(57)【要約】  エコールを効率的に産生できるエコールの製造方法を提供する。  ダイゼイン類を含有する培地中で、エコール産生菌及びラクトバチルス・カゼイ  ＹＩＴ ９０２９株を培養するエコールの製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイゼイン類を含有する培地中で、エコール産生菌及びラクトバチルス・カゼイ  ＹＩＴ ９０２９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ―１３６６）を培養するエコールの製造方法。
【請求項２】
ダイゼイン類が、ダイゼイン、ダイゼイン配糖体及びジヒドロダイゼインから選択される１種以上である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ダイゼイン類を含有する培地が、豆乳を主成分とする培地である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
エコール産生菌がコリオバクテリア科に属する細菌である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
エコール産生菌がスラッキア属細菌である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
エコール産生菌がＳｌａｃｋｉａ  ｓｐ．ＹＩＴ １１８６１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２３１）である、請求項１〜５のいずれかの方法。
【請求項７】
ダイゼイン類を含有する培地中で、エコール産生菌及びラクトバチルス・カゼイ  ＹＩＴ ９０２９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ―１３６６）を培養するエコール含有発酵組成物の製造方法。
【請求項８】
ダイゼイン類を含有する培地が、豆乳を主成分とする培地である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ダイゼイン類を含有する培地中で、エコール産生菌及びラクトバチルス・カゼイ  ＹＩＴ ９０２９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ―１３６６）を培養してなるエコール含有発酵組成物。
【請求項１０】
ダイゼイン類を含有する培地が、豆乳を主成分とする培地である、請求項９記載のエコール含有発酵組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エコール産生菌を用いてエコールを効率的に製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大豆食品に多く含まれるイソフラボンは、不定愁訴等の更年期障害の改善や骨粗鬆症の予防、高脂血症や動脈硬化の予防、乳がんや前立腺がんの予防等に効果がある機能性成分として知られている。近年の研究により、イソフラボンの一つであるダイゼイン（Ｄａｉｄｚｅｉｎ）は、体内の腸内細菌によってエストロゲン作用や抗酸化作用がより強力なエコール（Ｅｑｕｏｌ）に代謝されることが明らかになり、エコールは体内で上記の作用を奏する主要な有効成分の一つとして注目されている。【０００３】
体内でのダイゼインからエコールへの産生は全てのヒトで一律に行われるのではなく、その産生能には個人差があり、３０〜５０％のヒトがエコール産生能を有することが報告されている（非特許文献１）。そこで、エコール産生能を有する腸内細菌の探索が精力的に行われており、エコール産生能を有する微生物として、バクテロイデス・オバタス、ストレプトコッカス・インターメディアス、ストレプトコッカス・コンステラータス（特許文献１）、ラクトコッカス・ガルビエ（特許文献２）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス  ＴＭ−１株、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＪＣＭ  １２７３（特許文献３）、プロピオニバクテリウム・フレウンデレッキ、ビフィドバクテリウム・ラクチス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトコッカス・ラクチス、エンテロコッカス・フェシウム、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・サリバリウス（特許文献４）、ＳＮＵ−Ｊｕｌｏｎｇ７３２（非特許文献２）、アドレクロイチア・エクオリファシエンス、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス、スラッキア・エクオリファシエンス、Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐｐ．ＴＭ−３０株、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．Ｙ７９１８、ｇｒａｍ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏ０３（非特許文献３）が報告されている。また、本出願人は、ダイゼインからのエコール変換能が高い微生物として、スラッキア（Ｓｌａｃｋｉａ）属細菌である、Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．ＹＩＴ １１８６１（ＮＡＴＴＳ株）を見出している（特許文献５）。【０００４】
