(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的配列を含む予め選択したＲＮＡ標的の、サンプル中での存在を検出する核酸サンドイッチハイブリダイゼーション検定法であって、
ａ．前記サンプルを、ＲＮＡバイナリ・リポーター・プローブの一対とともに、そのリポーター・プローブの前記標的配列に対するハイブリダイゼーションを促進する条件でインキュベートする工程；
ｂ．前記サンプルを、ＤＮＡキャプチャー・プローブとともに、そのキャプチャー・プローブの前記標的に対するハイブリダイゼーションを促進する条件下でインキュベートする工程；
ｃ．そのキャプチャー・プローブを固体表面に固定化する工程；
ｄ．工程ａ、ｂ及びｃの後に、前記固体を洗浄する工程；
ｅ．洗浄した固体を、リボヌクレアーゼＨとともにインキュベートして、そこからＲＮＡバイナリ・プローブ−ＲＮＡ標的ハイブリッドを放出する工程；
ｆ．キャプチャー・プローブを含む固体から、放出されたＲＮＡバイナリ・プローブ−ＲＮＡ標的ハイブリッドを含む液体を分離する工程；
ｇ．ＲＮＡ向けＲＮＡリガーゼである酵素でバイナリ・プローブを連結して、ＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼに対するテンプレートであるＲＮＡ分子を形成する工程；
ｈ．ＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼで前記テンプレートを増幅する工程；及び
ｉ．増幅されたテンプレートの存在を検出する工程；
を含む核酸サンドイッチハイブリダイゼーション検定法。
【請求項２】
予め選択したＲＮＡ標的の、サンプル中での存在を検出する核酸サンドイッチハイブリダイゼーション検定法であって、ＲＮＡバイナリ・レポーター・プローブ−標的ハイブリッドをＤＮＡキャプチャー・プローブで固定化し、固定化したハイブリッドを洗浄し、開裂を使用してキャプチャー・プローブからレポーター・プローブ−標的ハイブリッドを分離し、開裂したレポーター・プローブ−標的ハイブリッドをキャプチャー・プローブから単離し、及びレポーター．プローブ−標的ハイブリッドのＲＮＡレポーター・プローブを、ＲＮＡ向けＲＮＡリガーゼで連結して、ＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼに対するテンプレートであるＲＮＡ分子を形成する検定法。
【請求項３】
前記ＲＮＡ向けＲＮＡリガーゼが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼである請求項１または２に記載の検定法。
【請求項４】
前記ＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼが、ＱＢレプリカーゼである請求項１から３のいずれか一項に記載の検定法。
【請求項５】
分離工程ｆの後、第二のキャプチャー・ＤＮＡキャプチャー・プローブを添加し、前記第二のキャプチャー・プローブを使用して工程ｂ−ｆを繰り返す請求項１、３または４に記載の検定法。
【請求項６】
標的配列を含む予め選択した標的の存在を検出する核酸サンドイッチハイブリダイゼーション検定を行うための試薬のキットであり、
連結された場合、ＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼによって指数的に増幅可能であるレポーター分子を生産する、前記標的配列にハイブリダイズ可能なバイナリ・ＲＮＡレポーター・プローブの一対と、前記標的にハイブリダイズ可能なキャプチャー・プローブとを含むキット。
【請求項７】
さらに、
５ＭのＧｕＳＣＮバッファー；
リボヌクレアーゼＨ；
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ；
Ｑβレプリカーゼ；
を含み、及び任意に、
キャプチャー・プローブがビオチン化したテイルを有する場合、さらにストレプトアビジンで被覆された常磁性粒子を含む請求項６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、国立保険機構（National Institutes of Health）により審査され、許可番号ＨＬ−７３５２１として、政府の補助のもとになされた。合衆国政府は、本発明においてある種の権利を有する。
本発明は、核酸ハイブリダイゼーション(hybridization)検定、より詳しくは、オリゴヌクレオチド・プローブを用いたサンドイッチ・ハイブリダイゼーション検定法に関する。このような検定法は、変種(mutant)遺伝子の検定、生物学的サンプルにおける病原体の検定、及び食品、農産物または環境における生物(organism)またはウイルスの検定といった広範な応用を有する。
発明の背景
オリゴヌクレオチド・プローブは、そのプローブに相補的な標的核酸配列を含む核酸標的とともに、極端に特異的で安定な「ハイブリッド」として知られる錯体を形成する。一般的に、この原理を利用する検定は、通常、サンプルの核酸とオリゴヌクレオチド・プローブとを特異的なプローブ−標的ハイブリッドの形成を促進する条件下で接触させ、ハイブリダイゼーションしていないプローブを洗い流し、ハイブリダイゼーションしたプローブの数を（一般には、プローブにつけた信号発生器を測定することにより）測定し、標的核酸配列の数を示すという過程を有している（GillespieとSpiegelman, 1965）。検出のために、放射性原子や蛍光性部位(moiety)が用いられていた。少数の標的分子を検出するために、そのプローブは、増幅可能なリポーター(reporter)ＲＮＡ(Chu等，1986)、さもなくば、埋められたプローブ配列を含む増幅可能な組換えＲＮＡ(Lizardi等，1988)のような増幅可能な基(group)を含んでいてもよい。バクテリオファージＱβレプリカーゼ(replicase)が増幅に用いられるとき、ＲＮＡは直接的に増幅されるが、ＤＮＡプローブは間接的に増幅される。即ち、このプローブが転写されてＲＮＡが合成され、次いでこのＲＮＡが直接的に増幅される(Martinelli等，1992)。この応用において、我々は、プローブを、それが直接的増幅可能であろうと、間接的増幅可能であろうと、「増幅可能」とみなす。
サンドイッチ・ハイブリダイゼーション検定法が知られている(DunnとHassell, 1977;Ranki等，1983;Syvanen等，1986)。核酸サンドイッチ検定法において、「キャプチャー・プローブ(capture probe)」が、標的を、その標的に「リポーター・プローブ」がハイブリダイゼーションされていてもされていなくても、固体表面に結合するために用いられる。我々は、このリポーター・プローブを、「信号プローブ」と呼ぶことがある。キャプチャー・プローブは、標的のリポーター・プローブがハイブリダイゼーションする部位とは異なる部位でハイブリダイゼーションする。得られた錯体は、標的核酸を含み、キャプチャー・プローブはその標的ともハイブリダイゼーションし、おそらく、リポーター・プローブもまたその標的にハイブリダイゼーションする。このキャプチャー・プローブの一端は「ヘッド」と呼ばれ、標的とハイブリダイゼーション可能であり、他端は「テイル」と呼ばれ、このキャプチャー・プローブを、粒子表面のような固体表面に結合される機能を持つ部位からなる。これら２つのプローブのハイブリダイゼーションは、両方のプローブの過剰量、一般には大過剰量を用いて標的の溶液とともにインキュベーションし、次いで固体表面への固定化といった不溶化処理をすることによって達成される。リポーター・プローブの検出を行う前に、標的とハイブリダイゼーションしていない過剰のリポーター・プローブを取り除くため、強く洗浄する。
上述のサンドイッチ検定法を含む核酸ハイブリダイゼーション検定法は、リポーター・プローブの粒子や他の固体表面に対する非特異的な結合によるバックグラウンド(background)やノイズのために、小さな感度しか得られなかった。このバックグラウンドやノイズを減少させるために、粒子をアルブミンで前処理して非特異的結合をブロックすることが行われたが、リポーター・プローブの標的に対する共有結合的架橋により、さらに強力な洗浄が必要になった(Yabuki等，1986)。また、プローブ−標的ハイブリッドは、「可逆的標的捕捉(reversible target capture)」として知られる方法で、ひとつの固体表面から他の表面に転移させた(Morrissey等，1989;Hunsaker等，1989)。可逆的標的捕捉において、キャプチャー・プローブ−標的−リポーター・プローブの錯体もしくはハイブリッドは、粒子から繰り返し放出され、新たな粒子を含む新たな容器に移され、再捕捉され（キャプチャー・プローブのテイルを介して新たな粒子に固定化され）、そして強力に洗浄される。放出、移動、再捕捉、洗浄のサイクルを多数回繰り返した後、最後の粒子に非特異的に結合したリポーター・プローブの数は、かなり減少した。全過程は、非特異的結合したリポーター・プローブを取り除くのに有効であり、放射性原子や蛍光性部位を含む従来のリポーター・プローブを用いても、バックグラウンドは検出されなかった(Thompson等，1989)。しかし、可逆的標的捕捉は複雑であり、経時的に劣化し、機械集約的(machine-intensive)であり高価でもある。
増幅可能なリポーター・プローブ(Lizardi等，1988)を、可逆的標的捕捉と組み合わせて使用すると、サンプル中の標的核酸は、従来のリポーター・プローブで検出されるレベルより低いレベルでしか検出されない(Lomeli等，1989)。得られる検定法は、知られている最も感度の高いハイブリダイゼーション検定法であると報告されている(PrintchardとStefano，1991)。
上述したようなバックグラウンド低減対策を含む検定法では、完全にバックグラウンドを取り除いたものはない。可逆的標的捕捉を使用した検定法のうちで最も感度の高いものであっても、増幅可能なリポーター・プローブによって提供される出力(power)の最大の利点を取るのに十分な感度ではない。例えば、可逆的標的捕捉の３サイクルの後であっても、約１０，０００の非特異的に結合したリポーター・プローブが存在することが示された(Lomeli等，1989)。このことは、１００，０００以上の標的分子を含むサンプルの検定の感度を制限する。
「スマート・プローブ(smart probes)」、即ち、リポーター信号を発生する能力が、それらの標的に対するハイブリダイゼーション特性に依存している（即ち、「標的依存性」のプローブ）が、感度を向上させる手段として提案された。スマート・プローブの一例は、信号発生がプローブ内で起こるコンホメーション変化に依存するような「分子スイッチ（switch）」を有するものである(Lizardi等，1992)。
開示されているスマート・プローブの他の例は、ＤＮＡ「バイナリ・プローブ(binary probes)」である。ＤＮＡリポーター・プローブの対が、ＤＮＡ標的分子上で、隣接するお互いにハイブリダイゼーションし、一方のプローブは、そのハイブリッドを固体表面に固定する機能も果たし、それは洗浄できる。このプローブは、標的依存の形状(fasion)、即ち、ＤＮＡ−向けの(directed)ＤＮＡリガーゼによる連結反応で連結できる。連結した生成物であるＤＮＡ「リポーター分子」は、一方のリポーター・プローブがプローブ−標的ハイブリッドの固体表面への固定化のために使用され、他方のリポーター・プローブが放射性原子または蛍光性部位を有しているので、それ自身検出されるかもしれない(Landegren等，1088;LandegrenとHood，1991)。また、上記したように、バイナリ・プローブの一方で固定化されたＤＮＡリポーター分子は、直接的または間接的のいずれかで増幅されうる。Ｑβレプリカーゼは、ＤＮＡリポーター分子を直接増幅するために使用してもよく、ＤＮＡリポーター分子をバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって転写して、ＱβレプリカーゼのようなＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼのテンプレートであるＲＮＡ転写を生成してもよい。いずれの場合にも、指数的増幅は検出可能な生成物を生成し、その検出は標的核酸の存在を示すと報告されている(Martinelli等，1992)。周知のバイナリ・プローブ検定法においてハイブリダイゼーションされていない固定化用プローブ（即ち、ＤＮＡバイナリ・プローブの一方）が固体表面に結合され、まさに、ハイブリダイゼーションされていないキャプチャー・プローブは、ユナリ(unary)・リポーター・プローブを使用するサンドイッチハイブリダイゼーション検定法のようである。
