(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
0003774238.tif 000042
よりなる群から選択される式を有する化合物。
【請求項２】
式：
【化２】
0003774238.tif 000043
を有する請求項１記載の化合物。
【請求項３】
請求項１または２記載の該化合物およびテクネチウム-９９ｍを含むシンチグラム造影剤。
【請求項４】
請求項１または２記載の該化合物および第一スズイオンを含む組成物。
【請求項５】
請求項１または２記載の該化合物および細胞傷害性放射性同位元素、またはスカンジウム-４７、銅-６７、ガリウム-７２、イットリウム-９０、スズ-１１７ｍ、ヨウ素-１２５、ヨウ素-１３１、サマリウム-１５３、ガドリニウム-１５９、ジスプロシウム-１６５、ホルミウム-１６６、イッテルビウム-１７５、ルテチウム-１７７、レニウム-１８６、レニウム-１８８、アスタチン-２１１、ビスマス-２１２およびビスマス-２１３よりなる群から選択される放射性同位元素を含む放射性治療剤。
【請求項６】
放射性医薬製剤調製用キットであって、請求項１または２記載の所定量の化合物を含む密閉バイアルを含む該キット。
【請求項７】
さらに、該化合物をテクネチウム-９９ｍ、レニウム-１８６またはレニウム-１８８で標識するのに十分な量の還元剤を含む請求項６記載のキット。
【請求項８】
化学的ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成、または固相ペプチド合成による請求項１または２記載の化合物の製法。
【請求項９】
哺乳動物体内の部位を造影するための医薬組成物製造における請求項１または２記載の化合物の使用。
【請求項１０】
カルシトニン受容体の発現または過剰発現によって特徴付けられる疾患、または乳癌、卵巣癌および肺癌よりなる群から選択される疾患を治療するための医薬製造における請求項１または２記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、放射性金属イオンを含めた金属イオンと錯体化できるカルシトニン受容体結合試薬、および哺乳動物体内の造影部位での使用または治療における使用、特に癌治療における使用のためのかかる試薬の標識の具体例に関する。
発明の背景
多数の研究は、胃癌のごときいくつかの型の癌の長期死亡率動向を低下させるのに過去６０年にわたってなされてきた。しかしながら、同一期間中に、他の癌についての死亡率動向は、相変わらず安定し、増加した。例えば、肺癌は、世界中で最高頻度の癌であり、男性および女性間の癌死亡率の主要原因である。乳癌は、女性の最も一般的な癌であり、女性において癌死亡率の第二の主要原因であり、卵巣癌死亡率は、何世紀も増加している。また、白血病および非ホジキンリンパ腫のごとき小児および成人リンパ性癌は、癌死亡率のかなりの原因であり続けている。早期診断および有効な治療は、これらの癌の全てにつき依然として目標である。
何年か前に、部位指向の診断および治療が提唱され、動物体内の特定部位のｉｎ ｖｉｖｏターゲッティングを可能とした。一般的に、部位指向の診断または治療は、診断剤の場合の標識と、または治療剤の場合の細胞傷害剤と結合した、疾患部位または疾患を引き起こす生物に特異的な抗体のごときターゲッティング基を使用する。非常に大きな文献の集合は、診断的造影を目的とする抗体または抗体断片を放射性標識することに関連して存在する。同様に、モノクローナル抗体または種々の放射性同位元素を使用した多数の部位指向の治療剤は、米国特許第４,４５４,１０６号；第４,４７２,５０９号；第４,８２８,９９１号；５,２４６,６９１号；第５,３５５,３９４号；および第５,６４１,４７１号；ＥＰ４２９６２４において；ＥＰ５８５９８６；ＷＯ９０/１５６２５等の記載されるごとき年月にわたって提唱されて来ている。かかる抗体ベースの薬剤は、抗体断片またはヒト型抗体がターゲッティング基として使用される時でさえ、該抗体に対する処置動物の免疫応答に関連して副作用が生じる。
抗体ベースの部位指向の診断剤および治療剤の利点は、受容体特異的ペプチドまたは小分子のごとき低分子量を有するターゲッティング基を使用する場合に、回避することができる。しかしながら、化合物の受容体特異的を保持しつつ、ペプチドまたは小分子と標識剤または細胞傷害剤とのカップリングは、技術的に困難であり得る。受容体に特異的結合するための化合物の能力を保存するペプチドおよび他の小分子の放射性標識法は、共有の米国特許第５,２２５,１８０号；第５,４０５,５９７号；第５,４４３,８１５号；第５,５０８,０２０号；第５,５５２,５２５号；第５,５６１,２２０号；第５,６２０,６７５号；第５,６４５,８１５号；第５,６５４,２７２号；第５,７１１,９３１号；第５,７１６,５９６号；第５,７２０,９３４号；および第５,７３６,１２２号；放棄された米国特許出願第０７/９５５,４６６；およびＷＯ９２/１３５７２、ＷＯ９３/１０７４７、ＷＯ９３/１７７１９、ＷＯ９３/２１９６２、ＷＯ９３/２３０８５、ＷＯ９３/２５２４４、ＷＯ９４/００４８９、ＷＯ９４/０７９１８、およびＷＯ９４/２８９４２に開示される。これらの特許および公開で開示された方法は、部位指向の診断用造影剤の製造に特に適当である。共通に譲渡された米国特許第５,６２０,６７５号；第５,７１６,５９６号；ＷＯ９４/００４８９；ＷＯ９５/０３３３０；ＷＯ９５/００５５３；ＷＯ９５/３１９２１；およびＷＯ９６/０４３０８は、部位指向の放射性治療に用いることができるソマトスタチンペプチドアナログを開示する。共通に譲渡されたＷＯ９５/３３４９７は、部位指向の放射性診断または放射性治療について用いることができるソマトスタチンアナログ、ｇｐIIｂ/IIIａ受容体結合ペプチドおよび白血球結合ペプチドを開示する。共通に譲渡されたＷＯ９６/３００５５は、部位指向の放射性診断または放射性治療に用いることができる血管作用性腸管ペプチド(ＶＩＰ)受容体結合ペプチドを開示する。
腫瘍細胞は、受容体結合試験によって示されるごとく、特定の受容体または受容体サブタイプをしばしば偶然に発現または過剰発現する。いくつかの型の癌において、腫瘍細胞マーカーは、病気が進行するにつれて変化でき、かくして患者の予後を恐らくは反映する。腫瘍細胞が発現する種類の受容体は、腫瘍の病因に特有であり得、かくして腫瘍用の相対的な特異的マーカーを提供できる。例えば、放射性標識したソマトスタチンアナログは、神経内分泌系腫瘍、黒色腫、肺癌およびある種の乳癌に特異的結合することが示されてきた。かかるアナログの一つのである111Ｉｎ-ＯＣＴＲＥＯＳＣＡＮは、神経内分泌系腫瘍を造影する用途について市販認可を受けた。第二の放射性標識したソマトスタチンアナログ、99mＴｃ-デプレオチド(Ｄｅｐｒｅｏｔｉｄｅ)は、肺癌造影の用途について第三相臨床試験を完了した。123Ｉ-血管作用性腸管ペプチドは、結腸および胃の腺癌を標的として示されてきた。
カルシトニン(ＣＴ)は、上昇した血清中カルシウムレベルに応答して、甲状腺から分泌される３２個のアミノ酸ペプチドである。カルシトニンは、多数の生物学的作用を有し、それは標的臓器の細胞表面上に存在する受容体によって媒介される。ＣＴに高親和性の受容体は、骨、腎臓、肺および中枢神経系において同定された。骨では、ＣＴは破骨細胞による骨吸収を阻害し；腎臓では、ＣＴはカルシウムイオン排泄を増大させ；および中枢神経系では、該ペプチドは無痛覚、胃酸分泌および食欲阻害を誘導する。少量のＣＴは、毒性効果なくして動物およびヒトに投与され、サケＣＴを臨床的に用いて、パジェット病、悪性腫瘍の高カルシウム血症および骨粗鬆症のごときかかる骨疾患を治療する。静脈内投与したカルシトニンは、血液を迅速に清澄にし、主に尿中に排出される。投与したＣＴについての主な局部部位は、腎臓、肝臓および長骨の骨端である。
循環ＣＴレベルは、癌、例えば、髄様甲状腺癌、小細胞肺癌、カルシノイド、乳癌および胃腸癌のいくつかの型または段階についてのマーカーであると考えられる。高親和性ＣＴ受容体は、リンパ様細胞、ヒト肺癌細胞系、ヒト乳癌細胞系および初代乳癌組織において同定された。Ｆｉｎｄｌａｙら（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９６：５１３-５２０は、ＣＴ受容体がある種の胸、肺、卵巣およびリンパ腫癌細胞系において過剰発現されることを報告している。
いくつかの種（ヒト、サケおよびウサギ）からのＣＴのアミノ酸配列は、以下に記載される：
0003774238.tif 000002
（ここに、アミノ酸の一文字略語は、Ｚｕｂａｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２ｄｅｄ.、１９８８、ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｐ.３３に見出すことができ、ここに、ペプチドのアミノ末端部分において２つのシステイン残基間に下線を施したアミノ酸は、ジスルフィド結合を表す）。種の間にカルボキシル末端のプロリンアミドおよび１および７位のジスルフィド結合したシステイン残基を含めた９つの残基は保存されている。サケおよびウサギのＣＴは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで共にヒトＣＴより強力である。
ＣＴペプチドアナログは開発され、化学的に不安定なジスルフィドが、米国特許第４,０８６,２２１号に記載されるごとく２-アミノスベリン酸間に形成された安定な炭素−炭素架橋と置換された。その分子のアミノ末端、中間領域、カルボキシル部分を欠失するＣＴアナログは、ＣＴ受容体に弱い結合のみを示す。
多くのアミノ酸置換体をＣＴ分子の残基８および２２間に作成して、生物学的に活性なＣＴアナログを生成する。いずれかの天然形態のＣＴに最小の配列相同性を有するいくつかのＣＴアナログは、サケＣＴのものと同様の生物学的活性を有する。(Ｃｂｚ-ＬＨＫＬＱＹ-ＯＭｅのごとき)切形ＣＴペプチド誘導体は実質的な受容体結合活性も保持する。
腫瘍は異なる受容体を発現または過剰発現できるので、さまざまな放射性診断剤および放射性治療剤が、癌に対する最適な診断的および治療的様相を与えるために必要である。
発明の概要
肺および卵巣腺癌、乳癌およびリンパ腫の細胞表面上のＣＴ受容体は、ｉｎ ｖｉｖｏにてかかる腫瘍を局在、同定および治療するためのマーカーとして開発できる。本発明者らは、初めて、ＣＴ受容体に高親和性結合する能力および有利な薬物動態学を所有するＣＴ誘導ペプチドを含めた小さな合成化合物を開発し、それによって、腫瘍部位での診断剤および治療剤の局在をｉｎ ｖｉｖｏで有効にできる。本発明の試薬は、ＣＴ受容体の発現または過剰発現によって特徴付けられた腫瘍検出、疾患段階付けおよび腫瘍の転移の広がりの評価に有用な、迅速で、費用効果の優れた、非侵襲性の診断造影法の基礎を提供する。また、本発明の試薬は、例えば、ＣＴ受容体を発現する腫瘍細胞の局在に続いて手術、放射線治療または化学療法によって、他の治療様相の治療的有効性評価の基礎を提供する。本発明の試薬は、部位指向の放射性治療用のターゲッティング基としても用いることができる。
