(57)【要約】本発明は、生体試料中のタンパク質を液体クロマトグラフ質量分析によって測定するための試料の前処理方法であって、生体試料に酢酸水溶液を添加して、酢酸の濃度が２０〜５０重量％の範囲の前処理用試料を調製する工程を有することを特徴とする。本発明によれば、生体試料中の目的とするタンパク質のサンプル容器への吸着を抑制することができるため、質量分析を用いた生体試料中のタンパク質の測定感度を高めることができる。また、質量分析結果の再現性が向上し、信頼性を高めることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中のタンパク質を液体クロマトグラフ質量分析によって測定するための試料の前処理方法であって、
生体試料に酢酸水溶液を添加して、酢酸の濃度が２０〜５０重量％の範囲の前処理用試料を調製する工程を含む、生体試料の前処理方法。
【請求項２】
請求項１に記載の生体試料の前処理方法において、
前記前処理用試料の酢酸の濃度範囲が３５〜４５重量％である、生体試料の前処理方法。
【請求項３】
請求項１に記載の生体試料の前処理方法において、さらに、
前記前処理用試料を用いて前処理を行う工程と、
前記前処理を行った後の試料液に酢酸水溶液を添加して、該酢酸の濃度が２０〜５０重量％の範囲となる分析用試料を調製する工程とを有する、生体試料の前処理方法。
【請求項４】
請求項３に記載の生体試料の前処理方法において、
前記分析用試料の酢酸の濃度範囲が３５〜４５重量％である、生体試料の前処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中のタンパク質を液体クロマトグラフ質量分析で測定する前に行われる前処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液や生体組織等の生体試料に含まれる或る種のタンパク質の量の増加又は低下が特定の疾患と関連することが知られており、このようなタンパク質をバイオマーカとして特定の疾患の診断やスクリーニングが行われている。バイオマーカとなるタンパク質の中には生体試料中に微量しか含まれないものも多く、バイオマーカによる正確な診断やスクリーニングを行うためには、該バイオマーカを高感度且つ高精度に測定する必要がある（特許文献１）。【０００３】
液体クロマトグラフィと質量分析を組み合わせた液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）は、従来よりタンパク質やペプチドの分析に用いられている方法の一つであるが、特に近年のＬＣＭＳ装置における分離技術の進歩により高感度な分析が可能となり、微量なタンパク質の定量に不可欠な方法になりつつある。【０００４】
生体試料には、タンパク質をはじめとする様々な成分が含まれており、それらの中には、目的とするタンパク質の分析を阻害するような不要成分もある。そのため、一般的に、ＬＣ／ＭＳ装置で生体試料を分析する前に該生体試料から不要成分を除去するための前処理が行われる。このような前処理として、例えば、目的タンパク質に特異的に接合する抗体を用いて生体試料から目的タンパク質を単離する処理、固相抽出カラムを用いて生体試料中の不要成分とそれ以外の成分を分離する処理、等がある。【０００５】
上記の前処理を行うため、被検体から採取された生体試料はサンプル容器に入れられ、そこで適宜の溶媒によって希釈されたり濃縮されたりして、前処理に適した状態に調製される。その後、調製された試料を用いて前述の前処理が行われる。また、前処理が行われた生体試料は、前のサンプル容器とは別のサンプル容器に入れられ、ＬＣ／ＭＳ分析に適した濃度に調製される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第WO2015/125216号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一般に試料の調製は、ガラス製のサンプル容器、若しくはポリプロピレン（ＰＰ）やポリエチレン（ＰＥ）等のプラスチック製のサンプル容器の中で行われる。ところが、このようなサンプル容器に生体試料を収容すると、該生体試料中の成分の一部がサンプル容器の内面に吸着する。具体的には、ガラス製のサンプル容器の場合は、容器表面を覆うシラノール基とシロキサンによってイオン的吸着と疎水的吸着がそれぞれ起き、プラスチック製のサンプル容器の場合は、高分子ポリマーに基づく疎水的吸着が起きる。目的とするタンパク質が微量である場合に、その一部がサンプル容器に吸着され、しかも吸着する量にバラツキがあると、ＬＣ／ＭＳの再現性が悪くなり、分析結果の信頼性が低下する。【０００８】
