(57)【要約】  本発明は、以下の特性を有する少なくとも1種の細菌を含む、胃におけるＩＬＣ２誘導剤を提供する：（１）バンコマイシンに対する感受性、および、（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。
2020071463.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特性を有する少なくとも1種の細菌を含む、胃におけるＩＬＣ２誘導剤：
（１）バンコマイシンに対する感受性、および、
（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。
【請求項２】
細菌が、さらに以下の特性を有する、請求項１記載の誘導剤：
（３）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する。
【請求項３】
細菌が、Ｓ２４−７科に属する細菌である、請求項１または２記載の誘導剤。
【請求項４】
細菌が、以下の（１）または（２）のヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の誘導剤：
（１）配列番号２８に示されるヌクレオチド、または、
（２）配列番号２８に示されるヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド。
【請求項５】
以下の特性を有する少なくとも１種の細菌を含む、胃におけるＩｇＡ産生誘導剤：
（１）バンコマイシンに対する感受性、および、
（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。
【請求項６】
細菌が、さらに以下の特性を有する、請求項５記載の産生誘導剤：
（３）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する。
【請求項７】
細菌が、Ｓ２４−７科に属する細菌である、請求項５または６記載の産生誘導剤。
【請求項８】
細菌が、以下の（１）または（２）のヌクレオチドを含む、請求項５〜７のいずれか一項記載の産生誘導剤：
（１）配列番号２８に示されるヌクレオチド、または、
（２）配列番号２８に示されるヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド。
【請求項９】
以下の特性を有する細菌を含む、経口感染症の治療または予防剤：
（１）バンコマイシンに対する感受性、および、
（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。
【請求項１０】
細菌が、さらに以下の特性を有する、請求項９記載の治療または予防剤：
（３）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する。
【請求項１１】
細菌が、Ｓ２４−７科の細菌である、請求項９または１０記載の治療または予防剤。
【請求項１２】
細菌が、以下の（１）または（２）のヌクレオチドを含む、請求項９〜１１のいずれか一項記載の治療または予防剤：
（１）配列番号２８に示されるヌクレオチド、または、
（２）配列番号２８に示されるヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド。
【請求項１３】
経口感染症が、以下の群から選択される感染の少なくとも１つである、請求項９〜１２のいずれか一項記載の治療または予防剤：
ピロリ菌感染症、Ｏ：１５７感染症、およびサルモネラ感染症。
【請求項１４】
以下の特性を有する少なくとも1種の細菌を対象に経口投与することを含む、胃におけるＩＬＣ２誘導方法：
（１）バンコマイシンに対する感受性、および、
（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。
【請求項１５】
細菌が、さらに以下の特性を有する、請求項１４記載の誘導方法：
（３）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する。
【請求項１６】
細菌が、Ｓ２４−７科に属する細菌である、請求項１４または１５記載の誘導方法。
【請求項１７】
細菌が、以下の（１）または（２）のヌクレオチドを含む、請求項１４〜１６のいずれか一項記載の誘導方法：
（１）配列番号２８に示されるヌクレオチド、または、
（２）配列番号２８に示されるヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド。
【請求項１８】
以下の特性を有する少なくとも１種の細菌を対象に経口投与することを含む、胃におけるＩｇＡ産生誘導方法：
（１）バンコマイシンに対する感受性、および、（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。
【請求項１９】
細菌が、さらに以下の特性を有する、請求項１８記載の産生誘導方法：
（３）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する。
【請求項２０】
細菌が、Ｓ２４−７科に属する細菌である、請求項１８または１９記載の産生誘導方法。
【請求項２１】
細菌が、以下の（１）または（２）のヌクレオチドを含む、請求項１８〜２０のいずれか一項記載の産生誘導方法：
（１）配列番号２８に示されるヌクレオチド、または、
（２）配列番号２８に示されるヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド。
【請求項２２】
以下の特性を有する細菌を対象に経口投与することを含む、経口感染症の治療または予防方法：
（１）バンコマイシンに対する感受性、および、
（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。
【請求項２３】
細菌が、さらに以下の特性を有する、請求項２２記載の治療または予防方法：
（３）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する。
【請求項２４】
細菌が、Ｓ２４−７科の細菌である、請求項２２または２３記載の治療または予防方法。
【請求項２５】
細菌が、以下の（１）または（２）のヌクレオチドを含む、請求項２２〜２４のいずれか一項記載の治療または予防方法：
（１）配列番号２８に示されるヌクレオチド、または、
（２）配列番号２８に示されるヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド。
【請求項２６】
経口感染症が、以下の群から選択される感染の少なくとも１つである、請求項２２〜２５のいずれか一項記載の治療または予防方法：
ピロリ菌感染症、Ｏ：１５７感染症、およびサルモネラ感染症。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃に存在するＩＬＣ２を標的としたＩｇＡ産生誘導剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃は強酸性が維持されており、これまでは臓器としての役割は食物の消化および殺菌を行うのみであると考えられてきた。Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ（「Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ」、「ピロリ菌」等とも称する）が胃に生着する報告を皮切りに、胃とピロリ菌との関連性が着目され始めたが、現在までに行われている研究は、「組織としての胃」に関するものがほとんどである。【０００３】
実際に、様々な科学系雑誌で報告されている胃と細菌に関する研究は、主にピロリ菌感染による胃がん発症メカニズムや、ピロリ菌自体の構造からの感染機構解明などに関する研究である。免疫応答に限れば、Ｔ細胞応答とがんに関する研究を行っているグループは少数存在するが、胃に存在する共生細菌と免疫担当細胞との関連性については今のところ報告はほとんどない。【０００４】
また、近年、自然リンパ球（Ｉｎｎａｔｅ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌ：ＩＬＣ）が、体内の様々な組織で恒常性を維持する重要な役割を担っていることが判明した。このＩＬＣは細胞の性質や転写因子の発現の違いなどにより、ＩＬＣ１、ＩＬＣ２、ＩＬＣ３の３つのサブセットに分類されている（非特許文献２〜６）。これらＩＬＣの研究により、今まで獲得免疫だけでは説明できなかった疾患の発症メカニズムが初めて明らかになる等、現在では世界中で注目されている細胞群である（非特許文献１）。【０００５】
しかしながら本発明者らの研究により、胃にも免疫学的に重要な役割が存在し（非特許文献７）、そしてこの応答は主に細菌によって誘導されるＩＬＣ２によるものであることも明らかになってきた。胃は食物を分解および殺菌するためだけの臓器ではなく、食事摂取と同時に上昇する感染のリスクを化学的及び免疫学的に制御することで、腸管に到達する前に細菌叢の選別を行う重要な臓器であることが示唆された。しかしながら、現時点においていかなる細菌によりＩＬＣ２が誘導されるかは明らかとはなっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｐｉｔｓ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３  Ｆｅｂ；１３（２）：１４５−９．
【非特許文献２】Ｓａｔｏｈ−Ｔａｋａｙａｍａ  Ｎ.  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００８  Ｄｅｃ  １９；２９（６）：９５８−７０．
【非特許文献３】Ｓａｔｏｈ−Ｔａｋａｙａｍａ  Ｎ.  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１４  Ｎｏｖ  ２０；４１（５）：７７６−８８．
【非特許文献４】Ｍａｌｏｙ  ＫＪ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１３  Ａｐｒ  １８；３８（４）：６３０−２．
【非特許文献５】Ｍｏｒｏ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１０  Ｊａｎ  ２８；４６３（７２８０）：５４０−４．
【非特許文献６】Ｎｅｉｌｌ  ＤＲ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１０  Ａｐｒ  ２９；４６４（７２９３）：１３６７−７０．
【非特許文献７】Ｍｕｈａｍｍａｄ  ＪＳ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐａｋ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ．２０１２  Ｓｅｐ；６２（９）：９５５−９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、胃に存在する免疫担当細胞（特にＩＬＣ２）の役割や胃の共生細菌叢との関わりを明らかにすることで、新規の抗感染症治療薬等の開発へつなげることをその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、（１）胃における共生細菌の存在が、胃におけるＩＬＣ２の存在量に影響を与え得ること、（２）共生細菌が胃におけるＩＬＣ２の機能（ＩＬ−５およびＩＬ−１３の産生能）に影響を与え得ること、（３）胃におけるＩＬＣ２の誘導をもたらす細菌は、バンコマイシンに感受性であり、且つ、アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールに耐性を有すること、（４）胃におけるＩＬＣ２の誘導を主にもたらす細菌がＳ２４−７科に属する細菌であること、（５）胃におけるＩＬＣ２の誘導を主にもたらすＳ２４−７科に属する細菌が、配列番号２８で表されるヌクレオチド配列を有する細菌（例、Muribaculum intestinale）であること等を見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。【０００９】
［Ａ１］以下の特性を有する少なくとも1種の細菌を含む、胃におけるＩＬＣ２誘導剤：
（１）バンコマイシンに対する感受性、および、
（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。
［Ａ２］細菌が、さらに以下の特性を有する、［Ａ１］記載の誘導剤：
（３）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する。
［Ａ３］細菌が、Ｓ２４−７科に属する細菌である、［Ａ１］または［Ａ２］記載の誘導剤。
［Ａ４］細菌が、以下の（１）または（２）のヌクレオチドを含む、［Ａ１］〜［Ａ３］のいずれか記載の誘導剤：
（１）配列番号２８に示されるヌクレオチド、または、
（２）配列番号２８に示されるヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド。
［Ａ５］以下の特性を有する少なくとも１種の細菌を含む、胃におけるＩｇＡ産生誘導剤：
（１）バンコマイシンに対する感受性、および、
（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。
［Ａ６］細菌が、さらに以下の特性を有する、［Ａ５］記載の産生誘導剤：
（３）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する。
