(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が配列番号：１に示されるコード配列である、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
配列番号：２に示されるアラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）種のCOアミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸であって、前記ヌクレオチド配列の発現がトランスジェニック植物において開花を遅らせ、該開花の時期は実質的に春化により影響を受けないことを特徴とする核酸。
【請求項４】
配列番号：１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
co変異を補足することができる、請求項３又は４に記載の核酸。
【請求項６】
前記変異がアラビドプシス・タリアナ内にある、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
前記コードされたポリペプチドがジンクフィンガーに特徴的なシステインの配置を含む、請求項３〜６のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項８】
前記システインの配置がC−X2−C−X16−C−X2−Cである、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
前記コードされたポリペプチドがジンクフィンガーを含む、請求項３〜６のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１０】
配列番号：６又は配列番号：８に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
【請求項１１】
前記アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が配列番号：５又は配列番号：７に示されるコード配列である、請求項10に記載の核酸。
【請求項１２】
前記ポリペプチドの発現のための調節配列の制御下にある、請求項１〜11のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１３】
前記調節配列が誘導可能プロモーターを含む、請求項12に記載の核酸。
【請求項１４】
前記プロモーターが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのアイソホームIIの27kDサブユニットのためのトウモロコシ遺伝子から得られる、請求項13に記載の核酸。
【請求項１５】
遺伝子発現のアンチセンス調節に用いるのに適した、請求項１〜11のいずれか１項に記載の核酸のコード配列に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸。
【請求項１６】
請求項１〜11又は請求項15のいずれか１項に記載のDNAである核酸であって、そのヌクレオチド配列が当該ヌクレオチド配列のアンチセンス転写のための調節配列の制御下にあることを特徴とする核酸。
【請求項１７】
誘導可能プロモーターを含む、請求項16に記載の核酸。
【請求項１８】
前記プロモーターがグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのアイソホームIIの27kDサブユニットのためのトウモロコシ遺伝子から得られる、請求項17に記載の核酸。
【請求項１９】
植物細胞の形質転換のために適し、請求項１〜18のいずれか１項に記載の核酸を含む核酸ベクター。
【請求項２０】
請求項１〜18のいずれか１項に記載の核酸を含む植物細胞。
【請求項２１】
そのゲノム内に異種の前記核酸を有する、請求項20に記載の植物細胞。
【請求項２２】
半数体ゲノム当り１より多くの前記ヌクレオチド配列を有する、請求項21に記載の植物細胞。
【請求項２３】
請求項20〜22のいずれか１項に記載の植物細胞を含む植物。
【請求項２４】
請求項23に記載の植物の自家もしくは雑種の子孫もしくは後代、又は前記植物、子孫もしくは後代のいずれか一部もしくは零余子。
【請求項２５】
種子である、請求項24に記載の零余子。
【請求項２６】
植物の開花特性に影響を与える方法であって、前記植物の細胞内の核酸から、請求項１〜14のいずれか一に記載の核酸によりコードされるポリペプチドを発現させることを含む方法。
【請求項２７】
植物の開花特性に影響を与えるための、請求項１〜14のいずれか一に記載の核酸を植物の細胞内での発現させることによる当該核酸の使用。
【請求項２８】
アンチセンス制御により植物の開花特性に影響を与えるための、請求項15〜18のいずれか１項に記載の核酸を植物の細胞内での発現させることによる当該核酸の使用。
【請求項２９】
アラビドプシス・タリアナ以外の植物種からのCOアミノ酸配列をコードする核酸分子を同定及びクローニングする方法であって、当該アミノ酸配列は、配列番号：２に示される配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、且つ前記アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の発現がトランスジェニック植物において開花を遅らせ、該開花の時期は実質的に春化により影響を受けないものであり、該方法が、配列番号：１に示される配列から得られるヌクレオチド配列を用いる、ことを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項29に記載の方法により得られるCO核酸。
【請求項３１】
配列番号：５又は配列番号：７に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項30に記載の核酸。
【請求項３２】
アラビドプシス・タリアナ以外の植物種からCOアミノ酸配列をコードする核酸分子を同定及びクローニングする方法であって、当該アミノ酸配列は配列番号：２に示される配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、且つ前記アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の発現がトランスジェニック植物において開花を遅らせ、該開花の時期は実質的に春化により影響を受けないものであり、該方法が、配列番号：５又は配列番号：７に示される配列から得られるヌクレオチド配列を用いることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、植物における開花の遺伝的制御並びにそれに関連する遺伝子のクローニング及び発現に関する。更に詳しくは、本発明は、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）のCONSTANS（CO）遺伝子及びブラシカ・ナプス（Brassica napus）を含む他の種からの相同体のクローニング及び発現、並びに植物における前記遺伝子の操作及び使用に関する。
植物における有効な開花は、意図された産物が花又はそれから生産された種子である場合特に重要である。この１つの観点は、開花の時間的調節である：開花の開示を早めること又は遅めることは、農業家及び種子製造者に役立ち得る。開花に影響を与える遺伝メカニズムは、標的植物の開花特徴を変えるための手段を供する。開花が作物生産に重要である種は多数あり、本質的に種から成長する全ての作物である。ここでの重要な例は、温暖な気候の地域において最も農業経済的に重要である穀物、米及びトウモロコシ並びにより温い気候における小麦、大麦、エンバク及びライ麦である。重要な種子産物は、脂肪種子ナタネ及びキャノーラ（canola）、テンサイ、トウモロコシ、ヒマワリ、大豆及びサトウモロコシである。それらの根について収集された多くの作物は、もちろん種子から毎年成長され、いずれかの種の種子の産生は、植物が開花し、受粉され、そして種子をつける能力に極めて依存する。園芸において、開花の時期調整が重要である。その開花が制御され得る園芸植物は、レタス、エンダイブ、並びにキャベツ、ブロッコリー及びカリフラワーを含むアブラナ属野菜、並びにカーネーション及びフウロソウを含む。
アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）は、長い昼間の下で早期に、短い昼間の下で遅期に開花する長日植物である。それは小さく十分にキャラクタライズされたゲノムを有するので、比較的容易に形質転換され、再生されて迅速な成長サイクルを有する。アラビドプシスは開花及びその制御を研究する理想的なモデルである。
我々は、日長へのこの応答に必要とされる遺伝子の１つがFGとも呼ばれるCONSTANS又はCO遺伝子であることを発見した。我々は、この遺伝子の変異を有する植物が長日下でそれらの野生型より遅く開花するが、短日下で同時に開花することを発見した。それゆえ、我々はCO遺伝子産物が長日下での開花の促進に関連することを結論づけた。
Putterill et al, Mol. Gen. Genet. 239 : 145〜157（1993）は、イースト人工染色体（YAC）ライブラリーと一緒の染色体及び遺伝子COを含む300kb領域を含むアラビドプシスの染色体５上の連続DNAの1700kbの単離に関する予備的クローニングの研究を記載する。その研究はCO遺伝子のクローニング及び同定に失敗している。
我々は、本明細書において供されるCO遺伝子（Putterill et al., 1995）をクローニングして配列決定した。実験のセクションで後に議論されるように、予想されるよりきびしいクローニングを行う予想されない困難及び複雑さがあった。
本発明の第１の態様によれば、CO機能を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を提供する。当業者は、“CO機能”がアラビドプシス・タリアナのCO遺伝子のような表現型で開花の時間調整（時間調整は実質的に春化により影響を受けない）に影響を及ぼす能力、特にアラビドプシス・タリアナにおけるCO変異又は他の種におけるCO表現型を補足する能力に言及するのに用いられ得る。CO変異体は長日下での開花の遅れを示し、ここで開花の時間調整は実質的に春化により影響を受けない（例えばKorneef et al.（1991）を参照のこと）。
本発明による核酸は、アラビドプシス・タリアナのCO遺伝子の配列を有し得、又はその供される配列の変異体、誘導体もしくは対立遺伝子であり得る。好ましい変異体、誘導体及び対立遺伝子は、野生型遺伝子によりコードされる蛋白質の機能的特徴、特に本明細書に議論されるような開花を促進する能力を保持する蛋白質をコードするものである。他の好ましい変異体、誘導体及び対立遺伝子は、野生型と比較して開花を遅らせる蛋白質及びその供される配列を有する遺伝子をコードする。変異体又は誘導体を生産するための配列の変換は、コードされたポリペプチドにおける１以上のアミノ酸の付加、挿入、欠失又は置換を導く核酸における１以上のヌクレオチドの付加、挿入、欠失又は置換により行われ得る。もちろん、コードされたアミノ酸と差のない核酸への変換も含まれる。
CO遺伝子のための好ましい核酸配列を、CO機能を有するポリペプチドのコードされたアミノ酸配列と共に図１に示す。
本発明は、供される配列のいずれか一を有する核酸を含むベクター、好ましくは核酸配列によりコードされるポリペプチドが発現され得るベクターも提供する。そのベクターは、好ましくは、植物細胞内への形質転換に適している。本発明は、このようなベクターで形質転換された宿主細胞、特に植物細胞を更に含む。これにより、本発明による核酸を含む植物細胞のような宿主細胞が提供される。その細胞内において、その核酸は、染色体内に組み込まれ得る。半数体のゲノム当り１以上の異種核酸配列が存在し得る。これは、例えば以下に議論されるように、内生のレベルと比較して遺伝子産物の発現の増加を可能にする。
本発明による核酸を含むベクターは、特にベクターがゲノム内への組換えのために細胞内に核酸を導入するのに用いられるなら、プロモーター又は他の調節配列を含む必要はない。
