(57)【要約】本開示は、抗原特異的な免疫寛容または免疫抑制のための医薬組成物を提供する。本開示は、ＣＤ４陽性アナジーＴ細胞と、ＣＤ８陽性アナジーＴ細胞とを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、アナジーＴ細胞は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体によって誘導される。特定の実施形態において、医薬組成物は、さらに、制御性Ｔ細胞（例えば、ＦＯＸＰ３陽性ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞）を含んでもよい。
2019245038.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４陽性アナジーＴ細胞と、
ＣＤ８陽性アナジーＴ細胞と
を含む医薬組成物。
【請求項２】
前記アナジーＴ細胞は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子によって誘導される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、請求項３〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
さらに、制御性Ｔ細胞を含む請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記制御性Ｔ細胞は、ＦＯＸＰ３陽性ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子によってアナジーが誘導された細胞を含む医薬組成物であって、該組成物は、ＣＤ８陽性細胞を含み、さらに、該組成物はＦＯＸＰ３陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の少なくとも１種以上を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
ＦＯＸＰ３陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞のすべてを含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ＣＤ８陽性細胞はＣＤ４４陽性である、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ＣＤ８陽性細胞はＣＤ４５ＲＡ陰性かつＣＤ４５ＲＯ陽性である、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ＦＯＸＰ３陽性細胞はＣＤ４陽性である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記ＦＯＸＰ３陽性細胞はＣＤ２５陽性である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記医薬組成物は、抗原特異的な免疫寛容または免疫抑制のためのものである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記抗体は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体またはこれらの組み合わせを含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記細胞は、前記阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原、あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合するステップによって誘導された細胞である、請求項２〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物を含む、被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための医薬組成物。
【請求項２１】
前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞およびそれらの細胞に由来する細胞、組織または臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記移植免疫拒絶反応は、腎臓、肝臓、心臓、皮膚、肺、すい臓、食道、胃、小腸、大腸、神経、血液、免疫系細胞を含む血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球または骨髄が移植されることにより生じることを特徴とする、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記抗原の含有物は細胞である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
細胞を含む医薬を製造する方法であって、該方法は、
（Ａ）ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合する工程と、
（Ｂ）該混合によって得られる細胞生成物が、ＣＤ８陽性細胞を含むことを確認する工程と、
（Ｃ）該細胞生成物がＦＯＸＰ３陽性およびＣＤ４陽性の少なくとも1種の細胞を含むことを確認する工程と、
を包含する、方法。
【請求項２５】
前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞生成物におけるＣＤ８陽性細胞の存在、およびＦＯＸＰ３陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の少なくとも１種の細胞の存在が、前記細胞生成物が医薬として使用され得ることを示す、請求項１７に記載の方法。
【請求項３２】
前記医薬は、前記被験体由来の抗原または前記被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するためのものである、請求項２４〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記工程（Ｂ）が、抗ＣＤ８抗体によりＣＤ８を検出することを含み、前記工程（Ｃ）が、抗ＦＯＸＰ３抗体および抗ＣＤ４抗体の少なくとも１種の抗体によりＦＯＸＰ３およびＣＤ４の少なくとも１種を検出することを含む、請求項２４〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記検出が、ＦＡＣＳにより実施されることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
被験体由来の細胞に発現する抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための細胞を含む医薬の品質を管理する方法であって、該方法は、
（Ａ）該細胞がＣＤ８陽性細胞を含むことを確認する工程、および
（Ｂ）該細胞がＦＯＸＰ３陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の少なくとも１種の細胞を含むことを確認する工程
を含む、方法。
【請求項３６】
前記工程（Ａ）が、抗ＣＤ８抗体によりＣＤ８を検出することを含み、前記工程（Ｂ）が、抗ＦＯＸＰ３抗体および抗ＣＤ４抗体の少なくとも１種の抗体によりＦＯＸＰ３およびＣＤ４の少なくとも１種を検出することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記検出が、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロット、またはＰＣＲにより実施されることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物を製造するための、阻害因子を含む組成物であって、該阻害因子が、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子である、組成物。
【請求項３９】
前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４３】
前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
細胞の混合物を含む医薬を製造するためのキットであって、該キットは、
（Ａ）ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、
（Ｂ）ＣＤ８を検出するための手段と、
（Ｃ）ＦＯＸＰ３およびＣＤ４の少なくとも１つを検出するための手段と
を含む、キット。
【請求項４６】
前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載のキットまたは方法。
【請求項５２】
前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、請求項５１に記載のキットまたは方法。
【請求項５３】
前記細胞の混合物におけるＣＤ８陽性細胞の存在、およびＦＯＸＰ３陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の少なくとも１種の細胞の存在が、前記細胞の混合物が医薬として使用され得ることを示す、請求項４５〜５２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５４】
前記医薬は、前記被験体由来の抗原または前記被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するためのものである、請求項４５〜５３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５５】
被験体由来の細胞に発現する抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための細胞を含む医薬の品質を管理するためのキットであって、該キットは、
（Ａ）ＣＤ８を検出するための手段と、
（Ｂ）ＦＯＸＰ３およびＣＤ４の少なくとも１種を検出するための手段と
を含む、キット。
【請求項５６】
前記ＣＤ８を検出するための手段が、抗ＣＤ８抗体を含み、ＦＯＸＰ３およびＣＤ４の少なくとも１種を検出するための手段が、抗ＦＯＸＰ３抗体および抗ＣＤ４抗体の少なくとも１種の抗体を含む、請求項４５〜５５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５７】
前記検出は、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロット、またはＰＣＲにより行われることを特徴とする、請求項５６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、免疫寛容に関する新規技術に関する。より特定すると、本開示は、アナジーＴ細胞を含む医薬組成物、当該医薬組成物の製造、および当該医薬組成物の品質管理に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓移植は、末期の肝不全の患者に対する最終的な処置として広く使用されてきた。毎年、日本国外では２０、０００以上の症例があり、日本では５００を超える症例がある。【０００３】
移植は、末期の腎臓、心臓、肝臓、膵臓の臓器不全に対して選択される主な処置の１つであり、近年における移植拒絶反応の処置の著しい進歩にもかかわらず、免疫抑制レジメン無しには移植の大部分は最終的には拒絶される。連続的な薬物療法に依存する現在の免疫抑制レジメンは、薬物では移植に対して明確に向けられた反応のみならず、全ての免疫反応を抑制するため、臓器移植患者に、感染症や癌に対する感受性の増加を生じやすくしてしまう。【０００４】
再生医療も注目されるが、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等を用いても、最終的には自己由来の細胞ではない限りは免疫拒絶反応が起こり得るため、免疫寛容の技術は注目されている。【０００５】
この免疫寛容を誘導する技術として、Ｔ細胞の抗原特異的な免疫不応答（アナジー）の誘導がある。具体的には、抗原提示細胞上のＣＤ８０／ＣＤ８６と未活性化（ナイーブ）Ｔ細胞上のＣＤ２８との相互作用を阻害する抗体を臓器移植患者に直接投与して生体内でドナー抗原特異的アナジーを誘導する技術（特許文献１）や、同じ抗体の存在下でレシピエント細胞と放射線照射したドナー細胞を共培養により体外でドナー抗原特異的アナジー細胞を誘導し、レシピエントに戻す技術が報告されている（特許文献２、特許文献３および非特許文献1〜３）。【０００６】
非特許文献１は、体外でドナー抗原特異的アナジー細胞を誘導し、レシピエントに戻す技術において、ＣＤ８陽性細胞を除去しても、免疫抑制にほとんど影響がないことを報告している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００２−５０４１２０号公報
【特許文献２】特表２００７−１３１５９８号公報
【特許文献３】特表２０１６−５２００８１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓａｔｏｒｕ  Ｔｏｄｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｒｏｇｙ、  ６４（ｖｏｌ．２）、６３２−６４３  （２０１６）
【非特許文献２】Ｔｅｒａｏｋａ  Ｓ，  Ｋｏｙａｍａ  Ｉ，  Ｂａｓｈｕｄａ  Ｈ，  Ｕｃｈｉｄａ  Ｋ，  Ｔｏｎｓｈｏ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｒｅｓ  ２（１）  ｐ１−８
【非特許文献３】Ｂａｓｈｕｄａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１５：１８９６−１９０２  （２００５）．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＣＤ８０／ＣＤ８６とＣＤ２８との相互作用を阻害する抗体等の阻害因子を用いてＴ細胞のアナジーを誘導しても、アナジーが誘導されたＴ細胞の混合物中にＣＤ８陽性細胞が存在しない場合、ＣＤ８陽性細胞が存在する場合と比べて、免疫寛容を誘導する能力が有意に低下することを初めて見出した。本発明者らは、免疫寛容を誘導するためには、ＣＤ８陽性細胞が重要な働きを果たすことを見出した。【００１０】
したがって、本開示は以下を提供する。
（１）  ＣＤ４陽性アナジーＴ細胞と、ＣＤ８陽性アナジーＴ細胞とを含む医薬組成物。
（２）  前記アナジーＴ細胞は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子によって誘導される、上記項目に記載の医薬組成物。
（３）  前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（４）  前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（５）  前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（６）  前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（７）  前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（８）  前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（９）  さらに、制御性Ｔ細胞を含む項目１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（１０）  前記制御性Ｔ細胞は、ＦＯＸＰ３陽性ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性である、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（１１）  ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子によってアナジーが誘導された細胞を含む医薬組成物であって、該組成物は、ＣＤ８陽性細胞を含み、さらに、該組成物はＦＯＸＰ３陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の少なくとも１種以上を含む、医薬組成物。
（１２）ＦＯＸＰ３陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞のすべてを含む、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（１３）前記ＣＤ８陽性細胞はＣＤ４４陽性である、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（１４）前記ＣＤ８陽性細胞はＣＤ４５ＲＡ陰性かつＣＤ４５ＲＯ陽性である、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（１５）前記ＦＯＸＰ３陽性細胞はＣＤ４陽性である、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（１６）前記ＦＯＸＰ３陽性細胞はＣＤ２５陽性である、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（１７）前記医薬組成物は、抗原特異的な免疫寛容または免疫抑制のためのものである、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（１８）前記抗体は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体またはこれらの組み合わせを含む、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（１９）前記細胞は、前記阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原、あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合するステップによって誘導された細胞である、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（２０）上記項目のいずれかに記載の組成物を含む、被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための医薬組成物。
（２１）前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞およびそれらの細胞に由来する細胞、組織または臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（２２）前記移植免疫拒絶反応は、腎臓、肝臓、心臓、皮膚、肺、すい臓、食道、胃、小腸、大腸、神経、血液、免疫系細胞を含む血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球または骨髄が移植されることにより生じることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（２３）前記抗原の含有物は細胞である、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（２４）細胞を含む医薬を製造する方法であって、該方法は、
（Ａ）ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合する工程と、
（Ｂ）該混合によって得られる細胞生成物が、ＣＤ８陽性細胞を含むことを確認する工程と、
（Ｃ）該細胞生成物がＦＯＸＰ３陽性およびＣＤ４陽性の少なくとも1種の細胞を含むことを確認する工程と、
を包含する、方法。
（２５）  前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（２６）  前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（２７）  前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（２８）  前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（２９）  前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（３０）  前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の方法。
（３１）前記細胞生成物におけるＣＤ８陽性細胞の存在、およびＦＯＸＰ３陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の少なくとも１種の細胞の存在が、前記細胞生成物が医薬として使用され得ることを示す、上記項目のいずれかに記載の方法。
（３２）前記医薬は、前記被験体由来の抗原または前記被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するためのものである、上記項目のいずれかに記載の方法。
（３３）前記工程（Ｂ）が、抗ＣＤ８抗体によりＣＤ８を検出することを含み、前記工程（Ｃ）が、抗ＦＯＸＰ３抗体および抗ＣＤ４抗体の少なくとも１種の抗体によりＦＯＸＰ３およびＣＤ４の少なくとも１種を検出することを含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（３４）前記検出が、ＦＡＣＳにより実施されることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の方法。
（３５）被験体由来の細胞に発現する抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための細胞を含む医薬の品質を管理する方法であって、該方法は、（Ａ）該細胞がＣＤ８陽性細胞を含むことを確認する工程、および（Ｂ）該細胞がＦＯＸＰ３陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の少なくとも１種の細胞を含むことを確認する工程を含む、方法。
（３６）前記工程（Ａ）が、抗ＣＤ８抗体によりＣＤ８を検出することを含み、前記工程（Ｂ）が、抗ＦＯＸＰ３抗体および抗ＣＤ４抗体の少なくとも１種の抗体によりＦＯＸＰ３およびＣＤ４の少なくとも１種を検出することを含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（３７）前記検出が、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロット、またはＰＣＲにより実施されることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の方法。
