より４番目のアミノ酸は、Ｃｙｓのチオール基とＮ−エチルマレイミド（Ｎ−Ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ジチオスレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、４−ビニルピリジン（４−Ｖｉｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ）との反応により得られる生成物であってもよい。
また、上記機能的誘導体としては、側鎖の類似していないアミノ酸の置換であってもよく、例えば、配列番号１〜６いずれかに記載のアミノ酸配列で表されるペプチドのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が他のアミノ酸又はアミノ酸アナログ、例えば、Ａｌａに置換したアミノ酸配列で表されるペプチドのうち、ＨＬＡ−Ａ２４分子と結合能を有し、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体が配列番号１〜６いずれか記載のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を認識するＣＴＬに認識されるペプチドが挙げられる。
例えば、配列番号４に示す抗原ペプチドの機能的誘導体として、配列番号３９、４０、４２〜４５、４８いずれかに記載のアミノ酸配列で表されるペプチド、配列番号５に示す抗原ペプチドの機能的誘導体として、配列番号２６、２７、３０、３２に記載のアミノ酸配列で表されるペプチドが挙げられる。
なお、上記ペプチドのうちＡｌａに置換可能である位置のアミノ酸は、本来のアミノ酸と異なる更に他のアミノ酸、又はアミノ酸アナログに置換できる可能性がある。例えば、配列番号５記載のアミノ酸配列で表される抗原ペプチドの４番目のアミノ酸は、Ａｌａの他、Ａｓｐ、Ｇｌｕ等の酸性アミノ酸以外のアミノ酸若しくはアミノ酸アナログに置換することができる。例えば、配列番号５１又は５２記載のアミノ酸配列で表される、Ｓｅｒ又はＧｌｙで置換されたペプチドが挙げられる。
また、ジスルフィド結合等によるペプチドの２量体としては、システインのチオール基を介したジスルフィド結合による配列番号５記載のアミノ酸配列で表されるペプチドの２量体が例示される。
上記の他、例えば配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるペプチドの機能的誘導体には、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるペプチドを用いて誘導したＣＴＬに認識される、ＭＡＧＥ−３を始めとするＭＡＧＥファミリータンパク質由来のペプチドも含まれる。同様に配列番号２に記載されたアミノ酸配列で表されるペプチドの機能的誘導体には、配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるペプチドで誘導したＣＴＬに認識される、ＭＡＧＥ−３を始めとするＭＡＧＥファミリータンパク質由来のペプチドも含まれる。配列番号３に記載されたアミノ酸配列で表されるペプチドの機能的誘導体には、配列番号３記載のアミノ酸配列で表されるペプチドで誘導したＣＴＬに認識される、ＭＡＧＥ−１を始めとするＭＡＧＥファミリータンパク質由来のペプチドも含まれる。
配列番号４に記載されたアミノ酸配列からなるペプチドの機能的誘導体には、配列番号４記載のアミノ酸配列からなるペプチドを用いて誘導したＣＴＬに認識される、ＣＥＡ及び非特異的交差反応性抗原（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＮＣＡ）由来のペプチドも挙げられる。配列番号５に記載されたアミノ酸配列で表されるペプチドの機能的誘導体には、配列番号５記載のアミノ酸配列で表されるペプチドで誘導したＣＴＬに認識される、ＣＥＡ及びＮＣＡ由来のペプチドも挙げられる。
以下、本明細書において配列番号１又は２で表されるペプチド及びその機能的誘導体をＭＡＧＥ−３抗原ペプチド並びに配列番号３で表されるペプチド及びその機能的誘導体をＭＡＧＥ−１抗原ペプチドと総称する。同様に配列番号４又は５で表されるペプチド及びその機能的誘導体をＣＥＡ抗原ペプチド、配列番号６で表されるペプチド及びその機能的誘導体をＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原ペプチドと総称する。以下本明細書において使用する「抗原ペプチド」とは、特に断りの無い限りＭＡＧＥ−３抗原ペプチド、ＭＡＧＥ−１抗原ペプチド、ＣＥＡ抗原ペプチド及び／又はＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原ペプチドから任意に選択されたペプチドであることを示す。
抗原ペプチド及びその誘導体は、液相又は固相のアミノ酸のカップリングによる有機化学的方法により調製することができる。また、抗原ペプチドのアミノ酸配列をコードした核酸を用いた組換えＤＮＡ技術を利用しても調製することができる。組換えＤＮＡ技術によって得られたペプチドは必要に応じ適当な有機化学的又は生化学的手法等を用いることにより、修飾してもよい。
本発明のＣＴＬにおいて、ＭＡＧＥ−３抗原ペプチドを用い誘導されたＣＴＬはＨＬＡ−Ａ２４及びＭＡＧＥ−３共に陽性の腫瘍細胞を、ＭＡＧＥ−１抗原ペプチドを用い誘導されたＣＴＬはＨＬＡ−Ａ２４及びＭＡＧＥ−１共に陽性の腫瘍細胞を、ＣＥＡ抗原ペプチドを用い誘導されたＣＴＬはＨＬＡ−Ａ２４及びＣＥＡ共に陽性の腫瘍細胞を、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原ペプチドを用い誘導されたＣＴＬはＨＬＡ−Ａ２４及びＨＥＲ２／ｎｅｕ共に陽性の腫瘍細胞を、それぞれ選択的に傷害できることから腫瘍に対する細胞医薬として、また該ＣＴＬ感受性細胞の検出等に使用することができる。
本発明の第２の態様は第１の態様のＣＴＬを有効成分とする制がん剤に関する。該制がん剤は、該ＣＴＬを医薬的に許容される希釈剤に懸濁した形で提供される。なお、ここで言う希釈剤とは例えば該ＣＴＬの保存に適した培地、生理食塩水、又はリン酸緩衝生理食塩水である。培地としてはＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖなどの培地が一般的に挙げられる。また該制がん剤には医薬的に許容される担体が安定化の目的で添加されていてもよい。なおここで言う担体とはヒト血清アルブミン等である。該制がん剤には第１の態様のＣＴＬを、ＣＴＬ１種類当り１０4〜１０8個／ｍｌ、好ましくは５×１０5〜５×１０7個／ｍｌ含有させる。
上記制がん剤をヒトに投与する場合注射器で投与することができ、成人１人当りの投与量としては通常ＣＴＬ数が、ＣＴＬ１種類当り１０6〜１０10個となるようにする。なお上記範囲は目安でありこれに限定されるものではない。また有効成分であるＣＴＬは投与するヒト由来のものであるため、該制がん剤の毒性は特に認められない。
本発明の制がん剤は、有効成分として含有するＣＴＬが認識可能な抗原ペプチドを発現している腫瘍細胞を有するがん患者に投与されるが、例えば、ＭＡＧＥは当初メラノーマ患者の悪性腫瘍細胞から同定された抗原であるが、その後メラノーマ以外のがん患者の約１０〜５０％の頻度で発現していることが確認されている。ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２又はＭＡＧＥ−３の発現している腫瘍細胞としてはメラノーマのほか、例えば肺がん、乳がん、頭けい部がん、胃がん、食道がん、膀胱がん等に由来する腫瘍細胞が挙げられる〔Ｂ．ゴーグラー（B.Gaugler）ら、ジャーナル  オブ  イクスペリメンタル  オブ  メディスン、第１７９巻、第９２１〜９３０頁（１９９４）〕。したがって、例えば、ＭＡＧＥ−３抗原ペプチドを用い誘導された本発明の第１の態様のＣＴＬを有効成分として含有する制がん剤はＨＬＡ−Ａ２４及びＭＡＧＥ−３共に陽性の腫瘍細胞よりなる上記がんを有する患者の治療に有用である。
なお、上記制がん剤を用いる場合他の制がん剤と併用してもよいが、免疫抑制的に働く制がん剤の併用は好ましくない。
本発明の第３の態様は、第１の態様のＣＴＬの誘導方法に関する。該ＣＴＬは、配列番号１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを使用することにより誘導することができる。
イン  ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で該ＣＴＬを誘導する場合、例えばＨＬＡ−Ａ２４を発現している生体よりの体外摘出試料を用い誘導することができる。本明細書における体外摘出試料とは、血液のほか、手術などにより摘出したリンパ節、脾臓、その他各種臓器が包含され、これらの試料に存在するリンパ球や浸潤リンパ球細胞が好適に使用される。
