(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式で表されるトリペプチドからなるアンジオテンシン変換酵素阻害物質。
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ
【請求項２】
前記アンジオテンシン変換酵素阻害物質が、マグロ魚肉組織を精製することにより得られる請求項１記載のアンジオテンシン変換酵素阻害物質。
【請求項３】
前記マグロ魚肉組織が、加工残滓である請求項２記載のアンジオテンシン変換酵素阻害物質。
【請求項４】
前記マグロ魚肉組織の精製が、タンパク分解酵素により、当該マグロ魚肉組織におけるタンパク鎖中のぺプチド結合を切断する段階を含むものである請求項２または３記載のアンジオテンシン変換酵素阻害物質。
【請求項５】
前記タンパク分解酵素が、エンド型の酵素およびエキソ型の酵素あるいはいずれか一方である請求項４記載のアンジオテンシン変換酵素阻害物質。
【請求項６】
以下の工程（Ａ）〜（Ｅ）を含む、請求項１記載のアンジオテンシン変換酵素阻害物質の製造方法。
（Ａ）マグロ魚肉組織を回収し、均一化処理を施す工程。
（Ｂ）均一化処理が施されたマグロ魚肉組織に、タンパク分解酵素を加えて、４０〜７０℃の範囲内の温度で以て当該マグロ魚肉組織を分解処理する工程。
（Ｃ）分解処理後、大分子画分を除去するとともに、短鎖ペプチドを回収する工程。
（Ｄ）短鎖ペプチドを脱塩し、塩基性ペプチド粗製物を得る工程。
（Ｅ）塩基性ペプチド粗製物を分離処理してアンジオテンシン変換酵素阻害物質を回収する工程。
【請求項７】
前記マグロ魚肉組織が、加工残滓である請求項６記載のアンジオテンシン変換酵素阻害物質の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害物質を有効成分とする血圧降下剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥと称する場合もある。）の阻害物質およびその製造方法並びに当該アンジオテンシン変換酵素阻害物質を用いた血圧降下剤に関する。さらに詳しくは、血圧上昇作用を示すアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の活性を阻害し、健康食品や医薬品として有用なアンジオテンシン変換酵素阻害物質およびその製造方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、人体の血圧上昇に関する原因の一つとして、アンジオテンシン変換酵素がアンジオテンシンＩをアンジオテンシンIIに変換させるメカニズムが知られている。このアンジオテンシンII は血圧を上昇せしめ、人体に対し数々の悪影 響を及ぼすことが知られており、したがって、このアンジオテンシン変換酵素の働きを阻害することで、血圧の上昇を抑制できるとして、従来より阻害活性物質に関する様々な研究が行なわれてきた。
【０００３】
そこで、蛇毒ペプチドやその類緑体あるいは合成ペプチドが、アンジオテンシン変換酵素阻害物質として知られている。しかしながら、蛇毒ペプチドやその類緑体は阻害活性効果が低く、また値段が高いという問題があった。一方、合成ペプチドは人体への影響等の点で問題があった。
【０００４】
そこで、蛇毒ペプチド以外の天然物を対象とした有効成分の検索も行われており、それらの幾つかは既に報告されるに至っている。
例えば、特開平６−４１１９１号公報や特開昭６０−２３０８６号公報等には、アンジオテンシン変換酵素阻害物質として、牛乳や牛等のカゼイン由来のペプチドが開示されており、特開平４−２８２４００号公報には、アンジオテンシン変換酵素阻害物質として、乳清タンパク質由来のペプチドが開示されている。
また、特開平５−１１２４６５号公報や特公平７−１１６２３３号公報には、アンジオテンシン変換酵素阻害物質として、カツオやイワシ由来のペプチドが開示されており、特公平７−１１９２３４号公報には、アンジオテンシン変換酵素阻害物質として、オキアミ由来のペプチドが開示されており、特公平７−７８０７６号公報には、アンジオテンシン変換酵素阻害物質として、マグロやサバ由来のペプチドが開示されている。
【０００５】
しかしながら、これまでに用いられてきた天然のアンジオテンシン変換酵素阻害活性物質の抽出原料は、回収効率が低く、高価であるという問題があった。また、従来の抽出原料から得られるアンジオテンシン変換酵素阻害活性物質の阻害活性は、不十分なものが多かった。
