(57)【要約】  効率的かつ汎用性の高い被験物質の標的分子の同定方法。予め所定の薬効を有することが確認されている被験物質の標的遺伝子を同定する方法であって、標的候補遺伝子、そのシスエレメント及びそのトランスエレメントから選ばれる１以上を改変した細胞又はＲＮＡ干渉によって標的候補遺伝子の発現を抑制した細胞を、被験物質の存在下に培養し、生物的活性の低下を生じる改変細胞又は細胞を検出することを特徴とする、当該被験物質の標的遺伝子の同定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
予め所定の薬効を有することが確認されている被験物質の標的遺伝子を同定する方法であって、標的候補遺伝子、そのシスエレメント及びそのトランスエレメントから選ばれる１以上を改変した細胞又はＲＮＡ干渉によって標的候補遺伝子の発現を抑制した細胞を、被験物質の存在下に培養し、生物的活性の低下を生じる改変細胞又は細胞を検出することを特徴とする、当該被験物質の標的遺伝子の同定方法。
【請求項２】
改変細胞が標的候補遺伝子の上流に誘導可能なプロモーターを挿入したものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
改変細胞の培養が、濃度が改変細胞の生物的活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）の１／１０００以上かつＩＣ５０の１０倍以下である誘導物質と、濃度が標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞の生物的活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）の１／１０００以上かつＩＣ５０の１０倍以下である被験物質の存在下に改変細胞を培養するものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
改変細胞の培養が、改変細胞の生物的活性が標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞に比べて５０％以下に低下している場合に、濃度が標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞の生物的活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）の１／１０００以上かつＩＣ５０の１０倍以下である被験物質の存在下に改変細胞を培養するものである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
改変細胞の培養が、濃度が改変細胞の生物的活性を最大の５０％に低下させる濃度（ＥＣ５０）以上かつＥＣ５０の１００倍以下である誘導物質と、濃度が標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞の生物的活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）の１／１０００以上かつＩＣ５０の１０倍以下である被験物質の存在下に改変細胞を培養するものである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
誘導物質の濃度がＩＣ５０の１／１００以上かつＩＣ５０以下である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
誘導可能なプロモーターがＴｅｔ−Ｏｆｆ（登録商標）プロモーターである、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項８】
被験物質の薬効が抗菌薬、抗真 菌薬、抗悪性腫瘍薬及び抗ウイルス薬からなる群より選択される１種以上である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
生物的活性の低下が細胞増殖活性の低下である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞が真核細胞である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が真菌細胞である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、予め所定の薬効を有することが確認されている被験物質の標的遺伝子を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある疾患に効果を示す薬物について、その薬物が細胞内又は細胞外分泌物でどのような分子（タンパク質、核酸、脂質等の標的分子）に作用し、その分子の機能をどのように変化させるのか、また、このことが薬効とどのようにむすびつくのかは、薬物の作用機序の解明において重要な情報である。生体の働きを指標にした化合物スクリーニング（表現型スクリーニング）による従来の創薬では、スクリーニングの段階では標的分子や作用機序が不明であり、標的分子がいまだに分からないままである薬物も多く存在する。【０００３】
より効果的な薬物の開発にあたっては、薬物の標的分子を同定することが必要である。標的分子の同定方法としては、遺伝子発現、タンパク質発現、シグナル伝達の変動解析などの分子生物学的な手法、形質転換細胞等を利用する方法、薬剤にビオチンなどを標識し、これと作用する標的分子を同定する方法等が知られているが、細胞内の複雑なネットワークを反映して、非常に多くの時間と労力が必要とされる。そのため、効率的かつ汎用性の高い標的分子の同定方法の開発が望まれている。【０００４】
カンジダをはじめとする病原真菌の中には、重篤な日和見感染の原因菌が存在する。高齢化に伴う易感染患者の増加により、真菌症患者の増加は避けられない状況にあるにも関わらず、全身投与が可能な抗真菌薬には４系統しか存在せず、さらに副作用や耐性株の出現の問題があるため、新たな抗真菌薬の開発が急務である。しかしながら、カンジダを含めた様々な真菌のゲノムシーケンス解析の結果から、ヒトと真菌にはアミノ酸配列に相同性がみられるタンパク質が多く存在することが分かっており、抗真菌活性物質は、多くの場合、ヒトに対する副作用が現れる可能性が危惧される。抗真菌薬開発の段階で標的分子が同定されれば、副作用の回避も可能となるため、このような観点からも、効率的かつ汎用性の高い標的分子の同定方法の開発が望まれている。【０００５】
これまでに、例えば、化合物の標的を決定する方法として、必須の細胞プロセスに関与する遺伝子の遺伝子産物の発現が制御された細胞のライブラリーを提供し、該ライブラリーを該化合物に曝し、細胞増殖をアッセイする方法が提案されている（特許文献１）。しかしながら、化合物の標的を決定する際に、遺伝子産物の発現をどのように制御すればよいのかについては具体的に開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００２−５１１２３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、予め所定の薬効を有することが確認されている被験物質の標的遺伝子の、効率的かつ汎用性の高い同定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、標的候補遺伝子、そのシスエレメント及びそのトランスエレメントから選ばれる１以上を改変した改変細胞又はＲＮＡ干渉によって標的候補遺伝子の発現を抑制した細胞を、被験物質の存在下に培養することで、改変細胞又は細胞に対する被験物質の効果が顕著に奏されること、培養後に生物的活性の低下を生じる改変細胞又は細胞を検出することで、被験物質の標的遺伝子を効率よく同定できることを見出した。具体的には、標的候補遺伝子の上流に誘導可能なプロモーターを挿入した改変細胞を、濃度が改変細胞の生物的活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）の１／１０００以上かつＩＣ５０の１０倍以下である誘導物質と、濃度が標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞の生物的活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）の１／１０００以上かつＩＣ５０の１０倍以下である被験物質の存在下に培養することで、改変細胞に対する誘導物質と被験物質の効果が相乗的に奏されること、培養後に生物的活性の低下を生じる改変細胞を検出することで、被験物質の標的遺伝子を効率よく同定できることを見出し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔１１〕を提供するものである。