本発明は、放射性金属キレート剤に共有結合する、好ましくはＣＴペプチド、ＣＴ誘導体またはＣＴアナログを含めたＣＴ受容体結合試薬を提供する。本発明の試薬において使用されるＣＴ受容体結合化合物は、約１０,０００ダルトン未満の分子量を有する。いくつかの具体例において、本発明の試薬は、該試薬のＣＴ受容体結合部分のペプチド結合の存在または放射性金属のキレート化剤におけるペプチド結合の存在によってペプチドとして特徴付けられる。本発明の試薬は、以下の実施例４に記載されたアッセイのごとく標準化されたアッセイにおいて比較する場合に、該受容体用の放射性ヨウ素化の天然ＣＴの親和性の約１０分の１以上であるＣＴ受容体結合親和性を有する。好ましい具体例において、本発明の試薬は、該標準化されたアッセイにおいて比較される場合に、該受容体についての天然ＣＴまたは天然ＣＴの放射性ヨウ素化された種以上のＣＴ受容体結合親和性を有する。
本発明の放射性医薬は、部位特異的診断剤または治療剤として使用できる。テクネチウム-９９ｍ、ヨウ素-１２３およびヨウ素-１３１で標識した場合、本発明の試薬は、シンチグラム造影剤として使用できる。磁性金属、常磁性金属、超磁性金属または超常磁性金属で標識した場合、本発明の試薬は、磁気共鳴コントラスト剤として使用できる。細胞傷害性放射性ヌクレオチドで標識した場合、本発明の試薬は、部位指向の放射性治療において用いることができる。また、本発明は、本発明の放射性標識したＣＴ受容体結合化合物および薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本発明のＣＴ受容体結合試薬およびその放射性具体例の製法も提供される。
また、本発明は、本発明の試薬から、放射性標識したＣＴ受容体結合化合物用のキットを提供する。本発明のキットは、所定量の本発明の試薬、および所望により該試薬を放射性標識するのに十分な量の還元剤を含有する密閉バイアルを含む。
本発明は、本発明の放射性標識したＣＴ受容体結合剤の診断的および治療的使用法を提供する。一の具体例において、方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ造影を得ることによって哺乳動物体内の部位を造影するための標識体における本発明の試薬を使用するのに提供される。
また、本発明は、動物に本発明の治療的に有効量の放射性標識ＣＴ受容体結合試薬を投与する工程を含めたＣＴ受容体の発現または過剰発現によって特徴付けられる疾患を軽減する方法を提供する。
本発明の他の態様および利点は、以下に記載された、次の好ましい具体例のより詳細な記載において明らかである。
発明の詳細な記載
本発明は、診断用および治療用のＣＴ受容体結合製剤の調製に有用なＣＴ受容体結合試薬を提供する。本発明の目的について、「ＣＴ受容体結合化合物」なる用語は、当業者によって認識されたさまざまな細胞型において発現したＣＴ受容体に特異結合するＣＴ、ＣＴの断片、ＣＴのアナログ、およびＣＴの誘導体を自然発生するのを達成することを意図する。また、該受容体結合特性を真似て設計された化合物は、この定義に含まれ、本発明によって達成される。
本発明の目的について、「ＣＴ受容体結合親和性」なる用語は、とりわけ、解離定数、阻害定数またはＩＣ50値によって結合親和性を測定するこれらの方法を含めて、当業者に知られたいずれかの方法によって測定されるごとき結合親和性を意味することを意図する。
「該受容体についての放射性ヨウ素化ＣＴの親和性の少なくとも１０分の１のＣＴ受容体結合親和性を有する」なる用語は、ＣＴ受容体直接結合または競合的阻害アッセイにおいて測定されるごとく、該試薬の解離定数（Ｋd）が放射性ヨウ素化ＣＴのＫdより１０倍以上であること、または該試薬の阻害定数（Ｋi）またはＩＣ50が、ＣＴ受容体競合的阻害アッセイにおいて測定されるごとく、放射性ヨウ素化ＣＴより１０倍以下であることを意味することを意図する。
「該受容体について天然のＣＴまたはＣＴの放射性ヨウ素化種以上のＣＴ受容体結合親和性を有する」なる用語は、ＣＴ受容体直接結合または競合的阻害アッセイにおいて測定されるごとく、非標識ＣＴまたは放射性ヨウ素ＣＴ以上の解離定数（Ｋd）を有する試薬を達成することを意図する。あるいは、この用語は、ＣＴ受容体競合的阻害アッセイにおいて測定されるごとき天然のＣＴまたは放射性ヨウ素化ＣＴ以下の阻害定数（Ｋi）またはＩＣ50を有することを試薬が達成するように解釈できる。
本発明に従って、本発明の試薬は、以下に記載のごとく標準化されたアッセイにおいて比較した場合、該受容体についての放射性ヨウ素化天然ＣＴの親和性より少なくとも１０倍大きいＣＴ受容体結合を有する。好ましい具体例において、本発明の試薬は、該標識化されたアッセイにおいて比較した場合、該受容体について、天然のＣＴまたは天然のＣＴの放射性ヨウ素化種以上に大きいＣＴ受容体結合親和性を有する。
ＣＴ受容体に関する本発明の放射性医薬の解離定数または結合阻害定数、ならびに125Ｉ標識ＣＴ自体の結合とかかる結合の親和性または結合活性は、Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、Ａ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ａ.Ｌｅｖｉｔｚｋｉ、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ/Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ(Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１９８４)に記載されたもののごとき公知の方法を用いて決定できる。好ましくは、以下の実施例４に記載されたアッセイのごとき標準化されたＣＴ受容体結合アッセイを使用して、本発明の試薬のＣＴ受容体結合親和性を測定する。
該ＣＴ受容体結合化合物に加えて、本発明によって供された試薬は、ＣＴ受容体についての該化合物の結合特異性が実質的に変更されるかかる方法において該化合物と共有結合する放射性キレート化剤を含む。
いずれの放射性金属キレート化剤もＣＴ受容体結合化合物に共有結合して、本発明の試薬を提供できる。例えば、ＣＴ受容体結合化合物、好ましくはペプチドは、式：
Ｃ(ｐｇｐ)S-(ａａ)-Ｃ（ｐｇｐ）S
［式中、(ｐｇｐ)Sは水素またはチオール保護基であって、(ａａ)はチオール基を含まないいずれかのα-またはβ-アミノ酸である。好ましい具体例において、該アミノ酸はグリシンである］
を有するキレート化剤に共有結合できる。
他の実施例として、本発明の試薬に有用な放射性金属キレート化剤は、式：
Ａ-ＣＺ(Ｂ)-｛Ｃ(ＲaＲb)｝n-Ｘ
［式中、ＡはＨ、ＨＯＯＣ、Ｈ2ＮＯＣ、(ペプチド)-ＮＨＯＣ、(ペプチド)-ＯＯＣ、Ｒc2ＮＣＯまたはＲd；Ｂは、Ｈ、ＳＨまたは-ＮＨＲc、-Ｎ(Ｒc)-(ペプチド)またはＲd；Ｚは、ＨまたはＲd；Ｘは、ＳＨまたは-ＮＨＲc、-Ｎ(Ｒc)-(ペプチド)またはＲd；Ｒa、Ｒb、ＲcおよびＲdは、独立してＨまたは直鎖もしくは分岐鎖または環状低級アルキル；ｎは、０、１または２；ＲcはＣ1-Ｃ2アルキル、アミノ酸または２ないし約１０個のアミノ酸を含むペプチド；および：(１)ここに、Ｂは、-ＮＨＲcまたは-Ｎ(Ｒc)-(ペプチド)、ＸはＳＨであって、ｎは１または２；(２)ここに、Ｘは、-ＮＨＲcまたは-Ｎ(Ｒc)-(ペプチド)、ＢはＳＨであって、ｎは１または２；(３)ここに、ＢはＨまたはＲd、ＡはＨＯＯＣ、Ｈ2ＮＯＣ、(ペプチド)-ＮＨＯＣまたは(ペプチド)-ＯＯＣ、ＸはＳＨであって、ｎは０または１；(４)ここに、ＡはＨまたはＲd、次いで、ここにＢはＳＨ、Ｘは-ＮＨＲcまたは-Ｎ(Ｒc)-(ペプチド)であって、ＸはＳＨ、Ｂは-ＮＨＲcまたは-Ｎ(Ｒc)-(ペプチド)であって、ｎは１または２；(５)ここに、ＸはＨまたはＲd、ＡはＨＯＯＣ、Ｈ2ＮＯＣ、(ペプチド)-ＮＨＯＣまたは(ペプチド)-ＯＯＣであって、ＢはＳＨ；(６)ここに、Ｚはメチル、Ｘはメチル、ＡはＨＯＯＣ、Ｈ2ＮＯＣ、(ペプチド)-ＮＨＯＣまたは(ペプチド)-ＯＯＣであり、ＢはＳＨであって、ｎは０；および(７)ここに、ＢはＳＨ、ＸはＳＨでなくて、ここにＸはＳＨ、ＢがＳＨでない］
の単一チオール含有基を含む。
この放射性金属キレート化剤は好ましい具体例は、化学式：
Ｒ1-ＣＯ-(アミノ酸)1-(アミノ酸)2-Ｚ
［式中、(アミノ酸)1および(アミノ酸)2は、各々独立して、チオール基を含まないいずれかの第一α-またはβ-アミノ酸、Ｚはシステイン、ホモシステイン、イソシステイン、ペニシラミン、２-メルカプトエチルアミンまたは３-メルカプトプロリルアミンであるチオール含有基であって、Ｒ1は低級(Ｃ1-Ｃ4)アルキル、アミノ酸または２ないし１０個のアミノ酸を含むペプチドである。Ｚがシステイン、ホモシステイン、イソシステインまたはペニシラミンである場合、該基のカルボニル基は、ヒドロキシル基、ＮＲ3Ｒ4基に共有結合し、ここに各Ｒ3およびＲ4は、独立してＨまたは低級(Ｃ1-Ｃ4)アルキル、アミノ酸または２ないし１０個のアミノ酸を含むペプチドである］；または
Ｙ-(アミノ酸)2-(アミノ酸)1)-ＮＨＲ2
［式中、Ｙはシステイン、ホモシステイン、イソシステイン、ペニシラミン、２-メルカプトアセテートまたは３-メルカプトプロピオネートであるチオール含有基であり、(アミノ酸)1および(アミノ酸)2は、各々独立して、チオール基を含まないいずれかの第一α-またはβ-アミノ酸であって、Ｒ2はＨまたは低級(Ｃ1-Ｃ4)アルキル、アミノ酸または２ないし１０個のアミノ酸を含むペプチドである。Ｙがシステイン、ホモシステイン、イソシステインまたはペニシラミンである場合、該基のアミノ基は、-Ｈ、アミノ酸または２ないし１０個のアミノ酸を含むペプチドに共有結合する］
を有する。
本発明のこの態様の特定の具体例において、この放射性金属キレート化剤の式は：
-(アミノ酸)1-(アミノ酸)2-Ａ-ＣＺ(Ｂ)-｛Ｃ(Ｒ1Ｒ2)｝n-Ｘ｝、
-Ａ-ＣＺ(Ｂ)-｛Ｃ(Ｒ1Ｒ2)｝n-Ｘ｝-(アミノ酸)1-(アミノ酸)2、
-(第一α,ω-またはβ,ω-ジアミノ酸)-(アミノ酸)1-Ａ-ＣＺ(Ｂ)-｛Ｃ(Ｒ1Ｒ2)｝n-Ｘ｝、
および
-Ａ-ＣＺ(Ｂ)-｛Ｃ(Ｒ1Ｒ2)｝n-Ｘ｝-(アミノ酸)1-(第一α,β-またはα,γ-ジアミノ酸)