他の検定法は、標的に依存する信号発生反応を使用する。そのような反応は、リガーゼ連鎖反応ＬＣＲ(Barany，1991)、ポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲ(Erlich等，1991)、マルチ酵素増幅反応３ＳＲ(Guatelli等，1990)、標準置換増幅反応ＳＤＡ(Walker等，1992)、及び標的依存性複製反応ＴＤＲ(Kramer及びLizardi，1989)である。
本発明の目的は、核酸ハイブリダイゼーション検定の感度を向上させ、好ましくは、１００分子程度に少量の標的核酸を検出でき、好ましくはネガティブサンプルでは信号を発生しないようにバックグラウンドを無くした検定法を提供することである。
本発明の他の目的は、可逆的標的捕捉の欠点、即ち、複雑さ、コスト、経時的劣化及び機械集約的を取り除いた高感度の核酸ハイブリダイゼーション検定法を提供することである。
本発明の他の目的は、わずかな標的核酸の検出を可能にする指数的増幅に匹敵する高感度な検定法を提供することにある。
本発明の特別な目的は、精巧な実験室なしで、野外条件下でも実施することのできる高感度な核酸ハイブリダイゼーション検定法を提供することにある。粒子を必要としないが、ディップスティック(dipstick)のような使いやすい固体を含む検定は、この点において望ましい。
本発明の他の目的は、定量的にも定性的にも向上した感度を持つ核酸ハイブリダイゼーション検定法を提供することである。
本発明のこれら及び他の目的は、以下の説明から明らかになるであろう。
発明の概要
この説明及びそれに続く請求の範囲において、我々は分子を単独で（例えば、「キャプチャー・プローブ」）参照することがある。同様に、錯体（例えば、「プローブ−標的ハイブリッド」）にも適用する。実際のところ、多くのコピーが使用され作られることが理解されるであろう。我々は、厄介な場合は、「コピー等」とは言わずに複数で表すことがある。当業者は、文脈からその意味を理解するだろう。
本発明の検定法は、サンドイッチ核酸ハイブリダイゼーション検定法であり、これは、固体表面に標的を固定化すること及び固体を洗浄することを含む核酸ハイブリダイゼーション検定法を意味する。本発明のサンドイッチ核酸ハイブリダイゼーション検定法は、少なくともひとつの改善を、好ましくはバックグラウンドの低減と感度の向上という両方の改善を含んでいる。この検定法の必須の特徴は、キャプチャー・プローブを使用することであり、これは、リポーター・プローブではなく、標的またはリポーター・プローブ−標的ハイブリッドを固体表面に固定化するのに用いられるプローブを意味する。一つ以上のキャプチャー・プローブを使用してよい（これは、標的の異なる配列とハイブリダイゼーション可能な少なくとも２つのキャプチャー・プローブを意味する）が、少なくとも一つは用いなければならない。本発明に適用したように、「リポーター・プローブ」は、リポーター・プローブの標的を固体表面に固定化する機能を有しないプローブに限られる。従来技術のバイナリ・プローブ検定法は、キャプチャー・プローブの使用を含んでいない。むしろ、それらは、バイナリ・リポーター・プローブのひとつを、リポーター・プローブ−標的ハイブリッドを固体表面に固定化する手段として使用している。よって、従来技術のバイナリ・プローブ検定法で使用されているバイナリ・リポーター・プローブは、後述の請求の範囲を含む本発明に適用する用語としての「リポーター・プローブ」ではない。我々は、このことが、かなりのバックグラウンドの好ましくない源を与えると考える、なぜなら、多くの（典型的には１０10から１０13）の固定化するリポーター・プローブのコピーが洗い落とされず、標的−非依存性の連結反応に好ましい高い濃度を与えるからである。そのためまたは他の理由のため、バイナリ・プローブ検定法で異なる(separate)キャプチャー・プローブを用いるとき、かなりの改善が得られる。
本発明による検定の第２の特徴は、実質的に標的単独または標的−ユナリ・リポーター・プローブハイブリッドがキャプチャー・プローブによって固定化されたとき、好ましくは標的−バイナリ・リポーター・プローブハイブリッドがキャプチャー・プローブによって固定化されたときに、標的またはリポーター・プローブ−標的ハイブリッドを、場合に応じて、キャプチャー・プローブがら分離することである。この分離は、開裂及びそれに次ぐ部分、即ち、一方の標的またはリポーター・プローブ−標的ハイブリッドの単離によって行われる。「開裂」とは、標的またはキャプチャー・プローブ中の適当な部位における少なくとも一つのホスホジエステル結合の破壊を意味する。
我々は、残ったキャプチャー・プローブが、かなりのバックグラウンドの好ましくない源になり、キャプチャー・プローブの多く（典型的には１０13）のコピーが、リポーター・プローブの非特異的結合のための部位を提供すると考える。また、キャプチャー・プローブの存在は、リピーター分子の蛍光による検出の間に存在するなら、かなりのバックグラウンドを生ずるかもしれない。バイナリ・プローブを用いたとき、キャプチャー−プローブ分離が好ましいが、本発明のすべての実施態様に必要なわけではない。バイナリ・プローブ、異なるキャプチャー・プローブ、及び強力な洗浄または可逆的標的キャプチャーの使用は、多くの場合に要求される感度を満足するだろう。
本発明の感度向上の改善は、核酸サンドイッチハイブリダイゼーション検定法に広く応用できる。標的は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。リポーター・プローブは、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。また、キャプチャー・プローブもＤＮＡでもＲＮＡでもよい。さらに、キャプチャー・プローブは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのような化学合成された核酸類似物を含んでいてもよい。
リポーター・プローブ−標的ハイブリッドのキャプチャー・プローブからの分離を含む実施態様では、リポーター・プローブの性質も検出可能な信号の発生も臨界的ではない。このプローブはユナリであっても、バイナリであってもよい。ユナリ・スマート・プローブを用いてもよい。このプローブ、即ちバイナリ・プローブの一方は、放射性原子や蛍光性部位のような検出可能な部位を含んでいてもよく、無色の基質とともにインキュベートして多くの着色生成物を生ずる酵素を含んでいてもよい(Leary等，1983)。指数的増幅を利用した信号発生技術が好ましい。リポーター・プローブまたはリポーター分子は、ＲＮＡ向けのＲＮＡポリメラーゼのテンプレート(template)であってもよい(Lomili等，1989)。用いることのできる他の指数的増幅技術は、ＬＣＲ、ＰＣＲ、３ＳＲ、ＳＤＡ及びＴＤＲである。
我々が「標的精製」と呼んでいるキャプチャー・プローブからの標的の分離を含む実施態様では、検定は、ＬＣＲ、ＰＣＲ、３ＳＲ、ＳＤＡ及びＴＤＲの群から選ばれる標的に依存した信号発生技術を含んでいなければならない。
信号の検出法は特に限られない。放射性計数またはイメージング、比色、蛍光または冷光のような任意の適当な信号検出方法が用いられる。信号検出は、定量的検出に対して「活動中(on the fly)」であっても、または経時的(over time)であってもよい。
キャプチャー・プローブが固定化される固体表面の種類も特に限られない。その固体は、例えば、粒子、ディップスティックまたは管の表面であってもよい。可逆的標的捕捉において、固定化が永久的か可逆的か否かに応じて、任意の適当な固定化技術を用いてよい。
バイナリ・プローブを採用した実施態様では、標的向けの方法での連結が必要であるが、その方法は特に限られない。タンパク質またはリボサイムリガーゼを用いてもよいが、化学的連結反応、光誘引性連結反応または自己連結反応のような非酵素的方法を用いてもよい。
キャプチャー・プローブの分離を採用したバイナリ・プローブの実施態様では、連結反応は分離に先行しても引き続いてもよいが、連結反応が分離に引き続くのが好ましい。さらに、キャプチャー・プローブが単離される方法も特に限られない。液相から固相を分離する方法はよく知られており、典型的なアスピレーション(aspiration)及びデカンテーションを含んでいる。キャプチャー・プローブからの分離は、好ましくは、可逆的標的捕捉なしで用いられるが、それらの技術の組み合わせもまた用いてもよい。可逆的標的捕捉なしで、キャプチャー・プローブのテイルがビオチン部位を持ち、粒子表面に共有結合したビオチンと結合するストレプトアビジン分子またはアビジン分子を有する場合のようにキャプチャー・プローブは固定表面に永久的に結合する。キャプチャー・プローブからの分離を含む実施態様では、好ましい実施態様は、ＤＮＡとハイブリダイゼーションしたＲＮＡを開裂するリボヌクレアーゼ（「ＲＮａｓｅ  Ｈ」）での開裂を利用する。ＤＮＡキャプチャー・プローブは、標的が開裂される場合のＲＮＡ標的に利用される。ＲＮＡキャプチャー・プローブは、キャプチャー・プローブが開裂される場合のＤＮＡ標的に利用される。
本発明の好ましい実施態様は、ＲＮＡ標的に対する検定である。なぜならば、検出に好適なＲＮＡ標的は、ほとんどの場合、サンプル中の対応するＤＮＡ標的より非常に多く存在するからである。
高感度の検定のためには、直接的あるいは間接的（転写の後）のリポーター・プローブの指数的増幅が好ましい。増幅可能なリポーター・プローブを利用する検定は、理論的には、１つの標的分子まで検出することができる。それは、単独の増幅可能なリポーター・プローブは、それ自身の十億のコピーの生成のテンプレートとして振る舞い（LevisohnとSpiegelman，1968）、元のリポーター・プローブの検出を導くからである。実際の検出限界は、標的分子とハイブリダイゼーションしていないリポーター・プローブを取り除く方法の効率によって決定される。可逆的標的捕捉を利用する検定の感度は、上述したような、非特異的に結合したリポーター・プローブの残存によって制限される。本発明によって、ハイブリダイゼーションしないリポーター・プローブの残存が著しく減少し、検定の感度を１０００倍以上高めることができる。
