(57)【要約】  対象生物において効率的にRNAサイレンシングを誘導する方法を提供する。RNAサイレンシング用のRNAの生産能を有する微生物の菌体を有機溶媒で処理してから対象生物に摂取させることにより、対象生物においてRNAサイレンシングを誘導する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象生物においてRNAサイレンシングを誘導する方法であって、
微生物の死菌体を対象生物に摂取させる工程を含み、
前記微生物が、RNAサイレンシング用のRNAの生産能を有し、
前記死菌体が、有機溶媒による処理に供されており、
前記死菌体が、RNAサイレンシング用のRNAを含有する、方法。
【請求項２】
前記工程の前に、さらに、前記微生物の菌体を前記処理に供することにより前記死菌体を調製する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記死菌体を、前記RNAの量に換算して、１０pg-RNA／個体〜１０μg-RNA／個体の量で前記対象生物に摂取させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
対象生物におけるRNAサイレンシング誘導用の組成物の製造方法であって、
前記微生物の菌体を有機溶媒による処理に供することにより死菌体を調製する工程を含み、
前記組成物が、前記死菌体を含有し、
前記微生物が、RNAサイレンシング用のRNAの生産能を有し、
前記死菌体が、RNAサイレンシング用のRNAを含有する、方法。
【請求項５】
前記有機溶媒が、アルコールである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記有機溶媒が、エタノールまたはメタノールである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記処理の際の前記有機溶媒の濃度が、該有機溶媒がエタノールである場合は３０％（ｖ／ｖ）以上であり、該有機溶媒がメタノールである場合は５０％（ｖ／ｖ）以上である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記処理が、１分以上実施される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物が、コリネ型細菌または腸内細菌科に属する細菌である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物が、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌またはエシェリヒア（Escherichia）属細菌である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）またはエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物が、非改変株と比較して、リボヌクレアーゼIIIの活性が低下するように改変されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象生物が、害虫である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
対象生物におけるRNAサイレンシング誘導用の組成物であって、
微生物の死菌体を含有し、
前記微生物が、RNAサイレンシング用のRNAの生産能を有し、
前記死菌体が、有機溶媒による処理に供されており、
前記死菌体が、RNAサイレンシング用のRNAを含有する、組成物。
【請求項１５】
前記有機溶媒が、アルコールである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記有機溶媒が、エタノールまたはメタノールである、請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記処理の際の前記有機溶媒の濃度が、該有機溶媒がエタノールである場合は３０％（ｖ／ｖ）以上であり、該有機溶媒がメタノールである場合は５０％（ｖ／ｖ）以上である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記処理が、１分以上実施される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記微生物が、コリネ型細菌または腸内細菌科に属する細菌である、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記微生物が、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌またはエシェリヒア（Escherichia）属細菌である、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）またはエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記微生物が、非改変株と比較して、リボヌクレアーゼIIIの活性が低下するように改変されている、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記対象生物が、害虫である、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象の生物においてRNAサイレンシングを誘導する方法に関する。
【技術背景】
【０００２】
害虫等の対象生物において、選択した遺伝子の機能発現を外部から提供されるRNAによって阻害する技術が知られている。当該技術は、例えば、RNAサイレンシングと呼ばれている。RNAサイレンシング用のRNAは、例えば、単独で、あるいは他の成分と組み合わせて、対象生物に提供することができる（特許文献１、非特許文献１）。また、RNAサイレンシング用のRNAは、例えば、Escherichia coli等の微生物で発現させ、そのRNAを含有する菌体を、そのまま、あるいは熱処置をしてから、対象生物に提供することができる（特許文献２〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】WO2010/140675
【特許文献２】US2013-0011372
【特許文献３】米国特許9,445,603
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Zhu F, et. al., Ingested RNA interference for managing the populations of the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Pest Manag Sci. 2011 Feb;67(2):175-82.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
RNAを自然界へ提供する場合は、UV等の電磁波による分解作用や酸化、または環境中のRNA分解酵素等により、そのRNAの構造安定性が問題となる場合がある。また、RNAを精製品として単離精製するためには大きなコストがかかる。一方、RNAを発現させた微生物の菌体を生きたまま利用する場合は、遺伝子組み換え生物の環境中への放出という点で生態系への悪影響が懸念される。更に、RNAを発現させた微生物の菌体を加熱（熱処理）により滅菌して利用する場合は、菌体に含有されるRNAが熱や菌体内での化学反応により極度に分解されてしまうという課題がある。【０００６】
本発明は、対象生物において効率的にRNAサイレンシングを誘導する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、RNAサイレンシング用のRNAの生産能を有する微生物の菌体を有機溶媒で処理してから対象生物に摂取させることで、当該対象生物において効率的にRNAサイレンシングを誘導することができることを見出し、本発明を完成させた。【０００８】
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
対象生物においてRNAサイレンシングを誘導する方法であって、
微生物の死菌体を対象生物に摂取させる工程を含み、
前記微生物が、RNAサイレンシング用のRNAの生産能を有し、
前記死菌体が、有機溶媒による処理に供されており、
前記死菌体が、RNAサイレンシング用のRNAを含有する、方法。
［２］
前記工程の前に、さらに、前記微生物の菌体を前記処理に供することにより前記死菌体を調製する工程を含む、前記方法。
［３］
前記死菌体を、前記RNAの量に換算して、１０pg-RNA／個体〜１０μg-RNA／個体の量で前記対象生物に摂取させる、前記方法。
［４］
対象生物におけるRNAサイレンシング誘導用の組成物の製造方法であって、
前記微生物の菌体を有機溶媒による処理に供することにより死菌体を調製する工程を含み、
前記組成物が、前記死菌体を含有し、
前記微生物が、RNAサイレンシング用のRNAの生産能を有し、
前記死菌体が、RNAサイレンシング用のRNAを含有する、方法。
［５］
前記有機溶媒が、アルコールである、前記方法。
［６］
前記有機溶媒が、エタノールまたはメタノールである、前記方法。
［７］
前記処理の際の前記有機溶媒の濃度が、該有機溶媒がエタノールである場合は３０％（ｖ／ｖ）以上であり、該有機溶媒がメタノールである場合は５０％（ｖ／ｖ）以上である、前記方法。
［８］
前記処理が、１分以上実施される、前記方法。
［９］
前記微生物が、コリネ型細菌または腸内細菌科に属する細菌である、前記方法。
［１０］
前記微生物が、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌またはエシェリヒア（Escherichia）属細菌である、前記方法。
［１１］
前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）またはエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である、前記方法。
［１２］
前記微生物が、非改変株と比較して、リボヌクレアーゼIIIの活性が低下するように改変されている、前記方法。
［１３］
前記対象生物が、害虫である、前記方法。
［１４］
対象生物におけるRNAサイレンシング誘導用の組成物であって、
微生物の死菌体を含有し、
前記微生物が、RNAサイレンシング用のRNAの生産能を有し、
前記死菌体が、有機溶媒による処理に供されており、
前記死菌体が、RNAサイレンシング用のRNAを含有する、組成物。
［１５］
前記有機溶媒が、アルコールである、前記組成物。
［１６］
前記有機溶媒が、エタノールまたはメタノールである、前記組成物。
［１７］
前記処理の際の前記有機溶媒の濃度が、該有機溶媒がエタノールである場合は３０％（ｖ／ｖ）以上であり、該有機溶媒がメタノールである場合は５０％（ｖ／ｖ）以上である、前記組成物。
［１８］
前記処理が、１分以上実施される、前記組成物。
［１９］
前記微生物が、コリネ型細菌または腸内細菌科に属する細菌である、前記組成物。
［２０］
前記微生物が、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌またはエシェリヒア（Escherichia）属細菌である、前記組成物。
［２１］
前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）またはエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である、前記組成物。
［２２］
前記微生物が、非改変株と比較して、リボヌクレアーゼIIIの活性が低下するように改変されている、前記組成物。
［２３］
前記対象生物が、害虫である、前記組成物。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】プラスミドpBS4SΔrncの構築手順を示す図。
【図２】プラスミドpVC7-sacBの構築手順を示す図。
【図３】プラスミドpVC7-Pf1-Hv-iapの構築手順を示す図。
【図４】プラスミドpVC7H2-Pf1-Hv-iap-Pf1revの構築手順を示す図。
【図５】目的RNAを保持するコリネ型細菌菌体をエタノール処理した後の菌体から抽出したRNAの非変性PAGEでの電気泳動結果を示す図（写真）。矢印は目的RNAの位置を示す。
【図６】目的RNAを保持するコリネ型細菌菌体をメタノール処理した後の菌体から抽出したRNAの非変性PAGEでの電気泳動結果を示す図（写真）。矢印は目的RNAの位置を示す。
【図７】ニジュウヤホシテントウへの投与実験に供した各種処理をしたコリネ型細菌菌体から抽出したRNAの電気泳動結果を示す図（写真）。C, Hv-iap RNAの非生産株2256ΔrncΔpAM330/pVC7H2; Hviap, Hv-iap RNAの生産株2256ΔrncΔpAM330/pVC7H2-Pf1-Hv-iap-Pf1rev。殺菌処理なし：菌体の殺菌処理を行わず、培養後の菌体をただちにRNAprotect Bacteria Reagent処理して抽出されたRNA。矢印は、目的RNAの泳動位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明においては、微生物の死菌体を利用する。同死菌体を、「有効成分」または「本発明の死菌体」ともいう。同微生物を、「本発明の微生物」ともいう。
【００１２】
本発明の死菌体は、具体的には、本発明の微生物の菌体であって、有機溶媒による処理に供されており、且つRNAサイレンシング用のRNAを含有するものである。有機溶媒による処理を、「有機溶媒処理」ともいう。RNAサイレンシング用のRNAを、「目的RNA」ともいう。
【００１３】
有効成分を利用することにより、具体的には有効成分を対象生物に摂取させることにより、対象生物においてRNAサイレンシングを誘導することができる。すなわち、有効成分を利用することにより、具体的には有効成分を対象生物に摂取させることにより、対象生物においてRNAサイレンシングを誘導する効果が得られる。同効果を、「RNAサイレンシング誘導効果」ともいう。「RNAサイレンシング」とは、RNAの存在に依拠して遺伝子の発現が抑制される現象をいう。RNAサイレンシングとしては、RNA干渉やアンチセンス法が挙げられる。RNAサイレンシングにより発現が抑制される遺伝子を、「対象遺伝子」ともいう。RNAサイレンシングにより、例えば、対象遺伝子の種類や対象遺伝子の発現抑制の程度に応じた表現型が生じ得る。そのような表現型としては、対象生物の活動の抑制が挙げられる。すなわち、一態様においては、RNAサイレンシングにより、対象生物の活動を抑制することができる。活動の抑制としては、摂食阻害、生育阻害、繁殖阻害、致死が挙げられる。発現抑制により致死等の活動の抑制をもたらす遺伝子としては、アポトーシス阻害因子をコードする遺伝子が挙げられる。対象生物の活動の抑制により、例えば、対象生物が駆除され得る。すなわち、一態様においては、RNAサイレンシングにより、対象生物を駆除することができる。また、対象生物が害をもたらすものである場合、対象生物の活動の抑制により、例えば、対象生物による害が防除され得る。すなわち、一態様においては、RNAサイレンシングにより、対象生物による害を防除することができる。対象生物による害としては、対象生物の種類に応じた害が挙げられる。対象生物による害としては、例えば、食害が挙げられる。具体的には、例えば、対象生物が農業害虫である場合、対象生物による害としては、植物の食害が挙げられる。RNAサイレンシング誘導効果は、例えば、対象遺伝子の発現の低下、対象生物の表現型、または対象生物による害の防除を指標として、確認することができる。対象遺伝子の発現の低下は、後述するタンパク質の活性を低下させる手法における遺伝子の発現の低下の確認と同様に確認することができる。対象遺伝子の発現の低下の程度は、所望の結果（例えば所望の表現型）が得られる限り、特に制限されない。有効成分の利用時の対象遺伝子の発現量は、例えば、有効成分の非利用時の、９０％以下、７０％以下、５０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。表現型は、表現型の種類に応じて適宜確認することができる。例えば、活動の抑制は、対象生物の摂食量、体のサイズ、生存個体数、産卵数、孵化数、または孵化率の減少を指標として、確認することができる。対象生物の摂食量、体のサイズ、生存個体数、産卵数、孵化数、または孵化率の減少は、それぞれ、対象生物の摂食量、体のサイズ、生存個体数、産卵数、孵化数、または孵化率を測定することにより確認することができる。生存個体数として、具体的には、単位区画当たり（例えば、対象生物の生活圏の単位面積または単位体積当たり）の生存個体数が挙げられる。産卵数として、具体的には、単位区画当たり（例えば、対象生物の生活圏の単位面積または単位体積当たり）の産卵数や、対象生物の個体当たりの産卵数が挙げられる。孵化数として、具体的には、単位区画当たり（例えば、対象生物の生活圏の単位面積または単位体積当たり）の孵化数や、対象生物の個体当たりの孵化数が挙げられる。害の防除は、害の種類に応じて適宜確認することができる。
【００１４】
＜１＞対象生物
対象生物は、有効成分（すなわち本発明の死菌体）を摂取できるものであれば、特に制限されない。対象生物としては、害虫が挙げられる。害虫としては、農業害虫、貯穀害虫、衛生害虫、食品害虫、財産害虫、家畜害虫、不快害虫が挙げられる。
【００１５】