［式中、(アミノ酸)1および(アミノ酸)2は、各々独立して、いずれかの自然発生の、修飾された、置換または変更されたチオール基を含まないα-またはβ-アミノ酸；ＡはＨ、ＨＯＯＣ、Ｈ2ＮＯＣ、(アミノ酸またはペプチド)-ＮＨＯＣ、(アミノ酸またはペプチド)-ＯＯＣまたはＲ4；ＢはＨ、ＳＨまたは-ＮＨＲ3、-Ｎ(Ｒ3)-(アミノ酸またはペプチド)またはＲ4；ＺはＨまたはＲ4；ＸはＳＨまたは-ＮＨＲ3、-Ｎ(Ｒ3)-(アミノ酸またはペプチド)またはＲ4；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、独立してＨまたは直鎖もしくは分岐鎖または環状低級アルキル；ｎは、０、１または２のいずれかの整数；(ペプチド)は２ないし約１０個のアミノ酸のペプチド；および：(１)ここに、Ｂは、-ＮＨＲ3または-Ｎ(Ｒ3)-(アミノ酸またはペプチド)、ＸはＳＨであって、ｎは１または２；(２)ここに、Ｘは、-ＮＨＲ3または-Ｎ(Ｒ3)-(アミノ酸またはペプチド)、ＢはＳＨであって、ｎは１または２；(３)ここに、ＢはＨまたはＲ4、ＡはＨＯＯＣ、Ｈ2ＮＯＣ、(アミノ酸またはペプチド)-ＮＨＯＣまたは(アミノ酸またはペプチド)-ＯＯＣ、ＸはＳＨであって、ｎは０または１；(４)ここに、ＡはＨまたはＲ4、次いで、ここにＢはＳＨ、Ｘは-ＮＨＲ3または-Ｎ(Ｒ3)-(アミノ酸またはペプチド)であって、ＸはＳＨ、Ｂは-ＮＨＲ3または-Ｎ(Ｒ3)-(アミノ酸またはペプチド)であって、ｎは１または２；(５)ここに、ＸはＨまたはＲ4、ＡはＨＯＯＣ、Ｈ2ＮＯＣ、(アミノ酸またはペプチド)-ＮＨＯＣまたは(アミノ酸またはペプチド)-ＯＯＣであって、ＢはＳＨ；(６)ここに、Ｚはメチル、Ｘはメチル、ＡはＨＯＯＣ、Ｈ2ＮＯＣ、(アミノ酸またはペプチド)-ＮＨＯＣまたは(アミノ酸またはペプチド)-ＯＯＣであり、ＢはＳＨであって、ｎは０；および(７)ここに、ＢはＳＨ、ＸはＳＨでなくて、ここにＸはＳＨ、ＢがＳＨでない］
よりなる群から選択される。
本発明のこの態様の特に好ましい具体例は、-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ-Ｃｙｓ-、Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ-、Ｇｌｙ-Ｇｌｙ-Ｃｙｓ-、-(ε-Ｌｙｓ)-Ｇｌｙ-Ｃｙs-、(δ-Ｏｒｎ)-Ｇｌｙ-Ｃｙｓ-、-(γ-Ｄａｂ)-Ｇｌｙ-Ｃｙｓ-、-(β-Ｄａｐ)-Ｌｙｓ-Ｃｙｓ-および-(β-Ｄａｐ)-Ｇｌｙ-Ｃｙｓ-よりなる群から選択される式を有する放射性金属キレート化剤を含む。(これらの式において、ε-Ｌｙｓは典型的なα-アミノ基よりむしろε-アミノ基が、隣接したアミノ酸のカルボキシル基に共有結合してペプチド結合を形成するリジン残基を表し；δ-Ｏｒｎは典型的なα-アミノ基よりむしろδ-アミノ基が、隣接したアミノ酸のカルボキシル基に共有結合してペプチド結合を形成するオルニチン残基を表し；γ-Ｄａｂはγ-アミノ基が、隣接したアミノ酸のカルボキシル基に共有結合してペプチド結合を形成する２,４-ジアミノ酪酸残基を表し；次いで、β-Ｄａｐはβ-アミノ基が、隣接したアミノ酸のカルボキシル基に共有結合してペプチド結合を形成する１,３-ジアミノプロピオン酸残基を表すと理解されるであろう)
他の具体例において、本発明の試薬の放射性金属キレート化剤は、
式：
0003774238.tif 000003
［式中、各Ｒは独立してＨ、ＣＨ3またはＣ2Ｈ5；各(ｐｇｐ)Sは独立してチオール保護基またはＨ；ｍ、ｎおよびｐは独立して２または３；Ａは直鎖または環状低級アルキル、アリール、複素環、その組合せまたは置換誘導体；およびＸはペプチドである］
を有するビスアミノ-ビスチオールキレート化剤である。
別法として、本発明のこの具体例におけるビスアミノビスチオールキレート化剤は、
式：
0003774238.tif 000004
［式中、各Ｒは独立してＨ、ＣＨ3またはＣ2Ｈ5；ｍ、ｎおよびｐは独立して２または３；Ａは直鎖または環状低級アルキル、アリール、複素環、その組合せまたは置換誘導体；ＶはＨまたはＣＯ-ペプチド；Ｒ'はＨまたはペプチド；ＶがＨの場合、Ｒ'はペプチドであり、Ｒ'がＨの場合、ＶはＣＯ-ペプチドである。本発明の目的では、これらの構造を有するキレート基は「ＢＡＴ」基という］
を有する。
別法として、本発明の試薬において用いられた放射性金属キレート化剤は、
ジエチレントリアミン五酢酸(ＤＴＰＡ)
(ＨＯＯＣＣＨ2)2Ｎ(ＣＲ2)(ＣＲ2)Ｎ(ＣＨ2ＣＯＯＨ)(ＣＲ2)(ＣＲ2)Ｎ(ＣＨ2ＣＯＯＨ)2
［式中、各Ｒは独立してＨ、Ｃ1ないしＣ4アルキル、またはアリールであって、一つのＲは二価のリンカーに共有結合し；
エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)：
(ＨＯＯＣＣＨ2)2Ｎ(ＣＲ2)(ＣＲ2)Ｎ(ＣＨ2ＣＯＯＨ)
［式中、各Ｒは独立してＨ、Ｃ1ないしＣ4アルキル、またはアリールであって、一つのＲは二価のリンカーに共有結合する］；
１,４,７,１０-テトラアザドデカン四酢酸；
0003774238.tif 000005
［式中、ｎは２または３である整数であり、ここに各Ｒは独立してＨ、Ｃ1ないしＣ4アルキル、またはアリールであって、一つのＲはＣＴ受容体結合化合物およびデスフェリオキサミンに共有結合する。大部分の放射性金属は、上記の放射性金属キレート化剤を含む本発明の試薬にキレートできる］
よりなる群から選択される式を有し得る。
また、本発明の試薬は、
(ｉ)式：
0003774238.tif 000006
を有する基、
(ii)式：
0003774238.tif 000007
を有する基、
［式中、ｎ、ｍおよびｐは、独立して０または１である各整数；各Ｒは'は、独立してＨ、低級アルキル、Ｃ2-Ｃ4ヒドロキシアルキルまたはＣ2-Ｃ4アルコキシアルキル、および各Ｒは独立してＨまたはＲ"、ここにＲ"はチオール基を含まない置換または非置換低級アルキルまたはフェニル；および一つのＲまたはＲ'はＬ、ここにＬはターゲッティング基に金属キレート化剤を結合する二価のリンカー基であって、一つのＲ'がＬである場合、ＮＲ'2はアミンである］
よりなる群から選択される放射性金属キレート化剤を含むことができる。
好ましい具体例において、ＬはＣ1-Ｃ6直鎖、分岐鎖または環状アルキル基、カルボン酸エステル、カルボキシアミド、スルホンアミド、エーテル、チオエーテル、アミン、アルケン、アルキル、１,２-、１,３-または１,４-結合の、所望により置換されてもよいベンゼン環またはアミノ酸または２ないし約１０個のアミノ酸のペプチド、またはその組合せである。
好ましい具体例において、Ｒ"はＣ1-Ｃ6直鎖、分岐鎖または環状アルキル基；-ＣqＯＣr-、-ＣqＮＨＣr-または-ＣqＳＣr-基、ここにｑおよびｒはｑ＋ｒの合計が６以下である独立して１ないし５の整数であり；(Ｃ1-Ｃ6)アルキル-Ｘ、ここにＸはヒドロキシル基、置換アミン、グアニジン、アミジン、置換チオール基またはカルボン酸、エステル、リン酸または硫酸基であり；フェニル基またはハロゲンヒドロキシル、置換アミン、グアニジン、アミジン、置換チオール、エーテル、リン酸または硝酸基で置換されたフェニル基；インドール基；１ないし３個の窒素、酸素またはイオウ原子またはその組合せを含むＣ1-Ｃ6複素環基である。
本発明に従って、ＣＴ受容体結合試薬の放射性金属キレート化剤は、
式：
0003774238.tif 000008
［式中、Ｒ1およびＲ2は各々独立してＨ、低級アルキル、Ｃ2-Ｃ4ヒドロキシアルキル、またはＣ2-Ｃ4アルコキシアルキル；Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は独立してＨ、チオール基を含まない置換または非置換の低級アルキルまたはフェニル；Ｒ7およびＲ8は各々独立してＨ、低級アルキル、低級ヒドロキシアルキルまたは低級アルコキシアルキル；Ｌは二価のリンカー基であって、ＺはＣＴペプチドである］
を有し得る。
本発明のさらに好ましい金属キレート化剤は、
式：
0003774238.tif 000009
［式中、Ｒ1およびＲ2は各々独立してＨ、低級アルキル、Ｃ2-Ｃ4ヒドロキシアルキル、またはＣ2-Ｃ4アルコキシアルキル；Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は独立してＨ、チオール基を含まない置換または非置換の低級アルキルまたはフェニル、およびＲ3、Ｒ4、Ｒ5またはＲ6のうち一つはＺ-Ｌ-ＨＮ(ＣＨ2)n-であり、ここにＬは二価のリンカー基、Ｚはターゲッティング基、およびｎは１ないし６の整数；Ｒ7およびＲ8は各々独立してＨ、低級アルキル、低級ヒドロキシアルキルまたは低級アルコキシアルキル；およびＸは、アミノ基、置換アミノ基または-ＮＲ1-Ｙ、ここにＹはアミノ酸、アミノ酸アミド、または２ないし１０個のアミノ酸を含むペプチドである］
のキレート化剤を含む。
本発明のさらに好ましい金属キレート化剤は、
式：
0003774238.tif 000010
［式中、Ｒ1およびＲ2は各々独立してＨ、低級アルキル、低級ヒドロキシアルキルまたは低級アルケニルアルキル；Ｒ3およびＲ4は独立してＨ、チオール基を含まない置換または非置換の低級アルキルまたはフェニル；ｎは１ないし６の整数；Ｌは二価リンカー基；およびＺはＣＴペプチド基である］
を有するキレート化剤を含む。
さらにより好ましいキレート基は、式：
0003774238.tif 000011
［式中、Ｌは二価リンカー基およびＺはＣＴペプチド基である］
のキレート化剤を含む。
本発明の最も好ましいキレート基は、以下の式：
(アミノ酸)1-(アミノ酸)2-システイン-、
(アミノ酸)1-(アミノ酸)2-イソシステイン-、
(アミノ酸)1-(アミノ酸)2-ホモシステイン-、
(アミノ酸)1-(アミノ酸)2-ペニシラミン-、
(アミノ酸)1-(アミノ酸)2-２-メルカプトエチルアミン-、
(アミノ酸)1-(アミノ酸)2-２-メルカプトプロリルアミン-、
(アミノ酸)1-(アミノ酸)2-２-メルカプト-２-メチルプロピルアミン-、
(アミノ酸)1-(アミノ酸)2-３-メルカプトプロリルアミン-、
［式中、(アミノ酸)はチオール基を含まない第一αまたはβアミノ酸であって、ここに、該キレート化剤は、キレート化剤のカルボキシル末端またはアミノ酸基のうち一つの側鎖と共有結合を介してターゲッティング基またはリンカー基のいずれかに結合する］
を有するキレート化剤を含む。
また、最も好ましいキレート化剤は、上記の式のキレート化剤を含み、ここに、(アミノ酸)1は、α,ω-またはβ,ω-アミノ酸のいずれかであり、ここに該α-またはβ-アミノ基は、遊離アミンであって、該α,ω-またはβ,ω-アミノ酸はωアミノ基を介して共有結合する。
他の最も好ましいキレート化剤は、
-システイン-(アミノ酸)-(α,β-またはβ,γ-ジアミノ酸)；
-イソシステイン-(アミノ酸)-(α,β-またはβ,γ-ジアミノ酸)；