本発明の好ましい実施態様は、増幅可能なバイナリ・プローブを利用する。即ち、プローブは、それらが互いに連結したとき（及び互いに連結したときにのみ）、指数的に増幅可能なリポーター・プローブを形成するか、または指数的に増幅可能な分子の生成のテンプレートとして振る舞う。本発明の好ましい実施態様では、２つのバイナリ・プローブの連結反応で形成され得るリポーター・プローブのセットは：１）コンパチブルな(compatible)ＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼとともにインキュベートすることにより直接指数的に増幅され得る組換えＲＮＡ(Miele等，1983)；２）プロモーター(promoter)（またはＤＮＡポリメラーゼとともにインキュベーションすることにより延長され(extended)プロモーターを形成する配列）、及び、プロモーターにコンパチブルであるＤＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼによって転写され得るＲＮＡをエンコード(encode)し、その転写がコンパチブルなＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼとインキュベートする事により指数的に増幅されうる配列からなるＤＮＡテンプレート；３）ＬＣＲ、ＰＣＲ、３ＳＲ、ＳＤＡ及びＴＤＲのような指数的増幅のテンプレートとして振る舞うＤＮＡまたはＲＮＡを含んでいる。
本発明の好ましい実施態様は、その表面に共有結合したストレプトアビディンを有する固体表面を使用し、キャプチャー・プローブが粒子の表面に永久的に結合されるようなビオチン部位を含むキャプチャー・プローブを使用する。我々の実験室で実施された好ましい実施態様は、固体として常磁性粒子を使用したが、本発明による開裂−分離の態様は、良好な設備を持つ実験室を必要としないような検定法とした。ディップスティックまたは反応管（試験管）は、特に野外条件(field condition)下での実施に採用された検定法での固体として提供された。
本発明の好ましい実施態様は、バイナリ・プローブ、異なるキャプチャー・プローブ、及びキャプチャー・プローブからのバイナリ・プローブ−標的ハイブリッドの分離を使用する（よって、キャプチャー・プローブに非特異的に結合するようになるバイナリ・プローブから形成する標的依存性ハイブリッドを顕著に減少させる）。これらの好ましい実施態様では、１回の洗浄サイクルで、ハイブリダイゼーションしていないバイナリ・プローブ、ハイブリダイゼーションしていない細胞(callular)核酸、及び他のすべての細胞物質を充分に取り除くことができる。好ましくは、分離が連結反応に先行する。
本発明の好ましい実施態様は、ＲＮＡからなるバイナリ・プローブと標的向けＲＮＡリガーゼを用いた検定法であり、その標的向けＲＮＡリガーゼは、「ＲＮＡ向けＲＮＡリガーゼを用いたＲＮＡの診断的検定法及びキット」という名称で、Ｓ．ティアギ(S.Tyagi)が発明者である米国特許出願番号０８／００４，９９３（以後、ティアギ出願番号０８／００４．９９３とする）、及び、「ＲＮＡバイナリ・プローブ及びリボザイムリガーゼを用いたＲＮＡの診断的検定法及びキット」という名称で、Ｐ．リザルディ(P.Lizardi)、Ｓ．ティアギ、Ｕ．ランデグレン(U.Landegren)、Ｆ．クレーマー(F.Kramer)及びＪ．ツォスタック(J.Szostak)が発明者である米国特許出願番号０８／００５，８９３（以後、リザルディ出願番号０８／００５．８９３とする）に記載されているが、これらはともに本出願と同日に出願され、ともにここで参考文献として取り入れる。よって、ＲＮＡ向けＲＮＡリガーゼとして、ＤＮＡ向けＤＮＡリガーゼまたはリボザイムリガーゼのいずれかを使用することができる。ＤＮＡ向けＤＮＡリガーゼとして好ましいのは、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼまたはＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼである。リボザイムリガーゼとして好ましいのは、テトラヒメナリボザイムリガーゼである（DounaとSzostak，1989）。本発明の他の実施態様は、ＲＮＡ標的、ＤＮＡからなるバイナリ・プローブ、及びＴ４ＤＮＡリガーゼといった適当なＤＮＡリガーゼを利用する。
お互いに連結したとき（またはお互いに連結したときにのみ）直接または間接に指数的に増幅されるリポーター分子を形成するバイナリ・プローブを使用する好ましい実施態様において、指数的に増幅される分子は、ＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼのテンプレートであることが好ましい。好ましい実施態様では、ＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼは、Ｑβレプリカーゼ、ＭＳ２レプリカーゼ、またはＳＰレプリカーゼのような、バクテリオファージＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼである。最も好ましい実施態様では、ＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼは、Ｑβレプリカーゼである。他の好ましい実施態様では、ＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼは、ブロメ・モザイク・ウイルス(brome mosaic virus)、カウパー(cowper)・モザイク・ウイルス、カカンバー(cucumber)・モザイク・ウイルス、またはポリオ(polio)・モザイク・ウイルスに感染した細胞のような、ウイルスに感染した真核細胞から単離する。さらに他の好ましい実施態様では、ＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（KonarskaとSharp，1989）。
指数的に増幅される分子がＱβレプリカーゼのテンプレートとして振る舞う組換えＲＮＡである実施態様では、組換えテンプレートの配列が、以下の群のＲＮＡの配列から導かれるのが好ましい：ＭＤＶ−１、ミクロバリアント(microvariant)ＲＮＡ、ナノバリアント(nanovariant)ＲＮＡ、ＣＴ  ＲＮＡ、ＲＱ１３５ＲＮＡ、ＲＱ１２０ＲＮＡ、及びＱβＲＮＡ。最も好ましい実施態様では、このＲＮＡはＭＤＶ−１ＲＮＡである。
指数的に増幅される分子が、プローブ配列が埋め込まれたＭＤＶ−１ＲＮＡ配列（Lizardi等，1988;及びLomeli等，1989）からなる組換えＲＮＡである実施態様では、プローブ配列は、ＭＤＶ−１ＲＮＡの配列のいかなる位置にも挿入することができる。ＭＤＶ−１ＲＮＡへの配列の挿入（及びＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼの他のＲＮＡテンプレートへのプローブ配列の挿入）の好ましい位置は、複製に必要な領域から離れた領域の分子の外側に位置するヘアピン・ループ(hair pin roop)において起こるものであるが（Miele等，1983）、プローブ配列は、任意の位置の挿入可能であり、その結果得られる組換えは、指数的に複製されるかどうか試験することができる。好適な挿入部位を与える潜在的なヘアピン・ループを同定する方法、望まれる組換えＲＮＡを構成する方法、及びその結果得られる組換えが、コンパチブルなＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼとインキュベーションすることにより指数的に複製されるかどうかを試験する方法は、当業者には良く知られている。
好ましい実施態様において、指数的に増幅可能な組換えＲＮＡは、３０から８０のヌクレオチド長の挿入されたプローブ配列を含む。最も好ましい実施態様では、指数的に増幅可能な組換えＲＮＡは、約４０のヌクレオチド長の挿入されたプローブ配列を含んでいる。好ましい実施態様では、指数的に増幅可能な組換えＲＮＡが、各バイナリ・プローブに含まれるように「半分ずつ(halves)」に切断される方法は、指数的に増幅可能な組換えＲＮＡの配列が、プローブ配列のほぼ真ん中において切断される。この概念を例示するために、指数的に増幅可能な組換えＲＮＡが２２０のヌクレオチド長の配列に基づいており、その組換えが埋め込まれた４０のヌクレオチド長のプローブ配列を含んでおり、そのプローブ配列が２２０ヌクレオチド長の配列のヌクレオチド６０と６１の間に挿入され（結果的に２６０のヌクレオチド長の配列になった）と考える。すると、好ましい実施態様において、左側のプローブは、２２０ヌクレオチド長配列の最初の６０ヌクレオチドの配列からなり、そのすぐ隣（バイナリ・プローブの一端、例えば３’末端）は、４０ヌクレオチド長の埋め込まれたプローブ配列の最初の２０ヌクレオチドであり、右側のバイナリ・プローブは、４０ヌクレオチド長の埋め込まれたプローブ配列の第２の２０ヌクレオチドからなり（バイナリ・プローブの５’末端において）、そのすぐ隣は、２２０ヌクレオチドの配列の１６０ヌクレオチドの残りの１６０ヌクレオチドである。
バイナリ・プローブがＲＮＡからなり、ＤＮＡテンプレートからの転写によって調製されるべきものであるとき、その５’末端にプローブ配列を有するバイナリ・プローブは、グアノシンから始まるのが好ましい、なぜならば、グアノシンは、周知のＤＮＡ向けＤＮＡポリメラーゼを用いる調製における５’末端として好ましいからである。
バイナリ・プローブがＲＮＡからなり、バイナリ・プローブを結合するためにリボザイムリガーゼが使用されるとき、その５’末端にプローブ配列を有するバイナリ・プローブは、その５’末端に付加的グアノシンを含んでいる必要がある。このグアノシンは、バイナリ・プローブが互いに連結したときに、リボザイムによって取り除かれる。
バイナリ・プローブがＤＮＡからなり、それらのうちの１つがプロモーター（または、ＤＮＡポリメラーゼとインキュベートすることにより延長されてプロモーターを形成する配列）を有しているとき、さらに、それらがともに連結されているとき、得られるＤＮＡは、プロモーターにコンパチブルなＲＮＡポリメラーゼによって転写され得るＲＮＡをエンコードする配列を有している。そして、そのバイナリ・プローブをどのように設計するかについての多くの好ましい実施態様が存在する。これらの好ましい実施態様は以下のものを含む。１）プロモータ配列をエンコードするバイナリ・プローブは、その３’末端にヘアピン構造を持たなければならず、その茎状部(stem)は、（二本鎖）プロモーターからなるか、またはＤＮＡポリメラーゼとのインキュベーションによって延長されて（二本鎖）プロモーターを形成することもでき、よって、異なる相補的ＤＮＡ鎖が、プロモーターをエンコードして機能的プロモーターを形成する配列とハイブリダイゼーションするために存在しなければならないという要求を取り除く。２）バイナリ・プローブが、その３’末端にヘアピン構造を含み、それが（二本鎖）プロモーターからなるとき、その３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼとのインキュベートによるそれ自身の延長のためのプライマーとして使用するのが好ましく、その結果、コンパチブルなＤＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼによる転写の二本鎖テンプレートが形成され、よって、転写にヘアピン構造が存在することによる阻害効果を除去する（テンプレートが一本鎖を保持する）。３）プロモーター配列をエンコードするバイナリ・プローブは、コンパチブルなＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼの結合部位からなる増幅可能な組換えＲＮＡの領域をエンコードしないのが好ましく、その結果、このバイナリ・プローブ（連結していなければ）から調製され得る短い転写を確認する設計が複製され得ない。
そして最後に、本発明の好ましい実施態様では、１）増幅の間にＲＮＡに放射性ヌクレオチドを取り込む、及び２）臭化エチジウムまたはヨウ化プロピジウム(propidium iodide)のような増幅されたＲＮＡに結合したとき蛍光を発する分子を結合するということを含む検出方法が好ましい。