本発明による核酸分子及びベクターは、実質的に純粋なもしくは均一な形態において、又は開花に影響を及ぼすことができるポリペプチドをコードする配列以外の関心の種もしくは源の核酸もしくは遺伝子のないもしくは実質的にない状態で天然の環境から、例えばCO配列以外のアラビドプシス・タリアナ核酸において単離されて供され得る。
核酸は、もちろん適切には二本鎖又は一本鎖、cDNA又はゲノムDNA、RNA、全体又は部分的に合成されたものであり得る。
本発明は、開示されるいずれかの核酸配列の発現産物、並びに適切な宿主細胞において適切な条件下でそれをコードする核酸からの発現による発現産物を作る方法も含む。当業者は、十分に、ベクターを作製し、組換え遺伝子発現の産物の発現及び回収のためのプロトコルをデザインすることができる。プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ホツアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び適切な他の配列を含む適切な調節配列を含む適切なベクターを選択し、又は作製することができる。更に詳細には、例えば、Molecular Cloning : a Laboratory Manual : 2nd edition, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと。形質転換方法は用いられる宿主によるが、それは公知である。
本発明は、本発明による核酸を含む植物細胞、並びにその植物の自家受粉したもしくはハイブリッド後代及びいずれかの子孫、更に種子を含む植物、後代もしくは子孫のいずれか一部もしくは零余子を更に含む。
本発明の更なる態様は、アラビドプシス・タリアナ以外の植物種からCO相同体を同定及びクローニングする方法であって、該方法が図１に示されるものから得られるヌクレオチド配列を用いることを特徴とする方法を提供する。その配列が図５及び図６に示される遺伝子をこの様にクローニングした。これらから得られた配列は、それ自体、他の配列を同定及びクローニングするのに用いられ得る。本明細書に供されるヌクレオチド配列情報、又はそのいずれかの一部は、その発現産物が開花特徴に影響を与える能力についてテストされ得る相同性のある配列を見い出すためにデータ・ベース・サーチにおいて用いられ得る。これらは、“CO機能”又は変異体表現型を補足する能力を有し、ここでその表現型は（特に長日下で）開花が遅らせられ、好ましくは開花の時間調整は本明細書に開示されるような春化により実質的に影響を受けない。あるいは、核酸ライブラリーは、当業者に公知である事実、並びにそれにより同定され次にテストされる相同的配列を用いてスクリーニングされ得る。
本発明は、図１に示されるものから得られるヌクレオチド配列を用いて得られたCO相同体をコードする核酸も含む。CO相同体配列を図５及び６に示す。本発明には、図５又は図６に示される配列から得られたヌクレオチド配列を用いて得られたCO相同体をコードする核酸も含む。
CO蛋白質は、
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GATA転写因子内に含まれるもののようなジンクフィンガーを特徴とする蛋白質のアミノ末端におけるシステインの配置を含む。７の独立して単離されたCO変異体が記載され、我々は全ての７つの場合において、CO活性の減少を引きおこす配列変換を同定した。それらの５つはジンクフィンガーを形成するためのそれらの配列から指定される領域内に変換を有し、他の２つはその蛋白質のカルボキシ末端における隣接したアミノ酸において変化を有する。これらの変換の位置はCOが、おそらくDNAと結合し、転写因子として作用するジンクフィンガーを含む蛋白質をコードするという我々の解釈を支持する。
アラビドプシス・タリアナのCO遺伝子のための配列情報の供給は、他の植物種からの相同的配列の入手を可能にする。サザンハイブリダイゼーション実験において、アラビドプシス・タリアナのCO遺伝子を含むプローブは、ブラシカ・ニグラ（Brassica nigra）、ブラシカ・ナプス（Brassica napus）及びブラシカ・オレラセアエ（Brassica oleraceae）から抽出されたDNAとハイブリダイズする。これらの種の異なるバラエティーは、それらのDNAが制限酵素で切断され、COプローブとハイブリダイズする場合に、制限フラグメント長の多形性を示す。次にこれらのRFLPは、周知の位置の他のRFLPに対してCO遺伝子をマッピングするのに用いられ得る。この方法において、例えば、３つのCO遺伝子相同体をブラシカ・ナプスの連結グループＮ５，Ｎ２及びＮ12にマッピングした（D. Lydiate、未出版）。RFLPマッピングに用いられた集団を開花時間のために先に評価した。それは、CO相同体の特定の対立遺伝子が開花時間に影響を与える対立遺伝子変異と共に分離することを証明した。連結グループＮ２及びＮ12へマッピングされた遺伝子座は、開花時間のための最も極度の対立遺伝子変異を示した。
成功した２つのブラシカ・ナプス相同体のクローニングを実施例５に記載する。
これは、アラビドプシスのCO遺伝子が他の植物種における開花時間を調節することを確認する。
これにより、本発明の範囲には、アラビドプシス・タリアナのCOの相同体であるアミノ酸をコードする核酸分子である。相同性は、ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列レベルにおいてであり得る。好ましくは、核酸配列は、図１のヌクレオチド配列によりコードされる配列と相同性を有し、アラビドプシス・タリアナ以外の種から好ましくは少くとも約50％、又は60％、又は70％、又は80％の相同性、最も好ましくは少くとも90％の相同性を有し、そのコードされたポリペプチドは、アラビドプシス・タリアナ CO遺伝子での表現型、好ましくは開花の時間調整に影響を与える能力を有する。これらは、アラビドプシス・タリアナ COと比較して開花を促進又は遅延させ得、変異体、誘導体又は対立遺伝子は野生型と比較して開花を促進又は遅延させ得る。
CO遺伝子相同体は、米及びトウモロコシのような経済的に重要な単子葉植物の作物からも同定され得る。単子葉植物及び双子葉植物において同じ蛋白質をコードする遺伝子はヌクレオチドレベルにおいて相対的に低い相同性を示すが、アミノ酸配列は保存されている。公共の配列データベースにおいて、我々は、ランダムシーケンシングプログラムにおいて得られ、その活性に重要であるこが知られている蛋白質の領域においてCOと相同性を有するいくつかのアラビドプシスcDNAクローン配列を同定した。同様に、ランダムに配列決定されたcDNAにおいて、我々は、DNAレベルにおいてCOに相対的に低い相同性を有するが、アミノ酸レベルにおいて高い相同性を示す１つのクローンを同定した。このクローン及び我々がトウモロコシから同定した他のものは、米及び他の穀物から全体のCO遺伝子ファミリーを同定するのに用いられ得る。これらのクローンの各々を配列決定し、それらの発現パターンを研究し、そしてそれらの発現を変える効果を検査することにより、開花時間を調節することにおいてCOと同様の機能を行う遺伝子が得られうる。もちろん、これらの配列の変異体、誘導体及び対立遺伝子は、アラビドプシス・タリアナ  CO遺伝子のために先に議論されるのと同じ言葉で本発明の範囲内に含まれる。
本発明による核酸は、開花が遅らされた変異体表現型を補足することができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得、ここで開花の時間調整は実質的に春化により影響を受けない。開花の遅延は長日下であり得る。本発明はまた、開花の時間調整に影響を与える能力を有するポリペプチドをコードする野生型遺伝子の変異体又は誘導体であるヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記変異体又は誘導体表現型が、開花の時間調整が春化により実質的に影響を受けずに、早く又は遅く開花することを特徴とする核酸を提供する。これらは、Lee et alにより報告されるLD遺伝子から区別される。
春化は、通常数週間、おそらく約30日間の期間の植物（苗木）又は種子の低温（通常ちょうど０℃超）処理である。それは、それらが芽又は花をこわす前にいくつかの植物種により要求される処理であり、冬の冷たさの効果を刺激する。
更に本発明によれば、発現の制御のための調節配列の作用的制御下において、本発明により供されるようなヌクレオチドの配列がそのゲノム内に組み込まれている植物細胞を提供する。本発明の更なる態様は、ヌクレオチドの配列を含むベクターの植物細胞内への導入と、前記ベクターと前記植物細胞ゲノムとの間の組換えを引きおこし、又はそれを許容して前記ヌクレオチドの配列を前記ゲノム内に導入することを含む、前記のような植物細胞を生産する方法を提供する。
本発明による植物細胞を含む植物も提供する。そのいずれか一部もしくは零余子、種子、自家受粉した又はハイブリッドの子孫及び後代も提供する。
本発明は、植物の細胞内における異種CO遺伝子配列（又は先に議論されるような変異体、対立遺伝子、誘導体もしくはその相同体）の発現を含む植物の開花特性に影響を与える方法を提供する。“異種”という言葉は、問題のヌクレオチドの遺伝子／配列が、遺伝的処理を用いて、即ちヒトの介入により植物の前記細胞内に導入されていることを示す。その遺伝子は、ゲノム外のベクター上にあり得、又はゲノム内に好ましくは安定に組み込まれ得る。異種遺伝子は、内在性の均等な遺伝子、即ち同じ事又は開花の制御において同様な機能を通常行うものと置換され得、又はその挿入された配列は、内在性遺伝子に付加され得る。異種遺伝子の導入の利点は、遺伝子発現に影響を与え、それにより好みにより開花させることができるために、遺伝子の発現を、選択されたプロモーターの制御下におくことができる能力である。更に、例えば野生型より高い又は低い活性を有する野生型遺伝子の変異体又は誘導体は、内在性遺伝子の場所に用いられ得る。
本発明を用いて変えられ得る主要な開花特性は開花の時間調整である。CO遺伝子の遺伝子産物の不十分な発現は、（CO変異体表現型により示唆されるような）開花の遅れを導き；過剰発現は、（CO遺伝子の余分な複製を有するトランスジェニックアラビドプシス植物で、及びCaMV 35Sプロモーターからの発現により証明されるような）早熟の開花を導き得る。この制御の程度は、例えばハイブリッド生産における雄性及び雌性の親系統の同調する開花を確実にするのに役立つ。他の使用は、成長する時期を広げ、又はせばめるために気候の指定に従って、開花を早め、又は遅らせることである。これは、アンチセンス又はセンス制御の使用を含み得る。
変化され得る第２の開花特性は、苗条上の花の配置であり得る。アラビドプシスにおいて、花は側面上に発達するが、苗条の頂部において発達しない。これは、LEAFY遺伝子（Weigel et al., 1992）の発現の位置により決定され、LEAFYが苗条の頂部において発現されるようにする末端の花（terminal flower）（Shannon and Meeks-Wagner, 1991）のような変異も頂部における花の発達を導く。COがLEAFYの十分な活性のために必要とされる証拠があり（Putterill et al., 1995）、それにより、CO発現のパターンを増加させ、又は変えることにより、LEAFY発現の、それゆえ花の発達のレベル及び位置も変えられ得る。これは実施例４に例示される。これは、変更された配置の花を有する新しい種々の園芸の種を作り出すことにおいて有利に用いられ得る。
CO遺伝子又は相同体のような本発明に従う核酸は、開花の時間調整を使用者の制御下におくために外部から誘導可能な遺伝子プロモーターの制御下におかれ得る。誘導可能なプロモーターの使用は以下に記載される。これは、花の形成、及び次の種子の形成のような出来事が、例えば切断した花又は装飾用の開花性鉢植物における市場の要求に合うように時間調整され得る。鉢植物において開花を遅らせることは、販売の時点まで製造元からの製品の輸送に利用できる期間を長くすることに有利であり、開花時期を長くすることは、購入者に明らかに有利である。