害虫として、具体的には、チョウ目（コナガ科、ヤガ科、メイガ科、ハマキガ科、ハモグリガ科、シンクイガ科、キバガ科、ツトガ科、ヒトリガ科、ドクガ科等）、カメムシ目（ヨコバイ科、ウンカ科、キジラミ科、アブラムシ科、コナジラミ科、カイガラムシ科、カスミカメムシ科、グンバイムシ科、カメムシ科、ナガカメムシ科等）、コウチュウ目（コガネムシ科、コメツキムシ科、テントウムシ科、カミキリムシ科、ハムシ科、ゾウムシ科等）、ハエ目（イエバエ科、クロバエ科、ニクバエ科、ハナバエ科、ミバエ科、ヒメコバエ上科、キモグリバエ上科等）、バッタ目（バッタ科、イナゴ科、オンブバッタ科等）、アザミウマ目（アザミウマ科、シマアザミウマ科、メロアザミウマ科等）、ティレンクス目（アフェレンコイデス科、ネオティレンクス科等）、トビムシ目（シロトビムシ科、ツチトビムシ科等）、ダニ目（ハダニ科、ワクモ科、コナダニ科、ヒゼンダニ科等）、柄眼目（ナメクジ科、オナジマイマイ科等）、カイチュウ目（カイチュウ科、アニサキス科等）、後睾吸虫目、有壁吸虫目、ゴキブリ目（ブラベルスゴキブリ科、クリプトケルクス科、オオゴキブリ科等）、シミ目（シミ科、ムカシシミ科、メナシシミ科等）に分類される生物が挙げられる。
【００１６】
チョウ目の害虫として、具体的には、ニカメイガ、コブノメイガ、イチモンジセセリ、イネヨトウ、アワヨトウ、フタオビコヤガ、ハスモンヨトウ、シロイチモジマダラメイガ、ヒメイチモジマダラメイガ、ダイズサヤムシガ、マメシンクイガ、ウコンノメイガ、カブラヤガ、タマナヤガ、イモコガ、シロモンヤガ、タバコガ、オオタバコガ、ヨトウガ、シロイチモジヨトウ、コナガ、モンシロチョウ、オオモンシロチョウ、ハイマダラノメイガ、タマナギンウワバが挙げられる。カメムシ目の害虫として、具体的には、トビイロウンカ、セジロウンカ、ヒメトビウンカ、ツマグロヨコバイ、イナズマヨコバイ、アカスジカスミカメ、アカヒゲホソミドリカスミカメ、クモヘリカメムシ、アオクサカメムシ、ミナミアオカメムシ、イネカメムシ、イネクロカメムシ、トゲシラホシカメムシ、オオトゲシラホシカメムシ、シラホシカメムシ、コバネヒョウタンナガカメムシ、ホソハリカメムシ、イチモンジカメムシ、クサギカメムシ、ブチヒゲカメムシ、ギアブラムシ、ムギクビレアブラムシ、トウモロコシアブラムシ、イズアブラムシが挙げられる。コウチュウ目の害虫として、具体的には、イネミズゾウムシ、イネクビホソハムシ、イネゾウムシ、シコメツキ、マルクビクシコメツキ、ドウガネブイブイ、ウガネブイブイ、マメコガネ、アカビロウドコガネ、インゲンテントウ、フタスジヒメハムシ、オオニジュウヤホシテントウ、ニジュウヤホシテントウ、ナミテントウ、ヒメコガネ、スジコガネ、ウリハムシ、キスジノミハムシが挙げられる。ハエ目の害虫として、具体的には、イネカラバエ、イネヒメハモグリバエ、ムギアカタマバエ、タネバエ、ダイズサヤタマバエ、ダイズクキモグリバエ、マメハモグリバエ、トマトハモグリバエ、アシグロハモグリバエ、ナスハモグリバエが挙げられる。バッタ目の害虫として、具体的には、コバネイナゴ、ハネナガイナゴが挙げられる。アザミウマ目の害虫として、具体的には、イネアザミウマ、ミナミキイロアザミウマが挙げられる。ティレンクス目の害虫として、具体的には、ネコブセンチュウ、ネグサレセンチュウ、シストセンチュウが挙げられる。トビムシ目の害虫として、具体的には、ヤギシロトビムシ、マツモトシロトビムシが挙げられる。ダニ目の害虫として、具体的には、ムギダニ、ナミハダニ、カンザワハダニ、ケナガコナダニ、スジブトホコリダニが挙げられる。柄眼目の害虫として、具体的には、カタツムリ、ナメクジが挙げられる。カイチュウ目の害虫として、具体的には、回虫が挙げられる。後睾吸虫目の害虫として、具体的には、横川吸虫が挙げられる。有壁吸虫目の害虫として、具体的には、日本住血吸虫が挙げられる。ゴキブリ目の害虫として、具体的には、チャバネゴキブリ、クロゴキブリ、ワモンゴキブリ、チュウトウゴキブリが挙げられる。シミ目の害虫として、具体的には、ヤマトシミ、セイヨウシミが挙げられる。
【００１７】
対象生物としては、１種の生物を対象としてもよく、２種またはそれ以上の生物を対象としてもよい。
【００１８】
＜２＞有効成分およびその製造
有効成分（すなわち本発明の死菌体）は、本発明の微生物の菌体を有機溶媒処理に供することにより得られる。すなわち、本発明は、本発明の微生物の菌体を有機溶媒処理に供する工程を含む、有効成分の製造方法を提供する。同工程を、「有機溶媒処理工程」ともいう。有機溶媒処理工程は、具体的には、本発明の微生物の菌体を有機溶媒処理に供することにより有効成分を調製する工程であってもよい。
【００１９】
本発明の微生物の菌体は、本発明の微生物を培養することにより得られる。有効成分の製造方法は、有機溶媒処理工程の前に、さらに、本発明の微生物を培地で培養する工程を含んでいてもよい。同工程を、「培養工程」ともいう。培養工程は、具体的には、本発明の微生物を培地で培養することにより本発明の微生物の菌体を調製する工程であってもよい。有効成分の製造方法は、例えば、本発明の微生物を培地で培養する工程、および前記培養により得られた菌体を有機溶媒処理に供する工程を含む、方法であってもよい。
【００２０】
＜２−１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、有効成分（すなわち本発明の死菌体）を調製できるものであれば特に制限されない。有効成分は、目的RNAを含有する。よって、有機溶媒処理に供される菌体（すなわち本発明の微生物の菌体）は、目的RNAを含有する。したがって、本発明の微生物は、目的RNAの生産能を有する微生物である。本発明の微生物は、１種の目的RNAの生産能を有していてもよく、２種またはそれ以上の目的RNAの生産能を有していてもよい。同様に、有効成分および有機溶媒処理に供される菌体（すなわち本発明の微生物の菌体）は、いずれも、１種の目的RNAを含有していてもよく、２種またはそれ以上の目的RNAを含有していてもよい。
【００２１】
本発明の微生物は、少なくとも目的RNAの発現ユニットを有することに依拠して、目的RNAの生産能を有する。すなわち、本発明の微生物は、目的RNAの発現ユニットを有する。目的RNAの発現ユニットを有する微生物は、微生物に目的RNAの発現ユニットを導入することにより取得できる。本発明の微生物は、例えば、目的RNAの発現ユニットの導入により、または目的RNAの発現ユニットの導入と他の性質との組み合わせにより、目的RNAの生産能を獲得したものであってよい。
【００２２】
本発明の微生物は、目的RNAの生産能を有する限り、任意の性質を有していてよい。本発明の微生物は、例えば、目的RNAの発現ユニットを含むベクター以外の、プラスミド等のベクターを有していてもよく、有していなくてもよい。すなわち、例えば、本発明の微生物が本来的にプラスミドを有する場合、当該プラスミドをキュアリング（除去）してもよい。また、本発明の微生物は、例えば、リボヌクレアーゼIII（RNaseIII）の活性が低下するように改変されていてもよい。本発明の微生物を構築するための改変の実施順序は特に制限されない。
【００２３】
なお、本発明の微生物またはそれを構築するために用いられる微生物を「宿主」という場合がある。
【００２４】
＜２−１−１＞目的RNAの生産能を有する微生物
「目的RNAの生産能を有する微生物」とは、培地で培養したときに、目的RNAを発現し、RNAサイレンシング誘導効果が得られる程度に菌体内に蓄積する能力を有する微生物をいう。目的RNAの生産能を有する微生物は、例えば、1 mg/L-培養液以上、2 mg/L-培養液以上、5 mg/L-培養液以上、10 mg/L-培養液以上、20 mg/L-培養液以上、50 mg/L-培養液以上、または100 mg/L-培養液以上の量で目的RNAを菌体内に蓄積することができる微生物であってもよい。
【００２５】
微生物としては、細菌や酵母が挙げられる。
【００２６】
細菌としては、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌やコリネ型細菌が挙げられる。
【００２７】
腸内細菌科に属する細菌としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、フォトラブダス（Photorhabdus）属、プロビデンシア（Providencia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）等の属に属する細菌が挙げられる。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌を用いることができる。
【００２８】
エシェリヒア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエシェリヒア属に分類されている細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、Neidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に記載されたものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられる。エシェリヒア・コリとして、具体的には、例えば、W3110株（ATCC 27325）やMG1655株（ATCC 47076）等のエシェリヒア・コリK-12株；エシェリヒア・コリK5株（ATCC 23506）；BL21(DE3)株等のエシェリヒア・コリB株；およびそれらの派生株が挙げられる。
【００２９】
エンテロバクター属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエンテロバクター属に分類されている細菌が挙げられる。エンテロバクター属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）やエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランスとして、具体的には、例えば、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスとして、具体的には、例えば、エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、NBRC12010株（Biotechnol Bioeng. 2007 Mar 27; 98(2) 340-348）、AJ110637株（FERM BP-10955）が挙げられる。また、エンテロバクター属細菌としては、例えば、欧州特許出願公開EP0952221号明細書に記載されたものが挙げられる。なお、Enterobacter agglomeransには、Pantoea agglomeransと分類されているものも存在する。
【００３０】
パントエア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりパントエア属に分類されている細菌が挙げられる。パントエア属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。パントエア・アナナティスとして、具体的には、例えば、パントエア・アナナティスLMG20103株、AJ13355株（FERM BP-6614）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）、SC17株（FERM BP-11091）、SC17(0)株（VKPM B-9246）、及びSC17sucA株（FERM BP-8646）が挙げられる。なお、エンテロバクター属細菌やエルビニア属細菌には、パントエア属に再分類されたものもある（Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 337-345 (1989); Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)）。例えば、エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイ等に再分類された（Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 337-345 (1989)）。本発明において、パントエア属細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。
【００３１】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エルビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）が挙げられる。クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）が挙げられる。
【００３２】
コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、およびミクロバクテリウム（Microbacterium）属等の属に属する細菌が挙げられる。
【００３３】
コリネ型細菌として、具体的には、下記のような種が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）
コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）
コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）
コリネバクテリウム・クレナタム（Corynebacterium crenatum）
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）
コリネバクテリウム・メラセコーラ（Corynebacterium melassecola）
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）（Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)）
コリネバクテリウム・ハーキュリス（Corynebacterium herculis）
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Brevibacterium immariophilum）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium thiogenitalis）
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)）
ブレビバクテリウム・アルバム（Brevibacterium album）
ブレビバクテリウム・セリナム（Brevibacterium cerinum）
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）
【００３４】
コリネ型細菌として、具体的には、下記のような菌株が挙げられる。
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium crenatum AS1.542
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
【００３５】
なお、コリネバクテリウム属細菌には、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に統合された細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)）も含まれる。また、コリネバクテリウム・スタティオニスには、従来コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに分類されていたが、16S rRNAの塩基配列解析等によりコリネバクテリウム・スタティオニスに再分類された細菌も含まれる（Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010)）。
【００３６】
酵母は、出芽酵母であってもよく、分裂酵母であってもよい。酵母は、一倍体の酵母であってもよく、二倍体またはそれ以上の倍数性の酵母であってもよい。酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属、ピチア・シフェリイ（Pichia ciferrii）、ピチア・シドウィオラム（Pichia sydowiorum）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）等のピヒア属（ウィッカーハモマイセス（Wickerhamomyces）属ともいう）、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）等のキャンディダ属、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）等のハンゼヌラ属、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属に属する酵母が挙げられる。
【００３７】
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。
【００３８】
＜２−１−２＞目的RNAの発現ユニットの導入
目的RNAは、RNAサイレンシング用のRNAである。「RNAサイレンシング用のRNA」とは、対象生物においてRNAサイレンシングを誘導する（引き起こす）ことができるRNAをいう。目的RNAとしては、１種のRNAを利用してもよく、２種またはそれ以上のRNAを利用してもよい。また、１種の対象遺伝子に対して、１種の目的RNAを利用してもよく、２種またはそれ以上の目的RNAを利用してもよい。２種またはそれ以上の目的RNAを利用する場合、それら目的RNAは、単一の微生物により発現させてもよく、複数の微生物により発現させてもよい。