さらに、従来のアンジオテンシン変換酵素阻害活性物質は、農業・水産業の分野において一次的に採取・収穫された状態のものを対象としており、資源の有効な活用という面からも、食品などの二次的な製造過程で発生する加工残滓中等から、生理活性物質を得ることが望まれていた。特に、今後の我が国に予想される高齢者社会に対応し、有用な生理活性物質を医薬品のみならず、様々な食品へ素材として利用するためにも、安価に供給できる原料・製造方法の開発が望まれるが、この様な観点からの開発研究は、未だ実用の域に達していないのが現状である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上述の問題に鑑みなされたものであり、缶詰の加工残滓として処理されるマグロ魚肉等の、延いては天然資源の有効活用に資するとともに、健康食品の素材や医薬品の原料として有用な活性作用に優れたアンジオテンシン変換酵素阻害物質、その製造方法および当該アンジオテンシン変換酵素阻害物質を用いた血圧降下剤を安価に提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明者は、主にキハダマグロやビンナガマグロを原料としたツナ缶詰の製造工程で、残滓として発生する血合い肉や普通筋肉等を原料として、これに含まれるアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有する成分の検索と特定とを行ない、新規なぺプチドを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明によれば、アンジオテンシン変換酵素阻害物質であって、下記式で表されるトリペプチドからなることを特徴とする。
【０００９】
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ
【００１０】
また、本発明のアンジオテンシン変換酵素阻害物質を構成するにあたり、マグロ魚肉組織を精製することにより得られるものであることが好ましい。
【００１１】
また、本発明のアンジオテンシン変換酵素阻害物質を構成するにあたり、マグロ魚肉組織が、加工残滓であることが好ましい。
【００１２】
また、本発明のアンジオテンシン変換酵素阻害物質を構成するにあたり、マグロ魚肉組織の精製が、タンパク分解酵素により、マグロ魚肉組織のタンパク鎖中のぺプチド結合を切断する段階を含むものであることが好ましい。
【００１３】
また、本発明のアンジオテンシン変換酵素阻害物質を構成するにあたり、タンパク分解酵素が、エンド型の酵素およびエキソ型の酵素あるいはいずれか一方であることが好ましい。
【００１４】
また、本発明の別の態様は、下記式で表されるトリペプチドからなるアンジオテンシン変換酵素阻害物質の製造方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｅ）を含むことを特徴とする。
【００１５】
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ
【００１６】
（Ａ）マグロ魚肉組織を回収し、均一化処理を施す工程。
（Ｂ）均一化処理が施されたマグロ魚肉組織に、タンパク分解酵素を加えて、４０〜７０℃の範囲内の温度で以て当該マグロ魚肉組織を分解処理する工程。
（Ｃ）分解処理後、大分子画分を除去するとともに、短鎖ペプチドを回収する工程。
（Ｄ）短鎖ペプチドを脱塩し、塩基性ペプチド粗製物を得る工程。
（Ｅ）塩基性ペプチド粗製物を分離処理してアンジオテンシン変換酵素阻害物質を回収する工程。
【００１７】
また、本発明のアンジオテンシン変換酵素阻害物質の製造方法を実施するにあたり、使用するマグロ魚肉組織が、加工残滓であることが好ましい。
【００１８】
また、本発明の別の態様は、血圧降下剤であって、上述したアンジオテンシン変換酵素阻害物質を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態を具体的に説明する。
本発明のアンジオテンシン変換酵素阻害物質は、下記構造式（１）、（２）および（３）でそれぞれ示されるテトラペプチド、トリペプチドおよびジペプチドからなる群から選ばれる少なくとも一つのペプチドを含有する。
なお、ペプチド（１）〜（３）は、それぞれ単一種であっても複数種の組み合わせであってもよい。また、これらのペプチド（１）〜（３）は主成分として使用すれば良く、他の添加剤を併用することができる。