プロモーターに適用されるような“誘導可能”という言葉は、当業者により十分に理解される。本質において、誘導可能プロモーターの制御下での発現は、適用される刺激に応じて“スイッチ・オン”され、又は増加される。刺激の性質はプロモーター間で種々である。いくつかの誘導可能なプロモーターは、適切な刺激の欠如下では小さな又は検出不可能なレベルの発現をおこさない（又は発現しない）。他の誘導可能プロモーターは、刺激の欠如下で検出可能な構造的発現を引きおこす。刺激の欠如下での発現のレベルがいくらであろうと、いずれの誘導可能なプロモーターからの発現も正確な刺激の存在下で増加される。好ましい状況は、発現のレベルが、表現型の特徴を変えるのに効果的な量による関連する刺激の適用に基づいて増加する場合である。これにより、刺激の欠如下で基底レベルの発現を引きおこし、ここでそのレベルは極めて低く要求される表現型をもたらさない（及び実際に０であり得る）誘導可能又は“スイッチ可能”なプロモーターが用いられ得る。刺激の適用に基づいて、発現は、要求される表現型をもたらすレベルまで増加（又はスイッチ）される。
適切なプロモーターは、実質的に全ての植物組織において高レベルで発現されるカリフラワーモザイクウイルス（Cauliflower Mosaic Virus）35S（CaMV 35S）（Benfey et al, 1990ａ及び1990ｂ）；外来性の毒性緩和剤の適用に応答して活性化されるトウモロコシグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼイソホームII（GST−II−27）遺伝子プロモーター（WO 93／01294, ICI Ltd）；野菜の頂部の分裂組織並びに植物の胴体、例えば内側篩部、花の原基、根及び苗条における分枝点におけるいくつかの十分に局在化した位置において発現されるカリフラワーmeri５プロモーター（Medford, 1992 ; Medford et al, 1991）；並びに花の発達において極めて早く発現されるアラビドプシス・タリアナLEAFYプロモーター（Weigel et al, 1992）を含む。
選択された遺伝子構成物を細胞内に導入する場合、当業者に公知である特定の考慮を払わなければならない。挿入されるべき核酸は、転写を行うであろう効果的な調節因子を含む構成物内に作製されるべきである。その構成物を細胞内に移す利用できる方法がなければならない。その構成物が細胞膜内にあるとすれば、内在性の染色体材料内への一体化が行われるか、又は行われないかのいずれかであろう。最後に、植物が考慮される限り、標的細胞タイプは細胞が全体の植物内に再生され得るようでなければならない。
その配列を含むDNAセグメントで形質転換された植物は、植物の遺伝子操作のための標準的な技術により生産され得る。DNAは、その天然の遺伝子転移能力を利用するアグロバクテリア（Agrobacterium）が有するディスアームド（disarmed）Ti−プラスミドベクター（EP-A-270355, EP-A-0116718, NAR 12（22）8711〜87215, 1984）、粒子又はマイクロプロジェクティルボンバードメント（US 5100792, EP-A-444882, EP-A-434616）、マイクロインジェクション（WO 92／09696, WO 94／00583, EP 331083, EP 175966）、エレクトロポレーション（EP 290395, WO 8706614）又は直接的DNA取込みの他の形態（DE 4005152, WO 9012096, US 4684611）のようないずれかの適切な技術を用いて植物細胞内に形質転換され得る。アグロバクテリアが、双子葉植物種を形質転換するために当業者により広く用いられる。アグロバクテリアはいくつかの単子葉植物種内に外来DNAを形質転換することができると報告されているが（WO 92／14828）、アグロバクテリアが効能がなく又は効果がない場合、マイクロプロジェクティルボンバードメント、エレクトロポレーション及び直接的DNA取込みが好ましい。あるいは、形質転換過程の効能を増加させるために、異なる技術の組合せ、例えば、アグロバクテリアで被覆された微小粒子でのボンバードメント（EP-A-486234）又は傷を導くためのマイクロプロジェクティルボンバードメントの後のアグロバクテリアとの同時培養（EP-A-486233）が用いられ得る。
形質転換の特定の選択は、特定の植物種を形質転換するその効能、並びに選択された特定の方法で本発明を実施する人の経験及び好みにより決定されよう。植物細胞内へ核酸を導入するための形質転換系の特定の選択は本発明に本質的でなく、又はそれを限定するものでないことは当業者に明らかであろう。
本発明において、センス方向でヌクレオチド配列を導入することにより過剰発現が達成され得る。これにより、本発明は、植物の開花特徴に影響を与える方法であって、該方法が植物の細胞内の核酸から本発明に従う核酸のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの発現を引きおこし、又は許容することを含むことを特徴とする方法を提供する（実施例４を参照のこと）。
遺伝子産物ポリペプチドの不十分な発現は、アンチセンス技術又は“センス制御”を用いて達成され得る。遺伝子発現を下降調節するためのアンチセンス遺伝子又は部分的配列の使用は現在十分に確立されている。DNAの“アンチセンス”鎖の転写が標的遺伝子の“センス”鎖から転写される通常のmRNAに相補的であるRNAを産生するようにDNAがプロモーターの制御下におかれる。二本鎖DNAのために、これは、“逆方向”におけるコーディング配列又はそのフラグメントをプロモーターの制御下におくことにより達成される。相補的アンチセンスRNA配列は、次にmRNAと結合して二本鎖を形成して標的遺伝子からの内在性mRNAの蛋白質への翻訳を阻害すると考えられる。これが実際の作用の態様であるか否かはまだ不確かである。しかしながら、その技術が働くことは確立された技術である。例えばRothstein et al, 1987 ; Smith et al, 1988 ; Zhang et al, 1992を参照のこと。
これにより、本発明は、植物の開花特性に影響を与える方法であって、該方法が、植物の細胞内において本発明に従う核酸からのアンチセンス転写を引きおこす又は許容することを含むことを特徴とする方法も提供する。
標的遺伝子の異なる複製がセンス、即ち標的遺伝子と同じ方向において挿入される場合、過剰発現がおこる個体、及び標的遺伝子からの蛋白質の下降発現がおこるいくつかの個体を含む特定の範囲の表現型が生産される。挿入された遺伝子が内在性遺伝子の一部のみである場合、形質転換した集団中の下降発現する個体の数が増加する。センス制御、特に下降制御がおこるメカニズムは十分に理解されていない。しかしながら、この技術は、科学及び特許文献にも十分に報告されており、遺伝子制御のために慣用的に用いられている。例えば、Van der Krol, 1990 ; Napoli et al, 1990 ; Zhang et al, 1992を参照のこと。
これにより、本発明は、植物の開花特性に影響を与える方法であって、該方法が、植物の細胞内において、本発明による核酸からの発現を引きおこし、又は許容することを含むことを特徴とする方法も提供する。これは、開花特性に影響を与える能力を有するポリペプチドの活性を抑制するのに用いられ得る。ここで、ポリペプチドの活性は、好ましくは、植物細胞内の下降発現の結果として抑制される。
先に言及されるように、CO遺伝子の発現パターンは、それを外来プロモーターに融合することにより変えられ得る。例えば、Imperial Chemical Industries Limitedの国際特許出願WO 93／01294は、トウモロコシグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、イソホームII遺伝子の27kDサブユニット（GST−II−27）から単離された化学的に誘導可能な遺伝子プロモーター配列を記載する（図２を参照のこと）。GST−II−27プロモーターは、外来遺伝子に連結され、形質転換により植物内に導入された場合に、その外来遺伝子の発現の外部からの制御のための手段を供する。CO遺伝子の構造領域は、図２に示される翻訳開始点の下流のGST−II−27プロモーターに融合される。
GST−II−27遺伝子プロモーターは、成長中の植物に適用され得る特定の化学的化合物により誘導されることが示された。そのプロモーターは単子葉植物及び双子葉植物の両方で機能的である。それゆえ、それは、キャノーラ、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、綿のような野外の作物；小麦、大麦、米、トウモロコシ、モロコシのような穀物；トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、西洋ナシ、サクランボ、バナナ、及びメロンのような果樹；並びにニンジン、レタス、キャベツ及びタマネギのような野菜を含む種々の遺伝的に改変された植物における遺伝子発現を調節するのに用いられ得る。GST−II−27プロモーターは、根、葉、幹及び再生組織を含む種々の組織における使用にも適している。
従って、本発明は、更なる態様において、アラビドプシス・タリアナ、他の植物からの相同体又はそのいずれかの変異体、誘導体もしくは対立遺伝子のような本発明により供されるヌクレオチド配列に作用的に結合された誘導可能プロモーターを含む遺伝子構成物を提供する。これは遺伝子の発現の調節を可能にする。本発明は、前記遺伝子構成物で形質転換された植物、並びにこのような構成物の植物細胞内への導入及び／又は適切な刺激の適用、効果的な外来のインデューサーの適用による植物細胞内の構成物の発現の誘導を含む方法も提供する。そのプロモーターは、GST−II−27遺伝子プロモーター又はいずれかの他の誘導可能な植物プロモーターであり得る。
早期の開花を引きおこすCO活性の促進
CO活性を減少させる変異は、誘導的長日条件下で遅れた開花を引きおこし、これは長日下で開花を促進することにおけるCOの関連性を示す。それはCO変異がこれらの条件下で開花時間に影響を与えないので、非誘導的短日下ではおそらく必要とされない。CO転写物は、長日下で極めて低い量で存在し、PCRを用いてcDNAを増幅することによってのみ検出されている。COを含むT-DNAを有するいくつかの形質転換植物が長日下で野生型より少し早く、短日下で野生型よりかなり早く開花するという観察は、特に非誘導性短日下において、CO転写物のレベルが開花時期を制限することを示唆する。これは、開花が、遺伝子の発現を変えるための外来プロモーターを用いることにより操作され得ることを示唆する。
非誘導性条件下での早期の開花の誘導
非誘導性条件下でのCO転写物レベルの操作は早期の又は調節された開花を導き得る。本明細書に開花されるもののようなプロモーター融合体は、非誘導的条件下で野生型の植物において見い出されるより高いレベルにおけるCO mRNAの発現を可能にする。CaMV 35S又はmeri５融合体の使用は、早期の開花を導く一方、GSTII融合体の使用は調節された開花を導く。
誘導性条件下での早期の開花の誘導
野生型アラビドプシス植物は誘導性条件下で極めて迅速に開花し、CO遺伝子は、低下レベルであるか、開花する前に発現される。しかしながら、COの余分な複製を含むいくつかの形質転換野生型植物は野生型植物より少し早く開花することが示されている、CO産物のレベルは、プロモーター、例えばCaMV 35S又はmeri５融合体の導入によって増加され得る。GSTIIのような誘導可能プロモーターは、例えば最初に特定の種のCO変異体を形成し、次に調節された様式において変異の補完ができる誘導可能なプロモーターCO融合体を導入することにより、開花を調節するのに用いられ得る。
遅れた開花を引きおこすCO活性の阻害
CO変異は、アラビドプシスの遅れた開花を引きおこす。形質転換の試みは、CO活性を減少させるのに用いられ得、それにより特定の範囲の植物種において開花を遅らせ、又は防止する。種々のストラテジーが用いられ得る。
センス又はアンチセンスRNAの発現
いくつかの場合において、内在性植物遺伝子の活性は、先に議論されるようにトランスジーンからの相同的アンチセンスRNAの発現により削減されている。同様に、トランスジーンからのセンス転写物の発現は、先に議論されるようにその遺伝子の対応する内在的複製の活性を削減し得る。COアンチセンス又はセンスRNAの発現は、内在性遺伝子の活性を削減し、遅れた開花を引きおこし得る。