一方、Ｌ．カゼイ・シロタ株（ＬｃＳ）であるＹＩＴ ９０２９株は、広く、乳酸菌飲料や発酵乳において使用され、様々な生理作用を有することが明らかにされている。
しかしながら、当該ＹＩＴ ９０２９株をエコール産生菌と組み合わせて使用することについては、全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９９／７３９２号
【特許文献２】国際公開第２００５／４２号
【特許文献３】特開２００６−２０４２９６号公報
【特許文献４】特表２００６−５０４４０９号公報
【特許文献５】特許第５６３１８６２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Proc Soc Exp Biol Med、Vol.217、No.3、p335-339(1998)
【非特許文献２】Appl Environ Microbiol、Vol.71、p214-219(2005)
【非特許文献３】J Biosci Bioeng、Vol.102、p247-250(2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、微生物によりエコールを効率的に産生できるエコールの製造方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、ダイゼイン類を含有する培地中で、エコール産生菌とラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９株を混合培養することにより、エコールを効率よく製造できることを見出し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の１）〜１０）に係るものである。
１）ダイゼイン類を含有する培地中で、エコール産生菌及びラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６６）を培養するエコールの製造方法。
２）ダイゼイン類が、ダイゼイン、ダイゼイン配糖体及びジヒドロダイゼインから選択される１種以上である、１）の方法。
３）ダイゼイン類を含有する培地が、豆乳を主成分とする培地である、１）又は２）の方法。
４）エコール産生菌がコリオバクテリア科に属する細菌である、１）〜３）のいずれかの方法。
５）エコール産生菌がスラッキア属細菌である、１）〜４）のいずれかの方法。
６）エコール産生菌がＳｌａｃｋｉａ  ｓｐ．ＹＩＴ １１８６１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６６）である、１）〜５）のいずれかの方法。
７）ダイゼイン類を含有する培地中で、エコール産生菌及びラクトバチルス・カゼイ  ＹＩＴ ９０２９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ―１３６６）を培養するエコール含有発酵組成物の製造方法。
８）ダイゼイン類を含有する培地が、豆乳を主成分とする培地である、７）の方法。
９）ダイゼイン類を含有する培地中で、エコール産生菌及びラクトバチルス・カゼイＹＩＴ ９０２９株を培養してなるエコール含有発酵組成物。
１０）ダイゼイン類を含有する培地が、豆乳を主成分とする培地である、９）のエコール含有発酵組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、エコール又はエコールを含有する発酵組成物を効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】培養後のＮＡＴＴＳ株の菌数を示す図。
【図２】培養後の生成物の濃度。図中の値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）。
【図３】ＬｃＳとＮＡＴＴＳ株の共培養におけるＮＡＴＴＳ株の菌数の推移。図中の値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）。
【図４】ＬｃＳとＮＡＴＴＳ株の共培養におけるエコール濃度の推移。図中の値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において、ダイゼイン類としては、ダイゼイン、ダイゼイン配糖体及びジヒドロダイゼインから選択される１種以上を意味し、ダイゼイン配糖体としては、具体的には、ダイジン、マロニルダイジン、アセチルダイジン等が挙げられる。
【００１３】
本発明において、エコール（ｅｑｕｏｌ）とは、ダイゼイン類の主な代謝産物である、７−ヒドロキシ−３−（４’−ヒドロキシフェニル）−クロマンを指す。エコールには、鏡像異性体（Ｒ−エコール及びＳ−エコール）が存在するが、本発明により得られるエコールは、ラセミ体でもよく、鏡像異性体の一方のみ又は鏡像異性体の一方を多く含むものでもよい。
【００１４】