（３８）上記項目のいずれかに記載の医薬組成物を製造するための、阻害因子を含む組成物であって、該阻害因子が、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子である、組成物。
（３９）  前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（４０）  前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（４１）  前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（４２）  前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（４３）  前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（４４）  前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（４５）細胞の混合物を含む医薬を製造するためのキットであって、該キットは、（Ａ）ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子と、（Ｂ）ＣＤ８を検出するための手段と、（Ｃ）ＦＯＸＰ３およびＣＤ４の少なくとも１つを検出するための手段とを含む、キット。
（４６）  前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載のキット。
（４７）  前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載のキット。
（４８）  前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（４９）  前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（５０）  前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載のキットまたは方法。
（５２）  前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載のキットまたは方法。
（５３）前記細胞の混合物におけるＣＤ８陽性細胞の存在、およびＦＯＸＰ３陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の少なくとも１種の細胞の存在が、前記細胞の混合物が医薬として使用され得ることを示す、上記項目のいずれかに記載のキット。
（５４）前記医薬は、前記被験体由来の抗原または前記被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するためのものである、上記項目のいずれかに記載のキット。
（５５）被験体由来の細胞に発現する抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための細胞を含む医薬の品質を管理するためのキットであって、該キットは、（Ａ）ＣＤ８を検出するための手段と、（Ｂ）ＦＯＸＰ３およびＣＤ４の少なくとも１種を検出するための手段とを含む、キット。
（５６）  前記ＣＤ８を検出するための手段が、抗ＣＤ８抗体を含み、ＦＯＸＰ３およびＣＤ４の少なくとも１種を検出するための手段が、抗ＦＯＸＰ３抗体および抗ＣＤ４抗体の少なくとも１種の抗体を含む、上記項目のいずれかに記載のキット。
（５７）  前記検出は、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロット、またはＰＣＲにより行われることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載のキット。
（Ｂ１）
ＣＤ８陽性アナジーＴ細胞を含む、ＣＤ４陽性アナジー細胞とともに用いて免疫寛容を惹起するための医薬組成物。
（Ｂ２）
上記項目１〜５７または他の項目のいずれかに示す１または複数の特徴をさらに含む、項目Ｂ１に記載の医薬組成物。
（Ｃ１）
ＣＤ４陽性アナジーＴ細胞を含む、ＣＤ８陽性アナジー細胞とともに用いて免疫寛容を惹起するための医薬組成物。
（Ｃ２）
上記項目１〜５７または他の項目のいずれかに示す１または複数の特徴をさらに含む、項目Ｂ１に記載の医薬組成物。
（Ｄ１）
被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防する方法であって、  ＣＤ４陽性アナジーＴ細胞と、
ＣＤ８陽性アナジーＴ細胞とを有効量で、該被験体に投与する工程を含む、方法。
（Ｄ２）
前記アナジーＴ細胞は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体によって誘導される、上記項目に記載の方法。
（Ｄ３）  前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｄ４）  前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｄ５）  前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｄ６）  前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｄ７）  前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｄ８）  前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｄ９）  制御性Ｔ細胞を投与する工程をさらに含む、項目１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（Ｄ１０）  前記制御性Ｔ細胞は、ＦＯＸＰ３陽性ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｄ１１）  被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防する方法であって、該方法は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子によってアナジーが誘導された細胞を有効量で、該被験体に投与する工程を含み、該アナジーが誘導された細胞は、ＣＤ８陽性細胞を含み、さらに、該アナジーが誘導された細胞はＦＯＸＰ３陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の少なくとも１種以上を含む、方法。
（Ｄ１２）ＦＯＸＰ３陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞のすべてを含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｄ１３）前記ＣＤ８陽性細胞はＣＤ４４陽性である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｄ１４）前記ＣＤ８陽性細胞はＣＤ４５ＲＡ陰性かつＣＤ４５ＲＯ陽性である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｄ１５）前記ＦＯＸＰ３陽性細胞はＣＤ４陽性である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｄ１６）前記ＦＯＸＰ３陽性細胞はＣＤ２５陽性である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｄ１７）
前記アナジーが誘導された細胞は、抗原特異的な免疫寛容または免疫抑制を惹起するる、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｄ１８）前記抗体は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体またはこれらの組み合わせを含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｄ１９）前記細胞は、前記阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原、あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合するステップによって誘導された細胞である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｄ２０）上記項目のいずれかに記載の組成物を含む、被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための方法。
（Ｄ２１）前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞およびそれらの細胞に由来する細胞、組織または臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｄ２２）前記移植免疫拒絶反応は、腎臓、肝臓、心臓、皮膚、肺、すい臓、食道、胃、小腸、大腸、神経、血液、免疫系細胞を含む血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球または骨髄が移植されることにより生じることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｄ２３）前記抗原の含有物は細胞である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｅ１）  被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための医薬を製造するための、ＣＤ４陽性アナジーＴ細胞およびＣＤ８陽性アナジーＴ細胞の使用。
（Ｅ２）  前記アナジーＴ細胞は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体によって誘導される、上記項目に記載の使用。
（Ｅ３）  前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｅ４）  前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｅ５）  前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｅ６）  前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｅ７）  前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｅ８）  前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｅ９）  前記ＣＤ４陽性アナジーＴ細胞およびＣＤ８陽性アナジーＴ細胞はさらに、制御性Ｔ細胞を含む項目１〜８のいずれか一項に記載の使用。
（Ｅ１０）  前記制御性Ｔ細胞は、ＦＯＸＰ３陽性ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｅ１１）  被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防する医薬を製造するための、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子によってアナジーが誘導された細胞の使用であって、該アナジーが誘導された細胞は、ＣＤ８陽性細胞を含み、該アナジーが誘導された細胞はＦＯＸＰ３陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の少なくとも１種以上を含む、使用。
（Ｅ１２）前記アナジーが誘導された細胞は、ＦＯＸＰ３陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞のすべてを含む、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｅ１３）前記ＣＤ８陽性細胞はＣＤ４４陽性である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｅ１４）前記ＣＤ８陽性細胞はＣＤ４５ＲＡ陰性かつＣＤ４５ＲＯ陽性である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｅ１５）前記ＦＯＸＰ３陽性細胞はＣＤ４陽性である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｅ１６）前記ＦＯＸＰ３陽性細胞はＣＤ２５陽性である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｅ１７）  前記アナジーが誘導された細胞は、抗原特異的な免疫寛容または免疫抑制を惹起する、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｅ１８）前記抗体は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体またはこれらの組み合わせを含む、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｅ１９）前記アナジーが誘導された細胞は、前記阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原、あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合するステップによって誘導された細胞である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｅ２０）上記項目のいずれかに記載の組成物を含む、被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための使用。
（Ｅ２１）前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞およびそれらの細胞に由来する細胞、組織または臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｅ２２）前記移植免疫拒絶反応は、腎臓、肝臓、心臓、皮膚、肺、すい臓、食道、胃、小腸、大腸、神経、血液、免疫系細胞を含む血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球または骨髄が移植されることにより生じることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｅ２３）前記抗原の含有物は細胞である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｆ１）  被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための、ＣＤ４陽性アナジーＴ細胞およびＣＤ８陽性アナジーＴ細胞の細胞混合物。
（Ｆ２）  前記アナジーＴ細胞は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体によって誘導される、上記項目に記載の細胞混合物。
（Ｆ３）  前記阻害因子が、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれかに記載の細胞混合物。
（Ｆ４）  前記タンパク質が、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である、上記項目のいずれかに記載の細胞混合物。
（Ｆ５）  前記抗体の改変体が、抗原結合断片である、上記項目のいずれかに記載の細胞混合物。
（Ｆ６）  前記細胞表面分子の改変体が、融合タンパク質である、上記項目のいずれかに記載の細胞混合物。
（Ｆ７）  前記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の細胞混合物。
（Ｆ８）  前記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである、上記項目のいずれかに記載の細胞混合物。
（Ｆ９）  さらに、制御性Ｔ細胞を含む項目１〜８のいずれか一項に記載の細胞混合物。
（Ｆ１０）  前記制御性Ｔ細胞は、ＦＯＸＰ３陽性ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性である、上記項目のいずれかに記載の細胞混合物。
（Ｆ１１）  被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子によってアナジーが誘導された細胞であって、該アナジーが誘導された細胞は、ＣＤ８陽性細胞を含み、該アナジーが誘導された細胞はＦＯＸＰ３陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の少なくとも１種以上を含む、アナジーが誘導された細胞。
（Ｆ１２）ＦＯＸＰ３陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞のすべてを含む、上記項目のいずれかに記載のアナジーが誘導された細胞。
（Ｆ１３）前記ＣＤ８陽性細胞はＣＤ４４陽性である、上記項目のいずれかに記載のアナジーが誘導された細胞。
（Ｆ１４）前記ＣＤ８陽性細胞はＣＤ４５ＲＡ陰性かつＣＤ４５ＲＯ陽性である、上記項目のいずれかに記載のアナジーが誘導された細胞。
（Ｆ１５）前記ＦＯＸＰ３陽性細胞はＣＤ４陽性である、上記項目のいずれかに記載のアナジーが誘導された細胞。
（Ｆ１６）前記ＦＯＸＰ３陽性細胞はＣＤ２５陽性である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（Ｆ１７）  抗原特異的な免疫寛容または免疫抑制を惹起する、上記項目のいずれかに記載のアナジーが誘導された細胞。
（Ｆ１８）前記抗体は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体またはこれらの組み合わせを含む、上記項目のいずれかに記載のアナジーが誘導された細胞。
（Ｆ１９）前記アナジーが誘導された細胞は、前記阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原、あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合するステップによって誘導された細胞である、上記項目のいずれかに記載のアナジーが誘導された細胞。
（Ｆ２０）上記項目のいずれかに記載の組成物を含む、被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するためのアナジーが誘導された細胞。
（Ｆ２１）前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞およびそれらの細胞に由来する細胞、組織または臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載のアナジーが誘導された細胞。
（Ｆ２２）前記移植免疫拒絶反応は、腎臓、肝臓、心臓、皮膚、肺、すい臓、食道、胃、小腸、大腸、神経、血液、免疫系細胞を含む血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球または骨髄が移植されることにより生じることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載のアナジーが誘導された細胞。
（Ｆ２３）前記抗原の含有物は細胞である、上記項目のいずれかに記載のアナジーが誘導された細胞。
本開示は以下をも提供する。
（Ｇ１）ＣＤ４陽性アナジーＴ細胞と、
ＣＤ８陽性アナジーＴ細胞と
を含む医薬組成物。
（Ｇ２）前記アナジーＴ細胞は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体によって誘導される、上記項目に記載の組成物。
（Ｇ３）さらに、制御性Ｔ細胞を含む、上記項目のいずれかに記載の医薬組成物。
（Ｇ４）前記制御性Ｔ細胞は、ＦＯＸＰ３陽性ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（Ｇ５）ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体によってアナジーが誘導された細胞を含む医薬組成物であって、該組成物は、ＣＤ８陽性細胞を含み、さらに、該組成物はＦＯＸＰ３陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の少なくとも１種以上を含む、組成物。
（Ｇ６）ＦＯＸＰ３陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞のすべてを含む、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（Ｇ７）前記ＣＤ８陽性細胞はＣＤ４４陽性である、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（Ｇ８）前記ＦＯＸＰ３陽性細胞はＣＤ４陽性である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（Ｇ９）前記ＦＯＸＰ３陽性細胞はＣＤ２５陽性である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（Ｇ１０）前記医薬組成物は、抗原特異的な免疫寛容または免疫抑制のためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（Ｇ１１）前記抗体は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体またはこれらの組み合わせを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（Ｇ１２）前記細胞は、前記抗体と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原、あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合するステップによって誘導された細胞である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（Ｇ１３）項目Ｇ１〜Ｇ１２のいずれか一項に記載の組成物を含む、被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための医薬組成物。