CO蛋白質の改良型の発現
転写因子及び他のDNA結合蛋白質は、DNA結合、二量化又は転写活性化のために要求されるアミノ酸配列がその蛋白質の分かれたドメインによりコードされているモジュール構造をしばしば有する（Ptashne及びGann, 1990による調査）、これは、DNA結合蛋白質の機能の１つのみを示す端が切り取られ、又は融合した蛋白質の構造を許容する。COの場合、試験管内での遺伝子の改変及び蛋白質の改良型の発現は、内在性の完全な蛋白質の支配的な阻害を導き得、それにより開花を遅らせる。これは、以下のことを含む種々の方法において達成され得る。
DNA結合領域のみをコードする端が切り取られたCO蛋白質の発現
COのジンクフィンガー含有領域が必要とされ、DNAへの結合を許容するのに十分であり得る。DNA結合領域のみをコードする端が切り取られ、又は変異された蛋白質が内在性蛋白質より高いレベルにおいて発現されたなら、CO結合部位のほとんどは、変異型により占有され、それにより十分に活性な内在性蛋白質の結合を阻害する。変異蛋白質の結合は、その変異蛋白質は、転写活性化、転写阻害又は蛋白質−蛋白質相互作用のような生物的過程に関連し得るCOのいずれかの他の領域を含まないであろうので、CO作用を防ぐ効果を有するだろう。
COのそれに類似したジンクフィンガーを含むネズミ転写因子GF１の試験管内分析は、先に記載される特性を有する端が切り取られたCO蛋白質が設計され得るであろうことを示唆する。Martin及びOrkin（1990）は、ジンクフィンガーのみを含むGF１の端が切り取られた型はDNA結合活性を保持したが、転写活性化を行うことができないことを証明した。同様に、ドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster）のジンクフィンガー含有PANNIER蛋白質は、剛毛形成のために要求される遺伝子の活性化を抑制するのに必要とされる。ジンクフィンガーを含まないドメインにおける変異は、おそらくこれらの蛋白質はDNAに結合するが、野生型蛋白質が行う方法で他の蛋白質と相互作用しないため、遺伝子活性の支配的超抑制を引きおこした（Ramain et al, 1993）。
DNA結合ドメインをコードしない変異CO蛋白質の発現
阻害分子の第２の形態は、COがその生物効果を有するために二量化し、又は他の蛋白質と複合体を形成しなければならないなら、そしてこれらの複合体がCOがDNAに結合する必要性なしに形成することができるなら、デザインされ得る。この場合、DNA結合ドメイン内で変異されるが、野生型蛋白質の他の特徴の全てを含むCO蛋白質の発現は阻害効果を有するだろう。変異蛋白質が内在性蛋白質及びCOが通常形成する二量体より高い濃度で存在したなら、内在性蛋白質のほとんどは変異蛋白質での二量体を形成し、DNAと結合しないであろう。同様に、COが他の蛋白質と複合体を形成するなら、COの変異形態は、次にDNAと結合しないであろうこれらの複合体の大部分に関与するだろう。
これらの特性を有するDNA結合蛋白質の変異形態が先に報告されている。例えば、イースト細胞において、GAL４の転写活性化ドメインを含む蛋白質の発現は、CYC１遺伝子の発現を減少させることができる。CYC１は通常GAL４により活性化されないので、GAL４活性化ドメイン隔絶蛋白質がCYC１活性化のために必要とされないことが提唱された（GIll及びPtashne, 1988）。同様に、ドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster）のPANNIER蛋白質のジンクフィンガー領域における変異は支配的な表現型を有する。これはおそらく、変異蛋白質がPANNIER活性に本質的な蛋白質を隔絶し、野生型蛋白質と相互作用するそれらの効用を削減するからである（Ramain, 1993）。
本発明の態様及び実施形態は、添付の図面を引用して実施例として詳細に記載されよう。更なる態様及び実施形態が当業者に明らかになるであろう。本書面に言及される全ての文献は引用により本明細書に組み込まれる。
図面において：
図１は、アラビドプシス・タリアナから得られたCO ORF（配列番号：１）、及びその予想されるアミノ酸配列（配列番号：２）である本発明の１つの実施形態に従うヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列をアミノ酸配列の上に示す。ボールドで示される領域は両方ジンクフィンガードメインを含む。
図２はGST−II−27遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列（配列番号：３）を示す。融合体を作るのに用いられるフラグメントはボールドで示されるHindIII及びNdeＩ部位に隣接する。
図３は、シグナルイントロン、プロモーター配列及び翻訳終了コドンを含むアラビドプシス・タリアナから得られたCO遺伝子を含むゲノムDNAのヌクレオチド配列（配列番号：４）を示す。示されるゲノム領域は、翻訳開始部位の上流2674bpから開始し、ポリアデニル化部位の直後で終わる。COオープン読み枠はボールドで示され、単一のイントロンにより継続される。
図４は、CaMV 35Sプロモーターのソースとして用いられるpJIT62プラスミドを示す。黒くぬられた線として示されるKpnＩ−HindIIIフラグメントをプロモーターのソースとして用いた。
図５は、ブラシカ・ナプス（配列番号：５）から得られたCO ORF及びその予想されるアミノ酸配列（配列番号：６）である本発明の更なる実施形態に従うヌクレオチド配列を示す。
図６は、ブラシカ・ナプスから得られた第２のCO ORF（配列番号：７）及びその予想されるアミノ酸配列（配列番号：８）である本発明の更なる実施形態に従うヌクレオチド配列を示す。
実施例１−CO遺伝子コスミド及びRFLPマーカーのクローニング及び分析
λCHS2のDNAをR. Feinbaum（Massachusetts General Hospital（MGH）, Boston）から得た。YACライブラリーコロニーフィルター及び植物ゲノムDNAブロットに、放射能標識プローブとして全DNAを用いた。コスミドｇ6833, 17085, 17861, 19027, 16431, 14534, ｇ5962及びｇ4568を、Brain Hauge（MGH, Boston）から得、30μｇ／mlカナマイシンの存在下で培養して、−70℃においてグリセリン・ストックとして維持した。全てのコスミドDNAを、YACライブラリーコロニーフィルター及び植物ゲノムDNAブロットへ放射能標識プローブとして用いた。コスミドpCIT1243をElliot Meyerowitz（Caltech, Pasadena）により得、100μｇ／mlストレプトマイシン／スペクチノマイシンの存在下で培養し、−70℃でグリセリン・ストックとして維持した。pCIT30ベクター配列は、pYAC４由来ベクターに相同性を有し、それゆえYACライブラリーコロニーフィルターは、コスミドから抽出された挿入DNAとハイブリダイズした。pCIT1243の全DNAを、植物ゲノムDNAブロットへの放射能標識プローブとして用いた。
YACライブラリー
EG, abi及びライブラリーをChris Somerville（Michigen State University）から得た。EWライブラリーを
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から得、YupライブラリーをJoe Ecker（University of Pennsylvania）から得た。そのライブラリーのマスター・コピーを、（Schmidt et al. Aust. J. Plant Physiol. 19 : 341〜351（1992）に記載されるように）−70℃で保存した。作業用ストックを４℃において選択的Kiwibrew寒天上に維持した。Kiwibrewは選択的な完全最小培地からウラシルをとり、11％カザミノ酸を含むものである。ライブラリーの作業用ストックを、96−プロングレプリケーターを用いて３ケ月毎に取りかえた。
イーストコロニーフィルター
８〜24ライブラリープレートからの一連のイーストコロニーDNAを含むHybond-N（Amersham）フィルター（８cm×11cm）を作製して、（Coulson et al. Nature 335 : 184〜186（1988）に記載されるように）処理し、（Schmidt and Dean Genome Analysis, vol.4 : 71〜98（1992）により記載されるように）改良した。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は製造元の証明に従った。ランダム−ヘキサマーラベリングにより放射能標識プローブを調製した。
パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）によるイースト染色体調製及び分画
Kiwibrew５ミリリッターに単一のイーストコロニーを接種し、24時間、30℃で培養した。イーストスフェロプラストを、室温で１時間、2.5mg/ml Novozym（Novo Biolabs）と共にインキュベートすることにより生成した。次に１Ｍソルビトールをスフェロプラストの最終容量が50μｌになるように加えた。１Ｍソルビトール中の溶解LMPアガロース８マイクロリッター（１％Incertアガロース、FMC）をスフェロプラストに加え、その混合物を簡単にボルテキシングして、プラグモールド内に分注した。プラグを1.5mlエッペンドルフチューブ内に入れ、次に100mM EDTA, pH8, １％ Sarkosyl中の１mg／mlプロテイナーゼＫ（Boehringer Mannheim）１mlで50℃で４時間、インキュベートした。その溶液を置換して、そのプラグを一晩、インキュベートした。そのプラグをTEで各々30分間、３回、0.5×TUBEで30分間２回、洗浄した。PFGEをPulsaphorシステム（LKB）を用いて行った。プラグの３分の１を１％アガロースゲル上に充填し、４℃で36時間、170Ｖ，20ｓパルスで0.5×TBE中で電気泳動した。DNAマーカーは、Bancroft and Wolk, Nucleic A Res. 16 : 7405〜7418（1988）により記載されるように調製されたλDNAのコンカテューである。DNAを、臭化エチジウムで染色することにより視覚化した。
制限酵素消化及び逆ポリメラーゼ鎖反応（IPCR）のためのイーストゲノムDNA
イーストスフェロプラストを先のように調製した他は本質的にHeard et al.（1989）により記載されるようにイーストゲノムDNAを調製した。最後にDNAをフェノール／クロロホルムで２回、クロロホルムで１回、抽出して、エタノール沈殿させた。５ml培養物からの生成物は約10μｇ DNAであった。
IPCRによるYAC及びフラグメントの単離
イーストゲノムDNA（100ng）をAluＩ, HaeIII, EcoRＶ又はHincIIで消化した。その消化物を１回、クロロホルム抽出し、次にエタノール沈殿させた。そのDNAフラグメントを２Ｕリガーゼ（BRL）の存在下で16℃で一晩、100μｌの容量中での連結反応により環状化した。10分間、65℃での連結混合物のインキュベーションの後、逆プライマー対を用いて10μｌ連結混合物上でIPCRを行った。IPCR条件並びにＣ及びＤプライマー対は、Schmidt et al.（1992）により記載されている。JPシリーズはM. Hirse（IMM Molecular Genetics Group, Oxford）からのものである。
示される酵素での消化の後、次のプライマー対を用いた。
左端IPCRのために：
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右端IPCRのために：
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IPCR反応のアリコートを、1.5％アガロースゲル上での電気泳動により検査し、その反応の１μｌを、I. Huang（MGH, Boston）により推奨される条件及びＦプライマーシリーズを用いてPCRにより再増幅した。再増幅のための条件は、30サイクル（１分、94℃；１分、45℃；及び３分、72℃）を用いた他はIPCRについてと同じである。Ｆプライマーはクローニング部位の極めて近くでアニールし、それによりPCR産物中に存在するベクター配列の量を減少させる。更に、それらは、EW及びS YACsの破壊されたクローニング部位に極めて近くにFokＩを導入する。