-ホモシステイン-(アミノ酸)-(α,β-またはβ,γ-ジアミノ酸)；
-ペニシラミン(アミノ酸)-(α,β-またはβ,γ-ジアミノ酸)；
２-メルカプト酢酸-(アミノ酸)-(α,β-またはβ,γ-ジアミノ酸)；
２-または３-メルカプトプロピオン酸-(アミノ酸)-(α,β-またはβ,γ-ジアミノ酸)；
２-メルカプト-２-メチルプロピオン酸-(アミノ酸)-(α,β-またはβ,γ-ジアミノ酸)；
［式中、(アミノ酸)はチオール基を含まない第一α-またはβ-アミノ酸であって、ここに、キレート化剤は、該キレート化剤のアミノ酸末端またはアミノ酸基のうちの一つの側鎖との共有結合を介してターゲッティング基またはリンカー基のいずれかに結合する］
よりなる群から選択されるものを含む。
特に好ましい金属キレート化剤は、Ｇｌｙ-Ｇｌｙ-Ｃｙｓ-、Ａｒｇ-Ｇｌｙ-Ｃｙｓ-、-(ε-Ｌｙｓ)-Ｇｌｙ-Ｃｙｓ-、-(δ-Ｏｒｎ)-Ｇｌｙ-Ｃｙｓ-、-(γ-Ｄａｂ)-Ｇｌｙ-Ｃｙｓ-、-(β-Ｄａｐ)-Ｌｙｓ-Ｃｙｓ-および-(β-Ｄａｐ)-Ｇｌｙ-Ｃｙｓ-よりなる群から選択される。（これらの式において、アミノ酸表示は、前記と同一の意味を有する）
上記の式IIIを有する放射性金属キレート化剤の例は、該キレート基が構造：
0003774238.tif 000012
を有するＧｌｙ-Ｇｌｙ-Ｃｙｓ-である。
構造タイプＶIIを有するキレートリガンドは、構造：
0003774238.tif 000013
を有するオキソテクネチウム錯体を形成する。
上記の構造タイプＶを有する放射性金属キレート化剤の例は、構造：
0003774238.tif 000014
のキレート化剤を形成するＬｙｓ-(ω-ペプチド)-Ｇｌｙ-Ｃｙｓ．アミドである。
構造タイプＩＸを有するキレートリガンドは、構造：
0003774238.tif 000015
を有するオキソテクネチウム錯体を形成する。
上記の構造IIを有する放射性金属キレート化剤を含む本発明の試薬の例は、構造：
0003774238.tif 000016
のキレート化剤を形成する(ターゲッティング基)-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-α,β-ジアミノプロピオンアミドである。
構造タイプＸＩを有する放射性診断剤は、構造：
0003774238.tif 000017
を有するオキソテクネチウム錯体を形成する。
チオール保護基｛(ｐｇｐ)S｝に共有結合したチオールを含む本発明によって提供された放射性金属キレート化剤およびＣＴ受容体結合試薬において、該チオール保護基は、同一または異なることができ、限定されるものではないが、
-ＣＨ2-アリール(アリールは、フェニルまたはアルキルもしくはアルキルオキシで置換されたフェニルである)；
-ＣＨ-(アリール)2、(アリールは、フェニルまたはアルキルもしくはアルキルオキシ置換されたフェニル)；
-Ｃ-(アリール)3、(アリールは、フェニルまたはアルキルもしくはアルキルオキシ置換されたフェニル)；
-ＣＨ2-(４-メトキシフェニル)；
-ＣＨ-(４-ピリジル)(フェニル)2；
-Ｃ(ＣＨ3)3
-９-フェニルフルオレニル；
-ＣＨ2ＮＨＣＯＲ(Ｒは、置換または非置換のアルキルまたはアリール)：
-ＣＨ2-ＮＨＣＯＯＲ(Ｒは、置換または非置換のアルキルまたはアリール)；
-ＣＯＮＨＲ(Ｒは、置換または非置換のアルキルまたはアリール)；
-ＣＨ2-Ｓ-ＣＨ2-フェニルであり得る。
好ましい保護基は、-ＣＨ2-ＮＨＣＯＲを有し、ここに、Ｒが１および８個の間の炭素原子を有する低級アルキル、フェニル、または低級アルキル、ヒドロキシルアルキル、低級アルコキシ、カルボキシ、または低級アルコキシカルボニル置換されたフェニルである。最も好ましい保護基は、アセトアミドメチル基である。
本発明の試薬がペプチドであるＣＴ受容体結合化合物を含む場合、該ペプチドは、好ましくは、アミノ酸配列：
0003774238.tif 000018
［式中、Ｘはシステイン残基、ホモシステイン残基およびホモホモシステイン残基よりなる群から選択される］
を含む。別法として、該ペプチドは、アミノ酸配列：
0003774238.tif 000019
［式中、Ｘ1はアラニン残基、グリシン残基、およびセリン残基よりなる群から選択され；Ｘ2はシステイン残基、ホモシステイン残基およびホモホモシステイン残基よりなる群から選択される］
を含み得る。かかるペプチドは、以下に記載されたアミノ酸配列：
0003774238.tif 000020
において特に具体化されるもののごとき自然発生のヒトＣＴおよびＣＴペプチドアナログを含む。
本発明の試薬の特に好ましい具体例は、
0003774238.tif 000021
全ての自然発生のアミノ酸は、標準的略語を用いて略記される(Ｇ.Ｚｕｂａｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ(２ｄ.ｅｄ.).１９８８(ＭａｃＭｉｌｌｅｎ、Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ)ｐ.３３に見出される)。本発明の目的では、自然発生のアミノ酸は、親油性(アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、プロリン、トリプトファンおよびバリンならびにシステインのＳ-アルキル化誘導体)、親水性(アスパラギン、グルタミン、トレオニン、セリン)、酸性(グルタミン酸およびアスパラギン酸)、塩基性(アルギニン、ヒスチジンおよびリジン)のごとく特徴付けられる。ε-Ｋ、δ-Ｏｒｎ、γ-Ｄａｂおよびβ-Ｄａｐは、上記の意味を有する。(ＢＡＴ)は、Ｎ6,Ｎ9-ビス(２-メルカプト-２-メチル-プロピル)-６,９-ジアザノナン酸を表し；Ｋ.(ＢＡＴ)およびＬｙｓ.(ＢＡＴ)は、(ＢＡＴ)のアミノ酸側鎖上のε-アミノ基にてアシル化されたアミノ酸リジンを表し；Ｃ(ＢＡＴ)およびＣｙｓ(ＢＡＴ)は、Ｓ-(Ｎ6,Ｎ9-ビス(２-メルカプト-2-メチルプロピル)-６,９-ジアザノナン-１-イル)システインを表し；(ＢＡＴ)は、(Ｎ6,Ｎ9-ビス(２-メルカプト-２-メチルプロピル)-１,４,１０-トリアザデカン；(ＢＡＴ-ＢＭ)は、Ｎ-｛２-(Ｎ',Ｎ'-ビス(２-マレイミドエチル)アミノエチル｝-Ｎ9-(ｔ-ブトキシカルボニル)-Ｎ6,Ｎ9-ビス(２-メチル-２-トリフェニル-メチルチオプロピル)-６,９-ジアザノナンアミド；(ＢＡＴ-ＢＳ)は、Ｎ-｛２-(Ｎ',Ｎ'-ビス(２-スクシンイミドエチル)アミノエチル｝-Ｎ6,Ｎ9-ビス(２-メルカプト-２-メチルプロピル)-６,９-ジアザノナンアミド；(ＢＭＨ)は、ビス-マレイミドヘキサン；(ＢＳＨ)は、ビス-スクシンイミドヘキサン；(ＢＭＭＥ)はビス-マレイミドメチルエーテル；(ＢＳＥＥ)は、ビス-スクシンイミドエチルエーテル；(ＢＭＥＥ)はビス-マレイミドエチルエーテル；および(ＢＳＭＥ)は、ビス-スクシンイミドメチルエーテルである。本明細書に用いるごとく、次のアミノ酸およびアミノ酸アナログは、以下の略語によって表されることを意図する：Ａｃｍは、スルフヒドリル保護アセトアミドメチル；Ｐｅｎはペニシラミン；Ａｃａは、６-アミノカプロン酸；Ｈｌｙはホモリジン；Ａｐｃは、Ｌ-｛Ｓ-(３-アミノプロピル)システイン；ＦDは、Ｄ-フェニルアラニン；ＷDは、Ｄ-トリプトファン；ＹDは、Ｄ-チロシン；Ｃｐａは、Ｌ-(４-クロロフェニル)アラニン；Ｔｈｐは、４-アミノ-テトラヒドロチオピラン-４-カルボン酸；Ｄ-Ｎａｌは、Ｄ-２-ナフチルアラニン；Ｄｇｐは、ジプロピルグリシン；Ｎｌｅはノルロイシン；Ｈｃｙはホモシステイン；Ｈｈｃは、ホモホモシステイン；Ａｉｂは、アミノイソ酪酸；Ｎａｌは、２-ナフチルアラニン；Ｄ-Ｎａｌは、Ｄ-２-ナフチルアラニン；Ａｉｎは、２-アミノインダン-２-カルボン酸；Ａｃｈｘａは、４-アミノ-シクロヘキシルアラニン；Ａｍｆは４-アミノメチル-フェニルアラニン；Ａｅｃは、Ｓ-(２-アミノエチル)システイン；Ａｐｃは、Ｓ-(３-アミノプロピル)システイン；Ａｅｓは、Ｏ-(２-アミノエチル)セリン；Ａｐｓは、Ｏ-(３-アミノプロピル)セリン；Ａｂｕは、２-アミノ酪酸；Ｎｖａは、ノルバリン；およびＡｓｕは、２-アミノスベリン酸、ここに、Ａｓｕ残基を含むペプチドのアミノ末端アミノ酸は、アミノ末端アミノ基およびＡｓｕ残基��側鎖のカルボン酸基間のアミド結合を介して環化する。
本発明により、ＣＴ受容体結合ペプチドは、アミノ酸側鎖に結合した放射性金属キレート化剤を有する１以上のアミノ酸誘導体を含み得る。好ましくは、放射性金属キレート化剤は、該ＣＴ受容体結合ペプチドのカルボシル末端にて該ペプチドに組込まれる。さらに好ましくは、放射性金属キレート化剤は、天然ペプチドの１４位に対応するシステインの側鎖イオウ原子で合成のＣＴ受容体結合ペプチドに組み込まれる。最も好ましくは、該放射性金属キレート化剤は、該配列：
0003774238.tif 000022
を有するＣＴ受容体結合ペプチドのアミノ酸の側鎖に組込まれる。
最も好ましくは、該放射性金属キレート化剤は、配列番号：９の該ペプチドの１３位のシステインの側鎖イオウ原子にてＣＴ受容体結合ペプチドに組込まれる(配列番号：９で太字強調により区別)。
本発明の該試薬のさらなる具体例は、少なくとも２つの合成ＣＴ受容体結合化合物を含み、各化合物は、放射性金属キレート化剤と共有結合し、多価リンカーは、各化合物への結合、各キレート化剤への結合およびある化合物および他の化合物のキレート化剤への結合よりなる群から選択される共有結合を形成する。また、この具体例のさらなる変更は、本発明に従って生じ得る。本発明のこの具体例における用途に適当な多価リンカーは、ＣＴアナログ、ＣＴ受容体結合化合物、ＣＴペプチドまたは放射性金属キレート化剤に共有結合できる、またはＣＴ受容体結合化合物および放射性金属キレート化剤に共に結合できる少なくとも２つの同一官能基を含む。好ましい官能基は、限定なくして、第一アミン、第二アミン、ヒドロキシル基、カルボン酸基またはチオール反応基を含む。好ましい具体例において、該多価リンカーは、ビス-スクシンイミジルメチルエーテル(ＢＳＭＥ)、ビス-スクシンイミドエチルエーテル(ＢＳＥＥ)、４-(２,２-ジメチルアセチル)安息香酸(ＤＭＢＡ)、Ｎ-｛２-(Ｎ',Ｎ'-ビス(２-スクシンイミド-エチル)アミノエチル)｝-Ｎ6,Ｎ9-ビス(２-メチル-２-メルカプト-プロピル)-６,９-ジアザノナンアミド(ＢＡＴ-ＢＳ)、トリス(スクシンイミジルエチル)アミン(ＴＳＥＡ)、ビス-スクシンイミドヘキサン(ＢＳＨ)、４-(Ｏ-ＣＨ2ＣＯ-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ-Ｃｙｓ.アミド)-２-メチルプロピオフェノン(ＥＴＡＣ)、トリス(アセトアミドエチル)アミン、ビス-アセトアミドメチルエーテル、ビス-アセトアミドエチルエーテル、α,ε-ビス-アセチルリジン、リジンおよび１,８-ビス-アセトアミド-３,６-ジオキサ-オクタン、またはその誘導体を含む。