［Ａ７］細菌が、Ｓ２４−７科に属する細菌である、［Ａ５］または［Ａ６］記載の産生誘導剤。
［Ａ８］細菌が、以下の（１）または（２）のヌクレオチドを含む、［Ａ５］〜［Ａ７］のいずれか記載の産生誘導剤：
（１）配列番号２８に示されるヌクレオチド、または、
（２）配列番号２８に示されるヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド。
［Ａ９］以下の特性を有する細菌を含む、経口感染症の治療または予防剤：
（１）バンコマイシンに対する感受性、および、
（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。
［Ａ１０］細菌が、さらに以下の特性を有する、［Ａ９］記載の治療または予防剤：
（３）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する。
［Ａ１１］細菌が、Ｓ２４−７科の細菌である、［Ａ９］または［Ａ１０］記載の治療または予防剤。
［Ａ１２］細菌が、以下の（１）または（２）のヌクレオチドを含む、［Ａ９］〜［Ａ１１］のいずれか記載の治療または予防剤：
（１）配列番号２８に示されるヌクレオチド、または、
（２）配列番号２８に示されるヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド。
［Ａ１３］経口感染症が、以下の群から選択される感染の少なくとも１つである、［Ａ９］〜［Ａ１２］のいずれか記載の治療または予防剤：
ピロリ菌感染症、Ｏ：１５７感染症、およびサルモネラ感染症。
［Ｂ１］以下の特性を有する少なくとも1種の細菌を対象に経口投与することを含む、胃におけるＩＬＣ２誘導方法：
（１）バンコマイシンに対する感受性、および、
（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。
［Ｂ２］細菌が、さらに以下の特性を有する、［Ｂ１］記載の誘導方法：
（３）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する。
［Ｂ３］細菌が、Ｓ２４−７科に属する細菌である、［Ｂ１］または［Ｂ２］記載の誘導方法。
［Ｂ４］細菌が、以下の（１）または（２）のヌクレオチドを含む、［Ｂ１］〜［Ｂ３］のいずれか記載の誘導方法：
（１）配列番号２８に示されるヌクレオチド、または、
（２）配列番号２８に示されるヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド。
［Ｂ５］以下の特性を有する少なくとも１種の細菌を対象に経口投与することを含む、胃におけるＩｇＡ産生誘導方法：
（１）バンコマイシンに対する感受性、および、（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。
［Ｂ６］細菌が、さらに以下の特性を有する、［Ｂ５］記載の産生誘導方法：
（３）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する。
［Ｂ７］細菌が、Ｓ２４−７科に属する細菌である、［Ｂ５］または［Ｂ６］記載の産生誘導方法。
［Ｂ８］細菌が、以下の（１）または（２）のヌクレオチドを含む、［Ｂ５］〜［Ｂ７］のいずれか記載の産生誘導方法：
（１）配列番号２８に示されるヌクレオチド、または、
（２）配列番号２８に示されるヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド。
［Ｂ９］以下の特性を有する細菌を対象に経口投与することを含む、経口感染症の治療または予防方法：
（１）バンコマイシンに対する感受性、および、
（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。
［Ｂ１０］細菌が、さらに以下の特性を有する、［Ｂ９］記載の治療または予防方法：
（３）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する。
［Ｂ１１］細菌が、Ｓ２４−７科の細菌である、［Ｂ９］または［Ｂ１０］記載の治療または予防方法。
［Ｂ１２］細菌が、以下の（１）または（２）のヌクレオチドを含む、［Ｂ９］〜［Ｂ１１］のいずれか記載の治療または予防方法：
（１）配列番号２８に示されるヌクレオチド、または、
（２）配列番号２８に示されるヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド。
［Ｂ１３］経口感染症が、以下の群から選択される感染の少なくとも１つである、［Ｂ９］〜［Ｂ１２］のいずれか記載の治療または予防方法：
ピロリ菌感染症、Ｏ：１５７感染症、およびサルモネラ感染症。
［Ｃ１］胃におけるＩＬＣ２を誘導するための方法における使用のための、以下の特性を有する少なくとも1種の細菌：
（１）バンコマイシンに対する感受性、および、
（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。
［Ｃ２］細菌が、さらに以下の特性を有する、［Ｃ１］記載の細菌：
（３）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する。
［Ｃ３］細菌が、Ｓ２４−７科に属する細菌である、［Ｃ１］または［Ｃ２］記載の細菌。
［Ｃ４］細菌が、以下の（１）または（２）のヌクレオチドを含む、［Ｃ１］〜［Ｃ３］のいずれか記載の細菌：
（１）配列番号２８に示されるヌクレオチド、または、
（２）配列番号２８に示されるヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド。
［Ｃ５］胃におけるＩｇＡの産生を誘導するための方法における使用のための、以下の特性を有する少なくとも１種の細菌：
（１）バンコマイシンに対する感受性、および、
（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。
［Ｃ６］細菌が、さらに以下の特性を有する、［Ｃ５］記載の細菌：
（３）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する。
［Ｃ７］細菌が、Ｓ２４−７科に属する細菌である、［Ｃ５］または［Ｃ６］記載の細菌。
［Ｃ８］細菌が、以下の（１）または（２）のヌクレオチドを含む、［Ｃ５］〜［Ｃ７］のいずれか記載の細菌：
（１）配列番号２８に示されるヌクレオチド、または、
（２）配列番号２８に示されるヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド。
［Ｃ９］経口感染症を治療または予防するための方法における使用のための、以下の特性を有する細菌：
（１）バンコマイシンに対する感受性、および、
（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。
［Ｃ１０］細菌が、さらに以下の特性を有する、［Ｃ９］記載の細菌：
（３）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する。
［Ｃ１１］細菌が、Ｓ２４−７科の細菌である、［Ｃ９］または［１０］記載の細菌。
［Ｃ１２］細菌が、以下の（１）または（２）のヌクレオチドを含む、［Ｃ９］〜［Ｃ１１］のいずれか記載の細菌：
（１）配列番号２８に示されるヌクレオチド、または、
（２）配列番号２８に示されるヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド。
［Ｃ１３］経口感染症が、以下の群から選択される感染の少なくとも１つである、［Ｃ９］〜［Ｃ１２］のいずれか記載の細菌：
ピロリ菌感染症、Ｏ：１５７感染症、およびサルモネラ感染症。
［Ｄ１］胃におけるＩＬＣ２の誘導用医薬を製造するための以下の特性を有する少なくとも1種の細菌の使用：
（１）バンコマイシンに対する感受性、および、
（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。
［Ｄ２］細菌が、さらに以下の特性を有する、［Ｄ１］記載の使用：
（３）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する。
［Ｄ３］細菌が、Ｓ２４−７科に属する細菌である、［Ｄ１］または［Ｄ２］記載の使用。
［Ｄ４］細菌が、以下の（１）または（２）のヌクレオチドを含む、［Ｄ１］〜［Ｄ３］のいずれか記載の使用：
（１）配列番号２８に示されるヌクレオチド、または、
（２）配列番号２８に示されるヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド。
［Ｄ５］胃におけるＩｇＡ産生誘導用医薬を製造するための、以下の特性を有する少なくとも１種の細菌の使用：
（１）バンコマイシンに対する感受性、および、
（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。
［Ｄ６］細菌が、さらに以下の特性を有する、［Ｄ５］記載の使用：
（３）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する。
［Ｄ７］細菌が、Ｓ２４−７科に属する細菌である、［Ｄ５］または［Ｄ６］記載の使用。
［Ｄ８］細菌が、以下の（１）または（２）のヌクレオチドを含む、［Ｄ５］〜［Ｄ７］のいずれか記載の使用：
（１）配列番号２８に示されるヌクレオチド、または、
（２）配列番号２８に示されるヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド。
［Ｄ９］以下の特性を有する細菌を含む、経口感染症の使用：
（１）バンコマイシンに対する感受性、および、
（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。
［Ｄ１０］細菌が、さらに以下の特性を有する、［Ｄ９］記載の使用：
（３）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する。
［Ｄ１１］細菌が、Ｓ２４−７科の細菌である、［Ｄ９］または［Ｄ１０］記載の使用。
［Ｄ１２］細菌が、以下の（１）または（２）のヌクレオチドを含む、［Ｄ９］〜［Ｄ１１］のいずれか記載の使用：
（１）配列番号２８に示されるヌクレオチド、または、
（２）配列番号２８に示されるヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド。
［Ｄ１３］経口感染症が、以下の群から選択される感染の少なくとも１つである、［Ｄ９］〜［Ｄ１２］のいずれか記載の使用：
ピロリ菌感染症、Ｏ：１５７感染症、およびサルモネラ感染症。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、哺乳動物の胃においてＩＬＣ２を誘導することができる。また、ＩＬＣ２が誘導される結果として、胃におけるＩｇＡ産生を亢進することができる。これにより、ピロリ菌をはじめとした、ＩｇＡにより除去可能な微生物の感染に起因する疾患等を治療および／または予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、マウスの胃における各種ＩＬＣの存在割合の検討結果を示す図である。（ａ）本実施例の概要。（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）小腸および胃における各種ＩＬＣの細胞数又は細胞の割合。
【図２】図２は、マウスの胃ＩＬＣ２におけるＩＬ−３３Ｒａの発現を示す図である。（ａ）小腸および胃におけるＫＬＲＧ１およびＳｃａ１発現細胞数。（ｂ）小腸および胃におけるＩＬ−３３Ｒα発現細胞の割合。
【図３】図３は、共生細菌による胃ＩＬＣ２への影響を示す図である。（ａ）本実施例の概要。（ｂ）および（ｃ）ＳＰＦマウスおよびＧＦマウスにおけるＩＬＣ２の細胞数。（ｄ）ＳＰＦマウスおよびＧＦマウスにおけるＩＬ−３３Ｒα発現細胞の割合。
【図４】図４は、共生細菌による胃ＩＬＣ２の機能への影響を示すである。（ａ）および（ｂ）ＳＰＦマウスおよびＧＦマウスにおける、胃中のＩＬ−５発現細胞またはＩＬ−１３発現細胞の細胞数。（ｃ）および（ｄ）ＳＰＦマウスおよびＧＦマウスにおける、胃中のＣＤ３およびＣＤ４陽性細胞（即ち、Ｔ細胞）並びにＣＤ１９およびＢ２２０陽性細胞(即ち、Ｂ細胞) の細胞数。通常状態下において、胃におけるＴ細胞およびＢ細胞数に変化が見られなかった。
【図５】図５は、ＳＰＦマウスの胃由来微生物叢の経口摂取による、ＧＦマウスの胃ＩＬＣ２の誘導を示す図である。（ａ）本実施例の概要。（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）ＳＰＦマウスの胃由来微生物叢を経口摂取したＧＦマウスの胃におけるＩＬ−５発現細胞またはＩＬ−１３発現細胞の細胞数の経時的変化。
【図６】図６は、ＳＰＦマウスの胃由来微生物叢の経口摂取による、ＧＦマウスの胃または糞便中の細菌叢の経時的変化を示す図である。（ａ）ＧＦマウスの胃または糞便中の細菌種の存在割合の経時的変化。（ｂ）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓの存在割合の経時的変化。（ｃ）Ｓ２４−７科の存在割合の経時的変化。
【図７】図７は、胃ＩＬＣ２の誘導に影響を与える共生細菌群の薬剤耐性にかかる特性を示す図である。（ａ）本実施例の概要。（ｂ）および（ｃ）抗生物質処理後のＩＬＣ２細胞数の変化。