【００２０】
Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ      ・・・（１）
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ              ・・・（２）
Ｉｌｅ−Ｐｈｅ                      ・・・（３）
【００２１】
本発明のアンジオテンシン変換酵素阻害物質は、たとえば、ツナ缶詰加工時等に残滓として発生する残滓マグロ魚肉（加工残滓と称する。）を原料として、これを加工する事によって製造することができる。すなわち、残滓マグロ魚肉をタンパク分解酵素で処理し、水溶化させた後、これを精製することによって得ることが出来る。
【００２２】
ここで用いられる好ましいタンパク分解酵素は、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼなど、タンパク鎖中のペプチド結合を適時切断するものである。また、より好ましくは、サモアーゼ、プロチンなどのエンド型、またはフレーバーザイムのようなエキソ型など市販の酵素を単独、または組み合わせて使用する事で、抽出の効率と必要コストを調整することができる。
【００２３】
本発明を構成する各ぺプチドの精製方法としては、たとえば、限外瀘過膜処理、ゲル瀘過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆層クロマトグラフィーなどを挙げることができる。したがって、これらを単独、または任意に組み合わせて精製方法に用いることができる。
【００２４】
ツナ缶詰製造の原料として利用される魚種にはキハダマグロ，ビンナガマグロ等があり、いずれも使用することができる。但し、以下の例では、便宜上、最も一般的なキハダマグロの加工残滓である血合い肉を原料として用い、当該血合い肉から新規ぺプチドを抽出及び精製して、本発明におけるアンジオテンシン変換酵素阻害物質の製造方法の一例（Ａ〜Ｅ）を説明する。
（Ａ）マグロ魚肉組織の回収および均一化処理工程
まず、例えば缶詰製造工程で加熱変性処理後、不要部分として除去、廃棄されるキハダマグロの血合い肉を回収する。これに重量で以て約２〜５倍程度の水を加え、血合い肉（肉片）を微小サイズにホモジナイズ処理し、さらに、ｐＨを５〜１０の範囲内の値に調整する。
（Ｂ）マグロ魚肉組織の分解処理工程
均一化処理が施されたマグロ魚肉組織に、タンパク分解酵素を添加し、酵素の特性によっても若干異なるが、４０〜７０℃程度の範囲内の温度にて、所定時間、攪拌しながら反応処理させる。
【００２５】
（Ｃ）短鎖ペプチドの回収工程
次いで、遠心分離にて上澄液のみを回収し、続いて分画分子量１，０００〜６，０００程度の限外瀘過膜にて瀘過し、酵素にて十分に低分子化されなかった大分子画分を除去する。そして、腸管吸収に有利と言われているアミノ酸２〜５残基程度の短鎖ぺプチドを低分子画分の溶液として選択的に回収する。
（Ｄ）短鎖ペプチドの脱塩工程
次いで、低分子画分の溶液に対して、Ｈ+ 型に再生処理した強酸性陽イオン交換樹脂を充填したカラムを用いて脱塩処理を施す。そして、アンモニア水溶液に溶解する塩基性画分のみに精製し、塩基性ぺプチド粗製物を得る。
【００２６】
（Ｅ）塩基性ペプチド粗製物の分離処理工程
さらに、塩基性ぺプチド粗製物を、瀘材として、東ソー社製、商品名：Ｔｏｙｏｐｅａｌ  ＨＷ４０Ｆ樹脂を充填したカラムにてゲル瀘過処理し、次いで、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で分離することにより、アンジオテンシン変換酵素阻害物質を回収することができる。
【００２７】
なお、本発明を構成する各ペプチドは、構成成分となるアミノ酸を、通常のペプチド合成法に従って、結合させることによって得ることも可能である。
【００２８】
上述の方法によって得られた各ペプチドは、その如何によらず、いずれも優れたアンジオテンシン変換酵素阻害活性を示し、血圧降下剤として、また、血圧降下機能を有する天然素材として利用する事が出来る。
すなわち、塩基性ペプチド粗製物または精製した各ぺプチドを主成分とした物質を、ビスケットやスープなどの食品の加工材料として添加し、血圧上昇抑制作用を有する健康食品あるいは血圧降下剤そのものとして提供することができる。
【００２９】
