(57)【要約】  本発明は、キャッサバ粕からグルコース糖液を効率よく製造する方法および当該グルコース糖液を発酵原料として化学品を製造する方法を提供することを課題とし、かかる課題を解決するために、キャッサバ粕を原料とするグルコース糖液の製造方法であって、工程（１）キャッサバ粕の固形分濃度が１０重量未満となるよう大気圧下で６０℃以上の熱水を接触させ、熱水処理物を得る工程、工程（２）前記熱水処理物にグルコアミラーゼおよびペクチナーゼを添加して、加水分解し、加水分解物を得る工程、工程（３）前記加水分解物を、固液分離し、液体画分を回収する工程、を含むグルコース糖液の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャッサバ粕を原料とするグルコース糖液の製造方法であって、
工程（１）キャッサバ粕に、前記キャッサバ粕の固形分濃度が１０重量％未満となるよう大気圧下で６０℃以上の熱水を接触させ、熱水処理物を得る工程、
工程（２）前記熱水処理物にグルコアミラーゼおよびペクチナーゼを添加して、加水分解し、加水分解物を得る工程、
工程（３）前記加水分解物を固液分離し、液体画分を回収する工程、
を含むグルコース糖液の製造方法。
【請求項２】
前記工程（２）のグルコアミラーゼの添加量が、酵素活性としてキャッサバ粕の乾燥重量１ｇあたり０．０１Ｕ以上である、請求項１に記載のグルコース糖液の製造方法。
【請求項３】
前記工程（２）のペクチナーゼの添加量が、ポリガラクツロン酸分解活性としてキャッサバ粕の乾燥重量１ｇあたり０．０１Ｕ以上である、請求項１または２に記載のグルコース糖液の製造方法。
【請求項４】
前記ペクチナーゼがアクレモニウム属微生物由来であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のグルコース糖液の製造方法。
【請求項５】
前記固液分離が遠心分離である、請求項１〜４のいずれかに記載のグルコース糖液の製造方法。
【請求項６】
前記液体画分を精密ろ過膜に通じてろ過し、透過側より除菌されたグルコース糖液を回収する工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のグルコース糖液の製造方法。
【請求項７】
前記液体画分を限外ろ過膜に通じてろ過し、非透過側からグルコアミラーゼおよびペクチナーゼを回収する工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のグルコース糖液の製造方法。
【請求項８】
前記除菌されたグルコース糖液を限外ろ過膜に通じてろ過し、非透過側からグルコアミラーゼおよびペクチナーゼを回収する工程を含む、請求項６に記載のグルコース糖液の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法によりグルコース糖液を得る工程および当該工程により得られたグルコース糖液を発酵原料として化学品を製造する工程を含む、化学品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キャッサバ粕を原料としたグルコース糖液の製造方法および当該グルコース糖液を発酵原料とする化学品の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境保護の観点における化石燃料代替として、バイオマスから製造した糖を原料に発酵法による化学品の製造が検討されており、デンプンやショ糖を原料とした燃料用エタノールの製造がアメリカ、ブラジル、タイなどで推進されている。その一方で、デンプンやショ糖は食料源でもあるため、倫理的な観点から、バイオマスの非可食部への転換が求められている。【０００３】
そこで、バイオマスの非可食部より扱いやすく食料とも競合しない原料として注目されているのがキャッサバ粕である。キャッサバの根茎はデンプンが多く含まれるため、デンプン製造の原料として古くから利用されている。キャッサバ粕はキャッサバの根茎からデンプンを取り出した後の残渣であるが、残渣には、繊維分以外にデンプンも多く残存している。そのため、キャッサバ粕は飼料として利用されている例もあるが、その価値は低く、廃棄されている分も多い。【０００４】
特許文献１、２には、キャッサバ粕に残存するデンプンをグルコースに加水分解し、エタノールを製造する方法が記載されている。しかしながら、これらの特許文献では、キャッサバ粕に残存するデンプンの加水分解反応と、エタノール発酵を同時に行っており、キャッサバ粕から糖液を製造する方法は記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１１４９６２号
【特許文献２】国際公開第２０１４／０１０５６７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、キャッサバ粕からグルコース糖液を製造することができれば、得られたグルコース糖液を発酵原料として利用し、キャッサバ粕をエタノール以外の化学品の製造にも利用できると考えた。キャッサバ粕からグルコース糖液を製造するためには、キャッサバ粕に含まれるデンプンをグルコースに加水分解した後、固液分離してグルコース糖液を得る必要がある。本発明者らは、キャッサバ粕を特許文献１に記載の方法を参考に加水分解して、得られた加水分解物の固液分離を試みたが、キャッサバ粕を加水分解すると粘度が増大し、ほとんど液体画分が得られなかった。【０００７】
本発明は、キャッサバ粕を糖化した後の粘度を低下させ、キャッサバ粕から効率よくグルコース糖液を製造する方法および当該グルコース糖液を発酵原料として化学品を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した課題を解決するべく、本発明者は鋭意研究した結果、キャッサバ粕からグルコース糖液を効率よく製造する方法および当該グルコース糖液を発酵原料として化学品を製造する方法を見出した。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［９］を包含する。
［１］キャッサバ粕を原料とするグルコース糖液の製造方法であって、
工程（１）キャッサバ粕に、前記キャッサバ粕の固形分濃度が１０重量％未満となるよう大気圧下で６０℃以上の熱水を接触させ、熱水処理物を得る工程、
工程（２）前記熱水処理物にグルコアミラーゼおよびペクチナーゼを添加して、加水分解し、加水分解物を得る工程、
工程（３）前記加水分解物を固液分離し、液体画分を回収する工程、
を含むグルコース糖液の製造方法。