本発明によって提供されたＣＴ受容体結合化合物は、いずれかの適当な合成法を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏにて化学合成できる。好ましくは、ＣＴペプチドは、組換え法を用いて本発明により合成できる。より好ましくは、ＣＴペプチド、ＣＴペプチド誘導体およびＣＴペプチドアナログは、ペプチド合成機を用いて本発明により一般的に有利に調製できる。本発明のＣＴペプチドは、固相ペプチド合成法のごとき当業者によく知られた技術を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて化学合成の間に該ペプチドに放射性金属キレート化剤を共有結合させることによって、好ましく合成される。このように、放射性金属キレート化剤は、該ペプチドの実質的にいずれかの位置にて基選択的様式の該ペプチドに組込み、それによって、ＣＴ受容体についての該ペプチドの親和性および特異性の減少を防止できる。
本発明に従って、ＣＴ受容体結合ペプチドは、保護されたチオール含有アミノ酸、典型的には、システイン残基を有して調製され、該ペプチドへ組み込まれる。合成樹脂からの該ペプチドの切断およびアミノ末端残基の環化に続いて、該保護されたチオール基は、脱保護され、放射性金属キレート化剤およびチオール反応基を含む置換基で合成される。
上記のごとく、本発明のＣＴ受容体結合試薬は、放射性標識して、放射性診断剤または放射性治療剤を提供できる。本発明の放射性標識試薬を用いた例示的な放射性診断の適用は、シンチグラム造影であり、ここに、ＣＴ受容体を担う腫瘍の局在および程度を決定できる。本明細書において用いられた「シンチグラム造影剤」なる用語は、放射活性を検出する手段(限定されるものではないが、ガンマ-カメラまたはシンチレーション検出プローブを含む)によって放射性標識試薬を検出できることを達成することを意味する。本発明の放射性治療の具体例において、ＣＴ受容体結合試薬は、細胞傷害性放射性ヌクレオチドで標識され、動物、好ましくはヒトにおける疾患または他の軽い病気に有用であり、かかる疾患または他の軽い病気は、ＣＴ受容体の発現または過剰発現によって特徴付けられる。ＣＴ関連疾患または軽い病気は、限定されるものでないが、乳癌、卵巣癌、肺癌、リンパ腫、およびかかる腫瘍を含む細胞の細胞表面上にＣＴ受容体の発現を介するＣＴ受容体結合化合物、ＣＴまたはその誘導体ならびにアナログを結合できる悪性腫瘍または良性腫瘍の増殖によって特徴付けられる他の疾患を含む。
いずれの放射性金属も本発明の試薬と錯体化して、放射性診断剤または放射性治療剤を供給できる。例えば、本発明の試薬は、テクネチウム-９９ｍ、ヨウ素-１２５またはヨウ素-１２３で放射性標識して、シンチグラム造影剤を提供できる。また、本発明は、磁性、常磁性、超磁性または超常磁性の金属原子、イオンまたは粒子と錯体を形成できるＣＴ受容体結合試薬を提供する。また、本発明のＣＴ受容体結合試薬は、スカンジウム-４７、銅-６７、ガリウム-７２、イットリウム-９０、スズ-１１７ｍ、ヨウ素-１２５、ヨウ素-１３１、サマリウム-１５３、ガドリニウム-１５９、ジスプロシウム-１６５、ホルミウム-１６６、イッテルビウム-１７５、ルテチウム-１７７、レニウム-１８６、レニウム-１８８、アスタチン-２１１、ビスマス-２１２およびビスマス-２１３よりなる群から選択される細胞傷害性放射性同位元素で有利に放射性標識して、放射性治療剤を提供できる。
本発明の該試薬を用いて放射活性テクネチウムまたはレニウムの錯体を形成する場合、該テクネチウム錯体、好ましくはテクネチウム-９９の過テクネチウム酸の塩、または過レニウム酸塩の形態におけるレニウムを還元剤の存在下、該試薬と反応させる。好ましい還元剤は、亜ジチオン酸塩、第一スズおよび第一鉄イオンであり；最も好ましい還元剤は、塩化第一スズである。別法として、該錯体は、本発明の試薬とテクネチウムまたはレニウムの予め形成された不安定な錯体、および転移リガンドとして公知のもう一つの化合物とを反応させることによって形成できる。このプロセスは、リガンド交換として公知であり、当業者によく知られている。不安定な錯体は、例えば、酒石酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩またはマンニトールのごとき転移リガンドを用いて形成できる。本発明で有用なテクネチウム-９９ｍの過テクネチウム酸塩またはレニウム塩には、ナトリウム塩またはアンモニア塩ならびに低級アルキルアンモニア塩のごときアルカリ金属塩を含む。
また、本発明は、放射性医薬としての用途の放射性標識試薬を調製するためのキットにおいて具体化される。本発明のキットは、所定量のＣＴ受容体結合試薬、および所望により、放射性金属がテクネチウム-９９ｍ、レニウム-１８６またはレニウム-１８８である場合に、還元剤を含有する密閉バイアルを含む。例えば、本発明の適当量の試薬は、テクネチウム-９９ｍ、レニウム-１８６またはレニウム-１８８で該試薬を標識するのに十分な量で、塩化第一スズのごとき還元剤を含むバイアルに導入される。また、（例えば、酒石酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩またはマンニトールのごとき）記載の適当量の転移リガンドは、キットに含まれる。また、該キットは、例えば、浸透圧調整用の医薬的に許容される塩、緩衝剤、保存剤等のごとき慣用的医薬添加物を含む。該キットの成分は、液体、凍結または乾燥形態であり得る。好ましい具体例において、キット成分は、凍結乾燥形態で供される。本発明によるテクネチウム-９９ｍ、レニウム-１８６またはレニウム-１８８標識の放射性医薬は、以下の実施例に記載のごときバイアルおよび条件下の反応の適当量のテクネチウム-９９ｍ、レニウム-１８６もしくはレニウム-１８８またはその放射性ヌクレオチド錯体の添加によって調製できる。
本発明のキットは、診断造影に適した形態で、またはヨウ素-１２３およびヨウ素-１３１、好ましくはヨウ素-１２３を含めたヨウ素の放射性元素を用いた治療剤として具体化できる。この具体例において、該キットは、ヨウ素同位体で放射性標識できる所定量のＣＴ受容体結合試薬を含む。密閉バイアルを含む。この具体例での用途に適当なＣＴ受容体結合試薬は、ＣＴ受容体に特異結合するＣＴ自体、ＣＴ誘導体、ＣＴアナログ、ＣＴミメティクスおよびＣＴペプチドミメティクスを含む。ペプチドおよびペプチドミメッティックＣＴ受容体結合試薬が具体例において使用される場合、試薬中のチロシン残基は、放射性ヨウ素化できる。かかるチロシン残基は、該ペプチドまたはペプチドミメティックにおいて自然発生でき、または該チロシン残基は、ＣＴ受容体に対する試薬の結合を妨害しない該ペプチドまたはペプチドミメティックの位置で付加できる。シンチグラムおよび治療用途用のテクネチウムおよびレニウム標識試薬について、この具体例のキットに用いられる、投与用量、投与部位および経路、製剤および投与される特定の放射性活性は、本明細書に記載される。
本発明によって供された造影剤は、腫瘍の造影、特に、ＣＴ受容体を発現または過剰発現する新生物細胞によって特徴付けられる初代および転移新生物部位を造影し、特に、通常の方法を用いる検出に対して臨床的に不応性であった初代およびとりわけ転移胸部、肺および卵巣腫瘍由来細胞のごときにおいて有用である。本発明によって供された造影試薬は、これらの臓器において疾患を診断するための腎臓または骨のごとき臓器を視覚化するために使用できる。
診断目的では、有効な診断の量の本発明の診断剤または放射性診断剤は、好ましくは、静脈内投与される。放射性診断の具体例において、放射性標識の局在は、ガンマシンチグラム造影法のごとき慣用的な方法を用いて検出できる。非放射活性の診断的具体例において、本発明の常磁性金属標識化診断剤の蓄積部位の局在は、磁気共鳴造影法を用いて達成される。
シンチグラム造影では、本発明によるテクネチウム-９９ｍ標識試薬は、単一の注射用量で投与される。本発明により供されたテクネチウム-９９ｍ標識試薬は、生理食塩水媒体のごとき静脈内注射用のいずれの通常の媒体または血漿媒体において静脈注射できる。一般的に、投与されるべき単位用量は、約０.０１ｍＣｉないし約１００ｍＣｉ、好ましくは、１ｍＣｉないし２０ｍＣｉの放射活性を有する。単位用量にて注射されるべき溶液は、約０.０１ｍｌないし約１０ｍｌである。静脈内投与後、ｉｎ ｖｉｖｏ造影は、数分間で行うことができる。しかしながら、造影は、放射性標識試薬が患者に注射された後、所望ならば、何時間もより長く行なうことができる。大部分の場合、十分量の投与用量は、約０.１時間以内に造影されるべき領域を蓄積して、シンチフォト（ｓｃｉｎｔｉｐｈｏｔｏ）を撮るのを可能とする。診断目的のためのシンチグラム造影法のいずれの慣用的な方法も本発明により利用できる。
本発明の目的では、放射性治療は、疼痛軽減ないし腫瘍切除の範囲のいずれかの治療効果または治療されるべき特定の癌に関連した症状の軽減を達成する。本発明の該試薬は、治療目的に用いられる場合に、有効量の細胞傷害性放射性同位元素で放射性標識される。この目的では、約１０ｍＣｉないし約２００ｍＣｉの量の細胞傷害性放射性同位元素は、いずれかの適当な臨床的経路を介して、好ましくは、静脈内注射によって投与できる。
本発明に従って、有効な放射性診断剤および放射性治療剤は、以下の通り同定され得る。ＣＴ断片、ＣＴペプチドアナログおよびＣＴ誘導体を含めた、ＣＴ受容体結合化合物を含む本発明の試薬は、本発明の方法を用いて合成され、放射性金属キレート化剤を該化合物と共有結合させる。次いで、該試薬は、所望の放射性金属と同様なキレート特性を有する放射性金属または非放射活性同位元素と錯体化し、次いで、ＣＴ受容体結合は、放射性ヨウ素化ＣＴを用いて、本明細書で記載のごとこきｉｎ ｖｉｔｒｏ競合結合アッセイにおいて評価した。この方法の例として、ＲｅＯを使用して、以下の実施例４に開示のごとく、９９ｍ-テクネチウム放射性標識シンチグラム造影剤として用いるＣＴ受容体結合ペプチドの適合性を評価する。
これらの化合物を作成および標識する方法は、以下の実施例においてより十分に例示され、それは、上記の発明および有利な結果のある態様を示し、例示によって示されるが、限定されるものではない。
実施例１
ＢＡＴキレート化剤の合成
とりわけＳ-システイン由来のＢＡＴキレート化剤およびε-アミノリジン由来のＢＡＴキレート化剤を共有された同時係属出願の米国特許第０８/４１４,４２４号（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす）の方法に従って調製した。
実施例２
固相ペプチド合成法