例えば血液を用いる場合、ＨＬＡ−Ａ２４陽性のヒト血液より調製した末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ；以下、ＰＢＭＣと略す）より得られるリンパ球に繰り返し抗原刺激を与えることによりＣＴＬを誘導することができる。抗原刺激は、例えばリンパ球を調製した同一血液より調製した抗原提示能を有する細胞に抗原ペプチドをＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体として細胞表面に提示した抗原提示細胞等を用いることにより実施できる。誘導されたＣＴＬは、更に抗ＣＤ−３抗体等による刺激や抗原ペプチド存在下各種刺激を加え増殖させることができる。例えばＩＬ−７存在下、ＰＢＭＣより調製したリンパ球１に対し抗原提示細胞を０．０１〜１の割合で混合することによりＣＴＬ誘導を実施することができる。別の態様として、ＩＬ−７及びキーホール  リムペット  ヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；ＫＬＨ）存在下、ＰＢＭＣに抗原ペプチドを細胞培養液中、抗原ペプチド１種類当り１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ添加することによりＣＴＬ誘導を実施することができる。
誘導されたＣＴＬは、クローン化することにより安定した細胞傷害性を有するリンパ球として維持することもできる。例えば、誘導されたＣＴＬに抗原、各種サイトカイン、抗ＣＤ３抗体刺激を与えることにより増殖させることができる。
誘導された特異的ＣＴＬは、ＣＴＬを誘導した抗原ペプチドと放射性物質等で標識した標的細胞に対する傷害性、放射能の取り込みによって測定できるＣＴＬ増殖の抗原特異的な増加若しくはＣＴＬや標的細胞より抗原特異的に遊離されるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ等のサイトカイン量を測定することにより検出することができる。その他蛍光色素等によって標識された抗原ペプチドや複合体の使用によって直接確認することもできる。この場合、例えばＣＴＬをＣＴＬ特異的抗体とカップリングさせた第１蛍光マーカーと接触させてから第２蛍光マーカーとカップリングさせた抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体を接触させ、そして二重標識細胞の存在をＦＡＣＳ（fluorescence−activated cell sorting）分析によって行ことができる。
一方、イン  ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）におけるＣＴＬの誘導は、例えば抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体として細胞表面に提示した抗原提示細胞を生体に投与することにより実施することができる。ヒトに投与する場合、成人１人当りの投与量は通常１０4〜１０9個である。別法として、抗原ペプチドを適当なアジュバントと混合し生体に投与することにより、該ペプチドに特異的なＣＴＬを誘導することもできる。アジュバントとしては、▲１▼フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジュバント、▲２▼フロイント不完全アジュバント、▲３▼水酸化アルミニウム、みょうばん等の無機物ゲル、▲４▼リゾレシチン、ジメチルオクタデシルアンモニウムブロミド等の界面活性剤、▲５▼硫酸デキストラン、ポリＩＣ等のポリアニオン、▲６▼ムラミルペプチド、タフトシン等のペプチド、▲７▼リビ（Ｒｉｂｉ）社製のモノホスホリルリピド（monophosphoryl lipid；ＭＰＬ）Ａ等があるが、特に限定されない。生体におけるＣＴＬの誘導には抗原ペプチドとアジュバントの混合物のほか、ＭＨＣクラスII拘束性のヘルパーＴ細胞抗原ペプチドを混合し投与してもよい。なお、該抗原ペプチドは生体内における安定化のため適当なリンカーを介して高級脂肪酸やヘルパーＴ細胞抗原ペプチドと共有結合させ投与してもよい。ヒトに投与する場合、成人１人当りの投与量は抗原ペプチド濃度として、抗原ペプチド１種類当り０．１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、更に好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇである。
ＣＴＬを誘導するための抗原ペプチドによる刺激のために、抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を用いることもできる。この場合ＨＬＡ−Ａ２４分子は天然のＨＬＡ−Ａ２４分子である必要はなく、抗原ペプチドとの結合性を本質的に保存している断片であってもよい。これらの断片は、例えば、天然のＨＬＡ−Ａ２４分子のタンパク分解又は組換えＤＮＡ技術により調製することができる。この複合体はβ2−ミクログロブリン、更に複合体を認識する抗体を共存させて安定化させることができる。
本発明の第４の態様は、配列番号１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを有効成分としたＣＴＬ誘導剤に関する。ＣＴＬ誘導剤は、抗原ペプチドを単独又は他の分子（ヘルパーＴ細胞抗原ペプチド及び／又はアジュバント）との混合物として生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水に懸濁した形で供給される。該抗原ペプチドは、高級脂肪酸やヘルパーＴ細胞抗原ペプチドとの共有結合体あるいはＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体としてもよい。該誘導剤には抗原ペプチドを、抗原ペプチド１種類当り０．０１〜１００重量％、好ましくは０．１〜９５重量％含有させる。
該ＣＴＬ誘導剤は、イン  ビトロで本発明のＣＴＬを増殖させるための培地への添加物、Ｔリンパ球増殖活性、遅延型皮膚反応を指標とした免疫感作状態の診断などに利用することができる。例えば培地への添加物として使用する場合、使用量は培地中のペプチド濃度として、抗原ペプチド１種類当り１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌである。
本発明の第５の態様は、配列番号１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを有効成分とした制がん剤に関する。該制がん剤は、１）抗原ペプチドを単独、２）抗原ペプチドと医薬的に許容される担体及び／又は希釈剤との混合物、又は３）更に必要ならば上記１）若しくは２）に補助剤を加えた形で提供される。なおここで言う担体とは例えば、ヒト血清アルブミンであり、また希釈剤とは例えばリン酸緩衝液、蒸留水、生理食塩水等である。また補助剤とは薬学的に許容される上記アジュバント等が挙げられる。該制がん剤をヒトに投与する場合、注射器で投与することもできるし、噴霧等の方法で粘膜からの経皮吸収等で投与してもよい。該制がん剤には抗原ペプチドを、抗原ペプチド１種類当り０．０１〜１００重量％、好ましくは０．１〜９５重量％含有させる。成人１人当りの投与量はペプチド濃度として、抗原ペプチド１種類当り０．１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、更に好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇである。なおヒトに投与した場合、該ペプチドの毒性は特に認められない。
該制がん剤を使用する場合、他の制がん剤と併用してもよいが免疫抑制的に働く制がん剤の併用は好ましくない。
本発明の第６の態様は、配列番号１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体をその細胞表面に提示する抗原提示細胞に関する。以下、本明細書における「抗原提示細胞」とは、特に断りの無い限りＭＡＧＥ−３抗原ペプチド、ＭＡＧＥ−１抗原ペプチド、ＣＥＡ抗原ペプチド及び／又はＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原ペプチドから選択される少なくとも１つの抗原ペプチドを提示した抗原提示細胞を示す。該抗原提示細胞は、本発明のＣＴＬの誘導に用いることができる。