［２］前記工程（２）のグルコアミラーゼの添加量が、酵素活性としてキャッサバ粕の乾燥重量１ｇあたり０．０１Ｕ以上である、［１］記載のグルコース糖液の製造方法。
［３］前記工程（２）のペクチナーゼの添加量が、ポリガラクツロン酸分解活性としてキャッサバ粕の乾燥重量１ｇあたり０．０１Ｕ以上である、［１］または［２］に記載のグルコース糖液の製造方法。
［４］前記ペクチナーゼがアクレモニウム属微生物由来であることを特徴とする［１］〜［３］のいずれかに記載のグルコース糖液の製造方法。
［５］前記固液分離が遠心分離である、［１］〜［４］のいずれかに記載のグルコース糖液の製造方法。
［６］前記液体画分を精密ろ過膜に通じてろ過し、透過側より除菌されたグルコース糖液を回収する工程を含む、［１］〜［５］のいずれかに記載のグルコース糖液の製造方法。
［７］前記液体画分を限外ろ過膜に通じてろ過し、非透過側からグルコアミラーゼおよびペクチナーゼを回収する工程を含む、［１］〜［５］のいずれかに記載のグルコース糖液の製造方法。
［８］前記除菌されたグルコース糖液を限外ろ過膜に通じてろ過し、非透過側からグルコアミラーゼおよびペクチナーゼを回収する工程を含む、［６］に記載のグルコース糖液の製造方法。
［９］［１］〜［８］のいずれかに記載の方法によりグルコース糖液を得る工程および当該工程により得られたグルコース糖液を発酵原料として化学品を製造する工程を含む、化学品の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明では、キャッサバ粕を加水分解して、固液分離により効率的にグルコース糖液を製造することが可能となり、当該グルコース糖液を発酵原料として利用することで、キャッサバ粕を利用して各種の化学品を製造することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
キャッサバ粕とは、キャッサバの根茎（キャッサバ芋）からデンプンを製造する際の副産物であって、デンプンを取り出した後に排出される残渣のことである。キャッサバ芋からデンプンを製造する方法は、以下の方法が挙げられる。最初にキャッサバ芋を洗浄、剥皮し、粗砕する。その後、磨砕機にかけ、組織を粉砕分散する。磨砕分散後、デンプンと繊維にふるい別けされる。この繊維分がキャッサバ粕である。キャッサバ粕には水分が残存した状態のウエット品と、ウエット品を乾燥させたドライ品があるが、いずれも用いることができ、どちらか片方のみを用いてもよいし、混合してもよい。また、粉砕処理等を行うことで粒子サイズを調整してもよい。入手の方法は、キャッサバ粕排出業者から買い取るなどするか、飼料用に市販されているものを購入することができる。
【００１２】
以下、本発明のグルコース糖液の製造方法について工程ごとに説明する。
【００１３】
［工程（１）：キャッサバ粕に、前記キャッサバ粕の固形分濃度が１０重量％未満となるよう大気圧下で６０℃以上の熱水を接触させ、熱水処理物を得る工程］
【００１４】
工程（１）は、キャッサバ粕を熱水に接触させ、キャッサバ粕に含まれるデンプンの水和を促進する工程である。水和とは、水分子が付加する現象で、デンプンの水和は特に糊化とも呼ばれる。水の存在下で加熱することでデンプンに水分子が付加し、水和させることができる。デンプンを水和させることで、酵素によるデンプンの加水分解が効率よく進む。本発明では、キャッサバ粕と大気圧下で６０℃以上の熱水を、キャッサバ粕の固形分濃度が１０重量％未満になるよう調整して接触させる。キャッサバ粕の固形分濃度が１０重量％以上になると、熱水処理物が増粘し取り扱いが困難になる上、後工程の固液分離による液体画分の回収が困難になる。一方、固形分濃度の下限は特に制限はなく、固形分濃度が低い方がキャッサバ粕の粘度を低くすることができるため取り扱いしやすいが、あまりに希薄であると使用する水の量が増えるため、経済性の観点から、０．１重量％以上１０重量％未満が好ましい。より好ましくは１重量％以上１０重量％未満であり、さらに好ましくは５重量％以上１０重量％未満である。
【００１５】
固形分濃度は、固体と液体の混合物において、混合物中における固体の割合を指し、本発明では、キャッサバ粕と大気圧下で６０℃以上の熱水とを接触させた混合物中におけるキャッサバ粕の乾燥重量の割合である。固形分濃度の具体的な測定方法以下のとおりである。赤外線水分計を用いて、キャッサバ粕に含まれる水分割合Ｒｗ（重量％）を測定し、下の式（１）より算出した値を用いる。赤外線水分計には、ＦＤ−７２０（株式会社ケツト科学研究所製）を用い、乾燥温度１０５℃で３０秒間の水分変化量が０．０５％以下になったら測定を停止する自動停止モードにて測定した値を用いる。
固形分濃度（重量％）＝１００−Ｒｗ・・・（式１）
【００１６】
キャッサバ粕の乾燥重量は、キャッサバ粕の重量Ｗａ（ｇ）からキャッサバ粕に含まれる水分の重量を引いた重量である。乾燥重量の具体的な測定方法は、固形分濃度と同様に赤外線水分計を用いて、水分割合Ｒｗ（重量％）を測定し、下の式（２）より算出した値を用いる。
乾燥重量（ｇ）＝Ｗａ−Ｗａ×Ｒｗ・・・（式２）
【００１７】
熱水の温度は、大気圧下で６０℃以上であればよく、好ましくは７０℃以上、さらに好ましくは８０℃以上である。６０℃以下であると、キャッサバ粕中に含まれるデンプンが十分に水和されずに後の工程の酵素反応の効率が低くなる。また、大気圧下で熱水処理を行うため、熱水の温度の上限は１００℃である。
【００１８】
キャッサバ粕と熱水とを接触させる時間は、キャッサバ粕に含まれるデンプンが十分に水和されかつ経済的に適当な時間を設定すればよいが、好ましくは３０分以上、より好ましくは１時間以上、さらに好ましくは２時間以上、通常、１６時間以下である。また、このとき、熱水の温度を保持するために、加温してもよい。
【００１９】
［工程（２）：前記熱水処理物にグルコアミラーゼおよびペクチナーゼを添加して加水分解し、加水分解物を得る工程］
【００２０】
工程（２）は、工程（１）で得られた熱水処理物に加水分解酵素を添加して、加水分解反応を行い、加水分解物を得る工程である。
【００２１】
工程（２）で添加するグルコアミラーゼは、アミロースとアミロペクチンのα−１，４グルコシド鎖を非還元性末端からグルコース単位で切断するエキソ型酵素である。グルコアミラーゼの添加量としては、使用する酵素剤によって効果的な範囲を設定すればよいが、キャッサバ粕の乾燥重量１ｇあたりの酵素活性として０．０１Ｕ以上であることが好ましく、０．１Ｕ以上であることがより好ましく、０．２Ｕ以上であることがさらに好ましい。上限に制限はないが、経済性の観点から、例えば、１００Ｕ以下とすることができる。
【００２２】
