(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記アミノ酸配列で示されるペプチド又はその塩を有効成分として含有する血圧降下剤。
Lys Val Leu Pro Val Pro Gln
【請求項２】
獣乳成分を原料として、発酵法により得ることを特徴とする請求項１記載の血圧降下剤の製造法。
【請求項３】
獣乳成分を原料として、プロティナーゼ処理により得ることを特徴とする請求項１記載の血圧降下剤の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、血圧降下作用等を有し、医薬品、特定保健用食品、健康食品等に利用できるペプチド又はその塩を有効成分として含有する血圧降下剤及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来血圧降下剤として、天然物、化学合成物等が多数報告されており、例えば化学合成物としては、カプトプリル（Ｄ−２−メチル−３−メルカプトプロパノイル−Ｌ−プロリン）が有名であり、既に経口用降圧剤として実用化されている。しかし、これら化学合成物は、常に安全性の問題に注意を払わなければならない。
【０００３】
また、天然物あるいは天然物由来の血圧降下物質としては、蛇毒ペプチド及びその類縁体等が知られている。また食品原料由来のペプチド性物質にも降圧作用が見られることが報告されており、例えば獣乳カゼイン、魚肉蛋白質等の酵素分解物から得られるペプチドに降圧作用があることが報告されており、最近、特に乳酸菌産生プロティナーゼによるカゼイン分解ペプチドの血圧降下作用に関する報告がなされている（N. Yamamoto et, al. J. Dairy Sci. 77: 917-922 (1994)、N. Yamamoto et, al., Biosci. Biotech. Biochem., 58, 776-778 (1994)）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、安全性が高く、微量の経口投与で有効な血圧降下作用を示す血圧降下剤及びその製造法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、下記アミノ酸配列で示されるペプチド又はその塩を有効成分として含有する血圧降下剤が提供される。
Lys Val Leu Pro Val Pro Gln
また本発明によれば、獣乳成分を原料として、発酵法により得ることを特徴とする前記血圧降下剤の製造法が提供される。
更に本発明によれば、獣乳成分を原料として、プロティナーゼ処理により得ることを特徴とする前記血圧降下剤の製造法が提供される。
【０００６】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の血圧降下剤において、有効成分は、前記アミノ酸配列で示されるペプチド又はその塩である。その塩としては、薬理学上許容される塩類、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩及びクエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、乳酸塩等の有機酸塩を挙げることができる。
【０００７】
前記ペプチドを調製するには、後に詳述する獣乳成分を原料として、発酵法又はプロティナーゼ処理等により処理し、公知の方法で目的とするペプチドを精製する方法等により得ることができる。即ち前記ペプチドは、獣乳蛋白質成分の１種であるβカゼインを構成するペプチド単位の一部である。また公知の有機化学合成法により得ることもできる。
【０００８】
本発明の血圧降下剤は、前記ペプチド又はその塩を含有するものであるので、その製造法においては、獣乳カゼインを原料とする微生物による発酵法、あるいは獣乳カゼインのプロティナーゼによる酵素加水分解法等により製造することができ、前記ペプチドを単離する程度の精製を必ずしも行なう必要はない。
【０００９】