【００３９】
目的RNAは、RNAサイレンシング誘導効果が得られる限り、特に制限されない。目的RNAは、１種の対象遺伝子に対してRNAサイレンシングを誘導するものであってもよく、２種またはそれ以上の対象遺伝子に対してRNAサイレンシングを誘導するものであってもよい。目的RNAは、対象生物の種類、対象遺伝子の種類、RNAサイレンシングの態様等の諸条件に応じて、適宜選択できる。
【００４０】
目的RNAとしては、対象遺伝子から転写されるRNAとハイブリダイズできるRNAが挙げられる。また、目的RNAとしては、対象遺伝子から転写されるRNAとハイブリダイズできるRNAを生じるRNAも挙げられる。すなわち、目的RNAは、例えば、そのまま、あるいは適宜改変を受けてから、対象遺伝子から転写されるRNAとハイブリダイズできるRNAであってよい。具体的には、例えば、目的RNAをRNA干渉用の長い二本鎖RNA（dsRNA）として構成し発現する場合、dsRNAから短い二本鎖RNA（siRNA）が生じ、さらにsiRNAから一本鎖siRNAが生じ、一本鎖siRNAが対象遺伝子から転写されるRNAとハイブリダイズすればよい。そのような改変は、例えば、有効成分が対象生物に摂取されてから起こってよい。
【００４１】
目的RNAは、上記ハイブリダイズのために、例えば、対象遺伝子から転写されるRNAの塩基配列またはその部分配列に対して相補的な塩基配列を有していてよい。対象遺伝子から転写されるRNAの塩基配列を、「センス配列」ともいう。また、上記の相補的な塩基配列（すなわち、センス配列またはその部分配列に対して相補的な塩基配列）を、「アンチセンス配列」ともいう。すなわち、目的RNAとしては、アンチセンス配列を有するRNAが挙げられる。また、目的RNAとしては、アンチセンス配列のバリアント配列を有するRNAも挙げられる。バリアント配列は、RNAサイレンシング誘導効果が得られる限り、具体的には、例えば、対象遺伝子から転写されるRNAと目的RNAがハイブリダイズできる限り、特に制限されない。バリアント配列については、後述するリボヌクレアーゼIII遺伝子のバリアントについての記載を準用できる。また、目的RNAは、例えば、上記のようなRNAの塩基配列から選択される２つまたはそれ以上の塩基配列を組み合わせて有していてもよい。目的RNAは、例えば、１種の対象遺伝子に対して、２コピーまたはそれ以上のアンチセンス配列またはそのバリアント配列を有していてもよい。また、目的RNAは、例えば、１種の対象遺伝子に対して、２種またはそれ以上のアンチセンス配列またはそのバリアント配列を有していてもよい。また、目的RNAは、例えば、２種またはそれ以上の対象遺伝子に対して、アンチセンス配列またはそのバリアント配列を有していてもよい。なお、「塩基配列を有する」という表現は、特記しない限り、当該「塩基配列を含む」ことを意味し、当該「塩基配列からなる」場合も包含する。すなわち、目的RNAは、アンチセンス配列またはそのバリアント配列からなるものであってもよく、さらに他の塩基配列を含んでいてもよい。他の塩基配列は、目的RNAは、RNAサイレンシング誘導効果が得られる限り、具体的には、例えば、対象遺伝子から転写されるRNAと目的RNAがハイブリダイズできる限り、特に制限されない。
【００４２】
目的RNAは、例えば、一本鎖RNA（１分子のRNA鎖からなるRNA）であってもよく、二本鎖RNA（２分子のRNA鎖からなるRNA）であってもよい。二本鎖RNAは、単一の種類のRNA分子からなる二本鎖（ホモ二本鎖）であってもよく、２種の異なるRNA分子からなる二本鎖（ヘテロ二本鎖）であってもよい。二本鎖RNAとして、具体的には、例えば、或るRNA鎖とその相補鎖からなる二本鎖RNAが挙げられる。また、目的RNAは、例えば、１分子のRNA鎖と１分子のDNA鎖からなる二本鎖であってもよい。目的RNAは、一本鎖の領域と二本鎖の領域の両方を含んでいてもよい。すなわち、例えば、一本鎖RNAは、分子内で部分的に二本鎖構造（例えば、ステムループ構造）を形成していてもよい。また、例えば、二本鎖RNAは、部分的に一本鎖構造を含んでいてもよい。RNA干渉を誘導する場合、目的RNAは、例えば、長い二本鎖RNA（dsRNA）や短い二本鎖RNA（siRNA）等の二本鎖RNAとして構成し発現してよい。なお、RNA干渉に用いられるRNAは、必ずしも２分子のRNA鎖からなる必要はない。すなわち、RNA干渉においては、ヘアピン状のshort hairpin RNA（shRNA）等の分子内で二本鎖構造を形成した一本鎖RNAを、二本鎖RNAの代わりに利用することもできる。また、アンチセンス法の場合、目的RNAは、例えば、一本鎖RNAとして構成し発現してよい。
【００４３】
目的RNAの長さは、特に制限されない。目的RNAの長さは、例えば、２０残基以上、５０残基以上、または１００残基以上であってもよく、１００００残基以下、５０００残基以下、２０００残基以下、１０００残基以下、または５００残基以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。また、目的RNAが有するアンチセンス配列またはそのバリアント配列の長さは、例えば、２０残基以上、５０残基以上、または１００残基以上であってもよく、１００００残基以下、５０００残基以下、２０００残基以下、１０００残基以下、または５００残基以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。
【００４４】
「目的RNAの発現ユニット」とは、目的RNAを発現できるよう構成された遺伝子構造物をいう。目的RNAの発現ユニットは、５’から３’方向に、宿主で機能するプロモーター配列および目的RNAをコードする塩基配列を含む。プロモーター配列を単に「プロモーター」ともいう。目的RNAをコードする塩基配列を「目的RNAをコードする遺伝子」または「目的RNA遺伝子」ともいう。目的RNA遺伝子は、プロモーターの下流に、同プロモーターによる制御を受けて目的RNAが発現するよう連結されていればよい。また、目的RNAの発現ユニットは、宿主で目的RNAを発現させるために有効な制御配列（オペレーターやターミネーター等）を、それらが機能し得るように適切な位置に有していてもよい。なお、本発明において、「目的RNA遺伝子の発現」、「目的RNA遺伝子の転写」、「目的RNAの発現」、「目的RNAの転写」は、互いに同義に用いることができる。目的RNAの発現ユニットは、目的RNAの種類や転写態様等の諸条件に応じて適宜設計できる。
【００４５】
目的RNAの転写態様は、目的RNAが得られる限り、特に制限されない。目的RNA遺伝子は、例えば、一方向に（すなわち二本鎖の片方のストランドのみを鋳型として）転写されてもよく、双方向に（すなわち二本鎖のそれぞれのストランドを鋳型として）転写されてもよい。目的RNA遺伝子を双方向に転写することは、同遺伝子を挟んで逆向きに配置されたプロモーター（すなわち二本鎖のそれぞれのストランドにおいて同遺伝子の５’側に配置されたプロモーター）から同遺伝子を転写することにより実施できる。すなわち、目的RNAの発現ユニットは、そのような２つのプロモーターを含んでいてもよい。その場合、両プロモーターは同一であってもよく、なくてもよい。目的RNA遺伝子を一方向に転写することにより、典型的には、一本鎖RNAが得られる。目的RNA遺伝子を双方向に転写することにより、典型的には、二本鎖RNAが得られる。また、二本鎖RNAのそれぞれのストランドを個別の発現ユニットから転写することによっても、二本鎖RNAが得られる。
【００４６】
目的RNA遺伝子は、例えば、クローニングにより取得することができる。クローニングには、例えば、目的RNA遺伝子を含むゲノムDNAやcDNA等の核酸を利用することができる。また、目的RNA遺伝子は、例えば、その塩基配列に基づいて全合成することによっても取得することができる（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。取得した目的RNA遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。すなわち、目的RNA遺伝子を改変することにより、そのバリアントを取得することができる。遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的の部位に目的の変異を導入することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。あるいは、目的RNA遺伝子のバリアントを全合成してもよい。また、取得した目的RNA遺伝子に対して、適宜、プロモーター配列の導入等の改変を行い、目的RNAの発現ユニットを取得することができる。なお、目的RNAの発現ユニットの他の構成要素（例えば、プロモーター配列）や目的RNAの発現ユニット全体も、目的RNA遺伝子と同様に取得することができる。
【００４７】
目的RNA遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。「宿主において機能するプロモーター」とは、宿主においてプロモーター活性、すなわち遺伝子の転写活性、を有するプロモーターをいう。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、目的RNA遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。また、プロモーターは、遺伝子の発現について、誘導性のものであってもよく、構成的（constitutive）なものであってもよい。
【００４８】
プロモーターとしては、例えば、解糖系、ペントースリン酸経路、ＴＣＡ回路、アミノ酸生合成系、細胞表層タンパク質の遺伝子のプロモーターが挙げられる。また、プロモーターとしては、以下のような強力なプロモーターを用いてもよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において機能する強力なプロモーターとしては、例えば、T7プロモーター、T5プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーター、F1プロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、lacプロモーター、tacプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、msrAプロモーター、Bifidobacterium由来のPm1プロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、コリネ型細菌において機能する強力なプロモーターとしては、例えば、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター（Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679(2000)）、酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、その他の強力なプロモーターであるcspB、SOD、tufプロモーター（Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.）、lacプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、F1プロモーター、T7プロモーター、T5プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーターが挙げられる。プロモーターとしては、特に、F1プロモーター、T7プロモーター、T5プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーター等のファージ由来のプロモーターが挙げられる。F1プロモーターの塩基配列を、配列番号１７に示す。
【００４９】
プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。例えば、プロモーター領域内の−３５、−１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（WO00/18935）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモーター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
【００５０】
プロモーターは、例えば、上記例示したプロモーターの塩基配列（例えば配列番号１７の塩基配列）を有するプロモーターであってよい。また、プロモーターは、上記例示したプロモーター（例えば配列番号１７の塩基配列を有するプロモーター）の保存的バリアントであってもよい。すなわち、例えば、上記例示したプロモーターは、そのまま、あるいは適宜改変して用いることができる。上記プロモーター名で特定されるプロモーターは、それぞれ、上記例示したプロモーターに加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。例えば、「F1プロモーター」という用語は、配列番号１７の塩基配列を有するプロモーターに加えて、その保存的バリアントを包含するものとする。プロモーターの保存的バリアントについては、後述するリボヌクレアーゼIII遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。例えば、プロモーターは、元の機能が維持されている限り、配列番号１７の塩基配列に対して、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有する塩基配列を有するプロモーターであってもよい。なお、プロモーターについての「元の機能」とは、その直下流に接続された遺伝子を所定の条件下で発現する機能をいう。「所定の条件下」とは、元のプロモーターがその直下流に接続された遺伝子を発現できる条件をいう。プロモーターの保存的バリアントは、例えば、元のプロモーターの80%以上、90%以上、または100%以上の転写活性を有していてよい。遺伝子の発現の有無や強度（転写活性）は、例えば、レポーター遺伝子を用いて確認することができる。
【００５１】
目的RNA遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、目的RNA遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとして、具体的には、例えば、バクテリオファージBFK20のターミネーター、T7ターミネーター、T4ターミネーター、fdファージターミネーター、tetターミネーター、およびtrpAターミネーターが挙げられる。
【００５２】
各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
【００５３】
目的RNAの発現ユニットを宿主に導入する手法は特に制限されない。「目的RNAの発現ユニットの導入」とは、目的RNAの発現ユニットを宿主に保持させることをいい、具体的には、目的RNA遺伝子を発現可能に宿主に導入することであってよい。「目的RNAの発現ユニットの導入」には、特記しない限り、予め構築した目的RNAの発現ユニットを宿主に一括して導入する場合に限られず、少なくとも目的RNA遺伝子が宿主に導入され、且つ宿主内で目的RNAの発現ユニットが構築される場合も包含される。本発明の微生物において、目的RNAの発現ユニットは、プラスミド等の染色体外で自律複製するベクター上に存在していてもよく、染色体上に組み込まれていてもよい。すなわち、本発明の微生物は、例えば、ベクター上に目的RNAの発現ユニットを有していてよく、言い換えると、目的RNAの発現ユニットを含むベクターを有していてよい。また、本発明の微生物は、例えば、染色体上に目的RNAの発現ユニットを有していてよい。本発明の微生物は、目的RNAの発現ユニットを１コピーのみ有していてもよく、２またはそれ以上のコピーで有していてもよい。本発明の微生物が有する目的RNAの発現ユニットのコピー数は、例えば、５コピー／ｃｅｌｌ以上、１０コピー／ｃｅｌｌ以上、２０コピー／ｃｅｌｌ以上、３０コピー／ｃｅｌｌ以上、５０コピー／ｃｅｌｌ以上、７０コピー／ｃｅｌｌ以上、１００コピー／ｃｅｌｌ以上、１５０コピー／ｃｅｌｌ以上、２００コピー／ｃｅｌｌ以上、３００コピー／ｃｅｌｌ以上、５００コピー／ｃｅｌｌ以上、または１０００コピー／ｃｅｌｌ以上であってもよく、２０００コピー／ｃｅｌｌ以下、１５００コピー／ｃｅｌｌ以下、１０００コピー／ｃｅｌｌ以下、５００コピー／ｃｅｌｌ以下、または３００コピー／ｃｅｌｌ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。本発明の微生物は、１種類の目的RNAの発現ユニットのみを有していてもよく、２またはそれ以上の種類の目的RNAの発現ユニットを有していてもよい。目的RNAの発現ユニットのコピー数および種類は、それぞれ、目的RNA遺伝子のコピー数および種類と読み替えてもよい。本発明の微生物が２つまたはそれ以上の目的RNAの発現ユニットを有する場合、それら発現ユニットは、目的RNAを製造できるように本発明の微生物に保持されていればよい。例えば、それら発現ユニットは、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、それら発現ユニットは、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。