増幅可能なＲＮＡバイナリ・プローブ、異なるＤＮＡキャプチャー・プローブ、ＲＮａｚｅＨとのインキュベーションによるキャプチャー・プローブからのリポーター・プローブ−標的ハイブリッドの開裂、及びキャプチャー・プローブを含む粒子からのリポーター・プローブ−標的ハイブリッドの単離を用いて、本発明の検定法は、定性的及び定量的に、サンプル当たり１００から１０，０００，０００分子の量のＲＮＡ標的分子を、及び、１００，０００の未感染のヒトリンパ球細胞を含むサンプル中の１つのＨＩＶ−１感染したヒトのリンパ球細胞まで、標的分子を含まないサンプルや感染した細胞を含まないサンプルに対するバックグラウンド信号無しに検出できることが示された。この感度のレベルは、可逆的標的捕捉に頼ることなしに達成された。
本発明は、予め選択された標的に対する診断用キットも包含する。本発明のキットは、ユナリ・リポーター・プローブ、少なくとも１つのキャプチャー・プローブ、開裂薬、及び診断的検定を行う手段(instructions)を含んでいてよい。キットは、１対のバイナリ・プローブ、少なくとも１つのキャプチャー・プローブ、開裂薬、及び手段を含んでいてもよい。好ましいキットは、１対のバイナリ・プローブ、少なくとも１つのキャプチャー・プローブ、開裂薬、及び手段を含む。好ましいキットは、酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、及びＱβレプリカーゼ）、及び任意に他の試薬を含んでいてもよい。
特に好ましい実施態様を含む本発明の多くの実施態様の詳しい説明が、「詳細な説明」に与えられる。「詳細な説明」及び「実施例」のいずれも、本発明の範囲または好ましい実施態様の請求の範囲を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１の検定法を表す。
図２は、実施例１のプローブの配列を示す。
図３は、実施例１のバイナリ・プローブの調製を表す。
図４は、既知量の標的分子に対する実施例１の検定法で得られる典型的な結果を示す。
図５は、既知量の感染した細胞に対する実施例１の検定法で得られる結果を示す。
図６は、既知量の感染した細胞に対する実施例１の他の検定法で得られる結果を示す。
図７は、実施例２の検定法を表す。
図８は、実施例２のプローブの配列を示す。
図９は、実施例３の検定法を表す。
図１０は、実施例４の検定法を表す。
詳細な説明
上述したように、本発明は、リポーター・プローブ及び異なるキャプチャー・プローブ、即ちリポーター・プローブではないキャプチャー・プローブを用いる核酸サンドイッチハイブリダイゼーション検定に広く適用される。
下記の実施例１に記載した我々の最も好ましい高感度検定におけるように、少なくとも１つ、任意に１つ以上のキャプチャー・プローブが用いられる。１つではなく２つのキャプチャー・プローブを用いることは、与えられた標的分子が捕捉される機会が増加される。なぜならば、捕捉作用は１００％有効ではないからである。
キャプチャー・プローブ−標的ハイブリッドは、そのハイブリッドが検定の間に失われない程度に安定であることが望ましい。当業者は、特別な検定の処理条件に耐えるのに十分に長いハイブリッド長を選択することができる。一般に、３０−５０塩基対のキャプチャー・プローブ−標的ハイブリッド長が好ましく、それは、キャプチャー・プローブの（ヌクレオチドの）ヘッドの長さを決定する。キャプチャー・プローブのテイルは、そのキャプチャー・プローブを固体表面に永久にまたは可逆的に固定化するために用いられる。本発明によるキャプチャー・プローブの分離を用いる場合、キャプチャー・プローブのテイルは、ストレプトアビジン被覆した固体表面と反応するビオチン基であるのが好ましい。キャプチャー・プローブのヘッドとテイルの間はスペーサーであり、一般的には、オリゴヌクレオチド配列である。ハイブリダイゼーション及び連結反応を溶液中で実施すること、即ち、標的が固体表面に固定化されない場合が好ましい。特に、そのような好ましい検定については、スペーサーは極端に短くてもよい。好ましいスペーサーは、３−８のヌクレオチド長である。
好ましい開裂過程または開裂薬は、標的核酸の性質、キャプチャー・プローブの性質、及び、もし存在するならリポーター・プローブの性質に依存している。一般に、起こりうる８つの異なった状況がある。下記の表１は各状況をローマ数字で示している。
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以下の９つの開裂技術は、リポーター・プローブ−標的ハイブリッドを、開裂薬によってキャプチャー・プローブから放出する種々の方法を、表１の状況を参照して例示したものである。
１．一本鎖−特異的リボヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼＡまたはリボヌクレアーゼＴ１等）でＲＮＡ標的を開裂する（状況ＩＶ）。これらのリボヌクレアーゼはＤＮＡを開裂しないので、非特異的に結合したリポーター・プローブはキャプチャー・プローブから放出されない。この技術の実施態様を、実施例６に記載した。この開裂技術は、標的精製には適用できない。
２．リボザイムでのＲＮＡ標的の部位特異的開裂（状況Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶ）。リボザイムは、標的ＲＮＡの特別な部位を開裂するように設計できるので（HaseloffとGerlach，1988）、検定に特異性の第３の要素が加えられる。標的ＲＮＡの開裂は、標的中のキャプチャー・プローブが結合する部位及びリポーター・プローブが結合する部位の間の領域で起こるように設計され、よって、リポーター・プローブ−標的ハイブリッドが固体表面から放出される。この技術の２つの実施態様が、実施例３に記載されている。
３．ＲＮＡ標的のリボヌクレアーゼＩＩＩ（”ＲＮａｓｅＩＩＩ”）での、ＲＮＡからなる部位特定(site-identifying)プローブを用いた部位特異的開裂（状況ＩＶ）。部位特定プローブは、標的中のキャプチャー・プローブが結合する部位及びリポーター・プローブが結合する部位の間の領域で起こる標的の予め選択された部位に相補的であるよう設計される。この部位特定プローブは、最初のハイブリダイゼーション混合物中に含まれる。リボヌクレアーゼＩＩＩは、特定の配列における二本鎖ＲＮＡのみを開裂するので（KrinkeとWulff，1990）、検定に特異性の第３の要素が加えられる。標的ＲＮＡの開裂は、キャプチャー・プローブが結合する部位及びリポーター・プローブが結合する部位の間の領域で起こり、よって、リポーター・プローブ−標的ハイブリッドが固体表面から放出される。我々は、リボヌクレアーゼＩＩＩが、それらが十分長ければ、ほとんどすべての二本鎖ＲＮＡを開裂することを実験的に見い出した。この理由により、状況Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩにおいてリボヌクレアーゼＩＩＩを用いるのは好ましくない。この技術の実施態様を実施例４に記載した。
４．リボヌクレアーゼＨによる、ＤＮＡからなる部位特定プローブを用いたＲＮＡ標的の部位特異的開裂（状況Ｉ）。部位特定プローブは、標的中のキャプチャー・プローブが結合する部位及びリポーター・プローブが結合する部位の間の領域で起こる標的の予め選択された部位に相補的であるよう設計される。この部位特定プローブは、最初のハイブリダイゼーション混合物中に含まれる。リボヌクレアーゼＨは、ＤＮＡにハイブリダイゼーションしたＲＮＡのみを開裂するので、開裂は、部位特定プローブが結合した部位に限られる。部位特定プローブを用いることは、検定に、特異性の第３の要素を導入する。標的ＲＮＡの開裂は、キャプチャー・プローブが結合する部位及びリポーター・プローブが結合する部位の間の領域で起こり、よって、リポーター・プローブ−標的ハイブリッドが固体表面から放出される。
５．制限エンドヌクレアーゼによる、ＤＮＡからなる部位特定プローブを用いたＤＮＡ標的の部位特異的開裂（状況Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩ）。部位特定プローブは、標的中のキャプチャー・プローブが結合する部位及びリポーター・プローブが結合する部位の間の領域で起こる標的の予め選択された部位に相補的であるよう設計される。この部位特定プローブは、最初のハイブリダイゼーション混合物中に含まれる。制限エンドヌクレアーゼは、特定の配列の二本鎖ＤＮＡのみを開裂するので、検定に特異性の第３の要素が加えられる。標的ＤＮＡの開裂は、キャプチャー・プローブが結合する部位及びリポーター・プローブが結合する部位の間の領域で起こり、よって、リポーター・プローブ−標的ハイブリッドが固体表面から放出される。
６．ＤＮＡキャプチャー・プローブのヘッドが結合した部位におけるリボヌクレアーゼＨによるＲＮＡ標的の開裂（状況ＩＩＩ）。リボヌクレアーゼＨは、ＤＮＡにハイブリダイゼーションしたＲＮＡのみを開裂するので、開裂はこの特定の部位に限られる。当業者には容易に理解されるような、キャプチャー・プローブの適切な設計によって、標的ＲＮＡの開裂がキャプチャー・プローブ−標的ハイブリッドを破壊しリポーター・プローブ−標的ハイブリッドを固体表面から放出する。この好ましい技術の実施態様は実施例１に記載した。
７．ＤＮＡ標的が結合した部位におけるリボヌクレアーゼＨでのＲＮＡキャプチャー・プローブの開裂（状況ＶＩ）。リボヌクレアーゼＨはＤＮＡにハイブリダイゼーションしたＲＮＡのみを開裂するので、開裂はこの特定の部位に限られる。当業者には容易に理解されるような、キャプチャー・プローブの適切な設計によって、キャプチャー・プローブのヘッドの開裂がキャプチャー・プローブ−標的ハイブリッドを破壊しリポーター・プローブ−標的ハイブリッドを固体表面から放出する。この技術の実施態様は実施例８に記載した。
８．ＲＮＡキャプチャー・プローブのヘッドが結合した部位におけるリボヌクレアーゼＩＩＩでのＲＮＡ標的の開裂（状況ＩＩ）。リボヌクレアーゼＩＩＩは二本鎖ＲＮＡのみを開裂するので、開裂はこの特定の部位に限られる。キャプチャー・プローブ−標的ハイブリッド中のＲＮＡの両方の鎖の開裂は、リポーター・プローブ−標的ハイブリッドを固体表面から放出する。この技術の実施態様は実施例５に記載した。
９．ＤＮＡキャプチャー・プローブのヘッドが結合した部位における制限エンドヌクレアーゼでのＤＮＡ標的の開裂（状況ＶＩＩ及びＶＩＩＩ）。キャプチャー・プローブ−標的ハイブリッド中のＤＮＡの両方の鎖の開裂は、リポーター・プローブ−標的ハイブリッドを固体表面から放出する。この技術の実施態様は実施例７に記載した。
本発明の検定法は、核酸サンドイッチハイブリっど形成検定の分野の当業者には容易に理解できるある種の検定技術を利用する。
この技術を、リポーター・プローブ−標的ハイブリッドがキャプチャー・プローブと分離された実施態様について説明する。大過剰のリポーター・プローブとキャプチャー・プローブを、ハイブリダイゼーションを促進する条件下でサンプルに添加する。ハイブリダイゼーションは、好ましくは溶液中で生ずる。固体表面にキャプチャー・プローブを予め固定化しておくことは、好ましくはないが除外されるものでもない。続いてキャプチャー・プローブのテイルを介した固定化、その後、上澄みを除去して固体を好ましくは強力に洗浄し、清浄な上澄みを加える。使用したとき、開裂はリポーター・プローブ−標的ハイブリッドを上澄み中に放出し、ついで、デカンテーションまたはアスピレーションによって、キャプチャー・プローブを含む固体から分離する。バイナリ・プローブを用いるとき、好ましくは検定のこの段階において、それらは連結する。もし必要なら、増幅及び検出が続く。いくつかの検出方法が良く知られており、それらは、放射（放射性ヌクレオチドトリホスフェート(triphosphate)の使用）、色（比色法）（例えば、基質に色の変化を生ずることのできる酵素の使用）、蛍光（例えば、ヨウ化プロピジウムのような色素の使用）、及びルミネセンス（例えば、開裂で光子を放出するアルカリフォスファターゼ(alkaline phosphatase)基質の使用）を含んでいる。検出は、以下に述べるように、定性的でも定量的でもよい。