左端IPCR産物の再増幅に用いられるプライマーは次の通りである：
EG, abi及びS YACsのために：
0003782106.tif 000006
EW及びYup YACsのために：AluＩ,
0003782106.tif 000007
右端IPCR産物の再増幅のために次のプライマーを用いた。
EG, abi及びS YACsのために：AluＩ,
0003782106.tif 000008
EW及びYUP YACsのために：AluＩ,
0003782106.tif 000009
結果として生ずるPCR産物を、BamHＩ（EG及びabi YACs）又はEcoRＩ（Yup YACs）と一緒の消化に本来用いられる酵素で切断することにより精製して、１％ LMPアガロースゲル上で分離した。YAC及びプローブを、溶解アガロースにおけるランダムプライミングを用いて放射能標識し、適切な場合、FokＩで消化してベクター配列を除去し、次にハイブリダイゼーションプローブとして用いた。
プラスミドレスキューによるYAC左端プローブの単離
EG, abi及びEW YACsからのYACを左端フラグメントのプラスミドレスキューを、Schmidt et al.により記載されるように行った。
植物ゲノムDNAの単離
植物ゲノムDNAを、その組織を液体窒素中におき、RNaseステップを省いた他は、Tai and Tanksley, Plant Mol. Biol. Ren. 8 : 297〜303（1991）により本質的に記載されるように温室成長植物から単離した。この方法を用いて、ラージスケール（2.5〜５gの葉）及びミニプレップ（３〜４の葉）のDNAを調製した。
ゲルブロッティング及びハイブリダイゼーション条件
Hybond-Nへのゲル転移、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、DNAをUV Stratalinker処理1200μｌ×100；Stratagene）によりフィルターに固定し、及び／又は２時間、80℃で焼いた他は製造元の説明に従った。放射能標識DNAを、ランダムヘキサマーラベリングにより調製した。
RFLP分析
植物ゲノムDNAの２〜３マイクログラムを、交雑に用いられる親植物から調製し、17の制限酵素：DraＩ, BclＩ, CfoＩ, EcoRＩ, EcoRＶ, HincII, BglIII, RsaＩ, BamHＩ, HindIII, SacＩ, AluＩ, HinfＩ, Sau3A, TaqＩ及びMboＩの１つで、300μｌ容量において切断した。その消化されたDNAをエタノール沈殿させ、0.7％アガロースゲル上で分離し、Hybond-Nフィルター上にブロットした。放射能標識コスミドλ又はYAC末端プローブDNAをフィルターにハイブリダイズしてRFLPを同定した。
COの近隣に組換えを有する植物の選択
組換え体を選択する最初のステップは、CO変異及び密接に連結されたマーカーを有する系統を形成することである。これを異なるフランキングマーカーで２回行った。最初の実験において、CO−２対立遺伝子（Koornneef et al. 1991）及びtt４を有するLandsberg erecta系統を作製した。tt４変異はアントシアニンの産生を防止する。これは、このマップが類似した位置にあるので、カルコンシンターゼをコードする遺伝子における障害であることが先に示唆されている（Chang et al. 1988）。その二重変異体をNiederzenz生態型の個体に交雑し、結果として生ずるハイブリッドを自家受粉してＦ2集団を形成した。次にこの集団を、組換えがCO−２とtt４との間に行われている個体のために表現型でスクリーニングした。更に、両方の変異についてホモ接合のＦ2植物を用いてCO−２に対してマーカーRFLPｇ4568をおいた。
第２の実験は、親として２つのマークされた系統を用いることによって行った。これらの最初のものはLandsberg erectaバックグラウンド中にchp７を含み、
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未規定のバックグラウンドの系統間のLandsberg erectaへの交雑からMaarten Koornneef（Wageningen）により得られた。第２の親はマーカーlu及びalb２を含んでいた。これを、alb２変異を有するＳ96バックグラウンドの植物
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の、CO−１及びluを含む系統
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への交雑からMaarten Koornneefにより選択した。次に、chp７, CO−１系統をlu, alb２系統及びハイブリッドの自家受粉により得られたＦ2集団に交雑した。この集団を用いて、luとCO−１との間、及びCO−１とalb２との間の乗換えを有する組換え体を単離した両方のクラスの組換え体が、luホモ接合体としての表現型と認識された。ホモ接合体の場合、alb２は致命的であるので、これらは組換えでluとalb２との間でおこるなら、存在するだけである。
CO（FG）座の単離
CO遺伝子は、染色体５の上腕部上に位置し、tt４に近い２cMである。アラビドプシスにおける１cMの平均物理的距離は約140kbである。それゆえCHSからCOへの距離は約300kbと予想される。
我々は、CHSに密接に連結された（約２cM）RFLPマーカーをEG及びEW YACライブラリーにハイブリダイズすることにより開始した。これは18のハイブリダイズするYACを形成した。これらをパルスフィールドゲルにかけ、サザンブロットを行い、適切なRFLPクローンにハイブリッド形成した。これは、コロニーハイブリダイゼーションの結果を確認し、YACのサイズを測定した；それらは50kb〜240kbのサイズの範囲であった。次にYACを制限酵素で消化し、RFLPマーカーDNAとハイブリダイズして、そのフラグメントのパターンをマーカーのそれと比較した。これにより我々は、それらがRFLPマーカー内に全てのフラグメント又はそれらのいくつかのみを含むか否かを決定することができ、いかにしてYACが互いに関連しているかを導き出すことができた。ほとんどの場合、この配置は、YAC内に挿入されたアラビドプシスDNAの末端に位置した逆ポリメラーゼ鎖反応（PCR）で作られたフラグメントの単離、並びにこれらの、適切なオーバーラップするYACへのハイブリダイゼーションにより後に確認された。
次にRFLPマーカー周囲の短いコンティーグ（contig）を伸長させた。我々は、この領域からオーバーラップするコスミドクローンの２セットを得て、YACライブラリーに対して適切な１つを用いた。これは２つの新しいYACを同定した。我々が同定した20YACのほとんどから得られた末端プローブを用いてライブラリーをスクリーニングし、両方向においてクローン領域に伸びる新しいYACを同定した。全てにおいて67YACの詳細な分析が必要であった。我々は、RFLPマーカー6833, CHS, pCIT1243及び5962を含み、約1700kb長であるアラビドプシスDNAの１つの連続セグメントをアセンブリすることができた。
コンティーグ内のCOの位置を、COに極めて密接に連結されたクロスオーバーを含む組換え体の単離の後の詳細なRFLP分析により決定した。フランオング表現型マーカーを用いることにより、組換え体を同定した。最初に我々はCO及びtt４でマークされたLandsberg erecta染色体を作った。次に我々は、これをNiedersenzに交雑してCOとtt４との間のクロスオーバーを有する組換え染色体について1200のF2植物をスクリーニングした。この方法において、我々は、それらの子孫の表現型を評価することにより確認された12の組換え体を見い出した。これらの組換え体の少なさは、tt４とCOとの極めて密接な結合を確認させた。次にこれらの組換え体を用いてCOをコンティーグ上においた。例えば、それらのいくつかはクロスオーバーのtt４側上にLandsberg DNAを、CO側上にNiedersenz DNAを含む。我々の作業の間に単離されたDNAと、RFLPマーカーとして小さなフラグメントを用い、それらを組換え体から抽出されたDNAにハイブリダイズすることにより、COに関連して配置した。我々は、COとalb２との間の組換え体についてスクリーニングすることによる近位側上で同様の試みを行った。この作業は、２つのYACと約300kb離れたプローブとの間にCOを配することで開始した。
その300kb内により正確にCOをおくために、COとフランキング表現型マーカーとの間のより大きいクロスオーバーについてスクリーニングした。先に記載されたのと同様の理論的解釈を用いて、COとalb２との間の全部で46のクロスオーバー（COに近位の1.6cMの間隔）、及びCOとluとの間の135（COへの遠位5.3cMの間隔）を同定して、我々のコンティーグから得られた適切なRFLPマーカーで分析した。これは、その遺伝子を２つのYAC末端プローブにより規定される極めて短い領域に位置させた。これらを、University of Minnesotaにより我々に供されたコスミドライブラリーをスクリーニングするのに用い、その全体の領域にまたがる３のコスミドを含む短いコスミドコンティーグを作製した。これらのコスミドの分析は、詳細なRFLPマッピングが約35kb長の領域に位置したCOを有することを示した。
その遺伝子をコスミド内に位置させるために、それらの各々をCO変異体内に導入し、結果として生ずる植物を、いずれのコスミドがCO変異体表現型を正すかを決定するために検査した。CO−２及びtt４変異についてホモ接合である植物の根を、各々のコスミドを含むアグロバクテリア株と共に同時培養（Olszewski and Ausubel, 1988 ; Valvekens et al 1989）、カナマイシン耐性植物を再生した。その再生体（Ｔ１世代）を自家受粉して、それらの子孫を、それらがT-DNAを含むことを確認するためにカナマイシンを含む培地上に植えた（表１）。
全部で、コスミドＡを含む５の独立した形質転換体、コスミドＢを含む９つ、並びにコスミドＣを含む13はカナマイシン耐性Ｔ２子孫を形成し、更に研究した。これらのＴ２ファミリーの各々からの20〜40の植物の開花時間を、長日温室内で測定した。コスミドＡで作られた形質転換植物の孫の全てがCO−２変異体と同程度に遅く開花した。これは、このコスミドがCO遺伝子を含まないことを示唆した。しかしながら、コスミドＢ及びＣを含む植物から得られたファミリーのいくつかは早く開花する個体を含んでいた。全体で、コスミドＢを有する植物から得られた９のファミリーの６つ、及びコスミドＣを有すそれらから得られた13が野生型と同程度に早く開花する植物を含んだ。これらの早く開花する個体の全てが明るい色の種子を作った。これは、それらが形質転換体に用いられる系統に存在するtt４変異を有し、それゆえ本実験が野生型植物の種子で汚染されている単なる結果ではないことを示す（実験手順）。これらの結果は、CO遺伝子がコスミドＢ及びＣの両方に含まれることを強く示唆した。
その相補結果を確認するためにＴ３世代において更なる実験を行った。全部で、コスミドＢから得られた５のＴ２早期開花性植物、並びにコスミドＣからの６つを自家受粉してＴ３世代において更に研究した。この分析のために選択されたＴ２植物の各々は、異なる形質転換体から得られ、Ｔ２ファミリーにおいて最も早く開花する植物であり、各々のカナマイシンセンシティビティーのために３のカナマイシン耐性の苗木の比率を示したファミリーのメンバーであり、それゆえおそらく１つの遺伝子座のみにおいてトランスジーンを含んでいた（表１）。これらのＴ３ファミリーにおける苗木の全てがカナマイシンに対して耐性があり、親のＴ２植物がT-DNAについてホモ接合であることを証明した。これは、最も早く開花するＴ２植物がCOトランスジーンについてホモ接合であることを証明した。