そこで、吸着を防止するための処理をサンプル容器の表面に施したり、吸着防止剤を生体試料に加えたりすることが従来より行われている。サンプル容器の表面処理として、サンプル容器の表面にシリコーン等のコーティング剤を塗布する処理、サンプル容器の表面に親水基を導入する処理が挙げられる。しかしながら、サンプル容器の表面に塗布されたコーティング剤が、生体試料の調製に用いられた溶媒中に溶け出すことがあり、それがＬＣ／ＭＳにおける目的タンパク質のイオン化を妨げたり（イオンサプレッション）、ピーク検出を妨げたりする。また、サンプル容器の表面に親水基を導入する処理では、疎水的吸着を防止することができない。【０００９】
また、生体試料に添加される吸着防止剤として有機溶媒（アセトニトリル、メタノール）、界面活性剤、ペプチド（ＢＳＡ消化物）が挙げられる。しかしながら、有機溶媒は、ＬＣ／ＭＳにおいて一般的に使用される逆相分離カラムによる成分保持を妨げることがある。逆相分離カラムによる成分保持が妨げられると、クロマトグラムのピーク形状の異常（ピーク割れやテーリング）が起きる。また、界面活性剤はＬＣ／ＭＳのイオン源の汚染やイオンサプレッションを引き起こし、感度低下を招く。さらに、ペプチドの添加は、生体試料の組成を複雑にするため、イオンサプレッションによる検出感度の低下が懸念される。【００１０】
このように、従来、サンプル容器へのタンパク質の吸着を防止するために行われていた処理はいずれも、十分に吸着を防止できなかったり、ＬＣ／ＭＳを用いたタンパク質の分析の障害になったりするという問題があった。
なお、ここでは、前処理の例として、生体試料から不要成分を除去する処理を挙げたが、それ以外の処理（例えばタンパク質を消化したり、アルキル化したりする処理）を前処理として行う場合も同様である。【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、生体試料中のタンパク質がサンプル容器に吸着することを防止することができ、且つ、生体試料中のタンパク質をＬＣＭＳを用いて測定するときの障害にならない、生体試料の前処理方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために成された本発明に係る、生体試料中のタンパク質を液体クロマトグラフ質量分析によって測定するための試料の前処理方法は、
生体試料に酢酸水溶液を添加して、酢酸の濃度が２０〜５０重量％の範囲の前処理用試料を調製する工程を含むことを特徴とする。【００１３】
本発明者は、上記課題を解決すべく、サンプル容器へのタンパク質の吸着を防止するための様々な方法を検討し、実験を行った結果、生体試料に２０〜５０重量％という比較的高濃度の酢酸が含まれている場合に、生体試料中のタンパク質のサンプル容器への吸着を抑えることができることを見出した。しかも、このような高濃度の酢酸と生体試料を含む前処理用試料に対して前処理を行った後の試料液を液体クロマトグラフ質量分析装置に導入してタンパク質を分析するときに、上記高濃度の酢酸が分析の障害にならない。【００１４】
生体試料には、血液（全血、血漿、血清）、細胞間質液、唾液、尿等の被検体から採取された試料（一次試料）、該一次試料から二次的に得られた試料、例えば組織抽出液、細胞培養液、細胞抽出液等が含まれる。
本発明において、被検体は、主に哺乳動物であり、特にヒトである。
生体試料中のタンパク質には、被検体の体内に内在するタンパク質だけでなく、被検体に医薬として投与されたタンパク質も含まれる。【００１５】
本発明においては、被検体から採取された生体試料はサンプル容器に入れられ、そこに酢酸水溶液を添加して上記の前処理用試料が調整された後、適宜の前処理に供される。本発明において、酢酸水溶液で生体試料を調製する主な目的は、生体試料の希釈や濃縮、ｐＨ値の調整等である。前処理としては、遠心分離、固相抽出カラムや透析による分離等、不要成分とそれ以外の成分を分離する処理の他、生体試料中のタンパク質の変性・還元処理、アルキル化処理、プロテアーゼ処理等が挙げられる。【００１６】
サンプル容器に生体試料が入れられると、直ちに生体試料中のタンパク質のサンプル容器への吸着が始まる。したがって、できるだけ早い時期に生体試料に酢酸水溶液を添加することが好ましい。そのため、例えば、被検体から採取した生体試料をサンプル容器に入れると同時に該生体試料に酢酸水溶液を添加したり、被検体から生体試料を採取するために使用される器具に予め酢酸水溶液を収容したりすると良い。【００１７】
また、例えば前処理用試料を固相抽出カラムに流して不要成分を除去する前処理を行ったときに、固相抽出カラムから流出する目的成分を含んだ溶出液には、固相抽出カラムの充填剤を活性化するための有機溶媒、充填剤に捕捉されている不要成分を洗浄するための洗浄液や目的タンパク質を溶出するための有機溶媒が含まれる。そのため、溶出液に含まれる酢酸の濃度が上記の範囲を下回る。【００１８】
そこで、上記方法においては、さらに、前記前処理用試料を用いて前処理を行う工程と、
前記前処理を行った後の試料液に酢酸を添加して、該酢酸の濃度が２０〜５０重量％の範囲となる分析用試料を調製する工程とを有することが好ましい。