本発明において、エコール産生菌としては、ダイゼイン類（ダイゼイン配糖体、ダイゼイン、ジヒドロダイゼイン）を資化してエコールを生成する微生物であれば特に限定されず、例えば、スラッキア属、アドレクロイチア属、エガセラ属、バクテロイデス属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、ビフィドバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、ラクトバチルス属、エンテロコッカス属等に属する微生物が挙げられ、より具体的には、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス、スラッキア・エクオリファシエンス、Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐｐ．ＴＭ−３０株、Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．ＹＩＴ １１８６１株（本明細書において、「ＮＡＴＴＳ株」とも称する）、アドレクロイチア・エクオリファシエンス、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．Ｙ７９１８、バクテロイデス・オバタス、ストレプトコッカス・インターメディアス、ストレプトコッカス・コンステラータス（特許文献１）、ラクトコッカス・ガルビエ（特許文献２）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス  ＴＭ−１株、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＪＣＭ  １２７３（特許文献３）、プロピオニバクテリウム・フレウンデレッキ、ビフィドバクテリウム・ラクチス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトコッカス・ラクチス、エンテロコッカス・フェシウム、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・サリバリウス（特許文献４）等が挙げられる。
このうち、コリオバクテリア科に属するスラッキア属細菌、アドレクロイチア属細菌、エガセラ属細菌が好ましく、より好ましくはスラッキア属細菌である。具体的には、例えばスラッキア・イソフラボニコンバーテンス、スラッキア・エクオリファシエンス、Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐｐ．ＴＭ−３０株が挙げられ、より好ましくは、Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐ．ＹＩＴ １１８６１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２３１）株である。
【００１５】
ラクトバチルス・カゼイ  ＹＩＴ ９０２９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６６）株は、Ｌ．カゼイ・シロタ株（本明細書において、「ＬｃＳ」とも称する）であり、昭和５６年１月１２日、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現在は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター）に寄託されている。
【００１６】
本発明のエコールの製造方法は、ダイゼイン類を含有する培地中で、エコール産生菌及びラクトバチルス・カゼイ  ＹＩＴ ９０２９株を混合して培養することにより行われる。
ダイゼイン類を含有する培地は、ダイゼイン類又はダイゼイン類を分散又は溶解させた液を培地に添加することにより調製できる。この場合に、ダイゼイン類の水への溶解性を高めるべく、培地に可溶化剤を適宜含有させることができる。また、ダイゼイン類を含有する培地は、ダイゼイン類を含有する原料、例えば豆乳を主成分とする培地（以下、「豆乳培地」と称する）であってもよい。
【００１７】
上記培地は、本発明の微生物を培養することができる限り、その種類及び組成には特に限定はない。上記培地は、通常、液体培地であるが、固体培地であってもよい。また、乳を主成分とする培地（例えば牛乳、山羊乳、羊乳、豆乳などの動物及び植物由来の液状乳、脱脂粉乳、全粉乳、或いは粉乳や濃縮乳から還元した乳をそのまま或いは水で希釈した乳培地）であってもよい。
また、上記培地のｐＨ（培養開始時）は、通常５．０〜８．０、好ましくは５．５〜７．５、更に好ましくは６．０〜７．０である。
また、上記培地には、例えば、水溶性の有機物を炭素源として加えることができる。水溶性の有機物としては、グルコース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、キシロース、マンノース、ラムノース、リボース、ソルボース、トレハロース、セロビオース、ラクトース、マルトース、シュクロース、ラフィノース、メリビオース、メレジトース、ラクチュロース、グリコーゲン、エリスリトール、ソルビトール、アドニトール、マンニトール、イノシトール、ラクチトール、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、イヌリン、可溶性でんぷん等の糖類の他、ピルビン酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、吉草酸、イソ吉草酸、酪酸、イソ酪酸、プロピオン酸及び酢酸など有機酸類等の化合物を挙げることができる。