（Ｇ１４）前記疾患、障害または状態は、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞およびそれらの細胞に由来する細胞、組織または臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応からなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（Ｇ１５）前記移植免疫拒絶反応は、腎臓、肝臓、心臓、皮膚、肺、すい臓、食道、胃、小腸、大腸、神経、血液、免疫系細胞を含む血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球または骨髄が移植されることにより生じることを特徴とする、項目Ｇ１４に記載の組成物。
（Ｇ１６）前記抗原の含有物は細胞である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（Ｇ１７）細胞を含む医薬を製造する方法であって、該方法は、
（Ａ）ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合する工程と、
（Ｂ）該混合によって得られる細胞生成物が、ＣＤ８陽性細胞を含むことを確認する工程と、
（Ｃ）該細胞生成物がＦＯＸＰ３陽性およびＣＤ４陽性の少なくとも1種の細胞を含むこ
とを確認する工程と、
を包含する、方法。
（Ｇ１８）前記細胞生成物におけるＣＤ８陽性細胞の存在、およびＦＯＸＰ３陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の少なくとも１種の細胞の存在が、前記細胞生成物が医薬として使用され得ることを示す、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｇ１９）前記医薬は、前記被験体由来の抗原または前記被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するためのものである、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｇ２０）前記工程（Ｂ）が、抗ＣＤ８抗体によりＣＤ８を検出することを含み、前記工程（Ｃ）が、抗ＦＯＸＰ３抗体および抗ＣＤ４抗体の少なくとも１種の抗体によりＦＯＸＰ３およびＣＤ４の少なくとも１種を検出することを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（Ｇ２１）前記検出が、ＦＡＣＳにより実施されることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｇ２２）被験体由来の細胞に発現する抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための細胞を含む医薬の品質を管理する方法であって、該方法は、
（Ａ）該細胞がＣＤ８陽性細胞を含むことを確認する工程、および
（Ｂ）該細胞がＦＯＸＰ３陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の少なくとも１種の細胞を含むことを確認する工程
を含む、方法。
（Ｇ２３）前記工程（Ａ）が、抗ＣＤ８抗体によりＣＤ８を検出することを含み、前記工程（Ｂ）が、抗ＦＯＸＰ３抗体および抗ＣＤ４抗体の少なくとも１種の抗体によりＦＯＸＰ３およびＣＤ４の少なくとも１種を検出することを含む、項目Ｇ２２に記載の方法。
（Ｇ２４）前記検出が、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロット、またはＰＣＲにより実施されることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の方法。
（Ｇ２５）細胞の混合物を含む医薬を製造するためのキットであって、該キットは、
（Ａ）ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体と、
（Ｂ）ＣＤ８を検出するための手段と、
（Ｃ）ＦＯＸＰ３およびＣＤ４の少なくとも１つを検出するための手段と
を含む、キット。
（Ｇ２５Ａ）細胞の混合物を含む医薬の品質を管理するためのキットであって、該キットは、
（Ａ）ＣＤ８を検出するための手段と、
（Ｂ）ＦＯＸＰ３およびＣＤ４の少なくとも１つを検出するための手段と
を含む、キット。
（Ｇ２６）前記細胞の混合物におけるＣＤ８陽性細胞の存在、およびＦＯＸＰ３陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の少なくとも１種の細胞の存在が、前記細胞の混合物が医薬として使用され得ることを示す、上記項目のいずれかに記載のキット。
（Ｇ２７）前記医薬は、前記被験体由来の抗原または前記被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するためのものである、上記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ｇ２７Ａ）前記医薬は、免疫寛容を利用して処置または予防するためのものである、上記項目のいずれかに記載のキット。
（Ｇ２８）被験体由来の細胞に発現する抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための細胞を含む医薬の品質を管理するためのキットであって、該キットは、
（Ａ）ＣＤ８を検出するための手段と、
（Ｂ）ＦＯＸＰ３およびＣＤ４の少なくとも１種を検出するための手段と
を含む、キット。
（Ｇ２９）前記ＣＤ８を検出するための手段が、抗ＣＤ８抗体を含み、ＦＯＸＰ３およびＣＤ４の少なくとも１種を検出するための手段が、抗ＦＯＸＰ３抗体および抗ＣＤ４抗体の少なくとも１種の抗体を含む、上記項目のいずれか一項に記載のキット。
（Ｇ３０）前記検出は、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロット、またはＰＣＲにより行われることを特徴とする、上記項目のいずれかに記載のキット。【００１１】
本開示において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本開示のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【００１２】
本開示の組成物は、ＣＤ４陽性アナジーＴ細胞およびＣＤ８陽性アナジーＴ細胞を含み、ＣＤ８陽性アナジーＴ細胞を含まないものよりも高い免疫寛容の誘導能を有する。また、免疫寛容を誘導するための医薬の製造において、ＣＤ８陽性細胞を指標として医薬の品質を管理することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、免疫寛容を惹起するために必要な成分を特定する機能喪失アッセイの結果を示す。（ｉ）アナジー細胞の生成：Ｃ５７ＢＬ６（以下、Ｂ６と略記）マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を摘出し、脾臓細胞（リンパ球）を得た。その後、スティミュレイターとなるＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞に放射線（γ線）３０Ｇｙを照射したのち、Ｂ６由来脾臓細胞と１：１で混合し、抗ＣＤ８０抗体と抗ＣＤ８６抗体を各最終濃度が１０μｇ／ｍＬになる様に添加し、適切な体積の培養液において３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養を開始した。培養開始から７日目に遠心により培養液を除いた後に、新たにＢＡＬＢ／ｃ由来の放射線照射脾臓細胞と抗ＣＤ８０抗体／抗ＣＤ８６抗体とを含む培養液を培養開始時と同じ条件で添加した。培養１４日目に細胞を回収しアナジー細胞を得た。（ｉｉ）各細胞表現型の選別：得られたアナジー細胞に、ＰＥ蛍光標識抗ＣＤ８抗体を反応させた後、抗ＰＥ磁気ビーズを用いた自動磁気細胞分離装置（ａｕｔｏ−ＭＡＣＳ）により、細胞をＣＤ８陽性とＣＤ８陰性とに選別した。またＰＥ蛍光標識ＣＤ１９抗体を用いて同様の操作を行い、細胞をＣＤ１９陽性とＣＤ１９陰性とに選別した。さらに、ＦＯＸＰ３発現制御性Ｔ細胞（ｒｅｇＴ細胞）を細胞表面抗原の発現で識別できるよう、レスポンダー細胞がＦｏｘＰ３とヒトＣＤ２とを同時に発現する様に遺伝子改変を行ったＢ６由来マウスを使用し、ＰＥ蛍光標識抗ヒトＣＤ２抗体と抗ＰＥ磁気ビーズを用いたａｕｔｏ−ＭＡＣＳにより、ヒトＣＤ２陽性細胞（ＦｏｘＰ３発現ｒｅｇＴ細胞）とヒトＣＤ２陰性細胞とに選別し、免疫反応抑制能試験に使用した。（ｉｉｉ）免疫反応抑制能試験：新たに採取したＢ６マウス由来の脾臓細胞をレスポンダーとして、また新たに採取したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞をスティミュレイターとして用い、それぞれの細胞を１：１の比率で含む混合培養物を、９６ウェルプレートの各ウェル中、２００μＬの体積で作製した（１ウェルあたりの各細胞数は、１×１０５個）。この混合培養物に対し、レスポンダーＢ６脾臓細胞の細胞数との比率が、１、１／２、１／４、１／８、または１／１６となるように、何の選別も行わなかった全アナジー細胞（図１ａ）、アナジーＣＤ８陽性細胞のみの細胞集団もしくはアナジーＣＤ８陽性細胞を除いた残りの細胞集団（図１ｂ）、ｒｅｇＴ細胞のみの細胞集団もしくはｒｅｇＴ細胞を除いた残りの細胞集団（図１ｃ）、またはＣＤ１９陽性細胞（Ｂ細胞）のみの細胞集団もしくはＢ細胞を除いた残りの細胞集団（図１ｄ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。培養開始４日目に３Ｈ−チミジンを添加し、培養開始５日目（３Ｈ−チミジン添加の１６〜２０時間後）に培養細胞を回収し、シンチレーションカウンターにより３Ｈ−チミジン取込み量を測定した。各図中、「ｎａｉｖｅ」は、レスポンダーのみのウェル、「ａｌｌｏ」は、レスポンダーとスティミュレイターのみのウェルであり、「ｎａｉｖｅ」の３Ｈ−チミジン取込み量の平均値を１としてグラフを作成した。
【図２】図２は、ＣＤ８０／８６ブロッキングによる抑制機能獲得アッセイの結果を示す。実施例１と同様の手法で、野生型Ｂ６マウスおよびＦｏｘＰ３とヒトＣＤ２とを同時に発現する様に遺伝子改変を行ったＢ６由来マウスからそれぞれ得た脾臓細胞に対し、ＢＡＬＢ／ｃ由来の放射線照射脾臓細胞と抗ＣＤ８０抗体／抗ＣＤ８６抗体とによる処理を行い、アナジー細胞を得た。このアナジー細胞とともに、野生型Ｂ６マウスおよびＦｏｘＰ３とヒトＣＤ２とを同時に発現する様に遺伝子改変を行ったＢ６由来マウスから得た無刺激のナイーブ脾臓細胞を、それぞれＰＥ蛍光標識抗マウスＣＤ８抗体またはＰＥ蛍光標識抗ヒトＣＤ２抗体と反応させた。その後、抗ＰＥ磁気ビーズを用いたａｕｔｏ−ＭＡＣＳにより、細胞を、ＣＤ８陽性とＣＤ８陰性とに、またはヒトＣＤ２陽性とヒトＣＤ２陰性とに選別した。選別した各細胞を、実施例１に記載される９６ウェルプレート上の混合培養系に添加し、その免疫抑制能を調べた。各図中、「ｎａｉｖｅ」（ｉはより正確にはトレマ（上の点が２つ）を表す。本明細書中同様である。）は、レスポンダーのみのウェル、「ａｌｌｏ」は、レスポンダーとスティミュレイターのみのウェルであり、「ｎａｉｖｅ」の３Ｈ−チミジン取込み量の平均値を１としてグラフを作成した。
【図３】図３は、アナジー誘導後の純化細胞が移植後に寛容誘導能力を有するかどうかをマウスを用いた実験で確認した結果を示す。実施例１と同様の手法で、野生型Ｂ６マウスおよびＦｏｘＰ３とヒトＣＤ２とを同時に発現する様に遺伝子改変を行ったＢ６由来マウスの脾臓細胞に対し、ＢＡＬＢ／ｃ由来の放射線照射脾臓細胞と抗ＣＤ８０抗体／抗ＣＤ８６抗体とによる処理を行い、アナジー細胞を得た。得られたアナジー細胞（全アナジー細胞）から、実施例１と同様の手法でＣＤ８陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞またはヒトＣＤ２陽性細胞を選別した。野生型Ｂ６マウスに２Ｇｙの放射線（γ線）を照射した３日後にＢＡＬＢ／ｃマウスの心臓を移植し、直後（または心臓移植と同日のうち）にナイーブＢ６脾臓細胞または得られたアナジー細胞を尾静脈から投与し、心臓の拒絶を観察した。各群５匹以上で実験を行った。図３ａは、アナジー細胞を移植しない場合、あるいは全アナジー細胞を２×１０６個、４×１０６個または６×１０６個投与した場合の、心臓移植マウスの累積生存を示す。図３ｂは、レシピエントマウスに対する放射線照射の効果を示す。それぞれ、レシピエントマウスに対する放射線照射なし＋全アナジー細胞５×１０６個、レシピエントマウスに対する２．５Ｇｙ放射線照射＋ナイーブＢ６脾臓細胞４×１０６個、またはレシピエントマウスに対する２．５Ｇｙ放射線照射＋全アナジー細胞４×１０６個の処置を与え、その後のマウスの生存を追跡した。図３ｃおよび図３ｄは、様々な純化細胞集団を投与した場合の、心臓移植マウスの生存を示す。
【図４】図４は、ヒトＰＢＭＣに由来するアナジー細胞の能力を示す。（ｉ）アナジー細胞の生成：４人のボランティア（２人をスティミュレイター、２人をレスポンダーとする）のヒト末梢血から単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離し、スティミュレイターＰＢＭＣには放射線（γ線）３０Ｇｙを照射し、レスポンダーＰＢＭＣと１：１で混合した。混合したＰＢＭＣに、抗ヒトＣＤ８０抗体と抗ヒトＣＤ８６抗体をそれぞれ最終濃度が１０μｇ／ｍＬになる様に添加し、適切な体積の培養液において３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養を開始した。培養開始から７日目に遠心により培養液を除いた後に、放射線照射スティミュレイターＰＢＭＣと抗ＣＤ８０抗体／抗ＣＤ８６抗体を含む培養液を培養開始時と同じ条件で添加した。培養１４日目に細胞を回収し、遠心により培養液をウォッシュアウトし、アナジー細胞を得た。（ｉｉ）各細胞表現型の選別：得られたアナジー細胞を、ＰＥ蛍光標識マウス抗ヒトＣＤ２５抗体、ＦＩＴＣ蛍光標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体、ＡＰＣ蛍光標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体によって染色した後、ＪＳＡＮセルソーター（ベイバイオサイエンス社）を用いて各細胞を純化した。（ｉｉｉ）免疫反応抑制能試験：新たに採取した同一のボランティアのＰＢＭＣを、レスポンダー、スティミュレイターとして用い、それぞれの細胞を１：１の比率で含む混合培養物を、９６ウェルプレートの各ウェル中、２００μＬの体積で作製した（１ウェルあたりの各細胞数は、２×１０５個）。この混合培養物に対し、レスポンダーＰＢＭＣの細胞数との比率が、１／２、１／４、１／８、または１／１６となるように、全アナジー細胞を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した（図４ａ）。図４ｂでは、上記混合培養物に対し、ＣＤ２５陽性細胞を純化した細胞集団（ＣＤ２５＋）、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性ｒｅｇＴ細胞を純化した細胞集団（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）、または純化したＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性ｒｅｇＴ細胞および純化したＣＤ８陽性細胞を加えた細胞集団（ＣＤ２５＋／ＣＤ８＋）を、レスポンダーＰＢＭＣの細胞数との比率が各々１／２となるように添加した。図４ｃでは、上記混合培養物に対し、レスポンダーＰＢＭＣの細胞数との比率が、１／２、１／４、１／８、または１／１６となるように、ＣＤ４陽性細胞を純化した細胞集団、ＣＤ４陰性細胞を純化した細胞集団、または全アナジー細胞を添加し、免疫抑制能を比較したものである。各図中、「ｎａｉｖｅ」は、レスポンダーのみのウェル、「ａｌｌｏ」は、レスポンダーとスティミュレイターのみのウェルであり、「ｎａｉｖｅ」の３Ｈ−チミジン取込み量の平均値を１としてグラフを作成した。
【図５】図５は、アナジー細胞による免疫抑制は、抗原に特異的であることを示す図である。この図は、抗ＣＤ８０／８６抗体存在下でＢａｌｂ／Ｃマウス脾臓細胞で刺激されたＢ６マウス由来のアナジー細胞のＢ６マウスへの移入後の、心臓の生着率を示す。移植されたＢＡＬＢ／ｃマウスの心臓の拒絶を１００％阻害し１００日後でも心臓が生着しているが、これに対して他家（３ｒｄ  ｐａｒｔｙ）であるＣＢＡマウスの心臓は移植後に速やかに拒絶反応を引き起こし、約５０日で１００％拒絶されることが示された。
【図６】図６は、アナジー細胞がナイーブ細胞よりも迅速にドナー（スティミュレイター）細胞に結合することで、ナイーブ細胞の反応および増殖を阻害していることを示す。実施例１と同様の手法で、Ｂ６マウスから得た脾臓細胞に対し、ＢＡＬＢ／ｃ由来の放射線照射脾臓細胞と抗ＣＤ８０抗体／抗ＣＤ８６抗体とによる処理を行い、アナジー細胞を得た。この実験では、蛍光色素ＧＦＰを恒常的に発現する様に遺伝子改変したＢ６マウスから新たに得た脾臓細胞をレスポンダーとして用いた。１２ウェルプレート内で、上述のレスポンダーＢ６脾臓細胞およびスティミュレイター（ドナー）ＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞をそれぞれ１×１０６個／ｍｌ含む４ｍｌの混合培養系に、上記アナジー細胞を、レスポンダーＢ６脾臓細胞との比率が１／２になるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。培養開始から１日後から３日後まで経時的にプレートを観察し、写真を撮った。
【図７】図７は、アナジー細胞の中で免疫抑制能（アナジー誘導能）を発揮する細胞はＣＤ４４陽性であることを示す。実施例１と同様の手法で、Ｂ６マウスから得た脾臓細胞に対し、ＢＡＬＢ／ｃ由来の放射線照射脾臓細胞と抗ＣＤ８０抗体／抗ＣＤ８６抗体とによる処理を行い、アナジー細胞を得た。このアナジー細胞をＰＥ蛍光標識抗マウスＣＤ８抗体、ＰＥ蛍光標識抗マウスＣＤ４抗体、およびＡＰＣ蛍光標識抗マウスＣＤ４４抗体で染色後、ＪＳＡＮセルソーターを用いてＣＤ８陽性ＣＤ４４陰性細胞またはＣＤ４陽性ＣＤ４４陰性細胞を除去した細胞集団を作製し、この細胞集団または全アナジー細胞を、レスポンダーＢ６脾臓細胞との比率が１／２、１／４、１／８、または１／１６となるように混合培養系に添加した（図７ａ）。さらに、ＪＳＡＮセルソーターを用いてＣＤ８陽性ＣＤ４４陽性細胞またはＣＤ４陽性ＣＤ４４陽性細胞を純化した細胞集団を作製し、レスポンダーＢ６脾臓細胞との比率が１／２、１／４、または１／８となるように混合培養系に添加した（図７ｂ）。図７ｃは、アナジー細胞の表現型をＦＡＣＳによって調べた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１５】
（用語の定義）
本明細書において「約」とは、本明細書で使用される場合、後に続く数値の±１０％を意味する。
【００１６】
本明細書において、「免疫寛容」とは、特定の抗原に対する特異的免疫反応を示さないか、特異的免疫反応が抑制された状態のことである。免疫寛容は、免疫細胞（特にＴ細胞）が特定の抗原に対する特異的免疫反応を示さないか、特異的免疫反応が抑制された状態と、ヒトが特定の抗原に対する特異的免疫反応を示さないか、特異的免疫反応が抑制された状態の両方またはいずれか一方を意味していてもよい。免疫寛容が惹起されることにより、免疫拒絶反応に対する処置が可能になったり、アレルギーに対する治療が可能なったりすることから注目されている。本明細書において、「アナジー」とは、抗原提示細胞から抗原を提示される際に共刺激が入力されないことにより、当該次回に共刺激のある条件で刺激されても反応できなくなった状態を意味する。したがって、本明細書では「アナジー細胞」とは、免疫寛容が生じた（免疫不応答の）細胞をいい、「アナジーＴ細胞」は、免疫寛容が生じた（免疫不応答の）Ｔ細胞であり、活性化されないことのほか、再び同じ抗原にであったときに無反応であるＴ細胞も包含される。なお、本明細書において、「免疫寛容を誘導されたＰＢＭＣ（またはＴ細胞）」と「アナジーなＰＢＭＣ（またはＴ細胞）」とは同意義である。アナジー細胞であるかどうかは、例えば、ＣＤ４４陽性を確認することによって確認することができるが、これに限定されない。
【００１７】
本明細書において、「被験体」とは、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）を含む。特定の実施形態では、被験体は、ヒトである。
【００１８】
本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではａｇｅｎｔに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、その他の有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「阻害因子」は、所定の作用（例えば、相互作用、シグナル伝達など）を阻害することができる、あらゆる種類の低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖などをいう。特定の理論に束縛されることは望まないが、本開示において、細胞表面のＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用をブロックし、ＣＤ２８共刺激シグナルを阻害することにより、Ｔ細胞にアナジーを誘導する。本開示では、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用をブロックするのに使用される阻害因子は、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。一局面では、上記タンパク質は、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である。別の局面では、上記抗体の改変体は、抗原結合断片である。別の局面では、上記細胞表面分子の改変体は、融合タンパク質である。別の局面では、上記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される。別の局面では、上記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである。また、上記相互作用を間接的に阻害する因子（例えば、シグナル伝達の上流または下流のシグナルの阻害因子）も組み合わせて使用することも想定される。
【００１９】