【図８】図８は、各種細菌群が有する薬剤耐性にかかる特性を示す図である。（ａ）抗生物質処理後の各種細菌群の存在数の変化。（ｂ）抗生物質処理後のＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａおよびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓの存在割合の変化。
【図９】図９は、胃におけるＳ２４−７の局在を示す図である。
【図１０】図１０は、胃におけるＩＬＣ２数と各細菌の個体数の関係を示す図である。（ａ）各抗生物質で処理されたマウス由来の胃内容物中における、科レベルでの各細菌の相対的な個体数のヒートマッププロファイル。（ｂ）抗生物質（アンピシリン、ネオマイシン、メトロニダゾール、およびコリスチン）で処理されたマウス又はＳＰＦマウス（対照）由来の胃内容物における、科レベルでの各細菌の個体数とＩＬＣ２数のスキャッタープロファイル。
【図１１−Ａ】図１１−Ａは、ヘリコバクターピロリの感染に対する免疫応答に関する各種データを示す図である。（ａ）ピロリ菌感染マウスにおけるＣａｇＡタンパク質の検出。（ｂ）ピロリ菌感染後のＩＬＣ２細胞数の経時的変化。（ｃ）ピロリ菌感染後のマウス胃組織に存在するピロリ菌ＣＦＵ。（ｄ）から（ｆ）ピロリ菌感染後のＢ細胞およびＴ細胞数の経時的変化。
【図１１−Ｂ】図１１−Ｂは、ヘリコバクターピロリの感染に対する免疫応答に関する各種データを示す図である。（ａ）および（ｂ）ピロリ菌感染後の胃におけるＩＬＣ２の細胞数の経時的変化。（ｃ）ピロリ菌感染後の胃におけるＢ細胞およびＴ細胞の細胞数の経時的変化。（ｄ）抗ＩＬ−５抗体処理によるＩｇＡ量の経時的変化。（ｅ）ピロリ菌感染後のＩｇＡ量の経時的変化。
【図１１−Ｃ】図１１−Ｃは、ヘリコバクターピロリの感染に対する免疫応答に関する各種データを示す図である。（ａ）および（ｂ）ピロリ菌感染後のＩＬ−５またはＩＬ−１３産生ＩＬＣ２の細胞数の経時的変化。（ｃ）ピロリ菌感染後の胃におけるＩＬ−３３の量の経時的変化。（ｄ）および（ｅ）抗ＩＬ−５抗体処理による、ＩｇＡ産生細胞の減少。（ｆ）ピロリ菌感染後のｐＬｇＲの発現量の経時的変化。
【図１２】図１２は、バンコマイシン処理マウスの胃におけるバクテリア結合ＩｇＡ量を示す図である。（ａ）および（ｂ）ＳＰＦマウスおよびバンコマイシン処理マウスにおける胃内容物および胃粘液中のバクテリアに結合するＩｇＡ抗体の量。
【図１３】図１３は、Ｍｕｒｉｂａｃｕｌｕｍ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅ（ＹＬ２７）の感染に対する免疫応答に関する各種データを示す図である。（ａ）本実施例の概要。（ｂ）および（ｃ）ＹＬ２７感染後の胃におけるＩＬＣ２の細胞数の経時的変化。（ｄ）ＩＬ−５またはＩＬ−１３を産生するＩＬＣ２の細胞数の経時的変化。
【図１４】図１４は、ＹＬ２７感染に対するｐＩｇＲの発現量の変化、および、胃内容物または糞便におけるＩｇＡ産生量を示す図である。
【図１５】図１５は、ＧＦマウスに感染させたＹＬ２７が、ＧＦマウスの胃に接着していることを示す写真図である。
【図１６】図１６は、実施例１２の概要を示す図である。
【図１７】図１７は、ＹＬ２７を感染させた後にピロリ菌を感染させたマウスにおける胃内容物または糞便におけるＩｇＡ産生量を示す図である。
【図１８】図１８は、ＹＬ２７を感染させた後にピロリ菌を感染させたマウスの胃におけるｐＩｇＲの発現量の変化を示す図である。
【図１９】図１９は、胃に存在するピロリ菌量の測定に基づく、ＹＬ２７のピロリ菌感染の抑制を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．ＩＬＣ２誘導剤
本発明は、以下の特性を有する少なくとも１種の細菌を含む、胃におけるＩＬＣ２誘導剤（以下、「本発明のＩＬＣ２誘導剤」と称することがある）を提供する：
（１）バンコマイシンに対する感受性、および、
（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。本発明のＩＬＣ２誘導剤は、配合される特定細菌の機能により、適用対象における胃において免疫担当細胞の一種であるＩＬＣ２の発現を誘導することができる。
【００１３】
本発明のＩＬＣ２誘導剤に配合される細菌は、バンコマイシンに対する感受性を有し、且つ、アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対して耐性を有する細菌として特徴づけられる。一態様において、本発明のＩＬＣ２誘導剤に配合される細菌は、バンコマイシンに対する感受性を有し、且つ、アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも２つの薬剤に対して耐性を有する細菌で有り得、好ましくは、バンコマイシンに対する感受性を有し、且つ、アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも３つの薬剤に対して耐性を有する細菌で有り得、より好ましくは、バンコマイシンに対する感受性を有し、且つ、アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも３つの薬剤に対して耐性を有する細菌で有り得、特に好ましくは、バンコマイシンに対する感受性を有し、且つ、アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールの全てに対して耐性を有する細菌で有り得る。一態様において、本発明のＩＬＣ２誘導剤に配合される細菌は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする。また、別の一態様において、本発明のＩＬＣ２誘導剤に配合される細菌は、Ｓ２４−７科に属する細菌であることを特徴とする。
【００１４】
Ｓ２４−７科に属する細菌とは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ目Ｓ２４−７科に属するグラム陰性細菌を意味する。Ｓ２４−７科に属する細菌は、広く恒温動物と共生することが報告されている（Ｏｒｍｅｒｏｄ  ＫＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．２０１６  Ｊｕｌ  ７；４（１）：３６．）。なお、本明細書において恒温動物とは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、及びヒト等が例示されるが、Ｓ２４−７科に属する細菌をはじめとし、上記した薬剤特性を有する細菌が共生し得る恒温動物であれば特に限定されない。なお、Ｓ２４−７科に属する細菌は、以下の実施例に示される通り、バンコマイシンに対する感受性を有し、且つ、アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールの全てに対して耐性を有することから、かかる特性を基準として存在を確認することができる。或いは、以下の実施例に示される通り、Ｓ２４−７科に属する細菌は、配列番号１に示される核酸配列を有する場合がある。従って、配列番号１に示される核酸配列をプローブとして用いることによってもその存在を確認することができる場合がある。
【００１５】
本発明の一態様において、細菌は、Muribaculum intestinale（「ＹＬ２７」等とも称される）であり得るが、これに限定されない。尚、ＹＬ２７は、配列番号２８で表される配列からなる１６ｓ ｒＲＮＡを有する。従って、一態様において、本発明に用いられる細菌は、（１）配列番号２８に示されるヌクレオチドを含む細菌、または、（２）配列番号２８に示されるヌクレオチドと少なくとも９０％以上（より好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の同一性を有するヌクレオチドを含む細菌であり得る。
【００１６】
本発明のＩＬＣ２誘導剤に配合される細菌は、恒温動物と共生し、その胃、小腸、大腸、および糞便等に存在する細菌である。従って、本発明のＩＬＣ２誘導剤に配合される細菌は、かかる細菌源より細菌を採取することにより容易に入手することができる。一態様において、かかる細菌源より採取した細菌を純水や緩衝液に懸濁させ細菌懸濁液とした後、自体公知の方法（例えば、特開２０１５−１８８４０７、特開２０１２−１７５９７３、特開２０１０−０４１９６７、国際公開ＷＯ２００７／０２３７１１、特開２００５−２２９８３７等）を用いて培養してもよい。また、これらの培養の際に、適切な抗生物質等を添加することにより、不要な微生物のコンタミネーションを除去してもよい。具体的には、本発明のＩＬＣ２誘導剤に配合される細菌は、アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールに耐性を有することから、これらのうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、特に好ましくはこれら４種類の薬剤を培養の際に添加することで、本発明の誘導剤に配合される細菌の純度を高めることができる。
【００１７】
本発明のＩＬＣ２誘導剤に配合される細菌の調製方法の一具体例としては、恒温動物（例えば、マウス）を開腹し、その胃腸に含まれる内容物および／または粘液を採取する方法が例示される。採取された内容物および／または粘液には、バンコマイシンに対する感受性を有し、且つ、アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対して耐性を有する細菌が含まれる。従って、該内容物および／または粘液をそのまま有効成分とすることもできるし、これらに含有される細菌のうち、バンコマイシンに対する感受性を有し、且つ、アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対して耐性を有する細菌を上述した方法を用いて単離および／または培養した後に、有効成分として配合することもできる。なお、本明細書において「単離」とは、目的とする細菌以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味するが、目的とする細菌以外の細菌が完全に除去されている態様の他、目的とする細菌数が過半数を占め、それ以外の細菌が微量に存在している態様も含まれ得る。
【００１８】
本発明のＩＬＣ２誘導剤に配合される細菌の配合量は、所望の効果を得られる限り特に限定されず、本発明のＩＬＣ２誘導剤の総重量に対して、通常０．００１〜１００重量％、好ましくは０．０１〜１００重量％、より好ましくは１〜１００重量％、特に好ましくは１０〜１００重量％であり得るが、特にこれに限定されない。
【００１９】
本発明のＩＬＣ２誘導剤の好適な適用対象としては、胃における免疫担当細胞としてＩＬＣ２を有する恒温動物であれば特に限定されないが、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、及びヒトであり、最も好ましくはヒトである。
【００２０】
本発明のＩＬＣ２誘導剤の剤型は、所望の効果が得られる限り特に限定されるものではなく、医薬に通常用いられる賦形剤などと共に、経口投与製剤とすることができる。経口投与製剤の剤型は、所望の効果を得られる限り特に限定されないが、本発明のＩＬＣ２誘導剤に配合される細菌が製剤中で生存した状態を維持できるよう、半固体状または液体状であることが好ましい。経口投与製剤は、医薬に通常用いられる賦形剤および／または添加剤を配合してもよい。
【００２１】
或いは、本発明のＩＬＣ２誘導剤は、食品組成物の形態で提供されてもよい。食品組成物で提供する場合もまた、本発明のＩＬＣ２誘導剤に配合される細菌が食品組成物中で生存した状態を維持できるよう、当該食品組成物は半固体状または液体状であることが好ましい。このような食品組成物の例としては、ヨーグルト、ゼリー、飲料等が例示されるが、これらに限定されない。
【００２２】
一態様において、本発明は、本発明のＩＬＣ２誘導剤を対象に経口投与することを含む、対象の胃におけるＩＬＣ２の誘導方法を提供する。本方法は、上述したＩＬＣ２誘導剤を対象に経口投与することにより実施され得る。
【００２３】
２．ＩｇＡ産生誘導剤
本発明はまた、以下の特性を有する少なくとも１種の細菌を含む、胃におけるＩｇＡ産生誘導剤（以下、「本発明のＩｇＡ産生誘導剤」と称することがある）を提供する：
（１）バンコマイシンに対する感受性、および、
（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。本発明のＩｇＡ産生誘導剤は、配合される特定細菌の機能により、適用対象における胃において免疫担当細胞の一種であるＩＬＣ２の発現を誘導することができる。誘導されたＩＬＣ２はＩＬ−５やＩＬ−１３等のサイトカインを産生／分泌し、胃に存在するＢ細胞を刺激する。刺激されたＢ細胞は抗体産生細胞に分化し、その結果として、適用対象の胃におけるＩｇＡ産生を誘導・亢進することができる。
【００２４】
本発明のＩｇＡ産生誘導剤に配合される細菌、その薬剤特性、その調製方法、その配合量、ならびに本発明のＩｇＡ産生誘導剤の適用対象および剤型等については、「１．ＩＬＣ２誘導剤」に説明したものと同様とすることができる。
【００２５】
一態様において、本発明は、本発明のＩｇＡ産生誘導剤を対象に経口投与することを含む、対象の胃におけるＩｇＡ産生誘導方法を提供する。本方法は、上述したＩｇＡ産生誘導剤を対象に経口投与することにより実施され得る。
【００２６】
一態様において、本発明のＩｇＡ産生誘導剤は、医薬品または食品の形態で提供することができる。食品組成物で提供する場合もまた、本発明のＩｇＡ産生誘導剤に配合される細菌が食品組成物中で生存した状態を維持できるよう、当該食品組成物は半固体状または液体状であることが好ましい。このような食品組成物の例としては、ヨーグルト、ゼリー、飲料等が例示されるが、これらに限定されない。
