(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自然発症した「新穴あき病」炎症部より分離した非定型エロモナス・サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）を、グリセリン、酵母エキス及び非イオン性界面活性剤を添加したハートインヒュージョン培地を用いて、まず18℃〜25℃で２〜７日間静置培養し、次に18℃〜25℃で２〜５日間撹拌培養することを特徴とする非定型エロモナス・サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）の大量培養方法。
【請求項２】
ハートインヒュージョン培地の濃度が2.5％であり、グリセリン、酵母エキス及び非イオン性界面活性剤の添加量が、それぞれ10.0％、0.5%及び0.05％である請求項１に記載の非定型エロモナス・サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）の大量培養方法。
【請求項３】
24℃で３日間静置培養し、24℃で２日間撹拌培養する請求項１又は２に記載の非定型エロモナス・サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）の大量培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、不活化ワクチンと非油性のアジュバントを混合投与により生体防御活性能を高め、それによって細菌感染から防御しようとするものであり、更に詳しくは、「新穴あき病」症の起因菌である非定型Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ（エロモナス・サルモニシダ）菌体をホルマリン処理により不活化した細菌細胞を非油性アジュバント、例えばアルミニウム塩粒体アジュバントと混合し、対象魚例えばニシキコイの腹腔内に投与して、生体防御機能を高める事により感染防御活性を亢進させるものである。なお、本発明でいうＡ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａは特定の菌株に限定するものでなく、「新穴あき病」の起因菌である非定形Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ 全属をさすものでる。
【０００２】
【従来の技術】
魚病ワクチンについては公開番号１１−３３２５５８にブリ類の腸球菌感染症の予防ワクチン，公開番号８−４０９３２にスタフィロコカス属の感染症の予防ワクチン、開番号特開平６−１１３８３４にフグ科類の口白症のウイルスの予防ワクチン、開番号特開平９−１７６０４３に魚類用のイリドウイルス感染症ワクチンがそれぞれ開示されている。
【０００３】
一方、養殖ニシキコイで体表部に潰瘍性炎症を伴い致死性の高い疾病が流行し、大きな被害ををもたらしている。  本疾病は１９７０年代にキンギョやニシキコイで流行した「穴あき病」に類似しているが、体幹部に潰瘍性炎症を伴う点は「穴あき病」の症状と同じであるが、鰭や鰭基部、口唇部、鰓などにも潰瘍性炎症が発症し、致死性が高いを特徴とし、従来の「穴あき病」とは異にしており、錦鯉養殖業界では、これを「新穴あき病」と称している。
【０００４】
本疾病は当歳魚などの小型魚でも発症し、致死性が高く、従来の治療で有効であった水産用抗菌剤の投与や昇温治療法で効果は認められず、また潰瘍患部の大きさに関わらず、死に到らしめる。  「新穴あき病」の羅患鯉の発生した際、池の消毒、保菌鯉の完全隔離を行い、他鯉への感染を防御する手段をとらなければならない。
従って、その発症原因の究明と予防治療法対策の確立が緊急の課題となっていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
最近、若林等により自然発症羅患ニシキコイの潰瘍炎症部位より菌株が分離され、表現形質および１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列により、この菌株が非定型Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａと同定され、皮下注射によりその強い病原「新穴あき病」性を認めるとともに、この菌株が原因菌であるとした。この菌は非常に伝播性が強く、「新穴あき病」の蔓延防止にはワクチンの投与が必須である。
【０００６】