また、当該塩基性ペプチド粗製物または精製した各ぺプチドを主成分とした物質を、薬事的に認められる担体（賦形剤、滑沢剤、結合剤、賦香剤、等）と共に、常法に従って経口投与用の錠剤、カプセル剤、トローチ剤、粉末、または細粒・顆粒剤、水溶液に溶解させた液剤などとし、血圧降下剤として経口投与するか、または、注射剤として静脈内投与するなどして活用することができる。
【００３０】
【実施例】
本発明を以下の実施例により、さらに具体的に説明するが、本発明はこれらの例により何ら限定されるものではない。
【００３１】
（実施例１）
（１）アンジオテンシン変換酵素阻害物質の作成
缶詰製造ではキハダマグロなどの生魚体を加熱変性処理し、これより不要部分を除去して、製品を製造しており、一般に、食品として利用されるのは元重量の３５〜４５％程度であり、さらに、５〜１０％程度のペットフードが作られる。したがって、これらの合計利用率は、元重量の５０〜５５％程度である。一方で、不要部分として除去される加熱変性後の魚肉は、元重量の１０〜２０％にも及び、この中には、血合い肉や精肉などの可食部分が、骨やウロコなどと共に少なからず含まれている。そこで、実施例１ではこれらの廃棄部分に含まれる魚肉、特にキハダ血合い肉を選別回収し、これを原料としてアンジオテンシン変換酵素阻害物質を作成した。
【００３２】
すなわち、回収した魚肉（キハダ血合い肉）１００ｇに対して、蒸留水５００ｇを加え、ポリトロンを用いて微小サイズにホモジナイズし、ｐＨ＝６．０に調整した。
その後、たんぱく分解酵素サモアーゼＰＣ−１０（大和化成社製）を魚肉１００重量部に対して、１／１００重量程度加え、温度５０〜６５℃で以て約２４時間攪拌しながら分解処理を施した。
かかる分解処理の終了後、温度１００℃、１０分間の条件で加熱を行ない、魚肉中に含まれている酵素を失活させた。その後、回転数９０００ｒｐｍ、２０分間の条件で以て遠心分離機を用いて上清を回収した。
【００３３】
次いで、０．４５μのメンブレンフィルタを用いて、回収した上清液から夾雑物を除去した。その後、分画分子量約４０００の限外瀘過膜ＳＡＰ−１０１３（旭化成工業社製）を用い、主に、分子量４０００以下の低分子を含んだ画分と、それ以上の分子量を含んだ画分とに分画した。
なお、ペプチドの吸収において、長鎖・大分子のペプチドは、消化作用によって分解されたり、体内での消化管表面からの吸収効率が低いと考えられるので、より効率的に作用すると考えられる低分子画分を用いた。
【００３４】
次いで、低分子画分に対して、Ｈ+ 型に置換した強酸性陽イオン交換樹脂ダイヤイオンＵＢＫ５３０（三菱化成社製）を用いて脱塩した。そして、アンモニア溶液に溶出した塩基性画分を減圧濃縮及びフリーズドライ処理して、乾燥粉末状態の塩基性ペプチド粗製物を実施例１におけるアンジオテンシン変換酵素阻害物質として得た。
【００３５】
なお、得られたアンジオテンシン変換酵素阻害物質（塩基性ペプチド粗製物）を、全自動タンパク質一次構造分析装置ＰＰＳＱ−１０（島津製作所社製）を使用して構造解析することにより、当該塩基性ペプチド粗製物中には、Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＰｈｅおよびＩｌｅ−Ｐｈｅのアミノ酸配列で表されるペプチドがそれぞれ含まれていることが確認されている。
【００３６】
（２）アンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性（ＩＣ50値）測定
得られた塩基性ペプチド粗製物につき、山本らの方法（日胸疾会誌１８（５），１９８０，ｐ２９７〜ｐ３０３）に基づいて、アンジオテンシン変換酵素の阻害活性（ＩＣ50値）を測定した。
【００３７】
すなわち、ウサギ肺由来のアンジオテンシン変換酵素（ＳＩＧＭＡ社製）３ｍＵに、ホウ酸ソーダ１／２０Ｍ溶液およびホウ酸１／５Ｍ溶液を９：１１の重量割合で混合して調製したホウ酸緩衝液を用意した。
次に、このホウ酸緩衝液に１．０Ｍ濃度で塩化ナトリウムを溶かして、食塩ホウ酸緩衝液を作成した。
それから、この食塩ホウ酸緩衝液に、１２．５ｍＭ濃度になるように基質Ｈｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（ペプチド研究所製）を溶解させ、基質溶液からなる溶液を作成した。
そして、さらにこの溶液に対して、所定の試料（塩基性ペプチド粗製物）を加えて混合液を作り、この混合液０．２５ｍｌを３７℃で６０分間の条件でインキュベートし、その後、０．５Ｎ塩酸０．２５ｍｌを加え酵素反応を停止させた。