【００２７】
３．経口感染症の治療および／または予防剤
本発明はまた、以下の特性を有する少なくとも１種の細菌を含む、経口感染症の治療または予防剤（以下、「本発明の治療または予防剤」と称することがある）を提供する：
（１）バンコマイシンに対する感受性、および、
（２）アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、およびメトロニダゾールからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に対する耐性。本発明の治療または予防剤は、配合される特定細菌の機能により、適用対象における胃において免疫担当細胞の一種であるＩＬＣ２の発現を誘導することができる。誘導されたＩＬＣ２はＩＬ−５やＩＬ−１３等のサイトカインを産生／分泌し、胃に存在するＢ細胞を刺激する。刺激されたＢ細胞は抗体産生細胞に分化し、その結果として、適用対象の胃におけるＩｇＡ産生が誘導・亢進され、ピロリ菌をはじめとする経口感染症の治療および／または予防が達成される。
【００２８】
本発明の治療または予防剤に配合される細菌、その薬剤特性、その調製方法、その配合量、ならびに本発明のＩｇＡ産生誘導剤の適用対象および剤型等については、「１．ＩＬＣ２誘導剤」に説明したものと同様とすることができる。
【００２９】
本発明の治療または予防剤は、胃粘膜における分泌型ＩｇＡ抗体の産生を誘導・亢進することにより、胃に存在する病原性微生物の排除を促進する。かかる観点を考慮すると、本発明の治療または予防剤は、経口感染症のなかでも、とりわけ、ピロリ菌感染症に好適に使用され得る。尚、Ｓ２４−７は腸管においてもメジャーな菌として検出されることから、Ｏ：１５７やサルモネラ感染などの感染性の菌種が引き起こす感染性腸炎から腸管を防御する可能性が考えられる。従って、一態様において、本発明の治療または予防剤は、ピロリ菌感染症、Ｏ：１５７感染症、およびサルモネラ感染症の治療または予防に用いることができる。
【００３０】
一態様において、本発明の治療または予防剤は、医薬品または食品の形態で提供することができる。食品組成物で提供する場合もまた、本発明の治療または予防剤に配合される細菌が食品組成物中で生存した状態を維持できるよう、当該食品組成物は半固体状または液体状であることが好ましい。このような食品組成物の例としては、ヨーグルト、ゼリー、飲料等が例示されるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明の治療剤の適用対象は、上記した経口感染症の患者である。また、本発明の予防剤の適用対象は、健常者または上記した経口感染症が治癒した対象である。
【００３２】
本発明の治療剤は、治療有効量のＳ２４−７科の細菌を対象が摂取し得るような量で投与される。該治療有効量は、治療剤が投与される対象の身長、体重、性別、投与経路、投与スケジュール等によって異なり得るが、当業者であれば適宜決定することができる。
【００３３】
また、本発明の予防剤は、予防有効量のＳ２４−７科の細菌を対象が摂取し得るような量で投与される。予防有効量は、予防剤が投与される対象の身長、体重、性別、投与経路、投与スケジュール等によって異なり得るが、当業者であれば適宜決定することができる。
【００３４】
一態様において、本発明は、本発明の治療または予防剤を対象に経口投与することを含む、経口感染症の治療または予防方法を提供する。本方法は、上述した経口感染症の治療または予防剤を対象に経口投与することにより実施され得る。
【００３５】
なお、本明細書における「治療」には、疾患の治癒のみならず、疾患の寛解および疾患の程度の改善も含まれ得る。
【００３６】
また、本明細書における「予防」には、疾患の発症を防ぐことに加えて、疾患の発症を遅らせること、疾患の発症時の対象の状態が、通常の該疾患の発症の状態と比較して軽度であることが含まれる。加えて、本明細書における「予防」には、治療後の該疾患の再発を防ぐこと、治療後の該疾患の再発を遅らせること、治療後の該疾患の再発時の対象の状態が、通常の該疾患の再発時の状態と比較して軽度であることも含まれる。
【００３７】
以下の実施例において本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
[材料と方法]
１．マウス
Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスはＣＬＥＡ（ＣＬＥＡ  ＪＡＰＡＮ,ＩＮＣ）より購入し、理化学研究所において特定病原体フリー（ＳＰＦ）条件下で４週間以上飼育した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎバックグラウンドを有する無菌（ＧＦ）マウスはＣＬＥＡより購入し、理化学研究所または横浜市立大学における滅菌ビニルアイソレーターで維持した。Ｒａｇ２−／−マウス（Ｎ．Ｓａｔｏｈ−Ｔａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｆｌｏｒａ  ｄｒｉｖｅｓ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２２  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ＮＫｐ４６＋  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ｉｎｎａｔｅ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｅｎｓｅ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２９，  ９５８−９７０  （２００８））、Ｉｌ−３３ｇｆｐ／ｇｆｐマウス（Ｋ．Ｏｂｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＬ−３３  ｉｓ  ａ  ｃｒｕｃｉａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ｒａｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０７，  １８５８１−１８５８６（２０１０））、ＣＤ３ε−／−マウス（Ｍ．Ｍａｌｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ３−ｅｐｓｉｌｏｎ  ｇｅｎｅ．  ＥＭＢＯ  Ｊ  １４，  ４６４１−４６５３（１９９５））、ＲＯＲγｔｇｆｐ／ｔマウス（Ｇ．Ｅｂｅｒｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＯＲｇａｍｍａ（ｔ）  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５，  ６４−７３  （２００４））は、Ｄｉ  Ｓａｎｔｏ博士、Ｎａｋａｅ博士、Ｍａｌｉｓｓｅｎ博士、およびＬｉｔｔｍａｎ博士より、それぞれ提供された。全てのマウス（８〜１８週齢）は、理化学研究所横浜ブランチの動物実験委員会または横浜市立大学の調査委員会により提供されたガイドラインを順守した実験に用いられ、且つ日本の法律に沿って行われた。【００３９】
２．細胞調製、フローサイトメトリー解析および細胞内染色
胃組織をマウスの体内からピックアップした後速やかに開き、次いで、冷ＰＢＳバッファーまたはＲＰＭＩ培地で穏やかに胃内容物を洗浄した。胃組織を小片にカットし、１．０ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ）で消化した。結果として得られた上清をプールし、最後に４０μｍメッシュフィルターを通過させた。小腸粘膜固有層リンパ球（ＬＰＬ）の単離およびフローサイトメトリー解析は、Ｎ．Ｓａｔｏｈ−Ｔａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ−ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ＩＬ−２２−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ＮＫｐ４６（＋）  ｉｎｎａｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４１，７８０−７８６（２０１１）およびＹ．Ｓａｓａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｑｕａｒｔｚ−Ｓｅｑ：ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ，  ｒｅｖｅａｌｓ  ｎｏｎ−ｇｅｎｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １４，Ｒ３１（２０１３）に記載される方法を用いて行った。フローサイトメトリー解析については、２．４Ｇ２ｍＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）でＦｃレセプターをブロッキングした後、各表面抗体を用いて４℃で全ての細胞を染色し、死細胞はＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で染色した。表面または細胞内の染色は、特定の蛍光色素を連結した抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅおよびＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｈｅｃｈ、以下の表１参照）を用いて行った。抗マウスＤＣＬＫ抗体は製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の説明書に従ってａｌｅｘａ４８８で標識した。細胞内サイトカイン染色については、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）存在下、単離した細胞を、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン(２μｇ／ｍｌ)とともに、又はＰＭＡおよびイオノマイシンなしで、２時間、３７℃でインキュベートした。表面抗体で染色した後、インキュベートした細胞を４％ＰＦＡ含有ＰＢＳで１５分室温で固定した。固定した細胞を１×透過化バッファー（Ｆｏｘｐ３／ＴＦバッファーセット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に含まれる）を用いて６０分間、４℃で透過化した。細胞における転写因子検出については、単離された細胞を製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の説明書に従ってＦｏｘｐ３／ＴＦ染色バッファーセットを用いて細胞内抗体で染色した。細胞解析およびソーティングについては、細胞は、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析した。フローサイトメトリーによる全てのリンパ球解析については、リンパ球はまずＦＳＣおよびＳＳＣ強度により定義され、次いでＣＤ４５発現に基づいて慎重にゲーティングした。データはＦｌｏｗＪｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で解析した。【００４���】
【表１】
2020071463.tif 000003
【００４１】
３．ＲＮＡ−ｓｅｑおよび量的ＰＣＲ
ＲＮＡ−ｓｅｑについては、ＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、９８％またはそれ以上の純度で、胃または小腸から抽出された１０００細胞を５０μｌの溶解バッファー（ＱＩＡＧＥＮ）へ直接ソーティングした。ソーティング後のすべてのステップは、若干の改変を有するＱｕａｒｔｚ−ｓｅｑ法（ライブラリ；ＫＡＰＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ，ｉｌｌｕｍｉｎａ．アダプタ；Ｎｅｘｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｏｌｉｇｏ  ｆｏｒ  ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＮＥＢ）に従った（詳細は、Ｙ．Ｓａｓａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｑｕａｒｔｚ−Ｓｅｑ：ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ，  ｒｅｖｅａｌｓ  ｎｏｎ−ｇｅｎｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １４，  Ｒ３１  （２０１３）を参照されたい）。全てのサンプルは、ＨｉＳｅｑ１５００、ラピッドモードで配列決定された。量的ＰＣＲ解析については、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｃｒｏ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ＲＮＡトータルＲＮＡを精製した胃細胞または腸細胞調製物より抽出した。全組織ＲＮＡ発現解析については、胃または腸は液体窒素中に凍結した。凍結した組織を液体窒素中で摩砕し、ＲＮＡを、溶解バッファー（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて粉末化組織から抽出した。ｃＤＮＡを製造業者の説明書に従って、逆転写酵素（Ｒｅｖａｔｒａ  Ａｃｅ、ＴＯＹＯＢＯ）を用いて生成し、次いで、プライマー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ；表２参照）またはＩｌ２５およびＩｌ３３に対するＴａｑＭａｎプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；表３参照）を用いて、ＲＴ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ  ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥｘＴａｑ  ＩＩ）を用いて、量的ＰＣＲ解析を行った。【００４２】