固相ペプチド合成法(ＳＰＰＳ)をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いて、およびジシクロヘキシルカルボジイミド/ヒドロキシベンゾトリアゾールまたは２-(１Ｈ-ベンゾトリアゾール-１-イル)１,１,３,３-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート/ヒドロキシベンゾトリアゾール(ＨＢＴＵ/ＨＯＢＴ)でカップリングする９-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Ｆｍｏｃ)アミノ末端保護を用いて、およびカルボキシル末端酸用のｐ-ヒドロキシメチルヘノキシメチル-ポリスチレン(ＨＭＰ)樹脂またはＳａｓｒｉｎTMもしくはクロロトリチル樹脂またはカルボキシル末端アミド用のＲｉｎｋアミド樹脂を用いて０.２５ミリモル(ｍｍｏｌｅ)スケールで行なった。
適当には、Ｆｍｏｃ-Ｃｙｓ(ＢＡＴ)-およびＮα-Ｆｍｏｃ-Ｎε-(ＢＡＴ)Ｌｙｓを共有および同時係属出願の米国特許第０８/４１４,４２４号（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす）に記載のごとく合成した。
適当には、２-クロロアセチル、２-ブロモアセチルおよび２-ブロモ-３-フェニルプロピオニル基をＳＰＰＳの間にカップリングした最終残基として適当な２-ハロ酸を用いて、または樹脂に結合したＮ末端遊離アミノ酸ペプチドを２-ハロ酸/ジイソプロピルカルボジイミド/Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド/ＮＭＰまたは２-ハロ酸無水物/ジイソプロピルエチルアミン/ＮＭＰのいずれかで処理することによって導入する。
適当には、ＨＰＬＣ-精製した２-ハロアシル化ペプチドは、所望により０.５-１.０ｍＭ ＥＤＴＡまたはアセトニトリルもしくはＴＨＦを含むリン酸塩または炭酸水素塩緩衝液または希釈水酸化アンモニウムの０.１-１.０ｍｇ/ｍｌの溶液(ｐＨ８.０)を１-４８時間撹拌することによって環化し、続いて所望により酢酸で酸性化し、凍結乾燥し、ＨＰＬＣ精製する。
適当には、チオール含有ペプチドをクロロアセチル含有の、チオール保護テクネチウム-９９ｍ錯体化基と室温にてｐＨ１０で０．５-４時間反応させ、続いて酢酸で酸性化し、該溶液を蒸発させて対応するペプチド硫化物アダクトを得る。脱保護および精製は、記載のごとくルーチン的に行なって、キレート化剤ペプチドコンジュゲートを得る。
適当には、ＢＳＭＥ、ＢＳＥＥおよびＢＳＨアダクトは、単一チオール含有ペプチド（所望により０.５ｍＭ ＥＤＴＡまたはＤＭＦもしくはＴＨＦまたはアセトニトリルを含有する、Ｎ-メチルモルホリンまたはＮ-エチル-モルホリンでｐＨ７に緩衝したＤＭＦ中、またはｐＨ７-８の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中の５ないし５０ｍｇ/ｍｌ）と、アセトニトリルで予め溶解された、各々、０.５モル当量のＢＭＭＥ(ビス-マレイミドメチルエーテル)、ＢＭＥＥ(ビス-マレイミドエチルエーテル)またはＢＭＨ(ビス-マレイミドヘキサン)とを室温にて、約１-１８時間反応させることによって調製する。該溶液を濃縮し、生成物をＨＰＬＣによって精製した。
適当には、ＴＳＥＡアダクトは、単一チオール含有ペプチド(所望により０.５ｍＭ ＥＤＴＡまたはＤＭＦもしくはＴＨＦまたはアセトニトリルを含有する、Ｎ-メチルモルホリンまたはＮ-エチル-モルホリンでｐＨ７に緩衝したＤＭＦ中の１０ないし１００ｍｇ/ｍｌのペプチド、またはｐＨ７-８の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中の５ないし５０ｍｇ/ｍｌペプチドの濃度)と、アセトニトリルまたはＤＭＦ中で予め溶解した０.３３モル当量のＴＭＥＡ(トリス(２-マレイミドエチル)アミン)とを１モル当量のトリエタノールアミンの有り無しで、室温にて１-１８時間反応させることによって調製する。かかる反応混合物を含有するアダクトを濃縮し、次いで、該アダクトをＨＰＬＣによって精製する。
適当には、(ＢＡＭ)(Ｎ1,Ｎ4-ビス(２-メルカプト-２-メチルプロピル)-１,４,１０-トリアザデカン)は、最初に該ペプチドカルボン酸塩をＤＭＦ、ＮＭＰまたは塩化メチレン中のジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドまたはＨＢＴＵ/ＨＯＢｔの混合物で活性化し、続いてジイソプロピルエチルアミンの存在下のカップリングして、該ペプチドにコンジュゲートする。カップリングの後、該コンジュゲートを上記のごとく脱保護する。
適当には、(ＢＡＴ)(Ｎ6,Ｎ9-ビス(２-メルカプト-２-メチルプロピル)-６,９-ジアザノナン酸)は、ペプチド合成の間、(Ｎα(Ｆｍｏｃ)Ｎε(Ｎ-Ｂｏｃ)-Ｓ,Ｓ'-ビストリチル-ＢＡＴ)リジン(共有および同時係属出願の米国特許第０８/０４４,８２５号（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす）の実施例２に記載のごときＮα(Ｆｍｏｃ)-リジンおよびＮε(Ｎ-Ｂｏｃ)-Ｓ,Ｓ'-ビストリエチル-ＢＡＴから調製）または(Ｎ(Ｆｍｏｃ)-Ｓ,Ｓ'-ビストリチル-ＢＡＴ)システイン(共有および同時係属出願の米国特許第０８/４１４,４２４号（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす）の実施例１Ｆに記載のごとき調製）のごとき保護アミノ酸誘導体としてペプチドに組込まれ、次いで、合成樹脂から完成したペプチドを切断した後脱保護する。
適当には、ＢＡＴ-ＢＳ(Ｎ-｛２-(Ｎ',Ｎ'-ビス(２-スクシンイミドエチル)アミノエチル)｝-Ｎ6,Ｎ9-ビス(２-メルカプト-２-メチルチオプロピル)-６,９-ジアザノナンアミド)アダクトは、単一チオール含有ペプチド(所望により０.５ｍＭ ＥＤＴＡまたはＤＭＦもしくはＴＨＦまたはアセトニトリルを含有する、Ｎ-メチルモルホリンまたはＮ-エチル-モルホリンでｐＨ７に緩衝したＤＭＦ中、または５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７-８)中の２ないし５０ｍｇ/ｍｌペプチドの濃度)をアセトニトリルまたはＴＨＦ中に予め溶解した０.５モル当量のＢＡＴ-ＢＭ(Ｎ-｛２-(Ｎ',Ｎ'-ビス(２-マレイミドエチル)アミノエチル｝-Ｎ9-(ｔ-ブトキシカルボニル)-Ｎ6,Ｎ9-ビス(２-メチル-２-トリフェニル-メチルチオプロピル)-６,９-ジアザノナンアミド)とを室温にて約１-１８時間反応させることによって調製する。次いで、該溶液を蒸発させて、乾燥し、(ＢＡＴ-ＢＳ)-ペプチドコンジュゲートを１０ｍｌのＴＦＡおよび０.２ｍｌのトリエチルシランで１時間処理することによって脱保護する。該溶液を濃縮して、生成アダクトをエーテルで沈澱させ、次いでＨＰＬＣによって精製する。
適当には、ペプチド前駆体を側鎖保護した、Ｎ末端遊離アミンおよびＣ末端遊離酸とジフェニルホスホリルアジドとの反応によって(アミノ-およびカルボキシル末端間を)環化させる。
ＳａｓｒｉｎTM樹脂結合ペプチドは、ジクロロメタン中の１％ＴＦＡの溶液を用いて切断して、保護ペプチドを得る。適当には、保護したペプチド前駆体は、アミノおよびカルボキシル末端間をジフェニルホスホリルアジドを用いて、側鎖保護された、アミノ末端遊離アミンおよびカルボキシル遊離酸の反応によって環化する。
ＨＭＰまたはＲｉｎｋアミド樹脂結合生成物をルーチン的に切断し、保護された環化ペプチドを所望により１００：５：５：２.５：２の比の水、チオアニソール、エタンジチオールおよびトリエチルシランまたはトリイソプロピルシランを含む、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、またはＴＦＡおよび塩化メチレンよりなる溶液を用いて室温にて、０.５-３時間脱保護する。適当には、生成物は、トリフェノールメタノール/ＴＦＡ中で再びＳ-トリチル化され、Ｎ-Ｂｏｃ基を(Ｂｏｃ)2Ｏを用いて該ペプチドに導入した。
適当には、補欠分子族でさらに修飾するために設計されたペプチドまたはペプチド様配列内のチオールの官能価をＳ-ｔ-ブチル(混合したｔ-ブチル二硫化物の生成)またはｐ-メトキシベンジルのごとき化合物を用いて保護した。Ｓ-ｔ-ブチル基は、ジチオトレイトールまたはメルカプトエタノールの溶液での処理によって除去され、一方、ｐ-メトキシベンジル基は、ｍ-クレゾールのごとき遊離ラジカルスカベンジャーの存在下、トリフルオロ酢酸中の三フッ化ホウ素エーテル化合物を用いて除去する。放射性金属結合基を含む補欠分子ペプチドをＮ末端２-ハロアセチル基で終わるＳＰＰＳによって調製する。該補欠分子族は、樹脂から取り去り、いずれかのチオール基を例えば、トリチル基で保護する。次いで、環状チオエーテルを調製するための上記と実質的に同一条件の下、ハロアセチル化配列をチオール含有ペプチドとカップリングする。次いで、残りの保護基の除去は、本明細書中に記載された方法を用いて達成して、最終生成物を得る。
粗ペプチドは、Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐａｋ Ｃ１８カラムおよびアセトニトリルで修飾された水中の０.１％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)を用いる勾配溶出を用いた予備的高圧液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)によって精製する。アセトニトリルを溶出画分から蒸発させ、次いでそれを凍結乾燥する。各生成物の同定は、速電子衝撃質量分光法(ＦＡＢＭＳ)または電子スプレー分光法(ＥＳＭＳ)によって確認する。
本明細書中に提供される合成のＣＴ受容体結合ペプチド、誘導体およびアナログ、ならびにＥＳＭＳまたはＦＡＢＭＳによって同定されるかかる合成の生成物を以下の表Ｉに示す。
0003774238.tif 000023
0003774238.tif 000024
実施例３
テクネチウム-９９ｍで放射性標識するための一般的方法
実施例２のごとく調製された０.１ｍｇのペプチドを０.１ｍｌまたは０.２ｍｌの水または０.９％生理食塩水に溶解した。テクネチウム-９９ｍグルセプテートは、２００ｍＣｉまで含有する０.２５ｍｌのテクネチウム-９９ｍの過テクネチウム酸ナトリウムで、Ｇｌｕｃｏｓｃａｎバイアル(Ｅ.Ｉ.ＤｕＰｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ、Ｉｎｃ.、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ)で復元することによって調製し、室温で１５分間静置した。次いで、２５μｌのテクネチウム-９９ｍグルセプテートを該ペプチドに添加し、反応は室温にて１５ないし６０分間または１００℃にて１０ないし３０分間続け、次いで０.２μｍのフィルターを通して濾過した。
