(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
連鎖球菌による感染中に発現され、且つヒトの血清から単離され少なくとも次の配列式（１）を有することを特徴とする精製された細菌タンパク質もしくはその免疫原性フラグメント。
0003744937.tif 000040
【請求項２】
次の性質の一方または両方を有することを特徴とする請求項１に記載の細菌タンパク質もしくはその免疫原性フラグメント。
（１）免疫主体保存抗原であること、および
（２）動物モデル（マウス）を敗血症感染から防御するヒト抗体と反応すること。
【請求項３】
心臓弁への結合に関与していることを特徴とする、請求項１または２に記載の細菌タンパク質。
【請求項４】
該タンパク質が、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus. oralis）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Streptococcus sobrinus）、ストレプトコッカス・ゴルドニー（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・サンギス（Streptoccocus sanguis）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・ミチス（Streptococcus mitis）、ストレプトコッカス・ミチオー（Streptococcus mitior）、ストレプトコッカス・パラサンギス（Streptococcus parasanguis）およびストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）から成る群の１つより得られることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細菌タンパク質もしくはその免疫原性フラグメント。
【請求項５】
配列ＹＥＶＥＫＥＬＶＤＬＰＶＥＰＳおよびＫＴＰＤＱＮＩＰＤＫＰＶＥＰＴのいずれか１つからなる免疫原性フラグメント。
【請求項６】
配列ＳＹＥＮＥＰＴＰＰＶＫＴＰＤ、ＥＰＡＰＶＡＰＳＹＥＮＥＰＴＰおよびＷＹＳＬＮＧＫＩＲＡＶＤＶＰＫのいずれか１つからなる免疫原性フラグメント。
【請求項７】
配列ＹＥＶＥＫＰＬＥＰＡＰＶＡＰＳからなる免疫原性フラグメント。
【請求項８】
配列ＫＴＰＤＱＰＥＰＳＫＰＥＥＰＴからなる免疫原性フラグメント。
【請求項９】
配列ＴＭＹＰＮＲＱＰＧＳＧＷＤＳＳからなる免疫原性フラグメント。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載の細菌タンパク質の断片である、免疫原性フラグメント。
【請求項１１】
連鎖球菌による感染中に発現されるタンパク質から得られる、請求項５〜９のいずれかに記載の免疫原性フラグメント。
【請求項１２】
さらに、タンパク質が心臓弁への結合に関与するものであることを特徴とする、請求項５〜９のいずれかに記載の免疫原性フラグメント。
【請求項１３】
連鎖球菌による感染を治療する医薬の製造に用いられる、請求項１〜４のいずれかに記載の細菌タンパク質に対する阻害剤の使用方法であって、阻害剤が請求項１〜１２の何れかに記載のタンパク質またはその免疫原性フラグメントに特異的な抗体からなる使用方法。
【請求項１４】
連鎖球菌による感染の診断薬の製造に用いられる、請求項１〜４のいずれかに記載の細菌タンパク質に対する阻害剤の使用方法であって、阻害剤が請求項１〜１２の何れかに記載のタンパク質またはその免疫原性フラグメントに特異的な抗体からなる使用方法。
【請求項１５】
連鎖球菌による感染のインビトロ検出法に用いられる、請求項１〜４のいずれかに記載の細菌タンパク質に対する阻害剤の使用方法であって、阻害剤が請求項１〜１２のいずれかに記載のタンパク質またはその免疫原性フラグメントに特異的な抗体からなる使用方法。
【請求項１６】
検出法が、酵素結合免疫吸着法、ラジオイムノ法、ラテックス凝集法およびイムノブロット法から成る群の１つより選ばれることを特徴とする、請求項１４または１５に記載の使用方法。
【請求項１７】
抗体またはその抗原結合性フラグメントが、ヒト組換え抗体またはその抗原結合性フラグメントである、請求項１３〜１６のいずれかに記載の使用方法。
【請求項１８】
連鎖球菌による感染のインビトロ検出法に用いられる、請求項１〜１２の何れかに記載のタンパク質またはその免疫原性フラグメントの使用方法。
【請求項１９】
連鎖球菌に対する診断薬の製造に用いられる、配列ＹＥＶＥＫＰＬＥＰＡＰＶＡＰＳ、ＴＭＹＰＮＲＱＰＧＳＧＷＤＳＳおよびＷＹＳＬＮＧＫＩＲＡＶＤＶＰＫから選択される少なくとも２つの免疫原性フラグメントの使用方法。
【請求項２０】
検出法または診断薬における検出法が、酵素結合免疫吸着法、ラジオイムノ法、ラテックス凝集法およびイムノブロット法から成る群の１つより選ばれることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の使用方法。
【請求項２１】
連鎖球菌による感染を治療する医薬の製造に用いられる、請求項１〜１２の何れかに記載のタンパク質またはその免疫原性フラグメントの使用方法。
【請求項２２】
連鎖球菌による感染中に発現される細菌タンパク質もしくはその免疫原性フラグメントをコードし、次の配列式（２）のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子。
0003744937.tif 000041
0003744937.tif 000042
【請求項２３】
ＤＮＡ分子がコードするタンパク質が、次の性質の一方または両方を有することを特徴とする請求項２２に記載のＤＮＡ分子。
（１）免疫主体保存抗原であること、および
（２）動物モデル（マウス）を敗血症感染から防御するヒト抗体と反応すること。
【請求項２４】
さらに、ＤＮＡ分子がコードするタンパク質が、心臓弁への結合に関与するものであることを特徴とする請求項２２または２３に記載のＤＮＡ分子。
【請求項２５】
請求項２２〜２４の何れかに記載のＤＮＡ分子を包含する発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
この発明は、連鎖球菌（Storeptococci）および腸球菌（Enterococci）による感染症、特に心内膜炎（endocarditis）および敗血症（septicaemia）の診断、予防および治療に関する。
心内膜炎は、一般に、連鎖球菌および腸球菌の感染によって引き起こされる。これらは、感染患者の心臓弁内で生育し、それに障害を与える細菌種である。心内膜炎は、現在、臨床的特徴、心エコー図および心雑音の存在によって診断されている。原因微生物は、血液培養によって同定される（培養陽性心内膜炎）のが一般的である。しかしながら、心内膜炎の感染患者のおよそ１０％において培養血液が陰性である。このことが診断を誤らせ、および／または治療を遅らせることになりかねない。
培養血液が陰性となる活性で感染性の心内膜炎が存在することは、今世紀の初頭から臨床学的にも認識されていた。そのような培養陰性心内膜炎の原因因子としては、（１）以前に抗生物質治療を受けたこと、（２）選好性で遅延生育性の細菌、および（３）非細菌性微生物などが挙げられる。
リウマチ熱、心臓弁障害または人工心臓を有する患者は、通常の歯科処置や胃腸処置を受けただけで二次的な連鎖球菌感染を受けて心内膜炎になる危険性がある。
さらに、近年大きくなっている問題は、バンコマイシン抵抗性腸球菌（vancomycin−resistent  enterococci：ＶＲＥ）の蔓延である。許可されている抗生物質の多くまたは全てに対して抵抗性のある腸球菌の出現は治療の選択の幅を少なくしており、最近の研究によれば、血液中にＶＲＥが存在した患者の３６．６％が死亡しており、バンコマイシンに感受性の腸球菌における１６．４％と対照的である。したがって、あらゆる種類の腸球菌、特にＶＲＥに対する治療が切望されている。
心内膜炎（特に培養陰性の心内膜炎）の診断法の一つは、患者の血清をイミノブロッティングして、原因微生物に対する抗生物質の増加レベル、および種特異性と考えられるイミノブトットのパターンを調べることである（Clark & Burnie, J. Clin. Pathol. 1991, 44, 152-156；Burnie et., J. Clin. Pathol, 1987, 40：1149-1158；Burnie & Clark, J. Immunol. Methods, 1989, 123：217-225）。しかしながら、連鎖球菌および腸球菌の個々の種（species）を同定することはできるが、種の間で幾つかの交差反応があり絶対的な診断を困難にすることがある。また、イムノブロッティングは、煩雑であるとともに高価である。
培養陽性心内膜炎および培養陰性の心内膜炎の両者に対する現行の治療に必要な抗生物質の中には高毒性のものがあり、例えば、バンコマイシンやゲンタマイシンは腎毒性や聴器毒性を有する場合がある。さらに、微生物がもはや存在しないと考えられる場合であっても熱がしつこく残存するために、抗生物質に対する患者の応答性を評価することは困難である。