【００３８】
次いで、これに酢酸エチル１．５ｍｌを加え、１５秒間強く攪拌した。生成された馬尿酸を酢酸エチルに溶解させ、当該酢酸エチル層を０．５ｍｌ分別回収した。この回収した酢酸エチル層から溶媒を加熱除去した後、１Ｍ濃度の食塩水３ｍｌを加え、吸光度を用いて、波長２２８ｎｍにおける吸光度を測定した（ＯＤ／ｓ）。
【００３９】
一方、インキュベート前にあらかじめ、０．５Ｎ塩酸を加え、酵素反応を阻害したものの吸光度をブランクとし（ＯＤ／ｂ）、試料（塩基性ペプチド粗製物）を添加しなかったものの吸光度をコントロールとして（ＯＤ／ｃ）、以下の式によってアンジオテンシン変換酵素の阻害阻害率（単に、阻害率と称する場合もある。）を算出した。
【００４０】
【数１】
0003787585.tif 000002
【００４１】
この式により得られた阻害率と、添加した試料（塩基性ペプチド粗製物）量より阻害率が５０％となる点を求めて、その値をＩＣ50値とした。なお、実施例１におけるＩＣ50値は、９５μｇ／ｍｌという優れたＩＣ50値を示した。結果を表１に示す。
【００４２】
（３）経口投与試験
得られた塩基性ペプチド粗製物を、高血圧症（ＳＨＲ）ラット（加齢とともに血圧が上昇するラット、株式会社星野試験動物飼育所より購入）の餌に配合して、当該ラットを飼育した。
具体的に、１週齢の１８匹のＳＨＲラットを下記に示すストック（Ｓｔｏｃｋ）の飼料により２週間予備飼育した後、当該ラットを６匹づつ第１群（対照食）と、第２群（塩基性ペプチド粗製物の２．５重量％添加食）と、第３群（塩基性ペプチド粗製物の５．０重量％添加食）に分けた。なお、１００ｇあたりの対照食、２．５重量％添加食および５．０重量％添加食の各飼料素材の混合量（ｇ）はそれぞれ以下に示す表１のとおりである。
【００４３】
【表１】
0003787585.tif 000003
【００４４】
次に、第１〜３群のＳＨＲラットに、表１に示す各飼料を８週間それぞれ与えた。なお、飼料とともに、飲料水は全期間を通じて自由摂取とした。また、室内照明を昼夜１２時間の周期で以て点灯および消灯を繰り返した。さらに、室温を２３℃±１℃の一定温度に保持した。
そして、実験期間中、ＳＨＲラットの体重および摂取量は毎日、血圧は週１回それぞれ測定した。血圧測定は、非観血法で以て行い、静脈圧測定装置（ＫＮ−２１０、夏目製作所製）を用い、予めＳＨＲラットを４０℃にした加温器を用いて３〜５分間加温した後、血圧を測定した。結果を表２及び図１に示す。
【００４５】
また、飼育期間終了後ＳＨＲラットを解剖し、臓器重量（肝臓、脾臓、心臓、腎臓）、血漿脂質（コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬＣ／高密度リボタンパク−コレステロール、リン脂質）および肝臓脂質（コレステロール、トリグリセリド、リン脂質）をそれぞれ常法を用いて測定した。結果を表３に示す。
【００４６】
さらに、血漿中のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害阻害率を、山本らの方法に準拠して測定した。すなわち、塩化ナトリウムーホウ酸緩衝液（ｐＨ＝８．３）に、基質のヒプリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシン（ペプチド研究所Ｎｏ．３０６４）を溶解させ、血漿を加えて３７℃で以て６０分間加温した。そして、ＡＣＥの作用で遊離した馬尿酸を酢酸エチルで抽出し、乾固した後、１ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム溶液に溶解させ、波長２２８ｎｍにおける吸光度を測定した。また、ＡＣＥ活性１Ｕは、この実験条件下で毎分１ｎｍｏｌの馬尿酸を生成する酵素量として表した。なお、当該試験に用いたサンプル（塩基性ペプチド粗製物）のＡＣＥ５０％阻害活性濃度、すなわちＩＣ50は、４０μｇ／ｍｌであった。
【００４７】
表２、３及び図１に示す結果から容易に理解されるように、実施例１の塩基性ペプチド粗製物を配合した実験群のＳＨＲラット（第２群および第３群）は、通常食の実験群のＳＨＲラット（第１群）と比較して、
▲１▼飼料の投与を開始して第３週（１０週齢）までは血圧上昇抑制に関して顕著な差は見られなかったが、第４週からは有意に血圧上昇が抑制されていることが確認された（ダンカン／Ｄｕｎｃａｎの多重範囲検定法により、危険率５％の有意差検定準拠、以下同様である）。