該抗原提示細胞は、抗原提示能を有する細胞を用いることにより調製することができる。抗原提示能を有する細胞には、例えば抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体をその細胞表面に提示することが可能な、マクロファージやＢ細胞、樹状細胞（ＤＣ：dendritic cells）を始めとする白血球細胞が挙げられる。ＤＣは、細胞当り抗原提示量が多く、また抗原提示に必要な細胞表面分子〔ＣＤ８０、ＣＤ８６等のコスティミュラトリー・シグナル（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌ）分子等〕の発現量も高いため抗原提示能を有する細胞として特に好適である。上記抗原提示能を有する細胞は、本明細書における体外摘出試料より調製することができる。例えばＤＣは、１）ＰＢＭＣよりいくつかの細胞表面マーカー等を基に単離精製してくる、２）単球よりGM-CSFとIL-4により誘導してくる、３）ＣＤ−３４陽性細胞よりGM-CSF、TNF-α、SCF等のサイトカインで誘導してくる等いずれかの方法により調製することができる。
抗原提示能を有する細胞表面に抗原ペプチドを提示させるには、例えば上記抗原提示能を有する細胞と抗原ペプチドの少なくとも一つを混合後必要に応じて過剰量を洗浄し、ＨＬＡ−Ａ２４分子上に抗原ペプチドを負荷させる方法が挙げられる。なお、上記抗原提示能を有する細胞の調製法法における１）の方法で調製した細胞のように、既にＨＬＡ−Ａ２４分子上に本発明とは無関係の抗原ペプチドを提示していると考えられる細胞は、抗原ペプチドを負荷する前に酸処理などを行うことにより、ＨＬＡ−Ａ２４分子上に存在する本発明のＣＴＬを誘導出来ないペプチドを除去してもよい。該抗原提示能を有する細胞は単一の抗原ペプチドが負荷された細胞のほか、細胞１個当り数種類の抗原ペプチドが負荷されていてもよい。また、別法として、Ｂ細胞やＣＤ３４陽性細胞に対して上記抗原ペプチドを提示させることのできる発現ベクターにより該細胞を形質転換する方法が挙げられる。このようなベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＱＭｎｅｏ、ｐＣＥＰ４等の市販のプラスミドに、組換えＤＮＡ技術によって細胞表面に提示させたい抗原ペプチドの少なくとも１つをコードする遺伝子を組込んだ、発現用プラスミドベクターが挙げられる。更に該発現ベクターは、細胞表面に提示させたい抗原ペプチドの両端に細胞内で効率良くプロテアーゼの分解を受けるように適当なアミノ酸配列をコードする遺伝子が付加されていてもよい。更に、レトロウィルスベクターやアデノウィルスベクターも好適に利用される。
抗原提示細胞は、非増殖性とすることが好ましい。細胞を非増殖性とするためには、Ｘ線等の放射線照射又はマイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）等の薬剤による処理を行えばよい。
本発明の第７の態様は、第６の態様の抗原提示細胞を有効成分として含有するＣＴＬの誘導剤に関する。該誘導剤は、該抗原提示細胞を、細胞の保存に適した培地、生理食塩水、又はリン酸緩衝生理食塩水に懸濁した形で供給される。培地としてはＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ１０などの培地が一般的である。また該培地又は緩衝液には血清アルブミン等を安定化の目的で添加してもよい。該誘導剤には抗原提示細胞を、抗原提示細胞１種類当り１０3〜５×１０6個／ｍｌ、好ましくは１０4〜１０6個／ｍｌ含有させる。
該ＣＴＬの誘導剤は、イン  ビトロで本発明のＣＴＬを増殖させるための培地への添加物としての利用のほか、Ｔリンパ球増殖活性を指標とした免疫感作状態の診断などにも利用することができる。例えば培地への添加物として使用する場合、ＣＴＬへ誘導するリンパ球１に対し通常０．０１〜１の割合で用いる。
本発明の第８の態様は、第６の態様の抗原提示細胞を有効成分として含有する制がん剤である。該制がん剤は、該抗原提示細胞を医薬的に許容される希釈剤に懸濁した形で提供される。ここで言う希釈剤とは、細胞の保存に適した培地、リン酸緩衝液、生理食塩水等である。培地としてはＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ１０などの培地が一般的に挙げられる。また、該制がん剤には医薬的に許容される担体を安定化のために添加してもよい。ここで言う担体とは、ヒト血清アルブミン等である。該制がん剤には抗原提示細胞を、抗原提示細胞１種類当り１０5〜１０8個／ｍｌ、好ましくは５×１０5〜５×１０7個／ｍｌ含有させる。該制がん剤をヒトに投与する場合注射器で投与することができ、成人１人当りの投与量は抗原提示細胞数として、抗原提示細胞１種類当り通常１０4〜１０9個である。なお、上記範囲はあくまで目安であり、これに限定されるものではない。また、有効成分である抗原提示細胞は投与するヒト由来のものであるため、該制がん剤の毒性は特に認められない。
該制がん剤を使用する場合、他の制がん剤と併用してもよいが免疫抑制的に働く制がん剤の併用は好ましくない。
本発明の第９の態様は、第１の態様のＣＴＬを被検細胞と接触させた際に生じる変化を指標とした該ＣＴＬの感受性細胞の検出方法に関する。ＣＴＬと被検細胞中の感受性細胞との接触により生じる変化としては、例えばＣＴＬによる標的細胞溶解、サイトカイン遊離、又はＣＴＬの増殖が挙げられる。標的細胞溶解の検出は、例えばラジオアイソトープや蛍光色素により被検細胞を標識後ＣＴＬと混合した際に、被検細胞より遊離されるラジオアイソトープ量や蛍光色素量を測定することにより実施できる。サイトカイン遊離の検出は、ＣＴＬ又は被検細胞からのGM-CSF、TNF、IFN-γ等の遊離量を測定することにより実施することができる。またＣＴＬの増殖は、3Ｈ−チミジンの細胞への取り込み量の測定や、顕微鏡観察などによるＣＴＬ細胞数の測定などにより実施することが出来る。この変化により、被検細胞中に存在するＨＬＡ−Ａ２４及びＭＡＧＥ−３共に陽性若しくはＨＬＡ−Ａ２４及びＭＡＧＥ−３関連抗原共に陽性の腫瘍細胞、ＨＬＡ−Ａ２４及びＭＡＧＥ−１共に陽性若しくはＨＬＡ−Ａ２４及びＭＡＧＥ−１関連抗原共に陽性の腫瘍細胞、ＨＬＡ−Ａ２４及びＣＥＡ共に陽性若しくはＨＬＡ−Ａ２４及びＣＥＡ関連抗原共に陽性の腫瘍細胞、及び／又はＨＬＡ−Ａ２４及びＨＥＲ２／ｎｅｕ共に陽性若しくはＨＬＡ−Ａ２４及びＨＥＲ２／ｎｅｕ関連抗原共に陽性の腫瘍細胞を検出することが可能である。
本発明の第１０の態様は、第１の態様のＣＴＬを有効成分として含有する、第１の態様のＣＴＬに感受性の細胞の検出剤に関する。該検出剤は、該ＣＴＬの保存に適した培地、生理食塩水、又はリン酸緩衝生理食塩水に懸濁した形で供給される。培地としてはＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖ又はＸ−ＶＩＶＯ１０などの培地が一般的である。また該培地又は緩衝液には血清アルブミン等をＣＴＬ安定化の目的で添加してもよい。該検出剤には第１の態様のＣＴＬを、ＣＴＬ１種類当り１０4〜１０8個／ｍｌ含有させる。
該検出剤は、被検細胞中における本発明のＣＴＬに感受性細胞の検出の他、被検細胞に発現するＨＬＡがＨＬＡ−Ａ２４であるか同定するＨＬＡタイピングにも用いることが出来る。
本発明の第１１の態様は、ＨＬＡ拘束性抗原ペプチドから選択される少なくとも一つの抗原ペプチド存在下、該抗原ペプチドとＨＬＡ分子との複合体を認識可能なＣＴＬを被検細胞と接触させることを特徴とするＨＬＡ分子の検出方法に関する。
例えば、被検細胞表面上のＨＬＡ−Ａ２４分子は、第１の態様のＣＴＬと被検細胞を接触させることによって生じる変化を指標に検出することが出来る。ＣＴＬと被検細胞の接触により生じる変化としては、例えばＣＴＬによる標的細胞溶解、サイトカイン遊離、又はＣＴＬの増殖が挙げられる。標的細胞溶解の検出は、例えばラジオアイソトープや蛍光色素により被検細胞を標識後ＣＴＬと混合した際に、被検細胞より遊離されるラジオアイソトープ量や蛍光色素量を測定することにより実施できる。サイトカイン遊離の検出は、ＣＴＬ又は被検細胞からのGM-CSF、TNF、IFN-γ等の遊離量を測定することにより実施することができる。またＣＴＬの増殖は、3Ｈ−チミジンの細胞への取り込み量の測定や、顕微鏡観察などによるＣＴＬ細胞数の測定などにより実施することが出来る。
上記測定値によりＨＬＡ−Ａ２４分子の発現の有無の検出のみならず、被検細胞上のＨＬＡ−Ａ２４分子の発現量を測定することも可能である。なお被検細胞にＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−１、ＣＥＡ又はＨＥＲ２／ｎｅｕが発現しているか不明の場合には以下の方法によりＨＬＡ−Ａ２４分子を検出することが出来る。本方法においては、反応液中に被検細胞及び最終０．０１〜５０μｇ／ｍｌとなるよう配列番号１〜６いずれか記載のアミノ酸配列からなる抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも１つの抗原ペプチド、更に該抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を認識する第１の態様のＣＴＬを共存させ、ＣＴＬと被検細胞を接触させればよい。
