(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
過剰量のビオチン含有培地において、ビオチン作用抑制物質の存在下でＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物を炭素源及び窒素源を含む液体培地に接種し、増殖が維持し続ける濃度のビオチン作用抑制物質を添加し、炭素源及び菌体増殖促進効果を持つ栄養素の両方を流加しつつ培養液の引き抜きを行うことにより菌体増殖を伴うＬ−グルタミン酸の連続培養を行い、培養終了後に培養液中に生成蓄積したＬ−グルタミン酸を採取することを特徴とする連続発酵によるＬ−グルタミン酸の製造法。
【請求項２】
過剰量のビオチン含有培地中において、ビオチン作用抑制物質の非存在下でL−グルタミン酸生産能を有する微生物を炭素源及び窒素源を含む液体培地に接種し、炭素源及び菌体増殖促進効果を持つ栄養素の両方を流加しつつ培養液の引き抜きを行うことにより菌体増殖を伴うＬ−グルタミン酸の連続培養を行い、培養終了後に培養液中に生成蓄積したL−グルタミン酸を採取することを特徴とする連続発酵によるL−グルタミン酸の製造法。
【請求項３】
ビオチン作用抑制物質が脂肪酸もしくはそのエステルまたはペニシリンもしくはその誘導体である、請求項１または２に記載のL−グルタミン酸の製造法。
【請求項４】
連続培養における培地中の炭素源濃度を５ｇ/ｌ以下に保持する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のL−グルタミン酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
Ｌ−グルタミン酸は調味料などの食品素材や各種化成品の原料として広く利用されている。本発明は連続発酵法によりＬ−グルタミン酸を効率よく製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、Ｌ−グルタミン酸の需要の増大により工業的に有利な製造法の開発が望まれており、下記の様な製造方法が発明されている。
【０００３】
（１）バッチ（Ｂａｔｃｈ）培養法、流加培養法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養法）
これらの培養法は、連続培養法と比較して設備的には簡素であり、短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないというメリットがある。しかし、時間経過とともに培養液中のＬ−グルタミン酸濃度が高くなり、浸透圧あるいは生成物阻害等の影響により生産性及び収率が低下してくる。このため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持するのが困難である。
【０００４】
（２）連続培養法
連続培養法は、発酵槽内で目的物質が高濃度に蓄積するのを回避することによって、長時間にわたって高収率かつ高生産性を維持できるという特徴がある。
連続培養法の中で最も単純で一般的な形式は単槽連続培養法であり、アミノ酸発酵においてもＬ−リジン発酵、Ｌ−アルギニン発酵など多くの報告がなされている（Ｌｙｓ：Toshihiko Hirao et. al.  Appl. Microbiol. Biotechnol., 32, 269-273 (1989)、Ａｒｇ：Tomoki Azuma et. al.  J. Ferment. Technol., 66 (3), 285-290(1988)）。これらＬ−リジンやＬ−アルギニンの発酵では、通常、菌体増殖と目的アミノ酸の生成が同時に起こるため、単槽連続培養法の適用は容易であった。
【０００５】
一方、Ｌ−グルタミン酸発酵は実用レベルの単槽連続培養法は困難とされてきた。すなわち、従来、Ｌ−グルタミン酸発酵は菌体生長因子であるビオチンの除去、ペニシリン等の抗生物質添加、界面活性剤の添加、温度変換等なんらかの方法で菌体増殖を停止させなければ、Ｌ−グルタミン酸は多量に生成しないとされていた（▲１▼発酵工学会誌, Vol.41, No.12, 645-651(1963)、▲２▼近代工業化学, Vol.23, 121-142, 朝倉書店）。Ｂａｔｃｈ培養法やＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養法でＬ−グルタミン酸を多量に生成させるためには、菌体増殖を停止させる培養条件にするのである。従って、Ｌ−グルタミン酸発酵を連続培養で製造する場合、従来の菌体増殖を停止させる培養条件では菌体が流出するのみで、菌体を発酵槽内に維持できないから不適と考えられてきた。そのため、Ｌ−グルタミン酸発酵における連続培養法の研究は、当初、上田氏ら（発酵工学会誌, Vol.41, No.9, 450-458, 1963）や三村氏ら（発酵工学会誌, Vol.42, No.2, 70-78, 1964）のように、第１槽で菌体の増殖を行わせ、第２槽以降で菌体の増殖を抑制しＬ−グルタミン酸の生成を行わせる多槽連続培養法の研究が行われた。