本発明は、培養陽性心内膜炎および培養陰性心内膜炎の両者に特異的な連鎖球菌および腸球菌に起因する感染症の診断および治療（本明細書における「治療」とは予防を含むと解すべきものとする）する方法であって、これにより上述の問題を少なくともかなりの程度克服する方法を提供するものである。
実験により連鎖球菌抗原のクローニング、配列決定および特性分析を行った結果、連鎖球菌および腸球菌による感染中に発現されるタンパク質を決定することができ、それとともに、該蛋白質の免疫原性フラグメント（断片）であって、連鎖球菌および腸球菌による感染症の予防および治療に有用なフラグメントを得ることができた。
本発明に従えば、連鎖球菌または腸球菌による感染中に発現され、且つ、少なくとも以下の配列式（１）を有するヒト血清から分離された精製細菌タンパク質、または、その免疫原生フラグメント、または、その類縁体（アナログ）が提供される：
0003744937.tif 000002
式（１）における各アルファベット文字は独立したアミノ酸を表すと理解すべきであり、それぞれは、アミノ酸について慣用的に使用されている単一アルファベット文字である。
本発明に従い連鎖球菌または腸球菌による感染中に発現される細菌タンパク質は、該タンパク質の全体的な機能が保持されている限り、配列式（１）における１個またはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されたタンパク質を包含する。
本発明に従う細菌タンパク質は、さらに、次の性質の一方または両方を特徴とする。
（１）免疫主体保存（immunodominant conserved）抗原であること。
（２）敗血症感染に対して防御された動物モデル（マウス）における組換えヒト抗体であること。
本発明に従う細菌タンパク質は、さらに、心臓弁への結合にも関与していることも特徴とすることができる。
該細菌タンパク質は、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Streptococcus sobrinus）、ストレプトコッカス・ゴルドニー（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・サンギス（Streptoccocus sanguis）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・ミチス（Streptococcus mitis）、ストレプトコッカス・ミチオー（Streptococcus mitior）、ストレプトコッカス・パラサンギス（Streptococcus parasanguis）、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）から成る群の１つより得ることができる。
さらに、この細菌タンパク質は、バンコマイシン抵抗性のエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）およびエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）から成る群の１つより得ることもできる。
連鎖球菌または腸球菌による感染中に発現される細菌タンパク質の特定フラグメントには、任意のペプチドエピトープ（「免疫原性フラグメント（immunogenic fragments）」、例えば、数個のアミノ酸またはその類縁体が含まれる。そのようなエピトープとしては、YEVEKPLEPAPVAPS、SYENEPTPPVKTPD、KTPDQPEPSKPEEPT、EPAPVAPSYENEPTP、YEVEKELVDLPVEPS、KTPDQNIPDKPVEPT、TMYPNRQPGSGWDSSおよびWYSLNGKIRAVDVPKが挙げられる。このようなペプチドは、従来から存する液相または固相のペプチド合成技術を用いて合成することができる。
別の視点として本発明は特に、少なくとも配列式（１）もしくはその免疫原性フラグメント、またはその類縁体を含むアミノ酸配列を有し連鎖球菌または腸球菌による感染中に発現される組換え細菌タンパク質を提供する。
前述したように、心内膜炎に対する現行の治療は抗生物質によるものであり、他の症候が緩和された後でも熱が残存するために評価するのが困難になることが多い。抗生物質による治療の効率、例えば、最低阻害濃度、最低細菌濃度およびバック滴定を測るのに現在可能なテストは、単に微生物の感受性を測定するものであり、患者内の実際の微生物の死亡を検知するものではない。後に詳述するように、本発明者は初めて、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、ストレプトコッカス・ゴルドニー（S.gordonii）、ストレプトコッカス・サンギス（S.sanguis）およびストレプトコッカス・ミチス（S.mitis）による心内膜炎に罹り抗生物質治療を受けている患者においては、疾病の消退に伴い２週間以内にＩｇＭ力価が少なくとも５０％降下することを示した。このことによって抗生物質治療を成功させる直接的なマーカーが得られ、病原体の死亡に対する直接的なマーカーを示すことが初めて可能となった。このＩｇＭ抗体は心内膜炎に特異的であるので、培養陽性心内膜炎および培養陰性心内膜炎の双方、特に培養陰性心内膜炎の診断に用いることができる。
かくして、本発明は、連鎖球菌または腸球菌による感染中に発現する細菌タンパク質に対するＩｇＭ抗体を用いる培養陽性心内膜炎および培養陰性心内膜炎の診断方法も提供するものであり、ここで、該細菌タンパク質、したがって、該タンパク質に対して引き起こされるＩｇＭ抗体は、抗生物質治療の開始後の２週間以内に５０％降下するものであり、これにより病原体死亡のマーカーとして機能する。
その他の用途として、従来から存する技術を用い、連鎖球菌または腸球菌による感染、特に、培養陽性および培養陰性の心内膜炎を引き起こす細菌感染症の予防および治療に用いる活性阻害剤を得るためのスクリーニング法に本発明に従う細菌タンパク質を利用することができる。そのようなスクリーニング法も本発明の別の視点を形成するものである。
さらに別の用途において、本発明に従う細菌タンパク質は、抗体の産生に特に好適である。かくして、本発明のさらに別の観点に従えば、連鎖球菌または腸内菌による感染中に発現され、少なくとも配列式（１）もしくはその免疫原性フラグメントまたはその類縁体を含むアミノ酸配列を有し、免疫原として使用される細菌タンパク質が提供される。
当該細菌タンパク質に標準的な免疫学的手法を用いて免疫原として使用できるようにすることができる。かくして、例えば、このタンパク質を任意の好適な宿主（ホスト）に注入し、精製および／または濃縮後に血清を集めて所望の抗細菌タンパク質ポリクローナル抗体を得ることができる。宿主注入の前に適当な媒体（ベヒクル）中で該細菌タンパク質を調製することもでき、したがって、本発明のさらに別の観点に従えば、連鎖球菌または腸球菌による感染中に発現され少なくとも配列式（１）もしくはその免疫原性フラグメントまたはその類縁体を含むアミノ酸配列を有する細菌タンパク質とともに、薬剤的に許容できるキャリヤ（担体）、稀釈剤または賦形剤から成る組成物が提供される。
抗細菌タンパク質抗体を生成するためには、アフィニティクロマトグラフィを用い、アフィニティ媒体として本発明の細菌タンパク質を固定化したものを利用することができる。かくして、本発明の他の観点に従えば、連鎖球菌または腸球菌による感染中に発現され少なくとも配列式（１）もしくはその免疫原性フラグメントまたはその類縁体を含むアミノ酸を有する細菌タンパク質であって、不溶性支持体（担体）に共有結合された細菌タンパク質が提供される。
細菌タンパク質もしくはそのフラグメントまたはその類縁体の各種の誘導体を用いて該タンパク質、もしくはフラグメントまたは類縁体を阻害（抑制）することができる。感染中に発現される本発明の細菌タンパク質を免疫原として用いて抗体を産生させることにより、タンパク質の作用に対する阻害物（抑制剤）の１種が得られる。一般に該細菌タンパク質の阻害剤は連鎖球菌または腸菌による感染、特に、培養陽性心内膜炎および培養陰性心内膜炎の両者の診断、そして特に予防と治療に有用であると期待され、したがって、本発明の別の特徴を形成する。阻害剤としては、感染中に発現される細菌タンパク質に対する拮抗物質、またはその産生を抑止する物質が含まれる。好適な阻害剤の例としては、当該細菌タンパク質の作用を拮抗する薬剤（抗体を含む）および感染発現される細菌タンパク質の化学的類縁体、および当該細菌タンパク質の産生を抑止する抗センスＲＮＡおよびＤＮＡが挙げられる。好適な阻害剤は適当なスクリーニング法で決定することができ、例えば、試験モデル、例えば動物モデル（マウスモデル）で、阻害剤候補の能力、すなわち、連鎖球菌または腸球菌による感染中に発現されるような本発明に従う細菌タンパク質もしくはその免疫原性フラグメントまたは、その類縁体の作用を拮抗し、またはその産生を特視する能力を測定することによって行われる。
さらに、従来から存する手法を用いる適当なエピトープマッピングにより［Geysen他、J. Immunol. Methods, 102：259-274（1987）；Hopp and Woods, PNAS USA, 78（６）：3824-3828（1981）；Novotny他、PNAS USA, 83：226-230（1986）］、感染中に発現される細菌タンパク質のペプチドフラグメントを同定して、化学的に合成することもできる。このタイプの合成ペプチド抗原は、前述したように、阻害剤を産生、例えば、診断および治療に用いられる抗体を産生させるのに用いられ、または、抗血清、例えばワクチンに用いられる非特異性ポリクローナル抗血清を産生させるのに用いられることができ、前述のように本発明のさらに別の特徴を形成するものである。