【００５４】
目的RNAの発現ユニットは、例えば、目的RNAの発現ユニットを含むベクターを用いて宿主に導入できる。目的RNAの発現ユニットを含むベクターを「目的RNAの発現ベクター」ともいう。目的RNAの発現ベクターは、例えば、目的RNAの発現ユニットをベクターと連結することにより、構築することができる。また、例えば、ベクターが宿主で機能するプロモーターを備える場合、目的RNAの発現ベクターは、当該プロモーターの下流に目的RNA遺伝子を連結することによっても、構築することができる。目的RNAの発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同ベクターが導入された形質転換体が得られる、すなわち、目的RNAの発現ユニットを宿主に導入することができる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。ベクターのコピー数は、例えば、５コピー／ｃｅｌｌ以上、１０コピー／ｃｅｌｌ以上、２０コピー／ｃｅｌｌ以上、３０コピー／ｃｅｌｌ以上、５０コピー／ｃｅｌｌ以上、７０コピー／ｃｅｌｌ以上、１００コピー／ｃｅｌｌ以上、１５０コピー／ｃｅｌｌ以上、２００コピー／ｃｅｌｌ以上、３００コピー／ｃｅｌｌ以上、５００コピー／ｃｅｌｌ以上、または１０００コピー／ｃｅｌｌ以上であってもよく、２０００コピー／ｃｅｌｌ以下、１５００コピー／ｃｅｌｌ以下、１０００コピー／ｃｅｌｌ以下、５００コピー／ｃｅｌｌ以下、または３００コピー／ｃｅｌｌ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）、pACYC184、pMW219（ニッポンジーン社）、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233‐2（クロンテック社製）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、pACYC、L4440（US2017-0137841）、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pHM1519（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；pCRY30（特開平3-210184）；pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE、およびpCRY3KX（特開平2-72876、米国特許5,185,262号）；pCRY2およびpCRY3（特開平1-191686）；pAJ655、pAJ611、およびpAJ1844（特開昭58-192900）；pCG1（特開昭57-134500）；pCG2（特開昭58-35197）；pCG4およびpCG11（特開昭57-183799）；pPK4（米国特許6,090,597）；pVK4（特開平9-322774）；pVK7（特開平10-215883）；pVK9（US2006-0141588）；pVC7（特開平9-070291）；pVS7（WO2013/069634）が挙げられる。また、コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば��pVC7のバリアントであるpVC7H2（本願実施例）も挙げられる。
【００５５】
また、目的RNAの発現ユニットは、例えば、人工トランスポゾン等のトランスポゾンを使用して宿主の染色体上に導入できる。トランスポゾンが使用される場合は、相同組換えまたはそれ自身の転移能によって目的RNAの発現ユニットが染色体上に導入される。また、目的RNAの発現ユニットは、その他、相同組換えを利用する導入法により宿主の染色体上に導入できる。相同組換えを利用する導入法としては、例えば、直鎖状DNA、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミド、または宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクター等を用いる方法が挙げられる。目的RNAの発現ユニットは、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ目的RNAの発現ユニットの多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、少なくとも目的RNA遺伝子を染色体上に導入し、目的RNAの発現ユニットを染色体上に構築してもよい。例えば、宿主の染色体上のプロモーター配列の下流に目的RNAを導入することにより、染色体上に目的RNAの発現ユニットを構築することができる。なお、目的RNA遺伝子等の、目的RNAの発現ユニットの一部の染色体への導入も、目的RNAの発現ユニット全体の染色体への導入と同様に行うことができる。
【００５６】
染色体上に目的RNAの発現ユニットが導入されたことは、例えば、同発現ユニットの全部又は一部と相補的な塩基配列を有するプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、または同発現ユニットの塩基配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCRによって確認できる。
【００５７】
形質転換の方法は特に限定されず、一般に使用される方法、例えば、プロトプラスト法（Gene, 39, 281-286(1985)）、エレクトロポレーション法（Bio/Technology, 7, 1067-1070(1989)）、電気パルス法（特開平2-207791号公報）等を使用することができる。
【００５８】
＜２−１−３＞リボヌクレアーゼIIIの活性低下
本発明の微生物は、リボヌクレアーゼIII（RNaseIII）の活性が低下するように改変されていてよい。本発明の微生物は、具体的には、リボヌクレアーゼIIIの活性が非改変株と比較して低下するように改変されていてよい。リボヌクレアーゼIIIの活性は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。すなわち、本発明の微生物は、例えば、リボヌクレアーゼIIIの活性が欠損（消失）するように改変されていてもよい。リボヌクレアーゼIIIの活性が低下するように微生物を改変することにより、同微生物の目的RNAの生産能を向上させることができる、すなわち、同微生物による目的RNAの生産を増大させることができる、と期待される。
【００５９】
以下に、リボヌクレアーゼIIIおよびそれをコードする遺伝子について説明する。
【００６０】
「リボヌクレアーゼIII」とは、二本鎖RNA等の特定のRNAを切断する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう（EC 3.1.26.3）。同活性を「リボヌクレアーゼIII活性」ともいう。また、リボヌクレアーゼIIIをコードする遺伝子を「リボヌクレアーゼIII遺伝子」ともいう。
【００６１】
リボヌクレアーゼIII遺伝子としては、rnc遺伝子が挙げられる。rnc遺伝子にコードされるタンパク質（リボヌクレアーゼIII）を「Rncタンパク質」ともいう。
【００６２】
微生物が有するrnc遺伝子等のリボヌクレアーゼIII遺伝子の塩基配列およびそれらにコードされるRncタンパク質等のリボヌクレアーゼIIIのアミノ酸配列は、例えば、NCBI（National Center for Biotechnology Information）等の公開データベースから取得できる。C. glutamicum ATCC 13869株のrnc遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするRncタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３０および３１に示す。すなわち、リボヌクレアーゼIII遺伝子は、例えば、上記例示したリボヌクレアーゼIII遺伝子の塩基配列（例えば配列番号３０に示す塩基配列）を有する遺伝子であってよい。また、リボヌクレアーゼIIIは、例えば、上記例示したリボヌクレアーゼIIIのアミノ酸配列（例えば配列番号３１に示すアミノ酸配列）を有するタンパク質であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、特記しない限り、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」ことを意味し、当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合も包含する。
【００６３】
リボヌクレアーゼIII遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したリボヌクレアーゼIII遺伝子（例えば配列番号３０に示す塩基配列を有する遺伝子）のバリアントであってもよい。同様に、リボヌクレアーゼIIIは、元の機能が維持されている限り、上記例示したリボヌクレアーゼIII（例えば配列番号３１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質）のバリアントであってもよい。そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。本発明において、「rnc遺伝子」という用語は、上記例示したrnc遺伝子に限られず、その保存的バリアントを包含するものとする。同様に、「Rncタンパク質」という用語は、上記例示したRncタンパク質に限られず、その保存的バリアントを包含するものとする。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示したリボヌクレアーゼIII遺伝子やリボヌクレアーゼIIIのホモログや人為的な改変体が挙げられる。
【００６４】
「元の機能が維持されている」とは、遺伝子またはタンパク質のバリアントが、元の遺伝子またはタンパク質の機能（活性や性質）に対応する機能（活性や性質）を有することをいう。すなわち、「元の機能が維持されている」とは、リボヌクレアーゼIII遺伝子にあっては、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質（すなわちリボヌクレアーゼIII活性を有するタンパク質）をコードすることをいう。また、「元の機能が維持されている」とは、リボヌクレアーゼIIIにあっては、タンパク質のバリアントが、リボヌクレアーゼIII活性を有することをいう。
【００６５】
リボヌクレアーゼIII活性は、酵素をその基質となるRNA（例えば二本鎖RNA）とインキュベートし、酵素依存的なRNAの開裂を測定することにより測定できる。具体的には、リボヌクレアーゼIIIの活性測定は、通常、以下のようにして行われる（Methods Enzymol. 2001;342:143-58.）。一つの方法は、3Hで標識されたポリ（A−U）の合成基質（二本鎖状態）に対して、酵素（例えば、細胞（菌体）からの粗抽出液またはそれを部分精製した酵素）を加えて、35℃にて反応させ、その反応液をトリクロロ酢酸処理し、沈殿画分（高分子量の核酸が含まれる）にある放射能（ラジオアクティビティー）の反応時間に伴う減少度合いを測定するという方法である。すなわち、放射能の減少度合いを基質の開裂の指標としてリボヌクレアーゼIIIの活性を算出できる。また、別法は、32Pで放射能標識した二本鎖RNAを基質にして、それを、酵素を含む反応液（30 mM Tris-HCl (pH8.0), 250 mM グルタミン酸カリウムまたは160 mM NaCl、5 mM スペルミジン、0.1 mM EDTA, 0.1 mM DTT）にいれ、37℃で５分間の保温の後に、最終濃度10mMのMgCl2を加えてRNA分解反応を開始させ、適宜、反応させた後に、そこへ等量のEDTA-電気泳動用マーカー色素混液（EDTAの終濃度が20mM以上となるような濃度）を加えて、反応を停止させるという方法である。次いで、反応後のサンプルを、7 M尿素を含むTBE緩衝液（89 mM Tris/Tris-borate, 2 mM EDTA）での15%(w/v)変性ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動に供し、そのゲルを放射線画像解析装置にかけて、分解されたRNAの断片を解析することで、リボヌクレアーゼIIIの活性を検出できる。
【００６６】
以下、保存的バリアントについて例示する。
【００６７】
リボヌクレアーゼIII遺伝子のホモログまたはリボヌクレアーゼIIIのホモログは、例えば、上記例示したリボヌクレアーゼIII遺伝子の塩基配列または上記例示したリボヌクレアーゼIIIのアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、リボヌクレアーゼIII遺伝子のホモログは、例えば、コリネ型細菌等の微生物の染色体を鋳型にして、これら公知のリボヌクレアーゼIII遺伝子またはその周辺領域の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得することができる。
【００６８】
リボヌクレアーゼIII遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したリボヌクレアーゼIIIのアミノ酸配列（例えば、配列番号３１に示すアミノ酸配列）において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００６９】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００７０】
また、リボヌクレアーゼIII遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したリボヌクレアーゼIIIのアミノ酸配列（例えば、配列番号３１に示すアミノ酸配列）全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を意味する。
【００７１】
また、リボヌクレアーゼIII遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したリボヌクレアーゼIII遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号３０に示す塩基配列）の相補配列又は同相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。
【００７２】
上記プローブは、例えば、遺伝子の相補配列の一部であってよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。プローブとしては、例えば、300 bp程度の長さのDNA断片を用いることができる。そのような場合、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【００７３】
また、宿主によってコドンの縮重性が異なるので、リボヌクレアーゼIII遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。すなわち、リボヌクレアーゼIII遺伝子は、遺伝コードの縮重による上記例示したリボヌクレアーゼIII遺伝子のバリアントであってもよい。
【００７４】
２つの配列間の配列同一性のパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。このような数学的アルゴリズムの限定されない例としては、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448の類似性を検索する方法、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877に記載されているような、改良された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズムが挙げられる。
【００７５】
これらの数学的アルゴリズムに基づくプログラムを利用して、配列同一性を決定するための配列比較（アラインメント）を行うことができる。プログラムは、適宜、コンピュータにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、PC/GeneプログラムのCLUSTAL（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能）、ALIGNプログラム（Version 2.0）、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能）のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTAが挙げられる。これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムについては、Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244、Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331によく記載されている。
【００７６】