上記の炭素源に加えて、培地には、窒素源を加えることができる。好ましい無機窒素源としては、アンモニウム塩や硝酸塩が挙げられ、例えば、硫安、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、クエン酸アンモニウム、硝酸カリウム、硝酸ソーダ等が挙げられる。有機窒素源としては、アミノ酸類、酵母エキス、ペプトン類、肉エキス、肝臓エキス、消化血清末等が挙げられ、好ましくは、アルギニン、システイン、シトルリン、オルニチン、リジン、酵母エキス、ペプトン類等が挙げられる。特に、エコール産生菌の増殖を向上させる点から、アルギニンを添加するのが好ましい。アルギニンとしては、Ｌ体、Ｄ体、それらの混合物でもよいが、好ましくはＬ−アルギニンである。アルギニンは塩の形態をとっても良く、塩としては、例えば塩酸塩、グルタミン酸塩、クエン酸塩等を挙げることができ、好ましくは塩酸塩である。培地中のアルギニン含有量は、０．４〜２．５ｗ／ｖ％、好ましくは０．８〜２．１ｗ／ｖ％である。尚、アルギニンの塩を使用した場合、アルギニンの含有量とは、遊離体のアルギニンに換算した量である。
【００１８】
更に、炭素源や窒素源に加えて、エコール産生菌の培養に適した他の有機物あるいは無機物、例えばビタミンなどの補因子や各種の塩類等の無機化合物を培地に加えることもできる。無機化合物としては、例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、塩化コバルト、塩化カルシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、明ばん、モリブデン酸ソーダ、塩化カリウム、ホウ酸等、塩化ニッケル、タングステン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、硫酸第一鉄アンモニウムが挙げられる。
また、ビタミン類としては、例えば、ビオチン、葉酸、ピリドキシン、チアミン、リボフラビン、ニコチン酸、パントテン酸、ビタミンＢ１２、チオオクト酸、ｐ−アミノ安息香酸が挙げられる。また、ポルフィリン化合物であるヘミンを添加することも可能である。
【００１９】
また、豆乳培地としては、豆乳又は豆乳を原料として製造される豆乳製品（例えば、低脂肪豆乳（不二製油社）等）をそのまま又は必要に応じ希釈して基本培地とし、適宜、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ等のビタミン類や、各種ペプチド、酵母エキス、茶エキス、オレイン酸、アミノ酸類（アルギニン塩、システイン塩等）、カルシウム、マグネシウム等の塩類を添加したものが挙げられる。
【００２０】
上記培地へのエコール産生菌の播種量は、例えば０．０１〜５０ｖ／ｖ％、好ましくは０．１〜５．０ｖ／ｖ％、より好ましくは１．０ｖ／ｖ％とすることが挙げられ、ラクトバチルス・カゼイ  ＹＩＴ９０２９の播種量は、例えば０．０１〜５．０ｖ／ｖ％、好ましくは０．０１〜１．０ｖ／ｖ％、より好ましくは０．１ｖ／ｖ％とすることが挙げられる。
【００２１】
培養温度及び培養時間は、ダイゼイン類を資化することができればよく、培養温度は、通常２５〜４２℃、好ましくは３０〜４０℃、より好ましくは３５〜３９℃である。また、培養時間は通常、１日〜７日、好ましくは１日〜３日である。
また、培養は通常、窒素ガス、炭酸ガス、水素ガスもしくはこれらの混合ガスを用いた嫌気条件下で静置培養することにより行われるが、攪拌培養を行ってもよい。
【００２２】
培養終了後、エコールの回収は、例えば、培養後の培養物を適切な有機溶媒により分画することにより行うことができる。その後、必要に応じて溶媒を除去し、公知の方法で精製することにより、エコールを得ることができる。
また、例えば、豆乳培地やダイゼイン類を含有する乳培地を用いて培養を行った場合、当該培養物は、そのまま、あるいは通常発酵豆乳食品に添加される他の食品素材と混合することによりエコールを含有する発酵組成物とすることができる。
【００２３】
上記の発酵組成物は、食品、医薬品、化粧品等として提供することができる。例えば、飲料、ケフィア、ヨーグルト等の生菌含有タイプの発酵豆乳食品にもなり、その形態としては、例えばハードタイプ、ソフトタイプ、プレーンタイプ、甘味タイプ、フルーツタイプ、ドリンクタイプ、フローズンタイプ等が挙げられる。
【００２４】
斯かる発酵組成物には、必要に応じて、食品、医薬品、化粧品等に配合可能な各種素材、例えば、各種糖質、増粘剤、乳化剤、各種ビタミン剤等の任意成分を配合することができる。具体的には、ショ糖、パラチノース、トレハロース、ラクトース、キシロース、麦芽糖等の糖質、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット、還元水飴、還元麦芽糖水飴等の糖アルコール、アスパルテーム、ソーマチン、スクラロース、アセスルファムＫ、ステビア等の高甘味度甘味料、寒天、ゼラチン、カラギーナン、グァーガム、キサンタンガム、ペクチン、ローカストビーンガム、ジェランガム、カルボキシメチルセルロース、大豆多糖類、アルギン酸プロピレングリコール等の各種増粘（安定）剤、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤、クリーム、バター、サワークリームなどの乳脂肪、クエン酸、乳酸、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸等の酸味料、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ類等の各種ビタミン類、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガン等のミネラル、ヨーグルト系、ベリー系、オレンジ系、花梨系、シソ系、シトラス系、アップル系、ミント系、グレープ系、アプリコット系、ペア、カスタードクリーム、ピーチ、メロン、バナナ、トロピカル系、ハーブ系、紅茶、コーヒー系等のフレーバー類を配合することができる。