しかし、Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ  は良好な発育を示す定型すら、ＶＢＮＣ（Ｖａｂｌｅ  ｂｕｔｎｏｎ−ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ生育しているが培養不可菌）に馴化し、移行してしていくとも言われている。まして、培養が困難な非定形Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａを大量培養し、多量の菌体を取得する事は不可能であった。
【０００７】
【発明の実施の形態】
発明者は鋭意に検討を重ね、ハートインフージョン培地で通気量を培養途中でｓｉｆｔ−ｕｐする事により大量の菌体の取得に成功した。さらに、腹腔内投与による抗体価の上昇のために使用する免疫補助剤（Ａｄｊｕｖａｎｔ）  は一般的にオイルベース基材が使用され、そのため接種部位に潰瘍が発症し、従ってニシキコイの商品価値を損なう恐れがあった。  発明者はさらに検討を重ね、炎症を伴わない非油性のＡｄｊｕｖａｎｔアルミニウム塩を使用使用することにより接種部位に潰瘍が発症しない方法に成功した。
【０００８】
次に、非定型Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ  ワクチンの製造について詳述する。「新穴あき病」の羅患鯉の体表患部、腎臓、脾臓及び肝臓を摘出し、その摘出臓器に無菌生理食塩水を加えて、ホモジナイザーで冷やしながら粉砕させる。粉砕液を傾瀉させ、その上清液を集める。得られた上清液を３％馬脱繊維血液寒天培地に劃線塗抹し、２５℃  ５日間培養する。
【０００９】
得られた菌株の生化学的性状および血清学的分類等により非定形Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａであると確認する。さらに、その菌株を皮下接種法により、その病原性を調べる。
【００１０】
病原性と血清学的確認により同定された起因菌はハートインヒュージョンおよびブレンハートインヒュージョン液体培地１．０ｍｌに１０２〜１０８ＣＦＵ、好ましくは１０６ＣＦＵになるよう懸濁し、−８５℃で保存する。菌株の培養に際しては、−８５℃で保存した菌株を２０℃〜５０℃好ましくは４０℃で急速に溶解させる。完全に溶解させた後、直ちに氷冷する。
【００１１】
この溶解懸濁液０．１ｍｌをハートインヒュージョン  またはブレインハートインヒュージョン液体培地５ｍｌを含む試験管に接種し、１８℃〜２５℃、好ましくは２４℃で２〜７日  好ましくは５日間培養し、これを前々種培養とする。
次いで、上記培地５０ｍｌを含む１００ｍｌ三角フラスコ培地に前々種培養を移植し、１８℃〜２５℃、好ましくは２４℃で２〜７日、好ましくは５日間培養する。これを前種培養とする。
【００１２】
次いで、本培養としてハートインヒュージョンおよびブレンハートインヒュージョン液体培地  ９５０ｍｌと攪拌子を含む１０００ｍｌの三角フラスコに接種し、１８℃〜２５℃、好ましくは２４℃で２〜７日  好ましくは３日間静置培養し、続いて１８℃〜２５℃、好ましくは２４℃で、２〜５日、好ましくは３日間攪拌培養する。
【００１３】
得られた培養懸濁液を無菌的に２５００ｘＧ〜５０００ｘＧ、好ましくは３０００ｘＧ、１０〜３０分、好ましくは２０分間遠心分離（ＫＯＫＵＳＡＮ  Ｈ−１０３Ｎ  では３５００ｒｐｍ，２０分）を行い、集菌する。
【００１４】
次いで、無菌リン酸緩衝化生理食塩水で数回洗菌、好ましくは２〜３回洗菌する。洗浄菌体を無菌水に懸濁させ、その濃度が５０ｍｇ〜５００ｍｇ（湿体重量）、好ましくは１００ｍｇ（湿体重量）になるよう調整した後、ホルマリンを徐々に添加し、その濃度が０．３〜０．７％、好ましくは０．５％になるよう調整する。  このホルマリン処理は１８℃〜２５℃  好ましくは２４℃で１８〜３０時間  好ましくは２４時間攪拌しながら反応を行なう。
【００１５】
ホルマリン処理懸濁液を無菌精製水あるいは無菌蒸溜水で３〜１０回、好ましくは５〜７回洗浄し、ホルマリンが残留していない事、及びこの懸濁液にＡ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａの生菌が存在していない事を確認する。
【００１６】
確認した後、１ｍｇ／ｍｌ  （無菌水）の懸濁液に調整し、バイアル瓶に無菌充填する。
【００１７】
【実施例】
〈実施例１  ワクチンの製造〉
（００１）  「新穴あき病」罹患コイの体表発症患部より分離した非定型Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ  をハートインフージョンブイヨン（日水製薬製）溶液に、数回精製水で洗浄した細菌用粉末寒天（日水製薬製）１％を加え、１２１℃、２０分間加圧滅菌後、ペトリシャーレに流し込み固化する。このペトリシャーレ培地にＡ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａを劃線塗抹し、２４時間  ４日間培養する。