〔１〕予め所定の薬効を有することが確認されている被験物質の標的遺伝子を同定する方法であって、標的候補遺伝子、そのシスエレメント及びそのトランスエレメントから選ばれる１以上を改変した細胞又はＲＮＡ干渉によって標的候補遺伝子の発現を抑制した細胞を、被験物質の存在下に培養し、生物的活性の低下を生じる改変細胞又は細胞を検出することを特徴とする、当該被験物質の標的遺伝子の同定方法。
〔２〕改変細胞が標的候補遺伝子の上流に誘導可能なプロモーターを挿入したものである、〔１〕に記載の方法。
〔３〕改変細胞の培養が、濃度が改変細胞の生物的活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）の１／１０００以上かつＩＣ５０の１０倍以下である誘導物質と、濃度が標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞の生物的活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）の１／１０００以上かつＩＣ５０の１０倍以下である被験物質の存在下に改変細胞を培養するものである、〔２〕に記載の方法。
〔４〕改変細胞の培養が、改変細胞の生物的活性が標的候補遺伝子の発現を抑制していない細胞に比べて５０％以下に低下している場合に、濃度が標的候補遺伝子の発現を抑制していない細胞の生物的活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）の１／１０００以上かつＩＣ５０の１０倍以下である被験物質の存在下に改変細胞を培養するものである、〔２〕に記載の方法。
〔５〕改変細胞の培養が、濃度が改変細胞の生物的活性を最大の５０％に低下させる濃度（ＥＣ５０）以上かつＥＣ５０の１００倍以下である誘導物質と、濃度が標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞の生物的活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）の１／１０００以上かつＩＣ５０の１０倍以下である被験物質の存在下に改変細胞を培養するものである、〔２〕に記載の方法。
〔６〕誘導物質の濃度がＩＣ５０の１／１００以上かつＩＣ５０以下である、〔３〕に記載の方法。
〔７〕誘導可能なプロモーターがＴｅｔ−Ｏｆｆ（登録商標）プロモーターである、〔３〕又は〔４〕に記載の方法。
〔８〕被験物質の薬効が抗菌薬、抗真菌薬、抗悪性腫瘍薬及び抗ウイルス薬からなる群より選択される１種以上である、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕生物的活性の低下が細胞増殖活性の低下である、〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕細胞が真核細胞である、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕細胞が真菌細胞である、〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、予め所定の薬効を有することが確認されている被験物質の標的遺伝子を効率的にかつ汎用性高く同定することができる。また、本発明の方法における改変細胞又は細胞の培養及び検出は短時間で実施できるため、比較的不安定な被験物質についても標的遺伝子の同定が可能である。被験物質の標的遺伝子が同定されることで、当該被験物質の作用機序の解明や、より効果の高い薬剤の効率的な開発にもつながり得る。さらに、既存の薬剤の作用機序の解明による新薬開発、既存薬再開発（ドラッグリポジショニング）、原因不明の疾患メカニズムの理解、副作用の原因解明等にも貢献することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】カンジダ・グラブラータでの標的遺伝子同定に用いるＴｅｔ−Ｏｆｆシステムを示す。
【図２】カンジダ・グラブラータのテトラサイクリン転写抑制株（Ｔｅｔ株）を用いた抗真菌薬フルコナゾールの標的遺伝子の同定に関する図である。
【図３】カンジダ・グラブラータのＴｅｔ株を用いたフルコナゾールの標的遺伝子の同定に関する図である。
【図４】カンジダ・グラブラータのＴｅｔ株を用いたフルコナゾールの標的遺伝子の同定に関する図である。
【図５】カンジダ・グラブラータのＴｅｔ株を用いたフルコナゾールの標的遺伝子の同定に関する図である。
【図６】カンジダ・グラブラータのＴｅｔ株を用いた抗真菌薬テルビナフィンの標的遺伝子の同定に関する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の被験物質の標的遺伝子の同定方法は、標的候補遺伝子、そのシスエレメント及びそのトランスエレメントから選ばれる１以上を改変した細胞又はＲＮＡ干渉によって標的候補遺伝子の発現を抑制した細胞を、被験物質の存在下に培養し、生物的活性の低下を生じる改変細胞又は細胞を検出することを特徴とする。
【００１３】
本発明に用いられる「被験物質」とは、生体内、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトに投与される物質であり、予め薬効が確認されている物質であれば、特に制限されない。被験物質は、新規物質であっても、公知物質であってもよく、天然に存在する物質であっても、化学的もしくは生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよい。また、化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。被験物質としては、具体的には、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機化合物、無機化合物、微生物、動植物由来成分（例えば、乾燥物、抽出物、発酵物、培養上清等）、これらを含有する組成物等が例示される。
【００１４】
被験物質の薬効、すなわち薬としての効能は、特に制限されない。薬効としては、例えば、鎮痛薬、麻酔薬、抗中毒薬/物質乱用治療薬、抗菌薬、抗けいれん薬、抗認知症薬、抗うつ薬、制吐薬、抗真菌薬、抗痛風薬、抗炎症薬、抗片頭痛薬、筋無力症薬、抗マイコバクテリア薬、抗悪性腫瘍薬、抗寄生虫薬、抗パーキンソン病薬、抗精神病薬、抗痙性剤、抗ウイルス薬、抗不安薬、双極性障害治療薬、血糖調節薬、血液製剤/血液調節薬/血液量増量剤、心血管治療薬、中枢神経系用薬、歯科口腔薬、皮膚科用薬、胃腸薬、泌尿生殖器薬、ホルモン賦活薬/ホルモン補充薬/ホルモン調節薬、ホルモン抑制薬、免疫薬、炎症性腸疾患治療薬、代謝性骨疾患治療薬、眼科用薬、耳鼻科用薬、呼吸器薬、骨格筋弛緩薬、睡眠障害治療薬等が挙げられる。このうち、抗菌薬、抗真菌薬、抗悪性腫瘍薬、抗ウイルス薬が好ましく、抗真菌薬がさらに好ましい。
【００１５】
本発明において「標的遺伝子」とは、被験物質による作用を受け、そのことが被験物質の薬効に結びつく遺伝子である。ここで、標的遺伝子とは、被験物質が直接作用する標的分子をコードする遺伝子の他、標的分子と会合する分子をコードする遺伝子、標的分子を活性化又は抑制する分子をコードする遺伝子、標的分子を活性化又は抑制する分子を構築するために必要な分子をコードする遺伝子等の標的関連遺伝子をも包含するものである。標的遺伝子の候補遺伝子としては、本発明に用いられる改変細胞が由来する細胞又は本発明に用いられる細胞のゲノムにコードされている遺伝子に限定されず、異種あるいは同種遺伝子間ノックイン遺伝子も含まれる。このうち、細胞の生物的活性に影響及ぼす遺伝子であることが好ましく、細胞増殖活性を指標にして簡便に標的遺伝子を同定することができる点で、細胞の生育に必須の遺伝子であることがさらに好ましい。細胞の生育に必須の遺伝子とは、細胞の成長、増殖に必要な遺伝子であり、当該遺伝子を破壊した場合に細胞が生育遅延又は生育不能となる遺伝子を意味する。
【００１６】
本発明において「誘導可能なプロモーター」とは、外部より添加される誘導物質又は外部より負荷される刺激の有無により、プロモーターと作動可能に連結された遺伝子の発現を制御し得るプロモーターのことをいう。ここで、作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）とは、制御領域（プロモーター等）と遺伝子のコード領域とが適切な位置関係で配置された結果、当該制御領域の機能により、遺伝子の発現が制御される状態のことを指す。遺伝子の発現の制御は、遺伝子からの転写の誘導、増強、抑制、阻害等を包含する概念である。