▲２▼但し、第２群と第３群との間に、血圧上昇の抑制に関して有意差は見られなかった。したがって、第２群の飼用量、すなわち、１００ｇあたり２．５重量％添加するだけで、第３週から、十分な血圧上昇抑制効果が得られることが確認された。
▲３▼ＳＨＲラットの体重変化および飼料摂取量ともに顕著な差は見られなかった。
▲４▼ＳＨＲラットの血漿中のコレステロール、トリグリセライド含量および肝臓中のコレステロール、リン脂質含量については、顕著な差は見られなかった。但し、肝臓中のトリグリセライド含量については、有意で以て低下する傾向が見られた。
▲５▼血漿ＡＣＥ活性については、有意に低い値が得られることが確認された。但し、第２群と第３群との間に、血漿ＡＣＥ活性について有意差は見られなかった。
【００４８】
【表２】
0003787585.tif 000004
【００４９】
【表３】
0003787585.tif 000005
【００５０】
（４）静脈注射試験
得られた塩基性ペプチド粗製物を、ＳＨＲラット（株式会社星野試験動物飼育所より購入）の静脈に注射して、当該ラットの血圧を測定した。
具体的に、９週齢の９匹のＳＨＲラットを上記ストック飼料により１週間予備飼育した後、当該ラットを３匹づつ第１群（生理食塩水を注射）と、第２群（塩基性ペプチド粗製物／生理食塩水を注射）と、第３群（血圧降下剤カプトプリルを注射）に分けた。そして、ＳＨＲラットの尾静脈に塩基性ペプチド粗製物／生理食塩水等を注射した。
【００５１】
なお、各注射量は、ＳＨＲラットの体重差を考慮して５０ｍｇ／ｋｇ体重とした。また、飼育中、飼料と飲料水は自由摂取とした。
そして、注射直前、注射後１、２、４および６時間経過後の血圧を非観血法で以て測定した。結果を図２に示す。
【００５２】
図２に示す結果から容易に理解できるように、実施例１の塩基性ペプチド粗製物をＳＨＲラットに直接投与することにより、当該ＳＨＲラットの血圧を低下させる効果があり、しかも長時間（６時間以上）にわたって効果が持続することが確認された。
【００５３】
また、実施例１の塩基性ペプチド粗製物は、注射後１時間から顕著な血圧降下傾向が見られたのに対し、カプトプリル（ＳＱ１４２２５、ＩＣ50＝１．０９ｎｇ／ｍｌ）の場合は、注射後２時間過ぎから血圧降下の傾向が見られた。したがって、実施例１の塩基性ペプチド粗製物は、血圧降下剤として一般的なカプトプリル（ＳＱ１４２２５）よりも、血圧降下作用として速効性を有することも確認された。
【００５４】
（実施例２〜４）
（１）アンジオテンシン変換酵素阻害物質の作成
実施例１と同様の方法で以て、他の魚肉の部位（キハダ精肉、ビンナガ血合い肉およびビンナガ精肉）について、それぞれ塩基性ペプチド粗製物をアンジオテンシン変換酵素阻害物質として得た。
【００５５】
（２）アンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性（ＩＣ50値）測定
実施例１と同様の方法で以て、得られた塩基性ペプチド粗製物の阻害活性をそれぞれ測定した。その結果、キハダ精肉についてＩＣ50値＝１６６μｇ／ｍｌ、ビンナガ血合い肉についてＩＣ50値＝２００μｇ／ｍｌ、およびビンナガ精肉についてＩＣ50値＝１５６μｇ／ｍｌという結果が得られた。それぞれの結果を表４に示す。
【００５６】
表４の結果から容易に理解されるように、他の原料魚・部位に比較し、キハダマグロの血合い肉より得られた塩基性ペプチド粗製物の阻害活性が最も高いことが確認された。
また、食品向けの加工用素材、または以降の精製を必要としない用途に対しては、この塩基性ペプチド粗製物であっても十分に血圧降下作用等の目的を達成するものである。さらに、未利用資源としてされていた残滓を活用し、用途拡大を図る上で重要な、コストの低減を考えた場合、この粗製物を利用することは、非常に有意義である。
【００５７】
その他、残滓物がキハダ血合い肉に限定されず、同じくツナ缶詰製造に利用されるビンナガマグロでも、阻害活性が認められ、同じく使用可能な原料であることが確認された。さらに、残滓発生時に血合い肉と共に廃棄される精肉にも活性が認められたことは、あえて、残滓を血合い肉のみに選別する必要がないということもできる。
【００５８】
【表４】
0003787585.tif 000006
【００５９】
（実施例５）
実施例５においては、実施例１で得られた塩基性ペプチド粗製物を精製することにより、阻害活性のより高いアンジオテンシン変換酵素阻害物質を提供することを目的とする。これは、薬理的理由などにより、ペプチドの粗製物は利用できない場合に適用されるものである。