本発明により、補体活性化工程が必須であった従来の抗ＨＬＡ抗体を用いたＨＬＡ分子の検出方法では検出不可能であった腫瘍細胞のＨＬＡ−Ａ２４分子の検出が可能となる。
なお、本方法において使用する抗原ペプチドは、配列番号１〜６いずれかに記載のアミノ酸配列で表されるペプチド又はその機能的誘導体から選択される少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドに特に限定されなく、種々のＨＬＡ拘束性抗原ペプチドを用いることにより、種々のＨＬＡ分子の検出を行なうことが出来る。例えば、ＨＬＡ−Ａ２拘束性抗原ペプチドを用いることによりＨＬＡ−Ａ２分子の検出を行なうことも出来る。ＨＬＡ−Ａ２拘束性抗原ペプチドとしては、例えば、配列番号３７で表されるＭＡＧＥ−３由来のペプチド、配列番号３８で表されるインフルエンザマトリックスペプチド由来のペプチドが挙げられる。
なお、ＨＬＡの各タイプには更にサブタイプが存在する。例えば、ＨＬＡ−Ａ２は、Ａ*０２０１、Ａ*０２０６、Ａ*０２０７を始めとする１０種類以上のサブタイプに分類される。ＨＬＡ拘束性抗原ペプチドは、各サブタイプ間でも異なるため、例えば、制がん剤などとしてＣＴＬを利用する時にはＨＬＡ分子のサブタイプまで決定することが重要である。抗ＨＬＡ抗体を用いたＨＬＡ分子の検出方法（タイピング）では不可能であったサブタイプの分類が本方法では可能である。例えば、配列番号３７記載のアミノ酸配列を有するペプチドを用いると、Ａ*０２０１拘束性のＣＴＬを誘導することが出来、このＣＴＬと該ペプチドを組み合わせて用いることにより、被検細胞のＨＬＡ−Ａ２分子のサブタイプまで決定することが出来る。なお、本方法は、被検細胞より抽出したＤＮＡを用いるＤＮＡタイピング法より実際の細胞表面上で発現しているＨＬＡ分子を検出出来る点で優れている。
実施例
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１  ＭＡＧＥ−３抗原ペプチド特異的ＣＴＬの調製（１）
本実施例におけるＣＴＬは、スタフィロコッカス  アウレウス  コワン−Ｉ（Staphylococcus aureus Cowan-I；ＳＡＣ−Ｉ）を用いた誘導法により調製した。
（１）ＣＴＬ誘導用ペプチドの選択及び合成
３１４アミノ酸よりなるＭＡＧＥ−３タンパク質のアミノ酸配列について、ＨＬＡ−Ａ２４結合性モチーフ構造を有する配列（Ｎ末端より２番目がTyr、Phe、Trp、Metのいずれかのアミノ酸であり、Ｃ末端がLeu、Ile、Phe、Trpのいずれかのアミノ酸であるペプチド）を中心に、その他の位置のアミノ酸の種類も考慮して検索した。その結果、ＭＡＧＥ−３抗原ペプチドの候補ペプチドとして表１に示した７個のペプチドが存在することが明らかとなった。
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なお、表１において配列番号の項の番号は、各ペプチドのアミノ酸配列を示した配列表の配列番号を示す。またＭＡＧＥ−３中の位置の項の番号は、ＭＡＧＥ−３タンパクのＮ末端からのアミノ酸数を示す。また名称の項の記号は、本発明者らが命名したペプチドの名称を示す。
表１に示したＭＡ３−１〜ＭＡ３−７の７種のペプチドをペプチド合成機（ＰＳＳＭ−８：島津製作所製）を用い、固相Ｆｍｏｃ法にて作製した。
（２）ＰＢＭＣの調製
ＨＬＡ−Ａ２４を保有する健常人から成分採血により採血を行い、白血球画分を集め更に以下の分離方法に従ってＰＢＭＣを分離した。すなわち、採血液をＲＰＭＩ１６４０培地で約２倍希釈後、フィコール−パック（Ficoll-Paque）分離液（ファルマシア社製）上に重層し、５００×ｇで２０分間室温で遠心した。中間層のＰＢＭＣをピペットで回収、洗浄して９０％牛胎児血清（FCS、インターゲン社製）と１０％ジメチルスルホキシド（シグマ社製）からなる保存液に懸濁した状態で液体窒素中に保存した。
（３）エフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ）の調製
下記の方法でＭＡ３−１、ＭＡ３−２、ＭＡ３−４、ＭＡ３−６、ＭＡ３−７いずれかのペプチドで個別に刺激された５種類のエフェクター細胞を調製した。
（２）で調製した保存ＰＢＭＣを融解後、細胞濃度が４×１０6個／ｍｌとなるように５Ｈ−ＲＰＭＩに懸濁した。なお５Ｈ−ＲＰＭＩは、ＲＰＭＩ１６４０培地にヒトＡＢ型血清（アーバインサイエンス社製）を終濃度５％（ｖ／ｖ）、非必須アミノ酸（ギブコＢＲＬ社製）を終濃度０．１ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム（ギブコＢＲＬ社製）を終濃度１ｍＭ、L-グルタミン（ギブコＢＲＬ社製）を終濃度４ｍＭ、硫酸ゲンタマイシン（アーバインサイエンス社製）を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように加えた培地である。細胞懸濁液２５ｍｌを抗ＣＤ４抗体を結合したＴ−１５０フラスコ（AIS MicroCELLector、アプライドイミューンサイエンス社製）に入れ１時間室温にて反応後、非接着細胞を回収し２×１０6個／ｍｌとなるように５Ｈ−ＲＰＭＩに懸濁した。この懸濁液を、ＭＡ３−１、ＭＡ３−２、ＭＡ３−４、ＭＡ３−６、ＭＡ３−７いずれかのペプチドを用い後記実施例８の（１）の記載の方法により調製したＳＡＣ−１処理による５種類の初回刺激用抗原提示細胞と個別に等量混合し、ＩＬ−７（ジェンザイム社製）を最終濃度１５ｎｇ／ｍｌとなるように加え、２４ウェル培養プレートの各ウェルに２ｍｌずつ分注し、３７℃のＣＯ2インキュベーター内で培養した。翌日、終濃度１０ｎｇ／ｍｌとなるようにＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ社製）を加えた。６日後に培養上清を半量除き、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７を含む５Ｈ−ＲＰＭＩを等量加えた。
更に３日間培養を行った後細胞を遠心により回収し、細胞濃度が２×１０6個／ｍｌとなるように５Ｈ−ＲＰＭＩに懸濁した。この懸濁液を、ＭＡ３−１、ＭＡ３−２、ＭＡ３−４、ＭＡ３−６、ＭＡ３−７いずれかのペプチドを用い後記実施例８の（２）のように調製した抗原提示細胞を含むプレートに１ｍｌ／ウェルずつ加え同一ペプチドによる再刺激を施した。翌日IL-10を終濃度１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加し、更に２日置きに、培養上清を半量除き、２０ＩＵ／ｍｌのｒＩＬ−２（塩野義製薬社製）を含む５Ｈ−ＲＰＭＩを等量加え、１週間ＣＯ2インキュベーター内で培養する。同様の再刺激を更に３回行った後細胞を回収し、エフェクター細胞とした。
（４）ＣＴＬ標的細胞の調製
細胞傷害活性測定のための標的細胞として、ＨＬＡ−Ａ２４を発現しているＥＢＶトランスフォームＢ細胞であるＴＩＳＩ（ＷＳＮＯ９０４２）を用いた。まずＴＩＳＩ細胞を測定前日に（１）で調製したＭＡ３−１、ＭＡ３−２、ＭＡ３−４、ＭＡ３−６、ＭＡ３−７いずれかのペプチドを個別に１０μｇ／ｍｌを含む５種類の培地〔以下、該培地で培養したＴＩＳＩをＴＩＳＩ（＋）と表記〕、又はペプチドを含まない培地〔以下、該培地で培養したＴＩＳＩをＴＩＳＩ（−）と表記〕中で一晩培養した。測定当日、各５×１０6個の、５種類のＴＩＳＩ（＋）及びＴＩＳＩ（−）を各々２００μＣｉのＮａ251ＣｒＯ4溶液中に３７℃で１時間混和し、その後１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培養液で洗浄し51Ｃｒ標識した標識標的細胞を調製した。
（５）ＣＴＬによる細胞傷害活性の測定
（３）のエフェクター細胞を５×１０5〜１×１０6個／ｍｌとなるように５Ｈ−ＲＰＭＩで希釈後、９６ウェル培養プレートの各ウェルに１００μl／ウェルずつ分注しておき、これに（４）で調製した１×１０4個の51Ｃｒ標識標的細胞及び３×１０5個のＫ５６２細胞を含む１００μlの細胞懸濁液を加えた。なおＫ５６２細胞は混入するＮＫ細胞による非特異的傷害活性を除くために用いた。
上記細胞懸濁液を４００×ｇで１分間遠心後、３７℃のＣＯ2インキュベーター中に５時間放置した。その後各ウェルの培養液上清１００μｌを採取しガンマカウンターを用いて、遊離された51Ｃｒ量を測定した。
特異的細胞傷害活性は以下の計算式（数１）に従って算出した。
特異的細胞傷害活性（％）＝〔（各ウェルの測定値−最小放出値）