（００２）  （００１）で得られたシャーレに滅菌ハートインフージョンブイヨン１０ｍｌを流し込み、無菌的に菌を掻き取る。  得られた細菌懸濁液（ＯＤ６０００．５）０．５ｍｌを１ｍｌ用滅菌バイエルに注意深く移し込み、−８５℃で保存する。
（００３）  −８５℃で小分け保存したＡ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａを約４０℃の水で急速溶解後、氷冷中で保存した。
（００４）  ハートインヒュージョン液体培地５ｍｌを含む試験管６本を１２１℃、２０分高圧滅菌し、放冷後、（００３）で得られた溶解保存液を接種し、２４℃、５日間静置培養した。これを前々種培養とした・
（００５）  ハートインヒュージョン液体培地５０ｍｌを含む１００ｍｌ三角フラスコ６個に、（００４）で得られた前々種培養を移植する。次いで、２４℃、７日間静置培養しこれを種培養とした。
（００６）  ハートインヒュージョン液体培地９５０ｍｌと攪拌子を挿入した１０００ｍｌの三角フラスコを前述同様の条件で滅菌し、（００５）で得られた前培養を接種した。次いで、２４℃、３日間静置培養し、これをマルチ攪拌機（Ｓｌｏｗ  ｓｔｉｒｒｅｒ  ＳＷ−８００Ｎ−１ＮＩＳＳＩＮ  製）に乗せ、目盛６に合わせて２４℃３日間攪拌培養を行なった。実測濁度、ＯＤ６００  １．１０）。
（００７）  （００６）で得られた培養液６Ｌを遠心機（ＫＯＫＵＳＡＮ  Ｈ−１０３Ｎ）３５００ｒｐｍ、２０で集菌した。得られた菌体を無菌精製水で３回水洗した（湿体５０ｇ）。
（００８）  （００７）で得られた菌体（湿体５０ｇ）を更に無菌リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）３００ｍｌで１回、（００７）で記載した方法で洗浄した。
（００９）  ＰＢＳ洗浄菌体（湿体５０ｇ）を４００ｍｌの滅菌ＰＢＳに懸濁した。
（０１０）  （００９）で得られた懸濁液を攪拌しながらホルマリンの濃度が０．５％になるよう注意深く添加し、２４℃で２４時間反応した。
（０１１）  （０１０）で得られたホルマリン処理菌体を無菌ＰＢＳで４〜５回洗浄を繰り返した。
（０１２）  （０１１）で得られた洗浄菌体（乾燥菌体として８２０ｍｇ）を無菌ＰＢＳ１０ｍｌに懸濁した。この懸濁液にＡ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａの生菌およびホルマリンが残存していない事を衛生試験法に準じ確認した。この懸濁液を適宜希釈し１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう調整した。
（０１３）  （０１２）で得られて懸濁液を滅菌したバイエル瓶に無菌的に１．０ｍｌを充填し冷蔵保存した。これを不活化ワクチンとした。
【００１８】
＜実施例２  免疫補助剤（アジュバンド）の調整
（０１４）  ５００ｍｌの容器に硫酸アルミニウム（Ａｌ２（ＳＯ４）３・１８Ｈ２Ｏ）１６．７ｇを２５ｍｌの蒸留水に溶かす。次いで１Ｎの苛性ソーダ（ＮａＯＨ）を徐々に加えて混合する。得られた沈殿物を蒸留水で数回洗う。次いでこの沈殿物を粉散機（Ｍｏｄｅｌ  Ｓ−１  ナショナル製）にかけて微粒子とした。
（０１５）  （０１４）で得られた微粒子懸濁液を少なくとも１０分以上の静置で沈殿しない懸濁液とした。
（０１６）  この乾燥重量を量り、正確に無菌ＰＢＳに１０ｍｇ／ｍｌになるよう調整し、滅菌バイエル瓶に充填した。これを冷蔵で保存する。
【００１９】
＜実験例１  安全性試験＞
（０１７）  平均重量４０ｇの当歳魚の供試鯉に（０１３）で得られた不活化ワクチンおよび（０１６）で得られた免疫補助剤を等量混合した被検液を実投与量である０．２ｍｌ（実験例１（０１７）０．２）を基本量として、その２倍量（実験例１（０１７）０．４）および３倍量（実験例１（０１７）０．６）を各群５尾に腹腔内投与し、１ヶ月間１７℃で５０Ｌ水槽で通気をを伴って飼育した。その生存数と体幹部の異常観察、体重測定と剖検所見により安全性を検討した。その結果を表１に示す。
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この表から分かるようにワクチンの実投与の３倍量でも何ら異常は認められず、本ワクチンが安全である事を確認した。なお、比較試験として無菌リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）０．６ｍｌを腹腔内投与した（比較試験（０１７））。
【００２０】
＜実験例２  ワクチン投与による凝集抗体価の確認＞