【００１７】
誘導可能なプロモーター及び誘導物質又は誘導刺激の種類は、当該プロモーターを導入する細胞の種類、細胞の増殖に対する影響、細胞への毒性、操作の簡便性等を考慮して適宜選択すればよい。誘導可能なプロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、ラクトース誘導性プロモーター（ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｐｓｐａｃプロモーター等）、ガラクトース誘導性プロモーター（ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ４プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ｍｅｌ１プロモーター等）、キシロース誘導性プロモーター（ｘｙｌＡプロモーター、ｘｙｌＢプロモーター等）、アラビノース誘導性プロモーター（ａｒａＢＡＤプロモーター等）、ラムノース誘導性プロモーター（ｒｈａＢＡＤプロモーター等）、テトラサイクリン誘導性プロモーター（ｔｅｔプロモーター等）、ホルモン誘導性プロモーター（ＭＭＴＶプロモーター等）、金属誘導性プロモーター（メタロチオネインプロモーター等）、アルコール誘導性プロモーター（ａｌｃＡプロモーター等）、温度誘導性プロモーター（λｐＬプロモーター、λｐＲプロモーター等）、熱ショック誘導性プロモーター（ｈｓｐ７０プロモーター等）、光誘導性プロモーター（ｒｂｃＳプロモーター）等が挙げられる。誘導可能なプロモーターのうち、操作の簡便性の観点から、誘導物質の添加により制御下にある遺伝子の発現を制御（例えば誘導又は阻害）し得るプロモーターが好ましく、標的遺伝子の同定精度の観点から、誘導物質非存在下で制御下にある遺伝子の発現を誘導し、誘導物質存在下で用量依存的に制御下にある遺伝子の発現を抑制するプロモーターがより好ましい。具体的には、テトラサイクリン誘導性プロモーターであって、誘導物質であるテトラサイクリン又はその誘導体の非存在下で制御下にある遺伝子の発現を誘導し、存在下で発現を抑制する、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（登録商標）システムにおけるプロモーターが好ましい。テトラサイクリン又はその誘導体としては、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン等が挙げられるが、誘導活性の強さの観点から、ドキシサイクリンが好ましい。
【００１８】
本発明に用いられる「改変細胞」は、標的候補遺伝子、そのシスエレメント及びそのトランスエレメントから選ばれる１以上を改変した細胞であればよく、改変により、標的候補遺伝子の発現量が標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞における当該遺伝子の発現量に比して増加又は減少し、被験物質に対する感受性が標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞に比して高められた改変細胞であることが好ましい。被験物質に対する改変細胞の感受性が標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞に比して高いとは、例えば、改変細胞と標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞を、それぞれ同濃度の被験物質の存在下に培養し、生物的活性を測定した際に、改変細胞の生物的活性が標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞の生物的活性に比して低いことを意味する。
ここで、標的候補遺伝子のシスエレメントとは、標的候補遺伝子と同一分子上（シスの位置）、具体的には標的候補遺伝子の５’非翻訳領域、３’非翻訳領域又はイントロンに位置し、遺伝子の転写活性に影響を与える領域のことである。シスエレメントとしては、これらに限定されるものではないが、オペレーター、プロモーター、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＴボックス、エンハンサー等が例示される。標的候補遺伝子のトランスエレメントとは、標的候補遺伝子の発現に影響を与える別の遺伝子又はその遺伝子発現産物（例えば転写因子）のことであり、シスエレメントの塩基配列を介して遺伝子の転写を調節する。
また、ここで、標的候補遺伝子、そのシスエレメント及びそのトランスエレメントから選ばれる１以上の改変とは、遺伝子組換え、ゲノム編集、セルフクローニング、点変異等の当業者に公知の方法により、標的候補遺伝子、そのシスエレメント及びそのトランスエレメントから選ばれる１以上のＤＮＡ配列を変化せしめることをいう。例えば、当該領域において、一部の塩基（例えば１〜２０個程度、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個の塩基）が置換、欠失、付加及び／又は挿入される場合等が挙げられる。
また、「標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞」としては、標的候補遺伝子の発現を野生株の細胞に比して増強又は抑制していない細胞であればよく、野生株の細胞、改変細胞の宿主細胞、改変細胞に標的候補遺伝子を再導入した細胞、野生型の細胞に形質転換マーカーのみを導入した細胞等が挙げられる。このうち、入手の容易さの観点から、野生株の細胞が好ましい。
【００１９】
このような「改変細胞」としては、標的候補遺伝子の上流に誘導可能なプロモーターを挿入したものが好ましい。具体的には、標的候補遺伝子の本来のプロモーターにかえて、誘導可能なプロモーターを含む制御領域が、プロモーターと標的候補遺伝子とが作動可能に連結するように挿入されていることが好ましい。当該制御領域には、必要に応じて、オペレーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ターミネーター等の制御配列や、当業者に公知の各種の配列、例えば、制限酵素切断部位、形質転換マーカー、シグナル配列、リーダー配列等を含んでいてもよい。このうち、改変細胞の選抜を容易にする観点から、形質転換マーカーを含むことが好ましい。形質転換マーカーとしては、これらに限定されるものではないが、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性マーカー遺伝子や、ロイシン合成酵素遺伝子、ヒスチジン合成酵素遺伝子、トリプトファン合成酵素遺伝子、リジン合成酵素遺伝子、メチオニン合成酵素遺伝子、アデニン合成酵素遺伝子、ウラシル合成酵素遺伝子等の栄養要求性マーカー遺伝子等が挙げられる。また、誘導可能なプロモーターの上流の配列の影響を受けた意図しない発現を回避するため、誘導可能なプロモーターの上流にターミネーター配列を配置してもよい。これらの各種配列は、導入する細胞の種類、誘導可能なプロモーターの種類、培養培地等の条件に応じて、当業者が適宜選択して使用することができる。
【００２０】
細胞の標的候補遺伝子の上流に誘導可能なプロモーターを挿入する手段としては、特に制限されず、公知の方法を用いることができる。かかる方法の具体例として、相同組換えを利用する方法を以下に説明するが、本発明における改変細胞の作製方法はこの方法に限定されるものではない。
【００２１】
まず、誘導可能なプロモーターを含む発現ベクターを作製する。公知の遺伝子工学的手法により、適当な発現ベクターに、誘導可能なプロモーターと、必要に応じて、プロモーターの制御配列、形質転換マーカー等を含む制御領域をクローニングする。制御領域において、制御配列は、プロモーターが機能し得るように配置し、形質転換マーカーは、プロモーターの機能を妨げないようにプロモーターより上流の５’側に配置することが好ましい。各種の誘導可能なプロモーターがクローニングされた発現ベクターは市販されているので、それを利用してもよい。
【００２２】
次に、標的候補遺伝子の５’隣接領域のゲノムＤＮＡに相同な領域（相同領域Ａ）、上記の誘導可能なプロモーター等を含む制御領域、及び標的候補遺伝子のＯＲＦの５’末端領域のゲノムＤＮＡに相同な領域（相同領域Ｂ）を含むＤＮＡカセットを作製する。ここで、標的候補遺伝子の５’隣接領域とは、標的候補遺伝子の開始コドンより上流の隣接する領域を指す。相同領域Ａは、相同組換え後に標的候補遺伝子の本来のプロモーター活性は失われるが、他の遺伝子の発現に対する影響は最小限となる領域を選択することが好ましい。また、標的候補遺伝子のＯＲＦの５’末端領域とは、標的候補遺伝子の開始コドンから下流の領域を指す。