本明細書において広義の「抗体」は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することができる分子またはその集団をいう。本明細書における広義の「抗体」は、全長抗体（すなわち、Ｆｃ部分を有する抗体）であっても、Ｆｃ部分を欠いている抗体であってもよい。Ｆｃ部分を欠いている抗体は、目的の抗原に結合することができればよく、そのような抗体としては、例えば、Ｆａｂ抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆｖ抗体、ｓｃＦｖ抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、どのようなタイプの抗体であってもよく、すなわち、当該分野において公知の免疫グロブリンであってもよい。例示的な実施形態において、抗体は、アイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭのクラスの抗体である。例示的な実施形態において、本明細書に記載される抗体は、１つまたは複数のアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、および／またはミュー重鎖を含む。例示的な実施形態において、本明細書に記載される抗体は、１つまたは複数のカッパまたは軽鎖を含む。例示的な態様において、抗体は、ＩｇＧ抗体であり、４つのヒトサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のうちの１つである。また、本開示における使用が想定される抗体としては、ラクダ科動物由来の抗体（例えば、ＶＨＨ抗体）、サメ由来の抗体（例えば、一本鎖抗体）、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ、単一ドメイン抗体）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、タンデムジ−ｓｃＦＶ、タンデムトリ−ｓｃＦｖ）などが挙げられ、これらは、当該分野において公知である。例えば、Ｋｏｒｔｔら、Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ．  ２００１  １８巻：９５〜１０８頁、（２００１年）およびＴｏｄｏｒｏｖｓｋａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２４８巻：４７〜６６頁、（２００１年）などを参照されたい。また抗体は、抗体修飾物または抗体非修飾物を含む。抗体修飾物は、抗体と、例えばポリエチレングリコール等の各種分子が結合していてもよい。抗体修飾物は、抗体に公知の手法を用いて化学的な修飾を施すことによって得ることができる。人工的に作出された抗体および抗体の種々の修飾／改変方法については、生化学（２０１６）第８８巻第３号３８０〜３８５頁も参照のこと。
【００２０】
本明細書において狭義の「抗体」は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することができるイムノグロブリンまたはその集団をいい、その改変体を「抗体の改変体」という。本明細書における狭義の「抗体」は、全長抗体（すなわち、Ｆｃ部分を有する抗体）であり得、本明細書における「抗体の改変体」は、上記抗体のＦｃ部分を欠いている改変体であり得る。したがって、本明細書において狭義の抗体は全長抗体とも称され得、抗体の改変体は全長抗体の改変体とも称され得る。Ｆｃ部分を欠いている改変体は、目的の抗原に結合することができればよく、そのような改変体としては、例えば、Ｆａｂ抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆｖ抗体、ｓｃＦｖ抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。また抗体の改変体は、抗体修飾物または抗体非修飾物を含む。抗体修飾物は、抗体と、例えばポリエチレングリコール等の各種分子が結合していてもよい。抗体修飾物は、抗体に公知の手法を用いて化学的な修飾を施すことによって得ることができる。
【００２１】
本開示の一実施形態において「ポリクローナル抗体」は、例えば、抗原に特異的なポリクローナル抗体の産生を誘導するために、哺乳類（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、サル等）、鳥類等に、目的の抗原を含む免疫原を投与することによって生成することが可能である。免疫原の投与は、1つ以上の免疫剤、および所望の場合にはアジュバントの注入をしてもよい。アジュバントは、免疫応答を増加させるために使用されることもあり、フロイントアジュバント（完全または不完全）、ミネラルゲル（水酸化アルミニウム等）、または界面活性物質（リゾレシチン等）等を含んでいてもよい。免疫プロトコールは、当該技術分野で公知であり、選択する宿主生物に合わせて、免疫応答を誘発する任意の方法によって実施される場合がある（タンパク質実験ハンドブック,羊土社(2003):86-91.）。
【００２２】
本開示の一実施形態において「モノクローナル抗体」は、集団を構成する個々の抗体が、少量自然に生じることが可能な突然変異を有する抗体を除いて、実質的に単一のエピトープに対応する同一な抗体である場合を含む。または、集団を構成する個々の抗体が、少量自然に生じることが可能な突然変異を有する抗体を除いて、実質的に同一である抗体であってもよい。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、異なるエピトープに対応する異なる抗体を典型的に含むような、および／または同一なエピトープに対応する異なる抗体を典型的に含むような、通常のポリクローナル抗体とは異なる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養から合成できる点で有用である。「モノクローナル」という形容は、実質的に均一な抗体集団から得られるという特徴を示していてもよいが、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、モノクローナル抗体は、"Kohler  G,  Milstein  C.,  Nature.  1975  Aug  7;256(5517):495-497."に掲載されているようなハイブリドーマ法と同様の方法によって作製してもよい。あるいは、モノクローナル抗体は、米国特許第4816567号に記載されているような組換え法と同様の方法によって作製してもよい。または、モノクローナル抗体は、"Clackson  et  al.,  Nature.  1991  Aug  15;352(6336):624-628."、または"Marks  et  al.,  J  Mol  Biol.  1991  Dec  5;222(3):581-597."に記載されているような技術と同様の方法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。または、"タンパク質実験ハンドブック,羊土社(2003):92-96."に掲載されている方法でよって作製してもよい。
【００２３】
本開示の一実施形態において「キメラ抗体」は、例えば、異種生物間における抗体の可変領域と、抗体の定常領域とを連結したもので、遺伝子組換え技術によって構築できる。マウス-ヒトキメラ抗体は、例えば、"Roguska  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  1994Feb  1;91(3):969-973."に記載の方法で作製できる。マウス-ヒトキメラ抗体を作製するための基本的な方法は、例えば、クローン化されたcDNAに存在するマウスリーダー配列および可変領域配列を、哺乳類細胞の発現ベクター中にすでに存在するヒト抗体定常領域をコードする配列に連結する。または、クローン化されたcDNAに存在するマウスリーダー配列および可変領域配列をヒト抗体定常領域をコードする配列に連結した後、哺乳類細胞発現ベクターに連結してもよい。ヒト抗体定常領域の断片は、任意のヒト抗体のH鎖定常領域およびヒト抗体のL鎖定常領域のものとすることができ、例えばヒトH鎖のものについてはCγ1、Cγ2、Cγ3またはCγ4を、L鎖のものについてはCλまたはCκを各々挙げることができる。
【００２４】
本開示の一実施形態において「ヒト化抗体」は、例えば、非ヒト種由来の1つ以上のCDR、およびヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域（FR）、さらにヒト免疫グロブリン由来の定常領域を有し、所望の抗原に結合する抗体である。抗体のヒト化は、当該技術分野で既知の種々の手法を使用して実施可能である(Almagro  et  al.,  Front  Biosci.  2008  Jan  1;13:1619-1633.)。例えば、CDRグラフティング（Ozaki  et  al.,Blood.1999  Jun1;93(11):3922-3930.）、Re-surfacing  (Roguska  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  US  A.1994Feb  1;91(3):969-973.)、またはFRシャッフル（Damschroder  et  al.,  Mol  Immunol.  2007Apr;44(11):3049-3060.  Epub  2007  Jan  22.）などが挙げられる。抗原結合を改変するために（好ましくは改善するために）、ヒトFR領域のアミノ酸残基は、CDRドナー抗体からの対応する残基と置換してもよい。このFR置換は、当該技術分野で周知の方法によって実施可能である（Riechmann  et  al.,  Nature.  1988  Mar  24;332(6162):323-327.）。例えば、CDRとFR残基の相互作用のモデリングによって抗原結合に重要なFR残基を同定してもよい。または、配列比較によって、特定の位置で異常なFR残基を同定してもよい。
【００２５】
本開示の一実施形態において「ヒト抗体」は、例えば、抗体を構成する重鎖の可変領域および定常領域、軽鎖の可変領域および定常領域を含む領域が、ヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来する抗体である。主な作製方法としてはヒト抗体作製用トランスジェニックマウス法、ファージディスプレイ法などがある。ヒト抗体作製用トランスジェニックマウス法では、内因性Igをノックアウトしたマウスに機能的なヒトのIg遺伝子を導入すれば、マウス抗体の代わりに多様な抗原結合能を持つヒト抗体が産生される。さらにこのマウスを免疫すればヒトモノクローナル抗体を従来のハイブリドーマ法で得ることが可能である。例えば、"Lonberg  et  al.,  Int  Rev  Immunol.  1995;13(1):65-93."に記載の方法で作製できる。ファージディスプレイ法は、典型的には大腸菌ウイルスの一つであるM13やT7などの繊維状ファージのコート蛋白質（g3p、g10p等）のN末端側にファージの感染性を失わないよう外来遺伝子を融合蛋白質として発現させるシステムである。例えば、"Vaughan  et  al.,  Nat  Biotechnol.  1996  Mar;14(3):309-314."に記載の方法で作製できる。
【００２６】
本明細書において、「被験体由来の細胞」とは、本開示の組成物が投与される被験体から得た細胞または該被験体から得た細胞に由来する細胞をいう。本明細書において、「被験体由来の抗原」とは、免疫応答を生じさせる被験体自身が生成する抗原、例えば、自己免疫疾患を有する被験体における自己免疫疾患の原因となる被験体自身が生成する抗原をいう。本明細書において、「被験体に由来しない抗原」とは、免疫応答を生じさせ得る外来の抗原をいう。本明細書において、「被験体に由来しない」「抗原の含有物（ａｎｔｉｇｅｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌ）」は、被験体に由来しない抗原を含有する任意の物質または物質の集合物をいい、例えば、被験体に由来しない抗原を発現している細胞、細胞集団、組織等が挙げられる。
【００２７】
本明細書において、「移植免疫拒絶反応」とは、臓器、組織または細胞の移植を受けた被験体において、被験体の免疫系が、移植された臓器、組織または細胞に対して攻撃し、損傷または破壊することをいう。
【００２８】
本明細書において、「アレルギー」とは、被験体に由来しない抗原に対して、免疫応答が過剰に起こる状態をいう。アレルギーを引き起こす被験体に由来しない抗原は、アレルゲンとも呼ばれ、例えば、ダニ抗原、卵白抗原、ミルク抗原、小麦抗原、ピーナッツ抗原、大豆抗原、ソバ抗原、ゴマ抗原、コメ抗原、甲殻類抗原、キウイ抗原、リンゴ抗原、バナナ抗原、モモ抗原、トマト抗原、マグロ抗原、サケ抗原、サバ抗原、牛肉抗原、鶏肉抗原、豚肉抗原、ネコ皮屑抗原、昆虫抗原、花粉抗原、イヌ皮屑抗原、真菌抗原、細菌抗原、ラテックス、ハプテンおよび金属等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２９】
本明細書において、「自己免疫疾患」とは、免疫系が自身の細胞、組織または臓器に対して望ましくない免疫応答を行う任意の疾患をいう。自己免疫疾患としては、例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、１型糖尿病、炎症性腸疾患（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）、全身性エリテマトーデス、乾癬、強皮症、自己免疫性甲状腺疾患、円形脱毛症、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ熱、胃炎、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、膵島炎、卵巣炎、精巣炎、ブドウ膜炎、水晶体起因性ブドウ膜炎、重症筋無力症、原発性粘液水腫、悪性貧血、自己免疫性溶血性貧血、アジソン病、強皮症、グッドパスチャー症候群、腎炎（例えば、糸球体腎炎）、乾癬、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、特発性血小板減少性紫斑病、特発性白血球減少症、ウェゲナー肉芽腫および多発性／皮膚筋炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書において、「移植片対宿主病」とは、移植された臓器、組織または細胞が、免疫応答によって、移植を受けた被験体の細胞、組織または臓器を攻撃し、損傷または破壊することをいう。
【００３１】
本明細書において、「ｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞またはそれらの細胞に由来する細胞、組織もしくは臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応」とは、ｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞が有する抗原、またはｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞に由来する細胞、組織もしくは臓器が有する抗原によって生じる免疫拒絶反応をいう。
【００３２】
（好ましい実施形態）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本開示の例示であり、本開示の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本開示の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、本明細書中の記載を参酌して、任意の実施形態を組み合わせ得る。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
【００３３】
（医薬ならびに治療および予防）
本発明者らは、ＣＤ８０／ＣＤ８６とＣＤ２８との相互作用を阻害する阻害因子を用いてＴ細胞のアナジーを誘導しても、アナジーが誘導されたＴ細胞を含む混合物中にＣＤ８陽性細胞が存在しない場合、免疫寛容を誘導する能力が低下することを明らかにした。このことは、ＣＤ８陽性細胞を除去しても、免疫抑制にほとんど影響がない可能性を報告する非特許文献４とは対照的であり、予想外であった。
【００３４】
一態様において、本開示は、ＣＤ４陽性アナジーＴ細胞と、ＣＤ８陽性アナジーＴ細胞とを含む医薬組成物を提供する。このような医薬組成物は、抗原特異的な免疫寛容または免疫抑制のために使用され得る。このアナジーＴ細胞は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子によって誘導され得る。このような阻害因子は、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。一局面では、上記タンパク質は、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である。別の局面では、上記抗体の改変体は、抗原結合断片である。別の局面では、上記細胞表面分子の改変体は、融合タンパク質である。別の局面では、上記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される。別の局面では、上記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである。。
【００３５】
いくつかの実施形態において、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６は、抗原提示細胞により発現され、ＣＤ２８は、Ｔ細胞により発現される。
【００３６】
いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、制御性Ｔ細胞、例えばＦＯＸＰ３陽性ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞をさらに含み得る。このような制御性Ｔ細胞は、特定の抗原に対する特異的免疫反応を示さない「免疫寛容」に直接関与するものではなく、必須の成分ではないが、免疫応答を抑制することができるために、好ましい実施形態では、本開示の組成物は、制御性Ｔ細胞をさらに含んでもよい。
【００３７】
本開示の別の局面において、本開示は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子によってアナジーが誘導された細胞を含む医薬組成物であって、該組成物は、ＣＤ８陽性細胞を含み、さらに、該組成物はＦＯＸＰ３陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の少なくとも１種以上を含む、組成物を提供する。このような医薬組成物は、抗原特異的な免疫寛容または免疫抑制のために使用され得る。特定の実施形態において、本開示の組成物は、ＦＯＸＰ３陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞のすべてを含んでもよい。
【００３８】
本発明者は、アナジーが誘導されたＣＤ８陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞（ＣＤ８陽性アナジー細胞およびＣＤ４陽性アナジー細胞とも称する）には、ＣＤ４４陽性の細胞を多く含むことを明らかにした。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ８陽性細胞および／またはＣＤ４陽性細胞は、ＣＤ４４陽性であり得る。また、アナジー細胞の生成の確認には、ＣＤ４４の他に、ＣＤ４５ＲＡ/ＣＤ４５ＲＯも使用することができる。例えば、一局面において、ＣＤ８陽性細胞および／またはＣＤ４陽性細胞はＣＤ４５ＲＡ陰性かつＣＤ４５ＲＯ陽性である。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ＦＯＸＰ３陽性細胞はＣＤ４陽性および／またはＣＤ２５陽性であり得る。本開示の組成物は、制御性Ｔ細胞をさらに含むことが好ましく、制御性Ｔ細胞は、ＦＯＸＰ３陽性であり、さらに、ＣＤ４陽性および／またはＣＤ２５陽性であり得る。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子は、低分子、タンパク質、核酸、脂質、糖、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。一局面では、上記タンパク質は、抗体もしくはその改変体、または細胞表面分子もしくはその改変体である。別の局面では、上記抗体の改変体は、抗原結合断片である。別の局面では、上記細胞表面分子の改変体は、融合タンパク質である。別の局面では、上記阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体もしくはこれらの抗原結合断片、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質からなる群より選択される。別の局面では、上記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである。いくつかの実施形態において、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６は、抗原提示細胞により発現され、ＣＤ２８は、Ｔ細胞により発現される。特定の実施形態において、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる阻害因子は、抗ＣＤ８０抗体および／または抗ＣＤ８６抗体あるいはＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質であり得る。本開示における使用が想定される阻害因子としては、上述されるようにＣＴＬＡ−４  Ｉｇ融合タンパク質が挙げられる。ＣＴＬＡ−４  Ｉｇ融合タンパク質は、抗原提示細胞上におけるＣＤ８０／ＣＤ８６への結合について、Ｔ細胞上の共刺激受容体であるＣＤ２８と競合し、その結果、Ｔ細胞の活性化を阻害するように機能する。本開示では、上記ＣＴＬＡ−４  Ｉｇ融合タンパク質として、アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標））、ベラタセプトまたはＭａｘｙ−４が想定される。ベラタセプトは、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する結合アビディティを顕著に増大させる２つのアミノ酸置換（Ｌ１０４ＥおよびＡ２９Ｙ）を含有する（Ｄａｖｉｅｓ  ＪＫら、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．（２０１２）；２１（９）：２０４７〜６１、Ａｄａｍｓ  ＡＢら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１６）１９７（６）：２０４５〜５０を参照のこと）。また、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質と同様の効果が期待される阻害因子として、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質（Ｐｅａｃｈ  ＲＪら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．（１９９４）１８０（６）：２０４９〜２０５８）も挙げられる。本開示の阻害因子は、核酸の形態でも使用され得る。一例を挙げると、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質をコードする核酸を、アデノウイルスベクターなどを介して細胞に導入し、発現させることも想定される。例えば、Ｊｉｎ  ＹＺら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．（２００３）；３５（８）：３１５６〜９を参照のこと。