用いられた長日条件下において、CO−２変異植物は野生型対照よりかなり遅く開花した（表１）。Ｔ３植物は、規定された長日条件下で少くとも野生型と同程度早くに開花し、いくつかの個体は野生型より早く開花した（表１）。この分析は、コスミドＢ及びＣが長日下における開花時期に対するCO−２変異の効果を補正することができることを確認し：これは、これらのコスミドの両方がCOを含み、それゆえその遺伝子がそれらの間のオーバーラップの領域内にあることを示した。この領域は6.5kb長であった。
我々は、コスミドＢ及びＣにより共有される6.5kbの配列を決定した。これは、我々がそのDNA配列から直ちに同定することができる１つの遺伝子のみを含む。ポリメラーゼ鎖反応を用いて、この遺伝子を、３つの独立して単離されたCO変異体から増幅した。これらの遺伝子の配列決定は、３つ全てが変異を含むことを証明した。これは、相補分析と共に、これがCO遺伝子であることの決定的な証拠である。COの予測されるアミノ酸配列は、先に報告された遺伝子に対する相同性を示さなかった。しかしながら、そのアミノ末端は、ジンクフィンガーを形成すると予想される２つの領域を含む。これは、その蛋白質産物がDNAに結合し、おそらく転写因子であることを示す。
REG17B5及びLEW4A9により規定される300kb領域内でCOを同定することの予想外の困難さ
1.  より詳細なRFLPマッピング及び相補性による遺伝子の位置づけ
言及されるように、Putterill et al, Mol. Gen. Genet. 239 : 145〜157（1993）は300kbの領域内へのCOの位置づけを記載した。RFLPマッピングによりより正確にCOを位置づけるために、２つの材料が必要とされた：300kb領域内にクロスオーバーを有する更なる組換え体、及びこれらの組換え体に対するプローブとして用いるための更なるRFLPマーカー。
luとCOとの間、又はCOとalb２との間の組換え体を選択した。全体でluとCOとの間の1.6cM中に68のクロスオーバーを同定し、COとalb２との間の5.3cM中に128を同定した。これは、6.8cMにおいて196のクロスオーバー、又はcM当り平均29のクロスオーバーに等しい。これらの組換え体の中で、300kb内のクロスオーバーは予想外に下降表現された：300kbは約1.5cMに等価であるので、43（29×1.5）のクロスオーバーはこの領域内と予想されよう。23のみが見い出された。
これらのクロスオーバーの分析も、300kb以内であるRFLPプローブとして用いられ得るYAC末端プローブがないであろうので、困難であった。これは、組換え体を作製するのに用いられる親系統の間のRFLPを検出するそれらがないためであった。１つのRFLPマーカー（pCIT1243）をその領域に利用し、これが組換え体を分析するのに用いられる場合、それがREG17B5とCOとの間に見い出され得、それによりpCIT1243とLEW4A9との間の遺伝子を位置づける。しかしながら、その遺伝子のより正確な位置は、適切なプローブがないため、本方法により行われ得ないであろう。
pCIT1243とLEW4A9との間のクロスオーバーの分布は非対称であった：pCIT1243とCOとの間に１つ、及びCOとLEW4A9との間に19存在した。我々は、その遺伝子がpCIT1243に近くにあると考えた。それゆえ、この領域からのプローブ（LEG4C9, Labi19E1, pCIT1243, LEG21H11及びREG4C9）のプールを用いてコスミドライブラリーをスクリーニングしてpCIT1243からLEW4A9に向かって伸長する一連のコスミドクローンを供した。個々のプローブでのこれらのクローンの分析は、３つのコスミドＡ，Ｂ及びＣが要求される方向においてpCIT1243から伸びていることを示した。次にRFLPマーカーとしてこれらを用い、その遺伝子がコスミド上にあることを証明した。
それゆえ、その手順は300kb領域内に十分な組換え体を作ること、及び適切なRFLPマーカーを同定することにおける困難性のためPutterill et alの論文において認められるより複雑であった。
2.  相補性による遺伝子の同定
３つのコスミドＡ，Ｂ及びＣを変異植物内に導入し、Ｂ及びＣが変異の効果を補正し得ることを示した。それゆえその遺伝子はＢ及びＣにより共有されるDNA上になければならないが、Putterillの論文において、CO遺伝子の最終的同定について提唱された方法は失敗した。ナーザン・ブロットに対するプローブとして相補的DNAを用いることによりCOについて転写物を同定することができ、又は７つの対立遺伝子の１つが遺伝子を誘導するであろうサザンブロット上での再配置を示すであろうことが仮定されている。実際、我々はナーザン・ブロット上でCO転写物を検出することができず、またその遺伝子があり得る位置を示すいずれの再配置も検出されなかった。
この試みの失敗により、我々は変異体に相補的であるゲノムDNAを配列決定した。DNAのコンピューター分析により、互いに隣接した２つのオープン読み枠を同定し、我々はこれらがCO遺伝子を表すと考えた。いずれの転写物もナーザン・ブロット上で検出され得ず、いずれのcDNAもいくつかのcDNAライブラリーで検出されなかったので、１つは遺伝子を予想したが、我々はORFが活性的に転写されるいずれの証拠もまだ有していなかった。それゆえ我々は、ポリメラーゼ鎖反応を用いてRNA調製物からcDNAを増幅した。これは、これらの２つのORFが実際に１つの活性遺伝子を表すことを示した。次にCO対立遺伝子を配列決定することにより、それらが１つの塩基変換を含んでおり、又は１つの場合、９bpの欠失を含んでいることを確認した。それは、Putterill et alの論文において提唱される試みによっては検出されないであろう。
遺伝子構造
遺伝子構造を決定するために、CO遺伝子のためのcDNAをRT-PCR（Experimental Procedures）を用いて同定した。cDNAの配列は、233bpイントロンの除去によりそのゲノム配列中で同定される両方のORFから得られる1122bp ORFを含む。このオープン読み枠の転写は、42kdの分子量を有する373アミノ酸を含む蛋白質を形成すると予測される。その転写開始部位は決定しなかったが、フレーム内で、転写終了コドンはATGの３コドン上流に位置しており、これは、全体の翻訳された領域が同一であることを示した。転写物の３′末端は、３′−RACEにより形成される４つのフラグメントを配列決定することにより位置決めされた。それらは全て互いの５塩基以内の異なる位置にポリ−Ａ尾を含んでいた。
CO遺伝子の予測される翻訳産物との相同性を有する蛋白質について、利用できるデータベースを調査した。PROSITEディレクトリーを調査することにおいてはCO蛋白質内にモチーフが検出されなかった。更に、CO蛋白質配列をGenBankにおけるものと比較するFASTAサーチにおいても大きな相同性は検出されなかった。CO配列の、アラビドプシスからクローンされた他の開花時期遺伝子であるLUMINIDEPENDENS（Lee et al, 1994）のそれとの直接の比較でも相同性は検出されなかった。しかしながら、目による蛋白質配列の分析は、CO蛋白質のアミノ末端近くの２つの領域に存在するシステイン残基の全致した配列を同定した。これらの領域の各々は、GATA−１転写因子のジンクフィンガードメイン（Ｃ−Ｘ2−Ｃ−Ｘ17−Ｃ−Ｘ2−Ｃ）に類似するＣ−Ｘ2−Ｃ−Ｘ16−Ｃ−Ｘ2−Ｃ配列中に４つのシステインを含む。
予測されるCO蛋白質配列内で互いに直接、隣接し、その各々が提唱されるジンクフィンガーの１つを含む２つの43アミノ酸延伸体の比較は、合致した相同性を示す：アミノ酸の46％が同一であり、86％が同一又は関連したいずれかのものである。その保存性は、その領域がDNA結合のために必要とされる塩基性ドメインであり、高度に保存性のあるGATA１転写因子を暗示させる各々のフィンガーのカルボキシ側上に最も現れる（Trainor et al, 1990 ; Brendel and Karlin, 1989 ; Ramain et al, 1993）。CO蛋白質において、この領域は任意的にも変化されている：アミノ・フィンガーに隣接した領域において６、カルボキシ・フィンガーの次のものにおいて３の正味の正電荷があった。
WisconsinパッケージのFASTAプログラムを用いるhGATA１のジンク・フィンガーを含み、GATA１ファミリー（Ramain et al, 1993）のメンバー間で保存されている116アミノ酸とのCOジンクフィンガーのCO蛋白質配列の比較により、COのジンクフィンガー両方にわたり、hGATA１のジンクフィンガーのシステイン及びCOのそれをアラインする１つの相同性のある81アミノ酸領域を同定した。COとhGATA１のこれらの領域の間では、アミノ酸の21％が同一であり、65％が類似又は同一であった。それゆえ、COはGATA１ファミリーのメンバーではないが、ジンクフィンガーの領域におけるそれらへの類似性を示し、ジンクフィンガー含有蛋白質の新しいクラスを表す。
これらの領域がCO活性のために重要であることの更なる示唆は、CO−１及びCO−２対立遺伝子の両方における変異が、提唱されるフィンガー領域の間で保存されている残基に影響を及ぼすことである：CO−２はＮ末端フィンガーのカルボキシ側上のアルギニンをヒスチジンに変え、CO−１欠失はＣ末端フィンガーのカルボキシ側から３つのアミノ酸を除去する。
長日及び短日成長植物におけるCO mRNAの発現
いくつかのアラビドプシスcDNAライブラリーをスクリーニングすることによりCO cDNAに見い出されず、３〜４葉段階における苗木から抽出されたポリＡ mRNAのナーザン・ブロットでもそれは検出されなかった（データは示さない）。それゆえ、RT-PCRの後のサザンブロッティング及びCO特異性プローブへのハイブリダイゼーションを用いてCO転写物を検出した。これらの実験に用いられるRNAを３〜４葉段階における苗木から単離した。なぜならこれは、長日下でちょうど花の芽が目に見え、それゆえ遺伝子が発現されるような時期であるようであるからである。
長日下で成長する植物から作られた６の独立したRNA調製物全てが、CO cDNAについて予想されるサイズのハイブリダイズするフラグメントを形成した。CO転写物の欠如における差が野生型又はCO−１変異植物の間で検出されなかったことは、CO遺伝子の活性がそれ自体の転写を促進するのに必要とされないことを示す。
長日下の開花時間はCO遺伝子投与により影響を受ける。
野生型対立遺伝子とCO−１又はCO−２のいずれかとのヘテロ接合体である植物は、長日下でCOホモ接合体とLandsberg erectaとの間の中間の時期に開花する（Koornneef et al, 1991 ; F. Robson、未出版）。これらの変異対立遺伝子の配列決定は、それら両方がそのアミノ酸配列へのフレーム変換を含むことを証明した。これは、COの部分的な優性についての２つのモデルを示唆し得よう。変異対立遺伝子は、開花の誘導を妨害する変えられた産物を生じ得、又は変異は、開花時期の遅れを導くヘテロ接合体におけるCO蛋白質の機能の損失及びレベルの２倍の減少を引きおこし得るだろう（ハプロー不十分性）。そのハプロー不十分性の説明に本明細書に含まれる結果により合致する。
相補実験において、コスミドＢ又はＣの２つのコピーを含み、CO−２対立遺伝子についてホモ接合である形質転換植物は、長日下において野生型植物と同時にしばしば開花した。変異対立遺伝子が野生型蛋白質の活性を妨害する産物をコードするなら、これはおこらないと予想されるだろう。更にCO転写物を検出するためにRT-PCRを用いる必要性は、それが極めて低いレベルであり、転写物レベルの更なる削減か遅れた開花を引きおこす可能性があることで一貫していることを示唆する。
COの投与量の増加は、長日下で少し早い開花を導き得る。これは、CO遺伝子の余分なコピーを有する形質転換系統のいくつかが野生型植物より少し早く開花するという観察から結論づけられる（表１及び２）。先に議論されるハプロー不十分表現型と合わせたこの観察は、COの発現のレベルが長日下におけるアラビドプシスの開花時期の重大な決定因子であることを示唆する。
方法
成長条件及び開花時期の測定