【０００６】
その後、菌体増殖工程とＬ−グルタミン酸生成工程を別々に行うと言う発想に基づく培養方法として、セルリサイクル培養法と固定化菌体培養法の二法が開発されてきた。
【０００７】
まず、セルリサイクル培養法は、菌体の増殖が停止しているＬ−グルタミン酸が生成した培養液を引き抜いた後、菌体とＬ−グルタミン酸を分離して菌体だけをリサイクルする方法であり（特開昭５２−１３６９８５、特開昭６０−１３３８９１または特開昭６２−４８３９４）、高収率及び高生産性を比較的長時間維持できる。しかし、この方法は菌体分離装置が必要となるため培養装置が複雑になるという欠点があった。更に、セルリサイクル培養法は、菌体増殖を停止した菌体をリサイクルするため、時間経過とともに菌体そのもののＬ−グルタミン酸生産能が低下してしまうことから、培養時間には限りがあった。
【０００８】
一方、固定化菌体培養法もＬ−グルタミン酸を高収率及び高生産性で得ることが可能である(H.S.KIM et al.  Biotechnology and Bioengineering, Vol.26, 2167-2174(1982))が、菌体を固定化する方法を実用化するためには固定化担体が高価であることと合わせ、担体交換の技術など解決すべき課題が多く、工業化には必ずしも適さない。
【０００９】
このように、Ｂａｔｃｈ培養法やＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養法でＬ−グルタミン酸を高収率で生成する培養条件では、菌体の増殖を完全に停止させるため、培養後半における発酵菌のＬ−グルタミン酸生産能力が低下し、生産性の向上が困難であった。また、従来の連続培養法は、菌体を発酵槽に追加添加するか若しくはリサイクルするための装置が必要となることで、装置全体が複雑になること及び雑菌汚染の可能性が増加すること、更には菌体増殖が停止する条件で培養するため高生産性の持続が困難であること等、工業化を達成するためには課題が多い。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
Ｌ−グルタミン酸の需要拡大に応え、より安価に製造するためには、従来以上にＬ−グルタミン酸発酵の生産性を高める必要があった。そこで、本発明が解決しようとする課題は、菌体増殖とＬ−グルタミン酸生成を同時に発酵槽内で行い、かつ簡便な装置でＬ−グルタミン酸の高生産性連続培養法を発明することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、従来の発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法を改良すべく鋭意検討した結果、ブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属に属し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物を、炭素源及び窒素源を含む液体培地に接種し、炭素源及び菌体増殖促進効果を持つ栄養素の両方を流加しつつ培養を続けることにより、菌体増殖を止めることなく、温度、界面活性剤、抗生物質、ビオチンの濃度等により菌体増殖を制御・維持しながら同時にＬ−グルタミン酸を連続培養で生成させ、高い生産性と収率を得られることを発見した。つまり、従来考えられてきたような菌体増殖を停止する培養条件でＬ−グルタミン酸生成を行うのではなく、生成活性の高いフレッシュな菌体を増殖させつつＬ−グルタミン酸生成が効率よく行われることを見い出したこと、及びフレッシュな菌体の増殖があるために、培養液の引き抜きを行っても、培養槽内の菌体量が維持され、連続培養が長時間に渡って、高生産性を維持するという知見に基づき本発明を完成させるに至った。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に使用する菌株は、Ｌ−グルタミン酸生成能を有するものであれば、特に制限されるものではなく、Ｌ−グルタミン酸発酵に使用されている通常の発酵菌を使用することができる。例えば、下記のような菌株が挙げられる。
【００１３】
0003812019.tif 000002
【００１４】