【００４１】
いくつかの実施形態において、アナジー細胞は、抗体等の阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原、あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合するステップによって誘導された細胞であり得る。抗原の含有物は細胞であり得、該細胞の増殖および活性化を防止するために、放射線照射され得る。
【００４２】
特定の実施形態では、本開示の組成物を含む、被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための医薬組成物が提供され得る。被験体由来の抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態としては、例えば、移植免疫拒絶反応、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞およびそれらの細胞に由来する細胞、組織または臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応等の免疫寛容を必要とする疾患、障害または状態が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
いくつかの実施形態において、移植免疫拒絶反応は、腎臓、肝臓、心臓、皮膚、肺、すい臓、食道、胃、小腸、大腸、神経、血液、免疫系細胞を含む血球細胞、骨、軟骨、血管、角膜、眼球または骨髄が移植されることにより生じることを特徴とする。
【００４４】
本開示が対象とする疾患等が移植免疫拒絶反応である実施形態において、アナジー細胞は、抗体等の阻害因子と、レシピエント由来の細胞（ＰＢＭＣまたは脾臓細胞）と、ドナー由来の抗原またはドナー由来の抗原の含有物とを混合することによって誘導され得る。ドナー由来の抗原の含有物は、ＰＢＭＣ、脾臓細胞または移植される臓器由来の細胞などであり得る。
【００４５】
本開示が対象とする疾患等がアレルギーである実施形態において、アナジー細胞は、抗体等の阻害因子と、被験体由来の細胞（ＰＢＭＣまたは脾臓細胞）と、アレルギーを引き起こす被験体に由来しない抗原とを混合することによって誘導され得る。
【００４６】
本開示が対象とする疾患等が自己免疫疾患である実施形態において、アナジー細胞は、抗体等の阻害因子と、被験体由来の細胞（ＰＢＭＣまたは脾臓細胞）と、自己免疫疾患の原因となる被験体由来の抗原とを混合することによって誘導され得る。
【００４７】
本開示が対象とする疾患等が移植片対宿主病である実施形態において、アナジー細胞は、抗体等の阻害因子と、移植片を提供するドナーのＰＢＭＣまたは脾臓細胞と、レシピエント由来の抗原または該抗原の含有物とを混合することによって誘導され得る。レシピエント由来の抗原の含有物は、ＰＢＭＣ、脾臓細胞または臓器が移植される部位の周辺の細胞もしくはそれに由来する細胞などであり得る。
【００４８】
本開示が対象とする疾患等がｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞およびそれらの細胞に由来する細胞、組織または臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応である実施形態において、アナジー細胞は、抗体等の阻害因子と、被験体由来の細胞（ＰＢＭＣまたは脾臓細胞）と、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞から分化させた移植に用いる細胞とを混合することによって誘導され得る。
【００４９】
以下に本開示による疾患等の治療例を示すが、以下に限定されるものではない。
【００５０】
（アレルギーおよび自己免疫疾患）
アレルギーおよび自己免疫疾患に関しては、患者の末梢血から得たマクロファージを慣例的な方法により抗原提示能の高い樹状細胞（マクロファージ由来樹状細胞）へと分化させ、放射線（γ線）照射後のこの細胞にアレルギーや自己免疫疾患における過剰反応の原因となっている抗原を提示させ、同じ患者末梢血から得たＴ細胞群と、抗ＣＤ８０抗体および／または抗ＣＤ８６抗体あるいはＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質などの適切な阻害因子の存在下で１〜２週間共培養し、アレルギーや自己免疫疾患の原因となっている抗原に特異的なアナジー細胞を得る。このアナジー細胞を患者に投与することで、アレルギーや自己免疫疾患の原因となっている抗原に特異的な免疫寛容を誘導し、アレルギーおよび自己免疫疾患の予防および治療に用いる。予防的療法であるか治療であるか、さらに症状の強弱等の諸条件により、投与回数は複数回となることもある。
【００５１】
（移植片対宿主病）
移植片対宿主病においては、移植免疫拒絶反応に対する治療とは対照的に、移植片を提供するドナーのＰＢＭＣまたはＴ細胞等の移植片対宿主病の原因となりうる細胞を、放射線（γ線）照射した宿主由来のＰＢＭＣまたはそれ以外の細胞と抗ＣＤ８０抗体および／または抗ＣＤ８６抗体あるいはＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質などの適切な阻害因子の存在下で１〜２週間共培養し、宿主に特異的なアナジー細胞を得る。このアナジー細胞を宿主に投与することで、移植片対宿主病の原因となっている移植片による宿主への反応を抑制し（免疫寛容を誘導し）移植片対宿主病を予防および治療する。予防的療法であるか治療であるか、さらに移植する組織やその大きさ、症状の強弱等の諸条件により、投与回数は複数回となることもある。
【００５２】
（ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞およびそれらの細胞に由来する細胞、組織または臓器の移植によって引き起こされる免疫拒絶反応）
ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞を用いた治療への応用においては、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞から分化させた移植に用いる細胞または樹状細胞に放射線（γ線）を照射し、この細胞と移植を受ける患者のＰＢＭＣまたはＴ細胞群を抗ＣＤ８０抗体および／または抗ＣＤ８６抗体あるいはＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質などの適切な阻害因子の存在下で１〜２週間共培養し、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞から分化させた細胞に特異的なアナジー細胞を得る。このアナジー細胞を宿主に投与することで、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞に由来する移植した細胞、組織、および臓器に特異的な免疫寛容を誘導し、それらへの拒絶反応を予防および治療する。予防的療法であるか治療であるか、さらに移植する組織やその大きさ、症状の強弱の諸条件により、投与回数は複数回となることもある。
【００５３】
（医薬の製造方法）
本開示の別の局面において、本開示は、細胞を含む医薬を製造する方法であって、該方法は、（Ａ）ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体等の阻害因子と、被験体由来の細胞と、該被験体由来の抗原あるいは該被験体に由来しない抗原または該抗原の含有物とを混合する工程と、（Ｂ）該混合によって得られる細胞生成物が、ＣＤ８陽性細胞を含むことを確認する工程と、（Ｃ）該細胞生成物がＦＯＸＰ３陽性およびＣＤ４陽性の少なくとも1種の細胞を含むことを確認する工程と、を包含する、方法を提供する。本発明者らは、十分な免疫抑制能を発揮するためには、アナジーが誘導されたＴ細胞の混合物中にＣＤ８陽性細胞が含まれていることが重要であることを見出した。したがって、アナジーが誘導されたＴ細胞を含む医薬の製造において、ＣＤ８陽性細胞が含まれていることを担保することが重要である。このように製造された医薬は、被験体由来の抗原または被験体に由来しない抗原によって生じる被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するために使用され得る。ＣＤ８陽性細胞を生成するような阻害因子であれば、どのような阻害因子を用いてもよい。
【００５４】
いくつかの実施形態において、細胞生成物におけるＣＤ８陽性細胞の存在、およびＦＯＸＰ３陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の少なくとも１種の細胞の存在が、細胞生成物が医薬として使用され得ることを示す。
【００５５】
上記工程（Ｂ）において、ＣＤ８陽性細胞を含むことを確認するために、抗ＣＤ８抗体を使用して、ＣＤ８が検出され得る。上記工程（Ｃ）において、ＦＯＸＰ３陽性およびＣＤ４陽性の少なくとも1種の細胞を含むことを確認するために、抗ＦＯＸＰ３抗体および抗ＣＤ４抗体の少なくとも１種の抗体を使用して、ＦＯＸＰ３およびＣＤ４の少なくとも１種が検出され得る。検出するための具体的な手法としては、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、ウェスタンブロット、ＲＮＡの検出等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、検出するための具体的な手法は、ＦＡＣＳである。ＲＮＡの検出は、ＰＣＲ等の当該分野で公知の方法により行われる。ＦＯＸＰ３は、細胞内で発現されるものであるが、細胞を固定後に透過処理して細胞内を染色することが可能であり、同様にＦＡＣＳ等の手法により検出することが可能である。この方法で使用するために適切な市販の製品としては、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＴＭ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＃３（ｃａｔ＃８８−８９９５−４０）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＴＭ  Ｍｏｕｓｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＃１（ｃａｔ＃８８−８１１１−４０）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＴＭ  Ｈｕｍａｎ／Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＃１（ｃａｔ＃８８−４９９９−４０）、およびｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＴＭ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ｃａｔ＃８８−８９９６−４０）などが挙げられる。
【００５６】
（品質管理方法）
別の局面において、本開示は、細胞製剤（細胞含有医薬）の品質管理方法を提供する。より詳細には、本開示は、被験体由来の細胞に発現する抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための細胞を含む医薬の品質を管理する方法であって、該方法は、（Ａ）該細胞がＣＤ８陽性細胞を含むことを確認する工程、および（Ｂ）該細胞がＦＯＸＰ３陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の少なくとも１種の細胞を含むことを確認する工程を含む、方法を提供する。被験体由来の細胞に発現する抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための細胞を含む医薬において、一定の品質（十分な免疫寛容）を維持するために、そのような細胞を含む医薬中にＣＤ８陽性細胞が含まれているかどうかを管理することが重要な点の一つである。
【００５７】
上記工程（Ａ）において、ＣＤ８陽性細胞を含むことを確認するために、抗ＣＤ８抗体を使用して、ＣＤ８が検出され得る。上記工程（Ｂ）において、ＦＯＸＰ３陽性およびＣＤ４陽性の少なくとも1種の細胞を含むことを確認するために、抗ＦＯＸＰ３抗体および抗ＣＤ４抗体の少なくとも１種の抗体を使用して、ＦＯＸＰ３およびＣＤ４の少なくとも１種が検出され得る。検出するための具体的な手段としては、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロットおよびＰＣＲ等が挙げられるが、これらに限定されない。ＦＯＸＰ３は、細胞内で発現されるものであるが、細胞を固定後に透過処理して細胞内を染色することが可能であり、同様にＦＡＣＳ等の手法により検出することが可能である。
【００５８】
以下に、典型的な本開示の細胞製剤の製造および品質管理の方法の一例を示す。
【００５９】
（アナジーＴ細胞を含む細胞製剤の製造および品質管理）
１．生物由来原料およびその対応状況
一つの実施形態では、アナジーＴ細胞の製造工程において、表１に記載の生物由来原料基準に適合した生物由来原料を使用する。
【００６０】
アナジーＴ細胞の投与は、レシピエントに対しドナーからの臓器移植（例えば、肝臓移植）が実施された後に行われる。ドナー臓器（例えば、肝臓）の中には、自己由来アナジーＴ細胞の材料であるドナー由来単核球もウイルス除去されない状態で含まれており、ドナー由来単核球を含んだままドナー臓器（例えば、肝臓）はレシピエントに移植される。そのため、自己由来アナジーＴ細胞の材料として使用するドナー由来単核球は、生物由来原料に該当しないと考える。
【００６１】
【表１】
2019245038.tif 000003
ベラタセプト（例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹから入手可能）
２．細胞製剤の製法
一つの実施形態では、細胞製剤は以下のように製造することができる。以下に例示する各種数値等は、代表例であり、当業者は適宜変更して細胞製剤の製造を行うことができる。
１）  投与１９日前頃に、医療機関においてドナーにアフェレーシスを実施し、ドナーアフェレーシス産物を３０Ｇｙの放射線を照射し、細胞増殖能を無くした後に、細胞加工を実施する細胞培養加工施設へ発送する。
２）  ドナーアフェレーシス産物受領後、細胞培養加工施設において、ドナー単核球を密度勾配遠心法により分離、回収後、２つに分けて凍結し、−８０±１０℃で保管する。
３）  投与１４日前頃に、医療機関においてレシピエントにアフェレーシスを実施し、レシピエントアフェレーシス産物を、細胞加工を実施する細胞培養加工施設へ発送する。
４）  レシピエントアフェレーシス産物受領後、細胞培養加工施設において、レシピエント単核球を密度勾配遠心法により分離、回収し、解凍したドナー単核球ならびに抗ＣＤ８０抗体および抗ＣＤ８６抗体またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質などの阻害因子と共培養する。
５）  投与７日前頃に培地交換を行う。７日間培養した中間製品を回収し、解凍したドナー単核球ならびに抗ＣＤ８０抗体および抗ＣＤ８６抗体またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質などの阻害因子と共培養する。
６）  投与当日に細胞加工物を密度勾配遠心法により回収後に、洗浄し、生理食塩液に充填する。
７）  医療機関に発送し、医療機関でレシピエントに投与する。
【００６２】
（製造および品質試験フローの代表例）
【００６３】
【化１】
2019245038.tif 000004
３．工程内管理試験
一つの実施形態では、製造工程内において、表２に記載した工程内管理試験を実施することができる。以下に例示する各種数値等や手順は、代表例であり、当業者は適宜変更して工程内管理試験を実施することができる。
【００６４】
【表２】
2019245038.tif 000005
４．規格試験、特性解析試験
一つの実施形態では、最終製品を用いて表３に記載した規格試験を行うことができる。表３に例示する手順は、代表例であり、当業者は適宜変更して規格試験、特性解析試験を実施することができる。例えば、その改変例としては、実施例８に例示した規格を挙げることができる。誘導性抑制性Ｔ細胞投与時には結果が判明しない場合、工程内管理試験の結果を参考に、治験製品の出荷を判断することができる。
【００６５】
また、製造工程内の細胞、最終製品を用いて表３に記載した特性解析試験を行うことができる。
【００６６】
【表３】
2019245038.tif 000006
上記治験製品規格試験、特性解析試験は、本明細書に記載されるとおりであり、治験製品規格試験は、外観、細胞数、生細胞率、細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ/ＣＤ４５ＲＯ）、製造工程由来不純物（ドナー由来細胞、培地成分、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、細胞凍害保護液成分、比重分離液成分）、ウイルス否定試験、無菌試験、マイコプラズマ否定試験、およびエンドトキシンを含み得る。効能試験として、培養細胞を用いたリンパ球混合試験（ＭＬＲ）によるサイトカイン産生もしくはトリチウム取り込み試験を含み得る。細胞表現型の基準値については、例えば、ＣＤ３陽性細胞比率は、代表的には表中の５０％以上を基準値とすることができ、あるいは例えば、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上あるいは、これらの間の数値（１％、０．５％刻み等で設定し得る）であってもよい。ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ８陽性ＣＤ４４陽性細胞比率は、代表的には表中の１０％以上を基準値とすることができ、あるいは例えば、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１１％以上、１２％以上、１３％以上、１４％以上、１５％以上などであってもよい。ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ４４陽性細胞比率は、設定しなくてもよく、あるいは例えば、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１１％以上、１２％以上、１３％以上、１４％以上、１５％以上などを基準値として設定してもよい。ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性細胞比率は、設定しなくてもよく、あるいは例えば、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１１％以上、１２％以上、１３％以上、１４％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上などを基準値として設定してもよい。ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性細胞比率は、設定しなくてもよく、あるいは例えば、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１１％以上、１２％以上、１３％以上、１４％以上、１５％以上などを基準値として設定してもよい。ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性細胞比率は、設定しなくてもよく、あるいは例えば、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１１％以上、１２％以上、１３％以上、１４％以上、１５％以上などを基準値として設定してもよい。ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ２５細胞比率は、代表的には表中の５％以上を基準値とすることができ、あるいは例えば、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１１％以上、１２％以上、１３％以上、１４％以上、１５％以上などであってもよい。細胞数は、１×１０９個以上を代表的に基準として採用し得るが、あるいは、例えば、１×１０８個以上、５×１０８個以上、１×１０９個以上、２×１０９個以上、３×１０９個以上などであってもよい。生細胞率は、７０％以上を代表的に基準として採用し得るが、あるいは、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上などを基準として採用することもできる。
【００６７】
（最終製品の組成）
最終製品は、一例をあげると、下記表に記載の構成物で構成される。これらの規格もまた、当業者は適宜変更して組成を変更して再生医療等製品を構成することができる。
【００６８】
【表３−１】
2019245038.tif 000007
当業者は、規格試験、特性解析試験について、本明細書に記載される技術的事項を適宜参酌して必要に応じて変更を行って具体的に実施することができる。
【００６９】
５．再生医療等製品の投与方法
一つの実施形態において、臓器移植後１４日後に一回投与する。当業者は、投与方法やその期間等について、本明細書に記載される技術的事項を適宜参酌して必要に応じて変更を行って具体的に実施することができる。
【００７０】
（キット）