【実施例】
【００２５】
実施例１
（１）使用菌株
エコール産生菌：Slackia sp. YIT 11861（以下、ＮＡＴＴＳ株）
乳酸菌：Lactobacillus acidophilus YIT 0198
Lactobacillus casei YIT 0180T
Lactobacillus casei YIT 9029(以下、ＬｃＳ)
Lactococcus lactis ss lactis YIT 2008T
Lactococcus lactis ss lactis YIT 2027
Streptococcus thermophilus YIT 2037T
Streptococcus thermophilus YIT 2001
Streptococcus thermophilus YIT 2021【００２６】
（２）使用培地
ＮＡＴＴＳ株の培養には変法ＧＡＭ平板培地（日水製薬）を、各種乳酸菌の培養にはＭＲＳ培地（ベクトン・ディッキンソン：ＢＤ）を使用した。
豆乳培地は、表１に示す組成とし、システイン塩酸塩及びアルギニン塩酸塩以外の成分を精製水に溶解し、１００℃、３０分加熱して脱気した。システイン塩酸塩を加えた後にＮ２ガスを吹き込み冷却し、試験管に１２．６ｍＬずつ分注した後、１１５℃、２０分オートクレーブした。培養前にフィルター滅菌済みの１５ｗ／ｖ％アルギニン塩酸塩を１．４ｍＬ加えたものを培地とした。【００２７】
【表１】
2019189389.tif 000002
【００２８】
（３）培養方法
ＮＡＴＴＳ株は、嫌気グローブボックス内で変法ＧＡＭ平板培地（日水製薬）にＮＡＴＴＳ株の凍結保存液（分散媒：２０％グリセロール溶液）を２００μＬ播種し、３７℃で２４時間培養した。生育したコロニーを平板１枚あたり２ｍＬの変法ＧＡＭ液体培地に懸濁し、接種菌液とした。
各種乳酸菌は、凍結保存菌株（マイクロバンク：イワキ）を４ｍＬのＭＲＳ培地に接種して、３７℃で２４時間好気培養したものを前培養液とした。
ＮＡＴＴＳ株と乳酸菌の共培養は、ＮＡＴＴＳ株は１．０％、乳酸菌株は０．１％となるように豆乳培地に接種し、３７℃で７２時間嫌気培養した（各組み合わせは、ｎ＝３で実施）。嫌気ガスは、窒素ガスを使用した。【００２９】
（４）ＮＡＴＴＳ株の菌数測定方法
１）培養液の前処理
培養液２００μＬに８００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加え、そこに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に３８．３ｍｇ／ｍＬとなるように溶解したプロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ（天野エンザイム）を１５０μＬ添加し、４５℃で３分間インキュベートした。４℃のもと２０，４００×ｇで５分間遠心し、上清をピペッティングで除去した後、ペレットを２００μＬのＴＥバッファー（ｐＨ８．０）に再懸濁した。そこに４００μＬのＲＮＡｐｒｏｔｅｃｔ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を添加し５分間室温で放置した後、２０，４００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。得られた沈殿はＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。【００３０】
２）菌数測定
上記の沈殿から既報［１）Matsuda K et al. Establishment of an analytical system for the human fecal microbiota, based on reverse transcription-quantitative PCR targeting of multicopy rRNA molecules. Appl Environ Microbiol. 75:1961-1969 (2009)］に従ってＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ｑＰＣＲ法［２）Tsuji, H. et al. Isolation and characterization of the equol-producing bacterium Slackia sp. strain NATTS. Arch Microbiol. 192, 279-87 (2010)］によりＮＡＴＴＳ株の菌数を測定した。使用したプライマーは表２に示した。なお、標準曲線の作成には、純粋培養菌液のＤＡＰＩカウントの結果をもとに培養液の菌数調整を行い、上記１）と同様に酵素処理を加えた後に抽出したＲＮＡを用いた。【００３１】