一般に、Ｌ−グルタミン酸生産菌の中には、過剰量のビオチン含有培地中において、ビオチン作用抑制物質の存在下でＬ−グルタミン酸を生産する菌株とビオチン作用抑制物質が非存在下でＬ−グルタミン酸を生産する菌株が存在することは良く知られているところである。これらのうち、ビオチン作用抑制物質が非存在下でＬ−グルタミン酸を生産する微生物は本発明において好ましい微生物である。具体的には、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物が、ビオチン濃度１０μｇ／ｌ以上、例えば１０−１０００μｇ／ｌの液体栄養培地中でビオチン作用抑制物質を添加せずに培養せしめた場合、Ｌ−グルタミン酸を生成蓄積できる性質を有する微生物が本発明において好ましい微生物として上げられる。
【００１５】
更には、ＦＥＲＭ ＢＰ−４１７２（ＡＪ１２８２１），ＦＥＲＭ ＢＰ−４１７３（ＡＪ１２８２２）、ＦＥＲＭ ＢＰ−４１７４（ＡＪ１２８２３）のように、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株をビオチン濃度が１０μｇ／ｌ以上、例えば１０−１０００μｇ／ｌの液体栄養培地中でビオチン作用抑制物質を添加せずに培養を行った場合にＬ−グルタミン酸を生成蓄積できる性質を有する菌株（特開平６−２３７７７９公報）を用いれば、界面活性剤や抗生物質等のビオチン作用抑制物質の添加を必要としないことから長時間にわたり培養管理が簡単であり、また、コスト面で安価にＬ−グルタミン酸が製造できる。さらには、ＦＥＲＭ ＢＰ−５１８９（ＡＪ１３０２９）のような、ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性変異を有し、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産する能力を有する変異株（ＷＯ９６／０６１８０国際公開パンフレットに記載の微生物）についても、同様なことが言える。
【００１６】
本発明で使用する培地としては炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が良い。炭素源としては、グルコ−ス、シュ−クロ−ス、フラクト−ス、ガラクト−ス、ラクト−ス等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、エタノ−ルなどのアルコ−ル類、グリセリンなども使用される。窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、コ−ンスティ−プリカ−、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を適宜添加することができる。
【００１７】
本発明に使用する微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合にはその栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加する。また、消泡剤も必要に応じて使用する。
【００１８】
本発明では、培地中の炭素源濃度は５ｇ／ｌ以下に保持される様にするのが好ましい。その理由は、培養液の引き抜きによる糖分の流失を最小限にするためである。
【００１９】
微生物の培養は通常ｐＨ５−８、温度２５−４０℃の範囲で好気的条件で行われる。培養液のｐＨは無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。
【００２０】
一方、ビオチン作用抑制物質の存在下でＬ−グルタミン酸を有利に製造する菌株の場合は、適度な温度（２５−４０℃）、適度な界面活性剤濃度（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテ−ト；１００−５０００mg/l）、適度な抗生物質濃度（ペニシリン；０．１−５０U/ml）、適度なビオチン濃度（５−５０００μg/l）で菌体増殖をある程度制御・維持しながら連続培養を行うと、菌体増殖と同時に高収率、高生産性でＬ−グルタミン酸を生産する。
【００２１】
例えば、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９の場合、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテートで制御・維持するのであればその濃度は１００−１０００mg/lが好ましい。
【００２２】