／（最大放出値−最小放出値）〕×１００    （数１）
上式（数１）において、最小放出値は標的細胞及びＫ５６２細胞のみ入っているウェルの51Ｃｒ量であり、標的細胞からの51Ｃｒの自然遊離量を示す。また、最大放出値は、標的細胞に界面活性剤トリトンＸ−１００を加えて細胞を破壊した際の51Ｃｒ遊離量を示している。結果を表２に示す。
0003840268.tif 000003
表２においてＥ／Ｔは標的細胞に対するエフェクター細胞の比を示す。
その結果、ＭＡ３−２で誘導して得られたエフェクター細胞がＭＡ３−２ペプチド添加したＴＩＳＩ（＋）に対して抗原ペプチド特異的な細胞傷害性を示した。
実施例２  ＭＡＧＥ−３抗原ペプチド特異的ＣＴＬの調製（２）
本実施例におけるＣＴＬは、ＫＬＨを用いた誘導法により調製した。なお抗原ペプチドは、実施例１の（１）で調製したＭＡ３−１、ＭＡ３−２、ＭＡ３−４、ＭＡ３−６、ＭＡ３−７の５種のペプチドを使用した。
（１）ＰＢＭＣの調製
ＨＬＡ−Ａ２４を保有している健常人から採血を行い、以下の分離方法に従ってＰＢＭＣを分離した。すなわち、採血液を同量のＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させ、フィコール−パック分離液上に重層し、５００×ｇで２５分間室温で遠心した。中間層のＰＢＭＣをピペットで回収し、１５ｍｌ遠心管に入れ、ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄した。次に、細胞最終濃度が４×１０6個／ｍｌとなるように５Ｈ−ＲＰＭＩに懸濁した。
（２）エフェクター細胞の調製
下記の方法によりＭＡ３−１、ＭＡ３−２、ＭＡ３−４、ＭＡ３−６、ＭＡ３−７いずれかのペプチドで個別に刺激された５種類のエフェクター細胞を調製した。
（１）で調製したＰＢＭＣにペプチド２０μg／mlを加えた５Ｈ−ＲＰＭＩを等量混合した後、３７℃のＣＯ2インキュベーター内で２〜３時間放置した。これにＫＬＨ（カルビオケム社製）溶液及びＩＬ−７溶液をそれぞれ最終濃度５μｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。該細胞懸濁液を２４ウェル培養プレートの２ウェルに２ｍｌずつ分注し、３７℃のＣＯ2インキュベーター内で培養した。３日後、１０００  ＩＵ／ｍｌのｒＩＬ−２を含む５Ｈ−ＲＰＭＩを６０μｌ（最終ｒＩＬ−２濃度３０ＩＵ／ｍｌ）加えた。
１週間培養後、細胞を遠心により回収し、細胞濃度が５×１０5個／ｍｌとなるように５Ｈ−ＲＰＭＩに懸濁する。この懸濁液を、ＭＡ３−１、ＭＡ３−２、ＭＡ３−４、ＭＡ３−６、ＭＡ３−７いずれかのペプチドを用い後記実施例８の（４）記載の方法により調製した抗原提示細胞のいずれか１種を含む５種類のプレートに１ｍｌ／ウェルずつ加え、再刺激した。翌日ｒＩＬ−２溶液（１０００ＩＵ／ｍｌ）を６０μl加え、１週間ＣＯ2インキュベーター内で培養した。同様の再刺激を更に４回行った後、細胞を回収し、エフェクター細胞とした。
上記の方法で得られた５種のエフェクター細胞を４×１０6個／ｍｌとなるように５Ｈ−ＲＰＭＩに懸濁した。
（３）ＣＴＬ標的細胞の調製
標識標的細胞として実施例１の（４）と同様に調製したＴＩＳＩ（−）、５種類のＴＩＳＩ（＋）のほかにＭＡＧＥ−３及びＨＬＡ−Ａ２４共に陽性であるＷｉＤｒ（大腸がん細胞株）、ＴＥ１１（食道がん細胞株）、ＭＲＫｎｕ１（乳がん細胞株）を使用した。更に、ＭＡＧＥ−３陽性、ＨＬＡ−Ａ２４陰性のがん細胞株であるKATO-III（胃がん細胞株）も使用した。WiDr、TE11、MRKnu1、及びKATO-IIIは各５×１０6個の細胞を200μCiのＮａ251ＣｒＯ4の溶液中に３７℃で１時間混和し、その後１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培養液で洗浄することにより51Ｃｒ標識した。
（４）ＣＴＬによる細胞傷害活性の測定
（２）で調製したエフェクター細胞及び（３）で調製した標的細胞を用い細胞傷害活性を測定した。標的細胞としてＴＩＳＩ（−）及びＴＩＳＩ（＋）を用いた場合は実施例１の（５）と同様の方法で測定した。なおエフェクター細胞と標的細胞の反応時間は４．５時間とした。他の４種類の標識がん細胞株を標的細胞として用いた場合は、９６ウェル培養プレートの各ウェルに前記（２）のエフェクター細胞懸濁液を１００μｌ／ウェル（４×１０5個／ウェル）分注しておき、これに５×１０3個の51Ｃｒ標識標的細胞及び１．５×１０5個のＫ５６２細胞を含む１００μlの細胞懸濁液を加えた。４００×ｇで１分間遠心後、３７℃のＣＯ2インキュベーター中に４．５時間放置した。その後各ウェルの培養液上清１００μlを採取しガンマカウンターを用いて、遊離された51Ｃｒ量を測定した。特異的細胞傷害活性は実施例１の（５）と同様の計算により求めた。結果を表３に示す。
0003840268.tif 000004
なお表３においてＥ／Ｔは標的細胞に対するエフェクター細胞の比を、ＮＤは未測定であることを示す。
更に、ＭＡ３−２あるいはＭＡ３−４により誘導したエフェクター細胞のＴＩＳＩ（−）及びＴＩＳＩ（＋）に対する各種Ｅ／Ｔでの特異的細胞傷害性曲線を図１及び図２に、WiDr、TE11、MRKnu1細胞に対する各種Ｅ／Ｔでの特異的細胞傷害性曲線を図３及び図４に示す。
図１はＭＡ３−２で誘導したエフェクター細胞を、図２はＭＡ３−４で誘導したエフェクター細胞を用いた結果を示す。また四角印（□）は標的細胞としてＴＩＳＩ（＋）を、ひし形印（◇）はＴＩＳＩ（−）を用いた結果を示す。
図３はＭＡ３−２で誘導したエフェクター細胞を、図４はＭＡ３−４で誘導したエフェクター細胞を用いた結果を示す。また四角印（□）は標的細胞としてＷｉＤｒを、ひし形印（◇）はＴＥ−１１を、白丸印（○）はＭＲＫｎｕ１を用いた結果を示す。
図３及び図４に示された細胞傷害活性は、反応系にクラスＩ抗体（Ｗ６／３２）を共存させることによって阻害された。また、ＭＡ３−２あるいはＭＡ３−４により誘導されたエフェクター細胞はＭＡＧＥ−３陽性及びＨＬＡ−Ａ２４陰性のがん細胞株であるＫＡＴＯ−ＩＩＩには細胞傷害性を示さなかった。
以上の結果より、ＭＡ３−２、ＭＡ３−４ペプチドにより誘導したエフェクター細胞は抗原ペプチド特異的な細胞傷害性を示すと共に、ＨＬＡ−Ａ２４及びＭＡＧＥ−３共に陽性のがん細胞株に対して細胞傷害性を示すＣＴＬであった。
実施例３  ＭＡＧＥ−１抗原ペプチド特異的ＣＴＬの調製
本実施例におけるＣＴＬはＫＬＨを用いたＣＴＬ誘導法により調製した。
（１）ＣＴＬ誘導用ペプチドの選択及び合成
３０９アミノ酸よりなるＭＡＧＥ−１タンパク質のアミノ酸配列〔モレキュラー  イムノロジー（Molecular Immunology）、第３１巻、第１４２３〜１４３０頁（１９９４）〕について、実施例１の（１）と同様にＨＬＡ−Ａ２４結合性モチーフ構造を有する配列を中心に、その他の位置のアミノ酸の種類も考慮して検索した。その結果、表４に示した５個のペプチドを候補抗原ペプチドとして選択した。
0003840268.tif 000005
なお、表４において配列番号の項の番号は、各ペプチドのアミノ酸配列を示した配列表の配列番号を示す。またＭＡＧＥ−１中の位置の項の番号は、ＭＡＧＥ−１タンパク質のＮ末端からのアミノ酸数を示す。また名称の項の記号は、本発明者らが命名したペプチドの名称を示す。
表４に示したＭＡ１−１〜ＭＡ１−５の５種のペプチドをペプチド合成機を用いて作製した。
（２）ＫＬＨを用いた誘導法によるＭＡＧＥ−１抗原ペプチド特異的ＣＴＬの調製
実施例３の（１）で調製したＭＡ１−１、ＭＡ１−２、ＭＡ１−３、ＭＡ１−４、ＭＡ１−５のいずれかのペプチド、及びＭＡ１−１、ＭＡ１−２、ＭＡ１−３、ＭＡ１−４、ＭＡ１−５のいずれかのペプチドを用い後記実施例８の（４）記載の方法により調製した抗原提示細胞を用いて実施例２の（２）と同様の方法でエフェクター細胞を調製し、各種標的細胞に対する細胞傷害活性を測定した。使用した標的細胞はＴＩＳＩ（−）、ＭＡ１−１、ＭＡ１−２、ＭＡ１−３、ＭＡ１−４、ＭＡ１−５のいずれかのペプチド添加培地で培養した５種類のＴＩＳ１（＋）の他にＭＡＧＥ−１及びＨＬＡ−Ａ２４共に陽性であるＮＵＧＣ−３（胃がん細胞株）、ＴＥ−１１、ＭＡＧＥ−１陽性及びＨＬＡ−Ａ２４陰性であるＫＡＴＯ−III、ＭＡＧＥ−１及びＨＬＡ−Ａ２４共に陰性であるＲａｊｉ（リンフォーマ）である。ＭＡ１−１により誘導したエフェクター細胞の各種標的細胞に対する各種Ｅ／Ｔでの特異的細胞傷害性曲線を図５に示す。
図５において黒丸印（●）は標的細胞としてＮＵＧＣ−３を、黒四角（■）印はＴＥ１１を、逆三角印（▽）はＫＡＴＯＩＩＩを、ひし形印（◇）はＲａｊｉを、三角印（△）はＴＩＳＩ（−）を用いた結果を示す。