【００６０】
（１）アンジオテンシン変換酵素阻害物質の作成
実施例１の方法をもって得られた塩基性ペプチド粗製物には、種々のペプチドが含まれ、必ずしも全ての成分が阻害活性を示す訳ではない。
そこで、塩基性ペプチド粗製物１００ｍｇを蒸留水１ｇに溶かして溶液を作成した。この溶液について、ＴｏｙｏｐｅａｌＨＷ４０Ｆ（東ソー社製）を充填したガラスカラム（φ１０×１２００ｍｍ）を用い、蒸留水を移動相としたゲル瀘過カラムクロマトグラフィー法により分画した。この時、フロー温度は１５℃、フローレート（流速）は１ｍｌ／ｍｉｎとした。溶出する移動相を５ｍｌづつのフラクションに分け取り、それぞれの波長２２０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００６１】
その結果、図３に示す溶出パターンを得た。これを、Ｆ１〜Ｆ４のグループに分け移動相に使用した蒸留水を蒸発除去して溶出物を得た。さらに、これらの溶出物のアンジオテンシン阻害活性を測定し、得られたＩＣ50値を表５に示す。
【００６２】
【表５】
0003787585.tif 000007
【００６３】
これより、Ｆ２画分が他にくらべて、高い阻害活性を示すことが確認された。そこで、再度、ゲル瀘過カラムクロマトグラフィー法によりＦ２画分を中心に細かく分画を行い、図４に示す様に、Ｎ１〜Ｎ３画分を得た。Ｎ１〜Ｎ３画分のＩＣ50値をそれぞれ表６に示す。
【００６４】
【表６】
0003787585.tif 000008
【００６５】
この結果、Ｎ１およびＮ２画分が他にくらべて、高い阻害活性を示すことが確認された。そこで、より回収量が多く、しかもＡＣＥ阻害活性が高いＮ１画分を対象にして、μＢＯＮＤＡＳＨＥＲ５μＣ１８−１００Ａ（φ１９×１５０ＩＤ）（ウォーターズ社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー分析装置で、１重量％ＴＦＡアセトニトリル／水混合溶液で溶出処理を行った。得られたクロマトグラフを図５に示す。さらに、Ｎ１画分を、ここで得られたクロマトグラフに従い、再度、同装置にて、Ｃ１〜Ｃ４画分に分画し、それぞれのＡＣＥ阻害活性を比較した。その結果を表７に示す。
【００６６】
【表７】
0003787585.tif 000009
【００６７】
以上の手順にて、Ｆ２画分付近のＮ１画分中のＣ４画分が、アンジオテンシン変換酵素阻害活性が特に高いことがわかった。そこで、Ｃ４画分の高速液体クロマトグラフィー分析装置によるクロマトグラフの各ピークを単独に回収し、それらの中から、本発明の構造を持つペプチドを得た。また、得られた各ピークの５０％阻害活性濃度であるＩＣ50値を表８に示す。
【００６８】
【表８】
0003787585.tif 000010
【００６９】
得られた、（１）〜（３）の各ペプチドを、全自動タンパク質一次構造分析装置ＰＰＳＱ−１０（島津製作所社製）を用いて構造解析したところ、以下のアミノ酸配列を有していることが確認された。
（１）Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ
（２）Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ
（３）Ｉｌｅ−Ｐｈｅ
【００７０】
また、ここで得られた各単離画分ＦＡＢ−マススペクトル分析装置にて、質量分析した結果、上述のデータともよく一致し、各ピークの成分として、これらが妥当であると判断された。
【００７１】
さらに、これらの活性を再確認するために、上式で表されるペプチドについて、固相合成法により、合成されたペプチド（国産化学社製）を用いて、５０％阻害活性濃度ＩＣ50を求めたところ、表８に示した結果と非常によく一致し、得られたペプチドがアンジオテンシン阻害活性（ＡＣＥ阻害活性）を持つことが実証された。
【００７２】
したがって、（１）〜（３）の各ペプチドが、強くアンジオテンシン変換酵素の阻害活性を阻害する成分であることがわかった。
【００７３】
（比較例１）
キハダマグロの普通肉２ｋｇをミンチし、これを８溶量倍の１Ｍ酢酸−２０ｍＭ塩酸水溶液中に懸濁させ、オートクレーブ中で１２０℃にて５分間加熱した。こん懸濁液を室温まで冷却後、遠心分離機を用いて１６００ｒｐｍ、３０分間の条件で以て遠心分離し、上清を採取した。この上清液に活性化したＯＤＳ樹脂（５５〜１０５μｍ）８０ｇを加え、１時間撹拌した。その後、ガラスフィルター（３Ｇ）で濾過して、これを４％酢酸８００ｍｌで洗浄後、１５％アセトニトリル１リットルで溶出させ、溶出液を減圧下で溶媒を除去して、画分１を得た。この画分１の５０％阻害活性濃度ＩＣ50は、約５３０μ（μｍｏｌ／ｍｌ）であった。