対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同性があるヌクレオチド配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTヌクレオチド検索を、BLASTNプログラム、スコア＝100、ワード長＝12にて行うことができる。対象のタンパク質と相同性があるアミノ酸配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTタンパク質検索を、BLASTXプログラム、スコア＝50、ワード長＝3にて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索やBLASTタンパク質検索については、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。また、比較を目的としてギャップを加えたアライメントを得るために、Gapped BLAST（BLAST 2.0）を利用できる。また、PSI-BLAST（BLAST 2.0）を、配列間の離間した関係を検出する反復検索を行うのに利用できる。Gapped BLASTおよびPSI-BLASTについては、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、またはPSI-BLASTを利用する場合、例えば、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、アミノ酸配列に対してBLASTX）の初期パラメーターが用いられ得る。アライメントは、手動にて行われてもよい。
【００７７】
２つの配列間の配列同一性は、２つの配列を最大一致となるように整列したときに２つの配列間で一致する残基の比率として算出される。なお、アミノ酸配列間の「同一性」とは、具体的には、特記しない限り、blastpによりデフォルト設定のScoring Parameters（Matrix：BLOSUM62；Gap Costs：Existence＝11, Extension＝1；Compositional Adjustments：Conditional compositional score matrix adjustment）を用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してよい。また、塩基配列間の「同一性」とは、具体的には、特記しない限り、blastnによりデフォルト設定のScoring Parameters（Match/Mismatch Scores＝1,-2；Gap Costs＝Linear）を用いて算出される塩基配列間の同一性を意味してよい。
【００７８】
なお、上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、その他の任意のタンパク質や目的RNA、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。
【００７９】
以下に、リボヌクレアーゼIII等のタンパク質（酵素）の活性を低下させる手法について説明する。
【００８０】
「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の活性が非改変株と比較して低下することを意味する。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株と比較して低下することを意味する。ここでいう「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が低下するように改変されていない対照株を意味する。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。非改変株として、具体的には、各微生物種の基準株（type strain）が挙げられる。また、非改変株として、具体的には、微生物の説明において例示した菌株も挙げられる。すなわち、一態様において、タンパク質の活性は、基準株（すなわち本発明の微生物が属する種の基準株）と比較して低下してよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum ATCC 13032株と比較して低下してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum 2256株（ATCC 13869）と比較して低下してもよい。なお、「タンパク質の活性が低下する」ことには、同タンパク質の活性が完全に消失している場合も包含される。「タンパク質の活性が低下する」とは、より具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることを意味してよい。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（mRNA量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合も包含される。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合も包含される。タンパク質の活性の低下の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して低下していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００８１】
タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成できる。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の発現が非改変株と比較して低下することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、具体的には、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変株と比較して低下することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、より具体的には、遺伝子の転写量（mRNA量）が低下すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合も包含される。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００８２】
遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。遺伝子の転写効率の低下は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより弱いプロモーターに置換することにより達成できる。「より弱いプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも弱化するプロモーターを意味する。より弱いプロモーターとしては、例えば、誘導型のプロモーターが挙げられる。すなわち、誘導型のプロモーターは、非誘導条件下（例えば、誘導物質の非存在下）でより弱いプロモーターとして機能し得る。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
【００８３】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。「遺伝子が破壊される」とは、正常に機能するタンパク質を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味する。「正常に機能するタンパク質を産生しない」ことには、同遺伝子からタンパク質が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能（活性や性質）が低下又は消失したタンパク質が産生される場合も包含される。
【００８４】
遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子を欠失（欠損）させることにより達成できる。「遺伝子の欠失」とは、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失をいう。さらには、染色体上の遺伝子のコード領域の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。遺伝子のコード領域の前後の配列には、例えば、遺伝子の発現調節配列が含まれてよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域（タンパク質のＮ末端側をコードする領域）、内部領域、Ｃ末端領域（タンパク質のＣ末端側をコードする領域）等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。欠失させる領域は、例えば、遺伝子のコード領域全長の１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の長さの領域であってよい。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、欠失させる領域の下流でフレームシフトが生じ得る。
【００８５】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドン（ナンセンス変異）を導入すること、または１〜２塩基の付加または欠失（フレームシフト変異）を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
【００８６】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の塩基配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する塩基配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、挿入部位の下流でフレームシフトが生じ得る。他の塩基配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【００８７】
遺伝子の破壊は、特に、コードされるタンパク質のアミノ酸配列が欠失（欠損）するように実施してよい。言い換えると、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、タンパク質のアミノ酸配列（アミノ酸配列の一部または全部の領域）を欠失させることにより、具体的には、アミノ酸配列（アミノ酸配列の一部または全部の領域）を欠失したタンパク質をコードするように遺伝子を改変することにより、達成できる。なお、「タンパク質のアミノ酸配列の欠失」とは、タンパク質のアミノ酸配列の一部または全部の領域の欠失をいう。また、「タンパク質のアミノ酸配列の欠失」とは、タンパク質において元のアミノ酸配列が存在しなくなることをいい、元のアミノ酸配列が別のアミノ酸配列に変化する場合も包含される。すなわち、例えば、フレームシフトにより別のアミノ酸配列に変化した領域は、欠失した領域とみなしてよい。アミノ酸配列の欠失により、典型的にはタンパク質の全長が短縮されるが、タンパク質の全長が変化しないか、あるいは延長される場合もあり得る。例えば、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該欠失した領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域への終止コドンの導入により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該導入部位より下流の領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域におけるフレームシフトにより、当該フレームシフト部位がコードする領域を欠失させることができる。アミノ酸配列の欠失における欠失させる領域の位置および長さについては、遺伝子の欠失における欠失させる領域の位置および長さの説明を準用できる。
【００８８】
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した破壊型遺伝子を作製し、該破壊型遺伝子を含む組換えDNAで宿主を形質転換して、破壊型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を破壊型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えDNAには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。破壊型遺伝子としては、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域を欠失した遺伝子、ミスセンス変異を導入した遺伝子、ナンセンス変異を導入した遺伝子、フレームシフト変異を導入した遺伝子、トランスポゾンやマーカー遺伝子等の挿入配列を挿入した遺伝子が挙げられる。相同組換えに用いる組換えＤＮＡの構造は、所望の態様で相同組換えが起こるものであれば特に制限されない。例えば、破壊型遺伝子を含む線状ＤＮＡであって、両端に染色体上の野生型遺伝子の上流および下流の配列をそれぞれ備える線状ＤＮＡで宿主を形質転換して、野生型遺伝子の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、１ステップで野生型遺伝子を破壊型遺伝子に置換することができる。破壊型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション（Red-driven integration）」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状DNAを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
【００８９】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【００９０】
なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。また、タンパク質に複数のアイソザイムが存在する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、複数のアイソザイムの全ての活性を低下させてもよく、一部のみの活性を低下させてもよい。すなわち、例えば、それらのアイソザイムをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。
【００９１】
上記のようなタンパク質の活性を低下させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
【００９２】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【００９３】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
【００９４】
遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR、マイクロアレイ、RNA-Seq等が挙げられる（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量（例えば、細胞当たりのmRNAの分子数）は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００９５】
タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。タンパク質の量（例えば、細胞当たりのタンパク質の分子数）は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００９６】
遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
【００９７】
上記したタンパク質の活性を低下させる手法は、リボヌクレアーゼIIIの活性低下に限られず、任意のタンパク質の活性低下および任意の遺伝子の発現低下に利用できる。
【００９８】
＜２−２＞有効成分の製造
＜２−２−１＞培養
本発明の微生物を培養することにより、本発明の微生物の菌体が得られる。
【００９９】
本発明の微生物は、例えば、細菌等の微生物の培養に通常用いられる培養条件に従って培養することができる。本発明の微生物は、例えば、炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地で培養することができる。さらに、例えば、ビタミンやアミノ酸等の有機微量栄養素を必要に応じて添加することもできる。
【０１００】
炭素源としては、例えば、グルコースおよびスクロースのような炭水化物類、酢酸のような有機酸類、アルコール類、その他を使用することができる。窒素源としては、例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その他を使用することができる。無機イオンとしては、例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン等を必要に応じて適宜使用することができる。培養は、例えば、pH5.0〜8.5、15℃〜37℃の適切な範囲にて好気的条件下で10時間〜120時間実施することができる。また、細菌等の微生物によるＬ−アミノ酸生産における培養条件や、細菌等の微生物によるタンパク質の分泌生産法における培養条件を参照することもできる（WO01/23591、WO2005/103278、WO2013/065869、WO2013/065772、WO2013/118544、WO2013/062029等）。また、目的RNAの発現のために誘導型プロモーターを用いる場合は、適宜、目的RNAの発現を誘導することができる。