【表２】
2020071463.tif 000004
【００４３】
【表３】
2020071463.tif 000005
【００４４】
４．ＲＮＡ−ｓｅｑのリードアライメントおよびＧｅｎｅ  Ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
差次的遺伝子発現はＲソフトウェアにおけるＤＥｓｅｑパッケージを用いて解析し、各解析において、これらの遺伝子をｌｏｇ２  ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ  Ｖａｌｕｅ、ｐ−ＶａｌｕｅおよびＦＤＲ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｖａｌｅにより同定した。複数の試験に対するｐ−ＶａｌｕｅおよびＦＤＲ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅは、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いて計算した。Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓには、各細胞タイプまたはコンディションを含む。【００４５】
５．１６Ｓ  ｒＲＮＡのサンプル調製並びにデータ処理および解析
胃内容物および粘液サンプルは、遠心および上清の除去後速やかに−８０℃でストックした。ＤＮＡ抽出は、Ｔ．Ｊｉｎｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＬ−２２ＢＰ  ｄｉｃｔａｔｅｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｅｙｅｒ’ｓ  ｐａｔｃｈ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｕｐｔａｋｅ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，（２０１７）およびＴ．Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｍｉｃｓ  ｕｎｃｏｖｅｒｓ  ｈｏｓｔ−ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｍｕｔｕａｌｉｓｍ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ  ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ．  ＤＮＡ  Ｒｅｓ  ２１，  ４６９−４８０（２０１４）に記載される方法に若干の変更を加えた方法を用いて行った。解析については、Ｖ４可変領域（５１５Ｆ−８０６Ｒ）を、製造業者（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ，Ｉｎｃ）の手順書に従って調製されたイルミナＭｉｓｅｑライブラリで配列決定した。２０％変性ＰｈｉＸ（ｓｐｉｋｅ−ｉｎ）を有するサンプルライブラリーは、Ｍｉｓｅｑ  ５００サイクルキットを用いて配列決定し、２×２５０ｂｐペアエンドリードを得た。【００４６】
配列決定したデータの分類学的割り当ておよび相対存在量の推定は、ＱＩＩＭＥ  ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージの解析パイプラインを用いて行った。キメラチェックはＵＣＨＩＭＥを用いて行った。操作的分類単位（ＯＴＵ）は、９７％類似性で定義した。ＯＴＵは、Ｔ．Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｍｉｃｓ  ｕｎｃｏｖｅｒｓ  ｈｏｓｔ−ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｍｕｔｕａｌｉｓｍ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ  ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ．  ＤＮＡ  Ｒｅｓ  ２１，４６９−４８０（２０１４）に記載されるＲＤＰｃｌａｓｓｉｆｉｅｒを用いたＧｒｅｅｎｇｅｎｅｓデータベースでの比較に基づいたタキソノミーを割り当てた。【００４７】
６．抗生物質処理、胃内容物および粘液調製、並びに移植実験
ＳＰＦコンディションのマウスに、飲料水にアンピシリン（０．１ｇ／Ｌ）、コリスチン（１ｇ／Ｌ）またはバンコマイシン（０．５ｇ／Ｌ）を添加し、３週間、経口的に摂取させた。対照とするＳＰＦ条件のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスまたは抗生物質処理マウスから、胃の内容物および粘液を得た。開いた胃は滅菌したＰＢＳ中で穏やかに洗浄した。回収した内容物をホモジナイズし、十分にボルテックスした。大粒子を除去するため、チューブを３０秒間静置した。粘液領域の解析については、胃内容物を洗浄後の胃組織を湾曲針で擦り取った。上皮および大粒子を除去するためのスピンダウン後、上清を胃粘液解析に用いた。経口移植実験については、３００μｌの胃内容物及び粘液の混合物をＧＦマウスに１回または週１回で４週間、経口的に摂取させた。腸内微生物叢を減少させるため、同腹仔のＣＤ３ε＋／＋およびＣＤ３ε−／−の妊娠雌マウスを、アンピシリン（０．１ｇ／Ｌ）、バンコマイシン（１ｇ／Ｌ）、ネオマイシン（１ｇ／Ｌ）、およびメタロニダゾール（１ｇ／Ｌ）を含む抗生物質カクテルを飲料水に添加して、子マウスの離乳（出産後２１日）まで経口的に摂取させることで、抗生物質処理した。【００４８】
７．フローサイトメトリー解析によるＩｇＡコートされた細菌の評価
対照ＧＦマウスまたはＨ.ピロリ菌感染マウスから胃内容物を得た。開いた胃を滅菌されたＰＢＳ１ｍｌで穏やかに洗浄した。該内容物を７００ｇ、５分間遠心し、この上清をさらに１２０００ｇ、５分間遠心することで、非結合性のＩｇＡを除去した。細菌を、Ｓ．Ｋａｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｘｐ３（＋）  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４１，  １５２−１６５（２０１４）に記載されるように、ＰＥコンジュゲート抗マウスＩｇＡ抗体およびＤＡＰＩで染色した。ＰＢＳでの洗浄後、細菌をＦＡＣＳバッファーに懸濁し、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩを用いて解析した。【００４９】
８．ピロリ菌の培養、感染および感染チェック
本明細書において用いたＨ.ピロリ株；ＰＭＳＳ１をｓｈｅｅｐ  ｂｌｏｏｄ  ａｇａｒ  ｐｌａｔｅで増殖させ、Ｎ．Ｓａｔｏｈ−Ｔａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ−ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ＩＬ−２２−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ＮＫｐ４６＋  ｉｎｎａｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４１，  ７８０−７８６（２０１１）に記載される液体培地において培養した。１×１０９  ＣＦＵ／マウスでマウスに経口的に感染させ、感染後２週間または９週間の時点で解析のためにマウスを屠殺した。これらのマウスのすべての胃腸に対して、ＰＭＳＳ株のＣａｇＡ遺伝子発現によりピロリ菌感染を確認した。【００５０】
９．免疫組織学
胃の８μｍの凍結切片の免疫組織学的解析は、Ｎ．Ｓａｔｏｈ−Ｔａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｆｌｏｒａ  ｄｒｉｖｅｓ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２２  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ＮＫｐ４６＋  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ｉｎｎａｔｅ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｅｎｓｅ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２９，９５８−９７０（２００８）およびＮ．Ｓａｔｏｈ−Ｔａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ−ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ＩＬ−２２−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ＮＫｐ４６＋  ｉｎｎａｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４１，７８０−７８６（２０１１）に記載される方法で行った。一次抗体としては、ラット抗Ｂ２２０抗体（ＲＡ３−６２Ｂ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用した。切片は、ＤＡＰＩを用いて染色した。スライドはＬｅｉｃａ  ＡＦ６０００を用いて観察した。【００５１】
１０．統計解析
実験結果は平均±ｓ．ｅ．ｍ．で示す。グループ間の統計学的な差は、対応のないスチューデントｔ検定を用いて決定した。２者間以上のグループ間の統計学的な比較は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）を使用した。Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意とした。全てのデータはＧｒａｐｈ−ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。【００５２】
［参考例１］胃における各種ＩＬＣの存在割合の検討
ＳＰＦマウスの小腸は２％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地で１ｍｇ／Ｌの濃度に調整したＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（Ｗａｋｏ）を使用し、大腸も同様に１ｍｇ／Ｌ濃度に調整したＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（ＳＩＧＭＡ）中で３７℃，１５分間攪拌した。１５分後に上清のみを回収し、その後残った腸断片にＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅを加えて同様の作業を２回繰り返し行い上清を回収した。回収した上清は１００μｍ Ｃｅｌｌｓｔｒａｉｎｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてろ過を行い、遠心分離後リンパ球単離に使用した。細胞懸濁液の遠心分離後、４ｍｌの４０％Ｐｅｒｃｏｌｌに懸濁し１５ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎ  ｔｕｂｅに移した後、パスツールピペットを用い等量の７０％  Ｐｅｒｃｏｌｌをゆっくり加えて下方へ重層させ、２０００ｒｐｍ，２０℃で２０分間遠心分離を行った。遠心分離後は、密度勾配によって生じた中間層を採取し２％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁することでリンパ球を単離した。一方、胃から回収した細胞は４０μｍ  Ｃｅｌｌｓｔｒａｉｎｅｒを用いてろ過を行うことで粘液などを取り除いた。【００５３】
上述の手法により回収したリンパ球を適量の２％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地で懸濁し、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅ（９６  Ｗｅｌｌ，Ｆｌａｔ  Ｂｕｔｔｏｍ  ｗｉｔｈ  Ｌｏｗ  Ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｌｉｄ，ＦＡＬＣＯＮ）に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種した。遠心分離後、１／５００量のＺｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）とＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒ（２％ＦＢＳ／Ｄ−ＰＢＳ（−））にて最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌに調整したＰｕｒｉｆｉｅｄ  Ｒａｔ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＣＤ１６／ＣＤ３２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し４℃で１５分間静置してブロッキングと死細胞の染色を行った。その後Ｆａｃｓ  ｂｕｆｆｅｒにて細胞を洗浄し、遠心分離後にそれぞれの抗体希釈液（ＣＤ３、ＣＤ４５、ＴＣＲｂ、ＣＤ１９、ＣＤ１２７、ＣＤ９０．２）を細胞に添加して４℃で２０分間静置させ、細胞表面に発現されている抗原を蛍光標識された抗体で染色した。【００５４】