別の局面において、本開示は、細胞製剤を製造するためのキットを提供する。さらに別の局面において、本開示は細胞製剤の品質管理のためのキットを提供する。詳細には、本開示は、細胞の混合物を含む医薬を製造するためのキットであって、該キットは、（Ａ）ＣＤ８０および／またはＣＤ８６と、ＣＤ２８との相互作用を阻害することができる抗体等の阻害因子と、（Ｂ）ＣＤ８を検出するための手段と、（Ｃ）ＦＯＸＰ３およびＣＤ４の少なくとも１つを検出するための手段とを含む、キットを提供する。
【００７１】
いくつかの実施形態において、細胞の混合物におけるＣＤ８陽性細胞の存在、およびＦＯＸＰ３陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の少なくとも１種の細胞の存在が、細胞の混合物が医薬として使用され得ることを示す。
【００７２】
本開示のキットで製造された細胞の混合物を含む医薬は、アナジーが誘導されたＣＤ８陽性Ｔ細胞と、ＦＯＸＰ３陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の少なくとも１種の細胞を含んでおり、被験体由来の抗原または被験体に由来しない抗原によって生じる被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するために使用され得る。
【００７３】
別の局面において、被験体由来の細胞に発現する抗原または該被験体に由来しない抗原によって生じる該被験体における疾患、障害または状態を処置または予防するための細胞を含む医薬の品質を管理するためのキットであって、該キットは、（Ａ）ＣＤ８を検出するための手段と、（Ｂ）ＦＯＸＰ３およびＣＤ４の少なくとも１種を検出するための手段とを含む、キットを提供する。いくつかの実施形態において、ＣＤ８を検出するための手段が、抗ＣＤ８抗体を含み、ＦＯＸＰ３およびＣＤ４の少なくとも１種を検出するための手段が、抗ＦＯＸＰ３抗体および抗ＣＤ４抗体の少なくとも１種の抗体を含む。検出は、例えば、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロット、ＰＣＲ等により行われ得る。
【００７４】
（自己由来制御性Ｔ細胞製造手順）
以下に、自己由来制御性Ｔ細胞の典型的な製造方法を説明する。
【００７５】
事前の確認
一つの実施形態では、事前の確認は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬、手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更して事前の確認の製造を行うことができる。
【００７６】
ドナー及び患者の感染症スクリーニング検査を実施し、ドナーについてはＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗体、ＨＩＶ−１／２、ＨＴＬＶ−１抗体が全て陰性であることを確認する。
【００７７】
１．ドナーリンパ球の分離（無菌下で行う）代表例
一つの実施形態では、ドナーリンパ球の分離は以下のように製造することができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更してドナーリンパ球の分離を行うことができる。
・アフェレーシスでドナーリンパ球を回収バッグに採取し、その回収バッグを放射線照射する。
・前述の放射線照射済み末梢血単核球を、適量のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  PREMIUM(GE  Healthcare  #17-5442-02)またはLymphocyte  separation  Solution(ナカライテスク#20828)等（例えば、２０ｍＬ）が入った遠心管に入れ、８６０Ｇで２０分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをslow、ブレーキをslowに設定する）する。
・上清を捨て、リンパ球層を含む細胞浮遊液を、別の遠心管（例えば、５０ｍＬ遠心管２本）に移す。
・細胞浮遊液の入った遠心管に、生理食塩液を追加し（例えば、全液量が５０ｍＬになるまで適量）、シリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた５０ｍＬシリンジ）またはピペットで吸引排出を繰り返して、よく混和させる。
・５００Ｇで１０分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをfastに設定してもよい）する。
・上清を捨て、再度生理食塩液を追加し（例えば、全液量が５０ｍＬになるまで適量）、細胞ペレットを、ピペットで吸引排出を繰り返して、よく混和させる。
・５００Ｇで５分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをfastに設定してもよい）する。
・上清を捨てる。
・予めドナーより採取した血漿を含むＡＬｙＳ５０５Ｎ-0培養液(細胞科学研究所  （CSTI）1020Ｐ10))を、細胞ペレットに加え（例えば、全液量が３１ｍＬになるまで適量）、ピペットで吸引排出を繰り返して、よく混和させる。
・シリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた１ｍＬシリンジ）またはピペットで、適量（例えば、０．３ｍＬ）抜き取り、細胞数および生細胞数を確認する。
【００７８】
２．ドナーリンパ球の凍結保存（無菌下で行う）
一つの実施形態では、ドナーリンパ球の凍結保存は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更してドナーリンパ球の凍結保存を行うことができる。
・凍結バッグ（例えば、フローズバッグF-050  ２５ｍＬ凍結バッグ(株)ニプロ89-101）
を無菌下で開封し、ラベルに必要事項（日付、製造番号、ドナー名）を記入する。
・シリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた３０ｍＬシリンジ）で、細胞浮遊液を取り、凍結バッグに入れる。
・ＡＣＤ液（(株)テルモTP-A05ACD、例えば、細胞浮遊液１５ｍＬに対して２ｍＬ）を、細胞浮遊液が入った凍結バッグに加え、４℃で冷却した保冷剤に挟んで、１０分間程度冷やす。
・シリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた２０ｍＬシリンジ）を用いて、４℃で冷却したＣＰ−１（極東製薬工業(株)  551-27202-4細胞凍害保護液CP-1）例えば、８．５ｍＬ）を、凍結バッグに１分半程度の時間をかけて加える。この際、凍結バッグをゆっくり攪拌する。
・シリンジを用いて、凍結バッグおよびそのポート内の空気を全て抜き取る。
・チューブシーラーを使用して凍結バッグをシールし、まず４℃で約５〜１０分冷却し、その後−８０℃の冷凍庫で保管する。
【００７９】
３．ドナーリンパ球の解凍（無菌下で行う）
一つの実施形態では、ドナーリンパ球の解凍は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更してドナーリンパ球の解凍を行うことができる。
・保存されたドナー細胞の凍結バッグを、例えば、３７℃恒温槽で解凍する。以降の操作は、好ましくは無菌下で行う。
・シリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた５０ｍＬシリンジ）を用いて、解凍された凍結バッグから細胞浮遊液を抜き取り、遠心管（例えば、５０ｍＬ遠心管２本に１２．５ｍＬずつ）に移す。
・細胞浮遊液の入った遠心管に、例えば５％アルブミン液(日本製薬(株)  123146364  献血アルブミン5％静注12.5g/250mL)（例えば、細胞浮遊液１２．５ｍＬに対して３７．５ｍＬ）を追加し、よく混和させる。その後、約５分間静置する。
・例えば、６００Ｇで１０分間、２２℃で遠心分離（例えば、好ましくは、遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをslowに設定する）する。
・上清を静かに捨て、細胞ペレットに、洗浄用のアルブミン加生理食塩液（例えば、５％アルブミン液２５ｍＬと生理食塩液１９ｍＬから作製する）等の適宜の液を加えて懸濁する。
・例えば、６００Ｇで１０分間、２２℃で遠心分離（例えば、好ましくは、遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをslowに設定する）する。
・上清を静かに捨て、細胞ペレットに、ＡＬｙＳ５０５Ｎ培養液（例えば、５０ｍＬ遠心管に対して１０ｍＬ）を加えて懸濁する。
・ＡＬｙＳ５０５Ｎ-0培養液またはそれと同等の液が入った培養バッグ（例えば、(株)ニプロ87598  ニプロメディウムALyS505NB10）に、抗ヒトＣＤ８０抗体（例えば、ｍ２Ｄ１０．４；Ｃａｔ．Ｎｏ．１６−０８０９−８５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）と抗ヒトＣＤ８６抗体（例えば、ＩＴ２．２；Ｃａｔ．Ｎｏ．１６−０８６９−８５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）をそれぞれ例えば最終濃度１０μｇ／ｍＬで加え（またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（例えば、ベラタセプト）等の同等の阻害因子を加え）、この培養バッグに、上記の細胞浮遊液をシリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた２０ｍＬシリンジ）で注入して加える。一例では、培養バッグ中の総液量は、約８４０ｍＬである。
【００８０】
４．患者リンパ球の分離〜一次培養開始（無菌下で行う）
一つの実施形態では、患者リンパ球の分離は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更して患者リンパ球の分離を行うことができる。
・患者より採取した血漿は、恒温槽中、例えば、５６℃で３０分間加温し、非働化しておく。直ちに使用しないものは、凍結保存する。
・患者より採取した末梢血を、適量の適切な媒体、例えばＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（例えば、２０ｍＬ）が入った遠心管に入れ、例えば、８６０Ｇで２０分間、２２℃で遠心分離（例えば、好ましくは、遠心分離機のアクセルをslow、ブレーキをslowに設定する）する。
・上清を捨て、リンパ球層を含む細胞浮遊液を、別の遠心管（例えば、５０ｍＬ遠心管２本）に移す。
・細胞浮遊液の入った遠心管に、生理食塩液を追加し（例えば、全液量が５０ｍＬになるまで適量）、ピペットで吸引排出を繰り返して、よく混和させる。
・例えば、５００Ｇで１０分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをfastに設定してもよい）する。
・上清を捨て、再度生理食塩液を追加し（例えば、全液量が５０ｍＬになるまで適量）、細胞ペレットを、ピペットで吸引排出を繰り返して、よく混和させる。
・例えば、５００Ｇで５分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをfastに設定してもよい）する。
・上清を捨て、細胞ペレットに、例えば、ＡＬｙＳ５０５Ｎ-0培養液（例えば、１０ｍＬ）を加えて懸濁し、細胞浮遊液を作製する（例えば、合計２０ｍＬになるまでＡＬｙＳ５０５Ｎ-0培養液を追加する）。ここで、０．５ｍＬ程度の細胞浮遊液を抜き取り、細胞数、生細胞数および表面抗原の発現を確認する。
・「３．ドナーリンパ球の解凍」で作製したＡＬｙＳ５０５Ｎ-0培養液中ドナー細胞および抗体等の阻害因子が入った培養バッグに患者由来の非働化血漿を追加する。
・この培養バッグに、上記患者由来細胞浮遊液をシリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた２０ｍＬシリンジ）で注入して加え、チューブシーラーを使用して培養バッグをシールする。一例では、培養バッグ中の総液量は、約1000mＬである。
・３７℃インキュベーター内で、例えば、１週間培養する。
【００８１】
５−１．培地交換（例えば、１週間目、好ましくは無菌下で行う）
一つの実施形態では、培地交換は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更して培地交換を行うことができる。
・インキュベーターから培養バッグを取り出し、内容物を、遠心管（例えば、２２５ｍＬ遠心管４本）に分注する。
・例えば、６００Ｇで１０分間、２２℃で遠心分離（例えば、好ましくは、遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをfastに設定してもよい）する。
・上清を静かに捨て、細胞ペレットに、例えば、ＡＬｙＳ５０５Ｎ-0培養液を加えて懸濁し、細胞浮遊液を作製する（例えば、合計２０ｍＬになるまでＡＬｙＳ５０５Ｎ-0培養液を追加する）。ここで、０．３ｍＬ程度の細胞浮遊液を抜き取り、細胞数および生細胞数を確認する。
・例えば、ＡＬｙＳ５０５Ｎ-0培養液が入った培養バッグに、細胞浮遊液をシリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた２０ｍＬシリンジ）で注入して加える。
・抗ヒトＣＤ８０抗体（例えば、２Ｄ１０．４）希釈液と抗ヒトＣＤ８６抗体（例えば、ＩＴ２．２）希釈液を、それぞれ例えば、最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように（またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（例えば、ベラタセプト）等の阻害因子を用いてもよい。）、培養バッグにシリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた２０ｍＬシリンジ）で注入して加える。
【００８２】
５−２．ドナーリンパ球の解凍・抗原再刺激〜二次培養開始（例えば、１週間目、無菌下で行う）
一つの実施形態では、ドナーリンパ球の解凍・抗原再刺激〜二次培養開始は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更してドナーリンパ球の解凍・抗原再刺激〜二次培養開始を行うことができる。
・保存されたドナー細胞の凍結バッグと患者由来の非働化血漿を、例えば、３７℃恒温槽で解凍する。以降の操作は、好ましくは、無菌下で行う。
・シリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた５０ｍＬシリンジ）を用いて、解凍された凍結バッグからドナー細胞浮遊液を抜き取り、遠心管（例えば、５０ｍＬ遠心管２本）に移す。
・ドナー細胞浮遊液の入った遠心管に、５％アルブミン液（例えば、５０ｍＬ遠心管２本につき、合計で約５０ｍＬ）を追加し、よく混和させる。その後、約５分間静置する。
・例えば、６００Ｇで１０分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをslowに設定する）する。
・上清を静かに捨て、細胞ペレットに、洗浄用のアルブミン加生理食塩液（例えば、５％アルブミン液２５ｍＬと生理食塩液１９ｍＬから作製する）を加えて懸濁する。
・例えば、６００Ｇで１０分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをfast、ブレーキをslowに設定する）する。
・上清を静かに捨て、細胞ペレットに、例えば、ＡＬｙＳ５０５Ｎ-0培養液（例えば、５０ｍＬ遠心管に対して１０ｍＬ）を加えて懸濁する。
・「３．ドナーリンパ球の解凍」で作製したＡＬｙＳ５０５Ｎ培養液中患者細胞および抗体等の阻害因子が入った培養バッグに、解凍した患者由来の非働化血漿（例えば、１０ｍＬ）をシリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた２０ｍＬシリンジ）で注入して加え、さらに、この培養バッグに、上記の細胞浮遊液をシリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた２０ｍＬシリンジ）で注入して加える。一例では、培養バッグ中の総液量は、約1000ｍＬである。
・チューブシーラーを使用して培養バッグをシールする。
・３７℃インキュベーター内で、例えば、１週間培養する。
【００８３】
６．二次培養中の検査（培養細胞抜き取り試験）
一つの実施形態では、二次培養中の検査は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更して二次培養中の検査を行うことができる。
・代表的に、二次培養開始から３日目（培養通算１０日目）に少量の培養液を、培養バッグから抜き取り、マイコプラズマ汚染などについて検査する。
【００８４】
７．培養リンパ球の回収・充填（無菌下で行う）
一つの実施形態では、培養リンパ球の回収・充填は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更して培養リンパ球の回収・充填を行うことができる。
・例えば、二次培養開始から７日目（培養通算１４日目）インキュベーターから培養バッグを取り出し、内容物を、遠心管（例えば、２２５ｍＬ遠心管４本）に分注する。
・例えば、６００Ｇで１０分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをｆａｓｔ、ブレーキをｆａｓｔに設定してもよい）する。
・上清を静かに捨て、細胞ペレットに、生理食塩液を加えて懸濁する。
・例えば、６００Ｇで１０分間、２２℃で遠心分離（例えば、好ましくは、遠心分離機のアクセルをｆａｓｔ、ブレーキをｆａｓｔに設定してもよい）する。
・上清を静かに捨て、細胞ペレットに、生理食塩液（例えば、１０ｍＬ）を加えて懸濁し、細胞浮遊液を作製する。
・細胞浮遊液を、適量のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（例えば、２０ｍＬ）が入った遠心管（例えば、５０ｍＬ遠心管）に静かに入れて重層させる。
・例えば、８６０Ｇで２０分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをｓｌｏｗ、ブレーキをｓｌｏｗに設定する）する。
・上清を捨て、リンパ球層を含む細胞浮遊液を、別の遠心管（例えば、５０ｍＬ遠心管）に移す。
・細胞浮遊液の入った遠心管に、生理食塩液を追加し（例えば、全液量が５０ｍＬになるまで適量）、シリンジ（例えば、１８Ｇ注射針をつけた５０ｍＬシリンジ）で吸引排出を繰り返して、よく混和させる。
・例えば、５００Ｇで１０分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをｆａｓｔ、ブレーキをｆａｓｔに設定してもよい）する。
・上清を５ｍＬ程度残して他は捨て、ピペットで吸引排出を繰り返して、よく混和させる。
・生理食塩液を追加し（例えば、全液量が５０ｍＬになるまで適量）、シリンジ（例えば、例えば、１８Ｇ注射針をつけた５０ｍＬシリンジ）で吸引排出を繰り返して、よく混和させる（ａ）。
・例えば、５００Ｇで５分間、２２℃で遠心分離（遠心分離機のアクセルをｆａｓｔ、ブレーキをｆａｓｔに設定してもよい）する（ｂ）。
・上清を５ｍＬ程度残して他は捨て、ピペットで吸引排出を繰り返して、よく混和させる（ｃ）。
・上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）をさらに２回繰り返す。
・最後の遠心分離後の上清を、適量（例えば、４ｍＬ）を抜き取り、無菌検査およびマイコプラズマ検査に供する。
・再度生理食塩液を加えて懸濁し、細胞浮遊液を、最終的な容器（例えば、１００ｍＬ生理食塩液のボトル）に移す。適量（例えば、４ｍＬ）を抜き取り、最終的な生成物の、細胞数、生細胞数、表面抗原の発現およびエンドトキシンの含有量を確認する。
【００８５】
８．二次包装
一つの実施形態では、二次包装は以下のように行うことができる。以下に例示する各種数値、試薬や手順等は、代表例であり、当業者は適宜変更して二次包装を行うことができる。
・代表的には、適切な基準（代表的には、ＮＵＨＣＰＣ−Ｍ−１２−ＡＴＲＥＧ）に基づいてラベルに被験者ＩＤ、製造番号、使用期限を入力して印刷し、容器にラベルを貼付する。
・適切な基準（代表的には、ＮＵＨＣＰＣ−ＰＭＦ−ＡＴＲＥＧ１４）に基づいて「用法・用量・効能または効果ならびに使用上の注意または取扱い上の注意」を発行する。
・チャック付ビニール袋に試験物および「用法・用量・効能または効果ならびに使用上の注意または取扱い上の注意」を収納する。
・出荷するまで移送容器に入れてモニタリングユニット内に保管する。
【００８６】
（注記）
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。
【００８７】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００８８】
以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００８９】
以下、実施例に基づいて本開示をより具体的に説明する。ただし、本開示はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本明細書全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。【００９０】
（実施例１：機能喪失アッセイ）
本実施例では、免疫寛容を惹起するために必要な成分の特定を行うため、機能喪失アッセイを行った。以下に説明する。【００９１】
（材料および方法）
（アナジー細胞の生成）
既に文献に記載された方法に従い実験を行った（1-3）。要約すると、C57BL6(以下B6)
マウスおよびBALB/cマウス(日本クレア、日本チャールス・リバー、等)から脾臓を摘出し、赤血球を溶血し脾臓細胞（リンパ球）を得た後、4×106細胞/mlとなるように10%非働化ウシ胎児血清(FCS)(SIGMA  #  172012-500ML  Lot  11D257またはbiosera  #FB-1380/500  Lot.015BS482)を含むRPMI1640培地(Sigma;R8758-500MK)にて調整した。スティミュレイターとなるBALB/c脾臓細胞に放射線(γ線)３０Ｇｙを照射したのち、B6脾臓細胞と１：１で混合し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製ハムスター抗マウスＣＤ８０抗体（16-10Ａ１）（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６−０８０１−８２）とラット抗マウスＣＤ８６抗体（GL1）（Ｃａｔ．Ｎｏ．１４−０８６2−８２）を各最終濃度が１０μｇ／ｍＬになる様に添加し、12ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、#3513）（1〜2.5mＬ）、6ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ．Ｎｏ．3516)(3〜6mＬ)、6ｃｍシャーレ(Greiner  CELLSTAR（登録商標）dish，Ｃａｔ．Ｎｏ．628160)(3〜6mＬ)または１０ｃmシャーレ(Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ．Ｎｏ．430167)(10〜15mＬ)にて３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で14日間培養した。培養開始から7日目に遠心により培養液を除いた後に、新たにBALB/c由来の放射線照射脾臓細胞と抗CD80抗体/抗CD86抗体とを含む培養液を培養開始時と同じ条件で添加した。14日後に細胞を回収しアナジー細胞を得た。【００９２】