本発明の別の視点に従えば、連鎖球菌または腸球菌による感染中に発現される細菌タンパク質であって、少なくとも配列式（１）もしくはその免疫原性フラグメントまたはその類縁体を含むアミノ酸配列を有するタンパク質の誘導体であり、当該タンパク質もしくはそのフラグメントまたはその類縁体を阻害する誘導体が提供される。
そのような阻害剤は、単独で、または、適当な場合には他の薬剤、例えば、他の抗生物質と組合わせることにより有用である。
本発明のこの視点に従う特に有用な阻害剤の群は、当該細菌タンパク質を認識しそれに結合する能力を有する抗体である。
かくして、本発明のさらに別の視点に従えば、連鎖球菌または腸球菌による感染中に発現され少なくとも配列式（１）もしくはその免疫原性フラグメントまたはその類縁体を含むアミノ酸配列を有する細菌タンパク質の１つまたはそれ以上のエピトープに対して特異的な単離、精製された抗体が提供される。
この抗体は、全体が抗体であるものでもよいし、または、その抗原結合性フラグメントであってもよく、また、一般にどのイムノグロブリンクラスに属するものでもよい。かくして、例えば、この抗体は、イムノグロブリンＭ抗体であり、そして、特に、イムノグロブリンＧ抗体である。この抗体またはそのフラグメントは、動物由来のもの、例えば、哺乳動物由来のものであり、例えば、ネズミ、ラット、またはヒト由来のものである。この抗体は、天然の抗体またはそのフラグメントであってもよいし、所望される場合には、組換え抗体フラグメント、すなわち、組換えＤＮＡ技術を用いて調製された抗体または抗体フラグメントであってもよい。
特別の組換え抗体または抗体フラグメントとしてはヒト組換え抗体が挙げられ、特に以下のものが挙げられる。（１）抗原結合部位を有する抗体またはフラグメントであって、少なくともその一部が別の抗体から誘導されたもの。例えば、１つの抗体の超可変または相補性決定領域が第２の別の抗体の可変構造領域に結合されたもの（ヨーロッパ特許明細書第２３９４００号の記載されているようなもの）、（２）非Ｆｖ配列が他の別の抗体の非Ｆｖ配列によって置換された組換え抗体またはそのフラグメント（ヨーロッパ特許明細書第１７１４６９号、１７３４９４号および１９４２７６号に記載されているようなもの）、または（３）実質的に天然のイムノグロブリン構造を保有する組換え抗体またはフラグメントであるが、ヒンジ領域のシステイン残基の数が天然のイムノグロブリンに見出されるものとは相違しており、該組換え抗体またはフラグメントの表面ポケット中の１つまたはそれ以上のシステイン残基が該天然イムノグロブリンに存在する他のアミノ酸残基に代わっているようになったもの（国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ８８／００７３０およびＰＣＴ／ＧＢ８８／００７２９に記載されているようなもの）。
この抗体または抗体フラグメントは、ポリクローナルであってもよいが、モノクロナール源のものが好ましい。それらは、当該細菌タンパク質の単一のエピトープまたは複数のエピトープに対して特異的なものである。
抗原結合性抗体フラグメントとしては、例えば、F(ab')2、Fab'またはFabフラグメントのように、全抗体のタンパク質加水分解切断によって得られたフラグメント、または、Ｆｖフラグメントのように、組換えＤＮＡ技術によって得られたフラグメント（国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ８８／０７４７に記載されているようなもの）が挙げられる。
本発明に従う抗体は、感染中に発現される当該細菌タンパク質を抗原として用い、周知の免疫学的技術により調製することができる。かくして、例えば、好適な宿主（ホスト）に細菌タンパク質を注入し、適当な精製および／または濃縮（例えば、固定化した細菌タンパク質をアフィニティ媒体としたアフィニティクロマトグラフィによる）の後に血清を集めて所望のポリクローナル抗体が得られる。別の方法として、例えば、Kohler等によるEur. J. Inmunol. 6：511, 1976の方法を用いて、細菌タンパク質を注入した宿主から脾細胞またはリンパ球を回収して不死化し、得られた細胞を分離して、抗連鎖球菌または腸球菌細菌タンパク質モノクローナル抗体を産生する遺伝学的に単一のセルラインを得ることもできる。抗体フラグメントは、従来から存する技術、例えば、ペプシンまたはパパインを用いる酵素分解により製造することができる。本発明に従う組換え抗体を製造することが所望される場合には、例えば、ヨーロッパ特許出願第１７１４６９号、第１７３４９４号、第１９４２７６号および第２３９４００号に記載されているような方法を用いて製造することができる。
本発明に従う抗体は、従来から存する手法を用いて、検出可能なラベルで標識化することができ、また、エフェクター分子、例えば、抗菌剤またはトキシンまたは酵素のような薬剤と複合化することもでき、そのような標識化抗体または抗体複合体も本発明に包含される。
本発明に従う抗体は、診断および／または予防および／または治療に利用される。すなわち、診断用には、この抗体を使用して、宿主（ホスト）生物中に細菌タンパク質が存在するかを検知し、宿主に特別の連鎖球菌または腸球菌の感染があったかを確認し、とりわけ、培養陰性の心内膜炎においてそのような生物の存在を調べ、および／または、そのような感染症の治療の進行を監視することができる。このような診断法は、本発明の別の特徴を形成するものであり、一般的には、標準的な技術、例えば、酵素結合免疫吸着法、ラジオイムノ法、ラテックス凝集法またはイムノブロッティング法のような免疫学的方法を利用する。
本発明に従う抗体は、さらに、上述したように、連鎖球菌または腸球菌による細菌感染症の治療に用いることもでき、単独で用いられてもよく、またはエフェクター分子と複合化することもでき、後者の場合は、感染微生物をエフェクター分子、例えば抗菌剤で攻撃するのに用いられる。治療用途においては該抗体は従来の手法に従って製剤化され、例えば、薬剤として許容されるキャリヤまたは賦形剤（例えば等張塩溶液）とともに製剤化され、治療すべき感染症の特徴や患者の年齢に応じた適当な用量で投与されるようにする。
所望ならば、抗体の混合物を用いて診断および／または予防および／治療を行うこともでき、例えば、本発明に従う細菌タンパク質の異なるエピトープを認識するような２種類の抗体から成る混合物、および／または、本発明の細菌タンパク質の同じまたは異なるエピトープを認識する異なるクラスの抗体から成る混合物、例えば、ＩｇＧ抗体とＩｇＭ抗体の混合物を用いることもできる。
本発明に従うタンパク質またはそのフラグメント、類縁体、阻害剤、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ヒトまたは動物の身体の治療法または診断法に用いることができる。
診断テスト法は、酵素結合免疫吸着法、ラジオイムノアッセイ、ラテックス凝集アッセイおよびイムノブロットアッセイより成る群の１つから選ぶことができる。
そのようなタンパク質、フラグメント、類縁体、阻害剤、抗体または抗原結合性フラグメントは、薬剤として許容できるキャリヤ（担体）、稀釈剤または賦形剤と組み合わせて、ヒトまたは動物の身体の診断法または治療法に使用される組成物の一部を形成することができる。
本発明に従う細菌タンパク質は、各種の方法により調製することができ、例えば、イオン交換やゲルクロマトグラフィおよび電気泳動法のような従来から存する分離技術を用いて適当な細菌細胞抽出物からタンパク質分画することにより、または、後述の「実験」の項で詳述するように、組換えＤＮＡ技術を利用することにより調製される。組換えＤＮＡ技術を用いることは、本発明に従う実質的に純粋な細菌タンパク質を調製するために特に好適である。
かくして、本発明のさらに別の視点に従えば、連鎖球菌または腸球菌による感染中に発現され少なくとも配列式（１）もしくはそのフラグメントまたはその類縁体を含むアミノ酸配列を有する細菌タンパク質を製造するための方法であって、（１）該タンパク質の前駆体（プリカーサー）をコードする遺伝子を含むベクターにより形質転換された宿主生物を培養する工程、および（２）該タンパク質を回収する工程から成る方法が提供される。
本発明のこの視点において切断される前駆体は、好ましくは、形質転換された宿主生物において産生されるタンパク質の少なくとも一部と少なくともアミノ酸配列式（１）とから成る融合タンパク質である。そのような融合タンパク質も本発明の別の特徴を形成する。この融合タンパク質は、形質転換された宿主生物により高レベルで産生されるタンパク質を含むことが望ましい。そのようなタンパク質として好適なものとしては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）タンパク質の少なくとも一部、または、β−ガラクトシダーゼタンパク質の少なくとも一部が挙げられる。
本発明のさらに別の視点に従えば、連鎖球菌または腸球菌による感染中に発現される細菌タンパク質もしくはその免疫原性フラグメントまたはその類縁体をコードし、実質的に以下のヌクレオチド配列式（２）を有するＤＮＡ配列およびその相同体（homologues）が提供される。
0003744937.tif 000003
0003744937.tif 000004