制御領域がクローニングされた発現ベクターを鋳型として、制御領域を増幅するプライマー対であって、５’末端に標的候補遺伝子の５’隣接領域のゲノムＤＮＡに相同なＤＮＡ配列を付加したプライマー及び５’末端に標的候補遺伝子のＯＲＦの５’末端領域のゲノムＤＮＡに相同なＤＮＡ配列を付加したプライマーを用いて、ＰＣＲを行う。この際、プライマーは、誘導可能なプロモーターと標的候補遺伝子が作動可能に連結されるように設計する。ＰＣＲ条件は、増幅サイズ、プライマーの塩基長、ＧＣ含有率、Ｔｍ値等を考慮して、適宜決定すればよい。得られたＰＣＲ増幅産物は、必要に応じて、常法に従って単離、精製してもよい。かくして、相同領域Ａ、誘導可能なプロモーター等を含む制御領域、及び相同領域Ｂを含むＤＮＡカセットが得られる。
【００２３】
あるいは、当該ＤＮＡカセットは、次の手法によっても得ることができる。相同領域Ａ及びＢを、相同組換えに用いる細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、それぞれ適当なプライマーを用いてＰＣＲで増幅する。増幅した相同領域ＡのＤＮＡ断片は、制御領域を含む発現ベクター中の制御領域の上流に、増幅した相同領域ＢのＤＮＡ断片は、制御領域を含む発現ベクター中の誘導可能プロモーターの下流に、プロモーターと標的候補遺伝子が作動可能に連結されるように、例えば、制限酵素を用いて挿入する。これにより、ＤＮＡカセットを含む発現ベクターが得られる。
【００２４】
相同領域Ａ及びＢの長さは、相同組換えを起こし得る塩基長である限り特に制限されないが、それぞれ、通常約１０ｂｐ以上、好ましくは約５０ｂｐ以上、より好ましくは約１００ｂｐ以上、さらに好ましくは約５００ｂｐ以上であり、また、通常約１０ｋｂｐ以下、好ましくは約５ｋｂｐ以下、より好ましくは約３ｋｂｐ以下である。また、相同領域Ａ及びＢの長さは、通常約１０ｂｐ〜約１０ｋｂｐであり、好ましくは約５０ｂｐ〜約５ｋｂｐであり、より好ましくは約１００ｂｐ〜約３ｋｂｐであり、さらに好ましくは約５００ｂｐ〜約３ｋｂｐである。相同領域Ａ及びＢの長さは、相同組換えに用いる細胞の種類、挿入するＤＮＡの長さ等を考慮して、適宜設定すればよい。
【００２５】
次いで、ＤＮＡカセット又はＤＮＡカセットを含む発現ベクターを制限酵素で切断する等して１本鎖したものを、公知の方法により相同組換えに用いる細胞に導入する。細胞への導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、酢酸リチウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ウイルスベクターを利用する方法等が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、細胞の種類、導入効率等を考慮して適宜選択すればよい。その後、形質転換マーカーによる選抜を行い、細胞のゲノム上の相同領域Ａ及びＢにおいて相同組換えを生じ、標的候補遺伝子の上流に誘導可能なプロモーターが挿入された、すなわち、標的遺伝子の本来のプロモーターが誘導可能プロモーターに置換された改変細胞を単離する。誘導可能なプロモーターがゲノムの所望の位置に組み込まれたかどうかは、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法等によって確認すればよい。かくして、標的候補遺伝子の上流に誘導可能なプロモーターが挿入された改変細胞が得られる。
【００２６】
本発明に用いられる「細胞」は、ＲＮＡ干渉によって標的候補遺伝子の発現を抑制した細胞であればよく、ＲＮＡ干渉により、標的候補遺伝子の発現量が標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞における当該遺伝子の発現量に比して減少し、被験物質に対する感受性が対応する野生株の細胞に比して高められた細胞であることが好ましい。
ここで、ＲＮＡ干渉とは、二本鎖ＲＮＡにより、二本鎖ＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡが分解され、遺伝子発現が抑制される現象を意味する。ＲＮＡ干渉に用いる二本鎖ＲＮＡは、対象となる遺伝子の配列に応じて、当業者が適宜選択して使用することができる。
当該細胞における標的候補遺伝子の発現制御による生物的活性量は、標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞における当該生物的活性量の好ましくは約５０％以上、より好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、また好ましくは１００％未満、より好ましくは約９８％以下であり、また好ましくは約５０％以上１００％未満、より好ましくは約６０％以上１００％未満、さらに好ましくは約７０％以上約９８％以下である。
【００２７】
本発明に用いられる改変細胞が由来する細胞又は本発明に用いられる細胞としては、原核細胞、真核細胞の何れでもよく、被験物質の薬効に応じて適宜選択すればよい。原核細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞等を例示することができる。真核細胞としては、真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞等を例示することができる。例えば、被験物質が抗菌薬である場合には細菌細胞を、被験物質が抗真菌薬である場合には真菌細胞を、被験物質が抗悪性腫瘍薬である場合には動物細胞、より具体的には対象となる悪性腫瘍の培養細胞を選択すればよい。被験物質が抗ウイルス薬である場合には、標的候補遺伝子及び／又はそのシスエレメントを改変したウイルスを感染させた宿主細胞を用いればよい。あるいは、ドラッグリポジショニングに向け、被験物質の薬効から通常想定される細胞とは異なる細胞を用いてもよい。
【００２８】
本発明において「生物的活性」とは、実験により定量可能な細胞の活性を意味し、例えば、細胞の代謝活性、ＤＮＡ合成活性、増殖活性、呼吸活性等が挙げられる。生物的活性は、細胞の種類、評価する活性項目等に応じて、公知の方法により評価すればよい。生物的活性としては、増殖活性が好ましく、例えば、ＭＴＴ法、ＸＴＴ法、ＷＳＴ−１法、セルカウント法、コロニー法、濁度法、リアルタイムＰＣＲ法、フローサイトメトリー法等で測定できる。
【００２９】
本発明に用いる被験物質の濃度は、０より大きく、標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞の生物的活性を５０％阻害する濃度の１０倍を超えない濃度、好ましくは生物的活性を５０％を超えて阻害しない濃度、より好ましくは４０％を超えて阻害しない濃度、さらに好ましくは３０％を超えて阻害しない濃度、さらに好ましくは阻害しない濃度である。具体的には、標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞の生物的活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）の１／１０００以上、好ましくは１／１００以上、より好ましくはＩＣ５０の１／１０以上、さらに好ましくはＩＣ５０の２．５／１０以上であり、また好ましくはＩＣ５０の１０倍以下、より好ましくはＩＣ５０以下、さらに好ましくはＩＣ５０の７．５／１０以下である。また、被験物質の濃度は、好ましくはＩＣ５０の１／１０００以上かつＩＣ5０の１０倍以下、より好ましくはＩＣ５０の１／１００以上かつＩＣ５０以下、さらに好ましくはＩＣ５０の１／１０以上かつＩＣ５０以下、さらに好ましくはＩＣ５０の２．５／１０以上かつＩＣ５０の７．５／１０以下である。被験物質の濃度がＩＣ５０の１／１０００未満であると、測定対象となる改変細胞又は細胞に対する被験物質の効果が生物的活性の低下として現れにくい。一方、被験物質の濃度がＩＣ５０の１０倍を超えると、測定対象となる改変細胞又は細胞の生物的活性の低下が、被験物質の標的候補遺伝子への作用によるものか、被験物質の細胞毒性によるものかの判別が困難となる。よって、本発明の方法の標的遺伝子の同定能が十分に発揮されない。
被験物質のＩＣ５０は、細胞の種類、評価する生物的活性等に応じて、公知の手法により適宜決定することができる。例えば、評価する生物的活性が細胞の増殖活性である場合には、段階的に希釈した被験物質の存在下又は非存在下に標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞を培養し、培養後の細胞数、濁度等を被験物質濃度に対してプロットしたグラフを作成する。得られたグラフから、被験物質の非存在下における細胞数、濁度等を１００％とした場合に、細胞数、濁度等を５０％まで阻害する被験物質の濃度をＩＣ５０として算出すればよい。