好ましい実施態様では、粒子に結合したキャプチャー・プローブを、放出されたリポーター・プローブ−標的ハイブリッドを含む溶液から物理的に除去することのできる分離方法が使用される。非常磁性粒子を用いるとき、粒子を試験管の底に集めるために遠心分離が用いられ、リポーター・プローブ−標的ハイブリッドを含む上澄みはアスピレーションによって除去することができる。また、粒子が常磁性であるとき（これは、遠心分離を要しないので好ましい）、粒子を試験管の壁面に引き寄せるために磁石が用いられ、リポーター・プローブ−標的ハイブリッドを含む上澄みは除去することができる。
本発明の好ましい実施態様では、表面に共有結合されたストレプトアビジンを含む常磁性粒子、及び、そのテイルにビオチン部位を含むキャプチャー・プローブを使用する（従って、キャプチャー・プローブは、粒子またはビーズの表面に永久的に結合することができる）。
本発明による検定法の好ましい実施態様は、特に高感度検定について、ＲＮＡ標的に対するものであり、単一のリポーター分子、少なくとも１つのＤＮＡキャプチャー・プローブ及びリボヌクレアーゼＨからでさえも、容易に検出できる増幅した信号を生ずる能力を有するＲＮＡリポーター・プローブを使用する。
本発明の特に好ましい実施態様では、バイナリ・ハイブリダイゼーション・プローブであるリポーター・プローブを使用するが、それは、標的を固体表面に固定化する機能を持たず、互いに隣接して正確にハイブリダイゼーションされた場合、標的に依存した反応において互いに連結するだけであり、また、それらが連結されたとき、Ｑβレプリカーゼによって、直接的に（レプリカーゼのテンプレートとして振る舞う）、または間接的に（転写テンプレートとして振る舞い、その転写がレプリカーゼのテンプレートとして振る舞う）、指数的に増幅される組換えリポーター分子を形成する。最も好ましいのは、ＤＮＡキャプチャー・プローブ及びＲＮＡバイナリ・プローブを使用するＲＮＡ標的に対する検定である。本発明の方法は、バイナリ・ハイブリダイゼーション・プローブを用い、連結反応及び増幅反応が固体表面の存在による阻害を受けずに行われるとき、特に有効である。それに対して、バイナリ・ハイブリダイゼーション・プローブを使用する従来の方法は、バイナリ・プローブの一方をプローブ−標的ハイブリッドの固定化に使用する（Landegren等，1988）。また、これらの方法は、連結反応の間、固体表面の影響を受ける。
本発明の一つの重要な目的は、サンプル中に１００程度の、非常に少ない標的分子を、ネガティブサンプルからのバックグラウンドなしに検出する検定法である。実施例１は、そのような検定法の好ましい実施態様を例示している。実施例１の検定法は、ＲＮＡバイナリ・リポーター・プローブを使用したＲＮＡ標的の検定法であり、このＲＮＡバイナリ・リポーター・プローブの連結反応は、ＲＮＡ向けＲＮＡポリメラーゼ、この場合はＱβレプリカーゼ、によって直接増幅可能なＲＮＡリポーター分子を生成する。異なるキャプチャー・プローブを使用することは、バイナリ・リポータ・プローブの連結反応の前に、両方のバイナリ・リポーター・プローブの未使用のコピーを洗い落とすことを可能にする。連結反応は標的に依存している。我々がバックグラウンドの源であると考えている標的に依存しない連結反応は、固体表面に高濃度で固定化された一方のバイナリ・リポーター・プローブを有するのではなく、両方のバイナリ・プローブを洗い落とすことによって大きく減少する。
たとえそうであっても、非特異的に結合したリポーター・プローブは、バックグラウンドの源として残存している。可逆的標的キャプチャーは、このバックグラウンドの源を、多くの検定で許容される低レベルまで減少させるひとつの技術である。しかしながら、可逆的標的キャプチャーは、重大な欠点を有している。第一に、高コスト、経時的劣化、複雑そして機械集約的である。第二に、可逆的標的捕捉を繰り返すごとに、幾分のリポーター・プローブ−標的ハイブリッドを失う可能性がある。第三に、キャプチャー・プローブ自体が、リポーター・プローブの非特異的結合の結合部位を与える。可逆的標的捕捉では、すべてのキャプチャー・プローブが、少量は標的に結合し、大過剰は標的に結合せずに残存している。
実施例１の検定法は、これらの欠点をすべて処置した。リポーター・プローブ−標的ハイブリッドは、リポーター・プローブ−標的−キャプチャー・プローブハイブリッドをリボヌクレアーゼで開裂することにより、両方のキャプチャー・プローブから分離する。この開裂は、リポーター・プローブ−標的ハイブリッドを放出し、キャプチャー・プローブ及び固体（実施例１では、この固体は常磁性粒子）の表面ではなく、それに非特異的に結合したリポーター・プローブを残し、容易に物理的分離ができるようにする。連結反応は、この分離の後に行われる。Ｑβレプリカーゼによる直接的な増幅及び検出が続く。
この過程の組み合わせにより、非特異的ハイブリダイゼーションによるバックグラウンドはゼロまで低減される。その結果、検定は１００標的核酸分子まで少量を検出するのに十分な感度である。結局、最も重要なことに、例えばバイナリ・リポーター・プローブといったスマート・プローブと、キャプチャー・プローブからリポーター・プローブ−標的ハイブリッドを分離する過程を伴う異なるキャプチャー・プローブとの組み合わせを使用することにより、高コスト、経時的劣化、複雑そして機械集約的である可逆的標的捕捉に頼らずに、これらの極めて感度の良い検定を実施することが可能になる。従って、高感度ハイブリダイゼーション検定が、ディップスティック上で、臨床的免疫検定で通常用いられている単純な洗浄技術を用いて実施できる。
既に述べたように、本発明は、本発明の検定法を実施するためのキットをも含む。好ましいキットは、以下の材料(items)のいくつかまたはすべてを含んでいて良い。
１．臨床サンプル中の細胞の溶菌のための５Ｍのグアニジンチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）バッファー；
２．予め選択した核酸標的に対するキャプチャー・プローブ及びリポーター・プローブ、好ましくはバイナリ・プローブを含む混合物；
３．ストレプトアビジンを共有結合させたディップスティック、反応管、または常磁性粒子のような固体；
４．磁性分離装置；
５．ヌクレオチド；
６．リボヌクレアーゼＨ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及びＱβレプリカーゼ；
７．連結反応及び増幅のためのバッファー；
８．放射性アルファ−Ｐ22−シチジン三リン酸またはヨウ化プロピジウムのような、増幅したリポーターを検出する試薬。
９．バイナリ・プローブがＤＮＡからなるとき、E.coli ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント；及び
１０．本発明の検定法を実施する手段。
基本となるキットは、バイナリ・リポーター・プローブ、少なくとも１つのキャプチャー・プローブ及び手段、即ち材料２と１０のみを含んでいてもよい。他のキットは、ユナリ・リポーター・プローブ、少なくとも１つのキャプチャー・プローブ、及び開裂薬、好ましくはリボヌクレアーゼＨ、及び手段、即ち、材料２、６及び１０を含んでいてもよい。好ましい検定のさらに完全なキットは、バイナリ・リポーター・プローブ、少なくとも１つのキャプチャー・プローブ、それらに加えて材料１、３、６及び１０を含み、適宜に材料９を含む。材料１−３及び５−１０（材料９は適当なときのみ含まれる）を含むキットは、固体がディップスティックまたは試験管であるとき、設備の整った研究所の外で実施される検定に特に有効である。
先に述べたように、本発明のある実施態様は、標的の精製を含む核酸サンドイッチハイブリダイゼーション検定のタイプである。
キャプチャー・プローブ、開裂過程及び分離過程に関する先の段落の記述は、同様に標的精製にも当てはまるが、リポーター・プローブについては考慮する必要がない。なぜならば、それらは、標的精製のときには存在しないからである。本発明の標的精製を含む検定に好適な標的は、ＲＮＡ標的である。それは、検出に好適なＲＮＡ標的は、ほとんどの場合、サンプル中の対応するＤＮＡ標的より豊富に存在するからである。
標的精製に続いてＬＣＲが行われるとき、ＲＮＡプローブ、及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（タンパク質分子）、またはテトラヒメナリボザイムリガーゼ（ＲＮＡ分子）のようなＲＮＡ向けリガーゼを用いるのが好ましい。後者を用いるとき、ＬＣＲプローブは、９ヌクレオチド長を越えない長さのハイブリダイゼーションを有する。
本発明の標的精製を含む検定法に好適なキットは、以下の材料の一部もしくは全部を含んでいてよい。
１．５Ｍ  ＧｕＳＣＮ
２．予め選択したＲＮＡ標的に対するＤＮＡキャプチャー・プローブ
３．ストレプトアビジン被覆した常磁性粒子のような固体
４．磁性分離装置
５．リボヌクレアーゼＨ
６．ＲＮＡ  ＬＣＲプライマー
７．Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
８．ＬＣＲバッファー
９．手段
完全なキットは、材料１−９のすべてを含む。基本となるキットは、少なくとも材料２、６及び９を含む。本発明の検定法の実施態様における標的精製のすべてのキットは、少なくとも材料２及び９を含み、好ましくは材料３及び５も含む。
実施例
実施例１：ＲＮＡ標的、ＲＮＡバイナリ・プローブ、ＤＮＡキャプチャー・プローブ、及びリボヌクレアーゼＨ開裂
本発明は、サンドイッチハイブリダイゼーション検定におけるバックグラウンドを低減するが、それと同時に検定のフォーマット(format)を単純化する。ＲＮＡバイナリ・プローブを採用したこの実施態様は、ＲＮＡ標的、ここでは、ヒト免疫不全ウイルス（”ＨＩＶ”）ＲＮＡによって例示するが、その検出に対して図１に一般的に示したような非常に高感度の検定法を導く。標的１の標的配列２は、ＨＩＶ  ＲＮＡのインテグラーゼ(integrase)領域に位置する。検定は、サンプルを５Ｍのグアニジンチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）に溶解することから始める。次いで、４つの異なる核酸プローブの混合物をサンプルに加える。これらのプローブは、図１に示したように、ＨＩＶ  ＲＮＡにハイブリダイゼーションする。プローブのうちの２つは、ＤＮＡからなるキャプチャー・プローブ３、４である。各キャプチャー・プローブは、その３’末端にハイブリダイゼーション配列５または６を有し、それらは標的１に相補的である。また、キャプチャー・プローブ３、４は、その５’末端にビオチン部位７を有している。他の２つのプローブ８、９は、ＲＮＡからなるバイナリ・リポーター・プローブである。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリッドはストレプトアビジン１１で被覆された常磁性粒子１０の表面に捕捉され、ストレプトアビディン１１は、キャプチャー・プローブのビオチン部位７に強く結合する。次いで、常磁性粒子１０は強力に洗浄されてハイブリダイゼーションしていないバイナリ・プローブが除去される。次に、キャプチャー・プローブにハイブリダイゼーションしている領域において標的ＲＮＡを開裂するために、ＲＮａｓｅＨを添加する。標的ＲＮＡの開裂によって、バイナリ・プローブ−標的ハイブリッド１２（図１に連結反応の後に示されている）がキャプチャー・プローブから自由になる。
開裂放出過程は、定量的であり特異的である。ＤＮＡキャプチャー・プローブまたは常磁性粒子の表面（即ち、バックグラウンド信号の源）に非特異的に結合したバイナリ・プローブは、この開裂によって放出されない。常磁性粒子１０は廃棄される。この一段階の標的依存的放出を用いた検定法では、多段階の可逆的標的捕捉法で達成される信号−ノイズ比と同等またはそれより優れた信号−ノイズ比が達成される。