0003744937.tif 000005
本発明に従うＤＮＡ配列の別の特徴は、該配列がコードする細菌タンパク質が、次の特性の一方または両方を有しているということである。
（１）免疫主体保存抗原であること、および
（２）敗血症感染に対して防御された動物モデル（マウス）における組換えヒト抗体であること。
さらに、ＤＮＡ配列は、それがコードするタンパク質は心臓弁への結合に関与しているということも特徴である。
この配列を有するＤＮＡは、後の「実験」の項で記述するように細菌ゲノムＤＮＡから得ることができる。
本発明のＤＮＡ配列は、従来からの技術を用いて発現ベクターに導入することができる。したがって、本発明の別の視点として、実質的にＤＮＡ配列式（２）またはその相同体を含有する発現ベクターが提供される。
このベクターは、適当な選択マーカー、プロモーター、その他の必要なコントロール領域が付与されることにより、所定の宿主細胞中で使用され得るようになる。そのようなベクターにより形質転換された宿主細胞も本発明の別の特徴を形成するものである。好適な宿主細胞としては、細菌（例えば大腸菌）および組織培養の哺乳動物細胞が挙げられる。
ＤＮＡ配列式（２）は、また、感染状態における連鎖球菌および腸球菌の存在を確認するのに用いるＤＮＡプローブを構築するのに用いることもでき、そのようなプローブも発明に包含される。さらに、そのようなプローブは、例えばポリメラーゼチェイン反応を用いて、循環している細菌の核酸を検知して、そのような細菌感染の診断法として用いることもできる。プローブは、従来から存する技術を用いて合成することができ、固相上で固定化したり、あるいは、検出可能なラベルで標識化することもできる。
本発明に従うＤＮＡ配列、ベクター、プローブまたは阻害剤は、ヒトや動物の身体の治療法または診断法において利用される。
連鎖球菌および腸球菌は、心臓弁に結合してそれに障害を引き起こすことにより心内膜炎を引き起こすことは知られている。連鎖球菌が心臓弁組織にまたは人工弁に結合するときの可能な作用機構として提示されているのは、フィブロネクチンのような細胞外のマトリックスタンパク質に連鎖球菌が予め結合し、これによって、障害を受けた弁表面への細菌の固着とコロニー形成が起こるということである（Lowrance他、J. Clin. Invest., 1990, 86：7-13）。これは、フィブロネクチンが該細菌に対する組織レセプターとして作用することを示唆している。しかしながら、我々が初めて明らかにしたところによれば、心内膜炎におけるフィブロネクチンの役割に関する従来の学説は正しくない。我々の研究によれば、後述するように、フィブロネクチンに対する抗体は、ＰＡｃに結合し、フィブロネクチンとの事前交差吸収により、中和され、ＰＡｃはフィブロネクチンと同様に、障害を受けた心臓弁に直接（フィブロネクチンを介するのではなく）結合することを示している。この分子仮説は、ＰＡｃの立証できる作用機構である。かくして、本発明は、連鎖球菌または腸球菌による感染に対するヒトまたは動物の身体の治療法または診断法において用いられるフィブロネクチンもしくはその免疫原性フラグメントまたはその類縁体、またはフィブロネクチンに対する抗体またはその抗原結合性フラグメントも提供するものである。
さらに、「実験」の項で、後述するように、本発明者が初めて明らかにしたところによれば、ストレプトコッカス・オラリス（S. oralis）、ストレプトコッカス・ゴルドニー（S. gordonii）およびストレプトコッカス・サンギス（S. sanguis）感染による心内膜炎の患者からの血清は、約８５ｋＤａの抗原であり、熱ショック９０分子に特異的なマウスモノクローナル抗体と反応する抗原を有する。我々は、さらに、終点で死亡するマウスのS. oralisモデルにおいては、ＨＳＰ９０に特異的な抗体は統計学的に有意の生存率の増加を示すことも明らかにした。このことは、該抗原はＨＳＰ９０グループに属することを示している。かくして、ＨＳＰ９０に対する抗体は、ストレプトコッカス・オラリス（S. oralis）、ストレプトコッカス・ゴルドニー（S. gordonii）およびストレプトコッカス・サンギス（S. sanguis）によって引き起こされた感染症の診断および治療に用いることができる。
かくして、本発明は、ストレプトコッカス・オラリス（S. oralis）、ストレプトコッカス・ゴルドニー（S. gordonii）およびストレプトコッカス・サンギス（S. sanguis）による感染症のヒトまたは動物の診断法または治療法において用いられる、ＨＳＰ９０に特異的な抗体もしくはその免疫原性フラグメントまたはその類縁体を提供する。
本発明の実施例を示す以下の「実験」の項から本発明はさらに明らかになるであろう。
実  験
１．抗体応答特性
次の症例から血清を入手した。
ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）による敗血症１２例、
ストレプトコッカス・ゴルドニー（Streptococcus gordonii）による心内膜炎１４例、
ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）による心内膜炎２例、
ストレプトコッカス・サンギス（Streptococcus sanguis）による心内膜炎２例、
心内膜炎の臨床的症状を有さず、好中球減少のない患者からのコントロール血清２０、および
心内膜炎の臨床的症状を有さず、好中球減少のある患者からのコントロール血清２０。
２．種の同定
上述の血清を用いて、可能なときには、Beighton他によるJ. Med. Microbiol., 1991, 35 ：367-372に記載の方法に従って原因微生物の同定を行った。すなわち、ストレプトコッカス・オラリス（S. oralis）の６例については単離物が入手できたので、JM Hardie（個人的な依頼）によりストレプトコッカス・オラリス（S. oralis）と同定された。その他は、アエスクリン（aesculin）陰性でラフィノース（raffinose）陰性なビリダンス（viridans）連鎖球菌であり、ストレプトコッカス・ゴルドニー（S. gordonii）（これは１００％アエスクリン陽性であり）やストレプトコッカス・ミチス（S. mitis）（これは１００％ラフィノース陽性）ではないと決定され、また、おそらくストレプトコッカス・サンギス（S. sanguis）（これは７５％アエスクリン陽性で７５％ラフィノース陽性）でもないと判断された。ストレプトコッカス・ゴルドニー（S. goudonii）の１４例およびストレプトコッカス・サンギス（S. sanguis）の２例については、そのうちの３例の単離物について、ストレプトコッカス・ゴルドニー（S. gordonii）と断定された。その他については単離物が得られなかったが、当初のＡＰＩプロフィルがアエスクリン陽性であることを示していた。このことからストレプトコッカス・ミチス（S. mitis）でないと判断され、また、おそらくストレプトコッカス・オラリス（S. oralis）（１８％アエスクリン陽性）でもないと判断された。次いで、これらをストレプトコッカス・ゴルドニー（S. gordonii）およびストレプトコッカス・サンギス（S. sanguis）に対するＩｇＭ応答の強さに従ってストレプトコッカス・ゴルドニー（S. gordonii）またはストレプトコッカス・サンギス（S. sanguis）のいずれかに分けた。ストレプトコッカスス・オラリス（S. oralis）の心内膜炎の例は、Beighton他による方法（1991）に従って同定された。
３．イムノブロティング用菌株源
Burnie他によるJ. Clin. Pathol., 1987, 40：1149-1158に概説されたプロトコールに従い、S. sanguis NCTC 7863, S. oralis NCTC 7864および S. goudonii NCTC 7868から抗原抽出液を調製した。
４．イムノブロティング
次いで、上述した菌株を用い、Burnie他（1987）に記載されているようにイムノブロッティングを実施した。
前述した患者血清のイムノブロットの結果は、表１（S. oralis）、表２（S. gordonii）および表３（S. sanguis）ならびに図１〜図５（Figure 1〜Figure 5）にまとめられている。
図１は、S. oralisによる敗血症についてのイムノブロットを示す。３症例からの前血清および後血清のそれぞれについてＩｇＭおよびＩｇＧの抗体変化が示されている。
図２は、S. gordoniiによる心内膜炎のイムノブロットを示す。トラック１はS. gordonii NCTC 7868に対する抗フィブロネクチン抗体、また、トラック２はフィブロネクチンに対する交差吸収を示す。トラック３〜８は、S. gordonii心内膜炎の３症例におけるそれぞれＩｇＭおよびＩｇＧを示す。
図３は、S. gordonii心内膜炎のさらに５症例についてS. gordonii抗原に対する結果をトラック１／２，３／４，５／６，９／１０および１１／１２に示している。トラック７／８はトラック９／１０と同じ症例について抗体レベルを前処理したものについて示したものであり、ＩｇＭは約８５ＫＤａにおけるバンド、またＩｇＧは約１８０、５８、５６および５２ＫＤａにおけるバンドに対して上昇していることが示されている。