【００３０】
本発明に用いられる誘導物質の濃度又は誘導刺激の強度は、誘導可能なプロモーターが、誘導物質又は誘導刺激の非存在下で制御下にある遺伝子の発現を誘導し、誘導物質又は誘導刺激の存在下で用量依存的に制御下にある遺伝子の発現を抑制するプロモーターである場合には、好ましくは測定対象となる改変細胞の生物的活性を５０％阻害する濃度又は強度（ＩＣ５０）の１／１０００以上、より好ましくはＩＣ５０の１／１００以上、さらに好ましくはＩＣ５０の１／１０以上、さらに好ましくはＩＣ５０の２．５／１０以上であり、また好ましくはＩＣ５０の１０倍以下、より好ましくはＩＣ５０以下、さらに好ましくはＩＣ５０の７．５／１０以下である。また、誘導物質の濃度又は誘導刺激の強度は、好ましくはＩＣ５０の１／１０００以上かつＩＣ５０の１０倍以下、より好ましくはＩＣ５０の１／１００以上かつＩＣ５０以下、さらに好ましくはＩＣ５０の１／１０以上かつＩＣ５０以下、さらに好ましくはＩＣ５０の２．５／１０以上かつＩＣ５０の７．５／１０以下である。誘導物質の濃度又は誘導刺激の強度がＩＣ５０の１／１０００未満であると、測定対象となる改変細胞に対する誘導物質又は誘導刺激の効果が生物的活性の低下として現れにくい。一方、誘導物質の濃度又は誘導刺激の強度がＩＣ５０の１０倍を超えると、測定対象となる改変細胞の生物的活性の低下が、誘導物質又は誘導刺激の標的候補遺伝子への作用によるものか、誘導物質又は誘導刺激の細胞毒性によるものかの判別が困難となる。よって、改変細胞に対し、誘導物質又は誘導刺激と被験物質とを適用しても、両者の効果が顕著に現れず、すなわち、相乗効果が奏されず、本発明の方法の標的遺伝子の同定能が十分に発揮されない。なお、改変細胞の生物的活性が、誘導物質又は誘導刺激の非存在下で標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞の生物的活性に比して低下している場合、好ましくは５０％以下に低下している場合、また、好ましくは５０％〜９０％に低下している場合、より好ましくは５０％〜７０％に低下している場合には、誘導物質又は誘導刺激は添加又は負荷しなくてもよい。
また、誘導可能なプロモーターが、誘導物質又は誘導刺激の非存在下で制御下にある遺伝子の発現を抑制し、誘導物質又は誘導刺激の存在下で用量依存的に制御下にある遺伝子の発現を誘導するプロモーターである場合には、誘導物質の濃度又は誘導刺激の強度は、好ましくは測定対象となる改変細胞の生物的活性を最大の５０％に低下させる濃度又は強度（ＥＣ５０）以上であり、また好ましくはＥＣ５０の１００倍以下、より好ましくはＥＣ５０の１０倍以下である。また、誘導物質の濃度又は誘導刺激の強度は、好ましくはＥＣ５０以上かつＥＣ５０の１００倍以下、より好ましくはＥＣ５０以上かつＥＣ５０の１０倍以下である。誘導物質の濃度又は誘導刺激の強度がＥＣ５０未満であると、測定対象となる改変細胞の生物的活性の低下が、誘導物質又は誘導刺激の標的候補遺伝子への作用によるものか、誘導物質又は誘導刺激の不足により単に細胞の生育が阻害されたことによるものかの判別が困難となる。一方、誘導物質の濃度又は誘導刺激の強度がＥＣ５０の１００倍を超えると、測定対象となる改変細胞に対する誘導物質又は誘導刺激の効果が生物的活性の低下として現れにくい。よって、改変細胞に対し、誘導物質又は誘導刺激と被験物質とを適用しても、両者の効果が顕著に現れず、すなわち、相乗効果が奏されず、本発明の方法の標的遺伝子の同定能が十分に発揮されない。
誘導物質又は誘導刺激のＩＣ５０は、細胞の種類、評価する生物的活性等に応じて、公知の手法により適宜決定することができる。例えば、評価する生物的活性が細胞の増殖活性である場合には、段階的に希釈した誘導物質又は段階的に強度を変化させた誘導刺激の存在下又は非存在下に測定対象となる改変細胞を培養し、培養後の細胞数、濁度等を誘導物質濃度又は誘導刺激強度に対してプロットしたグラフを作成する。得られたグラフから、誘導物質又は誘導刺激の非存在下における細胞数、濁度等を１００％とした場合に、細胞数、濁度等を５０％まで阻害する誘導物質又は誘導刺激の濃度をＩＣ５０として算出すればよい。被験物質と誘導物質又は誘導刺激のＩＣ５０の算出方法は、同じであっても、異なってもよいが、精度の観点から、同じであることが好ましい。誘導物質又は誘導刺激のＩＣ５０は、改変細胞の種類ごとに決定される濃度であり、標的候補遺伝子を異にする改変細胞では、異なる値となり得る。
誘導物質又は誘導刺激のＥＣ５０は、細胞の種類、評価する生物的活性等に応じて、公知の手法により適宜決定することができる。例えば、評価する生物的活性が細胞の増殖活性である場合には、段階的に希釈した誘導物質又は段階的に強度を変化させた誘導刺激の存在下又は非存在下に測定対象となる改変細胞を培養し、培養後の細胞数、濁度等を誘導物質濃度又は誘導刺激強度に対してプロットしたグラフを作成する。得られたグラフから、最大反応の半分の反応を示す濃度又は強度をＥＣ５０として算出すればよい。誘導物質又は誘導刺激のＥＣ５０は、改変細胞の種類ごとに決定される濃度であり、標的候補遺伝子を異にする改変細胞では、異なる値となり得る。
【００３１】
本発明の方法を用いて被験物質の標的遺伝子を同定するには、標的候補遺伝子、そのシスエレメント及びそのトランスエレメントから選ばれる１以上を改変した改変細胞又はＲＮＡ干渉によって標的候補遺伝子の発現を抑制した細胞を、上記特定濃度の被験物質の存在下に培養し、生物的活性の低下を生じる改変細胞又は細胞を検出すればよい。
【００３２】
改変細胞又は細胞（以下、改変細胞等と称する）の培養法は、特に制限されず、細胞の種類と生物的活性の測定に応じた培地に改変細胞等を接種し、特定濃度の被験物質の存在下で、常法に従い培養すればよい。被験物質は、液体培地に直接添加する、固体培地に含有させる、固体培地に塗布する等して培地に添加すればよく、その添加時期は、改変細胞等の接種前であっても接種後であってもよい。培養時間は、細胞の種類、評価する生物的活性等に応じて適宜設定すればよいが、通常約３時間〜約７日、好ましくは約１２時間〜約２日、さらに好ましくは約１２〜約２４時間である。
【００３３】
改変細胞等の培養後に、当該改変細胞等の生物的活性を測定し、被験物質の非存在下で改変細胞等を培養したとき又は同濃度の被験物質の存在下で標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞を培養したときと比べて、生物的活性が低下していた場合には、当該改変細胞等における標的候補遺伝子が、被験物質の標的遺伝子であると判断できる。
【００３４】
あるいは、改変細胞等の培養後に、当該改変細胞等の生物的活性を測定し、特定濃度の被験物質の存在下に培養した標的候補遺伝子を異にする他の改変細胞等の生物的活性と比べて、生物的活性が最も低下していた場合には、当該改変細胞における標的候補遺伝子が、被験物質の標的遺伝子であると判断できる。なお、生物的活性が最も低下していた改変細胞と次に低下していた少なくとも１種の改変細胞の標的候補遺伝子がコードする分子が、互いに会合する、一方が他方を活性化又は抑制する、一方が他方を活性化又は抑制する分子を構築するために必要である等の関係がある場合には、これらの標的候補遺伝子群を標的遺伝子と判断できる。また、例えば、これらの過剰発現株を作製し、過剰発現により被験物質に対して低感受性化が起こる株の標的候補遺伝子が標的遺伝子であり、感受性に変化がない株の標的候補遺伝子が標的関連遺伝子と判断できる。
【００３５】
また、改変細胞が標的候補遺伝子の上流に誘導可能なプロモーターを挿入したものである場合に、被験物質の標的遺伝子を同定するには、改変細胞を、上記特定濃度の誘導物質又は上記特定強度の誘導刺激と、上記特定濃度の被験物質の存在下に培養し、生物的活性の低下を生じる改変細胞を検出すればよい。
【００３６】
改変細胞の培養法は、特に制限されず、細胞の種類と生物的活性の測定に応じた培地に改変細胞を接種し、特定濃度の誘導物質又は特定強度の誘導刺激及び特定濃度の被験物質の存在下で、常法に従い培養すればよい。誘導物質及び被験物質は、液体培地に直接添加する、固体培地に含有させる、固体培地に塗布する等して培地に添加すればよく、その添加時期は、改変細胞の接種前であっても接種後であってもよく、添加順は制限されない。誘導刺激は、改変細胞を含む培地に対し刺激の種類に応じて負荷すればよい。培養時間は、細胞の種類、評価する生物的活性等に応じて適宜設定すればよいが、通常約３時間〜約７日、好ましくは約１２時間〜約２日、さらに好ましくは約１２〜約２４時間である。