【０１０１】
このような条件下で本発明の微生物を培養することにより、目的RNAが転写され、菌体内に蓄積する、すなわち、目的RNAを含有する菌体が得られる。
【０１０２】
目的RNAが発現および蓄積したことは、例えば、菌体抽出物を含む画分を試料として電気泳動を行い、目的RNAの分子量に相当するバンドを検出することにより確認することができる。
【０１０３】
＜２−２−２＞有機溶媒処理
本発明の微生物の菌体を有機溶媒処理に供することにより、有効成分（すなわち本発明の死菌体）が得られる。
【０１０４】
具体的には、例えば、本発明の微生物の菌体を有機溶媒処理に供することにより、菌体を死滅させることができ、以て有効成分が得られる。すなわち、有機溶媒処理に供される菌体は、生菌体であってよい。菌体の死滅の程度は、有効成分の利用用途に応じて許容される範囲であれば、特に制限されない。有機溶媒処理は、例えば、生菌率が、１×１０−５以下、１×１０−６以下、１×１０−７以下、または１×１０−８以下となるように実施することができる。「生菌率」とは、有機溶媒処理前の生菌数に対する有機溶媒処理後の生菌数の比率を意味してよい。「有機溶媒処理前」とは、有機溶媒処理を実施する前の時点であって、且つ、本発明の微生物の菌体が死滅する前の時点であれば、特に制限されない。「有機溶媒処理前」とは、具体的には、例えば、有機溶媒処理の開始時を意味してよい。菌体の死滅は、例えば、有機溶媒処理後の反応液を培養に供することにより確認できる。菌体の死滅は、具体的には、例えば、有機溶媒処理後の反応液を固体培地に接種し、コロニーの出現の有無または程度を確認することにより、確認できる。すなわち、生菌数は、例えば、コロニー形成単位（colony forming unit；ｃｆｕ）として測定することができる。
【０１０５】
菌体は、培養液に含まれたまま有機溶媒処理に供してもよく、培養液から回収して有機溶媒処理に供してもよい。菌体は、適宜、濃縮、希釈、洗浄、懸濁等の処理に供してから有機溶媒処理に供してもよい。これらの処理は、RNAサイレンシング誘導効果を損なわない限り、特に制限されない。これらの処理は、単独で、あるいは適宜組み合わせて実施することができる。すなわち、有機溶媒処理に供される菌体としては、菌体を含有する培養物、該培養物から回収した菌体、それらの処理物が挙げられる。これらの態様の菌体は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。
【０１０６】
菌体を培養液から回収する手法は特に制限されず、例えば公知の手法を利用できる。そのような手法としては、例えば、自然沈降、遠心分離、濾過が挙げられる。また、凝集剤（flocculant）を利用してもよい。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。回収した菌体は、適当な媒体を用いて適宜洗浄することができる。また、回収した菌体は、適当な媒体を用いて適宜再懸濁することができる。洗浄や懸濁に利用できる媒体としては、例えば、水や水性緩衝液等の水性媒体（水性溶媒）が挙げられる。
【０１０７】
有機溶媒処理は、菌体と有機溶媒とを接触させることにより実施できる。有機溶媒処理が実施される系（例えば、菌体と有機溶媒を含有する懸濁液）を、「反応液」ともいう。有機溶媒処理の条件（例えば、有機溶媒の種類や濃度、菌体の濃度、有機溶媒処理の時間、有機溶媒処理の温度、有機溶媒処理のｐＨ）は、RNAサイレンシング誘導効果を損なわず、且つ菌体を死滅させることができる限り、特に制限されない。
【０１０８】
有機溶媒としては、本発明の微生物に対して殺菌能を示すものを適宜選択できる。有機溶媒としては、アルコール類、エーテル類、エステル類、アルデヒド類、ケトン類、アルカン類、フェノール類が挙げられる。アルコールとしては、エタノールやメタノールが挙げられる。有機溶媒としては、１種の有機溶媒を用いてもよく、２種またはそれ以上の有機溶媒を組み合わせて用いてもよい。反応液中の有機溶媒の濃度は、例えば、３０％（ｖ／ｖ）以上、４０％（ｖ／ｖ）以上、５０％（ｖ／ｖ）以上、６０％（ｖ／ｖ）以上、７０％（ｖ／ｖ）以上、８０％（ｖ／ｖ）以上、９０％（ｖ／ｖ）以上、または９５％（ｖ／ｖ）以上であってもよく、９９％（ｖ／ｖ）以下、９７％（ｖ／ｖ）以下、９５％（ｖ／ｖ）以下、９０％（ｖ／ｖ）以下、８０％（ｖ／ｖ）以下、７０％（ｖ／ｖ）以下、６０％（ｖ／ｖ）以下、または５０％（ｖ／ｖ）以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。反応液中の有機溶媒の濃度は、具体的には、例えば、３０％（ｖ／ｖ）〜９９％（ｖ／ｖ）、４０％（ｖ／ｖ）〜９９％（ｖ／ｖ）、または５０％（ｖ／ｖ）〜９９％（ｖ／ｖ）であってもよい。反応液中の有機溶媒の濃度は、有機溶媒がエタノールである場合に、例えば、３０％（ｖ／ｖ）以上であってもよく、特に５０％（ｖ／ｖ）以上であってもよい。反応液中の有機溶媒の濃度は、有機溶媒がメタノールである場合に、例えば、５０％（ｖ／ｖ）以上であってもよく、特に７０％（ｖ／ｖ）以上であってもよい。
【０１０９】
反応液中の菌体の濃度（例えば、有機溶媒処理の開始時における反応液中の生菌体の濃度）は、例えば、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、または１×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であってもよく、１×１０１２ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１×１０１１ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、または１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。反応液中の菌体の濃度（例えば、有機溶媒処理の開始時における反応液中の生菌体の濃度）は、具体的には、例えば、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１×１０１１ｃｅｌｌｓ／ｍＬであってもよい。
【０１１０】
反応液は、菌体と有機溶媒からなるものであってもよく、他の成分を含有していてもよい。他の成分としては、水や水性緩衝液等の水性媒体（水性溶媒）が挙げられる。
【０１１１】
有機溶媒処理の時間は、例えば、１分以上、２分以上、３分以上、５分以上、１０分以上、または２０分以上であってもよく、２時間以下、１時間以下、３０分以下、２０分以下、１０分以下、または５分以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。有機溶媒処理の時間は、具体的には、例えば、１分〜２０分であってもよい。有機溶媒処理の温度は、例えば、１０℃以上、２０℃以上、または３０℃以上であってもよく、５０℃以下、４０℃以下、３０℃以下、または２０℃以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。有機溶媒処理の温度は、具体的には、例えば、２０℃〜３０℃であってもよい。有機溶媒処理の温度は、通常、室温であってよい。有機溶媒処理のｐＨは、例えば、５〜９、または６〜８であってよい。有機溶媒処理は、例えば、静置下で実施してもよく、撹拌または振盪下で実施してもよい。有機溶媒処理の条件は、有機溶媒処理の開始から終了まで均一であってもよく、そうでなくてもよい。
【０１１２】
このようにして有機溶媒処理を実施することにより、有効成分（本発明の死菌体）が得られる。
【０１１３】
本発明の死菌体は、反応液に含まれたままRNAサイレンシングに用いてもよく、反応液から回収してRNAサイレンシングに用いてもよい。本発明の死菌体は、適宜、濃縮、希釈、洗浄、懸濁等の処理に供してからRNAサイレンシングに用いてもよい。これらの処理は、RNAサイレンシング誘導効果を損なわない限り、特に制限されない。これらの処理は、単独で、あるいは適宜組み合わせて実施することができる。すなわち、本発明の死菌体としては、死菌体を含有する反応液、該反応液から回収した死菌体、それらの処理物が挙げられる。これらの態様の死菌体は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。本発明の死菌体の回収や処理は、有機溶媒処理に供される菌体の回収や処理と同様に実施することができる。本発明の死菌体は、例えば、回収し、洗浄し、再懸濁し、RNAサイレンシングに用いてもよい。本発明の死菌体は、具体的には、例えば、本発明の組成物として調製され、RNAサイレンシングに用いてもよい。
【０１１４】
＜３＞本発明の組成物
本発明の組成物は、有効成分（すなわち本発明の死菌体）を含有する組成物である。
【０１１５】
本発明の組成物は、対象生物に摂取させて利用することができる。本発明の組成物の使用態様は、「本発明の方法」において詳述する。本発明の組成物を利用することにより、具体的には本発明の組成物を対象生物に摂取させることにより、対象生物においてRNAサイレンシングを誘導することができる、すなわち、RNAサイレンシング誘導効果が得られる。すなわち、本発明の組成物は、対象生物におけるRNAサイレンシング誘導用の組成物であってよい。RNAサイレンシング誘導用の組成物を、「RNAサイレンシング誘導剤」ともいう。なお、一態様においては、RNAサイレンシングにより、対象生物の活動を抑制することができる。すなわち、RNAサイレンシング誘導用の組成物の一態様は、対象生物の活動の抑制用の組成物であってよい。対象生物の活動の抑制用の組成物を、「対象生物の活動抑制剤」ともいう。また、一態様においては、RNAサイレンシングにより、対象生物を駆除することができる。すなわち、RNAサイレンシング誘導用の組成物の一態様は、対象生物の駆除用の組成物であってよい。対象生物の駆除用の組成物を、「対象生物の駆除剤」ともいう。また、一態様においては、RNAサイレンシングにより、対象生物による害を防除することができる。すなわち、RNAサイレンシング誘導用の組成物の一態様は、対象生物による害の防除用の組成物であってよい。対象生物による害の防除用の組成物を、「対象生物による害の防除剤」ともいう。
【０１１６】
本発明の組成物は、有効成分からなるものであってもよく、有効成分以外の成分を含有していてもよい。
【０１１７】
有効成分以外の成分は、RNAサイレンシング誘導効果を損なわない限り、特に制限されない。有効成分以外の成分としては、本発明の組成物の用途に応じて許容可能なものを利用できる。有効成分以外の成分としては、例えば、農薬用、肥料用、飼料用、医薬用等の用途に通常用いられる成分が挙げられる。そのような成分として、具体的には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定化剤、希釈剤、界面活性剤、展着剤、pH調整剤、水、アルコール、ビタミン、ミネラル等の添加剤が挙げられる。また、有効成分以外の成分としては、培養工程や処理工程で用いた成分も挙げられる。有効成分以外の成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【０１１８】
本発明の組成物の形態は特に制限されない。本発明の組成物は、例えば、粉末状、顆粒状、液状、ペースト状、キューブ状等のいかなる形態であってもよい。本発明の組成物は、対象生物がそのまま摂取できる形態で提供されてもよいし、対象生物が摂取できる形態に使用前に調製されてもよい。本発明の組成物は、例えば、対象生物用の餌（飼料）として構成されてもよい。また、本発明の組成物は、例えば、農薬として構成されてもよい。
【０１１９】
本発明の組成物における各成分（すなわち、有効成分および任意でその他の成分）の含有量や含有量比は、RNAサイレンシング誘導効果が得られる限り、特に制限されない。本発明の組成物における各成分の含有量や含有量比は、有効成分の態様、その他の成分の種類、対象生物の種類、および本発明の組成物の利用態様等の諸条件に応じて適宜選択することができる。
【０１２０】
本発明の組成物における有効成分の含有量は、例えば、乾燥菌体重量あるいは湿菌体重量に基づく含有量として、０．０１％（ｗ／ｗ）以上、０．１％（ｗ／ｗ）以上、１％（ｗ／ｗ）以上、５％（ｗ／ｗ）以上、または１０％（ｗ／ｗ）以上であってもよく、１００％（ｗ／ｗ）以下、９９．９％（ｗ／ｗ）以下、７０％（ｗ／ｗ）以下、５０％（ｗ／ｗ）以下、３０％（ｗ／ｗ）以下、１０％（ｗ／ｗ）以下、５％（ｗ／ｗ）以下、または１％（ｗ／ｗ）以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。
【０１２１】
また、本発明の組成物における有効成分の含有量は、例えば、対象生物による有効成分の摂取量が所望の範囲となるような量であってもよい。具体的には、本発明の組成物における有効成分の含有量は、例えば、本発明の組成物を利用して対象生物に有効成分を摂取させた際に、対象生物による有効成分の摂取量が所望の範囲となるような量であってよい。対象生物による有効成分の摂取量は、例えば、後述する範囲であってよい。
【０１２２】
本発明の組成物が２種またはそれ以上の成分を含有する場合、各成分は、互いに混合されて本発明の組成物に含有されていてもよく、それぞれ別個に、あるいは、任意の組み合わせで別個に、本発明の組成物に含有されていてもよい。
【０１２３】
本発明の組成物は、有効成分を製造することにより得られる。すなわち、本発明は、有効成分を製造する工程を含む、本発明の組成物の製造方法を提供する。有効成分を製造する工程については、有効成分の製造方法の記載を準用できる。すなわち、有効成分の製造方法は、そのまま、本発明の組成物の製造方法と読み替えてもよい。
【０１２４】
＜４＞本発明の方法
本発明の方法は、有効成分（すなわち本発明の死菌体）を対象生物に摂取させることを含む方法である。
【０１２５】
本発明の方法は、さらに、本発明の死菌体を調製する工程を含んでいてもよい。すなわち、本発明の方法は、例えば、有機溶媒処理工程を含んでいてもよいし、培養工程を含んでいてもよい。
【０１２６】
本発明の方法により、具体的には有効成分を対象生物に摂取させることにより、対象生物においてRNAサイレンシングを誘導することができる、すなわち、RNAサイレンシング誘導効果が得られる。すなわち、本発明の方法は、対象生物においてRNAサイレンシングを誘導する方法であってよい。なお、一態様においては、RNAサイレンシングにより、対象生物の活動を抑制することができる。すなわち、本発明の方法の一態様は、対対象生物の活動を抑制する方法であってよい。また、一態様においては、RNAサイレンシングにより、対象生物を駆除することができる。すなわち、本発明の方法の一態様は、対象生物を駆除する方法であってよい。また、一態様においては、RNAサイレンシングにより、対象生物による害を防除することができる。すなわち、本発明の方法の一態様は、対象生物による害を防除する方法であってよい。
【０１２７】
対象生物による有効成分の摂取量は、RNAサイレンシング誘導効果が得られる限り、特に制限されない。有効成分の摂取量は、目的RNAの量に換算して、例えば、１０pg-RNA／個体以上、１００pg-RNA／個体以上、１ng-RNA／個体以上、１０ng-RNA／個体以上、または１００ng-RNA／個体以上であってもよく、１００μg-RNA／個体以下、１０μg-RNA／個体以下、１μg-RNA／個体以下、１００ng-RNA／個体以下、または１０ng-RNA／個体以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。有効成分の摂取量は、目的RNAの量に換算して、具体的には、例えば、１０pg-RNA／個体〜１０μg-RNA／個体であってもよい。
【０１２８】
有効成分を対象生物に摂取させる手段は特に制限されない。有効成分を対象生物に摂取させる手段は、対象生物の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。
【０１２９】
例えば、対象生物の巣や移動経路等の生活圏に有効成分を配置することにより、有効成分を対象生物に摂取させることができる。その場合、有効成分は、対象生物が摂取できる態様で生活圏に配置されればよい。例えば、有効成分を保持する対象生物用の餌を生活圏に配置することができる。そのような餌としては、例えば、有効成分を含有する組成物であって、対象生物用の餌として構成されたものを利用することができる。有効成分を含有する組成物については、本発明の組成物の説明を準用できる。また、そのような餌としては、例えば、有効成分を対象生物用の餌と組み合わせて利用することもできる。
【０１３０】
また、例えば、対象生物が食害をもたらすものである場合、食害を受ける対象物に有効成分を保持させることにより、対象生物が対象物を摂食した際に有効成分を併せて対象生物に摂取させることができる。食害を受ける対象物としては、植物が挙げられる。すなわち、有効成分は、例えば、植物等の食害を受ける対象物に施用することができる。有効成分の施用方法は、対象物の種類等の諸条件に応じて適宜選択することができる。植物への施用としては、植物体への散布や塗布が挙げられる。有効成分は、植物体の全体に施用してもよく、植物体の一部に施用してもよい。有効成分は、例えば、植物体の地上部全体に施用してもよい。植物体の一部としては、葉、茎、幹、根、果実が挙げられる。有効成分は、少なくとも、対象生物により食害を受ける部分に施用してよい。有効成分を葉に施用する場合、有効成分は、葉の表面および裏面の一方のみに施用されてもよく、両方に施用されてもよい。有効成分は、例えば、そのまま、あるいは適宜、有効成分を含有する組成物として調製され、対象物に施用することができる。有効成分を含有する組成物については、本発明の組成物の説明を準用できる。有効成分は、特に、液体の形態で対象物に施用することができる。すなわち、有効成分は、具体的には、例えば、有効成分を含有する液体組成物として調製され、対象物に施用することができる。