図４は、S. oralis心内膜炎のイムノブロットを示し、トラック３／４はＩｇＭとＩｇＧを示し、S. oralisの１８０ＫＤａバンドと交差反応する抗フィブロネクチン抗体がトラック１、そして、フィブロネクチンとの交差吸収の効果がトラック２に示されている。
図５は、S. sanguis心内膜炎についてのイムノブロットを示すものであり、２症例の両方についてのＩｇＭ（トラック３および５）およびＩｇＧ（トラック４および６）、S. sanguisの１２０ＫＤａバンドと交差反応する抗フィブロネクチン抗体をトラック１、また、フィブロネクチンとの交差吸収の効果をトラック２に示す。
注解
(a)S. oralis敗血症
感染からの回復時に約１８０ＫＤａのバンドに対するＩｇＭおよび／またはＩｇＧ。
(b)S. gordonii心内膜炎
以下のバンドに対するＩｇＧがさらに検出された。すなわち、約１８５ＫＤａ（１例）、１６５ＫＤａ（２例）、１５５ＫＤａ（１例）、１４０ＫＤａ（１例）、１３２（１例）、１１０（１例）、９４（１例）、６１ＫＤａ（１例）、５０ＫＤａ（１例）および４５ＫＤａ（１例）。４５ＫＤａバンドに対する追加のＩｇＭが検出された（１例）。S. gordonii NCTC 7868由来の８５ＫＤａおよび１８０ＫＤａのバンドに対して大部分の症例がＩｇＭ、そしてすべて症例がＩｇＧを有している。他の免疫主体バンドは約６５ＫＤａおよび４７ＫＤａにおけるものを含んでいた。
(c)S. oralis心内膜炎
１つの症例が以下のような追加の抗体を有していた。すなわち、約１８０、１４０および６５ＫＤａにおけるバンドに対するＩｇＭ、ならびに、約１８０、１４０、１２０、５８、５１、４６および３５ＫＤａにおけるバンドに対するＩｇＧ。いずれの症例も、S. oralis NCTC 7864由来の８５および１８０ＫＤａのバンドに対するＩｇＭおよびＩｇＧを有していた。
(d)S. sanguis心内膜炎
患者は両方とも、S. sanguis NCTC 7863由来の約１２０および８５ＫＤａにおけるバンドに対する抗体（ＩｇＭおよびＩｇＧ）を産生していた。
(e)S. sobrinus / S. mutans心内膜炎
イムノブロッティングにより、心内膜炎患者は約１８５、２００および２２０ＫＤａにおける３つのバンドに対して抗体（ＩｇＭおよびＩｇＧ）を有していたことが示された。
さらに、８５ＫＤａにおけるバンド（S. oralis NCTC 7864, S. gordonii NCTC 7868およびS. sanguis NCTC 7863）は、いずれも、熱ショック９０分子に特異的なマウスモノクローナル抗体（ＬＫＶＩＲＫに対する。本出願人による先行特許出願ＷＯ９２／０１７１７、ＷＯ９１／００３５１およびＧＢ２２７００７６参照）と反応し、この分子がＨＳＰ９０グループに属することが示された（図６参照）。同図において、トラック１はS. oralis NCTC 7864、トラック２はS. goudonii NCTC 7868、トラック３はS. sanguis NCTC 7863、トラック４はS. oralisの臨床単離物である。
５．S. sobrinusおよびS. oralisの免疫主体抗原のクローニング
５−１  S. sobrinusクローニング
(i)ＤＮＡ単離とラムダＺＡＰIIライブラリー作成
Manchester大学バクテリアコレクションNo.２６３（ＭＵＣＯＢ２６３）のS. sobrinus株をストレプトコッカス・ソブリヌス（S. sobrinus）源として用いた。当初、このＭＵＣＯＢ２６３微生物は、上記刊行物に示されたところによればストレプトコッカス・ミュータンス（S. mutans）と判断された。しかしながら、この菌株を詳細にテストしたところ、ＭＵＣＯＢ２６３は、生化学的にはS. sobrinusにより近いものであることが示された（D. Brattal教授との個人的交信による）。今後の混乱を避けるため、この微生物をS. sobrinus ＭＵＣＯＢ２６３と命名し直すことにする。０．２％グルコースおよび４０ｍＭのＤ，Ｌ−スレオニン（シグマ社製）を含有する脳−心臓浸出培養液中、３７℃において振動させながら一晩、細菌細胞を培養した。この細菌を５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してハーベストした後、洗浄し、１２．５ｍｌの０．０２Ｍトリス（ｐＨ８．２）に再懸濁させた。次いで蒸留水に溶かした２０Ｍポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２４％の２５ｍｌを添加し混合した。リソチームを３４．６ｍｇ／ｍｌ（１００μｇ／ユニットに相当）で添加し、ＯＤ６００を測定し、細菌培養液の１０倍稀釈液を得た。３７℃で１時間保持した後、生成したスフェロブラストを５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、および１ｍＭのＥＤＴＡ（ＴＥ）の５０ｍｌに完全に再懸濁させた。このスフェロブラストを１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の５０ｍｌを用いて６０℃で１５分間、溶解した。標準的手法（Maniatis他、Molecular Cloning - A laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbour, New Youk, 1989）を用い、ＲＮＡａｓｅ−Ａ（シグマ社製）で処理し（このＲＮＡａｓｅを１００℃で１５分間、予め沸騰しておく）、プロテアーゼＫで処理し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、さらにエタノールで沈殿させた。０．３Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．２）の存在下におけるエタノール沈殿によりプラスミドＤＮＡを除去した。４℃において３６時間、ＴＥで透析することによりさらに精製を行った。
このＤＮＡを機械的に剪断し、ＥｃｏＲＩリンカーを添加し、分画し、ラムダＺＡＰIIベクターアームにインサートを結合させた。当該ライブラリーは２ｋｂ〜７ｋｂの範囲のインサートサイズを有した。
(ii)抗体スクリーニング
心内膜炎患者から血清を採取し、抗体スクリーニングに用いた。Escherichia coli XL1 - Blue細胞を、Ｌ寒天培養液（バクトートリプトン１０ｇ／ｌ，酵母抽出物５ｇ／ｌ，塩化ナトリウム１０ｇ／ｌ，マルトース２ｇ／ｌ，バクト-寒天１５ｇ／ｌ）に、約３，０００ｐｆｕ／８５ｍｍで感染させた。プラークをニトロセルロース（ポアサイズ０．４５μｍ，ドイツGottingennのSartorius AG製）に移し、４２℃で３時間培養した後、３７℃で２時間、１０ｍＭのイソプロピルＢ-Ｄ-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含浸させた。これらのフィルターを、緩衝塩溶液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス）中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，シグマ社製）を用いて一晩ブロックした。フィルターに３％ＢＳＡで１００倍に稀釈した患者血清を添加し、室温で２時間培養し、次いで、フィルターを洗浄液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％）で３０分間洗浄した後、第２の抗体、すなわち、ＢＳＡ３％に溶かした抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲート（シグマ社製）を添加した。室温で１時間保持した後、フィルターを再び洗浄し、等体積のナフトールＡＳＭＸホスフェート（シグマ社製、蒸留水に溶かした０．４ｍｇ／ｍｌ溶液）とFast Red ＴＲ塩［シグマ社製，０．２Ｍのトリス（ｐＨ８．２）中の６ｍｇ／ｍｌ溶液］（Fast Red染色剤）で染色した。陽性プラークを、２００μｌのＳＭ（１００ｍＭの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス−ＣｌｐＨ７．５、１０ｍＭの硫酸マグネシウム、ゼラチン０．０００１％）および２〜３滴のクロロホルムを含有する１．５ｍｌの試験管に移した。上述の方法によりプラークの精製を行った。
(iii)抗原を指標とする抗体の選択