更にＭＡ１−１添加培地を用い得られたＴＩＳＩ（＋）、図５に示されたＮＵＧＣ−３細胞株及びＴＥ−１１細胞株に対する細胞傷害活性は、反応系にクラスＩ抗体（Ｗ６／３２）を共存させることによって阻害された。
したがってＭＡ１−１で誘導したエフェクター細胞はＨＬＡ−Ａ２４及びＭＡＧＥ−１共に陽性のがん細胞株に対するＣＴＬであることが明らかとなった。
実施例４  ＣＥＡ抗原ペプチド特異的ＣＴＬの調製（１）
本実施例におけるＣＴＬは、実施例１と同様にＳＡＣ−１を用いるＣＴＬ誘導法により調製した。
（１）ＣＴＬ誘導用ペプチドの選択及び合成
４６４アミノ酸よりなるＣＥＡタンパク質のアミノ酸配列について、ＨＬＡ−Ａ２４結合性モチーフ構造を有する配列を中心に、その他の位置のアミノ酸の種類も考慮して検索した。その結果、表５に示した５個のペプチドが存在することが明らかとなった。
0003840268.tif 000006
なお、表５において配列番号の項の番号は、各ペプチドのアミノ酸配列を示した配列表の配列番号を示す。またＣＥＡタンパク質中の位置の項の番号は、ＣＥＡタンパク質中のＮ末端からのアミノ酸数を示す。また名称の項の記号は、本発明者等が命名したペプチドの名称を示す。
表５に示した５種のペプチドをペプチド合成機を用いて作製した。
（２）エフェクター細胞の調製
実施例１の（２）と同様の方法で調製した保存ＰＢＭＣ、ＣＥ−１、ＣＥ−３、ＣＥ−４、ＣＥ−５のいずれかのペプチドを用い後記実施例８の（１）記載の方法により調製したＳＡＣ−１処理による初回刺激用抗原提示細胞、及びＣＥ−１、ＣＥ−３、ＣＥ−４、ＣＥ−５のいずれかのペプチドを用い後記実施例８の（２）記載の方法により調製した抗原提示細胞いずれか１種を含む４種のプレートを用い、実施例１の（３）と同様の方法でＣＥ−１、ＣＥ−３、ＣＥ−４、ＣＥ−５のいずれかのペプチドで個別に刺激された４種類のエフェクター細胞を調製した。
（３）ＣＴＬ標的細胞の調製
細胞傷害活性測定のための標的細胞として、実施例１の（４）と同様の方法でＣＥ−１、ＣＥ−３、ＣＥ−４、ＣＥ−５のいずれかのペプチドを添加した培地で培養し得られた５種のＴＩＳＩ（＋）及び胃がん細胞株ＭＫＮ−４５（ＨＬＡ−Ａ２４及びＣＥＡ陽性）を用いた。なお上記各細胞は、細胞傷害活性測定当日実施例１の（４）と同様の方法で51Ｃｒ標識した。
（４）ＣＴＬによる細胞傷害活性の測定
（２）のエフェクター細胞及び（３）の標的細胞を用い、実施例１の（５）と同様の方法で特異的細胞傷害活性（％）を算出した。
結果を表６に示す。
0003840268.tif 000007
表６においてＥ／Ｔは標的細胞に対するエフェクター細胞の比を示す。
その結果、ＣＥ−３で誘導して得られたエフェクター細胞がＣＥ−３ペプチドを添加培地で培養したＴＩＳＩ（＋）に対して抗原ペプチド特異的な細胞傷害性を示す共に、ＭＫＮ−４５に対しても細胞傷害活性を示した。
実施例５  ＣＥＡ抗原ペプチド特異的ＣＴＬの調製（２）
本実施例におけるＣＴＬは抗原提示用樹状細胞（ＤＣ）を用いた誘導法により調製した。
実施例４の（１）で調製したＣＥ−２及びＣＥ−３の２種のペプチドについて、健常人のＰＢＭＣより各々のペプチドを認識するエフェクター細胞を誘導し細胞傷害活性を測定した。
（１）エフェクター細胞の調製
下記の方法によりＣＥ−２又はＣＥ−３いずれかのペプチドで個別に刺激された２種類のエフェクター細胞を調製した。
実施例１の（２）で調製したＰＢＭＣを融解後、細胞濃度が２×１０7個／ｍｌとなるように４℃の１％ヒトＡＢ血清を含むＰＢＳ（以下、１Ｈ−ＰＢＳと略す）に懸濁した。２×１０7個／ｍｌのＰＢＭＣに対して１Ｈ−ＰＢＳで洗浄した抗ＣＤ８抗体を結合したビーズ（Dynabeads M450、ダイナル社製）を１４μｌ加え、１時間４℃で反応後非接着細胞を除いた。非接着細胞を除いた後、最初に用いた細胞数１×１０8個に対して０．９ｍｌの１Ｈ−ＰＢＳに懸濁し、０．１ｍｌの細胞解離用ビーズ（DETACHaBEAD、ダイナル社製）を加えた。１時間室温で混和後解離した細胞を回収し１Ｈ−ＰＢＳで洗浄した。洗浄した細胞を２×１０6個／ｍｌとなるように５Ｈ−ＲＰＭＩに懸濁し、ＣＥ−２又はＣＥ−３いずれかのペプチドを用い実施例８の（３）記載の方法で調製したＤＣ懸濁液と等量ずつ混和した。この懸濁液に最終濃度１０ｎｇ／ｍｌとなるようにＩＬ−７を加え、４８ウェル培養プレートの各ウェルに０．５ｍｌずつ分注し３７℃のＣＯ2インキュベーター内で培養する。翌日１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０を含む５Ｈ−ＲＰＭＩを５０μｌ加えた。
１週間後に各ウェルの培養上清を除き細胞を0.5mlの5H-RPMIに懸濁した。この懸濁液をＣＥ−２又はＣＥ−３いずれかのペプチドを用い実施例８の（２）記載の方法で調製した抗原提示細胞いずれか１種を含むプレートに加え、再刺激した。翌日、IL-10を終濃度１０ng/mlとなるように添加し、更に２日置きに、培養上清を半量除き、20 IU/ml rIL-2を含む5H-RPMIを等量加え、１週間ＣＯ2インキュベーター内で培養した。同様の再刺激を更に３回行った後、各ウェルにおけるエフェクター細胞についてＴＩＳＩ（＋）、ＴＩＳＩ（−）に対する細胞傷害活性を測定した。細胞傷害活性を示したエフェクター細胞は個別に抗ＣＤ３抗体又は抗原刺激に用いた各ペプチドを用いて増殖させた。増殖した細胞を５Ｈ−ＲＰＭＩに懸濁し下記（３）の方法で細胞傷害活性を測定した。
（２）ＣＴＬ標的細胞の調製
標的細胞として実施例４の（３）と同様にＴＩＳＩ（−）、ＣＥ−２又はＣＥ−３を添加培地で培養した２種類のＴＩＳＩ（＋）を調製した。またＭＫＮ−４５は１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γで３７℃４８時間処理した。上記４種の標的細胞は細胞傷害活性測定当日、実施例４の（３）記載と同様の方法により51Ｃｒ標識した。
（３）ＣＴＬによる細胞傷害活性の測定
（１）で調製したエフェクター細胞及び（２）で調製した標識標的細胞を用い実施例１の（５）記載の方法と同様に細胞傷害活性を測定した。結果を表７に示す。
0003840268.tif 000008
なお表７においてＥ／Ｔは標的細胞に対するエフェクター細胞の比を示す。
その結果、ＣＥ−２又はＣＥ−３いずれかのペプチドで誘導して得られたエフェクター細胞がＴＩＳＩ（＋）及びＭＫＮ−４５に対して抗原ペプチド特異的な細胞傷害性を示し、ＣＥＡ特異的なＣＴＬであることが明らかとなった。
実施例６  ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原ペプチド特異的ＣＴＬの調製（１）
本実施例におけるＣＴＬは、実施例１と同様にＳＡＣ−１を用いるＣＴＬ誘導法により調製した。
（１）ＣＴＬ誘導用ペプチドの選択及び合成
１２５５アミノ酸よりなるＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質のアミノ酸配列について、ＨＬＡ−Ａ２４結合性モチーフ構造を有する配列を中心に、その他の位置のアミノ酸の種類も考慮して検索し、表８に示した５個のペプチドを選択し、ペプチド合成機を用いて作製した。
0003840268.tif 000009
なお、表８において配列番号の項の番号は、各ペプチドのアミノ酸配列を示した配列表の配列番号を示す。またＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質中の位置の項の番号は、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質中のＮ末端からのアミノ酸数を示す。また名称の項の記号は、本発明者等が命名したペプチドの名称を示す。
（２）エフェクター細胞の調製
下記の方法でＨＥ−１〜ＨＥ−５のいずれかのペプチドで個別に刺激された５種類のエフェクター細胞を調製した。
実施例１の（２）で調製した保存ＰＢＭＣ、ＨＥ−１〜ＨＥ−５いずれかのペプチドを用い後記実施例８の（１）記載の方法で調製したＳＡＣ−１処理による初回刺激用抗原提示細胞、及びＨＥ−１〜ＨＥ−５いずれかのペプチドを用い後記実施例８の（２）記載の方法で調製した抗原提示細胞いずれか１種を含む５種のプレートを用い、実施例１の（３）と同様の方法でＨＥ−１〜ＨＥ−５いずれかのペプチドで刺激された５種のエフェクター細胞を調製した。
（３）ＣＴＬ標的細胞の調製
細胞傷害活性測定のための標的細胞として、実施例１の（４）と同様の方法でＨＥ−１〜ＨＥ−５のいずれかのペプチドを含有する培地で培養した５種類のＴＩＳＩ（＋）並びに卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３（ＨＬＡ−Ａ３及びＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性）及びそのＨＬＡ−Ａ２４形質転換株ＳＫＯＶ−Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ２４及びＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性）を用いた。更に上記細胞は細胞傷害活性測定当日実施例１の（４）と同様の方法で51Ｃｒ標識した。