【０１３１】
なお、対象生物の生活圏に有効成分を配置することや、食害を受ける対象物に有効成分を施用すること等の、有効成分を対象生物が摂取できる状態にすることを、「有効成分の使用」ともいう。
【０１３２】
有効成分の使用時期や使用量は、RNAサイレンシング誘導効果が得られる限り、特に制限されない。有効成分の使用時期や使用量は、対象生物の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。有効成分は、例えば、対象生物の発生前に予防的に使用してもよく、対象生物の発生後に対症的に使用してもよい。有効成分は、１回のみ使用してもよく、２回またはそれ以上使用してもよい。有効成分は、間欠的に使用してもよく、連続的に使用してもよい。有効成分の使用量は、例えば、上述したような有効成分の所望の摂取量を達成できるように設定できる。
【０１３３】
また、有効成分は、他の成分と併用してもよい。他の成分については、本発明の組成物の説明における有効成分以外の成分についての記載を準用できる。
【０１３４】
有効成分は、例えば、本発明の組成物を利用して（すなわち本発明の組成物を摂取させることにより）、対象生物に摂取させることができる。すなわち、本発明の方法の一態様は、例えば、本発明の組成物を対象生物に摂取させることを含む方法であってよい。「有効成分を対象生物に摂取させること」には、本発明の組成物を対象生物に摂取させることも包含される。同様に、有効成分は、例えば、本発明の組成物を利用して、対象生物の生活圏に配置することや、食害を受ける対象物に施用することができる。すなわち、「有効成分を使用すること」には、本発明の組成物を使用することも包含される。本発明の組成物は、例えば、そのまま、あるいは適宜、水、生理食塩水、緩衝液、アルコール等の液体で希釈、分散、または溶解し、使用することができる。また、本発明の組成物は、他の成分と併用してもよい。他の成分については、本発明の組成物の説明における有効成分以外の成分についての記載を準用できる。本発明の組成物の使用態様については、上述したような有効成分の使用に関する記載を準用できる。
【０１３５】
＜５＞有効成分の使用
また、本発明は、上記のような用途での有効成分の使用を提供する。すなわち、本発明は、例えば、RNAサイレンシング誘導、対象生物の活動の抑制、対象生物の駆除、または対象生物による害の防除のための有効成分の使用や、RNAサイレンシング誘導用、対象生物の活動の抑制用、対象生物の駆除用、または対象生物による害の防除用の組成物の製造のための有効成分の使用を提供する。
【実施例】
【０１３６】
以下、非限定的な実施例によって、本発明をさらに更に具体的に説明する。【０１３７】
＜１＞Corynebacterium glutamicumのリボヌクレアーゼIII遺伝子欠損株の取得
C. glutamicum 2256株（ATCC13869株、以降、2256株とだけ記すこともある）のリボヌクレアーゼIII（RNaseIII）ホモログ遺伝子（以降、rnc遺伝子と記す）の破壊株を以下のようにして作製した。【０１３８】
まず、既知のRNaseIIIとのアミノ酸配列の相同性をもとに、遺伝子データベース（GenBank）にて、C. glutamicum 2256（Accession No. AP017557）のゲノム配列情報におけるREGION: 2115207..2115950に存在する領域がrnc遺伝子であると推定した。そこで、その遺伝子を欠損させるために必要な情報として、そのORF（オープンリーディングフレーム）領域と、その上流領域と下流領域の各々約1,000塩基（1kb）ずつのDNA塩基配列情報を遺伝子データベース（GenBank）から取得した。【０１３９】
次に、2256株の菌体から、DNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN製）を用いてゲノムDNAを取得し、これを鋳型として、配列番号１および配列番号２のプライマーを用いてrnc遺伝子の上流約1kb分のDNA断片を、また、配列番号３および配列番号４のプライマーを用いてrnc遺伝子の下流約1kb分のDNA断片を、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase（TAKARA BIO製）にてそれぞれPCR増幅して取得した。なお、PCR条件はメーカー推奨プロトコルに準じた。続いて、これらのDNA断片を、sacB遺伝子を搭載するプラスミドpBS4S（WO2005/113745及びWO2005/113744；C. glutamicumにおいては複製能を持たない）に以下の手順で連結した。具体的には、pBS4Sを鋳型とし、配列番号５及び配列番号６のプライマーを用いて、PrimeSTAR GXL DNA PolymeraseにてPCR増幅を行い、pBS4Sの増幅断片を取得した。次いで、上記で取得したrnc遺伝子上流域と下流域の両DNA断片とpBS4Sの増幅断片とを混合し、In-Fusion HD Cloning Kit（クロンテック製）を使用してそれら３つの断片の連結を行った（図１）。そして、その反応液を用いて、エシェリヒア・コリJM109株のコンピテントセル（TAKARA BIO製）を形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むLB寒天培地上に塗布した。37℃で一晩、培養後、寒天培地上に出現したコロニーから単一コロニーを分離し、カナマイシン耐性となった形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを常法により抽出し、構造解析により、rnc遺伝子の上流域と下流域のDNA断片を含むプラスミドを確認した。そして、これをpBS4SΔrncと命名した（図１）。【０１４０】
このプラスミドはコリネ型細菌内で自律複製できないため、本プラスミドをコリネ型細菌へ導入した場合、極めて低頻度であるが、本プラスミドが遺伝的相同組換え反応により染色体に組み込まれ、カナマイシン耐性を示す形質転換株が出現する。そこで、2256株を電気パルス法により高濃度の上記プラスミドpBS4Δrncを用いて形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex寒天培地（グルコース 5g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・7H2O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、pH7.5（KOHにて調整）、寒天20g/L）に塗布し30℃で一晩培養した。その結果、数コロニーが出現した。この培地上に生育してきた株は、該プラスミドのrnc遺伝子の近傍（上流域かあるいは下流域）のDNA配列断片と2256株のゲノム上の同遺伝子近傍の領域との間で相同組換えを起こした結果、同ゲノム中に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびsacB遺伝子が挿入されている株、いわゆる一回組み換え株となる。【０１４１】
次に、これらの一回組換え体を、カナマイシンを含まないCM-Dex液体培地（寒天を含まないこと以外はCM-Dex寒天培地と同一の組成）にて30℃で一晩培養し、適当に希釈した後に、カナマイシンを含まない10%(w/v)スクロース含有Dex-S10寒天培地（スクロース 10g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・4H2O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、ビオチン 10μg/L、pH7.5（KOHにて調整）、寒天20g/L）に塗布し、30℃にて一晩培養した。その結果、数個のコロニーが出現した。そこで、出現したコロニーをKOD FX NEO（TOYOBO製）を使用したコロニーPCR反応に供し、rnc遺伝子欠損株の選別を行った。配列番号７及び配列番号８のプライマーを用いて、それらの株のrnc遺伝子領域の長さをPCR増幅にて分析した結果、2256株（野生型）のゲノムDNAを鋳型にしたものよりもPCR増幅でのDNA断片の長さが短いものがあった。そこで、その内の一つの株をrnc遺伝子欠損株として選抜し、2256Δrnc株と命名した。【０１４２】
＜２＞2256株の内在性プラスミドpAM330のキュアリング
2256株は、内在性プラスミドとしてpAM330を有する（Yamaguchi, Ryuji, et al. "Determination of the complete nucleotide sequence of Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and analysis of its genetic information." Agricultural and biological chemistry 50.11 (1986): 2771-2778.）。pAM330とエシェリヒア・コリ用汎用ベクターであるpHSG399（TAKARA BIO製）とのコンポジットプラスミドpVC7（特開1997-070291）にsacB遺伝子を搭載したpVC7-sacBを作製した。具体的には、pBS4Sプラスミドを鋳型として、配列番号９と配列番号１０のプライマーを使用し、PrimeSTAR GXL DNA PolymeraseにてPCR増幅し、sacB遺伝子の増幅断片を得た。また、pVC7プラスミドを鋳型として、配列番号１１と配列番号１２のプライマーを使用し、KOD FX NEO（TOYOBO製）にてPCR増幅し、pVC7ベクターの増幅断片を得た。このようにして得た増幅断片を混合し、In-Fusion HD Cloning Kit（クロンテック製）使用して互いに連結した。次に、この反応溶液を用いて、エシェリヒア・コリJM109株のコンピテントセル（TAKARA BIO製）を形質転換し、クロラムフェニコール25μg/mlを含むLB寒天培地上に塗布して37℃で一晩培養した。その後、出現したコロニーから単一コロニーを分離した。こうして得られた形質転換体から常法によりプラスミドDNAを抽出し、DNA配列の解読により目的とするプラスミドを確認し、これをpVC7-sacBと命名した（図２）。2256Δrnc株にpVC7-sacBを電気パルス法により導入し、クロラムフェニコール5μg/mlを含むCM-Dex寒天培地に塗布し30℃で一晩培養後、2256Δrnc/pVC7-sacB株の形質転換体を複数個取得した。続いて、それらの株をCM-Dex培地で一晩培養し、さらに、これらの株をDex-S10寒天培地に塗布して、30℃にて一晩培養することで、pVC7-sacBが脱落しスクロース非感受性となった2256ΔrncΔpAM330株を取得した。【０１４３】
＜３＞発現ベクターの構築
プラスミドpVC7（特開1997-070291）において、pVC7の全塩基配列6679 bpのうち、1172番目（制限酵素HindIIIの切断認識部位の5’末端から２つ目の塩基Aを＋１とする）の塩基をシトシン（C）からグアニン（G）に置換することで、pVC7H2を取得した。なお、pVC7H2は、KOD -Plus- Mutagenesis Kit（東洋紡社製）を用いて作製した。具体的には、プラスミドpVC7を鋳型とし、上記キットに添付の作成プロトコルに従い、配列番号１３及び配列番号１４のプライマーを用いることでpVC7H2を作成した。pVC7H2を、常法に従い2256ΔpAM330株へ形質転換した。選択培地はクロラムフェニコール（5 μg/ml）を含むCM-Dex培地を使用した。その結果、コロニーは良好に形成し、そのコロニーを、クロラムフェニコール（5mg/L）を含むCM-Dex液体培地に加え、30℃にて終夜振とう培養した。その培養液より常法に従い、保持するプラスミドを抽出し、その調製したプラスミド溶液の一部をアガロース電気泳動にかけ、プラスミドのDNAバンドを調べたところ、pVC7H2は、高コピー数を示した。【０１４４】
＜４＞目的RNA発現プラスミドpVC7H2-Pf1-Hv-iap-Pf1revの構築
目的RNAとしてHv-iap RNAをF1プロモーターの制御下で双方向に発現するプラスミドpVC7H2-Pf1-Hv-iap-Pf1revを以下の手順で構築した。【０１４５】
ニジュウヤホシテントウ由来のアポトーシス阻害因子IAPをコードするiap遺伝子由来cDNAの部分配列であるHv-iap（配列番号１５）のDNA断片を、WO2010/140675に記載の情報をもとに、化学合成により作成した。また、バクテリオファージBFK20由来のF1プロモーター（配列番号１７）を含む配列番号１６のDNA断片を化学合成により作成した。そして、F1プロモーターの直後にHv-iap配列を連結したDNA配列を含むプラスミドの構築を以下のように実施した（図３）。まず、pVC7を鋳型として配列番号１８と配列番号１９のプライマーを使用し、KOD FX NEO（TOYOBO製）にてPCR増幅し、pVC7のDNA断片を得た。また、配列番号１６のDNA断片を鋳型とし、配列番号２０と配列番号２１のプライマーを使用し、PrimeSTAR HS（TAKARA BIO製）にてPCR増幅し、F1プロモーター配列を含むDNA断片を得た。また、配列番号１５のDNA断片を鋳型として、配列番号２２と配列番号２３のプライマーを使用し、PrimeSTAR HS（TAKARA BIO製）にてPCR増幅し、Hv-iap配列のDNA断片を得た。そして、これら3種のDNA断片を混合し、In-Fusion HD Cloning Kit（クロンテック製）にて連結した。次に、この反応溶液を用いて、エシェリヒア・コリJM109株のコンピテントセル（TAKARA BIO製）を形質転換し、クロラムフェニコール25μg/mlの耐性株を取得し、得られた形質転換体から常法によりプラスミドを抽出した。DNA配列決定により目的とするプラスミドであることを確認し、そのうちの一つをpVC7-Pf1-Hv-iapと命名した（図３）。【０１４６】
pVC7H2を鋳型とし配列番号１８と配列番号２４のプライマーを使用し、KOD FX NEO（TOYOBO製）にてPCR増幅し、pVC7H2のDNA断片を得た。また、配列番号１６のDNA断片を鋳型とし、配列番号２５と配列番号２６のプライマーを使用し、PrimeSTAR HS（TAKARA BIO製）にてPCR増幅し、F1プロモーター配列を含むDNA断片を得た。このようにして得た両DNA断片を混合し、In-Fusion HD Cloning Kit（クロンテック製）にて連結した。次に、この反応溶液を用いて、エシェリヒア・コリJM109株のコンピテントセル（TAKARA BIO製）を形質転換し、クロラムフェニコール25μg/mlを含むLB寒天培地上に塗布して37℃で一晩培養した。その後、出現したコロニーから単一コロニーを分離し、得られた形質転換体から常法によりプラスミドを抽出した。DNA配列決定により目的とするプラスミドであることを確認し、これをpVC7H2-Pf1revと命名した（図４）。【０１４７】
次に、pVC7H2-Pf1revのF1プロモーターの下流に制限酵素サイトKpnIサイトおよびXhoIサイトを導入する為、pVC7H2-Pf1revを鋳型として、配列番号１８と配列番号２７のプライマーを使用し、KOD-Plus- Mutagenesis Kit（TOYOBO製）を用いてインバースPCRを実施後に、DpnI処理、リン酸化反応、およびセルフライゲーション反応を実施して増幅DNA断片を環状化し、エシェリヒア・コリJM109株のコンピテントセル（TAKARA BIO製）に導入した。それらの菌体をクロラムフェニコール25μg/mlを含むLB寒天培地上に塗布して37℃で一晩培養した。その後、出現したコロニーから単一コロニーを分離し、得られた形質転換体から常法によりプラスミドを抽出した。DNA配列決定により目的とするプラスミドであることを確認し、これをpVC7H2-KpnI-XhoI-Pf1revと命名した（図４）。【０１４８】
続いて、pVC7-Pf1-Hv-iapを鋳型として、配列番号２８と配列番号２９のプライマーを使用し、PrimeSTAR HS（TAKARA BIO製）にてPCRを行い、KpnI制限酵素サイト―F1プロモーター領域―Hv-iap領域―XhoI制限酵素サイトの並びとなるDNA断片を取得した。そして、本DNA断片と、pVC7H2-KpnI-XhoI-Pf1revの各々に対し、制限酵素KpnI及びXhoIによる切断を行った後、MinElute PCR Purification Kit（キアゲン製）で精製を行い、両精製産物を混合し、Ligation high Ver.2（TOYOBO製）でライゲーション反応を実施することで、両DNA断片を連結した。次に、この反応溶液を用いて、エシェリヒア・コリJM109株のコンピテントセル（TAKARA BIO製）を形質転換し、クロラムフェニコール25μg/mlの耐性菌株を取得した。得られた形質転換体から常法によりプラスミドを抽出し、DNA配列決定により目的とするプラスミドであることを確認し、これをpVC7H2-Pf1-Hv-iap-Pf1revと命名した（図４）。【０１４９】
＜５＞Hv-iap RNA含有コリネ型細菌菌体のエタノール処理