Ｌ−グルタミン酸を効率よく産生させるために、必要により培地中にビオチンまたはその誘導体を適宜添加することができる。それに加えて、脂肪酸若しくはそのエステル、またはペニシリン若しくはその誘導体を添加することも有効である。ビオチンまたはその誘導体の添加は発酵菌のＬ−グルタミン酸生産能を長時間にわたって維持させるために有効である。添加量は培養液中の濃度が５−５０００μg/l程度になるようにするのがよい。  一方、脂肪酸は炭素数１２−１８の飽和高級脂肪酸が良く、そのエステルはグリセロ−ルエステル、ソルビタンエステル、シュクロ−スエステル、ポリエチレングリコ−ルエステル、ポリオキシエチレンソルビタンエステルなどから選ばれる。脂肪酸またはそのエステル及びペニシリンまたはその誘導体を添加する場合、その培養液中の濃度は通常濃度以下、つまり増殖を停止することなく増殖が維持し続ける濃度まで添加できる。例えば、脂肪酸またはそのエステルを添加する場合はその濃度は１００−１０００mg/l程度が適当であり、ペニシリンまたはその誘導体を添加する場合は、反応液中の濃度として０．２−１０U/ml程度が適当である。
【００２３】
さて、本発明の培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行ってＬグルタミン酸濃度及び菌体濃度を高くした後に連続培養（引き抜き）を開始しても良いし、高濃度の菌体をシ−ドし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。
【００２４】
適当な時期から流加液の供給及び引き抜きを行う。流加液供給と引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、流加液の供給と引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。流加液には上記に示したような菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。
【００２５】
生産性は、次の式で計算する。
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【００２６】
本発明の方法によれば、Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養法（培養時間４０時間）と比較して、Ｌ−グルタミン酸の生産性は２倍程度向上する。
【００２７】
また、本培養法のＬ−グルタミン酸生成活性は、セルリサイクル法と比較して、明らかに長時間維持できるという長所がある。これは、本連続培養法とセルリサイクル法におけるＬ−グルタミン酸の生成活性経時変化結果（図１）から明らかである。図１の培養条件は、特開昭６２ー４８３９４に掲載されている方法で行った。ただし、本連続培養法については、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテートを５００ｍｇ／ｌ濃度添加した後、グルコース、ＫＨ2ＰＯ4、ＭｇＳＯ4、大豆蛋白酸加水分解物及びポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテートを含む基質溶液の連続的な供給および反応培養液の引き抜きを行った。こうして、本発明の方法は、セルリサイクル連続培養よりも安定的にＬ−グルタミン酸の高生産性を維持できるのである。
【００２８】
本発明の方法に使用される発酵装置の代表的な一例を図２に示す。生成活性のあるフレッシュな菌体を増殖しつつ、Ｌ−グルタミン酸を生成する連続培養操作は、通常、単一の発酵槽で行うのが、培養管理上好ましい。しかしながら、菌体を増殖しつつ、Ｌ−グルタミン酸を生成する連続培養法であれば、発酵槽の数は問わない。発酵槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵槽を用いることもあり得る。この場合、複数の発酵槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても、各発酵槽の培養条件を菌体増殖を行いつつＬ−グルタミン酸を生成する条件でさえあれば、Ｌ−グルタミン酸の高生産性は得られるのである。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例により、本発明を詳細に説明する。
【００３０】
【実施例１】
グルコ−ス ３０g/l、ＫＨ2ＰＯ4 １g/l、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.4g/l、尿素 ４g/l、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０mg/l、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ２０mg/l、大豆蛋白酸加水分解物 １５ml/l、ビオチン ３００μg/lを含む培地３０mlを５００ml容振とうフラスコに入れ、１１５℃、１０分加熱殺菌した。これを室温まで冷やし、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９を接種して２４時間３０℃にて種培養した。