【００３７】
改変細胞の培養後に、当該改変細胞の生物的活性を測定し、同濃度の誘導物質単独もしくは同強度の誘導刺激単独の存在下で当該改変細胞を培養したとき及び／又は同濃度の被験物質単独の存在下で当該改変細胞を培養したときと比べて、生物的活性が低下していた場合には、当該改変細胞における標的候補遺伝子が、被験物質の標的遺伝子であると判断できる。
【００３８】
あるいは、改変細胞の培養後に、当該改変細胞の生物的活性を測定し、特定濃度の誘導物質又は特定強度の誘導刺激及び特定濃度の被験物質の存在下に培養した標的候補遺伝子を異にする他の改変細胞の生物的活性と比べて、生物的活性が最も低下していた場合には、当該改変細胞における標的候補遺伝子が、被験物質の標的遺伝子であると判断できる。なお、生物的活性が最も低下していた改変細胞と次に低下していた少なくとも１種の改変細胞の標的候補遺伝子がコードする分子が、互いに会合する、一方が他方を活性化又は抑制する、一方が他方を活性化又は抑制する分子を構築するために必要である等の関係がある場合には、これらの標的候補遺伝子群を標的遺伝子と判断できる。また、例えば、これらの過剰発現株を作製し、過剰発現により被験物質に対して低感受性化が起こる株の標的候補遺伝子が標的遺伝子であり、感受性に変化がない株の標的候補遺伝子が標的関連遺伝子と判断できる。
【００３９】
また、改変細胞が標的候補遺伝子の上流に誘導可能なプロモーターを挿入したものであり、改変細胞の生物的活性が、誘導物質又は誘導刺激非存在下で標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞の生物的活性に比して５０％以下に低下している場合に、被験物質の標的遺伝子を同定するには、改変細胞を上記特定濃度の被験物質の存在下に培養し、生物的活性の低下を生じる改変細胞を検出すればよい。
【００４０】
改変細胞の培養法は、特に制限されず、細胞の種類と生物活性の測定に応じた培地に改変細胞を接種し、特定濃度の被験物質の存在下で、常法に従い培養すればよい。被験物質は、液体培地に直接添加する、固体培地に含有させる、固体培地に塗布する等して培地に添加すればよく、その添加時期は、改変細胞の接種前であっても接種後であってもよい。培養時間は、細胞の種類、評価する生物的活性等に応じて適宜設定すればよいが、通常約３時間〜約７日、好ましくは約１２時間〜約２日、さらに好ましくは約１２〜約２４時間である。
【００４１】
改変細胞の培養後に、当該改変細胞の生物的活性を測定し、被験物質の非存在下で改変細胞を培養したとき又は同濃度の被験物質の存在下で標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞を培養したときと比べて、生物的活性が低下していた場合には、当該改変細胞における標的候補遺伝子が、被験物質の標的遺伝子であると判断できる。
【００４２】
あるいは、改変細胞の培養後に、当該改変細胞の生物的活性を測定し、特定濃度の被験物質の存在下に培養した標的候補遺伝子を異にする他の改変細胞の生物的活性と比べて、生物的活性が最も低下していた場合には、当該改変細胞における標的候補遺伝子が、被験物質の標的遺伝子であると判断できる。なお、生物的活性が最も低下していた改変細胞と次に低下していた少なくとも１種の改変細胞の標的候補遺伝子がコードする分子が、互いに会合する、一方が他方を活性化又は抑制する、一方が他方を活性化又は抑制する分子を構築するために必要である等の関係がある場合には、これらの標的候補遺伝子群を標的遺伝子と判断できる。また、例えば、これらの過剰発現株を作製し、過剰発現により被験物質に対して低感受性化が起こる株の標的候補遺伝子が標的遺伝子であり、感受性に変化がない株の標的候補遺伝子が標的関連遺伝子と判断できる。
【００４３】
本発明の一実施態様においては、改変細胞等を、特定濃度の誘導物質又は特定強度の誘導刺激の存在下、特定濃度の被験物質の存在下、並びに特定濃度の誘導物質又は特定強度の誘導刺激及び特定濃度の被験物質の存在下に培養し、それぞれについて生物的活性を測定し、相乗効果ｉｎｄｅｘを算出できる。相乗効果ｉｎｄｅｘは、それ自体公知の算出式を用いて算出すればよい。このような算出式としては、例えば、以下の式が例示されるが、これに限定されるものではない。
【数１】
2019163796.tif 000002
（式中、Ａは誘導物質又は誘導刺激存在下で培養した場合の生物的活性を示し、Ｂは被験物質存在下で培養した場合の生物的活性を示し、Ｃは誘導物質又は誘導刺激及び被験物質の共存在下で培養した場合の生物的活性を示す。）
ここで、生物的活性の値は、評価項目によって異なるが、例えば細胞増殖を指標とする場合は、細胞数、濁度等の実測値又は測定値の偏差値を用いることができる。
【００４４】
異なる遺伝子を標的候補遺伝子とする改変細胞等についても、上記の操作を行い、得られた相乗効果ｉｎｄｅｘを比較して、最も高い相乗効果ｉｎｄｅｘを示す改変細胞等を検出する。かくして検出された改変細胞等における標的候補遺伝子が、被験物質の標的遺伝子であると判断できる。なお、最も高い相乗効果ｉｎｄｅｘを示す改変細胞等と次に高い相乗効果ｉｎｄｅｘを示す少なくとも１種の改変細胞等の標的候補遺伝子がコードする分子が、互いに会合する、一方が他方を活性化又は抑制する、一方が他方を活性化又は抑制する分子を構築するために必要である等の関係がある場合には、これらの標的候補遺伝子群をまとめて標的遺伝子と判断できる。
【００４５】
このような態様は、例えば、９６ウェルプレートの各ウェルに、それぞれ異なる遺伝子を標的候補遺伝子とする改変細胞等を接種し、特定濃度の誘導物質もしくは特定強度の誘導刺激、特定濃度の被験物質、又は特定濃度の誘導物質もしくは特定強度の誘導刺激及び特定濃度の被験物質の存在下に一定期間培養し、培養後に各ウェルの生物的活性を測定して、改変細胞等の種類毎に相乗効果ｉｎｄｅｘを算出し、その結果から、最も相乗効果ｉｎｄｅｘの高い改変細胞等を検出することで実施できる。異なる遺伝子を標的候補遺伝子とする改変細胞等は、所望の改変細胞等を選択して用いてもよいし、種ごとにライブラリーを作製し、これを用いてもよい。該ライブラリーとしては、対象となる種の全遺伝子についての改変細胞等からなるライブラリー、対象となる種の生育に影響を及ぼす遺伝子についての改変細胞等からなるライブラリー、対象となる種の生育に必須の遺伝子についての改変細胞等からなるライブラリー等が挙げられる。
【００４６】
本発明においては、被験物質の濃度、より好ましくは誘導物質の濃度又は誘導刺激の強度と被験物質の濃度を、それぞれ、改変細胞等毎に特定範囲とすることにより、標的遺伝子を標的候補遺伝子とする改変細胞等に対する被験物質の効果が奏され、より好ましくは誘導物質又は誘導刺激と被験物質の効果が相乗的に奏されて、当該改変細胞等の生物的活性が顕著に低下し、これを検出することで、効率的に被験物質の標的遺伝子を同定することが可能となる。
【００４７】
後記実施例では、本発明の方法の好適な実施形態の一つとして、標的候補遺伝子の上流に誘導可能なプロモーターを挿入した組換え真菌細胞を用い、被験物質の標的遺伝子を同定する方法を示す。具体的には、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）のテトラサイクリン転写抑制株（以下、Ｔｅｔ株とも称す）細胞を用い、抗真菌薬の標的遺伝子を同定する方法を示す。
テトラサイクリン又はその誘導体の添加の有無により目的遺伝子の発現を制御するＴｅｔ−Ｏｆｆ（登録商標）システム（図１）では、テトラサイクリン又はその誘導体の非存在下では、Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）を含むテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒＴＡ）がＴｅｔオペレーター（ＴｅｔＯ）に結合してプロモーターが活性化され、プロモーターの制御下にある遺伝子の転写が誘導される一方、テトラサイクリン又はその誘導体の存在下では、ｒＴＡのＴｅｔＯへの結合がテトラサイクリン又はその誘導体によって阻害されるため、プロモーターの転写活性化が起こらず、プロモーターの制御下にある遺伝子の転写は抑制される。このようにＴｅｔ−Ｏｆｆシステムは、外部からテトラサイクリン又はその誘導体を添加するだけで所望の遺伝子の転写を制御でき、また、テトラサイクリン又はその誘導体は、真菌やその宿主となる動物に対して毒性が低いことから、真菌を含む真核細胞の遺伝子の発現制御に適している。また、短時間で目的の遺伝子発現がほぼ完全に抑制できることからも、当該システムは有用である。
【００４８】
（１）Ｔｅｔ株の作製