（４）ＣＴＬによる細胞傷害活性の測定
（２）のエフェクター細胞及び（３）の標的細胞を用い、実施例１の（５）と同様の方法で特異的細胞傷害活性（％）を算出した。結果を表９に示す。
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表９においてＥ／Ｔは標的細胞に対するエフェクター細胞の比を示す。
その結果、ＨＥ−１で誘導して得られたエフェクター細胞がＨＥ−１ペプチド添加培地で培養したＴＩＳＩ（＋）に対して抗原ペプチド特異的な細胞傷害性を示した。
実施例７  ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的ＣＴＬの調製（２）
本実施例におけるＣＴＬは抗原提示用樹状細胞（ＤＣ）を用いた誘導法により調製した。
実施例６の（１）で調製したＨＥ−１ペプチドについて、健常人のＰＢＭＣより該ペプチドを認識するエフェクター細胞を誘導し細胞傷害活性を測定した。
（１）エフェクター細胞の調製
実施例１の（２）で調製したＰＢＭＣ、ＨＥ−１ペプチドを用い後記実施例８の（３）記載の方法で調製したＤＣ、及びＨＥ−１ペプチドを用い後記実施例８の（２）記載の方法で調製した抗原提示細胞を含むプレートを用い、実施例５の（１）と同様の方法でＨＥ−１ペプチドで刺激されたエフェクター細胞を調製した。
（２）ＣＴＬ標的細胞の調製
標的細胞として実施例６の（３）と同様にＴＩＳＩ（−）、ＨＥ−１添加培地で培養で培養したＴＩＳＩ（＋）を調製した。またＳＫＯＶ３及びＳＫＯＶ３−Ａ２４は１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γで３７℃４８時間処理した。上記４種の標的細胞は細胞傷害活性測定当日、実施例１の（４）と同様の方法により51Ｃｒ標識した。
（３）ＣＴＬによる細胞傷害活性の測定
（１）で調製したエフェクター細胞及び（２）で調製した標識標的細胞を用い実施例１の（５）記載の方法と同様に細胞傷害活性を測定した。結果を表１０に示す。
0003840268.tif 000011
なお表１０において、Ｅ／Ｔは標的細胞に対するエフェクター細胞の比を示す。
その結果、ＨＥ−１ペプチドで誘導して得られたエフェクター細胞がＴＩＳＩ（＋）及びＳＫＯＶ３−Ａ２４に対して抗原ペプチド特異的な細胞傷害性を示し、ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的なＣＴＬであることが明らかとなった。
実施例８  非増殖性抗原提示細胞の調製
（１）ＳＡＣ−１処理による抗原提示細胞の調製
実施例１の（２）で調製した保存ＰＢＭＣを融解後、細胞濃度が２×１０6個／ｍｌとなるように５Ｈ−ＲＰＭＩに懸濁した。細胞懸濁液にＳＡＣ−Ｉ（Pansorbin cells、カルビオケム社製）を終濃度０．００５％、Immunobeads（Rabbit anti-Human IgM、バイオラド社製）を終濃度２０μｇ／ｍｌ、更にＩＬ−４（ジェンザイム社製）を終濃度２０ｎｇ／ｍｌとなるように加え、６ウェル培養プレートの各ウェルに５ｍｌずつ分注し３７℃のＣＯ2インキュベータ内で４日間培養した。４日間培養した細胞を終濃度１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む生理食塩水で洗浄後、細胞濃度が１×１０7個／ｍｌとなるように１％ＢＳＡと３μｇ／ｍｌのβ2ミクログロブリンを含むクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で懸濁した後、氷中２分間処理した。次に、細胞懸濁液の５倍容量の１％ＢＳＡ、β2ミクログロブリンを３μｇ／ｍｌ及びペプチドを１０μｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で細胞を洗浄後、１％ＢＳＡと３μｇ／ｍｌのβ2ミクログロブリン及び５０μｇ／ｍｌのペプチドを含むリン酸緩衝液に懸濁し２０℃で４時間反応させた。反応後、Ｘ線照射（5500Rad）を行い細胞濃度が１×１０6個／ｍｌとなるように５Ｈ−ＲＰＭＩに懸濁し初回刺激用抗原提示細胞を調製した。
（２）接着細胞からの抗原提示細胞の調製
実施例１の（２）で調製したＰＢＭＣを融解後Ｘ線照射（5500Rad）を行った。次いで細胞濃度が４×１０6個／ｍｌとなるよう５Ｈ−ＲＰＭＩに懸濁した細胞懸濁液を２４ウェル培養プレートに１ｍｌ／ウェルずつ分注し、ＣＯ2インキュベーター内で１．５時間培養した。その後、非接着細胞を吸引除去し、更に各ウェルをＲＰＭＩ１６４０で洗浄して非接着細胞を除いた。次に、３μｇ／ｍｌのβ2ミクログロブリン及び２０μｇ／ｍｌのペプチドを含む５Ｈ−ＲＰＭＩを個別に各ウェルに０．５ｍｌずつ分注し、ＣＯ2インキュベーター内で培養した。２時間後に上清を吸引除去し５Ｈ−ＲＰＭＩで１回洗浄し、プレートの各ウェルに残った細胞を再刺激用抗原提示細胞とした。
（３）ＤＣリッチな抗原提示細胞の調製
実施例２の（１）で調製した保存ＰＢＭＣを融解後、細胞濃度が２×１０6個／ｍｌとなるように５Ｈ−ＲＰＭＩに懸濁し、該細胞懸濁液１０ｍｌをＴ−２５フラスコ（ヌンク社製）に入れた。１．５時間３７℃に放置後、非接着細胞を除き、残った接着細胞に、ＧＭ−ＣＳＦ（ジェンザイム社製）を１０００Ｕ／ｍｌ及びＩＬ−４（ジェンザイム社製）を２０００Ｕ／ｍｌ含む５Ｈ−ＲＰＭＩを、１０ｍｌ加え、３７℃のＣＯ2インキュベーター内で培養しＤＣ細胞を誘導した。７日後に浮遊細胞を回収した。接着細胞は細胞解離バッファー（ギブコＢＲＬ社製）にて回収し５Ｈ−ＲＰＭＩで洗浄後、浮遊細胞と合せた。回収した細胞を、ペプチド４０μｇ／ｍｌ、β2ミクログロブリン３μｇ／ｍｌ及びを含む１％ヒト血清アルブミンを加えた生理食塩水中に３×１０6個／ｍｌとなるように懸濁し、２０℃の恒温槽中で４時間反応させた。反応後、Ｘ線照射（５５００Ｒａｄ）を行った後、１×１０6個／ｍｌとなるように１％ヒト血清アルブミンを加えた生理食塩水で希釈し抗原提示細胞とした。
（４）全ＰＢＭＣからの抗原提示細胞の調製
実施例２の（１）と同じ方法で分離したＰＢＭＣを、マイトマイシン処理し〔ＰＢＭＣ  １×１０7個／ｍｌの懸濁液にマイトマイシンＣ（ＩＣＮバイオメディカルズ社製）を２００μｇ／ｍｌとなるように添加し、３０分間放置〕、ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄した後、ペプチドをに２０μg／ｍｌとなるよう加えた５Ｈ−ＲＰＭＩを等量混合した後、２４ウェル培養プレートに１ｍｌ／ウェルずつ分注し抗原提示細胞として使用した。
実施例９    ＣＥＡ抗原ペプチド機能的誘導体の作製
（１）ＣＥ−２改変体及びＣＥ−３改変体の合成
実施例５の（１）で合成したＣＥ−２を基に表１１に示す１２種の改変体を設計した。
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同様にＣＥ−３を基に表１２に示す１７種の改変体を設計した。
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表１１及び１２に示したＣＥ−２０１〜ＣＥ−２１２及びＣＥ−３０１〜ＣＥ−３１５の２７種のペプチドをペプチド合成機を用いて作製した。
なお表１２におけるＣＥ−３１６は、実施例５の（１）で作製したＣＥ−３（２．８５μｍｏｌ）にＤＨＣＰ（宝酒造社製）水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌ加え、３７℃、１９時間反応させた後ＨＰＬＣで精製することにより作製した。
またＣＥ−３１７は、配列番号５で表されるＣＥ−３のアミノ酸配列においてＮ末より４番目のシステインのチオール残基を介したジスルフィド結合により２分子のＣＥ−３が結合したＣＥ−３の２量体である。本ペプチドはＣＥ−３を０．３ｍＭとなるよう溶解した０．０２Ｍ  ＮＨ4ＨＣＯ3水溶液中で３７℃、２４時間反応させた後ＨＰＬＣで精製することにより作製した。
（２）ＣＥ−２又はＣＥ−３の機能的誘導体の同定
ＣＥ−２又はＣＥ−３とＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を認識する実施例４において得られたＣＴＬが、表１１及び表１２に示したペプチド又はペプチド類似体とＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を認識するか確認した。