再懸濁したE. coli XL1 - Blue細胞の１００μｌアリコート２つに、精製した陽性ファージの高力価ストックの稀釈物を感染させて５，０００ｐｆｕ／８５ｍｍＬブロス寒天プレートとなるようにした。ファージ吸着は３７℃、３０分間行われた。吸着ミックスをＬアガロース培養液０．８％の２．５ｍｌアリコートに添加し、混合し、Ｌブロス寒天プレートに注入した。これらのプレートを４２℃で２．５時間培養した後、１０ｍＭのＩＰＴＧ中に予備浸漬し、室温で少なくとも１時間乾燥させたニトロセルロースフィルター（ポアサイズ０．４５μｍ、Sartorius社製）を添加し、３７℃で一晩培養した。次いで、各フィルターをトリス緩衝塩溶液[１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．２）]で３０分間にわたり３回洗浄し、３％ＢＳＡ中、４℃において一晩ブロックした。ＢＳＡ３％に溶かした患者血清の１０倍稀釈液をフィルターに加え、振動しながら室温で３時間培養した。この血清を取出し、涸渇血清（depleted serum）と呼び、４℃で保存した。フィルターを、Ｔｗｅｅｎ２０−トリス緩衝塩溶液［１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．２）、Ｔｗｅｅｎ２０，０．０５％］を用いて１００分間にわたり５回洗浄し、さらに塩−Ｔｗｅｅｎ２０溶液（１５０ｍＭの塩化ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％）で一回洗浄した。５ｍｌのグリシン／塩緩衝液［１５０ｍＭの塩化ナトリウム、２００ｍＭのグリシン−Ｃｌ（ｐＨ２．８）］を加え室温下に３０分間振動させることにより、結合した抗体を溶出させた。１００μｌ当たり０．０４ｇのトリスを含有する容器内に緩衝液を吸引し、溶出抗体（eluted antibody）と呼び、４℃で保存した。当初の血清、涸渇血清および溶出抗体を一次抗体として用い、上述したイムノブロット法にほぼ従って、S. sobrinus ＭＵＣＯＢ２６３のウエスタンブロットを実施した。抗原は、Ｘプレス中で粉砕した後の当該菌株の上清とした。二次抗体は、３％ＢＳＡに溶かした抗ヒトＩｇＭおよびＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲートの１０００倍稀釈液とした。
結果
培養陽性の心内膜炎患者血清から当初に選択された６０，０００ｐｆｕから抗体陽性の６クローンが単離、精製された。このような抗原を指標とする抗体選択（antigen-directed antibody selection）によれば、溶出抗体が約１８５ＫＤａ抗原に結合していることから、クローニングされ発現された配列はS. sobrinusと共通のエピトープを含むことが示された。
(iv)ＤＮＡインサートのインビボ切除
テトラサイクリン１２５μｇ／μｌを含有するＬブロスで３７℃において培養した。E. coli XL1 - Blue細胞の一夜培養物１０ｍｌを２，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離し、１０ｍＭの硫酸マグネシウム４ｍｌ中に再懸濁させ、４℃ににおいて培養した。E. coli XL1 - Blue細胞２００μｌ、高力価抗体陽性ファージ（１．７８×１０8／８５ｍｍプレート）１８０μｌおよびＲ４０８ヘルパーファージ１μｌを５０ｍｌのプラスチック製円錐管内で混合し、３７℃で１５分間培養した（ヘルパーファージおよびE. coli XL1 - Blue細胞はＣＬＯＮＴＥＣＨから入手）。次いで、この二重感染細菌に２×ＹＴ培地［塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、バクト−トリプトン１６ｇ／ｌ（ｐＨ７．０）］５ｍｌを添加し、振動下に３７℃において３時間培養した。細胞を７０℃で２０分間加熱することにより細胞を殺し、次に５分間激しくかきまぜることにより破砕した。該細胞を４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ｐBluescriptＳＫ（−）ファージミドを含有する上清をデカンテーション採取して、４℃において保存した。ファージミド溶液１０μｌを再懸濁E. coli XL1 - Blue細胞２００μｌに添加し、培地を３７℃で１５分間培養し、さらに、Ｌブロス寒天プレート（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有）に１μｌ、２５μｌ、７５μｌおよび１００μｌアリコートでまくことにより、ファージミドを増殖させた。
(v)プラスミドＤＮＡの調製と変性
Magic（ＲＴＭ）MinipresＤＮＡ精製システム（Promega製）を用いて細菌コロニーからｐBluescriptＳＫ（−）プラスミドＤＮＡを精製し、Maniatis他による方法（１９８９）によってアルカリ変性した。すなわち、ＤＮＡ１．５から２００μｇを含有する溶液８μｌを２Ｍ水酸化ナトリウムの２μｌに加え、軽く攪拌、遠心した後、１０分間室温下に放置した。次いで、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）３μｌ、蒸留水７μｌおよび−２０℃の無水エタノール６０μｌを添加し、−７０℃で３０分間ＤＮＡを沈殿させた。沈殿物を１３，０００ｒｐｍで１分間、ペレットにし、−２０℃のエタノール７０％で洗浄し、そして、真空乾燥した。乾燥後のペレットを−２０℃で保存した。
(vi)ＤＮＡ配列決定
Sequenase（Ｒ）Version ２．０（Cambridge Bioscience製）を用い２段階連鎖停止法に従ってＤＮＡ配列決定を行った。アニーリング工程は６６℃で２分間行い、ラベル化は、２２℃で４分間行い、そして停止反応は３８℃で５分間行った。二次構造を含む領域は、ｄＧＴＧをｄＩＴＰで置換することにより分解した。４６〜５１℃において１１、８、５および２時間、配列決定反応を行った。
(vii)ＴＡクローニング（ＲＴＭ）によるサブクローニング
ファージミドクローンは、クローニングされた遺伝子の５′末端を有してはいないので、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＴＡクローニング（ＲＴＭ）に従い５′末端をサブクローニングすることにした。０．０μｇ、０．７μｇのS. sobrinus ＭＵＣＯＢ２６３ゲノムＤＮＡを含有する２つの試験管のそれぞれに以下に示すＰＣＲ試薬を添加し蒸留水を加えて全量が６４．３μｌとなるようにした；０．１μｇ／μｌのプライマー１（ＣＡＧＴＣＴＣＣＧＴＣＣＣＡＡＣＧＡＣＴＧＣＧ）５．３μｌ、０．１μｇ／μｌのプライマー２（ＧＣＴＣＣＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＴＧＧＴＣ）４．４μｌ、１０×Ｔａｑ緩衝剤（Northumbria Biochemicals社製、Northumberland）（ｎｂ１）１０μｌ、およびｄＮＴＰ［ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ（Promega製）の各１２．５μｌが９５０μｌの脱イオン水に添加されたもの］１６μｌ。次いで、ＰＣＲ反応系の上にミネラルオイルの層を注意深く設け、９５℃において１０分間ＤＮＡを変性し、２．５WeissユニットのＴａｑ（ｎｂ１）を添加した。ＰＣＲの条件は、９４℃で１．５分間、５０℃で１．５分間、および７２℃で３分間で３０サイクルとした後、７２℃において１０分間で最終的な伸長を行った。ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ■切断ラムダＤＮＡマーカーと並べて、５０ボルトで２時間、ＰＣＲ生成物（３０μｌ）をＴＢＥゲル０．８％の上を流した。
ＴＡクローニング（ＲＴＭ）システムVersion １．３（InVitrogen Corporation, British Biotechnologies社製、Oxon）を用い、メーカープロトコールに従い、インサートＤＮＡのサブクローニングを行った。１２℃において一晩、０．７μｇのＰＣＲ反応系を蒸留水で４倍に稀釈したもの３．０μｌ、０．７μｇのＰＣＲ反応系を２倍に稀釈したもの４．７μｌ、および陰性コントロールを含有する連結反応を行った。形質転換に際しては、３７℃で一晩培養の後に白色の組換え体コロニーを選び出し、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトイラノシド（Ｘ−Ｇａｌ−２５μｌ、４０ｍｇ／ｍｌ溶液／プレート）に２回まき、純粋で安定なサブクローンを得た。S. sobrinusからクローニングされたＤＮＡの起源をサザンブロティングにより確認した。得られた全配列を表４に示す。
５．２  S. oralisクローニング
これは記述した方法と本質的に同じ方法で行った。違いは、ベクターがラムダｇｔｌ１であったということ、およびＤＮＡ源がストレプトコッカス・オラリス（Streptcoccus oralis）の臨床単離物であったということである。ライブラリーは、ＥｃｏＲＩで部分的に分解したゲノムＤＮＡライブラリーであった。陽性な１０クローンが同定され、そのうちの１つについてＴＡクローニング（ＲＴＭ）システムによりサブクローニングを行った。S. oralisからのクローンの起源の確認はサザンブロティングによって行った。抗原を指標とする抗体選択により、S. oralisの１８０ＫＤａ抗原と交差反応するエピトープを有することが示された（図７参照）。この図において、トラック１および３は、S. oralisに対する抗体を有する２人の患者からの当初の血清を示し、トラック２および４は、１８０ＫＤａのバンドに結合する溶出後のサブ成分を示す。クローンの配列は表５に示されている。
配列の比較
S. sobrinusから得られた配列は、S. sobrinusのＳｐａＡ抗原に対して９９．２％の相同性、また、S. mutansのＰＡｃ抗原に対して６８．４％の相同性を有していた。S. oralisは、S. mutans ＰＡｃタンパク質前駆体に対し、６０５個のアミノ酸において７６．２％の相同性、また、S. sobrinus ＳｐａＡタンパク質前駆体およびS. mutans表面抗原■／■前駆体の両方に対し６０６個のアミノ酸において７３．８％の相同性を有していた。両配列は、３９個のアミノ酸から成る３ケのタンデム反復モチーフを有していた。これから６種類のペプチドを得て、この共有血清のエピトープマッピングを行うのに用いた。