上記方法によれば、前処理が終わった後、ＬＣ／ＭＳへ導入されるまでの間にサンプル容器内の分析用試料に含まれるタンパク質がサンプル容器に吸着することを防止できる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、生体試料中の目的とするタンパク質のサンプル容器への吸着を抑制することができるため、質量分析を用いた生体試料中のタンパク質の測定感度を高めることができる。また、質量分析結果の再現性が向上し、信頼性を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明に係る前処理方法の概略的な流れを説明する図。
【図２】ペプチド標品（グルカゴン）を、種々の組合せの試料調製用溶媒と希釈溶媒を用いて調製した後、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行ったときの検出強度（Area値）を示す。
【図３】ペプチド標品（インスリン）を、種々の組合せの試料調製用溶媒と希釈溶媒を用いて調製した後、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行ったときの検出強度（Area値）を示す。
【図４】ペプチド標品（グルカゴン）を、種々の濃度の試料調製用溶媒及び希釈溶媒で調製した後、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行ったときの検出強度（Area値）を示す。
【図５】ペプチド標品（グルカゴン）を、４０％の酢酸水溶液で調製した後、直ちにＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行ったときと１９時間放置してからＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行ったときの検出強度（Area値）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、生体試料中のタンパク質を液体クロマトグラフ質量分析によって測定するための試料の前処理方法であって、生体試料に酢酸水溶液を添加して、所定の濃度範囲の酢酸を含む前処理用試料を調製する工程を有することを特徴とする。前記前処理用試料の酢酸の濃度範囲は２０〜５０重量％であることが好ましく、さらには３５〜４５重量％であることが好ましい。
本発明の方法を用いることにより、従来、サンプル容器へのタンパク質やペプチドの吸着を防止するために行われていた有機溶媒、界面活性剤、又はペプチドの生体試料への添が不要となる、或いは添加量を低減することができる。また、従来、サンプル容器へのタンパク質やペプチドの吸着を防止するために行われていたサンプル容器の表面処理が不要となる。
【００２２】
図１は、本発明に係る前処理方法の概略的な流れを示している。ここでは、血漿を生体試料とし、前処理として固相抽出を行う場合を例に挙げて説明する。
＜サンプル調製＞
被検体から血液を採取する。血液の採取には、プロテアーゼ阻害剤カクテルが予め収容された採血管を用いる。採取した血液に、内部標準として安定同位体元素標識ペプチド等を加えた後、遠心分離により血漿と血球成分に分離する。そして血漿５００μＬを採取し、サンプル容器に入れる。
次に、サンプル容器に４０％の酢酸水溶液を１０μＬ添加し、５〜１０分間、常温で撹拌する。これにより、血漿中のタンパク質間の相互作用、ペプチド間の相互作用が解かれる。
続いて、５％のアンモニウム水和物５００μＬをサンプル容器内に添加し、ボルテックスで撹拌し、１０００μＬの前処理用試料を得る。
【００２３】
＜固相抽出（ＳＰＥ）＞
次に、固相抽出カラムを用いて、上記で得られた前処理用試料に含まれる不要成分を除去するための前処理を行う。固相抽出カラムには、Ｃ１８担体等、非極性充填剤を使用した固相抽出カラム、或いは、陰イオン又は陽イオン交換充填剤を使用した固相抽出カラムを使用することができる。
【００２４】
まずは、固相抽出カラムの充填剤を有機溶媒（メタノール等）で濡らして該充填剤を活性化させる（コンディショニング）。
次に、上記の前処理用試料（１０００μＬ）を所定の流速で固相抽出カラムの充填剤に流す（サンプルロード）。
【００２５】
続いて、前処理用試料に含まれる目的タンパク質と不要成分の極性に合わせた適宜の洗浄液を充填剤に流す（洗浄）。これにより充填剤に吸着していた不要成分が固相抽出カラムから排出される。洗浄液としては、例えば５％アンモニウム水和物や１０％アセトニトリル（ＡＣＮ）を用いることができる。
最後に、充填剤に溶離液を流して、該充填剤に保持されていた目的タンパク質を溶出する。溶離液としては、例えば、ＡＣＮ：水：酢酸＝４５：２５：３０となるように調製された溶液を用いることができる。前記酢酸には例えば３０％酢酸が用いられる。
【００２６】
上記のようにして得られた溶出液に６０％の酢酸水溶液を添加して、酢酸濃度が４０％の分析用試料を調製する。そして、この分析用試料をＬＣ／ＭＳ装置に導入し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を実行する。