Sanyo Gallenkamp Controlled Environment室内で20℃において植物を成長させることにより、規定される条件下で開花時期を測定した。短日は、ハロゲン化タングステンランプが供された400ワットハロゲン化金属粉体スターランプでの10時間の光の光周期を含む。これは、113.7μモル光子ｍ-2ｓ-1の光合成活性照射（PAR）及び2.41の赤：遠赤比のレベルを供した。同様のキャビネット及びランプを長日に用いた。光周期は、短日下で用いられるのと同じ条件下で10時間であり、ハロゲン化タングステンランプのみを用いて更に８時間、延長した。このキャビネットにおいて、10時間：用いられるランプの組合せは、92.9μモル光子ｍ-2ｓ-1のPAR及び1.49の赤：遠赤比を供した。８時間の延長は、14.27μモルｍ-2ｓ-1のPAR及び0.66の赤：遠赤比を形成した。
植物の大集団の開花時期を温室内で測定した。夏においては、植物は単に日光で成長させた。冬においては、最少の光周期が16時間であるよう補給光を供した。
開花時期を測定するために、種子を湿ったフィルター紙上に４℃で４日間おいて休止状態を破り、次に土にまいた。発芽した苗木を、脱水を妨ぐために、最初の１〜２週間密着フィルム又は繁殖用のふたで普通に覆った。開花時期を、花のつぼみが目で見える時期におけるロゼットにおいて子葉を除く葉の数を数えることにより測定した。葉の数は、95％信頼限界における標準誤差で示される。種まきから花のつぼみの出現までの日数も記録したがこれは示さない。葉の数と開花時期との間の密接な相関関係は、Landsberg erectaとCO対立遺伝子とについて先に証明されている（Koornneef et al, 1991）。
植物材料
用いた普通の野生型遺伝子型はアラビドプシス・タリアナLandsbergエレクタ（erecta）である。CO−１変異体をRedei（1962）により単離し、ERECTAバックグラウンド内においた。我々の実験は、Landsbergエレクタからの検出可能なRFLP又は配列バリエーションを示さなかった。CO−２対立遺伝子をLandsbergエレクタにおいて単離した（Koornneef et al, 1991）。COの正確なRELPマッピングに用いられる系統の詳細は先に記載されている（Putterill et al, 1993）。
記録される全ての場合において、本明細書内における遺伝子型の記載を過剰に複雑にしないためにこれは言及されていないが、CO−２を有する系統もtt４を有さなかった。tt４変異はカルコンシンターゼ遺伝子内にあり、種子被覆内のアントシアニン蓄積を防止するが、開花時期に影響は与えない（Koornneef et al, 1983）。その変異は、COから約3.3cMの染色体５上に位置する（Putterill et al, 1993）。CO−２ tt４系統の使用は個々のプラスミドがCO−２変異を有することを確認するのに役立った。
RNA抽出
Stiekema et al（1988）により記載されるものの改良型である方法を用いてRNAを抽出した。液体窒素中の５ｇの凍った組織をコーヒーグラインダー内に入れ、15mlのフェノール及び15mlの抽出緩衝液（50mM Tris pH８, １mM EDTA, １％ SDS）の混合物で抽出した。その混合物を振とうして遠心し、25mlの水性層を回収した。次にこれを0.7mlの４Ｍ塩化ナトリウム、10mlのフェノール及び10mlのクロロホルムの混合物で激しく振とうした。その水性層を、遠心後に回収して25mlのクロロホルムで抽出した。次に、２mlの10Ｍ LiCLを加えることにより水性層25mlからRNAを沈殿させ、その沈殿を遠心により回収した。そのペレットを２mlのDEPC水中に溶かし、４Ｍ塩化ナトリウム0.2ml及びエタノール４mlを加えることによりRNAを沈殿させた。遠心後、そのペレットを0.5mlのDEPC水中に溶かし、RNA濃度を決定した。
DNA抽出
アラビドプシスDNAをDean et al（1992）により記載されるCTAB抽出法により行った。
RT-PCRによるcDNAの単離
温室内の長日下で成長する２〜３葉の段階における全体の苗木から全RNAを単離した。最初のcDNA鎖合成のために、10μｌの容量は10μｇのRNAを３分間、65℃に加熱し、次に氷上で迅速に冷却した。１μｌのRNAsin, １μｌの標準dT17−アダプタープライマー（１μｇ／μｌ；Frohman et al, 1988）、４μｌの５×逆転写酵素緩衝液（250mM Tris HCl pH8.3, 375mM KCl, 15mM MgCl2）、２μｌ DTT（100mM）、１μｌ dNTP（20mM）、１μｌ逆転写酵素（200ユニット、M-MLV Gibco）を含む10μｌの反応混合物を作製した。その混合物を２時間42℃でインキュベートし、水で200μｌまで希釈した。
希釈された最初の鎖合成反応物10μｌを、４μｌの2.5mM dNTP、10μｌの10×PCR緩衝液（Boehringer＋Mg）、１μｌの各々のプライマーの100ng／μｌ溶液、73.7μｌの水及び0.3μｌの５units／μｌ Taqポリメラーゼ（Boehringer又はCetus Amplitaq）を含むPCR混合液90μｌに加えた。用いたプライマーは、CO49（COの転写開始の上流38bpに位置した５′GCTCCCACACCATCAAACTTACTAC ５′端）及びCO5B（COの転写終了コドンの57bp上流に位置した５′CTCCTCGGCTTCGATTTCTC５′）であった。その反応は、94℃で１分、55℃で１分、72℃で２分の34サイクル、最後に72℃で10分、行った。
20μｌの反応物をアガロースゲルを通して分離し、臭化エチジウムで染色した後、予想される大きさのフラグメントの存在を証明した。そのDNAをフィルターに移した。関心のフラグメントはCO遺伝子から得られた短いDNAフラグメントとハイブリダイズすることが示された。PCR反応物の残りを他のゲル上に充填し、その増幅されたフラグメントを抽出し、T4 DNAポリメラーゼで処理してEcoRＶで切断されたBluescriptベクター（Stratagene）に連結した。PCR反応を重複して行い、２つの独立して増幅されたcDNAを、いずれかのPCR由来の誤差が検出されることを確実にするために配列決定した。
３′RACEによるcDNAフラグメントの単離
最初の鎖cDNA合成を、RT-PCRのために先に記載されるのと同じ条件、RNA調製及びdT17−アダプターを用いて行った。次に普通のアダプタープライマー（５′gactcgagtcgacatcg ; Frohman et al, 1988）及び先に記載されるCO49プライマーを用いてPCRを行った。PCR条件は、増幅サイクルの前に72℃での40分を更に追加した他は先に記載されるのと同じである。20μｌの反応物をアガロースゲルを通して分離し、長さにおいて550bpと1.6kpとの間のフラグメントのスミヤーを検出した。その反応物の残りを同様のゲル上に充填し、１〜２kbのフラグメントを含むと予測される領域を切り出し、DNAを抽出して、アダプタープライマー及び他のCO特異性プライマー（CO28, COの転写開始部位の下流94bpに位置した５′tgcagattctgcctacttgtgc, ５′）を用いて２回目のPCRにかけた。このPCRをアガロースゲル上でモニターした時、1.3kbの予測されたサイズのフラグメントが検出された。このフラグメントをゲルから抽出し、T4 DNAポリメラーゼで処理し、EcoRＶで切断されたBluescript DNAに連結した。２つの独立した増幅から回収された４つの増幅されたフラグメントを完全に配列決定した。４つ全てが、本明細書に記載されるように少し異なる位置でポリアデニル化されていた。
RT-PCRによるCO転写物の検出
RNAを異なる段階において制御された環境キャビネットにおいて成長された植物から単離した他は、cDNAクローンを単離するのに用いられた方法についてちょうど先に記載されるように、最初の鎖合成を行った。
CO cDNAを増幅するのに用いられるプライマーは、本明細書及び実験手順において先に記載されている。対照として用いられる遺伝子のcDNAを増幅するのに用いられるプライマーはCO１（５′TGATTCTGCCTACTTGTGCTC）及びCO２（５′GCTTGGTTTGCCTCTTCATC）であった。
DNA配列決定
Bluescriptプラスミドベクター内に挿入された関心のフラグメントを配列決定するのにSanger法を用いた。Sequenceキット（United States Biochemical Corporation）を用いて反応を行った。
７のCO対立遺伝子の各々を含むクローンの単離
対立遺伝子の各々についてホモ接合である植物からDNAを抽出した。ゲノムDNAの約１ngを水で10μｌに希釈して、プライマーCO41（COの転写開始コドンの263bp上流に位置した５′ggtcccaacgaagaagtgc ５′端）及びCO42（COの転写停止コドンの334bp下流に位置した５′cagggaggcgtgaaagtgt ５′端）を用いた他は、先に記載されるように90μｌの反応混合物に加えた。PCR条件は、94℃で３分、次に94℃で１分、55℃で１分、72℃で２分の34サイクル、最後に72℃で10分であった。各々の場合において、これは、予測されるサイズ、1.95kbの主要なフラグメントを形成した。各々の対立遺伝子について重複してPCRを行った。各々の場合、その反応物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿してT4 DNAポリメラーゼで処理した。次にその反応物をアガロースゲルを通して分離し、そのフラグメント精製してEcoRＶで切断されたSK＋Bluescriptに連結した。連結反応を大腸菌DH５α内に導入し、その組換えプラスミドを、予測される大きさの挿入を有するものについて、コロニーPCRによりスクリーニングした。各々の対立遺伝子から得られた２つの独立して増幅されたフラグメントのDNA配列を決定した。
ファージ及びコスミドライブラリーのスクリーニング
コスミドライブラリーのライゼート（Olszewski and Ausubel, 1988）を用いて大腸菌DH５αに感染させ、２万のコロニーを本明細書に記載されるプローブでスクリーニングした。３つのcDNAライブラリーをスクリーニングしてCO cDNAの同定を試みた。スクリーニングされたプラークの数は、（EC Arabidopsis Stock Center, MPI, Cologneにより供給された）“aerial parts”ライブラリーから５×105、（Dr A. Bachmairにより作製され、EC Arabidopsis Stock Centerにより供給された）滅菌ビーカー中で成長する植物から作製されたライブラリーの３×105プラーク、並びに（Ohio State UniversityにおけるArabidopsis Biological Resource Centerにより供給された）CD4-71-PRL2ライブラリーの１×106プラークであった。
アラビドプシスの形質転換
COの近隣からのDNAを含むコスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）C58C1内に移動し、そのT-DNAを、Valvekens et al, 1988により記載されるようにアラビドプシス植物内に導入した。試験管内で成長した植物の根を単離して、２日間、カルス誘導性培地（Valvekens et al, 1988）上で増殖させた。次にその根を短い断片に切断して、関心のプラスミドを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスと共に同時培養した。その根外植物をブロッティング紙上で乾燥させ、２〜３日間、カルス誘導性培地上においた。アグロバクテリウムを洗い落とし、根を乾燥させ、アグロバクテリウムを殺すためのバンコマイシン及び形質転換した植物細胞を選択するためのカナマイシンを含む苗条誘導性培地（Valvekens et al, 1988）上においた。約６週間後、根上の緑色のカルスが苗条を形成し始める。これらを除去して、発芽培地（Valvekens et al, 1988）を含むペトリ皿又はマゼンタ・ポット内に入れた。これらの植物はマゼンタ・ポット内で種子を形成する。次にこれらを、トランスジーン（Valvekens et al, 1988）を含む形質転換された苗木を同定するためにカナマイシンを含む発芽培地上にまいた。
実施例２−COオープン読み枠へのプロモーター融合体の作製