本発明でのグルコアミラーゼの酵素活性は、４−ニトロフェニル−β−マルトシド（Ｇ２−β−ＰＮＰ）の分解活性として測定する。具体的には、Ｇ２−β−ＰＮＰ溶液およびβ−グルコシダーゼ溶液の混合液に適当に希釈した酵素液を添加して、３７℃で１０分間反応させる。反応停止および遊離した４−ニトロフェノール（ＰＮＰ）を発色させるため炭酸ナトリウム溶液を添加し、４００ｎｍで吸光度を測定する。ブランクは、炭酸ナトリウム溶液添加後に酵素液を添加する以外は同様の方法で反応させたものを用いる。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのＰＮＰを生成する量とし、タンパク質量１ｍｇあたりの活性は以下の式（３）、（４）で算出する。
酵素液あたりの活性（Ｕ／ｍＬ）＝（Ｅｓ−Ｅｂ）×０．１７１×Ｄｆ・・・（式３）
タンパク質量１ｍｇあたりの活性（Ｕ／ｍｇ）＝酵素液あたりの活性（Ｕ／ｍＬ）÷酵素液のタンパク濃度（ｍｇ／ｍＬ）・・・（式４）
式３中のＥｓは測定試料の吸光度、Ｅｂはブランクの吸光度、Ｄｆは測定試料の希釈倍率をそれぞれ表す。
【００２３】
工程（２）で添加するペクチナーゼは、ペクチンを加水分解する酵素の総称であって、ペクチンエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼがこれに含まれ、一般的にこれらのうち少なくとも１種類を含むものをペクチナーゼと呼ぶ。本発明では、いずれもペクチナーゼとして用いることができるが、ポリガラクツロン酸分解活性を有するペクチナーゼを用いることが好ましい。ポリガラクツロナーゼおよびペクチンリアーゼはポリガラクツロン酸分解活性を有する。その他、必要に応じてポリガラクツロン酸分解活性を有するペクチナーゼと、上記にペクチナーゼとして挙げた酵素とを混合してペクチナーゼとして用いてもよい。
【００２４】
ポリガラツクロナーゼとは、ペクチンの主な構成成分であるポリガラクツロン酸を単糖またはオリゴ糖のガラクツロン酸に分解する加水分解酵素であり、ポリガラクツロン酸分解活性は以下の方法により測定する。
【００２５】
１．５ｍＬチューブに１０μＬの１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）、２０μＬの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸、６０μＬの超純水を添加し、５０℃で５分間恒温する。次に、１０μＬの適当に希釈した酵素液を加え、５０℃で３０分間反応させた後、１００μＬのジニトロサリチル酸試薬を添加し、５分間煮沸して還元糖の発色を行い、氷水中で急冷する。続いて、４００μＬの超純水を加え、５３５ｎｍにおける吸光度を測定する。別途、５３５ｎｍにおけるガラクツロン酸標準液の検量線を用意しておき、当該検量線よりＤ−ガラクツロン酸の生成量を求め、１分間に１μｍｏｌのＤ−ガラクツロン酸相当の還元糖を生成する量を酵素１単位（１Ｕ）として算出する。測定のブランクには、酵素液を加えずに上記と同様にジニトロサリチル酸試薬添加まで処理し、その後酵素液を添加して還元糖の発色を行ったものを用いる。検量線は、０〜２．０ｇ／Ｌの範囲のＤ−ガラクツロン酸標準液にジニトロサリチル酸試薬を加えて、上記と同様に発色させたものを用いる。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのＤ−ガラクツロン酸相当の還元糖を生成する量とする。本発明で用いるポリガラクツロナーゼは、上記活性測定で、タンパク質量１ｍｇあたり０．１Ｕ以上の活性を有する酵素を用いることが好ましい。タンパク濃度は、ブラッドフォード法などの既存の方法で測定することができる。
【００２６】
ペクチナーゼの添加量としては、用いる酵素により効果的かつ経済的に妥当な範囲を適宜設定すればよいが、キャッサバ粕の乾燥重量１ｇあたり０．００１ｍｇ以上が好ましく、より好ましくは０．００５ｍｇ以上、さらに好ましくは０．０１ｍｇ以上である。上限に制限はないが、経済性の観点から、例えば、１００ｍｇ以下とすることができる。
【００２７】
また、添加するペクチナーゼは、ポリガラクツロン酸分解活性として、キャッサバ粕の乾燥重量１ｇあたり０．０１Ｕ以上が好ましく、より好ましくは０．０５Ｕ以上、さらに好ましくは０．１Ｕ以上である。上限に制限はないが、経済性の観点から、例えば、１００Ｕ以下とすることができる。
【００２８】
工程（２）の加水分解反応の好ましい温度は、例えば、３０〜６０℃が好ましく、熱水処理物を当該温度に調整した後ペクチナーゼおよびグルコアミラーゼを添加することが好ましい。
【００２９】
工程（２）の加水分解反応に好ましいｐＨの値は例えば、ｐＨ４〜７．５が好ましい。ｐＨ調整剤には、既存の酸またはアルカリを用いればよい。酸としては、例えば、塩酸、硫酸などがあげられる。アルカリとしては、例えば、水酸化ナトリウム、アンモニアなどがあげられる。
【００３０】
工程（２）の加水分解反応の好ましい処理時間は、酵素の加水分解が十分行われる範囲で設定すればよいが、例えば、１〜２４時間、好ましくは２〜１２時間、さらに好ましくは、３〜８時間である。１時間未満では十分に反応が進まないが、２４時間より長い時間ではコンタミネーションの原因になる。
【００３１】
グルコアミラーゼやペクチナーゼは、市販の酵素製剤を利用するのが簡便で好ましいが、酵素生産微生物の培養液を酵素液として直接用いてもよく、精製酵素を用いてもよい。また、複数の酵素を混合して用いてもよい。
【００３２】
酵素生産微生物の培養液を酵素液として用いる場合には、菌体を除去して用いることが好ましい。アミラーゼを生産する酵素生産微生物としては、アスペルギルス属微生物、バチルス属微生物など知られており、これらの微生物由来のグルコアミラーゼを好ましく用いることができる。ペクチナーゼを生産する微生物としては、アスペルギルス属微生物、アクレモニウム属微生物、トリコデルマ属微生物、リゾパス属微生物などが知られており、これらの微生物由来のペクチナーゼを好ましく用いることができ、特にアクレモニウム属由来のペクチナーゼを好ましく用いることができる。アスペルギルス属微生物としては、例えば、アスペルギルス・アクリータス、アスペルギルス・ニガーなどが挙げられ、トリコデルマ属微生物としては、例えば、トリコデルマ・リーセイ、トリコデルマ・ビリデなどが挙げられ、アクレモニウム属微生物としては、例えば、アクレモニウム・セルロリティカスなどが挙げられるが、これらのうち、アクレモニウム・セルロリティカスが好ましい。
【００３３】