【００２７】
このように、本発明に係る前処理方法は、前処理用試料、或いは分析用試料を調製するために用いる溶媒を酢酸水溶液とした以外は、従来を同様の溶媒や器具を使って前処理を行うことができる。
【００２８】
なお、上記では、固相抽出（ＳＰＥ）を前処理として説明したが、サンプル調製の工程で行った遠心分離も前処理に含めることができる。すなわち、本発明に係る前処理方法は、生体試料に含まれるタンパク質をＬＣ／ＭＳ又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳするために、複数の前処理を行う場合にも適用可能である。
【００２９】
また、上記では、被検体から採取した生体試料を例に挙げたが、市販されているペプチド標品も生体試料に含まれる。この場合は、ペプチドを溶解する溶媒として酢酸水溶液を用いることができる。
【実施例】
【００３０】
次に、本発明を具体的な実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下の説明では「％」は重量％を表すものとする。【００３１】
［実施例１］
［試料の調製（本発明の前処理）］
市販のグルカゴン標品（製品名「グルカゴン  ヒト」、富士フイルム和光純薬株式会社）をポリプロピレン製のサンプル容器（製品名「Protein LoBind tubes」、Eppendorf）に入れ、その中に試薬調製溶媒を添加し、さらに、希釈溶媒で段階希釈して、グルカゴンの体積モル濃度が0.01nM、0.1nM、1nM、10nM、100nMの５種類のグルカゴン溶液又は0.01nM、0.1nM、1nM、10nMの４種類のグルカゴン溶液をそれぞれ調製した。
試薬調製溶媒には、４０％酢酸水溶液、０．１％ギ酸、生理食塩水、リン酸緩衝液のいずれかを用い、希釈溶媒には、４０％酢酸水溶液または０．１％ギ酸を用いた。そして、試薬調製溶媒と希釈溶媒の組合せが異なる７組について、それぞれ上記の体積モル濃度のグルカゴン溶液を用意した。【００３２】
［ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析］
上記で得られた７組のグルカゴン溶液を液体クロマトグラフ質量分析計（超高速トリプル四重極型LC/MS/MSシステム LCMS-8060、株式会社島津製作所）に導入して、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。各試料について３回ずつＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。【００３３】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析で得られたグルカゴンに由来するプリカーサイオン（m/z 940.10）のプロダクトスペクトルからプロダクトイオン（m/z 697.15）の強度を求めた。各試料について３回ずつＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を実施して得られた結果を図２に示す。図２から分かるように、試薬調製溶媒及び希釈溶媒の両方が４０％酢酸水溶液であるときの検出強度（Area値）は、その他の組合せのときの検出強度に比べて劇的に増大していた。【００３４】
［実施例２］
市販のインスリン標品（製品名「ヒトインスリン」、シグマ  アルドリッチ）について、実施例１と同じ試薬調製溶媒、希釈溶媒を用いて、インスリンの体積モル濃度が0.01nM、0.1nM、1nM、10nM、100nMの５種類のインスリン溶液又は0.01nM、0.1nM、1nM、10nMの４種類のインスリン溶液をそれぞれ調製した。
このようにして得られた７組のインスリン溶液を、実施例１と同じ液体クロマトグラフ質量分析計に導入して、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。そして、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析で得られたスペクトルからインスリンに由来するプリカーサイオン（m/z 1162.50）のプロダクトスペクトルからプロダクトイオン（m/z [0]345.15）の強度を求めた。各試料について３回ずつＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を実施して得られた結果を図３に示す。図３から分かるように、実施例２においても、試薬調製溶媒及び希釈溶媒の両方が４０％酢酸水溶液であるときの検出強度（Area値）は、その他の組合せのときの検出強度に比べて劇的に増大していた。【００３５】
［実施例３］
試薬調製用溶媒及び希釈溶媒をいずれも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％の酢酸水溶液とし、実施例１と同様の手順で市販のグルカゴン標品をポリプロピレン（ＰＰ）製のサンプル容器（製品名「TORAST-H Bio Vial」、株式会社島津ジーエルシー）内で調製及び希釈してグルカゴンの体積モル濃度が100nMのグルカンゴン溶液を得た。