（０１８）  本発明の不活化ワクチン（１０ｍｇ／ｍｌ）および免疫補助剤（アジュバント）（１０ｍｇ／ｍｌ）の等量混合液０．２ｍｌを供試鯉の腹腔内に投与し（実験例２−１）、常法通り２週間飼育した後、尾静脈よりヘパリンで処理した注射筒で採血した。なお、比較試験として無菌ＰＢＳ０．２ｍｌを同様腹腔内に投与した（比較試験（０１８））。
（０１９）  （０１８）で記載した同様の方法で、実投与量の２倍量の不活化ワクチン（実験例２−２）および３倍量の不活化ワクチン（実験例２−３）免疫補助剤と混合して投与し、投与量により凝集抗体価について検討した。次いで常法通り２週間飼育したのち、尾静脈よりヘパリン処理した注射筒により採血した。
（０２０）  （０１８）および（０１９）で得られたヘパリン化血液を常法通り血清を調整した。
（０２１）  得られた血清の抗体化はマイクロタイター法で行なった。即ち、ＰＢＳで段階的に希釈した血清２５μｌを各ウェルに流し込み、次いで不活化ワクチン懸濁液（１０ｍｇ／ｍｌ）２５μｌを各ウェルに添加した。充分に混合した後、一昼夜室温で放置して凝集反応を行なった。尚、対照実験として、正常な鯉にワクチンの代わりにＰＢＳを腹腔内に投与し、２週間飼育後、採血して血清を調整した。生じた凝集は目視で確認し、凝集が生じなくなったウェルを１〜１２のスコアーで評価した。なお、凝集価はＬｏｇ２で表示した。
（０２２）  この結果を表２に示す。  表中、（＋）は凝集陽性を（−）は陰性を示す。この際、Ｂｌａｎｋとは、不活化ワクチン（菌体  １０ｍｇ／ｍｌ）２５μｌとＰＢＳ  ２５μｌのみをウエルに添加したものである。
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（０２３）  不活化ワクチン０．２ｍｌ（実投与量）の投与量で、飼育２週間後の凝集抗体価はスコア１０（１：１０２４）であり、この抗体力価は不活化ワクチンの投与量による差は認められなかった。不活化ワクチン０．２ｍｌ（実投与量）の投与量で充分に抗体が産生されている事を確認できた。
【００２１】
＜実験例３  チャレンジ試験による有効性の確認＞
チャレンジ試験に供試した被検鯉は３０日間１７℃、一日一回の投餌で予備飼育を行い、体重測定、外観観察を行い異常がない事を確認した。
（０２４）  実験群としてワクチン非投与・非感染群１１尾（陰性対照  比較試験１）、ワクチン非投与・感染群１１尾（陽性対照  実施例１）およびワクチン投与・感染群１１尾（陽性対照  実施例２）の３群に群別した。
各被検鯉は１７℃に保温した５０Ｌ水槽で通気しながら飼育した。
（０２５）  感染スケジュールは、（０１８）で調整した不活化ワクチンを腹腔に投与して２週間後にチャレンジ試験に供した。
（０２６）  感染は−８５℃で保存したＡ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ懸濁液を急速溶解させ、直接ハートインヒュージョン寒天培地に塗抹し、２４℃  ５日間培養した菌体を用いた。
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（０２７）  培養菌体を無菌ＰＢＳで掻きとり、同無菌緩衝液で洗浄した。洗浄菌体を滅菌したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３  ０．０１Ｍ）３．０Ｌに均一になるよう均一に懸濁し、これを浸漬感染液とした。
（０２８）  浸漬感染液のＡ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ  生菌濃度は６．７ｘ１０６ＣＦＵ／ｍｌとした。
（０２９）  １７℃に保持した感染液３．０Ｌに被検鯉１１尾を１時間浸漬し、感染させた。  感染後、１７℃に保った５０Ｌの水槽に移し、飼育した。なお、給餌は一日一回とした。
（０３０）  Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ  感染後の被検鯉の死亡の推移を図１に示す。ワクチン非投与・感染群は感染後、８日目で斃死が始まり、２８日で全数斃死した。しかし、ワクチン投与・非感染群では２８日間の飼育で２尾のみが斃死したに過ぎない。
（０３１）  表３は感染後２８日目の死亡推移の結果を纏めたものである。
ワクチン投与・非感染群の感染後飼育２８日目のＲＰＳ値（相対生存率）は８１．８％であり、その有意性をＦｉｓｈｅｒの直接確立計算値より求めた。その結果、表３に示すように、直接確立計算値は０．０２％となり、統計学的にもその有意性を確認した。
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【００２２】
＜実験例４  斃死鯉の潰瘍性炎症の確認＞