一部の実験では、PE蛍光標識抗マウスCD8抗体(53-6.7;ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、#12-0081-85)をアナジー細胞に反応させた後、抗ＰＥ磁気ビーズ(ミルテニーバイオテク#1300-10-639)を用いたauto-MACS(ミルテニーバイオテク)により、細胞をCD8陽性とCD8陰性とに選別した。またPE蛍光標識CD19抗体(1D3;ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、#12-0193-85)を用いて同様の操作を行い、細胞をCD１９陽性とCD１９陰性とに選別した。これらの細胞を免疫反応抑制能試験に使用した。さらに、一部の実験では、ＦＯＸＰ３発現制御性T細胞（regT細胞）を細胞表面抗原の発現で識別できるよう、レスポンダー細胞がFoxP3とヒトCD2とを同時に発現する様に遺伝子改変を行ったB6由来マウス(4)を使用し、PE蛍光標識抗ヒトCD２抗体(RPA-2.10;ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、  #12-0029-42)と抗ＰＥ磁気ビーズを用いたauto-MACSにより、ヒトCD2陽性細胞（FoxP3発現regT細胞）とヒトCD2陰性細胞とに選別し、免疫反応抑制能試験に使用した。【００９３】
（免疫反応抑制能の評価）
既に文献に記載された方法に従い実験を行った（3）。要約すると、アナジー細胞をレスポンダーB6脾臓細胞との比率が1/2から1/16になるように調整した後に、９６ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．3799)上での新たに採取したB6マウスおよびBALB/cマウスの脾臓細胞を用いた1×106細胞/mＬでの１：１混合培養物(最終的に２００μＬ／ウェルで４ウェルずつ)に添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した(１ウェルあたりに、B6マウスおよびBALB/cマウスの脾臓細胞は、それぞれ1×１０５細胞、アナジー細胞は、1×１０５細胞の1/2〜1/16の細胞数)。培養開始４日目に３Ｈ−チミジン（１０μＬ）を添加し、培養開始５日目（３Ｈ−チミジン添加の１６〜２０時間後）にＣｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により培養細胞を回収し、シンチレーションカウンターにより３Ｈ−チミジン取込み量を測定した。ナイーブなB6リンパ球細胞の無刺激での３Ｈ−チミジン取込み量を１としてグラフを作成し、比較検討した。【００９４】
（結果）
結果を図１に示す。値は、無刺激状態(ナイーブ)の３Ｈ−チミジン取込み量の平均値を１として算出した値を示す。図１aに示すように、何の選別も行わなかった全B6脾臓培養細胞は、抗ＣＤ８０／８６抗体存在下でスティミュレイターBALB/c脾臓細胞と共に培養した（以後、「抗体・スティミュレイター処理」という）後、新鮮な（ナイーブ）B6脾臓細胞のBALB/c脾臓細胞への反応を抑制する効果があることが確認された。このアナジーが誘導された全培養細胞（細胞混合物）は、アナジーＣＤ８陽性細胞、アナジーＣＤ４陽性細胞、制御性T細胞（ｒｅｇＴ細胞）に加え他の細胞（ＣＤ１９陽性Ｂ細胞）も含むことが予想される。【００９５】
この抗体・スティミュレイター処理後の細胞混合物から、ＣＤ８陽性細胞（殆どがＣＤ４４陽性のアナジーＣＤ８陽性細胞）を純化した試料を用いて実験したところ、アナジーＣＤ８陽性細胞のみの細胞集団でも抑制効果が有ることが分かり（黒色）、アナジーＣＤ８陽性細胞を除いた残りの細胞集団には抑制効果が無い（灰色）ことが示された(図1b)。【００９６】
さらに、図１ｃに示すように、抗体・スティミュレイター処理後の細胞混合物から、ヒトＣＤ２陽性細胞＝ｒｅｇＴ細胞を純化したところ、ｒｅｇＴ細胞のみの細胞集団でも抑制効果が有り（黒色）、またｒｅｇＴ細胞を除いた残りの細胞集団にも同様の抑制効果が有る（灰色）ことが示された。【００９７】
一方で、図１dに示すように、抗体・スティミュレイター処理後の細胞混合物から、ＣＤ１９陽性細胞（Ｂ細胞）を純化した場合、Ｂ細胞のみの細胞集団では抑制効果が無いが（黒色）、Ｂ細胞を除いた残りの細胞集団には抑制効果が有る（灰色）ことが示された。【００９８】
このように、ＣＤ８陽性細胞を欠落させると、免疫反応の抑制＝免疫寛容の誘導が著しく低下し、CD8陽性細胞単独でも強い免疫寛容誘導が示されたことから、ＣＤ８陽性細胞は、有効な免疫寛容の誘導には必須の細胞であることが理解される。したがって、免疫寛容誘導細胞製品を製造する際には、ＣＤ８陽性細胞の有無の確認は品質管理上重要であることが理解される。【００９９】
純化したＦＯＸＰ３陽性細胞集団でも、ＦＯＸＰ３陽性細胞を欠落させた細胞集団でも、同様の抑制作用が観察され、これはCD8陽性細胞が免疫寛容を誘導する能力を有することと矛盾しない。また制御性T細胞として広く知られるＦＯＸＰ３陽性細胞に免疫抑制能を有することとも合致する。従って、抗体・スティミュレイター処理後の全アナジー細胞中で、免疫寛容を誘導するに有効な細胞は、アナジーＣＤ８陽性細胞とともにＦＯＸＰ３陽性細胞であり、この混合物が最も有効に免疫寛容を誘導すると考えられる。【０１００】
ＣＤ１９について選別した実験から、ＣＤ１９陽性細胞（Ｂ細胞）には抑制効果がないことが分かり、ＣＤ１９陽性細胞は不要であることが理解される。【０１０１】
（実施例２：ＣＤ８０／８６ブロッキングによる抑制機能獲得アッセイ）
本実施例では、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の免疫寛容誘導能力（免疫拒絶抑制能力）が、抗体・スティミュレイター処理によるアナジー誘導によるものであることを確認するとともに、同様の実験をＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞においても行った。【０１０２】
（材料および方法）
実施例１と同様の手法で、野生型B6マウスおよびFoxP3とヒトCD2とを同時に発現する様に遺伝子改変を行ったB6由来マウスからそれぞれ得た脾臓細胞に対し、抗体・スティミュレイター処理を行い、アナジー細胞を得た。このアナジー細胞とともに、野生型B6マウスおよびFoxP3とヒトCD2とを同時に発現する様に遺伝子改変を行ったB6由来マウスから得た無刺激のナイーブ脾臓細胞を、それぞれPE蛍光標識抗マウスCD8抗体またはPE蛍光標識抗ヒトCD２抗体と反応させた。その後、抗ＰＥ磁気ビーズを用いたauto-MACSにより、細胞を、CD8陽性とCD8陰性とに、またはヒトCD２陽性とヒトCD２陰性とに選別した。選別した各細胞を、９６ウェルプレート上の混合培養系に添加し、その免疫抑制能を調べた。【０１０３】
（結果）
結果は図２に示す。【０１０４】
図２a(値は、無刺激状態(ナイーブ)の３Ｈ−チミジン取込み量の平均値を１として算出した値を示す。)に示すように、アナジーＣＤ８陽性細胞には抑制効果が有ること（黒色）、および無刺激のナイーブ脾臓細胞から単離したＣＤ８陽性細胞には抑制効果がないこと（灰色）が示された。さらに図２ｂに示すように、抗体・スティミュレイター処理後のｒｅｇＴ細胞（黒色）も免疫抑制能を発揮し、その抑制能は、無刺激のナイーブなｒｅｇＴ細胞（灰色）に比べて強いことが示された。【０１０５】
これらのことから、ＣＤ８陽性細胞が免疫寛容を惹起する（免疫反応の抑制）には、抗ＣＤ８０／８６抗体存在下でのスティミュレイターBALB/c脾臓細胞を用いた刺激によるアナジー誘導が必要であり、同様のことは、regT細胞がより強力な免疫抑制機能を発揮する際にも当てはまることが分かった。すなわち、抗体・スティミュレイター処理により誘導されるアナジーＣＤ８陽性細胞とｒｅｇＴ細胞とには強力な免疫寛容誘導能があることが示された。【０１０６】
（実施例３：純化アナジー細胞の移植後の寛容誘導能力）
本実施例では、アナジー誘導後の純化細胞が移植後に寛容誘導能力を有するかどうかを確認した。【０１０７】
（材料および方法）
実施例１と同様の手法で、野生型B6マウスおよびFoxP3とヒトCD2とを同時に発現する様に遺伝子改変を行ったB6由来マウスの脾臓細胞から、抗ＣＤ８０／８６抗体存在下でのスティミュレイターBALB/c脾臓細胞との共培養でアナジー細胞を得た。さらに一部の実験では、得られたアナジー細胞（全アナジー細胞）から、実施例１と同様の手法でCD8陽性細胞、CD4陽性細胞またはヒトCD２陽性細胞を選別した。野生型B6マウスに２Ｇｙの放射線(γ線)を照射した3日後にBALB/cマウスの心臓を移植し、直後（または心臓移植と同日のうち）にナイーブB6脾臓細胞または得られたアナジー細胞を尾静脈から投与し、心臓の拒絶を観察した。各群5匹以上で実験を行った。【０１０８】
（結果）
図３にその結果を示す。図３aに示す様に、アナジー細胞を移植しない場合、移植した心臓は約2週間までに全例が拒絶される。それに対して、全アナジー細胞投与群では、投与した細胞数に依存して心臓の生着率が改善され、6×106個の全アナジー細胞の移入では、移植した心臓への寛容が誘導されたと判定される100日以降でも全てのマウスで移植した心臓が生着していた。図３bに示す様に、この寛容誘導は、レシピエントマウスに放射線照射した後にアナジー細胞を移入した場合にのみ観察され、放射線照射無しにアナジー細胞を投与した場合や、放射線照射マウスにナイーブ細胞を移入した場合には全く観察されなかった。アナジー細胞からヒトCD2陽性細胞（FoxP3発現regT細胞）、またはアナジーCD8陽性細胞を除去した細胞集団を放射線照射マウスに投与した場合は、全アナジー細胞移入のような100日後での移植した心臓の100％の生着は見られず、明らかに寛容誘導能が低下しており、全アナジー細胞（アナジー細胞混合物）の投与の優位性が明らかであった（図３c）。また、純化したナイーブCD8陽性T細胞の投与では、全てのマウスで移植した心臓は拒絶されたのに対し、アナジーCD8陽性T細胞を移入した場合には投与したマウスのうち40%で寛容が誘導された（図3d）。さらに、ナイーブヒトCD2陽性細胞（FoxP3発現regT細胞）を移入した場合でも寛容が誘導されるマウスはいるものの、アナジーヒトCD2陽性細胞（FoxP3発現regT細胞）の投与の方が、より効果的に寛容を誘導した（図3d）。従って、アナジーCD8、CD4、FoXP3陽性細胞それぞれの単独投与よりも、アナジー細胞混合物の投与は、移植された心臓に対する拒絶反応をより効果的に抑制し、さらにレシピエントに放射線照射等による骨髄抑制を起こすことで、より効果的に寛容を誘導することが示された。【０１０９】
この結果は、実施例１と矛盾するものでは無く、純化されたアナジーCD8、CD4、FoｘP3陽性細胞やナイーブFoxP3陽性細胞を単独で投与した場合であっても、その細胞数が多ければ、アナジー細胞混合物の移入と同等の移植した心臓に対する拒絶反応の抑制（寛容誘導＝100日以上の移植した心臓の生着）を示す可能性を否定するものではない。また、この実験では遺伝子改変されたマウスを用いたため細胞表面のヒトCD2の発現により、細胞を生かしたままFoxp3発現細胞＝抑制性T細胞を純化できたが、一般には、細胞内におけるFoxp3の発現を生きた細胞で検出することはできない。代用としてCD25陽性CD4陽性Ｔ細胞を用いた場合、活性化したCD4陽性T細胞が抑制性T細胞よりも多く含まれ、その免疫抑制機能は弱いことが知られている。またFoxp3陽性抑制性T細胞は少ないため、アナジーFoxp3発現抑制性細胞の純化は非常に難しい。実際に、図３ｄに示した1×106個のヒトCD2発現細胞＝FoxP3発現細胞を得るには、1×107個以上の全アナジー細胞を必要とした。従って、ここに示された結果は、混合物がより実用的かつ効果的であることを明らかに示している。【０１１０】
（実施例４：ヒトPBMCに由来するアナジー細胞の能力）
次に、本実施例では、ヒトＰＢＭＣに由来するアナジー細胞の能力について評価した。【０１１１】
（材料および方法）
(アナジー細胞の生成)
既に文献に記載された方法に従い実験を行った（5-8）。Ｐｒｏｍｏ  ｃｅｌｌ社製Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ―４４０１０）またはＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  PREMIUM(GE  Healthcare  #17-5442-02)またはLymphocyte  separation  Solution(ナカライテスク#20828)等を用いて、4人のボランティア（2人をスティミュレイター、2人をレスポンダーとする）のヒト末梢血から単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離し、４×１０６細胞／ｍｌとなるよう２％ヒトＡＢ型血清（プール）添加Ｂｉｏｗｅｓｔ社製ＡＬｙＳ５０５Ｎ−０培地（細胞科学研究所（CSTI）1020Ｐ10）で調整した。スティミュレイターＰＢＭＣには放射線(γ線)３０Ｇｙを照射し、レスポンダーＰＢＭＣと１：１で混合した。上記にて混合したＰＢＭＣに、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製マウス抗ヒトＣＤ８０抗体（2D10.4）（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６−０８０９−８５）とマウス抗ヒトＣＤ８６抗体（IT2.2）（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６−０８６９−８５）をそれぞれ最終濃度が１０μｇ／ｍＬになる様に添加し、12ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、#3513）、6ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ．Ｎｏ．3516)(、6ｃｍシャーレ(Greiner  CELLSTAR（登録商標）dish  ，Ｃａｔ．Ｎｏ．628160)、または１０ｃmシャーレ(Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ．Ｎｏ．430167)にて３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養を開始した。培養開始から7日目に遠心により培養液を除いた後に、放射線照射スティミュレイターPBMCと抗CD80抗体/抗CD86抗体を含む培養液を培養開始時と同じ条件で添加した。培養14日目に細胞を回収し遠心により培養液をウォッシュアウトし、アナジー細胞を得た。一部の実験では、PE蛍光標識マウス抗ヒトCD25抗体(BC96;ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  #12-0259-42)、FITC蛍光標識マウス抗ヒトCD4抗体(RPA-T4;ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  #11-0049-42)、APC蛍光標識マウス抗ヒトCD8抗体(RPA-T8;ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  #17-0088-42)を用いてアナジー細胞を染色後、JSANセルソーター(ベイバイオサイエンス社)を用いて各細胞を純化して混合培養系に添加した。【０１１２】
（免疫反応抑制能の評価）
得られたアナジー細胞をレスポンダーPBMCとの比率が1/2から1/16になるように調整した後に、新たに採取した同一のボランティアのＰＢＭＣを用いた９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．３７９９）上での各2×１０5個/２００μＬ／ウェルでの４ウェルずつの混合培養系に添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。培養開始４日目に３Ｈ−チミジン（１０μＬ）を添加し、培養開始５日目（３Ｈ−チミジン添加の１６〜２０時間後）にＣｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により培養細胞を回収し、シンチレーションカウンターにより３Ｈ−チミジン取込み量を測定した。ナイーブなレスポンダーPBMCの無刺激での３Ｈ−チミジン取込み量を１としてグラフを作成し、比較検討した。【０１１３】
（結果）
結果を図４に示す。【０１１４】
図４aは、「抗体・スティミュレイター処理後の全アナジー細胞」の用量依存的な免疫反応抑制能を示す。抗体・スティミュレイター処理後の全アナジー細胞の比率が高いほど抑制効果が高いことが明らかである。【０１１５】
図４bは、抗体・スティミュレイター処理後の全アナジー細胞をソーティングにより、左3番目のバーから右へ順に、CD8陽性CD44陽性アナジー細胞とregT細胞を含むCD25陽性細胞を純化した細胞集団（灰色）、CD4陽性CD25陽性regＴ細胞を純化した細胞集団（縦縞）、さらに純化したCD4陽性CD25陽性regT細胞に純化したCD8陽性細胞を加えた細胞集団（黒色）を用いて、免疫抑制能を比較したものである。ここに示される結果から、regT細胞は、単独では免疫抑制能は無く、CD8陽性T細胞と共存することで免疫抑制能を発揮することが明らかである。【０１１６】
図４cは、抗体・スティミュレイター処理後の全アナジー細胞をＣＤ４陽性細胞（灰色）とCD4陰性細胞（斜線）とに選別し、その全アナジー細胞（黒色）と免疫抑制能を比較したものである。値は、無刺激状態(ナイーブ)の３Ｈ−チミジン取込み量の平均値を１として算出した値を示す。CD4陽性細胞にはregT細胞が含まれ、CD4陰性細胞にはCD8陽性細胞が含まれる。CD4陽性細胞でもCD4陰性細胞でも免疫抑制が示されている。【０１１７】
図4bでregT細胞単独では免疫抑制能を発揮できなかったこととCD8陽性細胞との共存在下でregT細胞の免疫抑制能が発揮されていることから、regT細胞の充分な免疫抑制能の発揮にはCD8陽性細胞もしくはregT細胞以外のCD4陽性細胞の存在が必要であることが示唆された。CD4陰性細胞の免疫抑制能は、この中に含まれるアナジーCD8陽性T細胞に由来するものと考えられる。【０１１８】
（実施例５：抗原特異的抑制を示す実験）
本実験では、抗体・スティミュレイター処理後の全アナジー細胞のドナー特異的寛容誘導を確認した。【０１１９】
(材料および方法)
実施例１と同様の手法で、野生型B6マウス(H-2b)から得た脾臓細胞を、抗ＣＤ８０／８６抗体存在下でBALB/cマウス(H-2b)由来の脾臓細胞で刺激し培養してアナジー細胞を得た。このアナジー細胞を２Ｇｙの放射線照射3日後にBALB/cマウスまたはCBAマウス(H-2k)の心臓を移植した野生型B6マウスに5×106個尾静脈から投与し、心臓の拒絶を観察した。【０１２０】
（結果）
図5に示す様に、抗ＣＤ８０／８６抗体存在下でBalb/Cマウス脾臓細胞で刺激されたB6マウス由来のアナジー細胞のB6マウスへの移入は、移植されたBALB/cマウスの心臓の拒絶を100％阻害し100日後でも心臓が生着している、つまり、寛容が誘導されている。これに対して3rd  partyであるCBAマウスの心臓は移植後に速やかに拒絶反応が引き起こされ、約50日で100％拒絶される。【０１２１】
以上から、抗ＣＤ８０／８６抗体存在下で抗原に反応させられたホスト由来のリンパ球は、その抗原特異的な免疫反応の抑制能を有することが示された。【０１２２】
(実施例６：アナジー細胞の選択的な早期接着によるナイーブ細胞の免疫反応抑制)
本実験では、アナジー細胞がナイーブ細胞よりも迅速にドナー（スティミュレイター）細胞に結合することで、ナイーブ細胞の反応および増殖を阻害していることを確認した。【０１２３】
(材料および方法)
実施例１と同様の手法で、B6マウスから得た脾臓細胞を、抗ＣＤ８０／８６抗体存在下でBALB/cマウス由来の脾臓細胞で刺激しアナジー細胞を得た。この実験では、蛍光色素GFPを恒常的に発現する様に遺伝子改変したB6マウスから新たに得た脾臓細胞をレスポンダーとして用いた。12ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．３７９９）内で、上述のレスポンダーB6脾臓細胞およびスティミュレイター（ドナー）BALB/c脾臓細胞をそれぞれ1×１０6個/ml含む４mlの混合培養系に、上記アナジー細胞を、レスポンダーB6脾臓細胞との比率が1/2になるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。1日後から3日後まで経時的にプレートを観察し、写真を撮った。【０１２４】
(結果)
図６に写真の代表的な像をしめす。最下段のアナジー細胞を加えた培養系でのみ、培養1日後から細胞の塊（クラスター）が形成され、これはナイーブ細胞とドナー細胞のみ(上から2段目)の系では観察されない。従って、アナジー細胞が、おそらくBALB/c由来の細胞を中心とする細胞塊を形成していることが推察される。培養2日後以降になると、ナイーブＢ６脾臓細胞も細胞塊を形成し始め、同時にその部位で蛍光が強くなっている。これは、BALB/c脾臓細胞に接着し反応した、蛍光を発するナイーブ細胞の増加によると考えられ、この様な蛍光の増強は、ナイーブ細胞単独培養の上段と、アナジー細胞を添加した培養系では観察されない。従って、ナイーブ細胞の増殖反応はアナジー細胞の添加で抑制されていることが示唆される。この結果から、アナジー細胞はナイーブ細胞よりも迅速にドナー細胞に接着し、ナイーブ細胞によるドナー細胞の認識(接着)を阻害することにより、ナイーブ細胞の反応=増殖を阻害していることが示唆される。【０１２５】
（実施例７：免疫抑制能（アナジー誘導能）を発揮する細胞の属性）
本実験ではアナジー細胞の中で免疫抑制能（アナジー誘導能）を発揮する細胞はCD44陽性であることの確認実験を行った。【０１２６】
(材料および方法)