エピトープマッピング
Geysen他によるJ. Immunol. Methods, 102：259 - 274（1987）に概説されているプロトコールおよびその中の参照文献に従って、S. oralisからのクローニングされた抗原のエピトープマッピングを行った。このエピトープマッピングにおいては、クローニングされたS. oralis抗原についてオーバーラップする完全な１組のノナペプチドを合成した。ペプチド１は１〜９の残基をカバーし、ペプチド２は２〜１０の残基をカバーし、そしてペプチド３は３〜１１の残基をカバーし、以下同様にという具合である。すべての血清について２００倍稀釈において１でＩｇＧを調べ、３０分後に記録を停止した。調べた血清は次のとおりである。
（１）ビリダンス心内膜炎（ｎ＝８）（S. sanguis  ｎ＝２、S. oralis ｎ＝２、S. gordonii ｎ＝４）
（２）S. oralis敗血症（ｎ＝５）
（３）S. mutans心内膜炎（ｎ＝２）
（４）E. faecalis心内膜炎（ｎ＝２）
（５）陰性コントロール（ｎ＝５）
以下のようなペプチドについてエピトープを決定した。
（１）少なくとも３ケのウエルにおいて陽性であったもの。
（２）光学密度が各ウエルにおいて陰性コントロールの２倍であり、大部分のウエルにおいて０．８より大きかったもの。
このエピトープマッピングにより合計で９ヶのエピトープが明らかにされた（表１０参照）−ＮＦＫＱＧＱＧ、ＲＱＰＧ、ＳＷＹＧＡＧ、ＧＫＩＲＡＶ、ＲＬＦＡＱＰＱ、ＡＧＲＰＫ、ＰＴＧＹＱＦＤ、ＹＰＴＶＶ、およびＬＬＫＫＡ。最初のエピトープマッピングの後に、各血清について各ウエルに対する陽性を再検査した（表１１参照）。
６．クローニングされたS. oralisからの免疫主体エピトープの調製
合成ペプチド（５．２の「配列の比較」参照）のうち、ペプチド１〜５は、１５個のアミノ酸長から成る短ペプチドとしてS. oralisの配列をカバーしている。ペプチド５とペプチド６は、異なるS. sobrinus領域をカバーしている。これらの配列は、表６および表８に示している。
この６種類のペプチドはCambridge Biochemicals社（Nantwich）によって製造され、二回蒸留水に溶解し最終濃度２ｍｇ／ｍｌとした。０．５ｍｌのアリコートとして−７０℃で保存し、１回の凍結−解凍操作の後、−２０℃で保存した。各ペプチドについて１ヶずつ、６ヶのプラスチック製マイクロタイタープレート［Falcon(R)3912, Microtest(RTM) Flexible Assay Plate,平底の９６ウエル付−Liverool, Fred BakerのBecton Dickinson & Co社製］のウエルを、リン酸緩衝液（１００ｍｌの蒸留水にタブレット１ヶを溶解したもの、Oxoid、BasingstokeのUnipath社製；ＰＢＳ）に溶かした１０μｇ／ｍｌ合成ペプチド溶液の２００μｌで被覆した。ペプチドを添加し、４℃で一晩放置してウエルを被覆した。次いで、Nunc-Immuno Wash (RTM)（DenmarkのInterMed製）を用いてＰＢＳ中で５回、マイクロタイタープレートを洗浄することにより、過剰のペプチドを除去した。一次抗体、すなわち、血清の３％ＢＳＡ溶液を１／１０稀釈したもの２００μｌを添加し、室温下に１時間放置して抗原−抗体結合を行わせた。ＰＢＳで５回洗浄した後、以下のいずれか２００μｌをウエルに満たした。
（ｉ）ヤギ抗ヒトＩｇＭペルオキシダーゼコンジュゲートの３％ＢＳＡ（Sigma製）を１／１０００に稀釈したもの、
（ii）ヤギ抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲートの３％ＢＳＡ（Sigma製）を１／１０００に稀釈したもの、または
（iii）ＰＢＳ。
コンジュゲートは、室温で１時間反応させた。次いで前と同じようにプレートを洗浄し、各ウエルにＡＢＴＳ染色剤２００μｌを添加した［２、２′−アミノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）の３タブレット；ジアンモニウム塩；および３０％ｗ／ｗ過酸化水素溶液の１６０μｌ（Sigma）が、１Ｍクエン酸でｐＨ４．０に調製された１２５ｍＭジナトリウム水素オルソホスフェート緩衝液６０ｍｌに溶かされたもの］。このＡＢＴＣ染色剤は、使用直前に調製した。次いで反応開始後５分、１０分および１５分において４０５ｎｍにおける各ウエルのシグナル強度を、インパクトドットマトリックスプリンター（Panasonic ＫＸ−Ｐ１０８１、日本の大阪のPanasonic Matsushita Electric Industrial Co製）に付属したマイクロタイタープレートリーダー［Titertek Muliskan (10)ＰＬＵＳ  ＭＫＨ、FinlandのLabsystems製］で読みとった。
６種類のペプチドのうちどれが最も特異的で強力な陽性シグナルを発生するS. sobrinus／S. oralis抗原領域を表すものであるかを決定するために、それらのペプチドのそれぞれを間接ＥＬＩＳＡに用いた。
５種類の血清から成るパネル（S. mutans心内膜炎、S. oralis心内膜炎、S. oralis敗血症、S. lactis心内膜炎およびS. aureus心内膜炎の各症例からの単一血清）を用いてすべてのペプチドについてスクリーニングを行った。
６種類のペプチドはすべて、S. mutansおよびS. oralisによる心内膜炎の症例由来の血清により認識された。それらのペプチドの光学密度は、S. oralisによる敗血症由来の血清、およびS. lactisおよびS. aureusによる心内膜炎由来のコントロール（対照）用血清に対してはきわめて低かった。ペプチド１が、S. mutans心内膜炎において最も高いＯＤ（光学密度）（ＩｇＧ）を示したので、さらなる研究に選択した（表７）。
間接ＥＬＩＳＡ
エピトープマッピングおよびクローニングされたS. oralisからの免疫主体エピトープの調製の結果から（上記参照）、３種類のペプチドについて間接ＥＬＩＳＡテストによりさらに調べた。３種類のペプチドとは、ＹＥＶＥＫＰＬＥＰＡＰＶＡＰＳ（ペプチド１）、ＴＭＹＰＮＲＱＰＧＳＧＷＤＳＳ（エピトープＲＱＰＧを含有する−エピトープ番号７４から７９；ペプチド７）およびＷＹＳＬＮＧＫＩＲＡＶＤＶＰＫ（エピトープＧＫＩＲＡＶを含有する−エピトープ番号１４４から１４７；ペプチド８）である。
テストした血清
以下の症例からの血清：S. mutans(2)、S. oralis(3)、S. gordonii(10)、S. sanguis(2)、E. faecalis(11)、S. bovis(8)、S. agalactiae(1)、S. pneunoniae(4)、グループＧ連鎖球菌(2)、S. aureus(2)、コアグラーゼ陰性ぶどう球菌(6)、Candida albicans(1)、Candida parapsilosis(2)およびE. coli(1)による心内膜炎、S. oralis(8)、E. fa alis(7)、E. faecium(2)による敗血症、およびS. milleriによる脳腫瘍。コントロールとしてさらに、ＳＬＥ患者(3)および連鎖球菌感染の証拠のない好中球減少性白血症患者(20)からの血清をテストした。
光学密度は、ペプチド１については表８、また、ペプチド１、２および３については表８ａに示されている。
結果
まとめると、産生ＩｇＧは連鎖球菌による心内膜炎患者に特異的であり、また、産生ＩｇＭはStreptococcus oralis / gordonii / sanguis / mitisによる心内膜炎に特異的であった。
ＩｇＧについて光学密度のカットオフ（区切り点）を０．６とし、また、ＩｇＭについてのそれを０．４とすれば、S. mutans心内膜炎（患者１）、S. oralis心内膜炎（患者４）、S. gordonii心内膜炎（患者６〜１４）およびS. sanguis心内膜炎（患者１６および１７）の症例のすべてがこれの基準のどれかを満たす。コントロールは、E. faecalis、S. bovisおよびグループＧ連鎖球菌による心内膜炎の症例における産生ＩｇＧを除いては、すべて陰性であった（表９）。
このデータは、培養性心内膜炎のテストにおいて有用であることを証明している。そして、培養陰性の症例にも適用し得る。
症例６、１３および１５において治療中にＩｇＭが降下していたことから、ＩｇＭの降下は、治療成功のマーカーであることを示している。
結果を総合的に分析すると（下記の表１２および１３参照）、ペプチド１を用いて行ったテストは最も正確で特異性の高かった（１００％特異性）が、感度は最も低かった（５０％感度）。他の２種類のペプチドによるテストは感度は高かったが、特異性はより低く且つ偽陽性がより多くなっていた。このことは、各ペプチドは単独で用いても有用ではあるが、１種以上のペプチドを用いた組合わせテストを行うことによって感度および特異性のいずれもが高い総合的なテストが可能であることを示している。
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７．フィブロネクチン結合性の検討
クローニングされたタンパク質におけるフィブロネクチン結合活性を調べるために、ペプチド１〜６の各々について前述のプロトコールに従って、間接ＥＬＩＳＡ反応を行わせた。