市販のグルコアミラーゼとしては、Ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）、グルクザイムＡＦ６、グルクザイムＮＬ４．２（天野エンザイム株式会社製）、ＡＭＹＬＯＧＬＵＣＯＳＩＤＡＳＥ（ＭＥＧＡＺＹＭＥ社製）などが挙げられる。市販のペクチナーゼとしては、Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）、ペクチアナーゼＰＬ「アマノ」（天野エンザイム株式会社製）、アクレモニウムセルラーゼ（Ｍｅｉｊｉ  Ｓｅｉｋａファルマ株式会社製）、メイセラーゼ（Ｍｅｉｊｉ  Ｓｅｉｋａファルマ株式会社製）、Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ，ｅｎｚｙｍｅ  ｂｌｅｎｄ（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）などが挙げられる。上記の市販のペクチナーゼは、ポリガラクツロン酸分解活性を有している。
【００３４】
本発明の工程（１）または工程（２）では、加水分解酵素としてα−アミラーゼをさらに添加してもよい。α−アミラーゼは、デンプンのα−１，４結合を不規則に切断する酵素であり、長鎖のデンプンを短鎖のオリゴ糖に分解するため、α−アミラーゼを添加することで、工程（２）で得られる加水分解物の粘度をさらに低下させることができ、固液分離による液体画分の回収率が向上する。α−アミラーゼは、耐熱性のものが多く、最適温度が７０℃前後のα−アミラーゼは、工程（１）の熱水処理時に添加することができる。
【００３５】
α−アミラーゼの添加量は、キャッサバ粕の乾燥重量１ｇあたりの酵素活性として０．０１Ｕ以上であることが好ましく、０．１Ｕ以上であることがより好ましい。上限に制限はないが、経済性の観点から、例えば、１００Ｕ以下とすることができる。本発明でα−アミラーゼの酵素活性は、２−クロロ−４−ニトロフェニル６５−アジド−６５−デオキシ−β−マルトペンタオシド（Ｎ３−Ｇ５−β−ＣＮＰ）の分解活性として、測定した値を用いる。「２−クロロ−４−ニトロフェニル６５−アジド−６５−デオキシ−β−マルトペンタオシド」の「６５」は、マルトオリゴ糖を構成するグルコースの還元末端側から５番目のグルコース残基の６位の水酸基が置換されていることを示す。具体的には、Ｎ３−Ｇ５−β−ＣＮＰ溶液およびグルコアミラーゼおよびβ−グルコシダーゼ溶液の混合液に適当に希釈した酵素液を添加して、３７℃で１０分間反応させる。反応停止および遊離した２−クロロ−４−ニトロフェノール（ＣＮＰ）を発色させるため炭酸ナトリウム溶液を添加し、４００ｎｍで吸光度を測定する。ブランクは、炭酸ナトリウム溶液添加後に酵素液を添加する以外は同様の方法で反応させたものを用いる。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのＣＮＰを生成する量とし、タンパク質量１ｍｇあたりの活性は以下の式（５）および上記式（４）で算出する。
酵素液あたりの活性（Ｕ／ｍＬ）＝（Ｅｓ−Ｅｂ）×０．１７９×Ｄｆ（式５）
式５中のＥｓは測定試料の吸光度、Ｅｂはブランクの吸光度、Ｄｆは測定試料の希釈倍率をそれぞれ表す。
【００３６】
α−アミラーゼとしては、市販の酵素製剤を用いてもよいし、酵素生産微生物の培養液や、培養液を精製して用いてもよい。市販の酵素製剤は、α−Ａｍｙｌａｓｅ，ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）、クライスターゼＴ１０Ｓ（天野エンザイム株式会社製）、ＦＵＮＧＡＬ ＡＬＰＨＡ ＡＭＹＬＡＳＥ（ＭＥＧＡＺＹＭＥ社製）などが挙げられる。
【００３７】
また、α−アミラーゼを添加する場合、熱水処理物のｐＨを酵素に適したｐＨに調整することが好ましく、具体的には、ｐＨ４〜７．５である。ｐＨ調整剤には、既存の酸またはアルカリを用いればよい。酸としては、例えば、塩酸、硫酸などがあげられる。アルカリとしては、例えば、水酸化ナトリウム、アンモニアなどがあげられる。
【００３８】
［工程（３）：前記加水分解物を固液分離し、液体画分を回収する工程］
【００３９】
工程（２）で得られる加水分解物には、デンプンが加水分解されたグルコースが含まれており、グルコースは水に溶けやすいため、加水分解物を固液分離して得られた液体画分がグルコース糖液となる。固形分濃度の高いキャッサバ粕の加水分解物では、加熱を行うことで増粘する上、水分の保持力が高いため、工業的に広く使用されている遠心分離などの固液分離法では、液体画分を分離、回収することが困難である。一方、本発明では、キャッサバ粕の固形分濃度が１０重量％未満となる条件で熱水処理し、得られた熱水処理物をグルコアミラーゼおよびペクチナーゼで加水分解を行うことによって、加水分解物の粘度を低下させ、固液分離による液体画分の回収が可能になる。
【００４０】
液体画分の回収率は、以下の式（６）によって測定する。液体画分の回収率は、２０％以上になることが好ましく、５０％以上がより好ましい。
（回収率％）＝（固液分離後に回収した液体画分の重量）÷（加水分解物の重量）×１００・・・（式６）
【００４１】
本発明で用いる固液分離の方法は、スクリューデカンタ、分離板型遠心分離機、サイクロンなどの遠心分離、沈降分離、スクリュープレスなどの圧搾分離、フィルタプレス、ベルトプレス、ベルトフィルター、プレコートフィルタなどのろ過分離などが挙げられ、それらを組み合わせてもよい。
【００４２】
本発明では、遠心分離が好ましい。遠心分離は、遠心力をかけることにより比重差のあるものを分離する方法である。遠心分離の処理条件は、機種、相対遠心加速度（×Ｇ）、遠心分離時間、遠心分離温度などを考慮して適宜決定できるが、好ましい相対遠心加速度としては、５００〜６００００×Ｇ、より好ましくは５００〜２００００×Ｇである。処理の方法としては、連続式とバッチ式があるがいずれでもよい。遠心分離温度としては、２０〜６０℃が好ましい。
【００４３】
工程（３）で回収した液体画分はそのまま、グルコース糖液として用いてもよいが、液体画分をさらに精密ろ過膜に通じて、精密ろ過膜の透過側より除菌されたグルコース糖液を回収してもよい。除菌することにより、微生物が増殖を抑え、グルコース糖液中に含まれるグルコース濃度の減少や、ｐＨの変化などを防ぐことができる。
【００４４】