また、試薬調製用溶媒及び希釈溶媒をいずれも１０％、３０％、５０％の酢酸水溶液とし、実施例１と同様の手順で市販のグルカゴンをガラス製のサンプル容器（製品名「1.5mL  試料びん」、株式会社島津ジーエルシー）内で調製及び希釈して体積モル濃度が100nMのグルカンゴン溶液を得た。【００３６】
上記で得られたグルカゴン溶液について、実施例１と同じ液体クロマトグラフ質量分析計に導入して、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を実施し、プロダクトイオンの検出強度を求めた。各試料について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を１０回ずつ実施した。その結果を図４に示す。図４から分かるように、ＰＰ製のサンプル容器及びガラス製のサンプル容器を用いたときのいずれにおいても、試薬調製用溶媒及び希釈溶媒が１０％酢酸水溶液であるときの検出強度が最も低かった。また、ＰＰ製のサンプル容器を用い、且つ、試薬調製用溶媒及び希釈溶媒が２０％〜５０％の酢酸水溶液であるときの検出強度は、いずれもガラス製のサンプル容器を用いたときの検出強度よりも高く、特に３０〜５０％酢酸水溶液を試薬調製用溶媒及び希釈溶媒としたときの検出強度は非常に優れていた。【００３７】
以上より、ＰＰ製のサンプル容器を用いるときは、試薬調製用溶媒及び希釈溶媒として２０％〜５０％の酢酸水溶液を用いることにより優れた吸着抑制効果が発揮され、ガラス製のサンプル容器を用いるときは、ＰＰ製のサンプル容器ほどではないが、試薬調製用溶媒及び希釈溶媒として３０％〜５０％の酢酸水溶液を用いることにより優れた吸着抑制効果が発揮されることが分かった。【００３８】
［実施例４］
試薬調製溶媒及び希釈溶媒をいずれも４０％酢酸水溶液として、グルカゴンの体積モル濃度が100nMの６個のグルカゴン溶液を調製した。そして３個のグルカゴン溶液は調製後すぐに液体クロマトグラフ質量分析計に導入し、残り３個は４℃の温度下で１９時間放置した後、前記液体クロマトグラフ質量分析計に導入して、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を実行した。その結果を図５に示す。なお、本実施例で使用したグルカゴン標品及びサンプル容器、液体クロマトグラフ質量分析計は実施例１と同じであった。【００３９】
図５から分かるように、調製直後にＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を実施した結果と１９時間放置してからＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を実施した結果との間に大きな違いがなかった。このことから、試薬調製溶媒及び希釈溶媒をいずれも４０％酢酸水溶液として調製したグルカゴン溶液は、サンプル容器内でのグルカゴンの吸着が抑えられていたことが推測された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年1月21日(2021.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、生体試料中のタンパク質がサンプル容器に吸着することを防止することができ、且つ、生体試料中のタンパク質をＬＣ／ＭＳを用いて測定するときの障害にならない、生体試料の前処理方法を提供することである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明は、生体試料中のタンパク質を液体クロマトグラフ質量分析によって測定するための試料の前処理方法であって、生体試料に酢酸水溶液を添加して、所定の濃度範囲の酢酸を含む前処理用試料を調製する工程を有することを特徴とする。前記前処理用試料の酢酸の濃度範囲は２０〜５０重量％であることが好ましく、さらには３５〜４５重量％であることが好ましい。
本発明の方法を用いることにより、従来、サンプル容器へのタンパク質やペプチドの吸着を防止するために行われていた有機溶媒、界面活性剤、又はペプチドの生体試料への添加が不要となる、或いは添加量を低減することができる。また、従来、サンプル容器へのタンパク質やペプチドの吸着を防止するために行われていたサンプル容器の表面処理が不要となる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
このように、本発明に係る前処理方法は、前処理用試料、或いは分析用試料を調製するために用いる溶媒を酢酸水溶液とした以外は、従来と同様の溶媒や器具を使って前処理を行うことができる。
【国際調査報告】
2020059013.tif 000008
2020059013.tif 000009