カンジダ・グラブラータのＴｅｔ株は、例えば、次のように構築できる。
まず、構成的プロモーターの下流にＴｅｔＲ及び転写因子からなるｒＴＡが作動可能に連結されている発現ベクターを作製する。構成的プロモーターとは、宿主細胞の生育条件とは無関係に、制御下にある遺伝子を発現させるプロモーターである。構成的プロモーターとしては、例えば、カンジダ・グラブラータ由来のプロモーター、カンジダ・グラブラータと系統的に近縁であるサッカロマイセス・セレビシエ由来のプロモーター等が例示される。当該発現ベクターは、常法に従ってカンジダ・グラブラータに導入し、その後、導入細胞を選抜することで、ｒＴＡを発現するカンジダ・グラブラータ株を得る。
【００４９】
一方、ＴｅｔＯと最小プロモーターを連結したキメラプロモーター（Ｔｅｔプロモーター）と、該キメラプロモーターの上流に形質転換マーカーを含む発現ベクターを作製する。最小プロモーターは、ドキシサイクリン存在下での発現抑制状態が維持できるように、減数分裂期以外でその発現が常に抑制されている遺伝子のプロモーターを用いることが好ましい。次いで、該発現ベクターを鋳型として、形質転換マーカー遺伝子とキメラプロモーターからなる領域を増幅するプライマー対であって、５’末端に標的候補遺伝子の５’隣接領域のゲノムＤＮＡに相同なＤＮＡ配列を付加したプライマー及び５’末端に標的候補遺伝子のＯＲＦの５’末端領域のゲノムＤＮＡに相同なＤＮＡ配列を付加したプライマーを用いて、ＰＣＲを行う。この際、プライマーは、キメラプロモーターと標的候補遺伝子が作動可能に連結されるように設計する。かくして、相同領域、形質転換マーカー遺伝子、キメラプロモーター及び相同領域からなるＤＮＡカセットが得られる。
得られたＤＮＡカセットを、常法に従って、上記のｒＴＡを発現するカンジダ・グラブラータ株に導入し、相同組換えにより宿主ゲノム中に組み込み、形質転換マーカーを利用して相同組換えを生じた細胞（Ｔｅｔ株）を選抜する。キメラプロモーターがゲノム中の所望の位置に組み込まれたかどうかは、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより確認することができる。
【００５０】
（２）ドキシサイクリン及び被験物質の濃度の決定
（１）で得られたＴｅｔ株を、段階的に希釈したドキシサイクリンの存在下又は非存在下に培養後、分光光度計により６００ｎｍにおける濁度を測定し、濁度をドキシサイクリンの濃度に対してプロットしたグラフを作成する。得られたグラフから、Ｔｅｔ株をドキシサイクリンの非存在下に培養した場合の濁度を１００％とした場合に、濁度を５０％まで阻害するドキシサイクリンの濃度を、ＩＣ５０として算出する。なお、Ｔｅｔ株をドキシサイクリン非存在下で培養した場合に、標的候補遺伝子の発現を制御していないカンジダ・グラブラータ細胞に比べて濁度が５０％以下であった場合には、本発明の方法で用いるドキシサイクリン濃度は０とする。
また、標的候補遺伝子の発現を制御していないカンジダ・グラブラータ細胞を、段階的に希釈した被験物質である抗真菌薬の存在下又は非存在下に培養後、分光光度計により６００ｎｍにおける濁度を測定し、濁度を抗真菌薬の濃度に対してプロットしたグラフを作成する。得られたグラフから、該細胞を抗真菌薬の非存在下に培養した場合の濁度を１００％とした場合に、濁度を５０％まで阻害する抗真菌薬の濃度を、ＩＣ５０として算出する。
Ｔｅｔ株及び標的候補遺伝子の発現を制御していないカンジダ・グラブラータ細胞は、カンジダ・グラブラータの培養に通常用いられる同化性の炭素源、窒素源、その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い振盪培養又は通気攪拌培養すればよい。例えば、培地としては、ＳＤ培地、ＰＤＡ培地、ＹＰＤ培地等が例示される。培地のｐＨは、約５〜約８に調整するのが好ましく、培養温度は、通常約２０℃〜約３５℃、好ましくは約２５℃〜約３０℃であり、培養時間は、通常約１０時間〜約１０日、好ましくは約１２時間〜約５日、さらに好ましくは約１２時間〜約２日である。
【００５１】
（３）Ｔｅｔ株の培養
上記（２）で決定されたＩＣ５０を基準とする特定濃度のドキシサイクリン及び特定濃度の抗真菌薬の存在下に、（１）で得られたＴｅｔ株を培養し、ＯＤ６００もしくはＯＤ６６０における濁度を測定する。Ｔｅｔ株の培養条件は、（２）に準じればよい。
【００５２】
（４）標的遺伝子の同定
Ｔｅｔ株について、ドキシサイクリン及び抗真菌薬の存在下での培養時の濁度、同濃度のドキシサイクリンの存在下での培養時の濁度、及び同濃度の抗真菌薬の存在下での培養時の濁度を用い、下記の式（２）に従って、相乗効果ｉｎｄｅｘを算出する。
【数２】
2019163796.tif 000003
（式中、Ａはドキシサイクリン存在下で培養した場合の濁度を示し、Ｂは抗真菌薬存在下で培養した場合の濁度を示し、Ｃはドキシサイクリン及び抗真菌薬の共存在下で培養した場合の濁度を示す。）
【００５３】
カンジダ・グラブラータの各遺伝子のＴｅｔ株について、好ましくは各生育必須遺伝子のＴｅｔ株について、上記の操作を行い、得られた相乗効果ｉｎｄｅｘを比較して、最も高い相乗効果ｉｎｄｅｘを示すＴｅｔ株を検出する。当該Ｔｅｔ株における標的候補遺伝子が、抗真菌薬の標的遺伝子と判断できる。あるいは、最も高い相乗効果ｉｎｄｅｘを示すＴｅｔ株と次に高い相乗効果ｉｎｄｅｘを示す少なくとも１種のＴｅｔ株の標的候補遺伝子がコードする分子が、互いに会合する、一方が他方を活性化又は抑制する、一方が他方を活性化又は抑制する分子を構築するために必要である等の関係がある場合には、これらの標的候補遺伝子群を標的遺伝子と判断できる。
【００５４】
後記実施例では、真菌として、病原真菌の中でもゲノムサイズが比較的小さく、遺伝子操作が容易であり、ゲノムワイドな機能解析に適しているため、カンジダ・グラブラータを例示している。しかしながら、評価対象の真菌としては、カンジダ・グラブラータに限定されるものではなく、例えば、ツボカビ門；クモノスカビ属、ケカビ属などの接合菌門；子嚢菌門；クリプトコッカス属（例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ等）、マラセチア属（例えば、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｆｕｒｆｕｒ等）、さび病菌などの担子菌門；白癬菌（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ等）、スポロトリックス属、黒色真菌などの不完全菌；酵母などが挙げられる。子嚢菌門としては、白癬菌（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ等）、スポロトリックス属（例えば、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｋｉｉ等）、アスペルギルス属（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ニューモシスチス属（例えば、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ等）；カンジダ属（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｒａｂｒａｔａ等）、サッカロマイセス属（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等）などの出芽酵母、シゾサッカロマイセス属などの分裂酵母などの酵母；アオカビ、コウジカビ、アカパンカビなどのカビ；アミガサタケ、トリュフなどのキノコ、ユーティパ（Ｅｕｔｙｐａ）属、いもち病菌、うどんこ病菌、黒星病菌、さび病菌等も用いることができることは理解される。このうち、ヒトに対する病原性が知られている白癬菌、スポロトリックス属、アスペルギルス属、ニューモシスチス属、カンジダ属、サッカロマイセス属等を対象とするのが好ましい。
【実施例】
【００５５】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００５６】
実施例１  カンジダ・グラブラータのＴｅｔ株を用いた抗真菌薬フルコナゾールの標的遺伝子の同定（１）
（１）Ｔｅｔ株の作製