精密ろ過膜は、液体画分の処理量や濁度等に応じて、十分にろ過できかつ除菌可能な膜の材質、形状、孔径を有する膜を適宜選択すればよい。材質は、有機膜と無機膜に大別され、有機膜としては、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルフォン（ＰＥＳ）などを例示することができる。無機膜としては、酸化アルミニウム、酸化チタン、などを例示することができる。形状は、平膜、中空糸膜などを例示することができ、膜の強度等の観点から中空糸膜が好ましい。孔径は一般的に０．０１μｍ〜１０μｍであるが、微生物を除去できかつろ過に支障のない孔径を適宜選択すればよい。好ましくは、０．０１〜１μｍである。本発明で用いる精密ろ過膜としては、例えば、トレフィルＨＦＳシリーズ（東レ株式会社製）、マイクローザＰシリーズ、Ｕシリーズ（旭化成株式会社製）、ＳＰＶ０．１、ＳＰＶ０．２（Ｓｙｎｄｅｒ社製）、などを挙げることができる。
【００４５】
本発明の方法で製造したグルコース糖液には、グルコース以外の糖が含まれていてもよいが、グルコース糖液に含まれる糖のうち、グルコースが主成分となる。グルコース糖液に含まれる糖に占めるグルコースの割合は、好ましくは６５％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８５％以上である。
【００４６】
グルコース濃度は、比色定量法、高速液体クロマトグラフィーなど既存の方法により定量することができる。
【００４７】
工程（３）で回収した液体画分や、除菌されたグルコース糖液をさらに限外ろ過膜に通じてろ過し、非透過側からグルコアミラーゼおよびペクチナーゼや、その他キャッサバ粕の加水分解に利用した酵素を回収することができる。回収した酵素を再利用すれば、グルコース糖液の製造コストを削減することができる。この場合、グルコース糖液は、限外ろ過膜の透過側から回収できる。
【００４８】
本発明で用いる限外ろ過膜は、ウルトラフィルトレーション膜、ＵＦ膜とも呼ばれ膜である。本発明で使用する限外ろ過膜の分画分子量は、少なくともグルコースを透過でき、酵素を阻止できる限外ろ過膜であればよく、具体的には、分画分子量３００〜２００，０００の範囲が好ましく、より好ましくは分画分子量５，０００〜１００，０００の範囲である。
【００４９】
限外ろ過膜の材質としては、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）などの合成高分子を素材とした膜を使用することが好ましい。
【００５０】
限外ろ過膜の具体例は、トレフィルＨＦＵシリーズ（東レ株式会社製）、マイクローザＡＩＰシリーズ（旭化成株式会社製）、ＧＲ４０ＰＰ、ＧＲ５１ＰＰ、ＧＲ６０ＰＰ、ＧＲ６１ＰＰ（アルファラバル株式会社製）、ＳＰＥ５、ＳＰＥ１０、ＳＰＥ３０、ＳＰＥ１００（Ｓｙｎｄｅｒ社製）などが挙げられる。
【００５１】
本発明の方法で得られたグルコース糖液を発酵原料として使用して、化学品を製造することができる。
【００５２】
本発明の方法で得られるグルコース糖液を発酵原料として化学品を製造する際に利用する微生物は、パン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌などが挙げられる。微生物は自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【００５３】
発酵により得られる化学品としては、微生物や培養細胞が生産する物質であれば特に制限はない。具体例としては、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。例えば、アルコールとしては、エタノール、ブタノール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、グリセロールなど、有機酸としては、酢酸、乳酸、コハク酸、リンゴ酸など、アミノ酸としては、リジン、グルタミン酸など、核酸としては、イノシン酸、グアニル酸、イノシン、グアノシンなどを挙げることができる。また、酵素などのタンパク質、抗生物質などのような物質の生産に適用することもできる。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明のグルコース糖液の製造方法に関し、さらに詳細に説明するために実施例を挙げて説明する。【００５５】
（参考例１）ポリガラクツロン酸分解活性の測定
１．５ｍＬチューブに１０μＬの１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２、ナカライテスク株式会社製）、２０μＬの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸、６０μＬの超純水を添加し、５０℃で５分間恒温した。これに１０μＬの適当に希釈した酵素液を加え、５０℃で３０分間反応させた後、１００μＬのジニトロサリチル酸試薬を添加し、５分間煮沸して還元糖の発色を行った。氷水中で急冷した後、４００μＬの超純水を加え５３５ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線よりＤ−ガラクツロン酸の生成量を求めた。ブランクは、酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させた。検量線は、０〜２．０ｇ／Ｌの範囲のＤ−ガラクツロン酸標準液にジニトロサリチル酸試薬を加えて、同様に発色させた。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのＤ−ガラクツロン酸相当の還元糖を生成する量とした。これと、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で測定した酵素液のタンパク質濃度とから、酵素液に含まれるタンパク質濃度あたりのポリガラクツロン酸分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。以降の実験では、本結果をもとに、酵素の添加量を算出して用いた。【００５６】
本手法により表１に示す種類の酵素製剤に関してポリガラクツロン酸分解活性を測定し、以下の検討に利用した。酵素活性の測定結果を表１に示す。Ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒと、Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ，ｅｎｚｙｍｅ  ｂｌｅｎｄ（Ｃｅｌｌｉｃ  ＣＴｅｃ２）は、シグマアルドリッチジャパン合同会社から購入した物を利用した。ここで、Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ，ｅｎｚｙｍｅ  ｂｌｅｎｄは、「Ｈｏｎｇｍｉｎｇら、ＢｉｏＥｎｅｒｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２０１８）  １１：４５６−４６５」によって、トリコデルマ属微生物由来のペクチナーゼであると解析されている。アクレモニウムセルラーゼはＭｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社から購入した物を利用した。アクレモニウムセルラーゼはＭｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社から購入した物を利用した。以降の検討の酵素添加量は、キャッサバ粕乾燥重量１ｇに対する酵素の重量またはＵとして記載する。【００５７】