先ず実施例４の（２）と同様の方法で調製したＣＥ−２を認識するＣＴＬが、51Ｃｒ標識ＴＩＳＩ（−）細胞、及びＣＥ−２０１〜ＣＥ−２１２ペプチドのいずれか１つを用い実施例４の（３）と同様の方法で調製した１２種の51Ｃｒ標識ＴＩＳＩ（＋）細胞に対し傷害性を示すか確認した。その結果ＣＥ−２を認識するＣＴＬは、ＣＥ−２０１、ＣＥ−２０３、ＣＥ−２０４、ＣＥ−２０６、ＣＥ−２０７、ＣＥ−２０８、ＣＥ−２０９、ＣＥ−２１０、ＣＥ−２１２を添加した培地での培養により得られた51Ｃｒ標識ＴＩＳＩ（＋）に対し明らかな細胞傷害性を示した。なお該ＣＴＬは、51Ｃｒ標識ＴＩＳＩ（−）細胞に対しては細胞傷害性を示さず、ＣＥ−２０１、ＣＥ−２０３、ＣＥ−２０４、ＣＥ−２０６、ＣＥ−２０７、ＣＥ−２０８、ＣＥ−２０９、ＣＥ−２１０、ＣＥ−２１２がＣＥ−２の機能的誘導体であることが明らかとなった。
４人の健常人ＰＢＭＣを出発材料として実施例４の（２）と同様の方法で調製して得られた、ＣＥ−３を認識する出発材料が異なる４種のＣＴＬが、51Ｃｒ標識ＴＩＳＩ（−）細胞及び表１２に示した１７種のペプチドのいずれか１つを用い実施例４の（３）と同様の方法で調製した１７種の51Ｃｒ標識ＴＩＳＩ（＋）細胞に対し傷害性を示すか確認した。その結果ＣＥ−３を認識するＣＴＬは、ＣＥ−３０１、ＣＥ−３０２、ＣＥ−３０５、ＣＥ−３０７、ＣＥ−３１０、ＣＥ−３１１、ＣＥ−３１２、ＣＥ−３１４、ＣＥ−３１６、ＣＥ−３１７いずれかのペプチドを個別に添加した培地での培養により得られた１０種の51Ｃｒ標識ＴＩＳＩ（＋）に対し明らかな細胞傷害性を示した。なお該ＣＴＬは51Ｃｒ標識ＴＩＳＩ（−）細胞に対しては細胞傷害性を示さず、ＣＥ−３０１、ＣＥ−３０２、ＣＥ−３０５、ＣＥ−３０７、ＣＥ−３１０、ＣＥ−３１１、ＣＥ−３１２、ＣＥ−３１４、ＣＥ−３１６、ＣＥ−３１７がＣＥ−３の機能的誘導体であることが明らかとなった。
実施例１０  ＣＴＬを用いたＨＬＡ−Ａ２４分子の検出
本発明のＣＴＬによりＨＬＡ−Ａ２４分子が検出出来るかヒト由来ＰＢＭＣを被検細胞として検討した。
従来法の抗ＨＬＡ抗体を用い、発現しているＨＬＡタイプの判明している８人より実施例１の（２）と同様の方法でＰＢＭＣを調製し、被検細胞用ＰＢＭＣ８検体とした。各検体を２つに分け、一方は１０μｇ／ｍｌとなるようにＣＥ−３を溶解した５Ｈ−ＲＰＭＩに各々懸濁し、これをＣＥ−３添加検体群とした。もう一方は５Ｈ−ＲＰＭＩに各々懸濁し、これをＣＥ−３無添加検体群とした。各群を３７℃で２時間放置後、遠心分離操作により細胞を回収し、上清を除去した。本操作によりＣＥ−３添加群より過剰のＣＥ−３を除去した。次いで上記１６種の細胞を５Ｈ−ＲＰＭＩに懸濁後、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに各々１×１０4個づつ分注した。次いで各ウェルに実施例４においてＣＥ−３を用い得られたＣＴＬを３×１０4個づつ加え、３７℃、２２時間ＣＯ2インキュベーター内に放置後、各ウェル上清中のＩＦＮ−γ量をデュオセット〔Ｄｕｏ  ｓｅｔ；ジェンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）社製〕により測定した。その結果ＣＥ−３添加群の内、ＨＬＡ−Ａ２４分子を発現しているヒトより調製したＰＢＭＣ５検体を分注したウェルにのみＩＦＮ−γの存在が確認された。なお対照としたＣＥ−３無添加群のいずれのウェルのＩＦＮ−γ量は検出限界以下であった。従って本発明のＣＴＬを用いることによりＨＬＡ−Ａ２４分子を検出出来ることが明らかとなった。
一方、ＣＥ−３添加群においてＩＦＮ−γの存在が認められたＰＢＭＣ検体のうち、ＨＬＡ−Ａ２４ホモのヒトより調製したＰＢＭＣ検体を分注したウェルにおけるＩＦＮ−γ量は、ＨＬＡ−Ａ２４ヘテロのヒトより調製したＰＢＭＣ検体を分注したウェルにおけるＩＦＮ−γ量の約２倍量存在した。従って本発明のＣＴＬを用いることによりＨＬＡ−Ａ２４発現量を推定出来ることが明らかとなった。
実施例１１  ＣＴＬを用いたＨＬＡ−Ａ２分子の検出及びＨＬＡ−Ａ２サブタイプの同定
配列番号３７記載のアミノ酸配列で表されるＭＡＧＥ３由来のＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドであるＦＬＷＧＰＲＡＬＶを用いて、実施例１（３）と同様の方法で、ＨＬＡ−Ａ２（Ａ*０２０１）を保有する健常人由来のＰＢＭＣよりエフェクター細胞を調製した。標的細胞としてＨＬＡ−Ａ２細胞である．２２１（Ａ２．１）細胞を細胞傷害性測定前日に上記ペプチド１０μｇ／ｍｌを含む培地（．２２１（Ａ２．１）（＋））又は含まない培地（．２２１（Ａ２．１）（−））で培養したものを使用した。測定当日、51Ｃｒ標識した．２２１（Ａ２．１）（＋）又は．２２１（Ａ２．１）（−）細胞とエフェクター細胞を混和し、５時間後培地中に遊離された51Ｃｒ量を測定した。その結果、調製したエフェクター細胞がペプチド特異的な傷害性を示すＣＴＬであることが明らかとなった。また、．２２１（Ａ２．１）（＋）又は．２２１（Ａ２．１）（−）細胞とＣＴＬを混和し１日後の上清中のＩＦＮ−γを測定したところ、エフェクター細胞であるＣＴＬがペプチド特異的にＩＦＮ−γを遊離することが明らかとなった。このＣＴＬを増やした後、各種ＨＬＡ−Ａ２細胞に対してペプチド特異的なＩＦＮ−γ遊離作用の有無を検討した。
１）株化細胞．２２１（Ａ２．１）（ＨＬＡ−Ａ* ０２０１）、ＣＬＡ（ＨＬＡ−Ａ* ０２０６）、ＦＵＮ（ＨＬＡ−Ａ* ０２０３）、ｐ８１５（ＨＬＡ−Ａ* ０２０２）に対する反応性
上記各細胞にペプチドＦＬＷＧＰＲＡＬＶを１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で４時間インキュベートした。過剰のペプチドを洗浄除去後、９６ウェルマイクロプレートに１×１０4個／０．１ｍｌ／ウェル入れ、これにＣＴＬ細胞を１×１０5個／０．１ｍｌ／ウェル加え、２０時間反応させた。対照としてペプチド無添加細胞を用意し、同様にＣＴＬ細胞と反応させた。反応液より上清を取り適当に希釈後、ＩＦＮ−γ量を定量した。その結果、このＣＴＬは、．２２１（Ａ２．１）（ＨＬＡ．Ａ* ０２０１）に対してのみ、ペプチド特異的なＩＦＮ−γの遊離を起こしていた。
２）ヒトＰＢＭＣに対する反応性
ボランティア健常人３人のＰＢＭＣ（Ａ氏：ＨＬＡ−Ａ* ０２０７／Ａ１１、Ｂ氏：Ａ* ０２０６／Ａ２４、Ｃ氏：Ａ* ０２０１／Ａ* ０２０６）にペプチドＦＬＷＧＰＲＡＬＶを１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で２時間インキュベートした。過剰のペプチドを洗浄除去後、９６ウェルマイクロプレートに各１×１０4個／０．１ｍｌ／ウェル入れ、これにＣＴＬ細胞を１×１０4個／０．１ｍｌ／ウェル加え、２０時間反応させた。対照としてペプチド無添加細胞を用意し、同様にＣＴＬ細胞と反応させた。反応液より上清を取り適当に希釈後、ＩＦＮ−γ量を定量した。その結果、このＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ* ０２０１を有するＣ氏のＰＢＭＣに対してのみ、ペプチド特異的なＩＦＮ−γの遊離を起こしていた。
上記１）、２）の結果より、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチド及びそのペプチドでＨＬＡ−Ａ* ０２０１のＰＢＭＣより誘導したＣＴＬを用いることにより、被検細胞についてＤＮＡタイピングを実施することなく、ＨＬＡ−Ａ２のサブタイプまで同定できることが明らかとなった。
配列表フリーテキスト
配列番号３３のアミノ酸配列の４番目のアミノ酸は、２−ハイドロキシ−４（Ｒ，Ｓ）−Ｌ−システイン−Ｓ−イル−２−シクロペンテン−１−オンである。
産業上の利用可能性
本発明のＣＴＬはＨＬＡ−Ａ２４及びＭＡＧＥ−３共に陽性、ＨＬＡ−Ａ２４及びＭＡＧＥ−１共に陽性、ＨＬＡ−Ａ２４及びＣＥＡ共に陽性、又はＨＬＡ−Ａ２４及びＨＥＲ２／ｎｅｕ共に陽性の腫瘍細胞を選択的に傷害することができ、がん治療を目的とした細胞医薬として、また、体外摘出試料中のＨＬＡ−Ａ２４及びＭＡＧＥ−３共に陽性の腫瘍細胞、ＨＬＡ−Ａ２４及びＭＡＧＥ−１共に陽性、ＨＬＡ−Ａ２４及びＣＥＡ共に陽性、又はＨＬＡ−Ａ２４及びＨＥＲ２／ｎｅｕ共に陽性の腫瘍細胞の有無の検出、更に抗原ペプチドと同時に使用することにより体外摘出試料中の細胞のＨＬＡタイピング等に有用である。また本発明の抗原提示細胞は該ＣＴＬを調製するあるいは制がん剤として有用である。更に本発明の抗原ペプチドを有効成分とした医薬用組成物はＣＴＬの誘導剤更には制がん剤として有用である。
配列表
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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