カンジダ・グラブラータの各遺伝子の上流にＴｅｔ−Ｏｆｆプロモーターを挿入したテトラサイクリン転写抑制株（Ｔｅｔ株）は、Ｕｅｎｏ  Ｋ，  Ｕｎｏ  Ｊ，  Ｎａｋａｙａｍａ  Ｈ，  Ｓａｓａｍｏｔｏ  Ｋ，  Ｍｉｋａｍｉ  Ｙ，  Ｃｈｉｂａｎａ  Ｈ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＹＫＵ８０  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ．  Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｃｅｌｌ．  ２００７；６：  １２３９-１２４７．に記載の方法で作製した。【００５７】
（２）ドキシサイクリン及びフルコナゾールの５０％阻害濃度の決定
１００μＬのＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ、２％  ｇｌｕｃｏｓｅ）を９６穴細胞培養プレートに滴下した。そこに、段階的に希釈したドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を添加し、（１）で作製したＴｅｔ株を植菌し、３０℃で２０時間培養し、ＯＤ６００で濁度を測定した。Ｔｅｔ株の濁度が、Ｄｏｘの追加によって、Ｄｏｘ非存在下で培養した場合の濁度の約５０％に減少した濃度をＩＣ５０とした。ここで、例えば、ＥＲＧ１１遺伝子を標的候補遺伝子とするＴｅｔ株のＤｏｘに対するＩＣ５０は１μＭであった。
別途、１００μＬのＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ、２％  ｇｌｕｃｏｓｅ）を９６穴細胞培養プレートに滴下した。そこに、段階的に希釈したフルコナゾール（Ｆｌｕ）を添加し、標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞株（野生株：ＣＢＳ１３８株）を植菌し、３０℃で２０時間培養し、ＯＤ６００で濁度を測定した。ＣＢＳ１３８株の濁度が、Ｆｌｕの追加によって、Ｆｌｕ非存在下で培養した場合の濁度の約５０％に減少した濃度をＩＣ５０とした。ＣＢＳ１３８株のＦｌｕに対するＩＣ５０は５０μＭであった。【００５８】
（３）Ｔｅｔ株の培養
１００μＬのＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ、２％  ｇｌｕｃｏｓｅ）に、各Ｔｅｔ株について（２）で算出したＩＣ５０の３／１０の濃度のＤｏｘ及び／又はＦｌｕ  ２５μＭを添加したものを、９６穴細胞培養プレートに滴下した。例えば、ＥＲＧ１１遺伝子を標的候補遺伝子とするＴｅｔ株の場合には、Ｄｏｘの濃度を０．３μＭとした。そこに（１）で作製した各Ｔｅｔ株を植菌し、３０℃で２０時間培養し、ＯＤ６００で濁度を測定した。【００５９】
（４）相乗効果ｉｎｄｅｘの算出
各Ｔｅｔ株について、Ｄｏｘ及び２５μＭ  Ｆｌｕの存在下での培養時の濁度、同濃度のＤｏｘの存在下での培養時の濁度、及び同濃度のＦｌｕの存在下での培養時の濁度を用い、下記の式（３）に従って、相乗効果ｉｎｄｅｘを算出した。
【数３】
2019163796.tif 000004
（式中、ＡはＤｏｘ存在下で培養した場合の濁度を示し、ＢはＦｌｕ存在下で培養した場合の濁度を示し、ＣはＤｏｘ及びＦｌｕの共存在下で培養した場合の濁度を示す。）【００６０】
（５）結果
（４）で算出した相乗効果ｉｎｄｅｘを図２に示す。その結果、ＥＲＧ１１遺伝子を標的候補遺伝子とするＴｅｔ株の相乗効果ｉｎｄｅｘが、他のＴｅｔ株の相乗効果ｉｎｄｅｘより顕著に高く、ＥＲＧ１１遺伝子がフルコナゾールの標的遺伝子と考えられた。実際に、ＥＲＧ１１遺伝子は、フルコナゾールの標的遺伝子として知られているので、本方法により、被験物質である抗真菌薬フルコナゾールの標的遺伝子を同定できることが確認された。【００６１】
実施例２  カンジダ・グラブラータのＴｅｔ株を用いた抗真菌薬フルコナゾールの標的遺伝子の同定（２）
実施例１（１）で作製したＴｅｔ株を、各Ｔｅｔ株について実施例１（２）で算出したＩＣ５０の３／１００倍の濃度のＤｏｘ及び／又は７．５μＭ  Ｆｌｕを用いた以外は実施例１（３）の方法に準じて培養した。このとき、例えば、ＥＲＧ１１遺伝子を標的候補遺伝子とするＴｅｔ株の場合には、Ｄｏｘの濃度を０．０３μＭとした。その後、実施例１（４）の方法に準じてＴｅｔ株の相乗効果ｉｎｄｅｘを算出した。
算出した相乗効果ｉｎｄｅｘを図３に示す。その結果、フルコナゾールの標的遺伝子として知られるＥＲＧ１１遺伝子が、高い相乗効果ｉｎｄｅｘを示すことが認められた。【００６２】
実施例３  カンジダ・グラブラータのＴｅｔ株を用いた抗真菌薬フルコナゾールの標的遺伝子の同定（３）
実施例１（１）で作製したＴｅｔ株を、各Ｔｅｔ株について実施例１（２）で算出したＩＣ５０の３／１０００倍の濃度のＤｏｘ及び／又は２５μＭ  Ｆｌｕを用いた以外は実施例１（３）の方法に準じて培養した。このとき、例えば、ＥＲＧ１１遺伝子を標的候補遺伝子とするＴｅｔ株の場合には、Ｄｏｘの濃度を０．００３μＭとした。その後、実施例１（４）の方法に準じてＴｅｔ株の相乗効果ｉｎｄｅｘを算出した。
算出した相乗効果ｉｎｄｅｘを図４に示す。その結果、フルコナゾールの標的遺伝子として知られるＥＲＧ１１遺伝子が、高い相乗効果ｉｎｄｅｘを示すことが認められた。【００６３】
実施例４  カンジダ・グラブラータのＴｅｔ株を用いた抗真菌薬フルコナゾールの標的遺伝子の同定（４）
実施例１（１）で作製したＴｅｔ株を、各Ｔｅｔ株について実施例１（２）で算出したＩＣ５０の濃度のＤｏｘ及び／又は５０μＭ  Ｆｌｕを用いた以外は実施例１（３）の方法に準じて培養した。このとき、例えば、ＥＲＧ１１遺伝子を標的候補遺伝子とするＴｅｔ株の場合には、Ｄｏｘの濃度を１μＭとした。その後、実施例１（４）の方法に準じてＴｅｔ株の相乗効果ｉｎｄｅｘを算出した。
算出した相乗効果ｉｎｄｅｘを図５に示す。その結果、フルコナゾールの標的遺伝子として知られるＥＲＧ１１遺伝子が、高い相乗効果ｉｎｄｅｘを示すことが認められた。【００６４】
実施例５  カンジダ・グラブラータのＴｅｔ株を用いた抗真菌薬テルビナフィンの標的遺伝子の同定
（１）ドキシサイクリン及びテルビナフィンの５０％阻害濃度の決定
１００μＬのＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ、２％  ｇｌｕｃｏｓｅ）を９６穴細胞培養プレートに滴下した。そこに、段階的に希釈したドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を添加し、実施例１（１）で作製したＴｅｔ株を植菌し、３０℃で２０時間培養し、ＯＤ６００で濁度を測定した。Ｔｅｔ株の濁度が、Ｄｏｘの追加によって、Ｄｏｘ非存在下で培養した場合の濁度の約５０％に減少した濃度をＩＣ５０とした。ここで、例えば、ＥＲＧ１遺伝子を標的候補遺伝子とするＴｅｔ株のＤｏｘに対するＩＣ５０は０．５μＭであった。
別途、１００μＬのＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ、２％  ｇｌｕｃｏｓｅ）を９６穴細胞培養プレートに滴下した。そこに、段階的に希釈したテルビナフィン（Ｔｅｒ）を添加し、標的候補遺伝子の発現を制御していない細胞株（野生株：ＣＢＳ１３８株）を植菌し、３０℃で２０時間培養し、ＯＤ６００で濁度を測定した。ＣＢＳ１３８株の濁度が、Ｔｅｒの追加によって、Ｔｅｒ非存在下で培養した場合の濁度の約５０％に減少した濃度をＩＣ５０とした。ＣＢＳ１３８株のＴｅｒに対するＩＣ５０は４８μＭであった。【００６５】
（２）Ｔｅｔ株の培養
実施例１（１）で作製したＴｅｔ株を、各Ｔｅｔ株について実施例５（１）で算出したＩＣ５０の１／２の濃度のＤｏｘ及び／又は１２μＭ  Ｔｅｒを用いた以外は実施例１（３）の方法に準じて培養した。このとき、例えば、ＥＲＧ１遺伝子を標的候補遺伝子とするＴｅｔ株の場合には、Ｄｏｘの濃度を０．２５μＭとした。【００６６】
（３）相乗効果ｉｎｄｅｘの算出
各Ｔｅｔ株について、Ｄｏｘ及び１２μＭ  Ｔｅｒの存在下での培養時の濁度、同濃度のＤｏｘの存在下での培養時の濁度、及び同濃度のＴｅｒの存在下での培養時の濁度を用いた以外は実施例１（４）の方法に準じて相乗効果ｉｎｄｅｘを算出した。【００６７】
（４）結果
（３）で算出した相乗効果ｉｎｄｅｘを図６に示す。その結果、ＥＲＧ１遺伝子を標的候補遺伝子とするＴｅｔ株の相乗効果ｉｎｄｅｘが、他のＴｅｔ株の相乗効果ｉｎｄｅｘより顕著に高く、ＥＲＧ１遺伝子がテルビナフィンの標的遺伝子と考えられた。実際に、ＥＲＧ１遺伝子は、テルビナフィンの標的遺伝子として知られているので、本方法により、被験物質である抗真菌薬テルビナフィンの標的遺伝子を同定できることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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