【表１】
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【００５８】
（参考例２）グルコース濃度の分析
糖液または培養液中のグルコースを下記に示すＨＰＬＣ条件で標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＨＩＬＩＣｐａｋ  ＶＧ−５０  ４Ｅ  ＳＨ１０１１（昭和電工）
カラム温度：４０℃
検出法：示差屈折計検出器
検出器温度：４０℃
移動相：水：アセトニトリル＝２５：７５
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ【００５９】
（参考例３）エタノール濃度の分析
培養液中のエタノールを下記に示すＨＰＬＣ条件で標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒシリーズ  ＳＨ１０１１（昭和電工）
カラム温度：６５℃
検出法：示唆屈折検出器
検出器温度：４０℃
移動相：０．００５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ【００６０】
（参考例４）乳酸濃度の分析
培養液中の乳酸を下記に示すＨＰＬＣ条件で標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＳＰＲ−Ｈ、Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＳＣＲ−１０１Ｈ（島津製作所）
カラム温度：４５℃
検出法：ポストカラムｐＨ緩衝化電気伝導度検出法
移動相：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃【００６１】
（参考例５）キャッサバ粕の乾燥重量の測定
赤外線水分計としてＦＤ−７２０（株式会社ケツト科学研究所製）を用い、乾燥温度１０５℃で３０秒間の水分変化量が０．０５％以下になったら測定を停止する自動停止モードにてキャッサバ粕に含まれる水分割合Ｒｗ（重量％）を測定し、式（２）より乾燥重量を算出した。
乾燥重量（ｇ）＝Ｗａ−Ｗａ×Ｒｗ・・・（式２）【００６２】
（実施例１）キャッサバ粕の固形分濃度１０重量％未満の条件でのグルコース糖液の製造
参考例５の方法でキャッサバ粕の乾燥重量を測定し、５０ｍＬのチューブにキャッサバ粕を乾燥重量１ｇはかりとり、８０℃に加温した熱水を固形分濃度５％になるように添加した。ヒートブロックローテーター  ＴＨＥＲＭＯ  ＢＬＯＣＫ  ＲＯＴＡＴＥＲ  ＳＮ−０６ＢＮ（株式会社日伸理化製）を用いて８０℃で２時間処理し、熱水処理物を得た。その後、グルコアミラーゼとしてＡｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）を０．２Ｕ／ｇ、ペクチナーゼとしてＣｅｌｌｕｌａｓｅ，ｅｎｚｙｍｅ  ｂｌｅｎｄ（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）を０．４ｍｇ／ｇ（ポリガラクツロン酸分解活性として０．３２Ｕ／ｇ）それぞれ添加し、５０℃で８時間処理して加水分解物を得た。加水分解物を１５００×Ｇで３分間遠心分離して液体画分をグルコース糖液として回収した。回収した液体画分の重量を測定し、式７により回収率を算出した。また、参考例２の方法でグルコース糖液のグルコース濃度を測定した。結果を表２に示す。【００６３】
（比較例１）キャッサバ粕の固形分濃度２５ｗｔ％の条件でのグルコース糖液の製造
参考例５の方法でキャッサバ粕の乾燥重量を測定し、特許文献１の実施例を参考に、キャッサバ粕の固形分濃度２５％になる条件で、グルコース糖液の製造を検討した。５０ｍＬチューブにキャッサバ粕を乾燥重量１ｇはかりとり、水をキャッサバ粕の固形分濃度２５％になるように添加して混合した。α−アミラーゼとしてα−Ａｍｙｌａｓｅ，ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）をキャッサバ粕乾燥あたり０．０２４Ｕ／ｇ添加し、オートクレーブで９０℃、３時間処理した。さらにグルコアミラーゼとしてＡｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）を０．２Ｕ／ｇ添加し、５０℃で８時間処理して加水分解物を得た。得られた加水分解物を１５００×Ｇで３分間遠心分離したが、本比較例の方法で処理した処理物は、流動性が低く、遠心分離により液体画分を得ることができなかった。【００６４】
（比較例２）キャッサバ粕の固形分濃度１５ｗｔ％の条件でのグルコース糖液の製造
参考例５の方法でキャッサバ粕の乾燥重量を測定し、５０ｍＬのチューブにキャッサバ粕を乾燥重量３ｇはかりとり、８０℃に加温した熱水を固形分濃度１５％になるように添加した。ヒートブロックローテーター  ＴＨＥＲＭＯ  ＢＬＯＣＫ  ＲＯＴＡＴＥＲ  ＳＮ−０６ＢＮ（株式会社日伸理化製）を用いて８０℃で２時間処理し、熱水処理物を得た。その後、グルコアミラーゼとしてＡｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）を０．２Ｕ／ｇ添加し、５０℃で８時間処理して加水分解物を得た。加水分解物を１５００×Ｇで３分間遠心分離した後、回収した液体画分の重量を測定し、式７により回収率を算出した。また、参考例２の方法で液体画分の単糖濃度を測定した。結果を表２に示す。【００６５】
（比較例３）キャッサバ粕の固形分濃度１５ｗｔ％の条件でのグルコース糖液の製造
グルコアミラーゼとしてＡｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）を０．２Ｕ／ｇ、ペクチナーゼとしてＣｅｌｌｕｌａｓｅ，ｅｎｚｙｍｅ  ｂｌｅｎｄ（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）をペクチナーゼとして０．４ｍｇ／ｇ（ポリガラクツロン酸分解活性として０．３２Ｕ／ｇ）それぞれ添加した以外は、比較例２と同様の条件・操作で加水分解反応を行い、液体画分の回収率を算出した。結果を表２に示す。【００６６】