サンドイッチにフィブロネクチンを添加したか否かにかかわらず、６種類のペプチドの全てにおいて、間接ＥＬＩＳＡによるＯＤ値は２より大きくなっていた。このことは、ポリクローナル血清（抗フィブロネクチン０．５ｍｇ／ｍｌ、シグマ製［Ｆ１５０９］）がペプチドに直接反応したことを示唆した。次にこの血清を１：４０の稀釈率でイムノブロットし、そして、交差吸収後、１ｍｇ／ｍｌ抗体の１００μｌを１ｍｇ／ｍｌフィブロネクチン（Ｆ２００６シグマ製）の１００μｌとともに、３７℃において３０分間反応させた。これによって、抗血清は、S. oralisの１８０ＫＤａ抗原、S. gordoniiの１８０ＫＤａ抗原およびS. sanguisの１２０ＫＤａ抗原と特異的に反応することが明らかにされた。これは、図１のトラック１と２（S. gordonii）、図４のトラック１と２（S. oralis）および図５のトラック１と２（S. sanguis）に示されている。図９は、抗体がS. sobrinusの１８５ＫＤａ抗原（トラック１）およびS. oralis（臨床単離物）の１８０ＫＤａ抗原（トラック３）と交差反応すること、および事前吸収によりフィブロネクチンとの交差反応性を排除することを示している。これは、それら微生物について以前に明らかにした免疫主体抗原であり、フィブロネクチンの模倣体（mimic）として作用することを示唆している。これが、それらの連鎖球菌が心臓弁に結合するメカニズムと思われる。当該ペプチドの配列をヒトのフィブロネクチンと比較すると本質的な相同性が示された（ＧＣＧプログラムＧａｐ；フィブロネクチンの配列、Kornblitt他、ＥＭＢＯ  J., 4：1755−1759、1985）。フィブロネクチン分子のうち最も相同性の高い領域は、フィブロネクチンタンパク質の７５０残基から始まる６９個の残基配列である。類似率および同一率はそれぞれ４８．７％および３５．９％であった（図１０）。
８．ヒト組換え抗体
ビリダンス連鎖球菌に感染し（培養血液陽性）食道切開を受け、アモキシリンおよびゲンタマイシンにより回復した患者の抹梢血リンパ球から、イムノグロブリンＨ鎖およびＬ鎖の可変域（Ｖ）遺伝子のライブラリーを作成した。このライブラリーについてS. oralis ＮＣＴＣ７８１４に対するイムノブロットによりスクリーニングを行うと、１８０ＫＤａのバンドに対する組換え抗体が確認された（第１１図、トラック５および６）。同図には比較のために、S. oralisによる敗血症のから回復中の患者の前ＩｇＭおよび後ＩｇＭ（トラック１および２）ならびに前ＩｇＧおよび後ＩｇＧ（トラック３および４）を示している。
ライブラリーを作成は、Marks他（J. Mol. Biol., 1991, 222：581 - 597）の記載に従いｐＣＡＮＴＡＢ５ベクターを用いて行った。該ベクターは、Pharmacia社（英国のMilton Keyens）からキットの一部として市販されているものである。ビリダンス連鎖球菌（培養血液陽性）敗血症から回復中の患者の末梢血リンパ球のｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡから得られたＨ鎖およびＬ鎖のＶ遺伝子を、Not I/Sfi Iにより分解されたｐＣＡＮＴＡＢ５にランダムに結合させサブクローニングした。その結果得られるファージ表面に発現した単鎖Ｆｖフラグメント（ＳｃＦｖ）を、特定の合成ペプチドエピトープ、すなわち、ＹＥＶＥＫＰＬＥＰＡＰＶＡＰＳ、ＴＭＹＰＮＲＱＰＧＳＧＷＤＳＳ、およびＷＹＳＬＮＧＫＩＲＡＶＤＶＲＫ（ペプチド１、７および８）に対して４回パンニングすることにより増殖した。４回のパンニングの後、２０クローン（それぞれ最後のパンニングから得られたもの）について次の処理を行った。
１．Bst１フィンガープリントしてパンニング処理の集中度を確認した。さらに
２．当初のペプチド（上で詳述したもの）に対して間接ＥＬＩＳＡで調べた。その条件は、以下のとおりである。
組換え抗体：ニート。
ファージ特異的モノクローナル：２０００分の１。
抗マウスセイヨウワサビペルオキシダーゼ：１０００分の１。
ＰＢＳ中、１０μｇ／ｍｌでウエルにペプチド１００ｍｌを入れて４℃で一晩培養。
結果
ペプチド１
Bst１フィンガープリントを行うと選択した２０クローンは同一であった。間接ＥＬＩＳＡは０．２５〜０．３０の範囲で変化した（コントロールは０．１７）。２つのクローン（ＰＡＣ１およびＰＡＣ）を動物実験用に選択した。
ペプチド７
１６クローンから６つのタイプが得られた。そのうち１つのタイプ（タイプＡ）が、１６クローンのうち７クローンをしめ、このタイプのみが間接ＥＬＩＳＡにおいて陽性の記録を示した（０．２７６〜０．３１８）（コントロールは０．１７）。１つのクローン（クローン３）を動物実験用に選択した（ＰＡＣ３）。
ペプチド８
１６のクローンから１０のタイプが得られた。そのうちの２つのタイプ（ＡおよびＢ）は、それぞれ３クローンおよび４クローンをしめた。これらのクローンはいずれもＥＬＩＳＡで陽性の結果を示さなかった。８つのクローンのうち５つが陽性のＥＬＩＳＡ結果を示し（範囲０．２３５〜０．３０４、コントロールは０．１３８）、独特のBst１フィンガープリントを示した。このうちの１クローン（クローン７）を動物実験用に選択した。
ペプチド１〜３に特異的な選択クローンに関し、S. oralisおよびバンコマイシン抵抗性E. faecium感染症治療における効能を調べるために、ＰＡＣ１〜４およびコントロールを用いて一連の実験を行った。
実験１
この実験は、Ｂａｌｂ／ｃマウスを用い死亡時を終点とする急性連鎖球菌感染モデルとして行ったものである。条件は以下の通りである。
S. oralis用量：５．７×１０9
ファージ用量：５×１０8ｐｆｕ／ｍｌ
先ず抗体を、次いで２時間後にS. oralisを投与。
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ＤＥＰＡＧＥ：ガンジダ特異的カルボキシ末端ＨＳＰ９０抗原（配列ＤＥＰＡＧＥ）に対する抗体であり、無関係ファージ、すなわち、コントロールとして作用するものである。
フィッシャーの完全２−テールＰ値は、Ｂ３．７については４８時間で（Ｐ０．０３）、ＰＡＣ１については２時間（Ｐ０．００９５）、さらにＰＡＣ２については４８時間（Ｐ０．０２）で統計学的有意性を示した。Ｂ３．７は、ＨＳＰ９０ストレスタンパク質に特異的な組換え抗体であり、ＨＳＰ９０タンパク質に特異的な抗体が、S. oralis、そしておそらくその他の連鎖球菌および腸球菌による感染症の診断および治療に有用であることを示唆している。
実験２
これは、ＣＤ１マウスを用いる慢性連鎖球菌感染モデルであり、脾臓および腎臓のコロニー係数をいろいろな終点で実施した。条件は以下のとおりである。
S. oralis用量：２．５×１０9。
ファージ用量：５×１０10ｐｆｕ／ｍｌ。
先ずS. oralisを、次いで２４時間後に抗体を投与。
陽性カウント＞１０4／ｇ／ｍｌ。
Ｓ＝脾臓、Ｋ＝腎臓。
Ｓ＋Ｋ＝脾臓の結果および腎臓の結果を合わせたもの。
４日目、７日目および１２日目に５匹のマウスを殺した。
１０日目に抗体を再注入。
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２４時間後の注入の後はファージは回収されず、すべてのマウス血液培養物は陰性。脾臓および腎臓の結果を合わせると、フィッシャーの完全２−テールＰ値はＰＡＣ２について統計学的有意性を示した。
実験３
これは、ＣＤ１マウスによる高レベルのバンコマイシン抵抗性E. faeciumを用いる感染モデルとして行った。条件は以下の通りである。
E. faecium用量：３×１０10／ｍｌ。
ファージ用量：５×１０10ｐｆｕ／ｍｌ。
先ずE. faeciumを、次いで２４時間後に抗体を投与。
陽性＞１０4ｇ／ｍｌ。Ｓ＝脾臓、Ｋ＝腎臓。
Ｓ＋Ｋ＝脾臓＋腎臓。
２日目に自然死亡したものを培養。
４日目に５匹のマウスを殺した。
Ｍ１３Ｋ０７における生存マウス３匹、およびＰＡＣ２抗体における生存マウス５匹を７日目に殺した。
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全陽性数      コントロール：１９／２２
ＰＡＣ      ：１３／１８
これは、当該微生物が＞１０4／ｇ／ｍｌである場合を陽性であるとして、自然死亡（２日目）から得られた脾臓と腎臓の結果と殺した５匹のマウス（４日目）の結果を組み合わせることによって得られたものである。この結果から、ＰＡＣ２は、バンコマイシン抵抗性E. faeciumに対してある程度の活性を有しているものと思われる。
実験４
これは、バイコマイシン抵抗性のE. faeciumを感染させたＢａｌｂ／ｃマウスを用いる急性連鎖球菌感染モデルとして行った。終点は死亡時とした。条件は以下の通りであった。
微生物：高レベル（＞２５６ｍｇ／ｌ）のバンコマイシン抵抗性E. faecium。
E. faecium用量：５×１０10／ｍｌ。
ファージ用量：５×１０10ｐｆｕ／ｍｌ。
先ず抗体を与え、次に２時間後にE. faeciumを投与した。
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フィッシャーの完全２−テールＰ値は、ＰＡＣ２について４８時間において統計学的有意性を示した（Ｐ０．０２）。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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