（０３２）  Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａの感染により斃死した鯉に発症した潰瘍性炎症部位の平均数をワクチン非投与・感染群およびワクチン投与・感染群別に纏めたのが表３である。
（０３３）  表４に示すように、ワクチン非投与・感染群の斃死鯉に発症した潰瘍性炎症患部数は１尾当たり平均４．８の炎症患部が検出されるのに反し、ワクチン投与・感染群の斃死鯉での炎症患部数は１尾当たり１箇所の炎症が検出されたに過ぎない。統計学的にも有意差が認められ、ワクチンにより潰瘍性炎症の発症を抑制していることが確認された。
【００２３】
＜実験例５  斃死鯉より感染菌の回収＞
（０３４）  斃死鯉の体表潰瘍患部および腎臓、肝・膵臓より感染菌の回収を行なった。
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（０３５）  体表の潰瘍部患部からは無菌的に切除し、また腎臓、肝・膵臓は無菌的に摘出し、定法とおりホモゲナイズした後、無菌ＰＢＳで段階的希釈を行いハートインヒュージョン寒天培地あるいは馬脱繊維血（日本バイオテスト研究所製）を含むトリプトソーヤ寒天培地（日本製薬製）で検出した。培養は２４℃、４〜５日間行った。
（０３６）  この結果を表５に示す。
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（０３７）  本表に示すように、ワクチン非投与・感染群の斃死鯉で発症した全例の体表部潰瘍性炎症患部から感染菌であるＡ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａは回収されたが、腎臓、肝・膵臓からの感染菌の回収は１１尾中３尾に過ぎなかった。
ワクチン投与・感染群で斃死した被検鯉の体表患部（尾鰭）からはＡ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａは検出できなかった。
【００２４】
＜実験例６ Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａの大量培養の検討＞
（０３８）ブドウ糖０．１％、食塩０．０５％、リン酸水素２カリウム０．２５％を基礎培地として種々の有機体窒素について検討した。その結果、表６に示すように、Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａの生育にはハートインヒュージョンおよびブレインハートインヒュージョンが至適有機窒素体であると認めた。そのうち、酵母エキス、ポリペプトンおよび肉エキスではＡ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａの増殖は認められなかった。
（０３９） ハートインヒュージョン２．５％を基本培地として、種々の糖類１．０％の影響について検討したところ、ブドウ糖、ショ糖、マンニット、乳糖では殆ど菌の増殖効果は認められず、わずかにグリセリンに菌の増殖促進が認められたに過ぎない。
（０４０） 次に通気量の影響について検討した。５０ｍｌの三角フラスコにハートインヒュージョン２，５％５ｍｌ、１５ｍｌ、３０ｍｌおよび５０ｍｌとそれぞれに攪拌子を入れて高圧滅菌後、Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ ０．１ｍｌを接種し、２４℃５日間低速攪拌しながら培養を行なった。その結果、培地容量（培地通気量）に関係なく、培地１ｍｌ当りの菌体の収量はほぼ一定であった。しかし、接種菌量を５０倍にしたところ、通気量の高い培地（培地容量の少ない培地）で著しい菌の増殖が認められた。
（０４１） （０３８），（０３９），（０４０）の結果から、ハートインヒュージョンと通気量および通気量と接種菌量間に交互作用の有無をも考慮して、表７に示す第２水準のＬ１６（２１５）の割り付けに基づいた実験計画法により５０ｍｌの三角フラスコレベルで培養条件の検討を行なった。
【表６】
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その結果、通気と接種菌量間に交互作用が認められ、接種菌量を多くして通気攪拌培養する事が好ましく、従って、Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａを大量培養する至適培養条件はハートインヒュージョンブイヨンで３日間静置培養し、次いで２日間攪拌培養に切り替えることにより多量の菌体が得られることを認めた。この際の菌体の収量の９５％の信頼限界は２００ｍｇ±１１ｍｇ／Ｌ（乾燥重量）である。
【表７】
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