（比較例４）キャッサバ粕の固形分濃度５ｗｔ％かつペクチナーゼ無添加の条件でのグルコース糖液の製造
キャッサバ粕を乾燥重量１ｇ添加し、固形分濃度が５ｗｔ％になるように熱水を添加した以外は、比較例２と同様の条件・操作で加水分解反応を行い、液体画分の回収率を算出した。結果を表２に示す。【００６７】
実施例１と比較例２、３、４の結果から、固形分濃度を１０％未満に調整してキャッサバ粕の熱水処理を行った後、グルコアミラーゼとペクチナーゼで加水分解反応を行うと、加水分解を遠心分離して回収できる液体画分の回収率が著しく向上することがわかった。【００６８】
【表２】
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【００６９】
（実施例２〜６）ペクチナーゼ添加量の検討
ペクチナーゼの添加量を、０．０１２５ｍｇ（実施例２）、０．０６２５ｍｇ（実施例３）、０．１２５ｍｇ（実施例４）、０．６２５ｍｇ（実施例５）、３．７５ｍｇ（実施例６）（ポリガラクツロン酸分解活性としてはキャッサバ粕乾燥重量１ｇあたり０．０１Ｕ（実施例２）、０．０５Ｕ（実施例３）、０．１Ｕ（実施例４）、０．５Ｕ（実施例５）、３．０Ｕ（実施例６））に変更した以外は、実施例１と同様の条件・操作でグルコース糖液の製造を検討した。液体画分の回収率と、グルコース糖液のグルコース濃度を測定した結果を表３に示す。これらの結果から、いずれのペクチナーゼの添加量でも、液体画分の回収率は２０％以上の値が得られることがわかった。また、ペクチナーゼをキャッサバ粕乾燥重量１ｇあたり０．１２５ｍｇ（ポリガラクツロン酸分解活性として０．１Ｕ）以上添加すると、液体画分の回収率がさらに向上し、５０％以上となった。【００７０】
【表３】
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【００７１】
（実施例７）精密ろ過膜によるグルコース糖液の除菌
実施例１で製造したグルコース糖液を２０ｍＬシリンジ（テルモ株式会社製）に回収し、シリンジの先に精密ろ過膜としてＭｉｌｌｅｘ−ＧＶ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ  ０．２２μｍ（メルクミリポア製）を装着した。シリンジ内の液体を押し出すことにより精密ろ過処理を行い、ろ液を回収した。ろ液の回収は、クリーンベンチ内で行い、滅菌された５０ｍＬチューブに回収することで空中落下菌が入らないように操作した。精密ろ過後の液体画分と、精密ろ過処理を行わない液体画分をそれぞれ室温で１日放置した後、参考例（２）の方法でグルコース濃度の測定を行った。結果を表４に示す。精密ろ過処理を行った液体画分は、室温で放置した後もグルコース濃度の低下はほとんど確認されなかったが、精密ろ過処理を行っていない液体画分では、室温で放置するとグルコース濃度が低下した。これらの結果により、精密ろ過処理で、液体画分の除菌が可能であることがわかった。【００７２】
【表４】
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【００７３】
（実施例８）グルコース糖液からのエタノール製造
実施例１で製造したグルコース糖液を利用して、微生物の発酵によるエタノール製造を行った。エタノール発酵微生物には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＯＣ−２株）を利用した。５ｍＬのＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で１６時間培養した（前培養）。実施例１で製造したグルコース糖液をフィルター（ステリカップ０．２２μｍ、メルクミリポア社製）に通じてろ過したものを試験管に１０ｍＬはかりとり、濁度が０．５になるように前培養液を添加した。３０℃で培養を行い、エタノールを製造した。参考例３の方法により培養液のエタノール濃度を測定した結果を表５に示す。本結果により、本発明の方法で得られたグルコース糖液を発酵原料として、エタノールを製造できることを確認した。【００７４】
【表５】
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【００７５】
（実施例９）グルコース糖液からの乳酸製造
実施例１で製造したグルコース糖液を利用して、微生物の発酵による乳酸製造を行った。乳酸発酵微生物には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ（ＮＢＲＣ１２７１４株）を利用した。５００ｍＬのバッフル付き三角フラスコに１％炭酸カルシウムとともにＭＲＳ培地（２０ｇ／Ｌグルコース入り）に植菌し、４２℃で１６時間培養した（前培養）。本培養には少量多連培養装置（エイブル株式会社）を用いた。実施例１で製造したグルコース糖液をフィルター（ステリカップ０．２２μｍ、メルクミリポア）に通じてろ過滅菌した後、予めオートクレーブ滅菌した培養槽に１００ｍＬはかりとった。前培養液を５ｍＬ添加し、２Ｎ水酸化カルシウムにて適宜中和しつつ４２℃で培養を行い、乳酸を製造した。培養終了時までに、添加した２Ｎ水酸化カルシウムは２１ｍｌであり、培養終了時の培養液の総量は１２１ｍｌであった。参考例（４）の方法で培養液中の乳酸濃度を測定した結果および、培養液１２１ｍｌ中に製造された乳酸量を表６に示す。本結果により、本発明の方法で得られたグルコース糖液を発酵原料として、乳酸を製造できることを確認した。【００７６】
【表６】
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【００７７】
（参考例６）トリコデルマ属微生物由来の酵素液の調製
トリコデルマ属微生物の培養液を以下の方法で調製し、ペクチナーゼの酵素液として用いた。【００７８】
［前培養］