上澄み中において、標的上に互いに隣接して正確にハイブリダイゼーションしたバイナリ・プローブの対は、標的に依存した方法で互いに連結する。連結したプローブ１３は、次いでＱβレプリカーゼとインキュベートすることにより増幅される。増幅された信号は、標的の存在に厳密に依存しており、時間の関数としての信号レベルは、最初のサンプル中にあるＨＩＶ  ＲＮＡの分子数の定量的な決定に用いられる。標的に依存したＲＮａｓｅＨに媒介された放出過程と、標的に依存した連結反応過程とを組み合わせることにより、バックグラウンド信号は完全に除去される。
Ａ．プローブの調製
この実施例で使用されるプローブ（図２）は、３つの機能部分を有している。標的にハイブリダイゼーションする４０−５０ヌクレオチドのヘッド、およそ４ヌクレオチドのスペーサー、及び固体表面に強く結合するテイルである。我々は、テイルにビオチン部位を選び、それを各キャプチャー・プローブの５’末端に共有結合させた。ビオチン部位は、キャプチャー・プローブの３’末端及び内部を含むあらゆる位置に結合させることが可能である。テイルは、ホモポリヌクレオチドのような他の親和性試薬から形成してもよい。
図１は、キャプチャー・プローブ３、４を標的１に結合する方法を示している。捕捉の効率を上げ、バイナリ・プローブ−標的錯体の放出の厳重さを向上させるために、１つではなく２つの異なるキャプチャー・プローブを使用した。キャプチャー・プローブ３、４は、標的１に、バイナリ・プローブが結合する標的配列２の両側において結合する。キャプチャー・プローブ３のハイブリダイゼーション配列５は、ＨＩＶゲノムＲＮＡの４４１５−４４５８領域に対して相補的であり、キャプチャー・プローブ４のハイブリダイゼーション配列６は、ＨＩＶゲノムＲＮＡの４８０８−４８５２領域に対して相補的である。図２は、この実施例で用いた２つのキャプチャー・プローブ３、４の配列を示している。下線は、標的ＲＮＡに相補的なハイブリダイゼーション配列５、６を示す。両方のキャプチャー・プローブは、ＤＮＡ合成器で調製された。
この特別な実施態様で設計されたリポーター分子は、図１に示すように、２つのバイナリ・プローブの連結反応を必要とする。バイナリ・プローブを使用することは、好ましい実施態様である。図１は、バイナリ・リポーター・プローブ８、９の設計を例示している。プローブ８の５’末端は、我々の以前の研究（Lomeli等，1989）で使用したＨＩＶに対して複製可能なプローブの最初の６９ヌクレオチドからなる。次の２３ヌクレオチドは、プローブ配列１５であり、ＨＩＶゲノムＲＮＡの４５９６−４６１８領域に相補的である。プローブ９の５’末端は、１９ヌクレオチドのプローブ配列からなり、ＨＩＶゲノムＲＮＡの４５７７−４５９５領域に相補的である。プローブ９の残りの部分１６は、我々の以前の研究（Lomeli等，1989）で使用したＨＩＶに対して複製可能なプローブのヌクレオチド９５−２８０に相当する。図２は、バイナリ・プローブ８、９の配列を示す。下線は、標的配列に相補的な、ハイブリダイゼーション配列１５、１７を示す。これらの分子は、Ｑβレプリカーゼとインキュベートするときは、いずれも良好な複製器(replicator)ではないが、互いに連結したときは、指数的に増幅可能なリポーター分子を形成する。
バイナリ・プローブ８、９は、図３に示すポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で生成されたＤＮＡテンプレートから転写された。Lomeli等1989の１８２７頁に記載されたプラスミド２０を我々はｐＴ７ＭＤＶＨＩＶ２０と呼んでいるが、これをＰＣＲ反応におけるＭＤＶの源として用いた。プラスミドの関連部分を図３に示した。これは、当然に二本鎖である。４つのＰＣＲプライマー２１、２２、２３及び２４は、プラスミド２０には存在しないが必要とされるＰＣＲ生成物２７、２８への付加的配列に貢献するように設計された。ＰＣＲ生成物２７は、プライマー２１、２２から生成された。ＰＣＲ生成物２８は、プライマー２３、２４から生成された。プライマー２２は、プローブ８に対するテンプレートにおける末端の２３のヌクレオチド２５を与える。プライマー２３は、プローブ９に対するテンプレートの５’末端におけるＴ７プロモーター２６を与える。（プラスミド２０は、プライマー２１の領域におけるＴ７プロモーターを与える。）プローブ８は、通常の方法で、そのＰＣＲテンプレートから転写されるが、プローブ９の合成は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写の条件下での修飾を必要とする。連結反応におけるホスフェート基のドナーは、プローブ９の場合、その５’末端に単一のホスフェート基を有していなければならない。転写によって調製されたＲＮＡ分子は、通常その５’末端に三リン酸を有している。５’末端に単一のホスフェート基を有するプローブ９を調製するために、ヌクレオチド５’−トリホスフェートの１０倍過剰なグアノシン５’−モノホスフェートを、転写反応に含まなければならない。これにより、プローブ９の第１の位置に、グアノシン５’モノホスフェートを組み入れることができる。結果として、プローブ９のコピーは、その５’末端に、必要とされるモノホスフェートを有する。転写の後、各バイナリ・プローブＲＮＡ８、９は、合成したポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製される。ＲＮＡは、そのゲル切片から、２Ｍのグアニジンチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）溶液中に直接溶離される。
この実施例を行うことにより、我々は、上述のように１０倍過剰ではなく、２０倍過剰のグアノシン５’−モノホスフェートを用いることにより、プローブ９がさらに改善されることを見い出した。さらに過剰量を用いると、連結反応の効率は、１０％から３０％に、３倍になった。
Ｂ．ハイブリッド化、捕捉、洗浄、及び放出
本実施例の検定法は、既知量のＨＩＶ  ＲＮＡ分子を含むサンプルに対して実施した。ＨＩＶのインテグラーゼ遺伝子のｍＲＮＡに相当するＲＮＡを、モデル標的として用いた。このＲＮＡは、我々の実験室で調製した線形化した(linearized)プラスミドｐＧＥＭ−インテグラーゼから転写することによって調製した。異なる量、例えば、１０００００００、１００００００、１０００００、１００００、１０００、１００、１０及び０分子のインテグラーゼＲＮＡを含む５０マイクロリットルの２ＭのＧｕＳＣＮを入れた８本の管を、厳格な希釈によって用意した。各キャプチャー・プローブの１０13分子と、各バイナリ・プローブ２×１０10分子とを含む２ＭのＧｕＳＣＮ溶液（５０マイクロリットル）を、各管に添加した。ハイブリダイゼーションは、摂氏３７度で１時間インキュベートすることによって行った。次いで、ストレプトアビジン（プロメガ(Promega)）で被覆した常磁性粒子の懸濁液３００マイクロリットルを、このハイブリダイゼーション混合液に添加した。摂氏３７度で１０分間インキュベートすることにより、プローブ−標的ハイブリッドを、常磁性粒子表面に捕捉した。その粒子を、２ＭのＧｕＳＣＮで４回、３００ｍＭのＫＣｌで３回、そして最後に、１Ｘリガーゼバッファー（６６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ）で２回洗浄した。洗浄後、５０マイクロリットルの１Ｘリガーゼバッファーに溶解した１単位のＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨ（ファーマシア(Pharmacia)）を添加した。摂氏３７度で１０分間インキュベートすることにより、バイナリ・プローブ−標的ハイブリッドは、常磁性粒子表面から放出された。この混合物を含む管を、磁性分離装置によって与えられた磁場に配置し、常磁性粒子を試験管の壁面に引き寄せた。次いで、アスピレーションによって上澄みを常磁性粒子から分離し、新しい管に入れた。そして、標的に正確にハイブリダイゼーションしたバイナリ・プローブを連結させるために、プローブ−標的ハイブリッドを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとともにインキュベートした。連結反応は、４０マイクロリットルの上澄み中で、４０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、摂氏３７度で１時間インキュベートすることにより行った。
また、本実施例の検定法は、既知量のＨＩＶ感染した細胞を含むサンプルに対しても実施した。臨床的サンプルに対するこの検定法の特異性及び感受性を示すために、ヒト末梢リンパ球をＨＩＶに感染させた。これらの感染した細胞は、未感染のヒト末梢リンパ球で厳密に希釈した。異なる量、例えば、６０００００、６００００、６０００、６００、６０、６、０及び０個の感染した細胞を含む８本の管を用意した。これらの管は、すべて同じ数、例えば６０００００個の細胞を含んでいる。管は遠心分離にかけられ、上澄みを除去した。各管に、２４０マイクロリットルの５ＭのＧｕＳＣＮを添加した。次いで、細胞を溶菌するために、各管を３７℃で２時間インキュベートした。溶菌の後、各管から４０マイクロリットルずつを検定した。４つすべてのプローブを含む６０マイクロリットルの溶液を、リセート(lysate)に添加した。この溶液の添加は、リセート中のＧｕＳＣＮの濃度を２Ｍまで低下させた。ハイブリダイゼーション及び引き続くすべての反応は、前の段落に記載したのと同様に行った。
Ｃ．増幅
連結したバイナリ・プローブからなるリポーター分子は、次いで、Ｑβレプリカーゼとインキュベートすることによって増幅された。増幅に先立って、リポーター分子−標的ハイブリッドを別々にメルト(melt)させる必要はない。複製反応のすべての成分を含む混合物を、８本の管各々に添加した。最後の反応混合物（１２０マイクロリットル）は、４５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、４００マイクロモルのＡＴＰ、４００マイクロモルのＧＴＰ、４００マイクロモルのＵＴＰ、４００マイクロモルのアルファ−Ｐ32−ＣＴＰ、及び１ミリリットル当たり５０マイクログラムのＱβレプリカーゼを含む。各反応は、摂氏３７℃でインキュベートされ、各反応から、インキュベーションの１０分から３１分の間、１分間隔で４マイクロリットルずつのサンプルを取り出した。各サンプルは、４５マイクロリットルの停止溶液（１２０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、及び１ｍｌ当たり３マイクログラムのプロテイナーゼＫ）と混合した。この溶液は、必要なマグネシウムイオンを隔離することによって複製を停止させる。停止溶液は、サンプルに添加する前に、タイタープレート(titer plates)で調整した。各停止した反応中のＲＮＡは、ＲＮＡを酸溶液（３６０ｍＭリン酸、２０ｍＭピロリン酸ナトリウム、及び２ｍＭのＥＤＴＡ）中で析出させ、その析出物をブロッティング(blotting)膜（ゼータ・プローブ(Zeta probe)、バイオラド(Biorad)）に捕捉し、その膜を酸溶液で洗浄することにより、組み込まれていないヌクレオシドトリホスフェートから分離された。ブロッツ(blots)上のＲＮＡはオートラジオグラフィで観察された。
Ｄ．結果