細胞内に発現している抗原に関しては、細胞内染色法により染色を行った。細胞表面抗体により染色後、Ｄ−ＰＢＳ（−）で細胞を洗浄した。遠心分離後、Ｆｉｘａｔｉｏｎ／  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ液（Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加して、遮光状態下にて４℃で３０分間静置することで細胞固定と細胞膜透過を行った。細胞固定後Ｄ−ＰＢＳ（−）で細胞洗浄を行い、遠心分離にて上清を除去した。次に、Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  （Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で再度細胞の洗浄を行った。遠心分離後Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒで希釈したそれぞれの核内染色抗体（ＧＡＴＡ３およびＲＯＲｇｔ）を各ｗｅｌｌに添加し、遮光をした状態で４℃で３０分静置し染色を行った。染色後はＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒとＦａｃｓ  ｂｕｆｆｅｒで細胞洗浄後、ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒに適量懸濁しフローサイトメトリー解析に使用した。染色細胞はＦＡＣＳＡｒｉａIII（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、フローサイトメトリー解析を行った。得られたデータの解析は、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ）を使用し行った。取得したフローサイトメトリー結果は、ＣＤ３、ＴＣＲｂ、ＣＤ１９を発現しておらずＣＤ４５を発現する細胞集団のみを示している。【００５５】
図１に示される通り、小腸と比較して、胃ではＩＬＣ２が極めて優勢（ＩＬＣ１：５％、ＩＬＣ２：９４％、ＩＬＣ３：０．６％）であることが示された。【００５６】
［参考例２］胃ＩＬＣ２におけるＩＬ−３３Ｒａの発現の確認【００５７】
ＳＰＦマウスの小腸は２％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地で１ｍｇ／Ｌの濃度に調整したＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（Ｗａｋｏ）を使用し、大腸も同様に１  ｍｇ／Ｌ濃度に調整したＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（ＳＩＧＭＡ）中で３７℃，１５分間攪拌した。１５分後に上清のみを回収し、その後残った腸断片にＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅを加えて同様の作業を２回繰り返し行い上清を回収した。回収した上清は１００μｍ  Ｃｅｌｌｓｔｒａｉｎｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてろ過を行い、遠心分離後リンパ球単離に使用した。細胞懸濁液の遠心分離後、４ｍｌの４０％Ｐｅｒｃｏｌｌに懸濁し１５ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎ  ｔｕｂｅに移した後、パスツールピペットを用い等量の７０％  Ｐｅｒｃｏｌｌをゆっくり加えて下方へ重層させ、２０００ｒｐｍ，２０℃で２０分間遠心分離を行った。遠心分離後は、密度勾配によって生じた中間層を採取し２％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁することでリンパ球を単離した。一方、胃から回収した細胞は４０μｍ  Ｃｅｌｌｓｔｒａｉｎｅｒを用いてろ過を行うことで粘液などを取り除いた。【００５８】
上述の手法により回収したリンパ球を適量の２％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地で懸濁し、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅ（９６Ｗｅｌｌ，  Ｆｌａｔ  Ｂｕｔｔｏｍ  ｗｉｔｈ  Ｌｏｗ  Ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｌｉｄ，ＦＡＬＣＯＮ）に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種した。遠心分離後、１／５００量のＺｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）とＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒ（２％ＦＢＳ／Ｄ−ＰＢＳ（−））にて最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌに調整したＰｕｒｉｆｉｅｄ  Ｒａｔ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＣＤ１６／ＣＤ３２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し、４℃で１５分間静置してブロッキングと死細胞の染色を行った。その後Ｆａｃｓ  ｂｕｆｆｅｒにて細胞を洗浄し、遠心分離後に表３または４に沿ってそれぞれの抗体希釈液（ＣＤ３、ＣＤ４５、ＴＣＲｂ、ＣＤ１９、ＣＤ１２７、ＣＤ９０．２、Ｓｃａ１、ＫＬＲＧ１およびＩＬ３３Ｒａ）を細胞に添加して４℃で２０分間静置させ、細胞表面に発現されている抗原を蛍光標識された抗体で染色した。取得したフローサイトメトリー結果は、ＣＤ３、ＴＣＲｂ、ＣＤ１９を発現しておらずＣＤ４５を発現する細胞集団のみを示している。ＩＬ３３Ｒａの発現は、さらにＳｃａ１、ＫＬＲＧ１を共に発現する細胞に関して示している。【００５９】
図２に示される通り、ＩＬ−３３Ｒａは小腸ＩＬＣ２と比較して、胃ＩＬＣ２において高発現していることが示された（ＳＩ  ＬＰＬ：５．６、Ｓｔｏｍａｃｈ：２４）。【００６０】
［実施例１］共生細菌による胃ＩＬＣ２への影響の検討
ＳＰＦマウスおよび無菌（ＧＦ）マウスの小腸は２％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地で１ｍｇ／Ｌの濃度に調整したＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（Ｗａｋｏ）を使用し、大腸も同様に１ｍｇ／Ｌ濃度に調整したＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（ＳＩＧＭＡ）中で３７℃，１５分間攪拌した。１５分後に上清のみを回収し、その後残った腸断片にＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅを加えて同様の作業を２回繰り返し行い上清を回収した。回収した上清は１００μｍ  Ｃｅｌｌｓｔｒａｉｎｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてろ過を行い、遠心分離後リンパ球単離に使用した。細胞懸濁液の遠心分離後、４ｍｌの４０％Ｐｅｒｃｏｌｌに懸濁し１５ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎ  ｔｕｂｅに移した後、パスツールピペットを用い等量の７０％  Ｐｅｒｃｏｌｌをゆっくり加えて下方へ重層させ、２０００ｒｐｍ、２０℃で２０分間遠心分離を行った。遠心分離後は、密度勾配によって生じた中間層を採取し２％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁することでリンパ球を単離した。一方、胃から回収した細胞は４０μｍ  Ｃｅｌｌｓｔｒａｉｎｅｒを用いてろ過を行うことで粘液などを取り除いた。【００６１】
上述の手法により回収したリンパ球を適量の２％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地で懸濁し、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅ（９６  Ｗｅｌｌ，  Ｆｌａｔ  Ｂｕｔｔｏｍ  ｗｉｔｈ  Ｌｏｗ  Ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｌｉｄ，ＦＡＬＣＯＮ）に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種した。遠心分離後、１／５００量のＺｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）とＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒ（２％ＦＢＳ／Ｄ−ＰＢＳ（−））にて最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌに調整したＰｕｒｉｆｉｅｄ  Ｒａｔ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＣＤ１６／ＣＤ３２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し４℃で１５分間静置してブロッキングと死細胞の染色を行った。その後Ｆａｃｓ  ｂｕｆｆｅｒにて細胞を洗浄し、遠心分離後に表３または４に沿ってそれぞれの抗体希釈液（ＣＤ３、ＣＤ４５、ＴＣＲｂ、ＣＤ１９、ＣＤ１２７、ＣＤ９０．２、Ｓｃａ１、ＫＬＲＧ１およびＩＬ３３Ｒａ）を細胞に添加して４℃で２０分間静置させ、細胞表面に発現されている抗原を蛍光標識された抗体で染色した。取得したフローサイトメトリー結果は、ＣＤ３、ＴＣＲｂ、ＣＤ１９を発現しておらずＣＤ４５を発現する細胞集団のみを示している。ＩＬ３３Ｒａの発現は、さらにＳｃａ１、ＫＬＲＧ１を共に発現する細胞（即ち、ＩＬＣ２）に関して示している。【００６２】
図３に示される通り、ＳＰＦマウスとＧＦマウスでは、胃ＩＬＣ２の存在量が大きく異なっており、共生細菌が胃ＩＬＣ２の存在量に影響を与えることが示された。【００６３】
［実施例２］共生細菌による胃ＩＬＣ２の機能への影響の検討
上述した手法により回収したリンパ球は１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地にＬ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを加えたＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、一部サイトカイン産生確認に使用した。リンパ球は１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるようにＴｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅ（９６Ｗｅｌｌ，Ｆｌａｔ  Ｂｕｔｔｏｍ  ｗｉｔｈ  Ｌｏｗ  Ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｌｉｄ）に播種した。無刺激またはＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩｏｎｏｍｙｃｉｎ（１iｇ／ｍｌ）と共に、細胞内タンパク質輸送阻害剤であるＧｏｌｇｉ  Ｐｌｕｇ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し、３７℃、２５％ＣＯ２インキュベータ内で２時間静置した。２時間の静置後に遠心分離を行い、上述同様に細胞表面分子の染色を行った。染色した細胞はＤ−ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、遠心分離後４％ＰＦＡ／Ｄ−ＰＢＳ（−）を添加して常温、１５分間静置し細胞固定を行った。遠心分離後、Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒで細胞を洗浄した。透過処理後、それぞれのＩＬ−５とＩＬ−１３抗体をＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒで希釈し、その希釈液を各ｗｅｌｌに添加し、遮光をした状態で４℃で６０分静置し染色を行った。染色細胞はＦＡＣＳＡｒｉａIII（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、フローサイトメトリー解析を行った。得られたデータの解析は、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ）を使用し行った。図４は、ＣＤ３、ＴＣＲｂ、ＣＤ１９を発現せず、ＣＤ４５、Ｓｃａ１、ＫＬＲＧ１を発現する細胞（即ち、ＩＬＣ２）についてＩＬ−５とＩＬ−１３の産生について比較を行った。【００６４】