【００３１】
グルコ−ス ６０g/l、ＫＨ2ＰＯ4 １g/dl、ＭｇＳＯ4 １g/l、大豆蛋白酸加水分解物 １５ml/l、ビオチン ３００μg/lを含む基質溶液２７０mlを予め滅菌した１l容小型ガラス反応槽に入れ、これに前述の種培養液３０mlを加え、３０℃に保温した。除菌酸素を毎分３００ml通気し、ｐＨをNH3ガスにて７．５に保ちつつ攪拌培養を行った。
【００３２】
培養開始後５時間目にポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテートを５００mg/lの濃度になるように添加した。反応槽へは毎時３０mlずつ、グルコ−ス １８０g/l、ＫＨ2ＰＯ4 １g/dl、ＭｇＳＯ4 １g/dl、大豆蛋白酸加水分解物 １５ml/l、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート ５００mg/lを含む基質溶液を連続的に供給し、同量の反応培養液を引き抜き、反応槽内の液量を一定に保った。
【００３３】
引き抜いた培養液の糖濃度は、いずれも５ｇ／ｌ以下であった。
【００３４】
図３は比増殖速度の経時変化を示したものである。ここで、比増殖速度とは、微小時間ｄｔ内に増殖する菌体濃度ｄＸは、その時点に存在する菌体濃度Ｘに正比例すると考えた時の比例定数を示し、単位は１／ｈである。また、比増殖速度相対値とは、対数増殖初期の比増殖速度を１としたときの相対値を意味する。Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養法とは異なり、本連続培養法は菌体増殖が培養を通じて連続的に行われていることがわかる。
【００３５】
本培養を４０時間続けることにより、Ｌ−グルタミン酸は収率は５６％、生産性は５ｇ／ｌ／ｈｒの成績が得られた。
【００３６】
一方、比較のため、Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養法により検討した。
すなわち、グルコ−ス ６０g/l、ＫＨ2ＰＯ4 １g/dl、ＭｇＳＯ4 １g/l、大豆蛋白酸加水分解物 １５ml/l、ビオチン ３００μg/lを含む基質溶液270mlを予め滅菌した１l容小型ガラス反応槽に入れ、これに上述の種培養液３０mlを入れ、同様の条件にて攪拌培養した。
【００３７】
培養開始後５時間目にポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテートを２０００mg/lの濃度になるように多量に添加した。反応槽へは毎時６mlずつ、グルコ−ス ４００g/l、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート ２０００mg/lを含む基質溶液を連続的に供給した。しかし、同量の反応培養液の引き抜きは行わず、反応槽内の液量を増加せしめた。菌体増殖は図３に見られるように、培養２０時間を立たずに停止している。こうして、４０時間まで反応を続け、Ｌ−グルタミン酸は収率５６％、生産性２．６ｇ／ｌ／ｈｒの成績を得た。
【００３８】
本連続培養法は，Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養法と比較して、単位時間当たり２倍のＬ−グルタミン酸が生成され、生産性が著しく向上した。
【００３９】
【実施例２】
グルコ−ス ３０g/l、ＫＨ2ＰＯ4 １g/l、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.4g/l、尿素 ４g/l、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０mg/l、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ２０mg/l、大豆蛋白酸加水分解物 １５ml/l、ビオチン ３００μg/lを含む培地３０mlを５００ml容振とうフラスコに入れ、１１５℃、１０分加熱殺菌した。これを室温まで冷やし、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＦＥＲＭ ＢＰ−４１７２（ＡＪ１２８２１）を接種して２４時間３０℃にて種培養した。
【００４０】
グルコ−ス ６０g/l、ＫＨ2ＰＯ4  １g/l、ＭｇＳＯ4 １g/l、大豆蛋白酸加水分解物 １５ml/l、ビオチン ３００μg/lを含む基質溶液２７０mlを予め滅菌した１l容小型ガラス反応槽に入れ、これに上述の種培養液を入れ、３０℃に保温した。除菌酸素を毎分３００ml通気し、ｐＨをNH3ガスにて７．５に保ちつつ攪拌培養を行った。反応槽へは毎時２５mlずつ、グルコ−ス ３００g/l、ＫＨ2ＰＯ4 １g/dl、ＭｇＳＯ4 １g/dl、大豆蛋白酸加水分解物 １５ml/lを含む基質溶液を連続的に供給し、同量の反応培養液を引き抜き、反応槽内の液量を一定に保った。