【００７４】
また、ＳＰ−セファデックスＣ−２５を充填したカラム（１．８×５０ｃｍ）に通し、０．２Ｍピリジンー酢酸緩衝液（ｐＨ＝３．１）〜２Ｍピリジンー酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）の直線濃度勾配で溶出した。そして、ＡＣＥ阻害活性を有する画分を集めて画分２を得た。この画分２の５０％阻害活性濃度ＩＣ50は、約１９０μ（μｍｏｌ／ｍｌ）であった。
【００７５】
次いで、画分２を、ＳＰ−セファデックスＧ−２５を充填したカラム（２．５×９３ｃｍ）に通し、０．２Ｍ酢酸で溶出した。そして、ＡＣＥ阻害活性を有する画分を集めて画分３を得た。この画分３の５０％阻害活性濃度ＩＣ50は、約１００μ（μｍｏｌ／ｍｌ）であった。
【００７６】
次いで、画分３に対して、デベロシルＯＤＳ−７を用いたＨＰＬＣ（カラム：０．８×２５ｃｍ、溶出液：０．０５％ＨＣｌの１０〜２０％ＣＨ3ＣＮ）処理を施した。そして、ＡＣＥ阻害活性を有する画分を集めて画分４を得た。この画分４の５０％阻害活性濃度ＩＣ50は、約５０μ（μｍｏｌ／ｍｌ）であった。
【００７７】
次いで、画分４に対して、アサヒパックＧＳ−２２０を用いたＨＰＬＣ（カラム：０．７６×５０ｃｍ、溶出液：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液）処理を施した。そして、ＡＣＥ阻害活性を有する画分を集めて画分５（平均重量分子量約１０００）を得た。この画分５の５０％阻害活性濃度ＩＣ50は、約０．８（μｍｏｌ／ｍｌ）であった。
したがって、比較例１のアンジオテンシン変換酵素阻害物質は、本発明のアンジオテンシン変換酵素阻害物質と比較して、ＡＣＥ阻害活性が低いことが確認された。
【００７８】
なお、当該画分５のペプチドに対して、全自動タンパク質一次構造分析装置ＰＰＳＱ−１０（島津製作所社製）を用いて構造解析したところ、以下のアミノ酸配列を主成分として有していることが確認された。
Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ
【００７９】
【発明の効果】
以上説明したように、Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＰｈｅおよびＩｌｅ−Ｐｈｅのアミノ酸配列で表されるペプチドを含んで構成することにより、優れたアンジオテンシン変換酵素に対する優れた阻害活性を有するアンジオテンシン変換酵素阻害物質を提供することができるようになった。
【００８０】
また、これまでは乾燥させてフィッシュミール加工し、肥料や飼料程度にしか利用することのできなかった缶詰加工残滓のマグロ魚肉を人が摂取することができる魅力のある機能性素材として、しかも安価に提供することができるようになった。
【００８１】
さらに、食品素材としての使用、血圧降下剤の原料として利用することができるとともに、粗製品も同様に生理活性効果を示すので、これを利用することができることから、さらなる天然資源の有効利用を図ることができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＨＲラットにおける血圧の経時変化（経口投与）を示す図である。
【図２】ＳＨＲラットにおける血圧の経時変化（静脈投与）を示す図である。
【図３】本発明の実施例１において得られた粗製物を、ゲル瀘過カラムクロマトグラフィーを用いて分画し、溶出するフラクションの２２０ｎｍの吸光度を測定し、得られた溶出パターンを示す説明図である。
【図４】図３に示す場合におけるＦ２画分を中心に、さらに細かく分画を行なった場合の溶出パターンを示す説明図である。
【図５】図４に示す場合において、アンジオテンシン変換酵素阻害活性が比較的高いＮ１画分を高速液体クロマトグラフィー分析装置で溶出を行ない、得られたクロマトグラフを示す説明図である。
【図１】
0003787585.tif 000011
【図２】
0003787585.tif 000012
【図３】
0003787585.tif 000013
【図４】
0003787585.tif 000014
【図５】
0003787585.tif 000015