コーンスティープリカー５％（ｗ／ｖ）、グルコース２％（ｗ／ｖ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウム０．１４％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．１４％（ｗ／ｖ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖ）、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物０．０１％（ｗ／ｖ）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００４％（ｗ／ｖ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．０２６％（ｗ／ｖ）となるよう蒸留水に溶解し、１００ｍＬを５００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコに入れ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭとＴｗｅｅｎ８０をそれぞれ０．０１％（ｗ／ｖ）となるよう添加した。この前培養培地にトリコデルマ・リーセイＰＣ３−７株を１×１０５個／ｍＬになるよう植菌し、２８℃、１８０ｒｐｍにて７２時間振とう培養し、前培養液とした（振とう装置：ＴＡＩＴＥＣ製 ＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲ ＢＲ−４０ＬＦ）。【００７９】
［本培養］
コーンスティープリカー５％（ｗ／ｖ）、グルコース２％（ｗ／ｖ）、セルロース（アビセル）１０％（ｗ／ｖ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウム０．１４％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖ）、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物０．０１％（ｗ／ｖ）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００４％（ｗ／ｖ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖ）、ホウ酸０．００６％（ｗ／ｖ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖ）となるよう蒸留水に溶解し、２．５Ｌを５Ｌ容ジャーファーメンター（ＡＢＬＥ製 ＤＰＣ−２Ａ）に入れ、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭとＴｗｅｅｎ８０をそれぞれ０．０１％（ｗ／ｖ）となるよう添加し、前記の方法にて得た前培養液を２５０ｍＬ接種した。その後、２８℃、３００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍにて８７時間培養を行った。得られた培養液を遠心分離して上清を回収し、回収した上清を０．２２μｍフィルターでろ過して菌体を除いたものを、トリコデルマ属微生物培養酵素液として以下実施例に使用した。  
また、本培養液を参考例１と同様の操作でポリガラクツロン酸分解酵素活性を測定したところ、０．８Ｕ／ｍｇであった。【００８０】
（実施例１０）トリコデルマ属微生物由来の培養液をペクチナーゼとして用いたグルコース糖液の製造
ペクチナーゼとして、参考例６で調製したトリコデルマ属微生物由来の酵素液を用いた以外は、実施例２と同様の条件・操作でグルコース糖液の製造を検討した。液体画分の回収率と、グルコース糖液のグルコース濃度を測定した結果を表７に示す。本結果により、培養液を用いた場合であっても、市販酵素を用いた実施例２の場合と同様に、グルコース糖液を製造可能であることを確認した。また、糖液の回収率や、回収した糖液のグルコース濃度も、実施例２と同程度であった。【００８１】
【表７】
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【００８２】
（実施例１１）アクレモニウム属微生物由来ペクチナーゼを用いたグルコース糖液の製造
アクレモニウム属微生物由来ペクチナーゼである市販のアクレモニウムセルラーゼ（Ｍｅｉｊｉ  Ｓｅｉｋａファルマ株式会社製）を用いた以外は、実施例２と同様の条件・操作でグルコース糖液の製造を検討した。液体画分の回収率と、グルコース糖液のグルコース濃度を測定した結果を表７に示す。本結果により、アクレモニウム属微生物由来のペクチナーゼを用いた場合も、グルコース糖液を製造可能であることを確認した。また、本実施例１１の結果と、実施例２、実施例１０の結果を比較すると、酵素添加量が同じ場合、トリコデルマ属微生物由来のペクチナーゼと比べて、アクレモニウム属微生物由来ペクチナーゼの方が、糖液の回収率が高く、回収した糖液に含まれるグルコース濃度も高いことがわかった。【００８３】
（実施例１２）ＵＦ膜を用いた糖液からの酵素回収
実施例１と同様に処理した加水分解物を遠心分離（１，５００×Ｇ、３分間）にて固液分離し、上清５．４ｇと加水分解残渣４．６ｇを得た。加水分解残渣を５．４ｍＬの超純水で再度懸濁し、遠心分離（１，５００×Ｇ、３分間）にて洗浄液５．４ｇと加水分解残渣４．６ｇに固液分離した。加水分解物の上清と洗浄液は混合し、実施例７と同様の方法で、精密ろ過膜でろ過し、ろ液を回収した。回収したろ液を、分画分子量１０，０００の限外ろ過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ  ｂｉｏｔｅｃｈ製）を用いて、非透過側が１ｍＬ以下になるまで８，０００Ｇにて遠心ろ過した後、脱塩のため非透過液に超純水を加えて１０倍以上に希釈し、再度非透過側が１ｍＬ以下になるまで８，０００Ｇにて遠心ろ過を行った。得られた非透過液を回収酵素液とし、回収酵素液あたりのグルコアミラーゼの活性（Ｕ／ｍｌ）を以下の方法で測定した。【００８４】
Ｇ２−β−ＰＮＰ溶液およびβ−グルコシダーゼ溶液の混合液に適当に希釈した回収酵素液を添加して、３７℃で１０分間反応させた。反応停止および遊離した４−ニトロフェノール（ＰＮＰ）を発色させるため炭酸ナトリウム溶液を添加し、４００ｎｍで吸光度を測定した。ブランクは、炭酸ナトリウム溶液添加後に酵素液を添加する以外は同様の方法で反応させたものを用いた。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのＰＮＰを生成する量とし、酵素液あたりのグルコアミラーゼの活性（Ｕ／ｍｌ）は、式（３）を用いて算出した。０．１５Ｕ／ｍｌの酵素活性が確認できた。結果を表８に示す。【００８５】
また、比較例１の加水分解物についても同様に酵素回収を試みたが、加水分解物の液体画分を回収できなかったため、酵素回収も不可能であった。【００８６】
【表８】
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【国際調査報告】
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