上記の実施例で作成したプラスミドpVC7H2とpVC7H2-Pf1-Hv-iap-Pf1revを、それぞれ上記の実施例に記載した方法で、C. glutamicum 2256ΔrncΔpAM330株へ導入し、形質転換体を取得した。そして、これらの形質転換体を5 μg/mlのクロラムフェニコールを添加したCM-Dex培地で24時間振盪培養した。その後、その培養液から一部を抜き取り、107倍に希釈し、CM-Dex寒天培地へ撒くことで、上記の培養液に含まれる生菌数を計測した。その結果、生菌数は4.4x109個／mLと判明した。次に、上記の培養液0.2mLを遠心し、菌体を集菌した。その菌体へ、表１に記載の各濃度のエタノールを含む10 mMリン酸バッファー（pH6.8）1mLを添加し、よく混合することで菌体をエタノール処理した。すなわち、エタノール処理開始時の生菌体濃度は約109個／mLであった。なお、処理温度と処理時間は、室温（約25℃）で10分間とした。処理後の菌体懸濁液を遠心（12,000rpm, 2分間）し、上清を除いたのち、そこへ0.2mLのCM-Dex培地を加えて菌体を懸濁した。その懸濁液0.1mL（生菌数として約4x108個）をCM-Dex寒天培地へ撒き、生育を確認した。【０１５０】
結果を表１に示す。エタノール濃度30％から95％の範囲で処理した菌体の場合、寒天培地上には一つもコロニーが形成されなかった。すなわち、エタノール濃度30％から95％の範囲で、生菌率としては少なくとも10-8以下となった。このことから、エタノール濃度30％以上で、本コリネ型細菌菌体は事実上完全に死滅することが判明した。【０１５１】
【表１】
2019163827.tif 000002
【０１５２】
次に、エタノール処理による菌体内の目的RNAの変化を調べるため、上記のエタノール処理後に、集菌した菌体を室温で24時間静置したのちに、菌体から全RNAを抽出し、それを非変性PAGEに供した。具体的には、上記の菌体に対して、15 mg-リゾチーム（シグマ製）／ml - TE緩衝液225 μlを添加し室温で30分間反応し、さらに20 mg/ml ProteinaseK（タカラ製）25 μlを添加し更に30分間反応した後、TRIzol LS Reagent（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用いてプロトコルに沿って、RNAの抽出を実施した。また、非変性PAGEは6％のTBE Gel（Novex製）でプロトコルに従って評価した。【０１５３】
なお、このRNA安定性評価のための対照区としては、エタノール処理を行わず、培養液0.2mL分の菌体を10 mMリン酸バッファー（pH6.8）1mLのみで懸濁したものを用いた。具体的には、上記リン酸バッファーの懸濁液を10分間静置し、遠心後に上清部分を除いた菌体を調製し、それを室温で24時間静置したものを「無処理」サンプルとして、また、菌体の培養後に速やかにRNAprotect Bacteria Reagent（キアゲン製）処理したものを「P.C.」サンプルとして用いた。【０１５４】
結果を図５に示す。長さが350bp付近の目的RNAのバンドが、10％〜40％濃度（v/v）のエタノールで処理したサンプルでは「P.C.」対照区よりも少なくなっているのに対して、50％〜95％濃度（v/v）のエタノールで処理したサンプルでは「P.C.」対照区とほぼ同程度に保持されていることがわかった。また、50％〜95％濃度（v/v）のエタノールで処理したサンプルでは「無処理」サンプルと比較しても目的RNAの量が多いことから、エタノール処理をすることにより、目的RNAの生産菌を殺菌すると同時に菌体内の目的RNAがより安定に保持されることがわかった。【０１５５】
＜６＞Hv-iap RNA含有コリネ型細菌菌体のメタノール処理
実施例＜５＞と同様に、10％〜95％濃度(v/v)メタノール／10 mMリン酸バッファー（pH6.8）を用いてコリネ型細菌菌体を処理し、コリネ型細菌の生存率と目的RNAの蓄積量を評価した。【０１５６】
結果を表２および図６に示す。メタノール濃度50％から95％の範囲で、生菌率は少なくとも10-8以下となった。このことから、メタノール濃度50％以上で、本コリネ型細菌菌体は事実上完全に死滅することが判明した。また、菌体内の目的RNAは、70％〜95％濃度のメタノール処理区で良好に保持されることがわかった。【０１５７】
【表２】
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【０１５８】
＜７＞Hv-iap RNA含有コリネ型細菌菌体の加熱処理
実施例＜５＞で得た培養液0.2mLを無菌的にエッペンドルフチューブへ入れて、遠心して得た菌体を1 mlの10 mMリン酸バッファー（pH6.8）で懸濁し、１０分間静置した。それを再度遠心して得た菌体を、100℃に設定したヒートブロックで30分間、加温することで殺菌処理を行った。殺菌処理後の菌体に0.2mLのCM-Dex培地を加えて菌体を懸濁し、その0.1mL分をCM-Dex寒天培地へ撒いたところ、寒天培地上には一つもコロニーは形成しなかった。すなわち、生菌率としては少なくとも10-8以下となった。このことから、100℃で30分間の加熱処理にて本コリネ型細菌菌体は事実上完全に死滅することが判明した。こうして、加熱滅菌した目的RNA含有菌体を調製した。【０１５９】
＜８＞Hv-iap RNA含有コリネ型細菌菌体のニジュウヤホシテントウへの投与実験
実施例＜５＞および＜６＞で調製した各アルコールの濃度（v/v）が80％の条件で処理を行った菌体と、実施例＜７＞で調製した熱処理（100℃、30分間）を行った菌体を用いて、ニジュウヤホシテントウへの投与試験を実施した。すなわち、Hv-iap生産菌としては、2256ΔrncΔpAM330/pVC7H2-Pf1-Hv-iap-Pf1rev株を用いた。また、対照区として、Hv-iapを生産しないベクターのみを導入した2256ΔrncΔpAM330/pVC7H2株を用いた。それぞれの処理後の菌体内のRNAを非変性PAGEで評価した結果、熱処理と比較してエタノール処理およびメタノール処理では目的RNAであるHv-iapのRNAバンドが明確に見られ、Hv-iapが菌体内に安定に保持されていることが確認できた（図７）。【０１６０】
次に、下記のようにして、作物害虫であるニジュウヤホシテントウに摂食させるために、エタノール処理、メタノール処理、または熱処理を施した各菌体サンプルを調製した。【０１６１】
エタノール処理菌体サンプルおよびメタノール処理菌体サンプルは、以下の手順で調製した。実施例＜５＞で得た培養液1.5mLを遠心して集菌し、その菌体ペレットに1125μlの滅菌milliQ水と375μlの200mMリン酸バッファーを添加し、ピペッティングで懸濁したのちに、15ｍL容のファルコンチューブへその懸濁液を移し、そこへエタノールあるいはメタノールを6ml添加しよく混合した。それを室温にて１０分間静置し、その後、それを5,000rpm（3,270 g）x 10分間の遠心にかけ、菌体を集めた。次に、そこへ、10mMリン酸バッファー（pH6.8）7.5mLを加えて菌体を懸濁し、遠心し、菌体を洗浄後に、菌体へ0.8mLの10mMリン酸バッファー（pH6.8）を加えて再び懸濁した。そして、これをエッペンドルフチューブへ入れ、遠心後に上清を除くことで、エタノール処理あるいはメタノール処理菌体を得た。【０１６２】
熱処理菌体サンプルは、以下の手順で調製した。実施例＜５＞で得た培養液1.5mLを遠心し、集菌した菌体へ、10mMリン酸バッファー（pH6.8）を7.5mL加えて菌体を懸濁した。それを約1.5mLずつチューブ５本へ移したのち遠心（14,000g x ５分間）し、上清を除いて、菌体の入ったチューブを100℃設定のヒートブロックに入れて３０分間加熱した。その後、各チューブへ0.8mLの10mMリン酸バッファー（pH6.8）を加えて懸濁し、それを最終的に、一本のエッペンチューブへ集めて、遠心より上清を除き、熱処理菌体を得た。【０１６３】
以上のように調製した、エタノール処理、メタノール処理、または熱処理を施した各菌体サンプルに50 μlの蒸留水を加え懸濁することで、各々の菌体懸濁液を調製した。そして、この菌体懸濁液0.5 μlをニジュウヤホシテントウの3齢幼虫に経口にて摂取させた。また、対照区としては、水のみをニジュウヤホシテントウの3齢幼虫に摂取させた。すなわち、実験区は、表３に示す７つの区とし、各実験区について幼虫を4〜5匹用いた。上記の試料（菌体懸濁液または水）を摂取させた後、幼虫を摂食用の芋葉に移した。２４時間後に、新たな芋葉へ各実験区の幼虫を移し、摂食させた古い芋葉を回収した。さらに２４時間後（試料摂取の４８時間後）に、摂食させた芋葉を回収した。０〜２４時間と２４〜４８時間での幼虫による芋葉の摂食の程度を測定し、それぞれ、「２４時間後」と「４８時間後」の摂食のデータとした。【０１６４】
結果を表３に示す。適切な濃度のエタノールあるいはメタノールで目的RNA含有菌体を処理することで菌体を死滅させることができ、以て目的の害虫においてRNAサイレンシングを誘導することができるRNA含有死菌体を調製できることが分かった（実験区３と５）。すなわち、本手法は、既存の熱処置によるRNA含有死菌体（実験区７）の調製方法に比べて、RNAサイレンシングの誘導に極めて有効であることが示された。【０１６５】
【表３】
2019163827.tif 000004
【０１６６】
＜９＞目的RNA発現プラスミドpL4440-Pt7-Hviap-Pt7revの構築
目的RNAとしてHv-iap RNAをT7プロモーターの制御下で双方向に発現するプラスミドpL4440-Pt7-Hviap-Pt7revを以下の手順で構築した。【０１６７】
＜９−１＞pVC7-Pt7-KpnI-XhoI-Pt7revの作製
pVC7を鋳型とし配列番号32と配列番号33のプライマーを使用し、KOD FX NEO（TOYOBO製）にてPCR増幅し、pVC7のDNA断片を得た。次に、[T7プロモーター領域-KpnI制限酵素サイト-XhoI制限酵素サイト-逆向きT7プロモーター領域]を含むDNA断片取得のため、配列番号34と配列番号35のDNA断片を合成しアニーリングした。両DNA断片を混合し、In-Fusion HD Cloning Kit（クロンテック製）にて連結した。次に、この反応溶液を用いて、エシェリヒア・コリJM109株のコンピテントセル（TAKARA BIO製）を形質転換し、クロラムフェニコール25μg/mlを含むLB寒天培地上に塗布して37℃で一晩培養した。その後、出現したコロニーから単一コロニーを分離し、得られた形質転換体から常法によりプラスミドを抽出した。DNA配列決定により目的とするプラスミドであることを確認し、これをpVC7-Pt7-KpnI-XhoI-Pt7revと命名した。【０１６８】
＜９−２＞pVC7-Pt7-Hviap-Pt7revの作製
ニジュウヤホシテントウ由来のアポトーシス阻害因子IAPをコードするiap遺伝子由来cDNAの部分配列であるHv-iap（配列番号１５）のDNA断片を鋳型として、配列番号36と配列番号37のプライマーを使用し、KOD FX NEO（TOYOBO製）にてPCR増幅し、[KpnI制限酵素サイト-Hv-iap配列-XhoI制限酵素サイト]を含むDNA断片を得た。そして、本DNA断片とpVC7-Pt7-KpnI-XhoI-Pt7revのそれぞれを制限酵素KpnI及びXhoIで切断し、MinElute PCR Purification Kit（キアゲン製）で精製した。両精製物を混合し、Ligation high Ver.2（TOYOBO製）でライゲーション反応を実施することで、両DNA断片を連結した。次に、この反応溶液を用いて、エシェリヒア・コリJM109株のコンピテントセル（TAKARA BIO製）を形質転換し、クロラムフェニコール25μg/mlを含むLB寒天培地上に塗布して37℃で一晩培養した。その後、出現したコロニーから単一コロニーを分離し、得られた形質転換体から常法によりプラスミドを抽出した。DNA配列決定により目的とするプラスミドであることを確認し、これをpVC7-Pt7-Hviap-Pt7revと命名した。【０１６９】
＜９−３＞pL4440-Pt7-Hviap-Pt7revの作製
プラスミドL4440（US2017-0137841）を鋳型とし、配列番号38と配列番号39のプライマーを使用し、KOD FX NEO（TOYOBO製）にてPCR増幅し、DNA断片を得た。また、プラスミドpVC7-Pt7-Hviap-Pt7revを鋳型とし、配列番号40と配列番号41のプライマーを使用し、KOD FX NEO（TOYOBO製）にてPCR増幅し、DNA断片を得た。両DNA断片を混合し、In-Fusion HD Cloning Kit（クロンテック製）にて連結した。次に、この反応溶液を用いて、エシェリヒア・コリJM109株のコンピテントセル（TAKARA BIO製）を形質転換し、アンピシリン100μg/mlを含むLB寒天培地上に塗布して37℃で一晩培養した。その後、出現したコロニーから単一コロニーを分離し、得られた形質転換体から常法によりプラスミドを抽出した。DNA配列決定により目的とするプラスミドであることを確認し、これをpL4440-Pt7-Hviap-Pt7revと命名した。【０１７０】
＜１０＞Hv-iap RNA含有E. coli菌体の調製
プラスミドpL4440-Pt7-Hviap-Pt7revをE. coli HT115(DE3)株（GE Healthcare Dharmacon社）へ導入し、形質転換体pL4440-Pt7-Hviap-Pt7rev/HT115(DE3)を取得した。この形質転換体を100μg/mLのアンピシリンを添加したLB培地で37℃、120rpmで振盪培養した。培養開始の約3時間後に培養液のOD660が0.5付近になった時点でIPTG（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）を終濃度1mMになるように添加し、更に3時間培養した。その培養液から一部を抜き取り、LB培地にて104倍に希釈し、この希釈液の0.1mLをLB寒天培地へ撒くことで、この培養液に含まれる生菌数を計測した。その結果、生菌数は約2 x 107個/mLと判明した。次に、この菌体に対してエタノール処理を施した。エタノール処理は、培養液5.6mLから遠心分離により集菌した菌体に80％のエタノールを含む10mMリン酸バッファー（pH6.8）を5.6mL添加し、よく混合したのち、室温（25℃）で10分間静置することで実施した。その後、遠心分離によりエタノール処理菌体を回収した。【０１７１】
別途、エタノール処理後の生存率を調べるために、上記と同様にエタノール処理を実施し、培養液として0.1mL分の処理菌体液（エタノール処理前の生菌数として約2 x 106個）をLB寒天培地へ撒いた。その結果、寒天培地上には一つもコロニーは形成しなかった。すなわち、生菌率としては2 x 106分の１以下となった。このことから、上記エタノール処理によりE. coli菌体は事実上完全に死滅することが確認された。【０１７２】
一方、ベクタープラスミドであるL4440をE. coli HT115(DE3)株へ導入し、形質転換体L4440/HT115(DE3)を取得した。上記と同様の手順で、この形質転換体を培養し、培養液5.6mLから集菌した菌体にエタノール処理を実施し、エタノール処理菌体を取得した。【０１７３】
また、実施例＜５＞と同様にして、菌体内のHv-iap RNAの蓄積を確認した。【０１７４】
＜１１＞Hv-iap RNA含有E. coliのニジュウヤホシテントウへの供与実験
実施例＜１０＞で調製したエタノール処理した各菌体サンプルに50 μlの蒸留水を加え懸濁することで、各々の菌体懸濁液を調製した。そして、この菌体懸濁液0.5 μlをニジュウヤホシテントウの3齢幼虫に経口にて摂取させた。また、対照区としては、水のみをニジュウヤホシテントウの3齢幼虫に摂取させた。すなわち、実験区は、表４に示す３つの区とし、各実験区について幼虫を５匹用いた。上記の試料（菌体懸濁液または水）を摂取させた後、幼虫を摂食用の芋葉に移した。２４時間後に、新たな芋葉へ各実験区の幼虫を移し、摂食させた古い芋葉を回収した。さらに２４時間後（試料摂取の４８時間後）に、摂食させた芋葉を回収した。０〜２４時間と２４〜４８時間での幼虫による芋葉の摂食の程度を測定し、それぞれ、「２４時間後」と「４８時間後」の摂食のデータとした。【０１７５】
結果を表４に示す。エタノール処理したHv-iap RNA含有E. coli菌体の場合、２４時間までに芋葉の摂食量の低下が観察され、２４時間以降では摂食量のさらに顕著な低下が観察された。すなわち、エタノール処理したE. coli菌体を用いることにより目的の害虫においてRNAサイレンシングを十分に誘導できることがわかった。【０１７６】
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【０１７７】
本発明によれば、対象生物において効率的にRNAサイレンシングを誘導することができる。【０１７８】
＜配列表の説明＞
配列番号１〜１４：プライマー
配列番号１５：Hv-iapの塩基配列
配列番号１６：F1プロモーターを含むＤＮＡ断片の塩基配列
配列番号１７：F1プロモーターの塩基配列
配列番号１８〜２９：プライマー
配列番号３０：C. glutamicum 2256（ATCC 13869）のrnc遺伝子の塩基配列
配列番号３１：C. glutamicum 2256（ATCC 13869）のRncタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３２〜４１：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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