前記発酵法においては、発酵原料として獣乳成分、例えば牛乳、山羊乳、馬乳又はこれらの脱脂乳の乳培地等を用いることができる。またカゼインあるいはカゼイン塩を添加したＢＬ培地、Briggs liver broth培地、ＭＲＳ培地、ＧＡＭ培地、ＴＴＹ培地、ＭＧＬＰ培地等を用いることができる。使用できる乳酸菌としては、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・デルブルィキィ・サブスペシィーズ・ブルガリカス(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）等のラクトバチルス属乳酸菌を用いることができる。更に好ましくはラクトバチルス・ヘルベティカス JCM-1003（Lactobacillus helveticus JCM-1003）、ラクトバチルス・デルブルィキィ・サブスペシィーズ・ブルガリカス JCM-1002（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus JCM-1002）、ラクトバチルス・アシドフィラス JCM-1132（Lactobaticillus acidophilus JCM-1132）等を挙げることができる。
【００１０】
発酵条件としては、発酵温度２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃、発酵時間３〜３０時間、好ましくは６〜１２時間の条件下で行なうことができる。発酵時間はスターター接種量及び発酵温度により異なるが、発酵乳酸量が好ましくは０．５〜２．０重量％、更に好ましくは０．７〜１．５重量％となるまで行うことにより、目的とするペプチドを含む発酵乳を得ることができる。
【００１１】
具体的には、例えばスターター接種量３重量％、発酵温度３７℃、発酵時間８時間程度で発酵乳酸量を０．７〜０．８重量％とすることができ、またスターター接種量１重量％、発酵温度３７℃とした場合には、発酵時間１０〜１２時間程度で、発酵乳酸量を０．７〜０．８重量％とすることができる。更に長時間発酵を行った場合には、乳酸菌が産生するペプチダーゼの作用を受けて、有効成分としてのペプチドは減少する。更に発酵を続けることにより、前記ペプチダーゼの作用を受けて新たにVal Pro ProやIle Pro Proが生成し、新たな血圧降下作用を示すことが知られている(日本農芸化学学会誌 67, 3, 289(1993))。しかし前述の発酵条件では、血圧降下作用を示す量のVal Pro ProやIle Pro Proの生成は認められない。
【００１２】
前記獣乳カゼインのプロティナーゼ酵素加水分解法は、原料として獣乳カゼイン、獣乳カゼイン塩等を用い、酵素として、例えば微生物産生プロティナーゼを用いることができる。
前記微生物産生プロティナーゼは、微生物、例えば乳酸菌由来のものを用いることができる。このような乳酸菌産生プロティナーゼにより獣乳成分を酵素加水分解する方法は従来知られた方法である。例えば、ラクトバチルス ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)産生プロティナーゼの性質とカゼイン配列内の切断点についての報告があるが(Claude ZEVACO and J.C.GRIPON, Le Lait, 68, 393-408(1988)、Yamamoto N. et. al., J. Biochem., 114, 740-745(1993))、前記ペプチドLys Val Leu Pro Val Pro Gln部位での切断は報告されていない。更にラクトバチルス・ラクティス・サブスペシィーズ・クレモリス(Lactobacillus lactis subsp. cremoris)産生P1及びP3タイプのプロティナーゼによるβカゼイン加水分解の比較についても報告されており（Julian R. Reid et.al.Applied Microbiology and Biotechnology, 36, 344-351(1991))、その切断点より、前記ペプチドの生成が予測される。しかし、前記ペプチドの血圧降下作用及び前記ペプチドを発酵乳中から調製する方法の報告はなされていない。
【００１３】
前記乳酸菌産生プロティナーゼを調製する際の乳酸菌、及びこれらを培養する際の培地としては、具体的には、前記発酵法で列挙したものを好ましく挙げることができる。
【００１４】