【００４１】
引き抜いた培養液の糖濃度は、いずれも５ｇ／ｌ以下であった。
【００４２】
図４は比増殖速度の経時変化を示したものである。菌体増殖が培養を通じて連続的に行われていることがわかる。
【００４３】
本培養を４０時間続けることにより、Ｌ−グルタミン酸は収率５６％、生産性６．６ｇ／ｌ／ｈｒの成績を得た。
【００４４】
一方、比較のため、Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養法により検討した。
すなわち、グルコ−ス ６０g/l、ＫＨ2ＰＯ4 １g/l、ＭｇＳＯ4 １g/l、大豆蛋白酸加水分解物 １５ml/l、ビオチン３００μg/lを含む基質溶液２７０mlを予め滅菌した１l容小型ガラス反応槽に入れ、これに上述の種培養液を３０mlを入れ、同様の条件にて攪拌培養した。反応槽へは毎時７mlずつ、グルコ−ス ５００g/lの基質溶液を供給し、４０時間まで反応を続け、Ｌ−グルタミン酸は収率５４％、生産性３．２ｇ／ｌ／ｈｒの成績を得た。
【００４５】
本連続培養法は、Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養法に対して、単位時間当たり２倍のＬ−グルタミン酸を生成し、生産性が著しく向上した。
【００４６】
【実施例３】
グルコ−ス ３０g/l、ＫＨ2ＰＯ4 １g/l、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.4g/l、尿素 ４g/l、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０mg/l、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ２０mg/l、大豆蛋白酸加水分解物 １５ml/l、ビオチン ３００μg/lを含む培地３０mlを５００ml容振とうフラスコに入れ、１１５℃、１０分加熱殺菌した。これを室温まで冷やし、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＦＥＲＭ ＢＰ−４１７２（ＡＪ１２８２１）を接種して２４時間３０℃にて種培養した。
【００４７】
グルコ−ス ６０g/l、ＫＨ2ＰＯ4 １g/l、ＭｇＳＯ4 １g/l、大豆蛋白酸加水分解物 １５ml/l、ビオチン ３００μg/lを含む基質溶液２７０mlを予め滅菌した１l容小型ガラス反応槽に入れ、これに上述の種培養液を入れ、３０℃に保温した。除菌酸素を毎分３００ml通気し、ｐＨをNH3ガスにて７．５に保ちつつ攪拌培養を行った。反応槽へは毎時４０mlずつ、グルコ−ス １８０g/l、ＫＨ2ＰＯ4 １g/dl、ＭｇＳＯ4 １g/dl、大豆蛋白酸加水分解物 １５ml/lを含む基質溶液を連続的に供給し、同量の反応培養液を引き抜き、反応槽内の液量を一定に保った。
【００４８】
引き抜いた培養液の糖濃度は、いずれも５ｇ／ｌ以下であった。
【００４９】
本培養を１００時間続けることにより、Ｌ−グルタミン酸は収率５５％、生産性８．３ｇ／ｌ／ｈｒの成績を得た。
【００５０】
図５はＬ−グルタミン酸生成活性の経時変化を示したものである。長時間を通じて活性が持続していることがわかる。
【００５１】
【発明の効果】
本発明の方法により、Ｌ−グルタミン酸を高い生産速度で連続生産することができる。また、連続生産方式の採用により長時間培養が可能となり、労力負担を低下させることができる。更に、セルリサイクル連続培養法や多段連続培養法等に較べ装置がシンプルであるため、固定費の削減、雑菌汚染に対しても有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本培養法とセルリサイクル法のＬ−グルタミン酸生成活性の経時変化
【図２】本発明の方法に使用する発酵装置の一例（単槽）
【図３】実施例１の連続発酵法及び比較のＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養法で得られた、比増殖速度の経時変化
【図４】実施例２の連続発酵法及び比較のＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養法で得られた、比増殖速度の経時変化
【図５】実施例３の連続発酵法で得られたＬ−グルタミン酸生成活性の経時変化
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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