これらの結果から、バックグラウンドなしで極めて高感度が達成されることが示された。図４は、ＨＩＶインテグラーゼＲＮＡ分子の一連の希釈液に対する上述した検定法の典型的な結果を示す図である。図４はオートラジオグラムである。各行は、表示した時間に渡っての、与えられたサンプルのからの信号を示している。図４における各ドットの強度は、サンプルを取り出したときに管内に存在するＲＮＡ量に比例している。オートラジオグラムに最初にＲＮＡが見られる時間は、存在する標的の数に依存している。標的の数が増えるに従って、信号が現れるのが早くなる。標的の数が１／１０になると、少なくとも２分の遅れが生ずる。１００個の標的までは明瞭な信号を発する。１０標的分子または標的無しでは、さらに８分間インキュベーションしても信号を発しなかった（図示せず）。ＨＩＶ  ＲＮＡ標的の１００分子は、明らかに検出可能であり、それ以下では信号を発しなかった。
上述したように、検出可能な標的の最小数は１００分子である。しかし、複製前の対応する管中における、連結した複製可能なＲＮＡ分子はかなり少ない。我々は、ハイブリダイゼーション、捕捉、洗浄、及び放出の後に残ったプローブ−標的錯体の数が、最初に存在した標的数の３０％であることを実験的に決定した。さらに我々は、連結反応の効率が１０％であることを決定した。従って、最初に１００個の標的分子を含む管において、たった３個の複製可能なＲＮＡ分子が存在できるであろう。少なくとも１つの複製可能なＲＮＡ分子が増幅反応を開始することが必要とされるので、１００分子未満しか含まないサンプルは信号を発しないであろう。感染した臨床サンプルは、少なくとも１，０００この標的分子（単一の感染細胞に対応する）を含むと考えられるので、この極めて高感度の検定法は実質的にすべての臨床応用に対して十分な感度を有している。上述した連結反応効率を３倍するプローブ９の調製の改善は、この検定法の感度をさらに向上させるであろう。
図５及び６は、本発明の臨床的利用を示す２つの実験結果を示している。これらの結果は、ＨＩＶ感染したヒト末梢リンパ球に対する本発明の検定法の結果を示す。図５及び６は、図４について示したようなオートラジオグラムである。２つの実験結果をまとめて考慮すると、１００，０００個の未感染細胞を含むサンプル中の１つの感染細胞が検出でき、感染細胞を含まないサンプルでは信号が得られないことが示された。これらの実験において、各サンプルは、合計１００，０００個の細胞を含んでいる。第１の実験（図５）における結果によると、サンプル中の感染細胞の数と、信号が現れる時間との間には明瞭な関係が見られる。感染細胞の数が増加すると、信号の出現が早くなる。よって、この検定法は定性的でも定量的でもある。各々１００，０００個の未感染細胞を含む（感染細胞を含まない）２つの対照は、信号を発しなかった。しかし、１個の感染細胞を含む管もまた信号を与えなかった。我々は、溶菌の後、サンプルは完全に混合されないと仮定した。溶菌されたサンプルは（細胞(cellular)ＤＮＡの存在によって）極度に粘性が高く、２４０マイクロリットル容のリセート中に６個の感染細胞しか存在しないので、検定のために取り出される４０マイクロリットルのサンプル中にＨＩＶ  ＲＮＡをサンプリングしない可能性が高い。そのような可能性をなくすために、次の実験に使用する前に、サンプルを冷凍し、解かし、次いで強力に撹拌した。これらの良く撹拌したサンプルについても検定を繰り返した。結果は、図６の下側の６サンプルに示したように、我々の仮説が正しく、適当な撹拌の後では、約１個の感染細胞からの核酸を含む管でも適当な遅延時間において強い信号を発することが示された。
第２の実験の他の目的は、各感染細胞中のＨＩＶ  ＲＮＡ分子の数を見積もることである。この目的のために、２つの標準を用意した。第１の標準管である標準１は、１，０００，０００個のＨＩＶインテグラーゼｍＲＮＡ転写体を含む。第２の標準管である標準２は、１００，０００個の未感染細胞からのｌｙｓａｔｅ及び１，０００，０００分子のＨＩＶインテグラーゼｍＲＮＡ転写体を含む。実験結果は、図６の上側の２つのサンプルに示したように、未感染細胞からのリセートの存在は、わずかなクエンチング効果を有することが示された。この内部標準から得られた信号から、我々は、各感染細胞が約３，０００のＨＩＶ標的分子を含むことを見積もることができる。
注意書きは規則通りである。我々の実験室は、空気によって運ばれる汚染源となる傾向を有する複製可能なＲＮＡ分子についての研究に使用された。上記の検定法の試験において、ひとつの管において異常な信号を得た。増幅したＲＮＡの電気泳動分析により、それはリポーターではないことが示された。Ｑβレプリカーゼは、多くのＲＮＡを増幅し、我々のサンプルは汚染された。
実施例２：ＤＮＡ標的、ＤＮＡバイナリ・プローブ、ＲＮＡキャプチャー・プローブ及びＲＮａｚｅＨ開裂
図７に一般的に示したこの好ましい実施態様は、標的ＤＮＡに対するものであり、ＤＮＡからなるバイナリ・プローブ５８、５９を使用する。この実施例では、キャプチャー・プローブ５３、５４は、ＲＮＡからなり、ビオチン部位、この場合では、固体表面に固定化するための末端ビオチン部位５７を有する。キャプチャー・プローブの配列を図８に示した。各バイナリ・プローブは、増幅可能なＲＮＡに転写できるＤＮＡテンプレートの部分である。バイナリ・プローブ５８は、その５’末端６４に、標的配列５２の部分であるＨＩＶ  ＲＮＡ５１の４５３２−４５５３領域に対してハイブリダイゼーションできる２２のヌクレオチドを含んでいる。このプローブ配列６４の隣は、ＭＤＶ−１（＋）ＲＮＡの５’末端をエンコードする６０のヌクレオチド６３である。プローブ５８の３’末端は、ヘアピン構造６０を形成する。このＤＮＡの３’末端が、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントとインキュベートすることによって延長されたとき、得られる二本鎖ＤＮＡはＭＤＶ−１配列に向けられたＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む。図８は、ヘアピン構造６０を含むプローブ５８の配列を示す。囲み６７は、プローブ５８の３’末端が囲み６７を”満たす”ように延長されたときＴ７プロモーターとなるものを示している。バイナリ・プローブ５９は、その３’末端６６に、標的配列であるＨＩＶ  ＲＮＡの領域４５５４−４５７６に相補的な２３のヌクレオチドを有している。このプローブ配列６６の隣は、ＭＤＶ−１（＋）ＲＮＡの３’末端をエンコードする１５８のヌクレオチドからなるセグメント６５である。２つのＤＮＡバイナリ・プローブの配列を図８に示した。プローブ５８は、ＤＮＡ合成器で合成された２つのオリゴデオキシリボヌクレオチドの連結反応によって調製された。プローブ５９は同様にして調製された。しかし我々は、ＤＮＡ配列をバクテリオファージＭ１３ベクターに連続的にクローニングすることによって調製した。ファージからの一本鎖ＤＮＡが単離された。このＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼによって、プローブ配列の末端において開裂された。開裂の部位は、オリゴデオキシリボヌクレオチドとハイブリダイゼーションすることによって二本鎖にされた。開裂したプローブ配列は、ゲル電気泳動によって精製された。
これらのプローブは、ＨＩＶ  ＲＮＡとハイブリダイゼーションし、そのハイブリッドは捕捉され、実施例１と同じ方法で洗浄された。洗浄の後、常磁性粒子をＲＮａｓｅＨとともにインキュベートした。ＲＮａｓｅＨは、標的にハイブリダイゼーションしたキャプチャー・プローブを分解させ、バイナリ・プローブ−標的ハイブリッド７０（図７に示した）を上澄み中に放出する。この上澄み中のハイブリッドは、次いで常磁性粒子から分離され、新しい試験管に移された。次に、ハイブリッドは、標的に正確にハイブリダイゼーションしたバイナリ・プローブを結合するために、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとともにインキュベートした。連結反応の後、ハイブリッドは、転写体７１を生成するために、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼとともにインキュベートした。これらのインキュベーションは、図７に、別の過程として示した。これらの酵素の働きを組み込むことにより、（実施例１に記載したような）Ｑβレプリカーゼとのインキュベーションによって連続的に指数的に増幅される複製可能なＲＮＡ分子の調製が導かれる。
実施例３：ＲＮＡ標的、ＲＮＡバイナリ・プローブ、ＤＮＡまたはＲＮＡキャプチャー・プローブ及びリボザイム開裂
リポーター・プローブ−標的ハイブリッドを標的に依存して放出する我々の最も好ましい方法は、ＲＮａｓｅとインキュベートすることによって標的を開裂することである。ある状況では、リボザイムは、標的を、キャプチャー・プローブ及びリポーター・プローブの間の領域で特異的に開裂するのに用いられる。この開裂に対しては、「ハンマーヘッド(hammerhead)」リボザイム（HaseloffとGerlach，1988）が好ましいが、この領域を標的とすることのできる他のリボザイムも使用することができる。図９は、ハンマーヘッドリボザイムを用いたこの実施例の、ひとつの実施態様を例示している。
標的ＲＮＡ８１は、標的配列８２を含んでいる。ハイブリダイゼーション配列８５及びビオチン部位８６を含む単一のＤＮＡキャプチャー・プローブ８４が、常磁性粒子８７に、そのストレプトアビジン被覆８８を介して結合していることが示されている。ＲＮＡバイナリ・リポーター・プローブ９０、９２の対が、標的配列８２上で、各々配列９１、９３を介して互いに隣接してハイブリダイゼーションしていることが示されている。キャプチャー・プローブ８４とリポーター・プローブ９０、９２のあいだの位置で標的８１にハイブリダイゼーションしているのは、ハンマーヘッドリボザイム８９であり、それはハイブリダイゼーション配列９４、９５を含んでいる。配列９４、９５は、「認識配列(recognition sequence)」と呼ばれることもある。
このリボザイム８９は、認識配列９４（２５−３０のヌクレオチド長）が、認識配列９５（６−７のヌクレオチド長）より長くなるように設計されている。リボザイム８９は、付加的プローブとして加えられる。８３における標的の開裂を効率的にするため、マグネシウムイオン濃度を２０ミリモル濃度に調製し、管を５５℃で６０分間インキュベートした。認識配列９５が充分短いので開裂した標的を保持できないため、リポーター・プローブ−標的ハイブリッドは溶液中に放出される。この放出は標的依存性である。放出に引き続いて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとインキュベーションすることによってバイナリ・プローブ９０、９２が連結される。次に、連結したプローブ、即ちリポーター・プローブ（図示せず）は、Ｑβレプリカーゼとインキュベーションすることにより増幅される。
この実施例と代替できる実施態様では、ＲＮＡキャプチャー・プローブが用いられ、キャプチャー・プローブのヘッドはリボザイムである（あるいは、キャプチャー・プローブのヘッドは、リボザイム及び標的に相補的な付加的配列からなる）。
実施例４：ＲＮＡ標的、ＤＮＡバイナリ・プローブ、ＤＮＡキャプチャー・プローブ及びＲＮＡ部位特定プローブをともなうＲＮａｓｅＩＩＩ開裂
リポーター・プローブ−標的ハイブリッドは、我々が「放出プローブ」と呼ぶことのある４０−５０のヌクレオチド長の部位特定プローブに補助された標的に依存した方法によって放出される。このプローブは、ＲＮＡからなっていなければならず、他のプローブに沿ってＲＮＡ標的にハイブリダイズすることができる。ＲＮａｓｅとのインキュベーションは、標的をキャプチャー・プローブとバイナリ・リポーター・プローブとの間で開裂し、バイナリ・リポーター・プローブ−標的ハイブリッドを増幅用溶液中に放出する。ＲＮａｓｅＩＩＩ開裂部位は、二本鎖ＲＮＡの特定の配列について、文献に記載されているが、我々は、３０ヌクレオチド長より長い二本鎖ＲＮＡがＲＮａｓｅＩＩＩの良好な基質であることを観察した。このために、ＲＮＡリポーター・プローブとＲＮＡ標的の間のハイブリッドは分解し、ＤＮＡリポーター・プローブとＤＮＡキャプチャー・プローブが用いられる。