発酵条件としては、発酵温度２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃、発酵時間３〜３０時間、好ましくは６〜１２時間の条件下で行うことができる。また、得られる発酵液は、通常ｐＨ３〜４を示すが、目的とするプロティナーゼの収率を増加させるためには、前記発酵液を中性域のｐＨに保ち行うのが好ましい。更にプロティナーゼの抽出は、好ましくは５〜４０℃にて１０〜６０分間抽出する工程を２〜５回繰り返すことにより行うことができる。
【００１５】
前記乳酸菌産生プロティナーゼで獣乳カゼイン等の獣乳成分を分解するには、該乳酸菌産生プロティナーゼと、例えばリン酸緩衝液等の緩衝液に溶解した獣乳成分とを混合し、３０〜５０℃にて、１〜１２時間反応させ、次いで、遠心分離し、好ましくは分子量分画１００００〜５００００の限外濾過膜等で限外濾過し、更に逆相液体カラムクロマトグラフィーを用いて目的のペプチドを含む成分を精製する方法等により得ることができる。この際乳酸菌産生プロティナーゼと獣乳成分との混合割合は、重量比で１：１００〜１：５０００であるのが好ましい。
【００１６】
本発明の血圧降下剤は、前記ペプチド又はその塩を有効成分として含有するので、ヒトをはじめとする哺乳動物の高血圧の治療、予防に有効である。
【００１７】
本発明の血圧降下剤の投与方法は、主に経口投与、静脈注射等で行うことができる。剤形は、液状として、また乾燥粉末とした後に錠剤、顆粒製剤、カプセル製剤等として用いることもできる。前記ペプチド又はその塩は、発酵法、酵素加水分解法又は有機化学合成法により得られたそれ自体、又は更に公知の方法により精製処理を行なったものを前記各種剤形となるよう調製して使用することができる。前記ペプチド又はその塩は、後述するように微量でも血圧降下作用を発揮するので、前記酵素加水分解法又は発酵法で得られた前記ペプチド又はその塩を含む溶液を、そのまま、又は種々の栄養分等を加えて、もしくは飲食品内に含有させて血圧降下作用、高血圧予防の機能をもたせた機能性食品、特定用保健食品、健康食品等として用いることができる。更に前記発酵物を、ヨーグルト、チーズ等の直接摂取用発酵食品として用いることもできる。
【００１８】
本発明の血圧降下剤の投与量は、患者の年齢、体重、高血圧症状等により異なるが、前記ペプチド又はその塩の含有量に換算して、０．５ｍｇ／体重ｋｇ・日以上で有効である。好ましくは１ｍｇ／体重ｋｇ・日前後で使用するのが望ましい。また前記発酵法で得られた発酵乳をヨーグルトとして摂取する場合は、好ましくは５〜２０ｍｌ／体重ｋｇ・日の摂取量で、目的とする血圧降下作用を得ることができる。
【００１９】
前記ペプチドをＷＫＹラット（１５週令、体重約３００ｇ、ｎ＝５）へ１０ｍｇ／体重ｋｇ・日、１か月間経口投与したが、ラットに異常は認められず、本発明のペプチドの安全性が確認された。
【００２０】
【発明の効果】
本発明の血圧降下剤は、ヒト及び哺乳動物の血圧を有効に降下させることができ、安全性が高く、副作用が少ないため、医薬品、機能性食品等への利用が可能である。また前記血圧降下剤は、獣乳成分を原料としたプロティナーゼ処理法又は発酵法により、容易にしかも安価に製造することができる。
本発明は、血圧降下作用等を有し、医薬品、特定保健用食品、健康食品等に利用できる新規なペプチド又はその塩を有効成分として含有する血圧降下剤及びその製造法に関する。
【００２１】
【実施例】
以下実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２２】
【実施例１】
乳酸菌としてラクトバチルス・ヘルベティカス JCM-1003のスターター発酵液３００ｇを用い、９重量％の脱脂粉乳１０ｋｇに接種した後、３Ｎ水酸化ナトリウム溶液を自動的に加え、ｐＨを６．０に保ちながら、濁度１．０になるまで３７℃、５時間培養した（濁度測定方法は、培養液１０ｍｌにクエン酸ナトリウムを終濃度１重量％になるように加え、乳蛋白質を可溶化した後、５９０ｎｍの吸光度を測定した）。培養終了後クエン酸ナトリウムを全発酵液に１重量％となるように添加し、室温にて２０分間保持して乳蛋白質を可溶化した。次に５０００回転／分、２０分間の遠心分離を行い集菌した菌体を、２０ｍＭ塩化カルシウム、５０ｍＭβ−グリセロリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）５０ｍｌを加えて３７℃で３０分間保温、抽出した。次いで１００００回転／分、１０分間の遠心分離を行い上清液を採取した。抽出、遠心操作を４回繰り返して、上清液約２００ｍｌを採取した（粗抽出液）。この粗抽出液を予め５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ＴＥ緩衝液、ｐＨ７．８）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム（５ｍｌ）に通した。カラムを０．３Ｍの塩化ナトリウムを含むＴＥ緩衝液３０ｍｌで洗浄後、１．０Ｍ塩化ナトリウムを含むＴＥ緩衝液１５ｍｌで溶出し、約１５０μｇの乳酸菌産生プロティナーゼをほぼ単一なものとして得た。