該テクネチウム-９９ｍ標識ペプチドの純度は、次の条件を用いて逆相ＨＰＬＣによって測定した：Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐａｋ Ｃ-１８、５μ、３.９ｍｍ×１５０ｍｍ分析用カラムに各放射性標識化ペプチドを負荷し、該ペプチドは、１ｍｌ/分(Ｄｅｌｔａ-Ｐａｋ)に等しい溶媒の流れで溶出させた。勾配溶出は、２０-５０％溶媒Ｂ/溶媒Ａ(溶媒Ａは水中の０.１％ＣＦ3ＣＯＯＨであって、溶媒Ｂは９０/１０ ＣＨ3ＣＮ/Ｈ2Ｏ中の０.１％ＣＦ3ＣＯＯＨ)の勾配を用いて２０分間、続いて１００％Ｂ/Ａで３分間行った。
放射性成分を積分記録計に連結した直列型放射性金属検出器を用いて検出した。テクネチウム-９９ｍグルセプテートおよびテクネチウム-９９ｍ過テクネチウム酸ナトリウムは、これらの条件下、１および４分の間で溶出させたが、該テクネチウム-９９ｍ標識ペプチドは、非常に長い時間の後に溶出した。ペプチドは、２２０ｎｍにて分光光度検出によって検出した。
非放射性レニウム錯体は、本発明の各ペプチド試薬をジメチルホルムアミドまたはアセトニトリル/水において、Ｃｏｔｔｏｎら(１９６６、Ｉｎｏｒｇ.Ｃｈｅｍ.５：９-１６)に記載にによってごとく調製した約１モル当量のオキソテトラブロモレニウム酸テトラブチルアンモニウム(+５)と共に溶解させ、０.５-５日間撹拌することによって調製した。該レニウム錯体をテクネチウム-９９ｍ標識ペプチドについての上記のごとき逆相ＨＰＬＣによって単離し、ＦＡＢＭＳまたはＥＳＭＳによって特徴付けた。非放射性ペプチドは、直列型分光光度検出器によってペ２２０ｎｍにてプチドとして検出された。
例えば、Ｒｅ-１８６またはＲｅ-１８８を用いた放射性レニウム錯体は、テクネチウム-９９ｍ標識用の同一プロトコルを用いて、または該ペプチドおよび過レニウム酸塩の溶液に還元剤を添加することによって、もしくは所望によりクエン酸塩のごときリガンド転移剤を用い、室温および１００℃の間の温度にて反応を５および６０分の間インキュベートして適当な過レニウム酸塩から調製する。
ペプチド、テクネチウム-９９ｍ標識ペプチドおよびＲｅＯ-錯体化ペプチドのＨＰＬＣ精製結果を表IIに示す。
0003774238.tif 000025
0003774238.tif 000026
実施例４
生物学的アッセイ
Ａ．結合阻害アッセイ
本発明の範囲のペプチド試薬、またはそのＲｅＯ錯体化の具体例は、以下に詳述するごとく、ラット脳または胸部腫瘍細胞系からの膜を用いて、および胸部腫瘍細胞系からの全細胞に対する、ＣＴ受容体への125Ｉ-ＣＴの特異結合を阻害する能力を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いて試験した。
ラット脳のミクロソーム膜画分およびＴ-４７Ｄ細胞(Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＡＴＣＣ受入番号.ＨＴＢ-１３３から入手)を使用したアッセイを用いて、Ｆｉｓｈｅｒら(１９７７、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｃａｎｃｅｒ ３５：７７７-７８４)の方法に従ってＣＴ受容体についての高親和性を有するアナログを同定した。略言すれば、組織を細かく切り、ホモジナイズした。該膜を数回洗浄し、蛋白質含量をアッセイし、結合アッセイに用いた。膜蛋白質をテストされるべき試薬の変化させた濃度の存在および不存在下で、０.１μＣｉの125ＩのサケＣＴ(Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ)とインキュベートした。非錯体化およびＲｅＯ錯体化試薬の双方を試験した。該ＣＴ受容体の125Ｉ-ＣＴの１００パーセント特異結合は、過剰な非標識サケＣＴ(Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ)の受容体飽和濃度(１μＭ)の存在下で測定した総125Ｉ-ＣＴ結合と125Ｉ-ＣＴの非特異的結合間の差と定義した。試験された試薬が５０％まで125Ｉ-ＣＴの特異結合を阻害する濃度は、ＩＣ50と定義した。
試験された各試薬のＣＴ受容体の膜組織標本に対する結合の結果を表IIIに示す。これらの結果は、本発明の範囲内にあるペプチド試薬およびかかる試薬のＲｅＯ錯体が、ＣＴ受容体を発現している腫瘍細胞および脳膜と結合することを示す。
同様の試験を全Ｔ-４７Ｄ細胞およびＭＣＦ-7細胞(ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ-２２)を用いて、本発明の範囲内のさらなるペプチド試験で行った。該細胞は、実質的にＦｉｎｄｌａｙら(１９９０、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３０：３２１-３２６)の方法によって行なった。略言すれば、細胞を生理食塩水で洗浄し、ハンクの平衡塩溶液に再懸濁した。１億ないし２億個の細胞を１μＭの非標識サケＣＴの存在および不存在下で、０.１μＣｉの125Ｉ-サケＣＴとインキュベートして、１００％の特異結合値を決定した。細胞は、非錯体および／またはＲｅＯ錯体形態において、試験されるべき試薬の濃度を変更させることの有無において、０.１μＣｉの125Ｉ-ＣＴとインキュベートした。ＩＣ50値は、上記のごとく決定した。試験された各試薬の結果を表ＩＶに示した。
0003774238.tif 000027
0003774238.tif 000028
これらの結果は、本発明の範囲内にあるペプチド試薬およびかかるペプチドのＲｅＯ錯体が全細胞上のＣＴ受容体に特異結合でき、該試薬が２つの異なるＣＴ受容体を発現している胸部腫瘍細胞系においてＣＴ結合の強力な阻害剤であることを示した。
Ｂ．乳癌細胞系におけるＣＴ受容体発現
全細胞への125Ｉ-ＣＴの結合を用いて７つの異なるヒト乳癌細胞系におけるＣＴ受容体密度を評価した。該受容体の飽和を達成するために異なる濃度のＣＴの存在下、細胞当りの部位密度をＭＣＦ-７細胞について測定した。
次いで、データは、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（１９４９、Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６００-６７２）の方法によって線形化して、受容体密度を概算した。略言すれば、飽和曲線を線形化し、Ｋdを（-１/勾配）として計算し、次いでＢmaxは該曲線のＸ軸切片に等かった。他の細胞系（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから得られた各々）を125Ｉ-ＣＴの単一濃度でＭＣＦ-７細胞と比較し、それによって125Ｉ-ＣＴおよびそれらのＣＴ受容体密度を概算した。そのデータを表Ｖにまとめる。
0003774238.tif 000029
これらのデータは、アッセイされた乳癌細胞系の８６％（７のうち６）がＣＴ受容体について陽性であったことを示す。かくして、本発明の試薬の標的受容体は、試験された大部分の乳癌細胞系に存在する。最近、本発明の試薬についての標的受容体が初代乳癌において過剰発現することが判明した（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら（１９９７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７３、８１２-８１５）。これらの結果は、本発明のＣＴペプチドがヒトにおける腫瘍の診断および処置について有用な部位特異的な試薬を調製するのに適当であることを示す。
Ｃ．ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ
乳癌細胞系を受容体発現についてスクリーニングし、最良の細胞系を免疫欠損マウスにおいて異種移植用に選択した。これらの腫瘍モデルを用いて、上記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて確認された高親和性ペプチドのｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍ターゲッティング能力を評価した。
ＣＴ受容体を発現している乳癌細胞（Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ-７）を免疫欠損マウスまたはスプレーグ・ドーリーラットに埋込み、腫瘍を増殖させた。新しい99mＴｃ-ＣＴペプチドを試験するために、腫瘍を持つマウスまたはラットに約６ｍＣｉ/１０ｎｍｏｌペプチドにて約０．０２５ｍＣｉで注射した。該動物を頚部脱臼させ、ガンマカメラを用いて５分間静止的に像を写す。次いで、99mＴｃ-ＣＴペプチドの生物学的分布を注射用量の標準的アリコートと一緒にガンマカウンターにおいて血液、腫瘍、標的臓器および筋肉を計算することによって測定した。生物学的分布の時点を選択して、初期相、中間相および後期相の99mＴｃ-ＣＴアナログのクリアランスを表した。生物学的分布試験は、至適なシグナル対ノイズ比が注射後９０分に生じることを示した。選択されたアナログの腫瘍造影の能力を評価するために、血液および種々の組織における放射活性の比を腫瘍のものと比較した。９０分後の代表的生物学的分布データを以下の表ＶＩに示す。
0003774238.tif 000030
上記の開示は、本発明のある特定の具体例を強調し、全ての修飾およびそれに等しい変更は、添付した特許請求の範囲に記載のごとく、本発明の精神および範囲内にあると理解されるべきである。
配列表
(1)一般的情報：
(i)出願人：ディーン、リチャード・ティ
ブッシュ、ラリー・アール、
ピアソン、ダニエル・エイ
リスター-ジェイムズ、ジョン
(ii)発明の名称：カルシトニン受容体結合ペプチド
(iii)配列数：１１
(iv)通信宛先：
(A)宛先：ダイアタイド・インコーポレイテッド
(B)街：デルタ・ドライブ９番
(C)市：ロンドンデリー
(D)州：ニュー・ハンプシャー
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：０３０５３
(v)コンピューター判読形式：
(A)媒体型：フロッピーディスク
(B)コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ互換性
(C)オペレーティングシステム：ＰＣ-ＤＯＳ/ＭＳ-ＤＯＳ
(D)ソフトウェア：PatentIn Release #1.0,Version #1.30