図４に示される通り、ＳＰＦマウスとＧＦマウスでは、ＩＬ−５およびＩＬ−１３発現細胞の存在量に大きな差があることが示された。また、胃において、ＩＬＣ２以外のＩＬ−５および／またはＩＬ−１３を主に産生する細胞であるＴ細胞およびＢ細胞の細胞数には差がないことが確認された（図４（ｃ）および（ｄ））。即ち、共生細菌の存在の有無が、Ｔ細胞やＢ細胞には影響を与えず、胃におけるＩＬＣ２の数およびその機能にのみ影響を与えることが示された。【００６５】
［実施例３］胃由来微生物叢の経口摂取による胃ＩＬＣ２の誘導
ＳＰＦマウスの胃内容物および胃の粘膜組織をこすり取り、ＰＢＳで懸濁後に１００μｍ  Ｃｅｌｌｓｔｒａｉｎｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてろ過し計３ｍｌに調整して、そのうち３００μｌを経口投与した。一回の投与を行ったマウスと、一週間に１回を４度繰り返したマウスは、最後の経口投与から１週間後に同時に解析に使用した。経口投与を行ったマウスおよびコントロールとして無菌マウスから胃を摘出し、細胞内サイトカイン産生検出法を用いて実験をおこなった。上述した手法により回収したリンパ球は１０％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地にＬ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを加えたＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、一部サイトカイン産生確認に使用した。リンパ球は１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるようにＴｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅ（９６Ｗｅｌｌ，Ｆｌａｔ  Ｂｕｔｔｏｍ  ｗｉｔｈ  Ｌｏｗ  Ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｌｉｄ）に播種した。回収したリンパ球は、細胞内タンパク質輸送阻害剤であるＧｏｌｇｉ  Ｐｌｕｇ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し、３７℃、２５％ＣＯ２インキュベータ内で２時間静置した。２時間の静置後に遠心分離を行い、上述同様に細胞表面分子の染色を行った。染色した細胞はＤ−ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、遠心分離後４％ＰＦＡ／Ｄ−ＰＢＳ（−）を添加して常温、１５分間静置し細胞固定を行った。遠心分離後、Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒで細胞を洗浄した。透過処理後、それぞれのＩＬ−５とＩＬ−１３抗体をＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒで希釈し、その希釈液を各ｗｅｌｌに添加し、遮光をした状態で４℃で６０分静置し染色を行った。染色細胞はＦＡＣＳＡｒｉａIII（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、フローサイトメトリー解析を行った。得られたデータの解析は、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ）を使用し行った。図５（ａ）は、本実施例の概要を示す図である。図５（ｂ）および（ｄ）は、ＣＤ３、ＴＣＲｂ、ＣＤ１９を発現せず、ＣＤ４５、Ｓｃａ１、ＫＬＲＧ１を発現する細胞（即ち、ＩＬＣ２）について、ＩＬ−５またはＩＬ−１３産生を、ＦＡＣＳを用いて比較し（図５（ｂ））、さらに定量した（図５（ｄ））図である。図５（ｃ）は、経口摂取の回数と細胞数の関係を示す図である。【００６６】
図５に示される通り、ＳＰＦマウスの胃由来の内容物および／または粘液をＧＦマウスに経口摂取させると、摂取回数に比例して、ＧＦマウスの胃における細菌存在量が増加し、且つ、ＩＬ−５またはＩＬ−１３を分泌する細胞（即ち、ＩＬＣ２）の細胞数が増加した。これは、ＳＰＦマウスの胃由来の内容物および／または粘液に含まれる共生細菌がＧＦマウスの胃に生着することで、ＧＦマウスの胃におけるＩＬＣ２が誘導されたことを示す。換言すれば、図５の結果は、胃の共生細菌がＩＬＣ２の数及びその機能に影響を与えることを示すものといえる。【００６７】
［実施例４］胃由来微生物叢の経口摂取による細菌叢の解析
糞便、胃内容物および胃粘膜層を経口投与したマウスの菌叢解析を行った。糞便および胃内容物は１０ｍｇを測り取りＤＮＡ抽出に使用した。１０ｍｇの糞便サンプルに４５０μｌのＴｒｉｓ−１０×ＥＤＴＡ（１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を添加後ｖｏｒｔｅｘで懸濁し、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｓｔｏｃｋ（ｗａｋｏ）３００ｍｇ／ｍｌを２５μｌ添加、３７℃で１時間、１０００ｒｐｍで振盪させながらインキュベートした。その後Ａｃｈｒｏｍｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｓｔｏｃｋ（ｗａｋｏ）２０，０００Ｕ／ｍｌを５５μｌ添加し、３７℃で０．５時間、１０００ｒｐｍで振盪させながらインキュベートした。１０％ＳＤＳを６１．５μｌ添加し、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  ｓｔｏｃｋ（メルク）２５ｍｇ／ｍｌを２５．７μｌ添加した後、５５℃で１時間、１０００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。６５０μｌのｐｈｅｎｏｌ／ＣＨＣｌ３／ＩＡＡ（ナカライ）を添加し、５分間ｒｏｔａｔｏｒで振盪させた。その後１３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清に６５０μｌのｐｈｅｎｏｌ／ＣＨＣｌ３／ＩＡＡを添加し、５分間ｒｏｔａｔｏｒで振盪させた。その後１３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を３００μｌ回収した。回収した上清に５０μｌの３Ｍ−ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ナカライ）、１０００μｌの１００％ＥｔＯＨを添加し懸濁した。−２０℃で静置した後、１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心後上清を吸引しＰｅｌｌｅｔに７０％ＥｔＯＨを１０００μｌ添加した。その後再び１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心分離後Ｐｅｌｌｅｔを４０℃で１０分間乾燥させ、２５０μｌのＴＥに懸濁した。２５０μｌのうち２００μｌにＲＮａｓｅ（１０ｍｇ／ｍｌ）を２μｌ添加し、３７℃、１時間インキュベートした。２００μｌの１０％ＰＥＧ６０００−２．５Ｍ  ＮａＣｌを添加し、３０分間インキュベートした。１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間遠心分離し上清を取り除いた後１０００μｌの７０％ＥｔＯＨで洗浄した後再び１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間遠心分離し上清を取り除いた後Ｐｅｌｌｅｔを４０℃で１０分間乾燥させた。その後５０  μｌのＴＥに懸濁し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ）でＤＮＡ濃度を測定した。抽出したＤＮＡは５ｎｇ／μｌに希釈し、５１５Ｆ（ＧＴＧＣＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ：配列番号２６）と８０６Ｒ（ＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ：配列番号２７）のプライマーを使用して１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ４領域を増幅させた。ＰＣＲ産物はＡＭＰｕｒｅ  ｂｅａｄｓを用いて精製し、Ｎｅｘｔｒａ  ＸＴ  Ｉｎｄｅｘ  Ｋｉｔ  ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてＰＣＲ反応でバーコード配列を付与した。ＰＣＲの後再びＡＭＰｕｒｅ  ｂｅａｄｓを用いてＰＣＲ産物を精製し、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＤＮＡ濃度を測定した。濃度測定の結果から全サンプルを１ｎｇ／μｌに希釈し、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）でＤＮＡのサイズと濃度を確認後ＫＡＰＡ  ｑＰＣＲを行った。Ｍｉｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）により遺伝子配列をシーケンスし、パッケージソフトウェアＱＩＩＭＥ（ｈｔｔｐ：／／ｑ���ｉｍｅ．ｏｒｇ／）を使って得られた遺伝子配列を９７％の配列類似度でクラスタリングしＯｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）を作成した後、得られたＯＴＵをＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ）を用いてデータベース検索し細菌種を同定した。【００６８】
図６に示される通り、ＳＰＦマウスの胃由来の内容物および／または粘液を経口摂取させるにつれ、ＧＦマウスの胃および糞便中には、Ｓ２４−７科に属する細菌の存在量が増加することが示された。即ち、Ｓ２４−７科に属する細菌量の胃における増加が、胃におけるＩＬＣ２の誘導に大きな影響を与える可能性が示された。【００６９】
［実施例５］胃ＩＬＣ２の誘導に影響を与える共生細菌群の同定１
ＳＰＦコンディションのマウスに、飲料水にアンピシリン（０．１ｇ／Ｌ）、コリスチン（１ｇ／Ｌ）、ネオマイシン（１ｇ／Ｌ）、メトロニダゾール（１ｇ／Ｌ）またはバンコマイシン（０．５ｇ／Ｌ）を添加し、３週間、経口的に摂取させた。対照とするＳＰＦ条件のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスまたは抗生物質処理マウスの胃からリンパ球を回収し、上述の手順にてフローサイトメトリー解析をおこなった。【００７０】
図７に示される通り、アンピシリン（Ａｍｐ）、コリスチン（Ｃｏｌｉｓｔｉｎ）、ネオマイシン（Ｎｅｏ）、メトロニダゾール（ＭＮＺ）を摂取させたマウスにおいては、対照（ＳＰＦ）と比較して胃ＩＬＣ２の細胞数に大きな変化は見られなかった。一方で、バンコマイシンを摂取させたマウスにおいては、胃ＩＬＣ２の細胞数が減少していた。従って、胃ＩＬＣ２の誘導に影響を与える共生細菌は、アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、メトロニダゾールには耐性を有するが、バンコマイシンに対しては感受性であることが示された。【００７１】
［実施例６］胃ＩＬＣ２の誘導に影響を与える共生細菌群の同定２
Ｍｉｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）により遺伝子配列をシーケンスし、パッケージソフトウェアＱＩＩＭＥ（ｈｔｔｐ：／／ｑｉｉｍｅ．ｏｒｇ／）を使って得られた遺伝子配列を９７％の配列類似度でクラスタリングしＯｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）を作成した後、得られたＯＴＵをＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ）を用いてデータベース検索し細菌種を同定した。菌叢情報は上述の方法にて適切に正規化を行い、それぞれの抗生物質投与群に関して、各種菌叢が占める割合を算出した。結果を図８に示す。【００７２】
図８に示される通り、バンコマイシンに対しては感受性であり、且つ、アンピシリン、コリスチン、ネオマイシン、メトロニダゾールに対して耐性を有する共生細菌には、Ｓ１４−７科に属する細菌が含まれることが示された。【００７３】
［実施例７］Ｓ２４−７の局在の検討