【００２３】
次にカゼイン１ｇを２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍｌに溶解し、前記乳酸菌産生プロティナーゼ５０μｇと混合し、４２℃で１５時間反応させた。その反応液を１００００回転／分、１０分間の遠心後に上清を回収し、限外濾過（商品名「アドバンテック東洋ＵＨＰ−１５０」、限外濾過膜：分子量分画１００００、富士フィルター工業株式会社製）を行ったところ、カゼイン１ｇからプロティナーゼ分解ペプチド約７００ｍｇ（収率約７０％）が限外濾過外液９０ｍｌ中に得られた。
【００２４】
次いで得られた全限外濾過外液を、次の条件に従って逆相高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を用いて１０分おきに分取し、６つの溶出画分を得た。
【００２５】
0003782837.tif 000002
それぞれの溶出画分を凍結乾燥し、生理食塩水５０ｍｌにて溶解した。それらを高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ：日本チャールズ・リバー社より購入、１群５匹、１９〜２５週令、雄）に胃ゾンデで２ｍｌ／匹強制投与し、６時間後にコントロール群（０．０５％カゼイン）と血圧降下値を比較した。血圧測定は、非観血式血圧測定装置（商品名「ＰＥ−３００」、ナルコバイオシステムズ社製）を用い、tail cuff法で最高血圧値を求めた。溶出開始２０〜３０分後の画分に最大の血圧降下活性が確認されたので、その画分２５ｍｌを前記方法によりＨＰＬＣで再分画し、図１の溶出結果を得、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つの画分を分取した。それぞれの溶出画分全量を凍結乾燥して生理食塩水２５ｍｌに溶解し、前記方法により高血圧自然発症ラットに強制投与して、６時間後の血圧降下値を測定した。その結果、Ｄ画分に最大の血圧降下値を得たので、Ｄ画分１０ｍｌを前記方法によりＨＰＬＣで更に溶出し、主要ピーク１０本を分取した。それぞれの分取したピークを凍結乾燥後、水５ｍｌに溶解して濃度勾配を下記の通りに変更した他は前記方法と同じ条件で、全量をＨＰＬＣを用いて精製した。
【００２６】
（Ｂ液／Ａ液＋Ｂ液）×１００（％）：１５％→３０％（４０分）（以下、濃度勾配（２）と略す）
最終的に精製した画分をそれぞれ凍結乾燥後、水３０μｌに溶解し、島津製作所社製「全自動タンパク質一次構造分析装置ＰＰＳＱ−１０システム」により、ペプチドのＮ末端からアミノ酸配列を分析した結果、１０種のペプチドが同定された。得られた各ペプチドのアミノ酸配列を表１に示す。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
【実施例２】
実施例１で得られた１０種のペプチドと同じアミノ酸配列のぺプチドを、島津製作所社製ペプチド自動合成装置「ＰＰＳＭ−８型」を用いて固相法により合成し、それぞれの降圧作用を下記の方法に従って測定した。動物及び血圧測定方法は実施例１に準じ、各々のペプチド１ｍｇ／体重ｋｇを胃ゾンデで強制投与し、コントロール群と比較した。その結果、１種類のペプチド（Lys Val Leu Pro Val Pro Gln)が有意に血圧低下作用を示すことが確認された。血圧降下値は、−24.1±7.8*で、コントロール群に対して有意差があった（*；P<0.05）。結果を（投与前最高血圧値−投与後最高血圧値）±ＳＥで表２に示す。更に他の２種類のペプチド（Thr Lys Val Ile Pro、Tyr Lys Val Pro Gln Leu）も血圧低下の傾向が認められた。
【００２９】
【表２】
0003782837.tif 000004
【００３０】
【実施例３】