(vi)現時の出願データ：
(A)出願番号：
(B)出願日：
(C)分類：
(vii)先行出願データ：
(A)出願番号：ＵＳ ０８/８４７，００７
(B)出願日：１９９７年５月１日
(Viii)代理人/代行者情報
(A)氏名：マクダニエルズ、パトリシア エイ
(B)登録番号：第３３，１９４号
(C)参照/明細書番号：ＤＩＴＩ １２５．１ＰＣＴ
(ix)電気通信情報
(A)電話：（０６３）４３７-８９７０
(B)ファックス：（６０３）４３７-８９７７
(2)配列番号：１に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)長さ：３２アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：両形態
(ii)配列の種類：ペプチド
(vi)起源：
(A)生物名：カルシトニン--ヒト
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：ジスルフィド結合
(B)存在位置：１．．７
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：修飾部位
(B)存在位置：３２
(D)他の情報：/生成物＝「プロリン ３２」/ラベル＝アミド
(xi)配列：配列番号：１：
0003774238.tif 000031
(2)配列番号：１に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)長さ：３２アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：両形態
(ii)配列の種類：ペプチド
(vi)起源：
(A)生物名：カルシトニン--サケ
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：ジスルフィド結合
(B)存在位置：１．．７
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：修飾部位
(B)存在位置：３２
(D)他の情報：/生成物＝「プロリン ３２」/ラベル＝アミド
(xi)配列：配列番号：２：
0003774238.tif 000032
(2)配列番号：３に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)長さ：３２アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：両形態
(ii)配列の種類：ペプチド
(vi)起源：
(A)生物名：カルシトニン--ウナギ
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：ジスルフィド結合
(B)存在位置：１．．７
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：修飾部位
(B)存在位置：３２
(D)他の情報：/生成物＝「プロリン ３２」/ラベル＝アミド
(xi)配列：配列番号：３：
0003774238.tif 000033
(2)配列番号：４に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)長さ：３２アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：両形態
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：領域
(B)存在位置：１．．６
(D)他の情報：/生成物＝「Ｓ１はアセチル化され、Ｘ６はＨｈｃである」
/ラベル＝環化
/注意＝「該ペプチドはセリン１のＮ末端アセチル基およびホモホモシステイン６のチオール間のチオエーテル結合によって環化される」
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：修飾部位
(B)存在位置：１３
(D)他の情報：/生成物＝「Ｃ １３」
/ラベル＝ＢＡＴ
/注意＝「システイン１３のチオール基は、ビスアミノビスチオールキレート化剤に結合する」
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：修飾部位
(B)存在位置：３１
(D)他の情報：/生成物＝「プロリン ３１」
/ラベル＝アミド
(xi)配列：配列番号：４：
0003774238.tif 000034
(2)配列番号：５に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)長さ：３１アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：両形態
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：領域
(B)存在位置：１．．６
(D)他の情報：/生成物＝「Ｓ１はアセチル化され、Ｘ６はＨｈｃである」/ラベル＝環化
/注意＝「該ペプチドはセリン１のＮ末端アセチル基およびホモホモシステイン６のチオール間のチオエーテル結合によって環化される」
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：修飾部位
(B)存在位置：１３
(D)他の情報：/生成物＝「プロリン ３１」
/ラベル＝アミド
(xi)配列：配列番号：５：
0003774238.tif 000035
(2)配列番号：６に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)長さ：３１アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：両形態
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：領域
(B)存在位置：１．．６
(D)他の情報：/生成物＝「Ｓ１はアセチル化され、Ｘ６はＨｃｙである」/ラベル＝環化
/注意＝「該ペプチドはセリン１のＮ末端アセチル基およびホモシステイン６のチオール間のチオエーテル結合によって環化される」
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：修飾部位
(B)存在位置：３１
(D)他の情報：/生成物＝「プロリン ３１」
/ラベル＝アミド
(xi)配列：配列番号：６：
0003774238.tif 000036
(2)配列番号：７に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)長さ：３１アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：両形態
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：領域
(B)存在位置：１．．６
(D)他の情報：/生成物＝「Ｓ１はアセチル化される」
/ラベル＝環化
/注意＝「該ペプチドはセリン１のＮ末端アセチル基およびシステイン６のチオール間のチオエーテル結合によって環化される」
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：修飾部位
(B)存在位置：１３
(D)他の情報：/生成物＝「プロリン ３１」
/ラベル＝アミド
(xi)配列：配列番号：７：
0003774238.tif 000037
(2)配列番号：８に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)長さ：３１アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：両形態
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：領域
(B)存在位置：１．．６
(D)他の情報：/生成物＝「Ｘ６はＡｓｕである」
/ラベル＝環化
/注意＝「該ペプチドはセリン１および２-アミノスベリン酸６間の結合によって環化される」
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：修飾部位
(B)存在位置：３１
(D)他の情報：/生成物＝「プロリン ３１」
/ラベル＝アミド
0003774238.tif 000038
(2)配列番号：９に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)長さ：３１アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：両形態
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：領域
(B)存在位置：１．．６
(D)他の情報：/生成物＝「Ｓ１はアセチル化され、Ｘ６はＨｈｃである」
/ラベル＝環化
/注意＝「該ペプチドはセリン１のＮ末端アセチル基およびホモホモシステイン６のチオール間のチオエーテル結合によって環化される」
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：修飾部位
(B)存在位置：３１
(D)他の情報：/生成物＝「プロリン ３１」
/ラベル＝アミド
(xi)配列：配列番号：９：
0003774238.tif 000039
(2)配列番号：１０に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)長さ：６アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：環状
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：領域
(B)存在位置：１．．６
(D)他の情報：/生成物＝「Ｓ１はアセチル化され、Ｘ６はＣ、ＨｃｙまたはＨｈｃである」
/ラベル＝環化
/注意＝「該ペプチドはセリン１のＮ末端アセチル基およびＸ６のチオール間のチオエーテル結合によって環化される」
(xi)配列：配列番号：１０：
0003774238.tif 000040
(2)配列番号：１１に関する情報：
(i)配列の特性：
(A)長さ：６アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：環状
(ii)配列の種類：ペプチド
(ix)配列の特徴：
(A)配列の特徴を表す記号：領域
(B)存在位置：１．．６
(D)他の情報：/生成物＝「Ｘ１はＡ，ＧまたはＳ；Ｘ６はＣ、ＨｃｙまたはＨｈｃである」
/ラベル＝環化
/注意＝「該ペプチドはＮ末端メチレン基およびＸ６のチオール間のチオエーテル結合によって環化される」
(xi)配列：配列番号：１１：
0003774238.tif 000041