全体のCO遺伝子を含むPvuII−EcoRＶフラグメントをBluescriptTMプラスミドの特有のEcoRＶ部位内に挿入した。EcoRＶ部位により規定されるその末端がBluescriptTMポリリンカー内でHindIII部位に隣接するような方向で、CO遺伝子フラグメントを挿入した。このプラスミドをpCO１と呼んだ。pCO１内に挿入されたPvuII−EcoRＶフラグメントは、CO蛋白質の翻訳が開始される点の両方の５′において２つのHindIII部位を含んでいる。pCO１のHindIIIでの切断は、翻訳の開始の63bp上流からポリアデニル化部位の下流であるPvuII部位への全体のCOオープン読み枠、並びにポリリンカー内のHindIII部位への連結により作り出されるPvuII／EcoRＶ接合からの全てのbluescriptベクターを含むフラグメントを作り出す。このフラグメントへの適切な方向でのプロモーター含有フラグメントの連結は、COオープン読み枠へのプロモーターの融合を形成する。例えば、以下に記載されるように、種々のプロモーターがこの位置に挿入され得る。
COオープン読み枠へのGSTIIプロモーター融合体
GSTIIプロモーター含有フラグメントをHindIII−NdeＩフラグメントとして（Zenecaにより供給される）プラスミドpGIE7から得た。その配列を図２に示す。オリゴヌクレオチドアダプター（５′TACAAGCTTG）をNdeＩ部位に挿入し、それをHindIII部位に転化した。次にその結果として生ずるプラスミドをHindIIIで切断し、そのプロモーター含有フラグメントをCOオープン読み枠を含むHindIIIフラグメントに連結した。転写がCOオープン読み枠に向かっておこるであろうような方向でGSTIIプロモーターを含む組換えプラスミドをPstＩ消化により同定した。次にこのGSTII-CO融合体をClaＩ−XbaＩフラグメントとしてJones et al（1992）により記載されるバイナリーベクター内に動かした。
そのバイナリーベクターはアグロバクテリウム・ツメファシエンス株内に導入され得、その融合体を双子葉植物種内に導入するのに用いられ得、又はその融合体は裸のDNAの形質転換法により単子葉植物種内に導入され得る。形質転換のためのプロトコルは、先に議論されるように多くの種について確立されている。
GSTIIプロモーターは、WO 93／01294（Imperial Chemical Industries Limited）に記載されるような除草剤毒性緩和剤ジクロルアミド及びフルラゾールのような外来性インデューサーの適用によりCO遺伝子の発現を誘導するのに用いられ得る。
COオープン読み枠へのヒート・ショックプロモーター融合
かわりの誘導可能なシステムは、（Balcells et al, 1994により議論される）種々の植物種において高温への露出に応答する発現により誘導される十分キャラクタライズされた大豆ヒート・ショックプロモーター、Gmhsp 17.3Bの使用である。そのプロモーターは、T4 DNAポリメラーゼでの処理の後にGSTII融合体について先に記載されるようにHindIIIで切断されたpCO１内に挿入され得る440bp XbaＩ−XhoＩフラグメント（Balcells et al, 1994）として利用できる。次にその結果として生ずる融合体は、先に記載されるようにバイナリーベクター、アグロバクテリウム・ツメファシエンス及び形質転換植物内に導入され得る。CO発現は、約40℃の温度に植物を露出することにより誘導され得る。
テトラサイクリン耐性遺伝子オペレーターを含む改良型CaMV 35SプロモーターのCO遺伝子への融合
バクテリアテトラサイクリン耐性遺伝子からの３つのオペレーターを含む改変されたCaMV 35Sプロモーターは化学的に誘導可能なシステムとして開発されている。テトラサイクリン遺伝子レプレッサー蛋白質の存在下において、このプロモーターは不活性であるが、この抑制は、テトラサイクリンを植物に供することにより乗り越えられる（Gatz et al, 1992）。これは、COオープン読み枠に融合され得るかわりの化学的に誘導可能なプロモーターである。そのプロモーターは、T4 DNAポリメラーゼでの処理後に先に記載されるようにHindIIIで切断されたpCO１内に挿入され得るSmaＩ−XbaＩフラグメントとして利用できる（Gatz et al, 1992）。レプレッサー遺伝子も含む植物内へのこの融合体の導入の後、CO発現は、テトラサイクリンを植物に供することにより誘導され得る。
COオープン読み枠へのCaMV 35Sプロモーター融合
CaMV 35SプロモーターをプラスミドpJIT62（図４に示される物理的地図）から単離した。CaMV 35Sプロモーターを含むKpnＩ−HindIIIフラグメントを、HindIII及びKpnＩで切断されたプラスミドpCO１への連結反応によりCOオープン読み枠に融合した。次に単一のKpnＩ部位をアダプターオリゴヌクレオチド（５′TATCGATAGTAC）の挿入によりClaＩ部位に移し、次にCO ORFに融合されたプロモーターを含むClaＩ−BamHＩフラグメントをバイナリーベクターに挿入した。その融合体を、先に記載されるように、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの使用により、又は裸のDNAとしてのいずれかで形質転換植物内に導入し得る。
COオープン読み枠へのmeri５プロモーターの融合
meri５プロモーターは、2.4kb BglII−StuＩフラグメント（Medford et al, 1991）として利用できる。これはＴ４ポリメラーゼで処理され、先に記載されるようにpCO１のHindIII部位内に挿入され得る。次にその融合体は、先に記載されるように形質転換植物内に導入され得る。
実施例３−COの余分なコピーを有する植物の短日下での開花時期
短日条件下において、野生型植物及びCO−２ホモ接合体は両方、ほぼ同じ時期に開花する。このことは、CO産物がこれらの条件下で開花するのに必要とされないことを示す。しかしながら、短日下において、コスミドＢ及びＣが得られたT-DNAを有するCO−２ tt４ファミリーのいくつかは親CO−２系統及び野生型の両方より早く開花した（表１）。特にコスミドＣを有する２つの系統（４及び６）は野生型よりかなり早く開花した。これは、いくつかのファミリーにおいては、COの形質転換複製がもとのコピーより高レベルで発現され、又は生態型的に発現されること、並びにこれが野生型植物のそれより短日下での早い開花を導くことを示唆した。
コスミドＢも野生型Landsbergエレクタ植物、並びに先に記載されるのと同様にして同定された単一遺伝子座におけるトランスジーンについてホモ接合のＴ２細胞内に導入した（表１）。Ｔ３世代において分析された３つの独立した形質転換体の１つは長日下で野生型植物より少し早く、短日下でかなり早く開花した（表１）。これは、少くともいくつかの染色体位置において、CO遺伝子の余分なコピーが、早い開花を引きおこし得ることを再び示唆する。
実施例４−CaMV 35Sプロモーター／CO遺伝子融合体を用いる開花特性への影響
CaMV 35SプロモーターのCOオープン読み枠への融合を、CO変異アラビドプシス植物内に導入した。最初に、実施例２に記載されるClaＩ−BamHＩフラグメントをバイナリーベクターSLJ1711（Jones et al, 1992）のClaＩ−BamHＩ部位内に挿入した。次にこのベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス株をアラビドプシス根の外植の形質転換のために用い、次にValvekens et al.（1988）に記載されるように形質転換植物を再生した。
結果として生ずる形質転換植物は誘導的及び非誘導的条件下の両方で野生型よりかなり早く開花した。例えば、誘導的長日条件下において、野生型植物は約５の葉を形成した後、開花したが、形質転換植物は３〜４の葉で開花した。非誘導性短日下において、野生型植物は約20の葉で開花し、形質転換植物は３〜４の葉で開花した。それゆえCO mRNAの存在割合を増加させるため、又はCO転写の特異性を変えるためのプロモーター融合の使用は、野生型植物のそれより劇的に早い開花を導くのに用いられ得る。
更に、CO遺伝子へのCaMV 35Sプロモーターの融合体を有する形質転換植物のいくつかは、苗条の端において末端の花を形成した。野生型植物の苗条は、不確定的に苗条の側面上に花を成長させ、形成する不確定の成長を示す。しかしながら、末端花（terminal flower）（tf１）変異体は苗条の頂部に花を形成することにより時期尚早に苗条発達を終わる確定的な成長を示す。野生型植物において、TFL遺伝子は、頂部の細胞内でLEAFY（LFY）のような花の発達を促進する遺伝子の発現を防止することにより苗条の頂部における花の形成を防ぐと考えられる。これは、LFYがtf１変異体の苗条頂部で発現されるが、野生型植物ではそうでないこと、並びにCaMV 35SプロモーターのLFYへの融合が形質転換植物の末端花の形成（Weigel and Nilssen, 1995）を引きおこすことの観察により支持される。それゆえ、いずれの他の理論にも通ずることを意図しないが、CaMV 35SプロモーターへのCOの融合は、苗条の頂部においてLFYのような遺伝子を活性化することにより末端花を引きおこし得るのだろう。
CaMV 35SプロモーターへのCO融合により生ずる２つの表現型、早期の開花及び末端花の形成は、他のプロモーターの使用により分けられ得る。例えば、末端花形成は、主に頂部の分裂組織で発現される先に言及されるmeri５遺伝子のそれのようなプロモーターを用いることにより最適化され得、他方、末端花のない早期の開花は、ヒート・ショックプロモーターのような頂部分裂組織内であまり発現されないプロモーターからの遺伝子を発現することから生じ得るだろう。
実施例５−ブラシカ・ナプスからのCO相同体のクローニング
ブラシカ・ナプスDNAから作られたラムダゲノムDNAライブラリーをスクリーニングするのに低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション（Sambrook et al., 1989）を用いた。明確にハイブリダイズするクローンを分析し、（HindIII, XhoＩ, EcoRＶ, XbaＩ, EcoRＩ, 及びNdeＩを用いる）制限酵素切断部位の構造マップにより分類した。CO相同体はCO遺伝子ファミリーの他のメンバーから区別した。それは、アラビドプシス CO遺伝子のそれとの制限酵素マップの類似性のため、並びにアラビドプシスゲノム内にCOの近くに位置した第２のゲノムがブラシカクローン中の同様の位置に存在することが示されたからである。次に、ブラシカ・ナプス関連群Ｎ10及びＮ19（Sharpe et al., 1995）上に存在する遺伝子に対応する２つのCO相同体をプラスミド内にサブクローニングして配列決定した。Ｎ10関連群からの遺伝子を図５に示し、Ｎ19関連群からのそれを図６に示す。これらの遺伝子によりコードされた蛋白質のアミノ酸配列は、アラビドプシス CO遺伝子のそれに極めて類似している。それは特に、その蛋白質の機能に重要であることが変異誘発により証明されている領域においてである；ジンクフィンガー領域にわたる86アミノ酸が84％の同一性であり、アラビドプシス変異体の２つにおいて影響を受けるその蛋白質のカルボキシ末端における50アミノ酸は88％の同一性である。これらの２つの領域が、最も保存されており、その蛋白質の中央部からの介在187アミノ酸は64％の同一性である。
この配列分析は、CO相同体からアラビドプシスの他の植物種から単離され得ることを示す。更に、制限フラグメント長多形性マッピングは、CO相同体が他の種の開花時期を調節するのに重要であることを強く示唆する。例えば、ブラシカ・ニグラ（Brassica nigra）において、CO相同体は開花時期のための主要な量的特性遺伝子座と共に同時分離し、そしてブラシカ・ナプスにおいて、関連群Ｎ２及びＮ12へのCO相同体マッピングは開花時期のための対立遺伝子変異と共に同時分離する。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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