【表２】
2019189389.tif 000003
【００３２】
（５）豆乳培地中のイソフラボンアグリコン及びその代謝物の分析
培養７２時間後の嫌気豆乳培地０．５ｍＬをねじ口試験管に移し、２．５ｍＬのジエチルエーテルを加えて激しく混合した。試験管を１，０００×ｇで１０分間遠心し、エーテル相を新しい試験管に回収した後、残りの水相に再度２．５ｍＬのジエチルエーテルを加えて激しく混合した。試験管を１，０００×ｇで１０分間遠心し、エーテル相を上記の試験管に回収した後、４０℃に加温したブロックヒーターにより窒素気流下で乾固した。乾固させた抽出物を２５０μＬの８０ｖ／ｖ％メタノールに溶解した後、０．４５μｍフィルターでろ過した。ろ液中のダイゼイン及びその誘導体の定量には液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）を用いた。システムとして、質量分析計ＺＱ  ４０００を備えたアライアンスＨＰＬＣシステム（日本ウォーターズ）を用いた。分離カラムにはＣａｄｅｎｚａＣＤ−Ｃ１８（内径：３．０ｍｍ、長さ：７５ｍｍ、粒径３μｍ、インタクト）を、移動相には０．１％ギ酸／アセトニトリル混液（７０：３０）を使用し、サンプルアプライ量は１０μＬとした。解析にはＷａｔｅｒｓ  Ｅｍｐｏｗｅｒ  ２ソフトウエア（日本ウォーターズ）を用いた。標準曲線は、ダイゼイン、エコール、ジヒドロダイゼイン（ＤＨＤ）及びｏ−デスメチルアンゴレンシン（ｏ−ＤＭＡ）の標品のメタノール溶液を用いて作成した。各物質の定量範囲は１０〜１，０００ｎｇ／ｍＬとした。
なお、豆乳培地中に配糖体として含まれているイソフラボンアグリコン量は、菌株未接種の豆乳培地０．５ｍＬにアーモンド由来β−グルコシダーゼ（１００Ｕ／ｍＬ，ＳＩＧＭＡ）を含む０．２Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）を０．５ｍＬ加えて、３７℃で１６時間反応させ、遊離したイソフラボンアグリコンの濃度を、反応液０．５ｍＬを用いて上記と同様の方法で測定した。【００３３】
（６）結果
１）供試した８株の乳酸菌のすべての菌株との共培養により、培養後のＮＡＴＴＳ株の菌数が、ＮＡＴＴＳ株単独培養と比べて有意に高かった（図１−Ａ，Ｂ）。共培養に用いた菌株のなかでもＬ．ｃａｓｅｉ  ＹＩＴ  ９０２９株（ＬｃＳ）と組み合わせた場合に、１ｍＬあたり１０９ｃｅｌｌｓ以上の菌数まで到達した。【００３４】
２）Ｌ．  ｃａｓｅｉ  ＹＩＴ  ０１８０Ｔ、Ｌａｃ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＹＩＴ  ２００８Ｔ及びＬａｃ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＹＩＴ  ２０２７をＮＡＴＴＳ株と共培養すると、培養液中のダイゼイン及びゲニステイン濃度が高まった（図２−Ａ，Ｂ）。上記の３菌株のうち、Ｌ．  ｃａｓｅｉ  ＹＩＴ  ０１８０ＴとＮＡＴＴＳ株との組み合わせではエコールの産生が認められたが、他の菌株ではエコールの産生は観察されなかった。ＬｃＳとＮＡＴＴＳ株を組み合わせた場合のみ、他の乳酸菌と比較してダイゼイン濃度が低く、エコール濃度が顕著に高かった。（図２）。また、未接種の培地をβ−グルコシダーゼ（酵素処理）で処理するとダイゼインが生成し、これらは配糖体として培地中に存在していることが確認された。このことから、ＬｃｓとＮＡＴＴＳ株を組み合わせた場合、培地中に存在しているダイゼインがエコールへと効率よく変換されたことが分かった。【００３５】
実施例２  ＮＡＴＴＳ株とＬｃＳの共培養におけるＮＡＴＴＳ株の菌数及び生成物の経時変化
（１）培養方法
ＮＡＴＴＳ株を１．０％、ＬｃＳを０．１％となるように豆乳培地に接種し、実施例１（３）と同様の方法で培養を行った（ｎ＝３）。培養開始０、２４、４８、７２時間後に培養液の一部をサンプリングした。【００３６】
（２）培養液中のＮＡＴＴＳ株の菌数、イソフラボンアグリコン及びその代謝物の濃度を、実施例１（４）及び（５）と同様の方法で測定した。【００３７】
（３）結果
１）ＮＡＴＴＳ株単独培養では培養２４時間で菌数の僅かな増加が認められたが、それ以降では経時的に減少した。一方、ＬｃＳとの共培養では、ＮＡＴＴＳ株の菌数は培養２４時間で最大となり、以降７２時間までほぼ一定数を維持した（図３）。【００３８】
２）ＮＡＴＴＳ株単独では、ダイゼイン濃度に変化はなく、ダイゼインの代謝物であるＤＨＤ及びエコールも検出されなかった（図４−Ａ）。一方、ＬｃＳ単独培養では、培養２４時間でダイゼインの生成が認められ、培養７２時間までほぼ定常状態を維持した（図４−Ｂ）。ＮＡＴＴＳ株とＬｃＳとの共培養では、培養２４時間でエコールの産生が認められ、４８時間で定常状態に達した（図４−Ｃ）。また、ダイゼイン濃度が常に低く推移した一方で、培養２４時間でＤＨＤの生成が認められたことから、ＤＨＤを経由してエコールへと変換されたことが推測される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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