ＤＮＡバイナリ・プローブの好ましい設計を図１０に示した。標的ＲＮＡは、標的配列１０２を含んでいる。ハイブリダイゼーション配列１０５とビオチン部位１０６とを含む単一のＤＮＡキャプチャー・プローブ１０４が、常磁性粒子１０７に、そのストレプトアビジン被覆１０８を介して結合しているのが示されている。ＤＮＡバイナリ・リポーター・プローブ１１０、１１３の対が、標的配列１０２に、各々の配列１１１、１１４を介して、互いに隣接してハイブリダイゼーションしているのが示されている。プローブ１１０は、実施例２のプローブ５８と同様に、延長してＴ７プロモーターを形成できる末端部位１１２を有している。部位特定プローブ５９が、キャプチャー・プローブとリポーター・プローブとの間で、標的１０１とハイブリダイゼーションしているのが示されている。プローブ５９は、上述の通りである。ＲＮａｓｅＩＩＩとインキュベートすることにより、標的１０１は１０３において開裂する。
我々は、１１０、１１３のようなＤＮＡバイナリ・プローブが、標的に依存した方法でＴ４ＤＮＡリガーゼとインキュベートすることにより連結されることを示した。増幅可能なリポーターＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとのインキュベーションによる連結したＤＮＡバイナリ・プローブの転写によって生成される。引き続いて、ＱβレプリカーゼとのインキュベーションによるリポーターＲＮＡの増幅によって検出可能な信号が得られる。リポーター分子が組換えＭＤＶ−１ＲＮＡであるとき、プロモーターを完成するため、もし必要なら、ＤＮＡ鎖を延長して二本鎖テンプレートをするために、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとともに、少なくとも、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントが加えられる（そして、もちろんデオキシリボヌクレオチドが加えられる）。
実施例５：ＲＮＡ標的、ＤＮＡバイナリ・プローブ、ＲＮＡキャプチャー・プローブ及びＲＮａｓｅＩＩＩ開裂
実施例４で記載したＤＮＡキャプチャー・プローブではなく、キャプチャー・プローブはＲＮＡからなることができる。これにより、部位特定プローブを用いる必要が無くなる。キャプチャー・プローブ−標的ハイブリッド自身が、ＲＮａｓｅの基質となる。ＲＮａｓｅとのインキュベーションにより、バイナリ・プローブ−標的ハイブリッドが特異的に放出される。この放出に続いて、増幅された信号を発生させるために、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（及び実施例４で議論したように、おそらくＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント）、及びＱβレプリカーゼとインキュベートされる。
実施例６：ＲＮＡ標的、ＤＮＡバイナリ・プローブ、ＤＮＡキャプチャー・プローブ及びＲＮａｓｅＡ開裂
キャプチャー・プローブ及びリポーター・プローブがＤＮＡからなるとき、放出のために、ＲＮａｓｅＡのようなシングルストランド特異的リボヌクレアーゼが用いられる。ＲＮａｓｅＡは、標的を、プローブ−標的領域では開裂しない。なぜなら、その通常の基質が一本鎖ＲＮＡであるからである。しかし、標的開裂はキャプチャー・プローブと標的配列の間で起こるので、その放出は特異的である。非特異的に結合したリポーター・プローブが、キャプチャー・プローブ上に残っており、それは粒子表面に永久的に結合している。この放出に続いて、増幅された信号を発生させるために、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（及び実施例４で議論したように、おそらくＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント）、及びＱβレプリカーゼとインキュベートされる。
実施例７：ＤＮＡ標的、ユナリまたはバイナリ・プローブ、ＤＮＡキャプチャー・プローブ及び制限エンドヌクレアーゼ開裂
標的がＤＮＡであるとき、制限酵素が用いられる。キャプチャー・プローブのヘッドの配列は、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有している。リポーター・プローブ−標的ハイブリッドは、適当な制限エンドヌクレアーゼを持つ常磁性粒子とインキュベートすることにより、キャプチャー・プローブから放出される。リポーター・プローブの好ましい実施態様は、実施例１のようにＲＮＡバイナリ・プローブの対であるが、リポーター・プローブは、実施例４のようにＤＮＡバイナリ・プローブの対であってもよく、あるいは、リポーター・プローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡのユナリ・プローブであってもよい。バイナリ・プローブを用いる場合、放出されたバイナリ・プローブ−標的ハイブリッドは、次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとインキュベートされ、次いで、直接的または間接的に増幅される。
実施例８：ＤＮＡ標的、ＤＮＡバイナリ・プローブ、ＲＮＡキャプチャー・プローブおよびＲＮａｓｅＨ開裂
標的及びリポーター・プローブがＤＮＡであり、キャプチャー・プローブがＲＮＡからなるとき、キャプチャー・プローブからバイナリ・プローブ−標的ハイブリッドを特異的に放出させるためにＲＮａｓｅＨが使用できる。この放出に続いて、増幅された信号を発生させるために、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（及び実施例４で議論したように、おそらくＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント）、及びＱβレプリカーゼとインキュベートされる。
実施例９：リボザイムリガーゼ
この実施例は、ＲＮＡバイナリ・プローブ及び「つないだ(tethered)」リガーゼを用いたＲＮＡ標的の検定法を記載する。この「つないだ」リガーゼは、以下の３つの領域からなるＲＮＡ分子である。（１）リボザイムリガーゼ配列、（２）標的の標的配列近傍の領域に相補的な配列である「止め具(holdfast)」、及び、（３）リボザイムリガーゼ配列を止め具に結合する「つなぎ具(tether)」である。つないだリボザイムリガーゼは、Lizardi等の出願番号08,005,895に記載されているが、これは、ＲＮＡバイナリ・プローブを用いたＲＮＡの診断的検定法について、Tyagi, Landegren, Lizardi, Kramer及びSzostakによって本願と同日に出願されたものである。その出願では、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａリボザイムリガーゼ（DoudnaとSzostak, 1989）、及び、Lizardi等，出願番号08,005,895に記載された特別のバイナリ・プローブを使用している。
Ａ．バイナリ・リポーター・プローブ及びつないだリボザイムリガーゼの調製
「第１のプローブ」は、合成（人工）遺伝子のインビトロ転写で形成された７１のヌクレオチド長のＲＮＡである。このＲＮＡの配列は以下の通りである。
0003778925.tif 000003
このＲＮＡの最後の９ヌクレオチド（下線部）が、ＨＩＶ−１  ＲＮＡ標的配列の部分である配列３’−ＵＵＧＧＣＡＵＣＧ−５’に相補的な「第１のプローブ配列」である。
「第２のプローブ」は、以下の配列を持つ１８６−ヌクレオチド長のＲＮＡである。
0003778925.tif 000004
このＲＮＡの最初のヌクレオチドはグアノシンであり、それはＨＩＶ−１  ＲＮＡと対をなさないがテトラヒメナリボザイムリガーゼによる連結反応（DoudneとSzostak, 1989）には必要である。次の２８ヌクレオチド（下線部）は、配列３’−ＵＵＧＧＣＡＵＣＧ−５’の５’末端に隣接したＨＩＶ−１ＲＮＡ標的配列の他の部分である配列３’−ＵＧＡＣＣＡＣＵＵＵＡＡＣＧＡＣＧＧＵＡＡＣＡＧＡＣＡＵ−５’に相補的な「第２のプローブ配列」である。
第２のプローブは、設計されたＲＮＡ配列をコードし、Ｔ７プロモーターを有する合成遺伝子のインビトロ転写によって形成される。この合成遺伝子は、以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（Erlich等，1991）によって生成される。
0003778925.tif 000005
これらのプライマーは、Lomeli等，1989の1827頁に記載されているプラスミドｐＴ７ＭＤＶＨＩＶ２０の存在下でのポリメラーゼ連鎖反応において、第２のプローブの合成のための合成遺伝子を形成するために用いられる。１８６−ヌクレオチド長の転写は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製される。
つないだリボザイムリガーゼは、DoudnaとSzostak（1989）に記載されたように、インビトロ転写によっ生成される。つないだリボザイムリガーゼの転写のための合成遺伝子は、以下のプライマーを用いたプラスミドｐＪＤ１１００（DoudnaとSzostak, 1989）からのＰＣＲによって形成される。
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インビトロ転写の生成物は、３４５ヌクレオチド長で、配列５’−ＧＴＴＴＴＴＡＣＴＧＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧＣＴＡＡＴＴＴＴＡＡ−３’、及び、テトラヒメナリボザイムリガーゼ（DoudnaとSzostak, 1989）のＰ２ステムに結合した配列５’−ＴＴＴＧＡＧ−３’を持つつなぎ具を有する。止め具は、ＨＩＶ−１ＲＮＡ中の標的配列から取り出した５ヌクレオチドである配列に相補的である。
各バイナリ・プローブは、Ｑβレプリカーゼとのインキュベーションによって指数的に増幅されるか否かを試験された。
Ｂ．ＨＩＶ−１ＲＮＡの検定
検定は、各サンプルを２０マイクロリットルの５ＭのＧｕＳＣＮに溶解し、次いで各サンプルに、１０13分子の各キャプチャー・プローブ、２×１０10分子の第１のプローブ、２×１０10分子の第２のプローブ、及び２×１０10分子のつないだリボザイムリガーゼを含む８０マイクロリットルの溶液を添加した以外は、実施例１の検定と同様である。ハイブリダイゼーション及び洗浄は、２ＭのＧｕＳＣＮではなく１ＭのＧｕＳＣＮで行った。次いで、１回のリガーゼバッファーでの洗浄ではなく、リボザイムリガーゼバッファー（１０ｍＭのＮＨ4Ｃｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ2、４ｍＭのスペルミジン、及び３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）を用いた。次に、リボザイムリガーゼバッファーに溶解した１単位のＲＮａｓｅＨを添加し、３７℃で１０分間インキュベートすることによって、バイナリ・プローブ−標的ハイブリッドを、常磁性粒子表面から放出した。次いで、実施例１に記載したように、バイナリ・プローブ−標的ハイブリッドを粒子から分離した。分離したバイナリ・プローブ−標的ハイブリッドは、次いで、バイナリ・プローブを標的向けの形状に連結させるため、５８℃で６０分間インキュベートした（DoudnaとSzostak, 1989）。検定法のその他の部分は、実施例１に記載した通りである。
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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