マウスから摘出したサンプルにカルノア固定液（６０％メタノール、３０％クロロフォルム、１０％無水酢酸）を１ｍｌ加えて、６時間固定した。固定後は１ｍｌメタノールに置換し、３０分室温に静置した。３０分後にもう一度メタノールを加え３０分室温に静置した。３０分後、脱水したエタノールに交換し２０分室温で静置した。サンプルをカセットにいれＬａｉｃａ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒでエタノール（１時間）キシレン（２時間・３回）パラフィン（３時間・３回）のプログラムを行い、プログラム終了後パラフィンに包埋した。ブロックは５ｕｍに薄切しスライドガラスに貼り付けた。３７℃で伸張したあと、６０℃のオーブンに１０分間いれて乾燥させた。キシレンにスライドガラスを入れ１０分間ひたし、その後９９．５％エタノールにスライドガラスを５分間いれた。その後風乾させた。プローブを１０ｎＭになるように予め温めたハイブリ緩衝液（０．９Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ｐＨ７．４  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、０．１％ＳＤＳ）で希釈した。サンプルに重層し４８℃で２時間反応させた。反応終了後、ハイブリ緩衝液（０．９Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ｐＨ７．４  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、１０％フォルムアミド）を１００μｌのせ、４８℃で５分間反応させた。反応終了後、ＰＢＳで３回洗浄し、Ｌａｉｃａ  ＳＰ８にて検出を行った。【００７４】
なお、上記で用いたプローブの作成は以下の通り行った。対照（ＳＰＦマウス）、アンピシリン処理マウス、コリスチン処理マウス、ネオマイシン処理マウス、メトロニダゾール処理マウスでは減少していないが、バンコマイシン処理マウスにおいては減少している細菌を決定するため、これらの胃内容物に付着する細菌の核酸配列量を、Ｍｉｓｅｑ（イルミナ社）を用いて決定した。解析の結果、Ｓ２４−７科に属する細菌が有する配列がこの条件を満たすことを確認した（１１種類の配列を決定した）。これら１１種類の配列に共通する核酸配列（配列番号１）を決定した。配列番号１の３’末端を蛍光タンパク質（Ａ５５５）で標識してプローブを作成した。結果を図９に示す。【００７５】
図９に示される通り、Ｓ２４−７は胃の上皮に存在することが示された。本結果からも、Ｓ２４−７が胃に生着して細菌叢を構成し、胃におけるＩＬＣ２の誘導に大きな影響を与えていることが強く示唆された。【００７６】
［実施例８］胃におけるＩＬＣ２の細胞数とＳ２４−７の個体数の相関関係についての検討
ＳＰＦコンディションのマウスに、飲料水にアンピシリン（０．１ｇ／Ｌ）、コリスチン（１ｇ／Ｌ）、ネオマイシン（１ｇ／Ｌ）、メトロニダゾール（１ｇ／Ｌ）またはバンコマイシン（０．５ｇ／Ｌ）を添加し、３週間、経口的に摂取させた。その後、マウスの胃内容物および糞便を回収し、実施例４および６で示された通りに解析した。また、同時期に胃から回収したリンパ球を上述の手順の通りフローサイトメトリー解析を行った。菌叢解析により得られたそれぞれの菌数について１％以上の値を上限として、菌種（科）とフローサイトメトリー解析結果との相関図をヒートマップおよびスキャッタープロットとして作成した。【００７７】
図１０に示される通り、Ｓ２４−７の細菌の個体数と、ＩＬＣ２の細胞数とには強い正の相関関係が示された（ｒ＝０．８、ｐ＝０．０３）。一方で、Ｓ２４−７科以外の細菌の個体数とＩＬＣ２の細胞数との間にはそのような関係は認められなかった。本結果から、Ｓ２４−７の細菌が、胃におけるＩＬＣ２の増加を誘導することが示された。【００７８】
［実施例９］ヘリコバクターピロリの感染に対する免疫応答の詳細な検討
無菌マウスは１ｘ１０９ＣＦＵ／３００μｌ  ＰＢＳに調整したものを経口投与した。ヘリコバクターピロリ数が最も多い時期である感染２週間後と胃に炎症症状を呈する９週間後について検討した。バクテリア結合性ＩｇＡは上述の方法で検出を行った。つぎに感染後２週間および９週間後の胃を摘出し、胃を開いてＰＢＳで内容物を軽く洗浄後、組織を凍結破砕した。粉末状にした胃にＱＩＡＧＥＮ  ＲＮＡｅａｓｙ  ｋｉｔに添付されているＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、添付プロトコルに従ってＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ酵素を用いて逆転写しｃＤＮＡを得た。ｃＤＮＡはｐＩｇＲ特異的プライマーを用いて、定量的ＰＣＲを行い検討した。また、感染後２週間の胃は上述した細胞内サイトカイン産生プロトコルに従い無菌マウスと比較検討した。結果を図１１−Ａから図１１−Ｃに示す。【００７９】
ヘリコバクターピロリの感染を確認するため、該細菌が分泌するCagAタンパク質を検出を行ったところ、感染後2週間の時点においては明確な存在が確認された一方で、感染後9週間の時点では該タンパク質は検出されず、また、小腸（SI）においてはいかなる時点においてもCagAタンパク質は検出されなかった（（図１１−Ａ（ａ））。また、ヘリコバクターピロリ感染マウスにおける胃中ＩＬＣ２の細胞数は、感染後２週間の時点で最大化した（図１１−Ａ（ｂ）、図１１−Ｂ（ａ）および（ｂ））。一方で、図１１−Ａ（ｃ）に示される通り、胃におけるＰＭＳＳ１  ＣＦＵは感染後１週間の時点でピークとなった。Ｂ細胞は感染後２週間の時点で有意に増加しており、且つ、感染後９週間の時点において細胞数は増加したままを維持していた。一方で、Ｔ細胞は感染後３週間の時点まで増加しなかった（図１１−Ａ（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および図１１−Ｂ（ｃ））。また、感染後２週間の時点において、ＩＬ−５またはＩＬ−１３を発現するＩＬＣ２が顕著に増加していた（図１１−Ｃ（ａ）および（ｂ））。感染後２週間の時点では、胃組織中のＩＬ−３３の産生量が顕著に増加しており（図１１−Ｃ（ｃ））、ヘリコバクターピロリへの応答免疫として、ＩＬＣ２によるサイトカイン産生が重要であることが強く示唆された。さらに、ヘリコバクターピロリ感染ＧＦマウスを抗ＩＬ−５抗体で処理すると、胃におけるＣＤ１９−Ｂ２２０−ＩｇＡ＋プラズマＢ細胞およびＣＤ１９＋Ｂ２２０−ＩｇＡ＋プラズマブラストＢ細胞が、感染後２週間の時点で大きく減少し（図１１−Ｃ（ｄ）および（ｅ））、付随して胃組織におけるＩｇＡ分泌の低下がもたらされることが示された（図１１−Ｂ（ｄ））。図１１−Ｂ(ｅ)に示される通り、ヘリコバクターピロリに結合するＩｇＡは感染後２週間の時点で最も高くなり、その後減少した。感染後９週間の時点におけるヘリコバクターピロリの顕著な減少は、ＩｇＡによる該細菌のクリアランスによるものであると考えられる。また、図１１−Ｃ（ｆ）に示される通り、ＩｇＡを分泌型にする際に重要なｐＩｇＲは、腸管での発現量と比較して胃における発現量が増強しており、これもまたヘリコバクターピロリの排除にＩｇＡが関与していることを間接的に示す証拠と考えられる。【００８０】
以上から、ヘリコバクターピロリの感染に対して、次のような防御応答が起こることが示唆される：（１）胃組織によりＩＬ−３３の産生、（２）ＩＬ−３３によるＩＬＣ２の活性化、（３）ＩＬＣ２によるＩＬ−５および／またはＩＬ−１３の産生、（４）ＩＬＣ２により産生されたＩＬ−５および／またはＩＬ−１３によるＢ細胞の活性化、（５）Ｂ細胞によるＩｇＡの産生、並びに、（６）ＩｇＡによるヘリコバクターピロリへの結合およびクリアランス。【００８１】
［実施例１０］バンコマイシン処理マウスの胃におけるバクテリア結合ＩｇＡ量の検討
バンコマイシン投与を３週間行ったマウスおよびコントロールとしてＳＰＦマウスの胃内容物と胃粘液層を上述の方法で回収した。回収したサンプルは１ｇに対して１ｍｌの無菌ＰＢＳを加え良く懸濁した後、８０００ｇで５分遠心を行った。上清をバクテリア層として回収し、再度１５０００ｇで１５分遠心を行った。沈殿物をＩｇＡが結合したバクテリアとして回収し、１％ＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄後、２．４Ｇ２抗体で１５分ブロッキングを行った。１％ＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄後、蛍光色素であるＰＥを結合した抗ＩｇＡ抗体で４度、３０分染色した。染色後はＰＢＳで３度洗浄し、ＤＡＰＩで５分染色し、最後にもう一度ＰＢＳにて洗浄してフローサイトメトリー解析を行った。【００８２】
図１２に示される通り、対照（バンコマイシン未処理のＳＰＦマウス）と比較して、バンコマイシン処理したＳＰＦマウスの胃内容物および胃粘液（バイオフィルム）においては、バクテリアに結合しているＩｇＡ量の減少が示された。これは即ち、バンコマイシン処理により胃におけるＳ２４−７の固体数が減少し、付随してＩＬＣ２の細胞数が減少する。ＩＬＣ２の減少により、ＩＬ−５および／またはＩＬ−１３の産生量が低下し、Ｂ細胞の活性化が低減される。その結果、胃において分泌されるＩｇＡ量が減少したと考えられる。従って、本実施例は、Ｓ２４−７科の共生細菌が胃における分泌型ＩｇＡ量に直接的に影響を与え得ることを実証するものである。【００８３】
［実施例１１］Muribaculum intestinaleによる胃ＩＬＣ２およびＩｇＡの誘導
Ｔｙｐｅ  ｓｔｒａｉｎであるＭｕｒｉｂａｃｕｌｕｍ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅ（「ＹＬ２７」とも称する）を１ｘ１０８ＣＦＵ/マウスをＧＦマウスに一度だけ経口投与で感染させ、２週間後に当該感染マウスを解剖して、胃の細胞を、フローサイトメトリーで解析した。本実験の概要を図１３（ａ）に、実験結果を図１３（ｂ）〜（ｄ）にそれぞれ示す。【００８４】
図１３に示される通り、ＹＬ２７を感染させたＧＦマウスでは、胃に存在するＩＬＣ２が有意に増加していた。また、２型のサイトカイン（ＩＬ−５およびＩＬ−１３）も増加していた。従って、ＹＬ２７は、胃におけるＩＬＣ２を誘導することができる細菌であることが示された。【００８５】
さらに、感染したマウスの胃の組織におけるｐｌｇＲの発現をｑＰＣＲで確認した。同時に、胃内容物および糞便に含まれるＩｇＡの量をＥＬＩＳＡで確認した。結果を図１４に示す。【００８６】
図１４に示される通り、Ｙ２７に感染したマウスの胃の組織においては、ｐｌｇＲの発現量が有意に増加していた（図１４（ａ））。また、Ｙ２７に感染したマウスの胃内容物および糞便のいずれにおいても、ＩｇＡ量が増加していた。【００８７】
［実施例１２］胃におけるＹＬ２７の存在の確認
ＹＬ２７を感染させたマウスの胃において、当該ＹＬ２７が存在することを確認した。Ｙ２７の１６ｓ  ｒＲＮＡの３３８−３５５を検出するプローブ（ＥＵＢ３３８（５'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-３'：配列番号２９）に、蛍光色素（Ａｌｅｘａ４８８）を結合させ、ＦＩＳＨ法（プロトコールの詳細は上記参照）によりＹＬ２７の胃における存在を確認した。結果を図１５に示す。【００８８】
図１５に示される通り、ＹＬ２７感染マウスの胃中には、ＹＬ２７が存在することが示された。【００８９】
［実施例１３］ＹＬ２７によるピロリ菌の感染予防効果の検討
無菌マウスにＹＬ２７（１ｘ１０８／ｍｏｕｓｅ）を経口投与した。該投与後１週間の時点において再度ＹＬ２７（１ｘ１０８／ｍｏｕｓｅ）を投与した。２回目のＹＬ２７の投与の翌日に、ピロリ菌を経口感染させた。ピロリ菌感染後２週間の時点で感染マウスを解剖し、（１）感染マウスの胃内容物又は糞便におけるＩｇＡ産生量、（２）感染マウスの胃におけるｐＩｇＲのｍＲＮＡ発現量、及び、（３）感染マウスの胃組織中のピロリ菌量を解析した。尚、（１）および（２）に用いた解析方法は上述のとおりである。また、（３）の解析方法の概要は次の通りである：ピロリ菌感染後２週間の時点のマウスを屠殺し、胃を採取した。採取した胃から内容物を取り除き、胃組織の重量を測定後にハサミで細断し、ピロリ菌(ＰＭＳＳ１)培養液体培地に懸濁した。懸濁液はしばらく静置して、次いで大きな組織を除いた後に、ピロリ菌培養用寒天培地（ＢＤ  ＢＢＬＰｌａｔｅ)で２日間培養した。【００９０】
本実施例の実験スケジュールの概要を図１６に示し、（１）〜（３）の結果を図１７〜１９にそれぞれ示す。【００９１】
図１７に示される通り、ＩｇＡ産生量は、胃内容物では有意差はないもののＩｇＡ量は増加しており、糞便中のＩｇＡ量は有意に増加していた。また、図１８に示される通り、胃組織におけるｐＩｇＲ発現も、ＹＬ２７の感染前投与により有意に発現が誘導されていた。【００９２】
さらに、図１９に示される通り、ＹＬ２７を事前に投与したマウスでは、対照と比較して有意に胃に存在するピロリ菌数が減少していた。【００９３】
以上の結果から、ＹＬ２７はピロリ菌感染を抑制し得ることが示された。換言すれば、ＹＬ２７の摂取により、ピロリ菌感染を予防し得ることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明によれば、対象における胃において免疫担当細胞の一種であるＩＬＣ２の発現を誘導することができる。誘導されたＩＬＣ２はＩＬ−５やＩＬ−１３等のサイトカインを産生／分泌し、胃に存在するＢ細胞を刺激する。刺激されたＢ細胞は抗体産生細胞に分化し、その結果として対象の胃におけるＩｇＡ産生が誘導・亢進され、ピロリ菌をはじめとする経口感染症の治療および／または予防することができる。従って、本発明は、医薬分野等において非常に有用である。【００９５】
本出願は、日本で出願された特願２０１８−１８９４８９（出願日：２０１８年１０月４日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−Ａ】
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【図１１−Ｂ】
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【図１１−Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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