実施例１と同様の手法で、野生型B6マウスから得た脾臓細胞を、抗ＣＤ８０／８６抗体存在下でBALB/c細胞で刺激しアナジー細胞を得た。このアナジー細胞をAPC蛍光標識抗マウスCD8抗体(53-6.7;eBioscience#17-0081-82またはBioLegend;  #100730)、PerCP/Cy5.5蛍光標識抗マウスCD4抗体(RM4-5;eBioscience  #45-0042-82またはGK1.5;BioLegend;  #100434)、およびAPC/Cy7蛍光標識抗マウスCD44抗体(BioLegend;  #1003028)で染色後、JSANセルソーター(ベイバイオサイエンス社)を用いてCD8陽性CD44陰性細胞またはCD4陽性CD44陰性細胞を除去した後、混合培養系に添加した。さらに、JSANセルソーターを用いてCD8陽性CD44陽性細胞またはCD4陽性CD44陽性細胞を純化して混合培養系に添加する実験も行った。【０１２７】
（結果）
図７aに示される様に、アナジー細胞からCD8陽性CD44陰性細胞またはCD4陽性CD44陰性細胞を除去しても、全アナジー細胞の添加と同様に、新たな混合培養系におけるレスポンダー細胞であるナイーブB6脾臓細胞の増殖を抑制することが観察された。このことから、CD44陰性細胞には免疫抑制作用すなわちアナジー誘導能は無いことが示された。さらに図７bに示される様に純化したCD8陽性CD44陽性細胞またはCD4陽性CD44陽性細胞には、単独でも免疫抑制能があることが示され、これまでの実施例で示されたアナジーCD8陽性細胞またはアナジーCD4陽性細胞による免疫抑制はCD44陽性細胞により発揮されていることが確認された。【０１２８】
また、同時にアナジー細胞の表現型をＦＡＣＳによって調べたところ、図７cに示される様に、アナジーCD8陽性T細胞中で強い免疫抑制機能を持つアナジーCD44陽性細胞は16.61%、アナジーCD4陽性T細胞中の強い免疫抑制機能を持つアナジーCD44陽性細胞は31.01%であった。【０１２９】
（実施例８：様々な阻害因子を用いた免疫寛容の惹起）
本実施例では、様々な阻害因子を用いても免疫寛容を惹起することができることを示す。【０１３０】
（アナジー細胞の生成）
基本的には、実施例１に記載の方法および既に文献に記載された方法に従い実験を行う（１〜３）。レシピエントＰＢＭＣおよびドナーＰＢＭＣには、それぞれヒト末梢血から新鮮に分離したものを使用するか、または−８０℃で凍結保存したものを急速解凍して使用し、これらの細胞はともに、自己血漿または１０％非働化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（ＳＩＧＭＡ  ＃  １７２０１２−５００ＭＬ  Ｌｏｔ  １１Ｄ２５７またはｂｉｏｓｅｒａ  ＃ＦＢ−１３８０／５００  Ｌｏｔ．０１５ＢＳ４８２）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ；Ｒ８７５８−５００ＭＫ）にて４×１０６細胞／ｍＬに調整する。ドナーＰＢＭＣには、２０Ｇｙ放射線を照射しておく。これらのレシピエントＰＢＭＣとドナーＰＢＭＣとを、１：１で混合し、この混合物に、阻害因子（例えば、抗ＣＤ８０抗体／抗ＣＤ８６抗体では、それぞれ最終濃度１０μｇ／ｍｌ、ベラタセプト（またはアバタセプト）では、最終濃度１０μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌ）を添加する。培養は、６ｃｍシャーレ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＣＥＬＬＳＴＡＲ（登録商標）ｄｉｓｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６２８１６０）（培養体積３〜６ｍＬ）または１０ｃｍシャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４３０１６７）（培養体積１０〜１５ｍＬ）にて３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で７日間行う（培養開始時の細胞密度は、４×１０６細胞／ｍＬ）。【０１３１】
培養開始から7日目に遠心により、培養したレシピエントＰＢＭＣを回収し、上記の培地で４×１０６細胞／ｍＬに調整する。この培養したレシピエントＰＢＭＣに、新たに調製した照射済みドナーＰＢＭＣを細胞数比２：１になるように添加し、さらに阻害因子（例えば、抗ＣＤ８０抗体／抗ＣＤ８６抗体では、それぞれ最終濃度５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、ベラタセプト（またはアバタセプト）では、最終濃度１０μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌ）も添加する。培養は、上記と同じ条件で７日間行う（細胞密度：４×１０６細胞／ｍＬ）。【０１３２】
（免疫反応抑制能の評価）
培養開始から通算して１４日目に遠心により誘導細胞を回収し、基本的には既に文献に記載された方法に従いリンパ球混合試験を行った（３）。細胞懸濁物を、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで共培養する。共培養開始４日目に３Ｈ−チミジン（１０μｌ）を添加し、共培養開始５日目（３Ｈ−チミジン添加の１６〜２０時間後）に培養液中の３Ｈ−チミジンを除去し、３Ｈ−チミジン取込み量を測定し、免疫反応抑制能を確認することができる。【０１３３】
(実施例９：細胞製剤の品質管理)
細胞製剤の製法については、上述の実施例１〜７における記載を参照のこと。実施例に準じて製造された細胞製剤について、以下のように品質管理を行う。【０１３４】
満たすべき品質規格の代表例は以下のとおりである。【０１３５】
【表４】
2019245038.tif 000008
（細胞製剤の品質管理試験）
本明細書に記載の方法によって、例えば、実施例１〜７の記載に準じて生成されたアナジー細胞が、最終製品の品質規格に合致するか否か調べるために、以下の試験を実施する。【０１３６】
・外観
生理食塩液中に懸濁させたアナジー細胞を、外観について目視で調べる。品質規格に合致する懸濁液は、微黄白色〜淡黄色の細胞からなるはずである。【０１３７】
・細胞表現型およびアナジー細胞の純度
アナジー細胞を、各表現型についてフローサイトメトリーで調べるために、例えば以下の抗体を使用し、多重染色により解析する：
ＣＤ３：ＦＩＴＣ蛍光標識抗ヒトＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃１１−００３８−４２）またはＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ蛍光標識抗ヒトＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃ＣＤ０３２８）
ＣＤ４：ＰＥ蛍光標識抗ヒトＣＤ４抗体（ＲＰＡ−Ｔ４；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃２５−００４９−４２）
ＣＤ８：ＡＰＣ蛍光標識抗ヒトＣＤ８抗体（ＲＰＡ−Ｔ８；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃１７−００８８−４２）
ＣＤ２５：ＰｅｒＣＰ蛍光標識抗ヒトＣＤ２５抗体  （ＭＥＭ−１８１；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃Ａ１５８０２）
ＣＤ４４：ＰＥ−Ｃｙ７蛍光標識抗ヒトＣＤ４４抗体（ＩＭ７；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃２５−０４４１−８２）
ＣＤ４５：Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ蛍光標識抗ヒトＣＤ４５抗体（ＨＩ３０；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃３０４０３２）
ＣＤ４５ＲＡ：ＦＩＴＣ蛍光標識抗ＣＤ４５ＲＡ抗体（ＡＬＢ１１；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａ０７７８６）またはＰＥ蛍光標識抗ＣＤ４５ＲＡ抗体（ＡＬＢ１１；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＩＭ１８３４Ｕ）
ＣＤ４５ＲＯ：ＥＣＤ蛍光標識抗ＣＤ４５ＲＯ抗体（ＵＣＨＬ１；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＩＭ２７１２Ｕ）またはＰＥ蛍光標識抗ＣＤ４５ＲＯ抗体（ＵＣＨＬ１；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａ０７７８７）またはＡＰＣ蛍光標識抗ＣＤ４５ＲＯ抗体（ＵＣＨＬ１；Ｂａｙ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２０−０４５７）
手順
ＣＤ３陽性細胞比率、生細胞中のＣＤ４５陽性細胞比率、ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ８陽性ＣＤ４４陽性細胞比率、ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ４４陽性細胞比率、ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性細胞比率、ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性細胞比率、ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性細胞比率およびＣＤ３陽性細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性細胞比率
生理食塩液中に懸濁させたアナジー細胞を、上記抗体に反応させた後に、Ｚｏｍｂｉｅ  ＮＩＲ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＬｇｅｎｅｄ  ＃４２３１０６）を用いて死細胞を染色する。この多重蛍光染色された細胞をＦＡＣＳ  Ｖｅｒｓｅ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）において、全生細胞中のＣＤ３陽性細胞の比率を決定する。【０１３８】
品質規格に合致するアナジー細胞は、５０％以上の細胞がＣＤ３陽性となるはずである。同時に、蛍光に基づき、生細胞中のＣＤ４５陽性細胞の比率、生きた全ＣＤ３陽性細胞中のＣＤ８陽性ＣＤ４４陽性細胞の比率、ＣＤ４陽性ＣＤ４４陽性細胞の比率、ＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性細胞の比率、ＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性細胞の比率、ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性細胞の比率、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性細胞の比率を決定する。【０１３９】
品質規格に合致するアナジー細胞は、生細胞の９５％以上の細胞がＣＤ４５陽性となるはずであり、赤血球や血小板などの不純物を顕著な量では含まない。さらに、品質規格に合致するアナジー細胞は、ＣＤ３陽性細胞集団中、5％以上がＣＤ８陽性ＣＤ４４陽性、5％以上がＣＤ４陽性ＣＤ４４陽性、5％以上がＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性、5％以上がＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性、5％以上がＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性、そして５％以上がＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性の細胞である。【０１４０】
・安全性
基本的には、日本薬局方または該当する各国の薬局方の記載に準拠して試験を行う。以下に、例示的な実施形態を述べる。【０１４１】
無菌試験法
アナジー細胞浮遊液を軽く遠心分離し、その上清を、無菌試験に供する。日本薬局方における代表的な無菌試験の一つである直接法では、上清を、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地または液状チオグリコール酸培地に接種し、それぞれ３０〜３５℃または２０〜２５℃で１４日間以上培養する。その後、培養物を培養期間中に数回観察する。別の代表的な無菌試験であるメンブランフィルター法では、上清を無菌希釈液（例えば、１ｇ／Ｌの肉製又はカゼイン製ペプトン溶液（ｐＨ７．１±０．２））で希釈し、希釈した上清をメンブランフィルター上に移し、濾過する。その後そのメンブランフィルターを、上述の２種類の培地にそれぞれ入れ、１４日間以上培養する。品質規格に合致する製品では、培養期間中及び最終日に、培地に肉眼的な微生物の増殖は存在しない。【０１４２】
エンドトキシン試験法
アナジー細胞浮遊液を、適宜生理食塩液で希釈し、ｐＨ６．０〜８．０に調製する。その後、ライセート試薬と混合し、ライセート試液のゲル形成を指標として（ゲル化法）、またはライセート試液のゲル化過程における濁度変化を指標として（比濁法）もしくは合成基質の加水分解による発色を指標として（比色法）、試料中のエンドトキシン濃度を定量的に求める。必要に応じて、ライセート試薬の表示感度を確認する予備試験を行う。品質規格に合致する製品では、エンドトキシン濃度は、０．２５ＥＵ／ｍＬ未満にならなければならない。【０１４３】
マイコプラズマ否定試験
培養液、またはアナジー細胞浮遊液を軽く遠心分離し、その上清を、マイコプラズマ否定試験に供する。日本薬局方における代表的なマイコプラズマ否定試験の一つである培養法では、試料を、寒天平板培地に接種し、５〜１０％の炭酸ガスを含む窒素ガス中で、適切な湿度のもと３５〜３７℃で１４日間以上培養する、あるいは、試料を、液体培地を入れた容器に接種し、３５〜３７℃で培養し、液体培地の色調変化を観察したときか、または培養開始から一定期間ごとに液体培養物からアリコートを取り、新たな寒天平板培地に播いて、培養を続ける。その後、全ての寒天平板培地を対象に７日目と１４日目に倍率１００倍以上の顕微鏡でマイコプラズマの集落の有無を調べる。別の代表的なマイコプラズマ否定試験である指標細胞を用いたＤＮＡ染色法では、典型的には、指標細胞であるＶｅｒｏ細胞と指定のマイコプラズマ菌株を用いる。この方法では、カバーグラスを沈めた培養ディッシュなどに指標細胞を接種し、５％炭酸ガスを含む空気中、３５〜３８℃で一日増殖させる。その後試料（培養液または上清）を添加して、同様の条件で３〜６日間培養を続ける。カバーグラス上の培養細胞を固定後、ビスベンズイミド等の染色剤によりＤＮＡ蛍光染色し、蛍光顕微鏡（倍率４００〜６００倍またはそれ以上の倍率）で検鏡し、陰性（非接種）対照及びマイコプラズマ陽性対照と比較しながら、細胞核を囲むように微小な核外蛍光斑点を持つ細胞が０．５％以上存在した場合には、マイコプラズマ陽性と判断する。品質規格に合致する製品では、マイコプラズマ陰性であるべきである。【０１４４】
・細胞数
生理食塩液中に懸濁させたアナジー細胞を、血球計算盤を用いて顕微鏡下で、または自動セルカウンターにより細胞数を測定する。品質規格に合致する、投与に適切なアナジー細胞の数は、１×１０８〜３０×１０８個（例えば、１００ｍＬ生理食塩液中）であり、この範囲を下回る場合には、適宜細胞を追加すべきである。【０１４５】
・生細胞率
生理食塩液中に懸濁させたアナジー細胞を、０．３〜０．５％トリパンブルー染色液（例えば、カタログ＃３５５２５−０２、ナカライテスク）と混合し、血球計算盤を用いて顕微鏡下で、または自動セルカウンターにより生細胞数を測定する。品質規格に合致する製品では、７０％以上の細胞が生細胞であるべきである。【０１４６】
（考察）
以上の結果から、本開示の組成物は、
１）CD44陽性CD8陽性T細胞とCD44陽性CD4陽性T細胞を中心とする免疫抑制細胞の集団であり、混合物であることにより、その性能は強く発揮される。
２）この細胞集団は同時にFoxP3陽性のregT細胞を含有すると示唆されるが、このregT細胞の抑制能もまた、抗CD80/86抗体存在下での抗原刺激というアナジーを誘導する培養系で増強され、またCD44陽性CD8陽性細胞、CD44陽性CD4陽性細胞の存在下でその抑制能はより強く発揮される。
３）抗CD80/86存在下で一度抗原に反応し選択され、抗原特異的になったアナジーCD8陽性細胞およびアナジーCD4陽性細胞が、ナイーブ細胞より早く、抗原を認識しカバーすることが、免疫抑制の機序の1つであることが証明された。これらは、従来の免疫拒絶抑制実験では判明していなかったことで、非常に重要な知見である。【０１４７】
これらの知見は、免疫拒絶抑制のための細胞製剤の品質管理において重要なチェックポイントとなり得る。【０１４８】
表４で示した最終製品の規格は、代表例であり、細胞表現型等の基準値は、適切に変更することができ、その改変例としては、表３に記載される例を挙げることができる。【０１４９】
参考文献
以下の参考文献は、実施例等において基本技術として参照したものであり、これらの文献が本開示に対して先行技術を構成することを認めるものではない。これらの内容は参考として援用される。
1.  Bashuda  H,  Kimikawa  M,  Seino  K,  Kato  Y,  Ono  F,  Shimizu  A,  et  al.  Renal  allograft  rejection  is  prevented  by  adoptive  transfer  of  anergic  T  cells  in  nonhuman  primates.  The  Journal  of  clinical  investigation.  2005;115(7):1896-902.
2.  Bashuda  H,  Shimizu  A,  Uchiyama  M,  Okumura  K.  Prolongation  of  renal  allograft  survival  by  anergic  cells:  advantages  and  limitations.  Clin  Transplant.  2010;24  Suppl  22:6-10.
3.  Luo  Z,  Gotoh  M,  Grochowiecki  T,  Tanaka  T,  Kimura  F,  Kawashima  H,  et  al.  Anergic  T  cells  generated  in  vitro  suppress  rejection  response  to  islet  allografts.  Transplantation.  2000;69(10):2144-8.
4.  Miyao  T,  Floess  S,  Setoguchi  R,  Luche  H,  Fehling  HJ,  Waldmann  H,  et  al.  Plasticity  of  Foxp3(+)  T  cells  reflects  promiscuous  Foxp3  expression  in  conventional  T  cells  but  not  reprogramming  of  regulatory  T  cells.  Immunity.  2012;36(2):262-75.
5.  Davies  JK,  Barbon  CM,  Voskertchian  A,  Nadler  LM,  Guinan  EC.  Ex  vivo  alloanergization  with  belatacept:  a  strategy  to  selectively  modulate  alloresponses  after  transplantation.  Cell  transplantation.  2012;21(9):2047-61.
6.  Davies  JK,  Gribben  JG,  Brennan  LL,  Yuk  D,  Nadler  LM,  Guinan  EC.  Outcome  of  alloanergized  haploidentical  bone  marrow  transplantation  after  ex  vivo  costimulatory  blockade:  results  of  2  phase  1  studies.  Blood.  2008;112(6):2232-41.
7.  Davies  JK,  Nadler  LM,  Guinan  EC.  Expansion  of  allospecific  regulatory  T  cells  after  anergized,  mismatched  bone  marrow  transplantation.  Science  translational  medicine.  2009;1(1):1ra3.
8.  Davies  JK,  Yuk  D,  Nadler  LM,  Guinan  EC.  Induction  of  alloanergy  in  human  donor  T  cells  without  loss  of  pathogen  or  tumor  immunity.  Transplantation.  2008;86(6):854-64.
（注記）
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本出願は、日本国特許出願特願２０１８−１１９００１（２０１８年６月２２日出願）に対して優先権主張の利益を主張するものであり、当該出願の内容は本願において、その内容が（全部であり得る）参考として援用されることが理解される。また、日本国特許出願特願２０１８−１１８９９６および特願２０１８−１１９００３（いずれも２０１８年６月２２日出願）ならびにそれらに対して優先権主張する国際出願の内容は、その一部または全文が、本明細書において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１５０】
本開示は、特定の抗原に特異的な免疫寛容が誘導された細胞を含む医薬組成物を提供する。このような技術に基づく製剤等に関連する産業（製薬）において利用可能な技術が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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