実施例２で有意に血圧降下活性の見られたペプチド Lys Val Leu Pro Val Pro Gln について、投与量と血圧降下度に関するドーズレスポンスを調べた。動物及び血圧測定方法は、実施例１に準じて行なった。即ち、血圧測定はペプチド０．２、０．５、１．０、２．０ｍｇ／体重ｋｇを各群ラットに経口投与し、投与６時間後の最高血圧値を測定してコントロール群と比較することにより行なった。その結果を図２に示す。図２より、０．５〜２．０ｍｇ／体重ｋｇの範囲で、用量依存的な効果が認められた。
【００３１】
【実施例４】
乳酸菌としてラクトバチルス・ヘルベティカスJCM-1003を用い、菌体を９重量％脱脂乳培地１５ｇに接種後、２０時間培養した。その培養液全量を更に９重量％脱脂乳培地５００ｇに接種し、３７℃で乳酸量が０．８％となるまで培養してヨーグルトとした。次いでホモジナイザー（商品名「Ｄ ７８０１型」、Mitamura Riken Kogyo 社製）で液状化後、１００００回転／分で１０分間遠心した。得られた上清１００ｇを、限外濾過（商品名「アドバンテック東洋ＵＨＰ−１５０」、限外濾過膜：分子量分画１００００、富士フィルター工業株式会社製）にかけ、７０ｍｌの限外濾過液を得た。得られた限外濾過液３ｍｌを凍結乾燥後水１ｍｌに溶解し、実施例１の溶出条件で、全量をＨＰＬＣを用いて前記濃度勾配（１）に従って分析した。実施例１で、前記濃度勾配（１）に従ってペプチドを得た溶出時間と同じ溶出時間に溶出したピークを分取した。
得られた画分全量を凍結乾燥後に水１ｍｌに溶解し、実施例１の溶出条件で、全量をＨＰＬＣを用いて前記濃度勾配（２）に従って分析した。実施例１で、前記濃度勾配（２）に従ってペプチドを得た溶出時間と同じ溶出時間に溶出したピークを分取した。得られた画分全量を凍結乾燥後水３０μｌに溶解し、全量を島津製作所社製「全自動タンパク質一次構造分析装置ＰＰＳＱ−１０システム」により、ペプチドのＮ末端から分析した結果、Lys Val Leu Pro Val Pro Glnであることが確認された。発酵乳５００ｇ中には、Lys Val Leu Pro Val Pro Glnが約５８μｇ／ｍｌ含有されていた。
【００３２】
【実施例５】
実施例４と同様の方法で、ラクトバチルス・ヘルベティカスJCM-1003を用いてヨーグルトを得、それをホモジナイザー（商品名「Ｄ ７８０１型」、Mitamura Riken Kogyo 社製）で液状化後、７ｇ／体重ｋｇをＳＨＲラットに胃ゾンデを用いて強制投与し、６時間後の最高血圧値を測定し、未発酵乳（９重量％脱脂乳）投与群と比較した。動物の条件及び血圧測定方法は、実施例１に準じた。結果を（投与前最高血圧値−投与後最高血圧値）±ＳＥで表３に示す。表３の結果より、未発酵乳投与群と比較し有意に血圧が降下したことが判る（−25.4±5.6**、**；P<0.01）。
【００３３】
【表３】
0003782837.tif 000005
【００３４】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
0003782837.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１で血圧降下の見られた画分をＡ〜Ｄの４つに分取した時のグラフである。
【図２】図２は、実施例３で行った Lys Val Leu Pro Val Pro Glnの投与量と血圧降下度の関係を示すグラフである。
【符号の説明】
１  ペプチド Lys Val Leu Pro Val Pro Gln 含有ピーク
２  ペプチド Leu Gln Ser Trp 含有ピーク
３  ペプチド Arg Glu Leu Glu Glu Leu 含有ピーク
４  ペプチド Thr Lys Val Ile Pro 含有ピーク
５  ペプチド Ala Met Lys Pro Trp 含有ピーク
６  ペプチド Tyr Lys Val Pro Gln Leu, Met Lys Pro Trp Ile Gln Pro Lys, Leu Leu Tyr Gln Gln Pro Val 含有ピーク
７  ペプチド Ala Tyr Phe Tyr Pro, Ala Met Lys Pro Trp Ile Gln Pro Lys 含有ピーク
【図１】
0003782837.tif 000007
【図２】
0003782837.tif 000008